(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテアソーム・インヒビターの薬力学薬物作用のモニター方法であって、プロテアソーム・インヒビターの投与後の１以上の特定の時刻にて、哺乳類から採取された試験生体試料または複数の試料におけるプロテアソーム活性を測定し；該試験生体試料または複数の試料におけるプロテアソーム活性量を決定し；次いで、該試験生体試料におけるプロテアソーム活性量をプロテアソーム・インヒビターが投与されていない哺乳類から採取された参照生体試料におけるそれと比較することを特徴とする該方法。
【請求項２】
該生体試料が、血液、尿、臓器、および組織試料よりなる群から選択される請求項１記載の方法。
【請求項３】
該生体試料が、腫瘍生検、皮膚生検、結腸生検、関節液、気管支液、筋肉細胞、血液細胞、および血液細胞前駆体よりなる群から選択される請求項１記載の方法。
【請求項４】
該生体試料が血液試料である請求項２記載の方法。
【請求項５】
該血液試料が白血球ライゼートである請求項４記載の方法。
【請求項６】
該生体試料が全血細胞ライゼートである請求項４記載の方法。
【請求項７】
該哺乳類が、ラット、マウス、非ヒト霊長類、およびヒトよりなる群から選択される請求項１記載の方法。
【請求項８】
該哺乳類がヒトである請求項７記載の方法。
【請求項９】
プロテアソーム活性が、２０Ｓプロテアソーム・アクチベーターの存在下、タンパク質分解速度をアッセイすることによって測定される請求項１記載の方法。
【請求項１０】
該アクチベーターがＳＤＳである請求項９記載の方法。
【請求項１１】
該生体試料が血液細胞ライゼートであって、ＳＤＳが０．０３５％の濃度にて存在する請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
該生体試料が全血細胞ライゼートであって、ＳＤＳが０．０５％の濃度にて存在する請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
キモトリプシン活性がアッセイされる請求項１記載の方法。
【請求項１４】
トリプシン活性がアッセイされる請求項１記載の方法。
【請求項１５】
該生体試料におけるプロテアソーム活性および該参照試料におけるプロテアソーム活性がタンパク質濃度に対して別々に規格化される請求項１記載の方法。
【請求項１６】
該生体試料におけるプロテアソーム活性および該参照試料におけるプロテアソーム活性が細胞数に対して別々に規格化される請求項１記載の方法。
【請求項１７】
該生体試料におけるプロテアソーム活性および該参照試料におけるプロテアソーム活性が、該プロテアソームの第１のペプチダーゼ活性の該プロテアソームの第２のペプチダーゼ活性に対する比として別々に決定される請求項１記載の方法。
【請求項１８】
該第１のペプチダーゼ活性がキモトリプシン活性であって、該第２のペプチダーゼ活性がトリプシン活性である請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
該プロテアソーム・インヒビターがペプチジルアルデヒド、ビニルスルホン、エポキシケトン、ペプチジルボロン酸、およびラクタシスチン・アナログよりなる群から選択される請求項１記載の方法。
【請求項２０】
該プロテアソーム・インヒビターがペプチジルボロン酸である請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
該ペプチジルボロン酸が：
Ｎ−アセチル−Ｌ−ロイシン−β−（１−ナフチル）−Ｌ−アラニン−Ｌ−ロイシンボロン酸；
Ｎ−（８−キノリン）スルホニル−β−（１−ナフチル）−Ｌ−アラニン−Ｌ−ロイシンボロン酸；
Ｎ−（ピラジン）カルボニル−Ｌ−フェニルアラニン−Ｌ−ロイシンボロン酸；
β−（１−ナフチル）−Ｌ−アラニン−Ｌ−ロイシンボロン酸；および
Ｎ−（４−モルホリノ）カルボニル−［Ｏ−（２−ピリジルメチル）］−Ｌ−チロシン−Ｌ−ロイシンボロン酸
よりなる群から選択される請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
該ペプチジルボロン酸がＮ−（ピラジン）カルボニル−Ｌ−フェニルアラニン−Ｌ−ロイシンボロン酸である請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
該プロテアソーム・インヒビターがラクタシスチン・アナログである請求項１９記載の方法。
【請求項２４】
該ラクタシスチン・アナログが、ラクタシスチン、クラスト−ラクタシスチンβ−ラクトン、７−エチル−クラスト−ラクタシスチンβ−ラクトンおよび７−ｎ−プロピル−クラスト−ラクタシスチンβ−ラクトンよりなる群から選択される請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
該ラクタシスチン・アナログが７−ｎ−プロピル−クラスト−ラクタシスチンβ−ラクトンである請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
ベースラインのプロテアソーム活性を決定する方法であって、哺乳類から採取した生体試料または複数の試料におけるプロテアソーム活性を測定し、ここに、該試料は、血液、尿、臓器、および組織試料よりなる群から選択され；次いで、該生体試料または複数の試料におけるプロテアソーム活性量を決定することを特徴とする該方法。
【請求項２７】
該哺乳類が疾患または病的な状態に罹患していると特徴付けられる請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
さらに、該哺乳類から採取された生体試料におけるプロテアソーム活性量を該疾患または病的な状態に罹患していない哺乳類から採取された参照生体試料におけるプロテアソーム活性量と比較することを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
疾患または病的な状態に罹患している哺乳類から採取された生体試料についてのプロテアソーム活性データが、該参照生体試料についてのプロテアソーム活性データと比較される前に、同一の疾患または病的な状態に罹患している他の哺乳類から採取された生体試料について得られたデータと組合わされる請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
該哺乳類がヒトである請求項２６〜２９いずれか１記載の方法。
【請求項３１】
該哺乳類が薬物投与されている請求項２６記載の方法。
【請求項３２】
該薬物はプロテアソーム・インヒビターではない請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
薬物が投与されている哺乳類から採取された生体試料についてのプロテアソーム活性データが、該参照生体試料についてのプロテアソーム活性データと比較される前に、該薬物が投与されている他の哺乳類から採取された生体試料について得られたデータと組合わされる請求項３１記載の方法。
【請求項３４】
該哺乳類がヒトである請求項３１〜３３いずれか１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
発明の属する技術分野
本発明は生体試料におけるプロテアソーム活性を測定する方法に関する。より詳しくは、本発明はプロテアソーム・インヒビターの生体内投与後の薬物作用をモニターする方法に関する。
【０００２】
関連技術の概要
２６Ｓプロテアソームは、真核細胞中の細胞内タンパク質ターンオーバーの大部分を担う多重触媒性プロテアーゼであり、損傷し、酸化され、またはミスフォールドされたタンパク質のタンパク質分解性分解、ならびに種々の細胞機能に必要な主要調節タンパク質のプロセシングまたは分解を含む［Ciechanover, Cell 79:13-21 (1994); Coux et al., Ann. Rev. Biochem. 65:801-847 (1995); Goldberg et al., Chemistry & Biolgy 2:503-508 (1995)］。先ず、タンパク質基質は、小タンパク質、ユビキチン、の複数の分子への共有コンジュゲーションにより標識する。次いで、得られたポリユビキチン化タンパク質を認識し、該２６Ｓプロテアソームにより分解する。
【０００３】
該２６Ｓプロテアソームの触媒性コアを構成するのは２０Ｓプロテアソームであって、約７００ｋＤａ分子量の多サブユニット複合体である。Ｃｏｕｘら［Ann. Rev. Biochem. 65:801-847 (1995)］は、該２０Ｓプロテアソームは単独でユビキチン化タンパク質を分解しないが、複数のペプチダーゼ活性を有することを教示する。基質優先性に基づき、Couxらはこれらの活性をキモトリプシン様、トリプシン様、ポスト−グルタミルヒドロラーゼ、分枝鎖アミノ酸優先、および小天然アミノ酸優先と特徴付けた。Couxらは、２０Ｓプロテアソーム活性の劇的な活性化を５５℃までの加熱、塩基性ポリペプチド、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、グアニジンＨＣｌまたは脂肪酸と共のインキュベーション、水に対する透析のごとき生体内処理によって、あるいはＰＡ２８もしくはＰＡ７００のごとき生理上のレギュレーターによって、誘発し得ることも教示する。McCormackら［Biochemistry 37:7792-7800 (1998)］は、Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ＡＭＣ、Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−ＡＭＣ、およびＺ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−２ＮＡ（式中、ＳｕｃはＮ−スクシニルであり、ＡＭＣは７−アミノ−４−メチルクマリンであって、２ＮＡは２−ナフチルアミンである）を含む種々のペプチド基質が該２０Ｓプロテアソームにより切断されることを教示する。
【０００４】
ユビキチン−プロテアソーム経路は多数の生理学的プロセスにおいて中心的な役割を演じる。Deshaies［Trends in Cell Biol. 5:428-434 (1995)］およびHoyt［Cell 91:149-151 (1997)］は、サイクリン、サイクリン依存性キナーゼ・インヒビター、および腫瘍抑制タンパク質を含む細胞周期タンパク質の調節されたタンパク質加水分解が制御された細胞周期進行にとって必要であることおよび、これらのタンパク質のタンパク質加水分解が該ユビキチン−プロテアソーム経路を経由して発生することを教示する。Palombellaら［WO95/25533］は、それ自体が免疫および炎症反応に関連する遺伝子の調節において中心的な役割を演じる転写因子ＮＦ−κＢの活性化は阻害性タンパク質、ＩκＢ−αのプロテアソーム媒介分解に依存することを教示する。GoldbergおよびRock［WO94/17816］は、該ユビキチン−プロテアソーム経路による細胞タンパク質の連続ターンオーバーが抗原提示において本質的な役割を演じる。
【０００５】
本質的な生理学的役割を機能しつつ、該ユビキチン−プロテアソーム経路は、癌、炎症性疾患、または自己免疫疾患のごとき病的な状態の結果またはその原因として発生する不適切または加速されたタンパク質分解も媒介し、そこではこれらの正常な細胞タンパク質は脱調節になっている。さらに、Goldberg［U.S. Pat. NO.5,340,736 (1994)］は、癌、慢性感染症、発熱、筋非活動（萎縮）、神経創傷、腎不全、および肝不全のごとき状態に関係するか壁シーまたは筋衰弱は該ユビキチン−プロテアソーム経路によるタンパク質分解の増大に由来することを教示する。Gonzalezら［J. Exp. Med. 184:1909 (1996)］は、原虫寄生虫の成熟の間に生じる細胞骨格再構成はプロテアソーム依存であることを教示する。
【０００６】
かくして、プロテアソーム活性の阻害は、これらまたは該プロテアソームのタンパク質分解機能に直接的にまたは間接的に媒介される他の状態における治療介入の有望な新たな手法を提供する。Goldbergら［Chemistry & Biology 2:503-508 (1995)］は、プロテアソーム・インヒビターはヒト疾患の動物モデルにおける炎症性生体内反応をブロックすることを教示する。
【０００７】
本発明者らは炎症性および自己免疫疾患および癌の治療用のプロテアソーム・インヒビターを開発している。本発明者らは、プロテアソーム・インヒビターを哺乳類に投与する場合、過度なプロテアソーム阻害を回避するように注意して用量処方を選択することが重要であることを見出した。典型的には、新薬候補の用量処方は生体試料における薬物濃度を測定し、次いで、所望する薬物レベルを達成するように投与量および投与頻度を設定することによって決定する（例えば、［Ritschel, Handbook of Basic Pharmacokinetics, Fourth Edition, Drug Intelligence Publication, Inc., Hamilton, IL, 1992］を参照）。本発明者らは、これらの標準方法はプロテアソーム・インヒビターにとって不適切であることを発見した。かくして、プロテアソーム・インヒビター薬物作用をモニターする高感度な方法についての技術の必要がある。
【０００８】
発明の概要
本発明はプロテアソーム・インヒビター薬物作用をモニターする高感度な方法を提供する。驚くべきことに、本発明者らは、生体試料における、薬物濃度ではなく、むしろ、プロテアソーム活性の生体外アッセイがプロテアソーム・インヒビターの薬力学的薬物作用をモニターする有用な方法を提供し、このデータが将来投与すべきプロテアソーム・インヒビターのさらなる投与量および投与頻度を選択するためのガイダンスを提供することを発見した。
【０００９】
第１の局面において、本発明は、哺乳類におけるプロテアソーム・インヒビターの薬力学薬物作用をモニターする方法を提供し、それは、該哺乳類に該プロテアソーム・インヒビターを投与し；該プロテアソーム・インヒビターを投与した後、１以上の特定の時刻にて、該哺乳類から１以上の試験生体試料を採取し；該試験生体試料または複数の試料におけるプロテアソーム活性を測定し；該試験生体試料または複数の試料におけるプロテアソーム活性量を定量し；次いで、該試験生体試料におけるプロテアソーム活性量をプロテアソーム・インヒビターが投与されていない哺乳類から採取された参照生体試料におけるそれと比較することを特徴とする。
【００１０】
第２の局面において、本発明はプロテアソーム・インヒビターについての用量処方を決定する方法を提供し、それは、該哺乳類に該プロテアソーム・インヒビターを投与し；該プロテアソーム・インヒビターを投与した後、１以上の特定の時刻にて、該哺乳類から１以上の試験生体試料を採取し；該試験生体試料または複数の試料におけるプロテアソーム活性を測定し；該試験生体試料または複数の試料におけるプロテアソーム活性量を定量し；該試験生体試料におけるプロテアソーム活性量をプロテアソーム・インヒビターが投与されていない哺乳類から採取された参照生体試料におけるそれと比較し、次いで、将来投与すべきプロテアソーム・インヒビターの投与量および投与頻度を選択することを特徴とする。
【００１１】
第３の局面において、本発明は、哺乳類におけるベースラインのプロテアソーム活性を決定する方法を提供し、それは、該哺乳類から１以上の生体試料を採取し；該生体試料または複数の試料におけるプロテアソーム活性を測定し；次いで、該生体試料または複数の試料におけるプロテアソーム活性量を定量することを特徴とする。一つの好ましい具体例において、該哺乳類は疾患または病的な状態に罹患している。もう一つの好ましい具体例において、該哺乳類は、薬物が投与されている。ある具体例において、該方法は、さらに、該哺乳類に投与すべきプロテアソーム・インヒビターの投与量および投与頻度を決定することを特徴とする。
【００１２】
第４の局面において、本発明は、哺乳類からの生体試料におけるプロテアソーム活性を測定するためのキットを提供し、該キットは該生体試料を調製する手段およびプロテアソーム活性を測定する手段を含む。ある好ましい具体例において、該哺乳類はヒトである。ある別の好ましい具体例において、該生体試料は血液、尿、または組織生検試料である。
【００１３】
好ましい具体例の詳細な説明
本発明は生体試料におけるプロテアソーム活性を測定する方法に関する。より詳しくは、本発明はプロテアソーム・インヒビターの生体内投与後の薬物作用をモニターする方法に関する。本明細書に列記された特許出願、特許および参考文献は、この分野の知識を示し、それにより、出典明示してそれらの全ては本明細書に含まれるとみなす。不一致の場合、本開示が優先する。
【００１４】
驚くべきことに、本発明者らは、生体試料における薬物濃度ではなく、むしろ、プロテアソーム活性の生体外アッセイがプロテアソーム・インヒビターの薬力学的薬物作用をモニターする有用な方法を提供し、このデータが将来投与すべきプロテアソーム・インヒビターのさらなる投与量および投与頻度を選択するためのガイダンスを提供することを発見した。
【００１５】
本発明は、プロテアソーム・インヒビター薬物作用をモニターする高感度な方法を提供する。プロテアソーム・インヒビターは、筋衰弱のごとき、該プロテアソームのタンパク質分解機能に直接的に媒介されるか、あるいは、転写因子ＮＦ−κＢおよび細胞周期調節タンパク質のごとき、プロテアソームにより処理されるか分解されるタンパク質により間接的に媒介される状態の治療用の有望な新たな治療薬である。本発明者らは、多数の動物腫瘍モデルまたは炎症のモデルにおいてプロテアソーム・インヒビターの生体内効力を実証した。しかしながら、本発明者らは、過度なプロテアソーム阻害は致死を含む毒性効果をもたらすことも見出した。理論に固執するつもりはなく、本発明者らは、これらの毒性効果は主に機序ベースであって、プロテアソーム機能の多面発現性に起因すると確信する。
【００１６】
かくして、プロテアソーム・インヒビターの安全投与は薬物レベルの密なモニターおよび過剰用量を防止する用量処方の注意深い選択が必要である。当該分野において典型的には、薬物レベルは、血漿中の親薬物またはその代謝産物の量を測定することによってモニターする（例えば、［Ritschel, Handbook of Basic Pharmacokinetics, Fourth Edition, Drug Intelligence Publications, Inc., Hamilton, IL, 1992］を参照）。時間関数の薬物レベルの測定は、該薬物の薬力学プロファイル、最大濃度（Ｃｍａｘ）、半減期（ｔ１／２）、曲線下面積（ＡＵＣ）、および分布体積（Ｖｄ； volume of distribution）のごときそれからのパラメータを与える。しかしながら、本発明者らは、これらの標準方法はプロテアソーム・インヒビターでの使用には適していないことを発見した。動物に治療用量のプロテアソーム・インヒビターの静脈投与して数分以内に、該薬物は血漿区画において実質的に検出されない。理論に固執するつもりはなく、本発明者らは、該プロテアソーム・インヒビターは血管内および組織内の細胞内プロテアソームにより急速に退去さらせれるものと確信する。かくして、血漿中で循環する薬物の測定は、存在する生活性な薬物量をかなり少なく見積もる。かくして、プロテアソーム・インヒビターの真の薬力学的プロファイルをより正確に反映する代替方法が至急必要とされる。
【００１７】
本発明の目的に関し、以下の定義を用いる：
「プロテアソーム・インヒビター」とは、該２０Ｓもしくは２６Ｓプロテアソームまたはそれらの活性を直接的または間接的に阻害するいずれの基質をも意味する。好ましくは、そのような阻害は特異的である。すなわち、該プロテアソーム・インヒビターは、別の関係のない生物学的効果を生じるのに必要なインヒビターの濃度よりも低い濃度にてプロテアソーム活性を阻害する。好ましくは、プロテアソーム阻害に必要なプロテアソーム・インヒビターの濃度は、関係のない生物学的効果を生じるのに必要な濃度よりも、少なくとも２倍低く、より好ましくは少なくとも５倍低く、さらにより好ましくは少なくとも１０倍低く、最も好ましくは少なくとも２０倍低い。本発明において使用されるプロテアソーム・インヒビターの非限定的な実施例は、ペプチジルアルデヒド（例えば、［Stein et al., WO95/24914 published September 21, 1995; Siman et al., WO91/13904 published September 19 1991; Iqbal et al., J. Med. Chem. 38:2276-2277 (1995)］を参照）、ビニルスルホン（例えば、［Bogyo et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 94:6629 (1997)］を参照）、α',β'−エポキシケトン（例えば、［Spaltenstein et al. Tedrahedron Lett. 37:1343 (1996)］を参照）、ペプチドボロン酸（例えば、［Adams et al. WO96/13266 published May 9, 1996; Siman et al. WO91/13904 published September 19, 1991］を参照）、およびラクタスチンおよびラクタスチン・アナログ（例えば、［Fenteany et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3358 (1994); Fenteany et al. WO96/32105 published October 19, 1996］を参照）を含み、それにより、その全部を出典明示して、それらの各々は本明細書に含まれるとみなす。
【００１８】
「生体試料」とは、動物から採取されたいずれの体液、臓器、または組織試料をも意味する。該動物は該試料を採取する際、生死は問わない。好ましくは、該動物は哺乳類であり、その語はヒトを含む意味である。
「試験生体試料」とは、プロテアソーム・インヒビターが投与されている動物から採取した生体試料を意味する。
「参照生体試料」とは、プロテアソーム・インヒビターが投与されていない動物から採取した生体試料を意味し、すでに調製されているか、または書面、読取り可能な、もしくは電子的形態に保存されている統計的または歴史的参照を含む。「読取り可能な形態」とは、機械または技師にとって特別の意味があると理解することができるいずれの形態も意味する。
「標準試料」とは、既知または一定量の２０Ｓまたは２６Ｓプロテアソーム活性を含む試料を意味する。
【００１９】
「プロテアソーム活性」とは、該２６Ｓまたは２０Ｓプロテアソームに関係するいずれのタンパク質加水分解またはペプチド加水分解活性をも意味する。
「ペプチド」とは、ペプチド結合によって直鎖アレイにおいて互いに連結したアミノ酸残基の直鎖アレイからなる分子を意味する。本発明のそのようなペプチドは約３個ないし約５００個のアミノ酸を含むことができ、さらに、二次、三次または四次構造を含むことができ、ならびに、分子内会合は、限定されないが、共有結合により（例えば、ジスルフィド結合により）、または、キレート化、静電相互作用、疎水性相互作用、水素結合、イオン双極子相互作用、双極子−双極子相互作用、または上記のいずれの組合わせによることができる。
【００２０】
第１の局面において、本発明は、哺乳類におけるプロテアソーム・インヒビターの薬力学薬物作用をモニターする方法を提供し、それは、該哺乳類に該プロテアソーム・インヒビターを投与し；該プロテアソーム・インヒビターを投与した後、１以上の特定の時刻にて、該哺乳類から１以上の試験生体試料を採取し；該試験生体試料または複数の試料におけるプロテアソーム活性を測定し；該試験生体試料または複数の試料におけるプロテアソーム活性量を定量し；次いで、該試験生体試料におけるプロテアソーム活性量をプロテアソーム・インヒビターが投与されていない哺乳類から採取された参照生体試料におけるそれと比較することを特徴とする。
【００２１】
該哺乳類から採取される生体試料は、限定されないが、血液、尿、臓器、および組織試料を含む。好ましくは、本発明のこの具体例による生体試料は血液試料であり、より好ましくは血液細胞ライゼートである。細胞溶解は、標準方法により達成することができる。ある好ましい具体例において、該生体試料は全血細胞ライゼートである。Kahnら［Biochem. Biophys. Res. Commun., 214:957-962 (1995)］およびTsubakiら［FEBS Lett., 344:229-233 (1994)］は、赤血球は該プロテアソームの内在性タンパク質性インヒビターを含有することを開示する。かくして、さらに少量の赤血球での生体試料の汚染が該アッセイを妨害するであろう。しかしながら、本発明者らは、該内在性プロテアソーム・インヒビターは約０．０５％の濃度のＳＤＳの存在下、不活性化され、赤血球ライゼートおよび全血細胞ライゼートを確実にアッセイできるようにする。この濃度のＳＤＳにて、全プロテアソーム活性は２０Ｓプロテアソームにるものである。精製２０Ｓプロテアソームは０．０５％ ＳＤＳにて不充分な安定性を示すが、細胞ライゼート中の２０Ｓプロテアソーム活性はこれらの条件下で安定である。全血細胞ライゼート中で該アッセイを行う能力は経済性および試料調製の容易性の観点から著しい利点を与える。
【００２２】
ある他の好ましい具体例において、該生体試料は白血球ライゼートである。血液細胞を分画する方法は当該分野で知られており［Rickwood et al., Anal. Biochem. 123:23-31 (1982); Fotino et al., Ann. Clin. Lab. Sci. 1:131 (1971)］、さらに実施例に記載する。細胞分離に有用な商業製品は、限定されないが、Ficol-PaqueR（Pharmacia Biotech）およびNycoPrepTM（Nycomed）を含む。いくつかの状況において、白血球ライゼートは、全血細胞ライゼートよりもより再現性のあるデータを与え、従って、それらの状況において好ましい。
【００２３】
試料調製における変動は、データ加工に規格化ステップを導入することにより補正し得る。ある好ましい具体例において、該試料におけるプロテアソーム活性を該試料中のタンパク質含有量に対して規格化することができる（特異的活性法）。該試料中の総タンパク質含有量は、限定されないが、ブラッドフォードアッセイ（Bradford assay）およびローリー法（the Lowry method）を含む標準方法を用いて決定し得る。ある他の好ましい具体例において、該試料におけるプロテアソーム活性を細胞数に対して規格化することができる。この具体例は、自動化細胞計数器が容易に入手可能な臨床環境のごとき環境において好ましい。
【００２４】
しばしば、プロテアソーム・インヒビターは、該プロテアソームの一つのペプチダーゼ活性の他のプロテアソーム・ペプチダーゼ活性に対する優先阻害を示す。本発明者らはこのこの示差的な阻害がタンパク質含有量または細胞数に基づく規格化手順に対する代替的手法を提供することを認識した。かくして、ある特定の好ましい具体例において、プロテアソーム阻害を該プロテアソームの一つのペプチダーゼ活性のもう一つに対する比として決定する。本発明のこの具体例によるプロテアソーム阻害の決定のための理論式の誘導を実施例に与える。本発明のこの具体例を機能させるため、研究下のプロテアソーム・インヒビターは一つのペプチダーゼ活性を少なくとも一つの他のペプチダーゼ活性に対して優先的に阻害するに違いない。アッセイすべきペプチダーゼ活性の選択、かくして、用いるべき適当なペプチド性基質は研究下のインヒビターに依存する。例えば、インヒビターＮ−（ピラジン）カルボニル−Ｌ−フェニルアラニン−Ｌ−ロイシンボロン酸（1）に関し、好ましくは、プロテアソーム阻害をキモトリプシン活性のトリプシン活性に対する比として決定する。キモトリプシン活性は1によって完全阻害され、一方、同一濃度範囲でトリプシン活性は1により活性化される。
【００２５】
生体試料を採取する哺乳類は、好ましくはラット、マウス、イヌ、ブタ、ウサギ、非ヒト霊長類、またはヒトである。非ヒト霊長類は、限定されないが、カニクイザル（cynomolgus monkeys)、タマリン、チンパンジー、およびヒヒを含む。より好ましくは、該哺乳類はヒトであり、最も好ましくは、プロテアソーム・インヒビターで治療処置を受けているヒトである。処置は病院環境内で、または外来患者ベースで行うことができる。好ましくは、該ヒトは、ユビキチン−プロテアソーム経路媒介不適切または加速されたタンパク質分解に起因する状態に罹患している患者である。好ましい具体例において、そのような状態は、ＨＩＶ感染；カヘキシー；マラリアのごとき原虫寄生疾患；癌、乾癬、および再発狭窄症のごとき細胞増殖性疾患；および炎症性疾患よりなる群から選択される。炎症性疾患は、限定されないが、骨−およびリウマトイド関節炎；潰瘍性大腸炎およびクローン病を含む炎症性腸疾患；敗血症；移植組織拒絶；喘息；および、卒中および心筋梗塞を含む虚血または再潅流損傷を含む。ある特定の具体例において、該ヒトは癌患者または虚血または再潅流損傷に罹患しているか、またはその危険性がある患者である。
【００２６】
本発明に使用するためのペプチドアルデヒド・プロテアソーム・インヒビターは、好ましくは、Steinら［WO95/24914 published September 21, 1995］、またはSimanら［WO91/13904 published September 19, 1991］に開示されたものを含み、これにより、それらの全部を出典明示して両方とも本明細書に含まれるものとみなす。
【００２７】
本発明に使用するためのボロン酸またはエステル化合物は、好ましくは、Adamsら［WO96/13266 published May 9, 1996］、またはSimanら［WO91/13904 published September 19, 1991］に開示されたものを含み、これにより、それらの全部を出典明示して両方とも本明細書に含まれるものとみなす。
【００２８】
より詳しくは、本発明に使用するボロン酸化合物は：
Ｎ−アセチル−Ｌ−ロイシン−β−（１−ナフチル）−Ｌ−アラニン−Ｌ−ロイシンボロン酸；
Ｎ−（８−キノリン）スルホニル−β−（１−ナフチル）−Ｌ−アラニン−Ｌ−ロイシンボロン酸；
Ｎ−（ピラジン）カルボニル−Ｌ−フェニルアラニン−Ｌ−ロイシンボロン酸；
β−（１−ナフチル）−Ｌ−アラニン−Ｌ−ロイシンボロン酸；および
Ｎ−（４−モルホリノ）カルボニル−［Ｏ−（２−ピリジルメチル）］−Ｌ−チロシン−Ｌ−ロイシンボロン酸
よりなる群から選択される。
【００２９】
本発明に使用するラクタシスチンおよびラクタシスチン・アナログ化合物は、好ましくは、Fenteanyら［WO96/32105 published October 17, 1996］に開示されたものを含み、これにより、その全部を出典明示して本明細書に含まれるものとみなす。より詳しくは、該ラクトスタチン・アナログは、クラスト−ラクタシスチンβ−ラクトン、７−エチル−クラスト−ラクタシスチンβ−ラクトンおよび７−ｎ−プロピル−クラスト−ラクタシスチンβ−ラクトンよりなる群から選択される。最も好ましくは、該ラクタシスチン・アナログは７−ｎ−プロピル−クラスト−ラクタシスチンβ−ラクトンである。
【００３０】
該プロテアソーム・インヒビターは、皮内、腹腔内、皮下、関節内、経口、気管内、鼻腔内、動脈内、静脈内、局所的、または経直腸を含むいずれの経路によっても該哺乳類にに投与することができる。ある好ましい具体例において、該プロテアソーム・インヒビターは腫瘍内投与することができる。非経口投与はボーラスまたは注入によって施すことができる。現在、静脈内または腹腔内経路による投与が好ましい。該プロテアソーム・インヒビターは、単一用量または繰返し用量で投与することができる。繰返し用量は、月１回から日数回までの範囲の頻度で投与することができる。以下に論ずるように、本発明の方法は特定のプロテアソーム・インヒビターに適当な投与量および頻度を決定するのに有用である。
【００３１】
該生体試料におけるプロテアソーム活性は、２０Ｓまたは２６Ｓプロテアソーム活性を決定するのに適当ないずれかのアッセイ法によって測定する（例えば、［McCormack et al., Biochemistry 37:7792-7800 (1998); Driscoll and Goldberg, J. Biol. Chem. 265:4789 (1990); Orlowski et al., Biochemistry 32:1563 (1993)］を参照）。好ましくは、検出可能な標識を有する基質を該反応混合物に供給し、該基質のタンパク質加水分的切断を基質の消失または切断生成物の発生を追跡することによってモニターする。該標識の検出は、例えば、蛍光、比色、放射線アッセイにより達成することができる。
【００３２】
２６Ｓプロテアソーム活性を決定するための好ましい基質は、限定されないが、リゾチーム、α−ラクトアルブミン、β−ラクトグロビン、インスリンｂ−鎖、およびオルニチン・デカルボキシラーゼを含む。２６Ｓプロテアソーム活性を測定すべき場合、好ましくは、該基質はユビキチン化されているか、あるいは、好ましくは、該反応混合物はユビキチンまたはユビキチン化酵素をさらに含む。
【００３３】
より好ましくは、該基質は長さにおいて１０個未満のアミノ酸のペプチドである。一つの好ましい具体例において、該ぺプチド基質は切断可能な蛍光標識を含有し、該標識の遊離を蛍光アッセイによりモニターする。本発明のこの具体例による好ましい基質の非限定的な例は、Ｎ−（Ｎ−カルボベンジルオキシカルボニルロイシルロイシルアルギニル）−７−アミノ−４−メチルクマリン（Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−ＡＭＣ）、Ｎ−（Ｎ−ベンゾイルバリルグリシルアルギニル）−７−アミノ−４−メチルクマリン（Ｂｚ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣ）、Ｎ−（Ｎ−カルボベンジルオキシカルボニルロイシルロイシルアルギニル）−７−アミノ−２−ナフチルアミン（Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−２ＮＡ）、またはＮ−（Ｎ−スクシニルロイシルロイシルバリルチロシル）−７−アミノ−４−メチルクマリン（Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ＡＭＣ）を含む。ある好ましい具体例において、該反応混合物は２０Ｓプロテアソーム・アクチベーターをさらに含む。好ましいアクチベーターは、Couxら［Ann. Rev. Biochem. 65:801-847 (1995)］に教示されたものを含み、好ましくはＰＡ２８またはドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）である。
【００３４】
該アッセイにおける日日変動は、バッファー溶液の差異、オペレーター変動、機器性能の変動、および温度変動のごとき要因に起因するであろう。そのような変動は、既知または一定のプロテアソーム活性を含む標準プロテアソーム試料に対して該生体試料および該参照試料の両方を標準化することによって最小限化し得る。ある好ましい具体例において、該標準試料は、精製２０Ｓプロテアソーム、より好ましくは、真核細胞からの精製２０Ｓプロテアソームを含む。２０Ｓプロテアソーム源は重要ではなく、限定されないが、哺乳動物を含み、限定されないが、ウサギを含む。ある好ましい具体例において、該標準試料は、限定されないが、血液試料を含む生体試料である。好ましくは、該生体試料は全血細胞ライゼート、より好ましくは、ヒト、好ましくはプロテアソーム・インヒビター投与されていないヒトからの全血細胞ライゼートである。
【００３５】
該試験生体試料において測定されたプロテアソーム活性をプロテアソーム・インヒビターが投与されていない哺乳類から採取された参照生体試料において測定されたそれと比較する。いくつかの好ましい具体例において、該試験生体試料および該参照生体試料は、それぞれ、別々に、処置を受けている哺乳類、好ましくはマウスの群からプールされた複数の試料を含む。別の好ましい具体例いおいて、該試験生体試料および該参照生体試料は、それぞれ、個々の哺乳類から採取された単一試料を含む。個々の試料のアッセイは、現在、該哺乳類のサイズが小さいために実行できない場合を除いて、好ましい。いくつかの好ましい具体例において、統計試料を個々の試験生体試料からまたは個々の参照生体試料からのデータをプールすることによって得る。
【００３６】
いくつかの好ましい具体例において、該参照試料は、プロテアソーム阻害処置を開始する前に該処置哺乳類から採取する。この具体例は、現在、哺乳類間変動の影響を最小限にするために高等哺乳類にとって好ましい。プロテアソーム・インヒビター薬物作用の臨床モニターは、現在、好ましくは、本発明のこの具体例を含意し、それは、各患者が自身のベースライン対照として機能する。
【００３７】
該参照試料と比較して該生体試料におけるプロテアソーム活性の低下は、該生体試料が採取された時点での該プロテアソーム・インヒビターの生体内効果を示す。いくつかの好ましい具体例において、生体試料は、該プロテアソーム・インヒビターの投与後の複数の時点にて採取する。これらの具体例において、該生体試料におけるプロテアソーム活性の測定は、該プロテアソーム・インヒビターの生体内効果の程度および持続時間の指標を与える。ある他の具体例において、複数の生体試料を１以上の時点にて単一の哺乳類から採取する。これらの具体例において、該生体試料におけるプロテアソーム活性の測定は、該哺乳類における該プロテアソーム・インヒビターの分布の指標を与える。
【００３８】
プロテアソーム活性測定における変動の可能性のある源は、個体間の差異、単一個体におけるプロテアソーム活性の時間的ゆらぎ、および白血球と赤血球とのプロテアソーム活性の差異を含む。３つの全ての変動源は、特定の活性に基づくプロテアソーム阻害決定に影響を与えるであろう。対照的に、該プロテアソームの一つのぺプチド活性のもう一つの活性に対する比に基づくプロテアソーム活性決定はより高い一貫性を示すであろう。
【００３９】
第２の局面において、本発明は、プロテアソーム・インヒビターの用量処方を決定する方法を提供し、それは、該哺乳類に該プロテアソーム・インヒビターを投与し；該プロテアソーム・インヒビターを投与した後、１以上の特定の時刻にて、該哺乳類から１以上の試験生体試料を採取し；該試験生体試料または複数の試料におけるプロテアソーム活性を測定し；該試験生体試料または複数の試料におけるプロテアソーム活性量を定量し；該試験生体試料におけるプロテアソーム活性量をプロテアソーム・インヒビターが投与されていない哺乳類から採取された参照生体試料におけるそれと比較し、次いで、将来投与すべきプロテアソーム・インヒビターの投与量および投与頻度を選択することを特徴とする。
本発明のこの局面による好ましい具体例は、該第１の局面について上記したものである。
【００４０】
好ましくは、投与量はｍｇ／ｋｇまたはｍｇ／ｍ２ベースで決定する。該将来用量（future dose）が投与される哺乳類は該生体試料が採取されたのと同一の哺乳類でよく、あるいは、それは異なる哺乳類でよい。いくつかの具体例において、上に挙げたステップを繰り返すことができる。例えば、臨床環境において、該投与量および投与頻度は、該患者から採取された生体試料におけるプロテアソーム活性の繰返しモニターの結果として、繰返しもしくは連続的に調整することができる。
【００４１】
ある好ましい具体例において、該プロテアソーム・インヒビターの投与量および投与頻度は過度なプロテアソーム阻害を回避するように選択される。いくつかの具体例において、過度なプロテアソーム阻害は毒性効果をもたらし、その毒性効果は、限定されないが、嘔吐、下痢、血液減少症、低血圧症および致死を含む。好ましくは、該プロテアソーム・インヒビターの投与量および投与頻度は、いずれの将来の生体試料におけるプロテアソーム阻害が約９５％を超えないように選択する。
【００４２】
ある他の好ましい具体例において、該プロテアソーム・インヒビターの投与量および投与頻度は、治療上有用なプロテアソーム阻害が達成するように選択する。好ましくは、治療上有用なプロテアソーム阻害は、治療上有益な抗腫瘍、抗炎症、抗菌または抗寄生虫効果をもたらす。好ましくは、該プロテアソーム・インヒビターの投与量および投与頻度は、将来の生体試料において少なくとも約１５％、好ましくは約２０％、より好ましくは約３０％、さらにより好ましくは約４０％、なおより好ましくは約５０％、および最も好ましくは約５０ないし約８０％のプロテアソーム阻害を達成するように選択するが、いくつかの場合、９５％程度の高いプロテアソーム阻害が好まれるであろう。
【００４３】
ある好ましい具体例において、該生体試料は疾患の座から採取する。一つの好ましい具体例において、該生体試料は、好ましくは癌患者からの腫瘍または腫瘍細胞を含む。この具体例の生体試料は好ましくは該患者に存在する腫瘍の生検により採取される。もう一つの好ましい具体例において、該生体試料は、血液細胞増殖障害を持つ患者からの血液細胞または血液細胞前駆体を含む。もう一つの好ましい具体例において、該生体試料は乾癬を持つ患者の皮膚生検により採取する。もう一つの好ましい具体例において、該生体試料は炎症性腸疾患に罹っている患者の直腸の生検により採取する。なおもう一つの好ましい具体例において、該生体試料は、好ましくは関節炎を持つ患者からの関節液を含む。さらにもう一つの好ましい具体例において、該生体試料は、好ましくはカヘキシー患者からの筋肉細胞を含む。さらになおもう一つの好ましい具体例において、該生体試料は、好ましくは喘息を持つ患者の気管支液を含む。
【００４４】
第３の局面において、本発明は、哺乳類におけるベースラインのプロテアソーム活性を決定する方法を提供し、それは、該哺乳類から１以上の生体試料を採取し；該生体試料または複数の試料におけるプロテアソーム活性を測定し；次いで、該生体試料または複数の試料におけるプロテアソーム活性量を定量することを特徴とする。ある具体例において、該方法は、さらに、該哺乳類に投与すべきプロテアソームの投与量および投与頻度を決定することを特徴とする。
本発明のこの局面による好ましい具体例は該第１および第２の局面について上記したものである。
【００４５】
本発明のこの局面による一つの好ましい具体例において、該哺乳類は疾患または病的な状況に罹患している。本発明者らは、生体内プロテアソーム活性がある疾患状態において変化するであろうと予想する。プロテアソーム活性の基準量からの逸脱をプロテアソーム・インヒビターでの処置の開始前に認定することは重要である。ベースラインのプロテアソーム活性が基準よりも高い場合、基準よりも高いプロテアソーム・インヒビターの投与量が必要であろう。逆に、ベースラインのプロテアソーム活性基準よりも低い場合、基準よりも低いプロテアソーム・インヒビターの投与量が必要であろう。
【００４６】
ある好ましい具体例において、疾患または病的な状態に罹っている哺乳類から採取された生体試料についてのプロテアソーム活性データを同一の疾患または状態を持つ他の哺乳類からの生体試料についてのプロテアソーム活性データと組合わせる。次いで、組合わされたデータは、該疾患または状態を持たない哺乳類または複数の哺乳類から採取された参照生体試料についてのプロテアソーム活性データと比較する。本発明のこの局面による方法は、もしあれば、該疾患または状態が有する生体内プロテアソーム活性に対する効果を統計的に決定することを可能とする。ある好ましい具体例において、該方法は、さらに、該疾患または病的な状態に罹患している哺乳類に投与すべきプロテアソーム・インヒビターの投与量および投与頻度を決定することを特徴とする。該プロテアソーム・インヒビターが投与されるべき病気の哺乳類はベースラインのプロテアソーム活性が決定されたものと同一の哺乳類でよく、あるいは、それは同一の疾患または状態を持つ異なる哺乳類でよい。
【００４７】
ある他の好ましい具体例において、本発明のこの局面による方法は、さらに、該哺乳類の診断または予後を決定することを特徴とする。本発明者らは、プロテアソーム活性レベルは、ベースラインのプロテアソーム活性を疾患の結果と関係付けるのに、および当該関連データに基づき、個々の哺乳類の予後を決定するのに有用であろうと予想する。
【００４８】
もう一つの好ましい具体例において、該哺乳類は薬物投与されている。様々な目的で投与された薬物は、例えば、該プロテアソームを阻害することにより直接的か、あるいは、例えば、代謝経路に影響することによってか、または基質の有用性に影響することにより間接的かのいずれかでプロテアソーム活性レベルに影響するであろう。本発明はこれらの影響をモニターし、薬物−薬物相互作用を予測する方法を提供する。ある好ましい具体例において、薬物処置哺乳類から、プロテアソーム・インヒビターでの該哺乳類の処置の開始前に採取した生体試料において、プロテアソーム活性を測定する。該方法は、さらに、投与すべきプロテアソーム・インヒビターの投与量および投与頻度を決定することを特徴とする。
【００４９】
ある他の具体例において、薬物処置哺乳類から採取された生体試料についてのプロテアソーム活性データを同一の薬物で処置された他の哺乳類から採取された生体試料についてのプロテアソーム活性データと組合わせる。次いで、組合わされたデータは、該薬物投与されていな哺乳類または複数の哺乳類から採取された参照生体試料についてのプロテアソーム活性データと比較する。本発明のこの局面による方法は、もしあれば、該疾患または状態が有する生体内プロテアソーム活性に対する効果を統計的に決定することを可能とする。ある好ましい具体例において、該方法は、さらに、該薬物で処置された哺乳類に投与すべきプロテアソーム・インヒビターの投与量および投与頻度を決定することを特徴とする。該プロテアソーム・インヒビターが投与されるべき薬物処置哺乳類は、ベースラインプロテアソーム活性が決定されたものと同一の哺乳類でよく、あるいは、それは同様に同一の薬物で処置されている異なる哺乳類でよい。
【００５０】
第４の局面において、本発明は、哺乳類からの生体試料におけるプロテアソーム活性を測定するためのキットを提供し、該キットは該生体試料を調製する手段およびプロテアソーム活性を測定する手段を含む。ある好ましい具体例において、該哺乳類はヒトである。ある他の好ましい具体例において、該生体試料は血液、尿、または組織生検試料である。
【００５１】
実施例
以下の実施例は、本発明のある好ましい具体例をさらに例示する意図であるが、本質的に限定するものではない。
【００５２】
実施例１：ラットおよび霊長類におけるＮ−（ピラジン）カルボニル−Ｌ−フェニルアラニン−Ｌ−ロイシンボロン酸（1）
ラット
Ｎ−（ピラジン）カルボニル−Ｌ−フェニルアラニン−Ｌ−ロイシンボロン酸（1）での単一用量静脈内薬物動力学的研究をスプラーグ−ドーリラット（１４０ないし２８０ｇ）において行った。動物を３群（群１および２において６匹／性別；群３において９匹／性別）に割当てた。群１、２および３の動物は、同一の用量体積で、それぞれ、０．０３、０．１または０．３ｍｇ／ｋｇの1を受けた。
【００５３】
血液試料（約１．０ｍＬ）は、第１日に動物の頸静脈血管から投与前および投与後約１、３、および２４時間にて収集した。該試料をクロマトグラフィー／質量分光分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）法を用いて1についてアッセイした。分析の定量下限は、ラット血漿および全血において1につき２．５ｎｇ／ｍＬに設定した。
【００５４】
該単一静脈投与後、1の血漿中または全血中レベルを０．３ｍｇ／ｋｇ用量レベルにおいてのみ測定した。実測Ｃｍａｘは該第１の時点に現われ；それ故、ピーク濃度までの時間（Ｔｍａｘ）をオスおよびメスのラットの両方に対して＜１０分と評価した。一般的に、オスは、メスよりも若干高いピーク濃度（Ｃｍａｘ）および濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ０−ｔ）値を有していた。オスにおいて、血漿中および全血中のＣｍａｘ値は、それぞれ、５１．８および２２．７ｎｇ／ｍＬであり、メスにおいては、それぞれ、３６．９および１９．１ｎｇ／ｍＬであった。オスにおいて、血漿中および全血中のＡＵＣ０−ｔ値は、それぞれ、１４．０および１８．６ｎｇ・時／ｍＬであり、メスにおいては、それぞれ、１２．９および１７．７ｎｇ・時／ｍＬであった。排出半減期（ｔ１／２）の評価は、当該ターミナル相（the  terminal phase）の間の1レベルの変動のため、不可能であった。該観察は、1は急速に血液から排除されることを示唆する。
【００５５】
霊長類
血中および血漿中の1のレベルは、霊長類における範囲発見研究の投与後２時間にて測定した。1の単一静脈投与を２匹のカニクイザル（１匹のオス、３．３ｋｇ；１匹のメス、２．３ｋｇ）に投与した。各サルは、１．０ｍＬ／ｋｇの用量体積にての２回の単一用量（第１日に０．１ｍｇ／ｋｇおよび第８日に０．３ｍｇ／ｋｇ）を受けた。当該ビヒクルは０．１％アスコルビン酸／２％エタノール／９８％食塩水（０．９％）であった。この研究は、ウィスコンシン州マジソンのCovance Laboratories Inc. により行われた。
【００５６】
静脈投与後、血液を各動物から第１日および第８日に投与後約２時間にて収集した。血液および血漿試料を試験物質含有量を分析するまで−２０±１０℃に維持するように設定したフリーザー中で貯蔵した。
【００５７】
試料は、クロマトグラフィー／質量分光分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）法を用いて1についてアッセイした。分析の定量下限は、サルの血漿および全血において1つき２．５ｎｇ／ｍＬに設定した。０．１ｍｇ／ｋｇの1の投与後２時間、1の濃度は血漿中で２．５ｎｇ／ｍＬ未満（オスおよびメス）；全血中の1の濃度は、オスにおいて３．７２ｎｇ／ｍＬであり、メスにおいて３．８６ｎｇ／ｍＬであった。０．３ｍｇ／ｋｇの1の投与後２時間、血漿中の1の濃度は４．６４ｎｇ／ｍＬ（メス）および６．４４ｎｇ／ｍＬ（オス）であり；全血中の1の濃度は、１０．６ｎｇ／ｍＬ（メス）および９．０１ｎｇ／ｍＬ（オス）であった。
【００５８】
実施例２：２０Ｓプロテアソーム活性の生体内測定のための末梢白血球ライゼートの調製
この調製手順は、哺乳類、特にラット、マウス、イヌ、ブタ、ウサギ、非ヒト霊長類、またはヒト対象から収集した血液試料に適用する。末梢白血球を収集した血液試料から分離し、試験されるまで約−７０℃にて貯蔵した。外来プロテアソーム・インヒビターの存在による該アッセイの干渉を避けるため、赤血球を厳密に排除することが重要である。
【００５９】
手順
必要量の血液を抗凝固剤を含有する管に収集する。ヒト対象および霊長類ににつき、約５ｍＬの血液が必要であり；ラットにつき、約４ｍＬの血液が必要であり；マウスにつき、５匹のマウスのそれぞれから約１ｍＬの血液が必要であって、該５つの血液試料をプールして約５ｍＬとする。
【００６０】
該血液試料を滅菌食塩水中で１：１（ｖ／ｖ）に希釈し、該血液−食塩水混合物を約２：１血液：NycoprepTMの比率にて１４×７５ｍｍポリスチレン試験管中のNycoprepTM分離媒体上に層にする。該試料を室温にて約３０分間５００×ｇにて遠心する。当該上部層を除去し、上部および底部層の間の〜２−３ｍｍの細胞バンドを残す。残りの細胞バンドをピペットによりきれいな遠心管に移す。該細胞バンドを３ｍＬの冷リン酸バッファー化食塩水で洗浄し、４℃にて５分間４００×ｇにて遠心する。該上清を注ぎ出し、ペレットを〜１ｍＬの冷リン酸バッファー化食塩水に再懸濁させる。該懸濁液を１．５ｍＬエッペンドルフミクロ遠心管に移し、４℃にて約１０分間６６００×ｇにてミニ遠心する。該上清を吸引除去し、細胞ペレットを−７０℃±１０℃にて貯蔵する。
【００６１】
実施例３：末梢白血球における２０Ｓプロテアソーム活性を測定するアッセイ
特異的活性法
該アッセイは遊離２０Ｓ粒子のＳＤＳ−誘発性キモトリプシン様活性に基づく。それは、蛍光法を用いて、該２０Ｓプロテアソームが小ペプチド基質中のアミド結合を加水分解する速度を測定する。インヒビターの存在下および不存在下でのこの速度の測定は、いかに酵素がインヒビターにより結合されるかの決定を可能にする。このアッセイを用いて、哺乳類、特にラット、マウス、イヌ、ブタ、ウサギ、非ヒト霊長類、またはヒト対象における末梢白血球における２０Ｓプロテアソーム活性を測定する。
【００６２】
略語および定義：
0004503182.tif 000002
【００６３】
手順
Ｙｓ基質をＤＭＳＯ中に溶かして６ｍＭにする。ミリＱウォーター中のＳＤＳの２％溶液（２ｇ／１００ｍＬ）をガラスビン中で調製する。２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０３５％ ＳＤＳ、１％ ＤＭＳＯ、および６０μＭ Ｙｓ基質を含有するＹｓ基質バッファーを調製する。該Ｙｓ基質バッファーの最終ｐＨは８．０である。
【００６４】
ウサギ網状赤血球からの精製２０Ｓプロテアソーム標準は、文献の手順［McCormack et al., Biochemistry 37:7792-7800 (1998)］に準じて調製し、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／０．５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．８）中で１：９（ｖ／ｖ）に希釈する。
【００６５】
ＤＭＦ中の５μＬの２０ｍＭ ＡＭＣ母液に２ｍＬのＤＭＦを添加する。得られた溶液をＤＭＳＯ中で１：２５に希釈して、２μＭ ＡＭＣ溶液を生成する。Ｙｓ基質バッファーのゼロ値を蛍光光度計で記録する（λｅｍ＝４４０ｎｍ；λｅｘ＝３８０ｎｍ）。２ｍＬのＹｓ基質バッファーに、合計５回まで３０秒毎に５μＬのＡＭＣを添加して、０ないし５０ｐｍｏｌのＡＭＣの補正曲線を作成する。各添加後、蛍光光度計の読みを１０ｎｍの励起バンド幅および２０ｎｍの発光バンド幅で読取る。傾斜が蛍光光度計補正である。
【００６６】
該２０Ｓプロテアソーム標準を２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／０．５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．８）中で１：１０に希釈して１２μｇ／ｍＬ母液を形成し、氷上に置く。１０μＬの標準２０Ｓプロテアソーム溶液を２ｍＬのＹｓ基質バッファーを含有するセルに添加し、反応を１０分間行う。最大直線傾斜を蛍光光度計で測定し、Ｙｓ基質バッファーおよび該アッセイ条件の補正（Ｙｓ補正）を与える。この値を該蛍光光度計補正で除して、標準２０Ｓプロテアソームの標準化活性を与える。
【００６７】
白血球を実施例１に記載したごとく調製し、２００μＬの５ｍＭ ＥＤＴＡを各試料に添加することによって溶解する。該試料を少なくとも１５分間氷上に放置する。
【００６８】
（総タンパク質含有量を測定する）ブラッドフォードタンパク質アッセイおよびヘモグロビンアッセイは、商業的に入手可能なキットを用いる標準手順の後に該試験試料につき実行する。白血球２０Ｓプロテアソーム活性の正確な測定値は、ヘモグロビン含有量が総タンパク質の１０％を超えると、決定できない。この場合、該試料を全血細胞ライゼートとして処理すべきである。
【００６９】
１０μＬの試験試料を２ｍＬのＹｓ基質バッファーを含有するセルに３７℃にて添加し、反応を１０分間行わせる。該２０Ｓプロテアソームの完全活性化は１０分以内に達成する。４分後および１０分までに読取った読みについて、一貫した結果が得られた。少なくとも１分間のデータの最大直線傾斜を測定する。速度が１ｐｍｏｌ ＡＭＣ／秒未満ならば、２０μＬの試験試料を用いて測定を繰り返す。
【００７０】
該試験試料における２０Ｓプロテアソームの量を以下の数式に従って算出する：
【００７１】
【数１】
0004503182.tif 000003
【００７２】
該アッセイを有効とみなすために、該試料中に存在するヘモグロビンは総タンパク質の１０％未満でなければならず、３回の２０Ｓプロテアソーム活性値は３％未満の標準偏差を有していなければならない。
【００７３】
実施例４：キモトリプシン：トリプシン活性比をプロテアソーム・インヒビターによるパーセント阻害に関連付ける数式の誘導
ｋｃおよびｋｔを、それぞれ、標準アッセイ条件下（インヒビター無し）でのキモトリプシンおよびトリプシンサイトの見かけ上の速度定数とする：
【００７４】
【数２】
0004503182.tif 000004
【００７５】
【数３】
0004503182.tif 000005
【００７６】
［式中、［２０Ｓ］ｔ＝総タンパク質濃度］
【００７７】
Ｅ・Ｉ複合体の形成をもたらすプロテアソーム修飾因子の存在下、キモトリプシンおよびトリプシンサイトに対する速度定数は未確認サイトに結合する修飾因子の単一の分子によって変化するであろう。この効果はβｃｋｃおよびβｔｋｔで表し得；ここに、
β＝０は、該修飾因子による完全阻害を示す。
（すなわち、Ｅ・Ｉ複合体は活性がない。）
β＜１は、部分阻害を示す。
（すなわち、Ｅ・Ｉ複合体はＥよりも低い活性を有する。）
β＝１は、阻害がないことを示す。
（すなわち、Ｅ・Ｉ複合体はＥと同一の活性を有する。）
β＞１は、活性化を示す。
（すなわち、Ｅ・Ｉ複合体はＥより高い活性を有する。）
【００７８】
修飾プロテアソームのある割合において（ｆ）：
【００７９】
【数４】
0004503182.tif 000006
【００８０】
【数５】
0004503182.tif 000007
【００８１】
【数６】
0004503182.tif 000008
【００８２】
【数７】
0004503182.tif 000009
【００８３】
パラメータｋｃ／ｋｔは、少なくとも個体内において、おそらくは種を越えて、実験的に決定し得る定数である。ｋｃ／ｋｔは該キモトリプシンおよびトリプシン活性の測定のためのアッセイ条件に依存するが、該インヒビターが何であるかには依存しない。パラメータβｃおよびβｔは特定のインヒビターに対する定数である。アッセイ条件へのそれらの依存性はｋｃ／ｋｔよりもかなり低いものと予想される。何故ならば、当該インヒビター−酵素複合体活性は、遊離酵素活性と異なって、活性が変化するに違いない。β＝０または１の場合、βはアッセイ条件への依存性がないことが予想される。アッセイ条件およびインヒビターの特定の組において、一旦、ｋｃ／ｋｔ、βｃおよびβｔが分かれば、粗試料のキモトリプシンおよびトリプシン活性を用いて、修飾プロテアソームの割合を算出し得る。
【００８４】
Ｎ−（ピラジン）カルボニル−Ｌ−フェニルアラニン−Ｌ−ロイシンボロン酸の特別な場合、βｃ＝０であり、それで
【００８５】
【数８】
0004503182.tif 000010
【００８６】
該プロテアソームのいずれの２つのペプチダーゼ活性の比の関数でプロテアソーム阻害を表現するのに、類似する数式を誘導し得る。
【００８７】
実施例５：末梢白血球における２０Ｓプロテアソーム活性を測定するアッセイ
キモトリプシンのトリプシン活性に対する比
該アッセイは遊離２０Ｓプロテアソーム粒子のＳＤＳ−誘発性キモトリプシン様およびトリプシン様活性に基づく。それは、蛍光分光法を用いて、該２０Ｓプロテアソームが小ペプチド基質を加水分解する速度を測定する。２０Ｓプロテアソーム活性のいくつかのプロテアソーム・インヒビターは、該キモトリプシン様活性を完全に阻害するが、該トリプシン様活性を活性化するので、そのようなインヒビターに結合された２０Ｓプロテアソームのパーセントは、該キモトリプシン様およびトリプシン様活性の比により、直接決定し得る。
【００８８】
略語および定義：
実施例３に記載の定義に加えて、以下の定義も適用する：
Ｒｓ基質          Ｎ−（Ｎ−ベンゾイルルバリルグリシルアルギニル）−
７−アミノ−４−メチルクマリン
(Bz-Val-Gly-Arg-AMC)（Bachem）
【００８９】
手順
該Ｙｓ基質バッファーは実施例３に記載したごとく調製する。
該Ｒｓ基質をＤＭＳＯ中に溶かして１０ｍＭにする。２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．６％ ＤＭＳＯ、および６０μＭ Ｒｓ基質を含有するＲｓ基質バッファーを調製する。
【００９０】
ウサギ網状赤血球からの精製２０Ｓプロテアソーム標準は、文献の手順［McCormack et al., Biochemistry 37:7792-7800 (1998)］に準じて調製し、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／０．５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．８）中で１：９（ｖ／ｖ）に希釈する。
【００９１】
蛍光光度計補正を実施例３に記載したごとく行う。
Ｙｓ基質バッファー補正を実施例３に記載したごとく行う。
Ｒｓ基質バッファー補正は、該Ｙｓ基質バッファーの代りに該Ｒｓ基質バッファーに置換えて同様に行う。
【００９２】
１０μＬの試験試料を２ｍＬのＹｓ基質バッファーを含有するセルに３７℃にて添加し、反応を１０分間行わせる。該２０Ｓプロテアソームの完全活性化は１０分以内に達成する。４分後および１０分までに読取られた読みについて、一貫した結果が得られた。少なくとも１分間のデータの最大直線傾斜を測定する。速度が１ｐｍｏｌ ＡＭＣ／秒未満ならば、２０μＬの試験試料を用いて測定を繰り返す。
【００９３】
２０μＬの試験試料を２ｍＬのＲｓ基質バッファーを含有するセルに３７℃にて添加し、反応を１０分間行わせる。該２０Ｓプロテアソームの完全活性化は１０分以内に達成する。４分後および１０分までに読取られた読みについて、一貫した結果が得られた。少なくとも１分間のデータの最大直線傾斜を測定する。速度が１ｐｍｏｌ未満でならば。８００μＬ Ｒｓバッファー中の２０μＬの試験試料を用いて測定を繰り返す。
【００９４】
次いで、パーセント阻害（％Ｉ）を以下の数式に従って算出する：
【００９５】
【数９】
0004503182.tif 000011
【００９６】
［式中、ｖｃ＝（キモトリプシン速度（ＦＵ／秒））／（アッセイされる試料の体積）；
ｖｔ＝（トリプシン速度（ＦＵ／秒））／（アッセイされる試料の体積）；
ｋｃ／ｋｔ＝該プロテアソーム・インヒビターの投与前に該対象から採取された１〜３つのベースライン試料の平均ｖｃ／ｖｔ；
βｔ＝該プロテアソーム・インヒビターの滴定により決定された活性化因子。プロテアソーム・インヒビター１につき、ヒト試料においてβｔ＝１．２８である。］
【００９７】
実施例６：２０Ｓプロテアソーム活性の生体内測定のための末梢全血細胞ライゼートの調製
必要量の血液を抗凝固剤を含有する管に収集する。典型的には、１ｍＬの血液が必要である。該血液を１．５ｍＬ エッペンドルフミクロ遠心管に移し、４℃にて約１０分間６６００×ｇにてミニ遠心する。血漿を吸引除去し、細胞ペレットを冷リン酸バッファー化食塩水の体積（〜０．５ｍＬ）中に１：１で再懸濁させる。該細胞懸濁液を再び４℃にて約１０分間６６００×ｇにてミクロ遠心する。上清を吸引除去する。１０μＬの細胞ペレットを１．５ｍＬ エッペンドルフミクロ遠心管に移し、０．５ｍＬの５ｍＭ ＥＤＴＡを添加する。残りの細胞ペレットを−７０℃にて凍結する。
【００９８】
１０〜２０μＬのこの試料を該アッセイに用いる（典型的なタンパク質濃度は５ｍｇ／ｍＬである）。
【００９９】
実施例７：末梢全血細胞における２０Ｓプロテアソーム活性を測定する
アッセイ
キモトリプシン様のトリプシン様活性に対する比
略語および定義：
実施例３および５に記載した略語および定義を適用する。
【０１００】
手順
該Ｙｓ基質をＤＭＳＯに溶かして６ｍＭにする。ミリＱウォーター中のＳＤＳの２％（２ｇ／１００ｍＬ）溶液をガラスビン中で調製する。２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ ＳＤＳ、１％ ＤＭＳＯ、および６０μＭ Ｙｓ基質を含有するＹｓ基質バッファーを調製する。該Ｙｓバッファーの最終ｐＨは８．０である。
【０１０１】
該Ｒｓ基質をＤＭＳＯに溶かして、１０ｍＭにする。２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．６％ ＤＭＳＯ、および６０μＭ Ｒｓ基質を含有するｒｓ基質バッファーを調製する。該Ｒバッファーの最終ｐＨは８．０である。
【０１０２】
標準全血ライゼートを実施例６に記載したごとく調製し、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／０．５ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．８）中で１：９に希釈する。
【０１０３】
蛍光光度計補正は、２０Ｓプロテアソーム標準の代りに標準全血ライゼートを用いて、実施例３に記載したごとく行う。
Ｙｓ基質バッファー補正は、２０Ｓプロテアソーム標準の代りに標準全血ライゼートを用いて、実施例３に記載したごとく行う。
Ｒｓ基質バッファー補正は、該Ｙｓ基質バッファーの代りに該Ｒｓ基質バッファーに置換えて同様に行う。
【０１０４】
６０μｇのタンパク質を含有する試験試料を２ｍＬのＲｓ基質バッファーを含有するセルに３７℃にて添加し、反応を１０分間行わせる。該２０Ｓプロテアソームの完全活性化は１０分以内に達成する。４分後および１０分までに読取られた読みについて、一貫した結果が得られた。少なくとも１分間のデータの最大直線傾斜を測定する。速度が１ｐｍｏｌ未満でならば。１２０μＬの試験試料を用いて測定を繰り返す。
次いで、パーセント阻害（％Ｉ）を以下の数式に従って算出する：
【０１０５】
【数１０】
0004503182.tif 000012
【０１０６】
［式中、ｖｃ＝（キモトリプシン速度（ＦＵ／秒））／（アッセイされる試料の体積）；
ｖｔ＝（トリプシン速度（ＦＵ／秒））／（アッセイされる試料の体積）；
ｋｃ／ｋｔ＝該プロテアソーム・インヒビターの投与前に該対象から採取された１〜３つのベースライン試料の平均ｖｃ／ｖｔ；
βｔ＝該プロテアソーム・インヒビターの滴定により決定された活性化因子。プロテアソーム・インヒビター１につき、ヒト試料においてβｔ＝１．２８である。］
【０１０７】
実施例８：ヒト志願者の末梢白血球におけるプロテアソーム活性レベル
方法
血液試料（各々約２ｍＬ）は、１０週間の期間にわたり７人のヒト志願者から５つの場合に採取した。収集後、白血球をNycoprepTMを用いて該個々の血液試料から単離した。得られたペレットは、試験の日まで−６０℃ないし−８０℃を維持するように設定したフリーザー中で貯蔵した。各場合に収集した試料をまとめて試験し、各試料は２回試験した。
【０１０８】
２０Ｓプロテアソーム活性は、該試料による蛍光（ＡＭＣ）−標識したペプチド基質のタンパク質分解加水分解の速度を測定し、該ライゼート中に存在するタンパク質の量に対して該活性を規格化することによって決定した。５μＬの試料を２ｍＬのアッセイ反応バッファー（１．０％ ＤＭＳＯ中の２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０３５％ ＳＤＳ、６０μＭ Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ＡＭＣ）および磁気攪拌子を含有するセルに添加した。該セルを蛍光分光器に置き、５分間にわたり検出可能な蛍光（λｅｍ＝４４０ｎｍ；λｅｘ＝３８０ｎｍ）の増大をモニターすることによって加水分解されたＡＭＣの量を測定している間、３７℃に維持した。反応開始後３および５分の間に収集されたデータの反応進行曲線の線形回帰あてはめが秒当たりの蛍光単位（ＦＵ／秒）での加水分解速度を与えた。タンパク質およびヘモグロビン濃度は、それぞれ、修正ブラッドフォードアッセイ（Pierce）およびヘモグロビン特異的酵素ベースアッセイ（Sigma）を用いて決定した。該試料中で測定されたタンパク質の総量を（該ヘモグロビン濃度から見積もった）赤血球が寄与するタンパク質量を差し引くことによって補正した。該試料における２０Ｓプロテアソーム活性を以下の数式から決定した：
【０１０９】
【数１１】
0004503182.tif 000013
【０１１０】
［式中、Ｃ＝該蛍光量を遊離ＡＭＣの濃度と等式化する転換因子（ＦＵ／ｐｍｏｌＡＭＣ）。］
【０１１１】
結果と考察
各ヒト志願者につき見出された平均２０Ｓプロテアソーム活性値は、１５．３３ないし４０．０４ｐｍｏｌ ＡＭＣ／秒／ｍｇタンパク質の範囲であった（表１および図１）。各試験日を越えて見出された活性を図２に示す。該母集団において見出された平均２０Ｓプロテアソーム活性は２９．９７±０．８０ｐｍｏｌ ＡＭＣ／秒／ｍｇタンパク質であった。
【０１１２】
【表１】
0004503182.tif 000014
【０１１３】
実施例９：Ｎ−（ピラジン）カルボニル−Ｌ−フェニルアラニン−Ｌ−ロイシンボロン酸（1）の投与後の単離した白血球および組織における時間的２０Ｓプロテアソーム活性
一般手順
1の用量製剤を研究の間毎日調製した。希釈物を母液から調製した。1の母液を９８％食塩水（０．９％）、２％エタノールおよび０．１％アスコルビン酸に加えた。該母液の希釈物を同一のビヒクルに加えた。
【０１１４】
メスのＣＤ２−Ｆ１マウス（１８ないし２０ｇ）、メスのＢＡＬＢ／ｃマウス（１８ないし２０ｇ）、メスのウィスターラット（１５０ないし２００ｇ）およびオスのスプラーグ−ドーリーラット（２５０ないし４５０ｇ）をTaconic Farims （Germantown, NY）から入手した。動物を少なくとも１週間観察し、研究開始前に全般的な健康を調査した。これらの研究に用いた動物は無症候であった。ポリカーボネートカゴ中に、マウスを１カゴ当たり５匹ずつ、ラットを１カゴ当たり３匹ずつ入れた。観察および研究の期間中、トウモロコシ穂の寝床（AND-1005; Farmers Exchange, Framingham, MA）を用いた。蛍光発光を制御して、約１２時間毎の交互明暗サイクルを自動的に与えた。温度および湿度を中央制御し、毎日記録し、読みは、それぞれ、２１±２℃および４５±５％の間の範囲であった。観察および研究の期間中、標準ローデントチャウ（standard rodent chow）（#5001, Purina, St. Louis, MO）のペレットは自由に得られた。ケンブリッジの水道水を水差しにより自由に与えた。該研究に差し障りがあると予想される餌および水の不純物は何も知られていない。
【０１１５】
薬物は、マウス当たり１００μＬまたはラットにおいて１．０ｍＬ／ｋｇの用量体積を用いて、ビヒクル中で静脈内（ＩＶ）に投与した。対照群は該ビヒクル（９８％食塩水（０．９％）、２％エタノール、０．１％アスコルビン酸）を投与した。動物は、一時にまたは複数時のいずれかで与えられる単一ＩＶボーラスとして1を投与される。瀕死の活動性を示す動物は、ＣＯ２吸入により安楽死させた。
1のＩＶ投与後、血液を種々の時点で取出し、末梢白血球を単離した。
【０１１６】
1の単一静脈投与後のマウスの末梢白血球において決定された生体外２０Ｓプロテアソーム活性
２つの組合わせた研究において、メスのＣＤ２−Ｆ１マウス（１８ないし２０ｇ）およびメスのＢＡＬＢ／ｃマウス（１８ないし２０ｇ）に1の単一静脈投与した（１００μＬの用量体積中０．１ないし３．０ｍｇ／ｋｇ）。該ビヒクルは９８％食塩水（０．９％）、２％エタノール、０．１％アスコルビン酸であった。血液試料は、投与して１．０および２４時間後に収集した。該２０Ｓプロテアソーム活性アッセイに必要とされる血液体積のために、５匹のマウスの群を一度に犠牲にし、それらの血液をして、単一のデータポイントを作成した。
【０１１７】
1の単一静脈投与後１．０時間にて全ての投与群についての２０Ｓプロテアソーム活性において有意な（ｐ＜０．０５）用量関連減少があり（図３）、２４時間にて回復し始めた（図４）。これらの研究は、1の単一静脈投与後のマウスの末梢白血球における２０Ｓプロテアソーム活性の用量依存性および可逆な阻害を実証した。
【０１１８】
1の単一静脈投与後のラットの末梢白血球において決定された生体外２０Ｓプロテアソーム活性
４つの組合わされた研究において、メスのウィスターラット（１５０ないし２００ｇ）に1の単一静脈投与した（１．０ｍＬ／ｋｇの用量体積中０．０３ないし０．３ｍｇ／ｋｇ）。血液試料は、1を投与して１．０、２４および４８時間後に収集した。
【０１１９】
1の静脈投与後１．０時間にて２０Ｓプロテアソーム活性において有意な（ｐ＜０．０５）用量関連減少があった（図５）。投与して２４時間後、２０Ｓプロテアソーム活性における用量関連減少は小さくなったが、高用量群（０．２ｍｇ／ｋｇ）において有意性（ｐ＜０．０５）が残った（図６）。投与して４８時間後、２０Ｓプロテアソーム活性はもはや有意な減少ではない（図７）。
【０１２０】
これらの研究は、1の単一静脈投与後のラットの末梢白血球における２０Ｓプロテアソーム活性の用量依存性および可逆な阻害を実証した。２０Ｓプロテアソーム活性レベルのベースラインにまで戻るより遅い速度がラットにおいて観察され、おそらく、マウスにおけるより速い1の代謝を示している。
【０１２１】
1の繰返し静脈投与後のラットの末梢白血球において決定された生体外２０Ｓプロテアソーム活性
７日間にわたり毎日1を静脈投与したとき、２０Ｓプロテアソーム活性における用量関連減少が最後の用量を投与して２４時間後に観察された。顕著な阻害が用量＞０．０５ｍｇ／ｋｇについて観察された。７日間毎日の静脈内用量を投与して２４時間後に観察された２０Ｓプロテアソーム阻害の程度は、単一静脈内用量を投与して２４時間後に観察されたものよりも大きく、おそらく、その生体標的であるプロテアソームに対する1の毎日投与の累積効果を反映する。
【０１２２】
２０Ｓプロテアソーム活性における有意な用量関連減少が、１４日間にわたる1の１日おきの静脈投与後２４時間で観察された。２０Ｓプロテアソーム活性における用量関連減少は、用量群＞０．２ｍｇ／ｋｇにおいて有意（ｐ＜０．０５）であった。２０Ｓプロテアソーム活性における有意な用量関連減少は、８週間にわたる1の週１回静脈投与の最後の用量の投与後２４時間でも観察された。２０Ｓプロテアソーム活性における用量関連減少は、用量群＞０．１ｍｇ／ｋｇにおいて有意（ｐ＜０．０５）であった。
【０１２３】
さらなる繰返し用量研究において、オスのスプラーグ−ドーリーラット（２５０ないし４５０ｇ；１群当たりｎ＝６）は、２週間にわたる1の週２回静脈投与で処理した。該ビヒクルは０．１％アスコルビン酸／２％エタノール／９８％食塩水（０．９％）であった。血液試料は、２０Ｓプロテアソーム活性の評価のため、最後の用量後１．０時間で収集した。
【０１２４】
２週間にわたり1を週２回投与したとき（合計４用量）、２０Ｓプロテアソーム活性における用量関連減少は最後の用量１．０時間後に観察された（図８）。２０Ｓプロテアソーム活性における用量関連減少は、全ての用量群＞０．０３ｍｇ／ｋｇにおいて有意（ｐ＜０．０５）であった。
【０１２５】
結果は、1の繰返し用量投与がラット白血球における２０Ｓプロテアソーム活性における用量関連減少を誘引することを示す。２０Ｓプロテアソーム活性の阻害の程度は、1が毎日または１日おきに与えられる単一用量後に見られるものよりも大きかった。1の用量の間隔が回復するように増大されたとき（すなわち、週１回の処方）、阻害の度合は、1の単一投与と同じである。この薬力学プロファイルは、過渡的阻害が観察される1の週２回用量を支持する。
【０１２６】
1の繰返し静脈投与後のラット組織における生体外２０Ｓプロテアソーム活性
２つの研究において、メスのウィスターラット（１５０ないし２００ｇ）に1の単一静脈内用量を投与した（１．０ｍｇ／ｋｇの用量中０．０３、０．１および０．３ｍｇ／ｋｇ）。該ビヒクルは０．１％アスコルビン酸／２％エタノール／９８％食塩水（０．９％）であった。組織試料は、２０Ｓプロテアソーム活性の評価のため、投与後１．０、２４および４８時間後に肝臓および脳から収集した。
【０１２７】
２０Ｓプロテアソーム活性における有意な（ｐ＜０．０５）用量関連減少が、1の静脈投与後１．０時間でラット肝臓において観察された。投与して２４時間後、２０Ｓプロテアソーム活性における用量関連減少は小さくなったが、高用量群（０．３ｍｇ／ｋｇ）においてい有意性（ｐ＜０．０５）が残った。投与して４８時間後、ラット肝臓における２０Ｓプロテアソーム活性はベースラインに戻った。該肝臓における２０Ｓプロテアソーム阻害の程度は、末梢白血球につき観察されたものよりも速くベースラインレベルに戻った。脳組織においては、２０Ｓプロテアソーム阻害は観察されず、この組織への1の浸透がないことを反映している。
【０１２８】
第３の研究において、オスのスプラーグ−ドーリーラット（２５０ないし４５０ｇ）に1の単一用量を投与した（１．０ｍｇ／ｋｇの用量体積中０．１および０．３ｍｇ／ｋｇ）。該ビヒクルは０．１％アスコルビン酸／２％エタノール／９８％食塩水（０．９％）であった。血液および組織試料を２０Ｓプロテアソーム活性の評価のため投与後１．０時間で収集した。収集された組織は、脳、結腸、肝臓、筋肉（腓腹）、前立腺および精巣であった。２０Ｓプロテアソーム活性における有意な（ｐ＜０．０５）用量関連減少が、1の静脈投与後１．０時間で、末梢白血球、大腸、肝臓、筋肉（腓腹）、および前立腺において観察された。２０Ｓプロテアソーム阻害は脳および精巣においては観察されず、これらの組織への1の浸透がないことを反映している。
【０１２９】
静脈投与して１．０時間後、脳および精巣を除く細胞において２０Ｓプロテアソーム阻害は末梢白血球につき観察されたものと同様であった。
【０１３０】
1の単一静脈投与後の霊長類において決定された生体外２０Ｓプロテアソーム活性
オスおよびメスのカニクイザル（２．２ないし３．５ｋｇ）を４群に（５匹／性別／群）割当てた。各群は、０（ビヒクル対照）、０．０４５、０．０６７または０．１００ｍｇ／ｋｇ／用量の1を４週間にわたり週２回０３ｍＬ／ｋｇの用量体積中の単一静脈内注射として受けた。該ビヒクルは０．１％アスコルビン酸／２％エタノール／９８％食塩水（０．９％）であった。該対照、低−および中−用量群から３匹のオス、２匹の高−用量のオス、および３匹のメス／群を第２７日の処理の終わりに犠牲にした。２匹の動物／性別／群を回復動物と称し、４週間にわたる処理に引続き２週間の回復を受け；それらは第４１日に犠牲にした。
【０１３１】
血液は、２０Ｓプロテアソーム活性決定のため、処理前、第１、８、１５および２２日の投与後１．０時間にて、および第５、１２、１９および２６日の投与前１．０時間に；および第３１、３４、３８および４１（回復犠牲動物）日に収集した。血液は、高用量オスからの２０Ｓプロテアソーム活性決定のため、それが８用量を受けた後第２６日に瀕死の状態で犠牲になる前にも採取した。投与後１．０時間の白血球２０Ｓプロテアソーム活性の決定は、酵素活性における顕著な用量関連減少を明かにし、それは次なる用量前、７２時間までに回復し（図９および１０）。該瀕死の動物は、第２６日の犠牲にて、その白血球において低残留２０Ｓプロテアソーム活性を有していたことが分かった。
これらのデータは1につき週２回処理処方を支持する。何故ならば、該２０プロテアソームレベルは用量間で回復するからである。
【０１３２】
実施例１０：ウサギ網状赤血球からの生成２０Ｓプロテアソームのキモトリプシンおよびトリプシン活性に対するＮ−（ピラジン）カルボニル−Ｌ−フェニルアラニン−Ｌ−ロイシンボロン酸（1）の効果
２０Ｓプロテアソームは、公開された手順［McCormack, et al., Biochemistry 37 7792-7800 (1998)］に準じて、ウサギ網状赤血球から精製した。キモトリプシンおよびトリプシンアッセイは、該プロテアソーム・インヒビター1の増大する濃度にて実施例３および５に記載したごとく行った。データを図１１に提示する。
【０１３３】
実施例１１：ウサギ網状赤血球からの精製２０Ｓプロテアソームに置けいるパーセント阻害とキモトリプシン活性のトリプシン活性に対する比との相関
ウサギ網状赤血球からの精製２０Ｓプロテアソームは、公開された手順［McCormack, et al., Biochemistry 37 7792-7800 (1998)］に準じて調製した。キモトリプシンおよびトリプシンアッセイは、該プロテアソーム・インヒビター1の増大する濃度にて実施例３および５に記載したごとく行った。該データをｖｃ／ｖｔ＝ｋｃ／ｋｔ＊（１−ｆ）／（１−ｆ＋βｔ＊ｆ）にあてはめ、ｋｃ／ｋｔ＝２．８８±０．０３、βｔ＝１．３８±０．０５であり、％Ｉ＝ｆ＊１００であった（図１２）。
【０１３４】
実施例１２：ラット白血球ライゼートにおけるパーセント阻害とキモトリプシン活性のトリプシン活性に対する比との相関
キモトリプシンおよびトリプシンアッセイは、該プロテアソーム・インヒビター1の増大する濃度にて実施例３および５に記載したごとく行った。データを実施例１０のごとくあてはめて、ｋｃ／ｋｔ＝１７．６±、およびβｔ＝１．１±０．２を得た（図１３）。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ７人のヒト志願者からの白血球における２０Ｓプロテアソーム活性のグラフ表記。
【図２Ａ〜Ｇ】  ７人のヒト志願者からの白血球における日単位の２０Ｓプロテアソーム活性のグラフ表記。
【図３】  Ｎ−（ピラジン）カルボニル−Ｌ−フェニルアラニン−Ｌ−ロイシンボロン酸（1）の静脈投与１．０時間後のネズミ白血球における２０Ｓプロテアソーム活性のグラフ表記。
【図４】  1の静脈投与２４時間後のネズミ白血球における２０Ｓプロテアソーム活性のグラフ表記。
【図５】  1の静脈投与１．０時間後のラット白血球における２０Ｓプロテアソーム活性のグラフ表記。
【図６】  1の静脈投与２４時間後のラット白血球における２０Ｓプロテアソーム活性のグラフ表記。
【図７】  1の静脈投与４８時間後のラット白血球における２０Ｓプロテアソーム活性のグラフ表記。
【図８】  ２週間にわたる1の週２回静脈投与１．０時間後のラット白血球における２０Ｓプロテアソーム活性のグラフ表記。
【図９】  1の静脈投与１．０時間後の霊長類白血球における２０Ｓプロテアソーム活性のグラフ表記。
【図１０】  1の静脈投与７２時間後の霊長類白血球における２０Ｓプロテアソーム活性のグラフ表記。
【図１１】  1の濃度の関数のキモトリプシン（□）およびトリプシン（◇）活性のグラフ表記であって、1はキモトリプシン活性を完全阻害するが、トリプシン活性の活性化を引起すことを示す。
【図１２】  ウサギ網状赤血球からの精製２０Ｓプロテアソームを用いるパーセントプロテアソーム阻害とキモトリプシン活性のトリプシン活性に対する比とを比較するグラフ図表。
【図１３】  ウサギ白血球ライゼートを用いるパーセントプロテアソーム活性とキモトリプシン活性のトリプシン活性に対する比とを比較するグラフ図表。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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