(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（イ）、（ロ）および（ハ）を有するプラスミドベクター。
（イ）インテグラーゼ遺伝子
（ロ）インテグラーゼ遺伝子を発現制御する領域をなすＤＮＡ
（ハ）１つのＬＴＲと他のＬＴＲとが連結する際に形成される末端塩基どうしの配列を少なくとも含み、インテグラーゼがインテグレーション反応を触媒する際の認識領域をなすＤＮＡ
【請求項２】
連結した２つのＬＴＲからなる領域を有し、前記（ロ）および（ハ）のＤＮＡが前記２つのＬＴＲからなる領域内のＤＮＡである、請求項１に記載のプラスミドベクター。
【請求項３】
さらに、前記インテグラーゼ遺伝子に核移行シグナルをコードするＤＮＡが付加された請求項１または２に記載のプラスミドベクター。
【請求項４】
前記インテグラーゼ遺伝子および／またはＬＴＲが、レトロウイルス科に属するウイルス由来である請求項１から３のいずれか１つに記載のプラスミドベクター。
【請求項５】
前記レトロウイルス科に属するウイルスが、レトロウイルス科オンコウイルス亜科に属するウイルスである請求項４に記載のプラスミドベクター。
【請求項６】
下記（ニ）をさらに有する請求項１から５のいずれか１つに記載のプラスミドベクター。
（ニ）宿主細胞のゲノムに挿入しようとする任意のＤＮＡ
【請求項７】
請求項６に記載のプラスミドベクターにより形質転換された形質転換体。
【請求項８】
請求項６に記載のプラスミドベクターがゲノムに挿入されているキメラトリ。
【請求項９】
請求項６に記載のプラスミドベクターがゲノムに挿入されている遺伝子導入トリ。
【請求項１０】
請求項６に記載のプラスミドベクターをトリの卵中の胚に注入して胚を構成する細胞のゲノムに請求項６における（ニ）のＤＮＡを挿入し、当該卵を孵化させて（ニ）のＤＮＡが挿入された個体を得る、外来ＤＮＡが挿入されたトリの作出方法。
【請求項１１】
請求項６に記載のプラスミドベクターを、トリの発生初期段階で採取した始原生殖細胞に導入して前記プラスミドベクターが有する請求項６における（ニ）のＤＮＡを当該始原生殖細胞のゲノムに挿入し、当該ＤＮＡが挿入された始原生殖細胞を別の個体の卵中の初期胚に注入し、当該卵を孵化させて、（ニ）のＤＮＡが挿入された個体を得る、外来ＤＮＡが挿入されたトリの作出方法。
【請求項１２】
請求項１０または１１の方法により得られる、生殖系列の細胞に外来ＤＮＡが挿入された個体を自然交配または人工授精させることを特徴とする、遺伝子導入トリ作出方法。
【請求項１３】
生体内（ヒトを除く）または生体外にて有用物質が産生される有用物質の生産方法であって、
請求項６に記載のプラスミドベクターが有する（ニ）のＤＮＡがタンパク質をコードする領域およびその発現を制御する領域を有しており、
当該プラスミドベクターを宿主細胞に導入して宿主細胞のゲノムに（ニ）のＤＮＡを挿入し、
宿主細胞内で（ニ）のＤＮＡがコードするタンパク質を発現させて有用物質を得る、有用物質の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、宿主細胞のゲノムに任意のＤＮＡを挿入することができるプラスミドベクターに関する。
【０００２】
さらに、本発明は、前記プラスミドベクターを用いた、形質転換体、遺伝子導入動物（以下「ＴＧ動物」ということがある）などの作出方法、および有用物質の生産方法に関する。
【０００３】
【従来の技術】
（１）外来ＤＮＡ導入技術の利用
宿主細胞のゲノムに外来のＤＮＡを挿入することは、産業および医療において非常に重要な技術であり、様々な分野に用いられている。
【０００４】
第一に、有用物質の生産が挙げられる。技術的に初期の段階では、このような目的のために大腸菌を宿主とするベクターが用いられ、現在でも利用されている。しかしながら、このシステムの欠点として、生産されたタンパク質の修飾の受け方が哺乳類あるいは鳥類とは違うことが挙げられる。このことはヒトまたは他の動物由来の有用タンパク質の産生および使用を目的とした場合に問題となる。特に大腸菌ではタンパク質への糖鎖の付加が起こらないため、糖タンパク質の生産には適さない。また、大腸菌では生産されたタンパク質が不溶性の凝集塊を形成する場合も多く、生理活性を持つタンパク質を得るためにはさらに何らかの処理を行うことが必要となる。
【０００５】
このような欠点を軽減するために、酵母を宿主とするベクターも用いられている。大腸菌とは異なり、酵母では糖鎖の付加は起こる。しかしながら、付加される糖鎖の種類が異なるため生理活性において問題となる場合もある。また、大腸菌と同様に生産されたタンパク質が凝集塊を作りやすいという欠点もある。
【０００６】
ウイルスを発現ベクターとして用いる方法も広く応用されている。現在、生理活性のあるタンパク質を大量に得る目的で、バキュロウイルスをベクターとする発現システムが広く使われている。このシステムでは、前記二者と比較して生理活性のあるタンパク質が得られる場合が多い様である。しかしながら、この場合にも糖タンパク質において付加される糖鎖の種類が異なるという問題や、凝集塊形成の問題が残されている。また、生産されるタンパク質の発現量がタンパク質によって大きく変動し、現在のところ遺伝子組換え体を構築しタンパク質を発現させるまでは、発現量の予測は出来ない。
【０００７】
動物細胞にプラスミドベクターを導入して有用タンパク質を発現させるという方法も用いられている。この場合には、発現タンパク質の修飾に関する問題がほとんどないという利点がある。プラスミドベクターを細胞内に導入する方法としては、電気的穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法など様々な方法が実用化されている。しかし、このようにして細胞内に導入されたＤＮＡは通常ゲノムに挿入されないために細胞の増殖過程で失われていき、ついには消失してしまう。そのためタンパク質を生産させようとするたびにＤＮＡの導入を行う必要が生ずる。
【０００８】
細胞に導入されたプラスミドＤＮＡは極めて低い頻度ではあるが宿主細胞のゲノムと組換えを起こし、ゲノムへの挿入が起こる場合がある。このようにして宿主細胞のゲノムに挿入されたＤＮＡは、宿主細胞の増殖により消滅することは通常ない。そのため、ベクターＤＮＡが挿入された細胞を人為的に選択することができれば永続的にタンパク質を発現する細胞を得ることができる。このような目的で、例えば、外来遺伝子および抗生物質に対する抵抗性タンパク質を同時に発現させ、抗生物質による選択により有用タンパク質を発現させる細胞が得られている。しかしながら、このようにして得られた細胞ではそのタンパク質の発現量は通常低く、そのためこの方法の適用範囲は限定されているのが実情である。
【０００９】
また、動物を利用した有用タンパク質の生産の試みもなされている。このような目的では、ウシ、ヤギあるいはブタなどの乳汁中に有用タンパク質を発現させる方法、あるいはニワトリの卵の中に有用タンパク質を発現させる方法などが試みられている。この方法が成功した場合には大量のタンパク質を得ることが可能となる。しかし前者の場合、ウシ、ヤギあるいはブタなどの大型哺乳類の遺伝子導入（transgenic；ＴＧ）動物を確立するためには莫大な資金がかかるという欠点がある。
【００１０】
また、後者のニワトリの場合、一般に、取り扱いの容易さなどから産卵された卵に外来ＤＮＡを導入することが考えられるが、哺乳類ＴＧ動物の作出で行われているように卵割前の受精卵または卵割開始後ごく初期段階の受精卵にマイクロマニピュレーター等を用いて核内にＤＮＡを注入するという方法は、産卵された時点で卵割が進んでいるため産卵後の卵では実施できない。また、すでに卵割して数が増えた細胞のそれぞれにマイクロマニピュレーターなどで外来遺伝子を導入するのは操作上極めて煩雑である。最近、産卵前に取り出したニワトリの未分割の受精卵にプラスミドＤＮＡをマイクロインジェクションにより導入し、これを体外培養で孵化させた個体を得、次世代以降への外来遺伝子の伝達を観察している報告がある（Love, J., et al., Biotechnology, 12, 60-63, 1994）が、いずれにしてもマイクロマニピュレーションやニワトリ受精卵の体外培養技術といった特殊技術が必要とされるものである。これらの問題点を克服するためニワトリ初期胚の始原生殖細胞を採取して、この細胞に外来遺伝子を導入し、これを別の発育鶏卵の初期胚に戻し孵化させるという方法が考案されている。この方法により、生殖系列の細胞内に外来遺伝子が導入された個体が得られ、成長したこの個体から生まれたヒナに外来遺伝子が伝達されることが期待される。しかしながら、この方法は採取した始原生殖細胞のゲノムに外来遺伝子を効率よく挿入させる方法が確立されていないことが大きな障害となって実用化に至っていない。
【００１１】
さらに、最近ではクローン技術の応用も試みられている。これは、動物の体細胞を採取し、in vitroで遺伝子導入を行い、ゲノムに外来遺伝子が挿入された細胞を選別し、マイクロマニピュレーションの技術を用いてその細胞から採取した核を、脱核した卵細胞に移植し、この細胞を雌の子宮に戻し産仔を得ようとするものである。しかしながら、マイクロマニピュレーションを用いての移植などには特殊技術が必要であり、また、クローン動物の確立には莫大な費用を要するという欠点がある。
【００１２】
ニワトリ始原生殖細胞内に外来遺伝子を導入する方法としても、マイクロマニピュレーターを用いて細胞内にＤＮＡを注入する方法が先ず挙げられる。しかしながら、１個の発育鶏卵の初期胚に戻すのに必要な始原生殖細胞の数は約１００個程度といわれており、マイクロマニピュレーターを用いるこの方法は多数の始原生殖細胞を処理するためには適した方法ではない。
【００１３】
大量の始原生殖細胞を処理する方法としては、電気的穿孔法によるプラスミドＤＮＡの導入や、ベクター自身の感染性を利用したレトロウイルスベクターの利用などが考えられる。前者に関しては、電気的穿孔法の応用により比較的効率よく始原生殖細胞への遺伝子の導入が可能であるとの報告があるが、（Hong, Y.H.,et al., Transgenic Res., 7, 247-252, 1998）、通常のプラスミドベクターを用いているため、導入された遺伝子が安定して子孫に伝達されるかについては問題が残っている。また後者のレトロウイルスベクターに関しては、これを用いてニワトリ始原生殖細胞に外来遺伝子を導入し、これを移植した別の卵の胚から孵化した個体の次世代への外来遺伝子の伝達を観察している報告（Vick, L., et al., Proc.R.Soc.Lond.B.Biol.Sci., 251, 179-182, 1993）があるが、その構築に時間がかかるうえ、一般にウイルスの増殖性が悪く感染効率も低いなどの難点がある。さらに、強力なプロモーターを組み込んだレトロウイルスベクターの作出は困難である。
【００１４】
ここまでは、ＴＧ動物については、有用タンパク質の生産という点に関連して述べてきたが、ＴＧ動物は他の様々な用途にも用いられている。例えば、ＴＧマウスはある遺伝子の機能を解析する目的に用いられたり、あるいは病原体のレセプターをコードする遺伝子を導入したＴＧマウスはその疾病のモデル動物として用いられている。また、ＴＧ動物の応用例としては、移植臓器を提供するための動物の作出なども考えられる。
【００１５】
ＴＧマウスの作出は既に確立された技術であると言える。しかしながら、ＴＧマウスの作出には、通常マイクロマニピュレーションという特殊な技術とそのための機材を必要とする。
【００１６】
最近、雄の精巣に直接ＤＮＡを注入し、雌との自然交配により受精卵中に外来遺伝子を導入し、より簡便にＴＧ動物を作出する方法が検討されている。実際に、マウスの雄の精巣にＤＮＡを注入後、自然交配で受精した受精卵から発生した初期の胚盤胞に外来遺伝子の発現が見られるとの報告がある（Ogawa S., et al., J.Reproduction and Developement, 41, 379-382, 1995）。しかし、このようにして導入した外来遺伝子が安定して子孫に伝わり、確実にＴＧマウスが作出されるまでには至っていない。
【００１７】
最近ＤＮＡワクチンという概念が生まれ研究が進められている。これは、対象となる動物の細胞内で免疫原となるタンパク質が発現するようにプロモーターと連結した遺伝子を含むＤＮＡを注射あるいは圧縮銃などによって当該動物に接種し免疫を賦与しようというものである。このアイデアの根底には、通常は、ワクチンとして不活化または弱毒化した病原体あるいは感染防御免疫を誘導するペプチドよりも、ＤＮＡの方が取り扱いが容易で開発の面で有利であるということがある。プラスミドＤＮＡを接種された動物の細胞内で実際に外来遺伝子の発現は観察されており、そして、不活性化ワクチンでは通常、誘導することが困難であるとされる細胞性免疫とともに、液性免疫の誘導も観察されている（Ulmer, J.B.et al., Science,259,1745-1749.1993）。しかしながら現在までのところ、免疫応答の誘導には大量のＤＮＡを必要とし実用化には至っていない。この理由の１つとして細胞内に取り込まれたＤＮＡが短期間のうちに除去されてしまうことが考えられる。そこで、プロウイルス化するレトロウイルスをベクターとして用いることが検討されている。具体的には、エイズの原因ウイルスであるＨＩＶのenv/rev遺伝子を組み込んだものをワクチンとして用いることが検討されているが（Irwin,M.J., et al., J.Virol., 68,5036-5044, 1994）、レトロウイルスをベクターとして用いるにはいくつもの問題点がある。（この問題点については下記にてまとめて説明する。）
宿主細胞のゲノムへ外来遺伝子を挿入する技術は、遺伝子治療としてヒトの難病の治療にも応用されている。先ず第一に遺伝病の治療が挙げられる。遺伝病とは重要な遺伝子の欠損あるいは変異により引き起こされる病気である。したがって、欠損あるいは変異した遺伝子を補う正常な遺伝子を導入することにより、症状は回復あるいは軽減することが考えられる。全ての細胞に遺伝子を導入することは実際上不可能であるため適用可能な遺伝病は限られるが、アデノシンデアミナーゼ(ＡＤＡ)欠損症における遺伝子治療のように成功例もある。
【００１８】
第二に癌の治療が以下のように挙げられる。先ず癌抑制遺伝子を導入したり、癌遺伝子のアンチセンスＲＮＡを発現する遺伝子を導入するなどして癌を抑えようというものであり、現在のところ最も有望視されていると思われる。次に、サイトカイン遺伝子を免疫担当細胞や癌細胞に導入したり、癌細胞に主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）関連遺伝子を導入したりして宿主の免疫機能を高めて癌を抑制しようというものがある。また、抗癌剤耐性遺伝子を導入して骨髄幹細胞等抗ガン剤に弱い細胞を保護した上で大量の抗ガン剤を投与しようというものもある。
【００１９】
第三に感染症の治療が挙げられる。ここで問題となるのは、エイズやＣ型肝炎に代表されるような病原体の増殖が遅く、宿主の免疫系を逃れているような疾病である。ここでも、病原体の増殖に必須な遺伝子の発現を抑える遺伝子（例えばアンチセンスやウイルスＲＮＡを特異的に切断するリボザイム遺伝子など）を病原体の標的細胞に導入することにより、遺伝子を導入した細胞を病原体から守ることができることが期待される。このような細胞単位の抗病性をさす細胞内免疫（Intracellular Immunization）という概念が近年提唱され研究が進められている(Baltimore, D., Nature, 335, 395-396, 1988)。
【００２０】
（２）レトロウイルスベクター等によるＤＮＡ挿入方法
ゲノムに外来ＤＮＡを挿入させる方法としては、外来ＤＮＡと薬剤耐性遺伝子を組み込んだプラスミドベクターを細胞内に導入し、ゲノムに外来ＤＮＡが組み込まれた細胞を薬剤によって選択する方法がある。これはある程度有効な方法であるが、挿入効率が極めて低いために培養細胞等限られた分野でしかこの方法を用いることが出来ない。
【００２１】
また、ＴＧ動物作出では核内に直接ＤＮＡを注入する方法がよく用いられ、この方法によれば核内に直接大量の外来ＤＮＡが入るために外来ＤＮＡがゲノムに挿入される確率は高い。しかしながら、この方法はマイクロマニピュレーター等の特殊な機械及び技術が必要な上、個々の細胞に操作を加えるために大量の細胞を処理することは作業上極めて煩雑である。
【００２２】
そこで、宿主細胞のゲノムに所望のＤＮＡ配列を挿入させる方法としては、現在のところレトロウイルスを用いる方法が最も一般的であると思われる。レトロウイルスは一本鎖のＲＮＡウイルスであり、そのゲノムＲＮＡは５’末端にキャップ構造を持ち、３’末端にポリＡをもつメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）様の構造をしている。宿主細胞のレセプターとの特異的な結合を介してウイルス粒子が吸着後、ウイルスエンベロープと細胞膜の融合が起こり、プレインテグレーションコンプレックス（pre-integration complex）が細胞質内に侵入する。この複合体にはウイルスＲＮＡのほかに、ウイルス粒子由来の逆転写酵素やインテグラーゼ等が含まれており、この逆転写酵素によりウイルスＲＮＡを鋳型として直鎖状二本鎖ＤＮＡが合成される。この時に、ウイルスＲＮＡにはなかった長い繰り返し配列 (long terminal repeat：ＬＴＲ) が両末端に形成される。この直鎖状二本鎖ＤＮＡはインテグラーゼ等とともに複合体の形で核内に移行し、やがて環状化する。そして、この環状化したＤＮＡはインテグラーゼの働きで宿主ゲノムに組み込まれる（ワトソン遺伝子の分子生物学、第４版、原著者：Watson, J.D., Hopkins, N, H., Roberts, J.W., Steitz, J.A., Weiner, A.M.,  監訳者：松原謙一、中村桂子、三浦謹一郎、株式会社トッパン、１９８８）。しかし、宿主ゲノムへの組み込みの前駆体はこのような環状ＤＮＡではなく、直鎖状二本鎖ＤＮＡであるとの報告もある（Brown, P.O., et al., Proc.Natl.Acad.Scl.USA., 86, 2525-2529, 1989.）。ここで作用を発揮するインテグラーゼは、感染後ウイルスゲノムから新たに転写・翻訳された産物ではなく、感染により宿主細胞にもちこまれたウイルス粒子由来のものであると考えられている。また、インテグラーゼの核内への移行ならびにその作用の発揮は、インテグラーゼとウイルスゲノムの両者が結合した形でなされているものと考えられる。
【００２３】
また、宿主細胞のゲノムへの組み込みは、直鎖状二本鎖ＤＮＡの環状化により形成された両ＬＴＲの連結部で起こるとの報告がある（Panganiban, A.T. and Temin, H.M., Cell, 36, 673-679, 1984.）。そして、インテグラーゼの認識配列に関する報告としては、Panganiban, A.T. and Temin, H.M.（Nature, 306, 155-160, 1983)やDuyk, G.ら（J.Virol., 56, 589-599, 1985）のものがある。
【００２４】
宿主細胞のゲノムに組み込まれた状態のウイルスをプロウイルスという。宿主細胞のＲＮＡポリメラーゼIIがプロウイルスのＬＴＲ内のプロモーターを認識して、レトロウイルスのＲＮＡが転写される。転写されたＲＮＡの一部はウイルスＲＮＡとして、他はスプライシングされてｍＲＮＡとして機能し、ウイルスタンパク質が合成される。このようにレトロウイルスはその生活環の中で宿主細胞のゲノムに組み込まれたプロウイルスの状態となる性質があり、この性質を利用して、レトロウイルスが宿主細胞のゲノムに外来遺伝子を挿入するためのベクターとして用いられる。
【００２５】
レトロウイルスはｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖの遺伝子を持ち、これらの遺伝子を欠損したウイルスは感染性はあるが、次世代のウイルス粒子をつくることが出来ない。そこで、これらの遺伝子の一つまたはそれ以上を欠損させ、代わりに外来遺伝子を挿入したウイルスをベクターとして用いると、このベクターは外来遺伝子の宿主細胞ゲノムへの挿入を引き起こし、それ以後感染性のウイルス粒子を産生しない安全なベクターとなる。
【００２６】
しかし、レトロウイルスベクターの安全性については問題もある。このようなベクターを増殖させるためには、欠損させたウイルスタンパク質を発現する細胞（ヘルパー細胞）を樹立し用いる。そのため低い確率ではあるが、ヘルパー細胞内のウイルス由来の遺伝子と、外来遺伝子を組み込んだベクタープラスミドとの間の相同組換えが起こり、増殖能力を持った感染性ウイルス（replicant competent retrovirus:ＲＣＲ）が生じる危険がある。実際このようなウイルスによりサルにＴ細胞リンパ腫が発生したとの報告もある(Donahue, R. E., et al., J. Exp. Med., 176, 1125-1135, 1992)。
【００２７】
レトロウイルスベクターはゲノムに外来遺伝子を挿入させるためのベクターとしては原理的には理想的ではあるが、下記に示すような問題点もある。
（ｉ）高力価のウイルスを得ることが難しいことが挙げられる。通常１０5〜１０7colony forming unit (cfu)/ml程度の力価のウイルスしか得ることができない。そのうえ遠心操作などによるウイルス粒子の濃縮過程で、宿主細胞のレセプターへの特異的吸着に関与するエンベロープタンパクを構成するＳＵポリペプチド等の消失が起こるため、感染性ウイルス粒子の濃縮は困難である。このことは、高力価のウイルスを得ることが非常に難しい理由の一つである。
（ii）ウイルスの感染効率が低いことが挙げられる。高力価のウイルスが得づらいことも相まって、十分な遺伝子の導入効率が期待できない。
（iii）強力なプロモーターを組み込んだ組換え体が作出できないことが挙げられる。これは、大量発現を目的とした場合に問題となる。
（iv）一般に、実用できるウイルスベクターの確立には多大の時間がかかる。
（v）レトロウイルスベクターの感染効率および導入遺伝子の発現効率が低い場合が多い。
（vi）生体内では、補体の作用によりウイルスが失活しやすい。
【００２８】
また、現在使用されている遺伝子導入ベクターの長所、短所について表１にまとめておく。
【００２９】
【表１】
0004474017.tif 000002
【００３０】
レトロウイルスのインテグラーゼ等に関連する報告としては、田中らによる報告がある(Shoji-Tanaka, A., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 203, 1756-1764, 1994)。この報告では、大腸菌で発現させたウシ白血病ウイルスのインテグラーゼを精製し、これをインテグラーゼ認識配列を組み込んだプラスミドとともにリポソームを担体として導入することにより、細胞へのＤＮＡの導入効率が数倍上昇したことを観察している。また、この細胞へのＤＮＡの導入効率の上昇は、ＬＴＲの連結部位およびその周辺の配列の有無により変化した。サザンハイブリダイゼーション法によりゲノムに挿入されたプラスミドＤＮＡの開裂部位を調べたところ、インテグラーゼとともに細胞内に導入されたプラスミドでは、ＬＴＲの連結部を含む領域で挿入が起こっていることが示唆されたが、インテグラーゼを伴わずプラスミド単独で細胞に導入した場合には、プラスミド内のＬＴＲ連結領域以外で組換えが起こっているであろうことを示す成績が得られている。
【００３１】
この報告では、インテグラーゼとＤＮＡを混合してから、室温で３０分間インキュベートしている。これは、インテグラーゼのもつＤＮＡとの結合能を利用して、積極的に両者の複合体形成を促進するために行っているものと思われる。従って、リポソームを担体として細胞へ導入後の、インテグラーゼおよびプラスミドの核への移行は、それぞれが単独ではなく、複合体として移行したものであり、従って、このシステムでのゲノムへの挿入は前述のレトロウイルスの生活環を利用したものと考えられる。
【００３２】
しかし、餅井は、上記田中らの方法をニワトリ受精卵に応用したが、細胞ゲノムへの外来遺伝子の挿入効率の上昇は観察されなかったことを報告している（蛋白質核酸酵素（Protein, Nucleic acid and Enzyme）, 40, 2265-2273, 1995）。
【００３３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明が解決しようとする課題は、外来ＤＮＡを宿主細胞のゲノムに挿入可能なベクターを提供することにある。さらに、このベクターの備えるべき条件として、外来ＤＮＡを組み込んだベクターの構築が容易であること、ベクターの大量生産が容易であること、外来ＤＮＡのゲノムへの挿入効率が良いこと、安全性が高いことなどが挙げられ、これらの条件を満たすベクターの開発をめざした。
【００３４】
また、本発明は、前記ベクターを用いた、形質転換体、ＴＧ動物等およびその作出方法、有用物質の生産方法などを提供することを課題とする。
【００３５】
【課題を解決するための手段】
上記のような状況に鑑み、本発明者らは、レトロウイルスベクターの長所を活かしながら、先に挙げた欠点を解決するようなベクターを構築する事を目指した。現在汎用されていると思われるレトロウイルスベクターの長所とは、レトロウイルスの生活環を利用したＤＮＡの宿主ゲノムへの挿入であり、短所は主としてレトロウイルスのウイルスとしての扱い難さに起因する事項である。
【００３６】
本発明者らは上記のような観点から鋭意研究を進め、取り扱いの手技が確立しているプラスミドを用い、インテグラーゼ遺伝子及びインテグラーゼの認識領域を有するベクターを作出することに思い至たり、驚くべきことにこのようなプラスミドが外来ＤＮＡをゲノムに効率よく挿入し得ることを見いだし、本発明を完成させた。
【００３７】
すなわち、本発明は、下記（イ）、（ロ）および（ハ）を有するプラスミドベクターであり、（イ）インテグラーゼ遺伝子（ロ）インテグラーゼ遺伝子を発現制御する領域をなすＤＮＡ（ハ）１つのＬＴＲと他のＬＴＲとが連結する際に形成される末端塩基どうしの配列を少なくとも含み、インテグラーゼがインテグレーション反応を触媒する際の認識領域をなすＤＮＡ、である。なお、本明細書では、このベクターを（イ）〜（ハ）を有するプラスミドベクターということがある。
【００３８】
また、本発明は、下記（イ）、（ロ）、（ハ）および（ニ）を有するプラスミドベクターであり、（イ）インテグラーゼ遺伝子（ロ）インテグラーゼ遺伝子を発現制御する領域をなすＤＮＡ（ハ）１つのＬＴＲと他のＬＴＲとが連結する際に形成される末端塩基どうしの配列を少なくとも含み、インテグラーゼがインテグレーション反応を触媒する際の認識領域をなすＤＮＡ（ニ）宿主細胞のゲノムに挿入しようとする任意のＤＮＡ、である。なお、本明細書では、このベクターを（イ）〜（ニ）を有するプラスミドベクターということがある。
【００４０】
また、本発明は、連結した２つのＬＴＲからなる領域を有し、前記（ロ）および（ハ）のＤＮＡが前記２つのＬＴＲからなる領域内のＤＮＡである、前記プラスミドベクターである。
【００４１】
また、本発明は、さらに、前記インテグラーゼ遺伝子に核移行シグナルをコードするＤＮＡが付加された前記プラスミドベクターである。
【００４２】
また、本発明は、前記インテグラーゼ遺伝子および／またはＬＴＲが、レトロウイルス科に属するウイルス由来である前記プラスミドベクターである。
【００４３】
また、前記レトロウイルス科に属するウイルスが、レトロウイルス科オンコウイルス亜科に属するウイルスである前記プラスミドベクターである。
【００４４】
また、本発明は、前記プラスミドベクターにより形質転換された形質転換体である。
【００４５】
また、本発明は、本発明に係るプラスミドベクターがゲノムに挿入されているキメラトリである。
【００４６】
また、本発明は、本発明に係るプラスミドベクターがゲノムに挿入されている、遺伝子導入トリである。
【００４７】
また、本発明は、（イ）〜（ニ）を有するプラスミドベクターをトリの卵中の胚に注入して胚を構成する細胞のゲノムに（ニ）のＤＮＡを挿入し、当該卵を孵化させて（ニ）のＤＮＡが挿入された個体を得る、外来ＤＮＡが挿入されたトリの作出方法である。
【００４８】
また、本発明は、（イ）〜（ニ）を有するプラスミドベクターを、トリの発生初期段階で採取した始原生殖細胞に導入して前記プラスミドベクターが有する（ニ）のＤＮＡを当該始原生殖細胞のゲノムに挿入し、当該ＤＮＡが挿入された始原生殖細胞を別の個体の卵中の初期胚に注入し、当該卵を孵化させて、（ニ）のＤＮＡが挿入された個体を得る、外来ＤＮＡが挿入されたトリの作出方法である。
【００４９】
また、本発明は、前記外来ＤＮＡが挿入されたトリの作出方法により得られる、生殖系列の細胞に外来ＤＮＡが挿入された個体を自然交配または人工授精させることを特徴とする、遺伝子導入トリ作出方法である。
【００５１】
また、本発明は、生体内（ヒトを除く）または生体外にて有用物質が産生される有用物質の生産方法であって、（イ）〜（ニ）を有するプラスミドベクターが有する（ニ）のＤＮＡがタンパク質をコードする領域およびその発現を制御する領域を有しており、当該プラスミドベクターを宿主細胞に導入して宿主細胞のゲノムに（ニ）のＤＮＡを挿入し、宿主細胞内で（ニ）のＤＮＡがコードするタンパク質を発現させて有用物質を得る、有用物質の生産方法である。
【００５５】
本明細書において「遺伝子の導入」とは、遺伝子を細胞内へ入れることであり、「遺伝子の挿入」とは、細胞のゲノムに遺伝子を組み込むことを意味する。ただし、「遺伝子導入（トランスジェニック：transgenic：ＴＧ）動物」というときの「導入」は、ここでいう「挿入」を意味する。また、本明細書では、「遺伝子導入動物」のことを「ＴＧ動物」ということがある。
【００５６】
また、本明細書において「インテグラーゼ遺伝子」というときは、インテグラーゼというタンパク質をコードするＤＮＡを意味する。また、本明細書においては、「ゲノム」とはゲノムを構成する核酸のことである。
【００５７】
本発明のベクターが、所望のＤＮＡを効率よく宿主細胞のゲノムへと挿入できる機序については、必ずしも明確ではないが、次のように推測される。まず、本発明のベクターが細胞内に導入されると通常のベクターと同様に核内へと移行し、核内においてインテグラーゼ遺伝子が転写されてｍＲＮＡが合成され、ｍＲＮＡが核外へ移行し細胞質中のリボソームでインテグラーゼが合成される。合成されたインテグラーゼは、核移行シグナルなどの働きにより再び核内に移行し、このインテグラーゼがインテグレーション反応を触媒する際の本発明のベクターに組み込まれた認識領域を認識して、当該認識領域でベクターを開裂させつつ宿主細胞のゲノムに挿入する。以上のような過程を経て本発明のベクターは、挿入しようとする任意のＤＮＡを宿主細胞のゲノムに挿入する事ができるものと考えられる。
【００５８】
レトロウイルス感染に於ては感染ウイルス粒子が持ち込んだインテグラーゼによりウイルスゲノムの宿主ゲノムへの挿入が行われる。この場合には、インテグラーゼはウイルスゲノムとともに移動していると想像される。
【００５９】
しかし、本発明のベクターは、このようなレトロウイルスの生活環からは類推できない経路を用いた特色のあるものであるといえる。本発明のベクターでは、プラスミド中にインテグラーゼ遺伝子が含まれ、インテグラーゼ遺伝子が宿主細胞内で発現して、プラスミドをゲノムに挿入させるのである。インテグラーゼ遺伝子をベクターに組み込んでおき、宿主細胞内でインテグラーゼ遺伝子を発現させてインテグラーゼを合成するということ、また、この宿主細胞内で合成されたインテグラーゼが、予めプラスミド内に組み込んでおいた、ＬＴＲを応用して作製された塩基配列領域を認識して環状ＤＮＡをゲノムに挿入させる反応を生じさせることができるという思想は未だかつてないものである。
【００６０】
【発明の実施の形態】
本発明は、新規なプラスミドベクターを提供するものであり、このプラスミドベクターは様々な応用が可能である。そこで、本発明の実施の形態を、（１）プラスミドベクターおよび形質転換体、（２）ＴＧ動物およびその作出方法等、（３）本発明の他の用途、に分けて以下説明する。
【００６１】
（１）本発明のベクターおよび形質転換体
本発明のベクターは、
（イ）インテグラーゼ遺伝子、
（ロ）インテグラーゼ遺伝子を発現制御する領域をなすＤＮＡ、
および
（ハ）インテグラーゼがインテグレーション反応を触媒する際の認識領域をなすＤＮＡ、
を有するプラスミドベクターである。
【００６２】
本発明のベクターは、宿主細胞のゲノムに効率よく挿入される。したがって、（イ）〜（ハ）を有するベクターに、通常の手段を用いて、任意のＤＮＡを組み込んでおき、これを宿主細胞に導入することによって、所望のＤＮＡを宿主細胞のゲノムに挿入することができる。
【００６３】
すなわち、本発明は、
（イ）インテグラーゼ遺伝子、
（ロ）インテグラーゼ遺伝子を発現制御する領域をなすＤＮＡ、
（ハ）インテグラーゼがインテグレーション反応を触媒する際の認識領域をなすＤＮＡ、
および
（ニ）宿主細胞のゲノムに挿入しようとする任意のＤＮＡ、
を有するプラスミドベクターをも提供するものである。
【００６４】
本発明のベクターは、プラスミドに、前記（イ）、（ロ）および（ハ）のＤＮＡを組み込むことにより作製できる。（イ）（ロ）および（ハ）を組み込むプラスミドは、宿主細胞のゲノムに挿入しようとするＤＮＡのサイズや、取り扱いの容易さなどにより定めることができ、制限酵素地図が既に作製された公知のプラスミドなどを用いることもできる。公知のプラスミドとしては、例えば、ｐＵＣ系、ｐＢＲ系、ｐＡＣＹＣ系などのプラスミドを用いることができる。
【００６５】
まず（イ）について説明する。インテグラーゼは、一般に、レトロウイルスが感染した細胞内で生産されるタンパク質であって、宿主内で逆転写酵素により複製されたウイルスゲノムが、宿主の染色体に組み込まれる反応を触媒するもの（分子細胞生物学辞典第１版、東京化学同人）とされている。インテグラーゼ遺伝子、すなわちインテグラーゼをコードするＤＮＡの配列としては、例えば、「Nucleic Acids Res., 18, 4022, 1990.」、「Virology, 137, 358-370, 1984.」、「Cell, 32, 853-869, 1983.」などにおいて明らかにされており、本発明のベクターには、このような公知のインテグラーゼ遺伝子を用いることができる。また、インテグラーゼ遺伝子は、例えば、公知のＤＮＡ配列を参考にしてプライマーを構築し、ＰＣＲ（Polymerase chain reaction）などの手法により新たに入手することも可能であり、このようにして得たインテグラーゼ遺伝子も用いることができる。
【００６６】
インテグラーゼタンパクは、３６ｋダルトンのタンパクとして合成されるが、ウイルス粒子内では３６ｋと３２ｋダルトンのタンパクとして存在することから、３６ｋダルトンのタンパクは３２ｋダルトンのタンパクの前駆体であると推測されている。インテグラーゼ活性は３６ｋダルトンと３２ｋダルトンの両者にあると報告がなされている（Terry, R., et al., J.Virol., 62, 2358-2365, 1988）。したがって、インテグラーゼ遺伝子としては、どちらのタンパクをコードするものでも使用することができる。
【００６７】
次に（ロ）について説明する。本発明のプラスミドベクターは、プラスミドベクター内に組み込まれたインテグラーゼ遺伝子が宿主細胞内で発現するための発現制御領域をなすＤＮＡを有する。発現制御する領域にはプロモーター、エンハンサー、サイレンサーなど一般に遺伝子発現制御のために用いられるＤＮＡを設けることができる。また、発現制御する領域は、レトロウイルスが元来有するインテグラーゼ遺伝子の発現制御領域を用いることができ、さらに宿主細胞内でインテグラーゼ遺伝子を発現させることができるものであれば前記のようなレトロウイルス由来のものに限られず、宿主細胞の種類などに応じ適宜定めることができる。例えば、特定の細胞に限定されずに発現させる場合には、レトロウイルスのＬＴＲ内のプロモーターやＳＶ４０のプロモーター等を使用することができる。また、特定の細胞に発現させることも可能であり、例えば、筋肉細胞においてはミオシン重鎖β等の、肝臓ではアルブミンやα−フェトプロテイン等の、Ｂリンパ球では免疫グロブリン等の発現制御領域を選択することができる。また、癌細胞に特異的に発現させる目的では、例えば、癌胎児抗原（cartinoembryonic antigen）やc-erb Ｂ２，Ｂ３あるいはＢ４ のプロモーター等を使用することができる。
【００６８】
次に（ハ）について説明する。本発明のプラスミドベクターは、インテグラーゼがインテグレーション反応を触媒する際の認識領域（以下「インテグラーゼ認識領域」ということがある）をなすＤＮＡを有する。インテグラーゼ認識領域は、インテグラーゼが宿主細胞のゲノムに環状ＤＮＡを挿入する反応、すなわちインテグレーション反応を触媒する際に、インテグラーゼが基質として認識する領域が含まれていればよい。
【００６９】
インテグラーゼ認識領域としては、例えば、ＬＴＲとＬＴＲとを連結させた場合に、一方のＬＴＲの末端塩基と、他方のＬＴＲの末端塩基とが連結した末端塩基どうしの配列（連結部位）を少なくとも含むＤＮＡがある。また、この連結部位を含む前後の８塩基程度の配列をアタッチメント(ａｔｔ)配列ということがあるが、このようなアタッチメント配列としては、例えば、ＲＳＶ（Proc.Natl.Acad.Sci.USA., 78, 4299-4303, 1981）、Murine leukemia virus（Cell, 63, 87-95, 1990）、Rous associated virus 2（J.Virol., 56, 589-599）、Spleen necrosis virus（Cell, 36, 673-679, 1984）やAvian reticuloendotheliosis virus（Cell, 36, 673-679, 1984）で報告されている「ＣＡＴＴＡＡＴＧ」、ＨＩＶ（J.Virol., 68, 3558-3569, 1994）で報告されている「ＣＡＧＴＡＣＴＧ」、あるいはVisna virus（J.Virol., 68, 3558-3569, 1994）で報告されている「ＣＡＧＣＡＣＴＧ」などが挙げられる。
【００７０】
ＬＴＲ（long terminal repeat）は、レトロウイルスのウイルスＤＮＡの両端で重複している長い末端反復配列のことであり、通常、Ｕ３−Ｒ−Ｕ５配列から構成されるＤＮＡが１単位である。上記の連結部位またはアタッチメント配列は、２つのＬＴＲの末端の組み合わせを「Ｕ５−Ｕ３」、「Ｕ３−Ｕ５」としたときに形成することができる。すなわち、インテグラーゼ認識領域は、例えば、ＬＴＲを２つ連結することにより、その２つのＬＴＲで構成される領域の内部に形成させることができる。したがって、（ハ）のＤＮＡとしては、２つのＬＴＲを連結させたものを用いることができる。ただし、２つのＬＴＲの全領域が必須とは限らず、連結部位またはアタッチメント配列を構成するＤＮＡを含み、かつこの前後にある周辺領域があれば、インテグラーゼ認識領域とすることができる場合もある。
【００７１】
例えばアタッチメント配列を含むインテグラーゼ認識配列のうちのアタッチメント配列の周辺領域は、インテグラーゼ遺伝子やＬＴＲの由来などにより差があり必ずしも一定ではないが、アタッチメント配列を含む２０〜４０塩基程度からなる領域である場合がある（Panganiban, A.T. and Temin, H.M., Nature, 306, 155-160, 1983: Duyk, G., et al., J.Virol., 56, 589-599, 1985）。
【００７２】
したがって、本発明のベクターは、（ハ）のＤＮＡとして、例えば、
（ａ）連結した２つのＬＴＲからなるＤＮＡ、または、
（ｂ）ＬＴＲを２つ連結したときに構成されるＤＮＡの一部が欠失、置換もしくは付加されたＤＮＡであって、かつインテグラーゼ認識領域を含むＤＮＡ、
などを用いることができる。（ｂ）における「ＬＴＲを２つ連結したときに構成されるＤＮＡの一部が欠失、置換もしくは付加されたＤＮＡ」には、ＬＴＲの一部分を用いる場合、例えば「連結部位およびその周辺領域からなる領域」または「アタッチメント配列およびその周辺領域からなる領域」を用いる場合が含まれる。
【００７３】
ＬＴＲのＤＮＡ配列は、例えば、「Cell, 32, 853-869, 1983」、「Genebank」の「accession No.AF110968, Y07725」あるいは同「X94150」等に明らかにされており、本発明のベクターには、これらのＬＴＲを用いることができる。また、ＬＴＲも、例えば、これらの公知のＤＮＡ配列を参考にしてプライマーを構築し、ＰＣＲなどの手法により新たに入手することも可能であり、このようにして得たＬＴＲも用いることができる。
【００７４】
多くの場合、ＬＴＲにはプロモーターが含まれており、このプロモーターがあることによりインテグラーゼ遺伝子は発現することができる。すなわち、連結した２つのＬＴＲからなる領域をプラスミドに組み込んだ場合、前記（ロ）インテグラーゼ遺伝子を発現制御する領域をなすＤＮＡを備えたベクターとすることができる。宿主細胞の種類などによりＬＴＲ中のプロモーターが機能しないような場合や、プロモーター部分をあえて除外してベクターを作製した場合などでも、インテグラーゼ遺伝子の上流にプロモーターなどの発現制御領域を別途設けることにより、インテグラーゼ遺伝子を発現させることができる。
【００７５】
また、本発明のプラスミドベクターには、インテグラーゼ遺伝子が組み込まれており、インテグラーゼ遺伝子が宿主細胞内で発現してインテグラーゼが細胞質内で合成される。インテグラーゼ遺伝子の由来などにもよるが、インテグラーゼに核移行シグナルがもともと備わっている場合には、インテグラーゼが核内へ移行してプラスミドの（ハ）の部分を認識し、プラスミドを宿主細胞のゲノムに挿入すると推定されるが、インテグラーゼに核移行シグナルが備わっていない場合や、備わっていてもインテグラーゼの核内への移行が円滑に進行しない場合には、予めプラスミド内にインテグラーゼの核移行シグナルをコードするＤＮＡを別途に付加しておくことが望ましい。例えば、核移行シグナルをコードするＤＮＡとしては、例えば、Nath, S.T. and Nayak, D.P.の報告（Mol.Cell.Biol., 10, 4139-4145, 1990：１４種の配列が記載された一覧表がある）やKalderon, D.らの報告にあるＳＶ４０ largeＴ抗原の核移行シグナル（Cell, 39, 499-509, 1984）等において明らかにされているものを用いることができ、その種類に応じて、プラスミド中のインテグラーゼ遺伝子の前および／または後に付加すればよい。
【００７６】
また、インテグラーゼ遺伝子およびＬＴＲは、好ましくはレトロウイルスに由来するものを用いることができ、レトロウイルスのなかでもより好ましくは、オンコウイルス亜科（Oncovirinae）に属するウイルス、さらに好ましくはアビアンリューコーシス−ザルコーマ  ウイルス（Avian luekosis-sarcoma virus）グループに属するウイルス、特に好ましくはラウス肉腫ウイルス(Rous sarcoma virus)に由来するものが好適である。
【００７７】
次に（ニ）について説明する。（ニ）は、宿主細胞のゲノムに挿入しようとする任意のＤＮＡであり、本発明のベクターを用いて所定の宿主細胞のゲノムに挿入しようと所望するところのＤＮＡである。（ニ）のＤＮＡは任意であるが、通常、このようなＤＮＡは何らかの機能を有しており、その機能の発現を期待してゲノムへの挿入が図られるものと思われる。宿主ゲノムへの挿入が予想される機能的なＤＮＡとしては、例えば、所定のタンパク質をコードする外来遺伝子およびその遺伝子の発現に関わるＤＮＡまたはこれらの一部分、およびアンチセンスやリボザイム等をコードするＤＮＡなどが挙げられる。外来遺伝子の発現制御に関わるＤＮＡとは、例えばプロモーター、エンハンサー、ターミネーター、リボソーム結合領域やＬＣＲ（locus control region）などが例示される。（ニ）のＤＮＡには、（ニ）のＤＮＡがプラスミドに組み込まれたか、また（ニ）のＤＮＡが宿主細胞のゲノムに挿入されたかなどを確認しやすくするために、いわゆるマーカー遺伝子となるＤＮＡを加えておくこともできる。
【００７８】
これら（イ）、（ロ）、（ハ）、（ニ）などのＤＮＡは、制限酵素、リガーゼなどを用いた通常の手法によりプラスミド中に組み込むことができる。制限酵素等は、（イ）などのＤＮＡを組み込む前の、本発明のベクターの基礎となるとベクターの種類に応じて選ぶことができる。また、本発明のベクターを細菌を用いて容易に大量に生産するためには、菌体内での増殖に必須な複製開始点を持つプラスミドをベクターとすればよい。また、本発明のベクターには、上記以外にも、一般にベクターとしてのプラスミドを構築する場合にプラスミド内に組み込むことのできるＤＮＡを組み込んでもよい。
【００７９】
本発明のベクターであることの確認は、例えば、作製したベクターを制限酵素で数カ所切断し電気泳動を行ったり、ＰＣＲ、サザンハイブリダイゼーション、シークエンシングなどを組み合わせるなどの一般的な手法により行うことができる。
【００８０】
本発明のベクターは、通常のプラスミドベクターと同様の手法により、宿主細胞の細胞内へと導入することができ、例えば、電気的穿孔法（エレクトロポレーション）、リン酸カルシウム法、リポソーム法、イムノジーン法などが挙げられる。
【００８１】
本発明のプラスミドベクターを導入する宿主細胞には、特段の制限はなく、例えば、大腸菌、酵母などの微生物、動植物の培養細胞、さらには動植物生体の細胞などが宿主細胞の対象となり得る。宿主細胞に導入された本発明のベクターが、ベクター内のインテグラーゼ遺伝子等の働きにより効率よく宿主細胞のゲノムに挿入される結果、本発明のベクターにより形質転換された形質転換体を得ることができる。
【００８２】
このような形質転換体のより具体的な実施の形態として、以下に説明するところのＴＧ動物等がある。
【００８３】
本発明のベクターは、インテグラーゼ遺伝子も有していることから、インテグラーゼも宿主細胞内で合成することができ、インテグラーゼをベクターとは別に導入するような操作を要しない。仮にインテグラーゼを別途に宿主細胞に導入するとなると、インテグラーゼというタンパク質を精製しておく必要性が生じ、しかもトランスフェクションさせるたびに精製インテグラーゼを用意する必要がある。しかし、タンパク質の精製は操作が煩雑である場合が多く、一般に、タンパク質の精製に比較すればプラスミドの作製自体は作業が容易である。すなわち、本発明のベクターは作製が容易であり、また一旦作製してしまえばその増産も通常の手法に従って容易に行うことができる。
【００８４】
本発明のベクターが宿主細胞のゲノム中のどこに挿入されるかは、必ずしも特定されない。しかし、まったくランダムに挿入されるわけではなく、ある特定の場所に高い割合で挿入される傾向がある。
【００８５】
（２）ＴＧ動物（遺伝子導入動物）等およびその作出方法等
（i）ＴＧ動物等およびその作出方法
本発明のベクターを用いて、キメラ動物やＴＧ動物など（本明細書では「ＴＧ動物等」ということがある）を作出することができる。本発明のベクターを所定の細胞に挿入することで本発明のベクターに予め組み込んでおいた外来ＤＮＡを、動物細胞のゲノムに挿入して形質転換させ、キメラ動物やＴＧ動物などを得ることができる。
【００８６】
ＴＧ動物等の作製のために本発明のベクターを導入する細胞としては、例えば受精卵、未受精卵、胚、生殖系列の細胞、あるいは始原生殖細胞などが挙げられる。また、細胞への導入は、プラスミドベクターについての通常の方法を用いて導入することができる。
【００８７】
ベクターは、前記（イ）〜（ニ）を有するベクターを用いる。（ニ）のＤＮＡは、ＴＧ動物等に組み込もうとしているＤＮＡであり、ＴＧ動物等の作出の目的に応じて選択することができる。ＴＧ動物等は、一般にシスエレメントの同定、遺伝子機能の解析、ヒト疾患モデル動物の作出、家畜の品種改良、生理活性物質の生産、移植臓器提供のための動物の作出などの研究や産業的利用が行われており、これらの目的に応じたＤＮＡを入手すれば、前記（イ）〜（ハ）を有するベクターに組み込んで、（イ）〜（ニ）を有するベクターを作製することができる。
【００８８】
以下、ＴＧ動物等の作出方法の具体的な実施形態について説明する。
【００８９】
第１の実施形態として、遺伝子が挿入されたトリの作出方法およびこのトリを用いてトリのＴＧ動物を作出する方法について説明する。（イ）〜（ニ）を有するプラスミドベクターをトリの卵中の胚に注入して、胚を構成する細胞のゲノムに前記（ニ）のＤＮＡを挿入し、この卵を孵化させて（ニ）のＤＮＡが挿入された個体（外来ＤＮＡが挿入されたトリ）を得ることができる。
【００９０】
所望の外来ＤＮＡを挿入させる対象となるトリは、特に制限はないが、例えば、ニワトリ、ダチョウ、七面鳥、アヒル、ガチョウ、ハト、ウズラなどが挙げられ、好ましくはニワトリ、ダチョウ、七面鳥、アヒルなどが挙げられる。
【００９１】
トリに挿入させようとするＤＮＡを組み込んだプラスミドベクター（すなわち（イ）〜（ニ）を有するプラスミドベクター）を作製し、これをトリの胚に注入する。プラスミドベクターの作製については、上記「（１）本発明のベクターおよび形質転換体」の項で説明したとおりである。
【００９２】
本発明の外来ＤＮＡが挿入されたトリの作出方法では卵中の胚にベクターを注入するので、このトリの作出方法で用いられる胚は、孵卵開始直前の状態（または産卵直後の状態）から孵化直前までの発生段階にある個体であり、本明細書では、孵卵開始直前から孵化直前までの期間を前後に分け、前半時期のものを「初期胚」、後半時期のものを「後期胚」という。本発明の外来ＤＮＡが挿入されたトリの作出方法においては、胚に注入すればよいが、好ましくは初期胚に注入する。
【００９３】
注入の方法は、従来からある通常のプラスミドベクターを胚に注入する手法と同様の手法により行うことができる。例えば、プラスミドベクターを生物学的に許容される生理的塩類溶液、あるいはリポソームなどと混合した溶液を調製し、卵殻の一部を切除して穴を開けておいた卵中の初期胚に、このベクターを含む溶液をガラスキャピラリーなどを用いて注入するなどして行うことができる。また、例えば、ベクターＤＮＡ−トランスフェリン−ポリＬリジン複合体を作製して、当該複合体をガラスキャピラリーで卵に注入することもでき、この複合体を用いれば、トランスフェリンと、ほとんどの細胞の細胞膜に存在するトランスフェリンレセプターとの相互作用により細胞内に取り込まれ、効率よくＤＮＡを細胞内に導入することができる。初期胚に注入することが好ましいことは上記したが、鳥類のＴＧ動物を作出する目的では、初期胚のうちでもできるだけ発生段階の進行していない時期に注入することがより好ましい。
【００９４】
胚に注入されたベクターは、胚を構成する細胞に導入される。さらに、細胞に導入されたベクターは当該細胞のゲノムに挿入され、挿入を予定していたＤＮＡ（（ニ）のＤＮＡ）がトリの胚の細胞のゲノムに組み込まれることになる。ベクターの細胞への導入を促進するために、電気的穿孔法（エレクトロポレーション）などを行うこともできる。
【００９５】
ベクターを胚に注入した後は、穴をビニールテープなどで塞いで孵卵を継続し、ヒナを孵化させ、外来ＤＮＡが挿入されたトリの個体を得ることができる。孵化したヒナの細胞に所望のＤＮＡが挿入されたかどうかは、ヒナの細胞などからＤＮＡを回収し、ＰＣＲやサザンハイブリダイゼーション法などを利用したＤＮＡを検出する通常の方法を行うことにより確認することができる。
【００９６】
上記のようにして、胚に本発明のベクターを導入することにより得られる外来ＤＮＡが挿入されたトリは、ほとんどの場合が、個体全体の細胞のうち一部の細胞に外来ＤＮＡが挿入されたキメラである。外来ＤＮＡが挿入される細胞は、体細胞または生殖系列の細胞のいずれか一方である場合、または双方の細胞である場合があり得る。（以下、始原生殖細胞、精母細胞、卵母細胞、精子、卵子などの生殖系列の細胞のうちの一部の細胞に外来ＤＮＡが挿入された個体を生殖系列キメラといい、生殖系列の細胞以外の体細胞のうちの一部の細胞に外来ＤＮＡが挿入された個体を体細胞キメラという。）胚に注入した場合、生殖系列キメラを得る確率を高めるには、例えば、始原生殖細胞が集中する孵卵２日目の胚の生殖三日月環（germinal crescent）の部分に導入することなども可能である。
【００９７】
体細胞、生殖系列の細胞のいずれに外来ＤＮＡが挿入されているかは、例えば、皮膚、血液細胞などの体細胞または精子もしくは卵子を採取して、上記と同様ＰＣＲなどの通常の手法を用いて確認することができる。
【００９８】
上記のようにして得られた、生殖系列の細胞に外来ＤＮＡが挿入されたトリを自然交配または人工授精させることにより、鳥類の遺伝子導入動物を作出することができる。すなわち、外来ＤＮＡが挿入された個体のうちから生殖系列キメラを選抜し（１世代目）、生殖系列キメラからＴＧ動物を作出する通常の方法を用いて、鳥類の遺伝子導入動物を作出することができる。
【００９９】
生殖系列キメラが生産する精子、卵子のうちには、外来ＤＮＡが挿入されているものと、そうではないものが生じる。したがって、例えば、生殖系列キメラ（１世代目）の個体と本発明のベクターを導入してない無処理の個体とを交配させて得た個体（２世代目）の中には外来ＤＮＡが挿入された個体とそうではない個体とが存在する。しかし、生殖系列キメラの個体と無処理の個体とを交配させて得た個体のなかで、外来ＤＮＡが挿入されたことが確認された個体は、相同染色体の一方には外来ＤＮＡが挿入されているヘテロのＴＧ動物である。さらに、ある１組の生殖系列キメラと無処理の個体とから得たヘテロなＴＧ動物どうしを交配させ、選抜を行うことにより、最短で３世代目で相同染色体の双方に外来ＤＮＡが挿入されて、いわゆるホモ化した個体を得ることができる。
【０１００】
一旦ヘテロなＴＧ動物、またはホモなＴＧ動物が作出されれば、このような外来ＤＮＡが挿入されている系統を通常の手段を用い継代して維持することができる。
【０１０１】
次に、遺伝子が挿入されたトリの作出方法およびこのトリを用いてトリのＴＧ動物を作出する方法の第２の実施形態を、第１の実施形態と異なる点を中心に説明する。第２の実施形態では、前記（イ）〜（ニ）有するプラスミドベクターをトリの発生初期段階で採取した始原生殖細胞に導入して前記プラスミドベクターが有する（ニ）のＤＮＡを当該始原生殖細胞のゲノムに挿入し、当該ＤＮＡが挿入された始原生殖細胞を、別の個体の卵中の初期胚に注入して当該胚を有する卵を孵化させて、遺伝子が挿入された個体を得る。
【０１０２】
一般に、始原生殖細胞はトリの発生の初期段階にある胚に多く含まれ、より具体的には例えばニワトリならば、孵卵開始後４８〜５５時間の胚の血液などから多く採取することができる。始原生殖細胞へのベクターの導入は、通常のプラスミドの導入方法に従って行うことができる。ベクターの導入された始原生殖細胞は、別の卵の中の胚に注入し、この卵を孵化させる。別の卵の初期胚に戻すというのは、通常、始原生殖細胞の採取に用いた胚は生存できず、始原生殖細胞を採取した胚に戻すことは困難なことによる。
【０１０３】
始原生殖細胞が注入された卵から孵化した個体のなかには、生殖系列キメラが含まれる。外来ＤＮＡが挿入された生殖系列キメラの選抜は、通常の方法に従って行うことができる。
【０１０４】
この生殖系列キメラの個体を用い、第１の実施の形態で説明したのと同様にして自然交配または人工授精を行うことにより、鳥類のＴＧ動物を得ることができる。
【０１０５】
次に、第３の実施形態となるＴＧ動物の作出方法について説明する。第３の実施形態では、非ヒト脊椎動物のオスの精巣内に、前記（イ）〜（ニ）を有するプラスミドベクターを注入し、当該プラスミドベクターが注入された前記動物を自然交配または人工授精させて遺伝子が挿入された個体（ＴＧ動物）を作出する。
【０１０６】
第３の実施形態において、脊椎動物に特に制限はないが、哺乳類、鳥類、は虫類、両生類、魚類のいずれに属する動物にも本発明の方法は適用でき、より具体的には、マウス、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタなどが好適なものとして挙げられる。
【０１０７】
脊椎動物のオスの精巣に本発明のベクターを導入するには、例えば、第１の実施形態のところで説明したのと同様のベクターを含む溶液を用意し、この溶液をシリンジなどを用いて精巣に注入すればよい。
【０１０８】
精巣内に注入されたベクターは、精巣内の生殖系列の細胞である精子形成細胞（spermatogenic cell）に導入され、さらに精子形成細胞のゲノムに挿入される。このようにして外来ＤＮＡがゲノムに挿入された精子形成細胞から増殖、分化した精子のうちには、外来ＤＮＡを有しているものが含まれている。したがって、精巣にベクターを注入されたオスをメスと交配させることにより得られる２世代目の中にはヘテロ遺伝子導入動物となっているものが存在し、ＰＣＲなどを用いた常法に従ってこの遺伝子導入動物を選抜することができる。自然交配および人工授精の手法は、脊椎動物の種類などに応じて、通常の方法に従って行うことができる。
【０１０９】
マウスのオスの精巣にＤＮＡを注入後、自然交配で受精した受精卵から発生した胚盤胞に外来遺伝子の発現が見られるとの報告がある（Ogawa S., et al., J.Reprod.Dev., 41, 379-382, 1995）。しかし、このようにして導入した外来遺伝子が安定して子孫に伝わり、確実にＴＧマウスが作出されるまでには至っていない。
【０１１０】
しかし、本発明のベクターを用いることにより、宿主細胞内に導入されたＤＮＡを効率よく宿主細胞のゲノムに挿入することが可能であるから、自然交配または通常の人工授精により、導入されたＤＮＡを安定して保持したＴＧマウスを作出することができる。これは、マウスに限らず、すべての哺乳類に応用可能な技術である。
【０１１１】
（ii）有用物質の生産
本発明のベクターを用いて、生体内（ヒトを除く）または生体外にて有用物質の生産を行うことができる。ベクターを用いて宿主細胞を形質転換させ有用物質を生産すること自体は既に行われており、本発明の有用物質の生産方法においても前記本発明のベクターを用いること以外は、ベクターを用いた一般的な有用物質の生産方法に従って行うことができる。
【０１１２】
すなわち、（イ）〜（ハ）を有するプラスミドベクターに、（ニ）のＤＮＡとして有用タンパク質をコードするＤＮＡ、および当該ＤＮＡを発現させるためのプロモーターなどを含む発現制御領域を組み込んだベクターを作製し、これを宿主細胞に導入し（ニ）のＤＮＡを宿主細胞のゲノムに挿入させ、このＤＮＡの発現により有用なタンパク質を得ることができる。また、（ニ）のＤＮＡが酵素をコードしているものであれば、この酵素を生成させることにより当該酵素の関与する反応を生じさせてタンパク以外の有用物質を得ることもできる。
【０１１３】
本発明のベクターを導入する宿主細胞には、特段の制限はなく、例えば、大腸菌、酵母などの微生物、動植物の培養細胞、さらには動植物生体の細胞などが宿主細胞の対象となり得る。宿主細胞が生体の体細胞であれば、体細胞キメラを、またはＴＧ動物を作出し、体細胞キメラ、ＴＧ動物に有用物質を生産させることができる。例えば、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタなどの哺乳動物の乳汁中に有用物質を産生させたり、ニワトリ、ダチョウ、アヒルなどの鳥類の卵中に有用物質を産生させることなどができる。
【０１１４】
有用物質の生産について、鳥類を用いた場合を例として、より具体的な実施形態を説明する。
【０１１５】
実施の形態の一例としては、（イ）〜（ニ）を有するプラスミドベクターにおける（ニ）のＤＮＡがタンパク質をコードする領域およびその発現を制御する領域を有しており、当該プラスミドベクターをトリの胚に注入して当該胚を構成する細胞のゲノムに（ニ）のＤＮＡを挿入し、当該ＤＮＡが挿入されたトリを作出し、当該ＤＮＡが挿入されたトリが産卵する卵中に有用物質を発現させ、有用物質を得る方法が特徴的な方法として挙げられる。
【０１１６】
（イ）〜（ニ）を有するプラスミドベクターの作製は、上記「（１）本発明のベクターおよび形質転換体」などで説明したとおりである。トリの卵中に産生させようとする有用物質は、その有用物質自体であるタンパク質をコードするＤＮＡ、またはその有用物質の生成させ得る酵素をコードするＤＮＡを入手できるものであれば特に制限はないが、例えば、サイトカイン、ヒト型抗体、ホルモン、抗血液凝固タンパク、ワクチンなどの生産に本発明の方法は好適である。
【０１１７】
卵中に有用物質を産生させるには、例えば、発現させたいタンパク質をコードするＤＮＡの上流に、卵中に大量に存在するタンパク質のプロモーター等の発現制御領域をつないで（ニ）のＤＮＡとし、このプラスミドベクターを胚に注入することにより行うことができる。例えば、卵白アルブミンのプロモーターを含む発現制御領域とこのプロモーターの下流にタンパク質をコードするＤＮＡを（ニ）のＤＮＡとしてプラスミドに組み込んでおき、このプラスミドベクターをトリの卵中の胚に導入し、この卵を孵化させて外来ＤＮＡが挿入された個体を得、このうちから体細胞キメラの個体を選抜すれば、輸卵管上皮で大量の有用タンパク質の発現が起こり、体細胞キメラの個体が産む卵の中に有用タンパク質の蓄積が起こることが期待される。発現させようとするタンパク質により異なるが、胚を構成するできるだけ多くの細胞にベクターが導入されることが、安定した生産を行う上では好ましい。
【０１１８】
また、生殖系列キメラから鳥類のＴＧ動物を作出し、このＴＧ動物の卵中に有用物質を産生させることもできる。
【０１１９】
すなわち、上記「（i）ＴＧ動物等およびその作出方法」のところで説明した方法により、生殖系列キメラ、ヘテロの遺伝子導入動物、ホモの遺伝子導入動物を得ることができ、本発明のベクターを用いて挿入する外来ＤＮＡとして、上記のような所定のタンパク質をコードする領域およびその発現制御領域を有するＤＮＡを用いればよい。
【０１２０】
より具体的には、（ニ）のＤＮＡがタンパク質をコードする領域およびその発現を制御する領域を有する（イ）〜（ニ）を有するプラスミドベクターを用い、このプラスミドベクターをトリの卵中の胚に注入して胚を構成する細胞のゲノムに当該ＤＮＡを挿入し、当該卵を孵化させる。孵化した個体の中から生殖系列の細胞に当該ＤＮＡが挿入された１世代目のトリを選抜し、この１世代目のトリを無処理の個体と自然交配または人工授精させて、挿入された外来ＤＮＡについてヘテロな遺伝子導入動物であるトリ（２世代目）を作出し、このヘテロな遺伝子導入動物が産卵する卵中から有用物質を回収する。また、同じ親から生まれたヘテロな遺伝子導入動物どうしをさらに自然交配または人工授精して作出される外来ＤＮＡについてホモまたはヘテロな遺伝子導入動物であるトリ（３世代目）を作出し、このホモまたはヘテロな遺伝子導入動物が産卵する卵中から有用物質を回収する。
【０１２１】
一旦ヘテロな遺伝子導入動物、またはホモな遺伝子導入動物が作出されれば、このような外来ＤＮＡが挿入されている系統を通常の手段を用い継代して維持することにより、３世代目以降のヘテロまたはホモの遺伝子導入動物を用いて継続的に有用物質の生産をすることができる。
【０１２２】
また、次のように有用物質を産生させることもできる。（ニ）のＤＮＡがタンパク質をコードする領域およびその発現を制御する領域を有する（イ）〜（ニ）を有するプラスミドベクターを用い、このプラスミドベクターを、トリの発生初期段階で採取した始原生殖細胞に導入して前記プラスミドベクターが有する当該ＤＮＡを当該始原生殖細胞のゲノムに挿入する。当該ＤＮＡが挿入された始原生殖細胞を別の個体の卵中の初期胚に注入し、当該卵を孵化させる。孵化した個体の中から生殖系列の細胞に当該ＤＮＡが挿入された１世代目のトリ選抜し、この１世代目のトリと無処理の個体とを自然交配または人工授精させて、挿入されたＤＮＡについてヘテロな遺伝子導入動物であるトリ（２世代目）を作出し、このヘテロな遺伝子導入動物であるトリが産卵する卵中から有用物質を回収する。また、同じ親から生まれたヘテロな遺伝子導入動物どうしをさらに自然交配または人工授精して外来ＤＮＡについてホモまたはヘテロな遺伝子導入動物であるトリ（３世代目）を作出し、このホモまたはヘテロな遺伝子導入動物が産卵する卵中から有用物質を回収する。
【０１２３】
一旦ヘテロな遺伝子導入動物、またはホモな遺伝子導入動物が作出されれば、このような外来ＤＮＡが挿入されている系統を通常の手段を用いて継代して維持することにより、３世代目以降のヘテロまたはホモの遺伝子導入動物を用いて継続的に有用物質の生産をすることができる。
【０１２４】
卵中に産生させた有用物質は、その有用物質に応じ通常の方法によって回収することができる。
【０１２５】
（３）本発明のベクターの他の用途
（イ）、（ロ）（ハ）および（ニ）を有する本発明のベクターは、形質転換に用いることができ、上記に説明した以外にも、目的に応じて選択した（ニ）のＤＮＡごとに様々な応用が可能である。
（i）ＤＮＡワクチン
（イ）、（ロ）、（ハ）および（ニ）を有する本発明のベクターは、ＤＮＡワクチンとして用いることができる。ＤＮＡワクチンとするには、対象となる動物の細胞内で免疫原となるタンパク質をコードするＤＮＡおよびこのタンパク質を発現させ得るプロモーター等と連結したＤＮＡを（ニ）のＤＮＡとしてベクターを作製すればよい。このようなタンパク質をコードするＤＮＡ等については既に多数のものが知られており、Davis, H.L. and McCluskie, M.J.の報告（Microbes and infection, 1, 7-21, 1999）等に記載されるヒト、あるいは非ヒト脊椎動物の感染症の感染防御抗原をコードする遺伝子などを（ニ）のＤＮＡとして用いることができる。
【０１２６】
ＤＮＡワクチンであるベクターは、ワクチンとして一般的な剤形とすることができ、具体的は、液状製剤、注射剤、乾燥製剤、カプセル化剤、金コロイド製剤、粉末製剤、微粒子化剤などの剤形とすることができ、好ましくは、経口投与用液状製剤、経口投与用乾燥製剤、カプセル製剤、微粒子化剤、注射剤などが挙げられ、特に好ましくは経口投与用乾燥製剤などが挙げられる。
【０１２７】
ＤＮＡワクチンの投与方法としては、注射による投与、経口投与などが挙げられる。注射による投与は、注射剤としたワクチンを通常の方法に従って、注射により生体内に導入すればよい。Vaccine誌によれば、微細粒子化されたプラスミドＤＮＡを経口投与することにより血液中の抗体および分泌型ＩｇＡの誘導が認められることが報告されており（Jones, D. H., et al., Vaccine, 15, 814-817, 1997)、この文献に示されるような方法に従って、本発明のベクターをワクチンとして経口投与することができる。ＤＮＡワクチンの経口投与法は、投与の簡便さ、投与部位の接種反応などの副作用が少ないこと、さらに局所免疫の誘導により、粘膜面を侵入門戸とする多くの病原体の感染防御が期待されることなどから優れた方法である。
【０１２８】
従来、プラスミドを用いての免疫応答の誘導には大量のＤＮＡを必要とし実用化には至っていなかった。この理由の１つとしては、細胞内に取り込まれたプラスミドＤＮＡが短期間のうちに除去されてしまうことが考えられる。しかし、本発明のベクターからなるワクチンを用いれば、細胞内に導入されたプラスミドが細胞ゲノムに挿入されるので、持続的に抗原が生産され、従来のような大量のＤＮＡを要せずとも、強い免疫刺激による強い免疫応答を生じさせることが期待できる。
【０１２９】
（ii）癌の遺伝子治療
本発明のベクターに（ニ）のＤＮＡとして下記に示すような癌治療の機能を発揮するＤＮＡを組み込み、このＤＮＡを細胞のゲノムに挿入させることで癌の治療を行う。具体的な実施形態について以下説明する。
【０１３０】
（ａ）本発明のベクターを用いた癌の治療法として、例えば、癌遺伝子のアンチセンスＲＮＡを発現させる方法、あるいは正常癌抑制遺伝子の導入による脱癌化あるいはアポトーシスの誘導による治療などが挙げられる。
【０１３１】
アンチセンスＲＮＡによる方法は、本発明のベクターによりゲノムに挿入されたＤＮＡが転写され、癌遺伝子に対するアンチセンスＲＮＡが生成されることにより、癌遺伝子のｍＲＮＡの翻訳を阻害し、癌を抑制するものである。（ニ）のＤＮＡとしてベクターに組み込む遺伝子としては例えば、肺癌に対してはＫ−ｒａｓ等、乳癌に対してはｃ−ｆｏｓやｃ−ｍｙｃ等が挙げられる。
【０１３２】
正常癌抑制遺伝子の導入による脱癌化は、癌抑制遺伝子が欠失、変異した癌細胞に当該癌抑制遺伝子を導入することにより腫瘍原性を低下させるものである。（ニ）のＤＮＡとしてベクターに組み込む遺伝子としては、例えば、ｐ５３遺伝子などの癌抑制遺伝子などが挙げられる。
【０１３３】
また、アポトーシスを利用した癌細胞の排除の機序はまだ不明な点が多いが、癌細胞にアポトーシスによる細胞死を誘導する癌抑制遺伝子として、例えばｐ５３遺伝子等が挙げられる。
【０１３４】
（ｂ）また、本発明のベクターを用いた癌の治療法として、例えば、癌細胞への薬剤代謝遺伝子、いわゆる自殺遺伝子の導入などによる癌治療も挙げられる。この治療は、本来細胞には存在しない微生物由来の代謝酵素遺伝子を本発明のベクターを用いて癌細胞に導入し、その酵素により活性化（毒性化）されるプロドラッグ（一般には抗微生物剤）を投与することで遺伝子導入癌細胞を選択的に死滅させようというものである。自殺遺伝子とプロドラッグの組み合わせとしては、例えば、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子とガンシクロビル、水痘帯状疱疹ウイルスのＴＫ遺伝子と６−メトキシプリンアラビノヌクレオシド、大腸菌のシトシンデアミナーゼ遺伝子と５−フルオロシトシン、大腸菌のプリンヌクレオシドホスホリラーゼと６−メチルプリン-２’−デオキシリボシド等が挙げられる。
【０１３５】
（ｃ）また、本発明のベクターを利用した癌の治療法として、免疫遺伝子療法による抗腫瘍免疫の増強が挙げられる。遺伝子導入の標的細胞により以下のような方法が例示される。
【０１３６】
癌細胞に細胞傷害を与えるエフェクター細胞を、本発明のベクターを導入する標的細胞とすることができる。すなわち、当該エフェクター細胞にサイトカイン遺伝子を導入し、抗腫瘍活性を増強しようというものである。導入する遺伝子としては、例えば、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターフェロン (ＩＦＮ) −γ、インターロイキン（ＩＬ）−２、ＩＬ−７、あるいはＩＬ−１２等をコードする遺伝子が挙げられる。
【０１３７】
癌細胞自体を本発明のベクターを導入する標的細胞とすることもできる。培養癌細胞に、サイトカイン遺伝子、接着分子をコードする遺伝子または主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）関連遺伝子等を導入し、これらの遺伝子をゲノムに挿入した細胞をワクチンとして用いるものである。それぞれの遺伝子として具体的には、例えば、サイトカイン遺伝子としてはＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＴＮＦ、ＩＦＮ、あるいは顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）等の遺伝子が、そして接着分子をコードする遺伝子としてはＣＤ８０、ＣＤ８６あるいはＩＣＡＭ−Ｉ等をコードする遺伝子が、またＭＨＣ関連遺伝子についてはクラスIあるいはクラスII遺伝子等の遺伝子が挙げられる。
【０１３８】
また、線維芽細胞や抗原提示細胞などを遺伝子導入の標的細胞とすることもできる。本発明のベクターを用いて、腫瘍特異抗原をコードする遺伝子、上述のサイトカイン遺伝子等を線維芽細胞や抗原提示細胞等に導入し、これをワクチンとして用いるものである。
【０１３９】
また、腫瘍特異抗原をコードする遺伝子をベクターに組み込み、このベクターをＤＮＡワクチンとして用いることもできる。
【０１４０】
（ｄ）また、本発明のベクターを利用した癌の治療法として、本発明のベクターを用いて抗癌剤耐性を賦与する方法も挙げられる。すなわち、本発明のベクターを用いて、造血幹細胞に抗癌剤耐性遺伝子を導入して抗癌剤耐性を獲得させ、より強力な癌化学療法から骨髄を保護しようというものである。抗癌剤耐性遺伝子としては、例えば、multi-drug resistance (ＭＤＲ)−１遺伝子やトポイソメラーゼ等が挙げられる。
【０１４１】
（ｅ）骨髄移植後の再発白血病に対する対策として、移植片対白血病効果を期待したドナーリンパ球輸注療法がある。しかし、副作用として重症の移植片対宿主病(graft-versus-host disease; ＧＶＨＤ) が問題となる場合がある。そこで、ドナーリンパ球に、本発明のベクターを用いて予め自殺遺伝子を組み込んでおき、ＧＶＨＤが生じた場合にプロドラッグを投与し、投与したドナーリンパ球を排除してこの副作用を解除しようとすることができる。
【０１４２】
（iii）感染症に対する遺伝子治療
本発明のベクターに、（ニ）のＤＮＡとして下記に示すような遺伝子を組み込み、このＤＮＡを細胞ゲノムに挿入させることで感染症の治療を行うことができる。
【０１４３】
感染症治療において特に問題になるのは、エイズやＣ型肝炎などに代表されるような、増殖が遅くまた宿主の免疫系を逃れるような疾病などである。感染症に対する遺伝子治療の１つとして、病原体の生活環を阻害する活性のあるタンパクあるいはＲＮＡをコードするＤＮＡを標的細胞内に導入、発現させる方法がある。この方法は、細胞内に外来遺伝子を入れて細胞レベルで感染抵抗性を賦与しようとするものであることから「細胞内免疫（intracellular immunization）」とも呼ばれている（Baltimore, D., Nature, 335, 395-396, 1988）。
【０１４４】
導入するＤＮＡとしては、アンチセンス、リボザイム、デコイ、トランスドミナント変異タンパク、病原体に対する特異性を持つ一本鎖抗体、小胞体に留まるように改変した病原体の受容体などをコードする遺伝子などが挙げられる。
【０１４５】
病原体の受容体に関しては、分泌型のものも有効であると考えられる。また、感染後早期に細胞を死に至らしめることで病原体の増殖を阻止するという治療法も考えられる。この目的で用いられるものとしては、例えば、ジフテリア毒素のＡフラグメントなどの毒性遺伝子や自殺遺伝子などが挙げられる。
【０１４６】
細胞内免疫法の他に、感染防御に関わる病原体の遺伝子を組み込んだベクターをワクチンとして用いることもできることは上記「（i）ＤＮＡワクチン」で説明したとおりである。外来遺伝子を組み込んだレトロウイルスベクターをワクチンとして用いるIrwin, M.J.らの報告（J.Virol.,68, 5036-5044, 1994）と同様にして、本発明のベクターを用いて細胞内で発現した外来タンパクに対して、細胞性免疫とともに液性免疫を引き起こすこともできる。
【０１４７】
（iv）先天性遺伝子疾患の治療
先天性遺伝子疾患を発症している患者細胞に、（ニ）のＤＮＡとして本来の正常な遺伝子を有する本発明のベクターを導入し、本来の正常な遺伝子を発現させて疾患を治療することができる。
【０１４８】
例えば、アデノシンデアミナーゼ欠損症に対しては、正常なアデノシンデアミナーゼ遺伝子を導入して治療することが可能と期待される。
【０１４９】
ベクターを医療目的に用いる場合、その安全性が大きな問題となるが、本発明のベクターはプラスミドであるから、レトロウイルスベクターのように相同組み換えによる増殖性ウイルスの出現のおそれはないため、レトロウイルスベクターに比べれば安全性は高いものと考えられる。
【０１５０】
【実施例】
以下、本発明について実施例に沿ってより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【０１５１】
＜実施例１＞ゲノム挿入型ベクターの作製
（１−１）ＬＴＲ領域およびインテグラーゼ遺伝子領域の増幅
レトロウイルスフリーの白色レグホンＬｉｎｅ−Ｍ（Ｃ／Ｏ）の有精卵を孵卵させ、孵卵１２日目の胚より調製した線維芽細胞に、ラウス肉腫ウイルス（Rous Sarcoma Virus、以下「ＲＳＶ」という。（財）日本生物科学研究所所有のものを使用。）を感染させた。
【０１５２】
感染２日後に、常法にしたがって（Molecular Cloning, 2nd edition: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.,以下「Ｍ.Ｃ.」という）細胞からＤＮＡを回収した。
【０１５３】
ＰＣＲに用いたプライマーはSchwartz, D.E.らの論文（Cell, 32, 853-869, 1983）に記載されているＲＳＶの塩基配列を参考に合成した。合成したプライマーの塩基配列は次の通りである。
U353  5'-GGCATTAATGTAGTCTTATGCAATACTCCTG-3'（配列番号１）
PSU535  5'-GTTAACGATATCAGATCTGCTTGATCCACCGGGCGACCAG-3'（配列番号２）
IN53  5'-TTGGATCCATGCCCTTGAGAGAGGCTAAAGATCTTC-3'（配列番号３）
PO35  5'-TTTATTTTAACTCTCGTTGGCAGCAAGGGTGTC-3'（配列番号４）
U535  5'-GGCATTAATGAAGCCTTCTGCTTCATTCA-3'（配列番号５）
NLSPO35 5'-TTTATTTTAAACCTTCCTCTTCTTCTTAGGACTCTCGTTGGCAGCAAGGGT-3'（配列番号６）
（プライマー配列の説明）
下記に記載のＲＳＶゲノムの塩基配列番号は、「Cell, 32, 853-869, 1983」の「図２」に記載されいるＲＳＶの塩基配列の先頭を１番としている。
U353の４〜９番：制限酵素ＶｓｐＩ認識配列。
U353の７〜３１番：ＲＳＶゲノム上の９０５８〜９０８２番。
PSU535の１〜６番：制限酵素ＨｉｎｃII認識配列。
PSU535の７〜１２番：制限酵素ＥｃｏＲＶ認識配列。
PSU535の１３〜１８番：制限酵素ＢｇｌII認識配列。
PSU535の１９〜４０番：ＲＳＶゲノム上の３５７〜３８０番の相補鎖。
IN53の３〜８番：制限酵素ＢａｍＨＩ認識配列。
IN53の９〜１１番：翻訳開始コドン
IN53の１２〜３６番：ＲＳＶゲノム上の４１１９〜４２４３番の配列。
PO35の１〜６番：ポリＡ付加シグナルの相補鎖。
PO35の７〜３３番：ＲＳＶゲノム上の５１６４〜５１９０番の相補鎖。
U535の４〜９番：制限酵素ＶｓｐI認識配列。
U535の７〜２９番：ＲＳＶゲノム上の７９〜１０１番の相補鎖。
NLSPO35の１〜６番：ポリＡ付加シグナルの相補鎖。
NLSPO35の７〜９番：終止コドンの相補鎖。
NLSPO35の１０〜３０番：遺伝子第５版（東京化学同人）２９２頁とアミノ酸のコドン表をもとに作製したＳＶ４０ largeＴ抗原の核移行シグナルをコードする配列。
PO35の３１〜５１番：ＲＳＶゲノム上の５１６４〜５１８７番の相補鎖。
【０１５４】
合成したプライマーには、プラスミドへのクローニングがしやすいように制限酵素の認識配列を付加した。インテグラーゼ遺伝子クローニング用３’側のプライマーＮＬＳＰＯ３５については、さらにＳＶ４０ largeＴ抗原核移行シグナルをコードする配列（Kalderon, D., et al., Cell, 39, 499-509, 1984）、ポリＡ付加シグナルを付加した。インテグラーゼ遺伝子クローニング用５’側プライマーＩＮ５３および３’側プライマーＰＯ３５については、Schwartz, D.E.ら（Cell, 32, 853-869, 1983）およびHippenmeyer P.J. and Grandgenett, D.P.（Virology, 137, 358-370, 1984）を参考に設計した。
【０１５５】
ＰＳＵ５３５については、インテグラーゼ遺伝子を転写させるのにＬＴＲ上のプロモーターを用いるため、ウイルスゲノム上で一番先頭にコードされるタンパクの読み枠の直前から上流に向かって作製した。ＬＴＲ領域クローニング用５’側プライマーＵ３５３、同じく３’側プライマーＵ５３５については、これらおよびＵ３５３、ＰＳＵ５３５によって増幅されるＰＣＲ産物をタンデムにつないだとき、ＲＳＶの生活環において２本鎖環状ＤＮＡ状態で見られるＬＴＲ−ＬＴＲ連結部位の配列ができるように設計した。このことについてもう少し詳しく説明する。
【０１５６】
ＲＳＶが感染細胞内で２本鎖環状ＤＮＡ状態になったとき、タンデムにつながったＬＴＲ−ＬＴＲの連結部位つまりＵ５とＵ３との間には「ATTAAT」という配列が存在する（Schwartz, D.E., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 74, 994-998,1977）。ウイルスＤＮＡがゲノムに組み込まれプロウイルスになる際にウイルスＤＮＡの両末端からそれぞれ２塩基の欠失が起こるため、プロウイルス中にはこの欠失部分の配列が存在しない（Virology, 2nd Edition, 1437-1500, edited by Fields, B.N., Knipe, D. M., et al., Raven Press, Ltd., New York, 1990.）（図１）。そこで、ＬＴＲ領域を増幅させるためのプライマーＵ３５３、Ｕ５３５の配列中に制限酵素ＶｓｐＩ認識配列「ATTAAT」を入れ、ＰＣＲで増幅した２つのＬＴＲ領域をつなげる際に制限酵素ＶｓｐＩで切断してからつなげることでＬＴＲ−ＬＴＲの連結部位に「ATTAAT」という配列を作った（図２）。
【０１５７】
これらのプライマーのセットを用いて上記ＲＳＶ感染線維芽細胞より抽出したＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行い、ＬＴＲ領域およびインテグラーゼ遺伝子領域を増幅した。インテグラーゼ遺伝子の塩基配列は配列番号８に示す。
【０１５８】
（１−２）プラスミドの構築
プラスミドｐＨＳＧ３９７（図３）を制限酵素ＶｓｐIで切断後、平滑末端化処理を行い、これにＰＳＵ５３５とＵ３５３で増幅させたＬＴＲを含む領域をつなげた。さらに、このプラスミドを制限酵素ＨｉｎｄIIIで切断後、平滑末端化処理を行い、さらに制限酵素ＶｓｐIで切断した。これにＵ５３５とＵ３５３とで増幅させたＬＴＲを含む領域を制限酵素ＲｓａIおよびＶｓｐIで切断したものをつなげて、ＬＴＲをタンデムに２つ持つがインテグラーゼ遺伝子を持たないプラスミドｐＬＴＲ４３を作製した（図４、図４中酵素の種類を示すアルファベットの上に＊をつけたところは、当該酵素で切断したあと、平滑末端化処理またはＰＣＲ産物などとつなげる処理により当該酵素で再び切れなくなったことを示す。他の図においても同様である。）。連結した２つのＬＴＲの配列は、配列表の配列番号７に示す。
【０１５９】
ｐＬＴＲ４３プラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＶで切断し、切断部位にＩＮ５３とＮＬＳＰＯ３５で増幅したインテグラーゼ遺伝子を含む領域をつなぐことで目的プラスミドｐＬＴＲ４３５を作製した（図５）。
【０１６０】
ｐＨＳＧ３９７からｐＬＴＲ４３、ｐＬＴＲ４３５までのプラスミド作製プロトコールを図６、図７に示す。
【０１６１】
＜実施例２＞トランスフェクションおよび解析
ｐＬＴＲ４３またはｐＬＴＲ４３５をそれぞれ別個に、マウスフレンド白血病由来細胞株ＭＥＬ細胞（理化学研究所細胞銀行より購入）へ、トランスフェリンフェクションキット（Bender MedSystems社）を用いて導入した。
【０１６２】
細胞の継代は１０倍希釈により行い、３代継代後の細胞からＤＮＡを回収し、ネステッドＰＣＲおよびサザンハイブリダイゼーションに用いた。
【０１６３】
（２−ｉ）ネステッドＰＣＲ
TaKaRa LA in vitro cloningキットを用いてベクターを含む細胞由来ＤＮＡをネステッドＰＣＲを行って増幅した。その原理を図８に示す。図８中に示されるように、プライマー１としてＰＳＵ５３５、プライマー３としてＵ５３５、プライマー２、４としてはキットに添付のCassette Primer C1、Cassette Primer C2をそれぞれ用いた。
【０１６４】
挿入されたベクターから宿主細胞ゲノムの中のＨｉｎｄIII認識配列までの距離によって、ＰＣＲで増幅されるバンドの大きさが変わる（図８中＊＊印を付けた太い矢印の部分）。したがって、ベクターが特異的な数箇所に挿入されるのであれば数本のバンドが、また不特定の箇所に挿入されるのであればスメアとして検出されることになる。
【０１６５】
ネステッドＰＣＲの結果を図９に示す。ｐＬＴＲ４３では、いずれのＰＣＲにおいても増幅産物は検出されなかった。このことは、ｐＬＴＲ４３がＭＥＬ細胞のゲノムにほとんど挿入されていないことを示す。一方、ｐＬＴＲ４３５を導入した細胞については、２回目のＰＣＲにおいてその増幅産物が検出され、その泳動は、スメアなバンドパターンとして現れた。ＰＣＲの鋳型としたＤＮＡは、ｐＬＴＲ４３、ｐＬＴＲ４３５のプラスミドを切断することはない制限酵素であるＨｉｎｄIIIで処理しているため、ここで検出している産物は、ゲノムに組み込まれずに環状で存在している導入プラスミドＤＮＡではなく、ゲノムに組み込まれた導入プラスミドＤＮＡより増幅されたものである。また、バンドパターンがスメアになっているとともに、一部に強いバンドが現れていることは、先の図８の原理よりｐＬＴＲ４３５はＭＥＬ細胞のゲノムの不特定な部位に挿入されるが、いずれか特定の部位に挿入されやすい傾向を示すものと推測される。
【０１６６】
（２−ii）サザンハイブリダイゼーション
（２−ii−１）  上記３代継代後の細胞からそれぞれ回収した２０μｇのＤＮＡを、ｐＬＴＲ４３、ｐＬＴＲ４３５のプラスミド内を２箇所で切断する制限酵素ＨｉｎｃIIおよび３箇所で切断するＥｃｏＲIでそれぞれ切断後、常法に従って（「Ｍ.Ｃ.」参照）、サザンハイブリダイゼーションを行った。
【０１６７】
その結果を図１０に示す。図１０に示される通り、ｐＬＴＲ４３５を導入した細胞から回収したＤＮＡについてのみバンドが検出されていることから、ｐＬＴＲ４３５は細胞に安定に保持されていることが明らかになった。
【０１６８】
なお、プローブは、プラスミドｐＨＳＧ３９７を酵素ＳａｌIで１箇所切断したものをTaKaRaランダムプライマーＤＮＡラベリングキットを用い、α−32Ｐ−ｄＡＴＰで標識したものを使用した。
【０１６９】
（２−ii−２）  上記３代継代後の細胞から回収したＤＮＡのうちｐＬＴＲ４３５を導入した細胞から得られたＤＮＡを、ｐＬＴＲ４３５を３箇所で切断する制限酵素ＥｃｏＲI、１箇所で切断する制限酵素ＳａｌI、切断しない制限酵素ＮｈｅIでそれぞれ処理し、（２−ii−１）と同様に常法に従って（「Ｍ.Ｃ.」参照）サザンハイブリダイゼーションを行った。
【０１７０】
その結果を図１１に示す。仮に、プラスミドがゲノムの不特定な様々な箇所に挿入されるのであれば、プラスミドを１箇所で切断する酵素ＳａｌIで切断すると、ゲノム中のＳａｌI認識配列から挿入されたプラスミドまでの長さが様々になるために、泳動後のＤＮＡ断片が１箇所に集中しないため、ハイブリダイゼーションではバンドは検出されないはずである。また、仮に、導入したベクターが細胞のゲノムに挿入されず、プラスミドの状態のままで細胞内に存在しているのであれば、プラスミドの大きさの位置にバンドが現れるはずである。しかし、図１１ではいずれでもなく、プラスミド内を複数切断するＥｃｏＲIでのみバンドが検出され、しかもバンドはプラスミドをＥｃｏＲIで切断したときに予測される位置に現れた。したがって、ｐＬＴＲ４３５が細胞のゲノム内の不特定な位置に挿入された形質転換体が得られたことが推定された。
【０１７１】
＜実施例３＞ニワトリへの遺伝子の導入
上記のレトロウイルスフリーの白色レグホンＬｉｎｅ−Ｍ（Ｃ／Ｏ）の有精卵を４８時間孵卵後、卵の側面に直径１ｃｍ程度の穴を開け、そこから発生途中の胚の胚盤葉（blastoderm）下腔へトランスフェリンフェクションキットで作製したＤＮＡ−トランスフェリン−ポリＬリジン複合体（実施例２でＭＥＬ細胞へのトランスフェクションに用いたものと同じもの）をガラスキャピラリーを用いて約２ｕｌ／胚で注入した。穴をビニールテープでふさいで再び孵卵し、ヒヨコを孵化させた。孵化後２週間目のヒナの翼下静脈から血液を採取した。
【０１７２】
採取した血液からGenomicPrepTM Blood DNA Isolation KIT（ファルマシア社）用いてＤＮＡを回収し、プライマーとしてＩＮ５３とＰＯ３５を用いてＰＣＲを行った結果を図１２に示す。
【０１７３】
図１２に示されるとおり、ｐＬＴＲ４３を注入した卵から孵化したヒヨコのＤＮＡを鋳型にした場合（図１２、レーン２）、増幅されたバンドは確認できなかった。他方、ｐＬＴＲ４３５を注入した卵から孵化したヒヨコのＤＮＡを鋳型にした場合（図１２、レーン３〜８：各レーンの検体は、それぞれ異なる個体から採取した）には、増幅されたバンドが確認された。すなわち、実施例２の結果もふまえると、ｐＬＴＲ４３５を胚盤葉下腔に注入して作出されたニワトリの細胞ゲノムにｐＬＴＲ４３５が挿入されたことが確認された。
【０１７４】
さらに、実施例の（２−ｉ）で行ったのと同様にTaKaRa LA in vitro cloningキットを用いてネステッドＰＣＲを行い、増幅されたＤＮＡの塩基配列を解析した（図１３）。
【０１７５】
図１３に示すように、増幅したバンドの塩基配列のすべてにＰＣＲに用いたＨｉｎｄIIIカセットの配列が見られた。しかし、ＨｉｎｄIIIカセット以外の部分では各クローン間に相同性は認められず、また、その配列は導入したベクターのものとは異なるものだった。このことからも、導入されたｐＬＴＲ４３５は、ニワトリのゲノムの不特定の箇所に挿入されたと推定された。
【０１７６】
ｐＬＴＲ４３５の存在を示すバンドの増幅が確認されたオスをさらに飼育し、成熟したところで精液を採取し、ＤＮＡを回収後、再びＩＮ５３（配列番号３）とＰＯ３５（配列番号４）を用いてＰＣＲを行った（図１４）。図１４に示されるとおり、生殖細胞中にも、卵に注入したＤＮＡが挿入されていることが推測された。
【０１７７】
したがって、本発明のベクターによればin vivoでの外来ＤＮＡの挿入が可能である。
【０１７８】
＜実施例４＞チャイニーズハムスター卵巣組織由来細胞（ＣＨＯ細胞）でのネコＧ−ＣＳＦの発現
プラスミドｐＥＧＦＰ−Ｃ１（Clontech社）のＥＧＦＰ遺伝子をネコＧ−ＣＳＦ遺伝子に置き換えたプラスミドｐＧＣＳＦ（図１５）を制限酵素ＭｌｕIで切断し、このプラスミドに、上記プラスミドｐＬＴＲ４３またはｐＬＴＲ４３５から制限酵素ＨｉｎｃIIでそれぞれ切断して取り出した「ＬＴＲ−ＬＴＲを含みインテグラーゼ遺伝子を含まないフラグメント」（本実施例４では「ＬＴＲ−ＬＴＲフラグメント」という）、または「ＬＴＲ−ＬＴＲ−インテグラーゼ遺伝子領域を含むフラグメント」（本実施例４では「ＬＴＲ−ＬＴＲ−インテグラーゼフラグメント」という）のいずれか一方を挿入して（図１６）、ＬＴＲ−ＬＴＲフラグメントが挿入されたプラスミドであるｐＧＣＳＦ−ΔＩＮ（図１７）、ＬＴＲ−ＬＴＲ−インテグラーゼフラグメントが挿入されたプラスミドであるｐＧＣＳＦ−ＩＮ（図１８）を作製した。また、ポジティブコントロールとして、バキュロウイルストランスファーベクターｐＢａｃＰＡＫ１（Clontech社）を用いて常法に従いネコＧ−ＣＳＦ遺伝子を組み込んだバキュロウイルスベクターを用いた。
【０１７９】
これらのプラスミドをそれぞれＣＨＯ細胞（理化学研究所細胞銀行より購入）へ、ＦｕＧＥＮＥ６（ファルマシア社）を用いてトランスフェクションし、トランスフェクション後の細胞培養上清中のＧ−ＣＳＦの活性をCell counting kit-8（DOJINDO社）を用いたネコＧ−ＣＳＦ感受性のマウス骨髄球様細胞株ＮＦＳ−６０細胞の増殖支持により測定した。なお、ポジティブコントロールについては、上記組換えバキュロウイルスをＳｆ２１ＡＥ細胞に感染させ、その培養上清を用いた。測定結果を表２に示す。測定はそれぞれ２検体ずつ行った。
【０１８０】
【表２】
0004474017.tif 000003
【０１８１】
表２の「継代１代目」の検体は、トランスフェクション後２日目に回収した細胞の培養上清である。また、細胞はトリプシン消化した後、その１／４量を継代した。さらに、その２日後に細胞の培養上清を回収し「継代２代目」の検体とした。なお、ネガティブコントロールとは、無処理のＣＨＯ細胞の培養上清である。表２からインテグラーゼ遺伝子を持たないｐＧＣＳＦ−ΔＩＮを導入した細胞の培養上清中のＧ−ＣＳＦ活性を継代１代目と継代２代目とで比較すると、継代２代目で明らかに低下していることがわかった。一方、インテグラーゼ遺伝子を持つｐＧＣＳＦ−ＩＮを導入した細胞の培養上清中のＧ−ＣＳＦ活性は、継代２代目で低下することはなく、むしろ上昇する傾向にあった。ｐＧＣＳＦ−ΔＩＮトランスフェクションの場合、継代１代目の測定値の平均値を１００％としたときに、継代２代目の測定値の平均値は約３３％である。一方、ｐＧＣＳＦ−ＩＮトランスフェクションの場合は、継代１代目の測定値の平均値を１００％としたときに、継代２代目の測定値の平均値は約１７５％である。このことは、ｐＧＣＳＦ−ＩＮは培養しているＣＨＯ細胞中に安定的に存在し、ネコＧ−ＣＳＦを安定的に産生することを示すものと考えられる。
【０１８２】
＜実施例５＞  ニワトリでの導入遺伝子の発現
ゲノム挿入型プラスミド に、サイトメガロウイルスのプロモーター／エンハンサーの下流に green fluorescent protein（「ＧＦＰ」と略称する）遺伝子をもつＤＮＡ断片を組み込んだプラスミドｐＬＴＲＧＦＰ４３５を作製した（図１９）。このプラスミドを上記実施例３と同様の胚操作によりゲノムにＧＦＰ遺伝子の挿入された個体を作出した。
【０１８３】
このニワトリの末梢血より得たリンパ球を、２０mg/ml ２−メルカプトエタノール、１０mM リポポリサッカライドおよび１０％ウシ胎児血清を加えたＲＰＭＩ１６４０培地中で２日間培養し、落射蛍光顕微鏡を用いて細胞でのＧＦＰの発現を観察した。培養前のリンパ球では緑色の蛍光を発するものは見られなかったが（データ示さず）、図２０の「２」に示すように、培養２日後では、顕著に蛍光を発する細胞が検出された。図２０の「１」は、同視野での顕微鏡写真である。
【０１８４】
さらに ＧＦＰのｍＲＮＡの発現を観察するために、図２０で用いた細胞から ＲＮＡを回収し、オリゴｄＴプライマーで逆転写反応を行った後、ＧＦＰ遺伝子内に設定したプライマーでＰＣＲを行った。用いたプライマーは、ｐＥＧＦＰＦ１：CTAGCGCTACCGGTCGCCACC（配列番号９）およびＧＦＰ５： GTTGCCGTCCTCCTTGAAGT（配列番号１０）である。このプライマーの組み合わせでは、ＧＦＰ遺伝子のｍＲＮＡが存在すれば４３０b. p.の ＤＮＡ断片が増幅されることが予想される。
【０１８５】
結果を図２１に示す。図２１中「Ｍ」はマーカーのレーンであり、レーン１、３は培養前のリンパ球より調整したＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲ（reverse transcription-PCR）、またレーン２、４は培養２日目のリンパ球より調整したＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲの結果である。また、レーン３は、レーン１に用いたＲＮＡを、逆転写反応を行わずにＲＮａｓｅ処理したものを用いた結果であり、レーン４はレーン２に用いたＲＮＡを逆転写反応を行わずにＲＮａｓｅ処理したものを用いた結果である。
【０１８６】
培養前のリンパ球より調整した ＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲではバンドは検出されなかったのに対し（レーン１）、培養後のものでは予想されたバンドが検出された（レーン２）。さらに、レーン２のバンドはＲＮａｓｅ処理により増幅されなかったことから（レーン４）、ゲノムＤＮＡが混入してこれを鋳型に増幅されたものではないことが確かめられた。これらの結果は、先の蛍光顕微鏡観察を反映するものである。
【０１８７】
以上の結果から、本プラスミドを用いることにより、目的とする外来遺伝子を生体のゲノムに挿入させ、その遺伝子を発現させることが可能であることが確認された。
【０１８８】
＜実施例６＞  次世代ニワトリへの導入遺伝子の伝搬（Ｔｇニワトリの作出）上記実施例３に示すように、本ベクターを発育鶏卵の胚盤葉下腔に注入することにより、孵化したヒヨコの体細胞のゲノムにＤＮＡの挿入が見られるのみならず、生殖細胞のゲノムへのＤＮＡの挿入がおこることが推測された。そこで、上記実施例５で作出した ＧＦＰ遺伝子の挿入が確認された個体と、ＧＦＰ遺伝子を導入してない未処置の個体との間で人工授精を行った。産卵された有精卵を人工孵化させ、２世代目の個体に導入したＤＮＡが伝搬されるかを検討した。
【０１８９】
試験は、上記実施例３と同様の方法で採取した血液からＤＮＡ抽出し、これをを鋳型に、導入遺伝子の挿入を検出する目的でプライマーＰＯ３５（配列番号４）とＵ５５３：TTGGTGTGCACCTGGGTTGAT（配列番号１１）とを用いてＰＣＲを行った。 またその際、ＰＣＲ反応が適切に起こっていることを判別するためのインターナルコントロールとしてオボアルブミンの５′上流領域にプライマーを設定して、両セットのＰＣＲを同一試験管内で行った。前者の遺伝子の増幅が見られれば１,３５０ b. p.のバンドが、また、後者の遺伝子が増幅されれば 661 b.p. のバンドが検出されることが予想される。
【０１９０】
図２２に各個体での典型的な泳動像を示す。図２２中レーン「Ｍ」はマーカーであり、レーン１〜８は、各個体から得たゲノムを用いたＰＣＲ産物の泳動像である。
【０１９１】
レーン１では、両者のバンドが検出されないことからＰＣＲ反応自体がうまくいっていないと考えられ、このような個体は判別不能とした。また、レーン６あるいは８のような個体は、インターナルコントロールとしたバンドは検出されるのに対し、１,３５０b. p.のバンドが検出されないことから、これらの個体には導入遺伝子の伝搬はないと判断された。一方、レーン２から５、および７の個体は双方のバンドが検出され、導入遺伝子の伝搬が起こっているものと判定された。このような解析から、２４個体のうち１３個体、すなわち約１／２の効率で導入遺伝子の子孫への伝搬が確認された。
【０１９２】
以上の成績から、本ベクターを用いることにより、従来困難とされていたＴＧニワトリの作出が容易に行えることが明らかとなった。
【０１９３】
＜実施例７＞パッケージングシグナルを含む非翻訳領域欠損プラスミドでのニワトリゲノムへの遺伝子挿入
通常、プラスミドにはその全体の大きさに限界があるため、より長い外来遺伝子を組み込む事を考慮した場合、必要のない配列は含まないほうが望ましい。上記の実施例１〜６で使用してきたゲノム挿入型プラスミドでは、非翻訳領域の転写に与える影響を避けるという理由から、パッケージングシグナルを含むＬＴＲの下流からポリメラーゼの翻訳開始点まで（「Ｐｓ」と略す）を除かない状態にしておいたが、この領域を欠損させたプラスミドでのゲノムへの挿入効果について検討した。
【０１９４】
Ｐｓを欠損させたプラスミド ｐΔＰｓＧＦＰ４３５の構成を図２３に示す。このプラスミドおよびＰｓをもつｐＬＴＲＧＦＰ４３５、ならびに陰性対照としてインテグラーゼ遺伝子を含まないｐΔＧＦＰ４３５（図２４）を上記実施例３と同様にニワトリ胚の胚盤葉下腔にガラスキャピラリーを用いて注入後、遺伝子導入装置ＣＵＹ２１（ＥＤＩＴタイプ；ＢＥＸ社製）を用いて電気的穿孔法により導入した。孵化後約２週目のヒヨコの血液細胞より調整したＤＮＡを用いて、上記実施例２と同様にＰＣＲを行い、ゲノムへの挿入を調べた。ただし、ゲノムの切断には制限酵素Ｘｂａ Iを用い、また、ＰＣＲには図８のプライマー１に相当するものとしてＰＥＧＦ１： ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTG（配列番号１２）を、プライマー３に相当するものとしてＰＥＧＦ２： GTCGAGCTGGACGGCGACGT （配列番号１３）を用いた。
【０１９５】
図２５に結果を示す。レーン１はｐΔＧＦＰ４３５を導入したニワトリから得られたゲノムを鋳型にしたＰＣＲであり、レーン２はｐＬＴＲＧＦＰ４３５を導入したニワトリから得られたゲノムを鋳型にしたＰＣＲであり、レーン３はｐΔＰｓＧＦＰ４３５を導入したニワトリから得られたゲノムを鋳型にしたＰＣＲの結果である。
【０１９６】
図２５に示されるように、陰性対照であるｐΔＧＦＰ４３５を導入した個体ではＰＣＲで増幅されるバンドは検出されなかった。一方、ｐＬＴＲＧＦＰ４３５と同様にｐΔＰｓＧＦＰ４３５を導入した個体においてはスメアなバンドとしてＰＣＲ増幅産物が検出されており、ゲノムの不特定の箇所への挿入が起こっていることが確認された。以上の結果から、Ｐｓを欠損させたｐΔＰｓＧＦＰ４３５においてもゲノムへの挿入に有効であることが判明した。
【０１９７】
＜配列表フリーテキスト＞
本明細書に含まれる配列表中の項目<223>におけるフリーテキストの記載内容を以下に示す。
（配列番号１）
Ｕ３の３’末端領域およびVspI制限酵素認識部位を含む、ＲＳＶのＬＴＲ増幅のためのＰＣＲ用合成プライマー。
（配列番号２）
ｐ１９遺伝子の非コーディング領域の５’末端領域、およびHincII、EcoRV、BglII制限酵素認識部位を含む、ＲＳＶのＬＴＲおよびＬＴＲの下流領域増幅のためのＰＣＲ用合成プライマー。
（配列番号３）
ＲＳＶインテグラーゼ遺伝子の５’末端領域およびBamHI制限酵素認識部位を含む、ＲＳＶのインテグラーゼ遺伝子増幅のためのＰＣＲ用合成プライマー。
（配列番号４）
ＲＳＶインテグラーゼ遺伝子の３’末端領域およびポリＡシグナルを含む、ＲＳＶのインテグラーゼ遺伝子増幅のためのＰＣＲ用合成プライマー。
（配列番号５）
Ｕ５の５’末端領域およびVspI制限酵素認識部位を含む、ＲＳＶのＬＴＲ増幅のためのＰＣＲ用合成プライマー。
（配列番号６）
ＲＳＶのインテグラーゼ遺伝子の３’末端領域、ポリＡシグナル、ＳＶ４０のラージＴ抗原の核移行シグナルを含む、ＲＳＶのインテグラーゼ遺伝子増幅のためのＰＣＲ用合成プライマー。
（配列番号７）
ＲＳＶの環状構造ＤＮＡの一部であり、ＬＴＲのタンデムリピートおよび非翻訳領域近傍の配列である。
（配列番号９）
ＧＦＰ遺伝子の５’末端領域およびNheI制限酵素部位の一部を含む、ＧＦＰ遺伝子を増幅するためのＰＣＲ用合成プライマー。
（配列番号１０）
ＧＦＰ ＯＲＦのアンチセンス配列を含む、ＧＦＰ遺伝子の一部を増幅するためのＰＣＲ用合成プライマー。
（配列番号１１）
ＬＴＲ配列のＵ５領域を含む、導入されたプラスミドベクターの一部を増幅するためのＰＣＲ用合成プライマー。
（配列番号１２）
ＧＦＰ ＯＲＦ配列の５’末端を含む、ＧＦＰ遺伝子の一部を増幅するためのＰＣＲ用合成プライマー。
（配列番号１３）
ＧＦＰ ＯＲＦ配列の一部を含む、ＧＦＰ遺伝子の一部を増幅するためのＰＣＲ用合成プライマー。
【０１９８】
【発明の効果】
本発明は主に次のような効果を有する。
（１）所望のＤＮＡを宿主細胞に効率よく宿主細胞のゲノムに挿入することができる。また、本発明のベクターは、in vitroでもin vivoでも所望のＤＮＡをゲノムへ挿入することができる。
（２）外来ＤＮＡをゲノムに挿入することができるので、性質の安定した形質転換体を得ることができる。また、性質の安定したＴＧ動物の作出も容易に行うことができる。
（３）本発明のベクターはプラスミドであり、また既知のプラスミドを用いて作製することができるので、ウイルスベクターに比べ作製が容易である。また、一旦作製してしまえば、その後の大量生産も容易である。
（４）プラスミド自体には病原性がなく、安全性の高いベクターとすることができる。
（５）レトロウイルスベクターと比較して、強力なプロモーターの使用が可能なベクターが得られる。
（６）例えば、ｐＵＣ系を基礎とした本発明ベクターであれば９ｋｂ、ｐＢＲ系を基礎とした本発明のベクターであれば１９ｋｂの外来遺伝子の組み込みが可能であり、大きなＤＮＡの挿入が可能である。
（７）本発明のベクターを細胞に導入すれば高い割合で当該ベクターがゲノムに挿入されるため、細胞の増殖過程でベクターのＤＮＡが失われにくい。したがって、形質転換を利用した有用物質の安定した生産が期待される。
（８）本発明のベクターは、ＤＮＡを構成要素としているため、ウイルスを基本とする従来のベクターのような生体の免疫機構による排除は起こりにくいことから、生体への繰り返し投与が可能である。
【０１９９】
【配列表】
0004474017.tif 000004
0004474017.tif 000005
0004474017.tif 000006
0004474017.tif 000007
0004474017.tif 000008
0004474017.tif 000009
0004474017.tif 000010
0004474017.tif 000011
【図面の簡単な説明】
【図１】２本鎖環状ウイルスＤＮＡが宿主ＤＮＡに挿入される際に２塩基欠失が起こる様子を示す図である。「Ｈ」、「Ｊ」、「Ｋ」、「Ｌ」、「Ｍ」、「Ｐ」は、ウイルスＤＮＡ組み込みの際ターゲットとなった宿主細胞ＤＮＡの塩基を表す。「’」印は同じアルファベットで表されている塩基の相補的な塩基を表す。
【図２】ＬＴＲ−ＬＴＲを作製する際に２本鎖環状ウイルスに見られるＬＴＲ−ＬＴＲ連結部位をどのように作ったかについて示す図である。なお、ＬＴＲの連結のさせ方を明らかにするため、連結させる部分の配列にはもともとＵ３、Ｕ５に含まれる配列も一部表示した。
【図３】プラスミドｐＨＳＧ３９７の構造を表す図である。
【図４】プラスミドｐＬＴＲ４３の構造を表す図である。
【図５】プラスミドｐＬＴＲ４３５の構造を表す図である。
【図６】ＬＴＲをタンデムに２つ持つがインテグラーゼ遺伝子を持たないプラスミドベクターｐＬＴＲ４３の作製の概略を示す図である。
【図７】ＬＴＲをタンデムに２つ持ちインテグラーゼ遺伝子を持つプラスミドベクターｐＬＴＲ４３５の作製の概略を示す図である。
【図８】ベクターが挿入された近傍の宿主細胞ＤＮＡのTaKaRa LA in vitro cloningキットによるクローニングを概説する図である。本実施例２、３ではプライマー１としてＰＳＵ５３５、プライマー３としてＵ５３５を、プライマー２、４としてはキットに添付の Cassette Primer C1、Cassette Primer C2を用いた。
【図９】実施例２におけるネステッドＰＣＲ後の結果を示す電気泳動の写真を表した図である。「Ｍ」はマーカーのレーンである。レーン上の「１」、「２」の数値は、それぞれ１回目のＰＣＲ産物であること、または２回目のＰＣＲ産物であることを示す。１回目のＰＣＲに用いたプライマーは、ＰＳＵ５３５、Cassette Primer C1であり、２回目のＰＣＲに用いたプライマーは、Ｕ５３５、Cassette Primer C2である。
【図１０】実施例２における(２−ii−１)のサザンハイブリダイゼーションの結果を示す泳動写真を表した図である。矢印は、マーカー以外の試料（検体）においてバンドが現れた位置を示す。レーンＭはマーカーであり、レーンＥはEcoRIで切断したもの、レーンＨｃはHinCIIで切断したものである。
【図１１】実施例２における(２−ii−２)のサザンハイブリダイゼーションの結果を示す泳動写真を表した図である。矢印は、マーカー以外の試料（検体）においてバンドが現れた位置を示す。レーンＭはマーカーであり、レーンＥはEcoRIで切断したもの、レーンＮはNheIで切断したもの、レーンＳはSalIで切断したものある。ｐＬＴＲ４３５は、EcoRIにより２箇所、NheIにより０箇所、SalIにより１箇所切断される。
【図１２】実施例３におけるヒヨコの血液から回収したＤＮＡについてＰＣＲを行い、その結果を示す泳動の写真を表した図である。レーンＭはマーカーであり、レーン１はプラスミドベクターを導入していないネガティブコントロール、レーン２はｐＬＴＲ４３を導入した卵から孵化したヒヨコのＤＮＡのＰＣＲ、３〜８はｐＬＴＲ４３５を導入した卵から孵化したヒヨコのＤＮＡのＰＣＲの結果である。
【図１３】ＬＡ ＰＣＲによって遺伝子導入ニワトリから増幅されたＤＮＡの塩基配列の比較を示す図である。「HindIII Cassette」はクローニングに用いたカセットを示す。長方形の枠で囲われた部分は、HindIII site同士のligationによってできたHindIII siteを示す。
【図１４】実施例３における成熟したニワトリの精液から回収したＤＮＡについてＰＣＲを行い、その結果を示す泳動の写真を表した図である。矢印は、マーカー以外の試料（検体）においてバンドが現れた位置を示す。
【図１５】プラスミドｐＥＧＦＰ−Ｃ１からプラスミドｐＧＣＳＦを作製する工程の概略を示す図である。
【図１６】プラスミドｐＧＣＳＦからプラスミドｐＧＣＳＦ−ΔＩＮまたはプラスミドｐＧＣＳＦ−ＩＮを作製する工程の概略を示す図である。
【図１７】プラスミドｐＧＣＳＦ−ΔＩＮの構造を表す図である。
【図１８】プラスミドｐＧＣＳＦ−ＩＮの構造を表す図である。
【図１９】プラスミドｐＬＴＲＧＦＰ４３５の構造を示す図である。
【図２０】遺伝子導入ニワトリ末梢血由来細胞の顕微鏡写真を示す図である。「１」は、末梢血由来細胞の２日培養後の顕微鏡写真であり、「２」は「１」と同視野における蛍光および可視光を当てた細胞の顕微鏡写真を示す。「２」中の矢印のうち、大きい方は典型的なＧＦＰ陽性細胞を指し示し、小さい方は典型的なＧＦＰ陰性細胞を指し示す。
【図２１】実施例５におけるＰＣＲ後の結果を示す泳動写真を示した図である。図２１中「Ｍ」はマーカーのレーンであり、レーン１、３は培養前のリンパ球より調整したＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲ、またレーン２、４は培養２日目のリンパ球より調整したＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲの結果である。また、レーン３は、レーン１に用いたＲＮＡを、逆転写反応を行わずにＲＮａｓｅ処理したものを用いた結果であり、レーン４はレーン２に用いたＲＮＡを逆転写反応を行わずにＲＮａｓｅ処理したものを用いた結果である。
【図２２】実施例６におけるＰＣＲ後の結果を示す泳動写真を示した図である。図２２中レーンＭはマーカーであり、レーン１〜８は、各個体から得たゲノムを用いたＰＣＲ産物の泳動像である。
【図２３】Ｐｓを有するプラスミドであるｐＬＴＲＧＦＰ４３５、およびＰｓを欠損させたプラスミドであるｐΔＰｓＧＦＰ４３５の構造を示す図である。
【図２４】インテグラーゼ遺伝子を備えていないプラスミドであるｐΔＧＦＰ４３５の構造を示す図である。
【図２５】実施例７におけるＰＣＲ後の結果を示す泳動写真を示した図である。レーン１はｐΔＧＦＰ４３５を導入したニワトリから得られたゲノムを鋳型にしたＰＣＲであり、レーン２はｐＬＴＲＧＦＰ４３５を導入したニワトリから得られたゲノムを鋳型にしたＰＣＲであり、レーン３はｐΔＰｓＧＦＰ４３５を導入したニワトリから得られたゲノムを鋳型にしたＰＣＲの結果である。
【符号の説明】
図中、制限酵素は以下のように省略して記載される場合がある。また、酵素の種類を示すアルファベットの上に＊をつけたところは、当該酵素で切断したあと、平滑末端化処理またはＰＣＲ産物などとつなげる処理などにより当該酵素で切断されなくなったことを示す。
Ｂ・・・ＢａｍＨＩ
Ｃ・・・ＣｌａＩ
Ｅ・・・ＥｃｏＲＩ
Ｈ・・・ＨｉｎｄIII
Ｈｃ・・・ＨｉｎｃII
Ｋ・・・ＫｐｎＩ
Ｍ・・・ＭｌｕＩ
Ｎ・・・ＮｈｅＩ
Ｒｓ・・・ＲｓａＩ
Ｒｖ・・・ＥｃｏＲＶ
Ｓ・・・ＳａｌＩ
Ｓｃ・・・ＳａｃＩ
Ｓｐ・・・ＳｐｈＩ
Ｖ・・・ＶｓｐＩ
Ｘｂ・・・ＸｂａＩ
Ｘｈ・・・ＸｈｏＩ
Ｐ・・・ＰｓｔＩ
Ｂｇ・・・ＢｇｌII
【図１】
0004474017.tif 000012
【図２】
0004474017.tif 000013
【図３】
0004474017.tif 000014
【図４】
0004474017.tif 000015
【図５】
0004474017.tif 000016
【図６】
0004474017.tif 000017
【図７】
0004474017.tif 000018
【図８】
0004474017.tif 000019
【図９】
0004474017.tif 000020
【図１０】
0004474017.tif 000021
【図１１】
0004474017.tif 000022
【図１２】
0004474017.tif 000023
【図１３】
0004474017.tif 000024
【図１４】
0004474017.tif 000025
【図１５】
0004474017.tif 000026
【図１６】
0004474017.tif 000027
【図１７】
0004474017.tif 000028
【図１８】
0004474017.tif 000029
【図１９】
0004474017.tif 000030
【図２０】
0004474017.tif 000031
【図２１】
0004474017.tif 000032
【図２２】
0004474017.tif 000033
【図２３】
0004474017.tif 000034
【図２４】
0004474017.tif 000035
【図２５】
0004474017.tif 000036