(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶液状態で保存安定な、配列番号１で示されるアミノ酸配列の耐熱性カルシウム依存型グルタミン酸デヒドロゲナーゼおよび２−オキソグルタル酸を含有する第１試薬、及び、ＮＡＤＨを含有する第２試薬から成ること、を特徴とするカルシウム測定用液状試薬。
【請求項２】
耐熱性カルシウム依存型グルタミン酸デヒドロゲナーゼが、７０℃熱処理（ｐＨ７．０、２０分間）においても８０％以上の初期活性値を保持していること、を特徴とする請求項１に記載の液状試薬。
【請求項３】
更に、調節因子を第１試薬又は第２試薬のいずれかに含有すること、を特徴とする請求項１又は２に記載の液状試薬。
【請求項４】
調節因子がキレート剤であること、を特徴とする請求項３に記載の液状試薬。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の液状試薬を使用すること、を特徴とするカルシウムの測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、試料中の生体物質に由来するカルシウムの測定用液状試薬に関する。本発明の試薬はカルシウム依存型グルタミン酸デヒドロゲナーゼ及び調節因子を含み、液体状であることを特徴とする。
【０００２】
本発明はさらに、前記測定試薬を用いることを特徴とする、生体物質に含まれるカルシウムの測定方法、及び、カルシウム依存型グルタミン酸デヒドロゲナーゼの効率的製造システムも提供するものである。
【０００３】
【従来の技術】
カルシウムイオンは、生体内で重要な機能を果しており、生体内カルシウムの９９％は骨・歯に局在しているが、およそ７００ｍｇ／日は骨への吸収と排泄を繰り返している。そのため、骨に比べると量的には少ないが、体液や、細胞中にもカルシウムは存在する。体液や細胞中のカルシウムは血液凝固のほか“セカンドメッセンジャー”として神経伝達機能、筋収縮機能、ホルモン作用など生体活動の重要な働きに関与しているため、体液中特に血液中のカルシウムレベルは厳密に一定に保たれなければならない。血液中のカルシウムレベルはビタミンＤ、副甲状腺ホルモン、カルシトニンなどによって一定に保たれていることは知られている通りであり、健常人の場合は、血液中には９〜１１ｍｇ／ｄｌ存在し日内変動の多くとも±３％と厳密に維持されている。これが一旦疾病になると、変動するようになる。粘液水腫、悪性腫瘍サイコドーシス、高タンパク質血症、甲状腺機能亢進症等の疾病では高カルシウム血症に、また、上皮小体機能低下症、骨軟化症、腎性クル病、尿毒性、低タンパク質血症、悪性腫瘍骨転移等の疾病では低カルシウム血症へと変動する。健常人の血中カルシウムレベルがわずかにでも変動をきたしたならば、それは疾病に起因するものであると容易に判定が可能であるので血中カルシウムの定量は臨床検査上非常に重要な検査項目となる。
【０００４】
このように、正確且つ簡便にカルシウムを測定することのできるすぐれた方法の開発が希求されている一方、近年、多くの臨床検査用測定試薬組成物が、凍結乾燥された粉末から溶液状のものに置き換えられる傾向にある。これは多忙な臨床検査業務の現場において、粉末状の測定試薬組成物を、使用の都度、溶液に溶かす作業過程が省略され、現場の負担が軽減されるからである。カルシウムの測定に関しても、簡便な液体状の試薬の開発が希求されている。また、特に液体状試薬において問題となる保存時の偶発的温度変化に対する安定性の面からも、長期間保存に適したものが希求されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記した当業界における要望に応えるためになされたものであって、液状のカルシウム測定用試薬、特に液状試薬でありながら長期間保存することのできるすぐれたカルシウム測定用試薬を新たに開発する目的でなされたものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記目的を達成するためになされたものであって、本発明者らは、各方面から検討した結果、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（以下、ＧＬＤＨということもある）に着目した。一般にＧＬＤＨは、図１に示される式（１）で表わされる反応を触媒する酵素であって、例えば、酵素番号１．４．１．２．；１．４．１．３；１．４．１．４．等で示される酵素が例示される。
【０００７】
これらの内、酵素番号１．４．１．２．の酵素は、ＮＡＤ+（酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）に特異的で、動物組織、植物、細菌に分布している。酵素番号１．４．１．３．の酵素は、ＮＡＤ+とＮＡＤＰ+（酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）の両方と反応性を有し、動物の肝・腎臓のミトコンドリアに局在している。酵素番号１．４．１．４．の酵素は、酵母、細菌中にありＮＡＤＰ+に特異的である。
【０００８】
本発明者らは、ＧＬＤＨについて更に研究した結果、ＧＬＤＨのなかでも、特に、カルシウムイオンが存在しないと活性を発現しないＧＬＤＨ（つまり、カルシウム依存型ＧＬＤＨ）にはじめて着目し、このカルシウム依存型酵素（ＧＬＤＨ）と試料中のカルシウムイオンとを接触せしめたところ、基質の存在下において試料中のイオン濃度に依存してＧＬＤＨの酵素活性が変化すること、そしてこれを測定することによってカルシウムイオンの測定が可能であることをはじめて見出した。そして更に鋭意研究の結果、本発明者らは、液相において、カルシウム依存型ＧＬＤＨが、保存時の温度変化に対する安定性を示し、溶液中で高い酵素活性を長期間維持することを新たに見いだした。そして、生体物質のカルシウム測定系（液相）に、前記カルシウム依存型ＧＬＤＨを採用することにより本発明を完成するに至った。即ち、本発明は、これらの有用新知見に基づいてなされたものであって、特に、試料中の生体物質に由来するカルシウムを測定するための液状試薬として、カルシウム依存型ＧＬＤＨを使用することを特徴とするものである。
【０００９】
本発明は、生体物質のカルシウムの定量方法において、該ＧＬＤＨの活性を利用するものである。
より詳細には、先ず、血液、血清、血漿、膵液等の試料に存在するカルシウムイオンを利用して、不活性型ＧＬＤＨを活性型ＧＬＤＨに変換する。アンモニア、２−オキソグルタル酸、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ及び該活性型ＧＬＤＨを作用させる。そして、例えば、ＮＡＤＰＨの減少速度を３４０ｎｍ付近における吸光度で測定することにより、生体物質由来のカルシウムの量を定量する。例えば、図２に示される式（２）のような反応によってカルシウムの量を測定することができる。
【００１０】
（カルシウム依存型ＧＬＤＨ）
本発明は、上記反応に示したようにカルシウム依存型ＧＬＤＨを利用するものである。カルシウム依存型ＧＬＤＨとしては、カルシウムイオンが存在しないと活性を発現することのできないＧＬＤＨであれば、すべてのＧＬＤＨが使用可能である。カルシウム依存型ＧＬＤＨとしては、限定されるわけではないが、植物に由来するＧＬＤＨが好ましく、特に、トウモロコシが好ましい。トウモロコシＧＬＤＨは、７０℃、ｐＨ７．０の条件下で、２０分間の熱処理を行っても酵素活性が保持され、溶液状態で保存安定な酵素を用いたカルシウム測定用液状試薬を提供できる。
【００１１】
トウモロコシ由来のカルシウム依存型ＧＬＤＨのアミノ酸配列及びそれをコードする遺伝子の塩基配列に関しては、Sakakibara H et al. (1995) Plant Cell Physiol. 36, 5:789-797「Isolation and Characterization of a cDNA that encodes maize glutamate dehydrogenase」 に記載されている。
そのアミノ酸配列を配列表の配列番号１、及び、図３、図４に示す。
【００１２】
その他のカルシウム依存型ＧＬＤＨ、例えば植物由来であれば良く、トウモロコシ以外に、アオクサやエンドウ由来のＧＬＤＨも利用可能である。
本発明のカルシウム依存型ＧＬＤＨは、限定されるわけではないが、植物などから公知の方法によって、抽出、精製することができる。例えば、トウモロコシ由来の酵素に関する前述したPlant Cell Physiol. (1995) 36, 5:789-797に記載された方法に準じて行うことが出来る。また、本発明のカルシウム依存型ＧＬＤＨは、合成によるＧＬＤＨや遺伝子工学によって得られた組換え型ＧＬＤＨであっても良い。当業者は本明細書の開示に基づいて容易にカルシウム依存型ＧＬＤＨを得ることができる。
【００１３】
例えば、カルシウム依存型ＧＬＤＨについては、上記したように、そのアミノ酸配列及びそれをコードする遺伝子の塩基配列のいずれもが本発明者らによって明らかにされているので、トウモロコシその他の植物や動物等の天然物から抽出するほか、合成法によって得ることができるし、該ＧＬＤＨ遺伝子の遺伝子断片を市販の発現ベクター等公知の発現ベクターに挿入し、得られたプラスミドを用いて大腸菌等の宿主を形質転換し、形質転換体を培養して目的ＧＬＤＨを得るといった遺伝子工学によって該ＧＬＤＨを工業的に製造することも可能である。
【００１４】
（カルシウム依存型ＧＬＤＨを含む液状試薬）
本発明の液状試薬は、水性媒体中にカルシウム依存型ＧＬＤＨを含むことを特徴とする。カルシウム依存型ＧＬＤＨは、０．１単位／ｍｌから５０単位／ｍｌ、好ましくは、０．５単位／ｍｌから１０単位／ｍｌの濃度で含まれる。この場合のＧＬＤＨの単位は、ＧＬＤＨの活性測定の標準的な条件下、例えば、３７℃、ｐＨ８．０で、１分間あたり１μｍｏｌのＮＡＤ+を生成する酵素の量を１単位とする。
【００１５】
本発明の液状試薬は、さらに、所望により０．２ｍＭ〜０．５ｍＭ、好ましくは０．３ｍＭ〜０．４ｍＭのＮＡＤＨ、および０．１ｍＭ〜２０ｍＭ、好ましくは０．５ｍＭ〜１０ｍＭの２−オキソグルタル酸を含む。これらは、液状試薬中にカルシウム依存型ＧＬＤＨと共にあらかじめ含まれていても、あるいは反応時に加えるように、別々の容器に含まれていてもよい。
【００１６】
本発明はさらに、本発明の液状試薬とともに、調節因子を含有してもよい。本発明においては、上記したようにカルシウム依存型ＧＬＤＨを使用することによってカルシウムの定量が充分に可能であるが、当該グルタミン酸デヒドロゲナーゼは、カルシウムに対する見掛けのＫｍを酵素的性質の上から調べたところ１０μＭであったこと、そこで、血清カルシウム濃度を測定する上で重要となる０〜４ｍＭまでの直線的な検量線を作成するには、カルシウム濃度に対する活性化調節を行うことで、より微量の血清カルシウム量を直線的に測定できることもはじめて確認した。
【００１７】
調節因子としては、キレート剤その他、カルシウム濃度に対する活性調節可能な因子がすべて使用可能である。キレート剤としては、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ＣｙＤＴＡ（トランス−１，２−シクロヘキサンヂアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸）、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）、ＧＥＤＴＡ（グリコールエーテルジアミン四酢酸）、ＴＴＨＡ（トリエチレンテトラミン（六酢酸）、メチルＥＤＴＡ（ジアミノプロパン四酢酸）などのほか、ＮＴＡ（ニトリロ三酢酸）、ＥＤＴＡ−ＯＨ（ヒドロキシエチレンジアミン三酢酸）、ＩＤＡ（イミノニ酢酸）、ＨＩＤＡ（ヒドロキシエチルイミノニ酢酸）等既知のキレート剤が適宜使用されるが、好適なキレート剤の１例としてはＮＴＡが挙げられる。
【００１８】
本発明は、更に、本発明に係る測定試薬とともに、上記した調節因子を含むものであってもよく、例えばキレート剤を別の容器に含んだ測定キットも提供するものである。この場合、調節因子の含有量は、０．１〜１００ｍＭであり、好ましくは、ＮＴＡの場合は、１〜５０ｍＭが良く、上述した種々のキレートにより適宜変更される。
【００１９】
（生体物質に由来するカルシウムの測定方法）
本発明の試薬を用いて、生体物質に由来するカルシウムを測定することができる。具体的には、本発明の方法は、前記生体物質に内在するカルシウムイオン量に依存して不活性型ＧＬＤＨが活性型ＧＬＤＨに変換され、そして、本ＧＬＤＨの酵素活性を測定することで当該カルシウムイオンの量を、単一酵素法により測定することを特徴とする。さらに、調節因子を併用することで、より試料中の低濃度で存在するカルシウムの定量を行うことが可能となる。
【００２０】
本発明の試料は、前記生体物質を含む可能性のあるものであれば特に限定されず、血液、血清、血漿、膵液等の体液が含まれる。試料は、生体から得たものであっても、あるいは研究試薬等人為的に調製されたものであってもよい。
【００２１】
本発明においては、生体物質に存在するカルシウムを用いて、不活性型であるカルシウム依存型ＧＬＤＨを、活性型ＧＬＤＨに変換する。ついで、２−オキソグルタル酸およびＮＡＤＨを含む反応溶液を作用させる。反応は、ｐＨ６〜９において行い、好ましくは２５℃〜４０℃で、５分〜１時間行う。
【００２２】
上記反応により、カルシウムイオンにより活性型に変換されたＧＬＤＨの酵素活性は、公知の方法によって測定することができる。限定するわけではないが、例えば、ＮＡＤＰＨは３４０ｎｍにおいて特異的な吸収特性を有するので、当該波長における吸光度をＧＬＤＨを反応させる前後で測定し、その変化をカルシウムのＧＬＤＨの変換量として得られたデータと比較することにより、生体物質由来のカルシウムの量を測定することができる。
【００２３】
上記したように、本発明の測定方法において、より直線的な検量線を得るためには、調節因子としてキレート剤を添加、作用させることが好ましい（式２）。その場合、限定するわけではないが、本発明のカルシウム測定用液状試薬での調節因子は、カルシウムによる活性型ＧＬＤＨへの変換させる前、若しくは変換時に反応させれば良い。
【００２４】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を制限するためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾、変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
【００２５】
【実施例１】
トウモロコシ由来のカルシウム依存型ＧＬＤＨについて、以下により、その発現、抽出及び精製を行った。
【００２６】
ａ）トウモロコシ由来のカルシウム依存型ＧＬＤＨ遺伝子の菌体内発現
トウモロコシ由来のカルシウム依存型ＧＬＤＨ遺伝子の全長領域は以下の文献で記述報告されている。(Sakakibara H et al. (1995) Plant Cell Physiol. 36, 5:789-797「Isolation and Characterization of a cDNA that encodes maize glutamate dehydrogenase」)
【００２７】
そこで、該全長領域の内、カルシウム依存型ＧＬＤＨ遺伝子を含む制限酵素部位ＢｓｐＨＩからＥｃｏＲＩまでのおよそ１．５ｋｂ遺伝子断片を市販の発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）のマルチクローニング部位であるＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＩ部位に挿入し、トウモロコシ由来グルタミン酸デヒドロゲナーゼを発現するプラスミドｐＴｒｃＺｍＧＬＤＨを構築した。大腸菌株ＪＭ１０５を宿主とし形質転換体を得た後、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンナトリウムを含むＬＢ培地（０．５％酵母エキス、１％トリプトン、１％塩化ナトリウムから成る、ｐＨ７．５）で形質転換体E.coli JM105/pTrcZmGLDHを液体培養し、対数増殖期に組換え型グルタミン酸デヒドロゲナーゼの発現誘導剤として１ｍＭＩＰＴＧ（イソプロピルチオβガラクトシド）を添加した。２Ｌ培養液を用いたフラスコ振とう培養により、当該形質転換体が６ｇ湿重得られ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ総活性として２３４８単位が菌体内に発現蓄積できた。なお、当該グルタミン酸デヒドロゲナーゼの酵素活性は、上述の式（２）を基に以下に示す条件で測定した。
【００２８】
上記に例示したように、本発明においては、ＧＬＤＨをコードする遺伝子の少なくとも一部を含有する組換えプラスミドを導入してなる形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia  coli）を使用して、ＧＬＤＨを効率的に製造することができる。なお、この形質転換体は、Escherichia coli JM105/pTrcZmGLDHと命名され、工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ  ＢＰ−６７０５として寄託されている。
【００２９】
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【００３０】
ｂ）トウモロコシ由来組換え型ＧＬＤＨの抽出及び精製
上述のフラスコ培養で得られた形質転換体６ｇ（湿重）を出発材料とし、菌体破砕・抽出、熱処理および各種クロマトグラフィの組合せにより、菌体破砕・抽出液に対して精製倍率を１６５倍にまで高めることができた。精製酵素標品の比活性は、６６０Ｕ／ｍｇを示した。精製工程のあらましを下記表１に列記した。
【００３１】
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【００３２】
ｃ）トウモロコシ由来組換え型ＧＬＤＨの活性
上記抽出・精製工程によって得られたトウモロコシ由来のカルシウム依存型ＧＬＤＨの酵素活性を上述の実施例１ａ）に示す条件で測定した。その結果、上記の精製工程を通じて、４０Ｌの菌体培養より精製ＧＬＤＨがトウモロコシ由来のものが４万単位得られた。得られたカルシウム依存型ＧＬＤＨの性質を以下に示した。
【００３３】
分子量                  ；  ２９０ｋＤａ（６量体）ゲルろ過
サブユニット分子量      ；  ４４，０９１
ｐＨ活性                ；  至適ｐＨ７．０〜８．０
ｐＨ安定性              ；  ｐＨ５〜１１（７０℃で２０分間処理）
金属イオンによる活性化  ；  Ｃａ2+又はＣａ++に対するＫｍはおよ        そ１０μＭ。他の金属イオンでは活性化されず。
作用温度                ；  ２０℃〜８０℃
熱安定性                ；  ７０℃熱処理（ｐＨ７．０、２０分間）においても８０％以上の初期活性値を保持した。
溶液保存安定性          ；  活性化剤となるカルシウムイオンの添加／無添加にかかわらず、３７℃で１週間の加速虐待においても初期活性値の６０％以上を保持した。
【００３４】
【実施例２：カルシウム測定に対する酵素活性調節】
実施例１で得られたカルシウム依存型ＧＬＤＨを用いて、血清カルシウム濃度の測定のためのカルシウム濃度に対する酵素活性化調節評価を行った。血清カルシウム濃度領域に対する濃度依存的な活性化応答性を得るために、調節因子として各種キレート剤（０．２ｍＭ）を添加した際のトウモロコシ由来ＧＬＤＨのカルシウム濃度に対する活性化パターンを求めた。試料カルシウム濃度を横軸にとり縦軸に酵素活性化の相対速度（％）をプロットした。その結果を図５に示した。種々のキレート剤添加によりカルシウム活性化速度を調節できることを見い出した。０〜４ｍＭの試料カルシウム濃度に対しては、ほぼ直線的な活性化応答性が得られる調節因子としてＮＴＡが特に有効であることを見い出した。
【００３５】
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【００３６】
（カルシウム試料液）
測定機器          ：  自動分析機コーバスファラ（ロッシュ社製）
測定温度          ：  ３７℃
測定波長          ：  ３４０ｎｍ
試薬添加比率      ：  サンプル：純水：第１試薬：第２試薬＝６：４：２４０：６０（μＬ）
活性化速度の算出  ：  カルシウム試料液サンプルと第１試薬を添加・混合した後、ＮＡＤＨを含む第２試薬を添加し、カルシウムによる活性化パターンを酵素反応の初速度（ΔＡ３４０／ｍｉｎ）の上から求めた。
【００３７】
【実施例３：血清カルシウムの定量】
実施例２の結果をもとに、さらにＮＴＡ濃度とカルシウム検量線との関係を調べた結果、以下のような測定試薬の調製により直線的な検量線を作成可能であることを見い出した。その結果を図６に示した。また塩化カルシウム水溶液を標準液とした検量線より、市販コントロール血清（コンセーラ、日水製薬製）のカルシウム値（試料１）を測定し、当試料１に１ｍＭ塩化カルシウムを添加した試料２の測定値との上から回収率を算出した。その結果、下記表２に列記したように試料１に対する試料２の添加カルシウム濃度の回収率は１００．２％と算出され、調製した本試薬は優れた血清カルシウム測定に対する特異性を示すことを見い出した。
【００３８】
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【００３９】
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【００４０】
（血清カルシウムを測定するための吸光度変化量の算出）
実施例２に記述した操作手順に従いカルシウム測定した。
【００４１】
【発明の効果】
上記の通り、本発明の液状試薬は、カルシウム依存型ＧＬＤＨを用いることにより、溶液中で高い酵素活性を長期間維持する。本試薬は、溶液状態での保存安定性にすぐれているため、取扱い易い液状試薬キットに組むことが可能となり、簡便且つ正確に生体試料その他の試料中のカルシウムを測定することができる。
【００４２】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＧＬＤＨ酵素反応のメカニズムを示した図である。
【図２】ＧＬＤＨによるカルシウム量の測定メカニズムを示した図である。
【図３】ＧＬＤＨのアミノ酸配列１を示す。
【図４】同２を示す。
【図５】血清カルシウム濃度領域に対する濃度依存的な活性化応答性を示す。
【図６】ＮＴＡを調節因子としたカルシウムの検量線を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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