(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロプレート中に定められたマイクロプレートウェルの目標層に光学的に焦点合わせするための方法であって、前記ウェルはウェルの下に透明な領域を有し、前記方法は
ａ）  焦点スポットを有するビームからの鏡面反射を用いて、マイクロプレートの下側の特定化した場所における光学参照点を光学的に感知するステップと、
ｂ）  ビームの焦点スポットを、前記参照点からウェル中の目標層への固定された距離だけ、マイクロプレートウェルの底部よりも少なくとも部分的に上に移動させるステップと、
ｃ）  異なるマイクロプレートウェルに対応して、複数の場所に対してステップａ−ｂを繰返すステップとを含む、方法。
【請求項２】
ステップａは
ｉ）  マイクロプレートウェルのウェル底面にビームを方向付けるステップと、
ii）  ビームを焦点合わせすることによってそのビームが下面の近くに焦点スポットを有し、そこから鏡面反射を起こすようにするステップと、
iii）  前記焦点スポットからの前記鏡面反射を回収するステップと、
iv）  前記回収した鏡面反射の強度を検出するステップと、
ｖ）  前記ウェルの長手軸に沿ってマイクロプレートウェルのウェル底面を移動させるステップと、
vi）  ステップｉ−ivを繰返すステップと、
vii）  鏡面反射の最大強度が検出されたウェル底面の場所を定めることによって前記ウェル底面の場所を定めるステップと、
viii）  前記ウェル底面を前記光学参照点として用いるステップとを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップａは
ｉ）  光のビームの焦点スポットを第１のマイクロプレートウェルの下側にあるウェル底面上に非直角に方向付けることによって、そのビームがウェル底面の近くに焦点スポットを有し、そこから鏡面反射を起こすようにするステップと、
ii）  位置検知型検出器を用いて、鏡面反射の位置検知型検出器上の感光範囲における光の強度レベルおよび光の位置を検出するステップと、
iii）  ステップａ−ｂを繰返しながらウェルの長手軸に沿ってウェル底面を移動させるステップと、
iv）  鏡面反射の最大強度が検出されたウェル底面の場所を定めることによってウェル底面の場所を定めるステップとを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
複数の目標層に焦点合わせするステップをさらに含み、複数の目標層の１つの各々は複数のマイクロプレートウェルの１つに含まれ、このステップは
ｖ）  光が最大強度測定値に達したときに感光範囲に沿って光の位置を定めるステップと、
vi）  マイクロプレートウェル内の第１の目標層にビームを再焦点合わせするステップとを含み、前記第１の目標層は前記ウェル底面に対して定められた関係にあり、さらに
vii）  光のビームの焦点スポットを第２のマイクロプレートウェルのウェル底面上に非直角に方向付けることによって、そのビームが下面の近くに焦点スポットを有し、そこから鏡面反射を起こすようにするステップと、
viii）  位置検知型検出器を用いて、第２のマイクロプレートウェルのウェル底面からの鏡面反射の位置検知型検出器上の感光範囲における別の光の強度レベルおよび光の位置を検出するステップと、
ix）  第２のマイクロプレートウェルから測定された感光範囲に沿った光の位置と、最大の光の強度が測定されたときに第１のマイクロプレートウェルから測定された感光範囲に沿った光の位置とを比較するステップと、
ｘ）  この比較から第２のマイクロプレートウェルのウェル底面の場所を定めるステップと、
xi）  この焦点スポットを、ウェル底面に対して定められた関係にある第２の目標層に再置するステップと、
xii）  複数のマイクロプレートウェルに対してステップvii−ｘを繰返すステップとを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ステップａは
ｉ）  マイクロプレート中に定められたマイクロプレートウェルのウェル底部の上面にビームを方向付けるステップと、
ii）  前記ビームを焦点合わせすることによってそのビームがウェル底部の上面の近くに焦点スポットを有し、そこから鏡面反射を起こすようにするステップと、
iii）  焦点スポットに対してウェルの長手軸に沿ってウェル底部の上面を移動させる際に鏡面反射光の強度を測定するステップと、
iv）  最大の鏡面反射が検出されたときにウェル底部の上面の位置の場所を定めることによってウェル底部の上面の場所を定めるステップと、
ｖ）  前記ウェル底部の上面を前記光学参照点として用いるステップとを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記マイクロプレートのウェル底部の下面の反射率を変えることによってウェル底部の下面が減少した反射率を有するようにする最初のステップをさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記マイクロプレートのウェル底部の上面の反射率を変えることによって前記ウェル底部の上面が増加した反射率を有するようにする最初のステップをさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
参照点を用いてビームを再焦点合わせすることにより、焦点スポットが部分的にマイクロプレートウェルの底部内にあり、かつマイクロプレートウェルの底面における材料の層を部分的に照らすようにすることによってさらに定められる、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
目標層は３０−１５０ミクロンの範囲の厚みを有する、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記ビームはレーザビームである、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記ビームは少なくとも６３３ｎｍの波長を有するレーザビームである、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
マイクロプレートウェルのウェル底面に対して定められた関係にある、マイクロプレートウェル内に含まれる薄い目標層を照明するための光学スキャナであって、前記スキャナは
公知の波長のビームを生成するレーザと、
鏡面反射するウェル底面の方向における焦点スポットにビームを焦点合わせするためにビームの経路に位置するレンズと、
前記鏡面反射光の経路に位置する光学検出光学部品とを含み、前記検出光学部品は前記反射光の強度を測定し、さらに
マイクロプレートの前記底面に対して前記ウェルの長手軸に沿って焦点スポットを移動させるための、マイクロプレートを保持するプラットホーム手段と、
前記強度プロファイルのピーク強度を検出することによって下面の場所を識別し、それによって薄い目標層の場所を定めるための手段とを含む、光学スキャナ。
【請求項１３】
光学検出光学部品は
鏡面反射光の経路に位置する位置検知型検出器を含み、前記位置検知型検出器は検出器の光活性領域上の光スポットの位置をモニタすると同時に光の強度をモニタし、さらに
光の強度によって位置データを分離することによって位置データを標準化するための回路を含む、請求項１２に記載の光学スキャナ。
【請求項１４】
位置検知型検出器の前の鏡面反射光の経路に位置する開口をさらに含む、請求項１３に記載の光学スキャナ。
【請求項１５】
鏡面反射の経路に位置する第２のレンズをさらに含み、前記レンズは鏡面反射光を焦点合わせする、請求項１３に記載の光学スキャナ。
【請求項１６】
前記光学検出光学部品は
鏡面反射ビームの経路に位置することによってその強度プロファイルを生じさせるための開口と、
前記開口の末端部に位置する光検出器とを含み、前記検出器は前記反射光の強度を測定する、請求項１２に記載の光学スキャナ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【関連出願のクロスリファレンス】
この発明は、１９９９年１月７日に出願された米国特許出願連続番号第０９／２２６，８４２号の部分的な継続である。
【０００２】
【技術分野】
この発明は一般的に、光学測定のための光を容量空間に焦点合わせする方法に関し、より特定的には、マイクロプレート内のウェルにおける測定とともに用いるためのオートフォーカスシステムに関する。
【０００３】
【背景技術】
多くの研究アッセイにおいては、蛍光を用いて興味の対象を同定し、または数える。血清学、細胞学、微生物学および組織病理学において、蛍光検出は多くの適用を有する。蛍光を用いることの主な利点は、蛍光は低いレベルで検出できるために高感度のテストが可能なことである。蛍光を用いることの第２の利点は、異なる蛍光組成物がさまざまな異なる励起および放射波長を有することである。このため、マーカとして異なる波長に関連付けられた各興味の対象に対するアッセイを行なうことによって、単一のサンプル中での複数の対象のアッセイの開発が可能である。付加的な利点は、蛍光は放射性同位元素の使用を必要としないため、試薬の使用が安全であり、かつより簡単に処理できることである。
【０００４】
蛍光に基づくアッセイの使用の適用の１つに、医薬品となる可能性のあるものを同定するための組成物のスクリーニングがある。薬剤発見のプロセスは、組合せの化学によって作られた多数の薬剤候補のスクリーニングのステップを含み、極度に多数のアッセイを必要とする。このプロセスを簡略化するために、しばしばアッセイ手順が自動化される。自動化によってスクリーニングのスループットが大きく増加し、新たな薬剤であり得るもののよりよい費用対効果による分離が可能となる。
【０００５】
スクリーニングプロセスを自動化する方法の１つは、サンプルをマイクロプレートウェルに導入するステップを含む。これらのウェルはしばしば、プラスチックのサンプルプレート上の矩形の配列中に列をなして配される小さな円筒形の容器である。一般的に用いられるマイクロプレートは、プレート当たり９６、３８４、またはそれ以上のウェルを有する。これらのプレートを自動的に取扱うことによって、マイクロプレートにおけるサンプルのスクリーニングのより高いスループットが可能となる。
【０００６】
現在、マイクロプレートおよび蛍光を用いるアッセイは、マイクロプレートウェルの２次元的な読取によって放射を検出する。たとえば米国特許第５，５８９，３５１号は、マイクロプレート中のウェルから送られる光を検出する蛍光分析システムを教示する。ウェルからの光が集められて反射器に伝達され、反射器は光を単一の検出器に方向付ける。このシステムはウェルの列の連続的な読取を可能にする。ウェルの読取は２次元的にもたらされ、各ウェルは放射光の単一の光源として読取られる。このため、ウェル内の局在化された事象における情報を集めるというアッセイの可能性がなくなる。米国特許第５，７８４，１５２号は、蛍光放射を検出する別のマイクロプレート読取機を教示する。この読取機には光学部材が含まれるため、特定の波長に対する調節可能な検出が可能となる。ここでも検出は２次元の態様でもたらされる。
【０００７】
マイクロプレートを用いるとき、マイクロプレートウェルの３次元の読取によってより多くの情報を集めることが可能となる。目標の蛍光はしばしばマイクロプレートウェルの底部に局在化する。マイクロプレートウェル中の液体はしばしば付加的な未結合の蛍光試薬を含む。標準的な２次元マイクロプレート蛍光アッセイにおいては、同じ液体中でマイクロプレートウェルの底部の蛍光を検出することはできない。ウェルの底部における蛍光放射は、ウェルの残りの深さにおける未結合の蛍光組成物から放射されるバックグラウンド蛍光によってマスクされる。簡略化した高スループットスクリーニングにおいて、未反応の蛍光試薬を取除くことなくウェルの底部層の検出が可能であることが理想的である。
【０００８】
マイクロプレートウェルの底部層からの蛍光を検出できるようにするためには、ウェル底部の薄い層に自動的に焦点合わせをして蛍光放射を励起できることが必要である。そのためには、マイクロプレートウェルの底部の３０から１５０ミクロンの深さに光源を焦点合わせできることが必要である。この焦点深度はウェルの底部に仮想毛細管、すなわち深さわずか３０から１５０ミクロンのウェル底部の領域を有する焦点層を作り出す。
【０００９】
マイクロプレートのジオメトリは、マイクロプレートウェルの底部に焦点合わせする試みを困難にする。プレートが光学許容度に対して均一であれば、標準的な焦点距離が可能である。しかし、マイクロプレートウェルの底面の場所は３０から１５０ミクロンの許容度に対して均一ではない。この問題を克服するためには、マイクロプレートウェルの底部の場所を正確に定め、この場所に焦点合わせする方法を考案する必要がある。高スループットシステムにおいて、この方法は迅速かつ正確でなければならない。
【００１０】
マイクロプレートの底部層を検出するための公知の方法の１つでは、蛍光検出を用いてマイクロプレートウェル内の目標層の上に光学的にオートフォーカスする。レーザ光の焦点スポットがウェル底部の上面よりも下にあるときには、最小限の蛍光が検出される。マイクロプレートを、マイクロプレートウェルのｚ軸に沿って動かすとき（ｚ軸とはマイクロプレートウェルの長手軸である）、その焦点スポットはいくつかの点においてウェル底部の上面と交差し始める。焦点スポットがウェルに入ると、焦点スポットからの光がウェル中の蛍光組成物のいくつかからの蛍光放射を励起し始める。焦点スポット全体がウェル底部の上面よりも上にあるとき、蛍光強度は最大に達する。図２は、焦点スポットがウェル中に移動するときの蛍光強度のグラフである。蛍光強度の最大平坦部の開始点は、焦点スポット全体がウェル底部の上面よりも上にきたときのプレートの場所である。これはマイクロプレートウェル内でビームを再焦点合わせするために用いられてきた。しかし実際には、この方法を行なうことは困難であることが明らかになった。蛍光グラフを用いてウェル内の焦点スポットの配置を定めるために必要とされる時間は、高スループット適用のために十分なほど迅速ではない。
【００１１】
したがってこの発明の目的は、マイクロプレートウェルの底部における薄い層に自動的に焦点合わせできる方法および装置を提供することである。この焦点合わせの手順は迅速、正確、かつ未結合の蛍光試薬を含む異なるアッセイにおける蛍光測定に適合可能であるべきである。この発明の付加的な目的は、この焦点合わせの方法を用いて、マイクロプレートウェル内の液体の体積を定め得るようにすることである。
【００１２】
【発明の概要】
前述の目的は、焦点合わせされた光のビームを用いて、マイクロプレートウェル底部の上面すなわちウェルの底部を定める面などの、マイクロプレート上の参照点を光学的に感知し、この参照場所を用いて、その参照場所に対する定められた関係に位置決めされるマイクロプレートウェル内の目標に光のビームを再焦点合わせする方法および装置を通じて達成される。目標層を走査することにより、特に蛍光を用いて目標物質を同定するときに、マイクロプレートウェル内の目標以外の場所からの光学干渉なしにマイクロプレートウェル内の薄い層のアッセイが可能となる。
【００１３】
第１の実施例において、この方法は、マイクロプレートの下側の光学的に検出可能な参照面において起こる材料界面に向けて光のビームを焦点合わせすることによって達成される。次いでこの参照面を光のビームの焦点スポットに対して動かす。この移動が起こるときに参照面からの鏡面反射が回収され、焦点開口を通じて光検出器に方向付けられて、そこで鏡面反射の強度が測定される。光のビームの焦点スポットが参照面上にあるときには最大量の光が焦点開口を通じて検出器に方向付けられ、ピーク強度が測定される。一旦参照面の場所がわかると、目標層が参照面に対して公知の関係にあるときには、この場所を用いて光のビームをマイクロプレートウェル中の目標層に再置できる。焦点スポットが目標層に再置されると、蛍光が励起され、目標層の走査を用いて検出される。
【００１４】
オートフォーカス法の代替的な実施例において、焦点開口および検出器は位置検知型検出器に取換えられる。ここでも光のビームの焦点スポットがマイクロプレートウェルの下側の参照面に方向付けられる。この参照面は光のビームの焦点スポットに対して動かされるが、検出器は静止して保たれる。この移動が起こるとき、その移動中に反射される焦点スポットをイメージングするために十分に大きい感受性領域を有する位置検知型検出器に参照標準からの鏡面反射が方向付けられる。この位置検知型検出器は、反射光の強度と、検出器上の反射光の位置との両方を測定する。第１の実施例と同様に、最大検出光強度の測定は、焦点スポットが参照面上にあることに相関する。その光が測定される鏡面反射の最大強度に達するとき、その光は位置検知型検出器上の位置においても検出される。焦点スポットが参照面を目標にするとき、位置検知型検出器上のこの位置がその場所である。一旦位置検知型検出器上のこの位置がわかると、それを決定性表示として用いて、マイクロプレート上の他の場所における参照面の位置を見つけることができる。第１の実施例と同様、一旦参照面の場所が定められると、それを用いてその後光学的に走査される目標層に焦点スポットが再位置決めされる。
【００１５】
【好ましい実施例の説明】
図１を参照すると、レーザ１０はレーザビーム１１を生成する。好ましい実施例においてはヘリウム−ネオンレーザが用いられる。このレーザは６３３ｎｍの波長において干渉光を生成できる。この波長の光を用いることによって、生物サンプル中の蛍光目標組成物の最適な検出が可能となる。なぜなら、典型的な生物サンプルの吸光はこの波長よりも下であるため、前記サンプルからの自己蛍光が最小化されるためである。レーザ光１１は第１のステアリング鏡１２によって方向付けられて第１のシャッタ２２を通る。次に光は第２のステアリング鏡１４によって方向付けられて第２のシャッタ２４を通る。シャッタ２２および２４はレーザの安全要求に従うために含まれる。レーザ光は第２のシャッタ２４を通過した後にレーザ線フィルタ２６を通る。レーザ線フィルタはプラズマ管光を抑制し、かつレーザ光を送るために含まれる。プラズマ光は回収される蛍光と干渉するため、これが必要である。レーザ光はレーザ線フィルタ２６を通過してビームスプリッタ２８に達する。ビームスプリッタ２８は光の一部をレーザ電力センサ１６に反射する。電力センサ１６はレーザの電力を継続的にモニタし、光電力出力が特定的な要求よりも下になったかどうかを検出できる。付加的には、光電力をモニタすることによって光出力を正常化できる。ビームスプリッタ２８によって偏光されなかったレーザ光は、ビームスプリッタを通り、正のコントラクタレンズ３０および負のコントラクタレンズ３２を通って送られる。これらのレンズは、レーザ光ビームの大きさを成形して目標のマイクロプレートウェル上に要求される焦点スポットの大きさを生成するために用いられる。次いで、レーザ光はレーザ２色性スプリッタ３４によって方向付けられ、振動する亜鉛めっき鉄板鏡３６に達する。振動する亜鉛めっき鉄板鏡３６の動きにより、レーザ光は１つの軸に沿って移動する。この光は振動する亜鉛めっき鉄板鏡３６によって方向付けられて亜鉛めっき鉄板リレーレンズ３８を通り、リレー折り畳み鏡５６によって方向付けられて光を焦点合わせする対物リレーレンズ５４を通る。亜鉛めっき鉄板レンズ３８および対物リレーレンズ５４の目的は、亜鉛めっき鉄板の中心を照らしたレーザを対物レンズの入射瞳上にイメージングすることである。好ましい実施例においては、リレー折り畳み鏡５６がレーザ光１１を方向付けることによって、光はその光が以前方向付けられていた面と直交するようになる。次に光は対物レンズ５１を通過し、目標のマイクロプレートウェル底部の下面５３に達する。
【００１６】
この光学システムは、ウェル底部の下面５３の２次元的な走査を可能にする。亜鉛めっき鉄板鏡３６は、焦点合わせされた光の１つの軸に沿った移動を可能にする。マイクロプレート５３を保持するためのステージ（図示せず）は、焦点合わせされた光の別の軸に沿った移動を可能にする。ステージの増分的な動きは、マイクロタイタプレートの下面のラスタ線走査をもたらす。マイクロプレートウェルに含まれる薄い目標層の面のラスタ線走査は、制限された深さの場を有する大きい表面領域にわたる蛍光の検出を可能にする。
【００１７】
光が一旦ウェル底部の下面５３を通ってマイクロプレートウェル５５に入ると、光の焦点スポットがどこに向けられているかに依存して、２つの光源から光を回収できる。
【００１８】
第１に、ウェル底部の下面５３における空気からガラス／プラスチックへの遷移など、材料の遷移があるいくつかの表面からの鏡面反射からレーザ光の一部を回収できる。この光は対物レンズ５１および対物リレーレンズ５４を通じて反射され、リレー折り畳み鏡５６によって方向付けられて亜鉛めっき鉄板リレーレンズ３８を通る。反射光は次いで亜鉛めっき鉄板鏡３６によって方向付けられてレーザ２色性スプリッタ３４に達する。この光は反射光であるため、これは元のレーザ光１１と同じ波長であり、レーザ２色性スプリッタ３４を通過せずに負のコントラクタレンズ３２および正のコントラクタレンズ３０を通るよう方向付けられてビームスプリッタ２８に達する。ビームスプリッタ２８は、この鏡面反射したレーザ光を焦点センサレンズ５８を通じて開口５０に向けて方向付ける。焦点合わせされたこの反射光は開口５０によって止められることなくセンサ５２によって検出される。これについては、図３ａ、３ｂ、３ｃおよび３ｄに関連してさらに説明する。
【００１９】
第２に、レーザ光はマイクロプレート５３のウェル５５の内部に焦点合わせされてもよい。ウェル内には蛍光組成物が含まれており、これはレーザ光１１の波長の光によって励起される。レーザ光がマイクロプレートウェル５５の内部の蛍光組成物に方向付けられるとき、公知の波長の蛍光が生成される。好ましい実施例において、この蛍光組成物はＣｙ５TMおよびＣｙ５．５TMであり、これらはイリノイ州アーリントンハイツのアマシャム・ライフサイエンス社（Amersham Life Sciences, Inc.）から入手可能な蛍光体であって、それぞれ６７０ｎｍおよび６９８ｎｍにおいて最大限に蛍光を放射する。この光が放射され、その一部は対物レンズ５１に入り、対物リレーレンズ５６を通過してリレー折り畳み鏡５６に達する。この蛍光放射光は亜鉛めっき鉄板リレーレンズ３８を通って亜鉛めっき鉄板鏡３６に達し、これは蛍光をレーザ２色性鏡３４に方向付ける。レーザ２色性スプリッタ３４は、レーザ光の波長の光を反射し、かつ蛍光放射の波長の光を通すように選択される。レーザ２色性スプリッタ３４を通過した蛍光は次いでロングパスフィルタ４０に入る。ロングパスフィルタは、レーザ２色性スプリッタ３４を通過したあらゆるレーザ光を抑制する。好ましい実施例において、ロングパスフィルタ４０は６４５ｎｍ以上の波長を通し、それより低い波長の光を抑制する。次いで蛍光は折り畳み鏡４２によって方向付けられて空間フィルタレンズ４４を通り、空間フィルタレンズは開口４６を通じて蛍光を焦点合わせする。この開口は、目的の収集体積の外側に由来する蛍光放射の光線を遮断する。開口４６を通過した蛍光は蛍光２色性フィルタ４８によって方向付けられ、これは光を２つのチャネルに分ける。６８０ｎｍ以下の光は蛍光２色性フィルタ４８によって反射され、蛍光を検出する光電子増倍管６２に達する。６８０ｎｍ遮断よりも上の光は蛍光２色性フィルタ４８を通過して、光電子増倍管６４によって検出される。
【００２０】
同種のアッセイは、マイクロプレートウェルの走査の場の深さを、マイクロプレートウェル内に含まれる薄い目標層に制限することを要求する。目標細胞または蛍光ビーズはしばしばマイクロプレートウェルの底部に位置する。これは、ウェルの底部に結合する何らかの組成物への目標体の結合、または重力による沈殿の結果である。溶液中に残った未反応の蛍光組成物は通常、マイクロプレートウェル内の特定の目標層からの蛍光の局在化した検出を妨げる。未反応の蛍光組成物からのバックグラウンド蛍光は、マイクロプレートウェル中の目標層からの蛍光を検出不可能にするおそれがある。マイクロプレートウェル中の目標層の場所を定め、この場所に光のビームを焦点合わせする必要がある。このことによって、目標でないウェルの領域からの照明および蛍光放射が防がれる。必要とされる焦点深度は、マイクロプレートウェルの底面から３０から１５０ミクロンの範囲である。マイクロプレートはこの許容度に対して光学的に平らであるように設計されていないため、目標層に対する公知の関係を有する参照点を自動的に感知する何らかの方法が必要である。
【００２１】
光学オートフォーカスの主要な実施例を図３ａ、３ｃおよび３ｄに示す。図３ａに、マイクロプレートウェル底部の下面１１４を検出するために用いられる図１のオートフォーカス部材を示す。マイクロプレートウェルは、マイクロプレートの頂部から下向きに延在する壁によって形成される。ウェルの底部は、透明なガラスまたはプラスチック材料の層によって形成される。ウェル底部の上面は、ウェルの開いた頂端部に面する。このウェル底部の下面は、マイクロプレートの開いた下側から下に面する。目標細胞１２０は、マイクロプレートウェル中の液体の底部に重力によって沈下した。ウェル底部を含むプラスチックまたはガラスの層は、目標細胞が沈下したウェル底部の上面１１６と、ウェル底部の下面１１４とを有する。レーザ光のビーム１１０はビームスプリッタ１２４を通るよう方向付けられ、レンズ１１２によって焦点スポットに焦点合わせされる。この焦点スポットはウェル底部の下面１１４に方向付けられる。ウェル底部の下面１１４に方向付けられた光の一部は鏡面反射によってレンズ１１２に向けて反射される。この光はビームスプリッタ１２４によって方向付けられ、焦点センサレンズ１２８を通って、焦点センサ開口１３２に向かう。焦点センサ開口は焦点合わせされていない光に対する止めとして作用する。この開口の大きさを変えることによって、焦点スポットの大きさを合わせることができる。焦点センサ開口１３２を通過した光は焦点センサ１３６によって検出される。この焦点センサはフォトダイオードであっても、または反射光の強度を測定するその他の装置であってもよい。ウェル底部の下面１１４の場所を定めるために、マイクロタイタプレートはマイクロプレートウェルの長手方向の軸に沿って動かされる。その結果、焦点スポットがこの軸に沿って動かされる。ビームの焦点スポットがウェル底部の下面１１４にないとき、ウェル底部の下面１１４からの鏡面反射はより広く散乱される。この散乱光は焦点センサ開口１３２によって止められるため、検出器１３６はあまり光を検出しない。反対に、焦点合わせされたビームのくびれ部分がウェル底部の下面１１４にあるとき、ウェル底部の下面１１４からの鏡面反射はあまり散乱されない。そのため、より多くの光が焦点センサ開口１３２を通過し、その光が検出器１３６によって検出される。図４は、ウェル底部の下面１１４を、焦点合わせされた光ビームのくびれ部分に対してｚ軸に沿って動かしたときに検出される光の強度をグラフにしたものである。ｚ軸上の位置５において、ビームの焦点スポットはプレートのウェル底部の下面よりも下にあり、焦点センサ開口を通って焦点合わせされる光はほとんどない。マイクロプレートがｚ軸に沿って動かされ、ビームの焦点スポットがウェル底部の下面に近づくにつれて、ウェル底部の下面からのより多くの鏡面反射が検出される。ｚ軸上の位置５．４付近において、鏡面反射が最大強度に達する。これは光のビームの焦点スポットがウェル底部の下面１１４に焦点合わせされたときに起こる。マイクロプレートをｚ軸に沿って動かすと、ビームの焦点スポットがウェル底部の内部に入るため、鏡面反射の強度は減少する。この方法を用いて、ビームの焦点スポットがウェル底部の下面１１４に焦点合わせされる、ｚ軸に沿った場所を定めることができる。次いでこの場所を参照点として用いて、光ビームの焦点スポットをマイクロプレートウェル中の目標層に再置する。ウェル底部の下面１１４とウェル底部の上面１１６との間の距離は、ウェル底部を含むプラスチックまたはガラス材料の厚みである。この厚みの寸法は、マイクロプレートの製造者より入手可能である。光ビームのくびれ部分をウェル底部の上面１１６のすぐ上に移動することによって、細胞の目標体１２０の場所を定めることができる。次いで、この光学システムによって目標層の走査をもたらすことができる。
【００２２】
図３ａに関して説明したオートフォーカス法においては、焦点合わせされた光ビームの長手軸が、マイクロプレートウェル底部の下面１１４に対して実質的に垂直であることが要求される。これは、亜鉛めっき鉄板リレー鏡３６を中心合わせし、この鏡を静止して保持することによってもたらされる。光はレンズ１１２によってウェル底部の下面１１４に対して垂直に焦点合わせされる。
【００２３】
図３ｂに示される代替的な実施例においては、検出器を取換えることによってオートフォーカスシステムの付加的な特徴を可能にする。この実施例において、レーザ光１１０はビームスプリッタ１２４を通って亜鉛めっき鉄板リレー鏡１４２に達する。この実施例において、亜鉛めっき鉄板リレー鏡１４２は中心合わせされずに、レーザビーム１１０がウェル底部の下面１１４に対して非垂直な角度に方向付けられるような固定された位置に動かされて、静止して保持される。したがってレーザ光１１０がレンズ１１２を通ってウェル底部の下面１１４に達するとき、レーザ光の長手軸はウェル底部の下面１１４に対して垂直ではなく、ウェル底部の下面１１４に対して非直角に方向付けられる。レーザ光１１０は鏡面反射によりウェル底部の下面１１４によって反射され、反射光１２６が生じる。この光はレンズ１１２を通り、亜鉛めっき鉄板リレー鏡１４２によって方向付けられてビームスプリッタ１２４に達する。反射光１２６は元のレーザ光１１０と同じ波長であるため、この光はビームスプリッタ１２４を通過する代わりに焦点センサレンズ１２８を通るように方向付けられて位置検知型検出器１４０に達する。
【００２４】
位置検知型検出器（ＰＳＤ）の一例は、検出器の光学感受性ストリップ上の光スポットの位置に直接比例してアナログ出力を生成するシリコンフォトダイオードである。これによって、検出器上の光の強度および光の位置の同時測定が可能となる。光がフォトダイオードに衝突すると、光電流が生じる。入射光によって生じたこの光電流は入力電流であり、２つの出力電流に分けられる。光学感受性ストリップ上の出力電流の分配は、検出器上の光の位置を示す。出力電流の和は光の強度を示す。
【００２５】
光の強度の測定は、図３ａに示されるのと同じ態様で用いられる。マイクロプレートの下側の表面の場所を定めるために、ウェル底部の下面１１４はビームの焦点スポットに対して動かされる。このことによって焦点スポットはウェル底部の下面１１４の下からウェル底部の下面１１４に動かされる。このとき、だんだん小さくなる光のスポットによってＰＳＤの感光部材の幅の中により多くの光が衝突するために、ＰＳＤによって検出される光の強度が増加する。光強度のピークにおいて、ビームのくびれ部分はウェル底部の下面１１４に焦点合わせされる。これを参照場所として用いて、ビームのくびれ部分をマイクロプレートウェル内の目標層に再置できる。焦点スポットがウェル底部の下面１１４の下からこの面に移動し、次いでウェル底部の中に移動すると、反射光の強度はここでも図４に示される曲線と類似の形のガウス曲線を形成する。曲線のピークにおいて反射光の強度は最大となり、これは焦点スポットがウェル底部の下面１１４にあることを示す。
【００２６】
ＰＳＤ１４０上の感光ストリップの幅は、ＰＳＤ１４０とともに用いられる光学構成を定める。ストリップの幅が非常に狭いとき、焦点センサレンズ１２８とＰＳＤ１４０との間に開口が置かれてもよい。この開口は焦点合わせされない光に対する止めとして機能し、焦点スポットがウェル底部の下面１１４に向けて、およびそこから移動されるときにガウス曲線を生成する。反対にＰＳＤ上の感光ストリップの幅が広いとき、そのＰＳＤ１４０は焦点センサレンズ１２８なしで用いられてもよい。ウェル底部の下面１１４に焦点合わせされるときに鏡面反射が平行にされるため、光の強度が測定される。
【００２７】
ＰＳＤは光の強度に加えて、ＰＳＤの感光長さに沿った光の場所も測定する。光はウェル底部の下面１１４に対して非直角に向けられるため、光のビームのくびれ部分に対してウェル底部の下面１１４を動かすことによって、焦点合わせされたビームの中央が下面１１４に当たる場所が変化する。このことにより、ＰＳＤの感光長さに沿って反射光が衝突する場所が変化する。よって、ウェル底部の下面１１４が焦点スポットに対して動かされると、光はＰＳＤの長さに沿って動く。焦点スポットのウェル底部の下面１１４上の位置は、ＰＳＤの１つの場所に衝突する光に対応する。焦点スポットがウェル底部の下面１１４の下に移動するとき、光はＰＳＤに沿った一方の方向にこの場所から離れ、焦点スポットがウェル底部の下面１１４の上に移動するときには、光は他方の方向にこの場所から離れる。
【００２８】
マイクロプレートウェル内の目標層に焦点合わせするためにＰＳＤを用いることは、マイクロプレートがｚ軸に沿って動かされるときに、第１にＰＳＤ上の反射光の強度と反射光の位置との両方を測定することを要求する。そのピーク強度は、焦点スポットのウェル底部の下面上の場所に対応する。このことは１つのマイクロプレートウェルに対するｚ軸に沿った移動の範囲を要求する。一旦１つのマイクロプレートウェルに対してこれらの測定が行なわれると、ピーク光強度に対する測定に対応する、ＰＳＤの長さに沿った場所がわかる。一旦この場所がわかると、それが参照測定値となって、マイクロプレート上のその他のウェルに対する決定性オートフォーカスが可能となる。プレート上のその他の各ウェルに対し、ｚ軸に沿った鏡面反射の単一の測定は、ＰＳＤの感光長さに沿った場所に対応する。このＰＳＤに沿った場所を、強度ピークであることが知られるＰＳＤに沿った位置と比較できる。これは、ビームのくびれ部分をウェル底部の下面に焦点合わせするために必要な、下面の移動方向および量の両方を示す。
【００２９】
関連する測定を行なうために、ＰＳＤとともに回路が用いられる。図８の光学位置感知検出回路を参照すると、光はシリコンフォトダイオード１６０に当たり、これは検出器の光学的に活性な領域上の光のスポットの位置に直接比例するアナログ出力を与える。出力信号は電極１６１および１６２において取得される。電極１６１からの出力は演算増幅器１７０に供給され、電極１６２からの出力は演算増幅器１７０と並列な経路にある演算増幅器１７２に供給される。この２つの演算増幅器は、クロスカップリングされた並列な対称経路に位置する。演算増幅器１７０は演算増幅器１９２の入力にクロスカップリングされ、この演算増幅器１９２も演算増幅器１７２からの入力を受取る。演算増幅器１９０は演算増幅器１７２にクロスカップリングされ、この演算増幅器１７２も演算増幅器１７０からの入力を受取る。この態様で信号は加えられたり減じられたりし、上側のチャネルにおいては演算増幅器１９０の適切な入力によって、演算増幅器１９０の出力は減法信号Ｘ１−Ｘ２であり、一方下側のチャネルにおいては演算増幅器１９２の出力は加法信号Ｘ１＋Ｘ２である。これら２つの組合された信号はアナログ除算器１９６に供給され、これは２つの信号の比をＸ１−Ｘ２／Ｘ１＋Ｘ２として取得する。演算増幅器１９２の出力Ｘ１＋Ｘ２は強度測定値を与える。アナログ除算器１９６の出力は光の強度に対して標準化された検出器上の入射光の位置を与える。
【００３０】
図３ｃに、マイクロプレートウェル中の目標層の場所を定めるための代替的な光学オートフォーカス法を例示する。この方法において、焦点スポットはウェル底部の上面１１６に方向付けられる。図３ａと同様に、この表面からの鏡面反射が回収されて焦点センサ開口１３２を通じて焦点合わせされ、焦点センサ１３６によって検出される。図３ａと同様に、焦点スポットはｚ軸に沿って動かされる。また図３ａと同様に、ビームの焦点スポットがウェル底部の上面１１６に位置するときに鏡面反射の最大強度が起こる。ここでもこの表面を、興味ある目標を含む層の場所に対する参照点として用いることができる。図５は、光のビームの焦点スポットに対してウェル底部を動かしたときにウェル底部の下面およびウェル底部の上面から検出される強度プロファイルを例示するものである。約２０．５における大きい方の強度ピークは、ウェル底部の下面からの鏡面反射である。約２１．４における小さい方の第２のピークは、ウェル底部の上面からの反射である。この第２のピークは第１のピークよりもかなり小さく、ウェル底部の上面からの鏡面反射がかなり少ないことを示す。これは反射指数がより低いことによるものである。
【００３１】
この低い反射指数は、１つの材料から別の材料への異なる遷移によるものである。鏡面反射によって生成される光の量は次の式によって定められる。
【００３２】
Ｉ＝（Ｎ−Ｎ′）2／（Ｎ＋Ｎ′）2
Ｎは、光が通過する第１の材料の反射指数である。
【００３３】
Ｎ′は、光が通過する第２の材料の反射指数である。
この式から、反射指数が離れた材料間の遷移に対する鏡面反射の方が大きくなることが示される。マイクロプレートウェル底部の下面は、反射指数１の空気から反射指数１．４７から１．５のプラスチックまたはガラスへの遷移である。これら２つの反射指数の相違が比較的大きいことから、図５に見られる２０．５における強度ピークのような鏡面反射が生じる。反対にマイクロプレートウェル底部の上面は、反射指数１．４７のプラスチックから反射指数１．３３のウェル内に含まれる液体への遷移である。この反射指数の相違が比較的小さいことから、図５に見られる２１．４におけるかなり小さい強度ピークが生じる。マイクロプレートによっては、用いられる材料の光学品質が、ウェル底部の上面からの鏡面反射による強度ピークを決定するには不十分なこともある。
【００３４】
反射指数を変えて鏡面反射による上面の検出を可能にするために、表面にコーティングを付加してもよい。たとえば、ウェル底部の下面をコーティングで被覆することによって反射を減少させてもよい。この反射防止コーティングは、真空蒸着によってウェル底部の下面に付加される。反射防止コーティングに用いられる組成物の例にはフッ化マグネシウムおよび三フッ化ランタンが含まれる。代替的には、ウェルの上面をコーティングによって被覆することにより反射を増加させてもよい。反射を増加させるための組成物は金属中性コーティングを含み、これは所望の量の反射を与えるために所望の厚みでウェル底部の上面に真空蒸着されてもよい。
【００３５】
マイクロプレートウェル中の目標層に光学的に焦点合わせするための別の方法は、マイクロプレートウェル中の薄い層の場所に対する参照点として機能する、マイクロプレートの下側に加えられる光学的に検出可能な特徴を用いる。図６に、これらの特徴を有するマイクロプレート１５０の底部の一部を示す。光学的に検出可能なウェル１５４は光学的に検出可能な特徴を有することにより、ウェル底部の上面の正確な位置測定を可能にする。一旦この表面が検出されると、光学的特徴を有さないウェル１５２の上面を検出するための参照点としてこれが用いられる。
【００３６】
図７に、光学的に検出可能なレジストレーション標識の例を示す。図７は、光学的に検出可能であるように物理的に変えられたウェル底部の上面を示す。影を付けた部分は、表面からの反射を減少させるために粗くした表面の領域を示す。影を付けていない領域は、粗くしていない、かなり高い量の鏡面反射を有する領域を示す。焦点スポットをこの光学的に変化させた底面上に焦点合わせし、その表面を横切って走査するとき、その焦点スポットがプレートの底部の粗い領域から底部の粗くない領域に移動する際にはっきりした遷移がある。スポットが焦点合わせされていないとき、その遷移はあまりはっきりしなくなる。
【００３７】
この光学的参照標識は、その場所がウェル底部の場所に対して定められた関係を有していれば、ウェル底部の下面に位置しても、ウェル底部の上面に位置しても、またはマイクロプレートの下側の別の場所に位置してもよい。光学的に検出可能な参照は、前述の罫書き標識であっても、また代替的にはバーコードの印であっても、または（前述の中性コーティングなどの）パターン化された反射コーティングであってもよい。
【００３８】
図３ｄに、液面１１８を検出するために用いられる図１のオートフォーカス部材を示す。一旦ウェルの底部の上面１１６の場所が定められると、光ビームの焦点スポットをウェルの頂部に向けてｚ軸に沿って動かしてもよい。焦点スポットが液面に近接するとき、鏡面反射された光を焦点センサ１３６によって検出できる。他の表面と同様に、焦点スポットを表面１１８に向けて動かすと反射される光の強度が増加し、焦点スポットが液面１１８に位置するときに最大点に達する。液面１１８およびマイクロプレートウェル底部の上面１１６の場所がわかると、ウェルのジオメトリが知られている場合にはウェル中の液体の体積を算出することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  この発明に従った、オートフォーカス能を有する蛍光分光計の光学部材を示す図である。
【図２】  先行技術の焦点合わせ法の結果を示すグラフ図である。
【図３ａ】  ウェル底部の下面を検出するために用いられる図１のオートフォーカス光学部材を示す図である。
【図３ｂ】  代替的な検出器を用いる図３ａの光学システムを示す図である。
【図３ｃ】  ウェル底部の上面を検出するために用いられる図１のオートフォーカス光学部材を示す図である。
【図３ｄ】  マイクロプレートウェル内の液体の表面を検出するために用いられる図１のオートフォーカス光学部材を示す図である。
【図４】  マイクロプレートウェルの下面を光ビームの焦点スポットに対してウェルの長手軸に沿って動かしたときの、光の鏡面反射のグラフを示す図である。
【図５】  マイクロプレートウェルの底部を光ビームの焦点スポットに対してウェルの長手軸に沿って動かしたときの、反射光の強度の第２のグラフを示す図である。
【図６】  光学的に検出可能なレジストレーション標識を有するマイクロプレートの部分を示す図である。
【図７】  図６のマイクロプレートにおいて用いられる、マイクロプレートウェル底部の光学的に検出可能なレジストレーション標識を示す図である。
【図８】  図３ｂの位置検知型検出器とともに用いられる回路を示す回路図である。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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