(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２２、配列番号２７及び配列番号６３から成る群より選択されるヌクレオチド配列からなる又はそれに相補的な単離ヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号２３、配列番号２８及び配列番号６４から成る群より選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする単離ヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の前記ヌクレオチドによってコードされる精製ポリペプチド。
【請求項４】
配列番号２３、配列番号２８及び配列番号６４から成る群より選択されるアミノ酸配列からなる精製ポリペプチド。
【請求項５】
配列番号２８のアミノ酸配列のＣ末端に１−６個の付加アミノ酸を有するアミノ酸配列からなる精製ポリペプチド。
【請求項６】
配列番号２３のアミノ酸配列の１６４位、１７９位、１８７位、２３４位及び２４４位に位置する５個のＣ末端システインアミノ酸のうち少なくとも１個がアラニンで置換されているアミノ酸配列からなる精製ポリペプチド。
【請求項７】
請求項４、５又は６に記載の前記精製ポリペプチドに対するポリクローナル又はモノクローナル抗体。
【請求項８】
配列番号２３、配列番号２８及び配列番号６４から成る群より選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含有する組成物。
【請求項９】
トキソプラスマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）のＰ３５をさらに含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物が診断試薬である、請求項８又は９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ポリペプチドが組換え又は合成方法によって生産される、請求項８に記載の組成物。
【請求項１２】
ａ）トキソプラスマに対するＩｇＭ抗体を含むことが疑われる被験試料を、配列番号２３、配列番号２８及び配列番号６４から成る群より選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含有する組成物と接触させること；及びｂ）ポリペプチド／ＩｇＭ抗体複合体の存在を検出すること、の工程を含み、前記複合体の存在が前記被験試料中の前記ＩｇＭ抗体の存在を指示する、被験試料においてトキソプラスマに対するＩｇＭ抗体の存在を検出するための方法。
【請求項１３】
ａ）トキソプラスマに対するＩｇＭ抗体を含むことが疑われる被験試料を、配列番号２３、配列番号２８及び配列番号６４から成る群より選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含有する組成物と、ＩｇＭ抗体／抗原複合体の形成のために十分な時間及び条件下で接触させること；ｂ）生じたＩｇＭ抗体／抗原複合体に、検出可能なシグナルを生成することができるシグナル生成化合物に結合した抗体を含むコンジュゲートを、前記コンジュゲートが結合抗体に結合するのに十分な時間及び条件下で添加すること；及びｃ）前記シグナル生成化合物によって生じるシグナルの存在を検出することにより、前記被験試料中に存在する可能性のあるＩｇＭ抗体の存在を検出すること、の工程を含む、被験試料においてトキソプラスマに対するＩｇＭ抗体の存在を検出するための方法。
【請求項１４】
ａ）トキソプラスマに対するＩｇＧ抗体を含むことが疑われる被験試料を、１）配列番号２３、配列番号２８及び配列番号６４から成る群より選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチド及び２）Ｐ３５を含有する組成物と接触させること；及びｂ）抗原／ＩｇＧ抗体複合体の存在を検出すること、の工程を含み、前記複合体の存在が前記被験試料中の前記ＩｇＧ抗体の存在を指示する、被験試料においてトキソプラスマに対するＩｇＧ抗体の存在を検出するための方法。
【請求項１５】
ａ）トキソプラスマに対するＩｇＧ抗体を含むことが疑われる被験試料を、１）配列番号２３、配列番号２８及び配列番号６４から成る群より選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチド及び２）Ｐ３５を含有する組成物と、ＩｇＧ抗体／抗原複合体の形成のために十分な時間及び条件下で接触させること；ｂ）生じたＩｇＧ抗体／抗原複合体に、検出可能なシグナルを生成することができるシグナル生成化合物に結合した抗体を含むコンジュゲートを、前記コンジュゲートが結合抗体に結合するのに十分な時間及び条件下で添加すること；及びｃ）前記シグナル生成化合物によって生じるシグナルの存在を検出することにより、前記被験試料中に存在する可能性のあるＩｇＧ抗体を検出すること、の工程を含む、被験試料においてトキソプラスマに対するＩｇＧ抗体の存在を検出するための方法。
【請求項１６】
ａ）トキソプラスマに対するＩｇＭ抗体を含むことが疑われる被験試料を、前記ＩｇＭ抗体に特異的な抗抗体と、抗抗体／ＩｇＭ抗体複合体の形成のために十分な時間及び条件下で接触させること；ｂ）生じた抗抗体／ＩｇＭ抗体複合体に、検出可能なシグナルを生成することができるシグナル生成化合物に結合した、配列番号２３、配列番号２８及び配列番号６４から成る群より選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むコンジュゲートを、前記コンジュゲートが結合抗体に結合するのに十分な時間及び条件下で添加すること；及びｃ）前記シグナル生成化合物によって生じるシグナルの存在を検出することにより、前記被験試料中に存在する可能性のあるＩｇＭ抗体を検出すること、の工程を含む、被験試料においてトキソプラスマに対するＩｇＭ抗体の存在を検出するための方法。
【請求項１７】
ａ）トキソプラスマに対するＩｇＧ抗体を含むことが疑われる被験試料を、前記ＩｇＧ抗体に特異的な抗抗体と、抗抗体／ＩｇＧ抗体複合体の形成のために十分な時間及び条件下で接触させること；ｂ）生じた抗抗体／ＩｇＧ抗体複合体に、各々が検出可能なシグナルを生成することができるシグナル生成化合物に結合した、１）配列番号２３、配列番号２８及び配列番号６４から成る群より選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチド及び２）Ｐ３５を含むコンジュゲートを、前記コンジュゲートが結合抗体に結合するのに十分な時間及び条件下で添加すること；及びｃ）前記シグナル生成化合物の各々によって生じるシグナルの存在を検出することにより、前記被験試料中に存在する可能性のあるＩｇＧ抗体を検出すること、の工程を含む、被験試料においてトキソプラスマに対するＩｇＧ抗体の存在を検出するための方法。
【請求項１８】
ａ）配列番号２３、配列番号２８及び配列番号６４から成る群より選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含有する組成物；及び
ｂ）検出可能なシグナルを生成することができるシグナル生成化合物に結合した抗体を含むコンジュゲート
を含む、被験試料においてトキソプラスマに対するＩｇＭ抗体の存在を判定するためのキット。
【請求項１９】
ａ）１）配列番号２３、配列番号２８及び配列番号６４から成る群より選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチド及び２）Ｐ３５を含有する組成物；及び
ｂ）検出可能なシグナルを生成することができるシグナル生成化合物に結合した抗体を含むコンジュゲート
を含む、被験試料においてトキソプラスマに対するＩｇＧ抗体の存在を判定するためのキット。
【請求項２０】
ａ）ＩｇＭ抗体に特異的な抗抗体；及び
ｂ）配列番号２３、配列番号２８及び配列番号６４から成る群より選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含有する組成物
を含む、被験試料においてトキソプラスマに対するＩｇＭ抗体の存在を判定するためのキット。
【請求項２１】
ａ）ＩｇＭ抗体に特異的な抗抗体；
ｂ）２）検出可能なシグナルを生成することができるシグナル生成化合物、に結合した、１）配列番号２３、配列番号２８及び配列番号６４から成る群より選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む組成物を含有するコンジュゲート
を含む、被験試料においてトキソプラスマに対するＩｇＭ抗体の存在を判定するためのキット。
【請求項２２】
ａ）ＩｇＧ抗体に特異的な抗抗体；及び
ｂ）１）配列番号２３、配列番号２８及び配列番号６４から成る群より選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチド及び２）Ｐ３５を含有する組成物
を含む、被験試料においてトキソプラスマに対するＩｇＧ抗体の存在を判定するためのキット。
【請求項２３】
ａ）ＩｇＧ抗体に特異的な抗抗体；
ｂ）各々が、検出可能なシグナルを生成することができるシグナル生成化合物に結合した、１）配列番号２３、配列番号２８及び配列番号６４から成る群より選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、及び２）Ｐ３５、を含むコンジュゲート
を含む、被験試料においてトキソプラスマに対するＩｇＧ抗体の存在を判定するためのキット。
【請求項２４】
（ａ）トキソプラスマに対するＩｇＭ抗体を含むことが疑われる被験試料を、前記ＩｇＭ抗体に特異的な抗抗体と、抗抗体／ＩｇＭ複合体の形成のために十分な時間及び条件下で接触させること；（ｂ）生じた抗抗体／ＩｇＭ複合体に、配列番号２３、配列番号２８及び配列番号６４から成る群より選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む抗原を、前記抗原が結合ＩｇＭ抗体に結合するのに十分な時間及び条件下で添加すること；及び（ｃ）生じた抗抗体／ＩｇＭ／抗原複合体に、検出可能なシグナルを生成することができるシグナル生成化合物に結合したモノクローナル又はポリクローナル抗体を含有する組成物を含むコンジュゲートを添加すること；及び（ｄ）前記シグナル生成化合物によって生じるシグナルを検出することにより、前記被験試料中に存在する可能性のあるＩｇＭ抗体を検出すること、の工程を含む、被験試料においてトキソプラスマに対するＩｇＭ抗体の存在を検出するための方法。
【請求項２５】
（ａ）トキソプラスマに対するＩｇＧ抗体を含むことが疑われる被験試料を、前記ＩｇＧ抗体に特異的な抗抗体と、抗抗体／ＩｇＧ複合体の形成のために十分な時間及び条件下で接触させること；（ｂ）生じた抗抗体／ＩｇＧ複合体に、１）配列番号２３、配列番号２８及び配列番号６４から成る群より選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと２）Ｐ３５の混合物を含む抗原を、前記抗原が結合ＩｇＧ抗体に結合するのに十分な時間及び条件下で添加すること；（ｃ）生じた抗抗体／ＩｇＧ／抗原複合体に、検出可能なシグナルを生成することができるシグナル生成化合物に結合したモノクローナル又はポリクローナル抗体を含有する組成物を含むコンジュゲートを添加すること；及び（ｄ）前記シグナル生成化合物によって生じるシグナルを検出することにより、前記被験試料中に存在する可能性のあるＩｇＧ抗体を検出すること、の工程を含む、被験試料においてトキソプラスマに対するＩｇＧ抗体の存在を検出するための方法。
【請求項２６】
ａ）トキソプラスマに対するＩｇＭ及びＩｇＧ抗体を含むことが疑われる被験試料を、１）配列番号２３、配列番号２８及び配列番号６４から成る群より選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチド及び２）Ｐ３５を含有する組成物と、ＩｇＭ抗体／抗原複合体及びＩｇＧ抗体／抗原複合体の形成のために十分な時間及び条件下で接触させること；ｂ）生じたＩｇＭ抗体／抗原複合体及びＩｇＧ抗体／抗原複合体に、検出可能なシグナルを生成することができるシグナル生成化合物に結合した抗体を含むコンジュゲートを、前記コンジュゲートが結合ＩｇＭ及びＩｇＧ抗体に結合するのに十分な時間及び条件下で添加すること；及びｃ）前記シグナル生成化合物によって生じるシグナルを検出することにより、前記被験試料中に存在する可能性のあるＩｇＭ及びＩｇＧ抗体の存在を検出すること、の工程を含む、被験試料においてトキソプラスマに対するＩｇＭ及びＩｇＧ抗体の存在を検出するための方法。
【請求項２７】
ａ）トキソプラスマに対するＩｇＭ及びＩｇＧ抗体を含むことが疑われる被験試料を、前記ＩｇＭ抗体及び前記ＩｇＧ抗体に特異的な抗抗体と、抗抗体／ＩｇＭ抗体複合体及び抗抗体／ＩｇＧ抗体複合体の形成のために十分な時間及び条件下で接触させること；ｂ）生じた抗抗体／ＩｇＭ抗体複合体及び生じた抗抗体／ＩｇＧ抗体複合体に、各々が、検出可能なシグナルを生成することができるシグナル生成化合物に結合した、１）配列番号２３、配列番号２８及び配列番号６４から成る群より選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、及び２）Ｐ３５、を含有する組成物を含むコンジュゲートを、前記コンジュゲートが結合抗体に結合するのに十分な時間及び条件下で添加すること；及びｃ）前記シグナル生成化合物によって生じるシグナルを検出することにより、前記被験試料中に存在する可能性のあるＩｇＭ及びＩｇＧ抗体を検出すること、の工程を含む、被験試料においてトキソプラスマに対するＩｇＭ及びＩｇＧ抗体の存在を検出するための方法。
【請求項２８】
（ａ）トキソプラスマに対するＩｇＭ及びＩｇＧ抗体を含むことが疑われる被験試料を、前記ＩｇＭ抗体に特異的な抗抗体及び前記ＩｇＧ抗体に特異的な抗抗体と、抗抗体／ＩｇＭ複合体及び抗抗体／ＩｇＧ複合体の形成のために十分な時間及び条件下で接触させること；（ｂ）生じた抗抗体／ＩｇＭ複合体及び生じた抗抗体／ＩｇＧ複合体に、１）配列番号２３、配列番号２８及び配列番号６４から成る群より選択されるアミノ酸からなる選択ポリペプチド及び２）Ｐ３５を含む抗原を、前記抗原が結合ＩｇＭ抗体に結合するのに十分な時間及び条件下で添加すること；及び（ｃ）生じた抗抗体／ＩｇＭ／抗原複合体及び抗抗体／ＩｇＧ／抗原複合体に、検出可能なシグナルを生成することができるシグナル生成化合物に結合したモノクローナル又はポリクローナル抗体を含有する組成物を含むコンジュゲートを添加すること；及び（ｄ）前記シグナル生成化合物によって生じるシグナルを検出することにより、前記被験試料中に存在する可能性のあるＩｇＭ及びＩｇＧ抗体を検出すること、の工程を含む、被験試料においてトキソプラスマに対するＩｇＭ及びＩｇＧ抗体の存在を検出するための方法。
【請求項２９】
ａ）非ヒト哺乳類に、配列番号２３、配列番号２８及び配列番号６４から成る群より選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを注入すること；
ｂ）前記非ヒト哺乳類の脾細胞を骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマを生成すること；及び
ｃ）前記ハイブリドーマがモノクローナル抗体を産生するために十分な時間及び条件下で、前記ハイブリドーマを培養すること
の工程を含む、モノクローナル抗体を生産する方法。
【請求項３０】
プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ３Ｃ（５２−３００ａａ）。
【請求項３１】
配列番号２０のヌクレオチド配列からなる又は前記配列に相補的な単離ヌクレオチド。
【請求項３２】
配列番号２１のアミノ酸配列からなる精製ポリペプチド。
【請求項３３】
プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ４Ｃ（５２−２９４ａａ）。
【請求項３４】
配列番号２５のヌクレオチド配列からなる又は前記配列に相補的な単離ヌクレオチド。
【請求項３５】
配列番号２６のアミノ酸配列からなる精製ポリペプチド。
【請求項３６】
プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０  ＭＩＸ１。
【請求項３７】
配列番号６１のヌクレオチド配列からなる又は前記配列に相補的な単離ヌクレオチド。
【請求項３８】
配列番号６２のアミノ酸配列からなる精製ポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トキソプラスマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）に対するＩｇＭ及び／又はＩｇＧ抗体の検出において使用しうる遺伝子操作したＰ３０抗原ならびに抗原の組合せ又は混合物に関する。さらに、本発明はまた、この遺伝子操作したＰ３０抗原及び抗原の組み合わせを使用する方法、この遺伝子操作したＰ３０抗原及び抗原の組合せに対して惹起される抗体、ならびに遺伝子操作したＰ３０抗原及び組合せ中に存在する抗原を含むキット及びワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
トキソプラスマは、球虫類亜綱（Ｃｏｃｃｉｄｉａ）に分類される偏性細胞内寄生生物である。この寄生生物は、哺乳類及び鳥類の両方に感染する比較的広い宿主範囲を有する。この生物は自然界に遍在し、３つの形態：タキゾイト、シスト及び接合子嚢（オーシスト）として存在する（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．，ＭｃＬｅｏｄ，Ｒ．，Ｄｅｓｍｏｎｄｓ，Ｇ．，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｅｔｕｓ  ａｎｄ  Ｎｅｗｂｏｒｎ  Ｉｎｆａｎｔ（Ｊ．Ｒ．ＲｅｍｉｎｇｔｏｎとＪ．Ｏ．Ｋｌｅｉｎ編集）、ｐ．１４０−２６７，Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（１９９５））。急性感染期に認められるタキゾイトは、すべての有核哺乳類細胞を侵襲することができる侵襲性形態である。感染の急性段階後、ブラディゾイトと呼ばれる組織シストが宿主細胞内で形成され、宿主の生存中、宿主生物の体内に残存する。生の又は調理していない肉はブラディゾイトの摂取を生じさせることがあり、それが個体に感染して急性感染をもたらしうるので、シストは、特にヒトにおいて、感染の伝播に重要である。接合子嚢は有性生殖の一段階であり、それらが糞便中に排泄されるネコ科の腸内層においてのみ発生する。
【０００３】
健常成人が汚染された肉又は猫の糞便を通して獲得するトキソプラスマ感染はしばしば無症候性である。妊娠女性及び免疫抑制患者では、臨床結果が非常に深刻な場合がある。妊娠中、特に第一トリメスターの間に獲得されたトキソプラスマによる急性感染は、胎内の胎児への子宮内伝播を生じることがあり、精神遅滞及び胎児死亡を含む重篤な胎児及び新生児合併症をもたらす。免疫抑制個体における過去のトキソプラスマ感染又は急性感染の再燃は病原性でありうる。トキソプラスマ性脳炎はＡＩＤＳ患者における罹病及び死亡の主要原因である。トキソプラスマ感染はまた、小児及び成人における脈絡網膜炎の重要な原因であることが示されている。
【０００４】
トキソプラスマによる感染の診断は、血液又は体液からのトキソプラスマの単離、胎盤又は胎児の組織におけるこの生物の存在の証明、特異的核酸配列（例えばＤＮＡプローブ）の検出による抗原の存在の証明、又は血清試験を用いて感染に応答して宿主によって合成されるトキソプラスマ特異的免疫グロブリンの検出によって確立されうる。
【０００５】
トキソプラスマ特異的抗体の検出及び抗体力価の測定は、トキソプラスマ症の診断において使用される重要なツールである。トキソプラスマ症の診断のために最も広く使用される血清試験は、セービン−フェルドマン色素試験（Ｓａｂｉｎ，Ａ．Ｂ．とＦｅｌｄｍａｎ，Ｈ．Ａ．（１９４８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  １０８，６６０−６６３）、間接赤血球凝集素（ＩＨＡ）試験（Ｊａｃｏｂｓ，Ｌ．とＬｕｎｄｅ，Ｍ．（１９５７）Ｊ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．４３，３０８−３１４）、ＩＦＡ（間接蛍光抗体）試験（Ｗａｌｔｏｎ，Ｂ．Ｃ．ら（１９６６）Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．１５，１４９−１５２）、凝集試験（Ｆｏｎｄａｔｉｏｎ  Ｍｅｒｉｅｕｘ，Ｓｅｒｏｌｏｇｉｅ  ｄｅ  ｌ’Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  Ｔｏｘｏｐｌａｓｍｉｑｕｅ  ｅｎ  Ｐａｒｔｉｃｕｌｉｅｒ  ａ  Ｓｏｎ  Ｄｅｂｕｔ：Ｍｅｔｈｏｄｅｓ  ｅｔ  Ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ  ｄｅｓ  Ｒｅｓｕｌｔａｎｔｓ，Ｌｙｏｎ，ｐ．１８２（１９７５））及びＥＬＩＳＡ（Ｎａｏｔ，Ｙ．とＲｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．（１９８０）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１４２，７５７−７６６）である。ＥＬＩＳＡ試験は最も実施が容易な試験の１つであり、トキソプラスマ特異的ＩｇＭ及びＩｇＧの検出のための多くの自動化血清試験が市販されている。
【０００６】
感染個体におけるＩｇＭ及びＩｇＧ抗体の検出のための現在の試験は、血清抗体を検出する能力が大きく異なりうる。それ故、市販のキット間で有意のアッセイ間変動が見られる。種々の市販キットの間で認められる相違は、主として血清試験のために使用される抗原の調製を原因とする。大部分のキットは、高い比率の寄生生物外物質、例えば哺乳類細胞、組織培養成分等を含む、組織培養又はマウスにおいて増殖させた全タキゾイト又は音波破砕タキゾイトのいずれかを使用する。精製された標準化抗原又はタキゾイト抗原の調製のための標準方法が存在しないため、アッセイ間の変動性が存在し、アッセイの感受性及び特異性に関して異なる性能特性を有する種々のアッセイを生じていることは驚くに当らない。
【０００７】
前述したように、タキゾイト抗原を用いる血清試験の限界、ならびに感染の発症の判定に関して残存する問題を考慮すると、分子生物学によって得られる精製組換え抗原は、それらが精製され、標準化されうるという点で魅力的な代替選択肢である。文献において、多くのトキソプラスマ（Ｔｏｘｏ）遺伝子がクローン化されており、免疫反応性組換えトキソプラスマ抗原を生産するために適切な宿主において発現されてきた。例えばＴｏｘｏ  Ｐ２２（ＳＡＧ２）、Ｐ２４（ＧＲＡ１）、Ｐ２５、Ｐ２８（ＧＲＡ２）、Ｐ２９（ＧＲＡ７）、Ｐ３０（ＳＡＧ１）、Ｐ３５、Ｐ４１（ＧＲＡ４）、Ｐ５４（ＲＯＰ２）、Ｐ６６（ＲＯＰ１）、及びＴｏｘｏ  Ｐ６８抗原が記述されている（Ｐｒｉｎｃｅら（１９９０）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ  ４３，９７−１０６；Ｃｅｓｂｒｏｎ−Ｄｅｌａｕｗら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６，７５３７−７５４１；Ｊｏｈｎｓｏｎら（１９９１）Ｇｅｎｅ  ９９，１２７−１３２；Ｐｒｉｎｃｅら（１９８９）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．３４，３−１３；Ｂｏｎｈｏｍｍｅら（１９９８）Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．４６，１４１１−１４２１；Ｂｕｒｇら（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１，３５８４−３５９１；Ｋｎａｐｐら（１９８９）欧州特許出願第４３１５４１Ａ２号；Ｍｅｖｅｌｅｃら（１９９２）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．５６，２２７−２３８；Ｓａａｖｅｄｒａら（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７，１９７５−１９８２；欧州特許出願第７５１  １４７号）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
おそらく、トキソプラスマ特異的免疫グロブリンの検出のための初期スクリーニング免疫測定法において単一トキソプラスマ抗原ではタキゾイトを置換できない。これにはいくつかの理由があると考えられる。第一に、感染の間に産生される抗体は感染の時期によって異なる、すなわち感染個体によって産生される抗体は、種々のエピトープと反応して経時的に変化する。第二に、組換え抗原中に存在するエピトープは、発現のために使用する宿主及び用いる精製方式に依存して、タキゾイトから調製される天然抗原とは異なるか又は反応性がより低いと考えられる。第三に、感染に応答して産生される種々のクラスの免疫グロブリン、例えばＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥを検出するためには種々の組換え抗原が必要であると考えられる。
【０００９】
アッセイの特異性及び感受性に関するタキゾイト抗原の限界を克服するため、トキソプラスマ特異的免疫グロブリンの検出のための新しいアッセイを設計するために組み合わせて使用できるトキソプラスマ抗原に関する検索を実施した。Ｍａｉｎｅら（米国特許第６，３２９，１５７  Ｂ１号）は、トキソプラスマ特異的ＩｇＧ及びＩｇＭの検出のための組換えトキソプラスマ抗原カクテルを開示している。前記トキソプラスマ抗原カクテルは、遺伝子操作された修飾を有する可溶性タンパク質として大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）においてＴｏｘｏ  Ｐ３０を発現することにより、改善され、増強されうると判断された。この遺伝子操作したＰ３０抗原及び改善された抗原カクテルを以下でさらに詳細に説明する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、遺伝子操作したトキソプラスマＰ３０抗原ならびにトキソプラスマの遺伝子操作したＰ３０抗原及びＰ３５抗原の両方を含有する組成物を包含する。この遺伝子操作抗原及び組成物は診断試薬として使用でき、遺伝子操作抗原及びこの組成物中の抗原は、組換え又は合成のいずれかによって生産しうる。
【００１１】
特に、本発明は、配列番号２２、配列番号２７及び配列番号６３から成る群より選択されるヌクレオチド配列に少なくとも７０％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む又はそれに相補的な単離ヌクレオチド配列又はそのフラグメントを包含する。本発明はまた、配列番号２３、配列番号２８及び配列番号６４から成る群より選択されるアミノ酸配列に少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする単離ヌクレオチド配列又はそのフラグメントを包含する。本発明はまた、前述したヌクレオチド配列のいずれかによってコードされる精製ポリペプチドを包含する。
【００１２】
さらに、本発明は、配列番号２３、配列番号２８及び配列番号６４から成る群より選択されるアミノ酸配列に少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有する精製ポリペプチド又はそのフラグメントを包含する。また、本発明は、配列番号２８のＣ末端に１−６個の付加アミノ酸を有するアミノ酸配列を含む精製ポリペプチド又はそのフラグメントを包含する。本発明はまた、５個のＣ末端アミノ酸のいずれか１個又はそれ以上がシステインからアラニンに変化している、配列番号２３におけるようなアミノ酸配列を含む精製ポリペプチド又はそのフラグメントを包含する。さらに、本発明はまた、これらの精製ポリペプチドに対するポリクローナル又はモノクローナル抗体を包含する。
【００１３】
本発明はまた、配列番号２３、配列番号２８及び配列番号６４から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含有する組成物を包含する。この組成物は診断試薬として使用でき、この組成物のポリペプチドは組換え又は合成手段によって生産しうる。
【００１４】
さらに、本発明は、ａ）トキソプラスマに対するＩｇＭ抗体を含むことが疑われる被験試料を、配列番号２３、配列番号２８及び配列番号６４から成る群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含有する組成物と接触させること；及びｂ）ポリペプチド／ＩｇＭ抗体複合体の存在を検出すること、の工程を含み、前記複合体の存在が前記被験試料中の前記ＩｇＭ抗体の存在を指示する、被験試料においてトキソプラスマに対するＩｇＭ抗体の存在を検出するための方法を包含する。
【００１５】
さらに、本発明はまた、ａ）トキソプラスマに対するＩｇＭ抗体を含むことが疑われる被験試料を、配列番号２３、配列番号２８及び配列番号６４から成る群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含有する組成物と、ＩｇＭ抗体／抗原複合体の形成のために十分な時間及び条件下で接触させること；ｂ）生じたＩｇＭ抗体／抗原複合体に、検出可能なシグナルを生成することができるシグナル生成化合物に結合した抗体を含むコンジュゲートを、前記コンジュゲートが結合抗体に結合するのに十分な時間及び条件下で添加すること；及びｃ）前記シグナル生成化合物によって生じるシグナルの存在を検出することにより、前記被験試料中に存在する可能性のあるＩｇＭ抗体の存在を検出すること、の工程を含む、被験試料においてトキソプラスマに対するＩｇＭ抗体の存在を検出するための方法を包含する。
【００１６】
さらに、本発明は、ａ）トキソプラスマに対するＩｇＧ抗体を含むことが疑われる被験試料を、１）配列番号２３、配列番号２８及び配列番号６４から成る群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド及び２）Ｐ３５を含有する組成物と接触させること；及びｂ）抗原／ＩｇＧ抗体複合体の存在を検出すること、の工程を含み、前記複合体の存在が前記被験試料中の前記ＩｇＧ抗体の存在を指示する、被験試料においてトキソプラスマに対するＩｇＧ抗体の存在を検出するための方法を包含する。
【００１７】
本発明はまた、ａ）トキソプラスマに対するＩｇＧ抗体を含むことが疑われる被験試料を、１）配列番号２３、配列番号２８及び配列番号６４から成る群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド及び２）Ｐ３５を含有する組成物と、ＩｇＧ抗体／抗原複合体の形成のために十分な時間及び条件下で接触させること；ｂ）生じたＩｇＧ抗体／抗原複合体に、検出可能なシグナルを生成することができるシグナル生成化合物に結合した抗体を含むコンジュゲートを、前記コンジュゲートが結合抗体に結合するのに十分な時間及び条件下で添加すること；及びｃ）前記シグナル生成化合物によって生じるシグナルの存在を検出することにより、前記被験試料中に存在する可能性のあるＩｇＧ抗体を検出すること、の工程を含む、被験試料においてトキソプラスマに対するＩｇＧ抗体の存在を検出するための方法を包含する。
【００１８】
さらに、本発明は、ａ）トキソプラスマに対するＩｇＭ抗体を含むことが疑われる被験試料を、前記ＩｇＭ抗体に特異的な抗抗体と、抗抗体／ＩｇＭ抗体複合体の形成のために十分な時間及び条件下で接触させること；ｂ）生じた抗抗体／ＩｇＭ抗体複合体に、検出可能なシグナルを生成することができるシグナル生成化合物に結合した、配列番号２３、配列番号２８及び配列番号６４から成る群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むコンジュゲートを、前記コンジュゲートが結合抗体に結合するのに十分な時間及び条件下で添加すること；及びｃ）前記シグナル生成化合物によって生じるシグナルの存在を検出することにより、前記被験試料中に存在する可能性のあるＩｇＭ抗体を検出すること、の工程を含む、被験試料においてトキソプラスマに対するＩｇＭ抗体の存在を検出するための方法を包含する。
【００１９】
さらに、本発明は、ａ）トキソプラスマに対するＩｇＧ抗体を含むことが疑われる被験試料を、前記ＩｇＧ抗体に特異的な抗抗体と、抗抗体／ＩｇＧ抗体複合体の形成のために十分な時間及び条件下で接触させること；ｂ）生じた抗抗体／ＩｇＧ抗体複合体に、各々が、検出可能なシグナルを生成することができるシグナル生成化合物に結合した、１）配列番号２３、配列番号２８及び配列番号６４から成る群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド及び２）Ｐ３５を含むコンジュゲートを、前記コンジュゲートが結合抗体に結合するのに十分な時間及び条件下で添加すること；及びｃ）前記シグナル生成化合物の各々によって生じるシグナルの存在を検出することにより、前記被験試料中に存在する可能性のあるＩｇＧ抗体を検出すること、の工程を含む、被験試料においてトキソプラスマに対するＩｇＧ抗体の存在を検出するための方法を包含する。
【００２０】
本発明はまた、ａ）１）配列番号２３、配列番号２８及び配列番号６４から成る群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド及び２）Ｐ３５から成る群より選択される少なくとも１つのポリペプチド、及びｂ）医薬適合性のアジュバント、を含むワクチンを包含する。
【００２１】
また、本発明は、配列番号２３、配列番号２８及び配列番号６４から成る群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含有する組成物；及び検出可能なシグナルを生成することができるシグナル生成化合物に結合した抗体を含むコンジュゲート、を含む、被験試料においてトキソプラスマに対するＩｇＭ抗体の存在を判定するためのキットを包含する。
【００２２】
また、本発明は、１）配列番号２３、配列番号２８及び配列番号６４から成る群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド及び２）Ｐ３５を含有する組成物；及び検出可能なシグナルを生成することができるシグナル生成化合物に結合した抗体を含むコンジュゲート、を含む、被験試料においてトキソプラスマに対するＩｇＧ抗体の存在を判定するためのキットを包含する。
【００２３】
加えて、本発明は、
ａ）ＩｇＭ抗体に特異的な抗抗体；及び
ｂ）配列番号２３、配列番号２８及び配列番号６４から成る群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含有する組成物
を含む、被験試料においてトキソプラスマに対するＩｇＭ抗体の存在を判定するためのキットを包含する。
【００２４】
さらに、本発明は、
ａ）ＩｇＭ抗体に特異的な抗抗体；
ｂ）２）検出可能なシグナルを生成することができるシグナル生成化合物、に結合した、１）配列番号２３、配列番号２８及び配列番号６４から成る群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、を含むコンジュゲート
を含む、被験試料においてトキソプラスマに対するＩｇＭ抗体の存在を判定するためのキットを包含する。
【００２５】
また、本発明は、
ａ）ＩｇＧ抗体に特異的な抗抗体；及び
ｂ）１）配列番号２３、配列番号２８及び配列番号６４から成る群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド及び２）Ｐ３５を含有する組成物
を含む、被験試料においてトキソプラスマに対するＩｇＧ抗体の存在を判定するためのキットを包含する。
【００２６】
本発明のもう１つのキットは、
ａ）ＩｇＧ抗体に特異的な抗抗体；
ｂ）各々が、検出可能なシグナルを生成することができるシグナル生成化合物に結合した、１）配列番号２３、配列番号２８及び配列番号６４から成る群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び２）Ｐ３５、を含むコンジュゲート
を含む、被験試料においてトキソプラスマに対するＩｇＧ抗体の存在を判定するためのキットを包含する。
【００２７】
さらに、本発明は、（ａ）トキソプラスマに対するＩｇＭ抗体を含むことが疑われる被験試料を、前記ＩｇＭ抗体に特異的な抗抗体と、抗抗体／ＩｇＭ複合体の形成のために十分な時間及び条件下で接触させること；（ｂ）生じた抗抗体／ＩｇＭ複合体に、配列番号２３、配列番号２８及び配列番号６４から成る群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む抗原を、前記抗原が結合ＩｇＭ抗体に結合するのに十分な時間及び条件下で添加すること；及び（ｃ）生じた抗抗体／ＩｇＭ／抗原複合体に、検出可能なシグナルを生成することができるシグナル生成化合物に結合したモノクローナル又はポリクローナル抗体を含有する組成物を含むコンジュゲートを添加すること；及び（ｄ）前記シグナル生成化合物によって生じるシグナルを検出することにより、前記被験試料中に存在する可能性のあるＩｇＭ抗体を検出すること、の工程を含む、被験試料においてトキソプラスマに対するＩｇＭ抗体の存在を検出するための方法を包含する。
【００２８】
加えて、本発明は、（ａ）トキソプラスマに対するＩｇＧ抗体を含むことが疑われる被験試料を、前記ＩｇＧ抗体に特異的な抗抗体と、抗抗体／ＩｇＧ複合体の形成のために十分な時間及び条件下で接触させること；（ｂ）生じた抗抗体／ＩｇＧ複合体に、１）配列番号２３、配列番号２８及び配列番号６４から成る群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドと２）Ｐ３５の混合物を含む抗原を、前記抗原が結合ＩｇＧ抗体に結合するのに十分な時間及び条件下で添加すること；（ｃ）生じた抗抗体／ＩｇＧ／抗原複合体に、検出可能なシグナルを生成することができるシグナル生成化合物に結合したモノクローナル又はポリクローナル抗体を含有する組成物を含むコンジュゲートを添加すること；及び（ｄ）前記シグナル生成化合物によって生じるシグナルを検出することにより、前記被験試料中に存在する可能性のあるＩｇＧ抗体を検出すること、の工程を含む、被験試料においてトキソプラスマに対するＩｇＧ抗体の存在を検出するための方法を包含する。
【００２９】
本発明はまた、ａ）トキソプラスマに対するＩｇＭ及びＩｇＧ抗体を含むことが疑われる被験試料を、１）配列番号２３、配列番号２８及び配列番号６４から成る群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド及び２）Ｐ３５を含有する組成物と、ＩｇＭ及びＩｇＧ抗体／抗原複合体の形成のために十分な時間及び条件下で接触させること；ｂ）生じたＩｇＭ抗体／抗原複合体及びＩｇＧ抗体／抗原複合体に、検出可能なシグナルを生成することができるシグナル生成化合物に結合した抗体を含むコンジュゲートを、前記コンジュゲートが結合ＩｇＭ及びＩｇＧ抗体に結合するのに十分な時間及び条件下で添加すること；及びｃ）前記シグナル生成化合物によって生じるシグナルを検出することにより、前記被験試料中に存在する可能性のあるＩｇＭ及びＩｇＧ抗体の存在を検出すること、の工程を含む、被験試料においてトキソプラスマに対するＩｇＭ及びＩｇＧ抗体の存在を検出するための方法を包含する。
【００３０】
本発明はまた、ａ）トキソプラスマに対するＩｇＭ及びＩｇＧ抗体を含むことが疑われる被験試料を、前記ＩｇＭ抗体及びＩｇＧ抗体に特異的な抗抗体と、抗抗体／ＩｇＭ抗体複合体及び抗抗体／ＩｇＧ抗体複合体の形成のために十分な時間及び条件下で接触させること；ｂ）生じた抗抗体／ＩｇＭ抗体複合体及び生じた抗抗体／ＩｇＧ抗体複合体に、各々が、検出可能なシグナルを生成することができるシグナル生成化合物に結合した、１）配列番号２３、配列番号２８及び配列番号６４から成る群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び２）Ｐ３５、を含有する組成物を含むコンジュゲートを、前記コンジュゲートが結合抗体に結合するのに十分な時間及び条件下で添加すること；及びｃ）前記シグナル生成化合物によって生じるシグナルを検出することにより、前記被験試料中に存在する可能性のあるＩｇＭ及びＩｇＧ抗体を検出すること、の工程を含む、被験試料においてトキソプラスマに対するＩｇＭ及びＩｇＧ抗体の存在を検出するための方法を包含する。
【００３１】
さらに、本発明はまた、（ａ）トキソプラスマに対するＩｇＭ及びＩｇＧ抗体を含むことが疑われる被験試料を、前記ＩｇＭ抗体に特異的な抗抗体及び前記ＩｇＧ抗体に特異的な抗抗体と、抗抗体／ＩｇＭ複合体及び抗抗体／ＩｇＧ複合体の形成のために十分な時間及び条件下で接触させること；（ｂ）生じた抗抗体／ＩｇＭ複合体及び生じた抗抗体／ＩｇＧ複合体に、１）配列番号２３、配列番号２８及び配列番号６４から成る群より選択されるアミノ酸を有する選択ポリペプチドと２）Ｐ３５の混合物を含む抗原を、前記抗原が結合ＩｇＭ及びＩｇＧ抗体に結合するのに十分な時間及び条件下で添加すること；及び（ｃ）生じた抗抗体／ＩｇＭ／抗原複合体及び抗抗体／ＩｇＧ／抗原複合体に、検出可能なシグナルを生成することができるシグナル生成化合物に結合したモノクローナル又はポリクローナル抗体を含有する組成物を含むコンジュゲートを添加すること；及び（ｄ）前記シグナル生成化合物によって生じるシグナルを検出することにより、前記被験試料中に存在する可能性のあるＩｇＭ及びＩｇＧ抗体を検出すること、の工程を含む、被験試料においてトキソプラスマに対するＩｇＭ及びＩｇＧ抗体の存在を検出するための方法を包含する。
【００３２】
本発明はまた、非ヒト哺乳類に、配列番号２３、配列番号２８及び配列番号６４から成る群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを注入すること；前記非ヒト哺乳類の脾細胞を骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマを生成すること；及び前記ハイブリドーマがモノクローナル抗体を産生するために十分な時間及び条件下で、前記ハイブリドーマを培養すること、の工程を含む、モノクローナル抗体を生産する方法を包含する。
【００３３】
さらに、本発明は、プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ３Ｃ（５２−３００ａａ）、プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ４Ｃ（５２−２９４ａａ）、ならびにプラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ１を包含する。
【００３４】
本発明はまた、配列番号２０のヌクレオチド配列を含む又は前記配列に相補的な単離ヌクレオチド配列ならびに配列番号２１のアミノ酸配列を含む精製ポリペプチドを包含する。
【００３５】
さらに、本発明は、配列番号２５のヌクレオチド配列を含む又は前記配列に相補的な単離ヌクレオチド配列ならびに配列番号２６のアミノ酸配列を含む精製ポリペプチドを包含する。
【００３６】
加えて、本発明は、配列番号６１のヌクレオチド配列を含む又は前記配列に相補的な単離ヌクレオチド配列ならびに配列番号６２のアミノ酸配列を含む精製ポリペプチドを包含する。
【００３７】
本発明はまた、それぞれ、アミノ酸１−２４９から成るＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ３Ｃ（５２−３００ａａ）の領域、アミノ酸１−２４３から成るＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ４Ｃ（５２−２９４ａａ）の領域、及びアミノ酸１−２４９から成るＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ１の領域と同じ抗原性を有する、ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ３Ｃ（５２−３００ａａ）、ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ４Ｃ（５２−２９４ａａ）、又はＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ１の部分又はフラグメントを包含する。
【００３８】
ここで引用するすべての米国特許及び公開文献は、それらの全体が参照してここに組み込まれる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
トキソプラスマに対するＩｇＧ及びＩｇＭ抗体の検出のための既知のアッセイの困難さを上記で詳細に述べた。それ故、陽性血清又は血漿中のそのような抗体の存在を正確に検出し、それによって偽陰性又は偽陽性試験の問題を排除することができる免疫測定法を発見することが必要であった。本発明は、そのような求められる免疫測定法、特にヒト血清においてＩｇＧ及び／又はＩｇＭ抗体の存在を正確に検出する抗原及び抗原の組合せを提供する。
【００４０】
特に、本発明は、免疫測定法においてＰ３０抗原の抗トキソプラスマＩｇＧ及びＩｇＭ免疫反応性を最大化する、各々のタンパク質のＣ末端の小さく且つ正確な欠失を含む、ここでは「ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ３Ｃ（５２−３００ａａ）」及び「ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ４Ｃ（５２−２９４ａａ）」と称する遺伝子操作した形態のＰ３０抗原を包含する。本発明はまた、ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ３Ｃ（５２−３００ａａ）と同じＣ末端の欠失ならびにアラニンに変化した５個のＣ末端システイン残基を含む、ここでは「ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ１」と称する遺伝子操作した形態のＰ３０抗原を包含する。本発明はまた、Ｃ末端の最後の５個のシステインのいずれか１個又はそれ以上がアラニンに変化したＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ３Ｃ（５２−３００ａａ）のアミノ酸配列を含むポリペプチドを包含する。
【００４１】
ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ３Ｃ抗原をコードする遺伝子のヌクレオチド配列を図１６に示し、配列番号２２で表わす。この抗原のアミノ酸配列も図１６に示しており、配列番号２３で表わす。ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ４Ｃ抗原をコードする遺伝子のヌクレオチド配列を図２０に示し、配列番号２７で表わす。この抗原のアミノ酸配列も図１６に示しており、配列番号２８で表わす。ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ１抗原をコードする遺伝子のヌクレオチド配列を図３２に示し、配列番号６３で表わす。この抗原のアミノ酸配列も図３２に示しており、配列番号６４で表わす。
【００４２】
本発明はまた、配列番号２２、配列番号２７又は配列番号６３のヌクレオチド配列に少なくとも約７０％のヌクレオチド配列同一性、好ましくは少なくとも約８０％のヌクレオチド配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む又はそれに相補的なヌクレオチド配列を包含することに留意すべきである。（前記の範囲内のすべての整数（すなわち７０から１００の間）も、本発明の範囲内に含まれるとみなされる。）前記のパーセント同一性を有する配列又は相補的配列は、単離されたもとの配列が由来する以外の種又はソースから誘導しうる。
【００４３】
また、本発明は、配列番号２３、配列番号２８又は配列番号６４のアミノ酸配列に少なくとも約７０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド配列を包含することに留意すべきである。（前記の範囲内のすべての整数（すなわち７０から１００の間）も、本発明の範囲内に含まれるとみなされる。）
本発明に関して、「相補性」とは、２つのＤＮＡセグメントの間の関連性の度合と定義される。相補性は、１つのＤＮＡセグメントのセンス鎖が、適切な条件下で他のＤＮＡセグメントアンチセンス鎖とハイブリダイズして二重らせんを形成する能力を測定することによって決定される。その二重らせんにおいて、アデニンが一方の鎖に現われる場合は常に、チミンが他方の鎖に出現する。同様に、グアニンが一方の鎖に認められる場合は常に、シトシンが他方の鎖に認められる。２つのＤＮＡセグメントのヌクレオチドの間の関連性が大きいほど、２つのＤＮＡセグメントの鎖の間でハイブリッド二重鎖を形成する能力が高い。
【００４４】
「同一性」の語は、特定比較ウインドウ又はセグメントにわたってヌクレオチド対ヌクレオチドベースでの２つの配列の関連性を指す。それ故、同一性は、２つのＤＮＡセグメントの同じ鎖（センス又はアンチセンスのいずれか）（又は２つのアミノ酸配列）の間の一致、照応又は等価の度合と定義される。「配列同一性のパーセンテージ」は、特定領域にわたって２つの最適に整列された配列を比較し、両方の配列内で同一塩基又はアミノ酸が生じる位置の数を測定してマッチする位置数を決定し、それらの位置数を比較するセグメント内の総位置数で除して、その結果に１００を乗じることによって算定される。配列の最適整列は、Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）のアルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）のアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｍｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８５：２４４４（１９８８）の方法によって、及び関連アルゴリズムを履行するコンピュータプログラム（例えばＣｌｕｓｔａｌ  Ｍａｃａｗ  Ｐｉｌｅｕｐ（ｈｔｔｐ：／／ｃｍｇｍ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｂｉｏｃｈｅｍ２１８／１１Ｍｕｌｔｉｐｌｅ．ｐｄｆ；Ｈｉｇｇｉｎｓら、ＣＡＢＩＯＳ．５Ｌ１５１−１５３（１９８９））、ＦＡＳＴＤＢ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２５：３３８９−３４０２（１９９７））、ＰＩＬＥＵＰ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）又はＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））によって実施しうる。（米国特許第５，９１２，１２０号参照。）
２つのアミノ酸配列の間の「類似性」は、両方の配列における一連の同一且つ保存されたアミノ酸残基の存在と定義される。２つのアミノ酸配列の間の類似性の度合が高いほど、２つの配列の照応、一致又は等価性が高い。（２つのアミノ酸配列の間の「同一性」は、両方の配列における一連の厳密に同じか又は不変のアミノ酸残基の存在と定義される。）「相補性」、「同一性」及び「類似性」の定義は当業者に周知である。
【００４５】
「によってコードされる」は、核酸配列によってコードされるポリペプチドからの少なくとも３個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも８個のアミノ酸、さらに一層好ましくは少なくとも１５個のアミノ酸のアミノ酸配列を含むポリペプチド配列又はその部分をコードする核酸配列を指す。
【００４６】
本発明はまた、中等度にストリンジェントな条件下で、前述したヌクレオチド配列を含む又は前記配列に相補的なヌクレオチド配列を有する核酸にハイブリダイズしうる単離ヌクレオチド配列を包含する。核酸分子の一本鎖形態が適切な温度及びイオン強度の条件下でもう１つ別の核酸分子にアニーリングすることができるとき、その核酸分子は他方の核酸分子に「ハイブリダイズしうる」（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版（１９８９）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照）。温度及びイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。「ハイブリダイゼーション」は、２つの核酸が相補的配列を含むことを必要とする。しかし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに依存して、塩基間のミスマッチが起こりうる。核酸をハイブリダイズするための適切なストリンジェンシーは、核酸の長さ及び相補性の度合に依存する。そのような変数は当技術分野において周知である。より明細には、２つのヌクレオチド配列の間の類似性又は相同性の度合が大きいほど、それらの配列を有する核酸のハイブリッドのためのＴｍ（融解温度）の値が大きい。１００ヌクレオチド以上の長さのハイブリッドに関しては、Ｔｍを算定するための方程式が導かれている（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出参照）。より短い核酸とのハイブリダイゼーションについては、ミスマッチの位置がより重要となり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出参照）。
【００４７】
ここで使用するとき、「単離核酸フラグメント又は配列」は、場合により合成、非天然又は変化したヌクレオチド塩基を含む、一本鎖又は二本鎖のＲＮＡ又はＤＮＡの重合体である。ＤＮＡの重合体の形態の単離核酸フラグメントは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又は合成ＤＮＡの１又はそれ以上のセグメントで構成されうる。（特定ポリヌクレオチドの「フラグメント」は、特定ヌクレオチド配列の領域に同一か又は相補的な、おおよそ少なくとも約６ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約８ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１０ヌクレオチド、さらに一層好ましくは少なくとも約１５ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも約２５ヌクレオチドの隣接配列を含むポリヌクレオチド配列を指す。（米国特許第６，１８３，９５２  Ｂ１号参照）。これに対し、特定ポリペプチドの「フラグメント」は、特定ポリペプチドから誘導される少なくとも５アミノ酸、より好ましくは少なくとも約１０アミノ酸、さらに一層好ましくは少なくとも１５アミノ酸を含むアミノ酸配列を指す。）ヌクレオチド（通常はそれらの５’−一リン酸形態で認められる）は、以下のようにそれらの一文字名称で表わされる：アデニル酸又はデオキシアデニル酸（それぞれＲＮＡ又はＤＮＡに関して）は「Ａ」、シチジル酸又はデオキシシチジル酸は「Ｃ」、グアニル酸又はデオキシグアニル酸は「Ｇ」、ウリジル酸は「Ｕ」、デオキシチミジル酸は「Ｔ」、プリン（Ａ又はＧ）は「Ｒ」、ピリミジン（Ｃ又はＴ）は「Ｙ」、Ｇ又はＴは「Ｋ」、Ａ又はＣ又はＴは「Ｈ」、イノシンは「Ｉ」、及びいずれかのヌクレオチドは「Ｎ」。
【００４８】
「機能的に等価であるフラグメント又はサブフラグメント」及び「機能的に等価のフラグメント又はサブフラグメント」の語は、ここでは交換可能に使用される。これらの語は、そのフラグメント又はサブフラグメントが活性酵素をコードするか否かに関わらず、遺伝子発現を変化させる又はある種の表現型を生じさせる能力が保持されている単離核酸フラグメントの部分又は配列を指す。それが由来するもとのポリペプチド配列と機能的に等価であるフラグメント又はサブフラグメントは、もとのポリペプチドと同じ性質（例えば結合、抗原性等）を有する配列を指す。
【００４９】
「相同性」、「相同な」、「実質的に同様」及び「実質的に対応」の語は、ここでは交換可能に使用される。それらは、１又はそれ以上のヌクレオチド塩基における変化が、遺伝子発現を仲介する又はある種の表現型を生じさせる核酸フラグメントの能力に影響を及ぼさない核酸フラグメントを指す。これらの語はまた、生じる核酸フラグメントの機能的性質を、最初の修飾されていないフラグメントと比べて実質的に変化させない、１又はそれ以上のヌクレオチドの欠失又は挿入などの、本発明の核酸フラグメントの修飾を指す。それ故、当業者が認識するように、本発明は特定例示配列より多くを包含することが了解される。
【００５０】
「遺伝子」は、コード配列に先行する（５’−非コード配列）又は後続する（３’非コード配列）調節配列を含む、特定タンパク質を発現する核酸フラグメントを指す。
【００５１】
「天然遺伝子」は、それ自体の調節配列を有する、天然に認められる遺伝子を指す。これに対し、「キメラ構築物」は、通常天然では共に認められることがない核酸フラグメントの組合せを指す。従って、キメラ構築物は、異なるソースから誘導される調節配列及びコード配列、又は同じソースから誘導されるが通常天然で認められるものとは異なるように配置されている調節配列及びコード配列を含みうる。（「単離」の語は、配列がその天然環境から取り出されていることを意味する。）
「作動可能に連結された」の語は、一方の機能が他方によって調節される、単一核酸フラグメント上の核酸配列の結合を指す。例えば、プロモーターがそのコード配列の発現を調節することができる（すなわちコード配列がそのプロモーターの転写調節下にある）とき、プロモーターはコード配列に作動可能に連結されている。コード配列は、センス又はアンチセンス方向で調節配列に作動可能に連結されうる。
【００５２】
ここで使用するとき、「発現」の語は、機能性最終産物の生産を指す。遺伝子の発現は、遺伝子の転写及びｍＲＮＡの前駆体又は成熟タンパク質への翻訳を含む。「アンチセンス阻害」は、標的タンパク質の発現を抑制することができるアンチセンスＲＮＡ転写産物の生産を指す。「共抑制」は、同一又は実質的に同様の外来性又は内在性遺伝子の発現を抑制することができるセンスＲＮＡ転写産物の生産を指す。
【００５３】
「成熟」タンパク質は、翻訳後加工されたポリペプチド、すなわち一次翻訳産物中に存在するプレ又はプロペプチドが除去されたものを指す。「前駆体」タンパク質は、ｍＲＮＡの翻訳の一次生成物、すなわちプレ及びプロペプチドがまだ存在するものを指す。プレ及びプロペプチドは、細胞内局在化シグナルでありうるが、これに限定されない。
【００５４】
ここで使用する標準組換えＤＮＡ及び分子クローニング手法は当技術分野において周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９８９（以下「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」）の中で詳細に記述されている。
【００５５】
「組換え」の語は、例えば化学合成による又は遺伝子工学手法を用いた核酸の単離セグメントの操作による、さもなければ分離している２つの配列のセグメントの人工的組合せを指す。
【００５６】
「ＰＣＲ」又は「ポリメラーゼ連鎖反応」は、特定ＤＮＡセグメントの大量の合成のための手法であり、一連の反復サイクルから成る（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）。典型的には、二本鎖ＤＮＡを熱変性し、標的セグメントの３’領域に相補的な２個のプライマーを低温でアニーリングして、次に中間温度で伸長する。これら３つの連続工程の１セットをサイクルと称する。
【００５７】
ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）は、鋳型の反復複製によって短時間にＤＮＡを数百万倍に増幅するために使用される強力な手法である。（Ｍｕｌｌｉｓら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５１：２６３−２７３（１９８６）；Ｅｒｌｉｃｈら、欧州特許出願第５０，４２４号；欧州特許出願第８４，７９６号；欧州特許出願第２５８，０１７号；欧州特許出願第２３７，３６２号；Ｍｕｌｌｉｓ、欧州特許出願第２０１，１８４号；Ｍｕｌｌｉｓら、米国特許第４，６８３，２０２号；Ｅｒｌｉｃｈ、米国特許第４，５８２，７８８号；及びＳａｉｋｉら、米国特許第４，６８３，１９４号）。この工程は、ＤＮＡ合成を開始させるためにインビトロ合成した特定オリゴヌクレオチドのセットを利用する。プライマーの設計は、分析しようとするＤＮＡの配列に依存する。この手法は、鋳型を高温で融解すること、プライマーを鋳型内の相補的配列にアニーリングすること、その後ＤＮＡポリメラーゼで鋳型を複製すること、の多くのサイクル（通常２０−５０）を通して実施される。
【００５８】
さらに、本発明はまた、ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ３Ｃ、ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ４Ｃ又はＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ１に対して惹起されるポリクローナル又はモノクローナル抗体を包含する。そのような抗体は、例えば免疫測定法、ワクチン、キットにおいて、又は研究のために使用しうる。
【００５９】
前述したように、本発明はまた、次の２つの抗原：遺伝子操作したＰ３０及びＰ３５を含む組成物又は混合物を包含する。抗原のこの組合せ又は混合物は、ＩｇＧ陽性血清又は血漿におけるＩｇＧの検出のために（すなわち診断試薬として）使用しうる。さらに、前記抗原は組換え又は合成のいずれかによって作製しうる。加えて、本発明はまた、これらの抗原に対して惹起される抗体を含有する組成物を包含する。
【００６０】
さらに、前述したように、本発明はまた、遺伝子操作したＰ３０抗原を包含する。この抗原は、ＩｇＭ陽性血清又は血漿におけるＩｇＭの検出のために（すなわち診断試薬として）使用でき、また前記抗原は組換え又は合成のいずれかによって作製しうる。さらに、本発明はまた、この抗原に対して惹起される抗体を包含する。
【００６１】
実際に、血清又は血漿試料中のＩｇＭ及びＩｇＧの両方の力価を測定しようとする場合は、遺伝子操作したＰ３０及びＰ３５のような抗原の組成物又は混合物を免疫測定法において使用しうる。そのような抗原の組合せも本発明の範囲内に包含される。
【００６２】
本発明はまた、前述した抗原の組合せを用いてＩｇＭ及び／又はＩｇＧを検出する方法を包含する。より明細には、２つの基本的なタイプのアッセイ、競合及び非競合（例えば免疫測定（ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｒｉｃ）及びサンドイッチ）アッセイが存在する。両方のアッセイにおいて、抗体又は抗原試薬は固相に共有又は非共有結合する。共有結合のための架橋剤は既知であり、固相の一部であるか又は被覆の前に誘導体化しうる。免疫測定法において使用される固相の例は、多孔性及び無孔性材料、ラテックス粒子、磁気粒子、微粒子、ビーズ、膜、マイクロタイターウエル及びプラスチックチューブである。固相材料の選択及び抗原又は抗体試薬を標識する方法は、所望アッセイ形式の性能特徴に基づいて決定される。一部の免疫測定法では、標識を必要としない。例えば、抗原が赤血球などの検出可能粒子上にある場合は、凝集に基づいて反応性を確認することができる。あるいは、抗原−抗体反応は眼に見える変化（例えば放射状免疫拡散）をもたらしうる。ほとんどの場合は、免疫測定法において使用する抗体又は抗原試薬の１つをシグナル生成化合物又は「標識」に結合する。このシグナル生成化合物又は「標識」は、それ自体検出可能であるか又は検出可能産物を生成する１又はそれ以上の付加的な化合物と反応しうる（米国特許第６，３９５，４７２  Ｂ１号も参照のこと）。そのようなシグナル生成化合物の例は、色素原、放射性同位体（例えば１２５Ｉ、１３１Ｉ、３２Ｐ、３Ｈ、３５Ｓ及び１４Ｃ）、蛍光化合物（例えばフルオレセイン、ローダミン）、化学発光化合物、粒子（可視又は蛍光）、核酸、錯化剤、又は酵素などの触媒（例えばアルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ及びリボヌクレアーゼ）を含む。酵素を使用する場合、色、蛍光又は光形成基質の添加は検出可能なシグナル生成をもたらす。時間分解蛍光、内部反射蛍光、増幅（例えばポリメラーゼ連鎖反応）及びラマン分光法などの他の検出系も有用である。
【００６３】
ヒトにおいて特異的抗体の力価及び種類を観察するために一般的に使用される２つの一般的方式がある：（１）抗原を前述したような固相に提示し、特異的抗体を含むヒト生体液を抗原と反応させて、次にシグナル生成化合物に連結した抗ヒト抗体で、抗原に結合した抗体を検出する；及び（２）抗ヒト抗体を固相に結合し、特異的抗体を含むヒト生体液を結合抗体と反応させて、次にシグナル生成化合物に連結した抗原を添加し、体液試料中に存在する特異的抗体を検出する。両方の方式において、抗ヒト抗体試薬は、アッセイの意図する目的に応じて、すべての抗体クラスを認識しうるか、あるいは抗体の特定クラス又はサブクラスに特異的でありうる。これらのアッセイ方式ならびに他の既知の方式は本発明の範囲内であることが意図されており、また当業者に周知である。
【００６４】
特に、免疫測定抗体捕獲に基づくイムノアッセイの２つの説明例は、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬ）によって製造されているＩＭｘ  Ｔｏｘｏ  ＩｇＭ及びＴｏｘｏ  ＩｇＧ抗体アッセイである。どちらのアッセイも、ヒト血清又は血漿においてトキソプラスマ（Ｔ．ｇｏｎｄｉｉ）に対する抗体を測定する自動化微粒子酵素免疫測定法（ＭＥＩＡ）である（Ｓａｆｆｏｒｄら（１９９１）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．４４：２３８−２４２）。一方のアッセイはＩｇＭ抗体を定性的に測定し、最近の暴露又は急性感染を指示し、他方のアッセイはＩｇＧを定量的に測定し、慢性又は過去の感染を指示する。これらのアッセイは、トキソプラスマ抗原で被覆した微粒子を固相として用いる。特に、標本を被覆微粒子に添加して、トキソプラスマに特異的な抗体を結合させる。その後、トキソプラスマ抗原に複合したＩｇＭ（又はＩｇＧ）クラス抗体に特異的に結合する、アルカリホスファターゼ複合抗ヒトＩｇＭ（又は抗ヒトＩｇＧ）を添加する。適切な基質（例えば４−メチルウンベリフェリルホスフェート）の添加後、酵素触媒代謝回転の速度を蛍光に基づいて監視する。
【００６５】
遺伝子操作したＰ３０とＰ３５の混合物はＩｇＧ  Ａｂｂｏｔｔ免疫測定法において使用でき、遺伝子操作したＰ３０抗原は単独でＩｇＭ  Ａｂｂｏｔｔ免疫測定法において使用しうる。加えて、遺伝子操作したＰ３０とＰ３５の混合物は、所望する場合、どちらのアッセイにおいても使用しうる。さらに、他のＡｂｂｏｔｔ以外のアッセイ又はプラットフォームも、本発明のための各々の抗原又は抗原の組合せと共に使用しうることに留意しなければならない。
【００６６】
そこで、本発明は、（ａ）ＩｇＭ抗体を含むことが疑われる被験試料を遺伝子操作したＰ３０と接触させること；（ｂ）被験試料中に存在するＩｇＭ抗体の存在を検出すること、の工程を含む、被験試料においてＩｇＭ抗体を検出する方法を包含する。より明細には、本発明は、（ａ）ＩｇＭ抗体を含むことが疑われる被験試料を遺伝子操作したＰ３０と、ＩｇＭ抗体／抗原複合体の形成のために十分な時間及び条件下で接触させること；（ｂ）生じたＩｇＭ抗体／抗原複合体に、検出可能なシグナルを生成することができるシグナル生成化合物に結合した抗体（ＩｇＭに対する）を含むコンジュゲートを、前記コンジュゲートが結合抗体に結合するのに十分な時間及び条件下で添加すること；及び（ｃ）シグナル生成化合物によって生じるシグナルの存在を検出することにより、被験試料中に存在する可能性のあるＩｇＭ抗体の存在を検出すること、の工程を含む、被験試料においてＩｇＭ抗体を検出する方法を包含する。この抗原に結合する対照又は検定物質も使用しうる。さらに、この方法はまた、遺伝子操作したＰ３０に加えてＰ３５の使用も含みうる。
【００６７】
加えて、本発明はさらに、被験試料中に存在する可能性のあるＩｇＭの存在を検出するための方法を包含する。この方法は、（ａ）ＩｇＭ抗体を含むことが疑われる被験試料を、ＩｇＭに特異的な抗抗体と、抗抗体／ＩｇＭ複合体の形成のために十分な時間及び条件下で接触させること及び（ｂ）被験試料中に存在する可能性のあるＩｇＭの存在を検出すること、の工程を含む。（そのような抗抗体は市販されており、また、例えば哺乳類を抗体の精製ｍｕ−鎖で免疫することによって作製しうる。）
より明細には、この方法は、（ａ）ＩｇＭ抗体を含むことが疑われる被験試料を、ＩｇＭに特異的な抗抗体と、抗抗体／ＩｇＭ複合体の形成のために十分な時間及び条件下で接触させること；（ｂ）生じた抗抗体／ＩｇＭ複合体に、検出可能なシグナルを生成することができるシグナル生成化合物に結合した、遺伝子操作したＰ３０を含むコンジュゲートを、前記コンジュゲートが結合抗体に結合するのに十分な時間及び条件下で添加すること；及び（ｃ）シグナル生成化合物によって生じるシグナルの存在を検出することにより、被験試料中に存在する可能性のあるＩｇＭ抗体の存在を検出すること、の工程を含みうる。抗抗体に対する抗体を含む対照又は検定物質も使用しうる。さらに、所望する場合は、前記コンジュゲートはＰ３５も含みうる。
【００６８】
前記アッセイの各々において、遺伝子操作したＰ３０を遺伝子操作したＰ３０とＰ３５の混合物に置き換えることによってＩｇＧを検出しうる。また、ＩｇＧに特異的な抗抗体を使用する。加えて、ＩｇＭ及びＩｇＧ抗体の両方を検出しようとする場合は、遺伝子操作したＰ３０及びＰ３５を免疫測定法において使用しうる。
【００６９】
本発明はまた、被験試料中のＩｇＭの存在を検出するための第三の方法を包含する。この方法は、（ａ）ＩｇＭ抗体を含むことが疑われる被験試料を、ＩｇＭに特異的な抗抗体と、抗抗体／ＩｇＭ複合体の形成のために十分な時間及び条件下で接触させること；（ｂ）生じた抗抗体／ＩｇＭ複合体に、遺伝子操作したＰ３０を含む抗原を、前記抗原が結合ＩｇＭ抗体に結合するのに十分な時間及び条件下で添加すること；及び（ｃ）生じた抗抗体／ＩｇＭ／抗原複合体に、検出可能なシグナルを検出することができるシグナル生成化合物に結合した、前記抗原に対するモノクローナル又はポリクローナル抗体を含有する組成物を含むコンジュゲートを添加すること；及び（ｄ）シグナル生成化合物によって生じるシグナルの存在を検出することにより、被験試料中に存在する可能性のあるＩｇＭ抗体の存在を検出すること、の工程を含む。やはり、抗抗体に対する抗体を含む対照又は検定物質を使用しうる。前記抗原混合物は、所望する場合は、Ｐ３５をさらに含みうる。
【００７０】
この方法では、遺伝子操作したＰ３０抗原を遺伝子操作したＰ３０とＰ３５の混合物に置き換えること及びＩｇＧに特異的な抗抗体を使用することによってＩｇＧを検出しうる。しかし、ＩｇＭ及びＩｇＧ抗体の両方を検出しようとする場合は、遺伝子操作したＰ３０及びＰ３５を免疫測定法において使用しうる。
【００７１】
また、前記方法のすべてが、そのような検出を所望する場合は、ＩｇＡ抗体（α−特異的コンジュゲートと共に）及び／又はＩｇＥ抗体（ε−特異的コンジュゲートと共に）を検出するために使用しうることに留意すべきである。
【００７２】
さらに、本発明はまた、遺伝子操作したＰ３０及びＰ３５抗原の混合物と医薬適合性のアジュバントを含むワクチンを包含する。そのようなワクチンは、哺乳類においてＩｇＧ抗体を惹起することを所望する場合に投与しうる。本発明はまた、遺伝子操作したＰ３０抗原と医薬適合性のアジュバント（例えばフロイントアジュバント又はリン酸緩衝食塩水）を含むワクチンを包含する。そのようなワクチンは、哺乳類においてＩｇＭ抗体を惹起することを所望する場合に投与しうる。加えて、本発明はまた、遺伝子操作したＰ３０及びＰ３５抗原の混合物ならびに医薬適合性のアジュバントを含むワクチンを包含する。このワクチンは、哺乳類においてＩｇＭ及びＩｇＧ抗体の両方を惹起することを所望する場合に投与すべきである。
【００７３】
キットも本発明の範囲内に包含される。より明細には、本発明はＩｇＧ及び／又はＩｇＭの存在を判定するためのキットを包含する。特に、被験試料においてＩｇＭの存在を判定するためのキットは、ａ）遺伝子操作したＰ３０；及びｂ）検出可能なシグナルを生成することができるシグナル生成化合物に結合した抗体（ＩｇＭに対する）を含むコンジュゲートを含む。キットはまた、遺伝子操作したＰ３０に結合する試薬を含む対照又は検定物質も含みうる。
【００７４】
やはり、ＩｇＭではなくＩｇＧを検出することを所望する場合は、前記キットは、遺伝子操作したＰ３０ではなく遺伝子操作したＰ３０とＰ３５の混合物、ならびにＩｇＧに対する抗体を含む。ＩｇＭ及びＩｇＧの両方を検出しようとする場合は、キットは遺伝子操作したＰ３０及びＰ３５を含む。
【００７５】
本発明はまた、被験試料においてＩｇＭ及び／又はＩｇＧを検出するためのもう１つの種類のキットを包含する。ＩｇＭの存在を検出するために使用する場合は、キットは、ａ）ＩｇＭに特異的な抗抗体、及びｂ）遺伝子操作したＰ３０を含みうる。遺伝子操作したＰ３０に結合する試薬を含む対照又は検定物質もキットに含まれうる。より明細には、キットは、ａ）ＩｇＭ抗体に特異的な抗抗体、及びｂ）遺伝子操作したＰ３０を含む、検出可能なシグナルを生成することができるシグナル生成化合物に結合したコンジュゲート
を含みうる。やはり、キットは、遺伝子操作したＰ３０に結合する試薬を含む対照又は検定物質も含みうる。
【００７６】
さらに、ＩｇＭではなくＩｇＧを検出することを所望する場合は、前記キットは、遺伝子操作したＰ３０単独ではなく、遺伝子操作したＰ３０とＰ３５の混合物、ならびにＩｇＧに特異的な抗抗体を含む。ＩｇＭ及びＩｇＧの両方を検出しようとする場合は、キットは遺伝子操作したＰ３０及びＰ３５を含みうる。
【００７７】
以下の非制限的実施例を使用して本発明を説明する：
【実施例１】
【００７８】
一般的方法
（実験材料及び入手源）
制限酵素、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ及びｐＭＡＬ（登録商標）タンパク質融合及び精製システムは、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）から購入した。
【００７９】
ＤＮＡ及びタンパク質分子量標準物質、プラスミドミニプレップ、臭化エチジウム及びプレキャストポリアクリルアミドゲルは、ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）から購入した。
【００８０】
マルトースは、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。
【００８１】
ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット及びＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットは、Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）から購入した。
【００８２】
合成オリゴヌクレオチドは、Ｓｉｇｍａ  Ｇｅｎｏｓｙｓ（Ｔｈｅ  Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ）から購入した。
【００８３】
ＥＰＩＣＵＲＩＡＮ  Ｃｏｌｉ（商標）ＸＬ−１  ＢＬＵＥ（ｒｅｃＡ１  ｅｎｄＡ１  ｇｙｒＡ９６  ｔｈｉ−１  ｈｓｄＲ１７  ｓｕｐＥ４４  ｒｅｌＡ１  ｌａｃ［Ｆ’  ｐｒｏＡＢ  ｌａｃＩｑ  ＺＤＭ１５  Ｔｎ１０（Ｔｅｔｒ）］）スーパーコンピテント大腸菌細胞は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）より入手した。
【００８４】
ＧｅｎｅＡｍｐ（商標）試薬キット及びＡｍｐｌｉＴａｑ（商標）ＤＮＡポリメラーゼは、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ（Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）から購入した。
【００８５】
ＳｅａＫｅｍ  ＧＴＧアガロースは、ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＭＥ）から購入した。
【００８６】
Ｂａｃｔｏ−Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、Ｂａｃｔｏ−Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ、Ｂａｃｔｏ−Ａｇａｒアンピシリン、緩衝液、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００、ウシ胎仔血清（Ｔｏｘｏ抗体不含）、スクロース、アジ化ナトリウム、尿素、ＥＤＴＡ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、無機塩、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、Ｔｗｅｅｎ  ２０、グリセロール、４−メチルウンベリフェリルホスフェート（ＭＵＰ）、トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン（Ｔｒｉｓ）、ＡｘＳＹＭ  Ｔｏｘｏ  ＩｇＧ及びＩｇＭアッセイ試薬、検定物質及び対照、硫酸塩誘導体化微粒子、脱脂粉乳、Ｎｉｐａｓｅｐｔ、Ａ５６６２０、Ｂｒｉｊ−３５、マウス血清、マンニトール、ＡｘＳＹＭ装置、試薬及び必要品は、Ａｂｂｏｔｔ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，Ｉｎｃ．（Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬ）から購入した。
【００８７】
（培地、緩衝液及び一般試薬）
「Ｓｕｐｅｒｂｒｏｔｈ  ＩＩ」は、水酸化ナトリウムでｐＨを７．２に調整した、１１．２５ｇ／Ｌ  トリプトン、２２．５ｇ／Ｌ  酵母抽出物、１１．４ｇ／Ｌ  二塩基リン酸カリウム、１．７ｇ／Ｌ  一塩基リン酸カリウム、１０ｍｌ／Ｌ  グリセロールを含んだ。
【００８８】
（一般的方法）
ＤＮＡの酵素消化はすべて、供給者の指示に従って実施した。ＤＮＡマイクログラム当り少なくとも５単位の酵素を使用し、ＤＮＡの完全な消化のために十分なインキュベーション時間をおいた。ＤＮＡの操作及び大腸菌へのＤＮＡの形質転換において使用した様々なキット、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、及びマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）及びＭＢＰ融合タンパク質の精製については、供給者のプロトコールに従った。ＣＭＰ−ＫＤＯシンテターゼ（ＣＫＳ）を含む大腸菌溶解産物の精製（米国特許第６，３２９，１５７  Ｂ１号）、アガロースゲルでのＤＮＡの制限分析、アガロースゲルからのＤＮＡフラグメントの精製、及びＴ４  ＤＮＡリガーゼによるＤＮＡフラグメントの連結に関しては、標準手順を使用した。（Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９））。ＤＮＡ塩基配列分析は、Ｌａｒｋ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）によって実施された。
【実施例２】
【００８９】
ｐＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０発現ベクターの構築
免疫測定法において、米国特許第６，３２９，１５７  Ｂ１号に述べられているトキソプラスマ抗原カクテルの免疫反応性を改善するために、大腸菌における可溶性Ｔｏｘｏ  Ｐ３０の生産を可能にする適切な異種タンパク質発現系を探索した。米国特許第５，６４３，７５８号に述べられている大腸菌マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）融合及び精製系が、大腸菌における可溶性融合タンパク質の生産及び精製のために有用であることを認めた。（特に、その中に述べられているベクターは、対象タンパク質がＭＢＰから開裂されうるように特異的プロテアーゼ（例えば第Ｘａ因子、エンテロキナーゼ又はＧｅｎｅｎａｓｅ（登録商標））の制限部位をコードする配列を有する。）ＭＢＰへのタンパク質の融合は、大腸菌におけるそれらの溶解度を上昇させる（ＫａｐｕｓｔとＷａｕｇｈ（１９９９）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ８，１６６８−１６７４）。天然Ｔｏｘｏ  Ｐ３０がタキゾイト膜への挿入の前に翻訳後開裂されるという所見（Ｂｕｒｇら（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：３５８４−３５９１）を考慮に入れていくつかの異なる構築物を作製した。Ｔｏｘｏ  Ｐ３０についての正確な開裂部位は不明である。
【００９０】
米国特許第６，３２９，１５７  Ｂ１号に述べられているプラスミドｐＴｏｘｏ−Ｐ３０を、Ｔｏｘｏ  Ｐ３０遺伝子の種々の部分を含むＤＮＡフラグメントを生成するための一連のＰＣＲ反応のための鋳型ＤＮＡとして使用した。ｐＴｏｘｏ−Ｐ３０プラスミドＤＮＡは標準方法を用いて作製した。ｐＭＡＬ−ｃ２Ｘ（細胞質発現ベクター）及びｐＭＡＬ−ｐ２Ｘ（ペリプラズム発現ベクター）プラスミドをＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ  ＭＡより購入し、Ｔｏｘｏ−Ｐ３０遺伝子フラグメントをサブクローニングするための準備において制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化した。
【００９１】
（工程Ａ：ｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０（５２−３３６ａａ）の構築）
プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０（５２−３３６ａａ）を、プラスミドｐＴｏｘｏ−Ｐ３０に含まれるＴｏｘｏ  Ｐ３０  ＤＮＡのＰＣＲ増幅によって得た、Ｔｏｘｏ  Ｐ３０を含むＤＮＡフラグメントをｐＭＡＬ−ｃ２ＸのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングすることによって構築した（図１）。プラスミドｐＭＡＬ−ｃ２ＸをＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ベクター骨格をＱｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットで精製した。ＥｃｏＲＩ部位を含む、Ｐ３０遺伝子のヌクレオチド４６４から始まるセンスプライマー及びＰ３０遺伝子のヌクレオチド１３１８から始まる、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を含むアンチセンスプライマー（Ｂｕｒｇら（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：３５８４−３５９１）を以下に示すように合成した：
センスプライマー［配列番号：１］
【００９２】
【化１】
0004602084.tif 000002
（ＥｃｏＲＩ部位に下線を付している。）
【００９３】
アンチセンスプライマー［配列番号：２］
【００９４】
【化２】
0004602084.tif 000003
（ＨｉｎｄＩＩＩ部位に下線を付している。）
【００９５】
前記センス及びアンチセンスプライマーを、プラスミドｐＴｏｘｏ−Ｐ３０を含むＰＣＲ反応混合物に加えた。ＰＣＲ増幅及びＱｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットによる反応混合物の精製後に、反応混合物をＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、Ｔｏｘｏ  Ｐ３０を含む８５５塩基対のＤＮＡフラグメントをＱｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットで精製した。精製した８５５塩基対フラグメントを１６℃で一晩ｐＭＡＬ−ｃ２Ｘ／ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩに連結した。連結混合物をコンピテントＸＬ−１  Ｂｌｕｅ細胞に形質転換した。その形質転換体からミニプレップＤＮＡを作製し、制限酵素分析によってＰ３０  ＤＮＡ配列の存在に関してスクリーニングした。プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０（５２−３３６ａａ）は、ｐＭＡＬ−ｃ２ＸのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングされたＴｏｘｏ  Ｐ３０遺伝子を含んだ。プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０（５２−３３６ａａ）の完全なＤＮＡ配列［配列番号：３］を図２に示し、及びＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０（５２−３３６ａａ）融合タンパク質の対応するアミノ酸配列［配列番号：４］も図２に示しており、その中で、配列番号４のアミノ酸残基３９２−６７６はトキソプラスマのＰ３０抗原のアミノ酸５２−３３６に対応する。ＴｏｘｏＰ３０（５２−３３６ａａ）のＤＮＡ配列［配列番号：５］を図３に示し、及びＴｏｘｏＰ３０（５２−３３６ａａ）タンパク質の対応するアミノ酸配列［配列番号：６］も図３に示しており、その中で、配列番号６のアミノ酸残基１−２８５はトキソプラスマのＰ３０抗原のアミノ酸５２−３３６に対応する。
【００９６】
（工程Ｂ：ｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０（５２−３３６ａａ）の構築）
プラスミドｐＭＢＰ−ｐ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０（５２−３３６ａａ）を、プラスミドｐＴｏｘｏ−Ｐ３０に含まれるＴｏｘｏ  Ｐ３０  ＤＮＡのＰＣＲ増幅によって得た、Ｔｏｘｏ  Ｐ３０を含むＤＮＡフラグメントをｐＭＡＬ−ｐ２ＸのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングすることによって構築した（図４）。プラスミドｐＭＡＬ−ｐ２ＸをＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ベクター骨格をＱｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットで精製した。ＥｃｏＲＩ部位を含む、Ｐ３０遺伝子のヌクレオチド４６４から始まるセンスプライマー及びＰ３０遺伝子のヌクレオチド１３１８から始まる、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を含むアンチセンスプライマー（Ｂｕｒｇら（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：３５８４−３５９１）を以下に示すように合成した：
センスプライマー［配列番号：１］
【００９７】
【化３】
0004602084.tif 000004
（ＥｃｏＲＩ部位に下線を付している。）
【００９８】
アンチセンスプライマー［配列番号：２］
【００９９】
【化４】
0004602084.tif 000005
（ＨｉｎｄＩＩＩ部位に下線を付している。）
【０１００】
前記センス及びアンチセンスプライマーを、プラスミドｐＴｏｘｏ−Ｐ３０を含むＰＣＲ反応混合物に加えた。ＰＣＲ増幅及びＱｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットによる反応混合物の精製後に、反応混合物をＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、Ｔｏｘｏ  Ｐ３０を含む８５５塩基対のＤＮＡフラグメントをＱｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットで精製した。精製した８５５塩基対フラグメントを１６℃で一晩ｐＭＡＬ−ｐ２Ｘ／ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩに連結した。連結混合物をコンピテントＸＬ−１  Ｂｌｕｅ細胞に形質転換した。その形質転換体からミニプレップＤＮＡを作製し、制限酵素分析によってＰ３０  ＤＮＡ配列の存在に関してスクリーニングした。プラスミドｐＭＢＰ−ｐ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０（５２−３３６ａａ）は、ｐＭＡＬ−ｐ２ＸのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングされたＴｏｘｏ  Ｐ３０遺伝子を含んだ。プラスミドｐＭＢＰ−ｐ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０（５２−３３６ａａ）の完全なＤＮＡ配列［配列番号：７］を図５に示し、及びＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０（５２−３３６ａａ）融合タンパク質の対応するアミノ酸配列［配列番号：８］も図５に示しており、その中で、配列番号８のアミノ酸残基４１７−７０１はトキソプラスマのＰ３０抗原のアミノ酸５２−３３６に対応する。
【０１０１】
（工程Ｃ：プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１Ｃ（５２−３２４ａａ）の構築）
プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１Ｃ（５２−３２４ａａ）の構築における中間体である、プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１（５２−３２４ａａ）を、プラスミドｐＴｏｘｏ−Ｐ３０に含まれるＴｏｘｏ  Ｐ３０  ＤＮＡのＰＣＲ増幅によって得た、Ｔｏｘｏ  Ｐ３０を含むＤＮＡフラグメントをｐＭＡＬ−ｃ２ＸのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングすることによって構築した（図６）。プラスミドｐＭＡＬ−ｃ２ＸをＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ベクター骨格をアガロースゲル上で精製した。ＥｃｏＲＩ部位を含む、Ｐ３０遺伝子のヌクレオチド４６４から始まるセンスプライマー及びＰ３０遺伝子のヌクレオチド１２８２から始まる、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を含むアンチセンスプライマー（Ｂｕｒｇら（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：３５８４−３５９１）を以下に示すように合成した：
センスプライマー［配列番号：１］
【０１０２】
【化５】
0004602084.tif 000006
（ＥｃｏＲＩ部位に下線を付している。）
【０１０３】
アンチセンスプライマー［配列番号：９］
【０１０４】
【化６】
0004602084.tif 000007
（ＨｉｎｄＩＩＩ部位に下線を付している。）
【０１０５】
前記センス及びアンチセンスプライマーを、プラスミドｐＴｏｘｏ−Ｐ３０を含むＰＣＲ反応混合物に加えた。ＰＣＲ増幅及びＱｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットによる反応混合物の精製後に、反応混合物をＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、Ｔｏｘｏ  Ｐ３０ｄｅｌ１を含む８１９塩基対のＤＮＡフラグメントをアガロースゲル上で精製した。精製した８１９塩基対フラグメントを１６℃で一晩ｐＭＡＬ−ｃ２Ｘ／ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩに連結した。連結混合物をコンピテントＸＬ−１  Ｂｌｕｅ細胞に形質転換した。その形質転換体からミニプレップＤＮＡを作製し、制限酵素分析によってＰ３０  ＤＮＡ配列の存在に関してスクリーニングした。プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１（５２−３２４ａａ）は、ｐＭＡＬ−ｃ２ＸのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングされたＴｏｘｏ  Ｐ３０ｄｅｌ１遺伝子を含んだ。
【０１０６】
プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１（５２−３２４ａａ）のＤＮＡ配列の分析及び対応するアミノ酸配列の分析は、公開配列（Ｂｕｒｇら（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：３５８４−３５９１）からの２つのアミノ酸変化を生じさせる、Ｐ３０遺伝子内の塩基変化を明らかにした。これらの突然変異は、前記で引用したＢｕｒｇらの番号付け慣例に従えば、合成ＥｃｏＲＩ部位（ヌクレオチド４６４）の下流及びＢａｎＩ部位（ヌクレオチド１１００）の上流に位置した。プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１（５２−３２４ａａ）における突然変異を次のように矯正した：プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１Ｃ（５２−３２４ａａ）を、Ｔｏｘｏ  Ｐ３０遺伝子の５’矯正部分を含む、プラスミドｐＭＢＰ−ｐ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０（５２−３３６ａａ）からのＥｃｏＲＩ／ＢａｎＩフラグメント、及びＴｏｘｏ  Ｐ３０ｄｅｌ１遺伝子の３’部分を含む、プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１（５２−３２４ａａ）からのＢａｎＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントをｐＭＡＬ−ｃ２ＸのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングすることによって構築した（図７）。プラスミドｐＭＡＬ−ｃ２ＸをＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ベクター骨格をアガロースゲル上で精製した。プラスミドＤＮＡ、ｐＭＢＰ−ｐ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０（５２−３３６ａａ）及びｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１（５２−３２４ａａ）を一般的方法によって作製した。プラスミドｐＭＢＰ−ｐ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０（５２−３３６ａａ）及びｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１（５２−３２４ａａ）をＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、Ｔｏｘｏ  Ｐ３０遺伝子を含む８５５及び８１９塩基対のフラグメントをアガロースゲルで精製した。８５５塩基対のＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントをＢａｎＩで消化し、Ｔｏｘｏ  Ｐ３０遺伝子の５’矯正部分を含む６３７塩基対のＥｃｏＲＩ／ＢａｎＩフラグメントをアガロースゲル上で精製した。８１９塩基対のＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントをＢａｎＩで消化し、Ｔｏｘｏ  Ｐ３０ｄｅｌ１遺伝子の３’部分を含む１８２塩基対のＢａｎＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントをアガロースゲル上で精製した。精製した６３７及び１８２塩基対フラグメントを１６℃で一晩ｐＭＡＬ−ｃ２Ｘ／ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩに連結した。連結混合物をコンピテントＸＬ−１  Ｂｌｕｅ細胞に形質転換した。その形質転換体からミニプレップＤＮＡを作製し、制限酵素分析によってＰ３０  ＤＮＡ配列の存在に関してスクリーニングした。プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１Ｃ（５２−３２４ａａ）は、ｐＭＡＬ−ｃ２ＸのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングされたＴｏｘｏ  Ｐ３０ｄｅｌ１Ｃ遺伝子を含んだ。プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１Ｃ（５２−３２４ａａ）の完全なＤＮＡ配列［配列番号：１０］を図８に示し、及びＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１Ｃ（５２−３２４ａａ）融合タンパク質の対応するアミノ酸配列［配列番号：１１］も図８に示しており、その中で、配列番号１１のアミノ酸残基３９２−６��４はトキソプラスマのＰ３０抗原のアミノ酸５２−３２４に対応する。ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１Ｃ（５２−３２４ａａ）のＤＮＡ配列［配列番号：１２］を図９に示し、及びＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１Ｃ（５２−３２４ａａ）タンパク質の対応するアミノ酸配列［配列番号：１３］も図９に示しており、その中で、配列番号１３のアミノ酸残基１−２７３はトキソプラスマのＰ３０抗原のアミノ酸５２−３２４に対応する。
【０１０７】
（工程Ｄ：ｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ２（５２−３１１ａａ）の構築）
プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ２（５２−３１１ａａ）を、プラスミドｐＴｏｘｏ−Ｐ３０に含まれるＴｏｘｏ  Ｐ３０  ＤＮＡのＰＣＲ増幅によって得た、Ｔｏｘｏ  Ｐ３０を含むＤＮＡフラグメントをｐＭＡＬ−ｃ２ＸのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングすることによって構築した（図１０）。プラスミドｐＭＡＬ−ｃ２ＸをＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ベクター骨格をアガロースゲル上で精製した。ＥｃｏＲＩ部位を含む、Ｐ３０遺伝子のヌクレオチド４６４から始まるセンスプライマー及びＰ３０遺伝子のヌクレオチド１２４３から始まる、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を含むアンチセンスプライマー（Ｂｕｒｇら（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：３５８４−３５９１）を以下に示すように合成した：
センスプライマー［配列番号：１］
【０１０８】
【化７】
0004602084.tif 000008
（ＥｃｏＲＩ部位に下線を付している。）
【０１０９】
アンチセンスプライマー［配列番号：１４］
【０１１０】
【化８】
0004602084.tif 000009
（ＨｉｎｄＩＩＩ部位に下線を付している。）
【０１１１】
前記センス及びアンチセンスプライマーを、プラスミドｐＴｏｘｏ−Ｐ３０を含むＰＣＲ反応混合物に加えた。ＰＣＲ増幅及びＱｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットによる反応混合物の精製後に、反応混合物をＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、Ｔｏｘｏ  Ｐ３０ｄｅｌ２を含む７８０塩基対のＤＮＡフラグメントをアガロースゲル上で精製した。精製した７８０塩基対フラグメントを１６℃で一晩ｐＭＡＬ−ｃ２Ｘ／ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩに連結した。連結混合物をコンピテントＸＬ−１  Ｂｌｕｅ細胞に形質転換した。その形質転換体からミニプレップＤＮＡを作製し、制限酵素分析によってＰ３０  ＤＮＡ配列の存在に関してスクリーニングした。プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ２（５２−３１１ａａ）は、ｐＭＡＬ−ｃ２ＸのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングされたＴｏｘｏ  Ｐ３０ｄｅｌ２遺伝子を含んだ。プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ２（５２−３１１ａａ）の完全なＤＮＡ配列［配列番号：１５］を図１１に示し、及びＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ２（５２−３１１ａａ）融合タンパク質の対応するアミノ酸配列［配列番号：１６］も図１１に示しており、その中で、配列番号１６のアミノ酸残基３９２−６５１はトキソプラスマのＰ３０抗原のアミノ酸５２−３１１に対応する。ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ２（５２−３１１ａａ）のＤＮＡ配列［配列番号：１７］を図１２に示し、及びＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ２（５２−３１１ａａ）タンパク質の対応するアミノ酸配列［配列番号：１８］も図１２に示しており、その中で、配列番号１８のアミノ酸残基１−２６０はトキソプラスマのＰ３０抗原のアミノ酸５２−３１１に対応する。
【０１１２】
（工程Ｅ：ｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ３Ｃ（５２−３００ａａ）の構築）
プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ３Ｃ（５２−３００ａａ）の構築における中間体である、プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ３（５２−３００ａａ）を、プラスミドｐＴｏｘｏ−Ｐ３０に含まれるＴｏｘｏ  Ｐ３０  ＤＮＡのＰＣＲ増幅によって得た、Ｔｏｘｏ  Ｐ３０を含むＤＮＡフラグメントをｐＭＡＬ−ｃ２ＸのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングすることによって構築した（図１３）。プラスミドｐＭＡＬ−ｃ２ＸをＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ベクター骨格をアガロースゲル上で精製した。ＥｃｏＲＩ部位を含む、Ｐ３０遺伝子のヌクレオチド４６４から始まるセンスプライマー及びＰ３０遺伝子のヌクレオチド１２１０から始まる、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を含むアンチセンスプライマー（Ｂｕｒｇら（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：３５８４−３５９１）を以下に示すように合成した：
センスプライマー［配列番号：１］
【０１１３】
【化９】
0004602084.tif 000010
（ＥｃｏＲＩ部位に下線を付している。）
【０１１４】
アンチセンスプライマー［配列番号：１９］
【０１１５】
【化１０】
0004602084.tif 000011
（ＨｉｎｄＩＩＩ部位に下線を付している。）
【０１１６】
前記センス及びアンチセンスプライマーを、プラスミドｐＴｏｘｏ−Ｐ３０を含むＰＣＲ反応混合物に加えた。ＰＣＲ増幅及びＱｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットによる反応混合物の精製後に、反応混合物をＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、Ｔｏｘｏ  Ｐ３０ｄｅｌ３を含む７４７塩基対のＤＮＡフラグメントをアガロースゲル上で精製した。精製した７４７塩基対フラグメントを１６℃で一晩ｐＭＡＬ−ｃ２Ｘ／ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩに連結した。連結混合物をコンピテントＸＬ−１  Ｂｌｕｅ細胞に形質転換した。その形質転換体からミニプレップＤＮＡを作製し、制限酵素分析によってＰ３０  ＤＮＡ配列の存在に関してスクリーニングした。プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ３（５２−３００ａａ）は、ｐＭＡＬ−ｃ２ＸのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングされたＴｏｘｏ  Ｐ３０ｄｅｌ３遺伝子を含んだ。
【０１１７】
プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ３（５２−３００ａａ）のＤＮＡ配列の分析及び対応するアミノ酸配列の分析は、Ｐ３０タンパク質の未熟鎖終結を導く、終結コドンのアミノ酸の置換を生じさせるＰ３０遺伝子内の単一塩基変化を明らかにした。この突然変異は、Ｂｕｒｇらの番号付け慣例に従えば、合成ＥｃｏＲＩ部位（ヌクレオチド４６４）の下流及びＢａｎＩ部位（ヌクレオチド１１００）の上流に位置した。プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ３（５２−３００ａａ）における突然変異を次のように矯正した：
プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ３Ｃ（５２−３００ａａ）を、Ｔｏｘｏ  Ｐ３０遺伝子の５’矯正部分を含む、プラスミドｐＭＢＰ−ｐ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０（５２−３３６ａａ）からのＥｃｏＲＩ／ＢａｎＩフラグメント、及びＴｏｘｏ  Ｐ３０ｄｅｌ３遺伝子の３’部分を含む、プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ３（５２−３００ａａ）からのＢａｎＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントをｐＭＡＬ−ｃ２ＸのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングすることによって構築した（図１４）。プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ３Ｃ（５２−３００ａａ）を、２００２年９月＿＿のブタペスト条約の約定の下に、ＡＴＣＣ  １０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０−２２０９に寄託し、アクセッション番号ＡＴＣＣ＿＿を与えられた。
【０１１８】
プラスミドｐＭＡＬ−ｃ２ＸをＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ベクター骨格をアガロースゲル上で精製した。プラスミドＤＮＡ、ｐＭＢＰ−ｐ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０（５２−３３６ａａ）及びｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ３（５２−３００ａａ）を一般的方法によって作製した。プラスミドｐＭＢＰ−ｐ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０（５２−３３６ａａ）及びｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ３（５２−３００ａａ）をＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、Ｔｏｘｏ  Ｐ３０遺伝子を含む８５５及び７４７塩基対のフラグメントをアガロースゲルで精製した。８５５塩基対のＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントをＢａｎＩで消化し、Ｔｏｘｏ  Ｐ３０遺伝子の５’矯正部分を含む６３７塩基対のＥｃｏＲＩ／ＢａｎＩフラグメントをアガロースゲル上で精製した。７４７塩基対のＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントをＢａｎＩで消化し、Ｔｏｘｏ  Ｐ３０ｄｅｌ３遺伝子の３’部分を含む１１０塩基対のＢａｎＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントをアガロースゲル上で精製した。精製した６３７及び１１０塩基対フラグメントを１６℃で一晩ｐＭＡＬ−ｃ２Ｘ／ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩに連結した。連結混合物をコンピテントＸＬ−１  Ｂｌｕｅ細胞に形質転換した。その形質転換体からミニプレップＤＮＡを作製し、制限酵素分析によってＰ３０  ＤＮＡ配列の存在に関してスクリーニングした。プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ３Ｃ（５２−３００ａａ）は、ｐＭＡＬ−ｃ２ＸのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングされたＴｏｘｏ  Ｐ３０ｄｅｌ３Ｃ遺伝子を含んだ。プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ３Ｃ（５２−３００ａａ）の完全なＤＮＡ配列［配列番号：２０］を図１５に示し、及びＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ３Ｃ（５２−３００ａａ）融合タンパク質の対応するアミノ酸配列［配列番号：２１］も図１５に示しており、その中で、配列番号２１のアミノ酸残基３９２−６４０はトキソプラスマのＰ３０抗原のアミノ酸５２−３００に対応する。ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ３Ｃ（５２−３００ａａ）のＤＮＡ配列［配列番号：２２］を図１６に示し、及びＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ３Ｃ（５２−３００ａａ）タンパク質の対応するアミノ酸配列［配列番号：２３］も図１６に示しており、その中で、配列番号２３のアミノ酸残基１−２４９はトキソプラスマのＰ３０抗原のアミノ酸５２−３００に対応する。
【０１１９】
（工程Ｆ：ｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ４（５２−２９４ａａ）の構築）
プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ４Ｃ（５２−２９４ａａ）の構築における中間体である、プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ４（５２−２９４ａａ）を、プラスミドｐＴｏｘｏ−Ｐ３０に含まれるＴｏｘｏ  Ｐ３０  ＤＮＡのＰＣＲ増幅によって得た、Ｔｏｘｏ  Ｐ３０を含むＤＮＡフラグメントをｐＭＡＬ−ｃ２ＸのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングすることによって構築した（図１７）。プラスミドｐＭＡＬ−ｃ２ＸをＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ベクター骨格をアガロースゲル上で精製した。ＥｃｏＲＩ部位を含む、Ｐ３０遺伝子のヌクレオチド４６４から始まるセンスプライマー及びＰ３０遺伝子のヌクレオチド１１９２から始まる、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を含むアンチセンスプライマー（Ｂｕｒｇら（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：３５８４−３５９１）を以下に示すように合成した：
センスプライマー［配列番号：１］
【０１２０】
【化１１】
0004602084.tif 000012
（ＥｃｏＲＩ部位に下線を付している。）
【０１２１】
アンチセンスプライマー［配列番号：２４］
【０１２２】
【化１２】
0004602084.tif 000013
（ＨｉｎｄＩＩＩ部位に下線を付している。）
【０１２３】
前記センス及びアンチセンスプライマーを、プラスミドｐＴｏｘｏ−Ｐ３０を含むＰＣＲ反応混合物に加えた。ＰＣＲ増幅及びＱｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットによる反応混合物の精製後に、反応混合物をＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、Ｔｏｘｏ  Ｐ３０ｄｅｌ４を含む７２９塩基対のＤＮＡフラグメントをアガロースゲル上で精製した。精製した７２９塩基対フラグメントを１６℃で一晩ｐＭＡＬ−ｃ２Ｘ／ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩに連結した。連結混合物をコンピテントＸＬ−１  Ｂｌｕｅ細胞に形質転換した。その形質転換体からミニプレップＤＮＡを作製し、制限酵素分析によってＰ３０  ＤＮＡ配列の存在に関してスクリーニングした。プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ４（５２−２９４ａａ）は、ｐＭＡＬ−ｃ２ＸのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングされたＴｏｘｏ  Ｐ３０ｄｅｌ４遺伝子を含んだ。
【０１２４】
プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ４（５２−２９４ａａ）のＤＮＡ配列の分析及び対応するアミノ酸配列の分析は、公開配列（Ｂｕｒｇら（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：３５８４−３５９１）からの２つのアミノ酸変化を生じさせる、Ｐ３０遺伝子内の塩基変化を明らかにした。これらの突然変異は、Ｂｕｒｇらの番号付け慣例に従えば、合成ＥｃｏＲＩ部位（ヌクレオチド４６４）の下流及びＢａｎＩ部位（ヌクレオチド１１００）の上流に位置した。プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ４（５２−２９４ａａ）における突然変異を次のように矯正した：
プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ４Ｃ（５２−２９４ａａ）を、Ｔｏｘｏ  Ｐ３０遺伝子の５’矯正部分を含む、プラスミドｐＭＢＰ−ｐ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０（５２−３３６ａａ）からのＥｃｏＲＩ／ＢａｎＩフラグメント、及びＴｏｘｏ  Ｐ３０ｄｅｌ４遺伝子の３’部分を含む、プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ４（５２−２９４ａａ）からのＢａｎＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントをｐＭＡＬ−ｃ２ＸのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングすることによって構築した（図１８）。プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ４Ｃ（５２−２９４ａａ）を、２００２年９月のブタペスト条約の約定の下に、ＡＴＣＣ  １０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０−２２０９に寄託し、アクセッション番号ＡＴＣＣ＿＿を与えられた。
【０１２５】
プラスミドｐＭＡＬ−ｃ２ＸをＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ベクター骨格をアガロースゲル上で精製した。プラスミドＤＮＡ、ｐＭＢＰ−ｐ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０（５２−３３６ａａ）及びｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ４（５２−２９４ａａ）を一般的方法によって作製した。プラスミドｐＭＢＰ−ｐ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０（５２−３３６ａａ）及びｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ４（５２−２９４ａａ）をＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、Ｔｏｘｏ  Ｐ３０遺伝子を含む８５５及び７２９塩基対のフラグメントをアガロースゲルで精製した。８５５塩基対のＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントをＢａｎＩで消化し、Ｔｏｘｏ  Ｐ３０遺伝子の５’矯正部分を含む６３７塩基対のＥｃｏＲＩ／ＢａｎＩフラグメントをアガロースゲル上で精製した。７２９塩基対のＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントをＢａｎＩで消化し、Ｔｏｘｏ  Ｐ３０ｄｅｌ４遺伝子の３’部分を含む９２塩基対のＢａｎＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントをアガロースゲル上で精製した。精製した６３７及び９２塩基対フラグメントを１６℃で一晩ｐＭＡＬ−ｃ２Ｘ／ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩに連結した。連結混合物をコンピテントＸＬ−１  Ｂｌｕｅ細胞に形質転換した。その形質転換体からミニプレップＤＮＡを作製し、制限酵素分析によってＰ３０  ＤＮＡ配列の存在に関してスクリーニングした。プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ４Ｃ（５２−２９４ａａ）は、ｐＭＡＬ−ｃ２ＸのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングされたＴｏｘｏ  Ｐ３０ｄｅｌ４Ｃ遺伝子を含んだ。プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ４Ｃ（５２−２９４ａａ）の完全なＤＮＡ配列［配列番号：２５］を図１９に示し、及びＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ４Ｃ（５２−２９４ａａ）融合タンパク質の対応するアミノ酸配列［配列番号：２６］も図１９に示しており、その中で、配列番号２６のアミノ酸残基３９２−６３４はトキソプラスマのＰ３０抗原のアミノ酸５２−２９４に対応する。ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ４Ｃ（５２−２９４ａａ）のＤＮＡ配列［配列番号：２７］を図２０に示し、及びＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ４Ｃ（５２−２９４ａａ）タンパク質の対応するアミノ酸配列［配列番号：２８］も図２０に示しており、その中で、配列番号２８のアミノ酸残基１−２４３はトキソプラスマのＰ３０抗原のアミノ酸５２−２９４に対応する。
【０１２６】
（工程Ｇ：ｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ４ｄｅｌ８（８３−２９４ａａ）の構築）
プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ４ｄｅｌ８（８３−２９４ａａ）を、プラスミドｐＴｏｘｏ−Ｐ３０に含まれるＴｏｘｏ  Ｐ３０  ＤＮＡのＰＣＲ増幅によって得た、Ｔｏｘｏ  Ｐ３０を含むＤＮＡフラグメントをｐＭＡＬ−ｃ２ＸのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングすることによって構築した（図２１）。プラスミドｐＭＡＬ−ｃ２ＸをＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ベクター骨格をアガロースゲル上で精製した。ＥｃｏＲＩ部位を含む、Ｐ３０遺伝子のヌクレオチド５５７から始まるセンスプライマー及びＰ３０遺伝子のヌクレオチド１１９２から始まる、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を含むアンチセンスプライマー（Ｂｕｒｇら（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：３５８４−３５９１）を以下に示すように合成した：
センスプライマー［配列番号：２９］
【０１２７】
【化１３】
0004602084.tif 000014
（ＥｃｏＲＩ部位に下線を付している。）
【０１２８】
アンチセンスプライマー［配列番号：２４］
【０１２９】
【化１４】
0004602084.tif 000015
（ＨｉｎｄＩＩＩ部位に下線を付している。）
【０１３０】
前記センス及びアンチセンスプライマーを、プラスミドｐＴｏｘｏ−Ｐ３０を含むＰＣＲ反応混合物に加えた。ＰＣＲ増幅及びＱｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットによる反応混合物の精製後に、反応混合物をＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、Ｔｏｘｏ  Ｐ３０ｄｅｌ４ｄｅｌ８を含む６３６塩基対のＤＮＡフラグメントをアガロースゲル上で精製した。精製した６３６塩基対フラグメントを１６℃で一晩ｐＭＡＬ−ｃ２Ｘ／ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩに連結した。連結混合物をコンピテントＸＬ−１  Ｂｌｕｅ細胞に形質転換した。その形質転換体からミニプレップＤＮＡを作製し、制限酵素分析によってＰ３０  ＤＮＡ配列の存在に関してスクリーニングした。プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ４ｄｅｌ８（８３−２９４ａａ）は、ｐＭＡＬ−ｃ２ＸのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングされたＴｏｘｏ  Ｐ３０ｄｅｌ４ｄｅｌ８遺伝子を含んだ。プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ４ｄｅｌ８（８３−２９４ａａ）の完全なＤＮＡ配列［配列番号：３０］を図２２に示し、及びＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ４ｄｅｌ８（８３−２９４ａａ）融合タンパク質の対応するアミノ酸配列［配列番号：３１］も図２２に示しており、その中で、配列番号３１のアミノ酸残基３９２−６０３はトキソプラスマのＰ３０抗原のアミノ酸８３−２９４に対応する。ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ４ｄｅｌ８（８３−２９４ａａ）のＤＮＡ配列［配列番号：３２］を図２３に示し、及びＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ４ｄｅｌ８（８３−２９４ａａ）タンパク質の対応するアミノ酸配列［配列番号：３３］も図２３に示しており、その中で、配列番号３３のアミノ酸残基１−２１２はトキソプラスマのＰ３０抗原のアミノ酸８３−２９４に対応する。
【０１３１】
（工程Ｈ：ｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１０（５２−２８４ａａ）の構築）
プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１０（５２−２８４ａａ）を、プラスミドｐＴｏｘｏ−Ｐ３０に含まれるＴｏｘｏ  Ｐ３０  ＤＮＡのＰＣＲ増幅によって得た、Ｔｏｘｏ  Ｐ３０を含むＤＮＡフラグメントをｐＭＡＬ−ｃ２ＸのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングすることによって構築した（図２４）。プラスミドｐＭＡＬ−ｃ２ＸをＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ベクター骨格をアガロースゲル上で精製した。ＥｃｏＲＩ部位を含む、Ｐ３０遺伝子のヌクレオチド４６４から始まるセンスプライマー及びＰ３０遺伝子のヌクレオチド１１６２から始まる、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を含むアンチセンスプライマー（Ｂｕｒｇら（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：３５８４−３５９１）を以下に示すように合成した：
センスプライマー［配列番号：１］
【０１３２】
【化１５】
0004602084.tif 000016
（ＥｃｏＲＩ部位に下線を付している。）
【０１３３】
アンチセンスプライマー［配列番号：３４］
【０１３４】
【化１６】
0004602084.tif 000017
（ＨｉｎｄＩＩＩ部位に下線を付している。）
【０１３５】
前記センス及びアンチセンスプライマーを、プラスミドｐＴｏｘｏ−Ｐ３０を含むＰＣＲ反応混合物に加えた。ＰＣＲ増幅及びＱｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットによる反応混合物の精製後に、反応混合物をＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、Ｔｏｘｏ  Ｐ３０ｄｅｌ１０を含む６９９塩基対のＤＮＡフラグメントをアガロースゲル上で精製した。精製した６９９塩基対フラグメントを１６℃で一晩ｐＭＡＬ−ｃ２Ｘ／ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩに連結した。連結混合物をコンピテントＸＬ−１  Ｂｌｕｅ細胞に形質転換した。その形質転換体からミニプレップＤＮＡを作製し、制限酵素分析によってＰ３０  ＤＮＡ配列の存在に関してスクリーニングした。プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１０（５２−２８４ａａ））は、ｐＭＡＬ−ｃ２ＸのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングされたＴｏｘｏ  Ｐ３０ｄｅｌ１０遺伝子を含んだ。プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１０（５２−２８４ａａ）の完全なＤＮＡ配列［配列番号：３５］を図２５に示し、及びＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１０（５２−２８４ａａ）融合タンパク質の対応するアミノ酸配列［配列番号：３６］も図２５に示しており、その中で、配列番号３６のアミノ酸残基３９２−６２４は、配列番号３６のアミノ酸残基５４６がグルタミン酸の代わりにグリシンであることを除いて、トキソプラスマのＰ３０抗原のアミノ酸５２−２８４に対応する。ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１０（５２−２８４ａａ）のＤＮＡ配列［配列番号：３７］を図２６に示し、及びＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１０（５２−２８４ａａ）タンパク質の対応するアミノ酸配列［配列番号：３８］も図２６に示しており、その中で、配列番号３８のアミノ酸残基１−２３３は、配列番号３８のアミノ酸残基１５５がグルタミン酸の代わりにグリシンであることを除いて、トキソプラスマのＰ３０抗原のアミノ酸５２−２８４に対応する。
【０１３６】
（工程Ｉ：プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１１（５２−２１４ａａ）の構築）
プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１１（５２−２１４ａａ）を、プラスミドｐＴｏｘｏ−Ｐ３０に含まれるＴｏｘｏ  Ｐ３０  ＤＮＡのＰＣＲ増幅によって得た、Ｔｏｘｏ  Ｐ３０を含むＤＮＡフラグメントをｐＭＡＬ−ｃ２ＸのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングすることによって構築した（図２７）。プラスミドｐＭＡＬ−ｃ２ＸをＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ベクター骨格をアガロースゲル上で精製した。ＥｃｏＲＩ部位を含む、Ｐ３０遺伝子のヌクレオチド４６４から始まるセンスプライマー及びＰ３０遺伝子のヌクレオチド９５２から始まる、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を含むアンチセンスプライマー（Ｂｕｒｇら（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：３５８４−３５９１）を以下に示すように合成した：
センスプライマー［配列番号：１］
【０１３７】
【化１７】
0004602084.tif 000018
（ＥｃｏＲＩ部位に下線を付している。）
【０１３８】
アンチセンスプライマー［配列番号：３９］
【０１３９】
【化１８】
0004602084.tif 000019
（ＨｉｎｄＩＩＩ部位に下線を付している。）
【０１４０】
前記センス及びアンチセンスプライマーを、プラスミドｐＴｏｘｏ−Ｐ３０を含むＰＣＲ反応混合物に加えた。ＰＣＲ増幅及びＱｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットによる反応混合物の精製後に、反応混合物をＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、Ｔｏｘｏ  Ｐ３０ｄｅｌ１１を含む４８９塩基対のＤＮＡフラグメントをアガロースゲル上で精製した。精製した４８９塩基対フラグメントを１６℃で一晩ｐＭＡＬ−ｃ２Ｘ／ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩに連結した。連結混合物をコンピテントＸＬ−１  Ｂｌｕｅ細胞に形質転換した。その形質転換体からミニプレップＤＮＡを作製し、制限酵素分析によってＰ３０  ＤＮＡ配列の存在に関してスクリーニングした。プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１１（５２−２１４ａａ）は、ｐＭＡＬ−ｃ２ＸのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングされたＴｏｘｏ  Ｐ３０ｄｅｌ１１遺伝子を含んだ。プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１１（５２−２１４ａａ）の完全なＤＮＡ配列［配列番号：４０］を図２８に示し、及びＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１１（５２−２１４ａａ）融合タンパク質の対応するアミノ酸配列［配列番号：４１］も図２８に示しており、その中で、配列番号４１のアミノ酸残基３９２−５５４はトキソプラスマのＰ３０抗原のアミノ酸５２−２１４に対応する。ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１１（５２−２１４ａａ）のＤＮＡ配列［配列番号：４２］を図２９に示し、及びＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１１（５２−２１４ａａ）タンパク質の対応するアミノ酸配列［配列番号：４３］も図２９に示しており、その中で、配列番号４３のアミノ酸残基１−１６３はトキソプラスマのＰ３０抗原のアミノ酸５２−２１４に対応する。
【実施例３】
【０１４１】
大腸菌におけるｒｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０抗原の発現
（工程Ａ：大腸菌におけるクローニングされた遺伝子の発現）
実施例２のＭＢＰ融合タンパク質、ｒｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０（５２−３３６ａａ）、ｒｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１Ｃ（５２−３２４ａａ）、ｒｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ２（５２−３１１ａａ）、ｒｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ３Ｃ（５２−３００ａａ）、ｒｐＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ４Ｃ（５２−２９４ａａ）、ｒｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ４ｄｅｌ８（８３−２９４ａａ）、ｒｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１０（５２−２８４ａａ）及びｒｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１１（５２−２１４ａａ）を発現する細菌クローン、ｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０（５２−３３６ａａ）、ｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１Ｃ（５２−３２４ａａ）、ｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ２（５２−３１１ａａ）、ｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ３Ｃ（５２−３００ａａ）、ｐＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ４Ｃ（５２−２９４ａａ）、ｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ４ｄｅｌ８（８３−２９４ａａ）、ｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１０（５２−２８４ａａ）及びｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１１（５２−２１４ａａ）を、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む「ＳＵＰＥＲＢＲＯＴＨ  ＩＩ」培地で対数期まで増殖させ、先に述べられているようにＩＰＴＧを添加して（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（１９９３）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３１：６２９−６３５）ＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０融合タンパク質の合成を誘導した。誘導の４時間後に、細胞を採集し、タンパク質精製を行うまで細胞ペレットを−８０℃で保存した。
【０１４２】
（工程Ｂ：ＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０融合タンパク質の精製）
可溶性融合タンパク質、ｒｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０（５２−３３６ａａ）、ｒｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１Ｃ（５２−３２４ａａ）、ｒｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ２（５２−３１１ａａ）、ｒｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ３Ｃ（５２−３００ａａ）、ｒｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ４Ｃ（５２−２９４ａａ）、ｒｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ４ｄｅｌ８（８３−２９４ａａ）、ｒｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１０（５２−２８４ａａ）及びｒｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１１（５２−２１４ａａ）を、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  ｐＭＡＬ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆｕｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ指示マニュアルに従って細胞ペーストからの溶解後に精製した。溶解及び遠心分離後、融合タンパク質を含む粗上清をアミロースアフィニティーカラムに負荷した。カラムの洗浄後、融合タンパク質をマルトースでカラムから溶出し、適切なカラム分画をプールして、０．２μフィルターでろ過し、その後微粒子に被覆するまで２−８℃で保存した。
【実施例４】
【０１４３】
自動化Ｔｏｘｏ  ＩｇＧ及びＩｇＭ免疫測定法におけるｒｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０抗原の評価
（工程Ａ：微粒子へのｒｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０抗原の被覆）
微粒子を被覆する前に、ｒｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０（５２−３３６ａａ）、ｒｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１Ｃ（５２−３２４ａａ）、ｒｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ２（５２−３１１ａａ）、ｒｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ３Ｃ（５２−３００ａａ）、ｒｐＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ４Ｃ（５２−２９４ａａ）、ｒｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ４ｄｅｌ８（８３−２９４ａａ）、ｒｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１０（５２−２８４ａａ）及びｒｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１１（５２−２１４ａａ）抗原を１ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈し、３７℃で２４時間インキュベートした。熱処理工程後、ｒｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０抗原を、転倒型回転装置上で、室温で３０分間、ＥＤＡＣと共にＭＥＳ、ｐＨ６．２緩衝液を含む容器内の硫酸誘導体化ポリスチレン微粒子（１−５％固体）に別々に被覆した。次に、被覆した微粒子を１４，０００×ｇで１０分間の遠心分離によって収集し、上清を廃棄した。微粒子を、注射器と針を使用してＴｒｉｓ緩衝液、ｐＨ７．５、ＥＤＴＡ、塩化ナトリウム、Ｔｗｅｅｎ  ２０、ウシ胎仔血清（Ｔｏｘｏ抗体不含）、アジ化ナトリウム及びスクロースを含む微粒子保存緩衝液中に再懸濁した。その後、微粒子を微粒子保存緩衝液で０．１−０．３％固体の最終濃度に希釈し、プラスチックビンに満たした。
【０１４４】
（工程Ｂ：ＡｘＳＹＭ（登録商標）Ｔｏｘｏ  ＩｇＧ  ｖ２試薬パック、検定物質、対照、パネル６及びアッセイディスケットの説明）
自動化ＡｘＳＹＭ  Ｔｏｘｏ  ＩｇＧ  ｖ２アッセイ用試薬パックはヒト抗Ｔｏｘｏ  ＩｇＧの検出のために設計されており、以下の成分から成る。ビンＮｏ．１は、微粒子保存緩衝液中の精製組換えＴｏｘｏ抗原（実施例４Ａ）で被覆した微粒子を含む。アッセイにおいてヒト抗ＭＢＰ又は抗ＣＫＳ抗体が偽陽性反応を生じさせるのを防ぐため、精製ＭＢＰ又はＣＫＳを微粒子保存緩衝液に添加することができる。ビンＮｏ．２は、好ましいコンジュゲートであるヤギ抗ヒトＩｇＧアルカリホスファターゼコンジュゲートを含む。このコンジュゲートを滴定して０．１−５μｇ／ｍｌの作業濃度を決定する。コンジュゲートを、Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ７．４、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及び亜鉛、Ｎｉｐａｓｅｐｔ、Ａ５６６２０、脱脂粉乳、Ｂｒｉｊ−３５、マウス血清及びマンニトールを含むコンジュゲート希釈液に希釈する。ビンＮｏ．３は、微粒子及びアッセイ基質への非特異的結合を最小限に抑えるための好ましいアッセイ希釈液を含む。このアッセイ希釈液は、塩化ナトリウム、ＥＤＴＡナトリウム、脱脂粉乳、Ｎｉｐａｓｅｐｔ、Ａ５６６２０及びＴｗｅｅｎ  ２０を含むＴｒｉｓ緩衝液、ｐＨ７．５から成る。ビンＮｏ．４は、リン酸緩衝ライン希釈液（ｌｉｎｅ  ｄｉｌｕｅｎｔ）を含む。
【０１４５】
Ａ−Ｆと表示された６つのアッセイ検定物質は、Ｔｏｘｏ  ＩｇＧ陽性血漿プール又はヒト抗Ｔｏｘｏ  ＩｇＧモノクローナル抗体から誘導され、ＡｘＳＹＭ（登録商標）Ｔｏｘｏ  ＩｇＧ  ｖ２アッセイを検定するために必要である。これらの検定物質は、先にＴＯＸ−Ｓ  ＷＨＯ国際標準に適合した検定物質に適合する。これらの検定物質の濃度範囲は０−３００ＩＵ／ｍｌである。陽性及び陰性対照は、アッセイの較正を評価し、アッセイの有効性を確認するために必要である。陽性対照は、Ｔｏｘｏ  ＩｇＧ陽性血漿プール又はヒト抗Ｔｏｘｏ  ＩｇＧモノクローナル抗体から作製する。陰性対照は、Ｔｏｘｏ  ＩｇＧ陰性血漿プールから作製する。パネル６は、急性トキソプラスマ症を有する供血者由来のＴｏｘｏ  ＩｇＧ及びＩｇＭ陽性血漿単位のプールである。
【０１４６】
ＡｘＳＹＭ（登録商標）Ｔｏｘｏ  ＩｇＧ  ｖ２アッセイ用のアッセイディスケットは、Ａｂｂｏｔｔ  「ＡｘＳＹＭ（登録商標）」装置（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬ）で自動化免疫測定法を実施するために必要なアッセイプロトコールソフトウエアを含む。前述したＡｘＳＹＭ（登録商標）Ｔｏｘｏ  ＩｇＧ  ｖ２試薬パック、アッセイ検定物質及び対照に加えて、装置上に配置された以下のアッセイ成分が、アッセイを実施するために必要である：試料コップ、ＡｘＳＹＭ（登録商標）ライン希釈液、ＭＥＩＡ緩衝液、反応容器、ＭＵＰ及び基質細胞。自動化アッセイのための事象の順序は次の通りである：キッティングセンター（ｋｉｔｔｉｎｇ  ｃｅｎｔｅｒ）内のピペット分注プローブが患者試料及びライン希釈液を反応容器の試料ウエルに送達する。次にピペット分注プローブが、試薬パックからアッセイに必要とされる適切な容量のアッセイ希釈液、ライン希釈液及びコンジュゲートを指定された反応容器ウエルに供給する。このプローブが、次に、試薬パックから組換えＴｏｘｏ抗原被覆微粒子及び希釈試料のアリコートを指定反応容器ウエルに送達する。次に反応容器を処理回転台（カルーセル）に移す。Ｔｏｘｏ特異的抗体がＴｏｘｏ組換え抗原被覆微粒子に結合して、抗原−抗体複合体を形成する。アッセイ希釈液を反応混合物及び基質細胞に添加し、反応混合物のアリコートを補助回転台内のガラス繊維基質に移す。微粒子は不可逆的に基質に結合する。基質をＭＥＩＡ緩衝液及びライン希釈液で洗って、非結合抗体を除去する。ヤギ抗ヒトＩｇＧアルカリホスフェートコンジュゲートが基質に添加され、Ｔｏｘｏ組換え抗原によって捕獲されたＴｏｘｏ特異的ＩｇＧに結合する。次に基質をＭＥＩＡ緩衝液で洗って非結合酵素−抗体コンジュゲートを除去する。酵素基質ＭＵＰを基質に添加する。ヤギ抗ヒトＩｇＧに結合した基質上に存在するアルカリホスファターゼ酵素がＭＵＰからのホスホリル部分の加水分解を触媒し、ＡｘＳＹＭ  ＭＥＩＡ光学系によって測定される高度蛍光産物を生成する。シグナル強度（速度計数）は、試料中に存在するＴｏｘｏ特異的ＩｇＧ抗体の量に比例する。
【０１４７】
（工程Ｃ：ＡｘＳＹＭ（登録商標）Ｔｏｘｏ  ＩｇＭ  ｖ２試薬パック、指数検定物質、対照及びアッセイディスケットの説明）
自動化ＡｘＳＹＭ  Ｔｏｘｏ  ＩｇＭ  ｖ２アッセイ用試薬パックはヒト抗Ｔｏｘｏ  ＩｇＭの検出のために設計されており、以下の成分から成る。ビンＮｏ．１は、微粒子保存緩衝液中の精製組換えＴｏｘｏ抗原（実施例４Ａ）で被覆した微粒子を含む。アッセイにおいてヒト抗ＭＢＰ又は抗ＣＫＳ抗体が偽陽性反応を生じさせるのを防ぐため、精製ＭＢＰ又はＣＫＳを微粒子保存緩衝液に添加することができる。ビンＮｏ．２は、好ましいコンジュゲートであるヤギ抗ヒトＩｇＭアルカリホスファターゼコンジュゲートを含む。このコンジュゲートを滴定して０．１−５μｇ／ｍｌの作業濃度を決定する。コンジュゲートを、Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ７．４、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及び亜鉛、Ｎｉｐａｓｅｐｔ、Ａ５６６２０、脱脂粉乳、Ｂｒｉｊ−３５、マウス血清及びマンニトールを含むコンジュゲート希釈液に希釈する。ビンＮｏ．３は、微粒子及びアッセイ基質への非特異的結合を最小限に抑えるための好ましいアッセイ希釈液を含む。このアッセイ希釈液は、塩化ナトリウム、ＥＤＴＡナトリウム、脱脂粉乳、Ｎｉｐａｓｅｐｔ、Ａ５６６２０及びＴｗｅｅｎ  ２０を含むＴｒｉｓ緩衝液、ｐＨ７．５から成る。ビンＮｏ．４は、リン酸緩衝ライン希釈液又はＲＦ中和緩衝液のいずれかを含む。
【０１４８】
指数検定物質は、Ｔｏｘｏ  ＩｇＭ陽性血漿プール又はヒト抗Ｔｏｘｏ  ＩｇＭモノクローナル抗体から誘導され、ＡｘＳＹＭ（登録商標）Ｔｏｘｏ  ＩｇＭ  ｖ２アッセイを検定するために必要である。陽性及び陰性対照は、アッセイの較正を評価し、アッセイの有効性を確認するために必要である。陽性対照は、Ｔｏｘｏ  ＩｇＭ陽性血漿プール又はヒト抗Ｔｏｘｏ  ＩｇＭモノクローナル抗体から作製する。陰性対照は、Ｔｏｘｏ  ＩｇＭ陰性血漿プールから作製する。
【０１４９】
ＡｘＳＹＭ（登録商標）Ｔｏｘｏ  ＩｇＭ  ｖ２アッセイ用のアッセイディスケットは、Ａｂｂｏｔｔ  「ＡｘＳＹＭ（登録商標）」装置（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬ）で自動化免疫測定法を実施するために必要なアッセイプロトコールソフトウエアを含む。前述したＡｘＳＹＭ（登録商標）Ｔｏｘｏ  ＩｇＭ  ｖ２試薬パック、指数検定物質及び対照に加えて、装置上に配置された以下のアッセイ成分が、アッセイを実施するために必要である：試料コップ、ＡｘＳＹＭ（登録商標）ライン希釈液、ＭＥＩＡ緩衝液、反応容器、ＭＵＰ及び基質細胞。自動化アッセイのための事象の順序は次の通りである：キッティングセンター内のピペット分注プローブが患者試料及びライン希釈液を反応容器の試料ウエルに送達する。次にピペット分注プローブが、試薬パックからアッセイに必要とされる適切な容量のアッセイ希釈液、ライン希釈液又はＲＦ中和緩衝液及びコンジュゲートを指定された反応容器ウエルに供給する。このプローブが、次に、試薬パックから組換えＴｏｘｏ抗原被覆微粒子及び希釈試料のアリコートを指定反応容器ウエルに送達する。次に反応容器を処理回転台に移す。Ｔｏｘｏ特異的抗体がＴｏｘｏ組換え抗原被覆微粒子に結合して、抗原−抗体複合体を形成する。アッセイ希釈液を反応混合物及び基質細胞に添加し、反応混合物のアリコートを補助回転台内のガラス繊維基質に移す。微粒子は不可逆的に基質に結合する。基質をＭＥＩＡ緩衝液及びライン希釈液又はＲＦ中和緩衝液で洗って、非結合抗体を除去する。ヤギ抗ヒトＩｇＭアルカリホスフェートコンジュゲートが基質に添加され、Ｔｏｘｏ組換え抗原によって捕獲されたＴｏｘｏ特異的ＩｇＭに結合する。次に基質をＭＥＩＡ緩衝液で洗って非結合酵素−抗体コンジュゲートを除去する。酵素基質ＭＵＰを基質に添加する。ヤギ抗ヒトＩｇＭに結合した基質上に存在するアルカリホスファターゼ酵素がＭＵＰからのホスホリル部分の加水分解を触媒し、ＡｘＳＹＭ（登録商標）  ＭＥＩＡ光学系によって測定される高度蛍光産物を生成する。シグナル強度（速度計数）は、試料中に存在するＴｏｘｏ特異的ＩｇＭ抗体の量に比例する。
【０１５０】
（工程Ｄ：ＡｘＳＹＭ（登録商標）Ｔｏｘｏ  ＩｇＧ  ｖ２及びＴｏｘｏ  ＩｇＭ  ｖ２免疫測定法におけるＭＢＰ融合タンパク質、ｒｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０（５２−３３６ａａ）、ｒｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１Ｃ（５２−３２４ａａ）、ｒｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ２（５２−３１１ａａ）、ｒｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ３Ｃ（５２−３００ａａ）、ｒｐＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ４Ｃ（５２−２９４ａａ）、ｒｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ４ｄｅｌ８（８３−２９４ａａ）、ｒｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１０（５２−２８４ａａ）及びｒｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１１（５２−２１４ａａ）の評価
実施例４Ａで述べたＴｏｘｏ抗原で被覆した微粒子を用いて実施例４Ｂ及び４Ｃで述べたようにＡｘＳＹＭ（登録商標）Ｔｏｘｏ  ＩｇＧ及びＩｇＭ試薬パックを構築した。Ｔｏｘ  ＩｇＧ  Ａ及びＦ検定物質（Ａｃａｌ及びＦｃａｌ）及びパネル６（ＰＮＬ６）をＡｘＳＹＭ  Ｔｏｘｏ  ＩｇＧ  ｖ２試薬パックで試験し、またＴｏｘｏ  ＩｇＭ陰性対照（ＮＣ）、指数検定物質（ＩＣ）及びパネル６（ＰＮＬ６）をＡｘＳＹＭ（登録商標）  Ｔｏｘｏ  ＩｇＭ  ｖ２試薬パックで試験した。その結果を以下の表１及び２に示す。
【０１５１】
【表１】
0004602084.tif 000020
0004602084.tif 000021
【０１５２】
【表２】
0004602084.tif 000022
0004602084.tif 000023
【０１５３】
表１及び２の両方で認められるように、意外な結果が得られた。特に、ＴｏｘｏＰ３０抗原のＣ末端からのアミノ酸の欠失は、４２アミノ酸の欠失までの（表１及び２においてタンパク質ｒｐＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ４Ｃ（５２−２９４ａａ）をタンパク質ｒｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０（５２−３３６ａａ）と比較する）、パネル６に関する高い速度計数及びＦｃａｌ／Ａｃａｌ、パネル６／Ａｃａｌ及びパネル６／ＮＣについての改善された速度計数比によって測定されるように、改善されたＴｏｘｏ特異的ＩｇＧ及びＩｇＭ免疫反応性を生じさせた。遺伝子操作したｒｐＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ４Ｃ（５２−２９４ａａ）タンパク質は、パネル６に関する最大速度計数及び両方のアッセイにおいて最大速度計数比を生じた。これらの結果は、ＴｏｘｏＰ３０のＣ末端の小さな欠失は、完全長タンパク質では閉塞されているＴｏｘｏ特異的ＩｇＧ及びＩｇＭの結合のための新しいエピトープを明らかにする又は使用可能にすることを示唆する。さらなるＣ末端アミノ酸の欠失（表１及び２においてタンパク質ｒｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１０（５２−２８４ａａ）及びｒｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１１（５２−２１４ａａ）をタンパク質ｒｐＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ４Ｃ（５２−２９４ａａ）と比較する）は免疫反応性の低下をもたらし、より大きなＣ末端欠失によるＩｇＧ及びＩｇＭエピトープの喪失を示唆した。これに対し、タンパク質ｒｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ４ｄｅｌ８（８３−２９４ａａ）を生成する、最適タンパク質ｒｐＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ４Ｃ（５２−２９４ａａ）のＮ末端における小さな３０アミノ酸欠失の導入は、Ｔｏｘｏ特異的ＩｇＧ及びＩｇＭ免疫反応性を完全に排除した。これらの結果はまた、ＴｏｘｏＰ３０タンパク質のＣ末端部分に存在するシステイン残基の一部は最適Ｔｏｘｏ  ＩｇＧ及びＩｇＭ免疫反応性のために必要ではないことを示唆する。例えば、最適タンパク質ｒｐＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ４Ｃ（５２−２９４ａａ）は１１個のシステイン残基を含み、良好であるが最適ではない免疫反応性を示したタンパク質ｒｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１１（５２−２１４ａａ）は７個のシステイン残基を含んだ。
【実施例５】
【０１５４】
システイン残基をアラニンに変更する突然変異を含むＴｏｘｏ  Ｐ３０合成遺伝子の構築
実施例４ＤにおけるＴｏｘｏ  Ｐ３０遺伝子の欠失分析から得た結果に基づき、新しいシリーズのＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０融合タンパク質を構築した。成熟Ｔｏｘｏ  Ｐ３０タンパク質には１２個のシステイン残基が存在するので（Ｂｕｒｇら（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１，３５８４−３５９１；Ｖｅｌｇｅ−Ｒｏｕｓｓｅｌら（１９９４）Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．６６：３１−３８）、数学的に、１２個のシステイン残基の１個又はそれ以上をアラニンに変更することの様々な組合せを含む、構築することができる２１２又は４，０９６個の異なるＴｏｘｏ  Ｐ３０タンパク質が存在する。Ｔｏｘｏ  Ｐ３０抗原の免疫反応性をさらに最適化するために４，０９６の異なるシステインからアラニンへの組合せすべてを試みることは確かに不可能である。それ故、実施例４Ｄにおける結果を使用して、自動化免疫測定法において改善されたＴｏｘｏ  ＩｇＧ及びＩｇＭ免疫反応性の潜在的可能性を有する、構築すべき異なる突然変異型Ｔｏｘｏ  Ｐ３０遺伝子の数をしぼった。様々なシステイン残基をアラニンに変更し、同時にＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ３Ｃ（５２−３００ａａ）（配列番号２２及び図１６）内に存在するＴｏｘｏ  Ｐ３０遺伝子に同じ３’欠失を導入する突然変異を含む３つのＴｏｘｏ  Ｐ３０遺伝子のインビトロ合成のために、突然変異型オリゴヌクレオチドを設計した。
【０１５５】
各々のＴｏｘｏ  Ｐ３０遺伝子の合成は、１６のオーバーラップオリゴヌクレオチドの合成と構築を必要とした。これらのオリゴヌクレオチドは、２０−２３残基がオーバーラップする隣接オリゴヌクレオチドと共に長さ６７−７２塩基の範囲であった。Ｐ３０遺伝子を、ＥｃｏＲＩ部位を含むＰ３０センスプライマーとＨｉｎｄＩＩＩ部位を含むアンチセンスプライマーを使用した反復（ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ）ＰＣＲとそれに続く構築遺伝子のＰＣＲ増幅によって作製した（Ｗｉｔｈｅｒｓ−Ｍａｒｔｉｎｅｚら（１９９９）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｒ．１２：１１１３−１１２０；Ｐｒｙｔｕｌｌａら（１９９６）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３９９：２８３−２８９；Ｋａｔａｏｋａら（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２５０：４０９−４１３）。ＰＣＲ増幅後、図３０に図式的に示すように、Ｐ３０遺伝子をＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、アガロースゲルで精製して、あらかじめＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化しておいたｐＭＡＬ−ｃ２Ｘベクター骨格に連結した。
【０１５６】
（工程Ａ：ｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０  ＭＩＸ１の構築）
プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０  ＭＩＸ１を、１６オリゴヌクレオチドの合成と構築によって得た、Ｔｏｘｏ  Ｐ３０を含む合成ＤＮＡフラグメントをｐＭＡＬ−ｃ２ＸのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングすることによって構築した（図３０）。このプラスミドは、プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ１内のＴｏｘｏ  Ｐ３０  ＤＮＡ配列が変化して、Ｔｏｘｏ  Ｐ３０の１２個のシステイン残基のうち５個（システインＮｏ．８−１２）がアラニンに変わっているという点で、実施例２ＥのプラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ３Ｃ（５２−３００ａａ）と異なる。プラスミドｐＭＡＬ−ｃ２ＸをＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ベクター骨格をアガロースゲルで精製した。ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ１遺伝子の構築のために以下のオリゴヌクレオチドを合成した：
【０１５７】
【化１９】
0004602084.tif 000024
0004602084.tif 000025
0004602084.tif 000026
【０１５８】
遺伝子合成の第一工程では、各々のオリゴヌクレオチド４ピコモルを一緒に混合し、次のような反復ＰＣＲを用いて構築した：９５℃、５分間の１サイクル、次いで９５℃、１分間、５５℃、２分間、７２℃、２分間の３５サイクル；７２℃、１０分間の１サイクル、次に４℃の浸漬サイクル。遺伝子合成の第二工程では、ＥｃｏＲＩ部位を含む、Ｐ３０遺伝子のヌクレオチド４６４から始まるセンスプライマー及びＰ３０遺伝子のヌクレオチド１２１０から始まる、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を含むアンチセンスプライマー（Ｂｕｒｇら（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：３５８４−３５９１）を以下に示すように合成した：
センスプライマー［配列番号：１］
【０１５９】
【化２０】
0004602084.tif 000027
（ＥｃｏＲＩ部位に下線を付している。）
【０１６０】
アンチセンスプライマー［配列番号：６０］
【化２１】
0004602084.tif 000028
（ＨｉｎｄＩＩＩ部位に下線を付している。）
【０１６１】
前記センス及びアンチセンスプライマーを、遺伝子合成の第一工程からの構築オリゴヌクレオチドを含むＰＣＲ反応混合物に加えた。ＰＣＲ増幅及びＱｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットによる反応混合物の精製後に、反応混合物をＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、Ｔｏｘｏ  Ｐ３０ＭＩＸ１を含む７４７塩基対のＤＮＡフラグメントをアガロースゲルで精製した。精製した７４７塩基対フラグメントを１６℃で一晩ｐＭＡＬ−ｃ２Ｘ／ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩに連結した。連結混合物をコンピテントＸＬ−１  Ｂｌｕｅ細胞に形質転換した。その形質転換体からミニプレップＤＮＡを作製し、制限酵素分析によってＰ３０合成ＤＮＡ配列の存在に関してスクリーニングした。プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ１は、ｐＭＡＬ−ｃ２ＸのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングされたＴｏｘｏ  Ｐ３０ＭＩＸ１遺伝子を含んだ。プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ１の完全なＤＮＡ配列［配列番号：６１］を図３１に示し、及びＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ１融合タンパク質の対応するアミノ酸配列［配列番号：６２］も図３１に示しており、その中で、配列番号２１の５５５、５７０、５７８、６２５、６３５に位置するシステインアミノ酸残基は、今や配列番号６２の５５５、５７０、５７８、６２５、６３５に位置するアラニンアミノ酸である。プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ１を、２００２年９月のブタペスト条約の約定の下に、ＡＴＣＣ  １０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０−２２０９に寄託し、アクセッション番号ＡＴＣＣ＿＿を与えられた。ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ１のＤＮＡ配列［配列番号：６３］を図３２に示し、及びＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ１タンパク質の対応するアミノ酸配列［配列番号：６４］も図３２に示しており、その中で、配列番号２３の１６４、１７９、１８７、２３４、２４４に位置するシステインアミノ酸残基は、今や配列番号６４の１６４、１７９、１８７、２３４、２４４に位置するアラニンアミノ酸である。
【０１６２】
（工程Ｂ：ｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０  ＭＩＸ３の構築）
プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０  ＭＩＸ３を、１６オリゴヌクレオチドの合成と構築によって得た、Ｔｏｘｏ  Ｐ３０を含む合成ＤＮＡフラグメントをｐＭＡＬ−ｃ２ＸのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングすることによって構築した（図３０）。このプラスミドは、プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ３内のＴｏｘｏ  Ｐ３０  ＤＮＡ配列が変化してＴｏｘｏ  Ｐ３０の１２個のシステイン残基のうち６個（システインＮｏ．７−１２）がアラニンに変わっているという点で、実施例２ＥのプラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ３Ｃ（５２−３００ａａ）と異なる。プラスミドｐＭＡＬ−ｃ２ＸをＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ベクター骨格をアガロースゲルで精製した。ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ３遺伝子の構築のために以下のオリゴヌクレオチドを合成した：
【０１６３】
【化２２】
0004602084.tif 000029
0004602084.tif 000030
【０１６４】
遺伝子合成の第一工程では、各々のオリゴヌクレオチド４ピコモルを一緒に混合し、次のような反復ＰＣＲを用いて構築した：９５℃、５分間の１サイクル、次いで９５℃、１分間、５５℃、２分間、７２℃、２分間の３５サイクル；７２℃、１０分間の１サイクル、次に４℃の浸漬サイクル。遺伝子合成の第二工程では、ＥｃｏＲＩ部位を含む、Ｐ３０遺伝子のヌクレオチド４６４から始まるセンスプライマー及びＰ３０遺伝子のヌクレオチド１２１０から始まる、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を含むアンチセンスプライマー（Ｂｕｒｇら（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：３５８４−３５９１）を以下に示すように合成した：
センスプライマー［配列番号：１］
【０１６５】
【化２３】
0004602084.tif 000031
（ＥｃｏＲＩ部位に下線を付している。）
【０１６６】
アンチセンスプライマー［配列番号：６０］
【０１６７】
【化２４】
0004602084.tif 000032
（ＨｉｎｄＩＩＩ部位に下線を付している。）
【０１６８】
前記センス及びアンチセンスプライマーを、遺伝子合成の第一工程からの構築オリゴヌクレオチドを含むＰＣＲ反応混合物に加えた。ＰＣＲ増幅及びＱｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットによる反応混合物の精製後に、反応混合物をＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、Ｔｏｘｏ  Ｐ３０ＭＩＸ３を含む７４７塩基対のＤＮＡフラグメントをアガロースゲルで精製した。精製した７４７塩基対フラグメントを１６℃で一晩ｐＭＡＬ−ｃ２Ｘ／ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩに連結した。連結混合物をコンピテントＸＬ−１  Ｂｌｕｅ細胞に形質転換した。その形質転換体からミニプレップＤＮＡを作製し、制限酵素分析によってＰ３０合成ＤＮＡ配列の存在に関してスクリーニングした。プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ３は、ｐＭＡＬ−ｃ２ＸのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングされたＴｏｘｏ  Ｐ３０ＭＩＸ３遺伝子を含んだ。プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ３の完全なＤＮＡ配列［配列番号：６６］を図３３に示し、及びＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ３融合タンパク質の対応するアミノ酸配列［配列番号：６７］も図３３に示しており、その中で、配列番号２１の５３０、５５５、５７０、５７８、６２５、６３５に位置するシステインアミノ酸残基は、今や配列番号６７の５３０、５５５、５７０、５７８、６２５、６３５に位置するアラニンアミノ酸である。ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ３のＤＮＡ配列［配列番号：６８］を図３４に示し、及びＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ３タンパク質の対応するアミノ酸配列［配列番号：６９］も図３４に示しており、その中で、配列番号２３の１３９、１６４、１７９、１８７、２３４、２４４に位置するシステインアミノ酸残基は、今や配列番号６９の１３９、１６４、１７９、１８７、２３４、２４４に位置するアラニンアミノ酸である。
【０１６９】
（工程Ｃ：ｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０  ＭＩＸ５の構築）
プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０  ＭＩＸ５を、１６オリゴヌクレオチドの合成と構築によって得た、Ｔｏｘｏ  Ｐ３０を含む合成ＤＮＡフラグメントをｐＭＡＬ−ｃ２ＸのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングすることによって構築した（図３０）。このプラスミドは、プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ３内のＴｏｘｏ  Ｐ３０  ＤＮＡ配列が変化して、Ｔｏｘｏ  Ｐ３０の１２個のシステイン残基のうち６個（システインＮｏ．２及び８−１２）がアラニンに変わっているという点で、実施例２ＥのプラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ３Ｃ（５２−３００ａａ）と異なる。プラスミドｐＭＡＬ−ｃ２ＸをＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ベクター骨格をアガロースゲルで精製した。ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ５遺伝子の構築のために以下のオリゴヌクレオチドを合成した：
【０１７０】
【化２５】
0004602084.tif 000033
0004602084.tif 000034
【０１７１】
遺伝子合成の第一工程では、各々のオリゴヌクレオチド４ピコモルを一緒に混合し、次のような反復ＰＣＲを用いて構築した：９５℃、５分間の１サイクル、次いで９５℃、１分間、５５℃、２分間、７２℃、２分間の３５サイクル；７２℃、１０分間の１サイクル、次に４℃の浸漬サイクル。遺伝子合成の第二工程では、ＥｃｏＲＩ部位を含む、Ｐ３０遺伝子のヌクレオチド４６４から始まるセンスプライマー及びＰ３０遺伝子のヌクレオチド１２１０から始まる、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を含むアンチセンスプライマー（Ｂｕｒｇら（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：３５８４−３５９１）を以下に示すように合成した：
センスプライマー［配列番号：１］
【０１７２】
【化２６】
0004602084.tif 000035
（ＥｃｏＲＩ部位に下線を付している。）
【０１７３】
アンチセンスプライマー［配列番号：６０］
【０１７４】
【化２７】
0004602084.tif 000036
（ＨｉｎｄＩＩＩ部位に下線を付している。）
【０１７５】
前記センス及びアンチセンスプライマーを、遺伝子合成の第一工程からの構築オリゴヌクレオチドを含むＰＣＲ反応混合物に加えた。ＰＣＲ増幅及びＱｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットによる反応混合物の精製後に、反応混合物をＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、Ｔｏｘｏ  Ｐ３０ＭＩＸ３を含む７４７塩基対のＤＮＡフラグメントをアガロースゲルで精製した。精製した７４７塩基対フラグメントを１６℃で一晩ｐＭＡＬ−ｃ２Ｘ／ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩに連結した。連結混合物をコンピテントＸＬ−１  Ｂｌｕｅ細胞に形質転換した。その形質転換体からミニプレップＤＮＡを作製し、制限酵素分析によってＰ３０合成ＤＮＡ配列の存在に関してスクリーニングした。プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ５は、ｐＭＡＬ−ｃ２ＸのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングされたＴｏｘｏ  Ｐ３０ＭＩＸ５遺伝子を含んだ。プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ５の完全なＤＮＡ配列［配列番号：７１］を図３５に示し、及びＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ５融合タンパク質の対応するアミノ酸配列［配列番号：７２］も図３５に示しており、その中で、配列番号２１の４２２、５５５、５７０、５７８、６２５、６３５に位置するシステインアミノ酸残基は、今や配列番号７２の４２２、５５５、５７０、５７８、６２５、６３５に位置するアラニンアミノ酸である。ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ５のＤＮＡ配列［配列番号：７３］を図３６に示し、及びＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ５タンパク質の対応するアミノ酸配列［配列番号：７４］も図３６に示しており、その中で、配列番号２３の３１、１６４、１７９、１８７、２３４、２４４に位置するシステインアミノ酸残基は、今や配列番号７４の３１、１６４、１７９、１８７、２３４、２４４に位置するアラニンアミノ酸である。
【実施例６】
【０１７６】
大腸菌におけるｒｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ抗原の発現
（工程Ａ：大腸菌におけるクローニングされた遺伝子の発現）
実施例５のＭＢＰ融合タンパク質、ｒｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ１、ｒｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ３及びｒｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ５を発現する細菌クローン、ｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ１、ｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ３及びｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ５を、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む「ＳＵＰＥＲＢＲＯＴＨ  ＩＩ」培地で対数期まで増殖させ、先に述べられているようにＩＰＴＧを添加して（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（１９９３）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３１：６２９−６３５）ＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ融合タンパク質の合成を誘導した。誘導の４時間後に、細胞を採集し、タンパク質精製を行うまで細胞ペレットを−８０℃で保存した。
【０１７７】
（工程Ｂ：ＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ融合タンパク質の精製）
可溶性融合タンパク質、ｒｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ１、ｒｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ３及びｒｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ５を、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  ｐＭＡＬ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆｕｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ指示マニュアルに従って細胞ペーストからの溶解後に精製した。溶解及び遠心分離後、融合タンパク質を含む粗上清をアミロースアフィニティーカラムに負荷した。カラムの洗浄後、融合タンパク質をマルトースでカラムから溶出し、適切なカラム分画をプールして、０．２μフィルターでろ過し、その後微粒子に被覆するまで２−８℃で保存した。
【実施例７】
【０１７８】
自動化Ｔｏｘｏ  ＩｇＧ及びＩｇＭ免疫測定法におけるｒｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ抗原の評価
（工程Ａ：微粒子へのｒｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ抗原の被覆）
微粒子を被覆する前に、ｒｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ１、ｒｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ３及びｒｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ５抗原を１ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈し、３７℃で２４時間インキュベートした。熱処理工程後、ｒｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ抗原を、転倒型回転装置上で、室温で３０分間、ＥＤＡＣと共にＭＥＳ、ｐＨ６．２緩衝液を含む容器内の硫酸誘導体化ポリスチレン微粒子（１−５％固体）に別々に被覆した。次に、被覆した微粒子を１４，０００×ｇで１０分間の遠心分離によって収集し、上清を廃棄した。微粒子を、注射器と針を使用してＴｒｉｓ緩衝液、ｐＨ７．５、ＥＤＴＡ、塩化ナトリウム、Ｔｗｅｅｎ  ２０、ウシ胎仔血清（Ｔｏｘｏ抗体不含）、アジ化ナトリウム及びスクロースを含む微粒子保存緩衝液中に再懸濁した。その後、微粒子を微粒子保存緩衝液で０．１−０．３％固体の最終濃度に希釈し、プラスチックビンに満たした。
【０１７９】
（工程Ｂ：ＡｘＳＹＭ（登録商標）Ｔｏｘｏ  ＩｇＧ  ｖ２及びＴｏｘｏ  ＩｇＭ  ｖ２免疫測定法におけるＭＢＰ融合タンパク質、ｒｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ１、ｒｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ３及びｒｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ５の評価
実施例７Ａで述べたＴｏｘｏ抗原で被覆した微粒子を用いて実施例４Ｂ及び４Ｃで述べたようにＡｘＳＹＭ（登録商標）Ｔｏｘｏ  ＩｇＧ及びＩｇＭ試薬パックを構築した。Ｔｏｘ  ＩｇＧ  Ａ及びＦ検定物質（Ａｃａｌ及びＦｃａｌ）及びパネル６（ＰＮＬ６）をＡｘＳＹＭ  Ｔｏｘｏ  ＩｇＧ  ｖ２試薬パックで試験し、またＴｏｘｏ  ＩｇＭ陰性対照（ＮＣ）、指数検定物質（ＩＣ）及びパネル６（ＰＮＬ６）をＡｘＳＹＭ  Ｔｏｘｏ  ＩｇＭ  ｖ２試薬パックで試験した。その結果を以下の表３及び４に示す。
【０１８０】
【表３】
0004602084.tif 000037
【０１８１】
【表４】
0004602084.tif 000038
【０１８２】
表３及び４に認められるように、アラニンで置換された５個のＣ末端システイン残基を含む、遺伝子操作したｒｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ１抗原は、パネル６に関する最も高い速度計数及びＦｃａｌ／Ａｃａｌ、パネル６／Ａｃａｌ及びパネル６／ＮＣについての最も高い速度計数比によって測定されるように、最良のＴｏｘｏ  ＩｇＧ及びＩｇＭ免疫反応性を生じた。加えて、ｒｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ１抗原は、試験したいずれのｒｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０抗原に関してもＴｏｘｏ  ＩｇＭ  ｖ２アッセイにおいてパネル６に関する最も高い速度計数及び最も高いパネル６／ＮＣ速度計数比を生じた（表１及び２参照）。アラニンで置換された５個のＣ末端システイン残基プラスアラニンによるシステインＮｏ．２の置換を含む、ｒｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ５抗原は、いずれのアッセイにおいても免疫反応性ではなかった。この結果は、Ｔｏｘｏ  Ｐ３０の最初の２個のシステイン残基の欠失が免疫反応性の完全な喪失を生じさせた、ｒｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ４ｄｅｌ８（８３−２９４ａａ）抗原に関して得られた結果と一致した（表１及び２参照）。それ故、Ｔｏｘｏ  Ｐ３０のＣ末端半分におけるいくつかのシステイン残基のアラニンによる置換は抗原のより高いＴｏｘｏ  ＩｇＧ及びＩｇＭ免疫反応性を生じさせるのに対し、Ｔｏｘｏ  Ｐ３０のＮ末端半分における１個のシステイン残基のアラニンによる置換は免疫反応性を完全に廃するという驚くべき結果が得られた。
【実施例８】
【０１８３】
ｒｐＴｏｘｏＰ３５Ｓ抗原の精製及び被覆
米国特許第６，３２９，１５７  Ｂ１号に述べられているｒｐＴｏｘｏＰ３５Ｓ抗原を大腸菌において発現させ、実施例６Ａで述べたように細胞ペーストを採集した。次にこの抗原を以下で述べるように細胞ペーストから精製し、微粒子に被覆した。
【０１８４】
（工程Ａ：ｒｐＴｏｘｏＰ３５Ｓ抗原の精製）
ｒｐＴｏｘｏＰ３５Ｓ抗原を大腸菌において不溶性融合タンパク質として発現させた。細胞ペーストの溶解後、ｒｐＴｏｘｏＰ３５Ｓ抗原を含む封入体を水、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及び尿素で洗った。次にｒｐＴｏｘｏＰ３５Ｓ抗原をＳＤＳ／ＤＴＴ緩衝液に可溶化し、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００カラムに適用した。適切なカラム分画をプールし、１ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈して、０．２μフィルターでろ過し、その後被覆時まで−８０℃で保存した。
【０１８５】
（工程Ｂ：微粒子へのｒｐＴｏｘｏＰ３５Ｓ抗原の被覆）
ｒｐＴｏｘｏＰ３５Ｓ抗原を解凍し、穏やかに加温して溶液にし、その後遠心分離によって粒状物を除去した。次にこの抗原を室温で一晩、ＭＢＳ緩衝液、ｐＨ６．２を３回交換して透析し、転倒型回転装置上で、室温で３０分間、ＥＤＡＣと共にＭＥＳ、ｐＨ６．２緩衝液を含む容器内の硫酸誘導体化ポリスチレン微粒子（１−５％固体）に被覆した。次に、被覆した微粒子を１４，０００×ｇで１０分間の遠心分離によって収集し、上清を廃棄した。微粒子を、注射器と針を使用してＴｒｉｓ緩衝液、ｐＨ７．５、ＥＤＴＡ、塩化ナトリウム、Ｔｗｅｅｎ  ２０、ウシ胎仔血清（Ｔｏｘｏ抗体不含）、アジ化ナトリウム及びスクロースを含む微粒子保存緩衝液中に再懸濁した。その後、微粒子を微粒子保存緩衝液で０．１−０．３％固体の最終濃度に希釈し、プラスチックビンに満たした。
【実施例９】
【０１８６】
遺伝子操作したＰ３０抗原を用いた抗原カクテルの開発
遺伝子操作を通してＰ３０抗原のＴｏｘｏ  ＩｇＧ及びＩｇＭ免疫反応性の有意の改善を達成した後（実施例４及び７）、ＡｘＳＹＭ（登録商標）Ｔｏｘｏ  ＩｇＧ  ｖ２及びＩｇＭ  ｖ２アッセイにおいて、米国特許第６，３２９，１５７  Ｂ１号に述べられているＴｏｘｏ抗原で被覆した微粒子の予備的再評価を実施した。これらの抗原被覆微粒子ならびにＰ３０抗原、ｒｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ３Ｃ（５２−３００ａａ）、ｒｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ４Ｃ（５２−２９４ａａ）及びｒｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ１で被覆した微粒子の評価は、ｒｐＴｏｘｏＰ３５Ｓ抗原と、ｒｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ３Ｃ（５２−３００ａａ）、ｒｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ４Ｃ（５２−２９４ａａ）又はｒｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ１抗原のいずれかとの新しい組合せはＡｘＳＹＭ（登録商標）Ｔｏｘｏ  ＩｇＧ  ｖ２アッセイの性能を改善しうることを示唆した。加えて、ｒｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ３Ｃ（５２−３００ａａ）、ｒｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ４Ｃ（５２−２９４ａａ）又はｒｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ１抗原単独で、ＡｘＳＹＭ（登録商標）Ｔｏｘｏ  ＩｇＭ  ｖ２アッセイの性能を改善することができた。遺伝子操作したＰ３０抗原及び新しい遺伝子操作Ｐ３０／Ｐ３５抗原カクテルの診断上の有用性を明らかにするために、Ｔｏｘｏ抗体に関して陰性のヒト血清及び急性又は慢性トキソプラスマ症の患者から採取した血清を、ＡｘＳＹＭ（登録商標）Ｔｏｘｏ  ＩｇＧ  ｖ２及びＩｇＭ  ｖ２アッセイにおいて試験した。
【０１８７】
（工程Ａ：ＡｘＳＹＭ（登録商標）Ｔｏｘｏ  ＩｇＧ  ｖ２試薬パックの構築）
精製Ｔｏｘｏ抗原、ｒｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ３Ｃ（５２−３００ａａ）、ｒｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ４Ｃ（５２−２９４ａａ）、ｒｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ１及びｒｐＴｏｘｏＰ３５Ｓを、実施例４Ａ及び７Ａで前述したように微粒子に被覆した。次に微粒子を０．２％個体の最終濃度に希釈し、次の３つの微粒子混合物を作製した：ｒｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ３Ｃ（５２−３００ａａ）：ｒｐＴｏｘｏＰ３５Ｓの２：１ｖ／ｖ混合物で被覆した微粒子（Ｐ３０ｄｅｌ３／Ｐ３５と表示する）；ｒｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ４Ｃ（５２−２９４ａａ）：ｒｐＴｏｘｏＰ３５Ｓの２：１ｖ／ｖ混合物で被覆した微粒子（Ｐ３０ｄｅｌ４／Ｐ３５と表示する）；及びｒｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ１：ｒｐＴｏｘｏＰ３５Ｓの２：１ｖ／ｖ混合物で被覆した微粒子（Ｐ３０ＭＩＸ１／Ｐ３５と表示する）。これらの３つの微粒子混合物をプラスチックビンに満たし、実施例４Ｂで述べた個別のＡｘＳＹＭ（登録商標）Ｔｏｘｏ  ＩｇＧ  ｖ２試薬キットに構築して、Ｐ３０ｄｅｌ３Ｃ／３５、Ｐ３０ｄｅｌ４Ｃ／３５及びＰ３０ＭＩＸ１／３５と表示した。
【０１８８】
（工程Ｂ：ＡｘＳＹＭ（登録商標）Ｔｏｘｏ  ＩｇＭ  ｖ２試薬パックの構築）
精製Ｔｏｘｏ抗原、ｒｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ３Ｃ（５２−３００ａａ）、ｒｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ４Ｃ（５２−２９４ａａ）、ｒｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ１及びｒｐＴｏｘｏＰ３５Ｓを、実施例４Ａ及び７Ａで前述したように微粒子に被覆した。次に微粒子を０．２％個体の最終濃度に希釈し、プラスチックビンに満たした。実施例４Ｃで述べた各々の被覆微粒子でＡｘＳＹＭ（登録商標）Ｔｏｘｏ  ＩｇＭ  ｖ２試薬キットを構築し、Ｐ３０ｄｅｌ３Ｃ、Ｐ３０ｄｅｌ４及びＰ３０ＭＩＸ１と表示した。
【０１８９】
（工程Ｃ：試験用ヒト血清）
フランス人母集団からのヒト血清の３つの群をこの評価において試験した：第１群（ｎ＝１００）それぞれＡｂｂｏｔｔ  ＩＭｘ（登録商標）Ｔｏｘｏ  ＩｇＧ及びＩｇＭアッセイ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬ）によりＴｏｘｏ  ＩｇＧ及びＩｇＭ抗体に陰性のヒト血清；第２群（ｎ＝５６）それぞれＡｂｂｏｔｔ  ＩＭｘ（登録商標）Ｔｏｘｏ  ＩｇＧ及びＩｇＭアッセイによりＴｏｘｏ  ＩｇＧ抗体に陽性及びＩｇＭ抗体に陰性のヒト血清；第３群（ｎ＝５２）高感度直接凝集試験（ＨＳＤＡ）（Ｄｅｓｍｏｎｔｓ，Ｇ．とＲｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．（１９８０）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１１：５６２−５６８）によりＴｏｘｏ  ＩｇＧ抗体に陽性及びＩｇＭ免疫捕獲試験（ＩＣ−Ｍ）（Ｐｏｕｌｅｔｔｙら（１９８５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ７６：２８９−２９８）によりＴｏｘｏ  ＩｇＭ抗体に陽性のヒト血清。ＡｘＳＹＭ（登録商標）Ｔｏｘｏ  ＩｇＧ  ｖ２及びＴｏｘｏ  ＩｇＭ  ｖ２アッセイのためのアッセイ検定物質及び対照を実施例４Ｂ−Ｄで前述したように作製した。Ｔｏｘｏ特異的ＩｇＧ及びＩｇＭの検出のためにタキゾイト抗原を使用する、ＡｘＳＹＭ（登録商標）Ｔｏｘｏ  ＩｇＧ及びＩｇＭアッセイ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬ）を、標本の試験における標準アッセイとして包含した。
【０１９０】
（工程Ｄ：ＡｘＳＹＭ（登録商標）Ｔｏｘｏ  ＩｇＧ  ｖ２アッセイの評価）
第１−３群のすべての標本をＡｘＳＹＭ（登録商標）Ｔｏｘｏ  ＩｇＧ  ｖ２アッセイ（Ｐ３０ｄｅｌ３Ｃ／３５、Ｐ３０ｄｅｌ４Ｃ／３５及びＰ３０ＭＩＸ１／３５）及びＡｘＳＹＭ（登録商標）Ｔｏｘｏ  ＩｇＧアッセイによって試験した。ＡｘＳＹＭ  Ｔｏｘｏ  ＩｇＧアッセイのための３ＩＵ／ｍｌと同じアッセイカットオフ値を、２−３ＩＵ／ｍｌの不確定帯と共に、ＡｘＳＹＭ（登録商標）Ｔｏｘｏ  ＩｇＧ  ｖ２アッセイに使用した。組換え抗原に基づくＡｘＳＹＭ（登録商標）Ｔｏｘｏ  ＩｇＧ  ｖ２アッセイの成績を、タキゾイト抗原に基づくＡｘＳＹＭ（登録商標）Ｔｏｘｏ  ＩｇＧアッセイと比較し、表５−７に示している。
【０１９１】
【表５】
0004602084.tif 000039
【０１９２】
【表６】
0004602084.tif 000040
【０１９３】
【表７】
0004602084.tif 000041
【０１９４】
表５−７からわかるように、Ｐ３５抗原と遺伝子操作したＰ３０抗原（Ｐ３０ｄｅｌ３Ｃ、Ｐ３０ｄｅｌ４Ｃ又はＰ３０ＭＩＸ１）の組合せを使用するＡｘＳＹＭ（登録商標）Ｔｏｘｏ  ＩｇＧ  ｖ２アッセイは、全体にわたる高い相対的診断感受性（１００％）、特異性（１００％）及び一致性（１００％）によって明らかにされたように、トキソプラスマ特異的ＩｇＧの検出のための感受性が高く且つ特異的なアッセイである。３つのＡｘＳＹＭ（登録商標）Ｔｏｘｏ  ＩｇＧ  ｖ２アッセイすべてが、相関係数によって測定したとき、ＡｘＳＹＭ（登録商標）Ｔｏｘｏ  ＩｇＧアッセイと定量的に極めて良好に一致し、相関係数はすべて０．９５又はそれ以上であった。ＡｘＳＹＭ（登録商標）Ｔｏｘｏ  ＩｇＧ  ｖ２アッセイと組み合わせた、遺伝子操作Ｔｏｘｏ  Ｐ３０抗原（Ｐ３０ｄｅｌ３Ｃ、Ｐ３０ｄｅｌ４Ｃ又はＰ３０ＭＩＸ１）及びＰ３５抗原から成るＴｏｘｏ組換え抗原カクテルは、トキソプラスマ特異的ＩｇＧ抗体の検出のためにタキゾイトに取って代わるのに必要且つ十分である。
【０１９５】
さらに、ＩｇＧ抗体の検出における使用のために、タキゾイト抗原と比べて組換え抗原カクテルにはいくつかの利点がある。第一に、抗原が精製されており、免疫測定法に負荷する各々の抗原の量、例えばタンパク質濃度を正確に決定し、標準化することができる。これは、異なるタキゾイト抗原ロットで製造されたキットにおいて一般的に認められるロット間の差を最小限に抑える。それ故、異なる抗原カクテルロットで製造されたキットの異なるロットは、ロットごとに極めて一貫する。第二に、固相へのタンパク質の被覆を監視するために個々の組換えＴｏｘｏ抗原に対するマウス又はヒトモノクローナル抗体を使用する。これは、生産される各々のロットが一貫することをさらに確実にする。第三に、精製抗原のより高い比活性という事実により、精製抗原を使用したアッセイの実際の臨床的感受性はより高い。最後に、抗原カクテルで製造されるキットは長期的な保存期間中より安定であり、これらの抗原を使用したアッセイの性能は、アッセイの貯蔵寿命を通じて一定なままである。タキゾイト抗原で製造されるキットはあまり安定ではなく、それらの性能は経時的に変化しうる。
【０１９６】
加えて、単一抗原だけを使用するのに比べて、カクテルを使用することには多くの利点がある。例えば、感染に対する免疫応答は個体によって異なる。一部の個体は、感染の初期（急性トキソプラスマ症）にＰ３５に対する抗体を産生するがＰ３０に対する抗体は産生せず、また別の個体は感染の後期（慢性トキソプラスマ症）にＰ３０に対する抗体を産生するがＰ３５に対する抗体は産生しない。それ故、本発明の抗原カクテルは両方の個体群を検出する。
【０１９７】
さらに、免疫応答は時間と共に変化する。例えば、ある個体は、最初にＰ３５に対する抗体を産生し、その後はＰ３０だけに対する抗体を産生しうる。それゆえ、本発明のカクテルは両方のタイプの「陽性」個体を検出する。
【０１９８】
さらに、個体は、異なるＴｏｘｏ血清型、菌株又は単離物に感染しうる。そこで、産生されるすべての抗体の存在を検出するには多数の抗原が必要であるような免疫応答が起こりうる。やはり、本発明のカクテルはそのような検出を可能にする。
【０１９９】
また、トキソプラスマに対する免疫応答はいくつかの抗原を対象とすることが、タキゾイトタンパク質に関するこれまでのウエスタンブロット実験から知られている。やはり、本発明の抗原カクテルは、これらの抗原に応答して産生されるすべての抗体の検出を可能にする。
【０２００】
（工程Ｅ：ＡｘＳＹＭ（登録商標）Ｔｏｘｏ  ＩｇＭ  ｖ２アッセイの評価）
第１−３群のすべての標本をＡｘＳＹＭ（登録商標）Ｔｏｘｏ  ＩｇＭ  ｖ２アッセイ（Ｐ３０ｄｅｌ３Ｃ、Ｐ３０ｄｅｌ４Ｃ及びＰ３０ＭＩＸ１）及びＡｘＳＹＭ（登録商標）Ｔｏｘｏ  ＩｇＭアッセイによって試験した。ＡｘＳＹＭ（登録商標）  Ｔｏｘｏ  ＩｇＭ  ｖ２アッセイに関する予備的カットオフ値の決定を助けるための受動者動作特性（ＲＯＣ）を使用した（指数値≧０．６）（Ｚｗｅｉｇ，ＨＭ（１９９３）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３９：５６１−５７７）。さらに、アッセイの不正確性を説明するために指数値の不確定帯０．５００−０．５９９を導入した。組換え抗原に基づくＡｘＳＹＭ（登録商標）Ｔｏｘｏ  ＩｇＭ  ｖ２アッセイの成績を、タキゾイト抗原に基づくＡｘＳＹＭ（登録商標）Ｔｏｘｏ  ＩｇＭアッセイと比較し、表８−１０に示している。
【０２０１】
【表８】
0004602084.tif 000042
【０２０２】
【表９】
0004602084.tif 000043
【０２０３】
【表１０】
0004602084.tif 000044
【０２０４】
表８−１０からわかるように、遺伝子操作したＰ３０抗原（Ｐ３０ｄｅｌ３Ｃ、Ｐ３０ｄｅｌ４Ｃ又はＰ３０ＭＩＸ１）を使用するＡｘＳＹＭ（登録商標）Ｔｏｘｏ  ＩｇＭ  ｖ２アッセイは、全体にわたる高い相対的診断感受性（範囲＝９７．２％−１００％）、特異性（範囲＝９４．５％−９５．７％）及び一致性（範囲＝９５．４％−９６．４％）によって明らかにされたように、トキソプラスマ特異的ＩｇＧの検出のための感受性が高く且つ特異的なアッセイである。ＡｘＳＹＭ（登録商標）Ｔｏｘｏ  ＩｇＭ  ｖ２アッセイと組み合わせた、遺伝子操作したＴｏｘｏ組換えＰ３０抗原（Ｐ３０ｄｅｌ３Ｃ、Ｐ３０ｄｅｌ４Ｃ又はＰ３０ＭＩＸ１）及びＰ３５抗原から成るＴｏｘｏ組換え抗原カクテルは、トキソプラスマ特異的ＩｇＭ抗体の検出のためにタキゾイトに取って代わるのに必要且つ十分である。
【０２０５】
さらに、ＩｇＭ抗体の検出における使用のために、遺伝子操作した組換えＴｏｘｏ  Ｐ３０抗原にはタキゾイト抗原と比べていくつかの利点がある。第一に、抗原が精製されており、免疫測定法に負荷する各々の抗原の量、例えばタンパク質濃度を正確に決定し、標準化することができる。これは、異なるタキゾイト抗原ロットで製造されたキットにおいて一般的に認められるロット間の差を最小限に抑える。それ故、異なる組換え抗原ロットで製造されたキットの異なるロットは、ロットごとに極めて一貫する。第二に、固相へのタンパク質の被覆を監視するために組換えＴｏｘｏ抗原に対するマウス又はヒトモノクローナル抗体を使用する。これは、生産される各々のロットが一貫することをさらに確実にする。第三に、精製抗原のより高い比活性という事実により、精製抗原を使用したアッセイの実際の臨床的感受性はより高くなる。最後に、組換え抗原で製造されるキットは長期的な保存期間中より安定であり、この抗原を使用したアッセイの性能は、アッセイの貯蔵寿命を通じて一定なままである。タキゾイト抗原で製造されるキットはあまり安定ではなく、それらの性能は経時的に変化しうる。
【図面の簡単な説明】
【０２０６】
【図１】プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０（５２−３３６ａａ）の構築の概略図である。（ここで及び本明細書全体を通じて記載する、括弧内のアミノ酸範囲は、天然Ｐ３０抗原から誘導したアミノ酸配列（例えばプラスミド、タンパク質等に存在する）を指す。
【図２】プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０（５２−３３６ａａ）のＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０（５２−３３６ａａ）融合タンパク質のアミノ酸配列［配列番号：４］をコードするヌクレオチド１−７４７８のＤＮＡ配列［配列番号：３］を示す。
【図２Ａ】プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０（５２−３３６ａａ）のＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０（５２−３３６ａａ）融合タンパク質のアミノ酸配列［配列番号：４］をコードするヌクレオチド１−７４７８のＤＮＡ配列［配列番号：３］を示す。
【図２Ｂ】プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０（５２−３３６ａａ）のＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０（５２−３３６ａａ）融合タンパク質のアミノ酸配列［配列番号：４］をコードするヌクレオチド１−７４７８のＤＮＡ配列［配列番号：３］を示す。
【図２Ｃ】プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０（５２−３３６ａａ）のＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０（５２−３３６ａａ）融合タンパク質のアミノ酸配列［配列番号：４］をコードするヌクレオチド１−７４７８のＤＮＡ配列［配列番号：３］を示す。
【図２Ｄ】プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０（５２−３３６ａａ）のＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０（５２−３３６ａａ）融合タンパク質のアミノ酸配列［配列番号：４］をコードするヌクレオチド１−７４７８のＤＮＡ配列［配列番号：３］を示す。
【図３】ＴｏｘｏＰ３０（５２−３３６ａａ）遺伝子のヌクレオチド１−８５０のＤＮＡ配列［配列番号：５］及び対応してコードされるＴｏｘｏＰ３０（５２−３３６ａａ）タンパク質のアミノ酸配列［配列番号：６］を示す。
【図４】プラスミドｐＭＢＰ−ｐ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０（５２−３３６ａａ）の構築の概略図である。
【図５】プラスミドｐＭＢＰ−ｐ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０（５２−３３６ａａ）のＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０（５２−３３６ａａ）融合タンパク質のヌクレオチド１−７５５３のＤＮＡ配列［配列番号：７］及び対応してコードされるアミノ酸配列［配列番号：８］を示す。
【図５Ａ】プラスミドｐＭＢＰ−ｐ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０（５２−３３６ａａ）のＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０（５２−３３６ａａ）融合タンパク質のヌクレオチド１−７５５３のＤＮＡ配列［配列番号：７］及び対応してコードされるアミノ酸配列［配列番号：８］を示す。
【図５Ｂ】プラスミドｐＭＢＰ−ｐ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０（５２−３３６ａａ）のＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０（５２−３３６ａａ）融合タンパク質のヌクレオチド１−７５５３のＤＮＡ配列［配列番号：７］及び対応してコードされるアミノ酸配列［配列番号：８］を示す。
【図５Ｃ】プラスミドｐＭＢＰ−ｐ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０（５２−３３６ａａ）のＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０（５２−３３６ａａ）融合タンパク質のヌクレオチド１−７５５３のＤＮＡ配列［配列番号：７］及び対応してコードされるアミノ酸配列［配列番号：８］を示す。
【図５Ｄ】プラスミドｐＭＢＰ−ｐ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０（５２−３３６ａａ）のＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０（５２−３３６ａａ）融合タンパク質のヌクレオチド１−７５５３のＤＮＡ配列［配列番号：７］及び対応してコードされるアミノ酸配列［配列番号：８］を示す。
【図６】プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１（５２−３２４ａａ）の構築の概略図である。
【図７】プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１Ｃ（５２−３２４ａａ）の構築の概略図である。
【図８】プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１Ｃ（５２−３２４ａａ）のＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１Ｃ（５２−３２４ａａ）融合タンパク質のヌクレオチド１−７４４２のＤＮＡ配列［配列番号：１０］及び対応してコードされるアミノ酸配列［配列番号：１１］を示す。
【図８Ａ】プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１Ｃ（５２−３２４ａａ）のＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１Ｃ（５２−３２４ａａ）融合タンパク質のヌクレオチド１−７４４２のＤＮＡ配列［配列番号：１０］及び対応してコードされるアミノ酸配列［配列番号：１１］を示す。
【図８Ｂ】プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１Ｃ（５２−３２４ａａ）のＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１Ｃ（５２−３２４ａａ）融合タンパク質のヌクレオチド１−７４４２のＤＮＡ配列［配列番号：１０］及び対応してコードされるアミノ酸配列［配列番号：１１］を示す。
【図８Ｃ】プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１Ｃ（５２−３２４ａａ）のＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１Ｃ（５２−３２４ａａ）融合タンパク質のヌクレオチド１−７４４２のＤＮＡ配列［配列番号：１０］及び対応してコードされるアミノ酸配列［配列番号：１１］を示す。
【図８Ｄ】プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１Ｃ（５２−３２４ａａ）のＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１Ｃ（５２−３２４ａａ）融合タンパク質のヌクレオチド１−７４４２のＤＮＡ配列［配列番号：１０］及び対応してコードされるアミノ酸配列［配列番号：１１］を示す。
【図９】ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１Ｃ（５２−３２４ａａ）遺伝子のヌクレオチド１−８１９のＤＮＡ配列［配列番号：１２］及び対応してコードされるＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１Ｃ（５２−３２４ａａ）タンパク質のアミノ酸配列［配列番号：１３］を示す。
【図１０】プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ２（５２−３１１ａａ）の構築の概略図である。
【図１１】プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ２（５２−３１１ａａ）のＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ２（５２−３１１ａａ）融合タンパク質のヌクレオチド１−７４０３のＤＮＡ配列［配列番号：１５］及び対応してコードされるアミノ酸配列［配列番号：１６］を示す。
【図１１Ａ】プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ２（５２−３１１ａａ）のＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ２（５２−３１１ａａ）融合タンパク質のヌクレオチド１−７４０３のＤＮＡ配列［配列番号：１５］及び対応してコードされるアミノ酸配列［配列番号：１６］を示す。
【図１１Ｂ】プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ２（５２−３１１ａａ）のＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ２（５２−３１１ａａ）融合タンパク質のヌクレオチド１−７４０３のＤＮＡ配列［配列番号：１５］及び対応してコードされるアミノ酸配列［配列番号：１６］を示す。
【図１１Ｃ】プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ２（５２−３１１ａａ）のＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ２（５２−３１１ａａ）融合タンパク質のヌクレオチド１−７４０３のＤＮＡ配列［配列番号：１５］及び対応してコードされるアミノ酸配列［配列番号：１６］を示す。
【図１１Ｄ】プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ２（５２−３１１ａａ）のＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ２（５２−３１１ａａ）融合タンパク質のヌクレオチド１−７４０３のＤＮＡ配列［配列番号：１５］及び対応してコードされるアミノ酸配列［配列番号：１６］を示す。
【図１２】ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ２（５２−３１１ａａ）遺伝子のヌクレオチド１−７８０のＤＮＡ配列［配列番号：１７］及び対応してコードされるＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ２（５２−３１１ａａ）タンパク質のアミノ酸配列［配列番号：１８］を示す。
【図１３】プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ３（５２−３００ａａ）の構築の概略図である。
【図１４】プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ３Ｃ（５２−３００ａａ）の構築の概略図である。
【図１５】プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ３Ｃ（５２−３００ａａ）のＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ３Ｃ（５２−３００ａａ）融合タンパク質のヌクレオチド１−７３７０のＤＮＡ配列［配列番号：２０］及び対応してコードされるアミノ酸配列［配列番号：２１］を示す。
【図１５Ａ】プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ３Ｃ（５２−３００ａａ）のＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ３Ｃ（５２−３００ａａ）融合タンパク質のヌクレオチド１−７３７０のＤＮＡ配列［配列番号：２０］及び対応してコードされるアミノ酸配列［配列番号：２１］を示す。
【図１５Ｂ】プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ３Ｃ（５２−３００ａａ）のＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ３Ｃ（５２−３００ａａ）融合タンパク質のヌクレオチド１−７３７０のＤＮＡ配列［配列番号：２０］及び対応してコードされるアミノ酸配列［配列番号：２１］を示す。
【図１５Ｃ】プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ３Ｃ（５２−３００ａａ）のＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ３Ｃ（５２−３００ａａ）融合タンパク質のヌクレオチド１−７３７０のＤＮＡ配列［配列番号：２０］及び対応してコードされるアミノ酸配列［配列番号：２１］を示す。
【図１５Ｄ】プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ３Ｃ（５２−３００ａａ）のＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ３Ｃ（５２−３００ａａ）融合タンパク質のヌクレオチド１−７３７０のＤＮＡ配列［配列番号：２０］及び対応してコードされるアミノ酸配列［配列番号：２１］を示す。
【図１６】ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ３（５２−３００ａａ）遺伝子のヌクレオチド１−７４７のＤＮＡ配列［配列番号：２２］及び対応してコードされるＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ３Ｃ（５２−３００ａａ）タンパク質のアミノ酸配列［配列番号：２３］を示す。
【図１７】プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ４（５２−２９４ａａ）の構築の概略図である。
【図１８】プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ４Ｃ（５２−２９４ａａ）の構築の概略図である。
【図１９】プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ４Ｃ（５２−２９４ａａ）のＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ４Ｃ（５２−２９４ａａ）融合タンパク質のヌクレオチド１−７３５２のＤＮＡ配列［配列番号：２５］及び対応してコードされるアミノ酸配列［配列番号：２６］を示す。
【図１９Ａ】プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ４Ｃ（５２−２９４ａａ）のＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ４Ｃ（５２−２９４ａａ）融合タンパク質のヌクレオチド１−７３５２のＤＮＡ配列［配列番号：２５］及び対応してコードされるアミノ酸配列［配列番号：２６］を示す。
【図１９Ｂ】プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ４Ｃ（５２−２９４ａａ）のＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ４Ｃ（５２−２９４ａａ）融合タンパク質のヌクレオチド１−７３５２のＤＮＡ配列［配列番号：２５］及び対応してコードされるアミノ酸配列［配列番号：２６］を示す。
【図１９Ｃ】プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ４Ｃ（５２−２９４ａａ）のＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ４Ｃ（５２−２９４ａａ）融合タンパク質のヌクレオチド１−７３５２のＤＮＡ配列［配列番号：２５］及び対応してコードされるアミノ酸配列［配列番号：２６］を示す。
【図１９Ｄ】プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ４Ｃ（５２−２９４ａａ）のＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ４Ｃ（５２−２９４ａａ）融合タンパク質のヌクレオチド１−７３５２のＤＮＡ配列［配列番号：２５］及び対応してコードされるアミノ酸配列［配列番号：２６］を示す。
【図２０】ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ４Ｃ（５２−２９４ａａ）遺伝子のヌクレオチド１−７２９のＤＮＡ配列［配列番号：２７］及び対応してコードされるＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ４Ｃ（５２−２９４ａａ）タンパク質のアミノ酸配列［配列番号：２８］を示す。
【図２１】プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ４ｄｅｌ８（８３−２９４ａａ）の構築の概略図である。
【図２２】プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ４ｄｅｌ８（８３−２９４ａａ）のＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ４ｄｅｌ８（８３−２９４ａａ）融合タンパク質のヌクレオチド１−７２５９のＤＮＡ配列［配列番号：３０］及び対応してコードされるアミノ酸配列［配列番号：３１］を示す。
【図２２Ａ】プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ４ｄｅｌ８（８３−２９４ａａ）のＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ４ｄｅｌ８（８３−２９４ａａ）融合タンパク質のヌクレオチド１−７２５９のＤＮＡ配列［配列番号：３０］及び対応してコードされるアミノ酸配列［配列番号：３１］を示す。
【図２２Ｂ】プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ４ｄｅｌ８（８３−２９４ａａ）のＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ４ｄｅｌ８（８３−２９４ａａ）融合タンパク質のヌクレオチド１−７２５９のＤＮＡ配列［配列番号：３０］及び対応してコードされるアミノ酸配列［配列番号：３１］を示す。
【図２２Ｃ】プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ４ｄｅｌ８（８３−２９４ａａ）のＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ４ｄｅｌ８（８３−２９４ａａ）融合タンパク質のヌクレオチド１−７２５９のＤＮＡ配列［配列番号：３０］及び対応してコードされるアミノ酸配列［配列番号：３１］を示す。
【図２２Ｄ】プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ４ｄｅｌ８（８３−２９４ａａ）のＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ４ｄｅｌ８（８３−２９４ａａ）融合タンパク質のヌクレオチド１−７２５９のＤＮＡ配列［配列番号：３０］及び対応してコードされるアミノ酸配列［配列番号：３１］を示す。
【図２３】ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ４ｄｅｌ８（８３−２９４ａａ）遺伝子のヌクレオチド１−６３６のＤＮＡ配列［配列番号：３２］及び対応してコードされるＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ４ｄｅｌ８（８３−２９４ａａ）タンパク質のアミノ酸配列［配列番号：３３］を示す。
【図２４】プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１０（５２−２８４ａａ）の構築の概略図である。
【図２５】プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１０（５２−２８４ａａ）のＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１０（５２−２８４ａａ）融合タンパク質のヌクレオチド１−７３２２のＤＮＡ配列［配列番号：３５］及び対応してコードされるアミノ酸配列［配列番号：３６］を示す。
【図２５Ａ】プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１０（５２−２８４ａａ）のＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１０（５２−２８４ａａ）融合タンパク質のヌクレオチド１−７３２２のＤＮＡ配列［配列番号：３５］及び対応してコードされるアミノ酸配列［配列番号：３６］を示す。
【図２５Ｂ】プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１０（５２−２８４ａａ）のＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１０（５２−２８４ａａ）融合タンパク質のヌクレオチド１−７３２２のＤＮＡ配列［配列番号：３５］及び対応してコードされるアミノ酸配列［配列番号：３６］を示す。
【図２５Ｃ】プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１０（５２−２８４ａａ）のＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１０（５２−２８４ａａ）融合タンパク質のヌクレオチド１−７３２２のＤＮＡ配列［配列番号：３５］及び対応してコードされるアミノ酸配列［配列番号：３６］を示す。
【図２５Ｄ】プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１０（５２−２８４ａａ）のＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１０（５２−２８４ａａ）融合タンパク質のヌクレオチド１−７３２２のＤＮＡ配列［配列番号：３５］及び対応してコードされるアミノ酸配列［配列番号：３６］を示す。
【図２６】ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１０（５２−２８４ａａ）遺伝子のヌクレオチド１−６９９のＤＮＡ配列［配列番号：３７］及び対応してコードされるＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１０（５２−２８４ａａ）タンパク質のアミノ酸配列［配列番号：３８］を示す。
【図２７】プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１１（５２−２１４ａａ）の構築の概略図である。
【図２８】プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１１（５２−２１４ａａ）のＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１１（５２−２１４ａａ）融合タンパク質のヌクレオチド１−７１１２のＤＮＡ配列［配列番号：４０］及び対応してコードされるアミノ酸配列［配列番号：４１］を示す。
【図２８Ａ】プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１１（５２−２１４ａａ）のＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１１（５２−２１４ａａ）融合タンパク質のヌクレオチド１−７１１２のＤＮＡ配列［配列番号：４０］及び対応してコードされるアミノ酸配列［配列番号：４１］を示す。
【図２８Ｂ】プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１１（５２−２１４ａａ）のＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１１（５２−２１４ａａ）融合タンパク質のヌクレオチド１−７１１２のＤＮＡ配列［配列番号：４０］及び対応してコードされるアミノ酸配列［配列番号：４１］を示す。
【図２８Ｃ】プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１１（５２−２１４ａａ）のＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１１（５２−２１４ａａ）融合タンパク質のヌクレオチド１−７１１２のＤＮＡ配列［配列番号：４０］及び対応してコードされるアミノ酸配列［配列番号：４１］を示す。
【図２８Ｄ】プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１１（５２−２１４ａａ）のＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１１（５２−２１４ａａ）融合タンパク質のヌクレオチド１−７１１２のＤＮＡ配列［配列番号：４０］及び対応してコードされるアミノ酸配列［配列番号：４１］を示す。
【図２９】ＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１１（５２−２１４ａａ）遺伝子のヌクレオチド１−４８９のＤＮＡ配列［配列番号：４２］及び対応してコードされるＴｏｘｏＰ３０ｄｅｌ１１（５２−２１４ａａ）タンパク質のアミノ酸配列［配列番号：４３］を示す。
【図３０】プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ１、ｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ３及びｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ５の構築の概略図である。
【図３１】プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ１のＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ１融合タンパク質のヌクレオチド１−７３７０のＤＮＡ配列［配列番号：６１］及び対応してコードされるアミノ酸配列［配列番号：６２］を示す。
【図３１Ａ】プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ１のＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ１融合タンパク質のヌクレオチド１−７３７０のＤＮＡ配列［配列番号：６１］及び対応してコードされるアミノ酸配列［配列番号：６２］を示す。
【図３１Ｂ】プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ１のＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ１融合タンパク質のヌクレオチド１−７３７０のＤＮＡ配列［配列番号：６１］及び対応してコードされるアミノ酸配列［配列番号：６２］を示す。
【図３１Ｃ】プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ１のＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ１融合タンパク質のヌクレオチド１−７３７０のＤＮＡ配列［配列番号：６１］及び対応してコードされるアミノ酸配列［配列番号：６２］を示す。
【図３１Ｄ】プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ１のＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ１融合タンパク質のヌクレオチド１−７３７０のＤＮＡ配列［配列番号：６１］及び対応してコードされるアミノ酸配列［配列番号：６２］を示す。
【図３２】ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ１遺伝子のヌクレオチド１−７４７のＤＮＡ配列［配列番号：６３］及び対応してコードされるＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ１タンパク質のアミノ酸配列［配列番号：６４］を示す。
【図３３】プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ３のＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ３融合タンパク質のヌクレオチド１−７３７０のＤＮＡ配列［配列番号：６６］及び対応してコードされるアミノ酸配列［配列番号：６７］を示す。
【図３３Ａ】プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ３のＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ３融合タンパク質のヌクレオチド１−７３７０のＤＮＡ配列［配列番号：６６］及び対応してコードされるアミノ酸配列［配列番号：６７］を示す。
【図３３Ｂ】プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ３のＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ３融合タンパク質のヌクレオチド１−７３７０のＤＮＡ配列［配列番号：６６］及び対応してコードされるアミノ酸配列［配列番号：６７］を示す。
【図３３Ｃ】プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ３のＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ３融合タンパク質のヌクレオチド１−７３７０のＤＮＡ配列［配列番号：６６］及び対応してコードされるアミノ酸配列［配列番号：６７］を示す。
【図３３Ｄ】プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ３のＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ３融合タンパク質のヌクレオチド１−７３７０のＤＮＡ配列［配列番号：６６］及び対応してコードされるアミノ酸配列［配列番号：６７］を示す。
【図３４】ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ３遺伝子のヌクレオチド１−７４７のＤＮＡ配列［配列番号：６８］及び対応してコードされるＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ３タンパク質のアミノ酸配列［配列番号：６９］を示す。
【図３５】プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ５のＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ５融合タンパク質のヌクレオチド１−７３７０のＤＮＡ配列［配列番号：７１］及び対応してコードされるアミノ酸配列［配列番号：７２］を示す。
【図３５Ａ】プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ５のＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ５融合タンパク質のヌクレオチド１−７３７０のＤＮＡ配列［配列番号：７１］及び対応してコードされるアミノ酸配列［配列番号：７２］を示す。
【図３５Ｂ】プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ５のＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ５融合タンパク質のヌクレオチド１−７３７０のＤＮＡ配列［配列番号：７１］及び対応してコードされるアミノ酸配列［配列番号：７２］を示す。
【図３５Ｃ】プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ５のＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ５融合タンパク質のヌクレオチド１−７３７０のＤＮＡ配列［配列番号：７１］及び対応してコードされるアミノ酸配列［配列番号：７２］を示す。
【図３５Ｄ】プラスミドｐＭＢＰ−ｃ２Ｘ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ５のＭＢＰ−ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ５融合タンパク質のヌクレオチド１−７３７０のＤＮＡ配列［配列番号：７１］及び対応してコードされるアミノ酸配列［配列番号：７２］を示す。
【図３６】ＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ５遺伝子のヌクレオチド１−７４７のＤＮＡ配列［配列番号：７３］及び対応してコードされるＴｏｘｏＰ３０ＭＩＸ５タンパク質のアミノ酸配列［配列番号：７４］を示す。
【図１】
0004602084.tif 000045
【図２】
0004602084.tif 000046
【図２Ａ】
0004602084.tif 000047
【図２Ｂ】
0004602084.tif 000048
【図２Ｃ】
0004602084.tif 000049
【図２Ｄ】
0004602084.tif 000050
【図３】
0004602084.tif 000051
【図４】
0004602084.tif 000052
【図５】
0004602084.tif 000053
【図５Ａ】
0004602084.tif 000054
【図５Ｂ】
0004602084.tif 000055
【図５Ｃ】
0004602084.tif 000056
【図５Ｄ】
0004602084.tif 000057
【図６】
0004602084.tif 000058
【図７】
0004602084.tif 000059
【図８】
0004602084.tif 000060
【図８Ａ】
0004602084.tif 000061
【図８Ｂ】
0004602084.tif 000062
【図８Ｃ】
0004602084.tif 000063
【図８Ｄ】
0004602084.tif 000064
【図９】
0004602084.tif 000065
【図１０】
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【図１１】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２２Ｄ】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２５Ｄ】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２８Ｃ】
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【図２８Ｄ】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３１Ｃ】
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【図３１Ｄ】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３３Ｃ】
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【図３３Ｄ】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３５Ｃ】
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【図３５Ｄ】
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【図３６】
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【配列表】
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