(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウレアーゼ拮抗阻害剤としてホウ酸又はその塩の存在下、試料中の尿素をウレアーゼで加水分解させ、その分解により生じるアンモニアに、α−ケトグルタル酸及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型の存在下、グルタミン酸脱水素酵素を作用させ、その作用によるニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型の減少速度を測定する尿素窒素の測定方法において、フェニルボロン酸又はその誘導体を存在させることを特徴とする尿素窒素の測定方法。
【請求項２】
フェニルボロン酸又はその誘導体が、フェニルボロン酸、３−アセチルフェニルボロン酸又は４−アセチルフェニルボロン酸である請求項１記載の尿素窒素の測定方法。
【請求項３】
(a)α−ケトグルタル酸、(b)ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型、(c)グルタミン酸脱水素酵素、(d)ホウ酸又はその塩、(e)ウレアーゼ、及び(f)フェニルボロン酸又はその誘導体を含有する尿素窒素測定用試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ウレアーゼ拮抗阻害剤としてホウ酸又はその塩を共存させ、ウレアーゼを用いて試料中の尿素窒素を測定する方法において、試料中に含まれるポリオールの影響がない尿素窒素の測定方法及びそれに用いる測定用試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体試料等に存在する尿素窒素量は、種々の腎機能障害及び肝硬変等の肝実質障害時に変動することが知られており、その障害度及び予後の診断に極めて重要な指標である。この尿素窒素の測定方法として、ウレアーゼ反応によって尿素を加水分解し、生じるアンモニアにα−ケトグルタル酸（以下、α−ＫＧという）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（以下、ＮＡＤＨという）又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（以下、ＮＡＤＰＨという）、及びグルタミン酸脱水素酵素（以下、ＧＬＤＨという）を作用させ、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの減少量を紫外部の吸収変化として測定する方法（以下、ウレアーゼ−ＧＬＤＨ法という）が知られている。
【０００３】
この方法においては、正常ヒト血清中の尿素濃度は３〜９mM（尿素窒素として８〜２５mg／dL）であるのに対し、ウレアーゼの尿素に対するＫｍ値は数mM程度と小さいため、終末点法が適当であったが、ウレアーゼに対する拮抗阻害剤としてホウ酸又はその塩を加えることにより、尿素に対する見かけのＫｍ値を測定系における尿素濃度より十分大きくし、反応速度法での測定を可能とし、高濃度の尿素を測定できる尿素窒素の測定法が提案されている（特公平3-65160号）。
【０００４】
しかしながら、ウレアーゼの拮抗阻害剤としてホウ酸又はその塩を用いると、試料中にマンニトール等のポリオールが存在する場合、ホウ酸がポリオールとキレート錯体を形成し、拮抗阻害剤としてのホウ酸の有効濃度が低下し、ウレアーゼの反応速度が増大するため、結果的に測定値が上昇し、正誤差を生じるという問題があった。実際、安定化剤としてマンニトールが添加されている試料や、脳圧降下剤、利尿剤としてマンニトール製剤を使用した患者の尿を試料とした場合には、マンニトールによる正誤差を受ける恐れがある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、マンニトール等のポリオール含有試料においても、ウレアーゼ拮抗阻害剤としてホウ酸又はその塩を用いて尿素窒素を正確に測定できる方法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
かかる実情において、本発明者らは鋭意検討した結果、フェニルボロン酸又はその誘導体を用いれば、ウレアーゼ拮抗阻害剤として用いるホウ酸とポリオールとの錯体形成が抑えられ、ポリオール含有試料においても尿素窒素を正確に測定できることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、ウレアーゼ拮抗阻害剤としてホウ酸又はその塩の存在下、試料中の尿素をウレアーゼで加水分解させ、その分解により生じるアンモニアに、α−ケトグルタル酸及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型の存在下、グルタミン酸脱水素酵素を作用させ、その作用によるニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型の減少速度を測定する尿素窒素の測定方法において、フェニルボロン酸又はその誘導体を存在させることを特徴とする尿素窒素の測定方法を提供するものである。
【０００８】
また、本発明は、(a)α−ケトグルタル酸、(b)ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型、(c)グルタミン酸脱水素酵素、(d)ホウ酸又はその塩、(e)ウレアーゼ、及び(f)フェニルボロン酸又はその誘導体を含有する尿素窒素測定用試薬を提供するものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明において、測定対象となる試料としては、尿素成分を含むものであれば特に制限されないが、例えば血漿、血清、尿、ずい液、腹腔液、透析液、これらの希釈液等が挙げられる。
【００１０】
本発明で用いるフェニルボロン酸誘導体としては、３−アミノフェニルボロン酸、３−アセチルフェニルボロン酸、４−アセチルフェニルボロン酸等が挙げられる。フェニルボロン酸又はその誘導体としては、フェニルボロン酸、３−アセチルフェニルボロン酸、４−アセチルフェニルボロン酸を用いるのが好ましい。フェニルボロン酸又はその誘導体の濃度は、最終濃度で０．１〜５０mM、特に１〜３０mMであるのが好ましい。
【００１１】
本発明で用いるα−ＫＧ、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨ、ＧＬＤＨ、ウレアーゼ、ホウ酸又はその塩の使用濃度は、試料中のアンモニア量、測定すべき尿素量等により異なり、適宜選択することができる。例えば、α−ＫＧは、通常１〜３０mM、好ましくは５〜２０mMの範囲である。ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨは、通常０．０５〜３mM、好ましくは０．１〜１mMの範囲であり、測定時の吸光度限界を超えない範囲で選択すれば良い。ＧＬＤＨは、牛肝臓由来、細菌由来等の何れでも良く、その由来は特に制限されず、使用濃度は０．１〜１００単位／mL、特に１〜２０単位／mLが好ましい。ウレアーゼは、ナタマメ由来、細菌由来等の何れでも良く、その由来は特に制限されず、使用濃度は１〜１００単位／mL、特に５〜５０単位／mLが好ましい。ホウ酸又はその塩は、通常０．１〜５００mM、好ましくは１〜１００mMである。ホウ酸塩としては、ホウ酸ナトリウム、ホウ酸カリウム等を用いることができる。
【００１２】
本発明において、尿素窒素測定時のｐＨは、通常ｐＨ６〜１０、特にｐＨ７〜１０の範囲であるのが好ましい。ｐＨの調整は、緩衝液によって行うのが好ましく、通常用いられる緩衝液、例えばトリス緩衝液、塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、イミダゾール緩衝液、ジエタノールアミン緩衝液、トリエタノールアミン緩衝液、ＨＥＰＥＳやBicine等のグッド緩衝液などを使用することができる。
【００１３】
測定は、測定対象試料と、α−ＫＧ、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨ、ＧＬＤＨ、ホウ酸又はその塩、ウレアーゼ、及びフェニルボロン酸又はその誘導体を混合し、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの減少量を、紫外部（好ましくは３３０〜３５０nm）の吸収変化として測定することにより行われる。
ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの減少速度を指標とする反応速度法であるため、測定に要する時間は短く、かつ紫外部吸収を有する試料中の干渉物質等の影響をほとんど受けることがない。
【００１４】
本発明の尿素窒素測定用試薬は、(a)α−ＫＧ、(b)ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨ、(c)ＧＬＤＨ、(d)ホウ酸又はその塩、(e)ウレアーゼ、及び(f)フェニルボロン酸又はその誘導体を含有するものであり、１剤式、２剤式等のいずれの形態とすることもできる。
２剤式とする場合、フェニルボロン酸又はその誘導体、及びその他の成分は、第一試薬と第二試薬のいずれか一方、又は両方に配合することができる。
また、２剤式とする場合には、緩衝液、α−ＫＧ、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨ、及びフェニルボロン酸又はその誘導体を含有する第一試薬と、緩衝液、α−ＫＧ、ＧＬＤＨ、ウレアーゼ、ホウ酸又はその塩、及びフェニルボロン酸又はその誘導体を含有する第二試薬とからなるのが好ましい。
各成分の配合量は、特に制限されないが、使用時に前記のとおりの濃度になるよう用いるのが好ましい。
【００１５】
【実施例】
次に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらにより何ら制限されるものではない。
【００１６】
実施例１
第一試薬として、炭酸水素ナトリウム緩衝液  １５mM、α−ＫＧ  １０mM、ＮＡＤＰＨ  ０．３３mM、及び３−アセチルフェニルボロン酸  １０mMを含有するｐＨ１０．３の水溶液を調製した。
一方、第二試薬として、Bicine緩衝液  ３５０mM、α−ＫＧ  １０mM、ＧＬＤＨ  ６Ｕ／mL、ウレアーゼ  ２２．５Ｕ／mL、ホウ酸  ５６mM、及び３−アセチルフェニルボロン酸  １０mMを含有するｐＨ８．１５の水溶液を調製した。
【００１７】
実施例２
実施例１において、３−アセチルフェニルボロン酸の代わりにフェニルボロン酸１５mMを用いる以外は実施例１と同様にして、第一試薬及び第二試薬を調製した。
【００１８】
比較例１
実施例１において、３−アセチルフェニルボロン酸を配合しない以外は実施例１と同様にして、第一試薬及び第二試薬を調製した。
【００１９】
試験例１
試料として、尿素窒素濃度３３mg／dLの試料、及びマンニトール１重量％を含む尿素窒素濃度３３mg／dLの試料を調製し、さらに後者を前者で希釈して、マンニトール濃度が各々０．２、０．４、０．６、０．８重量％であり、かつ尿素窒素濃度３３mg／dLの試料を調製した。
これらの試料について、実施例１、実施例２及び比較例１の試薬を用いて尿素窒素濃度を測定した。すなわち、これら試料各６μLに第一試薬２４０μLを加え、３７℃で５分間加温後、第二試薬６０μLを加え、波長３４０nmにおける単位時間当たりの吸光度変化を、日立７１７０形自動分析装置を用いて測定した。試料中の尿素窒素濃度は、標準液（尿素窒素３０mg／mL）を測定することにより、予め作成した検量線より求めた。
結果を表１及び図１に示す。
【００２０】
【表１】
0004503151.tif 000002
【００２１】
表１及び図１の結果より、ウレアーゼ拮抗阻害剤としてホウ酸を用いるウレアーゼ−ＧＬＤＨ法において、３−アセチルフェニルボロン酸又はフェニルボロン酸を共存させた実施例１及び実施例２では、これらを使用しない比較例１に比べ、試料中のマンニトールの影響を受けず、尿素窒素濃度を正確に測定することができた。
【００２２】
実施例３
第一試薬として、炭酸水素ナトリウム緩衝液  １５mM、α−ＫＧ  １０mM、ＮＡＤＰＨ  ０．３３mM、及び３−アセチルフェニルボロン酸  ２０mMを含有するｐＨ１０．３の水溶液を調製した。
一方、第二試薬として、Bicine緩衝液  ３５０mM、α−ＫＧ  １０mM、ＧＬＤＨ  ６Ｕ／mL、ウレアーゼ  ２２．５Ｕ／mL、及びホウ酸  ５６mMを含有するｐＨ８．１５の水溶液を調製した。
【００２３】
実施例４
第一試薬として、炭酸水素ナトリウム緩衝液  １５mM、α−ＫＧ  １０mM、及びＮＡＤＰＨ  ０．３３mMを含有するｐＨ１０．３の水溶液を調製した。
一方、第二試薬として、Bicine緩衝液  ３５０mM、α−ＫＧ  １０mM、ＧＬＤＨ  ６Ｕ／mL、ウレアーゼ  ２２．５Ｕ／mL、ホウ酸  ５６mM、及び３−アセチルフェニルボロン酸  ５０mMを含有するｐＨ８．１５の水溶液を調製した。
【００２４】
試験例２
試料として、尿素窒素濃度１２mg／dLの試料、及びマンニトール１重量％を含む尿素窒素濃度１２mg／dLの試料を調製し、さらに後者を前者で希釈して、マンニトール濃度が各々０．２、０．４、０．６、０．８重量％であり、かつ尿素窒素濃度１２mg／dLの試料を調製した。
これらの試料について、実施例３、実施例４及び比較例１の試薬を用い、試験例１と同様にして尿素窒素濃度を測定した。
結果を表２及び図２に示す。
【００２５】
【表２】
0004503151.tif 000003
【００２６】
表２及び図２の結果より、ウレアーゼ拮抗阻害剤としてホウ酸を用いるウレアーゼ−ＧＬＤＨ法において、３−アセチルフェニルボロン酸を共存させた実施例３及び実施例４では、これを使用しない比較例１に比べ、試料中のマンニトールの影響を受けず、尿素窒素濃度を正確に測定することができた。
【００２７】
【発明の効果】
本発明によれば、ウレアーゼ拮抗阻害剤としてホウ酸又はその塩を用いる反応速度法による尿素窒素の測定において、誤差を与えるマンニトール等のポリオールを含む試料においても、正確に尿素窒素濃度を測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】試験例１において、マンニトールによる尿素窒素濃度測定への影響を示す図である。
【図２】試験例２において、マンニトールによる尿素窒素濃度測定への影響を示す図である。
【図１】
0004503151.tif 000004
【図２】
0004503151.tif 000005