(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
(ａ)  遺伝子組換えによって製造されるヒトインシュリンまたはその誘導体サンプルを調製し；
(ｂ)  前記サンプルを希釈緩衝液と混合し；
(ｃ)  化学発光トレーサーを（ｂ）の混合物に添加し；
(ｄ)  Ｃペプチド含有不純物に対して特異的な抗体を（ｃ）の混合物に添加し；
(ｅ)  少なくとも１つの標識を有する、ヤギ抗インシュリンＣペプチド抗体を捕捉するための二次抗体で被覆したビーズを（ｄ）の混合物に添加し；そして
(ｆ)  Ｃペプチド含有不純物の存在を検出または測定する
工程からなる、遺伝子組換えによって製造されたヒトインシュリンまたはその誘導体サンプル中のＣペプチド含有不純物を非放射性アッセイによって検出または測定する方法であって、
この方法は８.５から９.０のｐＨで実施する、上記方法。
【請求項２】
Ｃペプチド含有不純物がＣペプチド、プレプロインシュリンもしくはその誘導体、またはＣペプチド含有インシュリンもしくはその誘導体である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｃペプチド含有不純物に特異的な抗体がサルＣペプチドを認識する請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
はじめに：
リコンビナントインシュリンは形質転換させた大腸菌（E. coli）が発現した融合蛋白質の下流部プロセッシングによって製造される。折り畳み反応の後、トリプシン処理によって、インシュリンの正確なジスルフィド架橋を含むインシュリン前駆体をプレプロインシュリンから切断する。（トリプシンは−Ａｒｇ−Ａｒｇ−（Ｂ３１−Ｂ３２）および−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−（Ａ１−Ａ０）の配列部位での同時切断によりＣペプチドを遊離させる）。サルのＣペプチドのアミノ酸配列は、ヒトのＣペプチドと３７位のアミノ酸が異なるだけである（Ｐｒｏに対してＬｅｕ）。
【０００２】
精製工程後に、ヒトインシュリン最終生成物は少量のプレプロインシュリンおよびその派生物、Ｃペプチド含有インシュリン誘導体並びに単離Ｃペプチド（集合的にＣペプチド様活性と称する）の存在について分析する必要がある。以下の記述では、略語“ＨＩ”は“ヒトインシュリン”として、“ＨＩＡ１”は“Ｇｌｙ(Ａ２１)−Ａｒｇ(Ｂ３１)−Ａｒｇ(Ｂ３２)−ヒトインシュリン”として、さらに“ＨＩＡ２”は“Ｌｙｓ(Ｂ３)，Ｇｌｕ(Ｂ２９)−ヒトインシュリン”としてそれぞれ用いられる。前記分析は通常は放射性イムノアッセイ(“ＲＩＡ”)により実施される。
【０００３】
前記ＲＩＡ法の欠点は、新しくヨウ素付加したトレーサーおよび３日間のインキュベーション期間を必要とし、その結果、実施場所が限定されるという欠点がある。さらにまた、サンプルの調製は非常に時間を要し、かつ変化に鋭敏であり、以前の測定によれば、いくつかの事例ではトレーサーの品質、サンプルの取り扱い、および３日間のインキュベーション時の沈殿による予想できない障害のためにアッセイが左右されることが判明した。その結果再検査が必要となり時間の空費という結果をもたらすだけである。
【０００４】
ＲＩＡ法のまた別の欠点は、前記方法は、カルボキシペプチダーゼＢ（“ＣＰＢ”）による切断前の精製工程から得られるＨＩＡ１またはＨＩサンプルに対しては利用できないということである。なぜならば、これらのサンプルはこのアッセイ方法で与えられるｐＨでは沈殿するからである。ＲＩＡアッセイの緩衝液のｐＨを高めることによりサンプルの溶解は改善されるが、アッセイの性能は低下する。本発明の目的は、ＨＩ（INSUMAN(登録商標)）、ＨＩＡ１（GLARGINE(登録商標)）およびＨＩＡ２製造のエンドプローブ（end probe）中のインシュリンＣペプチド含有不純物を定量するとともに、前記３種のインシュリン亜型のインプロセスアイテム（in process item）中のインシュリンＣペプチド含有不純物を定量するためにイムノアッセイで利用できる抗体を作製することである。
【０００５】
これらの抗体は単離されたサルＣペプチドおよび（プレ）プロインシュリン（“ＰＲＩ”）に親和性を示すだけでなく、例えば以下のようなモデル化合物とも結合しなければならない：ＰＰＩ、ヒトおよび／またはサルＣペプチド、ＨＩ還元／アルキル化型、ＥＤＰでエンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎにより切断されたＨＩ、ＨＩＡ２のＣペプチド、およびＨＩＡ２ ＰＰＩ。これらのモデル化合物は、インシュリンの工業的遺伝子組換え製造で予想される一群の副生成物および不純物を示すようにデザインされる。
【０００６】
上記の要求を満たす抗体調製物は適当なアッセイ様式で用いて、選択した特定のインプロセスアイテムについてだけでなく、インシュリン製造のエンドプローブ中のインシュリンＣペプチド様免疫反応性を定量することができる。
【０００７】
検査アイテムの物理的特性のために、使用される抗体は、約８.５〜９.０のｐＨで十分な親和性で抗原と反応する必要がある。そのような相互反応は、約１mg／mLのインシュリン含有量を含むことを特徴とするサンプルマトリックスによって影響を受けてはならない。本イムノアッセイは、１０ng／mL（ヒトインシュリンの１０ppmに匹敵する）未満のＣペプチド含有不純物（インシュリンＣペプチド様免疫反応性）を定量することが可能でなければならない。
理論的にはいくつかのＣペプチド含有不純物がインシュリン製造の副生成物として予想できる。それらは図１ａに示されている。
【０００８】
【発明の概要】
本発明は、
(ａ)  遺伝子組換えにより製造されるヒトインシュリンまたはその誘導体サンプルを調製し；
(ｂ)  前記サンプルを希釈緩衝液と混合し；
(ｃ)  トレーサーを（ｂ）の混合物に添加し；
(ｄ)  抗体を（ｃ）の混合物に添加し；
(ｅ)  少なくとも１つの標識を有する”Ｃペプチド第二抗体ビーズ”を（ｄ）の混合物に添加し；そして
(ｆ)  Ｃペプチド不純物の存在を検出または測定する
遺伝子組換えにより製造されるヒトインシュリンまたはその誘導体サンプル中のＣペプチド不純物を非放射性アッセイによって検出または測定する方法に関する。
【０００９】
図面の説明
図１Ａは、想定されるＣペプチド含有不純物の模式図である。
図１Ｂは、図１Ａの記号の説明である。
図２は、スーパーデックスペプチド（１０／３０）を用いた、検定物質であるチトクロームＣ（Ｃ）、アプロチニン（Ａ）およびビタミンＢ１（Ｂ）の溶出プロフィールを示す。Ｃペプチドトレーサーは、チトクロームＣおよびアプロチニンの間の位置に対称性ピークとして溶出する（太線）。
図３は、半合成ヒトインシュリン調製物中のＣペプチド不純物を検出および特定する６種の異なるアッセイの実施で得た標準曲線を示す。
【００１０】
図４Ａ、図４Ｂは、ＰＰＩ ＥＭＤフラクトゲルカラムに適用した抗サルインシュリンＣペプチド抗体を含む単離血清サンプルの溶出プロフィールを示す。
図５は、前記カラム（ＰＰＩ ＥＭＤフラクトゲルカラム）から得た抗サルインシュリンＣペプチド抗体を含む濃縮グリシン溶出物の溶出プロフィールを示す。この溶出物のクロマトグラフィーはスーパーデックス２００（２６／６０）排除カラムで実施した。
図６は、スーパーデックス２００（２６／６０）排除カラムから得た分画１７−２４の第二のゲル濾過クロマトグラフィーの溶出プロフィールを示す。より高純度を得るために同じカラムを用いた。
【００１１】
図７は、エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎによる切断に対するＨＩ、ＨＩ還元／アルキル化型の感受性を分析するＳＤＳゲルを示す。サンプルは一切のジスルフィド架橋を還元するためにＤＴＥを含んでいる。
図８は、本発明の被覆ビーズアッセイ手順を用いた、コントロール抗原類ＨＩ ＰＰＩ、ヒトＣペプチド、サルＣペプチドおよびＰＰＩ還元／アルキル化型の分析を示す。９９Ｓｅｒ９調製物を坑血清として用いた。
図９は、本発明の被覆ビーズアッセイ手順を用いた、コントロール抗原類サルＣペプチド、エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ切断ＨＩ ＰＰＩ、ＨＩＡ２ ＰＰＩ、およびＨＩＡ２ Ｃペプチドの分析を示す。９９Ｓer９調製物を坑血清として用いた。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明は、本来のＲＩＡの上記の欠点を回避できる新規な非放射性イムノアッセイに関する。本新規なアッセイは以下を基にしている：
１．ＰＰＩでアフィニティー精製したヒツジＳ９５−１１由来の抗体、
２．サンプル溶解後に各サンプルでｐＨ制御およびｐＨ調節を必要としない簡略化した二工程サンプル希釈手順、
３．長期にわたって安定で、その結果長期間同一のトレーサーでアッセイを実施することができる化学発光Ｃペプチドトレーサー、
４．結合抗原またはトレーサーの存在下、非存在下でヤギ抗インシュリンＣペプチド抗体を捕捉するための二次抗体（Daiichi Radioisotope Labs. LTD）で被覆したポリスチロールビーズ、
５．全成分をわずか５時間一緒にインキュベートする一工程同時インキュベーション。
【００１３】
本アッセイはｐＨ８.５〜８.７で実施されるので、ＨＩおよびＨＩＡ１検査アイテムは両方とも全インキュベーション時間中溶解したままでであり、さらに同アッセイにょって変動することなく分析される。
リコンビナントインシュリンＨＩおよびＨＩＡ１のＣペプチドはサルのプロインシュリンから得られたので、サルインシュリンのＣペプチドを検出するために適切なアッセイが、ＨＭＲリコンビナントインシュリンエンドプローブおよびインプロセスアイテム中のインシュリンＣペプチド様免疫反応性を定量するために必要とされる。
ＨＩＡ２のＣペプチドは、ヒトインシュリンのＣペプチドと比較した場合突然変異を有し、そのＣ末端領域で切り縮められている。したがってそれは人工的産物で天然に存在するペプチドではない。
【００１４】
血清中のインシュリンＣペプチドの濃度を決定するために利用できる市販の診断用イムノアッセイがいくつか存在する。全てのアッセイは、ヒトインシュリンＣペプチドに対する種特異性を示し、いくつかのものはラット、ウシおよびブタのＣペプチドに対して種特異性を示すが、サルＣペプチドに対して特異性を示すものはない。
前記市販アッセイの目的は、Ｃペプチドまたはプロインシュリンのいずれかに対して可能なかぎり特異性を示させることである。しかしながら、本出願人の意図は、ＣペプチドおよびＰＰＩの両方にほぼ同じ親和性で相互作用する抗体（アッセイ）を得ることであった。
【００１５】
本発明の方法で用いられる抗体は、哺乳類（好ましくはヒツジ）を精製されたインシュリンのＣ鎖（好ましくは欧州特許0032675に記載されたサルインシュリンＣ鎖）で免疫し、続いて適当な担体に固定したインシュリンでアフィニティー精製することによって得られる。前記固定されるインシュリンは、好ましくは半合成ヒトインシュリンまたはリコンビナントヒトＰＰＩである。この抗体の精製は実施例および添付図面で詳述する。
【００１６】
我々は、３種の市販アッセイについてそれらが必要条件を満たすか否か検査した。前記３アッセイは、（１）ＲＩＡ被覆Ｃペプチド；（２）ヒトＣペプチドＲＩＡキット；および（３）ヒトプロインシュリンＲＩＡキットであった。
１．ＲＩＡ被覆Ｃペプチド（カタログ番号323.171: BYK Sangtec Diagnostica GmbH & Co. KG 63120 Dietzenbach, Germany; ３時間プロトコル）
本アッセイは、与えられたサンプルに存在するサルインシュリンＣペプチドを定量するためには適当ではなかった。これは以下の理由による：
ａ) サルＣペプチドおよび／またはＰＰＩとの交差反応性が不十分（供給元によれば２５％）；
ｂ) サンプル緩衝液の成分が不適当；または
ｃ) サンプル中の高濃度のヒトインシュリン（１ｍｇ／ｍＬ）による妨害。
【００１７】
２．ヒトＣペプチドＲＩＡキット（カタログ番号HCP-20K: Linco Research Inc. St. Louis, MO63304-USA；２日間アッセイプロトコル）
本アッセイはヒトＣペプチドに対する抗体を基にしており、本抗体はサルＣペプチドに対して９０％、およびヒトプロインシュリンに対して４％未満の交差反応性を示す。
本アッセイはＨＩサンプルを分析するために使用できる。しかしながら、キット緩衝液のｐＨのためにＨＩ製造のインプロセスアイテムでは沈殿が生じる。ＨＩＡ１の場合（これはｐＨ７．４では溶解しない）、本アッセイは使用できない。本発明の化学発光物質被覆ビーズアッセイと比較したとき、次のことが示される。すなわち、このアッセイで使用される抗体はヒトおよびサル由来の単離Ｃペプチドとより強力に結合するが、それでも本キットの抗体は、ＨＩ、ＰＰＩまたはＥＤＰ部位で切断したＰＰＩとは本発明の抗体調製物ほど充分な相互反応をしない。本発明の被覆ビーズアッセイはｐＨ８.７で実施され、一方、前記LincoアッセイはｐＨ７.４で実施されることは留意されるべきである。
【００１８】
３．ヒトプロインシュリンＲＩＡキット（カタログ番号HPI-15K,K: Linco Research Inc. St. Louis, MO63304-USA；３日間アッセイプロトコル）
本アッセイはサルＣペプチドを検出できない。したがってその特異性はわれわれの要求には十分ではない。
【００１９】
ヒトＣペプチドまたはヒトプロインシュリンに対する抗体を基準とし、中性ｐＨで実施されるアッセイでは、我々が必要とする要件は満足されないことが結論された。
【００２０】
本発明のアッセイのための要件は以下のとおりである：
- アッセイｐＨは８.５より高い；
- ＰＰＩに対して十分な特異性を有する；
- モデル検査化合物に対して十分な結合親和性を有する；
- １mg／mLのＨＩの存在が本抗体の結合親和性に干渉しない；
- 放射性活性を使わない；および
- アッセイ時間が短い。
【００２１】
必要なアッセイを得るための手段は以下のとおりである：
- 担体と結合していないサルインシュリンＣペプチドで免疫し；
- ＰＰＩカラムでアフィニティー精製し；
- ヒトインシュリンと特異的または非特異的に相互反応する一切の抗体を免疫吸着により除去し；
- 種々の血液から得られた抗体をそれらと化学発光ＣペプチドトレーサーとのｐＨ８.５での結合を精査することによってスクリーニングし；
- モデル検査化合物を作製し；さらに
-  当該ｐＨで高い緩衝能力をもつ緩衝液を用いて８.５より高いｐＨでのアッセイを確立する。
【００２２】
【実施例】
本発明をこれから実施例によって詳述するが、ただしこれら実施例に限定されるわけではない。
以下の実施例では、下記の材料および装置のいくつかまたは全てが用いられる：
２回蒸留水
リン酸一ナトリウム、Riedel(04269)
塩化ナトリウム、Merck
アジ化ナトリウム、Merck
ウシ血清アルブミン、Behringwerke(ORHD20/21）
ウシガンマグロブリン、Sigma(G-5009)
グリシン、Riedel(33226)
ポリエチレングリコール−２０％(“ＰＥＧ−２０”)、Biodata
水酸化ナトリウム−フィキザナール、Riedel(38210)
水酸化ナトリウム−２Ｍ、Riedel(35254)
酢酸ナトリウム三水和物、Merck(6267)
リン酸、８５％、Riedel(30417)
半合成ヒトインシュリン（ＨＩet）バッチ：A48U114およびA48U118
ＲＩＡポリスチレン管、１２×７５mm、Sarstedt(55476)
Ｃペプチド第二抗体ビーズ、ＣＰIII、Daiichi Radioisotope Labs; Ltd, Tokyo
プロクリン（Proclin）３００、Supelco(4-8127)
ダルベッコーリン酸緩衝食塩水(“ＰＢＳ”)、Sigma(D-5652)
ベリラックス（Berilux）溶液Ｒ１およびＲ２、Behring
センサーチップＣＭ５、Pharmacia BIAcore
カルボジイミドカップリングキット、Pharmacia BIAcore
蛋白質濃度定量用ＢＣＡアッセイ、Pierce（溶液Ａ：No.23223；溶液Ｂ：No.23224）
蛋白質濃度測定用ＩｇＧスタンダード、Pierce(31204)
フラクトゲルＥＭＤアズラクトン（Fractogel EMD Azlacton）６５０(Ｓ)、Merck(1.10087)
ＮｕＰＡＧＥ ４−１２％およびＭＥＳ泳動緩衝液を使用するＳＤＳゲル電気泳動系、Novex
銀染色キットプラスワン、Pharmacia Biotech(コード番号17-1150-01）
(他の全ての化学物質は、Sigma、MerckまたはRiedel de Haenから購入した)
【００２３】
装置：
マルチペット、Eppendorf
マイクロリットルピペット、Abimed, Gilson
マイクロラブＭ、Hamilton
メスフラスコおよびメスシリンダー
旋回ミキサーレアックス（Reax）２０００、Heidolph
デジタルペーハーメーター、Knick
オートクリニルーマット（AutoCliniLumat）ＬＢ９５２Ｔ／１６、Berthold
ウォラックウィザード（Wallac Wizard）１４７０マルチディテクターガンマカウンター（RIA-Calc, Multi-Calcソフトウエア搭載)、 Wallac
ビアコア（BIAcore）１０００、Pharmacia BIAcore
冷却遠心機（ＧＳ−６）、Beckmann
スプラフュージ（Suprafuge）２２、Heraeus Sepatech
バイオフュージ（Biogfuge）１３Ｒ、メガフュージ（Megafuge）１.０Ｒ、Heraeus Sepatech
ＳＤＳゲル電気泳動系（モデル３５４０パワーサプライを含む）、Novex
エッペンドルフ管インキュベーター、Eppebdorf
ヘーファー（Hoefer）自動ゲル染色装置、Pharmacia
天秤ＰＭ４００、ＰＭ４０００、Mettler
ＡＴ２６１デルタレンジ、Mettler
ウルトラフリー−１５  １０kDa、Millipore（UFV2BGC）
グラスプレフィルター（直径４７mm）、Schleicher & Schuell（421026）
メンブレンフィルター（直径５０mm）、５μm、Schleicher & Schuell (400214）
メンブレンフィルター（直径５０mm）、０.２μm、Schleicher & Schuell (404114）
【００２４】
アフィニティークロマトグラフィー用ＦＰＬＣ１、Pharmacia
コントローラーＬＣＣ−５００プラス
２×ポンプＰ−５００
ポンプＰ５０
ポンプＰ−１
ユビコードＳII および伝導率検出装置
ＥＲＣ３３１２脱気装置
２２１１スーパーラックフラクションコレクター
４×ＭＶ−８バルブ
１×ＭＶ−７バルブ
【００２５】
ゲル透過クロマトグラフィー用ＦＰＬＣ２、Pharmacia
コントローラーＬＣＣ−５００プラス
２×ポンプＰ−５００
ポンプＰ−１
ユビコードＳ検出装置
ＥＲＣ３６１２脱気装置
２２１１スーパーラックフラクションコレクター
１×ＭＶ−７バルブ
液流ストッパー
手動バルブＳＲＶ−４
【００２６】
略語：
ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン
ＣＶ：変動係数
ＥＬＩＳＡ：酵素結合免疫吸着アッセイ
ＨＩet：半合成ヒトインシュリン
ＰＢＳ：リン酸緩衝食塩水
ＰＰＩ：プレプロインシュリン
ＱＣ：クォリティーコントロール
ＲＩＡ：放射性免疫アッセイ
【００２７】
以下の実施例で用いられる固有のアッセイの成分：
抗体：
抗体はヒツジ（Ｓ９５−１１）を精製インシュリンＣペプチドで免疫して得た。動物から採血して得た血清サンプルを実施例１の精製プロトコルにしたがって精製した。得られたアフィニティー精製抗体は１：１５００の希釈で本アッセイに用いることができる。
【００２８】
以下の抗体が得られた：
Ｚ２１２７，  ９９Ｓer１ ＳＤ２／Ｆ１７−２２；
Ｚ９４，      ９９Ｓer２ ＳＤ２／Ｐ３；
Ｓ９５−１１，９９Ｓer７／ＳＤ２−６５０／Ｆ１７−２２；
Ｓ９５−１１，９９Ｓer８／ＳＤ２−６５１／Ｆ１７−２１；
Ｓ９５−１１，９９Ｓer９／ＳＤ２−６５２／Ｆ１７−２４；
Ｓ９５−１１，９９Ｓer１０／ＳＤ２−６８０／Ｆ１５−２５；
Ｓ９５−１１，９９Ｓer１１／ＳＤ２−６８１／Ｆ１５−２４；
Ｓ９５−１１，９９Ｓer１２／ＳＤ２−６８２／Ｆ１５−２４
【００２９】
トレーサーおよび標準物質：
リコンビナントヒトＨＩインシュリンから単離したＣペプチド（ヒト配列の代わりにサルの配列）をスタンダードおよびトレーサーとして用いる。純度は９９％である。
【００３０】
サンプル緩衝液：
サンプル緩衝液は１００mLの蒸留水に０.３２６ｇのビシン（Bicine; Sigma B-3876）を溶解して調製した。ｐＨは１ＮのＮａＯＨを用いて８.７に調節する。スタンダード／希釈緩衝液：
半合成ヒトインシュリン（ＨＩet、材料の項参照）を１０mMのＨＣｌに溶解し１０mg／mL溶液とする。このインシュリン溶液をさらにサンプル緩衝液を用いて１：１０に希釈する。
抗体緩衝液：
市販のＰＢＳ粉末（Sigma D-5652）を約９８０mLの水に溶解し、ｐＨを１ＮのＮａＯＨを添加して７.７に調節する。洗剤 TWEEN-20(登録商標)を添加してその最終濃度を０.０５％にする。本緩衝液の容積をメスシリンダーで正確に１Ｌに調整する。最後にＢＳＡを１.５％（ｗ／ｖ）となるように溶解する。
【００３１】
実施例の詳述
実施例１：
Ｉ．アッセイの実施
Ａ．サンプルの溶解：
約０.５〜０.８mgのサンプルを１０mMのＨＣｌに溶解して１０mg／mL溶液を得た。続いてこの完全に溶解させた材料をさらにサンプル緩衝液で１：１０に希釈した。
Ｂ．トレーサー調製物：
アクリジニウムアシルスルホンアミド誘導体Ｋｉ２５６（それぞれドイツ特許DE3805318 および DE3628573）を用いて、発光アクリジニウムエステル部分とＣペプチドとの直接共有結合によりＣペプチドトレーサーを作製できる。化学発光はアルカリ性Ｈ2Ｏ2（F. McCarpa, Acc. Chem. Res. 9:201ff. (1976)）の添加によって誘発される。
【００３２】
この化学発光Ｃペプチドトレーサーを調製するために、以下の溶液を混合し、周囲温度で２０分インキュベートした：
１．１ＬのＨ2Ｏに８.１７ｇのＫＨ2ＰＯ4、７.１２ｇのＮａ2ＨＰＯ4、８.７７ｇのＮａＣｌおよび０.５ｇのＮａＮ3を含む緩衝液２５５μＬ、ｐＨは１ＮのＮａＯＨを用いて８.０に調整；
２．Ｈ2Ｏに２mg／mLの濃度のＣペプチド１２５μＬ；
３．１２０μＬの標識Ｋｉ２５６（１mLのアセトニトリルに１０mg）。
【００３３】
前記標識とＣペプチド内の官能基との共有結合反応は１００μＬのＬ−リジン（１０mg／mL）の添加によって停止させた。この標識されたＣペプチドをＦＰＬＣ系に組み込んだスーパーデックスペプチド（Superdex Peptide）１０／３０カラム（Pharmacia）を用いサイズ選別ゲルクロマトグラフィーにより精製した。泳動緩衝液はＰＢＳ、０.０４％プロクリン（Proclin）であった。流速は０.２mL／分であった。
アプロチニンとチトクロームＣとの間の位置で溶出した蛋白質を採集し、一緒にして部分標本として凍結した（バッチ２）。トレーサー作製の再現性は一度立証された。アッセイでの使用に最適なトレーサーストック溶液の希釈は経験的に決定した。
【００３４】
Ｃ．スーパーデックスペプチド(１０／３０)によるトレーサーの精製：
カリブレーターとしてのチトクロームＣ（Ｃ）、アプロチニン（Ａ）、およびビタミンＢ１（Ｂ）の溶出は図２に示されている。未反応標識、リジンおよび他の緩衝液成分は、チトクロームＣおよびアプロチニンとの間の位置で対称性ピーク（太線）として溶出するトレーサーから排除できる。
【００３５】
Ｄ．スタンダードの調製：
インシュリンＣペプチドの１mg／mLのストック溶液（下記＃２のとおり）を水で調製する。このストックから一部分を取り、希釈緩衝液でさらに１：１００に希釈する。両サンプルを使用まで凍結保存する。
スタンダードは後者のサンプル（１０μｇ／mL）から一部分を希釈緩衝液で１：１００に希釈し、続いて１：４に４回希釈することによって調製する。その結果、１００ng／mL、２５ng／mL（Ｓ４）、６.２５ng／mL（Ｓ３）、１.５６３ng／mL（Ｓ２）および０.３９ng／mL（Ｓ１）のスタンダードが得られる。全ての希釈は、未知製品のインシュリンサンプルの条件に類似させるために１mg／mLのＨＩetを含む希釈緩衝液で実施する。スタンダードＳ１−Ｓ４のみをアッセイに用いる。
【００３６】
II．アッセイプロトコル
１．各試験管当たりそれぞれの濃度のスタンダード２００μＬを用い、各スタンダードはトリプリケートで用意する。
２．２００μＬの溶解サンプルを用い、サンプルはデュープリケートで分析する。
３．純粋な希釈緩衝液を用い（３×２００μＬ）Ｓ０値を得る。
４．トレーサー（バッチ２）をサンプル緩衝液で１：４００００に希釈する。このトレーサー溶液１００μＬを各試験管に添加する。
【００３７】
５．抗体調製物９９Ｓer９を抗体緩衝液で１：１５００に希釈し、１００μＬを各試験管に添加する。
６．試験管内の内容物を混合する。その後、１つの“Ｃペプチド第二抗体ビーズ”を加える。
７．周囲温度で５時間振盪した後、液体を吸引により除去する。真空ポンプに連結した手動１０チップ洗浄ヘッドを用いて約０.８mLの水で５回ビーズを洗浄する。続いて、サンプルをルミノメーターで分析する。各々０.３mLの溶液Ｒ１(Ｈ2Ｏ2)およびＲ２（ＮａＯＨ）の自動連続分散によってサンプル中の化学発光を刺激する。放射光を１秒間測定し、ＲＬＵ(相対光単位)として表示する。
８．結果の算出は、標準曲線の logit／log 変換を用いてアナライザー自体のソフトウェアによって自動的に実施される。
【００３８】
III．アッセイの特徴
真性バックグラウンドの変動
Ａ．半合成ヒトインシュリンの測定
本アッセイの目的は、ＰＰＩ、インシュリンＣペプチド、および想定されるインシュリン不純物（ヒトインシュリンのＡ鎖またはＢ鎖に共有結合したＣペプチドの一部分を含む）を特定することである。これらの抗原構造は、正確なプロセッシングを受けた過剰量のインシュリンの存在下で決定されねばならない。このインシュリンバックグラウンドによって誘発される変動を分析するために、半合成インシュリン（濃度１mg／mL）を繰り返し分析した。半合成インシュリンは、それがサルＣペプチドに由来する不純物を含んでいないということ、さらに、それはスタンダード／希釈緩衝液の成分であるということを確認する目的のために使用されねばならない。
半合成インシュリンは、上記のサンプルの溶解で述べたように１mg／mLの濃度の１０倍に溶解した。これらのインシュリンサンプルを同じ日のアッセイで分析した。このインシュリンサンプルについて得られた結果は表１に示す。
【００３９】
【表１】
0004601884.tif 000002
【００４０】
上記の結果は、半合成ヒトインシュリンは平均してトレーサーと抗体との結合を混乱させないことを示している。しかしながら、Ｂ／Ｂ０の最大値が１０６％で最小値が９１％となるある程度の変動性がある。
この発見により、未知のサンプルにおいて得られる、Ｂ／Ｂ０が９０％（＝平均値−３×標準偏差）を越える値は計算されるべきではないと結論され、バックグラウンドと解した（検出限界）。Ｂ／Ｂ０＞９０％であるサンプルはおそらく＜０.４ppmのＣペプチド様活性を含んでいる。反復性（アッセイ内変動性）は、これらのＨＩet（バックグラウンド）サンプルで分析されたように４％である。
同じ４％の値が、約１ng／mLのＣペプチド様免疫反応性を含むサンプル（サンプルＨＩＡ１ 055AKR 01＋02、表１参照）で見出された。ＨＩetプローブのように、検査アイテムを１mg／mLの濃度の１０倍で溶解し、同じ日に分析した。
【００４１】
Ｂ．インシュリン最終製品サンプルについての統計的アプローチの適用
同じ統計的アプローチをＨＩおよびＨＩＡ１製造の最終製品に採用した。この目的のために、２３の異なるＨＩサンプルおよび６つの異なるＨＩＡ１サンプルを同じ日に分析した。結果を表２に示す。
【００４２】
【表２】
0004601884.tif 000003
【００４３】
上記データは、ＨＩの最終製品は平均してＣペプチド様活性を全く含んでいないことをはっきりと示している。なぜならば、個々の測定値の変動は半合成ヒトインシュリンで得られたものと類似しているからである。（２４の個々のサンプルの）ＨＩ群とＨＩet（同じアッセイで１０回分析された１つのサンプル）との間には顕著な相違はない。ＨＩサンプルの最小値および最大値（それぞれ８９.９％または１０９％）もまたＨＩetで得られた値（それぞれ９１％または１０６％）に近い。
ＨＩＡ１サンプルに関しては、Ｃペプチド様免疫反応性が最終製品に存在すると結論することができる。しかしながら、その含有量は、標準曲線を参考に定量したとき０.５〜１ppmの範囲である（下記参照）。
【００４４】
Ｃ．標準曲線：
６つの異なるアッセイで得られた標準曲線を図３に示す。Ｂ／Ｂ０（％）で表したこれら曲線の数値は表３にまとめた。曲線の統計分析は表４に示す。
【表３】
0004601884.tif 000004
【００４５】
上記曲線パラメーターは以下のとおりである：
- ＥＤ20＝１４.４４±０.９９ng／mL（ＣＶ＝６.８６％）
- ＥＤ50＝３.２１±０.２３ng／mL（ＣＶ＝７.２１％）
- ＥＤ80＝０.９１±０.１０ng／mL（ＣＶ＝１０.７１％）
【００４６】
【表４】
0004601884.tif 000005
【００４７】
上記に提示したデータは以下の事柄を示している：
１．この標準曲線の再現性は高い。
２．半合成ヒトインシュリンは本抗体によって認識されない。
３．Ｃペプチド様活性はＨＩバッチＣ０３８では測定されない。
４．得られたＣＶ値（ＨＩetでは３.９％、ＨＩバッチＣ０３８では２.９７％）が示すとおり、このアッセイによるサンプル分析の再現性は高い。
【００４８】
IV．アッセイの特異性
上記に提示したデータは、概略した方法を用いたとき本アッセイは純粋なヒトインシュリンによって極めてわずかな影響しか受けないことをはっきりと示している。これは医薬用インシュリン調製物でのＣペプチド様免疫反応性の測定の前提条件である。
【００４９】
モデル化合物を含むＣペプチドを用いて、既定のアッセイ様式で我々の抗体の特異性を調べた。モデル化合物についての説明は以下の節で述べる。
１．ＨＩ ＰＰＩ
２．ヒトＣペプチド
合成ヒトインシュリンＣ鎖はSigma（カタログ番号 C-5051）から入手した。純度は９７％とされ、ペプチド含有量は８４％である。
３．ＨＩ還元／アルキル化型
この目的は保護されたＮおよびＣ末端をもつ直鎖状Ｃペプチドを分析することである。このコントロールは折り畳まれていないＰＰＩに類似し、その中心部分と結合する抗体はアフィニティー精製坑血清調製物の特異性に寄与することを示す。このコントロールサンプルの調製については実施例４で述べる。
【００５０】
４．ＣペプチドのＥＤＰ（Ｃ６−Ｃ７）部位でエンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎで切断されたＨＩ
この目的は共有結合したＣペプチド配列をＢ鎖のＣ末端および／またはＡ鎖のＮ末端にもつヒトインシュリンを分析することである。このコントロールは、ＣペプチドのＥＤＰ部位の酸切断によって得られる不純物に類似する。本コントロールはまた、不完全なトリプシン切断によって生じる想定される不純物に類似する。このコントロールサンプルの調製については実施例５で述べる。
【００５１】
５．ＨＩＡ２ Ｃペプチド（チャージＨＤ／１９,２１.０７.９９：純度＞９９％）：
このＣペプチドは、ＨＩ Ｃペプチドと比較したときそのＮ末端が切り縮められており、したがってＮ末端のエピトープが失われている。ＨＩＡ２ Ｃペプチドは、単離ＨＩ ＣペプチドでそのＮ末端が切断または改変されている不純物のためのモデルとして機能する。
６．ＨＩＡ２ ＰＰＩ（チャージ：ＵＢ１１／３０−ＨＰ２；純度９６％）：
ＨＩＡ２ Ｃペプチドのように、この変異ＰＰＩは、ＰＰＩ（これはＨＩ ＰＰＩと比べて劇的に改変されたＣペプチド部分をもつ）とその抗体との免疫反応性をモニターするために役立つモデル抗原として機能する。
上記のモデル化合物を用いたコントロールアッセイの結果はその解釈と併せて実施例７に示す。
【００５２】
Ｖ．コントロール実験のまとめ
この一群のモデル化合物は我々のアフィニティー精製坑血清調製物９９Ｓer９の特異性をはっきりと示している。
提示した全ての結果から、本出願で開示したビーズアッセイは、インシュリン製造から生じるサンプル中のＣペプチド様免疫反応性を測定するために非常に適切であると結論できる。示されたアッセイデザインで用いた抗体調製物は全てのモデル化合物を認識するので、リコンビナントインシュリン製造から生じるサンプル中の全ての主要な想定されるＣペプチド不純物はこのアッセイによって認識されると結論することができる。
【００５３】
実施例２：
本発明のアッセイを用いたＨＩ精製時に夾雑するＣペプチド含有不純物の排除についての分析（３つの代替的アッセイとの比較）
３つの異なる製造方法（ＵＡ１１４、ＵＡ０１１５、ＵＡ１１６）におけるＣペプチド様免疫反応性の排除について調べるために新規なイムノアッセイを採用した。精製工程１２（サンプルＳＢ）、１３（サンプルＫＡおよびＫＢ）および１４（サンプルＵＡ）に由来する検査アイテムを、インシュリンＣペプチド様免疫反応性について分析した。
本発明のビーズアッセイ（“ビーズ”）を用いて得られた結果を以下の市販の代替的アッセイの結果と比較する：（１）ＨＭＲ−ＲＩＡ（“ＲＩＡ”）、（２）Linco Research Inc.のヒトＣペプチドＲＩＡキット（“Linco ＲＩＡ”）および（３）NewLab Diagnostic Systems GmbH が開発したＥＬＩＳＡ法（“ＮewＬab”）。
【００５４】
用いたアッセイの簡単な説明：
(１)  ＲＩＡ（オリジナル）：固定ＰＰＩでアフィニティー精製した抗体９９Ｓer７による放射性イムノアッセイ。サルＣペプチドをトレーサーとして用い、ＨＩ ＰＰＩをスタンダードとして用いる。標準曲線の範囲は０.３９〜２５ng／mLである（検出限界：０.５ng／mL）。
(２)  Ｌinco ＲＩＡ：抗ヒトＣペプチド抗体による市販の放射性イムノアッセイ。このアッセイはサルＣペプチドとＰＰＩの良好な交差反応性を示すが、ＨＩ ＰＰＩとの結合はビーズアッセイと比べたとき３倍低下する（下記表９参照）。ヒトＣペプチドがスタンダードおよびトレーサーとして用いられる。標準曲線の範囲は０.１〜５.０ng／mLである（検出限界は０.１ng／mL）。
【００５５】
(３)  ＮewＬab：NewLab Diagnostic Systems GmbH により開発されたサンドイッチ方式ＥＬＩＳＡで、モノクローナル抗ヒトＣペプチド（Fitzgerald）およびポリクローナル抗サルＣペプチド血清を用いる。このアッセイは単離Ｃペプチドに対して強い優先性を示す（ＰＰＩ樹脂でのアフィニティー精製を実施していないモノクローナル抗ヒトＣペプチドおよびポリクローナル抗サルＣペプチド）サルＣペプチドをスタンダードとして用いる。標準曲線の直線範囲は０.５〜１０ng／mLである（検出限界は０.５ng／mL）。
(４)  ビーズ：本発明のアッセイ。非放射性被覆ビーズアッセイは、ＨＩ ＰＰＩアフィニティーカラムでのアフィニティー精製後に得られた抗体９９Ｓer９（ＲＩＡの抗体と同様）を基にしている。サルＣペプチドをスタンダードおよびトレーサーとして用いる。標準曲線の範囲は０.３９〜２５.０ng／mLである（検出限界０.４ng／mL）。
【００５６】
以下の表では、略語について以下の定義を用いる：
ＳＢ：精製工程１２（イオンクロマトグラフィー）後の検査アイテム；
ＫＡおよびＫＢ：精製工程１３(ＲＰクロマトグラフィー)後の検査アイテム;
ＵＡ：精製工程１４（最終結晶化）後の検査アイテム；
ＮＤ：実施せず。
【００５７】
【表５】
0004601884.tif 000006
【００５８】
【表６】
0004601884.tif 000007
【００５９】
【表７】
0004601884.tif 000008
【００６０】
結果：
１．本発明の新規なイムノアッセイによって、ＨＩ精製方法におけるインプロセスコントロールアイテム中におけるＣペプチド免疫反応性の除去の程度を決定できる（表５〜７、最下段ビーズ(４)を参照されたい）。Ｃペプチドがスタンダードとして用いられるので、本発明から得られた値はオリジナルＲＩＡの場合よりも約２.５〜３倍低い（(４)と比較した上記の(１)を参照されたい）。実際、４倍の違いが認められ（平均値）、これは、ＲＩＡと比較したとき劇的に短縮されたインキュベーション時間に比例する。
【００６１】
２．Ｃペプチド様免疫反応性は、本発明の被覆ビーズアッセイを用いたときＨＩエンドプローブでは検出されない。その算出濃度は、ＨＩetについて測定可能な値の範囲内にある。ＫＡ／ＫＢおよびＵＡサンプルの平均値は以下のとおりである：
ＫＡ／ＫＢ 114 由来のサンプルについては１０４.７±３.７（ＣＶ＝３.５％）（ｎ＝８）
ＫＡ／ＫＢ 115 由来のサンプルについては１０３.８±５.３（ＣＶ＝５.１％）（ｎ＝８）
ＫＡ／ＫＢ 116 由来のサンプルについては９９.８±３.７（ＣＶ＝３.７％）（ｎ＝８）
ＵＡ 114 由来のサンプルについては１０２.３±３.７（ＣＶ＝３.６％）（ｎ＝４）
ＵＡ 115 由来のサンプルについては１００.３±３.２（ＣＶ＝３.２％）（ｎ＝４）
ＵＡ 116 由来のサンプルについては９９.１±３.８（ＣＶ＝３.８％）（ｎ＝４）
これら全ての値はＨＩetを繰り返し測定して決定したその変動範囲に厳密に適合する。
【００６２】
３．表５の最下段（ビーズ(４)）に示したデータは、本発明のアッセイは再現性のある結果を提供できることを明らかにした。
４．オリジナルＲＩＡ（１）の問題は、サンプルの取り扱いまたはアッセイの作業における明瞭な過誤では説明できないランナウェーを有することである。さらに、このアッセイは再現性が低いことが特徴である。
５．Ｌinco ＲＩＡ（２）はオリジナルＲＩＡ（１）よりはるかに強固で再現性についても改善されている。オリジナルＲＩＡほど重大ではないが、このアッセイもまたオリジナルＲＩＡと同様にサンプルの希釈方法に問題がある（表５〜７参照）。Ｌinco ＲＩＡは検査に用いた中でもっとも感度の高いアッセイであるので、０.１〜０.５ng／mLの濃度範囲で微量のインシュリンＣペプチド様活性がいくつかの最終製品サンプルで検出できる。
６．ＲＩＡ（１）、Ｌinco（２）およびビーズ（４）のアッセイでは、ＨＩetを常にコントロールとして導入した（表５〜７参照）。理論的には、ＨＩet値を全ての結果から差し引いて、インシュリン精製の最終アイテムのほとんどで実際にはインシュリンＣペプチド免疫反応性はまったく存在しないか、またはきわめて微量しか存在しないことを示すことができる。
【００６３】
７．ＮewＬab ＥＬＩＳＡでは、そのバックグラウンドが検査アイテム自体（ＨＩetではなく）により決定されるので明瞭な結果は得られなかった。さらに、このアッセイは、ＰＰＩに対する交差反応性の程度が明らかでない抗ヒトプロインシュリンＣペプチドモノクローナル抗体（クローンM607239; カタログ番号FZ10-C65）の親和性によって支配されている。ＮewＬabアッセイでＰＰＩとの相互反応がどの程度強いかを示すデータはない。このアッセイデザイン（主としてＣペプチドの分析のためにデザインされている）の結果として、低い値（Ｌinco アッセイの場合よりもさらに低い）のＣペプチド免疫反応性（存在する場合には）が“ソースサンプル”で測定できる。この事実については、サンプルは使用ｐＨでは極めて良好には溶解されないという別の解釈も可能であろう。しかしながら、ＮewＬab ＥＬＩＳＡプロトコルの固有スタンダードの取り扱い手順では溶解が完全であることの確認は要求されていない。
【００６４】
結論：
開示した本発明の新規なイムノアッセイは、ヒトインシュリン製造で生じるインプロセスコントロールアイテムにおけるＣペプチド様免疫反応性の除去の分析に極めて適切で、高い感度、正確さおよび良好な再現性（ＣＶ＜５％）を示す。
本発明のアッセイで検出可能なインシュリンのＣペプチド様活性の最低濃度は０.４ng／mLである。したがって、この値未満の全ての値はバックグラウンドノイズであると考えられ、数値として表すべきではない。
【００６５】
本新規なアッセイの長所は以下のとおりである：
- 本アッセイは化学発光標識を使用する非放射性アッセイである。
- トレーサーは非常に安定である。したがって同一のトレーサー物質を長期間（品質の低下なく約２０週）用いることができる。長期にわたりアッセイ条件が比較可能で安定であることは、日常的に使用することおよび結果を長期間にわたり比較しうることの前提条件である。
- 全アッセイ時間はわずかに５時間である。特定の調製作業は要求されない。アッセイはサンプルの到着後１〜２日以内に実施できる。
- 本アッセイは、連続工程または中間洗浄を必要としない均質アッセイである。５０以上の異なるプローブを同じ日に分析できる。
- 本アッセイの実施に複雑な専門的装置は不要である。
【００６６】
- 本アッセイは安価である（日常的標識作業不要、放射能装置不要、放射性廃棄物はない、標準的な実験室器具のみが要求される）。
- アッセイの基本は単純で、その結果、特別な経験をもたない技術スタッフを訓練して本分析を迅速に実施させることができる。
- サンプルの希釈は単純な２工程手順でその後のｐＨ測定および調整を必要としない。サンプルは全インキュベーション時間の間溶解したままである。これはＨＩ、ＨＩＡ１最終製品でも、下流プロセッシング工程の全ての中間アイテムでもそのとおりである。これは他のアッセイのいずれでも達成できないことである。
- 本アッセイは４％の確実な再現性を有し（表１参照）、アッセイ間変動性は４％である（表４参照）。両数値はＢ／Ｂ０の未加工データを基準に算出した。
【００６７】
- ＨＩプローブおよびＨＩＡ１プローブの両プローブを同じアッセイプロトコル、成分および緩衝液を用いて分析できる（表５〜８参照）。
- ＨＩＡ２のＣペプチド様免疫反応性は、同じアッセイプロトコル、成分および緩衝液を用い１０ppmカットオフ（検出限界）により分析できる。
- 本アッセイは、特別な試験管またはマイクロプレートを用いるときは被覆試験管形式、またはマイクロウェル形式に変更できる。このようにして第二の抗体ビーズの購入を回避することができる。
- アッセイの感度は、インキュベーション時間の延長、より高濃度の抗体およびトレーサーの使用（これら両者の容積を減少させることができる）によって改善することができる。
- 本アッセイのみがその特異性を正確に開示する。
【００６８】
実施例３：
“プレプロインシュリン様活性”を定量するイムノアッセイで使用するヒツジ抗サルインシュリンＣペプチド抗体の精製
アフィニティー樹脂の調製
Ｉ．ヒトインシュリンとフラクトゲルＥＭＤアズラクトン６５０（Ｓ）とのカップリング
Ａ．樹脂の条件付け
７ｇのフラクトゲル（Fractogel）ＥＭＤアズラクトン（Azlacton）６５０（Ｓ）を１５分間１４０mLのＰＢＳ（ｐＨ７.４）で膨潤させた。前記のインキュベーションの後、グラスフィルターを通過させて上清を除去した。残ったゲル（約２４mL）を２０mLのＰＢＳ（ｐＨ７.４）に分散させた。
【００６９】
Ｂ．ヒトインシュリンの溶解
１２０mgの半合成ヒトインシュリン（インシュリンＥＴ［インシュリンHPU,HGR,IE Sap.Nr.:1163212, Muster A48, Ch.-B.:U118］）を３mLの５０mMリン酸に溶解させた。この溶液をゆっくりと５０mLのＰＢＳ（ｐＨ９.４）に撹拌しながら滴下した。この工程の最後にｐＨは６.６５に下降した。最後に、２ＭのＮａＯＨを注意深く添加してインシュリン溶液のｐＨを７.４に調整した。
【００７０】
Ｃ．カップリング反応
前記インシュリン溶液と条件付けしたゲルを混合し、官能基をもつアズラクトンを介してカップリング反応を周囲温度で進行させた。反応ビーカーを進行方向にゆっくりと回転させることによって定常的かつ慎重に混合した。周囲温度で４時間後に、未反応リガンドを含む上清を濾過して除き、ゲルを１２０mLのＰＢＳで洗浄した。ＨＰＬＣ分析で６７mgの未結合ヒトインシュリンを認めた。結果として５３mgがＥＭＤフラクトゲルに共有結合によって固定された。
【００７１】
樹脂上の残りの活性基は１２０mLの０.２Ｍグリシン（ｐＨ８.０）の添加によって封鎖した。反応を周囲温度で進行させた。再び、反応ビーカーを進行方向にゆっくりと回転させることによって定常的かつ慎重に混合した。１６〜２０時間後に、未反応グリシンを含む上清を濾過して除き、各々１２０mLのＰＢＳ（ｐＨ７.４）、０.１Ｍの酢酸ナトリウム、０.２Ｍのグリシン（ｐＨ２.８）の３回サイクルでゲルを洗浄した。
得られたヒトインシュリン共有結合アフィニティー樹脂を、保存料として０.０４％のプロクリン（Proclin）を含むＰＢＳ（ｐＨ７.４）に分散させ、ＨＲ１６／１５ ＦＰＬＣカラムに注入した。
【００７２】
II．ヒトＰＰＩとフラクトゲルＥＭＤアズラクトン６５０（Ｓ）とのカップリング
Ａ．樹脂の条件付け
１４.５ｇのフラクトゲルＥＭＤアズラクトン６５０（Ｓ）を１５分間２９０mLのＰＢＳ（ｐＨ７.４）で膨潤させた。前記のインキュベーションの後、グラスフィルターを通過させて上清を除去した。残ったゲル（約５０mL）を２０mLのＰＢＳ（ｐＨ７.４）に分散させた。
Ｂ．ＰＰＩの溶解
２５０mgのＰＰＩを６mLの５０mMリン酸に溶解させた。この溶液をゆっくりと１００mLのＰＢＳ（ｐＨ９.４）に撹拌しながら滴下した。この工程の最後にｐＨは６.６０に下降した。最後に、２ＭのＮａＯＨを注意深く添加してＰＰＩ溶液のｐＨを７.４に調整した。
【００７３】
Ｃ．カップリング反応
前記ＰＰＩ溶液と条件付けしたゲルを混合し、官能基をもつアズラクトンを介してカップリング反応を周囲温度で進行させた。反応ビーカーを進行方向にゆっくりと回転させることによって定常的かつ慎重に混合した。周囲温度で４時間後に、未反応リガンドを含む上清を濾過して除き、ゲルを１２０mLのＰＢＳで洗浄した。ＨＰＬＣ分析で６７mgの未結合ＰＰＩを認めた。結果として１７１mgがＥＭＤフラクトゲルに共有結合によって固定された。
【００７４】
樹脂上の残りの活性基は２５０mLの０.２Ｍグリシン（ｐＨ８.０）の添加によって封鎖した。反応を周囲温度で進行させた。再び、反応ビーカーを進行方向にゆっくりと回転させることによって定常的かつ慎重に混合した。１６〜２０時間後に、未反応グリシンを含む上清を濾過して除き、各々２５０mLのＰＢＳ（ｐＨ７.４）、０.１Ｍの酢酸ナトリウム、０.２Ｍのグリシン（ｐＨ２.８）の３回サイクルでゲルを洗浄した。
得られたＰＰＩ共有結合アフィニティー樹脂を、保存料として０.０４％のプロクリンを含むＰＢＳ（ｐＨ７.４）に分散させ、ＸＫ２６／２０ＦＰＬＣカラムに注入した。
【００７５】
III．抗インシュリンＣペプチド抗体のアフィニティークロマトグラフィーによる精製
Ａ．血清の調製
抗体精製のための供給源は、精製サルインシュリンＣペプチドで免疫したヒツジＳ９５−１１の血清である。この血清は融解まで−２０℃で保存した。融解後、血清の全容積は７９mLであった。これに６５mLの水と１６mLのＰＢＳ（１０倍濃縮、０.４％のプロクリンを含む）を添加して容積を２倍にし、クロマトグラフィーのための緩衝条件を調整した。続いてこの希釈した血清を２６０００×ｇで３０分４℃で遠心した。５μmおよび０.２μmのメンブレンを重ねグラスフィルターによって補強したもので上清を濾過した。
【００７６】
Ｂ．アフィニティークロマトグラフィー
精製スケジュールの論理的根拠は、想定されるヒツジ抗インシュリン抗体のみならずＥＭＤフラクトゲル樹脂およびヒトインシュリンの配列と非特異的に結合する抗体を、前記血清をヒトインシュリンアフィニティー樹脂に通すことによって第一の工程で除去することである。
第二の工程では、抗サルインシュリンＣペプチド抗体をそれらがＣペプチドに結合した後で精製できる（前記ＣペプチドはＥＭＤフラクトゲル上に固定されたＰＰＩの不可欠の部分である）。
ＰＰＩによるアフィニティークロマトグラフィーは、固定Ｃペプチドによるクロマトグラフィーに代わって採用した。なぜならば、ＰＰＩ様免疫反応性の定量用イムノアッセイで精製抗体を使用するためには、インシュリン成分となお結合しているＣペプチドおよび／またはＣペプチドフラグメントとの結合が前提条件であるからである。
【００７７】
IV．精製プロトコル
Ａ．サンプルの適用
ヒトインシュリンＥＭＤフラクトゲルＨＲ１６／１１カラム(“第一のカラム”)をＰＰＩ ＥＭＤフラクトゲルＸＫ２６／１１カラム(“第二のカラム”)に直接連結することによって、希釈したヒツジの血清を一工程で２つのアフィニティーカラムにポンプで送り込んだ（流速３.５mL／分）。第一のカラムは全ての望ましくない結合物を排除するが、抗インシュリンＣペプチド抗体とは反応しない。第二のカラムは抗サルインシュリンＣペプチド抗体と特異的に結合する。
非特異的ヒツジ抗体ならびに血清成分は第二のカラムのアフィニティー樹脂と反応することはできないので、したがってカラムを通過して溶出物中に流れ込む。アフィニティーカラムによって特異的抗体が全て捕捉されていることを、流出物をＢＩＡcore(登録商標)系を用いて分析することによってチェックした。流出分画には検出可能な結合活性は存在しなかった。
【００７８】
Ｂ．溶出
血清の通過後、２つのカラムを切り離し、それぞれ別個に０.１Ｍのグリシン、０.０４％のプロクリン（ｐＨ２.７）で溶出させた（流速：５mL／分）。
第一のカラムの場合、酸性溶出液によって直ちにアフィニティーマトリックスが再生される。これを続いてＰＢＳ緩衝液で十分に平衡化させることによって条件付けすることができる。
ＰＰＩ ＥＭＤフラクトゲルカラムの溶出プロフィールは図４Ｂに示されている。分画９−２２は、ＢＩＡcore(登録商標)系で分析したとき活性な抗サルインシュリンＣペプチド抗体を含んでいる。表示の分画を一緒にし、Amicon Ultrafree-15（１０kDaの分子量を排除するメンブレン）を用いて１０mLに濃縮した。
【００７９】
抗体をさらに精製し、それらを中性緩衝液に移すために、濃縮したグリシン溶出物をスーパーデックス２００（２６／６０）サイズ排除カラムでクロマトグラフィーを実施した。その溶出プロフィールは図５に示されている。分画１７−２４は精製ヒツジ抗サルインシュリンＣペプチド抗体を含んでいる。より純度の高い抗体を得るために、第二のゲル濾過クロマトグラフィーを同じスーパーデックス２００（２６／６０）カラムを用いて実施した（図６）。分画１７−２１に溶出した蛋白質を一緒にし、最終抗体調製物“99Ser9-rechr”として保存した。
【００８０】
ＰＰＩ ＥＭＤフラクトゲルおよびスーパーデックス２００カラムの溶出物と同様に、縦列連結アフィニティーカラムの流出物をＢＩＡcore(登録商標)系を用いて分析した。この技術は、センサーチップの表面で発生する６０nLのフローセル中でアフィニティークロマトグラフィーを模倣することによって迅速な抗サルインシュリンＣペプチド抗体の検出を可能にする。このフローセルに固定されたＰＰＩと結合する活性な抗体は、高い感度をもつ表面プラスモン共鳴によって検出できる。
【００８１】
結果：
抗体調製物の容積はメスシリンダーによって測定されたとおり２４mLであった。蛋白質濃度は、供給元（Pierce）の指示にしたがってマイクロウェル方式でＢＣＡ法によって決定した。５６０nmでのＯＤはSpectra III Elisa読み取り装置（SLT）を用いて測定した。
既知濃度のＩｇＧによる標準曲線を用いて抗体調製物の未知濃度を算出した。mg／mL値を作図データから直接読み取った。
開示した抗体調製物の濃度は０.４５４mg／mLであった。抗体の総収量は１０.９mgであった。この抗体調製物を１mLずつの部分標本に分け、それぞれを99Ser9／rechr.F17-22 で標識し、−７０℃で保存した。
【００８２】
結論：
上記に開示した抗体調製物（99Ser9／rechr.F17-22）をイムノアッセイ、特に変型アッセイ（被覆ビーズ化学発光アッセイ）で用いて、インシュリンＣペプチド様免疫反応性を定量できる。
【００８３】
実施例４：
ヒトＰＰＩ（バッチ２１６−１）のアルキル化：
３.２８mgのＰＰＩを１０９μＬのＨ2Ｏに溶解し、さらに１０９μＬの１０倍濃縮ＰＢＳ緩衝液（０.４％プロクリン補充）を添加して希釈した。最終的に８７５μＬのＨ2Ｏを添加してＰＰＩ含有量が３mg／mLの溶液を調製した。このＰＰＩ溶液９９０μＬに１ＭのＤＴＥ（水溶液）１０μＬをピペットで加えた。このサンプルを３７℃で５時間インキュベートした。１時間の反応の後、蛋白質の沈殿が検出できた。残りの反応時間の間、ｐＨを９.０に上昇させた後でなお沈殿は存在していた。
ＰＰＩのＳ−Ｓ架橋の還元を停止させるため、さらに遊離スルフヒドリルを再酸化および／または新規なＳ−Ｓ結合の発生から保護するために、１８５mgの固形ヨードアセトアミドを添加し、暗所で４℃で４時間インキュベートした。
【００８４】
続いて、得られたアルキル化ＰＰＩを４００mL ＰＢＳ、０.０４％プロクリンを用いて２回Tube-O-Dialyserで透析した。 沈殿した蛋白質を遠心で除いた。サンプルの加水分解後にアミノ酸分析を実施することによって、透明な上清（１.３mL）中に２３μｇ／mLの可溶性アルキル化ＰＰＩを測定できた。
ＳＤＳゲル電気泳動アミノ酸分析において侵入速度をかすかに遅延させることおよびエンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎによって蛋白分解に対する感受性を向上させることによって、有効な誘導化が達成されたことが証明された。明らかに、エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎは、ＤＰ−部位の他に誘導システインで還元ＰＰＩを切断する。
【００８５】
実施例５：
エンドプロテイナーゼＡｓｐ−ＮによるヒトＰＰＩのＥＤＰ部位での切断
エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎは、ペプチド結合をアスパラギン酸およびシステイン酸におけるＮ末端で特異的に切断する金属プロテアーゼである。ヒトＰＰＩ（ＨＩＡ１ ＰＰＩ）はその配列内にただ１つのアスパラギン酸を含むだけである。それはＣペプチド内に存在し、プロリン残基のＮ末端に位置し、酸に不安定なＤＰ（Ｃ６−Ｃ７）部位を生じる。この部位はおそらくＰＰＩ分子の外側表面に存在し、したがってエンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎが近づくことができる。システイン残基は全てＳ−Ｓ架橋内に含まれ、前記分子の内部に埋没し、したがって蛋白分解攻撃から守られている。ＥＤＰ部位でＰＰＩを分割することによって、有用なモデル化合物が生成され、我々のアフィニティー精製抗体の特異性を正確に示すために役立つ。
【００８６】
Ｃペプチド内のＥＤＰ部位を切断するために、５０μＬのＰＰＩ（水に０.７mg／mL）および５０μＬの５０mMトリス／塩酸（ｐＨ８.０）（０.２Ｍの尿素含有）を混合した。蛋白分解は２５μＬのエンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ（１０mMのトリス−塩酸（ｐＨ７.５）に１μｇを溶解）を添加して開始させ、３７℃で３２時間インキュベートした。反応はサンプルの凍結によって停止させた。
ゲル電気泳動およびその後の銀染色は、ＰＰＩがＥＤＰ部位で定量的に切断されたことを示した（酵素により切断された蛋白質ではジスルフィド結合の還元後２つのバンドは分離される）（実施例６を参照）。未切断の還元型ＰＰＩ（これはなお単鎖分子である）の位置には目に見える蛋白質バンドは残っていない。
【００８７】
エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ切断ＰＰＩは、以下のようなモデル（コントロール）化合物として役立つ：
- ＥＤＰ部位の酸による切断から生じる不純物を模擬する、
- 依然としてＡ鎖のＣ末端に結合したＣペプチドの部分および／またはＢ鎖のＮ末端のＣペプチドの部分を有する、不完全なトリプシン切断から生じたインシュリン派生物を模擬する。
【００８８】
実施例６：
ＨＩおよびＨＩ還元／アルキル化型、並びにそのエンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ切断生成物のＳＤＳゲル電気泳動（４〜１２％）による分析
Ｓ−Ｓ架橋を完全に還元するためにＤＴＥを含むＳＤＳ緩衝液中でサンプルを電気泳動ゲルに適用した（図７を参照）。
【００８９】
実施例７：
ヒツジＳ９５−１１から得たアフィニティー精製抗体の本開示アッセイ形式における特異性
１．本出願で開示したアッセイを用いたＨＩ ＰＰＩ、ＨＩ（サル）Ｃペプチド、ＰＰＩ還元／アルキル化型、およびＨＩ Ｃペプチドの分析（９９Ｓer９調製物による）。全ての化合物は１mg／mLのＨＩetを含む希釈緩衝液で希釈した。結果については図８を参照されたい。
２．本出願で開示したアッセイを用いたＨＩ（サル）Ｃペプチド、エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎで切断したＨＩ ＰＰＩ、ＨＩＡ２ ＰＰＩ、およびＨＩＡ２ Ｃペプチドの分析（９９Ｓer９調製物による）。全ての化合物は１mg／mLのＨＩetを含む希釈緩衝液で希釈した。結果については図９を参照されたい。
【００９０】
結果および解釈：
１．ＨＩ ＣペプチドおよびＨＩ ＰＰＩは、平行的な希釈関係および分子量の相違と急激に減少させたインキュベーション時間に左右される曲線の右シフト（係数はおよそ６）によって示されるように、抗体によって等しく認識される（下記の表８参照）。
２．ヒトＣペプチドはこのアッセイによって認識されるが、５０％抑制を得るためには約１８０ng／mLが必要である。これは、サルＣペプチドと比較したとき５５倍高い濃度である。これらのデータは本抗体調製物のサルＣペプチド（アミノ酸３７（Ｐｒｏに対してＬｅｕ）だけがヒトの配列と異なっている）に対する高い特異性を明瞭に示している（表８参照）。
３．エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ切断ＰＰＩに対して明瞭な交差反応性が存在する。しかしながら、希釈曲線は波打っており、無傷のＰＰＩと比較したときおよそ１０倍の反応性低下が存在する（表８参照）。このことは、Ｃペプチドのただ一カ所に分割（split）を導入することによって構造的エピトープが破壊されること、およびＥＤＰ部位は９９Ｓｅｒ９抗体調製物によって認識される主要な免疫学的エピトープであることを示している。
【００９１】
４．アルキル化ＰＰＩは顕著な免疫反応性の低下をもたらすことなく認識されるが、このことは、Ｎ末端およびＣ末端のアミノ酸を特異的に認識する抗体はアフィニティークロマトグラフィーによって除去され、その結果それら抗体は本抗体調製物の特異性に影響を及ぼすことができないことを示している。アルキル化ＰＰＩはＰＰＩのサイズを持った直鎖状Ｃペプチドを反映しているので、ＰＰＩおよびＰＰＩ還元／アルキル化型の希釈曲線は多かれ少なかれ重なり合う。
５．そのＣペプチドのＮ末端部分のエピトープが排除され変異しているＨＩＡ２ ＣペプチドおよびＨＩＡ２ ＰＰＩでは、希釈曲線の強い平坦化が認められる。しかしながら、抗体９９Ｓer９はなお、ＨＩ ＰＰＩの対応する構造と比較したとき約３５倍低い親和性でこれら抗原と結合する。希釈曲線のこの波状状態は、単一特異性を有する抗体の多様な集団（ポリクローナル血清の如く）が、関連するが同一ではないエピトープをもつ抗原と反応する状況に典型的なものである。抑制曲線の低抗原濃度におけるこの急激な下降は、直鎖状Ｃペプチドの（不変）Ｃ末端部分と抗体群の反応を表している。曲線の平坦相は、かなりの量の抗体群がＨＩＡ２ Ｃペプチド（変異しＨＩ ＰＰＩと比べて構造的に変化している）の中心部分およびＮ末端部分と低下したアフィニティーで結合したことを示している。これら関連抗原は、ＨＩ抗原のように効果的にトレーサー（標識されたＨＩＣペプチド）を抗体から追い出すことはできない。
【００９２】
６．ＥＤＰ部位で切断されたＰＰＩ ＨＩＡ２およびＰＰＩ ＨＩは本アッセイによってほぼ等しく認識されるが、このことはまた、抗体調製物９９Ｓer９による免疫認識におけるＥＤＰ部位の重要性を示している。１０ng／mL以上の濃度のこれらの抗原または関連抗原は本アッセイによって検出できる。
オリジナルＲＩＡ（１）およびＬincoアッセイ（２）（上記実施例２参照）では、濃度は２０ng／mL以上でなければならない。ＮewＬab（３）によって開発されたＥＬＩＳＡについては対応するデータを提供することは不可能である。なぜならば、コントロールは実施されず、この方法を用いたＰＰＩの検出限界に関するデータは存在しないからである。アッセイデザインから推論すると、ＥＬＩＳＡは、ＰＰＩおよびＰＰＩ誘導体に対してＬincoアッセイよりも低い交差反応性を示すであろう。
【００９３】
【表８】
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【００９４】
モデル化合物を用いて得られた全ての結果を要約すれば、ヒツジＳ９５−１１から得られた抗体調製物９９Ｓer９（およびＲＩＡで用いられる９９Ｓer７）は、種々のＣペプチド含有抗原（“Ｃペプチド様免疫反応性”という表現で表わされる）を明瞭に特定するために必要な要件を満たしているということができる。
【００９５】
実施例９：
インシュリンＨＩＡ１製造から生じるインプロセスアイテムの分析−下流処理工程でのインシュリン様免疫反応性の除去
【００９６】
【表９】
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【００９７】
実施例１０：
免疫およびサルＣペプチドに対して作製されたポリクローナル抗体を有するヒツジ（Ｓ９５／１１）の血清サンプリング
本実施例は、ヒツジの免疫およびサル由来のＣペプチドに対して作製された抗体を有するヒツジの血清のサンプリングについて述べる。
雌のヒツジを Gerhard Mundschenk（Zwerggasse 2; 65468 Trebur-Astheim）から購入し、通常の標準的ヤギ用飼料で農場（Hermann Kettenbach, Im Birkenfeld 38, 65719 Hofheim-Langenhain）で維持した。このヒツジにＳ９５／１１と記号を付した。
【００９８】
免疫の開始時に、前記ヒツジ（Ｓ９５／１１）を等容積の物質（１mLの食塩水＋１mLの完全フロイントアジュバント（cFA; Difco Laboratories, Detroit, Michigan, USA）の１：１混合物）中の抗原（最初に２mgのサルＣペプチド）で免疫した。この乳液は投与直前に調製し、皮下の２〜３カ所に注射した。２〜４週間の間隔で実施したブースター注射は、食塩水（1mL）と不完全フロイントアジュバント（Sigma Chemicals, Heidelberg, Germany）（１mL）の１：１混合物中の同じ量の抗原（２mgのＣペプチド）から成る。２週間から２カ月の間隔で、血液サンプルを頸静脈穿刺によって採取した。坑血清を分注し次の使用まで−２０℃で保存した。インシュリン最終製品中のＰＰＩを検出するアッセイの開発のために特定のサンプルを選んだ。
【００９９】
リコンビナントヒトインシュリンは、トランスフェクトした大腸菌（E. coli）で発現させた融合蛋白質から製造する。変性融合蛋白質からヒトインシュリンがプロセッシングされるときに、いわゆるＰＰＩが中間物質として生成される。後者はさらに、トリプシンによって触媒される酵素切断によりさらにプロセッシングされる。２つの鎖をもつ異種二量体インシュリンが、−Ａｒｇ−Ａｒｇ−（Ｂ３１−３２）および−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−（Ａ１−Ａ０）の配列部位での同時切断により単鎖ＰＰＩから生成される。インシュリンは更なる精製工程を経て製造される。最終製品のＰＰＩの不純物（＜１０ppm）を検出するイムノアッセイを開発するためには、インシュリンに由来する干渉交差反応がないので、Ｃペプチドに対して作製されたポリクローナル抗体は特に適切である。対照的に、抗原としてＰＰＩで免疫した場合、主要な量の抗体はインシュリンに対して誘導されるであろう。後者は、１０6倍も過剰なインシュリンの存在下で微量のＰＰＩ（＜１０ppm）を検出するためには適切でないであろう。
【０１００】
使用されるＣペプチド内の免疫原性を有するインシュリン様決定基（Ｃペプチド３４位または３４−３５位の−Ｌｙｓまたは−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−の如き）を避けるために、これらの塩基性アミノ酸Ａｒｇ−を含まないサルＣペプチドを調製し、サルＣペプチドとして用いた。
ｃＦＡの最初の使用からｉＣＡへの切り替えを含む免疫手順およびタイムスケジュールは、個々の抗原およびペプチドに対して作製されるポリクローナル抗体の製造について文献に記載されている標準的な方法と一致する。
【０１０１】
サルＣペプチドに対するポリクローナル抗体を含むヒツジの坑血清作製のための免疫スケジュールおよび血液サンプリングについて説明する。一定量の抗原（サルＣペプチド）をそれぞれ１mLの０.９％食塩水および１mLのアジュバントの１：１混合物に溶解した。血液サンプリングの日付は下記に示す。下記の実験に使用した抗原はサルＣペプチド（ロット番号：DJIII,-S43）である。使用した最初のアジュバントはＫＦＡ（Difco）Lot70052LA である。ブースターのアジュバントはＩＦＡ（Sigma）Lot96H8950 である。
【０１０２】
【表１０】
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【０１０３】
【表１１】
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【０１０４】
実施例１０に関する参考文献：
１．Cuβler,K., Hartinger,J.: Gibt es Alternativen zum Einsatz von Freundschem Adjuvants bei der Immunisierung von Labortieren? Tagungsabschnitt“Immunisierung und Adjuvantien" des 4. Oesterreichischen Internationalen Kongresses Ueber“Ersatzund Ergaenzungsmethoden zu Tierversuchen in der biomedizinischen Forschung", 24-26. September 1995(Linz).
２．Bennett,B., Check, I.J., Olsen, M.R., Hunter, R.L.: A comparison of commercially available aduvants for use in research. J. Immunol. Meth. 153, 31-40, 1992.
３．Finger, H.:“Das Freundsche Adjuvants-Wesen und Bedeutung". Im: G. Heyman (Ed.): Arbeiten aus dem Paul-Ehrlich-Institut, dem Georg-Speyer-Haus und dem Ferdinand-Blum-Institut zu Frankfurt a.M., Heft 60, Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1964.
４．Fineberg, S.E., Galloway, J.A., Fineber, N., Goldman, J.: Effects of species origin, purification levels and formulation on insulin immunogenicity. Diabetes 32, 592,1983.
【０１０５】
実施例１１：サンプル調製
インシュリンは結晶化または凍結乾燥後は中性溶液に比較的溶けにくいことが知られている。高濃度のインシュリン溶液を得るために、したがってインシュリンプローブは最初は酸（例えば希リン酸または塩酸のいずれか）に溶解し、続いて適量のＮａＯＨを迅速に添加してアルカリ性ｐＨ（９.０〜１０.５）に調整しなければならない。続いて使用ｐＨをタイトレーションにより、または対応する緩衝液を添加することにより調整する。上記に概略した方法は時間を要し、面倒で、さらに各プローブについて別個の注意が要求される。
【０１０６】
この仰々しい手順を避けるために、我々はインシュリン溶解のための別のプロトコルを検討した。目的は１mg／mLの濃度でｐＨが８.６〜９.０の透明なインシュリン溶液を得ることであった。
- ９より高いｐＨは、（特にトリプシン切断後の）プロセスアイテム中のＨＩＡ１およびインシュリンを溶液（ＨＩＡ１のＩＰは７.４）として維持するために有益である。
- ９.０より低いｐＨは高い親和性と安定性を有する抗原抗体反応に有益である。
我々は、ｐＨ９.０で安定な抗原（ＨＩ ＰＰＩ）／抗体結合を選び出すために８.０〜９.５の範囲のｐＨに適切な種々の緩衝液を調べた。検査した緩衝液は以下のとおりであった：トリス、ＴＡＰＳ、ビシン、ＧｌｙＧｌｙ、ビストリスプロパン、Ｃｈｅｓ、リン酸塩／ＥＤＴＡ（Linco Research Inc.のヒトＣペプチドＲＩＡキットで使用されている）。
さらに、種々の緩衝液濃度を分析し、ｐＨ９.０で緩衝液の濃度を高めることによって抗原／抗体結合が徐々に乱されることを示した。
【０１０７】
先の考察から、我々は最終的な比較のために２０mMの濃度の４種の緩衝液を選んだ：
１．トリス（Tris）*（Merck-108382）
２．ＴＡＰＳ**（Sigma T-5130）
３．ビシン（Bicine）***（Sigma B-3876）
４．ＧｌｙＧｌｙ****（Calbiochem 3630）
これらの緩衝液は必要量の固体を水に溶解し、適量のＮａＯＨを添加してｐＨ９.０に調節することによって調製した。全てが良好な抗原／抗体結合を約８.５から９.０のｐＨ範囲で示した。
約０.５mg〜０.８mgのインシュリンサンプルを１０mMの塩酸に溶解し、１０mg／mL溶液を得た。続いてこの透明な溶解物質をさらに上記の緩衝液の１つを用いて１：１０に希釈した。結果を下記の表に示す。
【０１０８】
【表１２】
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【０１０９】
全ての実験例で、ｐＨは酸性インシュリン溶液の添加後に変化しないか、またはわずかしか影響を受けない。しかしながら、驚いたことにビシン緩衝液でのみ常に透明なＨＩＡ１溶液またはインプロセスアイテム溶液が得られた。
したがって、ビシン緩衝液系を選択することによって、簡単なサンプル溶解方法の確立およびイムノアッセイのインキュベーション時間中の安定な分析物質／緩衝液の条件の確立のために重要な突破口が得られた。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】  想定されるＣペプチド含有不純物の模式図である。
【図１Ｂ】  図１Ａの記号の説明である。
【図２】  スーパーデックスペプチド（１０／３０）を用いた、検定物質であるチトクロームＣ（Ｃ）、アプロチニン（Ａ）およびビタミンＢ１（Ｂ）の溶出プロフィールを示す。Ｃペプチドトレーサーは、チトクロームＣおよびアプロチニンの間の位置に対称性ピークとして溶出する（太線）。
【図３】  半合成ヒトインシュリン調製物中のＣペプチド不純物を検出および特定する６種の異なるアッセイの実施で得た標準曲線を示す。
【図４Ａ】  ＰＰＩ ＥＭＤフラクトゲルカラムに適用した抗サルインシュリンＣペプチド抗体を含む単離血清サンプルの溶出プロフィールを示す。
【図４Ｂ】  ＰＰＩ ＥＭＤフラクトゲルカラムに適用した抗サルインシュリンＣペプチド抗体を含む単離血清サンプルの溶出プロフィールを示す。
【図５】  前記カラム（ＰＰＩ ＥＭＤフラクトゲルカラム）から得た抗サルインシュリンＣペプチド抗体を含む濃縮グリシン溶出物の溶出プロフィールを示す。この溶出物のクロマトグラフィーはスーパーデックス２００（２６／６０）排除カラムで実施した。
【図６】  スーパーデックス２００（２６／６０）排除カラムから得た分画１７−２４の第二のゲル濾過クロマトグラフィーの溶出プロフィールを示す。より高純度を得るために同じカラムを用いた。
【図７】  エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎによる切断に対するＨＩ、ＨＩ還元／アルキル化型の感受性を分析するＳＤＳゲルを示す。サンプルは一切のジスルフィド架橋を還元するためにＤＴＥを含んでいる。
【図８】  本発明の被覆ビーズアッセイ手順を用いた、コントロール抗原類ＨＩ ＰＰＩ、ヒトＣペプチド、サルＣペプチドおよびＰＰＩ還元／アルキル化型の分析を示す。９９Ｓｅｒ９調製物を坑血清として用いた。
【図９】  本発明の被覆ビーズアッセイ手順を用いた、コントロール抗原類サルＣペプチド、エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ切断ＨＩ ＰＰＩ、ＨＩＡ２ ＰＰＩ、およびＨＩＡ２ Ｃペプチドの分析を示す。９９Ｓｅｒ９調製物を坑血清として用いた。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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