(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的細胞内に分子を送達させる装置において、
パルス波形を提供する波形発生機と、
電極アッセンブリーホルダーと、
上記電極アッセンブリーホルダーによって機械的に支持され、電気伝導経路によって上記波形発生機に電気的に連結し、生物学的細胞内に送達されるべき分子でコートされた電極を含む電極アッセンブリーとを備える、装置。
【請求項２】
上記電極アッセンブリーは上記電極アッセンブリーホルダーから取り外し可能で、置換可能である請求項１に記載の装置。
【請求項３】
上記電極アッセンブリーは電極アッセンブリー伝導ストリップを含み、
上記電極アッセンブリーホルダーは、上記電極アッセンブリーが上記電極アッセンブリーホルダーに機械的に連結された場合上記電極アッセンブリー伝導ストリップで記録可能なホルダー伝導体を含み、上記電極アッセンブリーホルダーは上記ホルダー伝導体と上記波形発生機の間に電気的伝導経路を有する請求項１又は２に記載の装置。
【請求項４】
さらに、上記電極アッセンブリーが上記電極アッセンブリーホルダーによって機械的に支持され、上記波形発生機に電気的に連結されたのち、上記電極アッセンブリーから取り外される上記電極アッセンブリーのための滅菌パッケージングを含む、請求項１から３の何れか１項に記載の装置。
【請求項５】
上記波形発生機は少なくとも３つの単一の、オペレーターで制御され、独立にプログラムされたＤＣ電気パルスの連続を包含するパルス波形を提供する装置において、連続した少なくとも３つのＤＣ電気パルスは以下の特性、（ａ）少なくとも３つのパルス中の少なくとも２つはパルス振幅が互いに相異する、（ｂ）少なくとも３つのパルス中の少なくとも２つはパルス幅が互いに相異する、および（ｃ）少なくとも３つのパルス中２つの第一セットにおける第一のパルス間隔は少なくとも３つのパルス中２つの第二セットにおける第二のパルス間隔と相異するの特性の１つ、２つまたは３つを有する請求項１から４の何れか１項に記載の装置。
【請求項６】
上記電極は針型電極である請求項１から５の何れか１項に記載の装置。
【請求項７】
上記電極は電気的に絶縁された外表面電極チップ部分および電気的に絶縁された外表面電極ベース部分を含む、請求項１から６の何れか１項に記載の装置。
【請求項８】
上記電極は巨大分子でコートされている請求項１から７の何れか１項に記載の装置。
【請求項９】
上記コートは固相である、請求項１から８の何れか１項に記載の装置。
【請求項１０】
上記巨大分子はポリヌクレオチドを含む請求項８又は９に記載の装置。
【請求項１１】
上記巨大分子はＤＮＡを含む請求項８又は９に記載の装置。
【請求項１２】
上記巨大分子はＲＮＡを含む請求項８又は９に記載の装置。
【請求項１３】
上記巨大分子はタンパク質を含む請求項８又は９に記載の装置。
【請求項１４】
分子を生物学的細胞に送達させるための装置において、
パルス波形を提供する波形発生機と、
電極アッセンブリーホルダーと、
上記電極アッセンブリーホルダーによって機械的に支持され、電気伝導経路によって上記波形発生機に電気的に連結し、生物学的細胞内に送達されるべき分子でコートされた電極を含み、上記コートは固相である、電極アッセンブリーとを備える装置。
【請求項１５】
生物学的細胞内に送達されるべき分子でコートされた電極を含む滅菌電極アッセンブリーと、上記電極を波形発生機に電気伝導経路で連結するための伝導ストリップと、上記滅菌電極アッセンブリーを囲む内部滅菌パッケージとを含む、パッケージされた滅菌電極アッセンブリー。
【請求項１６】
上記電極は電気的に絶縁された外表面電極チップ部分ならびに電気的に絶縁された外表面電極ベース部分を含む、請求項１５に記載のパッケージされた滅菌電極アッセンブリー。
【請求項１７】
上記電極は針型電極である請求項１５又は１６に記載のパッケージされた滅菌電極アッセンブリー。
【請求項１８】
上記電極は巨大分子でコートされている請求項１５から１７の何れか１項に記載のパッケージされた滅菌電極アッセンブリー。
【請求項１９】
上記巨大分子はポリヌクレオチドを含む請求項１８に記載のパッケージされた滅菌電極アッセンブリー。
【請求項２０】
上記巨大分子はＤＮＡを含む請求項１８に記載のパッケージされた滅菌電極アッセンブリー。
【請求項２１】
上記巨大分子はＲＮＡを含む請求項１８に記載のパッケージされた滅菌電極アッセンブリー。
【請求項２２】
上記巨大分子はタンパク質を含む請求項１８に記載のパッケージされた滅菌電極アッセンブリー。
【請求項２３】
駆逐された分子を生物学的細胞内に送達させる際、前記パルス波形はエレクトロポレーション波形である請求項１から１３の何れか１項に記載の装置。
【請求項２４】
前記エレクトロポレーション波形は１００〜２０，０００ボルト／ｃｍの範囲である請求項２３に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願との相互参照）
本出願は係属中の1999年1月28日付けの出願に係る米国特許仮出願一連番号第60/117,755号に基づく優先権を主張する。
【０００２】
（技術分野）
本発明は一般的に細胞内への巨大分子送達のための方法および装置に関する。さらに詳しくは、本発明は、巨大分子たとえばポリヌクレオチドワクチン（DNAワクチンおよび／またはRNAワクチン）およびタンパク質ベースのワクチンのような物質を、感覚を低下（痛みを低下）させて、表皮組織中の選ばれた細胞内に送達させるための方法および装置を提供する。
【０００３】
（背景技術）
従来技術における最初のDNA予防接種操作は、DNAの液体溶液が、トランスフェクションを増強するための添加物を使用せずにマウスの筋肉内に注射されたことから裸のDNA予防接種と呼ばれた。この方法は、数個の細胞をトランスフェクトし、マウスに発現した抗原に対する免疫応答を誘導する。しかしながら、ヒトおよび霊長類では、この方法はうまく働かない。
【０００４】
従来技術においては、DNAワクチンの有効性の改良がDNA送達のためのバイオリスティックな方法によって得られた。バイオリスティックな方法は金属のマイクロビーズをDNAで被覆し、この粒子を選ばれた速度に加速したのち皮膚内に粒子を打ち込むことによって行われる。この方法は裸のDNAよりもはるかに優れた働きがある。理由の一部は、DNAで被覆した粒子がハンゲルスハンス細胞をトランスフェクトする機会が増大する深さまで皮膚に注入されることである。しかしながら、バイオリスティックな方法には幾つかの欠点がある。第一にそれはある種の皮膚障害を生じ、これは個人により瘢痕を形成することがある。第二に、有効性は増大したものの、さらに高い有効性が必要である。第三に弾道粒子は処置後、患者の内部に残ることである。この点で、瘢痕形成を生じる皮膚傷害が起こらないDNAを生物学的細胞に送達するための方法が提供されることが望ましい。また処置される細胞内に弾道粒子の残留を残さないDNAを生物学的細胞に送達するための方法が提供されることが望ましい。興味あることに以下の米国特許すなわち第5,036,006号および第5,478,744号にはバイオリスティックな方法が開示されている。
【０００５】
生物学的細胞に巨大分子を送達するその他の多くのアプローチが、従来技術に開示され、以下の米国特許または他の刊行物に以下のように記載されている。
【０００６】
Weaverらの米国特許第5,019,034号には、電極を、患者の組織表面たとえば皮膚の上部に配置する組織のエレクトロポレーション方法が開示されている。皮膚の処置に使用される分子は皮膚表面の上部における貯蔵部中に配置され、処置分子は皮膚組織内に経皮的に貫入されなければならない。すなわち、処置分子は皮膚の外部から皮膚の内部に通過しなければならない。処置すべき皮膚の層が表皮の基底板に近い場合、皮膚の表面層は比較的非透過性であるばかりか、処置すべき細胞に処置分子が到達するためには、処置分子はかなりの皮膚組織を横切らなければならない。このような処置方法では、基底板に近い細胞を処置するためには不十分である。皮膚表面上に位置する電極を使用し、処置分子を表皮の基底板に近い生物学的細胞にまで経皮的に皮膚を通過させるよりも、処置分子に皮膚を経皮的に通過させることなく、表皮内の生物学的細胞に分子を送達させるためのエレクトロポレーション方法が提供されることが望ましい。
【０００７】
Hofmannらの米国特許第5,273,525号には、エレクトロポレートすべき組織の付近に薬物または遺伝子材料を配置するための中空の皮下用注射針を採用する、組織中への薬物および遺伝子材料のエレクトロポレーションのための装置が開示されている。中空の皮下用注射針を組織に使用する場合はいつでも、組織は中空の皮下用注射針によって円形の断片に切断される。その結果、患者が皮下注射を受ける場合には、患者はかなりの痛みを感じることになる。このような円形への切断を回避し、関連するかなりの痛みを回避するためには、皮下用注射針を使用しない生物学的細胞への分子の送達方法が提供されることが望ましい。
【０００８】
Hofmannらの米国特許第5,318,514号は、薬物および遺伝子の細胞内へのエレクトロポレーションのためのアプリケーターが開示されている。このアプリケーターは複数個の針型電極を包含し、これらは患者の皮膚内に貫入させることができる。皮膚内にエレクトロポレートされる材料は液体貯蔵部に維持され、これがその液体のための開口のあるセルフォームエラストマー担体を湿潤させる。エレクトロポレートされる材料は液体中、貯蔵部および開口のあるセルフォームエラストマーの両者内に維持されるので、電極表面における材料の量の注意深いコントロールは難しい。貯蔵部および開口のあるセルフォームエラストマーから針型電極の表面に流れ出す液体量をコントロールすることは困難であり、したがって患者にエレクトロポレーション方法が実施されるときに電極16の表面に実際に存在する処置分子の量をコントロールすることは難しい。その上このような方法でエレクトロポレートされる組織上では、液体メジウムの存在は灌流または洗浄効果を示すことがあり、これはエレクトロポレーション過程を妨害する。これらの点で、エレクトロポレーション方法を患者に実施するときに電極上に流れ出す液体メジウムを使用しない、生物学的細胞へ分子を送達するためのエレクトロポレーション方法が提供されることが望ましい。
【０００９】
表皮細胞内への遺伝子の移入を仲介するエレクトロポレーションの使用に関する他の開示には、"DNA-mediated gene transfer into epidermal cells using electroporation" と題するReissらのBiochem.Biophys.Res.Commun. 137 (1): 244-249, 1986の文献および "In vivo electroporation and stable trans formation of skin cells of newborn mice by plasmid DNA" と題するTitomirovのBiochim. Acta, 1088 (1): 131-134, 1991の文献がある。
【００１０】
Weaverの米国特許第5,389,069号には処置物質を組織中に深く提供するために中空シリンダー状の注射針を使用する組織のインビボエレクトロポレーションのための方法および装置が開示されている。上述のように、中空シリンダー状の注射針の使用を回避することは、それに伴う痛みを避けるために望ましい。
【００１１】
いずれもFelgnerらの米国特許第5,580,859号および5,589,466号には、注射法によって患者の筋肉および皮膚内に巨大分子を送達する方法が開示されている。これらの方法はエレクトロポレーションを使用していない。
【００１２】
Erikssonの米国特許第5,697,901号には、加圧した遺伝子担送液体メジウムを中空の微小注射針とともに使用することにより、組織内への遺伝子の送達が開示されている。液体メジウムの使用におけるコントロールおよび灌流の問題は上述の通りである。興味あることは、Erikssonが２つの点で痛みの主題を処理していることである。中空の微小注射針システムは痛みの処置に使用できると述べられている。外傷による痛みは冷却によって緩和することができるとも述べられている。本発明者らはここで、Erikssonは彼の処置方法自体が痛みのない、もしくは痛みを減弱した処置方法であるとして論じていないことを指摘したい。本発明者らは、Erikssonによって用いられる加圧液体注射法は痛みのない、もしくは痛みの減弱した処置方法を導くものではないと考えている。この点で、微小注射針を使用するが患者に液体を注射するために加圧液体注射工程を用いない遺伝子治療処置方法が提供されることが望ましい。
【００１３】
Henryらによる "Microfabricated Microneedles: A Novel Approach to Trans dermal Drug Delivery" と題するJournal of Pharmaceutical Sciences 87 (8): August 1988, 922-925 の文献には、微小注射針のアレイを表皮へ貫入させ微小サイズの穿孔を残し、微小穿孔表皮内への液体により担送される処置剤の経皮的浸透を促進する方法が開示されている。微小注射針は顕微鏡的な距離しか表皮内に挿入されないので、微小注射針の使用は無痛である可能性が考えられる。微小注射針が電極として使用されることの開示はない。また、Henryらの文献には、エレクトロポレーション工程は開示されていない。
【００１４】
痛みを減弱させる処置の問題に関してはさらに、エレクトロポレーションにおける２つの重要な電気的パラメーターがインビボでの痛みの感知に密接な関係があることに留意すべきである。１つのパラメーターはインビボ組織によって経験される絶対電圧である。他のパラメーターはインビボ組織によって経験されるパルス幅である。これらの点に関連して、エレクトロポレーションを受ける細胞に比較的低い絶対電圧を適用し、エレクトロポレーションを受ける細胞にできれば比較的短いパルス幅を有するパルスを適用する、生物学的細胞に分子を送達するためのエレクトロポレーション方法を提供することが望ましい。
【００１５】
巨大分子を表皮細胞内に送達するための方法および装置においては、さらに他の特徴が望まれる。たとえば、電極を表皮内に貫入させる場合、伝導性ベース電極部分および電極の伝導性チップは一般にエレクトロポレーション過程、およびとくに処置される生物学的細胞に関して望ましくない電気特性を表す可能性がある。この点で表皮細胞内に巨大分子を送達する方法および装置では電極のベース部分およびチップ部分は非伝導性になるように提供されることが望ましい。
【００１６】
複数個の針型電極を有する電極アッセンブリーが一旦患者に使用された場合、以後の使用のためにそれらを清浄化し滅菌することは困難な課題である。この点に関し、細胞内に巨大分子を送達するための方法および装置では、電極アッセンブリーを使い捨てにして提供することが望ましい。
【００１７】
使い捨て電極アッセンブリーを使用する場合は、使い捨て電極アッセンブリーを滅菌パッケージング中にパッケージすることが望ましい。
【００１８】
すなわち、上述の従来技術の主要部は生物学的細胞に分子を送達するためエレクトロポレーションを使用することはよく知られていることを指示するが、上述の従来技術は以下の望ましい組み合わせ、すなわち（1）瘢痕形成を生じる皮膚の傷害を起こさない、（2）処置された細胞内に弾道粒子の残留を残さない、（3）処置分子を経皮的に皮膚を通過させないで、基底板付近の表皮の生物学的細胞に分子を送達するエレクトロポレーション法を提供する、（4）皮下注射針を使用しない、（5）患者にエレクトロポレーション法を実施するときに電極上に流れ出す液体メジウムを使用しない、（6）患者に液体を注射するための加圧液体注射工程を使用しない、（7）エレクトロポレーションを受ける細胞に比較的低い絶対電圧を適用する、（8）エレクトロポレーションを受ける細胞に比較的短いパルス幅を有するパルスの適用を用いることができる、（9）電極のベース部分およびチップ部分を非伝導性にする、（10）使い捨ての電極アッセンブリーを提供するおよび（11）滅菌パッケージング中にパッケージした電極アッセンブリーを提供する、
の大部分を有する、細胞内へ巨大分子を送達する方法および装置については教示も示唆もない。上述の望ましい特徴は、以下の記述から明らかなように、細胞内に巨大分子を送達する本発明のユニークな方法および装置によって提供される。本発明の従来技術に優る他の利点も明らかになるものと確信する。
【００１９】
（発明の開示）
本発明の一態様によれば、以下の工程：
（a）電極アッセンブリー中の電極を送達すべき分子でコートし、
（b）コートされた電極を有する電極アッセンブリーを電極アッセンブリーホルダーに結合させ、
（c）波形発生機を準備し、
（d）電極と波形発生機の間に電気伝導経路を確立し、
（e）電極を生物学的細胞がそれらの間に配置されるように位置させ、ついで
（f）電極上の分子が電極から駆逐されて生物学的細胞内に送達されるように、波形発生機から電極にパルス波形を提供する工程を包含する、生物学的細胞内への分子送達のための方法が提供される。
【００２０】
パルス波形は少なくとも３つの単一の、オペレーター制御され、独立にプログラムされたDC電気パルスの連続を生物学的細胞に適用することにより提供される。連続した少なくとも３つのDC電気パルスは以下の特性、すなわち（a）少なくとも３つのパルス中の少なくとも２つはパルス振幅が互いに相異する、（b）少なくとも３つのパルス中の少なくとも２つはパルス幅が互いに相異する、および（c）少なくとも３つのパルス中２つの第一セットにおける第一のパルス間隔は少なくとも３つのパルス中２つの第二セットにおける第二のパルス間隔とは相異するの特性の1つ、2つまたは３つを有する。
【００２１】
さらに、この方法は電極アッセンブリーと波形発生機の間に電気伝導経路を有する電極アッセンブリーホルダーを提供する工程を包含することができる。
【００２２】
さらに、この方法は電極アッセンブリーを滅菌パッケージ中に提供する工程を包含することができる。この場合、使用前に滅菌パッケージから電気アッセンブリーを取り出す。
【００２３】
さらにこの方法は、電気的に絶縁された外表面電極チップおよび電気的に絶縁された外表面電極ベース部分を提供する工程を包含することができる。
【００２４】
電極コーティング中の分子は、固相中にあり、好ましくは巨大分子である。電極コーティング中の巨大分子は、ポリヌクレオチドワクチン（DNAワクチンおよび／またはRNAワクチン）またはタンパク質ベースのワクチンを包含することができる。
【００２５】
本発明の変法では、分子は患者の表皮組織中のランゲルハンス細胞に、患者に対する知覚を低下させ（痛みを減弱させまたはほぼ無痛または痛みがなく）送達することができる。患者に分子の知覚低下送達を提供するためには、以下の条件すなわち（a）パルス波形は0.1〜300ボルトの範囲の絶対適用電圧を有する、（b）反対の極性の電極は50〜500ミクロンの範囲の分離距離で分離される、および（c）電極は表皮組織の基底板層までおよびそれをわずかに越えて上皮組織中に貫入させる条件を維持させる。
【００２６】
コートされた分子を電極から駆逐するパルス波形は電気泳動波形である。分子を生物学的細胞内に送達させるパルス波形はエレクトロポレーション波形である。一般に、共通のパルス波形がコートされた分子の電極からの駆逐、および駆逐された分子の生物学的細胞内への送達の両者を行う。
【００２７】
生物学的細胞はインビボ、エクスビボ、またはインビトロである。さらに特定すれば、生物学的細胞は表皮組織内であり、また表皮組織におけるランゲルハンス細胞である。
【００２８】
本発明の他の態様によれば、生物学的細胞内に分子を送達するための装置であり、パルス波形を提供する波形発生機を包含する。電極アッセンブリーホルダーが提供され、電極アッセンブリーは電極アッセンブリーホルダーによって機械的に支持される。電極アッセンブリーホルダーはまた電気伝導経路により波形発生機に電気的に連結される。電極アッセンブリーは生物学的細胞内に送達される分子でコートされた電極を包含する。
【００２９】
電極アッセンブリーは電極アッセンブリーホルダーから取り外しが可能で置換可能である。この点に関し、電極アッセンブリーは電極アッセンブリー伝導性ストリップを包含する。電極アッセンブリーホルダーは電極アッセンブリーが電極アッセンブリーホルダーに機械的に連結された場合、電極アッセンブリー伝導性ストリップで記録可能なホルダー伝導体を包含する。また、電極アッセンブリーホルダーはホルダー伝導体と波形発生機の間の電気伝導経路を包含する。
【００３０】
装置に関しては、滅菌パッケージを電極アッセンブリーのために提供することができる。電極アッセンブリーが電極アッセンブリーホルダーによって機械的に支持され、波形発生機に電気的に連結されたのちに、滅菌パッケージは電極アッセンブリーから取り外すことができる。
【００３１】
装置に関しては所望により、波形発生機は少なくとも３つの単一の、オペレーター制御され、独立にプログラムされたDC電気パルスの連続を包含するパルス波形を生物学的細胞に提供する。連続した少なくとも３つのDC電気パルスは、以下の特性すなわち（a）少なくとも３つのパルス中の少なくとも２つはパルス振幅が互いに相異する、（b）少なくとも３つのパルス中少なくとも２つはパルス幅が互いに相異する、および（c）少なくとも３つのパルス中２つの第一セットにおける第一のパルス間隔は少なくとも３つのパルス中２つの第二セットにおける第二のパルス間隔とは相異するの特性の1つ、2つまたは３つを有する。
【００３２】
電極は、電気的に絶縁された外表面電極チップ部分および電気的に絶縁された外表面電極ベース部分を包含することができる。電極は巨大分子でコーティングされ、巨大分子には、ポリヌクレオチドワクチン（DNAワクチンおよび／またはRNAワクチン）および／またはタンパク質ベースのｗクチンが包含される。ポリヌクレオチドワクチンまたはタンパク質ベースのワクチンは、電極を患者に使用するに先立ち、電極をコートする固相とすることができる。
【００３３】
本発明のさらに他の態様によれば、生物学的細胞に送達すべき分子でコーティングされた電極を含む滅菌電極アッセンブリーを包含するパッケージされた滅菌電極のアッセンブリーが提供される。電極アッセンブリーは、波形発生機に通じる補足的な電気伝導経路で連結するための電極アッセンブリー伝導ストリップを包含する。さらに、内部滅菌電極パッケージはその中に含有される滅菌電極アッセンブリーを囲い込む。
【００３４】
パッケージされた滅菌電極アッセンブリーに関しては、電極は電気的に絶縁された外表面電極チップ部分ならびに電気的に絶縁された外表面電極ベース部分を包含することができる。
【００３５】
パッケージされた滅菌電極アッセンブリーに関しては、電極は固相ポリヌクレオチド（DNAワクチンおよび／またはRNAワクチン）および／またはタンパク質ベースのワクチンを包含できる巨大分子でコートされる。
【００３６】
本発明によれば、電場仲介トランスフェクションを用い、DNAによるインビボでの細胞のトランスフェクションは有効な方法である。さらに、電場は他の巨大分子たとえばRNAおよびタンパク質の細胞内送達にも使用することができる。従来技術では、電場送達はトランスフェクションのために要求される高い電圧の電気パルスによって痛みが誘発されるので１つの欠点であった。これに反して、本明細書に記載したように、無痛（またはほぼ無痛）の効率的な電場仲介送達を用い、巨大分子（DNA, RNAおよびタンパク質）をインビボ組織中細胞内へ送達する方法が提供される。
【００３７】
エレクトロポレーションによる電場仲介DNAトランスフェクションに要求される電場は100ボルト／cm〜20,000ボルト／cmの範囲である。本発明によれば500ミクロン（0.5 mm）の最大電極間ギャップを用い、この範囲を絶対電圧範囲に変換すると、5〜1,000ボルトの範囲である。DNAを電極から駆逐するための電気泳動電圧を考慮すると絶対電圧の範囲は0.1〜1,000ボルトの範囲である。
【００３８】
電気刺激から生じる痛みの知覚は幾つかの因子に依存する。これらの中には、電圧、アンペア数、パルスの立ち上がり時間、パルス幅、およびパルスの周波数がある。インビボ組織に直接適用される閾値以上では、電圧の上昇およびパルス幅の拡大が痛みの増大を生じる。
【００３９】
巨大分子のインビボ電場仲介送達における無痛には２つの閾値が重要である。第一の閾値は痛みのための閾値である。インビボにおいて組織に直接適用される絶対電圧（および所望によりパルス幅も）を痛みの閾値以下に低下させることが望ましい。しかしながら反対の第二の閾値は巨大分子の電場仲介送達に要求される最小電場である。通常この第二の閾値を越えてパルスパラメーターが上昇すると巨大分子の送達における効率の上昇を生じる。過度の上昇は細胞死を招来する。
【００４０】
幸いなことに、巨大分子の電場仲介送達のために重要な電場パラメーターは、絶対電圧ではなくボルト／cmである。一定な電場を維持するためには、電極間の距離を低下させると、絶対電圧は低下させる必要がある。同様に、電極間の距離を低下させて、絶対電圧を同じに維持すると、電場が上昇する。したがって電極間の距離を狭くすれば、インビボにおいて組織に直接適用される絶対電圧を低下させることが可能である。
【００４１】
絶対電圧に加えてパルス幅も重要である。きわめて狭いパルス幅は痛み知覚に要求される閾値電圧を上昇させる。ある限界内でのエレクトロポレーション効率はパルス電圧にパルス幅を乗じた商に比例する。これは、電圧を上昇させることができれば、パルス幅は低下させることができることを意味する。したがって、電極間距離の低下も使用するパルス幅を低下することを可能にする。
【００４２】
電極間距離を低下させる他の利点は、表皮を通って真皮まで浸透させる電極の部分の電極間に存在する皮膚神経が少ないことである。与えられた適用電圧では電極間に神経が少ないほど、受ける痛みは低下する。
【００４３】
痛みに影響する他の因子は神経終末に対する電場の近接である。皮膚においては、神経および神経終末は真皮を通じて存在するが、表皮には存在しない。しかしながら、真皮の上部乳頭層には神経はごく稀である。これは、表皮または表皮プラス上部真皮（真皮の乳頭層）のみに浸透する電極は多くの神経には接近しないことを意味する。したがって、きわめて短い電極は挿入により痛みをほとんど誘発しないか、大部分の電場は表皮内に位置する電極の間に存在するので、電場の適用時に痛みを誘発することがない。
【００４４】
本発明の巨大分子を細胞内に送達するための方法および装置には多くの適用が予想される。略述すれば、このような適用にはポリヌクレオチド予防接種、タンパク質予防接種、および遺伝子療法が包含される。
【００４５】
DNA予防接種には、２つの主要な要求がある。一つはインビボにおける遺伝子発現であり、他方は抗原を発現する細胞の少なくとも一部は抗原提示細胞であることが必要である。接近し得る抗原提示細胞の最高濃度はランゲルハンス細胞と呼ばれる細胞として皮膚に存在する。これらの細胞は樹状細胞と呼ばれる抗原提示細胞のきわめて有効なグループの一部である。エレクトロポレーションはインビボにおいて選ばれた細胞をトランスフェクトするための実行可能な別法である。
【００４６】
タンパク質もまた電場仲介送達を用いて細胞内に導入することができる。慣用の予防接種では、タンパク質は、皮下注射針を用いて細胞の外側に送達される。このタイプの送達は細胞性の細胞傷害リンパ球免疫応答を誘発するには不十分である。一部の感染性疾患は感染の効率的クリアランスのために免疫応答の成分として細胞傷害性リンパ球応答を要求する。細胞内へのタンパク質の送達は、その応答の誘導を促進する。
【００４７】
治療用遺伝子医薬の細胞内への送達は、それらの細胞に欠けているタンパク質を発現させる目的で、遺伝子療法の基礎である。本発明の方法および装置は皮膚に加えてすべての臓器表面上の細胞内に治療用遺伝子を送達するために使用することができる。本発明の方法は、予防接種（または処置）、DNA予防接種および遺伝子療法の目的、または他の理由で、インビボにおける組織に巨大分子を送達する、痛みのない、有効な方法である。２つの特性の少なくとも１つをもつ電極が組織中の細胞内に巨大分子を送達するために使用される。２つの特性の１つは神経終末のある組織に深く浸透しない十分短い長さの電極である。他の特性は、電極間の距離が使用するパルスのパラメーター（電圧およびパルス幅）を無痛にするのに十分小さくすることである。これらの特性の一方または他方のみがすべての与えられた適用に必要であるが、それらを一緒に使用することもできる。
【００４８】
以上の簡単な説明は以下の本発明の詳細な説明をよりよく理解できるように、また本発明の技術への寄与をよりよく評価できるように、本発明のさらに重要な特徴をむしろ広く述べている。もちろん、以下に記述され、付随する特許請求の範囲の主題である本発明の付加的な特徴がある。
【００４９】
この点に関して、本発明の好ましい実施態様を詳細に説明する前に、本発明は図面における以下の説明または例示に掲げる構造および成分の配列の詳細への適用に限定されるものではないことを理解すべきである。本発明には他の実施態様ならびに様々な方法での実行および実施が可能である。また、本明細書に用いた語句および用語は説明のためのものであり、限定とみなすべきではない。
【００５０】
本技術分野における熟練者にはそれ自体、開示に基づく概念は、本発明の幾つかの目的を実施するための他の構造、方法およびシステムを設計するための基礎として容易に利用できることは自明であろう。したがって、特許請求の範囲は、それらが本発明の精神および範囲から逸脱しない限り、このような均等な構造を含むものとみなすことが重要である。
【００５１】
上述の観点において、本発明の目的は、瘢痕形成を生じる皮膚傷害を起こさない、巨大分子を細胞内に送達するための新規な改良された方法および装置を提供することである。
【００５２】
本発明の他の目的は処置される細胞中に弾道粒子の残留を残さない、巨大分子を細胞内に送達する新規な改良された方法および装置を提供することである。
【００５３】
本発明のさらに他の目的は、皮膚を通して経皮的に処置分子を通過させないで、表皮の基底板付近における生物学的細胞内に分子を送達させるためのエレクトロポレーション法を与える、巨大分子を細胞内に送達するための新規な改良された方法および装置を提供することにある。
【００５４】
本発明のさらに他の目的は、患者にエレクトロポレーション法を実施する場合電極上に流れ出してくる液体メジウムを使用しない、巨大分子を細胞内に送達するための新規な改良された方法および装置を提供することにある。
【００５５】
本発明のさらに他の目的は、患者に液体を注射するための加圧液体注射工程を使用しない、巨大分子を細胞内に送達するための新規な改良された方法および装置を提供することにある。
【００５６】
本発明のなおさらに他の目的はエレクトロポレーションを受ける細胞に比較的低い絶対電圧を適用する、巨大分子を細胞内に送達するための新規な改良された方法および装置を提供することにある。
【００５７】
本発明のさらに他の目的は、エレクトロポレーションを受ける細胞に、所望により比較的短いパルス幅を有するパルスを適用する、巨大分子を細胞内に送達するための新規な改良された方法および装置を提供することにある。
【００５８】
本発明のさらに他の目的は電極のベース部分およびチップ部分を非伝導性にする、巨大分子を細胞内に送達するための新規な改良された方法および装置を提供することにある。
【００５９】
本発明のさらに他の目的は、使い捨て電極アッセンブリーを提供する、巨大分子を細胞内に送達するための新規な改良された方法および装置を提供することにある。
【００６０】
本発明のさらに他の目的は、電極を滅菌パッケージング中にパッケージする、巨大分子を細胞内に送達するための新規な改良された方法および装置を提供することにある。
【００６１】
これらは、本発明のさらに他の目的とともに本発明を特徴づける様々な新規性の特徴に沿って、添付され本開示の一部を形成する特許請求の範囲における特殊性で指摘される。本発明、その使用によって得られるその操作利益および特異的な目的のよりよい理解のために、本発明の好ましい実施態様が例示される添付の図面および記述事項を参照すべきである。
【００６２】
（図面の簡単な説明）
以下の本発明の詳細な説明を研究したのちに、本発明がよりよく理解され、上述の目的ならびに上に掲げた目的以外の目的がより明白になるものと考えられる。このような説明には添付の図面が参考になる。
【００６３】
図中、図１は、本発明の全体的な装置の模式的な例示である。
図２は、表皮層に浸透し、表皮細胞内に巨大分子を送達するパルス波形によって駆逐される本発明の予めコートされた電極の模式的な例示である。
図３は、電極のチップ部分の模式的な例示である。
図４は、電極アッセンブリーの側面図である。
図５は、図４に示す電極アッセンブリーの底面図である。
図６は、電極の交互に反復する列の交互の極性を例示する図５に示す電極アッセンブリーの側面図である。
図７は、電極の交互に反復する列を連結する交互伝導体を示す図４の電極アッセンブリーの上面図である。
図８は、滅菌パッケージ中にカッケージした電極アッセンブリーを模式的に示す図である。
図９は、電極を巨大分子でコートするために使用される装置を模式的に示す。
【００６４】
発明の実施の態様
方法及び装置が、細胞内への巨大分子の送達のために提供され、また図面を参照して前記方法及び装置が以下に記述される。生物学的細胞内への分子の送達方法は、前記装置を使用し、また、
（ａ）電極アセンブリー１２内の電極１６を、送達すべき分子により被覆し、
（ｂ）被覆電極１６を有する電極アセンブリー１２を電極アセンブリーホルダ１３に取り付け、
（ｃ）波形発生器１５を備え、
（ｄ）電極１６及び波形発生器１５の間に電気的伝導性経路を設置し、
（ｅ）電極１６を、生物学的細胞がそれらの間に位置するように配置し、ならびに
（ｆ）波形発生器１５から電極１６にパルス波形を与え、以て電極１６上の分子を電極１６から追い出し、生物学的細胞に送達させる工程を含む。
【００６５】
該方法の一つの変法において、分子は患者における低減された感覚を以て、患者の表皮２０のランゲルハンス細胞に送達される。該パルス波形は、０．１から３００ボルトまでの範囲の絶対付加電圧を有する。反対の極性の電極１６は、５０から５００ミクロンまでの範囲の分離距離を以て分離されている。電極１６は、表皮組織の基底膜層を僅かに越えるまで、表皮組織に貫入される。
【００６６】
電極１６から被覆している分子を運び去るパルス波形は、電気泳動波形である。電気泳動波形は、０．１から１００ボルト／ｃｍまでの範囲であり得る。生物学的細胞中に運び去った分子を送達するパルス波形は、電気穿孔法波形である。電気穿孔法波形は、１００から１０，０００ボルト／ｃｍまでの範囲であり得る。共通のパルス波形は、電極１６の被覆している分子を運び去り、かつ運び去られた分子を生物学的細胞中に送達させる。
【００６７】
分子が送達された生物学的細胞は、生体内（in vivo）、生体外（ex vivo）又は試験管内（in vitro）にあり得る。より特定的には、生物学的細胞は、表皮２０（表皮組織）内、及び表皮組織内のランゲルハンス細胞２２であり得る。
【００６８】
電気泳動的電気パルスにより電極１６から運び去られた分子は、電気穿孔パルスにより細胞内に送達される。例示的プロトコールに従えば、パルス波形は波形発生器１５により、連続する少なくとも３回の演算器−制御された、独立してプログラムされる直流（ＤＣ）電気パルスを、生物学的細胞に付加することにより与えられる。連続する少なくとも３回のＤＣ電気的パルスは、以下の特徴、（１）少なくとも３回のパルスの内の少なくとも２回は、パルス強度において互いに異なること、（２）少なくとも３回のパルスの内の少なくとも２回はパルス幅において互いに異なること、及び（３）少なくとも３回のパルスの内の２回の第一の組の第一のパルス間隔が、少なくとも３回のパルスの内の２回の第二の組の第二のパルス間隔とは異なることの内の１種、２種又は３種を有する。
【００６９】
電極アッセンブリーホルダ１３は、電極アッセンブリー１２及び波形発生器１５の間に、伝導体２１を含む電気的伝導性経路が与えられる。
【００７０】
電極アッセンブリー１２は、使用前に外電極アッセンブリー１２から取り除かれる滅菌包装２４内に与えられ得る。
【００７１】
好ましくは、電極１６は、円錐型頂部を有し、これによってそれらは針状電極と称される。電極１６には、電気的に絶縁された外部表面電極先端部１７及び電気的に絶縁された外部表面電極基部１９が備えられ得る。該電気的に絶縁された外部表面電極基部１９は、パルス電圧が付加された場合に上部表層を横切って流れる電流を最小にする。更に、ＤＮＡは電気的に絶縁された外部表面電極基部１９に対してほとんど結合しない。電気的に絶縁された外部表面電極先端部１７と電気的に絶縁された外部表面電極基部１９との間の電極１６の外部表面領域は、外部絶縁層を有さず、ＤＮＡ結合のために良好な表面である。電気的に絶縁された外部表面電極先端部１７と電気的に絶縁された外部表面電極基部１９との間の外部表面領域は、導電性であり、活性電極領域と称されうる。電気的に絶縁された外部表面電極先端部１７は、組織内に火傷を生じうる大きな局所的電場強度を阻止する。
【００７２】
前腕の表皮２０内のランゲルハンス細胞２２にＤＮＡワクチンを送達するために適した電極アセンブリー１２は、次の特徴を有する：
（ａ）電極長  −−  １３０ミクロン
（ｂ）電極材料抵抗率  −−  ０．１オーム−ｃｍ未満
（ｃ）先端部の絶縁  −−  先端末端から１０ミクロン上方に伸長
（ｄ）基部の絶縁  −−  電極担体から５５ミクロン下方に伸長
（ｅ）電極先端部平面度−−１平方ミクロン未満
（ｆ）基部の電極直径  −−  ４３ミクロン
（ｇ）導電性列における電極間隔  −−  １３０ミクロン
（ｈ）導電性列における電極数  −−  ３５
（ｉ）導電性列の間隔  −−  ２６０ミクロン（２ｘ１３０）
（ｊ）導電性列の数  −−  ２５
【００７３】
表皮への適用について、電極１６の長さは表皮の厚さ２０により決定される。表皮の厚さは、人体の異なる部位において差異がある。例えば、内側前腕又は三角筋上方の側方上腕部の表皮２０の厚さは、足のかかと又は足裏の表皮２０の厚さよりもかなり薄い。
【００７４】
電極被覆中の分子は、固相中にあり、好ましくは巨大分子１８である。該電極被覆中の巨大分子１８は、ＤＮＡワクチン及び／又はタンパクに基づくワクチンを含んでよい。ＤＮＡワクチン及びタンパク質の基づくワクチンは、電極１６に塗布された固相ＤＮＡワクチン又はタンパク質の基づくワクチンの形態であり得る。
【００７５】
好ましくは、電極アセンブリー１２は、電極アセンブリーホルダ１３から脱着及び交換可能である。電極アセンブリー１２は、電極−アセンブリー−導電性ストリップ２６を含む。電極アセンブリーホルダ１３は、ホルダ伝導体を含み、これら導電体は、電極アセンブリー１２が電極アセンブリーホルダ１３と機械的に連結された際に電極−アセンブリー−導電性ストリップ２６と合致されうる。電極アセンブリーホルダ１３は、ホルダ伝導体と波形発生器１５との間に電気的伝導性の経路を有する。
【００７６】
上述したように、巨大分子を組織中の細胞内に送達するためには３つの主要な構成要素が必要とされる。それらは波形発生器１５，電極アセンブリーホルダ１３及び電極アセンブリー１２である。波形発生器は、組織内に電場を発生させるために必要な電気的パルスを供給する。電極アセンブリー１２は、電極１６を含み、またＤＮＡ又はタンパク質巨大分子は該電極１６に塗布される。電極アセンブリーホルダ１３は、電極アセンブリー１２と波形発生器１５との間を連結する。
【００７７】
電極アセンブリー１２は、電極配列の形態であってよく、これは電極上に予め負荷された巨大分子を有する使い捨ての１回使用の電極配列の形態であり得る。この点に関して、予め負荷された電極配列は、滅菌包装物として提供されうる。このような電極配列の使用に際して、滅菌包装物が開封され、該電極配列が電極配列ホルダに装着される。電極アセンブリーホルダは、ヒトにより把持され、電極アセンブリーが患者の皮膚に押しつけられ、そして電極アセンブリーは該電極アセンブリーが表皮角質層に進入するように患者の皮膚中に圧入される。好ましくは、電極アセンブリーの電極先端は、表皮の樹状細胞であるランゲルハンス細胞の領域に位置する。
【００７８】
次いで、パルス波形が、波形発生器から電極アセンブリーホルダを介して電極アセンブリーに送られる。パルス波形は、予め負荷された巨大分子を電極アセンブリーから表皮内に搬送する。表皮内において、パルス波形は、巨大分子が標的細胞にはいるように標的表皮細胞を電気的浸透化させる。
【００７９】
図２に示されるように、電極アセンブリー１２は、非導電性電極担体１４及び該電極担体１４に保持される複数の個別の針状電極１６を有する。電極１６の活性領域２９は、電極表面の小文字の“ｘ”１８として示される巨大分子により被覆されている。パルス波形の影響下で巨大分子１８のいくらかが電気泳動的電圧により電極１６から運び出され、表皮２０に入り、電気穿孔電圧によって樹状ランゲルハンス細胞２２及び表皮２０内の基底膜２５上の生きている表皮中の生きている上皮細胞２３に送達される。
【００８０】
波形発生器１５は、プロトコールにあったパルスを生成する。波形発生器の出力は、電圧、パルス幅、パルス間隔、パルス数、及びパルスの方向量等のパルスパラメタの単一選択に関して常套のものである。別法として、波形発生器の出力は、パルスからパルスへの任意のパラメタ（電圧、パルス幅、パルス間隔、パルス数）を変化させる能力についてプログラム可能であり得る。可変的出力は、巨大分子の細胞内への電場媒介的な送達に要求される電場よりむしろ、異なる電場が、電極１６からの巨大分子の移動のために要求されることから、至適性能のために必要とされる。適当なプログラム可能なパルス発生器は、Cyto Pulse Sciences, Inc., 私書箱６０９、コロンビア、ＭＤ２１０４５により製造されるパルスエイジル（PulseAgile）（米国特許商標局に登録）、モデルＰＡ−４０００電気穿孔システムである。モデルＰＡ−４０００は、種々の強度（電圧）、幅及び間隔の矩形波を送り出す。
【００８１】
パルスからパルスへの電圧、パルス幅、パルス間隔及びパルス数のプログラム可能な制御に加え、他の２種のパラメタのプログラム制御が望まれる。一つは、加えられる電場の方向又はベクトルの制御である。他方は、電極選択の制御である。一つの応用において、電場の方向は、巨大分子のよりよい分布を保証するために反転されうる。他の応用において、電極配列のそれぞれの組が、順次選択されうる。
【００８２】
電極選択及び電場方向選択のための適当な装置は、上記ＰＡ−４０００電気穿孔システムの選択的要素であるプラグラム化パルススイッチである。
【００８３】
電極アセンブリー１２は、２種類の機能を提供する。それは巨大分子を所望の部位に送達し、また電場を組織に送達する。該電極アセンブリー１２は、
１．非導電性電極担体１４．
２．電極担体１４上に組み立てられた針状の電極１６の配列。
３．波形発生器１５に電気的に結合するための、電極アセンブリーホルダ１３上のホルダ伝導体に電気的に結合する電極−アセンブリー−導電性ストリップ２６からなる。
【００８４】
本発明方法の実施において、針状電極１６の先端が、図２に示されるように針の角質層２７の穿孔ならびに表皮２０及び上皮３１への到達を伴って、患者の表皮２０に押し付けられる。
【００８５】
図４、５及び６を参照すると、針の配列は、導電性であるＮ個の列からなる。列中の各針状電極１６は、その列中の他の全ての針と電気的に結合している。これらの列は、電気的パルスにより：
１．独立して、
２．対を形成して、
３．全ての列が同時に、一つの列が陽極、次の列が陰極、その次の列が陽極等になるよう活性化する、
等の何れかにより運用される。
【００８６】
表皮２０内のランゲルハンス細胞２２への電場媒介巨大分子送達（ＤＮＡトランスフェクション及びタンパク質送達について）に要する電極アセンブリー（配列）は、以下の仕様を有する：
１．導電性の列内の各針状電極が、一緒に電気的に結合される配列当たりの複数の導電性列。
２．隣接する列は、互いに電気的に分離される。
３．導電性列当たりに２００〜１００の針状電極。
４．針の長さは、処置される領域の表皮の厚さに適合するよう選択される。
５．電極針の絶縁される列間の距離は、負荷される電圧及び侵入される組織の電気力学的性質に従って選択される。
６．最も近接する電気的に結合された電極針の間隔は、組織損傷を最小化し、かつ電場を最大化すべく選択される。
７．電極は、個々に、又は列でもって、又は列の群を以ての何れかにて電気的に指定される。
【００８７】
電極針は、多くの形態を有しうる。針状電極の形態の例は：円筒状針、平型針、円錐型針、刀身型針である。針は、尖った、丸い又は鈍いものでありうる。これらの型のそれぞれは、電極列当たりに単一又は複数であり得る。
【００８８】
電極アセンブリーホルダの目的は、波形発生器及び電極アセンブリー間の電気的結合を確立し、また電極アセンブリーが患者に適用される際に該電極アセンブリーに対して支持を与えることである。それは、患者への適用のための機械的接触を与える。それは、また電極アセンブリーの滅菌状態を維持しつつ、電極アセンブリーの患者組織への送達手段も与える。
【００８９】
電極アセンブリーは、以下の任意的な特徴を有しうる。それは、電極アセンブリーの組織への適切な圧力を与える手段を有しうる。それは、適切な適用圧力、進行中の電気的送達及び電気的送達の完了を示す表示器を有しうる。それは、パルスプロトコール開始のためのスイッチを有しうる。それは、適切な圧力が電極アセンブリーホルダに加わった際に、自動的にパルスプロトコールを開始する手段を有しうる。
【００９０】
上述したように、ＤＮＡ及びタンパク質巨大分子を含む巨大分子は、電気泳動電圧により被覆電極から運び去られる必要があり、これによりそれらは組織内の標的生物学的細胞中に巨大分子を送達ための電気穿孔パルスの適用に先行して、組織の細胞外空間を通して動きうる。
【００９１】
上述したように、巨大分子は最初は電極１６の外部表面に結合されている。電極１６を巨大分子１８にて被覆するための機械的方法において、比較的高濃度の巨大分子１８が溶媒又は液体担体に溶解又は懸濁される。次いで電極１６が、該溶液又は懸濁物に浸漬される。次いで、溶媒又は液体担体を蒸発させ、電極１６錠に巨大分子１８の固体被覆を残す。別法として、電極１６は噴霧により被覆される。電極被覆のための他の機械的手段も可能である。
【００９２】
ＤＮＡ等の巨大分子は、多くの表面に対して良好な効率を以て結合する。材料の物理的及び化学的性質が、電極表面への結合を向上するために使用されうる。
【００９３】
巨大分子は、それぞれ異なった結合力を有する種々の分子間相互作用により互いに結合する傾向がある。これらの同じ力は、溶液中の分子間に加えて、個待機室と溶解性分子との間にも作用する。分子間相互作用は：
１．溶媒和：  溶媒の結合。分子成分と溶媒分子との間の相互作用。
２．疎水性相互作用：  溶媒との相互作用不能であることの結果としての溶質−溶質相互作用；回避的相互作用。
３．ファンデルワールス力は、全ての分子間に存在する弱い引力である。それは短距離である場合にのみ有効で、相補的形状に基づく相互作用の場合により強くなりうる。
４．水素結合は、水素と窒素及び酸素等の他の分子の間に形成される結合である。
５．イオン結合は、分子の反対電荷部分の引力に基づく引力である。
６．共有結合は、分子的結合の最も強いものである。
【００９４】
ＤＮＡに関してより特定的には、ＤＮＡは、水に対する溶解性に乏しく、かつ電荷を有する。ヌクレオチド中の有機環は、ＤＮＡに疎水性を与える。ＤＮＡポリマー中のリン酸分子は、正味の負の電荷を与える。
【００９５】
電極表面とＤＮＡとの間の最も強い結合は、疎水性結合である。電極が正の電荷を有する場合に、ＤＮＡは電極に向けて移動し、これによってＤＮＡと導電性疎水性表面との相互作用が増強される。送達のためには、電荷が逆転されるであろう。電極表面からの移動は、同様な電荷の斥力が、疎水性及び他の分子相互作用の力を越えると直ちに起こる。
【００９６】
ＤＮＡは、ＤＮＡを金属（電極表面等）又は他の導電性材料に正電荷の使用により結合することによって、特定の部位に被覆されうる。続いて、ＤＮＡを電極表面から持ち去り、また引き続きＤＮＡを生物学的細胞に送達するために、負の電荷が同じ表面に負荷される。負に荷電するＤＮＡは、正電極に向けて電場を移動するであろう。この現象は、電気泳動と称される。正電極がほとんどの金属がそうであるように疎水性であると、正電荷及び疎水性相互作用が共に作用して、ＤＮＡを表面に保持する。
【００９７】
ほとんどの巨大分子は、その等電点以外のｐＨにおいて、溶液中で正味の電荷を有する。例えば、ＤＮＡは、生理学的ｐＨにおいては負に荷電する。このことは、ＤＮＡ分子が正電極に向けて移動するであろうことを意味する。この性質は、巨大分子を、結合が前掲の他の分子的相互作用を介して起こる電極との接触をもたらすために使用される。例えば、ＤＮＡは、その疎水性故に結合しうる。
【００９８】
電気的被覆は、巨大分子の電荷を利用する。上述したようにＤＮＡは負に荷電し、従って正に荷電する電極に移動する。一つの被覆工程における電極１６の被覆に使用される装置を例示する図９を参照すると、ＤＮＡは緩衝溶液に添加され、次いで陽極として機能する電極と共にチェンバー内に置かれる。好ましくは、この電極は陽極の金属がＤＮＡに接触することを妨げるべく、ゲル接触面によって緩衝溶液から分離される。電極装置は、液体中に挿入され、電極装置に正の電荷が負荷され、ＤＮＡを電極装置表面に引き寄せる。該ＤＮＡは疎水性又は他の相互作用により、逆電荷にて反発されるまで電極装置表面に結合する。ＤＮＡは、糖類等の保護剤を伴い、又は伴わずに、また他の担体分子を伴い、又は伴わずに該装置状にて乾燥される。処置材料の標的細胞への取込を促進する物質を、電極上の被覆に添加することもできる。
【００９９】
電極アセンブリー状の巨大分子の量は、応用に依存して変化する。例えばＤＮＡ免疫のためには、電極アセンブリーには０．０１〜１００マイクログラムのプラスミドＤＮＡが負荷される。
【０１００】
滅菌的材料及び滅菌的局所環境が、巨大分子を用いる電極アセンブリーの製造において使用されうる。別法として、アセンブリーは、製造後に滅菌されうる。
【０１０１】
発明の方法及び装置を使用して、巨大分子１８を患者に投与する工程の一連の順序は、以下のように記述される。診療室において、波形発生器１５が、電極アセンブリーホルダ１３に接続される。個々の適用について、所望の巨大分子が負荷された電極１６の電極アセンブリー１２が選択される。次いで、電極アセンブリー１２が電極アセンブリーホルダ１３に機械的に接続される。電極アセンブリーホルダ１３が施術者により把持され、電極１６が患者の組織（典型的には皮膚）に押し付けられる。電極１６が表皮２０に進入し、実質的に基底膜層のみに到達する。電極１６が表皮２０内にこのように位置した後、巨大分子送達工程が開始され、選択された電場パターンが始まる。送達工程が完了した後に、電極１６は表皮２０から取り除かれ、電極アセンブリー１２が廃棄される。
【０１０２】
上述したように、電気的プロトコールは、巨大分子を電極から組織内に運び出し、続いて巨大分子が組織内細胞へ送達されるべく設計される。ＤＮＡについては、電気的パルスの典型的順序は以下の通りである。最初に一連の低電圧（電気泳動）パルスが電極１６に付加されてＤＮＡが全ての負に荷電した電極から取り出される。典型的には電極の交互の列が負に荷電する。次いで、より高電圧の電気穿孔パルスが電極１６に付加され、ＤＮＡが細胞内に運ばれる。次いで、電極の極性が逆転され、逆の極性を持った低電圧パルスが残る電極からＤＮＡを運び出す。次いで高電圧電気穿孔パルスが付加されて、ＤＮＡを細胞内に押し進める。
【０１０３】
この巨大分子送達システムの重要な用途は、巨大分子を皮膚に送達することである。この用途のために、電極針の長さは、電極の基底部及び基部膜（基底膜）への侵入を許容するように選択される。真皮への僅かな侵入も起こってよい。患者腕部へのこの用途のために、１３０ミクロンの電極長が選択される。この深度は、表皮細胞の処置を可能とする。ＤＮＡワクチン又は遺伝子治療のために、この送達法によりトランスフェクトされる細胞は、樹状細胞（皮膚ランゲルハンス細胞２２）及び上皮細胞である。
【０１０４】
巨大分子の表皮内の生物学的細胞への投与とは別に、発明の方法及び装置は、手術中の組織及び植物等の他の生物学的環境においても使用されうる。
【０１０５】
広範囲にわたる方法が、発明の電極アセンブリー１２の製造に使用されうる。多くの実施例が以下に示される。
【０１０６】
標準的マイクロチップ製造方法が、本発明に従って非導電性の支持体上に導電性微小針を作製するために適用されうる。一つの例において、シリコン又は他の非導電性層、及び金属層からなる未加工品が使用される。マスクは、列内よりも列の間においてより腐食を促すように設計され、列の間の非導電性空間を持った電極の導電性の列を生じる。
【０１０７】
電極アセンブリーの構築の他の方法は、押出し微小製造の既知技術の適用によるものであり、例は以下の通りである。電極材料及び隣接する絶縁材料は、セラミック、金属又は他の粉末を、熱可塑性結合剤と混合することにより調製される。個々の成分は、合わせられ、互いに結合するように熱加圧される。得られたロッドは、その大きさが減少するように押し出される。押し出しに続き、新たなロッドが複数の押し出し棒からなるロッドとして合わされる。この新たなロッドは、再度押し出されて複数ロッドの大きさが、最初の押し出しロッドの大きさまで減少される。大きさが所望の大きさまで減少された後に、この部品は結合剤を除去すべく加熱されうる。第２に、金属及びセラミック粉末を合わせて焼結するためにより高温度が使用される。該ロッドは、焼結の前又は後にディスク状に切断される。差動的砂粒吹き付け又は他の機械的もしくは化学的技術が、絶縁材の表面に針を立てるために使用されうる。製造のための他の方法は、導電性及び非導電性層からなるサンドイッチから、物質を除去するレーザーミル技術の使用であろう。
【０１０８】
電極配列の幾つかについて、電極間の距離は、機械的な組立のために十分に大きい。そのようなアセンブリーの例は以下のようである。所望の金属組成及び直径のワイヤーが、アセンブリのために巻き枠上に配置される。ワイヤーが、正しく離間する用にワイヤーを配列する装置に供給される。セラミック又はプラスチック材料が、流通システムに注入され、これは電極間の隙間の完全な充填を生じ、また電極の外部枠の形を形成する。プラスチック又はセラミックは、固化され、円盤状に切断される。得られたディスクは、より軟質のマトリクスを利用して、差動的に浸食される。浸食は、機械的方法、化学的方法又はそれらの組み合わせを使用して行われうる。表面浸食は、支持マトリクスから上方に突出する所望の長さの針を残す。
【０１０９】
他の製造技術は以下のように記述される。３０ｍｍの長さ及び１２０ミクロンの直径を有するステンレス鋼の針を得る。一つの供給元は、鍼術供給会社である。Ｓｅｉｒｉｎ  Ｎｏ．０２針が例である。針は、ハンドルが存在する場合には切り取る。針の数は、装置の各列について選択される。この例では列当たりに３５本の針が使用される。針は、針先端部が整列するように注意深く並べられる。この工程は、注意を要し、他方の顕微鏡スライドグラスの先端に９０℃の角度で接着された顕微鏡スライドグラスにより作製されるジグが、整列を補助する道具となる。該スライドは、顕微鏡にて整列を検査するためにも使用される。針の列（針の群）は、５０ミクロン厚のテープによりとめられる。２又はそれ以上の針の束が、各束の先端を次の束に整列させて電極列を形成するように積み重ねられる。針は、ワイヤーに銀ロウ付けされ、交互の針の束が電気的に接続される。全体の支持構造は、針の束の電極列を支持するように与えられる。
【０１１０】
本発明が、瘢痕を生じる皮膚の損傷の原因とならない細胞への巨大分子の送達のための方法及び装置を提供することにより、与えられた目的の全てを遂行することは、上記から明らかである。発明により、巨大分子を細胞に送達するための方法及び装置が提供され、これは処置される細胞内に弾道粒子の残留物を残さない。発明により、巨大分子を基底層に近い表皮内の生物学的細胞に送達するための電気穿孔法は、処置分子を経皮的に透過させない。発明により、細胞への巨大分子の送達方法及び装置は皮下的な針を使用しない。発明により、電気穿孔工程が患者に行われる際に、電極に流れ落ちる液体媒体を使用しない細胞への巨大分子の送達方法及び装置が提供される。
【０１１１】
発明により、液体を患者に注射するための加圧液体注射工程を使用しない細胞への巨大分子の送達方法及び装置が提供される。発明により、比較的に低い電圧が、電気穿孔法を受ける細胞に付加される。発明により、細胞に付加されるパルスは、所望により電気穿孔法を受ける細胞に対して、比較的短いパルス幅を有しうる。発明により、所望により電極の基部及び先端部が非導電性である電極を採用しうる細胞への巨大分子の送達方法及び装置が提供される。発明により、細胞への巨大分子の送達方法及び装置は、使い捨て電極アセンブリーを備える。発明により、電極アセンブリーが滅菌包装中に包装される、細胞への巨大分子の送達方法及び装置が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、本発明の全体的な装置の模式的な例示である。
【図２】  図２は、表皮層に浸透し、表皮細胞内に巨大分子を送達するパルス波形によって駆逐される本発明の予めコートされた電極の模式的な例示である。
【図３】  図３は、電極のチップ部分の模式的な例示である。
【図４】  図４は、電極アッセンブリーの側面図である。
【図５】  図５は、図４に示す電極アッセンブリーの底面図である。
【図６】  図６は、電極の交互に反復する列の交互の極性を例示する図５に示す電極アッセンブリーの側面図である。
【図７】  図７は、電極の交互に反復する列を連結する交互伝導体を示す図４の電極アッセンブリーの上面図である。
【図８】  図８は、滅菌パッケージ中にカッケージした電極アッセンブリーを模式的に示す図である。
【図９】  図９は、電極を巨大分子でコートするために使用される装置を模式的に示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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