(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の一般式（I）：
【化１】
0004521894.tif 000008
（式中、Ｒは、ガロイル基、または隣接する２つのＲが一緒になってヘキサヒドロキシジフェノイル基を示す）で示される化合物を有効成分として含有するMT1-MMPおよびマトリライシン(MMP-7)阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、タンニン化合物を有効成分とするマトリックスメタロプロテアーゼ（matrix metalloproteinases : MMPs）阻害剤に関する。さらに、MMPsによる細胞外基質（extracellular matrix : ECM）の分解によって引き起こされる慢性関節リウマチ、変形性関節症等の関節疾患、がん細胞の転移、歯肉炎等の難治性疾患の治療および予防に有用なMMPs阻害剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
MMPsは、結合組織の分解および再構築（remodelling）に関与する一群の酵素で、Zn2+を活性部位にもつ。現在までに16種類ものヒトMMPsが同定され（Nagase, H. : Biol. Chem., 378 : 151-160, 1997）、これらは、一次構造と基質特異性の違いから、コラゲナーゼ群、ゼラチナーゼ群、ストロメライシン群、膜型（MT-MMP）、およびその他（マトリライシン）の５群に分類される。
【０００３】
MMPsは、細胞外基質の構成タンパク質、例えば、関節のライニング（lining）、間質性の結合組織、基底膜、軟骨などに存在するタンパク質を分解する。これらのタンパク質は、コラーゲン（collagen）、ラミニン（laminin）、エラスチン（elastin）、フィブロネクチン（fibronectin）、プロテオグリカン（proteoglycan）などを含む。
【０００４】
コラーゲンは、哺乳動物組織の約１/３を占める主要な構造タンパク質であり、軟骨、骨、腱、および皮膚を含む多くのマトリックス組織の必須な成分である。間質性コラゲナーゼ（MMP-1）は、nativeなI、II、III型コラーゲン分子を３：１の箇所で特異的に切断する。コラゲナーゼにより１箇所を切断されると、通常の組織内では安定なコラーゲン分子は、生理学的温度（体温）で自然に変性して一本鎖のゼラチンとなり、他の様々なプロテアーゼにより分解されるようになる。その結果、マトリックス組織の構造の完全性が失われる。この過程は不可逆的である。
【０００５】
ゼラチナーゼ（MMP-2）は、ゼラチン（変性コラーゲン）、IV型コラーゲン（基底膜）およびV型コラーゲン、フイブロネクチン（軟結合組織および基底膜に存在する高度にクロスリンクした高分子の多機能性糖タンパク質）、およびエラスチン（動脈、腱、皮膚など弾性組織の特殊成分をなす構造タンパク質）を変性させる。
【０００６】
ストロメライシン１（MMP-3）および２（MMP-10）は、ラミニン、フイブロネクチン、プロテオグリカン、およびコラーゲン（IV型およびIX型）を含む広範囲のマトリックス基質を分解する。
【０００７】
マトリライシン（MMP-7）も、また、プロテオグリカン、ゼラチン、エラスチンおよびラミニンを含む広範囲のマトリックス基質を分解する。
【０００８】
正常組織においては、MMPsの活性は、１）潜在型酵素（pro-MMP）の産生、２）その潜在型酵素の活性化、３）活性化酵素のインヒビターによる阻害、の３つのステップで厳密に調節されている。その結果、MMPsによる結合組織の分解と、新しいマトリックス組織の合成とは、ダイナミックに平衡を保っている。
【０００９】
しかしながら、多くの病的疾患においては、MMPs活性の調節不能により、MMPs活性が増強し、ECMの分解が亢進する。これらの病的状態は、動脈硬化、関節炎（例えば、慢性関節リウマチおよび変形性関節症）、歯周疾患、異所性脈管形成、腫瘍性浸潤および転移、組織の潰瘍形成（例えば、角膜潰瘍、胃潰瘍、或いは表皮性潰瘍）、骨疾患（例えば、骨粗鬆症および人工関節置換術後の弛みなどの骨吸収性疾患）、血管再閉塞および再狭窄、HIV感染および糖尿病合併症、等の難治性疾患の治癒を遅延させている主要な原因の一つとなっている。したがって、MMPsに対して阻害作用を有する物質は、これら難治性疾患の予防および治療剤として有用であると考えられる。
とりわけ、がん細胞の組織浸潤・転移の際の細胞外マトリックスの分解に関与するMMPsの役割は重要で、MMPsの作用を阻害する物質は、がんの浸潤・転移を抑制する薬剤として有望である。
【００１０】
例えば、血管新生の阻害やMMPsの活性化の阻害によるがん転移治療薬として、ヒドロキサム酸骨格をもつマリマスタット（3R-(2,2-ジメチル-1S-メチルカルバモイル-プロピルカルバモイル)-2S-ヒドロキシ-5-メチル-ヘキサノ-ヒドロキサム酸）を始めとして、いくつかの抗転移薬剤が臨床開発中である。しかしこれらの抗腫瘍転移薬剤は、腫瘍細胞の生物学的特徴を標的としているので、抗がん剤のように、直接的腫瘍縮小効果が認められないため、抗がん剤の評価基準をそのまま適用して判断するのが難しく、その有用性の臨床評価はこれからである。
また、タンニン化合物が、トポイソメラーゼ阻害活性を有し、それによる抗癌剤ことが記載されている（特開平6-72885公報,特開平7-138165公報）。しかしながら、タンニン化合物が、MMPsに対して阻害作用を示すことは、これまで知られていない。
【００１１】
その他、MMPs阻害剤として、フラボノイド化合物（特開平8-104628号公報）、エスクレチン誘導体（特開平8-183785号公報）、スルホニルアミノ酸誘導体（特開平9-309875号公報）、TIMPs（特開平10-17492号公報）、等が知られている。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
このように、これまで報告されている数多くのMMPs阻害剤の臨床応用について、抗腫瘍転移薬剤を例にとれば、その臨床的有用性は、まだ不明であり、さらに新たなMMPs阻害剤の候補物質の開発が求められている。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために、ポリフェノール類の抗酸化活性や抗ウイルス活性など多様な生物活性に着目し、その一種であるカテキン化合物のMMPs阻害活性を調べたところ、そのうちのいくつかが、優れたMMPs阻害活性を有することを見出している。そこで、ポリフェノール類であるタンニン化合物についても、MMPs阻害活性を調べた結果、該化合物が、優れたMMP阻害作用を示し、結果として、MMPs活性の調節不能に起因する難治性疾患の治療および予防に対して有用性が期待できることを見出し、本発明を完成した。。
【００１４】
すなわち、本発明は、
（１）タンニン化合物を有効成分として含有するマトリックスメタロプロテアーゼ（MMPs）阻害剤、
（２）タンニン化合物が下記の一般式（I）：
【化３】
0004521894.tif 000002
（式中、Ｒは、ガロイル基、または隣接する２つのＲが一緒になってヘキサヒドロキシジフェノイル基を示す）
で示される化合物である（１）記載のマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤、（３）タンニン化合物を有効成分として含有するマトリックスメタロプロテアーゼ（MMPs）活性調節不能に起因する難治性疾患の治療および予防剤、
（４）タンニン化合物が下記の一般式（I）：
【化４】
0004521894.tif 000003
（式中、Ｒは、ガロイル基、または隣接する２つのＲが一緒になってヘキサヒドロキシジフェノイル基）
で示される化合物である請求項３記載の難治性疾患の治療および予防剤、
（５）難治性疾患が慢性関節リウマチ、変形性関節症、歯周疾患、異所性脈管形成、腫瘍性浸潤および転移、潰瘍形成、骨疾患、血管再閉塞、血管再狭窄、HIV感染症、または糖尿病合併症である（４）記載の治療および予防剤、
に関する。
【００１５】
【発明の実施の形態】
タンニン化合物は、広く植物中（特に樹皮に多く含まれる）に存在する多数のフェノール性ヒドロキシル基をもつ複雑な構造の芳香族化合物で、水で抽出される。本発明のタンニン化合物は、該タンニン化合物であって、かつMMPs阻害作用を示すタンニン化合物を全て包含する。タンニン化合物は、化学構造上、１）加水分解性タンニン化合物、および２）縮合型タンニン化合物に分類される。加水分解性タンニン化合物は、一般に、分子内のポリフェノール部分として、ガロイル（galloyl）基、ヘキサヒドロキシジフェノイル（hexahydoxydiphenoyl; HHDP)基、およびその酸化体などがあり、これらが、分子内の糖または環状ポリアルコールとエステル結合した構造をもつ。これらは、それぞれガロタンニン（gallo-tannin)、およびエラジタンニン（ellagitannin)と総称される。酸や酵素によって、このエステル結合が切断されやすいので、加水分解性タンニンの名がある(Okuda, T. et al.: Heterocycles,15 : 1323, 1981; 奥田拓男: 化学と薬学の教室, 80: 12, 1983; 81: 22,1983; 83: 2,1984)。
一方、縮合型タンニン化合物は、カテキン（catechin)類が、たがいに分子間で、Ｃ4-Ｃ8、またはＣ4-Ｃ6位などでＣ-Ｃ結合により結ばれた２量体以上の大きい分子を順次形成したものである。酸や酵素の作用でこの縮合がさらに進行し、より大きい分子を形成していくことが多い(Okuda, T. et al.: Heterocycles,15 : 1323, 1981; 奥田拓男: 化学と薬学の教室, 80: 12, 1983; 81: 22,1983; 83: 2,1984)。
加水分解性のタンニンの糖部分の１位とポリフェノールが結合して、Ｃ-配糖体を形成し、糖の環が開環した構造をもつＣ-配糖体型タンニン（C-glycoside tannin)、加水分解性タンニン分子にカテキン類が結合した複合タンニン化合物（complex tannin)(Okuda,T. et al.: Chem. Pharm. Bull., 35 : 443, 1987)、加水分解性タンニンが２分子以上たがいに結合したオリゴマー化合物（oligomeric hydrolyzable tannin)(Okuda, T. et al.: J. Natl. Prod.,52: 1, 1989)、分子内のポリフェノール部分が、カフェー酸（caffeoyl基）であるカフェータンニン（caffeetannin)(奥田拓男・他: 薬誌,106: 894,1986)やシソ科タンニン（labiataetannin)(奥田拓男・他: 薬誌,106: 1108, 1986; Agata,I. et al.: Chem. Pharm. Bull. 35: 3223, 1988)、DHHDP(dehydrohexahydroxy diphenoyl)基をもつエラジタンニン（dehydroellagitannin)［Okuda, T. et al.: Tetrahedron Lett. 23: 3941, 1982)がアスコルビン酸と縮合したもの(Okuda,T. et al.: Chem. Pharm. Bull. 34: 4075, 1986)、などタンニン化合物の種類は多い。
【００１６】
本発明のタンニン化合物は、タンニン含有植物から、水、または水分含量の多い水性エタノールを用いて抽出する。タンニン含有植物としては、先ず、日常的に飲用している、緑茶、紅茶などの茶葉が挙げられるが、その他にも、例えば、ツバキ（Camellia japonica)、ハーブ・スパイスとして、ベイベリイ（Bayberry)、クローブ（Clove)、シャクヤク（Peony)、ローズ・レッド（Rose red)、ベイリーフ、コンフリー（Comfrey)、ユーカリ（Eucalyptus)、メリーザ（Melissa)、ペニーロイヤル（Pennyroyal)、ローズ・ピンク（Rose pink)、スター・アニス（Star anise)、タイムなどが挙げられる。これらの植物は、採取された直後は、一般に多量の水分を含有するので、含有成分タンニンの変質を防止するためにも、乾燥が必要である。
これらのタンニン含有植物からのタンニンの抽出は、水性溶媒、例えば、精製水、或いは、エタノールやメタノールを含む精製水により行う。抽出温度、および時間は、タンニンの安定性を考慮して、当業者が適宜設定することができる。抽出液は、そのまま本発明に用いることができるが、抽出液の濃縮物、あるいは該抽出液を分画、文献に記載の方法(Hashimoto, M. et al.: Chem. Pharm. Bull. 37: 77-85, 1989)で精製したタンニン化合物を用いることが好ましい。また、化学合成したタンニンでもよい。好ましくは、一般式（I）で示されるタンニン化合物（式中、Ｒは、ガロイル基、または隣接する２つのＲが一緒になってヘキサヒドロキシジフェノイル基を示す）などを、本発明のMMPs阻害剤として用いることができるが、これらに限定されるものではない。本発明においては、また、タンニン化合物を単独または組み合わせて用いることができる。
【００１７】
本発明において、例えば、一般式（I）（式中、Ｒは表１に示すようにガロイル基、または隣接する２つのＲが一緒になってヘキサヒドロキシジフェノイル基を示す）に示す２種のタンニン化合物（化合物１および２）は、表２に示すように、MMP-7、MT1-MMP、およびMMP-2に対して、化合物１は、50％酵素阻害濃度（IC50）が、それぞれ、0.04、0.3、および39μM、化合物２は、それぞれ、0.048、0.4、および16μMと、何れも極めて低濃度で、優れたMMPs阻害作用を有することが明らかである。
【００１８】
【表１】
0004521894.tif 000004
【００１９】
すなわち、化合物１、および２は、通常の上皮性細胞には発現しないが、上皮性のがん細胞である大腸がんや胃がんで特異的に発現が亢進しているMMP-7（Mori, M. et al.: Cancer, 75: 1516-1519, 1995; Kataoka, H. Oncol. Res. 9: 101-109, 1997）、潜在型MMP-2の細胞膜上の活性化因子であり（Sato, H. et al.: Nature, 370: 61-65, 1994）、さらに、様々ながん細胞の膜上に発現していることが示されているMT1-MMP（Yamamoto, M. et al.: Cancer Res. 56: 384-392, 1996; Okada, A. et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 2730-2734, 1995; Ohtani, H. et al.: Int. J. Cancer, 68: 565-570, 1996）、あるいは、がん組織中で、その活性型が検出されているMMP-2（Davies, B. et al.: Cancer Res. 53: 5365-5369, 1993; Emonard, H.P. et al.: Cancer Res. 52: 5845-5848, 1992）に対して優れた阻害作用を示している。
がん組織中の活性型MMP-2の存在は、胃がんや乳がんの浸潤度と非常によく相関していることから（Polette, M. et al.: Virchows Arch. 428: 29-35, 1996）、MMP-2のがん浸潤における役割がさらにクローズアップされている。また、MT1-MMP自身もI、II、III型コラーゲン、フィブロネクチンを分解することが報告され（Ohuchi, E. et al.: J. Biol. Chem. 272: 2466-2451, 1997）、この酵素が発現することは、ECM分解を２方向から助長することが示唆される。
このようなことから、MMPsに対して優れた阻害作用を示すタンニン化合物は、がんの組織浸潤・転移を抑制することが期待され、抗腫瘍転移薬として有望である。また、多くの病的疾患においては、MMPs活性の調節不能により、MMPs活性が増強し、ECMの分解が亢進する。これらの病的状態は、動脈硬化、関節炎（例えば、慢性関節リウマチおよび変形性関節症）、歯周疾患、異所性脈管形成、組織の潰瘍形成（例えば、角膜潰瘍、胃潰瘍、或いは表皮性潰瘍）、骨疾患（例えば、骨粗鬆症および人工関節置換術後の弛みなどの骨吸収性疾患）、血管再閉塞および再狭窄、HIV感染および糖尿病合併症、等の難治性疾患の治癒を遅延させている主要な原因の一つとなっている。したがって、MMPsに対して阻害作用を有する物質は、これら難治性疾患の予防、および治療剤としても有用であると考えられる。本発明者らは、先に、カテキン類が優れたMMPs阻害作用を有することを見出しており、カテキン類とタンニン化合物とを組み合わせることにより、MMPs阻害作用のスペクトラムの拡大、相加効果、或いは相乗効果が期待される。
【００２０】
本発明のタンニン化合物を有効成分とするMMPs阻害剤の製剤形態は、一般的な形態でよい。タンニン化合物単独、またはタンニン化合物と製剤上許容できる単体若しくは希釈剤との混合物のいずれでも、製剤として使用することができる。
製剤中の有効成分の量も限定されるものではない。
【００２１】
本発明のMMPs阻害剤は、経口または非経口のいずれでも投与することができる。投与量は、年令、個人差、病状等に依るので、特に限定されないが、１日当たり0.1〜500mg/kg（体重）、好ましくは、0.5〜200mg/kg（体重）である。通常、１日量を、１回または２〜４回に分けて投与する。
【００２２】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。
【００２３】
［実施例１］
マトリライシン（MMP-7）、膜型のMT1-MMP（membrene-type MMP）、およびゼラチナーゼＡ（MMP-2）のcDNA（Nagase, H. : Biol. Chem., 378 : 151-160, 1997 ; Sato, H. et al.: Nature, 370 : 61-65, 1994 ; Crit. Rev. Oral. Biol. Med., 4 : 197-250, 1993）を、C末端にヒスチジン６残基を持つ組換え潜在型酵素（proMMP）として、大腸菌大量発現系を用い発現させた後、活性化した。
【００２４】
発現ベクターpTH-72は、タンデムリピートのＴ７プロモーターの下流に、リボソーム結合部位、翻訳開始コドン、マルチクローニング部位、ヘキサヒスチジンタグをコードする配列、および翻訳終始コドンを含んでいる。
【００２５】
ヒトMT1-MMP（プロドメイン-触媒ドメイン）cDNAを、5’PCRプライマー：5'-ggcggatccatgctcgcctccctcggctcg-3'（配列番号：１）、および３'PCRプライマー：3'-gccgtcgacgttcccgtcacagatgttggg-5'（配列番号：２）を用い、MT1-MMPの3.5kb cDNA断片を含むpME18S-MTMMPを鋳型として、PCR反応を行った。得られた18Leuから322Asnまでをコードする0.8kb PCR断片をBam HI/Sal Iで消化し、pTH-72発現ベクター（pTH-MT1MMP-PC）のBam HI/Sal I部位にクローン化した。
【００２６】
ヒトMMP-2（プロドメイン-触媒ドメイン）cDNAを、5’PCRプライマー：5'-ggcggatccatggcgccgtcgcccatcatc-3'（配列番号：３）、および３'PCRプライマー：3'-gccgtcgactacaatgtcctgtttgcagat-5'（配列番号：４）を用い、MMP-2の3.3kb cDNA断片を含むpSG-GelAを鋳型として、PCR反応を行った。得られた30Alaから474Valまでをコードする1.3kbPCR断片をBam HI/Sal Iで消化し、pTH-72発現ベクター（pTH-MMP2-PC）のBam HI/Sal I部位にクローン化した。
【００２７】
ヒトMMP-7は、文献記載の方法（Itoh, M. et al.: J. Biochem., 119 : 667-673, 1996）で発現させた。
【００２８】
ヒト組換えMMPsの発現、精製、および巻き戻し（リフォールディング；refolding）は、公知の方法（例えば、西村義文,大野茂雄 監修 : タンパク実験プロトコール, 細胞工学別冊 実験プロトコールシリーズ２ 構造解析編, 1997）に準じて行った。すなわち、発現ベクター（pTH-MMP-7、pTH-MT1-MMP-PC、或いはpTH-MMP2-PC）を、大腸菌BL21（DE3）株にトランスフェクトし、IPTGで発現誘導した。発現タンパクは、Ni-NTA樹脂（QIAGEN INC., USA）を用いてアフィニティー精製後、リフォールディングを行い、MMP-7およびMT1-MMPはトリプシンと37℃、5分間反応後、DIFP(diisopropylphosphofluoridate)とトリプシン阻害剤(Tris-HCl 50mM, NaCl 150mM, CaCl2 10mM, NaN3 0.02%, Brij35 0.05%)を加えることにより活性型へ移行させた。一方、MMP-2はp-APMA(p-aminophenylmerucuric acetate)と37℃、15分間反応させることにより活性型へ移行させた。これを酵素標本とし、蛍光性ペプチド基質(MOCAc/DNP peptide)切断活性反応を、蛍光マイクロプレートリーダー(励起波長 340nm, 蛍光波長 400nm)による蛍光強度で測定し、酵素活性とした。一般式（I）（式中、Ｒは、ガロイル基、または隣接する２つのＲが一緒になってヘキサヒドロキシジフェノイル基を示す）に示すタンニン２種は、50％エタノールに溶解させ10mMとし、水で1mM,  300mM, 100μM, 30μM, 10μM, 3μMに希釈した。MMPs阻害活性の測定は、活性型MMP40μl, タンニン20μl, アッセイバッファー20μl (Tris-HCl pH7.5 500mM, NaCl 1.5M, CaCl2 100mM, ZnSO4 500μM, NaN3 30mM, Brij35 0.05%)を、37℃、15分間プレインキュベーションした後、MOCAc/DNP peptide 120μl (4.16μM)を添加し、37℃、15分毎に２時間反応させた。２時間後の50％酵素阻害濃度（IC50）を、表２に示す。
【００２９】
【表２】
0004521894.tif 000005
【００３０】
表２から、タンニン化合物が優れたMMPs阻害作用を有することが明らかである。
【００３１】
【発明の効果】
本発明により、タンニン化合物が、MMPsに対して優れた阻害作用を有することが明らかにされた。MMPsを有効成分として含有するMMPs阻害剤は、MMPs活性調節不能に起因する難治性疾患、例えば、動脈硬化症、関節炎（例えば、慢性関節リウマチおよび変形性関節症）、歯周疾患、異所性脈管形成、腫瘍性浸潤および転移、組織の潰瘍形成（例えば、角膜潰瘍、胃潰瘍、或いは表皮性潰瘍）、骨疾患（例えば、骨粗鬆症および人工関節置換術後の弛みなどの骨吸収性疾患）、血管再閉塞および再狭窄、HIV感染および糖尿病合併症、等の治療および予防剤として期待できる。
【配列表】
0004521894.tif 000006
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