(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式：
0004468592.tif 000003
で表される３，３’−ジケトトレハロース。
【請求項２】
トレハロースをグルコース３脱水素酵素により酸化することを特徴とする、請求項１記載の３，３’−ジケトトレハロースの製造方法。
【請求項３】
請求項１記載の３，３’−ジケトトレハロースを含むトレハラーゼ阻害剤。
【請求項４】
請求項１記載の３，３’−ジケトトレハロースを含む蛋白質凍結乾燥安定剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、新規トレハロース誘導体、その製造方法、ならびに本発明のトレハロース誘導体を含むトレハラーゼ阻害剤および凍結乾燥安定剤に関する。
背景技術
トレハロース（α−Ｄ−グルコピラノシル  α−Ｄ−グルコピラノシド）は２分子のＤ−グルコースが１，１結合した形の非還元性二糖類である。３種の異性体が存在するが、天然にはα，α体のみが存在し多くの有機体に広く分布する。昆虫では血リンパ中に存在しており、主要血糖として存在するだけでなく、不凍剤として耐寒性を保持する作用を有する。
トレハラーゼはトレハロースに特異的な酵素であり、トレハロースを２分子のグルコースに加水分解する。トレハラーゼはバクテリア、酵母、菌類、昆虫、哺乳類を含む動物界と植物界に広く分布する。
哺乳類における小腸のトレハラーゼは、小腸の上皮細胞に局在し、摂取されたトレハロースの加水分解を行う機能をもつ。しかし血液中にはトレハロースが存在しないため、腎臓のトレハラーゼの生理学的機能はまだ解明されていない。
これまで、豚の腎臓由来トレハラーゼに関して、種々のトレハロース誘導体に対する親和性が報告されている（図１、２）。α，α−トレハロースはトレハラーゼの基質となるが、その異性体であるβ，β−トレハロース、α，β−トレハロースは親和性を全く持たない。また、α，Ｄ−マンノピラノシルα，Ｄ−マンノピラノシドとα，Ｄ−グルコピラノシルα，Ｄ−マンノピラノシドのように、基質の水酸基のわずかの変化のみでその親和性は大きく変化する。トレハラーゼの種々の特性については、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４０，６９２−６９８，１９９６：Ｂｉｏｃｈｉｍｉ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ１２４４，２９１−２９４，１９９５：Ｂｉｏｃｈｉｍｉ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ７９１，４５−４９，１９８４を参照されたい。
多くの昆虫ではトレハロースは血リンパに存在し主要血糖である。また、酵母、菌類では主要な貯蔵糖である。昆虫、酵母、菌類に存在するトレハラーゼは、グルコースをそれぞれの器官に供給する作用を有する調節酵素であると考えられる。したがって、トレハラーゼ阻害剤は殺菌剤または殺虫剤として有用であることが期待される。
これまでに報告されているトレハラーゼ阻害剤としては、例えば、Ｓ−ＧＩ（ｄｅｏｘｙｎｏｊｉｒｉｍｙｃｉｎ）、トレハロスタチン（ｔｒｅｈａｌｏｓｔａｔｉｎ）、バリダマイシンＡ（ｖａｌｉｄａｍｙｃｉｎ  Ａ）、バリドキシルアミンＡ（ｖａｌｉｄｏｘｙｌａｍｉｎｅ  Ａ）、ＭＤＬ２５６３７、カスタノスペルミン（ｃａｓｔａｎｏｓｐｅｒｍｉｎｅ）、トレハゾリン（ｔｒｅｈａｚｏｌｉｎ）、スーダトレスチン（ｓｕｉｄａｔｒｅｓｔｉｎ）が挙げられる（図３）。これらのうち、バリドキシルアミンＡ、トレハゾリン、スーダトレスチンは、阻害定数Ｋｉ値がそれぞれ２．４×１０−９Ｍ、１．９×１０−８Ｍ、５．０×１０−８Ｍであり、強いトレハラーゼ阻害剤であることが報告されている。また、トレハゾリンとスーダトレスチンは、トレハラーゼ以外の他のグルコシダーゼに対しては阻害を示さないため、トレハラーゼに特異的な阻害剤である。実際、バリダマイシンＡは既に植物病原菌Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉによるイネの葉鞘の害に対して殺菌剤として用いられている。また、バリドキシルアミンＡはタバコの害虫に対し、殺虫効果を持つと考えられている。
種々のトレハラーゼ阻害剤については、Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂ１２０，６３９−６４６，１９９８：Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，３１６（２），８２１−８２６，１９９５：Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５５（３），８９５−８９７，１９９１：Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  ４４（１０），１１６５−１１６８，１９９１：Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  ４０（４），５６３−５６５，１９８７：Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．６１Ｂ，１１１−１１４，１９７８を参照されたい。
トレハロースはまた、蛋白質を凍結乾燥する際、蛋白質を保護する能力を持つことが知られており、酵素、膜、ワクチン、動物や植物の細胞や器官など生体分子の低温保護剤として用いられている（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．，２：２９３−３１４，１９９６）。例えば、トレハロースを凍結乾燥保護剤として用いたとき、グルコース脱水素酵素の凍結乾燥時の安定性が大幅に高まることが見いだされている。しかし、トレハロースは血液中に存在するトレハラーゼにより加水分解されてグルコースを生じること、およびＧ３ＤＨの基質となるため、グルコースアッセイ用酵素および１，５−アンヒドロ−Ｄ−グルシトール分析用酵素の凍結乾燥安定剤として用いることはできなかった。
したがって、本発明は、トレハラーゼ阻害剤および蛋白質凍結乾燥安定剤として有用な新規トレハロース誘導体を提供することを目的とする。
発明の開示
本発明は、次式：
0004468592.tif 000002
で表される新規化合物、３，３’−ジケトトレハロースを提供する。本発明の化合物は、トレハラーゼによる分解作用を受けず、かつ高いトレハロース阻害活性を有することが見いだされた。さらに、本発明の化合物は、蛋白質の凍結乾燥安定化剤として有用であることが見いだされた。
発明を実施するための最良の形態
本発明の３，３’−ジケトトレハロースは、グルコース３−脱水素酵素を用いてトレハロースを酸化することにより容易に合成することができる。化学的に合成することも可能であるが、糖類は多数の水酸基を有しているため、特定部位を修飾するためには多段階の反応を必要とする。
グルコース３−脱水素酵素（ｇｌｕｃｏｓｅ  ３−ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ；Ｇ３ＤＨ）は糖類のＣ−３位の水酸基を特異的に脱水素化し、３−ケト糖を生成する酵素である。Ｇ３ＤＨはこれまでに４種類（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．、Ｃｙｔｏｐｈａｇａ  ｍａｒｉｎｏｆｌａｖａ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｍ由来Ｇ３ＤＨ）が報告されている。
Ｇ３ＤＨは、例えば、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．２２：２６９−２７４，１９９８に記載の方法を用いて調製することができる。簡単には、Ｈａｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．α−１５株（Ｄｅｌｅｙａ  ｓｐ．α−１５株）を常法にしたがって培養し、回収した菌体を破壊して水溶性画分を得る。これを透析、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー等の方法により精製する。
本発明の３，３’−ジケトトレハロースは、Ｇ３ＤＨ酵素電極法を用いてトレハロースを酸化することにより製造することができる。酵素電極法の原理を図４に示す。電極用のセルを遮光し、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）にトレハロース、Ｇ３ＤＨ、および電子メディエーターを加える。電子メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェロセン、オスミウム誘導体、フェナジンメトサルフェート等を用いることができる。対極白金、作用極白金メッシュ、参照極Ａｇ／ＡｇＣｌを用いて３７０ｍＶｖｓＡｇ／ＡｇＣｌの定電位電解を行う。薄層クロマトグラフィーにより反応をモニターし、トレハロースのスポットの経時変化を観察する。反応終了後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等を用いて、反応生成物を精製することができる。
あるいは、例えばフェリシアン化カリウムを１００ｍＭ以上の濃度で用いることにより、電極を使わずに酵素反応を進行させることもできる。
本発明はまた、本発明の３，３’−ジケトトレハロースを含むトレハラーゼ阻害剤を特徴とする。本発明の３，３’−ジケトトレハロースは、阻害定数Ｋｉ＝２．４２×１０−６Ｍという、高いトレハラーゼ阻害活性を有することが見いだされた。したがって、本発明のトレハラーゼ阻害剤は、トレハロースおよびトレハラーゼの作用を解明する研究用試薬として、および殺菌剤または殺虫剤として有用である。
さらに本発明は、３，３’−ジケトトレハロースを含む蛋白質凍結乾燥安定化剤を特徴とする。特に、酵素を凍結乾燥する際に本発明のトレハロース誘導体を添加することにより、酵素解凍後に高い残存酵素活性を得ることができる。さらに、本発明のトレハロース誘導体は血中に存在するトレハラーゼにより分解されてグルコースを生成しないため、グルコースアッセイ用のＧＯＤ、ＧＤＨ等の酵素の凍結乾燥安定化剤として非常に有用である。
なお、本出願が有する優先権主張の基礎となる出願である日本特許出願平成１１−０７３５６８号の明細書に記載の全内容を、本明細書の一部としてここに引用する。
以下に実施例により本発明をより具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１
Ｇ３ＤＨの調製
Ｈａｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．α−１５株を、１リットルあたり１０ｇポリペプトン、１ｇ酵母抽出物、３０ｇＮａＣｌ、２ｇＫ２ＨＰＯ４、１０ｇα−メチル−Ｄ−グルコシドを含有する培地（ｐＨ７．０）中で、３０℃にて２４時間好気培養した。回収した菌体を２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中に懸濁して、フレンチプレスで菌体を破砕した。超遠心分離により上清を分離し（４００００ｒｐｍ、１．５ｈ）、氷冷しながら硫酸アンモニウムを２４３ｇ／ｌの割合で加えて塩析した。遠心分離により上清を分離し（１００００ｇ、２０分）、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で一晩透析して、粗精製Ｇ３ＤＨを得た。この粗精製Ｇ３ＤＨに対し、高速液体クロマトグラフィー（８０２０シリーズ：東ソー（株））で疎水クロマトグラフィーを行うことによりＧ３ＤＨを精製した。
酵素活性の測定は常法に従い、１分間に１μｍｏｌのグルコースが酸化される酵素量を１単位（Ｕ）とした。
実施例２
酵素電極法を用いたトレハロースの酸化
電極用のセルを遮光し、トレハロース（林原（株）；０．１０３ｇ：終濃度２０ｍＭ）、実施例１で得たα−１５由来Ｇ３ＤＨ（１０Ｕ）および電子メディエーターとしてフェリシアン化カリウム（終濃度１００ｍＭ）を入れ、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で全量を１５ｍｌとした。ウォーターバスを使用して反応温度を２６℃に保ち、対極白金、作用極白金メッシュ、参照極Ａｇ／ＡｇＣｌを用いて３７０ｍＶｖｓＡｇ／ＡｇＣｌの定電位電解を行った。経時変化を観察するため、２時間毎に２００μｌずつサンプリングし、そのサンプルをそれぞれ乾燥、メタノールに溶解し、遠心分離（１５０００ｒｐｍ，５分）により不溶性物質を除去した。同様にもう一度メタノール抽出を行い、残存蛋白質を完全に除去した。得られたサンプルを乾燥してメタノールを除去し、蒸留水に再溶解し、得られたサンプルを薄層クロマトグラフィーにより観察した。展開溶媒としてアセトニトリル：水＝７：３の割合の混合液を用いた。
薄層クロマトグラフィーの結果、トレハロースのスポット（Ｒｆ＝０．４５）は時間とともに薄くなってゆき、Ｒｆ＝０．５７の位置にスポットが現れた。電極反応によって約１２時間でトレハロース誘導体が合成できた。
実施例３
反応生成物の精製
電極反応後の反応溶液をナスフラスコに入れ、ロータリーエバポレーターを用いて濃縮、乾燥後メタノールに溶解した。不溶解物を吸引濾過し、得られたろ液を再度濃縮、乾燥後蒸留水に溶解、シリカゲルをつめたオープンカラムで未反応トレハロースと生成物を分離した。溶離液にはアセトニトリル：水＝７：３を用いた。こうして分離した溶液を濃縮、乾燥後蒸留水に溶解、アンバーライト（陽イオン交換樹脂）をつめたオープンカラムにより反応溶液中に存在する陽イオンを吸着除去した。溶離液としては水を用いた。溶出した水溶液をさらに濃縮、乾燥後蒸留水に溶解し、アンバーライト（陰イオン交換樹脂）をつめたカラムにより反応溶液中に含まれる陰イオンを吸着除去した。溶離液としては水を用いた。溶出した水溶液を濃縮、乾燥し、反応生成物を回収した。
実施例４
１３Ｃ  ＮＭＲによる反応生成物の解析
実施例３で得た反応生成物を重水（Ｄ２Ｏ）に溶解し、１３Ｃ  ＮＭＲにより構造解析した。比較としてトレハロースも同様に行った。
精製後のサンプルを１３Ｃ  ＮＭＲで構造解析した結果、図５に示される結果が得られた。これをトレハロースおよび３−ケトトレハロースと比較した（図６）。反応生成物のピークをトレハロースのピークの位置と比較すると、生成物のピークのうちＣ−３のピークが低磁場シフトしていた。このシフトは３−ケトトレハロースのＣ−３と同じである。このことから、この反応生成物は２分子のグルコース残基の両方の３位にケト基が入った、３，３’−ジケトトレハロースであることが明らかとなった。
実施例５
酸加水分解による反応生成物の解析
精製した反応生成物を水２００μｌに溶解し、４Ｎ硫酸２００μｌ（終濃度２Ｎ）を加え、９９℃で５時間熱処理を行い、加水分解した。得られた溶液のｐＨをｐＨ試験紙で確認しながら、中性になるまで１０Ｎ  ＮａＯＨを少量ずつ加えた。こうして得られたサンプルを薄層クロマトグラフィーで確認した。展開溶媒としてアセトニトリル：水＝６：４を用いた。比較としてトレハロースも同様に加水分解し確認した。
薄層クロマトグラフィーの結果を図７に示す。加水分解によりトレハロースからは２分子のグルコースが生成する。これに対し、反応生成物からはグルコースが生成しなかった。もし、反応生成物がトレハロースの２分子のグルコース残基のうちの１つのＣ−３位にケト基が入た３−ケトトレハロースであるなら、加水分解後グルコースと同じ位置にもスポットが現れるはずである。したがって、反応生成物はトレハロースの２分子のグルコース残基の両方のＣ−３位にケト基が入った、３，３’−ジケトトレハロースであることが明らかとなった。
実施例６
３，３’−ジケトトレハロースに対するトレハラーゼの作用
トレハロース、３，３’−ジケトトレハロースをそれぞれ１７ｍｇ（終濃度５０ｍＭ）量り取り、豚の腎臓由来トレハラーゼ（ＳＩＧＭＡ）３００μｌ（０．０８Ｕ）、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）７００μｌを加えて全量を１ｍｌとし、室温で攪拌しながら反応を開始した。反応開始から０，５，１０，２３，３３時間で２００μｌずつサンプリングし、加水分解の経時変化を観察した。これらのサンプルをそれぞれ真空下で濃縮し、メタノール２００μｌに溶解し、遠心分離で蛋白質を沈殿させることによりメタノール抽出を行った。この上清を濃縮、さらにもう一度メタノール抽出を行うことにより残存する蛋白質を完全に除去した。こうして得られたサンプルを真空下で一晩乾燥させることによりメタノールを完全に除去した。残渣を水２００μｌに溶解し、高速液体クロマトグラフィー（ＣＣＰＳ、ＣＯ−８０２０、ＲＩ−８０２０、Ｃｈｒｏｍａｔｏｃｏｒｄｅｒ２１：東ソー（株））により観察した。カラムは糖分析用カラム、流速０．６５ｍｌ／ｍｉｎ、溶離液は水で測定した。
ＨＰＬＣの結果を図８のグラフに示す。グラフより、時間の経過と共に、トレハロースはグルコースに変換されている様子が観察された。これに対し、３，３’−ジケトトレハロースはトレハロースと同じ分解条件でも減少が見られなかったので、トレハラーゼによる加水分解は起こっていないことがわかる。したがって、トレハラーゼは３，３’−ジケトトレハロースを基質としないことが示された。
実施例７
トレハラーゼ阻害活性
３，３’−ジケトトレハロース溶液１００μｌ（トレハラーゼ反応系の全量２００μｌ中の終濃度がそれぞれ０，０．１，０．５，１．０，５．０，１０．０μＭになるように調製）と豚の腎臓由来トレハラーゼ２６μｌ（０．００７Ｕ）を、３７℃で５分間攪拌した。次に、トレハロース（終濃度０，５，１０，２０ｍＭ）を加え、全量を２００μｌとした。緩衝液は５０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を用いた。この溶液を３７℃で３０分間攪拌することによりトレハラーゼ反応を進行させ、９５℃で５分間熱処理することによって失活させて反応を停止した。反応溶液中のグルコース濃度を測定し、グルコースの生成量からトレハラーゼ活性を算出した。トレハラーゼ活性の１Ｕは、１分間に１μｍｏｌのトレハロースから２μｍｏｌのグルコースを生成する量とした。
トレハロース濃度とトレハラーゼ活性の関係より、トレハラーゼのトレハロースに対するミカエリス定数Ｋｍは６．６ｍＭと求められた。また、３，３’−ジケトトレハロース濃度が高くなるほど反応速度が減少していることから、トレハラーゼは３，３’−ジケトトレハロースによって阻害されていることがわかる。図９にはディクソンプロットを示す。ディクソンプロットでは、阻害剤濃度  ｖｓ  １／反応速度のグラフ上において、２つの異なる基質濃度を同一グラフ上に描いたとき交差する点における阻害剤濃度から阻害物質定数が求まる。これにより、３，３’−ジケトトレハロースのトレハラーゼに対する阻害定数Ｋｉは２．４２×１０−６Ｍと求められた。
以上の結果より、３，３’−ジケトトレハロースはトレハラーゼに対し、阻害作用を有することが分かる。
実施例８
蛋白質凍結乾燥安定化
ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を補酵素とするグルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）を用いて、本発明の化合物の蛋白質凍結乾燥安定化作用を調べた。Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ  由来ＰＱＱＧＤＨを、Ｍｏｌ，Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８９），２１７：４３０−４３６に記載の遺伝子配列に基づいて、組換え大腸菌で生産した。菌体を破壊して得た水溶性画分を陽イオンクロマトグラフィーにより精製することにより調製した。この酵素を、終濃度５μＭ  ＰＱＱ、１ｍＭＣａＣｌ２の存在下で室温で１時間インキュベートすることによりホロ化した。次に、本発明の化合物を終濃度５０ｍＭとなるように加え、試料を６０μＬずつ分注し、−８０℃で凍結した。対照としては本発明の化合物を添加せずに酵素を凍結した。次に、凍結酵素をデシケータ中で、１０Ｐａ、０℃で１２時間乾燥した。この凍結乾燥酵素を４，２８，４５または７０℃で１時間熱処理した後、酵素の残存活性を測定した。酵素活性の測定は、１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０中においてＰＭＳ（フェナジンメトサルフェート）−ＤＣＩＰ（２，６−ジクロロフェノールインドフェノール）を用い、ＤＣＩＰの６００ｎｍの吸光度変化を分光光度計を用いて追跡し、その吸光度の減少速度を酵素の反応速度とした。このとき、１分間に１μｍｏｌのＤＣＩＰが還元される酵素活性を１ユニットとした。また、ＤＣＩＰのｐＨ７．０におけるモル吸光係数は１６．３ｍＭ−１とした。
測定したいずれの温度においても、本発明の化合物を添加したものは、対照と比較して酵素の残存活性が高かった。すなわち、本発明の化合物は、酵素の凍結乾燥安定化作用を有することがわかった。
産業上の利用性
本発明のトレハロース誘導体は、トレハラーゼ阻害剤および蛋白質凍結乾燥安定剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
図１は、種々のトレハロース誘導体を示す。
図２は、種々のトレハロース誘導体を示す。
図３は、種々のトレハラーゼ阻害剤を示す。
図４は、酵素電極法の原理を示す。
図５は、本発明の化合物の１３Ｃ  ＮＭＲ構造解析を示す。
図６は、本発明の化合物および比較化合物の１３Ｃ  ＮＭＲ構造解析を示す。
図７は、本発明の化合物の加水分解生成物を示す。
図８は、本発明の化合物を加水分解したときの経時変化を示す。
図９は、本発明の化合物のトレハラーゼ阻害作用についてのディクソンプロットを示す。
【図１】
0004468592.tif 000004
【図２】
0004468592.tif 000005
【図３】
0004468592.tif 000006
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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