(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
IgGクラスの治療用抗体又は治療用抗原結合性抗体フラグメントの免疫原性又は毒性を抑制する方法であって、
トウモロコシに由来する植物宿主系において、治療用ヒト化IgG抗体又は治療用ヒト化抗原結合性抗体フラグメントをコードする核酸を含んでなるヌクレオチド配列を発現させる段階を含んでなるとともに、
前記植物宿主系が、免疫原性又は毒性の抑制された治療用ヒト化IgG抗体又は治療用ヒト化抗原結合性抗体フラグメントを発現するよう、哺乳動物宿主系とは異なるようにタンパク質のＮ結合グリコシル化を改質するものである、方法。
【請求項２】
前記発現段階の前に、植物宿主系を、哺乳動物宿主系とは異なるようにタンパク質のＮ結合グリコシル化を改質するという特徴について選別にかける段階を含んでなり、これによって免疫原性又は毒性の抑制された糖タンパクを産生する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記植物宿主系が更に前記治療用ヒト化抗体又は治療用ヒト化抗体フラグメントをＯ結合グリコシル化しないものである、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記核酸がＮ結合グリコシル化を防ぐために突然変異されている、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
IgGクラスの診断用抗体又は診断用抗原結合性抗体フラグメントの免疫原性又は毒性を抑制する方法であって、
トウモロコシに由来する植物宿主系において、診断用ヒト化IgG抗体又は診断用ヒト化抗原結合性抗体フラグメントをコードする核酸を含んでなるヌクレオチド配列を発現させる段階を含んでなるとともに、
前記植物宿主系が、免疫原性又は毒性の抑制された診断用ヒト化IgG抗体又は診断用ヒト化抗原結合性抗体フラグメントを発現するよう、哺乳動物宿主系とは異なるようにタンパク質のＮ結合グリコシル化を改質するものである、方法。
【請求項６】
前記発現段階の前に、植物宿主系を、哺乳動物宿主系とは異なるようにタンパク質のＮ結合グリコシル化を改質するという特徴について選別にかける段階を含んでなり、これによって免疫原性又は毒性の抑制された糖タンパクを産生する、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記植物宿主系が更に前記診断用ヒト化抗体又は診断用ヒト化抗体フラグメントをＯ結合グリコシル化しないものである、請求項５又は６記載の方法。
【請求項８】
前記核酸がＮ結合グリコシル化を防ぐために突然変異されている、請求項５〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
前記植物宿主系が、哺乳動物宿主系で発現された抗体と比較して、補体媒介細胞障害（Ｃ’ＭＣ）が消失又は低減された治療用ヒト化IgG抗体又は治療用ヒト化抗原結合性抗体フラグメントを発現するよう、哺乳動物宿主系とは異なるようにタンパク質のＮ結合グリコシル化を改質するものである、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記植物宿主系が、哺乳動物宿主系で発現された抗体と比較して、補体媒介細胞障害（Ｃ’ＭＣ）が消失又は低減された治療用ヒト化IgG抗体又は治療用ヒト化抗原結合性抗体フラグメントを発現するよう、哺乳動物宿主系とは異なるようにタンパク質のＮ結合グリコシル化を改質するものである、請求項５記載の方法。
【請求項１１】
IgGクラスの治療用抗体又は治療用抗原結合性抗体フラグメントの免疫原性又は毒性を抑制する方法であって、
治療用ヒト化IgG抗体又は治療用ヒト化抗原結合性抗体フラグメントのＮ結合グリコシル化を、哺乳動物宿主系とは異なるように改質する、トウモロコシに由来する植物宿主系を提供する段階と、
前記植物宿主系において、治療用ヒト化IgG抗体又は治療用ヒト化抗原結合性抗体フラグメントをコードする核酸を含んでなるヌクレオチド配列を発現させることにより、免疫原性又は毒性が低減されたヌクレオチド配列を産生する段階を含んでなる、方法。
【請求項１２】
IgGクラスの診断用抗体又は診断用抗原結合性抗体フラグメントの免疫原性又は毒性を抑制する方法であって、
診断用ヒト化IgG抗体又は診断用ヒト化抗原結合性抗体フラグメントのＮ結合グリコシル化を、哺乳動物宿主系とは異なるように改質する、トウモロコシに由来する植物宿主系を提供する段階と、
前記植物宿主系において、診断用ヒト化IgG抗体又は診断用ヒト化抗原結合性抗体フラグメントをコードする核酸を含んでなるヌクレオチド配列を発現させることにより、免疫原性又は毒性が低減されたヌクレオチド配列を産生する段階を含んでなる、方法。
【請求項１３】
前記植物宿主系が、哺乳動物宿主系で発現された対応する抗体と比較して、補体媒介細胞障害（Ｃ’ＭＣ）が消失又は低減された治療若しくは診断用ヒト化IgG抗体又は治療若しくは診断用ヒト化抗原結合性抗体フラグメントを発現するよう、ヒト化IgG抗体又はヒト化抗原結合性抗体フラグメントのＮ結合グリコシル化を哺乳動物宿主系とは異なるように改質するものである、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
IgGクラスの治療用抗体又は治療用抗原結合性抗体フラグメントの免疫原性又は毒性を抑制する方法であって、
哺乳動物宿主系で発現された対応する抗体と比較して、補体媒介細胞障害（Ｃ’ＭＣ）が消失又は低減されたヒト化IgG抗体又はヒト化抗原結合性抗体フラグメントを発現するよう、治療用ヒト化IgG抗体又は治療用ヒト化抗原結合性抗体フラグメントのＮ結合グリコシル化を哺乳動物宿主系とは異なるように改質する、トウモロコシに由来する植物宿主系を提供する段階と、
前記植物宿主系において、治療用ヒト化IgG抗体又は治療用ヒト化抗原結合性抗体フラグメントをコードする核酸を含んでなるヌクレオチド配列を発現させる段階と、
発現された治療用ヒト化IgG抗体又は治療用ヒト化抗原結合性抗体フラグメントを単離する段階を含んでなる、方法。
【請求項１５】
IgGクラスの診断用抗体又は診断用抗原結合性抗体フラグメントの免疫原性又は毒性を抑制する方法であって、
哺乳動物宿主系で発現された対応する抗体と比較して、補体媒介細胞障害（Ｃ’ＭＣ）が消失又は低減されたヒト化IgG抗体又はヒト化抗原結合性抗体フラグメントを発現するよう、診断用ヒト化IgG抗体又は診断用ヒト化抗原結合性抗体フラグメントのＮ結合グリコシル化を哺乳動物宿主系とは異なるように改質する、トウモロコシに由来する植物宿主系を提供する段階と、
前記植物宿主系において、診断用ヒト化IgG抗体又は診断用ヒト化抗原結合性抗体フラグメントをコードする核酸を含んでなるヌクレオチド配列を発現させる段階と、
発現された診断用ヒト化IgG抗体又は診断用ヒト化抗原結合性抗体フラグメントを単離する段階とを含んでなる、方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明はキメラ抗体NR-LU-13又は同一もしくは類似の結合特異性を有するその他の抗体に由来するヒト化抗体、そのフラグメント（例えば、可変領域及びscFv等）、かかるヒト化抗体又はフラグメントを含むコンジュゲート（融合タンパク質等）、並びに診断及び治療的プレターゲッティング方法及び組成物におけるかかるヒト化抗体又はフラグメントの利用に関する。本発明は更に例えば腫瘍の処置及びイメージングのための慣用の免疫治療及び免疫診断方法及び組成物におけるかかるヒト化抗体の利用に関する。
発明の背景
有効なターゲッティング成分であると既に開示されている特異的な抗体はNR-LU-10、即ち、ヒト癌抗原に対して産生されたネズミモノクローナル抗体である。NR-LU-10はほとんどの癌腫において発現される約40キロダルトンの糖タンパク質抗原を認識する見かけ上150キロダルトンの分子量のネズミIgG2b汎癌腫（pancarcinoma）モノクローナル抗体である。NR-LU-10はヒト臨床試験において数百人の患者に安全に投与されている。しかしながら、その欠点はそれがネズミに由来するモノクローナル抗体である点にある。これはその抗体を繰り返し投与した場合に免疫原性がターゲッティング効能を潜在的に下げることがあるため不利である。治療効能は一回の投与を利用して得られうるが、複数回の投与プロトコールが現状好まれている。
ネズミ抗体の免疫原性を抑制する手段として、様々な方法が論文の中に報告されている。かかる方法にはネズミ可変性領域及びヒト定常領域を含むキメラ抗体の製造、ネズミ抗体に由来する可変結合性配列を含んで成る一本鎖抗体の製造、そのサイズの小ささを理由に免疫原性が潜在的に弱いネズミ抗体の抗原結合性フラグメントの製造、ヒトモノクローナル抗体の製造、並びに「ヒト化」抗体の製造が挙げられる。
ネズミモノクローナル抗体は例えばネズミFv領域（即ち、抗原結合性部位を含む）又はその相補性決定領域をコードするヌクレオチド配列をヒト定常領域配列（抗体のFc領域に含まれている）をコードするヌクレオチド配列と遺伝子組換させることにより一層ヒト様にすることができうる。これらの抗体は典型的にはキメラ抗体と呼ばれている。
これに関連して、NR-LU-13と呼ばれているNR-LU-10に由来するキメラ抗体が過去に報告されている。この抗体はNR-LU-10のネズミFv領域を含み、それ故NR-LU-10と同じ結合特異性を含んで成る。従って、このキメラ抗体はNR-LU-10抗原に結合する。
ヒト化は理想的には非免疫原性であり、親非ヒト抗体分子の抗原結合特性を完璧に残した抗体を提供する。非免疫原性は有害な免疫原性反応なく複数回の投与を可能にする。ヒト化抗体を製造するための様々な方法が論文の中に報告されている。例えば、ヒト化抗体は：（ａ）非ヒトCDRのみをヒトフレームワーク及び定常領域にグラフトさせることにより（Jonesら、Nature 321: 522-25（1986）; Verhoeyenら、Science 239: 1534-1536（1988））；又は（ｂ）非ヒト可変ドメイン全体を移植し（リガンド結合特性を残すため）、しかも免疫原性を抑えるために露出残基の置換によりそれらにヒト様表層を「着せる」ことにより（「ベニア貼り」抗体（veneered antibodies）とも呼ばれている）（Padlan，Molec.Immun．28: 489-498（1991）; Padlan，Molec.Immun．31（3）: 169-217（1994））、潜在的に製造されうる。
報告によれば、ヒト可変領域フレームワークドメイン内でのネズミ残基の保持は得られるヒト抗体の適正な結合機能の保持に役立つ。ヒト化抗体は宿主受容者における抗体の免疫原性を潜在的に弱める又は消失させることが報告されており、それ故生物有用性を高め、且つ有害な免疫反応の可能性を抑え、従って複数回の抗体投与を潜在的に可能にする。また、所望の結合特異性を有する抗体に由来するscFv並びに抗体フラグメント、例えばFv，Fd，Fab，Fab′及びF（ab）′2フラグメントは、インタクト抗体よりも弱い免疫原性を有するターゲッティング成分を製造するためのその他の公知の手段を構成する。本質的に、一本鎖抗体及び抗体フラグメントは、その小さいサイズを理由に、インタクト抗体よりも免疫原性が弱いことがある。
組換タンパク質、例えば抗体は発現のために用いる種々の宿主細胞において様々にグリコシル化されることも知られている。本質的に、異なる宿主細胞はグリコシル化部位又はグリコシル化モチーフと呼ばれているタンパク質上の特定の部位をグリコシル化する点で特徴的な態様を有する。
例えば、植物細胞は主にＯ−結合グリコシル化によりタンパク質をグリコシル化し、一方動物細胞は典型的にはＮ−結合及びＯ−結合グリコシル化によりタンパク質をグリコシル化する。また、特異的な炭水化物及びグリコシル化パターンは特定の宿主に依存して変わる。
論文の中で、オリゴ糖はタンパク質を特異的な部位へとターゲッティングする限りにおいて有意義でありうると報告されている。更に、炭水化物は免疫原性応答を誘導しうることも知られている。従って、外来宿主細胞において発現されるタンパク質は、発現のために利用される宿主細胞により導入される炭水化物残基を理由に免疫原応答を誘導しうる可能性がある。例えば、植物細胞において発現される哺乳動物タンパク質は、植物細胞が哺乳細胞とは著しく異なるようにタンパク質をグリコシル化するため、免疫原となりうる可能性がある。
抗体NR-LU-13の結合した抗原に結合するネズミ又はキメラ抗体の免疫原性に関連する困難性により、改善された組成物及び方法についての当業界におけるニーズがある。本発明はこのニーズを満たし、またその他の関連の利点を供する。
発明の概要
本発明の目的はNR-LU-13に由来する（又はNR-LU-13の結合した抗原に結合するその他の非ヒト抗体に由来する）ヒト化抗体、又はかかるヒト化抗体のフラグメントであって、ヒトにおいて抑制された免疫原性又は毒性を示し、しかもNR-LU-13抗原に対する結合能力を保持しているものの提供にある。
本発明の別の目的はNR-LU-13に由来するもしくはその他の非ヒト抗体に由来するヒト化抗体又はそのフラグメントであってNR-LU-13の結合した抗原に結合するものを含むコンジュゲートの提供にある。
本発明の更なる別の目的は改善された二段階プレターゲッティング方法の提供にあり、ここでその改善はターゲッティング成分としてNR-LU-13の結合した抗原に結合するNR-LU-13に由来するもしくは別の非ヒト抗体に由来するヒト化抗体又はそのフラグメントを利用することを含んで成る。
本発明の別の目的は改善された三段階ターゲッティング方法の提供にあり、ここでその改善はターゲッティング成分として、NR-LU-13の結合した抗原は結合するNR-LU-13に由来するもしくは別の非ヒト抗体に由来するヒト化抗体又はそのフラグメントを利用することを含んで成る。
本発明の更なる別の目的はNR-LU-13の結合した抗原に結合するNR-LU-13に由来するもしくは別の非ヒト抗体に由来するヒト化抗体又はそのフラグメントを含んで成るコンジュゲートを含む処置又は診断用組成物の提供にある。
本発明のより特異的な目的はNR-LU-13の結合した抗原に結合することのできるNR-LU-13に由来するヒト化抗体又はそのフラグメントを、リガンド又は抗リガンドパートナーの構成員、好ましくはアビジンもしくはストレプトアビジン、又はビオチンに結合することのできるフラグメントもしくは誘導体に直接又は間接的に付加されて含んで成るコンジュゲートを提供することにある。
本発明の別の目的は癌の処置又は診断の方法において利用するための、NR-LU-13の結合した抗原に結合するNR-LU-13に由来するヒト化抗体又はそのフラグメントを含んで成るコンジュゲートの提供にある。
本発明の更に特異的な目的はNR-LU-13の結合した抗原に結合する本明細書においてヒト化NRX451と呼ぶNR-LU-13に由来する特異的なヒト化可変重及び軽鎖配列又はそれらのフラグメントを製造することにある。
本発明の別の特異的な目的はNR-LU-13の結合した抗原に結合するヒト化NRX451又はそのフラグメントを利用して癌を処置又は診断するための組成物の提供にある。
本発明の別の目的は、抗体、詳しくは１又は複数の潜在的なグリコシル化部位が消失され、それ故免疫原性又は毒性が抑制されるように突然変異されたネズミ、キメラ又はヒト化抗体の製造にある。
本発明の別の目的は抗体、好ましくはＮ−結合グリコシル化を消失させるように突然変異された又はＮ−結合グリコシル化を抑制するように改質されたヒト抗体のプレターゲッティング方法及び慣用の抗体療法における利用にある。
かくして、本発明はヒト化抗体又は抗原結合性ヒト化抗体フラグメントを提供し、ここで当該抗体又は抗体フラグメントは抗体NR-LU-13の結合した抗原に特異的に結合し、そして好ましくは当該抗体又は抗体フラグメントはＮ−結合グリコシル化を有さないか、又はそのＮ−結合グリコシル化が免疫原性もしくは毒性を抑制するために発現後に改質されている。本発明は更にIgGクラスの抗体又は抗原結合性抗体フラグメントの免疫原性又は毒性を抑制する方法であって、（ａ）抗体又は抗体フラグメントをＮ−結合グリコシル化しないという特徴について宿主系を選別する；そして（ｂ）当該宿主系においてIgG抗体又は抗原結合性抗体フラグメントをコードする核酸（例えば、DNAもしくはRNA又は機能的均等物）を含んで成るヌクレオチド配列を発現させる；段階を含んで成る。本発明は更に免疫原性又は毒性を抑制するためにIgGクラスの抗体又は抗原結合性抗体においてＮ−結合グリコシル化を消失させるための方法であって、宿主系においてIgG抗体又は抗原結合性抗体フラグメントをコードする核酸（例えばDNAもしくはRNA又は機能的均等物）を含んで成るヌクレオチド配列を発現させることも含んで成る方法を提供し、ここで当該宿主系は抗体又は抗体フラグメントをＮ−結合グリコシル化しないものである。本発明は更にIgGクラスの抗体又は抗原結合性抗体フラグメントのＮ−結合グリコシル化を改質するための方法（例えば免疫原性又は毒性を抑制するため）であって、当該抗体又は抗体フラグメントをＮ−結合グリコシル化を改質する後発現改質に委ねることを含んで成る方法を提供する。好適な態様において、IgGクラスの抗体又はフラグメントを免疫原性又は毒性を抑制するために化学的に改質させる。
リガンド、抗リガンド、診断薬又は治療薬に直接又は間接的に付加された本発明のヒト化抗体又は抗体フラグメントを含んで成るコンジュゲートを提供する。本発明の抗体もしくは抗体フラグメント又はコンジュゲートと、薬理学的に許容される担体又は希釈剤との組合せを含んで成る薬理組成物を提供する。本発明の抗体もしくは抗体フラグメント又はコンジュゲートもしくは組成物は診断薬又は医薬として、診断又は治療的プレターゲッティング方法において利用するため；及び癌の診断のための診断薬又は癌の処置のための医薬の製造のために利用されるために提供する。
本発明のこれら及びその他の態様は下記の詳細な説明及び添付図面を参照することにより一層明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
図１はNR-LU-13よりヒト化抗体を合成するために用いた配列分析及びコンピューターモデリングの模式図である。
図２はNR-LU-13軽鎖及びNR-LU-13重鎖可変領域のヌクレオチド及びアミノ酸配列を含む。
図３はヒト化NRX451軽鎖と称する、NR-LU-13に由来する好適な可変軽鎖配列のアミノ酸配列を含む。
図４はヒト化NRX451重鎖と称する、NR-LU-13に由来する好適な可変重鎖配列のアミノ酸配列を含む。
図５はNRX451重鎖及びNRX451軽鎖と称するNR-LU-13の重鎖及び軽鎖可変領域、並びにそれに由来するヒト化重鎖及び軽鎖可変領域のアラインメントである。
図６ａ及び６ｂは（ａ）キメラNR-LU-13抗体のFv及び（ｂ）それに由来するヒト化Fv（NRX451）の分子モデルを含む。
図７ａ−７ｅはヒト抗体配列の特定の位置についてのアミノ酸頻度を含む。
図８はNRX451を発現させるために用いたプラスミドpNRX451-Cの中間体であるpcDNA 3を示す。
図９はNRX451を発現させるのに用いたプラスミドpNRX451-Cを示す。
図10は特異的なNRX451ヒト化抗体産生クローンについてのカッパー及びガンマーELISAの結果を含む。
図11は競合免疫反応によるインタクトNR-LU-10抗体に対するヒト化NRX451抗体の免疫反応性を対比させている。
図12は本発明に従って製造したヒト化抗体を含む種々の放射性ラベルした抗体の組織生体分布を対比させている。
図13はマウスハイブリドーマ細胞において生産されたネズミNR-LU-10に対するCHO細胞、植物細胞及び幼虫において発現されたヒト化NR-LU-13（NRX451）の生体分布を対比させている。
図14は酸化／還元と非酸化・還元NRX451とのレクチン結合プロフィールを対比させている。
図15ａ−15ｃは未改質及び改質NRX451における補体媒介細胞障害性（CMC）を示す。
図15ｄは未改質及び改質NRX451における抗体依存性細胞障害性（ADCC）を示す。
図16ａ−16ｃはマウスモデルにおけるラベル化NRX451及び酸化／還元NRX451の50／50の同時注射の生体分布を対比させている。
図17はヒト癌患者におけるNRX451及び酸化／還元NRX451の血液浄化率を対比させている。
図18はCHO発現NRX451（−○−）、トウモロコシ発現NRX451（−□−）及びコーン発現されたNRX451のAsn→Gln突然変異体（−△−）のlog10希釈品に対して曝露させたMCF-7細胞の補体媒介細胞障害性を示す。10％の最終希釈率のヒト血清を補体の起源とした。結合は細胞障害パーセントとして示す。
図19はCHO発現NRX451（−○−）、トウモロコシ発現NRX451（−□−）及びコーン発現されたNRX451のAsn→Gln突然変異体のlog10希釈品に対して曝露させたMCF-7細胞を示す。ヒト末梢血液単核細胞も25：１のエフェクター、対、標的細胞の比で加えた。その結果を細胞障害パーセントとして示す。
図20はNRX451及びネズミIgG類似体NR-LU-10のマウスにおける血液消失を対比させている。
図21ａ−21ｂはNRX451及びネズミIgG類似体NR-LU-10の腫瘍無胸腺マウスにおける生体分布を対比させている。
図22はトウモロコシの種子において発現されたストレプトアビジン（SA）に化学的に接合したＮ結合グリコシル化突然変異NRX451の腫瘍無胸腺マウスにおける生体分布を示す。
図23はマウスにおける合成浄化剤を利用した及び利用していない放射性ラベルしたトウモロコシ発現されたＮ結合グリコシル化突然変異NRX451／SAコンジュゲートの血液消失の結果を含む。
図24ａ−24ｂは放射性ラベルしたトウモロコシ発現されたＮ結合グリコシル化突然変異NRX451／SAコンジュゲート及びプレターゲッティング方法を利用してその後に投与した111DOTA−ビオチンの腫瘍無胸腺マウスにおける生体分布を含む。
発明の詳細な説明
本発明について記載する前に、以降に利用する一定の用語の定義を記述することが本発明の理解のうえで役に立ちうる。
抗体  本明細書においてはポリクローナル及びモノクローナル抗体の双方を含む；そしてそれはインタクト分子、そのフラグメント（例えばFv，Fd，Fab，Fab′及びF（ab）′2フラグメント、インタクト分子及び／又はフラグメントの多量体又は凝集体であってよい；そしてそれは天然、又は例えば免疫、合成もしくは遺伝子工学により製造したものであってよい。
タンパク質  本明細書においては、タンパク質、ポリペプチド及びペプチドを含む。そしてそれはインタクト分子、そのフラグメント、又はインタクト分子及び／又はフラグメントの多量体又は凝集体であってよい；そしてそれは天然、又は例えば合成（化学及び／又は酵素的合成を含む）又は遺伝子工学により製造したものであってよい。
ヒト化抗体  これは非ヒト抗体（典型的にはネズミ）に由来する、又はキメラ抗体に由来する抗体であって、親抗体の抗原結合特性を保持又は実質的に保持しているが、ヒトにおける免疫原性が弱い抗体を意味する。これは様々な方法、例えば（ａ）非ヒトCDRのみをヒトフレームワーク及び定常領域にグラフトさせることにより（ヒト化）；又は（ｂ）非ヒト可変ドメインを移植し、しかも表層残基の置換によりそれらにヒト様表層を「着せる」ことにより（「ベニア貼り」）成し遂げることができうる。かかる方法は例えばJonesらNature 321: 522-525（1986）; MorrisonらProc.Natl.Acad.Sci．81: 6851-6855（1984）; Morrison and Oi，Adv.Immunol．44: 65-92（1988）; VerhoeyerらScience 239: 1534-1536（1988）; Padlan，Molec.Immun．28: 489-498（1991）; Padlan，Molec.Immun．31（3）: 169-217（1994）に開示されている。本発明において、ヒト化抗体には「ヒト化」及び「ベニア貼り」抗体が含まれるであろうが、キメラ抗体は含まれない。ヒト化の好適な方法は非ヒト重鎖及び軽鎖配列のヒト重鎖及び軽鎖配列に対するアラインメント、かかるアラインメントに基づく非ヒトフレームワークのヒトフレームワークによる選択及び置換、ヒト化配列のコンホメーションの推定のための分子モデリング、並びに親抗体に対するコンホメーションの対比、それに続くヒト化配列モデルの推定コンホメーションが親非ヒト抗体の非ヒトCDRのコンホメーションに近似するまでCDRの構造を妨害するCDR領域における残基の繰り返し戻し突然変異を含んで成る。このヒト化の方法を図１に模式図で示す。また、かかるヒト化抗体は例えばアシュウェル（Ashwell）レセプターを介して、又は例えばガラクトース残基もしくはその他のヘキソースの組込みによるその他のレセプター媒介浄化メカニズムを介して取込み及び浄化を促進せしめるように更に誘導化してよい（例えば米国特許第5,530,101及び5,585,089号）。
ヒト化抗体フラグメント  これは抗原に結合し、且つ例えばガラクトース残基の組込みにより浄化及び取込みを促進せしめる構造的特徴を示すように誘導化されていることのあるヒト化抗体に由来するフラグメントを意味する。これには例えばF（ab），F（ab）′2，scFv、軽鎖可変領域、重鎖可変領域及びそれらの組合せが挙げられる。
相補性決定領域又はCDR  本明細書で用いる語CDRとは、天然イムノグロブリン結合部位の天然Fv領域の結合親和性と特異性とを一緒に規定するアミノ酸配列を意味する（ChothiaらJ.Mol.Biol．196: 901-917（1987）; KabatらU.S.Dept．of Health and Human Services NIH Publication No.91-3242（1991））。
フレームワーク領域又はFR  本明細書で用いる語FRとはCDR間に介在するアミノ酸配列を意味する。この抗体のこれらの部分の一の機能はCDRを適切な配向に保つことにある（CDRが抗原に結合するようにさせる）。
定常領域又はCR  本明細書で用いる語CRとはエフェクター機能を供する抗体分子の部分を意味する。本発明において、ネズミ定常領域はヒト定常領域により置換されている。課題のヒト化抗体の定常領域はヒトイムノグロブリンに由来する。この重鎖定常領域は５種類のアイソタイプ：アルファー、デルタ、エプシロン、ガンマー又はミューのいづれかより選ばれうる。更に、様々なサブクラス（例えば重鎖のIgGサブクラス）の重鎖が種々のエフェクター機能を司っており、それ故所望の重鎖定常領域を選定することにより、所望のエフェクター機能を有するキメラ抗体が製造できうる。好適なヒト定常領域はガンマー１（IgG1）、ガンマー２（IgG2）、ガンマー３（IgG3）及びガンマー４（IgG4）である。ガンマー１（IgG1）アイソタイプのFc領域が好ましい。この軽鎖定常領域はカッパー又はラムダタイプであってよく、カッパータイプが好ましい。
キメラ抗体  これは典型的には異なる種の２種類の抗体に由来する抗体含有配列である（例えば米国特許第4,816,567号）。最も典型的なキメラ抗体はヒト及びネズミ抗体フラグメント、一般にはヒト定常及びネズミ可変領域を含んで成る。
NR-LU-10  大行列した癌腫上で発現される約40キロダルトンの糖タンパク質抗原を認識するIgG2bアイソタイプのネズミモノクローナル抗体。この抗体はヒト臨床試験において安全に投与されている汎癌腫抗体である。NR-LU-10に結合する抗原はその他の癌腫組織のうち、とりわけ小細胞肺、非小細胞肺、結腸、胸、腎臓、卵巣及び膵臓等の癌により発現される。この抗体は今まで２段階及び３段階プレターゲッティング方法においてターゲッティング成分として使用されていた。
NR-LU-13  NR-LU-10の可変軽鎖及び重鎖領域とヒト定常ドメインとを含むキメラモノクローナル抗体。この抗体はNR-LU-10と同じ抗原に結合する。
NR-LU-10又はNR-LU-13抗原  これらの語は同義語として用い、そしてNR-LU-10又はNR-LU-13と結合する抗原を意味する。これは幾多の癌腫及び非癌性組織により発現される約40キロダルトンの糖タンパク質抗原である。
ヒト化NRX451又はヒト化NRX451軽鎖又はヒト化NRX451重鎖  これはNR-LU-13のFvに由来する特異的なヒト化可変性ドメイン配列を意味する。
ヒト化抗体又はヒト化抗体フラグメントコンジュゲート  本発明のヒト化抗体又はヒト化抗体フラグメントを含むコンジュゲート。これらのコンジュゲートは以降に定義するリガンド又は抗リガンド及び／又は活性剤を含みうる。このリガンド、抗リガンド又は活性剤は例えば公知のリンカーの利用を介してヒト化抗体又はヒト化抗体フラグメントに直接又は間接的に付加されていてよい。これらのコンジュゲートは例えばアシュウェルレセプター媒介浄化を介して肝臓取込みを誘導するガラクトースの如きヘキソースの組込みにより取込み及び浄化を誘導する構造的特徴を示す又は示すように誘導化されていてよい。
プレターゲッティング  本明細書において規定するプレターゲッティングはリガンド／抗リガンドペアーの一方の構成員に接合したターゲッティング成分の標的部位集中化を包括する。このターゲッティング成分コンジュゲートの最適な標的、対、非標的蓄積のために十分な時間の後、当該リガンド／抗リガンドペアーの他方の構成員に接合した活性剤を投与し、そして当該標的部位においてこのターゲッティング成分コンジュゲートを（直接又は間接的に）結合させる。プレターゲッティングは任意的に浄化剤の投与という追加の段階をも包括する。
ターゲッティング成分  規定の細胞集団に結合する分子。このターゲッティング成分は標的細胞集団上に又はその中に存在する任意の標的、例えばレセプター、オリゴヌクレオチド、酵素基質、抗原決定基又はその他の結合部位に結合しうる。このターゲッティング成分はタンパク質、ペプチド、抗体及びその抗体フラグメント、融合タンパク質等であってよい。抗体は本明細書を通じてターゲッティング成分の模範例として用いている。腫瘍は標的の模範例として用いている。
リガンド／抗リガドペアー  一般に比較的高い親和性の特異的結合性を示す分子の相補性／抗相補性セット。典型的なリガンド／抗リガンドペアーには亜鉛フィンガータンパク質／ds DNAフラグメント、酵素／インヒビター、ハプテン／抗体、レクチン／炭水化物、リガンド／レセプター、及びビオチン／アビジン又はストレプトアビジンが挙げられる。ビオチン／アビジン又はストレプトアビジンがリガンド／抗リガンドペアーの模範例として本明細書に通じて用いられている。
リガンド  本明細書において定義する「リガンド」は動物又はヒトに静脈内投与したときに迅速な血清、血液及び／又は全身浄化を示す比較的小さな可溶性分子である。ビオチン及びビオチン類似体が模範のリガンドとして用いられている。アビジン及びストレプトアビジンに対して弱い又は強い結合親和力を有するビオチンの類似体は当業界において周知である。
抗リガンド  本明細書において定義する「抗リガンド」とは相補性リガンドの高い親和性、そして好ましくは多価結合性を示す。好ましくは、この抗リガンドはターゲッティング成分に接合させたとき、迅速な腎臓浄化を回避するのに十分に大きく、そしてターゲッティング成分−リガンドコンジュゲートの架橋及び凝集を達成するのに十分な多価性を含む。単価の抗リガンドも本発明により考慮される。本発明の抗リガンドは例えば肝臓取込みを誘導するヘキソース残基の取込みにより、取込みを誘導する構造的特徴を示す又は示すように誘導化されていてよい。本明細書においてはアビジン及びストレプトアビジンを模範的な抗リガンドとして用いている。
アビジン  本明細書において定義する「アビジン」にはビオチンの高親和性多価又は単価結合ができるアビジン、ストレプトアビジン並びにその誘導体及び類似体が含まれる。典型的なストレプトアビジン分子は米国特許第5,168,049及び5,272,254号に記載されている。
浄化剤  受容者の循環系において存在する投与成分（例えばターゲッティング成分−リガンド、ターゲッティング−抗リガンド又は抗リガンドのみ）に結合、複合形式又は何らかの形で一体化することができ、それ故受容者の身体からの循環成分の浄化、血液循環からの除去、又は循環系における不活性化を促進する試薬。浄化剤は好ましくは浄化剤と同じ処置プロトコールにおいて利用するターゲッティング成分により認識される標的細胞集団に対するかかる浄化剤のアクセスを制約する物理特性、例えばサイズ、電荷、形態又はそれらの組合せを特徴とする。
活性剤  放射性核種、抗腫瘍剤、サイトカイン、ホルモン、毒素等の診断又は治療薬。放射性核種治療薬は模範的な活性剤である。
標的細胞保持  標的細胞表層においての、又は標的細胞内に残る放射性核種又はその他の治療薬の時間。かかる治療薬を含むコンジュゲート又は分子の異化作用が主に標的細胞保持の損失を司るようである。
コンジュゲート  コンジュゲートは互い同志に直接的（例えば共有又は非共有結合）又は間接的（例えば間接的に組込まれた又は結合した）に一体化している２以上の分子の組合せである分子をいう。コンジュゲートには化学コンジュゲート（共有又は非共有結）、融合タンパク質等を含む。コンジュゲートはリガンド又は抗リガンド、及び／又は活性剤を有しうる。
免疫原性  受容者に投与されたときに免疫応答（体液又は細胞性）を誘導するターゲッティングタンパク質又は治療成分の能力の尺度である。本発明はコンジュゲート及びその構成成分の免疫原性を考慮する。
非グリコシル化抗体又は非グリコシル化ヒト化抗体  これらの層は、グリコシル化を消失又は抑制するよう本来潜在的にグリコシル化される部位におけるアミノ酸残基を改質するように部位特異的突然変異誘発により突然変異された抗体もしくはヒト化抗体、又はその抗原結合性フラグメントを意味する。
免疫原性の抑制されたヒト化抗体  これは親抗体と比べ抑制された免疫原性を示すヒト化抗体、例えばNR-LU-13に関するヒト化NRX451重鎖及びヒト化NRX451軽鎖配列を含むヒト化抗体を意味する。
親抗体の結合特性を実質的に保持するヒト化抗体  これはヒト化抗体であって、かかるヒト化抗体を製造するために用いた親抗体により認識される抗原に特異的に結合する能力を保持するものを意味する。例えば、NR-LU-13の結合特性を実質的に保持するヒト化抗体は幾多の癌腫により発現される約40キロダルトンのタンパク質、そしてより好ましくはNR-LU-13と同じエピトープに特異的に結合する。好ましくは、このヒト化抗体は親抗体と同一又は実質的に同一の抗原結合親和性を示すであろう。一般に、親和力は親抗体の親和力とほぼ同程度である。抗原結合親和力をアッセイするための方法は当業界において周知であり、そして半最大（half-maximal）結合アッセイ、競合アッセイ及びスキャッチャードアッセイが挙げられる。
適宜、上記の定義は機能的均等物、即ち、長さ、構造、成分等において相違するが、にもかかわらず規定の分子の１又は複数の機能を発揮又は達成することのできる分子を含む。上記の分子の機能的均等物には本発明の抗体又は抗体フラグメントの機能的均等物が挙げられる。一の機能的均等物は「擬似」化合物、即ち、抗原結合のために適正な形態及び／又は配向を擬似するようにデザインされた有機化学構築体をいう。その他の機能的均等物はコンピューター補助分子モデリングを利用して構築した「最小」ポリペプチドとしてデザインされた短いポリペプチド及び改変された結合親和力を有する突然変異体であり、その最小ポリペプチドは抗体の抗原結合親和力を示す。
上記の通り、本発明はNR-LU-13を介して認識される（同一又は異なるエピトープにおいて）抗原に結合するNR-LU-13又はその他の非ヒト抗体に由来するヒト化抗体及びその抗原結合性フラグメントの製造、並びに特に二段階及び三段階プレターゲッティング方法におけるその用途に関する。更に、当該ヒト化抗体が典型的にはヒト定常領域を含むであろうとして、それらは治療用抗体としても用いられうる。特に、ヒト定常領域を含むヒト化抗体は典型的にはヒトエフェクター機能、例えば補体媒介細胞障害性（CMC）及び抗体依存性細胞媒介細胞障害性（ADCC）活性を誘導する。かかる活性は補体タンパク質又はADCCエフェクター細胞、NK多形態核細胞及び単球により直接的な腫瘍細胞溶解をもたらしうる。また、かかる活性は炎症性エフェクター細胞、マクロファージ及び多形態核白血球の浸潤により代表される炎症応答の誘導をもたらしうる。従って、これらのヒト化抗体はその他の活性剤、例えば放射性核種又は毒素に対する付加なしで腫瘍細胞溶解を強めうる。
他方、エフェクター配列を有する又は有さないヒト化抗体及び抗原結合性フラグメントを所望の治療機能を発揮させるために活性剤に付加してよい。
前述の通り、NR-LU-13はネズミFv配列及びヒト定常ドメイン配列を含むキメラ抗体である。NR-LU-13はNR-LU-10と同じエピトープにおいてNR-LU-13抗原に結合する抗体である。NR-LU-10は150キロダルトンの分子量を有するIgG2bアイソタイプのネズミモノクローナル抗体である汎癌腫抗体である。前述の通り、このモノクローナル抗体及びそのFabフラグメントはヒト臨床試験において何百人もの患者に安全に投与されている。
ラジオイムノアッセイ、免疫沈殿及び蛍光活性化セルソーティング（FACS）分析がNR-LU-10の反応プロフィールを決定するために利用されている。NR-LU-10標的抗原は固定化培養細胞上で、又は様々な癌細胞の界面活性剤抽出物中に存在する。例えば、NR-LU-10抗原は小細胞肺、非小細胞肺、結腸、胸、腎臓、卵巣、膵臓及びその他の癌腫組織により発現される。NR-LU-10抗体の腫瘍反応性を表Ａに示し、一方正常組織とのNR-LU-10反応性を表Ｂに示す。表Ｂにおける値は下記の通りに得られる。陽性NR-LU-10組織反応性はかかる組織によるNR-LU-10抗原発現を示唆する。NR-LU-10抗原はVarkiら「Antigens Associated with a Human Lung Adenocarcinoma Defined by Monoclonal Antibodies」Cancer Research 44: 681-687（1984）及びOkabeら「Monoclonal Antibodies to Surface Antigens of Small Cell Carcinoma of the Lung」Cancer Research 44: 5273-5278（1984）に更に記載されている。
組織検体を３つの反応性パラメーターに従って評価した：（１）反応の強度；（２）細胞タイプ内の反応の均質性；及び（３）抗体と反応性である細胞のパーセンテージ。これら３つの値を０〜500の単項重み比較値へと併合し、500が最も強い反応性とする。この比較値は様々な組織の比較を促進する。表Ｂはまとめた反応値、調べた組織サンプルの後、及びNR-LU-10と陽性反応するサンプル数を含む。
NR-LU-10抗原のエピトープに結合する抗体の調製のための方法も公知であり、そして米国特許第5,084,396号に記載されている。簡単には、かかる抗体は下記の手順により調製されうる：
−多価抗原の第一エピトープに対して特異的な第一モノクローナル抗体をイムノグロブリンに結合できる不活性な不溶性マトリックス上に吸収させる；
−この免疫収着体を多価NR-LU-10抗原を含む抽出物と組合せ、不溶化免疫複合体を形成する。ここでこの第一エピトープは第一モノクローナル抗体によりマスクされている；
−動物をこの不溶化免疫複合体で免疫する；
−この免疫動物由来の脾臓細胞をミエローマ細胞と融合させ、当該多価抗原の第二エピトープに対して特異的な第二モノクローナル抗体を産生可能なハイブリドーマを形成する；
−当該第二モノクローナル抗体を製造するためにこのハイブリドーマを培養する；そして
−当該ハイブリドーマの産物として当該第二モノクローナル抗体を集める。
上記の特許に記載の手順に従って調製したモノクローナル抗体NR-LU-01，NR-LU-02，NR-LU-03及びNR-LU-06はプレターゲッティング方法において利用するのに適当であるNR-LU-10と同一の癌抗原に結合する典型的な抗体である。
NR-LU-10抗原と反応性であるその他の抗体も標準的なハイブリドーマ製造及びスクリーニング技術により調製し得る。このようにして製造及び同定した任意のハイブリドーマクローンを抗原及び組織特異性を確証するために上記の通りに更にスクリーニングし得る。
0004503706.tif 000002
0004503706.tif 000003
0004503706.tif 000004
0004503706.tif 000005
0004503706.tif 000006
0004503706.tif 000007
0004503706.tif 000008
0004503706.tif 000009
0004503706.tif 000010
ところで、NR-LU-10抗原に結合するNR-LU-13抗体及び非ヒト起源のその他の抗体が特にプレターゲッティング方法におけるターゲッティング成分として治療及び診断用途を有するが、それらは一つの潜在的な欠点に悩まされる。詳しくは、それらは非ヒト（例えばネズミ）配列を有するため、それらはヒトにおいて免疫原でありうる。かかる免疫原性を理由とするこの欠点は抗体の反復投与に基づくターゲッティング効能を抑制しうる。
かくして、本発明はNR-LU-13と実質的に同じ抗原結合特性を有し、しかも抑制された免疫原性を示すターゲッティング成分を提供する。より詳しくは、本発明はNR-LU-13により認識されるものと同じ癌抗原、そしてより好ましくは同じエピトープに特異的に結合するNR-LU-13又はその他の非ヒト抗体に由来するヒト化抗体、及び抗原結合性ヒト化抗体フラグメントを提供する。本明細書において利用する抗体NR-LU-13に結合した抗原に「特異的に結合する」ヒト化抗体又はヒト化抗体フラグメントは少なくとも約104Ｍ-1の結合親和力を有する。好ましくは、この結合親和力は少なくとも約106Ｍ-1、そしてより好ましくは少なくとも約108Ｍ-1である。
前述の通り、論文の中でヒト化抗体は同一又は実質的に同一の抗原結合特性を示すが、抑制された免疫原性を示すネズミ抗体に潜在的に由来しうることが報告されている。
ヒト化抗体は様々な方法により製造されうる。これらのヒト化方法には：（ａ）非ヒトCDRのみをヒトフレームワーク及び定常領域にグラフトされる（例えばJonesら、Nature 321: 522-525（1986）（慣用のヒト化抗体）; Verhoeyenら、Science 239: 1534-1536（1988））；及び非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、露出残基の置換によりこれらのドメインをおおい隠す（ベニア貼りする）（免疫原性を抑制するため）（例えばPadlan，Molec.Immun．28: 489-498（1991）（ベニア貼り抗体）が含まれる。前述の通り、本明細書において定義するヒト化抗体は慣用の「ヒト化」及び「ベニア貼り抗体」の双方を含んでいる。
本発明において、一連の配列分析及び分子モデリング段階を包括するヒト化プロトコールを利用してNR-LU-13をヒト化する選択を行う。このプロトコールを図１において模式的に示す。本質的には、これはネズミの重鎖及び軽鎖可変配列のヒトの重鎖及び軽鎖可変領域配列との比較；配列類似性に基づく選定のフレームワーク残基の置換；親ネズミ及び推定ヒト化配列に対応する分子モデルの作製；親ネズミ配列に対応する分子モデルとの比較により相補性決定領域（CDR）のコンホメーションを乱すものとして信じられている残基を改質するためのもどし突然変異；改質配列に基づく分子モデルの構築；及びこのモデルと親ネズミ配列との比較；を含んで成る。この分析はヒト化モデルにおけるCDRのコンホメーションが親ネズミモデルにおけるCDRコンホメーションに非常に合致するまで続ける。このプロトコールはNR-LU-13に結合した抗原に対して特異的なその他の非ヒト（例えばネズミ）抗体、そしてより好ましくはNR-LU-13と同じエピトープに結合する抗体をヒト化するためにも利用されうる。
より詳しくは、NR-LU-13のヒト化に関し、相補性決定領域（CDR）及びフレームワーク領域（FR）を含む可変重鎖及び軽鎖ドメイン全体を含むNR-LU-13抗体をコードするDNAフラグメントをクローニングし、そしてこれらのDNAフラグメントを公知の方法により配列決定する。ネズミ可変重鎖及び軽鎖配列をコードするアミノ酸配列をヒト配列ペアー（同一クローンに由来するイムノグロブリン軽鎖及び重鎖）のデーターベースと比較する。NR-LU-13のクローニングした重鎖及び軽鎖可変領域のこのDNA配列及び推定アミノ酸配列を図２に示す。かかる比較のために利用したイムノグロブリン配列データーはKabatら「Sequences of Proteins of Immunological Interest」U.S.Dept.Health and Human Services、第５版、1991より得た。構造データーはBernsteinら「The protein databank: A computer based archival file for macromolecular structures」J.Mol.Biol．112: 535-542（1977）より得た。
配列対比の後、同一性の最も高いヒト抗体配列を「グラフト化」抗体についての一次フレームワークを供給するために選定した。同一性の最も高い配列ペアーはクローンR3.5H5G’CL（Manheimer-Loryら、J.Exp.Med.，174（1991年12月）1639-1642）のそれであることがわかった。次いでNR-LU-13に由来するオリジナルネズミCDRの配列を選定したヒトフレームワーク構造へと移した。この工程は一次推定ヒト化Fv配列を供した。この一次ヒト化配列を前述の一連の突然変異にかけた。
この一次推定ヒト化配列を次に三次元モデルにおいて配列を試験することにより「精製した」。オリジナルのネズミ配列及び一次ヒト化配列の分子モデルを構築した。ネズミモデル及びヒト化モデルにおける等等な残基位置を比較した。CDRの構造を乱すものと推定されるヒト化モデルにおける残基を「戻し突然変異させた」。次いで改質推定ヒト化配列の分子モデルを構築し、そして再びネズミ分子モデルと比較した。推定ヒト化配列分子モデリング及び「戻し突然変異」、それに続く得られる改質ヒト化配列モデルのネズミモデルとの対比のサイクルをヒト化モデルにおけるCDRのコンホメーションがネズミモデルのCDRコンホメーションに近密に合致するまで繰り返した。このヒト化プロトコールを図１に模式的に示す。
NR-LU-13に由来する可変重鎖及び軽鎖配列（NRX451軽鎖及びNRX451重鎖配列と称する）によりこの方法論を利用し、ヒト化NRX451重鎖及び軽鎖配列を得た。これらのヒト化軽鎖及び重鎖配列をそれぞれ図３及び図４に示す。両図において、親NRX451重鎖及び軽鎖ネズミ配列残基とは異なる可変重鎖又は軽鎖フレームワーク領域を太字で示す。
図３及び４からヒト化可変重鎖及び軽鎖配列（NRX451重鎖及びNRX451軽鎖配列と呼ぶ）はFabフラグメントのＣ部分に向ってFvドメインの土台において主に親ネズミ抗体可変配列と相違する。課題のNRX451ネズミ及びヒト化配列の番号はUDB番号付けに従っている。これらのヒト化可変重鎖及び軽鎖配列はNR-LU-13よりも弱い免疫原性を示すヒト化抗体をもたらすことを意図する。
図３及び４に示すNRX451配列（ヒトイムノグロブリンとのその配列類似性）がヒトにおいて抑制された免疫原性を誘導する抗体を供し（ネズミNR-LU-10又はキメラNR-LU-13と比べて）、そして更に長期化した血清半減期を示しうることを意図するが、上記のNRX451配列のその他改質が本発明の範囲に属する。例えば、これらのヒト化配列は欠失、付加又は置換突然変異により更に改質されうる。特に、それらはPadlan，Molec.Immunol．28: 489-491（1991）の方法に従う１又は複数の露出したフレームワーク残基の置換により改質されうる。例えば、置換を考慮した特定のアミノ酸残基は別のアミノ酸、例えばセリンによる重鎖の60位のシステインである。
詳しくは、本発明は抗原結合に有害な影響を実質的に及ぼさない置換改質を含む。例えば、これは保存性アミノ酸置換、例えば酸性アミノ酸の別の酸性アミノ酸による置換を含む。保存性アミノ酸置換は当業界において公知である。
更に、本発明はプラスミドであるpNRX451に含まれているNRX451重鎖及びNRX451軽鎖配列並びにそれらのフラグメントを包括する。NRX451のプラスミド（pNRX451）はヒト化重鎖及び軽鎖をコードするcDNAを含むpcDNA 3（Invitrogen）に由来する哺乳動物発現ベクターである。
また、これらは機能的（抗原結合性）ヒト化配列を生み出すように１又は複数のアミノ酸残基の欠失によりトランケーションさせてよい。例えば、CHO及び昆虫細胞における課題のヒト化抗体の発現の際、課題のヒト化NRX451配列の残基を欠くフラグメント（細胞切断メカニズム又は精製方法を理由に製造されたことが明らかなもの）は機能的、即ち、NR-LU-13抗原に結合し続けることが観察された。詳しくは、上記のヒト化配列を含むが、NRX451ヒト化重鎖配列の最初の７個のＮ末端残基を欠くヒト化Fv配列が機能的であることが観察された。これらの結果に基づく、その他の欠失、例えば課題のヒト化NRX451のＮ末端及びＣ末端欠失も機能的である（抗原に結合する）ことが期待される。機能的な欠失は様々な欠失の系列発現及び得られる欠失のNR-LU-13抗原に結合する能力を決定するスクリーニングにより同定されうる。下記の通り、突然変異した抗体配列は任意の様々な宿主系、例えば哺乳動物細胞（例えばCHO細胞）、昆虫、植物細胞、遺伝子導入植物及び遺伝子導入動物において発現されうる。
前述の通り、本発明の抗体（特にIgGクラス）の改質であってＮ結合グリコシル化を消失させるための改質（即ち、Ｎ結合グリコシル化を防ぐための抗体の事前発現の改質）又はＮ結合グリコシル化の改質（即ち、抗体のＮ結合グリコシル化の後発現の改質）に更に関連する。本明細書に記載の通り、Ｎ結合グリコシル化の消失又は改質は免疫原性及び／又は毒性を抑制する有利な特性を有する。抗体はそのアイソタイプに依存する特徴的な部位にてグリコシル化された糖タンパク質である。例えば、IgGは各CH２ドメインにおけるAsn-Xaa-Ser（Thr）モチーフにてバイアンターナリー（bianternary）複合体としてＮ結合グリコシル化されている（ここでこのモチーフにおいてXaaは任意のアミノ酸であり、そしてSer及びThrは互換性となっている）。グリコシル化は８〜90個の糖分のサイズに範囲するオリゴ糖がこのモチーフにAsn残基（297）においてＮ結合しているときの後翻訳現象として生ずる。
抗体の三次構造に対する、そして特にそのFc領域に対するグリコシル化の作用は構造的に有意義であることが知られている。例えば、かかる有意性はNMR研究により示されている（R.A.Dwekら、J.Anat．187: 279-292（1995）「Glycobiology: The function of sugar in the IgG molecule」を参照のこと）。更に、グリコシル化はC1q結合として有意義であり、そして単球に対する抗体結合はグリコシル化モノクローナル抗体において有意に抑制される。
また、IgGにおけるグリコシル化パターンの改質はリウマチ様関節炎、年令及び妊娠等の幾多の病気に関連することが報告されている（Dwekら、後述）。従って、モノクローナル抗体のグリコシル化の商業的生産は最近関心がもたれはじめている。より詳しくは、不適当なグリコシル化パターンは、モノクローナル抗体製造が幾多の新規の生物を含むように広がっていることを理由に関心がもたれはじめ、ここで幾多の生物はヒト細胞に非類似でタンパク質をグリコシル化する。今まで、モノクローナル抗体は哺乳動物細胞においてのみ発現されていた。しかしながら、新規且つ改善されたベクター系、タンパク質精製及び培養方法の開発により、抗体、例えばネズミ、キメラ及びヒト化抗体は幾多の宿主及び宿主細胞系、例えば哺乳動物、酵母、昆虫及び植物細胞において発現されうる。これは有意義な利点を供するが（例えば昆虫は高い組換タンパク質発現率を典型的に供する）；種々の宿主においてタンパク質を発現させるのに少なくとも一つの潜在的な問題がある。詳しくは、種々の宿主におけるタンパク質発現の再現性は十分にコントロールされているが、後翻訳修飾は適切な宿主細胞系の固有の特性である。一般に、宿主細胞はタンパク質を特徴的な態様で、即ち、グリコシル化パターンでグリコシル化する。
新規の発現系におけるグリコシル化の後翻訳プロセスは潜在的な問題であると信じられ、なぜならそれは改変された炭水化物認識を理由に得られる糖タンパク質の生体分布に影響を及ぼしうるからである。これに関連して、オリゴ糖が認識要素を司ることが幅広く知られている。例えば、細胞及び組織から単離した多くの動物タンパク質は炭水化物ドメインを認識する配列モチーフを有する。従って、グリコシル化部位の修飾はタンパク質の生体分布を変えるものと予測されるであろう。
更に、オリゴ糖は抗体構造に影響するため、グリコシル化部位の修飾は抗体分子の構造及び結合コンホメーションに潜在的に有害な影響を及ぼすものと予測されうる。しかしながら、本発明の開示の通り、抗体の炭水化物成分（特にNR-LU-13抗原に対するヒト化抗体）の消失又は修飾は有害な効果よりも有利な効果をもつ。
IgGクラス抗体の免疫原性又は毒性を抑制又は失わせるため、本発明はＮ結合グリコシル化を防止又は改質するための抗体の事前発現又は後発現修飾を提供する。モノクローナル抗体、例えばキメラ及びヒト化抗体並びにそのフラグメントにおける潜在的なグリコシル化部位の消失は部位特異的突然変異誘発により成し遂げられうる。詳しくは、本発明は抗体又は抗体フラグメント、好ましくはヒト化抗体又はヒト化可変配列をコードするDNA配列の、１又は複数のグリコシル化部位に又はその近くに置換突然変異を導入する部位特異的突然変異誘発が含まれる。
これはグリコシル化部位内に含まれているアミノ酸残基に対応する、又はそれに十分に近いイムノグロブリン配列をコードするDNAにおけるコドンを、かかるアミノ酸の改質が当該グリコシル化部位のグリコシル化を消失させるように部位特異的突然変異誘発することによって成し遂げられる。一般に、これはイムノグロブリンの中に存在するAsn-Xaa-Ser（Thr）グリコシル化モチーフの部位特異的突然変異誘発を包括するであろう。例えば、かかるAsn-Xaa-Ser（Thr）モチーフはIgGのCH２ドメインにおいて抗体分子における保存部位にて存在していることで知られる。
かかる部位でのグリコシル化の消失は抗体配列の中に含まれているグルコシル化部位の、その中に含まれている１又は複数のアミノ酸を改変せしめ、かかる部位でのグリコシル化を防ぐ部位特異的突然変異誘発により成し遂げる。所望の部位においてDNA配列の中に部位特異的突然変異誘発を導入するための方法は当業界において周知である。
従って、一般に当該方法は所望の抗体をコードするDNA配列をクローニングし、その中に含まれているグリコシル化モチーフを同定し、そして当該グリコシル化モチーフにおける１又は複数のコドンを改質し、選定の宿主細胞におけるかかるDNAの発現の結果としての抗体が当該部位においてグリコシル化されていないようにアミノ酸置換突然変異を導入することを含んで成るであろう。
前述の通り、部位特異的突然変異誘発の方法は当業界において周知である。部位特異的突然変異誘発において、この置換は所望の塩基変更を組込んだオリゴヌクレオチドを化学合成し、このオリゴヌクレオチドを改変すべきDNAコード配列とハイブリダイゼーションさせ、そしてこの誤対合したプライマーをDNAポリメラーゼで伸長させて新たな遺伝子配列を構築することにより成し遂げられる。突然変異した遺伝子をその後適当な宿主生物又は発現系に挿入し、突然変異DNAもしくはRNAを供するか、又は改変タンパク質生成物を製造する。典型的には、かかる改質はグリコシル化モチーフにおけるアスパラギン残基を別のアミノ酸に置換するであろう。
他方、グリコシル化モチーフは配列Asn-Xaa-Ser／Thrの中のアスパラギン又はセリン／スレオニンのいづれかのDNAコドンの欠失により変えられることがあり、これはかかる部位でのグルコシル化を防ぐ。例えば、当該グリコシル化部位に隣接する２個の固有制限部位の間のDNA配列はアスパラギンコドン抜きで化学合成できうる。オリジナルの野生型DNA配列は２個の制限部位を利用してプラスミド構築体においてこの改変配列と交換されうる。
例えば、一の手段は、改質すべき標的配列、即ち、Asn-Xaa-Ser（Thr）モチーフをコードするDNA部分と重複する２種類のオリゴヌクレオチド（一方は挿入すべき突然変異を含む）の合成；２通りの独立したポリメラーゼ連鎖反応の実施（ここで第一反応においては突然変異オリゴヌクレオチドを増幅させる）；そしてPCR「縫いつけ反応」を実施する第二ポリメラーゼ連鎖反応を実施する；ことを含んで成る。これは本質的に突然変異したオリゴヌクレオチドと、所望の突然変異を含む一本鎖突然変異cDNAを構築するための第二オリゴヌクレオチドプライマーの組合せをもたらす。突然変異を含む増幅cDNAを次にオリジナル（非突然変異）抗体DNA配列を含むベクターの適当な挿入部位に挿入する。得られるクローンを配列決定し、その突然変異が適切な部位に挿入されているかを確認する。
グリコシル化部位の突然変異は任意のクローン化抗体配列、例えばネズミ抗体配列、キメラ抗体配列及びヒト化抗体配列の中に導入してよい。得られる突然変異抗体DNA配列を次に所望の発現系において発現させ、グリコシル化の抑制された又はグリコシル化のない抗体を得る。
他方、IgG抗体のＮ結合グリコシル化（及び任意的にＯ結合グリコシル化）は発現後に改質されうる。発現前及び発現後の双方にて抗体（又はフラグメント）を改質するのは本発明の範囲に属する。後発現改質とは発現後にＮ結合グリコシル化を消失又は改質（例えば少なくとする）ことを意味する。後発現改質には：抗体又は抗体フラグメントをＮ結合グリコシル化しない宿主系（発現系）における抗体配列の発現；化学修飾；及び酵素修飾を含む。宿主系は以下により詳しく説明する。抗体上のグリコシル化部位は酵素除去できうる。タンパク質分子上の炭水化物を切断できる幾多のグリコシダーゼがある。Ｎ結合炭水化物の脱グリコシル化のために一般的に用いられているいくつかのＮグリコシダーゼの例には：高マンノース型及びハイブリドオリゴ糖を切断するエンドグリコシダーゼＨ；バイアンテナリー複合型オリゴ糖鎖を切断するエンドグリコシダーゼＦ；並びにトリ及びテトラアンテナリ複合型鎖及び上記のＮグリコシドにより切断されるその他を切断するペプチドＮ−グリコシドＦ；が挙げられる。Ｏ結合炭水化物はＯ−グリカナーゼ等を利用して酵素除去することもできる。グリコシダーゼは市販されている（例えば、Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO）。これらの酵素及び当業者に公知のその他はpH4.0〜9.0の間での温和な反応条件を利用して特定の炭水化物の一部を除去できる。例えば、PNGase FはpH8.0で最も活性であるが、±１のpH単位でも適切に機能するであろう。
免疫原性及び／又は毒性を抑制するために抗体を修飾するための本発明の化学修飾方法論は酸化、それに任意的に後続しうる還元工程である。抗体上の炭水化物の酸化はアルデヒド基を構築し、それはその対応のアルコールへと還元されうる。この方法は温和な酸化剤、例えばメタ過ヨウ素酸ナトリウムの利用、それに続く温和な還元剤、例えば硼水素化ナトリウムの利用を包括する。この酸化手順において、チオエーテル又はチオエーテル含有化合物、例えばメチオニンを抗体の補体決定領域における酸化感受性アミノ酸を保護するためにこの反応混合物に任意的に加えてよい。その他の水溶性チオエーテルも同じ目的のために利用してよい。かかる化合物の利用は酸化すべき特定の抗体に関して最適化されうることが当業者に明らかであろう。また、酸化及び還元剤のモル濃度並びに本発明において利用されるその他のパラメーターも各抗体につき最適化されうる。
酸化剤により構築される反応性アルデヒドの取扱い（例えば安定化）においてその他の方法が利用されうる。例えば、酸化の後に還元工程を省く場合、アルデヒドは対応のカルボン酸へと酸化できうる。この変換は手軽な反応であり、そして様々な温和な酸化剤、例えば酸素、過酸化水素、Ｎ−ブロモスクシニミド、酸化銀、過マンガン酸ナトリウム等を利用して達成されうる。更なる別の方法論はアルデヒドをキャッピングし、抗体内に存在する任意のその他の機能に対してそれらを不活性にすることを包括する。キャッピング剤にはヒドロキシルアミン、例えばカルボメトキシアミン、又はヒドラジド誘導体、例えば酢酸ヒドラジド及びメチルヒドラジノ−カルボキシレートが挙げられる。これら２クラスのキャッピング剤のいづれかの反応は安定な付加物の形成をもたらす。その他の方法は第一アミン（例えばグリシン）及びシアノ硼水素化ナトリウムによる還元性アルキル化によるアルデヒドの安定アミンへの変換を包括する。上記の試薬は全て市販され（例えばAldrich Chemical Co.，Milwaukee，WI及びSigma Chemical Co.，St.Louis，MO）、そしてその使用手順は当業者に公知である。
本発明の一の態様において、メタ過ヨウ素酸ナトリウム（NaIO4）を利用するNRX451上の炭水化物の酸化、それに続く硼水素化ナトリウムによる還元は抗体依存性細胞障害（ADCC）活性に影響を及ぼすことなく抗体の補体媒体細胞障害（C’MC）活性を効果的に不活性化させた。例えば、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコースアミン（GlcNac）は３と４番目の炭素との間で対応のアルデヒド基へと酸化される。この態様において、メチオニンをこの反応混合物に加えて抗体の補体決定領域における酸化感受性アミノ酸を保護する。NaIO4がモノクローナル抗体のC’MC活性を改変しないことは論文の中に既に報告されている（Awwardら、Cancer Immunol.Immunother．38: 23-30（1994））。しかしながら、驚くべき且つ好都合には、本明細書において開示の通り本発明の酸化／還元手順はADCC活性に影響を及ぼすことなくC’MC活性を改変せしめた。炭水化物の修飾度はレシチン結合ELISAによりモニターした。C’MC及びADCC活性は当業界に周知のin vitro 51Cr放出細胞障害アッセイを利用して測定した。
CHO細胞において産生された抗体NRX451は第一臨床試験段階においてヒト被験者に与えたときに若干の細胞障害性を示した。この特定の抗体はin vitro分析よりADCC及びC’MC活性を有することが決定された。また、このモノクローナル抗体はヒトの腸の中に位置する抗原と交差反応性であり、それは毒性の原因であり得、そして腫瘍部位と反応性である。従って、本発明は患者において示されているC’MC活性及び毒性を除去する炭水化物の化学修飾を述べる。化学修飾したNRX451を利用する臨床試験の結果は患者において毒性作用をもたらさなかった。酸化／還元ヒト化抗体NRX451により研究した７人の患者のデーターはこの抗体が安全に投与されうることを示唆する。
上記の方法論又は本明細書の中で引用するその他のヒト化方法を利用し、ヒト化配列はNR-LU-13の結合した癌抗原に対して生起させたその他の抗体から誘導されうる。かかる抗体は本明細書において引用する米国特許第5,084,396号に例示されている。これらの抗体にはNR-LU-01，NR-LU-02，NR-LU-03及びNR-LU-06、並びにそれらのフラグメントが挙げられる。
ヒト化可変配列を同定した後、対応のDNA配列を合成し、そしてヒト化抗体の製造のために用いる。前述の通り、これらのヒト化抗体は好ましくはNR-LU-13の結合した抗原に対して抗原結合親和力を示すであろう。一般にこの結合親和力は少なくとも約104Ｍ-1；好ましくは少なくとも約106Ｍ-1；そしてより好ましくは少なくとも約108Ｍ-1であろう。抗原に対する抗体の親和力を決定するためのアッセイは当業界において周知であり、そして例えば半最高（half-optimal）結合アッセイ、競合アッセイ及びスキャッチャード分析が含まれる。
ヒト化抗体は適当な宿主系内でのヒト化可変重鎖及び軽鎖の実現により得られる。本質的には、本明細書において利用する適当な「宿主系」とは宿主細胞組織又は多細胞生物を含む任意の発現系と、課題のヒト化抗体又はそのフラグメントをコードする核酸配列を含む１又は複数のベクターとを意味し、それらは組合さって、機能性抗体、即ち、ヒト化重鎖及び軽鎖の発現のため、一緒に特徴的な抗原結合構造を供する。
以下の文献は組換イムノグロブリンの発現のために適当な方法及び宿主系の代表例である：WeidleらGene 51: 21-29（1987）; DoraiらJ.Immunol．13（12）: 4232-4241（1987）; De WaeleらEur.J.Biochem．176: 287-295（1988）; ColcherらCancer Res．49: 1738-1745（1989）; WoodらJ.Immunol．145（a）: 3011-3016（1990）; BulensらEur.J.Biochem．195: 235-242（1991）; BeggingtonらBiol.Technology 10: 169（1992）; KingらBiochem.J．281: 317-323（1992）; PageらBiol.Technology 9: 64（1991）; KingらBiochem.J．290: 723-729（1993）; ChaudaryらNature 339: 394-397（1989）; JonesらNature 321: 522-525（1986）; Morrison and Oi，Adv.Immunol．44: 65-92（1988）; BenharらProc.Natl.Acad.Sci．USA 91: 12051-12055（1994）; SingerらJ.Immunol．150: 2844-2857（1993）; CootoらHybridoma 13（3）: 215-219（1994）; QueenらProc.Natl.Acad.Sci．USA 86: 10029-10033（1989）; CaronらCancer Res．32: 6761-6767（1992）; CotomaらJ.Immunol.Meth．152: 89-109（1992）。
機能性組換抗体、そして特にヒト化及びキメラ抗体を産生できるベクター、宿主細胞、組織及び生物等の発現宿主系は当業界において周知である。更に、組換抗体の発現のために適当な宿主系は市販されている。
イムノグロブリン又は抗体フラグメントを発現できることで知られる宿主系には、例えば、哺乳動物細胞、例えばチャイニーズ・ハムスター卵巣（CHO）細胞、COS細胞、ミエローマ細胞；細菌、例えばエッシェリヒア・コリ（Escherichia coli）；酵母細胞、例えばサッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）；昆虫細胞、例えばスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）；がとりわけその他の細胞のうちで挙げられる。CHO細胞はイムノグロブリンを効率的に発現及び分泌するその能力により多数の研究者により利用されている。また、昆虫細胞も所望され、なぜならそれらは高度な組換タンパク質発現が可能だからである。
昆虫細胞又は昆虫における発現は好ましくはバキュロウィルスポリヘドリンプロモーターの転写コントロール下で異種タンパク質（ここではヒト化イムノグロブリン配列）を発現できる組換バキュロウィルスベクターを利用して行う（例えば、バキュロウィルス／昆虫細胞発現系に関する米国特許第4,745,051号）。ポリヘドリンは高度に発現されるタンパク質であり、それ故そのプロモーターは効率的な異種タンパク質生産を司る。好適なバキュロウィルスはオートグラファ・カリフォルニカ（Autographa californica）（ACMNPV）である。適当なバキュロウィルスベクターはInvitrogenより市販されている。
本質的に、これらのベクターは例えばポリヘドリンプロモーターに作用可能式に連結されたヒトNR-LU-13可変重鎖及び軽鎖配列を含む組換バキュロウィルスを製造するよう例えば相同組換により改質する。好ましくは、このバキュロウィルスは昆虫の腸の壁の細胞に侵入し、これらの細胞の核へと移動し、そして複製し、感染細胞及び組織の中に蓄積する挿入体をもたらし、それは最終的に昆虫を溶解する。発現されたヒト化抗体を次に昆虫又は昆虫残渣から回収する。
更に、当該ヒト化抗体は遺伝子導入植物又は動物において発現されうる。課題のヒト化抗体配列は乳腺組織において特異的に活性化されるプロモーター、例えば乳特異的プロモーターに作用可能式に連結されている。かかる方法は米国特許第4,873,316号及び米国特許第5,304,498号に記載されている。
典型的には、かかる方法は作用可能式に連結されたポリペプチド配列の分泌を可能にするシグナルペプチド、乳特異的プロモーター、例えばカゼインプロモーター、エンハンサー配列及びNR-LU-10抗原に特異的なヒト化イムノグロブリン配列、例えばNR-LU-13に由来するヒト化配列を含むベクターを利用するであろう。
このベクターは適当な宿主、例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウサギ、ラット、カエル又はマウス胚の中に、典型的には発現ベクターが特定の胚のゲノムの中に組込まれる条件下でのマイクロインジェクションにより導入されるであろう。次いで得られる遺伝子導入胚を代理母に移し、そして乳の中においてヒト化抗体を含み且つ発現されている遺伝子導入体を同定するために子孫をスクリーニングする。抗体配列を含む及び／又は発現する遺伝子導入体は例えばサザンブロット又はウェスタンブロット分析により同定できうる。かかる遺伝子導入動物により産生される乳を集め、そしてヒト化抗体をそれから単離する。前述の通り、かかる方法は米国特許第4,873,316号及び同5,304,498号に詳細に記載されている。
課題のヒト化抗体配列は植物、例えば遺伝子導入植物、植物組織、植物種子及び植物細胞においても発現されうる。かかる方法は例えば米国特許第5,202,422号に記載されている。
植物、植物組織及び植物細胞の形質転換のために適当な発現ベクターは当業界において公知である。一般に、かかるベクターは注目のDNA（ここではヒト化抗体配列）、適当なプロモーター（典型的には細菌又はウィルスプロモーター）及び植物又は植物細胞において機能的な選択マーカーを含む。所望のDNAを植物及び植物細胞に導入するための方法には、例えば、アグロバクテリア（Agrobacterium）媒介形質転換、プロトプラスト形質転換、花粉への遺伝子導入、再生器官への注入、及び未熟胚への注入が挙げられる。
次に形質転換胚又は植物を伝統的な方法、例えば交配−受精、戻し交配等により子孫を作るのに用いる。ヒト化抗体を発現する子孫を例えばウェスタンブロッティング、細胞結合アッセイ等により同定する。これらの子孫を培養し、そして回収し、次いで抗体の回収のために用いる。かかる方法は米国特許第5,202,422号及び同5,004,863号に詳細に記載されている。異種タンパク質の発現のために有用な植物は周知であり、そして例えばトマト、タバコ、トウモロコシ、ダイズ及び綿植物が挙げられる。例えば、グリコシル化部位を消失させるために任意的に更に突然変異された課題のヒト化抗体は抗体及び抗体フラグメントをＮ結合グリコシル化及び／又はＯ結合グリコシル化しない植物細胞において発現されうる。
機能性ヒト化抗体の組換発現は２通りの一般的な方法のいづれかにより行ってよい。第一の方法においては、宿主又は宿主細胞を適当な定常領域に融合した重鎖及び軽鎖可変配列の双方の発現を供する単一ベクターでトランスフェクションする。第二の方法において、宿主細胞を２種類のベクターでトランスフェクションする。ここでそれぞれのベクターは適当な定常領域に融合した可変重鎖又は軽鎖配列のいづれかの発現を供する。
NR-LU-13に由来する課題のヒト化配列は適当な宿主細胞の中で、機能的な抗体フラグメント（例えばFv）又は全抗体が得られる条件下で発現させる。好ましくは、かかる配列はヒト定常配列、即ち、ヒト重鎖又は軽鎖定常配列に融合しているであろう。ヒト定常配列は周知であり、そして論文の中に報告されている。例えばKabatら「Sciences of Proteins of Immunological Interest」第５版、U.S.Dept.Health & Human Services（1991）はかかる配列を含む。ヒト化抗体の製造のために用いる公知のヒト定常配列には、例えば、ヒトガンマー１、ガンマー３及びガンマー４（ヒト重鎖定常配列）並びにカッパー及びラムダー（ヒト軽鎖定常配列）が含まれる。選定のヒト定常配列はヒト化抗体のエフェクター機能に影響を及ぼす。
細胞培養物、例えばCHO細胞又は昆虫細胞において組換抗体を発現するうえで、宿主細胞による抗体の分泌を供することが好ましい。これはヒト化重鎖及び軽鎖配列をコードするDNAを適当なシグナルペプチド配列、即ち、特定の宿主細胞により認識されてプロセシングされるものに作用可能式に連結することを含む。シグナルペプチドは周知であり、そして入手できる。典型的には、宿主細胞又は発現タンパク質と相同性のシグナルペプチドを選定する。例えば、ネズミNR-LU-10の内因性シグナルペプチドを使用してよい。
当該発現系（例えば発現ベクター）は好ましくはトランスフェクタントの選択及びヒト抗体の発現を担う配列を含むであろう。従って、好ましくはこの１又は複数のベクターは選択を可能にする遺伝子、例えば抗生物質（又は薬剤）耐性遺伝子を含むであろう。また、このベクターは好ましくは重鎖及び軽鎖の効率的な発現を担うプロモーター、並びにその他の調節配列、例えばポリアデニル化領域、エンハンサー領域等を含むであろう。組換抗体の発現に適当な系のデザインは周知であり、そして組換イムノグロブリンの発現に関する上記の文献により明らかな通り、当業者の知識の範囲内のものである。
イムノグロブリンの発現のために適当な宿主細胞の周知の例はCHO細胞である。CHO細胞又はその他の哺乳動物細胞の中でイムノグロブリンを発現するうえで、ベクターのコピー数を増やし、且つ抗体収率を高めるよう増幅を担う配列を含ませることが所望される。かかる配列には、限定することなく、優性選択マーカー、例えばジヒドロフォレートリダクターゼ（DHFR）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（NEO）、グルタミンシンセターゼ（GS）、アデノシンデアミナーゼ（ADA）がとりわけ挙げられる。
哺乳動物におけるタンパク質の発現のために適当なプロモーターの例には、限定することなく、ウィルスプロモーター、例えばヒトサイトメガロウィルス（CMV）早期プロモーター、SV40早期及び後期プロモーター、並びにRSVプロモーター及びエンハンサーが含まれる。また、哺乳動物プロモーター、例えばイムノグロブリンプロモーター、成長ホルモンプロモーター、例えばウシ成長ホルモンプロモーター、等が利用されうる。強力プロモーター、即ち、高レベルの転写を担うものを選択することが好ましい。
また、当該ベクターはポリアデニル化配列（ポリＡ）配列を含み、これはmRNA安定性を高め、それ故タンパク質生産を高めるように機能するmRNAのポリアデニル化を担う。適当なポリＡ配列の例には、限定することなく、SV40ポリＡ配列、及びウシ成長ホルモンプロモーター（BGH）ポリＡ配列がとりわけ挙げられる。
本発明の一の態様において、CHO（dhfr）細胞の中で課題のヒト化配列を発現することを選定し、この細胞は市販のベクターに由来するが改質されたベクターでトランスフェクションしたものとする。
プラスミドベクターpcDNA 3はInvitrogen Corp.（San Diego，CA）より入手した。このベクターは標的遺伝子発現のためのヒトサイトメガロウィルス（hCMV）プロモーター及びエンハンサー（Boshartら、Cell 41: 521-530（1985））、哺乳動物細胞の中での選択のためのネオマイシン耐性遺伝子、並びにE．コリの中での増殖及び選択のための原核系複製起点及びベーターラクタマーゼ遺伝子を含む。ベクターpcDNA 3は第二hCMVプロモーター及びエンハンサー、更には遺伝子増幅のためのDHFR遺伝子及び抗体遺伝子に適合する更なる制限部位を組込むために改質した。
一の態様において、重鎖及び軽鎖NRX451ヒト化可変配列をヒトγ１及びＫ定常領域に融合させることを選択する。しかしながら、その他のヒト定常領域をそれと置換してよい。利用した正確な方法は実施例に詳細に記してある。更に、課題のNRX451ヒト化重鎖及び軽鎖配列を含むヒト抗体はその他の定常領域を用いて又は機能的な組換抗体を発現できるその他の公知の宿主系を用いて発現されうる。特に、課題のヒト化抗体は上述の通り遺伝子導入植物もしくは動物、又は昆虫において発現されうる。
ヒト化抗体は発現された後、精製され、次いで抗原に結合するその能力についてアッセイされる。組換イムノグロブリンを精製するための方法は周知であり、そして組換抗体の製造に関連する引用することで本明細書に組入れる文献の中に記載されている。例えば、抗体を精製する周知の方法はプロテインＡ精製を含み、その理由は抗体のFc領域に結合するプロテインＡの性質にある。
抗原に結合する課題のヒト化抗体の能力は抗原−抗体親和力をアッセイするための幾多の公知の方法のいづれかにより決定する。前述の通り、親ネズミ抗体NR-LU-13は幾多の癌腫の上で発現される約40キロダルトンの糖タンパク質に結合する。この抗原はVarkiら、Cancer Res．44: 681-687（1984）; OkabeらCancer Res．44: 5273-5278（1989）において特性決定されている。即ち、NR-LU-13抗原に結合する本発明に従って製造したヒト化抗体の能力の試験はルーチンである。更に、この抗原のエピトープに結合する抗体の能力の評価のための方法は公知である。
本発明の一の観点において、本発明のヒト化抗体（又はそのフラグメント）は医療診断及び治療目的のための方法における有用な手段となるであろう。診断方法又は治療方法は哺乳動物宿主内の標的部位の有無の検査に関して説明する。治療目的のためのin vivo投与のためにヒト化抗体又は抗体コンジュゲートを利用する基準を決定するとき、一般に達成可能なターゲッティング比は高く、そして腫瘍に導入される治療薬の絶対用量は有意な腫瘍応答を誘導するのに十分である。本発明において述べているヒト化抗体を利用するための方法は例えば米国特許第4,877,868；5,175,343；5,213,787；5,120,526；及び5,202,169号に見い出せうる。
本発明の好適な態様において、本発明の抗体コンジュゲート又は組成物はプレターゲッティング方法において利用される。本質的には、かかるプレターゲッティング方法は慣用の癌診断又は治療と比べ、向上したターゲッティング比又は標的細胞部位に対する増大した絶対用量を特徴とする。プレターゲッティング方法の一般的な説明は米国特許第4,863,713；5,578,287及び5,630,996号に見い出せうる。更に、典型的なプレターゲッティングアプローチを以下にまとめる。
プレターゲッティング方法は２通りの一般的なタイプである：三段階プレターゲッティング方法及び二段階プレターゲッティング方法。
三段階プレターゲッティングプロトコールはターゲッティング成分−リガンドコンジュゲートの投与を特徴とし、これは標的部位での集中を可能にし、且つ循環系における希釈を可能にする。これに抗リガンドの投与が続き、それはターゲッティング成分−リガンドコンジュゲートに結合し、そして血液から未結合のターゲッティング成分−リガンドコンジュゲートを浄化し、更には標的部位としてのターゲッティング成分−リガンドコンジュゲートに結合する。かくして、抗リガンドは標的部位に結合していないターゲッティング成分−リガンドコンジュゲートの浄化及びターゲッティング成分−リガンド：抗リガンド複合体の形成のための標的部位への付加による二重機能を発揮する。最後に、迅速な全身浄化を示す診断又は治療活性剤−リガンドコンジュゲートを投与する。
循環系中の活性剤−リガンドコンジュゲートが標的部位に結合したターゲッティング成分−リガンド：抗リガンド複合体に近づくと、この複合体の抗リガンド部分は循環する活性剤−リガンドコンジュゲートのリガンド部に結合し、かくして標的部位にターゲッティング成分−リガンド：抗リガンド：リガンド活性剤「サンドイッチ」を生成する。更に、未結合の診断又は治療薬が迅速に浄化するリガンド（ゆっくりと浄化するターゲッティング成分、例えば抗体、抗体フラグメントではなく）に付加されるため、この技術は活性剤に対する軽減された非標的曝露を供する。
他方、二段階プレターゲッティング方法は上記の抗リガンドの投与段階を排除する。これら「二段階」手順はターゲッティング成分−リガンド又はターゲッティング成分−抗リガンドの投与、それに続くリガンド／抗リガンドペアーの対立構成員に接合した活性剤の投与を特徴とする。
本発明の二段階プレターゲッティング方法における任意的な段階として、特に浄化機能を供するようにデザインされたリガンド又は抗リガンドを投与し、循環するターゲッティング成分−リガンド又はターゲッティング成分−抗リガンドの浄化を促進する。かくして、この二段階プレターゲッティングアプローチにおいて、浄化剤は、直接的に、又は予め投与しておいた標的細胞結合化ターゲッティング成分−抗リガンド又はターゲッティング成分−リガンドコンジュゲートを介して標的細胞集団に結合することはない。
本発明のプレターゲッティング方法におけるターゲッティング成分はそれが規定の標的細胞集団、例えば腫瘍細胞に結合する機能特性を有する。この点で有用な好適なターゲッティング成分は抗体（ポリクローナル又はモノクローナル）であり、例えばヒトモノクローナル抗体又は「ヒト化」ネズミもしくはキメラ抗体も本発明に係るターゲッティング成分として有用である。ヒト化抗体の一部の例にはCHO産生されたもの、宿主、例えば植物（例えばトウモロコシ、ダイズ、タバコ等）、昆虫、哺乳動物、酵母及び細菌において産生されたものが挙げられる。ヒト化抗体は抗体NR-LU-13の結合した抗原に結合するものであってよい。好ましくは、ヒト化抗体はＮ結合グリコシル化を有さないか、又は免疫原性もしくは毒性を抑制するためにそのＮ結合グリコシル化が後発現改質されたものであってよい。
課題のヒト化抗体はその他の診断又は治療活性薬に付加されていないときでさえも抗腫瘍活性を潜在的に有し得、その理由はヒトエフェクター機能を供しうるヒト定常配列の存在にある。しかしながら、抗体（治療又は診断薬）コンジュゲートは治療及び診断のみにおいて既知の用途を有するが、本発明の好適な態様において、ヒト化抗体が模範的なターゲッティング成分としてこのプレターゲッティング方法において利用されるであろう。
本発明において利用するのに適当なリガンド／抗リガンドにはビオチン／アビジン又はストレプトアビジン、ハプテン及びエピトープ／抗体、フラグメント又はその類似体、例えば擬似体、レクチン／炭水化物、亜鉛フィンガータンパク質／ds DNAフラグメント、酵素インヒビター／酵素、並びに類似体及びその誘導体が含まれる。好適なリガンド及び抗リガンドは少なくとも約ＫA≧109Ｍ-1又はKD≦10-9Ｍの親和力をもって互いと結合する。ビオチン／アビジン又はストレプトアビジンが好適なリガンド／抗リガンドペアーである。
一般にかかるプレターゲッティング方法には好ましくは浄化機能を供する抗リガンドの投与が挙げられる。この浄化はおそらくは血液の中で循環するコンジュゲートの架橋及び／又は凝集に寄因し、それは受容者のRES（網状内皮系）による複合／凝集浄化を招く。本発明の一の態様において、このタイプの抗リガンド浄化は好ましくは多価分子により成し遂げられる。しかしながら、それ自体RESにより浄化するのに十分なサイズの単価分子も採用できうる。
他方、レセプター、例えばアシュウェルレセプター又はその他のレセプターを基礎とする浄化メカニズムを、肝臓を介する抗リガンド、抗リガンドコンジュゲート又はヒト化抗体の浄化を供するようヘキソース残基、例えばガラクトース又はマンノース残基の添加により開発できうる。かかる浄化メカニズムは上記のRES複合体／凝集体浄化メカニズムほど浄化剤の価値にあまり依存しない。
例えば、もし浄化を供するためにターゲッティング成分−リガンド又はターゲッティング成分−抗リガンドが誘導化されているなら（即ち、ヘキソース残基の添加）、浄化剤は必要でないであろう。好適な浄化剤は米国特許第5,624,896及び5,616,690号；並びにPCT出願公開番号WO95／15978に記載されている。
本発明の診断及び治療活性剤には抗腫瘍剤、例えば放射性核種、サイトカイン、薬剤及び毒素が挙げられる。
本発明において有用な放射性核種にはガンマー放射剤、ポジトロン放射剤、オーガー（Auger）電子放射剤、Ｙ線放射剤及び蛍光放射剤が挙げられ、治療用途のためにはベーター又はアルファー放射剤が好ましい。放射性核種は当業界において周知であり、そして123Ｉ，125Ｉ，130Ｉ，131Ｉ，133Ｉ，135Ｉ，47Sc，72As，72Se，90Ｙ，88Ｙ，97Ru，100Pd，101mRh，119Sb，128Ba，197Hg，211At，212Bi，153Sm，169Eu，212Pb，109Pd，111In，67Ga，68Ga，64Cu，67Cu，75Br，76Br，77Br，99mTc，11Ｃ，13Ｎ，15Ｏ，166Ho及び18Ｆが挙げられる。治療用放射性核種には188Re，186Re，203Pb，212Pb，212Bi，109Pd，64Cu，67Cu，90Ｙ，125Ｉ，131Ｉ，77Br，211At，97Ru，105Rh，198Au，166Ho及び199Ag or 177Luが挙げられる。
その他の抗腫瘍剤、例えば増殖細胞に対する活性剤が本発明において有用である。典型的な抗腫瘍剤にはサイトカイン、例えばIL−２，IL−12、インターフェロンα，β又はγ、腫瘍壊死因子等、レクチン炎症応答プロモーター（セレクチン）、例えばＬ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、Ｐ−セクチン等及び類似の分子が挙げられる。
ここで利用するのに適当な薬剤には慣用の化学治療剤、例えばビンブラスチン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、メトトレキセート、５−フルオロウラシル、６−チオグアニン、シタラビン、シクロホスファミド及びシス−プラチナ、並びにCancer: Principles and Practice of Oncology,第２版，V．T．DeVita，Jr.，S．Hellman，S．A．Rosenberg，J．B．Lippincott Co.，Philadelphia，PA，1985第14章に記載のその他の慣用の化学治療剤が含まれる。本発明に属する好適な薬剤はトリコセセンである。本発明の実施における診断又は治療活性剤としてここで利用するのに適当なその他の好適な薬剤にはNCI Investigational Drugs，Pharmaceutical Data 1987，NIH公開番88−2141，1987年八月改訂版に記載の実験用薬剤が挙げられる。
本発明において有用な潜在的ないくつかの毒素はＡ及びＢ鎖より成る。Ａ鎖は細胞障害領域であり、そしてＢ鎖はインタクト毒素分子（ホロ毒素）のレセプター結合領域である。この点で好適な毒素にはホロ毒素、例えばアブリン、リシン、モデッシン、シュードモナス外毒素Ａ、ジフテリア毒素、百日ぜき毒素及びシガ毒素；並びにＡ鎖又は「Ａ鎖様」分子が挙げられる。
好適な態様において、当該ターゲッティング成分は本発明のヒト化抗体又はヒト化抗体コンジュゲートを含んで成り、リガンド／抗リガンド結合ペアーはビオチン／アビジン（例えばストレプトアビジン）であり、そして活性剤はプレターゲッティング方法における放射性核種であろう。特に好適なターゲッティング方法は２段階方法であり、そして浄化剤を利用する。好適なヒト化抗体ターゲッティング成分はNR-LU-13の結合した抗原に特異的に結合する抗体及びグリコシル化を有さない又はそのグリコシル化が化学修飾されているヒト化抗体である。
当業者は、本願及びその中に引用する出願における教示に基づき、有効な診断又は治療的に有効な用量及び処置プロトコールを容易に決定できうる。これは例えば特に選定の治療又は診断薬、導入ルート、標的部位のタイプ、注目の標的部位に対するターゲッティング成分の親和力、ターゲッティング成分と正常組織との任意の交差反応性、患者の症状、処置が単独であるか又はその他の処置との組合せであるか、等の要因にとりわけ依存するであろう。
例えば、プレターゲッティング方法におけるヒト化抗体−アビジン又はストレプトアビジンコンジュゲートの場合、適当な用量は約10〜約2500mg、より好ましくは約50〜1500mg、そして最も好ましくは約100〜800mgの範囲であろう。リガンド−活性剤コンジュゲート、例えば放射性核種−ビオチン含有コンジュゲートの用量は一般に約0.001〜約10mg、そしてより好ましくは約0.1〜２mgの範囲であろう。例えば、リガンド−活性剤、Ｙ−90−DOTA−ビオチンの適切な用量は0.1〜2.0mgにおいて約10〜300mCiに範囲する。また、In111は１〜10mCiにおいて単独で、又はＹ90と組合せて使用されうる。放射活性の範囲は採用するアイソトープに依存する。
一般にかかるプレターゲッティング方法には浄化剤の投与が含まれるであろう。浄化剤の用量は循環系から事前投与したコンジュゲートを実質的に、即ち約50％以上、より好ましくは約90％以上、そして最も好ましくは100％近くまで浄化するのに足りる量であろう。一般に、これはヒト化抗体−マトレプトアビジンコンジュゲートの投与の数日後、好ましくは約１〜５日後、より好ましくは少なくとも約１〜２日後に投与されるであろう。一般に、浄化剤をいつ投与するかの決定はターゲッティング成分コンジュゲートの標的取込み及び内性浄化に依存する。特に好適な浄化剤はアシュウェルレセプター媒介浄化を供するもの、例えばガラクトシル化タンパク質、例えばガラクトシル化ビオチニル化ヒト血清アルブミン（HSA）並びにガラクトース及びビオチンを含む小分子浄化剤である。HSAを基礎とする浄化剤の場合、浄化剤の典型的な用量は約100〜1000mg、そして好ましくは約200〜500mgの範囲であろう。
浄化剤を投与するなら、リガンド−活性剤コンジュゲートは好ましくは約２〜12時間後に投与する。
当該コンジュゲートは公知の投与方法により投与されうる。公知の投与方法には、例えば腹腔内注射、静脈内注射、筋肉内注射、鼻内投与がとりわけ挙げられる。静脈内投与が一般に好ましい。
本発明を下記の実施例により更に説明する。これらの実施例は本発明を制限するものではない。
実施例
実施例１
NRX451のヒト化配列
本質的に、NR-LU-抗体の可変領域をコードするcDNA配列（抗体産生ハイブリドーマはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションにATCC受託番号SD3273として寄託され、そしてATCC寄託番号＿＿＿＿＿へも変更されている）をクローニングし、そして公知の方法により配列決定した。クローニングしたNR-LU-13の軽鎖及び重鎖配列のcDNA配列を図２に含ませている。これらの配列を利用し、全可変軽鎖及び可変重鎖領域を含むNR-LU-13のFv領域のアミノ酸配列を推定した。
Ａ．ヒト化プロトコール
簡単には、ヒト化プロトコールは図１に概略する配列分析及び分子モデリングのサイクルを含んで成る。配列ヒトAbデーターはイムノグロブリン配列データーベースより入手し（E．A．Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest，US Department of Health and Human Services,第５版、1991）、そして構造データーはBrookhavenデーターバンクより入手した（F．C．Bernsteinら、J．Molec．Biol．112: 535-42，（1977））。
NR-LU-13の抗体重鎖及び軽鎖配列をヒト配列ペアー（同一のクローンに由来するイムノグロブリン軽鎖及び重鎖）のデーターベースと比較した。この比較に基づき、最も同一性の高いヒト配列を選定し、グラフ化抗体のフレームワークを供した。NR-LU-13のネズミ相補性決定領域（CDR）の配列を選定のヒトフレームワークに移した。このプロセスは「一次」ヒト化Fv配列を供した。
次にこの一次ヒト化配列を三次元モデルにおいて配列を検査することにより精製した。モデルはオリジナルのネズミ配列及び一次推定ヒト化配列より構築した。ネズミモデル及びヒト化モデルにおける均等な残基位置を比較した。CDRの構造を乱すものと推定されるヒト化モデルにおける残基は「もどし突然変異させた」、即ち、ネズミフレームワーク残基を保存させた。次いで改変配列を利用してモデルを構築し、そして再びネズミFvモデルと比較した。「もどし突然変異」をモデル化し、そしてそれをネズミモデルと比較するこのサイクルを、ヒト化モデルにおけるCDRのコンホメーションが親ネズミモデルにおけるCDRコンホメーションと近似するまで続いた。NR-LU-13に由来する課題のヒト化重鎖及び軽鎖配列をもたらすこの特異的な段階式プロセスを図１に含ませている。
Ｂ．配列分析
NR-LU-13抗体の可変配列を、機能性抗体と共に発現されるCDRのわかっている58組のκ−重鎖ペアーと比較した。最も同一性の高い配列ペアーはヒト抗体クローンR3.5H5G’CL（A．Manheimer-Loryら、J．Exp．Med．174: 1639-52（1991））に由来するものであることが見い出された。NR-LU-13抗体はκＶ／ｈIIｃ鎖ペアーを含む。R3.5H5G’CL抗体はκＩ／ｈＩ鎖ペアーである。従って、軽鎖及び重鎖の両者を最も相同性であるヒトクラスから選定した。
NR-LU-13軽鎖及び重鎖配列を異常配列位置を同定するためにイムノグロブリン配列のデーターベースと比較した。各残基位置の相対的な頻度は、重鎖フレームワーク領域３（HFR３）がNR-LU-13抗体配列内で最も異常な領域であり、そして特に位置Cys181が異常であることを示した。調べたほとんどの配列において（90％）、この位置はTyr残基で占められ、ＶL／ＶH−界面の必須要素を成していた。選定位置内での残基頻度を図7a−7fに示す。
Ｃ．構築体のモデリング
ｉ．プロトコールのモデリング
モデルはMartinら、Proc．Natl．Acad．Sci.，USA 86: 9268-72（1989）及びPedersenら、Immunomethods 1: 126-36（1992）に記載の合成アルゴリズムを利用して構築した。
可能な限り、CDRは標準ループ（Crothiaら、Nature 342: 877-83（1989））からモデル化した。残りのループはデーターベースサーチと最初の方法の組合せを利用し、R．E．Bruccoleri and M．Karplus，Biopolymers 26: 137-68（1987）のコンホメーションサーチプログラムCOGENを用いてモデル化した。NRX451 CDRの場合、Ｌ１，Ｌ２，Ｌ３，Ｈ１及びＨ２は標準ループから構築した。CDR H3はCDRの土台でのデーターベースサーチ及びコンホメーション空間の飽和を試みるループの中央部の最初のフラグメントサーチを利用して構築した。CDR H3は標準ループの骨格原子及びフレームワーク残基由来の全ての原子のみを含む結合部位上に構築した。CDR側鎖は全てCOGENを利用して再構築させた。
これらのモデルはエネルギーが最少限となっている。この最少化において、フレームワークの骨格は固定してあるが、フレームワーク側鎖及びCDRは可動式である。
ii．「もどし突然変異」の概略
CDR-グラフト化NRX451（「一次」みかけ配列）からの一次「もどし突然変異」（ネズミフレームワーク残基の置換）を同定し、そこでCDRの標準分類をフレームワーク配列の変化により変えた。一位置のみが同定された…Arg193（R3.5H5’GCL）／Ala193（NRX451）。この位置はCDR H2の標準決定基である（グラフト２及びその後に組込まれている）。R3.5H5G’CLフレームワーク配列内に改変残基タイプをもつCDR残基の５Ａ内の任意の残基位置を、側鎖又は骨格コンホメーションがNRX451とR3.5H5G’CLモデルとの間で有意に変化しているなら、「もどし突然変異させた」。このようにして残基位置Ser55，Thr141，Tyr181，Ala182，Met191，Ser198及びAla218を「もどし突然変異させた」（グラム４及びそれ以降に組込む）。
最後に、R3.5H5G’CLフレームワーク及びNRX451フレームワーク間での全ての残基相違を目視検査した。CDRに近い２つの更なる残基位置が同定され（Thr75及びPhe77）、そして「もどし突然変異させた」。
iii．ヒト化モデル
最後のNRX451／R3.5H5G’CLモデルにおいて、NR-LU-13とNRX451ヒト化配列との間で相違する軽鎖及び重鎖可変領域の残基は主にFvドメインの土台からFabフラグメントのＣ領域に向かって存在していた（図５参照）。モデルをProCheck（v.2.1）を用いて分析した（R．A．Laskowskiら、Instruction Manual「Procheck v.2.1: Programs to check the stereochemical quality of protein studies」Oxford Molecular Ltd．（1993））。図６はNR-LU-13及びNRX451に由来する第一ヒト化Fvの分子モデルを含む。
４．ヒト化配列
ヒト化軽鎖及び重鎖配列はそれぞれNR-LU-13に由来し、NRX451重鎖及び軽鎖と称し、図３及び４に示す。NR-LU-13及びヒト化NRX451の可変配列を図５に並べる。それらの鎖に別々に番号付けをする。
かくして、これらの配列に基づき、かかるヒト化可変領域をコードするDNAが合成される。
実施例２
ヒト化可変領域の構築のための一般的方法論
可変領域の合成
ヒト化可変領域を一連の重複オリゴヌクレオチドとして合成した。各完全可変領域は長さ400〜500塩基とした。
約16通りのオリゴヌクレオチド（オリゴ）を重鎖及び軽鎖の双方をカバーするために合成した。オリゴは40〜88塩基のサイズに範囲する。アニーリングした遺伝子フラグメントをPCRにより増幅し、そしてクローニングした。各可変領域はクローニングを促進するための制限部位、真核細胞から分泌を誘導するためのリーダー配列、及び定常領域との正確な接続を可能にするスプライスドナー部位を含んだ。
真核系発現ベクター
真核細胞を安定的にトランスフェクションせしめ、且つ抗体鎖の高レベル発現を誘導するベクターを構築した。CMVプロモーター及びエンハンサー並びにネオマイシン耐性遺伝子を含む市販のベクターを第二CMVプロモーター及びエンハンサー、イムノグロブリン定常領域及びDHFR遺伝子を含むように改変させた。
ベクターpCDNA３はInvitrogen Corp．（San Diego，CA）より購入した。このベクターを図８に示す。pCDNA３のネオマイシン耐性遺伝子は真核細胞におけるＧ418耐性トランスフェクタントの選択を可能にする。このベクターは選択及びＥ．コリ内での増殖を可能にする原核系要素を含む。
第二CMVプロモーター及びエンハンサー領域をPCRを利用して付加し、存在するCMV要素をコピーし、次いでpCDNA３の中に挿入した。詳しくは、オリゴヌクレオチドNX62（CCTGACGAATTCGTTGACATTGATTATTGAC）及びNX63（CCTGACGCGGCCGCTTCGATAAGCCAGTAAGC）を合成し、CMVの５′及び３′末端のそれぞれにアニーリングした。NX62及びNX63を合成してEcoRI及びNotＩ制限部位のそれぞれを導入した。PCRは標準のプロトコールにより実施し、そして得られるフラグメントをEcoRI及びNotＩにより制限消化した。プラスミドpCDNA３を同様に消化し、そしてそのフラグメントを当業界周知の標準手順により挿入した。得られるプラスミドをpCMV４と命名する。
カッパー定常領域及び先行するイントロンをPCRによりヒト末梢血液リンパ球DNAから単離した。オリゴヌクレオチドNX64（GTTCGGCTCGAGCACAGCTAGCATTATCTGGGATAAGCATGCTG）及びNX65（GTTACGGGGCCCCTAACACTCTCCCCTGTTGAAG）を合成し、定常領域エキソンに先行するイントロン及び定常領域の３′末端のそれぞれにアニーリングさせた。NX64はXhoＩ及びNheＩ制限部位の双方を含む。NX65は定常領域停止コドンに続くApaＩ制限部位を含む。PCRは標準の手順により実施した。このフラグメントをXhoＩ及びApaＩで消化し、そして標準のプロトコールによりpCMV14に挿入した。得られるプラスミドをpC４−CK３と命名する。
先行するイントロン及び後続するポリアデニル化部位を含むヒトガンマー１定常領域をヒトプラスマ細胞腫（MC／CAR，ATCC CRL 8083）DNAからPCRにより単離した。オリゴヌクレオチドNX66（GTACGCGGATCCCAGACACTGGACGCTG）及びNX67（CATTCGGAATTCGAACCATCACAGTCTCGC）を合成し、先行するイントロン及びポリアデニル化部位のそれぞれとアニールさせた。NX66はBamHI部位を含む。NX67はポリアデニル化部位に続くEcoRI部位を含む。PCRは標準の手順により実施した。フラグメントを標準の手順によりpCDNA３に挿入した。得られるプラスミドをｐガンマー１−４と命名した。
重鎖及び軽鎖のヒト化可変領域を同じようにして合成した。一式の８種の重複オリゴヌクレオチドを各可変領域及び天然ネズミリーダー配列のそれに合成した。内部の６種のオリゴヌクレオチドは長さ79〜88塩基であり、19〜26塩基対重複する。外部のオリゴヌクレオチドは長さ40〜44塩基であり、制限部位を含む（Vh; HindIII及びBamHI，Vk; NotＩ及びNheＩ）。３′外部オリゴヌクレオチドはイントロンスプライスドナー部位を含む。PCRは１pmolづつの内部オリゴヌクレオチド及び30pmolづつの外部プライマーを含んだ。反応の温度プロフィールは下記の通りとした：94℃で５分１サイクル及び72℃で５分１サイクルの得られるPCR生成物を適当な酵素で消化し、そしてpC４−CK３（Vk）又はｐガンマー１−４（Vh）に挿入し、プラスミドpVKE及びｐ４ガンマーＢのそれぞれを供した。双方のプラスミドをBalII及びEcoRIで制限エンドヌクレアーゼ切断した。pVKEに由来する６キロベース（kb）のフラグメント及びｐ４ガンマーＢに由来する3.2kbのフラグメントを連結してpWE1A2を形成させた。プラスミドpWE1A2は本質的にゲノム（イントロン含有）形態の完全ヒト化重鎖及び軽鎖を含んだ。pWE1A2でトランスフェクションしたCOS及びCHO細胞からの抗体発現は非常に弱かった。
このプラスミドをcDNA形態の抗体遺伝子を含むように改変させた。更なるBGHポリアデニル化領域を重鎖cDNAに続くように付加した。DHFR遺伝子及びコントロール要素を加えた。
BGHポリアデニル化領域をPCRを利用してpCDNA３からコピーし、そしてBamHI／EcoRIフラグメントとしてpWE1A2に挿入した。得られるプラスミドはガンマー定常領域を欠くが、XbaＩ／BamHIフラグメントとしてcDNAガンマー鎖に適合しうるようになっている。
RNAを市販のRNA抽出キット（Glass Max，Gibco BRL）によりpWE1A2トランスフェクションCHO（dhfr）細胞から抽出した。逆転写酵素−PCR（RT-PCR）を製造者の仕様（Perkin Elmer Cetus）に従って実施した。この手順において、ガンマー鎖定常領域の３′末端にアニールするNX109（GCTGACGAATTCTCATTTACCCGGAGACAGGGAG）を、ガンマー鎖メッセンジャーRNAをcDNAへとコピーする逆転写酵素反応を特異的にプライミングするために用いた。重鎖可変領域内にアニールするNX109及びNX110（CCGTCTATTACTGTTCTAGAGAGGTC）を逆転写反応において作製したDNAを増幅するために用いた。PCRプライマーはクローニングを促進するためのBamHI（NX109）及びXbaＩ（NX110）制限部位を含む。制限PCR生成物をこのプラスミドの中に挿入してp1A2.C1を形成した。
DHFR遺伝子転写ユニットをこのプラスミドに加えて真核細胞における遺伝子増幅を可能にした。DHFRコード配列にはSV40プロモーターが先行し、そしてSV40ポリアデニル化シグナルが後続する。DHFR及びコントロール要素をコードするDNAをPCRにより作製し、そしてp1A2.C1に挿入してプラスミドp61.1を形成した。
軽鎖遺伝子を重鎖に利用したものと同じプロセスによりcDNAへとスイッチした。カッパー定常領域の３′末端にアニールするオリゴヌクレオチドNX65（GTTACGGGGCCCCTAACACTCTCCCCTGTTGAAG）を逆転写のために用い、次いでNX65及びNXK1（CAGCGTGCGGCCGCACCATGGACATCAGGGCTCCTGCTCAG）を全カッパー鎖遺伝子のPCR増幅のために用いた。PCR生成物をp61.1に挿入し、pNRX451を形成した。このプラスミドを図９に示す。
実施例３
最終クローンの発現及び単離
NRX451
C2-451C4-100NMHP-2μＭ HP-161 E12-50μＭ-12G4-3E7
CHO（dhfr-）（ATCC CRL 9096）細胞を６穴プレートの中で線状化pNRX451プラスミドによりLipofectate（商標）（Gibco）を用いてトランスフェクションした。トランスフェクション細胞を10％の透析胎児牛血清（dFBS）（Sigma）並びに１Ｘのヒポキサンチン及びチミジン（Gibco）を含むIscove改良Dulbecco培地（IMDM）（Gibco）の中で回収した。２日間の回収後、トランスフェクション細胞をまだ10％のdFBS及び800μｇ／mlのGeneticin（登録商標）（Gibco）を含むがヒポキサンチン及びチミジンを欠くIMDMの中で選別した。
生存細胞を10％のdFBS及び100nMのメトトレキセート（Sigma）を含むIMDMの中で96穴プレートにおいて1000細胞／ウェルで遺伝子増幅にかけた。14回目の上清液を抗体産生についてガンマー／カッパーELISAで試験した。最高の生産ウェルを選び、そしてプールし、そしてC2-451C4-100nM HPと命名した。
次に細胞を10％のdFBS及び２μＭのメトトレキセート含むIMDMの中で96穴プレートにおいて100細胞／ウェルで増幅させた。14回目の上清液をガンマー／カッパーELISAで試験した。最高の生産ウェルを選び、そしてプールし、そしてC2-451C4-100nM HP-２μＭ HPと命名した。
このプールを10％のdFBS及び２μＭのメトトレキセートを含むIMDMの中で96穴プレートで１細胞／ウェルでクローニングした。14の21日目上清液をガンマー／カッパーELISAで試験した。最高の産生クローンを10％のdFBS及び２μＭのメトトレキセートを含むIMDMの中に維持し、そして10％のdFBS及び10.50又は200μＭのメトトレキセートを含むIMDMへと継代した。
最高の生産クローンを選び（C2-451C4-100nM HP-２μＭ HP-161 E12-50μＭ）、そして細胞バンキングの前に10％のdFBS及び50μＭのメトトレキセートを含むIMDM中での96穴プレートにおける２ラウンドの限界希釈にかけた。最終クローンをC2-451C4-100nM HP-２μＭ HP-161 E12-50μＭ-12G4-3E7と命名した（抗体産生ハイブリドーマはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションにATCC受託番号SD3273として寄託し、ATCC受託番号＿＿＿＿＿へと変更している）。
実施例４
NRX451の免疫反応性
ヒト化NRX451抗体は比較としてネズミNRLU-10を用いる競合免疫反応ELISAによる決定に従い免疫反応性を示した。これらの結果を図11に示す。これらの結果は、ヒト化抗体がNRLU-10の免疫反応性の65％より高い反応性を示すことを示した。
競合免疫反応ELISAのプロトコールは下記に示す。
競合免疫反応ELISA
免疫反応性を競合結合ELISAで評価し、ここでは標準のネズミNRLU-10及び試験抗体をKSA抗原陽性LS174細胞系のNP40（Sigma）抽出物に対する結合についてペルオキシダーゼラベル化ネズミNRLU-10と競合させている。
プレートの準備：96穴プレートにLS174のNP40抽出物最適希釈物を100μl／ウェルでコーティングする。乾くまで37℃で一夜インキュベーションする。
試薬の準備：
希釈液：PBS＋５％のニワトリ血清（Sigma）＋0.5％のツイーン20（Sigma）（PCT）
標準及び試験抗体：
標準及び試験抗体をPCTで12μｇ／mlと希釈する。
PCTの中で９回のlog２希釈を実施する。
ペルオキシダーゼNRLU-10:
PCTの中で最適濃度にまで希釈。
100μｌのペルオキシダーゼ−NRLU-10を500μｌづつの標準希釈品に加え、そして試験抗体を最終濃度10μｇ／ml（66.67nM）〜0.2μｇ／mlにする。
アッセイ：プレートを自動プレートワッシャーを用いてPBS＋0.5％のTween20で洗浄する。
100μｌの各希釈品を二重でプレートに加える。室温で60分インキュベーションする。
上記の通り洗浄する。
100μｌの基質バッファーを各ウェルに加える。
室温で30分インキュベーションする。
自動プレートリーダーで測定する。
計算：曲線を同一スロープにフィットさせるデーターのlog-logit変換の後、50％の阻害のために必要な未ラベル競合抗体の濃度（ｋ）を決定する。
ｋ標準／ｋ試験×100＝％免疫反応性
実施例５
研究間で放射性ラベル抗体の組織取込みにおける若干の変動が観察される。２種類の抗体構築体のin vivo比較のための最良の方法はそれぞれを別々のアイソトープ（例えばＩ−131とＩ−125）でラベルし、そして抗体の等モル混合物を腫瘍ヌードマウスに同時注射することを包括する。経験的に、これは生体分布データーからかなりの動物間変差を除去する。これはCHO産生ヒト化NR-LU-13（「NRX451」）及びハイブリドーマ産生ネズミNR-LU-10の比較のために行った。これらは２種類の基本的に相違するタンパク質であるため、絶対薬効における若干の差が予測され、そして認められた。しかしながら、各組織において存在する種々の血液−プール濃度を補正すると、これら２種類のタンパク質は全ての時点において類似の生体分布プロフィールを示すことが見い出された。これは図12から理解し得る。図12に示す値は各抗体構築体について（％注射用量／組織１ｇ）を（％注射用量／血液１ｇ）で徐することにより規定される比である。採取した組織は血液、尾（注射部位）、皮膚、筋肉、骨、肺、肝臓、脾臓、胃、腎臓、小腸及び腫瘍（皮下SW−1222結腸癌外植片）とした。一例を除き全ての主要器官及び組織について全ての組織の平均値が1.0未満であり続け、放射活性の血液系寄与を上まわる放射性ラベル化抗体のわずかな特異的保持を示唆する。例外は腫瘍であり、双方の構築体は一貫してほぼ同程度の上昇する特異的な経時的局在化を示した。このデーターは完全免疫反応性がヒト化構築体により保持され、そしてヒト化プロセスにより生非標的組織生体分布における若干の乱れが供与されるというin vitro評価を裏付けする。
CHOも幼虫NR451もGMP純度で製造された事実にもかかわらず、事前二重同時注射研究を上記と同一の外植片で実施した。タンパク質の同時注射の４，24，48及び168時間後に実施した生体分布の結果はそれらが著しい総合局在パターンを有することを示した。フローサイトメトリーによっても赤血球、顆粒球、単球又はリンパ球に対するNR-LU-10の検出可能な結合はなかった。
NRX451の各形態の薬効及び生体分布分析をヒト結腸癌腫外植片（SW122）を抱えるヌードマウスで実施した。図13はCHO細胞、タバコ植物細胞及び幼虫において産生されたNRX451の生体分布を示す。各状況における抗体を125Ｉで放射性ラベルした。１グループ当り４匹のマウスに尾静脈を介して50又は100μｇの抗体を注射した。血液、尾、肝臓、脾臓、胃、腎臓、小腸及び腫瘍における放射能の分布を４，24，48，120及び168時間目に決定した。
総合パターンは血液及び全軟質組織における抗体の連続時点での一貫した濃度の下降を示した。in vivo免疫反応性は24−168時間の全時点での腫瘍、対、血液カウント数の正の比及び０−48時間での腫瘍カウント数の上昇により実証された。各器官において血液プール活性を上まわる放射性ラベルの有意な非標的保持は認められなかった。
実施例６
NRX451の化学改質
実施例１〜３に従って製造したNRX451の化学修飾のために利用する酸化／還元方法を説明する。本実施例において、50mgのCHO生産されたNRX451を50mlのエーレンマイヤーフラスコの中でリン酸緩衝食塩水（PBS）により5.0mg／mlに希釈した。この溶液をマグネチックスタープレートを利用して150rpmにて本手順を通じて常に撹拌しておいた。この抗体溶液に1.0ml（10％ｖ／ｖ）の0.4Ｍのリン酸ナトリウムpH7.0を加え、最終溶液のpHを7.0にした。次いでメチオニン（8.2mg）をこの反応混合物に加え、最終濃度を5.0mMにする。この酸化段階のため、117.6mgのメタ過ヨウ素酸ナトリウム（NaIO4）をこの撹拌抗体溶液に加え、50mMの最終濃度にする。この酸化溶液を25℃で20分撹拌し、次いでこの反応混合物を310μｌのエチレングリコールでクエンチングした。更に20分経過後、この反応混合物を低温の0.5Ｍの硼酸ナトリウムpH9.0（最終容量25％）及び7.44mlのPBSで希釈した。
還元段階のため、上記の溶液を氷浴槽の中で４℃に冷やし、次いで94.6mgの硼水素化ナトリウム（NaBH4）を加えて100mMの最終濃度にする。４℃で３時間撹拌後、この混合物をテトラチオン酸ナトリウムで処理し、そしてこの酸化／還元抗体溶液を適切な保存バッファーPBSでバッファー変換した。
酸化／還元型のCHO生産されたNRX451と非酸化／還元型のCHO生産されたNRX451とのレクチン結合プロフィールを比較して炭水化物修飾の程度を決定した。図14でわかる通り、NRX451及び酸化／還元NRX451のレクチン結合プロフィールには著しい変化がある。ガラクトースに対してアルファー（２−）で末端連結されたシアル酸又は非酸化NRX451上に存在するＮ−アセチルガラクトースアミン及びガラクトース−Ｂ（１−40−Ｎアセチルグルコサミンが改変されていた。これの炭水化物は共に過ヨウ素酸塩による酸化に感受性であり、そして乱されているようである。
C’MC及びADCCアッセイを、NRX451と反応性である抗原を発現する２種類の細胞系MCF-7 ATCC No.HTB 22及びSW1222で実施した。図15ａ及びｂは酸化／還元NRX451にごくわずかなC’MC活性しかないことを示す。しかしながら、未処理NRX451は高レベルのC’MC活性を有した。図15ｃはNRX451の２つのコントロールを示し、その１つはアスパラギン結合型Ｎ−グリセンの全てのタイプを加水分解することで知られる酵素Ｎ−グリコシダーゼＦ（PNGase F）を利用して脱グリコシル化してある。他のコントロールは公知のグリコシル化インヒビターであるシニカマイシンの存在下で培養したNRX451である。双方のコントロールはin vitroアッセイにおいて低いC’MC活性を示した。図15ｄはADCC活性が全てのコントロール及び酸化／還元NRX451に完全に残されていることを示す。NRX451及び酸化／還元NRX451をマウスモデルに注射した場合、図16ａ，ｂ及びｃに示すように生体分布は同じである。
NRX451及び酸化／還元NRX451をGMPに従って調製し、そしてプレターゲッティング方法論に従う適切な用量を癌患者に与え、血液浄化を観察及び比較した。図17は２タイプのNRX451の血液浄化が注射の24時間後に同等であることを示した。
実施例７
CHO発現されたNRX451の臨床活性
この技術の一例において、トウモロコシ（コーン）細胞をNRX451及びNRX451の脱グリコシル化突然変異体の遺伝子を含む適当なベクター（例えば、米国特許第5,120,657；5,015,580；5,149,655；5,405,779；5,503,998；5,506,125；5,525,510又は5,584,807号）でトランスフェクションする。NRX451の脱グリコシル化突然変異体を重鎖上の297位（CH２ドメインの末端）でのAsn→Gln点突然変異の構築により作り、Ｎ結合グリコシル化部位を排除した。抗体を実現させ及び精製し、そしてヒト乳アデノ癌腫細胞系MCF-7（HTB 22 ATCC寄託）に対してADCC及びC’MCについて試験した。
C’MC研究のため、MCF-7細胞（２×106）を51Crで37℃で２時間かけてラベルした。培養培地（DMEM／F12,10％の胎児牛血清）で数回洗浄後、細胞を96穴丸底マイクロタイタープレートにウェル当り104個の細胞で加えた。CHO細胞（哺乳動物）において生産されたNRX451抗体、トウモロコシにおいて生産されたNRX451抗体、及びトウモロコシにおいて生産された脱グリコシル化を５μｇ／mlで始まるlog 10希釈品に加えた。更に、ヒト血清を補体源として、10％の最終希釈率で加えた。ウェルの容量を200μｌにした。37℃で3.5時間のインキュベーション後、プレートを遠心分離にかけ、そして100μｌの容量を各ウェルから集め、そしてPackard Gammaカウンターでカウントした。抗体及び補体により誘導された特異的な放出に加えて、51Crの自発放出を細胞のみを含むウェルの上清液を集めることにより決定した。総放出量は0.1％のNP40をウェルに加え、そして上記の通りに100μｌの容量を集めることにより決定した。特異的な放出は総放出可能量から各試験サンプルの自発放射を差し引き、そして補正済試験放出量を補正済総放出量で徐することにより計算した（％細胞障害率）。全てのサンプルを三重測定で集め、そしてデーターはこれらの値の平均と標準偏差として表わす。
ADCC分析の場合、C’MCに記載のものと同じ手順を利用したが、10％のヒト血清の代わりに、ヒト末梢血液リンパ球エフェクター細胞を25：１のエフェクター：標的細胞の比で加えた。プレートを3.5時間のインキュベーションアッセイの前に遠心分離にかけ、エフェクターと標的細胞との結合を促進させた。
図18及び19は示す結果によれば、CHO細胞においては生産されたNRX451抗体がC’MC及びADCCを効率的に媒介する。更に、トウモロコシ細胞において生産されたNRX451はADCCを媒介するが、C’MCは媒介しない。最後に、トウモロコシ細胞において生産されたAsn→Gln突然変異体はC’MCでもADCCでも媒介において完全に不能であった。
これらの結果は、植物と哺乳動物細胞発現との間での後翻訳修飾の相違を理由にC’MCを媒介できないIgG1ヒト化抗体を製造することができることを示唆する。更に、Asn→Glnの突然変異はグリコシル化部位の破壊を介するADCCの排除をもたらす。まとめると、これらのデーターは発現系の選択又はＮ結合グリコシル化のための一部位突然変異及び植物発現系の組合せに基づき、エフェクター機能について抗体をテーラーメードできることを示唆する。
実施例８
NRX451の部位特異的突然変異誘発
ヒトイムノグロブリン重鎖のCH2-ドメインにおけるＮグリコシル化部位はポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により部位特異的突然変異誘発した。オリゴヌクレオチドNX156（5’AGCAGTAC CAA AGC ACG TAC CGG GTG 3’）及びＮX157（5’TACGTGCTTTG GTA CTG CTC CTC 3’）を合成し（DNAgency，Malvern，PA）、Ｎグリコシル化部位（Asn-Ser-Thr）を含む領域上のヒト重鎖遺伝子のコード（NX156）及び非コード（NX157）鎖にアニールさせた。双方のオリゴヌクレオチドはコドンAAC（アスパラギン）をCAA（グルタミン）へと突然変異させるようにデザインされた２塩基誤対合を含む。PCRの第一ラウンドにおいては、鋳型としてのプラスミドPNRX451及びUltma DNAポリメラーゼを用いる製造者の仕様（Perkin Elmer，Branchburg，NJ）に従う独の反応において、NX156を下流プライマーNX113（5’GCTGACGGAT CCTCATTTAC CCGGAGACAG GGAG 3’）と対合させ、そしてNX157を上流プライマーNX110（5’CCGTCTATTA CTGTTCTAGA GAGGTC 3’）と対合させた。得られるPCR生成物はNX110／NX157プライマーについては476塩基対、そしてNX156／NX113プライマーペアーについては634塩基であり；そして突然変異の上流及び下流のそれぞれに及ぶ重鎖領域を含んで成る。これらのPCR生成物とGeneclean（Biolol，Vista，CA）を介してアガロースゲルから精製し、そしてプライマーNX110及びNX113を用いる第二PCRにおいて連続フラグメントと組合せた。得られるPCR生成物は1190塩基対であり、そして所望の突然変異を含んでいた。この生成物を制限酵素SstII及びBamHIで消化して471塩基対フラグメントを作製し、それを発現ベクターpNRX451の中にクローニングし、Ｎグリコシル化部位含有野生型遺伝子フラグメントを置換した。
実施例９
トウモロコシ種子において生産されたNRX451完全抗体のin vivo評価
トウモロコシ種子由来の精製NRX451完全抗体を125Ｉで放射性ラベルし、そして131Ｉで放射性ラベルしたCHO細胞生産されたネズミNR-LU-10完全抗体と比較した。２種類の抗体（25μｇ／25μｇ）の当モル混合物を皮下SW−1222結腸癌腫外植片をもつヌードマウス（20〜25ｇ）に静脈内注射し、そして血液浄化を同混合物の非腫瘍マウスのi.v.注射に従って評価した。
研究＃１：
Ｔ＝０；25mgの131Ｉ−ネズミNR-LU-10完全抗体（muLU-10）及び25μｇの125Ｉ−トウモロコシ生産されたNRX451完全抗体の混合物を皮下SW−1222結腸癌腫外植片をもつヌードマウス（20〜25ｇ）に注射する。動物を投与の４，24，48，120及び168時間後に殺し、そして解剖する。腫瘍及び非標的組織を秤量し、そして131Ｉ及び125Ｉの検出のためにカウントにかける。非腫瘍Balb／ｃマウスの別のグループに同じ混合物を注射し、そして血液からの放射能の消失速度を比較するために系列血液サンプルを採取した。
結果：
図20に示すように、双方のアイソトープは血液から、早期（α期）分布及び後期消失優先期（β期）の双方においてほぼ同じ速度で消失した。消失半減期はヒト化NR-LU-13抗体（huLu-13）については77.0hr、それに対して同時注射ネズミでは74.3hrであると計算された。血液保持時間に関し、NRX451完全抗体とネズミNR-LU-10との間で有意差はなかった。
同時注射した構築体の生体分布も非常に似ていた。図21Ａ及び21Ｂに示すのは投与後の連続時間での腫瘍マウスにおける血液、軟質組織及び腫瘍放射能濃度である。双方の構築体は全ての軟質組織において類似の下降する濃度を示し、それに血液からの経時消失が続いた。腫瘍を除き、全ての組織において放射能の非特異的保持の徴候はわずかであった。腫瘍取込みプロフィールは48時間まで放射能濃度の上昇を示し、120時間目での％i.d.／ｇ値は連続腫瘍増殖により減少した（実際の値：120時間目での腫瘍における双方のアイソトープの％i.d.は任意の前の時点のそれのほぼ２倍であった）。ネズミ及びヒト化抗体は共に取込みの速度、程度及び保持に関し、定量的に似たような腫瘍取込みプロフィールを示した。各完全抗体のin vivo評価において、huNR-LU-13完全抗体（トウモロコシ種子において発現）とネズミ型（ハイブリトーマ細胞）との間での有意差はなかった。
研究＃２：
デザイン：
Ｔ＝０；ストレプトアビジンに化学接合させた50μｇの125Ｉ−NRX451（NARX451／SA）をSW−1222結腸癌腫外植片をもつヌードマウス（20〜25ｇ）にi.v.注射する。動物を投与後４，24，48，120及び168時間目に殺し、そして解剖した。腫瘍及び非標的組織を秤量し、そして125Ｉの検出のためにカウントにかけた。
結果：
トウモロコシ種子由来の精製NRX451完全抗体の評価を、ストレプトアビジンへのこの材料の化学修飾及びプレターゲッティングした腫瘍導入におけるその後の利用で続いた。しかしながら、まずストレプトアビジンコンジュゲートの評価のみをまず行った。図22に示すのは投与後連続時間での腫瘍ヌードマウスにおける血液、軟質組織及び腫瘍放射能濃度である。腫瘍を除き、全ての組織において放射能の非特異的保持の徴候はわずかであった。腫瘍取込みプロフィールは120時間まで上昇することが示された。総合パターンは連続時点での血液及び全ての軟質組織における抗体の一貫した下降する濃度を示す。in vivo免疫反応性は24−168時間の全時点での腫瘍、対、血液濃度の正の比、及び０−48時間での腫瘍局在化の上昇により実証される。40−50％のID／ｇでピークとなる腫瘍取込みはmuNR-LU-10／SA及び上記の非接合抗体で観察されたものと似ていた。経時的な腫瘍保持はmuNR-LU-10／SAの歴史的なコントロールと似ていた。放射性ラベルの24−168時間の時点での各器官における血液プール活性より高いほとんど有意でない非標的保持が認められた。４時間目での全ての十分に灌流された組織における高い値はこの時点での高い血液プール活性に関連しうる。
研究＃２（続き）
デザイン：
Ｔ＝０；ストレプトアビジンに化学接合した400μｇの125Ｉ−NRX451完全抗体（トウモロコシ種子）（NRX451／SA）を皮下SW−1222結腸癌腫外植片をもつヌードマウス（20〜25ｇ）にi.v.注射する。ｔ＝20時間；1.0μｇの111In−DOTA−ビオチンをi.v.注射する。動物を111In−DOTA−ビオチンの投与の２，24，48及び120時間後（ｔ＝０から28，50，74及び144時間後）に殺し、そして解剖した。腫瘍及び非標的組織を秤量し、そして125Ｉ及び111Inの検出のためのカウントにかけた。別の非腫瘍Balb／ｃマウスのグループには400μｇの125Ｉ−NRX451／SAを注射し、その24時間後に食塩水又は100μｇの合成浄化剤（CN16LCBT）を注射し、そして系列血液サンプルを採取して血液からの放射能の消失速度を比較した。
結果：
図23に示す通り、放射活性は血液から、早期（α期）分布及び後期消失優先期（β期）の双方においてゆっくりと消失した。24時間目での合成浄化剤の注射はオリジナル濃度の＜10％のレベルに至る血液放射能の急降下をもたらした。血液放射活性濃度（＜１％）における若干のリバウンドが24−48時間にて認められ、muLU-10／SAコンジュゲートで達成される歴史的な結果と一致する。血清濃度の底値はプレターゲッティング実験のための低められたバックグランドを供するのに十分であった。
完全プレターゲッティングモードにおけるNRX451／SAの評価は上記の投与スケジュールに従って達成された。図24Ａに示すのは浄化剤及びDOTA−ビオチン投与後の時間でのNRX451／SAコンジュゲートに一体化した125Ｉ放射能の血液、軟質組織及び腫瘍濃度である。血液レベルはかなり低く、非腫瘍マウスにおける研究結果と一致し、そして血液の中に通常存在する放射能は肝臓に局在しており、GN16LCBT浄化剤の利用に関わるレセプター媒介浄化と一致した。図22に示すものよりも明らかに低いが、50μｇのNRX451／SAの投与に由来する図22におけるデーター、対、図24Ａのデーターにおける400μｇのNRX451／SAを考慮すると、腫瘍取込みは事実上NRX451／SAの化学理論量よりも高い。経時的な腫瘍保持時間は同じ投与方式において利用したmuNR-LU-10／SAの歴史的コントロールに似ていた。各器官における血液プール活性及び肝臓により処理される材料を上まわる放射性ラベルのほとんど有意でない非標的保持が明らかである。
図24ＢはDOTA−ビオチン投与に関する対応の血液、軟質組織及び腫瘍の111In放射能濃度を示す。腫瘍を除く全ての組織において低い濃度が認められ、全時点での腫瘍結合放射能の速度、程度及び保持はターゲッティング剤としてmuLU-10／SAを利用して観察されるものと一致した。ストレプトアビジンに対する化学コンジュゲートを利用する完全プレターゲッティング用途において、NRX451完全抗体（トウモロコシ種子において発現）とネズミ型（ハイブリドーマ発現）との間で有意差はなかった。
【図１】
0004503706.tif 000011
【図２】
0004503706.tif 000012
【図３】
0004503706.tif 000013
【図４】
0004503706.tif 000014
【図５】
0004503706.tif 000015
【図６Ａ】
0004503706.tif 000016
【図６Ｂ】
0004503706.tif 000017
【図７Ａ】
0004503706.tif 000018
【図７Ｂ】
0004503706.tif 000019
【図７Ｃ】
0004503706.tif 000020
【図７Ｄ】
0004503706.tif 000021
【図７Ｅ】
0004503706.tif 000022
【図８】
0004503706.tif 000023
【図９】
0004503706.tif 000024
【図１０】
0004503706.tif 000025
【図１１】
0004503706.tif 000026
【図１２】
0004503706.tif 000027
【図１３Ａ】
0004503706.tif 000028
【図１３Ｂ】
0004503706.tif 000029
【図１３Ｃ】
0004503706.tif 000030
【図１３Ｄ】
0004503706.tif 000031
【図１４】
0004503706.tif 000032
【図１５Ａ】
0004503706.tif 000033
【図１５Ｂ】
0004503706.tif 000034
【図１５Ｃ】
0004503706.tif 000035
【図１５Ｄ】
0004503706.tif 000036
【図１６Ａ】
0004503706.tif 000037
【図１６Ｂ】
0004503706.tif 000038
【図１６Ｃ】
0004503706.tif 000039
【図１７】
0004503706.tif 000040
【図１８】
0004503706.tif 000041
【図１９】
0004503706.tif 000042
【図２０】
0004503706.tif 000043
【図２１Ａ】
0004503706.tif 000044
【図２１Ｂ】
0004503706.tif 000045
【図２２】
0004503706.tif 000046
【図２３】
0004503706.tif 000047
【図２４Ａ】
0004503706.tif 000048
【図２４Ｂ】
0004503706.tif 000049