(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドである開始酵素を改変した酵素であって、該開始酵素に挿入される少なくとも一つのアミノ酸及び該開始酵素のアミノ酸の少なくとも一つの置換を含む少なくとも１つのミモトープを有する改変した酵素を含む、キメラ酵素であって、
該キメラ酵素は開始酵素の酵素活性を有しており、該キメラ酵素の活性は、結合分子がミモトープへ結合すると調節され、
該開始酵素は、下記に示すβ−ラクタマーゼのアミノ酸配列を含み、
該ミモトープの少なくとも１つは、該β−ラクタマーゼ配列のT271、M272、R275又はそれらの複数の位置で挿入されている、キメラ酵素。
0004416185.tif 000023
【請求項２】
前記結合分子が抗体であることを特徴とする請求項１のキメラ酵素。
【請求項３】
前記ミモトープが、前記β−ラクタマーゼ配列のV103、E104、Y105又はそれらの複数の位置で挿入されていることを特徴とする請求項１のキメラ酵素。
【請求項４】
前記ミモトープがランダムペプチド配列であることを特徴とする請求項１のキメラ酵素。
【請求項５】
前記キメラ酵素は、クローンpsa19Aj302、クローンpsa19Rb404、クローンP10L4-01、クローンp661L3-01、クローンp66L4-01、クローンP66L4-03、クローンp66L4-05、クローンp66L4-06、クローンp19L3-01、クローンp19L4-01、クローンp19L4-04、クローンp19L4-05、クローンp66RB330、クローンp66RB316、クローンp66RB318、又はクローンp66RB319によってコードされる、キメラβ−ラクタマーゼである、請求項１に記載のキメラ酵素。
【請求項６】
請求項１、２、３、４又は５のキメラ酵素をコードする配列を含む単離された核酸。
【請求項７】
以下のステップを含む、テストサンプル中の分析対象物の存在又は量を測定する方法：請求項１、２、３、４又は５のキメラ酵素を（１）テストサンプル、（２）キメラ酵素のミモトープに結合する結合分子、及び（３）キメラ酵素が触媒的に作用する基質と接触させて反応混合物を形成させ；そしてキメラ酵素によって行われた基質の触媒作用の量を検出する（ただし結合分子はキメラ酵素による触媒作用を調節する）。
【請求項８】
前記分析対象物が結合分子への結合をキメラ酵素と競合することを特徴とする請求項７の方法。
【請求項９】
前記分析対象物が前立腺に特異的な抗原であることを特徴とする請求項７の方法。
【請求項１０】
前記結合分子が前記分析対象物であることを特徴とする請求項７の方法。
【発明の詳細な説明】
関連出願の参照
本出願は１９９６年１１月２７日に出願されたシリアルＮｏ．０８／７５７４２５の部分係属出願である。
発明の背景
所望の物質の存在及び量を測定するアッセイの開発は医学、獣医学研究、及び環境的利用を含む様々な目的のために極めて求められている。所望の物質によって調節可能な活性を有する分子を設計し単離することが更に求められている。これらの調節可能な分子は直接的又は間接的に（例えば競合によって）分子の活性を調節する分析対象物（analyte）の能力を利用して所望の分析対象物の量及び存在を検出するのに有用である。
発明の説明
本発明は結合分子によって調節することができる活性を有するキメラ標的分子に関する。本発明はキメラ標的分子を利用してサンプル中の所望の分析対象物の存在及び／又は量を検出する方法にも関する。分析対象物は結合分子、又は結合分子のリガンドであり、その結合分子は標的分子に結合すると標的分子の活性を検出可能な様式で変更させる。本発明の一つの側面では結合分子はキメラ分子に結合してそれを不活性化させる。テストサンプル中の分析対象物は結合分子と競合し及び／又は結合分子をキメラ分子から置換し、それを再活性化させる。分析対象物の存在下での活性の再出現はテストサンプル中のその存在及び量を示す。本発明の他の側面はキメラ標的分子を調節する結合分子及びその製造方法に関する。
本発明によれば所望の標的分子（ＴＭ）は結合分子（ＢＭ）が付着することができる少なくとも一つの結合部位成分（ＢＳＭ）を持つように改変されることができる。ＢＭがＢＳＭへ付着すると、ＴＭに関連する活性は検出可能な様式で（例えばＴＭの活性の増大又は減少）変更される。かくしてＢＳＭはＢＭの結合に応答して所望のＴＭの活性を（全体的又は部分的に）切り換える調節スイッチとして作用することができる。ＢＳＭは結合分子の結合が標的分子の活性化を調節するように選択されることもできる。本発明によればミモトープ（mimotope）は好ましいＢＳＭである。ＢＳＭは配列の挿入によって、分子中に存在する配列を新しい配列に置換することによって、分子中の既存の配列に突然変異を誘発させることによって、等々の方法によって標的分子中へ導入される（engineered）ことができる。導入は当業者に利用できる方法によって行うことができる。
「キメラ（chimeric）」標的分子、例えば「キメラ酵素（chimeric enzyme）」という用語は結合部位成分が標的分子に挿入された後、又は標的分子の一部分が結合部位成分によって置換された後に結果として生ずる生成物を意味する。明確にするため、ＢＳＭの導入前の標的分子を開始標的分子と呼ぶことにする。従ってもしある酵素が開始材料ならば、それは「開始酵素（starting enzyme）」と呼ばれる。ＢＳＭが導入されると開始酵素は「キメラ酵素」と同一視される。以下の実施例においてはβ−ラクタマーゼが開始酵素として用いられ、そこにアミノ酸を含む結合部位成分が導入されてキメラ酵素を生ずる。それがキメラである理由は、それが開始酵素のアミノ酸と結合部位成分のアミノ酸から構成されているからである。
「結合分子（binding molecule）」という用語は結合部位成分に特異的に結合又は付着する分子を意味する。「特異的な（specific）」という用語は結合分子が結合部位成分のアミノ酸配列内の又は前記アミノ酸配列を含むアミノ酸の規定された配列を認識するということを意味する。特異性は結合部位成分の一次アミノ酸配列単独の、又は標的分子又は挿入部位又は他の部位での置換に元来存在するアミノ酸との組合せの関数であることができる。抗体、ポリペプチド、アプタマー（aptamer）、核酸、医薬、及び化学リガンドを含む様々な結合分子を用いることができる。抗体は当該技術分野で知られているようにモノクローナル、ポリクローナル、一本鎖、遺伝子工学の技術によって改造された抗体等であることができる。例えばReiter等,Nature Biotechnology,14:1239-1245,1996;Bird等,Science,242:423-426,1988を参照されたい。
結合分子はエピトープ又は決定基と呼ばれる巨大分子の特殊な部分に結合することができる。エピトープは線型決定基であることもできるし、構造的決定基であることもできる。例えばAbbas等,Cellular and Molecular Immunology,Second Edition,W.B.Saunders Co.,1991,特に第４７−４９頁を参照されたい。「ミモトープ」は個々の「エピトープ」と同一の結合分子によって認識されるものの「エピトープ」とは異なる組成を持つ決定基である。例えば結合分子はアミノ酸の一次配列を含むエピトープを認識する（つまりそのエピトープに結合する）抗体であってもよい。このエピトープの「ミモトープ」はアミノ酸の異なる一次配列を含むものの同一抗体によってなおも認識される。「ミモトープ」は「エピトープ」から少なくとも一アミノ酸だけ異なっている。ミモトープはハプテン、及び非タンパク質性分子又は成分（例えば炭化水素、ビオチン等）を含む他の分子を模倣することができる。上述の通りミモトープはアミノ酸残基によって形成される構造的決定基であることもできるし、又はキメラ分子の隔てられた部分からの他の成分であることもできる。更にミモトープは開始ＴＭに既に存在しており、キメラＴＭに残存している（つまり置換されなかった）成分（例えばアミノ酸）を含んでいてもよい。ミモトープは以下に述べるように選択することができる。例えば実施例においてはランダムアミノ酸を標的に導入して所望の結合分子によって認識について選抜又は選択することによって行われる。
ミモトープを用いることの利点はエピトープの構造に関する知識は必要とされないということである。この知識は得ることが一般的に困難である。特にもしエピトープが線型でない場合はそうである。本発明の一つの側面ではミモトープのライブラリーが作製され、標的分子、好ましくはループへ導入される（例えば挿入される）。結果として生ずるキメラ分子は次に活性の保持について選抜又は選択される。ミモトープは例えば５アミノ酸、好ましくは６アミノ酸（ランダムヘキサペプチド）、又は７，８，９，１０アミノ酸長を含むランダム配列から引出すことができる。本発明のこの側面では活性を保持しているキメラ標的分子が同定されると、それらは次に所望の結合分子によって認識について選抜される。結合分子は炭水化物、又は他の非タンパク質性ハプテン又は非ハプテン、又はアミノ酸配列に対する抗体であることができる。特に後者の場合、本発明を実施するのに配列情報は必要とされない。
標的分子は所望の検出可能な活性について選択されることができる。例えばＴＭはβ−ラマタマーゼ:P.Soumillion等,J.Mol.Biol.,237:415-422,1994;プラスミン:L.Jespers等,conference communication;前立腺に特異的な抗原（prostate specific antigen）:R.Eerola等,Biochem.Biophys.Res.Comm.,200:1346-1352,1994;ズブチリシン:P.Soumillion等,Appl.Biochem.Biotechnol.,47:175-190,1994;トリプシン:D.R.Corey等,Gene,128:129-134,1993;アルカリホスファターゼ:J.McCafferty等,Prot.Enging.,4:955-961;β−ガラクトシダーゼ:I.N.Maruyama等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:8273-8277,1994;スタフィロコッカルヌクレアーゼ:J.Ku & P.G.Schultz,Bioorg.Med.Chem.,2:1413-5,1994;及びJ.Light & R.A.Lerner,Bioorg.Med.Chem.,3:955-67,1995;グルタチオントランスフェラーゼ:M.Widersten & B.Mannervick,J.Mol.Biol.,250:115-122,1995;リゾチーム:K.Maenaka等,Biochem.Biophys.Res.Comm.,218:682-687,1996;及び触媒性抗体:K.D.Janda等,Proc.Natl.Acad.Sci USA,91:2532-2536,1994であることができる。
上述の標的分子はファージで発現されてきた。それらはＢＳＭの選択方法に直接適用しやすい。例えばエステラーゼ、ピルビン酸キナーゼ、グルコースオキサダーゼ、酪酸デヒドロゲナーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ルシフェラーゼの他の酵素もファージで発現されることができ、本発明に有用である。ＴＭは蛍光活性を持つタンパク質（例えば緑蛍光タンパク質ＧＦＰ:Chalfie等,1994,Science,263:802;Cheng等,1996,Nature Biotechnology,14:606;Levy等,1996,Nature Biotechnology,14:610）であってもよく、それは蛍光タンパク質内に含まれているＢＳＭへのＢＭの結合によって調節される。ＴＭは検出可能な活性を持つ第二分子を活性化する／不活性化する調節分子であることもできる。例えばGTPase活性化タンパク質（ＧＡＰ）はrasの如きＧ−タンパク質を刺激する。ＧＡＰがＧ−タンパク質を活性化する能力はＢＳＭをＧＡＰに導入することによって調節することができる。ＢＭが改変されたＧＡＰのＢＳＭに付着すると、ＧＡＰの刺激活性は調節されることができる。Ｇ−タンパク質に対するその上流効果（upstream effect）は例えばＧ−タンパク質のGTPase活性を測定することによって監視することができる。例えばTrahey及びMcCormick,Science,238:542-545,1987を参照されたい。ＴＭは別のタンパク質のサブユニット（それはそれ自体が酵素的又は他の検出可能な活性を持つ）であってもよい。更にＴＭは核酸酵素（例えばリボザイム）、ハンマーヘッド型酵素（例えばRNAse P）、又はヘアピン型酵素であることもできる。もし核酸が標的分子として用いられるのなら、導入された結合部位成分は改変された又は天然に存在するヌクレオチドを通常含むだろう。ＴＭは生体外での転写及び翻訳系に関与する転写アクティベーター又はリプレッサーであってもよい；活性の検出は発現される酵素又は蛍光分子の活性レベルで行うことができる。
ＢＭのキメラ分子への、好ましくはＢＳＭでの結合は様々なやり方で活性に影響を与えることができる。結合分子はキメラＴＭを不活性化させてもよい。「不活性化する（inactivate）」という用語はキメラＴＭの活性が減少される又は弱められることを意味する。結合分子はキメラＴＭが全く活性を持たないか又は無視できるほどの活性しか持たないようにキメラＴＭを完全に不活性化させてもよいし、又はその活性の一部分のみを不活性化させてもよい（例えばKcatが減少させられるか又はＫｍが増大させられる）。キメラＴＭは活性及び不活性形態の少なくとも二つの形態で存在することができる。平衡ではキメラＴＭの集団は分子の混合物を含み、そのいくつかは活性形態のＴＭであり、いくつかは不活性形態のＴＭであるだろう。ＢＭは不活性形態のＴＭに結合するように選択されることができる。キメラＴＭの集団に添加されると、ＢＭの不活性なＴＭへの付着は混合物の平衡を不活性形態へと移動させることができる。結果として混合物はＢＭの存在下でその不在下よりも活性が小さくなるだろう。かくして結合分子はキメラＴＭの集団を不活性形態へ移動させることによってキメラＴＭの活性を調節し、それによって集団の活性を全体として減少させる。選択された開始酵素は二つの異なる形態：活性及び不活性形態で存在することができるセリンプロテアーゼであることができる。不活性形態は対応する酵素前駆体のそれに類似している。平衡は酵素をその活性形態に維持している塩橋（塩結合ともいう）を阻害することによって活性から不活性形態へ移動することができる；このことは塩橋に関与するペプチド鎖のアミノ末端の脱プロトン化を導くｐＨの増大によって行うことができるか又はこのアミノ末端の化学的改変によって行うことができる。塩橋のエネルギーは活性形態がそれほど強くは安定化されない程度のものであるので（2.9Kcal/mol,A.R.Fersht,J.Mol.Biol.,64:497-509,1972参照）平衡は比較的容易に不活性形態へ移動されることができる。ＢＭ（例えばモノクローナル抗体）のアミノ酸末端への結合はかなりのオーダーで平衡を移動させることができる。
キメラ分子の活性化はＢＭによっても調節されることができる。活性化の最も単純な例は酵素前駆体を酵素に変換する酵素前駆体中へのペプチド結合のタンパク質分解的開裂である。古典的な例はセリンプロテアーゼの活性化、又はより特異的にはトリプシンによってペプチド結合Arg15-Ile16がタンパク質分解的に開裂されることによるキモトリプシノゲンのキモトリプシンへの活性化である。開裂されたペプチド結合の領域に導入されたエピトープ又はミモトープに結合する抗体又は他のＢＭは活性化を阻害することができる。他の例はリン酸化の状態によって活性が調節される酵素のリン酸化の阻害又は脱リン酸化である。グリコーゲンホスホリラーゼは一例である：それがSer14でリン酸化されるとそれはその活性化形態に実質的になるが、脱リン酸化は酵素を不活性化させる。リン酸化部位の近くでの導入されたエピトープ又はミモトープへの抗体又は他のＢＭの結合はホスホリラーゼキナーゼ及びホスホプロテインホスファターゼそれぞれによる活性化／不活性化機構を阻害するだろう。
より一般的には、活性の調節に貢献する酵素のいかなる翻訳後修飾も外来分子のＢＳＭ（例えば抗体）への結合によって阻害されることができる。
結合部位成分はＮ−及びＣ−末端との融合を含めて、標的分子のいかなる所望の位置へも導入されることができる。一以上の（例えば二，三，四又は五つの）ＢＳＭが隣近する又は異なる領域で標的成分へ導入されることができる。標的分子への複数回の導入（例えば挿入又は置換）は例えばミモトープを与えるため（例えばミモトープは標的分子中の二つの異なる部位での導入によって与えられるアミノ酸からなっていてもよい）、結合分子が結合することができる一以上の部位を提供するため、ＢＭが酵素を活性化する一つの部位及び第二ＢＭが酵素を不活性化するもう一つの部位を与えるため等の様々な理由のために行われることができる。二つの（又はそれ以上の）部位でアミノ酸配列を挿入する又はアミノ酸配列をミモトープで置換することの利点は不連続なミモトープが構築されることができ、それによって結合分子が付着することができる高親和性部位が提供されるということである。好ましくは上述の通り結果として生ずるキメラＴＭはＢＳＭの導入後もその活性を少なくとも幾らかは保持している。更にＢＳＭへのＢＭの付着はキメラ標的分子の上述の活性の調節をもたらす。後者の二つの側面（活性の保持及び結合分子による結果として生ずるキメラ分子の保持された活性の調節）は本発明の好ましい側面である。かくして導入（例えば挿入）の好ましい部位はＴＭの活性は削除されないが、それがアミノ酸残基の付加によって置換又は改変された時にＴＭの活性の調節スイッチとして作用することができる位置である。
ＴＭ中でＢＳＭが導入（例えば挿入及び／又は置換）される部位は当業者に知られているような様々な方法によって選択されることができる。例えばＴＭの三次元（３Ｄ）構造が知られている場合、部位は導入のための分子中の所望の位置を特異的に同定することによって選択されることができる。ある目的のためには結合分子による付着に利用できる標的分子の表面の露出された部位を選択することが望ましいであろう。３Ｄ構造は例えば結晶学による実験的手法に従って決定されることができるし、及び／又はそれはアミノ酸配列データの既知の構造から導き出されることもできる。例えばHolm及びSander,Science,273:595-602,1995を参照されたい。もし３Ｄ構造が知られていない場合、導入部位は他の情報に基づいて選択されることができる。例えばタンパク質の構造が知られていない場合、限定的タンパク質分解に敏感な部位又は二次構造予測によって又は疎水性パターンの分析によってループであることが強く予想される部位は導入（例えば挿入又は置換）に好適である。代わりにＢＳＭはＴＭ中の任意の位置に導入されてもよい。
導入部位は活性部位でないことが好ましく、そこから遠く（例えばそこから約１，５，１５，２０又は２５Å）離れた位置にあることが更に好ましい。キメラ分子の活性は改変が活性部位に近いか又はそこから遠く離れているかどうかにかかわらず、挿入又は置換された配列への結合によって調節可能でなければならない。
標的及びキメラ分子は当該技術分野で利用できる方法によって製造することができる。例えば遺伝子工学がアミノ酸又はヌクレオチド残基を含む標的及びキメラ分子を製造するのに用いられることができる。一つの具体例ではクローニングされた遺伝子が開始標的分子及び結果として生ずるキメラ標的分子の開始材料として用いられる。以下に記載する実施例においては開始酵素β−ラクタマーゼについてのクローニングされた遺伝子がキメラ酵素を製造する開始材料として用いられる。ＢＳＭは当業者に利用できる様々な方法（例えばKunkel,Proc.Natl.Acad.Sci.,82:488-492,1985;Sayers及びEckstein,“Directed Mutagenesis:A practical approach,”McPherson,Ed.IRL Press 1991,pp.49-69;Munir等,J.Biol.Chem.,267:6584-6589,1992;Brennan等,Proc.Natl.Acad.Sci.,92:5783-5787,1995）を用いて開始ＴＭへ導入されることができる。導入は相同組換えを介して置換ベクターを用いて行うこともできる。本発明の目的のためには、開始遺伝子内の配列がアミノ酸配列が開始配列と異なる程度まで突然変異誘発させられた場合、結果として生ずる遺伝子をコードするポリペプチドはキメラである。それがキメラである理由は、異なるアミノ酸配列、つまり結合部位成分、が開始標的分子へ導入されているからである。開始材料が酵素でありかつ酵素がそのヌクレオチド配列の変化によって突然変異誘発させられている特別な実施例においては、結果として生ずるキメラ酵素は天然に存在するアミノ酸配列によって置換されているアミノ酸結合部位成分を含むだろう。一つの具体例においては野生型酵素（又は他のポリペプチド）をコードする遺伝子の配列は導入の標的とされる遺伝子の領域の上流及び下流に二つの制限酵素認識部位を導入するためにKunkel又はEcksteinのプロトコルに従って部位指向突然変異誘発によって改変される；好ましくは突然変異はコードされる酵素が不活性になるようにコード配列にも同時に導入される；改変された遺伝子を含むプラスミド、ファージミド又はファージは「ベクター」と呼ばれるだろう。このベクターは新しい制限酵素認識部位で対応する制限酵素で消化され、部位間の配列をコードする小断片は捨てられる。平行して合成縮重オリゴヌクレオチドライブラリーがMunir等,J.Biol.Chem.,267:6584-6589,1992の方法に従って製造される；それらは適切な制限酵素認識部位の間にタンパク質配列中の対応する残基の任意置換をコードする縮重したヌクレオチド配列を含む。代わりに野生型配列はタンパク質配列中の対応する位置での任意のポリペプチドの挿入をコードする長いヌクレオチド配列によって置換される。制限酵素で消化した後、合成オリゴヌクレオチドは消化されたベクターの精製された大断片と結合され、連結反応混合物はイー・コリ（E.coli）細胞を形質転換させるのに用いられる。通常、約１０6〜１０8個の形質転換体を含むライブラリーが製造される。活性のある酵素を生産するクローンがこれらから選択される（以下の記載を参照されたい）。配列の異なる部分にランダム突然変異が導入されている二つのライブラリーでの活性のある酵素を生産するクローンの組換えが不連続なミモトープを持つ酵素を生産するために行われる。
遺伝子工学が利用される一つの具体例においては、標的分子（例えば酵素）をコードする遺伝子は所望のホスト中でのポリペプチドの発現に適した発現ベクター中へクローニングされることができる。哺乳類の細胞（例えばＨｅＬａ，ＣＯＳ，Ｌｔｋ−，又はＣＨＯの如きヒト、サル、又は齧歯動物の細胞）、昆虫細胞（例えばＳｆ９又はショウジョウバエ）、細菌（例えばイー・コリ、ストレプトコッカス（Streptococcus）又はバチルス（bacillus））、酵母、真菌類、又は植物を含む様々なホストが考慮される。Methods in Enzymology,Volume 185,ed.,D.V.Goeddelも参照されたい。Ｓｆ９発現はGraziani等,Oncogene,7:229-235,1992と同様に行わせることができる。繊維状ファージ系は細菌中で以下のものを含む結合分子に付着するペプチドを発現させて選択するのに用いられている：抗体（Scott及びSmith,249:386-390,1990;Grihalde等,Gene,166:185-195,1995）,ストレプトアビジン（Kay等,Gene,128:59-65,1993;Devlin等,Science,249:404-406,1990）,リボヌクレアーゼＤＮＡ（Rebor及びPabo,Science,263:671-673,1994）。Jespers等,Biotechnology,13:378-382,1995も参照されたい。Parmley及びSmith,Gene,76:305-318,1985;de la Cruz等,J.Biol.Chem.,263:4318-4322,1988;Bass等,Proteins,8:309-314,1990;Cwirla等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:6378-6382,1990;McCafferty等,Nature,348:552-554,1990;Clackson等,Nature,352:624-628,1991;Lowman等,Biochemistry,30:10823-10838,1991;J.McCafferty等,Prot.Eng.,pp.955-961,1991;Kang等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:4363-4366,1991;Barbas等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:7978-7982,1991;Roberts等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:2429-2433,1992も参照されたい。繊維状ファージ発現系に好ましいポリペプチドはファージ上に好適に折り畳まれるか又は十分に活性な形態でファージで少なくとも発現されるものである。所望の開始分子が好適であるかどうか同定するために、その分子をコードする核酸が発現に好適なようにファージ中にクローニングされる。次に、発現された分子は従来の方法に従って活性を検定される。次に、開始分子へのＢＳＭの導入は上述の手順に従って行われることができる。例えばGrihalde等を参照されたい。発現制御配列はホスト適合性、及び例えば高コピー数、高量、誘導、増幅、制御された発現等の所望の目的のために選択される。用いることのできる他の配列はＳＶ４０、ＣＭＶ由来のものの如きエンハンサー、誘導可能プロモーター、又は選択的又は特異的細胞発現を可能にする他の要素を含む。
本発明はキメラ標的分子をコードする核酸にも関する。かかる核酸は例えばキメラ標的分子をコードするヌクレオチド配列に操作可能に結合された発現制御配列の様々な配列を更に含む。「発現制御配列」という句は核酸配列であってそれが操作可能に結合されている核酸の発現を調節する配列を意味する。発現はmRNA又はポリペプチドのレベルで調節されることができる。かくして発現制御配列はmRNA関連要素及びタンパク質関連要素を含む。かかる要素はプロモーター、エンハンサー（ウィルスの又は細胞の）、リボソーム結合配列、転写終結因子等を含む。発現制御配列はそれがヌクレオチドコード配列の発現に影響を与えるように又は発現を達成するように配置される場合、ヌクレオチドコード配列に操作可能に結合される。例えばプロモーターがコード配列の５′に操作可能に結合される場合、コードの配列の発現はプロモーターによって制御される。キメラ分子をコードする核酸は例えば少なくとも９５％−９９％のヌクレオチド同一性の選択を可能にする条件の如きストリンジェントな条件下でそれにハイブリダイズする核酸をも含む。ポリペプチドであるキメラＴＭについてはそれをコードする核酸は例えばヌクレオチド縮重を含む。核酸はＤＮＡ及びＲＮＡを含む。
例えば当業者なら知っている通り組合せ化学によって化合物を組立てる方法の化学的／又は合成的方法もキメラ分子を作るのに用いることができる。
上述の通り、本発明の一つの側面は結合分子によって調節されることができる活性を持つキメラ標的分子に関する。「それによってキメラ標的分子の活性は結合分子が結合すると調節される」という句はキメラＴＭへの、好ましくはＢＳＭでの結合分子の付着がキメラＴＭの活性に検出可能な様式で影響を与えることを意味する。キメラＴＭがβ−ラクタマーゼの如き酵素である場合、結合分子はβ−ラクタム結合を加水分解するその活性に影響を与えるだろう。結合分子の作用は活性を減少させるか又は削除する（例えばβ−ラクタム結合を開裂させるその能力を減少させるか又は削除する）ものであることができる。結合分子は例えば活性を増大させる、その特異性を変化させる、それを活性化させる等の他の方法でも活性に影響を与えることができる。
一つの好ましい具体例ではランダムペプチド配列が例えば酵素の標的分子の選択された部位で導入される。挿入又は置換によって導入されたＢＳＭを持つ、結果として生ずるキメラ標的分子を含むライブラリーを製造するための開始標的分子の改変後、開始標的分子の活性を保持しているキメラ分子を選択することが望ましい。「キメラ標的分子は開始標的分子の活性を持つ」という句は開始ＴＭが活性を持ちかつ結果として生ずるキメラＴＭも活性を持つことを意味する。キメラＴＭの活性は開始ＴＭとは定量的に又は定性的に異なることができる。例示のため、以下の実施例においては開始酵素はβ−ラクタマーゼである。β−ラクタマーゼはβ−ラクタム結合を加水分解する酵素である。ペニシリン、セファロスポリン、アンピシリン等を含む様々な化合物が基質として用いられることができる。天然に存在するアミノ酸に加えて置換する又は挿入された結合部位成分を持つキメラβ−ラクタマーゼはβ−ラクタム結合を加水分解する能力を持つだろう。キメラβ−ラクタマーゼにおけるこの活性は例えば開始酵素よりも大きいか又は小さくすることができ（例えば異なるKcat又は異なるＫｍを持つ）、及び／又は異なる基質特異性を持つことができる。
最初のステップは所望の活性を保持している、結果として生ずるキメラ分子を選択することである。酵素活性が所望の活性であるなら、次に選択アッセイがそれのために設計されることができる。所望の分子の選択は当業者なら知っている通りの様々な方法によって行われることができる。例えば選択は色によって（例えば酵素による開裂が検出可能な色を持つ最終生成物を生成する場合）、活性酵素を発現するクローンについて耐性（例えば薬剤耐性）を比較することによって行うことができる。一つの具体例では選択はライブラリーを固体培地に塗布し、色原体の又は蛍光体の基質を添加し、そして個々のコロニーでの生成物の発現を観察することによって行うことができる。生体内選択は分子が抗生物質の存在下での成長に必要な場合（抗生物質耐性；この手法は実施例１においてベータラクタマーゼを用いて行われる）、又は活性が栄養要求性細菌において失われている基本遺伝子の補償に用いられる場合（例えばアミノ酸についての栄養要求性）に適用することができる。生体外選択も例えばＷＯ  ９３／１１２４２のように酵素がファージで発現される場合、用いることができる。
選択された酵素の活性を測定するためにはいかなる古典的分光光度測定、蛍光測定、電位差測定（pHstat）法が用いられることができる。特にORIGEN（商標）法（IGEN Gaithersburg,MD）が生成物形成の検出に用いられることができる（Liang等,J.Am.Chem.Soc.,118:9198-9199,1996;Liang等,Anal.Chem.,68:2426-2431,1996）。選択の次のステップは結合分子に結合するクローンを同定することである。一つの具体例においてはキメラ標的分子はファージで発現される。選択は抗体選別法、カラムクロマトグラフィー等によって行われることができる。例えばGrihalde等,Gene,166:187-195（1995）;McNally等,J.Bio.Chem.,270:19744-19751,1995;O’Neil及びHoess,Curr.Opin.Struct.Biol.,5:443-449,1995を参照されたい。本発明の別の側面においては、基質溶離は抗体結合によって阻害されるキメラ標的分子の活性を同定するのに利用される。例えば所望のミモトープを持つ（例えばファージで発現される）キメラ酵素がミモトープ特異的な抗体によって認識されるその能力によって選択される。活性が抗体によって阻害されるキメラ酵素を同定するため、キメラ酵素は好適な基質の添加によって抗体から溶離される。他の具体例においてはキメラ標的分子はホスト細胞（例えば細菌、昆虫細胞、哺乳動物の細胞）の表面で発現され、選択は細胞溶解なしに行われることができる。キメラ標的はホスト細胞内で発現されることもでき、例えば細胞を透過性にした又は溶解した後、又は発現された生成物を結合分子にアクセス可能にさせた後、選択が行われる。
キメラ標的分子はテストサンプル中の分析対象物の存在又は量を検出するのに用いることができる。一つの具体例においてはキメラＴＭはキメラ酵素である。キメラ酵素は（１）分析対象物を含むテストサンプル、及び（２）キメラＴＭ酵素が触媒的に作用する基質と接触させられて反応混合物を形成する。反応混合物中に存在する分析対象物の量はキメラ酵素によって行われる基質の触媒作用の量を監視又は検出することによって測定される（ただし分析対象物はキメラ酵素による触媒作用を調節する）。テストサンプルは存在又は量がわかっていることが望ましい分析対象物を含むいかなるサンプル（例えば血液、血清、尿、排泄物、又はリンパ液の如き体液、組織ホモジネート、生体組織、器官液、組織培養培地等）であることができる。「分析対象物analyte）」はテストサンプル中の存在が検出されている分子を意味する。一つの具体例においては分析対象物は前立腺に特異的な抗原（PSA）、癌胚抗原（carcinoma embryonic antigen）（ＣＥＡ）、c-erbB2、発癌遺伝子の生成物、ウィルス（ＨＩＶ又は肝炎ウィルス）、細菌（ぶどう状球菌）に特異的な抗体の如き抗体であり、キメラＴＭはキメラ酵素である。抗体又はＢＭのキメラ酵素への結合又は付着はキメラ酵素による基質での触媒作用を調節することができる。活性の調節は上述されている。好ましい実施例においてはキメラ酵素の酵素活性は抗体によって減少（不活性化）される。かくしてテストサンプル中の分析対象物抗体の存在は個々の分子として又は集団としてのキメラ酵素によって証明される活性の減少を監視又は検出することによって測定することができる。代わりに分析対象物は上述のタンパク質又はその断片の如きポリペプチドである。キメラ分子が好適な結合分子と組合されると、その活性は調節される。
本発明の他の側面においてはキメラ酵素の活性を調節する結合分子（ＢＭ）及びキメラ酵素を含む反応混合物の活性は分析対象物（結合分子のリガンド）によって更に影響されることができる。分析対象物はキメラ酵素とＢＭとの相互作用の直接的競合物として作用することができる：添加された分析対象物は結合分子と競合するか又はＴＭから結合分子を置換し、検出可能な活性に対するその調節効果を逆転させる。一つの具体例においては結合分子はキメラＴＭを不活性化させる：分析対象物の添加は反応混合物中の活性の回復をもたらすだろう。
酵素アッセイは既知の手順に従って行うことができる。例えば活性は一時的に、動力学的に（kinetically）、又は終止点によって監視されることができる。キメラ酵素は液体中にあることもできるし、又は固体支持体上にあることもできる（例えばセルロース、Sephadex、プラスチック、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリビニル、セルロースニトレート、ポリエチレン、ナイロン、ポリメチルメタクリレート等の如き材料に直接結合されるか又はビオチン−ストレプトアビジン結合を介して結合されることができる）。結合は当業者なら知っているような方法で行われることができる。基質、結合、及び一般的なアッセイに関する様々な手法については例えばMethods in Enzymology,Volume  ７３を参照されたい。分析対象物又は結合分子を含むテストサンプルとキメラ分子を「接触させる」という用語は分析対象物又は結合分子が所望の手段によってキメラ分子と接触状態にもたらされるということを意味する。接触は以下の方法によって行われることができる：キメラＴＭを含む溶液にテストサンプルを添加することによって、分析対象物又はＢＭを含む溶液にキメラ酵素を含む固体支持体を浸すことによって、キメラＴＭを含む固体支持体に分析対象物を含む溶液を滴下することによって等。もし基質が用いられるのなら（例えばキメラＴＭが酵素である場合）、基質は分析対象物と同時に、又はその前後で、つまり同時又は逐次的にキメラ酵素と接触させることができる。
上述の通り、キメラＴＭは所望の活性（例えば酵素的、蛍光、活性化、相補的等）を持ついかなる分子であってもよい。分析対象物を検出するためのアッセイは当業者なら知っている通り、選択されたキメラＴＭの活性における変化を監視する又は検出するために作り変えることができる。
本発明の他の側面においては、分析対象物は結合分子の競合物である。結合分子との競合の存在又は量はその存在を確かめるのに用いられる。かかるプロセスの一例が実施例２において記述されている。所望の分子（実施例においてはそれは前立腺に特異的な抗原、つまり「PSA」である）について特異的な抗体によって認識されるミモトープを持つキメラ分子（実施例においてはそれはβ−ラクタマーゼである）が製造される。ミモトープへの抗体の結合はキメラ分子の活性を減少させる。分析対象物（実施例１においてはそれはPSAである）はミモトープへの結合について抗体と競合する。かくして、もし分析対象物が存在していればキメラ分子に結合する抗体は少なくなる。キメラ分子に結合する抗体が少ないので、キメラ分子は分析対象物の不在下よりも活性となる。
本発明のアッセイは医学的、獣医学的、環境的、及び様々な診断上の利用（例えば病気、病原性の病気、環境汚染、組織培養汚染等の検出）に有用である。例えば、患者中の癌の存在は特異的な抗原又は抗体の存在を検出することによって決定することができる。癌を持っている人は前立腺に特異的な抗原（PSA）又は癌胚抗原（ＣＥＡ）の如き様々な抗原のレベルが増大していることが知られている。
核酸、ポリペプチド、抗体等の他の側面については分子生物学、タンパク質科学、及び免疫学の標準的な教科書が参照される。例えばDavis等（1986）,Basic Methods in Molecular Biology,Elsevier Sciences Publishing,Inc.,New York;Hames等（1985）,Nucleic Acid Hybridization,IL Press,Molecular Cloning,Sambrook等;Current Protocols in Molecular Biology,F.M.Ausubel等編,John Wiley & Sons,Inc;Current Protocols in Human Genetics,Nicholas C.Dracopoli等編,John Wiley & Sons,Inc.;Current Protocols in Protein Science;John E.Coligan等編,John Wiley & Sons,Inc.;Current Protocols in Immunology;John E.Coligan等編,John Wiley & Sons,Inc.を参照されたい。
【図面の簡単な説明】
図１ａ，１ｂ，及び１ｃはlib1及びlib3ライブラリーを作るのに用いられた挿入部位を示す：lib1 1.V103,2.E104及び3.Y105;lib3:4.T271及び5.M272;触媒部位6.S70。
図２及び図３は突然変異体β−ラクタマーゼpsa19A;302に対する抗体psa19の阻害効果を示すグラフである。図３は図２のふくらみ部分を示すグラフであり、酵素活性を０−５０ｎＭでpsa19の関数として表す。
図４はキメラp19Rb404の活性に対するpsa19抗体の効果を示すグラフである。
図５Ａ及び５Ｂは二つの異なる基質（それぞれCenta及びPADAC）を用いたキメラp66Rb330の活性に対するpsa66抗体の効果を示すグラフである。
図６はファージ酵素P19L3-01及びpsa 19mAbの存在下でPenGに対して行われたpsa抗原のアッセイを示すグラフである。
実施例
実施例  １
ライブラリーの構築
コートタンパク質pIIIと融合したβ−ラクタマーゼ遺伝子を持つ繊維状ｆｄファージ（fdBla+）はSoumillion,P.,Jespers,L.,Bouchet,M.,Marchand-Brynaert,J.,Winter,G.及びFastrez,J.Selection of β-lactamase on Filamentous Bacteriophage by Catalytic Activity.J.Mol.Biol.237,415-422（1994）に記載された。ファージの制限酵素地図は図１ａに与えられている；ファージ遺伝子３内に導入された制限酵素認識部位ApaLIとNotIの間に挿入されたＲ−Ｔｅｍ  β−ラクタマーゼ遺伝子のＤＮＡ配列はコードするアミノ酸配列と共に図１ｂに与えられている（部位指向性突然変異によって）ランダム化された領域のどちらかの側でfdBla+プラスミド特異的制限酵素認識部位を導入することによって、そしてこれらの部位間で部分的に縮重された小さなＤＮＡ断片をクローニングすることによって三つのライブラリーlib1,lib2,及びlib3が構築された。挿入は所望の配列のオリゴヌクレオチドを合成することによって、そしてオリゴヌクレオチドの３′非縮重部分にハイブリダイズする小さなプライマーの伸長によってそれらを二本鎖ＤＮＡに変換することによって作り出された。lib4ライブラリーはlib1突然変異をカバーするfdBla+プラスミドのEcoRI-PvuI制限断片をlib3ライブラリーへのfdBla+プラスミドの対応する突然変異していない断片と交換することによって構築された。ＤＮＡライブラリーはイー・コリのＴＧ１株に電気穿孔法によって導入された。付随的な詳細は以下に与えられている。
ファージ酵素ストックの製造
ファージ酵素ライブラリーは電気形質転換された（electrotransformed）細菌を固体ＬＢ培地及び７．５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含む５３０ｃｍ2の広いプレートに広げることによって製造された。形質転換体は３７℃で２０時間成長させられ、次にそれらはプレートをＬＢ培地で洗浄することによって回収された。細菌は遠心分離によって捨てられ、ファージはＰＥＧ／ＮａＣｌ沈殿によって上澄みから精製された。ファージ当たりに発現されるβ−ラクタマーゼの平均数を増加させるため、ファージライブラリーは液体媒地で２３℃でmAbでの選択の直前まで再増幅された（３７℃でファージ当たり０．２のβ−ラクタマーゼに比較して２３℃でファージ当たり１のβ−ラクタマーゼが発現される。データは示さず）。活性について選択されたライブラリーはそれらが（１０μｇ／ｍｌ又は３０μｇ／ｍｌで）アンピシリンを含むプレートに塗布されたことを除いては同一の条件で製造された。個々のクローンは２３℃で液体ＬＢ媒地中で常に増幅された。
酵素アッセイ
ファージでのβ−ラクタマーゼ活性は液体中で２０℃でｐＨ７．５の５０ｍＭ  Ｎａリン酸緩衝液中でアッセイされた。特記されない限り、ベンジルペニシリン（PenG）が基質として用いられた。吸光度の減少は２３２ｎｍで時間の関数として測定され、ファージ酵素のモル当たり秒-1で表されるkcatの値を与えた。
実施例  ２
１．β−ラクタマーゼタンパク質の活性部位の縁のループでのライブラリー（lib1）の構築
ランダムペプチド配列はＲ−Ｔｅｍ  β−ラクタマーゼの配列の領域１０３−１０５に挿入されている（J.G.Sutcliffe,Proc.Natl.Acad.Sci.,75:3737-3741,1995）。Ｖ１０３−Ｖ１０５を含む領域における活性部位の縁のループは挿入−置換部位として選択された。何故ならその位置は触媒ポケット（catalytic pocket）に近く、しかも配列はクラスＡ  β−ラクタマーゼの間でこの領域においてほとんど保存されていないからである。図１ｃを参照されたい。
二つの異なるlib1ライブラリー、lib1A-B及びlib1Dが不活性化されたベクターに基づいて構築された。それらは両方とも残基Ｅ１０４−Ｙ１０５及びＶ１０３−Ｙ１０５の代わりにそれぞれ６アミノ酸の挿入を含む。これらのライブラリーの理論的大きさは６４００００００の異なる配列である。不活性化されたベクター（fdBlaI1）はホスホロチオエート法（Nakamaye,K.C.及びEckstein,F.（1986）Nucl.Acid Res.14,9679-9688）を用いてfdBla+の部位指向性突然変異誘発によって製造された。このベクターは二つの新しい制限酵素認識部位BbsI及びSgrAI、及び酵素を不活性化させる停止コドンを特徴とする（模式図１ａ）。
模式図１ａ；β−ラクタマーゼ遺伝子のコドン１００と１０９の間のfdBlaI1の配列（制限酵素認識部位は下線を引かれ、停止コドンを導入するために挿入された塩基は太字で示され、コードされる残基はＤＮＡ配列の下に示されている）：
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ランダム配列を含む合成オリゴヌクレオチドの３′非縮重部分への小さなプライマーのアニーリング、Ｔ４ポリメラーゼによって触媒されるプライマーの伸長、及び１５％ポリアクリルアミドでの精製によって、模式図１ｂ及び１ｃに示されるような二つの二本鎖オリゴヌクレオチドカセットが製造された。
模式図１ｂ：ランダムカセット及びプライマーを含むオリゴヌクレオチドの配列：
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模式図１ｃ：lib1A-B構築のための二本鎖カセット（制限酵素認識部位は下線を引かれ、BbsIの開裂部位は矢印によって示されている）。
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ベクターはBbnsI及びSgrAIを用いて制限酵素消化され、アガロースで精製された。カセットはBbsI及びNgoMIを用いて制限酵素消化された。次に１０倍過剰のカセットがベクターと結合された。汚染されたfdBlaI1ベクターはBbsI消化によって除去された。生成物は電気穿孔に対する準備として１００μｌの緩衝液中で再懸濁された。この連結反応混合物の４μｌは２回、コンピーテントなＴＧ１細胞を形質転換させてライブラリーlib1A及びlib1Bを製造するのに用いられた。これらのライブラリーのサンプルは１０μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含む固体ＬＢ培地に塗布され、４μｌの電気穿孔当たり得られたクローンの数が測定された（lib1A及びlib1Bについてそれぞれ１．８×１０6及び４．７×１０6個のクローンであった）。lib1A-Bライブラリーの活性は様々なアンピシリン濃度のプレートに細菌のサンプルを塗布し、３７℃又は２３℃でのインキュベート後に得られるクローンを計算することによって評価された。これらの力価測定は３０−４０秒-1より高い活性を持つクローンを明確に選択するための条件（つまり、１０μｇ／ｍｌの溶解されたばかりのアンピシリンを含むＬＢプレートでの３７℃、１７時間のインキュベーション）の決定を可能にした。ライブラリーの活性は低い。何故ならそれらのクローンのうち０．０５％及び０．０８％のみが１０μｇアンピシリン／ｍｌ、３７℃で成長することができるからである。活性の測定はこの活性を確認されたそれらの条件下で選択されたいくつかの個々のクローンについて行われた。表１を参照されたい。いくつかの個々のクローンが配列決定された。配列の変異性は中程度であり、短くされた配列を持つクローンが存在している。これは挿入物を構築するために用いられる縮重したオリゴヌクレオチドがアクリルアミドで生成されたにもかかわらず観察された。精製ステップは十分なものであるが、挿入物はこの領域においてたぶん良好に取り扱われず、結局、短くされた配列に主に相当する活性クローンがまれに選択される。
lib1A-Bライブラリーの活性画分は大規模で製造された（＝lib1C2及びlib1C4）。lib1A-Bは１０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するプレートで成長する０．０５％−０．０８％クローンの６．４×１０7倍、つまり３２０００〜５１０００クローンを含むべきである。我々の目的は完全なファージ及びＤＮＡライブラリーを製造することである。後者は組換えライブラリーlib4を作るのに用いられるだろう。ＤＮＡライブラリーの単離に十分なだけの材料を製造するためには、大皿での２回の塗布が必要であった。一回目には１４個の４μｌ電気穿孔生成物は５２ｍｌのＳｏｃ培地での希釈後、２３×２３ｃｍの皿（１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン及び１０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む固体培地）に塗布された。３７℃で１８時間の成長後、細菌は１２０ｍｌの液体ＬＢ培地に集められた。６００ｎｍで０．５の光学濃度に希釈された細胞溶液の６０倍希釈は１０個の大皿に塗布され、７９０００クローンを生成した（libC2）。実験は繰り返され、１５００００クローンが得られた（libC4）。これらからファージ及びＤＮＡライブラリーが実施例１に記載の通り、及び従来の方法（Sambrook等,（1989）Molecular cloning:A laboratory Manual.2nd Edit.,Cold Spring Harbor Laboratory）によってそれぞれ製造された。いくつかの個々のクローンは多量に製造され、それらの活性が測定され及びそれらの配列が決定された。表２を参照されたい。
同一のプロトコルがライブラリーlib1Dを製造するのに用いられた。カセットは模式図１ｄに示される自己ハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをその二本鎖の形（模式図１ｅ）に変換することによって構築された。
模式図１ｄ：ランダムカセットを含む自己ハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの配列
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模式図１ｅ：lib1A-Bの構築のための二本鎖カセット：制限酵素認識部位は下線を引かれ、BbsI及びNgoM1についての開裂部位は矢印で示されている。
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精製、及びBbsI及びNgoMIによる制限酵素消化後、このカセットは制限酵素消化されてアガロース精製されたベクターfdBlaI1に結合された。汚染されたクローニングベクターはBbsI消化によって除去され、連結反応混合物は電気穿孔法によるＴＧ１細胞の形質転換に用いられた。３μｌから９．２×１０6個の形質転換体が生成され、そのうち０．１１％が１０μｇ／ｍｌアンピシリン含有培地で成長するほど十分活性のある酵素を生成した。完全なライブラリー（lib1D2）はlib1C2及びlib1C4について記述されたのと同様に製造された。いくつかのクローンの活性及び配列が決定された。表３を参照されたい。
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２．β−ラクタマーゼのα１１ヘリックスに先行するループ中のライブラリー（lib3）の構築
β−ラクタマーゼのα１１ヘリックスに先行するループ（残基２７１−２７２）が挿入部位として選択された。何故ならその位置は触媒ポケットに比較的近く、しかもそこは既知のβ−ラクタマーゼの間で配列がほとんど保存されていないからである。この領域はlib1ライブラリーの挿入部位（残基１０３−１０６）に関しても非線型エピトープの構築について好適に配置されている。実際、これらの二つの領域は活性部位の反対の端に位置する。図１ｃを参照されたい。
一つの実施例においては、β−ラクタマーゼのアミノ酸Ｔ271及びＭ272は５残基の縮重した配列に交換され、lib3dライブラリーを与えた。このライブラリーはlib1ライブラリーを構築するのに用いられた方法に従って構築された。不活性化されたベクター（fdBlaI2）はホスホロチオエート法（Nakamaye,K.C.及びEckstein,F.（1986）Nucl.Acid Res.14,9679-9688）を用いてfdBla+の部位指向性突然変異誘発によって生産された。このベクターは二つの新しいBbsI制限酵素認識部位及び酵素を不活性化させる一つの停止コドンを特徴とする（模式図２ａ）。
模式図２ａ：β−ラクタマーゼ遺伝子のコドン２６７及び２７８の間のfdBlaI2の配列（制限酵素認識部位は下線を引かれ、開裂部位が示されている。停止コドンを導入するために挿入された塩基は太字で示され、コードされる残基はＤＭＡ配列の下に示されている）：
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二つの二本鎖オリゴヌクレオチドカセットは模式図２ｂ及び２ｃに示されるように、ランダム配列を含む合成オリゴヌクレオチドの３′非縮重部分への小さなプライマーのアニーリング、Ｔ４ポリメラーゼによって触媒されるプライマーの伸長、及び１５％ポリアクリルアミドでの精製によって製造される。
模式図２ｂ：ランダムカセットを含むオリゴヌクレオチド及びプライマーの配列
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模式図２ｃ：lib3dの構築のための二本鎖カセット：Bbs1制限酵素認識部位は下線を引かれ、開裂部位は矢印で示されている。
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ベクター及びカセットはBbsIで制限酵素消化された。次に１０倍過剰のカセットがベクターと結合された。汚染されたfdBlaI2ベクターはBbnsI消化によって除去された。生成物は１００μｌに再懸濁された。この連結反応混合物の４μｌはコンピーテントなＴＧ１細胞を形質転換させてライブライリーlib3dを製造するのに用いられた。これらのライブラリーのサンプルは１０μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含む固体ＬＢ培地に塗布され、４μｌの電気穿孔当たり得られたクローンの数が測定された（４．５×１０5個のクローンであった）。ライブラリーの活性は様々なアンピシリン濃度のプレートに形質転換された細菌のサンプルを塗布し、３７℃又は２０℃でのインキュベート後に得られるクローンを計数することによって評価された。クローンの２−３％、つまり約８×１０4個の異なるクローンが活性があるとわかった。位置２７２のメチオニンは活性のあるクローンで強く保存されていた。表４を参照されたい。１０μｇアンピシリンで選択されたクローンの約３分の１が５残基より短い配列を含んでいた。これは短くされた二本鎖オリゴヌクレオチドの割合が少ないβ−ラクタマーゼベクターへの縮重した挿入物がクローニング中に存在するためである；短い挿入クローンはより活性があるのでその後で強く選択される。
lib3dライブラリーはlib1と組換えられるほど十分に大きくて活性があったが、その変異性は同一領域に、しかし残基Ｔ271のみが置換された第二のライブラリーの構築を示唆した。挿入の大きさは新しい挿入部位のより離れた位置を考慮に入れるため、５ではなく６アミノ酸に増加された。lib3fライブラリーはlib3dのようにカセットをfdBlaI2ベクターにクローニングすることによって構築された。そのカセットは模式図２ｄに示されている。
模式図２ｄ：lib3fの構築のための二本鎖カセット：BbsI制限酵素認識部位は下線を引かれ、開裂部位は矢印で示されている。
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４μｌの連結反応混合物でのＴＧ１の形質転換は７．０×１０6個のクローンを与えた。
製造されたライブラリーlib3fは極めて活性があった。何故なら約７％のクローンが３７℃で１０μｇアンピシリン／ｍｌで成長することができたからである。これらの条件下で選択されたいくつかのクローンの配列決定は活性のあるクローンは幅広い配列変異性を持っており、しかも短くされた挿入配列を含んでいないことを示した。表５を参照されたい。これは縮重したオリゴヌクレオチドがアクリルアミドゲルで精製されたためである。
lib3fライブラリーの活性画分は６μｌの連結反応混合物を１００μｌのＴＧ１細胞で３回電気穿孔し、そしてまず１２ｍｌのＳｏｃ培地、次に４８ｍｌのＬＢ培地に希釈することによって製造された。細菌は１０個の大皿（２３×２３ｃｍ）に塗布され、そして３７℃で１８時間成育された。次にライブラリーは４℃で２０ｍｌのＬＢ培地で３回プレートから回収された。細菌は遠心分離され、二本鎖ＤＮＡは通常の方法で抽出され、CsCl勾配で精製され、多量のＤＮＡストップを与えた；ファージは上澄みから精製された（＝lib3G）。ライブラリーの大きさは約４×１０6の異なる活性クローンであり、lib3Gライブラリーの活性はpsa抗体を用いた直接親和性選択を可能にした（以下を参照されたい）。lib3dは同様に取り扱われ、活性ライブラリーlib3Eを生成した。
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３．lib1及びlib3ライブラリーの組換え
ライブラリー（１０３−１０５領域のlib1C2,1C4及び1D2、及び２７１−２７２領域のlib3E及び3G）はアンピシリンで選択され、kcatが４０秒-1より高い（つまり、野生型活性の４％以上の）クローンを本質的に含んでいる。lib1及びlib3ライブラリーの大きさはそれぞれ約１×１０4及び４×１０6クローンである。
アンピシリンでのlib3Gライブラリーの更なる選択がそれをlib1ライブラリーと組換える前に行われた。lib3Gは極めて大きく、配列変異性が広いので、最も活性のあるクローンのみが選択された。これは活性のある組換えライブラリーを得るチャンスを増加させると予測される。lib3Gライブラリーは３０μｇアンピシリン／ｍｌ、３７℃で選択され、その条件はそのクローンの１０％を選択させた。このようにしてライブラリーの活性は１．５倍に増大された。
組換えライブラリーを構築するため、lib1C2,1C4及び1D2は集められ（pooled）,lib3Hライブラリーで組換えられた。上述の集められたlib1ライブラリーとlib3HライブラリーはEcoRI及びPvuIで消化された。lib1由来の大断片のライブラリー及びlib3H由来の小断片のライブラリーはゲルで精製され、結合され、形質転換に用いられた。ライブラリー（rec1）はそのクローンの約２０％が１０μｇアンピシリン、３７℃で成長できるほど極めて活性があった。このことはそのクローンの２０％が４０秒-1より高い活性を持つことを意味する。これらのクローンの配列決定は二つのクローン／１３のみが両方の位置に完全な挿入を同時に含むことを示した。表６を参照されたい。この頻度は約５０％の短くされた挿入がlib1ライブラリー中に存在するためである。適切に構築されたクローンの活性を測定するため、アンピシリンで選択されなかったいくつかのクローンのkcatが測定された。分析された１２クローンのうち、二つのみが１０秒-1より低い活性を持っていた。表７を参照されたい。良好に構築されたクローンはたとえそれらの大部分が１０μｇアンピシリン／ｍｌで成育することがたぶんできないにしても適切な活性を持っているようにみえる。
大きさの大きい組換えライブラリーを得るため、いくつかの異なるクローニングアプローチが行われた。最良のライブラリーは大規模で製造され（＝lib rec4b）、約５×１０7の異なるクローンを含んでいる。このライブラリーはpsa抗体での選択前、いかなる更なる処理にも供されなかった。アンピシリンでの選択は良好に構築されたクローンの割合を増大させるために用いることができる。
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実施例  ３
１．モロクローナル抗体psa10及びpsa66による結合についての選択
３回の選択が選択剤としてのビチオン化されたpsa10及びpsa66抗体（CanAg Diagnostics AB,Gothenburg,Sweden製）で飽和されたストレプトアビジンでコーティングされたマグネティックビーズ（Dynal AS,Oslo,Norway製のDynabeads M280）での選別によってlib3j（lib3E,lib3G（a）及びlib3G（b）ライブラリーを集めることによって製造されたもの）及びrec4Bライブラリーについて行われた。抗体について高親和性の突然変異体β−ラクタマーゼを発現するファージがこれらのライブラリーから抽出された。各々の場合において選択の第１回目と第３回目の間で１０００倍以上の増幅倍率（選択の第３回目と第１回目の間で溶離された−低ｐＨでの又は基質添加による溶離による−ファージの数の比）が得られた。これは効率的な選択が行われたことを示す。
酵素活性に対するmAbの作用は基質を添加する前の少なくとも１０分間、様々なmAb濃度でファージ酵素をインキュベートした後、決定された。加水分解の速度は基質濃度がmAbに結合しているか又はしていない改変された酵素のＫmよりも少なくとも３倍高い条件下で常に測定された。酵素とmAbとの間の解離定数は図２に示される阻害曲線から以下の式に基づいて決定された：
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式中、[E]t及び[mAb]tはそれぞれ総酵素及び抗体濃度、[E.mAb]は酵素−mAb複合体濃度、ｋｄは酵素−mAb複合体の解離定数、kcat E及びkcat E.mAbは遊離酵素と複合体の触媒定数である。
第３回目の選択の後、psa抗体が基質としてのPenGに結合する活性の影響が選択されたライブラリーで測定された、psa66で選択されたrec4bライブラリーの場合、軽い阻害が観察された（３．３×１０-7Ｍのpsa66で２０％まで）。大きな基質（PADAC又はCenta）が用いられると、この阻害効果は４０−４５％にも達した。
選択の第３回目から溶離されるファージの特性決定はライブラリーのlib3領域で強い選択が行われたことを示した。この位置では低い配列変異性のみが観察された。表８及び９を参照されたい。lib1領域においては配列の保存は観察されなかった。それにもかかわらず、この領域は野生型残基がこれらのクローンにおいて置換されるため、抗体結合に寄与しているようである。しかし、psa10及びpsa66エピトープはたぶん線状であると考えられている。psa66で選択されたファージの場合、SX（1-0）L/IQコンセンサスモチーフが由来し得る。このモチーフは同一抗体での選択後、ω−ループで作られたライブラリー（lib2）から前に単離されたクローンにも存在していた。このモチーフはpsa配列には見出されない。psa66を用いてミモトープが選択されている。ＨＰＱ配列はpsa10で選択されたいくつかのクローンで見出された。このことは抗体ではなくストレプトアビジンで少なくとも部分的に選択が行われたことを示唆する。psa10のビオチン化された生成物においてわずかな沈殿が見えるので、抗体は変性され、ストレプトアビジンのビーズをコーティングしていなかったのかもしれない。psa10で選択されたlib3j及びrec4bライブラリーの活性がストレプトアビジン結合によって調節されることができるかが試されたが、陽性の結果は得られなかった。rec4bライブラリーの場合にはかすかな刺激が観察された。
lib3j及びrec4bライブラリーからpsa66で選択されたいくつかの個々のクローンが分析された。それらはすべて高い活性を持っていた。表９を参照されたい。一方、lib3jライブラリーから単離されたクローンの場合には、調節は見出されなかった。lib1領域の配列が変異に富むため、選択されたクローンは極めて多様で、調節レベルはクローンに依存していたが（３．３×１０-7Ｍのpsa66で）PADAC（R.N.Jones等.,Clin.Microbiol.,15:677-683,1982）又はCenta（R.N.Jones等,Clin.Microbiol.,15:954-958,1982）で主に３０−６０％の阻害であった。この割合はpsa66の濃度が１．７×１０-6Ｍに増加される場合の７０％以上の高さであり得る。PenGが基質として用いられる場合、阻害はそれほど重要ではない。作用の相違は基質の大きさの相違から主に生ずるようであり、大きい基質ほど結合抗体の存在下で加水分解されるのが遅い。（[psa66]＝∞での）最大阻害は最も良く調節されるクローンの一つ（p66Rb316）について計算されており、PADACでは６８％、Centaでは７５％に達する（ｋｄ＝１．２×１０-7Ｍ）。psa66で選択されたrec4bライブラリーは多くの異なるクローンを含むようにみえるので、より良く調節されるクローンがその中に存在している可能性は除外できない。
p66Rb316クローンにおいては野生型残基Ｅ104−Ｙ105がＴ104Ｇ105に置換されており、野生型残基Ｔ271がDGSRQによって置換されている。予期せぬことに、Ｒ275はＱ275に突然変異している。これらの配列は前立腺に特異的な抗原（psa）には存在していない。結果として、モノクローナル抗体はミモトープを認識する。
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２．モノクローナル抗体psa19での結合についての選択
psa19抗体（CanAg diagnostics AB,Gothenburg,Sweden）を用いて選別することによって３回の選択がlib3jライブラリーで行われた。いくつかのクローンはpsa19結合による活性の調節について分析された。かかる活性アッセイを行うため、ファージ酵素は５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７で２．４×１０-9Ｍの濃度に希釈された。PSA19モノクローナル抗体は０−２．６μＭの最終濃度で添加された。１０分後、基質（ベンジルペニシリン）が５×１０-4Ｍの最終濃度で添加された。活性は２３２ｎｍでの吸光度の減少速度の測定によって測定された。psa19Aj302として同定されlib3jライブラリーから抽出されるファージについての突然変異体β−ラクタマーゼの触媒活性に対するモノクローナル抗体psa19の阻害効果のプロットが図２及び３に示されている。図３は図２のふくらみ部分である。それは０−５０ｎＭの［psa19］の関数としての活性を示す。活性は４×１０-9Ｍのpsa19抗体濃度で６０％に、飽和で１７％に減少されている。これは活性の増大を観察することによって分析対象物PSA自体をｎＭ濃度で検出することを可能にする。
psa19Aj302クローンにおいては野生型残基Ｔ271はSWPVKSによって置換された。予期せぬことにＲ275もＱ275に突然変異した。これらの配列はPSAには存在していない。従ってモノクローナル抗体はミモトープを認識する。
psa19抗体を用いてrec4Bライブラリーにも３回の選択が適用された。psa抗体結合によって活性が調節されるクローンが見出された（psa19Rb404）。ファージ酵素は５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７で２．４×１０-9Ｍの濃度に希釈された。psa抗体は０−２．６μＭの最終濃度で添加された。１０分後、基質（ベンジルペニシリン）が５×１０-4Ｍの最終濃度で添加された。活性は２３２ｎｍでの吸光度の減少速度の測定によって測定された。psa19の不在下、１３４秒-1のkcatが見出された。psa19結合は抗体の不在下で見出される活性の８％の活性を阻害する。効果の半分は５０ｎＭのpsa19の濃度で観察された（psa19とβ−ラクタマーゼ突然変異体との間の複合体についてＫｄ＝５×１０-8Ｍ）。図４を参照されたい。クローンの配列決定によって、野生型残基Ｅ104−Ｙ105がＱ104−Ｇ105によって置換されたこと、及び野生型残基Ｔ271が配列GPWPRQによって置換されたことが明らかになった。この配列はpsaには存在していない。
３．まとめ
二つの大きなライブラリー、つまりlib3j及びrec4bが構築された。これらのライブラリーは極めて活性があり、kcat値が野生型Fdblaクローンの３−１３％の範囲にあるクローンの抗体についての選択を可能にした。活性ライブラリーの構築は調節可能なβ−ラクタマーゼ突然変異体の発見の前提条件であるとみなされた。表１０はlib3及びlib4の選抜の結果をまとめている。
rec4bライブラリーの単一の成功した親和性選択は結合パートナーによって、つまりpsa66抗体によって強く調節されるクローンを可能にした。
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lib3及びlib4ライブラリーからpsa mAbで単離されたいくつかの良好に調節されるクローンの特性決定が行われた。大部分のクローンはループＣに完全な挿入を含んでいるが（lib3及びlib4クローン）、ループＡには点突然変異しか含んでいない（lib4クローン）。ループＡでの完全な挿入の欠如はlib4ライブラリーの構築に用いられた活性lib1クローンの約５０％が完全な挿入を含んでいなかったためである。これらのクローンはlib1ライブラリーの活性についての生体内選択から生ずる。何故ならそれらは適切ではあるが貧弱な活性を持つlib1クローン（非選択lib1クローンの０．１％未満で示される不適当な挿入を含むクローン）の大部分よりも多くの利点を有するからである。ループＣにおいてはライブラリーをクローニングするのに用いられる生体外合成された断片の内側を除く突然変異された領域の外側でいくつかの「余分な（extra）」突然変異が見出された。これらのクローンは活性についての生体内選択中、優先的に増幅されたようにもみえる。すべてのクローンはペニシリン基質ベンジルペニシリン（PenG）及びセファロスポリン基質PADACについてテストされた。最も重要な阻害を与えた基質を用いて得られた結果のみが示されている。阻害の値（相対活性）は飽和濃度のmAbの存在下で測定された。
実施例  ４
lib1ライブラリーはDynabeads M280で直接選別することによって分析され、ストレプトアビジンへの結合によって調節されるファージ酵素が抽出された。２０秒-1のkcat、Ｋｄ＝１．２×１０-7のストレプトアビジンの結合定数、及び１．３の阻害係数を持つクローンが見出された。５×１０-7の濃度でのビオチンの添加は活性をストレプトアビジンの不在下で観察される活性にまで回復させた。Ｖ103−Ｙ105の代わりにＬ102−Ｓ106に挿入されたペプチドの配列はYHPQNSであった。
実施例  ５
psa66抗体（CanAg diagnostics AB,Gothengburg,Sweden）を用いて選別することによってRec4bライブラリーで３回の選択が行われた。クローンp66Rb330が選択され、psa66結合による活性の調節について分析された。二つの基質が用いられた。観察された効果は基質に依存していた。図５Ａ及び５Ｂを参照されたい。Centaを基質とすると１．７２倍の活性化が観察された。PADACでは２．６倍の阻害が観察された。両方の活性化／阻害曲線は、モノクローナル抗体psa66と酵素との間の同一の結合定数：Ｋｄ＝３６０ｎＭに適合することができる。このクローンは配列決定された：野生型残基Ｖ103−Ｙ105はLLAGYで置換され、野生型残基Ｔ271−Ｒ275はDLGAVで置換されていた。これらの配列はPSAには存在しておらず、それ故モノクローナル抗体はミモトープを認識する。
実施例  ６
ライブラリー３が選抜され、クローンP19L3-01がそこから選択された。実施例３及び表１０を参照されたい。このクローンはpsa 19mAbで最良の阻害を示した（Ｋｄ＝５ｎＭ）。このクローンは成長させられ、psa抗原及びpsa 10mAbとの競合に対するその応答を研究するのに用いられた。１ｎＭのファージ酵素P19L3-01、５ｎＭのpsa 19mAb、２００ｎｇ／ｍｌのＢＳＡ及び様々な濃度のpsa抗原の存在下で、PenGが５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５中で基質として用いられた。psa抗原のレベルは０．１ｎＭから１５０ｎＭまで変化させられた。kcat（秒-1）が活性の尺度として用いられた。図８を参照されたい。
これまでに及び図で引用されたすべての出願、特許及び刊行物のすべての開示はここで参考文献として組み入れられる。
当業者ならこれまでの記述を用いて本発明を完全に利用することができると考えられる。それ故、これまでに述べた好ましい特別の具体例は例示としてのみ解釈されるべきであり、いかなる場合においても開示の残りの部分を限定するように解釈されるべきではない。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６】
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