(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の可逆的染色のための方法において：
（ａ）レセプター分子を有する細胞を含む試料を提供し、
（ｂ）この細胞と、
（ｉ）前記レセプターと特異的に結合する少なくとも１個の成分、その際、前記少なくとも１個の成分は、少なくとも１個の第１パートナーと少なくとも１個の他のパートナーとから成る結合複合体の少なくとも１個の第１パートナーと結合し、その際、成分とレセプターとは低いアフィニティー相互作用を示すものであり、
（ｉｉ）前記第１パートナーに対する少なくとも２個の結合部位を有する前記結合複合体の少なくとも１個の他のパートナー；および
（ｉｉｉ）（ｉ）および／または（ｉｉ）と結合しているかまたは結合する能力を有する検出可能な標識
とを接触させる工程を含み、その際、結合複合体の１個または複数個の第１パートナーおよび１個または複数個の他のパートナーは可逆的結合を形成し、かつ、その際、少なくとも２個の成分（ｉ）、少なくとも１個の他のパートナー（ｉｉ）および少なくとも１個の標識（ｉｉｉ）を含む結合体は、レセプター分子を介して前記細胞に結合し、その際、前記細胞は染色され、その際、前記可逆的結合が１０−６〜１０−１３ＭのＫｄを有することを特徴とする、細胞の可逆的染色のための方法。
【請求項２】
さらに（ｃ）前記試料の染色されていない細胞と前記染色細胞とを分離する工程を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
さらに（ｄ）染色細胞と、第１パートナーと他のパートナーとの間の結合を分断する能力を有する結合複合体の遊離第１パートナー又は前記遊離第１パートナーの類似体とを接触させることによって、可逆的結合を分断し、前記細胞から前記染色を除去する工程を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞がＴ細胞であり、レセプター分子がＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）であり、かつ成分（ｉ）がＴＣＲ結合ペプチドおよびＭＨＣ分子を含有するＴＣＲ結合リガンドである、請求項１から３までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
工程（ｂ）、工程（ｃ）および工程（ｄ）を、１５℃以下の温度で実施する、請求項１から４までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
工程（ｄ）中で、染色された細胞とビオチン又はビオチン類似体とを接触させることによって、可逆的結合を分断する、請求項３から５までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
結合複合体が、
（ａ）（ｉ）ビオチンおよび（ｉｉ）ビオチンと可逆的結合が可能なストレプトアビジン類似体またはアビジン類似体、
（ｂ）（ｉ）ストレプトアビジンまたはアビジンと可逆的結合が可能なビオチン類似体、および（ｉｉ）ストレプトアビジンまたはアビジン、または前記ビオチン類似体と可逆的結合が可能なストレプトアビジン類似体またはアビジン類似体、および
（ｃ）（ｉ）ストレプトアビジン結合ペプチドまたはアビジン結合ペプチド、および（ｉｉ）ストレプトアビジンまたはアビジン、または前記ストレプトアビジン結合ペプチドまたはアビジン結合ペプチドと可逆的結合可能なストレプトアビジン類似体またはアビジン類似体
から選択される、請求項１から６までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
可逆的結合の分断により、細胞からのレセプター結合成分の解離が生じる、請求項３から７までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
共通の特異的レセプターの存在によって定義される細胞群を単離するための、請求項１から８までのいずれか１項に記載の方法の使用。
【請求項１０】
共通の特異的レセプターの存在によって定義される細胞群のｉｎ  ｖｉｔｒｏエキスパンションをさらに含む、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
共通の特異的レセプターの存在によって定義される細胞群が抗原特異的Ｔ細胞群であり、かつ、レセプター特異的結合成分が、ＴＣＲ結合ペプチドおよびＭＨＣ−分子を含有するＴＣＲ結合リガンドである、請求項９または１０に記載の使用。
【請求項１２】
ＴＣＲ−ＭＨＣアフィニティー測定のための、請求項１１に記載の使用により得られる抗原特異的Ｔ細胞群の使用。
【請求項１３】
Ｔ細胞群がＴ細胞であるかまたはＴ細胞クローンである、請求項１１又は１２に記載の使用。
【請求項１４】
細胞の可逆的染色のための試薬キットにおいて、
（ｉ）細胞上でレセプター分子と特異的に結合する少なくとも１個の成分、その際、前記少なくとも１個の成分は、少なくとも１個の第１パートナーと少なくとも１個の他のパートナーとから成る結合複合体の少なくとも１個の第１パートナーと結合し、その際、成分とレセプターとは低いアフィニティー相互作用を示すものであり、
（ｉｉ）前記第１パートナーに対して少なくとも２個の結合部位を有する前記複合体の少なくとも１個の他のパートナー、および
（ｉｉｉ）（ｉ）および／または（ｉｉ）と結合しているかまたは結合する能力を有する検出可能な標識
を含み、その際、結合複合体の１個または複数個の第１パートナーおよび１個または複数個の他のパートナーは、１０−６〜１０−１３ＭのＫｄを有する可逆的結合を形成する能力を有することを特徴とする、細胞の可逆的染色のための試薬キット。
【請求項１５】
細胞がＴ細胞であり、レセプター分子がＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）であり、かつ成分（ｉ）がＴＣＲ結合ペプチドおよびＭＨＣ分子を含有するＴＣＲ結合リガントである、請求項１４に記載の試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、細胞、特に抗原特異的Ｔ細胞の可逆的染色および機能的単離または特徴付けのための新規方法に関する。この技術を用いた場合には、Ｔ細胞の本来の機能的性質は、その同定および精製の後も本質的に保持することができる。したがって、この新規方法は、基礎研究および臨床的適用のための広範囲の便益を有する。
【０００２】
その機能的性質を変化させることのない抗原特異的Ｔ細胞の同定および精製は、科学的および臨床的重要性を有する。その抗原特異性に基づくＴ細胞の直接的同定方法（ELISPOT アッセイ（１）、細胞間サイトカイン染色（２）、分泌アッセイ［アフィニティ  マトリックス］（３）、ＭＨＣ多量体（２、４、５））が近年開発されている。しかしながら、これら同定技術に関する多くは、Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激を必要とし、この場合、これは、細胞の表現型および機能的性質を著しく変化させるものである。今日まで、ＭＨＣ多量体技術のみ、その表現型と独立して、抗原特異的Ｔ細胞の同定および精製を可能にしているが、しかしながら不運なことに、通常のＭＨＣ多量体染色は、機能的Ｔ細胞分析の妨げとなる。
【０００３】
Ｙｅｅら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２（１９９９）、２２２７−２２３４）は、ペプチド−ＭＨＣ四量体を用いての、不均質個体群からの高アビティティーメラノーマ反応性細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の単離を記載している。ＭＨＣ四量体はビオチン化（biotinylated）され、かつ蛍光標識基を有するアビジンと不可逆的に結合する。したがって、生理学的条件下での蛍光マーカーの除去は不可能である。Ｙｏｕｄｅら（Cancer Res. 60 (2000), 365-371）は、内在性ヒトパピローマウイルス抗原を認識するヒトＣＴＬｓを単離するための蛍光標識化されたＭＨＣ四量体の使用を記載している。さらに、ビオチン化ＭＨＣ分子が使用されるが、この場合、これは、生理学的条件下でストレプトアビジンと不可逆的に結合するため、Ｔ細胞からの検出試薬の除去は不可能である。
【０００４】
ＵＳ−Ａ−５９８５６５８では、可逆的な高アフィニティー相互作用に基づく、複数個の細胞からの標的細胞の分離方法が記載されている。方法は、標的細胞／細胞結合試薬／第１分子／第２分子／固体担体複合体の形成を含み、その際、細胞結合試薬は、標的細胞、たとえば抗体に対して特異的であり、その際、第１分子は可逆的に第２分子と結合し、その際、第１分子および第２分子の一つはカルモジュリンであり、かつ、第１分子および第２分子の他方は、カルモジュリン−結合ペプチドである。固体の担体に接着しない非標的細胞の除去後に、第１分子と第２分子との間の結合がリバースし、それによって標的細胞が、複数個の出発細胞から分離した細胞として放出される。
【０００５】
この方法の欠点は、標的細胞結合試薬が、標的細胞群の単離を可能にために、標的細胞に対して高いアフィニティーを有していることである。そのため、第１分子と第２分子との間の結合を除去した後に、標的細胞特異的試薬は、依然として標的細胞に結合したままである。
【０００６】
Ｗｅｒｔｈｅｒら（J. Immunol. Meth. 238 (2000), 134-141）は、単核細胞懸濁液から腫瘍細胞を単離するための抗体に基づくプロトコールを示している。標的細胞は、マグネットビーズと結合する抗体によって染色され、これによって、出発細胞群から分離される。マグネットビーズは、標的細胞の他の表現型的特徴付けを可能にするために、ＤＮａｓｅで消化することができるＤＮＡリンカーを介して標的細胞と結合する。さらに、この方法は、標的細胞から容易に除去することができない、高アフィニティー標的細胞結合試薬、すなわち、抗体を使用しなければならないといった欠点を有する。
【０００７】
Ｍａｒｅｌｌｉ−Ｂｅｒｇら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４４（２０００），２０５−２１５）は、マウス組織からの内皮細胞の単離のためのプロトコールを示している。内皮細胞は、特異的抗体によって標識化され、その後に、マイクロビーズと結合させることによって精製する。また、この方法も前記欠点を含むものである。
【０００８】
本質的にその機能的性質を変化させることのない、可逆的染色工程を含む、抗原−特異的Ｔ細胞群の同定および精製のための新規方法が見出された。より詳細には、標的細胞群の精製のために使用される試薬は、標的細胞から完全に除去することができる。この試みは、ＭＨＣ多量体染色の特異性および感受性と、細胞の機能的性質の保存とを組合せたものである。
【０００９】
Ｔ細胞は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）（６）に関連する、プロセス化（processed）抗原フラグメント（エピトープ）を認識する。Ｔ細胞の特異性は、そのＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）の構造によって決定され、この場合、これは、細胞表面上で高いレベルで発現する。エピトープ−特異的Ｔ細胞の直接的同定のための、ＴＣＲの天然リガンド−ＭＨＣ／エピトープ複合体−の使用に関する従来の試みは成功しなかった。この試みの欠点は、多くは、ＴＣＲ−ＭＨＣ／ペプチド相互作用の低いアフィニティーによって説明することができ、この場合、これは、特に高い解離速度によって特徴付けられる（図１のＡ）。
【００１０】
ＭＨＣ／ペプチドの多量化（たとえば、四量体分子への多量化）は、ＴＣＲｓとの相互作用の相対的アビディティーを、Ｔ細胞表面上での安定かつエピトープ−特異的結合を可能にする程度に増加させる（図１のＢ）。蛍光色素と結合したＭＨＣ多量化試薬は、フローサイトメトリーによって抗原−特異的Ｔ細胞の直接的同定のために使用することができる。この方法は、少なくとも数年間に亘ってのＴ細胞研究に革命を起こすものであり、これは、動物モデルならびにヒトにおいて直接的にｅｘ  ｖｉｖｏで、最初に抗原−特異的Ｔ細胞群の視覚化を可能にした（７、８）。
【００１１】
ＭＨＣ多量体染色を４℃でおこなう場合には、Ｔ細胞は、その本来の表現型を変化させることなく、同定かつ精製（ＦＡＣＳ、ＭＡＣＳ）することができる。しかしながら、ＭＨＣ多量化試薬が、ＴＣＲと結合する天然のリガンドを示すために、細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養への置換、あるいはレシピエントへのｉｎ  ｖｉｖｏ養子免疫伝達（adoptive in vitro transfer）は、ＴＣＲ内在化、活性化、過刺激および細胞死を含む、精製されたＴ細胞群の劇的な変化を生じる（図３および図４）。
【００１２】
このように、通常のＭＨＣ多量体技術は、エピトープ−特異的Ｔ細胞の直接的な視覚化および表現型分析を可能にする。しかしながら、ＭＨＣ多量体染色され、かつ精製されたＴ細胞のその後の機能分析およびｉｎ  ｖｉｖｏ導入は、ＴＣＲ−ＭＨＣ相互作用の残留およびその後に誘発されるシグナル化によって複雑化される。したがって、Ｔ細胞染色および精製の後に、表面−結合されたＭＨＣ多量体を除去するための方法の開発は、Ｔ細胞免疫の分野において極めて重要であり、かつ、ＭＨＣ多量体技術の臨床的適用および機能的診断への移行のために不可欠である。
【００１３】
したがって、本発明は：
（ａ）レセプター分子を有する細胞を含有する試料を提供し、
（ｂ）前記細胞と、
（ｉ）結合複合体の少なくとも一つの第１パートナーと結合している、前記レセプターと特異的に結合する少なくとも一つの成分；その際、成分とレセプターとは低いアフィニティー相互作用を有するものであり、
（ｉｉ）前記の第１パートナーに対する少なくとも２個の結合部位を有する前記結合複合体の少なくとも一つの他のパートナー；および
（ｉｉｉ）（ｉ）および／または（ｉｉ）と結合しているかまたは結合する能力を有する検出可能な標識とを接触させ、その際、結合複合体の一つまたはそれ以上の第１パートナーおよび一つまたはそれ以上の他のパートナーは、可逆的結合を形成する能力を有し、かつ、少なくとも２個の成分（ｉ）、少なくとも１個の成分（ｉｉ）および少なくとも１個の成分（ｉｉｉ）を含有する結合体が、レセプター分子を介して前記染色細胞と結合しており、
（ｃ）場合によっては、前記染色細胞を、前記試料の他の成分から分離し、かつ、
（ｄ）場合によっては、前記染色を、可逆的結合を分断することによって、前記細胞から除去する、
工程を含む、細胞の可逆的染色方法に関する。
【００１４】
本発明の特に好ましい実施態様は：
（ａ）Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）分子を有する細胞を含む試料を供給し、
（ｂ）前記細胞と、
（ｉ）少なくとも一つのＴＣＲ結合リガンド、たとえば、ＴＣＲ結合ペプチドおよび結合複合体の少なくとも一つの第１パートナーと結合するＭＨＣ分子；
（ｉｉ）結合複合体の第１パートナーに対する少なくとも２個の結合部位を有する結合複合体の少なくとも一つの他のパートナー；および
（ｉｉｉ）（ｉ）および／または（ｉｉ）に結合しているかまたは結合する能力を有する検出可能な標識；
とを接触させ、その際、結合複合体の１個または複数個の第１パートナーおよび１個または複数個の他のパートナーは、可逆的結合を形成する能力を有し、かつ、少なくとも２個のＴＣＲ結合リガンド（ｉ）、少なくとも１個の成分（ｉｉ）および少なくとも１個の成分（ｉｉｉ）を含有する結合体が、ＴＣＲ分子を介して前記Ｔ細胞に結合し、その際、前記Ｔ細胞は染色されており、
（ｃ）場合によっては、前記の染色されたＴ細胞を、前記試料の他の成分から分離し、かつ、
（ｄ）場合によっては、前記染色を、前記Ｔ細胞から、可逆的結合を分断することによって除去する、
工程を含む、T細胞の可逆的染色のための方法である。
【００１５】
本発明の方法は、たとえばＴ細胞の機能的レセプター分子を有する細胞、すなわち、機能的ＴＣＲ分子を有する細胞の可逆的染色に適しており、その際、前記レセプター分子は、レセプターリガンド、たとえばペプチド／ＭＨＣ複合体と結合する能力を有する。レセプターリガンドは、特に、レセプターリガンドとレセプター分子とが低いアフィニティー相互作用、たとえば、１０−２Ｍ〜１０−７Ｍ、特に１０−３Ｍ〜１０−６Ｍの範囲での解離定数Ｋｄを示す場合には、染色すべき細胞上に存在するレセプター分子に対して結合する能力を有する任意の分子であってもよい。したがって、レセプターリガンドの個々の分子は、標的細胞上で、レセプターとの安定した結合を形成する能力を有していない。レセプターとレセプターリガンドとの間の安定した結合を形成するための十分なアビディティーを提供するために、少なくとも２個またはそれ以上のリガンド分子は、標的細胞上でレセプター分子に対して協同的に結合しなければならない。この協同的結合は、第１パートナー−リガンド結合体のための、２個またはそれ以上、たとえば、３、４、５個またはそれ以上の結合部位を有する結合対の他のパートナーと結合する、結合対の第１パートナーと結合されたリガンド分子を用いることによって達成される。個々のリガンド分子が、極めて低い結合アフィニティーを有する場合には、協同的結合リガンド分子の数は、安定した結合形成のための十分なアビディティーを提供するために増加させなければならない。
【００１６】
リガンド分子は、結合対の１個またはそれ以上の第１パートナーと結合されていてもよい。たとえば、リガンド分子がペプチド／ＭＨＣ複合体である場合には、第１パートナー、たとえばペプチドは、ＭＨＣ分子のα鎖および／またはβ鎖に対して結合していてもよい。より好ましくは、リガンド分子は、少なくとも２個の第１結合パートナーを含有し、たとえば、第１結合パートナーは、ＭＨＣ分子のα鎖に結合されていてもよく、かつ、他の第１結合パートナーは、ＭＨＣ分子のβ鎖に結合されていてもよい。二者択一的に、いくつかの第１結合パートナー分子の連続的な配列は、リガンド分子であるかまたはリガンド分子のサブユニット、たとえば、ＭＨＣ分子のα鎖および／またはβ鎖と結合されていてもよい。
【００１７】
そのリガンドに対して低いアフィニティー相互作用を有する適したレセプター分子の他の例は、（１４）で記載されているような細胞接着レセプター分子、および（１５）で記載されているような共同刺激分子のためのレセプターである。さらに他の例は、低いアフィニティーを有する抗体およびそのフラグメントおよび人工結合分子、たとえばペプチド、リポカリン（lipochalins）およびたとえば、ランダムなライブラリーからの他のアプタマー（aptamer）であり、この場合、これらは、細胞表面上に位置する分子と結合し、かつ、特異的結合特性を有するが低い結合アフィニティーを示す。レセプターリガンドが、ＭＨＣ特異的ペプチドを含有する場合には、ペプチドが、分析すべき細胞のＴＣＲレセプターおよびＭＨＣ分子に対して結合能力を有するＴ細胞エピトープであることが好ましい。細胞は、好ましくは哺乳動物細胞、たとえば哺乳動物Ｔ細胞、特にヒト細胞、たとえば、ヒトＴ細胞、特に、予め定められた抗原特異性を有する哺乳動物Ｔ細胞の亜細胞群（subpopulation）である。
【００１８】
ペプチドは、ＴＣＲ分子、好ましくは予め定められた抗原特異性を有するＴＣＲ分子と結合する能力を有するＴ細胞エピトープを含有する。ペプチドは、通常は、約８個〜約２５個のアミノ酸の長さを有し、かつ、好ましくは予め定められたＭＨＣ分子クラス、たとえば、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩまたは非古典的ＭＨＣクラスと対立遺伝子（allele）−特異的に結合する能力を有する、いわゆるアンカーアミノ酸残基を含有する。ＭＨＣ分子は、好ましくは、組換え体可溶性ＭＨＣ分子であり、この場合、これは、細菌発現系（１６）または昆虫細胞発現系（１７）中で調製されてもよい。
【００１９】
本発明の重要な特徴として、結合複合体、たとえば、結合対は、少なくとも一つの第１パートナーおよび少なくとも一つの他のパートナーから成り、その際、少なくとも一つの他のパートナーは、第１パートナーに対して少なくとも２個の結合部位およびより好ましくは、少なくとも４個の結合部位を有していることが選択される。第１パートナーおよび第２パートナー間の結合は、可逆的であるべきであり、すなわち、結合は、請求された方法を実施するために適した条件下で、分断される能力を有していなければならない。好ましくは、可逆的結合は、定められたように適切な条件下で、たとえば、蛍光滴定（１１）による、１０−２〜１０−１３Ｍ、より好ましくは１０−３〜１０−１０Ｍおよび最も好ましくは１０−５〜１０−８ＭのＫｄを有する。特に好ましくは、高いＫｏｆｆ値を有する可逆的結合であって、たとえば、１０−１／秒〜１０−４／秒、特に１０−２／秒〜１０−３／秒を有する。
【００２０】
本発明の他の重要な特徴として、標的細胞、たとえばＴ細胞の染色および引き続いての場合による工程、すなわち染色された標的細胞、たとえばＴ細胞の単離および精製、および染色の除去は、低い温度、すなわち、本質的に、標的細胞、たとえばＴ細胞表現型の変化を生じうる活性化および／またはシグナル化を生じない温度で実施されてもよい。好ましくは、染色および引き続いての染色の除去は、≦１５℃、好ましくは≦１０℃、より好ましくは約４℃の温度で実施される。
【００２１】
染色された標的細胞、たとえばＴ細胞の、他の試料成分、たとえば染色されていないT細胞からの分離は、通常の方法、たとえば、細胞のソーティング、好ましくは市販の系を用いてのＦＡＣＳ法（たとえば、ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ｏｒ  Ｍｏｆｌｏ  ｂｙ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）であるか、あるいは、磁気的細胞分離法（たとえば、ＭＡＣＳ  ｂｙ  Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）によっておこなわれてもよい。
【００２２】
染色の除去は、好ましくは、結合複合体の第１パートナーと第２パートナーの間の可逆的結合の標的化された分断によって生じる。この分断は、染色細胞と、結合複合体の遊離第１パートナーであるか、あるいは結合第１パートナー（ｉ）および他のパートナー（ｉｉ）との間の結合を分断する能力を有するそれらの類似体とを接触させることによって達成されてもよい。好ましくは、遊離第１パートナーは、結合第１パートナーよりも他のパートナーに対して高いアフィニティーを有する、結合第１パートナーの類似体である。より好ましくは、遊離第１パートナーは、結合された第１パートナーのアフィニティーよりも少なくとも３オーダー、特に少なくとも５オーダーの大きさで高いアフィニティーを有する。特に、遊離第１パートナーは、少なくとも１ｘ１０−３および特に１ｘ１０−５の低いファクターによる、解離定数Ｋｄを有する。
【００２３】
染色細胞の検出のために使用された標識は、診断方法および分析方法において使用された任意の標識であってもよい。好ましくは、標識は、記載された方法中の細胞の特徴に悪影響を及ぼすことのないものである。標識の好ましい例は、蛍光染料または磁気性標識である。標識は、リガンド、たとえばペプチドおよび／またはＭＨＣ分子、結合複合体の第１パートナーおよび／または第２パートナーと結合していてもよい。標識は、直接的に標識されていてもよく、すなわち、標識は、前記に示したように、結合体の群の一つと結合していてもよい。二者択一的に、標識は間接的に標識されていてもよく、すなわち、前記に示したように結合体の群の一つと、順に結合する能力を有するレセプターと結合する標識である。
【００２４】
第１パートナーと第２パートナーとの間の可逆的結合の分断による、標的細胞からの染色の除去は、標的細胞上の少なくとも２個の低アフィニティーリガンドとレセプター分子との間の協同的結合の損失を示す。したがって、少なくとも２個の成分（ｉ）、少なくとも１個の成分（ｉｉ）および少なくとも１個の成分（ｉｉｉ）を含有する結合体は、完全に分断される。これは、結果として、標的細胞と結合する任意の試薬の完全な除去を生じ、それというのも、標的細胞上のレセプター結合成分とレセプターとの間の結合が、低いアフィニティー相互作用であるためである。
【００２５】
本発明による方法の原理は、以下の好ましい実施態様中で示され、この場合、結合複合体は：
（ａ）（ｉ）ビオチンおよび（ｉｉ）ビオチンと可逆的に結合する能力を有するストレプトアビジン類似体またはアビジン類似体、
（ｂ）（ｉ）ストレプトアビジンまたはアビジンと可逆的に結合する能力を有するビオチン類似体および（ｉｉ）前記ビオチン類似体と可逆的に結合する能力を有するストレプトアビジンまたはアビジンまたはストレプトアビジン類似体またはアビジン類似体、
（ｃ）（ｉ）ストレプトアビジン結合ペプチドまたはアビジン結合ペプチドおよび（ｉｉ）ストレプトアビジンまたはアビジン、または前記ストレプチアビジン結合ペプチドおよびアビジン結合ペプチドと可逆的に結合する能力を有するストレプトアビジン類似体またはアビジン類似体
から選択される。
【００２６】
特に好ましい実施態様において、ストレプトアビジンまたはアビジン、またはストレプトアビジン類似体またはアビジン類似体のオリゴマーまたはポリマーを、カルボキシル残基を多糖、たとえば、デキストランに導入することによって製造されてもよく、この場合、これらは、本質的に“Ｎｏｇｕｃｈｉ，Ａ．，  Ｔａｌａｈａｓｈｉ，Ｔ．，Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｔ．，Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｋ．，Ｔｋａｋｕｒａ，Ｙ．，Ｈａｓｈｉｄａ，Ｍ．＆  Ｓｅｚａｋｉ，Ｈ．（１９９２）Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｃｏｍｐｏｓｅｄ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｎｄ  ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ  Ｃ  ｄｅｘｔｒａｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ．  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３，１３２−１３７”で記載されたように、主要工程で製造されてもよい。その後に、ストレプトアビジンまたはアビジンまたはこれらの類似体は、内部リシン残基および／または遊離Ｎ−末端基の第１アミノ基を介して、デキストラン骨格中のカルボキシル基に、通常のカルボイミド化学を用いて、副次的工程で結合される。特に好ましい実施態様に関して、カップリング反応は、デキストラン１モル当たり、約６０モルのストレプトアビジンまたはＳｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎのモル比で実施される。しかしながら、ストレプトアビジンまたはアビジンのオリゴマーまたはポリマーは、二官能性リンカー、たとえば、グルタルデヒドを介しての架橋であるか、あるいは文献中に記載された他の方法によって得ることができる。
【００２７】
ストレプトアビジン結合ペプチドは、好ましくは、（９）、（１０）または米国特許５５０６１２１号明細書中で記載されたストレプトタグ（Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ）ペプチドから選択され、この場合、これらの文献は参考のために本明細書中に記載されるものである。より好ましくは、ストレプトタグ（Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ−）ペプチドは、アミノ酸配列  Ｔｒｐ−Ｘ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｙ−Ｚ［式中、Ｘは任意の好ましいアミノ酸であり、ＹおよびＺの双方はＧｌｙであるか、あるいはＹはＧｌｕであり、かつＺはＡｒｇまたはＬｙｓである］を含む。特に好ましくは、ペプチド  Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ（ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ）である。
【００２８】
他の特に好ましい実施態様において、結合複合体は、米国特許第５９８５６５８号明細書中に記載されたカルモジュリン−結合ペプチドおよびカルモジュリン、または二価のカチオンの存在に基づく任意の他の相互作用、特にレセプターと結合するペプチド、たとえばＦＬＡＧペプチドから選択されてもよく、この場合、これらは、米国特許第４８５１３４１号明細書中で記載されたようなモノクローナル抗体４Ｅ１１と結合する。これらの結合複合体の分断は、金属イオンのキラル化、たとえばカルシウムのキラル化によって、たとえばＥＤＴＡの添加によって達成される。
【００２９】
方法の原理：
ＭＨＣ多量体は、“相対的結合アビディティー”を増加させるが、一価のＴＣＲ−ＭＨＣ／ペプチド相互作用のアフィニティーを増加させることはない（図１Ａ）。単量体ＭＨＣ／ペプチド複合体は、安定してＴＣＲｓと結合しないために、ＭＨＣ多量体のＭＨＣ単量体への標的化された分断は、結果として表面結合されたＴＣＲリガンドの急速な解離を生じる。ＭＨＣ／ペプチド複合体の完全な解離の後に（活性化／シグナル化を生じることのない温度、好ましくは４℃）、Ｔ細胞の機能的性質は、引き続いての細胞培養への導入またはｉｎ  ｖｉｖｏ養子免疫伝達においても変化することはない。
【００３０】
従来のＭＨＣ多量体試薬の製造は、可溶性ＭＨＣ複合体の特異的なビオチン化に基づく。ストレプトアビジン（ＳＡ）が４個のビオチン結合部位を有しているために、ビオチン化されたＭＨＣ分子と（蛍光色素結合された）ストレプトアビジンとの４：１の比でのインキュベーションは、結果として、四量体ＭＨＣ試薬の形成を生じる（図１のＢ）。ストレプトアビジン：ビオチン結合の安定性は高く（Ｋｄ＜１ｘ１０−１３Ｍ、“Weber, P.C., Wendoloski, J.J., Pantolino, M.W. & Salemme, F.R. (1992) Crystallographic and thermodynamic comparison of natural and synthetic ligand bound to streptavidin. J. Am. Chem. Soc. 114, 3197-3200”中では４ｘ１０−４と記載されている）、したがって、試薬は極めて安定である。ビオチンのＭＨＣ−ストレプトアビジン多量体染色Ｔ細胞への添加（５０ｍＭの濃度まで試験された）は、試薬の安定性に対して著しい効果を与えることはなかった（適当なタイムウインドウの範囲内（≦１日））。
【００３１】
これとは対照的に、本発明による方法は、抗原−特異的Ｔ細胞の機能的単離のための生理学的条件下で、急速かつ標的化されたＭＨＣ多量体試薬の分断を可能にする技術であり；この場合、これは、特に低い温度（好ましくは４℃）での本質的に簡単かつ急速な分断を可能にする技術である。さらに、方法は、本質的にＴ細胞に対して非毒性であり、かつ使用された物質は、ｉｎ  ｖｉｖｏ適用（臨床適用）に関して無毒である。
【００３２】
米国特許第５５０６１２１号明細書中で開示されているようなペプチド配列（Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇｓ）は、ストレプトアビジンのビオチン結合部位に対する結合アフィニティーを、たとえば、約１０−４〜１０−５の間のＫｄで試験した（９、１０）。結合アフィニティーは、さらに、ストレプトアビジン分子の範囲内での突然変異タンパク質を生じさせることによって改善されてもよい。最適化されたストレプトアビジン突然変異タンパク質の例（Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎｓ）は、米国特許第６１０３４９３号明細書または（１１）中に記載されており、この場合、これらは、本明細書中において参考のためにのみ記載されている。好ましくは、ストレプトアビジン突然変異タンパク質は、野生型ストレプトアビジンの４４位で、Ｇｌｕが疎水性脂肪族アミノ酸（hlydrophobic aliphatic amino acid）たとえば、Ｖａｌ、Ａｌａ、ＩＩｅまたはＬｅｕによって置換されており、４５位で任意のアミノ酸が存在し、４６位で脂肪族アミノ酸および好ましくは疎水性脂肪族アミノ酸が存在し、および／または４７位でＶａｌが、塩基性アミノ酸、たとえば、ＡｒｇまたはＬｙｓ、特にＡｒｇによって置換されていることによって特徴付けられる。より好ましくは、Ａｌａは４６位であり、および／またはＡｒｇは４７位であり、および／またはＶａｌまたはＩＩｅは４４位である。さらに好ましくは突然変異タンパク質は、ＩＩｅ４４−Ｇｌｙ４５−Ａｌａ４６−Ａｒｇ４７またはＶａｌ４４−Ｔｈｒ４５−Ａｌａ４６−Ａｒｇ４７（（１１）で記載されているような“Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ”）から選択された配列を有する。Ｓｔｒｅｐ−ＴａｃｔｉｎとＳｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩとの相互作用は、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用に関する約１０−３のＫｄと比較して、約１０−６Ｍ（１１）のＫｄを有する結合アフィニティーによって特徴付けられる。Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎに対して高いアフィニティー（１０−１０Ｍ〜１０−１３のＫｄであると推定される）でさらに結合するビオチンは、結合部位に関してストレプタグＩＩ（Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ）と競合する。
【００３３】
本発明によれば、抗原−特異的Ｔ細胞染色のための安定したＭＨＣ多量体は、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ／ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎの相互作用に基づいて生成される。したがって、急速に、好ましくは２時間未満で、より好ましくは１時間未満で、かなり低い濃度のビオチンの存在下で、多量体を競合的に分断することが可能である（図２）。
【００３４】
この系は、ＭＨＣ多量体の分断のために要求される基準を満たすものであるが（前記参照のこと）：それというのも、ストレプ−タグＩＩ（Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ）／ストレプタクチン（ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ）とビオチン／ストレプタクチン（ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ）との間の著しいアフィニティーの差異のためであり、ビオチンの完全かつ極めて急速な競合的結合（低い温度であっても）が生じ；ビオチン（５０ｍＭの濃度まで試験された）はＴ細胞に関して非毒性であり、Ｔ細胞の機能を変化させることなく、かつ、少量のビオチン（ビタミンＨ）は、ｉｎ  ｖｉｖｏ適用においても無毒である。
【００３５】
ストレプ−タグＩＩ（Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ）／ストレプタクチン（ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ）系を、ＭＨＣ多量体の生成およびＴ細胞表面に結合する多量体のビオチンの添加による標的化された分断の双方について試験した。また、この試みに対して、可逆的Ｔ細胞染色は、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇｓを、ビオチン類似体、たとえばビオチンと比較して、ストレプトアビジンまたはアビジンに対して低いアフィニティーを有するアミノビオチン、イミノビオチンまたデスチオビオチンで置換することによって達成されてもよい。さらに好ましい実施態様は、ビオチン化ＭＨＣ分子の結合に対する遊離ビオチンと、ストレプ−タクチン（Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ）またはビオチンに対してより低いアフィニティーを有する他のストレプトアビジン類似体との競合に関する。
【００３６】
二者択一的に、従来公知の他のストレプトアビジン−結合ペプチドは、たとえば、Ｗｉｌｓｏｎらによって記載されているように使用されてもよい（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 (2001), 3750-3755）。
【００３７】
本発明の特徴は、可逆的結合が、標的化された方法で、少量の生理学的化合物ビオチン（ビタミンＨ）の添加によって分断することができるといった事実であり、この場合、この化合物は、生細胞に対して有害でもなければ、その機能的性質を変更するものでもなく、本発明において、この化合物またはその類似体で選択的に分断することができるすべての結合複合体を請求する。したがって、ストレプトアビジンまたはアビジンまたはその類似体と、ビオチンまたはビオチン類似体、あるいはストレプトアビジン結合ペプチドまたはアビジン結合ペプチドとの結合複合体に加えて、さらに他の結合複合体が本発明の目的のために適しており、この場合、これは、染色されるべき細胞に対して任意の悪影響を及ぼすことのない化合物、たとえばビオチンまたはビオチン類似体の添加によって分断することができる細胞の可逆的染色を可能にする。たとえば、抗原／抗体−結合対は、特にポリマー化またはオリゴマー化された抗体が使用される場合に適用することができる。ストレプトアビジン／アビジンおよびその類似体および／または抗体の以外のこのような結合複合体の他の例は、“Skerra A. (2000). Engineered protein scaffolds for molecular recognition. j. Mol. recognit. 13, 167-187”で記載されているような分子認識のための足場（scaffolds）となるいわゆる工学的タンパク質（engineered protein）であってもよく、この場合、これは、ビオチンまたはビオチン類似体を用いての分断による標的化された方法で分断することができる化合物を認識するために作製される。
【００３８】
さらに、本発明は、本質的に純粋な標的化細胞群に関し、この場合、これは、特定のレセプターの存在によって定義され、かつ、前記の共通のレセプターと結合するアフィニティー試薬を用いて、不均質細胞群（すなわち、不均質細胞とは、特定の共通レセプターの有無に関連する）から精製される。標的細胞群は、アフィニティー試薬が本質的に、完全に前記レセプターから除去されることを特徴とする（好ましくは、検出限界未満に除去される）。アフィニティー試薬の完全な除去は、前記に示されたように可逆的に多量化された低いアフィニティーのリガンドを用いて達成される。したがって、標的細胞群は、精製方法によって変化されることのない機能的性質（共通の特異的レセプターによって定義される）を有するものが提供される。標的細胞群を定義する特異的な共通のレセプターは、前記に示したような低いアフィニティーのリガンドが示されてもよいことに対しての任意のレセプターであってもよい。たとえば、レセプターは、細胞群または亜細胞群を定義する抗原であってもよく、たとえば、血液細胞、たとえばリンパ球、単球またはナチュラルキラー細胞、骨髄細胞または幹細胞、たとえば、ＣＤ３４−ポジティブ−周縁幹細胞（peripheral stem cells）の細胞群または亜細胞群であってもよい。他方では、レセプターは、さらに腫瘍細胞のためのマーカーであってもよい。
【００３９】
特に、本発明は、好ましいＴ細胞群の染色、未染色Ｔ細胞群を含有する試料からの染色されたＴ細胞の単離および前記染色の除去を含む精製工程によって、本質的に変化されることのない機能的性質を有する、本質的に純粋な抗原特異的Ｔ細胞群に関し、すなわち、このＴ細胞群の機能的性質は精製前と、精製後とは本質的に同一である。このＴ細胞群は、前記に示した方法によって得られてもよい。特に、Ｔ細胞群は、たとえば、抗体またはＴＣＲ結合リガンド、たとえば、多量体ＴＣＲ結合リガンドのような群の単離のために使用される任意の結合試薬を本質的に含有していない。
【００４０】
最後に、本発明は、融合ポリペプチドに関し、この場合、これは、（ａ）結合複合体の少なくとも一つの他のパートナーとの可逆的結合を形成する能力を有する、結合複合体の第１パートナーである少なくとも一つのペプチドドメイン、および（ｂ）細胞表面上のレセプターに対して特異的ではあるが低いアフィニティーで結合するリガンドドメインを含有する。融合ペプチドは、好ましくは遺伝的融合体であり、その際、一つまたはそれ以上の順次クラスター化されたペプチドドメインが、リガンドドメインのＮ−末端および／またはＣ−末端上に位置する。さらに、融合ポリペプチドは、いくつかのサブユニットから成り、その際、それぞれのサブユニットは、レセプターと一緒になって結合するリガンドサブドメインを形成する。この場合において、それぞれのサブユニットは、好ましくは、少なくとも一つのペプチドドメインを含有する。好ましい実施態様において、融合ポリペプチドは、（ａ）ストレプトアビジン−結合ペプチドおよび（ｂ）ＭＨＣ分子、好ましくは可溶性ＭＨＣ分子を含有する。たとえば、ストレプトアビジン結合ペプチドは、ＭＨＣ分子のα−鎖および／またはβ−ミクログロブリン鎖のＮ−末端および／またはＣ−末端と融合することができる。たとえば、少なくとも２個のストレプトアビジン−結合ペプチドを含有する融合ポリペプチド、たとえば、α−鎖およびβ−鎖の双方のＣ−末端に結合したストレプトアビジン−結合ペプチドを含有する融合ポリペプチドは、本発明の目的に適していることが示された。好ましいストレプトアビジン−結合ペプチドは、前記に示したようなストレプ−タグ（Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ）ペプチドであり、特にストレプタグＩＩ（Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ）である。さらに、本発明は、前記に示されたような融合ペプチドをコードする核酸に関し、その際、核酸は、好ましくは、組換えベクター上、特に、適したホスト細胞、たとえば、真核ホスト細胞または原核ホスト細胞中で請求された融合ポリペプチドの発現を可能にする発現ベクター上に位置する。
【００４１】
本発明の方法は、可逆的染色方法によって、標的細胞群、たとえば抗原特異的Ｔ細胞群の機能的単離を可能にする。標的細胞、たとえばＴ細胞の本来の機能的性質は、本質的に、同定および精製の後にも保持することができる。したがって、本発明の方法は、基礎的研究および臨床的適用に関する広範の便益を有するものである。好ましい適用例は、以下の通りである：
基礎的研究；
抗原特異的Ｔ細胞群の機能的性質の直接的ｅｘ  ｖｉｖｏ研究
ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＴ細胞の機能的性質は、極めて多様性であり、かつｉｎ  ｖｉｖｏ条件における特異性に依存していると示唆されるが、しかしながら、適切な研究ツールを欠くという理由から、これらの点についてはわずかにばかり理解されているにすぎない。ＭＨＣ多量体技術によって、エピトープ特異的Ｔ細胞群を、その機能的性質とは非依存的に、同定および精製することができる。しかしながら、多量体試薬の結合は、その後の機能的アッセイを妨害する。たとえば、ＭＨＣ−ストレプタグＩＩ（Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ）／ストレプタクチン（Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ）試薬を用いての可逆的Ｔ細胞染色は、変化していない種々のＴ細胞群の直接的な機能的ｅｘ  ｖｉｖｏ研究を可能にした最初の技術である。
【００４２】
高い効率を有するｉｎ  ｖｉｔｒｏエキスパンション（expansion）のための抗原−特異的Ｔ細胞群の精製
ｅｘ  ｖｉｖｏで得られたＴ細胞群の特徴付けは、しばしばさらに、Ｔ細胞系またはＴ細胞クローンへのｉｎ  ｖｉｔｒｏエキスパンションを必要とする。ＭＨＣ多量体技術を用いて、種々のＴ細胞群の範囲内の単一細胞または別個の表現型亜細胞群を単離することができるが、しかしながら、ＴＣＲに対する試薬の結合は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏエキスパンションの効率を阻害する。この試験の問題は、本発明の試薬、たとえば、ＭＨＣ−Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ／Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ試薬を用いての可逆的Ｔ細胞染色によって解決される。
【００４３】
養子免疫伝達試験のための抗原−特異的Ｔ細胞群の精製
免疫学的研究におけるｉｎ  ｖｉｖｏ試験の多くは、精製されたＴ細胞のレシピエント動物への養子免疫伝達を必要とする。移植されたＴ細胞群の純度および移植工程中に細胞中の考えられうる変化の双方について、これらの試験系において試験された。細胞群の最も高い純度は、ポジティブセレクトによって達成されるが、しかしながら、同定のために使用されたマーカー（通常は抗体）は、単離された細胞表面から除去することが困難であり、かつ、引き続いてのｉｎ  ｖｉｖｏ試験の結果の妨げとなる。本発明の試薬を用いての可逆的Ｔ細胞染色、たとえば、ＭＨＣ−ストレプタグＩＩ（Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ）／ストレプタクチン（Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ）試薬は、ポジティブセレクトと、その後の選択マーカーの除去との組合せを可能にし、養子免疫伝達試験を著しく改善するものである。
【００４４】
ＴＣＲ−ＭＨＣアフィニティー測定
エピトープ特異的Ｔ細胞群の多様性は、ＴＣＲ−ＭＨＣ／ペプチド結合アフィニティーの程度によって反映される。Ｔ細胞のＴＣＲ−ＭＨＣ／ペプチド結合アフィニティーの測定は極めて困難である一方で、いくつかの最近の試験では、ＭＨＣ／ペプチド解離速度は、かなりの結合アフィニティーとの相関があることが示されている（１２，１３）。本発明の試薬、たとえばＭＨＣ−Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ／Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ試薬を用いて、ＭＨＣ／ペプチド複合体は、エピトープ特異的Ｔ細胞の細胞表面上で堆積させることができ、かつ、ＭＨＣ解離速度は、ビオチンの添加による急速な単量化の後に、測定することができる。これは、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ骨格の除去は、ＭＨＣ解離速度よりも著しく速いことから可能である。
【００４５】
臨床的適用：
高い効率を有するｉｎ  ｖｉｔｒｏエキスパンションのための抗原−特異的Ｔ細胞群の精製
ヒトＴ細胞系またはクローンの生成（たとえば、病原体／腫瘍−特異的または自己反応性（autoreactive）Ｔ細胞）は、臨床研究、診断および免疫療法の多くの領域において必要である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養は、しばしば、抗原−特異的刺激のための標準的な条件における困難性によって制限される。抗原−特異的Ｔ細胞群の精製のための改善されたストラテジーは、ｉｎｖｉｔｒｏエキスパンションの効率を著しく増加させ、抗原−非依存的刺激、たとえばマイトージェンおよび抗−ＣＤ３の使用を可能にする。本発明による、たとえば、ＭＨＣ−Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ／Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ試薬を用いて、抗原−特異的Ｔ細胞は、ｅｘ  ｖｉｖｏで直接的に単離されてもよく、かつ、試薬の解離後にｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてエキスパンションすることができる。この試みは、通常のＭＨＣ多量体試薬を用いての精製よりもさらに効率がよいと期待され、たとえば、試薬の結合は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｔ細胞エキスパンションの効率をネガティブに干渉する。
【００４６】
他の機能的アッセイまたは療法のためのｉｎ  ｖｉｔｒｏエキスパンション細胞系またはクローンからの、抗原−特異的Ｔ細胞群の精製。
【００４７】
Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏエキスパンションにおいて、培養への抗原含有細胞またはフィーダー細胞の添加が必要とされる。他の機能的アッセイおよび特に治療的適用（たとえば、養子免疫伝達）に関して、コンタミネーションしたこれらの細胞を除去することは有用である。ポジティブセレクトのために（この場合、これらは、通常は、最も高い程度の純度を生じる）、選択マーカーは、Ｔ細胞表面から除去可能でなければならず、それというのも、機能的アッセイまたは養子免疫伝達の妨げとなるためである。Ｔ細胞がｉｎ  ｖｉｖｏ適用において使用される場合には、選択マーカーは、臨床的複雑性、たとえばアレルギー反応を引き起こす物質を含有する場合にはさらに除去しなければならない。たとえば、ＭＨＣ−Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ／Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ試薬を用いての可逆的Ｔ細胞染色は、これらすべての基準を十分に満たす。
【００４８】
“直接的養子免疫伝達法”のための抗原−特異的Ｔ細胞群のｅｘ  ｖｉｖｏ精製  細胞のレシピエントへの直接的導入によって、ｅｘ  ｖｉｖｏで直接的におこなわれた抗原−特異的Ｔ細胞群の単離（他の任意のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖を含まない）は、特に臨床的に重要である。直接的に単離された細胞群は、ｉｎ  ｖｉｖｏ適用のための培養細胞よりもより効率的であることが期待された。特にｉｎ  ｖｉｔｒｏエキスパンションされたＴ細胞の極めて多くの数は、効果的な養子免疫伝達のために必要とされ、この現象は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養条件へのＴ細胞の養子免疫伝達の際に最もおこりうる。この方法に関する重要な臨床適用のための例は、（別の方法で）Ｔ細胞−不含幹細胞移植中において、ＥＢＶ−および／またはＣＭＶ−特異的Ｔ細胞群の並行的な精製および養子免疫伝達であり、この場合、このプロトコールは、移植患者におけるＥＢＶおよびＣＭＶ−関連毒性の発生を減少させるとされる。たとえば、ＭＨＣ−Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ／Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ試薬を用いての可逆的Ｔ細胞染色および単離は、これらの臨床的適用のための理想的な方法であろう。
【００４９】
機能的Ｔ細胞診断
ＭＨＣ多量体技術は、直接的にｅｘ  ｖｉｖｏにおいて、抗原−特異的Ｔ細胞の定量化および表現型の特徴付けを可能にする。しかしながら、多量体試薬のＴＣＲへの結合は、機能的アッセイ中での精製された細胞の使用を複雑化させるものである（たとえば、慢性ウイルス感染症［ＨＩＶ、ＣＭＶ、ＥＢＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ］、腫瘍−特異的Ｔ細胞群）。たとえば、ＭＨＣ−Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ／Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ試薬を用いての可逆的Ｔ細胞および単離は、多くの臨床的状態における抗原−特異的Ｔ細胞の力強い評価を達成するものである。
【００５０】
本発明を、さらに、以下の図および実施例にしたがって説明する。
【００５１】
実施例
１．材料および方法
Ｈ２−Ｋｄ  Ｓｔｅｒｐ−ｔａｇＩＩ融合タンパク質の生成
ｐＥＴ３ａ／Ｈ２−Ｋｄ発現ベクター（５）は、標準的なＰＣＲ技術によって変化させ、Ｃ−末端ビオチン化部位をＳｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ配列と交換する。タンパク質発現は、ＩＰＴＧの添加によって、発現ホストＢＬ２１（ＤＥ３）中で誘発され、引き続いて、前記に示したように（５）封入体を精製する。
【００５２】
多量体ＭＨＣ  Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ試薬のｉｎ  ｖｉｔｒｏリフォールディングおよび生成
Ｈ２−Ｋｄ  Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｇおよびマウスβ２−ミクログロブリン（Ｃ−末端でのＨＳＶエピトープｔａｇを含有する）封入体を、８Ｍ尿素中で溶解し、かつ、その後に従来記載されているように（５）高い量の合成ＭＨＣ結合ペプチド（ここでは：それぞれ０．５ｍｇ／ｍｌのＬＬＯ９１−９９、ＧＹＫＤＧＮＥＹＩまたはｐ６０２１７−２２５、ＫＹＧＶＳＶＱＤＩ）の存在下での、アルギニン冨化バッファー中への急速な希釈によってリフォールディングされる。可溶性ＭＨＣ複合体は、ゲル濾過（Superdex 200HR, Pharmacia）によってさらに精製され、アリコートを液体窒素中で保存した。多量化のために、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎポリマーは、可溶性Ｈ２−Ｋｄ  Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ／ＬＬＯ９１−９９複合体と一緒に、２：１または１：１のモル比でインキュベートした（Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ結合部位１当たり２ＭＨＣ分子または１ＭＨＣ分子）。
【００５３】
常用の多量体ＭＨＣ試薬の製造
常用の四量体を、ＰＥ−またはＡｌｅｘａ５４６−結合ストレプトアビジン（Molecular Probes）を用いて製造した。ＭＨＣ多量体試薬は、０．０２％ＮａＡｚｉｄｅ、０．１ｍＭＥＤＴＡ、１μｇ／ｍｌ  ペプスタシンおよび１μｇ／ｍｌロイペプチン（５）を含有する、ｐＨ８．０のＰＢＳ中で２ｍｇ／ｍｌ中で保存した。
【００５４】
Ｔ細胞系の製造および染色、機能的アッセイ
ＬＬＯ９１−９９特異的Ｔ細胞系について、従来示されているように（１８）ｉｎｖｉｔｒｏエキスパンションをおこなった。ＭＨＣ−多量体染色を、１ｘ１０６細胞当たり、約２μｇのＨ２−Ｋｄ  Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ多量体試薬で、４℃で３０分に亘ってインキュベートすることによっておこなった。エピトープ−ｔａｇ染色のために、細胞を洗浄し、１％パラホルムアルデヒド中で簡単に固定し、引き続いて、未結合の第１マウスｍＡｂまたはラットｍＡｂ（たとえば、ＴＢ０６７、Ｎｏｖａｇｅｎ）および第２抗−マウスまたは抗−ラット−ＰＥ抗体（たとえば、Ａ８５−１、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）を用いて、抗−ＨＳＶｔａｇに対して染色した。フローサイトメトリーを、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Becton Dickinson）およびＦｌｏｗＪｏ  ソフトウエアを用いておこなった。解離試験に関して、染色された細胞を数回に亘って（通常１０回）、１ｍＭビオチンバッファー（ＰＢＳ、５％ＦＣＳ）中で、通常４℃で洗浄した。通常の５１Ｃｒ−放出および３Ｈ−チミジンの組込みアッセイを、従来示されているようにしておこなった（１８）。
【００５５】
養子免疫伝達試験
ＬＬＯ９１−９９特異的Ｔ細胞を、Ｈ２−Ｋｄ  Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ多量体試薬で、４℃（３０分）で染色し、引き続いて、ビオチン不含の媒体中で大規模に洗浄した。ビオチンの添加による解離を、前記に示したようにおこなった（コントロール群細胞を、ビオチン不含下で同様に処理した）。養子細胞導入を、１群当たり１マウス当たり１ｘ１０７細胞を、ナイーブ（vaive）ＢＡＬＢ／ｃマウスの尾の静脈中に挿入することによっておこなった。５ｘＬＤ５０Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎ系  ４３２５１（２ｘ４０４細胞）の静脈注入の４８時間後に、器官（脾臓および肝臓）当たりの細菌数を、組織ホモジネートの連続的な希釈のプレーティングによって測定した。
【００５６】
２．結果
ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＭＨＣ多量体染色とＴ細胞機能との干渉
細胞群の表現型の変更は、これまで低い温度（４℃）での以下のエピトープ−特異的Ｔ細胞が報告されている。これらの条件下で、ＴＣＲ−ＭＨＣ介在型シグナル化は達成されなかった。高い温度でのＭＨＣ多量体染色（たとえば、室温（ＲＴ）または３７℃）は、多量体のエピトープ特異的内在化によって蛍光シグナルの強度および／または安定性を改善するために実施されている。その表現型におけるＴ細胞の種々の処理の影響を分析するために、引き続いて染色されるＬＬＯ９１−９９−特異的Ｔ細胞系と、ＬＬＯ９１−９９／Ｈ２−Ｋｄ四量体とを、４℃または３７℃で比較した。ネガティブコントロールとして、異なるＬｉｓｔｅｒｉａｐ  エピトープ（ｐ６０２１７−２２７）を含有するＭＨＣ四量体を使用し；これらの試薬はＬＬＯ９１−９９−特異的Ｔ細胞のＴＣＲｓと結合することができず、このようにして潜在的なペプチド−非依存的作用をコントロールする。３７℃でのインキュベーションで、減少しより拡散した染色パターンを示すにもかかわらず、４℃で２時間に亘ってのインキュベーションの後に、すべてのＬＬＯ９１−９９−特異的Ｔ細胞は、高い強度の染色を示した（図３ａ、上部ヒストグラム）。これらの変化は、３７℃での染色の後に、表面ＴＣＲの相当のダウンレギュレーション（図３のａ、中間のヒストグラム）、およびａｎｎｅｘｉｎＶの増加した結合、アポトーシスの早期マーカー（図３のａ、下ヒストグラム）と相関を示した。免疫蛍光顕微鏡法（図３）は、４℃でのインキュベーションの後に、ＬＬＯ９１−９９／Ｈ２−Ｋｄ四量体の典型的な表面染色パターンを示し、その一方でもっとも多くの多量体は、３７℃で内在化する。表現型の変化は、非結合性ＭＨＣ多量体試薬を用いては検出されない。
【００５７】
ＭＨＣ多量体染色がさらにＴ細胞の機能を妨げるかどうかについて試験するために、我々は種々の処理がなされた細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬｓ）の細胞溶解能力について比較した。ＣＴＬｓは、特異的ＭＨＣ四量体またはコントロール試薬を用いて染色し、その後に、未結合のＭＨＣ分子を除去するためによく洗浄し、引き続いて、種々の濃度のＬＬＯ９１−９９ペプチドの存在下で、標的細胞比に対する一定のエフェクターで、３７℃でインキュベートした。ＭＨＣ四量体でのＣＴＬｓの標識化は、その細胞傷害プロフィールに著しい影響を及ぼす（図３のｃ）：（１）特異的溶解の最大％の減少（試験間で変化する減少の範囲、さらに図７のｂ参照）、（２）減少したペプチド感受性、および（３）ＬＬＯ９１−９９ペプチド不含下での増加した溶解性。溶解性の最大の減少および減少したペプチド感受性は、ＴＣＲ内在化および早期のアポトーシスによるものとみられる（図３のａ参照）。自然な溶解の増加は、少なくとも部分的に、“バイスタンダー作用”によって介在されるが、それというのも、さらにＭＨＣミスマッチ細胞系が影響するめであり（図３のｃ，棒グラフ）；細胞溶解性物質のＭＨＣ四量体によって誘発された放出は、隣接する標的細胞の生存性に作用する。さらに、エピトープ特異的Ｔ細胞のさらなるｉｎ  ｖｉｔｒｏエキスパンション上でのＭＨＣ多量体染色のネガティブな影響は著しい。ＬＬＯ９１−９９／Ｈ２−Ｋｄ四量体処理された細胞（図３のｄ）は、抗原またはマイトージェンによる刺激に対してあまり増殖せず、これは、アポトーシスを引き起こすＭＨＣ多量体によって誘発された過剰刺激を介してのＴ細胞の損失によるものと考えられる（図３のａ）。以上のことから、これらの発見は、ＭＨＣ多量体染色が、生理学的温度（３７℃）において、エピトープ特異的Ｔ細胞の本質的な表現型変化および機能的変化を誘発することを示している。
【００５８】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＭＨＣ多量体染色とT細胞機能との干渉
ＭＨＣ多量体染色がさらにｉｎ  ｖｉｖｏにおける機能に影響するかどうかを試験するために、種々の処理が施されたＴ細胞を、未成熟（naive）レシピエントマウスに養子免疫伝達し、引き続いて、リステリアモノサイトゲネスでの第１感染に対する保護を観察した。ネガティブコントロール群のＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、高い数の生菌が、感染４８時間後の脾臓において検出可能であった（図４のａ、灰色の棒グラフ）。非結合コントロールＭＨＣ四量体で処理された、１ｘ１０７ＬＬＯ９１−９９−特異的ＣＴＬｓの養子免疫伝達は、リステリア−特異的保護（黒色の棒グラフ）を生じた。しかしながら、結合ＬＬＯ９１−９９／Ｈ２−Ｋｄ四量体試薬での標的細胞の前処理は、結果として、保護能力の著しい損失を導く。保護の度合いは、標的細胞（図４ｂ）の数と相関し；結合ＭＨＣ四量体で予め処理された１ｘ１０７ＣＴＬｓは、著しいリステア−特異的保護を与えるが、その一方で１ｘ１０６細胞が導入されたマウスにおけるリストリア菌感染は、未処理マウスとは区別されない。１ｘ１０６コントロールＣＴＬｓの養子免疫伝達はなおも著しい保護を介在する。細胞導入の後に、コントロール細胞と比較して、より少ない数のＬＬＯ９１−９９特異的Ｔ細胞が、ＭＨＣ多量体染色細胞が与えられたレシピエントマウスから回収されうる（図４ｃ）；同様の結果は、導入されたＴ細胞とアロタイプ表面マーカー  ｔｈｙ１．１とのトラッキング（データは示されていない）で得られる。これらのデータは、ｉｎ  ｖｉｖｏ細胞導入上で、生存率および機能性の双方の点において、ＭＨＣ多量体染色の強い負の影響を示す。
【００５９】
可逆的ＭＨＣ多量体染色技術の改善
ＭＨＣ多量体は、“相対的結合アビディティー”を増加させるが、しかしながら、ＴＣＲ−ＭＨＣ／ペプチド相互作用のアフィニティーを増加させることはない。エピトープ−特異的Ｔ細胞は、ホルムアルデヒドと直接固定した場合に単量体ＭＨＣ／エピトープ分子とのいくつかの検出可能な相互作用を示すけれども（図５ａ、上部ヒストグラム）、簡単な洗浄の後に、すべての試薬によって誘導されたＭＨＣ分子は、細胞表面から消失する（図５ａ、下部ヒストグラム、４℃でおこなった）。これらの観察に基づいて、多量体のＭＨＣ単量体への標的化された分断は、結果として、表面結合ＴＣＲリガンドの急速な解離を引き起こすと仮定され、かつ、すべての方法が低い温度で実施される場合には、Ｔ細胞は、本来の機能的性質および表現型を保持することができるとされる（図２のモデル参照）。
【００６０】
近年、短いペプチド配列（ｓｔｒｅｐｔａｇＩＩ）が同定され、この場合、これは、突然変異されたストレプトアビジン分子、いわゆる“ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ”のビオチン結合部位に関する結合アフィニティー（ＫＤ約１０−６Ｍ）が示された。ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎと高いアフィニティー（ＫＤ＜１０−１３Ｍ）で結合する分子ビオチンは、効果的に、結合部位に対してＳｔｒｅｐｔａｇＩＩと競合する。ｓｔｒｅｐｔａｇＩＩ／ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎの相互作用に基づくＭＨＣ多量体が、Ｔ細胞染色のために製造される場合には、したがって、ｄ−ビオチンの相対的に低い濃度の存在下で、多量体を競合的に分断することが可能である（図２のモデル参照のこと）。
【００６１】
可溶性Ｈ２−Ｋｄ−ｓｔｒｅｐｔａｇＩＩ融合タンパク質を製造し；この場合、これは、組換えＭＨＣ分子を特異的に検出することが可能であり、エピトープ−ｔａｇ配列（ＨＳＶ／ｇｐＤ、Ｎｏｖａｇｅｎ）が、β２−ミクログロブリンのＣ−末端に対して融合される。これらの変化は、ｉｎ  ｖｉｖｏフォールディングされたＭＨＣ分子の安定性の結合特異性に影響することはなかった（データは示されていない）。多量化のためのＭＨＣ−ｓｔｒｅｐｔａｇＩＩ分子と“骨格”としてＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ−ポリマー（ＩＢＡ、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙにより提供されたもの）とのインキュベーションは、高い強度のＴ細胞染色を示し（図５ｂ）、この場合、これは、ｄ−ビオチンの存在下におけるインキュベーションの後に急速に減少する（１ｍＭ、すべて４℃）。不運にも、ＭＨＣｓｔｒｅｐｔａｇＩＩ／ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎポリマーでの染色は、さらに、ｄ−ビオチンの不含下での時間経過につれて減少し、その際、試薬の不安定性を示す（図５ｃ）。ＭＨＣ−ｓｔｒｅｐｔａｇＩＩ多量体の安定性を改善させるために、付加的なｓｔｒｅｐｔａｇＩＩを、β２−ミクログロブリンのＣ−末端と融合させた（ＨＳＶ−ｔａｇの後方、図６ａ）。このストラテジーは、本質的に試薬を改善し；ＬＬＯ９１−９９／Ｋｄ（２ｘ）ｓｔｒｅｐｔａｇＩＩ  ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ−ポリマー試薬によって染色されたＬＬＯ９１−９９−特異的Ｔ細胞は、時間に亘って安定している（図６ｂ）。ｄ−ビオチンの添加（１ｍＭ、すべて４℃）は、ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎポリマー骨格の急速かつ完全な解離を生じる（図６のｄおよび未発表の結果）。表面結合した試薬によって誘導されたＭＨＣ分子の量は、その後に急速に減少した（図６のｂ）。
【００６２】
可逆的ＭＨＣ多量体染色
Ｔ細胞機能上での可逆的ＭＨＣ多量体染色の効果を試験するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏエキスパンションされたＬＬＯ９１−９９−特異的Ｔ細胞系を、ＬＬＯ９１−９９／Ｋｄ（２ｘ）ｓｔｒｅｐｔａｇＩＩＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ−ポリマー試薬で染色し、かつｄ−ビオチン（１ｍＭ）を含有するかまたは含有しない冷バッファー（４℃）中で４時間に亘って洗浄した。コントロールとして、細胞を、結合（ＬＬＯ９１−９９／Ｈ２−Ｋｄ）または非結合（ｐ６０２１７−２２７／Ｈ２−Ｋｄ）の常用の四量体試薬を用いて予め処理した。ＭＨＣ−ｓｔｒｅｐｔａｇＩＩ多量体によって誘導されたＭＨＣ／ＬＬＯ９１−９９分子は、インキュベーションし、かつ、１ｍＭ  ｄ−ビオチンの存在下で洗浄した後に、細胞表面上で検出されることなく（図７のａ）；これらの条件下で、ＴＣＲダウンレギユレーションまたは増加したａｎｎｅｘｉｎＶ結合のような表現型の変更は観察されず；ｄ−ビオチンは、５０ｍＭの濃度まで試験され、かつ、傷害性またはＴ細胞機能の変化は観察されなかった（データは示されていない）。細胞傷害アッセイでの種々の処理が施されたＴ細胞の試験（図３ｃの参照）は、解離することなく、ＭＨＣ−ｓｔｒｅｐｔａｇＩＩ多量体染色細胞の高いバイスタンダー溶解を示し（図７のｂ、白抜きの四角）；試薬の解離の後に（白抜きの三角）、細胞傷害性Ｔ細胞の機能は、基本的にコントロール群とは区別されなかった（黒色の四角）。可逆的Ｔ細胞染色の正の効果は、さらに増殖アッセイにおいても証明された。ＭＨＣ多量体試薬が細胞表面上で保持される場合には（図７のｃ）、ＬＬＯ９１−９９−特異的Ｔ細胞は、抗原−特異的刺激またはマイトージェン刺激に対する乏しい反応性を示し；表面−結合されたＭＨＣ／ＬＬＯ９１−９９複合体の解離の後に、細胞の増殖反応性は、コントロール細胞と同様である。ＭＨＣｓｔｒｅｐｔａｇＩＩ多量体染色細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ機能の維持は、養子免疫伝達試験においてテストされた。ＬＬＯ９１−９９−特異的Ｔ細胞の常用の結合ＭＨＣ四量体試薬での前処理（図７のｄ、白抜きの棒グラフ）は、結果として、養子免疫伝達後のリステリア菌感染に対する保護を著しく減少させることが見出された。これとは対照的に、試薬によって誘導されたＭＨＣ複合体の完全な解離の後に、同数の細胞は、ポジティブコントロールと比較してほぼ同程度の保護が得られた。興味深いことに、養子免疫伝達前にＭＨＣ−ｓｔｒｅｐｔａｇＩＩ多量体の解離がない場合には、細胞は、常用のＭＨＣ四量体によって被覆された細胞よりもより効果的に再生される。血清中において、低いレベルのｄ−ビオチンがＭＨＣ−ｓｔｒｅｐｔａｇＩＩ多量体から骨格を分断することができることが見出されたことから（データは示されていない）、血清ｄ−ビオチンはさらに、ｉｎ  ｖｉｖｏ移入後に、ある程度の解離を生じさせることができると考えられる。
【００６３】
３．考察
我々のデータは、ＭＨＣ多量体が、生理学的温度下で染色されたＴ細胞の表現型および機能を著しく変更させることを示した。これは、我々のグループによる最近の発見によれば、ＭＨＣ多量体試薬によって介在される強いシグナルを示し、過刺激および細胞死を導く。この問題を克服するために、我々は、低い温度での表面染色によって抗原−特異的Ｔ細胞の特異的検出を可能にする可逆的染色工程を開発した。競合相手の添加によって、表面結合多量体の急速な解離、および引き続いてのＴ細胞表面からの単量体ＭＨＣ／ペプチド分子の解離が生じた。この新規技術を用いて、我々は、Ｔ細胞の機能的性質が、その同定および精製の後にも保持されうることを見出した。
【００６４】
いくつかのファクターについては、可逆的Ｔ細胞染色技術の改善において考慮されることが好ましい：（１）急速かつ完全な単量化は、低い温度（好ましくは４℃）で達成されるべきであり；（２）方法は、Ｔ細胞に対して非傷害性でなければならず；かつ、（３）使用された物質は、ｉｎ  ｖｉｖｏ適用（臨床）に対して無害でなければならない。ＭＨＣ−ｓｔｒｅｐｔａｇＩＩ多量体系は、これらすべての要求を満たすものである：（１）ｓｔｒｅｐｔａｇＩＩ／ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎと、ｄ−ビオチン／ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎとの間の極端なアフィニティーの差異から、完全かつ極めて急速な競合的結合が、低い温度であっても達成され；（２）低い濃度でのｄ−ビオチン（ビタミンＨ）は、Ｔ細胞に対して非傷害性であり；この場合、ｄ−ビオチンを５０ｍＭの濃度まで試験し、障害性またはＴ細胞機能の変化が見られなかった；（３）可逆的染色Ｔ細胞と一緒に移入されてもよいｄ−ビオチンの量は、通常のビタミン補給においてみられるｄ−ビオチン濃度よりもかなり低く、したがって無害である。
【００６５】
我々のデータは、可逆的染色工程が、Ｔ細胞群の表現型および機能的性質を保持することを示した。Ｔ細胞機能はさほど影響を受けない（図７参照）。表面結合ＭＨＣ／ペプチド複合体の解離後に、細胞上に試薬が残留することはない。従来の抗体に基づく染色および単離方法を用いた場合には、マーカーはポジティブに染色された細胞群上に残存し、その際、潜在的にＴ細胞機能に影響し、かつｉｎ  ｖｉｖｏ適用の成功に影響する；副作用（たとえばアレルギー反応）は、Ｆｃ−レセプターによって介在された機序または蛍光マーカー自体を介して誘発されうる。可逆的ＭＨＣ多量体染色は、これらの潜在的な複雑性を回避し、さらに、この技術のｉｎ  ｖｉｖｏ適用のためにさらに有利である。
【００６６】
我々は、特に、養子免疫伝達試験の結果における常用のＭＨＣ四量体染色の毒性を重要視し、この問題を、本発明による可逆的Ｔ細胞染色工程によって克服した。直接的なｅｘ  ｖｉｖｏ単離（たとえば、蛍光活性化（ＦＡＣＳ）または磁気活性化細胞分離）および定義された抗原−特異的Ｔ細胞群の養子免疫伝達は、極めて効果的な治療ストラテジーとして実証することができる。たとえば、（別の方法で）Ｔ細胞不含肝細胞移植中でのＥＢＶ−および／またはＣＭＶ−特異的Ｔ細胞群の養子免疫伝達は、移植患者においてもＥＢＶ−およびＣＭＶに関連する悪性腫瘍の発生率を減少させると考えられる。さらに、抗原−特異的Ｔ細胞の精製は、Ｔ細胞クローニングストラテジーの改善において重要な役割を示し、特に、精製された抗原−特異的細胞が、効果的な抗原−非依存型刺激細胞（マイトージェンまたは抗CD３）によってさらにエキスパンションされることが必要である場合には、特に重要である。我々は、ヒトＨＬＡ−ＳｔｒｅｐＴａｇＩＩ融合タンパク質および直接的に蛍光色素または磁気に結合されたＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎを製造する工程において、その潜在的臨床適用を試験した。さらに、可逆的多量体染色工程の基本原理は、他の低い結合アビディティーのレセプターリガンド相互作用に対して適用されてもよい。
【００６７】
【外１】
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【００６８】
【外２】
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【００６９】
【外３】
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【００７０】
【図面の簡単な説明】
【図１】  Ｔ細胞のＴＣＲに対する単量体および多量体ペプチド／ＭＨＣ複合体の結合を示す図。ＴＣＲに対するペプチド／ＭＨＣ複合体の結合によって、Ｔ細胞の機能的性質が、生理学的条件下において著しく変化する（従来技術）。
【図２】  本発明によるＴＣＲ分子に対するペプチド／ＭＨＣ多量体結合を示す図。ＴＣＲ分子に対するペプチド／ＭＨＣ多量体結合の標的化された分断によって、染色が取り除かれ、その結果として本質的に変化のない特性を有する精製されたT細胞群が得られる（本発明）。
【図３】  ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＭＨＣ多量体染色のＴ細胞機能に対する干渉を示す図。ａは、ＬＬＯ９１−９９特異的Ｔ細胞が、結合（ＬＬＯ９１−９９／Ｈ２−Ｋｄ）または非結合（ｐ６０２１７−２２５／Ｈ２−Ｋｄ）ストレプトアビジン−ＰＥ−四量体（“ｔｅｔ”）試薬で、４℃または３７℃で染色され、ＭＨＣ四量体染色（上）、ＴＣＲ発現（中央、ＴＣＲｈｉｇｈ細胞群後方の黒塗りグラフ）、およびアネキシンＶ結合（下）について、ヒストグラムで示したものである。ｂは、ＬＬＯ９１−９９／Ｈ２−Ｋｄストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ５４６四量体で、４℃または３７℃でインキュベーションした後の１時間に亘っての、ＬＬＯ９１−９９−特異的Ｔ細胞の免疫蛍光染色（赤色）を示したものである。ｃは、結合または非結合四量体試薬で、４℃で３０分に亘って染色されたＬＬＯ９１−９９−特異的Ｔ細胞を、その後に洗浄して未結合試薬を除去し、クロム放出アッセイに移した（エフェクターと標的との比は約５：１）ものである。ＬＬＯ９１−９９ペプチド濃度およびパーセント特異的溶解は、それぞれｘ軸およびｙ軸上に示した。棒グラフは、非結合ＭＨＣ四量体試薬（黒塗りのバー）または結合試薬（白抜きのバー）によって処理されたエフェクター細胞による、ＭＨＣミスマッチ標的細胞（１０−８Ｍ  ＬＬＯ９１−９９ペプチド条件およびペプチド不含条件のみ）の溶解度を示す。ｄは、ＬＬＯ９１−９９特異的Ｔ細胞を、ｃと同様に処理し、同系の放射線処理された脾細胞の存在下での増殖アッセイ中に移し、かつ、ペプチドまたは種々のマイトージェンの存在下で刺激したものである（ｘ軸）。
【図４】  ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＭＨＣ多量体染色とＴ細胞機能との干渉を示す図。ａおよびｂは、ＬＬＯ９１−９９特異的Ｔ細胞を、結合（ＬＬＯ９１−９９／Ｈ２−Ｋｄ）または非結合（ｐ６０２１７−２２５／Ｈ２−Ｋｄ）四量体（“ｔｅｔ”）試薬で、３０分に亘って染色し、未結合の試薬を取り除くためによく洗浄し、かつ、未成熟のレシピエントマウス中に導入した。６時間後に、マウスを、２ｘ１０４のリステリアモノサイトゲネスで感染させた。脾臓中で感染後４８時間で測定された生菌の数（ｙ軸）が、結合（ＬＬＯ９１−９９／Ｈ２−Ｋｄ、白抜き棒グラフ）または非結合（ｐ６０２１７−２２５／Ｈ２−Ｋｄ、黒抜き棒グラフ）四量体試薬で処理された、１ｘ１０７のＬＬＯ９１−９９特異的Ｔ細胞（ａ）または種々の数のＬＬＯ９１−９９特異的Ｔ細胞（ｂ）を養子免疫伝達した（１群当たり２マウス、標準偏差が示されている）ものについて示した。コントロール群のマウスはＮａＣｌのみのものである。ｃは、１ｘ１０７の種々の処理が施されたＴ細胞（ａと同様）の導入後のＬＬＯ９１−９９／Ｈ２−Ｋｄ四量体染色（ｙ軸）；ドットプロットは、ＣＤ８＋Ｔ細胞上につけられ（ｇａｔｅ）、その際、活性化Ｔ細胞上でダウンレギュレーションされた活性化マーカーである、ＣＤ６２Ｌで染色されておりｘ軸で示されている。
【図５】  可逆的ＭＨＣ多量体染色技術の発現を示す図。ａは、ＬＬＯ９１−９９−特異的Ｔ細胞を、単量体または四量体（“ｔｅｔ”）ＬＬＯ９１−９９／Ｈ２−Ｋｄ／β２ｍ−ＨＳＶ−ｔａｇまたはｐ６０２１７−２２５／Ｈ２−Ｋｄ／β２ｍ−ＨＳＶ−ｔａｇ試薬で、３０分に亘って染色した結果を示す。細胞を、洗浄することなく固定するか（上ヒストグラム）、あるいは２段階の洗浄工程後に、１％ホルムアルデヒドで固定し（下ヒストグラム）、引き続いて細胞表面（ｘ軸）上で保持されているＨＳＶ−エピトープｔａｇを染色した。ｂおよびｃは、ＬＬＯ９１−９９−特異的Ｔ細胞を、ＬＬＯ９１−９９／ＫｄｓｔｒｅｐｔａｇＩＩ／β２−ＨＳＶ−ｔａｇＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎポリマー（“ｐｏｌｙ”）で、４５分に亘って染色し、簡単に洗浄することによって、未結合の試薬を除去し、かつ、１ｍＭｄ−ビオチンの存在下（ｂ）または不含下（ｃ）でインキュベートし；すべての工程を４℃で実施した。細胞アリコートを、異なる時間間隔でハーベストし（前記ヒストグラムに示した）、１％パラホルムアルデヒドで固定し、かつ細胞表面上に残存するＨＳＶ−エピトープ−ｔａｇについて染色した（ｘ軸）。
【図６】  ＭＨＣｓｔｒｅｐｔａｇＩＩ／ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ多量体試薬の改善を示す図。ａは、副次的なｓｔｒｅｐｔｔａｇＩＩ配列とβ２−ミクログロブリンとの融合によるＭＨＣｓｔｒｅｐｔａｇＩＩ多量体試薬の安定化のためのモデルを示す図である。ｂは、ＬＬＯ９１−９９特異的Ｔ細胞を、ＬＬＯ９１−９９／ＫｄｓｔｒｅｐｔａｇＩＩ／β２−ｓｔｒｅｐｔａｇＩＩ−ＨＳＶ−ｔａｇ  ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎポリマー（“ポリ”）で、４５分に亘って染色し、簡単に洗浄することによって未結合の試薬を除去し、かつ、１ｍＭ  ビオチンの存在下（上ヒストグラム）または不含下（下ヒストグラム）でインキュベートした。すべての工程を４℃でおこない、細胞のアリコートを、異なる時間間隔の後にハーベストし（前記ヒストグラムに示した）、１％ホルムアルデヒドで固定し、かつ、細胞表面上の残存するＨＳＶ−エピトープｔａｇについて染色した結果を示す（ｘ−軸）。
【図７】  可逆的ＭＨＣ多量体染色およびＴ細胞機能を示す図。ＬＬＯ９１−９９特異的Ｔ細胞を、結合ＬＬＯ９１−９９／ＫｄｓｔｒｅｐｔａｇＩＩ／β２ｍ−ｓｔｒｅｐｔａｇＩＩ−ＨＳＶ−ｔａｇ  ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎまたは非結合（ｐ６０２１７−２２５／Ｈ２−Ｋｄ）多量体試薬で、３０分に亘って染色し、その後に、アッセイまたは養子免疫伝達の前に、ｄ−ビオチン（１ｍＭ、すべて４℃でおこなった）の存在下または不含下で４時間に亘って激しく洗浄した。ａは、組み換えＭＨＣ−分子の異なる処理が施されたＴ細胞上での染色を示す（エピトープ−ｔａｇ染色によって検出されたもの、ｘ軸）。
ｂは、ＬＬＯ９１−９９ペプチド被覆された標的細胞に対する（ペプチド滴定、ｘ軸）異なる処理が施されたＴ細胞の細胞傷害性（％特異的溶解、ｙ軸）を示し、その際、エフェクターの標的細胞に対する比は約５：１であり、図１のｃと比較する。ｃは、エピトープまたは種々のマイトージェンによって刺激された、異なる処理が施されたＴ細胞の、先天的に放射線照射された脾細胞中での増殖を示す図（ｙ軸）であり、図１ｄと比較する。ｄは、結合（ＬＬＯ９１−９９）または非結合（ｐ６０２１７−２２５）で処理された（左に示した）、４．１ｘ１０６ＬＬＯ９１−９９特異的Ｔ細胞の養子免疫伝達後の、リステリアモノサイトゲネス感染に対する保護を示す図である。マウスの２群は、結合ＭＨＣｓｔｒｅｐｔａｇＩＩ試薬（ストライプの棒グラフ）でインキュベートし、それぞれｄ−ビオチンの存在下で、洗浄された（上棒グラフ、大きいストライプ）かまたは洗浄されていない（下棒グラフ、小さいストライプ）ものであり、細胞に導入した。コントロールマウスは、結合された（白抜き棒グラフ）かまたは非結合の（黒塗り棒グラフ）常用のＭＨＣ四量体試薬（加えて、ｄ−ビオチン洗浄をおこなった）で処理された細胞を導入されたか、あるいは、ＮａＣｌのみが注入されたものである（灰色の棒グラフ）。生菌の数（ｙ軸）は、リステリア感染の４８時間後に測定した。データは、３個の独立した試験を示し、それぞれ１群当たり２個体のマウスであった。
【図８】  可逆的ＭＨＣ多量体染色がヒトＴ細胞に対して導入することができることを示す図。ＨＬＡ＊Ａ０２０１ｓｔｒｅｐｔａｇＩＩ融合タンパク質を製造し、かつ、組換えヒトβ２ミクログロブリン−ＨＳＶｔａｇ−ｓｔｒｅｐｔａｇＩＩおよびエピトープＭＡＲＴ１２７−３５の存在下でフォールドし、可溶性ＭＨＣ分子を得た。これらは、引き続いて、ストレプトタクチン−ポリマーで多量化し、かつ、ＭＡＲＴ２７−３５特異的Ｔ細胞クローン（Burkhard Schmidt, Instotute of Hematology, Klinikum rechts der Isar, Munichよって提供された）の染色のために使用された。ＭＡＲＴ１２７−３５−特異的Ｔ細胞を、４℃で３０分に亘って、ＨＬＡ＊Ａ０２０１ｓｔｒｅｐｔａｇＩＩ−Ｓｔｒｅｐｔａｃｔｉｎ多量体試薬で染色し；洗浄の後に、染色された細胞のアリコートを、１ｍＭ  ｄ−ビオチンの存在下で異なる時間に亘って培養し、その際、すべてを４℃で行った。ＨＳＶ−エピトープに対する第２染色を、前記に示したようにおこなった（図３の説明文参照のこと）；その後に細胞を１％パラホルムアルデヒド中で固定し、かつフローサイトメトリーによって分析した。ヒストグラムは、ＨＳＶエピトープｔａｇ染色に関する蛍光強度を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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