(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂ細胞を活性化するのに使用される組成物であって、配列番号４、配列番号５または配列番号６として同定されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、または、これらのバリアントであって、配列番号４、配列番号５または配列番号６として同定されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列を有し、且つ、Ｂ細胞を活性化するもの、を含む組成物。
【請求項２】
前記ポリペプチドまたはバリアントが、哺乳類のＢ細胞を活性化するのに使用される請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記哺乳類がヒトである請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ヒトが乳児である請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記ヒトがＴ細胞免疫不全またはアレルギーに罹っている請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
前記ヒトがＣＤ４０Ｌ陰性のＴ細胞またはＣＤ４０Ｌ不足（deficient）Ｔ細胞を有する請求項３に記載の組成物。
【請求項７】
Ｂ細胞の、免疫グロブリン高率分泌細胞に至る成長および分化を誘導するのに使用される組成物であって、前記組成物が請求項１に記載のものである組成物。
【請求項８】
哺乳類の抗原特異的Ｂ細胞を活性化するのに使用されるワクチンであって、前記ワクチンが、請求項１に記載の組成物およびＣＤ１４以外の抗原を含むワクチン。
【請求項９】
使用される際に哺乳類Ｂ細胞を活性化させ、配列番号４として同定されるアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチド、または、そのバリアントであって、配列番号４として同定されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列を有し、且つ、Ｂ細胞を活性化するもののアミノ酸配列を有する純粋なタンパク質または前記タンパク質の翻訳時および／または翻訳後修飾された形態を調製する方法であり、
（ｉ）培養条件下で、前記タンパク質をコードする核酸分子を含有し、および前記タンパク質または前記タンパク質の翻訳時および／または翻訳後修飾された形態を発現できる原核生物宿主または真核生物宿主を培養する工程と、
（ｉｉ）前記タンパク質または前記タンパク質の翻訳時および／または翻訳後修飾された形態を発現させる工程と、
（ｉｉｉ）前記タンパク質を培養物から回収する工程と
を含む方法。
【請求項１０】
使用される際に哺乳類Ｂ細胞を活性化させる単離されたポリペプチドまたはそのバリアントの、Ｂ細胞活性化を必要とする哺乳類内のＢ細胞を活性化するための医薬品の製造における使用であって、前記ポリペプチドまたはそのバリアントが請求項１において定義されたもののいずれかであることを特徴とする使用。
【請求項１１】
人工栄養乳を製造する方法であって、前記乳中に、使用される際に哺乳類Ｂ細胞を活性化させる単離されたポリペプチドまたはそのバリアントを組み込む工程を含み、前記ポリペプチドまたはそのバリアントが請求項１において定義されたもののいずれかであることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１１の方法によって製造される人工栄養乳。
【請求項１３】
ＣＤ１４以外の抗原を含有するワクチンを製造する方法であって、使用される際に哺乳類Ｂ細胞を活性化させる単離されたポリペプチドまたはそのバリアントを組み込み、ワクチン処方剤にする工程を含み、前記ポリペプチドまたはそのバリアントが請求項１において定義されたもののいずれかであることを特徴とする方法。
【請求項１４】
前記抗原と、前記ポリペプチドまたはバリアントの共役結合体を形成してワクチン処方剤にする工程を含む請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ワクチン処方剤に、前記抗原と、前記ポリペプチドまたはバリアントを混合し、ワクチン処方剤にする工程を含む請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
ＣＤ１４以外の抗原の所定量と、使用される際に哺乳類Ｂ細胞を活性化させる単離されたポリペプチドまたはそのバリアントの所定量とを含むワクチン調製用キットであって、前記ポリペプチドまたはそのバリアントが請求項１において定義されたもののいずれかであることを特徴とするワクチン調製用キット。
【請求項１７】
配列番号５のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して生じる抗体であって、前記抗体は、ヒトＢ細胞の活性を低減ないし阻害しなければＣＤ１４の高い血清濃度の結果として過剰に活性化されるヒトＢ細胞の活性を低減ないし阻害するために使用される抗体。
【請求項１８】
請求項１７記載の抗体の、ヒトＢ細胞の活性を低減または阻害する医薬品の製造における使用。
【請求項１９】
所望される抗原特異性を有する哺乳類Ｂ細胞が分泌するモノクローナル抗体を豊富にするために使用される組成物であって、前記組成物が請求項１に記載のものである組成物。
【請求項２０】
使用される際に哺乳類Ｂ細胞を活性化させる単離されたポリペプチドまたはそのバリアントの、Ｂ細胞を活性化させる医薬品の製造における使用であって、前記ポリペプチドまたはそのバリアントが請求項１において定義されたもののいずれかであることを特徴とする使用。
【請求項２１】
使用される際に哺乳類Ｂ細胞を活性化させる単離されたポリペプチドまたはそのバリアントの、人工栄養乳の製造における使用であって、前記ポリペプチドまたはそのバリアントが請求項１において定義されたもののいずれかであることを特徴とする使用。
【請求項２２】
使用される際に哺乳類Ｂ細胞を活性化させる単離されたポリペプチドまたはそのバリアントの、ワクチンの製造における使用であって、前記ポリペプチドまたはそのバリアントが請求項１において定義されたもののいずれかであることを特徴とする使用。
【請求項２３】
ワクチン調製のためのキットであって、前記キットが、使用される際に哺乳類Ｂ細胞を活性化させる単離されたポリペプチドまたはそのバリアントの所定量を含み、前記ポリペプチドまたはそのバリアントが請求項１において定義されたもののいずれかであることを特徴とする、ワクチン調製のためのキット。
【請求項２４】
使用される際に哺乳類Ｂ細胞を活性化させる単離されたポリペプチドまたはそのバリアントの、ヒトＢ細胞の活性を低減または阻害する医薬品の製造における使用であって、前記ポリペプチドまたはそのバリアントが請求項１において定義されたもののいずれかであることを特徴とする使用。
【請求項２５】
請求項２１に従って製造される人工栄養乳。
【請求項２６】
ＣＤ１４以外の抗原を含有するワクチンを製造する方法であって、使用される際に哺乳類Ｂ細胞を活性化させる単離されたポリペプチドまたはそのバリアントを組み込み、ワクチン処方剤にする工程を含み、前記ポリペプチドまたはそのバリアントが請求項１において定義されたもののいずれかであることを特徴とする方法。
【請求項２７】
人工栄養乳を製造する方法であって、使用される際に哺乳類Ｂ細胞を活性化させる単離されたポリペプチドまたはそのバリアントを組み込み、前記乳にする工程を含み、前記ポリペプチドまたはそのバリアントが請求項１において定義されたもののいずれかであることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
免疫学、生化学、ならびに細胞および分子生物学の分野の本発明は、Ｂ細胞を活性化するタンパク質または翻訳時および／または翻訳後に修飾されたＬＡＩＴタンパク質と呼ばれるタンパク質に関する。本発明はまた、医薬品製剤におけるそのようなタンパク質の利用、およびＬＡＩＴタンパク質またはその機能誘導体を含む薬剤組成物も対象とする。本発明はまた、ウシＬＡＩＴタンパク質またはその機能誘導体をコードする核酸分子、およびＢ細胞を活性化する天然形および組換え形の前記タンパク質の精製方法も対象とする。
発明の背景
一般にＢ細胞と呼ばれる骨髄由来「Ｂ」リンパ球は、リンパ液、血液、および免疫系の２次リンパ様組織に存在する一種の白血球である。Ｂ細胞は抗体分泌細胞、形質細胞の前駆体であり、それ自体体液性免疫応答の誘発に重要である。
成人の大部分の体液性免疫応答の誘発には、一般にＴ細胞と呼ばれる胸腺由来Ｔリンパ球、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、およびＢ細胞間のいくつかの細胞相互作用が関与している［Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ  １４７：１１５９，１９７８；  ＰＮＡＳ  ７７：１６１２，１９８２；  ＰＮＡＳ  ７９：１９８９，１９８２；  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．９５：９１４，１９８７］。
現在理解されているように、Ｔ細胞依存性Ｂ細胞活性化は、主要組織適合性複合体内（ＭＨＣ）でコードされるタンパク質と共にＡＰＣによって提示された抗原の認識によるＴ細胞の活性化を含み、これらのタンパク質はＡＰＣの細胞表面に発現される。この抗原に特異的、ＭＨＣ拘束性のＴ細胞とＡＰＣの相互作用の結果、２種類の細胞の相互活性化が生じ、Ｔ細胞が生理変化して、「ヘルパー機能」が顕在化する。
ヘルパーＴ細胞は、抗原特異的なＢ細胞を活性化することができる。Ｔ細胞とＢ細胞の相互作用の抗原特異性は、ＡＰＣとして機能するＢ細胞の最終的能力の結果、維持される。従って、静止している休止Ｂ細胞は有効なＡＰＣではない（ＰＮＡＳ  ７９：  １９８９，１９８２）が、Ｂ細胞は膜結合免疫グロブリンを介して抗原と特異的に相互作用し、その特異性は、その娘細胞が分泌する免疫グロブリンの特異性を反映する（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４０：９０４，１９７４）。
特定のＢ細胞による抗原の免疫グロブリン仲介インターナリゼーションには、さらに別の種類のＡＰＣである濾胞樹状細胞による提示が関与する可能性があり、そのインターナリゼーションの結果、Ｂ細胞による抗原処理の開始、ＭＨＣクラスＩＩおよびＢ７の発現の上向き調節、およびＭＨＣと関連した抗原由来のペプチドの提示を生じる（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：２０５５，１９９３）。この経路で活性化されたＢ細胞が活性化ヘルパーＴ細胞の標的である。
Ｔ細胞のヘルパー機能は、Ｔ細胞とＢ細胞の接触と、サイトカインと呼ばれるＴ細胞由来の可溶性メディエータとＢ細胞の原形質膜上に発現されたそのコグネイトリガンドとの相互作用との両方を介して伝達されるシグナルを含む。Ｔ細胞とＢ細胞の接触も、Ｔ細胞とＡＰＣの相互作用と同様に、ＭＨＣ拘束性を持つ（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：６２７，１９８２；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：６３４，１９８２）。しかし、２つのリンパ球系統、特にＴ細胞抗原受容体（ＴｃＲ）とＢ細胞によって発現されるＭＨＣ／抗原複合体との間のＭＨＣ拘束性相互作用を仲介する分子の特異的な相互作用は、Ｂ細胞の成長および分化の誘導を意味するものではない（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：３７５，１９８８）。
Ｔ細胞とＢ細胞の接触の要件に反映される必須の分子相互作用は、Ｂ細胞の形質膜上で発現されるＣＤ４０、およびＴ細胞の原形質膜上で発現されるそのコグネイトリガンドｇｐ３９（またはＣＤ４０Ｌ）によって仲介される（ＰＮＡＳ  ８９：６５５０，１９９２；  Ｎａｔｕｒｅ  ３５７：８０，１９９２）。このパラダイムは、Ｔ細胞とＡＰＣの相互作用の際およびＴ細胞とＢ細胞の相互作用後に、後者の膜での発現が増加するという観察と一致する（ＰＮＡＳ  ８９：６５５０，１９９２）。さらに、膜免疫グロブリンが仲介するＢ細胞と抗原の相互作用により、ＣＤ４０の膜発現が増加する（Ｓｅｍ．ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ６：３０３，１９９４）。ＣＤ４０とＣＤ４０Ｌの間の相互作用は、Ｂ細胞の成長、Ｂ細胞の免疫グロブリン分泌細胞への分化、および免疫グロブリンのアイソタイプスイッチの誘発を意味する（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：１５６７，１９９３）。
このモデルは、可溶性ＣＤ４０ＬまたはＣＤ４０に特異的なモノクローナル抗体（ｍＡｂ）がＢ細胞の成長および免疫グロブリン分泌への分化を誘発できるという観察と一致する（Ｓｅｍ．ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２６７，１９９４；  ＰＮＡＳ  ８３：４４９４，１９８６；  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：１４２５，１９８８）。
Ｔ細胞とＢ細胞の接触の必須要件に加えて、いくつかのＴ細胞由来のサイトカイン、ＩＬ−２、ＩＬ−４、およびＩＬ−５が、Ｂ細胞の成長および分化にとって重要である。これらのサイトカインに対するＢ細胞の感受性は、事前のＴ細胞との接触によって、大部分が制限される。従って、Ｔ細胞との接触後、Ｂ細胞はサイトカイン特異的膜受容体の発現を増加させる（ＰＮＡＳ  ８０：６６２８，１９８３；  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４５：２０２５，１９９０；  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：１１１８，１９９１）。ＩＬ−２およびＩＬ−５は、活性化Ｂ細胞の成長を助けることが実証されている（ＰＮＡＳ  ７７：１６１２，１９８０；  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．５２：１１５，１９８０）。さらに、ＩＬ−４および抗免疫グロブリンは、相乗的にＢ細胞の成長を援助することが示されている（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５５：９１４，１９８２）。
この点に関する顕著な例外は、ＩＬ−４およびＩＬ−５に対する休止Ｂ細胞の応答である。ＩＬ−４は、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質のｄｅ  ｎｏｖｏ転写および翻訳を誘発し（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５５：９１４，１９８２；  ＰＮＡＳ  ８１：６１４９，１９８４；  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６０：６７９，１９８４）、ＩＬ−５は、細胞成長のない状態で休止Ｂ細胞の免疫グロブリン高率分泌細胞への分化を助けることができる（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：２３２３，１９９２）。
いかなる場合も、Ｔ細胞およびＢ細胞の膜分子間の分子相互作用およびＴ細胞由来のサイトカインとＢ細胞におけるそれらのコクネイト受容体との相互作用からのシグナルは、複合シグナリングシステムの一部である。各シグナルはＢ細胞を活性化の別の段階へ進め、Ｂ細胞をその後の進行シグナルに感応可能にする。これらのシグナルは、個々にＢ細胞の成長および分化の完全なプロセスを進める能力を持つのではなく、相互に補足し合う（Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．９５：１７７，１９８７）。
１９８８年に、ヒツジの初乳に独特の活性が発見された（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：１３６６，１９８８）。タンパク質精製の古典的技術を用いて、プロリンの豊富なタンパク質（ＰＲＰ）を部分精製した。この物質は、休止Ｂ細胞の細胞周期の誘発を助け、かつその免疫グロブリン高率分泌細胞への分化を助けることが示された。これは明らかに、これらの機能を仲介する哺乳類由来のタンパク質の最初の報告であった。
その後、ヒツジのＰＲＰに特異的なモノクローナル抗体が調製された。抗体を用いて調製したアフィニティカラムにＰＲＰ標品を通したとき、溶離液および溶離物のウェスタンブロット分析によって評価すると、ＰＲＰは全てカラムに保持された。しかし、Ｂ細胞刺激活性は全て、溶離物内に存在した。従って、ヒツジの初乳に存在するＢ細胞向性生物活性の発表された特性は、ＰＲＰに起因するものではなかった（未発表情報）。
発明の概要
本発明は、新規のウシのタンパク質、およびそのタンパク質をコードする単離されたヌクレオチド配列を特徴とし、そのタンパク質は哺乳類由来のＢ細胞を活性化することができる。実質的に純粋なＬＡＩＴタンパク質、または翻訳時および／または翻訳後に修飾したＬＡＩＴタンパク質は、生化学的精製またはそれが天然の関連している他のタンパク質を実質的に含まない原核または真核宿主における組換え手段によって生産することができる。また本発明は、ウシの初乳の乳漿からＬＡＩＴタンパク質、または翻訳時および／または翻訳後に修飾した形の本発明のＬＡＩＴタンパク質を精製するプロセスであって、
（ｉ）サンプル内に含まれるタンパク質を塩析するステップ、
（ｉｉ）従来のタンパク質分画法を利用して、ステップ（ｉ）で塩析したタンパク質からＬＡＩＴタンパク質を濃縮し、最終的に精製するステップ
を含むプロセスも含む。
すべての場合において、このタンパク質は望ましい生物学的活性を有する。
本発明はまた、ＬＡＩＴタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子も対象とする。核酸分子はｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡとすることができる。
単離したウシのタンパク質は、ヒトＣＤ１４およびマウスＣＤ１４と相同性を有しており、従ってウシＣＤ１４とも呼ばれる。本発明は、ＣＤ１４、組換え形のそのタンパク質、またはその機能誘導体を投与することによって、Ｂ細胞を活性化する方法、特にそのような活性化を必要とする哺乳類のＢ細胞を活性化する方法を含む。
好適な実施形態では、哺乳類はヒトの患者である。
１つの態様では、本発明はＣＤ１４を乳児用フォーミュラに混合することを含む。本発明はＣＤ１４を幼児に投与することを含み、好適な投与の形態はそのようなフォーミュラを幼児に摂取させることである。
別の態様では、本発明はＣＤ１４をワクチン注射の一部として組み込むことを含む。本発明は、免疫化を必要とする患者にＣＤ１４および抗原を投与することを含み、好適な投与の形態は、ＣＤ１４および抗原の両方を含む単一調剤（ｓｉｎｇｌｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）の投与を含む。
別の態様では、本発明は、Ｔ細胞免疫不全の患者にＣＤ１４を投与することを含む。好適な態様では、本発明は、患者のＴ細胞の細胞表面のｇｐ３９（ＣＤ４０Ｌ）が発現不足であるかまたは全く存在しない特定のＴ細胞機能不全の患者に、ＣＤ１４を投与することを含む。
別の態様では、本発明は、血清ＣＤ１４が正常レベルより高いためにＢ細胞が過剰に活性化された機能不全患者に、ＣＤ１４に対する抗体を投与することを含む。好適な態様では、本発明は、Ｂ細胞が血清ＣＤ１４によって活性化された結果、リウマチ因子を分泌する慢性関節リウマチの患者に、ＣＤ１４に対する抗体を投与することを含む。
本発明は、それに対する抗体を形成させたかった抗原と最適下（ｓｕｂｏｐｔｉｍａｌ）の分裂促進濃度のＣＤ１４と共にＢ細胞を培養することによって、所望の特異性を有するｍＡｂを分泌するハイブリドーマを作製する新規の方法を含む。この方法で活性化したＢ細胞の集団は、活性化された抗原特異的Ｂ細胞を非常に多く含み、これは次いで、所望の特異性を持つｍＡｂを分泌するハイブリドーマの作製に使用される。
本発明は、Ｂ細胞の活性化を必要とする哺乳類でＢ細胞を活性化するための医薬品の調製におけるＣＤ１４の使用を含む。
本発明では天然のまたは組換えＣＤ１４を使用することができる。
本発明では、用語「ＣＤ１４」は、マウス、ウシまたはヒトのＣＤ１４を含む。
用語の定義
「機能誘導体」は、特異的な抗体に結合するか、そのコクネイト受容体を有する細胞でその受容体に結合するなど、本発明に係るその利用を可能にするＣＤ１４の機能の少なくとも一部分を保持する。本明細書で使用する「機能誘導体」は、以下で定義するＣＤ１４の「断片」または「バリアント」を含む。
ＣＤ１４の「断片」とは、ポリペプチドの任意の部分集合、すなわちより短いペプチドを指す。用語「断片」は、Ｃ末端、Ｎ末端、および配列内の１つ以上の部位における１つ以上のアミノ酸の欠失を含む、天然のタンパク質配列を有するＣＤ１４から誘導されるポリペプチドを示すのに使用される。そのような断片は、無傷ＣＤ１４ポリペプチドまたは翻訳時および／または翻訳後に修飾した形のＣＤ１４に特徴的な１つ以上の生物学的活性または機能を保持していなければならない。
ＣＤ１４の「バリアント」とは、天然のＣＤ１４またはその断片と同様の一次配列を有し、天然の活性が少なくとも部分的に保持されているポリペプチドを指す。変異ポリペプチドは合成手段またはポリペプチド内の欠失、挿入、または保存的アミノ酸置換を含む前記ポリペプチドの生物学的活性を保持する前記ポリペプチドをコードするｃＤＮＡの突然変異によって調製することができる。
本明細書で使用する用語「抗体」とは、免疫グロブリンタンパク質の非保存領域で明確なエピトープを結合する能力を持ち、それによって抗体が一つのタンパク質を別のタンパク質から区別することを可能にする免疫グロブリンタンパク質である。用語「エピトープ」は、抗体が結合できる分子の部分を指すものである。用語「抗体」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）またはキメラ抗体を含む。
ポリクローナル抗体は、抗原で免疫した動物の血清由来の不均一な抗体分子の集団である。
モノクローナル抗体は、抗原の明確なエピトープと結合することができる均一な抗体の集団である。ＭＡｂは、当業者に周知の方法によって得ることができる。このような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、およびＩｇＤを含む任意の免疫グロブリンクラスおよびそれらの任意のサブクラスとすることができる。用語「抗体」はまた、無傷分子および抗原と結合できる例えばＦａｂやＦ（ａｂ′）2’などのその断片の両方を含むものである。ＦａｂおよびＦ（ａｂ′）2’は、無傷抗体のＦｃ断片を欠いており、循環からより速く除去され、非特異的組織結合が無傷抗体より少なくなる（Ｗａｈｌら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２４：３１６−３２５，１９８３）。
キメラ抗体は、マウスｍＡｂ由来の可変部およびヒト免疫グロブリン由来の定常部を持つものなど、異なる部分が異なる動物種由来である分子である。
「抗原」は、抗原のエピトープに結合できる抗体を産生するように動物を追加的に誘導することが可能な、抗体が結合できる分子または分子の一部分である。抗原は、１つまたは１つを超えるエピトープを持つことができる。抗体がポリペプチド、その断片またはバリアントに「特異的」であると言うか、またはポリペプチド、その断片またはバリアントに「結合することができる」と言う場合、それは、抗原が高度に選択的に、その対応する抗体と反応し、他の抗原によって形成される多数のその他の抗体とは反応しないことを意味する。
【図面の簡単な説明】
図１Ａ〜図１Ｃは、天然のウシＬＡＩＴ（ｎＢｏ−ＬＡＩＴ）タンパク質の精製を示している。図１Ａは、５０ｍｇの６２％（ｖ／ｖ）（ＮＨ4）2ＳＯ4沈殿物をかけたアニオン交換カラム［ＦＰＬＣ−Ｍｏｎｏ−Ｑ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ］からの溶離プロフィールである。結合タンパク質を、１０ｍＭのビス−トリスプロパン中５０〜４００ｍＭのＮａＣｌの勾配および７．５〜９．５の同時ｐＨ勾配で溶離した。表１Ａは、ピーク活性を持つ画分、画分＃５７の生物活性を示す。浮遊密度の高いマウスの脾臓のＢ細胞を前述のように単離し（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３１：５８１，１９８３）、９６ウェルクラスタ平底組織培養皿（Ｃｏｓｔａｒ）で０．２ｍｌの血清を含まない培地０．２ｍｌ中５×１０4個の細胞で培養した。０．２５μｇ／ｍｌのＬＰＳの存在下または非存在下で、各画分を１０％（ｖ／ｖ）の最終濃度になるように加えた。４０時間後に、培地を１μＣｉの3Ｈ−ＴｄＲでパルスし、６時間後にフィルタディスクに採取し、シンチレーション分光光度計でチミジン取込みを評価した。数字はｃｐｍ×１０-3を表す。図１Ｂは、２０ｍｇの分画＃５７（図１Ａ）をかけた分子ふるいカラム［ＦＰＬＣ−Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５、Ｐｈａｒｍａｃｉａ］からの溶離プロフィールである。カラムは、０．４５ｍのＮａＣｌを含む２０ｍＭのトリスＨＣＬのｐＨ８．０の緩衝液で平衡化した。表１Ｂは、図１Ａに関連して説明したように評価した、ピーク画分、画分＃３８の生物活性を示す。図１Ｃは、１ｍｇの画分＃３８（図１Ｂ）をかけたヒドロキシアパタイトカラム［ＨＰＬＣ−ヒドロキシアパタイト、Ｐｈａｒｍａｃｉａ］からの溶離プロフィールである。結合タンパク質を、１ｍＭのＮａＣｌを含む、Ｋ2ＨＰＯ4勾配１〜５００ｍＭのｐＨ６．８の緩衝液で溶離した。表１Ｃは、図１Ａに関連して説明したように評価したピーク画分、画分＃２５の生物活性を示す。図中の挿入図は、分画＃２５からのタンパク質約５μｇの銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。左レーン：分画＃２５；右レーン：ＭＷマーカ、上からそれぞれ９７、６６、４５、３１、２１、および１４ｋＤ。
図２は、ヒトＣＤ１４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）の既知の配列およびｎＢｏ−ＬＡＩＴのアラインメントさせた断片を示す。Ｂｏ−ＬＡＩＴ断片は、アフィニティ精製した初乳ｎＢｏ−ＬＡＩＴから生成した（図３参照）。ヒトＣＤ１４の残基２３５〜２６４および３４４〜３５５に対応する断片は、ＣｎＢｒ切断で生成し、逆相ＨＰＬＣ（Ｃ８カラム、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で分離した各々約１８ｋＤの大きさのそれぞれメジャーおよびマイナーペプチドであった。ヒトＣＤ１４の残基５３〜６７に対応する断片は、ＣｎＢｒ切断で生成し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＰＶＤＦ膜への電気泳動で分離した２４ｋＤの断片の部分配列である。ヒトＣＤ１４の残基１９〜３６および１５１〜１６５に対応する断片は、トリプシン切断で生成し、逆相ＨＰＬＣ（Ｃ８カラム、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で分離した。ヒトＣＤ１４の予測された配列と重複するウシの配列の長さには、各断片について下線を付した。破線は同一アミノ酸を示し、ヒトの配列と異なるアミノ酸は明示されている。
図３は、ウシおよびヒトのアフィニティ精製された初乳ＬＡＩＴタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色を示す。レーン１：図１Ｃで示したと同様のＭＷマーカ；レーン２：ウシの初乳の乳漿の６２．５％（ｖ／ｖ）（ＮＨ4）2ＳＯ4沈殿物；レーン３：＃８４２セファロースアフィニティカラムからのｐＨ２．５溶離液、レーン４：レーン５に表す物質をかけたＣＤ１４特異的ｍＡｂの６３Ｄ３（ＰＮＡＳ  ７７：６７６４，１９８０）セファロースアフィニティカラムからのｐＨ２．５溶離液；レーン５：セファクリルＳ１００ＨＲで分画したヒトの初乳の乳漿レーン１〜５の各々は５μｇのタンパク質を含む。表２は、５×１０4の高浮遊密度のマウス脾臓Ｂ細胞を、血清を含まない培地で、示した刺激の存在下で４０時間培養し、１μＣｉの3Ｈ−ＴｄＲでパルスし、６時間後にフィルタディスクに採取し、シンチレーション分光光度計でチミジン取込みを評価した。数字はｃｐｍ×１０-3を表す。生物検定法の詳細は、図１Ａで説明した通りである。対照ｃｐｍ×１０-3：刺激無し、０．３：５０μｇ／ｍｌ  ＬＰＳ、７５．０；０．２５μｇ／ｍｌ  ＬＰＳ［ＬＰＳ↓］、０．８；および１μｇ／ｍｌ  ｍｌｇＭ特異的ｍＡｂのｂ−７−６（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４：７５３，１９８４）、０．７。
図４Ａおよび図４Ｂは、ｎＢｏ−ＬＡＩＴ活性の熱不安定性および抗体仲介阻害を示す。図４Ａは、ｎＢｏ−ＬＡＩＴを９５℃で１０分間熱処理した場合（●）と熱処理しなかった場合（○）について、示した濃度のアフィニティ精製したｎＢｏ−ＬＡＩＴの存在下で図１Ａについて説明したように培養した５×１０4の高浮遊密度のマウス脾臓Ｂ細胞によるチミジンの取込みを示す。培地を3Ｈ−ＴｄＲで４０時間パルスし、６時間後に採取し、液体シンチレーション分光光度計でチミジン取込みを評価した。挿入図は、ｎＢｏ−ＬＡＩＴを熱処理した（または熱処理しない）場合について、示した濃度のＬＰＳを含む培地における応答を示す。図４Ｂは、０．２５μｇ／ｍｌのアフィニティ精製したｎＢｏ−ＬＡＩＴまたは５０μｇ／ｍｌのＬＰＳのいずれかの存在下で、図４Ａについて説明したように確立した培地におけるチミジンの取込みを示す。これらの各刺激について、上述の濃度のポリクローナルウサギＩｇＧ抗Ｂｏ−ＬＡＩＴ、＃８４２、または正常ウサギＩｇＧのいずれかの存在下で培養した。ｎＢｏ−ＬＡＩＴおよびＬＰＳ仲介刺激の両方について＃８４２のＩｇＧによって仲介されたチミジン取込みの阻害率を括弧内に示す。正常ウサギＩｇＧによって仲介された阻害のレベルは、ｎＢｏ−ＬＡＩＴおよびＬＰＳ刺激でそれぞれ９〜２０％および１２〜３１％の範囲であった。単離した＃８４２ＩｇＧによって直接誘導されたＣＰＭは０．４および５０μｇ／ｍｌでそれぞれ４５４±５３から７６４±６９の範囲内であり、正常ウサギＩｇＧの場合、０．４および５０μｇ／ｍｌでそれぞれ２９７±３４から４２０±３１の範囲内であった。刺激を受けない対照では、どちらの組の実験でも１９５±２９ｃｐｍとなった。
図５Ａは、ウシＣＤ１４遺伝子を含む７．１ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ断片の制限酵素切断地図を示す。制限部位の略語は、Ｘ、ＸｈｏＩ；Ｐ、ＰｓｔＩ；Ｏ、ＮｃｏＩ；Ｂ、ＢａｍＨＩ；Ｎ、ＮｏｔＩ；Ｄ、ＢｓｓＨＩ；Ｔ、ＢｓｔＥＩＩ；Ｍ、ＳｍａＩ；Ｓ、ＳａｃＩＩ；Ｃ、ＨａｐＩ；Ｒ、ＥｃｏＲＶ；Ａ、ＳｐｈＩ；Ｇ、ＢｇＩＩＩ；Ｈ、ＨｉｎｄＩＩＩ；Ｅ、ＥｃｏＲＩである。図５Ｂは、ウシＣＤ１４の遺伝子座の略図である。黒く塗った部分は遺伝子のコード領域を表し、空白の囲みはイントロン配列である。ＡＴＧ開始コドンの前の斜線部は５′非翻訳領域であり、ＴＡＡ停止コドンの後の斜線部は３′非翻訳領域である。図５Ｃは、選択する配列決定法を示す略図である。矢印は配列決定の方向を表す。断片番号は右側に示す（詳しくは本文を参照されたい）。
図６は、ウシ（配列番号Ｎｏ．１）、ヒト（配列番号Ｎｏ．２）、およびマウス（配列番号ＮＯ．３）のＣＤ１４コード領域の核酸配列の比較を示す。最初の塩基位置はＡＴＧコドンの第１ヌクレオチドに対応し、最後のヌクレオチドはＴＡＡ停止コドンの第３ヌクレオチドに対応する。アラインメントはＤＮＡ  ＳＴＡＲ−Ｍｅｇａｌｉｇｎソフトウェアを使用し、加重残基表（ｗｅｉｇｈｅｄ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｔａｂｌｅ）を用いるクラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）法を適用して行われた。このアラインメントで使用するヒトｃＤＮＡ配列（受入れ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ）番号Ｐ０８５７１）およびマウスｃＤＮＡ配列（受入れ番号Ｐ０８５７１）は、スイス−タンパク質データベースから引き出した。
図７は、ウシ（配列番号Ｎｏ．４）、ヒト（配列番号Ｎｏ．５）、およびマウス（配列番号Ｎｏ．６）のＣＤ１４タンパク質のアミノ酸配列の比較を示す。アミノ酸配列は、図６に示す対応するｃＤＮＡ配列から演繹した。ＰＡＭ２５０残基加重表と一緒にＪ．Ｈｅｉｎによって記述された方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８３：６２６，１９９０）を用いてこのアラインメントを生成するために、ＤＮＡＳｔａｒ−Ｍｅｇａｌｉｇｎソフトウェアを使用した。
図８は、ウシＣＤ１４のｃＤＮＡコード領域の増幅に使用するプライマーを示す。図８Ａは、バキュロウィルス発現系に使用する前進プライマー（配列番号Ｎｏ．７）および逆プライマー（配列番号Ｎｏ．８）を示す。図８Ｂは、哺乳類発現系に使用する前進プライマー（配列番号Ｎｏ．９）および逆プライマー（配列番号Ｎｏ．１０）を示す。
図９は、天然のウシＣＤ１４および組換えウシＣＤ１４の免疫ブロッティングを示す。ウェスタンプロット分析を使用して、ｎＢｏ−ＬＡＩＴタンパク質の大きさを組換えＣＤ１４タンパク質と比較評価した。２５０ｎｇのＣＤ１４タンパク質を１２．５％のＳＤＳポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、１８０ｍＡで３０分間ＰＶＤＦ膜（ミリポア）に電気泳動で転移させた。膜をＴＢＳＴ（２０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０２５％Ｔｗｅｅｎ２０）中５％のスキムミルクで１時間ブロックし、その後５％のスキムミルクを補充したＴＢＳＴ中２．５μｇ／ｍｌの濃度のウサギ抗Ｂｏ−ＬＡＩＴ＃８４２Ａｂと共に１時間インキュベートした。ブロットをＴＢＳＴで、１回につき１０分間ずつ、３回すすいだ。セイヨウワサビのペルオキシダーゼ（ＢｉｏＲａｄ）を結合したヤギ抗ウサギＩｇＧを使用して、ウサギ抗体を検出した。次いで、膜をＴＢＳＴで３回すすいだ（１０分／回）。タンパク質を可視化するために、ＥＣＬキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用した。レーン１：ＭＷマーカ；レーン２：ｎＢｏ−ＬＡＩＴ  ８４２セファロースアフィニティ精製したｎＢｏ−ＬＡＩＴタンパク質；レーン３：ｒＢｏ−Ｓｆ９−１２ＣＡ５アフィニティ精製したＳｆ９昆虫細胞由来組換えウシＣＤ１４；レーン４：ｒＢｏ−Ｃ１２７−８４２セファロースアフィニティ精製したＣ１２７マウス乳房腫瘍細胞系由来組換えウシＣＤ１４。
図１０は、ｎＢｏ−ＬＡＩＴとＬＰＳの成長促進活性の比較を示す。図１Ａについて記載したように、高浮遊密度の休止マウス脾臓Ｂ細胞を調製し、培養し、採取した。示した濃度のアフィニティ精製したｎＢｏ−ＬＡＩＴ（図１について記載したようにアフィニティ精製した）またはＳ．ｔｙｐｈｏｓａ（Ｄｉｆｃｏ）から得たＬＰＳのいずれかを、培養の開始時に添加した。
図１１は、ｎＢｏ−ＬＡＩＴとＬＰＳの分化促進活性の比較を示す。図１Ａについて記載したように、高浮遊密度の休止マウス脾臓Ｂ細胞を調製し、培養した。１０μｇ／ｍｌのＬＰＳ［Ｓ．ｔｙｐｈｏｓａ（Ｄｉｆｃｏ）］または５００ｎｇ／ｍｌのアフィニティ精製ｎＢｏ−ＬＡＩＴを使用して２組の培養を開始し、示した時間後に採取した。市販のＥＬＩＳＡキットを使用して、上清中に存在するＩｇＭを定量することによって、累積ＩｇＭの産生を評価した。
図１２は、ｎＢｏ−およびｒＢｏ−ＬＡＩＴタンパク質の成長促進活性とＬＰＳの成長促進活性との比較を示す。図１Ａについて記載したように、高浮遊密度の休止マウス脾臓Ｂ細胞を調製し、培養し、採取した。示した濃度のｎＢｏ−ＬＡＩＴ（図１Ａについて記載したように精製する）、昆虫細胞または哺乳類細胞で生成したｒＢｏ−ＬＡＩＴ、およびＬＰＳ［Ｓ．ｔｙｐｈｏｓａ（Ｄｉｆｃｏ）］を培養の開示時に添加した。昆虫細胞から得られた組換えＢｏ−ＬＡＩＴは、Ｂｏ−ＬＡＩＴのｃＤＮＡをトランスフェクトしたＳｆ９細胞の培養上清からアフィニティ精製した。発現ベクトルは、インフルエンザヘムアグルチニン（ＨＡｔａｇ）由来のナペプチドをコードする３′２７ｍｅｒを含んでいた。ＨＡタグを認識する、ｍＡｂの１２ＣＡ５（Ｃｅｌｌ  ５７：７８７，１９８４）を結合したセファロースにＳｆ９上清を通すことによってアフィニティ精製を実施した。哺乳類発現系Ｃ１２７から得た組換えＢｏ−ＬＡＩＴのアフィニティ精製は、ウサギ８４２由来のポリクローナル抗血清から単離したＩｇＧを結合したセファロースを使用して、ｎＢｏ−ＬＡＩＴについて実施した。
図１３は、精製した一次Ｂ細胞およびＴ細胞の集団に対するｎＢｏ−ＬＡＩＴの成長促進活性の比較分析を示す。高浮遊濃度の休止マウス脾臓Ｂ細胞を、図１Ａについて記載したように調製した。一次Ｔ細胞は、脾臓Ｂ細胞を単離したのと同じ動物のリンパ節から単離した。具体的には、リンパ節懸濁液を、製造者の指示に従って、かつ前述のように抗Ｉｇカラム（Ｂｉｏｔｅｘ  Ｌａｂｏｒａ）に通した（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２４；９６７，１９９４）。免疫蛍光染色およびＦＡＣＳ分析によって評価すると、Ｔ細胞集団では、＞９５％がＣＤ３+、であり＜０．５％がｍｌｇ+であった。左の図は、示した濃度のアフィニティ精製ｎＢｏ−ＬＡＩＴに対して応答する、１．５×１０5個の精製したＴ細胞またはＢ細胞を含む培地の増殖応答を示す。右の図は、５０μｇ／ｍｌのＬＰＳ［Ｓ．ｔｙｐｈｏｓａ（Ｄｉｆｃｏ）］または１μｇ／ｍｌのコンカナバリンＡ（シグマ）のいずれかに対する同数のＢ細胞またはＴ細胞の増殖応答を示す。血清を含まない条件を使用し、全ての刺激は培養の開始時に添加した。４０時間後に、培地を１μＣｉの3Ｈ−ＴｄＲでパルスし、６時間後にフィルタディスク上に採取し、シンチレーション分光光度計でチミジン取込みを評価した。提示した数字は、２回の培養の平均ｃｐｍを表す。
図１４は、ｎＢｏ−ＬＡＩＴ仲介マウスＢ細胞成長のウシ胎児血清に対する独立性を示す。高浮遊濃度の休止マウス脾臓Ｂ細胞は、図１Ａについて記載したように調製し、培養し、採取した。血清を含まない培地に、示した濃度の熱不活化した（５６℃で１時間）ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）と、刺激無し（■）、０．５μｇ／ｍｌのアフィニティｎＢｏ−ＬＡＩＴ（○）、または５０μｇ／ｍｌのＬＰＳ［Ｓ．ｔｙｐｈｏｓａ（Ｄｉｆｃｏ）］（●）のいずれかとを補った。４０時間後に培地を１μＣｉの3Ｈ−ＴｄＲでパルスし、６時間後にフィルタディスク上に採取し、シンチレーション分光光度計によってチミジン取込みを評価した。提示した数字は、２回の培養の平均ｃｐｍを表す。
図１５は、（１）分画していない脾臓細胞、（２）図１Ａについて記載したように調製した高浮遊密度の休止マウス脾臓Ｂ細胞、および（３）後者の高浮遊濃度の休止集団から得られたＦＡＣＳソーティングｍｌｇ+Ｂ細胞に含まれるＣＤ１４のノーザンブロット分析を示す。ＦＡＣＳソーティングの場合、高浮遊濃度の細胞は、マウスＩｇｋに特異的なＦＩＴＣ結合ｍＡｂ１８７．１と共にインキュベートした（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １：５，１９８１）。３つの集団の各々におけるｍｌｇ+細胞の割合を示す。トリゾール法（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用い、製造者の指示に従って、３つの集団の各々の１０7個の細胞から全ＲＮＡを分離し、１．２％のホルムアルデヒドゲル上で分離した。真空ブロットシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて、ＲＮＡをナイロン膜（ＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ）に移した。膜製造者が推薦する通りに、架橋、プレハイブリッド形成、およびハイブリッド形成を行った。マウスのＣＤ１４に特異的なプローブは、前進プライマー５′−ＣＴＡ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＴＣＴ  ＣＣＣ  ＧＣＣ  ＣＣＡ  ＣＣＡ  ＧＡＧ  ＣＣＣ  ＴＧＣ  Ｇ−３′（配列番号Ｎｏ．１１）および逆プライマー５′−ＣＴＡ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＴＴＡ  ＡＡＣ  ＡＡＡ  ＧＡＧ  ＧＣＧ  ＡＴＣ  ＴＣＣ  ＴＡＧ  Ｇ−３′（配列番号Ｎｏ．１２）を使用してＰＣＲによって形成されたゲノムマウスＣＤ１４断片から得た。増幅断片は、アガロースゲル電気泳動によって分離し、切り出し、精製した。大きいリボソームサブユニットタンパク質の構成的に発現するｍＲＮＡに特異的なＬ３２のｃＤＮＡプローブ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１６：１０７５１，１９８８）を使用して、ＲＮＡのローディングを標準化した。プローブ（各１００ｎｇ）は、オリゴラベリングキット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて、ＤＮＡの０．２〜１×１０9ｃｐｍ／μｇの比活性で標識した。次に膜を０．２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳで６５℃で２時間洗浄し、Ｘ線フィルム（Ｋｏｄａｋ、Ｂｉｏｍａｘ  ＭＳ）に１から５日間暴露した。
図１６は、図１５で記述したｍｌｇ+細胞についてさらに精製したか、または精製していない高浮遊密度の休止マウス脾臓Ｂ細胞の５０μｇ／ｍｌのＬＰＳ［Ｓ．ｔｙｐｈｏｓａ（Ｄｉｆｃｏ）］および０．５μｇ／ｍｌのアフィニティ精製ｎＢｏ−ＬＡＩＴに対する応答を示す。図１Ａについて記載したように、培地を確立し、トリチウム標識チミジンでパルスし、採取し、チミジン取込みを評価した。提示する数字は、２回の培養の平均ｃｐｍを表す。
図１７は、組換えＢｏ−ＬＡＩＴ仲介Ｂ細胞の活性からのＣＤ４０の独立性を示す。高浮遊密度の休止マウス脾臓Ｂ細胞を、従来のＣ５７ＢＬ／６マウスか、ＣＤ４０座の標的破壊よって形成されたＣＤ４０欠損動物（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １：１６７，１９９４）のいずれかから単離した。細胞（１．５×１０5）を１０μｇ／ｍｌのＬＰＳ、または昆虫の細胞の発現系から得た示した濃度のｒＢＯ−ＬＡＩＴの存在下で培養した。図１Ａに関連して記載したように、培地にパルスを与え、採取した。提示した数字は、２回の培養の平均ｃｐｍを表す。
図１８は、ヒト（ｎＨｕ）、ウシ（ｎＢｏ）、およびマウス（ｎＭｏ）から得た天然ＣＤ１４の銀染色分析（左の図）および免疫ブロット分析（右の図）の比較を示す。ｎＨｕは、上述の通り、ネフローゼ患者の尿から分離した（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：１７７９，１９９４）。ｎＢｏは、図３について記述したように、ウシの初乳からアフィニティ精製した。ｎＭｏは、ＣＤ１４特異性ｍＡｂ  ３Ｃ１０を固定したセファロース４Ｂ（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５：１２６，１９８３）を使用して、アフィニティクロマトグラフィによって、マウスのハイブリドーマＯＫＴ３の上清から分離した（ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ７７：４９１４，１９８０）。銀染色の場合、各々の試料１μｇを１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで２００Ｖで４５分間分離した。タンパク質は、製造者の指示に従って銀染色法（Ｂｉｏｒａｄ）によって可視化した。免疫ブロットの場合、各々の試料２５０ｎｇを１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより１８０ｍＡで４５分間分離し、電気泳動により１８０ｍＡで３０分間ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移した。膜はＴＢＳＴ（２０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０２５％のＴｗｅｅｎ２０）中５％のスキムミルクで１時間ブロックし、その後５％のスキムミルクを補足したＴＢＳＴで１０μｇ／ｍｌの濃度のｍＡｂ  ３Ｃ１０（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５：１２６，１９８３）と共に１時間インキュベートした。ブロットは、ＴＢＳＴで１回につき１０分ずつ、３回すすいだ。セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＢｉｏＲａｄ）と結合させたヤギの抗マウスＩｇＧを使用して、マウス抗体を検出した。次に、膜をＴＢＳＴで３回（１回につき１０分）すすいだ。ＥＣＬキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して、タンパク質を可視化した。
図１９は、マウスＢ細胞の成長を刺激するためのヒト（ｎＨｕ）、ウシ（ｎＢｏ）、およびマウス（ｎＭｏ）から得た天然ＣＤ１４の比較分析を示す。これらの３つのタンパク質は、図１８で記載したように精製した。図１Ａで記載したように分離した高浮遊密度の休止マウス脾臓Ｂ細胞の示した濃度の３つのタンパク質に対する応答を評価した。培地は４０時間経過後に１μＣｉの3Ｈ−Ｔｄｒでパルスを与え、４６時間経過後に採取した。提示した数字は、示した濃度のｎＨｕ、ｎＢｏ、およびｎＭｏで刺激した２つの培養物の平均ｃｐｍを刺激を含まない２つの培養物の平均ｃｐｍで除することによって得られた、賦活化指数（ｉｎｄｅｘ  ｏｆ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）を表す。
図２０Ａおよび図２０Ｂは、臍帯血および扁桃腺からそれぞれ単離したヒトＢ細胞に対するｎＢｏ−ＬＡＩＴの成長促進活性を示す。図２０Ａは、正の選択によって単離した臍帯血Ｂ細胞によるチミジンの取込みを示す。臍帯血の白血球懸濁液を、全Ｂ細胞マーカＣＤ７２に特異的なフルオレセイン標識ｍＡｂで染色した。次にＣＤ７２の正の臍帯白血球を蛍光活性化細胞選別器（ＦＡＣＳｔａｒ  Ｐｌｕｓ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）で分離し、結果的に９８％を超える純度を得た。図１Ａについて記載したように、Ｂ細胞（１．５×１０5）を刺激が存在しない状態で、または２μｇ／ｍｌのｎＢｏ−ＬＡＩＴが存在する状態で培養した。Ｂ細胞は、１つはヒトＩｇｋ［ＬＯ−ＨＫ３（Ｉｎ  ″Ｒａｔ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｒａｔ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ″  ｅｄ．Ｈ．Ｂａｚｉｎ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，ＵＳＡ）］に特異的で、１つはヒトＩｇλ［ＬＯ−ＨＬ２、（Ｉｎ  ″Ｒａｔ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｒａｔ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ″  ｅｄ．Ｈ．Ｂａｚｉｎ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，ＵＳＡ）］に特異的な２つのｍＡｂを各々１．５μｇ／ｍｌのコーティング濃度で９時間予めコーティングしたウェルで、追加刺激の存在しない状態または２μｇ／ｍｌのｎＢｏ−ＬＡＩＴの存在する状態で培養した。６０時間後に培地を１μＣｉの3Ｈ−ＴｄＲでパルスし、１２時間後にフィルタディスク上に採取し、シンチレーション分光光度計によってチミジン取込みを評価した。図２０Ｂは、負の選択によって形成した扁桃腺Ｂ細胞を用いて得られた結果を示す。具体的には、ＣＤ３ε（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）に特異的なビオチニル化ｍＡｂで白血球懸濁液にラベル付けを行い、その後に「マイクロビーズ」を含む鉄を結合したアビジンを加えた（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）。標識した集団をＭＡＣＳに通し（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）、溶離液を採集した。この集団は、系特異的ｍＡｂで免疫蛍光染色することによって評価したとき、１％未満のＴ細胞および９７％を超えるＢ細胞を含んでいた。Ｂ細胞（１．５×１０5）は、図１Ａに関連して記載したように培養した。臍帯血Ｂ細胞に関しては、扁桃腺Ｂ細胞を、ヒトＩｇｋおよびλに特異的なプレートに結合したｍＡｂが存在する状態および存在しない状態で培養したが、この場合、ウェルは、濃度０．５μｇ／ｍｌの各々のｍＡｂを使用して予めコーティングした。培地は、図２０Ａについて記載したようにパルスし、採取し、チミジンの取込みを評価した。
図２１は、分娩後の経過時間に対する母乳内のＣＤ１４の濃度を示す。母乳は、分娩後の示した時間の経過時に２名の提供者（Ａ．Ｄ．およびＳ．Ｂ．）から採集した。清澄乳漿を調製し、含まれるＣＤ１４の濃度を、ＣＤ１４特異的ＥＬＩＳＡキット（ＩＢＬ、Ｈａｍｂｕｒｇ）を使用し、製造者の指示に従って評価した。
好ましい実施形態の説明
下記の実験は、本明細書ではウシＣＤ１４とも呼ぶ天然ウシＬＡＩＴタンパク質（ｎＢｏ−ＬＡＩＴ）の初乳乳漿からの精製を示す。精製したｎＢｏ−ＬＡＩＴのアミノ酸配列分析を示すが、ヒトＣＤ１４との相同性を示している。ヒトＣＤ１４の精製法を示す。ハイブリドーマ上清からのマウスＣＤ１４の精製法を示す。
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＢ細胞刺激アッセイを、アフィニティ精製した初乳Ｂｏ−ＬＡＩＴ、ヒト初乳ＣＤ１４、尿から得たヒトＣＤ１４およびハイブリドーマ上清から得たマウスＣＤ１４について記載する。マウス由来の高浮遊密度休止脾臓Ｂ細胞については、これら３種から得たＬＡＩＴタンパク質に反応して、細胞周期が始まり、進行していることと、ウシ由来ＬＡＩＴタンパク質への暴露に反応して、免疫グロブリン高率分泌細胞に分化することが示される。これらの活性化は規定の無血清培地で起こり、培地中のウシ胎児血清の存在はＬＡＩＴタンパク質媒介Ｂ細胞活性化に影響しないことも示される。ｎＢｏ−ＬＡＩＴが特異的にネズミのＢ細胞を活性化し、ネズミのＴ細胞は活性化しないこと、ＬＡＩＴタンパク質はＣＤ１４ｍＲＮＡが検出されないＢ細胞集団を活性化することを示す実験を示す。ウシＣＤ１４が、ＣＤ４０が発現されないＢ細胞の成長を誘導することを示す実験も示す。
ウシＣＤ１４をコードするゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡの両者について単離、クローニングおよび配列決定を示す。文献で周知のマウスＣＤ１４およびヒトＣＤ１４の配列との比較により、Ｂｏ−ＬＡＩＴとこれらの既知のＣＤ１４との間の配列の関係を示す。組換えウシＣＤ１４に関係するＢ細胞の成長および分化活性を示す。
昆虫および哺乳類の系の両者で組換えウシＣＤ１４を発現する方法を示す。特に、昆虫細胞内での組換えタンパク質の発現を容易にするために、バキュロウィルス発現ベクターを使用した。天然のＢｏ−ＬＡＩＴ（ｎＢｏ−ＬＡＩＴ）とバキュロウィルス発現系から得た組換えＢｏ−ＣＤ１４（ｒＢｏ−ＬＡＩＴ）のＢ細胞成長および分化特性を比較すると、後者は機能性であり、ｎＢｏ−ＬＡＩＴの約５０％の比活性を有することが明らかとなった。
ウシ由来のＣＤ１４をコードするｃＤＮＡのレシピエントとして、マウス乳癌細胞株Ｃ１２７を使用した。ｃＤＮＡをウシのパピローマウィルス発現ベクターにクローニングした。安定なＣ１２７形質転換体を確立し、アフィニティクロマトグラフィにより、Ｃ１２７の集密的培養物の上清から組換えＣＤ１４タンパク質を単離した。昆虫細胞およびＣ１２７由来の組換えＬＡＩＴタンパク質のウェスタンブロット分析により、この２つの発現系で種々の翻訳時および／または翻訳後修飾が生じていることが明らかとなった。哺乳類細胞由来の組換えウシＣＤ１４の比活性は昆虫細胞由来の組換え物質と同じであった。
天然のＢｏ−ＬＡＩＴと昆虫細胞および哺乳類細胞由来の組換えウシＣＤ１４によるＢ細胞成長促進活性の比較を示す。また、扁桃腺および臍帯血から単離したヒトＢ細胞に対する天然のＢｏ−ＬＡＩＴの成長促進活性を示す。結果は、ネズミＢ細胞に関しては、新生児または成人から単離したヒトＢ細胞はＢｏ−ＬＡＩＴ媒介成長を受けやすいことを示している。
ヒト初乳中および分娩後７８日目までの乳中に存在するＣＤ１４の濃度は、健常人ドナー血清中の３〜２０倍高いことが示される。
方法
ウシＬＡＩＴタンパク質の精製
出産直後のウシの最初の乳腺分泌物から５リットル超の初乳を得た。
（ｉ）最初に４，４２０ｇで３０分間初乳を遠心して、細胞と細胞デブリを除去することにより、清澄な初乳乳漿を調製した。次いで、この遠心上清を２５０，０００ｇで２時間遠心した。浮遊する脂肪およびペレット化したカゼインを捨て、清澄な初乳乳漿をさらに分画した。
各分画手法から得た各画分をｉｎ  ｖｉｔｒｏでＢ細胞成長促進活性についてアッセイした。すなわち、各画分を広範な濃度にわたり、既述（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３１：  ５８１，１９８３）のように、マウスの脾臓から得た浮遊密度の高い休止Ｂ細胞の成長刺激能についてアッセイした。これらの分析を通して、規定の無血清培地を使用した［５×１０-5２−β−メルカプトエタノール、５μｇ／ｍｌ鉄飽和トランスフェリン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ、Ｌｅｗｅｓ、英国）、０．５ｍｇ／ｍｌ脱脂ＢＳＡ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン（Ｇｉｂｃｏ）、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）および必須アミノ酸を補ったＩＭＤＭ（Ｇｉｂｃｏ）］。下記の単離スキームから得た画分を、分裂促進下（ｓｕｂｍｉｔｏｇｅｎｉｃ）濃度のＬＰＳ（０．２５μｇ／ｍｌ）と共に、直接調べた。下記のように、ＬＡＩＴタンパク質が純粋に近づくにつれて、直接的分裂促進特性が明らかとなった。
（ｉｉ）（ＮＨ4）2ＳＯ4中での逐次沈殿により、初乳乳漿調製物に含まれるタンパク質を塩析した。使用した漸増的な塩濃度は４２％、５０％、６２％、６５％（ｖ／ｖ）硫酸アンモニウム（ＡＳ）であった。従って、４２％で沈殿した物質の上清中のＡＳ濃度を５０％に上昇させ、５０％で沈殿した物質を取り出してから、残りの上清中のＡＳ濃度を６２％に上昇させるなどした。ＡＳで沈殿したペレットをそれぞれ、０．１５ＭのＮａＣｌおよび１ｍＭのＡＥＢＳＦ（ＴＮＡＥＢＳＦ）を含む１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）に可溶化させた。これらの画分を脱塩し、１０ＤＧカラムを使用してバッファをＴＮＡＥＢＳＦに換え、生物活性をアッセイした。Ｂ細胞成長促進活性の大部分は、上記スキームで６２％のＡＳで沈殿したものの中に単離された（示さず）。
（ｉｉｉ）３種の逐次タンパク質分画手法を使用して活性を実質的に高め、最終的に精製した。６２％ＡＳで沈殿した高活性画分５０ｍｇを陰イオン交換カラムにかけ、１０ｍＭビストリスプロパン中５０ｍＭから４００ｍＭのＮａＣｌ塩勾配および７．５から９．５のｐＨ勾配を同時に使用して物質を分離した。図１Ａは、このカラムからの溶離プロフィールを示しており、表１Ａはピーク活性を有する画分である画分＃５７を示している。次いで、画分＃５７  ２０ｍｇを、０．４５Ｍ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）で平衡化した分子ふるいカラムにかけた。この分画の溶離プロフィールを図１Ｂに示し、ピーク画分＃３８の活性を表１Ｂに示す。
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次いで、１ｍｇの画分＃３８を１ｍＭ  ＮａＣｌ中のハイドロキシアパタイトカラムにかけ、リン酸バッファ（ｐＨ６．８）中１ｍＭから５００ｍＭのリン酸カリウム勾配で溶離した。溶離プロフィールを図１Ｃに、関連する活性を表１Ｃに示す。
図１Ｃの挿入図は、ピーク活性を有する画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、銀染色したものを示し、相対分子量４６〜５０ｋＤを有する単一の主バンドが示されている。
ウシＬＡＩＴタンパク質の配列分析
精製したｎＢｏ−ＬＡＩＴの配列を分析した。Ｎ末端はブロックされていることが判った。この物質を臭化シアンまたはトリプシンで加水分解した。５つの画分が得られ、これらを逆相ＨＰＬＣまたはＳＤＳ−ＰＡＧＥ後にＰＶＤＦ膜に電気泳動的に転写して精製してから、配列決定を実施した。
図２に示すように、５つの画分はすべてヒトＣＤ１４と顕著に相同性を持って整列していた。
ウシおよびヒト初乳からのＬＡＩＴタンパク質のアフィニティ精製
従来のタンパク質分画手法を使用して単離したｎＢｏ−ＬＡＩＴを使用して、ウサギ（＃８４２）ポリクローナル抗体を調製した。この抗血清のＩｇＧ分画をプロテインＡ−セファロースで精製し、次いで、セファロース４Ｂに結合させた。
ｎＢｏ−ＬＡＩＴとヒトＣＤ１４（ＨｕＣＤ１４）の配列の相同性は、Ｂｏ−ＬＡＩＴがウシのＣＤ１４相同体である可能性を示唆した。このことを、入手できるＨｕＣＤ１４に特異的なモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を使用するアフィニティカラムを作製してさらに探索した。この抗体６３Ｄ３（ＰＮＡＳ  ７７：６７６４，１９８０）を、ｍＡｂ  １８７．１からなるアフィニティカラム［ラット抗マウスカッパ（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １：５，１９８１）］で対応のハイブリドーマ上清から生成し、セファロース４Ｂに結合させ、次いで、生成したｍＡｂをセファロース４Ｂに結合させた。
清澄にしたウシ初乳乳漿を上記のように、硫酸アンモニウムで逐次塩析した。ヒト初乳乳漿はセファクリルＳ１００ＨＲカラムで分画した。次いで、Ｂ細胞成長促進活性がピークの画分を、ウシからの物質については８４２−セファロースカラムを、ヒトからの物質については６３Ｄ３−セファロースカラムを使用してアフィニティ精製した。
アフィニティ精製した初乳Ｂｏ−ＬＡＩＴおよびアフィニティ精製した初乳ＣＤ１４のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を図３に示し、関連したＢ細胞成長促進活性を表２に示す。図示したように、両方の初乳調製物、ｐ４６〜５０ウシからの物質（図３、レーン３）およびｐ５０〜５２ヒトからの分子（図３、レーン４）から主要なバンドが単離された。
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表２に示す生物活性は、１００ｎｇ／ｍｌの濃度のアフィニティ精製したＢｏ−ＬＡＩＴはマウスの休止Ｂ細胞の成長を刺激したことを示している。１０ｎｇ／ｍｌで添加すると、この物質は分裂を促進しなくなり、分裂促進下濃度のＬＰＳまたはマウスＩｇＭに特異的なｍＡｂであるｂ−７−６（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４：  ７５３，１９８４）を添加すると副刺激が実施される。アフィニティ精製したヒトの物質は、調べた濃度ではそれ自身分裂促進性であることは認められなかったが、１０ｎｇ／ｍｌでは、Ｂ細胞の成長はウシからの物質とほぼ等しい効率で、同じ副刺激により刺激された。
ｎＢｏ−ＬＡＩＴの生物活性は熱に不安定であった。図４Ａに示すように、アフィニティ精製したＢｏ−ＬＡＩＴを９５℃で１０分間処理すると、関連するＢ細胞成長促進活性が失われる。ＬＰＳを同様に処理してもその活性に影響しなかった（図４Ａの挿入図）。また、ポリクローナル抗Ｂｏ−ＬＡＩＴ＃８４２は効率的にｎＢｏ−ＬＡＩＴのＢ細胞成長促進活性をブロックしたが、ＬＰＳの活性には影響を与えなかった。図４Ｂおよび挿入図を参照のこと。
ウシゲノムＣＤ１４の分子クローニング
ウシゲノムＥＭＢＬ３  ＳＰ６／Ｔ７ラムダライブラリ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、（Ｓｃｒｉｐｐｓ  ＩｎｓｔｉｓｔｕｔｅのＲ，Ｕｌｅｖｉｔｃｈから入手した）ヒトＣＤ１４  ｃＤＮＡの１．５ｋｂフラグメントでスクリーニングした。１５個の正のシグナルが得られ、シグナルの最も強いクローン「Ｂ２」を選択して、ウシＣＤ１４をさらに分析し、クローニングした。
クローンＢ２から単離、精製したファージＤＮＡの挿入サイズは約１５ｋｂであった。精製したＤＮＡを消化し、得られたヒトＣＤ１４に相同の配列を含む７．１ｋｂのＥｃｏＲＩ−Ｘｈｏｌ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ+（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローニングした。広範な酵素を使用した制限マッピングをした後、ヒトＣＤ１４プローブとハイブリッド形成すると、ウシＣＤ１４遺伝子をクローニングした断片内に局在化させることができる（図５Ａ）。別の制限マッピングを使用して、４つの短い断片（Ｉ〜ＩＶ）をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ+にサブクローニングすると、次の約５ｋｂの配列決定に、ウシＣＤ１４遺伝子全体が含まれる（図５Ｃ）。断片Ｉ（ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ、３．２ｋｂ）、ＩＩ（ＰｓｔＩ−ＰｓｔＩ、１．３５ｋｂ）、ＩＩＩ（ＰｓｔＩ−ＰｓｔＩ、０．３ｋｂ）およびＩＶ（ＰｓｔＩ−Ｘｈｏｌ、０．９５ｋｂ）を使用して、入れ子重複一方向欠失を構築した。これらの断片は、ウシＣＤ１４の遺伝子座の連続した配列を提供した。図５ＢはウシＣＤ１４ゲノム断片の組織を示す。
ウシＣＤ１４  ｃＤＮＡの分子クローニング
ポリ（Ａ+）ＲＮＡをウシの末梢血単球から単離し、Ｇｉｇａｐａｃｋ  ＩＩ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して、組換えラムダファージＤＮＡをパッケージングした。「Ｔｉｍｅ  Ｓａｖｅｒ  ｃＤＮＡ合成キット」（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）と共にＥｘｃｅｌｌ  ＥｃｏＲＩ／ＣＩＰベクターを使用してｃＤＮＡライブラリを作成した。
ライブラリは、ＰＣＲにより、ウシゲノムＣＤ１４断片のコーディング翻訳領域からのプローブでスクリーニングした（詳細は、下記のウシＣＤ１４断片を有するバキュロウィルス組換え発現ベクターの調製の項に示す）。ランダムヘキサヌクレオチドでプライムした第二鎖合成によりプローブを32Ｐで標識した（Ｏｌｉｇｏｌａｂｅｌｌｉｎｇキット、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）。非常に厳しい条件（０．１×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５℃、３時間）下でスクリーニング手順を実施した。得られたクローンの１つ（ＥｘＣｅｌｌ／ＢｏＣＤ１４−１）は１．４ｋｂの挿入を有し、これをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ+にサブクローニングし、進行性（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ）重複一方向欠失を含むｐＢＳ／ＢｏＣＤ１４サブクローンを使用して配列決定した（Ｎｅｓｔｅｄ  Ｄｅｌｅｔｉｏｎキット、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。
このウシＣＤ１４  ｃＤＮＡクローンは１３２７ｂｐからなる。ＡＴＧ開始コドンの次に、１１１６ｎｔのオープンリーディングフレームが続き、ヌクレオチド１２０２に停止コドンＴＡＡがある。このオープンリーディングフレームは８２ｂｐの５′非翻訳配列および１２２ｂｐの３′非翻訳配列に隣接した。ポリアデニル化シグナル５′−ＡＴＴＡＡＡＡ−３′は停止コドンの３′の１０５ｂｐにある。
ウシＣＤ１４のゲノムおよびｃＤＮＡ配列のアラインメントから、これらがｃＤＮＡの５′開始部分から、ＡＴＧ開始コドンの直後に認められる最初で唯一のイントロン（８８ｂｐ）まで同一線形であることが明らかになる。コード配列の残り部分は連続している。従って、ヒトおよびマウスのＣＤ１４について既述のイントロン−エキソンの構成はウシＣＤ１４に正確に保存されている。ウシＣＤ１４  ｃＤＮＡの翻訳ヌクレオチド配列をヒトおよびマウスのＣＤ１４  ｃＤＮＡの翻訳ヌクレオチド配列と比較すると、コード領域のヌクレオチドが各々７４．２％および６２．６％同一であることが明らかとなった（図６）。
ウシＣＤ１４タンパク質の一次構造をｃＤＮＡ配列から推測し、ウシＣＤ１４タンパク質は３７４個のアミノ酸からなる。最初のメチオニンの次に、真核細胞のシグナルペプチドに典型的な疎水性および／または中性の残基１５個が続く。ウシＣＤ１４のアミノ酸配列をヒトおよびマウスのＣＤ１４と並べると、各々７３．１％および６２．３％が同じであることが明らかとなった（図７）。３つの可能なＮ結合型グリコシル化部位（Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ）があり、そのすべてがヒトおよびマウスＣＤ１４に保存されている。さらに、ウシＣＤ１４は、ヒトおよびマウスのＣＤ１４に共通な、ロイシンを多く含む反復モチーフ（ＬＸＸＬＸＬ）を１０個含んでいる（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４５：３３１，１９９０）。
昆虫細胞での組換えウシＣＤ１４の発現
組換えＣＤ１４タンパク質を作製するためのＤＮＡの調製では、ＣＤ１４翻訳領域の全長断片をＰＣＲで作製した。ＰＣＲプライマーの特別なセットは、ウシＣＤ１４  ｃＤＮＡから得た配列情報に基づいて表した。５′末端のためのＰＣＲプライマーは、Ｎｈｅｌ用の２つの認識配列、コザック配列、ＡＴＧ開始コドンおよび最初の１７〜２１ヌクレオチドの翻訳コード領域を含んでいた。３′末端のためのＰＣＲプライマーは、Ｎｈｅｌ用の２つの認識配列、ＴＡＡ停止コドンまでで、停止コドンを含まない翻訳コード領域の最後の２１〜２４ヌクレオチドを含んでいた（図８Ａ）。
ウシＣＤ１４翻訳領域を、７．１ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＸｈｏｌゲノムＣＤ１４断片（上記参照）を鋳型として使用して増幅した。ＰＣＲはＰｗｏＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を使用して実施した。最終体積１００μｌに対して、鋳型ＤＮＡ５ｎｇ、１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．８５）、２５ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ（ＮＨ4）2ＳＯ4、２ｍＭ  ＭｇＳＯ4、各ｄＮＴＰ２５０ｍＭ、各プライマー２５０ｎＭ、ＰｗｏＤＮＡポリメラーゼ５単位を加えて、増幅を実施した。試料をＤＮＡ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用し、アニーリング温度７０℃で３０サイクル増幅した。
増幅した断片をＮｈｅｌで消化し、個々にバキュウロウィルストランスファベクターｐＥＴＬ−ＨＡ（Ｃ．Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ、ＯＣＩ／Ａｍｇｅｎ）のポリヘドリンプロモータの下流にサブクローニングした。このベクターはｐＥＴＬ由来のものであり（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３９：  １６１，１９９５）、インフルエンザヘムアグルチニン（ＨＡ）由来のノナペプチドをコードする３′の３０ｂｐのＮｈｅｌ−ＢａｍＨＩＤＮＡ断片と停止コドンＴＡＧを含む（５′−ＴＡＣ  ＣＡＡ  ＴＡＣ  ＧＡＴ  ＧＴＴ  ＣＣＡ  ＧＡＴ  ＴＡＣ  ＧＣＴ  ＴＡＧ−３′）（配列番号１３）。組換えトランスファーベクターは個々に、野生型バキュロウィルスＡｕｔｏｇｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核ポリヘドロシスウィルス（ＡｃＭＮＰＶ、Ｌｉｎｅａｒ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｍｏｄｕｌｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共にＳｆ９細胞にトランスフェクトした（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３９：  １６１，１９９５）。組換えバキュウロウィルスクローンを選択し、確立されたプロトコールに従って精製した（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３９：  １６１，１９９５）。Ｓｆ９細胞に５〜１０：１倍率で組換えバキュウロウィルスに感染させた。
経時的な分析を実施して、感染したＳｆ９細胞が組換えＣＤ１４タンパク質を分泌するのに必要とする最適時間を決定した。抗ＨＡモノクローナル抗体１２ＣＡ５を使用した、種々の時点で採取した細胞培地のイムノブロット分析（Ｃｅｌｌ  ５７：  ７８７，１９８４）により、組換えＣＤ１４タンパク質の発現は９６時間後に最高に達することが明らかとなった。その後の生物アッセイ用の組換えタンパク質を作製する実験ではこの時間を選択した（下記参照）。Ｓｆ９由来の組換えウシＣＤ１４のウェスタンブロット分析を図９に示す。
組換えウシＣＤ１４の哺乳類細胞での発現
哺乳類細胞で組換えウシＣＤ１４を安定して発現させるために、改変したｐＢＰＶ  Ｅｐｉｓｏｍａｌ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用した。形質転換細胞の直接選択を可能にするために、発現カセットの３．４ｋｂ上流に挿入する、ネオマイシン耐性遺伝子を含むことによりｐＢＰＶを改変した。このために、ｐＢＣＭＧＳｎｅｏ（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：９８，１９８８）からの１．９５ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−Ｘｂａｌ断片をｐＣＲＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングした。組換え構築体ｐＣＲＩＩ−ｎｅｏを精製し、クローニングした断片をＰＣＲで増幅した。ＰＣＲプライマーは、５′末端と３′末端の両方にＳａｌＩ認識配列を含むようにデザインした。プライマーの配列は、ＨｉｎｄＩＩＩ（プライマーＡ）とＸｂａｌ（プライマーＢ）のクローニング部位をフランクするｐＣＲＩＩベクターのポリリンカー領域に相補的であった。
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最終産物をＳａｌＩで消化し、ゲル精製し、内蔵発現カセットの転写オリエンテーションと同じ転写オリエンテーションでｐＢＰＶのＳａｌＩクローニング部位にサブクローニングした。修飾発現ベクターのプラスミド調製物ｐＢＰＶｎｅｏ−１３を作製した（Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ，Ｑｕｉａｇｅｎ）。
ｐＥＴＬ−ＨＡベクター内で遺伝子をＰＣＲ増幅することにより、ウシＣＤ１４の翻訳領域をコードするＤＮＡ断片を調製した。増幅反応に使用した５′末端ＰＣＲプライマーは次のものを含んだ。ＸｈｏＩ認識配列、次いで、ＮｈｅＩ認識配列（ｐＥＴＬ−ＨＡベクター内に存在）、コザック配列、ＡＴＧ開始コドン、および翻訳領域の最初の１１から１３ヌクレオチド。ＨＡコード配列に含まれる３′末端用のコアＰＣＲプライマーは、ＸｈｏＩ認識配列を含めることにより、５′配列について伸長した。プライマーを図８Ｂに示す。
ＰｗｏＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使用して、ＰＣＲを実施した。最終体積１００μｌ中に、ＤＮＡ鋳型５ｎｇ、１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．８５）、２５ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ（ＮＨ4）2ＳＯ4、２ｍＭ  ＭｇＳＯ4、２５０ｍＭの各ｄＮＴＰ、２５０ｎＭの各プライマー、ＰｗｏＤＮＡポリメラーゼ５単位を加えて増幅を実施した。サンプルは、ＤＮＡ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用しアニーリング温度７０℃で３０サイクル増幅した。
増幅した断片をＸｈｏＩで消化し、ゲル精製した。次いで、これらの断片をマウスメタロチオネインＩプロモータの下流のｐＢＰＶｎｅｏ−１３にサブクローニングした。サブクローニングする前に、ｐＢＰＶｎｅｏ−１３を適切な制限酵素で予処理し、仔ウシ腸ホスファターゼで脱リン酸化した。Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ（Ｑｕｉａｇｅｎ）を使用して組換えプラスミドを調製した。
細胞１０7個当たりＤＮＡ２０μｇ使用して、組換えプラスミド（ｐＢＰＶｎｅｏ１３−ＢｏＣＤ１４）をマウス乳癌細胞株Ｃ１２７（ＰＮＡＳ  ７８：２７２７，１９８１）にトランスフェクトした。Ｇｅｎｅパルサ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用し、９６０μＦ／２８０Ｖで電気穿孔して、ＤＮＡを移した。１．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の存在下で安定な形質転換産物を選択した。
免疫蛍光染色後、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳｔａｒ  Ｐｌｕｓを使用する蛍光活性化細胞ソーティングを実施して、高レベルの膜ＣＤ１４を発現するトランスフェクト産物（トランスフェクトしていないＣ１２７はＣＤ１４陰性である）濃度を上げた。外来タンパク質の膜発現レベルは、トランスフェクトしたＣ１２７細胞の４８時間集密培養上清で回収した分泌ＣＤ１４の量とよく相関した。昆虫細胞で得られた組換え物質の精製とは異なり、１２ＣＡ５−セファロースアフィニティカラムでＣ１２７由来の物質をアフィニティ精製することはできないことが明らかとなった。これは、Ｃ１２７細胞由来の組換えタンパク質ではＣ末端ＨＡタグが消失していることによる可能性がある。その結果、Ｃ１２７由来の組換えウシ１４ＣＤは８４２−セファロースでアフィニティ精製した。Ｃ１２７細胞由来の組換えウシＣＤ１４のイムノブロット分析を図９に示す。
ｎＢｏ−ＬＡＩＴとＬＰＳの成長および分化促進活性の比較
図１０に示す結果は、天然のＢｏ−ＬＡＩＴがＬＰＳの約２００倍の効率で、高浮遊密度ネズミ休止脾臓Ｂ細胞の成長を支持することを示している。５０ｎｇ／ｍｌのｎＢｏ−ＬＡＩＴは、１０μｇ／ｍｌのＬＰＳの存在下で認められたものと同等のＤＮＡ合成を誘導する。
ｎＢｏ−ＬＡＩＴのＢ細胞成長誘導能は、免疫グロブリンを分泌するよう高浮遊密度ネズミ休止脾臓Ｂ細胞の分化を誘導する能力と一致する。図１１に示すように、５００ｎｇ／ｍｌのｎＢｏ−ＬＡＩＴで誘導されたＩｇＭの累積量は１０μｇ／ｍｌのＬＰＳで誘導されたものと同等であった。培養期間２４時間以内に分泌されたＩｇＭの量を評価した。５００ｎｇ／ｍｌのｎＢｏ−ＬＡＩＴは、４８〜７２時間、７２〜９６時間、９６〜１２０時間の２４時間培養期間にそれぞれ、９５６±１０ｎｇ／ｍｌ、７５４±８．７ｎｇ／ｍｌ、２５±１．４ｎｇ／ｍｌのＩｇＭを誘導した。１０μｇ／ｍｌのＬＰＳで刺激した培養物についての値はそれぞれ、１４４２±７１ｎｇ／ｍｌ、８７４±３２ｎｇ／ｍｌおよび１８３±３ｎｇ／ｍｌであった。従って、ｎＢｏ−ＬＡＩＴは、Ｂ細胞を現在知られている最も強力な刺激で刺激したときに認められるものと同等の率で、高浮遊密度ネズミ休止脾臓Ｂ細胞で免疫グロブリンの分泌を誘導する能力を有する。さらに、ｎＢｏ−ＬＡＩＴはＬＰＳの１〜１０％の濃度で上記能力を有する。
ｎＢｏ−ＬＡＩＴがネズミ休止Ｂ細胞でアイソタイプスウィッチングを誘導する能力も評価した。上記培養物の上清もＩｇＧアイソタイプの存在について評価した。５００ｎｇ／ｍｌのｎＢｏ−ＬＡＩＴおよび１０μｇ／ｍｌのＬＰＳは各々、５日目までの累積レベル（ｎｇ／ｍｌ）で、ＩｇＧ１を７．０±０．１および５．６±０．６、ＩｇＧ２ａを３５８±３および４０６±８、ＩｇＧ２ｂを８±１および１１±２、ＩｇＧ３を７５±５および７５±０．５、ＩｇＡを６．５±１．５および５．０±０．３誘導することが観察された。従って、ｎＢｏ−ＬＡＩＴはＴ細胞のない状態でネズミ休止Ｂ細胞によるアイソタイプスイッチングを誘導する能力を有する。
ｎＢｏ−ＬＡＩＴタンパク質およびｒＢｏ−ＬＡＩＴタンパク質の成長促進活性の比較
昆虫細胞由来および哺乳類細胞由来の両方のウシＣＤ１４の組換え体は高浮遊密度ネズミ休止脾臓Ｂ細胞の分化を誘導する能力を有している。図１２に図示するように、昆虫細胞から得て、１２ＣＡ５−セファロースでアフィニティ精製したｒＢｏＣＤ１４は０．２〜３μｇ／ｍｌの濃度で強固な（ｒｏｂｕｓｔ）ＤＮＡ合成を誘導する。哺乳類発現系由来の組換え物質により同等の活性が支持され、両方の組換え体もｎｇ／ｍｌの濃度で、初乳由来のｎＢｏ−ＬＡＩＴで認められたと同等の活性で、Ｂ細胞成長を支持する。
従来のタンパク質分画手法またはアフィニティ精製のいずれかでウシ初乳から単離したｎＢｏ−ＬＡＩＴが仲介する生物活性が、観察されたタンパク質で仲介されることは、組換えウシＣＤ１４が仲介した生物活性の評価から確認される。図９に示すように、ウシＣＤ１４の組換え体のいずれの見かけ上の分子量もｎＢｏ−ＬＡＩＴの見かけ上の分子量とは等しくなかった。見かけ上の分子量に差が認められた理由は明らかではないが、翻訳時および／または翻訳後修飾の差、コアタンパク質サイズの差のいずれかまたはその両者による可能性がある。単球由来可溶性ＣＤ１４については文献で証明されており、これは現在理解されている３つの機構の１つで生成することができるが、その各機構により異なる分子量のタンパク質が生成される。単球由来可溶性ＣＤ１４は完全長分子として分泌されることができ（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：２１４４，１９９３；  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：  ６０４，１９９５）、膜発現ＧＰＩ共役結合体はホスホリパーゼで切断でき（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：  ５４７，１９８８；  ＥＭＢＯ  Ｊ．１３：  １７４１，１９９４）、膜発現ＧＰＩ共役結合体はセリン／スレオニンプロテアーゼで切断され、単球自体の外側形質膜で推定的に発現され、まだ特性付けられていない方法で活性される（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：  １５６７，１９９１）。ｒＢｏ−ＬＡＩＴおよび初乳由来のｎＢｏ−ＬＡＩＴの見かけ上の分子量の差がそれぞれの発現系で支持された組換え物質の翻訳時および／または翻訳後修飾の差またはコアタンパク質サイズの差またはその両者によるものであるのかはまだ決定されていない。
ｎＢｏ−ＬＡＩＴの成長促進活性はＢ細胞特異的である
ネズミＢ細胞に対するｎＢｏ−ＬＡＩＴの生物活性が認められているため、ネズミＴ細胞の生理に対する作用を調べた。単離、精製したＢ細胞はｎＢｏ−ＬＡＩＴに反応しないという事実は、Ｂｏ−ＬＡＩＴがＴ細胞も活性化できるという可能性を除外するものではない。
リンパ節Ｔ細胞は、既述（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：  ９６７，１９９４）のように抗Ｉｇカラム（Ｂｉｏｔｅｘ  Ｌａｂｏｒａ）で負の選択で単離した。得られた溶離物集団は、免疫蛍光染色およびＦＡＣＳ分析で評価すると、ＣＤ３+を９５％超、ｍＩｇ+細胞を０．５％超含んでいた。同じマウスから高浮遊密度脾臓Ｂ細胞を単離し、リンパ節Ｔ細胞および脾臓Ｂ細胞の両者のｎＢｏ−ＬＡＩＴに対する反応性を評価した。これらの集団の純度は、Ｂ細胞特異的有糸分裂促進剤ＬＰＳおよびＴ細胞特異的有糸分裂促進剤コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）に対する反応を分析することにより機能的に評価した。図１３の右パネルに示したように、Ｂ細胞は強固なＤＮＡ合成についてはＬＰＳに反応したが、Ｔ細胞は反応せず、ＣｏｎＡに対してはＴ細胞は反応したが、Ｂ細胞は反応しなかった。左パネルに示したように、Ｔ細胞は調べた用量範囲にわたりｎＢｏ−ＬＡＩＴに反応しなかったが、Ｂ細胞は１０ｎｇ／ｍｌ以上の濃度でｎＢｏ−ＬＡＩＴに反応した。
ＬＡＩＴタンパク質が誘導するＢ細胞の成長とウシ胎児血清
最近、単球が、血清由来のリポ多糖結合タンパク質（ＬＢＰ）が存在しないときに、前炎症性（ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）サイトカインの産生を伴うネフローゼ患者の尿から単離された可溶性ＣＤ１４（ｓＣＤ１４）に反応することが示されている（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：  １７７９０，１９９４）。対照的に、低濃度のＬＰＳがＣＤ１４発現単球によるこれらの同じサイトカインを刺激する力は血清依存性である（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：  ７１９，１９９２）。この血清依存性は高濃度のＬＰＳでは克服される。従って、１０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳで誘導された単球によるサイトカインの産生は血清／ＬＢＰに厳密に依存するが、５０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳで誘導された産生は依存しない。
ウシ胎児血清ＬＢＰの存在が低濃度のｎＢｏ−ＬＡＩＴの高浮遊密度ネズミＢ細胞の成長誘導能に影響するかを決定するために、５００ｎｇ／ｍｌのｎＢｏ−ＬＡＩＴで誘導された反応を、５０μｇ／ｍｌのＬＰＳで誘導された反応と比較し、広範囲のＦＢＳ濃度にわたり評価した。図１４に示すように、これらの刺激に対するＢ細胞の反応は培地中９％までのＦＢＳの存在では影響を受けなかった。
ＬＡＩＴタンパク質が誘導するＢ細胞の成長とｍＣＤ１４
ＬＰＳ仲介活性化に対するＢ細胞と単球の感受性の差は後者による膜ＣＤ１４（ｍＣＤ１４）の発現と関係する可能性がある。ＬＰＳ仲介活性化の感受性は、反応細胞上のｍＣＤ１４の存在により劇的に増強できることが直接示されている。特に、ｍＣＤ１４陰性のプレＢ細胞株のＬＰＳに対する感受性は、外因性ＧＰＩ結合ｍＣＤ１４の強制発現により約１０００倍上昇することが示されている（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：  １６９７，１９９２）。一次Ｂ細胞がｍＣＤ１４を発現するかについてはまだ議論がある。Ｂ細胞活性化におけるＬＰＳの比活性に比較してＢｏ−ＬＡＩＴの比活性が高いことは、この活性化様式がｍＣＤ１４発現に依存していないことと一致する。
Ｂｏ−ＬＡＩＴが仲介するＢ細胞活性化へのｍＣＤ１４の発現の関与を直接評価するために、ＣＤ１４特異的ｍＲＮＡの存在を、反応体として使用した高浮遊密度ネズミＢ細胞集団で評価した。下記の３つの脾臓由来の各集団の１０7個の細胞から全ＲＮＡを得た。これらは、未分画脾臓細胞と、ＬＡＩＴタンパク質仲介成長アッセイに日常的に使用されている、Ｔ細胞を枯渇させ、Ｐｅｒｃｏｌｌ分画した高浮遊密度細胞と、ＦＩＴＣと結合した、マウスＩｇＫに特異的なラットｍＡｂで免疫蛍光標識し［１８７．１（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １：５，１９８１）］、次いで、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳｔａｒ  Ｐｌｕｓセルソータで精製して、高浮遊密度Ｔ細胞枯渇集団から単離した膜Ｉｇ発現細胞であった。図１５に示すように、これらの３つの集団はそれぞれｍＩｇ+細胞を５９．２％、８３．５％、９９．８％含んでいた。これらの集団から単離したＲＮＡを１．２％ホルムアルデヒドゲルで分離し、ナイロン膜（ＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ）に移し、架橋結合させ、予備ハイブリッド形成させ、２つのプローブと順次ハイブリッド形成させた。
マウスＣＤ１４プローブはゲノムＤＮＡからＰＣＲによって得た。具体的には、０．４μｇのＢａｌｂ／ｃゲノムＤＮＡに、前向きプライマー５′−ＣＴＡ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＴＣＴ  ＣＣＣ  ＧＣＣ  ＣＣＡ  ＣＣＡ  ＧＡＧ  ＣＣＣ  ＴＧＣ  Ｇ−３′（配列番号１１）および逆向きプライマー５′−ＣＴＡ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＴＴＡ  ＡＡＣ  ＡＡＡ  ＧＡＧ  ＧＣＧ  ＡＴＣ  ＴＣＣ  ＴＡＧ  Ｇ−３′（配列番号１２）と共に、ＰｗｏＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を加えることにより、増幅を実施した。サンプルはアニーリング温度５５℃を使用し、ＤＮＡ  ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で３０サイクル増幅した。増幅断片をアガロースゲル電気泳動で分離し、ゲルから切り出し、精製した。Ｌ３２プローブ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１６：１０７５１，１９８８）を使用し、ＲＮＡ付加を正常化した。各プローブ（１００ｎｇ）はｏｌｉｇｏｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｐａｒｍａｃｈｉａ）を使用して比活性０．２〜１×１０9ｃｐｍ／μｇＤＮＡまで標識した。膜をプローブし、６５℃で２時間、０．２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳで洗い、曝露した。
図１５に示すように、未分画脾細胞およびＴ細胞枯渇高浮遊密度脾細胞から得たＲＮＡはＣＤ１４特異的ｍＲＮＡを含んでいたが、ＦＡＣＳで精製したＢ細胞は含んでいなかった。本明細書で休止Ｂ細胞と呼ぶＴ細胞枯渇高浮遊密度脾細胞を免疫蛍光染色およびＦＡＣＳ分析で評価すると、８５〜９０％がｍＩｇ+であったが、９８％超がＭＨＣクラスＩＩ+であることから、これらのＣＤ１４シグナルは混在する単球によるものと思われる。従って、この集団におけるＢ細胞のＢｏ−ＬＡＩＴ仲介成長は間接的なものであり、含まれる単球の活性化を介している可能性がある。
Ｔ細胞枯渇Ｐｅｒｃｏｌｌ分画脾細胞およびこの集団由来のＦＡＣＳ精製したｍＩｇ+細胞のｎＢＯ−ＬＡＩＴおよびＬＰＳ誘導成長に対する反応を比較した。図１６に示すように、両集団とも、両方の刺激に強く反応した。９９．８％純粋なＢ細胞集団では１０倍高い刺激指数が得られたが、これはこれらの培養で認められた非刺激バックグラウンドの低下によるものであった（図１６）。
ＬＡＩＴタンパク質誘導Ｂ細胞成長とＣＤ４０
上記のように、Ｂ細胞膜上で発現されるＣＤ４０に特異的なｍＡｂがネズミＢ細胞の成長を誘導することが観察されている（Ｓｅｍ．ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２６７，１９９４；  ＰＮＡＳ  ８３：  ４４９４，１９８６；  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：  １４２５，１９８８）。
抗ＣＤ４０とＬＡＩＴタンパク質誘導Ｂ細胞活性化の間に何らかの関係があるかを調べるために、従来のＣ５７ＢＬ／６マウスまたは標的遺伝子を破壊することによりＣＤ４０の発現をなくしたＣ５７ＢＬ／６マウスから単離した高浮遊密度脾Ｂ細胞の成長を刺激するｒＢｏ−ＬＡＩＴの能力を調べた（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １：  １６７，１９９４）。図１７に示すように、調べたｒＢｏ−ＬＡＩＴの濃度範囲にわたり、これらのＢ細胞の反応に差は認められなかった。
これらの結果は、ＣＤ４０自体が必ずしもＬＡＩＴタンパク質シグナリングに関与する必要はないが、ＣＤ４０が利用する第二のメッセンジャ発生系および推定上のＬＡＩＴタンパク質に対する膜受容体が共用されている可能性は排除されないことを示唆している。
天然ヒト、ウシおよびネズミＣＤ１４の比較分析
ネズミＢ細胞に対するｎＢＯ−ＬＡＩＴおよびｒＢｏＣＤ１４の活性が認められたので、初乳以外の流体から単離したマウスＣＤ１４（Ｍｏ）およびヒトＣＤ１４（Ｈｕ）の活性を調べた。Ｈｕ−ＣＤ１４はネフローゼ患者の尿中に存在することが示されている（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：  １７７９，１９９４）。Ｈｕ−ＣＤ１４は変更したプロトコールで単離した。尿に飽和（ＮＨ4）2ＳＯ4を最終濃度４５％（ｖ／ｖ）まで加えて沈殿させ、１４，０００ｇで３０分間遠心して、沈殿した物質を除去した。次いで、この遠心上清中の（ＮＨ4）2ＳＯ4濃度は７５％（ｖ／ｖ）まで上昇させた。沈殿を１４，０００ｇで３０分間遠心してペレット化し、１０ｍＭトリス、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、「完全」プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈａｉｍ）を含むＴＮバッファに溶かした。１３，０００ｇで１５分間遠心して、不溶性物質を除去した。この遠心上清を、ＴＮバッファ（ｐＨ８．０）で平衡化したＧ−１０カラム（Ｂｉｏ  Ｒａｄ）で脱塩した。次いで、この物質を、ヒトＣＤ１４特異的ｍＡｂの３Ｃ１０（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５：  １２６，１９８３）を結合させてあるセファロース４Ｂに通した。結合した物質を１００ｍＭアセテート、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ２．８で溶離し、直ちに１０倍量の１Ｍトリス（ｐＨ８．０）を加えて中和した。溶離液をｓｐｅｅｄ−ｖａｃで濃縮し、タンパク質濃度を比色により決定した。
ネズミＣＤ１４はマウスハイブリドーマＯＫＴ３（ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ７７：４９１９，１９８０）の上清から単離した。ＣＤ１４特異的ｍＲＮＡの発現について細胞集団をスクリーニング分析する間に、アッセイしたすべてのハイブリドーマがメッセージを含んでいることが観察された。ドナーと融合パートナーの両方がネズミ起源であれば、産生されたＣＤ１４もネズミ起源であろうということになる。ハイブリドーマＯＫＴ３はこれらの条件を満足した。ＣＤ１４タンパク質がＯＫＴ３により、単離に十分な量で産生されていたかを評価するため、１リットルのＯＫＴ３培養上清に含まれる物質を、ヒト尿由来ＣＤ１４について上記したように、３Ｃ１０−セファロースでアフィニティ精製した。３Ｃ１０の特異性は、ヒトＣＤ１４の残基７〜１０についてマッピングされている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：  ３６１，１９９５）。これらの残基はウシおよびネズミＣＤ１４によく保存されていた。
図１８の左のパネルは、アフィニティ精製したヒト尿Ｃｄ１４（ｎＨｕ）、初乳ウシＣＤ１４（ｎＢＯ）およびＯＫＴ３由来マウスＣＤ１４（ｎＭＯ）各１μｇの銀染色分析の比較を示している。図１８の右パネルは、ｍＡｂ３Ｃ１０でプローブした同じ３種のＣＤ１４各２５０ｎｇのイムノブロット分析の比較を示している。図示したように、ｍＡｂ３Ｃ１０に対する反応性と同様に、３つの調製物の純度はすべて同等であった。
それぞれのｃＤＮＡでコードされたアミノ酸の数が異なるこれら３種のＣＤ１４の分子量が明らかに異なるのは、翻訳時および／または翻訳後修飾による可能性がある。この点に関して、マウス、ヒトおよびウシＣＤ１４が各々５個、４個および３個の可能なＮ−グリコシル化部位を含むことは明らかである。
これらの３つのＣＤ１４調製物のネズミＢ細胞成長刺激能を評価した。図１９に示すように、これら３種から単離したＣＤ１４は比活性が同等で、ｎｇ／ｍｌの濃度範囲で活性であった。この結果はまた、同質遺伝子物質が機能性であり、具体的には、ネズミのＣＤ１４がネズミＢ細胞を刺激できることを示している。この結果はまた、初乳ＣＤ１４はそのＢ細胞刺激能について特有のものではなく、従って、泌乳の特別な環境で生成される特別な形の分子ではないようであることも示している。
ヒト臍帯血Ｂ細胞に対するｎＢｏ−ＬＡＩＴの成長促進活性
ネズミＢ細胞に対するｎＢｏ−ＬＡＩＴの種々の生物活性が認められたので、ヒトＢ細胞の生理に対する作用を検討した。２つの起源のＢ細胞を使用した。ＬＡＩＴタンパク質の１つの可能な役割は新生児の免疫系の発達の促進に関与することであるため、新生児から得たＢ細胞、具体的には臍帯血から単離したＢ細胞の増殖を刺激する能力を評価した。
臍帯血はリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１：１に希釈し、Ｐｅｒｃｏｌｌ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ρ＝１．０７７に載せた。図１Ａに関連して記載したように、勾配遠心した。ρ＝１．０７７／１．０００界面を採取し、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したＰＢＳで２回洗った。次いで、得られた白血球調製物を、フルオレセインと結合したＢ細胞膜マーカＣＤ７２に特異的なｍＡｂで染色した。次いで、ＣＤ７２陽性の臍帯血白血球をＦＡＣＳで正の選択をすると、９８％超の純度が得られた。次いで、これらの正の選択をしたＢ細胞を、ネズミＢ細胞の場合と同様に、無血清規定培地で培養した。ネズミＢ細胞の成長アッセイとヒトＢ細胞成長アッセイの唯一の違いは、ヒトＢ細胞の場合には、４０時間で６時間ではなく、６０時間で１２時間チミジンでパルスしたことであった。
図２０Ａに示すように、ｎＢｏ−ＬＡＩＴは新生児Ｂ細胞成長誘導能において、ＩｇＫおよびＩｇλに特異的なｍＡｂと共に作用する。固定化（プレート固定）した抗軽鎖ｍＡｂと２μｇ／ｍｌのｎＢｏ−ＬＡＩＴの両者はそれぞれ、バックグランドに比べチミジンの取り込みを上昇させるが、この２つを組み合わせるとさらに５倍上昇した。
これらの結果は、母乳を与える新生児が消費するＬＡＩＴタンパク質はＴ細胞の代用物として機能し、完全に発達したＴ細胞コンパートメントがない状態で、抗原に出会ったＢ細胞を刺激して、Ｉｇ分泌細胞への成長、分化を助けるという可能性を示唆している（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６９：  ２１４９，１９８９；  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４５：  ７４９，１９８９；  Ｉｎｔｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：  ８５９，１９９０：  Ｉｎｔｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：  ８６９，１９９０）。
ヒト初乳および正常血清中のＣＤ１４
初乳および正常血清中に存在するＣＤ１４濃度を決定するために、２人のドナーからの初乳サンプルと、５人の健常人ドナーからの血清サンプルとを、特異的ＥＬＩＳＡ（ＩＢＬ−Ｈａｍｂｕｒｇ）を使用して、ＣＤ１４の存在についてアッセイした。表３に示すように、この健常人コホートからの血清のＣＤ１４濃度は１．７〜３．２μｇ／ｍｌの範囲であり、性別に依存しなかった。これらの値はＧｒｕｎｗａｌｄ他の報告した値（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ．Ｍｅｔｈｏｄ  １５５：  ２２５，１９９２）とよく対応している。
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図２１に示すように、分娩２２時間後に採取した初乳（Ａ．Ｄ．）および分娩４日後に採取した早期母乳（Ｓ．Ｂ．）のＣＤ１４含量は正常血清の約２０倍高かった。１人のドナーからは分娩７８日後まで複数のサンプルを採取した（Ｓ．Ｂ．）。ＣＤ１４濃度は４日後の濃度と比べるとかなり低下したが、アッセイしたスクリーニング期間を通して、正常血清中の濃度の約３〜５倍高い濃度を維持した（図２１）。
授乳中の女性での血清ＣＤ１４濃度に関する情報はまだ得られていない。従って、初乳および母乳中で認められた高濃度のＣＤ１４がこれらの流体にのみ限定されるものであるか、授乳中の女性のすべての体液に一般的なＣＤ１４を反映するものかはまだ決定されていない。
新生児の免疫系の初乳ＣＤ１４のＢ細胞向性成長および分化活性への一時的曝露が新生児免疫応答機構の発達に部分的に役割を果たしている可能性がある。初乳にこの活性が存在することの生理学的関連性は、上記のように、おそらく初乳や早期母乳中にＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２が高濃度に存在することにより、新生児のＴ細胞機能が低下するという観察と一致する（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：  １０３９，１９８７；  Ｃｅｌｌ  ４９：  ４３７，１９８７；  ＥＭＢＯ  Ｊ．６：  １６３３，１９８７）。表２に示すように、分裂促進下濃度のＣＤ１４は分裂促進下濃度の膜免疫グロブリン特異的ｍＡｂと共にＢ細胞の活性化を支持する。ＣＤ１４は発達中の新生児免疫系ではＴ細胞代替物として機能する可能性がある。このように、ＣＤ１４を乳児用フォーミュラ添加剤として使用すると、乳児用合成フォーミュラを使用せずに、その免疫刺激作用に曝露されて、新生児に役立てることができる。
ヒト扁桃腺Ｂ細胞に対するｎＢｏ−ＬＡＩＴの成長促進活性
成人から単離したＢ細胞に対するｎＢｏ−ＬＡＩＴの、単独または固定化（プレート固定）抗軽鎖ｍＡｂとの併用での、ヒト扁桃腺から単離したＢ細胞を刺激する生物活性を評価した。
扁桃腺Ｂ細胞は負の選択で調製した。扁桃腺白血球は臍帯血白血球と同様に調製した。得られた集団を、ビオチニル化したＣＤ３ε特異的ｍＡｂ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）で標識した後、鉄含有「マイクロビーズ」（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）で標識した。１回洗った後、標識した集団をＭＡＣＳ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）に通し、溶離物を集めた。この集団は、系統特異的ｍＡｂを使用した免疫蛍光染色で評価すると、Ｔ細胞を１％未満、Ｂ細胞を９７％超含んでいた。次いで、これらのＢ細胞を、高浮遊密度ネズミＢ細胞の単離に使用したと同様に、Ｐｅｒｃｏｌｌ不連続密度勾配で分画した。記載したアッセイでは、ρ＝１．０８５／１．０７９界面で結合するこれらのＢ細胞を使用した。これらの負の選択をし、密度分画した休止Ｂ細胞は下記のように培養し、パルスし、臍帯血Ｂ細胞の場合と同様に採取した。
図２０Ｂに示すように、新生児から単離したＢ細胞について得られた結果とは対照的に、ｎＢｏ−ＬＡＩＴは単独で、３００ｎｇ／ｍｌの低濃度でこれらの休止扁桃腺Ｂ細胞の強力な成長を刺激した。また、固定化抗軽鎖ｍＡｂと併用して評価すると、一部の濃度のｎＢｏ−ＬＡＩＴでの反応が実質的に増強された。
成熟したヒトＢ細胞はｎＢｏ−ＬＡＩＴの成長促進活性に感受性であり、これらの活性はＢ細胞抗原受容体との同時連結との併用で増幅される。これらの結果は、そのアジュバント特性を高めるために、またはおそらくアジュバントの必要性を低減させることにより、ワクチン単体へのＬＡＩＴタンパク質の潜在的な使用を特性付ける。
ワクチン技術の限界は特定の抗原製剤の免疫原性である。ある種のアジュバントは、抗原特異的Ｔ細胞を動員し、活性化することにより機能すると思われる。ＣＤ１４は、抗原特異的Ｂ細胞反応のＴ細胞代替物として、Ｂ細胞は大きくなり、抗体分泌細胞に分化するだけではなく、活性化された後、Ｔ細胞動員用の効率的なＡＰＣとして機能するように、抗原特異的Ｂ細胞を活性化する改良された手段を提供できる。このことは、特異的免疫応答およびＴ細胞仲介アイソタイプスイッチングの普及の両方を増強するであろう。
Ｔ細胞免疫不全が知られている。ｇｐ３９（ＣＤ４０Ｌ）（Ｘ染色体にマップされる）の発現を欠くことによるＴ細胞機能不全に関連する免疫不全状態は、以下の特徴をもつ。（ｉ）Ｘ−結合ハイパーＩｇＭ症候群（ＨＩＭ）、（ｉｉ）共通可変免疫不全（ＣＶＩ）および（ｉｉｉ）Ｘ−結合無ガンマグロブリン尿症（ＸＬＡ）。これらの疾患状態の一部（ＨＩＭ）で、患者から単離したＴ細胞はＢ細胞を活性化できないことが示されており（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：  ９９０，１９９３）、この発現形は機能性ｇｐ３９（ＣＤ４０Ｌ）のないことと相関する。これらの状況では、ＣＤ１４は特異的な体液性反応の誘導を標的とした場合またはポリクローナルＢ細胞活性化剤として投与した場合、潜在的な環境的病原体への日常的な攻撃に対する防御と一致する、同質遺伝子Ｉｇのレベルを誘導／維持する働きをする可能性がある。
初乳中にＣＤ１４が存在することは、母乳を飲む新生児でのＢ細胞刺激における役割と一致する。新生児の免疫系の発達を助けるＣＤ１４の有効性を動物モデルで評価できる。
ＣＤ１４の座を標的破壊することにより作成したＣＤ１４不足の雌をヘテロ接合またはＣＤ１４不足の雄と交配させる。この結果、ＣＤ１４を発現するまたは発現しない仔イヌでのＢ細胞の発達に対する初乳ＣＤ１４のないことの作用を評価できる。具体的には、Ｂ細胞の個体発生および血清ＩｇＭおよびＩｇＧレベルの累積発達を比較し、これらの仔イヌが特異的免疫応答を起こす能力も比較する。
また、「天然」ＩｇＭの循環濃度の維持における血清ＣＤ１４（ｓＣＤ１４）の役割を評価できる。ＩｇＧおよびＩｇＭの循環濃度は別々の制御下にある。血清ＩｇＧは、無抗原環境下で飼育したマウスでは実質的に認められなかったが、ＩｇＭレベルは変化しなかった。血清ＩｇＭレベルの調節におけるｓＣＤ１４の潜在的な役割を扱うために、上記の交配で得られたＣＤ１４が十分なマウスと不十分なマウスとをノトバイオティックに育てた。
ｓＣＤ１４の調節不全の発現は特別な疾患状態の病理と関係する。慢性関節リウマチ（ＲＡ）患者では血清ｓＣＤ１４レベルが上昇する（Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９１（２）：  ２０７，１９９３）。また、ＲＡ患者の滑膜中の活性化されたＣＤ１４+単球数の上昇も報告されている（Ｂｒ．Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．２９（２）：  ８４，１９９０；  Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．２２（４）：  ６００，１９９５）。ＲＡ患者の滑液中のｓＣＤ１４レベルが上昇しているかはまだ決定されていないが、ＣＤ１４+単球は活性化されると、膜ＣＤ１４を切断できる膜関連プロテアーゼを発現し、その結果、ｓＣＤ１４が産生される（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：  ６０４，１９９５）。本明細書に記載したｓＣＤ１４のヒトＢ細胞活性化能と一致して、ＲＡ患者の滑液は高頻度で活性化されたＢ細胞を含んでおり、その少なくとも一部はリウマチ因子を産生している可能性がある（Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．３１（２）：  ２７２，１９８４；  Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５５（１）：  ９１，１９８４）。従って、ＲＡ患者におけるｓＣＤ１４産生の増加およびそれがリウマチ因子の産生を生じるＢ細胞の活性化に関与する可能性に関連する例が生じる。従って、抗体仲介のｓＣＤ１４のクリアランスの結果、ＲＡ患者でＢ細胞活性化の調節不全およびリウマチ因子の産生を介した症状を改善する可能性がある。また、抗体を介したｓＣＤ１４のクリアランスにより、単球によるプロ炎症性サイトカインのｓＣＤ１４誘導で支持された炎症を改善するであろう（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：  １７７９，１９９４）。
ヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の日常的な製造はいくつかの理由から難しく、その理由の多くは活性化したヒトＢ細胞で所望の抗原特異性を高めることができないことである。所望の抗原特異性を有するヒトＢ細胞を誘導する、ｓＣＤ１４の能力。ｓＣＤ１４がｉｎ  ｖｉｔｒｏでヒトＢ細胞の成長と分化を誘導できることから、ｓＣＤ１４を抗原特異的ｍＡｂの製造に使用することが可能となる。本明細書で、高濃度（０．５〜１μｇ／ｍｌ）のｓＣＤ１４はポリクローナルな様式でヒトＢ細胞を活性化することを示している。しかし、最適下分裂促進濃度のｓＣＤ１４は抗原Ｂ細胞受容体（ＢｃＲ）特異的ｍＡｂと相乗的に作用することが示されている。従って、最適下濃度のｓＣＤ１４はＢｃＲを介して相補シグナルを受けるＢ細胞を選択的に活性化する。ＢｃＲ特異的ｍＡｂはこれらの状況下で抗原代替物として機能する。ＢｃＲシグナルの伝達に特異性を付与すると、その結果に起こるＢ細胞の反応も特異的であろう。従って、抗ＢｃＲを特異的抗原で置き換えると、ｓＣＤ１４が同時に存在することにより提供される相乗的な刺激が抗原特異的Ｂ細胞にのみ向けられよう。従って、その結果の抗体産性は抗原特異性であろう。このように活性化したＢ細胞の集団は活性化された抗原特異的Ｂ細胞を非常に大量に含み、そのため、所望の特異性を有するｍＡｂを分泌するヒトハイブリドーマの作製が促進されよう。
ワクチン技術におけるアジュバントとしてのＣＤ１４の有効性は動物モデルを使用して評価できる。Ｂｏ−ＣＤ１４およびＨｕ−ＣＤ１４をハプテンＴＮＰで修飾する。ハプテン修飾した物質をｉｎ  ｖｉｔｒｏでポリクローナルＢ細胞活性化能について評価し、ハプテン化がＣＤ１４の生物活性を変化させなかったことを確認する。共役結合体を皮下または筋肉内注射して、血清をその特異抗体濃度について経時的に評価する。別のシリーズのマウスを使用して、排出リンパ節を収集し、含まれる抗体分泌細胞数を計測する。さらに、種々の量のＣＤ１４とタンパク質または細胞抗原との混合物でレシピエントを免疫する。血清の抗体価および抗原特異的Ｉｇ分泌細胞および総Ｉｇ分泌細胞を計測する。
ＣＤ１４の毒性はマウス、ラットおよびサルでの静脈内投与急性毒性試験で評価できる。ラットでの急性皮下投与刺激試験、および３種での複数回の皮下および静脈内注射を含む長期試験も実施できる。総体的な病理学的および病理組織学的評価とともに、血清化学および血液分析も実施する。哺乳類細胞でｉｎ  ｖｉｔｒｏで、マウスで微小核アッセイにより、遺伝子毒性能を評価できる。妊娠マウス、ラットおよびサルで催奇形性能を評価できる。
ＣＤ１４をヒト対象に投与する際には、従来の医薬品の慣行を使用できる。乳児用フォーミュラへの添加剤として、製造時にフォーミュラに添加することができる。錠剤またはカプセルまたは投与直前に混合する粉末として調製できる。ワクチン製剤の場合には、それ以外は標準の手順に従って製造するワクチンの一部として含めることができる。任意の慣用手段、例えば、静脈内、皮下、筋肉内、心室内、頭蓋内、嚢内、髄腔内、大槽内、腹腔内、または経口で投与できる。
非経口用処方は液体溶液または懸濁液の形とすることができる。
処方を作製するために当技術分野で知られている方法は、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に見られる。非経口投与用の処方は例えば賦形剤として滅菌水または食塩水、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、植物油、水添ナフタレン等を含むことができる。
投与用のＣＤ１４濃度は、例えば、投与量および投与経路により変化する。
ＣＤ１４の天然のアミノ酸配列からの変形としては、少なくとも、保存的に置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅｌｙ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ）を実施できる。保存的に置換は、特許文献、例えば、米国特許第５，２２６４，５５８号に記載されている。従って、例えば、非極性脂肪族中性アミノ酸、グリシン、アラニン、プロリン、バリンおよびイソロイシンの間での交換が可能であると思われる。同様に、極性脂肪族中性アミノ酸、セリン、スレオニン、メチオニン、アスパラギンおよびグルタミンの間での置換も可能である。荷電された酸性アミノ酸、アスパラギン酸およびグルタミン酸の間の置換も、荷電された塩基性アミノ酸、リジンおよびアルギニンの間での置換と同様可能である。フェニルアラニン、ヒスチジン、トリプトファン、チロシンを含めた芳香族アミノ酸の間での置換も同様に可能でろう。これらの置換または相互交換は当業者によく知られている。その他の置換も可能であろう。もちろん、バリアントタンパク質の天然のタンパク質との相同の割合が高いほど、代謝活性が保持されると考えられる。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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