(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
最も不飽和度の高い一以上の化合物を、これに加えて不飽和度の低い一以上の有機化合物および／または飽和有機化合物を含有し、且つ少なくとも４つの二重結合を含む少なくとも一つのポリ不飽和脂肪酸を含有する液体混合物から分離するための方法であって；
（ｉ）酸陽イオン交換体に完全に銀イオンを負荷することと、
（ii）該負荷された陽イオン交換体に前記液体混合物を混合することと、
（iii）前記混合物を、使用する溶媒の沸点未満の温度において、バッチ式方法で攪拌することと、
（iv）上清を分離することと、
（ｖ）前記銀イオンを前記陽イオン交換体から脱離させることによって、前記最も不飽和度の高い化合物を前記陽イオン交換体から脱離させること
を含んでなる方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記最も不飽和度の高い化合物は、硝酸ナトリウムを添加することにより前記イオン交換体から銀を脱離させることによって、前記陽イオン交換体から脱離されることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法であって、前記液体混合物が溶媒を含有することを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であって、前記溶媒はエーテル、エステル、ケトン、アルカン、アルコールおよびニトリルからなる群から選ばれることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項３に記載の方法であって、前記溶媒は、n-ヘキサン、n-ヘプタン、n-ペンタン、エタノール、メタノールおよびアセトニトリルからなる群から選ばれることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１〜５の何れか１項に記載の方法であって、前記液体混合物は、飽和脂肪酸および／またはn個の二重結合を含む不飽和脂肪酸および／またはn+1個以上の二重結合を含む脂肪酸を含有しており、前記n+1個以上の二重結合を含む脂肪酸が前記飽和脂肪酸または前記n個の二重結合を含む不飽和脂肪酸から分離され、nは3〜10の整数であることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１〜６の何れか１項に記載の方法であって、前記液体混合物は、粗製エステル混合物、プロセス油、エステル混合物、脂肪酸混合物および／またはポリ不飽和脂肪酸の誘導体を含有することを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項１〜７の何れか１項の何れか１項に記載の方法であって、前記液体混合物は、魚油、植物油および／または微生物油を含むことを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項１〜８の何れか１項に記載の方法であって、前記ポリ不飽和脂肪酸は、ヘキサデカテトラエン酸、ステアリドン酸、アラキドン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、オクタコサオクタエン酸からなる群から選ばれることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項１〜９の何れか１項に記載の方法であって、前記酸陽イオン交換体は、Dowex（登録商標）50 WX8、Dowex（登録商標）50 WX4、Dowex（登録商標）50 WX2、Dowex（登録商標）MWC1、Dowex（登録商標）MSC1、Dowex（登録商標）Monosphere C-350、Dowex（登録商標）CCR-2、Dowex（登録商標）DR 2030、Amberlite（登録商標）CG50、Amberlite（登録商標）IR-120、Amberlyst（登録商標）15、Bio-Rex（登録商標）70樹脂、Macherey & Nagel PS-DVB（登録商標）からなる群から選ばれることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０の何れか１項に記載の方法であって、前記酸陽イオン交換体は、硝酸銀での処理により負荷されることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１の何れか１項に記載の方法であって、前記負荷された陽イオン交換体と液体混合物との混合物が、上昇した温度で攪拌されることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって、前記温度は外部熱源の作用によって、またはマイクロ波、超音波もしくは電磁気の照射によって上昇されることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１〜３の何れか１項に記載の方法であって、前記銀イオンは、硝酸ナトリウムを添加することによって前記陽イオン交換体から脱離されることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、銀イオンを部分的または完全に負荷された陽イオン交換体において選択的に錯化し、その後に該錯体を解離させることによって、一以上の不飽和化合物またはその誘導体を、該化合物と共に他の比較的飽和度の高い化合物を含む混合物から得るための新規な抽出方法、例えばポリ不飽和脂肪酸またはその誘導体を、これと共に飽和および／または低不飽和度の脂肪酸もしくはその誘導体を含有する混合物から得るための、新規な抽出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリ不飽和の長鎖脂肪酸（PUFA）は、ヒトの代謝において不可欠な脂肪酸である。PUFAは、二つの大きな分類に分けることができる。その式がリノール酸に基づくω-6 PUFAに加えて、αリノレン酸に基づいて構成されるω-3 PUFAの分類が存在する。
【０００３】
PUFAは、細胞膜、網膜および髄膜の重要な構成ブロックであり、また重要なホルモン、例えばプロスタグランジン類、トロンボキサン類およびロイコトリエン類の前駆体である。
【０００４】
構成ブロックとしての機能に加えて、最近では益々頻繁に、PUFAがヒトの身体または疾患に対して直接的な種々の有用な効果を有することが見出されている。
【０００５】
多くの臨床的研究によって、PUFA類は、例えば癌、リューマチ性関節炎、高血圧、神経皮膚炎、および他の多くの疾患の場合に、治癒または寛解のために重要な寄与をなし得ることが見出された。これらの発見は、国際的な研究機関および権威が、PUFA類の日常的摂取のコントロールを推奨した事実に起因している。
【０００６】
ヒトには、炭素鎖のC9よりも大きい位置に二重結合を導入できる酵素系が欠けているので（Δ12デサチュラーゼの欠失）、ヒトは、PUFA類をデノボ（de novo）合成できない。ヒトは、食事による前駆体脂肪酸（例えばαリノレン酸）の供給が存在するときに、ポリ不飽和脂肪酸類を合成できるに過ぎない。しかし、この量がポリ不飽和脂肪酸の必要量をカバーするのに十分であるかどうかについては幾つかの論争がある。
【０００７】
必須脂肪酸の大部分は食事を介して消費される。特に、植物油はω-6脂肪酸に富んでいる（例えばマツヨイグサ油はγリノレン酸（GLA）を含有する）が、鎖長がC18以下であり、また魚油または微生物由来の油はω-3脂肪酸を含有している（例えば、鮭油はエイコサペンタエン酸（EPA）およびドコサヘキサエン酸（DHA）を含有する）。原理的に、魚油および微生物由来の油は、ポリ不飽和脂肪酸の唯一の商業的供給源である。しかし、一般に望ましいPUFAの含量は低く、またこれらは混合物で存在し、その場合にアンタゴニスト作用を有するPUFAが存在する可能性がある。PUFAの推奨される一日許容量を消費するためには、多量の油を消費しなければならない。特に、これは高投与量のPUFAを消費しなければならない患者に影響する（例えば、嚢胞性繊維症の場合）。目標とする個々のPUFAの効果を可能な限り達成するためには、豊富なまたは高純度のPUFAを使用しなければならない。従って、従来技術においては高純度PUFAについての大きな要求が存在する。
【０００８】
分析クロマトグラフィーシステム（カラムクロマトグラフィー）において、不飽和脂肪酸を精製および分離するために銀を負荷した陽イオン交換器を使用することは、既に報告されている。
【０００９】
ここでは、シリカゲルを用いた、HPLC［Adlof, R.O. and E.A. Emken (1985): 銀樹脂クロマトグラフィーによる魚油のω-3ポリ不飽和脂肪酸およびメチルエステルの単離, JAOCS, 62(11), 1592-1595; Christie, W.W. (1987): 高速液体クロマトグラフィーによる脂質の分離のための安定な銀負荷カラム, J. of High resolution chromatography & Chromatography Communications, 10, 148-150]、ＳＦＣ［Kadota, Yasuhiko; Tanaka, Isao; Ohtsu, Yutaka; Yamaguchi, Michihiro (1998): 銀負荷球状粘度を使用したクロマトグラフィーによるポリ不飽和脂肪酸の分離, II.高純度DHAの産業規模での調製, 日本有機化学会誌, 47(4), 351-357］、およびカラムクロマトグラフィーシステム［Nieto, S.; Ana M Cordoba; J. Sanhueza and A. Velenzueela (1997): 銀-樹脂クロマトグラフィーによる鰯油からのエイコサペンタエン酸およびドコサヘキサエン酸の高精製画分の入手; 半調製的方法, Grasas Y Aceitaes, 48(4), 197-199; Belarbi, El Hassan; Emilio Molina and Yusuf Chisti (2000): 微小藻類からの高純度エイコサペンタエン酸エステルの高収率かつ計量可能な回収方法, Enzyme and Microbial Technology, 26, 516-529］だけでなく、イオン交換体が使用される。これは、特に分析的方法に適用される。
【００１０】
更なるクロマトグラフィー方法は、リガンド交換クロマトグラフィー（LEC）である。これは、特にPUFAが分離されるべきでないシステムにおいて使用されてきた［Pyell, U., S. Schober and G. Stork (1997): パラジウム（II）または銀（I）陽イオンを負荷したキレート化シリカゲル上での、多環式芳香族炭化水素および多環式芳香族硫黄へテロ環のリガンド交換クロマトグラフィー分離, Fresenius J Anal Chem., 359, 538-541; Janak, K., M. Demirbueker, I. Haegglund and L.G. Blomberg (1992): 開管超臨界液体クロマトグラフィー用の静止相を与えるための、ポリ（メチル-3-プロピルチオール）シロキサンの修飾, Chromatographia, 34(5-8), 335-341］。
【００１１】
出願JP 45021376では銀負荷陽イオン交換システムが用いられており、ここではマツヨイグサ油に基づくエチルエステル混合物を精製するためのクロマトグラフィー材料として、Dowex（登録商標）50が記載されている。純粋なGLAEE画分（GLAEE＝γ-リノール酸エチルエステル）は、収率78％で首尾良く単離された。
【００１２】
全てのシステムにおいて、ポリ不飽和脂肪酸はカラムから極端に遅く且つ少ししか溶出しないという問題が生じる（Adlof, R.O.; H. Rakoff and E.A. Emken (1980): 部分凝集樹脂クロマトグラフィー(PARC): I.オクタデカジエン酸メチル異性体の溶出および分離に対する銀パーセントの影響. JAOCS, 9, 273-275）。この場合、多量の溶媒が消費される。更に、精製された生成物画分を分離するための分画段階が必要とされる。
【００１３】
純粋なアセトニトリル（ACN）またはアセトニトリルとの混合物を使用することによってのみ、許容可能な溶出時間が導かれる（DeJarlais, W.J.; R.O. Adlof and E.A. Emken (1983):銀樹脂カラムクロマトグラフィーにおける溶出液としてのアセトニトリル. JAOCS, 60(5), 975-978）。ここでは、一般に溶媒の再生を更に困難にする勾配系が使用される。
【００１４】
工業的使用の場合、多量のアセトニトリルを使用することは、高コストおよび毒物学的リスク（アセトニトリルは青酸（HCN）を含む可能性がある）のため著しく不適切である。
【００１５】
クロマトグラフィー法のスケールアップ、従って工業的使用もまた、使用されるカラム寸法についての制限を伴ってのみ可能である。
【００１６】
Adlof et al.(1980,上記の通り）は、部分的に銀負荷された陽イオン交換体を製造したが、これはアルコールを溶出液に用いて、ジ不飽和脂肪酸のエステルを溶出させることを可能にする。更に高度の不飽和脂肪酸は使用されていない。しかし、この場合にも同様に、アセトニトリル無しでの溶出は不可能である。
【００１７】
ＳＦＣによる製造のための魚油から出発すると、DHAEEのコスト＄550/kgが生じる［Alkio, M.; C. Gonzalez; M. Jantti and O. Altonen (200): 超臨界流体クロマトグラフィーを用いたツナ油からのポリ不飽和脂肪酸エステルの精製. JAOCS, 77(3), 315-321］。ここで、1時間当りおよび静止相1kg当りで略0.5gのDHAEEの製造速度が言及される。これは、0.05％の負荷（DHAEE／静止相）と等価である。ＳＦＣ設備の資本コストは200万＄である。
【００１８】
銀負荷マトリックスを使用した、魚油から出発するＳＦＣ製造法が同様に知られており、ここでは＄4000/KgでDHAEEを製造することができる［Tanaka, Isao (1996): 超臨界クロマトグラフィーは脂肪酸製造を促進する. Chem. Eng. April, 19-21］。
【００１９】
Yamamura等（Yamamura, R. and Y. Shimomura (1997): 単細胞油(single-cell oil)からのドコサヘキサエン酸エチルエステルおよびドコサペンタエン酸エチルエステルの工業的高速液体クロマトグラフィー精製, JAOCS, 74(11), 1435-1440）は、単細胞油から出発したHPLC製造法を報告しているが、製造コストは報告されていない。DHAEEの生産性は0.1 kg/hであった。使用したカラム（略160 kgのシリカゲル）を考慮すると、これは1時間当りおよび静止相1kg当りで略0.0006 kgの生産性を与える。これは0.06％の負荷に対応する。使用した溶媒は有毒なメタノールであった。
【００２０】
クロマトグラフィー系は、PUFA類を精製するための多くの問題を包含し、従って比較的大規模でポリ不飽和脂肪酸を製造するためには適していないことが明らかになっている（Zhou, Dequan and Xuebing Xu (2000): 魚油からの長鎖ポリ不飽和脂肪酸の酵素的富化；Shipin Kexue (Bejing), 21(12), 188-194. Teramoto, M.; H. Matsuyama; N. Ohnishi; S. Uwagawa and K. Nakai (1994): 硝酸銀水溶液を用いたポリ不飽和脂肪酸のめ）。
【００２１】
他方、温和な抽出法は、他の物質との混合物からPUFAを得るための顕著な利点を提供する可能性がある。
【００２２】
硝酸銀を含有するこのような水性抽出系に対する、最初ののアプローチが研究されている（Suzuki, T.; S. Kikuchi; K. Nakano; S. Kato and K. Nagahama (1993): 硝酸銀水溶液からのポリ不飽和脂肪酸エチルエステルの超臨界流体抽出. Bioseparation, 3, 197-204, Teramoto et al 1994）。Kato et al（S. Kato, N. Kunio, N. Hidetomi and N. Kaoru (1994): エマルジョン膜法によるポリ不飽和脂肪酸の分離および回収. JP06279781）は、水中油エマルジョンの使用を研究しており、全体のPUFA画分の分離だけが報告されている。しかしこの場合、健康に有害な硝酸銀の使用が工業的応用のための障害である。更に、水性環境においてはPUFAの酸化の危険が特に高く、これは、特に硝酸銀の存在によって更に加速される可能性がある。硝酸銀は比較的迅速に酸化銀に酸化され、一般的には不安定とみなされるので、硝酸銀の取扱は、非常に困難であることを更に立証する。
【００２３】
既述の銀を伴わない固相抽出系は、PUFAの分離において十分な選択性を示さない（Wilson, R.; J.R. Henderson; I. Burkow and J.R. Sargent (1993); アミノプロピル固相抽出カラムを使用したn-3ポリ不飽和脂肪酸の富化. Lipids, 28(1), 51-54）。出願人は、特にアセトニトリルの使用を伴わないような、PUFAを分離するための銀を用いた固相抽出法を知らない。
【００２４】
加えて、銀負荷膜を通しての拡散を促進することによる精製が試みられている［Shibaki, A.; Y. Irimoto; K. Sugita; T. Baba; I. Honjyo; S. Moriyama and T. sugo (1999): 銀イオン負荷された多孔質中空繊維膜へのドコサヘキサエン酸エチルエステルの選択的結合. JAOCS, 76(7), 771-775］。
【００２５】
抽出溶媒に対する構成国の法律の近似に関する1988年6月13日の88/344/EEC指令書（これは食品および食物成分の製造において留意されなければならない）により、DHAが食品分野のために製造されるときには、アセトニトリルの使用は絶対に排除されなければならない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２６】
従って、前記先行技術の観点からして、本発明の根底をなす目的は、他の物質、例えば他の有機飽和化合物または不飽和度の低い化合物との混合物から、不飽和化合物を得るための新規な方法を提供することである。
【００２７】
この方法は、先行技術に記載されたよりも良好で、且つ定量的に十分な精製を可能にするものでなければならず、且つ、当該方法の単純化および経済的設計を可能にするものでなければならない。更に、この方法は、例えば構造的に僅かしか異ならない不飽和化合物の相互分離を可能にするように、選択的でなければならない。
【００２８】
本発明の更なる目的は、他の物質との混合物から不飽和脂肪酸またはその誘導体を得るための新規な方法を提供することである。
【００２９】
この方法は、先行技術に記載されたよりも良好で、且つ定量的に十分な精製を可能にするものでなければならず、且つ、当該方法の単純化および経済的設計を可能にするものでなければならない。更に、この方法は、例えば構造的に僅かしか異ならない不飽和化合物またはその誘導体、例えばDHAEE／DPAEEの分離を可能にするために、選択的でなければならない。
【００３０】
好ましくは、本発明の方法は食品分野での使用に適すべきであり、従って、例えば、アセトニトリルまたは他の有毒な溶媒を流出媒体として使用せずに、混合物からPUFAを精製することを可能にするべきである。
【課題を解決するための手段】
【００３１】
この目的、および明示されていないが最初に述べた内容から誘導または推論できる他の目的は、請求項１に記載の方法によって達成される。本発明の好適な変形は、請求項１を引用した従属請求項に記載されている。
【００３２】
こらは、驚くべきことに、本発明の目的が：
（ｉ）強酸陽イオン交換対に銀イオンを負荷し、
（ｉｉ）負荷された陽イオン交換体に、少なくとも一つの溶媒を用いて、または用いないで、精製すべき不飽和化合物を含有する液体混合物を混合し、
（ｉｉｉ）バッチ法により、使用する前記溶媒の沸点未満の定義された温度で所定時間だけ、前記混合物を前記交換体に接触させ、
（ｖ）上清を分離し、
（ｖｉ）前記イオン交換体から前記不飽和化合物を脱離させることによって達成できるからである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
先に述べた方法とは対照的に、本願においては、分離のために必要な銀イオンに加えて、選択性、反応時間および分離の質に顕著に寄与するマトリックスが使用される。従って、先行技術に記載された方法では、銀イオンが存在しても、PUFAの分離が達成されないことが観察される可能性がある。
【００３４】
二重結合の数、並びに適用の分野およびそれにより是認される溶媒に応じて、本発明では異なる手順が用いられる。従って、4未満の二重結合を有する脂肪酸は、原理的にはアセトニトリルなしで、交換体から定量的に脱離させることができる。4以上の二重結合を有する脂肪酸は、アセトニトリル（図１、変形例Ａ）、新規再生方法（図１、変形例Ｂ）または部分的に銀負荷された交換体（図１、変形例Ｃ）が使用されるときにのみ、定量的に交換体から脱離させることができる。
【００３５】
一般的に、ポリ不飽和脂肪酸は異なる強さで交換体に結合することが認められている。従って、幾つかの場合には、極性溶媒中においてでも、追加の加熱を伴って、または伴わずに、定量的脱離が観察される。これは、PUFAの異なる錯化度によって説明することができる。従って、トリ不飽和PUFAは最大で6個の錯形成結合を形成し、またヘキサ不飽和PUFAは最大で12個の錯形成結合を形成して、より強い結合種を形成することができる。
【００３６】
不飽和化合物は、-20℃〜80℃の温度で、本発明に従って陽イオン交換体から脱離することができる。好ましくは、不飽和化合物は-20℃〜40℃の温度で脱離され、非常に好ましくは-20℃〜10℃の温度で脱離される。この脱離は、本発明に従って、ケトン類（好ましくはアセトン、2-メチルエチルケトン）、中鎖アルコール（好ましくは2-プロパノール、プロパノール又はブタノール）、短鎖アルコール（好ましくはメタノールまたはエタノール）、およびニトリル（好ましくはアセトニトリル）からなる群から選択される溶媒を添加することによって行うことができる。
【００３７】
本発明に従って混合物から単離できる化合物には、就中、脂肪酸（飽和、不飽和、もしくはポリ不飽和）、異性体脂肪酸（シス、トランス、共役、単離）、脂肪酸誘導体（例えばエーテルもしくはエステル、例えばメチルエステル、エチルエステル、ワックスエステル、トリグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリド）、修飾脂肪酸（例えばヒドロキシ脂肪酸、オキソ（ケト）脂肪酸、アミノ脂肪酸）、また誘導体として不飽和アルケン、不飽和アルコール、不飽和エーテル、不飽和ケトンもしくはアルデヒド、芳香族、ステロイドもしくはステロイドエステル、糖（モノマー、オリゴマー、…）、トコフェロール、アスタキサンチンが含まれる。
【００３８】
本発明に従って他の有機化合物との混合物から単離できる脂肪酸には、就中、ヘキサデカジエン酸、ヘキサデカトリエン酸、ヘキサデカテトラエン酸、リノール酸、γ-リノレン酸、α-リノレン酸、ステアリドン酸、アラキドン酸、エイコサトリエン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、テトラコサジエン酸、オクタコサオクタエン酸、およびこれら脂肪酸の塩、エステル、エーテルまたは他の誘導体が含まれる。
【００３９】
好ましくは、脂肪酸エチルエステルはこの方法によって精製される。
【００４０】
一般に、本発明に従って精製できる脂肪酸は、二以上の二重結合を有する鎖長C14〜C30の全ての脂肪酸、またはこのような脂肪酸の誘導体である。
【００４１】
二重結合の位置または二重結合のコンフィギュレーションに応じて、本発明を用いた化合物の分離が可能である。
【００４２】
特に、完全に銀負荷された交換体を使用するときは、最良の選択性およびPUFAでの最高の交換体の負荷が達成される。
【００４３】
本発明によれば、使用できる出発混合物は天然油、例えば魚油、植物油、微生物的に産生された油、プロセス油、エステル混合物、遊離脂肪酸混合物、不飽和化合物および／またはこれら化合物の誘導体である。
【００４４】
魚油は、例えば10〜20％のDHAを含み、また微生物的に産生された油は60％以下のDHAを含有する。従って、これらの油は異なる量の分離すべき脂肪酸を含有する。当業者にとって、これは精製工程で達成可能な特定の純度の純粋なDHAを評価するのを困難にする。従って、一般に、純度の質を評価するためには精製因子を定義することが道理にかなっている。最も単純な場合、精製因子は、生成物の純度と基質の純度の商である。この純度は、例えばガスクロマトグラフィー分析（単位：面積％）から決定することができる。
【００４５】
ＰF＝Ｐ（生成物中の脂肪酸）／Ｐ（基質中の脂肪酸）×100％
ここで、
ＰF＝精製因子
Ｐ＝純度
である。
【００４６】
成功した精製後の精製因子は、常に＞１である。しかし、出発混合物に応じて、更に高い値を達成することができる：出発混合物が0.5％の標的脂肪酸を有する場合であれば、精製後は95％、例えば190。
【００４７】
DHAEEの例において、高純度の95％DHAEEは、47％純度のDHAEE混合物からだけでなく、80％純度のDHAEE混合物からも製造することができる。これらの例における精製因子は、1.19から2.02である。
【００４８】
本発明の方法を実行するためには、クロマトグラフィーカラムは必要とされず、実際的な意味で分画を行う必要もない。
【００４９】
上清および生成物相の分離前には、一回の平衡を確立することだけが必要とされ、これは一定回数のプレート（例えばカラム）を達成した後、または幾つかの環境においては非常に多くの平行を確立した後にのみ分離が達成されるクロマトグラフィー（例えばHPLC、ＳＦＣ）とは全く対照的である。
【００５０】
クロマトグラフィーにおける溶媒の交換に起因して通常生じる技術的問題（空気泡、交換体の膨潤、不均一性）は、本発明の方法では生じない。同様に、分離カラム（勾配形成）に亘る流れの問題（不均一な流れ）は生じない。同時に、より高い生成物純度を達成することができる。また、生成物純度を標的化した方法で設定することが可能である。
【００５１】
驚くべきことに、ポリ不飽和脂肪酸またはこれらポリ不飽和脂肪酸（例えばDHAEE）の誘導体は、バッチプロセスにおいて、銀負荷陽イオン交換体上での高度に選択的な方法で溶液（例えばDHAEE／DPAEE）から一段階で錯化され得ることが、本発明者によって示された。
【００５２】
この錯化は、驚くべきことに、分離すべき脂肪酸濃度、使用するイオン交換体の種類およびその量、使用する溶媒、温度、時間、並びにイオン交換体の銀負荷に依存して、非常に簡単に制御することができる。
【００５３】
これらの関係は、精製を目的とした方法で使用することができる。一定の条件を確立することによって、複雑なクロマトグラフィー工程を伴わずに、高純度のPUFAを製造することができる。
【００５４】
従って、この新規な方法は、クロマトグラフィー法ではなく、選択的抽出方法である（より高度の不飽和脂肪酸／誘導体を陽イオン交換体上に錯化し、続いて単純に攪拌された容器内においてバッチ法で脱錯化する）。
【００５５】
本発明に従って使用できる陽イオン交換体は、以下のリストの中に見出すことができる（通常の商標で記載する）：Dowex（登録商標）50 WX8、Dowex（登録商標）50 WX4、Dowex（登録商標）50 WX2、Dowex（登録商標）MWC1、Dowex（登録商標）MSC1、Dowex（登録商標）Monosphere C-350、Dowex（登録商標）CCR-2、Dowex（登録商標）DR 2030、Amberlite（登録商標）CG50、Amberlite（登録商標）IR-120、Amberlyst（登録商標）15、Bio-Rex（登録商標）70樹脂、Macherey & Nagel PS-DVB（登録商標）。特に、下記の性質を有する陽イオン交換体を使用することができる：
強い酸性陽イオン交換体：親物質としてジビニルベンゼン分枝をもったスチレンを有し、活性の銀保有基としてスルホン酸基および／またはカルボキシル基を有し、且つミクロ多孔質または好ましくはマクロ多孔質であるゲル。特に、マクロ網状イオン交換体は、溶媒安定性で且つゲルに比較して著しく大きな表面積を有しているので、特に適している。これらは同様に、官能基としてスルホン酸基および／またはカルボキシル基を有している。
【００５６】
Amberlyst（登録商標）15およびDowex（登録商標）DR 2030は、特に好ましく使用することができる。
【００５７】
本発明に従って使用可能な陽イオン交換体の負荷容量は、この場合、全PUFAの0.1〜15重量％（PUFAのｇ／H＋交換体100ｇ）の範囲である。
【００５８】
この新規な方法は、驚くほど単純な方法で、今日までの先行技術に記載された精製方法の大きな単純化および経済的向上を表す。また、この方法は、何等の問題も伴わずに、大規模且つ産業的目的で採用することが可能である。
【００５９】
また、全く驚くべきことに、溶媒を用いた後続の洗浄操作および一以上の溶媒中での後続の加熱によって、陽イオン交換体上での生成物の純度を顕著に増大することができ、且つ選択的に制御できることが認められた。
【００６０】
本発明によれば、例えば、外部熱源、電磁波照射（例えばマイクロ波もしくは赤外線照射）を使用することによって、或いは超音波処理を介して、熱供給を与えることができる。この方法に有益な如何なる熱源を使用してもよい。
【００６１】
ここでは、熱（エネルギー）の影響によって、二重結合電子が全部は錯化形態では存在しない状態の不完全に錯化した脂肪酸（これは生成物脂肪酸である可能性があるが、二次的な脂肪酸または誘導体である可能性もある）が脱錯化され、好ましくは、より高次の不飽和脂肪酸が脱錯化後に陽イオン交換体に再錯化して、遊離になった位置を占有することが疑われる。この理論に従えば、同様に脱錯化される二次的脂肪酸は、銀負荷された陽イオン交換体に副次的範囲でのみ再結合して、大部分は上清中に残留する。その結果として、当該陽イオン交換体上における生成物脂肪酸の純度は顕著に増大する。
【００６２】
従って、本発明によれば、当該脂肪酸のより大きな純度を保証するために、脂肪酸を100％銀負荷された陽イオン交換体に錯化させた後に、当該システムに熱を供給することができる。好ましくは、この工程は、温度Ｔ＞40℃および圧力Ｐ＝1バールで実行される。特に好ましくは、この工程は40℃〜80℃で行われる。より好ましくは50℃〜70℃であり、更に好ましくは55℃〜65℃である。
【００６３】
温度＞40℃が用いられるときは、錯化反応の持続は30分づつ増大させることができ、一般にはより長い反応時間はより高い生成物純度を与える。しかし、殆どの場合には2.5時間で十分であることが判明している。
【００６４】
4未満の二重結合を有するPUFAまたはPUFA誘導体の場合、脱錯化剤としてのアセトニトリルの使用は、本発明の法方においては完全に省略することができる。何故なら、
（ｉ）生理学的に安全な溶媒中で脱離が進行し、
（ｉｉ）陽イオン交換体または銀自身についての完全に新規な再生法が発生している
条件が開発されているからである。
【００６５】
PUFAまたはその誘導体の結合のために本発明に従って使用できる溶媒は、次の群から選択することができる：アルカン、ケトン、エーテル、エステル、ジケトン、ジエステル、ジエーテル、ジオール、ポリオール、ニトリル、ジニトリル、およびアルコール。特に適したケトンは、アセトンおよび2-メチルエチルケトンであり、特に適したアルコールは中鎖アルコールの2-プロパノール、プロパノール、ブタノール、ヘキサノール、またはそれらの異性体である。更に適切なものは、アルカンであるn-ヘキサン、n-ヘプタン、n-オクタン、またはそれらの異性体であり、最も適切なものはニトリルであるアセトニトリル、また短鎖アルコールのエタノールおよびメタノールである。エタノールおよびメタノールは好ましい溶媒である。
【００６６】
本発明によれば、銀は、脂肪酸をイオン交換体に結合する各工程の後に酸（例えばHNO3）または塩基（例えばNaHCO3）を加えることによって脱離させることができる。こうして、錯化された脂肪酸は同時に放出される。銀は、塩（例えばAg2CO3）として析出するか、または溶液中に残留し（例えばNaHCO3）、デカントまたは抽出によって生成物脂肪酸から分離することができる。
【００６７】
次いで、銀は、塩基の添加（先の脱離がHNO3による場合、例えばNaHCO3の添加による）または酸の添加（先の脱離がNaHCO3による場合、例えばHNO3の添加による）により、本発明に従って溶液中に戻すことができる。
【００６８】
就中、本発明に従って以下の塩基を使用することができる：水酸化物、炭酸塩および有機塩基、特に水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、好ましくはトリエチルアミン、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、特に好ましくは炭酸カリウム、炭酸水素カリウム、炭酸ナトリウムおよび炭酸水素ナトリウム。
【００６９】
就中、本発明に従って以下の酸を使用することができる：リン酸、好ましくは塩酸、蟻酸および硫酸、特に好ましくは酢酸および硝酸。
【００７０】
殆どのイオン交換材料は他の陽イオンに比較してAg＋に対する親和性が高い（Ag＋≫Na＋≫H＋）結果として、銀は当該陽イオン交換体に定量的に結合する。種々の洗浄工程の後に、当該陽イオン交換体は再使用可能である。こうして、銀の再結合は、最初の結合に比較して少なくとも90％、好ましくは少なくとも95％、特に好ましくは＞99％である。
【００７１】
本発明の方法を使用すれば、1.01〜99の精製因子を達成することができ、その場合、これら精製因子は方法に依存するが、出発混合物中の目的化合物の濃度にも依存する。従って、高い精製因子は好都合ではあるが、それでも実施例に示すように、一つの更なる二重結合の存在においてのみ相互に異なる分子を相互に分離するときには、例えば、目的脂肪酸を80％純度から90％にすることが極めて重要である可能性がある。本発明の高い収率に関して、この例における対応する精製因子は「単に」1.125にすぎないが、これは、先行技術に記載された全ての方法およびプロセス、例えばクロマトグラフィー法およびプロセスの劇的な更なる発展を意味するものである。
【００７２】
本発明の方法においては、4以上の二重結合を含むPUFAまたはPUFA誘導体の場合、完全に銀負荷された陽イオン交換体を使用することができ、該交換体からは、アセトニトリルを使用して、或いは先に述べたように陽イオン交換体またはAg＋の再生によって、PUFAが首尾よく脱離される。
【００７３】
しかし、本発明によれば、4以上の二重結合を含むPUFAまたはPUFA誘導体については、好ましくは部分的に銀負荷された陽イオン交換体を使用することもでき、この場合の脱離は、アセトニトリルの使用を伴わずに、生理学的に無害な溶媒および／または熱によって行うことができる。
【００７４】
PUFAまたはその誘導体を脱離させるために本発明に従って使用できる溶媒は、次の群から選択することができる：ケトン（例えばアセトン、2-メチルエチルケトン）、好ましくは中鎖アルコール（例えば2-プロパノール、ブタノール、プロパノール）、非常に好ましくは短鎖アルコール（例えばメタノールもしくはエタノール）、またはこれら溶媒の混合物。
【００７５】
本発明は、液体混合物中に存在する化合物の飽和度に従って、該混合物を分画するための方法に関する。飽和度は、二重結合の数に依存する。該混合物は、ポリ不飽和有機化合物、不飽和有機化合物、または飽和有機化合物を含むことができ、また無機化合物を含むこともできる。
【実施例】
【００７６】
以下、図面を参照して本発明をより詳細に説明する：
用いられる略語：
DHA      全てのcis-4,7,10,13,16,19-ドコサヘキサエン酸
DPA      全てのcis-4,7,10,13,16-ドコサペンタエン酸(ω-6)
DHAEE    全てのcis-4,7,10,13,16,19-ドコサヘキサエン酸エチルエステル
DPAEE    全てのcis-4,7,10,13,16-ドコサペンタエン酸エチルエステル(ω-6)
SFC      超臨界流体クロマトグラフィー
PUFA      ポリ不飽和脂肪酸
用いられる用語：
負荷容量
カチオン交換体の負荷容量は、PUFAまたは定義された誘導体（例えばドコサヘキサエン酸エチルエステル；DHAEE）の総量を「g」で、または陽子を付加された形（H+型）で100gのカチオン交換体に錯形成され得る「パーセント(％，w/w)」で表される。
【００７７】
本発明を以下の例を参照して説明するが、これらの例は本発明を限定すると考慮され得ない。
【００７８】
別注のない限り、以下の全ての例において、精製に用いられた基質は、約80％DHAEEおよび20％DPAEE(ω-6)の混合物であり、これは株［Schizochytrium SR21 [Yokochi et al., Optimization of docosahexaenoic acid production by Schizochytrium limacinurn SR21”, Appl. Microbiol. Biotechnol.(1998), 49： 72-76]を用いる微生物発酵から得ることができる。この発酵から得られた「Schizochytrium」油をエチルエステルにエステル交換し、尿素を用いる沈殿に供し、飽和脂肪酸を除去した。DHAEEおよびDPAEEはさらにHPLC[Yamamura, supra]により精製することができ、精製実験のための基質として用いられる。量的に有意な総量でこのエチルエステル類をもう一方から分離することは、重要な課題である。なぜなら２つの脂肪酸は二重結合の数においてのみ異なるからである。
【００７９】
例１  銀イオンを100％負荷したAmberlyst(登録商標)15(20-50メッシュ)の製造
銀負荷されたイオン交換体は、Dowex(登録商標)50WX8（旧名称Dowex(登録商標)W-HCR-W2）についての「Nieto et al.(Nieto, S.；A.M. Cordoba；J. Sanhuenzy and A. Valenzuela(1997)：Obtention of highly purified fractions of eicosapentaenoic acid and docosahexaenoic acid from sardine oil by silver-resin chromatography：A semi preparative procedure. Grasas y Aceites, 48(4), 197-199)」に記載された方法に基づいて製造される。しかし、このための方法はかなり単純化され改変された。
【００８０】
物質は加熱可能なガラス製カラム中で調製されておらず、また予め有機溶媒で洗浄もされていない。しかし本発明の新規な方法では、Nieto et al.により開示された方法とは対照的に、物質の粒径が分離および収量の優良性の決め手となる。
【００８１】
20gのAmberlyst(登録商標)15を真空フィルタ、または真空フィルタを取り付けたガラスカラム中に配置し、1M 硝酸ナトリウム溶液(NaNO3)を用いて溶出液のpHが酸性から中性に変化するまで洗浄する。中和は、ナトリウムイオンを放出するためのプロトン交換の際に形成されて硝酸の形成が低減されたことを示す。カチオン交換体がナトリウムイオンを完全に負荷される場合、溶離剤は中性のままである。
【００８２】
次いで二つの異なる手順も以下に挙げることができる。
【００８３】
銀が溶離剤中で検出できるまでナトリウム負荷されたカチオン交換体を0.4M 硝酸銀溶液を用いて洗浄するか、その物質を最初に硝酸ナトリウム溶液を用いて濯ぐことにより丸底フラスコまたは円錐フラスコ中に移送する。次いで過剰な硝酸ナトリウム溶液を捨てる。その後、5.4mLの0.4M 硝酸銀溶液／Amberlyst(登録商標)15を8〜12時間撹する。上清を除去する。双方の場合において、Ag+負荷されたカチオン交換体を用いる手順は以下の通りである。
【００８４】
銀負荷されたカチオン交換体（約2.0mmolのAg+／H+交換体のmL，ここで1gのH+Dowex は約0.9mLのH+Dowexと等価である）を100mLの水を用いて３回洗浄して銀を除去し、次いで100mLのエタノールを用いて２回洗浄して水を除去する（１時間）。次いで100mLのアセトニトリル中で一晩（12時間）放置する。次いで各回毎に100mLのエタノールを用いて物質を２回洗浄し、該物質を使用することが可能となる。アセトニトリルもまた、100mLのエタノールを３回使用することにより置換できる。
【００８５】
異なる洗浄手段または活性化手順は、活性の弱い、または不活性な銀負荷されたカチオン交換をもたらし得る。銀負荷されたカチオン交換体中の水分含有量はここでは特に重要である。
【００８６】
例２  部分的に50％にまで銀イオン負荷されたAmberlyst(登録商標)15(20-50メッシュ)イオン交換体の製造
部分的に銀負荷されたAmberlyst(登録商標)物質は、カチオン交換体への銀の均一な分布を可能にするために撹拌することをもって調製される。50％銀負荷されたAmberlyst(登録商標)15物質は、2.7mLの0.4M 硝酸銀溶液／Amberlyst(登録商標)15のを8〜12時間添加することにより調製される。このバッチを12時間撹拌する。次いで上清をデカント分離し、銀負荷されたカチオン交換体を、二度蒸留した水を用いて３回洗浄する。次いで物質を100mLのエタノールを用いて２回洗浄し（各回１時間）、100mLのアセトニトリル（12時間）を用いて１回洗浄する。アセトニトリルはエタノールを複数回使用することにより置換できる。最終的には物質をエタノール中に取り出して使用する。同様に、0.1〜99.9％(100％銀負荷に基づく)銀負荷の物質を調製できる。
【００８７】
種々の脱離のプロトコール（図１）
変型例Ａ
π-電子供与体を用いるAg+交換体からの生成物の脱離
銀負荷されたカチオン交換体から生成物エステルを脱離できる溶媒は、交換体物質、銀負荷、および結合された脂肪酸エチルエステル（二重結合の数）により選択されなければならない。理想的な場合においては、π-電子供与体と同様に作用するような溶媒を使用できる。例としてアセトニトリル、1-ヘキセンまたはトルエンがある。
【００８８】
例えば結合したDHAEEは、銀負荷されたカチオン交換体から、最も単純な方法ではアセトニトリル(ACN)を添加することにより分離することが可能である。この場合アセトニトリルはPUFAよりも強力なπ-電子供与体である。
【００８９】
このため、100mLのACNをバッチに添加し、混合物を保護ガス下で室温で撹拌する。脂肪酸エチルエステルを完全に脱離した後、有機相を除去する。交換体物質をACNを用いて再び洗浄し、有機相を合体させる。溶媒を除去した後、精製されたDHAEEを僅かに黄色の油状物で得る。列挙した全ての例において、このために比較的少量のアセトニトリル、例えばn-ヘキサン中のアセトニトリルの混合物(10：90，v：v)で充分である。
【００９０】
下記の例３〜９は、交換体から複合脂肪酸を脱離するためにACNを用いる方法の例である。
【００９１】
例３  DHAEEおよびDPAEEの混合物を、エタノール中で24時間にわたり、Ag+ Amberlyst(登録商標)15(20-50メッシュ)に実験的に結合させる：
予備的実験では、交換体のPUFA負荷容量はPUFAの約5％重量（PUFAのg／100gのH+交換体）であることが見出された。
【００９２】
597.8mgのドコサヘキサエン酸エチルエステル(DHAEE)および144.0mgのドコサペンタエン酸エチルエステル(ω-6 DPAEE)を、100mLの無水エタノール中の例１からの100％ 銀負荷の交換体(10gのH+ Amberlyst(登録商標)15)の撹拌した溶液に添加した。この懸濁液を100rpmで24時室温で保護ガス下にて振とうする。PUFAの酸化を避けるために酸化防止剤をさらに添加してもよい（例えばトコフェロール、2,6-ジ-tert-ブチル-4-メチルフェノール(BHT)、アスコルビン酸パルミテート）。
【００９３】
30分または60分経過後のそれぞれの場合で、上清をガスクロマトグラフィにより分析することにより、反応物を量的かつ質的に評価する［HPGC689O，カラム：Macherey & Nagel FFAP Permabond 0.1μm(25m，0.25mm)，分配(10：1)、キャリアガス：ヘリウム(一定の流速1.0mL/分)，水素(30mL/分)および酸素(300mL/分)を燃料ガスとして用いるFID操作、作製：20mLのヘリウム，検出器および注入器の温度：それぞれの場合で255℃、GC炉温度プログラム：初期温度180℃、昇温速度10℃/分で最終温度230℃まで，このまま５分間保持、注入体積：1.0μL］。銀負荷されたカチオン交換に結合しない内部基準（例えば飽和脂肪酸または飽和脂肪酸のエステル、またはもう一方の誘導体）を反応バッチに添加することにより、上清中のポリ不飽和脂肪酸の量的分析を実施できる。
【００９４】
この場合、交換体の理論的な負荷は、用いられた全ての脂肪酸エチルエステルから上清中に残留する脂肪酸エチルエステルを減じることにより計算できる。生成物の純度は同様にこの方法により測定される（表１）。
【００９５】
この場合、実質的に全てのDHAEE(86.7％)が交換体上に錯形成される。DHAEEの純度は80％から実質的に91％に増大する。この錯形成反応はたった数時間後に完了する。
【００９６】
イオン交換体にPUFAが完全に負荷され（もはやさらなる結合が観察されない）、または所望の純度（例えばDHAEE＞90％）に達した際に、上清を除去し、イオン交換体物質を100mLのエタノールを用いて１回洗浄し、非結合脂肪酸エチルエステルの残渣から遊離させる。反応が完了した後、結合生成物脂肪酸のエチルエステルを銀負荷されたカチオン交換体から様々な方法により脱離することができる。
【００９７】
最も単純には、100mLのアセトニトリルとともに７時間保護ガス下にて撹拌することによりDHAEEを脱離させることができる。そのためには、エタノールまたはn-ヘキサン中のアセトニトリルの10％濃度の混合物だけで充分である。溶媒を除去した後、482.6mgの精製DHAEEを88.4％の純度で分離する。この値は表１から計算された値とよく一致する。DHAEEの収率は81％である。よって交換体の生成物負荷は4.8％（DHAEEのg／100gのH+交換体)である。上清から溶媒を除去した後、さらに66.4mgのDHAEEを分離した。全体のDHAEE回収率は92％である。
【００９８】
表１：DHAEEおよびDPAEEの混合物の、Ag+ Amberlyst(登録商標)15への結合の結果
【表１】
0004447906.tif 000002
【００９９】
例４  DHAEEおよびDPAEEの混合物を、エタノール中で210分にわたり、Ag+ Amberlyst(登録商標)15(20-50メッシュ)に実験的に結合させる：
このために、0.585gのドコサヘキサエン酸エチルエステル(DHAEE)および0.146gのドコサペンタエン酸エチルエステル(ω-6 DPAEE)の混合物を、100mLの無水エタノール中の100％ 銀-被覆された交換体（10gのH+ Amberlyst(登録商標)15と等価）の撹拌溶液に添加する。この懸濁液を保護ガス下にて100rpmで210分26℃で振とうする。この時間が示された時点で上清をガスクロマトグラフィにより分析した。
【０１００】
この方法により同様に生成物の純度および収率を測定できる（表２）。
【０１０１】
Dowex(登録商標)50WX8 200-400メッシュ（例６，表４）を用いた実験的結合と比較して、反応時間のかなりの減少、およびDHAEE負荷の1.2％（DHAEEのg／100gのH+Dowex 50WX8）から4.6％（DHAEEのg／100gのH+ Amberlyst(登録商標)）への著しい増大が観察された。DHAEEの純度は80％から92.9％を超える増大を示した。92.9％純度のDHAEEの収率は77.9％である。Dowex(登録商標)50WX8 シリーズ(20-40メッシュ)からの比較交換体（粒径）は、いかなるDHAEE負荷容量も示さず、よって純度への効果も示さない。
【０１０２】
表２：DHAEEおよびDPAEEの混合物の、Ag+ Amberlyst(登録商標)15(20-50メッシュ)への結合の結果
【表２】
0004447906.tif 000003
【０１０３】
例５  DHAEEおよびDPAEEの混合物を、n-ヘキサン中で、Ag+ Amberlyst(登録商標)15(20-50メッシュ)に実験的に結合させる：
このために、585.1mgのドコサヘキサエン酸エチルエステル(DHAEE)および146.0mgのドコサペンタエン酸エチルエステル(ω-6 DPAEE)を、100mLのn-ヘキサン中の完全に銀負荷された交換体(9.3gのH+ Amberlyst(登録商標)15)の撹拌溶液に添加する。この懸濁液を100rpmで3.5時間室温で保護ガス下にて振とうする。
【０１０４】
30分または60分経過後の各場合において、上清をガスクロマトグラフィにより分析することにより、反応物を量的かつ質的に評価する。交換体の論理的負荷は減法により計算できる。このような方法で同様に生成物の純度を測定できる（表３）。
【０１０５】
DHAEEの純度は80％から94.5％を超えるにまで増大した。添加は実質的にたった数分後に完了する。交換体へのDHAEEの負荷は4.4％のDHAEE／100gのH+交換体である。94.5％純度のDHAEEの収率は74.6％である。
【０１０６】
上清を除去し、カチオン交換物質を100mLのn-ヘキサンを用いて１回洗浄し、非結合脂肪酸エチルエステルの残渣から遊離させる。反応が完了した後、様々な方法により結合生成物の脂肪酸エチルエステルを銀負荷されたカチオン交換から脱離することができる。
【０１０７】
最も単純には、７時間保護ガス下にて100mLのアセトニトリルとともに撹拌することによりDHAEEを脱離できる。しかし純粋アセトニトリルのかわりに、n-ヘキサン中のアセトニトリルの10％濃度の混合物だけを用いても可能であり、理想的な結果を達成する。
【０１０８】
表３：DHAEEおよびDPAEEの混合物の、Ag+ Amberlyst(登録商標)15への結合の結果
【表３】
0004447906.tif 000004
【０１０９】
例６  DHAEEおよびDPAEEの混合物を、n-ヘキサン中で上昇温度にて、Ag+ Amberlyst(登録商標)15に実験的に結合させる：
このために、1.18gのドコサヘキサエン酸エチルエステル(DHAEE)および0.29gのドコサペンタエン酸エチルエステル(ω-6 DPAEE)を、100mLのn-ヘキサン中の完全に銀負荷された交換体(9.3gのH+ Amberlyst(登録商標))の撹拌溶液に添加する。この懸濁液を保護ガス下にて100rpmで室温にて２時間55℃で振とうする。適切ならば、PUFAの酸化を防ぐために抗酸化剤をさらに添加することができる（例えばトコフェロール、アスコルビン酸パルミテート）。
【０１１０】
30分または60分経過後のそれぞれの場合で、上清をガスクロマトグラフィにより分析することにより反応物を量的かつ質的に評価する。ここで交換体の論理的負荷は減法により計算できる。同様に、この方法で生成物の純度を測定できる（表４）。
【０１１１】
DHAEEの純度は79％から97.9％に増大した。結合はたった数分で完了する。交換体へのDHAEEの負荷は5.5％である（DHAEEのg／100gのH+交換体）。DHAEE収率は47.1％である。
【０１１２】
表４：DHAEEおよびDPAEEの混合物の、55℃でのAg+ Amberlyst(登録商標)15への結合の結果
【表４】
0004447906.tif 000005
【０１１３】
例７  DHAEEおよびDPAEEの混合物を、Ag+Dowex(登録商標)50WX8(200-400)メッシュに実験的に結合させる：
用いられた交換体物質のメッシュサイズの、分離への影響を立証するための研究も行われた。
【０１１４】
このために、291.4mgのドコサヘキサエン酸エチルエステル(DHAEE)および72.7mgのドコサペンタエン酸エチルエステル(ω-6 DPAEE)を、100mLの無水エタノール中の完全に銀負荷された交換体(21gのH+Dowex(登録商標)50WX8，200-400メッシュ)の撹拌溶液に添加する。この懸濁液を室温で保護ガス下にて24時間300rpmで磁気撹拌器を用いて撹拌する。
【０１１５】
30分または60分経過後のそれぞれの場合で、上清をガスクロマトグラフィにより分析することにより反応物を量的かつ質的に評価する。ここで交換体の論理的負荷を減法により計算できる。このような方法で同様に生成物の純度を測定できる（表５）。
【０１１６】
DHAEEの純度は80％から91.7％へ増大した。結合は46時間後に完了する。交換体へのDHAEEの負荷は1.2％（DHAEEのg／100gのH+交換体）である。91.7％純度DHAEEの収率は83.7％である
これとは対照的に、完全に銀負荷されたDowex(登録商標)50WX8 100-200メッシュ物質に負荷されたDHAEEは1.1％（DHAEEのg／100gのH+交換体）であり、完全に銀負荷されたDowex(登録商標)50WX8 20-40メッシュ物質に負荷された場合は、実質的に０％DHAEE／H+交換体である。よってここでは、交換体物質の粒径への明らかな依存が見出される。
【０１１７】
表５：DHAEEおよびDPAEEの混合物の、Ag+ Dwex(登録商標)50 WX8（200-400メッシュ）への結合の結果
【表５】
0004447906.tif 000006
【０１１８】
例８  Ag+Dowex(登録商標)50WX8にDHAEEおよびDPAEEの混合物を実験的に結合させ、その後に温度変化(shift)により濃縮する：
このために、116.7mgのドコサヘキサエン酸エチルエステル(DHAEE)および29.2mgのドコサペンタエン酸エチルエステル(ω-6 DPAEE)を、200mLの無水エタノール中の完全に銀負荷された交換体(25gのH+Dowex(登録商標)50WX8，100-200メッシュ)の撹拌溶液に添加する。この懸濁液を室温で保護ガス下にて24時間300rpmで、磁気撹拌器を用いて撹拌する。適切ならば、PUFAの酸化を防ぐために酸化防止剤（例えばトコフェロール、アスコルビン酸パルミテート）をさらに添加できる。
【０１１９】
30分または60分経過後のそれぞれの場合で、上清をガスクロマトグラフィにより分析することにより反応物を量的かつ質的に評価する。交換体の論理的負荷量を減法により計算できる。このような方法で同様に生成物の純度を測定できる（表６）。
【０１２０】
DHAEEの純度は80％から92.8％を超えるにまで増大した。結合は24時間後に完了する。DHAEEの交換体への負荷は0.40％（DHAEEのg／100gのH+交換体)である。
【０１２１】
PUFA負荷されたカチオン交換体を100mLの溶媒（例えばエタノール）を用いて洗浄し、次いでこれを溶媒（例えばエタノール，アセトン）中で加熱することにより、銀負荷されたカチオン交換体上のDHAEEの純度はさらに増大する。ここで用いた温度領域は50℃〜80℃である（表７）。
【０１２２】
表６：DHAEEおよびDPAEEの混合物の、Ag+Dowex(登録商標)50 WX8への結合の結果
【表６】
0004447906.tif 000007
【０１２３】
表７： 上清（エタノール）中のDKAEEおよびDPAEEの純度の、異なる温度にまで加熱する間の経過
【表７】
0004447906.tif 000008
【０１２４】
このために、パイレックスチューブ（パイレックスホウケイ酸塩ガラスチューブ16x100 mm, Merck Eurolab, Darmstadt）に、1.21％DHAEE（DHAEEのg／100gのH+Dowex）を負荷されたAg-Dowex(登録商標)50 WX8(200-400メッシュ）を各回毎に1mL充填し、2mLのエタノールを混合し、振動ミキサで混合する。次いでこのチューブを60℃，70℃および80℃)にまで加熱し、上清をガスクロマトグラフィにより分析する。Dowex上のDHAEEの実験開始時の純度は92.3％（Dowex(登録商標)50 WX8，200-400メッシュ）であった。2.5時間後、冷却し、上清を除去し、2mLのエタノールを用いて１回洗浄する。次いで2mLのACNを用いてDowexからDHAEEを３時間、脱錯化させる(decomplexed)。
【０１２５】
ACN相のガスクロマトグラフィ分析は、全ての実験において、銀負荷されたカチオン交換体上のDHAEEの濃度(enrichment)が約95％に至ることを示す。
【０１２６】
多くの場合、アセトニトリルによる生成物の脱離は望ましくないため、有毒な溶媒の使用を避けることができ、または完全に除外できる他の方法が開発された。これらの方法を以下に説明する。
【０１２７】
変型例Ｃ  ACNを用いずにAg+交換体から生成物を脱離する（図１）
＜４つの二重結合を有するPUFAを用いて錯形成する場合、同時に温度上昇させずに、または上昇させながら（例えば熱交換体、加熱槽、マイクロウェーブ、サーマルブロック）、極性溶媒（例えばn-ヘキサンのような非極性溶媒中での結合の場合はエタノール）を添加するだけで、ACNを用いることなく100％銀負荷されたカチオン交換体からPUFAを首尾よく脱離できる。
【０１２８】
一般的に、この温度は用いる溶媒の沸点をちょうど下回る。PUFAが非常に強力に錯形成されるならば、銀を100％負荷されていないカチオン交換体を使用でき、よってPUFAを強力に錯形成することはできない。多くの場合、温度上昇を伴わずに上記の溶媒の一つを用いるだけで、PUFAの分離除去は成功する。
【０１２９】
例９  DHAEEおよびDPAEEの混合物を、30％部分的に銀負荷されたAg+ Amberlyst(登録商標)15(20-50メッシュ)に実験的に結合させる：
このために、0.63gのドコサヘキサエン酸エチルエステル(DHAEE)および0.17gのドコサペンタエン酸エチルエステル(ω-6 DPAEE)の混合物を、100mLのn-ヘキサン中の30％銀負荷された交換体(10gのH+ Amberlyst(登録商標)15)の撹拌溶液中に添加する。この懸濁液を保護ガス下にて26℃で60分100rpmで振とうする。同様にこのような手法で生成物の純度を測定できる（表８）。
【０１３０】
DHAEEの純度は80％から90.5％に増大した。結合は数分後に完了する。交換体のDHAEE負荷は2.1％（DHAEEのg／100gのH+交換体)である。表からの論理的収率は90.5％純度DHAEEの32.5％である。
【０１３１】
生成物の脱離：ヘキサン相を非結合生成物とともに除去した後、100mLのエタノールを交換体に添加し、この混合物を30分室温で撹拌し、エタノール相を除去する。この相から、予め176.3mgのDHAEE（純度87.6％面積）を分離してよい。次いでこの交換体をさらに100mLのエタノールとともに70℃で１時間300rpmで撹拌する。この相から、さらに51.6mgのDHAEE（94.5％面積）を分離できる。しかしエタノール相の分画は必要ない。分離したヘキサン相から、ヘキサンを除去した後、379.9mgのDHAEEを再び分離する。結合DHAEEの回収率は96％を上回る。合体したエタノール抽出物は227.9mgのDHAEEを89.2％(面積)の純度でもたらす。DHAEEの収率は32％である。
【０１３２】
表８  DHAEEおよびDPAEEの混合物の、部分的に銀負荷されたAg+ Amberlyst(登録商標)15(20-50メッシュ)への結合の結果
【表８】
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【０１３３】
変型例Ｂ  脂肪酸エチルエステルの同時放出を利用してカチオン交換体から銀を脱離させる（図１および３）
例10  脂肪酸エチルエステルの再生脱離
Ag+Dowex(登録商標)からDHAEEを脱離させる際にアセトニトリルの使用を避けるために、図２に示す工程を用いることができる。
【０１３４】
反応物からエタノール性の上清を分離除去した後、過剰な0.4M 硝酸ナトリウム溶液(NaNO3)を用いて銀負荷されたカチオン交換を洗浄し銀を除去する。これは丸底フラスコ（バッチ）またはガラスカラムにおいて（連続して）実施できる。同時に、DHAEEをカチオン交換から放出させ、水相から油相としてデカント分離することができる。DHAEEを脱離させるために、ここで全ての銀を浸出脱離(leach off)させる必要はない。しかし実際には、完全なる脱離が最も簡便な方法である。
【０１３５】
生成物を分離除去した後、炭酸塩溶液(例えばNa2CO3，K2CO3 またはNaHCO3)を用いて銀を析出(precipitated out)させる。形成された炭酸銀(例えばAg2CO3)は、黄色の沈殿物として析出し、非常に簡単な方法で上清から濾過除去できる。次いでこの炭酸銀を化学量論的量の硝酸(HNO3)を含む溶液に中に添加する。この溶液は銀を再び結合させるのに直接用いることができる。
【０１３６】
交換体の銀負荷は、初期負荷にあたる。交換体の選択性は完全に維持される。
【０１３７】
この手法により、DHAEEの脱離および分離は溶媒なしで行うことが可能であり、とりわけ食品への適用に多大に好都合である。
【図面の簡単な説明】
【０１３８】
【図１】図１は、使用可能な溶媒に従ったAg+イオン交換体からの選択的抽出によりPUFAを精製する原理を示す説明図である。
【図２】図２は、本発明によるAg+イオン交換体上の脂肪酸エチルエステルの錯形成を示す説明図である
【図３】図３は、本発明による銀の再生工程を示す説明図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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