(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガスを検知するガス電極として被検知ガスを化学反応させる作用電極、前記作用電極に対する対極、前記作用電極の電位を制御する参照電極を、電解液を収容した電解槽の電解液収容部に臨んで設け、前記作用電極に被検知ガスを導くガス導入部を設け、前記各電極にガス検知出力を得る出力回路を電気接続してある定電位電解式水素センサであって、
前記作用電極として、水素酸化に特異的な活性を有する第１水素酸化活性物質を含んだ水素酸化活性層を設け、前記第１水素酸化活性物質が有効成分としてヒドロゲナーゼを含有し、
前記電解液として、電子伝達のメディエータとしての機能を有する第２水素酸化活性物質を含有する定電位電解式水素センサ。
【請求項２】
前記水素酸化活性層が、ポリ−Ｌ−リジン (ＰＬＬ) を改質材として用いたヒドロゲナーゼの単分子膜あるいはＬＢ膜あるいはキャスト膜である請求項１に記載の定電位電解式水素センサ。
【請求項３】
ガスを検知するガス電極として被検知ガスを化学反応させる作用電極、前記作用電極に対する対極、前記作用電極の電位を制御する参照電極を、電解液を収容した電解槽の電解液収容部に臨んで設け、前記作用電極に被検知ガスを導くガス導入部を設け、前記各電極にガス検知出力を得る出力回路を電気接続してある定電位電解式水素センサであって、
前記電解液として、水素酸化に特異的な活性を有する第１水素酸化活性物質としてヒドロゲナーゼが添加された溶液を用い、
前記作用電極として、電子伝達のメディエータとしての機能を有する第２水素酸化活性物質を含んだ水素酸化活性層を設けてある電極を用いる定電位電解式水素センサ。
【請求項４】
ガスを検知するガス電極として被検知ガスを化学反応させる作用電極、前記作用電極に対する対極、前記作用電極の電位を制御する参照電極を、電解液を収容した電解槽の電解液収容部に臨んで設け、前記作用電極に被検知ガスを導くガス導入部を設け、前記各電極にガス検知出力を得る出力回路を電気接続してある定電位電解式水素センサであって、
前記作用電極として、水素酸化に特異的な活性を有する第１水素酸化活性物質であるヒドロゲナーゼと、電子伝達のメディエータとしての機能を有する第２水素酸化活性物質とを含んだ水素酸化活性層を設けてある定電位電解式水素センサ。
【請求項５】
前記第２水素酸化活性物質が、ビオロゲン化合物あるいはシトクロムｃ3を含有している請求項１〜４のいずれか一項に記載の定電位電解式水素センサ。
【請求項６】
前記ビオロゲン化合物が、ＭＶ、ＰＢＶ、ＰＯＶである請求項１〜５のいずれか一項に記載の定電位電解式水素センサ。
【請求項７】
ヒドロゲナーゼを含む水素酸化活性層がＰＥＧＤＧＥを含有する請求項１又は２又は４又は５のいずれか一項に記載の定電位電解式水素センサ。
【請求項８】
前記水素酸化活性層が前記第１水素酸化活性物質および前記第２水素酸化活性物質を担持した活性炭粉末を塗着して形成してある請求項１〜７のいずれか一項に記載の定電位電解式水素センサ。
【請求項９】
前記ヒドロゲナーゼが、チオカプサ  ロセオペルシシナ（Ｔｈｉｏｃａｐｓａ  ｒｏｓｅｏｐｅｒｓｉｃｉｎａ）ＢＢＳ株由来である請求項１〜８のいずれか一項に記載の定電位電解式水素センサ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ガスを検知するガス電極として被検知ガスを化学反応させる作用電極、前記作用電極に対する対極、前記作用電極の電位を制御する参照電極を、電解液を収容した電解槽の電解液収容部に臨んで設け、前記作用電極に被検知ガスを導くガス導入部を設け、前記各電極にガス検知出力を得る出力回路を電気接続してある定電位電解式水素センサに関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、水素の検知には水素ガスセンサとして、水素と他のガスとの気体熱伝導率の違いを利用する気体熱伝導式、水素の触媒燃焼による素子温度の上昇を利用する接触燃焼式、水素よる半導体粒子表面の吸着酸素の消費に伴う半導体素子の自由電子の増加(抵抗値の減少)を利用する半導体式などが用いられている。また、水素の電気化学的酸化に伴う電流値を測定する電気化学式（定電位電解式）が用いられており、これは電解液を用いる湿式と固体電解質を用いる乾式が知られている。これら水素ガスセンサはそれぞれ得意とする濃度範囲や設置条件があり、用途に応じて使い分けられている。また、これら水素ガスセンサは、様々な工夫により他の可燃性ガスに対する水素の感度比を大きく向上させることにより、感度良く水素を認識することができるため、水素ガス漏洩を検知する手段として広く使用されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
上述した従来の水素ガスセンサは、他の可燃性ガスに対する水素の感度比を大きく向上させることにより水素を感度良く検知できるようにしたものであり、原理的に水素だけに感度を有するというようなものではない。このため、水素に対する高感度化には限界があり、さらに、水素以外の可燃性ガスを検知する可能性を否定できないため、水素ガスセンサからの警報には誤報が含まれている可能性があるといった問題を常に考慮した上で使用する必要があった。
【０００４】
従って、本発明の目的は、高水素選択性を有する定電位電解式水素センサを提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
近年、水素とプロトンとの酸化還元反応を特異的に触媒する蛋白質として知られるヒドロゲナ−ゼについての研究が進み、熱や酸素に対して十分な安定性を有するヒドロゲナ−ゼが発見された。さらに、ヒドロゲナーゼ生成菌の培養技術、ヒドロゲナーゼの分離精製技術が確立されている。また、ヒドロゲナーゼの電極への固定化技術等が研究されている。このように電極にヒドロゲナーゼを固定することにより、ヒドロゲナーゼを触媒として電気化学的もしくは光化学的に電流を検出したり、水素を発生させる試みがなされている。また、ヒドロゲナーゼにおいては、水素の酸化還元に作用する活性部位は局在化していると考えられており、電極とヒドロゲナーゼとの直接的な電子の授受は困難であると考えられているため、電極とヒドロゲナーゼとの間の電子の授受を仲介するメディエータが不可欠である。つまり、電子キャリアーとしてメディエータを化学結合したポリマーを電極表面に固定化し、緩衝液中において、水素溶存下でのヒドロゲナーゼの水素酸化による電流を検出したり、光励起により電子を放出する亜鉛錯体を用いることで、光化学的に水素を発生させるのである。
【０００６】
この反応は、化１の正反応に示したように、ヒドロゲナーゼを触媒として、緩衝液中のプロトンを還元することにより水素を発生させたものである。
【０００７】
【化１】
0004521797.tif 000002
【０００８】
本発明者らは、ヒドロゲナーゼは水素とプロトンの酸化還元反応を特異的に触媒する蛋白質であるから、化１で示した正反応の逆反応においても、緩衝液中の電極上で起こさせることが可能ではないかと考えた。さらに、上記目的を達成すべく、水素の酸化によるプロトンと電子の生成を電極に固定されたヒドロゲナーゼを触媒として行わせ、生じた電子を出力回路により検出することによって、水素に対して高選択性を有する水素ガスセンサとして利用できるのではないかと考え本発明に想到した。
【０００９】
ここで、前述のように、ヒドロゲナーゼを電極に固定し、メディエータを使用してヒドロゲナーゼと電極間の電子の授受を行い水素を発生させる反応は周知の技術であったが、水素を高感度に選択するための水素ガスセンサとして機能する電気化学的なセンサとしてヒドロゲナーゼを使用する技術はこれまで提案されていなかった。つまり、本発明は、本発明者らの前述の知見に基づき、多くの実験を重ねた上で実験的に確認され、完成に至ったものである。
【００１０】
〔構成１〕
この目的を達成するための本発明の特徴構成は、請求項１に記載のように、
ガスを検知するガス電極として被検知ガスを化学反応させる作用電極、前記作用電極に対する対極、前記作用電極の電位を制御する参照電極を、電解液を収容した電解槽の電解液収容部に臨んで設け、前記作用電極に被検知ガスを導くガス導入部を設け、前記各電極にガス検知出力を得る出力回路を電気接続してある定電位電解式水素センサであって、
前記作用電極として、水素酸化に特異的な活性を有する第１水素酸化活性物質を含んだ水素酸化活性層を設け、前記第１水素酸化活性物質が有効成分としてヒドロゲナーゼを含有し、
前記電解液として、電子伝達のメディエータとしての機能を有する第２水素酸化活性物質を含有することにある。
【００１１】
また、この目的を達成するための本発明の特徴構成は、請求項２に記載のように、請求項1に記載の発明において、
前記水素酸化活性層が、ポリ−Ｌ−リジン (ＰＬＬ) を改質材として用いたヒドロゲナーゼの単分子膜あるいはＬＢ膜あるいはキャスト膜であることにある。
【００１２】
〔作用効果１〕
つまり、ガスを検知するガス電極として被検知ガスを化学反応させる作用電極、前記作用電極に対する対極、前記作用電極の電位を制御する参照電極を、電解液を収容した電解槽の電解液収容部に臨んで設け、前記作用電極に被検知ガスを導くガス導入部を設けてあるから、前記ガス導入部より被検知ガスを前記作用電極に導くことが出来、導かれた前記被検知ガスが前記作用電極上において酸化反応することにより酸化電流が流れ、さらに、前記対極上では酸素の還元反応が起こり、前記作用電極上で生じた酸化電流と等量の還元電流が流れる。この反応に伴って流れる電流量は、前記作用電極上で反応した被検知ガス濃度に比例しており、前記各電極に電気接続してあるガス検知出力を得る出力回路によりこの電流量を測定することによって、前記被検知ガスの濃度が測定できるのである。
またガス種によって酸化還元電位が異なることを利用しているため、前記回路の設定電位によってはガスの選択的な検知が可能になる。また、ガス電極に用いる触媒を変えることで、目的とするガスに対して高い選択性を持たすことができるのである。
【００１３】
また、前記作用電極に水素酸化に特異的な活性を有する第１水素酸化活性物質を含んだ水素酸化活性層を設け、前記第１水素酸化活性物質が有効成分としてヒドロゲナーゼを含有することによって、前記作用電極に用いる触媒を水素に特異的な触媒とすることが出来る。つまり、前記ヒドロゲナーゼは、水素を特異的に酸化還元する蛋白質であるため、前記ヒドロゲナーゼを前記水素酸化活性層に含有させることによって、前記作用電極は水素に高い選択性を有することになるのである。
【００１４】
ここで、前記ヒドロゲナーゼは親水性の蛋白質であり、水素の酸化還元に作用する活性部位は局在化していると考えられており、電極とヒドロゲナーゼとの直接的な電子の授受は困難であると考えられているため、電極とヒドロゲナーゼとの間の電子の授受を仲介するメディエータが不可欠である。このため、前記電解液中に電子伝達のメディエータとしての機能を有する第２水素酸化活性物質を含有することにより、図３に示したように、前記作用電極付近で酸化分解された水素の酸化反応の結果生じた電子を前記メディエータが仲介し、前記作用電極に前記電子を伝達することが円滑に行われるのである。
【００１５】
このように、水素に高い選択性を有する前記作用電極に前記メディエータを介して円滑に電子を伝達することが出来るのであるから、水素に高い選択性を有する定電位電解式水素センサを提供することが出来るのである。
また、水素の原料となるメタノ−ル、メタンや一酸化炭素などには感度を示さず、水素に高い感度を有する水素ガスセンサ提供できれば、将来の水素エネルギーシステムのメンテナンスや安全対策に非常に役立つものと期待される。
【００１６】
ここで、高効率の電子伝達を可能にするための薄膜として、単分子膜、ＬＢ  （Ｌａｎｇｍｕｉｒ  Ｂｌｏｄｇｅｔｔ）法により作成されたＬＢ膜、キャスト法により作成されたキャスト膜がある。これらの膜の作成に用いられる分子は分子内に疎水性と親水性が分極して存在することが好ましいことが知られている。また、ヒドロゲナーゼの多くは親水性であるため、例えば、後述の実施例１に記載のＰＬＬ等の改質材を用いることによりヒドロゲナーゼの活性を変化させること無く疎水性を付与することが出来る。つまり、ＰＬＬを改質材として用いたヒドロゲナーゼの単分子膜やＬＢ膜を水素酸化活性層として用いれば、親水基と疎水基とを配向配列させることができ、高効率の電子伝達が実現するのである。
【００１７】
〔構成２〕
この目的を達成するための本発明の特徴構成は、請求項３に記載のように、
ガスを検知するガス電極として被検知ガスを化学反応させる作用電極、前記作用電極に対する対極、前記作用電極の電位を制御する参照電極を、電解液を収容した電解槽の電解液収容部に臨んで設け、前記作用電極に被検知ガスを導くガス導入部を設け、前記各電極にガス検知出力を得る出力回路を電気接続してある定電位電解式水素センサであって、
前記電解液として、水素酸化に特異的な活性を有する第１水素酸化活性物質としてヒドロゲナーゼが添加された溶液を用い、
前記作用電極として、電子伝達のメディエータとしての機能を有する第２水素酸化活性物質を含んだ水素酸化活性層を設けた電極を用いることにある。
【００１８】
〔作用効果２〕
つまり、ガスを検知するガス電極として被検知ガスを化学反応させる作用電極、前記作用電極に対する対極、前記作用電極の電位を制御する参照電極を、電解液を収容した電解槽の電解液収容部に臨んで設け、前記作用電極に被検知ガスを導くガス導入部を設け、前記各電極にガス検知出力を得る出力回路を電気接続してあるから、請求項１に記載の定電位電解式水素センサの基本的な構成を採用することが出来るのである。
【００１９】
また、前記電解液として、水素酸化に特異的な活性を有する第１水素酸化活性物質としてヒドロゲナーゼが添加された溶液を用いることにより、前記電解液中に含まれる前記ヒドロゲナーゼによって水素を特異的に酸化分解することができる。さらに、前記作用電極として、電子伝達のメディエータとしての機能を有する第２水素酸化活性物質を含んだ水素酸化活性層を設けてある電極を用いることにより、図４に示したように前記作用電極付近で酸化分解された前記水素の酸化反応の結果生じた電子を前記メディエータが仲介し、前記作用電極に前記電子を伝達することが円滑に行われるのである。
また、酸化反応の触媒としてヒドロゲナーゼを用いているから、水素に高い選択性を有する定電位電解式水素センサを提供することが出来るのである。
【００２０】
〔構成３〕
この目的を達成するための本発明の特徴構成は、請求項４に記載のように、
ガスを検知するガス電極として被検知ガスを化学反応させる作用電極、前記作用電極に対する対極、前記作用電極の電位を制御する参照電極を、電解液を収容した電解槽の電解液収容部に臨んで設け、前記作用電極に被検知ガスを導くガス導入部を設け、前記各電極にガス検知出力を得る出力回路を電気接続してある定電位電解式水素センサであって、
前記作用電極として、水素酸化に特異的な活性を有する第１水素酸化活性物質であるヒドロゲナーゼと、電子伝達のメディエータとしての機能を有する第２水素酸化活性物質とを含んだ水素酸化活性層を設けたことにある。
【００２１】
〔作用効果３〕
つまり、ガスを検知するガス電極として被検知ガスを化学反応させる作用電極、前記作用電極に対する対極、前記作用電極の電位を制御する参照電極を、電解液を収容した電解槽の電解液収容部に臨んで設け、前記作用電極に被検知ガスを導くガス導入部を設け、前記各電極にガス検知出力を得る出力回路を電気接続してあるから、請求項１に記載の定電位電解式水素センサの基本的な構成を採用することが出来るのである。
【００２２】
また、前記作用電極として、水素酸化に特異的な活性を有する第１水素酸化活性物質であるヒドロゲナーゼと、電子伝達のメディエータとしての機能を有する第２水素酸化活性物質とを含んだ水素酸化活性層を設けてあるから、前記ヒドロゲナーゼによって水素を特異的に酸化分解することができ、さらに、図５に示したように、前記水素の酸化反応の結果生じた電子を前記メディエータが仲介し、前記作用電極に前記電子を伝達することが円滑に行われるのである。
【００２３】
また、酸化反応の触媒としてヒドロゲナーゼを用いているから、水素に高い選択性を有する定電位電解式水素センサを提供することが出来るのである。
【００２４】
〔構成４〕
また、この目的を達成するための本発明の特徴構成は、請求項５に記載のように、請求項１〜４の発明において、
前記第２水素酸化活性物質が、ビオロゲン化合物あるいはシトクロムｃ3を含 有していることにある。
【００２５】
また、請求項６に記載のように、前記ビオロゲン化合物はメチルビオロゲン（ＭＶ）、ポリブチルビオロゲン（ＰＢＶ）、ポリオクチルビオロゲン（ＰＯＶ）であるのが好ましい。
【００２６】
また、この目的を達成するための本発明の特徴構成は、請求項７に記載のように、請求項項１又は２又は４又は５のいずれか一項の発明において、
ヒドロゲナーゼを含む水素酸化活性層がＰＥＧＤＧＥを含有することにある。
【００２７】
〔作用効果４〕
つまり、前記第２水素酸化活性物質に含まれるメディエータとしてビオロゲン化合物あるいはシトクロムｃ3を使用するのが好ましい。
【００２８】
前記ビオロゲン化合物としては、ＭＶ、ＰＢＶ、ＰＯＶ等のビオロゲンポリマーが含まれる。図７に前記ＭＶをメディエータとして用いた場合の前記作用電極表面における電子伝達の様子を示す。つまり、水素がヒドロゲナーゼにより酸化され、この時生じた電子がＭＶに伝達され、前記ＭＶは還元型ＭＶとなる。この還元型ＭＶは速やかに酸化されるのであるが、この際、前記作用電極に電子を伝達するのである。
また、前記ビオロゲン化合物は、合成し易く、電極表面での固定も容易であることから、汎用性の高いメディエータとして期待される。
【００２９】
また、前記ビオロゲン化合物を用いた場合、前記ビオロゲン化合物は前記ヒドロゲナーゼと複合体を形成し安定な分子膜を形成しているものと考えられるため、前記ビオロゲン化合物は電子伝達のメディエータとして機能するだけでなく、安定した水素酸化活性層を有する作用電極を提供することが出来る。
【００３０】
前記シトクロムｃ3は、硫酸還元菌中ではヒドロゲナーゼから電子を受け取り 細胞内に運び込む、ヒドロゲナーゼの電子伝達体としての機能を有するものであり、乾燥状態でも電子伝達活性が保持されているものである。特に固体膜において高い電気導電性を有するものであるから、前記作用電極の前記水素酸化活性層に前記第２水素酸化活性物質として含有させた場合には、酸化反応の結果生じた電子の伝達を容易に行うことが出来るようになる。一方、前記電解液中に第２水素酸化活性物質として含有させた場合においても電子伝達活性が保持されているため、酸化反応の結果生じた電子の伝達を容易に行うことが出来るようになる。
【００３１】
また、ヒドロゲナーゼを含む前記水素酸化活性層に、ヒドロゲナーゼ膜安定化材として、Ｐｏｌｙ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）ｄｉｇｌｙｃｉｄｙｌ  ｅｔｈｅｒ（ＰＥＧＤＧＥ）を加えてもよい。前記ＰＥＧＤＧＥを前記水素酸化活性層に添加した場合、前記水素酸化活性層は安定性を増すことが期待される。
【００３２】
〔構成５〕
また、この目的を達成するための本発明の特徴構成は、請求項８に記載のように、請求項１〜７の発明において、
前記水素酸化活性層が前記第１水素酸化活性物質および前記第２水素酸化活性物質を担持した活性炭粉末を塗着して形成してあることにある。
【００３３】
〔作用効果５〕
つまり、前記水素酸化活性層が前記第１水素酸化活性物質であるヒドロゲナーゼや前記第２水素酸化活性物質であるメディエータを担持した活性炭粉末を塗着して形成すれば、前述のように単分子膜やＬＢ膜を作製して前記作用電極上に固定する必要が無いため、簡便に水素に高い選択性を有する作用電極を作製することができ、その結果、簡便に水素に高い選択性を有する定電位電解式水素センサを提供することが出来る。そのため、製造コストの安価な定電位電解式水素センサを提供することが出来るのである。
【００３４】
また、前記活性炭粉末等のカーボンは、作用電極材料としても用いられており、電導性が高いため、前記作用電極への電子の伝達が容易に行われる。
【００３５】
〔構成６〕
また、この目的を達成するための本発明の特徴構成は、請求項９に記載のように、請求項１〜８の発明において、
前記ヒドロゲナーゼが、チオカプサ  ロセオペルシシナ（Ｔｈｉｏｃａｐｓａｒｏｓｅｏｐｅｒｓｉｃｉｎａ）ＢＢＳ株由来であることにある。
【００３６】
〔作用効果６〕
つまり、チオカプサ  ロセオペルシシナ（Ｔｈｉｏｃａｐｓａ  ｒｏｓｅｏｐｅｒｓｉｃｉｎａ、以下Ｔ．ｒｏｓｅｏｐｅｒｓｉｃｉｎａとする）のＢＢＳ株より精製したヒドロゲナーゼは、熱や酸素に対して十分な安定性を有し、７０℃付近で最適な酵素活性を示す。さらに、前記ＬＢ膜中においても酵素活性は３０−７０℃において良好に保持されている（図９参照）。このため、水素検出のために前記定電位電解式水素センサにおける前記電解液や前記ＬＢ膜の温度が７０℃付近まで上昇したとしても、前記Ｔ．ｒｏｓｅｏｐｅｒｓｉｃｉｎａのＢＢＳ株由来のヒドロゲナーゼを使用することによって、酵素活性が失活することなく安定性の高い定電位電解式水素センサを提供することが出来るのである。
【００３７】
【発明の実施の形態】
以下に本発明の実施の形態を図面に基づいて説明するが、本発明は、これらによって限定されるものではない。
〔実施例１〕
本発明の定電位電解式水素センサは、図１に示すような水素発生測定用装置を水素を検知すべく改変して用いることで実施可能である。つまり、電解液１０１を収容する電解槽１０２を形成する容器を設け、その電解槽１０２に収容した電解液１０１と接触自在になるように、被検知ガスを化学反応させる作用電極１０３、作用電極に対する対極１０４、前記作用電極の電位を制御する参照電極１０５を設けて構成してある。また、前記作用電極１０３は、ガス導入部１１１より導入された被検知ガスを前記作用電極１０３上で反応させる反応部に形成してある。前記作用電極１０３は、材料として酸化インジウム（ＩＴＯ）、黒鉛、金、グラスカーボン等を用いることができる。また、前記対極１０４は白金ワイヤーや金ワイヤーを用いることができ、前記参照電極１０５は銀、塩化銀電極で形成してある。前記電解液１０１として、酸性水溶液等を用いることが出来る。また、前記電解液１０１の温度を一定に保つために循環ポンプにより、水を循環させてもよい。
【００３８】
前記作用電極１０３上で生じた電子に基づく電流を検知自在な電流測定部２０１と前記作用電極１０３の電位制御自在な電位制御部２０２とを備えたガス検知回路に接続してガス検知装置として用いられる。
【００３９】
前記作用電極１０３表面上に、水素酸化に特異的な酵素活性を有するヒドロゲナーゼを含有した水素酸化活性層を設けることにより前記作用電極１０３は水素に高い選択性を有することになるのである。この時、前記作用電極１０３とヒドロゲナーゼとの直接的な電子の授受は困難であると考えられているため、前記作用電極１０３とヒドロゲナーゼとの間の電子の授受を仲介するメディエータを前記電解液１０１中に含有させることにより、図３に示したように前記作用電極１０３付近で酸化分解された前記水素の酸化反応の結果生じた電子を前記メディエータが仲介し、前記作用電極１０３に前記電子を伝達することが円滑に行われるのである。この時、前記電解液１０１中に含有させる前記メディエータとしては、ビオロゲン化合物であるメチルビオロゲン（ＭＶ）を使用するのが好ましい。
【００４０】
前記ヒドロゲナーゼは、紅色硫黄細菌であるＴ．ｒｏｓｅｏｐｅｒｓｉｃｉｎａのＢＢＳ株（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｍｏｓｃｏｗ）６０、３７９−３８４（１９９５）参照）をＰｆｅｎｎｉｎｇの方法を改良して嫌気条件下で培養し、Ｚｏｒｉｎらの方法に従って精製したものを用いた（図８参照）。
【００４１】
また、前記作用電極１０３表面の前記水素酸化活性層が、ヒドロゲナーゼの単分子膜あるいはＬＢ膜として配向配列することによって、高効率の電子伝達を可能にすることが出来る。高効率の電子伝達を可能にするための薄膜作成技術として、ＬＢ（Ｌａｎｇｍｕｉｒ  Ｂｌｏｄｇｅｔｔ）法がある。
ＬＢ法に用いられる分子は、分子内に疎水性、親水性が分極して存在することが必要である。タンパク質分子表面には疎水、親水部位がモザイク状に存在し、脂質分子の様な分極が少ない。また、分子全体として親水性のものが多く、気液界面で展開できず、水に溶解してしまうものが多い。ヒドロゲナーゼの多くは親水性であり、前記Ｔ．ｒｏｓｅｏｐｅｒｓｉｃｉｎａのＢＢＳ株より精製したヒドロゲナーゼにおいても同様である。それ故、水溶性タンパク質のＬＢ膜を作製する上で重要なことは、分子を変性させず、水溶性タンパク質に疎水性を付与することである。この目的のために、ＰＬＬを改質材として用いることにより、ヒドロゲナーゼのＬＢ膜を作製することができる。
ここで、ＬＢ膜作製におけるＰＬＬの役割は、ＰＬＬとヒドロゲナーゼが静電的相互作用により複合体を形成し、ヒドロゲナーゼの表面電荷が打ち消され、タンパク質の親水性が減少する。さらに、ＰＬＬがヒドロゲナーゼ間を架橋し、界面に展開されたタンパク質が下層水に溶け込みにくくなり、気液界面において単分子膜やＬＢ膜が形成されるのである。
【００４２】
前記下層水には１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）を用いた。前記Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に、１．１ｍｇ／ｍｌのヒドロゲナーゼ溶液２０μｌを滴下し、周知のグラスロッド法により展開することにより、気液界面上に分子膜を形成させた。ＰＬＬは前記下層水中にリジンモノマー濃度で０．５ｍＭを添加する。また、前記ＰＬＬが２０残基のペプチドの場合は、２５μＭを添加する。
気液界面上に展開した前記分子膜を、前記作用電極１０３であるＩＴＯ基板  （４ｘ３０ｘ１ｍｍ）上に３０ｍＮ／ｍの条件で積層化し、この層を水素酸化活性層とすることで前記作用電極１０３表面上にヒドロゲナーゼの単分子膜あるいはＬＢ膜を作成した。
【００４３】
つまり、ＰＬＬを用いることによりヒドロゲナーゼの活性を変化させること無く疎水性を付与することが出来る。つまり、ヒドロゲナーゼを単分子膜やＬＢ膜として水素酸化活性層に配列させることができるのであるから、高効率の電子伝達が実現するのである。
【００４４】
このようにして作製したＬＢ膜中のヒドロゲナーゼの熱安定性を、加熱後の水素発生による活性で評価した。水素発生は前述の周知の水素発生測定用装置を用いて周知の方法により行った。前記ＬＢ膜の加熱（３０−１００℃）は、電熱線のオーブンを用いて１０分間行った。測定に用いた前記ＬＢ膜は、石英基板上に一層に累積した膜 （０．３９ｍｇ／ｃｍ2）を用いた。比較対照として溶液状態のヒドロゲナーゼを用いた。前記ＬＢ膜中と等量のヒドロゲナーゼを含む緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０）を湯浴中で加熱（３０−１００℃）した後、活性測定を行った。
前記ＬＢ膜中のヒドロゲナーゼの熱安定性について評価を行った結果を図９に示す。前記ＬＢ膜中のヒドロゲナーゼの水素発生の活性は、３０−７０℃において保持されていた。完全な失活は前記緩衝液中のヒドロゲナーゼおよび前記ＬＢ膜中のヒドロゲナーゼともに１００℃であった。
尚、前記Ｔ．ｒｏｓｅｏｐｅｒｓｉｃｉｎａのＢＢＳ株より精製されたヒドロゲナーゼの活性最適温度は７０℃であるため、前記ヒドロゲナーゼは、定電位電解式水素センサでの使用において十分な安定性を有することが判明した。
【００４５】
また、高効率の電子伝達を可能にするための薄膜として、キャスト法により作製されたキャスト膜がある。このキャスト膜は、ヒドロゲナーゼ（１３ｍｇ／ｍＬ）２μＬ、ポリビオロゲン（１０ｍｇ／ｍＬ）２μＬ、Ｐｏｌｙ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）ｄｉｇｌｙｃｉｄｙｌ  ｅｔｈｅｒ（ＰＥＧＤＧＥ）（１０ｍｇ／ｍＬ）２μＬから成る６μＬの蛋白質溶液を、約７ｍｍ2の面積を有す るカーボン電極の表面に塗布することにより形成したキャスト面を４℃にて２４時間放置した後、前記キャスト面を透析膜にて被覆し、Ｏ−リングで固定することにより作製されるものである。
【００４６】
前記水素発生用測定装置に、逆に水素を通気し、各電極からの出力がどのように得られるかを求めたところ、図１０のようになった。通気は１００％水素及び１００％アルゴン（Ａｒ）によりコントロールした。
図１０によると、前記水素発生用測定装置に水素を通気すると次第に電極から電流出力が得られていることが判る。また、この電流値は、水素の通気に伴い上昇していることから、電解液中の水素濃度に比例することが読み取れる。また、アルゴンの通気により電解液中の水素濃度が低下すると電流出力が低下すると共に、再度水素を通気すると再現性よく電流出力が上昇することが判る。これにより、水素を含有する検知対象ガスを通気した時の定常的な電流出力強度あるいは、電流出力強度の上昇速度（電解液中での水素濃度の上昇速度）を知ることにより、前記検知対象ガス中の水素濃度を知ることが出来ることが判る。
【００４７】
〔実施例２〕
また、実施例１で用いた水素発生測定用装置の構成を採用し、前記電解液１０１としてヒドロゲナーゼを添加した溶液を用い、さらに、前記作用電極１０３として、ヒドロゲナーゼとの間の電子の授受を仲介するメディエータに被覆された電極を用いることも可能である。これにより、図４に示したように前記作用電極１０３付近で酸化分解された前記水素の酸化反応の結果生じた電子を前記メディエータが仲介し、前記作用電極１０３に前記電子を伝達することが円滑に行われるのである。
【００４８】
前記電解液１０１として、２０ｍＭリン酸カリウム（Ｋ3ＰＯ4）と２０ｍＭ塩化カリウム（ＫＣｌ）（ｐＨ７．０）に７μｇ／ｍＬの終濃度でヒドロゲナーゼを添加した。また、循環ポンプにより、水を循環させて前記電解液１０１を３０℃に維持して使用した。
【００４９】
前記作用電極１０３として、金電極を用い、前記メディエータとして前記ビオロゲン化合物に含まれるメチルビオロゲン化合物にチオール基を付し、これを自己集合単分子膜（ＳＡＭ膜）として図６に示したように前記作用電極上に固定した。この時、自己集合単分子膜上のビオロゲンの活性部位は、前記電解液中で揺らぐことが出来るため、前記電解液中に含まれるヒドロゲナーゼの活性部位と容易に結合し、酸化反応の結果生じた電子の伝達を容易に行うことが出来るようになる。尚、前記メチルビオロゲン化合物として、Ｎ−ｍｅｔｈｙ−Ｎ’−（ｍｅｒｃａｐｔｏｏｃｔｙｌ）−４，４’ｂｉｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍを用いると、チオール基が容易に金電極と反応し、固定化される。
【００５０】
前記ビオロゲン化合物以外に、硫酸還元菌中においてヒドロゲナーゼから電子を受け取り細胞内に運び込み、ヒドロゲナーゼの電子伝達体としての機能を有し、乾燥状態でも電子伝達活性が保持されているシトクロムｃ3を使用しても同様の効果が得られることが判る。
【００５１】
〔実施例３〕
また、実施例１で用いた水素発生測定用装置の構成を採用し、前記作用電極１０３の水素酸化活性層として、ヒドロゲナーゼとメディエータとの混合膜とすることも可能である。この時、図５に示したように、前記水素の酸化反応の結果生じた電子を前記メディエータが仲介し、前記作用電極１０３に前記電子を伝達することが円滑に行われるのである。
【００５２】
前記作用電極１０３の材料として酸化スズを用い、前記メディエータとしては、ビオロゲン化合物に含まれるビオロゲンポリマーであるポリブチルビオロゲン（ＰＢＶ）、ポリオクチルビオロゲン（ＰＯＶ）等を使用するのが好ましい。ここで、前記ビオロゲンポリマーは化２の一般式で表わすことができる。
【００５３】
【化２】
0004521797.tif 000003
【００５４】
この一般式において、ｎ＝４がＰＢＶ、ｎ＝８がＰＯＶである。
【００５５】
前記ビオロゲンポリマーは水溶性であり、混合膜である混合ＬＢ膜作製時に下層水である１０ｍＭ  Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ７．４）に溶解させた。ＫＳＶミニトラフにて前記混合ＬＢ膜を作製した。０．２９ｍｇ／ｍｌのヒドロゲナーゼ１００μＬを水面上に展開し、圧縮を行うことで、気液界面上にヒドロゲナーゼ分子膜の作製を行った。前記ヒドロゲナーゼ分子膜は３０ｍＮ／ｍの表面圧に維持し、前記酸化スズ電極基板を１回垂直方向に浸漬する方法で累積し、ビオロゲンポリマーとヒドロゲナーゼとの混合ＬＢ膜を作製した。
【００５６】
前記ビオロゲンポリマーは前記ヒドロゲナーゼと複合体を形成し安定な分子膜を形成しているものと考えられる。そのため、前記ビオロゲンポリマーは電子伝達のメディエータとして機能するだけでなく、安定した水素酸化活性層を有する作用電極を提供することが出来る。
【００５７】
さらに、ヒドロゲナーゼ膜安定化材として前記混合膜の構成に、前記ＰＥＧＤＧＥを加えてもよい。前記ＰＥＧＤＧＥは、化３に示した構造式で表わすことができる。
【００５８】
【化３】
0004521797.tif 000004
【００５９】
前記ＰＥＧＤＧＥを前記水素酸化活性層に添加した場合、前記水素酸化活性層は安定性を増すことが期待される。
例えば、グラスカーボン電極の表面上に設けられたヒドロゲナーゼとＰＢＶを含有する水素酸化活性層に前記ＰＥＧＤＧＥを添加することにより形成したキャスト膜の安定性を増大させることができる。
【００６０】
また、前記水素発生用測定装置において、通気する水素濃度を種々変化させた場合の出力を測定した所、図１１（ａ）に示す結果が得られた。この時、（１）ヒドロゲナーゼとＰＢＶの混合膜に安定化材としてＰＥＧＤＧＥを添加した水素酸化活性層を設けた電極、（２）グラスカーボンのみの電極、（３）ヒドロゲナーゼの単分子膜にＰＥＧＤＧＥを添加した水素酸化活性層を設けた電極とを用いた。つまり、（１）の電極を用いて経時的に水素濃度を変化させた場合においては、通気した被検知ガスが１００％水素である場合の出力は約１．０μＡ、５０％水素である場合の出力は約０．６μＡ、３０％水素である場合の出力は約０．３μＡ、１０％水素である場合の出力は約０．０５μＡであった。また、（２）の電極を用いて経時的に水素濃度を変化させた場合においては、いずれの水素濃度においても出力は得られなかった。さらに、（３）の電極を用いて経時的に水素濃度を変化させた場合においては、水素濃度５０〜１００％付近で出力は得られたものの、水素濃度５０％以下では出力は得られなかった。尚、（３）の電極を持ちいて得られた出力は微弱であったので、出力値を５倍して表示してある。
【００６１】
これらの結果より、ヒドロゲナーゼとメディエータであるＰＢＶとが存在することにより、良好に出力が得られることが判った。さらに、この出力は、水素濃度に対応したものであることが判った。
【００６２】
また、（１）の電極を用いて得られた水素濃度と得られた出力値との関係を明確にするためにグラフにプロットした所、図１１（ｂ）に示したように、ほぼ直線状のグラフが得られた。つまり、通気する水素濃度を種々変化させた場合に得られる出力は、水素濃度に正比例することが判明した。これにより、得られた電流出力より、容易に水素濃度を求められることが可能となるのである。
【００６３】
〔実施例４〕
前述の実施例１〜３において、前記水素酸化活性層が、前記ヒドロゲナーゼや前記メディエータを担持した活性炭粉末を塗着して形成された構成とすることも可能である。
つまり、実施例１の構成においては、前記ヒドロゲナーゼを前記活性炭粉末に担持させて前記作用電極１０３に塗着させる。実施例２の構成においては、前記メディエータを前記活性炭粉末に担持させて前記作用電極１０３に塗着させる。実施例３の構成においては、前記ヒドロゲナーゼと前記メディエータを前記活性炭粉末に担持させて前記作用電極１０３に塗着させるのである。このように構成することにより、前述のように単分子膜やＬＢ膜を作製して前記作用電極上に固定する必要が無いため、簡便に水素に高い選択性を有する作用電極を作製することができ、その結果、簡便に水素に高い選択性を有する定電位電解式水素センサを提供することが出来るのである。
【００６４】
〔別実施例〕
本発明の定電位電解式水素センサは、図２に示したような周知の定電位電解式ガスセンサにおいても実施可能である。
つまり、電解液１０１を収容する電解槽１０２を形成するケーシングを設け、前記電解槽１０２に収容した前記電解液１０１と接触自在になるように被検知ガスを化学反応させる作用電極１０３、前記作用電極に対する対極１０４、前記作用電極の電位を制御する参照電極１０５を設けて構成してある。前記作用電極１０３、前記対極１０４及び前記参照電極１０５は、ガス透過性の多孔質テフロン膜１０７の表面に、白金や金、パラジウム等の貴金属触媒を塗布焼結して形成したものである。ガス導入部より導入された被検知ガスは、前記多孔質テフロン膜１０７を通過した後、触媒（固相）、電解液（液相）、ガス（気相）の三相界面において電気化学反応を行うのである。
【００６５】
ここで、前記作用電極１０３の表面上に水素酸化に特異的な酵素活性を有するヒドロゲナーゼを含有した水素酸化活性層を設けることにより前記作用電極１０３は水素に高い選択性を有することになるのである。この時、電子の授受を仲介するメディエータを前記電解液１０１中に含有させることにより、前記作用電極１０３付近で酸化分解された前記水素の酸化反応の結果生じた電子を前記メディエータが仲介し、前記作用電極１０３に前記電子を伝達することが円滑に行われるのである。この時、前記電解液１０１中に含有させる前記メディエータとしては、ビオロゲン化合物であるメチルビオロゲン（ＭＶ）を使用するのが好ましい。
【００６６】
また、この定電位電解式ガスセンサの構成において、前記作用電極１０３をヒドロゲナーゼとの間の電子の授受を仲介するメディエータを含んだ水素酸化活性層を設けた電極とし、前記電解液１０１としてヒドロゲナーゼを添加した溶液を用いることも可能である。さらに、この定電位電解式ガスセンサの構成において、前記作用電極１０３の水素酸化活性層をヒドロゲナーゼとメディエータとの混合膜とすることも可能である。
【００６７】
前記メディエータは、前記メチルビオロゲン（ＭＶ）の他に、ビオロゲン化合物に含まれるビオロゲンポリマーであるポリブチルビオロゲン（ＰＢＶ）、ポリオクチルビオロゲン（ＰＯＶ）等が使用可能であり、前記ビオロゲン化合物に含まれるメチルビオロゲン化合物にチオール基を付し、これを自己集合単分子膜  （ＳＡＭ膜）として前記作用電極１０３表面上に固定することも可能である。さらに、前記作用電極１０３の水素酸化活性層を前記混合膜とした場合、膜の安定化材としてＰｏｌｙ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）ｄｉｇｌｙｃｉｄｙｌ  ｅｔｈｅｒ（ＰＥＧＤＧＥ）を加えてもよい。
【００６８】
また、前記メディエータは、前記ビオロゲン化合物以外にも、硫酸還元菌中においてヒドロゲナーゼから電子を受け取り細胞内に運び込み、ヒドロゲナーゼの電子伝達体としての機能を有し、乾燥状態でも電子伝達活性が保持されているシトクロムｃ3を使用することも可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の定電位電解式水素センサの実施例の概略図
【図２】本発明の定電位電解式水素センサの別実施例の概略図
【図３】作用電極にヒドロゲナーゼを含有した水素酸化活性層を設け、電解液にメディエータを添加した溶液を用いた定電位電解式水素センサにおける、ヒドロゲナーゼとメディエータと作用電極との間の電子伝達の概略図
【図４】作用電極にメディエータを含有した水素酸化活性層を設け、電解液にヒドロゲナーゼを添加した溶液を用いた定電位電解式水素センサにおける、ヒドロゲナーゼとメディエータと作用電極との間の電子伝達の概略図
【図５】作用電極にヒドロゲナーゼとメディエータを含有した水素酸化活性層を設けた定電位電解式水素センサにおける、ヒドロゲナーゼとメディエータと作用電極との間の電子伝達の概略図
【図６】作用電極に自己集合単分子膜（ＳＡＭ膜）を固定した図
【図７】メチルビオロゲン（ＭＶ）をメディエータとして用いた場合の作用電極表面における電子伝達の概略図
【図８】ヒドロゲナーゼの精製法の概略図
【図９】ＬＢ膜中のヒドロゲナーゼの熱安定性について評価を行ったグラフ
【図１０】水素通気による電流応答のグラフ
【図１１】通気する水素濃度を種々変化させた場合の電流応答のグラフ
（ａ）経時的に水素濃度を変化させた場合の出力
（ｂ）水素濃度と得られた出力値との関係
【符号の説明】
１０１    電解液
１０２    電解槽
１０３    作用電極
１０４    対極
１０５    参照電極
１０７    多孔質テフロン膜
１１１    ガス導入部
【図１】
0004521797.tif 000005
【図２】
0004521797.tif 000006
【図３】
0004521797.tif 000007
【図４】
0004521797.tif 000008
【図５】
0004521797.tif 000009
【図６】
0004521797.tif 000010
【図７】
0004521797.tif 000011
【図８】
0004521797.tif 000012
【図９】
0004521797.tif 000013
【図１０】
0004521797.tif 000014
【図１１】
0004521797.tif 000015