(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
全血液サンプル（ＷＢＳ）内の血球の種々のタイプを区別し列挙する装置であって、
（ａ）  血球（ＢＣ）が逐次流れることができるセル取調べゾーン（Ｚ）を画定する単一のフローセル（ＦＣ）と、
（ｂ）  容器（１０）から血液全体のサンプルを吸引する手段（１２）と、
（ｃ）  前記吸引された全血液サンプルの少なくとも第１のアリコートを配送する手段（１２）と、
（ｄ）  全血液の前記第１のアリコートを溶解試薬に注入し、主として白血球および有核赤血球を含む溶解サンプルを生成する手段（１４）と、
（ｅ）  前記溶解サンプルに含まれる１つもしくはそれより多いセルのサブセットを蛍光物質に注入し、それによって前記セルのサブセットを前記蛍光物質でラベル付けする手段（１４）と、
（ｆ）  計測された分量の前記溶解サンプルを配送する計測手段（１６）と、
（ｇ）  計測された前記分量の溶解サンプルを前記フローセルの前記セル取調べゾーン（Ｚ）中に流し、計測された前記分量の血球が前記セル取調べゾーン（Ｚ）中を逐次流れるようにする手段（１６）と、
（ｈ）  （ａ）血球が、前記セル取調べゾーン中を流れている間、ＤＣ電流が前記セル取調べゾーン中を流れるようにし、（ｂ）前記セル取調べゾーン中を流れているときに前記セルによって引き起こされる前記ＤＣ電流の変調を検出する回路手段（４１、８２、８６）と、
（ｉ）  サンプルの流れる方向に垂直な軸に沿って伝播する放射のビーム（Ｂ）を、前記セル取調べゾーン中を流れる個々の血球に照射する光学手段（４２、６２）であって、前記放射により前記蛍光物質が蛍光を発するようにする手段と、
（ｊ）  前記ゾーン内の照射された血球から拡散した放射を検出する放射拡散検出手段（ＬＤＳ１、ＬＤＳ２）と、
（ｋ）  前記光学手段によって照射された結果、蛍光物質でラベル付けされたセルのサブセットから蛍光を発する放射を検出する蛍光検出手段（ＰＭＴ１〜３）と、
（ｌ）  前記回路手段に、ならびに、それぞれ前記放射拡散手段および蛍光検出手段に、動作可能に結合される分析手段（２０）であって、それぞれＤＣ量（Ｖ）、光拡散（Ｓ）、蛍光（Ｆ）の特性に基づいて、白血球および蛍光物質でラベル付けされたセルの種々のサブセットの各濃度を区別し判定する手段と、を備え、該装置は、
（１）方形プリズム形状であり、かつ、前記サンプル内に形成された物体が一度に１つ通過することができる経路（３２）を画定する光学的透過性要素（３０）であって、前記経路は、各辺が５０マイクロメートルプラスもしくはマイナス１０マイクロメートルである実質的に正方形の、サンプルが流れる方向に垂直な横断面と、サンプルが流れる方向で計測したとき６５マイクロメートルプラスもしくはマイナス１０マイクロメートルの長さと、を有するセル取調べゾーン（Ｚ）を画定する光学的透過性要素を、前記フローセルはさらに備え、
（２）前記回路手段（４１）は、前記ＤＣ電流と同時に前記セル取調べゾーンを通過するＲＦ電流を確立する手段（８４）であって、前記血球のそれぞれが前記ゾーン中の前記ＲＦ電流を前記セルの内部伝導率の関数で変調する手段をさらに備え、
（３）前記分析手段（２０）は、それぞれのＲＦ伝導率（Ｃ）に基づいて白血球および蛍光物質でラベル付けされたセルの種々のサブセットの各濃度を区別し判定するようにさらに動作可能であることを特徴とする装置。
【請求項２】
前記配送する手段（１４）は、吸引された前記全血液サンプルの少なくとも第２のアリコートを配送し、また、前記装置は、
（ｍ）  全血液の前記第２のアリコートを賦形薬に注入して、主として赤血球および血小板を含む希釈サンプルを生成する手段（１４）と、
（ｎ）  前記希釈サンプルを蛍光物質に注入し、それによって、少なくとも１つの選択された赤血球もしくは血小板のサブセットが、当該蛍光物質でラベル付けされる手段（１４）と、
（ｏ）  計測された分量の前記希釈サンプルを配送し、計測された前記分量の前記希釈サンプルを前記フローセルの前記セル取調べゾーン中に流し、この計測された分量の血球が前記セル取調べゾーン中を逐次流れるようにする手段（１６）と、をさらに備え、
前記分析手段（２０）は、それぞれＤＣ量、ＲＦ伝導率、光拡散および蛍光の特性に基づいて、赤血球および血小板の種々のサブセットのそれぞれの濃度を区別し判定する請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記分析手段（２０）は、５個の異なる成熟白血球のサブセットを、それらそれぞれのＤＣ量（Ｖ）、ＲＦ伝導率（Ｃ）および光拡散（Ｓ）の特性の組合せを分析することによって区別する請求項１に記載の装置。
【請求項４】
前記分析手段（２０）は、異常、未成熟、および成熟の白血球のサブセットを、それらそれぞれのＤＣ量（Ｖ）、ＲＦ伝導率（Ｃ）、光拡散（Ｓ）および蛍光（Ｆ）の特性に基づいて区別する請求項１に記載の装置。
【請求項５】
前記フローセルは、電気エネルギー源に接続可能な電極（３８、４０）のペアと、光学要素（５１）であって、前記セル取調べゾーン内で発している放射を外部の光検出器へ前記光学要素を通じて光学的に結合することができる光学要素と、を支持する請求項１に記載の装置。
【請求項６】
前記分析手段（２０）は、計測された前記分量の前記希釈サンプル内の赤血球の絶対数を提供し、計測された前記分量の前記溶解サンプル内の白血球の絶対数を提供する前記回路手段（４１）に応答する請求項２に記載の装置。
【請求項７】
前記放射拡散検出手段は、前記軸に対して１０〜７０度の間の角度範囲内で拡散された放射を検出する第１の光検出器（ＬＤＳ２）を備える請求項１に記載の装置。
【請求項８】
前記第１の光検出器（ＬＤＳ２）は、さらに、前記軸に対して、（ａ）約１０〜約２０度の間、および（ｂ）約２０〜約７０度の間、の角度範囲内で拡散された放射を検出する請求項７に記載の装置。
【請求項９】
前記放射拡散検出手段は、前記軸に対して約９０度の角度で拡散された放射を検出する第２の光検出器（ＬＤＳ１）を備える請求項１に記載の装置。
【請求項１０】
全血液サンプル内のセルの種々のタイプおよびその各サブセットの各濃度を判定する自動化された方法であって、
（ａ）  トランスジューサ内の取調べゾーンを逐次通過する血球の各ＤＣ量（Ｖ）、光拡散（Ｓ）および蛍光（Ｆ）の特性を同時に計測する単一の前記トランスジューサを有するフローセル装置（ＦＣ）を提供するステップと、
（ｂ）  容器から血液全体のサンプルを吸引するステップと、
（ｃ）  前記吸引された全血液サンプルの第１および第２のアリコートを配送するステップと、
（ｄ）  全血液の前記第１のアリコートを溶解試薬に注入し、主として白血球の溶解サンプルを生成する手段と、
（ｅ）  全血液の前記第２のアリコートを賦形薬に注入し、希釈サンプルを生成するステップと、
（ｆ）  前記希釈サンプルもしくは溶解サンプルに含まれる１つもしくはそれより多いセルのサブセットを蛍光物質に注入し、それによって前記セルのサブセットを前記蛍光物質でラベル付けするステップであって、前記蛍光物質は、所定の波長の放射にさらされたときに蛍光を発するステップと、
（ｇ）  計測された分量の前記溶解サンプルおよび希釈サンプルを配送し、それぞれ計測された分量の前記溶解サンプルおよび希釈サンプルが前記取調べゾーン中を流れるようにするステップであって、前記計測された分量内の各前記血球が前記取調べゾーン中を逐次流れるステップと、
（ｈ）  ＤＣ電流が前記取調べゾーン中を流れている間、軸に沿って伝播する前記波長の放射のビームを前記取調べゾーン中を流れる個々の血球に照射するステップと、
（ｉ）  前記取調べゾーン内の照射された血球から発せられた蛍光によって拡散した放射を検出している間において、前記セル取調べゾーンを通過する前記血球によって引き起こされる前記ＤＣ電流の変調を検出するステップと、
（ｊ）  各セルのＤＣ量（Ｖ）および光拡散（Ｓ）の特性に基づいて、前記溶解サンプル内の正常および成熟白血球を区別し計数するステップと、
（ｋ）各セルのＤＣ量（Ｖ）、蛍光ラベル（Ｆ）および光拡散（Ｓ）の特性に基づいて、前記希釈サンプルもしくは溶解サンプル内の白血球、赤血球および血小板を区別し計数するステップと、を包含し、該方法は、
（１）方形プリズム形状であり、かつ、前記サンプル内に形成された物体が一度に１つ通過することができる経路を画定する光学的透過性要素であって、前記経路は、各辺が５０マイクロメートルプラスもしくはマイナス１０マイクロメートルである実質的に正方形の、サンプルが流れる方向に垂直な横断面と、サンプルが流れる方向で計測したとき６５マイクロメートルプラスもしくはマイナス１０マイクロメートルの長さと、を有するセル取調べゾーン（Ｚ）を画定する光学的透過性要素を、前記フローセル装置はさらに備え、
（２）ＲＦ電流が、前記ＤＣ電流と同時に前記セル取調べゾーンを通過し、前記血球のそれぞれが前記ゾーン中の前記ＲＦ電流を前記セルの内部伝導率の関数で変調し、
（３）前記ＲＦ電流の変調が検出されて、種々のセルタイプおよび／または血小板をさらに区別し計数するのに使われることを特徴とする方法。
【請求項１１】
（ｌ）  全血液の第３のアリコートを配送して、この第３のアリコートを、前記第３のアリコート内の少なくとも１つ選択されたサブセットのセルに特有の単一クローンの抗体に結合される蛍光色素を含む試薬に注入するステップであって、これによって、前記選択されたサブセットのセルが当該蛍光色素でラベル付けされるステップと、（ｍ）各セルのＤＣ量（Ｖ）、ＲＦ伝導率（Ｃ）、蛍光ラベル（Ｆ）および光拡散（Ｓ）の特性に基づいて、この選択されたサブセットを区別し計数するステップと、をさらに包含する請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記溶解サンプル内の有核赤血球、芽細胞および未熟セルを、そのセルの各光拡散特性および蛍光に基づいて区別し計数するステップをさらに包含する請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記溶解サンプル内の有核赤血球、芽細胞および未熟セルを、そのセルの各光拡散特性およびＤＣ量に基づいて区別し識別するステップをさらに包含する請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記溶解試薬は、前記蛍光物質を含む請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記蛍光物質はＣＰＯを含む請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記賦形薬は、前記蛍光物質を含む請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
前記蛍光物質を前記溶解試薬へ注入する前に、前記第１のアリコートは、前記蛍光物質が注入される請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
前記蛍光物質はＣＰＯである請求項１０に記載の方法。
【請求項１９】
前記賦形薬は、リン酸塩で緩和された生理的食塩水、コリフォスフィリンＯ（ＣＰＯ）、ドデシル基βＤマルトースおよびプロクリン３００を含む請求項１０に記載の方法。
【請求項２０】
各赤血球のヘモグロビン含有量を、その各ＤＣ量および光拡散特性に基づいて判断するステップをさらに包含する請求項１０に記載の方法。
【請求項２１】
各網状赤血球のヘモグロビン含有量を、その各ＤＣ量、光拡散および蛍光特性に基づいて分析するステップをさらに包含する請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
本発明は、全血液サンプルにおけるセルの、様々な構成成分もしくはタイプを区別して列挙する方法および装置の改良に関する。
【０００２】
〔背景技術〕
種々の病気および疾患の状態を診断するとき、患者の末梢血液を分析することで、成分の血球および血小板の様々なタイプを区別して列挙し、それらに関するある種のパラメータもしくは特徴を判定することは共通することである。種々のタイプの血球の各濃度および比率は、それがどのような疾患であってこのような病気が蔓延する程度を色濃く示すものである。一般に、全血液のサンプルは、様々なセルのタイプを含み、それには、液体媒体もしくは血漿内に漂流している血球および非血球（例えば腫瘍細胞、バクテリアなど）の両方がある。血球には３つの基本タイプがある。すなわち、赤血球（erythrocytes）、白血球（leukocytes）および血小板である。発育のレベルに依存して、赤血球は、しばしば３つのサブセットにさらに分類される。すなわち、有核赤血球（ＮＲＢＣ）、網状赤血球（「レチクス(rectis)」）、および成熟赤血球（ＲＢＣ）である。一方で、成熟した白血球は、異なる５つのサブセットのうちの１つに当てはまる。すなわち、単核細胞(monocyte)、リンパ球(lymphocyte)、好酸球(eosinophil)、好中球(neutrophil)および好塩基球(basophil)である。この白血球のサブセットのそれぞれは、発育、活性化、異常の各レベルに基づいたサブクラスにさらに分類することができる。一般に、赤血球の数は、白血球の数より１０００対１で勝る。血小板は、血を固める能力を制御するという観点から特に重要なものであり、成熟した血小板、網状の血小板、そして大型の血小板の、大体３つのタイプがある。
【０００３】
上述のセルのタイプおよびサブセットのそれぞれの各濃度および比率を判定することに加えて、血液サンプルを徹底的に分析することで、例えば、ヘモグロビン（Ｈｇｂ）濃度、ヘマトクリット値(hematocrit value)（Ｈｃｔ）、平均細胞量（ＭＣＶ）、赤血球、白血球および血小板の単位体積あたりの総数、赤血球の分布幅（ＲＤＷ）、血小板の分布幅（ＰＤＷ）など、様々な血液のパラメータおよび細胞の特性に関する情報が得られるであろう。
【０００４】
上述のセルのタイプのほとんどを検出し列挙することは、上述の細胞のパラメータを判定することと共に、商業的に入手可能な血液分析機器(hematology instrument)のいくつかを使って実現することができる。このような機器としては、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＣｏｕｌｔｅｒのＧＥＮ・Ｓ（登録商標）およびＭＡＸＭ（登録商標）血液分析機器、Ａｂｂｏｔｔ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓのＣｅｌｌＤｙｎｅ３０００／４０００血液分析機器、そして、Ｔｏａの血液分析機器のＳｙｓｍｅｘシリーズ、が含まれる。各細胞タイプに関するデータを自動的に獲得するとき、上述の血液分析機器の全ては、少なくとも２つの離散細胞分析トランスジューサを使う。これらトランスジューサのうちの１つ（もしくは複数）は、白血球の５つの異なるタイプを区別し列挙するのに便利なデータを獲得するように動作し、他のトランスジューサは、正確な分量のサンプル内での赤血球、白血球および血小板の数およびサイズを測定することに専ら使われる。複数のトランスジューサの各出力は、中央処理装置によって処理され、統一的なセル分析レポートを得ることができる。Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒの機器では、電気光学フローセル（トランスジューサ）は、各白血球の分量（Ｖ）、電気伝導率（Ｃ）および光拡散（Ｓ）の特性を示す信号を生成し、これらによって白血球の細胞の５つのタイプである「５要素区別(five-part differential)」が得られる。さらなるトランスジューサは、周知のＣｏｕｌｔｅｒ原理に基づいて動作し、非常に希釈サンプル内の赤血球および血小板を計数する役割と、溶解サンプルにおける白血球を計数する役割とを果たす。３つのトランスジューサからの情報は処理され、ある場合は、関連付けされ（例えば、Ｃｏｕｌｔｅｒトランスジューサによって計数された白血球の絶対数を、電気光学フローセルから得られる、各白血球のサブセットにおける比率をかけることによって）、各セルのタイプもしくはサブセットに関する情報、例えば、分析された血液サンプル全体における各白血球のサブセットの濃度（単位体積あたりの数）を提供する。Ａｂｂｏｔｔ機器では、５要素区別情報は、光拡散および偏光の情報のみを検出する光学フローセルによって得られる。ここで再度確認するが、Ｃｏｕｌｔｅｒ原理で動作するさらなるトランスジューサのペアは、白血球、赤血球および血小板のサイズおよび数を作成する役割を果たす。２つのトランスジューサのそれぞれの出力は、互いに関連つけされて種々のセルのタイプおよびサブセットに関する情報をレポートする。Ｔｏａの機器においては、５要素区別情報は、セルのＤＣ量およびＲＦ伝導率を測定するのみの電気フローセル（Ｃｏｕｌｔｅｒトランスジューサ）のペアによって得られる。種々の溶解試薬は、２つのトランスジューサを通過する前に、血液サンプルの２つ以上のアリコート(aliquots)を別々に処理するのに使われる。第３のＣｏｕｌｔｅｒトランスジューサは、赤血球および血小板を検出して計数するよう動作する。Ｂｅｃｋｍａｎ  ＣｏｕｌｔｅｒおよびＡｂｂｏｔｔ機器におけるように、いくつかのトランスジューサの出力のそれぞれは、関係付けされて５要素区別情報を提供する。
【０００５】
上述のように、従来の血液分析機器は、末梢血液サンプル内の大多数のタイプおよびサブセットを区別し列挙することができるが、全てのセルのサブセット、特に異常もしくは未熟なセルのサブセットを容易には識別することはできない。これらの異常もしくは未成熟なセルが検出され計数される「拡張区別」測定は、まず、顕微鏡のガラススライド上に興味のあるサンプルの血液のスミア(smear)を手動で生成し、このスミアを染料で着色して細胞を視覚化し、これによって興味のある異常もしくは未熟を、他のセルから視覚的に区別できるようにし、そして、このようにして得られた着色された血液のスミアを顕微鏡で検査する。この代替例として、拡張区別測定のいくつかの血液のタイプは、従来のフロー血球計算器(cytometer)を使って検出することができる。このような機器においては、例えば、（１）興味のあるセルに選択的に「タグをつける」役割を果たす蛍光色素でラベル付けされた単一クローンの抗体などのようなものをサンプルに混ぜるか、あるいは、（２）興味のある染料を選択的にマスクする蛍光染料をサンプルに混ぜるかすることによって予め準備された血液サンプルが光学フローセルを通過する。サンプル中の各セルはフローセルを通過する間、興味のあるセルに関連する蛍光物質を励起するフォトンのビームが照射させられる。ラベルが付けられたセルのそれぞれによって発せられる蛍光の放出は、各セルにより拡散された放射と共に検出され、サンプル内の他のセルから興味のあるセルを区別するのに使われる。商用の、スタンドアロンの、フロー血球計算器は、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｔｏａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ、Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ、Ｂｉｏ−ＲａｄおよびＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎによって作られる。フロー血球計算器と血液分析機器とを統合して単一の自動実験システムにすることは従来技術として知られているが、このシステムでは、血液サンプルは、順路に沿って自動的に区別機器を通過して進んでいく。サンプルを含むガラス瓶は各機器を通過する間、血液サンプルが各ガラス瓶から吸引されて機器によって分析される。離散血液分析およびフロー血球計算器機器を結合する機器システムは、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＣｏｕｌｔｅｒおよびＴｏａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓで商業的に入手可能であり、参考として例えばＴｏａのＨＳＴシリーズがある。
【０００６】
米国特許第5,631,165号および第5,565,499号では、血液分析およびフロー血球計算装置の各機能を完全に統合して単一の装置とする試みがなされている。このような装置は、複数のトランスジューサであって、蛍光を発し、かつ、マルチアングル光拡散をする光学フローセルを含むトランスジューサと、電気インピーダンス測定トランスジューサ（Ｃｏｕｌｔｅｒトランスジューサ）と、血液サンプルの全ヘモグロビン含有量を測定するカラーメータと、を備える。これらのトランスジューサの各出力は、処理され関係付けされ、赤、白および蛍光のセルに関するレポートを得ることができる。
【０００７】
上述の提案のように、セルのタイプもしくはサブセットの特性をレポートするために、複数のトランスジューサの各出力を関係付けさせる必要があるという点は、ある状況の下では、分析結果の不確かさを誘発するという問題点を含み得る。必要不可欠である関連付けステップの妥当性は、１つのトランスジューサによって処理されたサンプルは、他のトランスジューサによって処理されたのと含有量が一致するということを前提としている。いつもこうであるとは限らない。理想的には、セルに関する測定の全ては、同じトランスジューサによって同時になされるべきである。このような場合、独立もしくは離散したトランスジューサからのデータを関連付けする必要なない。さらに、単一のトランスジューサを使って単一のセルに関する複数のパラメータを同時に測定することは、離散したトランスジューサを使ってはできないような、あるいは、パラメータの測定がちょうどそのときに空間的に離散している場合における単一のトランスジューサでさえ使ってはできないような、多次元セル分析を可能とするのである。
【０００８】
単一の電気光学トランスジューサを使って、単一のセルに関する分量（Ｖ）、伝導性（Ｃ）、光拡散（Ｓ）および蛍光（Ｆ）を同時に測定することの望ましさは、従来例において既に提案されている。上述のように、このようなトランスジューサは、１つのトランスジューサで１つのセルに関していくつかの測定を行い、他のトランスジューサを使って同じタイプの別のセルに関して別の測定を行い、そして、２つのトランスジューサから得られた結果を関連付けする試みを行ってセルサンプルについてのある種の結論を引き出すものに比べ、同じセルについて同時に全て測定することができるという利点をもたらす。Ｔｈｏｍａｓ他による開示であるＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｖｏｌ．２５、Ｎｏ．７、ｐｐ８２７〜８３５（１９７７）では、セルの自動マルチパラメータ分析器（ＡＭＡＣ）が提案されている。このような分析器は、種々のセル特性、すなわち、上述のＶ、Ｃ、ＳおよびＦ特性を同時に測定できる単一のトランスジューサを備える。このＴｈｏｍａｓらの文献では、２つの異なる電気光学フローセル(electro-optical flow cell)が開示されており、一方のフローセル（ＡＭＡＣ  ＩＩＩ）は、一辺が１００マイクロメートルである正方形を横断面とするフロー通路を有し、もう一方のフローセル（ＡＭＡＣ  ＩＶ）は、円形の横断面を有する。ＡＭＡＣ  ＩＶフローセルは、製造し易さの点で利点を有するが、一方でＡＭＡＣ  ＩＩＩフローセルは、その平面な幾何形状および光収差を低減する固有能力ゆえに好ましく、それによって、励起ビームの放射をセルのパスへよりよく焦点を合わせることができ、また、セルの蛍光を光検出器によりよく結びつけることができる。Ｖ、Ｃ、ＳおよびＦを同時に測定することは提案されているが、ＡＭＡＣのＩＩＩもしくはＩＶのフローセルのどちらについてもこのような測定に使われたかについては明らかにしていない。このＴｈｏｍａｓらの文献では、例えば、ＡＭＡＣ  ＩＩＩフローセルを通過するしずく玉に対して処理されるＲＦ測定（「非透過性(opacity)」パラメータを判定するのに使われる）は、不正確な結果をもたらす。これらの結果は、フローセルの比較的大きな断面領域（１００×１００マイクロメートル）に関係する信号対ノイズ問題に起因する。さらに、光拡散の測定は、ＡＭＡＣフローセルを使っては決して実行されることがないことは明白である。このように、各セルに関して同時に測定するための単一のＶＣＳＦトランスジューサが他にも提案されているにもかかわらず、実践するためのこのような着想を低減するもの、あるいは、そうするために技術的に可能な技術を提供しているものはない。
【０００９】
〔発明の概要〕
上述の議論を鑑み、本発明の主たる目的は、上述のセルの特徴、すなわち、ＤＣ量、ＲＦ伝導率（非透過性）、光拡散および蛍光特性のような特徴を同時に判定できる自動装置を提供することにあり、これによって、個別のトランスジューサから集められたデータを関連付けする必要がなくなる。
【００１０】
本発明の他の目的は、血液サンプル全体におけるセルの分析をする改良された自動化された方法を提供することにあり、この方法は、興味のあるセルのサブセットに関する情報を抽出するために、複数の分離したトランスジューサから得られるデータを関係付けする必要がないという点で改良されたものである。
【００１１】
本発明の他の目的は、血液サンプル全体における血液セルのタイプを列挙するための、改良されたフローセル装置を提供することである。
【００１２】
本発明のある態様によれば、血液サンプル全体におけるセルの様々なタイプのそれぞれの濃度を識別し判定するための好適な機器は、通常、以下のような組み合された構成要素を備える。すなわち、
（ａ）血球が逐次流れることができるセル取調べゾーンを画定する単一のフローセル、
（ｂ）容器から血液サンプル全体を吸引する手段、
（ｃ）吸引された血液サンプル全体の少なくとも第１のアリコートを配送する手段、
（ｄ）全血液の第１のアリコートに溶解試薬(lysing reagent)を注入し、白血球および有核赤血球を主として含む溶解サンプルを提供する手段、
（ｅ）溶解サンプルに含まれるセルの１つもしくはそれより多いサブセットに蛍光物質を注入し、それによってセルの前述のサブセットをこの蛍光物質でラベル付けするようになる手段、
（ｆ）測定された分量の溶解サンプルを配送する測定手段、
（ｇ）測定された分量の溶解サンプルをフローセルのセル取調べゾーンへ通過させ、測定された分量内の血球がセル取調べゾーン中を逐次流れるようにする手段、
（ｈ）（ａ）それぞれが、（ｉ）セルの体積の関数でこのゾーンのＤＣ電流を変調し、（ｉｉ）セルの内部伝導率の関数でこのゾーンのＲＦ電流を変調するのに効果的であり、血球が流れている間にＤＣおよびＲＦ電流がセル取調べゾーンを流れることを同時に確立し、（ｂ）このＤＣおよびＲＦ電流の変調を検出する回路手段、
（ｉ）セル取調べゾーン中を流れる個々の血球に、サンプルが流れる方向に垂直な軸に沿って伝播する放射ビームを照射する光学的手段であって、蛍光物質が蛍光を発するようにこの放射がなされる手段、
（ｊ）このゾーン内において照射された血球から拡散された放射を検出する放射拡散検出手段であって、この放射拡散検出手段は、軸に関して測定された離散的な複数の角度範囲内で拡散された放射を検出するように構成される手段、
（ｋ）光学手段によって照射された結果、蛍光物質でラベル付けされたセルのサブセットから蛍光が発せられる放射を検出する蛍光検出手段、および、
（ｌ）回路手段と各放射拡散および蛍光検出手段とに動作可能に結合され、白血球の様々なサブセットおよび蛍光物質でラベル付けされたセルの各濃度を識別し判定する分析手段、である。
【００１３】
他の好適な実施例によれば、上述の配送手段は、吸引した全血液サンプル全体の第２のアリコートを配送し、また、この装置は以下の付加的な要素を更に備える。すなわち、
（ｍ）血液全体の第２のアリコートを賦形薬に注入し、主として赤血球および血小板を含む希釈サンプルを得る手段、
（ｎ）希釈サンプルを蛍光物質に合わせて、それによって、赤血球もしくは血小板のうちの少なくとも１つ選択されたサブセットが、この蛍光物質でラベル付けされる手段、および、
（ｏ）計測された分量の希釈サンプルを配送し、この計測された分量の希釈サンプルを、フローセルのセル取調べゾーン中に流し、測定された分量内の血球が、セル取調べゾーンを逐次通過するようにする手段、である。この実施例では、分析手段はさらに、ＤＣ量（Ｖ）、ＲＦ伝導率（Ｃ）、光拡散（Ｓ）および蛍光（Ｆ）の各特性に基づいて、赤血球および血小板の様々なサブセットの各濃度を区別し、判定するよう動作する。
【００１４】
好適には、ＤＣ量（Ｖ）、ＲＦ伝導率（Ｃ）および光拡散（Ｓ）に関する特性の組合せを分析することによって、成熟した白血球の５つの異なるサブセットとして区別される。その他の白血球のサブセット、異常セルおよび未成熟セル（例えば、ＮＲＢＣ、芽細胞、ＣＤ４／ＣＤ８ポジティブリンパ球、未熟顆粒白血球、異常リンパ球および幹細胞）は、ＤＣ量、ＲＦ伝導率、蛍光および光拡散の各特性に基づいて区別される。
【００１５】
この代替例として、本発明の装置は、様々なサブセットにおける個々の細胞のＶ、Ｃ、ＳおよびＦの特性を同時に判定することによって、赤血球および血小板のこのサブセットを区別する手段をさらに備える。
【００１６】
本発明の別の態様によれば、全血液サンプルにおける種々のセルタイプおよびその各サブセットを分析する自動化された方法は、
（ａ）トランスジューサ内の取調べゾーンを順次通過する血球のそれぞれのＤＣ量、ＲＦ伝導率、光拡散および蛍光特性を同時に測定することができる単一のトランスジューサを有するフローセル装置を提供するステップと、
（ｂ）容器から全血液のサンプルを吸引するステップと、
（ｃ）吸引された全血液サンプルの第１および第２のアリコートを配送するステップと、
（ｄ）全血液の第１のアリコートを溶解試薬に注入し、主として白血球の溶解サンプルを得るステップと、
（ｅ）全血液の第２のアリコートを賦形薬に注入し、希釈サンプルを得るステップと、
（ｆ）希釈もしくは溶解サンプルに含まれる１つもしくはそれより多いセルのサブセットを蛍光材料に注入し、これによって、所定の波長の放射にさらされたときに蛍光を発する蛍光材料でセルのこのサブセットをラベル付けするステップと、
（ｇ）測定した分量の溶解サンプルおよび希釈サンプルを配送し、測定した分量の溶解サンプルおよび希釈サンプルが、取調べゾーン中を連続的に流すことで、この測定された分量内における各血球が取調べゾーンを逐次流れるようにするステップと、
（ｈ）ＤＣおよびＲＦ電流の取調べゾーン中での流れが確立している間、取調べゾーン中を流れる個々の血球に軸に沿って伝播する波長を有する放射ビームを照射するステップであって、血球のそれぞれが、取調べゾーンを通過している間、（ｉ）取調べゾーンのＤＣ電流をセルの分量の関数で変調し、（ｉｉ）経路中のＲＦ電流の流れをセルの内部伝導率の関数で変調するのに有効であるステップと、
（ｉ）取調べゾーンにおいて照射された血球による放射拡散、および、取調べゾーンにおいて照射された血球から発せられる蛍光を検出する間、ＤＣおよびＲＦ電流の変調を検出するステップと、
（ｊ）各セルのＤＣ量（Ｖ）、ＲＦ伝導率（Ｃ）、光拡散（Ｓ）および蛍光（Ｆ）に関する特性に基づいて、溶解サンプル内の白血球の種々のタイプを区別し計数するステップと、
（ｋ）各セルのＤＣ量（Ｖ）、ＲＦ伝導率（Ｃ）、蛍光ラベル（Ｆ）および光の拡散（Ｓ）に関する特性に基づいて、希釈サンプル内の赤血球の種々のタイプを区別し計数するステップと、を備える。
【００１７】
本発明の他の実施例によれば、上述の自動化された方法は、（ｌ）全血液の第３のアリコートを配送し、この第３のアリコートを、第３のアリコート内の選択されたセルのサブセットに特有の単一クローンの抗体に結合される蛍光含有の試薬に注入し、それによって、選択されたセルのサブセットはこの蛍光色素でラベル付けされることになるステップと、（ｍ）このサブセットのＶ、Ｃ、ＳおよびＦに関する特性に基づいて選択されたサブセットを区別し計数するステップと、をさらに備える。また、本発明の方法が、セルのＶ、Ｃ、Ｓ、Ｆのパラメータに基づいて、溶解サンプル内の、有核赤血球、異常細胞、未熟細胞を区別し計数するステップをさらに備えれば好適である。
【００１８】
簡単に上述した自動された方法の代替例として、３つのサンプル（すなわち、溶解サンプル、希釈サンプルおよびラベル付けされたサンプル）のそれぞれにおけるセルのＶ、Ｃ、Ｓ、Ｆ特性を検出することに関連するステップは、例えば、白血球のみ分析したり、もしくは赤血球および血小板のみを分析したり、もしくは蛍光セルのみを分析したりするように、個別に実行することができる。
【００１９】
本発明のまた別の態様によれば、液体サンプル内に浮遊した血球および血小板を含む、形状を有する組織体のＶ、Ｃ、Ｓ、Ｆ特性を同時に検出する新しい光学フローセルが提供される。このようなフローセルは、直角プリズムの形式で光学的に透過性のある要素を備え、前記サンプルにおける形体が一度に１つ通過する経路を画定する。好適には、経路の一部分は、各辺がおよそ５０マイクロメートルの実質的に正方形の横断面（サンプルが流れる方向に垂直に決定される）と、サンプルが流れる方向に対しておよそ６５マイクロメートルの長さと、を有するセル取調べゾーンを画定する。フローセルは、電気エネルギー源に接続可能で、かつ、粒子が通過している間にフローセル中を流れる電流を発生する電極対を支持し、また、放射がセル取調べゾーン内に発せられる光学的要素が、光検出器に光学的に結合される。
【００２０】
本発明およびその多くの利点は、添付の図面を参照して、次の好適な実施例の詳細な説明でよりよく認識できるであろう。
【００２１】
〔好適な実施例の詳細な説明〕
ここで図を参照すると、図１は、本発明の自動化されたセル分析器（ＣＡ）を概略的に例示している。この分析器は、容器すなわちガラス瓶１０から全血液サンプル（ ＷＢＳ）を吸引し、コントローラ１１の指示によって細胞の構造を分析し、調査結果をレポートするように、構成されている。例えば、単一のチューブホルダ、サンプルトレイもしくはラックホルダのようなサンプル運搬装置(sample transporter : ＳＴ)によって運ばれた１つもしくはそれより多いガラス瓶１０は、コンベア（図示せず）によって前進させられ、血液サンプルを吸引プローブＰへ提示する。これは、所定の分量の血液を、ガラス瓶１０から従来の血液サンプリングバルブ１２など（例えば、共通に譲渡された米国特許第5,255,568号、第4,702,889号、第4,507,977号および第4,445,391号において開示されているようなもの）へくみ出すよう、選択的に動作可能である。このバルブは、分析のために、サンプルを正確なアリコートにマイクロリットルの分量で分割する公知の方法で動作する。この複数のアリコートＡ１、Ａ２、Ａ３は、サンプル準備ステーション１４に分配されるが、ここでは、各アリコートは混合され、さもなければサンプル内の選択されたセルを処理する試薬が注入される。好適な実施例によれば、サンプル準備ステーションは、例えば、溶解され着色されたサンプルＳＬ（蛍光色素で着色された主として白血球および他の細胞（例えばＮＲＢＣ）を備える）、希釈されて着色されたサンプルＳＤ（非常に希釈された懸濁液内において血球の全タイプを含み、セルのいくつか（例えばレチックのサブセット）が蛍光染料で着色される）、溶解されてタグが付けられたサンプルＳＴ（懸濁液内において主として白血球を備え、この懸濁液には、例えば単一クローンの抗体を介して、蛍光色素でタグもしくはラベルが付けられた選択された白血球（例えば、ＣＤ４およびＣＤ８のポジティブセル）が含まれる）を生成することができる。そして、正確に測定された分量で準備されたサンプルは、測定機構１６によって、単一のマルチパラメトリックトランスジューサ１８を連続的に通過する。マルチパラメトリックトランスジューサ１８は、次に詳しく説明するように、上述の蛍光染料の着色あるいは蛍光染料のタグもしくはラベルによって提供されるように、各アリコート内の各細胞の異なる４つの特性、すなわち、各セルのＤＣ量（Ｖ）、そのＲＦ伝導性（Ｃ）、その光の拡散特性（Ｓ）およびその蛍光（Ｆ）に関する特性、を同時に計測するように動作する。ＤＣ量およびＲＦ伝導率はそれぞれ単一の測定パラメータを提供する一方で、各セルの光拡散の特性は、それぞれが異なる測定パラメータをもたらすいくつかの種々の離散的な角度範囲内で測定される。
【００２２】
好適な実施例では、光拡散が異なる４つの角度範囲内、すなわち、（ａ）中域角度光拡散(medium angle light scatter)もしくはＭＡＬＳと呼ばれる約１０度と約７０度との間、（ｂ）下方中域角度光拡散(lower medium angle light scatter)もしくはＬＭＡＬＳと呼ばれる約１０度と約２０度との間、（ｃ）上方中域角度光拡散(upper medium angle light scatter)もしくはＵＭＡＬＳと呼ばれる約２０度と約７０度との間、（ｄ）名目上は直交(orthogonal)であり、側方拡散(side-scatter)もしくはＳＳと呼ばれる約８０度と約１００度との間、である。同様に、セルの蛍光染料は、離散的な多数の波長範囲Ｆ１、Ｆ２およびＦ３内で好適には測定されるが、この範囲は、興味のあるセルをラベル付けするのに使われる染料および蛍光色素の各蛍光発散スペクトルによって決定される。それゆえ、以下に記述する実施例においては、ＶおよびＣに、４つの光拡散および３つの蛍光の測定を＋した異なる９個の測定が、各セルもしくは血小板に対して同時になされる。明らかに、光拡散測定値の数は、所望のとおり増加させることができ、また、興味のあるセルにラベル付けするのに使われる染料および蛍光色素によって発せられる蛍光スペクトルの数に対応して光検出器の数を増加させることによって、蛍光測定の数を（常識の範囲内で）増加させることができる。Ｖ、ＣおよびＳパラメータについての議論は、例えば回転光拡散(rotated light scatter : RLS)および非透過性（ＲＦ／ＤＣすなわちＣ／Ｖ）など、ここで述べた他の様々なパラメータと共に、Ｃ．ＲｏｄｒｉｇｕｅｚおよびＷ．Ｃｏｕｌｔｅｒに対して付与された、共通に譲渡された米国特許第5,125,737号において見ることができる。各トランスジューサの出力Ｖ、Ｃ、ＳおよびＦは分析器２０に供給されるが、分析器２０は、プログラムされたアルゴリズムに基づいて、サンプル内の種々のセルのタイプおよびサブセットを区別し列挙し、様々な血液およびセルのパラメータ、例えばＨｇｂ、Ｈｃｔ、ＭＣＶなどを判定し、そしてレポートＲを提供よう動作する。マルチパラメトリックトランスジューサ１８は、４つのセルパラメータを同時に測定するので、また、正確に計測された分量のサンプルがトランスジューサを通過するので、従来のセル分析システム全てにおいて必要とされているような、複数のトランスジューサの各出力を関係付ける必要はなく、したがって、分析器の精度はさらに拡大する。また、単一のセルに対して４個のパラメータを同時に測定することによって、各セルについての４パラメータ多次元分析が可能となり、それによってより正確な（あいまいではない）セルのタイプの判定が可能となる。
【００２３】
上で簡単に説明したセル分析器の主要な構成要素は、単一の、マルチパラメトリックトランスジューサ１８である。図２〜７の拡大図でよりよく示したように、トランスジューサ１８は、分析のために、セルが１度に１つずつ（逐次）通過することができる内部経路３２を有する光学要素３０を一般に備える血球計算フローセルＦＣとして特に構成される。経路３２の中心は、光学要素３０の幾何学的中心に位置しており、この光学要素３０は細くなって、通過するセルのＶ、Ｃ、ＳおよびＦパラメータが同時に判定されるセル取調べゾーンＺを画定している。コーン形状カップ３４、３５は、光学要素の対向する各壁３６に結合されており、また、このコーン形状カップ３４、３５は、流体力学的に焦点が合わされるかあるいはセル取調べゾーンにサンプルを中心に置くのに使われる、分析すべきサンプルとシース液体との両方を、光学要素に導き、そこを通って排出されて廃棄されるときに通過させる手段としての役割を果たす。カップ３４、３５によってそれぞれ画定されて取り囲まれたチャンバ３４Ａ、３５Ａは、スペースが取られた電極３８、４０を含むが、これらの電極は、ＤＣ／ＲＦ回路４１（以下で説明する）に接続可能である。この回路の構成要素は、（ａ）セルが一度に１つずつ通過している間にセル取調べゾーンに流れるＤＣおよびＲＦ電流を生成し、（ｂ）取調べゾーンをセルが通過することによって生成される各ＤＣおよびＲＦ電流における変調を検出する。セルの電気抵抗は、サンプルおよびシース流体内の浮遊流体の電気抵抗とは異なるので電流変調が発生することが理解できよう。各セルが取調べゾーンを通過し、適切な連続波レーザ４２によって発生する焦点が合わされたレーザビームＢで照射され、そして、各セルから拡散された放射（光）が光拡散検出器ＬＤＳ１およびＬＤＳ２のペアで検出される。同時に、もしあるならばレーザ放射により励起された結果としてのセルの蛍光着色もしくは蛍光ラベルで発せられた蛍光放射が、以下で説明するように蛍光検出器ＦＤによって検出される。
【００２４】
図３の拡大図を参照すると、光学要素３０は方形のプリズム形状を有し、４個の長方形の光学的に平坦な面５０と上述の対向した各壁３６とを備える。好適には各面５０間の各幅Ｗは同じであって、好適にはそれぞれ約４．２ｍｍであり、また、各壁５０の各長さＬは約６．３ｍｍである。光学的要素３０は溶解したシリカもしくは石英で製造されるのが特に好ましい。光学的要素３０の中央領域に形成されるフロー経路３２は、要素３０の中心を通過する長手方向の軸Ａに対して同心状に、かつサンプルが流れる方向に平行に構成される。フロー経路３２は、上述のセル取調べゾーンＺと、先が細くなっている対向するホール穴５４のペアと、を備え、ホール穴５４は、各底面付近にセル取調べゾーンと流体的に通信するための開口部を有する。好適には、セル取調べゾーンの横断面は方形の形状であり、各辺の幅Ｗ’は名目上５０マイクロメートル±１０マイクロメートルである。取調べゾーンの長さＬ’は軸Ａに沿って測定すると、取調べゾーンの幅Ｗ’の約１．２〜１．４倍であり、すなわち、好適には約６５マイクロメートル±１０マイクロメートルである。この寸法は、取調べゾーンを通過するセルについてのＤＣおよびＲＦ測定値（以下で説明する）を最適化するのに必要であることがわかっている。先が細くなっているホール穴５４の最大直径は、終端の壁３６で測定して、約１．２ｍｍである。平凸レンズ５１は、光学要素の平坦な面５０のうちの１つに（例えば光学セメントによって）適切に装着されるが、このレンズは、以下で説明するように、取り調べゾーンからの蛍光放射を、蛍光を検出する光検出器パッケージＦＤに、光学的に結合するように作動する。説明したタイプの光学的構造は５０×５０マイクロメートルの毛管状の開口部を含む石英の正方形ロッドから作られ、そして、それに続いて通信するホール穴５４を画定するために規定の寸法どおりに作りあげられる。
【００２５】
図２を参照すると、フローセルの終端カップ３４、３５は、複数のポートＰ１〜Ｐ８に備えられるが、それらは、１）分析すべき１つもしくはそれより多いサンプルとシース流体とをフローセルに導き、２）サンプルおよびシース流体を廃棄するために排出し、３）１つもしくは両方のカップチャンバを廃棄のために水で洗い流し、そして４）フローセルラインに注入するために真空にするという役割を果たす。ポートＰ１〜Ｐ３は、計測機構１６に流体的に結合しており、分析のためにアリコートを経路３２に注入するのに使われる多チャンネルノズルＮ（図４Ｂが最もよく示している）に、サンプルの測定されたアリコートＳＬ、ＳＤおよびＳＴを導く役割を果たす。ポートＰ４もまた、計測機構１６に結合しており、計測された分量のシース流体ＳＦをカップ３４に導く役割を果たすが、この流体は、サンプルに対して水力学的に焦点を合わせるように、すなわちサンプルをセル取調べゾーンの中心に置くようにする。図４Ｂを参照すると、サンプルノズルＮは、部分的に図示されているが、３つの並列チャンネルＣ１、Ｃ２、Ｃ３を有しており、それらは各サンプルアリコートに対して１つ毎であり、サンプルを配送するポートＰ１〜Ｐ３の１つ毎に対応している。図４Ａに例示されるように、図２の計測装置１６は、正確に計測された分量のサンプルをサンプルノズルＮの中央のチャンネルに配送しているのである。これは、取調べゾーンに向かってサンプルを投入する役割を果たす。その間に、チャンバ３４Ａに入力された計測された分量のシース流体ＳＦは、圧力がかけられポートＰ４を介して経路３２を流れる。そのとき、シース流体は、サンプルストリームを一様に取り囲んでこのサンプルをセル取調べゾーンＺの中央に流し、これによって、流体力学的な焦点合わせを達成することができる。過度のシース流体は、ポートＰ５を介してチャンバ３４Ａから排出される。ゾーンＺを出るとき、サンプルおよびシース流体は、サンプル出口チューブ５８によって集められ、これによって、再循環するセルがＤＣおよびＲＦ測定値に影響を及ぼすことを防ぐ。図４Ａにおいては、血球ＢＣ１が、サンプル誘導ノズルＮの中央ポートから出ているのが示されており、血球ＢＣ２がゾーンＺの中心にあって、楕円状に焦点が合わされたレーザビームＢ内にあることが示されており、血球ＢＣ３が、廃棄用に接続されているサンプル出口チューブ５８に流入しているのが示されている。チャンバ３５Ａ内の流体の圧力を制御ししてそれによって取調べゾーンから出た後のサンプルの流れを制御するために、チャンバ３５Ａは、シース流体を大量に維持し、この流体はポートＰ７を介して流入してポートＰ８を介して廃棄するために排出される。
【００２６】
上述のフローセルに加えて、マルチパラメトリックトランスジューサ１８は、図３〜５に示すように、興味のある選択されたセルによって運ばれた蛍光物質を励起する波長を有するＲビームＢを放射するレーザ４２のようなものと、セルが通過させられる位置における取調べゾーンＺ内に位置する、楕円形状のくびれ６４にレーザビームの焦点を合わせるレンズ６２と、を備える。適切なレーザ源は、４８８ナノメートルを発する連続波アルゴンレーザと、５３２ナノメートルを発するダイオードポンプソリッドステートレーザと、である。楕円くびれ６４の好適な１／ｅ２のディメンジョンは、約１０×１００マイクロメートルであり、小さい方のディメンジョンは、サンプルが流れる方向、すなわち軸Ａに沿った方向である。照射されたセルによって拡散される放射は、取調べゾーン内で、２つの光拡散検出器ユニットＬＤＳ１およびＬＤＳ２によって検出される。ＬＤＳ１は、ビームＢの軸に関してほぼ法線方向（すなわち、約９０度±１０度）に拡散する光を検出するような位置にあり、ＬＤＳ２は、約１０度と７０度との間（ＭＡＬＳ）の角度範囲内で前方面に拡散される光を検出するような位置に置かれ、また、そのように構成される。ＬＤＳ１は好適には焦点レンズ６５を備え、この焦点レンズ６５は、側方拡散光をピンダイオード６６のようなものに焦点を合わせるように動作する。これは、側面に拡散する放射を集め、プリアンプＰを介して図１の分析器２０へＬＳ９０パルス信号を出力する。ＭＡＬＳ光拡散検出器ＬＤＳ２は、図７に詳細を示すが、上方中域角度光拡散（ＵＭＡＬＳ）領域７８および下方中域角度光拡散（ＬＭＡＬＳ）領域８０の２つの光感知領域を有する。上述のように、ＵＭＡＬＳ領域は、２０〜７０度の間の角度領域で拡散する光を検出するようになっており、また、ＬＭＡＬＳ領域は、１０〜２０度の間の角度領域で拡散する光を検出するようになっている。蝶ネクタイの形状をしたマスク８２は、拡散しないレーザ光および１０度より小さい範囲で拡散する光が、ＬＭＡＬＳ領域に当たらないようにする。マスク８２はまた、水平面付近で拡散もしくは回折したどんな光も、ＵＭＡＬＳおよびＬＭＡＬＳ領域のどちらにも当たらないようにする。ＬＤＳ２は、ＭＡＬＳ、ＵＭＡＬＳおよびＬＭＡＬＳパルス信号を個別に生成するが、これらは適切なプリアンプＰを介して分析器２０へ出力される。
【００２７】
取調べゾーン内の照射されたセルによって発せられた蛍光放射は、光学要素３０に取り付けられた上述のレンズ５１によって集められ、レンズアセンブリ７０によってコリメートされかつ空間的にろ波され、ビームスプリット光二色性ミラー(beam-splitting dichroic mirror)ＢＳ−１、ＢＳ−２ならびにフィルタ７１、７２および７３のネットワークを介して複数の光マルチプライヤチューブＰＭＴ−１、ＰＭＴ−２およびＰＭＴ−３に中継される。従来のやり方では、各光マルチプライヤチューブは、光二色性ミラーおよびフィルタ状の光コーティングによって決定される波長範囲内の蛍光放射を検出する。光マルチプライヤチューブの各出力は、適度に増幅され、パルス信号ＦＬ１、ＦＬ２およびＦＬ３として図１の分析器２０に供給される。
【００２８】
ＤＣ／ＲＦ回路４１は、ＤＣ電流源８２と、ＲＦ発振器／検出器８４と、結合回路８６と、プリアンプＰとを備える。結合回路は、ＤＣ源およびＲＦ発振器／検出器によって生成される電流を線形に結合し、上述のセル取調べゾーンにこの電流を加える。好適には、ＲＦ構成要素は、約２２．５ＭＨｚの周波数を有する。セルがゾーンＺを通過するとき、ゾーンのインピーダンスは変動し、セルの物理量Ｖ（しばしばＤＣ量と呼ばれる）を関数とするＤＣ電流の変調、およびセルの内部伝導率Ｃを関数とするＲＦ電流の変調が生じる。結合回路は変調された電流を分離し、それにより、ＤＣパルス信号はＤＣプリアンプＰに運ばれ、また、変調されたＲＦ電流は発振器／検出器によって検出され、この結果、ＲＦプリアンプＰに運ばれるＲＦパルス信号が生じる。ＤＣおよびＲＦパルス信号の両方は、分析器２０へ出力される。
【００２９】
図２を参照すると、サンプル準備ステーション１４は、上述したように、分析のために全血液の複数のアリコートＡ１、Ａ２、Ａ３を準備する機能を有する。したがって、ステーション１４は、複数の混合チャンバＭＣ１、ＭＣ２、ＭＣ３を備え、適切なポンプ（図示せず）によって血液サンプルバルブ１２から排出されるアリコートＡ１、Ａ２、Ａ３をそれぞれ受ける。図示のように、混合チャンバＭＣ１は、全血液の第１のアリコートＡ１を受けるように位置しており、これを、蛍光染料を含んでもよい賦形薬Ｄと混合する。このやり方においては、希釈サンプルＳＤは、赤血球／血小板の分析のために準備される。同様に、混合チャンバＭＣ２は、分析のために第２のアリコートを受けるように位置している。混合チャンバＭＣ２では、全血液サンプルは、適切な溶解試薬Ｌ、消光試薬Ｑ、そしてオプションとして蛍光染料Ｓと合わせられる。このやり方においては、赤血球がサンプルから除去され、そしてこのサンプルは白血球区別分析のために準備される。類似のやり方では、第３のアリコートＡ３は、混合チャンバＭＣ３に分配されるが、混合チャンバＭＣ３は、選択されたセルを蛍光色素でラベル付けする単一クローンの抗体を使ってさらなる分析のためのサンプルを準備する試薬を受けるように位置する。この試薬は、溶解試薬Ｌ、消光Ｑおよび蛍光色素でタグがつけられた単一クローンの抗体Ｍを含んでもよい。
【００３０】
図２に示すように、計測ステーション１６は、複数の計測ポンプＭＰ１〜ＭＰ５を備える。各ポンプは好適には注射器の一種であり、そのそれぞれは、コントローラ１１の制御の下で動作する適切なステッピングモータ（図示せず）で駆動し、正確なレートで液体をポンプする。計測ポンプＭＰ１〜ＭＰ３は、各混合チャンバＭＣ１〜ＭＣ３からフローセルの入力ポートＰ１〜Ｐ３へ所定量のサンプルＳＬ、ＳＤ、ＳＴを一定のレートで配送するようになっている。公知の方法では、計測ポンプＭＰ４およびＭＰ５は、計量されたシース流体ＳＦをフローセルに供給するように機能し、この流体は、感知ゾーンＺのセルに流体力学的に焦点を合わせる役割をする。
【００３１】
本発明の装置は、例えば、赤血球分析のみもしくは白血球の５要素区別のみ実行するように、サンプルＳＬ、ＳＤおよびＳＴのそれぞれを分析するように動作することができるが、一方で、サンプルが分析間で明らかに変化しないようにすることを確実にするように、少なくとも２つの分析が実行されるのが好適である。しかし、上述のように、１つの分析の結果を他のものに関係付けする必要はなく、例えば、便利な結果を得るために赤血球分析を白血球分析に関係付ける必要はない。それゆえ、例えばアリコートＡ１およびＡ２は各チャンバＭＣ１およびＭＣ２に配送される。希釈され着色されたサンプルＳＤはトランスジューサ１８に注入されて分析されるが、溶解され着色されたサンプルＳＬはまだ準備中である。フローセルＦＣはすすぎ落とされ、次のサンプルを不純物無しで分析できるようにする。そして溶解され着色されたサンプルＳＬはトランスジューサ１８に注入されて分析される。
【００３２】
図８を参照すると、分析器２０は、データ獲得モジュール８８およびコンピュータ９０からなる。データ獲得モジュール８８は、ＶＣＳＦトランスジューサからパルス信号（ＦＬ１、ＦＬ２、ＦＬ３、ＤＣ、ＲＦ、ＵＭＡＬＳ、ＬＭＡＬＳ、ＬＳ９０）を入力し、このパルス信号を増幅、ろ波および計数し、例えばパルス信号のそれぞれからピーク電圧のようなパルス情報を得て、このパルス情報をディジタル値（ＦＬ１’、ＦＬ２’、ＦＬ３’、ＤＣ’、ＲＦ’、ＵＭＡＬＳ’、ＬＭＡＬＳ’、ＬＳ９０’）に変換する。パルスピークのディジタル値およびパルス数は、分類、列挙、特長付けのためにコンピュータ９０に転送される。コンピュータ９０は、中央処理装置（ＣＰＵ）、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、読出し専用メモリ（ＲＯＭ）、キーボード、ディスプレイ、プリンタおよびネットワーク接続のような基本的な構成要素を含む。
【００３３】
上述の血液分析装置の動作は、次の実際の例から明らかとなるであろう。
〔例１〕
上述の自動化されたセル分析器は、以下で説明するように、赤血球および血小板を区別し列挙する方法を実行するのに使われる。本方法は、以下の構成要素を備える賦形薬Ｄ（図２）を利用する。
１．  リン酸塩で緩和された生理的食塩水（Phosphate Buffered Saline：ＰＢＳ）
２．  コリフォスフィリンＯ（Coriphosphine-O：ＣＰＯ）    ８マイクログラム／ミリリットル
３．  ドデシル基βＤマルトース(Dodecyl-β-D-maltose)    ２０マイクログラム／ミリリットル
４．  プロクリン３００(Proclin 300)    ．０５％
【００３４】
ＣＰＯは、膜透過性の、核酸に対して高親和性を有する蛍光染料分子である。ＣＰＯは、適切な波長で励起されたときに、付着した物質の分子構造によって決まる波長で蛍光を発する異染性分子である。ＤＮＡおよびＲＮＡ（共に核酸である）の両方を含むセルを着色するのに使われたとき、ＣＰＯは、セルのＤＮＡ含有に付着したときはある波長（ＦＬ１）で蛍光を発し、セルのＲＮＡ含有に付着したときは他の波長（ＦＬ２）で蛍光を発する。図２を参照すると、２マイクロリットルの全血液のアリコートＡ２は、サンプル準備ステーション１４における混合チャンバＭＣ２に配送され、約２秒間で２ミリリットルの賦形薬と混合され、希釈サンプルＳDが生成される。サンプルＳDの一部は、チャンバＭＣ２から真空（フローセルポートＰ５に割り当てられている）によってくみ出され、このチャンバとフローセルポートＰ２とを接続するラインに入れられ、それによってサンプルでラインを予め装填する。計測ポンプＭＰ２は、ステップモータで動作させられ、１０秒間、２マイクロリットル／秒の割合でフローセルへサンプルを進める。この間、取調べゾーンを通過する全セルは、計数され、区別（すなわち、タイプもしくはサブセットに関して特徴付けられる）される。このようにして、正確な分量である２０マイクロリットルのサンプルは、分析に付される。同時に、計測ポンプＭＰ４は、約８マイクロリットル／秒の割合でシース流体を配送する。ポートＰ１およびＰ４の領域の相違のために、サンプルおよびシース流体は、同じレートでフローセルを通過する。混合および注入を含めた全潜伏期は、名目上５．５秒であり、５〜１５秒の動作範囲である。既に述べたように、Ｖ、Ｃ、ＳおよびＦ測定値は、単一のマルチパラメトリックトランスジューサ１８内で全てのセルが作られており、測定データは、従来の手法で分析器２０によって処理され、レポートが生成されるが、このレポートは、赤血球および血小板の絶対数、網状赤血球および網状の血小板の絶対および相対計数、赤血球および網状赤血球の細胞性のヘモグロビン情報、上述のセルタイプの平均量、サンプルに対する全ヘモグロビンを含む、抽出されたパラメータを提供する。
【００３５】
ＣＰＯは、好適には核酸蛍光色素であるが、他の類似の色素を使っても受け入れ得る結果を作り出すことができる．ドデシル基βＤマルトース成分は、２つの機能を有する。すなわち、１）赤血球のセル毎のヘモグロビン（ＨＣ）を測定できる等容性のセル球体試薬として機能する、２）セルの膜を通過する染料の増加を促進して核酸を染色し、染色時間（通常のフロー血球計算器で約６０分）を１００倍低減する。プロクリン３００は、アンチバクテリア因子である。ＣＰＯは、４８８ナノメートルのアルゴンイオンレーザもしくは５３２ナノメートルで動作するダイオードポンプソリッドステートレーザで励起することができるが、これはこの例についての好適な励起である。蛍光検出システムＦＤは、ＤＮＡに相互作用する色素に主として応答する５７５ナノメートル（ＦＬ１）、およびＲＮＡに相互作用する色素に主として応答する６７５ナノメートル（ＦＬ２）の各発光を受信するように設定される。この例では、ＲＮＡは、興味のある信号（ＦＬ２）であり、以下の図では「蛍光」としてラベル付けされる。図９Ａは、赤血球および血小板について、非透過性（ＲＦ／ＤＣ）に対してプロットされた分量（ＤＣ）を示す拡散図である。成熟赤血球と網状赤血球とはオーバーラップし、赤血球の単一母集団として現れる。血小板は低い分量で表れる。ゴースト（すなわち、ヘモグロビンを失った赤血球）は非常に少ない数の赤血球を備え、その赤血球はダメージを受けており、ＨＣ測定から取り除く必要がある。図９Ｂは、ＤＣ量対ＵＭＡＬＳを示す。パターンは図９Ａのそれに対して不明瞭であるが、さらなるクラスタである一致赤血球(coincident red cell)は、同時に孔を横切る２つもしくはそれより多い赤血球によってもたらされ、識別される。一致赤血球もまた、ＨＣ測定から取り除かれるが、網状赤血球のパーセント（ＲＥＴ％）および絶対濃度（ＲＥＴ＃）を測定するときは考慮される。図９Ｃは、ＤＣ量対赤血球および血小板の蛍光を示す。成熟赤血球と網状赤血球とは容易に見分けられる。ゴーストの赤血球は、成熟赤血球もしくは網状赤血球であり得るが、結果には影響を与えない。網状の血小板のクラスタは、メインの血小板の個体群の右側（より高い蛍光）にはっきりと認められる。
【００３６】
好適なデータ分析方法を次に説明する。図１０Ａを参照すると、ＤＣ量および非透過性は、血小板Ｐ、赤血球ＲおよびゴーストＧを識別するのに使われる。図１０Ｂを参照すると、ＤＣ量およびＵＭＡＬＳは血小板ＰおよびゴーストＧ対赤血球Ｒの識別をはっきりさせるのに使われる。一致赤血球Ｃと非一致の成熟赤血球ＭＣ＋網状ＲＥＴとを識別する。図１０Ｃは、ＤＣ量対ＦＬ２は、成熟赤血球ＭＣと網状ＲＥＴ（一致するものと非一致のものと両方）とを識別するのに使われ、また、血小板Ｐのサブ個体群である網状血小板ＲＰを識別するのに使われる。白血球Ｗは、より高いＤＣ量とＦＬ２およびＦＬ１（図示せず）の著しく高い蛍光レベルとのために、本分析において区別される。分量、個体群、ＵＭＡＬＳおよび蛍光を含む分類を使って、ならびに、ＤＣ量から得られるセル計数情報を使って、網状赤血球のパーセント（ＲＥＴ％）、網目状の血小板、もしくは未熟血小板分数パーセント（ＩＰＦ％）、ならびに、絶対濃度（ＩＰＦ＃）をレポートする。また、以下の個体群に対する絶対濃度をレポートする。すなわち、赤血球（ＲＢＣ）、網状赤血球（ＲＥＴ＃）、血小板（ＰＬＴ）、網状の血小板および白血球（ＷＢＣ）である。上述のパラメータを使って、赤血球のサブ個体群を特徴付ける。すなわち、図１０Ｂを参照し、かつ、ＵＭＡＬＳおよび分量の関数を使って、網状赤血球（ＣＨｒ）および全赤血球（ＣＨ）についてセルごとのヘモグロビンを得るが、これらの両方から、さらなる臨床情報を得るためにヒストグラムを作ることができる。また、網状赤血球（ＭＣＨｒ）についてのセルごとのヘモグロビンの平均、および、全赤血球（ＣＨ）の平均赤血球ヘモグロビン量（ＭＣＨ）をも得る。ＤＣ量を使って、平均血小板分量（ＭＰＶ）、平均網状赤血球量（ＭＲＶ）、全赤血球の平均赤血球量（ＭＣＶ）および赤血球分布幅（ＲＤＷ）、を計算する。ヘマトクリット値（ＨＣＴ）はＭＣＶ×ＲＢＣ／１０で計算される。全ヘモグロビン（ＨＧＢ）はＭＣＨ×ＲＢＣで計算される。平均赤血球ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ）はＭＣＨ／ＭＣＶで計算される。
【００３７】
〔例２〕
上述の自動化されたセル分析器は、以下で説明する、白血球を区別するための拡張された方法を実行するのに使われる。本方法は、異染性色素（ＣＰＯ６２５マイクログラム／ミリリットル）、赤血球溶解試薬および消光試薬を利用し、残りの染色されていないセルへの溶解の影響を阻止もしくはさらに抑制する。２つ異なる好適な溶解および消光の例として、それらの分量および露出時間を以下の表に示す。代わりの溶解および消光試薬もまた、残りのセル（ＷＢＣおよびＮＲＢＣ）についての所望の電気光学特性を保持しつつＲＢＣを効果的に溶解するために必要なものとして利用される。
【００３８】
【表１】
0004468590.tif 000002
【００３９】
図２を参照すると、３４マイクロリットルのアリコートＡ３が、サンプル準備ユニット１４内の混合チャンバＭＣ１に運ばれ、３．４マイクロリットルのＣＰＯと３０秒間混ぜられる。上の表を参照すると、そして、５０７マイクロリットルのエリトライズ(Erythrolyse)ＩＩがＣＰＯで着色された血液に加えられてさらに５．３秒間混ぜられ、その間、２００マイクロリットルのスタビライズ(Stabilyse)がさらに８．５秒間続けて混ぜられる。
【００４０】
計測ポンプＭＰ３を使って、ある分量のサンプルＳＬを所定の期間フローセルを通過させ、例１で説明した手順を使って、４０マイクロリットルの分量のサンプルＳＬ内の全セルが調べられる。既に述べたように、Ｖ、Ｃ、ＳおよびＦの測定は、サンプルの全てのセルから得られ、これらの測定は、分析器２０によって処理され、通常の５種類の白血球のタイプおよび絶対的および相対的な濃度および少なくとも１つの異常なセルのタイプについてのリポートを作成するが、これらは、有核赤血球（ＮＲＢＣ）、芽細胞および未熟細胞を含むが、これに限定されるわけではない。ＣＰＯは、４８８ナノメートルのアルゴンイオンレーザもしくは５３２ナノメートルで動作するダイオードポンプソリッドステートレーザで励起することができるが、これはこの例に関しては好適な励起である。蛍光検出システムＦＤは、ＤＮＡに対して染色相互作用に原始的に反応する５７５マイクロメートル（ＦＬ１）、および、ＲＮＡに対して染色相互作用に原始的に反応する６７５マイクロメートル（ＦＬ２）の放射を受けるように設定される。
【００４１】
図１１Ａ、１１Ｂ、１２Ａ、１２Ｂ、１３Ａ、１３Ｂ、１４Ａおよび１４Ｂは、通常の末梢血液標本についての測定値の種々の組合せの拡散図を示しており、５つの正常の白血球の個体群である、リンパ球（Ｌｙｍｐｈ）、単核白血球（Ｍｏｎｏ）、好中球（Ｎｅｕｔ）、好酸球（Ｅｏ）および好塩基球（Ｂａｓｏ）のみが含まれている。デブリー(Debris)と呼ばれるクラスタもまた示されているが、これは、赤血球フラグメントの血小板および非生存白血球を含み、また、有核赤血球（ＮＲＢＣ）を含むかもしれない。図１１Ａは、ＤＣ量とＬＭＡＬＳとの拡散図を示す。ＬＭＡＬＳは、Ｌｙｍｐｈ＋Ｍｏｎｏ＋Ｂａｓｏと、Ｎｅｕｔ＋Ｅｏとの分離を最適にする。図１１ＢはＤＣ量とｌｏｇのＵＬＡＬＳとの拡散図である。ＵＭＡＬＳは、Ｅｏクラスタの最適な分離を提供する。図１２ＡはＤＣ量とＲＬＳとの拡散図とを示す。ＲＬＳは、ＬＭＡＬＳ測定値とＵＭＡＬＳ測定値との合計のｌｏｇを含む合計によって得られ、ＤＣ量の測定値に関する結果を回転もしくは規格化する。図１１Ａおよび１２Ａは、ＭｏｎｏクラスタがＤＣによってＬｙｍｐｈ＋Ｂａｓｏから分離されることは明らかである。図１２Ｂは、ＲＦ／ＤＣによって分類されるＢａｓｏおよびＬｙｍｐｈクラスタでの、ＤＣ量とＲＦ（伝導率）／ＤＣ（分量）との拡散図を示す。図１１Ａ〜１２Ａに示される光拡散測定で得られた分離の結果、ＮｅｕｔおよびＥｏでＢａｓｏをオーバーラップすることにより解決される。図１３Ａおよび１３Ｂは、それぞれ、ＤＣ量とＦＬ２（上述のように測定されたＲＮＡ蛍光）との拡散図、および、ＤＣ量とＦＬ１（上述のように測定されたＤＮＡ蛍光）との拡散図である。これら２つの図では、５個の通常の個体群が、種々の角度のオーバーラップで示されている。図１４Ａは、ＦＬ１とＦＬ２との拡散図を示す。この図を前の２つと比較すると、５つ全ての正常の個体群が認識できるのが明らかである。さらに、ほとんど空の領域ＢＬは、もしサンプルが有しているならば芽細胞が見られる拡散図上での位置として識別される。図１４ＢはＤＣとＦＬ２／ＦＬ１との拡散図である。２つの蛍光測定値の比は、芽細胞領域ＢＬを保持し、その領域に対して、ゲートを設ける(gating)、すなわち、境界を決定するのを容易にする。図１５Ａ〜１８Ｂは、異常なリンパ性白血病（ＡＬＬ）の末梢血液標本に付いての測定値の種々の組合せの拡散図を示しており、４つの正常の白血球の個体群であるリンパ球（Ｌｙｍｐｈ）、単核白血球（Ｍｏｎｏ）、好中球（Ｎｅｕｔ）および好酸球（Ｅｏ）と、非常に高濃度の芽細胞（Ｂｌａｓｔ）とを含んでいる。図１５Ａ〜１６Ｂは、それぞれ、ＤＣ量対ＬＭＡＬＳ、ＤＣ量対ＵＭＡＬＳ、ＤＣ量対ＲＬＳ、およびＤＣ量対ＲＦ／ＤＣの拡散図を示している。これら全ての図において、Ｂｌａｓｔの個体群が他のクラスタ全てに重なり合っているが、これにより、これらの測定値だけで適切な分類を不可能にしている。図１７Ａ〜１７Ｂは、それぞれ、ＤＣ対ＦＬ１およびＤＣ対ＦＬ２を示している。Ｂｌａｓｔ個体群は、どちらの場合も、他のクラスタと著しく重なり合っている。図１８Ａは、ＦＬ１対ＦＬ２の拡散図を示す。この場合、ＢｌａｓｔクラスタがＬｙｍｐｈクラスタと重な��合っている以外は、個体群のほとんどは溶解している。図１８Ｂは、ＤＣ量とＦＬ２／ＦＬ１との拡散図である。Ｌｙｍｐｈ、Ｂｌａｓｔ、Ｍｏｎｏ、Ｎｅｕｔは完全に溶解している。領域ＢＡは好塩基球が見られる領域を示している。Ｅｏクラスタは、ＵＭＡＬＳ（図１５Ｂ）によって分類される。
【００４２】
図１９Ａ〜Ｂは、正常の血液サンプルと有核赤血球（ＮＲＢＣ）を含む異常な血液サンプルとについて、ＬｏｇＦＬ２とＬｏｇＦＬ１との拡散図を示す。クラスタＷは白血球を含んでおり、図１１Ａ〜１８Ｂに示す全白血球個体群と等価である。クラスタＤのセットは、赤血球フラグメントおよび血小板を含むクラスタＲＰ、有核赤血球を含むクラスタＮＲＢＣ、ならびに、非生存白血球を含むクラスタ１２６からなる。クラスタセットＤは、図１１Ａ〜１８Ｂに示すデブリー個体群に等価である。３個の境界１２０、１２２、１２４は、クラスタセットＤを備えるクラスタを画定し分類する。境界１２０は、クラスタセットＤから白血球Ｗを分離する。境界１２２は、ＮＲＢＣクラスタおよび非生存白血球１２６から、赤血球フラグメントおよび血小板ＲＰを分離する。境界１２４は、非生存白血球クラスタ１２６からＮＲＢＣクラスタを分離する。
【００４３】
好適なデータ分析方法を以下で説明する。図２０Ａ〜２１Ｂを参照すると、ＤＣ量およびＦＬ１は、デブリスＤ個体群を白血球Ｗから識別するのに使われる。ＲＬＳ、ＤＣ量、ＲＦ／ＤＣ、ＦＬ１およびＦＬ２は、５個の正常の白血球個体群を識別するのに使われる。すなわち、好中球Ｎおよび好酸球ＥはＲＬＳで識別され、単核白血球ＭはＲＬＳおよびＤＣ量で識別される。また、リンパ球Ｌおよび好塩基球Ｂは、ＲＬＳおよびＤＣ量によって１つのグループとしてまず識別され、そして、ＲＦ／ＤＣによって分離される。芽細胞はＦＬ１、ＦＬ２およびＤＣ量によって識別される。ＦＬ２／ＦＬ１の計算されたパラメータは、分類を容易にする、基準に合わせられた直交図(orthogonal view)を提供する。未熟顆粒球ＩＧは、ＦＬ１およびＦＬ２の両方のパラメータにおいてより低い蛍光レベルへの重要なシフトと、より高いＤＣ量レベルへのシフトとを計測することによって識別される。上述の正常および異常の白血球の全タイプは、総白血球個体群におけるパーセントおよび絶対濃度（ＬＹＭＰＨ％、ＬＹＭＰＨ＃、ＭＯＮＯ％、ＭＯＮＯ＃、ＮＥＵＴ％、ＮＥＵＴ＃、ＥＯ％、ＥＯ＃、ＢＡＳＯ％、ＢＡＳＯ＃、ＩＭＭＧＲＡＮ％、ＩＭＭＧＲＡＮ＃、ＢＬＡＳＴ％、ＢＬＡＳＴ＃）としてレポートされる。白血球の絶対総数（ＷＢＣ）もまたレポートされる。図２２を参照すると、白血球Ｗは、境界１２０によってＦＬ１と同一であるとみなされる。赤血球および血小板ＲＰは、境界１２２によってＦＬ１と同一であるとみなされる。有核赤血球ＮＲＢＣおよび非生存白血球は、境界１２０、１２２によってＦＬ１と同一であるとみなされ、ＦＬ１およびＦＬ２の関数である境界１２４によって分類される。有核赤血球ＮＲＢＣは、白血球に対するパーセンテージ（ＮＲＢＣ％）として、および絶対濃度（ＮＲＢＣ＃）としてレポートされる。非生存白血球１２６が存在しない場合は、ぜい弱な白血球(Fragile White Cell )に関する分子濃度(Fraction percentage)および絶対濃度（ＦＷＣＦ％、ＦＷＣＦ＃）としてレポートされ、絶対白血球数（ＷＢＣ）がそれにしたがって調整される。
【００４４】
〔例３〕
次に１つもしくはそれより多い蛍光色素でラベル付けすることによって１つもしくはそれより多い白血球個体群をさらに分析する方法について説明する。この例では、リンパ球は、ＣＤ３、ＣＤ４およびＣＤ８を含む単一クローン抗体のカクテルでラベル付けされるが、各抗体は、表２で示すような種々の蛍光色素が結合されている。図２を参照すると、３４マイクロリットルのアリコートＡ３は、サンプル準備ユニット１４内の混合チャンバＭＣ３に運ばれ、１０マイクロリットルの単一クローンの抗体カクテルと混ぜられ、３０〜６０秒間培養される。溶解および消光は、例２の表１にしたがってサンプルに加えられる。計測ポンプＭＰ３は、ある分量のサンプルＳＴを、例１で述べた処理によってフローセルへ運ぶのに使われる。そして、このサンプルは、例１のようにフローセルによって調べられる。この例では、ラベル付けされたリンパ球の種々の蛍光色素は、例１および２で述べたレーザのいずれかで励起される。この例の蛍光色素の構成は次のとおりである。
【００４５】
【表２】
0004468590.tif 000003
ＰＥはフィコエリスリン(Phycoerythrin)
ＰＥ−ＣＹ５は、フィコエリスリンシクロム５(Phycoerythrin Cychrome 5 )結合
【００４６】
図２３は、ＬｏｇＦＬ１（ＣＤ４）とＬｏｇＦＬ２（ＣＤ８）との拡散図を示す。クラスタ１４０は、ＣＤ４ポジティブリンパ球を含む。第２のクラスタ１４２はＣＤ８ポジティブリンパ球を含む。第３のクラスタ１４４はＣＤ４ポジティブでもＣＤ８ポジティブでもないリンパ球を含む。図１２Ａ〜ＢのＶＣＳ（Volume-Conductivity-Scatter：分量−伝導性−拡散）の分析を参照すると、リンパ球個体群は、絶縁され、すなわち、ゲートが設けられ、免疫蛍光検査分析が実行できるようにし、かつサブセットが分類されて列挙され、リンパ球に対するパーセンテージおよび絶対濃度を得る。ＨＩＶの進行および治療を記録するのに使われるＣＤ４絶対数は特に興味深いものである。
【００４７】
〔例４〕
例として、上述の自動化されたセル分析器は、赤血球および血小板を区別し列挙し、白血球をさらに区別し、そして、１つもしくはそれより多い蛍光色素で興味のあるセルをラベル付けすることによって１つもしくはそれより多い白血球の個体群をさらに分析するのに使われる。この例では、例１〜３で述べたサンプル取調べを連続的に実行する間に、上記例１〜３で述べたサンプル準備が同時に（すなわち、並行して）実行される。それゆえ、分析全体は、約６０秒で実行される。３つのセルの取調べの結果は照合することができるが、しかし、関係付けることはできない。すなわち、各取調べのいずれの結果も、他の２つの取調べの結果には依存しない。解釈上のレポートは、３個の個別の取調べからの情報全てを結合することによって得ることができ、これにより、分析された血液サンプルの疑いのある異常についてのさらなる情報を得ることができる。
【００４８】
本発明は、いくつかの好適な実施例を参照することによって詳細に述べられた。しかし、種々の変形例および修正例が、本発明の精神および添付の請求項によって字義どおりに画定される範囲を逸脱することなく実行することができることが理解できよう。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明を具体化する血球分析装置のブロック図である。
【図２】  図１の装置の構成要素の多くを示す斜視図である。
【図３】  図２に示したマルチパラメトリックトランスジューサを備える光学要素の拡大した斜視図である。
【図４Ａ】  水流を示した図３のトランスジューサの概略図である。
【図４Ｂ】  図４Ａに示したサンプルノズルの一部分の斜視図である。
【図５】  図１の装置に使われる好適なフローセルの斜視図である。
【図６】  図１の装置に使われる好適なフローセルの断面図である。
【図７】  図１の装置の前方光拡散検出器を形成する部分の離散的要素の上面図である。
【図８】  図１の装置のデータ分析コンポーネントを備える要素の概略図である。
【図９Ａ】  図１の装置により得られたデータを例示する拡散図である。
【図９Ｂ】  図１の装置により得られたデータを例示する拡散図である。
【図９Ｃ】  図１の装置により得られたデータを例示する拡散図である。
【図１０Ａ】  図１の装置により得られたデータを例示する拡散図である。
【図１０Ｂ】  図１の装置により得られたデータを例示する拡散図である。
【図１０Ｃ】  図１の装置により得られたデータを例示する拡散図である。
【図１１Ａ】  図１の装置により得られたデータを例示する拡散図である。
【図１１Ｂ】  図１の装置により得られたデータを例示する拡散図である。
【図１２Ａ】  図１の装置により得られたデータを例示する拡散図である。
【図１２Ｂ】  図１の装置により得られたデータを例示する拡散図である。
【図１３Ａ】  図１の装置により得られたデータを例示する拡散図である。
【図１３Ｂ】  図１の装置により得られたデータを例示する拡散図である。
【図１４Ａ】  図１の装置により得られたデータを例示する拡散図である。
【図１４Ｂ】  図１の装置により得られたデータを例示する拡散図である。
【図１５Ａ】  図１の装置により得られたデータを例示する拡散図である。
【図１５Ｂ】  図１の装置により得られたデータを例示する拡散図である。
【図１６Ａ】  図１の装置により得られたデータを例示する拡散図である。
【図１６Ｂ】  図１の装置により得られたデータを例示する拡散図である。
【図１７Ａ】  図１の装置により得られたデータを例示する拡散図である。
【図１７Ｂ】  図１の装置により得られたデータを例示する拡散図である。
【図１８Ａ】  図１の装置により得られたデータを例示する拡散図である。
【図１８Ｂ】  図１の装置により得られたデータを例示する拡散図である。
【図１９Ａ】  図１の装置により得られたデータを例示する拡散図である。
【図１９Ｂ】  図１の装置により得られたデータを例示する拡散図である。
【図２０Ａ】  図１の装置により得られたデータを例示する拡散図である。
【図２０Ｂ】  図１の装置により得られたデータを例示する拡散図である。
【図２１Ａ】  図１の装置により得られたデータを例示する拡散図である。
【図２１Ｂ】  図１の装置により得られたデータを例示する拡散図である。
【図２２】  図１の装置により得られたデータを例示する拡散図である。
【図２３】  図１の装置により得られたデータを例示する拡散図である。
【図１】
0004468590.tif 000004
【図２】
0004468590.tif 000005
【図３】
0004468590.tif 000006
【図５】
0004468590.tif 000007
【図６】
0004468590.tif 000008
【図７】
0004468590.tif 000009
【図８】
0004468590.tif 000010
【図９Ａ】
0004468590.tif 000011
【図９Ｂ】
0004468590.tif 000012
【図９Ｃ】
0004468590.tif 000013
【図１０Ａ】
0004468590.tif 000014
【図１０Ｂ】
0004468590.tif 000015
【図１０Ｃ】
0004468590.tif 000016
【図１１Ａ】
0004468590.tif 000017
【図１１Ｂ】
0004468590.tif 000018
【図１２Ａ】
0004468590.tif 000019
【図１２Ｂ】
0004468590.tif 000020
【図１３Ａ】
0004468590.tif 000021
【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
0004468590.tif 000023
【図１４Ｂ】
0004468590.tif 000024
【図１５Ａ】
0004468590.tif 000025
【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
0004468590.tif 000027
【図１６Ｂ】
0004468590.tif 000028
【図１７Ａ】
0004468590.tif 000029
【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
0004468590.tif 000031
【図１８Ｂ】
0004468590.tif 000032
【図１９Ａ】
0004468590.tif 000033
【図１９Ｂ】
0004468590.tif 000034
【図２０Ａ】
0004468590.tif 000035
【図２０Ｂ】
0004468590.tif 000036
【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２】
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【図２３】
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