(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中におけるネオサルトリア・フィシェリ（Neosartoryafischeri）又はジゴサッカロマイセス・バイリ（Zygosaccharomycesbailii）の存在を検出する方法であって、リボゾーム単位の内部転写スペーサー（ＩＴＳ）中に含有される配列として、
ネオサルトリア・フィシェリ（Neosartoryafischeri）に対しては、配列番号９に対応するＩＴＳ１及び配列番号１０に対応するＩＴＳ２を、
ジゴサッカロマイセス・バイリ（Zygosaccharomycesbailii）に対しては、配列番号１１に対応するＩＴＳ１及び配列番号１２に対応するＩＴＳ２をそれぞれプライマーとして用い、該プライマーに特異的にハイブリタイズする試料中の標的微生物類のゲノムＤＮＡを増幅すること特徴とする、食品を汚染する可能性のある耐熱性微生物の検出方法。
【請求項２】
前記増幅をＰＣＲ法によって実施することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記微生物類が、果物、特に苺をベースにした食品中における微生物類であって、その胞子または細胞を遊離させかつ濃縮するために前記果物を含有する試料を前処理してＴａｑポリメラーゼの阻害剤の作用を低減または抑制し、さらに前記胞子または細胞からＤＮＡを抽出することを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
果物を含有する試料をセルラーゼ／ヘミセルラーゼの混合物で処理して液状化し、次に、ＤＮＡを抽出できる細胞を含有する製品を得ることが可能な条件下で濾過及び遠心分離することを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
配列番号９から１２までの配列から選択された配列を有するプライマー。
【請求項６】
ＤＮＡの増幅による検出と請求項３〜４のいずれか１項に記載の方法を実施するためのキットであって、請求項５に記載のプライマーを備えたことを特徴とするキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、食品分野における製品、特に果物を基材にした製品を汚染する可能性のある耐熱性真核微生物の迅速検出方法に関する。
【０００２】
特に対象となる微生物は、２種の糸状菌、即ちビソクラミス・ニヴェア（Byssochlamys nivea）及びネオサルトリア・フィシェリ（Neosartorya fischeri）と、一種の酵母、即ちジゴサッカロマイセス・バイリ（Zygosaccharomyces bailii）である。
【０００３】
これらの食品汚染物は、果物をベースにした製品に出現し、それらに対して、特にビソクラミス・ニヴェア（Byssochlamys nivea）については、人工的なすなわち防腐型の不快な傾向を与え、ネオサルトリア・フィシェリ（Neosartorya fischeri）の増殖は、腐敗とマイコトキシンの出現に関与しており、一方、ジゴサッカロマイセス・バイリ（Zygosaccharomyces bailii）は、ガスの生成を引き起こす。
【０００４】
これらの微生物類は、特に胞子の形態において極めて高い耐熱性を示し、食品業界で適用されている従来の低温殺菌処理の後でさえも生存を維持することができる。
【０００５】
これらの微生物類の存在を検出するための従来の試験は、糸状菌の耐熱性または安息香酸のような当分野で従来使用されている保存剤に対する酵母の耐性を選択要因として利用することによって、選択培地の試料を変化させることからなる。
【０００６】
しかし、この種の検出では培養を必要とし、さらにそれ以上にかなり長い培養、すなわち数日から数週間の培養を要し、汚染されるかもしれない製品を極めて長期間保存する必要があるので、食品分野において実際には使用できないことになる。
【０００７】
従って、これらの微生物類の存在を極めて迅速に検出可能とする検出試験法を求めて研究が進められており、試料採取した製品が存続できるかあるいはその後の段階において処理できるかどうかを極めて迅速に見いだすために、前記試験法は、せいぜい数時間内に実施できなければならない。
【０００８】
本発明は、リボゾーム単位の内部転写スペーサー（ＩＴＳ：Internal Transcribed Spacers）中に含有される１組の配列をプライマーとして用い、該プライマーに特異的にハイブリタイズする試料中の標的微生物類のゲノムＤＮＡを増幅することによって、試料中におけるビソクラミス・ニヴェア（Byssochlamys nivea）、ネオサルトリア・フィシェリ（Neosartorya fischeri）又はジゴサッカロマイセス・バイリ（Zygosaccharomyces bailii）の存在を検出する方法を提供するものであり、特にリボゾーム単位の内部転写スペーサー（ＩＴＳ）中に含有される配列として、
ビソクラミス・ニヴェア（Byssochlamys nivea）に対しては、配列番号１に対応するＩＴＳ１又は配列番号２に対応するＩＴＳ２を、
ネオサルトリア・フィシェリ（Neosartorya fischeri）に対しては、配列番号３に対応するＩＴＳ１又は配列番号４に対応するＩＴＳ２を、
ジゴサッカロマイセス・バイリ（Zygosaccharomyces bailii）に対しては、配列番号５に対応するＩＴＳ１又は配列番号６に対応するＩＴＳ２をそれぞれプライマーとして用い、該プライマーに特異的にハイブリタイズする試料中の標的微生物類のゲノムＤＮＡを増幅すること特徴とするものである。
【０００９】
更に特別には、各ＩＴＳ１及びＩＴＳ２配列内において、ビソクラミス・ニヴェア（Byssochlamys nivea）に対しては配列番号７及び８の配列を、ネオサルトリア・フィシェリ（Neosartorya fischeri）に対しては配列番号９及び１０の配列を、ジゴサッカロマイセス・バイリ（Zygosaccharomyces bailii）に対しては配列番号１１及び１２の配列をそれぞれプライマーとして用いることができる。
【００１０】
使用可能な増幅方法としては、いわゆるＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法が特に使用される。
【００１１】
特に実施例で報告した試験法は、これらのプライマー類が完璧に識別し、かつ所望の微生物類と極めて近接及び関連している微生物類を区別することが可能である。
【００１２】
本発明はまた、食品、特に果物をベースにした食品及び特に苺をベースにした食品中におけるこれら微生物類の存在の検出方法に関し、この場合、その胞子または細胞を遊離させかつ濃縮するために前記果物を含有する試料を前処理してＴａｑポリメラーゼの阻害剤の作用を低減または抑制し、さらに前記胞子または細胞からＤＮＡを抽出する。
【００１３】
さらに特別には、果物を含有する試料をセルラーゼ／ヘミセルラーゼの混合物で処理して液状化し、次に、ＤＮＡを抽出できる細胞を含有する製品を得ることが可能な条件下で濾過及び遠心分離する。
【００１４】
前記試料はＴａｑポリメラーゼの阻害剤を含有することが極めて多いので、希釈によって、または試料をフェノール−クロロフォルムによる処理とアルコールによる沈殿によって、前記阻害剤の活性を低減できる段階を設けることが必要である。
【００１５】
本発明は特に食品業界を目的としているが、食品業界といかなる関係も有していない他の試料に含まれる微生物類を検出するためにも使用可能である。
【００１６】
最後に、本発明は、上述のプライマー及びこれらプライマーを用いた検出キットにも関する。
【００１７】
本発明のその他の特徴及び利点は、下記の実施例から一層明らかとなる。
【００１８】
実施例１−ＤＮＡの抽出及び増幅
Ｉ）真菌菌糸体約5mm2、真菌胞子105または酵母細胞106、で開始し、
−  ネジ栓付きミクロ試験管（1.5mLのエッペンドルフ型）中に、20mMのEDTA、0.8％SDSを含有するpH8.5の50mM Tris緩衝液200μL中の微生物懸濁液にガラスビーズ（直径0.25〜0.5mm）100μLを添加する。
−  最大周波数で1分間、攪拌する。
−  100℃で15分間（沸騰水）、混合物をインキュベーションする。
＊  胞子処理のため、前記攪拌及びインキュベーションを、
−  液体窒素中で凍結し、100℃で5分間沸騰させ、
−  液体窒素中で再凍結し、100℃で10分間沸騰させ、
−  10,000gで1分間遠心分離し（実験台遠心分離）、
−  上清を回収し、
−  水中で上清を10倍に希釈する。
この希釈上清を直接、増幅に使用する。
II）増幅は、20mM Tris−HCl、pH8.5、16mM（NH4）2SO4、2.5mM MgCl2、150μg/mL牛血清アルブミン、0.2μMの各dNTP及び各プライマーオリゴヌクレオチド100μMを含有する最終容量25マイクロリットル中で実施する。Taqポリメラーゼ（BioTaq，Bioprobe systems，フランス）2単位を反応に使用する。増幅反応は、パーキンエルマー2400サーモサイクラー（Perkin Elmer Corp．，USA）中で以下のように実施する。
−  ジゴサッカロマイセス（Zygosaccharomyces）、ビソクラミス（Byssochlamys）及びネオサルトリア（Neosartoria）について、
・  94℃で15秒間
・  58℃で10秒間
・  72℃で20秒間
このサイクルを30回繰り返す。72℃において5分間の末端伸張を行う。
III）1×TBE緩衝液、1μg/mLエチジウムブロマイド、0.8％アガロースの組成を有する電気泳動ゲル上で泳動させた後、得られた産物をＵＶで可視化する。
【００１９】
実施例２
検出対象の菌株に近接した種々の菌株における本発明の方法を用いて得られた結果は、上述の各プライマーによって良好に識別されることを示しており、下記の通りである。
【００２０】
使用したプライマーは、
−  ビソクラミス・ニヴェア（Byssochlamys nivea）について、配列番号７及び８
−  ネオサルトリア・フィシェリ（Neosartorya fischeri）について、配列番号９及び１０
−  ジゴサッカロマイセス・バイリ（Zygosaccharomyces bailii）について、配列番号１１及び１２
である。
【００２１】
A.fumigatusは、N.fischeriの無性形態であるので前記プローブに反応するということに注意されたい。
【００２２】
ネオサルトリア・フィシェリ（Neosartoria fischeri）に特異的なプライマーオリゴヌクレオチド：
0004499836.tif 000002
0004499836.tif 000003
0004499836.tif 000004
【００２３】
これらは、パリ国立歴史博物館から得られた菌株である。
【００２４】
ジゴサッカロマイセス・バイリ（Zygosaccharomyces bailii）に特異的なプライマーオリゴヌクレオチド：
0004499836.tif 000005
0004499836.tif 000006
【００２５】
これら菌株の由来：
DBVPG：イタリア国ペルージア植物生物学研究所（Dipartemento di Biologia Vegitale Perugia，Italie）
H：ソシエテ・ヒューデベルト（Societe Heudebert）
M：パリ国立歴史自然博物館（Museum National d’Historie Naturelle de Paris）
MUCL：ルーヴァン・カソリック大学菌培養コレクション（Mycotheque de l’Universite Cathorique de Louvains）
P：ソシエテ・ペルノ・リカール（Societe Pernod-Ricard）
SIAS：ソシエテ・シアス・フランス（Societe SIAS france）
【００２６】
【配列表】
（１）一般的情報
（ｉ）出願人
（Ａ）氏名：ＵＮＩＲ
（Ｂ）通り：４６  ＲＵＥ  ＤＵ  ＢＡＣ
（Ｃ）市：パリ
（Ｅ）国：フランス
（Ｆ）郵便番号：７５００７
（iii）配列数：１２
（２）配列番号１についての情報
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：塩基対１８６組
（Ｂ）型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖：一重鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）
（xi）配列記載：配列番号１
0004499836.tif 000007
（２）配列番号２についての情報
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：塩基対１８７組
（Ｂ）型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖：一重鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）
（xi）配列記載：配列番号２
0004499836.tif 000008
（２）配列番号３についての情報
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：塩基対１８３組
（Ｂ）型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖：一重鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）
（xi）配列記載：配列番号３
0004499836.tif 000009
（２）配列番号４についての情報
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：塩基対１７６組
（Ｂ）型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖：一重鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）
（xi）配列記載：配列番号４
0004499836.tif 000010
（２）配列番号５についての情報
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：塩基対２７９組
（Ｂ）型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖：一重鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）
（xi）配列記載：配列番号５
0004499836.tif 000011
（２）配列番号６についての情報
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：塩基対２３７組
（Ｂ）型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖：一重鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）
（xi）配列記載：配列番号６
0004499836.tif 000012
（２）配列番号７についての情報
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：塩基対２５組
（Ｂ）型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖：一重鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）
（xi）配列記載：配列番号７
0004499836.tif 000013
（２）配列番号８についての情報
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：塩基対２５組
（Ｂ）型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖：一重鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）
（xi）配列記載：配列番号８
0004499836.tif 000014
（２）配列番号９についての情報
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：塩基対２５組
（Ｂ）型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖：一重鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）
（xi）配列記載：配列番号９
0004499836.tif 000015
（２）配列番号１０についての情報
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：塩基対２７組
（Ｂ）型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖：一重鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）
（xi）配列記載：配列番号１０
0004499836.tif 000016
（２）配列番号１１についての情報
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：塩基対２５組
（Ｂ）型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖：一重鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）
（xi）配列記載：配列番号１１
0004499836.tif 000017
（２）配列番号１２についての情報
（ｉ）配列特性
（Ａ）長さ：塩基対２５組
（Ｂ）型：ヌクレオチド
（Ｃ）鎖：一重鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ii）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）
（xi）配列記載：配列番号１２
0004499836.tif 000018