(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的液体を長期間安定化するための一般式Ｉ
R1-O-(0)C-R2-C(O)-O-[CH2-CH2-O]n-CH2-CH2-OH       (式Ｉ)
（式中、
ｎは、１〜２００であり、そして
Ｒ1は、ステロールであり、
Ｒ2は、少なくとも１個の炭素原子がＮ、ＳまたはＯによって置換されていてもよい４〜８個のＣ原子を有する脂肪族または芳香族環であるかまたは０〜１２個のＣ原子を有する直鎖状または分枝鎖状の鎖である）
のステロールエステルの使用。
【請求項２】
Ｒ1が一般式II
【化１】
0004546596.tif 000005
（式中、
Ｒ4およびＲ5は、Ｈまたは−ＣＨ3であることができ、
Ｒ6は、１〜１２個のＣ原子を有する直鎖状または分枝鎖状の鎖、−ＯＨまたは＝Ｏ基であり、
環Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは、それぞれ、飽和であるか不飽和であるか、または芳香族性であり、
そしてＲ4＝−Ｃ(１９)Ｈ3である場合は、環ＢはＣ(９)とＣ(１０)との間で開環してＣ(１０)とＣ(１９)との間に二重結合を形成していてもよい）
の化合物である請求項１記載の使用。
【請求項３】
Ｒ1がコレステロール、ビタミンＤ３、スチグマステロールおよびエストロンからなる群から選択されたものである請求項１記載の使用。
【請求項４】
ステロールエステルを生物学的液体中の濃度が０.０５重量％〜５重量％であるような濃度で加える請求項１記載の使用。
【請求項５】
生物学的液体を凍結乾燥し、使用するために再構成する請求項１〜４の何れか一項記載の使用。
【請求項６】
生物学的液体を使用するまで凍結、有利には≦−１８℃で貯蔵する請求項１〜４の何れか一項記載の使用。
【請求項７】
本質的に天然または人工のマトリックス、少なくとも一種の診断的に関連した物質（分析物）および０.０５〜５重量％の濃度の請求項１記載の一般式Ｉのステロールエステルからなる試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、生物学的液体、特に凍結乾燥およびその後の再構成によって得られる生物学的液体、の長期間の安定化のためのステロールエステルの使用に関する。
【０００２】
生物学的液体を使用するすべての研究において、特に生物学的液体に対してまたは生物学的液体によって光学的に評価される調査が実施される研究において、混濁の問題それ自体が提起される。この混濁の原因は、必ずしも検出することができるとは限らないが、しばしばそれは、溶液からの蛋白質または脂質の沈澱である。さらに、これらの不安定性の原因は、水−不溶性リン脂質を含有するためにそれ自体が凝集する傾向を有する体液中に存在するリポ蛋白質巨大分子である。
【０００３】
不安定な蛋白質溶液を貯蔵する場合、混濁の発生または容器壁上の蛋白質の吸着が同様に起こり得、これらの製品の品質をかなり損傷する。
上述した不安定性は、さらに生物学的液体を安定化のために凍結乾燥する場合に増加する。生物学的液体の例は、ヒトまたは動物源の血清、血漿、脳脊髄液、胸膜滲出液または腹水である。
本発明の意義の範囲内において、このような生物学的液体は、また当業者にそれ自体知られている人工的または天然の液体マトリックス（例えば血清またはリン酸塩−緩衝ＮａＣｌ溶液）および一部分遺伝子工学によって製造することのできる添加した生物学的物質から形成された合成組成物の溶液であることもできる。
【０００４】
このような合成組成物の溶液は、しばしば対照または標準血清として使用される。
対照血清は、場合によっては修正されているが血清様組成を有するヒトまたは動物源の平均血清として理解され、これらの対照血清は、既知の濃度の血清成分、例えば蛋白質、酵素、酵素的に測定できる基質および電解質を含有し、これらの血清成分に対する測定法の対照に適している。
【０００５】
例えば酵素またはリポ蛋白質のような不安定な成分の保存寿命を保証するために、生物学的液体を凍結乾燥した形態でおよび／または低温度、好ましくは−１８℃以下の温度で貯蔵することができる。凍結乾燥の望ましくない副作用は、特にリポ蛋白質の溶解度挙動の変化によって対照血清の再構成後に起こる混濁である。これらの混濁は、しばしば、分光測定法を妨害するため、例えば試料ブランク値がさらに必要である。
問題はしばしば混濁のために起こるので、除去における多数の試みが既に行われている。しかしながら、たとえ溶液が既に見出されたとしても、これらは、これまでのところ本質的に厳密に限定された適用範囲および条件に制限される。
【０００６】
ＤＥ−Ｐ ３１ ０７ ０６０は、有機非糖様物質、例えばメタノール、アラニン、トリエチレングリコール、バリン、酢酸塩、乳酸塩または２−ヒドロキシメチル酪酸ナトリウムの添加を記載している。このような添加は、例えば、アラニンおよびメチル酪酸塩の場合においては、酵素反応の妨害を生ずる。
メタノールの添加は、一般に健康に有害である。酢酸ナトリウムを使用する場合は、対照血清はもはや、電解質測定のための普遍的な対照血清として使用することはできない。アンモニウム化合物の添加は、尿素測定を妨害する。他の物質は、一般的な試験妨害を起こし得る。
【０００７】
プロリンおよびデスオキシコール酸ナトリウムの添加によって混濁を回避する他の方法は、以前にＤＥ−Ａ ３３ ２９ ９５２に記載されている。しかしながら、この添加はそれが例えば蛋白質分離中人工産物を生じ、例えばクレアチニンの測定におけるトリクロロ酢酸による脱蛋白を困難にするという不利点を有している。
それ故に本発明は、生物学的液体の長期間の安定化のために一般的に使用し得る方法を見出すという目的に基づく。
【０００８】
意外にも、生物学的体液へのステロールエステルの添加によって、リポ蛋白質の存在下においてさえも安定化を達成することが可能であった。ステロールエステルで処理したリポ蛋白質含有体液の凍結乾燥後でさえも、溶解後透明な生成物が得られる。
意外にもまた、混濁する傾向があるかまたは蛋白質が容易に容器壁上に吸着される不安定な蛋白質溶液が、ステロールエステルの添加によって安定化されることが見出された。
【０００９】
意外にもさらに、特にステロールエステルを凍結乾燥前に対照血清に添加する場合は、混濁度の低いより均質な再構成した対照血清が製造されることが見出された。結果として、血清が全体としてより均質であるばかりでなく、また、対照血清中に含有されているパラメーターの濃度および活性測定の精度が改善される、すなわち、言明された理論値の再現が、品質対照血清の使用者によって容易である。
ステロールエステルは一般に３β−位置にヒドロキシ基を有する物質（ゴナン誘導体）のステロイド級に属する。有意な相違は、１７(２０)位に結合している側鎖に存在する。ステロールは大きな級である（Beyer等（1981）, Lehrbuch der organischen Chemie[Textbook of Organic Chemistry], 649−664頁“Steroids"）。この級の種々の代表的ステロール（例えばビタミンＤ３、エストロン、コレステロールおよびスチグマステロール）を使用して実施した実験は、一般的な適応性が保証されることを示す。コレステロールの誘導体が特に有利である。
【００１０】
さらに、本発明によるステロールエステルは、ジカルボン酸を経てカップリングされたポリエチレングリコール基を有している。原則的に、二官能反応性は本発明による機能に本質的に決定的に重要なので、すべての既知のジカルボン酸を使用することができる。次のジカルボン酸を有利に使用することができる：コハク酸、アジピン酸、セバシン酸。
ＰＥＧ基は、基本的にはまたステロールエステルの溶解性を保証しなければならず、そのため当業者は、必要に応じて実験によって最適の長さを容易に決定することができる。経験により、次の鎖の長さが有利である：ポリエチレングリコール６００、ポリエチレングリコール９００またはポリエチレングリコール３０００。
【００１１】
有利には比濁測定法において測定した混濁挙動が、安定化作用の目安として役立つ。当業者にとり、本発明によって他の相当する方法を使用することは容易である。
すなわち本発明は、生物学的液体を安定化する方法およびこの方法で安定化された液体に関する。
【００１２】
生物学的液体の長期間の安定化のために、一般式Ｉ
R1-O-(0)C-R2-C(O)-O-[CH2-CH2-O]n-CH2-CH2-OH         (式Ｉ)
（式中、
ｎは、１〜２００であり、そして
Ｒ1は、ステロールであり、
Ｒ2は、少なくとも１個の炭素原子がＮ、ＳまたはＯによって置換されていてもよい４〜８個のＣ原子を有する脂肪族または芳香族環、または０〜１２個のＣ原子を有する直鎖状または分枝鎖状の鎖である）
のステロールエステルを使用するのが好ましい、特にＲ1が一般式II
【化２】
0004546596.tif 000002
（式中、
Ｒ4およびＲ5は、Ｈまたは−ＣＨ3であることができ、
Ｒ6は、１〜１２個のＣ原子を有する直鎖状または分枝鎖状の鎖、−ＯＨまたは＝Ｏ基であり、
環Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは、それぞれ、飽和であるか不飽和であるか、または芳香族性であり、
そしてＲ4＝−Ｃ(１９)Ｈ3である場合は、環ＢはＣ(９)とＣ(１０)との間で開環してＣ(１０)とＣ(１９)との間に二重結合を形成していてもよい）
の化合物であるステロールエステルを使用することが好ましい。
【００１３】
ステロール基がコレステロール、ビタミンＤ３、シグマステロールまたはエストロンから選択されたものであるステロールエステルを使用することが、非常に特に好ましい。
有利には、ステロールエステルは生物学的液体中の濃度が０.０５〜５重量％、好ましくは０.１〜３重量％、特に好ましくは０.５〜１.５重量％であるような濃度で加えられる。
好ましくは生物学的液体は、それ自体当業者に知られている方法により凍結乾燥され、そして使用のために再構成される。
【００１４】
生物学的液体はまた、使用するまで凍結、有利には≦−１８℃で貯蔵される。
本発明はまた、本質的に天然または人工のマトリックス、少なくとも一種の診断的に関連した物質（分析物）および０.０５〜５重量％の濃度の一般式Ｉのステロールエステルからなる試薬に関する。
本発明による作用を得るために、本発明によるステロールエステルはまた、既知の安定剤、特に洗剤と合することもできる。
特に、ステロールエステルと非イオン性および／または双性イオン性洗剤との組み合わせが有利である。このような組み合わせにおけるステロールエステルの濃度は、有利に低下させることができる。
【００１５】
本発明における意義内の生物学的液体は、すでに上述した通りである。
長期間の安定性の概念は、またとりわけ測定方法および分析物に依存する。しかしながら、基本的に安定性は少なくとも６ヶ月、好ましくは少なくとも１２ヶ月、特に好ましくは少なくとも１８ヶ月である。生物学的液体は、５４６nmにおいて測定した混濁度が出発液体の混濁度と比較して３００％以上増加しない場合は、本発明の意義内で安定であるとして説明される。
以下の実施例は、本発明を限定することなく本発明を説明するものである。
【００１６】
【実施例】
実施例  １
健康な供与者からのクエン酸塩添加血漿を、コレステロール−ＰＥＧ９００（Fluka CH-9471 Buchs／Switzerland, Item No.26735）（CP）の種々の濃度で処理し、当業者にそれ自体知られている方法によって凍結乾燥した。
凍結乾燥体の再構成後混濁度を証明するために、ブランク値をBehring比濁計(BNA Dade Behring Marburg GmbH, D-35001 Marburg／Germany)上で測定し、吸光度を５４６nmで測定した。
【００１７】
【表１】
0004546596.tif 000003
【００１８】
実施例  ２
ヒトの血清を、コレステロール−ＰＥＧ９００（ＣＰ）の種々の濃度で処理し、種々の温度（２〜８℃、−２０℃）で貯蔵するかまたは凍結乾燥した。
混濁度を証明するために、ブランク値をBehring比濁計（ＢＮＡ）上で測定し、吸光度を５４６nmで測定した。
【００１９】
【表２】
0004546596.tif 000004