(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された核酸分子であって、ヌクレオチド配列ＡＴＴＡＴＡＣを含み、該ヌクレオチド配列は、インテグラーゼ組換えタンパク質によって認識される組換え部位内に位置する、核酸分子。
【請求項２】
インテグラーゼ組換えタンパク質によって認識される２以上の組換え部位を含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項３】
インテグラーゼ組換えタンパク質によって認識される前記組換え部位が、転写調節配列とオープンリーディングフレームとの間に位置し、該転写調節配列と該オープンリーディングフレームとが作動可能に連結されている、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項４】
前記転写調節配列がプロモーターである、請求項３に記載の単離された核酸分子。
【請求項５】
ベクターである、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項６】
前記ベクターがプラスミドである、請求項５に記載の単離された核酸分子。
【請求項７】
少なくとも１つの複製起点をさらに含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項８】
少なくとも２つの複製起点を含む、請求項７に記載の単離された核酸分子。
【請求項９】
原核生物細胞中での前記核酸分子の複製を可能にする少なくとも１つの複製起点を含む、請求項７に記載の単離された核酸分子。
【請求項１０】
前記原核生物細胞がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ細胞である、請求項９に記載の単離された核酸分子。
【請求項１１】
請求項１に記載の単離された核酸分子を１つ以上含む、単離された宿主細胞。
【請求項１２】
１以上の組換え部位を含む核酸分子を生成するための方法であって、該方法は、該核酸分子にハイブリダイズする２以上のプライマーの存在下で該核酸分子を増幅する工程を包含し、ここで、該プライマーのうちの１以上が、ヌクレオチド配列ＡＴＴＡＴＡＣを含む、方法。
【請求項１３】
前記核酸分子が、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
２以上の核酸分子を組換えるための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該２以上の核酸分子および少なくとも２つの組換えタンパク質を含む反応混合物を調製する工程；ならびに
（ｂ）該反応混合物を、該２以上の核酸分子間の組換えが起こるに充分な条件下でインキュベートする工程
を包含し、ここで、該核酸分子の各々が、少なくとも１つのヌクレオチド配列ＡＴＴＡＴＡＣを含む、方法。
【請求項１５】
前記少なくとも１つのヌクレオチド配列が、ａｔｔ配列である組換え部位内に位置する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記少なくとも２つの組換えタンパク質が、バクテリオファージλのゲノムによってコードされる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記少なくとも２つの組換えタンパク質が、Ｉｎｔ、ＩＨＦ、ＸｉｓおよびＣｒｅからなる群より選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記少なくとも２つの組換えタンパク質が、Ｉｎｔ、ＩＨＦおよびＸｉｓからなる群より選択される、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、概して、組換えＤＮＡ技術に関する。より詳細には、本発明は、核酸分子の組換えクローニングにおける使用のための組成物および方法に関する。本発明は特に、１以上の組換え部位または１以上の部分的な組換え部位（特にａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬ、およびａｔｔＲ）をコードする核酸分子、ならびにそれらのフラグメント、変異体、改変体および誘導体に関する。本発明はまた、１以上の組換え部位ヌクレオチド配列が、１以上のさらなる物理的ヌクレオチド配列または機能的ヌクレオチド配列と作動可能に連結した、このような核酸分子に関する。本発明はまた、本発明のベクターまたは核酸分子を含む宿主細胞、本発明の核酸分子によってコードされるポリペプチドおよびＲＮＡを産生する方法、ならびにこれらの核酸分子によってコードされるかまたは本発明の方法によって産生されるポリペプチド（これは、融合タンパク質であり得る）に関する。本発明はまた、本発明の１以上のポリペプチドまたはそれらのエピトープに結合する抗体（これらは、モノクロナール抗体またはポリクロナール抗体であり得る）に関する。本発明はまた、特定の特徴を有するキメラＤＮＡ分子および／またはＤＮＡセグメントを提供するための、核酸の組換えクローニング方法（インビボおよびインビトロ）における、これらの核酸分子、ベクター、ポリペプチドおよび抗体の使用に関する。より詳細には、本発明の抗体を使用して、本発明の核酸分子もしくはベクターによってコードされるタンパク質または融合タンパク質を同定および／または精製し得るか、あるいは本発明の核酸分子を同定および／または精製し得る。
【０００２】
（関連技術）
部位特異的リコンビナーゼ。部位特異的リコンビナーゼは、多くの生物体（例えば、ウイルスおよび細菌）に存在するタンパク質であり、エンドヌクレアーゼ特性およびリガーゼ特性の両方を有すると特徴付けられている。これらのリコンビナーゼ（いくつかの場合、会合タンパク質と共に）は、ＤＮＡ中の特定の塩基配列を認識し、そしてそれらのセグメントに隣接するＤＮＡセグメントを交換する。リコンビナーゼおよび会合タンパク質は、総称して「組換えタンパク質」といわれる（例えば、Ｌａｎｄｙ，Ａ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３：６９９−７０７（１９９３）を参照のこと）。
【０００３】
種々の生物体由来の多くの組換え系が記載されている。例えば、Ｈｏｅｓｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １４（６）：２２８７（１９８６）；Ａｂｒｅｍｓｋｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１（１）：３９１（１９８６）；Ｃａｍｐｂｅｌｌ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４（２３）：７４９５（１９９２）；Ｑｉａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７（１１）：７７９４（１９９２）；Ａｒａｋｉら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２５（１）：２５（１９９２）；ＭａｅｓｅｒおよびＫａｈｎｍａｎｎ、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２３０：１７０−１７６（１９９１）；Ｅｓｐｏｓｉｔｏら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５（１８）：３６０５（１９９７）を参照のこと。
【０００４】
これらの多くは、リコンビナーゼのインテグラーゼファミリーに属する（Ａｒｇｏｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ．５：４３３−４４０（１９８６）；Ｖｏｚｉｙａｎｏｖら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２７：９３０（１９９９））。おそらく、これらのうち最も研究されているのは、バクテリオファージλ由来のインテグラーゼ／ａｔｔ系（Ｌａｎｄｙ，Ａ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．３：６９９−７０７（１９９３））、バクテリオファージＰ１由来のＣｒｅ／ｌｏｘＰ系（ＨｏｅｓｓおよびＡｂｒｅｍｓｋｉ（１９９０）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第４巻、編：ＥｃｋｓｔｅｉｎおよびＬｉｌｌｅｙ、Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ；９０−１０９頁）およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ２μ環状プラスミド由来のＦＬＰ／ＦＲＴ系（Ｂｒｏａｃｈら、Ｃｅｌｌ  ２９：２２７−２３４（１９８２））である。
【０００５】
Ｂａｃｋｍａｎ（米国特許第４，６７３，６４０号）は、野生型組換え部位ａｔｔＢおよびａｔｔＰを用いる酵素的部位特異的組換えによってタンパク質産生ＤＮＡセグメントの組換えのための、λリコンビナーゼのインビボでの使用を開示する。
【０００６】
ＨａｓａｎおよびＳｚｙｂａｌｓｋｉ（Ｇｅｎｅ  ５６：１４５−１５１（１９８７））は、プロモーターに隣接する野生型ａｔｔＰ部位とａｔｔＢ部位との間の分子内組換えのための、インビボでのλＩｎｔリコンビナーゼの使用を開示する。これらの部位の配向はお互いに関して反転しているので、これは、目的の遺伝子に関するプロモーター領域の非可逆的なフリッピングを引き起こす。
【０００７】
Ｐａｌａｚｚｏｌｏら、Ｇｅｎｅ  ８８：２５−３６（１９９０）は、クローン化されたＤＮＡ配列の外側かつ野生型ｌｏｘＰ部位の間に位置する制限部位を含むバクテリオファージλアームを有する、ファージλベクターを開示する。Ｃｒｅリコンビナーゼを発現するＥ．ｃｏｌｉ細胞の、これらのファージベクターへの感染は、ｌｏｘＰ部位間の組換えおよびプラスミドレプリコン（クローン化されたｃＤＮＡを含む）のインビボでの切除を生じる。
【０００８】
Ｐｏｓｆａｉら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：２３９２−２３９８（１９９４））は、選択可能なマーカーを有する部分的な発現ベクターを、ゲノムＤＮＡに挿入し、２つの野生型ＦＲＴ認識配列に隣接させるための方法を開示する。細胞中に存在するようなＦＬＰ部位特異的リコンビナーゼは、所定の位置でゲノムにベクターを組み込むために使用される。レプリコンが機能的である条件下で、このクローン化されたゲノムＤＮＡは増幅され得る。
【０００９】
Ｂｅｂｅｅら（米国特許第５，４３４，０６６号）は、部位間のインビボでの組換えのための２つのｌｏｘＰ部位を含むＤＮＡに対する、部位特異的リコンビナーゼ（例えば、Ｃｒｅ）の使用を開示する。
【００１０】
Ｂｏｙｄ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１：８１７−８２１（１９９３））は、平滑末端化ＤＮＡのクローニングを容易にする方法を開示し、この方法は、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞の存在下で、Ｃｒｅ部位特異的リコンビナーゼによって作用する野生型ｌｏｃＰ部位を含む、脱リン酸化されたベクターとの分子間連結を促進する条件を使用する。
【００１１】
Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら（ＷＯ９３／１９１７２およびＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１（９）：２２６５（１９９３））は、特定の抗体の軽鎖および重鎖を、ｌｏｘＰ部位とｌｏｘＰ５１１部位との間の異なるファージベクターにクローン化し、そして新しいＥ．ｃｏｌｉ細胞にトランスフェクトするために使用するインビボ方法を開示する。Ｃｒｅ（宿主細胞において２つの親分子（１つのプラスミド、１つのファージ）に作用する）は、平衡状態にある４つの産物：２つの異なる融合体（ｌｏｘＰ部位またはｌｏｘＰ５１１部位のいずれかで組換えによって産生される）、および２つの娘分子を産生し、これらのうちの１つは所望の産物であった。
【００１２】
ＳｃｈｌａｋｅおよびＢｏｄｅ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：１２７４６−１２７５１（１９９４））は、野生型およびスペーサー変異ＦＲＴ組換え部位にそれぞれ隣接する、規定された染色体の位置で発現カセットを交換するインビボ方法を開示する。二重相互乗換えは、部位特異的組換えについてのこのＦＬＰ／ＦＲＴ系を使用することによって、培養された哺乳動物細胞において媒介された。
【００１３】
Ｈａｒｔｌｅｙら（米国特許第５，８８８，７３２号）は、核酸セグメントおよび分子の組換え交換のための組成物および方法（インビトロおよびインビボでの種々の核酸分子の組換えクローニングにおける使用を含む）を開示し、この方法は、野生型および変異組換え部位ならびに組換えタンパク質の組み合わせを使用する。
【００１４】
トランスポザーゼ。酵素（トランスポザーゼ）のファミリーはまた、レプリコン間の遺伝的情報を伝達するために使用されている。トランスポゾンは、構造的に多様であり、単体または化合物として記載されているが、代表的に、逆の配向でオーガナイズされたＤＮＡ配列に隣接するリコンビナーゼ遺伝子をコードする。トランスポゾンの組込みは、ランダムであるかまたは非常に特異的であり得る。Ｔｎ７（これは非常に部位特異的である）のような代表的なものは、レプリコン間のＤＮＡセグメントのインビボでの移動に適応されている（Ｌｕｃｋｌｏｗら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：４５６６−４５７９（１９９３））。
【００１５】
ＤｅｖｉｎｅおよびＢｏｅｋｅ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：３７６５−３７７２（１９９４）は、レシピエントＤＮＡ分子へのＤＮＡセグメントのインビトロでの挿入のための人工トランスポゾンの構築を開示する。この系は、酵母ＴＹ１ウイルス様粒子のインテグラーゼを使用する。目的のＤＮＡセグメントは、トランスポゾン様要素ＴＹ１の末端間で、標準的な方法を用いてクローン化される。ＴＹ１インテグラーゼの存在下で、得られる要素は、第２の標的ＤＮＡ分子へランダムに組み込む。
【００１６】
（組換え部位）。上記の組換えタンパク質および／またはトランスポザーゼにより媒介される組込み／組換え反応に対するキーはまた、組込み／組換え反応に関与するＤＮＡ分子上の認識配列（しばしば「組換え部位」と呼ばれる）である。これらの組換え部位は、組込みまたは組換えの初期段階の間に組換えタンパク質により認識され、そして結合される関与する核酸分子上の、ＤＮＡの別個の部分またはセグメントである。例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼ（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ）についてのこれらの組換え部位は、ｌｏｘＰであり、これは、８塩基対コア配列に隣接する２つの１３塩基対逆反復（リコンビナーゼ結合部位として作用する）を含む３４塩基対配列である。Ｓａｕｅｒ，Ｂ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．５；５２１−５２７（１９９４）の図１を参照のこと。認識配列の別の例としては、組換えタンパク質λＩｎｔにより認識される、ａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬおよびａｔｔＲ配列が挙げられる。ａｔｔＢは、２つの９塩基対コア型Ｉｎｔ結合部位および７塩基対オーバーラップ領域を含む約２５塩基対配列であり、一方ａｔｔＰは、コア型Ｉｎｔ結合部位およびａｒｍ型Ｉｎｔ結合部位ならびに補助タンパク質の組込み宿主因子（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｈｏｓｔ  ｆａｃｔｏｒ）（ＩＨＦ）、ＦＩＳおよび除去酵素（Ｘｉｓ）についての部位を含む約２４０塩基対配列である。Ｌａｎｄｙ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３：６９９−７０７（１９９３）を参照のこと；本明細書中に参考として援用される米国特許第５，８８８，７３２号もまた参照のこと。
【００１７】
（ＤＮＡクローニング）。ＤＮＡセグメントのクローニングは、現在では、多くの研究所における日常の慣用的な仕事として、かつ多くの遺伝的分析における前もって必要な工程として見出される。これらのクローニングの目的は、多様であるが、２つの一般的な目的が、考慮され得る：（１）比較的少量の公知のベクター（例えば、ｐＵＣ、ｐＧｅｍ、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ）で行われる、大きなＤＮＡまたはＲＮＡセグメント（染色体、ＹＡＣ、ＰＣＲフラグメント、ｍＲＮＡなど）からのＤＮＡの最初のクローニング、および（２）これらのＤＮＡセグメントの機能的分析のために特殊化されたベクターへのサブクローニング。多量の時間および努力が、最初のクローニングベクターからより特殊化されたベクターへのＤＮＡセグメントの移入において、両方とも費やされる。この移入は、サブクローニングと呼ばれる。
【００１８】
クローニングのための基本的な方法は、長年の間公知であり、そしてその間にほとんど変化していない。代表的なクローニングプロトコルは、以下のようである：
（１）目的のＤＮＡを１つまたは１つの制限酵素を用いて消化する；
（２）既知である場合、目的のＤＮＡセグメントをゲル精製する；
（３）適切な場合、適切な制限酵素を用いる切断、アルカリホスファターゼを用いる処理、ゲル精製などによりベクターを調製する；
（４）切断されず、かつ自己連結したベクターのバックグラウンドを削除するための適切なコントロールとともに、ＤＮＡセグメントをベクターに連結する；
（５）生じたベクターをＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞に導入する；
（６）選択されたコロニーを取り、そして小さい培養物を一晩増殖させる；
（７）ＤＮＡミニプレップ（ｍｉｎｉｐｒｅｐ）を作製する；そして
（８）アガロースゲルでか（しばしば診断的な制限酵素消化の後に）またはＰＣＲにより単離されたプラスミドを分析する。
【００１９】
ＤＮＡセグメントのサブクローニングのために使用される特殊化ベクターは、機能的に多様である。これらには、以下が含まれるが、これらに限定されない：種々の生物体において核酸分子を発現するためのベクター；核酸分子の発現を調節するためのベクター；タンパク質精製において補助するためのタグまたは細胞におけるタンパク質の追跡を可能にするためのタグを提供するためのベクター；クローン化されたＤＮＡセグメントを改変する（例えば、欠失を生成する）ためのベクター；プローブ（例えば、リボプローブ）の合成のためのベクター；ＤＮＡ配列決定のためのテンプレートの調製のためのベクター；タンパク質コード領域の同定のためのベクター；種々のタンパク質コード領域の融合のためのベクター；目的のＤＮＡを大量に提供するためのベクターなど。特定の研究が、いくつかの異なる特殊化ベクターへ目的のＤＮＡセグメントをサブクローニングすることを含むということは一般的である。
【００２０】
当該分野で公知のように、単純なサブクローニングは、１日で行われ得る（例えば、ＤＮＡセグメントは、大きくなく、そして制限部位がサブクローニングベクターの制限部位と適合性である）。しかし、多くの他のサブクローニング（特に未知の配列、長いフラグメント、毒性遺伝子、制限部位の不適切な配置、高いバックグラウンド、不純な酵素などを含むサブクローニング）は、数週間かかり得る。従って、ＤＮＡフラグメントのサブクローニングは、しばしばできるだけ少ない回数で行われるべき面倒な仕事とみなされる。
【００２１】
ＤＮＡセグメントのクローニングを容易にするためのいくつかの方法は、例えば、以下の参考文献に記載されテイル。
【００２２】
Ｆｅｒｇｕｓｏｎ，Ｊ．ら，Ｇｅｎｅ  １６：１９１（１９８１）は、酵母ＤＮＡのフラグメントのサブクローニングのためのベクターのファミリーを開示する。これらのベクターは、カナマイシン耐性をコードする。より長い酵母ＤＮＡセグメントのクローンは、部分的に消化され得、そしてサブクローニングベクターに連結され得る。元々のクローニングベクターがアンピシリンに対する耐性を伝達する場合、選択性はカナマイシンであるため、形質転換の前に精製は全く必要無い。
【００２３】
Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ，Ｔら、Ｇｅｎｅ  ４１：１２５（１９８６）は、ストレプトマイシン感受性遺伝子内の独特のクローニング部位を有するサブクローニングベクターを開示し；ストレプトマイシン耐性宿主において、優性感受性遺伝子におけるインサートまたは欠失を有するプラスミドのみが、ストレプトマイシン選択に耐える。
【００２４】
従って、制限酵素およびリガーゼを用いる伝統的なサブクローニング方法は、時間を浪費し、かつ比較的あてにならない。かなりの労働力が費やされ、そして２日以上後に所望のサブクローンが、候補プラスミドの中に見出され得ない場合には、全体のプロセスを、代替の条件を試して繰り返されなけれなならない。部位特異的リコンビナーゼがインビボでＤＮＡを組換えるために使用されたが、インビトロでのこのような酵素の首尾良い使用は、いくつかの問題をこうむると予測された。例えば、部位特異性および有効性は、インビトロでは異なると予測され；トポロジー的に連結された産物が予想され；そしてＤＮＡ基質および組換えタンパク質のトポロジーは、インビトロでかなり異なると予測された（例えば、Ａｄａｍｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：６６１−７３（１９９２）を参照のこと）。インビボで何時間もの間続き得る反応は、インビトロでは酵素が不活化する前にかなり少ない回数で起こると予測された。さらに、反応に関与する核酸分子のトポロジー（すなわち、線状、コイル状、超コイル状など）の効果が知られていなかったのと同様に、インビトロ反応におけるより長い時間のインキュベーションの後の組換え酵素の安定性は知られていなかった。複数のＤＮＡ組換え産物は、使用された生物学的宿主において、サブクローニングの不十分な信頼性、特異性または有効性を生じると予測された。従って、インビトロ組換え反応は、所望のレベルの産物を得るのに十分な有効性が期待されなかった。
【００２５】
従って、制限酵素およびリガーゼの公知の使用を超える利点を提供する代替のサブクローニング系を提供する、切実な必要が長い間存在する。
【００２６】
（発明の要旨）
本発明は、１つ以上の組換え部位または１つ以上の部分的組換え部位、特にａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬ、およびａｔｔＲならびにそれらのフラグメント、変異体、改変体および誘導体をコードする核酸分子に関する。本発明はまた、以下を含むような核酸分子に関する：１つ以上の組換え部位ヌクレオチド配列またはその部分、および１つ以上の付加的な物理的または機能的ヌクレオチド配列、例えば、１つ以上の多重クローニング部位、１つ以上の転写終結部位、１つ以上の転写調節配列（例えば、１つ以上のプロモーター、エンハンサー、またはレプレッサ）、１つ以上の翻訳シグナル配列、融合パートナータンパク質またはペプチド（例えば、ＧＳＴ、Ｈｉｓ6もしくはチオレドキシン）をコードする１つ以上のヌクレオチド配列、１つ以上の選択マーカーまたはモジュール、局在化シグナル（例えば、核局在化シグナルまたは分泌シグナル）をコードする１つ以上のヌクレオチド配列、１つ以上の複製起点，１つ以上のプロテアーゼ切断部位、遺伝子または遺伝子の部分によりコードされる１つ以上の所望のタンパク質またはペプチド、ならびに１つ以上の５’または３’ポリヌクレオチドテイル（特に、ポリＧテイル）をコードするヌクレオチド配列。本発明はまた、１つ以上の組換え部位ヌクレオチド配列が、１つ以上の付加的な物理的または機能的ヌクレオチド配列に作動可能に連結されるような核酸分子に関する。
【００２７】
本発明はまた、本発明の組換え部位ヌクレオチド配列（またはその部分）を含むプライマー核酸分子、ならびに１つ以上の標的特異的（例えば、１つ以上の遺伝子特異的）プライマー核酸配列に連結されるようなプライマー核酸分子に関する。このようなプライマーはまた、（例えば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲなどにより）増幅されるＤＮＡまたはＲＮＡ配列に相補的または相同な配列を含み得る。このようなプライマーはまた、タンパク質遺伝子（リボソーム結合部位、局在化シグナル、プロテアーゼ切断部位、レプレッサ結合部位、プロモーター、転写終止、終止コドンなど）の発現において有用な配列または配列の部分を含み得る。このプライマーはまた、ＤＮＡ分子の操作において有用な配列または配列の部分（制限部位、転位部位、配列決定のプライマーなど）を含み得る。本発明のプライマーは、核酸合成において使用され得、そして好ましくは核酸分子の増幅（例えば、ＰＣＲ）のために使用される。本発明のプライマーが、標的特異的または遺伝子特異的配列（合成または増幅される標的内に含まれ、翻訳シグナル、遺伝子配列、終止コドン、転写シグナル（例えば、プロモーター）などを含む任意の配列）を含む場合、標的配列または遺伝子の増幅または合成は、達成され得る。従って、本発明は、１つ以上の本発明のプライマーを核酸テンプレートと混合する工程、およびその混合物をテンプレートの全てまたは部分に相補的な第１の核酸分子を作製するのに十分な条件下でインキュベートする工程を包含する、核酸分子の合成に関する。従って、本発明は、詳細には、核酸分子を合成する方法に関し、この方法は、以下：
（ａ）核酸テンプレートをポリメラーゼ活性を有するポリぺプチドおよび１つ以上の組換え部位またはその部分を含む１つ以上のプライマーと混合する工程；ならびに
（ｂ）この混合物を、テンプレートの全てまたは一部と相補的でありかつ好ましくは１つ以上の組換え部位またはその部分を含む第１の核酸分子を合成するのに十分な条件下でインキュベートする工程、
を包含する。
本発明のこのような方法は、この第１の合成された核酸分子を、この第１の核酸分子の全てまたは一部に相補的な第２の核酸分子を合成するのに十分な条件下で、インキュベートする工程をさらに包含し得る。このような合成は、その末端の一方または両方に組換え部位またはその一部を有する第１の核酸分子を提供し得る。
【００２８】
好ましい局面において、核酸分子の合成について、少なくとも２つのプライマーが使用され、ここで各プライマーは、その末端において、および／または各プライマーの内部配列内に相同な配列を含む（約２〜約５００塩基、好ましくは約３〜約１００塩基、約４〜約５０塩基、約５〜２５塩基、そして最も好ましくは約６〜約１８塩基の長さのオーバーラップする相同性を有し得る）。好ましい局面において、第１のこのようなプライマーは、少なくとも１つの標的特異的配列および少なくとも１つの組換え部位またはその部分を含み、一方第２のプライマーは、少なくとも１つの組換え部位またはその部分を含む。好ましくは、第１のプライマーと第２のプライマーとの間の相同性領域は、組換え部位の少なくとも一部を含む。別の局面において、第１のプライマーと第２のプライマーとの間の相同性領域は、１つ以上のさらなる配列（例えば、発現シグナル、翻訳開始モチーフ、または増幅の際に所望の核酸配列に機能を付加する他の配列）を含み得る。実際には、プライマーの二対が、核酸分子の合成または増幅のプライムをする。好ましい局面において、合成されたかまたは増幅された核酸分子の全てまたは少なくとも一部は、テンプレートの全てまたは一部に相同性であり、そして合成されたかまたは増幅された分子の少なくとも一方の末端そして好ましくは両末端に、組換え部位またはその一部をさらに含む。このような合成されたかまたは増幅された核酸分子は、二重鎖または一重鎖であり得、そして本発明の組換えクローニング方法において使用され得る。本発明の相同性プライマーは、プライマーの１つの組が任意の合成または増幅反応のために標準化され得るという実質的な利点を提供する。すなわち、組換え部位配列（標的特異的配列を含まない）を提供するプライマーは、予め作製され得、そして使用のために容易に入手可能である。実際にこれにより所望の核酸分子を合成するかまたは増幅するために必要とされる標的特異的配列を含む、より短いあつらえたプライマーの使用が可能になる。従って、これにより、標的特異的プライマーを調製する際の時間および経費が低減される（例えば、標的特異的配列を含むより短いプライマーが、調製され得、そして合成反応において使用され得る）。他方では、標準化プライマーは、大量に生成され得、経費を低減し、そして所望の核酸分子の合成を容易にするために容易に（例えば、キットまたは製品として）提供され得る。
【００２９】
従って、１つの好ましい局面において、本発明は、１つ以上の核酸分子を合成または増幅する方法に関し、この方法は、以下：
（ａ）１つ以上の核酸テンプレートを、ポリメラーゼ活性または逆トランスクリプターゼ活性を有する少なくとも１つのポリぺプチドならびにテンプレート特異的（このテンプレートに相補的か、またはこのテンプレートにハイブリダイズし得る）配列を含む少なくとも１つの第１のプライマーおよび組換え部位の全てまたは一部を含む少なくとも１つの第２のプライマーと混合する工程であって、ここで第２のプライマーの少なくとも一部は、第１のプライマーの少なくとも一部に相同性であるかまたは相補的である、工程；ならびに
（ｂ）この混合物を、１つ以上の核酸分子を合成するかまたは増幅するのに十分な条件下でインキュベートする工程であって、この１つ以上の核酸分子は、テンプレートの全てまたは一部に相補的であり、かつこの分子の一方の末端および好ましくは両末端に１つ以上の組換え部位またはその部分を含む、工程、
を包含する。
【００３０】
より詳細には、本発明は、１つ以上の核酸分子を合成または増幅する方法に関し、この方法は、以下：
（ａ）１つ以上の核酸テンプレートを、ポリメラーゼ活性または逆トランスクリプターゼ活性を有する少なくとも１つのポリぺプチドならびにテンプレート特異的（このテンプレートに相補的であるか、またはこのテンプレートにハイブリダイズし得る）配列および組換え部位の少なくとも一部を含む少なくとも１つの第１のプライマー、ならびに組換え部位の全てまたは一部を含む少なくとも１つの第２のプライマーと混合する工程であって、ここで第２のプライマー上の組換え部位の少なくとも一部が、第１のプライマー上の組換え部位の少なくとも一部の相補的か、または相同性である、工程；ならびに
（ｂ）この混合物を、１つ以上の核酸分子を合成するかまたは増幅するのに十分な条件下でインキュベートする工程であって、この１つ以上の核酸分子は、テンプレートの全てまたは一部に相補的であり、かつこの分子の一方の末端そして好ましくは両末端に１つ以上の組換え部位またはその一部を含む、工程、
を包含する。
【００３１】
より好ましい局面において、本発明は、１つ以上の核酸分子を増幅するか、または合成する方法に関し、この方法は、以下：
（ａ）１つ以上の核酸テンプレートを、ポリメラーゼ活性または逆トランスクリプターゼ活性を有する少なくとも１つのポリぺプチドならびに組換え部位の少なくとも一部およびテンプレート特異的（テンプレートに相補的であるかまたはテンプレートにハイブリダイズし得る）配列を含む１つ以上の第１のプライマーと混合する工程；
（ｂ）この混合物を、テンプレートの全てまたは一部に相補的な１つ以上の核酸分子を合成するかまたは増幅するのに十分な条件下でインキュベートする工程であって、ここでこの分子が、この分子の一方の末端そして好ましくは両末端に組換え部位の少なくとも一部を含む、工程；
（ｃ）この分子を、１つ以上の組換え部位を含む１つ以上の第２のプライマーと混合する工程であって、ここで第２のプライマーの組換え部位が、第１の核酸分子上の組換え部位の少なくとも一部と相同性であるか、または相補的である、工程；ならびに
（ｄ）この混合物を、１つ以上の第２の核酸分子を合成するか、または増幅するのに十分な条件下でインキュベートする工程であって、この第２の核酸分子は、第１の核酸分子の全てまたは一部に相補的であり、そしてこの分子の一方の末端そして好ましくは両末端に１つ以上の組換え部位を含む、工程、
を包含する。
【００３２】
本発明はまた、本発明の核酸分子を含むベクター、本発明のベクターまたは核酸分子を含む宿主細胞、本発明の核酸分子によりコードされるポリぺプチドを作製する方法、およびこれらの核酸分子にコードされるか、または本発明の方法により作製されるポリぺプチド（これは融合タンパク質であり得る）に関する。本発明はまた、１つ以上の本発明のポリぺプチドまたはそのエピトープに結合する抗体（これらは、モノクローナルまたはポリクローナル抗体であり得る）に関する。本発明はまた、特定の特徴を有するキメラＤＮＡ分子および／またはＤＮＡセグメントを提供するための、インビトロおよびインビボで、核酸分子を組換えクローニングするための方法における、これらの核酸分子、プライマー、ベクター、ポリぺプチドおよび抗体の使用に関する。
【００３３】
本発明の抗体は、ペプチドまたはタンパク質（本発明により作製される融合タンパク質を含む）を同定および／または精製するための特定の使用、ならびに本発明の核酸分子またはその部分を同定および／または精製するための特定の使用を有し得る。
【００３４】
核酸分子のインビトロまたはインビボでの組換えクローニングのための方法は、一般的に、キメラ核酸分子を提供するための、少なくとも１つの核酸分子（少なくとも１つの組換え部位を有する）と第２の核酸分子（少なくとも１つの組換え部位を有する）との間の組換えに関する。１つの局面において、この方法は、キメラベクターを提供するための、第１のベクター（少なくとも１つの組換え部位を有する）と第２のベクター（少なくとも１つの組換え部位を有する）との間の組換えに関する。別の局面において、少なくとも１つの組換えを有する核酸分子は、キメラベクターを提供するために、少なくとも１つの組換えを有するベクターと組み合わされる。もっとも好ましい局面において、組換えに使用された核酸分子またはベクターは、２以上の組換え部位を含む。本発明のより好ましい実施形態において、組換え方法は、目的反応（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）（本明細書中で「ＬＲ反応」としても言及される）に関し、この方法において組換えは、エントリー（Ｅｎｔｒｙ）クローンと目的ベクター（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ）との間で生じる。このような反応は、発現クローン（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｃｌｏｎｅ）を作製するために目的の核酸分子をエントリークローン（Ｅｎｔｒｙ  Ｃｌｏｎｅ）から目的ベクターに移す。具体的には、本発明の方法はまた、エントリー（Ｅｎｔｒｙ）反応またはゲートウェイ（Ｇａｔｅｗａｙ）反応（本明細書中で「ＢＰ反応」としても言及される）に関し、この反応において、発現クローンは、エントリークローンを生成するために、ドナー（Ｄｏｎｏｒ）ベクターと組換えられる。他の局面において、本発明は、エントリーベクター（Ｅｎｔｒｙ  Ｖｅｃｔｏｒ）を少なくとも１つの核酸分子（例えば、遺伝子または遺伝子の一部）と組み合わせることによってエントリークローンを調製する方法に関する。本発明はまた、目的のベクター内に１以上（好ましくは、少なくとも２）の組換え部位を含むことによって、所望のベクターの目的ベクターへの転換に関する。より好ましい局面において、核酸分子（例えば、カセット）（少なくとも２の組換え部位を有し、その部位は選択マーカー（例えば、毒性遺伝子、または遺伝子またはエレメントを含む宿主細胞の生存を防ぐ遺伝的エレメント、および／または核酸分子（例えば、遺伝子またはエレメントを含むベクターまたはプラスミド）の複製、分配、または遺伝率を防ぐ）に隣接する）がベクターに添加され、本発明の目的ベクターが作製される。
【００３５】
本発明の使用のために好ましいベクターとしては、原核生物ベクター、真核生物ベクター、またはベクター（種々の原核生物系および／または真核生物系との間を往復し得る（例えば、シャトルベクター））が挙げられる。本発明の使用のための好ましい原核生物ベクターはとしては、グラム陽性細胞および／またはグラム陰性細胞において増殖および／または複製し得るベクターが挙げられるがこれらに限定されない。これらのベクターとしては、以下の細菌が挙げられる：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｐｒｏｔｅｕｓ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、ならびにＰｓｕｄｏｍｏｎａｓ属、および好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉ種。本発明の使用のための真核生物ベクターとしては、以下が挙げられる：増殖および／または複製するベクター、および酵母細胞、植物細胞、哺乳動物細胞、（特にヒトおよびマウス）、真菌細胞、昆虫細胞、線虫細胞、魚類細胞など。目的の特定のベクターとしては、クローニングベクター、配列決定ベクター、発現ベクター、融合ベクター、２ハイブリッドベクター、遺伝子治療ベクター、ファージディスプレイベクター、遺伝子標的ベクター、ＰＡＣ、ＢＡＣ、ＹＡＣ、ＭＡＣ、および逆２ハイブリッドベクターが挙げられるが、これらに限定されない。このようなベクターは、特定のベクターに依存して原核生物系および／または真核生物系において使用され得る。
【００３６】
別の局面において、本発明は、本発明の方法を行う際に使用され得るキットに関し、そしてより具体的には、クローニングキットまたはサブクローニングキットおよびＬＲ反応（Ｒｅａｃｔｉｏｎ）（例えば、発現クローンを作製する）を行うためのキット、ＢＰ反応（例えば、エントリークローンを作製する）を行うためのキット、および本発明のエントリークローンおよび目的ベクター分子を作製するためのキットに関する。このようなキットは、キャリアまたはレセプタクル（任意の数のコンテナをその中に受け、そして保有するために区画化されている）を含み得る。このようなコンテナは、本発明の方法を行うための任意の数の成分、またはこのような成分の組み合わせを含み得る。特に、本発明のキットは、以下からなる群より選択される１以上の成分（または、その組み合わせ）を含み得る：１以上の組換えタンパク質、または補助因子あるいはその組み合わせ、１以上の組換えタンパク質、または補助因子あるいはその組み合わせ、１以上の組成物（例えば、ＧＡＴＥＷＡＹTM  ＬＲ  ＣｌｏｎａｓｅTM  Ｅｎｚｙｍｅ  ＭｉｘまたはＧＡＴＥＷＡＹTM  ＢＰ  ＣｌｉｎａｓｅTM  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ）、１以上の反応緩衝液、１以上のヌクレオチド、１以上の本発明のプライマー、１以上の制限酵素、１以上のリガーゼ、ポリメラーゼ活性を有する１以上のポリペプチド（例えば、１以上の逆転写ポリメラーゼ、またはＤＮＡポリメラーゼ）、１以上のプロテイナーゼ（例えば、プロテイナーゼＫまたは他のプロテイナーゼ）、１以上の目的ベクター分子、１以上のエントリークローン分子、１以上の宿主細胞（例えば、コンピーテントセル（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、酵母細胞、動物細胞（哺乳動物細胞、昆虫細胞、線虫細胞、鳥類細胞、魚類細胞、などを含む）植物細胞、および最も好ましくはＥ．ｃｏｌｉ  ＤＥ３．１宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＬＩＢＲＡＲＹ  ＥＦＦＥＣＩＥＮＣＹ（登録商標）ＤＢ３．１TM  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌ））、本発明のキットを使用するための指示（例えば、本発明の方法を行うため）、など）。関連する局面のおいて、本発明のキットは、以下を含み得る：１以上の組換え部位またはその一部をコードする１以上の核酸分子、特に、本発明の１以上の組換え部位またはその一部をコードするヌクレオチド配列を含む１以上の核酸分子。好ましくは、このような核酸分子は、少なくとも２つの組換え部位を含み、この部位は、選択マーカー（例えば、毒性遺伝子および／または抗生物質耐性遺伝子）に隣接する。好ましい局面において、このような核酸分子は、カセットの形態（例えば、１以上、そして好ましくは２以上の組換え部位またはその一部を含む直鎖状核酸分子）である。
【００３７】
目的の核酸分子に組換え部位を挿入、または付加するためのキットは、１以上のヌクレアーゼ（好ましくは、制限ヌクレアーゼ）、１以上のリガーゼ、１以上のトポイソメラーゼ、１以上のポリメラーゼ、および１以上の組換え部位を含む１以上の核酸分子またはアダプター含み得る。目的の１以上の核酸分子に組換え部位を組み込むためのキットは、１以上の組換え部位を含む１以上の組換え配列ならなる群より選択される１以上の成分（またはその組み合わせ）含み得る。このような組換え配列は、１以上のトランスポゾン、統合ウイルス、相同性組換え配列、ＲＮＡ分子、１以上の宿主細胞などを含み得る。
【００３８】
本発明のエントリークローン分子を作製するための方法は、任意の数または多数の成分を含み得、そしてこのようなキットの組成物は、含まれる特定の方法に依存して異なり得る。このような方法は、本発明の組換えクローニング方法によってか、または従来の分子生物学技術（例えば、制限酵素消化および連結）を使用して、目的の核酸分子をエントリーベクターまたはドナーベクターに挿入する工程を含み得る。好ましい局面において、エントリークローンは、核酸増幅産物または核酸合成産物を使用して作製される。増幅産物または合成産物からのエントリークローン分子を合成するためのキットは、１以上のドナーベクター（例えば、１以上のａｔｔＰベクター（ｐＤＯＮＲ２０１（図４９）、ｐＤＮＯＲ２０２（図５０）、ｐＤＯＮＲ２０３（図５１）、ｐＤＯＮＲ２０４（図５２）、ｐＤＯＮＲ２０５（図５３）、ｐＤＯＮＲ２０６（図５３）、などが挙げられるが、これらに限定されない））からなる群より選択される１以上の成分（またはその組み合わせ）、ポリメラーゼ活性を有する１以上のポリペプチド（好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼおよび最も好ましくは熱安定性ポリメラーゼ）、１以上のプロテイナーゼ、１以上の反応緩衝液、１以上のヌクレオチド、１以上の組換え部位またはその一部を含む１以上のプライマー、および１以上のエントリークローンを作製するための指示を含み得る。
【００３９】
本発明の目的ベクターを作製するためのキットは、含まれる特定の方法に依存して異なり得るこのようなキットの任意の数の成分および組成物を含み得る。このような方法は、本発明の組換え方法または従来の分子生物学的技術（例えば、制限エンドヌクレアーゼ消化および連結）を含み得る。好ましい局面において、目的ベクターは、本発明の少なくとも１つの組換え部位（またはその一部）を含む核酸分子（好ましくは、選択マーカーに隣接する少なくとも２つの組換え部位またはその一部を含む核酸分子）を所望のベクターに挿入し、所望のベクターを本発明の目的ベクターに転換することよって作製される。このようなキットは、１以上の制限エンドヌクレアーゼ、１以上のリガーゼ、１以上のポリメラーゼ、１以上のヌクレオチド、反応緩衝液、少なくとも１つの組換え部位またはその一部を含む１以上の核酸分子（好ましくは、少なくとも１つの選択マーカー（例えば、少なくとも１つの選択マーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子および／または毒性遺伝子）を含むカセット）に隣接する少なくとも２つの組換え部位を含む、少なくとも１つの核酸分子）、およびこのような目的ベクターの作製のための指示からなる群より選択される少なくとも１つの成分（またはその組み合わせ）を含み得る。
【００４０】
本発明はまた、本発明の核酸分子によって生成されるペプチドおよびタンパク質（融合タンパク質であり得る）の同定および／または単離における本発明の抗体を使用するのためのキット、および本発明の核酸分子またはその一部の同定および／または単離のためキットに関する。このようなキットは、本発明の１以上の抗体、１以上の検出可能な標識、１以上の固体支持体などからなる群より選択される１以上の成分（またはその組み合わせ）を含み得る。
【００４１】
本発明の他の好ましい実施形態は、当該分野で公知のことから、以下の本発明の図面および記載から、および請求項から当業者には明らかである。
【００４２】
（発明の詳細な説明）
（定義）
続く説明において、組換えＤＮＡ技術において使用される多くの用語は、広範に利用される。このような用語が与えられるべき範囲を含む、本明細書および請求の範囲の明らかなそして一貫した理解を提供するために、以下の定義が提供される。
【００４３】
副産物は、クローン化またはサブクローン化されることを所望されるセグメントを欠く娘分子（組換えクローニングプロセスの間の２次的な組換え事象の後に産生される新しいクローン）である。
【００４４】
共組込みは、親（出発）分子の両方を含む本発明の少なくとも１つの組換え中間核酸分子である。通常、直線状である。いくつかの実施形態において、環状であり得る。ＲＮＡおよびポリペプチドは、適切な宿主細胞株（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉＤＢ３．１（特に、Ｅ．ｃｏｌｉＬＩＢＲＡＲＹＥＦＦＩＣＩＥＮＣＹ（登録商標）ＤＢ３．１TMＣｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌ））を用いて、そして共組込み分子において見出される両方の選択マーカーについて選択した共組込みから発現され得る。
【００４５】
宿主は、本発明の組換えクローニング産物、ベクター、または核酸分子のレシピエントであり得る任意の原核生物または真核生物である。本明細書中で使用される用語として、「宿主」は、遺伝的に操作され得る原核生物または真核生物を含む。このような宿主の例について、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８２）を参照のこと。
【００４６】
挿入物は、所望される核酸セグメントまたは本発明の方法によって操作され得る核酸セグメントの集団を含む。従って、用語挿入物は、特定の核酸（好ましくは、ＤＮＡ）セグメントまたはセグメントの集団を含むことを意味される。このような挿入物は、１つ以上の核酸分子を含み得る。
【００４７】
挿入物ドナーは、挿入物を運ぶ本発明の２つの親核酸分子（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）の１つである。挿入物ドナー分子は、組換え部位により両側に隣接された挿入物を含む。挿入物ドナーは、直線状または環状であり得る。本発明の１つの実施形態において、挿入物ドナーは、環状ＤＮＡ分子であり、そして組換えシグナルの外側のクローニングベクター配列をさらに含む（図１を参照のこと）。挿入物の集団または核酸セグメントの集団が、挿入物ドナーを作製するために使用される場合、挿入物ドナーの集団が生じ、そして本発明に従って使用され得る。このような挿入物ドナー分子の例は、ＧＡＴＥＷＡＹTMエントリーベクターであり、この例としては、図１０〜２０において描かれるそれらのエントリーベクター、およびライブラリークローンの産生のために、１つ以上のａｔｔＬ部位（例えば、ａｔｔＬ１、ａｔｔＬ２など）により、または１つ以上のａｔｔＢ部位（例えば、ａｔｔＢ１、ａｔｔＢ２など）により隣接された目的の遺伝子を含む他のベクターが挙げられるがこれらに限定されない。
【００４８】
産物は、組換えクローニングプロセスの間に、２次的な組換え事象後に産生されるＡ配列およびＤ配列を含む所望される娘分子の１つである（図１を参照のこと）。この産物は、クローン化またはサブクローン化されるべき核酸を含む。本発明に従って、挿入物ドナーの集団が使用される場合、産物分子の得られた集団は、挿入物ドナーの挿入物の集団の全てまたは一部分を含み、そして好ましくは、挿入物ドナーの元々の分子の代表的な集団を含む。
【００４９】
プロモーターは、開始コドンに近接して位置される、遺伝子の５’領域として一般に記載されるＤＮＡ配列である。隣接するＤＮＡセグメントの転写は、プロモーター領域で開始される。転写の抑制性プロモーター速度は、抑制剤に応答して減少する。転写の誘導プロモーターの速度は、誘導剤に応答して増加する。転写の構成性プロモーターの速度は、特に調節されないが、一般的な代謝状態の影響下で変更し得る。
【００５０】
認識配列：認識配列は、タンパク質、化合物、ＤＮＡ、またはＲＮＡ分子（例えば、制限エンドヌクレアーゼ、改変メチラーゼ、またはリコンビナーゼ）が、認識し、そして結合する特定の配列である。本発明において、認識配列は、通常、組換え部位をいう。例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼのための認識配列は、８塩基対コア配列に隣接している２つの１３塩基対逆方向反復（リコンビナーゼ結合部位として働く）から構成される３４塩基対配列であるｌｏｘＰである。Ｓａｕｅｒ，Ｂ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５：５２１−５２７（１９９４）を参照のこと。認識配列の他の例は、リコンビナーゼ酵素λインテグラーゼにより認識されるａｔｔＢ配列、ａｔｔＰ配列、ａｔｔＬ配列、およびａｔｔＲ配列である。ａｔｔＢは、２つの９塩基対コアタイプのＩｎｔ結合部位および１つの７塩基対オーバーラップ領域を含むおよそ２５塩基対配列である。ａｔｔＰは、コアタイプＩｎｔ結合部位およびアーム（ａｒｍ）タイプＩｎｔ結合部位ならびに補助タンパク質組込み宿主因子（ＩＨＦ）、ＦＩＳおよびエキシジョナーゼ（Ｘｉｓ）についての部位を含む、およそ２４０塩基対配列ある。Ｌａｎｄｙ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３：６９９−７０７（１９９３）を参照のこと。このような部位はまた、本発明の方法において、産物の産生を高める本発明に従って、操作され得る。このような操作された部位が、Ｐ１ドメインまたはＨ１ドメインを欠いて、組換え反応を不可逆にさせる（例えば、ａｔｔＲまたはａｔｔＰ）場合、このような部位は、これらの部位のドメインがいくつかの方法において改変されていることを示す、指定されたａｔｔＲ’またはａｔｔＰ’であり得る。
【００５１】
組換えタンパク質としては、除去（ｅｘｃｉｓｉｖｅ）タンパク質または組込み（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）タンパク質、酵素、補因子、または１つ以上の組換え部位を含む組換え反応に関わる関連タンパク質が挙げられ、こらは、野生型タンパク質（Ｌａｎｄｙ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３：６９９−７０７（１９９３）を参照のこと）、または変異体、誘導体（例えば、組換えタンパク質配列またはそのフラグメントを含む融合タンパク質）、フラグメント、およびその改変体であり得る。
【００５２】
組換え部位は、本発明の組換えクローニング方法によって、組込み（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）／組換え反応に参加するＤＮＡ分子における認識配列である。組換え部位は、組込みまたは組換えの開始段階の間に部位特異的組換えタンパク質によって認識され、そして結合される、この参加する核酸分子におけるＤＮＡの個々の部分またはセグメントである。例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼについての組換え部位は、８塩基対コア配列に隣接する２つの１３塩基対逆方向反復（リコンビナーゼ結合部位として働く）から構成される３４塩基対配列であるｌｏｘＰである。Ｓａｕｅｒ，Ｂ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．５：５２１−５２７（１９９４）の図１を参照のこと。認識配列の他の例としては、本明細書中に記載される、ａｔｔＢ配列、ａｔｔＰ配列、ａｔｔＬ配列、およびａｔｔＲ配列、ならびにその変異体、フラグメント、改変体および誘導体が挙げられ、これらは、組換えタンパク質λ  Ｉｎｔによって、および補助タンパク質組込み宿主因子（ＩＨＦ）、ＦＩＳおよびエキシジョナーゼ（Ｘｉｓ）によって認識される。Ｌａｎｄｙ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３：６９９−７０７（１９９３）を参照のこと。
【００５３】
組換えクローニングは、本明細書中に記載される方法であり、これによって、核酸分子のセグメントまたはこのような分子の集団が、インビトロまたはインビボで、交換され、挿入され、戻され（ｒｅｐｌａｃｅ）、置換されまたは改変される。本明細書中における「インビトロ」および「インビボ」によって、それぞれ、宿主細胞の外（例えば、無細胞系）または宿主細胞の中（例えば、宿主細胞によって発現される組換えタンパク質を使用して）で行われる組換えクローニングが意味される。
【００５４】
抑制（ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）カセットは、サブクローニングベクターに存在するリプレッサーまたは選択マーカーを含む、核酸セグメントである。
【００５５】
選択マーカーは、あるものを、しばしば特定の条件下で、分子（例えば、レプリコン）またはその分子を含む細胞についてあるいはそれらに対して、選択を可能にするＤＮＡセグメントである。これらのマーカーは、活性（例えば、限定されないが、ＲＮＡ、ペプチド、またはタンパク質の産生）をコードし得、またはＲＮＡ、ペプチド、タンパク質、無機化合物または無機組成物および有機化合物または有機組成物などに対する結合部位を提供し得る。選択マーカーの実施例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：（１）異なった毒性化合物（例えば、抗生物質）に対する耐性を提供する産物をコードするＤＮＡセグメント；（２）レシピエント細胞においてその他の点で欠損している産物をコードするＤＮＡセグメント（例えば、ｔＲＮＡ遺伝子、栄養要求性マーカー）；（３）遺伝子産物の活性を抑制する産物をコードするＤＮＡセグメント；（４）容易に同定され得る産物をコードするＤＮＡセグメント（例えば、β−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、および細胞表面タンパク質、のような表現型マーカー）；（５）細胞生存および／または機能に対して違ったふうに有害である産物を結合するＤＮＡセグメント；（６）上記番号１〜５において記載されるＤＮＡセグメントのいずれかの活性を、別のやり方で阻害するＤＮＡセグメント（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）；（７）基質を改変する産物を結合するＤＮＡセグメント（例えば、制限エンドヌクレアーゼ）；（８）所望される分子を単離または同定するために使用され得るＤＮＡセグメント（例えば、特定のタンパク質結合部位）；（９）他の非機能性（ｎｏｎ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）であり得る特定のヌクレオチド配列をコードするＤＮＡセグメント（例えば、分子の部分母集団のＰＣＲ増幅について）；（１０）ＤＮＡセグメントであって、これが存在しない場合、直接的または間接的に、特定の化合物に対する耐性または感受性を与えるＤＮＡセグメント；（１１）レシピエント細胞において毒性である産物をコードするＤＮＡセグメント；（１２）ＤＮＡセグメントを含む核酸分子の複製、分配（ｐａｒｔｉｔｉｏｎ）または遺伝力（ｈｅｒｉｔａｂｉｌｉｔｙ）を阻害するそのＤＮＡセグメント；および／または（１３）条件的複製機能（例えば、特定の宿主または宿主細胞株における複製あるいは特定の環境条件（例えば、温度、栄養条件など）下での複製）をコードするＤＮＡセグメント。
【００５６】
選択スキームは、エントリークローン、またはベクター、目的ベクター、ドナーベクター、発現クローンまたは発現ベクター、任意の中間体（例えば、共組込み物またはレプリコン）、および／または副産物を含む混合物由来の所望された産物の選択、富化、または同定を可能にする任意の方法である。１つの好ましい実施形態の選択スキームは、組換えクローニングの間に結合されるかまたは結合されないいずれかの少なくとも２つの成分有する。１つの成分は、選択マーカーである。他の成分は、選択マーカーのインビトロまたはインビボでの発現、あるいは選択マーカーを運ぶプラスミドを保有する細胞（または核酸分子（例えば、レプリコン））の生存を制御する。一般に、この制御エレメントは、選択マーカーのリプレッサーまたはインデューサーであるが、選択マーカーの発現または活性を制御する他の方法が使用され得る。リプレッサーが使用されるかまたはアクチベーターが使用されるかは、マーカーが陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）選択についてかまたは陰性（ｎｅｇａｔｉｖｅ）選択についてか、および種々のＤＮＡセグメントの正確な配置に依存し、それは当業者に容易に明らかである。好ましい要求は、この選択スキームが、１つ以上の所望の産物のみの選択またはこれらのみについての富化を生じることである。本明細書中で定義されるように、ＤＮＡ分子について選択する工程は、（ａ）所望されるＤＮＡ分子の存在について選択するかまたは富化する工程、および（ｂ）所望されるＤＮＡ分子でないＤＮＡ分子の存在に対して選択するかまたは富化する工程を包含する。
【００５７】
１つの実施形態において、選択スキーム（これは逆に行われ得る）は、３つの形態のうちの１つをとり、これらは、図１よって議論される。第１は、選択マーカーおよびリプレッサーと共に本明細書中で例示され、従って、セグメントＤを有し、そしてセグメントＣを欠く分子に対して選択する。第２は、セグメントＣを有する分子に対して、およびセグメントＤを有する分子について選択する。第２の形態の可能な実施形態は、インビトロの反応産物が導入されるべき細胞に毒性遺伝子（ｇｅｎｅ  ｔｏｘｉｃ）を運ぶＤＮＡセグメントを有する。毒性遺伝子は、毒性（ｔｏｘｉｃ）遺伝子産物（毒性タンパク質または毒性ＲＮＡ）として発現されるＤＮＡであり得るか、またはそれ自体毒性であり得、そして自然に（ｏｆ  ｉｔｓｅｌｆ）毒性であり得る（後者の場合、毒性遺伝子は、「遺伝特性（ｈｅｒｉｔａｂｌｅ  ｔｒａｉｔ）」のその古典的な定義を持つことが理解される）。
【００５８】
このような毒性遺伝子産物の例は、当該分野で周知であり、そして以下を含むが、これらに限定されない：制限エンドヌクレアーゼ（例えば、ＤｐｎＩ）、アポトーシス関連遺伝子（例えば、ＡＳＫ１またはｂｃｌ−２／ｃｅｄ−９ファミリーのメンバー）、ヒト免疫欠損ウイルス（ＨＩＶ）の遺伝子を含むレトロウイルス遺伝子、ＮＰ−１のようなディフェンシン、転換された反復ＤＮＡ配列または対向パリンドロームＤＮＡ配列、ΦＸ１７４またはバクテリアファージＴ４由来の遺伝子のようなバクテリアファージリーシス遺伝子；ｒｐｓＬのような抗生物質感受性遺伝子、ｐｈｅＳのような抗菌感受性遺伝子、プラスミドキラー遺伝子、細菌に対して遺伝子産物の毒性を産生する真核生物転写ベクター遺伝子（例えば、ＧＡＴＡ−１）および抑制機能の非存在下において、宿主を死滅させる遺伝子（例えば、ｋｉｃＢ、ｃｃｄＢ、ΦＸ１７４Ｅ）（Ｌｉｕ，Ｑら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．８：１３００〜１３０９（１９９８））、ならびにレプリコン安定性および／または複製に消極的に影響を及ぼす他の遺伝子。あるいは、毒性遺伝子は、インビボで選択され得る（例えば、制限部位）。
【００５９】
誘導プロモーターに作動可能に結合される制限エンドヌクレアーゼについての多くの遺伝子コードは、公知であり、そして本発明において使用され得る。例えば、米国特許第４，９６０，７０７号（ＤｐｎＩおよびＤｐｎＩＩ）；同第５，０００，３３３号、同第５，０８２，７８４号および同第５，１９２，６７５号（ＫｐｎＩ）；同第５，４７，８００号（ＮｇｏＡＩＩＩおよびＮｇｏＡＩ）；同第５，１７９，０１５号（ＦｓｐＩおよびＨａｅＩＩＩ）：同第５，２００，３３３号（ＨａｅＩＩおよびＴａｑＩ）；同第５，２４８，６０５号（ＨｐａＩＩ）；同第５，３１２，７４６号（ＣｌａＩ）；同第５，２３１，０２１号および同第５，３０４，４８０号（ＸｈｏＩおよびＸｈｏＩＩ）；同第５，３３４，５２６号（ＡｌｕＩ）；同第５，４７０，７４０号（ＮｓｉＩ）；同第５，５３４，４２８号（ＳｓｔＩ／ＳａｃＩ）；同第５，２０２，２４８号（ＮｃｏＩ）；同第５，１３９，９４２号（ＮｄｅＩ）および同第５，０９８，８３９号（ＰａｃＩ）を参照のこと。Ｗｉｌｓｏｎ，Ｇ．Ｇ．、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：２５３９〜２５６６(１９９１);およびＬｕｎｎｅｎ，Ｋ．Ｄ．ら、Ｇｅｎｅ  ７４：２５〜３２（１９８８）も参照のこと。
【００６０】
第２の形態において、セグメントＤは、選択可（Ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ）マーカーを有する。毒性遺伝子は、ベクタードナー（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｄｏｎｏｒ）、共挿入（Ｃｏｉｎｔｅｇｒａｔｅ）、および副産物（Ｂｙｐｒｏｄｕｃｔ）分子を有する形質転換を排除するが、一方で選択マーカーは、この産物（Ｐｒｏｄｕｃｔ）を含む細胞について、そして挿入ドナー（Ｉｎｓｅｒｔ  Ｄｏｎｅｒ）のみを有する細胞に対して、選択するために使用され得る。
【００６１】
第３の形態は、同一分子においてシスであるセグメントＡおよびＤの両方を有する細胞を選択するが、異種分子においてトランスであるセグメントの両方を有する細胞を選択しない。このことは、２つの不活性フラグメント（これらは各々、セグメントＡおよびＤ上にある）に分裂される選択マーカーによって実施され得る。
【００６２】
フラグメントは、組換え部位に比較して配置され、セグメントが組換え事象によって一緒にもたらされる場合、それらは、機能性選択マーカーを再構成する。例えば、組換え事象は、プロモーターを構造核酸分子（例えば、遺伝子）と結合させ得、構造核酸分子の２つのフラグメントを結合させ得るか、または生存に必要なへテロ二量体遺伝子産物をコードする核酸分子を結合させ得るか、あるいはレプリコンの部分を結合させ得る。
【００６３】
部位特異的リコンビナーゼ：は、少なくとも以下の４つの成分（ａｃｔｉｖｅｓ）（またはそれらの組合せ）を代表的に有する型のリコンビナーゼである：（１）１つまたは２つの特異的核酸配列の認識；（２）この配列（単数または複数）の切断；（３）鎖交換に関するトポイソメラーゼ活性；および（４）切断された核酸の鎖を再び封じるリガーゼ活性。Ｓａｕｅｒ，Ｂ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｉｎｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５：５２１〜５２７（１９９４）を参照のこと。保存的な部位特異的組換えは、パートナー両方についての高い配列特異性によって、相同性組換えと転移とを区別する。この鎖交換機構は、ＤＮＡ合成の非存在下で特異的ＤＮＡ配列の切断および再結合を含む（Ｌａｎｄｙ，Ａ（１９８９）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５８：９１３〜９４９）。
【００６４】
サブクローニングベクター：は、好ましくは適切なレプリコンを含む環状または直鎖状の核酸分子を含むクローニングベクターである。本発明において、サブクローニングベクター（図１中のセグメントＤ）はまた、クローン化ＤＮＡ挿入物（図１中のセグメントＡ）に作用するか、またはこれと共に作用する最終産物に組み込まれることが望ましい機能エレメントおよび／または制御エレメントを含み得る。このサブクローニングベクターはまた、選択マーカー（好ましくはＤＮＡ）を含み得る。
【００６５】
ベクター：は、挿入に対して有用な生物学的特性または生化学的特性を提供する核酸分子（好ましくはＤＮＡ）である。例としては、プラスミド、ファージ、自動で繰り返す配列（ＡＲＳ）る配列、動原体およびインビトロまたは宿主において繰り返し得るか、または繰り返され得る配列、あるいは宿主細胞内で所望の位置に所望の核酸セグメントを伝達し得る他の配列が挙げられ得る。ベクターは、１以上の制限エンドヌクレアーゼ認識部位を有し得、ここで、この配列は、ベクターの基本的な生物学的機能の欠失を伴なわない決定様式で切断され得、そしてこの核酸フラグメントに、その複製およびクローニングをもたらすためにスプライスされ得る。ベクターは、プライマー部位（例えば、ＰＣＲのための）、転写開始部位および／または翻訳開始部位ならびに／あるいは調節部位、組換えシグナル、レプリコン、選択マーカーなどをさらに提供し得る。明らかに、相同性組換え、転移または制限酵素の使用を必要としない所望の核酸フラグメントの挿入の方法（例えば、ＰＣＲフラグメントのＵＤＧクローニング（米国特許第５，３３４，５７５号（本明細書中で全体が参考として援用される））、Ｔ：Ａクローニングなどを含むが、これらに限定されない）はまた、本発明に従って使用され得るクローニングベクターにフラグメントをクローニングするために適用され得る。このクローニングベクターはさらに、クローニングベクターで形質転換される細胞を同定する際の使用に適切な１以上の選択マーカーを含み得る。
【００６６】
ベクタードナー：は、本発明の２つの親の核酸分子（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）の１つである。この核酸分子は、所望の産物の一部となるＤＮＡベクターを含むＤＮＡセグメントを有する。このベクタードナーは、サブクローニングベクターＤ（または、それは、挿入ベクターが既にクローニングベクター（例えば、ＰＣＲについて、ａｔｔＢ部位を含むフラグメント；以下参照のこと）を含まない場合、クローニングベクターと呼ばれ得る）および組換え部位にに隣接するセグメントＣを含む（図１を参照のこと）。セグメントＣおよび／またはＤは、選択スキームについて上記されるように、所望の産物の娘分子についての選択に寄与するエレメントを含み得る。組換えシグナルは、同一であり得るか、または異なり得、そして同じか、または異なるリコンビナーゼによって作用され得る。さらに、ベクタードナーは、線状または環状であり得る。このようなベクタードナー分子の例としては、ＧＡＴＥＷＡＹTM目的（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ）ベクターが挙げられ、図２１〜４７および９０〜９６中に示されるこれらの目的ベクターを含むが、これらに限定されない。
【００６７】
プライマー：は、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子）の増幅または重合化の間、ヌクレオチドモノマーの共有結合によって伸長される一本鎖ヌクレオチドまたは二本鎖ヌクレオチドをいう。好ましい局面において、プライマーは、１以上の組換え部位またはこのような組換え部位の一部を含む。組換え部位の一部は、目的の組換え部位の、少なくとも２つの塩基（すなわち、塩基対「ｂｐ」と本明細書中で省略される）、少なくとも５〜２００塩基、少なくとも１０〜１００塩基、少なくとも１５〜７５塩基、少なくとも１５〜５０塩基、少なくとも１５〜２５塩基、または少なくとも１６〜２５塩基を含み、以下および実施例において、さらに詳細に記載される。組換え部位の一部を使用する場合、組換え部位の欠損部分は、新規に合成された核酸分子によるテンプレートとして提供され得る。このような組換え部位は、このプライマーの１つの末端または両末端内におよび／またはそこにおいて配置され得る。好ましくは、さらなる配列は、組換えを増強または改良し、ならびに／あるいは組換えの間組換え部位を安定化するための組換え部位（単数または複数）に隣接するプライマーに添加される。このような安定化配列は、任意長の任意の配列（好ましくは、Ｇ／Ｃに富む配列）であり得る。好ましくは、このような配列は、１〜約１０００塩基、１〜約５００塩基ならびに１〜約１００塩基、１〜約６０塩基、１〜約２５塩基、１〜約１０塩基、２〜約１０塩基および好ましくは約４塩基のサイズの範囲である。好ましくは、このような配列は、１塩基長より長く、そして好ましくは２塩基長より長い。
【００６８】
テンプレート：は、増幅、合成または配列決定される二本鎖核酸分子または一本鎖核酸分子をいう。二本鎖分子の場合、第１および第２の鎖を形成するためのその鎖の変性は、好ましくは、これらの分子が、増幅、合成、または配列決定されるか、またはこの二本鎖分子が、テンプレートとして直接的に使用され得る前に、実行される。一本鎖テンプレートについて、このテンプレートの一部に相補的なプライマーは、適切な条件下でハイブリダイズされ、次いで、ポリメラーゼ活性を有する１以上のポリペプチド（例えば、ＤＮＡポリメラーゼおよび／または逆転写酵素）は、このテンプレートの全てまたは一部に相補的な核酸分子を合成し得る。あるいは、二本鎖テンプレートについて、１以上のプロモーターは、このテンプレートの全てまたは一部に相補的な核酸分子を作製するための１以上のポリメラーゼと組合せて使用され得る。本発明に従って、新規に合成された分子は、元のテンプレート長と等しいかまたはこれより短くあり得る。さらに、核酸テンプレートの集団は、合成または増幅の間使用され、元のテンプレート集団の代表的な核酸分子の集団を産生し得る。
【００６９】
アダプター：は、オリゴヌクレオチドまたは核酸フラグメントもしくは１以上の組換え部位（またはこのような組換え部位の部分）を含むセグメント（好ましくはＤＮＡ）である。本発明に従って、これは、本明細書中で記載される環状または直線状挿入ドナー分子ならびに他の核酸分子に添加され得る。組換え部位の一部を使用する場合、欠損部位は、挿入ドナー分子によって提供され得る。このようなアダプターは、環状または直線状分子内の任意の位置で添加され得るが、このアダプターは、好ましくは、直線状分子の末端の１つまたは両末端においてまたはその付近で、添加され得る。好ましくは、アダプターは、目的の特定の核酸分子に（隣接する）両方の部位で位置づけられるように配置される。本発明に従って、アダプターは、標準的組換え技術（例えば、制限的消化および連合）によって目的の核酸分子に添加され得る。例えば、アダプターは、適切な制限酵素での第１の分子の消化によって環状分子に添加され得、切断部位でアダプターを添加し、そして切断部位でアダプターを含む環状分子を再形成する。他の局面において、アダプターは、ＲＮＡ分子などの組込みによる、相同性組換えによって添加され得る。あるいは、アダプターは、直線状分子の１以上の末端および好ましくはこの両方の末端に直接的に連合され得、それにより、１つの末端または両方の末端でアダプターを有する直線分子（単数または複数）を生じる。本発明の１つの局面において、アダプターは、直線状分子の集団（例えば、切断または消化されているｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムＤＮＡ）に添加され、この集団の全てまたは実質的部分の１つの末端および好ましくは両方の末端でアダプターを含む直線状分子の集団を形成し得る。
【００７０】
アダプター−プライマー：は、１以上の組換え部位（またはこのような組換え部位の一部）を含むプライマー分子であり、本発明に従って、本明細書中に記載される環状または直線状の核酸分子に添加され得る。組替え部位の一部を使用する場合、欠損部位は、本発明の核酸分子（例えば、アダプター）によって提供され得る。このようなアダプター−プライマーは、環状または直線状分子内の任意の位置で添加され得るが、このアダプター−プライマーは、好ましくは直線状分子の１つの末端または両方の末端においてもしくはこの付近で添加され得る。本発明の方法に従うこのようなアダプター−プライマーおよびその使用の例は、本明細書中の実施例２５中に示される。このようなアダプター−プライマーは、種々の状況において、かつ種々の技術（増幅（例えば、ＰＣＲ）、結合（例えば、酵素的結合または化学的／合成的結合）、組換え（例えば、相同組換えまたは非相同（非正統的）組換え）などを含むが、これらに限定されない）によって、環状または直線状核酸分子に１以上の組換え部位またはその一部を添加するために使用され得る。
【００７１】
ライブラリー：とは、核酸分子（環状または直線状）の収集をいう。１つの実施形態において、ライブラリーは、複数の（すなわち、２つ以上の）ＤＮＡ分子を含み得、これは、共通のソース（ｓｏｕｒｃｅ）生物体、ソース器官、ソース組織またはソース細胞由来であってもなくてもよい。別の実施形態において、ライブラリーは、生物体（「ゲノム」ライブライリー）のＤＮＡ含量のすべてまたは一部もしくは有意な部分の代表であるか、または細胞、組織、器官または生物体における発現された核酸分子（ｃＤＮＡライブラリー）のすべてまたは一部もしくは有意な部分の核酸分子の代表のセットである。ライブラリーはまた、新規な合成により作製されたランダム配列、１以上の配列の変異誘発などを含み得る。このようなライブラリーは、１以上のベクターにおいて含まれても含まれなくてもよい。
【００７２】
増幅：とは、ポリメラーゼを使用することでヌクレオチド配列の多くのコピーを増大させるための任意のインビトロの方法をいう。核酸増幅は、ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子、あるいはプライマーへのヌクレオチドの取り込みを生じ、それによってテンプレートに相補的な新規の分子を形成する。形成された核酸分子およびそのテンプレートは、さらなる核酸分子を合成するためのテンプレートとして使用され得る。本明細書中で使用される場合、１つの増幅反応は、多数回の複製からなり得る。ＤＮＡ増幅反応としては、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が挙げられる。１つのＰＣＲ反応は、ＤＮＡ分子の５〜１００「サイクル」の変性および合成からなり得る。
【００７３】
オリゴヌクレオチド：とは、１つのヌクレオチドのデオキシリボースまたはリボースの３’部分と隣接するヌクレオチドのデオキシリボースまたはリボースの５’部分との間でリン酸ジエステル結合によって結合される共有結合性のヌクレオチド配列を含む合成的分子または天然分子をいう。この用語は、この用語が特異的にいう核酸分子の任意の特異的な長さを必要に示すこれらの用語のいずれかを伴なわずに、用語「核酸分子」および「ポリヌクレオチド」と共に本明細書中で交換可能に使用され得る。
【００７４】
ヌクレオチド：とは、塩基−糖−リン酸エステル結合をいう。ヌクレオチドは、核酸分子の（ＤＮＡおよびＲＮＡ）のモノマー単位である。用語ヌクレオチドは、リボヌクレオシド三リン酸エステルＡＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＧ、ＧＴＰおよびデオキシリボヌクレオシド三リン酸（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＩＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、またはその誘導体）を含む。このような誘導体としては、例えば、［αＳ］ｄＡＴＰ、７−デアザ−ｄＧＴＰおよび７−デアザ−ｄＡＴＰが挙げられる。用語ヌクレオチドとはまた、本明細書中で使用される場合、ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸エステル（ｄｄＮＴＰ）およびその誘導体をもいう。ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸エステルの例示の例は、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰ、およびｄｄＴＴＰを含むが、これらに限定されない。本発明に従って、「ヌクレオチド」は、周知の技術によって非標識され得るかまたは検出可能に標識され得る。検出可能な標識は、例えば、放射性同位体、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識および酵素標識を含む。
【００７５】
ハイブリダイゼーション：用語「ハイブリダイゼーション」および「ハイブリダイズする」とは、二本鎖分子を産生する２つの相補的な一本鎖核酸分子（ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）の塩基対をいう。本明細書中で使用される場合、２つの核酸分子は、ハイブリダイズされ得るが、この塩基対は、完全に相補的ではない。従って、ミスマッチ塩基は、当該分野で周知の適切な条件が使用される場合、２つの核酸分子のハイブリダイゼーションを妨げない。幾つかの局面において、ハイブリダイゼーションは、「ストリンジェントな条件」下であるといわれる。本明細書中で使用される場合、「ストリンジェントな条件」に関しては、以下：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭ  クエン酸トリナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、１０％硫酸デキストランおよび２０ｇ／ｍｌの変性、剪断サケ精子ＤＮＡ、を含む溶液中での４２℃における一晩のインキュベーション、続いて約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中のフィルターの洗浄を意味する。
【００７６】
本明細書中で使用される組換えＤＮＡ技術ならびに分子生物学および細胞生物学の分野において使用される他の用語は、一般的に適用可能な分野の当業者に理解される。
【００７７】
（概要）
２つの反応は、図１中に一般的に示される、本明細書中で「ＧＡＴＥＷＡＹTMＣｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ」としていわれる、本発明の組換えクローニング系を構成する。これらの反応の第１であるＬＲ反応（図２）（本明細書中で目的反応（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）としても交換可能にいわれ得る）は、この系の主な経路である。ＬＲ反応は、エントリー（Ｅｎｔｒｙ）ベクターまたはクローンと目的ベクターとの間の、本明細書中で記載されるＧＡＴＥＷＡＹTM  ＬＲ  ＣｌｏｎａｓｅTM  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘのような組換えタンパク質のカクテルによって媒介される、組換え反応である。この反応は、発現クローンを産生するために、目的の核酸分子（これは、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｃＤＮＡライブラリーまたはそのフラグメントであり得る）をエントリークローンから発現ベクターへと転移する。
【００７８】
Ｌ、Ｒ、ＢおよびＰを標識された部位は、バクテリオファージλ組換えタンパク質について、それぞれａｔｔＬ、ａｔｔＲ、ａｔｔＢおよびａｔｔＰ組換え部位である。バクテリオファージλ組換えタンパク質は、Ｃｌｏｎａｓｅカクテル（本明細書中では多様に、「Ｃｌｏｎａｓｅ」または「ＧＡＴＥＷＡＹTMＬＲ  ＣｌｏｎａｓｅTMＥｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ」（本明細書中で記載されるように、ａｔｔＢ×ａｔｔＰ組換え反応を媒介する組換えタンパク質混合物のため）として言及される）を構成する。この組換えクローニング反応は、関連する、高度に特異的な切断反応および結合反応に等価である。このような観点により、組換えタンパク質は、エントリークローンにおける目的の核酸分子の左および右に対して切断し、そして目的ベクターにこれを結合させ、新規な発現クローンを産生する。
【００７９】
発現クローンにおける目的の核酸分子は、小さなａｔｔＢ１部位およびａｔｔＢ２部位によって隣接される。目的の核酸分子の配向およびリーディングフレームは、サブクローニングを通して維持される。なぜなら、ａｔｔＬ１は、ａｔｔＲ１のみと反応し、そしてａｔｔＬ２は、ａｔｔＲ２とのみ反応するためである。同様に、ａｔｔＢ１は、ａｔｔＰ１とのみ反応し、そしてａｔｔＢ２は、ａｔｔＲ２とのみ反応する。従って、本発明はまた、特異的に変更または増強され得る、（その改変体、フラグメント、変異体、および誘導体を含む）本発明の組換え部位（またはその一部）を使用する、制御されたクローニングまたは方向性クローニングの方法に関する。本発明はまた、任意の数の組換え部位パートナーまたは組合せにより一般的に関する（ここで、各組換え部位は、その対応する組換え部位に特異的でかつこれと相互作用する）。このような組換え部位は、好ましくは、組換え部位を変異または改変することにより作製され、任意の数の必要な特異性（例えば、ａｔｔＢ１−１０、ａｔｔＰ１−１０、ａｔｔＬ１−１０、ａｔｔＲ１−１０など）を提供し、これらの非限定の例は、本明細書中の実施例に詳細に記載される。
【００８０】
組換え反応物からのアリコートが、宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）へ形質転換され、そして適切な選択剤（例えば、メチシリンを含むか含まない、アンピシリンのような抗生物質）を含むプレート上に展開する場合、細胞は、コロニーから所望のクローンを取り込む。未反応の目的ベクター（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ）は、アンピシリン耐性遺伝子を保有するが、アンピシリン耐性コロニーを与えない。なぜならば、毒性遺伝子（例えば、ｃｃｄＢ）を含むからである。従って、アンピシリン耐性についての選択は、所望の産物を有するＥ．ｃｏｌｉ細胞を選択し、通常、アンピシリンプレート上の９０％を超えるコロニーを含む。
【００８１】
Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎａｌ（または「ＧＡＴＥＷＡＹTM」）クローニング反応（Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）に関連して、目的の核酸分子は、始めにエントリーベクター（Ｅｎｔｒｙ  Ｖｅｃｔｏｒ）中にクローン化され、エントリークローン（Ｅｎｔｒｙ  Ｃｌｏｎｅ）を作成する。複数の選択肢が、エントリークローンを作成するために利用可能である。この選択肢としては、エントリーベクターへの末端ａｔｔＢ組換え部位を有するＰＣＲ配列のクローン化；ＧＡＴＥＷＡＹTM  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ組換え反応の使用；エントリーベクターへの組換えによるＧＡＴＥＷＡＹTM  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍベクターにおいて調製されたライブラリー由来の遺伝子の移入；ならびに標準の組換えＤＮＡ方法による、制限酵素により生成したフラグメントおよびＰＣＲフラグメントのエントリーベクターへのクローン化が挙げられる。これらの試みは、本明細書中でさらに詳細に議論される。
【００８２】
ＧＡＴＥＷＡＹTM  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍの重要な利点は、目的の核酸分子（または、目的の核酸分子の集団でさえも）、およそ、約３０秒〜６０分間（好ましくは、約１〜６０分、約１〜４５分、約１〜３０分、約２〜６０分、約２〜４５分、約２〜３０分、約１〜２分、約３０〜６０分、約４５〜６０分、または約３０〜４５分）の単純な反応で１つ以上の目的ベクター中に並行してサブクローン化され得るエントリークローンとして存在することである。特に、本明細書中の実施例に記載されるように、より大きな核酸分子が使用される場合、より長い反応時間（例えば、２〜２４時間または一晩）は、組換え効率を増加し得る。さらに、所望の発現クローンを保有する高い割合のコロニーが得られる。このプロセスは、図３に概略的に図示され、これは、目的の分子が、複数の目的ベクターに同時にまたは別々に移され得る、本発明の利点を示す。ＬＥ反応（ＬＥ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）において、組み換えられる核酸分子の１つまたは両方は、任意の位相幾何（例えば、直線状、緩んだ環状、ニックの環状、高次コイル状など）を有し得るが、１つまたは両方は、好ましくは直線状である。
【００８３】
ＧＡＴＥＷＡＹTM  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍの第２の主要な経路は、ＢＰ反応（ＢＰ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）（図４）である。これはまた、エントリー反応（Ｅｎｔｒｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）またはゲートウォード反応（Ｇａｔｅｗａｒｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）として本明細書中で交換可能にいわれる。このＢＰ反応は、ドナープラスミド（Ｄｏｎｏｒ  Ｐｌａｓｍｉｄ）と発現クローン（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｃｌｏｎｅ）（図２における副生物の対応物）を組み換え得る。この反応は、エントリーベクターへ、発現クローン（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｃｌｏｎｅ）中の目的の核酸分子（これは、直線状、コイル状、高次コイル状などの種々の位相幾何のいずれかを有する）を移入し、新たなエントリークローンを生成する。一旦、この目的の核酸分子がエントリーベクターへクローン化されると、これは、上記のようにＬＥ反応（ＬＥ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）を介して新しい発現ベクターの移入され得る。ＢＰ反応において、組み換えられる核酸分子の１つまたは両方は、任意の位相幾何（例えば、直線状、緩んだ環状、ニックの環状、高次コイル状など）を有し得が、１つまたは両方は、好ましくは直線状である。
【００８４】
ＢＰ反応の有用なバリエーションは、増幅（例えば、ＰＣＲ）の産物の迅速なクローニングおよび発現または核酸合成を可能にする。末端の２５ｂｐのａｔｔＢ部位を含むプライマーを用いて合成された増幅（例えば、ＰＣＲ）の産物は、ゲートウォードクローニング反応のための効率的な基質として機能する。このような増幅産物は、ドナーベクターと組み換えられ、エントリークローンを作成し得る（図７を参照のこと）。この結果は、増幅フラグメントを含むエントリークローンである。次いで、このようなエントリークローンは、（ＬＥ反応を介して）目的ベクターと組み換えられ得、ＰＣＲ産物の発現クローンを得る。
【００８５】
ＬＲ反応のさらなる詳細が、図５Ａに示される。この反応を媒介するＧＡＴＥＷＡＹTM  ＬＲ  ＣｌｏｎａｓｅTM酵素混合物（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ）は、λ組換えタンパク質である、Ｉｎｔ（Ｉｎｔｅｇｒａｓｅ）、Ｘｉｓ（Ｅｘｃｉｓｉｏｎａｓｅ）およびＩＨＦ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  Ｈｏｓｔ  Ｆａｃｔｏｒ）含む。対照的に、ＢＰ反応（図５Ｂ）を媒介するＧＡＴＥＷＡＹTM  ＢＰ  ＣｌｏｎａｓｅTM酵素混合物は、ＩｎｔおよびＩＨＦのみを含む。
【００８６】
各ベクターの組換え（ａｔｔ）部位は、親ベクターにより与えられる、２つの異なるセグメントを含む。図５Ａおよび図５Ｂに記載される、各ａｔｔ部位の２つの部分を分割している千鳥模様のラインは、組換え反応中にＩｎｔにより生成される７塩基段差切断を示す。この構造は、図６においてより詳細に示され、これは、エントリークローンのａｔｔＬ１およびａｔｔＬ２部位と目的ベクターのａｔｔＲ１およびａｔｔＲ２との間の組換えにより生成される、発現クローンのａｔｔＢ組換え配列を示す。
【００８７】
発現クローン中の目的の核酸分子は、ａｔｔＢ部位に隣接し：ａｔｔＢ１は、左（アミノ末端）に対応し、そしてａｔｔＢ２は、右（カルボキシ末端）に対応する。Ｉｎｔにより生成される７塩基段差切断の左へのａｔｔＢ１中の塩基は、目的ベクターに由来し、そして段差切断の右への塩基は、エントリーベクターに由来する（図６を参照のこと）。この配列が、オープンリーディングフレームに対応して３通りで示されることに注意。エントリーベクターにクローン化される目的の核酸分子のリーディングフレームがａｔｔＢ１について示されるレーディングフレームと位相が一致する場合、アミノ末端タンパク質融合物は、目的の核酸分子とアミノ末端融合ドメインをコードするＧＡＴＥＷＡＹTM  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  目的ベクターとの間で作成され得る。３つ全てのリーディングフレームにおいてクローン化され得るエントリーベクターおよび目的ベクターは、本明細書中で（特に、実施例において）より詳細に記載される。
【００８８】
このＬＲ反応は、種々の目的ベクターとエントリークローンを組換えることにより、新たな発現ベクターに目的の所望の核酸分子の移入を可能にする。しかし、ＬＲ反応または目的反応（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）に関連して、目的の核酸分子は、好ましくは、始めにエントリークローンに変換される。エントリークローンは、図７に示されるように、いくつかの方法で作成され得る。
【００８９】
１つの試みは、制限酵素およびリガーゼを用いて、標準の組換えＤＮＡ方法を使用して、１つ以上のエントリーベクターに目的の核酸分子をクローン化することである。開始ＤＮＡフラグメントは、制限酵素消化によるかまたはＰＣＲ産物として生成され得る。このフラグメントは、エントリーベクター中のａｔｔＬ１とａｔｔＬ２組換え部位との間にクローン化される。不完全に消化されたエントリーベクター由来のバックグラウンドコロニーを最小にするために提供される、毒性または「死（ｄｅａｔｈ）」遺伝子（例えば、ｃｃｄＢ）は、排除され、そして目的の核酸分子により置換されるべきであることに注意。
【００９０】
エントリークローンを作成するための第２の試み（図７）は、本明細書中に詳細に記載されるように、エントリーベクターにおいて（ゲノムまたはｃＤＮＡの）ライブラリーを作成することである。次いで、このようなライブラリーは、例えば、酵母細胞または哺乳動物細胞のような適切な宿主細胞における、発現スクリーニングのために、目的ベクターへ移入され得る。
【００９１】
エントリークローンを作成するための第３の試み（図７）は、発現ベクター（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ）において調製されるｃＤＮＡ分子またはライブラリーから得られる発現クローン（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｃｌｏｎｅ）を使用することである。ａｔｔＢ部位に隣接するこのようなｃＤＮＡまたはライブラリーは、ＢＰ  Ｒｅａｃｔｉｏｎを介して、Ｄｏｎｏｒ  Ｖｅｃｔｏｒと組み換えられることにより、エントリーベクターへ導入され得る。所望ならば、全体の発現クローン（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｃｌｏｎｅ）ライブラリーは、ＢＰ  Ｒｅａｃｔｉｏｎを介してエントリーベクターへ移入され得る。発現クローン（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｃｌｏｎｅ）ｃＤＮＡライブラリーはまた、本明細書中で（特に、以下の実施例において）より詳細に記載されるように、種々の原核および真核のＧＡＴＥＷＡＹTM媒介ベクター（例えば、ｐＥＸＰ５０１発現ベクター（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ）（図４８を参照のこと）、および２−ハイブリッドおよびａｔｔＢライブラリーベクター）において構築され得る。
【００９２】
エントリークローンを作成するための第４の（かつ潜在的に最も汎用性の）試み（図７）は、増幅（例えば、ＰＣＲ）フラグメントクローニングによりエントリーベクターへ目的の核酸分子についての配列を導入することである。この方法は、図８に図示される。ＤＮＡ配列は、ａｔｔＢヌクレオチド配列（例えば、図９に示される配列であるが、これらに限定されない）の１以上のｂｐ、２以上のｂｐ、３以上のｂｐ、４以上のｂｐ、５以上のｂｐ、好ましくは６以上のｂｐ、より好ましくは６〜２５ｂｐ（特に１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ｂｐ）を含むプライマー、ならびに必要に応じて、１以上、２以上、３以上、４以上および最も好ましくは４もしくは５以上のさらなる末端ヌクレオチド塩基（好ましくはグアニンである）を使用して、以下および本明細書中の実施例において詳細に概説されるように、（例えば、ＰＣＲを用いて）始めに増幅される。次いで、このＰＣＲ産物は、ａｔｔＢ−ＰＣＲ産物が１以上のａｔｔＰ部位を含むドナーベクターと組み換えられるＢＰ反応を行うことによりエントリークローンに変換され得る。ＰＣＲフラグメントサブクローニングのためのこの試みおよびプロトコールの詳細は、実施例８および２１〜２５に提供される。
【００９３】
種々のエントリークローンは、これらの方法により作成され得、クローニングの選択肢の広範のアレイを提供し；多くの特定のエントリーベクターはまた、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から市販される。本明細書中の実施例は、選択されたエントリーベクターおよびこれらのクローニング部位の詳細のより徹底的な記載を提供する。特定の増幅のために最終的なエントリーベクターを選択することは、実施例４で議論される。
【００９４】
エントリーベクターおよびＤｉｓｔｉｎａｔｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒは、目的の核酸分子のアミノ末端領域（例えば、遺伝子、ｃＤＮＡライブラリーもくしは挿入物、またはそれらのフラグメント）が、ａｔｔＬ１部位の次に位置するように構築されるべきである。エントリーベクターは、好ましくは、ａｔｔＬ１部位の上流のｒｒｎＢ転写ターミネーターを含む。この配列は、目的のクローン化された核酸分子の発現をＥ．ｃｏｌｉにおいて信頼されるように「オフ」にすることを保証し、その結果、毒性遺伝子でさえも首尾よくクローン化し得る。従って、エントリークローンは、転写的にサイレントであるように設計され得る。また、エントリーベクター（およびこれによりエントリークローン）は、カナマイシン抗生物質耐性（ｋａｎr）遺伝子を含み、形質転換後のエントリークローンを含む宿主細胞の選択を容易にし得る。しかし、特定の適用においては、エントリークローンは、他の選択マーカーを含み得、これには、ゲンタマイシン耐性（ｇｅｎr）遺伝子、またはテトラサイクリン耐性遺伝子（ｔｅｔr）が挙げられるが、これらに限定ず、形質転換後のエントリークローンを含む宿主細胞の選択を容易にする。
【００９５】
一旦、目的の核酸分子をエントリーベクターへクローン化すると、それは、目的ベクターへ移され得る。図５Ａの上部右部分は、目的ベクターの概略図を示す。この厚い矢印は、いくつかの機能を示す（通常、転写または翻訳）。これは、このクローン中の目的の核酸分子に作用する。組換え反応中に、毒性または「死」遺伝子（例えば、ｃｃｄＢ）を含む、ａｔｔＲ１とａｔｔｒ２との間の領域は、ＤＮＡセグメントによりエントリークローンから置換される。アンピシリン耐性（ａｍｐr）遺伝子（目的ベクター上に保有される）を必要とし、そしてまた、死遺伝子を欠失した、組換え産物についての選択は、高い割合（大抵９０％を超える）のコロニーが、正確な挿入物を含むことを保証する。
【００９６】
目的の核酸分子を目的ベクターへ移すために、その目的ベクターは、目的の所望の核酸分子を含むエントリークローンと混合され、組換えタンパク質の反応混合液（例えば、ＧＡＴＥＷＡＹTM  ＬＲ  ＣｌｏｎａｓｅTM  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ）が添加され、この混合物をインキュベート（好ましくは、以下に記載されるように、例えば、大きな核酸分子の移入のために、特定の環境下で約６０分間またはそれ以上、約２５℃にて）し、そして任意の標準の宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌細胞；昆虫細胞、哺乳動物細胞、線虫細胞などのような動物細胞；植物細胞；および酵母細胞が挙げられる）株は、この反応混合物で形質転換される。使用される宿主細胞は、所望の選択により決定される（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＢ３．１（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．から市販される）は、ｃｃｄＢ死遺伝子を含むクローンの生存を可能にし、従って、融合体分子を選択するために使用され得る。すなわち、分子は、エントリークローンと目的ベクターとの間をハイブリッドする）。以下の実施例は、目的の核酸分子および発現ＲＮＡの移入ならびに種々の宿主におけるそれらの核酸分子によりコードされるポリペプチドの発現におけるエントリーベクターおよび目的ベクターの使用のための、さらなる詳細およびプロトコルを提供する。
【００９７】
従って、本発明のクローニング系は、複数の利点を提供する：
・一旦、目的の核酸分子がＧＡＴＥＷＡＹTM  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍへクローン化されると、それは、リーディングフレームおよび配向に完全に忠実に他のベクターの内外へ移され得る。すなわち、反応の進行によりエントリークローン中のａｔｔＬ１が、目的ベクター上のａｔｔＲ１と組み換えられるので、目的の核酸分子の方向性は、維持されるかまたは、エントリークローン目的ベクターへから移入される際に制御され得る。それ故、このＧＡＴＥＷＡＹTM  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍは、目的の核酸分子の方向的クローニングの効果的かつ簡便な方法を提供する。
・一段階のクローニングまたはサブクローニング：Ｃｌｏｎａｓｅとエントリークローンおよび目的ベクターとを混合し、インキュベートし、そして形質転換する。
・ａｔｔＢ部位をＰＣＲプライマーに付加することにより、インビトロ組換えにより容易にＰＣＲ産物をクローン化する。次いで、これらのエントリークローンを目的ベクターに直接移入する。このプロセスはまた、１工程で実施され得る（以下の実施例を参照のこと）。
・効果的な選択は、高い信頼度を与える：９０％以上（そして、しばしば９９％以上）のコロニーは、その新たなベクター中の所望のＤＮＡを含む。
・ＧＡＴＥＷＡＹTM  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍベクターへの現存の標準ベクターの１工程転換。
・ラージベクターまたはいくつかのクローニング部位を有するラージベクターに同一である。
・組換え部位が短く（２５ｂｐ）、そして終止コドンまたは第二の構造を含まないように操作され得る。
・反応は、高処理能力適用（例えば、診断目的のためかまたは治療的候補物スクリーニングのために）のために自動化され得る。
・この反応は、経済的であり：０．３μｇの各ＤＮＡを使用し；制限酵素、ホスファターゼ、リガーゼまたはゲル精製を使用しない。反応は、ミニプレップＤＮＡを使用して良好に進行する。
・１回の実験で、１つ以上の目的ベクターへ、多重クローンを（およびライブラリーでさえも）移入する。
・種々の目的ベクターが、生成され得、適用としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
・Ｅ．ｃｏｌｉにおけるタンパク質発現：ネイティブなタンパク質；精製のための、ＧＳＴ、Ｈｉｓ６、チオレドキシンなどを有する融合タンパク質、または１つ以上のエピトープタグ；Ｅ．ｃｏｌｉにおけるタンパク質の発現の際に有用な任意のプロモーター（例えば、ｐｔｒｃ、λＰLおよびＴ７プロモーター）が使用され得る
・真核細胞におけるタンパク質発現：ＣＭＶプロモーター、バキュロウイルス（Ｈｉｓ６タグを有するかまたは有さない）、Ｓｅｍｌｉｋｉ  Ｆｏｒｅｓｔウイルス、Ｔｅｔ調節
・ＤＮＡ配列決定（全てｌａｃプロモーター）、ＲＮＡプローブ、ファージミド（両鎖）
・種々のエントリーベクター（標準の組換えＤＮＡ方法による組換え的クローニングエントリーのために）が生成され得る：
・Ｅ．ｃｏｌｉに対する遺伝子毒性について、ちょうど上流の強力な転写終止
・３つのリーディングフレーム
・ＴＥＶプロテアーゼ切断部位を有するか有さない
・原核生物および／または真核生物の翻訳についてのモチーフ
・市販のｃＤＮＡライブラリーと互換性がある
・発現スクリーニングのための２−ｈｙｂｒｉｄライブラリーおよびファージディスプレイライブラリーを含む発現クローンｃＤＮＡ（ａｔｔＢ）ライブラリーはまた、構築され得る。
【００９８】
（組換え部位の配列）
１つの局面では、本発明は、核酸分子に関する。これは、単離された核酸分子であってもよいしなくてもよく、１つ以上の組換え部位またはその部分をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含む。特に、本発明のこの局面は、ａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬもしくはａｔｔＲ、またはこれらの組換え部位の配列の部分をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含むそのような核酸分子に関する。本発明はまた、このような核酸分子の変異体、誘導体およびフラグメントに関する。他に記載されない限り、本明細書中のＤＮＡ分子を配列決定することにより決定され得る全てのヌクレオチド配列は、手動または自動のＤＮＡ配列決定（例えば、当業者（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．およびＣｏｕｌｓｏｎ，Ａ．Ｒ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９４：４４４−４４８（１９７５）；Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４：５４６３−５４６７（１９７７））に慣用的である方法に従う、ジデオキシ配列決定）を使用して決定された。本明細書中で決定されるＤＮＡ分子によりコードされるポリペプチドの全てのアミノ酸配列は、上記のように決定されるＤＮＡ配列の概念的な翻訳により推定された。従って、これらの試みにより決定される任意のＤＮＡ配列について、当該分野において公知であるように、本明細書中で決定されるヌクレオチド配列は、いくつかのエラーを含み得る。このような方法により決定されるヌクレオチド配列は、配列決定されたＤＮＡ分子の実際のヌクレオチド配列に対して、代表的に少なくとも約９０％同一であり、より代表的には少なくとも約９５％〜少なくとも約９９．９％同一である。当該分野でもまた公知であるように、実際の配列と比較した決定されたヌクレオチド配列における単一の挿入または欠失は、ヌクレオチド配列の翻訳におけるフレームシフトを引き起こし、挿入または欠失の点に存在する、決定されたヌクレオチド配列によりコードされる推定アミノ酸配列が、配列決定されたＤＮＡ分子により実際にコードされるアミノ酸配とは完全に異なる。
【００９９】
他に記載されない限り、本明細書中に記載される各「ヌクレオチド配列」は、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。しかし、核酸分子またはポリヌクレオチドの「ヌクレオチド配列」により、ＤＮＡ分子またはポリヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチドの配列）について、およびＲＮＡ分子またはポリヌクレオチド（ここで特定のデオキシリボヌクレオチド配列中の各チミジンデオキシリボヌクレオチド（Ｔ）は、リボヌクレオチドウリジン（Ｕ）により置換される）について、意図される。従って、本発明は、ＤＮＡもしくはＲＮＡ分子、またはハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡ分子およびそれらの対応する相補ＤＮＡ鎖、相補ＲＮＡ鎖または相補ＤＮＡ／ＲＮＡ鎖の本発明の配列に関する。
【０１００】
第１のこのような局面において、本発明は、ａｔｔＢ１、またはその変異体、フラグメント、改変体、あるいは誘導体をコードする１以上のヌクレオチド配列を有する核酸分子を提供する。このような核酸分子は、図９に示された配列を有するａｔｔＢ１ヌクレオチド配列（例えば、ＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴ）、あるいはａｔｔＢ１について図９に示されたヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、またはその変異体、フラグメント、改変体、あるいはその誘導体を含み得る。しかし当業者は、以下のことを理解する。本発明の核酸分子に含まれるａｔｔＢ１配列中の１以上の塩基の、特定の変異、挿入、または欠損は、これらの分子の構造的完全性および機能的完全性を含まないで作製され得る；それ故、ａｔｔＢ１配列中のこのような変異、挿入、または欠損を含む核酸分子は、本発明の範囲内に含まれる。
【０１０１】
関連した局面において、本発明は、ａｔｔＢ２、またはその変異体、フラグメント、改変体、あるいは誘導体をコードする１以上のヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。このような核酸分子は、図９に示される配列を有するａｔｔＢ２ヌクレオチド配列（例えば、ＡＣＣＣＡＧＣＴＴＴＣＴＴＧＴＡＣＡＡＡＧＴＧＧＴ）、あるいはａｔｔＢ２について図９に示されたヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、またはその変異体、フラグメント、改変体、あるいは誘導体を含み得る。ａｔｔＢ１について上記のように、本発明の核酸分子に含まれるａｔｔＢ２配列中の１以上の塩基の特定の変異、挿入、または欠損は、これらの分子の構造的完全性および機能的完全性を含まないで作製され得る；それ故ａｔｔＢ２中のこのような変異、挿入、または欠損を含む核酸分子は、本発明の範囲内に含まれる。
【０１０２】
ａｔｔＢ１部位およびａｔｔＢ２部位を含む核酸分子を含む組換え宿主細胞（ｐＣＭＶＳｐｏｒｔ６としても公知である、ベクターｐＥＸＰ５０１；図４８を参照のこと）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＢ３．１（ｐＣＭＶＳｐｏｒｔ６）は、１９９９年２月２７日に、受託番号ＮＲＲＬ  Ｂ−３０１０８としてＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＮＲＲＬ）、１８１５  Ｎｏｒｔｈ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｔｒｅｅｔ、Ｐｅｏｒｉａ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ  ６１０６０４  ＵＳＡの収集に寄託された。寄託された核酸分子内のａｔｔＢ１部位およびａｔｔＢ２部位は、核酸カセットに含まれ、その核酸カセットは以下でより詳細に記載される１以上のさらなる機能的配列に関連する。
【０１０３】
別の関連する局面において、本発明は、ａｔｔＰ１、またはその変異体、フラグメント、改変体、あるいは誘導体をコードする１以上のヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。このような核酸分子は、図９に示される配列を有するａｔｔＰ１ヌクレオチド配列（例えば、
【０１０４】
【化４】
0004580106.tif 000002
）、あるいはａｔｔＰ１について図９に示されるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、またはその変異体、フラグメント、改変体、あるいは誘導体を含み得る。ａｔｔＢ１について上記のように、本発明の核酸分子内に含まれるａｔｔＰ１配列内の１以上の塩基の特定の変異、挿入、または欠損は、これらの分子の構造的完全性および機能的完全性を含まないで作製され得る；それ故、ａｔｔＰ１配列内のこのような変異、挿入、または欠損を含む核酸分子は、本発明の範囲内に含まれる。
【０１０５】
別の関連する局面において、本発明は、ａｔｔＰ２、またはその変異体、フラグメント、改変体、あるいは誘導体をコードする１以上のヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。このような核酸分子は、図９に示される配列を有するａｔｔＰ２ヌクレオチド配列（例えば、
【０１０６】
【化５】
0004580106.tif 000003
）、あるいはａｔｔＰ２について図９に示されるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、またはそれらの変異体、フラグメント、改変体、あるいは誘導体を含み得る。ａｔｔＢ１について上記のように、本発明の核酸分子内に含まれるａｔｔＰ２配列内の１以上の塩基の特定な変異、挿入、または欠損は、これらの分子の構造的完全性および機能的完全性を含まないで作製され得る；それ故、ａｔｔＰ２配列内のこのような変異、挿入、または欠損を含む核酸分子は、本発明の範囲内に含まれる。
【０１０７】
ａｔｔＰ１部位およびａｔｔＰ２部位を含む核酸分子（ｐＥＮＴＲ２１−ａｔｔＰｋａｎまたはｐＡｔｔＰｋａｎとしてもまた公知であるａｔｔＰベクターｐＤＯＮＲ２０１；図４９を参照のこと、）を含む組換え宿主細胞、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＢ３．１（ｐＡｔｔＰｋａｎ）（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＢ３．１（ｐＡＨＫａｎ）とも呼ばれる）は、１９９９年２月２７日に、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＮＲＲＬ）、１８１５  Ｎｏｒｔｈ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｔｒｅｅｔ、Ｐｅｏｒｉａ  Ｉｌｌｉｎｏｉｓ  ６１６０４  ＵＳＡの収集に受託番号ＮＲＲＬ  Ｂ−３００９９として寄託された。寄託された核酸分子内のａｔｔＰ１部位およびａｔｔＰ２部位は、核酸カセットに含まれ、この核酸カセットは、以下でより詳細に記載される１以上のさらなる機能的配列に関連する。
【０１０８】
別の関連する局面において、本発明は、ａｔｔＲ１またはその変異体、フラグメント、改変体、あるいは誘導体をコードする１以上のヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。このような核酸分子は、図９に示される配列を有するａｔｔＲ１ヌクレオチド配列（例えば、
【０１０９】
【化６】
0004580106.tif 000004
）、あるいはａｔｔＲ１について図９に示されるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、またはその変異体、フラグメント、改変体、あるいは誘導体を含み得る。ａｔｔＢ１について上記のように、本発明の核酸分子に含まれるａｔｔＲ１配列内の１以上の塩基の特定の変異、挿入、または欠損は、これらの分子の構造的完全性および機能的完全性を含まないで作製され得る；それ故、ａｔｔＲ１配列内のこのような変異、挿入、または欠損を含む核酸配列は、本発明の範囲内に含まれる。
【０１１０】
別の関連する局面において、本発明は、ａｔｔＲ２、またはその変異体、フラグメント、改変体、あるいは誘導体をコードする１以上の核酸配列を含む核酸分子を提供する。このような核酸分子は、図９に示される配列を有するａｔｔＲ２ヌクレオチド配列（例えば
【０１１１】
【化７】
0004580106.tif 000005
）、あるいはａｔｔＲ２について図９に示されるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、またはそれらの変異体、フラグメント、改変体、あるいは誘導体を含み得る。ａｔｔＢ１について上記のように、本発明の核酸配列に含まれるａｔｔＲ２配列内の１以上の塩基の特定の変異、挿入、または欠損は、これらの分子の構造的完全性および機能的完全性を含まないで作製され得る；それ故、ａｔｔＲ２配列内のこのような変異、挿入、または欠損を含む核酸分子は、本発明の範囲内に含まれる。
【０１１２】
リーディングフレームＡ、リーディングフレームＢ、ならびにリーディングフレームＣ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＢ３．１（ｐＥＺＣ１５１０１）（リーディングフレームＡ；図６４Ａを参照のこと）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＢ３．１（ｐＥＺＣ１５１０２）（リーディングフレームＢ；図６４Ｂを参照のこと）、およびＥ．ｃｏｌｉ  ＤＢ３．１（ｐＥＺＣ１５１０３）（リーディングフレームＣ；図６４Ｃを参照のこと）内のクローニング部位に並べられたａｔｔＲ１部位を含む組換え宿主細胞株、および対応するａｔｔＲ２部位を含む組換え宿主細胞株は、１９９９年２月２７日に、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＮＲＲＬ）、１８１５  Ｎｏｒｔｈ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｔｒｅｅｔ、Ｐｅｏｒｉａ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ  ６１６０４  ＵＳＡの収集に、それぞれ受託番号ＮＲＲＬ  Ｂ−３０１０３、ＮＲＲＬ  Ｂ−３０１０４、およびＮＲＲＬ  Ｂ−３０１０５として寄託された。寄託された核酸分子内のａｔｔＲ１部位およびａｔｔＲ２部位は、核酸カセットに含まれ、この核酸カセットは、以下でより詳細に記載される１以上のさらなる機能的配列に関連する。
【０１１３】
別の関連する局面において、本発明は、ａｔｔＬ１、またはその変異体、フラグメント、改変体、および誘導体をコードする１以上のヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。このような核酸分子は、図９に示される配列を有するａｔｔＬ１ヌクレオチド配列（例えば、
【０１１４】
【化８】
0004580106.tif 000006
）、あるいはａｔｔＬ１について図９に示されるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、またはその変異体、フラグメント、改変体、あるいは誘導体）を含み得る。ａｔｔＢ１について上記のように、本発明の核酸分子に含まれるａｔｔＬ１配列内の１以上の塩基の特定の変異、挿入、または欠損は、これらの分子の構造的完全性および機能的完全性を含まないで作製され得る；それ故、ａｔｔＬ１配列内のこのような変異、挿入、または欠損を含む核酸分子は、本発明の範囲内に含まれる。
【０１１５】
別の関連する局面において、本発明は、ａｔｔＬ２、またはその変異体、フラグメント、改変体、および誘導体をコードする１以上の核酸配列を含む核酸分子を提供する。このような核酸分子は、図９に示される配列を有するａｔｔＬ２ヌクレオチド配列（例えば、
【０１１６】
【化９】
0004580106.tif 000007
）、あるいはａｔｔＬ２について図９に示されるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、またはそれらの変異体、フラグメント、改変体、あるいは誘導体を含み得る。ａｔｔＢ１について上記のように、本発明の核酸分子に含まれるａｔｔＬ２配列内の１以上の塩基の特定の変異、挿入、または欠損は、これらの分子の構造的完全性および機能的完全性を含まないで作製され得る；それ故、ａｔｔＬ２配列内のこのような変異、挿入、または欠損を含む核酸分子は、本発明の範囲内に含まれる。
【０１１７】
リーディングフレームＡ、リーディングフレームＢ、ならびにリーディングフレームＣ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＢ３．１（ｐＥＮＴＲ１Ａ）（リーディングフレームＡ；図１０を参照のこと）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＢ３．１（ｐＥＮＴＲ２Ｂ）（リーディングフレームＢ；図１１を参照のこと）およびＥ．ｃｏｌｉ  ＤＢ３．１（ｐＥＮＴＲ３Ｃ）（リーディングフレームＣ；図１２を参照のこと）におけるクローニング部位に並べられたａｔｔＬ１部位を含む組換え宿主細胞、および対応するａｔｔＬ２部位を含む組換え宿主細胞は、１９９９年２月２７日に、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＮＲＲＬ）、１８１５  Ｎｏｒｔｈ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｔｒｅｅｔ  Ｐｅｏｒｉａ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ  ６１６０４  ＵＳＡの収集に、それぞれ受託番号ＮＲＲＬ  Ｂ−３０１００、ＮＲＲＬ  Ｂ−３０１０１、およびＮＲＲＬ  Ｂ−３０１０２として寄託された。寄託された核酸分子内のａｔｔＬ１部位およびａｔｔＬ２部位は、核酸カセットに含まれ、この核酸カセットは、以下でより詳細に記載される１以上のさらなる機能的配列に関連する。
【０１１８】
本明細書中に記載される各組換え部位配列あるいはその一部、または寄託されたクローンに含まれるヌクレオチド配列カセットは、（例えば、本明細書中に記載される組換えクローニング方法および／または当該分野で慣習的な標準的な制限クローニング技術を使用して）クローン化され得るか、または目的のベクターに挿入され得、例えばエントリーベクターまたは目的ベクター（目的の核酸分子の所望のセグメント（例えば、遺伝子、ｃＤＮＡ分子、またはｃＤＮＡライブラリー）を、所望のベクターまたは宿主細胞に移すために使用され得る）を産生するためにクローン化され得るか、挿入され得る。
【０１１９】
本明細書中に提供される情報（例えば、本明細書中に記載される組換え部位配列に対するヌクレオチド配列）を使用して、１以上の組換え部位、またはその一部をコードする本発明の単離された核酸分子は、標準的なクローニングおよびスクリーニング手順（例えば、開始物質としてｍＲＮＡを使用するｃＤＮＡをクローニングするための手順）を使用して入手され得る。好ましくは、このような方法としては、ＰＣＲに基づくクローニング方法（例えば、本明細書および以下の実施例に記載されるようなプライマーを使用する逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ））が挙げられる。あるいは、本明細書中で記載される組換え部位配列を含むカセットを含むベクターがＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）より市販されている。
【０１２０】
本発明はまた、１以上の組換え部位配列またはその一部、および１以上のさらなるヌクレオチド配列を含む核酸分子に関し、この核酸分子は、機能的部位または構造的部位（例えば、１以上のマルチクローニング部位、１以上の転写末端部位、１以上の転写制御配列（プロモーター、エンハンサー、リプレッサーなどであり得る）、１以上の翻訳シグナル（例えば分泌シグナル配列）、１以上の複製起点、１以上の融合パートナーペプチド（特に、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ヘキサヒスチジン（Ｈｉｓ6）、およびチオレドキシン（Ｔｒｘ））、１以上の選択マーカーまたはモジュール、局在化シグナルをコードする１以上のヌクレオチド配列（例えば、核局在化シグナル、または分泌シグナル）、１以上の複製起点、１以上のプロテアーゼ切断部位、目的のタンパク質またはポリペプチドをコードする１以上の遺伝子または遺伝子の一部、および１以上の５’ポリヌクレオチド伸長（特に、約１〜約２０、約２〜約１５、約３〜約１０、約４〜約１０の長さの範囲のグアニン残基の伸長、そして最も好ましくは、組換え部位ヌクレオチド配列の５’末端の４または５のグアニン残基の伸長））をコードし得る。１以上のさらなる機能的配列または構造的配列は、本発明の核酸分子に含まれる１以上の組換え部位配列に隣接しても、しなくてもよい。
【０１２１】
本発明のいくつかの核酸分子において、１以上のさらなる機能的部位または構造的部位をコードする１以上のヌクレオチド配列は、組換え部位をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結され得る。例えば、本発明の特定の核酸分子は、本発明の組換え部位またはその一部をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーター配列（例えば、Ｔ７プロモーター、ファージλＰＬプロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｌａｃ、ｔｒｐまたはｔａｃプロモーター、および当業者に知られた他の適切ｂなプロモーター）を有し得る。
【０１２２】
本発明の核酸分子（単離された核酸分子であり得る）は、ＲＮＡの形態（例えば、ｍＲＮＡ）、またはＤＮＡの形態（例えば、クローニングまたは合成的に産生されたｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを含む）、あるいはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドの形態であり得る。本発明の核酸分子は、２本鎖または１本鎖であり得る。１本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖であり得るか（センス鎖としても公知である）、または非コード鎖であり得る（アンチセンス鎖としても言及される）。本発明の核酸分子はまた、直鎖状、環状、コイル状、高次コイル状を含む、複数の位相を有し得る。
【０１２３】
「単離された」核酸分子は、そのネイティブな環境から取り出された核酸分子、ＤＮＡまたはＲＮＡを意図する。例えば、ベクターに含まれる組換えＤＮＡ分子は、本発明の目的のために単離されているとみなされる。単離されたＤＮＡ分子のさらなる例としては、異種宿主細胞内に維持される組換えＤＮＡ分子が挙げられ、そしてこれらのＤＮＡ分子は、組換えＤＮＡ技術によって生成されていようと、または合成化学技術によって生成されていようとも、溶液より（部分的または実質的に）精製される。単離されたＲＮＡ分子としては、インビボまたはインビトロでの本発明のＤＮＡ分子のＲＮＡ転写物が挙げられる。
【０１２４】
本発明はさらに、本発明の核酸分子の変異体、フラグメント、改変体、および誘導体に関し、それらは、１以上の組換え部位の一部、アナログ、または誘導体をコードする。改変体は天然に生じ得る（例えば、天然の対立形質改変体）。「対立形質改変体」とは、生物の染色体上の所定の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの代替形態の１つを意図する（Ｌｅｗｉｎ，Ｂ編、ＧｅｎｅｓＩＩ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８５））。非天然に生じる改変体は、例えば本明細書中で以下に記載されるような当該分野で公知の突然変異誘発技術を使用して生成され得る。
【０１２５】
このような改変体としては、ヌクレオチドまたはその一部の置換、欠損または付加、、あるいはその組み合わせによって産生される改変体が挙げられる。置換、欠損、または付加は、１以上のヌクレオチドに関与し得る。改変体は、コード領域、非コード領域、または両方において変化され得る。コード領域における変化は、保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換、欠損および付加を生成し得る。これらの中で特に好ましいのは、サイレント置換、付加、および欠損であり、それらは、コードされるポリペプチドまたはその一部の特性および活性を変化しない。そしてそれらはまた、組換え反応において組換え部位核酸配列の反応性を実質的に変化しない。保存的な置換もまた、この点において特に好ましい。
【０１２６】
本発明の核酸分子の特に好ましい変異体、フラグメント、改変体および誘導体としては、１５ｂｐコア領域（ＧＣＴＴＴＴＴＴＡＴＡＣＴＡＡ）内における１つ以上のヌクレオチド塩基の挿入、欠失または置換が挙げられるがこれらに限定されない。このコア領域は、４つ全ての野生型λａｔｔ部位（ａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬおよびａｔｔＲ）において同一である（米国出願第０８／６６３，００２号、１９９６年６月７日出願（現在、米国特許第５，８８８，７３２号）、同第０９／００５，４７６号、１９９８年１月１２日出願、および同第０９／１７７，３８７、１９９８年１０月２３日出願を参照し、これらはコア領域をより詳細に記載し、そしてこれらの開示は、本明細書中に参考としてその全体が援用される）。同様に、ａｔｔＢ１、ａｔｔＰ１、ａｔｔＬ１およびａｔｔＲ１におけるコア領域は、互いに同一であり、ａｔｔＢ２、ａｔｔＰ２、ａｔｔＬ２およびａｔｔＲ２におけるコア領域も同様である。詳細には、この点において、この１５ｂｐコア領域（ＧＣＴＴＴＴＴＴＡＴＡＣＴＡＡ）内で生じる７ｂｐオーバーラップ領域（ＴＴＴＡＴＡＣ、これは、インテグラーゼタンパク質に対する切断部位によって規定され、そして鎖の交換が起こる領域である）内における１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失または置換を含む核酸分子が好ましい。本発明のこの局面に従うそのような好ましい変異体、フラグメント、改変体および誘導体の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：７ｂｐオーバーラップ領域の位置１におけるチミジンが、欠失されたか、またはグアニン、シトシン、もしくはアデニンで置換された核酸分子；７ｂｐオーバーラップ領域の位置２のチミジンが、欠失されたか、またはグアニン、シトシンもしくはアデニンによって置換された核酸分子；７ｂｐオーバーラップ領域の位置３のチミジンが、欠失されたか、またはグアニン、シトシンもしくはアデニンによって置換された核酸分子；７ｂｐオーバーラップ領域の位置４のアデニンが、欠失されたか、またはグアニン、シトシンもしくはチミジンによって置換された核酸分子；７ｂｐオーバーラップ領域の位置５のチミジンが、欠失されたか、またはグアニン、シトシンもしくはアデニンによって置換された核酸分子；７ｂｐオーバーラップ領域の位置６のアデニンが、欠失されたか、またはグアニン、シトシンもしくはチミジンによって置換された核酸分子；および、７ｂｐオーバーラップ領域の位置７のシトシンが、欠失されたか、またはグアニン、チミジン、もしくはアデニンによって置換された核酸分子；あるいは、この７ｂｐオーバーラップ領域内の１つ以上のそのような欠失および／または置換の任意の組み合わせ。本明細書中の実施例２１に詳細に記載したように、７ｂｐオーバーラップ（ＴＴＴＡＴＡＣ）の最初の３つの位置に置換が作製された本発明の核酸分子の変異体が、組換え特異性に強く影響を与え、最後の４つの位置（ＴＴＴＡＴＡＣ）に置換が作製された変異体核酸分子は、部分的にのみ組換え特異性を変化させ、そして７ｂｐオーバーラップの外であるが１５ｂｐコア領域内のいずれかのヌクレオチド置換を含む変異体核酸分子は、組換え特異性には変化を与えないが、組換え効率���影響を与えることが、本発明において見出された。
【０１２７】
ゆえに、さらなる局面において、本発明はまた、組換え特異性に影響を与える１つ以上の組換え部位ヌクレオチド配列（詳細には、１５ｂｐコア領域内の７塩基対オーバーラップに実質的に対応し得、組換え特異性に影響を与える１つ以上の変異を有する１つ以上のヌクレオチド配列）を含む核酸分子に関する。詳細には、好ましいそのような分子は、コンセンサス配列（例えば、ＮＮＮＡＴＡＣ（ここで、「Ｎ」は、任意のヌクレオチド（すなわち、Ａ、Ｇ、Ｔ／ＵまたはＣであり得る）をいい、ただしコンセンサス配列における最初の３つのヌクレオチドの１つが、Ｔ／Ｕである場合、最初の３つのヌクレオチドの他の２つのうちの少なくとも１つは、Ｔ／Ｕではない））（本明細書において実施例２１に詳細に記載する）を含み得る。
【０１２８】
関連する局面において、本発明はまた、組換え効率を増強する１つ以上の組換え部位ヌクレオチド配列、詳細にはコア領域に実質的に対応し得かつ組換え効率を増強する１つ以上の変異を有する１つ以上のヌクレオチド配列を含む核酸分子に関する。「組換え効率を増強する」配列または変異は、組換え部位、好ましくはコア領域（例えば、ａｔｔ組換え部位の１５ｂｐコア領域）内の配列または変異を意味し、これは、組換え分子が、変異された配列もしくはコア領域を含まない分子（例えば、野生型の組換え部位コア領域配列を含む分子）と比較して変異された配列またはコア領域を含む場合、クローニング効率の増加を生じる（代表的には、試験配列の成功したクローニングを決定することによって（例えば、所定のクローニング混合物に対するＣＦＵ／ｍｌを決定することによって）測定される）。より詳細には、所定の配列または変異が組換え効率を増強するか否かは、本明細書中に記載されるような組換えクローニングにおける配列または変異を用いて決定され得、そしてその配列または変異が、変異されていない（例えば、野生型）配列と比較された場合に増強された組換えクローニング効率を提供するか否かを決定する。多くの組換え部位（詳細には、ａｔｔ組換え部位）に対する好ましいクローニング効率を増強する変異を決定する方法は、本明細書（例えば実施例２２〜２５）に記載される。ｃａａｃｔｔｎｎｔｎｎｎａｎｎａａｇｔｔｇ（ここで、「ｎ」は、任意のヌクレオチドを表す）のａｔｔＬコンセンサスコア配列に対する好ましいこのような変異組換え部位の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：例えば
【０１２９】
【化１０】
0004580106.tif 000008
。コア領域に加えａｔｔ部位の他の部分が、組換え効率に影響を与え得ることを当業者は理解する。バクテリオファージλａｔｔＰ部位中（２つはａｔｔＲ（Ｐ１およびＰ２）中、そして３つはａｔｔＬ（Ｐ’１、Ｐ’２およびＰ’３）中）に、インテグラーゼタンパク質に対するアーム結合部位と呼ばれる５つが存在する。コア結合部位と比較すると、インテグラーゼタンパク質はアーム部位に高い親和性で結合し、そしてそのタンパク質の２つの異なるドメインを介してコアおよびアーム部位と相互作用する。コア結合部位を有するので、Ｃ／ＡＡＧＴＣＡＣＴＡＴからなるアーム結合部位に対するコンセンサス配列は、５つのアーム結合部位と７つの非ａｔｔ部位との配列比較から推察される（ＲｏｓｓおよびＬａｎｄｙ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：７７２４−７７２８（１９８２））。各アーム部位は変異され、そして切除および組込み反応におけるその効果に対して試験される（Ｎｕｍｒｙｃｈら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１８：３９５３（１９９０））。ゆえに、特定の部位が、異なる方法で各反応に利用され、すなわち、Ｐ１およびＰ’３部位は、組込み反応に重要であるが、他の３つの部位は、程度を変えるための組込み反応に不要である。同様に、Ｐ２、Ｐ’１およびＰ’２部位は、切除反応に最も重要であるが、Ｐ１およびＰ’３は、完全に不要である。興味深いことに、Ｐ２が変異される場合、野生型ａｔｔＰ部位を用いたよりもより効果的に組込み反応が生じる。同様に、Ｐ１およびＰ’３が変異される場合、切除反応がより効率的に生じる。インテグラーゼアーム結合部位を変異する刺激性の効果は、特定の組換え部位を競合または阻害する部位か、または産物を出発物質に戻して転換する反応中で機能する部位を除去することによって説明され得る。実際、ＸＩＳ独立ＬＲ反応に関する証拠が存在する（ＡｂｒｅｍｓｋｉおよびＧｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５３：６７−７８（１９８１））。従って、ａｔｔ部位のコア領域における改変に加えて、本発明は、インテグラーゼアーム型結合部位における１つ以上の改変を含むａｔｔ部位の使用を意図する。いくつかの好ましい実施形態において、１つ以上の変異が、１つ以上のＰ１、Ｐ’１、Ｐ２、Ｐ’２およびＰ’３部位に導入され得る。いくつかの好ましい実施形態において、多重変異が、これらの部位の１つ以上に導入され得る。好ましいこのような変異は、インビトロにおいて組換えを増加する変異を含む。例えば、いくつかの実施形態において、ＢＰ反応に対応する組込み型の組換えが増強されるように、変異がアーム型結合部位に導入され得る。他の実施形態において、ＬＲ反応に対応する切除組換えが増強されるように、変異がアーム型結合部位に導入され得る。当然、本明細書中に含まれる案内（詳細には、組換え特異性および効率に対して変異される組換え部位の構築ならびに効果の評価）に基づいて、類似の変異または操作された配列が、本明細書中に記載される他の組換え部位（ｌｏｘ、ＦＲＴなどを含むが、これらに限定されない）に対して産生され得、そして本発明に従って使用される。例えば、組換え効率を増強するコア結合部位を選択するために使用される変異誘��戦略と類似して、同様の戦略が、ａｔｔＰ、ａｔｔＬおよびａｔｔＲのアーム、ならびにｌｏｘ、ＦＲＴなどのような他の組換え部位中の類似性配列における変化を選択するために使用され得、これは組換え効率を増強する。ゆえに、そのような変異の構築および評価は、過度の実験を伴わずに十分に当業者の能力の範囲内である。そのような変異を調製しかつ評価するある適切な方法論は、Ｎｕｍｒｙｃｈら（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １８（１３）：３９５３−３９５９に見いだされる。
【０１３０】
組換え効率を増強するのに適切であり得る他の変異配列および核酸分子は、本明細書中の説明から明らかであるか、または本明細書中の説明の観点における分子生物学の慣用的な実験および当該分野で容易に入手可能な情報のみを用いて、当業者によって容易に決定され得る。
【０１３１】
遺伝暗号が当該分野において周知であるので、当業者にとってまた、過度の実験なしで本明細書中に記載される核酸分子の縮重改変体を作製することは慣用である。ゆえに、本明細書中に記載される組換え部位をコードする核酸配列の縮重改変体を含む核酸分子はまた、本発明の範囲内に含まれる。
【０１３２】
本発明のさらなる実施形態は、本明細書中に記載の組換え部位の１５ｂｐコア領域内における７ｂｐオーバーラップ領域のヌクレオチド配列、または図９に示されるようなａｔｔＢ１、ａｔｔＢ２、ａｔｔＰ１、ａｔｔＰ２、ａｔｔＬ１、ａｔｔＬ２、ａｔｔＲ１もしくはａｔｔＲ２のヌクレオチド配列（またはその部分）、または任意のこれらのヌクレオチド配列、もしくはそのフラグメント、改変体、変異体および誘導体に相補的なヌクレオチド配列に、少なくとも５０％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、そしてより好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を含む。
【０１３３】
特定の組換え部位またはその部分をコードする参照ヌクレオチド配列に少なくとも、例えば９５％「同一な」ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドは、組換え部位をコードする参照ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチド当たり、５つまでの点変異（例えば、挿入、置換または欠失）を含み得るポリヌクレオチド配列以外は参照配列に同一であるポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を意図する。例えば、参照ａｔｔＢ１ヌクレオチド配列に少なくとも９５％同一なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、ａｔｔＢ１参照配列において５％までのヌクレオチドが、欠失もしくは別のヌクレオチドで置換され得るか、またはａｔｔＢ１参照配列中の全ヌクレオチドの５％までの多くのヌクレオチドが、ａｔｔＢ１参照配列中に挿入され得る。参照配列のこれらの変異は、参照ヌクレオチド配列の５’もしくは３’末端位置またはこれらの末端位置間のいずれかで生じ得、参照配列中のヌクレオチド間で個々にか、または参照配列内の１つ以上の連続した群においてかのいずれかで広がる。
【０１３４】
実際の問題として、任意の特定の核酸分子が、例えば所定の組換え部位のヌクレオチド配列またはその部分に少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるか否かは、初期配列整列のためのＤＮＡｓｉｓソフトウェア（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ  Ｂｒｕｎｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、続いて多重配列整列のためのＥＳＥＥ  第３．０版  ＤＮＡ／タンパク質配列ソフトウェア（ｃａｂｏｔ＠ｔｒｏｇ．ｍｂｂ．ｓｆｕ．ｃａ）のような公知のコンピュータープログラムを用いて簡便に決定され得る。あるいは、そのような決定は、ＢＥＳＴＦＩＴプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ  ５３７１１）（これは、２つの配列間の最良な相同性セグメントを見いだすためにローカル相同性アルゴリズム（ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２：４８２−４８９（１９８１））を使用する）を用いて達成され得る。特定の配列が、本発明に従う参照配列に例えば９５％同一であるか否かを決定するための、ＤＮＡｓｉｓ、ＥＳＥＥ、ＢＥＳＴＦＩＴまたは任意の他の配列整列プログラムを使用する場合、パラメーターは、参照ヌクレオチド配列の全長にわたって同一性のパーセンテージが計算され、そして参照配列中のヌクレオチド全数の５％までの、相同性におけるギャップが可能になるように設定される。
【０１３５】
本発明は、図９に示されるようなａｔｔＢ１、ａｔｔＢ２、ａｔｔＰ１、ａｔｔＰ２、ａｔｔＬ１、ａｔｔＬ２、ａｔｔＲ１またはａｔｔＲ２のヌクレオチド配列、または寄託されたクローンのヌクレオチド配列に、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である核酸分子に関し、これらが特定の機能ポリペプチドをコードするか否かに関わらない。なぜなら、特定の核酸分子が特定の機能ポリペプチドをコードしない場合でさえも、当業者は核酸分子を使用する方法（例えば、ハイブリダイゼーションプローブまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーとして）を理解するからである。
【０１３６】
変異はまた、部位特異的組換えを増強するためもしくは反応物の特性を変化させるなどのために、組換え部位ヌクレオチド配列中に導入され得る。そのような変異としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：コードされる誘導タンパク質を可能にする翻訳終止コドンを伴わない組換え部位；同じタンパク質によって認識されるが塩基配列が異なる組換え部位であって、その結果その組換え部位が意図される多重反応を可能にするそれらの相同性パートナーと、大きくまたは排他的に反応する、組換え部位；ならびに組換え部位のヘアピン形成を避けるための変異。どの特定の反応が生じるかは、反応混合物中に特定のパートナーが存在することによって特定化され得る。
【０１３７】
特定の変異を核酸配列中に導入するための手順は周知である。これらの多くが、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９−１９９６）に記載される。変異は、オリゴヌクレオチド中に設計され得、これはクローン化された配列を切除する改変に対して使用され得るか、または増幅反応において使用され得る。所望の変異ＤＮＡまたはＲＮＡを単離するために適切な選択方法が利用可能な場合、無作為変異誘発がまた利用され得る。所望の変異の存在は、周知の方法による核酸の配列決定によって確認され得る。
【０１３８】
以下の非限定の方法は、特定の組換え部位をコードする所定の核酸分子を改変または変異するために使用され得、本発明に使用され得る変異部位を提供する：
１．部位特異的（例えば、ａｔｔＰを提供するためのａｔｔＬおよびａｔｔＲ）または他（例えば、相同性）組換え機構による２つの親ＤＮＡ配列の組換え（ここで、親ＤＮＡセグメントは、１つ以上の塩基改変を含み、最終的な変異された核酸分子を生じる）；
２．所望の核酸分子の直接的な、変異または（部位特異的、ＰＣＲ、ランダム、偶発的などの）変異誘発；
３．親ＤＮＡ配列の（部位得的、ＰＣＲ、ランダム、偶発的などの）変異誘発、
親ＤＮＡは、再び結合され、所望の核酸分子を生成する；
４．所望のコア配列をコードするＲＮＡの逆転写；ならびに
５．所望の塩基変化または無作為な塩基変化を有する配列のデノボ合成（化学合成）、続いて当該分野で慣用である方法に従う配列決定または機能的分析。
【０１３９】
変異組換え部位の機能性は、所望される特定の特徴に依存する方法で実施され得る。例えば、組換え部位における翻訳終止コドンの欠失は、適切な融合タンパク質を発現させることによって実施され得る。相同性パートナーの間の組換え特異性は、適切な分子をインビトロ反応に導入し、そして本明細書中に記載されるかまたは当該分野で公知のような組換え産物に対してアッセイすることによって実施され得る。組換え部位における他の所望の変異は、制限部位、翻訳もしくは転写開始シグナル、タンパク質結合部位、特定のコード配列および核酸塩基配列の他の公知の機能性の存在または非存在を含み得る。組換え部位における特定の機能特質に対する遺伝的選択スキームは、公知の方法工程に従って使用され得る。例えば、（相互作用しない部位の対から）相互作用するパートナーを提供するための部位の改変は、その部位の間の組換えを介して、毒性物質をコードするＤＮＡ配列の欠失を要求することによって達成され得る。同様に、翻訳終止配列、タンパク質結合部位の存在または非存在などを除去する部位の選択が、当業者によって用意に工夫され得る。
【０１４０】
従って、本発明はまた、選択マーカーおよび／または所望のＤＮＡセグメントに隣接し、少なくとも１つ、そして好ましくは少なくとも２つの本発明の操作された組換え部位ヌクレオチド配列を有する、少なくとも１つのＤＮＡセグメントを含む核酸分子を提供し、ここで、少なくとも１つの上記組換え部位ヌクレオチド配列は、共挿入されたＤＮＡまたは産物ＤＮＡの形成におけるインビトロの組換えを増強する少なくとも１つの操作された変異を有する。そのような操作された変異は、本発明の組換え部位ヌクレオチド配列のコア配列の中であり得る；米国出願第０８／４８６，１３９号（１９９５年６月７日出願）、同第０８／６６３，００２号（１９９６年６月７日出願）（現在、米国特許第５，８８８，７３２号）、同第０９／００５，４７６号（１９９８年１月１２日出願）および同第０９／１７７，３８７号（１９９８年１０月２３日出願）を参照し、これらの開示は、本明細書中にその全体が参考として全て援用される。
【０１４１】
好ましい実施形態において、組換え部位は、配列が異なりそして互いに相互作用しないが、同じ配列（これは、互いに相互作用し得る）を含む部位は、互いの組換えを阻害するように処理され得るかまたは操作され得ることが、理解される。そのような概念は、本明細書中に考慮されそして援用される。例えば、タンパク質結合部位（例えば、抗体結合部位、ヒストン結合部位、酵素結合部位または任意の核酸分子結合タンパク質に対する結合部位）は、その部位の１つに隣接して操作され得る。操作された部位を認識するタンパク質の存在下において、リコンビナーゼはその部位へのアクセスに失敗し、従って核酸分子内の別の組換え部位が、優先的に使用される。共挿入の場合、この部位は、もはや反応し得ない。なぜなら、例えばａｔｔＢからａｔｔＬに変化されているからである。共挿入の分解の間またはその時、タンパク質は、不活性化され得（例えば、抗体、熱または緩衝液の交換によって）、そして第２の部位は組換えを起こし得る。
【０１４２】
本発明の核酸分子は、この組換えの少なくとも１つの増強を与える少なくとも１つの変異を有し得、この増強は、実質的に以下からなる群から選択される：（ｉ）組み込みを可能にすること；（ｉｉ）組換えを可能にすること；（ｉｉ）宿主因子についての要件を軽減すること；（ｉｉｉ）この共統合ＤＮＡまたは産物ＤＮＡ形成の有効性を向上させること；（ｉｖ）この共統合ＤＮＡまたは産物ＤＮＡ形成の特異性を向上させること；およびタンパク質結合部位を追加または欠失させること。
【０１４３】
他の実施形態において、本発明の核酸分子は、ＰＣＲプライマー分子であり得、これは本明細書中に記載される１つ以上の組換え部位配列またはそれらの部分、特に、３’末端で、増幅されるべき標的核酸分子と特異的に相互作用する標的特異的テンプレート配列に結合した、図９に示される配列（または図９に示される配列に相同な配列）、または改変体、フラグメント、それらの変異体または誘導体を含む。本発明のこの局面に従うプライマー分子は、さらに、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、１０、２０、２５、５０、１００、５００、１０００、またはそれより多い）のさらなる塩基を、それらの５’末端に含み得、そして好ましくは、１つ以上（特に４または５）のさらなる塩基を含み、これらの塩基は、好ましくは、それらの５’末端において、本発明の組換えクローニング系にプライマー分子を組み込む増幅産物の効率を増加するグアニンである。このような核酸分子およびプライマーは、本明細書中の実施例、特に実施例２２〜２５に詳細に記載される。
【０１４４】
本発明の特定のプライマーは、図９に示されるように、ａｔｔＢ１、ａｔｔＢ２、ａｔｔＰ１、ａｔｔＰ２、ａｔｔＬ１、ａｔｔＬ２、ａｔｔＲ１、またはａｔｔＲ２配列中に１つ以上のヌクレオチド欠失を含み得る。このような局面において、例えば、ａｔｔＢ２プライマーが構築され得、ここで、図９に示されるａｔｔＢ２配列の５’末端における初めの４ヌクレオチドのうち１つ以上は、欠失している。従って、本発明のこの局面に従うプライマーは、以下の配列を有し得る：
【０１４５】
【化１１】
0004580106.tif 000009
ここで、プライマーの３’末端における「ｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎ．．．ｎ」は、任意の長さ（例えば、１塩基から標的核酸分子（例えば、遺伝子）またはその部分の全ての塩基まで）の標的特異的配列を表し、この配列および長さは、増幅されるべき標的核酸分子の同一性に依存する。
【０１４６】
本発明のこの局面に従うプライマー核酸分子は、図９に示される組換え部位配列、またはそれらの部分を、標準ＰＣＲ標的特異的プライマーの５’末端に、当該分野で周知の方法に従って連結することによって、合成的に生成され得る。あるいは、本発明のさらなるプライマー核酸分子は、１つ以上のヌクレオチド塩基（これは、好ましくは、本明細書中で記載されるａｔｔヌクレオチド配列の、１つ以上、好ましくは５つ以上、そしてより好ましくは６つ以上の連続したヌクレオチドに対応する（例えば、本明細書中の実施例２０を参照のこと；米国出願第０８／６６３，００２号（１９９６年６月７日出願）（現在、米国特許第５，８８８，７３２号）、同第０９／００５，４７６号（１９９８年１月１２日出願）、および同第０９／１７７，３８７号（１９９８年１０月２３日出願）もまた参照のこと。これらの開示は、それらの全体が本明細書中で参考として援用される））を、標準ＰＣＲ標的特異的プライマーの５’末端に、当該分野で周知の方法に従って付加することによって、合成的に生成され、本明細書中に記載の特異的ヌクレオチド配列を有するプライマーを提供し得る。上記のように、本発明のこの局面に従うプライマー核酸分子はまた、それらの５’末端において、１、２、３、４、５またはそれより多いさらなるヌクレオチド塩基を必要に応じて含み得、そして好ましくは、それらの５’末端において、４つまたは５つのグアニンを含む。１つの特に好ましいこのような局面において、本発明のプライマー核酸分子は、標的特異的（例えば、遺伝子特異的）プライマー分子の５’末端に結合した、図９に示されるａｔｔＢ１またはａｔｔＢ２ヌクレオチド配列（またはそれらに対して相補的なヌクレオチド）の、１つ以上、好ましくは５つ以上、より好ましくは６つ以上、さらにより好ましくは、６〜１８または６〜２５個、そして最も好ましくは、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５個の連続したヌクレオチドまたはｂｐを含み得る。本発明のこの局面に従うプライマー核酸分子には、以下のヌクレオチド配列を有するａｔｔＢ１およびａｔｔＢ２誘導プライマー核酸分子が挙げられるが、これらに限定されない：
【０１４７】
【化１２】
0004580106.tif 000010
ここで、プライマーの３’末端における「ｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎ．．．ｎ」は、任意の長さ（例えば、１塩基から標的核酸分子（例えば、遺伝子）またはその部分の全ての塩基まで）の標的特異的配列を表し、この配列および長さは、増幅されるべき標的核酸分子の同一性に依存する。
【０１４８】
もちろん、本明細書に詳細に記載されるものと類似のさらなるプライマー核酸分子が、標的特異的（例えば、遺伝子特異的）プライマー分子の５’末端の連結した、図９に示されるａｔｔＰ１、ａｔｔＰ２、ａｔｔＬ１、ａｔｔＬ２、ａｔｔＲ１、またはａｔｔＲ２ヌクレオチド配列の、１つ以上、好ましくは５つ以上、より好ましくは６つ以上、さらにより好ましくは１０個以上、１５個以上、２０個以上、２５個以上、３０個以上など（全てまでおよび全てを含む）の連続したヌクレオチドまたはｂｐを使用して生成され得ることは、本明細書中に含まれる教示から当業者に明らかである。上記のように、このようなプライマー核酸分子は、それらの５’末端において、１、２、３、４、５個またはそれより多いさらなるヌクレオチド塩基を必要に応じてさらに含み得、そして好ましくは、それらの５’末端で、４つのグアニンを含む。図９に示されるａｔｔＢ１、ａｔｔＢ２、ａｔｔＰ１、ａｔｔＰ２、ａｔｔＬ１、ａｔｔＬ２、ａｔｔＲ１、およびａｔｔＲ２配列を含む他のプライマー分子、またはそれらの部分は、本明細書中に示されるガイダンスに従って、過度の実験を使用することなく、当業者によって作製され得る。
【０１４９】
本明細書中に記載される本発明のプライマーは、本発明の組換えシステムを使用するＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントのクローニング（以下の実施例８、１９および２１〜２５に詳細に記載される）において使用するため、各末端において組み替え部位配列により隣接した目的の核酸分子を有するＰＣＲフラグメントを産生する際に有用である（以下の実施例９で詳細に記載される）。
【０１５０】
（ベクター）
本発明はまた、本明細書中で記載されるように、本発明の１つ以上の核酸分子を含むベクターに関する。本発明によると、任意のベクターが、本発明のベクターを構築するために使用され得る。特に、当該分野で公知のベクターおよび市販のベクター（およびそれらの改変体または誘導体）は、本発明の方法において使用するために、１つ以上の組換え部位（もしくはそれらの部分）をコードする１つ以上の核酸分子、または変異体、フラグメント、あるいはそれらの誘導体を含むように、本発明に従って操作され得る。このようなベクターは、例えば以下から得られ得る：Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｒｏｃｈｅ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ＥｐｉＣｅｎｔｅｒ、ＯｒｉＧｅｎｅｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、およびＲｅｓｅｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ。このようなベクターは、次いで、例えば、目的の核酸分子をクローニングまたはサブクローニングするために使用され得る。一般的なクラスの特定の目的のベクターには、原核生物および／または真核生物のクローニングベクター、発現ベクター、融合ベクター、トゥーハイブリッドベクター、逆トゥーハイブリッドベクター、異なる宿主において使用するためのシャトルベクター、変異誘発ベクター、転写ベクター、大きな挿入物を受容するためのベクターなどが挙げられる。
【０１５１】
目的の他のベクターには、ウイルス由来のベクター（Ｍ１３ベクター、細菌性ファージλベクター、バクテリオファージＰ１ベクター、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ファージディスプレイベクター、組換えライブラリーベクター）、高い、低い、および調整可能なコピー数のベクター、単一の宿主中の組換えにおける使用に適合性のレプリコンを有するベクター（ｐＡＣＹＣ１８４およびｐＢＲ３２２）、ならびに真核生物エピソーム複製ベクター（ｐＣＤＭ８）が挙げられる。
【０１５２】
目的の特定のベクターには、原核生物発現ベクター（例えば、ｐｃＤＮＡＩＩ、ｐｓＳＬ３０１、ｐＳＥ２８０、ｐＳＥ３８０、ｐＳＥ４２０、ｐＴｒｃＨｉｓＡ、ＢおよびＣ、ｐＲＳＥＴ  Ａ、ＢおよびＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）、ｐＧＥＭＥＸ−１、およびｐＧＥＭＥＸ−２（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｉｎｃ．））、ｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＧＥＸベクター、ｐＥＺＺ１８、ｐＲＩＴ２Ｔ、およびｐＭＣ１８７１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｉｎｃ．）、ｐＫＫ２３３−２およびｐＫＫ３８８−１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）、およびｐＰｒｏＥｘ−ＨＴ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、ならびにそれらの改変体および誘導体が挙げられる。目的のベクターはまた、例えば、以下のような原核生物発現ベクターから作製され得る：
【０１５３】
【化１３】
0004580106.tif 000011
特定の目的の他のベクターには、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ、ｐＳＰＯＲＴ、コスミド、ファージミド、ＹＡＳ（酵母人工染色体）、ＢＡＣ（細菌人工染色体）、ＭＡＣ（哺乳動物人工染色体）、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ９（Ｑｕｉａｇｅｎ）、ｐＢＳベクター、ＰｈａｇｅＳｃｒｉｐｔベクター、ＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６Ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐｃＤＮＡ３（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＧＥＸ、ｐＴｒｓｆｕｓ、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＥＴ−５、ｐＥＴ−９、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＳＰＯＲＴ１、ｐＳＰＯＲＴ２、ｐＣＭＶＳＰＯＲＴ２．０、およびｐＳＶＳＰＯＲＴ１（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、ならびにそれらの改変体および誘導体が挙げられる。
【０１５４】
目的のさらなるベクターには、以下が挙げられる：
【０１５５】
【化１４】
0004580106.tif 000012
0004580106.tif 000013
特定の目的のトゥーハイブリッドベクターおよび逆トゥーハイブリッドベクターには、以下が挙げられる：
【０１５６】
【化１５】
0004580106.tif 000014
特定の目的の酵母発現ベクターには、ｐＥＳＰ−１、ｐＥＳＰ−２、ｐＥＳＣ−Ｈｉｓ、ｐＥＳＣ−Ｔｒｐ、ｐＥＳＣ−ＵＲＡ、ｐＥＳＣ−Ｌｅｕ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＲＳ４０１、ｐＲＳ４０２、ｐＲＳ４１１、ｐＲＳ４１２、ｐＲＳ４２１、ｐＲＳ４２２、ならびにそれらの改変体および誘導体が挙げられる。
【０１５７】
本発明によると、１つ以上の組換え部位、またはそれらの変異体、改変体、フラグメント、もしくは誘導体をコードする１つ以上の核酸分子を含むベクターは、標準的な分子生物学的方法を使用して、過度の実験を行うことなく、当業者によって産生され得る。例えば、本発明のベクターは、１つ以上の組換え部位（またはそれらの変異体、フラグメント、改変体または誘導体）をコードする１つ以上の核酸分子を、本明細書中に記載される１つ以上のベクターに、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８２）に記載される方法に従って導入することによって産生され得る。本発明の関連の局面において、これらのベクターは、１つ以上の組換え部位（またはそれらの部分）をコードする１つ以上の核酸分子に加えて、１つ以上のさらなる物理的または機能的ヌクレオチド配列（例えば、１つ以上の多クローニング部位をコードする配列）、１つ以上の転写終結部位、１つ以上の転写調節配列（例えば、１つ以上のプロモーター、エンハンサーまたはレプレッサ）、１つ以上の選択マーカーまたはモジュール、目的のタンパク質またはポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子または遺伝子の部分、１つ以上の転写シグナル配列、融合パートナータンパク質またはペプチドをコードする１つ以上のヌクレオチド配列（例えば、ＧＳＴ、Ｈｉｓ6、またはチオレドキシン）、１つ以上の複製起点、および１つ以上の５’または３’ポリヌクレオチドテール（特に、ポリＧ−テール）を含むように操作され得る。本発明のこの局面によると、１つ以上の組換え部位のヌクレオチド配列（またはそれらの部分）は、必要に応じて、本明細書中に記載される１つ以上のさらなる物理的または機能的ヌクレオチド配列に作動可能に連結され得る。
【０１５８】
本発明のこの局面に従う好ましいベクターには、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
【０１５９】
【化１６】
0004580106.tif 000015
しかし、本発明はまた、本明細書中に詳細に示されていない他のベクターを包含し、このベクターは１つ以上の組換え部位またはそれらの部分（あるいは、それらの変異体、フラグメント、改変体または誘導体）をコードする本発明の１つ以上の単離された核酸分子を含み、そしてこのベクターは、１つ以上の組換え部位またはその部分をコードする１つ以上の核酸分子に作動可能に必要に応じて連結され得る、本明細書中で記載される１つ以上のさらなる物理的または機能的ヌクレオチド配列をさらに含み得ることが当業者に理解される。このようなさらなるベクターは、本明細書中に示されるガイダンスに従って、当業者によって産生され得る。
【０１６０】
（ポリメラーゼ）
本発明に従う使用のための逆転写酵素活性を有する好ましいポリペプチド（すなわち、ＲＮＡテンプレートからのＤＮＡ分子の合成を触媒し得るポリペプチド）には、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭＬＶ）逆転写酵素、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）逆転写酵素、鳥類骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素、ラウス関連ウイルス（ＲＡＶ）逆転写酵素、骨髄芽球症関連ウイルス（ＭＡＶ）逆転写酵素、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）逆転写酵素、レトロウイルス逆転写酵素、レトロトランスポゾン逆転写酵素、Ｂ型肝炎逆転写酵素、カリフラワーモザイクウイルス逆転写酵素、および細菌逆転写酵素が含まれるがこれらに限定されない。特に好ましいのは、ＲＮＡｓｅ  Ｈ活性においてまた実質的に減少している逆転写酵素活性を有するポリペプチド（「ＲＮＡｓｅ  Ｈ-」ポリペプチド）である。「ＲＮＡ  Ｈ活性において実質的に減少している」ポリペプチドによって、野生型のＲＮａｓｅＨ活性またはＲＮａｓｅ  Ｈ-酵素（例えば、野生型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素）の約２０％未満、より好ましくは約１５％、１０％、または５％未満、そして最も好ましくは約２％未満を有するポリペプチドが意味される。ＲＮａｓｅＨ活性は、種々のアッセイ（例えば、米国特許第５，２４４，７９７号、Ｋｏｔｅｗｉｃｚ，Ｍ．Ｌ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１６：２６５（１９８８）およびＧｅｒａｒｄ，Ｇ．Ｆ．ら、ＦＯＣＵＳ  １４（５）：９１において記載されるようなアッセイ、これらのすべての開示は、本明細書中で参考として十分に援用される）によって決定され得る。本発明における使用のための適切なＲＮＡｓｅＨ-ポリペプチドは、以下を含むがこれらに限定されない：Ｍ−ＭＬＶ  Ｈ-逆転写酵素、ＲＳＶ  Ｈ-逆転写酵素、ＡＭＶ  Ｈ-逆転写酵素、ＲＡＶ  Ｈ-逆転写酵素、ＭＡＶ  Ｈ-逆転写酵素、ＨＩＶ  Ｈ-逆転写酵素、ＴＨＥＲＭＯＳＣＲＩＰＴTM逆転写酵素およびＴＨＥＲＭＯＳＣＲＩＰＴTMＩＩ逆転写酵素、ならびにＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴTM  Ｉ逆転写酵素およびＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴTM  ＩＩ逆転写酵素（これらは、例えば、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）から入手可能である）。一般的には、ＰＣＴ出願公開ＷＯ  ９８／４７９１２を参照のこと。
【０１６１】
本発明の方法における使用のために適切な核酸ポリメラーゼ活性を有する他のポリペプチドには、高熱性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ、クレノウフラグメント、Ｔ７ポリメラーゼ、およびＴ５ポリメラーゼ）、ならびに耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（以下を含むがこれらに限定されない：Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅｏｐｏｌｉｔａｎａ（Ｔｎｅ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ（Ｔｍａ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ（ＴｌｉまたはＶＥＮＴ（登録商標））ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ種ＧＢ−Ｄ（またはＤＥＥＰＶＥＮＴ（登録商標））ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｗｏｏｓｉｉ（Ｐｗｏ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｂｓｔ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ（Ｓａｃ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ（Ｔａｃ）ＤＮＡポリメラーゼ，Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｌａｖｕｓ（Ｔｆｌ／Ｔｕｂ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｒｕｂｅｒ（Ｔｒｕ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｂｒｏｃｋｉａｎｕｓ（ＤＹＮＡＺＹＭＥ（登録商標））ＤＮＡポリメラーゼ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ（Ｍｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ、ならびにそれらの変異体、改変体、および誘導体）が含まれる。このようなポリペプチドは、例えば、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）およびＳｉｇｍａ／Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から市販されている。
【０１６２】
（宿主細胞）
本発明はまた、本発明の１つ以上の核酸分子またはベクター（特に、本明細書中に詳細に記載される核酸分子またはベクター）を含む宿主細胞に関する。本発明のこの局面に従って使用され得る代表的な宿主細胞には、以下が含まれるがこれらに限定されない：細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、および動物細胞。好ましい細菌宿主細胞には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｓｐｐ．細胞（特に、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞および最も特定には、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＤＨ１０Ｂ、Ｓｔｂｌ２、ＤＨ５α、ＤＢ３、ＤＢ３．１（好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＬＩＢＲＡＲＹ  ＥＦＦＩＣＩＥＮＣＹ（登録商標）ＤＢ３．１TMコンピテント細胞；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、ＤＢ４およびＤＢ５；１９９９年３月２日に出願された米国仮出願番号６０／１２２，３９２号を参照のこと、この開示は、本明細書中でその全体が参考として援用される）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．細胞（特にＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＢ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ細胞）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．細胞、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｓｐｐ．細胞、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．細胞、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｓｐｐ．細胞（特に、Ｓ．ｍａｒｃｅｓｓａｎｓ細胞）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．細胞（特に、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ細胞）、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．細胞（特に、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍおよびＳ．ｔｙｐｈｉ細胞）が含まれる。好ましい宿主細胞には、昆虫細胞（最も好ましくは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ細胞、Ｓｐｏｄｐｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ  Ｓｆ９細胞およびＳｆ２１細胞ならびにＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓａ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｖｅ細胞）、線虫細胞（特に、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｃｅ細胞）、鳥類細胞、両生類細胞（特に、Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ細胞）、爬虫類細胞、哺乳動物細胞（最も具体的には，ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＢＨＫ細胞、およびヒト細胞）が含まれる。好ましい酵母細胞には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞およびＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞が含まれる。これらおよび他の適切な宿主細胞は、例えば、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ）およびＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＮＲＲＬ；Ｐｅｏｒｉａ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓから市販されている。
【０１６３】
本発明の核酸分子および／またはベクターを、本明細書中に記載する宿主細胞に導入して、本発明の１つ以上の核酸分子および／またはベクターを含む宿主細胞を産生するための方法は、当業者に知られている。例えば、本発明の核酸分子および／またはベクターは、感染、形質導入、トランスフェクション、および形質転換の周知の技術を使用して宿主細胞に導入され得る。本発明の核酸分子および／またはベクターは、単独でまたは他の核酸分子および／もしくはベクターとともに導入され得る。あるいは、本発明の核酸分子および／またはベクターは、沈殿物（例えば、リン酸カルシウム沈殿物）として、または脂質との複合体中で宿主細胞に導入され得る。エレクトロポレーションもまた、宿主に本発明の核酸分子および／またはベクターを導入するために使用され得る。同様に、このような分子は、化学的にコンピテントな細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）に導入され得る。ベクターがウイルスである場合、これは、インビトロでパッケージングされ得るか、またはパッケージング細胞に導入され得、そしてパッケージングされたウイルスは、細胞に導入され得る。従って、本発明のこの局面に従って細胞に本発明の核酸分子および／またはベクターを導入するために適切な広範な種々の技術は、当業者に周知でありそして当業者に日常的である。このような技術は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１６．３０−１６．５５頁（１９８９）、Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ら、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ、第２版、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．２１３−２３４頁（１９９２）、およびＷｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｅ．−Ｌ．、Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９８７）に十分に概説されており、これらは、これらの技術を詳述する多くの実験室マニュアルの例となるものであり、そしてこれらの関連する開示について、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【０１６４】
（ポリペプチド）
別の局面において、本発明は、本発明の核酸分子によってコードされるポリペプチド（本発明の核酸分子のすべての可能なリーディングフレームによってコードされるポリペプチドおよびアミノ酸配列を含む）、およびそのようなポリペプチドを産生する方法に関する。本発明のポリペプチドには、精製されたかまたは単離された天然の産物、化学合成手順の生成物、および原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、鳥類細胞、および高等植物細胞を含む）から組換え技術によって産生された生成物が含まれる。
【０１６５】
本発明のポリペプチドは、合成有機化学によって産生され得、そして好ましくは、本発明のベクターまたは単離された核酸分子を含む１つ以上の本発明の宿主細胞を使用する、標準的な組換え方法によって産生される。本発明に従って、ポリペプチドが、本発明の核酸分子に含まれるヌクレオチド配列の発現に好ましい条件下で、本発明の宿主細胞（これは、本発明の１つ以上の核酸分子（好ましくは発現ベクター中に含まれる）を含む）を培養することによって産生され、その結果、本発明の核酸分子によってコードされるポリペプチドが宿主細胞によって産生される。本明細書中で使用される場合、「ヌクレオチド配列の発現に好ましい条件」または「ポリペプチドの産生に好ましい条件」には、所定の宿主細胞による組換えポリペプチドの産生のために必要とされる最適な生理的（例えば、温度、湿度など）および栄養学的（例えば、培養培地、イオン）条件が含まれる。種々の宿主細胞（原核（細菌）細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、および植物細胞を含む）のためのこのような最適条件は、当業者に知られており、そして例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、（１９８９）、Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ら、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ、第２版、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、およびＷｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｅ．−Ｌ．、Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９８７）に見出され得る。
【０１６６】
いくつかの局面において、本発明のポリペプチドを単離または精製することが（例えば、以下に記載されるような抗体の産生のために）所望され得、単離された形態の本発明のポリペプチドの産生を生じる。本発明のポリペプチドは、当該分野において慣用的であるタンパク質精製の周知の方法によって組換え細胞培養物から回収および単離され得る。これらの方法には、硫酸アンモニウム沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン交換クロマトグラフィーまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーが含まれる。例えば、本発明の方法によって作製されるポリペプチド上のＨｉｓ６またはＧＳＴ融合タグは、当業者によって知られているように、Ｈｉｓ６またはＧＳＴタグを有するポリペプチドを結合する適切なアフィニティークロマトグラフィーマトリックスを使用して単離され得る。本発明のポリペプチドは、天然に精製された生成物、化学合成手順の生成物、および原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞）から組換え技術によって産生された生成物を含む。組換え産生手順において使用される宿主に依存して、本発明のポリペプチドは、グリコシル化されてもよいし、またはグリコシル化されなくてもよい。さらに、本発明のポリペプチドはまた、いくつかの場合に、宿主媒介プロセスの結果として、最初の改変されたメチオニン残基を含み得る。
【０１６７】
本発明の単離されたポリペプチドは、１つ以上の組換え部位をコードする本発明の核酸分子を含むポリヌクレオチドの１つ以上のリーディングフレームによってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。この核酸分子は以下を含む：図９に示されるヌクレオチド配列（またはそれに相補的なヌクレオチド配列）、もしくはそのフラグメント、改変体、変異体、および誘導体を有する、ａｔｔＢ１、ａｔｔＢ２、ａｔｔＰ１、ａｔｔＰ２、ａｔｔＬ１、ａｔｔＬ２、ａｔｔＲ１、およびａｔｔＲ２；本明細書中に記載される寄託されたクローンに含まれるポリヌクレオチドによってコードされる完全アミノ酸配列；ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で図９に示されるような本発明の組換え部位配列をコードするヌクレオチド配列（またはそれに相補的なヌクレオチド配列）を有するポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列；または上記のポリペプチドの一部もしくはフラグメントを含むペプチドもしくはポリペプチドをコードする核酸分子。本発明はまた、組換え部位ヌクレオチド配列または寄託されたクローンによってコードされるポリペプチドに連結される（代表的には、新生ポリペプチドを形成するペプチジル結合による）１つ以上のさらなるアミノ酸を有するさらなるポリペプチドに関する。このようなさらなるアミノ酸残基は、１つ以上の機能的ペプチド配列（例えば、１つ以上の融合パートナーペプチド（例えば、ＧＳＴ、Ｈｉｓ6、Ｔｒｘなど）など）を含み得る。
【０１６８】
本明細書中で使用される場合、用語「タンパク質」、「ペプチド」、「オリゴペプチド」および「ポリペプチド」は、（一般的に理解されるように）同義語として考慮される。そして各用語は、文脈が必要とするように、交換可能に使用されて、以下の特定の文脈で別に規定されていないかぎり、ペプチジル結合によって結合される２つ以上のアミノ酸、好ましくは５つ以上のアミノ酸、またはより好ましくは１０以上アミノ酸の鎖を示し得る。当該分野で一般的に理解されるように、本明細書中のすべてのペプチドの式または配列は、左から右に書かれ、そしてアミノ末端からカルボキシ末端への方向で書かれる。
【０１６９】
本発明のポリペプチドのいくつかのアミノ酸配列は、ポリペプチドの構造および機能に有意な効果なしで変化し得ることが、当業者によって理解される。配列におけるこのような差違が意図される場合、構造および活性を決定するタンパク質の決定的な領域が存在することを思い出すべきである。一般的に、類似の機能を実行する残基が使用される場合、三次構造を形成する残基を置換することは可能である。他の例において、変化がポリペプチドの決定的でない領域で起こる場合には、残基の型は、完全に重要であるというわけではないかもしれない。
【０１７０】
従って、本発明は、本発明のポリペプチドの改変体をさらに含む。この改変体は、本明細書中に記載されるポリペプチドに対して実質的に構造的な相同性を示すか、またはこれらのポリペプチドの特定の領域（例えば、以下で議論される部分）を含む対立遺伝子改変体を含む。このような変異体は、欠失、挿入、反転、反復、および型置換（例えば、別の残基の代わりに１つの親水性残基に置換すること、しかし、規則として、強い疎水性については強い親水性とはしない）を含み得る。小さな変化またはこのような「中性」または「保存性」アミノ酸置換は、一般的に活性にほとんど影響を有さない。
【０１７１】
代表的な保存性置換は、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの間で、１つの残基の別の残基への置換；水酸化残基ＳｅｒおよびＴｈｒの交換；酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換；アミド化残基ＡｓｎおよびＧｌｎの間の置換；塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換；ならびに芳香族残基ＰｈｅおよびＴｙｒの間の置換である。
【０１７２】
従って、本発明のポリペプチドのフラグメント、誘導体、またはアナログ（例えば、本明細書中に記載される組換え部位のヌクレオチド配列によってコードされるペプチドを含むもの）は、（ｉ）１つ以上のアミノ酸残基が保存性アミノ酸残基または非保存性アミノ酸残基（好ましくは、保存性アミノ酸残基）で置換されたものであり、そしてそのような置換されたアミノ酸残基は、遺伝コードによってコードされ得るか、または遺伝コードによってコードされないアミノ酸（例えば、デスモシン、シトルリン、オルニチンなど）であり得るもの；（ｉｉ）１つ以上のアミノ酸残基が、アミノ酸の通常の「Ｒ」基に加えて、置換基（例えば、リン酸基、水酸基、硫酸基、または他の基）を含むもの；（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドが別の化合物（例えば、ポリペプチドの半減期を増大させる化合物（例えば、ポリエチレングリコール））と融合しているもの；または（ｉｖ）さらなるアミノ酸が成熟ポリペプチド（例えば、免疫グロブリンＦｃ領域ペプチド、リーダーまたは分泌配列、成熟ポリペプチドの精製のために使用される配列（例えば、ＧＳＴ配列）またはプロタンパク質配列）と融合しているもの。このようなフラグメント、誘導体、およびアナログは、本発明に含まれることが意図され、そして本明細書中の教示および本発明の時点における当該分野の状態から、当業者の範囲内である。
【０１７３】
本発明のポリペプチドは、好ましくは、単離された形態で提供され、そして好ましくは、実質的に精製されている。本発明のポリペプチドの組換え産生バージョンは、ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ、Ｇｅｎｅ  ６７：３１−４０（１９８８）に記載される１工程方法によって実質的に精製され得る。本明細書中で使用される場合、用語「実質的に精製される」は、本発明の個々の調製物を意味し、ここで夾雑タンパク質（すなわち、本明細書中に記載される個々のポリペプチド、そのフラグメント、改変体、変異体、または誘導体ではないタンパク質）の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、７０％、または７５％、およびより好ましくは、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％（重量％）が調製物から除去されていることを意味する。
【０１７４】
本発明のポリペプチドは、本明細書中に記載されるポリペプチドに対して、少なくとも約５０％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、より好ましくは、少なくとも約７０％同一、少なくとも約７５％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、または少なくとも約９９％同一であるポリペプチドを含む。例えば、本発明の好ましいａｔｔＢｌ含有ポリペプチドは、図９において示される核酸配列（またはこれに相補的な核酸配列）を有するａｔｔＢｌのヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの３つのリーディングフレームによってコードされるポリペプチドに対して、本明細書中に記載される寄託されたｃＤＮＡクローンに含まれるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに対して、または、ストリンジェントな条件下で、図９において示される核酸配列（またはこれに相補的な核酸配列）を有するａｔｔＢｌのヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドに対してハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに対して、少なくとも約５０％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、より好ましくは、少なくとも約７０％同一、少なくとも約７５％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、または少なくとも約９９％同一であるポリペプチドを含む。類似のポリペプチドは調製され得、このポリペプチドは、図９に示されるような本発明のａｔｔＢ２ポリペプチド、ａｔｔＰ１ポリペプチド、ａｔｔＰ２ポリペプチド、ａｔｔＬ１ポリペプチド、ａｔｔＬ２ポリペプチド、ａｔｔＲ１ポリペプチド、およびａｔｔＲ２ポリペプチドに対して、少なくとも約６５％同一、より好ましくは、少なくとも約７０％同一、少なくとも約７５％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、または少なくとも約９９％同一である。本発明のポリペプチドはまた、少なくとも５、１０、１５、２０、または２５アミノ酸を有する、上記に記載のポリペプチドの一部またはフラグメントを含む。
【０１７５】
本発明の所与のポリペプチドの参照アミノ酸配列に対して、少なくとも、例えば、６５％「同一」のアミノ酸配列を有するポリペプチドとは、このポリペプチド配列が、本発明の所与のポリペプチドの参照アミノ酸配列の各１００アミノ酸当たり３５アミノ酸までの変化を含み得ること以外、ポリペプチドのアミノ酸配列が、この参照配列と同一であることを意味する。言い換えれば、参照アミノ酸配列と少なくとも６５％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るために、参照配列中に３５％までのアミノ酸残基が、失欠されるか、または別のアミノ酸で置換され得るか、あるいは、参照配列中の総アミノ酸残基の３５％までの多数のアミノ酸が、参照配列中に挿入され得る。この参照配列のこれらの変化は、参照アミノ酸配列のアミノ（−Ｎ）末端または炭素（Ｃ−）末端位置、あるいは、それらの末端位置間ならどこでも発生し得、参照配列または参照配列内の１以上の連続基中のいずれか残基内で個々に分散される。実際の手段として、所与のアミノ酸が、本発明の所与のポリペプチドのアミノ酸配列と、例えば、少なくとも６５％同一であるかどうかは、公知のコンピュータプログラム（核酸配列同一性の決定のための上記のプログラム）を慣用的に使用してか、またはより好ましくは、ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：４６７３−４６８０（１９９４））を使用して決定され得る。
【０１７６】
本発明のポリペプチドは、当業者に周知の方法を使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルまたはモレキュラーシーブゲル濾過カラム上の分子量マーカーとして使用され得る。さらに、以下に詳細に記載されるように、本発明のポリペプチドを使用して、タンパク質の発現、局在化、他の分子との相互作用を検出するため、または本発明のポリペプチド（融合ポリペプチドを含む）を単離するための種々のアッセイに有用であるポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を産生する。
【０１７７】
別の局面において、本発明は、本発明のポリペプチドのエピトープ含有部分を含むペプチドまたはポリペプチドを提供し、これは、本発明の１以上のポリペプチドに対して特異的に結合する抗体（特にモノクローナル抗体）を産生するために使用され得る。このポリペプチド部分のエピトープは、本発明のポリペプチドの免疫原性エピトープまたは抗原性エピトープである。「免疫原性エピトープ」は、全タンパク質が免疫原である場合、抗体応答を誘発するタンパク質の一部として規定される。これらの免疫原性エピトープは、分子上の少数の遺伝子座に限定されると考えられている。一方で、抗体が結合し得るタンパク質分子の領域は、「抗原エピトープ」と定義される。タンパク質の免疫原性エピトープの数は、抗原エピトープの数より一般に少ない（例えば、Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：３９９８−４００２（１９８３）を参照のこと）。
【０１７８】
抗原性エピトープを含有する（すなわち、抗体が結合し得るタンパク質分子の領域を含む）ペプチドまたはポリペプチドの選択について、タンパク質配列の一部を擬態する比較的短い合成ペプチドが、通常、部分的に擬態されたタンパク質と反応する抗血清を誘発し得ることが周知である（例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ，Ｊ．Ｇ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１９：６６０−６６６（１９８３）を参照のこと）。タンパク質反応性血清を誘発し得るペプチドは、タンパク質の一次配列で頻繁に表現され、これらは、一連の単純な化学的ルールによって特徴付けされ得、そしてインタクトなタンパク質の免疫優性領域（すなわち、免疫原性エピトープ）またはアミノ末端もしくはカルボキシ末端に限定されない。極度に疎水性であるペプチドおよび６以下の残基のペプチドは、一般に、擬態タンパク質に結合する誘発抗体で効果的ではなく；より長いペプチド、特にプロリン残基を含むペプチドが、通常効果的である（Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ，Ｊ．Ｇ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１９：６６０−６６６（１９８３））。
【０１７９】
上記のガイドラインに従ってデザインされた本発明のエピトープ含有ペプチドおよびポリペプチドは、好ましくは、少なくとも５つの配列を含み、より好ましくは、少なくとも７つ以上のアミノ酸を本発明のポリペプチドのアミノ酸配列内に含む。しかし、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列のより大きな部分を含み、約３０〜約５０個のアミノ酸、またはそれまでの任意の長さを含み、そして本発明の所与のポリペプチドの総アミノ酸配列を含む、ペプチドまたはポリペプチドがまた、本発明のエピトープ含有ペプチドまたはポリペプチドと考えられ、そしてまた擬態タンパク質と反応する誘導抗体に対して有用である。好ましくは、エピトープ含有タンパク質のアミノ酸配列は、水性溶媒中で実質的な溶解性を提供するように選択される（すなわち、この配列は、比較的親水性の残基を含み、そして高く疎水性の配列が、好ましくは、避けられる）；プロリン残基を含む配列が、特に好ましい。
【０１８０】
本発明のポリペプチドに対して特異的な抗体を産生するために使用され得る、エピトープ含有ポリペプチドまたはペプチドの非制限例としては、本発明の１以上の組換え部位コード核酸分子を含む、ポリヌクレオチドによってコードされたアミノ酸配列を含むポリペプチドの特定のエピトープ含有領域（これらには、図９に記載されるヌクレオチド配列を有するａｔｔＢ１、ａｔｔＢ２、ａｔｔＰ１、ａｔｔＰ２、ａｔｔＬ１、ａｔｔＬ２、ａｔｔＲ１およびａｔｔＲ２（またはこれらに相補的なヌクレオチド配列）をコードするものが挙げられる）；本明細書中に記載される寄託されたクローン中に含まれる、ポリヌクレオチドの３つのリーディングフレームによってコードされる完全なアミノ酸配列；ならびに図９に記載される本発明の組換え部位領域（またはその一部）をコードするヌクレオチド配列（またはそれに相補的な核酸配列）を有するポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドの全てのリーディングフレームによってコードされたアミノ酸配列が挙げられる。本発明のポリペプチドに対して特異的な抗体を産生するために使用され得る、他のエピトープ含有ポリペプチドまたはペプチドは、例えば、ＰＲＯＴＥＡＮコンピュータソフトウエア（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ；Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を使用する本発明のポリペプチドの、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ疎水性およびＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ抗原インデックスプロットの構築を介して、本明細書中に記載される本発明のポリペプチドの一次アミノ酸配列に基づく当業者に理解される。
【０１８１】
本発明のエピトープ含有ペプチドおよびポリペプチドは、本発明の核酸分子を使用する組換え手段を含む、ペプチドまたはポリペプチドを作製するために任意の従来の手段によって産生され得る。例えば、短いエピトープ含有アミノ酸配列は、組換え体の産生および精製の間、ならびに抗ペプチド抗体を産生するための免疫化の間に、キャリアとして作用するより大きなポリペプチドに融合され得る。エピトープ含有ペプチドはまた、化学合成の公知の方法を使用して合成され得る（例えば、米国特許第４，６３１，２１１号、およびＨｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．Ａ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：５１３１−５１３５（１９８５）（これらの両方は、本明細書中でその全体が参考として援用される）を参照のこと）。
【０１８２】
当業者は、本名発明のポリペプチドおよびそのエピトープ含有フラグメントが、当該分野で周知でかつ慣用の技術によって、支持体上で免疫化され得ることを理解する。「固体支持体」とは、ペプチドが免疫化され得る任意の固体支持体を意味する。このような固体支持体としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ニトロセルロース、ジアゾセルロース、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、セファロース、寒天、デンプン、ナイロン、ビーズおよびマイクロタイタープレート。固体支持体への本発明のペプチドの結合は、支持体にポリペプチドの１端または両端を結合することによって達成され得得る。結合は、ペプチドの１以上の内部部位でさなれ得る。多結合（ペプチドの内部と端部の両方）は、本発明に従って使用され得る。アミノ酸連結基（例えば、一次アミノ酸、カルボキシル基、またはスルフヒドリル（ＳＨ）基）を介してか、または化学連結基（例えば、スペーサを介する臭化シアン（ＣＮＢｒ）連結を用いる）によって結合され得る。支持体への非共有結合のために、ペプチドに親和性標識配列の付加には、例えば、ＧＳＴ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｂ．およびＪｏｈｎｓｏｎ，Ｋ．Ｓ．、Ｇｅｎｅ  ６７：３１（１９８８））、ポリヒスチジン（Ｈｏｃｈｕｌｉ，Ｅ．ら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．４１１：７７（１９８７））、またはビオチンが使用され得る。このような親和性標識は、ペプチドの支持体への可逆的な結合のために使用され得る。このような免疫化ポリペプチドまたはフラグメントは、例えば、以下に記載されるような、本発明の１以上のポリペプチド、あるいは本発明の１以上のポリペプチドに結合する他のタンパク質またはペプチドを認識する他のタンパク質またはペプチドに対して指向される抗体を単離のに有用であり得る。
【０１８３】
当業者がまた理解するように、本発明のポリペプチドおよび本明細書中に記載されるそれらのエピトープ含有フラグメントは、１以上の融合パートナータンパク質またはペプチド、あるいはその一部と組み合わされ得、これらには、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ＧＳＴ、Ｈｉｓ6、Ｔｒｘおよびイムノグロブリン（Ｉｇ）の定常ドメインの一部、得られた化学的ポリペプチドまたは融合ポリペプチド。これらの融合ポリペプチドは、分析フォーマットまたは診断フォーマット（ハイスループットを含む）での使用のための本発明のポリペプチドの精製（ＥＰ  ０  ３９４  ８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３１：８４−８６（１９８８））を容易にする。
【０１８４】
（抗体）
別の局面において、本発明は、本発明のポリペプチド（またはそのエピトープ含有フラグメント）あるいは核酸分子（またはその一部）を認識およびそれらと結合する抗体に関する。関連する局面において、本発明は、１以上の組換え部位核酸配列またはその一部の全リーディングフレームによってコードされる１以上のポリペプチドを認識およびそれらと結合する抗体、あるいは１以上の組換え部位核酸配列またはその一部を含む、１以上の核酸分子に関し、これらとしては、ａｔｔ部位（ａｔｔＢ１、ａｔｔＢ２、ａｔｔＰ１、ａｔｔＰ２、ａｔｔＬ１、ａｔｔＬ２、ａｔｔＲ１、ａｔｔＲ２などを含む）、ｌｏｘ部位（例えば、ｌｏｘＰ、ｌｏｘＰ５１１など）、ＦＲＴなど、またはそれらの変異体（ｍｕｔａｎｔ）、フラグメント、変異体（ｖａｒｉａｎｔ）および誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。一般に、米国特許第５，８８８，７３２号（これは、本明細書中でその全体が参考として援用される）を参照のこと。本発明の抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得、そして当該分野で周知の方法に従って、任意の種々の方法および種々の種によって調製され得る。例えば、米国特許第５，５８７，２８７号；Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ，Ｊ．Ｇ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１９：６６０−６６６（１９８３）；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ  ３７：７６７（１９８４）；およびＢｉｔｔｌｅ，Ｆ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２３４７−２３５４（１９８５）を参照のこと。本明細書中に記載のポリペプチドまたは核酸分子のいずれかに特異的な抗体（例えば、組換え部位核酸配列、あるいは本明細書中に記載されるか、または寄託されたクローンに含まれる、１以上の核酸分子によってコードされる１以上のポリペプチドに特異的に結合する抗体）、融合ポリペプチドに対する抗体（例えば、本明細書中に記載されるような本発明の、１以上の融合パートナータンパク質と１以上の組換え部位ポリペプチドとの間の融合ポリペプチドに結合する抗体）などは、本発明のインタクトなポリペプチドまたはポリヌクレオチド、あるいはそれらの１以上の抗原性ポリペプチドフラグメントに対して産生され得る。
【０１８５】
本明細書において使用されるように、用語「抗体」（Ａｂ）は、以下に記載されるような特別の内容を除いて、用語「ポリクローナル抗体」または「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）と交換可能に使用され得る。本明細書に使用されるように、これらの用語は、インタクトな分子および抗体フラグメント（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）2フラグメントのような）を含むことを意味し、これらは、本発明のポリペプチドまたは核酸分子、あるいはそれらの一部と特異的に結合し得る。従って、本発明のインタクトな抗体に加えて、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2および本明細書中に記載される抗体の他のフラグメント、ならびに本発明の１以上のポリペプチドまたはポリヌクレオチドと結合する他のペプチドおよびペプチドフラグメントもまた、本発明の範囲内に含まれることを理解すべきである。このような抗体フラグメントは、代表的に、パパイン（Ｆａｂフラグメントを産生する）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）2フラグメントを産生する）のような酵素を使用する、インタクトな抗体のタンパク質分解によって産生される。抗体フラグメント、およびペプチドまたはペプチドフラグメントもまた、組換えＤＮＡ技術の適用または合成化学を通じて産生され得る。
【０１８６】
本発明のエピトープ含有ペプチドおよびポリペプチド、ならびにそれらの核酸分子またはそれらの一部を使用して、本明細書中に一般に記載されるように、当該分野で周知の方法に従って、抗体を誘導し得る（例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、前出；Ｗｉｌｓｏｎら、前出；およびＢｉｔｔｌｅ，Ｆ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２３４７−２３５４（１９８５）を参照のこと）。
【０１８７】
本発明のこの局面に従ったポリクローナル抗体は、本明細書中に記載される本発明のポリペプチドまたは核酸分子あるいは標準技術に従ったそれらのタンパク質の１以上で、動物を免疫化することにより作製され得る（Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＬａｎｅ，Ｄ．、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８８）；Ｋａｕｆｍａｎ，Ｐ．Ｂ．ら：Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ：ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，４６８〜４６９頁（１９９５）を参照のこと）。本発明のポリペプチドまたは核酸分子あるいはそれらのタンパク質を認識およびそれらと結合する抗体を産生するために、動物を、遊離ペプチドまたは遊離核酸分子で免疫化し得るが；ペプチドを高分子キャリア（例えば、アルブミン、ＫＬＨ、または破傷風トキソイド（特に、本発明の核酸分子またはそのタンパク質に対する抗体を産生するため；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（前出）、１５４頁を参照のこと））、あるいは固相キャリア（例えば、ラテックスまたはガラスミクロビーズ（ｇｌａｓｓ  ｍｉｃｒｏｂｅａｄ）に結合することによって、抗体価が、ブーストされ得る。例えば、システインを含むペプチドは、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）のようなリンカーを使用してキャリアに連結され得る。一方で他のペプチドは、グルタルアルデヒドのようなさらなる一般的な連結剤を使用してキャリアに結合され得る。ウサギ、ラットおよびマウスのような動物は、例えば、約１００μｇのペプチド、ポリヌクレオチド、またはキャリアタンパク質、およびＦｒｅｕｎｄアジュバンドを含むエマルジョンの腹腔内注射および／または皮内注射によって、遊離のペプチドまたは核酸分子（ポリペプチド免疫原が、約２５アミノ酸より長い場合）あるいはキャリアに結合したペプチドまたは核酸分子のいずれかで免疫化され得る。例えば、固体支持体に吸収された遊離ペプチドまたは核酸分子を使用するＥＬＳＡアッセイによって、検出され得る抗体の有用な滴定量を提供するために、いくらかのブースター注射が、例えば、約２週間おきに必要とされ得る。別のアプローチにおいて、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドあるいはそれらの抗原性フラグメントの１以上を発現する細胞は、慣用の免疫学的な方法に従って、ポリクローナル抗体を含む血清の産生を誘導するために、動物に投与され得る。さらに別の方法において、本発明の１以上のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの調製は、本明細書中に記載されるように調製および精製され、天然の汚染物を実質的に含まなくさせる。次いで、このような調製物は、より高い特異的活性のポリクローナル抗血清を産生するために動物に導入され得る。使用される免疫化の方法に関係なく、免疫化動物の血清中の抗体価は、抗ペプチドまたは抗ポリヌクレオチド抗体の選択によって（例えば、固体支持体上でのペプチドまたはポリヌクレオチドの吸着および当該��野で周知の方法に従って選択された抗体の溶出によって）増加され得る。
【０１８８】
代替の方法において、本発明の抗体は、モノクローナル抗体（または本発明の１以上のポリペプチドに結合したそのフラグメント）である。このようなモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５）：Ｋｏｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１（１９７６）；Ｋｏｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２９２（１９７６）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．５６３〜６８１頁（１９８１））を使用して調製され得る。一般に、このような手順は、本発明のポリペプチドもしくはポリヌクレオチド（またはそれらのフラグメント）、あるいは本発明のポリペプチドもしくはポリヌクレオチド（またはそれらのフラグメント）を発現する細胞で、動物（好ましくは、マウス）を免疫化する工程を含む。このようなマウスの脾細胞を抽出し、そして適切な骨髄腫と融合する。本発明に従って任意の適切な骨髄腫細胞株が使用されるが；Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄから入手可能な親骨髄腫細胞株（ＳＰ2Ｏを使用することが、好ましい。融合後、得られたハイブリドーマ細胞がＨＡＴ培地中で選択的に維持され、次いでＷａｎｄｓら（Ｇａｓｔｏｅｎｔｅｒｏｌ．８０：２２５−２３２（１９８１））によって記載されるような希釈法に限定することによってクローンされる。次いで、このような選択を通じて得られたハイブリドーマ細胞をアッセイして、本発明のポリペプチドまたは核酸分子あるいはそれらのフラグメントの１以上と結合し得る抗体を分泌するクローンを同定する。従って、本発明はまた、特に、本発明のポリペプチドまたは核酸分子の１以上を認識およびこれらと結合する、本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞および細胞株を産生する。
【０１８９】
あるいは、本発明のポリペプチドまたはそのフラグメントの１以上と結合し得るさらなる抗体は、抗イディオタイプ抗体の使用を通じて２工程の手順で産生され得る。このような方法は、抗体自体が抗原であり、従って、第２の抗体と結合する抗体を得ることが可能であるという事実を用いて成される。この方法に従って、上記で調製されるように、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの１以上に対して特異的である抗体は、動物（好ましくは、マウス）を免疫化するために使用される。次いで、このような動物の脾細胞を使用して、ハイブリドーマ細胞を産生し、そして本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの１以上に対して特異的に抗体と結合し得る、抗体を産生するクローンを同定するために分泌され得るこのハイブリドーマ細胞は、本発明自体のポリペプチドによって阻害され得る。このような抗体は、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの１以上を認識する抗体に対して、抗イディオタイプ抗体を含み、そして本発明のポリペプチドまたはポリペプチドの１以上に対して特異的なさらなる抗体の形成を誘導するように、動物を免疫化するために使用され得る。
【０１９０】
使用のために、本発明の抗体は、必要に応じて、１以上の標識と共有結合または非共有結合で検出可能に標識化され得、これらとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：色素生産性試薬、酵素学的試薬、ラジオアイソトープ試薬、同位体試薬、蛍光性試薬、毒性試薬、化学ルミネセンス試薬、または核磁気共鳴定常（ｃｏｎｓｔａｎｔ）試薬または他の標識。
【０１９１】
適切な酵素ラベルの例には、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌性ヌクレアーゼ、Δ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母−アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロールホスフェートデヒドロゲナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、およびアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。
【０１９２】
適切な放射性同位体ラベルの例には、3Ｈ、111Ｉｎ、125Ｉ、131Ｉ、32Ｐ、35Ｓ、14Ｃ、51Ｃｒ、57Ｔｏ、58Ｃｏ、59Ｆｅ、75Ｓｅ、152Ｅｕ、90Ｙ、67Ｃｕ、217Ｃｉ、211Ａｔ、212Ｐｂ、47Ｓｃ、109Ｐｄなどが挙げられる。111Ｉｎは、好ましい同位体であり、ここで、これは、肝臓による125Ｉまたは131Ｉラベル化モノクロナール抗体の脱ハロゲン化の問題が回避されるために、インビボ画像化において使用される。さらに、この放射性ヌクレオチドは、画像化のためのより好ましいγ放射を有する（Ｐｅｒｋｉｎｓら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．１０：２９６−３０１（１９８５）；Ｃａｒａｓｑｕｉｌｌｏら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２８：２８１−２８７（１９８７））。例えば、１−（Ｐ−イソチオシアネートベンジル）−ＤＰＴＡを有するモノクロナール抗体に結合された111Ｉｎは、非腫瘍組織（特に、肝臓）内への取り込みをほとんど示さず、そしてそれによって、腫瘍限局化の特異性を増強し得る（Ｅｓｅｂａｎら，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２８：８６１−８７０（１９８７））。
【０１９３】
適切な非放射性同位体ラベルに例には、157Ｇｄ、55Ｍｎ、162Ｄｙ、52Ｔｒおよび56Ｆｅが挙げられる。
【０１９４】
適切な蛍光ラベルの例には、152Ｅｕラベル、フルオレセインラベル、イソチオシアネートラベル、ローダミンラベル、フィコエリトリンラベル、フィコシアニンラベル、アロフィコシアニン（ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ）ラベル、ｏ−フタルデヒド（ｐｈｔｈａｌｄｅｈｙｄｅ）ラベル、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）ラベル、およびフルオレサミンラベルが挙げられる。
【０１９５】
適切な毒素ラベルの例には、ジフテリア毒素、リシン、およびクロレラ毒素が挙げられる。
【０１９６】
化学発光ラベルの例には、ルミナル（ｌｕｍｉｎａｌ）ラベル、イソルミナルラベル、芳香族アクリジニウムエステルラベル、イミダゾールラベル、アクリジニウム塩ラベル、シュウ酸エステルラベル、ルシフェラーゼラベル、およびエクオリンラベルが挙げられる。
【０１９７】
核磁気共鳴コンストラスティング（ｃｏｎｓｔｒａｓｔｉｎｇ）剤の例には、Ｇｄ、Ｍｎ、および鉄のような重金属核が挙げられる。
【０１９８】
上記のラベルを本発明の抗体に結合させるための代表的な技術は、Ｋｅｎｎｅｄｙら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  ７０：１−３１（１９７６）、およびＳｃｈｕｒｓら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  ８１：１−４０（１９７７）によって提供される。後者において言及されたカップリング技術は、グルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸法、ジマレイミド法、ｍ−マレイミドベンジル−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル法であり、これらの方法の全ては、本明細書中で参考として援用される。
【０１９９】
本発明の抗体は、あるいは、例えば、このような固体相−固定化された抗体を使用して、クロマトグラフ手順および他の免疫学的手順を容易にするために、固体支持体に結合され得ることが当業者によって理解される。このような手順の中には、本発明の抗体の使用が含まれ、本発明の核酸分子によってコードされる１つ以上のエピトープを含むポリペプチド（これは、融合されたポリペプチドであり得るか、または本明細書中に記載される本発明の他のポリペプチドであり得る）を単離するか、精製し、あるいは本発明の１つ以上の組換え部位配列またはその一部分を含むポリヌクレオチドを単離するかまたは精製する。アフィニティークロマトグラフィーにより、例えば、固相支持体に結合される本発明の抗体を使用する、ポリペプチド（そして、アナログ、ポリヌクレオチドによる）の単離および精製のための方法は、当該分野で周知であり、そして当業者に知られている。本発明の抗体をまた他の適用に使用して、例えば、１つ以上のタンパク質、ポリペプチド、ポリヌクレオチドを、構造的および／または機能的複合体へ架橋または結合し得る。１つのこのような使用において、本発明の抗体は、２つ以上の個別のエピトープ結合領域を有し得、この領域は、例えば、抗体上の１つのエピトープ結合領域で第１のポリペプチド（これは、本発明のポリペプチドであり得る）に結合し得、そして抗体上の第２のエピトープ結合領域で第２のポリペプチド（これは、本発明のポリペプチドであり得る）を結合し得、それによって、第１および第２のポリペプチドを互いに接近した近位にもたらし、その結果、第１および第２のポリペプチドは、構造的におよび／または機能的に相互作用し得る（例えば、酵素とその基質を連結して、酵素触媒を実施するか、またはエフェクター分子とそのレセプターを連結して、エフェクター分子のレセプターへの特異的結合、あるいはレセプターによって媒介されるエフェクター分子に対する応答を実施するか、または誘起する）。本発明の抗体についてのさらなる適用は、例えば、固体支持体上での本発明の抗体、ポリペプチド、または核酸分子の大規模なアレイの作製を含み、これによって、例えば、タンパク質の高スループットスクリーニング、または本発明の核酸分子を含む宿主細胞によるＲＮＡ発現が容易になる（当該分野で、「チップアレイ」プロトコールとして公知である；例えば、米国特許第５，８５６，１０１号、同第５，８３７，８３２号、同第５，７７０，４５６号、同第５，７４４，３０５号、同第５，６３１，７３４号および同第５，５９３，８３９号を参照のこと。これらは、ポリペプチド（抗体を含む）およびポリヌクレオチドのチップアレイの作製および使用に関し、そしてこれらの開示は、本明細書中でその全体が参考として援用される）。「固体支持体」は、抗体が固定化され得る任意の固体支持体を意図する。このような固体支持体には、ニトロセルロース、ジアゾセルロース、ガラス、ポリスチレン、ポリビニルクロリド、ポリカルボネート、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、寒天、デンプン、ナイロン、ビーズおよびマイクロタイタープレートが挙げられるが、これらに限定されない。ガラスから作製されたビーズ、ラテックスまたは磁気物質が好ましい。本発明の抗体の固体支持体への連結は、支持体に抗体の一方または両方の末端を付着させることによって達成される。付着はまた、抗体の１つ以上の内部部位でなされ得る。複数の付着（抗体の内部および末端で）もまた、本発明に従って、使用され得る。付着は、アミノ酸連結基（例えば、第１級アミン、カルボキシル基、スルヒドリル（ＳＨ）基）を介し得るか、またはスペーサーを介するブロモシアン（ＣＮＢｒ）連結のような化学連結基により得る。非結合的な付着において、ペプチド（例えば、ＧＳＴ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．ＢおよびＪｏｈｎｓｏｎ，Ｋ．Ｓ．，Ｇｅｎｅ  ６７：３１（１９８８））、ポリヒスチジン（Ｈｏｃｈｕｌｉ，Ｅ．ら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．４１１：７７（１９８７））またはビオチン）に対する親和性タグ配列の添加が使用され得る。あるいは、付着は、本発明の抗体（例えば、プロテインＡまたはプロテインＧ）のＦｃ領域に結合するリガンドを使用することによって、達成され得る。このような親和性タグは、抗体の支持体への可逆的な付着のために使用され得る。ペプチドはまた、特異的リガンド−レセプター相互作用を介して、または当業者に知られているファージディスプレイ方法論を使用して、本発明のポリペプチドまたはそのフラグメントに結合するそれらの能力について認識され得る。
【０２００】
（キット）
別の局面において、本発明は、本発明の核酸分子、ポリペプチド、ベクター、宿主細胞、および抗体を作製する際に、そして組換えクローニング法において、使用され得る。本発明のこの局面に従うキットは、１つ以上の容器を含み得、この容器は、本発明の核酸分子、プライマー、ポリペプチド、ベクター、宿主細胞、または抗体の１以上を含み得る。特に、本発明のキットは、以下からなる群から選択される１つ以上の成分（またはそれらの組み合わせ）を含み得る：１つ以上の組換えタンパク質（例えば、Ｉｎｔ）または補助因子（例えば、ＩＨＦおよび／またはＸｉｓ）あるいはそれらの組み合わせ、１つ以上の組換えタンパク質または補助因子またはそれらの組み合わせを含む１つ以上の組成物（例えば、ＧＡＴＥＷＡＹTM  ＬＲ  ＣｌｏｎａｓｅTM  Ｅｎｚｙｍｅ  ＭｉｘまたはＧＡＴＥＷＡＹTM  ＢＰ  ＣｌｏｎａｓｅTM  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ）、１つ以上の目的ベクター（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ）分子（本明細書中で記載されるものを含む）、１つ以上のエントリークローン（Ｅｎｔｒｙ  Ｃｌｏｎｅ）またはエントリーベクター（Ｅｎｔｒｙ  Ｖｅｃｔｏｒ）分子（本明細書中で記載されるものを含む）、１つ以上のプライマー核酸分子（特に、本明細書中に記載されるもの）、１つ以上の宿主細胞（例えば、コンピテント細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞）、酵母細胞、動物細胞（哺乳動物細胞、昆虫細胞、線虫細胞、鳥類細胞、魚類細胞などを含む）、植物細胞、および最も特に、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＢ３、ＤＢ３．１（好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＬＩＢＲＡＲＹ  ＥＦＦＩＣＩＥＮＣＹ（登録商標）ＤＢ３．１TM  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、ＤＢ４およびＤＢ５；米国仮出願第６０／１２２，３９２号（１９９９年３月２日提出）および対応する米国実用出願 （Ｈａｒｔｌｅｙら、「Ｃｅｌｌｓ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｔｏｘｉｃ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｕｓｅｓ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」（本願と同日））、これらの開示は、その全体が本明細書中で参考として援用される）など。関連した局面において、本発明のキットは、１つ以上の組換え部位またはその部分をコードする１つ以上の核酸分子（例えば、本発明の１つ以上の組換え部位（または、その部分）をコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸分子）、および特に、本明細書に記載される寄託されたクローンに含まれる核酸分子の１つ以上を含み得る。本発明のこの局面に従うキットはまた、本発明の１つ以上の単離された核酸、本発明の１つ以上のベクター、本発明の１つ以上のプライマー核酸分子、および／または本発明の１つ以上の抗体を含み得る。本発明のキットは、さらに、核酸分子、ポリペプチド、ベクター、宿主細胞、または本発明の抗体との組合せにおいて有用な１つ以上のさらなる成分を含む１つ以上のさらなる容器を含み得、このさらなる成分には、１つ以上の緩衝液、１つ以上の洗剤、核酸ポリメラーゼ活性を有する１つ以上のポリペプチド、逆トランスクリプターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチド、１つ以上のトランスフェクション試薬、１つ以上のヌクレオチドなどを含み得る。このようなキットは、本発明の核酸分子、プライマー、べクター、宿主細胞、ポリペプチド、抗体および組成物を有利に使用する任意のプロセスにおいて使用され得る（例えば、核酸分子を合成する方法において（例えば、ＰＣＲのような増幅を介して）、核酸分子をクローニングする方法において（好ましくは、本明細書に記載される組換えクローニングを介して）など）。
【０２０１】
（組換えクローニングシステムの最適化）
組換えクローニングの方法における、本発明の核酸分子、または核酸分子を含むベクターの有用性は、多くのアッセイ方法の任意の１つによって決定され得る。例えば、本発明のエントリー（Ｅｎｔｒｙ）および目的（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ）ベクターは、機能するそれらの能力（すなわち、核酸分子、ＤＮＡセグメント、遺伝子、ｃＤＮＡ分子またはクローニングベクターから発現ベクター（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ）までのライブラリーの転移を媒介する）について、組換えクローニング反応を実施することによって評価され得る。この組換えクローニング反応は、以下の実施例に詳細に記載され、そして米国出願第０８／６６３，００２号（１９９６年６月７日に提出）（現在、米国特許第５，８８８，７３２号）、同第０９／００５，４７６号（１９９８年１月１２日提出）、同第０９／１７７，３８７号（１９９８年１０月２３日提出）、および同第６０／１０８，３２４号（１９９８年１１月１３日提出）に記載される。これらの開示は、本明細書中でその全体が参考として援用される。あるいは、本発明に従って作製されるエントリーベクター（Ｅｎｔｒｙ  Ｖｅｃｔｏｒ）および目的ベクター（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ）の機能性は、これらのベクターの共挿入分子を組換えそして作り出す能力、または目的の核酸分子を転移させる能力を、以下の実施例１９に詳細に記載されるようなアッセイを使用して、評価され得る。同様に、１つ以上の組換えタンパク質またはその組み合わせを含む組成物（例えば、ＧＡＴＥＷＡＹTM  ＬＲ  ＣｌｏｎａｓｅTM  Ｅｎｚｙｍｅ  ＭｉｘおよびＧＡＴＥＷＡＹTM  ＢＰ  ＣｌｏｎａｓｅTM  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ）の処方は、以下の実施例１８に記載されるようなアッセイを使用して最適化され得る。
【０２０２】
（用途）
本発明の組成物、方法およびキットについての多くの適用が存在する。これらの用途は、以下を含むが、それらに限定されない：ベクターを変更すること、遺伝子産物を細胞内の位置に標的化すること、所望のタンパク質から融合タグを切断すること、目的の核酸分子を調節遺伝配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）に操作可能に連結すること、融合タンパク質のための遺伝子を構築すること、コピー数を変更すること、レプリコンを変更すること、ファージにクローニングすること、ならびに、例えば、ＰＣＲ産物、ゲノムＤＮＡ、およびｃＤＮＡをクローニングすること。さらに、本発明の核酸分子、ベクター、および宿主細胞は、核酸分子によってコードされるポリペプチドの産生において、このようなポリペプチドに対する抗体の産生において、所望の核酸配列の組換えクローニングにおいて、そして本発明の核酸分子、ベクター、および宿主細胞の使用によって増強され得るか、または容易にされ得る他の適用において、使用され得る。
【０２０３】
特に、本発明の核酸分子、ベクター、宿主細胞、ポリペプチド、抗体およびキットは、１つ以上の所望の核酸分子、またはＤＮＡセグメント（例えば、１つ以上の遺伝子、ｃＤＮＡ分子またはｃＤＮＡライブラリー）を、クローニングベクター（Ｖｅｃｔｏｒ）または発現ベクター（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ）に転移させる方法において使用され得、このクローニングＶｅｃｔｏｒまたは発現ベクター（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ）は、所望の核酸分子またはＤＮＡセグメントのクローニングまたは増幅、またはそれらによってコードさせるポリペプチドの発現における使用のためのさらなる宿主細胞の形質転換において使用される。本発明の核酸分子、ベクターおよび宿主細胞を有利に使用し得るこのような組換えクローニング方法は、以下の実施例、および共有にかかる米国出願第０８／４８６，１３９号（１９９５年６月７日に提出）、米国出願第０８／６６３，００２号（１９９６年６月７日に提出）（現在、米国特許第５，８８８，７３２号）、同第０９／００５，４７６号（１９９８年１月１２日提出）、同第０９／１７７，３８７号（１９９８年１０月２３日提出）、および同第６０／１０８，３２４号（１９９８年１１月１３日提出）に詳細に記載され、これらの全ての開示が、本明細書中でその全体が参考として援用される。
【０２０４】
本明細書に記載される方法および適用に対する他の適切な改変および適応は、当業者に公知の情報の観点から本明細書中に含まれる発明の説明から容易に明らかであり、そして本発明の範囲またはその任意の実施形態から逸脱することなくなされ得ることが、関連分野の当業者によって理解される。ここで、本発明を詳細に説明することは、本発明が、以下の実施例に対する参考によってより明確に理解され、この実施例は、本明細書中で、例示のみの目的のために含まれ、そして本発明を制限することを意図しない。
【０２０５】
（実施例）
（実施例１：バクテリオファージλの組換え反応）
Ｅ．ｃｏｌｉバクテリオファージλは、溶解ファージとして増殖し得、この場合、宿主細胞は溶解し、子孫ウイルスを放出する。あるいは、λは、溶原化と呼ばれるプロセス（図６０を参照のこと）によってその宿主のゲノムに組み込む。この溶原状態において、ゲノムからのその切除を引き起こす条件が起こるまで、ファージゲノムは、多くの世代において、娘細胞に伝えられ得る。この点で、ウイルスは、そのライフサイクルの溶解部に入る。溶解経路と溶原経路との間の切換の制御は、分子生物学において、最も理解されたプロセスである（Ｍ．Ｐｔａｓｈｎｅ、Ａ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｗｉｔｃｈ、Ｃｅｌｌ  Ｐｒｅｓｓ、１９９２）。
【０２０６】
インビトロで実施される、λの組み込み的および切断的組換え反応は、本発明の組換えクローニングシステムの基礎である。これらは、以下のように模式的に表現され得る。
【０２０７】
【化１７】
0004580106.tif 000016
４つのａｔｔ部位は、反応を媒介するタンパク質のための結合部位を含む。野生型ａｔｔＰ、ａｔｔＢ、ａｔｔＬ、およびａｔｔＲ部位は、それぞれ約２４３、２５、１００、および１６８塩基対を含む。
【０２０８】
【化１８】
0004580106.tif 000017
反応（明細書中以下、「ＢＰ反応」といわれるか、あるいは、「エントリー（Ｅｎｔｒｙ）反応」または「Ｇａｔｅｗａｙ反応」と等価である）は、タンパク質ＩｎｔおよびＩＨＦによって媒介される。
【０２０９】
【化１９】
0004580106.tif 000018
反応（本明細書中以下、「ＬＢ」反応といわれるが、あるいは、「目的（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ）反応」と等価である）は、タンパク質Ｉｎｔ、ＩＨＦおよびＸｉｓによって媒介される。Ｉｎｔ（インテグラーゼ）およびＸｉｓ（切出し酵素）は、λゲノムによってコードされるが、ＩＨＦ（組込み宿主因子）は、Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質である。λ組換えの一般的な総説については、Ａ．Ｌａｎｄｙ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５８：９１３−９４９（１９８９）を参照のこと。
【０２１０】
（実施例２：組換えクローニング系の組換え反応）
ＬＲ反応−−エントリークローン（Ｅｎｔｒｙ  Ｃｌｏｎｅ）から目的ベクター（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ）へのＤＮＡセグメントの交換−−は、λ切断反応のインビトロバージョンである：
【０２１１】
【化２０】
0004580106.tif 000019
この配置についての実施上の規則が存在する：ＬＲ反応後、本方法の１つの配置において、ａｔｔ部位は、通常、機能的モチーフ（例えば、プロモーターまたは融合タグ）を発現クローン（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｃｌｏｎｅ）中の目的の核酸分子から分離し、そして２５ｂｐのａｔｔＢ部位は、ａｔｔＰ部位、ａｔｔＬ部位、およびａｔｔＲ部位よりもさらに小さい。
【０２１２】
組換え反応は保存性であること（すなわち、塩基対の正味の合成または損失は存在しないこと）に留意のこと。組換え部位に隣接するＤＮＡセグメントは、まれにしか切り換えられない。野生型λ組換え部位を、ＧＡＴＥＷＡＹTMクローニングシステムの目的のために、以下のように修飾する：
特定の好ましい目的ベクター（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ）を作製するために、ａｔｔＲの一部（４３ｂｐ）を除去して、切除反応を不可逆かつより効率的にした（Ｗ．Ｂｕｓｈｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：９０６，１９８５）。本発明の好ましい目的ベクター（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ）中のａｔｔＲ部位は、１２５ｂｐ長である。ａｔｔ部位のコア領域に、以下の２つの理由のために変異を作製した：（１）終止コドンを除去するため、および（２）組換え反応の特異性を確実にするため（すなわち、ａｔｔＲ１は、ａａｔＬ１とのみ反応し、ａｔｔＲ２はａｔｔＬ２とのみ反応する、などである）。
【０２１３】
他の変異を、ａｔｔＢ部位の１５ｂｐのコア領域に隣接する短い（５ｂｐ）領域中に導入して、一本鎖型のａｔｔＢプラスミド（例えば、ファージミドｓｓＤＮＡまたはｍＲＮＡ）における二次構造形成を最小化した。目的ベクター（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ）にクローニングした後の目的の核酸分子の左および右へのａｔｔＢ１およびｓｔｔＢ２の配列を、図６に示す。
【０２１４】
図６１は、エントリークローン（Ｅｎｔｒｙ  Ｃｌｏｎｅ）および目的ベクター（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ）が、ＬＲ反応において、いかにして組換えられて共組込み体（これは、２つの娘分子への第２の反応を通して分かれる）を形成するかを例証する。２つの娘分子は、その対合の部位に関わらず同一の一般的構造を有し、ａｔｔＬ１およびａｔｔＲ１またはａｔｔＬ２およびａｔｔＲ２が、最初に反応して共組込み体を形成する。これらのセグメントは、親の分子が両方とも環状であるか、一方が環状でありもう一方が線状であるか、または両方とも線状であるかに関わらず、これらの反応によってパートナーを交換する。この実施例において、Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ（これは、死遺伝子ｃｃｄＢをもまた保有する）に保有されるアンピシリン耐性についての選択は、所望のａｔｔＢ産物プラスミドについてのみ選択するための手段を提供する。
【０２１５】
（実施例３：組換えクローニングシステムにおけるタンパク質発現）
タンパク質は、インビボにおいて結果として２つのプロセス（転写（ＤＮＡからＲＮＡ）、および翻訳（ＲＮＡからタンパク質））から発現される。原核生物および真核生物におけるタンパク質発現の説明についは、以下の実施例１３を参照のこと。多くのベクター（ｐＵＣ、ＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ、ｐＧｅｍ）は、青白スクリーニング（ｂｌｕｅ−ｗｈｉｔｅ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）をするために、転写されるｌａｃＺ遺伝子の妨害を使用する。これらのプラスミド、および多くの発現ベクターは、クローン化された遺伝子の発現を制御するためにｌａｃプロモーターを使用する。このｌａｃプロモーターからの転写は、誘導因子（ｉｎｄｕｃｅｒ）ＩＰＴＧを添加することにより始動される。しかし、低レベルのＲＮＡが、誘導因子の非存在下において生成される。すなわち、ｌａｃプロモーターは、決して完全にオフの状態にあるというわけではない。この「漏洩」の結果は、Ｅ．ｃｏｌｉに対してその発現が有害である遺伝子を、ｌａｃプロモーターを含むベクターにクローニングすることが困難または不可能であることを証明し得るか、あるいはそれらの遺伝子が不活性変異体としてのみクローン化され得るということである。
【０２１６】
他の遺伝子発現系とは対照的に、エントリベクター（Ｅｎｔｒｙ  Ｖｅｃｔｏｒ）にクローン化された核酸分子は、発現されないように設計され得る。ａｔｔＬ１部位のちょうど上流にある強力な転写終結因子ｒｒｎＢ（Ｏｒｏｓｚら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０１：６５３、（１９９１））の存在が、そのベクタープロモーター（薬剤耐性および複製起点）からの転写がクローン化された遺伝子に到達しないようにしている。しかし、有毒遺伝子を目的ベクター（Ｄｅｓｔｉｎａｔｏｉｎ  Ｖｅｃｔｏｒ）にクローン化する場合、宿主は、ちょうど他の発現系と同じように、不調をきたし得る。しかし、インビトロ組換えによるサブクローニングの信頼性は、これが生じたことを認識することをより容易にし、そして必要な場合、本発明の方法に従って別の発現オプションを試みることをより容易にする。
【０２１７】
（実施例４：正しいエントリベクターの選択）
最良のベクターを選択する際になされなければならない２種類の選択が存在し、（１）クローン化されるべき特定のＤＮＡフラグメントによって指図される選択および（２）クローン化されたＤＮＡフラグメントを用いて達成される選択である。これらの因子は、使用されるエントリベクターの選択において重要である。なぜなら、所望される目的の核酸分子が、そのエントリベクターから目的ベクターに移動される場合、目的の核酸分子と、ａｔｔＬ１およびａｔｔＬ２（例えば図６において）のＩｎｔ切断部位との間の全ての塩基対が、同様に目的ベクターに移動する。目的ベクターに移動する結果として発現されないゲノミックＤＮＡについて、これらの決定は、重要ではない。
【０２１８】
例えば、特定の翻訳開始シグナルを有するエントリベクターを使用する場合、それらの配列は、所望の目的の核酸分子に対するアミノ末端融合が成されれば、アミノ酸に翻訳される。所望の目的の核酸分子が、融合タンパク質、ネイティブタンパク質もしくは両方として発現される得るか否かは、翻訳開始配列がクローン（ネイティブタンパク質）のａｔｔＢ部位の間に含まれなければならないか、あるいは目的ベクター（融合タンパク質）によって供給されなければならないか否かを指図する。特に、翻訳開始配列を含むエントリベクターは、これら部位における翻訳の内部開始がＮ末端融合タンパク質の収率を減少させ得るので、融合タンパク質の作製についてはあまり適切でないことを証明し得る。本発明の、組成物および方法によって提供されるこれらの２つの型の発現を、図６２に例示する。
【０２１９】
エントリベクターは、おそらく、全ての用途について最適ではない。目的の核酸分子が、任意のいくつかの最適なエントリベクターにクローン化され得る。
【０２２０】
１つの例として、ｐＥＮＴＲ７（図１６）およびｐＥＮＴＲ１１（図２０）を考慮すると、これらは、以下を含むが、これらに限定されない種々の用途において有用である：
・ほとんどの市販のライブラリーに由来するクローニングｃＤＮＡ。ｃｃｄＢ死遺伝子の左側および右側に対する部位を選択し、その結果、クローン化されるべきＤＮＡが２つ以上のこれらの制限部位を有しない場合に、方向性のクローニングが可能である。
・方向的な遺伝子のクローニング：ｃｃＢの左側にＳａｌＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｍｎＩ（平滑（ｂｌｕｎｔ））、またはＫｐｎＩ；右側にＮｏｔＩ、ＸｈｏＩ、ＸｂａＩ、またはＥｃｏＲＶ（平滑）。
・ＸｍｎＩ部位において、平滑アミノ末端を有する遺伝子または遺伝子フラグメントのクローニング。ＸｍｎＩ部位は、真核生物発現のために最も好ましい６つの塩基のうちの４つを有し（例えば、以下の実施例１３を参照のこと）、その結果クローン化されるべきＤＮＡの最初の３塩基は、ＡＴＧであり、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、それが適切な目的ベクターで転写される場合、真核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞）において発現される。さらに、ｐＥＮＴＲ１１において、ＡＴＧにて原核生物宿主細胞（特に、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ））のタンパク質合成を開始させるために、Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列を８ｂｐ上流に配置する。
・高度に特異的なＴＥＶ（Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｅｔｃｈウイルス）プロテアーゼ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．より入手可能）を使用して、アミノ末端融合物（例えば、Ｈｉｓ6、ＧＳＴまたはチオレドキシン）を切断する工程。目的の核酸分子を、平滑ＸｍｎＩ部位でクローン化する場合、ＴＥＶ切断は、発現されたタンパク質のアミノ末端側に２つのアミノ酸を残す。
・制限酵素およびリガーゼを用いるクローニングの間に、未切断エントリベクター分子または一本鎖切断エントリベクターに対して、選択する工程。ｃｃＢ遺伝子が、二重消化で除去されない場合、ｃｃＢ遺伝子は、ｃｃＢに対して細胞を耐性にする変異を含まない任意のレシピエントＥ．ｃｏｌｉ細胞を殺す（例えば、１９９９年３月２日に出願された米国仮出願第６０／１２２，３９２号を参照のこと（この開示は、本明細書中にその全体が参考として援用される））。
・全てのクローニング部位において、ＯＲＦを有するアミノ融合物を産生させる工程。ｃｃｄＢ遺伝子の上流（ａｔｔＬ１リーディングフレーム内）には終止コドンは存在しない。
さらに、ｐＥＮＴＲ１１はまた、以下の用途において、有用である；
・開始ＡＴＧにおいてＮｃｏＩ部位を有するｃＤＮＡを、ＮｃｏＩ部位へクローニングする工程。ＸｍｎＩ部位と同様に、この部位は、真核生物発現のために最も好ましい６塩基のうちの４つを有している。また、ＡＴＧにて原核生物宿主細胞（特に、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ））のタンパク質合成を開始させるために、Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列を８ｂｐ上流に配置する。
・カルボキシ末端融合物に対するリーディングフレームコンベンション（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ）と同じ位相で配置されるＯＲＦを有するカルボキシ融合タンパク質を産生する工程。
【０２２１】
表１は、エントリベクターのいくつか非限定例、およびそれらの特徴をいくつか列挙しており、そして図１０〜２０は、それらのクローニング部位を示す。表１に列挙される全てのエントリベクターは、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄから商業的に入手可能である。本明細書中では特に列挙されない他のエントリベクター（代替的特徴またはさらなる特徴を含む）を、本明細書中に含まれる開示を考慮すると、分子生物学および細胞生物学の慣用的な方法を使用して、当業者は作製し得る。
【０２２２】
【表１】
0004580106.tif 000020
エントリベクターｐＥＮＴＲ１Ａ（図１０Ａおよび１０Ｂ）、ｐＥＮＴＲ２Ｂ（図１１Ａおよび１１Ｂ）ならびにｐＥＮＴＲ３Ｃ（図１２Ａおよび１２Ｂ）は、制限部位が、異なるリーディングフレーム内にあるということを除いて、ほとんど同一である。エントリベクターｐＥＮＴＲ４（図１３Ａおよび１３Ｂ）、ｐＥＮＴＲ５（図１４Ａおよび１４Ｂ）、ならびにｐＥＮＴＲ６（図１５Ａおよび１５Ｂ）は、平滑ＤｒａＩ部位が、ＡＴＧメチオニンコドンを含む部位で置換されている以外は、本質的にｐＥＮＴＲ１Ａと同一である（ｐＥＮＴＲ４においてはＮｃｏＩ、ｐＥＮＴＲ５においてはＮｄｅＩ、およびｐＥＮＴＲ６においてはＳｐｈＩ）。開始ＡＴＧにこれらの部位の一つを含む核酸分子が、これらのエントリベクター内に簡便にクローン化され得る。ｐＥＮＴＲ４のＮｃｏＩ部位は、真核生物細胞における核酸分子の発現のために特に有用である。なぜなら、ＮｃｏＩ部位は、効率的な翻訳を提供する多くの塩基を含むからである（以下の実施例１３を参照のこと）。（ｐＥＮＴＲ５のＮｄｅＩ部位へクローン化される目的の核酸分子は、真核生物細胞において高度に発現され得るとは予期されない。なぜなら、開始ＡＴＧから−３位にあるシトシンは、真核生物遺伝子においてはめったにないからである）。
【０２２３】
エントリベクターｐＥＮＴＲ７（図１６Ａおよび１６Ｂ）、ｐＥＮＴＲ８（図１７Ａおよび１７Ｂ）、ならびにｐＥＮＴＲ９（図１８Ａおよび１８Ｂ）は、ａｔｔＬ１部位とクローニング部位との間にＴＥＶプロテアーゼに対する認識部位を含む。ＸｍｎＩ（平滑）、ＮｃｏＩ、およびＮｄｅＩに対する切断部位はそれぞれ、これらのエントリベクターにおいて一番多い５’部位である。アミノ融合物は、核酸分子がこれらのエントリベクターにクローン化される場合、効率的に除去され得る。ＴＥＶプロテアーゼは、非常に活性であり、かつ高度に特異的である。
【０２２４】
（実施例５：リーディングフレームの制御）
クローン化される核酸分子の発現において最も用心しなければならない課題の一つは、リーディングフレームが正確であることを確認することである（リーディングフレームは、融合物が２つのＯＲＦ（例えば、目的の核酸分子とＨｉｓ６もしくはＧＳＴドメインとの間）の間で作製される場合、重要である）。本発明の目的のために、以下のコンベンションを採用した：任意のエントリベクターにクローン化されたＤＮＡのリーディングフレームは、図１６Ａ、ｐＥＮＴＲ７に示されるａｔｔＢ１部位の位相と同じ位相でなければならない。ａｔｔＬ１部位の６つのＡは、２つのリジンコドン（ａａａ  ａａａ）に分割されるということに注意する。アミノ融合物を作製する目的ベクターを、このリーディングフレームにａｔｔＲ１部位を入れるように構築した。また、カルボキシ末端融合物のための目的ベクターを構築し、それらのベクターとしては、Ｈｉｓ6（ｐＤＥＳＴ２３；図４３）、ＧＳＴ（ｐＤＥＳＴ２４；図４４）、またはチオレドキシン（ｐＤＥＳＴ２５；図４５）Ｃ末端融合配列を含むベクターが挙げられる。
【０２２５】
従って、目的の核酸分子をエントリベクターにクローン化し、その結果ａｔｔＬ１部位内のａａａ  ａａａリーディングフレームが、核酸分子のＯＲＦと同じ位相である場合、アミノ末端融合物が、全ての融合タグについて自動的に正確に位相が等しくされる。これは、通常の場合を越える有意な改善であり、ここで各々の異なるベクターは、異なる制限部位および異なるリーディングフレームを有し得る。
【０２２６】
エントリベクターおよび目的ベクターの最も適切な組み合わせの選び方の実際的な例については、実施例１５を参照のこと。
【０２２７】
（材料）
他に示されない限り、本明細書中に含まれる残りの実施例において、以下の材料を使用した。
５×ＬＲ反応緩衝液：
２００〜２５０ｍＭ（好ましくは、２５０ｍＭ）Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５
２５０〜３５０ｍＭ（好ましくは、３２０ｍＭ）ＮａＣｌ
１．２５〜５ｍＭ（好ましくは、４．７５ｍＭ）ＥＤＴＡ
１２．５〜３５ｍＭ（好ましくは２２〜３５ｍＭおよび最も好ましくは３５ｍＭ）
スペルミジン−ＨＣｌ
１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン
ＧＡＴＥＷＡＹTMＬＲ  ＣｌｏｎａｓｅTM酵素混合物：
４μｌ当たりの１×ＬＲ反応緩衝液：
１５０ｎｇカルボキシ−Ｈｉｓ６−タグ化Ｉｎｔ（１９９８年１１月１３日に出願された米国特許出願第６０／１０８，３２４号、および１９９９年１２月１２日に出願された同第０９／４３８，３５８号（両出願は本明細書中に参考として全体が援用される）を参照のこと）
２５ｎｇカルボキシ−Ｈｉｓ６−タグ化Ｘｉｓ（１９９８年１１月１３日に出願された米国特許出願第６０／１０８，３２４号、および１９９９年１２月１２日に出願された同第０９／４３８，３５８号（両出願は本明細書中に参考として全体が援用される）を参照のこと）
３０ｎｇ  ＩＨＦ
５０％  グリセロール
５×ＢＰ反応緩衝液：
１２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５
１１０ｍＭ  ＮａＣｌ
２５ｍＭ  ＥＤＴＡ
２５ｍＭ  スペルミジン−ＨＣｌ
５ｍｇ／ｍｌ  ウシ血清アルブミン
ＧＡＴＥＷＡＹTMＢＰ  ＣｌｏｎａｓｅTM酵素混合物：
４μｌ当たりの１×ＢＰ反応緩衝液：
２００ｎｇカルボキシ−Ｈｉｓ６−タグ化Ｉｎｔ（１９９８年１１月１３日に出願された米国特許出願第６０／１０８，３２４号、および１９９９年１２月１２日に出願された同第０９／４３８，３５８号（両出願は本明細書中に参考として全体が援用される）を参照のこと）
８０ｎｇ  ＩＨＦ
５０％  グリセロール
１０×クロナーゼ（Ｃｌｏｎａｓｅ）停止溶液：
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０
１ｍＭ  ＥＤＴＡ
２ｍｇ／ｍｌ  プロティナーゼＫ
（実施例６：ＬＲ（「目的」）反応）
目的の核酸分子（そしてこの核酸分子は、最終的にはこの核酸分子によりコードされるポリペプチドの産生のために宿主細胞内に導入され得る）を含む新しい発現クローンを作製するために、目的の核酸分子を含む、本明細書中に記載されるように調製されるエントリクローンまたはベクターを、目的ベクターと反応させる。本実施例において、ａｔｔＬ部位に隣接するβ−Ｇａｌ遺伝子を、エントリクローンから目的ベクターに移動する。
必要とされる材料：
・５×ＬＲ反応緩衝液
・目的ベクター（好ましくは、線状化された）、７５〜１５０ｎｇ／μｌ
・目的の核酸分子を含む、エントリクローン、８μｌ以下のＴＥ緩衝液中１００〜３００ｎｇ
・陽性コントロールエントリクローン（ｐＥＮＴＲ−β−Ｇａｌ）ＤＮＡ（以下の注記を参照のこと）
・陽性コントロール目的ベクター、ｐＤＥＳＴ１（ｐＴｒｃ）、７５ｎｇ／μｌ・ＧＡＴＥＷＡＹTMＬＲ  ＣｌｏｎａｓｅTM酵素混合物（−８０℃にて保存）
・１０×クロナーゼ停止溶液
・ｐＵＣ１９ＤＮＡ、１０ｐｇ／μｌ
・化学的コンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞（能力：１×１０7ＣＦＵ／μｇ以上）、４００μｌ
・ＬＢプレート含有アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）およびメチシリン（２００μｇ／ｍｌ）±Ｘ−ｇａｌおよびＩＰＴＧ（以下を参照のこと）
（注記）
エントリークローン（Ｅｎｔｒｙ  Ｃｌｏｎｅ）ＤＮＡの調製：ＲＮａｓｅを用いて処理したＭｉｎｉｐｒｅｐ  ＤＮＡが、十分働く。ＧＡＴＥＷＡＹTM反応が、２０μｌの反応混合物当たり最適な約１００〜３００ｎｇのエントリークローン（Ｅｎｔｒｙ  Ｃｌｏｎｅ）を有するようなので、クローンされるべきＤＮＡの合理的に正確な定量化（±５０％）がアドバイスされる。
【０２２８】
陽性コントロールエントリークローン（Ｅｎｔｒｙ  Ｃｌｏｎｅ）、ｐＥＮＴＲ−β−Ｇａｌは、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）およびメチシリン（２００μｇ／ｍｌ）に加えて、ＩＰＴＧおよびＢｌｕｏ−ｇａｌ（またはＸ−ｇａｌ）を含むＬＢプレート上の予期される青コロニー対白コロニーの数に基づくコロニーの機能的分析を可能にする。β−ガラクトシダーゼは、大きなタンパク質であるので、ＳＤＳタンパク質ゲル上で、多くのより小さなタンパク質よりも顕著ではないバンドをしばしば生じる。
【０２２９】
陽性コントロールエントリーベクター（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｅｎｔｒｙ  Ｖｅｃｔｏｒ）ｐＥＮＴＥＲ−β−Ｇａｌにおいて、β−Ｇａｌのコード配列は、ｐＥＮＴＲ１１（図２０Ａおよび２０Ｂ）にクローン化されており、翻訳開始シグナルがＥ．ｃｏｌｉならび真核生物細胞における発現を可能にする。陽性コントロール目的ベクター（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ）（例えば、ｐＤＥＳＴ１（図２１））は、好ましくは直線化される。
【０２３０】
Ｘ−ｇａｌおよびＩＰＴＧプレートを調製するために、以下のプロトコルのいずれかが使用され得る：
Ａ．ガラス棒を用いて、ＬＢ寒天プレートの表面上に、４０μｌのＤＭＦ中の２０ｍｇ／ｍｌ  Ｘ−ｇａｌ（またはＢｌｕｏ−ｇａｌ）および４μｌの２００ｍｇ／ｍｌ  ＩＰＴＧを広げる。細胞をプレーティングする前に、３７℃で３〜４時間寒天に液体を吸着させる。
【０２３１】
Ｂ．プレートに注ぐ直前に、液体ＬＢ寒天に約４５℃で、５０μｇ／ｍｌにするためにＸ−ｇａｌ（またはＢｌｕｏ−Ｇａｌ）（ＤＭＦ中２０ｍｇ／ｍｌ）を、そして０．１〜１ｍＭにするためにＩＰＴＧ（水中で２００ｍＭ）を加える。Ｘ−ｇａｌおよびＢｌｕｏ−Ｇａｌを光遮蔽した容器中に保存する。
【０２３２】
コロニーの色は、３７℃で一晩インキュベーションした後に、数時間５℃でプレートに配置することによって高められ得る。プロトコルＢは、Ａよりも一貫したコロニーの色を与え得るが、Ａは、選択されたプレートが、短い注目で必要とされる場合、より便利である。
【０２３３】
Ｃｌｏｎａｓｅ反応における組換えは、長時間続く。４５〜６０分のインキュベーションが通常十分であるが、大きなＤＮＡを用いる反応、または親ＤＮＡの両方がスーパーコイル化される反応、または低いコンピテンスの細胞に形質転換される反応は、２５℃で２〜２４時間のような長いインキュベーション時間を用いて改良され得る。
【０２３４】
（手順）
１．以下のように反応を組み立てる（Ｃｌｏｎａｓｅ  ＬＲを凍結貯蔵所から移す前に、ＧＡＴＥＷＡＹTM  ＬＲ  ＣｌｏｎａｓｅTM  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ（「Ｃｌｏｎａｓｅ  ＬＲ」）以外全ての成分を室温で合わせる）：
【０２３５】
【表２】
0004580106.tif 000021
２．ＧＡＴＥＷＡＹTM  ＬＲ  ＣｌｏｎａｓｅTM  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘを−８０℃のフリーザーから移し、すぐに氷上に置く。Ｃｌｏｎａｓｅは溶かすのに数分間のみかかる。
【０２３６】
３．ＧＡＴＥＷＡＹTM  ＬＲ  ＣｌｏｎａｓｅTM  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘの４μｌを反応物２番および４番に加える。
【０２３７】
４．ＧＡＴＥＷＡＹTM  ＬＲ  ＣｌｏｎａｓｅTM  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘを−８０℃のフリーザーに戻す。
【０２３８】
５．チューブを２５℃で少なくとも６０分間インキュベートする。
【０２３９】
６．Ｃｌｏｎａｓｅ  Ｓｔｏｐ溶液２μｌをすべての反応物に加える。２０分間３７℃でインキュベートする。（この工程は、通常、１０〜２０倍、得たコロニーの総数を増加する）。
【０２４０】
７．２μｌを１００μｌのコンピテントＥ．ｃｏｌｉに形質転換する。１００μｇ／ｍｌでアンピシリンを含むプレート上で選択する。
【０２４１】
（実施例７：Ｅ．ｃｏｌｉの形質転換）
本発明の組換えクローニングシステムを使用して調製されたクローニングベクターまたは発現ベクター（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ）を導入するために、いずれかの標準Ｅ．ｃｏｌｉ形質転換プロトコルが満足するはずである。以下の工程は、最高の結果のために推奨される：
１．コンピテント細胞の混合物およびＲｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ反応産物を、熱ショック工程の前に少なくとも１５分静置させる。これは、組換えタンパク質がＤＮＡから解離するための時間を与え、そして形質転換効率を向上する。
【０２４２】
２．反応物を約１％〜５％の効率を期待する。すなわち、２μｌの反応物は、少なくとも１００ｐｇの発現クローン（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｃｌｏｎｅ）プラスミドを含むべきである（反応中の各親プラスミドの量、および引き続く希釈を考慮する）。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞は、１０7ＣＦＵ／μｇのコンピテンスを有する場合、全形質転換がアンピシリンプレート上に広げられるならば、１００ｐｇの所望のクローンプラスミドは、約１０００以上のクローンを与える。
【０２４３】
３．コントロールｐＵＣ  ＤＮＡ形質転換を常に行う。コロニーの数が予期したものでない場合、ｐＵＣ  ＤＮＡ形質転換によって、問題があった場所の指示が与えられる。
【０２４４】
（実施例８：ａｔｔＢ−ＰＣＲ産物の調製）
以下の実施例９に記載されるＰＣＲクローニング方法でのａｔｔＢ−ＰＣＲ産物の調製のために、ａｔｔＢ１配列およびａｔｔＢ２配列を含むＰＣＲプライマーを使用する。ａｔｔＢ１プライマー配列およびａｔｔＢ２プライマー配列は、以下である：
ａｔｔＢ１：５’−ＧＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴ−（テンプレート特異的配列）−３’
ａｔｔＢ２：５’−ＧＧＧＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴ−（テンプレート特異的配列）−３’
ａｔｔＢ１配列は、アミノプライマーに加えられるべきであり、ａｔｔＢ２配列は、カルボキシプライマーに加えられるべきである。これらのプライマーのそれぞれの５’末端の４グアニンは、本発明のクローニング方法における使用のために基質として、最小の２５ｂｐ  ａｔｔＢ配列の効率を高める。
【０２４５】
標準ＰＣＲ条件を使用して、ＰＣＲ産物を調製し得る。以下の提案されたプロトコルは、ＰＬＡＴＩＮＵＭ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃから市販（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ））を使用する。この酵素混合物は、ホットスタート（ｈｏｔ  ｓｔａｒｔ）の必要性を排除し、Ｔａｑに対する忠実度を改善し、そしてゲノムテンプレート上においてさえ、２００ｂｐ〜１０ｋｂまたはそれ以上のアンプリコンサイズの幅広い範囲の合成を可能にする。
【０２４６】
（必要とされる材料）
・ＰＬＡＴＩＮＵＭ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ）
・テンプレートに特異的なａｔｔＢ１含有プライマー対およびａｔｔＢ２含有プライマー対（上記を参照のこと）
・ＤＮＡテンプレート（直線化されたプラスミドまたはゲノムＤＮＡ）
・１０×  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ
・１０ｍＭ  ｄＮＴＰ混合物
・ＰＥＧ／ＭｇＣｌ2  Ｍｉｘ（３０％ＰＥＧ８０００、３０ｍＭ  ＭｇＣｌ2）  （手順）
１．）反応を以下のように組み立てる：
【０２４７】
【表３】
0004580106.tif 000022
*より多数のプラスミドテンプレートの使用は、より少ないサイクル（１０〜１５）のＰＣＲを可能にし得る。
【０２４８】
２．）適切に、二滴の鉱油を加える。
【０２４９】
３．）３０秒間９４℃で変性させる。
【０２５０】
４．）以下を２５サイクル行う：
９４℃を１５秒〜３０秒
５５℃を１５秒〜３０秒
テンプレート１ｋｂ当たり６８℃を１分間。
【０２５１】
５．）ＰＣＲ反応に続いて、産物の収率および均一性を評価するために、サイズ標準（例えば、１Ｋｂ  Ｐｌｕｓ  Ｌａｄｄｅｒ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ）および定量標準（例えば、Ｌｏｗ  Ｍａｓｓ  Ｌａｄｄｅｒ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ）とともに、１〜２μｌの反応混合物をアガロースゲルに適用する。
【０２５２】
ＰＣＲ産物の精製は、エントリーベクター（Ｅｎｔｒｙ  Ｖｅｃｔｏｒ）へ効率的にクローン化し得るａｔｔＢプライマーダイマーを除くために、推奨される。以下のプロトコルは、ｆａｓｔであり、＜３００ｂｐのサイズのＤＮＡを除去する：
６．）５０μｌのＰＣＲ反応物をＴＥを用いて２００μｌに希釈する。
【０２５３】
７．）１００μｌ  ＰＥＧ／ＭｇＣｌ2溶液を加える。混合し、そして室温で１０分間１３，０００ＲＰＭで素早く遠心分離する。上清を除く（ペレットは、透明であり、見るのが困難である）。
【０２５４】
８．）ペレットを５０μｌのＴＥに溶解し、ゲル上で回収をチェックする。
【０２５５】
開始ＰＣＲテンプレートが、Ｋａｎrについての遺伝子を含むプラスミドである場合、未反応の残りの開始プラスミドが、ＧＡＴＥＷＡＹTM  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ反応の形質転換由来の偽陽性コロニーの潜在的な供給源であるので、プラスミドを分解するために、完了したＰＣＲ反応物を制限酵素ＤｐｎＩで処理することが得策である。約５ユニットのＤｐｎＩを完了したＰＣＲ反応物に添加し、そして１５分間３７℃でインキュベートすることによって、この潜在的な問題は除去される。ＰＣＲ産物をＧＡＴＥＷＡＹTM  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ反応において使用する前に、６５℃で１５分間ＤｐｎＩを熱不活性化する。
【０２５６】
（実施例９：ＢＰ（「Ｇａｔｅｗａｒｄ」）反応を介するエントリーベクター（Ｅｎｔｒｙ  Ｖｅｃｔｏｒ）へのａｔｔＢ−ＰＣＲのクローニング）
ＰＣＲプライマーへの５’末端ａｔｔＢ配列の付加は、ＧＡＴＥＷＡＹTM  ＢＰ  ＣｌｏｎａｓｅTM  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘの存在下でのＤｏｎｏｒ（ａｔｔｐ）Ｐｌａｓｍｉｄを用いた組換えに効率的な基質であるＰＣＲ産物の合成を可能にする。この反応は、ＰＣＲ産物のエントリークローン（Ｅｎｔｒｙ  Ｃｌｏｎｅ）を産生する（図８を参照のこと）。
【０２５７】
ａｔｔＢ  ＰＣＲ基質を用いるＧａｔｅｗａｒｄ  Ｃｌｏｎｉｎｇの条件は、ａｔｔＢ−ＰＣＲ産物（図８を参照のこと）を発現クローン（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｃｌｏｎｅ）の代わりに使用し、そしてａｔｔＢ−ＰＣＲ陽性コントロール（ａｔｔＢ−ｔｅｔr）を発現クローン陽性コントロール（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｃｌｏｎｅ  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）（ＧＦＰ）の代わりに使用することを除いて、ＢＰ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下の実施例１０を参照のこと）の条件と同じである。
【０２５８】
（必要とされる材料：）
・５×ＢＰ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ
・所望のａｔｔＢ−ＰＣＲ産物ＤＮＡ、８μｌ以下のＴＥ中、５０〜１００ｎｇ。
・Ｄｏｎｏｒ（ａｔｔＰ）Ｐｌａｓｍｉｄ（図４９〜５４）、７５ｎｇ／μｌ、スーパーコイルＤＮＡ。
・ａｔｔＢ−ｔｅｔr  ＰＣＲ産物陽性コントロール、２５ｎｇ／μｌ。
・ＧＡＴＥＷＡＹTM  ＢＰ  ＣｌｏｎａｓｅTM  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ（−８０℃で保存）。
・１０×Ｃｌｏｎａｓｅ  Ｓｔｏｐ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ。
・ｐＵＣ１９  ＤＮＡ、１０ｐｇ／μｌ。
・化学的コンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞（コンピテンス：１×１０7ＣＦＵ／μｇ以上）、４００μｌ。
【０２５９】
（注記：）
・ａｔｔＢ−ＰＣＲ  ＤＮＡの調製：実施例８を参照のこと。
・Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｔｔＢ−ｔｅｔrＰＣＲ産物は、それ自身のプロモーターとともに、ｐＢＲ３２２のｔｅｔr遺伝子の機能性コピーを含む。コントロールＢＰ  Ｒｅａｃｔｉｏｎの形質転換物をカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）プレート上（ｋａｎr  Ｄｏｎｏｒ  Ｐｌａｓｍｉｄを使用する場合；図４９〜５２を参照のこと）に、または代替の選択試薬（例えば、ｇｅｎr  Ｄｏｎｏｒ  Ｐｌａｓｍｉｄが使用される場合、ゲンタマイシン、図５４を参照のこと）のプレートにプレートし、次いで、これらのコロニーの約５０個をテトラサイクリン（２０μｇ／ｍｌ）を有するプレート上に摘み上げ、陽性コントロール反応由来のコロニーの機能性ｔｅｔrを含むエントリークローン（Ｅｎｔｒｙ  Ｃｌｏｎｅ）の割合が決定され得る（％発現クローン（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｃｌｏｎｅ）＝（ｔｅｔr＋ｋａｎr（またはｇｅｎr）コロニーの数／ｋａｎr（またはｇｅｎr）コロニー）。
【０２６０】
（手順：）
１．反応を以下のように組み立てる。ＧＡＴＥＷＡＹTM  ＢＰ  ＣｌｏｎａｓｅTM  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘを凍結貯蔵所から移す前に、ＧＡＴＥＷＡＹTM  ＢＰ  ＣｌｏｎａｓｅTM  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ以外、全ての成分を合わせる。
【０２６１】
【表４】
0004580106.tif 000023
２．ＧＡＴＥＷＡＹTM  ＢＰ  ＣｌｏｎａｓｅTM  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘを−８０℃のフリーザーから移し、すぐに氷上に置く。Ｃｌｏｎａｓｅを溶かすには数分だけかかる。
【０２６２】
３．ＧＡＴＥＷＡＹTM  ＢＰ  ＣｌｏｎａｓｅTM  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘの４μｌをサブクローニング反応に加え、混合する。
【０２６３】
４．ＧＡＴＥＷＡＹTM  ＢＰ  ＣｌｏｎａｓｅTM  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘを−８０℃のフリーザーに戻す。
【０２６４】
５．２５℃で少なくとも６０分間インキュベートする。
【０２６５】
６．２μｌのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ（２μｇ／μｌ）を全ての反応物に加える。２０分間３７℃でインキュベートする。
【０２６６】
７．上記の３．２により、２μｌを１００μｌのコンピテントＥ．ｃｏｌｉに形質転換する。カナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢプレート上で選択する。
【０２６７】
（結果：）
初期の実験において、ｐＢＲ３２２由来のｔｅｔＲおよびａｍｐＲを増幅するためのプライマーが、ｔｅｔＲ特異的標的配列またはａｍｐＲ特異的標的配列のみ、標的配列およびａｔｔＢ１（前進（ｆｏｒｗａｒｄ）プライマーについて）配列またはａｔｔＢ２（逆プライマーについて）配列（図９に示される）、あるいは４つのグアニジンの５’テールを有するａｔｔＢ１配列またはａｔｔＢ２配列を含むように構築された。これらのプライマーの構築は、図６５に示される。これらのプライマーを使用するｐＢＲ３２２由来のｔｅｔＲおよびａｍｐＲのＰＣＲ増幅および本発明の組換えクローニングシステムを使用する宿主細胞へのＰＣＲ産物のクローニングの後に、図６６に示される結果が得られた。これらの結果は、ａｔｔＢ配列を含むプライマーが、テトラサイクリンプレートおよびアンピシリンプレート上で幾分多い数のコロニーを提供したことを示した。しかし、ａｔｔＢ配列に加えて、プライマー上に、４または５グアニジンの５’伸長を含むことは、図６６および６７に示されるように、有意により良いクローニングの結果を提供した。これらの結果は、組換えクローニングを使用するＰＣＲ産物のクローニングについて最適のプライマーが、４または５グアニン塩基の５’伸長を有する組換え部位配列を含む。
【０２６８】
ａｔｔＢ含有ＰＣＲ産物とａｔｔＰ含有Ｄｏｎｏｒプラスミドとの間の最適化学量論を決定するために、ＰＣＲ産物およびＤｏｎｏｒプラスミドの量が、ＢＰ  Ｒｅａｃｔｉｏｎの間で変化される実験が行われた。次いで、反応混合物は、宿主細胞に形質転換され、上記のようにテトラサイクリンプレート上にプレートされた。結果は図６８に示される。これらの結果は、ｔｅｔ遺伝子のサイズ範囲におけるＰＣＲ産物を用いた最適の組換えクローニングの結果について、ａｔｔＰ含有Ｄｏｎｏｒプラスミドの量が、約１００〜５００ｎｇ（最も好ましくは、約２００〜３００ｎｇ）の間であり、一方、ａｔｔＢ含有ＰＣＲ産物の最適濃度が、２０μｌ反応当たり、約２５〜１００ｎｇ（最も好ましくは、約１００ｎｇ）であることを示す。
【０２６９】
次いで、本発明の組換えクローニングアプローチによるクローニングの効率に対するＰＣＲ産物のサイズの効果を試験するために実験を行った。ａｔｔＢ１およびａｔｔＢ２部位を、２５６ｂｐ、１ｋｂ、１．４ｋｂ、３．４ｋｂ、４．６ｋｂ、６．９ｋｂおよび１０．１ｋｂのサイズで含むＰＣＲ産物を上記のように調製し、そしてエントリーベクターにクローン化し、そして宿主細胞をクローン化ＰＣＲ産物を含むエントリーベクターを用いて形質転換した。各ＰＣＲ産物についてクローニング効率を、以下のように、ｐＵＣ１９陽性コントロールプラスミドのクローニングに対して計算した。
【０２７０】
【化２１】
0004580106.tif 000024
図６９Ａ〜６９Ｃ（２５６ｂｐのＰＣＲフラグメントについて）、図７０Ａ〜７０Ｃ（１ｋｂのＰＣＲフラグメントについて）、７１Ａ〜７１Ｃ（１．４ｋｂ  ＰＣＲフラグメントについて）、図７２Ａ〜７２Ｃ（３．４ｋｂ  ＰＣＲフラグメントについて）、図７３Ａ〜７３Ｃ（４．６ｋｂのＰＣＲフラグメントについて）、７４（６．９ｋｂのＰＣＲフラグメントについて）および図７５〜７６（１０．１ｋｂのＰＣＲフラグメントについて）に、これらの実験の結果を示す。これらの図に示された結果を、異なる重量およびモルの入力ＰＣＲ  ＤＮＡについて、図７７に要約した。
【０２７１】
ともに、これらの結果は、本発明の組換えクローニングシステムにおいて、ａｔｔＢ含有ＰＣＲ産物が、比較的効率的に、約０．２５ｋｂから約５ｋｂまでのクローンのサイズにわたることを証明する。ＰＣＲ産物が約５ｋｂより非効率的に大きくなるにつれて（明らかに、融合体の遅い分解による）、組換え反応の間のインキュベーション時間がより長くなり、これらのより大きなＰＣＲフラグメントのクローニングの効率を改善する。あるいは、低レベルの入力ａｔｔｐドナープラスミドおよびおそらくａｔｔＢ含有ＰＣＲ産物を使用することによって、および／または融合体のより迅速な分解を補助するための反応条件を（例えば、緩衝液条件）調整することによって、大きな（約５ｋｂより大きい）ＰＣＲフラグメントのクローニングの効率を改良することが可能であり得る。
【０２７２】
（実施例１０：ＢＰ反応）
Ｇａｔｅｗａｒｄ（「エントリー（Ｅｎｔｒｙ）」）反応の１つの目的は、発現クローン（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｃｌｏｎｅ）をエントリークローンに変換することである。これは、発現クローンｃＤＮＡライブラリーから個々の発現クローンを単離し、そして目的の核酸分子を別の発現ベクター（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ）にトランスファーすることを望むか、またはａｔｔＢもしくはａｔｔＬライブラリーから分子の集団を移動することを所望する場合、有用である。あるいは、発現クローンを変異し得、ここで１つ以上の新しい発現ベクターに目的の変異された核酸分子をトランスファーすることを所望する。両方の場合において、目的の核酸分子をエントリークローンに変換することがまず必要である。
【０２７３】
（必要とされる材料）
・５×ＢＰ反応緩衝液
・発現クローンＤＮＡ、８μｌ以下のＴＥ中１００〜３００ｎｇ
・ドナー（ａｔｔｐ）ベクター、７５ｎｇ／μｌ、スーパーコイルＤＮＡ
・正のコントロールａｔｔＢ−ｔｅｔ−ＰＣＲ  ＤＮＡ、２５ｎｇ／μｌ
・ＧＡＴＥＷＡＹTM  ＢＰ  ＣｌｏｎａｓｅTM  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ（−８０℃で保存）
・クロナーゼ停止溶液（Ｃｌｏｎａｓｅ  Ｓｔｏｐ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（プロテイナーゼＫ、２μｇ／μｌ）
（注意：）
（発現クローンＤＮＡの調製：ＲＮアーゼワークスウェルで処理したＭｉｎｉｐｒｅｐ  ＤＮＡ）
１．ＬＲ反応（実施例１４を参照のこと）と共に、ＢＰ反応は、反応するＤＮＡのトポロジーによって強く影響される。一般的に、ＤＮＡが両方とも直鎖であるかまたは両方ともスーパーコイルである反応と比較して、ＤＮＡの一方が直鎖であり他方がスーパーコイルである場合、最も効率的である。さらに、ａｔｔＢ発現クローン（ベクター内のどこでも）を直線化することによって、一般的に、ドナー（ａｔｔＰ）プラスミド（Ｄｏｎｏｒ（ａｔｔＰ）Ｐｌａｓｍｉｄ）を直線化することより多くのコロニーを与える。発現クローンベクター内に適切な切断部位を発見することが困難であることを示す場合、ａｔｔＰ１部位とａｔｔＰ２部位との間で（例えば、ＮｃｏＩ部位で）ドナー（ａｔｔＰ）プラスミドを直線化し得、ｃｃｄＢ遺伝子を回避する。ドナー（ａｔｔＰ）プラスミドのマップは、図４９〜５４に与えられる。
【０２７４】
（手順）
１．以下の通りに反応を組み立てる。フリーザーからＧＡＴＥＷＡＹTM  ＢＰ  ＣｌｏｎａｓｅTM  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘを除去する前に、ＧＡＴＥＷＡＹTM  ＢＰ  ＣｌｏｎａｓｅTMＥｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘを除く全ての成分を室温で合わせる。
【０２７５】
【表５】
0004580106.tif 000025
２．−８０℃のフリーザーからＧＡＴＥＷＡＹTM  ＢＰ  ＣｌｏｎａｓｅTM  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘを取り出し、直ぐに氷上に置く。この混合物は、たったの２、３分で解凍した。
【０２７６】
３．４μｌのＧＡＴＥＷＡＹTM  ＢＰ  ＣｌｏｎａｓｅTM  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘをサブクローニング反応に加え、混合する。
【０２７７】
４．−８０℃フリーザーにＧＡＴＥＷＡＹTM  ＢＰ  ＣｌｏｎａｓｅTM  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘを戻す。
【０２７８】
５．２５℃で、少なくとも６０分間チューブをインキュベートする。ａｔｔＢ  ＤＮＡおよびａｔｔＰ  ＤＮＡの両方がスーパーコイルである場合、２５℃での２〜２４時間のインキュベーションを推薦する。
【０２７９】
６．２μｌのクロナーゼ停止溶液（Ｃｌｏｎａｓｅ  Ｓｔｏｐ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を加える。３７℃で１０分間インキュベートする。
【０２８０】
７．上記のように、２μｌを１００μｌの適格なＥ．ｃｏｌｉに形質転換する。５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢプレート上で選択する。
【０２８１】
（実施例１１：標準クローニング法を使用する、エントリーベクターへのＰＤＲ産物のクローニング）
（ＰＣＲ産物のクローニングのためのエントリーベクターの調製）
本発明の全てのエントリーベクターは、「左」制限部位と「右」制限部位との間のスタファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）として死の遺伝子ｃｃｄＢを含む。この配置の利点は、両方の制限酵素で切断されなかったベクター由来のバックグラウンドが実質的に存在しないことである。なぜなら、ｃｃｄＢ遺伝子の存在は、全ての標準Ｅ．ｃｏｌｉ株を殺傷するためである。従って、ｃｃｄＢフラグメントを除去するために、各エントリーベクター（Ｅｎｔｒｙ  Ｖｅｃｔｏｒ）を２回切断する必要がある。
【０２８２】
第２の制限酵素でエントリーベクターを消化した後、ホスファターゼ（子ウシ腸管アルカリホスファターゼ、ＣＩＡＰ、または熱感受性アルカリホスファターゼ、ＴＳＡＰ）で反応を処理することを強く推薦する。このホスファターゼは、反応混合物に直接添加され得、追加の時間インキュベートされ得、そして不活性化され得る。この工程は、ベクターとｃｃｄＢフラグメントの両方を脱リン酸化し、その結果、次のライゲーションの間、ｃｃｄＢフラグメントとエントリーベクターの終点についての目的のＤＮＡとの間に競合は少ない。
【０２８３】
（ＰＣＲ産物の平滑クローニング）
一般に、ＰＣＲ産物は、５’ホスファターゼを有さず（なぜなら、プライマーは通常５’ＯＨであるため）、そしてそれらは、平滑末端化される必要はない（この後者の点で、プライマーの配列が単一の３’塩基の付加に影響を及ぼす方法についての議論については、Ｂｒｏｗｎｓｔｅｉｎら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２０：１００６、１９９６を参照のこと）。以下のプロトコールは、これらの２つの欠陥を修復する。
【０２８４】
０．５ｍｌのチューブにおいて、エタノールによって、約４０ｎｇのＰＣＲ産物を沈殿させる（アガロースゲルから判断されるように）。
【０２８５】
１．  １μｌの１０ｍＭ  ｒＡＴＰ、１μｌの混合された２ｍＭ  ｄＮＴＰ（すなわち、２ｍＭ  ｄＡＴＰ、２ｍＭ  ｄＣＴＰ、２ｍＭ  ｄＴＴＰ、および２ｍＭ  ｄＧＴＰ）、２μｌの５×Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ緩衝液（３５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、５０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５００ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール）１０単位Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ、１μｌ  Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、および１０μｌに合わせるための水を含む１０μｌに、沈殿したＤＮＡを溶解する。
【０２８６】
２．  ３７℃で１０分間チューブをインキュベートし、次いで６５℃で１５分間インキュベートし、冷却し、任意の凝縮物をチューブの先端にもたらすために軽く遠心分離にかける。
【０２８７】
３．  ５μｌのＰＥＧ／ＭｇＣｌ2溶液を加え、混合し、そして室温で１０分間遠心分離する。上清を廃棄する。
【０２８８】
４．  ２μｌの５×Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、０．５単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼ、および約５０ｎｇの平滑末端化したホスファターゼ処理エントリーベクターを含む１０μｌ中で見えない沈殿物を溶解する。
【０２８９】
５．  ２５℃で１時間インキュベートし、次いで１０分間６５℃でインキュベートする。９０μｌのＴＥを加え、１０μｌを５０〜１００μｌの適格なＥ．ｃｏｌｉに形質転換する。
【０２９０】
６．  カナマイシン上に置く。
【０２９１】
（注意：）
上記プロトコールにおいて、工程ｂからｃは、同時に（Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼおよびポリメラーゼ活性を通して）ＰＣＲ産物の末端を磨き、および（Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを使用して）５’末端をリン酸化する。キナーゼを不活性化することが必要であり、その結果、工程ｅにおいて平滑末端化され、脱リン酸化されたベクターは、自己ライゲートし得ない。工程ｄ（ＰＥＧ沈殿）は、全ての小分子（プライマー、ヌクレオチド）を除去し、そしてまたクローン化されたＰＣＲ産物の収量を５０倍改善することが見出された。
【０２９２】
（制限酵素を用いる消化後のＰＣＲ産物のクローンニング）
制限酵素で消化されたＰＣＲ産物の効率的なクローニングは、３つの工程を包含する：ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの不活性化、制限酵素の効率的な切断、および小さなＤＮＡフラグメントの除去。
【０２９３】
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの不活性化：ＴａｑＤＮＡポリメラーゼおよびｄＮＴＰのＲＥ消化への繰越は、ＰＣＲ産物をクローニングする際の成功率を低下させる（Ｄ．Ｆｏｘら、ＦＯＣＵＳ２０（１）：１５、１９９８）。なぜなら、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼは、粘着性末端に充填し得、末端を平滑末端化するために塩基を加え得るためである。ＴａｑＱｕｅｎｃｈTM（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄから入手可能）またはフェノールによる抽出が、Ｔａｑを不活性化するために使用され得る。
【０２９４】
効率的な制限酵素切断：各ＰＣＲプライマーの５’末端における過剰の塩基は、ＰＣＲ産物の末端付近のＲＥ切断を補助する。安価なプライマーのアベイラビリティーによって、制限部位の５’側上の６〜９個の塩基を加えることは、末端のほとんどが消化されることを保証する優れた投入である。５倍過剰の制限酵素を用いた１時間以上のＤＮＡのインキュベーションは、成功を保証する。
【０２９５】
ライゲーション前の小分子の除去：プライマー、ヌクレオチド、プライマーダイマー、および制限酵素消化によって産生された小さなフラグメントは、クローニングベクターへのＰＣＲ産物の所望されるライゲーションを、全て阻害し得るかまたは競合し得る。このプロトコールは、小分子を除去するためにＰＥＧ沈殿を使用する。
【０２９６】
（制限酵素を用いてＰＣＲ産物の末端を切断するためのプロトコール）
１．ＰＣＲ産物中のＴａｑＤＮＡポリメラーゼの不活性化
オプションＡ：フェノールによる抽出
Ａ１．ＴＥで２００μｌにＰＣＲ反応物を希釈する。等容量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールを加え、２０秒間激しく撹拌し、１分間室温で遠心分離する。下相を廃棄する。
【０２９７】
Ａ２．ＤＮＡからフェノールを抽出し、以下の通りに濃縮する。等量の２−ブタノール（所望される場合、Ａｌｄｒｉｃｈの「Ｏｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ」で赤色に着色する）を加え、軽く撹拌し、室温で軽く遠心分離する。ブタノール上相を廃棄する。２−ブタノールを用いた抽出を繰り返す。この時点において、下水相の容量は、顕著に減少するはずである。２−ブタノールの上相を廃棄する。
【０２９８】
Ａ３．エタノールで、上記抽出液の水相からＤＮＡを沈殿させる。２００μｌの適切な制限酵素（ＲＥ）緩衝液に溶解する。
【０２９９】
オプションＢ：ＴａｑＱｕｅｎｃｈによる不活性化
Ｂ１．エタノールで、適切な量のＰＣＲ産物（１００ｎｇ〜１μｇ）を沈殿させ、２００μｌの適切なＲＥ緩衝液に溶解する。
【０３００】
Ｂ２．２μｌのＴａｑＱｕｅｎｃｈを加える。
【０３０１】
２．１０〜５０単位の制限酵素を加え、少なくとも１時間インキュベートする。ＰＣＲ産物の他端における消化のために緩衝液を交換する必要がある場合、エタノールで沈殿させる。
【０３０２】
３．１／２容量のＰＥＧ／ＭｇＣｌ2混合物をＲＥ消化に加える。十分に混合し、直ぐに室温で１０分間遠心分離する。上清（ペレットは通常見えない）を廃棄し、数分間再び遠心分離し、任意の残りの上清を廃棄する。
【０３０３】
４．適切な容量（元の増幅反応におけるＰＣＲ産物の量に依存する）のＴＥにＤＮＡを溶解し、回収を確証するために、アガロースゲルにアリコートを塗布する。クローニングのために使用される２０〜１００ｎｇの適切なエントリーベクターを同じゲルに塗布する。
【０３０４】
（実施例１２：ＧＡＴＥＷＡＹTMＣｌｏｎｉｎｇ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓの予想されるサイズの決定）
配列を電気的に切断しつなぎ合わせるソフトウェアプログラムにアクセスする場合、ＧＡＴＥＷＡＹTMＣｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ組換え産物のサイズおよび制限パターンの予測を補助するために電気的クローンを生成し得る。
【０３０５】
ＧＡＴＥＷＡＹTMＣｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ組換え反応において酵素Ｉｎｔによって実施される切断工程およびライゲーション工程は、７−ｂｐ５’−末端突出を形成する制限酵素切断を模倣し、続いて娘分子の末端を封じるライゲーション工程が実施される。クロナーゼカクテル中に存在する組換えタンパク質（以下の実施例１９を参照のこと）は、全ての４つの型のａｔｔ部位内に存在する１５ｂｐコア配列（種々の型のａｔｔ部位の各々に特徴的な他の隣接配列に加えて）を認識する。
【０３０６】
これらの部位を、それらが制限部位であるかのように、ソフトプログラムで処理することによって、種々の目的ベクター（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ）によってエントリークローンを切断し得、そしてつなぎ合わせ得、そしてＧＡＴＥＷＡＹTMＣｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ反応からの予想される結果の正確なマップおよび配列が得られ得る。
【０３０７】
（実施例１３：タンパク質発現（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ））
（タンパク質発現の簡単な概説）
転写：Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクター中の最も通常使用されるプロモーターは、ｌａｃプロモーターの改変体であり、そしてこれらはＩＰＴＧを成長培地に添加することによって、刺激され得る。通常、発現が所望されるまでプロモーターをオフに維持することが良く、その結果、宿主細胞は、幾つかの異種タンパク質の過多によってシック（ｓｉｃｋ）にならない。これは、Ｅ．ｃｏｌｉに使用されるｌａｃプロモーターの場合において、合理的に容易である。ｌａｃリプレッサータンパク質を作製するために、ｌａｃＩ遺伝子（またはそのより増殖性関連の、ｌａｃIq遺伝子）を供給する必要があり、これは、プロモーター付近で結合し、転写レベルを低く維持する。Ｅ．ｃｏｌｉ発現についての幾つかの目的ベクターは、この目的のためにそれら自体のｌａｃＩq遺伝子を保有する。（しかし、ｌａｃプロモーターは、ＩＰＴＧの非存在下においてでさえ、常にわずかに「ｏｎ」である。）
真核細胞中における転写を制御することは、簡単または効率的とは程遠い。Ｂｕｊａｒｄらのテトラサイクリン系は、最も成功したアプローチであり、目的ベクター（ｐＤＥＳＴ１１；図３１）の１つは、この機能を供給するために構築された。
【０３０８】
翻訳：リボソームは、ｍＲＮＡ内に存在する情報をタンパク質に変換する。リボソームは、メチオニン（ＡＵＧ）コドンを探すＲＮＡ分子を走査し、これは、ほぼ全ての新生タンパク質に取りかかる。しかし、リボソームは、始点のそれら由来のタンパク質の中央においてメチオニンについてコードするＡＵＧコドン間で区別し得なければならない。最もよく、リボソームは、１）最初にＲＮＡ中にあり（５’末端に向けて）、そして２）適切な配列状況を有する、ＡＵＧを選択する。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、好まれる状況（最初に、ＳｈｉｎｅおよびＤａｌｇａｒｎｏ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７：２２１（１９７５）によって認識された）は、開始ＡＵＧ、特にＡＧＧＡＧＧまたは幾つかの改変体の５〜１２塩基上流のプリンからの開始である。
【０３０９】
真核生物において、Ｋｏｚａｋ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１９８６７（１９９１））によって翻訳されたｍＲＮＡの調査は、開始メチオニンの周りの、好ましい配列状況、ｇｃｃＡｃｃＡＴＧＣ、を明らかにし、ここで−３におけるＡは最も重要であり、＋４におけるプリン（ここで、ＡＴＧのＡは＋１である）、好ましくは、Ｇは、次に最も影響力がある。−３においてＡを有することは、大部分のリボソームが、植物、昆虫、酵母、および哺乳動物中においてｍＲＮＡの第１のＡＵＧを選択するのに十分である。（真核細胞におけるタンパク質合成の開始の概説については、Ｐａｉｎ，Ｖ．Ｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３６：７４７−７７１、１９９６を参照のこと）。
【０３１０】
ＧＡＴＥＷＡＹTMＣｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍのための翻訳シグナルの重要性：
まず、翻訳シグナル（Ｅ．ｃｏｌｉ中のＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ、真核細胞中のＫｏｚａｋ）は、開始ＡＴＧに接近しなければならない。ａｔｔＢ部位は、２５塩基対長である。従って、翻訳シグナルが目的の核酸分子の天然ＡＴＧ付近に所望される場合、それらは、目的の核酸分子のエントリークローン内に存在しなければならない。さらに、エントリークローンから目的ベクターまで目的の核酸分子が移動される場合、任意の翻訳シグナルは沿って移動する。この結果は、エントリークローン中のＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏおよび／またはＫｏｚａｋ配列の存在または非存在が考慮されなければならず、最終的な目的ベクターが注意して使用される。
【０３１１】
第２に、リボソームは５’ＡＴＧを最もよく選択するが、内部ＡＴＧはまた、タンパク質合成を開始するために使用される。この内部ＡＴＧの周りの翻訳状況がよくなればなるほど、内部翻訳開始がより多く見られる。これは、ＧＡＴＥＷＡＹTMＣｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍにおいて重要である。なぜなら、目的の核酸分子のエントリークローンを作製し得、そしてＡＴＧ付近にＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏおよび／またはＫｏｚａｋ配列を有するように配列し得るからである。このカセットが目的の核酸分子を転写する目的ベクター内に組換えされる際、天然タンパク質が得られる。必要とされる場合、Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏおよび／またはＫｏｚａｋ配列が同じ読み取りフレーム内に任意の停止シグナルを含まないため、異なる目的ベクター内に融合タンパク質を作製し得る。しかし、これらの内部翻訳シグナルの存在によって、有意な量の天然タンパク質が作製され得、融合タンパク質を夾雑し得、そして融合タンパク質の収量を低下し得る。これは、特に、Ｈｉｓ６のような短い融合タグの場合にあり得る。
【０３１２】
良好な妥協（ｇｏｏｄ  ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅ）が推奨され得る。ｐＥＮＴＲ７（図１６）またはｐＥＮＴＲ８（図１７）のようなエントリーベクター（Ｅｎｔｒｙ  Ｖｅｃｔｏｒ）が選択される場合、コザック塩基がネイティブな真核生物発現のために存在する。Ｅ．ｃｏｌｉ翻訳のための状況は不十分であり、そのため、アミノ末端融合物の収量が良好であるはずであり、そしてこの融合タンパク質はＴＥＶプロテアーゼで消化されて、精製後にほぼネイティブなタンパク質を作製し得る。
【０３１３】
（Ｅ．ｃｏｌｉにおけるタンパク質の合成のために推奨される条件）  Ｅ．ｃｏｌｉ中でタンパク質を作製する場合、少なくとも最初に、培養物を３７℃の代わりに３０℃でインキュベートすることが賢明である。本発明者らの経験によって、タンパク質は、３０℃では凝集物をあまり形成しないようであることが示される。さらに、３０℃で増殖させた細胞からのタンパク質の収量は、しばしば改善される。
【０３１４】
発現することが困難であるタンパク質の収量もまた、一晩の培養物から直接収集するのとは全く異なって、一晩増殖させたものからその朝開始した培養物を用いて対数増殖期の中期の培養物を誘導することにより改善され得る。一晩の培養物から直接収集する場合、この細胞は好ましくは、対数増殖期後期または静止増殖期にあり、これは、不溶性凝集物の形成に好都合であり得る。
【０３１５】
（実施例１４：既存のベクターからの目的ベクター（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ）の構築）
目的ベクター（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ）は機能する。なぜなら、これらは、クロラムフェニコール耐性（ＣｍＲ）遺伝子および細胞死遺伝子（ｄｅａｔｈ  ｇｅｎｅ）ｃｃｄＢに隣接する２つの組換え部位（ａｔｔＲ１およびａｔｔＲ２）を有するからである。ＧＡＴＥＷＡＹTM  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍの組換え反応は、カセット（Ｃａｓｓｅｔｔｅ）全体（ａｔｔＢ部位の一部を含むいくつかの塩基を除く）を、エントリーベクター（Ｅｎｔｒｙ  Ｖｅｃｔｏｒ）からの目的のＤＮＡセグメントと交換する。ａｔｔＲ１、ＣｍＲ、ｃｃｄＢ遺伝子およびａｔｔＲ２は連続しているので、これらは、単一のＤＮＡセグメントによって移動し得る。このカセット（Ｃａｓｓｅｔｔｅ）がプラスミド中にクローニングされる場合、このプラスミドが目的ベクター（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ）となる。図６３は、ＧＡＴＥＷＡＹTM  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｃａｓｓｅｔｔｅの模式図を示す；ベクターｐＥＺＣ１５１０１、ｐＥＺＣ１５１０２およびｐＥＺＣ１５１０３に含まれる３つのリーディングフレームの全てにおけるａｔｔＲカセットを、それぞれ、図６４Ａ、図６４Ｂおよび図６４Ｃに示す。
【０３１６】
目的ベクター（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ）を構築するためのプロトコルを以下に表す。以下の点を心に留めておくこと：
・目的ベクター（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ）は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．から入手可能な（そして本明細書中に参考として援用される、１９９９年３月２日に出願された米国仮出願第６０／１２２，３９２号に詳細に記載される）Ｅ．ｃｏｌｉのＤＢ株のうちの１つ（例えば、ＤＢ３．１、および特にＥ．ｃｏｌｉ  ＬＩＢＲＡＲＹ  ＥＦＦＩＣＩＥＮＣＹ（登録商標）ＤＢ３．１TM  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌ）において構築され、そして増殖されなければならない。なぜなら、ｃｃｄＢ細胞死遺伝子は、ｃｃｄＢ遺伝子の存在下で生き延びるように変異していない全てのＥ．ｃｏｌｉ株を殺傷するからである。
【０３１７】
・目的ベクター（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ）を用いて融合タンパク質を作製する場合、適切なリーディングフレームを有するＧＡＴＥＷＡＹTM  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍカセットを用いなければならない。このカセットの末端のヌクレオチド配列を、図７８に示す。融合タンパク質ドメインのリーディングフレームは、６個のＡが２つのリジンコドンに翻訳されるように、ａｔｔＲ１部位（アミノ末端融合物について）のコア領域とインフレームでなければならない。Ｃ末端融合タンパク質については、ａｔｔＲ２部位のコア領域を通しての翻訳は、−ＴＡＣ−ＡＡＡ−とインフレームであって、−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−を生じるべきである。
【０３１８】
・各リーディングフレームのカセット（Ｃａｓｓｅｔｔｅ）は、クロラムフェニコール耐性遺伝子とｃｃｄＢ遺伝子との間に異なる独特の制限部位を有することに留意されたい（リーディングフレームＡについてはＭｌｕＩ、リーディングフレームＢについてはＢｇｌＩＩ、そしてリーディングフレームＣについてはＸｂａＩ；図６３を参照のこと）。
【０３１９】
・大部分の標準的なベクターは、そのベクターのＭＣＳにエントリーカセット（Ｅｎｔｒｙ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ）を挿入することにより、目的ベクター（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ）に変換され得る。
【０３２０】
（目的ベクター（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ）を作製するためのプロトコル）
１．ベクターがアミノ融合タンパク質を作製する場合、「ａａａ  ａａａ」トリプレットをａｔｔＲ１中に、融合タンパク質のトリプレットと相を合わせて維持することが必要である。どのエントリーカセット（Ｅｎｔｒｙ  ｃａｓｓｅｔｔｅ）を使用するかを以下の通りに決定する：
ａ．）エントリーカセット（Ｅｎｔｒｙ  ｃａｓｓｅｔｔｅ）をクローニングする制限部位付近の既存のベクターのヌクレオチド配列を完全に書く。これらは、融合ドメインのアミノ酸配列に対応するトリプレットで書かれなければならない。
【０３２１】
ｂ．）切断し、そして平滑にした後（すなわち、突出する５’末端にフィルインした後または突出する３’末端を研磨した後）の制限部位末端に対応する配列を通して垂直な線を画く。
【０３２２】
ｃ．）適切なリーディングフレームカセットを選択する：
・平滑末端のコード配列が、完全なコドントリプレットの後で終わった場合、リーディングフレームＡカセットを用いる。図７８、図７９および図８０を参照のこと。
【０３２３】
・平滑末端のコード配列が単一の塩基で終わった場合、リーディングフレームＢカセットを用いる。図７８、図７９および図８１を参照のこと。
【０３２４】
・平滑末端のコード配列が２つの塩基で終わった場合、リーディングフレームＣカセットを用いる。図７８、図７９、図８２Ａ〜Ｂおよび図８３Ａ〜Ｃを参照のこと。
【０３２５】
２．１〜５の微生物の既存のプラスミドを、（ａｔｔ部位に隣接する）目的の核酸分子が組換え反応の後にあることを望む位置で切断する。注：この工程で、可能な限り多くのＭＣＳ制限部位を除去した方がよい。このことは、ＧＡＴＥＷＡＹTM  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ内の制限酵素部位が、新たなプラスミド中で唯一である可能性をより高くする。このことは、目的ベクター（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ）を線状化するために重要である（実施例１４、下記）。
【０３２６】
３．５’リン酸をアルカリホスファターゼを用いて除去する。このことは強制的なことではないが、このことは、成功の確率を増大させる。
【０３２７】
４．末端を、フィルイン反応または研磨反応を用いて平滑にする。例えば、制限酵素で切断し、エタノールで沈澱させた１μｇのベクターＤＮＡに以下を添加する：
ｉ．２０μｌの５×Ｔ４  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（１６５  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−酢酸（ｐＨ７．９）、３３０ｍＭ酢酸Ｎａ、５０ｍＭ酢酸Ｍｇ、５００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、２．５ｍＭ  ＤＴＴ）
ｉｉ．５μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰミックス
ｉｉｉ．１単位のＴ４  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
ｉｖ．１００μｌの最終体積にするための水
ｖ．３７℃にて１５分間インキュベートする。
【０３２８】
５．ｄＮＴＰおよび小さなＤＮＡフラグメントを除去する：エタノール沈殿を行い（０．１Ｍ酢酸ナトリウムを含む３倍の体積の室温のエタノールを添加し、充分に混合し、充分に混合し、ｓ室温にて５〜１０分間にわたり直ちに遠心分離する）、湿った沈殿物を２００μｌのＴＥ中に溶解し、１００μｌの３０％  ＰＥＧ  ８０００、３０ｍＭ  ＭｇＣｌ2を添加し、室温にて１０分間にわたって直ちに遠心分離し、上清を捨て、数秒間、再度遠心分離し、全ての残りの液体を捨てる。
【０３２９】
６．１マイクロリットルあたり１０〜５０ｎｇの最終濃度になるようにＤＮＡを溶解する。２０〜１００ｎｇを超コイルプラスミドおよび直鎖状のサイズ標準の隣でゲルにアプライして、切断および回収を確認する。この切断は、１００％完全である必要はない。なぜなら、エントリーカセット（Ｅｎｔｒｙ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ）上のクロラムフェニコールマーカーについて選択するからである。
【０３３０】
７．１０μｌの連結反応物中で、１０〜５０ｎｇのベクター、１０〜２０ｎｇのエントリーカセット（Ｅｎｔｒｙ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ）（図７９）およびリガーゼ緩衝液中の０．５単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼを合わせる。１時間（または一晩、いずれか最も便利な方）後、１μｌを、ｇｙｒＡ４６２変異を有するコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ細胞のＤＢ株（本明細書中に参考として援用される、１９９９年３月２日に出願された米国仮出願第６０／１２２，３９２号を参照のこと）の１つ、好ましくはＤＢ３．１、そして最も好ましくはＥ．ｃｏｌｉ  ＬＩＢＲＡＲＹ  ＥＦＦＩＣＩＥＮＣＹ（登録商標）ＤＢ３．１TM  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌに形質転換する。エントリーカセット（Ｅｎｔｒｙ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ）上のｃｃｄＢ遺伝子は、ｃｃｄＢ遺伝子の存在下で生き延びるように変異していない他の株のＥ．ｃｏｌｉを殺傷する。
【０３３１】
８．ＳＯＣ培地中での発現後、１０μｌおよび１００μｌをクロラムフェニコール含有（３０μｇ／ｍｌ）プレートにプレーティングし、３７℃にてインキュベートする。
【０３３２】
９．コロニーを拾い、ミニプレップＤＮＡを作製する。このミニプレップをＲＮａｓｅ  Ａで処理し、そしてＴＥ中で保存する。適切な制限酵素を用いて切断して、このカセット（Ｃａｓｓｅｔｔｅ）の方向を決定する。このプラスミドのタンパク質発現機能のアミノ末端の隣にａｔｔＲ１部位を有するクローンを選択する。
【０３３３】
（目的ベクター（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ）を用いることについての注意）
・本発明者らは、目的ベクター（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ）が直鎖状であるかまたは弛緩している場合、ＧＡＴＥＷＡＹTM  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ反応物から約１０倍多くのコロニーが生じることを見出した。使用するコンピテント細胞が、非常にコンピテントである（１マイクログラムあたり１０8を超える）場合、目的ベクター（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ）を直鎖化することはそれほど必須ではない。
【０３３４】
・直鎖化のために用いられる部位は、エントリーカセット（Ｅｎｔｒｙ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ）内になければならない。各カセット内で１回または２回切断する部位を図８０〜８２に示す。
【０３３５】
・目的ベクター（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ）のミニプレップは、ＲＮａｓｅで処理する限り、良好に作動する。大部分のＤＢ株がｅｎｄＡ−である（本明細書中に参考として援用される、１９９９年３月２日に出願された米国仮出願第６０／１２２，３９２号を参照のこと）ので、ミニプレップは、事前のフェノール抽出を伴わずに制限酵素を用いて消化され得る。
【０３３６】
・ミニプレップＤＮＡのＯＤ260の読み取りは、ＲＮＡおよびリボヌクレオチドが、例えば、ＰＥＧ沈澱によって除去されていなければ、不正確である。
【０３３７】
（実施例１５：適切なエントリーベクター（Ｅｎｔｒｙ  Ｖｅｃｔｏｒ）および目的ベクター（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ）を選択する際のいくつかのオプション：一例）
いくつかの適用では、目的の核酸分子を２つの形態で発現させることが所望され得る：Ｅ．ｃｏｌｉ中でアミノ末端融合物として、そして真核生物細胞中でネイティブタンパク質として。このことは、いくつかの方法のうちのいずれかによって達成され得る：
オプション１：選択は、目的の核酸分子およびこの核酸分子を含むフラグメント、ならびに入手可能なエントリーベクター（Ｅｎｔｒｙ  Ｖｅｃｔｏｒ）に依存する。真核生物の翻訳については、Ｋｏｚａｋ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１９８６７，１９９１）によるコンセンサス塩基を開始メチオニン（ＡＴＧ）コドンの付近に必要とする。全てのエントリーベクター（Ｅｎｔｒｙ  Ｖｅｃｔｏｒ）は、このモチーフをＸｍｎＩ部位（平滑カッター）の上流に提供する。１つのオプションは、目的の核酸分子をそのＡＴＧを伴ってＰＣＲによって増幅し、アミノ末端を平滑にし、そして天然の停止コドン、続いて「右側の」制限部位（ｐＥＮＴＲベクターのＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩ、ＸｈｏＩ、ＥｃｏＲＶまたはＸｂａＩ）のうちの１つを含むカルボキシ末端を平滑にすることである。
【０３３８】
目的の核酸分子が、例えば、ＸｈｏＩ部位を有さないことがわかっている場合、この構造を有するＰＣＲ産物を作製し得る：
【０３３９】
【化２２】
0004580106.tif 000026
ＸｈｏＩで切断した後、このフラグメントは、クローニングする準備ができている：
【０３４０】
【化２３】
0004580106.tif 000027
（この例に従う場合、アミノオリゴ上にリン酸をつけることを忘れないように。）
オプション２：このＰＣＲ産物は、２つのエントリーベクター（Ｅｎｔｒｙ  Ｖｅｃｔｏｒ）にＸｍｎＩ部位とＸｈｏＩ部位との間にクローニングされて、所望の産物を生じ得る：ｐＥＮＴＲ１Ａ（図１０Ａ、図１０Ｂ）またはｐＥＮＴＲ７（図１６Ａ、図１６Ｂ）。ｐＥＮＴＲ１Ａにクローニングする場合、アミノ融合物は、最少数のアミノ酸を、融合ドメインと目的の核酸分子との間に有するが、この融合物は、ＴＥＶプロテアーゼを用いて除去され得ない。ｐＥＮＴＲ７におけるクローンについて逆もまた正しい。すなわち、アミノ融合物は、融合物と目的の核酸分子との間でより多くのアミノ酸を犠牲にしてＴＥＶプロテアーゼを用いて切断され得る。
【０３４１】
この実施例では、本発明者らは、本発明者らの仮想の目的の核酸分子をＸｍｎＩ部位とＸｈｏＩ部位との間でｐＥＮＴＲ７にクローニングすることにする。一旦このことが達成されたら、エントリークローン（Ｅｎｔｒｙ  Ｃｌｏｎｅ）ｐＥＮＴＲ７を用いたいくつかの任意のプロトコルが続き得る：
オプション３：目的の核酸分子がＰＣＲを用いて増幅されたので、目的の核酸分子を配列決定することが所望され得る。これを行うために、エントリーベクター（Ｅｎｔｒｙ  Ｖｅｃｔｏｒ）由来の目的の核酸分子を、標準的な配列決定プライマーについてのプライミング部位を有するベクター中に移入する。このようなベクターは、ｐＤＥＳＴ６である（図２６Ａ、図２６Ｂ）。この目的ベクター（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ）は、目的の核酸分子を、ｌａｃプロモーター（これは、漏出性である−−上記の実施例３を参照のこと）とは逆の方向に配置する。遺伝子産物がＥ．ｃｏｌｉに対して毒性である場合、この目的ベクター（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ）はその毒性を最小にする。
【０３４２】
オプション４：配列決定を続ける間、目的の核酸分子をＣＭＶプロモーターベクター（ｐＤＥＳＴ７、図２７；またはｐＤＥＳＴ１２、図３２）中に、またはバキュロウイルスベクター（ｐＤＥＳＴ８、図２８；またはｐＤＥＳＴ１０、図３０）中に昆虫細胞における発現のために組換えることにより、例えば、ＣＨＯ細胞における目的の核酸分子の発現をチェックすることを望み得る。これらのベクターは両方とも、目的の核酸分子のコード配列を転写し、ＸｍｎＩ部位の上流のコザック塩基を用いてこれをＰＣＲ産物のＡＴＧから翻訳する。
【０３４３】
オプション５：例えば、抗体を作製するためにタンパク質を精製することを望む場合、目的の核酸分子をＨｉｓ６融合物ベクターｐＤＥＳＴ２（図２２）中にクローニングし得る。目的の核酸分子は、ｐＥＮＴＲ７（図１６）のＴＥＶプロテアーゼ切断ドメインの下流にクローニングされるので、産生されるタンパク質のアミノ酸配列は、以下である：
【０３４４】
【化２４】
0004580106.tif 000028
目的ベクター（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ）およびエントリーベクター（Ｅｎｔｒｙ  Ｖｅｃｔｏｒ）を作製するために用いられたａｔｔＢ部位および制限部位は、下線の１１アミノ酸（ＧＩＴＳＬＹＫＫＡＧＦ）中に翻訳される。ＴＥＶプロテアーゼでの切断（矢印）は、２つのアミノ酸ＧＴを遺伝子産物のアミノ末端に残す。
【０３４５】
平滑（アミノ）−ＸｈｏＩ（カルボキシ）フラグメントとしてｐＥＮＴＲ７（図１６）中にクローニングされ、次いでＨｉｓ６融合ベクターｐＤＥＳＴ２（図２２）中への組換えによってクローニングされた、目的の核酸分子の例クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子について、図５５を参照のこと。
【０３４６】
オプション６：Ｈｉｓ６融合タンパク質が不溶性である場合、続けて、そしてＧＳＴ融合を試み得る。適切な目的（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ）ベクターはｐＤＥＳＴ３（図２３）である。
【０３４７】
オプション７：ＲＮＡプローブを作製することを必要とし、そしてＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼを好む場合、ｐＳＰＯＲＴ＋（ｐＤＥＳＴ５（図２５Ａ、図２５Ｂ））中にクローニングされた目的の核酸分子を用いてトップ鎖ＲＮＡを作製し得、そしてｐＳＰＯＲＴ（−）（ｐＤＥＳＴ６（図２６Ａ、２６Ｂ））中にクローニングされた目的の核酸分子を用いてボトム鎖ＲＮＡを作製し得る。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼおよびＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼについての対向するプロモーターもまたこれらのクローン中に存在する。
【０３４８】
オプション８：目的の核酸分子を種々の目的ベクター（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ）中に同じ実験でクローニングすることはしばしばやりがいがある。例えば、コロニーの数が、種々の組換え反応物をＥ．ｃｏｌｉ中に形質転換したときに広範に変動する場合、これは、目的の核酸分子がある状況では毒性であることの指標であり得る。（この問題は、ポジティブなコントロール遺伝子を各目的ベクター（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ）について用いる場合、より明白に明らかである。）詳細には、目的の核酸分子を、ｐＤＥＳＴ５に組換えたときよりもｐＤＥＳＴ６に組換えたときにより多くのコロニーが得られる場合、ｌａｃプロモーターの漏出性が、ｐＳＰＯＲＴ「＋」中で目的の核酸分子のいくらかの発現を引き起こすという良好な機会が存在する（目的の核酸分子は逆方向で存在するので、これは、ｐＤＥＳＴ６中では有害ではない）。
【０３４９】
（実施例１６：組換えクローニング反応を介した発現クローンへのＰＣＲ産物（または発現クローン）の１チューブ移入の実証）
本明細書中に記載されるＢｘＰ組換え（エントリー（Ｅｎｔｒｙ）またはＧａｔｅｗａｒｄ）反応では、アンピシリン耐性を付与するプラスミドにおけるａｔｔＢ１部位およびａｔｔＢ２部位が隣接したＤＮＡセグメントを、カナマイシン耐性を付与するａｔｔＰプラスミドへの組換えによって移入し、このことは、産物分子をもたらし、ここで、ＤＮＡセグメントには、ａｔｔＬ部位（ａｔｔＬ１およびａｔｔＬ２）が隣接していた。この産物プラスミドは、「ａｔｔＬエントリークローン（ａｔｔＬ  Ｅｎｔｒｙ  Ｃｌｏｎｅ）」分子を含む。なぜなら、これは、「ａｔｔＲ目的ベクター（ａｔｔＲ  Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ）」分子とＬｘＲ（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ）反応を介して反応し得、ＤＮＡセグメントの新規な（アンピシリン耐性）ベクターへの移入をもたらすからである。以前に記載された例では、ＢｘＰ反応産物をＥ．ｃｏｌｉ中に形質転換し、カナマイシン耐性コロニーを選択し、これらのコロニーを液体培養中で増殖させ、そしてミニプレップＤＮＡを調製し、その後、このＤＮＡを目的ベクター（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ）とＬｘＲ反応において反応させることが必要であった。
【０３５０】
以下の実験の目的は、ＢｘＰ反応（ＢｘＰ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）産物を直接ＬｘＲ反応物（ＬｘＲ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）に添加することによって形質転換工程およびミニプレップＤＮＡ工程を除去することであった。これは、ａｔｔＢ部位に隣接したＤＮＡセグメントが、プラスミドの代わりにＰＣＲ産物である場合、特に適切である。なぜなら、ａｔｔＢプラスミドは（一般に）アンピシリン耐性遺伝子を保有するが、ＰＣＲ産物は、形質転換によってアンピシリン耐性コロニーを与えることができないからである。従って、ＢｘＰ反応（ＢｘＰ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）におけるａｔｔＢ部位に隣接したＰＣＲ産物の使用は、その後のＬｘＲ反応（ＬｘＲ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）の所望のａｔｔＢ産物によってコードされるアンピシリン耐性について選択することを可能にする。
【０３５１】
以下の２つの反応を調製した：反応Ａ、ネガティブコントロール（非ａｔｔＢ  ＰＣＲ産物）（８μｌ）が、５０ｎｇのｐＥＺＣ７１０２（ａｔｔＰ  ドナープラスミドであり、カナマイシン耐性を付与する）および２μｌのＢｘＰ  Ｃｌｏｎａｓｅ（２２ｎｇ／μｌ  Ｉｎｔタンパク質および８ｎｇ／μｌ  ＩＨＦタンパク質）をＢｘＰ緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣＩ（ｐＨ７．８）、７０ｍＭ  ＫＣＩ、５ｍＭ  スペルミジン、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、２５０μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ）中に含んだ。反応Ｂ（２４μｌ）が、１５０ｎｇ  ｐＥＺＣ７１０２、６μｌ  ＢｘＰ  Ｃｌｏｎａｓｅ、および１２０ｎｇのａｔｔＢ−ｔｅｔ−ＰＣＲ産物を、反応Ａと同じ緩衝液中に含んだ。このａｔｔＢ−ｔｅｔ−ＰＣＲ産物は、プラスミドｐＢＲ３２２のテトラサイクリン耐性遺伝子を含んだ。この産物を、ａｔｔＢ１部位またはａｔｔＢ２部位のいずれかを含みかつ上記のようにその５’末端に４つのＧを有する２つのプライマーを用いて増幅した。
【０３５２】
この２つの反応を２５℃で３０分間インキュベートした。次いで、これらの反応物のアリコートを、ＬｘＲ反応またはＬｘＲ反応の適切なコントロールを含む新規な成分に添加した。５つの新規な反応をこのようにして生成した：
反応１：５μｌの反応Ａを、２５ｎｇのＮｃｏＩ切断したｐＥＺＣ８４０２（ａｔｔＲ目的ベクター（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ）プラスミド）をＬｘＲ緩衝液（３７．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣＩ（ｐＨ７．７）、１６．５ｍＭ  ＮａＣＩ、３５ｍＭ  ＫＣＩ、５ｍＭスペルミジン、３７５μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ）中に含み、そして１μｌのＧＡＴＥＷＡＹTM  ＬＲ  ＣｌｏｎａｓｅTM  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘを含む、５μｌのＬｘＲ反応物に添加した（総容量１０μｌ）。
【０３５３】
反応２：反応１と同じ。ただし、反応Ｂ（ポジティブ）のうちの５μｌを、反応Ａ（ネガティブ）の代わりに添加した。
【０３５４】
反応３：反応２と同じ。ただし、ＮｃｏＩ切断したｐＥＺＣ８４０２およびＧＡＴＥＷＡＹTM  ＬＲ  ＣｌｏｎａｓｅTM  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘの量を２倍にし、それぞれ、５０ｎｇおよび２μｌにした。
【０３５５】
反応４：反応２と同じ。ただし、２５ｎｇのｐＥＺ１１１０４（ポジティブコントロールのａｔｔＬエントリークローン（Ｅｎｔｒｙ  Ｃｌｏｎｅ）プラスミド）を反応Ｂのアリコートに加えて添加した。
【０３５６】
反応５：ポジティブコントロールＬｘＲ反応。２５ｎｇのＮｃｏＩ切断したｐＥＺＣ８４０２、２５ｎｇのｐＥＺ１１１０４、３７．５ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣＩ（ｐＨ７．７）、１６．５ｍＭのＮａＣＩ、３５ｍＭのＫＣＩ、５ｍＭのスペルミジン、３７５μｇ／ｍｌのＢＳＡおよび１μｌのＧＡＴＥＷＡＹTM  ＬＲ  Ｃｌｏｎａｓｅ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘを、総容量５μｌにて含む。
【０３５７】
５つの反応すべてを、２５℃で３０分間インキュベートした。次いで、上記の５つの反応の各々の１μｌのアリコート、および反応Ｂの残りの容量（標準ＢｘＰ反応）からの１μｌを、５０μｌのコンピテントＤＨ５α  Ｅ．ｃｏｌｉを形質転換するために使用した。ＤＮＡおよび細胞を、氷上で１５分間インキュベートし、４２℃で４５秒間ヒートショックし、そして４５０μｌのＳＯＣを添加した。各チューブを、３７℃で振盪しながら６０分間インキュベートした。各形質転換の１００μｌおよび４００μｌのアリコートを、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンまたは１００μｇ／ｍｌのアンピシリンのいずれかを含むＬＢプレート上にプレーティングした（表２を参照のこと）。１０ｐｇのｐＵＣ１９  ＤＮＡを用いた形質転換（ＬＢ−ａｍｐ100上にプレーティングした）が、ＤＨ５α細胞の形質転換効率に関するコントロールとして役立った。３７℃で一晩のインキュベーション後、各プレート上のコロニーの数を測定した。
【０３５８】
これらの反応の結果を、表２に示す。
【０３５９】
【表６】
0004580106.tif 000029
反応３から得られた４３コロニーのうちの３４個を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２ｍｌのＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ中に釣菌し、そしてこれらの培養物を、３７℃で振盪しつつ一晩増殖させた。３４個の培養物のうちの２７個が、少なくとも中程度の増殖を生じ、そしてこれらのうちの２４個を使用し、標準的プロトコルを使用して、ミニプレップＤＮＡを調製した。これらの２４個のＤＮＡを、１％アガロースゲル上でスーパーコイルド（ＳＣ）ＤＮＡとしてまず分析して、インサートを有するものを同定し、そしてそのインサートのサイズを評価した。この２４個のサンプルのうちの１５個が、ｔｅｔｘ７１０２がｐＥＺＣ８４０２と正しく組換えてｔｅｔｘ８４０２を生じる場合に推測されるサイズ（５５５３ｂｐ）のＳＣ  ＤＮＡを示した。これらのサンプルのうちの１つは、２つのプラスミドを含み、１つは、約５５００ｂｐそして１つは約３５００ｂｐであった。残りのクローンの大多数は、約４１００ｂｐのサイズであった。
【０３６０】
推定サイズ（約５５００ｂｐ）のＳＣ  ＤＮＡを示す１５個のクローンすべてを、制限エンドヌクレアーゼを用いての２つの別個の二重切断によって分析して、予測産物ｔｅｔｘ８４０２の構造を確認した。（プラスミド地図、図５７〜５９を参照のこと）。１組の切断において、このＤＮＡを、ＮｏｔＩおよびＥｃｏＲＩで処理した。これれは、両方のａｔｔＢ部位のちょうど外側でこの推定産物を切断して、１４７５ｂｐのフラグメント上にあるｔｅｔrインサートを解放するはずである。第２の組の切断において、このＤＮＡを、ＮｏｔＩおよびＮｒｕＩで切断した。ＮｒｕＩは、サブクローン化されたｔｅｔrインサート内で非対称的に切断し、そしてＮｏｔＩとともに、１０１９ｂｐのフラグメントを解放する。
【０３６１】
二重制限切断により分析した１５個のクローンのうち、１４個が、予測産物のフラグメントの推定サイズを示した。
【０３６２】
（解釈）
反応ＢのＤＮＡ成分であるｐＥＺＣ７１０２およびａｔｔＢ−ｔｅｔ−ＰＣＲが、図５６に示される。ＢｘＰ反応Ｂの所望の産物は、ｔｅｔｘ７１０２であり、これは、図５７に示される。このＬｘＲ反応は、ＢｘＰ反応の産物であるｔｅｔｘ７１０２（図５７）を、図５８に示される目的ベクターであるｐＥＺＣ８４０２と組換える。ｔｅｔｘ７１０２およびｐＥＺＣ８４０２を用いるＬｘＲ反応は、図５９に示される所望の産物ｔｅｔｘ８４０２を生じると推測される。
【０３６３】
反応２は、ＢｘＰ反応およびＬｘＲ反応を含み、ネガティブコントロール反応のコロニーより多いコロニーをほんの少しかしか生じなかった。対照的に、反応３は、２倍量のｐＥＺＣ８４０２（図５８）およびＬｘＲ  Ｃｌｉｎａｓｅを用い、多数のコロニーを生じた。これらのコロニーをさらに、制限消化により分析して、予測産物の存在を確認した。反応４は、混合ＢｘＰ＋ＬｘＲ反応において、既知の量のａｔｔＬエントリークローンプラスミドを含んだ。しかし、反応４は、同じＤＮＡをＬｘＲ反応単独において使用した場合（反応６）に得られるコロニーの約１％しか生じなかった。この結果は、このＬｘＲ反応が、ＢｘＰ反応の成分によって阻害され得ることを示唆する。
【０３６４】
反応３の産物の制限エンドヌクレアーゼ分析によって、かなり大きい比率のコロニー（分析した３４個のうちの１４個）が、所望のｔｅｔrサブクローンであるｔｅｔｘ８４０２を含むことが明らかになった（図５９）。
【０３６５】
上記の結果は、最初にＢｘＰ組換え反応、続いてＬｘＲ組換え反応を−−同じチューブにて−−適切な緩衝液混合物、組換えタンパク質、およびＤＮＡを完了したＢｘＰ反応に単に添加することによって実施するという、可能性を確立する。この方法は、ａｔｔＢ含有ＰＣＲ産物を別個の発現クローンに転換するより速い方法として有用であることを証明し、これらを目的ベクターと組換える前にまず中間体ａｔｔＬ−ＰＣＲインサートサブクローンを単離する必要性を排除するはずである。これは、これらの反応の自動化適用に特に有益であることを証明し得る。
【０３６６】
この同じ１つのチューブでのアプローチによって、ａｔｔＢプラスミドクローンに含まれる核酸分子を、新規な機能性ベクターに迅速に移入することも可能である。上記の例におけるように、ＢｘＰ反応にて生成されるａｔｔＬサブクローンを、ＬｘＲ反応において種々の目的ベクターと直接組換え得る。ａｔｔＢ含有ＰＣＲ産物の代わりにａｔｔＢプラスミドを使用するためのさらなる唯一の要件は、使用される目的ベクターが、ａｔｔＢプラスミド自体およびａｔｔＰベクター上に存在するものと異なる選択マーカーを含まなければならないことである。
【０３６７】
１つのチューブでの反応のための２つの代替的プロトコルもまた、有用であること、および上記の条件よりもいくらか最適であることを証明する。
【０３６８】
代替法１：
反応緩衝液は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ  ＮａＣＩ、０．２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、２．５ｍＭスペルミジン、および２００μｇ／ｍｌのＢＳＡを含んだ。ＰＣＲ産物（１００ｎｇ）＋ａｔｔＰドナープラスミド（１００ｎｇ）＋ＧＡＴＥＷＡＹTM  ＢＰ  ＣｌｏｎａｓｅTM  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ＋目的ベクター（１００ｎｇ）を１６（または３）時間インキュベーションした後、２μｌのＧＡＴＥＷＡＹTM  ＬＲ  ＣｌｏｎａｓｅTM  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ  （１０μｌの反応混合物あたり）を添加し、そしてその混合物を２５℃でさらに６（または２）時間インキュベートした。次いで、停止溶液を上記のように添加し、そしてその混合物を上記のように３７℃でインキュベートし、そして１μｌを用いてエレクトロコンピテント宿主細胞に、エレクトロポレーションにより直接形質転換した。この一連の実験の結果は、より長いインキュベーション時間（ＢＰ反応については３時間に対して６時間、ＬＲ反応については２時間に対して６時間）が、短い方のインキュベーション時間に関して得られる約２倍の多さのコロニーを生じた。２つの独立した遺伝子を用いると、正確なクローニングパターンを有する１０個／１０個のコロニーが得られた。
【０３６９】
代替法２：
代替法１についての上記の反応条件下で、標準ＢＰ反応を、２５で２時間実施した。このＢＰ反応後、以下の成分を、反応混合物に総容量７μｌにて添加した：
２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
１００ｍＭ  ＮａＣｌ
５μｇ／ｍｌ  Ｘｉｓ−Ｈｉｓ６
１５％グリセロール
約１０００ｎｇの目的ベクター。
次いで、この反応混合物を、２５℃で２時間インキュベートし、そして２．５μｌの停止溶液（２μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＬを含む）を添加し、その混合物を、さらに１０分間３７℃でインキュベートした。次いで、化学的にコンピテントな宿主細胞を、２μｌの反応混合物で形質転換するか、またはエレクトロコンピテントな宿主細胞（例えば、ＥＭａｘ  ＤＨ１０Ｂ細胞；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を、２５〜４０μｌの細胞あたり２μｌの反応混合物でエレクトロポレーションした。形質転換後、混合物をＳＯＣで希釈し、３７℃でインキュベートし、そして上記のように、その目的ベクターおよびエントリークローン上の選択マーカーについて選択する培地上にプレーティングした（Ｂ×Ｐ反応産物）。代替法１について記載される結果と類似の結果が、これらの反応条件を用いて得られた−−正確に組換えられた反応産物を含むより高レベルのコロニーが、観察された。
【０３７０】
（実施例１７：組換えクローニング反応を介する、発現クローン（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｃｌｏｎｅ）へのＰＣＲ産物（または発現クローン）の１つのチューブでの移入の実証）
組換えクローニングによる、発現クローンへのＰＣＲ産物ＤＮＡ（または発現クローン）の１つのチューブでの移入もまた、実施例１６に記載される手順から改変された手順を使用して達成した。この手順は、以下の通りである：
・標準ＢＰ（Ｇａｔｅｗａｒｄ）反応（実施例９および１０）を、２０μｌの容量で、２５℃で１時間実施する。
【０３７１】
・インキュベーションが終了した後、その２０μｌの総容量から１０μｌアリコートを採取し、そして１μｌのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ（２ｍｇ／ｍｌ）を添加し、そして３７℃で１０分間インキュベートする。この第１のアリコートを、形質転換およびＢＰ反応分析のゲルアッセイのために使用し得る。カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢプレート上にＢＰ反応形質転換をプレーティングする。
【０３７２】
・以下の試薬を、ＢＰ反応の残りの１０μｌアリコートに添加する：
１μｌの０．７５Ｍ  ＮａＣｌ
２μｌの目的ベクター（１５０ｎｇ／μｌ）
４μｌのＬＲ  ＣｌｏｎａｓｅTM（融解および短い混合の後）
・すべての試薬をよく混合し、そして２５℃で３時間インキュベートする。インキュベーションの終わりに、この反応を１．７μｌのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ（２ｍｇ／ｍｌ）で停止し、そして３７℃で１０分間インキュベートする。
【０３７３】
・完了した反応物２μｌを１００μｌのコンピテント細胞に形質転換する。１００μｌおよび４００μｌを、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含むＬＢプレート上にプレーティングする。
【０３７４】
（注記）
・コンピテント細胞が１０8ＣＦＵ／μｇ未満であり、そして十分なコロニーを獲得することが問題である場合は、そのＢＰ反応物を６〜２０時間インキュベートすることによって、収量を数倍改善し得る。エレクトロポレーションもまた、化学的形質転換よりも良好なコロニー結果を生じ得る。
【０３７５】
・約５〜６ｋｂよりも大きいＰＣＲ産物は、このＢＰ反応において有意により低いクローニング効率を示す。この場合、本発明者らは、ＢＰ工程およびＬＲ工程の両方について、より長いインキュベーション時間を使用することを薦める。
【０３７６】
・インサート遺伝子をいくつかの目的ベクター中に同時に移すことを所望する場合は、各目的ベクターに添加するために１０μｌのアリコートを有するように、最初のＢＰ反応容量をスケールアップする。
【０３７７】
（実施例１８：ＧＡＴＥＷＡＹTM  ＣｌｏｎａｓｅTM酵素組成物の最適化）
ＩｎｔおよびＩＨＦ（ＢＰ反応について）を含む酵素組成物を、標準の機能的組換えクローニング反応（ＢＰ反応）を使用して、以下のプロトコルによって、ａｔｔｂ含有プラスミドとａｔｔＰ含有プラスミドとの間で最適化した。
【０３７８】
（材料および方法）
（基質）
ＡｔｔＰ−スーパーコイルドｐＤＯＮＲ２０１
ＡｔｔＢ−線状の約１Ｋｂの[3Ｈ]ＰＣＲ産物（ｐＥＺＣ７５０１から増幅した）
（タンパク質）
ＩｎｔＨ６−−Ｈｉｓ6−カルボキシタグ化λインテグラ−ゼ（Ｉｎｔｅｇｒａｓｅ）
ＩＨＦ−−組換え宿主因子（Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  Ｈｏｓｔ  Ｆａｃｔｏｒ）
（Ｃｌｏｎａｓｅ）
５０ｎｇ／μｌのＩｎｔＨ６および２０ｎｇ／μｌのＩＨＦを、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｉ（ｐＨ７．５）、２２ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、５ｍＭスペルミジン、および５０％グリセロール中に混合している。
【０３７９】
（反応混合物（総容量４０μｌ）
１０００ｎｇのＡｔｔＰプラスミド
６００ｎｇのＡｔｔＢ[3Ｈ]ＰＣＲ産物
８μｌのＣｌｏｎａｓｅ（４００ｎｇ  ＩｎｔＨ６、１６０ｎｇ  ＩＨＦ）が、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２２ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、５ｍＭスペルミジン、５ｍＭ  ＤＴＴ中にある。
【０３８０】
反応混合物を、２５℃で１時間インキュベートし、４μｌの２μｇ／μｌのプロテイナーゼＫを添加し、そして混合物を、さらに２０分間３７℃でインキュベートした。次いで、混合物を、等容量のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールで抽出した。次いでその水層を、収集し、そして０．１容量の３Ｍ酢酸ナトリウムおよび２容量の冷１００％エタノールを添加した。次いで、チューブを、微小遠心機にて、最大ＲＰＭで、室温で１０分間遠心分離した。エタノールをデカントし、そしてペレットを７０％エタノールでリンスし、そして上記のように再遠心分離した。エタノールをデカントし、そしてペレットを５〜１０分間風乾し、次いで、２０μｌの、３３ｍＭ  Ｔｒｉｓ−酢酸（ｐＨ７．８）、６６ｍＭ酢酸カリウム、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭ  ＤＴＴ、および１ｍＭ  ＡＴＰ中に溶解し、次いで、２単位のエキソヌクレアーゼＶ（例えば、Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓａｆｅ；ＥｐｉＣｅｎｔｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を添加し、そしてその混合物を、３７℃で３０分間インキュベートした。
【０３８１】
次いで、Ｗｈａｔｍａｎ  ＧＦ／Ｃフィルター上に３０μｌの反応混合物をスポットし、フィルターを１０％  ＴＣＡ＋１％  ＮａＰＰｉで１回、１０分間洗浄し、５％ＴＣＡで３回、各５分間洗浄し、そしてエタノールで２回、各５分間洗浄することによって、サンプルを、ＴＣＡ洗浄した。次いで、フィルターを加熱ランプ下で乾燥させ、シンチレーションバイアル中に移し、そしてβ液体シンチレーション計数管（ＬＳＣ）にて計数した。
【０３８２】
このアッセイの背後にある原理は、エキソヌクレアーゼＶ切断の後、二本鎖環状ＤＮＡのみが、酸不溶性形態で残存することである。遊離末端を有するすべてのＤＮＡ基質および産物が切断されて酸可溶性形態になり、フィルター上に残存しない。従って、分子内組み込みおよび分子間組み込みの両方が完了した後に環状形態である、3Ｈ標識ａｔｔＢ線状ＤＮＡのみが、切断に対して抵抗性であり、そして酸不溶性産物として回収される。従って、このＣｌｏｎａｓｅ組成物における最適な酵素処方物および緩衝液処方物は、最高レベルの環状化した3Ｈ標識ａｔｔＢ含有配列を、ＬＳＣ中の最高のｃｐｍによって測定した場合に生じた処方物である。このアッセイは、ＧＡＴＥＷＡＹTM  ＢＰ  ＣｌｏｎａｓｅTM  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ組成物（Ｉｎｔ＋ＩＨＦ）の最適化のために設計したが、同じ型のアッセイを、ＧＡＴＥＷＡＹTM  ＬＲ  ＣｌｏｎａｓｅTM  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ組成物（Ｉｎｔ＋ＩＨＦ＋Ｘｉｓ）を最適にするために実施し得、ただし、その反応混合物は、１０００ｎｇのＡｔｔＲ（ＡｔｔＰの代わり）および６００ｎｇのＡｔｔＬ（ＡｔｔＢの代わり）、および４０ｎｇのＨｉｓ6−カルボキシタグ化Ｘｉｓ（ＸｉｓＨ６）を、ＩｎｔＨ６およびＩＨＦに加えて含む。
【０３８３】
（実施例１９：エントリーベクターおよび目的ベクターの機能性の試験）
本発明の特定のベクターの機能性の評価の一環として、そのベクターが組換わる能力を機能的に試験することが重要である。この評価は、組換えクローニング反応を（図２、４、および５Ａおよび５Ｂに図式化され、そして本明細書中に記載され、そして共有に係る米国特許出願番号０８／４８６，１３９（１９９５年６月７日出願）、同０８／６６３，００２（１９９６年６月７日出願）（現在米国特許第５，８８８，７３２号）、同０９／００５，４７６（１９９８年１月１２日出願）、および同０９／１７７，３８７（１９９８年１０月２３日出願）（これらのすべての開示は、本明細書中にその全体が参考として援用される）に記載されるように）実施し、Ｅ．ｃｏｌｉを形質転換し、そしてコロニー形成単位をスコア化することによって、実行し得る。しかし、代替的アッセイもまた、アガロースゲル電気泳動による所定のエントリーベクターまたは目的ベクターの機能性のより迅速でより簡単な評価を可能にするために実施し得る。以下が、このようなインビトロアッセイの説明である。
【０３８４】
（材料および方法：）
プラスミドテンプレートｐＥＺＣ１３０１（図８４）およびｐＥＺＣ１３１３（図８５）（各々、単一の野生型ａｔｔ部位を含む）を、それぞれ、ａｔｔＬまたはａｔｔＲ部位を含むＰＣＲ産物の生成のために使用した。プラスミドテンプレートを、ＡｌｗＮＩを用いて直鎖状にし、フェノール抽出し、エタノール沈殿して、１ｎｇ／μｌの濃度までＴＥ中に溶解した。
【０３８５】
【表７】
0004580106.tif 000030
ＰＣＲプライマーを、５００ｐｍｏｌ／μｌの濃度までＴＥ中に溶解した。プライマー混合物を調製した。プライマー混合物を調製し、これは、ａｔｔＬ１＋ａｔｔＬｒｉｇｈｔプライマー、ａｔｔＬ２＋ａｔｔＬｒｉｇｈｔプライマー、ａｔｔＲ１＋ａｔｔＲｒｉｇｈｔプライマー、およびａｔｔＲ２＋ａｔｔＲｒｉｇｈｔプライマーからなり、各混合物は、２０ｐｍｏｌ／μｌの各プライマーを含んでいた。
【０３８６】
（ＰＣＲ反応：）
１μｌのプラスミドテンプレート（１ｎｇ）
１μｌのプライマー対（各々、２０ピコモル）
３μｌのＨ２Ｏ
４５μｌのＰｌａｔｉｎｕｍ  ＰＣＲ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）。
【０３８７】
（サイクリング条件（ＭＪサーモサイクラーで行った）：）
９５℃／２分
９４℃／３０秒
５８℃／３０秒および７２℃／１．５分間の２５サイクル
７２℃／５分
５℃／維持。
【０３８８】
得られたａｔｔＬ  ＰＣＲ産物は１．５ｋｂであり、そして得られたａｔｔＲ  ＰＣＲ産物は、１．０ｋｂであった。
【０３８９】
ＰＣＲ反応物を、１５０μｌのＨ2Ｏおよび１００μｌの３×ＰＥＧ／ＭｇＣｌ2溶液を添加することによりＰＥＧ／ＭｇＣｌ2沈澱し、次いで、遠心分離した。このＰＣＲ産物を５０μｌのＴＥ中に溶解した。ＰＣＲ産物の定量を、これを１μｌ、ゲル電気泳動で行い、５０〜１００ｎｇ／μｌであると評価した。
【０３９０】
ａｔｔＬまたはａｔｔＲ部位を含むＰＣＲ産物の、ＧＡＴＥＷＡＹTMプラスミドとの組換え反応を以下の通りに行った：
８μｌのＨ２Ｏ
２μｌのａｔｔＬまたはａｔｔＲのＰＣＲ産物（１００〜２００ｎｇ）
２μｌのＧＡＴＥＷＡＹTMプラスミド（１００ｎｇ）
４μｌの５×目的（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ）緩衝液
４μｌのＧＡＴＥＷＡＹTM  ＬＲ  ＣｌｏｎａｓｅTM  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ  総容量２０μｌ（反応を、構成成分の容量を上記で示した量の約１／４に調節することにより総容量５μｌにスケールダウンし得るが、化学量論性は同じに維持する）。
【０３９１】
Ｃｌｏｎａｓｅ反応物を２５℃で２時間インキュベートした。２μｌのプロテイナーゼＫ（２ｍｇ／ｍｌ）を添加して、反応を停止させる。次いで、１０μｌを１％アガロースゲル上で泳動する。陽性コントロール反応を、ａｔｔＬ１  ＰＣＲ産物（１．０ｋｂ）とａｔｔＲ１  ＰＣＲ産物（１．５ｋｂ）とを反応させ、そしてａｔｔＬ２  ＰＣＲ産物とａｔｔＲ２産物とを同様に反応させることにより行って、より大きな（２．５ｋｂ）組換え反応産物の形成を観察した。陰性コントロールを、ａｔｔＬ１  ＰＣＲ産物とａｔｔＲ２  ＰＣＲ産物とを反応させ、そしてその逆もまた同様に反応させるか、またはａｔｔＬ  ＰＣＲ産物とａｔｔＬプラスミドとの反応になどより行った。
【０３９２】
代替的アッセイにおいて、ａｔｔＢ  エントリーベクターを試験するために、単一のａｔｔＰ部位を含有するプラスミドを用いた。単一のａｔｔ部位を含有するプラスミドをまた、全てのエントリーおよび目的（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ）ベクター（すなわち、それらは、ａｔｔＬ、ａｔｔＲ、ａｔｔＢおよびａｔｔＰを含む）を試験するために、一般に、組換え基質として使用し得た。これは、ＰＣＲ反応を行う必要性を排除する。
【０３９３】
（結果：）
目的（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ）およびエントリー（Ｅｎｔｒｙ）プラスミドは、適切なａｔｔ含有ＰＣＲ産物と反応した場合、直鎖状の組換え分子を形成し、この組換え分子は、ａｔｔＬのＰＣＲ産物も、ａｔｔＲのＰＣＲ産物も含まないコントロール反応物と比較した場合に、アガロースゲル上で容易に視覚化され得た。従って、本発明に従って構築された目的（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ）およびエントリーベクターの機能性は、図２、４、ならびに５Ａおよび５Ｂに記載されるように、目的（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ）またはエントリーいずれかの組換え反応を行うことによって決定されうるか、または本実施例に記載の直鎖化アッセイを行うことによりより迅速に決定されうる。
【０３９４】
（実施例２０：Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  アダプター−プライマーを用いたＰＣＲクローニング）
本明細書中に記載のように、ＧＡＴＥＷＡＹTM  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を用いたＰＣＲ産物のクローニングは、ＰＣＲ反応において使用される遺伝子特異的プライマーの末端にａｔｔＢ部位（ａｔｔＢ１およびａｔｔＢ２）の付加を必要とする。先の実施例において記載されたプロトコルは、ユーザーが、遺伝子特異的プライマーに２９ｂｐ（ａｔｔＢ部位を含有する２５ｂｐおよび４つのＧ残基）を付加することを示唆する。アダプターに特定の重複を含むより短い遺伝子特異的プライマーを組み合わせてＵｎｉｖｅｒｓａｌ  ａｔｔＢアダプター−プライマーを用い、ａｔｔＢ含有ＰＣＲ産物を作製することは、ＧＡＴＥＷＡＹTM  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍの高容量ユーザーに有利である。以下の実験は、６ｂｐ〜１８ｂｐの種々の長さの重複を含むＵｎｉｖｅｒｓａｌ  ａｔｔＢアダプター−プライマーおよび遺伝子特異的プライマーを用いて、このストラテジーの有用性を実証する。この結果により、１０ｂｐ〜１８ｂｐの重複を有する遺伝子特異的プライマーが、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ａｔｔＢアダプター−プライマーとともにＰＣＲ増幅に首尾よく使用されて、全長ＰＣＲ産物が作製されうることを実証する。次いで、これらのＰＣＲ産物を、ＧＡＴＥＷＡＹTM  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて特定の配向において高い忠実度で首尾よくクローニングし得る。
【０３９５】
（材料および方法：）
Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ａｔｔＢアダプター−プライマーが、ＰＣＲ反応物中に部分的ａｔｔＢ部位を含む遺伝子特異的プライマーとともに使用されて、全長ＰＣＲ産物を生成しうることを実証するために、ヒトヘモグロビンｃＤＮＡの小さな２５６ｂｐ領域を標的として選択し、その結果、中間サイズの産物は、アガロースゲル電気泳動により全長産物とは区別し得る。
【０３９６】
以下のオリゴヌクレオチドを使用した：
【０３９７】
【化２５】
0004580106.tif 000031
これらの実験の目的は、単純かつ効率的なＵｎｉｖｅｒｓａｌアダプターＰＣＲ方法を開発して、ＧＡＴＥＷＡＹTM  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍにおける使用のために適切な、ａｔｔＢ含有ＰＣＲ産物を生成することであった。反応混合物およびサーモサイクリング条件は、ＵｎｉｖｅｒｓａｌアダプターＰＣＲ方法が、いずれのＰＣＲ産物クローニング適用に対しても慣用的に適用可能であり得るように単純かつ効率的であるはずである。
【０３９８】
１８ｂｐおよび１５ｂｐ重複を含有する遺伝子特異的プライマーをＵｎｉｖｅｒｓａｌ  ａｔｔＢプライマーとともに使用して、優先的に全長ＰＣＲ産物を首尾よく増幅し得るＰＣＲ反応条件を最初に見いだした。これらの条件は以下に概略を述べる：
１０ピコモルの遺伝子特異的プライマー
１０ピコモルのＵｎｉｖｅｒｓａｌ  ａｔｔＢアダプター−プライマー
１ｎｇの、ヒトヘモグロビンｃＤＮＡ含有プラスミド
１００ｎｇのヒト白血球ｃＤＮＡライブラリーＤＮＡ
５μｌの１０×ＰＬＡＴＩＮＵＭ  Ｔａｑ  ＨｉＦｉ（登録商標）反応緩衝液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）
２μｌの５０ｍＭ  ＭｇＳＯ4
１μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ
０．２μｌのＰＬＡＴＩＮＵＭ  Ｔａｑ  ＨｉＦｉ（登録商標）（１．０ユニット）
Ｈ2Ｏで総反応容量を５０μｌにする。
【０３９９】
（サイクリング条件：）
【０４００】
【表８】
0004580106.tif 000032
この方法の効率を評価するために、５０μｌのＰＣＲ反応物のうち２μｌ（１／２５）を３％アガロースゲル−１０００ゲルで電気泳動した。１２ｂｐ以下の重複では、１つＵｎｉｖｅｒｓａｌ  ａｔｔＢアダプターを含むか、またはＵｎｉｖｅｒｓａｌ  ａｔｔＢアダプターを含まない、より小さな中間産物がこの反応で目立った。ＰＣＲ反応条件のさらなる最適化は、遺伝子特異的プライマーおよびＵｎｉｖｅｒｓａｌ  ａｔｔＢアダプター−プライマーの量を滴定することによって得た。ＰＣＲ反応系を、添加したプライマーの量が以下であったことを除いて、以下に概説するように設定した：
０、１、３または１０ピコモルの遺伝子特異的プライマー
０、１０、３０または１００ピコモルのアダプター−プライマー。
【０４０１】
（サイクリング条件：）
【０４０２】
【表９】
0004580106.tif 000033
制限量の遺伝子特異的プライマー（３ピコモル）および過剰なアダプター−プライマー（３０ピコモル）の使用により、より小さな中間産物の量が減少した。これらの反応条件を使用して、目立った全長ＰＣＲ産物を得るために必要な重複は、１２ｂｐに減少した。遺伝子特異的プライマーおよびアダプタープライマーの量を、以下のＰＣＲ反応においてさらに最適化した：
０、１、２または３ピコモルの遺伝子特異的プライマー
０、３０、４０または５０ピコモルのアダプター−プライマー。
【０４０３】
（サイクリング条件：）
【０４０４】
【表１０】
0004580106.tif 000034
２ピコモルの遺伝子特異的プライマーおよび４０ピコモルのアダプター−プライマーの使用により、中間産物の量はさらに減少し、そして１１ｂｐの重複を含有する遺伝子特異的プライマーを有する全長ＰＣＲ産物が目立って生じた。ＰＣＲ反応の成功を、アダプターなしのコントロールを行うことにより任意のＰＣＲ増幅物において評価しうる。制限量の遺伝子特異的プライマーの使用により、１／２５〜１／１０のＰＣＲ反応物が標準的なアガロースゲル上で電気泳動した場合に、わずかに見えるバンドまたはほとんど見えないバンドが得られるはずである。Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ａｔｔＢアダプター−プライマーの添加は、はるかに多くの全収量の産物を伴う強いＰＣＲ反応産物を生じるはずである。
【０４０５】
１８ｂｐ、１５ｂｐ、１２ｂｐ、１１ｂｐおよび１０ｂｐ重複の遺伝子特異的プライマーを使用した反応からのＰＣＲ産物は、ＣＯＮＣＥＲＴ（登録商標）Ｒａｐｉｄ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して精製した（５００ｂｐより大きなＰＣＲ産物をＰＥＧ沈澱しうる）。精製したＰＣＲ産物を、引き続き、ＧＡＴＥＷＡＹTM  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を用いてａｔｔＰ含有プラスミドベクターにクローニングし、そしてＥ．ｃｏｌｉに形質転換した。コロニーを選択し、そして適切な抗生物質培地上で計数し、そして正しい挿入物および配向についてＰＣＲによりスクリーニングした。
【０４０６】
ヒトβグロビン（Ｈｇｂ）遺伝子の一部のプラスミドクローンのａｔｔＢアダプターＰＣＲからの未処理の（ｒａｗ）ＰＣＲ産物（未精製）も、ＧＡＴＥＷＡＹTM  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ反応において使用した。完全ａｔｔＢ  Ｂ１／Ｂ２−Ｈｇｂ、１２Ｂ１／Ｂ２、１１Ｂ１／Ｂ２および１０Ｂ１／Ｂ２のａｔｔＢ重複Ｈｇｂプライマーで生成したＰＣＲ産物を、ＧＡＴＥＷＡＹTM  ｐＥＮＴＲ２１  ａｔｔＰベクター（図４９）に首尾よくクローニングした。各々から２４コロニー（合計２４×４＝９６）を試験し、そして各々をＰＣＲにより正確な挿入物を含むことを確認した。ｃｆｕ／ｍｌで表したクローニング効率を以下に示す：
【０４０７】
【表１１】
0004580106.tif 000035
興味深いことに、重複ＰＣＲ産物は、完全ａｔｔＢ  ＰＣＲ産物より高効率でクローニングされた。おそらく、そしてアガロースゲル上で可視化することにより確認されるように、アダプターＰＣＲ産物は、完全ａｔｔＢＰＣＲ産物よりわずかに明瞭であった。コロニー生成量（ｏｕｔｐｕｔ）の差異はまた、インタクトなａｔｔＢ部位を有するＰＣＲ産物分子の割合を反映しうる。
【０４０８】
ａｔｔＢアダプターＰＣＲ方法を使用すると、１２ｂｐ  ａｔｔＢ重複を有するＰＣＲプライマーを使用して、白血球ｃＤＮＡライブラリーおよびＨｅＬａの総ＲＮＡから調製した第１鎖ｃＤＮＡから、異なるサイズのｃＤＮＡを増幅した（１〜４ｋｂの範囲）。４つのｃＤＮＡのうち３つをこの方法により増幅し得たが、非特異的増幅産物もまた観察された（いくつかの条件下で遺伝子特異的増幅を妨害した）。この非特異的産物は、ａｔｔＢアダプター−プライマー単独を含有するが、いずれの遺伝子特異的重複プライマーも存在しない反応系において増幅した。この非特異的増幅産物は、ＰＣＲ反応のストリンジェンシーを増大させ、そしてａｔｔＢアダプターＰＣＲプライマー濃度を低下させることにより減少した。
【０４０９】
これらの結果は、この実施例に記載されるアダプター−プライマーＰＣＲアプローチがクローニングした遺伝子について十分に機能することを示す。これらの結果はまた、ＧＡＴＥＷＡＹTM  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍと適合するＰＣＲ産物を増幅するために単純かつ効率的な方法の開発を実証した。ＧＡＴＥＷＡＹTM  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍは、部分的にＵｎｉｖｅｒｓａｌ  ａｔｔＢアダプター−プライマーと重複するより短い遺伝子特異的プライマーの使用を可能にする。慣用的ＰＣＲクローニング適用において、１２ｂｐ重複の使用が推奨されている。そのため、この実施例に記載の方法は、１７残基以上までに遺伝子特異的プライマーの長さを減少し、結果としてＧＡＴＥＷＡＹTM  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍの高容量ユーザーに対するオリゴヌクレオチド費用のかなりの節減を生じる。さらに、この実施例に記載の方法およびアッセイを使用すると、当業者は、他の組換え部位に基づくまたはこれを含む類似のプライマー−アダプターまたはそのフラグメント（例えば、ａｔｔＬ、ａｔｔＲ、ａｔｔＰ、ｌｏｘ、ＦＲＴなど）を、慣用的な実験法のみを用いて設計および使用しうる。
【０４１０】
（実施例２１：バクテリオファージλ  ａｔｔＬおよびａｔｔＲ部位の変異分析：部位特異的組換えにおけるａｔｔ部位特異性の決定因子）
ａｔｔ部位特異性の決定因子を調査するために、バクテリオファージλ  ａｔｔＬおよびａｔｔＲ部位を体系的に変異誘発した。本明細書中に示されるように、特異性の決定因子を、１５ｂｐコア領域（ＧＣＴＴＴＴＴＴＡＴＡＣＴＡＡ）内の７ｂｐの重複領域（ＴＴＴＡＴＡＣ、これは、インテグラーゼタンパク質の切断部位により規定され、そして鎖交換が生じる領域である）に対して以前に位置づけた。この１５ｂｐコア領域は、４つのλａｔｔ部位全て（すなわち、ａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬおよびａｔｔＲ）で同一である。しかし、このコア領域は、これまで体系的に変異誘発されておらず、そして変異がａｔｔ部位特異性における独特な変化を生じることを正確に規定するとは考察されてこなかった。
【０４１１】
従って、部位特異性に対するａｔｔ配列の効果を試験するために、変異ａｔｔＬおよびａｔｔＲ部位をＰＣＲにより生成し、そしてインビトロ部位特異的組換えアッセイにおいて試験した。このようにして、コアａｔｔ部位の７ｂｐ重複領域内の全ての可能な単一塩基対変化を生成し、１５ｂｐコアａｔｔ部位ではない７ｂｐ重複の外側で５つのさらなる変化もまた生成した。各ａｔｔＬ  ＰＣＲ基質を、ａｔｔＲ  ＰＣＲ基質の各々とともに、インビトロ組換えアッセイにおいて試験した。
【０４１２】
（方法）
変異体ａｔｔＬ部位およびａｔｔＲ部位の組換えの効率および特異性の両方を試験するために、単純なインビトロの部位特異的組換えアッセイを開発した。ａｔｔＬおよびａｔｔＲのコア領域は、これらの部位の端部近くにあるので、所望のヌクレオチド塩基変化をＰＣＲプライマー内に取り込み、そして変異体ａｔｔＬおよびａｔｔＲ部位を含む一連のＰＣＲ産物を生成することが可能であった。ａｔｔＬおよびａｔｔＲ部位を含むＰＣＲ産物を、ＧＡＴＥＷＡＹTM  ＬＲ  ＣｌｏｎａｓｅTM  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）とのインビトロ反応における基質として使用した。１．５ｋｂのａｔｔＬ  ＰＣＲ産物と、１．０ｋｂのａｔｔＲ  ＰＣＴ産物との間の組換えは、２．５ｋｂの組換え分子を生じ、これを、アガロースゲル電気泳動およびエチジウムブロミド染色を使用して、モニターした。
【０４１３】
プラスミドテンプレートｐＥＺＣ１３０１（図８４）およびｐＥＺＣ１３１３（図８５）（各々が単一の野生型ａｔｔＬおよびａｔｔＲ部位をそれぞれ含む）を、組換え基質の生成のために使用した。以下の列挙は、Ｌ×Ｒ  Ｃｌｏｎａｓｅ反応における基質として使用したａｔｔＬ  ＰＣＲ産物を生成するためのＰＣＲ反応において使用したプライマーを示す（大文字は、野生型配列からの変化を示し、そして下線は、１５ｂｐコアａｔｔ部位内の７ｂｐオーバーラップ領域を表す；類似のセットのＰＣＲプライマーを使用して、マッチング変位を含むａｔｔＲ  ＰＣＲ産物を調製した）：
ＧＡＴＥＷＡＹTM部位（注：ＧＡＴＥＷＡＹTMプラスミド内のａｔｔＬ２配列は「ａｃｃｃａ」で開始し、一方でこの例におけるａｔｔＬ部位は、「ａｇｃｃｔ」で開始し、コア領域の外側の野生型ａｔｔＬを反映する。）：
【０４１４】
【化２６】
0004580106.tif 000036
0004580106.tif 000037
0004580106.tif 000038
注：最初の９の塩基がｇｇｇｇ  ａｇｃｃａであるさらなるベクター（すなわち、１５ｂｐコア領域にすぐ先行する位置のチミンをアデニンで置換する）（これは、上で概説した単一の塩基対の置換（または欠失）を含んでも含まなくてもよく、またこれらの実験において使用され得る）。
【０４１５】
ａｔｔＬ含有ＰＣＲ産物およびａｔｔＲ含有ＰＣＲ産物の組換え反応を、以下のように実施した：
【０４１６】
【表１２】
0004580106.tif 000039
Ｃｌｏｎａｓｅ反応物を、２５℃で２時間インキュベートした。
２μｌの１０×Ｃｌｏｎａｓｅ停止溶液（プロテイナーゼＫ、２ｍｇ／ｍｌ）を添加して、この反応を停止した。
１０μｌを１％アガロースゲル上で泳動した。
【０４１７】
（結果）
各ａｔｔＬ  ＰＣＲ基質を、ａｔｔＲ  ＰＣＲ基質の各々を用いて、インビトロ組換えアッセイで試験した。７ｂｐオーバーラップの最初の３つの位置（ＴＴＴＡＴＡＣ）での変化は、組換えの特異性を強力に変化させた。これらの変異ａｔｔ部位の各々は、野生型と同程度に、その同種パートナー変異体のみで組換えられた；これらは他のいかなるａｔｔ部位変異によっても検出可能には組換えられなかった。対照的に、最後の４つの位置（ＴＴＴＡＴＡＣ）の変化は、部分的にのみ特異性を変化させた；これらの変異体は、その同種の変異ａｔｔ部位ならびに野生型ａｔｔ部位で組換えられ、そして７ｂｐオーバーラップの最初の３つの位置に変異を有する部位以外の他の全ての変異ａｔｔ部位で部分的に組換えられた。７ｂｐオーバーラップの外側での変化は、組換えの特異性に影響を与えず、いくらかは組換えの効率に影響を与えることが見出された。
【０４１８】
これらの結果に基づいて、ａｔｔ部位特異性に関する以下の規則が決定された：
・７ｂｐオーバーラップにおける変化のみが、特異性に影響を与える。
・最初の３つの位置における変化が、特異性に強力に影響を与える。
・最後の４つの位置における変化が、特異性に弱く影響を与える。
【０４１９】
組換え反応の全体の効率に影響を与えた変異もまた、本方法によって評価された。これらの実験において、ａｔｔＬＴ１Ａ基質およびａｔｔＬＣ７Ｔ基質でわずかに増加した（２倍未満）組換え効率が、これらの基質がその同種ａｔｔＲパートナーと反応した場合に、観察された。ａｔｔＬＡ６Ｇ、ａｔｔＬ１４およびａｔｔＬ１５を含む、組換え効率（約２〜３倍）を減少させる変異もまた観察された。これらの変異は、恐らく、コアａｔｔ部位で結合するＩｎｔタンパク質に影響を与える変化を反映する。
【０４２０】
これらの実験の結果は、７ｂｐの最初の３つの位置（ＴＴＴＡＴＡＣ）における変化が、組換えの特異性を強力に変化させた（すなわち、１つ以上の変異を最初の３つのチミジンに有するａｔｔ配列は、その同種パートナーとのみ組換わり、そして他のいかなるａｔｔ部位変異とも交差反応しない）ことを実証する。対照的に、最後の４つの位置（ＴＴＴＡＴＡＣ）における変異は、部分的にのみ特異性を変化させた（すなわち、１つ以上の変異を最後の４つの塩基位置に有するａｔｔ配列は、７ｂｐオーバーラップの最初の３つの位置の１つ以上に変異を有する部位以外の、野生型ａｔｔ部位および全ての他の変異ａｔｔ部位と部分的に交差反応する）。７ｂｐオーバーラップの外側の変異は、組換えの特異性に影響を与えないことがわかり、いくらかは組換えの効率に影響を与える（すなわち、組換えの効率の減少を引き起こす）ことがわかった。
【０４２１】
（実施例２２：  ＧＡＴＥＷＡＹTM  クローニング反応のクローニング効率を増加させるａｔｔ部位変異の発見）
ａｔｔ部位特異性の決定を理解するために設計される実験において、ａｔｔＬのコア領域における点変異を作製した。次いで、これらの変異ａｔｔＬ配列を含む核酸分子を、ＬＲ反応において、同種ａｔｔＲ部位（すなわち、ａｔｔＬ部位の変異に対応する変異を含むａｔｔＲ部位）を含む核酸分子と反応させ、そして組換え効率を上記のように決定した。ａｔｔ部位のコア領域に位置するいくつかの変異を、組換え反応の効率をわずかに増加した（２倍未満）かまたは減少した（２倍〜４倍の間）のいずれかと記載した（表３）。
【０４２２】
【表１３】
0004580106.tif 000040
これらの変異は、恐らく、インテグラーゼタンパク質のコアａｔｔ部位を結合するための相対的親和性を、それぞれ増加または減少させるいずれかの変化を反映することもまた、注目された。インテグラーゼコア結合部位のコンセンサス配列（ＣＡＡＣＴＴＮＮＴ）は、文献で推定されているが、直接的には試験されていない（例えば、ＲｏｓｓおよびＬａｎｄｙ、Ｃｅｌｌ  ３３：２６１−２７２（１９８３）を参照のこと）。このコンセンサスコアインテグラーゼ結合配列は、ａｔｔＰおよびａｔｔＢに見出される４つのコアａｔｔ部位の各々の配列、ならびにコア配列に類似し、そしてインビトロでインテグラーゼが結合することが示された５つの非ａｔｔ部位の配列を比較することによって、確立された。これらの実験は、インテグラーゼのコアａｔｔ部位への結合を増加させる、従ってＧＡＴＥＷＡＹTMクローニング反応の効率を増加させる、多くのａｔｔ部位変異が同定され得ることを示唆する。
【０４２３】
（実施例２３：  組換え効率に対するコア領域変異の効果）
ａｔｔ部位コア領域における変異のクローニング効率を直接比較するために、単一の塩基の変化を、ａｔｔＢ１−ＴＥＴ−ａｔｔＢ２  ＰＣＲ産物のａｔｔＢ２部位に作製した。次いで、これらの変異ａｔｔＢ２配列を含む核酸分子を、ＢＰ反応において、非同種ａｔｔＰ部位（すなわち、野生型ａｔｔＰ２）を含む核酸分子と反応させ、そして組換え効率を上記のように決定した。標準的なａｔｔＢ１−ＴＥＴ−ａｔｔＢ２  ＰＣＲ産物と比較した、これらの変異ａｔｔＢ２含有ＰＣＲ産物のクローニング効率を、表４に示す。
【０４２４】
【表１４】
0004580106.tif 000041
上記で注目したように、ａｔｔＢ２．２部位における単一の塩基の変化は、ａｔｔＢ１−ＴＥＴ−ａｔｔＢ２  ＰＣＲ産物と比較して、ａｔｔＢ１−ＴＥＴ−ａｔｔＢ２．２  ＰＣＲ産物のクローニング効率を１３１％に増加させた。興味深いことに、この変異は、ａｔｔＢ２のインテグラーゼコア結合部位を、提案されるコンセンサス配列にさらに近くマッチする配列に変化させる。
【０４２５】
さらなる実験を実施して、ａｔｔＢ１−ＴＥＴ−ａｔｔＢ２  ＰＣＲ産物のクローニング効率を、インテグラーゼコア結合部位の提案されるコンセンサス配列（実施例２２を参照のこと）を含むａｔｔＢ部位を含むＰＣＲ産物と、直接比較した。以下のａｔｔＢ部位を使用して、ａｔｔＢ−ＴＥＴ  ＰＣＲ産物を増幅した：
【０４２６】
【化２７】
0004580106.tif 000042
ＢＰ反応を、３００ｎｇ（１００ｆｍｏｌｅ）のｐＤＯＮＲ２０１（図４９Ａ）と、２０μｌ容量の８０ｎｇ（８０ｆｍｏｌｅ）のａｔｔＢ−ＴＥＴ  ＰＣＲ産物との間で、２５℃で１．５時間のインキュベーションによって実施し、ｐＥＮＴＲ２０１−ＴＥＴ  エントリークローンを作製した。上記ａｔｔＢ部位の、ＢＰ反応におけるクローニング効率の比較を、表５に示す。
【０４２７】
【表１５】
0004580106.tif 000043
これらの結果は、インテグラーゼコア結合部位に関して提案されるコンセンサス配列と完全にマッチする配列を含むａｔｔＢ  ＰＣＲ産物が、標準的なＧａｔｅｗａｙ  ａｔｔＢ１およびａｔｔＢ２  ＰＣＲ産物より４倍高い効率で、エントリークローンを産生し得ることを実証する。
【０４２８】
次いで、上記で産生されたエントリークローンを、ＬＲ反応（２０μｌ容量のそれぞれのｐＥＮＴＲ２０１−ＴＥＴ  エントリークローンの５０ｎｇ（７７ｆｍｏｌｅ）と混合した３００ｎｇ（６４ｆｍｏｌｅ）ｐＤＥＳＴ２０；２５℃で１時間インキュベートした）を介してｐＤＥＳＴ２０（図４０Ａ）へと変換した。これらの反応に関するクローニングの効率を、表６で比較する。
【０４２９】
【表１６】
0004580106.tif 000044
これらの結果は、ａｔｔＢ１．６およびａｔｔＢ２．１０中に導入された、遺伝子をエントリークローン（ｅｎｔｒｙ  ｃｌｏｎｅ）に移入させる変異が、ＬＲ反応の効率をわずかに上昇させることを実証する。従って、本発明は、組換え効率を上昇させるａｔｔＢ部位での変異のみならず、ＢＰ反応によって作製されるａｔｔＬ部位を生じる対応する変異をもまた包含する。
【０４３０】
一定範囲のＰＣＲ産物量にわたるａｔｔＢ１．６−ＴＥＴ−ａｔｔＢ２．１０  ＰＣＲ産物のクローニング効率の上昇を試験するために、上記の実験と類似の実験を実施した。この実験では、ａｔｔＢ  ＰＣＲ産物の量を反応混合物中に滴定した。この結果を表７に示す。
【０４３１】
【表１７】
0004580106.tif 000045
これらの結果は、２０ｎｇの量において、標準のａｔｔＢ１−ＴＥＴ−ａｔｔＢ２  ＰＣＲ産物と比較してａｔｔＢ１．６−ＴＥＴ−ａｔｔＢ２．１０  ＰＣＲ産物で、６倍程度高いクローニング効率における上昇が達成されることを実証する。
【０４３２】
（実施例２４：最適組換え効率のためのａｔｔＢ配列必要要件の決定）
ａｔｔＢについての配列必要要件を試験するため、そしてどのａｔｔＢ部位が縮重ａｔｔＢ部位の集団の中から最高に効率良くクローン化するかを決定するために、一連の実験を実施した。ａｔｔＢ部位の中のＢ−アームにおいて５塩基の縮重性を含んだ縮重ＰＣＲプライマーを設計した。従って、これらの縮重配列は、ＢＰ反応において遺伝子をエントリークローンに移入し、引き続いてＬＲ反応においてこの遺伝子を発現クローンに移入する。従って、縮重ａｔｔＢおよびａｔｔＬ部位の集団は、かなり多数のサイクルでａｔｔＢからａｔｔＬに行きつ戻りつしつつ循環され得る。各移入工程で反応条件を変更することにより（例えば、反応時間を減少させることにより、および／またはＤＮＡ濃度を減少させることにより）、反応は、各サイクルでますますよりストリンジェントになされ得、従って、より効率的に反応するａｔｔＢおよびａｔｔＬ部位の集団に富化され得る。
【０４３３】
以下の縮重ＰＣＲプライマーを使用して、ｐＵＣ１８からｌａｃＺαフラグメントを含んだ５００ｂｐのフラグメントを増幅した（各プライマーのａｔｔＢ部分のみを示す）：
【０４３４】
【化２８】
0004580106.tif 000046
縮重ａｔｔ部位の開始集団のサイズは、４5すなわち１０２４分子である。２つのＢＰ反応および２つのＬＲ反応を通して、４つの異なる集団を移入した。各反応の形質転換後、適切な選択抗生物質を含有する液体培地において増殖することによって、形質転換体の集団を増幅した。このクローンの集団から、アルカリ溶解ミニプレップ法によってＤＮＡを調製し、そして次の反応に用いた。ＢＰおよびＬＲクローニング反応の結果を以下に示す。
【０４３５】
【表１８】
0004580106.tif 000047
これらの結果は、各々の連続した移入で、ａｔｔ部位の集団全体のクローニング効率が上昇し、そしてａｔｔＢ部位の規定において相当量の可撓性が存在することを実証する。特定のクローンを、上記反応から単離し得、組換え効率について個々に試験し得、そして配列決定し得る。次いで、このような新たな特異性を、既知の例と比較して、新たな組換え特異性を有する新たな配列の設計を導き得る。さらに、本明細書中に記載される富化およびスクリーニングのプロトコールに基づいて、当業者は、このような配列を含む核酸分子を使用する組換え反応において特異性の上昇を生じさせる他の組換え部位（例えば、他のａｔｔ部位、ｌｏｘ、ＦＲＴなど）における配列を容易に同定し得、そしてそれを使用し得る。
【０４３６】
（実施例２５：ａｔｔ部位ＰＣＲアダプタープライマーの設計）
５’末端に１２ｂｐのａｔｔＢ１およびａｔｔＢ２を有する遺伝子特異的プライマーを設計するために、さらなる研究を実施した。ａｔｔを含むプライマーについての最適プライマー設計は、任意のＰＣＲプライマーについての最適プライマー設計と同じである：プライマーの遺伝子特異的部分は、理想的には、５０ｍＭ塩で５０℃より高いＴｍを有するべきである（Ｔｍの計算は、式５９．９＋４１（％ＧＣ）−６７５／ｎに基づく）。
プライマー：
【０４３７】
【化２９】
0004580106.tif 000048
（プロトコール）
（１）２００ｎｇのｃＤＮＡライブラリーまたは１ｎｇのプラスミドクローンＤＮＡ（あるいは、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡが使用され得る）と１０ｐｍｏｌの遺伝子特異的プライマーとを５０μｌのＰＣＲ反応物中で、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する１つ以上のポリペプチド（例えば、本明細書中に記載されるもの）を使用して、混合する（１０ｐｍｏｌより多い遺伝子特異的プライマーの添加は、ａｔｔＢ  ＰＣＲ産物の収率を減少し得る）。さらに、ＲＮＡが使用される場合には、標準的な逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）プロトコールに従うべきである：例えば、Ｇｅｒａｒｄ，Ｇ．Ｆ．ら、ＦＯＣＵＳ  １１：６０（１９８９）；Ｍｙｅｒｓ，Ｔ．Ｗ．およびＧｅｌｆａｎｄ，Ｄ．Ｈ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０：７６６１（１９９１）；Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｗ．Ｎ．ら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２０：７８２（１９９６）；ならびに米国特許出願番号０９／０６４，０５７（１９９８年４月２２日出願）（これらのすべての開示が、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
【０４３８】
（１stＰＣＲプロフィール）
【０４３９】
【表１９】
0004580106.tif 000049
（２）各々３５ｐｍｏｌのａｔｔＢ１およびａｔｔＢ２アダプタープライマーを含む４０μｌのＰＣＲ反応混合物に、１０μｌを移す。
【０４４０】
（２ndＰＣＲプロフィール）
【０４４１】
【表２０】
0004580106.tif 000050
（留意点）
１．生成されたａｔｔＢ  ＰＣＲ産物の収率を評価するために、アダプターなしのプライマーコントロールを実施することが有用である。
２．直線化されたテンプレートは通常、わずかにより高いＰＣＲ産物収率を生じる。
【０４４２】
（実施例２６：ＧＡＴＥＷＡＹTMクローニングシステムを使用する１チューブ組換えクローニング）
ＧＡＴＥＷＡＹTMクローニングシステムを使用して、より容易かつより迅速なクローニングを提供するために、本発明者らは、ＢＰおよびＬＲ反応が、単一チューブ内で実施され得るプロトコール（「１チューブ」プロトコール）を設計した。以下が、このような１チューブプロトコールの例である：本実施例では、ＢＰ反応のアリコートを、ＬＲ成分を添加する前に採取するが、ＢＰおよびＬＲ反応は、最初にＢＰのアリコートを採取することを伴わずに、１チューブプロトコールにおいて実施され得る。
【０４４３】
【表２１】
0004580106.tif 000051
上記成分を単一チューブ内で混合した後、反応混合物を２５℃で４時間インキュベートした。反応混合物の５μｌのアリコートを取り出し、そして０．５μｌの１０×停止溶液をこの反応混合物に添加し、そして３７℃で１０分間インキュベートした。次いで、コンピテント細胞を、１００μｌの細胞あたり１〜２μｌのＢＰ反応物を用いて形質転換した；この形質転換は、個々のエントリークローン（Ｅｎｔｒｙ  ｃｌｏｎｅ）の単離およびＢＰ反応効率の定量のためのエントリークローン（Ｅｎｔｒｙ  ｃｌｏｎｅ）のコロニーを産生した。
【０４４４】
残存する２０μｌのＢＰ反応混合物に、ＬＲ反応の以下の成分を添加した。
【０４４５】
【表２２】
0004580106.tif 000052
上記成分を単一チューブ内で混合した後、反応混合物を２５℃で２時間インキュベートした。３μｌの１０×停止溶液を添加し、そしてこの混合物を３７℃で１０分間インキュベートした。次いで、コンピテント細胞を、１００μｌの細胞あたり１〜２μｌの反応混合物を用いて形質転換した。
【０４４６】
（留意点）
１．所望される場合、目的ベクター（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ）を、開始ＢＰ反応に添加し得る。
２．所望される場合、反応を１／２倍スケールダウンし得る。
３．ＢＰおよび／またはＬＲ反応についてより短いインキュベーション時間が用いられ得る（所望される反応のクローニング効率に対して増減する）が、より少ないコロニー数を代表的に生じる。
４．得られるコロニー数を数倍増加させるために、ＢＰ反応物を６〜２０時間インキュベートし、そしてＬＲ反応を３時間まで増加させる。エレクトロポレーションはまた、１〜２μｌのＰＫ処理反応混合物で十分に作用する。
５．約５ｋｂより長いＰＣＲ産物は、ＢＰ反応において有意により低いクローニング効率を示し得る。この場合、ＢＰおよびＬＲ工程の両方について、より長いインキュベーション時間（例えば、６〜１８時間）で１チューブ反応を使用することを本発明者らは推奨する。
【０４４７】
（実施例２７：ＬＲ反応の間の目的ベクター（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ）の緩和）
ＬＲ反応をさらに最適化するために、ＬＲ反応緩衝液の組成を上記から改変し、そしてこの改変された緩衝液をプロトコールにおいて使用して、ＬＲ反応の間の目的ベクター（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ）の酵素的緩和の影響を試験した。
【０４４８】
ＬＲ反応は、５×ＢＰ反応緩衝液（実施例５を参照のこと）をＬＲ反応に使用したことを除いて、通常通り（例えば、実施例６を参照のこと）に設定した。ＬＲ反応の間の目的ベクター（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ）の緩和を達成するために、トポイソメラーゼＩ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ：カタログ番号３８０４２−０１６）を、反応物中の総ＤＮＡ  １μｇあたり約１５Ｕの最終濃度で、この反応混合物に添加した（例えば、２０μｌのＬＲ反応物中で合計４００ｎｇのＤＮＡを有する反応混合物に対して、約６ユニットのトポイソメラーゼＩを添加した）。反応混合物を以下のように設定した。
【０４４９】
【表２３】
0004580106.tif 000053
反応混合物を２５℃で１時間インキュベートし、次いで、２μｌの２μｇ／μｌのプロテイナーゼＫを添加し、そして混合物を３７℃で１０分間インキュベートしてＬＲ反応を停止した。次いで、コンピテント細胞を、前述の実施例に記載のように形質転換した。これらの研究の結果により、トポイソメラーゼＩを使用するＬＲ反応での基質の緩和が、トポイソメラーゼＩの包含を伴わずに実施されたＬＲ反応と比較して、コロニー産生において２〜１０倍の増加を生じることが実証された。
【０４５０】
ここで、理解の明瞭さのために例証および実施例によって幾分詳細に本発明を完全に記載してきたが、本発明またはその任意の特定の実施形態の範囲に影響することなく、幅広くかつ等価な範囲の条件、処方および他のパラメーターで本発明を改変または変更することによって、同じことが実施され得ること、そしてこのような改変または変更が、添付の特許請求の範囲の範囲内に包含されると意図されることは、当業者に明らかである。
【０４５１】
本明細書中で言及したすべての刊行物、特許および特許出願は、本発明が関係する分野の当業者の技術のレベルの指標であり、そして個々の各刊行物、特許または特許出願が、参考として援用されると明確かつ個々に示される場合と同程度に、本明細書中で参考として援用される。
【０４５２】
【表２４】
0004580106.tif 000054
【０４５３】
【表２５】
0004580106.tif 000055
【０４５４】
【表２６】
0004580106.tif 000056
【０４５５】
【表２７】
0004580106.tif 000057
【０４５６】
【表２８】
0004580106.tif 000058
【０４５７】
【表２９】
0004580106.tif 000059
【０４５８】
【表３０】
0004580106.tif 000060
【０４５９】
【表３１】
0004580106.tif 000061
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、本発明の一般的な方法の１つを示し、ここで開始（親）ＤＮＡ分子は、環状または直鎖状であり得る。目標は、新しいサブクローニングベクターＤを、本来のクローニングベクターＢと交換することである。１つ実施形態において、ＡＤについて、かつ全ての他の分子（融合体（Ｃｏｉｎｔｅｇｒａｔｅ）を含む）に対して選択することが望ましい。四角と丸は、組換え部位である：例えば、ｌｏｘ（例えば、ｌｏｘＰ）部位、ａｔｔ部位、など。例えば、セグメントＤは、発現シグナル、タンパク質融合ドメイン、新しい薬剤マーカー、新しい複製起点、またはＤＮＡのマッピングあるいは配列決定のための特定化された機能を含み得る。融合体分子が、セグメントＡ（挿入物）に隣接するセグメントＤ（目的ベクター）を含み、それによってＤ内の機能的エレメントが、Ａ内の挿入物と並列することに注意するべきである。このような分子は、セグメントＢ＋Ｄ内の選択マーカーについて選択することによって、インビトロで（例えば、プロモーターが、インビトロ転写／翻訳のための遺伝子に隣接して位置する場合に）、またはインビボで（ｃｃｄＢ保有ベクターを増殖可能な細胞内での単離後）直接使用され得る。当業者は、この１段階方法は、本発明の特定の想像された適用において有用であることを理解する。
【図２】  図２は、本発明の組換えクローニング系のより詳細な描写であり、本明細書中では「ＧＡＴＥＷＡＹTM  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ」と言及される。この図は、「目的反応」（本明細書中において「ＬＲ反応」とも言及され得る）を介する発現クローンの産生を示す。ａｔｔＬ１部位とａｔｔＬ２部位との間に局在化した目的のＤＮＡ分子（例えば、遺伝子）を含むｋａｎrベクター（本明細書中において「エントリークローン」とも言及される）は、ａｔｔＲ１部位とａｔｔＲ２部位の間に局在化した毒性または「死」遺伝子を含む、ａｍｐrベクター（本明細書において「目的ベクター」と言及される）と、ＧＡＴＥＷＡＹTMＬＲ  ＣｌｏｎａｓｅTMＥｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ（Ｉｎｔ、ＩＨＦおよびＸｉｓの混合物）の存在下で反応される。２５℃で約６０分間のインキュベーション後、この反応は、ａｔｔＢ１部位とａｔｔＢ２部位との間に部位局在化した目的のＤＮＡ分子、およびｋａｎr副産物を含むａｍｐr発現クローン、ならびに中間体を得る。次いで、反応混合物は、細胞をアンピシリンを含む培地にプレートし、そしてａｍｐrコロニーを選ぶことによって選択され得る目的の核酸分子を含む宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）およびクローンに形質転換され得る。
【図３】  図３は、種々の発現クローンを産生するためのエントリークローンからの多重型の目的ベクターへの核酸分子のクローニングの概略図である。所定のエントリークローンと異なる型の目的ベクター（示さず）との間の組換えは、図２に示されるＬＲ反応を介して、種々の適用および宿主細胞型における使用についての複数の異なる発現クローンを産生する。
【図４】  図４は、「ＢＰ反応」（本明細書中において「エントリー反応」または「ゲートウェイ（Ｇａｔｅｗａｒｄ）反応」とも言及される）を介するエントリークローンの産生の詳細な図である。この図において示される例において、ａｔｔＢ１部位とａｔｔＢ２部位との間に局在化した目的のＤＮＡ分子（例えば、遺伝子）を含むａｍｐr発現ベクターは、ｋａｎrドナーベクター（例えば、ａｔｔＰベクター；本明細書中では、ＧＡＴＥＷＡＹTMＢＰ  ＣｌｏｎａｓｅTMＥｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ（ＩｎｔおよびＩＨＦの混合物）の存在下で、ａｔｔＰ１部位とａｔｔＰ２部位との間に局在化した毒性または「死」遺伝子を含むＧＡＴＡＷＡＹTMｐＤＯＮＲ２０１（図４９Ａ〜Ｃを参照のこと））と反応される。２５℃で６０分のインキュベーション後、反応は、ａｔｔＬ１とａｔｔＬ２部位との間に局在化した目的のＤＮＡ分子を含むｋａｎrエントリークローン、およびａｍｐr副産物遺伝子を与える。次いでエントリークローンは、宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）に形質転換され得、そしてエントリークローンを含むクローン（および従って目的の核酸分子）は、細胞をカナマイシン含有培地にプレートし、そしてｋａｎrコロニーを選ぶことによって選択され得る。この図はｋａｎrドナーベクターの使用の例を示すが、本明細書中に記載されるように他の選択マーカー（例えば、ゲンタマイシン耐性マーカー、テトラサイクリン耐性マーカー）を含むドナーベクターを使用することもまた可能である。
【図５】  図５は、ＬＲ（「目的」）反応（図５Ａ）、およびＧＡＴＥＷＡＹTMＣｌｏｎｉｎｇ  ＳｙｓｔｅｍのＢＰ（「エントリー」または「ゲートウェイ」）反応（図５Ｂ）のより詳細な概略図であり、各反応の反応物質、産物、および副産物を示す。
【図６】  図６は、発現クローンを作製するための目的ベクターへのサブクローニング後の目的の遺伝子に隣接するａｔｔＢ１部位およびａｔｔＢ２部位の配列を示す。
【図７】  図７は、本発明の組成物および方法を使用するエントリークローンを作製するための４つの方法の概略図である：１．制限酵素およびリガーゼを使用する；２．ａｔｔＬエントリーベクター内に調整されたｃＤＮＡライブラリーで開始する；３．Ｂ×Ｐ反応を介してａｔｔＢ発現ベクター内に調整されたライブラリー由来の発現クローンを使用する；および４．Ｂ×Ｐ反応を介して末端ａｔｔＢ部位を有するＰＣＲフラグメントの組換えクローニング。アプローチ３および４は、選択マーカー（例えば、ｋａｎr、ｇｅｎr、ｔｅｔrなど）を保有するエントリークローンを提供するドナーベクター（本明細書中では、ａｔｔＰベクター（例えば、ｐＤＯＮＲ２０１（図４９Ａ〜Ｃを参照のこと）、ｐＤＯＮＲ２０２（図５０Ａ〜Ｃを参照のこと）、ｐＤＯＮＲ２０３（図５１Ａ〜Ｃを参照のこと）、ｐＤＯＮＲ２０４（図５２Ａ〜Ｃを参照のこと）、ｐＤＯＮＲ２０５（図５３Ａ〜Ｃを参照のこと）、またはｐＤＯＮＲ２０６（図５４Ａ〜Ｃを参照のこと）））との組換えに依存する。
【図８】  図８は、Ｂ×Ｐ（エントリーまたはゲートウェイ）反応によるＰＣＲ産物のクローニングの概略図である。２５ｂｐの末端ａｔｔＢ部位（＋４つのＧ）を有するＰＣＲ産物は、Ｂ×Ｐ反応のための基質として示される。遺伝子のａｔｔＢ−ＰＣＲ産物とドナーベクターとの間の組換え（ｋａｎrを保有するエントリーベクターに寄与する）は、ＰＣＲ産物のエントリークローンを生じる。
【図９】  図９は、本明細書中で、ａｔｔＢ１、ａｔｔＢ２、ａｔｔＰ１、ａｔｔＰ２、ａｔｔＬ１、ａｔｔＬ２、ａｔｔＲ１およびａｔｔＲ２として示される組換え部位のヌクレオチド配列の表である。配列は、従来的に５’〜３’に記載される。
【図１０】本明細書中に示されたすべてのエントリーベクターについてのプラスミドバックボーンは、同じであり、そしてエントリーベクターｐＥＮＴＲ１Ａについて図１０Ａに示す。図１０は、エントリーベクターｐＥＮＴＲ１Ａの物理的マップおよびクローニング部位（図１０Ａ）、およびヌクレオチド配列（図１０Ｂ）の概略図である。
【図１１】  本明細書中に示されたすべてのエントリーベクターについてのプラスミドバックボーンは、同じであり、そしてエントリーベクターｐＥＮＴＲ１Ａについて図１０Ａに示される。図１１に示される他のエントリーベクターについて、各図のセットについて図「Ａ」に示される配列のみ（すなわち、図１１Ａ、図１２Ａなど）が、図１０に示される配列（ａｔｔＬ１−ａｔｔＬ２カセット内）とは異なる。プラスミドバックボーンは、同一である。図１１は、エントリーベクターｐＥＮＴＲ２Ｂのクローニング部位（図１１Ａ）およびヌクレオチド配列（図１１Ｂ）の概略図である。
【図１２】  本明細書中に示されたすべてのエントリーベクターについてのプラスミドバックボーンは、同じであり、そしてエントリーベクターｐＥＮＴＲ１Ａについて図１０Ａに示される。図１２に示される他のエントリーベクターについて、各図のセットについて図「Ａ」に示される配列のみ（すなわち、図１１Ａ、図１２Ａなど）が、図１０に示される配列（ａｔｔＬ１−ａｔｔＬ２カセット内）とは異なる。プラスミドバックボーンは、同一である。図１２は、エントリーベクターｐＥＮＴＲ３Ｒのクローニング部位（図１２Ａ）およびヌクレオチド配列（図１２Ｂ）の概略図である。
【図１３】  本明細書中に示されたすべてのエントリーベクターについてのプラスミドバックボーンは、同じであり、そしてエントリーベクターｐＥＮＴＲ１Ａについて図１０Ａに示される。図１３に示される他のエントリーベクターについて、各図のセットについて図「Ａ」に示される配列のみ（すなわち、図１１Ａ、図１２Ａなど）が、図１０に示される配列（ａｔｔＬ１−ａｔｔＬ２カセット内）とは異なる。プラスミドバックボーンは、同一である。図１３は、エントリーベクターｐＥＮＴＲ４のクローニング部位（図１３Ａ）およびヌクレオチド配列（図１３Ｂ）の概略図である。
【図１４】  本明細書中に示されたすべてのエントリーベクターについてのプラスミドバックボーンは、同じであり、そしてエントリーベクターｐＥＮＴＲ１Ａについて図１０Ａに示される。図１４に示される他のエントリーベクターについて、各図のセットについて図「Ａ」に示される配列のみ（すなわち、図１１Ａ、図１２Ａなど）が、図１０に示される配列（ａｔｔＬ１−ａｔｔＬ２カセット内）とは異なる。プラスミドバックボーンは、同一である。図１４は、エントリーベクターｐＥＮＴＲ５のクローニング部位（図１４Ａ）およびヌクレオチド配列（図１４Ｂ）の概略図である。
【図１５】  本明細書中に示されたすべてのエントリーベクターについてのプラスミドバックボーンは、同じであり、そしてエントリーベクターｐＥＮＴＲ１Ａについて図１０Ａに示される。図１５に示される他のエントリーベクターについて、各図のセットについて図「Ａ」に示される配列のみ（すなわち、図１１Ａ、図１２Ａなど）が、図１０に示される配列（ａｔｔＬ１−ａｔｔＬ２カセット内）とは異なる。プラスミドバックボーンは、同一である。図１５は、エントリーベクターｐＥＮＴＲ６のクローニング部位（図１５Ａ）およびヌクレオチド配列（図１５Ｂ）の概略図である。
【図１６】  本明細書中に示されたすべてのエントリーベクターについてのプラスミドバックボーンは、同じであり、そしてエントリーベクターｐＥＮＴＲ１Ａについて図１０Ａに示される。図１６に示される他のエントリーベクターについて、各図のセットについて図「Ａ」に示される配列のみ（すなわち、図１１Ａ、図１２Ａなど）が、図１０に示される配列（ａｔｔＬ１−ａｔｔＬ２カセット内）とは異なる。プラスミドバックボーンは、同一である。図１６は、エントリーベクターｐＥＮＴＲ７のクローニング部位（図１６Ａ）およびヌクレオチド配列（図１６Ｂ）の概略図である。
【図１７】  本明細書中に示されたすべてのエントリーベクターについてのプラスミドバックボーンは、同じであり、そしてエントリーベクターｐＥＮＴＲ１Ａについて図１０Ａに示される。図１７に示される他のエントリーベクターについて、各図のセットについて図「Ａ」に示される配列のみ（すなわち、図１１Ａ、図１２Ａなど）が、図１０に示される配列（ａｔｔＬ１−ａｔｔＬ２カセット内）とは異なる。プラスミドバックボーンは、同一である。図１７は、エントリーベクターｐＥＮＴＲ８のクローニング部位（図１７Ａ）およびヌクレオチド配列（図１７Ｂ）の概略図である。
【図１８】  本明細書中に示されたすべてのエントリーベクターについてのプラスミドバックボーンは、同じであり、そしてエントリーベクターｐＥＮＴＲ１Ａについて図１０Ａに示される。図１８に示される他のエントリーベクターについて、各図のセットについて図「Ａ」に示される配列のみ（すなわち、図１１Ａ、図１２Ａなど）が、図１０に示される配列（ａｔｔＬ１−ａｔｔＬ２カセット内）とは異なる。プラスミドバックボーンは、同一である。図１８は、エントリーベクターｐＥＮＴＲ９のクローニング部位（図１８Ａ）およびヌクレオチド配列（図１８ｂ）の概略図である。
【図１９】  本明細書中に示されたすべてのエントリーベクターについてのプラスミドバックボーンは、同じであり、そしてエントリーベクターｐＥＮＴＲ１Ａについて図１０Ａに示される。図１９に示される他のエントリーベクターについて、各図のセットについて図「Ａ」に示される配列のみ（すなわち、図１１Ａ、図１２Ａなど）が、図１０に示される配列（ａｔｔＬ１−ａｔｔＬ２カセット内）とは異なる。プラスミドバックボーンは、同一である。図１９は、エントリーベクターｐＥＮＴＲ１０のクローニング部位（図１９Ａ）およびヌクレオチド配列（図１９Ｂ）の概略図である。
【図２０】  本明細書中に示されたすべてのエントリーベクターについてのプラスミドバックボーンは、同じであり、そしてエントリーベクターｐＥＮＴＲ１Ａについて図１０Ａに示される。図２０に示される他のエントリーベクターについて、各図のセットについて図「Ａ」に示される配列のみ（すなわち、図１１Ａ、図１２Ａなど）が、図１０に示される配列（ａｔｔＬ１−ａｔｔＬ２カセット内）とは異なる。プラスミドバックボーンは、同一である。図２０は、エントリーベクターｐＥＮＴＲ１１のクローニング部位（図１９Ａ）およびヌクレオチド配列（図２０Ｂ）の概略図である。
【図２１】  図２１は、目的ベクターｐＤＥＳＴ１の開始コドンから−３５と−１０のプロモーター配列を示す物理的マップおよびＴｒｃ発現カセット（図２１Ａ）、およびヌクレオチド配列（図２１Ｂ〜Ｄ）の概略図である。このベクターはまた、ｐＴｒｃ−ＤＥＳＴ１とも言われる。
【図２２】  図２２は、目的ベクターｐＤＥＳＴ２の、物理的マップ、および開始コドンから−３５および−１０でのプロモーター配列を示すＨｉｓ６発現カセットの概略的描写（図２２Ａ）、ならびにヌクレオチド配列（図２２Ｂ〜Ｄ）である。このベクターはまた、ｐＨｉｓ６−ＤＥＳＴ２としても好ましくあり得る。
【図２３】  図２３は、目的ベクターｐＤＥＳＴ３の、物理的マップ、および開始コドンから−３５および−１０でのプロモーター配列を示すＧＳＴ発現カセットの概略的描写（図２３Ａ）、ならびにヌクレオチド配列（図２３Ｂ〜Ｄ）である。このベクターはまた、ｐＧＳＴ−ＤＥＳＴ３としても好ましくあり得る。
【図２４】  図２４は、目的ベクターｐＤＥＳＴ４の、物理的マップ、および開始コドンから−３５および−１０でのプロモーター配列ならびにＴＥＶプロテアーゼ切断部位を示すＨｉｓ６−Ｔｒｘ発現カセットの概略的描写（図２４Ａ）、ならびにヌクレオチド配列（図２４Ｂ〜Ｄ）である。このベクターはまた、ｐＴｒｘ−ＤＥＳＴ４としても好ましくあり得る。
【図２５】  図２５は、目的ベクターｐＤＥＳＴ５のａｔｔＲ１およびａｔｔＲ２部位（図２５Ａ）、物理的マップの概略的描写（図２５Ｂ）、ならびにヌクレオチド配列（図２５Ｃ〜Ｄ）である。このベクターはまた、ｐＳＰＯＲＴ（＋）−ＤＥＳＴ５としても好ましくあり得る。
【図２６】  図２６は、目的ベクターｐＤＥＳＴ６のａｔｔＲ１およびａｔｔＲ２部位（図２６Ａ）、物理的マップの概略的描写（図２６Ｂ）、ならびにヌクレオチド配列（図２６Ｃ〜Ｄ）である。このベクターはまた、ｐＳＰＯＲＴ（−）−ＤＥＳＴ６としても好ましくあり得る。
【図２７】  図２７は、目的ベクターｐＤＥＳＴ７のａｔｔＲ１部位、ＣＭＶプロモーター、および物理的マップの概略的描写（図２７Ａ）、ならびにヌクレオチド配列（図２７Ｂ〜Ｃ）である。このベクターはまた、ｐＣＭＶ−ＤＥＳＴ７としても好ましくあり得る。
【図２８】  図２８は、目的ベクターｐＤＥＳＴ８のａｔｔＲ１部位、バキュロウイルスポリヘドリンプロモーター、および物理的マップの概略的描写（図２８Ａ）、ならびにヌクレオチド配列（図２８Ｂ〜Ｄ）である。このベクターはまた、ｐＦａｓｔＢａｃ−ＤＥＳＴ８としても好ましくあり得る。
【図２９】  図２９は、目的ベクターｐＤＥＳＴ９のａｔｔＲ１部位、Ｓｅｍｌｉｋｉ  Ｆｏｒｅｓｔ  Ｖｉｒｕｓプロモーター、および物理的マップの概略的描写（図２９Ａ）、ならびにヌクレオチド配列（図２９Ｂ〜Ｅ）である。このベクターはまた、ｐＳＦＶ−ＤＥＳＴ９としても好ましくあり得る。
【図３０】  図３０は、目的ベクターｐＤＥＳＴ１０のａｔｔＲ１部位、バキュロウイルスポリヘドリンプロモーター、Ｈｉｓ６融合ドメイン、および物理的マップの概略的描写（図３０Ａ）、ならびにヌクレオチド配列（図３０Ｂ〜Ｄ）である。このベクターはまた、ｐＦａｓｔＢａｃＨＴ−ＤＥＳＴ１０としても好ましくあり得る。
【図３１】  図３１は、目的ベクターｐＤＥＳＴ１１の、テトラサイクリン調節ＣＭＶプロモーターを含むａｔｔＲ１部位および物理的マップの概略的描写（図３１Ａ）、ならびにヌクレオチド配列（図３１Ｂ〜Ｄ）である。このベクターはまた、ｐＴｅｔ−ＤＥＳＴ１１としても好ましくあり得る。
【図３２】  図３２は、目的ベクターｐＤＥＳＴ１２．２のａｔｔＲ１部位、ＣＭＶプロモーターのｍＲＮＡの開始、および物理的マップの概略的描写（図３２Ａ）、ならびにヌクレオチド配列（図３２Ｂ〜Ｄ）である。このベクターはまた、ｐＣＭＶｎｅｏ−ＤＥＳＴ１２、ｐＣＭＶ−ＤＥＳＴ１２、またはｐＤＥＳＴ１２としても好ましくあり得る。
【図３３】  図３３は、目的ベクターｐＤＥＳＴ１３のａｔｔＲ１部位、λＰLプロモーター、および物理的マップの概略的描写（図３３Ａ）、ならびにヌクレオチド配列（図３３Ｂ〜Ｃ）である。このベクターはまた、ｐλＰL−ＤＥＳＴ１３としても好ましくあり得る。
【図３４】  図３４は、目的ベクターｐＤＥＳＴ１４のａｔｔＲ１部位、Ｔ７プロモーター、および物理的マップの概略的描写（図３４Ａ）、ならびにヌクレオチド配列（図３４Ｂ〜Ｄ）である。このベクターはまた、ｐＰＴ７−ＤＥＳＴ１４としても好ましくあり得る。
【図３５】  図３５は、目的ベクターｐＤＥＳＴ１５のａｔｔＲ１部位、Ｔ７プロモーター、およびＮ末端ＧＳＴ融合配列の概略的描写、ならびに物理的マップ（図３５Ａ）、ならびにヌクレオチド配列（図３５Ｂ〜Ｄ）である。このベクターはまた、ｐＴ７  ＧＳＴ−ＤＥＳＴ１５としても好ましくあり得る。
【図３６】  図３６は、目的ベクターｐＤＥＳＴ１６のａｔｔＲ１部位、Ｔ７プロモーター、およびＮ末端チオレドキシン融合配列の概略的描写、ならびに物理的マップ（図３６Ａ）、ならびにヌクレオチド配列（図３６Ｂ〜Ｄ）である。このベクターはまた、ｐＴ７  Ｔｒｘ−ＤＥＳＴ１６としても好ましくあり得る。
【図３７】  図３７は、目的ベクターｐＤＥＳＴ１７のａｔｔＲ１部位、Ｔ７プロモーター、およびＮ末端Ｈｉｓ６融合配列の概略的描写、ならびに物理的マップ（図３７Ａ）、ならびにヌクレオチド配列（図３７Ｂ〜Ｄ）である。このベクターはまた、ｐＴ７  Ｈｉｓ−ＤＥＳＴ１７としても好ましくあり得る。
【図３８】  図３８は、目的ベクターｐＤＥＳＴ１８のａｔｔＲ１部位およびｐ１０バキュロウイルスプロモーターの概略的描写、ならびに物理的マップ（図３８Ａ）、ならびにヌクレオチド配列（図３８Ｂ〜Ｄ）である。このベクターはまた、ｐＦＢｐ１０−ＤＥＳＴ１８としても好ましくあり得る。
【図３９】  図３９は、目的ベクターｐＤＥＳＴ１９のａｔｔＲ１部位、および３９ｋバキュロウイルスプロモーターの概略的描写、ならびに物理的マップ（図３９Ａ）、ならびにヌクレオチド配列（図３９Ｂ〜Ｄ）である。このベクターはまた、ｐＦＢ３９ｋ−ＤＥＳＴ１９としても好ましくあり得る。
【図４０】  図４０は、目的ベクターｐＤＥＳＴ２０のａｔｔＲ１部位、ｐｏｌｈバキュロウイルスプロモーター、およびＮ末端ＧＳＴ融合配列の概略的描写、ならびに物理的マップ（図４０Ａ）、ならびにヌクレオチド配列（図４０Ｂ〜Ｄ）である。このベクターはまた、ｐＦＢ  ＧＳＴ−ＤＥＳＴ２０としても好ましくあり得る。
【図４１】  図４１は、目的ベクターｐＤＥＳＴ２１の、ＤＮＡ結合ドメインを有する２ハイブリッドベクター、ａｔｔＲ１部位、およびＡＤＨスプロモーターの概略的描写、ならびに物理的マップ（図４１Ａ）、ならびにヌクレオチド配列（図４１Ｂ〜Ｅ）である。このベクターはまた、ｐＤＢ  Ｌｅｕ−ＤＥＳＴ２１としても好ましくあり得る。
【図４２】  図４２は、目的ベクターｐＤＥＳＴ２２の、活性化ドメインを有する２ハイブリッドベクター、ａｔｔＲ１部位、およびＡＤＨスプロモーターの概略的描写、ならびに物理的マップ（図４２Ａ）、ならびにヌクレオチド配列（図４２Ｂ〜Ｄ）である。このベクターはまた、ｐＰＣ８６−ＤＥＳＴ２２としても好ましくあり得る。
【図４３】  図４３は、目的ベクターｐＤＥＳＴ２３のａｔｔＲ１およびａｔｔＲ２部位、Ｔ７プロモーター、およびＣ末端Ｈｉｓ６融合配列の概略的描写、ならびに物理的マップ（図４３Ａ）、ならびにヌクレオチド配列（図４３Ｂ〜Ｄ）である。このベクターはまた、ｐＣ−ｔｅｒｍ−Ｈｉｓ６−ＤＥＳＴ２３としても好ましくあり得る。
【図４４】  図４４は、目的ベクターｐＤＥＳＴ２４のａｔｔＲ１およびａｔｔＲ２部位、Ｔ７プロモーター、およびＣ末端ＧＳＴ融合配列の概略的描写、ならびに物理的マップ（図４４Ａ）、ならびにヌクレオチド配列（図４４Ｂ〜Ｄ）である。このベクターはまた、ｐＣ−ｔｅｒｍ−ＧＳＴ−ＤＥＳＴ２４としても好ましくあり得る。
【図４５】  図４５は、目的ベクターｐＤＥＳＴ２５のａｔｔＲ１およびａｔｔＲ２部位、Ｔ７プロモーター、およびＣ末端チオレドキシン融合配列の概略的描写、ならびに物理的マップ（図４５Ａ）、ならびにヌクレオチド配列（図４５Ｂ〜Ｄ）である。このベクターはまた、ｐＣ−ｔｅｒｍ−Ｔｒｘ−ＤＥＳＴ２５としても好ましくあり得る。
【図４６】  図４６は、目的ベクターｐＤＥＳＴ２６のａｔｔＲ１部位、ＣＭＶプロモーター、およびＮ末端Ｈｉｓ６融合配列の概略的描写、ならびに物理的マップ（図４６Ａ）、ならびにヌクレオチド配列（図４６Ｂ〜Ｄ）である。このベクターはまた、ｐＣＭＶ−ＳＰｎｅｏ−Ｈｉｓ−ＤＥＳＴ２６としても好ましくあり得る。
【図４７】  図４７は、目的ベクターｐＤＥＳＴ２７のａｔｔＲ１部位、ＣＭＶプロモーター、およびＮ末端ＧＳＴ融合配列の概略的描写、ならびに物理的マップ（図４７Ａ）、ならびにヌクレオチド配列（図４７Ｂ〜Ｄ）である。このベクターはまた、ｐＣＭＶ−Ｓｐｎｅｏ−ＧＳＴ−ＤＥＳＴ２７としても好ましくあり得る。
【図４８】  図４８は、ａｔｔＢクローニングベクタープラスミドｐＥＸＰ５０１についての物理的マップ（図４８Ａ）、クローニング部位（図４８Ｂ）、およびヌクレオチド配列（図４８Ｃ〜Ｄ）の描写である。このベクターは、本明細書中でｐＣＭＶ・ＳＰＯＲＴ６、ｐＣＭＶＳＰＯＲＴ６、およびｐＣＭＶＳｐｏｒｔ６として同等に好ましくあり得る。
【図４９】  図４９は、ＢＰ反応においてカナマイシン耐性ベクターを提供するドナープラスミドｐＤＯＮＲ２０１についての物理的マップの描写（図４９Ａ）、およびヌクレオチド配列（図４９Ｂ〜Ｃ）である。このベクターはまた、ｐＡｔｔＰｋａｎｒドナープラスミド、またはｐＡｔｔＰｋａｎドナープラスミドとしても好ましくあり得る。
【図５０】  図５０は、ＢＰ反応においてカナマイシン耐性ベクターを提供するドナープラスミドｐＤＯＮＲ２０２についての物理的マップ（図５０Ａ）、およびヌクレオチド配列（図５０Ｂ〜Ｃ）の描写である。
【図５１】  図５１は、ＢＰ反応においてカナマイシン耐性ベクターを提供するドナープラスミドｐＤＯＮＲ２０３についての物理的マップ（図５１Ａ）、およびヌクレオチド配列（図５１Ｂ〜Ｃ）の描写である。
【図５２】  図５２は、ＢＰ反応においてカナマイシン耐性ベクターを提供するドナープラスミドｐＤＯＮＲ２０４についての物理的マップ（図５２Ａ）、およびヌクレオチド配列（図５２Ｂ〜Ｃ）の描写である。
【図５３】  図５３は、ＢＰ反応においてテトラサイクリン耐性ベクターを提供するドナープラスミドｐＤＯＮＲ２０５についての物理的マップ（図５３Ａ）、およびヌクレオチド配列（図５３Ｂ〜Ｃ）の描写である。
【図５４】  図５４は、ＢＰ反応においてゲンタマイシン耐性ベクターを提供するドナープラスミドｐＤＯＮＲ２０６についての物理的マップ（図５４Ａ）、およびヌクレオチド配列（図５４Ｂ〜Ｃ）の描写である。このベクターはまた、ｐＥＮＴＲ２２  ａｔｔＰドナープラスミド、ｐＡｔｔＰＧｅｎｒドナープラスミド、またはｐＡｔｔＰｇｅｎｔドナープラスミドとしても好ましくあり得る。
【図５５】  図５５は、目的ベクターｐＤＥＳＴ２（図２２）中にサブクローニングされたＣＡＴのエントリークローン（ｐＥＮＴＲ７）の、ａｔｔＢ１部位、および物理的マップを示す。
【図５６】  図５６は、実施例１６、ｐＥＺＣ７１０２およびａｔｔＢ−ｔｅｒ−ＰＣＲに記載される単一チューブＢｘＰ反応の反応ＢのＤＮＡ成分を示す。
【図５７】  図５７は、実施例１６、ｔｅｔｘ７１０２に記載の単一チューブＢｘＰ反応の、反応Ｂの所望される産物の物理的マップである。
【図５８】  図５８は、目的ベクターｐＥＺＣ８４０２の物理的マップである。
【図５９】  図５９は、ｔｅｔｘ７１０２（図５７）およびｐＥＺＣ８４０２（図５８）を用いるＬｘＲ反応から生じる、予期されるｔｅｔrサブクローン産物、ｔｅｔｘ８４０２の物理的マップである。
【図６０】  図６０は、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるバクテリオファージλ組換え経路の概略的描写である。
【図６１】  図６１は、ＬＲ反応に加わるＤＮＡ分子の概略的描写である。ａｔｔＬ１およびａｔｔＲ１またはａｔｔＬ２およびａｔｔＲ２が最初に再結合するか否かに依存して、ＬＲ反応（このうち１つのみが本明細書で示される）の間に、２つの異なる同時統合物が形成する。１つの局面において、本発明は、目的の核酸分子の指向性クローニングを提供する。なぜなら、組換え部位は特異性を伴って反応するためである（ａｔｔＬ１はａｔｔＲ１と反応し；ａｔｔＬ２はａｔｔＲ２と反応し；ａｔｔＢ１はａｔｔＰ１と反応し；そしてａｔｔＢ２はａｔｔＰ２と反応する）。したがって、この部位の位置決めは、所望の配向で組換えフラグメントを有する所望のベクターの作成を可能にする。
【図６２】  図６２は、組換えクローニング方法および本発明の組成物を使用する、自然のタンパク質および融合タンパク質の発現の描写である。上の図は、天然のタンパク質の発現を示し、全ての翻訳開始シグナルはａｔｔＢ１部位とａｔｔＢ２部位との間に含まれている；そのために、これらのシグナルはエントリークローンの開始において存在しなくてはならない。下の図は、融合タンパク質の発現を示す（本明細書では、融合タンパク質を作製するために、リボソームがａｔｔＢ１およびａｔｔＢ２を通って読み取るように、Ｎ末端およびＣ末端の融合タグの両方の発現を示す）。天然のタンパク質発現ベクターとは異なり、Ｎ末端融合ベクターは、ａｔｔＢ１部位の上流の翻訳開始シグナルを有する。
【図６３】  図６３は、３つのＧＡＴＥＷＡＹTMクローニングシステムカセットの概略的描写である。３つの平滑末端カセットが示され、これは標準的発現ベクターを目的ベクターに変換する。示される各々のカセットは、３つの可能なリーディングフレームのうち１つのアミノ末端融合物を提供し、そしてその各々が、示されるような特有の制限切断部位を有する。
【図６４】  図６４は、３つのａｔｔＲリーディングフレームカセット、ｐＥＺＣ１５１０１（リーディングフレームＡ；図６４Ａ）、ｐＥＺＣ１５１０２（リーディングフレームＢ；図６４Ｂ）、およびｐＥＺＣ１５１０３（リーディングフレームＣ；図６４Ｃ）を含むプラスミドの物理的マップを示す。
【図６５】  図６５は、本発明のクローニング方法によって、ｐＢＲ３２２由来のｔｅｔrおよびａｍｐr遺伝子を増幅するために使用されるａｔｔＢプライマーを示す。
【図６６】  図６６は、図６５に示されるプライマーを使用して作製されたｔｅｔrおよびａｍｐrＰＣＲ産物の、組換えクローニングの結果を列挙する表である。
【図６７】  図６７は、ＰＣＲ産物のクローニング効率上のＰＣＲプライマーの５’末端上に含まれるグアニン（Ｇ’ｓ）数の効果を示すグラフである。しかし、グアニンの近くの他のヌクレオチド（Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｕまたはこれらの組合わせを含む）は、ＰＣＲ産物のクローニング効率を増大するために、ＰＣＲプライマー上の５’伸長としてしようされ得ることが注目される。
【図６８】  図６８は、ＢｘＰ反応におけるａｔｔＰおよびａｔｔＢ反応物の種々の量の滴定、およびＰＣＲ産物のクローニング効率の効果を示すグラフである。
【図６９】  図６９は、２５６ｂｐのＰＣＲ産物の、コロニーの形成の際の種々の重さ（図６９Ａ）またはモル数（図６９Ｂ）の効果、および２５６ｂｐのＰＣＲ産物の、ドナーベクターへのクローニングの効率（図６９Ｃ）を示す一連のグラフである。
【図７０】  図７０は、１ｋｂのＰＣＲ産物の、コロニーの形成の際の種々の重さ（図７０Ａ）またはモル数（図７０Ｂ）の効果、および１ｋｂのＰＣＲ産物の、ドナーベクターへのクローニングの効率（図７０Ｃ）を示す一連のグラフである。
【図７１】  図７１は、１．４ｋｂのＰＣＲ産物の、コロニーの形成の際の種々の重さ（図７１Ａ）またはモル数（図７１Ｂ）の効果、および１．４ｋｂのＰＣＲ産物の、ドナーベクターへのクローニングの効率（図７１Ｃ）を示す一連のグラフである。
【図７２】  図７２は、３．４ｋｂのＰＣＲ産物の、コロニーの形成の際の種々の重さ（図７２Ａ）またはモル数（図７２Ｂ）の効果、および３．４ｋｂのＰＣＲ産物の、ドナーベクターへのクローニングの効率（図７２Ｃ）を示す一連のグラフである。
【図７３】  図７３は、４．６ｋｂのＰＣＲ産物の、コロニーの形成の際の種々の重さ（図７３Ａ）またはモル数（図７３Ｂ）の効果、および４．６ｋｂのＰＣＲ産物の、ドナーベクターへのクローニングの効率（図７３Ｃ）を示す一連のグラフである。
【図７４】  図７４は、ＢｘＰ反応における６．９ｋｂのＰＣＲ産物の滴定の臭化エチジウム染色ゲルの写真である。
【図７５】  図７５は、１０．１ｋｂのＰＣＲ産物のドナーベクターへのクローニングの際のコロニー形成の際の、１０．１ｋｂのＰＣＲ産物の種々の量の効果を示すグラフである。
【図７６】  図７６は、ＢｘＰ反応における１０．１ｋｂのＰＣＲ産物の滴定の臭化エチジウム染色ゲルの写真である。
【図７７】  図７７は、０．２５６ｋｂ〜６．９ｋｂのサイズ範囲のＰＣＲフラグメントについての、図６９〜７４に示されるＰＣＲ産物クローニング効率実験の結果を要約した表である。
【図７８】  図７８は、ａｔｔＲカセットの末端での配列を示す。Ｃｍr−ｃｃｄＢカセットによって寄与される配列が示され、これは隣接ａｔｔＲ部位の外側末端を含む（囲み）。Ｉｎｔについてのねじれ切断部位が囲み領域において示される。エントリークローンでの組換えに続いて、ａｔｔＲ部位の外側の配列のみが、発現クローンの得られたａｔｔＢ部位に寄与する。両方の末端の下線部の配列は、融合タンパク質についての異なるリーディングフレームを示す（２つの代替のリーディングフレームＣカセットと共に、リーディングフレームＡ、Ｂ、またはＣが示される）。
【図７９】  図７９は、コードされたタンパク質のアミノ末端で、融合コドンを提供し得るいくつかの異なるａｔｔＲカセット（リーディングフレームＡ，Ｂ，またはＣにおいて）を示す。
【図８０】  図８０は、本発明のａｔｔＲリーディングフレームＡカセットにおけるシングルカット制限部位を示す。
【図８１】  図８１は、本発明のａｔｔＲリーディングフレームＢカセットにおけるシングルカット制限部位を示す。
【図８２】  図８２は、図７８に示される本発明の２つの代替のａｔｔＲリーディングフレームＣカセットにおけるシングルカット制限部位を示す（図８２Ａおよび８２Ｂ）。
【図８３】  図８３は、本発明のａｔｔＲリーディングフレームＣカセット（図７８および８２の代替Ａ）を含む、ａｔｔＲリーディングフレームＣ親プラスミドｐｒｆＣ親ＩＩＩについての、物理的マップ（図８３Ａ）、およびヌクレオチド配列（図８３Ｂ〜Ｃ）を示す。
【図８４】  図８４は、プラスミドｐＥＺＣ１３０１の物理的マップである。
【図８５】  図８５は、プラスミドｐＥＺＣ１３１３の物理的マップである。
【図８６】  図８６は、プラスミドｐＥＺ１４０３２の物理的マップである。
【図８７】  図８７は、プラスミドｐＭＡＢ５８の物理的マップである。
【図８８】  図８８は、プラスミドｐＭＡＢ６２の物理的マップである。
【図８９】  図８９は、本発明の２対の相同プライマーを使用する合成反応を示す。
【図９０】  図９０は、目的ベクターｐＤＥＳＴ２８の物理的マップの概略的描写（図９０Ａ）、およびヌクレオチド配列（図９０Ｂ〜Ｄ）である。
【図９１】  図９１は、目的ベクターｐＤＥＳＴ２９の、物理的地図の概略図（図９１Ａ）、およびヌクレオチド配列（図９１Ｂ−Ｄ）である。
【図９２】  図９２は、目的ベクターｐＤＥＳＴ３０の、物理的地図の概略図（図９２Ａ）、およびヌクレオチド配列（図９２Ｂ−Ｄ）である。
【図９３】  図９３は、目的ベクターｐＤＥＳＴ３１の、物理的地図の概略図（図９３Ａ）、およびヌクレオチド配列（図９３Ｂ−Ｄ）である。
【図９４】  図９４は、目的ベクターｐＤＥＳＴ３２の、物理的地図の概略図（図９４Ａ）、およびヌクレオチド配列（図９４Ｂ−Ｅ）である。
【図９５】  図９５は、目的ベクターｐＤＥＳＴ３３の、物理的地図の概略図（図９５Ａ）、およびヌクレオチド配列（図９５Ｂ−Ｄ）である。
【図９６】  図９６は、目的ベクターｐＤＥＳＴ３４の、物理的地図の概略図（図９６Ａ）、およびヌクレオチド配列（図９６Ｂ−Ｄ）である。
【図９７】  図９７は、ＢＰ反応においてゲンタマイシン耐性ベクターを提供する（ｄｏｎａｔｅ）ドナープラスミドｐＤＯＮＲ２０７について、物理的地図の描写（図９７Ａ）、およびヌクレオチド配列（図９７Ｂ−Ｃ）の描写（ｄｅｐｉｃｔｉｏｎ）である。
【図９８】  図９８は、２−ハイブリッドベクターｐＭＡＢ８５の、物理的地図の概略図（図９８Ａ）、およびヌクレオチド配列（図９８Ｂ−Ｄ）である。
【図９９】  図９９は、２−ハイブリッドベクターｐＭＡＢ８６の、物理的地図の概略図（図９９Ａ）、およびヌクレオチド配列（図９９Ｂ−Ｄ）である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２Ａ】
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【図５２Ｂ】
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【図５２Ｃ】
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【図５３Ａ】
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【図５３Ｂ】
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【図５３Ｃ】
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【図５４Ｂ】
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【図５４Ｃ】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４Ａ】
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【図６４Ｂ】
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【図６４Ｃ】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８】
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【図７９】
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【図８０】
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【図８１】
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【図８２】
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【図８３】
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【図８４】
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【図８５】
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【図８６】
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【図８７】
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【図８８】
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【図８９】
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【図９０】
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【図９１】
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【図９２】
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【図９３】
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【図９４Ａ】
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【図９４Ｂ】
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【図９４Ｃ】
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【図９４Ｄ】
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【図９４Ｅ】
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【図９５】
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【図９６】
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【図９７Ａ】
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【図９７Ｂ】
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【図９７Ｃ】
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【図９８】
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【図９９Ａ】
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【図９９Ｂ】
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【図９９Ｃ】
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【図９９Ｄ】
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