(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ser-Tyr-Thr-Ile-Glu-Ile-Asn-His-Arg-Leuに示されるアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項２】
請求項１記載のペプチドと、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合タンパク質又は融合ペプチド。
【請求項３】
請求項１記載のペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項４】
抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項３記載の抗体。
【請求項５】
ＨＬＡ分子と、請求項１記載のペプチドを用いることを特徴とする細胞傷害性Ｔ細胞又はその前駆細胞の検出方法。
【請求項６】
ＨＬＡクラスＩ分子と、請求項１記載のペプチドとの複合体を蛍光微粒子表面に形成させることを特徴とする細胞傷害性Ｔ細胞又はその前駆細胞の検出方法。
【請求項７】
ＨＬＡ分子と、請求項１記載のペプチドとを含有することを特徴とする細胞傷害性Ｔ細胞又はその前駆細胞の検出試薬。
【請求項８】
ＨＬＡクラスＩ分子と、請求項１記載のペプチドとの複合体と、蛍光微粒子とを含有することを特徴とする細胞傷害性Ｔ細胞又はその前駆細胞の検出試薬。
【請求項９】
請求項１記載のペプチドを用いることを特徴とするインビトロ刺激により誘導される細胞傷害性Ｔ細胞。
【請求項１０】
請求項３又は４記載の抗体を含有することを特徴とする癌の診断薬。
【請求項１１】
癌が、子宮頚癌、上皮様癌、Ｔ細胞腫、前骨髄性白血病、食道癌、膵癌、悪性黒色腫、肺癌、口腔癌、乳癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、神経芽細胞腫、大腸癌から選ばれた１又は２以上の癌であることを特徴とする請求項１０記載の癌の診断薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、癌・精巣抗原タンパク質若しくはペプチド及びそれをコードする癌・精巣遺伝子、並びに癌・精巣抗原タンパク質・ペプチドを用いた免疫誘導活性促進又は抑制物質のスクリーニング方法、癌・精巣抗原タンパク質若しくはかかる抗原タンパク質の部分ペプチド等を有効成分とする抗腫瘍剤、癌・精巣遺伝子を用いる癌の診断用プローブ等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
腫瘍細胞はしばしば、あるプロトオンコジーンのように正常細胞では通常発現されないかあるいは極めて低レベルでしか発現されていない様々な遺伝子を発現する（Science 235, 305-11, 1987）。このように異常発現する遺伝子群には、組織特異的分化に関与するものも含まれ（Immunol. Today 18, 267-8, 1997）、腫瘍細胞におけるこれらの遺伝子発現は、腫瘍細胞の悪性表現型に寄与していると考えられている。精巣は数多くの精巣特異的遺伝子を発現するが（Reprod. Fertility & Develop. 7, 695-704, 1995、Int. J. Develop. Biol. 40, 379-83, 1996）、それらの殆どは全くあるいは極く稀にしか一般の腫瘍では活性化しないと報告されている（Biochem. Biophys. Res. Comm. 241, 653-657, 1997）。しかし最近の研究により、癌と正常精巣両者に発現する遺伝子群が同定され、それらの中には、宿主に免疫応答を引き起こすものがあり、癌・精巣抗原（cancer-testis antigen：ＣＴ抗原）と呼ばれている。また、癌・精巣抗原遺伝子に対して相同的な塩基配列をもつが、精巣のみならず両性の生殖器官において表現されている遺伝子も知られている（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 10757-62, 1998、Cancer Res. 59, 1445-8, 1999、J. Biol. Chem. 273, 17618-25, 1998）。
【０００３】
癌・精巣抗原をコードする遺伝子を含めた上記の遺伝子は癌・精巣関連遺伝子と称され、以下に示す表１のように分類されている。癌患者に免疫反応を惹起する抗原をコ−ドする癌・精巣関連遺伝子としては、ＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＬＡＧＥ、ＳＳＸ等の遺伝子が知られている（Science 254, 1643-7, 1991、Immunity 2, 167-75, 1995、J. Exp. Med. 182, 689-98, 1995、Int. J. Cancer 76, 903-8, 1998、Int. J. Cancer 72, 965-71, 1997、Cancer Res. 56, 4766-72, 1996）。これらの抗原は、癌患者における抗体の産生や、細胞傷害性Ｔリンパ球に対する反応性によって同定されている（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 1914-8, 1997、Science 254, 1643-7, 1991）。その一方で、癌・精巣関連遺伝子の中には抗原性が明らかとなっていないものも知られている（The Cancer J. from Scientific American, 16-7, 1999、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 11810-3, 1995、Cancer Res. 59, 3215-21, 1999、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 10757-62, 1998、Cancer Res. 59, 1445-8, 1999）。前者には免疫反応を惹起するために生体内に充分量の発現があり、後者には充分量の発現がない可能性が考えられている。かかる癌・精巣関連遺伝子は、その本来の生理学的機能が殆どわかっていないものの、腫瘍と精巣における特異的遺伝子発現のメカニズムの解析において、あるいは癌の診断と治療への応用の可能性の観点から研究されている（Cancer Res. 55, 3478-82, 1995、Int. J. Cancer 80, 219-30, 1999）。
【０００４】
【表１】
0004503801.tif 000002
【０００５】
これまで知られている殆どの癌・精巣関連遺伝子は、ヒトＸ染色体に存在する。例えば、ＭＡＧＥサブファミリーはＸ染色体の4つの領域、Ｘｑ２８、Ｘｑ２１．３、Ｘｑ２６及びＸｑ１１．２３（Immunogenet. 40, 360-9, 1994、Cancer Res. 58, 743-52, 1998、Genomics 59, 161-7, 1999）に存在する。また、ＳＳＸ遺伝子はＸｑ１１．２（Nature Genet. 7, 502-8, 1994）に、ＬＡＧＥ１とＮＹ−ＥＳＯ−１はＸｑ２８（Cancer J From Scientific American 5: 16-17, 1999、Intl J Cancer 76, 903-908, 1998）に、またＧＡＧＥ遺伝子はＸｐ１１．２−Ｘｐ１１．４（Cancer Res. 59, 3157-3165, 1999）の間に存在する。しかし、最近、第１染色体に存在することが知られるシナプトネマル複合タンパク質（ＳＣＰ１）は癌・精巣関連遺伝子群の一員であることが示され（EMBO J. 11, 5091-5100, 1992）、また同時にこれはＨＯＭ−ＴＥＳ−１４遺伝子（Cytogen Cell Genet 78, 103-104, 1997、Proc Natl Acad Sci USA 95, 5211-5216, 1998）と同一であることも明らかにされている。
【０００６】
他方、生体の癌に対する拒絶反応は、組織あるいは細胞において組織適合抗原分子 (HLA)と結合した癌抗原ペプチドとの複合体を認識した細胞傷害性Tリンパ球により引き起こされることが知られている。腫瘍細胞に発現しているＨＬＡに癌抗原が結合することにより、細胞傷害性リンパ球が複合体を抗原と認識し拒絶反応を引き起こし、癌細胞を退縮させることが知られている。Marie Marchandらは、ＭＡＧＥ３遺伝子産物（タンパク質）の中の９アミノ酸残基からなる配列が、ＨＬＡクラスＩ分子の１つであるＨＬＡ−Ａ１と結合する性質を利用し、このアミノ酸配列を有するペプチドを合成して悪性黒色腫の患者に免疫したところ、２５例の患者のうち７例に腫瘍の退縮が認められることを報告している（Int. J. Cancer 80, 219-30, 1999）。
【０００７】
また、転写制御因子ＧＣＦはＥＧＦ（上皮増殖因子）レセプター遺伝子の転写制御領域に結合する因子として知られている（Cell 59, 815-25, 1989）。しかしながら、最近、既に報告されているＧＣＦｃＤＮＡは人工的な融合分子であることが明らかになった（Biochem. Biophys. Acta 1447, 125-31, 1999）。すなわちアミノ末端の配列は、新しく最近同定された転写因子であるＧＣＦ２に由来し（J. Biol. Chem. 273, 21594-602, 1998）、また残りの大部分のｃＤＮＡは本発明者らが仮りにＧＣＦ１と名付けた部分から成っている。塩基配列特異的なＤＮＡ結合活性はＧＣＦ２にあり、ＧＣＦ１はＤＮＡ結合活性を持たないことが明らかにされている（Biochem. Biophys. Acta 1447, 125-31, 1999）。しかし、ＧＣＦ１に特異的に結合するタンパク質をコードする遺伝子が、癌・精巣関連遺伝子であることは知られていなかった。
【０００８】
その他、サッカロミセス酵母を用いて、タンパク質−タンパク質相互作用をインビボで検出するシステムとして、酵母ツーハイブリッドシステム（Two-hybrid System）（Nature 340, 245-6, 1989、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 9578-82, 1991）が知られている。この酵母ツーハイブリッドシステムにおいては、酵母の転写アクチベーターであり、互いに分離しうるＤＮＡ結合ドメインと転写活性化ドメインとを有するＧａｌ４タンパク質が通常用いられ、例えば、Ｇａｌ４ＤＮＡ結合ドメインとＸタンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子を担持したプラスミドベクターと、Ｇａｌ４転写活性化ドメインとＹタンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子を担持したプラスミドベクターとを、ＬａｃＺやＨＩＳ３遺伝子等のレポーター遺伝子をもつ酵母に導入し、Ｇａｌ４機能が回復しレポーター遺伝子の転写が活性化されるかどうかをみることにより、ＸとＹの相互作用を検出することができる。かかる酵母ツーハイブリッドシステムにおいて、Ｘに既知のタンパク質を用い、Ｙをコードする遺伝子としてｃＤＮＡライブラリーを用いると、Ｘに相互作用するタンパク質をコードする遺伝子を前記ｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングすることができる。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
近年の分子生物学的研究から、癌抗原は表２のように分類されている。精巣にはヒト組織適合抗原分子（ＨＬＡ）クラスＩ分子の発現がないために、精巣細胞膜上のタンパク質はＴリンパ球により認識されない。このことから、癌・精巣抗原は精巣には発現するものの、免疫学的に癌に特異性が高く、狭義の癌特異抗原と考えられている。組織特異的分化抗原は、正常組織にもその発現がわずかながら認められることから、癌の免疫療法を行う際に、正常細胞に対する副作用が問題となっており、また、突然変異に基づく癌抗原は、個々の癌にその変異が限られる欠点をもっていることから、癌の免疫療法を行う際に適しているとはいえない。一方、癌・精巣抗原は、精巣以外の正常組織には発現せず、かつ広範囲の種々の癌に発現することから、癌の免疫療法剤としての期待が大きい。本発明の課題は、癌の診断と免疫療法に応用することができる癌・精巣抗原、すなわち精巣以外の正常組織には発現せず、かつ広範囲の種々の癌に発現し、宿主に免疫反応を惹起する癌・精巣抗原や、それをコードする癌・精巣遺伝子等を提供することにある。
【００１０】
【表２】
0004503801.tif 000003
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究し、哺乳類細胞の増殖をコントロールする遺伝子として、以前に転写制御因子として報告されたＧＣＦ(GC element binding Factor)と相互作用するタンパク質を、酵母ツーハイブリッドシステムを利用してスクリーニングし、転写制御因子ＧＣＦに特異的に結合するタンパク質の遺伝子をクローニングし、この遺伝子産物であるタンパク質Ｄ４０がヒト正常組織では実質的に精巣のみに、癌においては種々の組織と細胞由来の広範囲のヒト原発癌に発現する癌・精巣抗原であることを確認し、かかるＤ４０がヒト主要組織適合抗原のＨＬＡと高い親和性をもち、複数のＨＬＡと結合する９又は１０アミノ酸残基からなる配列を有することを見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち本発明は、（１）Ser-Tyr-Thr-Ile-Glu-Ile-Asn-His-Arg-Leuに示されるアミノ酸配列からなるペプチドや、（２）上記（１）記載のペプチドと、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合タンパク質又は融合ペプチドに関する。
【００１３】
また本発明は、（３）上記（１）記載のペプチドに特異的に結合する抗体や、（４）抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする上記（３）記載の抗体に関する。
【００１４】
また本発明は、（５）ＨＬＡ分子と、上記（１）記載のペプチドを用いることを特徴とする細胞傷害性Ｔ細胞又はその前駆細胞の検出方法や、（６）ＨＬＡクラスＩ分子と、上記（１）記載のペプチドとの複合体を蛍光微粒子表面に形成させることを特徴とする細胞傷害性Ｔ細胞又はその前駆細胞の検出方法に関する。
【００１５】
また本発明は、（７）ＨＬＡ分子と、上記（１）記載のペプチドとを含有することを特徴とする細胞傷害性Ｔ細胞又はその前駆細胞の検出試薬や、（８）ＨＬＡクラスＩ分子と、上記（１）記載のペプチドとの複合体と、蛍光微粒子とを含有することを特徴とする細胞傷害性Ｔ細胞又はその前駆細胞の検出試薬に関する。
【００１６】
また本発明は、（９）上記（１）記載のペプチドを用いることを特徴とするインビトロ刺激により誘導される細胞傷害性Ｔ細胞に関する。
【００１７】
また本発明は、（１０）上記（３）又は（４）記載の抗体を含有することを特徴とする癌の診断薬に関する。
【００１８】
また本発明は、（１１）癌が、子宮頚癌、上皮様癌、Ｔ細胞腫、前骨髄性白血病、食道癌、膵癌、悪性黒色腫、肺癌、口腔癌、乳癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、神経芽細胞腫、大腸癌から選ばれた１又は２以上の癌であることを特徴とする上記（１０）記載の癌の診断薬に関する。
【００１９】
【発明の実施の形態】
本発明の癌・精巣関連遺伝子は、酵母ツーハイブリッドシステムを用いることによって、転写制御因子ＧＣＦと相互作用するタンパク質をコードする遺伝子として、ｃＤＮＡライブラリー又はゲノムＤＮＡライブラリーからスクリーニングすることができ、また、本発明の癌・精巣抗原タンパク質は、かかるスクリーニングにより得られた癌・精巣関連遺伝子を発現させることにより得ることができる。ここで、癌・精巣関連遺伝子とは、正常精巣において特異的に発現が認められ、他の正常組織には実質的にその発現が認められず、悪性腫瘍において活性化が認められ、その結果高いレベルのｍＲＮＡが検出され、かつ、悪性腫瘍における発現が組織非特異的である、と定義される。
【００２０】
図１には、転写制御因子ＧＣＦを利用した酵母ツーハイブリッドシステムが図式化されている。転写制御因子ＧＣＦはＧａｌ４のＤＮＡ結合ドメインとの融合タンパク質（ＧａｌＤＢＤ−ＧＣＦ）として発現し、ｃＤＮＡライブラリーに由来するタンパク質はＧａｌ４の転写活性化ドメインとの融合タンパク質として発現するが、ＧａｌＤＢＤ−ＧＣＦとｃＤＮＡライブラリーに由来するタンパク質との相互作用（結合）によりレポーター遺伝子の転写が活性化され、Ｈｉｓ３遺伝子とＬａｃＺとの発現が生起することになる。したがって、レポーター遺伝子が発現している酵母を単離することにより、ＧＣＦと相互作用するタンパク質をコードするｃＤＮＡをクローニングすることができる。かかる酵母ツーハイブリッドシステムには、市販のMATCHMAKER(Clontech)やHybriZAP(Strayagene)を利用することができる。
【００２１】
上記酵母ツーハイブリッドシステムにより得られる転写制御因子ＧＣＦと相互作用するタンパク質として、癌・精巣抗原タンパク質Ｄ４０を挙げることができ、このＤ４０をコードする癌・精巣関連遺伝子としては、配列表の配列番号１に示される塩基配列を有するものを具体的に例示することができる。Ｄ４０癌・精巣関連遺伝子には２つのＯＲＦ（open reading frame）が存在する。したがって、本発明の対象となるタンパク質として、具体的に、配列番号２に示されるＤ４０（ＯＲＦ１）タンパク質又は配列番号３に示されるＤ４０（ＯＲＦ２）タンパク質や、配列番号２又は３に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ免疫誘導活性を有するタンパク質や、これらの組換えタンパク質を例示することができる。ここで免疫誘導活性とは、宿主に対して抗体産生、細胞性免疫、免疫寛容等の免疫反応を誘導する活性をいい、かかる免疫誘導活性の中でも、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）前駆細胞の頻度を上昇させるＴ細胞誘導活性を有するものが特に好ましい。
【００２２】
また、本発明の対象となるペプチドとしては、本発明のタンパク質の一部、例えば５個又は６個以上の連続したアミノ酸配列からなり、かつ組織適合抗原分子（ＨＬＡ）クラスＩに結合するペプチドであればどのようなものでもよく、上記Ｄ４０（ＯＲＦ１）タンパク質由来の配列番号４〜１１１のいずれかに示されるアミノ酸配列等からなるペプチド、例えば、Ser-Tyr-Thr-Ile-Glu-Ile-Asn-His-Arg-Leu（配列番号３６）や、上記Ｄ４０（ＯＲＦ２）タンパク質由来の配列番号１１２〜２２１のいずれかに示されるアミノ酸配列等からなるペプチドを具体的に例示することができる。また、上記ＨＬＡクラスＩとしては、ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−６８、ＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２４、ＨＬＡ−Ａ０２０１、ＨＬＡ−Ａ０２０５、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｂ８、ＨＬＡ−Ｂ１４、ＨＬＡ−Ｂ４０、Ｂ１５０１（Ｂ６２）等のＨＬＡクラスＩを具体的に挙げることができる。上記本発明の対象となるタンパク質及びペプチド、並びにこれらタンパク質及びペプチドに特異的に結合する抗体が特異的に結合する組換えタンパク質及びペプチドを総称して、以下「本件タンパク質・ペプチド」ということがある。なお、本件タンパク質・ペプチドはそのＤＮＡ配列情報等に基づき公知の方法で調製することができ、かかる抗原の由来はヒトに限定されるものではない。
【００２３】
上記本発明の対象となる遺伝子又はＤＮＡとして具体的には、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＤ４０（ＯＲＦ１）タンパク質をコードする遺伝子や、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ免疫誘導活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡや、配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるＤ４０（ＯＲＦ２）タンパク質をコードする遺伝子や、配列番号３に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ免疫誘導活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡや、配列番号１に示される塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列の一部または全部を含むＤＮＡを挙げることができる。これらはそのＤＮＡ配列情報等に基づき、例えばヒト遺伝子ライブラリーやヒトｃＤＮＡライブラリーなどから公知の方法により調製することができる。またＤ４０タンパク質をコードするｃＤＮＡの調製方法としては特に制限されるものではないが、例えば、ＨＬ６０やＴリンパ白血病細胞株Jurkat由来のｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡライブラリーから得ることができる。
【００２４】
また、配列番号１に示される塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列の一部又は全部をプローブとして、各種癌細胞由来のＤＮＡライブラリーに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションを行ない、該プローブにハイブリダイズするＤＮＡを単離することにより、Ｄ４０遺伝子と同効な目的とする免疫誘導活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを得ることもできる。かかるＤＮＡを取得するためのハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、４２℃でのハイブリダイゼーション、及び１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による４２℃での洗浄処理を挙げることができ、６５℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ，０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による６５℃での洗浄処理をより好ましく挙げることができる。なお、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与える要素としては、上記温度条件以外に種々の要素があり、当業者であれば、種々の要素を適宜組み合わせて、上記例示したハイブリダイゼーションのストリンジェンシーと同等のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００２５】
本発明の融合タンパク質や融合ペプチドとしては、本件タンパク質・ペプチドとマーカータンパク質及び／又はペプチドタグとが結合しているものであればどのようなものでもよく、マーカータンパク質としては、従来知られているマーカータンパク質であれば特に制限されるものではなく、例えば、アルカリフォスファターゼ、抗体のＦｃ領域、ＨＲＰ、ＧＦＰなどを具体的に挙げることができ、また本発明におけるペプチドタグとしては、Ｍｙｃタグ、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ＧＳＴタグなどの従来知られているペプチドタグを具体的に例示することができる。かかる融合タンパク質は、常法により作製することができ、Ｎｉ−ＮＴＡとＨｉｓタグの親和性を利用したＤ４０タンパク質等の精製や、Ｔ細胞誘導活性を有するタンパク質の検出や、Ｄ４０タンパク質等に対する抗体の定量、子宮頚癌、上皮様癌、Ｔ細胞腫、前骨髄性白血病、食道癌、膵癌、悪性黒色腫、肺癌、口腔癌、乳癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、神経芽細胞腫、大腸癌等の診断用マーカーなどとして、また当該分野の研究用試薬としても有用である。
【００２６】
本発明の前記タンパク質やペプチドに特異的に結合する抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体等の免疫特異的な抗体を具体的に挙げることができ、これらは上記Ｄ４０等のタンパク質又はその一部を抗原として用いて常法により作製することができるが、その中でもモノクローナル抗体がその特異性の点でより好ましい。かかるモノクローナル抗体等の抗体は、例えば、子宮頚癌、上皮様癌、Ｔ細胞腫、前骨髄性白血病、食道癌、膵癌、悪性黒色腫、肺癌、口腔癌、乳癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、神経芽細胞腫、大腸癌等の診断、ミサイル療法等の治療ばかりでなく、口腔癌等の悪性腫瘍の発症機構を明らかにする上で有用である。
【００２７】
上記の本発明の抗体は、慣用のプロトコールを用いて、動物（好ましくはヒト以外）に本件タンパク質・ペプチド若しくはエピトープを含むその断片、又は該タンパク質を膜表面に発現した細胞を投与することにより産生され、例えばモノクローナル抗体の調製には、連続細胞系の培養物により産生される抗体をもたらす、ハイブリドーマ法（Nature 256, 495-497, 1975）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Immunology Today 4, 72, 1983）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ法（MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, pp.77-96, Alan R.Liss, Inc., 1985）など任意の方法を用いることができる。
【００２８】
本発明の上記本件タンパク質・ペプチドに対する一本鎖抗体をつくるために、一本鎖抗体の調製法（米国特許第4,946,778号）を適用することができる。また、ヒト化抗体を発現させるために、トランスジェニックマウス又は他の哺乳動物等を利用したり、上記抗体を用いて、本件タンパク質・ペプチドを発現するクローンを単離・同定したり、アフィニティークロマトグラフィーでそのポリペプチドを精製することもできる。本件タンパク質・ペプチドやその抗原エピトープを含むペプチドに対する抗体は、前記のように各種癌の診断や治療に使用できる可能性がある。そして、これら抗体が特異的に結合する組換えタンパク質又はペプチドも、前記のように本発明の本件タンパク質・ペプチドに包含される。
【００２９】
また前記モノクローナル抗体等の抗体に、例えば、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソシアネート）又はテトラメチルローダミンイソシアネート等の蛍光物質や、125Ｉ、32Ｐ、14Ｃ、35Ｓ又は3Ｈ等のラジオアイソトープや、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ又はフィコエリトリン等の酵素で標識したものや、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の蛍光発光タンパク質などを融合させた融合タンパク質を用いることによって、本件タンパク質・ペプチドの機能解析を行うことができる。また本件発明の抗体を用いる免疫学的測定方法としては、ＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、血球凝集反応法、オクタロニー法等の方法を挙げることができる。
【００３０】
本発明はまた、上記本件タンパク質・ペプチドを発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞に関する。かかる本件タンパク質・ペプチドをコードする遺伝子の宿主細胞への導入は、Davisら（BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1986）及びSambrookら（MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989）などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載される方法、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション(transvection)、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング (scrape loading)、弾丸導入(ballistic introduction)、感染等により行うことができる。そして、宿主細胞としては、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス等の細菌原核細胞や、酵母、アスペルギルス等の真菌細胞や、ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９等の昆虫細胞や、Ｌ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞（ジヒドロ葉酸レダクターゼやチミジンキナーゼなどを欠損した変異株を含む）、ＢＨＫ２１細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｂｏｗｅｓ悪性黒色腫細胞等の動物細胞や、植物細胞等を挙げることができる。
【００３１】
また、発現系としては、上記本件タンパク質・ペプチドを宿主細胞内で発現させることができる発現系であればどのようなものでもよく、染色体、エピソーム及びウイルスに由来する発現系、例えば、細菌プラスミド由来、酵母プラスミド由来、ＳＶ４０のようなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルス由来のベクター、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来及びこれらの組合せに由来するベクター、例えば、コスミドやファージミドのようなプラスミドとバクテリオファージの遺伝的要素に由来するものを挙げることができる。この発現系は発現を起こさせるだけでなく発現を調節する制御配列を含んでいてもよい。
【００３２】
上記発現系を含んでなる宿主細胞やかかる細胞の細胞膜、またかかる細胞を培養して得られる本件タンパク質・ペプチドは、後述するように本発明のスクリーニング方法に用いることができる。例えば、細胞膜を得る方法としては、F. Pietri-Rouxel（Eur. J. Biochem., 247, 1174-1179, 1997）らの方法などを用いることができる。また、かかる本件タンパク質・ペプチドを細胞培養物から回収し精製するには、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法、好ましくは、高速液体クロマトグラフィーが用いられる。特に、アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば、本件タンパク質・ペプチドに対する抗体を結合させたカラムや、上記本件タンパク質・ペプチドに通常のペプチドタグを付加した場合は、このペプチドタグに親和性のある物質を結合したカラムを用いることにより、本件タンパク質・ペプチドを得ることができる。上記本件タンパク質・ペプチドの精製方法は、ペプチド合成の際にも適用することができる。
【００３３】
本発明において、上記本件タンパク質・ペプチドをコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物とは、染色体上の本件タンパク質・ペプチドをコードする遺伝子の一部若しくは全部が破壊・欠損・置換等の遺伝子変異により不活性化され、本件タンパク質・ペプチドを発現する機能を失なった非ヒト動物をいい、また、本件タンパク質・ペプチドを過剰発現する非ヒト動物としては、野生型非ヒト動物に比べてかかる本件タンパク質・ペプチドを大量に産生する非ヒト動物を具体的に提示することができる。そして、本発明における非ヒト動物としては、マウス、ラット等の齧歯目動物などの非ヒト動物を具体的に挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００３４】
ところで、メンデルの法則に従い出生してくるホモ接合体非ヒト動物には、本件タンパク質・ペプチド欠損型又は過剰発現型とその同腹の野生型とが含まれ、これらホモ接合体非ヒト動物における欠損型又は過剰発現型とその同腹の野生型を同時に用いることによって個体レベルで正確な比較実験をすることができることから、野生型の非ヒト動物、すなわち本件タンパク質・ペプチドをコードする遺伝子機能が染色体上で欠損又は過剰発現する非ヒト動物と同種の動物、さらには同腹の動物を、例えば下記に記載する本発明のスクリーニングに際して併用することが好ましい。かかる本件タンパク質・ペプチドをコードする遺伝子機能が染色体上で欠損又は過剰発現する非ヒト動物の作製方法を、Ｄ４０ノックアウトマウスやＤ４０トランスジェニックマウスを例にとって以下説明する。
【００３５】
例えば、Ｄ４０タンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損したマウス、すなわちＤ４０ノックアウトマウスは、マウス遺伝子ライブラリーからＰＣＲ等の方法により得られた遺伝子断片を用いて、ヒトＤ４０と相同性を有するマウスＤ４０をコードする遺伝子をスクリーニングし、スクリーニングされたマウスＤ４０をコードする遺伝子をウイルスベクター等を用いてサブクローンし、ＤＮＡシーケンシングにより特定する。このクローンのマウスＤ４０をコードする遺伝子の全部又は一部をｐＭＣ１ネオ遺伝子カセット等に置換し、３′末端側にジフテリアトキシンＡフラグメント（ＤＴ−Ａ）遺伝子や単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子等の遺伝子を導入することによって、ターゲッティングベクターを作製する。
【００３６】
この作製されたターゲティングベクターを線状化し、エレクトロポレーション（電気穿孔）法等によってＥＳ細胞に導入し、相同的組換えを行い、その相同的組換え体の中から、Ｇ４１８やガンシクロビア（ＧＡＮＣ）等の抗生物質により相同的組換えを起こしたＥＳ細胞を選択する。また、この選択されたＥＳ細胞が目的とする組換え体かどうかをサザンブロット法等により確認することが好ましい。その確認されたＥＳ細胞のクローンをマウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションし、かかる胚盤胞を仮親のマウスに戻し、キメラマウスを作製する。このキメラマウスを野生型のマウスとインタークロスさせると、ヘテロ接合体マウスを得ることができ、また、このヘテロ接合体マウスをインタークロスさせることによって、本発明のＤ４０ノックアウトマウスを作製することができる。また、Ｄ４０ノックアウトマウスにＤ４０発現能が欠失しているかどうかを確認する方法としては、例えば、上記の方法により得られたマウスからＲＮＡを単離してノーザンブロット法等により調べたり、またこのマウスにおけるＤ４０の発現をウエスタンブロット法等により直接調べる方法がある。
【００３７】
Ｄ４０のトランスジェニックマウスは、ヒト、マウス、ラット、ウサギ等に由来するＤ４０をコードするｃＤＮＡに、チキンβ−アクチン、マウスニューロフィラメント、ＳＶ４０等のプロモーター、及びラビットβ−グロビン、ＳＶ４０等のポリＡ又はイントロンを融合させて導入遺伝子を構築し、該導入遺伝子をマウス受精卵の前核にマイクロインジェクションし、得られた卵細胞を培養した後、仮親のマウスの輸卵管に移植し、その後被移植動物を飼育し、産まれた仔マウスから前記ｃＤＮＡを有する仔マウスを選択することにより、トランスジェニックマウスを創製することができる。また、ｃＤＮＡを有する仔マウスの選択は、マウスの尻尾等より粗ＤＮＡを抽出し、導入したＤ４０をコードする遺伝子をプローブとするドットハイブリダイゼーション法や、特異的プライマーを用いたＰＣＲ法等により行うことができる。
【００３８】
また、上記本件タンパク質・ペプチドをコードする遺伝子若しくはＤＮＡ、本件タンパク質・ペプチド、本件タンパク質・ペプチドとマーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合タンパク質、本件タンパク質・ペプチドに対する抗体、本件タンパク質・ペプチドを発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞等は、以下に具体的に説明するように、子宮頚癌、上皮様癌、Ｔ細胞腫、前骨髄性白血病、食道癌、膵癌、悪性黒色腫、肺癌、口腔癌、乳癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、神経芽細胞腫、大腸癌等の治療や診断に有用であり、免疫誘導活性の促進又は抑制物質のスクリーニングや本件タンパク質・ペプチドの発現の促進又は抑制物質のスクリーニングに用いることができるばかりでなく、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ４抗原陽性Ｔ細胞、ＣＤ８抗原陽性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、キラーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞等の全てのＴ細胞を含む）の誘導等の免疫応答のメカニズムの解明にも使用することができる。
【００３９】
本発明の免疫誘導活性促進又は抑制物質のスクリーニング方法としては、前記本発明の本件タンパク質・ペプチド又は本件タンパク質・ペプチドを発現している細胞膜と、被検物質とを用いる方法や、前記本件タンパク質・ペプチドを発現している細胞と、被検物質とを用いる方法や、本件タンパク質・ペプチドのノックアウトマウスやトランスジェニックマウス等の非ヒト動物と、被検物質とを用いる方法等を挙げることができる。また、前記本件タンパク質・ペプチドを発現している細胞と、被検物質とを用いる方法や、本件タンパク質・ペプチドのノックアウトマウスやトランスジェニックマウス等の非ヒト動物と、被検物質とを用いる方法等は本件タンパク質・ペプチドの発現促進若しくは抑制物質のスクリーニング方法に用いることができる。
【００４０】
上記本件タンパク質・ペプチド又は本件タンパク質・ペプチドを発現している細胞膜と被検物質とを用いるスクリーニング方法としては、本件タンパク質・ペプチド又は細胞膜表面に発現している本件タンパク質・ペプチドと、被検物質とを接触せしめ、該本件タンパク質・ペプチドの免疫誘導活性を測定・評価する方法を具体的に挙げることができる。また、本件タンパク質・ペプチドを発現している細胞と、被検物質とを用いるスクリーニング方法としては、本件タンパク質・ペプチドを発現している細胞と被検物質とを接触せしめ、該本件タンパク質・ペプチドの免疫誘導活性や本件タンパク質・ペプチドの発現量の変化を測定・評価する方法を具体的に挙げることができる。
【００４１】
前記本件タンパク質・ペプチドをコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物又は本件タンパク質・ペプチドを過剰発現する非ヒト動物と、被検物質とを用いたスクリーニング方法としては、これら非ヒト動物から得られる細胞又は組織と、被検物質とをインビトロで接触せしめ、該本件タンパク質・ペプチドの免疫誘導活性や本件タンパク質・ペプチドの発現量の変化を測定・評価する方法や、前記本件タンパク質・ペプチドをコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物又は本件タンパク質・ペプチドを過剰発現する非ヒト動物にあらかじめ被検物質を投与した後、該非ヒト動物から得られる細胞又は組織における該本件タンパク質・ペプチドの免疫誘導活性や本件タンパク質・ペプチドの発現量の変化を測定・評価する方法や、前記本件タンパク質・ペプチドをコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物又は本件タンパク質・ペプチドを過剰発現する非ヒト動物にあらかじめ被検物質を投与した後、該非ヒト動物における該本件タンパク質・ペプチドの免疫誘導活性や本件タンパク質・ペプチドの発現量の変化を測定・評価する方法などを具体的に挙げることができる。
【００４２】
上記被検物質と本件タンパク質・ペプチドとを用いたスクリーニング方法について、以下に具体的に例を挙げて説明するが、本発明のスクリーニング方法はこれらに限定されるものではない。上記被検物質と本件タンパク質・ペプチドとを接触せしめ、該本件タンパク質・ペプチドの免疫誘導活性を測定・評価する方法としては、例えば、末梢血リンパ球から通常のインターロイキン−２を用いてインビトロで多量に増殖させた腫瘍浸潤Ｔ細胞の存在下に被検物質と本件タンパク質・ペプチドとを接触せしめ、ＣＴＬなどのＴ細胞の誘導活性の増減を測定し、被検物質が非存在下の対照の場合と比較・評価する方法を具体的に例示することができる。また、上記被検物質と本件タンパク質・ペプチドを発現している細胞膜又は細胞とを接触せしめ、該本件タンパク質・ペプチドの発現量の変化を測定・評価する方法としては、本件タンパク質・ペプチド発現細胞を被検物質の存在下で培養し、一定時間培養後細胞膜表面に発現された本件タンパク質・ペプチドが減少又は増加したことを、本発明の本件タンパク質・ペプチドに特異的に結合する抗体を用いて、ＥＬＩＳＡ等による免疫化学的に検出して、あるいはｍＲＮＡの発現が抑制又は促進したことを指標として評価する方法を具体的に例示することができる。上記ｍＲＮＡの検出法は、ＤＮＡチップ、ノーザンハイブリダイゼーション等の方法で行なうことができる他、本件タンパク質・ペプチドをコードする遺伝子のプロモーターの下流にルシフェラーゼなどのレポーター遺伝子をつないだ遺伝子を導入した細胞を用いると、被検物質による本件タンパク質・ペプチドをコードする遺伝子の発現抑制又は促進は、前記レポーター遺伝子の活性を指標に検出することが可能となる。
【００４３】
また上記スクリーニング方法により得られる本発明の免疫誘導活性促進物質や発現促進物質は、免疫誘導活性の促進や本件タンパク質・ペプチドの発現の促進を必要としている患者の治療等に用いることができる。また、上記スクリーニング方法により得られる本発明の免疫誘導活性抑制物質や発現抑制物質は、免疫誘導活性の抑制や本件タンパク質・ペプチドの発現の抑制を必要としている患者の治療等に用いることができる。本発明の本件タンパク質・ペプチド又はこれに対する抗体は、子宮頚癌、上皮様癌、Ｔ細胞腫、前骨髄性白血病、食道癌、膵癌、悪性黒色腫、肺癌、口腔癌、乳癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、神経芽細胞腫、大腸癌等に対する抗腫瘍剤の有効成分として用いることができる。例えば、本件タンパク質・ペプチドを経口、静脈、皮内、皮下注射等により投与すると、インビボにおけるＴ細胞誘導活性が増大することによる抗腫瘍効果が期待できる。また上記抗体はミサイル療法に用いることができる。
【００４４】
本発明の細胞傷害性Ｔ細胞（活性化Ｔ細胞）又はその前駆細胞の検出方法としては、ＨＬＡ分子と本件ペプチドを用いる方法であれば特に制限されるものではなく、ＨＬＡクラスＩ分子等のＨＬＡ分子と本件ペプチドの複合体を用いる方法や、ＨＬＡクラスＩ分子等のＨＬＡ分子と本件ペプチドの複合体を細胞表面又は蛍光微粒子等の担体表面に形成させる方法を例示することができ、例えば、文献（Science, 274, 94-96, 1996）に記載されている方法に準じて、ＨＬＡクラスＩ分子と本件ペプチドの複合体を蛍光微粒子表面に形成させ、これに癌患者末梢血由来のＴリンパ球細胞を接触・結合させた後、蛍光微粒子表面に形成されたＨＬＡ−ペプチド複合体に結合したＴ細胞を検出する方法を挙げることができる。また、本発明の細胞傷害性Ｔ細胞（活性化Ｔ細胞）又はその前駆細胞の検出試薬としては、ＨＬＡ分子と本件ペプチドを含む試薬であれば特に制限されるものではなく、ＨＬＡクラスＩ分子等のＨＬＡ分子と本件ペプチドの複合体を含む試薬や、ＨＬＡクラスＩ分子等のＨＬＡ分子と本件ペプチドの複合体と、蛍光微粒子等の担体を含む試薬を例示することができる。
【００４５】
また、本発明の本件タンパク質・ペプチドを用いたインビトロ刺激により活性化Ｔ細胞を誘導することもできる。例えば、末梢血リンパ球や腫瘍浸潤リンパ球にＩＬ−２とともに本件タンパク質・ペプチドで刺激すると腫瘍反応性活性化Ｔ細胞が誘導され、この活性化されたＴ細胞は養子免疫療法に有効に用いることができる。また本件タンパク質・ペプチドを強力な抗原提示細胞である樹状細胞にインビボあるいはインビトロで発現させて、その抗原発現樹状細胞投与により免疫誘導を行うことができる。
【００４６】
さらに本発明の本件タンパク質・ペプチドをコードするＤＮＡ又はＲＮＡのアンチセンス鎖の全部又は一部を癌の診断用プローブとすることができ、また、この癌の診断用プローブや本件タンパク質・ペプチドに特異的に結合する抗体を含有する本発明の診断薬を用いると、子宮頚癌、上皮様癌、Ｔ細胞腫、前骨髄性白血病、食道癌、膵癌、悪性黒色腫、肺癌、口腔癌、乳癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、神経芽細胞腫、大腸癌等の癌を診断することができる。上記診断用プローブとしては、本件タンパク質・ペプチドをコードするＤＮＡ（ｃＤＮＡ）又はＲＮＡ（ｃＲＮＡ）のアンチセンス鎖の全部又は一部であり、プローブとして成立する程度の長さ（少なくとも２０ベース以上）を有するものが好ましい。かかる検出に用いられる検体としては、被験者の細胞、例えば血液、尿、唾液、組織等の生検から得ることができるゲノムＤＮＡや、ＲＮＡ又はｃＤＮＡを具体的に挙げることができるがこれらに限定されるものではなく、かかる検体を使用する場合、ＰＣＲ等により増幅したものを用いてもよい。
【００４７】
【実施例】
以下に、実施例を掲げて本発明を具体的に説明するが、この発明の技術的範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例Ａ［材料と方法］
Ａ−１（培養細胞株と腫瘍サンプル）
培養細胞株としては表３に示されるものを用いた。これらの細胞株は１０％牛胎仔血清と０．３％グルタミンを含むＲＰＭＩ １６４０又はＤＭＥＭ（Dulbecco Modified Eagle Medium）で維持し、３７℃、５％ＣＯ2存在下で培養した。原発腫瘍サンプルは北海道大学歯学部口腔外科、同医学部産婦人科、第二外科、第一内科手術より入手し、即座に液体窒素に冷凍し、使用時まで−８０℃に保存した。
【００４８】
【表３】
0004503801.tif 000004
【００４９】
Ａ−２（Ｄ４０のｃＤＮＡクローニング）
転写制御因子ＧＣＦのコーディング領域のカルボキシル末端２／３を、ｐＧＢＴ−９(Clontech)に組み入れ、得られたプラスミドｐＧＡＬ−ＧＣＦを酵母ツーハイブリッドシステムのスクリーニング用のベイト（bait）として使用した（図１参照）。まず、ｐＧＡＬ−ＧＣＦを酵母Ｙ１５３株（Genes Dev. 7, 555-69, 1993）にトランスフォームし、これを用いて不死化ヒトＢ細胞株のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。ヒスチジン及びＬａｃＺ表現型陽性クローン１個について、ＧＣＦとの結合特異性を検討しその塩基配列を同定した。このクローンを用いて、より長いクローンを得るため、ヒト前骨髄性白血病細胞株ＨＬ６０由来のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。さらに５′／３′ＲＡＣＥキット(Beohringer/Roche) に提示されたプロトコールに基づき、指定のプライマーを使用し、５′ＲＡＣＥ (Rapid Amplification of cＤＮＡ ends)（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 8998-9002, 1988）反応を行った。即ち、ＨＬ６０及びＴリンパ白血病細胞株Jurkat由来の全ＲＮＡとＤ４０特異的リバースプライマーＭＴ１９４  (5′-GAGTCCTCGGTGTGAAGCTTTA-3′；配列番号２２２)を用いて第一鎖のｃＤＮＡ合成に使用した。そのｃＤＮＡの３′末端にデオキシアデノシンを付加し、オリゴｄＴアンカープライマーとＤ４０特異的リバースプライマーＭＴ１９５ (5′-ACAGTGTGACTTGATGTCAGGT-3′；配列番号２２３) をＰＣＲに使用した。
【００５０】
Ａ−３（ＤＮＡシークエンスとホモロジー検索）
プラスミドＤＮＡはQiagenカラム(Qiagen)で精製し、サイクルシークエンス反応の鋳型として用いて、染色（Dye）ターミネーター法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5, 1977）を行い、蛍光ＤＮＡシークエンサー(373 genetic analyzer, ABI)を用いて塩基配列の決定を行い、公表されているデータベースに対してシークエンスの相同性を調べた。
【００５１】
Ａ−４（染色体マッピング）
文献（Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (1989): Molecular Cloning, Cold Spring Harber Press, New York, p7.39）記載の方法に準じて、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（fluorescence in situ hypridization;FISH）を行った。中期スプレッド（Metaphase spreads）は、ＥＢウイルスでトランスフォームしたヒト男性由来のリンパ球をコンカナバリン−Ａで刺激しブロモデオキシウリジン(BrdU) を取り込ませたものより調整した。Ｄ４０ｃＤＮＡ全長にわたる複数のｃＤＮＡクローンを混合したもの（２００ｎｇ)をビオチン標識した。このプローブｃＤＮＡをＲ−バンドで染色した中期染色体標本と３７℃、４８時間反応させた。その後、染色体標本を５０％ホルムアミド／０．５×ＳＳＣと２×ＳＳＣとで順次洗浄した。次に、抗ビオチン抗体（3 μg/ml、Vector）及びＦＩＴＣ抗ヤギ抗体（40 μg/ml, American Qualex）を用いてＦＩＳＨシグナルを増幅させた。さらに、抗ＦＩＴＣ−Ａｌｅｘａ４８８ (40 μg/ml, Molecular Probes)を用いてＦＩＳＨシグナルを増幅した。
【００５２】
Ａ−５（インビトロ転写と翻訳）
pBluescript KS(-)内にＤ４０ｃＤＮＡの全コーディング領域を持つプラスミドｐＢＳ−Ｄ４０とＴ７ＲＮＡポリメラーゼ、ＴＮＴウサギ網状赤血球溶解液 (Promega)とを用い、３５Ｓ−メチオニン存在下で反応を行った。翻訳された産物はＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で解析し、イメージアナライザーＢＡＳ２０００(Fuji Film)を用いて検出した。
【００５３】
Ａ−６（ウエスタンブロット）
細胞溶解液を、ＴＮＥバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．８、１％ＮＰ４０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ ＰＭＳＦ、  １０ｍｇ／ｍｌ Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、１０ｍｇ／ｍｌ Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ）を用いて調整し、８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上にて分析し、ニトロセルロースフィルターに固定した。抗フラッグ（Flag）モノクローナル抗体(M2: Kodak)及びペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスイムノグロブリン(Jackson ImmunoRes.)をそれぞれ第一抗体、第二抗体として使用した。シグナルの検出はＥＣＬシステム(Amersham)によって行った。
【００５４】
Ａ−７（ＲＮＡ分離）
酸性グアニディウム・チオサイアネイト・フェノール・クロロフォルム法（Anal. Biochem. 162, 156-159, 1987）により、細胞株及び腫瘍サンプルから全ＲＮＡを分離・精製した。およそ１×１０7個の細胞、８０ｍｇの腫瘍組織から、２ｍｌのＴｒｉｚｏｌ試薬 (Life Technology)を用いてＲＮＡを精製した。
【００５５】
Ａ−８（ノーザンブロット）
文献(Genomics 32, 483-484, 1996)記載の方法に準じてノーザンブロット解析を行った。ハイブリダイゼーションを、５０％ホルムアミド（formamide）、５×デンハード（Denhardt）溶液、０．５％ＳＤＳを含む溶液内で３７℃下で一晩行った。フィルターメンブレンを、次第により高いストリンジェンシーにて順次洗浄した。最終的には０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４８℃で洗浄し、シグナルをＢＡＳ２０００によって検出した。
【００５６】
Ａ−９（ＲＴ−ＰＣＲ）
１μｇの全ＲＮＡをSuperscript II RNase H- reverse transriptase (Life Technology)を用いてｃＤＮＡに逆転写した。ＰＣＲには０．１μｇのｃＤＮＡ、１０ｐｍｏｌの各特異的オリゴヌクレオチドプライマー(forward: MT1149; 5′-CACATCCAGTGAGACCA-3′；配列番号２２４、 reverse: MT152; 5′-TCCCATCTTCTGATGTG-3′；配列番号２２５、or forward: MT227; 5′-CAGGAATCCAATGCTTGG-3′；配列番号２２６、reverse: MT188; 5′-CTGTTGCAGGTAAGATC-3′；配列番号２２７) と０．５ｕｎｉｔのＴａｑポリメラーゼを用い、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、５０ｍＭ ＫＣｌ含有ｐＨ８．３のバッファー中で反応を行った。ＲＮＡのｉｎｔｅｇｒｉｔｙをチェックするためにβ−アクチンプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。
【００５７】
Ａ−１０（細胞傷害検定）
腫瘍組織におけるＤ４０遺伝子の発現がＲＴ−ＰＣＲ法によって認められた患者の末梢血を、比重１．０８２のファイコールコンレイ溶液に重層し、１５００ｒｐｍ、３０ｍｉｎの遠心操作によって、上から、血漿、リンパ球相、ファイコールコンレイ相、赤血球相に分離した。リンパ球相を回収して、無血清培地であるＡＩＭ−Ｖで一日培養した後、培養フラスコの底に接着した細胞群と浮遊細胞群を軽くフラスコを揺すって分離した。接着細胞群はＰＢＭＣ(peripheral blood mononuclear cells)と呼ばれる細胞群で、この中にはいわゆる抗原提示細胞（ＡＰＣ）と呼ばれるＢ細胞、マクロファージ、樹状細胞が含まれているが、その中でも特に抗原提示能が高い樹状細胞の培養条件である、ＡＩＭ−Ｖ＋ＧＭ−ＣＳＦでＡＰＣを４日間培養した。次いで、このＡＰＣの培養液中に被検ペプチドを１μＭの濃度で添加して２日間培養した後、培養液をＡＩＭ−Ｖ＋ＴＮＦ−α＋ＩＮＦ−αに交換してさらに２日間培養した。この培養後のＡＰＣの増殖能を奪うために放射線処理を行った。
【００５８】
他方、浮遊細胞群には主としてＴ細胞が含まれており、かかる浮遊細胞をＡＩＭ−Ｖ＋ＩＬ−２で４日間培養した。次いで、抗ＣＤ８抗体が固層化された磁気ビーズを用いてＣＤ８陽性Ｔ細胞を選択し、得られたＣＤ８陽性Ｔ細胞を４日間培養した。このＣＤ８陽性Ｔ細胞を上記放射線処理後のＡＰＣに加え２日間培養した。本発明者らによりＭＬＰＣ（Mix lymphocyte peptide culture）と名付けられたこの操作を２〜３回繰り返し、得られたＣＤ８陽性Ｔ細胞を細胞傷害検定に用いた。細胞傷害検定には、エフェクター細胞として上記２回のＭＬＰＣを終えたＣＤ８陽性Ｔ細胞を用い、標的細胞として51Ｃｒを取り込ませたＣ１Ｒ−Ａ２４細胞を用いた。被検ペプチドを１μＭ添加した標的Ｃ１Ｒ−Ａ２４細胞５×１０2とエフェクターＴ細胞２．５×１０3とを６時間共培養し、標的Ｃ１Ｒ−Ａ２４細胞から放出される51Ｃｒの放射活性を測定し、細胞傷害活性（％）を求めた。また、被検ペプチド無添加の場合を対照とした。
【００５９】
実施例Ｂ［結果］
Ｂ−１（Ｄ４０の同定とクローニング）
酵母ツーハイブリッドシステムを用いて、転写因子ＧＣＦに特異的に結合するタンパク質のスクリーニングを行った。上記実施例Ａ−２に記載したように、Ｇａｌ４のＤＮＡ結合ドメインとＧＣＦとの融合タンパク質を発現させるプラスミドｐＧＡＬ−ＧＣＦを酵母Ｙ１５３株に導入し、これを用いてヒトＢ細胞由来のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。検索した１２０万個の酵母クローンのうち、９個のクローンはヒスチジン及びＬａｃＺ表現型陽性であった。その内の１個をＤ４０と名付け、このＤ４０についてＧＣＦとの結合特異性を調べてみたところ、このクローンによってコードされるタンパク質はラミン（lamin）やｐ５３などのタンパク質には結合しないので、Ｄ４０とＧＣＦとの結合は特異的であることがわかった。
【００６０】
このクローンのＤＮＡ塩基配列を決定したところ、ＯＲＦが認められたが、これは３′側に終止コドンをもつが、アミノ末端のメチオニンに相当するコドンの５′側には終止コドンをもたなかった。このＤ４０ｃＤＮＡクローンをプローブとして、より長いクローンを得るために、ヒトの前骨髄性白血病細胞株ＨＬ６０のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。その結果、いくつかのクローンを分離したが、それらは何れも５′側には終止コドンをもたないことが示された。そこで、ＨＬ６０及びＴリンパ白血病細胞株Jurkat由来の全ＲＮＡを用いて、５′ＲＡＣＥ（Rapid amplification of cDNA ends) 法を行った。この方法により５′末端の読み枠に終止コドンをもつクローンを得ることに成功した（ＯＲＦ１）。さらに３′末端領域を含むクローンを得て、その塩基配列を決定したところ、ＯＲＦ１の３′側にもう一つのタンパク質（ＯＲＦ２）をコードする配列が存在することが判明した。Ｄ４０の全ｃＤＮＡ配列を配列番号１として、Ｄ４０（ＯＲＦ１）タンパク質のアミノ酸配列を配列番号２として、Ｄ４０（ＯＲＦ２）タンパク質のアミノ酸配列を配列番号３として、それぞれ示す。
【００６１】
また、Ｄ４０（ＯＲＦ１）ｃＤＮＡの塩基配列の一部及びそれにコードされるＯＲＦ１のアミノ酸配列を図２に示す。図２において、アミノ酸配列は塩基配列の下に一文字で示され、＊印は終止コドンを示し、配列の右と左の数字は塩基配列とアミノ酸配列中の位置を示している。また、ロイシンジッパー（Leucine zipper）様配列（Science 240, 1759-64, 1988）は太字で、種々のヒト組織適合抗原（ＨＬＡ）クラスＩ分子と高い親和性を示すペプチド例（表４参照）はアンダーラインで、それぞれ示されている。図２で示されるＤ４０（ＯＲＦ１）タンパク質や上記Ｄ４０（ＯＲＦ２）タンパク質のアミノ酸配列の中にはＨＬＡクラスＩ分子に結合するペプチドモチーフ（Immunogenet. 41, 178-228, 1995）と非常によく似た配列が認められる。ＨＬＡのクラスＩ分子に結合するアミノ酸配列を予測し、それをスコアで示すプログラム（J. Immunol. 152:163. 1994.  Web site; HLA Peptide Binding Predictions; http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla#bind/）を用いて、図２中のアンダーラインに示されているＤ４０（ＯＲＦ１）内のアミノ酸配列のスコアを算出した。結果を表４に示す。表４には、前記のようにＨＬＡクラスＩ分子と高い親和性を示す幾つかのペプチドが示されており、これらペプチドのアミノ酸配列のスコアは、すでにＨＬＡ−Ａ１分子によって結合することが示され細胞傷害性Ｔリンパ球に認識されることが証明されているＭＡＧＥ３の配列のスコアと同等かあるいはより高いことが示されている。したがって、図２中のアンダーラインに示されているＤ４０（ＯＲＦ１）内のアミノ酸配列は抗原性を有することがわかる。また、Ｄ４０（ＯＲＦ１）タンパク質内の配列番号４〜１１１のいずれかに示されるアミノ酸配列や、Ｄ４０（ＯＲＦ２）タンパク質内の配列番号１１２〜２２１のいずれかに示されるアミノ酸配列も前記スコアが大きく、抗原性を有する可能性がきわめて大きい。
【００６２】
【表４】
0004503801.tif 000005
【００６３】
図２に示されるように、Ｄ４０ｃＤＮＡ内のＯＲＦ１は８８７アミノ酸をコードする。ＯＲＦ１が正しいことを確かめるため、インビトロでのタンパク質の合成系としてよく知られている網状赤血球溶解液（reticulocyte lysate）を用いてインビトロ転写及び翻訳反応を前記実施例Ａ−５記載の方法により行った。Ｄ４０（ＯＲＦ１）タンパク質の全コード領域のｃＤＮＡを、Ｔ７ＲＮＡプロモーターを有するプラスミドに組入れた。このプラスミドを用いて、前記実施例Ａ−５に記載されているように反応を行った。結果を図３に示す。図３中、（＋）と（−）はＤ４０ｃＤＮＡ を含むプラスミドの有無を示し、またゲルの右側の数字は分子量マーカーを示す。かかる翻訳されたタンパク質のゲル解析の結果から、分子量１１０−１３０ＫＤの間に２本のバンドが認められた。
【００６４】
次に、Ｄ４０（ＯＲＦ１）によってコードされるタンパク質についてインビボにおける発現を調べてみた。Ｄ４０（ＯＲＦ１）タンパク質のアミノ末端にタグ (FLAG)としてＧａｌ４のＤＮＡ結合ドメインを付加したＤ４０（ＯＲＦ１）タンパク質を発現するプラスミドを、リポフェクトアミンを用いてＣｏｓ７細胞に導入した。４８時間後にＣｏｓ７細胞抽出液を調製し、前記実施例Ａ−６に記載されているように抗フラッグ抗体を用いてウエスタンブロットを行った。結果を図４に示す。図４中、ＳとＡＳは、Ｄ４０ｃＤＮＡをプラスミドにそれぞれセンスとアンチセンスにクローニングしたことを示し、またゲルの左側の数字は分子量マーカーを示す。図４に示されているように、分子量１２０ＫＤを示すバンドが検出された。
【００６５】
前記実施例Ａ−３に記載されているようにＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪの各データベースに対して相同性検索を行った結果、Ｄ４０（ＯＲＦ１）タンパク質と高い相同性を示すタンパク質は認められなかった。しかし、高いホモロジーを示さないものの、このＤ４０（ＯＲＦ１）タンパク質はいくつかのタンパク質、例えば、シネプトネマル複合タンパク質１（ＳＣＰ１）やパラミオシンなどのタンパク質とわずかながら相同性を有していた。これらα−ヘリックスに富むタンパク質は細胞内外の構造を結合させる繊維状タンパク質であると考えられている（EMBO J 11, 5091-5100, 1992）。したがって、Ｄ４０タンパク質は繊維タンパク質と関連し、精巣の細胞にのみ認められる細胞構造や、あるいは癌細胞で異所性に発現したときに認められる細胞構造の構築に寄与しているタンパク質である可能性を有する。前述したように、ＳＣＰ１は、ヒトの常染色体に存在する点においてもＤ４０との間で類似性を有する。また同様に相同性検索を行った結果、Ｄ４０（ＯＲＦ２）タンパク質と高い相同性を示すタンパク質は認められなかった。
【００６６】
Ｂ−２（Ｄ４０の染色体上局在）
蛍光インサイチューハイブリダイゼーションを用いて、Ｄ４０遺伝子の染色体上局在を決定した。図５に示すように、ヒト第１５染色体のセントロメア領域の近く、すなわち長腕のｑ１４−１５に明らかなシグナルが認められた。調べた４９個の細胞の内、４つ全てのクロマチドにこの領域における蛍光シグナルが認められたのは１個、３つのクロマチドに認められたのは３個、２つのクロマチドに認められたのは３０個、１つのクロマチドのみに認められたのは１５個の細胞であった。他の染色体には再現性ある蛍光シグナルは認められなかった。第１５染色体に特異的な a-satellite ＤＮＡプローブを用いて同時にハイブリダイゼーションを行った実験からも、Ｄ４０遺伝子がこの染色体に局在することが確かめられた。これらの結果は、Ｄ４０遺伝子がヒト染色体１５ｑ１４−１５に局在することを示している。
【００６７】
Ｂ−３（正常ヒト組織におけるＤ４０ｍＲＮＡの発現）
正常ヒト組織におけるＤ４０遺伝子の発現について、まずノーザンブロット法によって調べてみた。ヒト マルチプル ティッシュｍＲＮＡブロット メンブレーン(Clontech)に対してノーザンブロット法を行った結果を図６に示す。図６からもわかるように、Ｄ４０ｍＲＮＡの高い発現が精巣において認められた。また、精巣においては約５Ｋｂのメジャーな転写物と約３．５Ｋｂのマイナーな転写物が検出された。精巣以外では胎盤において、少なくとも精巣と比べて５０倍以下ではあるが、わずかながらＤ４０ｍＲＮＡの発現が認められた。しかし、それ以外の正常ヒト成人の組織においてはＤ４０の発現は全く認められなかった（図６上）。なお、同じメンブレーンからプローブを除き、β−アクチン用プローブでハイブリダイズしたところすべての組織に発現することを確認した（図６下）。
【００６８】
次にノーザンブロット法よりも感度の高いＲＴ−ＰＣＲ法を用いてノーザンブロットの結果を確認した。ヒト マルチプル ティッシュｃＤＮＡ(Clontech)を用いてＲＴ−ＰＣＲ法を行った結果を図７に示す。図７中の矢印は特異的なＰＣＲ産物を示す。このＲＴ−ＰＣＲの結果から、精巣においてＤ４０の高い発現が認められた。また、その他のヒト正常組織においては、胎盤においてわずかな発現が認められた以外には、Ｄ４０の発現は認められなかった。これらの結果により、正常のヒト組織においては、Ｄ４０ｍＲＮＡは精巣において選択的に発現していることが示された。
【００６９】
Ｂ−４（癌細胞株と原発癌におけるＤ４０の発現）
癌細胞におけるＤ４０の発現について調べてみた。まず、ＲＴ−ＰＣＲ法によって種々の癌細胞株におけるＤ４０の発現を調べてみた。結果を表３に示す。表３からわかるように、悪性黒色腫、肺癌、消化器系由来の癌を含めて調べた全ての癌細胞株においてＤ４０の発現が認められた。しかし正常胎児肺線維芽細胞株では発現が認められなかった。次に、ヒトの原発癌におけるＤ４０の発現の頻度を調べてみた。結果を表５に示す。表５からわかるように、Ｄ４０のｍＲＮＡは口腔癌、子宮癌、肺癌などの原発癌サンプルの大部分においてその発現が認められた。それらの中で、口腔癌は、調べてみた症例の約６３％においてＤ４０を発現していた。これは、調べた原発癌の中では最も高い頻度であった。子宮癌（４４％）、肺癌（４０％）、卵巣癌（３６％）、膵癌（２７％）、神経芽細胞腫（２０％）、大腸癌（１３％）にも見られたが、胆管癌、胃癌、セミノーマには見られなかった。Ｄ４０の発現はいくつかの癌細胞株と正常の精巣に認められ、この発現パターンからＤ４０は癌・精巣に選択的に発現する遺伝子群の一つであることがわかる（Immunol. Today 18, 267-8, 1997、The Cancer J. from Scientific American, 16-7, 1999）。
【００７０】
【表５】
0004503801.tif 000006
【００７１】
Ｂ−５（免疫誘導活性）
被検ペプチドとして、配列番号３６に示されるアミノ酸配列からなるペプチド（ＳＹＴＩＥＩＮＨＲＬ）を用い、該ペプチドの免疫誘導活性を前記Ａ−１０に記載されている細胞傷害検定により調べた。癌患者末梢血由来のＴ細胞による細胞傷害活性の結果を図８に示す。図８からも明らかなように、癌患者末梢血由来のＴ細胞（エフェクター細胞）は、ペプチド（ＳＹＴＩＥＩＮＨＲＬ）１μＭを添加した標的Ｃ１Ｒ−Ａ２４細胞を特異的に傷害し、ペプチド（ＳＹＴＩＥＩＮＨＲＬ）を添加してない対照の標的Ｃ１Ｒ−Ａ２４細胞を傷害しなかった。これらのことから、ペプチド（ＳＹＴＩＥＩＮＨＲＬ）が免疫誘導活性を有することがわかる。
【００７２】
【発明の効果】
精巣にはＨＬＡクラスＩ分子の発現が無いために、Ｄ４０が発現していてもＤ４０由来のペプチドとＨＬＡクラスＩ分子が複合体を形成することがなく、細胞傷害性Ｔリンパ球により認識されない。精巣以外の正常細胞では、ＨＬＡクラスＩ分子の発現があるが、Ｄ４０の発現が無いために、同様に細胞傷害性Ｔリンパ球により認識されない。しかし、癌細胞では、Ｄ４０とＨＬＡクラスＩ分子の両方の発現があるため、これらの複合体が細胞傷害性Ｔリンパ球により認識され、癌細胞は傷害される。本発明によると、Ｄ４０をはじめとして、癌の診断と免疫療法に応用することができる癌・精巣抗原、すなわち精巣以外の正常組織には発現せず、かつ広範囲の種々の癌に発現し、宿主に免疫反応を惹起する癌・精巣抗原や、それをコードする癌・精巣遺伝子等を提供することができる。
【００７３】
【配列表】
0004503801.tif 000007
0004503801.tif 000008
0004503801.tif 000009
0004503801.tif 000010
0004503801.tif 000011
0004503801.tif 000012
0004503801.tif 000013
0004503801.tif 000014
0004503801.tif 000015
0004503801.tif 000016
0004503801.tif 000017
0004503801.tif 000018
0004503801.tif 000019
0004503801.tif 000020
0004503801.tif 000021
0004503801.tif 000022
0004503801.tif 000023
0004503801.tif 000024
0004503801.tif 000025
0004503801.tif 000026
0004503801.tif 000027
0004503801.tif 000028
0004503801.tif 000029
0004503801.tif 000030
0004503801.tif 000031
0004503801.tif 000032
0004503801.tif 000033
0004503801.tif 000034
0004503801.tif 000035
0004503801.tif 000036
0004503801.tif 000037
0004503801.tif 000038
0004503801.tif 000039
0004503801.tif 000040
0004503801.tif 000041
0004503801.tif 000042
0004503801.tif 000043
0004503801.tif 000044
0004503801.tif 000045
0004503801.tif 000046
0004503801.tif 000047
0004503801.tif 000048
0004503801.tif 000049
0004503801.tif 000050
0004503801.tif 000051
0004503801.tif 000052
0004503801.tif 000053
0004503801.tif 000054
0004503801.tif 000055
0004503801.tif 000056
0004503801.tif 000057
0004503801.tif 000058
0004503801.tif 000059
0004503801.tif 000060
0004503801.tif 000061
0004503801.tif 000062
0004503801.tif 000063
0004503801.tif 000064
0004503801.tif 000065
0004503801.tif 000066
0004503801.tif 000067
0004503801.tif 000068
0004503801.tif 000069
0004503801.tif 000070
0004503801.tif 000071
0004503801.tif 000072
0004503801.tif 000073
0004503801.tif 000074
0004503801.tif 000075
0004503801.tif 000076
0004503801.tif 000077
0004503801.tif 000078
0004503801.tif 000079
0004503801.tif 000080
0004503801.tif 000081
0004503801.tif 000082
0004503801.tif 000083
0004503801.tif 000084
0004503801.tif 000085
0004503801.tif 000086
0004503801.tif 000087
0004503801.tif 000088
0004503801.tif 000089
0004503801.tif 000090
0004503801.tif 000091
0004503801.tif 000092
0004503801.tif 000093
0004503801.tif 000094
0004503801.tif 000095
0004503801.tif 000096
0004503801.tif 000097
0004503801.tif 000098
0004503801.tif 000099
0004503801.tif 000100
【図面の簡単な説明】
【図１】正常ヒト組織における本発明のＤ４０の発現部位を示す図である。
【図２】Ｄ４０ｃＤＮＡ の塩基配列の一部及び及びそれにコードされるＯＲＦによりコードされるアミノ酸配列を示す図である。
【図３】Ｄ４０ｃＤＮＡの網状赤血球溶解液を用いたインビトロ転写及び翻訳反応のＳＤＳ−ＰＡＧＥ上での解析結果を示す図である。
【図４】Ｄ４０ｃＤＮＡのＣｏｓ７細胞を用いたインビボ転写及び翻訳反応のウエスタンブロットの結果を示す図である。
【図５】蛍光インサイチューハイブリダイゼーションを用いた本発明のＤ４０遺伝子の染色体上局在を示す図である。
【図６】ノーザンブロット法による正常ヒト組織におけるＤ４０ｍＲＮＡの発現結果を示す図である。
【図７】ＲＴ−ＰＣＲ法による正常ヒト組織におけるＤ４０ｍＲＮＡの発現結果を示す図である。
【図８】癌患者末梢血由来のＴ細胞による細胞傷害活性の結果を示す図である。
【図１】
0004503801.tif 000101
【図２】
0004503801.tif 000102
【図３】
0004503801.tif 000103
【図４】
0004503801.tif 000104
【図５】
0004503801.tif 000105
【図６】
0004503801.tif 000106
【図７】
0004503801.tif 000107
【図８】
0004503801.tif 000108