(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試薬により発光処理を施した生菌から発生する光を撮像装置により測定し、得られた輝度データを所定時間画素毎に蓄積し、蓄積した輝度データが、所定の閾値以上の輝度値を持つ輝点の数を計数して生菌又はそのコロニーの存在数を測定する生菌数測定方法において、
予め設定した測定時間内において前記蓄積した輝度データ中に予め定められた輝度値を超え、かつ該輝点の分布と該輝点に隣接する輝点分布の重なり合いの有無を確認するステップと、隣接する輝点分布の重なり合いの有無を確認する前記ステップにおいて、隣接する輝点同士の重なり合いの存在を確認した時に前記撮像装置による測定を終了し、隣接する輝点同士の重なり合いの存在を確認した輝度データの直前に得られたデータに基づき輝点の数を計数することを特徴とする生菌数測定方法。
【請求項２】
生菌から発生する光を検出し測定する撮像装置と、
該撮像装置から得た輝度データを画素毎に蓄積して輝点の画像情報を得るイメージプロセッサと、
前記イメージプロセッサに蓄積されている画像情報を取込み解析して所定の閾値以上の輝度値を有する輝点の数を計数するデータ解析装置と、
前記撮像装置と、前記イメージプロセッサと、前記データ解析装置を制御する制御装置とを備え、
前記撮像手段による光の測定時間を制御する測定時間設定手段と、
該測定時間設定手段からの指示により前記イメージプロセッサの画像情報蓄積及び前記データ解析装置への読み出し制御する指示手段と、前記データ解析装置に読み込まれた画像情報中に予め定められた輝度値以上の画素の有無を測定する輝度測定手段と、前記輝度測定手段により確認された所定値以上の輝度値を有する画素の占有部分を測定する面積測定手段と、隣接する輝点の占有部分の重複部分の有無を検知する画素群検知手段とを有し、前記画素群検知手段が隣接する輝点の占有部分の重複部分の存在を検知したとき、画素情報の撮像、蓄積動作を終了し、前記データ解析装置に輝点計数動作指示を送出することを特徴とする生菌測定装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＡＴＰ−ルシフェラーゼ法を利用した生菌測定方法に係り、特に微生物の存在を現す発光現象の映像から電気的に正確に菌数又は菌のコロニー数をカウントできるようにした生菌数測定方法及び生菌測定装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
微生物（生菌）の存在を確認する方法として、ＡＴＰ−ルシフェラーゼ法がある。このＡＴＰ−ルシフェラーゼ法は、生きた細胞に特異的にまとまって存在するアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を利用してルシフェリン−ルシフェラーゼ反応（Ｒ−Ｒ）反応を行わせしめ、ＡＴＰ含量に比例して発生する微妙な発光を高感度検出器で検出することにより、微生物の存在を確認する方法であり、微生物の迅速検査法として注目されている。
【０００３】
この微生物の検査を行う方法として、例えば、特開平６−２３７７９３号に開示されているものがある。ここでは、先ず、検体液を濾過して生菌をフィルター上に補足し、このフィルターを微生物発光画面解析システムを用いて検出する。この微生物発光画面解析システムは、生菌を補足したフィルターを抽出試薬及び発光試薬で処理した後、標本ホルダーにセットし、光学系及び撮像手段（ＣＣＤ等）で構成されたテレビカメラを上記フィルターにできるだけ近接させてセッティングし、フィルターの発光状態を撮影し、画像処理装置、データ解析装置を介して画像データをディスプレイで表示、観察したり、解析結果をプリントアウトする。
【０００４】
図１は、その生菌数を測定するための生菌数測定装置の概要を示し、１はテーパーファイバー、光増幅部及び撮像管からなる高感度テレビカメラ、カメラコントローラ２、イメージプロセッサ３、データ解析装置４、テレビモニター５から構成されている。測定は、発光処理した生菌を保持したフィルター６を高感度テレビカメラ１に接近させておき、カメラコントローラ２及びイメージプロセッサ３を用いて２次元的の光子を所定時間、例えば、３０〜１８０秒間画素毎に蓄積し、菌体からの発光を撮像し、データ解析装置４により発光ノイズを消去して生菌による強い発光のみを残してテレビモニター５に表示する。この処理によって菌体由来以外の発光がノイズとして消去され、測定された輝点の数は生菌又はコロニーの数となる。
図２はフィルターのＡＴＰの発光状態を撮影した映像を示す。この映像は、培地上でＲ−Ｒ反応を起こさせ、微生物の存在する位置が周囲に対して明るく発光しており、これらの輝点の数が微生物の数となる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
以上のような生菌の存在と数を検出するための画像解析を使用した生菌数測定装置においては、検出装置が強い光を認識した場合、高いピークとなって現れ、モニター上ではピークの高さに応じた擬似カラーの点として表示される。輝点は、図２の上部のウインドウ（白い四角）内の輝点のように白い輝点となって表示される。また、図２の下方は輝点を３次元的に現したものである。３次元の画像において、海面のように波打っている部分が画像データのバックグラウンド（ＢＫＧ）となる青い点の集合を示し、広い輝点は中央の高いピークの束となって表示される。これらのピークは数値化されており、必要な座標のピーク強度がデータとして記憶される。画像データの低いレベルで揺らいでいるピーク強度を平均化し、この値を基準にしてある値（閾値）以上の高さと面積を持つピークを認識した場合に輝点１つとしてカウントする。画像に表示された点がＡＴＰによる輝点がＢＫＧに高さにより設定される。
【０００６】
ところで、上記生菌測定装置を使用して微生物を測定する場合、次のような問題が存在する。
【０００７】
すなわち、特定の微生物の測定時に、特定微生物よりも増殖の早い微生物が存在する場合には、増殖の早い微生物のATP−ルミネッセンス反応が早く進行し、輝点が広がり、近傍の輝点と重なりあって個々の輝点として判別不能となる、いわゆるオーバーレンジになってしまう可能性があった。図３（ａ）はビール酵母の発光計数画像を示し、ビール酵母の生菌数を正確にカウントできる状態を示している。一方、図３（ｂ）は、上述したオーバーレンジの状態を示す発光計数画像であり、同じビール酵母でも測定時間が適切でない(長すぎる)と、個々の輝点が広がり過ぎて輝点同士が重なり合い、個々の輝点として判別できなくなっている。
【０００８】
本発明は、生菌を画像解析装置を利用して測定する場合に設定時間が長すぎて上述のようなオーバーレンジ状態となることを防止することとのできる生菌測定方法及び生菌測定装置を得ることを目的としてなされたものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
オーバーレンジを判定するための条件について考察すると、検討すべき条件としては先にも触れたとおり（１）輝度値、（２）輝点の広がり（面積）である。
【００１０】
輝度値に関しては、少なくとも輝点として認識される輝度値を有する必要があり、そのためには、先に述べた「輝点」として識別ための目安、即ち測定開始時に設定する「閾値」（以下「判定閾値」という）以上の「輝度値」を有することが必要である。従って、「輝度値」の条件は、少なくとも測定前にあらかじめ設定する閾値以上を設定すればよい。なお、本発明のこれまでの経験によると、オーバーレンジした輝点の輝度値は、判定閾値の少なくとも１０倍高い値となることが解っており、オーバーレンジ判定輝度値を判定し閾値の１０倍程度に設定してもよい。
【００１１】
次に、１つの輝点の広がり（面積）の程度を確認し、オーバーレンジか否かを判定する。具体的な方法については、１例として、輝点画像上に点在する輝点の成長をモニターで観察し、近隣の輝点同士が重なり合った時点でオーバーレンジと判断し、測定を終了し、終了時点直前に得られて画像を輝点（もしくはコロニー）をカウントするための画像とする。この広がりの判定をデータ解析装置に行わせる場合には、得られた画像情報から輝点・輝度マップを作成し、先ず、上述した輝度値の判定を行い、次に輝点分布を認識しておき、輝度マップの重なりを検知する。」
以上の検討・確認から、請求項１の発明は、
試薬により発光処理を施した生菌から発生する光を撮像装置により測定し、得られた輝度データを所定時間画素毎に蓄積し、蓄積した輝度データが、所定の閾値以上の輝度値を持つ輝点の数を計数して生菌又はそのコロニーの存在数を測定する生菌数測定方法において、
予め設定した測定時間内において前記蓄積した輝度データ中に予め定められた輝度値を超え、かつ該輝点の分布と該輝点に隣接する輝点分布の重なり合いの有無を確認するステップと、前記蓄積した輝度データの中で上記条件を超えるに至ったデータが存在した時に前記撮像装置による測定を終了し、前記条件を超えた輝度データの直前に得られたデータに基づき輝点の数を計数することを特徴とする生菌数測定方法である。
【００１２】
また、請求項２の発明は、生菌から発生する光を検出し測定する撮像装置と、該撮像装置から得た輝度データを画素毎に蓄積して輝点の画像情報を得るイメージプロセッサと、
前記イメージプロセッサに蓄積されている画像情報を取込み解析して所定の閾値以上の輝度値を有する輝点の数を計数するデータ解析装置と、
前記撮像装置と、前記イメージプロセッサと、前記データ解析装置を制御する制御装置とを備え、
前記撮像手段による光の測定時間を制御する測定時間設定手段と、
該測定時間設定手段からの指示により前記イメージプロセッサの画像情報蓄積及び前記データ解析装置への読み出し制御する指示手段と、前記データ解析装置に読み込まれた画像情報中に予め定められた輝度値以上の画素の有無を測定する輝度測定手段と、前記輝度測定手段により確認された所定値以上の輝度値を有する画素の占有部分を測定する面積測定手段と、隣接する輝点の占有部分の重複部分の有無を検知する画素群検知手段とを有し、前記画素群検知手段からの検知情報に基づき、画素情報の撮像、蓄積動作を終了し、前記データ解析装置に輝点計数動作指示を送出することを特徴とする生菌測定装置である。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下には本発明の生菌測定方法及び測定装置をより詳細に説明するために実施例を図面を参照して説明する。
【００１４】
図４は、本発明の実施例に係る生菌測定装置１０の基本構成を示す。なお、生菌測定装置１０は、図１に示した生菌測定装置と基本構成は共通している。したがって、同一構成構成要素は同一符号を用いて説明する。
【００１５】
生菌測定装置１０は、高感度テレビカメラ１、カメラコントローラ２、イメージプロセッサ３、データ解析装置４、テレビモニター５からなる基本構成と、この基本構成を制御する制御装置７、輝点を計数するための条件を制御装置７に入力するための操作パネル８を備えている。
【００１６】
図５は制御装置７の構成を示し、入出力部７１、演算部（ＣＰＵ）７２、記憶部７３を備えている。入出力部７は、カメラコントローラ２、イメージプロセッサ３、データ解析装置４及び操作パネル８に接続され、それぞれ信号の授受を行う。演算部７２は、上記各構成要素からの信号入力に基づき信号処理を施すとともに、それぞれに対し制御信号を送出する。記憶部７３は、操作パネル８から入力される測定時間、オーバーレンジ値などの各種データや演算処理や制御プログラムを記憶している。
【００１７】
図６は操作パネル８の一例を示す。操作パネルは、ディスクリミネーターレベル設定部８０、菌種選択部８１、計数時間設定部８２、強度／ピクセル  設定部８３、オーバーレンジ輝度設定部８４、測定実時間表示部８５、デスティネーション記憶部８６、スタートボタン８７、継続ボタン８８、キャンセルボタン８９を備えている。これらのうち、主なものの機能について説明する。
【００１８】
ディスクリミネーターレベル設定部８０は、ＣＣＤカメラ１の絞りに相当するもので、ＣＣＤ固有のノイズレベルにより、発光情報がノイズに埋もれて検出できなくなることを防止するもので、ディスクリミネーターレベルを調整し、即ち、露出を調整することによりＣＣＤのノイズレベルに発光情報が埋もれないように調整するものである。ディスクリミネーターレベルの設定に際しては、操作パネル８からの入力により、制御部７よりカメラコントローラ２に制御信号が送出される。
【００１９】
選択部８１は、測定すべき対象である微生物を指定するものであり、ここでは、一例として、３種類の菌を設定することができるようにしてある。尚、菌名が指定されると、予め記憶された適正カウント時間、バックグラウンド弁別値が自動的に設定される。選択部は菌名表示部８１１、測定開始キー８１２、選択指定した菌（実施例では３種類の内いずれかのを測定するか指示するための選択ボタン８１３を備えている。
【００２０】
測定時間設定部８２は、各菌種毎に測定時間を設定する。設定範囲は１〜６００秒でスクロールバーで設定する。
【００２１】
輝度設定部(Intensity/pixel)８３は各菌種毎にバックグラウンドと輝点の弁別値（閾値）を設定する。
【００２２】
オーバーレンジ設定部(Over Range)８４は、オーバーレンジを判定するための条件の一つである輝度値(閾値)を設定する。先にも述べたとおり、オーバーレンジ判定の条件は、（１）輝度値、（２）輝点の広がり（輝点の占有面積）であり、「輝度値」に関しては、輝点を判定するために用いられる「判定閾値」を少なくとも輝度値におけるオーバーレンジ判定のための「閾値」として用いても良いことを示した。従って、本実施例では、オーバーレンジ判定のための輝度値として「判定閾値」そのものを設定するものとする。また、先に「判定閾値」の１０倍高い輝度値をオーバーレンジ判定のための閾値として用いても良いことを述べたが、判定閾値に換えてこの数値を設定してもよい。
測定実時間表示部(Real Measurement Time)８５は、選択された菌種の実際の測定に要する時間を表示すする。実際の測定には、設定された測定時間以外に５秒毎にデータ転送する時間が余分にかかり、自動的に計算されて表示される。
【００２３】
画像蓄積メモリ（Destination Memory）８６は、発光画像を蓄積するためのメモリを選択するもので、設置値は１又は２である。
【００２４】
制御装置７は、操作パネル８から入力された条件に基づき、各構成要素に制御信号を出す。
以下、制御装置７によって行われる生菌測定の動作を図６のフローチャートに従って説明する。
【００２５】
先ず、操作パネル８のスタートボタン８７が押されると、カメラコントローラ２及びイメージプロセッサ３に対し、測定開始指示信号が送出され、測定が開始され、ビデオカメラ１より取り込まれた画像情報をイメージプロセッサ３に蓄積される。５秒間の測定が実行されると（Ｓ２）、制御装置７より、測定中断信号がイメージプロセッサ３へ出力される（Ｓ４）。次に、イメージプロセッサ３に対し、蓄積された画像情報をデータ解析装置４に対し送出する指令信号を出力する（Ｓ６）。これにより、これまで蓄積された画像情報がデータ解析装置４に伝送される。制御装置７はデータの転送が終了したか否かを判断し（Ｓ８）、転送が終了していれば、カメラコントローラ２及びイメージプロセッサ３に対し、測定開始信号を再び送出する（Ｓ１０）。カメラコントローラ２及びイメージプロセッサ３において、再び測定が開始され（Ｓ１２）、同時に、制御装置７は、データ解析装置４に対し、蓄積されたデータに基づきオーバーレンジ演算を行わせる（Ｓ１４）。
【００２６】
［オーバーレンジ測定手順］
ここで、オーバーレンジの測定手順及びオーバーレンジ測定システムの１例について説明する。
【００２７】
図８は、オーバーレンジ測定手順を示す。データ解析装置４に取込まれた画像データより各画素の輝度値を演算しして輝度マップを作成する（Ｓ１４−１）
次に、当該輝度マップを２値化処理する（Ｓ１４−２）。これは輝度マップ中の所定輝度値以上の輝点を認識するための処理であり、所定輝度値以上の輝点とは基本的には菌体の発光による輝点を意味する。
【００２８】
オーバーレンジは試料中にＡＴＰルミネッセンス反応の早い菌が存在し、輝点の面積が急拡大して輝点同志が重なってしまう現象であり、輝度値は少なくとも生菌数測定装置によって確認できる。菌体の発光輝度と同等である２値化マップの作成を完了すると（Ｓ１４−３）、次に、輝点と判断された輝度値を有する発光部分の占有部分を認識する（Ｓ１４−４）。次に、近隣の輝点同志の重なり合いの有無を確認し、オーバーレンジの有無を判断する（Ｓ１４−５）。
【００２９】
［オーバーレンジ測定システム］
上記オーバーレンジ測定手順を実行する測定システムは、具体的には、データ解析装置４に含まれている。ここで、オーバーレンジ測定システムの概略構成を図９を参照して説明する。オーバーレンジ測定システム４１は、イメージプロセッサ３から供給される画像情報を記憶する画像情報記憶部４１１、画像情報の各画素の輝度値を演算し、輝度マップを作成する輝度マップ作成部４１２、輝度マップに示されている輝度値を２値化する２値化手段４１３、２値化輝度マップ中の輝点について近隣の輝点同志の重なり合いの有無を確認する高輝度画素群検知部４１４を有している。以上の構成により、制御部７のオーバーレンジ測定の指令に基づき、上記手順によるオーバーレンジの有無の測定を行う。
【００３０】
そして、制御装置７がその演算結果がオーバーレンジであると判断すると（Ｓ１６）、測定終了信号をカメラコントローラ２及びイメージプロセッサ３に送出する（Ｓ１８）。そして、測定が終了したときオーバーレンジ前の画像情報をデータ解析装置４に自動的に保存させる（Ｓ２０）。次いで、データ解析装置４に対し、輝点の計数指令を行う（Ｓ２２）。
【００３１】
一方、ステップ１６（Ｓ１６）において、オーバーレンジが確認されなければ、先に設定した測定時間を経過したか否が判断され（Ｓ２４）、経過していなければ、ステップ２に戻り、５秒間の測定を継続する。測定時間を経過していれば、測定を終了する（Ｓ１８）。
【００３２】
以上のように、本実施形態によれば、カメラ、イメージプロセッサを介して得られた画像情報について、予め設定したオーバーレンジ値と比較し、オーバーレンジの値を超えたときは、その時点で測定を終了し、オーバーレンジになる前の画像情報に基づいて輝点の計数を行うようにしているため、測定対象のサンプルの生菌の増殖が早い場合にあっても、常に正確な輝点数を測定することが可能となる。
【００３３】
図８は、本発明による生菌数測定装置を用いて行った輝点の撮影画像を示す。
図８（Ａ）、（Ｂ）、はオーバーレンジを設定しないで撮影したもの、図８（Ｃ）、（Ｄ）はオーバーレンジを設定して行った撮影画像を示す。図（Ａ）、（Ｂ）においては、輝点が増加し一面に広がり計数不能となっている。一方、図（Ｃ），（Ｄ）にあっては、明瞭に輝点が識別し得る状態で画像が得られており、計数処理も正確に行うことができる。
【００３４】
【発明の効果】
以上詳述したところから明らかなように、
本願発明によれば、試料中に増殖の早い微生物が存在している場合にあっても、適性な測定時間で測定を行い、正確な生菌の数の測定が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】微生物測定装置の基本構成を示す図である。
【図２】ＡＴＰの発光状態を示す図である。
【図３】ビール酵母の発光計数画像を示す図である。
【図４】本発明による生菌数測定装置の構成図である。
【図５】制御装置の構成図を示す。
【図６】操作パネルの詳細図を示す図である。
【図７】生菌数測定装置の動作フロー図である。
【図８】オーバーレンジ測定手順を示す図である。
【図９】オーバーレンジ測定システムの構成図である。
【図１０】輝点の撮影画像を示す図である。
【符号の説明】
１  テレビカメラ
２  カメラコントローラ
３  イメージプロセッサ
４  画像解析装置
４１  オーバーレンジ測定システム
５  テレビモニター
６  フィルター
７  制御装置
８  操作パネル
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
0004601209.tif 000009
【図９】
0004601209.tif 000010
【図１０】
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