(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
N-アシル化されたペプチドを生成するための方法であって、該方法は：
a)以下の一般式Iのアシル化剤と少なくとも１つの遊離のアミノ基を有するペプチドを、水性混合溶媒において塩基性条件下で、反応させることと；
【化１】
0004468174.tif 000006
式中
nは、0〜8であり；
R1は、COOR4であり；
R2は、親油性部分であり；
R3は、R3が付着されるカルボキシル基と共に、反応性のエステルまたは反応性のN-ヒドロキシイミドエステルであって、アミンをアシル化するために適したカルボン酸基のエステルを官能化させた形態のエステルを示し；および、
R4は、水素、C1-12-アルキル、およびベンジルから選択され；
b)R4が水素でない場合は、塩基性条件下でアシル化されたペプチドのエステル基（COOR4）をけん化することと；
c)N-アシル化されたペプチドを単離することと、
の工程を含み、前記a)の水性混合溶媒は、７未満%w／w非プロトン性極性溶媒を含むことによって特徴づけられる方法。
【請求項２】
アシル化剤が固体として反応混合物に添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法であって、前記工程a)の反応は、非プロトン性極性溶媒の存在下において生じ、かつ前記非プロトン性極性溶媒は、N-メチル-2-ピロリドン、テトラヒドロフラン、およびジメチルスルホキシドからなる群より選択される方法。
【請求項４】
非プロトン有機溶媒の全てが、アシル化剤のための溶媒として反応混合物に添加される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
アシル化剤が、酸を添加することによって安定化される溶液として反応混合物に添加される、請求項３または4に記載の方法。
【請求項６】
前記酸が、0.01%w／w〜1%w／wの濃度で非プロトン性極性溶媒に添加される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記酸が、0.05%w／w〜0.5%w／wの濃度で非プロトン性極性溶媒に添加される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記酸が、硫酸、メタンスルホン酸、およびトリフルオロ酢酸からなる群より選択される、請求項５〜７のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９】
前記工程a)の反応が、非プロトン性極性溶媒の非存在下で生じる、請求項1または２に記載の方法。
【請求項１０】
R4が水素である、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１１】
R4がC1-8-アルキルおよびベンジルから選択される、請求項１〜９のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１２】
R3は、R3が付着されるカルボキシル基と共に、反応性のN-ヒドロキシイミドエステルを示す、請求項１〜１１のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１３】
アシル化されたペプチドエステルが、10〜14の範囲のpH値でけん化される、請求項１〜９のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１４】
アシル化されたペプチドエステルが、9〜13のpH範囲でけん化される、請求項１〜９のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１５】
前記工程a)の反応混合物のpHが、pH9〜pH13である、請求項１〜１４のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１６】
前記工程a)の反応混合物のpHが、pH10〜pH12である、請求項１〜１４のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１７】
前記工程a)の反応混合物のpHが、pH11.0〜pH11.5である、請求項１〜１４のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１８】
前記工程a)の反応混合物の温度が、0〜50℃の範囲である、請求項１〜１７のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１９】
前記工程a)の反応混合物の温度が、5〜40℃の範囲である、請求項１〜１７のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２０】
前記工程a)の反応混合物の温度が、10〜30℃の範囲である、請求項１〜１７のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２１】
R2が、C3-39-アルキル、C3-39-アルケニル、C3-39-アルカジエニル、およびステロイド残基から選択される、請求項１〜２０のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２２】
R2-C（=O）-が、リトコロイルおよびヘキサデカノイルからなる群より選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
工程a)の出発原料として使用する前記ペプチドが、RP-HPLCによって決定すると少なくとも80%のペプチド純度を有する、請求項１〜２２のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２４】
工程a)の出発原料として使用する前記ペプチドが、RP-HPLCによって決定すると少なくとも90%のペプチド純度を有する、請求項１〜２２のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２５】
工程a)の出発原料として使用する前記ペプチドが、RP-HPLCによって決定すると少なくとも93%のペプチド純度を有する、請求項１〜２２のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２６】
工程a)の出発原料として使用する前記ペプチドが、RP-HPLCによって決定すると少なくとも95%のペプチド純度を有する、請求項１〜２２のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２７】
工程a)の出発原料として使用する前記ペプチドが、RP-HPLCによって決定すると97%のペプチド純度を有する、請求項１〜２２のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２８】
前記ペプチドが、GLP-1、exendin-4、GLP-2、グルカゴン、インスリン、GLP-1および以下のものなどの切断された類似体：Arg26-GLP-1(7-37); Arg34-GLP-1(7-37); Lys36-GLP-1(7-37); Arg26,34Lys36-GLP-1(7-37); Arg26,34Lys38GLP-1(7-38); Arg26,34Lys39-GLP-1(7-39); Arg26,34Lys40-GLP-1(7-40); Arg34Lys36-GLP-1(7-37); Arg26Lys39-GLP-1(7-39); Arg34Lys40-GLP-1(7-40); Arg26,34Lys36,39-GLP-1(7-39); Arg26,34Lys36,40-GLP-1(7-40); Gly8Arg26-GLP-1(7-37); Gly8Arg34-GLP-1(7-37); Gly8Lys36-GLP-1(7-37); Gly8Arg26,34Lys36-GLP-1(7-37); Gly8Arg26,34Lys39-GLP-1(7-39); Gly8Arg26,34Lys40-GLP-1(7-40); Gly8Arg26Lys36-GLP-1(7-37); Gly8Arg34Lys36-GLP-1(7-37); Lys36-GLP-1(7-37); Arg26,34Lys36-GLP-1(7-37); Arg26,34-GLP-1(7-37); Arg26,34Lys40-GLP-1(7-37); Arg26Lys36-GLP-1(7-37); Arg34Lys36-GLP-1(7-37); Val8Arg22-GLP-1(7-37); Met8Arg22-GLP-1(7-37);Gly8His22-GLP-1(7-37); Val8His22-GLP-1(7-37); Met8His22-GLP-1(7-37);His37-GLP-1(7-37); Gly8-GLP-1(7-37); Val8-GLP-1(7-37); Met8-GLP-1(7-37);Gly8Asp22-GLP-1(7-37); Val8Asp22-GLP-1(7-37); Met8Asp22-GLP-1(7-37);Gly8Glu22-GLP-1(7-37); Val8Glu22-GLP-1(7-37); Met8Glu22-GLP-1(7-37); Gly8Lys22-GLP-1(7-37); Val8Lys22-GLP-1(7-37); Met8Lys22-GLP-1(7-37); Gly8Arg22-GLP-1(7-37); Val8Lys22His37-GLP-1(7-37); Gly8Glu22His37-GLP-1(7-37); Val8Glu22His37-GLP-1(7-37); Met8Glu22His37-GLP-1(7-37);Gly8Lys22 His37-GLP-1(7-37); Met8Lys22His37-GLP-1(7-37);Gly8Arg22His37-GLP-1(7-37); Val8Arg22His37-GLP-1(7-37); Met8Arg22His37-GLP-1(7-37); Gly8His22His37-GLP-1(7-37); Val8His22His37-GLP-1(7-37); Met8His22His37-GLP-1(7-37); Gly8His37-GLP-1(7-37); Val8His37-GLP-1(7-37); Met8His37-GLP-1(7-37);Gly8Asp22 His37-GLP-1(7-37); Val8Asp22His37-GLP-1(7-37); Met8Asp22His37-GLP-1(7-37); Arg26-GLP-1(7-36)-アミド; Arg34-GLP-1(7-36)-アミド; Lys36-GLP-1(7-36)-アミド; Arg26,34Lys36-GLP-1(7-36)-アミド; Arg26,34-GLP-1(7-36)-アミド; Arg26,34Lys40-GLP-1(7-36)-アミド; Arg26Lys36-GLP-1(7-36)-アミド; Arg34Lys36-GLP-1(7-36)-アミド; Gly8-GLP-1(7-36)-アミド; Val8-GLP-1(7-36)-アミド; Met8-GLP-1(7-36)-アミド;Gly8Asp22-GLP-1(7-36)-アミド; Gly8Glu22His37-GLP-1(7-36)-アミド; Val8Asp22-GLP-1(7-36)-アミド; Met8Asp22-GLP-1(7-36)-アミド;Gly8Glu22-GLP-1(7-36)-アミド; Val8Glu22-GLP-1(7-36)-アミド; Met8Glu22-GLP-1(7-36)-アミド; Gly8Lys22-GLP-1(7-36)-アミド; Val8Lys22-GLP-1(7-36)-アミド; Met8Lys22-GLP-1(7-36)-アミド; Gly8His22His37-GLP-1(7-36)-アミド; Gly8Arg22-GLP-1(7-36)-アミド; Val8Arg22-GLP-1(7-36)-アミド; Met8Arg22-GLP-1(7-36)-アミド;Gly8His22-GLP-1(7-36)-アミド; Val8His22-GLP-1(7-36)-アミド; Met8His22-GLP-1(7-36)-アミド;His37-GLP-1(7-36)-アミド; Val8Arg22His37-GLP-1(7-36)-アミド; Met8Arg22His37-GLP-1(7-36)-アミド; Gly8His37-GLP-1(7-36)-アミド; Val8His37-GLP-1(7-36)-アミド; Met8His37-GLP-1(7-36)-アミド;Gly8Asp22 His37-GLP-1(7-36)-アミド; Val8Asp22His37-GLP-1(7-36)-アミド; Met8Asp22His37-GLP-1(7-36)-アミド; Val8Glu22His37-GLP-1(7-36)-アミド; Met8Glu22His37-GLP-1(7-36)-アミド;Gly8Lys22 His37-GLP-1(7-36)-アミド; Val8Lys22His37-GLP-1(7-36)-アミド; Met8Lys22His37-GLP-1(7-36)-アミド;Gly8Arg22His37-GLP-1(7-36)-アミド; Val8His22His37-GLP-1(7-36)-アミド; Met8His22His37-GLP-1(7-36)-アミド、並びにHGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPSKKKKKK-NH2（ZP-10）からなる群より選択される、請求項１〜２７のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２９】
前記ペプチドは、exendin-3、exendin-4、Arg34-GLP-1（7-37）、Gly8-GLP-1（7-36）-アミド、Gly8-GLP-1（7-37）、Val8-GLP-1（7-36）-アミド、Val8-GLP-1（7-37）、Val8Asp22-GLP-1（7-36）-アミド、Val8Asp22-GLP-1（7-37）、Val8Glu22-GLP-1（7-36）-アミド、Val8Glu22-GLP-1（7-37）、Val8Lys22-GLP-1（7-36）-アミド、Val8Lys22-GLP-1（7-37）、Val8Arg22-GLP-1（7-36）-アミド、Val8Arg22-GLP-1（7-37）、Val8His22-GLP-1（7-36）-アミド、Val8His22-GLP-1（7-37）、des（B30）ヒトインスリンからなる群より選択される、請求項１〜２８のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３０】
前記工程a)の反応混合物が、反応の間に一定のpHを維持するために適している緩衝液を含む、請求項１〜１７のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３１】
前記ペプチドが、インスリン・ペプチドでない、請求項１〜３０のいずれか1項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチドおよびタンパク質をアシル化するための方法に関する。より詳細には、本発明は、1つまたは複数のアシル基をペプチドまたはタンパク質に導入する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多数のペプチドについて、医事における使用が承認されており、ペプチドは、組換えDNA技術によって適切な宿主細胞で産生されてもよく、またはこれらは確立したペプチド合成技術によって合成によって生成されてもよい。しかし、これらの天然のペプチド類並びに類似体は、長期間にわたって高い血漿濃度のペプチドが必要とされる多くの臨床的徴候にとって容認できない高いクリアランス速度を示す傾向がある。天然の形態のペプチドが高いクリアランスを有するペプチドの例は、以下のものを含む：ACTH、副腎皮質刺激ホルモン放出因子、アンジオテンシン、カルシトニン、インスリン、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド-1（GLP-1）、グルカゴン様ペプチド-2（GLP-2）、インシュリン様成長因子-1、インシュリン様成長因子-2、胃抑制性ペプチド、成長ホルモン放出因子、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチド、セクレチン、エンテロガストリン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ソマトメジン、副甲状腺ホルモン、トロンボポエチン、エリスロポエチン、視床下部放出因子、プロラクチン、甲状腺刺激ホルモン、エンドルフィン、エンケファリン、バソプレッシン、オキシトシン、オピオイドおよびこれらの類似体、スーパーオキシドジスムターゼ、インターフェロン、アスパラギナーゼ、アルギナーゼ、アルギニンデアミナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、およびリボヌクレアーゼ。
【０００３】
種々のペプチドおよびペプチドの類似体の誘導体化は、有利な方向にペプチドのクリアランス速度に影響を及ぼすことが見いだされた。そのような誘導体化は、治療的なペプチドへの親油性のアシル基の導入であり、アシル化されていないペプチドに比べて、望ましい遅延性の作用プロフィールを生じる。それ故、治療的なタンパク質の投与を頻繁にしなくても、処方された治療に対する患者のコンプライアンスを改善し、投与されるペプチドの量が減少される。このことは、とりわけGLP-1およびこれらの類似体のアシル化を開示する国際公開公報第98／08871号において、とりわけGLP-2およびこれらの類似体のアシル化を開示する国際公開公報第98／08872号において、およびとりわけexendinおよびこれらの類似体のアシル化を開示する国際公開公報第99/43708号において記載され、かつ証明されている。アスパラギン酸およびグルタミン酸などのモノまたはジペプチド・スペーサーは、ペプチドとアシル基との間で望ましいことが証明された。遊離のカルボン酸基を含むスペーサーは、アシル化の前に保護されていなければならず、その後に脱保護しなければならない。欧州特許第1227107号は、ヒトインスリンのε-アミノ基のアシル化を開示する。国際公開公報第00/55119号は、ペプチド（たとえばGLP-1）をアシル化するための方法および新規のアシル化剤を開示する。
【０００４】
治療的なペプチドが、経済的に実行可能となるためには、ペプチドを生成する際の費用、並びにペプチドの治療用量が重要である。治療的なペプチドの生成の際の主な費用は、標的タンパク質に密接に関連する不純物、たとえば異性体、脱アミド（desamido）形態などから標的タンパク質を分離する必要がある精製工程である。これらの精製工程は、通常高価なクロマトグラフィー・マトリックスおよび溶媒、並びに全収率の減少を意味するクロマトグラフィによって行われる。
【０００５】
本発明の目的は、α-アミノ-α,ω-ジカルボン酸スペーサーを介してペプチドに親油基を導入するための効率的かつ経済的な方法を提供することである。本方法は、より特異的であり、したがってより高収率となり、密接に関連した不純物の形成が減少される。アシル化されたペプチドを生成する費用の有意な減少が達成される。治療が有用な患者数を最大にするために、並びに皮下注射、たとえば経皮および肺のデリバリーよりも低い生物学的利用能を有する代わりのデリバリー経路の利点を探索するためには、あまり高価ではないアシル化されたペプチドがたいへん望ましい。
【発明の開示】
【０００６】
本発明は、ペプチドまたはタンパク質の1つまたは複数のアミノ基をアシル化するための方法であって、該方法は：
a)以下の一般式Iのアシル化剤と少なくとも１つの遊離のアミノ基を有するペプチドを、水性混合溶媒において塩基性条件下で、反応させることと；
【化２】
0004468174.tif 000002
式中
nは、0〜8であり；
R1は、COOR4であり；
R2は、親油性部分であり；
R3は、R3が付着されるカルボキシル基と共に、反応性のエステルまたは反応性のN-ヒドロキシイミドエステルを示し；および、
R4は、水素、C1-12-アルキル、およびベンジルから選択され；
b)R4が水素でない場合は、塩基性条件下でアシル化されたペプチドのエステル基（COOR4）をけん化することと；
c)N-アシル化されたペプチドを単離することと、
の工程を含み、前記a)の水性混合溶媒は、10未満%w／w非プロトン性極性溶媒を含むことによって特徴づけられる方法を提供する。
【０００７】
一つの態様において、前記工程a)の反応は、8%w／w未満の非プロトン性極性溶媒、好ましくは5%w／w未満の非プロトン性極性溶媒、さらに好ましくは3%w／w未満の非プロトン性極性溶媒を含む水性混合溶媒中で生じる。
【０００８】
本方法のもう一つの態様において、アシル化剤は、固体として反応混合物に添加される。
【０００９】
も本方法のう一つの態様において、アシル化剤は、酸を添加することによって安定化される溶液として反応混合物に添加される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の説明  
ペプチドおよびタンパク質  
本発明は、インビボでのクリアランス速度を減少させるために、いずれかのペプチド（または、タンパク質）に、親油性のアシル基を導入するために有用である。このようなペプチドおよびタンパク質の例は、ACTH、副腎皮質刺激ホルモン放出因子、アンジオテンシン、カルシトニン、exendinおよびこれらの類似体、インスリンおよびこれらの類似体、グルカゴンおよびこれらの類似体、グルカゴン様ペプチド-1およびこれらの類似体、グルカゴン様ペプチド-2およびこれらの類似体、インシュリン様成長因子-1、インシュリン様成長因子-2、胃抑制性ペプチド、成長ホルモン放出因子、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチド、セクレチン、エンテロガストリン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ソマトメジン、副甲状腺ホルモン、トロンボポエチン、エリスロポエチン、視床下部放出因子、プロラクチン、甲状腺刺激ホルモン、エンドルフィン、エンケファリン、バソプレッシン、オキシトシン、オピオイドおよびこれらの類似体、スーパーオキシドジスムターゼ、インターフェロン、アスパラギナーゼ、アルギナーゼ、アルギニンデアミナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、およびリボヌクレアーゼである。
【００１１】
ペプチド（または、タンパク質）は、少なくとも１つの遊離のアミノ基を有するべきであることが理解されるべきであり、このようなアミノ基は、N末端のアミノ基または側鎖のアミノ基である。ペプチドまたはタンパク質は、D-アミノ酸、3-ヒドロキシプロリン、オルニチン、およびペンチルグリシンなどの遺伝暗号によってコードされないアミノ酸を含んでいてもよい。リジンおよびオルニチン・アミノ酸残基のアミノ基は、特に興味深い。本方法は、特にリジン残基のε-アミノ基のN-アシル化に関する。また、問題のペプチドまたはタンパク質が、二つ以上ペンダント・アミノ基を含んでいてもよく、その全てが、本発明に従ってNアシル化されてもよいことが理解されるべきである。
【００１２】
本発明は、特にGLP-1のアシル化およびこれらの類似体に適している。本発明に従ってNアシル化することができるGLP-1および類似体の例は、GLP-1および以下のものなどの切断された類似体：Arg26-GLP-1(7-37); Arg34-GLP-1(7-37); Lys36-GLP-1(7-37); Arg26,34Lys36-GLP-1(7-37); Arg26,34Lys38GLP-1(7-38); Arg26,34Lys39-GLP-1(7-39); Arg26,34Lys40-GLP-1(7-40); Arg34Lys36-GLP-1(7-37); Arg26Lys39-GLP-1(7-39); Arg34Lys40-GLP-1(7-40); Arg26,34Lys36,39-GLP-1(7-39); Arg26,34Lys36,40-GLP-1(7-40); Gly8Arg26-GLP-1(7-37); Gly8Arg34-GLP-1(7-37); Gly8Lys36-GLP-1(7-37); Gly8Arg26,34Lys36-GLP-1(7-37); Gly8Arg26,34Lys39-GLP-1(7-39); Gly8Arg26,34Lys40-GLP-1(7-40); Gly8Arg26Lys36-GLP-1(7-37); Gly8Arg34Lys36-GLP-1(7-37); Lys36-GLP-1(7-37); Arg26,34Lys36-GLP-1(7-37); Arg26,34-GLP-1(7-37); Arg26,34Lys40-GLP-1(7-37); Arg26Lys36-GLP-1(7-37); Arg34Lys36-GLP-1(7-37); Val8Arg22-GLP-1(7-37); Met8Arg22-GLP-1(7-37);Gly8His22-GLP-1(7-37); Val8His22-GLP-1(7-37); Met8His22-GLP-1(7-37);His37-GLP-1(7-37); Gly8-GLP-1(7-37); Val8-GLP-1(7-37); Met8-GLP-1(7-37);Gly8Asp22-GLP-1(7-37); Val8Asp22-GLP-1(7-37); Met8Asp22-GLP-1(7-37);Gly8Glu22-GLP-1(7-37); Val8Glu22-GLP-1(7-37); Met8Glu22-GLP-1(7-37); Gly8Lys22-GLP-1(7-37); Val8Lys22-GLP-1(7-37); Met8Lys22-GLP-1(7-37); Gly8Arg22-GLP-1(7-37); Val8Lys22His37-GLP-1(7-37); Gly8Glu22His37-GLP-1(7-37); Val8Glu22His37-GLP-1(7-37); Met8Glu22His37-GLP-1(7-37);Gly8Lys22 His37-GLP-1(7-37); Met8Lys22His37-GLP-1(7-37);Gly8Arg22His37-GLP-1(7-37); Val8Arg22His37-GLP-1(7-37); Met8Arg22His37-GLP-1(7-37); Gly8His22His37-GLP-1(7-37); Val8His22His37-GLP-1(7-37); Met8His22His37-GLP-1(7-37); Gly8His37-GLP-1(7-37); Val8His37-GLP-1(7-37); Met8His37-GLP-1(7-37);Gly8Asp22 His37-GLP-1(7-37); Val8Asp22His37-GLP-1(7-37); Met8Asp22His37-GLP-1(7-37); Arg26-GLP-1(7-36)-アミド; Arg34-GLP-1(7-36)-アミド; Lys36-GLP-1(7-36)-アミド; Arg26,34Lys36-GLP-1(7-36)-アミド; Arg26,34-GLP-1(7-36)-アミド; Arg26,34Lys40-GLP-1(7-36)-アミド; Arg26Lys36-GLP-1(7-36)-アミド; Arg34Lys36-GLP-1(7-36)-アミド; Gly8-GLP-1(7-36)-アミド; Val8-GLP-1(7-36)-アミド; Met8-GLP-1(7-36)-アミド;Gly8Asp22-GLP-1(7-36)-アミド; Gly8Glu22His37-GLP-1(7-36)-アミド; Val8Asp22-GLP-1(7-36)-アミド; Met8Asp22-GLP-1(7-36)-アミド;Gly8Glu22-GLP-1(7-36)-アミド; Val8Glu22-GLP-1(7-36)-アミド; Met8Glu22-GLP-1(7-36)-アミド; Gly8Lys22-GLP-1(7-36)-アミド; Val8Lys22-GLP-1(7-36)-アミド; Met8Lys22-GLP-1(7-36)-アミド; Gly8His22His37-GLP-1(7-36)-アミド; Gly8Arg22-GLP-1(7-36)-アミド; Val8Arg22-GLP-1(7-36)-アミド; Met8Arg22-GLP-1(7-36)-アミド;Gly8His22-GLP-1(7-36)-アミド; Val8His22-GLP-1(7-36)-アミド; Met8His22-GLP-1(7-36)-アミド;His37-GLP-1(7-36)-アミド; Val8Arg22His37-GLP-1(7-36)-アミド; Met8Arg22His37-GLP-1(7-36)-アミド; Gly8His37-GLP-1(7-36)-アミド; Val8His37-GLP-1(7-36)-アミド; Met8His37-GLP-1(7-36)-アミド;Gly8Asp22 His37-GLP-1(7-36)-アミド; Val8Asp22His37-GLP-1(7-36)-アミド; Met8Asp22His37-GLP-1(7-36)-アミド; Val8Glu22His37-GLP-1(7-36)-アミド; Met8Glu22His37-GLP-1(7-36)-アミド;Gly8Lys22 His37-GLP-1(7-36)-アミド; Val8Lys22His37-GLP-1(7-36)-アミド; Met8Lys22His37-GLP-1(7-36)-アミド;Gly8Arg22His37-GLP-1(7-36)-アミド; Val8His22His37-GLP-1(7-36)-アミド; Met8His22His37-GLP-1(7-36)-アミド；並びにこれらの誘導体である。これらのGLP-1類似体および切断された類似体のそれぞれが、本発明の別の態様を構成する。
【００１３】
また、本発明は、特にGLP-2およびこれらの類似体のアシル化に適している。本発明に従ってNアシル化することができるGLP-2および類似体の例は、GLP-2類似体およびLys20GLP-2（1-33）；Lys20Arg30GLP-2（1-33）；Arg30Lys34GLP-2（1-34）；Arg30Lys35GLP-2（1-35）；Arg30,35Lys20GLP-2（1-35）；およびArg35GLP-2（1-35）などの切断された類似体である。これらのGLP-2類似体および切断された類似体のそれぞれが、本発明の別の態様を構成する。
【００１４】
また、本発明は、特にexendin-3およびexendin-4並びにこれらの類似体のアシル化に適している。本発明に従ってN-アシル化することができるexendin類似体の例は、たとえば国際公開公報第99/43708号に開示されている。これらのexendin類似体および切断された類似体のそれぞれが、本発明の別の態様を構成する。
【００１５】
また、本発明は、特にインスリンおよびこれらの類似体のアシル化に適している。本発明に従ってN-アシル化することができるインスリンおよびこれらの類似体の例は、ヒトインスリンおよびdes（B30）-ヒトインスリンである。
【００１６】
本発明のさらなる態様において、N-アシル化は、ε-リジン残基のアミノ基で生じる。
【００１７】
アシル化剤  
本発明に従った方法において、少なくとも１つの遊離のアミノ基を有するペプチド（または、タンパク質）を一般式Iのアシル化剤と作用させる。
【化３】
0004468174.tif 000003
式Iの整数nは、好ましくは0〜8、特に、たとえばアスパラギン酸、グルタミン酸、その他に対応する0〜6である。好ましくは、nは、0〜2、たとえば0（アスパラギン酸）または1（グルタミン酸）などの0〜4である。これらの整数および範囲のそれぞれが本発明の別の態様を構成する。
【００１８】
式IのR1は、遊離酸基（COOH）またはエステル基（COOR4）を表す。R1がエステル基である場合、R4は、塩基性条件下で加水分解によって（対応するアルコール類として）除去することができる基から選択される。このような基の例は、C1-12-アルキル、例えばメチル、エチル、プロプ-1-イル、プロプ-2-イル、ブト-1-イル、ブト-2-イル、2-メチル-プロプ-1-イル、2-メチル-プロプ-2-イル（t-ブチル）、ヘキサ-1-イル、その他、およびベンジルである。これらの基のそれぞれが本発明の別の態様を構成する。
【００１９】
式IのR2は、ペプチドまたはタンパク質に取り込まれる親油性部分を表す。このような親油性部分は、典型的にはC3-39-アルキル、C3-39-アルケニル、C3-39-アルカジエニル、およびステロイド残基から選択される。C3-39-アルキルの具体例は、ヘプチル、ノニル、ウンデカニル、トリデカニル、ペンタデカニル、ヘプタデカニル、およびノナデカニルである。これらの親油性部分のそれぞれが本発明の別の態様を構成する。
【００２０】
親油性の置換基または部分は、20℃において約0.1mg／100mlの水〜約250mg／100mlの水の範囲の、好ましくは約0.3mg／100mlの水〜約75mg／100mlの水の範囲の水への溶解度を有することによって特徴づけられる。例えば、オクタン酸（C8）は、20℃で68mg／100mlの水への溶解度を有し、デカン酸（C10）は20℃で15mg／100mlの水への溶解度を有し、オクタデカン酸（C18）は、20℃で0.3mg／100mlの水への溶解度を有する。これらの親油性置換基の範囲のそれぞれが本発明の別の態様を構成する。
【００２１】
「C3-39アルキル」、「C3-39-アルケニル」、および「C3-39-アルカジエニル」の用語は、直鎖および分枝の、好ましくは直鎖の、それぞれ飽和、不飽和、ジ不飽和の、3-39炭素原子の炭化水素基を包含することが企図される。C3-39-アルキルの具体例は、ヘプチル、ノニル、ウンデカニル、トリデカニル、ペンタデカニル、ヘプタデカニル、およびノナデカニルである。
【００２２】
本明細書に使用される場合、「ステロイド残基」の用語は、親油基が、R2が付着されるカルボニル基と共に、ステロイドカルボン酸、すなわち三環系、四環系、および五環系の完全に飽和したか、または部分的に不飽和のC16-36-炭化水素に由来すること意味することが企図される。このような基R2-C（=O）-の例は、リトコロイル、デオキシコロイル、およびコロイルである。
【００２３】
前述の親油基の中で、C7-25-アルキル、C7-25-アルケニル、C7-25-アルカジエニル、およびステロイド残基は、特に適している。特に興味深い例は、ヘプチル、ノニル、ウンデカニル、トリデカニル、ペンタデカニル、ヘプタデカニル、ノナデカニル、リトコロイル、デオキシコロイル、およびコロイルである。これらの親油基のそれぞれが本発明の別の態様を構成する。
【００２４】
式IのR3は、R3が付着されるカルボキシル基と共に、反応性のエステルまたは反応性のN-ヒドロキシイミドエステルを示す。これらのエステル類のそれぞれが本発明の別の態様を構成する。反応性のエステルおよび反応性のN-ヒドロキシイミドエステルは、アミノ基、チオ基、およびヒドロキシ基のアシル化に使用される官能基として有機化学の（特にペプチド化学の）技術分野において周知である。本発明の前後関係の範囲内で、「反応性のエステルまたは反応性のN-ヒドロキシイミドエステル」の用語は、アミン（好ましくは一級アミン）をアシル化するために適したカルボン酸基のエステルを官能化させた形態を意味することが企図される。したがって、一級アミンのアシル化の選択性は、ヒドロキシ基およびチオ基のアシル化以上に好ましいことがよく理解されるはずである。反応性のN-ヒドロキシイミドエステルは、特に好ましい。
【００２５】
反応性のエステルの例は、1-ヒドロキシベンゾトリアゾールエステルおよび誘導体である。多くの非常に有効な試薬、たとえば2（1H-ベンゾトリアゾル-1イル）-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレートは、このようなカルボン酸の活性化されたエステルの形成のために既知である。このような反応性のエステルは、典型的には塩基、例えばトリアルキルアミンなどの有機塩基の存在下においてインサイチューで形成される。
【００２６】
反応性のN-ヒドロキシイミドエステルのイミド部分の例は、欧州特許第0511600A2号、3ページ〜7ページに具体的に記載されているものである。これらの中で特に興味深いイミド部分の例は、スクシンイミド、フタルイミド、その他であり、それぞれのこれらのイミド部分のそれぞれが本発明の別の態様を構成する。
【００２７】
式Iの反応性のN-ヒドロキシイミドエステルは、国際公開公報第00/55119号および国際公開公報第98／02460号に記載されているとおりに調製することができる。
【００２８】
式Iのアシル化試薬が遊離のα-カルボン酸（R4=水素）として使用される場合には、R4を選択的に除去することができる基である式Iの化合物は、R4が水素である対応する化合物に変換される。カルボン酸保護基は、触媒水素化によって除去することができるベンジル基または選択的に除去することができるアリル基であってもよい。ベンジル保護基は、炭素上でパラジウムおよび水素を使用することによって、室温で非プロトン性極性溶媒中での、たとえばアセトン中での触媒水素化によって除去してもよい。反応は、活発に撹拌する条件下で水素雰囲気（典型的には、0.1〜10気圧）で密閉容器で行ってもよい。反応は、典型的にはパラジウム触媒の品質に応じて、0.5〜12時間以内に完了する。従来の精密検査（work-up）を適用する。
【００２９】
反応条件  
式Iのアシル化剤とペプチドまたはタンパク質との間の反応は、10%w／w未満の非プロトン性極性溶媒を含む水溶液中において塩基性条件下で行われる。
【００３０】
本発明の1つの態様において、工程a)の反応は、0%w／w〜10%w／wの非プロトン性極性溶媒を含む水溶液中において行われる。
【００３１】
もう一つの態様において本発明の中で、工程a)の反応は、1%w／w〜10%w／wの非プロトン性極性溶媒を含む水溶液中において行われる。
【００３２】
もう一つの態様において本発明の中で、工程a)の反応は、1%w／w〜8%w／wの非プロトン性極性溶媒を含む水溶液中において行われる。
【００３３】
式Iのアシル化剤は、典型的にはアシル化されるペプチドのアミノ基の数に相関してわずかに過剰にに使用される。比率は、ペプチドのアミノ基の数を考慮して、典型的には1：1〜1：20で過剰なアシル化剤、好ましくは1：1.2〜1：5である。アシル化剤は、固体の反応混合物に添加してもよく、または溶液として反応混合物に添加してもよい。アシル化剤が溶液として添加される場合、非プロトン性極性溶媒中に溶解し、好ましくは酸を添加することによって安定化する。典型的には、安定化のための酸は、鉱酸（たとえば硫酸）である。
【００３４】
ペプチドは、使用するアシル化剤および反応条件の量に応じて、完全にNアシル化してもよく、または部分的にのみNアシル化してもよいことが理解されるべきである。N-アシル化は、実質的に化学量論的であることが好ましい。非プロトン性極性溶媒は、酸性の水素を含まない適度に）高い比誘電率を有する溶媒である（たとえば、Morrison and Boyd, Organic Chemistry, 5th ed. p 229を参照されたい）。典型的には、非プロトン性極性溶媒は、テトラヒドロフラン無水物（THF）、ジメチルホルムアミド無水物（DMF）、アセトン、ジクロロメタン、ジメチルスルホキシド（DMSO）、ジオキサン、ジメチルアセトアミド、およびN-メチル-2-ピロリドンから選択され、これらの混合物の中では、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ジメチルアセトアミド、およびN-メチル-2-ピロリドンが好ましく、N-メチル-2-ピロリドンが特に好ましい。
【００３５】
温度は、典型的には-10〜50℃の範囲で保たれる。
【００３６】
反応を円滑に進行させるために、混合溶媒のpH値は、9〜13などの7〜14の範囲、好ましくは10〜12の範囲であることが重要である。混合溶媒のpH値が10〜12の範囲であるときに、収率および純度に関する結果は、通常最適になる。所望のpH値は、アルカリ金属水酸化物、たとえば水酸化ナトリウムおよび水酸化カリウム、および／またはトリアルキルアミン（たとえばトリエチルアミン、N,N-ジイソプロプイルエチルアミン、その他）などの有機塩基を添加することによって得られる。また、pHを出発値に近くに保つために適した緩衝液を反応を開始する前に添加することが有利であろう。この目的ために使用してもよい緩衝液の例は、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液などである。
【００３７】
典型的な例として、工程(a)の反応は、タンパク質および式Iのアシル化剤を1：1〜1：5のモル比で使用して行われる。ペプチドは、典型的には0〜25℃などの-10〜30℃で水にプレ溶解し、水酸化アルカリ金属（たとえば、水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウム）を使用して所望のレベルにpHを合わせる。pH値は、酸、たとえば酢酸、および塩基、たとえばトリアルキルアミンを使用してさらに調整してもよいが、温度は、上記の範囲内であることが好ましい。あるいは、ペプチドは、関連した酸または塩基の適切な量の水溶液に直接プレ溶解させる。その後にアシル化剤を固体として、または非プロトン性極性溶媒の溶液として添加する。反応は、典型的には完了まで進行させる（HPLCによってモニターすることができる）（これは、水および酸たとえば酢酸を添加してpH6.5〜9.0にする前に、0.2〜1時間などの0.2〜4時間以内に典型的には得られる）。生成物は、典型的にはHPLCによって単離し、精製し、または等電pHによって沈殿させ、または精製の前に加水分解する（工程（b））。
【００３８】
R4が水素である式Iのアシル化剤を使用するときは、親油性部分を有するNアシル化されたペプチドまたはタンパク質および遊離のカルボン酸基が直接得られる。したがって、R4が水素である変種は、本発明の方法の好ましい態様を表す。
【００３９】
あるいは、すなわち、基R4がC1-12-アルキルまたはベンジルであるときに、Nアシル化されたペプチドエステル（または、タンパク質エステル）を、Nアシル化されたペプチドまたはNアシル化されたタンパク質を得るために塩基性条件下でけん化させる。けん化は、典型的には0.01〜4.0Mのアルカリ金属水酸化物、たとえば水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムの溶液中で行う。溶液のpHは、典型的には10〜14である。反応は、典型的には室温周辺などの0〜40℃で、0.1〜12時間、好ましくは0.5〜4時間進行することができる。反応後、たとえば、等電pHで沈澱により、および／または調製用のHPLCにより、性生物を精製する。したがって、R4がC1-12-アルキルまたはベンジルである変種は、本発明の方法のもう一つの好ましい態様を表す。
【００４０】
一本方法のつの態様において、アシル化剤は、固体として反応混合物に添加される。
【００４１】
本方法のもう一つの態様において、前記工程a)の反応は、0%w／w〜8%w／wの非プロトン性極性溶媒を、好ましくは0%w／w〜5%w／wの非プロトン性極性溶媒を、より好ましくは0%w／w〜3%w／wの非プロトン性極性溶媒を含む水性混合溶媒中で生じる。
【００４２】
本方法のさらにもう一つの態様において、前記工程a)の反応は、非プロトン性極性溶媒の存在下において生じ、前記非プロトン性極性溶媒はN-メチル-2-ピロリドン、テトラヒドロフランおよびジメチルスルホキシドからなる群より選択される。
【００４３】
本方法のさらにもう一つの態様において、非プロトン有機溶媒の全ては、アシル化剤の溶媒として反応混合物に添加される。
【００４４】
本方法のさらにもう一つの態様において、アシル化剤は、酸を添加することによって安定化される溶液として反応混合物に添加される。
【００４５】
本方法のさらにもう一つの態様において、前記酸は、0.01%w／w〜1%w／wの濃度で、好ましくは0.05%w／w〜0.5%w／wの濃度で非プロトン性極性溶媒に添加される。
【００４６】
本方法のさらにもう一つの態様において、前記酸は、硫酸、メタンスルホン酸、およびトリフルオロ酢酸からなる群より選択される。
【００４７】
本方法のさらにもう一つの態様において、工程a)の反応は、非プロトン性極性溶媒の非存在下で生じる。
【００４８】
本方法のさらにもう一つの態様において、式IのR4は水素である。
【００４９】
本方法のさらにもう一つの態様において、R4は、C1-8-アルキルおよびベンジルから選択される。
【００５０】
本方法のさらにもう一つの態様において、R3は、R3が付着されるカルボキシル基と共に、反応性のN-ヒドロキシイミドエステルを示す。
【００５１】
本方法のさらにもう一つの態様において、アシル化されたペプチドエステルは、10〜14の範囲のpH値で、好ましくは9〜13のpH範囲でけん化される。
【００５２】
本方法のさらにもう一つの態様において、アシル化されたペプチドエステルは、10〜13のpH範囲のなど、9〜14の範囲のpH値でけん化される。
【００５３】
本方法のさらにもう一つの態様において、工程a)の反応混合物のpHは、pH9〜pH13、好ましくはpH10から〜pH12、より好ましくはpH11.0〜pH11.5である。
【００５４】
本方法のさらにもう一つの態様において、工程a)の反応混合物は、反応の間に実質的に一定のpHを維持するために適している緩衝液を含む。
【００５５】
本方法の一つの態様において、前記緩衝液は、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、またはこれらの混合物である。
【００５６】
本方法のさらにもう一つの態様において、工程a)の反応混合物の温度は、0〜50℃の範囲で、好ましくは5〜40℃の範囲で、およびより好ましくは10〜30℃の範囲である。
【００５７】
本方法のさらにもう一つの態様において、R2は、C3-39-アルキル、C3-39-アルケニル、C3-39-アルカジエニル、およびステロイド残基から選択される。
【００５８】
本方法のさらにもう一つの態様において、R2-C（=O）-は、リトコロイルおよびヘキサデカノイルからなる群より選択される。
【００５９】
本方法のさらにもう一つの態様において、工程a)の出発原料として使用する前記ペプチドは、RP-HPLCによってけっていすると少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、または少なくとも97%のペプチド純度を有する。
【００６０】
本方法のさらにもう一つの態様において、前記ペプチドは、GLP-2、GLP-1、exendin-4、グルカゴン、インスリン、これらの類似体、および前述のいずれかの誘導体からなる群より選択される。
【００６１】
本方法のさらにもう一つの態様において、前記ペプチドは、GLP-1アゴニストである。
【００６２】
本方法のさらにもう一つの態様において、前記ペプチドは、exendin-3、exendin-4、Arg34-GLP-1（7-37）、Gly8-GLP-1（7-36）-アミド、Gly8-GLP-1（7-37）、Val8-GLP-1（7-36）-アミド、Val8-GLP-1（7-37）、Val8Asp22-GLP-1（7-36）-アミド、Val8Asp22-GLP-1（7-37）、Val8Glu22-GLP-1（7-36）-アミド、Val8Glu22-GLP-1（7-37）、Val8Lys22-GLP-1（7-36）-アミド、Val8Lys22-GLP-1（7-37）、Val8Arg22-GLP-1（7-36）-アミド、Val8Arg22-GLP-1（7-37）、Val8His22-GLP-1（7-36）-アミド、Val8His22-GLP-1（7-37）、des（B30）ヒトインスリン、およびこれらの類似体からなる群より選択される。
【００６３】
本方法のさらにもう一つの態様において、前記ペプチドは、Val8Trp19Glu22-GLP-1（7-37）、Val8Glu22Val25-GLP-1（7-37）、Val8TyR16Glu22-GLP-1（7-37）、Val8Trp16Glu22-GLP-1（7-37）、Val8Leu16Glu22-GLP-1（7-37）、Val8TyR18Glu22-GLP-1（7-37）、Val8Glu22His37-GLP-1（7-37）、Val8Glu22Ile33-GLP-1（7-37）、Val8Trp16Glu22Val25Ile33-GLP-1（7-37）、Val8Trp16Glu22Ile33-GLP-1（7-37）、Val8Glu22Val25Ile33-GLP-1（7-37）、Val8Trp16Glu22Val25-GLP-1（7-37）、およびこれらの類似体から成ることからなる群より選択される。
【００６４】
本方法のさらにもう一つの態様において、前記ペプチドは、HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPSKKKKKK-NH2（ZP-10）およびこれらの類似体から選択される。
【００６５】
本方法のもう一つの態様において、前記ペプチドは、インスリン・ペプチドでなく、すなわちインスリンまたはこれらの類似体でない。本方法のさらにもう一つの態様において、前記ペプチドは、1つのポリペプチド鎖だけを含む。本方法のさらにもう一つの態様において、前記ペプチドは、少なくとも１つのジスルフィド結合によって共有結合で接続された2つのポリペプチド鎖を含む。
【００６６】
本発明のもう一つの側面は、Arg34、Lys26(Nε-(γ-Glu(Nα-ヘキサデカノイル)))-GLP-1(7-37)、およびLysB29(Nε-テトラデカノイル) des(B30)ヒトインスリンおよびLysB29(Nε[Nα-リトコロイル-Glu-OH]) des(B30)ヒトインスリンからなる群より選択されるペプチド誘導体の調製のためのアシル化方法の使用である。
【実施例】
【００６７】
アシル化試薬の調製は、国際公開公報第00/55119号に記載したように行われる。
【００６８】
実施例において、カラムクロマトグラフィーによって生成物の最終的な精製物を得た。
【００６９】
実施例1  
Arg34GLP-1（7-37）を従来の組換えDNA技術によって（たとえば、国際公開公報第98/08871に記載したように）、酵母（S.cerevisiae）に発現した。次いで、培養液中のArg34GLP-1（7-37）を従来の逆相クロマトグラフィーによって精製し、その後ペプチドの等電pHで、すなわちpH5.4で沈殿させた。沈殿を遠心分離によって単離し、凍結した。
【００７０】
Arg34-GLP-17-37（1.47gの等沈殿した（iso-precipitated）凍結ペプチド材料、約0.10mmol）を10〜15℃で0.1mol／kgのトリエチルアミン（23ml）に溶解した。溶液のpHは、11.6であった。Nヘキサデカノイルグルタミン酸性γ-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（63.7mg、0.13mmol）を添加した。室温で20分後に、水（42ml）を添加し、1.0Mの酢酸を添加することによってpHを8.0に合わせた。
【００７１】
収率：RP-HPLC解析によって、反応混合物は、84%（領域による）のArg34Lys26-[N-ε-(γ-Glu(N-ヘキサデカノイル))]-GLP-17-37および0.5%（領域による）のArg34Lys26-[N-ε-(α-Glu(N-ヘキサデカノイル))]-GLP-17-37を含むことが示された。
【００７２】
実施例2  
Arg34GLP-1（7-37）を従来の組換えDNA技術によって（たとえば、国際公開公報第98/08871に記載したように）、酵母（S.cerevisiae）に発現した。次いで、培養液中のArg34GLP-1（7-37）を従来の逆相クロマトグラフィーによって精製し、その後ペプチドの等電pHで、すなわちpH5.4で沈殿させた。沈殿を遠心分離によって単離し、凍結した。
【００７３】
Arg34-GLP-17-37（1.57gの等沈殿した（iso-precipitated）凍結ペプチド材料、約0.14mmol）を10〜15℃で0.1mol／kgのトリエチルアミン（23ml）に溶解した。溶液のpHをトリエチルアミンを添加することによって11.5に合わせた。0.105%w／w 1MのH2SO4を含むN-メチル-2-ピロリドンに溶解した1.7mlのN-ヘキサデカノイルグルタミン酸性γ-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（92.1mg、0.19mmol）を添加した。室温で20分後に、水（42ml）を添加し、1.0Mの酢酸を添加することによってpHを8.0に合わせた。
【００７４】
収率：RP-HPLC解析によって、反応混合物は、83%（領域による）のArg34Lys26-[N-ε-(γ-Glu(N-ヘキサデカノイル))]-GLP-17-37および0.4%（領域によって）のArg34Lys26-[N-ε-(α-Glu(N-ヘキサデカノイル))]-GLP-17-37を含むことが示された。
【００７５】
実施例3  
Arg34GLP-1（7-37）を従来の組換えDNA技術によって（たとえば、国際公開公報第98/08871に記載したように）、酵母（S.cerevisiae）に発現した。次いで、培養液中のArg34GLP-1（7-37）を従来の逆相クロマトグラフィーによって精製し、その後ペプチドの等電pHで、すなわちpH5.4で沈殿させた。沈殿を遠心分離によって単離し、凍結した。
【００７６】
Arg34-GLP-17-37（1.53gの等沈殿した（iso-precipitated）凍結ペプチド材料、約0.13mmol）を室温で0.05mol／kgのトリエチルアミン（25ml）に溶解した。溶液のpHは10.9であった。H2SO4を伴わないN-メチル-2-ピロリドンに溶解した1.8mlのN-ヘキサデカノイルグルタミン酸性γ-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（94.2mg、0.19mmol）を添加した。室温で30分後に、水（42ml）を添加し、1.0Mの酢酸を添加することによってpHを8.0に合わせた。
【００７７】
収率：RP-HPLC解析によって、反応混合物は、75%（領域による）Arg34Lys26-[N-ε-(γ-Glu(N-ヘキサデカノイル))]-GLP-17-37のおよび4.0%（領域によって）Arg34Lys26-[N-ε-(α-Glu(N-ヘキサデカノイル))]-GLP-17-37を含むことが示された。
【００７８】
実施例4−＞10%w／wの濃度の非プロトン性極性溶媒での参照実施例  
Arg34GLP-1（7-37）を従来の組換えDNA技術によって（たとえば、国際公開公報第98/08871に記載したように）、酵母（S.cerevisiae）に発現した。次いで、培養液中のArg34GLP-1（7-37）を従来の逆相クロマトグラフィーによって精製し、その後ペプチドの等電pHで、すなわちpH5.4で沈殿させた。沈殿を遠心分離によって単離し、凍結した。
【００７９】
Arg34-GLP-17-37（1.57gの等沈殿した（iso-precipitated）凍結ペプチド材料、約0.14mmol）を10〜15℃で0.1mol／kgのトリエチルアミン（23ml）に溶解した。N-メチル-2-ピロリドン（6.8ml）を添加して、溶液のpHをトリエチルアミンを添加することによって11.5に合わせた。次いで、0.105%w／w 1MのH2SO4を含むN-メチル-2-ピロリドンに溶解した1.7mlのN-ヘキサデカノイルグルタミン酸性γ-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（92.1mg、0.19mmol）を添加した。室温で20分後に、水（54ml）を添加し、1.0Mの酢酸を添加することによってpHを8.0に合わせた。
【００８０】
収率：RP-HPLC解析によって、反応混合物は、87%（領域によって）のArg34Lys26-[N-ε-(γ-Glu(N-ヘキサデカノイル))]-GLP-17-37および0.5%（領域によって）のArg34Lys26-[N-ε-(α-Glu(N-ヘキサデカノイル))]-GLP-17-37を含むことが示された。
【００８１】
実施例5−＞10%w／wの濃度の非プロトン性極性溶媒濃度を有する参照実施例  
Arg34GLP-1（7-37）を従来の組換えDNA技術によって（たとえば、国際公開公報第98/08871に記載したように）、酵母（S.cerevisiae）に発現した。次いで、培養液中のArg34GLP-1（7-37）を従来の逆相クロマトグラフィーによって精製し、その後ペプチドの等電pHで、すなわちpH5.4で沈殿させた。沈殿を遠心分離によって単離し、凍結した。
【００８２】
Arg34-GLP-17-37（1.51gの等沈殿した（iso-precipitated）凍結ペプチド材料、約0.13mmol）を10〜15℃で0.1mol／kgのトリエチルアミン（20ml）およびN-メチル-2-ピロリドン（100ml）に溶解した。次いで、0.105%w／w 1MのH2SO4を含むN-メチル-2-ピロリドンに溶解した1.4mlのN-ヘキサデカノイルグルタミン酸性γ-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（74mg、0.15mmol）を添加した。室温で45分後に、水（206ml）を添加し、1.0Mの酢酸を添加することによってpHを8.0に合わせた。
【００８３】
収率：RP-HPLC解析によって、反応混合物は、57%（領域によって）のArg34Lys26-[N-ε-(γ-Glu(N-ヘキサデカノイル))]-GLP-17-37および14%（領域によって）のArg34Lys26-[N-ε-(α-Glu(N-ヘキサデカノイル))]-GLP-17-37を含むことが示された。
【００８４】
実施例6  
表1に、実施例1〜5の実験のArg34-GLP-17-37をアシル化するために使用する実験条件を要約してあり、生じる不純物Arg34Lys26-[N-ε-(α-Glu(N-ヘキサデカノイル))]-GLP-17-37（α-gluと省略）の含量を一覧表に記載してある。安定剤としてH2SO4を伴わないと、低濃度の非プロトン性極性溶媒は、α-glu不純物の量を減少させる際に有効なことが明らかである。安定剤を添加すると、有意な量のα-glu不純物が、有意に高い濃度、すなわち28%w／w以上の濃度の非プロトン性極性溶媒で始まる。
【００８５】
表1。GLP-1ペプチドをアシル化するときの反応混合物中の非プロトン性極性溶媒の含量および生じる不純物Arg34Lys26-[N-ε-(α-Glu(N-ヘキサデカノイル))]-GLP-17-37（α-glu）の区分。（例1〜5からのデータ）。
【表１】
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実施例7  
ナトリウム結晶化したdes（B30）-ヒトインスリン（1.74gの等電沈殿によって単離した凍結ペプチド材料、約0.088mmol）を室温で0.1mol／kgのトリエチルアミン（10.85ml）に溶解した。溶液のpHは、10.9であった。次いで、N-メチル-2-ピロリドン（1.25ml）に溶解したメチル（2S）-5-[（2,5-ジオキソ-1-ピロリジニル）オキシ]-2-｛[（3a,5b）-3-ヒドロキシ-9-メチル-24-オキソコラン-24-イル]アミノ｝-5-オキソペンタノアート（55.1mg、0.089mmol）を添加した。室温で30分後に、水（5℃、85ml）を添加した。
【００８６】
収率：RP-HPLC解析によって、反応混合物は、Nε-(リトコロイル-γ-グルタミル)-LysB29-des(B30)-ヒトインスリンを含むことが示された。
【００８７】
実施例8  
Arg34GLP-1（7-37）を従来の組換えDNA技術によって（たとえば、国際公開公報第98/08871に記載したように）、酵母（S.cerevisiae）に発現した。次いで、培養液中のArg34GLP-1（7-37）を従来の逆相クロマトグラフィーによって精製し、その後ペプチドの等電pHで、すなわちpH5.4で沈殿させた。沈殿を遠心分離によって単離し、凍結した。
【００８８】
Arg34GLP-1（7-37）を含む等電点沈殿（5.70gの凍結ペプチド材料、約0.38mmol）を15℃で0.1Mのリン酸水素二ナトリウム二水和物溶液（170mL、pHは、1MのNaOHで11.35に合わせた）に溶解した。溶液のpHは、1MのNaOHを添加することによって11.4に再調整した。0.105%w／w 1MのH2SO4を含むN-メチル-2-ピロリドンに溶解した3mLのN-ヘキサデカノイルグルタミン酸性γ-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（248.1mg、0.51mmol）を8分間で滴下して添加した。
【００８９】
試料を15℃で21.5時間の反応の間に引き出して、1mg／mLのグリシン（pH7.5）を含む0.1Mのリン酸二水素ナトリウム二水和物溶液を添加した。最終的な反応混合物を水（300mL）で希釈し、pHは氷酸（glacial acid）を添加することによって8.0に合わせた。
【００９０】
収率：RP-HPLC解析によって、反応混合物は、78-80%（領域によって）のArg34Lys26-[N-ε-(γ-Glu(N-ヘキサデカノイル))]-GLP-17-37および0.24-1.67%（領域によって）のArg34Lys26-[N-ε-(α-Glu(N-ヘキサデカノイル))]-GLP-17-37を含むことが示された。
【００９１】
表2。反応時間に対するArg34Lys26-[N-ε-(γ-Glu(N-ヘキサデカノイル))]-GLP-17-37（γ-Glu）およびArg34Lys26-[N-ε-(α-Glu(N-ヘキサデカノイル))]-GLP-17-37（α-Glu）の含量（実施例8からのデータ）。
【表２】
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【配列表】
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