(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
（Ｘ）ｎ−Ｙ
［式中、
Ｙは、-ＮＨ-、-ＣＯＯ-、-Ｏ-および／または-Ｓ-から選択される少なくとも１つの官能基を有する、インスリン、成長ホルモン、セファレキシン、ポリミキシン−Ｂ、ピペラシリンまたはプロプラノールの残基であり、そして
Ｘは、式（ｉ）：
0004416184.tif 000011
（式中、Ｒ1は、水素又はスルホであり；Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、それぞれ水素であり；そしてＡは、このラジカルがＹの-ＣＯＯ-または-Ｓ-基に結合しているとき共有結合であるか、あるいはＡは、このラジカルがＹの-ＮＨ-または-Ｏ-基に結合しているときＯＣＯ−であり、ｎは１以上の整数である）のラジカルであり、
ここで、式（ｉ）のラジカルにおいて、Ｒ1からＲ4が水素で、ＡがＯＣＯ−であるラジカル（９−フルオレニルメトキシカルボニル）は、以後Ｆｍｏｃと言い；Ｒ1からＲ4が水素で、Ａが共有結合であるラジカル（９−フルオレニルメチル）は、以後Ｆｍと言い；Ｒ1が２−スルホで、Ｒ2からＲ4が水素で、ＡがＯＣＯ−であるラジカル（２−スルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル）は、以後Ｓｕｌｆｍｏｃと言う］で示される化合物、またはその薬剤学的に許容される塩。
【請求項２】
Ｙは、Ｒ1は水素またはスルホであり、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は水素である式（ｉ）のラジカルの少なくとも１により置換されている、請求項１記載の化合物。
【請求項３】
Ｙは、インスリン分子の遊離アミノおよび／またはカルボキシルが、少なくとも１つの式（ｉ）のラジカルにより置換されている、インスリンの残基である、請求項２記載の化合物。
【請求項４】
Ｙは、インスリン分子の遊離ヒドロキシルが、少なくとも１つの式（ｉ）のラジカルにより置換されている、請求項３記載の化合物。
【請求項５】
１つまたはそれ以上のアミノが、Ｆｍｏｃにより置換されている、請求項３記載の化合物。
【請求項６】
１つまたはそれ以上のカルボキシルが、Ｆｍにより置換されている、請求項３記載の化合物。
【請求項７】
１つまたはそれ以上のアミノがＦｍｏｃにより置換され、１つまたはそれ以上のカルボキシルが、Ｆｍにより置換されている、請求項３記載の化合物。
【請求項８】
１つまたはそれ以上のカルボキシルがＦｍにより置換され、１つまたはそれ以上のヒドロキシルが、Ｆｍｏｃにより置換されている、請求項４記載の化合物。
【請求項９】
１つまたはそれ以上のアミノおよびヒドロキシルがＦｍｏｃにより置換され、１つまたはそれ以上のカルボキシルが、Ｆｍにより置換されている、請求項４記載の化合物。
【請求項１０】
ＧｌｙA1、ＰｈｅB1、またはＬｙｓB29位（ここで、ＡおよびＢは、インスリン分子のＡ鎖およびＢ鎖を示す）の遊離アミノにおいて１〜３個のＦｍｏｃを有するインスリン誘導体であって、ＧｌｙA1−Ｎ−（Ｆｍｏｃ）−インスリン、ＰｈｅB1−Ｎ−（Ｆｍｏｃ）−インスリン、ＬｙｓB29−Ｎ−（Ｆｍｏｃ）−インスリン、ＧｌｙA1，ＰｈｅB1−Ｎ−（Ｆｍｏｃ）2−インスリン、ＧｌｙA1，ＬｙｓB29−Ｎ−（Ｆｍｏｃ）2−インスリン、ＰｈｅB1，ＬｙｓB29−Ｎ−（Ｆｍｏｃ）2−インスリン、およびＧｌｙA1，ＰｈｅB1，ＬｙｓB29−Ｎ−（Ｆｍｏｃ）3−インスリンからなるインスリン誘導体の群から選択されるインスリン誘導体である、請求項３記載の化合物。
【請求項１１】
ＧｌｙA1、ＰｈｅB1、またはＬｙｓB29位（ここで、ＡおよびＢは、インスリン分子のＡ鎖およびＢ鎖を示す）の遊離アミノ基において１〜３個のＳｕｌｆｍｏｃを有するインスリン誘導体であって、ＧｌｙA1−Ｎ−（Ｓｕｌｆｍｏｃ）−インスリン、ＰｈｅB1−Ｎ−（Ｓｕｌｆｍｏｃ）−インスリン、ＬｙｓB29−Ｎ−（Ｓｕｌｆｍｏｃ）−インスリン、ＧｌｙA1，ＰｈｅB1−Ｎ−（Ｓｕｌｆｍｏｃ）2−インスリン、ＧｌｙA1，ＬｙｓB29−Ｎ−（Ｓｕｌｆｍｏｃ）2−インスリン、ＰｈｅB1，ＬｙｓB29−Ｎ−（Ｓｕｌｆｍｏｃ）2−インスリン、およびＧｌｙA1，ＰｈｅB1，ＬｙｓB29−Ｎ−（Ｓｕｌｆｍｏｃ）3−インスリンからなるインスリン誘導体の群から選択されるインスリン誘導体である、請求項３記載の化合物。
【請求項１２】
インスリンは、天然の、組換えまたは突然変異したヒト、ウシ、またはブタインスリンである、請求項３から１１までのいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１３】
（ｉ）ヒトまたはウシ成長ホルモンの-ＮＨ-または-Ｏ-基が、Ｒ1からＲ4が水素で、ＡがＯＣＯ−である請求項１に記載の式（ｉ）のラジカルに結合した、Ｆｍｏｃ−成長ホルモン；
（ｉｉ）セファレキシンの-ＮＨ-基が、Ｒ1からＲ4が水素で、ＡがＯＣＯ−である請求項１に記載の式（ｉ）のラジカルに結合した、Ｎ−Ｆｍｏｃ−セファレキシン、または、セファレキシンの-ＣＯＯ-基が、Ｒ1からＲ4が水素で、Ａが共有結合である請求項１に記載の式（ｉ）のラジカルに結合した、セファレキシン−Ｏ−Ｆｍ；
（ｉｉｉ）ポリミキシン−Ｂの２つの-ＮＨ-基のそれぞれの１つが、Ｒ1からＲ4が水素で、ＡがＯＣＯ−である請求項１に記載の式（ｉ）のラジカルに結合した、ジ−（Ｆｍｏｃ）−ポリミキシン−Ｂ；
（ｉｖ）ピペラシリンの-ＣＯＯ-基が、Ｒ1からＲ4が水素で、Ａが共有結合である請求項１に記載の式（ｉ）のラジカルに結合した、ピペラシリン−Ｏ−Ｆｍ；および
（ｖ）プロプラノロールの-Ｏ-基が、Ｒ1からＲ4が水素で、ＡがＯＣＯ−である請求項１に記載の式（ｉ）のラジカルに結合した、Ｆｍｏｃ−プロプラノロール
から選ばれる化合物。
【請求項１４】
Ｙが、Ｒ1からＲ4が水素で、ＡがＯＣＯ−である式（ｉ）のラジカルに結合した、請求項１に記載の化合物またはその薬剤学的に許容される塩、および薬剤学的に許容される担体を含む薬学的組成物。
【請求項１５】
請求項３から１２までのいずれか１項に記載のＮ−（Ｆｍｏｃ）−インスリンを含む、請求項１４記載の薬剤組成物。
【請求項１６】
天然のまたは組換えヒトＮ−（Ｆｍｏｃ）3−インスリンおよび／または、天然のおよび／または組換えヒトＮ−（Ｆｍｏｃ）2−インスリンを含む、請求項１５記載の薬剤組成物。
【請求項１７】
皮下注射、経皮または経口投与のための、請求項１４から１６までのいずれか１項に記載の薬剤組成物。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、不活性型から生物活性型への体内での化学変換を受けることが可能な新規な長期作用型プロドラッグ（該プロドラッグは、穏やかな塩基性条件に対して感受性の官能基を有する）、さらに詳しくはフルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）−およびフルオレニルメチル（Ｆｍ）−置換プロドラッグ、およびこれらを含む薬剤組成物に関する。
発明の背景
ヒトの治療および獣医学的治療の両方に現在使用されている治療用薬物は、種種の基準により分類することができる。例えば、薬物はタンパク性−ペプチド性を有する分子（すなわち、アミノ酸構成単位からなる）または非ペプチド性を有する分子として、あるいは経口吸収されるか、または血液循環に到達させるために他の様式（すなわち、注射、鼻内または局所的）により投与される薬物のような構造とは無関係の基準により、分類することができる。
経口吸収される化合物は、一般に、低分子量の、どちらかと言えば安定で、親油性（「油性」）かつ非ペプチド性のものである。事実上全てのペプチド性およびタンパク質薬物は、それらの固有の親水性（非親油性）および極性、および代謝的不安定性のため、これらの基準に従わず、大体注射により投与する必要がある。さらに、これらの分子は、多様な機作、特にタンパク質分解により体内で迅速に分解されるため、通常短命な分子種である。
非ペプチド性薬物は、しばしば充分に疎水性であり、胃腸管経路により血液循環に到達させることができる。これらの相対的化学安定性のため、非ペプチド性薬物は通常長命な種である。
タンパク質およびペプチド薬物には、主要かつ多くの臨床的用途を有する（例えば、糖尿病の治療におけるインスリン、前立腺癌の治療におけるゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）類似体、骨関連障害の治療におけるカルシトニン）。この最も重要な分子のファミリーのポテンシャルは大きいが、未だほんのわずかではないにしても部分的にしか探求されていない。これは、大部分はこれらが体内で短命であり、投与の様式の不便さのためである。抗生物質のような非ペプチド性薬物は比較的長命であるが、目的の循環レベルを継続して維持するためには１日数回水１週間にわたって（またはそれ以上）投与する必要がある。
薬物の経口吸収は、ヒトの疾患の治療、特に長期治療における非常に望ましい目標である。薬物の構造変更は、経口および局所吸収、生物学的安定性、および最終的に生物学的利用能の増大をもたらすことがある。現在こういった目標に大きな努力が向けられている。大部分のアプローチでは、その本来の構造（すなわち生物活性構造）が保存されるように薬物を修飾する。この本来の構造は、薬物の標的により特異的に認識される構造であり、かつ薬物の効力の必要不可欠な特徴である。しかし残念ながら多くの場合に、本来の構造はまた、「清掃機械システム（clearing machinery system）」（これは、薬物を結合し、薬物を分解または代謝することができ、そして薬物の廃棄を促進する）によっても認識される。従って、代謝安定性を増強するための要求と同時に、しばしば生物活性構造の安定化が試みられる。カプセル化、溶解度の低下および化学修飾のような方法が、この目標を達成するために用いられている。
抗生物質、抗ウイルス薬、抗高血圧薬、抗炎症薬、鎮痛薬、抗コレステロール血症薬、抗癌薬、抗糖尿病薬、成長促進薬、および他の薬物を含む、市販されているか、または将来開発されるであろう実質的に多く（全てではないが）のペプチド性および非ペプチド性薬物の半減期を延長することは非常に望ましい。ある閾値濃度以上で毒性である本来の薬物に関連するプロドラッグは、特に有益であろう。
発明の要約
従って本発明の目的は、穏やかな塩基性条件に対するその高い感受性、および体内の生理学的条件下で不活性型から生物活性型への変換を受けることができるその能力、を特徴とする新規なプロドラッグを提供することである。
本発明の別の目的は、遊離アミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基および／またはメルカプト基を有する薬物から得られるプロドラッグであって、本質的に生物学的に非活性であるが、投与後体内で自発的かつ緩徐に元の活性薬物分子に変換されることができるプロドラッグを提供することである。
本発明のさらに別の目的は、より高い代謝安定性および増大した生物学的利用能を示すプロドラッグを提供することである。
本発明のさらなる目的は、薬物投与の代替的可能性（例えば、経口および経皮）を示す、かつさらに生理学的障壁（例えば、脳血管関門）を貫通することができるプロドラッグを提供することである。
本発明のさらに他の目的は、体内の患部への特異的薬物ターゲティングを可能にするプロドラッグを提供することである。
従って本発明は、ある薬物から得られる誘導体化された新規なプロドラッグであって、遊離アミノ、カルボキシル、ヒドロキシルおよび／またはメルカプトを含む基から選択される該薬物分子の１つまたはそれ以上の基が、塩基に対して感受性で、穏やかな塩基性（例えば、生理学的）条件下で脱離可能な官能基により置換されている、新規なプロドラッグに関する。
除放性薬物のための本発明の新しい概念は、新規な、一般に疎水性のより高い薬物誘導体への誘導体化を含む。このアプローチにおいて、本来のコンホメーション、生物学的効力、および分解系によるその薬物の同一性の認識は、保存するよりもむしろ喪失することが好ましい。しかしこのアプローチの利点は、こうして修飾される誘導体が、インビボ条件下で緩徐かつ自発的に加水分解して本来の活性薬物に戻ることができるという事実にある。
具体的な実施態様において、本発明のプロドラッグは、式：
Ｘ−Ｙ
［式中、
Ｙは、遊離アミノ、カルボキシル、ヒドロキシルおよび／またはメルカプトから選択される少なくとも１つの官能基を有する薬物の残基であり、そして
Ｘは、式（ｉ）〜（iv）：
0004416184.tif 000002
（式中、Ｒ1およびＲ2は、同一であるかまたは異なって、それぞれ水素、アルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アリール、アルカリール（alkaryl）、アラルキル、ハロゲン、ニトロ、スルホ、アミノ、アンモニウム、カルボキシル、ＰＯ3Ｈ2、またはＯＰＯ3Ｈ2であり；Ｒ3およびＲ4は、同一であるかまたは異なって、それぞれ水素、アルキルまたはアリールであり；そしてＡは、このラジカルが薬物Ｙのカルボキシルまたはメルカプト基に結合しているとき共有結合であるか、あるいはＡは、このラジカルがＹのアミノまたはヒドロキシル基に結合しているときＯＣＯ−である）のラジカルから選択されるラジカルである］で示されるものである。
本発明において、Ｙは、遊離アミノ、カルボキシル、ヒドロキシルおよび／またはメルカプトから選択される少なくとも１つの官能基を有する、ヒトおよび獣医学的使用のための任意の薬物［例えば、抗糖尿病薬（例えば、インスリン）；成長促進薬（例えば、ヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン）；アミノグリコシド（例えば、ゲンタマイシン、ネオマイシンおよびストレプトマイシン）、ペニシリン（例えば、アモキシシリン、アンピシリン、ピペラシリン）およびセファロスポリン（例えば、セファクロール、セフミノックス（cefminox）およびセファレキシン）のようなβ−ラクタム、マクロライド（例えば、カルボマイシンおよびエリスロマイシン）、およびポリペプチド性抗生物質（例えば、バシトラシン、グラミシジンおよびポリミキシン）のような抗生物質；合成抗菌物質（例えば、トリメトプリム、ピロミジン酸（piromidic acid）、およびスルファメタジン）；鎮痛薬および抗炎症薬（例えば、アセトアミノフェン、アスピリン、イブフェナック、インドメタシン）；抗アレルギーおよび抗ヒスタミン薬（例えば、アムレキサノックス（amlexanox）およびクロモリン）；抗高コレステロール血症薬（例えば、クロフィブリン酸、オキシニアシン酸（oxiniacic acid）およびトリパラノール）；β−アドレナリン作用遮断薬および抗高血圧薬（例えば、ブプラノロール（bupranolol）、カプトプリル、インデノロール（indenolol)、プロプラノロールおよび４−アミノブタン酸）；抗新生物薬（例えば、ダウノルビシン、アザシチジン、６−メルカプトプリン、インターフェロン、インターロイキン−２、メソトレキセート、タキソールおよびビンブラスチン）；抗ウイルス薬（例えば、アシクロビル、ガンシクロビル、アマンタジン、インターフェロン、ＡＺＴおよびリバビリン（ribavirin））など（これらに限定されない）］の残基である。本発明の薬物という用語は、フェロモンをも包含する。
本明細書のＲ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4の定義の中の「アルキル」、「アルコキシ」、「アルコキシアルキル」、「アリール」、「アルカリール」および「アラルキル」という用語は、１〜８個、好ましくは１〜４個の炭素原子のアルキルラジカル、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピルおよびブチル、および６〜１０個の炭素原子のアリールラジカル、例えば、フェニルおよびナフチルを示すために使用される。「ハロゲン」という用語は、ブロモ、フルオロ、クロロおよびヨードを含む。
本発明の好ましい実施態様において、官能基は、ラジカル（ｉ）（ここで、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、水素であり、そしてＡは、ＯＣＯ−である）、すなわち、アミノ基の一時的可逆的保護のためにペプチド合成において広く使用される、周知の９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）ラジカルである（総説についてはエル・エー・カーピノ（L.A. Carpino），Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．（１９８７）２０，４０１−４０７を参照のこと）。Ｆｍｏｃ基は、その導入と脱離のための有利な合成操作、およびペプチド合成と便利な精製のために必要不可欠なものとしての選択的安定性のために、ペプチド合成には特に適している。さらには、関連する９−フルオレニルメチル（Ｆｍ）基も、カルボン酸官能基（例えば、アミノ酸）の可逆的マスキングに適用可能である。得られる９−フルオレニルメチルエステル（Ｆｍ−エステル）は、穏やかな塩基処理によりβ−脱離反応経路により親の遊離カルボン酸官能基を生じさせるため、同様に薬物のカルボン酸官能基の可逆的マスキングに使用することができる。Ｆｍｏｃ基はさらに、チロシン、セリンおよびトレオニンのヒドロキシル基の可逆的保護において同様に使用することができる。
ハロゲン化Ｆｍｏｃラジカル（ｉ）（ここで、Ｒ1およびＲ2の少なくとも１つは、２位または７位がハロゲン、好ましくはＣｌまたはＢｒである）、２−クロロ−１−インデニルメトキシカルボニル（ＣＬＩＭＯＣ）ラジカル（ii）、１−ベンゾ［ｆ］インデニルメトキシカルボニルウレタン（ＢＩＭＯＣ）ラジカル（iii）、ウレタンスルホンラジカル（iv）および対応するラジカル（ｉ）〜（iv）（ここで、Ａは、共有結合である）は、薬物の遊離アミノ、カルボキシル、ヒドロキシルおよびメルカプト官能基の置換にＦｍｏｃおよびＦｍと同様に使用することができ、そして塩基性（例えば、生理学的）条件下でのこのような基の脱離に対する広範な感受性を提供することができる。実際、上記ラジカル（ｉ）〜（iv）は、中性またはわずかにアルカリ性ｐＨおよび穏やかな条件での加水分解を受けるまれな化学物質の一般的ファミリーに属するもので、従ってα−およびε−アミノ基の一時的可逆的保護に、例えば、ペプチド合成において使用することができ、そして穏やかな塩基性条件下でβ−脱離反応によりアミノ官能基から脱離することができる。
本発明ではラジカル（ｉ）〜（iv）、好ましくはアミノおよび／またはヒドロキシル残基に共有結合したＦｍｏｃ、またはカルボキシルおよび／またはメルカプト残基に共有結合したＦｍは、体液の生理学的条件（すなわちｐＨ７．４および３７℃）下で、加水分解（β−脱離による）を受けて遊離アミノ、ヒドロキシ、メルカプトまたはカルボキシル官能基に戻る。
本発明のプロドラッグは、ラジカル（ｉ）〜（iv）を含む適切な試薬との薬物分子の反応により調製することができる。アミノ官能基に非常に特異的な試薬の９−フルオレニルメチル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）；アミノおよびヒドロキシルラジカルと反応して共有結合する、９−フルオレニルメトキシカルボニルクロリド（Ｆｍｏｃ−Ｃｌ）；メルカプトラジカルと反応してＳ−Ｆｍ誘導体を与える９−クロロメチルフルオレン（Ｆｍ−Ｃｌ）（ボダンスキー（Bodanszky）とベドナレック（Bednarek）、１９８２年）；およびカルボキシル官能基と反応してエステル化する９−フルオレニルメタノール（Ｆｍ−ＯＨ）のような、９−フルオレニルメチル（Ｆｍ）のいくつかの誘導体が利用可能である。
β−脱離とは異なる経路によりアミノ、カルボキシル、ヒドロキシルまたはメルカプト官能基から脱離することができる、塩基性条件に感受性の官能基も利用可能であるが、これらは通常薬物の保護には妥当でない大規模な操作を必要とする。知られている１つの例外は、トリフルオロアセチル基（ＴＦＡ）であり、これは、アミノ基からの容易な脱離においてＦｍｏｃと同等であるが、潜在的に毒性であるため、ＴＦＡ誘導体化薬物は、治療目的には推奨されない。これに反してＦｍｏｃ−アミノ酸（Ｆｍｏｃ−ロイシン）は、実験動物モデルにおいて低い毒性の指数を示した（バーチ（Burch）ら、１９９１年）。
本発明はさらに、本発明のプロドラッグおよび薬剤学的に許容される担体を含む、薬剤組成物に関する。
【図面の簡単な説明】
図１は、無細胞生物学的測定法（インスリン受容体チロシンキナーゼの濃縮調製物による［ポリ（Ｇｌｕ4Ｔｙｒ）］のリン酸化）により求めた、ＬｙｓB29−Ｎ−（Ｆｍｏｃ）1−インスリン（黒四角）、ＰｈｅB1，ＬｙｓB29−（Ｆｍｏｃ）2−インスリン（白四角）およびＧｌｙA1，ＰｈｅB1，ＬｙｓB29−Ｎ−（Ｆｍｏｃ）3−インスリン（３つ全てのアミノ基に置換、白丸）のいずれかの活性化（ｐＨ７．４、３７℃）の経時変化を示す。
図２は、正常ラットの血液グルコースレベルに及ぼす（Ｆｍｏｃ）2−インスリン（２ｍｌ  １０％ＤＭＳＯ中３ｍｇ／ラット）およびＮＰＨ−インスリン（３ｍｇ／ラット）の単回腹腔内投与の作用を示す。
図３は、正常ラットの血液グルコースレベルに及ぼす（Ｓｕｌｆｍｏｃ）2−インスリンおよび本来のインスリン（両方とも１ｍｌ水中３ｍｇ／ラット）の単回腹腔内投与の作用を示す。
図４は、トリプシンとキモトリプシンの混合物によるインスリン（白四角）およびＧｌｙA1，ＰｈｅB1，ＬｙｓB29−Ｎ−（Ｆｍｏｃ）3−インスリン（黒菱形）の分解を示す。
図５は、本来のインスリン投与（白四角）に比較した、糖尿病ストレプトゾトシン（streptozotocin）（ＳＴＺ）処理ラットの血液グルコースレベルに及ぼす単回ＧｌｙA1，ＰｈｅB1，ＬｙｓB29−Ｎ−（Ｆｍｏｃ）3−インスリン投与（黒丸）の作用を示す。
図６は、ＳＴＺ処理高血糖症ラットへのＰｈｅB1，ＬｙｓB29−Ｎ−（Ｆｍｏｃ）2−インスリンの単回投与が、血液グルコースレベルを下げる持続作用を誘導することを示す。
図７は、インキュベーションによる活性プロプラノロールの生成による、Ｎ−Ｆｍｏｃ−プロプラノロールのβ−アドレナリン拮抗能力を示す。
発明の詳細な説明
本発明は、薬物投与のよりよい経路を開発するための新規な概念により設計された、そしてその結果薬物安定性および生物活性が増強された、プロドラッグに関する。本発明の新規なアプローチでは、薬物の本来の構造、生物学的効力および標的認識能力は保存されているよりもむしろ喪失されるのが好ましいが、適用後は、こうして修飾された薬物は、体内で元の活性分子に自発的かつ緩徐に変換して戻る。
本発明の新規な概念により、現在適用されている多くの薬物は、生物内での全身性の受容体介在性分解を回避するため長命種である不活性プロドラッグに変換することができる。本発明のプロドラッグは、インビボの生理学的条件および均質な方法で元の薬物への自発的再生を受けるように設計される。本発明のプロドラッグの製造に利用可能な広い範囲の化学操作により、必要に応じて速い速度または遅い速度の再生が得られる。このため所定のプロドラッグは、溶解度が低く、従ってｓ．ｃ．吸収の速度が遅いというような物理特性を有するように調製することができる。さらに、循環血中の自発的再生の特性と組合せた、プロドラッグの疎水性指数の変更により、経口で非吸収性薬物の胃腸透過性プロドラッグに変換することができる。
本発明のプロドラッグは、ヒトと動物に使用するための修飾薬物だけでなく、修飾昆虫フェロモンをも含む。
本発明の１つの側面において、プロドラッグは修飾インスリンである。現在インスリンは、高血糖症、脂質、炭水化物およびタンパク質の代謝の変調および血管疾患からの合併症のリスクの上昇を特徴とする症候の群である糖尿病の支配的な薬物である。多くの患者は、インスリン依存性（ＩＤＤＭ、Ｉ型）またはインスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ、II型）として臨床的に分類することができる。西洋世界では約９０％の糖尿病患者は、II型糖尿病であり、残りの多くはＩ型である。米国のII型糖尿病の約７０％は、インスリン耐性に顕著に寄与する因子である肥満でもある。Ｉ型糖尿病では、膵β−細胞の広範な選択的喪失および低インスリン血症の状態がある。対照的にII型糖尿病患者では膵島からのβ−細胞の顕著な喪失はなく、これらの患者では２４時間にわたるインスリンの平均血漿濃度は、本質的に正常であるか、またはホルモンの作用に対する末梢抵抗のために上昇していることさえある。それにもかかわらず、II型糖尿病の個人は、相対的にインスリンが欠乏している。これは、正常な膵β−細胞が、高血糖症に直面したとき正常よりかなり多いインスリンを分泌することができるからであり、このためインスリンに対する中程度の耐性にもかかわらず個人を正常血糖に維持することができる。
事実上全ての型の糖尿病は、インスリンの作用と反対の作用を有する過剰なホルモン（グルカゴン、成長ホルモン、コルチゾール、およびカテコールアミン）と関係する、インスリンの循環濃度の低下（インスリン欠乏）またはインスリンに対する末梢組織の応答の低下（インスリン耐性）のいずれかのせいである。これらのホルモン異常により、炭水化物、脂質、ケトンおよびアミノ酸の代謝が変化する。この症候群の中心的な特徴は、高血糖である。
血漿中のインスリンの半減期は、約５〜６分である。インスリンの分解は、主に肝臓で起こり、少ない量で腎臓と筋肉でも起こる。門脈で肝臓に到達するインスリンの約５０％は分解されて、全身循環には到達しない。インスリンは腎糸球体により濾過され、尿細管（これもインスリンを分解する）により再吸収される。
肝臓におけるインスリンのタンパク質分解は、主として受容体介在性である。インスリン受容体結合後、複合体はエンドソームと呼ばれる小胞中に内在化し、ここで分解が開始する。あるインスリンはまた、分解のためにリソソームに送達される。肝細胞では、内在化したインスリンの約５０％が分解される。
インスリンは、糖尿病のケトアシドーシスの管理に決定的に重要であり、そして高血糖性非ケトン性昏睡の治療、ならびにＩ型およびII型糖尿病患者両方の手術中の管理において重要である。インスリンの皮下（ｓ．ｃ．）投与は、食餌および／または経口低血糖薬により適切に制御されない全てのＩ型患者および多くのII型糖尿病患者の基本的治療である。全ての症例において、目標は、血液グルコースだけでなく、低インスリン血症および高血糖症に由来する不均衡な代謝の全ての他の側面をも正常化することである。
主としてインスリンのｓ．ｃ．投与に基づく長期治療は、注入される栄養に応答してのインスリン分泌の正常な急速上昇と下降を模倣せず、そしてインスリンの肝臓の作用よりもむしろ選択的末梢作用を有するが、それにもかかわらずこの治療によりかなり成功している。
ｓ．ｃ．適用のために以前から利用されているインスリン製剤は、作用の持続時間により、短期、中期または長期作用性インスリンに分類され、そして元の種により分類される。ヒトインスリンは、今や広く利用可能であり、理論上は、ブタまたはウシインスリンよりも免疫原性が低いことが期待される（最後の２つのインスリンは、それぞれ１つおよび３つのアミノ酸がヒトインスリンと異なる）。しかし高度に精製すると、３つ全てのインスリンが、免疫応答を刺激する低いが測定可能な能力を有する。中性ｐＨ値での調製は、一般に安定であり、室温で長期の保存が可能である。従来の目的および治療目的のためには、インスリンの用量および濃度は、絶食ウサギに標準血糖を誘導するのに必要な量に基づく単位（Ｕ）で表される。インスリンの均質な製剤は、約２５U/mgを含有する。
短期または迅速作用性インスリンは、通常食事の３０〜４５分前に注射される、中性ｐＨ緩衝液に溶解した結晶性亜鉛インスリンの可溶性製剤である。これらの製剤は、最も迅速に作用が開始し、最も持続時間が短い。
安定な代謝条件下では、標準的インスリンは通常、中期、または長期作用性製剤と一緒に投与される。中期作用性インスリンは、水溶液には溶解性が低くなるように設計されたものであり、そのため皮下投与すると緩徐に溶解し、そしてその作用の持続時間は長い。最も頻繁に使用される２つの製剤は、硫酸プロタミンの添加により修飾されたリン酸緩衝液中の亜鉛インスリン結晶の懸濁液である、ＮＰＨインスリン（ＮＰＨは、ニュートラルプロタミンハーゲドルン（Neutral Protamine Hagedorn）を表す）、およびインスリンの溶解度を最小化するために塩化亜鉛の添加により修飾された酢酸緩衝液中のインスリンの懸濁液である、レンテ（Lente）インスリンである。
短期作用性インスリンは、０．４〜７時間作用することが期待されるため、そして中期作用性インスリンは、１．５〜２０時間の範囲で作用しうるため、２つのインスリンの組合せの正しいタイミングと用量には、反調節ホルモン（インスリンに対する）の活性が上がるとき、栄養学的性質、夜間（絶食）低血糖、および早朝高血糖のような可変パラメーターを考慮する必要がある。迅速作用性および長期または中期作用性インスリン製剤が同時投与されるならば、このような組合せの共通の不都合は、混合することにより、迅速作用性インスリンのいくつかは、長期または中期作用性製剤の過剰なＺｎ2+またはプロタミンと錯体を形成し、そのため中期およびさらには長期作用性インスリンに変換することもある。
ウルトラレンテ（Ultralente）インスリンまたは延長亜鉛インスリンまたはプロタミン亜鉛インスリン懸濁液のような長期作用性インスリンは、インスリンの不溶性製剤を達成するために亜鉛、または亜鉛＋プロタミンが過剰に添加されたインスリン製剤である。これらは、亜鉛インスリンの微細な粒子の懸濁液であり、これらの作用の持続時間を決定する粒子径のみが異なる。標準的インスリンとは異なり、ウルトラレンテインスリンは、作用の開始が非常に遅く延長した（「平坦な」）ピークを有する。これらは、１日中インスリンの低い基底濃度を提供することを支持するが、これらの長い半減期が最適用量を求めるのを困難にしており、そして定常状態の濃度が達成されるまでに数日の治療を必要とする。ウシおよびブタのウルトラレンテインスリンは、ヒトのウルトラレンテインスリンよりも作用の延長した経過を有する。負荷用量として正常１日用量３回の治療から開始して、次に１日１回または２回の注射を行うことが推奨される。
インスリンは、修飾のために利用可能な３つのアミノ基と６つのカルボキシル基を有する。本発明のインスリン誘導体は、インスリンＡおよびＢ鎖で１つまたはそれ以上の上記ラジカル（ｉ）〜（iv）により、１つまたはそれ以上のＧｌｙA1およびＰｈｅB1ラジカルの末端アミノ基で、ＬｙｓB29のε−アミノ基で、ＡｓｎA21およびＴｈｒB30の末端カルボキシル基で、および／またはＧｌｕA4、ＧｌｕA17、ＧｌｕB13、ＧｌｕB21の遊離カルボキシル基で置換されている。さらに、こうして置換されたカルボキシルおよび／またはアミノインスリン誘導体は、１つまたはそれ以上の官能基（ｉ）〜（iv）により、残基ＴｈｒA8、ＳｅｒA9、ＳｅｒA12、ＴｙｒA14、ＴｙｒA19、ＳｅｒB9、ＴｙｒB16、ＴｙｒB26、ＴｈｒB27およびＴｈｒB30の１つまたはそれ以上の遊離ヒドロキシル基でさらに置換されていてもよい。
本発明の１つの好ましい実施態様において、インスリン誘導体は、１つまたはそれ以上のＦｍｏｃ残基により、ＧｌｙA21およびＰｈｅB1の遊離末端アミノ基で、および／またはＬｙｓB29のε−アミノ基で置換されており、こうしてインスリン分子のＡ1、Ｂ1および／またはＢ29位に１〜３個のＦｍｏｃ置換基を有するインスリン誘導体、詳細にはＧｌｙA1−Ｎ−（Ｆｍｏｃ）1−、ＰｈｅB1−Ｎ−（Ｆｍｏｃ）1−およびＬｙｓB29−Ｎ−（Ｆｍｏｃ）1−インスリン、ＧｌｙA1，ＰｈｅB1−Ｎ−（Ｆｍｏｃ）2−、ＧｌｙA1，ＬｙｓB29−Ｎ−（Ｆｍｏｃ）2−およびＰｈｅB1，ＬｙｓB29−Ｎ−（Ｆｍｏｃ）2−インスリン、およびＧｌｙA1，ＰｈｅB1，ＬｙｓB29−Ｎ−（Ｆｍｏｃ）3−インスリンが得られる。
活性化Ｆｍｏｃ、例えば９−フルオレニルメチル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）とのインスリンの反応により、ＨＰＬＣ法により容易に分割可能な個々に純粋な形態で得られる、モノ−、ジ−およびトリ−Ｎ−Ｆｍｏｃ−インスリンが生成する。唯一の生成物としてジ−Ｎ−Ｆｍｏｃ−インスリンを得るために、１つの遊離アミノ基が最初に例えばｔ−Ｂｏｃ基により保護され、保護されたインスリン誘導体は過剰のＦｍｏｃ−ＯＳｕと反応し、そして次に保護基が脱離して、目的のジ−Ｎ−Ｆｍｏｃ−インスリンが得られる。糖尿病患者に投与されると、モノ−、ジ−およびトリ−Ｎ−Ｆｍｏｃ−は、本来のインスリンに変換されて、インビボで種々の期間（延長を含む）にわたる抗糖尿病作用が得られる。
インスリン（Ｃ−Ｆｍ）のカルボキシル基だけの置換のために、すなわち、末端ＡｓｎA21およびＴｈｒB30、およびＧｌｕA4、ＧｌｕA17、ＧｌｕB13およびＧｌｕB21残基において、インスリン分子の遊離アミノ基を、例えばｔ−Ｂｏｃ基により最初に保護し、次に３工程の反応（ここでは、（１）遊離カルボキシル基を、例えば、ｏ−ニトロフェノールまたはＮ−ヒドロキシ−スクシンイミドとの反応により活性エステル基に変換し；（２）９−フルオレニルメタノールとの活性化エステル基の反応をイミダゾールの存在下で行い；そして（３）保護ｔ−Ｂｏｃ基を脱離する）を行う。代替法では、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド、９−フルオレニルメタノールおよび４−ジメチルアミノピリジンによるカルボキシル基の１工程の直接エステル化、続いてｔ−Ｂｏｃ基の脱離を伴う。
アミノおよびカルボキシル基（Ｎ−Ｆｍｏｃ、Ｃ−Ｆｍ）の両方が置換されたＦｍｏｃ−インスリン誘導体を目的とするとき、最初にＮ−Ｆｍｏｃ誘導体をＦｍｏｃ−ＯＳｕにより調製し、次にＮ−Ｆｍｏｃインスリンを活性エステルに変換し、続いて上述のように９−フルオレニルメタノールと反応させる。
カルボキシルおよびヒドロキシル官能基（Ｃ−Ｆｍ、Ｏ−Ｆｍｏｃ）が置換されたＦｍ、Ｆｍｏｃ−インスリン誘導体の調製のために、最初にアミノ基をｔ−Ｂｏｃにより保護し、Ｃ−Ｆｍインスリン誘導体を上記のように調製し、続いて９−フルオレニルメトキシカルボニルクロリドと反応させ、そして保護Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ基を脱離する。
アミノ、カルボキシルおよびヒドロキシル官能基（Ｎ，Ｏ−Ｆｍｏｃ、Ｃ−Ｆｍ）が置換されたＦｍ、Ｆｍｏｃ−インスリン誘導体の調製のために、Ｎ−Ｆｍｏｃ、Ｃ−Ｆｍインスリンを上記のように調製し、次に９−フルオレニルメトキシカルボニルクロリドと反応させる。
本発明の修飾インスリンは、本来の、組換えまたは突然変異ヒト、ブタまたはウシインスリンのような、ヒトに使用するために適切な任意のインスリンから調製することができる。突然変異インスリンの例は、Ｂ１６−Ｔｙｒ→Ｈｉｓヒトインスリン類似体（カーズホルム（Kaarsholm）とルドビグセン（Ludvigsen）、１９９５年）、およびＢ２８およびＢ２９位の本来のアミノ酸配列が保存されているＬｙｓB28ＰｒｏB29ヒトインスリン類似体（インスリンリスプロ（lispro））である。インスリンリスプロは、ヒトインスリンと効力は等しいが、皮下注射部位からの吸収はより迅速である（キャンベル（Ｃａｍｐｂｅｌｌ）ら、１９９６年）。好ましい実施態様において、インスリンは、本来のまたは組換えヒトインスリンである。
本発明のモノ−Ｎ−Ｆｍｏｃ−インスリン誘導体は、［ポリ（Ｇｌｕ4Ｔｙｒ）］リン酸化測定法により測定すると、本来のインスリンの４０〜８０％の生物学的効力を有する。ジ−およびトリ−Ｎ−Ｆｍｏｃ−インスリン誘導体は、［ポリ（Ｇｌｕ4Ｔｙｒ）］リン酸化測定法により測定すると、それぞれ本来のインスリンの２〜９％および＜１％の生物学的効力を有する。正しい割合で適正に使用されると、これら３つの原型は、原理的に、現在糖尿病の皮下治療に適用される迅速作用性、中期作用性および長期作用性インスリンの従来の混合物を置換することができる。インスリンに関する側面において、本発明は、本発明の１つまたはそれ以上のインスリン誘導体および薬剤学的に許容される担体を含む薬剤組成物を提供する。長期作用性のために、本組成物は、好ましくはＮ−（Ｆｍｏｃ）3−インスリンまたはＮ−（Ｆｍｏｃ）2−インスリン誘導体単独または両方の混合物を含む。薬剤組成物は、例えば、経口処方としてまたは皮下注射のための、任意の適切な剤型で提供することができる。
この同じ側面の別の実施態様において、本発明は、糖尿病患者に有効用量の本発明の１つまたはそれ以上のインスリン誘導体を投与することを含む、糖尿病の治療法に関する。好ましい実施態様において、誘導体は、５〜８日の間隔で投与される、本来のまたは組換えヒトＮ−（Ｆｍｏｃ）3−インスリンまたはＮ−（Ｆｍｏｃ）2−インスリンのいずれか、または両方の混合物である。必要であれば、Ｆｍｏｃ−インスリン誘導体による治療は、迅速作用性インスリンの毎日の投与で完了する。
長期治療のために、インスリンは主として皮下注射により投与される。皮下投与される長期作用性インスリンによる現在の治療は、加えた物質が皮下注射の部位で潜在的に拡散しうるという事実のため、個々の糖尿病患者間で吸収に大きな変動があることが欠点である。本発明は、インスリン分子自体に「組み込まれた」低下した溶解度を持つインスリン誘導体を提供する。このため、ヒトの皮下吸収の大きな変動を排除し、また類似体の混合による妨害を最小化または排除さえすることが期待される。３つのＮ−（Ｆｍｏｃ）−インスリン原型の適正な混合物は、迅速作用性インスリンの必要を、Ｎ−（Ｆｍｏｃ）2およびＮ−（Ｆｍｏｃ）3−インスリンの徐放作用と結合させる（これらは全て、干渉作用なしに混合することができる）ため、延長した期間にわたって作用を持続しうる。
この同じ側面の別の実施態様において、本発明の組成物は、モノ、ジおよびトリ−Ｎ−Ｆｍｏｃ−インスリン誘導体の混合物を含む。Ｎ−（Ｆｍｏｃ）3−インスリンは、基本的に長期作用性インスリンであり；Ｎ−（Ｆｍｏｃ）1−インスリンは、［ポリ（Ｇｌｕ4Ｔｙｒ）］リン酸化測定法により測定すると、４０〜８０％生物学的に活性であり、かつ水溶液中で高い溶解度を示し、そしてＮ−（Ｆｍｏｃ）2−インスリンは、［ポリ（Ｇｌｕ4Ｔｙｒ）］リン酸化測定法により測定すると、２〜９％生物学的に活性であり、かつ水溶液中で溶解性が低い。３つの全ての類似体は、３７℃で生理学的ｐＨ値でインキュベーションすると完全に活性なインスリンに戻る。従って、３つの類似体の適正な混合物は、現在亜鉛とプロタミンを含有する製剤との標準的インスリンの複数注射により達成される、迅速作用、中期作用および長期作用を与える。
本発明の他の側面では、プロドラッグは、抗糖尿病薬、抗炎症薬、抗菌薬、抗ウイルス薬、抗新生物薬および抗高血圧薬、さらには免疫学的障害、皮膚科学的障害および神経学的障害の治療のための薬物を含むが、これらに限定されないヒトまたは獣医学的用途の薬物から誘導される。
本発明の薬剤組成物は、プロドラッグまたは薬剤学的に許容されるその塩、および薬剤学的に許容される担体を含む。ヒトおよび動物への薬物の任意の適切な投与経路、例えば、従来の注射、体内移植、経口、直腸内または局所投与が本発明では予想される。これらの製剤は、当業者に公知の従来法により、例えば、「レミントンの製剤科学（Remington’s Pharmaceutical Science）」、エー・アール・ジェンナロ（A.R. Gennaro）編、第１７版、１９８５年、マック出版社（Mack Publishing Company）、イーストン（Easton）、ペンシルバニア州、米国に記載されるように調製することができる。
ここで本発明は、以下の非限定的な例により説明される。
例
生物学的方法：
（ｉ）ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）処理ラットの調製
オスのウィスターラット（１８０〜２００ｇ）をワイズマン科学研究所（Weizmann Institute of Science）のホルモン研究部（Department of Hormone Research）から供給された。糖尿病は、マイエロビッチ（Meyerovitch）ら、１９８７、により新たに調製した０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）中のストレプトゾトシン（５５ｍｇ／ｋｇ体重）の溶液の単回静脈内注射により誘導した。（ｉｉ）インスリン受容体チロシンキナーゼの濃縮調製物は、マイエロビッチ（Meyerovitch）ら、１９９０、により記載されるようにラット肝臓膜から入手した。簡単に述べると、肝臓をプロテイナーゼインヒビターの存在下でホモジナイズし、１％トリトンＸ−１００で可溶化して、遠心分離した。上清をコムギ麦芽凝集素（ＷＧＡ）−アガロースカラム（シグマ（Sigma））に通した。吸着したインスリン受容体部分を、０．１％トリトンＸ−１００、１０％グリセロール、および０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含有する５０ｍＭ  ヘペス緩衝液（ｐＨ７．４）中の０．３Ｍ  Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコースアミンで溶出した。インスリンおよびインスリン誘導体の生物学的効力を以下の測定法（iii）および（iv）により評価した。
（iii）脂質生成（無傷の脂肪細胞の脂質への標識グルコースの取り込み）
本質的にロッドベル（Rodbell）、１９６４、の方法によりラット脂肪細胞を調製した。オスウィスターラットの脂肪パッドをはさみで小片に切り、３ｍｌの、ＮａＣｌ、１１０mM；ＮａＨＣＯ3、２５mM；ＫＣｌ、５mM；ＫＨ2ＰＯ4、１．２mM；ＣａＣｌ2、１．３mM；ＭｇＳＯ4、１．３mM；および０．７％  ＢＳＡを含有するＫＲＢ緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁した。激しく振盪しながらカルボゲン（carbogen）（９５％  Ｏ2、５％  ＣＯ2）の雰囲気下で２５ml柔軟プラスチック瓶中でコラゲナーゼ（１mg/ml）により消化を行った。次に５mlの緩衝液を加えて、細胞をメッシュスクリーンに通した。次に細胞を室温で浮遊させて１５mlプラスチック試験管中で数分間静置し、そして下の緩衝液を除去した。この操作（懸濁、浮遊、および下の緩衝液の除去）を３回繰り返した。
脂肪細胞懸濁液（３×１０5細胞／ml）をプラスチックバイアルに分配（１バイアル当たり０．５ml）し、カルボゲンの雰囲気下で３７℃で６０分間、インスリンの非存在下または存在下で、０．２mM［Ｕ−14Ｃ］グルコースと共にインキュベートした。脂質生成は、トルエンを主成分とするシンチレーション液を加える（１バイアル当たり１．０ml）ことにより終わらせて、抽出した脂質中の放射活性を計数した（ムーディー（Moody）ら、１９７４年）。典型的な実験ではインスリン刺激脂質生成はベースラインより４〜５倍高かった（ベースライン  ３×１０5細胞／ｈ当たり２０００ｃｐｍ；Ｖインスリン  ３×１０5細胞／ｈ当たり８，０００〜１０，０００ｃｐｍ）。この測定法において、インスリンは、脂質生成をＥＤ50値＝０．１５±０．０３ng/mlで刺激する（シェクター（Shechter）とロン（Ｒｏｎ）、１９８６年）。ＥＤ50値＝１５ng/mlを示すインスリン類似体は、本来のホルモンの〜１％の生物学的効力を有すると考えられる。
（iv）受容体チロシンキナーゼ活性測定
この測定法において、インスリンは、それ自体の受容体を活性化して、４：１モル比でＬ−グルタミン酸とＬ−チロシンを含有するランダムコポリマー［ポリ（Ｇｌｕ4Ｔｙｒ）］をリン酸化する。標準酵素測定法混合物（５０mM  ヘペス（ｐＨ７．４）−０．１％トリトンＸ−１００中最終容量６０μｌ）は、ＷＧＡ精製インスリン受容体（５μｇタンパク質）、２０mM  ＭｇＣｌ2、２mM  ＭｎＣｌ2、１００μＭ  ＡＴＰおよび種々の濃度（１ng/ml〜１０mg/ml）のインスリンまたはインスリン誘導体を含有していた。２２℃で３０分の予備インキュベーション後、ポリ（Ｇｌｕ4Ｔｙｒ）を加える（最終濃度０．７mg/ml）ことにより反応を開始し、これを２２℃で２０分間進行させ、ＥＤＴＡ（２０mM）を加えることにより終了させた。ポリＧｌｕ4Ｔｙｒ中のホスホチロシン含量を、ホスホチロシンに対する特異的モノクローナル抗体（最終希釈１：１００，０００）および125Ｉ−ＢＳＡ−ホスホチロシン結合体を使用する放射免疫測定法により定量した。この特別な測定法において、インスリンは、２０±３ng/mlの濃度で最大の半分の作用を促進する。ＥＤ50値＝２mg/mlを示すインスリン類似体は、本来のホルモンの〜１％の生物学的効力を有すると考えられる。
例１．Ｎ−Ｆｍｏｃ−インスリン誘導体の調製
（ａ）合成
ヒトインスリン（１００ｍｇ、１７．２μｍｏｌ）（バイオテクノロジー−ジェネラル（Biotechnology-General）、レホヴォト（Rehovot）、イスラエルから寄贈を受けた）は、１７．４mg（１７２μmol）トリエチルアミンを含有する４mlの分析等級のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に懸濁した。次にＦｍｏｃ−ＯＳｕ（５８ｍｇ、１７２μmol）を加えた。均一な反応混合物を２５℃で２０時間撹拌して、次に溶液が混濁するまで酢酸エチルを加えて、続いて沈殿が完了するまでエーテルを加えた。遠心分離により溶媒を除去し、沈殿物をエーテルで２回および水で２回洗浄した。この操作により、モノ、ジおよびトリ−Ｎ−Ｆｍｏｃ−インスリン誘導体の混合物が得られ、これを分取用ＨＰＬＣにより分離および精製した。モノ修飾Ｎ−Ｆｍｏｃ−インスリン誘導体は、粗生成物固体をイソプロパノールで洗浄することにより、ジおよびトリ修飾誘導体から分離することができる。
（ｂ）Ｎ−Ｆｍｏｃ−インスリン誘導体の単離と精製
粗生成物固体を、ＨＰＬＣ充填済みカラム（メルク（Merck）、リクロソーブ（LIChrosorb）ＲＰ−１８［７μｍ］を含有するリクロスカート（LIChrosCART）２５０−１０ｍｍ）を取り付けた逆相ＨＰＬＣ（スペクトラ−フィジックス（Spectra-Physics）ＳＰ８８００液体クロマトグラフィーシステム）に付した。Ｈ2Ｏ中の０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（溶液Ａ）とアセトニトリル：Ｈ2Ｏ（７５：２５）中の０．１％  ＴＦＡ（溶液Ｂ）から線形勾配が生成した。流速は１ml／分とした。Ｎ−（Ｆｍｏｃ）1−インスリン誘導体は、２１．１、２１．９および２２．８分の保持時間でカラムから出現し、Ｎ−（Ｆｍｏｃ）2−インスリン誘導体は２６．３、２７．１および２７．７分の保持時間で、そしてＮ−（Ｆｍｏｃ）3−インスリンは３１．５分の保持時間で出現した。２１〜２３分、２６〜２８分および３１．５分に対応する画分をプールし、凍結乾燥して化学的に性状解析した。２１〜２３分（モノ修飾インスリン）および２６〜２８分（ジ修飾インスリン）に対応する画分は、それぞれ個々のモノ−Ｆｍｏｃおよびジ−Ｆｍｏｃ−インスリン誘導体までさらに精製した。インスリン分子に結合したＦｍｏｃ基の量は、ＣＨ2Ｃｌ2中の５０％ピペリジンによる既知量のＮ−Ｆｍｏｃ−インスリン誘導体の処理により、３０１ｎｍで分光測光法で求めた。
（ｃ）Ｎ−Ｆｍｏｃ−インスリン誘導体の化学的性状解析
ＨＰＬＣ法による分取的分離により、７つのＮ−Ｆｍｏｃ−インスリン誘導体が得られた。これは、それぞれ３つのモノ修飾、３つのジ修飾および１つのトリ修飾誘導体を含む（表Ｉ）。保持時間と各化合物の収率表Ｉに示す。異なるＮ−Ｆｍｏｃ−インスリンは、容易に相互に分割することができ、本明細書で適用される実験条件下で精製した形態で得られる。ＰｈｅB1、ＬｙｓB29−Ｎ−（Ｆｍｏｃ）2−インスリン（保持時間＝２７．７分）およびＧｌｙA1、ＰｈｅB1、ＬｙｓB29−Ｎ−（Ｆｍｏｃ）3−インスリンは、質量スペクトルを含むいくつかの方法により性状解析した（表Ｉ）。
（ｄ）ＰｈｅB1、ＬｙｓB29−Ｎ−（Ｆｍｏｃ）2−インスリンの合成
生物検定法により、ＰｈｅB1、ＬｙｓB29−Ｎ−（Ｆｍｏｃ）2−インスリンが、長期作用性インスリンとして特に適していることが明らかになったため、これを合成するための代替法を計画した。ＧｌｙA1残基は、１当量の二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチルおよび溶媒としてＤＭＳＯ／Ｅｔ3Ｎ（２０：１）を使用して、計画した実験条件下でｔ−Ｂｏｃ基により特異的に保護した。ＨＰＬＣ法による分離後、ＧｌｙA1−Ｎ−Ｂｏｃ−インスリンは、溶媒としてＤＭＦおよび塩基としてＤＩＥＡを使用して、過剰のＦｍｏｃ−ＯＳｕ（１０当量）と反応させた。ＴＦＡで処理し、ＨＰＬＣで精製して、良好な収率（〜５０％）でＰｈｅB1、ＬｙｓB29−Ｎ−（Ｆｍｏｃ）2−インスリンを生成させた。
（ｅ）Ｎ−Ｆｍｏｃ−インスリン誘導体の生物学的性状解析
本発明のＮ−Ｆｍｏｃ−インスリン誘導体のいくつかの特徴は、表IIおよびIIIに要約する。水溶液への誘導体の溶解度は、修飾の増加と共に低下した。Ｎ−（Ｆｍｏｃ）1−インスリンは、本来のインスリンよりわずかに溶解性が低下しているだけであるが、一方Ｎ−（Ｆｍｏｃ）3−インスリンは、本来のホルモンより約２０倍も溶解性が低い。生物学的効力も同様に誘導体化が進むにつれて低下した。すなわち、モノ、ジおよびトリ−Ｎ−Ｆｍｏｃ−インスリンは、［ポリ（Ｇｌｕ4Ｔｙｒ）］リン酸化測定法により判定すると、それぞれ本来のインスリン生物学的効力の４０〜８０％、２〜９％および＜１％を示す。無傷のラット脂肪細胞による脂質生成の高感度生物学的測定法により、Ｆｍｏｃ−インスリン誘導体は、非常に低い生物学的効力を示す。すなわち、ＧｌｙA1−Ｎ−Ｆｍｏｃ−インスリンおよびジ−Ｎ−Ｆｍｏｃ−インスリンは、脂質生成測定法を使用すると、それぞれ本来のインスリン生物学的効力の４．７％および０．４〜１．４％を示す（表III）。７つ全ての誘導体は、ｐＨ８．５で２日間のインキュベーションにより本来のホルモンに戻る。このことは、完全な生物学的効力の回復（表IIおよびIII）、および分析ＨＰＬＣ法による分離に際しての本来のホルモンピーク（保持時間＝１５分）の出現を伴う誘導体のピークの消失により証明された。
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例２．Ｎ−Ｆｍｏｃ−インスリンの生物活性
（ａ）ｐＨ７．４でのＮ−Ｆｍｏｃ−インスリンの活性化の経時変化
糖尿病ラットにおけるＮ−Ｆｍｏｃ−インスリンの抗糖尿病価の試験の前に、その再活性化（本来のホルモンへの変換）速度を、試験管中で試験した。誘導体を、１０％ジメチルスルホキシドを含有するヘペス緩衝液（５０mM、ｐＨ７．４）に溶解し、３７℃（すなわち、生理学的ｐＨと体温）でインキュベートした。本来のインスリンと比較した生物学的効力の測定の前に、所定の時点でアリコートを採取した。生物活性を、インスリン受容体チミジンキナーゼ活性化（上記セクション（iv）生物学的操作に記載の無細胞測定法）と、（ii）生物学的操作に記載の無傷のラット脂肪細胞中の脂質生成の刺激とにより評価した。結果を図１に示す。半最大活性化は、ｔ1/2＝１４日のＮ−（Ｆｍｏｃ）3−インスリンについて起き、２１日のインキュベーション後にほとんど完全な活性化が明らかであった。
一般に、ｐＨ７．４でのＮ−（Ｆｍｏｃ）2−インスリンの活性化速度の方が速かった。Ｎ−（Ｆｍｏｃ）3−インスリンでみられた６日間の遅延期間は、Ｎ−（Ｆｍｏｃ）2−インスリンでは見られなかった。すなわち、Ｎ−（Ｆｍｏｃ）3−インスリンは、よりゆっくり加水分解されるＦｍｏｃ残基を有し、これが類似体の再活性化を制限しているようである。現実的な観点から、２つの類似体の混合物は、早期および後期をカバーして長期間活性なインスリンを放出することを意味する。比較的活性なモノ修飾Ｆｍｏｃ−インスリンは、ｐＨ７．４でｔ1/2＝５日で完全な生物学的効力を回復した。
いったん循環流中に達すると、Ｎ−（Ｆｍｏｃ）2−インスリンおよびＮ−（Ｆｍｏｃ）3−インスリンは、長期にわたって低いベース濃度のホルモンを提供すると予測される。これは主に、不活性な誘導体から活性な短命の本来のホルモンへの変換速度により支配されているかも知れない。幸いにも、Ｎ−（Ｆｍｏｃ）2,3−インスリンは、活性化速度が遅い（図１に示す）。速度が速い（突然）と（すなわち、時間単位ではなく分単位）、低血糖になったであろう。
ＰｈｅB1，ＬｙｓB29−Ｎ−（Ｆｍｏｃ）2−インスリンは、［ポリ（Ｇｌｕ4Ｔｙｒ）］リン酸化測定法により測定すると９％の生物活性を有し、本来のインスリンとＮ−（Ｆｍｏｃ）3−インスリンの間の中間の溶解度を示す。Ｎ−（Ｆｍｏｃ）3−インスリンと異なり、Ｎ−（Ｆｍｏｃ）2−インスリンの本来のホルモンへの変換は、図１に示すようにインキュベーション後まもなく（数時間以内）始まる。すなわち、Ｎ−（Ｆｍｏｃ）2−インスリン（もともと活性が高い）は、投与後の作用の出現が速いと予想される。すなわち、Ｎ−（Ｆｍｏｃ）2−インスリンとＮ−（Ｆｍｏｃ）3−インスリンの正しい組合せが、単回投与後迅速な発現と長期作用を特徴とするベースインスリン放出の理想的な処方であり、本発明の１つの好適な実施態様である。
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（ｂ）正常ラットへのＰｈｅB1，ＬｙｓB29−Ｎ−（Ｆｍｏｃ）2−インスリンの単回腹腔内投与の効果
（Ｆｍｏｃ）2−インスリンの長期作用性は、生物学的条件下でのその本来のホルモンへの遅い変換に由来することをさらに確認するために、追加のインビボ測定法を計画した。この測定法は、循環流中のインスリン（またはインスリン誘導体）の皮下投与後の長期作用性を反映している。正常ラットに、本来のインスリン、ＮＰＨ−インスリン、および（Ｆｍｏｃ）2−インスリン（３mg／ラット）を単回腹腔内注射で投与し、その血中グルコースレベルを３日間追跡した。結果を図２に示す。すなわち、本来のインスリン（図３）とＮＰＨ−インスリン（図２）は、それぞれ約１２時間および１５時間にわたって低血糖症を誘導した。低血糖症からの回復は、ｔ1/2がそれぞれ８時間と１０時間で起きた。
（Ｆｍｏｃ）2−インスリンは、約４８時間にわたって血中グルコースレベルを低下させ、低血糖症からの回復はｔ1/2が２６時間で起きた。これらの結果は、（Ｆｍｏｃ）2−インスリンの長期作用は、その固有の性質に由来し、ＮＰＨ−インスリンの通常の機序（すなわち、注射部位での沈殿と循環流への溶解−進入速度の遅さ）によるものではない、という我々の考えを支持している。予想されるように、この測定法で血中グルコースレベルを低下させる本来のインスリンとＮＰＨ−インスリンの能力の差は、皮下法による投与と比較すると小さい。この事実は、腹腔内に存在する大量の液体に帰因し、従ってＺｎ−結晶性インスリンが速く変換されてモノマー型を与える。
他の２つの（Ｆｍｏｃ）2−インスリン誘導体である［ＧｌｙA1，ＬｙｓB29］と［ＧｌｙA1，ＰｈｅＢ1］を合成し、この測定法で評価した。結果（データは示していない）は、両方の誘導体についてｔ1/2が２２〜２４時間で、ＰｈｅB1，ＬｙｓB29−Ｎ−（Ｆｍｏｃ）2−インスリンと同様に長期作用を示した。
（ｃ）Ｎ−（Ｆｍｏｃ）3−インスリンはタンパク質分解に対して耐性である本来のインスリンまたはＮ−（Ｆｍｏｃ）3−インスリン（５０mMヘペス（ｐＨ７．４）、１０％ＤＭＳＯ中でそれぞれ１mg/ml）を、３７℃でインキュベートした。次にキモトリプシンとトリプシン（それぞれ０．５％w/w）を加えた。所定の時点でアリコートを採取して、分析ＨＰＬＣ法を行なった。本来のインスリンピーク（保持時間１５分）とＮ−（Ｆｍｏｃ）3−インスリンピーク（保持時間３１．５分）の面積の低下により、分解パーセントを測定した。結果を図４に示す。
Ｎ−（Ｆｍｏｃ）3−インスリンは、ｐＨ７．４でキモトリプシンとトリプシンによるタンパク質分解に対して極めて耐性であった。タンパク質分解は、本来のインスリンとＮ−（Ｆｍｏｃ）3−インスリンについてｔ1/2が、それぞれ０．５と７．５時間で進んだ。
例３．ＳＴＺ−糖尿病ラットへのＰｈｅB1，ＬｙｓB29−Ｎ−（Ｆｍｏｃ）2−インスリンとＮ−（Ｆｍｏｃ）3−インスリンの単回皮下投与の効果
ＳＴＺラットは、インビボインスリン療法を評価するための優れたモデルである。このモデルでは、組織学的検査（ペダーソン（Pederson）ら、１９８９、が記載）によると、約９０％のβ−細胞機能がストレプトゾトシンにより破壊されている。このラットは、低インスリン血症（正常インスリンレベルの１０〜３０％を有する）、高血糖症（＞３００mg／dl；対照ラットの正常グルコースレベルは９０〜１００mg／dlである）、および異化性（catabolic）である。外見からわかる症状は、「病的」外観であり、液体摂取と尿排泄量が３〜４倍増加している。１日の体重増加は、対照ラットの正常な体重増加の１０〜２０％（０．３〜０．８ｇ／日／ラット）に低下している。ＳＴＺラットの組織の病理的変化は、非常に大きい。より顕著な生理学的変化の一部は、グリコーゲン代謝の主要酵素の活性の低下、肝臓グリコーゲンの欠乏、末梢組織における多くのグルコース輸送物質の低下、およびインスリンに対する応答の増加を伴わないインスリン結合能の増加である。
この糖尿病性ラットモデルでは、便利なインスリン療法は、１週間にわたるインスリンの連続的投与である（５単位／日／ラット）。この治療法は、血中グルコースレベルを正常にし、糖尿病性ラットを同化性（anabolic）状態に戻し、高血糖症や低血糖症により誘導される病状の多くを改善する。迅速作用性（正規）インスリンの単回投与は、数時間有効なだけである。また７日間の治療プロトコールが終わると、２４〜３０時間以内に高血糖症が再発する。
Ｎ−（Ｆｍｏｃ）3−インスリンは長期の抗糖尿病作用を有するかどうかを評価するために、糖尿病誘発の２週間後、ＳＴＺラットに、本来のインスリン（Ａ群、２５単位、１mg、１．０ml  Ｈ2Ｏ−１０％ＤＭＳＯに溶解、ｎ＝４）、またはＮ−（Ｆｍｏｃ）3−インスリン（Ｂ群、１．０ml  Ｈ2Ｏ−１０％ＤＭＳＯに溶解、ｎ＝４）の単回皮下注射を行なった。血中グルコースレベルと毎日の体重増加を、７日間追跡した。
結果を図５に示す。各点は、４匹のラットの血漿グルコースの平均±標準誤差を示す。Ｂ群の循環グルコースレベルは、有意に低かった。すなわち、Ｂ群では投与後２日目から出発して、グルコースレベルは９０〜１１０mg／dlと低く、この低いグルコースレベルは６日目まで続いた。７日目に、循環グルコースレベルにおいて、２群のラット間で有意差はなかった。Ｎ−（Ｆｍｏｃ）3−インスリンを投与したラットは、「健康な」外見をしていた。毎日の体重増加は、Ｂ群ではほとんど３倍であり、Ａ群とＢ群でそれぞれ０．５７±０．０８と１．４３±０．１４ｇ／ラット／日であった（データは示していない）。すなわち、Ｎ−（Ｆｍｏｃ）3−インスリンの単回投与は、４日間（出現が約２日間遅れた後に）継続する長期かつ満足できる抗糖尿病作用を示した。このインビボの長期作用は、この誘導体が受容体介在エンドサイトーシスから逃れ、タンパク質分解に対して耐性であることにより説明できる。さらにＮ−（Ｆｍｏｃ）3−インスリンは、水溶液に大体不溶性である。すなわちヒトでは、全体的な継続作用は、新しい成分（すなわち、寿命の長い共有結合的に修飾した不活性インスリン誘導体であって、本来のホルモンにゆっくり変換される）とともに皮下投与後、古い治療成分の置換（すなわち、「組み込まれた」不溶性インスリンの漸進的な溶解）により進む。このインスリン誘導体は不活性であるため、低血糖症が起きる恐れもなく大量に投与することができる。
ＰｈｅB1，ＬｙｓB29−Ｎ−（Ｆｍｏｃ）2−インスリンが実験的糖尿病ラットの血中グルコースレベルを低下させるのに有効であることを試験するために、糖尿病の誘導の９日後にＳＴＺ処理ラットに、Ｎ−（Ｆｍｏｃ）2−インスリンを単回皮下注射（Ａ群、３mg／ラット、２．０ml  ２０％ＤＭＳＯ、ｎ＝５）、または長期作用性インスリン（ＮＰＨ−ヒトインスリン、フムリン（Humulin）Ｎ、ＨＩ−３１０）（Ｂ群、ラット１匹あたり０．７５ml（３mg）、ｎ＝５）の単回皮下注射を行なった。Ｃ群（ｎ＝５）には、ビヒクルのみ（２０％ＤＭＳＯを２ml）投与した。血中グルコースレベルを毎日測定した。
結果を図６に示し、ここで水平の点線は、対照ラットの血漿グルコースの算術平均を示す。図６に示すように、ＨＰＬＣ精製したＰｈｅB1，ＬｙｓB29−Ｎ−（Ｆｍｏｃ）2−インスリンの単回皮下投与は、４日間にわたって正常血糖を誘導し、これらの異化性ＳＴＺラットモデルの毎日の体重増加を上昇させた（表III）。Ｎ−（Ｆｍｏｃ）2−インスリンは、市販の（不溶性）長期作用性調製物として有効であった。迅速作用性（可溶性）インスリンは、この実験系で数時間だけ、血中グルコースレベルを低下させるのに有効である（データは示していない）。この調製物は水溶液（ｐＨ７．４）中でかなり安定であり、懸濁液は皮下注射では正確に投与できないため、これが不溶性Ｎ−（Ｆｍｏｃ）3−インスリンより有利な点である。
例４．（２−スルホ）Ｆｍｏｃ−インスリンの生物活性
（ａ）（２−スルホ）Ｆｍｏｃ−インスリン（Ｓｕｌｆｍｏｃ−インスリン）の合成
Ｆｍｏｃ−インスリンの疎水性を低下させ、こうして水性緩衝液中の溶解度を上昇させ、インスリンへの再変換速度を修飾するために、Ｆｍｏｃ基自身を修飾した。これは、フルオレン環に極性基（好ましくは、荷電基）（例えば、ハロゲン、ニトロ、カルボキシル、アミノ、アンモニウム、およびスルホ基）を導入することにより行われる。求電子的置換反応では、フルオレンはまず２位で攻撃され、そして一般に、９位の置換基（例えば、ＣＨ2ＯＣＯ−ＯＳｕ）の性質は、置換の配向には影響を与えない。すなわち、０℃でジクロロメタン（ＤＣＭ）中の０．９当量のクロロスルホン酸でＦｍｏｃ−ＯＳｕを処理すると、（２−スルホ）Ｆｍｏｃ−ＯＳｕが高率に得られた（式（ｉ）、２位でＲ1＝ＳＯ3Ｈ、Ｒ2＝Ｒ3＝Ｒ4＝Ｈ、Ａ＝ＯＣＯ−ＯＳｕ）。１当量以上で処理すると、フルオレン環の７位でも置換が起きる。
活性な（２−スルホ）Ｆｍｏｃ−ＯＳｕエステルをインスリンのアミノ基に結合させて、インスリンに（２−スルホ）Ｆｍｏｃ基を導入した。反応は水性緩衝液（ｐＨ７．４）と過剰の試薬（〜２０当量）中で行なった。透析と凍結乾燥後、生成物を水溶性にした。ＨＰＬＣ分析は、質量スペクトル（ｍ／ｚ  ６４１１）で測定した時、１つの主要な生成物、おそらく（Ｓｕｌｆｍｏｃ）2−インスリンが優勢であることを示した。反応をアセトニトリル／水（１：１）中で行うと、主要な生成物は、質量スペクトル（ｍ／ｚ  ６７１３）により測定されたように（Ｓｕｌｆｍｏｃ）3−インスリンであった。
（ｂ）（２−スルホ）Ｆｍｏｃ−インスリンの活性化の経時変化
（Ｓｕｌｆｍｏｃ）2−インスリンを、ｐＨ８．５（０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ3）で３７℃で３６時間、またはｐＨ７．４（５０mMヘペス緩衝液）で１０日間、それぞれｔ1/2値は１２〜１５時間と６日間でインキュベートすると、完全に待ちホルモンに戻った。これは、分析ＨＰＬＣ法を使用することにより、本来のホルモンのピークの出現とともにインスリン誘導体のピークの消失により証明された。
（Ｓｕｌｆｍｏｃ）2−インスリンの本来のホルモンへの加水分解は、
（Ｆｍｏｃ）2−インスリンの加水分解と比較して速かった（ｐＨ７．４、３７℃で２１日間）。
（Ｓｕｌｆｍｏｃ）2−インスリンは０．５％生物活性を有し、水中で良好な溶解度を示す。ｐＨ８．５で３７℃でインキュベートすると、
（Ｓｕｌｆｍｏｃ）2−インスリンは、生物学的効力（ラット脂肪細胞中の脂質生成の測定）の時間依存性増加により判断すると、ｔ1/2値が４〜６時間で、無傷の本来のインスリンに戻る。
（ｃ）正常ラットへの（２−スルホ）Ｆｍｏｃ−インスリンの単回腹腔内投与の効果
（Ｓｕｌｆｍｏｃ）2−インスリンの長期作用活性を評価するために、皮下吸収の下流に、正常ラットに、本来のインスリン、ＮＰＨ−インスリン、または（Ｓｕｌｆｍｏｃ）2−インスリンを単回腹腔内注射した。血中グルコースレベルを２日間追跡した。図３は、（Ｓｕｌｆｍｏｃ）2−インスリンが２４時間にわたって低血糖症を誘導したことを示す。低血糖症からの回復は、ｔ1/2値＝１４時間で起きた。迅速およびＮＰＨ−インスリンの場合、これらのｔ1/2値は、それぞれ８時間（図３）と１０時間（図２）になった。すなわち、
（Ｓｕｌｆｍｏｃ）2−インスリンの単回投与は、中間の抗糖尿病作用を与え、すなわち迅速またはＮＰＨ−インスリンより１．５〜２倍長かった。これらの結果は、インビトロですでに見いだされた（Ｓｕｌｆｍｏｃ）2−インスリンの加水分解速度の加速に一致する。すなわち、フルオレン環の２位のスルホン酸基は、９位のプロトンの放出速度を増加させ、従ってＳｕｌｆｍｏｃ残基の加水分解を２〜３倍増加させた。種々の塩基に対するｓｕｌｆｍｏｃ基の安定性に関する初期の研究は、親の系よりも塩基感受性が大きいことを示した。さらに、グリシンからのＳｕｌｆｍｏｃ基の放出の速度定数は、例えばＦｍｏｃ基よりはるかに大きかった（約３０倍）。従って、インスリンにＳｕｌｆｍｏｃ基を導入することによる溶解度の上昇は、逆にこの誘導体の長期作用効果を低下させる。従って、受容体介在エンドサイトーシスと分解を免れることによる、長期持続性抗糖尿病作用の原理は、ｓｕｌｆｍｏｃ−インスリン誘導体についても真実である。
インスリンからのＳｕｌｆｍｏｃ基の除去速度の増大は、インスリン投与のいくつかの応用（例えば、中間調製物）において有効である。そのような調製物は市販の調製物に比較して、明らかに水性緩衝液中で完全に溶解性であるという利点を有する。さらに、多様な酸性または極性を有する他の基を、フルオレン環に導入することができる。従って、Ｆｍｏｃ基に導入される基のタイプや数の調節は、修飾インスリンの溶解度および再活性化速度を決定することができる。
例５．アミノ末端およびカルボキシ末端修飾インスリン（Ｎ−Ｆｍｏｃ−およびＣ−Ｆｍ−インスリン）誘導体の調製
Ｎ−（Ｆｍｏｃ）3−インスリン（６４．５mg；１０μmol；６０μmolのカルボン酸残基、すなわち４つの鎖内Ｇｌｕおよび２つのＣ−末端残基について）を、ｏ−ニトロフェノール（２５０μmol；３５mg）またはＮ−ヒドロキシスクシンイミド（２５０μmol；２８mg）とともに、８mlのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（ラボスキャン（Lab. Scan.）、ダブリン、アイルランド）に溶解し、溶液を４℃に冷却した。０．５mlのＤＭＦ中のＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ；２５０mmol、５３mg）の溶液を加え、反応混合物を４℃で１時間維持し、次に室温で６時間維持した。沈殿したＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシル尿素を遠心分離して除去し、Ｎ−（Ｆｍｏｃ）3−インスリンの、それぞれｏ−ニトロフェニルまたはＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを、乾燥した氷冷したエーテルにより沈殿させた。固体を乾燥エーテルで洗浄し、乾燥し、８mlのＤＭＦに溶解した。１mlのＤＭＦ中の９−フルオレニルメタノール（２５０μmol；５０mg）とイミダゾール（２５０μmol；１７mg）の溶液を加えた。反応混合物を室温で一晩放置した。乾燥エーテルで沈殿させて、６２mgのＮ−（Ｆｍｏｃ）3−インスリン、Ｃ−（Ｆｍ）n−インスリンを得た。主要な反応生成物は、Ｎ−（Ｆｍｏｃ）3−インスリンのヘキサ−９−フルオレニルメチルエステルＣ−（Ｆｍ）6であった（ｎ＝６）。
例６．カルボキシ末端Ｆｍ−インスリン（Ｃ−Ｆｍ−インスリン）の調製
ｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−Ｂｏｃ）3−インスリンの調製のために、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート（５６mg、２５８μmol）を、ＤＭＦ（４ml）中のインスリン（１００mg、１７．２μmol）とトリエチルアミン（１７４mg、１７２μmol）の氷冷した攪拌懸濁液に加えた。反応混合物を室温まで加温し、５時間攪拌した（徐々に清澄になる）。次に、溶液が濁るまで、酢酸エチルを加え、次にエーテルを加え、そして沈殿物を遠心分離し、エーテルで２回洗浄した。得られた粗生成物固体（９５mg）を、さらに精製することなく使用した。分析ＨＰＬＣは、２７．５分で溶出する１つの主要な生成物を示した。
この生成物を１０mlのＤＭＦに溶解し、上記したｏ−ニトロフェノールまたはＮ−ヒドロキシスクシンイミドで処理して、対応する活性エステルを得た。これらを、上記のイミダゾールの存在下で９−フルオレニルメタノールと反応させ、乾燥エーテルで沈殿させた後、Ｎ−（ｔ−Ｂｏｃ）3、Ｃ−（Ｆｍ）n−インスリンを粉末として得た（８７mg）。粉末を真空下でＰ2Ｏ5で乾燥し、次に５mlのトリフルオロ酢酸で室温で１時間処理し、Ｎ−末端ｔ−Ｂｏｃ保護基を除去した。この操作の間、インスリン誘導体のほとんどは溶解した。氷冷した乾燥エーテルを加えると、粉末が得られ、これを遠心分離して単離し、乾燥エーテルで完全に洗浄した。生成物（主に、Ｃ−（Ｆｍ）6−インスリン）の収率は７９mgであった。
例７．（Ｆｍｏｃ）1−ヒト成長ホルモン（Ｆｍｏｃ1−ｈＧＨ）の調製
通常の生理学的条件下で、健常被験体のｈＧＨレベルは、パルス的に数回（昼と夜）上昇する。ｈＧＨは短命の分子種である。現在の治療プロトコールでは、ｈＧＨを日に１回投与し、これは数時間のみ有効であると考えられている。昼と夜の２４時間ｈＧＨの閾値ベースのレベルを与える長期作用性（除放性）ｈＧＨ調製物は、非常に好ましい。
本来のｈＧＨ（バイオテクノロジージェネラル（Biotechnology General）、レホヴォット（Rehovot）、イスラエル；９．２mg）を、０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ3（２．０ml；ｐＨ８，５）に溶解し、ＤＭＳＯ（０．１ml）を加え（ＤＭＳＯの最終濃度、〜５％）、溶液を０℃に冷却した。次に、１０μlの１当量のＦｍｏｃ−ＯＳｕ（ＤＭＳＯ中１８．５mg/mlのストック溶液から採取した）を加え、穏やかに攪拌しながら、０℃で３０分反応を進めた。次にさらに１０μl（１当量のＦｍｏｃ−ＯＳｕを含有する）を加え、３０分後、混合物を７℃で一晩、水に対して透析した。半分取用ＨＰＬＣにより、本来のｈＧＨ（全体の〜２０％；保持時間３０分；ＲＰ−８カラム；２５０×１０mm；メルク（Merck））と修飾Ｆｍｏｃ−ｈＧＨ（全体の〜８０％；保持時間３２分）に対応する、２つの大きなタンパク質ピークが得られた。
表Ｖは、０．１ＭのＮａＨＣＯ3（ｐＨ８，５）中で３７℃でインキュベートする、Ｆｍｏｃ−ｈＧＨ（１mg/ml）から本来のｈＧＨへの変換を示す。所定の時点でアリコートを取り、分析ＨＰＬＣ操作を行なった（ＲＰ−８カラム）。Ｆｍｏｃ−ｈＧＨからｈＧＨへの変換を、本来のｈＧＨに対応するピーク面積の増大により評価した。
表Ｖに示すように、Ｆｍｏｃ−ｈＧＨは、本来のホルモンの受容体結合能の１５％を有する。ｐＨ８．５（３７℃）で約６日間、またはｐＨ１０，５（３７℃）で４日間、Ｆｍｏｃ−ｈＧＨをインキュベートすると、ＨＰＬＣ分析と受容体結合測定法により判断すると、完全に活性な本来のｈＧＨを与えた。
0004416184.tif 000007
例８．Ｎ−Ｆｍｏｃ−セファレキシンとセファレキシン−Ｏ−Ｆｍエステルの調製
セファレキシン［７−（Ｄ−α−アミノフェニルアセトアミド）デスアセトキシセファロスポラン酸）は、グラム陰性菌（−）とグラム陽性菌（＋）に対して広い活性スペクトルを有するβ−ラクタム抗生物質である。フルオレニルメチル（Ｆｍ）残基を、アミノ基（Ｎ−Ｆｍｏｃ−セファレキシン）またはエステル化（セファレキシン−Ｏ−Ｆｍ）によりカルボキシル基に共有結合させて、２つのモノ置換セファレキシンを調製した。
（ｉ）（ａ）Ｎ−Ｆｍｏｃ−セファレキシンの調製
ジクロロメタン（ＤＣＭ；２．５ml）中のセファレキシン水和物（シグマ（Sigma）、米国；５０mg、０．１４４ミリモル）とトリエチルアミン（２９mg、０．２８８ミリモル）の攪拌懸濁液に、ＤＣＭ（２．５ml）中のＦｍｏｃ−ＯＳｕ（１４５mg、０．４３２ミリモル）を、５分かけて滴下して加えた。１時間後に清澄になった反応混合物を、室温で一晩攪拌し、その間液は濁った。真空下で濃縮後、混合物にエーテルを加え、得られる沈殿物を濾過し、エーテルで２回洗浄した。ろ液をＤＣＭに溶解し、酸性化した水（ｐＨ〜２）、水および食塩水で抽出し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶液を濾過し濃縮した後、エーテルを加えた。沈殿した生成物を濾過し、エーテルで洗浄して、ＴＬＣ（１−ブタノール：酢酸：水、８：１：１）と分析ＨＰＬＣ法（３３分で溶出、同様の条件下で本来のセフェレキシンは６．５分で溶出する）により判断すると、Ｆｍｏｃ−セフェレキシンが純粋な生成物として得られた。質量スペクトル分析（高速原子衝撃、ＦＡＢ）は、Ｎ−Ｆｍｏｃ−セファレキシンの予測された分子量（Ｍ／Ｚ５７０．１［Ｍ＋Ｈ］+）を得た。
（ｉ）（ｂ）Ｆｍｏｃ−セファレキシンの抗菌力
本来のセフェレキシンとＦｍｏｃ−セファレキシンの抗菌力の測定のために、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）（０．５ml／ガラス試験管）の希薄懸濁液を含有する試験管を、表VIに記載の処理の前後に、増加した濃度の本来のセファレキシンまたはＦｍｏｃ−セファレキシンの非存在下および存在下で、３７℃で６時間インキュベートした。所定の時点でアリコートを採取し、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）の増殖を押さえるその効力について分析した。次に細菌の増殖を、分光学的に７００nmで測定して増加した濁度により評価した。
0004416184.tif 000008
表VIに示すように、Ｎ−Ｆｍｏｃ−セファレキシンは不活性である（〜６％）。６日間（ｐＨ７．４、３７℃）プレインキュベートすると、親化合物のＨＰＬＣモニタリングと抗菌力の約５０％の再獲得により判断した場合、本来のセフェレキシンが得られた。本来のセファレキシンは、インキュベーションにより実質的に時間依存性の自発的不活性化を受けるが、Ｎ−Ｆｍｏｃ−セファレキシンは、同じ条件に対してはるかに安定である。すなわち、インビボでのＮ−Ｆｍｏｃ−セファレキシンの予測される長期作用は、生理学的ｐＨと温度での高い化学的安定性、ならびに分解を免れることに帰因するようである。Ｎ−Ｆｍｏｃ−セファレキシンは、ペニシリナーゼに対する加水分解に対して、親化合物より安定である（データは示していない）。
（ii）セファレキシン−Ｏ−Ｆｍエステル（セフェレキシンフルオレニルメチルエステル）の調製
（ａ）Ｎ−Ｂｏｃ−セファレキシン
ＤＣＭ（３ml）中のセファレキシン水和物（５０mg、０．１４４ミリモル）とトリエチルアミン（２９mg、０．２８８ミリモル）の氷冷した攪拌懸濁液に、ＤＣＭ（２ml）中のジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート（９４．２mg、０．４３２ミリモル）を加えた。反応混合物を室温まで加温し、ＴＬＣ（１−ブタノール：酢酸：水、８：１：１）によりニンヒドリン陽性の出発物質が得られなくなるまで、室温で一晩攪拌した。次に反応混合物をＤＣＭ（２．５ml）で希釈し、酸性化した水（ｐＨ〜２）、水および食塩水で抽出し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。濃縮後、生成物を石油エーテル（沸点、４０〜６０℃）で沈殿させ、濾過し、再度石油エーテルで洗浄した。生成物は、ＴＬＣとＨＰＬＣ法により均一であった。
（ｂ）セファレキシン−Ｏ−Ｆｍエステル
ＤＣＭ（２ml）中のＮ−Ｂｏｃ−セファレキシン（２５mg、０．０５６ミリモル）、９−フルオレニルメタノール（２２mg、０．１１２ミリモル）および４−ジメチルアミノピリジン（１３．７mg、０．１１２ミリモル）の氷冷した攪拌溶液に、ＤＣＭ（１ml）中のＤＣＣ（２３．１mg、０．１１２ミリモル）の溶液を２０分間滴下して加えた。反応混合物を室温で一晩攪拌し、溶液をろ過してジシクロヒキシル尿素を除去した。ろ液をＤＣＭ（２．５ml）で希釈し、次に１Ｍ  ＮａＨＣＯ3溶液、１０％クエン酸、水および食塩水で２回抽出し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶液を蒸発させて、油状の固体を得て、これを石油エーテルで粉砕して、Ｂｏｃ−セファレキシン−ＯＦｍ生成物（ＴＬＣとＨＰＬＣで確認）を得た。粗生成物固体（２５mg）を１mlのＴＦＡ：ＤＣＭ（１：１v/v）溶液に溶解して、Ｂｏｃ残基を除去した。室温で２０分間放置後、蒸発させてＴＦＡを除去し、固体残渣をイソプロパノールに溶解し、次にこれを蒸発させた。この方法を２回繰り返した。粗生成物固体を石油エーテルで粉砕して、最終的な純粋なエステルを得た（ＴＬＣとＨＰＬＣ法で判断）。
例９．ジ−９−（フルオレニルメトキシカルボニル）ポリミキシンＢ［（Ｆｍｏｃ）2−ＰＭＸＢ］の調製
環状ペプチド抗生物質のファミリーの代表的メンバーであるポリミキシンＢ（ＰＭＸＢ）は、グラム陰性菌（−）に対して有効である。ＰＭＸＢは、５つのジアミノ酪酸残基を有し、これは、試薬４−（９−フルオレニルメトキシカルボニルオキシル）フェニル−ジメチルスルホニウムメチルサルフェート（Ｆｍｏｃ−ＤＳＰ）を使用して、Ｆｍｏｃ基の挿入により修飾することができる。Ｆｍｏｃ−ＤＳＰ試薬とペプチドのモル比は、ＰＭＸＢ分子の修飾の程度を決定するであろう。
（Ｆｍｏｃ）2−ＰＭＸＢの調製のために、Ｈ2Ｏ（１ml）中のＰＭＸＢ（シグマ（Sigma）、米国；１０mg、７．２μmol）と（Ｆｍｏｃ−ＤＳＰ；７．１mg、１４．４μmol）の攪拌溶液に、ＮａＨＣＯ3の溶液（０．１Ｍ、０．１５ml）を滴下して加えた。徐々に濁度を増した反応混合物を一晩室温で攪拌した。得られた沈殿物を遠心分離し、水で２回洗浄し、少量のＤＭＦに溶解し、エーテルで沈殿させて白色の粗生成物固体を得た。
0004416184.tif 000009
４０分で（流速０．８ml／分）７０％溶液Ａ（０．１％  ＴＦＡ水溶性）および３０％溶液Ｂ（アセトニトリル：水、７５：２５中の０．１％  ＴＦＡ）から１００％溶液Ｂまでの線形勾配を使用して行なった分析ＨＰＬＣ（ＲＰ−１８；２５０×４mm；メルク（Merck））は、３９分に溶出する主要な生成物を示した（これらの条件下でＰＭＸＢの保持時間は１３．５分である）。粗生成物固体を分取ＨＰＬＣにかけて、純粋な生成物を得た。（Ｆｍｏｃ）2−ＰＭＸＢを質量スペクトル（ＦＡＢ）で分析すると、この化合物についての予測された分子量（Ｍ／Ｚ  １６４７［Ｍ＋Ｈ］+）が得られた。
（Ｆｍｏｃ）2−ＰＭＸＢと本来のＰＭＸＢの抗菌力を、以下のように種々の実験条件下で測定した：大腸菌（E. coli）（ガラス試験管当たり０．５ml）の希薄懸濁液を、（Ｆｍｏｃ）2−ＰＭＸＢと本来のＰＭＸＢの濃度の増加有りまたは無しで、３７℃で６時間インキュベートした。所定の時点でアリコートを採取し、大腸菌（E. coli）の増殖を停止させる効力について分析し、次に細菌の増殖を７００nmでの濁度を測定することにより評価した。
表VIIIに示すように、（Ｆｍｏｃ）2−ＰＭＸＢは不活性（〜１％）であり（ｔ1/2値は、ｐＨ８．５と７．４でそれぞれ〜３と〜１日）で、ほとんど活性のＰＭＸＢに加水分解された。
例１０．ピペラシリン−フルオレニルメチルエステル（ピペラシリン−Ｏ−Ｆｍ）の調製
ピペラシリン（４−エチル−２，３−ジオキソピペラジンカルボニルアンピシリン）は、ペニシリンに関連するスペクトルの広い半合成抗生物質であり、経口投与では有効ではない。
ピペラシリン（遊離カルボキシル）を、ピペラシリンナトリウム塩（シグマ（Sigma）、米国）から酢酸エチルで酸性抽出して調製した。ピペラシリン−Ｏ−Ｆｍを、上記例８のセフェレキシン−ＯＦｍエステルについて記載したように、１当量のカルボキシルを２当量ずつの９−フルオレニルメタノール、４−ジメチルアミノピリジンおよびＤＣＣと反応させて合成した。ＤＣＭ−エーテルから粗生成物固体を再結晶して、ＴＬＣとＨＰＬＣ法で確認された純粋な生成物を得た。
例１１．Ｆｍｏｃ−プロプラノロールの調製
ベータブロッカーファミリーの代表的なメンバーであるプロプラノロール［１−（イソプロピルアミノ）−３−（１−ナフチルオキシ）−２−プロパノール］は、抗高血圧薬、抗狭心症薬、および抗不整脈薬として使用される。プロプラノロールは、β−アドレナリン作用性受容体に結合するが、これを活性化しない。これらの部位についてβ−アドレナリンアンタゴニストと競合すると、病的高血圧状態が低下する。患者は、毎日プロプラノロールを経口投与される。しかし、大多数のβ−アドレナリンアンタゴニスト（例えば、アセチルブトロール、アテノロール、ベタキソロール、カルテオロール、ナドロール、およびソタロール）は、本質的にやや親水性であり、経口投与された時有効に吸収されない。
Ｆｍｏｃ−プロプラノロールの調製のために、ＤＣＭ（２．５ml）中のＦｍｏｃ−ＯＳｕ（１７０mg、０．５０ミリモル）を、ジクロロメタン（ＤＣＭ、２．５ml）中の（±）−塩酸プロプラノロール（５０mg、０．１７ミリモル）とトリエチルアミン（３４mg、０．３４ミリモル）の攪拌溶液に、５分かけて滴下して加えた。
室温で一晩攪拌後、反応混合物を、酸性化した水、水および食塩水で抽出し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶液を蒸発させて、粗生成物固体を得て、次にこれをヘキサンで粉砕して、Ｆｍｏｃ−プロプラノロールを得た。生成物をＴＬＣ（１−ブタノール：酢酸：水、８：１：１）とＨＰＬＣにより調べると、純粋であった（同じ条件下でプロプラノロールとＦｍｏｃ−プロプラノロールの保持時間は、それぞれ１６分と５１分である）。質量スペクトル（ＦＡＢ）は、正しいＭ／Ｚ：４８２．２［Ｍ＋Ｈ］+を与えた。
Ｆｍｏｃ−プロプラノロールのβ−アドレナリン作用効力を分析した。結果を図７に示す。新たに調製したラットの脂肪細胞を、イソプロパノール（最終濃度１μg/ml、４μＭ）と所定濃度のプロプラノロール（白丸）、Ｆｍｏｃ−プロプラノロール（黒丸）、またはｐＨ８．５で３７℃で７日間インキュベートしたＦｍｏｃ−プロプラノロール（四角）とともに３７℃で２時間インキュベートした。次に培地に放出されたグリセロールの量を、シェクター（Shechter）、１９８２、に従って測定した。ＩＣ50は、イソプロテレノール介在グリセロール放出を最大の半分阻害するＮ−Ｆｍｏｃ−プロプラノロール誘導体（μＭ）の量である。
図７に示すように、Ｆｍｏｃ−プロプラノロールは、本来のプロプラノロールの〜７％の効力を有する。Ｆｍｏｃ−プロプラノロールをｐＨ８．５（３７℃）で７日間インキュベートすると、本来の薬剤のβ−アドレナリン作用効力の５０〜７０％が得られた。この誘導体は実質的に疎水性であり、これは胃腸管吸収を助ける性質である。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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