(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
流路と、前記流路を横切るガウス型の第一光線プロフィール及び前記流路に沿った非ガウス型の第二光線プロフィールを有した光線を発する光源と、を備えた、コンピュータと通信可能な測定装置と、
前記コンピュータにより読み取り可能であり、前記コンピュータにより実行可能なコンピュータ指令を保存するメモリー媒体と、
を含んで構成され、
前記コンピュータ指令が、
（ａ）前記流路に沿った前記非ガウス型の第二光線プロフィールを示すテンプレートを作ること、
（ｂ）前記測定装置で測定した蛍光サンプルイベントを捕捉すること、
（ｃ）前記サンプルイベントを前記テンプレートに対して時間的に位置合わせすること、
（ｄ）前記サンプルイベントを前記テンプレートに対して正規化すること、
（ｅ）前記正規化したサンプルイベントを積分し、前記サンプルイベント中の蛍光の総量を決定すること、
を含む、診断システム。
【請求項２】
前記光源が前記光線を発しているときに、
前記テンプレート作成指令（ａ）が、
前記光線を通過するように、１００％濃度の少なくとも一つの蛍光染料を含む少なくとも一つのミクロスフィアを流すこと、
前記少なくとも一つのミクロスフィアに関して少なくとも一つの蛍光強度グラフをプロットすること、
前記少なくとも一つの蛍光強度グラフの平均を含むように前記テンプレートを確定すること、を含み、
前記テンプレートは、その下の領域が、単位時間当たりの蛍光強度の最大量を表す、
請求項１に記載の診断システム。
【請求項３】
前記テンプレートが少なくとも一つのミクロスフィアのサイズおよび流速に関係する、請求項１に記載の診断システム。
【請求項４】
前記時間的な位置合わせ指令（ｃ）が、位置合わせのための最少二乗法を適用して行われる、請求項１に記載の診断システム。
【請求項５】
前記測定装置がフローアナライザを有する、請求項１に記載の診断システム。
【請求項６】
前記光源がレーザダイオードを有し、
該レーザダイオードの光線プロフィールが、前記流路と位置合わせされた主要軸を有する、請求項５に記載の診断システム。
【請求項７】
コンピュータにより読み取り可能であり、該コンピュータにより実行可能なコンピュータ指令を保存したメモリー媒体であって、
前記コンピュータは、流路に光線を照射する光源を有する測定装置と通信可能であり、
前記光線が、前記流路を横切るガウス型の第一光線プロフィール及び前記流路に沿った非ガウス型の第二光線プロフィールを有し、
前記コンピュータ指令は、
（ａ）前記流路に沿った前記非ガウス型の第二光線プロフィールを示すテンプレートを作ること、
（ｂ）前記測定装置で測定した蛍光サンプルイベントを捕捉すること、
（ｃ）前記サンプルイベントを前記テンプレートに時間的に位置合わせすること、
（ｄ）前記サンプルイベントを前記テンプレートに対して正規化すること、
（ｅ）前記正規化したサンプルイベントを積分し、前記サンプルイベント中の蛍光の総量を決定すること、
を含む、メモリー媒体。
【請求項８】
前記テンプレート作成指令（ａ）が、
前記光線を通過するように、１００％濃度の少なくとも一つの蛍光染料を含む少なくとも一つのミクロスフィアを流すこと、
前記少なくとも一つのミクロスフィアに関して少なくとも一つの蛍光強度グラフをプロットすること、
前記少なくとも一つの蛍光強度グラフの平均を含むように前記テンプレートを確定すること、を含み、
前記テンプレートは、その下の領域が、単位時間当たりの蛍光強度の最大量を表す、
請求項７に記載のメモリー媒体。
【請求項９】
前記テンプレートが少なくとも一つのミクロスフィアのサイズおよび流速に関係する、請求項７に記載のメモリー媒体。
【請求項１０】
前記時間的な位置合わせ指令（ｃ）が、位置合わせのための最少二乗法を適用して行われる、請求項７に記載のメモリー媒体。
【請求項１１】
流路に光線を照射する光源を備えた測定装置における、前記光源の光線プロフィールを改良する方法であって、
前記光線プロフィールが、前記流路を横切るガウス型の第一光線プロフィール及び前記流路に沿った非ガウス型の第二光源プロフィールを有し、
（ａ）前記流路に沿った前記非ガウス型の第二光線プロフィールを示すテンプレートを作ること、
（ｂ）前記測定装置で測定した蛍光サンプルイベントを捕捉すること、
（ｃ）前記サンプルイベントを前記テンプレートに時間的に位置合わせすること、
（ｄ）前記サンプルイベントを前記テンプレートに対して正規化すること、
（ｅ）前記正規化したサンプルイベントを積分し、前記サンプルイベント中の蛍光の総量を決定すること、
を含む方法。
【請求項１２】
前記テンプレート作成指令（ａ）が、
前記光線を通過するように、１００％濃度の少なくとも一つの蛍光染料を有する少なくとも一つのミクロスフィアを流すこと、
前記少なくとも一つのミクロスフィアに関して少なくとも一つの蛍光強度グラフをプロットすること、
前記少なくとも一つの蛍光強度グラフの平均を含むように前記テンプレートを確定すること、を含み、
前記テンプレートは、その下の領域が、単位時間当たりの蛍光強度の最大量を表す、
請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記テンプレートが少なくとも一つのミクロスフィアのサイズおよび流速に関係する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記時間的な位置合わせ指令（ｃ）が、位置合わせのための最少二乗法を適用して行われる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記測定装置は、前記光源としてレーザダイオードを有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
サンプルを流す流路を画定するフローセルと、
前記サンプルを照射し、前記流路を横切るガウス型の第一光線プロフィール及び前記流路に沿った非ガウス型の第二光線プロフィールを有する少なくとも一つの光源と、
を含んで構成される、フローアナライザ。
【請求項１７】
前記少なくとも一つの光源及び前記フローセルに対して少なくとも一つの光学的検知器をさらに備える、請求項１６に記載のフローアナライザ。
【請求項１８】
前記少なくとも一つの光学的検知器が、アバランシェフォトダイオード、光電子増倍管およびｐ−ｉ−ｎフォトダイオードのうちの一つを有する、請求項１７に記載のフローアナライザ。
【請求項１９】
前記光学的検知器と接続された少なくとも一つのＡ−Ｄ変換器と、
前記少なくとも一つのＡ−Ｄ変換器を制御する少なくとも一つのデジタル信号プロセッサと、
をさらに備える、請求項１７に記載のフローアナライザ。
【請求項２０】
前記少なくとも一つの光源として、少なくとも一つのレーザダイオードを備える、請求項１６に記載のフローアナライザ。
【請求項２１】
少なくとも一つの光源と、流路を形成するフローセルと、を含んで構成されるフローアナライザにおいて、光線プロフィール特性を改良する方法であって、
前記流路を横切るガウス型の第一光線プロフィール及び前記流路に沿った非ガウス型の第二光線プロフィールを有するように、前記少なくとも一つの光源を前記流路に対して位置決めする、方法。
【請求項２２】
前記少なくとも一つの光源として、少なくとも一つのレーザダイオードを有する、請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【関連出願】
本出願は、１９９８年５月１４日に出願された米国仮特許出願シリアルナンバー６０／０８５，５２２の優先権を主張する。
【０００２】
【発明の属する技術分野】
本発明は一般的にダイオードレーザを有する測定装置に関する。より詳細には、本発明は改良されたビームプロフィールを提供するように配向されたダイオードレーザを有する測定装置に関する。
【０００３】
【発明背景】
体外診断分析は、２０年以上の間ミクロスフィアを使用して行われてきた。ミクロスフィアとしてマイクロ粒子、ビーズ、ポリスチレンビーズ、マイクロビーズ、ラテックス粒子、ラテックスビーズ、蛍光ビーズ、蛍光粒子、着色粒子および着色ビーズがある。ミクロスフィアは分子反応の媒介物として働く。流動細胞光度測定法に使用するためのミクロスフィアはテキサス州オースティンのルミネックス株式会社等のメーカーから入手することが可能である。
【０００４】
例証となるミクロスフィアとその製造方法は、例えば、米国特許出願番号０９／２３４，８４１号「Microparticles with Multiple Fluorescent Signals」、Mark B. Cahndler, Don J. Chandler、あるいは、米国特許出願番号０９／１７２，１７４号「Precision Fluorescently Dyed Particles and Method of Marking and Using Same」、Don J. Chandler, Van S. Chandler, Beth Lambertに見ることができる。一例として、もしユーザーがＩｇＧ、Ａ、Ｍ、アイソタイプ分析を行った場合、ユーザーはビーズのセットとしてルミネックス８０７０ＩｇＧ、８０６０ＩｇＡおよび８０５０ＩｇＭビーズセットを選択する。
【０００５】
ミクロスフィアはその直径が１０ナノメーターから１００ミクロンであって均一であり、高度に球形をしている。ビーズベース分析は標準「ストリップテスト」において実現化されており、当該分析において、捕捉反応物質でコーティングされたビーズは、紙のストリップ上のある位置に固定され、他の反応物質を有するビーズは、同じ紙のストリップの他の位置を占拠する。標的の分析物がストリップに導入されると、第一のタイプのビーズは分析物に付着して流れるかまたは第二のタイプと混ざり、大抵は色の変化を発生し、そのことが標的の分析物の存在を示す。
【０００６】
より最近のビーズベースの分析はフローサイトメトリーを使用し、対象となる標的分析物との反応を測定する。従来のフローサイトメーターにおいては、図１に示すように、表面に反応物を有するサンプル細胞またはミクロスフィアを含んだサンプル生体液が、サンプルチューブからシース流の流れの中央に導入される。サンプル流体は、フローセルまたはキュベット１９１０の中央もしくは中央近傍に注入される。流体力学的フォーカシングとして知られているこの行程により、細胞は測定点の中央に再現性良く移送される。通常は、細胞またはミクロスフィアはフローセル中で懸濁状態にある。
【０００７】
レーザダイオード１９００は、懸濁物の流れによって細胞またはミクロスフィアがレーザビーム中を通過するように焦点を合わせる。従来のフローサイトメーターにおけるレーザダイオードは、円形の光線を楕円形の光線に成形してフローセル１９１０に焦点を合わせることが求められる。図１に見られるように、この楕円形の光線は、レーザダイオード１９００とフローセル１９１０の間に置かれた光線成形光学装置１９６０を使用して、円形の光線から成形される。
【０００８】
流れの中の対象物がレーザビームに打たれたとき、ある信号が検知器により検知される。この信号は前方散乱光強度と側方散乱光強度を有する。図１に示したフローサイトメーターにおいて、散乱光検知器１９３０、１９３２は、フローセル１９１０に対してレーザダイオード１９００の反対側に置かれ前方散乱光強度を測定し、また、流体の流れ／レーザビームの交差位置に合わせてレーザの側方に置かれて側方散乱光強度を測定する。前方散乱光強度は各細胞のサイズに関する情報を提供し、側方散乱光強度は各細胞の相対サイズと屈折率に関する情報を提供する。
【０００９】
米国特許第４，２８４，４１２号（HANSEN et al.）に開示されているような公知のフローサイトメーターは、血球の小分類を自動的に同定するのに使用されてきた。同定は、蛍光を発する抗体に反応する細胞表面上の抗原性決定基に基づいていた。サンプルは焦点を合わせたコヒーレント光により発光し、そして、前方散乱光、直角散乱光及び蛍光が検知されて細胞を同定するために使用される。
【００１０】
米国特許第５，７４７，３４９号（VAN DEN ENGH et al.）に記載されているように、蛍光染料を含ませたビーズである蛍光性ミクロスフィアを使用するフローサイトメーターもある。ミクロスフィアの表面は、サンプル流体中の細胞上のレセプタ、抗原、抗体等に引きつけられるタグでコーティングされる。したがって、蛍光染料を含んだミクロスフィアは特に細胞の成分と結合する。二つ以上の染料が同時に使用されることもあり、各染料により特定の状態を検知することができる。
【００１１】
通常、染料はレーザダイオード１９００からのレーザビームにより励起され、そして長波長の光を放つ。図１は、フローセル１９１０から増倍型光電管およびフィルタセット１９５６、１９５８、１９５９と側方散乱光検知器１９３２まで光を導くビームスプリッタ１９４２、１９４４、１９４６を使用する従来技術のフローサイトメーターを示す。このフローサイトメーターは、鏡１９７０を使用して前方散乱光を前方散乱光検知器１９３０に反射している。
【００１２】
標準のフローサイトメトリーによる競合阻害分析において、例えば、抗体はミクロスフィアと共有結合する。これらのビーズは蛍光染色された抗原と一緒に生物学的サンプルと混合される。対象の抗原が存在していれば、蛍光染色された抗原はビーズ上の場所を争い、無ければ、蛍光染色された抗原がビーズを覆う。フローサイトメトリーによる試験に際して、対象の抗原の存在は、対象の抗原を含むサンプルに関した蛍光放射の著しい減少により示される。
【００１３】
しかし、これら二つのタイプのビーズベースの分析の間には大きな違いがある。前者は簡単で廉価であるが、対象分析物のサンプル濃度が高くて粗い分析に限定される。後者は強力で高感度であるが、分析を行いその結果を解釈するのに１００，０００ドルの装置と高度に訓練された技術者を必要とする。
これら二つのタイプのビーズベース分析の間を橋渡しする商業的に入手できる装置はないように思われる。フローサイトメトリー分析の感度および柔軟性とストリップ分析の簡便性および低コストとを結びつける装置は、体外診断の技術を進歩させると考えられる。
【００１４】
フローサイトメーターのコストとサイズの大部分はレーザに起因すると考えられる。実際に市販されているフローサイトメーターのすべてに、励起源としてアルゴンイオン４８８ｎｍレーザが使用されている。それは大きく、数立方フィートを占め、大きな電源を必要とし、安定性を維持するために常時強制空冷をする必要がある。他の小さいより安価なレーザがあるが、フローサイトメトリーには適さないと思われる。例えば、色素レーザは非常に急激に燃え尽きる。Ｈｅ−Ｃｄレーザは非常に雑音が多い。周波数二重レーザは温度に敏感であり不安定である。Ｈｅ−Ｎｅレーザはかなり効果的であるが、その赤色出力は雑音が多い。
【００１５】
上記レーザの欠点を考慮して、レーザダイオードの長所が評価される。しかし、ダイオードレーザの問題は、その光線のプロフィールである。例えば、図２ａは標準のレーザダイオードのサンプル光線のプロフィールを示す。レーザダイオードの光線プロフィールは、一例として図２ｂに示されるような標準アルゴンイオンレーザの光線プロフィールと比較して非常に不均一である。
【００１６】
この不均一性は、粒子と細胞の間の実質的に均一な励起に依存する蛍光測定に関連するフローアナライザにとって大きなマイナス要因になると考えられる。この障害について図３を参考にして説明することができる。図３は、一例として、図２に示すレーザダイオードの光線プロフィールの主要軸の二次元グラフである。図３に示す光線プロフィールの主要軸がフローアナライザの流路を横切って置かれると、流路中の細胞またはミクロスフィア等の対象物は、同等レベルの光線を受けないことになる。図３のグラフ上の点１０、１２、１４、１６および１８は、光線プロフィールにおいて雑然と変わるエネルギーレベルを示している。
【００１７】
ミクロスフィアが流路を通過するときに、光線プロフィールのグラフの例えば点１０でレーザダイオードの光線を受けると、同じミクロスフィアが流路を通過し点１４でレーザダイオードの光線を受けた場合よりも、大きいエネルギーを得ることになると考えられる。したがって、光線プロフィール上の低いエネルギーレベルを有する点を通過する高い蛍光強度を有するミクロスフィアと、光線プロフィール上の高いエネルギーレベルを有する点を通過する低い蛍光強度を有するミクロスフィアと、を区別することは不可能と考えられる。
【００１８】
アルゴンレーザと共にダイオードレーザを第二のレーザとして有する市販のフローサイトメーターは、ダイオードレーザの光線プロフィールの変化の高い係数を当然のこととしている。さらにレーザダイオードが、同じ光線プロフィールを有する必要はない。実際に、例えば共振空胴における僅かな変化さえ、それぞれの光線プロフィールの形に影響する。このように、既存のフローサイトメーターのダイオードレーザは、同じ型の他のフローサイトメーターのダイオードレーザと同じ光線プロフィールを持つ必要がない。
【００１９】
このように、一例として、図１に示す市販のフローサイトメーターは、プリズム拡張器、光線成形拡張器およびマイクロレンズアレイ等の光線成形光学装置を有する。フローサイトメーターのダイオードレーザで従来技術で行おうとしていたことは、光学的に光線を集め二つの外側のピークを中心に導くことを意図したものであった。
【００２０】
そのような光学装置は不必要に高価であり、フローサイトメーターの製造を複雑にし、装置の全体のコストを高くすると考えられる。さらに、高価で複雑な光線成形光学装置が使用されるのにも拘わらず、結果として得られる光線のプロフィールは、図４に示すように未だ満足できるものではない。図４の光線プロフィールは図２ａに示されるものよりは良好であるが、例えば、流路を横切るエネルギー強度において未だ１０〜１５パーセントの変化を発生している。
【００２１】
上記の点から、不均一なダイオードレーザの光線プロフィールを調節することにより、散乱光と蛍光の精確な測定を提供するための方法および／または装置を提供することが望ましいと考えられる。
【００２２】
また、レーザダイオードと光学的に協同するまたは接続した光線成形光学装置のないそのような方法および／またはシステムを提供することが望ましいと考えられる。
【００２３】
さらにまた、フローアナライザを有するそのような方法および／またはシステムを提供することが望ましいと考えられる。
【００２４】
【課題を解決するための手段】
本発明の特徴と利点は、レーザダイオード等の光源の不均一な光線プロフィールを調整することにより、散乱光と蛍光の精確な測定を提供するための方法および／または装置を提供することである。
【００２５】
また、本発明の特徴と利点は、レーザダイオードおよび／または光学的に協同するまたは接続した光線成形光学装置のないそのような方法および／またはシステムを提供することである。
【００２６】
また、本発明の特徴と利点は、フローアナライザを有するそのような方法および／またはシステムを提供し、散乱光およびミクロスフィアまたはビーズから放射される蛍光の精確な測定を行うことである。
【００２７】
本発明の特徴と利点は、新規な診断システムを提供することである。本発明に係る診断システムは、流路とレーザダイオード等の光源を有する測定装置を備え、コンピュータと通信可能である。光源は、流路を横切るガウス型の第一光線プロフィールと流路に沿った非ガウス型の第二光線プロフィールとを有する。また、診断システムは、コンピュータにより読み取り可能であり、コンピュータにより実行可能なコンピュータ指令を保存するメモリー媒体を含む。コンピュータ指令は、次に示す連続の、非連続の、または独立のステップを有する。光源の光線プロフィールに関係したテンプレートが作られる。測定装置により蛍光サンプルが捕捉される。サンプルは時間的にテンプレートに位置合わせされる。サンプルはテンプレートに対して正規化される。正規化されたサンプルは積分されてサンプル中の蛍光の総量が決定される。
【００２８】
任意に、テンプレートはミクロスフィアのサイズおよび／または流速に関係する。任意に、時間的な位置合わせステップは位置合わせのための最少二乗法を使用することを含む。
【００２９】
任意に、測定装置はフローアナライザを有する。
【００３０】
フローアナライザは、プリズム拡張器、マイクロレンズアレイ、光線拡張器等の、光源と光学的に協同する光線プロフィール成形要素が不要である。また、フローアナライザは、流路を有し、動作時に、光源の光線プロフィールが流路に位置合わせされた主要軸を有する。また、フローアナライザは、サンプルイベントに対して蛍光強度ピークを検知するためのピーク検出器が不要である。
【００３１】
さらに、この発明の特徴と利点は、流路に光線を照射する光源を有する測定装置と通信可能であるコンピュータにより読み取り可能であり、このコンピュータにより実行可能なコンピュータ指令を保存したメモリー媒体を提供する。その光源は、流路を横切るガウス型の第一光線プロフィール及び流路に沿った非ガウス型の第二光線プロフィールを有する。コンピュータ指令は、次に示す連続の、非連続の、または独立のステップを有する。流路に沿った光源の第二光線プロフィールに関係したテンプレートが作られる。測定装置により蛍光サンプルが捕捉される。サンプルは時間的にテンプレートに位置合わせされる。サンプルはテンプレートに対して正規化される。正規化されたサンプルは積分されてサンプル中の蛍光の総量が決定される。
【００３２】
任意に、テンプレートはミクロスフィアのサイズおよび／または流速に関係する。任意に、時間的な位置合わせステップは位置合わせのための最少二乗法を使用することを含む。
【００３３】
さらに、この発明の他の特徴と利点は、測定装置におけるレーザダイオード等の光源の光線プロフィールを改良する方法を提供することにある。測定装置は流路を備え、その光源は、流路を横切るガウス型の第一光線プロフィールと流路に沿った非ガウス型の第二光線プロフィールとを有する。この方法は、次に示す連続の、非連続の、または独立のステップを有する。光源の光線プロフィールに関係したテンプレートが作られる。測定装置により蛍光サンプルが捕捉される。サンプルは時間的にテンプレートに位置合わせされる。サンプルはテンプレートに対して正規化される。正規化されたサンプルは積分されてサンプル中の蛍光の総量が決定される。
【００３４】
任意に、テンプレートはミクロスフィアのサイズおよび／または流速に関係する。任意に、時間的な位置合わせステップは位置合わせのための最少二乗法を使用することを含む。
【００３５】
さらに、この発明の他の特徴と利点は、流路を画定するフローセルを有するフローアナライザを提供することにある。このフローアナライザは、流路を横切るガウス型の第一光線プロフィール及び流路に沿った非ガウス型の第二光線プロフィールを有するレーザダイオードのような一つ以上の光源を有する。当該フローアナライザは、一つ以上の光源と光学的に協同する光線成形光学的要素またはアセンブリーが不要である。
【００３６】
また、フローアナライザは、サンプルイベントの蛍光強度ピークを検知するためのピーク検出器が不要である。任意に、流れ分析装置は、さらに、一つ以上のレーザダイオード等の光源及びフローセルと協同する一つ以上の光学的検知器を有する。一つ以上の光学的検知器は、アバランシェフォトダイオード、光電子増倍管、またはｐ−ｉ−ｎフォトダイオードを有する。
【００３７】
任意に、フローアナライザは、さらに、各光学的検知器に接続された一つ以上のＡ−Ｄ変換器を有する。任意に、フローアナライザは、また、一つ以上のＡ−Ｄ変換器を制御する一つ以上のデジタル信号プロセッサを有する。
【００３８】
さらに、本発明の他の特徴と利点は、一つ以上の光源と、流路を形成するフローセルと、を有するフローアナライザにおいて、光線プロフィール特性を改良する方法を提案することである。当該方法は、流路を横切るガウス型の第一光線プロフィール及び流路に沿った非ガウス型の第二光線プロフィールを有するように、一つ以上の光源を流路に対して位置決めすることを含む。
【００３９】
この新規な方法において、フローアナライザは、一つ以上の光源に接続される光線成形要素またはアセンブリが不要である。任意に、一つ以上の光源は一つ以上のレーザダイオードを有する。
【００４０】
以下に続く詳細な説明がよりよく理解されるように、また、この技術分野に対する貢献がよりよく認められるように、本発明の比較的重要な特徴を広く概説した。もちろん、以下に記載され、また、特許請求の範囲の主題を構成する本発明の他の特徴がある。
【００４１】
この点に関して、本発明の少なくとも一つの実施形態を説明する前に、本発明は以下の説明または図面に記載された構造の詳細と構成要素の配置に限定されるものではないということが、理解されるべきである。本発明は、他の実施形態が可能であり様々な方法で実施され得る。そしてここで使用されている語法と用語は、記載の目的に使用されたものであり限定のために使用されたものではないということも理解されるべきである。
【００４２】
このように、当業者は、この開示に基づく技術的思想を、本発明の色々な目的を実施するために他の構造、方法とシステムを設計するための基礎として使用できることを認識すべきである。したがって、特許請求の範囲は、本発明の精神と範囲から逸脱しない限り相当する構造を含むと解釈されることが重要である。
【００４３】
さらに、上記概要により、米国特許商標庁および一般公衆、そして特にこの技術分野の特許と法律用語または語法に不慣れな科学者、技術者と同業者は、簡単な調査により本願の技術的開示の性質と本質を速やかに特定することができる。上記概要は特許請求の範囲に特定される本願の発明を限定する意図を有していないし、決して本発明の範囲を限定する意図を有していない。
【００４４】
これらは本発明の他の目的とともに、本発明を特徴づける新規性の様々な特徴とともに本開示の一部を構成する特許請求の範囲中の特異性とともに指摘される。この発明、それを利用することにより達成されるその作用の利点と特別な目的がよりよく理解されるために、本発明の適した実施形態を図示した添付図面を参考として添付する。
【００４５】
（注釈および専門語）
【００４６】
下記詳細な説明はコンピュータまたはコンピュータのネットワークで実施されるプログラムの手順に特有の語で記載される。これらの手続き上の記載と表現は、同業者により最も効果的に彼らの仕事の内容を他の同業者に伝えるのに使用される手段である。
【００４７】
手順はここでそして一般的に望ましい結果へ導く首尾一貫した連続のステップである。これらのステップは物理量の物理的操作を必要とするものである。通常、そして必ずしもでないが、これらの量は、保存、伝送、結合、比較およびさもなければ操作される電気的または磁気的信号の形を取る。これらの信号をビット、値、要素、記号、特徴、用語、数字等として指示することは時として便利である。しかしながら、これらの総てまたは類似の用語は適当な物理量に関連しこれらの量に使用される便利なラベルに過ぎないことに注意しなければならない。
【００４８】
さらに、実行される操作は時々作業者によって行われる通常精神的な作業に関する追加比較等の用語として示される。このような作業者の可能性は、どのような場合にも、本発明の一部を形成するここに記載するどのような操作に置いても必要でなくまた望ましくない。運転は機械操作である。本発明の運転を行うための有用な機械は汎用デジタルコンピュータまたは類似の装置である。
【００４９】
【発明の実施の形態】
ダイオードレーザの光線プロフィールは、測定装置の流路に沿ったガウス型であり、流路を横切って複数のピークと谷を有することを上述した。
図５に図示しているように、光線プロフィールのピークと谷部が流路に沿うように且つ光線プロフィールのガウス型部分が流路を横切るように向けてレーザダイオードを置くとする。なお、図５の矢印は流路の方向を示す。例えば、このような光線プロフィールの配向を得るために、レーザダイオードは、図２ａに示されるようなガウス型光線プロフィールが流路に沿っている向きから、９０゜回転される。なお、図２ａの矢印は流路の方向を示す。予期せずそして好都合なことに、得られた光線は、流路に沿ってそして流路を横切っての両者にガウス型であるアルゴンイオンレーザと実質的に同じ軸外特性を発揮した。得られた光線のプロフィールを図６に例として示す。特に参照番号２０は流路を横切った光線プロフィールを示し、参照番号２２は流路に沿った光線プロフィールを示す。
【００５０】
高周波成分の存在にも拘わらず、フローサイトメトリーで使用される実質的に均一な標準ミクロスフィアは、実質的にまたは精確に光線プロフィール２２の複合波形を再現することが発見された。また、光線プロフィール２２に対する反射波形は、関連する蛍光放射波形に実質的にまたは精確に同じであることが発見された。
【００５１】
図７に、一例として、本発明による測定装置を示す。例えば、測定装置は標準のフローアナライザを有する。標準レーザダイオード１００は、動作時に、標準フローセル１１０中の流路を流れる流体を貫通する光線を放射する。レーザダイオード１００は、その光線プロフィールが、フローセル１１０の流路を横切ってガウス型であり且つ流路に沿って任意の未知のプロフィールとなるように置かれる。他の方法として、レーザダイオードは、光線プロフィールがフローセル１１０の流路を横切ってガウス型であり且つ流路に沿って任意の未知のプロフィールとなるように配置可能な標準的光源に置き換えることができる。任意に、測定装置はそのような光源を有する標準的な装置を有する。
【００５２】
反射した光および／または蛍光放射は、一つ以上の標準光学的検知器１２０、１２２、１２４、１２６、１２８により検知される。任意に光学的検知器は、一つ以上の蛍光分析用の標準光学的検知器１２０、１２２、１２４を有する。加えて、または他の方法として、任意に光学的検知器は標準側方散乱光検知器１２６および／または標準前方散乱光検知器１２８を有する。
【００５３】
光学的検知器１２０、１２２、１２４、１２６、１２８の出力は、一つの標準Ａ−Ｄ変換器１４０または各光学的検知器用のそれぞれのＡ−Ｄ変換器により処理される。各Ａ−Ｄ変換器１４０の出力は、一つ以上の標準デジタル信号プロセッサ１５０または他の標準データ処理装置に入力される。
【００５４】
本発明に係る測定装置は、任意に標準二色性ミラーのような一つ以上のビームスプリッタ１３０、１３２を有し、反射光および／または蛍光放射光を一つ以上の上記光学的検出器に導く。任意に、本発明に係る測定装置の小型化を容易にするために、一つ以上の標準ミラー１６０、１６２が好都合に使用され、光をビームスプリッタ１３０、１３２およびまたは光学的検知器１２０、１２２、１２４、１２６、１２８に導く。
【００５５】
図示したように、この発明において反射光および放射光は、アバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）、標準光電子増倍管、そして標準ｐ−ｉ−ｎフォトダイオード等の標準光学的検知器１２０、１２２、１２４、１２６、１２８により測定される。例えば、アバランシェフォトダイオードの出力は、任意に、連続的に電圧に変換され、次いで、デジタル信号プロセッサ（ＤＳＰ）１５０の制御の下でＡ−Ｄ変換器１４０により測定される。
【００５６】
例えば、この発明の運転の方法は図８を参考にして記載される。測定装置のレーザダイオードの光線プロフィールに関連するテンプレートを作る。図に示したように、主要軸に沿ったレーザダイオードの光線プロフィールを表現する複合波形のイメージが、テンプレートとしてＤＳＰのメモリー中に保存される。例えば、ステップＳ１０において、レーザダイオード１００は、その光線プロフィールが測定装置の流路を横切ってガウス型になり且つ流路に沿って任意に未知のプロフィールになるように置かれる。ステップＳ２０において、一つ以上の１００％濃度の蛍光染料を含む一つ以上の均一なサイズの参照ミクロスフィアが流路に沿ってフローセル１１０を通り、レーザダイオードの光線を受ける。ステップＳ３０において、一つ以上の参照イベントが、各ミクロスフィアについて、Ｘ軸を時間単位、Ｙ軸を蛍光強度の単位とした二次元グラフ上にプロットされる。グラフの軸は逆にすることも可能である。ステップＳ４０において、レーザダイオード１００に対するテンプレートが、時間合わせされた一連の参照イベントの蛍光強度プロットの平均値を含むように画定される。
【００５７】
ステップＳ５０において、蛍光サンプルイベントが測定装置を使用して捕捉される。例えば、フローセル１１０中を流れる生体サンプルに含まれた対象分析物に特有の反応物でコーティングされたミクロスフィアが、レーザダイオード１００の光線を通過する。当該ミクロスフィアは、参照ミクロスフィアに使用されたのと同じ一つ以上の蛍光染料を有する。通過するミクロスフィアは、サンプルイベントの複合波形の高周波成分を記録するのに充分な非常に速いレートでサンプリングされる。なお、レーザダイオードの光線を通過する各ミクロスフィアにつき一つ以上のサンプルイベントが処理されることで、本発明に従い実施される分析の精度が向上することを理解するべきである。また、ミクロスフィアについて上述したが、励起されたときに、例えばレーザダイオード等の光源の光線プロフィールを実質的に再現した蛍光放射強度プロットを得られる標準的フルオロフォアが、この発明に使用するのに有効で適している。
【００５８】
ステップＳ６０において、サンプルイベントは、テンプレートに時間的に位置合わせされるかまたは重ねられる。例えば、最少二乗フィット法を使用してイベントとテンプレートを時間的に位置合わせする。ステップＳ７０において、サンプルイベントは正規化され、テンプレートと比較される。ステップＳ８０において、正規化されたサンプルイベントが積分されてサンプル中の総蛍光量が決定される。この方法によれば、一例として、８０％濃度の蛍光染料を有するミクロスフィアがサンプルイベントを生成したとすると、それにより時間軸に沿う実質的に全点がテンプレートに対して８０％の蛍光強度を有する。
【００５９】
任意に、例えば異なるサイズのビーズおよび／または異なる流速を表す一つ以上のテンプレートが比較のために保存される。任意に、サンプル曲線とテンプレートの間に良好な適合がない場合、イベントは拒否される。良好な適合があった場合、選択されたテンプレートは他のチャンネルに適用される。正規化因子は、例えば散乱および／または蛍光強度の一次関数である。
【００６０】
この波形マッチング技術を使用することにより、一つ以上のダイオードレーザを使用可能なフローアナライザで、１００，０００ドルの標準的装置によって得られるのと同じ信頼性のある測定を達成することができることが判明した。図示するように、この低コスト装置には沢山の特にビーズベースの分析の分野における応用がある。
【００６１】
図１０は、この発明のコンピュータを備えた実施態様によるコンピュータ処理を行うための主中央処理ユニットの図である。ここで記載される手続きは、例えば、コンピュータまたはコンピュータのネットワークで実行されるプログラム手続きに特有の言葉で示される。
【００６２】
図９の外観図で見ると、参照番号９００で示されるコンピュータシステムは、ディスクドライブ９０４と９０６を有するコンピュータ９０２を有する。ディスクドライブを指示する番号９０４と９０６は、コンピュータシステムに収容され得るディスクドライブの数を象徴したものでしかない。通常、これらはフロッピーディスクドライブ９０４、ハードディスクドライブ（外側からは見えない）及びスロット９０６で示されるＣＤ−ＲＯＭドライブである。通常は、ドライブの数と型は、コンピュータの構成が違えば異なる。ディスクドライブ９０４と９０６は実際に選択的であり、スペースを考慮した場合に、ここに記載した処理過程／装置に連係して使用されるコンピュータシステムから容易に除くことができる。
【００６３】
また、コンピュータシステムは、選択的に、情報が表示されるディスプレーを有する。大抵の場合、キーボード９１０とマウス９０１を、中央処理ユニット９０２を操作する入力装置として有する。反面、携帯性を向上するために、キーボード９１０は機能が制限されたキーボードかまたは完全に除かれる。加えて、マウス９１２は任意にタッチパッド制御装置またはトラックボール装置であるか、同様に完全に除かれる。加えて、コンピュータシステムは、また任意に、以下に述べるように赤外線信号を送信および／または受信するための少なくとも一つの赤外線発信器および／または赤外線受信器を有する。
【００６４】
図１０は図９のコンピュータシステム９００の内部ハードウエアのブロック図である。バス９１４はコンピュータシステム９００の他の要素を接続する主情報ハイウエーとして働く。ＣＰＵ９１６はプログラムを実行するのに必要な計算と論理的作業を実行する中央処理ユニットである。リードオンリーメモリ（ＲＯＭ）９１８とランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）９０２はコンピュータの主メモリーを構成する。ディスク制御装置９２２はシステムのバス９１４に一つ以上のディスクドライブを接続する。これらのディスクドライブは、例えば９０４のようなフロッピーディスクドライブまたはＣＤ−ＲＯＭまたは９０６のようなＤＶＤ（デジタルビデオディスク）ドライブまたは内部または外部ハードドライブ９２４である。前記したように、これらの色々なディスクドライブとディスク制御装置は選択的な装置である。
【００６５】
ディスプレーインターフェース９２６はディスプレー９０８を接続し、バス９１４からの情報をディスプレー９０８に表示することを可能にする。繰り返すが、ディスプレー９０８はまた選択的な付属品である。例えば、ディスプレー９０８は置き換えられるかまたは除かれる。外部装置との通信のために、例えば、ここで記載されている装置の構成要素は、通信ポート９２８を使用し得る。例えば、光ファイバーおよび／または電気ケーブルおよび／または導線および／または光学的通信（即ち赤外線等）および／または無線通信（即ちラジオ周波数（ＲＦ）等）を外部装置と通信ポートの間の伝送媒体として使用することができる。周辺機器インターフェース９３０はキーボード９１０とマウス９１２を接続し、入力データをバス９１４に伝送することを可能にする。コンピュータの標準構成要素に加えて、コンピュータはまた任意に、赤外線発信器および／または赤外線受信器を有する。赤外線発信器は、データを赤外線信号伝送により発信／受信する一つ以上の処理構成要素／ステーションと連係してコンピュータシステムが使用されるとき、任意に使用される。赤外線発信器または赤外線受信器を使用する変わりに、コンピュータシステムは、任意に、低電力ラジオ発信器および／または低電力ラジオ受信器を使用する。低電力ラジオ発信器は処理過程の構成要素に受信される信号を発信し、そして低電力受信器を介して構成要素から信号を受ける。低電力ラジオ発信器および／または受信器は産業界において標準的な装置である。
【００６６】
図１１に図９と１０に示すディスクドライブで使用することができるメモリー媒体９３２を例として示す。一般的にフレキシブルディスク、ＣＤ−ＲＯＭまたはデジタルビデオディスク等のメモリー媒体は、例えば、コンピュータがここに述べる機能を実行するのを可能にするためのコンピュータを制御するためのシングルバイト言語とプログラム情報用のマルチバイトローカルを内蔵している。他の方法として、図９と１０に示すＲＯＭ９１８および／またはＲＡＭ９２０は、また、処理過程に関連した作業を実行するために中央処理ユニット９１６を指示するのに使用されるプログラム情報を保存するのに使用される。
【００６７】
コンピュータシステム９００は単一の処理装置、単一のハードディスクドライブと単一のローカルメモリを有するように図示されているが、システム９００は、任意に、適切な複数のまたは組合せの処理装置または保存装置を有することができる。コンピュータシステム９００は、実際上、この発明の原理により作動できる高度計算機、ハンドヘルド、ラップトップ／ノートブック、ミニ、大型コンピュータ、スーパーコンピュータおよびそれらの組合せのネットワークの処理システムを含む適した処理システムに置き換えるまたは処理システムと組み合わせることができる。
【００６８】
従来の処理システム構成については、「Computer Organization and Architecture」、William Stallings著、MacMillan Publishing Co.（第３版 １９９３）に詳細に記述されている。従来の処理システムネットワークデザインについては、「Deta Network Design」、Darren L. Spohn著、McGraw-Hill Inc.（１９９３）に詳細に記述されている。そして従来のデータ通信については、「Data Communications Principles」、R. D. Gitlin, J. F. Hayes, S. B. Weinstain著、Plenum Press（１９９２）および「The Irwin Handbook of Telecommunications」、James Harry Green著、Irwin Professional Publishing（第２版 １９９２）に詳細に記述されている。他の方法として、ハードウエアの構成は、例えば、さらにコンピュータの効率を上げるためにＭＩＭＤ（Multiple Instruction Multiple Data）の多重処理（multiprocessor）フォーマットにより整えることもできる。コンピュータの構成のこの形態については、例えば、米国特許第５，１６３，１３１号、Where Buses Cannot Go, Boxer A., IEEE Spectrum, February 1995, pp. 41-45、RPM: A Rapid Prototyping Engine for Multiprocessor System, Barroso, L. A. et al., IEEE Computer, February 1995, pp. 26-34に詳細に開示されている。他の好ましい実施形態において、上記処理装置、特にＣＰＵ９１６は、ＰＡＬ（プログラマブルアレイロジック）、ＰＬＡ（プログラマブルロジックアレイ）、ＤＳＰ（デジタル信号プロセッサ）、ＦＰＧＡ（書替え可能ゲートアレイ）、ＡＳＩＣ（特定用途向けＩＣ）、ＶＬＳＩ（超ＬＳＩ）等のプログラム可能な論理装置を含む他の適した処理回路に置き換えるまたは処理回路と組み合わせることができる。
【００６９】
本発明の多くの特徴と利点は詳細な説明から明らかであり、そして、本発明の本当の精神と範囲に入る本発明の全てのそのような特徴と利点を網羅することは特許請求の範囲によって意図される。さらに多くの修正態様と変更態様は当業者には容易に想到できるので、図示および記述された構成および作用に発明を限定することは望ましくなく、したがって、全ての適した修正態様と相当する態様は本発明の範囲に入る。
【図面の簡単な発明】
【図１】  従来技術のフローサイトメーターのブロック図である。
【図２】 図２ａは、矢印で示される測定装置の流路に沿った標準ダイオードレーザのサンプルガウス型光線のプロフィールである。図２ｂは、標準アルゴンレーザのサンプル光線のプロフィールである。
【図３】  標準ダイオードレーザの光線プロフィールの主要軸のグラフである。
【図４】  標準光線成形光学装置にかけられた標準ダイオードレーザの光線プロフィールのグラフである。
【図５】  矢印で示される測定装置の流路を横切る標準ダイオードレーザのサンプル光線のプロフィールである。
【図６】  ９０゜移動した同じダイオードレーザの光線プロフィールの上に重ねて示した流路に沿った標準ダイオードレーザの光線プロフィールである。
【図７】  本発明に係る実施形態のブロック図である。
【図８】  本発明による方法のフローチャートである。
【図９】  コンピュータおよび周辺機器の実施形態の図である。
【図１０】  本発明によるコンピュータの構成の実施形態の図である。
【図１１】  メモリー媒体の実施形態の図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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