(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標本中の標的核酸分子の検出方法において、
ａ）  リポータ遺伝子及びそのインビトロでの発現に必要な配列による、前記物質の特異的標識化段階、
ｂ）  前記リポータ遺伝子の無細胞系内でのインビトロ転写及び翻訳段階、
ｃ）  前記リポータ遺伝子によってコードされたリポータタンパク質のインビトロ検出段階、
を含んで成り、且つ段階ｂ）において、リポータ遺伝子の転写及び翻訳が、前記標的核酸分子の配列によってコードされたタンパク質と融合されたリポータタンパク質を導かないことを特徴とする方法。
【請求項２】
標本中の標的核酸分子の検出方法において、
ａ）  リポータ遺伝子及びそのインビトロでの発現に必要な配列による、前記物質の特異的標識化段階、
ｂ）  前記リポータ遺伝子の無細胞系内でのインビトロ転写及び翻訳段階、
ｃ）  前記リポータ遺伝子によってコードされたリポータタンパク質のインビトロ検出段階、
を含んで成り、且つ段階（ｃ）において、リポータタンパク質のインビトロ検出が、前記標的核酸分子の配列によってコードされたタンパク質を介入させないことを特徴とする方法。
【請求項３】
段階（ａ）において、標的核酸分子が、リポータ遺伝子及びインビトロでの該リポータ遺伝子の発現に必要な配列に対し、標的核酸分子の特異的リガンドを介して会合されており、前記リガンドが、リポータ遺伝子によって、及びインビトロでの該リポータ遺伝子の発現に必要な配列によって標識化されることを特徴とする請求項１または２に記載の標的核酸分子の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、標的物質特に核配列、ただしより一般的にはあらゆるタイプの物質の、標本中におけるin vitro検出方法に関する。
【０００２】
標的物質特に核酸配列の探求は、数多くの活動分野そして主として医学又は農産物加工分野に携わる数多くの研究所における主たる目的である。これらの分野では、標的物質の探求は、例えば以下のことを目的としている：
【０００３】
−  エイズ（ＨＩＶ）又はＢ型肝炎（ＨＢＶ）といったような疾病の原因となるウイルスの診断、
−  結核又はハンセン病といったような細菌を原因とする疾病の特異的診断、
−  遺伝病又は細胞ガンの原因である突然変異の診断、
−  農産物加工ライン内の細菌汚染の診断、
−  工業的方法内で利用される配管又はコンテナの生物学的腐食に関与する微生物の研究。
【０００４】
先行技術で利用されてきた診断方法の主たる問題点は、利用される検出用試験の特異性、感度、迅速性及び再現性にある。これらの問題点は一般に、利用される標識づけの性質に由来する。実際、１つの物質の標識づけの性質は、前記物質を追跡するか又は数量化することを可能にするあらゆるその後の検出の決め手である。それが、人間、動物又は植物のいずれの診断であろうと、又農産物加工、治療、薬学、研究、さまざまな工業的方法などのいずれに関するものであろうと、単数又は複数の標的物質を特異的に追跡し数量化することが必要である。この検出を最適なものとするためには、高性能でかつ高感度の標識づけ技術を利用できることが必要である。
【０００５】
核酸の特異的標識づけ技術の１つは、ＰＣＲによる増幅を利用する。ＰＣＲにおいて利用可能なプライマの標識づけは２つの方法つまり、プライマの好ましくはその５’未満による標識づけ又は増幅されたフラグメントの内部標識づけによって行なうことができる。
【０００６】
第１のタイプの標識づけは、低い比活性を示すという欠点をもち、従ってその後の顕示感度を制限する。プライマの５’に放射性リン酸塩（32Ｐ）を固定することが可能である。１つのプライマにつき１つの（32Ｐ）が得られることになる。ビオチン又は螢光色素を固定する場合、プライマ分子１つあたり最大３〜４個のマーカーを得ることが可能である。
【０００７】
放射性ヌクレオチドがアンプリコンの中に取込まれた場合、確かに比活性はより大きくなるが、放射性をさらに一層操作しなければならない。現在の傾向は、等方性標識づけ方法を低温標識づけ（螢光体、ジゴキシゲニン、ビオチン）で置換することである。
【０００８】
螢光体は、環境の変化に敏感である。すなわち、実験条件の変動（ｐＨ、酸化元素の存在など）が発生波長を変位させる可能性がある。その上、螢光の消衰（つまり消光）現象は十二分に記述されてきた。螢光体又はジゴキシゲニン又はビオチンにより標識づけされたヌクレオチドをポリメラーゼにより取込むことは、これらのヌクレオチドがＰＣＲによる重合反応を妨げる高い立体障害を呈することを理由にして、ほとんど効果がない。
【０００９】
タンパク質の放射性標識づけは、同位元素により標識づけされたアミノ酸を利用することによって行なうことができ、これには放射能の操作が関与している。抗原抗体反応によるタンパク質の標識づけは、それ自体充分な感度をもたない可能性がある。
【００１０】
本発明の目的はまさに、上述の欠点を示さない、感度の高い標的物質の検出方法を提供することにある。
【００１１】
この目的は、標本中の標的物質の検出方法において、
ａ）  リポータ遺伝子及びそのin vitroでの発現に必要な配列による、前記物質の特異的標識づけ段階、
ｂ）  前記リポータ遺伝子のin vitro転写及び翻訳段階、
ｃ）  前記リポータ遺伝子によってコードされたリポータタンパク質のin vitro検出段階、
を含んで成ることを特徴とする方法によって達成される。
【００１２】
従って、本発明の方法は、in vitroで発現可能なリポータ遺伝子を構成するＤＮＡ分子を標的物質に会合させることから成る標識づけに基づいている。従って、該標識づけは、標的物質に対し、その発現に必要な配列の制御下に置かれたリポータ遺伝子を会合させることから成る。
【００１３】
本発明の枠内で利用され得るin vitroでの転写プロモータは、特にファージプロモータＴ７、ＳＰ６、Ｑβ又はλに対応する可能性がある。
【００１４】
段階（ｂ）において、標的物質を特異的に顕示するような形でリポータ遺伝子によりコードされたタンパク質が得られる。
【００１５】
本発明の方法の対象となっている標識づけの顕示は、転写（段階ｂ）、翻訳（段階ｂ）及び検出（段階ｃ）の段階の際に増幅段階を利用することから、感度の高いものである。この増幅は、例えば、転写については５００という係数に対応する（Pokrovkaya et Gurevich, Analytical Biochemistry ２２０、４２０−４２３（１９９４）。
【００１６】
本発明の方法は、段階（ｃ）におけるタンパク質の検出試験によっても同様に特異的である。
【００１７】
さらに、本発明の方法は、転写段階の後、３ＳＲ、NASBA (Nucleic Acid Sequence-based Amplification(核酸配列に基づく増幅))、 TMA (Transcription Mediated Amplification(転写媒介増幅)) といったような当業者にとっては既知のあらゆる技術により写しの増幅段階を経由することができる。
【００１８】
標的物質が核酸分子に対応する場合には、顕示シグナルの増幅は、本発明の方法の段階（ａ）の際に開始することができる。１つの配列を特異的に増幅し、in vitroで発現されうるリポータ遺伝子を特異的オリゴヌクレオチド配列の存在と結びつけるような形で、特定のプローブ又はプライマのセットが利用される。リポータ遺伝子は、標的遺伝子が存在し増幅される場合にのみ発現される。上述のように、リポータ遺伝子又は標的遺伝子の増幅というのは、ＰＣＲ（polymerase chain reaction(ポリメラーゼ連鎖反応)）、 NASBA (nucleic acid sequence-based amplificaton (核酸配列に基づく増幅) )、 SDA (strand displacement amplification(ストランド変位増幅))、 bDNA (branched DNA signal amplification（有枝DNAシグナル増幅）)、 ローリングイサイクル、ＰＣＲから誘導された技術（nested PCR, multiplex PCR）によるものといったタイプの反応のことを意味する。
【００１９】
本発明の方法は、全ての反応がin vitroで実施されることから迅速かつ再現性あるものであり、そのため検出を標準化することが可能となる。
【００２０】
本発明の方法は、あらゆるタイプの物質に応用できるという点で注目に値するものである。ただし、本発明は、抗体、抗体フラグメント、ヌクレオチドフラグメント、遺伝子、細胞レセプタ、ペプチド、タンパク質、アミノ酸、グリコペプチド、糖、多糖類などといったような、化学的及び生物学的物質に対しさらに特定的に応用される。特定の１利用分野においては、標的物質はリポータ遺伝子自体であってもよい。
【００２１】
標識づけされた標的物質というのは、in vitroで発現されうるリポータ遺伝子に直接的又は間接的に会合したあらゆる物質を意味する。
【００２２】
リポータ遺伝子は、その発現の調節配列の存在下で、in vitro転写及び翻訳され得る遺伝子である。リポータ遺伝子がコードするタンパク質は、段階（ｃ）で、当業者にとって既知のあらゆる技術により検出され得る。一例を挙げると、リポータ遺伝子は、ＧＦＰ（Green Fluorescent Protein（緑色蛍光タンパク質）)タンパク質の遺伝子又はべータラクタマーゼ（ＴＥＭ−１）の遺伝子であり得る。ＧＦＰの場合、測定されるのは螢光の発出である。ベータラクタマーゼの場合、ニトロセフィンを含有する緩衝液中での翻訳反応の分画をインキュベートすることにより測定されるのは、この酵素の活性である。ニトロセフィンは、ベータラクタマーゼにより加水分解された時点で黄色から赤色に変色するという物性をもつ色素産生ベータラクタミンである。本発明の方法においては、ベータガラクトシダーゼ、ベータ−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ又はミクロペルオキシダーゼなどといったようなその他の全てのリポータ遺伝子を考慮することができる。
【００２３】
リポータ遺伝子は有利にも、１つの酵素についてコードする。本発明の方法の段階（ａ）における標的物質の標識づけの特異性は、当業者にとって既知のあらゆる直接的又は間接的方法によって実現することができる。
【００２４】
直接的方法というのは、標的物質が遺伝子及びin vitroでの前記リポータ遺伝子の発現に必要な要素に直接会合されていることを意味している。例えば、標的物質が、リポータ遺伝子及びin vitroでのその発現に必要な配列を同様に含む組換え型核酸分子の中に含まれた核配列であるような、組換え型核酸分子についての以下で記述するケースのことである。
【００２５】
間接的方法というのは、標的物質の特異的リガンドを介して、リポータ遺伝子及びin vitroでのその発現に必要な配列に対して標的物質が会合されていることを意味している。このリガンドは、リポータ遺伝子及びin vitroでのその発現に必要な要素に会合されている。従って、標的物質の特異的標識づけを実現することを可能にするのは、標的物質とこのリガンドの接触である。例えば、抗原から成る標的物質を特異的に認識する能力をもつ、リポータ遺伝子及びin vitroでのその発現に必要な配列によって標識づけされた抗体のことである。標的物質／リガンド対というのは、例えば、抗原／抗体、核配列／核配列、プローブ、レセプタ／レセプタのリガンドなどを意味する。
【００２６】
間接的実施形態においては、本発明の方法は、段階（ａ）において、標的物質を含有する可能性のある標本をこの標的物質の特異的リガンドと接触させることから成り、ここで前記リガンドは、リポータ遺伝子及びin vitroでのこのリポータ遺伝子の発現に必要な配列により標識づけされている。該方法の後続部分には、前述のものと同様、段階（ｂ）及び（ｃ）が含まれる。
【００２７】
標的物質の特異的リガンドの標識づけは、前述のものと同様に直接的又は間接的標識づけでありうる。
【００２８】
本発明の間接的方法に従うと、１つのタンパク質に対応する標的物質に対するリポータ遺伝子の会合は、複数の実施形態を認めている。実際、リポータ遺伝子及びin vitroでその発現に必要な配列から成る核酸分子の１つのタンパク質上での固定は、以下のような結合化合物を利用した当業者にとって既知の技術により実現可能である。
【００２９】
−  ストレプトアビジン／ビオチン（Kipriyanov et al.,（１９９５），Kum Antibodies Hybridomas ６（３）、９３−１０１）．
【００３０】
−  ポリリシンに対応するペプチド（Avrameas et al.,（１９９８）．PNAS ９５（１０）、５６０１−６；Curiel et al.,（１９９２）．Hum Gene Ther ３（２）、１４７−５４；Wu et al.,（１９９１）、J Biol Chem ２６６（２２）、１４３３８−４２；Kwoh et al., (１９９９）．Biochim Biophys Acta １４４４（２）、１７１−９０、Wu et al.,（１９９４）．J Biol Chem ２６９（１５）、１１５４２−６．
【００３１】
−  ｐ−アジド−テトラフルオロ−ベンジル（Ciolina et al.,（１９９９）．Bioconjug Chem １０（１）、４９−５５）．
【００３２】
−  ３重ＤＮＡらせん（Neves et al.,（１９９９）．FEBS Lett ４５３（１−２）、４１−５）。
【００３３】
直接標識づけによる本発明の方法は、以下で紹介する複数の実施形態をとる。
【００３４】
本発明の方法が実施される標本は、人間、動物、植物、環境からのあらゆる採取物又は、そのin vitroでの発現のための全ての情報を有するリポータ遺伝子により標識づけされ得るあらゆる材料であってよい。
【００３５】
本発明の方法の好ましい１つの実施形態は、有利には直接的方法による標的核配列の検出に関する。
【００３６】
従って、以下の記述は、１つの標本中の核配列のin vitro検出方法に関する。この方法は、以下の段階を含んで成る：
【００３７】
ａ）  ５’から３’に向かう方向で、ＲＮＡポリメラーゼプロモータ、その発現に必要な配列を有するリポータ遺伝子そして場合によってはＲＮＡポリメラーゼターミネータを含む組換え型核酸分子を標本から調製する段階であって、標的核酸配列がこれらの要素のうちのいずれか２つの間に局在化されている段階、
ｂ）  段階（ａ）で得た増幅産物の転写及び翻訳段階、
ｃ）  適切なあらゆる手段により、段階ｂ）で得たリポータ分子と呼ばれるリポータ遺伝子によりコードされたタンパク質の活性を顕示する段階。
【００３８】
直接的標識づけによる核酸配列に対応する標的物質の特異的検出の異なる特定の実施形態が、以下で引用されている。
【００３９】
本発明の方法は、遺伝子、遺伝子分画又はその他のあらゆる核酸フラグメントに対応しうる標的配列の検出に適合される。
【００４０】
本発明の方法は、分析すべき標本中で標的配列を特異的に検出しその後この標的配列について直接作業を進めることができるという利点を提供する。
【００４１】
本発明の方法は同様に、それが特に、in vitroで識別可能な活性をもたないペプチド又はタンパク質についてコードする標的核酸配列の検出に適しているという点においても注目に値する。
【００４２】
本発明の方法の第１の好ましい実施形態に従うと、段階（ａ）の核酸分子の調製は、標的核酸配列のin vitro増幅により実施される。
【００４３】
これは、ＰＣＲ又は、ＰＴ−ＰＣＲ、nested ＰＣＲ、multiplex ＰＣＲタイプのＰＣＲから誘導された技術又はＰＣＲとは異なる技術すなわちＮＡＳＢＡ（nucleic acid sequence-based amplification(核酸配列に基づく増幅))又はローリングサークルその他の技術による振幅であり得る。
【００４４】
以下「汎用」と呼ばれる本発明の方法の実施形態においては、方法の第１段階（ａ）は、当然のことながら、標的配列が分析対象の標本中に存在する場合に、以下で定義するセンス及びアンチセンスと呼ばれる２つのプライマを用いて標的配列の増幅反応を実施することに基づいている：
−  標的配列の５’領域に相同な少なくとも１つの部分を含むセンスプライマ、
−  標的配列の３’領域に相同な少なくとも１つの部分を含むアンチセンスプライマ。
【００４５】
なお、前記プライマ標的核酸配列の増幅後及び段階（ｂ）の後にリポータ遺伝子の発現を可能にする。
【００４６】
従って、本発明は同様に、
−  標的配列の領域５’に相同な部分を少なくとも１つ含むセンスプライマ、
−  標的配列の領域３’に相同な部分を少なくとも１つ含むアンチセンスプライマ、
を含んで成り、前記プライマが標的核酸配列の増幅後及び段階（ｂ）の後に、リポータ遺伝子の発現を可能にすることを特徴とする、本発明に従った方法の段階（ａ）で利用することのできるプライマセットにも関する。
【００４７】
本発明の汎用方法の特定の第１の実施形態においては、段階（ａ）は以下の３つの反応を含んでいる。
【００４８】
ａ')  そのセンスプライマがポリメラーゼＲＮＡプロモータを有し、そのアンチセンスプライマがリポータ遺伝子の配列の初めに相同な５’領域を有する一対のプライマを用いた標的配列の増幅反応、及び
【００４９】
ａ'') 増幅産物とリポータ遺伝子をハイブリッド形成させるような形で、その転写のためのＲＮＡポリメラーゼターミネータ、その翻訳のためのリボゾーム固定部位を場合によって有するリポータ遺伝子と前記反応の増幅産物を接触させる反応、次に、
【００５０】
ａ''')  そのセンスプライマが段階（ａ')のものと類似しておりアンチセンスプライマがリポータ遺伝子の下流側の１つの領域と相同な部分を含む一対のプライマを用いた段階（ａ''）の産物の増幅反応。
【００５１】
この実施形態では、ＰＣＲ反応混合物は、標本ＤＮＡ、２つのセンス及びアンチセンスプライマ、リポータ配列及びリポータ遺伝子の下流側の領域に相同な第３のプライマを含有する。段階（ａ'）の第１の増幅及び段階（ａ'''）の第２の増幅は、同時にでも同時にでなくても実施可能である。
【００５２】
添付図１ａに示されているように、反応ＰＣＲ１の第１サイクルは、標的配列の増幅を可能にする。この配列が反応培地内で充分な量でひとたび存在したならば、この配列はメガプライマとして役立ち、リポータ配列上でハイブリッド形成し、このときこの配列は第３のプライマにより増幅される。
【００５３】
本発明の汎用方法の第２の実施形態においては、段階（ａ）は、以下の２つの反応を含む（図１ｂ）：
ａ')  そのセンスプライマがポリメラーゼＲＮＡプロモータを有し、そのアンチセンスプライマがリポータ遺伝子の配列の初めに相同な５’領域を有する一対のプライマを用いた標的配列の増幅反応、及び
ａ'') そのセンスプライマが段階（ａ')のものと同一でありアンチセンスプライマが、場合によってその転写のためのＲＮＡポリメラーゼターミネータ、その翻訳のためのリボソームの固定部位を有するリポータ遺伝子から成るメガプライマである一対のプライマを用いた段階（ａ')の産物の増幅反応。
【００５４】
この実施形態においては、アンチセンスプライマは、それ自体前述のものと同様自らの翻訳のための全ての情報を有するリポータ配列の最初と相同な５’領域を有する、添付の図１ｂに示されているように、ＰＣＲ反応混合物は、標本ＤＮＡ、２つのセンスプライマ及びアンチセンスプライマ及びリポータ配列に対応するメガプライマを含有する。アンチセンスプライマは、センスプライマよりも少ない量で存在する。ＰＣＲ１反応の第１のサイクルは、標的配列の増幅を可能にする。この配列がひとたび反応培地内に充分な量で存在するようになった時点で、この配列は、ＰＣＲ１のセンスプライマ及びメガプライマを用いて増幅される（ＰＣＲ２）。
【００５５】
本発明の汎用方法の第３の実施形態においては（図１ｃ）、段階（ａ）には、そのセンスプライマがＲＮＡポリメラーゼプライマを有し、そのアンチセンスプライマがリボソーム固定部位についてコードする配列、リポータ遺伝子及び場合によって転写ターミネータを含む５’領域を有する一対のプライマを用いた、標的配列の増幅反応が含まれる。
【００５６】
添付の図１ｃに表わされているこの実施形態においては、アンチセンスプライマは、リボソームの固定部位、リポータ遺伝子及び場合によっては転写ターミネータについてコードする配列に対応する５’領域及び標的配列に特異的な３’領域を有する。ＰＣＲ反応混合物は、標本ＤＮＡ、２つのセンスプライマ及びアンチセンスプライマを含有する。
【００５７】
本発明は同様に、上述の実施形態を実施するための増幅による標識づけ用混合物にも関する。かかる混合物は、増幅サイクルの実施に必要な試薬、従ってより特定的には４つの三リン酸デオキシヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼの最適な活性を保証する塩及び試薬、ならびに上述のさまざまなタイプのプライマを含む。
【００５８】
本発明に従った汎用方法の第１の実施形態の段階（ａ）の実施形態に特に適合された増幅による標識づけ用混合物には、以下のものが含まれている：
【００５９】
−  そのセンスプライマがＲＮＡポリメラーゼプロモータを有しそのアンチセンスプライマがリポータ遺伝子の配列の始めに相同な５’領域を有するプライマ対、
−  その転写のためのＲＮＡポリメラーゼターミネータ及びその翻訳のためのリボソーム固定部位を場合によって有するリポータ遺伝子、及び
−  リポータ遺伝子の下流側の１つの領域に相同な第３のプライマ。
【００６０】
本発明に従った汎用方法の第２の実施形態の段階（ａ）の実施形態に特に適合された増幅による標識づけ用混合物には、以下のものが含まれている：
【００６１】
−  そのセンスプライマがＲＮＡポリメラーゼプロモータを有しそのアンチセンスプライマがリポータ遺伝子の配列の始めに相同な５’領域を有するプライマ対、及び
−  その転写のためのＲＮＡポリメラーゼターミネータ及びその翻訳のためのリボソーム固定部位を場合によって有するリポータ遺伝子から成るメガプライマ。
【００６２】
本発明に従った汎用方法の第３の実施形態の段階（ａ）の実施形態に特に適合された増幅による標識づけ用混合物には、そのセンスプライマがＲＮＡポリメラーゼプロモータを有しそのアンチセンスプライマがリボソームの固定部位、リポータ遺伝子及び場合によって転写ターミネータについてコードする配列を含む５’領域を有するプライマ対が含まれている。
【００６３】
従って、本発明は同様に、上述の汎用方法に従って標本中の標的核酸配列の検出のためのキットをも目的としている。
【００６４】
本発明に従った標本中の標的核酸配列の検出のためのキットには、上述のプライマセット、増幅に必要な混合物、三リン酸ヌクレオチド、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、翻訳細胞抽出物、リポータ分子の転写、翻訳そして場合によっては顕示に必要な混合物、そして場合によってはリポータ分子の活性を顕示することを可能にする単数又は複数の物質が含まれている。
【００６５】
本発明に従ったキットの特定の１例には、さらに、上述の増幅混合物のうちの１つ、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、三リン酸ヌクレオチド及び三リン酸デオキシヌクレオチド、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、翻訳細胞抽出物、リポータ分子の増幅、転写、翻訳、場合によっては顕示に必要な混合物、そして場合によってはリポータ分子の活性を顕示することを可能にする単数又は複数の物質が含まれる。
【００６６】
本発明の方法は、段階（ａ）のレベルで、同様に「パドロック（１、２、３、４、ＷＯ９７/１９１９３）と呼ばれるプローブの特性に基づいて実施することもできる。この実施形態は、特に、点突然変異を有する標的配列の検出に特に適合されている。
【００６７】
従って、「パドロック」プローブを利用した標的配列の検出は、汎用方法と呼ばれる本発明の方法について以上で記述された実施形態に対する１つの変形形態を構成する。
【００６８】
本発明は従って、同様に、標本中に標的配列が存在する場合、段階（ａ）の核酸分子の調製が、その標的配列とパドロックタイプのプローブのハイブリダイゼーションと連結によって実施されることを特徴とする標本中の標的核酸配列のin vitro検出方法にも関する。
【００６９】
前記プローブは、３’及び５’において、in vitroでのその翻訳のためのリボソームの固定部位の相補的配列及びその転写のためのＲＮＡポリメラーゼのプロモータ及び場合によってはターミネータの相補的配列を有するリポータ遺伝子の相補的配列によって分離されたセグメントによって構成されており、パドロックプローブの前記セグメント３’及び５’の配列は、求められる標的配列と接合的ハイブリッドを形成するような形でこの標的配列と相補的であり、プローブの５’末端は、リガーゼの作用下でのプローブの環状化を可能にするような形でリン酸塩基を有している。好ましくは、ニックシーリングリガーゼが利用されることになる。かくして、標的配列が存在しない場合、プローブは環状化され得ない。
【００７０】
前記プローブは同様に、５’及び３’において、場合によってＲＮＡポリメラーゼターミネータを伴うリポータ遺伝子の配列、リボソームの固定部位及びＲＮＡポリメラーゼプロモータの配列によって５’から３’で分離されたセグメントで構成されていてよい。
【００７１】
パドロックプローブのセグメント３’及び５’は、従って、添付の図２ａに示されているように、求められる標的配列上に相補的かつ接合的な形でハイブリッド形成するように定義されている。
【００７２】
従って、本発明は同様に、そのセグメント３’及び５’が、標的配列上で相補的にかつ接合的にハイブリッド形成するように定義されていることを特徴とする、上述の方法において利用可能であるパドロックプローブにも関する。
【００７３】
前述のように、パドロックプローブの使用に基づく本発明の方法は、突然変異をもつ標的核酸配列のin vitro検出のために有利に利用することができる。この場合、段階（ａ）の核酸分子の調製は、標的配列が存在する場合この標的配列とパドロックタイプのプローブのハイブリダイゼーションによって実施され、このプローブは、パドロックプローブの前記セグメント３’及び５’の配列が、それらが標的配列上にハイブリッド形成された時点で、突然変異を受ける可能性のあるクリティカルヌクレオチドがその接合点にくるような１つのハイブリッドを共に形成するような形で探求対象の標的配列と相補的であるということを特徴としながら、前述の２つのプローブのうちの１つに対応している。
【００７４】
かくして、本発明が、図２ｂに示されているように、標的配列のレベルでの突然変異の存在の証明に応用される場合、「パドロック」プローブのセグメント３’及び５’は、突然変異を受ける可能性のあるクリティカルヌクレオチドが、その標的配列上でハイブリッド形成された時点でその接合点にくるような形で定義される。誤対合の場合、リガーゼは２つの末端をリンクさせることができず、プローブの環状化は発生し得ない。
【００７５】
従って、本発明は、パドロックプローブの前記セグメント３’及び５’の配列が、それらの標的配列上にハイブリッド形成された時点でそのヌクレオチドがその接合点にくるような１つのハイブリッドを共に形成するような形で突然変異を受けることができる１つのヌクレオチドを支持する標的配列と相補的であることを特徴とする、上述の方法において利用可能であるパドロックプローブにも関する。
【００７６】
有利には、パドロックプローブの利用に基づく本発明の方法においては、環状化の後、プローブは、そのローリングサークル型複製のための鋳型として利用される。ローリングサークル型複製は、in vitroでのその発現のために必要な全てのシグナルと共にリポータ遺伝子の連鎖を有するＤＮＡ鋳型を産生するような形で、ＤＮＡポリメラーゼによる複製を開始するため、パッドロックプローブに相補的なプライマを用いて実施される（すなわち５’から３’で次の要素（ＰＮＡポリメラーゼプロモータ、リボソーム固定部位、リポータ遺伝子及び場合によってはＲＮＡポリメラーゼターミネータ）の反復）か又は、選択されたプローブに従ったこの配列の補体そして次にはこのＤＮＡ鋳型の相補的ストランドは、この鋳型を２本鎖にするような形で第２のオリゴヌクレオチドプライマから合成される。
【００７７】
この調製段階は、唯一の標的分子から数多くのコピーが産生されることから、検出の感度を増大している。
【００７８】
パドロックプローブに基づく本発明の方法のきわめて特定的な一実施形態は、
段階（ｂ）でその環状化の後のパドロックプローブ上のリポータ遺伝子の転写及び標的の相補的パドロックプローブに相補的なプライマを用いた相補的ストランドの合成を直接実施することから成る。
【００７９】
この実施形態には、核酸配列の検出か又は核酸配列上の突然変異の検出を可能にする前述のものに対応するパドロックプローブの、段階（ａ）における調製が含まれる。このパドロックプローブは、このパドロックプローブが標的核配列上でのそのハイブリダイゼーションの後に予め環状化されていた場合にのみＲＮＡポリメラーゼによるリポータ遺伝子の直接的転写が発生しうるような形で作り上げられる。この場合、ローリングサークルによる増幅は無く、標的の相補的パドロックプローブに対し相補的なプライマを用いたパドロックプローブの相補的ストランド合成、そして場合によってＲＮＡポリメラーゼによるパドロックプローブのリポータ遺伝子の連結とそれに続く直接的転写のみが存在する。
【００８０】
本発明は同様に、パドロックプローブを利用する本発明の方法の実施用キットにも関する。
【００８１】
かかるキットは、上述のとおりのプローブ、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ニックシーリングリガーゼ、三リン酸ヌクレオチド及び三リン酸デオキシヌクレオチド、複製を開始するためのプライマ、第２のＤＮＡストランドの合成を可能にするプライマ、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、リポータ分子の連結、複製、転写、翻訳及び顕示に必要な混合物を含んで成ることを特徴とする。
【００８２】
本発明に従ったキットの第１の例には、さらに特定的に以下のものが含まれている：
【００８３】
−  上述のパドロックタイプの２つのプローブのうちの１つ。パドロックプローブの前記セグメント３’及び５’の配列は、共に接合ハイブリッドを形成するような形で、探求対象の標的配列と相補的であり、プローブの５’末端はリガーゼの作用下でプローブの環状化を可能にするような形でリン酸塩基を有している。
【００８４】
−  ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ニックシーリングリガーゼ、三リン酸ヌクレオチド及び三リン酸デオキシヌクレオチド、ローリングサークル型複製を開始するためのプライマ、ローリングサークルによって生成されたＤＮＡ鋳型の第２のＤＮＡストランドの合成を可能にするプライマ、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、リポータ分子の連結、標識づけ、複製、転写、翻訳及び顕示に必要な混合物。
【００８５】
本発明に従ったキットの第２の例には、さらに特定的に以下のものが含まれている：
【００８６】
−  上述のパドロックタイプの２つのプローブのうちの１つ。パドロックプローブの前記セグメント３’及び５’の配列は、それらが標的配列上でハイブリッド形成された時点で突然変異を受ける可能性のあるクリティカルヌクレオチドがそれらの接合点にくるようなハイブリッドを共に形成するような形で、探求対象の標的配列と相補的であり、プローブの５’末端はリガーゼの作用下でプローブの環状化を可能にするような形でリン酸塩基を有している。
【００８７】
−  ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ニックシーリングリガーゼ、三リン酸デオキシヌクレオチド、三リン酸ヌクレオチド、ローリングサークル型複製を開始するためのプライマ、ローリングサークルによって生成されたＤＮＡ鋳型の第２のＤＮＡストランドの合成を可能にするプライマ、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、リポータ分子の連結、標識づけ、複製、転写、翻訳及び顕示に必要な混合物。
【００８８】
パドロックプローブを用いる上述の本発明のきわめて特定的な方法の実施のための第３のタイプのキットは、以下のものを含んで成る：
【００８９】
−  核酸配列の検出又は核酸配列上の突然変異の検出を可能にする上述のパドロックタイプのプローブのうちの１つ、
−  ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、リガーゼ、三リン酸デオキシヌクレオチド、三リン酸ヌクレオチド、環状化されたパドロックプローブの相補的ストランドを合成するためのプライマ、リポータ分子の連結、標識づけ、ＤＮＡ複製、転写、翻訳及び場合によっては顕示に必要な混合物、そして場合によってはリポータ分子の活性を顕示できるようにする単数又は複数の物質。
【００９０】
本発明の方法は、同様に、ＰＣＴ国際特許出願第ＷＯ９６/０１３２７号の中で記述されたタイプの「Continuous Isothermic Amplification(連続等温増幅）」略してＣＩＡとも呼ばれる等温増幅の枠内でも実施可能である。
【００９１】
本発明の方法のこの実施形態においては、探求対象の標的核酸配列は段階（ａ）で、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ及び、適切な温度で「ヘヤピン」構造と呼ばれる構造を形成するため逆方向反復配列を少なくとも１つ有する５’部分及び標的配列に特異的にハイブリッド形成できる３’部分で構成されているものを少なくとも１つ含む標的配列に特異的な２つのプライマを用いた特異的等温増幅によって、核酸標本から分離される。ヘヤピン状２本鎖構造の融合温度は、好ましくは標的配列と特異的にハイブリッド形成するプライマの一部分の融合温度以下である。これら２つの融合温度の差は、例えば１０℃でなる。その上、一方のプライマは、ファージＴ７のＲＮＡポリメラーゼプロモータのように、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの転写プロモータの配列を支持しており、もう１方のプライマは、リボソームの固定部位を５’に有するリポータ遺伝子を支持している。
【００９２】
本発明のこの実施形態においては、特に、リポータ遺伝子として、ミクロペルオキシダーゼについてコードする遺伝子を挙げることができる。有利な１実施形態に従うと、２つのプライマは、適切な温度でヘヤピン構造と呼ばれる構造を形成するため逆方向反復配列を有する。この２つのプライマの逆方向反復配列は同一であっても異なっていてもよい。相互のハイブリダイゼーションを避けるような形で、それらが異なるものであることが好ましい。
【００９３】
等温増幅に基づく本発明の方法の概略的表示は、添付図３に示されている。本発明の方法のこの実施形態において利用可能な異なるプライマ対としては、より特定的には、Ａと呼ばれる以下のような好ましいプライマ対を挙げることができる：
【００９４】
−  ５’から３’で、ＲＮＡポリメラーゼプロモータの逆方向相補的配列、このＲＮＡポリメラーゼプロモータの配列及び標的配列の上流側でハイブリッド形成する能力をもつ特異的配列で構成されたセンスプライマ、
【００９５】
−  ５’から３’で、リボソーム固定部位、リポータ遺伝子、前記リポータ遺伝子及び前記リボソーム固定部位の逆方向相補的配列、及び標的配列の下流側でハイブリッド形成する能力をもつ特異的配列で構成されたアンチセンスプライマ。ここで、上記プライマのうちの少なくとも１つは場合によって１つの制限部位を含んでいる。
【００９６】
本発明は同様に、上述の方法において利用される可能性のあるプライマセットにおいて、
−  標的配列の領域５’に相同な部分を少なくとも１つ含むセンスプライマ、
−  標的配列の領域３’に相同な部分を少なくとも１つ含むアンチセンスプライマ、
を少なくとも含んで成り、前記プライマが標的核酸配列の増幅後及び段階（ｂ）の後に、リポータ遺伝子の発現を可能にし、前記プライマの少なくとも１つが５’に逆方向反復配列を有することを特徴とするプライマセットにも関する。
【００９７】
等温増幅は、以下のような反応培地内で行なわれる：
−  標的配列を有する鋳型核酸分子、
−  ４つの三リン酸デオキシヌクレオチド、
−  ＤＮＡポリメラーゼの最適な活性を確保する塩及び試薬、
−  ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、
−  増幅すべき標的配列に特異的でかつ上述の逆方向反復配列を含むプライマ対。
【００９８】
ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、熱安定性であっても中温性であってもよい。有利には、例えば、E.coliのポリメラーゼＩＤＮＡのクレノウフラグメントといったように、ストランド変位活性の備わった中温性ＤＮＡポリメラーゼが利用される。このＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの添加は、反応の初めと、等温増幅の実施に先立つＤＮＡの変性に必要な最初の２つの加熱段階の後に行なわれる。
【００９９】
本発明の方法の段階（ａ）は、ＤＮＡストランドを分離するような形で上述の反応混合物を加熱し、次にプライマのハイブリダイゼーションを可能にするため冷却し、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長のため適切な温度に放置することから成る。これらの加熱、ハイブリダイゼーション及び伸長段階は、逆方向反復配列で構成された末端をもつ１本鎖標的配列を得る前に、２回目に反復される。この組換え型核酸分子は、その各々の末端においてヘヤピン構造のおかげで鋳型とプライマの両方の役目を提供する。
【０１００】
ＰＣＲで知られていることとは対照的に、増幅は、ここでは自然発生的に一定の温度で推移する。温度は、以下のことを可能にするように選択される：
−  線形形状とヘヤピン形状の間の逆方向反復配列の平衡、
−  ＤＮＡポリメラーゼによるプライマの伸長。
【０１０１】
添付の図３に示されているように、増幅産物は急速に大きなサイズに達し、そのため伸長が制限される可能性がある。増幅されたフラグメントのサイズを定義づけるプライマは、リポータ遺伝子に会合した標的配列の増幅を最適化するために選択される。
【０１０２】
本発明に従った等温増幅段階（ａ）の好ましい推移は、以下の通りである：
【０１０３】
ｉ）  場合によって標的配列が存在する核酸標本、４つの三リン酸デオキシヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼの最適な活性を確保する塩及び試薬、好熱性である場合にはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（そうでなければiii)、逆方向反復配列を含む増幅すべき標的配列の特異的プライマ対を含む反応混合物を、ＤＮＡストランドを分離させるような形で加熱する段階、次に、
【０１０４】
ii）  プライマのハイブリダイゼーションを可能にするために冷却する段階、そして
【０１０５】
iii)  中温性である場合にＤＮＡポリメラーゼを添加する、
【０１０６】
iv）  ＤＮＡポリメラーゼによる伸長のため適切な温度に反応混合物を置く、
【０１０７】
ｖ）  逆方向反復配列で構成された端部をもつ標的配列を得るべく、加熱段階（ｉ）、ハイブリダイゼーション段階（ii）、中温性である場合のＤＮＡポリメラーゼ添加段階及び伸長段階（iv）を２度目に反復する、
【０１０８】
vi）  −  直線形状とヘヤピン形状の間の逆方向反復配列の平衡、
−  ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによるプライマの伸長、
を可能にするような形で選択された温度で、先行段階の産物を鋳型及びプライマとして用いて増幅反応を実施させる。
【０１０９】
その上増幅産物は、制限酵素より、段階（ａ）のリポータ遺伝子に会合した標的配列の増幅反応の間又はその後に特異的に切断され得る。制限部位は好ましくは、プライマのうちの１つのレベル、そしてより好ましくはヘヤピンループ内、さらに厳密に言うと１つのプライマの２つの逆方向反復配列の中にある。
【０１１０】
プライマ及び酵素の切断部位の選択は、この切断がリポータ遺伝子のその後の転写を改変しないような形で、リポータ遺伝子の効果的な転写のために定義されることになる。
【０１１１】
上述の好ましいプライマ対Ａの場合、切断部位は、２つのプライマ上にあってよく、このとき各プライマ上で同一であっても異なるものであってもよい。
【０１１２】
従って、本発明は同様に、２つのプライマのうちの少なくとも１つが１つの制限部位を有することを特徴とする、前述の方法において利用することのできる上述のとおりのプライマセットをも目的としている。両方が制限部位を有する場合、それらは同一であっても異なっていてもよい。
【０１１３】
好ましくは、少なくとも１つのプライマ上に存在する制限部位は、ヘヤピンのループ内、より精確には１つのプライマの２つの逆方向反復配列の間に位置づけされている。
【０１１４】
本発明は同様に、４つの三リン酸デオキシヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼの最適な活性を確保する塩及び試薬、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、増幅すべき標的配列に特異的で５’にはリポータ配列を含有する逆方向反復配列を含むプライマ対を含んで成る、上述の等温増幅方法の実施のための反応混合物にも関する。
【０１１５】
本発明はさらに、上述のとおりのプライマセット、増幅反応混合物、場合によっては単数又は複数の制限酵素、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼリポータ分子の転写、翻訳及び顕示に必要な混合物を含んで成る、ＤＮＡ標本中の標的配列の検出方法の実施用のキットにも関する。
【０１１６】
標的物質が標的核酸配列である上述のキットの特定的な例以外に、本発明は、標的物質の如何に関わらず、少なくとも１つのリポータ遺伝子、リポータ遺伝子によりコードされたタンパク質の転写、翻訳及び顕示に必要な混合物の含むことを特徴とする、本発明の方法の実施用キットに関する。
【０１１７】
本発明の方法に従った複数の検出を唯一の管内で組合わせることも可能である。この場合、異なるリポータが、各標的物質を検出するために利用される。
【０１１８】
さらに、複数の標的物質のために同じリポータを利用することも可能である。このとき、陽性の結果は、標的物質の一方又は他方の存在のみを表わす。
【０１１９】
転写及び翻訳反応（段階ｂ）は、全く異なる又は同時の２つの段階に分解することができる。この後者のケースでは、転写及び翻訳反応は、同時に実施することができる。反対に段階を分解することにより、各段階の収量をより容易に最適化し、かくしてリポータタンパク質をより大量に産生することが可能となり、これは、比活性の低い酵素の場合にきわめて有用である。
【０１２０】
転写と翻訳の切り離しにより、ヌクレアーゼがＰＣＲによって調製されたものである場合に、それによるＤＮＡ鋳型の分解の問題も回避することが可能となる。実際、転写反応の構成成分は、翻訳抽出物とは対照的に、ヌクレアーゼによる汚染をほとんど受けていない。
【０１２１】
さらに、リポータ遺伝子の起源に応じて異なる翻訳細胞抽出物を利用することにより、翻訳を最適化することができる。実際、段階（ｂ）の写しの翻訳段階は、有利には、リポータ遺伝子と同じ起源又は近い起源の細胞抽出物を用いて実施される。一例としては、真核性リポータ遺伝子の翻訳のための、真核細胞から調製された翻訳抽出物の利用を挙げることができる。もう１つの図のケースでは、翻訳抽出物は、同じ生体又は同じタイプのもう１つの好極限生体（好熱性、好塩性、好酸性など）のリポータ遺伝子の翻訳のために、１つの好極限生体から調製される。
【０１２２】
これらの特異的抽出物は、翻訳の効率を改善することを可能にする。しかしながら、翻訳は、同様に、例えば E.coli の抽出物といったような標準抽出物を用いて実現することができる。
【０１２３】
このとき、本発明の方法は、利用される翻訳抽出物と写しの発現の区切りの間の適合を使用するという点で注目に値する。これらの抽出物は、同様に、探求対象の特性を含んでいないか、又はそれを含んでいるもののそれが探求対象の機能を検出するために実施されたテスト条件下では検出できないものであることをも特徴としている。ここで問題となっているのは、例えば、好熱性ベータガラクトシダーゼのｍＲＮＡを翻訳できるようにする中温性ベータガラクトシダーゼ活性を含む翻訳抽出物の利用、及び、中温性ベータガラクトシダーゼ活性を除去することになる、この好熱性ベータガラクトシダーゼの活性の高温での検出である。
【０１２４】
本発明の方法の特定の１つの実施は、実際には複数の翻訳抽出物の混合物であるような１つの翻訳抽出物を段階（ｂ）で利用することから成る。これは、例えば、シャペロンタンパク質Ｂを過剰発現するE.coliの翻訳抽出物と混合されたシャペロンタンパク質Ａを過剰発現するE.coliの翻訳抽出物のことでありうる。それが上述の特徴に対応するかぎり、あらゆるタイプの混合物を考慮することができる。同様にして、単数又は複数のコドンの単数又は複数の特異的ｔＲＮＡが中に再添加される翻訳抽出物を利用することが可能である。このように得られた翻訳抽出物はこのとき、例えば、翻訳抽出物の中にサプレッサｔＲＮＡを再添加することによるアンバーコドンを含むｍＲＮＡの翻訳といったように、これらの特異的コドンを含むｍＲＮＡを翻訳することを可能にする。
【０１２５】
翻訳抽出物を用いた段階（ｂ）の処理は同様に、例えばE.coli抽出物及び／又は前述のもの（ｔＲＮＡ、シャペロン‥）のように有利な分子により補足された又はされないその他全ての細胞抽出物（単複）のようにその標本起源の如何に関わらず標準翻訳抽出物を用いても実施することができる。
【０１２６】
同様に、段階（ｂ）の翻訳抽出物に対して、例えば、シャペロン、洗浄剤、スルフォベタイン、膜抽出物といったような、発現されたタンパク質のより効果的な折畳み又は突然変異に有利に作用する単数又は複数の物質を添加することも可能である。
【０１２７】
段階（ｃ）の１つの特定の実施形態に従うと、「リポータ分子」とも呼ばれるリポータ遺伝子によりコードされたタンパク質の活性の顕示は、その活性を顕示する能力をもつ単数又は複数の基質とリポータ分子を接触させることによって行なわれる。
【０１２８】
リポータ遺伝子によりコードされたタンパク質の活性の存在を実証するために、当業者であれば、あらゆるタイプの特異的基質を考慮することができる。当業者であれば、例えば、多数の酵素秤量及び基質調製方法が記述されてきたMethods In Enzymology 又は Annual Review of Biochemistryといったような文献を参照することができるだろう。
【０１２９】
段階（ｃ）のタンパク質の活性測定値は、リポータが例えばリポータ遺伝子Ｐである場合には螢光光度法読取り装置で、又、リポータが例えばベータラクタマーゼである場合には、比色法測定装置で、直接読取ることができる。読取り装置は、リポータの顕示に適合させられる。同時に、吸光度、粘度、質量分光光度法などによる測定も考慮することができる。リポータがそれに適している場合には、リポータの活性の連続的読取りを実施することも完全に考慮可能である。
【０１３０】
本発明の方法の１つの特定の応用形態は、例えば、１つの生体に対し又は１つのプロセス内でリポータ遺伝子及びその発現に必要な配列により標識づけされた標的物質を投与すること、その後、前記生体上で採取した標本中で又は前記プロセス中で、前記リポータ遺伝子によりコードされたタンパク質を、本発明の方法の段階（ｃ）に至るまでの本発明の段階の続行によって探求することから成る。
【０１３１】
本発明の方法は、有利には、特に分析すべき標本の数が多い場合に自動化することができる。標的物質を含有する標本は、このとき、数十乃至数千の場所を含みうるマイクロタイトレーション用プレート又はバイオチップに対応しうる支持体上に置かれる。これらの支持体は、
−  標的物質の調製（段階ａ）、
−  転写及び翻訳試薬の添加（段階ｂ）、リポータ分子の顕示（段階ｃ）、
のためにオートマトン上に設置される。
【０１３２】
従って、本発明は、前述の方法の各段階を実施するための単数又は複数の支持体、ロボット及びこれらの支持体の読取り装置の配置を含む装置に関する。
【０１３３】
本発明は同様に、上述の本発明の方法の段階（ａ）に対応する物質の標識づけ方法にも関する。従って、本発明は、リポータ遺伝子によって標識づけされた物質及びこの標識づけ方法により得られる可能性のある前記リポータ遺伝子のin vitro発現に必要な要素にも関する。
【０１３４】
本発明は、最終的に、標的物質のマーカーとしての、リポータ遺伝子及びこのリポータ遺伝子のin vitro発現に必要な要素の利用にも関する。
【０１３５】
本発明のその他の利点及び特徴は、以下の発明の実施例から明らかになることだろう。
【０１３６】
例Ｉ：ＰＣＲによる標識づけと検出
１）  ミクロペルオキシダーゼ８（ＭＰ８）についてコードする遺伝子を、発現ベクターｐＥＴ２６ｂ＋内でクローニングした。
【０１３７】
そのためには、部分的に相補的である２つのオリゴヌクレオチド ＭＩＣＲＯ１及びＭＩＣＲＯ２をハイブリッド形成させて、それぞれ遺伝子のＡＴＧの側の制限部位ＮdeＩ及びもう１方の末端にある部位ＸhoＩと適合性ある突出末端をもつ２本鎖ＤＮＡフラグメントを産生した。このＤＮＡフラグメントを、ＮdeＩ及びＸhoＩによって消化されたベクターｐＥＴ２６ｂ＋の中に挿入した。かくして、得られたプラスミドは、ＲＮＡポリメラーゼＴ７のプロモータ及び両側にあるそのターミネータの制御下でＭＰ８についてコードする遺伝子を含有する。
【０１３８】
【表１】
0004580104.tif 000002
−  ２本鎖ＤＮＡフラグメント：
【０１３９】
【表２】
0004580104.tif 000003
【０１４０】
２）  このプラスミドは次に、以下のＰＣＲの際に鋳型として役立つ：
プラスミド：  約１００ｎｇ
プライマｐＥＴ５’：  １０pmol
プライマｐＥＴ３’：  １０pmol
Taqpol（Appligene)：  ２Ｕ
ＤＮＴＰ：  各２００μＭ
Taqpol Appligeneミックス：  １Ｘ
【０１４１】
【表３】
0004580104.tif 000004
【０１４２】
実施された増幅サイクルは、以下の通りである：  ９４°で３分、（９４°で３０秒、６０°で３０秒、７２°で１分）を３０回、７２°で３分。
【０１４３】
このＰＣＲは、５’から３’で、ＲＮＡポリメラーゼＴ７のプロモータ、リボソームの固定部位、ＭＰ８遺伝子及びＲＮＡポリメラーゼＴ７の転写ターミネータを含むフラグメントを増幅することができる。ＰＣＲ産物を、クロロホルムフェノール抽出によって精製し、エタノールで沈降させた。
【０１４４】
３）  ＰＣＲ反応の産物を以下の条件下で転写させた：
ＰＣＲ産物：  １００μｇ
ＲＮＡポリメラーゼＴ７（ＮＥＢ）：  ３００Ｕ
ＲＮＡポリメラーゼＴ７ミックス（ＮＥＢ）：  １Ｘ
ＭｇＣｌ２：  ２０ｍＭ
ＤＴＴ：  ２０ｍＭ
ＮＴＰ：  各２ｍＭ
３７°で３時間
【０１４５】
４）  翻訳を０、２.７５及び１１μｇのＲＮＡから出発して、以下の条件下で実施した：
翻訳抽出物  ４３．８μｌ
ＲＮＡ      ０、２.７５及び１１μｇ（ＲＮＡ  ０、２.７５、１１μｇ）
水          ６０μｌ十分量
３７°で３時間
【０１４６】
５）  ミクロ酵素の活性秤量は、Hirayama et al., によって記述された以下のプロトコルに従って実施した。２つの標準スケールを実現した；  すなわち、そのうちの１つは１０μｌの翻訳を秤量する点について１０μｌの対照翻訳（ＲＮＡ無し）の存在下で実現された。得られた結果は下表１中に、ルミネセンス単位の表現で報告されている。
【０１４７】
【表４】
0004580104.tif 000005
【０１４８】
得られた標準スケールは、２.７５μｇの翻訳により０.１４ｎｇで産生されたＭＰ８の量を推定することを可能にし、このＰＣＲ産物が本発明の目的である方法によって立証できることを実証している。
【０１４９】
例II：パドロック及びローリングサークルによるＤＮＡ標的の検出
１）  以下のオリゴヌクレオチドを調製した：
【０１５０】
【表５】
0004580104.tif 000006
【０１５１】
２）  標的として利用されるプラスミドは、以下の配列を含有する：
【０１５２】
【表６】
0004580104.tif 000007
【０１５３】
この配列は、以上のパドロックプローブによって認識される。
【０１５４】
３）  連結反応は、以下のように実現された：
線状化された標的プラスミド：  ２μｇ
Ampligase ミックス(Epicentre)；  １Ｘ
アンプリガーゼ；  １０Ｕ
オリゴパドロック；  ０.２ｐmol
水；  ５０μｌ十分量
次に、以下の温度サイクルを実施した；  ９４°で３分、（９４°で１０秒、５５°で１０秒、６５°で１分３０秒）を３０回。
【０１５５】
４）  ローリングサークル増幅は、以下のプロトコルに従って行なわれた；
連結反応： １０μｌ
オリゴＰＡＤＲＣＭＰ８； １０ｐmol
ｄＮＴＰ； ３８４μＭ
クレノウポリメラーゼ； ５Ｕ
水； ２５μｌ十分量
３７°で２時間
オリゴヌクレオチド ＰＡＤＲＣＭＰ８は次のような配列をもつ；
【０１５６】
【表７】
0004580104.tif 000008
【０１５７】
これは、パドロックプローブの一部分と相補的であり、従ってローリングサークルに対するプライマとして役立つ。
【０１５８】
５）  相補的ストランドの合成
５０ｐmol のオリゴヌクレオチドＰＡＤＰＣＲ５’を５ｎmol のｄＮＴＰと共に再添加した。このオリゴヌクレオチドは、ローリングサークルにより増幅されたストランドと相補的である。反応混合物を１００℃で５分間加熱し、次に、ローリングサークル上でのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを可能にするため冷却させた。
【０１５９】
５ＵのクレノウＤＮＡポリメラーゼと５Ｕの制限酵素ＡseＩを次に再添加した。３７℃で２時間インキュベートした後、２本鎖ＤＮＡ分子が得られた。ＡseＩ部位がプロモータ配列のすぐ上流側に存在することから、ＡseＩによる切断は、多量体の短縮とを可能にし、かくして転写に有利に作用することになる。
【０１６０】
オリゴヌクレオチドＰＡＤＰＣＲ５’は、以下の配列を有する：
【０１６１】
【表８】
0004580104.tif 000009
【０１６２】
６）  転写
増幅産物の転写は、以下の条件下で実施された：
以上の反応の産物；  １０μｌ
ＲＮＡポリメラーゼＴ７（ＮＥＢ）；  １５０Ｕ
ＲＮＡポリメラーゼＴ７ミックス（ＮＥＢ）；  １Ｘ
ＭｇＣｌ２；  ２０ml
ＤＴＴ；  ２０ｍＭ
ＮＴＰ；  各２０ｍＭ
３７°で１２時間
【０１６３】
７）  翻訳：  翻訳を、以上の例で記述した通りに実施した。
【０１６４】
８）  秤量：  ミクロ酵素の活性の秤量を、Hirayama et al. により記述された以下のプロトコルに従って１０μｌの翻訳について実施した（Hirayama 0 et al.,１９９７，Analytical Biochem. ２４７，ｐ２３７〜２４１）：負の対照は、標的プラスミドが段階３において水と置換された完全実験である。翻訳及び秤量を、異なる反応ミックスを用いて２回行なった。
【０１６５】
得られた結果は、ルミネセンス単位の表現で下表２に報告されている。
【０１６６】
【表９】
0004580104.tif 000010
【０１６７】
参考文献
１）  Landegren, U., Samiotaki, M., Nilsson, M., Malmgren, H. et Kwiatkowski, M.（１９９６）．リガーゼを用いた遺伝子検出。METHODS ：酵素学的方法の手引き ９，８４−９０．
【０１６８】
２）  Landegren, U. et Nilsson M.（１９９７）．標的追跡：未来の遺伝子診断に向けての戦略Ann. Med, ２９，５８５−５９０．
【０１６９】
３）  Nilsson M., Malmgren, H., Samiotaki, kwiatkowski, M., Chowdhary, B. P. et Landegren, U（１９９４）．パドロックプローブ：  局在化したＤＮＡ検出のためのオリゴヌクレオチドの環状化。Science ２６５，２０８５−２０８８。
【０１７０】
４）  Nilsson M., Krejc, K., Koch, J., Kwiatkowski, M., Gustavsson, P.et Landegren, U.（１９９７），パドロックプローブが、単一ヌクレオチドの差異、起始原種及びヒト染色体１３及び２１内の動原体配列のインサイチュ分布を顕示する。Nature Genetics １６，２５２−２５５。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明の汎用方法の実施形態における反応段階を示す説明図である。
【図２】  求められる標的配列上に相補的かつ接合的な形でハイブリッド形成するように定義されているパドロックプローブのセグメントを示す説明図である。
【図３】  等温増幅に基づく本発明の方法を概略的に表示する説明図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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