(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
合成化合物において、
−炭化水素鎖を有するキャリヤー分子であって、該炭化水素鎖はオリゴペプチドまたはポリペプチドであり、ここで該炭化水素鎖は：
ａ）７〜５０個のアミノ酸であって、該アミノ酸は開鎖を形成し、該開鎖は該炭化水素鎖のアミノ酸により形成される結合が自由に回転しないようにキャリヤー分子に剛性を導入する少なくとも１つのアミノ酸を含んでなるアミノ酸；または
ｂ）８〜５０個のアミノ酸であって、該アミノ酸は環を形成するアミノ酸；
から成り、
ここで該炭化水素鎖は、塩基性の側鎖を有するアミノ酸、負に帯電した側鎖を有するアミノ酸、ヒドロキシル化した側鎖を有するアミノ酸、およびイオウを含有する側鎖を有するアミノ酸から成る群から選択される、該キャリヤー分子上の少なくとも２つのサイドアームのグラフトを許容する少なくとも２つの残基を含んでなる、キャリヤー分子；および
−前記キャリヤー分子上にグラフトされた少なくとも２つのサイドアームによって保持されたヒト心臓トロポニンＩの少なくとも２つの異なるエピトープ、
を含んでなる合成化合物。
【請求項２】
前記キャリヤー分子上のサイドアームのグラグトを許容する少なくとも２つの残基が、少なくとも２つのリジンである、請求項１に記載の合成化合物。
【請求項３】
前記炭化水素鎖がプロリンを含んでなる、請求項１または２に記載の合成化合物。
【請求項４】
前記サイドアームの各々が、トロポニンIの少なくとも２つの異なるエピトープを含有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の合成化合物。
【請求項５】
前記サイドアームの各々が、トロポニンIの２つの異なるエピトープを含有する、請求項４に記載の合成化合物。
【請求項６】
連続的であり、かつ少なくとも２つの異なるエピトープを保持する少なくとも２つのサイドアームのうちの２つがアミノ酸により保持され、該アミノ酸は、２ｎ＋１個（ここでｎは１〜６の整数を表す）のアミノ酸により相互に分離されている、請求項１〜３のいずれか１項に記載の合成化合物。
【請求項７】
前記オリゴペプチドまたはポリペプチドが、以下の配列：
Ｘ1−Ａ1−Ａ2−Ａ3−Ａ4−Ａ5−Ｘ2−Ａ6
を含み、
ここで、
Ｘ1およびＸ2は、同一でも異なっていてもよく、サイドアームを保持するアミノ酸であり、かつ塩基性の側鎖を有するアミノ酸、負に帯電した側鎖を有するアミノ酸、ヒドロキシル化した側鎖を有するアミノ酸、およびイオウを含有する側鎖を有するアミノ酸から成る群から選択され、
Ａ1およびＡ2は、Ａ1およびＡ2の１つがプロリンおよびフェニルアラニンから成る群から選択されるという条件で、プロリン、フェニルアラニン、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンから成る群から選択されるアミノ酸を表し、
Ａ3は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンから成る群から選択されるアミノ酸を表し、
Ａ4は、アルギニンおよびヒスチジンから成る群から選択されるアミノ酸を表し、
Ａ5は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンから成る群から選択されるアミノ酸を表し、
Ａ6は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンから成る群から選択されるアミノ酸を表す、請求項１〜６のいずれか１項に記載の合成化合物。
【請求項８】
前記Ｘ1およびＸ2がリジンを表す、請求項７に記載の合成化合物。
【請求項９】
前記Ａ3がグリシンを表す、請求項７または８に記載の合成化合物。
【請求項１０】
前記Ａ4がアルギニンを表す、請求項７〜９のいずれか１項に記載の合成化合物。
【請求項１１】
前記Ａ5がアラニンを表す、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の合成化合物。
【請求項１２】
前記Ａ6がグリシンを表す、請求項７〜１１のいずれか１項に記載の合成化合物。
【請求項１３】
前記オリゴペプチドまたはポリペプチドが、以下の配列：
−ＫＧＰＧＲＡＫＧ−
−ＫＧＦＧＲＡＫＧ−
−ＫＰＧＧＲＡＫＧ−および
−ＫＦＧＧＲＡＫＧ−
から成る群から選択される配列を含む、請求項７に記載の合成化合物。
【請求項１４】
前記各々のエピトープが、
ＴＥＰＨ、
ＡＬＬＧＡＲ、および
ＦＡＥＬ
から成る群から選択される少なくとも１つの配列を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の合成化合物。
【請求項１５】
前記キャリヤー分子が、
【化１】
0004447811.tif 000014
である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の合成化合物。
【請求項１６】
トロポニンＩ免疫検定のための標準または対照としての請求項１〜１５のいずれか１項に記載の合成化合物の使用。
【請求項１７】
水、血漿、または緩衝液の溶液中に請求項１〜１５のいずれか１項に記載の少なくとも１つの化合物を含有する組成物。
【請求項１８】
前記緩衝溶液が、リン酸緩衝液、コハク酸緩衝液及びトリスＨＣｌ緩衝液から成る群から選択される、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記緩衝溶液が：
５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、脱脂乳およびＥＤＴＡを含有するコハク酸緩衝液（ｐＨ＝５〜６）、
５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、カゼインおよびＥＤＴＡを含有するコハク酸緩衝液（ｐＨ＝５〜６）、
５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンおよびＢＳＡを含有するコハク酸緩衝液（ｐＨ＝５〜６）、
５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、脱脂乳およびＥＤＴＡを含有するリン酸緩衝液（ＫＨ2ＰＯ4／Ｋ2ＨＰＯ4、０．１Ｍ、ｐＨ＝６．５〜７．５）、
５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、カゼインおよびＥＤＴＡを含有するリン酸緩衝液（ＫＨ2ＰＯ4／Ｋ2ＨＰＯ4、０．１Ｍ、ｐＨ＝６．５〜７．５）、
５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンおよびＢＳＡを含有するリン酸緩衝液（ＫＨ2ＰＯ4／Ｋ2ＨＰＯ4、０．１Ｍ、ｐＨ＝６．５〜７．５）、
から成る群から選択される、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の少なくとも１つの合成化合物を標準または対照として用いる免疫検定法。
【請求項２１】
免疫検定がサンドウィッチ式のものである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
免疫検定キットであって、
−請求項１〜１５のいずれか１項で規定した少なくとも１つの合成化合物、及び
−免疫検定を行なうための少なくとも１つの通例の試薬、
を含む免疫検定キット。
【請求項２３】
免疫検定キットであって、
−請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の少なくとも１つの組成物、及び
−免疫検定を行なうための少なくとも１つの通例の試薬、
を含む免疫検定キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、免疫検定において、特にトロポニンＩの検定用の標準または対照として使用することができる合成化合物、その調製方法、そのような化合物を含有する組成物およびキット、ならびにそのような化合物を用いた免疫検定法に関する。
【０００２】
トロポニンは３種類のタンパク質、トロポニンＩ、ＴおよびＣからなる筋原繊維のタンパク質複合体であることが知られている。このタンパク質複合体は、ミオシンおよびアクチンとの相互作用によりそれがＣａ2+イオンによる筋収縮の制御に寄与することを可能にしている。より正確には、神経の刺激が筋の運動終板のレベルに達すると、筋小胞体に伝達される活動電位が発生することが知られている。次いでＣａ2+がサイトゾル中に放出され、トロポニンＣと結合し、トロポニンＩとトロポニンＣの間の相互作用を強め、その結果トロポニンＩ、Ｔ、Ｃ複合体の高次構造の変化をもたらす。次いで筋収縮運動を可能にするアクチン−ミオシン相互作用の部位が解放される。
【０００３】
それが心筋梗塞に続く心筋の壊死時の心筋であろうと、持続的な物理的力の加わった時の骨格筋であろうと筋が損傷すると、解放されるトロポニンが多かれ少なかれ血流中に急速に現れる。
【０００４】
こうして最近、「Circulation」 83、902-912 (1991) 中のトロポニンＴの検定でも、「Am. Heart J.」 110、1333-1344 (1987)および「Molecular Immunology」 29 (2)、271-278 (1992) 中のトロポニンＩの検定でも、トロポニンの検定は心筋梗塞の早期診断のために推奨されている。同様に、心筋梗塞後の血栓融解治療が成功したかどうかを測定するための心筋のトロポニンＴの検定が「Br. Heart J.」71、242-248 (1994)で提案され、また骨格筋の損傷を測定するための骨格のトロポニンＩの検定（American Association for Clinical Chemistry, 46th National Meeting, New Orleans, 1994年7月17〜21日の抄録第３５号）も提案されている。様々な心筋および骨格のトロポニンの検定が今日、ヒトおよび動物の病状診断に非常に役に立つ手段であることに注目されたい。
【０００５】
生物学的分析を行なう研究所で実施される免疫検定には、検定に必要な試薬（すなわち標識または別の方法による抗体、顕現剤、および希釈液）に加えて、試験される試料と類似の条件下で用いられ、結果を計算するための参照としておよび／または正の制御として働くことになる、判定すべき化合物に対する標準の製造業者による供給が必要である。
【０００６】
判定すべき化合物に用いる標準および／または対照を得るには、凍結乾燥の形態（ユーザーがその化合物を使用前に溶解することになる溶媒を添えた）またはすぐ使える精製された上記化合物を使用することができる。
【０００７】
生物学的試薬は不安定であるため、凍結乾燥した製品から調製される標準または対照溶液は、用量単位で凍結され−８０℃で貯蔵される。さらにこれらの溶液は、たとえプロテアーゼ阻害剤または抗菌剤を加えたとしても＋４℃で数時間を超えて安定ではないことが観察された。したがってユーザーは使用直前にその標準溶液を調製することが必要である。
【０００８】
フランス特許公開第A-2,701,954号には、トロポニンＣと混合したトロポニンＩまたはＴ、具体的にはトロポニンＩまたはトロポニンＴ 1当量当たりトロポニンＣ 1〜10モル当量の割合と塩化カルシウムを含有する水溶液からなることを特徴とする免疫検定用のトロポニンＩまたはＴの安定化した組成物が開示されている。この技術は、より大きなまたはより小さな程度まで希釈したトロポニンＩまたはトロポニンＴの標準溶液を＋４℃で数日間保存することを可能にする。
【０００９】
フランス特許公開第2,734,267号は、トロポニンＩ、トロポニンＴ、およびトロポニンＣによって形成される三重複合体から構成されるトロポニンの標準溶液について記述している。
【００１０】
これらの標準を得るために用いられる原料はヒトまたは動物起源のものであり、こうして得られた標準または対照は＋４℃で約１ヶ月間安定である。
【００１１】
国際公開第94/15217号は、トロポニンＩのＮ末端ペプチドを認識する抗体調製用の免疫原として有用な幾つかの合成ペプチドについて記述している。これらのペプチドの幾つかは、国際公開第94/15217号が対象範囲とする発明の主題である抗体を用いたトロポニンＩの免疫検定の標準として使用することができる。
【００１２】
同様に、国際公開第94/27156号は、心筋のトロポニンＩに特異的な抗体を用いて心筋のトロポニンＩを検定する方法に関する。これらの抗体は、骨格筋のトロポニンＩのない、したがって心筋のトロポニンＩに特異的な配列を有するペプチド断片から調製することができる。しかしながらこの出願は、トロポニンＩの免疫検定における標準としてある種のペプチドを使用する可能性については開示しておらず、また示唆もしていない。
【００１３】
国際公開第96/27661号がタンパク質およびペプチドを安定化させるための水溶液について記述していることもまた知られている。これらの溶液は、特にタンパク質またはペプチドの診断検査に用途が見出される。
【００１４】
国際公開第97/27661号によればこれら水溶液は、全トロポニンＩよりも不安定なことが分かっているトロポニンＩ断片の安定性を増すことさえも可能にする。
【００１５】
１９９７年１月８日公開の欧州特許公開第A-752 426号もまた、高分子量タンパク質（＞100 KD）またはポリマーなどのキャリヤー分子と結合した１以上のペプチドから構成されるトロポニンＩの標準について記述している。
【００１６】
欧州特許公開第A-650 053号は、樹枝状構造で相互に結合した１以上の受容体に対する活性部位を含有する合成による標準について記述している。この出願は、より具体的にわずか３週間のみ溶液中で安定なトロポニンＴ用の合成による標準について記述している。
【００１７】
国際公開第98/24816号は、トロポニンＩの生物学的検定において標準として使用することができる合成ビエピトープ化合物ついて記述している。
【００１８】
これらの化合物は、炭化水素骨格および／またはペプチド骨格からなるリンカーによって相互に結合したトロポニンＩの２つの異なるエピトープペプチド配列を含む線状構造からなり、これに加えてその２個のエピトープはそれぞれそのＮおよびＣ末端により付加的なペプチド配列と結合してもよい。
【００１９】
こうして得られた合成エピトープ化合物は溶液中ですぐれた安定性を示すが、十分な希釈直線性は示さない。
【００２０】
「希釈直線性」という表現は、参照用化合物に対する希釈因子の関数として得られる信号を表す関数を意味するものと理解され、それは理想的には直線によって表されるはずである。
【００２１】
さらに樹枝状結合を介して母体ペプチドの側方基上の分岐ペプチドによって形成される枝を含むペプチド性の母体からなる合成のペプチド構造が、国際公開第95/04543号で知られている。
【００２２】
これらの分岐ペプチド構造は、明確ならせんトポロジーを有するタンパク質を設計するために有用である。
【００２３】
本発明をもたらす本発明者等の研究は、トロポニンＩの少なくとも２つの異なるエピトープ配列を保持する分岐サイドアームを備えた国際公開第95/04543号に記載の型の分岐構造が、４℃の溶液中で高い安定性とすぐれた希釈直線性の両方を示すトロポニンＩ検定のための免疫検定用の標準または対照を提供するという発見を可能にした。
【００２４】
本発明の主題は、
Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐ、およびＳｉから選択された少なくとも１０個、有利には少なくとも１２個、好ましくは少なくとも１４個、かつ多くとも３００個、有利には多くとも１００個、好ましくは多くとも５０個の原子を有し、しかも炭化水素鎖上にサイドアームをグラフトすることを可能にする反応性のあるまたは反応することが可能な少なくとも２個の官能基を備えた炭化水素鎖を持つキャリヤー分子と、
上記キャリヤー分子上にグラフトされた上記サイドアームによって保持された少なくとも２個の異なるエピトープ、
とを含む少なくとも１種類の合成化合物の生体分子、特にポリペプチドまたはタンパク質の免疫検定用の標準または対照としての使用法である。
【００２５】
具体的には、炭化水素鎖は本質的に一連の -(CH2)n- 連鎖（ただし、ｎは１０〜３００、有利には１０〜１００、好ましくは１０〜５０の整数）で形成することができ、上記鎖は、問題のエピトープを保持するサイドアームを上記炭化水素上へグラフトすることを可能にする少なくとも２個の原子または基、具体的にはアミノ、ヒドロキシル、チオール、カルボキシル、またはカルボニル基が炭化水素鎖または炭化水素鎖の置換基に割り込むメンバーとして存在するという条件で、Ｏ、Ｓ、Ｎ、Ｐ、およびＳｉなどの１以上のヘテロ原子またはヘテロ基、特に窒素含有ヘテロ基によって、および／またはハロゲン、（C6〜C12）アルキル、（C6〜C12）アリール、（C6〜C12）アリール−（C1〜C12）アルキル、アルコキシ、ヒドロキシル、アルデヒド、（C1〜C12）アルキルカルボニル、アミノ、チオ、カルボキシル、オキソ、ヒドロキシ−（C1〜C12）アルキル、チオ（C1〜C12）アルキル、カルボキシ−（C1〜C12）アルキル、アミノ（C1〜C12）アルキル、あるいはヘテロ環が特にＯ、Ｓ、＝Ｎ、またはＮＲ（Ｒは水素原子またはC1〜C12アルキル基）である飽和または不飽和のヘテロ環式のC1〜C12の基などの原子または基で置換された１以上のヘテロ原子またはヘテロ基によって割り込まれている。
【００２６】
エピトープを保持するサイドアームがその上にグラフトされる、反応性のあるまたは反応することが可能な官能基の最小限のスペースを有することが望ましい。
【００２７】
これについてはエピトープは、サイドアーム上に炭素、窒素、または酸素原子のサイズの少なくとも９原子の間隔、あるいはペプチド性の炭化水素鎖の場合には少なくともアミノ酸３個の間隔に相当する少なくとも４０Åだけ離して配置されることが好ましい。
【００２８】
これに加えて、エピトープを保持するサイドアームは、特にこれらエピトープの１以上と抗体との免疫反応中に、上記アームの間のステアリン酸障害または相互作用が生じないようにキャリヤー分子上に配列されることが好ましい。
【００２９】
有利にはサイドアームは相互に角度を形成するように配列され、サイドアームが非平行配列、好ましくは反対方向に配列するように炭化水素鎖中にねじれまたは剛性を導入することにより相互作用を避けることができる。
【００３０】
炭化水素鎖は有利には、原核または真核タンパク質中に見出されるものなど天然のアミノ酸、あるいは非天然のアミノ酸からなるオリゴペプチドまたはポリペプチドである。
【００３１】
この場合、２つの連続するサイドアームは、好ましくは反応性の側鎖を含有しない、または不活性化した反応性の側鎖を含有する２ｎ＋１個のアミノ酸（ただしｎは整数を表し、有利には１〜６である）により相互に分離された上記で規定した２個のアミノ酸によって保持されることが好ましい。好ましくはｎ＝２であるが、ｎ＝３、ｎ＝４、およびｎ＝５の値でもよい結果が得られる。
【００３２】
本発明の第一の実施形態によれば炭化水素鎖は開いており、炭化水素鎖、特にオリゴペプチドまたはポリペプチドのすべての原子は回転が自由な結合、すなわち環外の結合を形成する。
【００３３】
この場合、一方のサイドアームの原子ともう一方のサイドアームの原子の間の相互作用を避けることを可能にする２つの連続するサイドアームの間の間隙は、アミノ酸によって保持された２つの連続するサイドアームが上記の間隔の条件に相当する場合に得られる（すなわち「２ｎ＋１」）。
【００３４】
本発明の第二の実施形態によれば炭化水素鎖は開いており、もはや炭化水素鎖の原子によって形成される結合がすべて自由回転することがないように分子中に剛性を導入する少なくとも１つの結合を含む。
【００３５】
例えば、炭化水素鎖がペプチド性のものまたは環の炭素原子でないか、あるいはそれのみではない場合、これは例えばｓＰ2炭素原子を意味してもよい。
【００３６】
炭化水素鎖がペプチド性のものでない場合、一方のサイドアームの原子ともう一方のサイドアームの原子の間の相互作用を避けることを可能にする２つの連続するサイドアームの間の間隙は、サイドアームを保持するアミノ酸の間に２ｎ＋１個（ｎは上記の定義による）のアミノ酸間隙をとることにより、またはペプチド鎖にその鎖中に剛性を生じさせる環状アミノ酸を導入することにより、またはこれら選択肢のどちらも同時に考慮に入れることによって得られる。
キャリヤー分子の剛性は例えば、プロリン残基によって付与することができる。
【００３７】
本発明の第三の実施形態によれば炭化水素、特にオリゴペプチドまたはポリペプチドの鎖は閉じて環を形成する。
【００３８】
所望の間隙を得るための上記条件を最もよく満たすことを可能にするペプチド配列は、式
Ｘ1−Ａ1−Ａ2−Ａ3−Ａ4−Ａ5−Ｘ2−Ａ6
に相当し、
上式でＸ1およびＸ2は、同じでも異なっていてもよく、サイドアームを保持するアミノ酸であり、塩基性の側鎖をもつアミノ酸、ヒドロキシル化された側鎖をもつアミノ酸、およびイオウを含有する側鎖をもつアミノ酸から選択され、Ｘ1およびＸ2は好ましくはリシンを表し、
Ａ1およびＡ2は、Ａ1およびＡ2の一方がプロリンおよびフェニルアラニンから選択されるという条件で、プロリン、フェニルアラニン、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンから選択されるアミノ酸を表し、
Ａ3は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンから選択されるアミノ酸を表し、好ましくはグリシンであり、
Ａ4は、アルギニンおよびヒスチジンから選択されるアミノ酸を表し、好ましくはアルギニンであり、
Ａ5は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンから選択されるアミノ酸を表し、好ましくはアラニンであり、
Ａ6は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンから選択されるアミノ酸を表し、好ましくはグリシンである。
【００３９】
したがって、特に好ましい最小限のペプチド配列は、配列
ＫＧＰＧＲＡＫＧ、
ＫＧＦＧＲＡＫＧ、
ＫＰＧＧＲＡＫＧ、および
ＫＦＧＧＲＡＫＧ
である。
【００４０】
キャリヤー分子は、開鎖の場合には少なくとも５個、有利には少なくとも７個のアミノ酸で、かつ多くとも１００個、有利には５０個、好ましくは３０個のアミノ酸、特に２０個のアミノ酸、また環状の場合には少なくとも８個、好ましくは少なくとも１０個で、かつ多くとも１００個、有利には５０個、好ましくは３０個、特に２０個のアミノ酸の結合のみからなり、しかもそれは塩基性の側鎖をもつアミノ酸、具体的にはリシン；負に帯電した側鎖をもつアミノ酸、具体的にはグルタミン酸またはアスパラギン酸；ヒドロキシル化された側鎖をもつアミノ酸、具体的にはセリンおよびトレオニン；およびイオウを含有する側鎖をもつアミノ酸、具体的にはシステイン；から選択される少なくとも２個の残基を含むことが好ましく、リシンは〔ラクナ〕のものである。
【００４１】
一般に本発明によるキャリヤー分子は、分子質量が約10 kDaを超えず、好ましくは約8 kDaを超えない。本発明による好ましいキャリヤー分子は約5 kDa未満の分子質量を有する。望ましい最小分子質量は一般に約1±0.2 kDaである。
【００４２】
エピトープは、抗体、好ましくは特定の抗体が存在するかどうかが検定される生体分子の任意のエピトープからなる。
【００４３】
トロポニンＩについては、Larue等（Molec. Immunology, vol.20, No.29, 271-278 (1992)）、Bodor等（Clin. Chem. Vol.38, No.11, 2203-2214 (1992)）、Granier等（Protein Science, vol.6, suppl. 1, p.61 (1997)）によって記述された、また国際公開第94/15217号中に記述された抗体を挙げることができる。これら抗体の大部分は市販されている（Hytest LTD, Turku, Finland）。抗体11E12および8E1が特に好ましい。
【００４４】
この後、エピトープをE1およびE2と呼び、E1とE2は異なる。
エピトープE1およびE2はキャリヤー分子上に各々単一コピーとして、あるいは数コピー、具体的には２、３、または４コピーとして存在することができる。
後者の場合、同一エピトープの２つのコピーが同一のサイドアーム上または２つの異なるサイドアーム上に存在することができる。
【００４５】
キャリヤー分子に付着するエピトープE1およびE2の数を保証するために本発明による化合物の合成を厳しく制御するのが有利であり、手順書、Gregory A. Grantによって発表された「Synthetic Peptides A user’s guide」 (UWBC Biotechnological Resource Series, Richard R. Burgess series editor (1992)) の第４章Evaluation of the finished productを用いることができる。下記参照。
【００４６】
しかしながら同一のサイドアームは、２個を超える同一または異なるエピトープを含まないことが好ましい。
エピトープが２コピーを超えて存在する場合には、それらは同数の追加のサイドアームによって保持されることが好ましい。
同一のサイドアーム上に２コピーが存在する場合には、エピトープE1およびE2は有利にはペプチド性または非ペプチド性のリンカーＺにより相互に分離される。
【００４７】
したがってリンカーＺは、
エピトープとリンカーＺによって形成される結合が検定すべき生体分子配列、具体的にはトロポニンＩの一部を一緒には形成しないという条件で、アミノ酸１〜４０個、好ましくは３〜２０個のペプチド配列か、
【００４８】
線状または分岐したアミノ（C1〜C10）アルキルカルボニル鎖か、または
アミノ酸１〜１０個の少なくとも１つのペプチド配列、および少なくとも１つの線状または分岐したアミノ（C1〜C10）アルキルカルボニル鎖からなる混合構築物を表すことができる。
【００４９】
−Ｅ1−Ｚ−Ｅ2−は、その−Ｅ1−Ｚ−Ｅ2−が検定すべき分子配列、例えば少なくともアミノ酸１個、好ましくはアミノ酸２個、特にアミノ酸５個の非保存的置換、欠失、または挿入によるトロポニンＩの与えられた断片と異なる場合、検定すべき生体分子、具体的にはトロポニンＩの配列の一部ではないと考えられる。
【００５０】
Ｚは具体的には、
式
-NH- (CH2)m-CO-
の鎖（ただしｍは１から１０の整数を表す）、または
式
-〔pep1-NH- (CH2)m-CO〕p-
-〔pep1-NH- (CH2)m-CO- pep2〕p-
-〔NH- (CH2)m-CO- pep2〕p-
の混合構築物（ただし、ｍは１〜１０の整数を表し、ｐは１〜５の整数を表し、またpep1およびpep2は同一でも異なっていてもよくアミノ酸２〜１０個を含有するペプチド鎖を表す）を表すことができる。
【００５１】
エピトープを保持するサイドアームは、好ましくはエピトープのＮおよびＣ末端、またはＥ1−Ｚ−Ｅ2によって形成される結合のＮおよびＣ末端にそれぞれ付加的な基、Ｚ1およびＺ2を備える。
【００５２】
Ｚ1は有利には、
水素原子；アセチル基；アミノ酸１〜１０個のペプチド配列；アミノ酸１〜１０個のα−アセチル化したＮ末端のペプチド配列；システイニル、ビオチニル、またはビオシチニル基；システイニル、アミノ、ヒドロキシル、ハロ、カルボキシル、ビオチニル、またはビオシチニル残基を保持するアミノ酸１〜１０個のペプチド配列か、
線状または分岐したアミノ（C1〜C10）アルキルカルボニル鎖か、
線状または分岐したＮ−α−アセチル化したアミノ（C1〜C10）アルキルカルボニル鎖か、
アミノ酸１〜１０個の少なくとも１つのペプチド配列、および少なくとも１つの線状または分岐したアミノ（C1〜C10）アルキルカルボニル鎖からなる混合構築物か、または
アミノ酸１〜１０個の少なくとも１つのペプチド配列と、アミノ、ハロ、ヒドロキシル、カルボキシル、ビオチニル、ビオシチニル、またはシステイニル残基を保持する少なくとも１つの線状または分岐したアミノ（C1〜C10）アルキルカルボニル鎖とからなる混合構築物を表す。
【００５３】
Ｚ2は有利には、
ヒドロキシルラジカル；アミノラジカル；アミノ酸１〜１０個のペプチド配列；および末端のアミノ、ヒドロキシル、カルボキシル、ハロ、システイニル、ビオチニル、またはビオシチニル基を保持するアミノ酸１〜１０個のペプチド配列か、
線状または分岐したアミノ（C1〜C10）アルキルカルボニル鎖か、
ヒドロキシルラジカルまたはアミノラジカルを保持する線状または分岐したアミノ（C1〜C10）アルキルカルボニル鎖か、
アミノ酸１〜１０個の少なくとも１つのペプチド配列、および少なくとも１つの線状または分岐したアミノ（C1〜C10）アルキルカルボニル鎖からなる混合構築物か、または
ヒドロキシルラジカルまたはアミノラジカルを保持する、アミノ酸１〜１０個の少なくとも１つのペプチド配列および少なくとも１つの線状または分岐したアミノ（C1〜C10）アルキルカルボニル鎖からなる混合構築物を表す。
【００５４】
側鎖は直接またはスペーサーを介してキャリヤー分子と結合しており、このスペーサーはキャリヤー分子によって保持された反応基と、またＺ1およびＺ2とそれぞれ反応するように選択された２種類の反応性官能基をその末端に備えた二官能性の基であることができる。
【００５５】
サイドアームはアミノ酸を多くとも１０個、有利には多くとも６個からなるエピトープを含み、またＺ、Ｚ1、およびＺ2基は天然および／または非天然アミノ酸からなるのが好ましい。
【００５６】
本発明の合成化合物は、下記の段階を含む方法によって得ることができる。
段階Ａ：サイドアームのグラフトを可能にする少なくとも２個の反応基を備えたキャリヤー分子を準備すること、
段階Ｂ：任意にそのキャリヤー分子を環化すること、
段階Ｃ：そのキャリヤー分子の反応基と反応性のある少なくとも１個の官能基を備えたサイドアーム形成用の分子を準備すること、
段階Ｄ：適切な条件下でサイドアームのカップリングとキャリヤー分子のカップリングを行なうこと。
【００５７】
炭化水素鎖およびスペーサーがポリペプチド性のものである場合、有利には上記の段階は下記の段階からなる。
【００５８】
段階Ａ：少なくとも２個の同一または異なる官能性の側方基（例えばアミノ）を含有する少なくとも２個のアミノ酸残基を備えたオリゴペプチドまたはポリペプチドを準備すること。
【００５９】
環化したペプチドの場合には、官能基が環化中に干渉が起きないように、またはそれらが通例の保護基を用いて一時的に保護されるように選択される。
【００６０】
段階Ｂ：直接またはカップリング剤を介してペプチドの予想される環化を行なうこと。
【００６１】
例えば、アミド結合を形成する場合、カップリングは塩基の存在下でヘキサフルオロリン酸ベンゾトリアゾリル−オキシ−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウム／１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（BOP/HOBt）の対を介して得ることができる。
【００６２】
段階Ｃ：直接またはカップリング剤を介して反応することが可能な官能基を各々保持する保護されていないサイドアームのペプチドを準備し、次いで
段階Ｄ：本発明による合成化合物を含有するように、サイドアームを形成するペプチドで上記オリゴペプチドまたはポリペプチドをカップリングすること。
【００６３】
好ましい実施形態においてキャリヤー分子の反応性官能基は、二官能性の基sSMCCを介して活性化されるアミノ官能基である。
【００６４】
段階Ｄにおいてサイドアームとキャリヤー分子の間の結合は、上記サイドアームのペプチドの-SH残基とキャリヤー分子のマレイミド基の間の求核置換反応によって行なわれる。
【００６５】
キャリヤー分子およびサイドアームは、適切な場所で有機合成および／またはペプチド化学の従来の方法によって得られる。
【００６６】
キャリヤー分子のペプチドおよびエピトープを保持するサイドアームのペプチドは、「J. Amer. Chem. Soc.」85、2149-2154 (1963) のR. B. Merrifieldの論文；「Peptides 1971」（Nesvadba H.編、North Holland, Amsterdam, p.111）中のR. C. Sheppardの記述；「Solid phase Peptide Synthesis, a practical approach」（IRL PRESS, Oxford University Press, p.25-34 (1989)）中のE. Athertonおよび R. L. Sheppardの記述に記載されている従来の方法による固相合成によって得ることができる。
【００６７】
自動合成装置としてMillipore製の合成装置「9050 Plus Pep Synthesizer」、Perspective製の「Pioneer」、またはABI製の「433A」を用いることができる。
【００６８】
ペプチドはまた、均質相合成によっても得ることできる。
合成に用いられる固形の担体は使用される技術および化学に適合しなければならない。例えば合成装置「9050 Plus Pep Synthesizer」上で合成するには、いわゆる「定常流」の技術に適した樹脂を使用することが推奨され、PEG PS樹脂がこの基準を満たす。これらの担体は、ビーズのポリスチレンの官能基と第一アミノ酸の付着点の間に位置するポリエチレングリコール（PEG）を基材とするスペーサーアームからなる。この固定点の性質は選択されるＣ末端の官能基により変わる可能性がある。例えばアミドの形態のペプチドに対してはPAL PEG PS型の樹脂を採用することができるはずである。
【００６９】
Novabiochem製の樹脂類もまた、定常流固相合成にとって必要な基準を満たす。さらにこれらは合成後いわゆる穏やかな酸性条件下でペプチドを放出することができるという利点を有し、アミノ酸の側鎖が化学的な基によって未だ保護されたままのペプチド断片を得ることを可能にする。
【００７０】
出発の樹脂および原料として用いられるアミノ酸は、市販されている製品（PerSeptive-Biosystem、Perkin-Elmer、Novabiochem）である。
【００７１】
使用することができる側鎖保護基は表Iで与えられる。
【００７２】
【表１】
0004447811.tif 000002
【００７３】
アミノ酸のα位置での第一アミンの一時的保護は、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Fmoc）基の助けを借りて行なうことができる。脱保護は、ジメチルホルムアミドに溶かしたピペリジンの２０％溶液で行なうことができる。
【００７４】
カップリングには、好ましくは過剰のジイソプロピルカルボジイミド（DIPCDI）および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBt）が用いられる。
【００７５】
キャリヤー分子を構成する環状ペプチドには、好ましくはFmoc Ala Nova Syn樹脂が用いられる。
【００７６】
合成後、樹脂を有機溶剤で洗浄し（ジメチルホルムアミド、次いでジクロロメタン）、真空下で乾燥し、次いで酸をベースとする溶液で処理する。
【００７７】
次いでこうして単離したペプチドを沈殿させ、エーテルで洗浄する。
環状ペプチドからなるキャリヤー分子に対しては、例えば、いわゆる「同じ方向に一列に並んだ（head-to-tail）」環化を行なうことができる。この段階に関してはペプチドはDMFに溶解し、カップリング剤はジイソプロピルエチルアミン（DIEA）またはＮ−メチルモルホリン（NMM）などの塩基の存在下のBOP/HOBtの対である。抽出後、環化したペプチドを沈殿させ、次いでエーテルベースの溶液で洗浄する。
【００７８】
次いで、こうして得られたペプチドをトリフルオロ酢酸溶液で処理し、次いで再度沈殿させ、エーテルで洗浄する。
【００７９】
非環状ペプチド性のキャリヤー分子に対してはPALPEG PS樹脂が用いられる。合成後、樹脂を有機溶剤（ジメチルホルムアミド、ジクロロメタン）で洗浄し、真空下で乾燥し、次いで適切なスカベンジャーを含有する０℃に冷却したトリフルオロ酢酸ベースの溶液で処理する。例えば、トリフルオロ酢酸８２％、フェノール５％、チオアニソール５％、およびエタンジチオ−ル３％を含有するＫ試薬を用いることが可能かも知れない。
サイドアームを形成するペプチドは、具体的には国際公開第98/24816号に記載のように得ることができる。
次いでこうして単離された合成ペプチドをエーテルで沈殿させる。
【００８０】
次いで環状または線状の合成化合物を逆相液体クロマトグラフィにより精製し、その純度を質量分析法により決定する。相としては、例えばBondapak C-18相を用いることができる。ペプチドを２種類の緩衝液の間の直線勾配により溶出し、その第一部は本質的に水性（例えば、水およびTFA 0.1%）であり、その第二部はむしろ有機性（例えば、アセトニトリル60%、水40%、およびTFA 0.08%を含有する混合物）である。集められた純粋な画分を一緒にし、真空下で濃縮し、凍結乾燥し、その純度を手順書、Gregory A. Grantによって発表された「Synthetic Peptides A user’s guide」 (UWBC Biotechnological Resource Series, Richard R. Burgess series editor (1992)) の第４章Evaluation of the finished product中に示されているように質量分析法によって検査する。
【００８１】
次いで、１以上のペプチド（サイドアームを形成する）の特異的または非特異的結合を可能にする二官能性の基で、キャリヤーのオリゴペプチドまたはポリペプチドのある特定の構成アミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、システインなど）の側鎖の官能基を活性化する。この型の結合に用いることができる上記で標的にされる側鎖の例としては、アミノ（第一／第二）、カルボキシル、チオール、水酸化物、およびアルデヒド基などを保持する鎖を挙げることができる。
【００８２】
二官能性の基を備える化合物の例としては、下記の化合物を用いることができる。すなわち、
BS3：スベリン酸ビス（スルホスクシニミジル）
sSMCC：シクロヘキサン−１−カルボン酸（スルホスクシニミジル−４−Ｎ−マレイミド−メチル）
BMH：ビス−マレイミドへキサン
DSG：グルタル酸ジスクシニミジル
5MBS：ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシミドエステル
MPBH：水酸化４−（４−Ｎ−マレイミドフェニル）酪酸
EDC：１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピラート）−カルボジイミド
【００８３】
本発明による最終合成化合物については、当業技術者により前述の質量分析技術を用いてこのような化合物の純度を検証することができる。さらに当業技術者ならば、分光測定法によって有効に測定される上記化合物の分子質量が、出発分子（キャリヤー分子、エピトープなど）の分子質量に照らして予想される分子質量に確かに相当することをはっきりと曖昧でなく確認することができる。したがって本発明は、当業技術者が自分が行なっている合成を精密に制御し、自分が何をしているかを正確に知ることを可能にする。
【００８４】
本発明の主題はまた、上記で規定したトロポニンＩの２つの異なるエピトープを備えた化合物である。
【００８５】
トロポニンＩのエピトープとしては、具体的にはペプチド配列TEPH、ALLGARおよびFAEL、あるいはその後者を含む配列を挙げることができる。
【００８６】
本発明の主題はまた、トロポニンＩの少なくとも２個のエピトープを備えた本発明の化合物を含有する組成物である。
【００８７】
それは、好ましくは緩衝液に溶かした前述のビエピトープの合成化合物からなる水溶液または組成物である。緩衝液としては例えば、Kathon（登録商標）およびウシ血清アルブミン（BSA）；あるいはKathon（登録商標）、Regilaitｖ（登録商標）、およびEDTA；あるいはKathon（登録商標）、Plasmion（登録商標）および任意にEDTA；あるいはKathon（登録商標）、カゼイン、およびEDTAを含有するリン酸緩衝液（KH2PO4/K2HPO4、pH=6.5〜7.5）を用いることができる。
【００８８】
また、Kathon（登録商標）およびウシ血清アルブミン（BSA）；あるいはKathon（登録商標）、Regilait（登録商標）、およびEDTA；あるいはKathon（登録商標）、Plasmion（登録商標）および任意にEDTA；あるいはKathon（登録商標）、カゼイン、およびEDTAを含有するコハク酸緩衝液（pH=5〜6）またはトリス−HCl緩衝液（pH=7.5〜8.5）を用いることもできる。
【００８９】
また、グリシン、Kathon（登録商標）、Regilait（登録商標）、およびEDTAを含有する緩衝液を用いることもできる。
【００９０】
Kathon（登録商標）、Regilait（登録商標）およびEDTAを含有するコハク酸またはリン酸緩衝液の使用が好ましい。
【００９１】
Kathon（登録商標）、すなわちRohm and Haas社により販売されている抗菌剤は、５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンおよび２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン（1.5%）からなる。
【００９２】
Regilait（登録商標）は、Regilait社（フランス）により販売されている脱脂粉乳である。
【００９３】
Plasmion（登録商標）はBellon Laboratories（フランス）により販売され、水に溶かした変性液状ゼラチン（30 g/l）、NaCl（5.382 g/l）、MgCl2（143 mg/l）、KCl（373 mg/l）、乳酸ナトリウム（3.360 g/l）からなる。
【００９４】
下記の緩衝液が特に好ましい。
Kathon（登録商標）（0.2%）、Regilait（登録商標）（0.05〜2%）、および2mM EDTAを含有する0.1Mコハク酸緩衝液（pH=6）；
Kathon（登録商標）（0.2%）、カゼイン（0.01〜0.5%）、および2mM EDTAを含有する0.1Mコハク酸緩衝液（pH=6）；
Kathon（登録商標）（0.2%）および1% BSAを含有する0.1Mコハク酸緩衝液（pH=6）；
Kathon（登録商標）（0.2%）、Regilait（登録商標）（0.05〜0.5%）、および2mM EDTAを含有する0.1Mリン酸緩衝液KH2PO4/K2HPO4（pH=7.5）；
Kathon（登録商標）（0.2%）、カゼイン（0.01〜0.1%）、および2mM EDTAを含有する0.1Mリン酸緩衝液KH2PO4/K2HPO4（pH=7.5）；および
Kathon（登録商標）（0.2%）および1% BSAを含有する0.1Mリン酸緩衝液KH2PO4/K2HPO4（pH=7.5）。
【００９５】
血漿または血清を含有する組成物および上記で規定した本発明の化合物もまた、本発明の一部を形成する。
【００９６】
上記で規定した化合物を標準または対照として用いる免疫検定法もまた、本発明の一部を形成する。
【００９７】
本発明はまた、上記で規定した少なくとも１種類のビエピトープ化合物または上記で規定したビエピトープ化合物を含有する少なくとも１種類の組成物を包含する免疫検定を実施するためのキットに関する。
【００９８】
下記の実施例は、本発明を例示するものであり、限定することなしに提供される。
【００９９】
実施例１：本発明による合成ビエピトープ化合物の調製
Ａ．キャリヤー分子の調製
下記の式の環状ペプチドを調製する。
【０１００】
【化１】
0004447811.tif 000003
【０１０１】
符号は１文字符号である。
このペプチドは、上記に記載したようにMerrifield（J. Am. Chem. Soc. 85,2149-2154 (1963)）によって１９６３年に開発された技術により固相上で合成される。
【０１０２】
上記化合物の合成には、合成装置として合成装置9050 Plus Pep Synthesizer、樹脂としてFmoc Ala Nova Syn樹脂を用いた。合成の様々な段階を下記の表IIにまとめる。
【０１０３】
【表２】
0004447811.tif 000004
【０１０４】
Dc* は二重カップリングを意味する。二重カップリングはペプチドの純度を高めるために行なうことができる。
【０１０５】
合成の終わりに樹脂をジメチルホルムアミド、次いでジクロロメタンで洗浄し、真空下で乾燥する。
【０１０６】
次に、酢酸、メタノール、およびジクロロメタン（5/1/4 v/v/v）を含有する溶液で樹脂を処理する。
【０１０７】
濾過により樹脂を溶液中のペプチドから単離する。濾液を濃縮し、ペプチドを冷エーテルで沈殿させて単離した。こうして化合物0.145gが得られる。
【０１０８】
次いでペプチドを下記の方法で環化する。
化合物100gをジメチルホルムアミド18 ml中に溶解し、それにBOP 2当量、HOBt 2当量、およびDIEA 5当量を相次いで加える。
【０１０９】
２時間の反応の後、環化されたペプチドを分離用漏斗で抽出する。
次いで有機相をNa2SO4上で乾燥し、次いでRotavapor（登録商標）または任意の他の適切な回転式蒸発器を用いて濃縮する。次いでエーテル、酢酸エチル、およびヘキサンの混合物（6/3/1 v/v/v）から、環化されたペプチドを０℃で１５時間沈殿させる。環化されたペプチド70 mg、すなわちキャリヤー分子70 mgが得られる。
【０１１０】
Ｂ．本発明によるビエピトープの合成化合物の調製
DMF／緩衝液（1/3：2/3）の混合物中に溶解したキャリヤー分子（すなわち上記環化されたペプチド）8 mgにsSMCC 6当量を１滴ずつ加えて活性化させる。反応物を１８〜２５℃で約４５分間撹拌し続ける。活性化したキャリヤー分子をHPLCによって過剰のsSMCCから分離する。純粋な画分を一緒にし、凍結乾燥する。活性化したキャリヤー分子4.5 mgが得られる（収率約４５％）。
【０１１１】
活性化したキャリヤー分子2 mgをPBS緩衝液、pH 6.5中に溶解する。この溶液にペプチドTRP 1116 Ac、すなわち、Ac-GSSNYRAYA-(TEPH)-AKK-Hx-PLELAGLG-(FAEL)-QDLCRQ-NH2 2当量（すなわち8 mg）を加える。
【０１１２】
括弧内のペプチド配列はトロポニンＩのエピトープを表す。
反応物を１８〜２５℃で４時間撹拌し続ける。
次いで、こうして得られた本発明による化合物を脱塩する（HPLC／透析）。
その分子質量を質量分析法によって評価する（Gregory A. Grantによって発表された手順書、「Synthetic Peptides A user’s guide」(UWBC Biotechnological Resource Series, Richard R. Burgess series editor (1992)) の第４章Evaluation of the finished product中に示されている実験計画案による）。
【０１１３】
同様の方法で、下記の式の本発明による化合物PEP 5、PEP 9、およびPEP 10を調製した。
【０１１４】
化合物PEP 5：
【０１１５】
【化２】
0004447811.tif 000005
【０１１６】
化合物PEP 9：
【０１１７】
【化３】
0004447811.tif 000006
【０１１８】
化合物PEP 10：
２つのバッチ、PEP 10 P1およびPEP 10 P2について
【化４】
0004447811.tif 000007
【０１１９】
本発明による化合物に関する希釈の結果の安定性および直線性を下記に示す。
実施例２：本発明による化合物の安定性
化合物PEP 5、PEP 9、およびPEP 10の安定性を、Bio-Rad（Marnes la Coquette, France）から販売されているBeckman社製の自動装置Access（登録商標）の助けを借りた化学発光表示値（相対発光単位すなわちRLUで表される信号）を用いたELISA検定によって評価し、次いで同じ方法で分析した従来技術の環化していない参照用ビエピトープ化合物（TRP 1116 Ac）の値と比較した。
【０１２０】
結果を下記の表IIIに示す。
【０１２１】
【表３】
0004447811.tif 000008
【０１２２】
* 希釈度の受け入れ基準：化合物が希釈可能であるためには、与えられた希釈度に対する実験に基づく信号／理論に基づく信号の比が1.00±0.2と同等であるべきである。100,000 RLU未満の信号を示す希釈度は考慮に入れるべきではない。
**  安定性の受け入れ基準：許容される実施X日後の安定性については、1.00±0.2と同等の実施時＋X日後における信号／実施時における信号の比を得る必要がある。
*** 0.2%のKathon、0.2%のRegilait、および2mM EDTAを含有する0.1Mコハク酸緩衝液、pH 6.0（または0.2%のKathonおよび1%のBSAを含有する0.1Mコハク酸緩衝液、pH 6.0）。
【０１２３】
従来技術の化合物TRP 1116 Acは、実施時＋２４時間以上、＋４℃で安定でない。
本発明による化合物PEP 5、PEP 9、およびPEP 10はすべて＋４℃で３ヶ月後も安定であり、またPEP 9の場合は６ヶ月後、PEP 5の場合は１２ヶ月後でさえ安定である。
【０１２４】
実施例３：希釈曲線の直線性の結果
結果を下記の表５に示す。
希釈度の受け入れ基準：化合物が希釈可能であるためには、与えられた希釈度に対する実験に基づく信号／理論に基づく信号の比が1.00±0.2と同等であるべきである。100,000 RLU未満の信号を示す希釈度は考慮に入れるべきではない。
【０１２５】
信号単位（RLU）で表わした結果
【表４】
0004447811.tif 000009
【０１２６】
【表５】
0004447811.tif 000010
【０１２７】
【表６】
0004447811.tif 000011
【０１２８】
【表７】
0004447811.tif 000012
【０１２９】
【表８】
0004447811.tif 000013
【０１３０】
本発明による化合物PEP 5、PEP 9、およびPEP 10に対する希釈曲線は、ペプチドTRP 1116 Acとは異なり、高い希釈度でさえ未だよい直線性を示す。
【０１３１】
その結果、本発明による化合物を使って信頼性のある結果を得ることができ、これらが従来技術の化合物よりもすぐれた安定性をもつことが分かるだけでなく、直線的な希釈曲線を得ることも可能になる。すなわちこれらは提起された問題を解決する。