(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
【化１】
0004499361.tif 000040
【化２】
0004499361.tif 000041
で示される化合物、またはそれらの製薬上許容される塩、溶媒和物もしくはカルボキシ基から誘導されるＣ１−Ｃ６アルキルエステルを有効成分として含有する、血清リポタンパク質変性を抑制するための医薬組成物。
【請求項２】
式：
【化３】
0004499361.tif 000042
【化４】
0004499361.tif 000043
で示される化合物、またはそれらの製薬上許容される塩、溶媒和物もしくはカルボキシ基から誘導されるＣ１−Ｃ６アルキルエステルを有効成分として含有する、動脈硬化症を治療または予防するための医薬組成物。
【請求項３】
式：
【化５】
0004499361.tif 000044
【化６】
0004499361.tif 000045
で示される化合物、またはそれらの製薬上許容される塩、溶媒和物もしくはカルボキシ基から誘導されるＣ１−Ｃ６アルキルエステルを有効成分として含有する、動脈硬化を基盤とする虚血性疾患を治療または予防するための医薬組成物。
【請求項４】
式：
【化７】
0004499361.tif 000046
で示される化合物、またはそれらの製薬上許容される塩、溶媒和物もしくはカルボキシ基から誘導されるＣ１−Ｃ６アルキルエステルを有効成分として含有する、動脈硬化症または動脈硬化を基盤とする虚血性疾患を治療または予防するための医薬組成物。
【請求項５】
式：
【化８】
0004499361.tif 000047
で示される化合物、またはそれらの製薬上許容される塩もしくは溶媒和物を有効成分として含有する、動脈硬化症または動脈硬化を基盤とする虚血性疾患を治療または予防するための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、Ｖ型またはＸ型分泌型ホスホリパーゼＡ２（Ｖ型またはＸ型ｓＰＬＡ２）の血清リポタンパク質に対する強力な変性作用を阻害するためのＶ型および／またはＸ型ｓＰＬＡ２阻害剤、詳細には動脈硬化を基盤とする虚血性疾患を治療、予防および診断するための医薬組成物に関する。
背景技術
動脈硬化は、動脈壁が肥厚、硬化を示す病変の総称である。動脈硬化病変は、病理学的に粥状動脈硬化、細動脈硬化および中膜壊死の３種類に大別されるが、中でも粥状動脈硬化は心筋梗塞や脳梗塞など虚血性疾患の原因となり得る点で最も重要視されている。粥状動脈硬化の発生と密接に関連しているのが高脂血症であり、これは血清中のコレステロールや中性脂肪などの血清脂質の量が増加した状態のことを言う。血清脂質はタンパク質と複合体を形成したリポタンパク質として存在し、特にコレステロールを含むリポタンパク質は、その密度により、超低密度リポタンパク質（ｖｅｒｙ  ｌｏｗ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ、ＶＬＤＬ）、低密度リポタンパク質（ｌｏｗ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ、ＬＤＬ）、高密度リポタンパク質（ｈｉｇｈ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ、ＨＤＬ）などに分類される。このうちＬＤＬは、末梢組織のＬＤＬ受容体を介して細胞内に取り込まれることにより細胞へコレステロールを供給する役割を担っている。
粥状動脈硬化の初期病態では、このＬＤＬが何らかの変性を受け、正常のＬＤＬと比較して脂質の過酸化、粒子全体の陰性電荷の増加、リン脂質の分解による組成変化とそれに伴う構造変化、小型化（密度の増加）などが引き起こされ（Ｙｏｋｏｄｅら、臨床検査４４，１０５２−１０５８（２０００））、この変性を受けたＬＤＬは血管内膜に浸潤した単球、マクロファージによってスカベンジャー受容体を介して取り込まれ、その結果コレステリルエステルの油滴を蓄積した泡沫細胞を生じさせ、Ｔリンパ球や血管平滑筋とともに脂肪線条（ｆａｔｔｙ  ｓｔｒｅａｋ）を形成する。その後、脂肪線条に存在する細胞間の相互作用により病変が進行し、繊維性硬班といわれる血管内腔における硬性の隆起病変へと進行し、さらに周囲の結合組織が増加することにより、石灰化や血栓の付着を伴う病態、粥状動脈硬化へと進行する。一方、ＨＤＬは、末梢組織の余剰のコレステロールを肝臓に運ぶ役割を担っており、動脈硬化の進展に対しては抑制的に働いている。しかし、血中ＨＤＬレベルが低下したりＨＤＬの変性が起こると、その機能低下により血中遊離コレステロール量が増加し、動脈硬化発症の原因の一つとなっている。
このように、ＬＤＬ、ＨＤＬなどのリポタンパク質の変性、すなわち質的変化は、動脈硬化の発症において非常に重要な要因となっている。変性の一つとしては酸化的な修飾が知られており、この場合、酸化ＬＤＬは陰性電荷が増加するとともに、小型化し密度が増加する。実際の動脈硬化病変部位では、酸化ＬＤＬの発現が検出されるとともに、人工的に酸化させたＬＤＬは、マクロファージの泡沫化を惹起するとともに、細胞を活性化させ種々のサイトカインの産生を亢進させるため、この酸化修飾が動脈硬化病態の進展に関与していると考えられている。
一方、変性ＬＤＬにおいては、リン脂質の組成変化（リン脂質の分解）が認められており、それに着目した研究から、リン脂質分解酵素の一つであるホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）が、ＬＤＬやＨＤＬの変性に関与する分子として注目されるようになった。ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２；ＥＣ  ３．１．１．４）は、３−ｓｎ−ホスホグリセリドの２−アシルエステル結合を加水分解するリン脂質分解酵素の総称である。その中で分泌型ＰＬＡ２（ｓＰＬＡ２）は、細胞外に分泌される低分子量（１３−１８ｋＤａ）のＰＬＡ２分子群であり、ヒトでは、ＩＢ型、ＩＩＡ型、ＩＩＤ型、ＩＩＥ型、ＩＩＦ型、Ｖ型、Ｘ型およびＸＩＩ型の８種類が知られている。いずれの分子種も、その構造中に１２〜１６個のＣｙｓ残基を持ち分子内ジスルフィド結合を形成しており、またＨｉｓ−Ａｓｐ残基からなる活性中心部位が保存されている。さらに、共通のＣａ２＋結合領域を持ち、酵素活性の発現にはｍＭオーダーのＣａ２＋が必要である（Ｉｓｈｉｚａｋｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，２４９７３−２４９７９（１９９９），Ｓｕｚｕｋｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５，５７８５−５７９３（２０００），Ｓｉｘら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １４８８，１−１９（２０００），およびＧｅｌｂら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５，３９８２３−３９８２６（２０００））。この中で、ＩＩＡ型ｓＰＬＡ２は、ヒト動脈硬化病変部位の血管平滑筋や泡沫細胞で発現が検出されており、その発現と動脈硬化進展の程度との間に相関性が認められている（Ｅｌｉｎｄｅｒら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１７，２２５７−２２６３（１９９７），およびＭｅｎｓｃｈｉｋｏｗｓｋｉら、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  １１８，１７３−１８１（１９９５））。また、ＩＩＡ型ｓＰＬＡ２を高発現させたトランスジェニックマウスでは、ＬＤＬの上昇やＨＤＬの減少を引き起こし動脈硬化病変が出現するとともに（Ｔｉｅｔｇｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５，１００７７−１００８４（２０００））、高脂肪食を摂取させた場合には、正常マウスに比べて動脈硬化病変の憎悪が観察されており（Ｉｖａｎｄｉｃら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１９，１２８４−１２９０（１９９９））、本酵素の動脈硬化病態進展への関与が注目されている。一方、ハチ毒由来のｓＰＬＡ２でＬＤＬを処理した場合には、粒子全体の陰性電荷の増加、リン脂質の組成変化が起こり、マクロファージへの取り込みの増加が認められ（Ａｖｉｒａｍら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１８５，４６５−４７２（１９９２））、虚血性疾患の危険因子の一つとして考えられている小粒子高密度ＬＤＬ（ｓｍａｌｌ  ｄｅｎｓｅ  ＬＤＬ）に非常に類似した特徴を示すことが明らかとなっている（Ｓａｒｔｉｐｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，２５９１３−２５９２０（１９９９））。さらに、ヘビ毒由来のｓＰＬＡ２でＨＤＬを処理した場合には、リン脂質分解に伴ってＨＤＬのサイズや密度が変化し、肝細胞による取りこみが増加することが知られている（Ｃｏｌｌｅｔら、Ｂｉｏｃｈｉｍ��Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １０４３，３０１−３１０（１９９０））。上記のように、ヒトｓＰＬＡ２分子の中ではＩＩＡ型においてリポタンパク質中のリン脂質を分解する活性が検出されているが、ＩＩＡ型の活性はＬＤＬに対する分解活性がハチ毒由来ｓＰＬＡ２に比べてかなり弱く（Ｈｕｒｔ−Ｃａｍｅｊｏら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｌｉｐｉｄｏｌ．１１，４６５−４７１（２０００））、またその活性はＬＤＬよりもＨＤＬに対して強いこと（Ｐｒｕｚａｎｓｋｉら、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ．Ｒｅｓ．３９，２１５０−２１６０（１９９８））が判明している。そのため、特に動脈硬化初期病態でのＬＤＬ変性化に関与する内因性のｓＰＬＡ２分子の実態については不明な点が多く残されており、ＩＩＡ型以外のｓＰＬＡ２分子が関与する可能性も考えられるが、これらｓＰＬＡ２分子のリポタンパク質変性作用や動脈硬化病変での発現については明らかにされていなかった。
ヒトＸ型ｓＰＬＡ２は、ＤＮＡデータベースよりｓＰＬＡ２関連配列に基づき、１９９７年に胎児肺組織よりクローニングされた（Ｃｕｐｉｌｌａｒｄら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，１５７４５−１５７５２（１９９７））。ヒトＸ型ｓＰＬＡ２の遺伝子は、他のｓＰＬＡ２と異なり第１６番染色体上に位置する。本ｓＰＬＡ２は、分子内に１６システイン残基を有し、ＩＢ型ｓＰＬＡ２とＩＩ型（ＩＩＡ／ＩＩＤ／ＩＩＥ／ＩＩＦ型）ｓＰＬＡ２のそれぞれに存在する特徴的な分子内ジスルフィド架橋をすべて含んでいる。さらに、ＩＩ型ｓＰＬＡ２に特有のカルボキシル基末端延長構造を有する。Ｘ型ｓＰＬＡ２には、１１アミノ酸残基から成るプロペプチド配列をＮ−末端に有する非活性型のプロ型と、そのプロペプチド部分がトリプシンなどのプロテアーゼによって切断、除去されて生じる活性型の２つの分子種が存在する（Ｍｏｒｉｏｋａら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３８１，３１−４２（２０００））。活性型のＸ型ｓＰＬＡ２は、哺乳動物由来の他のｓＰＬＡ２、特にＩＢ、ＩＩＡ型ｓＰＬＡ２と比較して、基質であるリン脂質の種類や性状に関わりなく高い酵素活性を有し、さらに細胞に作用させた際の細胞膜からのアラキドン酸遊離能やエイコサノイドおよびリゾリン脂質などの脂質性メディエーターの産生能がＩＢ、ＩＩＡ型ｓＰＬＡ２よりも非常に高いことが明らかにされている（Ｈａｎａｓａｋｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，３４２０３−３４２１１（１９９９）、Ｓａｉｇａら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １５３０，６７−７６（２００１））。特異抗体を用いた免疫組織化学的解析により、Ｘ型ｓＰＬＡ２の発現は、ＩＩ型肺胞上皮細胞や脾臓マクロファージで認められるほか、ヒト大腸ガン組織のガン細胞で発現が亢進していることが明らかにされており、本酵素が炎症・免疫応答や大腸ガン病態の発症・進展に関与することが示唆されている（Ｍｏｒｉｏｋａら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４８７，２６２−２６６（２０００））。しかし、Ｘ型ｓＰＬＡ２のリポタンパク質変性作用や動脈硬化病変部位での発現に関する報告はなく、本酵素が動脈硬化病態の発症・進展に関与することは知られていない。
Ｖ型ｓＰＬＡ２は、１９９４年にクローニングされた（Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９４，２６９，２３６５−２３６８）。ヒトＶ型ｓＰＬＡ２の遺伝子は、ＩＩＡ型と同じく第１番染色体上に位置する。本ｓＰＬＡ２は、分子内にＩＩＡ型よりも２個少ない１２個のシステイン残基を有し、ＩＩＡ型で認められるカルボキシル基末端延長構造も含まない。Ｖ型の発現は、心臓を主として、肺や炎症系細胞（肥満細胞、マクロファージなど）で認められ、これらの細胞では、脂質メディエーターの産生に関与していることが報告されている（村上  誠、工藤一郎、現代医療２０００，３２，５１７−５４８）。しかしながら、Ｖ型ｓＰＬＡ２のリポタンパク質の変性作用に関する報告はなく、本酵素が動脈硬化病態の発症・進展に関与することは知られていない。
発明の開示
本発明者らは、ヒトＶ型またはＸ型ｓＰＬＡ２の生理機能の解明を目指して鋭意研鑚を重ねた結果、Ｖ型またはＸ型ｓＰＬＡ２が血中のリポタンパク質中に存在するリン脂質から強力に脂肪酸を遊離させる作用を有することを見出した。
かかる知見をもとに、Ｖ型またはＸ型ｓＰＬＡ２のリポタンパク質変性作用に対するｓＰＬＡ２阻害化合物の抑制作用を証明し、本発明を完成した。
ｓＰＬＡ２阻害化合物に関しては、ＥＰ−６２０２１４（特開平７−０１０８３８、ＵＳ−５５７８６３４）、ＥＰ−６２０２１５（特開平７−０２５８５０、ＵＳ−５６８４０３４）、ＥＰ−６７５１１０（特開平７−２８５９３３、ＵＳ−５６５４３２６）、ＷＯ９６／０３１２０（特開平１０−５０５３３６）、ＷＯ９６／０３３７６（特開平１０−５０３２０８、ＵＳ−５６４１８００）、ＷＯ９６／０３３８３（特開平１０−５０５５８４）、ＷＯ９７／２１６６４（ＥＰ−７７９２７１）、ＷＯ９７／２１７１６（ＥＰ−７７９２７３）、ＷＯ９８／１８４６４（ＥＰ８３９８０６）、ＷＯ９８／２４４３７（ＥＰ８４６６８７）、ＷＯ９８／２４７５６、ＷＯ９８／２４７９４、ＷＯ９８／２５６０９、ＷＯ９９／５１６０５、ＷＯ９９／５９９９９等に記載の化合物、パラブロモフェナシルブロマイド（Ｒｏｂｅｒｔｓ  Ｍ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９７７，２５２，２４０５−２４１１）、メパクリン（Ｖａｄａｓ  Ｐ．ら、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９８６，５５，３９１−４０４）、マノアライド（Ｌｏｍｂａｒｄｏ  Ｄ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８５，２６０，７２３４−７２４０）、チエロシンＡ１（Ｙｏｓｈｉｄａ  Ｔ．ら、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ．１９９１，４４，１４６７−１４７０）、インドキサム（Ｈａｎａｓａｋｉ  Ｋ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９９  Ｎｏｖ  ２６；２７４（４８）：３４２０３−１１；Ｓｕｚｕｋｉ  Ｎ，ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０００  Ｆｅｂ  ２５；２７５（８）：５７８５−９３）等が知られているが、これらのｓＰＬＡ２阻害化合物が血清リポタンパク質変性に対して抑制作用を有するとの報告はない。
本発明は、以上のような知見に基づき完成するに至ったものである。
即ち、本発明は、
（１）Ｖ型および／またはＸ型ｓＰＬＡ２阻害化合物を有効成分として含有する、血清リポタンパク質変性を抑制するための医薬組成物、動脈硬化症を治療または予防するための医薬組成物または動脈硬化を基盤とする虚血性疾患を治療または予防するための医薬組成物；
（２）Ｖ型および／またはＸ型ｓＰＬＡ２阻害化合物が一般式（Ｉ）：
0004499361.tif 000002
［式中、Ａ環は以下の（ａ）〜（ｄ）：
0004499361.tif 000003
（式中、Ｒ１およびＲ２のいずれか一方は式：−（Ｌ１）−（酸性基）で示される基（式中、Ｌ１は酸性基との連結基であり、酸性基との連結基の長さは１〜５である）であり、他方は水素原子、非妨害性置換基または−（Ｌ１）−（酸性基）であり（ここにＬ１は前記と同意義）；および
Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立して、水素原子、非妨害性置換基、炭素環基、非妨害性置換基で置換された炭素環基、複素環基、または非妨害性置換基で置換された複素環基である）で表わされる環であり；および
−Ｂ−は以下の（ｅ）〜（ｈ）：
0004499361.tif 000004
（式中、Ｒ５は（ｊ）Ｃ１−Ｃ２０アルキル、Ｃ２−Ｃ２０アルケニル、Ｃ２−Ｃ２０アルキニル、炭素環基、または複素環基、（ｋ）それぞれ独立する１またはそれ以上の非妨害性置換基によって置換された前記（ｊ）で示される基、または式：−（Ｌ２）−Ｒ８で示される基（式中、Ｌ２は水素原子、窒素原子、炭素原子、酸素原子、および硫黄原子から選択される１〜１８原子の２価の連結基；およびＲ８は（ｊ）または（ｋ）から選択される基）で表される基であり；
Ｒ６は、水素原子、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ３アルキル、Ｃ３−Ｃ４シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ４シクロアルケニル、Ｃ１−Ｃ３アルキルオキシ、またはＣ１−Ｃ３アルキルチオであり；
Ｒ７は、水素原子または非妨害性置換基であり；
ＲＡは、式：
0004499361.tif 000005
（式中、Ｒ９およびＲ１０はそれぞれ独立して、水素原子、Ｃ１−Ｃ３アルキル、またはハロゲン；ＸおよびＹはそれぞれ独立して酸素原子または硫黄原子；およびＺは−ＮＨ２または−ＮＨＮＨ２）で表わされる基であり；
ＲＢは、−ＣＯＮＨ２または−ＣＯＮＨＮＨ２であり；および
Ｄ環はシクロヘキセン環またはベンゼン環である）で表わされる基である。
ただし、−Ｂ−が（ｅ）または（ｆ）で示される基である場合、Ａ環は（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）で示される環である。］
で示される化合物、そのプロドラッグ、もしくはそれらの製薬上許容される塩、またはそれらの溶媒和物である、本発明の医薬組成物；
好ましくはＶ型および／またはＸ型ｓＰＬＡ２阻害化合物が一般式（Ｉ）中、
Ｒ１が水素原子または式：−（Ｌ３）−Ｒ１１で示される基（式中、Ｌ３は−ＯＣＨ２−、−ＳＣＨ２−、−ＮＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ３）−、または−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２Ｃ６Ｈ５）−；およびＲ１１は−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨＳＯ２Ｃ６Ｈ５、−ＳＯ３Ｈ、または−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２）であり；および
Ｒ２が水素原子または式：−（Ｌ４）−Ｒ１２で示される基［式中、Ｌ４は式：
0004499361.tif 000006
（式中、Ｒ１３およびＲ１４はそれぞれ独立して、水素原子、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ１−Ｃ１０アラルキル、カルボキシ、アルキルオキシカルボニル、またはハロゲン）で示される基；およびＲ１２は−ＣＯＯＨ、−ＳＯ３Ｈ、または−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２）である］であるが、ただしＲ１およびＲ２が同時に水素原子となることはない化合物、そのプロドラッグ、もしくはそれらの製薬上許容される塩、またはそれらの溶媒和物である、本発明の医薬組成物；
より好ましくはＶ型および／またはＸ型ｓＰＬＡ２阻害化合物が一般式（Ｉ）中、
Ｒ３が水素原子、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル、アリール、または複素環基であり、およびＲ４が水素原子またはハロゲンである化合物、そのプロドラッグ、もしくはそれらの製薬上許容される塩、またはそれらの溶媒和物である、本発明の医薬組成物；さらに好ましくはＶ型および／またはＸ型ｓＰＬＡ２阻害化合物が一般式（Ｉ）中、
Ｒ５が−（ＣＨ２）１−６−Ｒ１５（ここに、Ｒ１５は式：
0004499361.tif 000007
（式中、ｂ、ｄ、ｆ、ｈ、ｊ、ｍ、およびｏはそれぞれ独立して０〜２の整数；Ｒ１６およびＲ１７はそれぞれ独立してハロゲン、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ１−Ｃ１０アルキルオキシ、Ｃ１−Ｃ１０アルキルチオ、アリールオキシ、フェニルおよびＣ１−Ｃ１０ハロアルキルから独立に選択される基；αは酸素原子または硫黄原子；βは−ＣＨ２−または−（ＣＨ２）２−；γは酸素原子または硫黄原子；ｃ、ｉ、およびｐは０〜５の整数；ｅは０〜７の整数；ｇは０〜４の整数；そしてｋおよびｎはそれぞれ独立して０〜３の整数）で示される基である化合物、そのプロドラッグ、もしくはそれらの製薬上許容される塩、またはそれらの溶媒和物である本発明の医薬組成物；
さらに好ましくはＶ型および／またはＸ型ｓＰＬＡ２阻害化合物が一般式（Ｉ）中、
Ｒ５が−ＣＨ２−Ｒ１８［ここに、Ｒ１８は式：
0004499361.tif 000008
（式中、βは−ＣＨ２−または−（ＣＨ２）２−；Ｒ１９は水素原子、Ｃ１−Ｃ３アルキル、またはハロゲン；およびＥは単結合、−ＣＨ２−または−Ｏ−）で示される基］で表わされる基である化合物、そのプロドラッグ、もしくはそれらの製薬上許容される塩、またはそれらの溶媒和物である本発明の医薬組成物；
さらに好ましくはＶ型および／またはＸ型ｓＰＬＡ２阻害化合物が一般式（Ｉ）中、Ｒ１が−ＯＣＨ２ＣＯＯＨである化合物、そのプロドラッグ、もしくはそれらの製薬上許容される塩、またはそれらの溶媒和物である、本発明の医薬組成物；
さらに好ましくはＶ型および／またはＸ型ｓＰＬＡ２阻害化合物が一般式（Ｉ）中、Ｒ２が水素原子である化合物、そのプロドラッグ、もしくはそれらの製薬上許容される塩、またはそれらの溶媒和物である、本発明の医薬組成物；
さらに好ましくはＶ型および／またはＸ型ｓＰＬＡ２阻害化合物が一般式（Ｉ）中、Ｒ６がＣ１−Ｃ３アルキルである化合物、そのプロドラッグ、もしくはそれらの製薬上許容される塩、またはそれらの溶媒和物である、本発明の医薬組成物；また
さらに好ましくはＶ型および／またはＸ型ｓＰＬＡ２阻害化合物が一般式（Ｉ）中、ＲＡが−ＣＨ２ＣＯＮＨ２または−ＣＯＣＯＮＨ２である化合物、そのプロドラッグ、もしくはそれらの製薬上許容される塩、またはそれらの溶媒和物である、本発明の医薬組成物；
より好ましくはＶ型および／またはＸ型ｓＰＬＡ２阻害化合物が式：
0004499361.tif 000009
0004499361.tif 000010
で示される化合物、そのプロドラッグ、もしくはそれらの製薬上許容される塩、またはそれらの溶媒和物である、本発明の医薬組成物；
具体的には、Ｖ型ｓＰＬＡ２阻害化合物が式：
0004499361.tif 000011
で表わされる化合物、そのプロドラッグ、もしくはそれらの製薬上許容される塩、またはそれらの溶媒和物である、本発明の医薬組成物：
またはＸ型ｓＰＬＡ２阻害化合物が式：
0004499361.tif 000012
0004499361.tif 000013
で示される化合物、そのプロドラッグ、もしくはそれらの製薬上許容される塩、またはそれらの溶媒和物である、本発明の医薬組成物：
（３）動脈硬化症または動脈硬化を基盤とする虚血性疾患を治療または予防するための医薬を製造するためのＶ型および／またはＸ型ｓＰＬＡ２阻害化合物の使用；好ましくはＶ型および／またはＸ型ｓＰＬＡ２阻害化合物が上記化合物である本発明の使用；および
（４）Ｖ型および／またはＸ型ｓＰＬＡ２阻害化合物の治療上効果を示す量をヒトを含む哺乳動物に投与することからなる、動脈硬化症または動脈硬化を基盤とする虚血性疾患による影響を緩和するための哺乳動物を治療または予防する方法；好ましくはＶ型および／またはＸ型ｓＰＬＡ２阻害化合物が上記化合物である本発明の哺乳動物を治療または予防する方法；
に関する。
発明を実施するための最良の形態
（１）Ｖ型および／またはＸ型ｓＰＬＡ２阻害化合物を有効成分として含有する、血清リポタンパク質変性を抑制するための医薬組成物
本発明者らは、ヒトＶ型およびＸ型ｓＰＬＡ２が血中のリポタンパク質中に存在するリン脂質から強力に脂肪酸を遊離させる作用を有することを見出した。さらに、ＬＤＬ、ＨＤＬに対するＶ型およびＸ型ｓＰＬＡ２の変性作用、即ちリン脂質分解、脂肪酸遊離、リゾリン脂質産生、陰性電荷の増加、マクロファージへの取りこみなどを、ＩＢ型やＩＩＡ型のｓＰＬＡ２と比較し、Ｖ型およびＸ型ｓＰＬＡ２の作用が非常に強力であることを示すとともに、これらの作用が従来報告されていた酸化によるリポタンパク質変性作用とは異なることを見出した。よって、本発明における「血清リポタンパク質変性」とは、リン脂質分解、脂肪酸遊離、リゾリン脂質産生、陰性電荷の増加、マクロファージへの取りこみなどを意味し、酸化による変性は含まれない。
本発明に使用される「Ｖ型および／またはＸ型ｓＰＬＡ２阻害化合物」は、Ｖ型ｓＰＬＡ２阻害化合物、Ｘ型ｓＰＬＡ２阻害化合物、またはＶ型およびＸ型ｓＰＬＡ２阻害作用の両者を有する化合物を意味する。本発明は、一つの態様として、Ｖ型ｓＰＬＡ２阻害化合物およびＸ型ｓＰＬＡ２阻害化合物の両化合物を有効成分として含有する医薬組成物も包含する。
Ｘ型ｓＰＬＡ２特異抗体を用い、動脈硬化病態モデル動物の血管病変部位の泡沫細胞においてＸ型ｓＰＬＡ２が発現していることが示された。よって、本発明には、Ｖ型および／またはＸ型ｓＰＬＡ２阻害化合物を有効成分として含有する、動脈硬化症を治療または予防するための医薬組成物または動脈硬化を基盤とする虚血性疾患を治療または予防するための医薬組成物が包含される。本発明における「動脈硬化症」とは、動脈壁が肥厚、硬化を示す病変の総称であり、動脈の狭窄閉塞による脳虚血発作、脳梗塞、狭心症、心筋梗塞、間欠性跛行を招くあらゆる病態を示す。本発明では、動脈硬化症のうち粥状動脈硬化症が好適に処置される。「動脈硬化を基盤とする虚血性疾患」とは、動脈硬化に起因する、または動脈硬化を伴う虚血性疾患を意味する。「虚血性疾患」とは、一般には局所性の貧血に由来する壊死等の種々の臨床的病態であるが、本発明との関連においては、血管内または血管自体の変化による閉塞性虚血を起因とする虚血性心疾患、特に狭心症、心筋梗塞、心不全、ならびに脳梗塞などを意味する。
２）上記一般式（Ｉ）で示されるＶ型および／またはＸ型ｓＰＬＡ２阻害化合物を有効成分として含有する本発明医薬組成物
一般式（Ｉ）中、単独でもしくは他の用語と組み合わせて用いられる「アルキル」なる用語は、指定した数の範囲の炭素原子数を有する、直鎖または分枝鎖の１価の炭化水素基を意味する。例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、ｎ−ノナニル、ｎ−デカニル、ｎ−ウンデカニル、ｎ−ドデカニル、ｎ−トリデカニル、ｎ−テトラデカニル、ｎ−ペンタデカニル、ｎ−ヘキサデカニル、ｎ−ヘプタデカニル、ｎ−オクタデカニル、ｎ−ノナデカニル、ｎ−イコサニル等が挙げられる。
一般式（Ｉ）中、単独でもしくは他の用語と組み合わせて用いられる「アルケニル」なる用語は、指定した数の範囲の炭素原子数および１個もしくは２個以上の二重結合を有する、直鎖または分枝鎖の１価の炭化水素基を意味する。例えば、ビニル、アリル、プロペニル、クロトニル、イソペンテニル、種々のブテニル異性体等が挙げられる。
一般式（Ｉ）中、「アルキニル」とは、指定した数の範囲の炭素原子数および１個もしくは２個以上の三重結合を有する、直鎖または分枝鎖の１価の炭化水素基を意味する。二重結合を有していてもよい。例えば、エチニル、プロピニル、６−ヘプチニル、７−オクチニル、８−ノニル等が挙げられる。
一般式（Ｉ）中、「炭素環基」とは、飽和または不飽和であって、置換されたまたは置換されていない、環を形成している原子が水素原子以外は炭素原子のみである５〜１４員環、好ましくは、５〜１０員環、さらに好ましくは５〜７員環の有機骨格から誘導される基を意味する。上記の炭素環が２〜３個連続しているものも包含する。代表的な炭素環基としては、シクロアルキル（例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、およびシクロオクチル）、シクロアルケニル（シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニル、およびシクロオクテニル）、フェニル、ナフチル、ノルボルニル、ビシクロヘプタジエニル、インデニル、スチルベニル、テルフェニリル、フェニルシクロヘキセニル、アセナフチル、アントリル、ビフェニリル、ビベンジリル、および式（ＩＩ）：
0004499361.tif 000014
で表わされるフェニルアルキルフェニル誘導体が挙げられる。
Ｒ３およびＲ４における炭素環基としては、フェニル、シクロヘキシル等が好ましい。
一般式（Ｉ）中、「複素環基」とは、単環式または多環式であって、飽和または不飽和であり、窒素原子、酸素原子、硫黄原子からなる群から選択される１〜３のヘテロ原子を含む５〜１４の環原子を有する、置換されたまたは置換されていない複素環骨格から誘導される基を意味する。例えば、ピリジル、ピロリル、フラニル、ベンゾフラニル、チエニル、ベンゾチエニル、ピラゾリル、イミダゾリル、フェニルイミダゾリル、トリアゾリル、イソオキサゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、チアジアゾリル、インドリル、カルバゾリル、ノルハルマニル、アザインドリル、ベンゾフラニル、ジベンゾフラニル、ジベンゾチオフェニル、インダゾリル、イミダゾ［１，２−ａ］ピリジニル、ベンゾトリアゾリル、アントラニリル、１，２−ベンズイソオキサゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、プリニル、プリジニル、ジピリジニル、フェニルピリジニル、ベンジルピリジニル、ピリミジニル、フェニルピリミジニル、ピラジニル、１，３，５−トリアジニル、キノリル、フタラジニル、キナゾリニル、キノキサリニル等が挙げられる。
Ｒ３およびＲ４における複素環基としては、フリル、チエニル等が好ましい。
Ｒ５における炭素環基および複素環としては、式：
0004499361.tif 000015
（式中、ｈは０〜２の整数、Ｒ１６およびＲ１７はそれぞれ独立してハロゲン、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ１−Ｃ１０アルキルオキシ、Ｃ１−Ｃ１０アルキルチオ、アリールオキシ、フェニル、およびＣ１−Ｃ１０ハロアルキルから独立に選択される基、αは酸素原子または硫黄原子、βは−ＣＨ２−または−（ＣＨ２）２−、γは酸素原子または硫黄原子、ｃ、ｉ、およびｐは０〜５の整数、ｅは０〜７の整数、ｇは０〜４の整数、ｋおよびｎはそれぞれ独立して０〜３の整数）で表わされる基が好ましい。ｃ、ｅ、ｇ、ｉ、ｋ、ｎ、および／またはｐが２以上の場合、複数個のＲ１６および複数個のＲ１７はそれぞれ異なっていてもよい。Ｒ１６がナフチル基の置換基である場合は、当該ナフチル基上の任意の位置で置換し得る。
さらに好ましくは、式：
0004499361.tif 000016
［式中、Ｒ１９は水素原子、Ｃ１−Ｃ３アルキル、またはハロゲン；Ｅは単結合、−ＣＨ２−または−Ｏ−：βは−ＣＨ２−または−（ＣＨ２）２−］
で表わされる基が挙げられる。
Ｒ５としては、上記の「炭素環」Ｃ１−Ｃ３アルキルおよび上記の「複素環」Ｃ１−Ｃ３アルキルが好ましい。
一般式（Ｉ）中、「非妨害性置換基」とは、上記の「炭素環基」、「複素環基」、および基本骨格の置換基として適当な基を意味する。例えば、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、Ｃ７−Ｃ１２アラルキル（例えば、ベンジルおよびフェネチル）、Ｃ７−Ｃ１２アルカリル、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ８シクロアルケニル、フェニル、トリル、キシリル、ビフェニリル、Ｃ１−Ｃ１０アルキルオキシ、Ｃ１−Ｃ６アルキルオキシＣ１−Ｃ６アルキル（例えば、メチルオキシメチル、エチルオキシメチル、メチルオキシエチル、およびエチルオキシエチル）、Ｃ１−Ｃ６アルキルオキシＣ１−Ｃ６アルキルオキシ（例えば、メチルオキシメチルオキシ、およびメチルオキシエチルオキシ）、Ｃ１−Ｃ６アルキルカルボニル（例えば、メチルカルボニルおよびエチルカルボニル）、Ｃ１−Ｃ６アルキルカルボニルアミノ（例えば、メチルカルボニルアミノおよびエチルカルボニルアミノ）、Ｃ１−Ｃ６アルキルオキシアミノ（例えば、メチルオキシアミノおよびエチルオキシアミノ）、Ｃ１−Ｃ６アルキルオキシアミノカルボニル（例えば、メチルオキシアミノカルボニルおよびエチルオキシアミノカルボニル）、モノまたはジＣ１−Ｃ６アルキルアミノ（例えば、メチルアミノ、エチルアミノ、ジメチルアミノ、およびエチルメチルアミノ）、Ｃ１−Ｃ１０アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ６アルキルチオカルボニル（例えば、メチルチオカルボニルおよびエチルチオカルボニル）、Ｃ１−Ｃ６アルキルスルフィニル（例えば、メチルスルフィニルおよびエチルスルフィニル）、Ｃ１−Ｃ６アルキルスルホニル（例えば、メチルスルホニルおよびエチルスルホニル）、Ｃ２−Ｃ６ハロアルキルオキシ（例えば、２−クロロエチルオキシおよび２−ブロモエチルオキシ）、Ｃ１−Ｃ６ハロアルキルスルホニル（例えば、クロロメチルスルホニルおよびブロモメチルスルホニル）、Ｃ１−Ｃ１０ハロアルキル、Ｃ１−Ｃ６ヒドロキシアルキル（例えば、ヒドロキシメチルおよびヒドロキシエチル）、Ｃ１−Ｃ６アルキルオキシカルボニル（例えば、メチルオキシカルボニルおよびエチルオキシカルボニル）、−（ＣＨ２）１−８−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、ベンジルオキシ、アリールオキシ（例えば、フェニルオキシ）、アリールチオ（例えば、フェニルチオ）、−（ＣＯＮＨＳＯ２Ｒ２０）（Ｒ２０はＣ１−Ｃ６アルキルまたはアリール）、−ＣＨＯ、アミノ、アミジノ、ハロゲン、カルバミル、カルボキシル、カルブアルキルオキシ、−（ＣＨ２）１−８−ＣＯＯＨ（例えば、カルボキシメチル、カルボキシエチル、およびカルボキシプロピル）、シアノ、シアノグアニジノ、グアニジノ、ヒドラジド、ヒドラジノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアミノ、ニトロ、ホスフォノ、−ＳＯ３Ｈ、チオアセタール、チオカルボニル、Ｃ１−Ｃ６カルボニル、炭素環基、複素環基等が挙げられる。これらは、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルキルオキシ、Ｃ２−Ｃ６ハロアルキルオキシ、Ｃ１−Ｃ６ハロアルキル、およびハロゲンからなる群から選択される１もしくは２以上の置換基で置換されていてもよい。
Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５の「非妨害性置換基で置換された」の「非妨害性置換基」としては、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルキルオキシ、Ｃ１−Ｃ６アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ６ハロアルキルが好ましい。さらに好ましくは、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ３アルキル、Ｃ１−Ｃ３アルキルオキシ、Ｃ１−Ｃ３アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ３ハロアルキルが挙げられる。
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４、およびＲ７における「非妨害性置換基」としては、Ｃ１−Ｃ６アルキル、アラルキル、Ｃ１−Ｃ６アルキルオキシ、Ｃ１−Ｃ６アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ６ヒドロキシアルキル、Ｃ２−Ｃ６ハロアルキルオキシ、ハロゲン、カルボキシ、Ｃ１−Ｃ６アルキルオキシカルボニル、アリールオキシ、アリールチオ、炭素環基、または複素環基が好ましい。さらに好ましくは、Ｃ１−Ｃ６アルキル、アラルキル、カルボキシ、Ｃ１−Ｃ６ヒドロキシアルキル、フェニル、またはＣ１−Ｃ６アルキルオキシカルボニルが挙げられる。
一般式（Ｉ）中、「ハロゲン」とは、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素を意味する。
一般式（Ｉ）中、「シクロアルキル」とは、指定した数の範囲の炭素原子数を有する、環状の１価の炭化水素基を意味する。例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル等が挙げられる。
一般式（Ｉ）中、「シクロアルケニル」とは、指定した数の範囲の炭素原子数および１個もしくは２個以上の二重結合を有する、環状の１価の炭化水素基を意味する。例えば、１−シクロプロペニル、２−シクロプロペニル、１−シクロブテニル、２−シクロブテニル等が挙げられる。
一般式（Ｉ）中、「アルキルオキシ」としては、例えば、メチルオキシ、エチルオキシ、ｎ−プロピルオキシ、イソプロピルオキシ、ｎ−ブチルオキシ、ｎ−ペンチルオキシ、ｎ−ヘキシルオキシ等が挙げられる。
一般式（Ｉ）中、「アルキルチオ」としては、例えば、メチルチオ、エチルチオ、ｎ−プロピルチオ、イソプロピルチオ、ｎ−ブチルチオ、ｎ−ペンチルチオ、ｎ−ヘキシルチオ等が挙げられる。
一般式（Ｉ）中、「酸性基」とは、適当な連結原子（後に「酸性基との連結基」として定義する）を介して基本骨格に結合している時、水素結合を可能にするプロトン供与体として働く有機基を意味する。例えば、式：
0004499361.tif 000017
（式中、Ｒ２１は水素原子、金属、またはＣ１−Ｃ１０アルキル、Ｒ２２はそれぞれ独立して水素原子またはＣ１−Ｃ１０アルキル、ただしＲ２１およびＲ２２を共に有する酸性基の場合は、Ｒ２１およびＲ２２の少なくとも１つは水素原子）で表わされる基が挙げられる。好ましくは、−ＣＯＯＨ、−ＳＯ３Ｈ、−ＣＯＮＨＳＯ２Ｃ６Ｈ５、またはＰ（Ｏ）（ＯＨ）２が挙げられる。さらに好ましくは、−ＣＯＯＨが挙げられる。
一般式（Ｉ）中、「酸性基との連結基」とは、−（Ｌ１）−なる記号で表わされる２価連結基を意味し、通常の関係では基本骨格のと「酸性基」を連結する役目をする。例えば、式：
0004499361.tif 000018
（式中、Ｍは−ＣＨ２−、−Ｏ−、−Ｎ（Ｒ２５）−、または−Ｓ−、Ｒ２３およびＲ２４はそれぞれ独立して水素原子、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アリール、アラルキル、カルボキシ、またはハロゲン）で表わされる基、および式：
0004499361.tif 000019
（式中、Ｒ１３およびＲ１４はそれぞれ独立して、水素原子、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ１−Ｃ１０アラルキル、カルボキシ、アルキルオキシカルボニル、またはハロゲン）で表わされる基が挙げられる。好ましくは、−Ｏ−ＣＨ２−、−Ｓ−ＣＨ２−、−Ｎ（Ｒ２５）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ３）−、または−Ｏ−ＣＨ（（ＣＨ２）２Ｃ６Ｈ５）−（式中、Ｒ２５はＣ１−Ｃ６アルキル）が挙げられる。さらに好ましくは、−Ｏ−ＣＨ２−または−Ｓ−ＣＨ２−が挙げられる。
一般式（Ｉ）中、「酸性基との連結基の長さ」なる用語は、基本骨格と「酸性基」をつなぐ連結基−（Ｌ１）−の最短の鎖の原子の数（水素原子を除く）を意味する。−（Ｌ１）−に炭素環がある場合、算出した炭素環の直径とほぼ等しい数の原子として計数する。従って、酸性基との連結基におけるベンゼン環およびシクロヘキサン環は、−（Ｌ１）−の長さを２原子として計数する。好ましい長さは、２〜３である。
一般式（Ｉ）中、「ハロアルキル」とは、任意の位置で前記「ハロゲン」により置換された前記「アルキル」を意味する。例えば、クロロメチル、トリフルオロメチル、２−クロロメチル、２−ブロモメチル等が挙げられる。
一般式（Ｉ）中、「ヒドロキシアルキル」とは、任意の位置でヒドロキシにより置換された前記「アルキル」を意味する。例えば、ヒドロキシメチル、２−ヒドロキシエチル、３−ヒドロキシプロピル等が挙げられる。ヒドロキシメチルが好ましい。
一般式（Ｉ）中、「ハロアルキルオキシ」の「ハロアルキル」は前記と同義である。例えば、２−クロロエチルオキシ、２−トリフルオロエチルオキシ、２−クロロエチルオキシ等が挙げられる。
一般式（Ｉ）中、「アリール」とは、単環状もしくは縮合環状芳香族炭化水素を意味する。例えば、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、アントリル等が挙げられる。特に、フェニル、１−ナフチルが好ましい。
一般式（Ｉ）中、「アラルキル」とは、前記「アルキル」に前記「アリール」が置換したもので、これらは置換可能な全ての位置で結合しうる。例えば、ベンジル、フェネチル、フェニルプロピル（例えば、３−フェニルプロピル）、ナフチルメチル（例えば、１−ナフチルメチル）等が挙げられる。
一般式（Ｉ）中、「アルキルオキシカルボニル」としては、例えば、メチルオキシカルボニル、エチルオキシカルボニル、ｎ−プロプルオキシカルボニル等が挙げられる。
一般式（Ｉ）中、「アリールオキシ」としては、フェニルオキシ等が挙げられる。
一般式（Ｉ）中、「アリールチオ」としては、フェニルチオ等が挙げられる。
一般式（Ｉ）中、「ハロフェニル」とは前記「ハロゲン」で１または２個所以上置換されたフェニルを包含する。例えば、フルオロフェニル、クロロフェニル、ブロモフェニル、ヨードフェニル、ジフルオロフェニル、ジクロロフェニル、ジブロモフェニル、トリフルオロフェニル、トリクロロフェニル、トリブロモフェニル、クロロフルオロフェニル、ブロモクロロフェニル等が挙げられる。
一般式（Ｉ）中、Ｄ環における「シクロヘキセン環」とは、隣接する環との縮合部分に有する１つの二重結合のみを環内に有するシクロヘキセン環を意味する。
Ａ環および−Ｂ−の好ましい組み合わせとしては、以下に示す（ｍ）〜（ｒ）で表わされる組み合わせが好ましい：
0004499361.tif 000020
特に（ｍ）〜（ｐ）で表わされる組み合わせが好ましい。
上記一般式（Ｉ）で示されるＶ型および／またはＸ型ｓＰＬＡ２阻害作用を有する化合物は、ＥＰ−６２０２１４（特開平７−０１０８３８、ＵＳ−５５７８６３４）、ＥＰ−６２０２１５（特開平７−０２５８５０、ＵＳ−５６８４０３４）、ＥＰ−６７５１１０（特開平７−２８５９３３、ＵＳ−５６５４３２６）、ＷＯ９６／０３１２０（特開平１０−５０５３３６）、ＷＯ９６／０３３８３（特開平１０−５０５５８４）、ＷＯ９８／１８４６４（ＥＰ８３９８０６）、ＷＯ９９／５１６０５、ＷＯ９９／５９９９９等に記載されている公知の方法により製造することができる。
Ｘ型ｓＰＬＡ２阻害作用を有する化合物の選別は、以下のようにして、まずヒトＸ型ｓＰＬＡ２発現細胞およびその培養上清を調製し、次いで候補化合物をその阻害活性についてアッセイすることで行われる。即ち、ヒトＸ型ｓＰＬＡ２をコードするｃＤＮＡ配列（Ｃｕｐｉｌｌａｒｄ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，１９９７，２７２，１５７４５−１５７５２）を、動物細胞用発現ベクターに挿入する。得られた発現ベクターを宿主細胞にトランスフェクションし、ヒトＸ型ｓＰＬＡ２を安定に発現する細胞を得る。発現細胞を培地にて培養し、その培養上清を調製する。次いで、Ｘ型ｓＰＬＡ２の阻害化合物を同定および評価するため、以下のクロモジェニックアッセイを用いる。このアッセイの一般的な説明は、Ｌａｕｒｅ  Ｊ．Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，Ｌｏｒｉ  Ｌ．ＨｕｇｈｅｓおよびＥｄｗａｒｄ  Ａ．Ｄｅｎｎｉｓによる記事「Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｙｎｏｖｉａｌ  Ｆｌｕｉｄ  Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ａ２  ｏｎ  Ｓｈｏｒｔ  Ｃｈａｉｎ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ−Ｍｉｘｅｄ  Ｍｉｃｅｌｌｅｓ：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ａｓｓａｙ  Ｓｕｉｔａｂｌｅ  ｆｏｒ  ａ  Ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ」（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０４，ｐｐ  １９０−１９７，１９９２：）に記載されている。
Ｖ型ｓＰＬＡ２阻害作用を有する化合物の選別は、ヒトＶ型ｓＰＬＡ２をコードするｃＤＮＡ配列（Ｃｈｅｎ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，１９９４，２６９，２３６５−２３６８）を用いる以外は、上記のようにして行うことができる。
Ｖ型および／またはＸ型ｓＰＬＡ２阻害作用を有する化合物が、酸性または塩基性の官能基を有する化合物である場合は、そのもとの化合物よりも水溶性が高く、かつ生理的に適切な様々な塩を形成することができる。代表的な製薬上許容される塩には、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アルミニウム等のアルカリ金属およびアルカリ土類金属の塩が含まれるがそれらに限定されない。塩は溶液中の酸を塩基で処理するか、または酸をイオン交換樹脂に接触させることによって遊離の酸から簡便に製造される。虚血再灌流障害治療または予防作用を有する化合物の比較的無毒の無機塩基および有機塩基の付加塩、例えば、該化合物と塩を形成するに十分な塩基性を有する窒素塩基から誘導されるアミンカチオン、アンモニウム、第四級アンモニウムは製薬上許容される塩の定義に包含される（例えば、Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅら，“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ，”Ｊ．Ｐｈａｒ．Ｓｃｉ．，６６，１−１９（１９７７））。さらにＶ型および／またはＸ型ｓＰＬＡ２阻害作用を有する化合物の塩基性基は適当な有機または無機の酸と反応させてアセテート、ベンゼンスルホネート、ベンゾエート、ビカルボネート、ビスルフェート、ビタータレート、ボレート、ブロミド、カムシレート、カーボネート、クロライド、クラブラネート、シトレート、エデテート、エジシレート、エストレート、エシレート、フルオライド、フマレート、グルセプテート、グルコネート、グルタメート、グリコリアルサニレート、ヘキシルレゾルシネート、ヒドロキシナフトエート、イオダイド、イソチオネート、ラクテート、ラクトビオネート、ラウレート、マレート、マレエート、マンデレート、メシレート、メチルブロミド、メチルニトレート、メチルスルフェート、ムケート、ナプシレート、ニトレート、オレエート、オキサレート、パルミテート、パントセネート、ホスフェート、ポリガラクトウロネート、サリシレート、ステアレート、スバセテート、スシネート、タネート、タルトレート、トシレート、トチフルオロアセテート、トリフルオロメタンスルホネート、バレレート等の塩を形成する。溶媒和物としては、有機溶媒および／または水との溶媒和物を包含する。水和物を形成する時は、任意の数の水分子と配位していてもよい。
Ｖ型および／またはＸ型ｓＰＬＡ２阻害作用を有する化合物が１またはそれ以上のキラル中心を有する場合は、光学活性体として存在し得る。同様に、該化合物がアルケニルまたはアルケニレンを含む場合は、シスおよびトランス異性体の可能性が存在する。Ｒ−およびＳ−異性体、シスおよびトランス異性体の混合物やラセミ混合物を含むＲ−およびＳ−異性体の混合物は、本発明の範囲に包含される。不斉炭素原子はアルキル基のような、置換基にも存在し得る。このような異性体はすべて、それらの混合物と同様に本発明に包含される。特定の立体異性体が所望である場合は、あらかじめ分割した不斉中心を有する出発物質を、立体特異的反応に付する当業者には公知の方法により製造するか、または立体異性体の混合物を製造してから公知の方法により分割する方法により製造する。
本明細書中、プロドラッグとは、化学的または代謝的に分解できる基を有するＶ型および／またはＸ型ｓＰＬＡ２阻害作用を有する化合物の誘導体であり、加溶媒分解により、または生理学的条件下でインビボにおいて薬学的に活性な化合物となる化合物である。該化合物の誘導体は、酸誘導体または塩基誘導体の両者において活性を有するが、酸誘導体が哺乳類生物における溶解性、組織結合性、放出制御において有利である（Ｂｕｎｇａｒｄ，Ｈ．，Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ，ｐｐ．７−９，２１−２４，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ  １９８５）。例えば、もとになる酸性化合物と適当なアルコールを反応させることによって製造されるエステル、またはもとになる酸性化合物と適当なアミンを反応させることによって製造されるアミドのような酸性誘導体を含むプロドラッグは当業者にはよく知られている。該化合物が有している酸性基から誘導される単純な脂肪族のまたは芳香族のエステルは好ましいプロドラッグである。さらに好ましくは、酸性基のＣ１−Ｃ６アルキルエステル（例えば、メチルエステル、エチルエステル）である。場合によっては、（アシルオキシ）アルキルエステルまたは（（アルコキシカルボニル）オキシ）アルキルエステルのような二重エステル型プロドラッグを製造することもできる。
「製薬上許容される」なる用語は、製剤中の他の成分と適合し、受容者にとって有害ではない担体、希釈剤または添加剤を意味する。
本発明治療または予防剤は経口、エアロゾル、直腸、経皮、皮下、静脈内、筋肉内、鼻腔内を含む様々な経路によって投与できる。本発明の製剤は、治療有効量の化合物を製薬上許容される担体または希釈剤とともに組み合わせる（例えば混合する）ことによって製造される。本発明の製剤は、周知の、容易に入手できる成分を用いて既知の方法により製造される。
本発明の組成物を製造する際、活性成分は担体と混合されるかまたは担体で希釈されるか、カプセル、サッシェー、紙、あるいは他の容器の形態をしている担体中に入れられる。担体が希釈剤として働く時、担体は媒体として働く固体、半固体、または液体の材料であり、それは錠剤、丸剤、粉末剤、口中剤、エリキシル剤、懸濁剤、エマルジョン剤、溶液剤、シロップ剤、エアロゾル剤（液体媒質中の固体）、軟膏の型にすることができ、例えば、１０％までの活性化合物を含む。本発明抗動脈硬化作用を有する化合物は、投与に先立ち製剤化するのが好ましい。
当業者には公知の適当な担体はいずれもこの製剤のために使用できる。このような製剤では担体は、固体、液体、または固体と液体の混合物である。例えば、静脈注射のために虚血再灌流障害治療または予防作用を有する化合物を２ｍｇ／ｍｌの濃度になるよう、４％デキストロース／０．５％クエン酸ナトリウム水溶液中に溶解する。固形の製剤は粉末、錠剤およびカプセルを包含する。固形担体は、香料、滑沢剤、溶解剤、懸濁剤、結合剤、錠剤崩壊剤、カプセル剤にする材料としても役立つ１またはそれ以上の物質である。経口投与のための錠剤は、トウモロコシデンプン、アルギン酸などの崩壊剤、および／またはゼラチン、アカシアなどの結合剤、およびステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、滑石などの滑沢剤とともに炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウムなどの適当な賦形剤を含む。
粉末剤では担体は細かく粉砕された活性成分と混合された、細かく粉砕された固体である。錠剤では活性成分は、適当な比率で、必要な結合性を持った担体と混合されており、所望の形と大きさに固められている。粉末剤および錠剤は約１〜約９９重量％の本発明の新規化合物である活性成分を含んでいる。適当な固形担体は、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、滑石、砂糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、デンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、低融点ワックス、ココアバターである。
無菌液体製剤は懸濁剤、エマルジョン剤、シロップ剤、およびエリキシル剤を含む。活性成分は、滅菌水、滅菌有機溶媒、または両者の混合物などの製薬上許容し得る担体中に溶解または懸濁することができる。活性成分はしばしば適切な有機溶媒、例えばプロピレングリコール水溶液中に溶解することができる。水性デンプン、ナトリウムカルボキシメチルセルロース溶液、または適切な油中に細かく砕いた活性成分を散布することによってその他の組成物を製造することもできる。
投与量は疾患の状態、投与ルート、患者の年齢、または体重によっても異なるが、成人に静注で投与する場合、通常０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ／時である。好ましくは、０．１〜１ｍｇ／ｋｇ／時である。
実施例
以下に本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
実施例１
Ｘ型ｓＰＬＡ２による単離ヒトリポタンパク質からの脂肪酸遊離作用
ＬＤＬとＨＤＬは、ヒト血漿より超遠心法（Ｈａｖｅｌら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．３４，１３４５−１３５３（１９５５））により単離した。０．５ｎｍｏｌ／Ｌから５００ｎｍｏｌ／ＬのヒトＩＢ、ＩＩＡおよびＸ型ｓＰＬＡ２を１２．５ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１２５ｍｇ／Ｌ牛血清アルブミン、１ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウムからなる反応液中で、ＬＤＬあるいはＨＤＬ（０．３５−１ｍｇ／ｍｌ）と３７℃で反応させた。リポタンパク質から遊離された脂肪酸をＤｏｌｅらの方法（Ｄｏｌｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３５，２５９５−２５９９（１９６０））により抽出し、既知の方法（Ｈａｎａｓａｋｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，３４２０３−３４２１１（１９９９））に従って９−アンスリルジアゾメタンにより標識した。次いで、逆相カラム（ＬｉｃｈｒｏＣＡＲＴ  １２５−４  Ｓｕｐｅｒｓｐｈｅｒ  １００  ＲＰ−１８  ｃｏｌｕｍｎｍｏｌ／Ｌｅｒｃｋ）を用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって溶出される標識物（脂肪酸）の蛍光を検出することにより、遊離脂肪酸の定量を行った。各ｓＰＬＡ２による脂肪酸遊離反応の用量依存性を調べるため、０．５，５，５０，５００ｎｍｏｌ／ＬのＸ型ｓＰＬＡ２ならびに５０，５００ｎｍｏｌ／ＬのＩＢ型およびＩＩＡ型ｓＰＬＡ２を６０分間作用させた。また、ｓＰＬＡ２による脂肪酸遊離反応の経時変化を調べるため、５０ｎｍｏｌ／Ｌの各ｓＰＬＡ２を用いて、ｓＰＬＡ２添加４時間後までの経時変化を調べた。薬物の阻害作用を調べる実験では、反応液中にｓＰＬＡ２を添加するのとほぼ同時に、ｓＰＬＡ２阻害化合物（インドキサム；Ｙｏｋｏｔａら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １４３８，２１３−２２２（１９９９））、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）阻害化合物（インドメタシン）または５−リポキシゲナーゼ（５−ＬＯＸ）阻害化合物（ＡＡ−８６１；２，３，５−トリメチル−６−（１２−ヒドロキシ−５，１０−ドデカジイニル）−１，４−ベンゾキノン（Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．７１３，４７０−４７３（１９８２））を、それぞれ終濃度１０μｍｏｌ／Ｌになるように添加した。
その結果、経時変化を調べた実験から、ＩＢ型、ＩＩＡ型、Ｘ型ｓＰＬＡ２の中では、Ｘ型ｓＰＬＡ２にのみ顕著な脂肪酸の遊離作用が認められた。Ｘ型ｓＰＬＡ２によるＨＤＬからの脂肪酸遊離反応は添加６０分後でプラトーに達し、一方、ＬＤＬからの遊離脂肪酸量は４時間後まで経時的に増加し続けた。次に、脂肪酸遊離反応の用量依存性を調べた結果、Ｘ型ｓＰＬＡ２では低用量の５ｎｍｏｌ／Ｌによって有意なＬＤＬおよびＨＤＬからの脂肪酸遊離作用が認められ、その反応には用量依存性が認められたが、ＩＢ、ＩＩＡ型ｓＰＬＡ２では、５００ｎｍｏｌ／Ｌの高用量でも微量の遊離が認められるのみであった（図１）。このＸ型ｓＰＬＡ２による脂肪酸遊離作用は、ｓＰＬＡ２阻害化合物（インドキサム）で阻害されたが、ＣＯＸ阻害化合物（インドメタシン）や５−ＬＯＸ阻害化合物（ＡＡ−８６１）では全く影響を受けなかった（図２）。
実施例２
Ｘ型ｓＰＬＡ２によるリポタンパク質リン脂質組成に対する作用
ＬＤＬおよびＨＤＬはヒト血漿より超遠心法（Ｈａｖｅｌら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．３４，１３４５−１３５３（１９５５））により単離した。５０ｎｍｏｌ／ＬのヒトＩＢ、ＩＩＡおよびＸ型ｓＰＬＡ２ならびに２０μｍｏｌ／ＬのＣｕＳＯ４を１２．５ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１２５ｍｇ／Ｌ牛血清アルブミン、１ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウムからなる反応液中でＬＤＬまたはＨＤＬ（１ｍｇ／ｍｌ）に３７℃で３、６、２４時間作用させた。その後、ＬＤＬ、ＨＤＬのリン脂質組成の変動について、ＨＰＬＣを用いて解析を行った。ＬＤＬサンプル１０μｇおよびＨＤＬサンプル１５μｇからそれぞれ既知の方法（Ｂｌｉｇｈら、Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７，９１１−９１７（１９５９））によりリン脂質の抽出を行った。次いで、既報に従い（Ｓａｉｇａら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １５３０，６７−７６（２００１））、順相ＨＰＬＣカラム（Ｕｌｔｒａｓｐｈｅｒｅ  ｓｉｌｉｃａ，４．６×２５０ｍｍと４．６×４５ｍｍ，Ｂｅｃｋｍａｎ）に添加し、溶出されるホスファチジルコリン（ＰＣ）およびリゾホスファチジルコリン（ｌｙｓｏ−ＰＣ）を分取して、そのリンの定量を行った。
その結果、ＬＤＬでは、ＣｕＳＯ４、Ｘ型ｓＰＬＡ２処理群において、３、６、２４時間と経時的にＰＣ含量の減少が認められ（図３Ａ）、ｌｙｓｏ−ＰＣ含量はＰＣの減少に相応して増加した（図３Ｂ）。ＨＤＬでは、ＣｕＳＯ４処理群ではＬＤＬの場合と同様にＰＣの経時的な減少とｌｙｓｏ−ＰＣの増加が認められた。一方、Ｘ型ｓＰＬＡ２によるＨＤＬのＰＣの分解はＬＤＬの場合に比べてかなり速く、３時間処理で１０％にまで減少し、ｌｙｓｏ−ＰＣ量もＰＣの減少に相応して３時間後にはＣｕＳＯ４処理ＨＤＬよりも６倍多く産生されていた。一方、ＩＢ、ＩＩＡ型ｓＰＬＡ２処理群においては、リン脂質の明らかな組成変化は認められなかった（図３Ａ，Ｂ）。
実施例３
Ｘ型ｓＰＬＡ２による単離ヒトリポタンパク質の陰性荷電に対する作用
ＬＤＬおよびＨＤＬはヒト血漿より超遠心法（Ｈａｖｅｌら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．３４，１３４５−１３５３（１９５５））により単離した。５０ｎｍｏｌ／ＬのヒトＩＢ、ＩＩＡ、Ｘ型ｓＰＬＡ２および２０μｍｏｌ／ＬのＣｕＳＯ４を１２．５ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１２５ｍｇ／Ｌ牛血清アルブミン、１ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウムからなる反応液中でＬＤＬあるいはＨＤＬ（１ｍｇ／ｍｌ）に３７℃でそれぞれ作用（３、６、２４時間）させた。その後、ＬＤＬは１μｇ、ＨＤＬは２μｇについて、アガロースゲル電気泳動（Ｈｅｌｅｎａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＴＩＴＡＮ  ＧＥＬ  Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ；９０Ｖ、２５分間）を行った。泳動後、ゲルを５０−６０℃で約１時間乾燥させてから６ｍｌの染色液（Ｈｅｌｅｎａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｆａｔ  Ｒｅｄ  ７Ｂアガロース溶液）で約３分間染色した後、２５ｍｌの脱色液（７０％メタノール）で脱色を行った。薬物の作用を調べる実験では、反応液にｓＰＬＡ２を添加するのとほぼ同時に、ｓＰＬＡ２阻害化合物（インドキサム）、ＣＯＸ阻害化合物（インドメタシン）または５−ＬＯＸ阻害化合物（ＡＡ−８６１）をそれぞれ終濃度１０μｍｏｌ／Ｌになるように添加した。
得られた結果を図４に示す。ＣｕＳＯ４処理をした場合には、ＬＤＬ、ＨＤＬともに未処理の場合と比較して経時的に陽極側へ大きく移動した（ＨＤＬについてデータは示していない）。ヒトｓＰＬＡ２で処理した場合には、Ｘ型ｓＰＬＡ２処理したＬＤＬやＨＤＬにおいてのみ、ＣｕＳＯ４処理時と同様な経時的な陽極側への移動が認められ、Ｘ型ｓＰＬＡ２の作用より脂肪酸が遊離されリン脂質組成が変化した結果、各リポタンパク質の陰性荷電が増加していることが確認された。このＸ型ｓＰＬＡ２によるリポタンパク質変性作用は、ｓＰＬＡ２阻害化合物（インドキサム）で阻害されたが、ＣＯＸ阻害化合物（インドメタシン）や５−ＬＯＸ阻害化合物（ＡＡ−８６１）では全く影響を受けなかった。
実施例４
Ｘ型ｓＰＬＡ２によるアポタンパク質に対する変性作用
ＬＤＬおよびＨＤＬはヒト血漿より超遠心法（Ｈａｖｅｌら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．３４，１３４５−１３５３（１９５５））により単離した。５０ｎｍｏｌ／ＬのヒトＩＢ、ＩＩＡおよびＸ型ｓＰＬＡ２ならびに２０μｍｏｌ／ＬのＣｕＳＯ４を１２．５ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１２５ｍｇ／Ｌ牛血清アルブミン、１ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウムからなる反応液中でＬＤＬあるいはＨＤＬ（１ｍｇ／ｍｌ）に３７℃で３、６、２４時間作用させた。その後、アセトン：エタノール（１：１）溶液にて脱脂処理をした後、泳動用緩衝液（１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ６．８），２％ＳＤＳ，３０％Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，０．１％２ＭＥ，０．１％ＢＰＢ）に溶解し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分析した。ＬＤＬ（アポＢ−１００）は４％ゲルで、ＨＤＬ（アポＡ−１）は４−２０％グラジエントゲルにそれぞれ５μｇを添加して泳動を行った。
その結果、ＣｕＳＯ４処理したアポＡ−１では、本来のタンパク分子量の位置のバンドがほとんど消失し、凝集を起こしたような広範な高分子側へシフトし、ＬＤＬ中のアポＢ−１００も高分子側へのバンドのシフトが認められた。一方、Ｘ型ｓＰＬＡ２で処理したアポＢ−１００やアポＡ−１においても、ＣｕＳＯ４処理の時ほど顕著ではないが、２４時間処理後でやはり同様な高分子側へシフトする現象が一部で認められた。一方、ＩＢ型やＩＩＡ型ｓＰＬＡ２処理では、未処理の場合と比較して変化は認められなかった。
実施例５
Ｘ型ｓＰＬＡ２によるリポタンパク質の脂質過酸化に対する作用
Ａ．チオバルビツール酸反応物質の生成）に対する作用
ＬＤＬおよびＨＤＬはヒト血漿より超遠心法（Ｈａｖｅｌら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．３４，１３４５−１３５３（１９５５））により単離した。５０ｎｍｏｌ／ＬのヒトＩＢ、ＩＩＡおよびＸ型ｓＰＬＡ２ならびに２０μｍｏｌ／ＬのＣｕＳＯ４を１２．５ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１２５ｍｇ／Ｌ牛血清アルブミン、１ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウムからなる反応液中でＬＤＬあるいはＨＤＬ（１ｍｇ／ｍｌ）に３７℃で３、６、２４時間させた。その後、ＬＤＬ、ＨＤＬそれぞれ１０μｇを生理的食塩水にて２００μｌに調製し、既知の方法（Ｎａｇａｎｏら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８８，６４５７−６４６１（１９９１））に従って、５００μｌの２０％ＴＣＡおよび５００μｌのチオバルビツール酸（３．３５ｍｇ／ｍｌ）を加えて９５℃で６０分間煮沸した。冷却後、ｎ−ブタノール（２ｍｌ）で脂質の過酸化の指標の一つであるチオバルビツール酸反応物質（ＴＢＡＲＳ）を抽出し、上澄中の蛍光（励起波長：５１５ｎｍ、蛍光波長：５５０ｎｍ）を測定した。なお、標準物質としてはテトラエトキシプロパンを用い、その検量線からＴＢＡＲＳの量を換算した。
得られた結果を図５ＡおよびＢに示す。ＬＤＬ（図５Ａ）、ＨＤＬ（図５Ｂ）ともにＣｕＳＯ４処理群においては６時間をピークとする顕著なＴＢＡＲＳの上昇が認められた。一方、Ｘ型ｓＰＬＡ２を含めたｓＰＬＡ２処理群全てにおいて、ＴＢＡＲＳの上昇は全く認められなかった。
Ｂ．共役ジエンの生成に対する作用
ＬＤＬおよびＨＤＬはヒト血漿より超遠心法（Ｈａｖｅｌら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．３４，１３４５−１３５３（１９５５））により単離した。５０ｎｍｏｌ／ＬのヒトＩＢ、ＩＩＡおよびＸ型ｓＰＬＡ２ならびに２０μｍｏｌ／ＬのＣｕＳＯ４を２．５ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０），２５ｍｇ／Ｌ牛血清アルブミン、１ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウム）からなる反応液中でＬＤＬ、ＨＤＬ（０．２ｍｇ／ｍｌ）に添加して３７℃で０〜６時間反応させた。その後、脂質の過酸化の指標の一つである共役ジエンの生成を、既知の方法（ＥｓｔｅｒｂａｕｅｒらＦｒｅｅ  Ｒａｄ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｓ．６，６７−７５（１９８９））に従って、２３４ｎｍの吸光度の経時変化をモニタリングすることにより調べた。
その結果、ＣｕＳＯ４処理群では、ＬＤＬ、ＨＤＬともに添加から９０分まで２３４ｎｍの経時的な吸光度の上昇が認められ、その後徐々に減少傾向を示した。一方、Ｘ型ｓＰＬＡ２を含めたｓＰＬＡ２処理群全てにおいて、２３４ｎｍにおける吸光度の変化は全く認められなかった。
以上の結果から、Ｘ型ｓＰＬＡ２によるリポタンパク質変性作用（脂肪酸遊離、リン脂質の組成変化、陰性荷電の増加、アポタンパク質の高分子化）は、ＣｕＳＯ４処理による酸化変性と同じ変化を示すものの、リポタンパク質の酸化作用には依存していないことが確認された。
実施例６
Ｘ型ｓＰＬＡ２による変性ＬＤＬのマウス腹腔マクロファージへの取り込み作用
マウス腹腔マクロファージは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（雄、生後８週令）の腹腔内に２ｍｌの４％チオグリコレート溶液を注入し、４日後に腹腔内細胞を採取後チャンバースライドに蒔き、無血清培地（ＢＩＯ  ＷＨＩＴＴＡＫＥＲ：Ｘ−ＶＩＶＯ  １５）存在下で２時間培養して非付着性細胞を洗浄操作で除くことにより調製した。本細胞に、０．２ｍｇ／ｍｌのＬＤＬ（Ｓｉｇｍａ）と５０ｎｍｏｌ／ＬのＸ型ＰＬＡ２を加えて４８時間無血清培地で培養した。マクロファージへのＬＤＬの取り込みは、細胞を４％ホルムアルデヒドで２０分間固定した後、Ｏｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ染色液で脂肪染色を行うことにより確認した。薬物の作用を調べる実験では、ｓＰＬＡ２を添加するのとほぼ同時に、ｓＰＬＡ２阻害化合物（インドキサム）、ＣＯＸ阻害化合物（インドメタシン）または５−ＬＯＸ阻害化合物（ＡＡ−８６１）をそれぞれ終濃度１０μｍｏｌ／Ｌになるように添加した。
その結果、Ｘ型ｓＰＬＡ２で処理した場合には、Ｏｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ染色陽性のシグナルが検出され、細胞内へのＬＤＬの取り込みが確認されたが、未処理の細胞では陽性のシグナルは検出されなかった。以上の結果から、Ｘ型ｓＰＬＡ２は、ＬＤＬのマクロファージへの取り込みを増加させることが明らかとなり、本酵素が動脈硬化病変部位に出現する泡沫細胞の形成に関与している可能性が示唆された。このＸ型ｓＰＬＡ２によるＬＤＬの細胞内取り込み反応は、細胞にＸ型ｓＰＬＡ２およびＬＤＬを添加する際にｓＰＬＡ２阻害化合物（インドキサム）を同時に加えることにより阻害されたが、ＣＯＸ阻害化合物（インドメタシン）または５−ＬＯＸ阻害化合物（ＮＤＧＡ）では全く影響を受けなかった。
実施例７
抗Ｘ型ｓＰＬＡ２ポリクローナル抗体を用いたマウス動脈硬化病変組織
での免疫組織化学的解析
動脈硬化病態モデル動物として実験に用いたのは、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  Ｖｏｌ．９４，ｐｐ．９３７−９４５（１９９４）に発表・記載されたアポリポタンパク質Ｅ遺伝子欠損マウスであり、雌・生後８週齢、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−ＡｐｏｅｔｍｌＵｎｃマウスをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂ．より購入した。対照群として、雄・同週齢のＣ５７ＢＬ／６を使用した。購入直後より、高脂肪食（ＣＡ−１（通常飼育固形飼料）にココアバター１５．８％、コレステロール１．２５％、コール酸Ｎａ０．５％を添加したもの）を給餌しながら飼育した。生後１２週齢、１７週齢、および２２週齢の各マウスを灌流駆血し、次いで４％パラホルムアルデヒド水溶液によって血管を化学固定し、解剖して心臓近傍の上行大動脈組織を採取した。同固定液に一昼夜浸漬した後、リン酸緩衝液で洗浄し、常法通りエタノール水溶液にて暫時脱水を施しパラフィンワックスに包埋した。ミクロトームを用いて厚さ５μｍ内外のパラフィン切片を調製し、スライドグラスに貼付して染色用病理標本を作製した。免疫組織化学は、各標本スライドをキシロールに漬けてパラフィンワックスを取り除き、０．３％Ｈ２Ｏ２を含むメタノールに３０分間反応させて内因性ペルオキシターゼを除去した後、５％の正常ヤギ血清で２０分間処置した。引き続いて、標本スライドを０．１％牛血清アルブミンを含むＰＢＳ水溶液中に３０分間浸した後、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｖｏｌ．２７４，Ｎｏ．４８，ｐｐ．３４２０３−３４２１１（１９９９）に記載の抗ヒトＸ型ｓＰＬＡ２（ウサギ）ポリクローナル抗体（６μｇ／ｍＬ）と１４時間、４℃で反応させた。その後、０．１％ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン一ラウリン酸塩（Ｔｗｅｅｎ２０；Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．Ｏｓａｋａ）含有のＰＢＳ水溶液で充分に洗浄し、ビオチンを結合したヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体と３０分間反応させ、ペルオキシダーゼ含有アビジン−ビオチン複合体試薬（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を処理し３０分間放置した。ＰＢＳ水溶液で洗浄後、２００μｇ／ｍＬのジアミノベンジジンと０．００６％Ｈ２Ｏ２を含む５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）緩衝液中で１０分間反応させることによって標的Ｘ型分子の周囲に増幅されたペルオキシダーゼ活性を呈色し、組織標本中のＸ型ｓＰＬＡ２の局在を可視化した。本解析においては、Ｘ型ｓＰＬＡ２分子の陽性シグナルは、ジアミノベンジデンの茶褐色の沈着として検出される。Ｘ型ｓＰＬＡ２シグナルの吸収中和実験は、抗体をスライドに添加する前に、精製したマウスＸ型ｓＰＬＡ２タンパク質（３００μｇ／ｍＬ）と２時間反応させ、その抗体およびタンパク質反応物を用いてスライドを処理することにより行った。また、０．４％ヘマトキシリン溶液を組織標本に処理して細胞核の対比染色も行った。
その結果、Ｘ型ｓＰＬＡ２の陽性シグナルは、採取した生後１２、１７、２２週齢のアポリポタンパク質Ｅ遺伝子欠損マウスの血管の中では、特に動脈硬化病変の初期的徴候である泡沫細胞の集積部位についてのみ局所的に検出された。一方、対照正常マウスの血管組織では動脈硬化病変は認められず、Ｘ型陽性シグナルは全く検出されなかった。また、マウスＸ型ｓＰＬＡ２タンパク質を用いた吸収中和処理により、アポリポタンパク質Ｅ遺伝子欠損マウスの動脈硬化病変部位に検出されたシグナルは完全に消失したことから、この陽性反応はＸ型ｓＰＬＡ２分子に特異的であることが確認された。また、これらの陽性シグナルは、非免疫のウサギから調製したＩｇＧでは認められなかった。以上の結果から、マウス動脈硬化モデルでの血管病変部位の泡沫細胞では、Ｘ型ｓＰＬＡ２分子が顕著に高発現していることが確認された。
実施例８
Ｘ型ｓＰＬＡ２変性ＬＤＬによるマクロファージ細胞内
コレステロールエステル量の増加作用
Ｘ型ｓＰＬＡ２による変性ＬＤＬは、ヒト血漿より単離したＬＤＬに５０ｎｍｏｌ／ＬのＸ型ｓＰＬＡ２を、１２．５ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１２５ｍｇ／Ｌ牛血清アルブミン、１ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウムからなる反応液中で、３７℃で２４時間作用させることで調製した。マウス腹腔マクロファージは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（雄、生後８週令）の腹腔内に２ｍｌの３％チオグリコレート溶液を注入し、４日後に腹腔内細胞を採取後２４穴プレートに蒔き、無血清培地（ＢＩＯ  ＷＨＩＴＴＡＫＥＲ：Ｘ−ＶＩＶＯ  １５）存在下で２時間培養して非付着性細胞を洗浄操作で除くことにより調製した。本細胞に、０．２ｍｇ／ｍｌのＬＤＬを加えて４８時間無血清培地で培養した後細胞を洗浄し、ヘキサンおよびイソプロパノールの混合液（３：２）中で３０分間静置する事でマクロファージ内に蓄積されたコレステロールを抽出した。抽出したコレステロールは、溶媒をイソプロパノールに置換した後、既知の方法（Ｇａｍｂｌｅら，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ．Ｒｅｓ．１９，１０６８−１０７０（１９７８））に従って、０．１Ｍリン酸緩衝液、１ｕｎｉｔ／ｍｌのコレステロールオキシダーゼ（Ｒｏｃｈｅ）、１０ｕｎｉｔ／ｍｌのペルオキシダーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、４０μｇ／ｍｌのｐ−ヒドロキシフェニル酢酸（Ｓｉｇｍａ）、および１ｕｎｉｔ／ｍｌのコレステロールエステラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ）からなる反応液中において３７℃で３０分間反応させ、溶液中の蛍光（励起波長：３０５ｎｍ、蛍光波長：４２０ｎｍ）を測定することにより総コレステロール量（遊離型コレステロール＋コレステロールエステル）を測定した。さらに、コレステロールエステラーゼを含まない反応液中で３７℃、３０分間反応させることにより、遊離型コレステロール量のみを測定した。なお、標準物質としてはコレステロールおよびコレステロールオレエートを用い、その検量線から総コレステロール量と遊離型コレステロール量を算出し、総コレステロール量から遊離型コレステロール量を差し引いた値をコレステロールエステル量とした。
その結果、Ｘ型ｓＰＬＡ２で処理したＬＤＬを取り込ませた場合には、非処理のＬＤＬを取り込ませた群に比べ、細胞内コレステロールエステル量の有意な増加が検出されたことから、本酵素により修飾されたＬＤＬが、動脈硬化病変部位に出現する泡沫細胞の形成に対して促進的に働く可能性が示唆された。
実施例９
ＨＤＬによるコレステロール引き抜き能力に対する
Ｘ型ｓＰＬＡ２変性の影響
Ｘ型ｓＰＬＡ２による変性ＨＤＬは、ヒト血漿より単離したＨＤＬに５０ｎｍｏｌ／ＬのＸ型ｓＰＬＡ２を、１２．５ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１２５ｍｇ／Ｌ牛血清アルブミン、１ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウムからなる反応液中で、３７℃で３時間作用させることで調製した。マウス腹腔マクロファージは、ＩＣＲマウス（雌、生後１２週令）の腹腔内洗浄液を回収し２４穴プレートに蒔き、１０％の牛胎仔血清含有培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ：Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）存在下で２時間培養して非付着性細胞を洗浄操作で除く事により調製した。本細胞に、５０μｇ／ｍｌのアセチル化ＬＤＬ（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．）を加えて２４時間培養することでマクロファージの泡沫化を行った。培地中の過剰なアセチル化ＬＤＬを除去した後、血清非存在下で１００μｇ／ｍｌのＨＤＬを加えて２４時間培養した後、細胞内コレステロールの抽出および定量を行い、ＨＤＬによる泡沫細胞からのコレステロール引き抜き能力について検討した。
その結果、Ｘ型ｓＰＬＡ２による変性ＨＤＬで処理した細胞群における細胞内コレステロールの引き抜き量は、非変性ＨＤＬで処理した細胞群に対して有意に減少していた。以上の結果から、本酵素によるＨＤＬの変性は、動脈硬化病変部位に出現する泡沫細胞のＨＤＬによるコレステロール引き抜き作用に対して抑制的に働いている可能性が示唆された（図６）。
実施例１０
Ｖ型ＰＬＡ２による単離ヒトリポタンパク質からの脂肪酸遊離作用
Ａ．ヒトＶ型ｓＰＬＡ２発現細胞の作製とその培養上清からの酵素の精製
ヒトＶ型ｓＰＬＡ２をコードするｃＤＮＡは、ＣＬＯＮＴＥＣＨ社のｈｕｍａｎ  ｈｅａｒｔ  ｍａｒａｔｈｏｎ  ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法により得た。ＰＣＲには、以下のプライマーを用いた。
0004499361.tif 000021
ｈＧＶ−Ｓは、コザック配列および制限酵素ＭｌｕＩ認識部位を有する。また、ｈＧＶ−ＡＳは、制限酵素ＮｏｔＩ認識部位を有する。ＰＣＲは、９４℃で０．５分、５５℃で０．５分、７２℃で２．５分の条件で３５サイクル行った。ＰＣＲ増幅断片を、ＭｌｕＩおよびＮｏｔＩで切断し、改変型ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＫ（−）に挿入した。塩基配列はＳｅｑｕｅｎａｓｅ  Ｖｅｒ．２．０（ＵＳＢ社）を用いて確認した。次に、カルボキシル基末端に６個のＨｉｓ残基を付加したＶ型ｓＰＬＡ２−ＨｉｓＴａｇ体は、ｈＧＶ−ＳプライマーおよびｈＧＶ−Ｈ６ＡＳプライマー（５’−ｃｔｃｇｃｔｇｃｇｇｃｃｇｃｃｔａａｔｇｇｔｇａｔｇｇｔｇａｔｇａｔｇｇｇａｇｃａｇｇａｔｇｔｔｇｇｇａａａｇ−３’）（配列番号３）を用い、ヒトＶ型ｓＰＬＡ２プラスミドＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより構築した。ＰＣＲ増幅断片を、ＳｍａＩおよびＮｏｔＩで切断し、Ｖ型ｓＰＬＡ２プラスミドＤＮＡの対応する部位と置換した。ＰＣＲで新たに増幅した領域の塩基配列を確認した後、そのｃＤＮＡを哺乳類細胞用発現ベクターのＳＲ−αプロモーター下流に挿入した。得られた発現ベクターをＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ試薬（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社）を用いて、宿主細胞ＣＨＯに使用説明書にしたがってトランスフェクションし、ヒトＶ型ｓＰＬＡ２を安定に発現するＣＨＯ細胞を得た。本発現細胞を、１０％ウシ胎児血清含有α−ＭＥＭ培地にてコンフルエント直前まで培養し、その培養上清を集め精製材料とした。
本培養上清から、ニッケルキレートしたＨｉＴｒａｐ  Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  ＨＰカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いて、ヒトＶ型ｓＰＬＡ２をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動上、単一にまで精製し（分子量約１４ｋＤａ）、以下のリポタンパク質変性作用について解析した。
Ｂ．Ｖ型ＰＬＡ２による単離ヒトリポタンパク質からの脂肪酸遊離作用
ＬＤＬおよびＨＤＬはヒト血漿より超遠心法（Ｈａｖｅｌら、Ｊ．Ｃｈｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．３４，１３４５−１３５３，（１９５５））により単離した。ヒトＩＩＡ型、あるいはＶ型ｓＰＬＡ２を１２．５ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０），１２５ｍｇ／Ｌ牛血清アルブミン、１ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウムからなる反応液中でＬＤＬ、ＨＤＬ（１ｍｇ／ｍｌ）に３７℃で反応させ、遊離される脂肪酸をＤｏｌｅらの方法（Ｄｏｌｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３５，２５９５−２５９９，（１９６０））により抽出した。次に、既知の方法（Ｈａｎａｓａｋｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，３４２０３−３４２１１（１９９９））に従い９−Ａｎｔｈｒｙｌｄｉａｚｏｍｅｔｈａｎｅにより標識した後、逆相カラム（ＬｉｃｈｒｏＣＡＲＴ  １２５−４  Ｓｕｐｅｒｓｐｈｅｒ  １００  ＲＰ−１８  ｃｏｌｕｍｎ，Ｍｅｒｃｋ）を用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により溶出される標識物（脂肪酸）の蛍光を検出することにより定量を行った。ＩＩＡ型、Ｖ型ｓＰＬＡ２による脂肪酸遊離の経時変化は、５０ｎｍｏｌ／Ｌの濃度を用いｓＰＬＡ２添加後３，６，２４時間の経時変化を調べた。薬物の作用を調べる実験では、反応液にｓＰＬＡ２を添加するのとほぼ同時にｓＰＬＡ２阻害剤（インドキサム）あるいはＣＯＸ阻害剤（インドメタシン）、をそれぞれ終濃度１０μｍｏｌ／Ｌになるように添加した。
その結果、Ｖ型ｓＰＬＡ２では非常に顕著な脂肪酸の遊離作用が認められ、ＨＤＬからの遊離反応は添加後３時間でプラトーに達し２４時間まで持続した。一方、ＬＤＬからの脂肪酸遊離は、Ｖ型ｓＰＬＡ２では２４時間後まで経時的に上昇し続けたのに対し、ＩＩＡ型ｓＰＬＡ２では、ごく少量の脂肪酸遊離が認められるのみであった（図７）。このＶ型ｓＰＬＡ２による脂肪酸遊離作用のうち、リノール酸遊離作用はｓＰＬＡ２阻害剤（インドキサム）で阻害されたが、ＣＯＸ阻害剤（インドメタシン）では全く影響を受けなかった（図８）。
実施例１１
Ｖ型ｓＰＬＡ２によるリポタンパク質リン脂質組成に対する作用
ＬＤＬおよびＨＤＬはヒト血漿より超遠心法（Ｈａｖｅｌら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．３４，１３４５−１３５３，（１９５５））により単離した。５０ｎｍｏｌ／ＬのヒトＩＩＡ型、あるいはＶ型ｓＰＬＡ２を１２．５ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０），１２５ｍｇ／Ｌ牛血清アルブミン、１ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウムからなる反応液中でＬＤＬ、ＨＤＬ（１ｍｇ／ｍｌ）に３７℃で３，６，２４時間させた後、ＬＤＬ、ＨＤＬのリン脂質組成の変動についてＨＰＬＣを用いて解析を行った。ＬＤＬサンプルの１０μｇあるいはＨＤＬサンプルの１５μｇより、それぞれＢｌｉｇｈらの方法（Ｂｌｉｇｈら、Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７，９１１−９１７，（１９５９））によりリン脂質の抽出を行った後、既報に従い（雑賀ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，．１５３０，６７−７６（２００１））、順相ＨＰＬＣカラム（Ｕｌｔｒａｓｐｈｅｒｅ  ｓｉｌｉｃａ，４．６×２５０ｍｍと４．６×４５ｍｍ，Ｂｅｃｋｍａｎ）に添加し、溶出されるホスファチジルコリン（ＰＣ）およびリゾホスファチジルコリン（ｌｙｓｏＰＣ）を分取して、リンの分析にて定量を行った。
その結果、ＬＤＬでは、Ｖ型ＰＬＡ２処理群において３，６，２４時間と経時的にＰＣの減少が認められ、リゾ−ＰＣはＰＣの減少に相応して増加した（図９ＡおよびＢ）。またＨＤＬでは、Ｖ型ｓＰＬＡ２によるＰＣの分解がかなり速く、３時間で約３０％まで減少、リゾ−ＰＣもＰＣの減少に相応して速やかに増加した。一方、ＩＩＡ型ｓＰＬＡ２処理群においては、リン脂質の有意な組成変化は認められなかった。
実施例１２
Ｖ型ＰＬＡ２による単離ヒトリポタンパク質に対する変性作用
ＬＤＬおよびＨＤＬはヒト血漿より超遠心法（Ｈａｖｅｌら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．３４，１３４５−１３５３，（１９５５））により単離した。５０ｎｍｏｌ／ＬのヒトＩＩＡ型、あるいはＶ型ｓＰＬＡ２を１２．５ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０），１２５ｍｇ／Ｌ牛血清アルブミン、１ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウムからなる反応液中でＬＤＬ、ＨＤＬ（１ｍｇ／ｍｌ）に３７℃で作用（３，６，２４時間）させた後、アガロースゲル（Ｈｅｌｅｎａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＴＩＴＡＮ  ＧＥＬ  Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）にＬＤＬは１μｇ、ＨＤＬは２μｇをスポットし、９０Ｖで２５分間電気泳動を行った。泳動後ゲルを５０〜６０℃で約１時間乾燥させてから６ｍｌの染色液（Ｈｅｌｅｎａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｉｅｓ，Ｆａｔ  Ｒｅｄ  ７Ｂアガロース溶液）で約３分間染色した後、２５ｍｌの脱色液（７０％メタノール）で脱色を行った。薬物の作用を調べる実験では、反応液にｓＰＬＡ２を添加するのとほぼ同時にｓＰＬＡ２阻害剤（インドキサム），ＣＯＸ阻害剤（インドメタシン）をそれぞれ終濃度１０μｍｏｌ／Ｌになるように添加した。
その結果、Ｖ型ｓＰＬＡ２処理をした場合には、ＬＤＬ、ＨＤＬともに未処理の場合と比較して陽極側へ大きく移動した。ＨＤＬの陽極側への移動度は、脂肪酸遊離作用と同じく３時間でプラトーに達し２４時間まで持続した。また、ＬＤＬの陽極側への移動度は、２４時間後まで経時的に増加し続けた。このように、Ｖ型ｓＰＬＡ２により脂肪酸が遊離された結果、各リポタンパク質の陰性電荷が変化（変性）していることが確認された（図１０）。一方、ヒトＩＩＡ型ｓＰＬＡ２で処理した場合には、各リポタンパク質の陽極側への移動は認められなかった。
このＶ型ｓＰＬＡ２によるリポタンパク質変性作用は、ｓＰＬＡ２阻害剤（インドキサム）で阻害されたが、ＣＯＸ阻害剤（インドメタシン）では全く影響を受けなかった。
実施例１３
Ｖ型ｓＰＬＡ２によるリポタンパクの脂質過酸化
（チオバルビツール酸反応物質）に対する作用
ＬＤＬおよびＨＤＬはヒト血漿より超遠心法（Ｈａｖｅｌら、Ｊ．Ｃｈｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．３４，１３４５−１３５３，（１９５５））により単離した。５０ｎｍｏｌ／ＬのヒトＩＩＡ型、あるいはＶ型ｓＰＬＡ２を１２．５ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１２５ｍｇ／Ｌ牛血清アルブミン、１ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウムからなる反応液中でＬＤＬ、ＨＤＬ（１ｍｇ／ｍｌ）に３７℃で作用（それぞれ２４，３時間）させた後、ＬＤＬ、ＨＤＬそれぞれ１０μｇを生理的食塩水にて２００μｌに調整し、Ｎａｇａｎｏらの方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８８，６４５７−６４６１，（１９９１））に従い５００μｌの２０％ＴＣＡおよび５００μｌのチオバルビツール酸（３．３５ｍｇ／ｍｌ）を加えて９５℃で６０分間煮沸した。冷却後、２ｍｌ  ｎ−ブタノールで脂質過酸化の指標であるチオバルビツール酸反応物質（ＴＢＡＲＳ）を抽出し、上澄中の蛍光（励起波長：５１５ｎｍ，蛍光波長：５５０ｎｍ）を測定した。なお、標準物質として、テトラエトキシプロパンを用い、その検量線からＴＢＡＲＳの量を換算した。
その結果、ＩＩＡ型およびＶ型ｓＰＬＡ２処理群全てにおいて、ＴＢＡＲＳの上昇は全く認められなかった。
実施例１４
Ｖ型ｓＰＬＡ２による変性ＬＤＬのマウス腹腔マクロファージへの取り込み作用  マウス腹腔マクロファージは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（雄、生後８週令）の腹腔内に２ｍｌの４％チオグリコレート溶液を注入し、４日後に腹腔内細胞を採取後チャンバースライドに蒔き、無血清培地（ＢＩＯ  ＷＨＩＴＡＫＥＲ：Ｘ−ＶＩＶＯ  １５）存在下で２時間培養して非付着性細胞を洗浄操作で除くことにより調製した。本細胞に、０．２ｍｇ／ｍｌのＬＤＬ（Ｓｉｇｍａ）と５０ｎｍｏｌ／ＬのＩＩＡ型、あるいはＶ型ｓＰＬＡ２を加えて４８時間無血清培地で培養した。マクロファージへのＬＤＬの取り込みは、細胞を４％ホルムアルデヒドで２０分間固定した後、Ｏｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ染色液で脂肪染色を行うことにより確認した。その結果、Ｖ型ｓＰＬＡ２で処理した場合には、Ｏｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ染色陽性のシグナルが検出され、細胞内へのＬＤＬの取り込みが確認されたが、ＩＩＡ型ｓＰＬＡ２で処理した場合ならびに未処理の細胞では陽性のシグナルは検出されなかった。以上の結果から、Ｖ型ＰＬＡ２は、ＬＤＬのマクロファージへの取り込みを増加させることが明らかとなり、本酵素が動脈硬化病変部位に出現する泡沫細胞の形成に関与している可能性が示唆された。
以下の参考例は、本発明における好ましい化合物におけるヒトＶ型またはＸ型ｓＰＬＡ２阻害活性を示す。
参考例
Ａ．ヒトＶ型またはＸ型ｓＰＬＡ２発現細胞の作成とその培養上清の調製
ヒトＶ型、Ｘ型ｓＰＬＡ２をコードするｃＤＮＡ配列（Ｃｈｅｎ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，１９９４，２６９，２３６５−２３６８ならびにＣｕｐｉｌｌａｒｄ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，１９９７，２７２，１５７４５−１５７５２）を、動物細胞用発現ベクターであるｐＳＶＬ  ＳＶ４０  Ｌａｔｅ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）のプロモーター下流域に順方向に挿入した。得られた発現ベクターをＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ試薬（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社）を用いて、宿主細胞ＣＨＯに使用説明書にしたがってトランスフェクションし、ヒトＶ型、Ｘ型ｓＰＬＡ２をそれぞれ安定に発現するＣＨＯ細胞を得た。各発現細胞を、１０％ウシ胎児血清含有α−ＭＥＭ培地にて３日間培養し、その培養上清を各酵素活性の測定に使用した。
Ｂ．阻害活性の検定
Ｖ型またはＸ型ｓＰＬＡ２のインヒビターを同定および評価するために、以下のクロモジェニックアッセイを用いる。このアッセイは９６ウェルマイクロタイタープレートを用いる高容量スクリーニングに適用されている。このアッセイの一般的な説明は、Ｌａｕｒｅ．Ｊ．Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，Ｌｏｒｉ  Ｌ．ＨｕｇｈｅｓおよびＥｄｗａｒｄ  Ａ  Ｄｅｎｎｉｓによる記事「Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｙｎｏｖｉａｌ  Ｆｌｕｉｄ  Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ａ２  ｏｎ  Ｓｈｏｒｔ  Ｃｈａｉｎ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ−Ｍｉｘｅｄ  Ｍｉｃｅｌｌｅｓ：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ａｓｓａｙ  Ｓｕｉｔａｂｌｅ  ｆｏｒ  ａ  Ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ」（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０４，ｐｐ  １９０−１９７，１９９２：）に記載されている。
被検化合物（または溶媒ブランク）をあらかじめ設定したプレートの配列に従って加え、反応はトリス緩衝液（２５ｍＭ，ｐＨ７．３）、ＣａＣｌ２（１０ｍＭ）、ＫＣｌ（１００ｍＭ）、ウシ血清アルブミン（１．０ｍｇ／ｍｌ）中、トライトンＸ１００（０．３ｍＭ）、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（１２５μＭ）の存在下、ジヘプタノイル・チオＰＣ（１ｍＭ）を、ヒトＶ型またはヒトＸ型のｓＰＬＡ２と反応させ、４０５ｎｍにおける吸光度変化を測定し、阻害活性を算出した。
ヒトＶ型酵素の場合は、４０μｌ／ウェルで４０℃、４５分間、ヒトＸ型酵素の場合には、１５μｌ／ウェルで４０℃、３０分間反応を行なった。
ＩＣ５０は、以下の表１−４に示した被検化合物のｌｏｇ濃度を１０％〜９０％阻害の範囲の阻害値に対して、プロットすることにより求めた。
Ｖ型ｓＰＬＡ２阻害試験の結果を以下の表５に、Ｘ型ｓＰＬＡ２阻害試験の結果を以下の表６にそれぞれ示す。
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製剤例
以下に示す製剤例１〜８は例示にすぎず、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。「活性成分」なる用語は、Ｖ型および／またはＸ型ｓＰＬＡ２阻害作用を有する化合物、そのプロドラッグ、もしくはそれらの製薬上許容される塩、またはそれらの溶媒和物を意味する。
製剤例１
硬質ゼラチンカプセルは次の成分を用いて製造する：
0004499361.tif 000030
製剤例２
錠剤は下記の成分を用いて製造する：
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成分を混合し、圧縮して各重量６６５ｍｇの錠剤にする。
製剤例３
以下の成分を含有するエアロゾル溶液を製造する：
0004499361.tif 000032
活性成分とエタノールを混合し、この混合物をプロペラント２２の一部に加え、−３０℃に冷却し、充填装置に移す。ついで必要量をステンレススチール容器へ供給し、残りのプロペラントで希釈する。バブルユニットを容器に取り付ける。
製剤例４
活性成分６０ｍｇを含む錠剤は次のように製造する：
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活性成分、デンプン、およびセルロースはＮｏ．４５メッシュＵ．Ｓ．のふるいにかけて、十分に混合する。ポリビニルピロリドンを含む水溶液を得られた粉末と混合し、ついで混合物をＮｏ．１４メッシュＵ．Ｓ．ふるいに通す。このようにして得た顆粒を５０℃で乾燥してＮｏ．１８メッシュＵ．Ｓ．ふるいに通す。あらかじめＮｏ．６０メッシュＵ．Ｓ．ふるいに通したナトリウムカルボキシメチルデンプン、ステアリン酸マグネシウム、およびタルクをこの顆粒に加え、混合した後、打錠機で圧縮して各重量１５０ｍｇの錠剤を得る。
製剤例５
活性成分８０ｍｇを含むカプセル剤は次のように製造する：
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活性成分、デンプン、セルロース、およびステアリン酸マグネシウムを混合し、Ｎｏ．４５メッシュＵ．Ｓ．のふるいに通して硬質ゼラチンカプセルに２００ｍｇずつ充填する。
製剤例６
活性成分２２５ｍｇを含む坐剤は次のように製造する：
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活性成分をＮｏ．６０メッシュＵ．Ｓ．のふるいに通し、あらかじめ必要最小限に加熱して融解させた飽和脂肪酸グリセリドに懸濁する。ついでこの混合物を、みかけ２ｇの型に入れて冷却する。
製剤例７
活性成分５０ｍｇを含む懸濁剤は次のように製造する：
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活性成分をＮｏ．４５メッシュＵ．Ｓ．のふるいにかけ、ナトリウムカルボキシメチルセルロースおよびシロップと混合して滑らかなペーストにする。安息香酸溶液および香料を水の一部で希釈して加え、攪拌する。ついで水を十分量加えて必要な体積にする。
製剤例８
静脈用製剤は次のように製造する：
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上記成分の溶液は通常、１分間に１ｍｌの速度で患者に静脈内投与される。
産業上の利用の可能性
上記のように、本発明者らは、Ｖ型およびＸ型ｓＰＬＡ２による血清リポタンパク質変性作用とともに、動脈硬化病変部位におけるＶ型およびＸ型ｓＰＬＡ２の発現を提示することにより、Ｖ型およびＸ型ｓＰＬＡ２が動脈硬化病態の発症・進展に関与することを初めて見出した。本発明はかかる知見を基礎としており、そして本発明は、Ｖ型またはＸ型ｓＰＬＡ２のリポタンパク質変性作用に対するｓＰＬＡ２阻害化合物の抑制作用を検討し、該阻害化合物の動脈硬化を基盤とする虚血性疾患への有用性を明らかにした。即ち、本発明は、Ｖ型および／またはＸ型ｓＰＬＡ２のリポタンパク質変性作用を抑制することによる動脈硬化を基盤とする虚血性心疾患に対する治療薬や予防薬として有用である。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、ＩＢ型、ＩＩＡ型およびＸ型ｓＰＬＡ２によるＬＤＬからのアラキドン酸遊離作用の用量依存性を示すグラフである（３７℃、１時間の反応）。
図２は、Ｘ型ｓＰＬＡ２によるＬＤＬからのアラキドン酸遊離作用に対する阻害化合物の影響を示すグラフである（ｓＰＬＡ２阻害化合物：インドキサム、ＣＯＸ阻害化合物：インドメタシン、５−ＬＯＸ阻害化合物：ＡＡ−８６１、各１０μｍｏｌ／Ｌ、阻害化合物がない場合のＸ型ｓＰＬＡ２によるＬＤＬからのアラキドン酸遊離量に対する％で示している）。
図３は、ＬＤＬをＩＢ型、ＩＩＡ型およびＸ型ｓＰＬＡ２、あるいはＣｕＳＯ４と反応（３、６、２４時間）させた後の、ＬＤＬ中の主要リン脂質であるホスファチジルコリン（ＰＣ）の含量（図３Ａ）と、そのリゾ体（ｌｙｓｏ−ＰＣ）の含量（図３Ｂ）の変化を示すグラフである。
図４は、ＬＤＬを、ＩＢ型、ＩＩＡ型、Ｘ型ｓＰＬＡ２、あるいはＣｕＳＯ４と反応（３、６、２４時間）させた後の、ＬＤＬの電荷について、アガロースゲル電気泳動にて解析した結果を示す、図面に代わる写真である（ゲル上側：陰極、下側：陽極）。
図５は、ＬＤＬ（Ａ）あるいはＨＤＬ（Ｂ）を、ＩＢ型、ＩＩＡ型およびＸ型ｓＰＬＡ２、あるいはＣｕＳＯ４と反応（３、６、２４時間）させた後の、各リポタンパク質中の脂質過酸化の変化を、チオバルビツール酸反応物質（ＴＢＡＲＳ）をマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）量に換算して示したグラフである。
図６は、Ｘ型ｓＰＬＡ２変性ＨＤＬによるコレステロール引き抜き量低下作用を示すグラフである。培地単独に対して、非変性ＨＤＬ（天然ＨＤＬ）添加により細胞内コレステロールエステル量の有意な低下が認められるが、Ｘ型変性ＨＤＬ（Ｘ−ＨＤＬ）では、ＨＤＬによる低下作用が有意に抑制されている。
図７は、ＩＩＡ型あるいはＶ型ｓＰＬＡ２によるＬＤＬからの脂肪酸遊離作用の時間経過を示すグラフである（３７℃、５０ｎｍｏｌ／Ｌ  ｓＰＬＡ２添加）。
図８は、Ｖ型ｓＰＬＡ２によるＬＤＬからのリノール酸遊離作用に対する阻害剤の影響を示すグラフである（ｓＰＬＡ２阻害剤：インドキサム、ＣＯＸ阻害剤インドメタシン：各１０μＭ：阻害剤がない場合のＶ型ｓＰＬＡ２によるＬＤＬからのリノール酸遊離量に対する％で示している）。
図９は、ＬＤＬをＩＩＡ型、あるいはＶ型ｓＰＬＡ２と反応（３、６、２４時間）させた後の、ＬＤＬ中の主要リン脂質であるホスファチジルコリン（ＰＣ）の含量（Ａ）と、そのリゾ体（ｌｙｓｏ−ＰＣ）の含量（Ｂ）の変化を示すグラフである（３７℃、５０ｎｍｏｌ／Ｌ  ｓＰＬＡ２添加）。
図１０は、ＬＤＬをＶ型ｓＰＬＡ２と反応（24時間）させた後の、ＬＤＬの電荷について、アガロースゲル電気泳動にて解析した結果を示す、図面に代わる写真である（ゲル上側：陰極、下側：陽極）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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