(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
UGT1A1酵素によってそれ自体又は中間代謝物が代謝されるカンプトテシン類似化合物の投与による白血球減少及び／又は下痢の発現リスクを予測する方法であって、UGT1A1酵素をコードする遺伝子のプロモータ領域におけるTA反復配列数が7であるヒト個体において、少なくとも、UGT1A1酵素をコードする遺伝子の686位の塩基がシトシンであるかまたはアデニンであるかを解析するステップを含む方法。
【請求項２】
UGT1A1酵素によってそれ自体又は中間代謝物が代謝されるカンプトテシン類似化合物の投与による白血球減少及び／又は下痢の発現リスクを予測する方法であって、UGT1A1酵素をコードする遺伝子の686位の塩基がアデニンであるヒト個体において、少なくとも、UGT1A1酵素をコードする遺伝子のプロモータ領域におけるTA反復配列数が6または7であることを解析するステップを含む方法。
【請求項３】
UGT1A1酵素によってそれ自体又は中間代謝物が代謝されるカンプトテシン類似化合物の投与による白血球減少及び／又は下痢の発現リスクを予測する方法であって、
（a）UGT1A1酵素をコードする遺伝子のプロモータ領域におけるTA反復配列数が6または7であることを解析するステップ、及び、
（b）UGT1A1酵素をコードする遺伝子の686位の塩基がシトシンであるかまたはアデニンであるかを解析するステップを含む方法。
【請求項４】
UGT1A1酵素をコードする遺伝子の686位の塩基を含むDNAを増幅するステップをさらに含む、請求項１又は３に記載の方法。
【請求項５】
UGT1A1酵素をコードする遺伝子のプロモータ領域におけるTA反復配列領域を含むDNAを増幅するステップをさらに含む、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項６】
(c)UGT1A1酵素をコードする遺伝子の211位の塩基がグアニンであるかまたはアデニンであるかを解析するステップをさらに含む、請求項１ないし５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
UGT1A1酵素をコードする遺伝子の211位の塩基を含むDNAを増幅するステップをさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記カンプトテシン類似化合物は、カンプトテシン誘導体である、ことを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記カンプトテシン誘導体は、トポテカン又はイリノテカンである、ことを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記カンプトテシン誘導体は、イリノテカンである、ことを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
UGT1A1酵素をコードする遺伝子の686位の塩基を解析するための核酸であって、UGT1A1酵素をコードする遺伝子の686位の塩基を含み、かつ配列番号３及び配列番号４のプライマーを用いたPCR法によって増幅され得る領域に由来するDNA断片に対して特異的にハイブリダイズする核酸を使用する、ことを特徴とする、請求項１、３ないし１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
UGT1A1酵素をコードする遺伝子のプロモータ領域におけるTA反復配列数を解析するための核酸であって、UGT1A1酵素をコードする遺伝子のTA反復領域の塩基を含み、かつ配列番号７及び配列番号８のプライマーを用いたPCR法によって増幅され得る領域に由来するDNA断片に対して特異的にハイブリダイズする核酸を使用する、ことを特徴とする、請求項２ないし１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
UGT1A1酵素をコードする遺伝子のプロモータ領域におけるTA反復配列数を解析するための核酸であって、UGT1A1酵素をコードする遺伝子のTA反復領域の塩基を含み、かつ配列番号９及び配列番号１０のプライマーを用いたPCR法によって増幅され得る領域に由来するDNA断片に対して特異的にハイブリダイズする核酸を使用する、ことを特徴とする、請求項２ないし１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
UGT1A1酵素をコードする遺伝子の211位の塩基を解析するための核酸であって、UGT1A1酵素をコードする遺伝子の211位の塩基を含み、かつ配列番号１及び配列番号２のプライマーを用いたPCR法によって増幅され得る領域に由来するDNA断片に対して特異的にハイブリダイズする核酸をステップ(c)において使用する、ことを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１ないし１０のいずれか一項に記載の、白血球減少及び／又は下痢の発現リスクを予測する方法の結果に基づき前記カンプトテシン類似化合物の投与量を設定するステップを含む、ことを特徴とする前記カンプトテシン類似化合物の投与量設定方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、薬物の代謝に関与する酵素をコードする遺伝子の多型を解析することにより、薬物の副作用発現リスクを予測する方法に関する。また、副作用発現リスクを予測するために用いられるキットに関する。さらに、副作用発現リスクの予測結果に基づき薬物の副作用発現リスクを低減する方法に関する。
詳しくは、ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）をコードする遺伝子の多型を分析することにより、ＵＧＴによってそれ自体又は中間代謝物が代謝される化合物の投与による副作用発現リスクを予測する方法及び副作用発現リスク予測用キット、並びに副作用発現リスクを低減する方法に関する。
背景技術
ヒトには２種類のＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）酵素、即ちＵＧＴ１とＵＧＴ２が存在する。ＵＧＴ１ファミリーは、スプライシングにより共通のエクソン２に連結される各プロモータ及びエクソン１を伴う遺伝子群から構成される（Ｒｉｔｔｅｒ，Ｊ．Ｋ．，Ｃｈｅｎ，Ｆ．，Ｓｈｅｅｎ，Ｙ．Ｙ．，Ｔｒａｎ，Ｈ．Ｍ．，Ｋｉｍｕｒａ，Ｓ．，Ｙｅａｔｍａｎ，Ｍ．Ｔ．，ａｎｄ  Ｏｗｅｎｓ，Ｉ．Ｓ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７：３２５７−３２６１，１９９２）。従って、その基質特異性はエクソン１に依存している。
ＵＧＴ１ファミリーの一つであるＵＧＴ１Ａ１遺伝子は、プロモータ及びエクソン２〜５に近接するエクソン１から構成される。ＵＧＴ１Ａ１酵素は、主としてビリルビンの抱合を担い、薬剤（エチニルエストラヂオール等）、生体異物化合物（フェノール、アントラキノン、フラボン等）、内因性ステロイドをグルクロニド化することができる（Ｓｅｎａｆｉ，Ｓ．Ｂ．，Ｃｌａｒｋｅ，Ｄ．Ｊ．，Ｂｕｒｃｈｅｌｌ，Ｂ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３０３：２３３−２４０，１９９４）。現在のところ、プロモータ領域とエクソンにおける３０以上の遺伝子多型がＵＧＴ１Ａ１酵素活性を低下させて体質性非抱合黄疸、クリグラー−ナジャー症候群、ギルバート症候群を引き起こすことが知られている（Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ，Ｐ．Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，７：２５５−２６９，１９９７）。最近のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析により、ＵＧＴ１Ａ１のアイソフォームがＳＮ−３８のグルクロニド化を担うこと、及び遺伝子多型がビリルビンの場合と同様にＳＮ−３８のグルクロニド化活性の減少に関与することが示唆された（Ｉｙｅｒ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０１：８４７−８５４，１９９８，Ｉｙｅｒ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．，６５：５７６−５８２，１９９９）。また、本発明者らは、ＵＧＴ１Ａ１遺伝子型に依存したＳＮ−３８及びＳＮ−３８グルクロニドの薬物動態学的個人差を指摘した（Ａｎｄｏ，Ｙ．，Ｓａｋａ，Ｈ．，Ａｓａｉ，Ｇ．，Ｓｕｇｉｕｒａ，Ｓ．，Ｓｈｉｍｏｋａｔａ，Ｋ．，ａｎｄ  Ｋａｍａｔａｋｉ，Ｔ．，Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌ．，９：８４５−８４７，１９９８）。
ＵＧＴ１Ａ１酵素によりその中間代謝物が代謝（抱合）される化合物の一つにイリノテカン（ＣＰＴ−１１）がある。イリノテカンは、カルボキシルエステラーゼにより代謝されて活性型ＳＮ−３８となる。ＳＮ−３８は、さらにＵＧＴ１Ａ１に抱合、解毒化されてそのβ−グルクロニドとなる。その後、胆汁を介して小腸で排泄され、細菌由来グルクロニダーゼによりＳＮ−３８とグルクロン酸に分解される（Ｔａｋａｓｕｎａ，Ｋ．，Ｈａｇｉｗａｒａ，Ｔ．，Ｈｉｒｏｈａｓｈｉ，Ｍ．，Ｋａｔｏ，Ｍ．，Ｎｏｍｕｒａ，Ｍ．，Ｎａｇａｉ，Ｅ．，Ｙｏｋｏｉ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｋａｍａｔａｋｉ，Ｔ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５６：３７５２−３７５７，１９９６）。ＳＮ−３８については、その薬物動態学的個人差により、薬物の効果の変動が引き起こされる可能性が示唆されている（Ｇｕｐｔａ，Ｅ．，Ｌｅｓｔｉｎｇｉ，Ｔ．Ｍ．，Ｍｉｃｋ，Ｒ．，Ｒａｍｉｒｅｚ，Ｊ．，Ｖｏｋｅｓ，Ｅ．Ｅ．，ａｎｄ  Ｒａｔａｉｎ，Ｍ．Ｊ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５４：３７２３−３７２５，１９９４，Ｋｕｄｏｈ，Ｓ．，Ｆｕｋｕｏｋａ，Ｍ．，Ｍａｓｕｄａ，Ｎ．，Ｙｏｓｈｉｋａｗａ，Ａ．，Ｋｕｓｕｎｏｋｉ，Ｙ．，Ｍａｔｓｕｉ，Ｋ．，Ｎｅｇｏｒｏ，Ｓ．，Ｔａｋｉｆｕｊｉ，Ｎ．，Ｎａｋａｇａｗａ，Ｋ．，Ｈｉｒａｓｈｉｍａ，Ｔ．，Ｙａｎａ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｔａｋａｄａ，Ｍ．，Ｊａｐ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，８６：４０６−４１３，１９９５）。
イリノテカンは、カンプトテシン類似化合物の一つであって、トポイソメラーゼＩを抑制することによる強い抗腫瘍活性を有することで知られている。イリノテカンは、特に結腸癌や肺癌の治療薬として広範に使用されているが、白血球の減少、下痢といった副作用が報告されており、その投与薬剤の用量規定因子（ｄｏｓｅ  ｌｉｍｉｔｉｎｇ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ）が問題とされる（Ｎｅｇｏｒｏ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，８３：１１６４−１１６８，１９９１，Ａｋａｂａｙａｓｈｉ，Ａ．，Ｌａｎｃｅｔ，３５０：１２４，１９９７，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ａｎｄ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｆｆａｉｒｓ  Ｂｕｒｅａｕ，Ｍｉｎｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｗｅｌｆａｒｅ（ｅｄ），Ｓｕｍｍａｒｙ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ａｐｐｒｏｖａｌ（ＳＢＡ）Ｎｏ．１（ｒｅｖｉｓｅｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）：ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ．Ｔｏｋｙｏ：Ｙａｋｕｊｉ  Ｎｉｐｐｏ，Ｌｔｄ．，１９９６）。イリノテカンの副作用は、時として致死的なものであり（Ｒｏｕｇｉｅｒ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ，３５２：１４０７−１４１２，１９９８，Ｋｕｄｏｈ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１６：１０６８−１６７４，１９９８，Ｍａｓｕｄａ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１８：４５９ａ，１９９９，Ｎｅｇｏｒｏ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，８３：１１６４−１１６８，１９９１）、実際、臨床試験中に、１２４５名中５５名の患者がイリノテカンの副作用により亡くなっているとの報告がある（Ａｋａｂａｙａｓｈｉ，Ａ．，Ｌａｎｃｅｔ，３５０：１２４，１９９７，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ａｎｄ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｆｆａｉｒｓ  Ｂｕｒｅａｕ，Ｍｉｎｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｗｅｌｆａｒｅ（ｅｄ），Ｓｕｍｍａｒｙ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ａｐｐｒｏｖａｌ（ＳＢＡ）Ｎｏ．１（ｒｅｖｉｓｅｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）：ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ．Ｔｏｋｙｏ：Ｙａｋｕｊｉ  Ｎｉｐｐｏ，Ｌｔｄ．，１９９６）。
尚、Ｒａｔａｉｎらは、ＵＧＴの活性を上昇させる化合物を用いることにより、イリノテカンの副作用を低減させる方法を提案している（米国特許第５７８６３４４号）。
発明の開示
以上のように、ＵＧＴ１Ａ１酵素が代謝に関与する薬剤の副作用は深刻な問題である。しかしながら、かかる副作用を予測する有効な手段は知られていない。一方、癌の化学療法においては、多くの場合治療指標が限られるので、薬剤の副作用を低減し、かつその効果を高めるために、各個人に応じた薬剤投与量を設定することが非常に重要となる。
このような状況に鑑み、本発明は、イリノテカンに代表される、それ自体又は中間代謝物がＵＧＴ１Ａ１酵素に代謝される化合物の投与による副作用を低減させる画期的な手段を提供することを目的とする。即ち、ＵＧＴ１Ａ１酵素によってそれ自体又は中間代謝物が代謝される化合物の投与による副作用発現リスクを予測する方法、当該方法を利用したキット、及び当該化合物の副作用発現リスクを低減させる方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、以上の課題を解決すべく、ＵＧＴ１Ａ１酵素をコードする遺伝子の多型に注目して研究を行った。具体的には、癌の化学治療においてイリノテカンの投与を受けた患者を対象に、ＵＧＴ１Ａ１遺伝子の多型とイリノテカンの副作用との相関について調べた。特に、ＵＧＴ１Ａ１遺伝子のプロモータ領域、エクソン１、エクソン４、及びエクソン５における多型について検討を行った。その結果、プロモータ領域におけるＴＡ反復配列の反復数の違いによる多型、及びエクソン１内の一塩基置換による二種類の多型（２１１位の塩基、及び６８６位の塩基）とイリノテカンの副作用との間に相関が認められた。かかる知見より、ＵＧＴ１Ａ１遺伝子におけるこれらの多型と、ＵＧＴ１Ａ１酵素によってそれ自体又は中間代謝物が代謝される化合物の投与による副作用の程度との間に相関があることが示唆された。従って、ＵＧＴ１Ａ１遺伝子のこれらの多型を解析することが、イリノテカンに代表される、ＵＧＴ１Ａ１酵素によってそれ自体又は中間代謝物が代謝される化合物の投与による副作用発現リスクの予測をするために有効な手段であると考えられた。特に、プロモータ領域における多型、及びエクソン１の６８６位の塩基置換による多型については、それぞれ単独でイリノテカンの副作用との間に相関が認められ、従って、当該二つの多型の解析は、それぞれ単独でもＵＧＴ１Ａ１酵素によってそれ自体又は中間代謝物が代謝される化合物の投与による副作用発現リスクの予測をするために有効な手段であると考えられた。本発明は、以上の知見及び検討の結果に基づきなされたものであり、次の構成からなる。
１．ＵＧＴ１Ａ１酵素によってそれ自体又は中間代謝物が代謝される化合物の投与による副作用発現リスクを予測する方法であって、少なくとも（ａ）：ＵＧＴ１Ａ１酵素をコードする遺伝子のプロモータ領域におけるＴＡ反復配列数を解析するステップを含む方法。
２．ＴＡ反復配列数を解析するステップが、ＴＡ反復配列数が５ないし８のいずれかであることを解析するステップである、１．に記載の方法。
３．ＴＡ反復配列数を解析するステップが、ＴＡ反復配列数が６または７であることを解析するステップである、１．に記載の方法。
４．ＵＧＴ１Ａ１酵素をコードする遺伝子のプロモータ領域におけるＴＡ反復配列領域を含むＤＮＡを増幅するステップをさらに含む、１．ないし３．のいずれかに記載の方法。
５．ＵＧＴ１Ａ１酵素によってそれ自体又は中間代謝物が代謝される化合物の投与による副作用発現リスクを予測する方法であって、（ｂ）：ＵＧＴ１Ａ１酵素をコードする遺伝子の６８６位の塩基を解析するステップ、及び／又は、（ｃ）：ＵＧＴ１Ａ１酵素をコードする遺伝子の２１１位の塩基を解析するステップをさらに含む、１．ないし４．のいずれかに記載の方法。
６．６８６位の塩基を解析するステップが、６８６位の塩基がシトシンであるかまたはアデニンであるかを解析するステップである、５．に記載の方法。
７．２１１位の塩基を解析するステップが、２１１位の塩基がグアニンであるかまたはアデニンであるかを解析するステップである、５．に記載の方法。
８．ＵＧＴ１Ａ１酵素をコードする遺伝子の６８６位の塩基を含むＤＮＡ、及び／又はＵＧＴ１Ａ１酵素をコードする遺伝子の２１１位の塩基を含むＤＮＡ、を増幅するステップをさらに含む、５．ないし７．のいずれかに記載の方法。
９．ＵＧＴ１Ａ１酵素によってそれ自体又は中間代謝物が代謝される化合物の投与による副作用発現リスクを予測する方法であって、少なくとも（ｂ）：ＵＧＴ１Ａ１酵素をコードする遺伝子の６８６位の塩基を解析するステップを含む方法。
１０．６８６位の塩基を解析するステップが、６８６位の塩基がシトシンであるかまたはアデニンであるかを解析するステップである、９．に記載の方法。
１１．ＵＧＴ１Ａ１酵素をコードする遺伝子の６８６位の塩基を含むＤＮＡを増幅するステップをさらに含む、９．又は１０．に記載の方法。
１２．前記化合物は、カンプトテシン類似化合物である、ことを特徴とする１．ないし１１．のいずれかに記載の方法。
１３．前記カンプトテシン類似化合物はカンプトテシン誘導体である、ことを特徴とする１２．に記載の方法。
１４．前記カンプトテシン誘導体は、トポテカン又はイリノテカンである、ことを特徴とする１３．に記載の方法。
１５．前記カンプトテシン誘導体は、イリノテカンである、ことを特徴とする１３．に記載の方法。
１６．１．ないし１５．のいずれかに記載の副作用発現リスクを予測する方法の結果に基づき前記化合物の投与量を設定するステップを含む、ことを特徴とする前記化合物の投与量設定方法。
１７．ＵＧＴ１Ａ１酵素をコードする遺伝子のプロモータ領域におけるＴＡ反復配列数を解析するための核酸であって、
ＵＧＴ１Ａ１酵素をコードする遺伝子のＴＡ反復領域の塩基を含み、かつ配列番号７及び配列番号８のプライマーを用いたＰＣＲ法によって増幅され得る領域に由来するＤＮＡ断片に対して特異的にハイブリダイズする核酸。
１８．ＵＧＴ１Ａ１酵素をコードする遺伝子のプロモータ領域におけるＴＡ反復配列数を解析するための核酸であって、
ＵＧＴ１Ａ１酵素をコードする遺伝子のＴＡ反復領域の塩基を含み、かつ配列番号９及び配列番号１０のプライマーを用いたＰＣＲ法によって増幅され得る領域に由来するＤＮＡ断片に対して特異的にハイブリダイズする核酸。
１９．ＵＧＴ１Ａ１酵素をコードする遺伝子の２１１位の塩基を解析するための核酸であって、
ＵＧＴ１Ａ１酵素をコードする遺伝子の２１１位の塩基を含み、かつ配列番号１及び配列番号２のプライマーを用いたＰＣＲ法によって増幅され得る領域に由来するＤＮＡ断片に対して特異的にハイブリダイズする核酸。
２０．ＵＧＴ１Ａ１酵素をコードする遺伝子の６８６位の塩基を解析するための核酸であって、
ＵＧＴ１Ａ１酵素をコードする遺伝子の６８６位の塩基を含み、かつ配列番号３及び配列番号４のプライマーを用いたＰＣＲ法によって増幅され得る領域に由来するＤＮＡ断片に対して特異的にハイブリダイズする核酸。
２１．ＵＧＴ１Ａ１酵素をコードする遺伝子のプロモータ領域におけるＴＡ反復配列数を解析するための核酸を含む、ＵＧＴ１Ａ１酵素によってそれ自体又は中間代謝物が代謝される化合物の投与による副作用発現リスク予測用キット。
２２．ＵＧＴ１Ａ１酵素をコードする遺伝子の６８６位の塩基を解析するための核酸、及び／又は、ＵＧＴ１Ａ１酵素をコードする遺伝子の２１１位の塩基を解析するための核酸をさらに含む、２１．に記載のキット。
２３．ＵＧＴ１Ａ１酵素をコードする遺伝子の６８６位の塩基を解析するための核酸を含む、ＵＧＴ１Ａ１酵素によってそれ自体又は中間代謝物が代謝される化合物の投与による副作用発現リスク予測用キット。
２４．前記化合物は、カンプトテシン類似化合物である、ことを特徴とする２１．ないし２３．のいずれかに記載のキット。
２５．前記カンプトテシン類似化合物はカンプトテシン誘導体である、ことを特徴とする２４．に記載のキット。
２６．前記カンプトテシン誘導体は、トポテカン又はイリノテカンである、ことを特徴とする２５．に記載のキット。
２７．前記カンプトテシン誘導体は、イリノテカンである、ことを特徴とする２５．に記載のキット。
２８．イリノテカンの副作用発現リスク予測用キットであって、少なくとも（ａ）：ＵＧＴ１Ａ１酵素をコードする遺伝子のプロモータ領域におけるＴＡ反復配列数を解析するための核酸、（ｂ）：ＵＧＴ１Ａ１酵素をコードする遺伝子の６８６位の塩基を解析するための核酸、のいずれか１以上を含む、キット。
２９．イリノテカンの副作用発現リスク予測用キットであって、ＵＧＴ１Ａ１酵素をコードする遺伝子の２１１位の塩基を解析するための核酸、をさらに含む、２８．に記載のキット。
３０．イリノテカンの副作用発現リスク予測用キットであって、少なくとも（ａ）：ＵＧＴ１Ａ１酵素をコードする遺伝子のプロモータ領域におけるＴＡ反復配列数を解析するための核酸、（ｂ）：ＵＧＴ１Ａ１酵素をコードする遺伝子の６８６位の塩基を解析するための核酸、のいずれか１以上を含み、さらに解析対象となるＵＧＴ１Ａ１酵素をコードする遺伝子のプロモータ領域におけるＴＡ反復配列領域を含むＤＮＡ、あるいはＵＧＴ１Ａ１酵素をコードする遺伝子の６８６位の塩基を含むＤＮＡを増幅するための試薬を含む、キット。
３１．イリノテカンの副作用発現リスク予測用キットであって、ＵＧＴ１Ａ１酵素をコードする遺伝子の２１１位の塩基を解析するための核酸及びＵＧＴ１Ａ１酵素をコードする遺伝子の２１１位の塩基を含むＤＮＡを増幅するための試薬をさらに含む、３０．に記載のキット。
発明を実施するための最良の形態
本発明は、（ａ）：ＵＧＴ１Ａ１酵素をコードする遺伝子のプロモータ領域におけるＴＡ反復配列数を解析するステップを含む、ＵＧＴ１Ａ１酵素によってそれ自体又は中間代謝物が代謝される化合物の投与による副作用発現リスクを予測する方法に関する。
ＵＧＴ１Ａ１酵素とは、ＵＤＰ（ウリジンニリン酸）−グルクロノシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）の一分子種である。ＵＧＴは生体においてビリルビンやステロイド等の内因性物質、特定の構造を有する薬剤等のグルクロン酸抱合（グルクロニド抱合）を触媒する酵素の総称であり、多くの薬剤の解毒化に関与する。ＵＧＴ１Ａ１は、例えば、上述のようにイリノテカンの代謝に深く関与することで知られている。
ＵＧＴ１Ａ１酵素をコードする遺伝子（以下、「ＵＧＴ１Ａ１遺伝子」という、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．：ＡＦ２９７０９３）は、プロモータ領域、エクソン１、エクソン１に続いて配置されるエクソン２〜エクソン５を有する。プロモータ領域、エクソン１〜エクソン５には複数の多型が存在することが知られている。
プロモータ領域における多型は、２塩基ペアー（ＴＡ）の反復配列（ＴＡ反復配列）数の違いによるものであり、（ＴＡ）５、（ＴＡ）６（ＴＡ）７、及び（ＴＡ）８（ＴＡ反復配列がそれぞれ５、６、７、及び８存在する）と称される多型が存在する（Ｍｏｎａｇｈａｎ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ，３４７：５７８−５８１，１９９６，Ｂｏｓｍａ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３３３：１１７１−１１７５，１９９５、Ｌａｍｐｅ  ＪＷ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，９，３４１−３４９，１９９９）。
本発明における、「ＴＡ反復配列数を解析する」とは、被検遺伝子のプロモータ領域におけるＴＡ反復配列の数を分析すること（当該配列数が５ないし８のいずれかであること、当該配列数が６又は７であること、を解析すること含む）を意味する。
一方、（ｂ）：ＵＧＴ１Ａ１酵素をコードする遺伝子の６８６位の塩基を解析するステップを含むことにより、ＵＧＴ１Ａ１酵素によってそれ自体又は中間代謝物が代謝される化合物の投与による副作用発現リスクを予測する方法を構成することができる。
また、上記（ａ）のステップと上記（ｂ）のステップを含むことにより本発明の方法を構成することもできる。また、上記（ａ）のステップと（ｃ）：ＵＧＴ１Ａ１酵素をコードする遺伝子の２１１位の塩基を解析するステップを含むことにより本発明の方法を構成することもできる。さらには、上記（ａ）のステップ、上記（ｂ）のステップ、及び上記（ｃ）のステップを含むことにより本発明の方法を構成することもできる。ここで、６８６位の塩基とは、ＵＧＴ１Ａ１遺伝子の転写開始点から下流方向に数えて６８６番目の塩基のことであり、同様に２１１位の塩基とは２１１番目の塩基である。
ステップ（ｂ）は、ＵＧＴ１Ａ１酵素をコードする遺伝子の６８６位の塩基を解析するステップである。６８６位の塩基には、シトシン（Ｃ）とアデニン（Ａ）の二種類の多型が存在することが知られている（Ａｏｎｏ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ，３４５：９５８−９５９，１９９５）。従って、「ＵＧＴ１Ａ１酵素をコードする遺伝子の６８６位の塩基を解析する」とは、特に、６８６位の塩基がシトシン又はアデニンのいずれかであることを分析することを意味する。
ステップ（ｃ）は、ＵＧＴ１Ａ１酵素をコードする遺伝子の２１１位の塩基を解析するステップである。２１１位の塩基には、グアニン（Ｇ）とアデニン（Ａ）の二種類の多型が存在することが知られている（Ａｏｎｏ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ，３４５：９５８−９５９，１９９５）。従って、「ＵＧＴ１Ａ１酵素をコードする遺伝子の２１１位の塩基を解析する」とは、特に、２１１位の塩基がグアニン又はアデニンのいずれかであることを分析することを意味する。
尚、上記のプロモータ領域におけるＴＡ反復配列数の解析、６８６位の塩基の解析、及び／又は２１１位の塩基の解析は、両アレルを対象とすることができる。
ＴＡ反復配列数を解析する方法、６８６位又は２１１位の塩基を解析する方法は特に限定されるものではなく、例えば、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法を利用したＰＣＲ−ＲＦＬＰ（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：制限酵素断片長多型）法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：単鎖高次構造多型）法（Ｏｒｉｔａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，８６，２７６６−２７７０（１９８９）等）、ＰＣＲ−ＳＳＯ（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：特異的配列オリゴヌクレオチド）法、ＰＣＲ−ＳＳＯ法とドットハイブリダイゼーション法を組み合わせたＡＳＯ（ａｌｌｅｌｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：アレル特異的オリゴヌクレオチド）ハイブリダイゼーション法（Ｓａｉｋｉ，Ｎａｔｕｒｅ，３２４，１６３−１６６（１９８６）等）、又はＴａｑＭａｎ−ＰＣＲ法（Ｌｉｖａｋ，ＫＪ，Ｇｅｎｅｔ  Ａｎａｌ，１４，１４３（１９９９），Ｍｏｒｒｉｓ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３４，２９３３（１９９６））、Ｉｎｖａｄｅｒ  法（Ｌｙａｍｉｃｈｅｖ  Ｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１７，２９２（１９９９））、プライマー伸長法を用いたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ（ｍａｔｒｉｘ）法（Ｈａｆｆ  ＬＡ，Ｓｍｉｒｎｏｖ  ＩＰ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  ７，３７８（１９９７））、ＲＣＡ（ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｉｃｌｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法（Ｌｉｚａｒｄｉ  ＰＭ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  １９，２２５（１９９８））、ＤＮＡチップ又はマイクロアレイを用いた方法（Ｗａｎｇ  ＤＧ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８０，１０７７（１９９８）等）、プライマー伸長法、サザンブロットハイブリダイゼーション法、ドットハイブリダイゼーション法（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８，５０３−５１７（１９７５））等、公知の解析方法を用いることができる。さらに、当該配列部分を直接シークエンスすることにより解析してもよい。尚、これらの方法は、任意に組み合わせて用いることもできる。また、ステップ（ａ）ないし（ｃ）の少なくとも二つを行い副作用発現リスクの予測をする場合には、全てのステップにおいて同じ解析方法を用いることができることは勿論のこと、それぞれのステップにおいて任意の解析方法を選択して用いることができる。
被験ＤＮＡが少量の場合には、ＰＣＲ法を利用したＰＣＲ−ＲＦＬＰ法等により解析することが検出感度ないし精度の面から好ましい。また、ＰＣＲ法又はＰＣＲ法に準じた遺伝子増幅方法により被検ＤＮＡを予め増幅した後、上記いずれかの解析方法を適用することもできる。一方、多数の被験ＤＮＡを解析する場合には、特にＴａｑＭａｎ−ＰＣＲ法、Ｉｎｖａｄｅｒ法、プライマー伸長法を用いたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ（ｍａｔｒｉｘ）法、ＲＣＡ（ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｉｃｌｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、又はＤＮＡチップ又はマイクロアレイを用いた方法を用いることが好ましい。
ＵＧＴ１Ａ１遺伝子は、被験者の血液、皮膚細胞、粘膜細胞、毛髪等から公知の抽出方法、精製方法を用いて取得することができる。また、本発明において解析される塩基部分を含むものであれば、全長ＤＮＡ又は部分ＤＮＡの別を問わず、本発明におけるＵＧＴ１Ａ１遺伝子として用いることができる。換言すれば、プロモータ領域の反復配列（ＴＡ）の反復数を解析するステップにおいては、当該反復配列部分を含む限り任意の長さのＤＮＡ断片を用いることができる。また、６８６位の塩基を解析するステップにおいては、当該塩基部分を含む限り任意の長さのＤＮＡ断片を用いることができる。同様に、２１１位の塩基を解析するステップにおいては、当該塩基部分を含む限り任意の長さのＤＮＡ断片を用いることができる。
また、ＵＧＴ１Ａ１遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡを用いて、各ステップにおける解析を行うこともできる。この場合には、例えばＵＧＴ１Ａ１遺伝子のｍＲＮＡを被験者の血液等から抽出、精製した後、逆転写によりｃＤＮＡを調製する。そして、当該ｃＤＮＡの塩基配列を解析することによりゲノムＤＮＡの多型部分の配列を予測する。
さらに、エクソン１における二つの多型については、ＵＧＴ１Ａ１遺伝子の発現産物を用いて解析することもできる。即ち、多型部分の発現産物（アミノ酸）を分析することにより、エクソン１の遺伝子型を決定することができる。この場合、エクソン１の当該多型部分に対応するアミノ酸を含んでいる限り、部分ペプチドであっても測定対象とすることができる。具体的には、エクソン１の２１１位における多型はコドン７１を変化させるため（グリシン又はアルギニンを生ずる）、コドン７１に対応するアミノ酸を少なくとも含むペプチドを測定対象として用いることができる。同様に、エクソン１の６８６位における多型はコドン２２９を変化させるため（プロリン又はグルタミンを生ずる）、コドン２２９に対応するアミノ酸を少なくとも含むペプチドを測定対象として用いることができる。尚、コドン７１に対応するアミノ酸及びコドン２２９に対応するアミノ酸の両者を含むペプチドないしタンパクを用いれば、二つの多型を併せて解析することが可能である。
ペプチド又はタンパクを用いて多型部分に対応するアミノ酸を分析する方法としては、周知のアミノ酸配列分析法（エドマン法を利用した方法）を用いることができる。また、アミノ酸の変化によりＵＧＴ１Ａ１遺伝子の発現産物の立体構造が変化することが予想されるため、免疫学的な手法によりアミノ酸の種類を分析することもできる。免疫学的な手法としては、例えば、ＥＬＩＳＡ法（酵素結合免疫吸着定量法）、ラジオイムノアッセイ、免疫沈降法、免疫拡散法等を挙げることができる。
「ＵＧＴ１Ａ１酵素によってそれ自体又は中間代謝物が代謝される化合物」とは、生体に投与されたときに、生体内においてＵＧＴ１Ａ１酵素によって直接代謝される化合物、又は一旦他の酵素等によって代謝され、その結果生ずる代謝産物（中間代謝物）がＵＧＴ１Ａ１酵素によって代謝される化合物をいう。かかる性質の化合物であれば特に限定されないが、例えば、カンプトテシン類似化合物が該当する。上記性質を有するカンプトテシン類似化合物であればその種類は特に限定されず、例えば、トポテカン、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）等の公知のカンプトテシン誘導体が該当する。さらに、上記性質が維持されることを条件に、公知のカンプトテシン類似化合物、公知のカンプトテシン誘導体（トポテカン、イリノテカン等）において一又は数個の置換基が他の原子又は原子団に置換された化合物であってもよい。
尚、ＵＧＴ１Ａ１酵素によってそれ自体又は中間代謝物が代謝される化合物の好適な例としてはイリノテカンを挙げることできる。
副作用発現リスクとは、本発明における化合物を投与することに起因して副作用が生ずる危険性をいう。ここで、副作用とは、本発明における化合物を投与した場合に期待される効果（薬効）以外の作用・効果をいい、生体に悪影響を及ぼすものは勿論のこと、当該化合物本来の効果を減少させるものも含まれる。従って、本発明の方法では当該化合物投与の本来の効果を減少させる危険性も副作用発現リスクに含まれる。
本発明の化合物がイリノテカンである場合の副作用の一例を示せば、白血球減少症又は下痢がある。これらの症状は、イリノテカンを投与された患者に対して、時として致死的な悪影響を及ぼす。
副作用の発現リスクを予測した結果は当該化合物の投与量を設定することに利用できる。そこで、本発明の他の局面は、上記副作用発現リスクを予測する方法の結果に基づき前記化合物の投与量を設定するステップを含む、ことを特徴とする前記化合物の投与量設定方法である。かかる投与量設定方法によれば、当該化合物投与により生ずる副作用の程度と、当該化合物投与により期待される本来の効果の程度とを比較考量して、投与対象（患者）毎に適切な投与量の設定を行うことができる。従って、副作用の発生を抑えつつ、当該化合物による効果的な治療を行うことが可能となる。即ち、別の見方をすれば、当該化合物の副作用を低減するための方法が提供されることとなる。
本発明の他の局面は、ＵＧＴ１Ａ１酵素をコードする遺伝子のプロモータ領域におけるＴＡ反復配列数を解析するための核酸（以下、「ＴＡ反復数解析用核酸」という）、ＵＧＴ１Ａ１酵素をコードする遺伝子の６８６位の塩基を解析するための核酸（以下、「６８６位解析用核酸」という）、及びＵＧＴ１Ａ１酵素をコードする遺伝子の２１１位の塩基を解析するための核酸（以下、「２１１位解析用核酸」という）を提供する。
ＴＡ反復数解析用核酸としては、ＵＧＴ１Ａ１酵素をコードする遺伝子のＴＡ反復領域の塩基を含み、かつ次の二組のプライマーセット（配列番号７と配列番号８の組、又は配列番号９と配列番号１０の組）のいずれかを用いたＰＣＲ法によって増幅され得る領域に由来するＤＮＡ断片に対して特異的にハイブリダイズする核酸を挙げることができる。
順方向プライマー（配列番号７）
0004447835.tif 000002
逆方向プライマー（配列番号８）
0004447835.tif 000003
順方向プライマー（配列番号９）
0004447835.tif 000004
逆方向プライマー（配列番号１０）
0004447835.tif 000005
６８６位解析用核酸としては、ＵＧＴ１Ａ１酵素をコードする遺伝子の６８６位の塩基を含み、かつ次のプライマーセット（配列番号３及び配列番号４）を用いたＰＣＲ法によって増幅され得る領域に由来するＤＮＡ断片に対して特異的にハイブリダイズする核酸を挙げることができる。
順方向プライマー（配列番号３）
0004447835.tif 000006
逆方向プライマー（配列番号４）
0004447835.tif 000007
２１１位解析用核酸としては、ＵＧＴ１Ａ１酵素をコードする遺伝子の２１１位の塩基を含み、かつ次のプライマーセット（配列番号１及び配列番号２）を用いたＰＣＲ法によって増幅され得る領域に由来するＤＮＡ断片に対して特異的にハイブリダイズする核酸を挙げることができる。
順方向プライマー（配列番号１）
0004447835.tif 000008
逆方向プライマー（３９３位〜４１２位）（配列番号２）
0004447835.tif 000009
本発明の他の局面は、ＵＧＴ１Ａ１酵素をコードする遺伝子のプロモータ領域におけるＴＡ反復配列数を解析するための核酸（ＴＡ反復数解析用核酸）を含む、ＵＧＴ１Ａ１酵素によってそれ自体又は中間代謝物が代謝される化合物の投与による副作用発現リスク予測用キットを提供する。
一方、ＵＧＴ１Ａ１酵素をコードする遺伝子の６８６位の塩基を解析するための核酸（６８６位解析用核酸）を含むことにより、ＵＧＴ１Ａ１酵素によってそれ自体又は中間代謝物が代謝される化合物の投与による副作用発現リスク予測用キットを構成することができる。
また、ＴＡ反復配列数解析用核酸に加えて、６８６位解析用核酸を含むことにより、本発明のキットを構成することもできる。さらに、ＴＡ反復配列数解析用核酸に加えて、ＵＧＴ１Ａ１酵素をコードする遺伝子の２１１位の塩基を解析するための核酸（２１１位解析用核酸）をさらに含むことにより、本発明のキットを構成することもできる。尚、各キットの使用方法に応じた一又は二以上の試薬を組み合わせて上記各キットを構成してもよい。例えば、ＵＧＴ１Ａ１酵素をコードする遺伝子のＴＡ反復配列数領域を含むＤＮＡを増幅するための試薬、ＵＧＴ１Ａ１酵素をコードする遺伝子の６８６位の塩基領域を含むＤＮＡを増幅するための試薬、及び／又はＵＧＴ１Ａ１酵素をコードする遺伝子の２１１位の塩基領域を含むＤＮＡを増幅するための試薬を組み合わせてキットを構成することができる。
以上の各核酸は、それぞれのキットにおいて利用される解析方法（上述したＰＣＲ−ＲＦＬＰ（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：制限酵素断片長多型）法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：単鎖高次構造多型）法（Ｏｒｉｔａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，８６，２７６６−２７７０（１９８９）等）等の解析方法）に用いられるものであって、例えば、プライマー、プローブである。プライマーの例としては、解析対象となる多型部位（プロモータ領域、６８６位の塩基、２１１位の塩基）を含む領域を特異的に増幅させることができるプライマーが挙げられる。また、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法を実行するキットを構成する場合には、例えば、ＰＣＲ増幅産物を制限酵素処理した場合に遺伝子型が識別されるように、特定の多型を有する場合に当該多型部分において特定の制限酵素部位が形成されるように設計したプライマーが用いられる。また、ＴａｑＭａｎ−ＰＣＲ法、Ｉｎｖａｄｅｒ法等を実行するキットを構成する場合には、各方法に用いられるプライマー及び／又はプローブを核酸の例として挙げることができる。
プローブ、プライマーには、解析方法に応じて、適宜ＤＮＡ断片又はＲＮＡ断片が用いられる。プローブ、プライマーの塩基長は、それぞれの機能が発揮される長さであればよく、プライマーの塩基長の例としては１５〜３０ｂｐ程度、好ましくは２０〜２５ｂｐ程度である。
上記のように、本発明の方法を容易に実施するためには、これに適した遺伝子多型検出キットを用いることが好ましい。このようなキットは、上記の説明に基づき容易に設計することができるが、基本的にＰＣＲ法等による被検ＤＮＡの増幅を行わずにゲノムＤＮＡでもアッセイが実施できる方法であるＩｎｖａｄｅｒ法を例としてさらに説明する。
Ｉｎｖａｄｅｒ法によるキットを構成する場合には、２種類の非蛍光標識オリゴヌクレオチド（１）、（２）と１種類の蛍光標識オリゴヌクレオチド（３）並びにＤＮＡの構造を認識して切断する特殊なエンドヌクレアーゼ活性を有する酵素（４）を使用する。２種類の非蛍光標識オリゴヌクレオチドをそれぞれ「アレルプローブ（あるいはシグナルプローブ、レポータプローブ）」、「インベーダープローブ」と呼び、蛍光標識オリゴヌクレオチドを「ＦＲＥＴプローブ」、ＤＮＡの構造を認識して切断する特殊なエンドヌクレアーゼ活性を有する酵素を「ｃｌｅｖａｓｅ」と呼ぶ。
（１）アレルプローブは、鋳型であるＵＧＴ１Ａ１酵素をコードする遺伝子（以下、略して「ＵＧＴ１Ａ１遺伝子」ともいう）中の解析対象となる多型部位（以下、「多型部位」という）より５’側に対して相補的となる塩基配列を有し、多型部位より一塩基３’側に対して相補結合し得ない任意の塩基配列（フラップと呼ぶ）を有するように設計する。すなわちアレルプローブ自体から見た場合、５’末端よりフラップ部分・鋳型中の多型部位より５’側に相補的な配列部分の順で構成されている。なおフラップの配列はＵＧＴ１Ａ１遺伝子配列はもとより、アレルプローブあるいはインベーダープローブ、さらには試料中のＵＧＴ１Ａ１遺伝子以外のＤＮＡと相補結合をし得ない配列を使用する。
（２）インベーダープローブは、鋳型であるＵＧＴ１Ａ１遺伝子中の多型部位より３’側に対して相補的に結合するように設計するが、多型部位にあたる配列は任意の塩基（Ｎ）でよい。すなわちインベーダープローブ自体から見た場合、５’末端より鋳型の多型部位より３’側に対して相補的な配列部分−３’末端にＮの順で構成されている。
このように構成された（１）、（２）は本発明の「ＴＡ反復数解析用核酸」、「６８６位解析用核酸」あるいは「２１１位解析用核酸」に相当する。（１）、（２）２種類のプローブとＵＧＴ１Ａ１遺伝子を相補結合させると多型部位にインベーダープローブの１塩基（Ｎ）が浸入（ｉｎｖａｓｉｏｎ）することができる。
（３）ＦＲＥＴ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）プローブは、ＵＧＴ１Ａ１遺伝子とは全く無関係な配列により構成することができ、検出したい多型部位によらず共通でよい。５’側には自分自身で相補結合できる配列を有し、３’側にはフラップに対して相補的な配列を有している。また、５’末端には蛍光色素を標識し、その上流には消光物質（クエンチャー）が結合されている。
（４）ｃｌｅｖａｓｅは、構造特異的フラップエンドヌクレアーゼ（ＦＥＮｓ）に分類されるＤＮＡの構造を認識して切断する特殊なエンドヌクレアーゼ活性を有する酵素であり、鋳型ＤＮＡ、インベーダープローブおよびアレルプローブの３つの塩基が並び、アレルプローブの５’末端がフラップ状になっている部分を認識して、そのフラップ部分を切断する。
以上のような３種類のプローブ（１）〜（３）とｃｌｅａｖａｓｅ（４）を用いると模式的に以下のような二段階の反応が生じる。
まずアレルプローブ（１）がＵＧＴ１Ａ１遺伝子と相補結合したときに、多型部位にインベーダープローブ（２）の３’末端（Ｎ）が侵入する。この３塩基が並んだ多型部位の構造をｃｌｅａｖａｓｅ（４）が認識してアレルプローブ（１）のフラップ部分を切断し、フラップ部分が遊離する。次に、アレルプローブ（１）から遊離したフラップ部分は、ＦＲＥＴプローブ（３）と相補的な配列をもつためＦＲＥＴプローブ（３）と相補結合する。このときフラップ部分の３’末端に存在する多型部位がＦＲＥＴプローブ（３）自身の相補結合部位に侵入する。ｃｌｅａｖａｓｅ（４）は、今度はこの構造を認識して蛍光色素が結合している部位を切断する。これにより蛍光色素はクエンチャーと離れるため蛍光を発する。この蛍光強度を測定して多型を検出し、解析する。
（１）〜（４）は例えば、（１）と（２）、（３）と（４）を組み合わせて２種類の試薬組成物として組み合わせて使用することや、（３）および（４）を事前に乾燥させてマイクロタイタープレートに封入しておくこともできる。これらによりアッセイのステップ数を減らすことができる。また（１）と（２）を含む試薬組成物にマグネシウム、緩衝剤等を適宜配合し、反応を最適化することもできる。さらに（１）〜（４）以外に測定中の試料の蒸発を防止する鉱油などを組み合わせてキットとすることもできる。
なお、アレルプローブ（１）について２種類のプローブを用意すれば、ＵＧＴ１Ａ１遺伝子がホモ接合体であるかヘテロ接合体であるかを鑑別することもできる。これらは、大西洋三，ポストシークエンスのゲノム科学「ＳＮＰ遺伝子多型の戦略」，９４−１３５，中山書店，２０００、Ｔｒｅｂｌｅ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，遺伝子医学，４：６８−７２，２０００の総説や国際公開公報であるＷＯ９７／２７２１４、ＷＯ９８／４２８７３に図解され、記載されているので、これらを参照して最適な設計をすることが可能である。
尚、本発明のキットによりＵＧＴ１Ａ１酵素によってそれ自体又は中間代謝物が代謝される化合物の投与による副作用発現リスクが予測できるため、その予測結果に基づいて投与対象毎に適切な当該化合物の投与量を設定できる。換言すれば、本発明のキットは、ＵＧＴ１Ａ１酵素によってそれ自体又は中間代謝物が代謝される化合物の投与量を設定するために用いることができる。
副作用発現リスクの少ないと判断される遺伝子多型（即ち、プロモータ領域のＴＡ反復配列数が６、エクソン１の２１１位がグアニン（Ｇ）である、及び／又は、エクソン１の６８６位がシトシンである）を有するＵＧＴ１Ａ１遺伝子又は、当該いずれかの多型部位を少なくとも一つ含有するＤＮＡ断片を、化合物の投与を受ける患者の細胞、特に、ＵＧＴ１Ａ１酵素が当該化合物の代謝、解毒化に作用する部位における細胞に導入することにより、当該化合物の副作用の発現リスクを低減することができる。遺伝子の導入は、当該化合物の投与前、投与中、又は投与後に行うことができる。遺伝子の導入は、例えば、遺伝子導入用プラスミド又はウイルスベクターを用いた方法、エレクトロポーレーション（Ｐｏｔｔｅｒ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１，７１６１−７１６５（１９８４））、リポフェクション（Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．３４，７４１３−７４１７（１９８４））、マイクロインジェクション（Ｇｒａｅｓｓｍａｎｎ，Ｍ．＆Ｇｒａｅｓｓｍａｎｎ，Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７３，３６６−３７０（１９７６））等の方法により行うことができる。
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。本実施例では、イリノテカン投与による副作用とＵＧＴ１Ａ１遺伝子の多型との相関を統計学的に解析した。
［患者情報及び臨床情報］
１９９４年７月から１９９９年６月にイリノテカンを含む化学療法を受けている日本人患者を対象とした。患者の安全を確保するために、イリノテカン使用前に骨髄機能が問題ないこと（白血球３×１０９／ｌ以上、血小板１００×１０９／ｌ以上）を確認した。さらに、水溶性下痢、麻痺性イレウス、間質性肺炎や肺線維症、広範囲にわたる重症の腹水や胸水、明らかな黄疸、イリノテカンに過敏症の既往歴がある患者を除外した。この結果、１１８名の患者を本実施例の対象とした。
イリノテカンの適応性を確認するため、週に一回は全血、血小板数および血清化学値について測定を行った。また、ビリルビン値は常に測定することとした。
患者情報（年齢、性別等）を含む臨床記録、並びにイリノテカン投与量及び投与スケジュール、他の薬や放射線療法の記録、イリノテカンによる副作用等について、レトロスペクティブに調査を行った。顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）やイリノテカン誘導性の下痢に対して日本において一般的に処方されている塩酸ロペラミドの投与日を数えた。Ｇ−ＣＳＦの予防投与により、好中球減少症がはっきりと発症することはなかった。イリノテカンの量規定因子（ｄｏｓｅ  ｌｉｍｉｔｉｎｇ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ）により、白血球減少症と下痢を引き起こすことが知られていることから、グレード４の白血球減少（＜０．９×１０９／ｌ）、グレード３又はそれ以上悪化した下痢（グレード３は５日以上続く下痢、グレード４は出血または脱水症状を伴う、各グレードは日本がん治療学会の基準に準ずる）を、ｓｅｖｅｒｅ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ（重篤副作用）と定義した。他の副作用は種々の患者背景に影響されることから、本実施例において分析対象としなかった。血清全ビリルビン値は、イリノテカン投与直前及び治療後の最高値について記録した。
［遺伝子型の分析］
各患者（１１８名）より血液サンプルを採取し、各サンプルについて遺伝子型の分析を行った。まず、１００〜２００μｌの全血からＱＩＡａｍｐ  Ｂｌｏｏｄ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてゲノムＤＮＡを調製した。尚、操作方法は当該キットに添付された説明書に従った。
各ゲノムＤＮＡについて、次の変異配列を解析した（図１を参照）。即ちＵＧＴ１Ａ１遺伝子における、ＴＡＴＡボックス内の２塩基ペアー（ＴＡ）の挿入（この結果、−３９位〜−５３位に（ＴＡ）７ＴＡＡを生ずる。このタイプをＵＧＴ１Ａ１＊２８と称する（Ｍｏｎａｇｈａｎ，Ｇ．，Ｒｙａｎ，Ｍ．，Ｓｅｄｄｏｎ，Ｒ．，Ｈｕｍｅ，Ｒ．，ａｎｄ  Ｂｕｒｃｈｅｌｌ，Ｂ．，Ｌａｎｃｅｔ，３４７：５７８−５８１，１９９６，Ｂｏｓｍａ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３３３：１１７１−１１７５，１９９５）、エクソン１のコドン７１における置換（転写開始点の下流２１１位のグアニン（Ｇ）をアデニン（Ａ）に置換する。当該置換はグリシンをアルギニンに変化させる（当該変異をＧ７１Ｒと表す。このタイプをＵＧＴ１Ａ１＊６と称する。）、エクソン１のコドン２２９におけるプロリンをグルタミンに換える置換（Ｐ２２９Ｑと表す。このタイプをＵＧＴ１Ａ１＊２７と称する。）、エクソン４のコドン３６７における置換（１０９９位における置換。シトシン（Ｃ）からグアニン（Ｇ）への置換。当該置換はアルギニンをグリシンに置換する。Ｒ３６７Ｇと表す。このタイプをＵＧＴ１Ａ１＊２９と称する。）、及びエクソン５のコドン４８６における置換（１４５６位における置換。チミン（Ｔ）からグアニン（Ｇ）への置換。当該置換はチロシン（Ｙ）をアスパラギン酸（Ｄ）に置換する。Ｙ４８６Ｄと表す。このタイプをＵＧＴ１Ａ１＊７と称する。）。（Ｍｏｎａｇｈａｎ，Ｇ．，Ｒｙａｎ，Ｍ．，Ｓｅｄｄｏｎ，Ｒ．，Ｈｕｍｅ，Ｒ．，ａｎｄ  Ｂｕｒｃｈｅｌｌ，Ｂ．，Ｌａｎｃｅｔ，３４７：５７８−５８１，１９９６，Ｂｏｓｍａ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３３３：１１７１−１１７５，１９９５，Ａｏｎｏ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ，３４５：９５８−９５９，１９９５，Ａｏｎｏ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９７：１２３９−１２４４，１９９３）。
ＵＧＴ１Ａ１＊２８は、先に報告されたＰＣＲ増幅反応を用いた方法（Ｍｏｎａｇｈａｎ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ，３４７：５７８−５８１，１９９６，Ａｎｄｏ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，８：３５７−３６０，１９９８に記載される方法）により得られる２５３−２５５塩基対の配列を直接決定することにより、最も一般的なアレル（ＵＧＴ１Ａ１＊１）と識別された。
塩基配列の解析は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｉｚｅｒを用いたダイ・ターミネタ・シークエンス反応を利用したサイクルシークエンシング法により行った（ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）。
その他の変異遺伝子型（ＵＧＴ１Ａ１＊６等）はＰＣＲ−ＲＦＬＰ法によりＵＧＴ１Ａ１＊１と識別された。エクソン１の分析のために、エクソン１を含む９２３塩基対の断片を先に報告された方法（Ａｋａｂａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔ．，４６：２１−２６，１９９８）に従って第１段階ＰＣＲにより増幅した。
続いて、ＵＧＴ１Ａ１＊６の分析のために、２３５塩基対の断片を増幅するように設計された入れ子（ｎｅｓｔｅｄ）プライマーを用いて第２段階ＰＣＲによる増幅反応を行った。ミスマッチ配列を含む順方向プライマーと逆方向プライマーは  次のとおりである。
順方向プライマー（１７８位〜２１０位）（配列番号１）
0004447835.tif 000010
逆方向プライマー（３９３位〜４１２位）（配列番号２）
0004447835.tif 000011
下線部はミスマッチ部位である。ＵＧＴ１Ａ１＊１ではＭｓｐＩ（タカラ酒造  株式会社、大津市、日本）制限酵素サイトが導入され、ＵＧＴ１Ａ１＊６では導入されないように順方向プライマーは設計されている。第１段階ＰＣＲ反応による増幅産物を１０００倍に希釈し、入れ子プライマーを用いたＰＣＲ（ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ、第２段階  ＰＣＲ）に供した。その際、サンプル５０μｌ中に、０．２ｍＭの各デオキシヌクレオチド三リン酸、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、各プライマー０．５μＭ、及びＴａｑポリメラーゼ１．３ユニット（宝酒造  株式会社、大津市、日本）を含有させた。ＰＣＲの条件は次のとおりである。９５℃、５ｍｉｎの反応、及びこれに続いて行われる２５サイクルの反応（９４℃、３０ｓ、６０℃、４０ｓ、及び７２℃、４０ｓ）である（ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＭＰ，宝酒造  株式会社、大津市、日本）。１μｌのＰＣＲ増幅産物を４ｕｎｉｔｓのＭｓｐＩで３７℃、１ｈ処理した。ＵＧＴ１Ａ１＊１由来のＤＮＡは２０３塩基対と３２塩基対の断片に消化され、ＵＧＴ１Ａ１＊６からは消化されなかった２３５塩基対の断片が生じ、ヘテロ接合ＤＮＡからは上記３断片の全てが生じた。
ＵＧＴ１Ａ１＊２７の塩基配列を決定には、３９９塩基対の断片を増幅するために設計された以下のプライマー（片方を入れ子プライマー（ｎｅｓｔｅｄ  ｐｒｉｍｅｒ）としてある）を用いた第２段階ＰＣＲを行った。
順方向プライマー（４８５位〜５０３位）（配列番号３）
0004447835.tif 000012
逆方向プライマー（８６５位〜８６７位及びイントロン１）（配列番号４）
0004447835.tif 000013
ＵＧＴ１Ａ１＊２７には二つのＢｓｒＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｖｅｒｌｙ，ＭＡ）制限酵素サイトが存在し（５５２位〜５５６位、及び６８４位〜６８８位）、一方、ＵＧＴ１Ａ１＊１にはかかる制限酵素サイトが一つ存在する（５５２位〜５５６位）。一連のＰＣＲ増幅反応は上記のＭｓｐＩ  ＲＦＬＰの場合と同一の条件で行った。ＰＣＲ増幅産物を、２．５ｕｎｉｔのＢｓｒＩにより、６５℃、１ｈの条件で消化した。その結果、ＵＧＴ１Ａ１＊２７からは１９９塩基対、１３２塩基対、及び６８塩基対の断片が生じ、ＵＧＴ１Ａ１＊１からは３３１塩基対及び６８塩基対の断片が生じた。尚、ヘテロ接合型のＤＮＡからは上記４断片の全てが生じた。
同様に、ＵＧＴ１Ａ１＊２９の塩基配列を、入れ子プライマーを用いたＰＣＲ−ＲＦＬＰ法により解析した。エクソン２、３、及び４を包含する第１段階ＰＣＲ増幅反応を、先に報告されている方法（Ａｋａｂａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔ．，４６：２１−２６，１９９８）に多少の改良を加えた方法に従って行った。即ち、第２段階ＰＣＲ増幅反応には、２８５塩基対の断片を増幅するために設計された、ミスマッチ配列を含む順方向プライマー及び逆方向プライマーを用いた。
順方向プライマー（イントロン３、及び１０８５位〜１０９８位、下線部はミスマッチ部位を示す）（配列番号５）
0004447835.tif 000014
逆方向プライマー（イントロン４）（配列番号６）
0004447835.tif 000015
順方向プライマーは、ＵＧＴ１Ａ１＊１からＣｆｒ１３Ｉ（宝酒造  株式会社、大津市、日本）制限酵素サイト（１０９５位〜１０９９位）を生じ、ＵＧＴ１Ａ１＊２９からはかかる制限酵素サイトが生じないように設計してある。尚、ＰＣＲ反応試薬混合物は、上記ＵＧＴ１Ａ１＊６における第２段階ＰＣＲ反応の場合と同一のものを使用した。ＰＣＲ増幅産物をＣｆｒ１３Ｉ酵素により消化した。ＵＧＴ１Ａ１＊１由来のＤＮＡは２５２塩基対及び３３塩基対の断片に消化され、ＵＧＴ１Ａ１＊２９由来のＤＮＡからは消化されなかった２８５塩基対の断片を生じた。
ＵＧＴ１Ａ１＊７の検出のために、先に報告されたプライマー（Ａｋａｂａ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔ．，４６：２１−２６，１９９８）を用いて、エクソン５の５７９塩基対の断片をＰＣＲ法により増幅した。
尚、ＰＣＲ反応試薬混合物は、上記ＵＧＴ１Ａ１＊６における第２段階ＰＣＲ反応の場合と同一のものを使用した。ＵＧＴ１Ａ１＊１の配列にはＢｓｒＩ制限酵素サイト（１４５２位〜１４５６位）が存在し、一方、ＵＧＴ１Ａ１＊７には当該制限酵素サイトは存在しない。従って、ＢｓｒＩ酵素を加えてインキュベーションすることにより、ＵＧＴ１Ａ１＊１は３６５塩基対及び２１４塩基対の断片に消化され、一方、ＵＧＴ１Ａ１＊７由来ＤＮＡからは消化されなかった５７９塩基対の断片が生じた。
上記の操作の結果得られた各制限酵素断片を、４％アガロースゲルを用いた電気泳動及びエチジウムブロマイド染色により分析した。以上全ての変異についての遺伝子型解析の結果は、直接的シークエンス分析により確認した。
以上の操作により、患者毎にＵＧＴ１Ａ１遺伝子の型を決定した。
［統計的解析］
イリノテカンの重篤副作用とＵＧＴ１Ａ１遺伝子の型（遺伝子多型）との相関関係の解析及び評価は、以下の統計的手法によって行った。
候補ファクターとして、性別、年齢、一般状態（Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｓｔａｔｕｓ：ＰＳ）、主要疾患、遠隔転移の存在、治療履歴、糖尿病と肝臓疾患との併発、化学療法レジュメ、同時に行われる放射線療法、及びイリノテカン点滴の投与スケジュール及び一回あたりの投与量を用いた。化学療法レジュメについては、３つのグループに分けた。即ち、イリノテカンのみを投与したグループ、イリノテカン及びプラチナ製剤（シスプラチン又はカルボプラチン）を投与したグループ、イリノテカン及び他の薬剤（パクリタセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、ドセタセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、ミトマイシン  Ｃ（ｍｉｔｏｍｙｓｉｎ  Ｃ）、又は５−フルオトウラシル（５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ））を投与したグループである。位置変数間の相関性（関連性）は、絶対変数に対してのχ２（カイ二乗）テスト又はＦｉｓｈｅｒ’ｓ  ｅｘａｃｔ  ｔｅｓｔ、又は連続変数に対してのＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ  ｔｅｓｔを用いて評価した。重篤副作用（ｐ＜０．１）と相関があると予想される候補変数は非限定マルティプルロジスティック回帰分析（ｕｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｌｏｇｉｓｔｉｃ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ）において取り込むこととした。顆粒球コロニー刺激因子及びロペラミド塩酸塩の全実質的投与量及び使用については、化学療法の結果に強く依存するものと考えられるため、多変量解析において考慮しなかった。最終的な統計モデルにおける変数は、ステップワイズ法を用いて有意水準０．２５（ｆｏｒｗａｒｄ）および０．１（ｂａｃｋｗａｒｄ）において選択した。重篤副作用の発現に対する遺伝子多型の重要性は、その他の要因を補正に加えることにより検討した。
上記の解析は、ＪＭＰ  ｖｅｒ．３．０．２ソフトウウェア（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．，Ｃａｒｙ，ＮＣ）を用いて行った。両側検定値（Ｐ値）が０．０５より小さい場合に統計的に有意な相違とした。
［イリノテカンの副作用と臨床情報］
１１８名の患者についての臨床情報を検討した結果、９名（８％）がグレード４の白血球減少症（≦０．９×１０９／ｌｉｔｅｒ）を経験しており、３８名（３２％）がグレード３の白血球減少症（１．９−１．０×１０９／ｌｉｔｅｒ）を経験していた。一方、３名（３％）がグレード４（出血性又は脱水症）の下痢を経験しており、１９名（１６％）がグレード３（５日以上の間、水状）の下痢を経験していた。グレード４の白血球減少症を経験した患者９名の内、５名はグレード３又は４の下痢も経験していた。また、グレード３又は４の下痢を経験した患者２２名の内、１６名はグレード３又は４の白血球減少症も経験していた。以上の臨床情報を基に、重篤副作用を経験した患者（以下、「副作用経験者」という）２６名と経験していない患者（以下、「副作用非経験者」という）９２名とに区分けし、臨床情報及びイリノテカン化学療法の情報を、図２の表及び図３の表にそれぞれまとめた。副作用経験者では、イリノテカンの実質的全投与量がより少なく、顆粒球コロニー刺激因子又はロペラミド（ｌｏｐｅｒａｍｉｄｅ）塩酸塩をより多く投与したことが分る。
［遺伝子型の分布］
１１８名全ての患者について、上記の方法によりその遺伝子型を決定し、図４にまとめた。尚、ＵＧＴ１Ａ１＊２９又はＵＧＴ１Ａ１＊７を有する患者はいなかった。また、９名については既に報告された結果（ＵＣＴ１Ａ１＊２８）を用いた（Ａｎｄｏ，Ｙ．，Ｓａｋａ，Ｈ．，Ａｓａｉ，Ｇ．，Ｓｕｇｉｕｒａ，Ｓ．，Ｓｈｉｍｏｋａｔａ，Ｋ．，ａｎｄ  Ｋａｍａｔａｋｉ，Ｔ．，Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌ．，９：８４５−８４７，１９９８．）。また、１１７名の患者に関して、化学療法前の全ビリルビンレベル、及び化学療法期間における全ビリルビンレベルの最大値を測定し、その結果を図４の表に併せて記載した。
図４の表に示されるように、５名の遺伝子型において、同時に二つの多型が認められた。即ち、２名（矢印Ａで示される）は、ヘテロ接合のＵＧＴ１Ａ１＊２８及びヘテロ接合のＵＧＴ１Ａ１＊６を有していた。また、３名は、ヘテロ接合のＵＧＴ１Ａ１＊２７を有し、同時にホモ接合（２名：矢印Ｃで示される）又はヘテロ接合（１名：矢印Ｂで示される）のＵＧＴ１Ａ１＊２８を有していた。
ともにヘテロ接合のＵＧＴ１Ａ１＊２８及びＵＧＴ１Ａ１＊６を有する２名（矢印Ａで示される）は正常範囲のビリルビンレベルであった（化学療法前は、それぞれ１３．９μｍｏｌ／ｌｉｔｅｒと１５．４μｍｏｌ／ｌｉｔｅｒ、化学療法開始後は、それぞれ１０．３μｍｏｌ／ｌｉｔｅｒと１５．４μｍｏｌ／ｌｉｔｅｒ）。これらの２名を除いて、遺伝型間のビリルビンレベルの相違は、化学療法前（ｐ＝０．０３１、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ  ｔｅｓｔ）及び化学療法開始後（ｐ＜０．００１、）ともに、統計的に有意であった。
ＵＧＴ１Ａ１＊２８アレルの出現頻度は、副作用経験者と副作用非経験患者について、それぞれ０．３０８（９５％ＣＩ、０．００４〜０．１４９）と０．０８７（９５％ＣＬ、０．０４６〜０．１２８）であり、ＵＧＴ１Ａ１＊６アレルの出現頻度については、同様に０．０７７（９５％ＣＩ、０．００４〜０．１４９）と０．１３６（９５％ＣＩ、０．０８６〜０．１８５）であった。
副作用経験者と副作用非経験者間のアレル分布における相違は、ＵＧＴ１Ａ１＊２８に関しては統計的に有意（ｐ＜０．００１）であったが、ＵＧＴ１Ａ１＊６に関しては有意と認められなかった（ｐ＞０．２、ＧＥＮＥＰＯＰ  ｖｅｒ．３．１ｄソフトウェア、ｔｈｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅｄｅ  Ｇｅｎｅｔｉｑｕｅ  ｅｔ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ，Ｆｒａｎｃｅ）。
［遺伝子型と副作用との相関］
ロジスティック回帰分析（ｌｏｇｉｓｔｉｃ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ）を行ったところ、ヘテロ接合又はホモ接合のＵＧＴ１Ａ１＊２８を有する遺伝子型が、重篤副作用の有効な指標になることが示された（見込み確率、５．２１；９５％  ＣＩ，１．９８〜１３．９６；ｐ＜０．００１、図４を参照）。他方、ＵＧＴ１Ａ１＊６と重篤副作用との統計的相関は見られなかった（見込み確率、０．５５；９５％  ＣＩ，０．１５−１．６１；ｐ＞０．２）。
次に、重篤副作用に影響を与える他の因子と遺伝子型の変異との比較を行った。図２の表及び図３の表に示されるように、性別、化学療法レジュメ、イリノテカン点滴スケジュールが高い毒性に関連する。そこで、これらのファクターについて相関性を調べた。その結果、化学療法レジュメとイリノテカン点滴スケジュールとの間に有意な相関（ｐ＜０．００１、χ２テスト）がみられた。即ち、３又は４週サイクルのイリノテカン治療を受けた１９名の内１２名（６３％）が、その他の抗癌剤の投与を受けていた。化学療法レジュメはイリノテカンの高い毒性と強い相関を有する変数と考えられたため、これを統計モデルに取り込んだ。
一方、化学療法レジュメ、性別、及びＵＧＴ１Ａ１＊２８遺伝子型の間には有意な相関が見られなかった。また、ＵＧＴ１Ａ１＊２８の他に、女性であること、及び他の抗癌剤（プラチナ製剤を除く）を使用すること、が重篤副作用に重要な因子であることがわかった。これらの二つの因子とＵＧＴ１Ａ１＊２８との比較を図５の表に示した。図５の表に示されるように、ＵＧＴ１Ａ１＊２８を有することにより、イリノテカンによる重篤副作用が７倍にも増加する。また、女性であることとイリノテカンの重篤副作用との間には有意なレベルの相関性は認められなかった。以上の知見より、ＵＧＴ１Ａ１＊２８が重篤副作用に対する指標として非常に有効であることがわかる。
一方、グレード４の白血球減少症及びグレード３以上の下痢を併発した５名の患者の内２名はＵＧＴ１Ａ１＊２８及びＵＧＴ１Ａ１＊２７を、他の２名はヘテロ接合のＵＧＴ１Ａ１＊６を、残りの一名はホモ接合のＵＧＴ１Ａ１＊１を（即ち、変異した遺伝型を有していない）それぞれ有していた。一方、５名の内４名（８０％）がプロモータ領域（ＵＧＴ１Ａ１＊２８）及びエクソン１（ＵＧＴ１Ａ１＊６又はＵＧＴ１Ａ１＊２７）の両方に変異した配列を有しており、これらの患者は生命に危険なレベルの毒性を受けていた。以上の結果から、ＵＧＴ１Ａ１＊２８に注目すれば、ＵＧＴ１Ａ１＊２８を有することにより、高い確率でイリノテカンの重篤副作用が生ずることが示唆される。従って、プロモータ領域の変異（ＴＡ反復配列の違い）を解析することによりイリノテカンの副作用発現リスクを予測可能であるといえる。また、ＵＧＴ１Ａ１＊２８とＵＧＴ１Ａ１＊６又はＵＧＴ１Ａ１＊２７のいずれかを併せて有することにより、高い確率でイリノテカンの重篤副作用が生ずることが示唆される。従って、プロモータ領域の変異とエクソン１における変異とを併せて解析することにより、イリノテカンの副作用発現リスクを予測可能であるといえる。
さらに、ホモ接合のＵＧＴ１Ａ１＊６を有する２名（図４の表、矢印Ｄで示される）は、重篤副作用を経験しておらず、また、ヘテロ接合のＵＧＴ１Ａ１＊２７を有する３名（同表、矢印Ｂ及び矢印Ｃで示される）はいずれも重篤副作用を経験していることがわかる。このことから、ＵＧＴ１Ａ１＊２７を有することにより、高い確率でイリノテカンの重篤副作用が生ずることが示唆される。従って、ＵＧＴ１Ａ１＊２７の存在、即ち、コドン２２９における多型を解析することにより、イリノテカンの副作用発現リスクを予測可能であるといえる。
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
産業上の利用の可能性
本発明の方法によれば、イリノテカンを代表とする、それ自体又は中間代謝物がＵＧＴ１Ａ１酵素に代謝される化合物の投与による副作用のリスクを事前に予測することができる。その結果、患者毎に副作用のリスクを考慮した化合物（薬剤）の投与が可能となり、副作用の低減が可能となる。特に、イリノテカンの投与による白血球減少症、下痢といった副作用の発現リスクを事前に予測することができ、当該副作用のリスクを軽減することができる。
また、日本人の２０％以上がＵＧＴ１Ａ１に変異を有しており、そのためイリノテカンの高い毒性に対して高いリスクを有し得ると考えられるため、ＵＧＴ１Ａ１の遺伝型を分析することにより、特に日本人患者におけるイリノテカンの副作用を軽減することができるといえる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、実施例において解析されるＵＧＴ１Ａ１遺伝子の多型をまとめた表である。２１１Ｇ→Ａは２１１位におけるグアニンからアデニンへの置換、６８６Ｃ→Ａは６８６位におけるシトシンからアデニンへの置換、１０９９Ｃ→Ｇは１０９９位におけるシトシンからグアニンへの置換、１４５６Ｔ→Ｇは１４５６位におけるチミンからグアニンへの置換をそれぞれ表す。また、Ｇ７１Ｒはコドン７１におけるグリシンからアルギニンへの置換、Ｐ２２９Ｑはコドン２２９におけるプロリンからグルタミンへの置換、Ｒ３６７Ｇはコドン３６７におけるアルギニンからグリシンへの置換、Ｙ４８６Ｄはチロシンからアスパラギン酸への置換をそれぞれ表す。
図２は、実施例において対象とされる患者の臨床情報をまとめた表である。ａは、日本癌治療学会の基準による。また、ｂは、カイ２乗テストの結果であり、ｃはＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕテストの結果である。
図３は、実施例において対象とされる患者のイリノテカン化学療法の情報をまとめた表である。ａ：日本癌治療学会の基準、ｂ：カイ２乗テスト、ｃ：Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ  Ｅｘａｃｔ  ｔｅｓｔ。
図４は、遺伝子型の分布を表にまとめたものである。６／６はＴＡ反復配列が６のアレルのホモ接合であること、６／７はＴＡ反復配列が６のアレルと７のアレルとのヘテロ接合であること、７／７はＴＡ反復配列が７のアレルのホモ接合であることをそれぞれ表す。Ｇｌｙ／Ｇｌｙはコドン７１がグリシンのアレルのホモ接合であること、Ｇｌｙ／Ａｒｇはコドン７１がグリシンのアレルとアルギニンのアレルとのヘテロ接合であること、Ａｒｇ／Ａｒｇはコドン７１がアルギニンのアレルのホモ接合であることをそれそれ表す。Ｐｒｏ／Ｐｒｏはコドン２２９がプロリンのアレルのホモ接合であること、Ｐｒｏ／Ｇｌｎはコドン２２９がプロリンのアレルとグルタミンのアレルとのヘテロ接合であることをそれぞれ表す。ａ：日本癌治療学会の基準、ｂ：平均値（四分位数間領域）。
図５は、重篤副作用に対するＵＧＴ１Ａ１＊２８の影響と他の因子の影響を統計的に比較（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｌｏｇｉｓｔｉｃ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ）した結果を示した表である。ａ：係数、ｂ：イリノテカンと他の抗癌剤（プラチナ製剤を除く）との組合せのレジュメ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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