(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
パナックスキンクフォリム植物から得た根の外植片から、安定な高ギンセノシド-産性パナックスカルス系を発生する方法であって、該方法が以下の工程：
(a)ムラシゲおよびスクーグの培地に従って改良した、炭水化物源を含有する基本培地上で、無菌カルス培養物を確立して、一次カルスを得、ここで、該基本培地は、2-4 mg/lのグリシン、200 mg/lのミオイノシトール、10 mg/lのチアミン塩酸塩、10 mg/lのピリドキシン塩酸塩および5 mg/lのニコチン酸を補充した、改良ムラシゲおよびスクーグ(1962)の培地であり、
(b)該一次カルスを最適成長のための培地IIに移し、ここで培地IIは、該基本培地に、2,4-ジクロロフェノキシ酢酸(0.5-2.0 mg/l)およびカイネチン(0.25-0.50 mg/l)を添加することによって得られるものであり、
(c)温度28±2℃、光照射強度1000〜2000luxおよび相対湿度70〜80％にて、培地II中で、6〜7週間毎に規則的に継代培養することによって、2年以上に渡り、該カルスを増殖かつ維持し、
(d)脆弱な淡白色のカルスを得、
(e)第20代の継代培養物からの、自発的な変異体として、高ギンセノシド生産性の紫に着色したカルスを単離し、
(f)該単離された紫に着色した変異体を、その後の少なくとも７代に渡る継代培養での選別および細胞凝集体のクローニングによって富化し、および
(g)該富化したカルス系を、培地IIIを使用して増殖させ、かつ連続的光照射強度3000-4000luxにて、該カルス培養物をインキュベートすること、ここで該培地IIIは、該基本培地の栄養塩、200 mg/lのミオイノシトール、2.0-4.0 mg/lのグリシン、0.5-1.0 mg/lのニコチン酸、0.5-2.0 mg/lのピリドキシンHCl、0.2-0.4 mg/lのチアミンHCl、2,4-D(0.1-0.5 mg/l)およびカイネチン(0.25-0.50 mg/l)を含むものである、
を含むことを特徴とする、上記方法。
【請求項２】
該根の外植片が、少なくとも3年齢のパナックスキンクフォリム植物から得たものである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
該根が、2-7mmの小さな外植片に細断されており、かつ水中で少なくとも4回十分に洗浄して、汚れおよび汚染物が除去されている、請求項１記載の方法。
【請求項４】
該根の外植片が、セントリミドで約5-10分間および塩化水銀で約10-30秒間処理することによって滅菌処理されている、請求項１記載の方法。
【請求項５】
該炭水化物源が、スクロース、EDTAおよび活性炭で処理した糖蜜および市販グレードの砂糖から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項６】
該選別されたカルス系が、RP-PCRアッセイにおける鋳型として、ゲノムDNAを使用して生成した、分子マーカーパターンによって遺伝的に特徴付けられる、請求項１記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項記載の方法により得られた安定な高ギンセノシド-産性パナックスカルス系から、粗製ギンセノシドをメタノール、次いでｎ−ブタノールで抽出することを特徴とするギンセノシドの製造方法。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか１項記載の方法により製造される、パナックスキンクフォリウムの、安定な高ギンセノシド-産性カルス系であって、
(a) 紫色の着色、
(b) 約45日間の培養における、成長指標204.8〜246.01％、
(c) 約45日間の培養における、ギンセノシド収率0.94〜1.33％f.wt.、
(d) 約45日間の培養における、粗抽出物からのギンセノシドRb群の収率49〜55％、
(e) 約45日間の培養における、粗抽出物からのギンセノシドRg群の収率35〜49％、および
(f) プライマー5'CGC AGT ACT C3'、 5'GTC CTACTC G3'、5'CTA CAC AGG C3'、5'GTC CTT AGC G3'、5'GTC CTC AAC G3'および5'CTA CTA CCG C3'を使用して、鋳型メガベースゲノムDNAによって製造した、PCR増幅されたフラグメントを有する特性DNAプロフィール、
を有することを特徴とする、上記カルス系。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、根の外植片から発生された、パナックスキンクフォリウム(Panax quinquefolium)(アメリカチョーセンニンジン)の安定な高ギンセノシド-産性カルス系および該カルス系の発生方法に関するものである。より詳細には、本発明のカルス系は、明白な紫色着色の形態学的なマーカーをもち、および正常な根に匹敵する、量および品位のサポニンを生成する。
本発明は、健康増進剤および老化防止薬物処方用の重要な成分として、市場において高い需要のある、チョーセンニンジンサポニン(ギンセノシド(ginsenosides))の、工業的生産性を高めるために、実行可能な代替選択肢を提供する。
【０００２】
【発明の背景】
チョーセンニンジン(一般名パナックス種(Panax species))の、4〜7年齢の植物の根から抽出した、ギンセノシド(トリテルペングリコシド)は、今日のハーブヘルスケア製品の重要な成分である。その強力な免疫調節性、アダプトゲン性(adaptogenic)および催淫性作用のために、チョーセンニンジンサポニンは、健康障害の幾つかの状態、例えば貧血、糖尿病、喘息、神経性無力症(neuroaesthemia)、消化不良、痙攣および癌並びにAIDSにおいてさえも、広く処方されている。価格が1kg当たり750-1000US＄であり、また年間総生産高35,000-40,000トンであり、パナックスの根は、今日におけるハーブヘルスケア製品流通量の、第4番目にあたる。韓国、中国および日本が、チョーセンニンジンの根の総供給量の大きな占有率を有している。[インドの製薬会社が、年間に、パナックスの根の粉末約400-500トンを輸入している]。チョーセンニンジンの根の主な起源は、P.ギンセン(ginseng)(韓国製パナックス)、P.キンクフォリウム(米国産のパナックス)およびP.ノトギンセン(notoginseng)(中国産のパナックス)である。
【０００３】
東洋産同族物と同等な、サポニン品位および含有率であることが分かっており、準ヒマラヤ領域において野生に産する、インド産の同族種、即ちP.シュードギンセン(pseudoginseng)およびP.シッキメンシスバン(sikkimensis Ban.)(Darjeeling, Sikkim, Arunachal Pradesh)は、今のところ工業的には利用されていない。パナックス種の伝統的な農場での生育は、極めて緩慢であり、かつ多大な労力を要する。これは、種子の発芽のために18-22ヶ月(引き続き、種子の休眠状態を破るための、2-3回の層積埋蔵(stratification)サイクル)、および該作物を成熟させ、かつ経済的な根のバイオマス収量およびサポニンの品位を達成するための、長い3-5年に及ぶ成熟期間を要する。従って、迅速な増殖(マイクロクローニング)のための組織培養に基づいた方法およびパナックスにおけるインビトロギンセノシド生産は、大きな将来性および可能性を秘めている。
【０００４】
【従来技術および参考文献】
組織培養研究、特に韓国産チョーセンニンジン、P.ギンセンの細胞懸濁培養でのインビトロギンセノシド生産の研究について多数の報告がある[農業および林業におけるバイオテクノロジー(Biotechnology in Agriculture & Forestry), 1988, Vol. 4(1), (Ed) Y.P.S. Bajaj, pp. 484-500; 植物の細胞培養および体細胞遺伝学(Cell culture and somatic Cell Genetics of Plants), 1988, Vol. 5, (Ed) I.K. Visil, pp. 213-234, J. Biotechnol., 52:121-126, Process Biochem., 33:69-74 (1998)]。チョーセンニンジンの細胞培養物中に検出される最大のギンセノシドレベルは、乾燥重量基準で、16mg/mであることが報告されている(Agri Cell Rep., Feb., 94)。遺伝的に形質転換された毛状の根におけるギンセノシド生産の可能性も、P.ギンセンについて示されている[Pl. Cell Rep., 1993, 12:681-686; 同, 1996, 15:555-560; Phytochemistry, 1998, 49:1929-1934]。これとは対照的に、P．キンクフォリウム細胞および組織培養については、僅かな報告があるに過ぎない[Phytochemistry, 1994, 35:1221-1225; Process Biochem., 1998, 33:69-74]。
【０００５】
本出願人は、その研究中の初期に、P．キンクフォリウムのカルスおよび細胞懸濁培養も、インビトロで特徴的なギンセノシドを生産できることを示した[Phytochemistry, 1994, 35:1221-1225]。その粗製ギンセノシド含有率(即ち、カルスおよび細胞培養物夫々に対して、0.56％および0.65％)およびこれら野生系培養物のギンセノシドのRbおよびRg群の比は、5週間の培養サイクル中、その年齢(継代培養後の日数)に伴って変動することを見出した。P．キンクフォリウムの高ギンセノシド産性系、特に種々のギンセノシド画分に富む系を単離する可能性は、上記報告において、本出願人によって最初に予想された。本発明は、このような方向性に基づいて、本出願人によってなされた絶え間ない努力の結果であり、従って本出願人は、高生産性のカルス系をここに開発した。これは、農場で栽培した植物の、3-4年齢の根の値に十分に匹敵する、1.21％f.wt.なる高い粗製ギンセノシドレベルを有する[Shoyakugaku Zosshi, 1978, 32:96; J. Herb. Species & Med., Pl. 1995, 3:41-50]。最近の市場の傾向は、P.ギンセンの野生の根の高すぎる価格のために、P．キンクフォリウムに対する需要が著しく高まっており、その東洋産の同族物よりも5-10倍も高価となっている[Pl. Med., 1996, 61:466-469]。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の主な目的は、根の外植片から発生させた、パナックスキンクフォリウム(Panax quinquefolium)(アメリカチョーセンニンジン)の安定な高ギンセノシド-産性カルス系、および従来法の諸欠点を解消した、該カルス系の発生方法を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、正常な根に匹敵する、量および品位のサポニンを生成するカルス系を単離して、工業的に実施可能な規模で、これらのヘルスケア化合物を生産するための、インビトロ法を工夫することにある。
更に別の本発明の目的は、パナックスキンクフォリウムのインビトロ生育条件およびインビトロ生産およびその工業化のための、他の実験パラメータを同定することにある。
更に別の本発明の目的は、より安価な炭水化物源の使用によって、インビトロでのギンセノシド生産コストを節減することにある。
本発明のもう一つの目的は、単離された高産性系の、形態学的なマーカー、遺伝子マーカー(DNA指紋)および化学的指紋を同定することにある。
【０００７】
【問題点を解決するための手段】
本発明の新規な構成は、以下の通りである:
(a)本発明は、第1に、P.キンクフォリウムの安定な高ギンセノシド-産性カルス系を提供することにあり、該キンクフォリウムのサポニン含有率は、その収率および品位の点で、農場で栽培したものに匹敵する。
(b)その手順を概説すると、カルスを維持するための、カルス培養物維持培地[有機アジュバントを2倍にした改良MS培地＋２００mg/lのミオイノシトール  ＋2,4-D(1.0 mg/l)+カイネチン(0.25 mg/l)]の処方、4.5年以上に及ぶ持続的な  生育および安定なギンセノシド生産を維持するための、増殖およびインキュベ  ーション環境の設定、例えば連続的な光照射(3000Lux)および28±2℃の温度  の設定。
(c)本発明は、パラメータ、例えば接種年齢、接種数対培地比、組織収穫スケジュール、培地pHの同定、および抽出、粗製ギンセノシドのTLC密度測定お  よびHPLC分析に帰せられ、これらは該単離系の更なる規模拡大のために必  要とされる。
(d)この単離されたカルス系は、形態学的に識別可能な特徴、特性DNAプロフ  ィールおよび安定な化学的指紋を有している。図1には、淡白色の非着色性  野生型系の同族体と比較して、該単離された系の該カルス細胞において、特徴  的な紫着色性を示す。その形態学的な外観は、殆どこのマーカー特性のカラー  表示において、これを合理的に行い得る程度に真である。
(e)この単離されたカルス系は、従来使用されていた高価な分析グレードのスクロースと比較して、エネルギー源として、安価な市販グレードの砂糖を使用した培地上で生育し、多量かつ高品位のギンセノシドを蓄積することが示された。これは、このような組織培養系の工業的利用のための、コスト削減法に導く、極めて重要な一歩である。
(f)この単離されたカルス系は、これを工業的ベースで利用することを可能とする  、所定の属性を全て備えている。
【０００８】
即ち、本発明は、根の外植片由来の、パナックスキンクフォリウム(米国産のチョーセンニンジン)の、安定な高ギンセノシド-産性カルス系であって、以下の特徴：
(a) 紫色の着色性、
(b) 約45日間の培養における、成長指標(growth Index) 204.8〜246.01、
(c) 約45日間の培養における、ギンセノシド収率0.94〜1.33％f.wt.、
(d) 約45日間の培養における、粗抽出物からのギンセノシドRb群の収率49〜55％、
(e) 約45日間の培養における、粗抽出物からのギンセノシドRg群の収率35〜49％、および
(f) 図3に示された如き、レーン1、2、3、4、5および6で示されるような、特性DNAプロフィール、図3には、それぞれプライマー5'CGC AGT ACT C3'、 5'GTC CTA CTC G3'、5'CTA CAC AGG C3'、5'GTC CTT AGC G3'、5'GTC CTC AAC G3'および5'CTA CTA CCG C3'を使用して、鋳型メガベースゲノムDNAによって製造した、PCR増幅されたフラグメントが示されており、またレーンMwは、1000bp下方から、100bp間隔のハシゴ状の標準サイズマーカーを示す、を有することを特徴とする、上記カルス系を提供する。
【０００９】
一態様において、本発明は、根の外植片から、安定な高ギンセノシド-産性カルス系を発生させる方法であって、以下の工程：
(a) ムラシゲおよびスクーグの培地に従って改良した基本培地上で、根の外植片由来の、無菌カルス培養物を確立して、一次カルスを得、
(b) 該一次カルスを最適成長のための培地IIに移し、
(c) 温度28±2℃、光照射強度1000〜2000luxおよび相対湿度70〜80％にて、培地II中で、6〜7週間毎に規則的に継代培養することによって、2年以上に渡り、該カルスを増殖かつ維持し、
(d) 脆弱な淡白色のカルスを得、
(e) 第20代の継代培養物からの、自発的な変異体として、高生産性の紫に着色したカルスを単離し、
(f) 該単離された紫に着色した変異体を、その後の少なくとも７代に渡る継代培養での選別および細胞凝集体のクローニングによって富化し、および
(g) 該富化したカルス系を、培地IIIを使用して増殖させ、かつ連続的光照射強度3000-4000 luxにて、該カルス培養物をインキュベートして、高生産性のカルス系を得る工程を含むことを特徴とする、上記方法を提供する。
【００１０】
本発明の一態様において、該根の外植片は、3年齢のパナックスキンクフォリウム植物から得られる。
更に別の態様では、該根は、長さ2-7mmの小さな外植片に細断されており、かつ水中で少なくとも4回十分に洗浄して、汚れおよび汚染物が除去されている。
更なる本発明の態様において、該根の外植片は、セントリミド(centrimide)で約5-10分間および塩化水銀で約10-30秒間処理することによって滅菌処理されている。
本発明の別の態様において、該工程(a)の該基本培地は、2-4 mg/lのグリシン、200 mg/lのミオイノシトール、10 mg/lのチアミン塩酸塩、10 mg/lのピリドキシン塩酸塩および5 mg/lのニコチン酸を補充した、改良ムラシゲおよびスクーグ(Murashige and Skoog) (1962)培地である。
更に別の本発明の態様において、該工程(b)で使用する培地IIは、最適カルス誘導のために、該基本培地に、2,4-ジクロロフェノキシ酢酸(0.5-2.0 mg/l)およびカイネチン(0.25-0.50 mg/l)を添加することによって得られる。
【００１１】
本発明のもう一つの態様において、該工程(g)で使用する培地IIIは、選別された系の最適成長のために、基本培地の栄養塩、200 mg/lのミオイノシトール、2.0-4.0 mg/lのグリシン、0.5-1.0 mg/lのニコチン酸、0.5-2.0 mg/lのピリドキシンHClおよび0.2-0.4 mg/lのチアミンHCl、2,4-D(0.1-0.5 mg/l)およびカイネチン(0.25-0.50 mg/l)を含む。
更に別の本発明の態様において、新たに収穫したカルス(5〜45日齢または1〜5ヶ月齢)からの、ギンセノシドの化学的抽出をメタノール(100％、4回)で行い、該乾燥した抽出物を水に再溶解し、最後にこの水可溶性部分を、水で飽和させたn-ブタノールで抽出し(4回)、該n-ブタノール画分を回収し、これを遠心分離処理し、得られる上澄を集め、これを真空下で乾燥する。
本発明の更に別の態様において、該選別されたカルス系は、ランダムに感作されたポリメラーゼ連鎖反応(RP-PCR)アッセイにおける鋳型として、該細胞系のゲノムDNAを使用して生成した、分子マーカーパターンによって遺伝的に特徴付けられる。
【００１２】
更に別の本発明の態様において、種々のギンセノシド画分の含有率および品位は、TLC密度測定法およびHPLC法によって、追跡しかつ同定することが出来る。
更に別の本発明の態様において、使用する該炭水化物源は、スクロース、EDTAおよび活性炭で処理した糖蜜および市販グレードの砂糖から選択することができる。
本発明のこのカルス系は、高い成長速度(成長指標=204.80-246.01)を有し、約45日間の培養において、選別されていない野生型の系(成長指標=21.40-36.56)よりも、高い(約7.5倍)バイオマス生産性をもたらす。
このカルス系は、また高い粗製ギンセノシド収率をも有する。該収率は、約45日間の培養において、野生型の系(0.24-0.37％)と比較して、選別されたカルス系においては、約4倍(0.94-1.33％f.wt.)大きい。本出願人は、ギンセノシドのRbおよびRg群の高い収率を観測した。約45日間の培養後に、該粗製抽出物は、該野生型の系におけるギンセノシドのRb群6-8％およびRg群33-45％に対して、該選別された系においては、該Rb群のギンセノシド49-55％および該Rg群のギンセノシド35-49％を有している。
【００１３】
本発明の簡単な方法論は以下の工程を含む:
(a) 該野生型系の無菌カルス培養物の確立および該高ギンセノシド−産性系の選別
本研究において使用した該野生型の系は、本出願人の以前の報告(Phytochemistry, 1994, 35:1221-1225)に記載のようにして発生させた。簡単に言えば、ボネラ(Bonnera)(ジャム＆カシミール(Jammu and Kashmir); 海抜3500)におけるCIMAP(インド、ラックノー(Lucknow) のセントラルインスティチュートオブメディシナルアンドアロマチックプランツ(Central Institute of Medicinal and Aromatic Plants))実験農場で生育させた、3年齢のP.キンクフォリウム植物の根を、小さな外植片(長さ2-7mm)に細断した。該外植片を水で4-5回洗浄して、全ての汚れを確実に除いた。該外植片の表面をセントリミド(10分)および0.1％HgCl2(10秒)で滅菌し、寒天ゲル培地上に、水平に移植した。本発明の実施中に使用した該基本培地(BM)は、ムラシゲ＆スクーグ培地(1962; Physiol. Plant, 15:473-497)であり、これは(mg/l単位で)NH4NO3(1650)、KNO3(1900)、KH2PO4(170)、MgSO4.7H2O (370)、CaCl2.2H2O(440)、ZnSO4.7H2O(8.60)、H3BO3(6.20)、Mn SO4.4H2O (22.30)、KI(0.83)、CuSO4.5H2O (0.025)、CoCl2.6H2O(0.025)、Na2MoO4.2H2O (0.25)、
Na2EDTA(37.25)、FeSO4.7H2O (27.85)、グリシン(2.0)、ニコチン酸(0.50)、ピリドキシンHCl(0.50)、チアミンHCl(0.10)、ミオイノシトール(100)、スクロース(30,000)および寒天(7,000)からなっていた。農場栽培中の、パナックス種による高い栄養並びに有機肥料要求を考慮して、本研究において使用した該基本培地(BM)は、ムラシゲ＆スクーグ培地(1962; Physiol. Plant, 15:473-497)に従って、MS培地に、200 mg/lのミオイノシトール、10 mg/lの各チアミン塩酸塩およびピリドキシンHClおよび5 mg/lのニコチン酸を配合することによって改良した(培地I)。
【００１４】
最適のカルス誘発は、基本培地(BM)が、更に2,4-ジクロロフェノキシ酢酸(0.5-1.5 mg/l)およびカイネチン(0.25-0.50 mg/l)で強化した場合(培地II)に、生じた。この誘導されたカルスを、2000Luxの光照射強度下で、温度28℃±2℃および相対湿度70-80％にて、6-7週間毎に新鮮な培地上で規則的に継代培養することによって、増殖させた。この高産性カルス系を、第20回の継代培養サイクルにおける、紫色に着色された集落状態で、自発的に発生した変異体として、該野生型系(淡白色の外観)から単離した。この変異体集落を切取り、その後の7回の継代培養サイクルについて、反復的な選別に付した。この選別された系は、該培地IIを、BMの栄養塩、200 mg/lのミオイノシトール、2.0-4.0 mg/lのグリシン、0.5-1.0 mg/lのニコチン酸、0.5-2.0 mg/lのピリドキシンHCl、0.2-0.4 mg/lのチアミンHCl、0.1-0.5 mg/lの2,4-Dおよび0.25-0.50 mg/lのカイネチンを含む、種々のカルス維持培地(培地III)に代えた場合に、良好に増殖した。この「細胞富化」選別技術によって、該着色された系(図2)を単離したが、これは安定な形態、特性DNAプロフィール(図3)およびインビトロでの迅速な成長を示し、またこれを化学的な分析にかけた。この選別された系は、その最適の増殖および培地中での成長のためには、高い強度(3000-4000 Lux)の連続的な光照射を必要とした。
【００１５】
(b) 該野生型および該選別された系の成長速度の研究
改善されたギンセノシドの収率および品位を達成するための、インビトロ成長およびその他の培養条件に関連して、該単離系のカルスを、種々の栄養/インキュベーション手順(処理)の下で継代培養し、かつその成長指標(GI)を以下の式に従って、時間の関数として算出した。
GI=[(収穫時点のF.Wt.−初期接種物)/(初期接種物)]×100
データ解析のために、24複製培養物/処理なる最小の値を使用し、該データをこれら全ての複製物について、平均の性能±SDとして表した。全ての実験は、少なくとも3回繰り返した。
【００１６】
(c) 該選別された系の分子的特徴付け
該選別された系を、ランダムに感作したポリメラーゼ連鎖反応(RP-PCR)アッセイにおける鋳型として、該細胞系のゲノムDNAを使用して発生させた、分子マーカーパターンによって、遺伝的に特徴付けした。最終体積25μl中の該増幅反応混合物は、400μMの各dNTP、1.0mMのMgCl2、10.0ピコモルのプライマー、0.25単位のTaqポリメラーゼおよび2.5μlのTaqバッファー(インドのバンガロアゲナイ(Bangalore Genei))、50.0 ngの鋳型DNAを含んでいた。一回の94℃(5分)、35℃(1.5分)および10℃(15分)の予備-PCRサイクルの後、該反応混合物の内容物を、40回のサイクルに付した。ここで、各サイクルは、一連の94℃(1.5分)、35℃(1.5分)および72℃(1.0分)からなっており、また最終的にPCR装置内(パーキンエルマーモデル(Parkin Elmer Model) 2400)で、72℃にて5分間の、延長完了(extension completion)インキュベーションにかけた。このPCR実験の終了時点において、増幅された生成物を、1xTAEバッファー中にて、1.4％アガロース上で、電気泳動的に分離した。10個の二本鎖(ds)DNAフラグメントのハシゴからなる、1000〜100塩基対(bp)の混合物を、同時に電気泳動させて、該増幅生成物のサイズ(bp)を測定した。
【００１７】
(d) 粗製ギンセノシドの抽出
カルスサンプルからの粗製ギンセノシドの抽出は、先に我々が報告した手順(Phytochemistry, 1994, 35:1221-1225)に従って行った。基本的にフルヤ等によって改良されたこの方法(Chem. Pharm. Bull., 1973, 21:98)を、簡単に以下のフローチャートによって説明する。
0004545255.tif 000002
【００１８】
(e) 粗ギンセノシド抽出物のTLC分析
該粗ギンセノシドを再度HPLCグレードのメタノールに溶解し、8000rpmにて15分間遠心分離処理し、上澄を集めた。この粗製サンプルを60F254E-メルク予備被覆TLCプレートにスポットを形成し、CHCl3:MeOH:H2O(13:7:2)からなる溶媒相を使用して、真正のギンセノシドサンプルの既知量と共に、クロマトグラフィーに付した。該プレートに10％ H2SO4を噴霧し、次いで100℃にて10分間加熱することによって、該ギンセノシド画分を可視化した。これらのスポットの定量のための走査を、530および700nmの二重波長密度計(島津製(Shimadzu))で実施した。
(f) 粗ギンセノシド抽出物のHPLC分析
該粗ギンセノシド混合物のHPLC分析を、ソリダチ＆スチッチャー(Solidati & Sticher) (Pl. Med., 1980, 38:348-357)の改良法に従って実施した。この分析は、C18ウオーターズμボンダパック(watersμ Bondapack)カラム(150x3.9mm)上で、ギンセノシドRb1、Rb2、Rc、Rd、RfおよびRoに対する移動相として、CH3CN: H2O:: 9:16(流量=0.5ml/分)を使用して実施した。これらに関するRt値は、夫々7.98、8.81、10.63、13.45、18.98および20.82であることが分かった。ギンセノシドReおよびRg1を分離するために、使用した移動相はCH3CN: H2O:: 11:39であった(これらに対する各Rt値は、夫々21.88および23.19であった)。検出は、λmax=203nmにて行った。全ての他の真正のギンセノシド画分は、カールロス(Carl Roth: ドイツ)から入手したが、ギンセノシドRoは、親切にもO.Tankaka教授(日本) により提供された。
【００１９】
【実施例】
以下の実施例は、上記の野生型および本発明の選別されたカルス系に関する、バイオマス収率、ギンセノシド生産性、接種密度の効果、収穫手順および種々の炭水化物源の有効性に関する比較を示すが、これらは本発明の範囲を何等限定するものではないと理解すべきである。
実施例1：該カルス系の成長速度およびギンセノシド生産性および品位
該選別された系の成長特性を研究し、45日間の栽培期間に渡る、野生型の系(コントロール)の特性と比較した。具体的な成長速度、粗製ギンセノシド含有率、および品位を、10日間間隔で追跡し、結果を表1に示した。該選別された系のより高いバイオマスおよびギンセノシド生産性が、インキュベーションの25日目に明らかになり、これは培養の45日まで維持された。該野生型の系は、培養の約25および35日目頃に、最大のバイオマスおよび粗製ギンセノシドを蓄積し、一方で該選別系の場合の対応する値は、培養の約40-50頃に達成された。成長指標による該バイオマス生産性は、45日間の培養後に、該野生型(30.2)と比較して、該選別系においては約7.5倍(232.7)である(表1)。生重量基準での該粗製ギンセノシド含有率は、該野生型(0.29％)と比較して、該選別系においては約4倍(1.21％)である。Rb: Rg画分によるギンセノシド品位に関連して、約25-30日目において野生型系は、最良であり、該選別系は、この場合にも、培養の約40日目に最良のプロフィールを示し、この時点でギンセノシドのRbおよびRg群の53％および43％が生成された。
該選別カルス系は、3年を越える長期のテスト期間中、20代に渡る継代培養世代に対して、そのインビトロ成長 (GI=210.8-292.09)、粗ギンセノシド含有率(1.09-1.27％f.wt.)およびギンセノシド品位(Rb/Rg比=1.12-1.30) に関する高い安定性を示した(表2)。一般的に該パナックス培養物は、冬期月(11月~2月)中に、夏季月(4月~8月)におけるよりも僅かに良好な生育を示した。
【００２０】
実施例2: 接種密度および収穫スケジュールの、ギンセノシドの生産性および品位に及ぼす影響
該選別系の生産性を高めるための収穫スケジュールおよび初期接種量を、4種の初期接種密度(10-40% w/v)について研究し、最良の成長並びにサポニン収率は、2-3ヶ月齢のカルスを、25-30%の初期接種密度(即ち、10-15g接種物/40mlの培地)で使用した場合に得られた。更に、Rb(特に、Rb2)およびRg(主としてRgおよびRe)群両者のギンセノシドを抽出しようとする場合には、30-35日の培養サイクルで、生育させるべきである。より高い興味が、40-45日間のインキュベーションを越える培養の場合には低下する、Rb1およびRb2画分にある場合には、この培養期間は5-10日間に減ずることが出来る。Rg群のサポニンに関連して、Rg1+Reが該ギンセノシドプールの主な画分である場合には、該培養物は、3-4ヶ月後に収穫すべきである。
【００２１】
実施例3: 該系の成長およびギンセノシド含有率に及ぼす種々の炭水化物の効果の比較
該培地中で、種々の炭水化物エネルギー源を使用して、コスト高のスクロースに対する安価な代用品の有効性を観察した(表4)。本研究で開発した該インビトロ手順のコストを節減するために、該栄養培地の最もコスト高な成分である、従来使用されていた炭素源としてのスクロース(Rs 250/kg)を、市販グレードの砂糖(Rs 14-16/kg)および製糖工業における廃副産物である、糖蜜(Rs 1.0/l)等の、より安価な源で代用することを試みた。市販グレードの砂糖の有効性を、カルス維持培地中で、1-4%(w/v)の濃度にて評価したが、糖蜜は、阻害性化合物を除去するために、(使用前に)ある予備処理にかけた。そのために、25%(w/v)の糖蜜溶液を、活性炭(2 g/l)で2時間処理し、30分間煮沸し、一夜放置した。次いで、濾過し(ファットマンNo.1)、遠心分離した。
【００２２】
得られた上澄を、水で希釈(x50倍)し、実験において0.3%(v/v)濃度で使用した。また、5%の該糖蜜(w/v)溶液を、10%(w/v)のNa2-EDTAで滴定して、EDTA-キレートとして析出させ、冷蔵庫内に一夜放置し、遠心分離し、上記のように50倍に希釈し、該培地で0.3%(v/v)濃度にて使用した。該野生型および選別カルス系を、3%(w/v)のスクロース(コントロール)、市販グレードの砂糖(3% w/v)および活性炭またはEDTA処理した糖蜜を補充した培地上で生育させた。50日間のインキュベーション期間まで、10日間隔で、バイオマス収率および粗ギンセノシド含有率について得た結果は、糖蜜がカルスの生育を維持できなかったのに対して、分析グレードのスクロースよりも約15倍も安価な、市販グレードの砂糖は、該野生型および選別カルス系両者に対する唯一のエネルギー源として使用できることを示す。事実、市販グレードの砂糖−含有培地は、該選別系の場合に、スクロースよりも10-15% 高いバイオマス収量を維持した(表4)。該砂糖含有培地における該粗ギンセノシド含有率は、またスクロース補充培地においても同様に高い収率を維持した。サポニンのHPLC分析も、種々のギンセノシド画分のレベルに及ぼす、如何なる阻害作用も示さなかった。
【００２３】
実施例4: 培地への酢酸ナトリウムの補充の、ギンセノシド収率に及ぼす影響
可能なプリカーサ酢酸ナトリウムの一種を、5-50 mg/lの範囲の濃度で、培地に配合した。酢酸ナトリウムは、サポニン生物産性用の推定上のプリカーサとして、他の研究者によって使用されていた(Pl. Med., 47:200-204)。しかしながら、P.キンクフォリウムの選別並びに非選別系(我々の研究)は、種々の酢酸ナトリウム濃度において、ギンセノシド含有率における急峻な低下(0.06-0.18%f.wt.)を示した。このことは、酢酸ナトリウムが、P.キンクフォリウムのカルスを使用したこのような育成実験において使用するには、不適当なプリカーサであることを示す。
【００２４】
上記実施例は、明らかに本発明が、高ギンセノシド産性の紫に着色された、P.キンクフォリウムのカルス系を与えることを示しており、該カルス系は、この植物種の農場で栽培された根において製造される、(収量および品位両者において優れた)ギンセノシドを合成し、かつ蓄積することができる。我々の知る限りにおいて、これはこの種の最初の系であり、工業的な規模拡大および利用のために必要な全ての要件を満たしている。
以下の表、即ち表1-4は、P.キンクフォリウムの野生型および選別カルス系における、バイオマス収率、種々のギンセノシド生産性、該選別系の安定性、ギンセノシドの定量的および定性的スペクトルに及ぼす影響に関する比較、および(カルス維持培地に補充される)種々の炭水化物エネルギー源の、夫々P.キンクフォリウムの野生型および選別カルス系における、バイオマス収率および粗ギンセノシド含有率に及ぼす有効性の比較を与える。
【００２５】
【表１】
表1：P.キンクフォリウム*の野生型および選別カルス系における、培養期間(年齢)の関数としての、バイオマス収率および種々のギンセノシドの生産性における変化の比較
0004545255.tif 000003
: 接種物サイズ=25%(10g/40ml 培地)
＊＊   : 各値は、全培養期間の、6、12および18ヶ月において実施した3回の分析の平均を表す(4個の複製体/分析)。
W: 野生系; S: 選別系; Tr.：痕跡量
【００２６】
【表２】
表2: 3年間の期間に渡る、成長指標による該選別系の安定性、粗ギンセノシド含有率およびRbおよびRgギンセノシドの比
0004545255.tif 000004
＊: パナックスカルス培養物は、夏季よりも冬期月において僅かに速い成長速度を示す。
＊＊: 各継代における生育の45-50日後に集められたデータである。
＊＊＊：全てのデータは、各6培養物の、4つのプールした複製体の平均を表す。
【００２７】
【表３】
表3: 収穫時点における培養期間の、P.キンクフォリウム*の野生並びに選別カルス系における、ギンセノシドの定量的および定性的スペクトルに及ぼす効果
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＊：接種物サイズ=30%(15g/50ml培地)
＊＊：接種物年齢=14ヶ月齢のカルス継代培養後7-8週
＊＊＊：各データは、分析用の3サンプルにプールした24個の複製体の平均を表す。
W: 野生系; S: 選別系; Tr. : 痕跡量
【００２８】
【表４】
表4：(カルス維持培地に補充された)種々の炭水化物エネルギー源の、P.キンクフォリウム*の野生型および選別カルス系の、バイオマス収率および粗製ギンセノシド含有率の比較
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【００２９】
本発明の主な利点は以下の通りである。
1. 本研究における該カルス系は、(30-50日以内に)農場栽培植物の3-5年齢の根に匹敵する、収率および品位で、ギンセノシドを生産することを可能とする。
2. 該カルス系は、P.キンクフォリウムによる、ギンセノシドの工業的生産用の、生育可能な代替源(カルス系)の発生をもたらす。
3. 本発明は、パナックスサポニンに対する世界的規模の需要並びに長い該パナックスの種子の休眠期および移植から収穫までの長い熟成期間(4-7年)を考慮して、パナックスの栽培に係わる問題点を考慮すれば、有意なものであると考える。
4. 本発明で使用する培養手順および条件は、十分に定義されており、かつ再現性のあるものである。
5. 本発明は、地理的な場所および気候条件とは無関係に、大規模でギンセノシドを生産するための有効な手段を提供する。
6. 培地等におけるスクロースを、市販グレードの砂糖で置換でき、このことは該方法のコスト節減に寄与するであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】パナックスキンクフォリウムの柔らかいカルス系を示す写真である。
【図２】本発明のカルスにおける、特徴的な紫の着色性を示す写真である。
【図３】パナックスキンクフォリウムの該選別カルス系の、DNAプロフィールを示す写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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