(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
レジオネラ属の核酸を属特異的に増幅する方法であって、２３〜４０塩基長であって、配列番号：１の９４位と１２６位の間の配列又は２５位と６７位の間の配列であるプライマーと、５Ｓ領域の反対側の鎖にハイブリダイズするプライマーとを用いることを特徴とする方法。
【請求項２】
試料中のレジオネラ属の細菌を検出する方法であって、２３〜４０塩基長であって、配列番号：１の９４位と１２６位の間の配列又は２５位と６７位の間の配列であるプライマーと、５Ｓ領域の反対側の鎖にハイブリダイズするプライマーとを用いて属特異的に核酸を増幅する工程、及び増幅された核酸に基づいてレジオネラ属の種を検出する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項３】
細菌の核酸配列の一部の属特異的増幅によるレジオネラ属の細菌を検出する方法であって、該一部が２３Ｓ領域と５Ｓ領域の間にあるスペーサー領域を含み、２３〜４０塩基長であって、配列番号：１の９４位と１２６位の間の配列又は２５位と６７位の間の配列であるプライマーと、５Ｓ領域の反対側の鎖にハイブリダイズするプライマーとを用いることを特徴とする方法。
【請求項４】
レジオネラ属の種を検出する工程において、レジオネラ種特異的プローブを用いる、請求項２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レジオネラの属の核酸を増幅する方法、およびレジオネラの属の細菌の属特異的又は種特異的同定方法並びにそれに適する試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
レジオネラは水棲の、至るところに存在するグラム陰性の好気性、細胞内でも成育可能な桿状の細菌である。レジオネラセー科は１つの属（レジオネラ）と現在知られている４８の種と５１の血清グループからなる。最も重要な種であるＬ．ニューモフィラ（L. pneumophila) からは１６の血清型が知られている。その最も重要な生息場所は水道パイプ、空調システム、及び冷却塔である。ヒトの感染は通常レジオネラを含むエアロゾル経由で起こる。レジオネラ症は、例えば温水系のシャワーヘッド、空調システムの汚染した冷却水を経由してしばしば流行として、あるいは散発的に発生する。ヒトからヒトへの感染は未だ知られていない。
【０００３】
レジオネラ感染は二つのグループに分けられる。すなわち、在郷軍人病、高熱、腹痛、頭痛、筋痛、及び錯乱そしてその他の神経症候をしばしば伴う急性の重篤な肺炎と、さらにはレジオネラ症の自己限定性の変種であるポンティアック熱であり、これはインフルエンザ様の症候を伴う。
【０００４】
Ｌ．ニューモフィラの最も重要な血清群はＬ．ニューモフィラ血清グループ１（Ｌ．ｐｎ．Ｓｅｒｏ．１）であり、これは在郷軍人病の最も頻度の高い原因菌である（約８０％）。しかしながら、大きな地域差が存在する。殊に、院内感染のレジオネラ症を治療するときに見られる。これに反し、Ｌ．ミクダデイ（L. micdadei)及び他の非ニューモフィラ種はポンティアック熱の原因菌と報告されている。
【０００５】
レジオネラ症の診断は困難である。レジオネラはフクシンで染色することは困難であり、従って実際上原因菌をグラム染色することは不可能となる。レジオネラは普通に用いられる培養基には成育せず、特殊な寒天及び２．５〜５％ＣＯ２を含む環境でしか成育しない。培養の感度（sensitivity)は、Ｌ．ニューモフィラで僅かに約２０％であり、他の種の場合は約５％に過ぎない。
レジオネラの検出のためには、中でも、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション、パルスフィールド電気泳動、リボタイピング、制限断片長多型、脂肪酸及びユビキノン分析、ｒＲＮＡ配列決定、ＲＴ−ＰＣＲ及びサザンブロット、ラテックス凝集、フーリエ変換赤外吸収スペクトロスコピー、間接免疫蛍光法及び炭水化物利用（ＢＩＯＬＯＧ系）が用いられている。
非特許文献１及び非特許文献２は、レジオネラの５Ｓ−ｒＤＮＡの配列決定について記載する。
【０００６】
水試料中のレジオネラを検出するためのキットは市販されている。このキットを用いて検出するときは、第１段階として５Ｓ−ｒＤＮＡの断片を属特異的に増幅する。同じ容器中でＬ．ニューモフィラ種のＭＩＰ遺伝子の断片を増幅する。このキットは、二つの増幅産物が生成する多重ＰＣＲを行うために全部で７個のプライマーを含む。続いて、増幅産物をリバース・ドット・ブロットを経て検出される。多数のプライマーを必要とするため、該キットを用いて実施するこの方法はかなり複雑となり、またキットの製造も複雑となる。さらに、該方法は感度に関しては満足できるものではない。
【非特許文献１】メディカル・ミクロビオロジカル・レター（Med. Microbiol. Lett.) 1994; 3: 279-290
【非特許文献２】クリニカル・ラボラトリース（Clin. Lab.) 1994; 40: 211-216
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、本発明の目的は、より少数の成分を含み、レジオネラの検出を容易にする試薬を提供することである。本発明の他の目的は、より特異的でそしてより多様なレジオネラの検出方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
従って、本発明の主題は、第１に、レジオネラ属の核酸を増幅する方法である。ここで、レジオネラ属の可能性のあるすべての種の核酸が７より少数のプライマーを用いて増幅される。本発明の他の主題は前記の増幅法の助けを借りた該細菌の検出方法である。
本発明の他の主題は、配列番号：１に記載の配列の一部に少なくとも９０％相同性を示す又は配列番号：１に記載の配列の一部に少なくとも９０％相補的である少なくとも１５塩基長の配列を含む核酸プローブの助けを借りてレジオネラ属の細菌を検出する方法である。
【０００９】
即ち、本発明の要旨は、
（１）レジオネラ属の核酸を属特異的に増幅する方法であって、レジオネラ属に属する可能性のあるすべての種を７より少数のプライマーを用いて増幅することを特徴とする方法、
（２）試料中のレジオネラ属の細菌を検出する方法であって、該試料中に存在するレジオネラ属のすべての種の核酸を７より少数のプライマーの１セットを用いて属特異的に増幅する工程、及び増幅された核酸に基づいてレジオネラ属の１以上の種を検出する工程を含む方法、
（３）該種が増幅産物のさまざまな大きさに従って区別されることを特徴とする、前記（２）記載の方法、
（４）増幅産物が、その後、属特異的プローブを用いて検出されることを特徴とする、前記（２）記載の方法、
（５）増幅産物が、その後、種特異的プローブを用いてレジオネラ種の存在について試験されることを特徴とする、前記（２）記載の方法、
（６）増幅産物が、その後、レジオネラサブグループ特異的プローブを用いてレジオネラサブグループの存在について試験されることを特徴とする、前記（２）記載の方法、
（７）細菌の核酸配列の一部の属特異的増幅によるレジオネラ属の細菌を検出する方法であって、該一部が２３Ｓ領域及び５Ｓ領域及びそれらの間にあるスペーサー領域をも含むことを特徴とする方法、
（８）増幅が、一方が２３Ｓ領域の鎖とハイブリダイズし、他方が５Ｓ領域の反対鎖とハイブリダイズする２個のプライマーを用いて行われることを特徴とする、前記（７）記載の方法、
（９）該プライマー配列が、配列番号：１の部分配列と少なくとも９０％相同であるか又は相補的である少なくとも１５塩基長の配列から選択される配列を含むことを特徴とする、前記（７）記載の方法、
（１０）配列番号：１の一部に少なくとも９０％相同的であるか又は配列番号：１の一部に少なくとも９０％相補的である長さが少なくとも１５塩基の配列を有する核酸プローブを用いてレジオネラ属の細菌を検出する方法、
（１１）該プローブが１５塩基より長いレジオネラ特異的配列をそれ以上一切含まないことを特徴とする前記（１０）記載の方法、
（１２）核酸プローブを用いる前に請求項９記載の増幅法を行い、そして該プローブを増幅部分の鎖とハイブリダイズさせることを特徴とする前記（１０）記載の方法、
（１３）レジオネラ属の可能性のあるすべての種を検出することができることを特徴とするレジオネラ属細菌を検出する方法、
（１４）配列番号：１の２３Ｓの配列又はスペーサー部分に少なくとも９０％相同的である、あるいは配列番号：１の２３Ｓの配列又はスペーサー部分に少なくとも９０％相補的である、レジオネラ属の細菌を検出するための核酸プローブ、
（１５）属特異的であることを特徴とする前記（１４）記載のプローブ、
（１６）配列番号：１の一部であって９４位と１２６位の間又は２５位と６７位の間の部分を含むことを特徴とする、前記（１４）記載のプローブ、
（１７）プローブの配列が９４位と１２６位の間の配列又は２５位と６７位の間の配列をカバーするものであることを特徴とする前記（１４）記載のプローブ、
（１８）レジオネラの核酸を属特異的に増幅するためのプライマー対であって、一方がレジオネラ・ゲノムの２３Ｓ領域で鎖とハイブリダイズし、他方が５Ｓ領域で反対鎖とハイブリダイズするプライマー対、
（１９）５ＳＲＮＡと２３ＳＲＮＡの間のスペーサー領域、及びゲノム中でスペーサー領域に直接続いておりそして最大長３７１ｂｐを有する５ＳＲＮＡと２３ＳＲＮＡの部分のみを含むレジオネラ特異的二本鎖核酸、
（２０）レジオネラ種の属特異的増幅及び種特異的検出用の試薬キットであって、７未満のプライマーの１セット、及び少なくとも１個のレジオネラ種特異的プローブを含む試薬キット、
に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、レジオネラ属に属する可能性のある細菌のすべての種を検出することができる。さらに本発明により、本発明の方法に使用することができるキットが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下に本発明について説明する。
本発明の骨子は、レジオネラ・ゲノム上の配列を捜し出し、レジオネラ属の一部である現在知られているすべてのレジオネラ種を検出するための核酸プローブを作成することである。
【００１２】
増幅とは、反応混合物中に存在する核酸またはその部分の濃度を増加させることを意味する。そのような増幅手順の例はＥＰ−Ａ−０２０１１８４号に記載されているポリメラーゼ連鎖反応、ＥＰ−Ａ−０３２９８２２号に記載されているいわゆるＮＡＳＢＡ法、及びそれらから誘導される方法である。
【００１３】
ＥＰ−Ａ−０２０１１８４号に記載されている方法では、増幅の対象となる核酸は、ハイブリダイゼーション条件下に過剰モルの２個のオリゴヌクレオチドプライマーと共にそして重合誘導剤とヌクレオチドの存在下に、一本鎖として存在し又は一本鎖として利用可能とされる。該プライマーは、各鎖に対して核酸鎖に相補的な対応するプライマーの伸長産物が合成されるように選択される、そして一方のプライマーの伸長産物は一旦その相補物から分離された後、他方のプライマーの伸長産物合成のための鋳型として働く。伸長産物はついでそれがそこで合成された鋳型から分離されそしてこうして得られた伸長産物はプライマーと再び反応するために利用される。これらのステップをサイクルで反復すると、プライマーのハイブリダイゼーション位置の内側にある核酸配列を指数関数的に増幅することが理論的には可能である。
【００１４】
ＥＰ−Ａ−０３２９８２２号の方法は、増幅の対象となる核酸が機能的にプロモーターに連結される、二本鎖核酸の生成のためのプライマーの構築を記載する。これを行うため、プライマーの一方は少なくとも一方の鎖のプロモーター領域を含んでいる。中間的に形成された転写複合体は、プロモーターの制御下に、増幅の対象となる核酸が鋳型として利用されつつリボ核酸が形成される条件の下に置かれる。こうして得られたリボ核酸は新たな転写可能な核酸複合体の形成に再度利用される。この系の利点は、等温プロセスとして実施できることである。
【００１５】
多重ＰＣＲとは、ＥＰ−Ａ−０３６４２５５号に記載された方法であると理解される。この方法では、多数のプライマーのハイブリダイゼーション位置の適当な配列をもつ核酸断片を増幅するために１個の反応容器が用いられる。そして該断片は通常そのゲノムの長さと位置を異にする。
【００１６】
本発明の方法は、いわゆるハイブリダイゼーション・テストの特殊な態様であり、その基礎は核酸診断の分野の熟練者には既知のものである。実験的細部が詳細に記載されていないときは、「核酸ハイブリダイゼーション（Nucleic acid hybridisation) 」ヘイムス及びヒギンス（B. D. Hames and S. J. Higgins, IRL Press, 1986) 、特にセクション１（ハイブリダイゼーション・ストラテジー）、セクション３（サザンハイブリダイゼーションの定量分析）、セクション４（定量的フィルターハイブリダイゼーション）、分子生物学におけるカレント・プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology),アウスベル（F.M.Ausubel)編，J. Wiley and Son, 1987, 特に2.9.1-2.9.10、及びモレキュラー・クローニング（Molecular Cloning)，サムブルック(J. Sambrook et al.)等編，CSH, 1989,特に9.4.7-9.5.8 の全内容が参照される。この参照には、標識化ヌクレオシド三リン酸の調製、これはＥＰ−Ａ−０３２９４７４号にも記載されているが、修飾又は非修飾オリゴヌクレオチドの化学的合成、制限酵素による核酸の切断、ハイブリダイゼーションの対象となる核酸との間の相同性の程度やそれらのＧＣコンテントやそれらの長さに依存する所定の特異性を達成するためのハイブリダイゼーション条件の選択、及びポリメラーゼによるヌクレオシド三リン酸から核酸の形成も含まれる。
【００１７】
本発明においては、標識とは直接的又は間接的に検出可能なグループであると理解される。直接的に検出可能なグループは、例えば、放射活性な（Ｐ３２）、色素類又は蛍光グループ又は金属原子である。間接的に検出可能なグループとしては、免疫学的に又は酵素学的に活性な化合物、例えば抗体、抗原、ハプテン、又は酵素、又は酵素的に活性な部分酵素が挙げられる。これらは次の反応又は反応連鎖において検出される。特に好ましいのは、ハプテンで標識されるヌクレオシド三リン酸（ｒＮＴＰ又はｄＮＴＰ）のようなハプテンであり、ポリメラーゼの基質（ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ）として一般に特によく用いられ、続いてハプテンで標識された抗体又はハプテン化されたヌクレオシドを用いる反応を行うことができる。この種のヌクレオシド三リン酸には、ブロモヌクレオシド三リン酸又はジゴキシゲニン、ジゴキシン、又はフルオレッセイン−結合ヌクレオシド三リン酸が含まれる。ＥＰ−Ａ−０３２４４７４号に記載されているステロイド及びその検出は特に適当であることが分かった。核酸中へのステロイドの取込みについてはＥＰ−Ａ−０３２４４７４号が参照できる。
【００１８】
本発明によりレジオネラの増幅及び検出プロセスに用いられる核酸は、特に、ゲノムの核酸である。ゲノムの核酸はリボゾームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）及び多数のスペーサー配列をコードする遺伝子をも含む。それらは、それらがコードするｒＲＮＡのサイズにより名称が与えられる。レジオネラのゲノムでは、遺伝子のこの順序は次のとおりである、１６Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子、２３Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子、及び５Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子。これらの遺伝子はいわゆるスペーサー領域により相互に隔てられている。
【００１９】
配列番号：１はレジオネラ属の種に含まれるゲノム配列と類似性を持つヌクレオチド配列を開示する。該配列は２個の隣接する２３Ｓ−ｒＲＮＡ、５Ｓ−ｒＲＮＡと２３Ｓ−ｒＲＮＡの間のスペーサー領域、及び５Ｓ−ｒＲＮＡを含む。配列番号：１は２３Ｓ−ｒＲＮＡの比較的小部分しかカバーしないが、スペーサー領域の全部と５Ｓ−ｒＲＮＡの約８０％を含んでいる。
配列番号：１は、レジオネラの属特異的な部分配列をそれから取り出すことができるヌクレオチド配列である。
【００２０】
本発明において理解するとき、核酸プローブという語は、機能に関して制限的であると解すべきでない。上記の性質は必須である。核酸プローブは、試料中に含まれるレジオネラ核酸とのそのハイブリダイゼーションが細菌の存在に対する尺度として役立つところのいわゆるプローブ又は検出プローブをカバーすべきである。これを達成するために核酸プローブは、検出又は増幅に本質的に悪影響を与えない部分を含むことが好ましい。このような分子部分としては、例えば、プローブ検出のための標識、例えば該プローブを含むハイブリッド、例えばビーズ又は表面、例えば試薬容器又は検出容器のような固定相（単数又は複数）に核酸を固定化させるグループ、又はレジオネラ配列に干渉しない他のヌクレオチド配列が挙げられる。核酸プローブの構造は、従って、レジオネラ核酸の検出方法に特に左右される。
【００２１】
核酸プローブは、一定の順序の塩基配列をもった分子であり、塩基対塩基相互作用により自然の核酸ハイブリッドを形成することができると理解される。これには天然の核酸も人工の核酸も含まれる。人工の核酸は、それが塩基の部分（例えば７−デアザｄＧＴＰのような塩基アナログを用いることにより）又は骨格（糖及び／又はリン酸ユニットを他の化学分子例えばペプチドで置換することにより）を修飾できる点で天然の核酸と異なる。このような人工的な核酸は、例えば、ＷＯ９２／２０７０２号に記載されているようなペプチド核酸（ＰＮＡ）である。核酸プローブの正確な機能にとって必須の因子は、それがプローブの選択性を達成するために特異的な塩基対形成をすることである。デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）からなる核酸プローブを持つことが特に好ましい。
【００２２】
核酸プローブはまた、酵素を用いることにより、レジオネラ核酸とのハイブリダイゼーションの際伸長され得るプライマーであるとも理解される。典型的な伸長反応は、例えば鋳型としてレジオネラ核酸を用いるＤＮＡポリメラーゼ（例えば、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ、クレノウ断片又はテルムス・アクアティクスのポリメラーゼ）によるモノヌクレオシド三リン酸ユニットの伸長である。この場合、プライマーの３’末端が現在使用されている酵素で伸長される。別の伸長反応はリガーゼであり、そこでは核酸プローブが別のオリゴヌクレオチドと酵素的に連結される（例えば、ＥＰ−Ａ−０３２０３０８号）。ポリメラーゼ反応とリガーゼ反応とからなる混合型も知られている（例えば、ＷＯ９０／０１０６９号）。
【００２３】
レジオネラ属に特異的な核酸プローブは、厳格に同一の条件下において、配列番号：１又はその相補物又は表１、２に掲げるレジオネラ種とハイブリダイズするもののヌクレオチド配列を有する核酸とハイブリダイズする核酸である。これらの核酸はレジオネラ属の種である可能性のあるすべてのものとハイブリダイズすることが好ましい。
【００２４】
図１に示す配列の属特異的配列は、２３Ｓ−及び／又は５Ｓ−領域にあるものが好ましい。適当なハイブリダイゼーション条件が選択されときは、スペーサー領域に属特異的プローブを設計することも可能である。
【００２５】
種特異的核酸プローブは、厳格に同一の条件下で、レジオネラ種のすべての血清型とハイブリダイズする核酸である。この種のプローブ及びその配列は、実施例３で示す。この実施例は、Ｌ．ニューモフィラ種のすべての血清型とハイブリダイズするが表１、２に掲げるレジオネラ属の他の種のすべてとハイブリダイズしないＬ．ニューモフィラ種プローブをも記載する。
【００２６】
【表１】
0004468406.tif 000002
【００２７】
【表２】
0004468406.tif 000003
【００２８】
本発明の核酸プローブは最小で１５塩基の長さであり、２３〜４０塩基の長さが特に好ましい。従って、いわゆる（核酸）合成機で化学合成することにより容易に得ることができる核酸である。レジオネラの属特異的配列として使用できる配列は、配列番号：１の配列から長さが少なくとも１５の塩基を選択することにより得ることができる。ハイブリダイゼーション条件に依存し属特異性において塩基の相違が１個又は２個あっても、通常その手順に影響しない。核酸プローブのサイズが大きくなるにつれて塩基の相違の数も増加すると理解される。従って、本発明では、配列番号：１の一部に少なくとも９０％相同性をもつプローブ又は配列番号：１の一部に少なくとも９０％相補的であるプローブが好ましい。配列番号：１の一部に厳格に相同な又は厳格に相補的な１５塩基（連続する）の最小配列長を持つプローブが特に好ましい。
【００２９】
プローブが特異的及び／又は非特異的ハイブリダイゼーションを招き得る付加的なレジオネラ種特異的配列又は非レジオネラ特異的配列を含むときは、種特異性は悪影響を受け得る。レジオネラ特異的配列は、それが存在する限り、長さが１５塩基長を超えないものが好ましい。さらに、核酸プローブは、それらがプロモーター又は複製起点及びそのレジオネラ非特異的領域に特徴的であるときは、機能的ヌクレオチド配列を含んでいてもよい。
【００３０】
配列番号：１の中では、属特異的配列を選択するのに又は殊に検出プローブのためにある領域が特に好ましい。特に好ましい領域は、９４位と１２６位の間、２５位と６７位の間、３３６位と２９３位の間そして３０７位と２８６位の間に見出される。特に好ましい態様では、プローブの配列は２６８位から２９６位までの配列などである。
【００３１】
先行技術と異なり、本発明の増幅方法は７個より少数のプライマーしか必要としない。これは、本発明の１個又は数個の核酸プローブをプライマーとして使用することにより達成できる。１個のプライマーのみを必要とする増幅方法は該プライマーが増幅の対象となる核酸とハイブリダイズすることで得られる。その後、それはＤＮＡポリメラーゼによりモノヌクレオシド三リン酸で伸長される。伸長産物は鋳型の核酸から分離され、そして上記の手順が新たなプライマーを用いて反復される。従って、各サイクルは核酸当たり１個伸長した産物を生ずる。従って、これは直線的増幅法である。指数関数的増幅は、ＥＰ−Ａ−０２０１１８４に記載されている主要な条件を満足する２個のプライマーを使用するとき理論的に可能となる。有利な態様においては、第１のプライマー対のハイブリダイゼーション位置の間で増幅の対象となる核酸断片とハイブリダイズする別のプライマー対を使用する。この態様は、「ネスティッドＰＣＲ（nested PCR) 」と呼ぶことがある。これは全部で４個の異なるプライマーを使用する。
【００３２】
転写反応に基づく増幅法は、通常増幅の対象となる核酸の一本鎖又は逆センス鎖のいずれかとハイブリダイズすることができる２個の核酸プローブを使用する。
【００３３】
本発明によれば、属特異的増幅法においてプライマーとして働く核酸プローブはレジオネラ属特異的プローブである。特に好ましい場合では、プライマーの一方はレジオネラ核酸の鎖と２３Ｓ−ｒＤＮＡ領域でハイブリダイズし、他方のプライマーは逆鎖（counter-strand)と５Ｓ−ｒＤＮＡ領域でハイブリダイズする。こうして、レジオネラの核酸配列の増幅部分は、２３Ｓ−ｒＤＮＡ領域の部分と５Ｓ−ｒＤＮＡ領域の部分及びそれらの間のスペーサー領域をもカバーする。理解を容易にするために、異なる種の増幅産物は元のプライマーの相互に向き合っている末端の間に位置する配列が異なっていることを認識することが必要である。この領域はスペーサー領域の配列をカバーすることが好ましい。
【００３４】
本発明の属特異的増幅法は、幾つかの目的を充足するために使用することができる。第１の可能性（例えば、スクリーニングに使用するとき）においては、試料中に存在するレジオネラ属のすべての種の全部を検出することが可能である。これは、属特異的増幅により得られた増幅産物を別の属特異的核酸プローブ（必要であれば検出用に標識されたもの）とハイブリダイズさせ、ついで得られるハイブリッドを検出することにより可能となる。核酸プローブ（検出プローブ）はそれが元のプライマーハイブリダイゼーション位置の近辺にある領域でハイブリダイズするように選ぶことができる。しかし、属特異的検出の特異性は、核酸プローブが相互に向かい合っているプライマー末端の領域に位置する増幅産物の領域でハイブリダイズするときにさらに増加する。特に好ましい態様では、属特異的検出プローブは配列番号：１の２４２位と２９９位の間でハイブリダイズし、そして２５ヌクレオチドと３５ヌクレオチドの間の長さを有し、さらに好ましくは２６〜３０ヌクレオチドを有する。プローブの長さが変わるとハイブリダイゼーション温度はそれに従って変えなければならない。最適な属特異的プローブは２６８位と２９６位の間でハイブリダイズし、従って２９ヌクレオチドの長さを有する。
【００３５】
原理的には、増幅産物の検出用の既知の検出方法、例えばサイズに基づく分離法（例えばゲル電気泳動）やブロット法はすべて使用することが可能である。スペーサー領域の様々なサイズに基づき、スクリーニング法で通常なされるオリエンテーションの迅速な情報を与える単純な高分解能アガロースゲル中で非ニューモフィラ種を識別することが既に可能である。しかし、通常検出プローブを用いるハイブリダイゼーションステップを含む検出を行うことも必要となる。逆ドット・ブロット法の使用も特に有利であることが分かった。これを行うため、属特異的核酸プローブを膜上に固定し、続いて増幅反応の産物を固定されたプローブに添加する。このためには、増幅産物が一本鎖として利用できることが必要である。標識されたモノヌクレオシド三リン酸が増幅の間に取り込まれるときは、核酸プローブを経て固定される増幅産物による検出が、非結合核酸を洗い落とした後容易に行うことができる。このような方法は、例えばＥＰ−Ａ−０２３７３６２号に記載されている。従って、該出願の全内容に対し参照がなされる。
【００３６】
しかしながら、検出はいわゆるサンドイッチ法でも可能である。この方法では付加的な標識化された属特異的核酸プローブ（検出プローブ）が固定化核酸プローブに加えて用いられる。該検出プローブは固体相結合プローブとは別の位置において増幅産物とハイブリダイズする。この方法の原理はＥＰ−Ｂ−００７９１３９号に記載されている。
【００３７】
本発明の属特異的増幅法は、しかし、レジオネラ種の単純で信頼できる検出（例えば、臨床の定型作業）又はレジオネラ種の混合物の単純で信頼できる検出（例えば、非ニューモフィラからＬ．ニューモフィラの識別）をも可能とする。この場合には、属特異的増幅法に引続き、相互に向き合っている２個のプライマー末端の間の増幅領域でハイブリダイズする種特異的プローブ（所望により標識化し）（検出プローブ）とハイブリダイゼーションを行うことができる。配列番号：２６〜配列番号：６８は、それから種特異的配列を個々の種に対して選択することができる配列を示す。種特異的な部分は、属特異的プライマーを用いて有利に増幅されるスペーサー領域に特に位置している。増幅産物の位置は（例えば、表１、２に示すように）、プライマーのハイブリダイゼーション位置から得ることができる（表１、２では、これはプライマー対Ｂ／Ｄである）。種特異的検出プローブは実施例３．７で与えるものが特に好ましい。これらのスペーサー配列の基礎となる種特異的検出プローブは、１５塩基対よりも長く全スペーサー領域よりも短いものが好ましい。
【００３８】
本発明の方法は、従って、先行する属特異的増幅反応で得られた１個の単一反応混合物を用いてレジオネラ種の多重検出を可能とする、そして該反応混合物はプローブ中に存在するレジオネラ種の部分の増幅産物を含んでいる。従って、レジオネラ属の細菌のより単純な、例えばより複雑でない検出を可能とするということが本発明の利点である。
【００３９】
本発明の他の主題は、従って、一方がレジオネラのゲノムの２３Ｓ領域の鎖とハイブリダイズし、他方が５Ｓ領域で逆鎖とハイブリダイズする、レジオネラ核酸を増幅するための１対のプライマーである。
【００４０】
本発明の別の主題は、５Ｓ−ｒＤＮＡと２３Ｓ−ｒＤＮＡとの間のスペーサー領域及びゲノム中でこのスペーサー領域に直接続いている５Ｓ−ｒＤＮＡ領域及び２３Ｓ−ｒＤＮＡ領域を含む２本鎖のレジオネラ特異的核酸である。好ましい態様では、これは最大長３７１塩基対の２本鎖核酸であって、属特異的増幅反応の産物である。
【００４１】
本発明のさらに別の主題は、少なくとも１個のレジオネラ属特異的核酸と少なくとも１個のレジオネラ種特異的プローブとを含んでなるレジオネラ種検出用試薬キットである。
【実施例】
【００４２】
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。
【００４３】
実施例１
細菌の取得と生育
本明細書で用いられるレジオネラの「標準種（type strain)」を、α−ケトグルタレートを添加した緩衝化イースト−炭エキストラクト寒天（P. H. Edelstein, Laboratory Diagnosis of infections caused by legionellae, Eur. J. Clin. Microbiol. Vol.6, 1, 4-10 (1987))上で、湿ＣＯ２雰囲気下に、インキュベーション温度３５℃で少なくとも３日間生育させた。グラム染色、顕微鏡検査、及び血液寒天プレート上でのインキュベーションにより、いかなる他の細菌の生育も認められなかった。レジオネラを、３ｍｌの再蒸留水でプレートから収穫し、希釈しそして１２，０００ｇで遠心分離した。上清を捨て、細胞ペレットを５００μｌの再蒸留水に再懸濁した。対数的段階希釈及び寒天プレート上のコロニー計数により、平均１０１０ＫＢＥ／ｍｌが得られた。
【００４４】
実施例２
ＤＮＡ消化
各細菌培養の２５０μｌを、２５０ｍＭのＮａＯＨ溶液２５０μｌを添加することによりアルカリ環境中で溶解し、ＤＮＡを放出させた（PCR: Clinical diagnostics and research; Springer Verlag Berlin/Heidelberg1992, p. 79-80) 。次いで、それをミネラルオイル（シグマ）１００μｌで覆い、そして９５℃まで加熱したサーマルミキサー中で２０分間インキュベートした。撹拌した後、遠心分離し、トリス−ＨＣｌ（ｐＨ５．０）３２μｌを添加して中和し、ついで再度撹拌し遠心分離した。再蒸留水を用いた対照試料は同様に処理して試料調製中の汚染の可能性をチェックした。
こうして得られた核酸は、これで増幅実験及びハイブリダイゼーション実験に使用することができる。
【００４５】
実施例３
レジオネラ（属及び種）の検出
本発明に従って、ジゴキシゲニン標識ｄＵＴＰを取り込ませつつ属特異的増幅を行うことにより、レジオネラを検出した。ついで、標識された増幅産物を逆ドット・ブロット法（Kawasaki et al., Genetic analysis using polymerase chain reaction - amplified DNA and immobilized oligonucleotideprobes: reverse dot-blot typing; in: Methods in Enzymology, Vol. 218, 1993) により検出した。
【００４６】
１．プローブ分離（テーリング反応）
ベーリンガー・マンハイム  ターミナルトランスフェラーゼ・キット２２０−５８２
２００ｐモルのオリゴヌクレオチド
２０μｌの５×反応緩衝液
６μｌの２５ｍＭのＣｏＣｌ２（最終濃度：１．５ｍモル）
８μｌの１０ｍＭのｄＴＴＰ（総量：８０ｎモル）
２．４μｌのターミナルトランスフェラーゼ（６０Ｕ）
ｄｄＨ２Ｏで１００μｌ
混合物を３７℃で１時間インキュベートした。
【００４７】
２．ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及びＰＣＲ産物のジゴキシゲニンによる標識
ＰＣＲ２５μｌ混合物
３．７５μｌのｄＮＴＰｓ（１ｍＭ濃度）
１．２５μｌのベーリンガーＤＩＧ  ＤＮＡ標識混合物
２．５μｌのパーキン・エルマー緩衝液Ｉ
０．７５μｌの各プライマー（ストック溶液１０μモル）
１μｌのＴａｑポリメラーゼ（パーキン・エルマー）（１：１０希釈用）
Ｈ２Ｏで２４μｌにする
１μｌのＤＮＡ
温度条件（プライマーＢ＆Ｄ；パーキン・エルマー９６００サーモサイクラー）
９５℃−３分間
９５℃−３０秒間；５４℃−２５秒間；７２℃−３０秒間：３０サイクル
７２℃−５分間
６℃に冷却
【００４８】
３．膜の調製
陽性に荷電したベーリンガー・マンハイムナイロン膜を薄いストリップに切断した。それらに鉛筆でマークを付け、先端をカットした１ｍｌピペットを用いて膜に円状にパンチした。プローブ１μｌ（２ｐモル）を添加し、１０分間風乾し、１２０ｍｌのストラートリンカー（登録商標）（ストラタジーン）でクロスリンクした。
膜を洗浄して（非結合プローブを除き）：
（１本の５０ｍｌファルコン（登録商標）チューブ中ですべてのストリップを一緒に）
洗浄液：５×ＳＳＰＥ，０．５％ＳＤＳ
６１℃で３０分間
再蒸留水で洗浄
風乾した後、ストリップを−２０℃で貯蔵することができる。
【００４９】
４．ハイブリダイゼーション
プリハイブリダイゼーション  −  番号を付したそれぞれのエッペンドルフ容
器中で行う。
溶液（３００ｍｌ部分）      ５×ＳＳＰＥ
０．５％ＳＤＳ
０．５％硫酸デキストラン
６１℃で３０分間
ハイブリダイゼーション
ＰＣＲ産物を９５℃で１０分間変性し、ついでプリハイブリダイゼーションの処理後手早く添加する。
温和に回転させながら、６１℃で正確に１時間ハイブリダイズさせる。
ハイブリダイゼーションの終了後、膜を下記の溶液３００μｌで洗浄する（同一のエッペンドルフ容器中で）：
２×ＳＳＰＥ
０．１％ＳＤＳ
洗浄工程（僅かに撹拌しながら）：室温で５分間を２回そして６５℃で１０分間を１回。
【００５０】
５．検出
すべての工程は５０ｍｌファルコンチューブ（緩衝液量は約３０ｍｌ）中で僅かに振りながら行う（ベーリンガー・マンハイム Cat. No. 117504) 。
ａ）３０分Ｄ１緩衝液
ｂ）３０分Ｄ２緩衝液
ｃ）抗体コンジュゲートの溶液３μｌと新鮮なＤ２緩衝液３０ｍｌを混合し、ついで３０分間インキュベートする。
ｄ）２×１５分Ｄ１緩衝液
ｅ）Ｄ３緩衝液中で短時間インキュベーション
ｆ）膜を透明カバー中に置き、ＤＮＡ側を上にする：
４５μｌＮＢＴ
３５μｌ×リン酸塩溶液
１０ｍｌのＤ３緩衝液
ｇ）色素溶液を添加する；膜は動かしてはいけない。正確に１５分間発色させる。
ｈ）停止溶液：Ｄ４緩衝液
ｉ）風乾させる。
【００５１】
緩衝液
２０×ＳＳＰＥ    ３ＭのＮａＣｌ                 175.3ｇNaCl
０．２Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４         27.6g NaH２PO４
２０ｍＭ  ＥＤＴＡ              7.4g EDTA
ＮａＯＨでｐＨ７．４に調整後、再蒸留水を添加して
１０００ｍｌにする
２×ＳＤＳ        ２０ｇＳＤＳ
ＨＣｌ（数滴）でｐＨ７．２に調整
再蒸留水で１０００ｍｌにする
Ｄ１              １００ｍＭのマレイン酸
１５０ｍＭのＮａＣｌ
０．３％（ｗ／ｖ）トゥィーン２０
ＮａＯＨを用い２０℃でｐＨ７．５に調整
Ｄ２              １．０％ブロッキング試薬（カゼイン、ベーリンガーキッ
ト）をＤ１に溶解する、使用前１時間に調製して−２０℃
に貯蔵する
Ｄ３              １００ｍＭトリス塩酸
１００ｍＭのＮａＣｌ
５０ｍＭのＭｇＣｌ２
２０℃でｐＨ９．５に調整する
Ｄ４              １０ｍＭのトリス塩酸
１ｍＭのＥＤＴＡ
ｐＨ８．０に調整する
【００５２】
６．ＰＣＲプライマー
18マー： 5'-GGCTGATTGT CTTGACCA-3 ’（プライマーＢ）  配列番号:2
20マー:  5'-AGGAAGCCTC ACACTATCAT-3 ’（プライマーＤ）配列番号:3
24マー:  GTTGAAGACT ACGACGTTGA TAGG （プライマーＡ）  配列番号:4
21マー:  AATGTTTCAC TTCTGAGTTC G (プライマーＣ）      配列番号:5
７．オリゴヌクレオチドプローブ（５Ｓ−ｒＤＮＡ）
属プローブ：
29マー: 5'-AACCACCTGA TACCATCTCG AACTCAGAA-3’        配列番号:6
Ｌ．ニューモフィラ種のプローブ：
30マー: 5'-ACGTGAAACG TATCGTGTAA ACTCTGACTC-3’       配列番号:7
Ｌ．アニサ種のプローブ：
26マー: 5'-ATGCGAATAC AAGATGTAGG TTGGGC-3’           配列番号:8
Ｌ．ミクダデイ種のプローブ：
34マー: 5'-ATGTAAATTG CTCAGACAAA TGAATACAGA GTTT-3’  配列番号:9
Ｌ．ブルネンシス種のプローブ：
31マー: 5'-CCTGTTTTTA CAGAGCACTT AACAATGCTC T-3’     配列番号:10
Ｌ．チェリイ（L. cherrii) 種のプローブ：
29マー: 5'-AATGCAAATA CAAGAAATTT AGGTTGGGC-3’        配列番号:11
Ｌ．シンシナチエンシス種のプローブ：
27マー: 5'-CTCTCTTTRT TTACCGGAAG TAACGCG-3’          配列番号:12
Ｌ．ドゥモフィイ種のプローブ：
26マー: 5'-ATCAATACCT GGGGTAGGAC ACCTGC-3’           配列番号:13
Ｌ．エリトラ種のプローブ：
24マー: 5'-AACCCGGGTA AGACCGGAAA AACC-3’             配列番号:14
Ｌ．フィーレイイ種のプローブ：
27マー: 5'-GCAAAAATGA AAGACAAATG CGTTTGT-3’          配列番号:15
Ｌ．イスラエレンシス種のプローブ：
27マー: 5'-TTAAACGCTT GTGAATCAAA CCCATTC-3’          配列番号:16
Ｌ．ヨルダニス種のプローブ：
27マー: 5'-TGATGAATGA ATATCCCCTA ACATGGG-3’          配列番号:17
Ｌ．ロングビーチャエ種のプローブ：
39マー: 5'-TGCTTGATAT AAGATATAAT ACCTCTTTAT TTACCTGAG-3’
配列番号:18
Ｌ．マセアチェルニイ種のプローブ：
32マー: 5'-GGCAATACTT TAATTAAAGG CATTAATGCC TA-3’    配列番号:19
Ｌ．モラビカ種のプローブ：
23マー: 5'-AGGCCTTGGG CTTGTTGATT GAA-3’              配列番号:20
Ｌ．セントヘレンシ種のプローブ：
40マー: 5'-GTGCTGAATA TAAGATATAA TGTTACTCTC TTTATTTACC-3’
配列番号:21
Ｌ．スピリテンシス種のプローブ：
25マー: 5'-GTGTGCCCTG AAGAAGAAAC AGGGT-3’            配列番号:22
Ｌ．ステイゲルワルチイ種のプローブ：
28マー: 5'-AATGTGTATA CAAGCTGTAG GTTGGCCA-3’         配列番号:23
Ｌ．ワドスワーシイ（L. wadsworthii) 種のプローブ：
30マー: 5'-GTACGTACGA ATTAGAGATT GGGTCTAGGC-3’       配列番号:24
【００５３】
８．検出法
ａ）４種の異なるプローブを用いる逆ドット・ブロット・ハイブリダイゼーション
上記の作業用プロトコールに従い、属特異的増幅法及び１個の属特異的（Ａ）及び／又は３個の種特異的（Ｂ：Ｌ．ニューモフィラ（L. pneumophila）; Ｃ：Ｌ．アニサ（L. anisa）; Ｄ：Ｌ．ミクダデイ（L. micdadei)）プローブを用いる検出法を実施した。図２は１０個のフィルター上での発色を示す。属特異的プローブ（Ａ）では、すべての場合で検出シグナルを生ずることを明瞭に見ることができる。Ｌ．ニューモフィラ特異的プローブ（Ｂ）は、血清型１、すなわち、Ｌ．ニューモフィラのフィラデルフィア株をも含むフィルターでのみ反応する。Ｌ．アニサ特異的プローブ（Ｃ）はフィルターＮｏ．４で明瞭なシグナルを生ずる。Ｌ．ミクダデイ種は、Ｌ．ミクダデイ特異的プローブ（Ｄ）でなければ検出できない。Ｌ．ゴルマニイは属特異的プローブでしか検出できない（フィルターＮｏ．９）。
【００５４】
下記の核酸を下記のフィルター上に置いた。
１：Ｌ．ドゥモフィイ        （２ｐモル  プローブ）
２：Ｌ．アニサ              （２ｐモル  プローブ）
３：Ｌ．アニサ              （４ｐモル  プローブ）
４：Ｌ．アニサ              （８ｐモル  プローブ）
５：Ｌ．ミクダデイＡＴＣＣ33218   （２ｐモル  プローブ）
６：Ｌ．ミクダデイＡＴＣＣ33218   （４ｐモル  プローブ）
７：Ｌ．ミクダデイＬ5443/90       （２ｐモル  プローブ）
８：Ｌ．ミクダデイＬ5443/90       （４ｐモル  プローブ）
９：Ｌ．ゴルマニイ
１０：Ｌ．ニューモフィラ血清型１フィラデルフィア
【００５５】
ニューモフィラ種及び非ニューモフィラ種の２３Ｓ−５Ｓスペーサー領域の増幅
図３、４、及び５は、本発明の属特異的プライマーを用いた２３Ｓ−５Ｓスペーサー領域の増幅の結果を示す。すべての場合に増幅が起こるが、多くの場合、それぞれの種の増幅産物のサイズに相違があることが明らかに観察できる。従って、増幅産物のサイズに基づき、属特異的増幅によってレジオネラ種を区別することが可能である。
１：Ｌ．ニューモフィラ血清型１２  ５７０−ＣＯ−Ｈ        （図３）
２：Ｌ．ニューモフィラ血清型１３
３：Ｌ．ニューモフィラ血清型１４  １１６９−ＭＮ−Ｈ
４：Ｌ．アニサ  ＷＡ−３１６−Ｃ３
５：Ｌ．ブルネンシス
６：Ｌ．チェリイ  ＯＲＷ
７：Ｌ．シンシナチエンシス７２−ＯＨ−Ｈ
８：Ｌ．ドゥモフィイ  ＮＹ−２３
９：Ｌ．エリトラ  ＳＥ−３２Ａ−Ｃ８
１０：Ｌ．フィーレイイ血清型１  ＷＯ−４４Ｃ
１１：Ｌ．フィーレイイ血清型２  ６９１−ＷＩ−Ｈ
１２：Ｌ．イスラエレンシス  ベルコビール（Bercovier)−４
Ｍ：１００ｂｐＤＮＡサイズマーカー
【００５６】
１：Ｌ．ヨルダニスＢＬ−５４０                          （図４）
２：Ｌ．ロングビーチャエ血清型１ロングビーチ−４
３：Ｌ．ロングビーチャエ血清型２ツッカー−１
４：Ｌ．マセアチェルニイ  ＰＸ−１−Ｇ２−Ｅ２
５：Ｌ．ミクダデイ  ＴＡＴＬＯＣＫ
６：Ｌ．モラビカ  ３１６−３６
７：Ｌ．オークリジェンシス  ＯＲ−１０
８：Ｌ．ルブリルーセンス  ＷＡ−２７０−Ｃ２
９：Ｌ．セントヘレンシ  Ｍｔ．Ｓｔ．Ｈｅｌｅｎｓ−４
１０：Ｌ．スピリテンシス  Ｍｔ．Ｓｔ．Ｈｅｌｅｎｓ−９
１１：Ｌ．ステイゲルワルチイ  ＳＣ−１８−Ｃ９
１２：Ｌ．ワドスワーシイ  ８１−７１６Ａ
Ｍ：１００ｂｐ  ＤＮＡサイズマーカー
【００５７】
１：ネガティブコントロール                                  （図５）
２：Ｌ．ニューモフィラ血清型１フィラデルフィア１
３：Ｌ．ニューモフィラ血清型２トーグ−１
４：Ｌ．ニューモフィラ血清型３ブルーミントン−２
５：Ｌ．ニューモフィラ血清型４ロスアンジェルス−１
６：Ｌ．ニューモフィラ血清型５ダラス−１Ｅ
７：Ｌ．ニューモフィラ血清型６シカゴ−２
８：Ｌ．ニューモフィラ血清型７シカゴ−８
９：Ｌ．ニューモフィラ血清型８コンコード−３
１０：Ｌ．ニューモフィラ血清型９ＩＮ−２３−Ｇ１−Ｃ２
１１：Ｌ．ニューモフィラ血清型１９ライデン−１
１２：Ｌ．ニューモフィラ血清型１１  ７９７−ＰＡ−Ｈ
Ｍ：１００ｂｐ  ＤＮＡサイズマーカー
【００５８】
実施例３で用いたプライマーＢとＤの代わりに、配列番号：１の別のハイブリダイゼーション位置を持つプライマーを使用することも可能である。次のものは、付加的なプライマーの確かなハイブリダイゼーション位置（最初の塩基対と塩基長）である。属特異的プローブに関しても適当なプローブが与えられる。リストは、遺伝子特異的増幅に特に適するプライマーの組み合わせをも示す。
【００５９】
実施例４
プライマーとプローブの考えられるバリエーション
プライマー
プライマーＢの考えられる変種
１）１０４位、１８マー、Ｔｍ４３．９℃（実施例３からのプライマーＢ）
２）１０５位、２１マー、Ｔｍ ４３．０℃
３）１１０位、２２マー、Ｔｍ ４２．８℃
４）１０３位、１８マー、Ｔｍ ４３．９℃
５）１０１位、１９マー、Ｔｍ ４２．７℃
６）１００位、１９マー、Ｔｍ ４３．５℃
７）９９位、２０マー、Ｔｍ ４４．２℃
８）１００位、２０マー、Ｔｍ ４５．０℃
９）９８位、２０マー、Ｔｍ ４３．５℃
１０）９４位、２１マー、Ｔｍ ４３．１℃
１１）１０４位、１９マー、Ｔｍ ４５．２℃
１２）１０５位、２３マー、Ｔｍ ４６．１℃
１３）１１３位、２３マー、Ｔｍ ４４．７℃
１４）１０２位、１９マー、Ｔｍ ４６．３℃
１５）１００位、２０マー、Ｔｍ ４５．０℃
１６）９９位、２１マー、Ｔｍ ４５．６℃
１７）９８位、２１マー、Ｔｍ ４５．８℃
１８）９６位、２２マー、Ｔｍ ４５．５℃
１９）１０５位、２２マー、Ｔｍ ４５．１℃
２０）１０９位、２３マー、Ｔｍ ４４．０℃
【００６０】
プライマーＤの考えられる変種
２１）３１６位、２０マー、Ｔｍ ４３．７℃（実施例３からのプライマーＤ）
２２）３１２位、１９マー、Ｔｍ ４６．０℃
２３）３１７位、２０マー、Ｔｍ ４４．９℃
【００６１】
プライマーＡ：
１）３４位、２１マー、Ｔｍ ４４．５℃
２）３５位、２２マー、Ｔｍ ４５．４℃
３）３７位、２１マー、Ｔｍ ４４．５℃
４）３９位、２０マー、Ｔｍ ４４．６℃
５）３８位、２９マー、Ｔｍ ４２．１℃
６）３１位、１８マー、Ｔｍ ４３．１℃
７）２９位、１８マー、Ｔｍ ４５．９℃
８）２７位、１８マー、Ｔｍ ４３．２℃
９）２５位、１８マー、Ｔｍ ４５．４℃
１０）４１位、１９マー、Ｔｍ ４３．８℃
【００６２】
プライマーＣ：
１１）２８６位、２１マー、Ｔｍ ４４．７℃
１２）２８６位、２０マー、Ｔｍ ４２．４℃
５Ｓ属プローブの考えられる変種（プライマーの組み合わせはＢ／Ｄのみ）
２６８位、２９マー、Ｔｍ ６１．０℃（実施例３で用いられたプローブ）
２６９位、２９マー、Ｔｍ ６０．７℃
２７０位、２９マー、Ｔｍ ６０．７℃
２７１位、３０マー、Ｔｍ ６１．５℃
２６７位、２９マー、Ｔｍ ６１．４℃
２６５位、２７マー、Ｔｍ ６０．６℃
２３Ｓ  属プローブ（プライマー組み合わせＡ／Ｃに適する）
5'-TTGTAGTAAT TGGCTGATTG TCTTGACCAT A-3'    配列番号：２５
考えられるＬ．ニューモフィラ種（プライマー組み合わせＢ／Ｄ及びＡ／Ｃに適する）の変種
１６２位、３９マー、Ｔｍ ５９．１℃（実施例３で使用されたプローブ）
１６０位、３２マー、Ｔｍ ５９．３℃
１６３位、３１マー、Ｔｍ ６０．１℃
１５９位、３３マー、Ｔｍ ５９．４℃
上記の位置（５’−末端塩基）は、図１に示す配列を指し、プライマーＡ及びＢは図１に示す配列の部分に相補的である。これらは、それぞれの位置で始まり、プライマーＤ及びＣはそれぞれの位置で始まる図１の配列の部分と同一の配列であり下流に続く（図１に示す配列から始まる）。
【００６３】
プライマーの組み合わせ
プライマーＢ／Ｄ                        プライマーＡ／Ｃ
１／２１                                １／１１
２／２１                                ２／１１
３／２１                                ３／１１
５／２１                                ４／１１
６／２１                                ５／１２
７／２１                                ６／１２
９／２１                                ７／１１
１０／２１                                ８／１２
１１／２２                                ９／１１
１２／２２                              １０／１１
１３／２２
１４／２２
１５／２２
１６／２２
１７／２２
１８／２２
１１／２３
４／２３
１９／２３
２０／２３
８／２３
１７／２３
プライマー及びヌクレオチド配列はすべてＤＮＡであり（プライマーとプローブの場合はオリゴヌクレオチド）、直鎖状であり、一本鎖である。
【００６４】
本発明のプローブはレジオネラに特異的であることが好ましい。即ち、本発明のプローブは、レジオネラ属に属さない生物のプライマー及び／又は検出プローブとしていかなる相互作用をも示さない。バシルス・セレウス（Bacillus cereus)、ブランハメラ・カタルハリス（Branhamella catharrhalis) 、キャンジダ・アルビカンス（Candida albicans) 、クラミディア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis)、コリネバクテリウム・ジフテリエ（Corynebacterium diphtheriae)、クリプトコックス（Crytococcus)、大腸菌、ヘモフィルス・インフルエンザエ（Haemophilus influenzae) 、ラクトバクテリウム（Lactobacterium) 、リステリア・モノシトゲネス（Listeria monocytogenes) 、ミコバクテリウム・アフリカヌム（Mycobacterium africanum)、Ｍ．アビウム（M. avium) 、Ｍ．ボビス（M. bovis) 、Ｍ．フラベセンス（M. flavescens)、Ｍ．フォルツイツム（M. fortuitum) 、Ｍ．ゴルダナエ（M. gordanae)、Ｍ．カンサシイ（M. kansasii)、Ｍ．テラエ（M. terrae)、Ｍ．ゼノピス（M. xenopis) 、ナイセリア・メニンギティジス（Neisseria meningitidis) 、ノカルディア（Nocardia) 、プロテウス・ブルガリス（Proteus vulgaris) 、シュードモナス・アエルギノーザ（Pseudomonas aeruginosa) 、ロドコックス（Rhodococcus)、サルモネラ・エンテリディチス（Salmonella enteriditis) 、スタフィロコックス・アウレウス（Staphylococcus aureus)、ストレプトコックス・フエカーリス（Streptococcus faecalis) 、Ｓｔ．ミレリ（St. milleri)、Ｓｔ．ニューモニエ（St. pneumoniae) 、Ｓｔ．ビリダンス（St. viridans) β−溶血性ストレプトコックス・ピオゲネス（St. pyogenes) 、トリコモナス・バギナリス（Trichomonas vaginalis)及びビブリオ・コレラエ（Vibrio cholerae)については、プライマー対Ｂ／Ｄ及びＡ／Ｃは有効でないという特徴を有する。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】図１は、レジオネラ属特異的配列と、２３Ｓ−領域、スペーサー領域及び５Ｓ−領域を示す。
【図２】図２は、４種の異なるプローブを用いる逆ドット・ブロット・ハイブリダイゼーションの結果（フィルター上での発色）を示す。  Ａは属特異的プローブ、ＢはＬ．ニューモフィラ特異的プローブ、ＣはＬ．アニサ特異的プローブ、そしてＤはＬ．ミクダデイ特異的プローブでの発色である。図中、１〜１０はフィルター上に置いた核酸である。１：Ｌ．ドゥモフィイ        （２ｐモル  プローブ）２：Ｌ．アニサ              （２ｐモル  プローブ）３：Ｌ．アニサ              （４ｐモル  プローブ）４：Ｌ．アニサ              （８ｐモル  プローブ）５：Ｌ．ミクダデイＡＴＣＣ33218   （２ｐモル  プローブ）６：Ｌ．ミクダデイＡＴＣＣ33218   （４ｐモル  プローブ）７：Ｌ．ミクダデイＬ5443/90       （２ｐモル  プローブ）８：Ｌ．ミクダデイＬ5443/90       （４ｐモル  プローブ）９：Ｌ．ゴルマニイ１０：Ｌ．ニューモフィラ血清型１フィラデルフィア
【図３】図３は、本発明の属特異的プライマーを用いた２３Ｓ−５Ｓスペーサー領域の増幅の結果を示す。増幅産物のサイズに基づき、属特異的増幅によってレジオネラ種を区別することが可能である。図中、１はＬ．ニューモフィラ血清型１２  ５７０−ＣＯ−Ｈ、２はＬ．ニューモフィラ血清型１３、３はＬ．ニューモフィラ血清型１４  １１６９−ＭＮ−Ｈ、４はＬ．アニサ  ＷＡ−３１６−Ｃ３、５はＬ．ブルネンシス、６はＬ．チェリイ  ＯＲＷ、７はＬ．シンシナチエンシス７２−ＯＨ−Ｈ、８はＬ．ドゥモフィイ  ＮＹ−２３、９はＬ．エリトラ  ＳＥ−３２Ａ−Ｃ８、１０はＬ．フィーレイイ血清型１  ＷＯ−４４Ｃ、１１はＬ．フィーレイイ血清型２  ６９１−ＷＩ−Ｈ、１２はＬ．イスラエレンシス  ベルコビール（Bercovier)−４の増幅産物をそれぞれ示す。Ｍは１００ｂｐＤＮＡサイズマーカーを示す。
【図４】図４は、本発明の属特異的プライマーを用いた２３Ｓ−５Ｓスペーサー領域の増幅の結果を示す。増幅産物のサイズに基づき、属特異的増幅によってレジオネラ種を区別することが可能である。図中、１はＬ．ヨルダニスＢＬ−５４０、２はＬ．ロングビーチャエ血清型１ロングビーチ−４、３はＬ．ロングビーチャエ血清型２ツッカー−１、４はＬ．マセアチェルニイ  ＰＸ−１−Ｇ２−Ｅ２、５はＬ．ミクダデイ  ＴＡＴＬＯＣＫ、６はＬ．モラビカ  ３１６−３６、７はＬ．オークリジェンシス  ＯＲ−１０、８はＬ．ルブリルーセンス  ＷＡ−２７０−Ｃ２、９はＬ．セントヘレンシ  Ｍｔ．Ｓｔ．Ｈｅｌｅｎｓ−４、１０はＬ．スピリテンシス  Ｍｔ．Ｓｔ．Ｈｅｌｅｎｓ−９、１１はＬ．ステイゲルワルチイ  ＳＣ−１８−Ｃ９、１２はＬ．ワドスワーシイ  ８１−７１６Ａの増幅産物をそれぞれ示す。Ｍは１００ｂｐ  ＤＮＡサイズマーカーを示す。
【図５】図５は、本発明の属特異的プライマーを用いた２３Ｓ−５Ｓスペーサー領域の増幅の結果を示す。増幅産物のサイズに基づき、属特異的増幅によってレジオネラ種を区別することが可能である。図中、１はネガティブコントロール、２はＬ．ニューモフィラ血清型１フィラデルフィア１、３はＬ．ニューモフィラ血清型２トーグ−１、４はＬ．ニューモフィラ血清型３ブルーミントン−２、５はＬ．ニューモフィラ血清型４ロスアンジェルス−１、６はＬ．ニューモフィラ血清型５ダラス−１Ｅ、７はＬ．ニューモフィラ血清型６シカゴ−２、８はＬ．ニューモフィラ血清型７シカゴ−８、９はＬ．ニューモフィラ血清型８コンコード−３、１０はＬ．ニューモフィラ血清型９ＩＮ−２３−Ｇ１−Ｃ２、１１はＬ．ニューモフィラ血清型１９ライデン−１、１２はＬ．ニューモフィラ血清型１１  ７９７−ＰＡ−Ｈの増幅産物をそれぞれ示す。Ｍは１００ｂｐ  ＤＮＡサイズマーカーを示す。
【図６】図６は、配列番号：１の配列を示す。
【図７】図７は、配列番号：２の配列を示す。
【図８】図８は、配列番号：３の配列を示す。
【図９】図９は、配列番号：４の配列を示す。
【図１０】図１０は、配列番号：５の配列を示す。
【図１１】図１１は、配列番号：６の配列を示す。
【図１２】図１２は、配列番号：７の配列を示す。
【図１３】図１３は、配列番号：８の配列を示す。
【図１４】図１４は、配列番号：９の配列を示す。
【図１５】図１５は、配列番号：１０の配列を示す。
【図１６】図１６は、配列番号：１１の配列を示す。
【図１７】図１７は、配列番号：１２の配列を示す。
【図１８】図１８は、配列番号：１３の配列を示す。
【図１９】図１９は、配列番号：１４の配列を示す。
【図２０】図２０は、配列番号：１５の配列を示す。
【図２１】図２１は、配列番号：１６の配列を示す。
【図２２】図２２は、配列番号：１７の配列を示す。
【図２３】図２３は、配列番号：１８の配列を示す。
【図２４】図２４は、配列番号：１９の配列を示す。
【図２５】図２５は、配列番号：２０の配列を示す。
【図２６】図２６は、配列番号：２１の配列を示す。
【図２７】図２７は、配列番号：２２の配列を示す。
【図２８】図２８は、配列番号：２３の配列を示す。
【図２９】図２９は、配列番号：２４の配列を示す。
【図３０】図３０は、配列番号：２５の配列を示す。
【図３１】図３１は、配列番号：２６の配列を示す。
【図３２】図３２は、配列番号：２７の配列を示す。
【図３３】図３３は、配列番号：２８の配列を示す。
【図３４】図３４は、配列番号：２９の配列を示す。
【図３５】図３５は、配列番号：３０の配列を示す。
【図３６】図３６は、配列番号：３１の配列を示す。
【図３７】図３７は、配列番号：３２の配列を示す。
【図３８】図３８は、配列番号：３３の配列を示す。
【図３９】図３９は、配列番号：３４の配列を示す。
【図４０】図４０は、配列番号：３５の配列を示す。
【図４１】図４１は、配列番号：３６の配列を示す。
【図４２】図４２は、配列番号：３７の配列を示す。
【図４３】図４３は、配列番号：３８の配列を示す。
【図４４】図４４は、配列番号：３９の配列を示す。
【図４５】図４５は、配列番号：４０の配列を示す。
【図４６】図４６は、配列番号：４１の配列を示す。
【図４７】図４７は、配列番号：４２の配列を示す。
【図４８】図４８は、配列番号：４３の配列を示す。
【図４９】図４９は、配列番号：４４の配列を示す。
【図５０】図５０は、配列番号：４５の配列を示す。
【図５１】図５１は、配列番号：４６の配列を示す。
【図５２】図５２は、配列番号：４７の配列を示す。
【図５３】図５３は、配列番号：４８の配列を示す。
【図５４】図５４は、配列番号：４９の配列を示す。
【図５５】図５５は、配列番号：５０の配列を示す。
【図５６】図５６は、配列番号：５１の配列を示す。
【図５７】図５７は、配列番号：５２の配列を示す。
【図５８】図５８は、配列番号：５３の配列を示す。
【図５９】図５９は、配列番号：５４の配列を示す。
【図６０】図６０は、配列番号：５５の配列を示す。
【図６１】図６１は、配列番号：５６の配列を示す。
【図６２】図６２は、配列番号：５７の配列を示す。
【図６３】図６３は、配列番号：５８の配列を示す。
【図６４】図６４は、配列番号：５９の配列を示す。
【図６５】図６５は、配列番号：６０の配列を示す。
【図６６】図６６は、配列番号：６１の配列を示す。
【図６７】図６７は、配列番号：６２の配列を示す。
【図６８】図６８は、配列番号：６３の配列を示す。
【図６９】図６９は、配列番号：６４の配列を示す。
【図７０】図７０は、配列番号：６５の配列を示す。
【図７１】図７１は、配列番号：６６の配列を示す。
【図７２】図７２は、配列番号：６７の配列を示す。
【図７３】図７３は、配列番号：６８の配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７３】
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【配列表】
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