(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘマトコッカスプールビアリースを含む細胞培養液をドデカンと混合及び攪拌して、フリーアスタキサンチン及びアスタキサンチンエステルを含むアスタキサンチン物質を含有するドデカン抽出物を得る第１段階と、
前記ドデカン抽出物を水酸化ナトリウム水溶液の添加されたメタノールと混合及び攪拌してフリーアスタキサンチンを含むアルコール抽出物を得る第２段階と、
前記第２段階で分離された前記ドデカンを再循環し、前記第１段階及び前記第２段階に繰り返し用いる第３段階と、
を含み、
前記ドデカンと前記メタノールとの体積比が１：１であることを特徴とする、ヘマトコッカスプールビアリースからフリーアスタキサンチンを選択的に分離する方法。
【請求項２】
前記第１段階では、前記ドデカンと前記細胞培養液の密度差を用いた自然定置により、前記細胞培養液から前記ドデカン抽出物を相分離して前記ドデカン抽出物を得、
前記第２段階では、前記ドデカン溶媒と前記メタノールの密度差を用いた自然定置により、前記ドデカンから前記フリーアスタキサンチンを含む前記メタノール抽出物を相分離し、前記メタノール抽出物を得る
ことを特徴とする、請求項１に記載のヘマトコッカスプールビアリースからフリーアスタキサンチンを選択的に分離する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は緑藻類からフリーアスタキサンチン（Ｆｒｅｅ−ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ）を選択的に分離する方法に関し、より具体的には、緑色微細藻類であるヘマトコッカスプールビアリース（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）からフリーアスタキサンチンを選択的に分離する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
赤色を呈するケトカロテノイド（ｋｅｔｏｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ）であるアスタキサンチン（ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ）は、β−カロチン（β−ｃａｒｏｔｅｎｅ）のような化学的構造を有するカロチノイド（ｃａｒｏｔｉｎｏｉｄ）系色素の一種であり、老化や癌の原因となる有害活性酸素をなくす能力を有する抗酸化機能性物質である。アスタキサンチンはβ−カロチンに比べて両末端基にヒドロキシル基（−ＯＨ）とケトン基（＝Ｏ）を１つずつ更に有する独特の分子構造的な特性を有するため、既存の抗酸化物質よりも極めて高い抗酸化活性を有し、例えば、代表的な抗酸化剤であるビタミンＥよりも５００倍、ベータ−カロチンより２０倍程度高い抗酸化活性を有する。
【０００３】
このような高い抗酸化性機能により、アスタキサンチンは、医薬品、食品添加剤及び動物と稚魚の飼料添加剤として広く用いられ、その需要量及び活用範囲が急激に拡大されるものと予想されている。
【０００４】
アスタキサンチンを生産する方法には、化学的合成法、カニやエビなどの甲殻類の外殻から抽出する方法、微生物菌株であるファフィロドジマ（Ｐｈａｆｆｉａ  ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）とヘマトコッカスプールビアリースを用いて直接生産する方法がある。
【０００５】
化学的合成法によって生産されたアスタキサンチンは、天然物質に比べて生体内吸収率が劣り、食品添加剤として安全性に対する問題点を有しており、ＦＤＡから食品添加剤として承認を受けられず、ノルウェー、チリ、カナダなど単に一部の国だけがこれを許容している。
【０００６】
合成アスタキサンチンに比べて、天然アスタキサンチンが生物体に高濃度で蓄積されるという研究結果によって、エビやカニの副産物から天然アスタキサンチンを生産するための努力を行ってきたが、分離及び精製過程における問題点により、アスタキサンチン供給源として使用が不適切な問題点がある。
【０００７】
結果的に、天然アスタキサンチンを生産するためには、菌株の培養を通じた生合成が求められ、その中でも最も産業上利用できる可能性を有する菌株は、ファフィロドジマとヘマトコッカスプールビアリースである。緑藻類であるヘマトコッカスプールビアリースは、酵母であるファフィロドジマに比べて極めて高いアスタキサンチン蓄積量を有するにもかかわらず、低い成長速度と厚い細胞壁、そして低い細胞密度のような問題点により、高成長性のファフィロドジマよりも現在の選好性及び産業性が遅れているが、ヘマトコッカス種だけが有する３Ｓ、３Ｓ’のアスタキサンチン異性体が脂質環境における安定性を高めるものと推定され、最も将来性のある生産方法と判断される。
【０００８】
従って、ヘマトコッカス種によるアスタキサンチンを商用化するためには、細胞の高濃度培養及びアスタキサンチンの高濃度生産に関連する技術だけでなく、細胞内に蓄積されたアスタキサンチンを効率よく回収する技術の開発が必須であるといえる。特に、光合成微細藻類の高濃度培養技術は、光培養器の開発などを通じて活発に行われているが、ヘマトコッカスアスタキサンチンの高濃度分離技術の開発は未だ充分ではなく、高純度のアスタキサンチン抽出物を得る方法が商業上利用できる程度に開発されずにいる。
【０００９】
これまで提示された代表的なヘマトコッカスアスタキサンチンの回収方法としては、水分を完全に除去した菌株を液体窒素で冷凍させた後、インパクトミル（ｉｍｐａｃｔ  ｍｉｌｌ）を用いて粉末化し、これを通じて菌株の細胞壁を破壊してアスタキサンチンを抽出する機械的処理法や、物理的ホモジナイザー（ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ）のような機械を用いて細胞壁を破壊した後、溶媒からアスタキサンチンを抽出する物理的処理法や、細胞壁を分解する酵素、つまり、セルラーゼ、ペクチナーゼ、プロテアーゼなどを用いて細胞壁を破壊した後、アスタキサンチンを抽出する生物学的処理法などがある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、上記のような方法は、低い抽出速度と高いアスタキサンチン破壊率、多くの手間と高額な処理費用のなどの問題点が存在し、それによって開発された技術が実用化に至らずにいるという問題があった。
【００１１】
従って、ヘマトコッカス種を用いたアスタキサンチンを商業的に大量生産するために、菌株から高濃度のアスタキサンチンを効率的に回収することができる新たな効率のよいアスタキサンチンの分離工程が希求されていた。
【００１２】
そこで、本発明は、このような問題に鑑みてなされたもので、その目的は、ヘマトコッカスアスタキサンチンを商用化するため、菌株からフリーアスタキサンチンの分離を極大化することが可能な、新規かつ改良されたヘマトコッカスプールビアリースからフリーアスタキサンチンを選択的に分離する方法を提供することにある。
【００１３】
本発明の他の目的は、前述した方法を通じてヘマトコッカス種を含む有用微細藻類培養液からアスタキサンチンを含む類似カロチノイド物質を抽出分離する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記課題を解決するために、本発明のある観点によれば、ヘマトコッカスプールビアリース（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）を含む細胞培養液をドデカンと混合及び攪拌してフリーアスタキサンチン（Ｆｒｅｅ−ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ）及びアスタキサンチンエステル（Ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ  ｅｓｔｅｒ）などのアスタキサンチン物質を含むドデカン抽出物（フリーアスタキサンチン及びアスタキサンチンエステルを含むアスタキサンチン物質を含有するドデカン抽出物）を得る第１段階と、ドデカン抽出物を水酸化ナトリウム水溶液の添加されたメタノールと混合及び攪拌してフリーアスタキサンチンを含むメタノール抽出物を得る第２段階と、第２段階で分離されたドデカンを再循環し、第１段階及び第２段階に繰り返し用いる第３段階と、を含み、ドデカンとメタノールとの体積比が１：１であるヘマトコッカスプールビアリースからフリーアスタキサンチンを選択的に分離する方法が提供される。
【００１８】
上記第１段階では、ドデカンと細胞培養液の密度差を用いた自然定置により、細胞培養液からドデカン抽出物を相分離してドデカン抽出物を得、上記第２段階では、ドデカン溶媒とメタノールの密度差を用いた自然定置により、ドデカンからフリーアスタキサンチンを含むメタノール抽出物を相分離し、メタノール抽出物を得てもよい。
【発明の効果】
【００２１】
本発明はヘマトコッカスプールビアリース培養液からフリーアスタキサンチンを選択的に効率よく回収することができる極めて簡単な形態の工程技術を提供することによって、高濃度のアスタキサンチン分離効率を極大化させるだけでなく、アルカン溶媒をフリーアスタキサンチン抽出するための媒介溶媒として繰り返し用いることによって、経済的なフリーアスタキサンチン分離工程を簡便に実現することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下に添付図面を参照しながら、本発明の好適な実施の形態について詳細に説明する。なお、本明細書及び図面において、実質的に同一の機能構成を有する構成要素については、同一の符号を付することにより重複説明を省略する。
【００２３】
上記課題を解決するために、本発明は、連続的に行われるアルカン系溶媒抽出段階及びアルコール溶媒抽出段階から構成された２段２相溶媒抽出段階を用いた緑色微細藻類であるヘマトコッカスプールビアリースからフリーアスタキサンチンを選択的に分離する方法を提供することにある。
【００２４】
より具体的には、本発明は、ヘマトコッカスプールビアリースを含む細胞培養液をアルカン系溶媒と混合及び攪拌してフリーアスタキサンチン及びアスタキサンチンエステルなどのアスタキサンチン物質を含むアルカン系溶媒抽出物を得る段階（第１段階）、及び
アルカン系溶媒抽出物をアルコールと混合及び攪拌してフリーアスタキサンチンを含むアルコール抽出物を得る段階（第２段階）を含む、ヘマトコッカスプールビアリースからフリーアスタキサンチンを選択的に分離する方法を提供することにある。
【００２５】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２６】
第１段階では、緑色微細藻類であるヘマトコッカスプールビアリースからアスタキサンチン物質を含むアルカン系溶媒抽出物を得る。より具体的には、細胞培養液をアルカン溶媒抽出段階に流入し、アルカン系溶媒と激しく混合させて細胞内部のアスタキサンチン物質をアルカン系溶媒相に抽出する。
【００２７】
本発明で用いたヘマトコッカスプールビアリースは、休眠段階に誘導された赤色の胞嚢細胞の形態であり、その菌体内に高濃度のアスタキサンチンを蓄積している。アスタキサンチンは、一般にヘマトコッカスプールビアリース内において、フリー形態のもの（アスタキサンチンの末端基に置換基が導入されていないもの）と、フリーアスタキサンチンの末端基に脂肪酸がエステル結合によって連結されたエステル形態のものが混合して蓄積されており、エステルを構成する主脂肪酸は、例えばＣ１８：１（オレイン酸）である。従って、細胞壁の損失によって外部に流出される疎水性のアスタキサンチン物質は、疎水性溶媒であるアルカン系溶媒によって急速に抽出される。
【００２８】
本発明におけるアルカン系溶媒は、アスタキサンチン物質を抽出することができる全てのアルカン系溶媒を用いることができ、好ましくは、線状又は分枝状のＣ１〜Ｃ２０のアルカンから構成された群から選ばれた溶媒を用いることができ、さらに好ましくはドデカン（ｄｏｄｅｃａｎｅ）を用いることができる。この時、アルカン系溶媒の使用量は、細胞培養液の濃度によって調節することができ、これは当業者であれば過度な実験なしに容易に調節することができるものと思量される。より具体的には、細胞培養液：アルカン系溶媒は、例えば、体積比で１：１を用いることができる。
【００２９】
また、アルカン系溶媒は、培養液と容易に相分離を形成するので、密度差による自然分離法によって容易にアスタキサンチン物質を含むアルカン系溶媒抽出物を分離することができる。
【００３０】
第２段階では、アルカン系溶媒抽出物から、アルコールを用いてフリーアスタキサンチンを含むアルコール抽出物を得る。
【００３１】
より具体的には、第１段階で分離されたアルカン系溶媒抽出物を、第２段階の抽出工程においてアルコール溶媒と混合して定置し、アルコール溶媒相にアスタキサンチン物質の抽出を誘導する。
【００３２】
本発明におけるアルコールは、アルカン系溶媒抽出物からフリーアスタキサンチンを抽出することができる全てのアルコールを用いることができ、好ましくは、線状又は分枝状のＣ１〜Ｃ６のアルコールからなる群から選択された溶媒を用いることができ、さらに好ましくは、例えばメタノールを用いることができる。この時、アルコールの使用量は、アルカン系溶媒抽出物の濃度によって調節でき、これは当業者であれば過度な実験なしに容易に調節することができるものと思量される。より具体的には、アルカン系溶媒抽出物：アルコールは、例えば体積比で１：１とすることができる。
【００３３】
一方、疎水性の高いアスタキサンチンエステル物質は、アルカン溶媒に残留しようとする性質が高いので、エステル結合の破壊を通じたフリーアスタキサンチン形態への転換過程が必要である。従って、本発明では、アルコール溶媒相に水酸化ナトリウムを水溶液の形態で添加し、アスタキサンチン両末端のエステル結合を加水分解することによって、アスタキサンチンエステル物質をフリーアスタキサンチン形態に誘導する。また、転換されたフリーアスタキサンチンは、連続してアルコール溶媒相に抽出する。
【００３４】
最終的に、アルコール溶媒相は、フリーアスタキサンチン形態で抽出が完了し、また、アルカン溶媒とアルコール溶媒がその密度差によって自然相分離が生じるので、フリーアスタキサンチン抽出物は、極めて容易に分離される。
【００３５】
以後、アルコール抽出物からフリーアスタキサンチンを得る方法は、当業界に広く知られた方法で容易に得ることができ、一例として溶媒蒸発によって容易に得ることができる。
【００３６】
本発明を記述するにあたり、溶媒相分離のための自然定置時間、抽出時間及び温度は特定しなかったが、これは抽出しようとする細胞培養液の量及び濃度などによって多様に調節することができ、これは当業者であれば過度な実験なしに容易に行うことができるため、本発明では特定の範囲に限定しない。
【００３７】
一方、アスタキサンチン物質が抽出完了されたアルカン溶媒は、アスタキサンチン物質を殆ど含まない状態であるので、循環して第１段階の抽出工程に再流入され、ヘマトコッカスプールビアリース細胞培養液からアスタキサンチン物質を抽出するのに繰り返し用いることができる（図１）。
【００３８】
本発明の選択的に分離する方法は、ヘマトコッカスプールビアリースだけでなく、有用微細藻類培養液からアスタキサンチン含む類似カロチノイド物質を抽出分離するのに有用に用いることができる。この時、具体的な反応溶媒の反応条件は特定の微細藻類によって変更できるが、アルカン系溶媒を用いた第１段階の抽出工程、及びアルコールを用いた第２段階の抽出工程は同一に行い、所望の類似カロチノイド物質を容易に分離することができる。
【実施例】
【００３９】
以下、本発明の好ましい実施例及び比較例を記載する。しかし、下記の実施例は本発明をより容易に理解するために提供されるものであり、本発明が下記の実施例に限られるものではない。
【００４０】
＜実施例１：フリーアスタキサンチンの選択的分離＞
よく培養された赤色のヘマトコッカスプールビアリース胞嚢細胞を図１に示した２段２相溶媒抽出工程に適用し、フリーアスタキサンチンを選択的に効率よく分離した。
【００４１】
（第１段階）
ヘマトコッカスプールビアリース胞嚢細胞を含む細胞培養液とアルカン溶媒であるドデカン（ｄｏｄｅｃａｎｅ）を、体積比１：１で第１段階の抽出工程に流入させた後、激しく混合した。細胞壁の損失及びドデカン溶媒へのアスタキサンチン抽出が完了した後、混合液を数分間定置させ、密度差によって細胞培養液と自然相分離したドデカン抽出物を分離した。
【００４２】
（第２段階）
第１段階で得られたドデカン抽出物を、第２段階の抽出工程に流入させ、アルコール溶媒であるメタノール（ｍｅｔｈａｎｏｌ）と体積比１：１で混合した。この時、ドデカン相にあるアスタキサンチン抽出物は、図２に示したＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィ：Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）分析結果のように、殆どアスタキサンチンエステル形態を帯びているが、このようなドデカン相に含まれている多様なアスタキサンチンエステル物質をフリーアスタキサンチン形態に転換するために、第２段階の抽出工程に適用されたメタノールは０．０２Ｍの水酸化ナトリウムが溶解されている形態のものを用いた。数時間のドデカンとメタノールの二相（ｔｗｏ  ｐｈａｓｅ）溶媒による抽出反応後、メタノール相から９５％以上の回収率でフリーアスタキサンチンを得（図２及び図３）、メタノール抽出物の分離もドデカン抽出物の場合と同様に密度差を用いた自然定置によって容易に行われた。
【００４３】
＜比較例１＞
第２段階の抽出工程で０．０２Ｍの水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）が溶解されているメタノールの代わりに、純水メタノールを用いてフリーアスタキサンチン分離工程を実施したことを除いては、実施例１と同一に実施した。
【００４４】
その結果を図３において実施例１の結果と比較して示した。本比較例では、苛性ソーダ（水酸化ナトリウム）による加水分解反応が存在しないので、アスタキサンチンエステル物質のアスプリアスタキサンチンへの転換が行われなかった。従って、メタノール相に抽出されたフリーアスタキサンチンの比率は、実施例１の場合と比較して顕著に低く現れ、図３に図示した結果の比較を通じて確認することができる。
【００４５】
＜実施例２：リサイクルされたドデカンを用いた分離方法＞
実施例１でアスタキサンチン物質が抽出完了されたドデカンは、アスタキサンチン物質を殆ど含まない状態であるので、第１段階の抽出工程に再循環してヘマトコッカスプールビアリース細胞培養液からアスタキサンチン物質抽出に繰り返し用いた。ドデカン抽出物からメタノール相へのフリーアスタキサンチン抽出過程は実施例１と同一に行い、その結果を図４に示した。
【００４６】
図４のように、ドデカン溶媒を循環して３回にわたり再び用いた場合にも、新たなドデカン溶媒を用いた場合に比べて、８０％以上のアスタキサンチンの回収率を維持することが分かった。
【００４７】
以上説明したように、本発明は、緑藻類からフリーアスタキサンチンを選択的に分離する方法に関し、より具体的には、ヘマトコッカスプールビアリース（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）を含む細胞培養液を、アルカン系溶媒と混合及び攪拌してフリーアスタキサンチン及びアスタキサンチンエステルなどのアスタキサンチン物質を含むアルカン系溶媒抽出物を得る段階（第１段階）と、アルカン系溶媒抽出物をアルコールと混合及び攪拌してフリーアスタキサンチンを含むアルコール抽出物を得る段階（第２段階）とを含む、ヘマトコッカスプールビアリースからフリーアスタキサンチンを選択的に分離する方法に関する。
【００４８】
本発明は、ヘマトコッカスプールビアリース培養液からフリーアスタキサンチンを選択的に効率よく回収することが可能な、極めて簡単な形態の工程技術を提供することによって、高濃度のアスタキサンチン分離効率を極大化させるだけでなく、アルカン溶媒を、フリーアスタキサンチンを抽出するための媒介溶媒として反復的に用いることによって、フリーアスタキサンチン分離工程の経済的な運転を、簡便に実現することができる。また、このような分離方法は、ヘマトコッカス種以外に有用微細藻類培養液からアスタキサンチンを含む類似カロチノイド物質を抽出分離するのにも、有用に用いられる。
【００４９】
以上、添付図面を参照しながら本発明の好適な実施形態について説明したが、本発明はかかる例に限定されないことは言うまでもない。当業者であれば、特許請求の範囲に記載された範疇内において、各種の変更例または修正例に想到し得ることは明らかであり、それらについても当然に本発明の技術的範囲に属するものと了解される。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】本発明で用いたフリーアスタキサンチンを選択的に分離するための２段２相溶媒抽出工程を概略的に示した工程図である。
【図２】２段２相溶媒抽出工程において、第１段階のドデカン抽出物と第２段階のメタノール抽出物のＨＰＬＣクロマトグラムを各々図示したグラフである。
【図３】ヘマトコッカスプールビアリース（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）胞嚢細胞からメタノール溶媒相への２段抽出過程において、水酸化ナトリウムを添加した場合（実施例１）と水酸化ナトリウムを添加しない場合（比較例  １）によるフリーアスタキサンチン抽出結果を比較して図示したグラフである。
【図４】第１段階の抽出溶媒であるドデカンの再使用によるフリーアスタキサンチン抽出率の維持結果を図示したグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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