(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の式（Ｉ）又は式（ＩＩ）のペントピラノシルヌクレオシド：
式（Ｉ）
【化１】
0004601817.tif 000051
｛ここで、
Ｒ１はＨ、ＯＨ、Ｈａｌ（ここでＨａｌはＢｒ又はＣｌである）、又は
【化２】
0004601817.tif 000052
若しくは  −Ｏ−Ｐ［Ｎ（ｉ−Ｐｒ）２］−（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）（ここでｉ−Ｐｒはイソプロピルである）から選ばれた基、又はＯ−アシル基であり、
Ｒ２、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ互いに独立して同一であるか又は異なって、Ｈ、Ｈａｌ（ここでＨａｌはＢｒ又はＣｌである）、ＮＲ５Ｒ６、ＯＲ７、ＳＲ８、＝Ｏ、ＣｎＨ２ｎ＋１（ここでｎは１〜１２の整数である）、式−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｒ１８のβ−脱離性基（ここでＲ１８はシアノ基、ｐ−ニトロフェニル基、又はフルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基である）、又は（ＣｎＨ２ｎ）ＮＲ１０Ｒ１１（ここでＲ１０Ｒ１１はＨ、ＣｎＨ２ｎ＋１である）、又は式
【化３】
0004601817.tif 000053
〔ここで、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ１５はそれぞれ互いに独立して同一であるか又は異なって、Ｈ、ＯＲ７（ここでＲ７は上記の意味をもつ）、又はＣｎＨ２ｎ＋１又はＣｎＨ２ｎ−１（ここでｎは上記の意味をもつ）である〕の基を介して結合されたＲ１０Ｒ１１であって、かつ
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８はそれぞれ互いに独立して同一であるか又は異なって、Ｈ、ＣｎＨ２ｎ＋１又はＣｎＨ２ｎ−１（ここでｎは上記の意味をもつ）、又は−Ｃ（Ｏ）Ｒ９（ここでＲ９は直鎖状又は分枝状の、置換されていてもよいアルキル又はアリール基である）であり、
Ｘ、Ｙ及びＺはそれぞれ互いに独立して同一であるか又は異なって、＝Ｎ−、＝Ｃ（Ｒ１６）−又は−Ｎ（Ｒ１７）−（ここでＲ１６及びＲ１７はそれぞれ互いに独立して同一であるか又は異なって、Ｈ、又は上記の意味をもつＣｎＨ２ｎ＋１又は（ＣｎＨ２ｎ）ＮＲ１０Ｒ１１である）であり、そして
Ｓｃ１及びＳｃ２はそれぞれ互いに独立して同一であるか又は異なって、アシル、トリチル又はアリルオキシカルボニル基から選ばれた保護基である｝；
式（ＩＩ）
【化４】
0004601817.tif 000054
｛ここで、
Ｒ１’はＨ、ＯＨ、Ｈａｌ（ここでＨａｌはＢｒ又はＣｌである）、又は
【化５】
0004601817.tif 000055
又は  −Ｏ−Ｐ［Ｎ（ｉ−Ｐｒ）２］−（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）（ここでｉ−Ｐｒはイソプロピルである）から選ばれた基、又はＯ−アシル基であり、
Ｒ２’、Ｒ３’及びＲ４’はそれぞれ互いに独立して同一であるか又は異なって、Ｈ、Ｈａｌ（ここでＨａｌはＢｒ又はＣｌである）、＝Ｏ、ＣｎＨ２ｎ＋１、ＣｎＨ２ｎ−１、式−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｒ１８のβ−脱離性基（ここでＲ１８はシアノ基、ｐ−ニトロフェニル基、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基である）、又は（ＣｎＨ２ｎ）ＮＲ１０’Ｒ１１’（ここでＲ１０’、Ｒ１１’はそれぞれ独立して上記のＲ１０又はＲ１１の意味をもつ）であり、
Ｘ’は、＝Ｎ−、＝Ｃ（Ｒ１６’）−又は−Ｎ（Ｒ１７’）−（ここでＲ１６’及びＲ１７’はそれぞれ独立して上記のＲ１６又はＲ１７の意味をもつ）であり、そして
Ｓｃ１’及びＳｃ２’は上記のＳｃ１及びＳｃ２の意味をもつ｝
を製造する方法であって、未保護ペントピラノシド部分を有するリボ−、アラビノ−、リキソー及び／又はキシロ−ピラノシルヌクレオシドから出発して、（ａ）第１の工程で、ペントピラノシドの２’、３’又は４’−位を先ず保護し、（ｂ）第２の工程で、残りの２’、３’又は４’−位のうち１カ所を保護することを特徴とする、前記製造方法。
【請求項２】
ペントピラノシルヌクレオシドがリボピラノシルヌクレオシドであることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ペントピラノシルヌクレオシドのペントピラノシル部がＤ又はＬ配置であることを特徴とする、請求項１又は２のいずれか１項記載の方法。
【請求項４】
用いられるペントピラノシルヌクレオシドが、ペントピラノシル−プリン、−２，６−ジアミノプリン、−６−プリンチオール、−ピリジン、−ピリミジン、−アデノシン、−グアノシン、−イソグアノシン、−６−チオグアノシン、−キサンチン、−ヒポキサンチン、−チミジン、−シトシン、−イソシトシン、−インドール、−トリプタミン、−Ｎ−フタロイルトリプタミン、−ウラシル、−カフェイン、−テオブロミン、−テオフィリン、−ベンゾトリアゾール又は−アクリジンであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ２’、Ｒ３’及び／又はＲ４’が２−フタルイミドエチル又はアリルオキシ基又は式−Ｎ［Ｃ（Ｏ）Ｒ９］２の基であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
ペントピラノシルヌクレオシドが、［（２’，４’−ジ−Ｏ−ベンゾイル）−β−リボピラノシル］ヌクレオシド、Ｎ−ベンゾイル−２’，４’−ジ−Ｏ−ベンゾイルリボピラノシルヌクレオシド、Ｎ−イソブチロイル−２’，４’−ジ−Ｏ−ベンゾイルリボピラノシルヌクレオシド、Ｏ６−（２−シアノエチル）−Ｎ２−イソブチロイル−２’，４’−ジ−Ｏ−ベンゾイルリボピラノシルヌクレオシド、Ｏ６−（２−（４−ニトロフェニル）エチル）−Ｎ２−イソブチロイル−２’，４’−ジ−Ｏ−ベンゾイルリボピラノシルヌクレオシド、β−リボピラノシルヌクレオシド、Ｎ−ベンゾイル−、Ｎ−イソブチロイル−、Ｏ６−（２−シアノエチル）−若しくはＯ６−（２−（４−ニトロフェニル）エチル）−Ｎ２−イソブチロイル−β−リボピラノシルヌクレオシド；４’−ＤＭＴ−ペントピラノシルヌクレオシド、Ｎ−ベンゾイル−４’−ＤＭＴ−リボピラノシルヌクレオシド、Ｎ−イソブチロイル−４’−ＤＭＴ−リボピラノシルヌクレオシド、Ｏ６−（２−シアノエチル）−Ｎ２−イソブチロイル−４’−ＤＭＴ−リボピラノシルヌクレオシド、Ｏ６−（２−（４−ニトロフェニル）エチル）−Ｎ２−イソブチロイル−４’−ＤＭＴ−リボピラノシルヌクレオシド、又はβ−リボピラノシル−Ｎ，Ｎ’−ジベンゾイルアデノシン；又はβ−リボピラノシル−Ｎ，Ｎ’−ジベンゾイルグアノシンであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
２’−保護位の場合に、保護基の転位が２’−位から３’−位へ行われることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
転位がＮ−エチルジイソプロピルアミン及び／又はトリエチルアミンの存在下に行われることを特徴とする、請求項７記載の方法。
【請求項９】
Ｓｃ１及びＳｃ１’がＳｃ２及びＳｃ２’と異なることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
保護基Ｓｃ１、Ｓｃ２、Ｓｃ１’又はＳｃ２’が、アシル基、ベンゾイル、ニトロベンゾイル及び／又はメトキシベンゾイル基、トリチル基から選択されることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
２’−又は３’−位が、塩基に不安定であるか、又は金属接触で除去されうる保護基、で保護されていることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
４’−位が、酸又は塩基に不安定である保護基で保護されていることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
反応が、結果として保護基が選択的に導入されるような低い温度で行われることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
（ａ）保護された核酸塩基を保護されたペントピラノースと反応させ、（ｂ）工程（ａ）からの生成物のペントピラノシル部位から保護基を除去し、（ｃ）工程（ｂ）からの生成物を請求項１〜１３のいずれか１項記載の方法に従い反応させることを特徴とする、ペントピラノシルヌクレオシドの製造方法。
【請求項１５】
保護されたペントピラノースがアノマーとして純粋であることを特徴とする、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
（ａ）式（ＩＩ）［ここで、Ｒ４’は（ＣｎＨ２ｎ）ＯＳｃ３又は（ＣｎＨ２ｎ）Ｈａｌ（ここで、ｎは上記の意味をもち、Ｓｃ３は保護基であり、Ｈａｌは塩素又は臭素である）である］の化合物をアジドと反応させ、（ｂ）（ａ）からの反応生成物を還元し、（ｃ）（ｂ）からの反応生成物を適当なフタルイミドと反応させ、（ｄ）（ｃ）の生成物のペントピラノシル部分の保護基を除去し、そして、（ｆ）請求項１〜１３のいずれか１項記載の工程を実施することを特徴とする、式（ＩＩ）［ここで、Ｒ４’は（ＣｎＨ２ｎ）ＮＲ１０’Ｒ１１’であり、Ｒ１０’Ｒ１１’は式（ＩＩＩ）の基を介して請求項１に定義した意味に結合されている］によるペントピラノシルヌクレオシドリンカーの製造のための請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
（ａ）適当なインドリンをピラノースと反応させてヌクレオシドトリオールを生成させ、（ｂ）（ａ）からの生成物のピラノシル部位のヒドロキシル基をアシル基で保護し、（ｃ）（ｂ）からの生成物を酸化し、（ｄ）（ｃ）からの生成物のピラノシル部位のヒドロキシル保護基を除去し、（ｅ）請求項１〜１３のいずれか１項記載の工程を実施することを特徴とする、式（Ｉ）［ここでＸ及びＹはそれぞれ互いに独立して同一であるか又は異なって、＝Ｃ（Ｒ１６）（ここでＲ１６はＨ又はＣｎＨ２ｎである）であり、Ｚは＝Ｃ（Ｒ１６）−（ここでＲ１６は請求項１に定義した意味をもつ（ＣｎＨ２ｎ）ＮＲ１０Ｒ１１である）である］によるペントピラノシルヌクレオシドリンカーの製造のための請求項１４記載の方法。
【請求項１８】
４’−保護ペントピラノシルヌクレオシドをさらなる工程でホスフィチル化し、あるいは固相に結合させることを特徴とする、請求項１〜１７のいずれか１項記載の方法。
【請求項１９】
（ａ）第１工程で、請求項１〜１８のいずれか１項記載の方法により製造された、保護されたペントピラノシルヌクレオシドを固相に結合させ、（ｂ）第２工程で工程（ａ）により固相に結合された３’−，４’−保護ペントピラノシルヌクレオシドを４’−位で脱保護し、ホスフィチル化３’−，４’−保護ペントピラノシルヌクレオシドにより伸長させ、そして、（ｃ）工程（ｂ）を繰り返すことを特徴とする、ペントピラノシル核酸の製造方法。
【請求項２０】
工程（ａ）及び／又は工程（ｂ）でペントフラノシルヌクレオシドもまた併合されることを特徴とする、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
工程（ｂ）による伸長のために用いられるカップリング試薬が、ホスホルアミダイトを用いる場合にはピリジニウム塩酸塩の酸性活性化剤であり、Ｈ−ホスホネートを用いる場合には、アリールスルホニルクロリド、ジフェニルクロロホスホネート、ピバロイルクロリド又はアダマントイルクロリドであることを特徴とする、請求項１９又は２０記載の方法。
【請求項２２】
さらなる工程（ｄ）において、保護基及び形成されたオリゴマーを固相から除去することを特徴とする、請求項１９〜２１のいずれか１項記載の方法。
【請求項２３】
ヒドラジン分解での除去が塩の存在下に行われることを特徴とする請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
さらなる工程で、式：
Ｓｃ４ＮＨ（ＣｎＨ２ｎ）ＣＨ（ＯＰＳｃ５Ｓｃ６）ＣｎＨ２ｎＳｃ７      （ＩＶ）
（式中、Ｓｃ４及びＳｃ７はそれぞれ互いに独立して同一であるか又は異なって、Ｆｍｏｃ及び／又はＤＭＴから選ばれた保護基であり、Ｓｃ５及びＳｃ６はそれぞれ互いに独立して同一であるか又は異なって、アリルオキシ及び／又はジイソプロピルアミノ基であり、ｎは請求項１に規定されたとおりのものである）のアリルオキシリンカーが併合されることを特徴とする、請求項１９〜２３のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、下記式（Ｉ）又は式（ＩＩ）のペントピラノシルヌクレオシド、その製造及び治療的、診断的及び／又は電子的構成要素の生産のための利用に関する。
【０００２】
【化８】
0004601817.tif 000002
【０００３】
【化９】
0004601817.tif 000003
【０００４】
背景技術
ピラノシル核酸（ｐ−ＮＡｓ）は一般に、ペントース単位がピラノース型であり、Ｃ−２′位とＣ−４′位との間でホスホジエステルにより繰り返して結合されている天然ＲＮＡに対し、異性である型構造のものである（図１）。「核酸塩基（ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ）」はここでは標準核酸塩基Ａ、Ｔ、Ｕ、Ｃ、Ｇ、Ｅを意味するものとして解されるが、またイソグアニン／イソシトシン及び２，６−ジアミノプリン／キサンチン対も、そして本発明の意味ではまた他のプリン及びピリミジンも「核酸塩基」に包含される。ｐ−ＮＡｓ、すなわちリボースから誘導されたｐ−ＲＮＡｓは最初にＥｓｃｈｅｎｍｏｓｅｒらにより報告された（参照、Ｐｉｔｓｃｈ，Ｓら．Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ１９９３，７６，２１６１； Ｐｉｔｓｃｈ，Ｓら．Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ１９９５，７８，１６２１；Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．１９９６，１０８，１６１９−１６２３）。それらはもっぱら、いわゆるワトソン−クリック対合の（Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ−ｐａｉｒｅｄ）、すなわちプリン−ピリミジン−及びプリン−プリン−対の、逆平行の、可逆的に融解する（ｍｅｌｔｉｎｇ）、擬リニアー状の（ｑｕａｓｉ−ｌｉｎｅａｒ）、そして安定な二重鎖（ｄｕｐｌｅｘｅｓ）を形成する。対掌性（ｃｈｉｒａｌｉｔｙ）の反対の意味のホモキラルｐ−ＲＮＡ鎖は同じく対合するのを制御でき、形成された二重鎖は厳密には非螺旋状である。この特異性は、超分子の構築のために価値があり、これはリボピラノースホスフェート基幹の比較的低いフレキシビリティー、基面（ｂａｓｅ ｐｌａｎｅ）の鎖軸に対する強度の傾き、及びこれから生じる、インターカテナリーベース（ｉｎｔｅｒｃａｔｅｎａｒｙ ｂａｓｅ）が生成二重鎖に積み重なる傾向と関係づけられ、結局、基幹の構築に２′，４′−シス−ジ置換リボピラノース環の関与に帰せられる。これらの特に良好な対合特性は超分子単位の構築に用いて、ｐ−ＮＡｓ対系をＤＮＡ及びＲＮＡと比べて好ましくさせる。それらは天然の核酸に直交する対系を形成する、すなわち特に診断分野で重要である、天然形態で産生するＤＮＡｓ及びＲＮＡｓとは対合しない。
【０００５】
Ｅｓｃｈｅｎｍｏｓｅｒら（１９９３以前）は、図２に示し、以下に説明するように最初にｐ−ＲＮＡを製造した。
【０００６】
このような状況において、適当な保護核酸塩基がビス（トリメチルシリル）アセタミドの作用で、そしてルイス酸、例えばトリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネートの作用でテトラベンゾイルリボピラノースのアノマー混合物と反応させられた（Ｈ．Ｖｏｒｂｒｕｇｇｅｎ，Ｋ．Ｋｒｏｌｉｋｉｅｗｉｃｚ，Ｂ．Ｂｅｎｎｕａ，Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．１９８１，１１４，１２３４に類似）。塩基（プリンの場合にはＴＨＦ／メタノール／水中のＮａＯＨ；ピリミジンの場合にはＭｅＯＨ中の飽和アンモニア）の作用下に、アシル保護された基を糖から除去し、生成物を酸性接触下にp−アニスアルデヒドジメチルアセタールで３′，４′−位で保護した。ジアステレオマー混合物を２′−位でアシル化し、３′，４′−メトキシベンジリデン−保護された２′−ベンゾエートを酸性処理、例えばメタノール中のトリフルオロ酢酸で脱アセタール化し、ジメトキシトリチルクロリドと反応させた。ベンゾエートの２′⇒３′転移はp−ニトロフェノール／４−（ジメチルアミノ）ピリジン／トリエチルアミン／ピリジン／ｎ−プロパノールで処理することにより開始された。ほとんどすべての反応はカラムクロマトグラフィーにより仕上げられた。次いで、この方法で合成されたキー単位、リボピラノースの４′−ＤＭＴ−３′−ベンゾイル−１′−核酸塩基誘導体を部分的にホスフィチル化し、リンカーを介して固相に結合させた。
【０００７】
次いで自動オリゴヌクレオチド合成で、４′−位で担体に結合された成分を、繰り返し酸性状態で脱保護し、ホスホルアミダイトをカップリング試薬、例えばテトラゾール誘導体の作用で結合させ、まだ遊離の４′−酸素原子をアセチル化し、リン原子をオリゴマー生成物を得るために酸化した。次いで、残留保護基を除去し、生成物を精製し、ＨＰＬＣで脱塩した。
【０００８】
しかし、Ｅｓｃｈｅｎｍｏｓｅｒらの報告した方法（１９９３以前）は次の不利を示す：
１．核酸塩基でのヌクレオシド化反応のための非アノマーとして純粋なテトラベンゾペントピラノース（Ｈ．Ｇ．Ｆｌｅｔｃｈｅｒ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９５５，７７，５３３７）の使用は、次の工程での過酷なクロマトグラフィーの必要のために最終生成物の収率を減少させる。
２．１′−位に核酸塩基を有するリボピラノースから出発して、保護された３′−ベンゾエートまでの５つの反応段階で合成が非常に遅延し、工業的規模での実施はほとんど不可能である。時間的浪費が大きい上に、得られるモノマー単位の収率がプリン単位アデニンの場合で２９％、ピリミジン単位ウラシルの場合で２４％と低い。
３．オリゴヌクレオチドの合成では、自動p−RNA合成で５−（４−ニトロフェニル）−１Ｈ−テトラゾールがカップリング試薬として用いられる。アセトニトリル中のテトラゾールの溶液でのこの試剤の濃度は、この場合に５−（４−ニトロフェニル）−１Ｈ−テトラゾール合成器の細管中で一様に晶出し、かくして合成が早期に終わるほどに高い。さらに、オリゴマーが５−（４−ニトロフェニル）−１Ｈ−テトラゾールで汚染されることが観察された。
４．報告されたｐ−ＲＮＡのオリゴヌクレオチドの仕上げ、特に塩基に不安定な保護基のヒドラジン溶液での除去は、オリゴマー中に高チミジン画分があると必ずしも可能ではない。
発明の開示
それ故に、本発明の目的は、既知及び新規のペントピラノシルヌクレオシドの製造を既知の方法より大規模に行うのを可能にし、上述の不利を回避するペントピラノシルヌクレオシドの新規な製造法を用いうるようにすることである。それ故に、本発明の課題は、未保護ペントピラノシドから出発して、（ａ）第１の工程で、ペントピラノシドの２′，３′又は４′−位を先ず保護し、（ｂ）第２の工程で、残りの２′，３′又は４′−位の他の位置を保護することを特徴とするペントピラノシルヌクレオシドの製造方法である。好ましい態様では、次の式（Ｉ）及び（ＩＩ）のものについてである。
式（Ｉ）
【０００９】
【化１０】
0004601817.tif 000004
【００１０】
｛ここで、Ｒ1はＨ、ＯＨ、Ｈａｌ（ここでＨａｌはＢｒ又はＣｌである）、又は式
【００１１】
【化１１】
0004601817.tif 000005
【００１２】
、又は式
【００１３】
【化１２】
0004601817.tif 000006
【００１４】
又は−Ｏ−Ｐ［Ｎ（ｉ−Ｐｒ）2］−（ＯＣＨ2ＣＨ2ＣＮ）（ここでｉ−Ｐｒはイソプロピルである）から選ばれた基であり、Ｒ2，Ｒ3及びＲ4はそれぞれ、互いに独立して、同一であるか又は異なって、Ｈ、Ｈａｌ（ここでＨａｌはＢｒ又はＣｌである）、ＮＲ5Ｒ6、ＯＲ7、ＳＲ8、＝Ｏ、ＣnＨ2n+1（ここでｎは１−１２、好ましくは１−８、特に１−４の整数である）、β−脱離性基（β−ｅｌｉｍｉｎａｂｌｅ  ｇｒｏｕｐ）、好ましくは式−ＯＣＨ2ＣＨ2Ｒ18（ここでＲ18はシアノ基、ｐ−ニトロフェニル基、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基である）、又は（ＣnＨ2n）ＮＲ10Ｒ11［ここでＲ10Ｒ11はＨ、ＣnＨ2n+1であるか又は式
【００１５】
【化１３】
0004601817.tif 000007
【００１６】
〔ここで、Ｒ12，Ｒ13，Ｒ14，Ｒ15はそれぞれ、互いに独立して、同一であるか又は異なって、Ｈ、ＯＲ7（ここでＲ7は上記の意味をもつ）、又はＣnＨ2n+1又はＣnＨ2n-1（ここでｎは上記の意味をもつ）である〕の基を介して結合されている］であって、かつＲ5，Ｒ6，Ｒ7，Ｒ8はそれぞれ、互いに独立して、同一であるか又は異なって、Ｈ、ＣnＨ2n+1又はＣnＨ2n-1（ここでｎは上記の意味をもつ）、又は−Ｃ（Ｏ）Ｒ9（ここでＲ9は直鎖状又は分枝状の、場合により置換されたアルキル又はアリール基、好ましくはフェニル基である）であり、Ｘ，Ｙ，Ｚはそれぞれ、互いに独立して、同一であるか又は異なって、＝Ｎ−、＝Ｃ（Ｒ16）−又は−Ｎ（Ｒ17）−（ここでＲ16及びＲ17はそれぞれ、互いに独立して、同一であるか又は異なって、Ｈ、又は上記の意味をもつＣnＨ2n+1又は（ＣnＨ2n）ＮＲ10Ｒ11である）であり、そしてＳc1及びＳc2はそれぞれ、互いに独立して、同一であるか又は異なって、Ｈ、又はアシル、トリチル又はアリルオキシカルボニル基、好ましくはベンゾイル又は４，４′−ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）基から選ばれた保護基である｝
式（ＩＩ）
【００１７】
【化１４】
0004601817.tif 000008
【００１８】
［ここで、Ｒ1′はＨ、ＯＨ、Ｈａｌ（ここでＨａｌはＢｒ又はＣｌである）、又は式
【００１９】
【化１５】
0004601817.tif 000009
【００２０】
、又は式
【００２１】
【化１６】
0004601817.tif 000010
【００２２】
又は−Ｏ−Ｐ［Ｎ（ｉ−Ｐｒ）2］−（ＯＣＨ2ＣＨ2ＣＮ）（ここでｉ−Ｐｒはイソプロピルである）から選ばれた基であり、Ｒ2′，Ｒ3′及びＲ4′はそれぞれ、互いに独立して、同一であるか又は異なって、Ｈ、Ｈａｌ（ここでＨａｌはＢｒ又はＣｌである）、＝Ｏ、ＣnＨ2n+1、ＣnＨ2n-1、β−脱離性基、好ましくは式−ＯＣＨ2ＣＨ2Ｒ18（ここでＲ18はシアノ基、ｐ−ニトロフェニル基、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基である）、又は（ＣnＨ2n）ＮＲ10′Ｒ11′（ここでＲ10′，Ｒ11′は互いに独立して、上記のＲ10又はＲ11の意味をもつ）であり、Ｘ′は＝Ｎ−、＝Ｃ（Ｒ16′）−又は−Ｎ（Ｒ17′）−（ここでＲ16′及びＲ17′は互いに独立して上記のＲ16又はＲ17の意味をもつ）であり、そしてＳc1′及びＳc2′は上記のＳc1及びＳc2の意味をもつ］
本発明によるペントピラノシルヌクレオシドは一般にペントピラノシル部がＤ配置（Ｄ  ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）である（しかし、Ｌ配置の場合もある）、リボ−、アラビノ−、リキソ−及び／又はキシロピラノシルヌクレオシド、好ましくはリボピラノシルヌクレオシドである。
【００２３】
通例、本発明によるペントピラノシルヌクレオシドは、ペントピラノシルプリン、−２，６−ジアミノプリン、−６−プリンチオール、−ピリジン、−ピリミジン、−アデノシン、−グアノシン、−イソグアノシン、−６−チオグアノシン、−キサンチン、−ヒポキサンチン、−チミジン、−シトシン、−イソシトシン、−インドール、−トリプタミン、−Ｎ−フタロイルトリプタミン、−ウラシル、−カフェイン、−テオブロミン、−テオフィリン、−ベンゾトリアゾール又は−アクリジン、特にペントピラノシルプリン、−ピリミジン、−アデノシン、−グアノシン、−チミジン、−シトシン、−トリプタミン、−Ｎ−フタロイルトリプタミン又は−ウラシルである。
【００２４】
この化合物はまた、リンカーとして、すなわち生体分子、例えばＤＮＡ、ＲＮＡのみならずｐ−ＮＡｓ、好ましくはｐＲＮＡｓなどの、天然型で産生する核酸又は修飾された核酸のような生体分子に共有結合しうる官能基をもつ化合物として用いられるペントピラノシルヌクレオシドを包含する。これはリンカーがｐ−ＮＡｓ用にはまだ知られていないので驚くべきことである。
【００２５】
例えば、これらは、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ2′、Ｒ3′及び／又はＲ4′が２−フタルイミドエチル又はアリルオキシ基であるペントピラノシルヌクレオシドを包含する。本発明による好適なリンカーは例えば好ましくはウラシルの５−位が修飾されているウラシルベースリンカー（ｕｒａｃｉｌ−ｂａｓｅｄ ｌｉｎｋｅｒｓ）、例えばＮ−フタロイルアミノエチルウラシルであり、またインドールベースリンカー、好ましくは例えばＮ−フタロイルトリプタミンのようなトリプタミン誘導体である。
【００２６】
驚くべきことに、本発明によれば、より取り扱いやすいペントピラノシル−Ｎ，Ｎ−ジアシルヌクレオシド、好ましくはプリン、特にアデノシン、グアノシン又は６−チオグアノシンもまた利用しうるようになり、その核酸塩基を簡単な方法で完全に脱保護しうる。それ故に本発明はまた、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ2′、Ｒ3′及び／又はＲ4′が式−Ｎ［Ｃ（Ｏ）Ｒ9］2の基、特にＮ6，Ｎ6−ジベンゾイル−９−（β−Ｄ−リボピラノシルアデノシンであるペントピラノシルヌクレオシドを包含する。
【００２７】
さらに驚くべきことには、本発明は、ペントピラノシド部位の３′−酸素原子上を除いて、保護基、好ましくは塩基又は金属接触により除去しうる保護基、特にアシル基、特に好ましくはベンゾイル基をもつ、ペントピラノシルヌクレオシドを利用しうるようになる。これらの化合物は、例えば追加の精製工程のような収率を低下させる追加の工程なしに、ペントピラノシド部位の４′−酸素原子にさらなる保護基、好ましくは酸又は塩基に不安定な保護基、特にトリチル基、特に好ましくはジメトキシトリチル基を直接導入するための出発物質として役立つ。
【００２８】
さらに、本発明は、ペントピラノシド部位の４′−酸素原子上を除いて、保護基、好ましくは酸又は塩基に不安定な保護基、特にトリチル基、特に好ましくはジメトキシトリチル基をもつ、ペントピラノシルヌクレオシドを利用しうるようになる。これらの化合物もまた、例えば追加の精製工程のような収率を低下させる追加の工程なしに、例えばペントピラノシド部位の２′−酸素原子などに、さらなる保護基、好ましくは塩基又は金属接触により除去しうる保護基、特にアシル基、特に好ましくはベンゾイル基を直接導入するための出発物質として役立つ。
【００２９】
一般に、本発明によるペントピラノシルヌクレオシドは、収率を高め、それ故に特に有利であるいわゆるワンポット（ｏｎｅ−ｐｏｔ）反応で反応させうる。次の化合物がペントピラノシルヌクレオシドの好適例である。
Ａ）［２′，４′−ジ−Ｏ−ベンゾイル）−β−リボピラノシル］ヌクレオシド、特に［２′，４′−ジ−Ｏ−ベンゾイル）−β−リボピラノシル］−アデニン、−グアニン、−シトシン、−チミジン、−ウラシル、−キサンチン又は−ヒポキサンチン、及びＮ−ベンゾイル−２′，４′−ジ−Ｏ−ベンゾイルリボピラノシルヌクレオシド、特に−アデニン、−グアニン又は−シトシン、及びＮ−イソブチロイル−２′，４′−ジ−Ｏ−ベンゾイルリボピラノシルヌクレオシド、特に−アデニン、−グアニン又は−シトシン、及びＯ6−（２−シアノエチル）−Ｎ２−イソブチロイル−２′，４′−ジ−Ｏ−ベンゾイルリボピラノシルヌクレオシド、特に−グアニン及びＯ６−（２−（４−ニトロフェニル）エチル）−Ｎ２−イソブチロイル−２′，４′−ジ−Ｏ−ベンゾイルリボピラノシルヌクレオシド、特に−グアニン。
Ｂ）β−リボピラノシルヌクレオシド、β−リボピラノシルアデニン、−グアニン、−シトシン、−チミジン、−ウラシル、−キサンチン又は−ヒポキサンチン、及びＮ−ベンゾイル−、Ｎ−イソブチロイル、 Ｏ6−（２−シアノエチル）−又はＯ6−（２−（４−ニトロフェニル）エチル）−Ｎ2−イソブチロイル−β−リボピラノシルヌクレオシド。
Ｃ）４′−ＤＭＴ−ペントピラノシルヌクレオシド、好ましくは４′−ＤＭＴ−リボピラノシルヌクレオシド、特に４′−ＤＭＴ−リボピラノシルアデニン、−グアニン、−シトシン、−チミジン、−ウラシル、−キサンチン又は−ヒポキサンチン、及びＮ−ベンゾイル−４′− ＤＭＴ−リボピラノシルヌクレオシド、特にＮ−ベンゾイル−４′− ＤＭＴ−リボピラノシルアデニン、−グアニン又は−シトシン、及びＮ−イソブチロイル−４′− ＤＭＴ−リボピラノシルヌクレオシド、特にＮ−イソブチロイル−４′− ＤＭＴ−リボピラノシルアデニン、−グアニン又は−シトシン、及びＯ6−（２−シアノエチル）− Ｎ2−イソブチロイル−４′− ＤＭＴ−リボピラノシルヌクレオシド、特にＯ6−（２−シアノエチル）− Ｎ2−イソブチロイル−４′− ＤＭＴ−リボピラノシルグアニン、及びＯ6−（２−（４−ニトロフェニル）エチル）−Ｎ2−イソブチロイル−４′− ＤＭＴ−リボピラノシルヌクレオシド、特にＯ6−（２−（４−ニトロフェニル）エチル）−Ｎ2−イソブチロイル−４′− ＤＭＴ−リボピラノシルグアニン。
Ｄ）β−リボピラノシル−Ｎ，Ｎ′−ジベンゾイルアデノシン又はβ−リボピラノシル−Ｎ，Ｎ′−ジベンゾイルグアノシン。
【００３０】
オリゴヌクレオチド合成の好適な前駆体は、例えば４′− ＤＭＴ−ペントピラノシルヌクレオシド−２′−ホスフィタミド／−Ｈ−ホスホネート、好ましくは４′− ＤＭＴ−リボピラノシルヌクレオシド−２′−ホスフィタミド／−Ｈ−ホスホネート、特に４′− ＤＭＴ−リボピラノシルアデニン−、−グアニン−、−シトシン−、−チミジン−、−キサンチン−、−ヒポキサンチン−又は−ウラシル−２′−ホスフィタミド／−Ｈ−ホスホネート、及びＮ−ベンゾイル−４′− ＤＭＴ−リボピラノシルアデニン−、−グアニン−又は−シトシン−２′−ホスフィタミド／−Ｈ−ホスホネート、及びＮ−イソブチロイル−４′− ＤＭＴ−リボピラノシルアデニン−、−グアニン−又は−シトシン−２′−ホスフィタミド／−Ｈ−ホスホネート、及びＯ6−（２−シアノエチル）−４′− ＤＭＴ−リボピラノシルグアニン−、−キサンチン−又は−ヒポキサンチン−２′−ホスフィタミド／−Ｈ−ホスホネート、又は Ｏ6−（２−（４−ニトロフェニル）エチル）−Ｎ2−イソブチロイル−４′− ＤＭＴ−リボピラノシル−グアニンであり、そして固体担体ヘのカップリング用には、例えば４′− ＤＭＴ−ペントピラノシルヌクレオシド−２′−スクシネート、好ましくは４′− ＤＭＴ−リボピラノシルヌクレオシド−２′−スクシネート、特に４′− ＤＭＴ−リボピラノシルアデニン−、−グアニン−、−シトシン−、−チミジン−、−キサンチン−、−ヒポキサンチン−又は−ウラシル−２′−スクシネート、及びＮ−ベンゾイル−４′− ＤＭＴ−リボピラノシルアデニン−、−グアニン−又は−シトシン−２′−スクシネート、及びＮ−イソブチロイル−４′− ＤＭＴ−リボピラノシルアデニン−、−グアニン−又は−シトシン−２′−スクシネート、及びＯ−（２−シアノエチル）−４′− ＤＭＴ−リボピラノシルグアニン−２′−スクシネート、及びＯ6−（２−（４−ニトロフェニル）エチル）−Ｎ2−イソブチロイル−４′− ＤＭＴ−リボピラノシルグアニン−２′−スクシネートである。
【００３１】
本発明による方法は、引用文献に記載された核酸塩基に制限されず、驚くべきことに多数の天然及び合成の核酸塩基を用いて成功裡に行われる。さらに、特に驚くべきことには本発明による方法は文献から知られた方法に比べて高収率で平均６０％の時間節約を伴って行われ、特に工業的適用に有利である。その上に、本発明による方法を用いると、文献に記載された方法に必要な精製工程、例えばクロマトグラフィーによる中間精製処理を要さず、反応が著しく空時収率を高めるいわゆるワンポット反応として行われる場合もある。
【００３２】
特別な態様として、２′−保護位の場合に、２′−位から３′−位への保護基の転移が一般的には塩基の存在下に行われ、特にＮ−エチルジイソプロピルアミン及び／又はトリエチルアミンの存在下に行われる。本発明に従い、この反応は特に有利にはワンポット反応として同じ反応容器で行われる。
【００３３】
さらに好ましい態様では、ピラノシルヌクレオシドは、酸に不安定であるか、塩基に不安定であるか、又は金属接触で除去されうる保護基Ｓc1、Ｓc2、 Ｓc1′又はＳc2′によって保護され、保護基Ｓc1及び Ｓc1′は保護基Ｓc2及びＳc2′とは異なっているのが好ましい。一般に、上記保護基はアシル基、好ましくはアセチル、ベンゾイル、ニトロベンゾイル及び／又はメトキシベンゾイル基、トリチル基、好ましくは４，４′−ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）基又はβ−除去しうる基、好ましくは式ＯＣＨ2ＣＨ2Ｒ18（ここで、Ｒ18はシアノ基、ｐ−ニトロフェニル基又はフルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基である）の基である。
【００３４】
特に好ましくは、２′−又は３′−位が、塩基に不安定であるか、又は金属接触で除去されうる保護基、好ましくはアシル基、特にアセチル、ベンゾイル、ニトロベンゾイル及び／又はメトキシベンゾイル基で保護され、及び／又は４′−位が、酸又は塩基に不安定である保護基、好ましくはトリチル基及び／又はＦｍｏｃ基、特にＤＭＴ基で保護されている。
【００３５】
文献から知られた方法と異なって、本発明による方法は、従って、アセタール又はケタールのようなアセタール保護基なしに処置し、追加のクロマトグラフィーによる中間精製処理を回避し、従って反応を驚異的に高い空時収率でワンポット反応として行わせるものである。
【００３６】
上記保護基は、好ましくは低温で導入され、それはこの手段で驚くほど選択的に導入しうるからである。こうして、例えば、ベンゾイル基の導入は低温でピリジン又はピリジン／メチレンクロリド中でベンゾイルクロリドと反応させることにより行われる。ＤＭＴ基は例えば、塩基例えばＮ−エチルジイソプロピルアミン（Ｈｕｎｉｇの塩基）及び例えばピリジン、メチレンクロリド又はピリジン／メチレンクロリド混合物の存在下にＤＭＴＣｌと反応させることにより導入される。
【００３７】
また、アシル化後及び／又は任意に行われる２′−又は３′−位の転移後に、反応生成物をクロマトグラフィーで精製するのもまた有利である。トリチル化後の精製は本発明方法によれば必要ではなく、それが特に有利なことである。
【００３８】
最終生成物は、必要ならば、さらに晶出により精製される。
本発明の別の課題は、（ａ）保護された核酸塩基を保護されたリボピラノースと反応させ、（ｂ）工程（ａ）からの生成物のリボピラノシル部位から保護基を除去し、そして（ｃ）工程（ｂ）からの生成物をより詳細に上記した方法に従い反応させる、リボピラノシルヌクレオシドの製造法である。
【００３９】
これに関連して、さらなる時間−及び物質−消費性のクロマトグラフィー工程を回避するために、アノマー性からして純粋な（ａｎｏｍｅｒｉｃａｌｌｙ  ｐｕｒｅ）保護されたペントピラノース、例えばテトラベンゾイルペントピラノース、好ましくはβ−テトラベンゾイルリボピラノースを用いるのが唯一有利である（Ｒ．Ｊｅａｎｌｏｚ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９４８，７０，４０５２）。
【００４０】
さらなる態様では、Ｒ4′が（ＣnＨ2n）ＮＲ10′Ｒ11′であって、 Ｒ10′Ｒ11′が既に示した意味をもつ式（ＩＩＩ）の基で結合されている式（ＩＩ）によるリンカーは、有利には次の工程：
（ａ）Ｒ4′が（ＣnＨ2n）ＯＳc3又は（ＣnＨ2n）Ｈａｌ（ここで、ｎは上記の意味をもち、Ｓc3は保護基、好ましくはメシレート（ｍｅｓｙｌａｔｅ）基であり、Ｈａｌは塩素又は臭素である）である式（ＩＩ）の化合物を、好ましくはＤＭＦ中でアジドと反応させ、次いで、
（ｂ）（ａ）からの反応生成物を好ましくは例えばピリジン中でトリフェニルホスフィンと反応させ、次いで、
（ｃ）（ｂ）からの反応生成物を適当なフタルイミド、例えばＮ−エトキシカルボニルフタルイミドと反応させ、そして、
（ｄ）（ｃ）からの反応生成物を適当な保護されたピラノース、例えばリボーステトラベンゾエートと反応させ、そして最後に、
（ｅ）保護基を、例えばメチレート（ｍｅｔｈｙｌａｔｅ）で除去し、そして、（ｆ）さらなる工程を既に上記したように実施することにより製造される。
【００４１】
さらに、リンカーとしてのインドール誘導体は蛍光発生能の利点を有し、それ故に特にごく少量の物質の検出を問題とするナノ技術への応用に好適である。例えば、インドール−１−リボシド（ｉｎｄｏｌｅ−１−ｒｉｂｏｓｉｄｅ）は既に「Ｎ．Ｎ．ＳＵｖｏｒｏｖら，Ｂｉｏｌ．Ａｋｔｉｖｎ．Ｓｏｅｄｉｎ．，Ａｋａｄ．Ｎａｕｋ ＳＳＳＲ １９６５，６０」及び「テトラヘドロン １９６７，２３，４６５３」に報告されている。しかし、３−置換誘導体を製造する類似の方法はない。一般に、これらの製造は、未保護糖成分のアミナール（ａｍｉｎａｌ）及びインドリンの生成を経て行われ、次いでこれを酸化によりインドール−１−リボシドへ転化する。例えば、インドール−１−グルコシド及び−１−アラビノシドが報告され（Ｙ．Ｖ．Ｄｏｂｒｉｙｎｉｎら，Ｋｈｉｍ．−Ｆａｒｍ Ｚｈ．１９７８，１２，３３）、その３−置換誘導体は通常フィールスマイヤー反応により製造された。しかし、インドールの３−位へのアミノエチル単位の導入のためのこのルートは、工業的応用にはあまりにも複雑である。
【００４２】
さらに好適な態様では、式（Ｉ）［式中のＸ及びＹはそれぞれ、互いに独立して、同一であるか又は異なって、＝Ｃ（Ｒ16）（ここでＲ16はＨ又はＣnＨ2nである）、Ｚは＝Ｃ（Ｒ16）−（ここでＲ16は（ＣnＨ2n）ＮＲ10Ｒ11である）である］によるリンカーは、それ故に有利には次の工程：
（ａ）適当なインドリン、例えばＮ−フタロイルトリプタミンをピラノース、例えばＤ−リボースと反応させてヌクレオシドトリオールを生成させ、次いで、
（ｂ）（ａ）からの生成物のピラノシル部位のヒドロキシル基を好ましくはアシル基、例えば無水酢酸で保護し、次いで、
（ｃ）（ｂ）からの生成物を、例えば２，３−ジクロロ−５，６−ジシアノパラキノンで酸化し、そして、
（ｄ）（ｃ）からの生成物のピラノシル部位のヒドロキシル保護基を、例えばメチレートで除去し、そして最後に、
（ｅ）さらなる工程を既に上記したように行う工程により製造される。
【００４３】
しかし、この方法はリボピラノースの場合に用いられるばかりではなく、リボフラノース及び２′−デオキシリボフラノース又は２′−デオキシリボピラノースの場合にも用いられ、これは特に有利である。用いられた糖のヌクレオシド化パートナー（ｎｕｃｌｅｏｓｉｄａｔｉｏｎ ｐａｒｔｎｅｒ）は好ましくはトリプタミン、特にトリプタミンのＮ−アシル誘導体、とりわけＮ−フタロイルトリプタミンである。
【００４４】
さらなる態様では、４′−保護、好ましくは３′，４′−保護ペントピラノシルヌクレオシドはさらなる工程でホスフィチル化され、あるいは固相に結合される。
【００４５】
ホスフィチル化（ｐｈｏｓｐｈｉｔｙｌａｔｉｏｎ）は、例えば、Ｎ−エチルジイソプロピルアミンのような塩基の存在下にモノアリル Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホルアミダイトにより、あるいは三塩化リン及びイミダゾール又はテトラゾールでの処理及び引き続いての塩基の添加での加水分解により行われる。生成物は、第１の場合にはホスホルアミダイトであり、第２の場合にはＨ−ホスホネートである。本発明による保護されたペントピラノシルヌクレオシドの固相、例えば「長鎖アルキルアミノ制御の多孔質ガラス」（ＣＰＧ，Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｍｕｎｉｃｈ）への結合は、例えばＥｓｃｈｅｎｍｏｓｅｒら（１９９３）に記載されているように行われる。
【００４６】
得られた化合物は、例えばペントピラノシル核酸の製造のために役立つ。
それ故に、本発明のさらなる課題は、次の工程：
（ａ）第1工程で、保護されたペントピラノシルヌクレオシドを既に上記したように固相に結合させ、そして、
（ｂ）第2工程で、工程（ａ）により固相に結合された３′−，４′−保護ペントピラノシルヌクレオシドを、ホスフィチル化３′−，４′−保護ペントピラノシルヌクレオシドにより伸長させ、次いで、例えば水性ヨウ素溶液で酸化し、そして、
（ｃ）所望のペントピラノシル核酸が発現するまで、工程（ｂ）を同一又は異なるホスフィチル化３′−，４′−保護ペントピラノシルヌクレオシドを用いて繰り返す工程によってペントピラノシル核酸を製造する方法である。
【００４７】
ピリジニウム塩酸塩、特にベンズイミダゾリウム  トリフレートなどの酸性活性化剤は、カップリング試薬としての５−（４−ニトロフェニル）−１Ｈ−テトラゾールに対比し、カップリング試薬ライン（ｌｉｎｅｓ）の阻害や生成物の汚染を全く起こさないので、ホスホルアミダイトを好ましくはアセトニトリル中で再結晶化及びアセトニトリルに溶解後に用いるときにカップリング試薬として好適である。
【００４８】
Ｈ−ホスホネートを用いるときには、カップリング試薬として、アリールスルホニルクロリド、ジフェニルクロロホスホネート、ピバロイルクロリド又はアダマントイルクロリドが特に好適である。
【００４９】
さらに、オリゴヌクレオチド特にｐ−ＮＡｓ、好ましくはｐ−ＲＮＡｓの保護基除去のヒドラジン分解に対し、ピリミジン塩基特にウラシル及びチミンを、オリゴヌクレオチドを破壊する開環から保護するには、塩化ナトリウムのような塩の添加によるのが有利である。アリルオキシ基は好ましくは、例えばヒドラジン分解の前に、パラジウム［Ｐｄ（０）］錯体で除去される。
【００５０】
さらに特別の態様では、天然型であるペントフラノシルヌクレオシド、例えばアデノシン、グアノシン、シチジン、チミジン及び／又はウラシルもまた、工程（ａ）及び／又は工程（ｂ）に併合され、それは、例えば混合ｐ−ＮＡ−ＤＮＡ又はｐ−ＮＡ−ＲＮＡへ導かれる。
【００５１】
別の特別の態様では、さらなる工程で、式：
Ｓc4ＮＨ（ＣnＨ2n）ＣＨ（ＯＰＳc5Ｓc6）ＣnＨ2nＳc7
（ＩＶ）
（式中、Ｓc4及びＳc7はそれぞれ、互いに独立して、同一であるか又は異なって、特にＦｍｏｃ及び／又はＤＭＴから選ばれた保護基であり、Ｓc5及びＳc6はそれぞれ、互いに独立して、同一であるか又は異なって、アリルオキシ及び／又はジイソプロピルアミノ基であり、ｎは既に上記した意味を有する）のアリルオキシリンカーが併合される。
【００５２】
特に好適なアリルオキシリンカーは［２−（Ｓ）−Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｏ1−ＤＭＴ−Ｏ2−アリルオキシジイソプロピルアミノホスフィニル−６−アミノ−１，２−ヘキサンジオール］である。
【００５３】
このようにして、例えばリジンから出発して、数反応工程で、アミノ−末端リンカーが合成され、それは活性化しうるリン化合物とともに酸に不安定な保護基を担持し、それ故に自動オリゴヌクレオチド合成に容易に用いられる（参照、例えばＰ．Ｓ．Ｎｅｌｓｏｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９８９，１７，７１７９；Ｌ．Ｊ．Ａｒｎｏｌｄら，ＷＯ８９０２４３９）。本発明の範囲はリジンベースリンカーで拡張され、それではリン原子上での常用のシアノエチル基に代えて、アリルオキシ基が導入され、それはそれ故にＮｏｙｏｒｉオリゴヌクレオチド法（ Ｒ．Ｎｏｙｏｒｉ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９０，１１２，１６９１−６ ）で有利に用いられる。
【００５４】
ｐ−ＮＡｓ、特にｐ−ＲＮＡｓは互いに安定な二重鎖を形成し、一般に天然型であるＤＮＡｓ及びＲＮＡｓとは対合しない。この性質はｐ−ＮＡｓを好適な対系（ｐａｉｒｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍｓ）にする。
【００５５】
このような対系（ｐａｉｒｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍｓ）は非共有（ｎｏｎ−ｃｏｖａｌｅｎｔ）相互作用の超分子系であり、それは選択性、安定性及び可逆性により特徴づけられ、その性質は好ましくは動力学的に、例えば温度、ｐＨ及び濃度により影響される。このような対系はまた、例えば異なる金属クラスター（ｃｌｕｓｔｅｒ）を一緒にして潜在的に新規な性質を有するクラスター会合（ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）を形成させるための「分子接着剤」としての選択的な性質を考慮して用いられる［参照、例えばＲ．Ｌ．Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，１９９６，３８２，６０７−９；Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚら， Ｎａｔｕｒｅ，１９９６，３８２，６０９−１１ ］。従って、 ｐ−ＮＡｓはまた、強力にかつ熱力学的に制御しうる対系を形成するので、ナノ技術分野、例えば新規物質、診断剤、治療剤及びまたマイクロエレクトロニクス、光学又はオプトエレクトロニクスの構成要素（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ）の製造に用いて、また分子種（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｐｅｃｉｅｓ）を集めるのを制御してタンパク組立（ａｓｓｒｍｂｌｉｅｓ）の（組合せ）合成用などの超分子単位を形成させるのに用いて好適である［参照、例えば、Ａ．Ｌｏｍｂａｒｄｉ，Ｊ．Ｗ．Ｂｒｙｓｏｎ，Ｗ．Ｆ．ＤｅＧｒａｄｏ，Ｂｉｏｍｏｌｅｋｕｌｓ（Ｐｅｐｔ．Ｓｃｉ．）１９９７，４０，４９５−５０４］。それ故に、更なる応用は特に、天然核酸をそこなわないｐ−ＮＡコードをもつタンパクやＤＮＡ／ＲＮＡ切片（ｓｅｃｔｉｏｎｓ）などの、機能的好ましくは生物学的単位を提供しうるために、診断及び医薬分野において生じる（参照、例えばＷＯ９３／２０２４２）。
【００５６】
生体分子、例えばＤＮＡ又はＲＮＡは、それと他の生体分子、例えばＤＮＡ又はＲＮＡ の双方が核酸塩基の相補的配列の結果として水素架橋の形成によって互いに結合しうる部分を含有している場合に、他の生体分子との非共有結合のために用いられる。このタイプの生体分子は、例えば信号増幅ののための分析システムにおいて用いられ、それでは配列が分析されるＤＮＡ分子が一方では非共有ＤＮＡリンカーのような手段で固体担体に固定され、他方では信号増幅しうる分岐鎖ＤＮＡ分子（ｂＤＮＡ）に結合されている（参照、例えばＳ．Ｕｒｄｅａ，Ｂｉｏｌ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．１９９４，１２，９２６又は米国特許第５６２４８０２号）。最後に記載したシステムの本質的欠点はこれまでのところポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による核酸分析法に対する感度に関してである（Ｋ．Ｍｕｌｌｉｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８７，１５５，３３５）。これは、中でも、分析されるＤＮＡ分子の非共有結合と同様に分析される、ＤＮＡ分子への固体担体の非共有結合が、特には必ずしも起こらないという事実に帰せられ、この結果として、配列認識と非共有結合の機能の混同（ｍｉｘｉｎｇ）が生じる。ＤＮＡ又はＲＮＡ対合法（ｐａｉｒｉｎｇ ｐｒｏｃｅｓｓ）に介入しない直交対系（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｐａｉｒｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）としてのｐ−ＮＡｓの使用は、この問題を有利に解決し、その結果として上記分析法の感度を顕著に増大しうる。
【００５７】
それ故に、本発明方法により得られるペントピラノシルヌクレオシド又はペントピラノシル核酸は、例えば生体分子との結合状態のような複合体の形態で、治療的、診断的及び／又は電子的構成要素のような医薬の製造に好適である。
【００５８】
本発明の意味での複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）とはｐ−ＮＡｓと他の生体分子、好ましくはペプチド、タンパク又は核酸の共有結合ハイブリッド、例えば抗体又はその機能部、天然型で産するＤＮＡ及び／又はＲＮＡである。抗体の機能部は、例えばＦｖ断片（Ｓｋｅｒｒａ＆Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４０，１０３８）、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ；Ｂｉｒｄら，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２，４２３；Ｈｕｓｔｏｎら、（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国８５，５８７９）又はＦａｂ断片（Ｂｅｔｔｅｒら、（１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ２４０，１０４１）である。
【００５９】
本発明の意味での生体分子とは、天然産生物質又はそれから誘導された物質である。
【００６０】
好適な態様では、それらはｐ−ＲＮＡ／ＤＮＡ又はｐ−ＲＮＡ／ＲＮＡ複合体である。
【００６１】
本発明による複合体は互いに直交する（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ）２つの対系を含有するので、配列認識及び非共有結合の機能が分子で実現されねばならないときに好ましくは用いられる。
【００６２】
逐次法及び集中法（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ａｎｄ  ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ）ともに複合体の製造に好適である。
【００６３】
逐次法では、例えばｐ−ＲＮＡオリゴマーの自動合成を同じ合成器で、試剤やカップリングプロトコルの再調整後に直接行った後、さらにＤＮＡオリゴヌクレオチドが合成される。この方法はまた逆の順序でも行われる。
【００６４】
集中法では、例えばアミノ末端リンカーを有するｐ−ＲＮＡオリゴマー及び、例えばチオールリンカーを有するＤＮＡオリゴマーが別の操作で合成される。次いで、好ましくは、文献から知られたプロトコルに従い、ｐ−ＲＮＡオリゴマーのヨードアセチル化及び２つの単位のカップリングが行われる（Ｔ．Ｚｈｕら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．ｃｈｅｍ．１９９４，５，３１２）。
【００６５】
集中法は特にそのフレキシビリティーのために好ましい。
本発明の意味での用語の複合体はまた、いわゆるアレイ（ａｒｒａｙｓ）を意味するものとして理解される。アレイは特に分析及び診断において分析物の同時決定に重要な役割を果たす、固定された認識種（ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｓｐｅｃｉｅｓ）の配列である。例としてペプチドアレイ（Ｆｏｄｏｒら，Ｎａｔｕｒｅ１９９３，３６４，５５５）や核酸アレイ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎら ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ１９９２，１３，１００８；Ｈｅｌｌｅｒ，米国特許第５６３２９５７号）がある。これらのアレイの高いフレキシビリティーは、認識種をコードしうるオリゴヌクレオチドに、そして結合された相補鎖（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｓｔｒａｎｄｓ）を固体担体上のある箇所に結合させることによって達成されうる。コード認識種をアンチコード（ａｎｔｉ−ｃｏｄｅｄ）固体担体に適用し、ハイブリッド形成条件を調整することにより、認識種は所望の位置に非共有結合される。結果として、種々のタイプの認識種、例えばＤＮＡ切片（ｓｅｃｔｉｏｎｓ）、抗体がハイブリッド形成条件を利用して固体担体上に同時に配列されうる（図３参照）。しかし、このためにまず必要なものとして、コード切片をできるだけ短くし、天然核酸ｐ−ＮＡｓ、好ましくはｐ−ＲＮＡｓをそこなわないために極めて強力で選択的であるコドン及びアンチコドンがあり、これらはこのために特に有利に好適である。
【００６６】
本発明の意味での用語の担体は、固体又はゼラチン状形態である物質、特にチップ状物質を意味するものとして理解される。好適な担体材料は、例えばセラミック、金属特に貴金属、ガラス、プラスチック、結晶性物質又は、上記材料の中でも特に担体の薄層であり、また、セルロースや構造タンパクのような（生体）分子フィラメントである。
【００６７】
それ故に、本発明はまた、認識種、好ましくは天然ＤＮＡ又はＲＮＡ鎖又はタンパク、特に抗体又は抗体の機能部位をコードするためのペントピラノシル核酸、好ましくはリボピラノシル核酸の利用に関する。これらは次いで図４による固体担体上で適当なコドンでハイブリッド形成される。このようにして、新規で診断的に有用なアレイを、常に新規な認識種の組合せを用いハイブリッド形成条件を調整することによってのみアレイ形態でコドンを具備させた固体担体の所望位置に常に組み込める。次いで、分析物、例えば血漿などの生物学的試料が適用されると、検出される種はあるパターンでアレイに結合され、次いで間接的に（例えば認識種の蛍光標識により）又は直接的に（例えばコドンの結合点でのインピーダンス測定により）記録される。次いで、ハイブリッド形成はコドンを有する担体のみが再び残るように適当な条件（温度、塩、溶媒、電気泳動法）で解除される。これは次いで再び他の認識種で装荷され、例えば他の試料の決定用の同じ分析物に対して用いられる。アレイフォーマットでの認識種の常に新規な配列及び対系としてのｐ−ＮＡｓの使用は他のシステム、例えばＷＯ９６／１３５２２と比べ特に有利である。
【００６８】
それ故に、本発明のさらなる課題は、特に上記のペントピラノシルヌクレオシドからなる診断薬又は既により詳細に上記した本発明による複合体に関する。以下の実施例及び図面は本発明をより詳細にそれを制限することなく述べることを意図したものである。
実施例
実施例１
１−｛３′−Ｏ−ベンゾイル−４′−Ｏ−［（４，４′−ジメトキシトリフェニル）メチル］−β−Ｄ−リボピラノシル｝チミンの合成
最初の４′−置換、次いでの２′−置換、次いでの転移（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）反応：
【００６９】
【化１７】
0004601817.tif 000011
【００７０】
１−（β−Ｄ−リボピラノシル｝チミンＡ５１．６ｇ（２００ミリモル）をアルゴン雰囲気下に無水ピリジン６２０ｍｌに溶解し、Ｎ−エチルジイソプロピルアミン７１．4ｍｌ（２．１当量（ｅｑ．））及びモレキュラーシーブ（４Å）１００ｇを加え、混合物をＫＰＧ攪拌器を用い１５分間攪拌した。ジメトキシトリチルクロリド（ＤＭＴＣｌ）９２ｇ（２７２ミリモル；１．３６当量）をクロロホルム（固体ＮａＨＣＯ３から新たに蒸留されたもの）２８０ｍｌに溶解し、この溶液をトリオール溶液に−6ないし−5℃で30分かけて滴下した。これをこの温度で1時間、次いで室温で一夜攪拌し、再度冷却し、さらにクロロホルム７０ｍｌ中のＤＭＴＣｌ２５ｇ（７４ミリモル；０．３７当量）を加えた。混合物を室温にならしめ4時間攪拌した。１−｛４′−Ｏ−［（４，４′−ジメトキシトリフェニル）メチル］−β−Ｄ−リボピラノシル｝チミンの分析データを得るために、少量の試料をとり、水性仕上げ処理（ｗｏｒｋ−ｕｐ）にかけ、クロマトグラフィーに付した。
【００７１】
【化１８】
0004601817.tif 000012
【００７２】
反応混合物を４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）２．４６ｇ（２０．５ミリモル；０．１当量）で処理し、−６℃に冷却し、ピリジン３０ｍｌ中のベンゾイルクロリド（ＢｚＣｌ）２７．９ｍｌ（０．２４モル；１．２当量）を−6℃から−１℃の間で１５分かけて滴下し、混合物を１０分間攪拌した。反応を完結させるために、さらにＢｚＣｌ２．８ｍｌ（２４ミリモル；０．１２当量）を冷却しながら２５分間隔で各場合に加え混合物を最後に２０分間攪拌した。
次いで無水ピリジン４６０ｍｌ、ｎ−プロパノール８４１ｍｌ（１１．２モル；５６当量）、ｐ−ニトロフェノール４４ｇ（０．３１６モル；１．５８当量）、ＤＭＡＰ２１．７ｇ（０．１８モル；０．９当量）及びＮ−エチルジイソプロピルアミン１３６ｍｌ（０．８モル；４当量）を室温で加え、混合物を６１−６３℃で４８時間攪拌した。
【００７３】
次いで混合物を室温で６０時間放置した。 反応混合物を再度６１−６３℃に２４時間加熱し、室温に冷却し、ロタベイパー（Ｒｏｔａｖａｐｏｒ）で濃縮した。残渣を酢酸エチル２リットルにとり、モレキュラーシーブをろ別し、有機相を3回各回水１リットルで抽出し、１０％濃度のクエン酸１．２リットルと攪拌して１回抽出し、有機相を再度分別し、水１リットルで一回抽出し、飽和ＮａＨＣＯ溶液１リットルで最後に抽出した。有機相を硫酸ナトリウムを用い乾燥し、ろ過し、濃縮した（残渣２２０ｇ）。
【００７４】
残渣を先ず予備精製のためヘプタン／酢酸エチル（１：１−０．１）のステップグラジエント（ｓｔｅｐ ｇｒａｄｉｅｎｔ）を用いてシリカゲル６０（２０×１０ｃｍ）でろ過し、次いでシリカゲル６０でのクロマトグラフィー（３０×１０ｃｍ；ジクロロメタン／酢酸エチル（１：０−１：１）のステップグラジエント）に付した。
以下のものが得られた。
非極性画分４０ｇ
１−｛３′−Ｏ−ベンゾイル−４′−Ｏ−［（４，４′−ジメトキシトリフェニル）メチル］−β−Ｄ−リボピラノシル｝チミンＢ５２．９ｇ
不純な化合物Ｂ３４．５ｇ
極性画分３．４ｇ
不純画分を再度クロマトグラフィーに付し（ＳＧ６０，４５×１０ｃｍ；ジクロロメタン／酢酸エチル，３：１）、さらに化合物Ｂ１１．３ｇを得た。全収量：化合物Ｂ６４．２ｇ（９７ミリモル）、すなわち収率４８％。１Ｈ−ＮＭＲは一致する。
実施例２
Ｎ４−ベンゾイル−１−｛３′−Ｏ−ベンゾイル−４′−Ｏ−［（４，４′−ジメトキシトリフェニル）メチル］−β−Ｄ−リボピラノシル｝シトシンの合成
最初の２′−置換、次いでの４′−置換、次いでの転移反応：
【００７５】
【化１９】
0004601817.tif 000013
【００７６】
全バッチを窒素雰囲気下に行った。
Ｎ4−ベンゾイル−１−（２′−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−リボピラノシル）シトシン２：
５４．０ｇ（０．１５５モル）のＮ４−ベンゾイル−１−（β−Ｄ−リボピラノシル）シトシン１をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）８３０ｍｌ及びピリジン１．５リットル（両溶媒は乾燥してモレキュラーシーブ３Åで保存）に１２４℃に加温しながら溶解した。ピリジン２１０ｍｌに溶解したＢｚＣｌ２３．０ｇ（０．１６３モル；１．０５当量）を−５８℃ないし−６３℃で３．５時間かけて滴下した。このバッチを冷却浴中で一夜攪拌し、ｎ−プロパノール９０．３ｇ（１．５モル；１０当量）を攪拌しながら混入しバッチを高真空で４０℃で濃縮した。ピリジン残渣をトルエン１５０ｍｌを２回加えることにより除去し、再度濃縮した。残渣１２４．３ｇをＣＨ２Ｃｌ２５００ｍｌに溶解し、各回半濃縮ＮａＨＣＯ３溶液３００ｍｌと攪拌することにより２回抽出し、沈でんした固体をろ別し乾燥した。残渣は６０．７ｇであった。 ＣＨ２Ｃｌ２相を濃縮した：２５．０ｇ。グラジエント（ｇｒａｄｉｅｎｔｓ）（ＡｃＯＥｔ／イソヘキサン，４：１、次いで無水ＡｃＯＥｔ、次いでＡｃＯＥｔ／ＭｅＯＨ，１９：１−２：１）を用いたシリカゲル６０（４０×１０ｃｍ）での分離クロマトグラフィーにより、次のものを得た（ＴＬＣ（シリカゲル，ＡｃＯＥｔ））：
２′、４′ジベンゾエート１６．８ｇ（２４％）Ｒｆ０．５
１２．４ｇの化合物１（２３％）Ｒｆ０．０
３５．４ｇの化合物２（５１％）Ｒｆ０．１４
Ｎ4−ベンゾイル−１−｛３′−Ｏ−ベンゾイル−４′−Ｏ−［（４，４′−ジメトキシトリフェニル）メチル］−β−Ｄ−リボピラノシル｝シトシン３
３５．４ｇ（７８ミリモル）の化合物２をＣＨ２Ｃｌ２３９０ｍｌ及びピリジン１８０ｍｌ（両者無水）、ＤＭＡＰ０．９４ｇ（７．８ミリモル；０．１当量）、Ｎ−エチルジイプロピルアミン３４．６ｍｌ（２０３ミリモル；２．６当量）及びＤＭＴＣｌ３３．１ｇ（９８ミリモル；１．２５当量）を加え、混合物を室温で２時間攪拌した。
ＴＬＣ（シリカゲル，ＡｃＯＥｔ）：Ｒｆ０．６
ＣＨ2Ｃｌ2を３０℃でストリッピング（留去）し、残渣をピリジン６４０ｍｌ、ＤＭＡＰ９．３７ｇ（７８ミリモル；１．０当量）、Ｅｔ3Ｎ３２．５ｍｌ（２３４ミリモル；３．０当量）、ｐ−ニトロフェノール２１．７ｇ（１５６ミリモル；２．０当量）及びｎ−プロパノール９３．８ｇ（１．５６ミリモル；２０当量）で処理し、６５℃で４２時間攪拌した。このバッチを高真空で５０℃で濃縮し、各回トルエン２５０ｍｌで２回処理し、濃縮した。残渣をＣＨ2Ｃｌ2１リットルにとり、各回希釈ＮａＨＣＯ3溶液５００ｍｌと攪拌することにより３回抽出し、有機相をＮａ2ＳＯ4を用いて乾燥し濃縮した：残渣９２．５ｇ。グラジエント（メチルｔ−ブチルエーテル／イソヘキサン２：１−４：１、次いでメチルｔ−ブチルエーテル／ＡｃＯＥｔ，１：４、次いでＡｃＯＥｔ／ＭｅＯＨ，１：１−１：３）を用いたシリカゲル６０（５０×１０ｃｍ）でのクロマトグラフィーにより、生成物含有画分を得た。該画分をＣＨ2Ｃｌ2／メチルｔ−ブチルエーテル（１：５）５４０ｍｌから再結晶した。晶析物を再度ＣＨ２Ｃｌ２／メチルｔ−ブチルエーテル（１：１）３００ｍｌから再結晶した。
３：ＴＬＣ（シリカゲル，ＣＨＣｌ3／ｉ−ＰｒＯＨ４９：１）：Ｒｆ０．１４次のものを得た： Ｎ４−ベンゾイル−１−｛３′−Ｏ−ベンゾイル−４′−Ｏ−［（４，４′−ジメトキシトリフェニル）メチル］−β−Ｄ−リボピラノシル｝シトシン３３０ｇすなわち化合物２に基づく収率５１％。1Ｈ−ＮＭＲは一致する。
実施例３
Ｎ6−ベンゾイル−９−｛３′−Ｏ−ベンゾイル−４′−Ｏ−［（４，４′−ジメトキシトリフェニル）メチル］−β−Ｄ−リボピラノシル｝アデニンの合成
最初の２′−置換、次いでの４′−置換、次いでの転移反応
【００７７】
【化２０】
0004601817.tif 000014
【００７８】
９−（β−Ｄ−リボピラノシル｝アデニン２：
６８．３７ｇ（１００ミリモル）のＮ6−ベンゾイル−９−（２′，３′，４′−トリ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−リボピラノシル）アデニン１をＮＨ3−飽和ＭｅＯＨ３００ｍｌ中で室温で一夜攪拌し、晶析物をろ別した：２３．５ｇ（８８％）の化合物２。
ＴＬＣ（シリカゲル，ＡｃＯＥｔ／ＭｅＯＨ２：１）：Ｒｆ０．２３
【００７９】
【化２１】
0004601817.tif 000015
【００８０】
Ｎ6，Ｎ6−ジベンゾイル−９−（β−Ｄ−リボピラノシル）アデニン３：
１６．８ｇ（６２．９ミリモル）の化合物２を窒素雰囲気下に無水ピリジン５００ｍｌに懸濁させ−４℃ないし−１０℃に冷却した。トリメチルクロロシラン４０ｍｌ（１９９ミリモル；５当量）を２０分かけて滴下し、混合物を冷却しながら２．５時間攪拌した。ピリジン７３ｍｌに溶解したベンゾイルクロリド３６．５ｍｌ（１９９ミリモル；５当量）を２５分かけて−１０ないし−１５℃で加え、冷却しながら１０分間、そして室温で２時間攪拌した。（ＴＬＣチェック（シリカゲル，ＡｃＯＥｔ／ヘプタン１：１）：Ｒｆ０．５）。混合物を再度−１０℃に冷却し、水（温度最大＋８℃）１３６ｍｌを混入させ、混合物を室温で一夜攪拌した。転化が完了した後、溶媒を留去し残渣を各回トルエン２００ｍｌに２回とり再度蒸発させた。混合物を各５００ｍｌのエーテル及び水で処理し、２時間機械的に攪拌し、両相にごくわずか溶解する生成物をろ別し、エーテル及び水で洗浄し、高真空でＰ2Ｏ5で乾燥した：２３．８ｇ（８０％）の化合物３。
ＴＬＣ（シリカゲル，ＡｃＯＥｔ／ＭｅＯＨ９：１）：Ｒｆ０．３５
【００８１】
【化２２】
0004601817.tif 000016
【００８２】
Ｎ6，Ｎ6−ジベンゾイル−９−（２′−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−リボピラノシル｝アデニン４：
２６．４ｇ（５５．５ミリモル）の化合物３を窒素雰囲気下に無水ＣＨ2Ｃｌ2５５０ｍｌ及びピリジン５５ｍｌ（各場合ともモレキュラーシーブに貯蔵）に溶解し、ＤＭＡＰ０．７３ｇ（５．５５ミリモル；０．１当量）で処理し、−８７ないし−９０℃に冷却した。ピリジン１４ｍｌ中のＢｚＣｌ８．５８ｇ（６１ミリモル；１．１当量）を１時間かけて滴下し、混合物を６０時間（週末）にわたり−７８℃で放置した。バッチを濃縮し、各回トルエン１００ｍｌで２回処理し、ピリジンを除去するために蒸発させた。グラジエント（ＡｃＯＥｔ／ヘプタン，１：１−９：１）を用いたシリカゲル６０（２０×１０ｃｍ）でのクロマトグラフィーにより、２３．２ｇの化合物４を得た。
化合物４：ＴＬＣ（シリカゲル，ＡｃＯＥｔ）：Ｒｆ０．３４
Ｎ6−ベンゾイル−９−｛３′−Ｏ−ベンゾイル−４′−Ｏ−［（４，４′−ジメトキシトリフェニル）メチル］−β−Ｄ−リボピラノシル｝アデニン５
２３．２ｇ（４０ミリモル）の化合物４を無水ＣＨ２Ｃｌ２１６０ｍｌに溶解し、次いでＤＭＴＣｌ１４．９ｇ（５６ミリモル；１．１当量）及びＮ−エチルジイソプロピルアミン１７．７ｍｌ（１０４ミリモル；２．６当量）で処理した。室温で２時間攪拌した後、さらにＤＭＴＣｌ４．０ｇ（１１．８ミリモル；０．３当量）を加え、混合物をさらに４０分間攪拌した。バッチを３５０−５２０ミリバール及び３５℃でロタベイパー（Ｒｏｔａｖａｐｏｒ）中で濃縮した。
ＴＬＣ（シリカゲル，ＡｃＯＥｔ／ヘプタン１：１）：Ｒｆ０．１８
残渣を無水ピリジン２６０ｍｌに溶解し、次いでｎ−プロパノール５１ｍｌ（６７９ミリモル；１７当量）、Ｅｔ3Ｎ１６．６ｍｌ（１２０ミリモル；３当量）、ｐ−ニトロフェノール１１．１ｇ（８０ミリモル；２当量）、ＤＭＡＰ５．３ｇ（４４ミリモル；１．１当量）で処理し、６０−６３℃で２３時間攪拌した。次いで、バッチを２１時間室温のままとした。反応混合物をロタベイパーで濃縮した。残渣を各回トルエン２００ｍｌで２回処理し、濃縮し、ＣＨ２Ｃｌ２に溶解し、水で３回抽出した。グラジエント（ＡｃＯＥｔ／ヘプタン，１：２−１：０；次いでＡｃＯＥｔ／ＭｅＯＨ１：０−９：１）を用いたシリカゲル６０（３０×１０ｃｍ）でのクロマトグラフィーにより、１３ｇの化合物５を得た。
化合物５：ＴＬＣ（シリカゲル，ＡｃＯＥｔ／ヘプタン４：１）：Ｒｆ０．２
次のものを得た：１３ｇのＮ6−ベンゾイル−９−｛３′−Ｏ−ベンゾイル−４′−Ｏ−［（４，４′−ジメトキシトリフェニル）メチル］−β−Ｄ−リボピラノシル｝アデニン５
すなわち化合物３に基づく収率３０％。1Ｈ−ＮＭＲは一致する。文献から知られた方法と比べた時間節約：５０％
実施例４
９−［３′−Ｏ −ベンゾイル−４′−Ｏ−［（４，４′−ジメトキシトリフェニル）メチル］−β−Ｄ−リボピラノシル｝−２−Ｏ−アリル−２−Ｎ−イソブチロイルグアニンの合成
最初の３′−置換、次いでの４′−置換：
【００８３】
【化２３】
0004601817.tif 000017
【００８４】
９−［３′−Ｏ −ベンゾイル−β−Ｄ−リボピラノシル｝−２−Ｏ−アリル−２−Ｎ−イソブチロイルグアニンＢ
ＧトリオールＡ３９３ｍｇ（１．０ミリモル）を乾燥ジクロロメタン４ｍｌに溶解した。溶液をトリメチルオルトベンゾエート０．５２ｍｌ（３．０ミリモル）及びカンファースルホン酸５８ｍｇ（０．２５ミリモル）で処理し、室温で１５時間攪拌した。次いで、混合物を０℃に冷却し、０℃に予備冷却された、アセトニトリル、水及びトリフルオロ酢酸の混合物（５０：５：１）２ｍｌで処理した。混合物を１０分間攪拌し溶媒を真空留去した。残渣を、ジクロロメタン／メタノール（１００：３）を用いてシリカゲル（２．３×２１ｃｍ）でのフラッシュクロマトグラフィーで精製し、４−Ｏ −ベンゾイル化合物２５ｍｇ（５％）、混合画分１３９ｍｇ（２８％）及び所望の３−Ｏ −ベンゾイル化合物Ｂ２０５ｍｇ（４１％）を得た。
【００８５】
【化２４】
0004601817.tif 000018
【００８６】
９−｛３′−Ｏ −ベンゾイル−４′−Ｏ−［（４，４′−ジメトキシトリフェニル）メチル］−β−Ｄ−リボピラノシル｝−２−Ｏ−アリル−２−Ｎ−イソブチロイルグアニンＣ
ジオールＢ１０１ｍｇ（０．２ミリモル）を乾燥ジクロロメタン３．２ｍｌに懸濁させた。懸濁液をＮ−エチルジイソプロピルアミン１７１μｌ（１．０ミリモル）、ピリジン３２０μｌ（３．９６ミリモル）及びＤＭＴＣｌ１０２ｍｇ（０．３ミリモル）で処理し、室温で攪拌した。２４時間後、さらにＤＭＴＣｌ１０２ｍｇ（０．３ミリモル）を加え、混合物を再度２４時間攪拌した。次いで、それをジクロロメタン３０ｍｌで希釈した。溶液を１０％濃度クエン酸水溶液２０ｍｌ及び飽和重炭酸ナトリウム溶液１０ｍｌで洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥し、真空濃縮した。残渣を、ジクロロメタン／メタノール（１００：１）を用いてシリカゲル（２．３×２０ｃｍ）でのフラッシュクロマトグラフィーで精製し、既知の所望生成物Ｃ３９ｍｇ（２４％）を得た。
実施例５
ｐ−ＲＮＡリンカー系（ｌｉｎｋｅｒ ｓｙｓｔｅｍｓ）の合成
官能単位の結合のために用いられるアミノ末端を有するリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）の用意を可能にする３つの方法を下記に示す。
５．１ウラシルベースリンカー
ウラシルの５位の変性に基づいての方法
ヒドロキシエチルウラシル２８は既知の方法（Ｊ．Ｄ．Ｆｉｓｓｅｋｉｓ，Ａ．Ｍｙｌｅｓ，Ｇ．Ｂ．Ｂｒｏｗｎ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９６４，２９，２６７０）に従って大規模に製造することができる。γ−ブチロラクトン２５をギ酸メチルでホルミル化し、ナトリウム塩２６を反応させて尿素誘導体２７を生成させ、これを環化させてヒドロキシエチルウラシル２８を得た（スキーム４）。
【００８７】
【化２５】
0004601817.tif 000019
【００８８】
スキーム４：ヒドロキシエチルウラシル２８の合成
【００８９】
【化２６】
0004601817.tif 000020
【００９０】
スキーム５：Ｎ−フタロイルアミノエチルウラシル３２の合成
ヒドロキシエチルウラシル２８をピリジン中のメタンスルホニルクロリドでメシル化し、化合物２９を得た（Ｊ．Ｄ．Ｆｉｓｓｅｋｉｓ，Ｆ．Ｓｗｅｅｔ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９７３，３８，２６４）。
【００９１】
次の段階は新規に発明されたものである：化合物２９をＤＭＦ中でアジ化ナトリウムを用い反応させて、アジド３０を生成させ、これをピリジン中でトリフェニルホスフィンで還元してアミノエチルウラシル３１を得た。化合物３１におけるアミノ基を最終的にＮ−エトキシカルボニルフタルイミドで保護した。リボーステトラベンゾエート３３をＮ−フタロイルアミノエチルウラシル３２でヌクレオシド化して好収率でリボーストリベンゾエート３４を得た。ピラノース環のアノマー中心は、Ｊ＝９．５ＨｚのＨ−Ｃ（１′）とＨ−Ｃ（２′）との間のカップリング（結合）定数から明らかにみられるように、β配位を有する。次いで、ベンゾエート保護基をＭｅＯＨ中でＮａＯＭｅで除去してリンカートリオール３５を得た。化合物３５をＤＭＡＰの存在下にピリジン／ジクロロメタン１：１０中で−７８℃でベンゾイルクロリドと反応させた。この方法で所望の２′−ベンゾエート３６（６４％）に加え、２′，４′−ジベンゾイル化生成物（２２％）を得た。これを集め、化合物３４の化合物３５へのメタノーリシスに類似して再度トリオール３５へ転化した。２′−ベンゾエート３６を、ジクロロメタン中でヒューニッヒ塩基（Ｈｕｎｉｇ′ｓ ｂａｓｅ）の存在下にジメトキシトリチルクロリドを用いて９０％を超える収率で４′位でトリチル化した。４′−ＤＭＴ−２′−ベンゾエート３７の４′−ＤＭＴ−３′−ベンゾエート３８への転移を、ｎ−プロパノール／ピリジン５：２中で、ＤＭＡＰ、ｐ−ニトロフェノール及びヒューニッヒ塩基の存在下に行った。クロマトグラフィー後、化合物３８を得た。４′−ＤＭＴ−３′−ベンゾエート３８を最終的にヒューニッヒ塩基の存在下にＣｌＰ（ＯＡｌｌ）Ｎ（ｉＰｒ）２と反応させてホスホルアミダイト３９を得た（スキーム６）。これは合成プロトコル（ｐｒｏｔｏｃｏｌ）を変更することなく自動オリゴヌクレオチド合成に用いられる。
【００９２】
【化２７】
0004601817.tif 000021
【００９３】
スキーム６：リンカーホスホルアミダイト３９の合成
操作：
ウラシルリンカー単位の合成
５−（２−アジドエチル）ウラシル（３０）
【００９４】
【化２８】
0004601817.tif 000022
【００９５】
１．操作
２６．０ｇ（０．１１モル）の化合物２９を内部温度計及び還流冷却器を備えた三ツ口フラスコ５００ｍｌ中でＤＭＦ２５０ｍｌに溶解し、混合物をアジ化ナトリウム１０．８ｇ（０．１６６モル）で処理した。次いで、懸濁液を６０℃で４時間攪拌した（ＴＬＣチェック，ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ（９：１））。ＤＭＦを留去し、残渣を水１５０ｍｌと攪拌した。固体をろ別し、水約５０ｍｌで洗浄し、五酸化リンでデシケーター中で一夜真空で乾燥した。１４．２ｇ（７１％）の化合物３０をｍ．ｐ．２３０−２３５℃（分解）の無色固体の状態で得た。
【００９６】
２．分析データ
５−（２−アジドエチル）ウラシル（３０）
【００９７】
【化２９】
0004601817.tif 000023
【００９８】
５−（２−アミノエチル）ウラシル（３１）
【００９９】
【化３０】
0004601817.tif 000024
【０１００】
１．操作
１４．２ｇ（７８．０ミリモル）の化合物３０を内部温度計及び還流冷却器を備えた三ツ口フラスコ２５０ｍｌ中でピリジン１７５ｍｌに懸濁させ、混合物をトリフェニルホスフィン６１．４ｇ（２３４ミリモル）で処理した。これを６０℃で５時間加熱し、室温で一夜攪拌した（ＴＬＣチェック，ＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ（５：１））。懸濁液に２５％濃度アンモニア溶液４０ｍｌを加え、次いで清澄化した。溶媒を回転蒸発器（ロータリーエバポレータ）中で真空で除去した。残渣をＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ（１：１）２００ｍｌ中で室温で３０分間攪拌し、晶析物をろ別し、ＣＨ2Ｃｌ2で洗浄し、五酸化リンでデシケーター中で真空で乾燥したのち、ｍ．ｐ．２１４−２２０℃の１０．０ｇ（８５％）の化合物３１を得た。
【０１０１】
２．分析データ
５−（２−アミノエチル）ウラシル（３１）
Ｍ．ｐ．：２１４−２２０℃（ガス発生を伴う、予備シンターリング）
【０１０２】
【化３１】
0004601817.tif 000025
【０１０３】
５−（２−フタルイミドエチル）ウラシル（３２）
【０１０４】
【化３２】
0004601817.tif 000026
【０１０５】
１．操作
９．６ｇ（６１．８ミリモル）の化合物３１を丸底フラスコ２５０ｍｌ中で水１００ｍｌに懸濁させ、Ｎａ２ＣＯ３６．６４ｇ（６２．６ミリモル）で処理した。室温で１５分間攪拌した後、Ｎ−エトキシカルボニルフタルイミド１４．３ｇ（６５ミリモル）を分けて加え、混合物を室温で３時間攪拌した（ＴＬＣチェック，ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ（５：１））。粘性の白色懸濁液を濃塩酸を用い注意深くｐＨ４に調整し、白色沈殿物をろ別した。水で洗浄後、固体を五酸化リンでデシケーター中で真空で乾燥してｍ．ｐ．３２４−３２７℃の１６．０ｇ（９１％）の化合物３２を得た。
【０１０６】
２．分析データ
５−（２−フタルイミドエチル）ウラシル（３２）：
Ｍ．ｐ．：３２４−３２７℃（分解）
【０１０７】
【化３３】
0004601817.tif 000027
【０１０８】
１−（２，３，４−トリ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−リボピラノシル）−５−（２−フタルイミドエチル）ウラシル（３４）
【０１０９】
【化３４】
0004601817.tif 000028
【０１１０】
１．操作
７．００ｇ（２４ミリモル）の化合物３２をアルゴン導入部、内部温度計及び隔膜（ｓｅｐｔｕｍ）を備えた三ツ口フラスコ２５０ｍｌ中でアセトニトリル１２０ｍｌに懸濁させた。先ず、ＢＳＡ１２．２ｍｌ（５０ミリモル）を、次いで３０分間攪拌後、さらにＢＳＡ７ｍｌ（２８ミリモル）を注入器で加えた。短時間４０℃に加熱後、反応混合物を清澄化した。ＴＭＳＯＴｆ１３ｍｌ（７２ミリモル）を室温で注入器で加えた。１時間後、生成物の生成は観察されなかった（ＴＬＣチェック，ＡｃＯＥｔ／ｎ−ヘプタン（１：１））。そこで、さらにＴＭＳＯＴｆ１３ｍｌ（７２ミリモル）を加えた。次いで、反応混合物を５０℃に加熱した。５０℃で２．５時間攪拌後（ＴＬＣチェック）、混合物を室温に冷却し、ＡｃＯＥｔ２５０ｍｌ及び飽和ＮａＨＣＯ3溶液１９０ｍｌの氷冷混合物に注ぎ、１０分間攪拌することにより強力に抽出した。ＮａＨＣＯ３溶液１００ｍｌで再度洗浄し、水性相をＡｃＯＥｔ１００ｍｌで再度抽出した。希釈有機相をＭｇＳＯ4を用いて乾燥し、溶媒を回転蒸発器（ロータリーエバポレータ）中で真空で除去した。オイルポンプ真空中で乾燥後、粗生成物２０．９ｇを得た。シリカゲル（ｈ＝２５ｃｍ，ψ＝５ｃｍ，ＡｃＯＥｔ／ｎ−ヘプタン（１：１））でのクロマトグラフィーにより、 ＴＬＣ均一な発泡性生成物を得た。これをエーテルを用いて温浸した。ろ過、オイルポンプ真空中で乾燥して１５ｇ（８６％）の化合物３４を得た。
【０１１１】
２．分析データ
１−（２，３，４−トリ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−リボピラノシル）−５−（２−フタルイミドエチル）ウラシル（３４）：
【０１１２】
【化３５】
0004601817.tif 000029
【０１１３】
５−（２−フタルイミドエチル）−１−（β−Ｄ−リボピラノシル）ウラシル（３５）
【０１１４】
【化３６】
0004601817.tif 000030
【０１１５】
１．操作
１５ｇ（２０ミリモル）の化合物３４を丸底フラスコ１リットル中でＭｅＯＨ５００ｍｌに溶解し、ＮａＯＭｅ３２４ｍｇ（６ミリモル）で処理し、水を排除しながら室温で一夜攪拌した（ＴＬＣチェック，ＡｃＯＥｔ／ｎ−ヘプタン１：１）。生成懸濁液にアンバーライトＩＲ−１２０をｐＨ７未満となるまで加えた。固体を加熱下に溶解し、イオン交換体から熱時ろ別し、ＭｅＯＨで洗浄した。溶媒除去後、残渣を各回水１５０ｍｌを用いて２回共蒸発させて粗生成物９ｇを得た。これをＭｅＯＨ９０ｍｌ中で１０分間還流下に加熱した。室温に冷却後、混合物をＥｔ２Ｏ６０ｍｌで処理し、４℃で一夜貯蔵した。これをろ過、Ｅｔ２Ｏで洗浄、及びオイルポンプで真空乾燥して７．８ｇ（９３％）の化合物３５を得た。
【０１１６】
２．分析データ
５−（２−フタルイミドエチル）−１−（β−Ｄ−リボピラノシル）ウラシル（３５）：
Ｍ．ｐ．：１３７℃（シンターリング）
【０１１７】
【化３７】
0004601817.tif 000031
【０１１８】
１−（２′−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−リボピラノシル）−５−（２−フタルイミドエチル）ウラシル
５−（２−フタルイミドエチル）−１−（β−Ｄ−リボピラノシル）ウラシル１０．６ｇ（２５ミリモル）をアルゴン流下の加熱四つ口フラスコ１リットル中でピリジン２０ｍｌに溶解し、ジクロロメタン２００ｍｌと混合した。混合物を−７０℃に冷却し、ピリジン５ｍｌ及びジクロロメタン２０ｍｌ中のベンゾイルクロリド３．８２ｍｌ（３３ミリモル）を冷却しながら徐々に滴下し、混合物を−７０℃で３５分間攪拌した。反応混合物を冷却した塩化アンモニウム溶液６００ｍｌに注ぎ、水性相を酢酸エチルで抽出した。化合させた有機相を水洗、乾燥し、真空で濃縮乾燥した。シリカゲルでのクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘプタン１：１）により１−（２′−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−リボピラノシル）−５−（２−フタルイミドエチル）ウラシル７．９ｇ（６０％）を得た。
ＴＬＣ：Ｒｆ０．２４（酢酸エチル／ヘプタン４：１）
【０１１９】
【化３８】
0004601817.tif 000032
【０１２０】
１−（２−Ｏ−ベンゾイル−４−Ｏ−（４，４′−ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−リボピラノシル）−５−（２−フタルイミドエチル）ウラシル
１−（２−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−リボピラノシル）−５−（２−フタルイミドエチル）ウラシル５．６ｇ（１０．７３ミリモル）をジクロロメタン６０ｍｌに溶解し、４，４′−ジメトキシトリチルクロリド４．７２ｇ（１３．９５ミリモル）及びＮ−エチルジイソプロピルアミン２．４ｍｌ（１３．９５ミリモル）で処理し、室温で２０分間攪拌した。反応混合物を ジクロロメタン１００ｍｌで希釈し、炭酸水素ナトリウム溶液及び２０％クエン酸溶液で洗浄し、乾燥し、真空で濃縮乾燥した。シリカゲルでのクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘプタン（１：１）＋２％トリエチルアミン）により１−（２−Ｏ−ベンゾイル−４−Ｏ−（４，４′−ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−リボピラノシル）−５−（２−フタルイミドエチル）ウラシル７．７ｇ（８７％）を得た。
ＴＬＣ：Ｒｆ０．５３（酢酸エチル／ヘプタン（１：１）＋２％トリエチルアミン）
【０１２１】
【化３９】
0004601817.tif 000033
【０１２２】
１−（３−Ｏ−ベンゾイル−４−Ｏ−（４，４′−ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−リボピラノシル）−５−（２−フタルイミドエチル）ウラシル
１−（２−Ｏ−ベンゾイル−４−Ｏ−（４，４′−ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−リボピラノシル）−５−（２−フタルイミドエチル）ウラシル３ｇ（３．６３ミリモル）、４−ニトロフェノール１ｇ（７．２６ミリモル）、４−（ジメチルアミノ）ピリジン０．４４ｇ（３．６３ミリモル）及びＮ−エチルジイソプロピルアミン３．７５ ｍｌ（２１．７８ミリモル）をイソプロパノール５．６ｍｌ及びピリジン２５ｍｌに溶解し、６５℃に加熱し、６５℃で３日間攪拌した。溶液を真空で濃縮乾燥し、残渣をジクロロメタン１５０ｍｌに溶解した。２０％クエン酸溶液及び炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄した後、溶液を硫酸マグネシウムで乾燥した。シリカゲルでのクロマトグラフィー（酢酸エチル／ジクロロメタン／イソヘキサン２：１：１）により１−（３−Ｏ−ベンゾイル−４−Ｏ−（４，４′−ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−リボピラノシル）−５−（２−フタルイミドエチル）ウラシル２．２７ｇ（７６％）を得た。
ＴＬＣ：Ｒｆ０．２７（酢酸エチル／イソヘキサン（２：１）＋１％トリエチルアミン）
【０１２３】
【化４０】
0004601817.tif 000034
【０１２４】
１−｛２′−Ｏ−［（アリルオキシ）（ジイソプロピルアミノ）ホスフィノ］−３′−Ｏ−ベンゾイル−４′−Ｏ−［（４，４′−ジメトキシトリフェニル）メチル］−β−Ｄ−リボピラノシル｝−５−（２−フタルイミドエチル）ウラシル
１−（３−Ｏ−ベンゾイル−４−Ｏ−（４，４′−ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−リボピラノシル）−５−（２−フタルイミドエチル）ウラシル８８ｍｇ（０．１１ミリモル）をジクロロメタン５ｍｌに溶解し、Ｎ−エチルジイソプロピルアミン７５μｌ（０．４４ミリモル）及びアリルオキシクロロ（ジイソプロピルアミノ）ホスフィン７０μｌ（０．３ミリモル）で処理し、室温で３時間攪拌した。反応を完結させるためにさらにアリルオキシクロロ（ジイソプロピルアミノ）ホスフィン３５μｌ（０．１５ミリモル）を加えた後、さらに室温で１時間攪拌し、反応混合物を真空で濃縮した。シリカゲルでのクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘプタン：グラジエント１：２−１：１−２：１、各場合２％トリエチルアミンを用いた）により１−｛２′−Ｏ−［（アリルオキシ）（ジイソプロピルアミノ）ホスフィノ］−３′−Ｏ−ベンゾイル−４′−Ｏ−［（４，４′−ジメトキシトリフェニル）メチル］−β−Ｄ−リボピラノシル｝−５−（２−フタルイミドエチル）ウラシル８５ｇ（７６％）を得た。
ＴＬＣ：Ｒｆ０．３６（酢酸エチル／ヘプタン２：１）
【０１２５】
【化４１】
0004601817.tif 000035
【０１２６】
５．２インドールベースリンカー
文献記載のように（Ｋｕｅｈｎｅら ，Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ４３，１３，１９７８，２７３３−２７３５）、無水フタル酸とトリプタミンからＮ−フタロイルトリプタミンを得た。これを（Ａ． Ｇｉａｎｎｉｓら，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．１９８９，１０１，２２０ に類似して）ボラン−ＴＨＦで還元してインドリンを得た。
【０１２７】
３−置換インドリンを先ずリボースと反応させ、ヌクレオシドトリオールを得て、次いで無水酢酸と反応させてトリアセテートを得た。混合物を２，３−ジクロロ−５，６−ジシアノパラキノンで酸化し、アセテートをナトリウムメトキシドで開裂し、選択的に２′位にベンゾイル化し、選択的に４′位にＤＭ−トリチル化し、転移反応を行わせて３′−ベンゾエートを得た。ホスホルアミダイトの生成は常法で行われた。これは合成プロトコルの変更なしに自動オリゴヌクレオチド合成に用いられる。
操作
３−（Ｎ−フタロイル−２−アミノエチル）インドリン
【０１２８】
【化４２】
0004601817.tif 000036
【０１２９】
フタロイルトリプタミンＡ５１．４ｇ（１７７ミリモル）を窒素雰囲気下に１Ｍボラン−ＴＨＦ溶液（２当量）３５４ｍｌに溶解し、０℃に冷却した。トリフルオロ酢酸３５４ｍｌを（ガスの発生に注意して）０℃で徐々に滴下し、混合物を３０分間攪拌した（ＴＬＣチェック：ＥｔＯＡｃ）。次いで水１７．３ｍｌを加え、混合物を１０分間攪拌し真空で濃縮した。残渣を１０％濃度ＮａＯＨ溶液／ジクロロメタンに溶解し、有機相を分別し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥し、ろ過、真空で濃縮した。残渣（５０．９ｇ）を加熱エタノール（３リットル）から再結晶して化合物Ｂ４１．４ｇを得た。ｍ．ｐ．１６１−１６２℃。母液を真空で濃縮し、残渣を再度エタノールから再結晶してさらに化合物Ｂ３．２ｇを得た。ｍ．ｐ．１５８−１５９℃。全収率：４４．６ｇ（１５３ミリモル）の化合物Ｂすなわち８６％。
【０１３０】
【化４３】
0004601817.tif 000037
【０１３１】
３−（Ｎ−フタロイル−２−アミノエチル）−１−（２′，３′，４′−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−リボピラノシル）インドール
【０１３２】
【化４４】
0004601817.tif 000038
【０１３３】
化合物Ａ４５．２ｇ（１５５ミリモル）及びＤ−リボース２３．２ｇ（１５５ミリモル；１．０当量）を乾燥エタノール７５０ｍｌに懸濁させ、窒素雰囲気下に４時間加熱還流した（ＴＬＣチェック：ＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ１０：１）。室温に冷却後、混合物を真空で濃縮した。残渣をピリジン３００ｍｌに溶解し、氷冷しながら無水酢酸１５５ｍｌで処理した。１５分後、氷浴を除去し、混合物を室温で１８時間攪拌した（ＴＬＣチェック：ＥｔＯＡｃ／イソヘキサン１：１）。この溶液を真空で濃縮し、各回トルエン３００ｍｌで３回共蒸発した。得られた油分をジクロロメタン９００ｍｌに溶解し、氷冷しながら２，３−ジクロロ−５，６−ジシアノパラキノン３８．８ｇ（１７１ミリモル；１．１当量）で処理した。１５分後、氷浴を除去し、混合物を室温で１．５時間攪拌した（ＴＬＣチェック：ＥｔＯＡｃ／イソヘキサン１：１）。沈殿を吸引ろ別し、ジクロロメタンで洗浄し、捨てた。ろ液を飽和ＮａＨＣＯ3溶液６００ｍｌで洗浄した。この過程で析出した沈殿を再度吸引ろ別し、ジクロロメタンで洗浄し、捨てた。併せた有機抽出物をＮａ2ＳＯ4で乾燥し、真空で濃縮した。残渣（９０．９ｇ）をシリカゲル６０でのクロマトグラフィー（１０×２５ｃｍ；ＥｔＯＡｃ／イソヘキサン２：３）により精製した。次のものを得た：純粋な化合物Ｂ２１．５ｇ、混合画分は４６．８３ｇでこの新たなクロマトグラフィー処理後にさらに純粋な化合物Ｂ２０．４ｇを得た。全収率：４１．９ｇ（７６ミリモル）の化合物Ｂすなわち４９％。
【０１３４】
【化４５】
0004601817.tif 000039
【０１３５】
３−（Ｎ−フタロイル−２−アミノエチル）−１−β−Ｄ−リボピラノシル−インドール
【０１３６】
【化４６】
0004601817.tif 000040
【０１３７】
化合物Ａ４４．１ｇ（８０ミリモル）を窒素雰囲気下に無水メタノール４００ｍｌに溶解した。混合物を氷冷しながら３０％濃度ナトリウムメトキシド溶液４．０mlで処理し、次いで室温で１８時間攪拌した。沈殿を吸引ろ別し、冷エタノールで洗浄した。ろ液を真空で濃縮した。残渣をジクロロメタンにとり、この溶液を飽和ＮａＨＣＯ3溶液で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥し、真空で濃縮した。得られた残渣を反応溶液から析出した沈殿と共に加熱エタノールから再結晶させて化合物Ｂ２２．６gを得た。融点１９６−１９８℃。母液を真空で濃縮し、残渣を再度エタノールから再結晶してさらに化合物Ｂ９．２ｇを得た。ｍ．ｐ．１８８−１９４℃。全収率：２５．８ｇの化合物Ｂ，すなわち７６％。
【０１３８】
【化４７】
0004601817.tif 000041
【０１３９】
１−（２′−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−リボピラノシル）−３−（Ｎ−フタロイル−２−アミノエチル）インドール
【０１４０】
【化４８】
0004601817.tif 000042
【０１４１】
化合物Ａ１０．６ｇ（２５ミリモル）を窒素雰囲気下に乾燥ジクロロメタン２５０ｍｌにとり、混合物をＤＭＡＰ３０５ｍｇ（２．５ミリモル）及びピリジン２０ｍｌで処理した。これを全てが溶液になるまで加熱し、次いで−７８℃で冷却した。ジクロロメタン８ｍｌに溶解したベンゾイルクロリド３．３５ｍｌ（２８．８ミリモル）を１５分間かけて滴下した。さらに３０分後ＴＬＣチェック（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン３：１）は完全な反応を示した。４５分後、この冷溶液を折り畳みフィルターを通して飽和ＮＨ４Ｃｌ溶液２００ｍｌに直接加え、ろ過残渣をジクロロメタンで洗浄した。有機相を１回水洗し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、濃縮した。残渣をトルエンで２回共蒸発させ、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン３：１を用いた１０×２０ｃｍシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィーにより精製して化合物Ｂ８．１ｇ（６４％）を得た。
【０１４２】
【化４９】
0004601817.tif 000043
【０１４３】
１−｛３′−Ｏ−ベンゾイル−４′−Ｏ−［（４，４′−ジメトキシトリフェニル）メチル−β−Ｄ−リボピラノシル｝−３−（Ｎ−フタロイル−２−アミノエチル）インドール
【０１４４】
【化５０】
0004601817.tif 000044
【０１４５】
化合物Ａ８．９ｇ（１６．９ミリモル）を窒素雰囲気下に乾燥ジクロロメタン１３５ｍｌに懸濁させた。混合物を（完全に溶液になるまで）ＤＭＡＰ２０６ｍｇ（１．６８ミリモル）、Ｎ−エチルジイソプロピルアミン５．８ｍｌ（３３．７ミリモル）及びピリジン約１２ｍｌで処理した。これを３４ｇのモレキュラーシーブ４Åで処理し、３０分間攪拌した。０℃に冷却後、ＤＭＴＣｌ１１．４ｇ（３３．７ミリモル）で処理し、冷却浴を除去後、７５分間攪拌した。次いで、さらにＤＭＴＣｌを１．９４ｇ（０．３４当量）、さらに４０分後１．１４ｇ（０．２当量）、及びさらに６５分後１．１４ｇ（０．２当量）加えた。４．２５時間後反応は完了した。次いで混合物をｎ−プロパノール２５．３ｍｌ（２０当量）で処理し、さらに３０分間攪拌し、次いで注意深く（泡発生）濃縮した。残渣をピリジン１００ ｍｌに溶解し、ＤＭＡＰ１．８５ｇ（１５．１ミリモル；０．９当量）、 Ｎ−エチルジイソプロピルアミン１３．０５ｍｌ（１０１ミリモル；６．０当量）、ｎ−プロパノール７１ ｍｌ（９４０ミリモル；５６当量）及びｐ−ニトロフェノール３．７４ｇ（２６．９ミリモル；１．６当量）で処理した。この混合物を窒素下に７５−８０℃で９６時間攪拌した。室温に冷却後、混合物をセライトを通してろ過し、濃縮した。残渣を、トルエン／ジエチルエーテル／トリエチルアミン９０：１０：１を用いてシリカゲル（９×１７ｃｍ）でのフラッシュクロマトグラフィーで精製した。生成物含有画分（９．２５ｇ）を先ずＥｔＯＡｃから再結晶させ、次いでトルエン／メタノールから再沈殿させて化合物Ｂ５．８６ｇ（４２％）を得た。
【０１４６】
【化５１】
0004601817.tif 000045
【０１４７】
１−｛２′−Ｏ−（アリルオキシ）（ジイソプロピルアミノ）ホスフィノ−３′−Ｏ−ベンゾイル−４′−Ｏ−［（４，４′−ジメトキシトリフェニル）メチル］−β−Ｄ−リボピラノシル｝−３−（Ｎ−フタロイル−２−アミノエチル）インドール
（２ジアステレオマー）
【０１４８】
【化５２】
0004601817.tif 000046
【０１４９】
アルコールＡ１６５８ｍｇ（２．０ミリモル）をアルゴン雰囲気下に乾燥ジクロロメタン１０ｍｌに溶解した。溶液をＮ−エチルジイソプロピルアミン１．０３ｍｌ（６．０ミリモル）及びモノアリルｎ−ジイソプロピルクロロホスホルアミダイト０．６３ｍｌ（２．８ミリモル）で処理し、室温で１時間攪拌した。次いで過剰のホスホリル化試剤をイソプロパノール６１μｌ（０．８ミリモル）を加えて分解した。１０分後、混合物を真空で濃縮し、残渣を、ヘキサン／ＥｔＯＡｃ／ＮＥｔ３（７５：２５：１）を用いてシリカゲル（３．３×２１ｃｍ）でのフラッシュクロマトグラフィーで精製した。生成物含有画分を濃縮し、ＣＣｌ４にとり、再度濃縮してほとんど無色の泡（ｆｏａｍ）２．０４ｇ（定量的）を得た。これはオリゴマー化に直接用いられ、数週間−２０℃に保持される。
シリカゲルでのＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン／ＮＥｔ３３３：６６：１）：０．４１
【０１５０】
【化５３】
0004601817.tif 000047
【０１５１】
５．３リジンベースリンカー
合成はスキーム７に描写され、以下に詳述される。
【０１５２】
【化５４】
0004601817.tif 000048
【０１５３】
スキーム７：リジンリンカーの合成
６−アミノ−２（Ｓ）−ヒドロキシヘキサン酸（１）を、 Ｌ−リジンから文献（Ｋ．−Ｉ．Ａｋｅｔａ，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．１９７６，２４，６２１）から知られた方法でジアゾ化及び次いでの加水分解により得た。
２−（Ｓ）−Ｎ−Ｆｍｏｃ−６−アミノ−１，２−ヘキサンジオール（２）
ＬｉＢＨ４３．４ｇ（１５６ミリモル，４当量）をアルゴン下に無水ＴＨＦ（発熱性）１００ｍｌに溶解した。約３０℃に冷却後、ＴＭＳＣｌ３９．６ｍｌ（３１２ミリモル，８当量）を徐々に滴下し（ガス発生）、沈殿を生成させた。６−アミノ−２（Ｓ）−ヒドロキシヘキサン酸 （１）５．７４ｇ（３９ミリモル）をアルゴン向流で分けて加え、混合物をＴＬＣ（シリカゲル；ｉ−ＰｒＯＨ／濃ＮＨ４ＯＨ／水７：２：１；ニンヒドリンで着色）がもはや出発物質を何ら示さなくなるまで（約３時間）６５℃に加熱した。混合物を氷冷しながらメタノール１２０ｍｌで注意深く処理した（激しいガス発生）。溶媒を真空で濃縮し、残渣を各回メタノール２００ｍｌで３回共蒸発させ、次いで無水ＤＭＦ１００ｍに溶解した。エチルジイソプロピルアミン１６ｍｌ（９３．６ミリモル，２．４当量）を加えた後、混合物を０℃に冷却し、ＦｍｏｃＣｌ１２．１ｇ（４６．８ミリモル，１．２当量）で分けて処理した。１５分後、冷浴を除去し、混合物を出発物質が消費されるまで（約３時間；ＴＬＣチェック：シリカゲル；ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＨＯＡｃ／水６０：３０：３：５）室温で攪拌した。反応溶液を飽和ＮａＨＣＯ３溶液６００ｍｌに加えた。沈殿をろ別し、水２００ｍｌで洗浄し、重量が一定になるまで（約６時間）高真空で５０℃で乾燥して、無色固体１３．９ｇを得た。これを酢酸エチル（４０ｍｌ）／ｎ−ヘキサン（３５ｍｌ）から再結晶した。収率：９．０５ｇ（６５％）
【０１５４】
【化５５】
0004601817.tif 000049
【０１５５】
２−（Ｓ）−Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｏ１−ＤＭＴ−６−アミノ−１，２−ヘキサンジオール（３）をＷＯ８９／０２４３９に従いＤＭ−トリチル化した。
２−（Ｓ）−Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｏ１−ＤＭＴ−Ｏ２−アリルオキシジイソプロピルアミノ−ホスフィニル−６−アミノ−１，２−ヘキサンジオール（４）
エチルジイソプロピルアミン０．５１ｍｌ（３．０ミリモル、３当量）及びクロロ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノアリルオキシホスフィン０．３３ｍｌ（１．５ミリモル，１．５当量）を無水ジクロロメタン１０ｍｌ中のアルコール（３）６７０ｍｇ（１．０２ミリモル）の溶液にアルゴン下に加えた。混合物を室温で２時間攪拌し、溶媒を真空で留去し、得られた残渣を、３．２×１６ｃｍシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー（ ＥｔＯＡｃ／イソヘキサン／ＮＥｔ３２０：８０：１）で精製して僅かに黄色の油分８３９ｍｇ（９７％）を得た。
ＴＬＣ：シリカゲル；ＥｔＯＡｃ／イソヘキサン／ＮＥｔ３５０：５０：１；ＵＶ； Ｒｆ０．７７。
【０１５６】
【化５６】
0004601817.tif 000050
【０１５７】
実施例６
カップリング試薬としてベンズイミダゾリウムトリフレートを用いる配列（ｓｅｑｕｅｎｃｅ）４′−インドールリンカー−Ａ８−２′のｐ−ＲＮＡオリゴの合成。
【０１５８】
インドールリンカーホスホルアミダイト１０８ｍｇ及びＡホスホルアミダイト２４４ｍｇを合成びん（ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ  ｖｉａｌ）に秤量し、Ａユニットを載置させたＣＰＧ担体２８．１ｍｇを充填したカラムとともにＫＯＨ上でデシケータ中に高真空で３時間放置した。ホスホルアミダイトを１ｍｌ（インドールリンカー）又は２．５ｍｌ（Ａホスホルアミダイト）のアセトニトリル中に溶解し、数粒のモレキュラーシーブを加え、ＫＯＨ上でデシケータ中に密閉放置した。
【０１５９】
ヨウ素２００ｍｇをアセトニトリル５０ｍｌに激しく攪拌しながら溶解した。全てが溶解した後（目視制御）、水２３ｍｌ及びｓｙｍ−コリジン４．６ｍｌを加え、溶液を一度完全に混合させた。脱トリチル化のため、ジクロロメタン中のジクロロ酢酸の６％濃度溶液を用いた。キャッピング試薬（無水酢酸＋塩基）を購入し、オリゴヌクレオチド合成に常法に従い用いた。
【０１６０】
ベンズイミダゾリウムトリフレートを加熱アセトニトリルから再結晶させ乾燥した。ほとんど無色の結晶を用い、無水アセトニトリル中の０．１Ｍ溶液をカップリング試薬として調製した。合成中、この溶液を常に清浄なままにし、合成器の管の閉塞を起こさせなかった。Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｅｃｏｓｙｎ３００＋（ＤＭＴ−ｏｎｅ）での修飾された（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）ＤＮＡカップリングサイクル：脱トリチル化７分、カップリング１時間、キャッピング１．５分、酸化１分。
【０１６１】
テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム２０ｍｇをジクロロメタン１．５ｍｌに溶解し、ジエチルアンモニウム重炭酸塩２０ｍｇ、トリフェニルホスフィン２０ｍｇ及びオリゴヌクレオチドを担持するガラス担体を加え、きつくシールし（Ｐａｒａｆｉｌｍ）、びん（ｖｉａｌ）を室温で５時間攪拌した。次いで、ガラス担体を分析用吸引フィルターで吸引ろ別し、ジクロロメタン、アセトン及び水で洗浄した。
【０１６２】
担体を０．１モルのナトリウムジエチルジチオカルバメート水溶液を用いて懸濁させ、室温で４５分間放置した。これを吸引ろ別し、水、アセトン、エタノール及びジクロロメタンで洗浄した。担体を２４％濃度ヒドラジン水和物溶液１．５ｍｌに懸濁させ、４℃で２４−３６時間振とうし、０．１モルのトリエチルアンモニウム重炭酸塩緩衝液（ＴＥＡＢバッファー）で ７ｍｌに希釈した。これをＷａｔｅｒｓ Ｓｅｐ−Ｐａｋカートリッジでヒドラジンがなくなるまで洗浄した。これを８０％濃度ギ酸溶液５ｍｌで処理し、３０分後濃縮乾燥した。残渣を水１０ｍｌにとり、ジクロロメタンで抽出し、水性相を濃縮し、次いでＨＰＬクロマトグラフィー（ｔＲ＝３３分，０．１Ｍトリエチルアンモニウム酢酸塩バッファー中のアセトニトリルのグラジエント）に付した。常法の脱塩により（Ｗａｔｅｒｓ Ｓｅｐ−Ｐａｋカートリッジ）によりオリゴヌクレオチドを得た。収率：１７．６ＯＤ。物質の同一性を，ＥＳＩマススペクトロスコピー：Ｍ（Ｃａｌｃ．）＝３０８２Ｄ，（Ｍ＋２Ｈ）２＋（ｆｏｕｎｄ）＝１５４１．９Ｄにより証した。
実施例７
複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）の製造
１．逐次法（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ ｐｒｏｃｅｓｓ）
先ず、配列（ｓｅｑｕｅｎｃｅ）Ａ８のｐ−ＲＮＡオリゴマーすなわちオクタマー（ｏｃｔａｍｅｒ）を実施例２に記載したようにＥｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｅｃｏｓｙｎ Ｄ３００＋上で調製し、次いで、試剤を次のとおりそれぞれ変更する：すなわち濃度２％のトリクロロ酢酸に代えて濃度６％のジクロロ酢酸を、ピリジン中のヨウ素に代えてコリジン中のヨウ素を、テトラゾール溶液に代えてベンズイミダゾリウムトリフレート溶液をそれぞれ用いる。合成プログラムを変えた後、さらに配列ＧＡＴＴＣのＤＮＡオリゴマーを既知の方法に従い合成する（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，オリゴヌクレオチド合成，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ１９８４）。脱アリル化、ヒドラジン分解、ＨＰＬクロマトグラフィー及び脱塩をｐ−ＲＮＡオリゴマー用に記載されているように（上記参照）行い、所望の複合体を得る。
２．集中法（ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ ｐｒｏｃｅｓｓ）
実施例２に記載されているように、配列４′−インドールリンカー−Ａ８−２′をもつｐ−ＲＮＡオリゴマーを調製し、精製し、ヨウドアセチル化する。配列ＧＡＴＴＣ−チオールリンカーのＤＮＡオリゴマーを既知の方法に従い合成し（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，オリゴヌクレオチド合成，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，英国１９８４）、精製する（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ：Ｎｏ．２０−２９３３からの３′−チオールリンカー）。二つの断片を緩衝液中に放置すると（Ｔ．Ｚｈｕ．ら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１９９４，５，３１２）複合体を生じ、これを最後にＨＰＬＣで精製する。
実施例８
ビオチン基のアミノ変性ｐ−ＲＮＡへの複合
先ず、実施例６に記載された方法に類似して、Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ ［２−（２−（４−（モノメトキシトリチル）アミノエトキシ）エチル２−シアノエチル （Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホルアミダイト）］の５′−アミノ変性剤５の手段で４′−末端にアミノ基を具備させた、配列ＴＡＧＧＣＡＡＴのｐ−ＲＮＡオリゴマーを合成した。オリゴヌクレオチド（１７．０４ＯＤ，０．１７５μｍｏｌ）を塩基性バッファー０．５ｍｌにとり、ビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル１．１４ｍｇ（２．５μｍｏｌ）を無水ＤＭＦ１１４μｌに溶解し、溶液を室温で１時間放置した。生成した複合体を予備（ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ）ＨＰＬＣで精製し、純粋な生成物をＳｅｐａｋを用いて脱塩した。収率：８．６ＯＤ（４９％）。Ｍ（ｃａｌｃ．）＝３０８０Ｄ，Ｍ（ｆｅｆ）＝３０８０．４Ｄ。
実施例９
シアニン又はビオチン−標識ｐ−ＲＮＡオンライン（ｏｎｌｉｎｅ）製造
先ず、種々のＡ，Ｔ，Ｇ，Ｃ及びＩｎｄ（Ｉｎｄ＝核酸塩基としてのアミノエチルインドール）ホスホルアミダイトを既知の方法により製造した。シアニン（Ｃｙ３−ＣＥ）及びビオチンホスホルアミダイトをＧｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈから得た。
【０１６３】
完全自動固相合成を各場合１５μｍｏｌを用いて行った。１合成サイクルは次の工程からなる。
（ａ）脱トリチル化： ＣＨ2Ｃｌ2（７９ｍｌ）中６％ＤＣＡ（ジクロロ酢酸）で５分；
（ｂ） ＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍｌ）、アセトニトリル（２０ｍｌ）で洗浄及び次いでのアルゴンでのフラッシング（ｆｌｕｓｈｉｎｇ）；
（ｃ）カップリング：活性化剤での樹脂の洗浄（ ＣＨ２Ｃｌ２０．２ｍｌ中の０．５ＭピリジンＨＣｌ）；活性化剤（０．７６ml）及び相当するホスホルアミダイト（０．７６ml：８当量；アセトニトリル中０．１Ｍ）の比１：１での３０分処理；
（ｄ）キャッピング：Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅからの５０％ＣａｐＡ（１０．５ｍｌ）及び５０％ＣａｐＢ（１０．５ｍｌ）（ＣａｐＡ：ＴＨＦ、ルチジン、無水酢酸；ＣａｐＢ：１−メチルイミダゾール、ＴＨＦ、ピリジン）で２分
（ｅ）酸化：ヨウ素溶液（アセトニトリル１００ｍｌ、水４６ｍｌ及びｓｙｍ−コリジン９．２ｍｌ中のヨウ素４００ｍｇ）１２０ｍｌで１分；
（ｆ）アセトニトリル（２２ｍｌ）で洗浄。
【０１６４】
引き続いてのオリゴヌクレオチドのＨＰＬＣ精製を容易にするために、最後のＤＭＴ（ジメトキシトリチル）又はＭＭＴ（モノメトキシトリチル）保護基をビオチン又はシアニンモノマーからは除去しなかった。最後のカップリングの変性ホスホルアミダイトでの検出は合成後にＵＶ（５０３ｎｍ）でのトリチルカチオン吸収の手段で樹脂の１％で実施される。
オリゴヌクレオチドの作製（ｗｏｒｋ−ｕｐ）：
アリルエーテル保護基を、ＣＨ2Ｃｌ2（１５ｍｌ）中のテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（２７２ｍｇ）、トリフェニルホスフィン（２７２ｍｇ）及びジエチルアンモニウム重炭酸塩の溶液で室温で５時間処理して除去した。次いで、ガラス担体をＣＨ2Ｃｌ2（３０ｍｌ）、アセトン（３０ｍｌ）及び水（３０ｍｌ）で洗浄した。パラジウム錯体残渣を除去するために、樹脂を０．１Ｍナトリウムジエチルジチオカルバメート水和物水溶液でリンスした。上述の洗浄操作を反対の順でもう一度行った。次いで、樹脂を高真空で１０分乾燥した。同時に脱ベンゾイル化を伴うガラス担体からの除去工程を２４％ヒドラジン水和物溶液（６ｍｌ）中４℃で行った。ＲＰ１８上でのＨＰＬＣチェッキング（１８−２５時間）後、オリゴヌクレオチド「Ｔｒｉｔｙｌ ＯＮ」を、活性化された（アセトニトリル、２０ｍｌ）Ｗａｔｅｒｓ Ｓｅｐ−Ｐａｋ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅでヒドラジンから取り除いた。ヒドラジンをＴＥＡＢ０．１Ｍ（３０ｍｌ）で洗浄した。次いで、オリゴヌクレオチドをアセトニトリル／ＴＥＡＢ０．１Ｍ（１０ｍｌ）で溶出した。次いで、混合物をＨＰＬＣ（断片配列の分離用）で精製し、ＤＭＴ脱保護（８０％濃度水性ギ酸３０ｍｌ）を行った。最後に脱塩して（ＴＥＡＢバッファー０．１Ｍ／アセトニトリル：１／１を用いたＳｅｐ−Ｐａｋ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅで）、純粋なシアニン−又はビオチン−標識オリゴマーを得た。このオリゴ溶液の一部（アリコート）をＥＳＩ−ＭＳを行うために用いた。４′Ｃｙ−ＡＩｎｄＴＴＣＣＴＡ２′：Ｍ＝３０２６、（Ｍ＋Ｈ）+＝３０２７。４′ビオチン−ＴＡＧＧＡＡＩｎｄＴ２′：Ｍ＝３０１４、（Ｍ＋Ｈ）2+ｍ／ｅ１５０８及び（Ｍ＋Ｈ）+ｍ／ｅ ３０１５。
オリゴ体（Ｏｌｉｇｏｓ）を貯蔵のため凍結乾燥した。
実施例１０
ｐ−ＲＮＡのＮ−（ヨードアセチルオキシ）−スクシンイミドでのヨードアセチル化
ｐ−ＲＮＡ配列：４′ＡＧＧＣＡＩｎｄＴ２′Ｍｗ＝２２６６．５６ｇ／モル（Ｉｎｄ＝インドール−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ2−リンカー
ｐ−ＲＮＡ１当量を０．１モル重炭酸ナトリウム溶液（ｐＨ８．４）に溶解し（３５０ｎｍｏｌ当たり１ｍｌ）、ＤＭＳＯ中のＮ−（ヨードアセチルオキシ）スクシンイミド溶液で処理した（ｍｇ当たり４０μｌ）。バッチをＡｌフィルムで暗くし（ｂｌａｃｋｅｄ ｏｕｔ）、室温で３０−９０分放置した。
【０１６５】
反応の進行を分析用ＨＰＬＣで監視した。標準条件は次のとおりである。
バッファーＡ；水での０．１モルのトリエチルアンモニウム酢酸塩バッファー
バッファーＢ；水：アセトニトリル（１：４）での０．１モルのトリエチルアンモニウム酢酸塩バッファー
グラジエント：１０％Ｂから出発して４０分で５０％Ｂへ
カラム材：Ｍｅｒｃｋ Ｄａｒｍｓｔａｄｔ ＧｍｂＨ製の、１０μＭのＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒｅ（登録商標）１００ＲＰ−１８；２５０×４ｍｍ
出発物質の保持時間：１８．４分
この場合の生成物の保持時間：２３．１分
反応が完了した後、バッチを水で４倍容に希釈した。Ｗａｔｅｒｓ Ｓｅｐ−Ｐａｋ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ ＲＰ−１８（１５ ＯＤ ２ｇのパッキングから）を２×１０ｍｌのアセトニトリル及び２×１０ｍｌの水で活性化し、オリゴを適用し、埋入させ（ｓｉｎｋ ｉｎ）、塩及び試剤を除去するために反応容器を２×１０ｍｌの水で洗浄し、３×１０ｍｌの水で再洗浄し、先ず５×１ｍｌの水：アセトニトリル（５０：１）、次いで水：アセトニトリル（１：１）で溶出した。生成物を非常に良い純度で１：１画分で溶出した。画分は冷却して暗所で濃縮し、併せ、再度濃縮した。収率をＵＶ吸収分光計で２６０ｎｍで決定した。質量分析：
配列：４′ＡＧＧＣＡＩｎｄ（ＣＨ2ＣＨ2ＮＨＣＯＣＨ2−Ｉ）Ｔ２′
算出（ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ）質量：２４３４．５０ｇ／モル
質量ＭＨ22+：２４３３ｇ／モル
実施例１１
ｐ−ＲＮＡの配列ＣＹＳＫＶＧのペプチドへの複合
ヨードアセチル化ｐ−ＲＮＡ（Ｍw＝２４３４．５０ｇ／モル）をバッファー系に溶解し（１１４ｎｍｏｌ当たり１０００μｌ）、次いでバッファーでのペプチド溶液（２モルのＣＹＳＫＶＧペプチド； Ｍw＝６５５．７７３ｇ／モル；バッファー２０μｌ中の２２８ｎｍｏｌ）で処理した。
バッファー系：Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅ Ｈａｅｎ製のＢｏｒａｘ／ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）を、１０ミリモルのＥＤＴＡジナトリウム塩の水溶液と１：１比で混合し、ＨＣｌを用いｐＨ６．３に調整した。このようにして５ｍＭのＮａ2ＥＤＴＡを含む溶液を得た。
【０１６６】
バッチを転化が完了するまで室温で暗所に放置した。反応をＨＰＬＣ分析で監視した。標準条件は次のとおりである。
バッファーＡ；水での０．１モルのトリエチルアンモニウム酢酸塩バッファー
バッファーＢ；水：アセトニトリル（１：４）での０．１モルのトリエチルアンモニウム酢酸塩バッファー
グラジエント：１０％Ｂから出発して４０分で５０％Ｂへ
カラム材：Ｍｅｒｃｋ Ｄａｒｍｓｔａｄｔ ＧｍｂＨ製の、１０μＭのＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒｅ（登録商標）１００ＲＰ−１８；２５０×４ｍｍ
出発物質の保持時間：１７．６分
生成物の保持時間：１５．５分
反応が完了した後、バッチをＲＰ−ＨＰＬＣで直接精製した。（標準条件は上記参照）。
【０１６７】
画分は冷却して暗所で濃縮し、併せ、再度濃縮した。残渣を水にとり、脱塩した。Ｗａｔｅｒｓ Ｓｅｐ−Ｐａｋ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ ＲＰ−１８（１５ ＯＤ ２ｇのパッキングから）を２×１０ｍｌのアセトニトリル及び２×１０ｍｌの水で活性化し、オリゴを適用し、埋入させ、塩を除去するために反応容器を２×１０ｍｌの水で洗浄し、３×１０ｍｌの水で再洗浄し、水：アセトニトリル（１：１）で溶出した。生成物画分は濃縮し、併せ、再度濃縮した。収率をＵＶ吸収分光計で２６０ｎｍで決定した。それは理論値の７０−９５％に達した。
質量分析：
配列：４′ＡＧＧＣＡＩｎｄ（ＣＨ2ＣＨ2ＮＨＣＯＣＨ2−ＣＹＳＫＶＧ）Ｔ２′
算出（ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ）質量：２９６２．３６ｇ／モル
質量ＭＨ22+：２９６２ｇ／モル
実施例１２
ｐ−ＲＮＡのペプチドライブラリへの複合
ヨードアセチル化ｐ−ＲＮＡ（Ｍｗ＝２４３４．５０ｇ／モル）をバッファー系に溶解し（８３２ｎｍｏｌ当たり１３００μｌ）、次いでペプチドライブラリ（ＣＫＲ−ＸＸ−ＯＨ；Ｘ＝Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ）溶液でバッファー［８モル；平均分子質量Ｍｍ＝６７７．８２ｇ／モル；バッファー２００μｍｏｌ中の４．５ｍｇ（６．６６μｍｏｌ）］中で処理した。
バッファー系：Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅ Ｈａｅｎ製のＢｏｒａｘ／ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）を、１０ミリモルのＥＤＴＡジナトリウム塩の水溶液と１：１比で混合し、ＨＣｌを用いｐＨ６．６に調整した。このようにして５ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡを含む溶液を得た。バッチを転化が完了するまで室温で暗所に放置した。反応をＨＰＬＣ分析で監視した。この場合、出発物質は７０時間後に消失した。分析用ＨＰＬＣの標準条件は次のとおりである。
バッファーＡ；水での０．１モルのトリエチルアンモニウム酢酸塩バッファー
バッファーＢ；水：アセトニトリル（１：４）での０．１モルのトリエチルアンモニウム酢酸塩バッファー
グラジエント：１０％Ｂから出発して４０分で５０％Ｂへ
カラム材：Ｍｅｒｃｋ Ｄａｒｍｓｔａｄｔ ＧｍｂＨ製の、１０μＭのＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒｅ（登録商標）１００ＲＰ−１８；２５０×４ｍｍ
出発物質の保持時間：１８．８分
生成物の保持時間：１３．９−３６．２分から数個のピーク
反応が完了した後、バッチを水を用い４倍容に希釈した。Ｗａｔｅｒｓ Ｓｅｐ−Ｐａｋ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ ＲＰ−１８（１５ ＯＤ ２ｇのパッキングから）を３×１０ｍｌのアセトニトリル及び３×１０ｍｌの水で活性化し、オリゴを適用し、埋入させ、反応容器を２×１０ｍｌの水で再洗浄し、塩及び過剰のペプチドを除去するためにカートリッジを３×１０ｍｌの水で再洗浄し、生成物がもはやＵＶ分光計で溶出されなくなるまで水：アセトニトリル（１：１）で溶出した。画分は冷却して暗所で濃縮し、併せ、再度濃縮した。
【図面の簡単な説明】
【図１】  天然に産生する形態（左）及びｐ−ＮＡ（右）の形態のＲＮＡの構造の断面を示す。
【図２】  Ｅｓｃｈｅｎｍｏｓｅｒら（１９９３）によるｐ−リボ（Ａ，Ｕ）オリゴヌクレオチドの合成を図式的に示す。
【図３】  固体担体上の固定化認識構造（アレイ）の配列を図式的に示す。
【図１】
0004601817.tif 000056
【図２】
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0004601817.tif 000058
【図３】
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