(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示すアミノ酸配列からなるオピオイドペプチド。
【請求項２】
リブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼをペプシン又はペプシン及びパンクレアチンで加水分解して得られる加水分解物から、オピオイドペプチドを採取することを特徴とするオピオイドペプチドの製造方法。
【請求項３】
前記ペプチドが請求項１記載のペプチドである請求項２記載のオピオイドペプチドの製造方法。
【請求項４】
リブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼが茶葉由来である請求項２のオピオイドペプチドの製造方法。
【請求項５】
茶葉から尿素溶液に可溶性のタンパク質画分を抽出し、同画分をペプシン又はペプシン及びパンクレアチンで加水分解し、得られる加水分解物からオピオイドペプチドを採取することを特徴とするオピオイドペプチドの製造方法。
【請求項６】
請求項１記載のオピオイドペプチド又はその生理的に許容可能な塩の１種又は２種以上を有効成分として含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、鎮痛、麻酔等のオピオイド活性を有するペプチド及びその製造方法、並びに当該ペプチド又はその塩を有効成分として含む医薬組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
脳内に存在する神経ペプチドとして、モルヒネと同様の麻酔鎮痛活性（オピオイド活性）を持つ一群のペプチドが知られており、オピオイドペプチドと呼ばれている。このようなオピオイドペプチドとして、エンケファリン、β−エンドルフィン、ネオエンドルフィン、ダイノルフィン、ロイモルフィン等、２０種以上の内因性オピオイドが報告されている。
【０００３】
一方、種々の食品のタンパク質から、オピオイド活性を有するペプチドが見出されている。これらのペプチドは、食品起源の生体調節因子として注目されている。食品由来の外因性オピオイドペプチドとしては、牛乳カゼイン由来のβ−カゾモルフィン（casomorphin）（1-7）（Brantlら、1979年）、β−カゾモルフィン（1-5）（Henschen、1979年）、β−カゾモルフィン（1-3）(Lottspeichら、1980年）、α−カゼインエキソルフィン（caseine xorphin）（Loukasら、1980年）、小麦グルテン由来のペプチド（特開平5-86094号）が知られている。
【０００４】
ところで、光合成を行なう緑色植物の葉緑素には、ルビスコ（RuBisCO：リブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ）と呼ばれる酵素が含まれている。本酵素は光合成の暗反応において、リブロース−１，５−二リン酸と二酸化炭素から二分子のグリセリン酸−３−リン酸を生成することにより、二酸化炭素をカルビン回路に取込む働きを持っており、地球上においてもっとも量が多い酵素であるともいわれている。現在までに、ルビスコから派生するオピオイドペプチドを単離し、その構造を決定したという報告は知られていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、新規なオピオイドペプチドを提供することを課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、抹茶の尿素可溶性蛋白質について研究を行ったところ、オピオイド活性を有するペプチドを分離、同定することに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち本発明は以下のとおりである。
（１）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるオピオイドペプチド。
（２）リブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼをペプシン又はペプシン及びパンクレアチンで加水分解して得られる加水分解物から、オピオイドペプチドを採取することを特徴とするオピオイドペプチドの製造方法。
（３）前記ペプチドが（１）のペプチドである（２）のオピオイドペプチドの製造方法。
（４）リブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼが茶葉由来である（２）のオピオイドペプチドの製造方法。
（５）茶葉から尿素溶液に可溶性のタンパク質画分を抽出し、同画分をペプシン又はペプシン及びパンクレアチンで加水分解し、得られる加水分解物からオピオイドペプチドを採取することを特徴とするオピオイドペプチドの製造方法。
（６）（１）のオピオイドペプチド又はその生理的に許容可能な塩の１種又は２種以上を有効成分として含む医薬組成物。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００９】
＜１＞本発明のペプチド
本発明のペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列からなり、オピオイド活性を示す。
【００１０】
本発明のペプチドは、後述する本発明のオピオイドペプチドの製造法によって製造することができる。また、本発明のペプチドは、通常のペプチドの化学合成法によって合成することもできる。
【００１１】
＜２＞オピオイドペプチドの製造法
本発明のオピオイドペプチドの製造法の第一の形態は、リブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼをペプシン又はペプシン及びパンクレアチンで加水分解して得られる加水分解物から、オピオイドペプチドを採取することを特徴とするオピオイドペプチドの製造方法である。
【００１２】
上記方法において、リブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼとしては、茶葉由来の酵素が挙げられる。
本発明のオピオイドペプチドの製造法の第二の形態は、茶葉から尿素溶液に可溶性のタンパク質画分を抽出し、同画分をペプシン又はペプシン及びパンクレアチンで加水分解し、得られる加水分解物からオピオイドペプチドを採取することを特徴とするオピオイドペプチドの製造方法である。
【００１３】
上記の各形態において、茶葉としては、茶葉の粉砕物又は磨砕物が挙げられる。具体的には、一般的に抹茶として市販されているものが挙げられる。
以下に、第二の形態に基づいて、抹茶を原料としてオピオイドペプチドを製造する方法について例示するが、第一の形態に基づいて茶葉以外のリブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ又は同酵素を含む画分を用いる場合も、同様にして、ペプシン又はペプシン及びパンクレアチン処理、並びにオピオイドペプチドの採取を行うことができる。
【００１４】
まず、抹茶粉末を５Ｍ〜飽和尿素液に分散溶解させた後、遠心分離又は濾過等で不溶物を除去し、尿素溶液に可溶性のタンパク質画分を抽出する。次に、こうして抽出された画分中のタンパク質を透析後、ペプシン又はペプシンとパンクレアチンの両方を用いて加水分解する。
【００１５】
ペプシンとしては、ブタの胃粘膜由来が挙げられるが、本発明では特に由来を問わない。パンクレアチンとしては、ブタすい臓由来等が挙げられるが、本発明では、どれを使用しても構わない。本発明において、ペプシンは、単独で使用しても、２種類以上を混合して使用しても構わない。パンクレアチンも同様である。
【００１６】
加水分解は、ペプシンを用いる場合は酸性条件下（ｐＨ１．５〜３．０）で行うことが好ましい。また、ペプシンとパンクレアチンの両方を用いる場合は、第一の酵素に適した条件で同酵素を反応させた後、第二の酵素に適した条件に調整して第二の酵素を反応させるとよい。このとき、パンクレアチンで反応させる場合は中性又は弱アルカリ性条件下（ｐＨ６．５〜９．０）で行うことが好ましい。
例えば、まず抹茶の尿素可溶性タンパク質を希塩酸等の酸性溶液中に分散溶解させた状態でペプシンで加水分解し、次いで中和又は弱アルカリ性にした後にパンクレアチンで加水分解する。
【００１７】
ペプシンおよびパンクレアチンは、いずれも遊離の状態で使用してもよく、担体に固定化したものを使用してもよい。
ペプシンまたはパンクレアチンの使用量は、いずれの場合も、例えば、乾燥した抹茶の尿素可溶性タンパク質又はリブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ１００ｇ当たり、約５，０００〜１００，０００ユニットの割合で用いるとよい。活性は、基質として米国メルク社製のハマーステインカゼイン１％溶液を用い、アンソン−萩原変法[赤堀四郎編  "酵素研究法"第２巻、２３７頁（昭和３６年１月１０日、朝倉書店発行）]により測定することができる。反応は３０℃で３０分間行ない、１分間に１μｇのチロシン相当量を遊離するのに要する酵素量を１ユニットとする。
【００１８】
より具体的な条件としては、例えば、２ｇ分の抹茶に相当する７Ｍ尿素抽出物を、透析を行なって尿素を除いたうえで、ｐＨ２．０に調整し、ペプシン５，０００ユニットを加えて、３７℃で５時間インキュベートする条件が挙げられる。また、例えば２ｇ分の抹茶に相当する尿素抽出物を、透析を行なって尿素を除いたうえで、ｐＨ２．０に調整し、ペプシン５，０００ユニットを加えて、３７℃で５時間インキュベートし、その後ｐＨを７．５に調整しパンクレアチン５，０００ユニットを加えて、３７℃で５時間インキュベートする条件が挙げられる。
反応後、ペプシンまたはパンクレアチンは、例えば、９０℃で１０分間加熱することにより、失活させる。反応後、ペプシン又はパンクレアチンは、例えば、９０℃で１０分間加熱することにより、失活させる。
【００１９】
尚、加水分解の条件は、種々の条件で一定量の茶葉の尿素可溶性蛋白質を加水分解し、得られる加水分解物についてオピオイド活性を測定し、最も高い活性の加水分解物が得られる条件を予め設定するとよい。条件としては、ｐＨ、温度、酵素量、処理時間が挙げられる。
【００２０】
次に、上記のようにして得られた加水分解物から、オピオイドペプチドを採取する。ここで採取されるオピオイドペプチドとしては、例えば配列番号１に示すペプチドが挙げられる。
【００２１】
具体的には、各種クロマトグラフィーによって前記加水分解物を分画し、オピオイド活性を示す画分を採集する方法が挙げられる。クロマトグラフィーとしては、逆粗カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が挙げられる、逆相カラムとしては、オクタデシルシラン（ODS）カラム、ニトロフェネチルカラム、シアノプロピルカラム等が挙げられる。
【００２２】
最終的に得られたペプチドは、例えばアプライドバイオシステム社製のプロテインシーケンサー（４９２型）等を使用して、アミノ酸配列を決定する。配列番号１に示すペプチドは、上記のようにして抹茶から分離、同定されたものである。
【００２３】
また、配列番号１で表されるペプチドは、化学合成によっても取得することができる。ペプチドの合成法は特に制限されないが、市販の自動ペプチド合成装置を使用して、同装置に添付されている標準プロトコールに従って合成を行なうことができる。目的とするペプチドは、合成反応物から、ＯＤＳカラムによる高速液体クロマトグラフィー等によって精製することができる。
【００２４】
＜３＞本発明の医薬組成物
本発明の医薬組成物は、前記本発明のペプチド又は生理学的に許容可能なその塩を有効成分として含む。塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩等が挙げられる。
【００２５】
本発明のペプチドは、極めて少量でオピオイド活性を示すので、鎮痛又は麻酔作用；情動、呼吸、脈動、体温、消化管機能、摂食、免疫等の整調；インシュリンやソマトスタチン等のホルモンの分泌調節、電解質の吸収促進、心筋の収縮調節等の作用を示すことが期待される。したがって、鎮痛麻酔剤、催眠剤、消化管ホルモン分泌促進剤、電解質の吸収促進剤、腸管ぜん動抑制又は胃腸輸送筋収縮による下痢改善剤としての利用が期待できる。
【００２６】
また、本発明のペプチドは、食品や飼料に添加して、またそれらと一緒に投与することもできる。本発明のペプチドは、リブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ、食品に含まれるタンパク質に由来するものであり、安全性が高いと考えられる。
【００２７】
さらに、本発明のペプチドは、オピオイド作用を阻害するオピオイド・アンタゴニストのスクリーニングに使用することができる。
本発明の医薬組成物において、含有させるペプチド又はその塩としては、単独でもよく、２種類以上の混合物であってもよい。
【００２８】
本発明の医薬組成物の好適な投与量は、投与される人間又は動物の年齢、体重、性別、症状、動物の種類等の条件によって適宜設定する。本発明の医薬組成物は、経口および非経口のいずれによっても投与可能であり、更に単独で投与しても、また製薬工業において通常使用されている固体担体や液体担体と一緒に投与してもよく、或いは他の薬剤と混合または組合せて使用するしてもよい。
【００２９】
また投与形態は、錠剤、丸剤、顆粒剤、カプセル、散剤、水溶液、注射剤等の任意の形態が可能である。
【００３０】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【００３１】
【実施例１】
抹茶の尿素可溶性タンパク質のペプシン加水分解物からのオピオイドペプチドの調製
（１）抹茶粉末２ｇを７Ｍ尿素液２００ｍｌに分散溶解させた後、３，５００Ｇで２０分間遠心分離して不溶物を除き、透析を行なって尿素を除いたうえで、１Ｎ塩酸を加えてｐＨを２．０に調整した。
【００３２】
この溶液に、ペプシン（米国シグマ社製）５０００ユニットを加えて３７℃で５時間インキュベートした。反応終了後、９０℃で１０分間加熱してペプシンを失活させ、３，５００Ｇで２０分間遠心分離して不溶物を除き、得られた上澄液を凍結乾燥して、ペプシンによる、抹茶の尿素可溶性蛋白質の加水分解物約０．２ｇを得た。
【００３３】
（２）上記（１）で得た抹茶の尿素可溶性蛋白質の加水分解物１ｍｇを、オクタデシルシラン（ODS）逆相カラム（ナカライテスク社製、Ｃｏｓｍｏｓｉｌ５Ｃ18−ＡＲII、内径４．６ｍｍ、長さ１５０ｍｍ）に注入した。次いで０．１％トリフルオロ酢酸水溶液（Ａ液）及び０．１％トリフルオロ酢酸を含有するアセトニトリル溶液（Ｂ液）を使用して、Ｂ液の濃度を０％から５０％まで５０分かけて直線的に増加する濃度勾配にて、１ｍｌ／分の流速で溶出させた。その時の波長２３０ｎｍにおける吸光度測定によるクロマトグラムを図１に示す。溶出液を経時的に採取し、各画分のオピオイド活性を測定したところ、図１に示したクロマトグラムにおいて矢印で表した、アセトニトリル濃度が約３７．５〜３８．５％の範囲で溶出してくる画分において、オピオイド活性が認められた。尚、本実施例において、オピオイド活性は実施例３に示す方法によって測定した。
【００３４】
（３）上記（１）で得た抹茶の尿素可溶性蛋白質の加水分解物５０ｍｇを使用して、上記（２）と同じ工程を繰り返して活性画分を得た。次に、これらの画分を、ニトロフェネチル逆相カラム（ナカライテスク社製、Ｃｏｓｍｏｓｉｌ５ＮＰＥ、内径４．６ｍｍ、長さ１５０ｍｍ）に注入し、上記（２）におけるのと同じ条件で溶出させた。溶出してくる各画分のオピオイド活性を測定したところ、アセトニトリル濃度が約３９〜４０％の範囲で溶出してくる画分にオピオイド活性が認められた。
【００３５】
（４）次に、上記（３）で得たオピオイド活性画分を、シアノプロピル逆粗カラム（ナカライテスク社製、Ｃｏｓｍｏｓｉｌ５ＣＮ、内径４．６ｍｍ、長さ１５０ｍｍ）を使用した逆相クロマトグラフィーカラムに供して、上記（２）、（３）におけるのと同様の条件で溶出させた。溶出してくる各画分を分取して、そのオピオイド活性を測定したところ、アセトニトリル濃度が約２６〜２７％の範囲のピーク画分にオピオイド活性が認められた。
【００３６】
（５）上記（４）で得たオピオイド活性画分を回収し、濃縮乾燥した。この乾燥物のアミノ酸配列を、アプライドバイオシステム社製のプロテインシーケンサー４９２型を使用して調べたところ、Ｎ末端から順次Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−Ｐｒｏ、Ｌ−Ｌｅｕ、Ｌ−Ａｓｐ、Ｌ−ＬｅｕおよびＬ−Ｐｈｅが遊離してきた。このことから、その構成アミノ酸のすべてがＬ−アミノ酸である配列番号１で表されるペプチドであることが確認された。
【００３７】
配列番号１で表されるペプチドの原料抹茶粉末からの収率（％）を、その分子量と２８０ｎｍにおける分子吸光係数から求めたところ、約０．０１％であることが確認された。
【００３８】
配列番号１に示すペプチドは、リブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼの大サブユニットの第１０３〜１０８残基と構造が一致することから、同酵素に由来することが明らかとなった。
【００３９】
【実施例２】
合成による本発明ペプチドの製造
配列番号１で表されるペプチドの合成は以下の方法で行なった。市販のＦｍｏｃ（Ｎ−α−９−フルオレニルメトキシカルボニル）―Ｐｈｅ−Ｗａｎｇ樹脂（置換率０．５ｍｅｑ／ｇ）０．６ｇ、２０％ピペリジンを含むジメチルフォルムアミドをペプチド合成装置（プロテインテクノロジー社ＰＳ−３）の反応槽中で、室温で反応させてＦｍｏｃ基を除去した。
【００４０】
次にＦｍｏｃ基の除去されたＰｈｅ−樹脂をジメチルフォルムアミドで洗浄し、この樹脂に１ｍｍｏｌのＦｍｏｃ−Ｌｅｕと１ｍｍｏｌのＨＢＴＵ（2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate O-Benzotriazole-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate）を含む０．４ＭＮ−メチルモルフォリンのジメチルフォルムアミド溶液５ｍｌを混合して反応槽に入れて室温で２０分間攪拌下に反応させた。
【００４１】
上記で得られた樹脂を、ジメチルフォルムアミドで洗浄して、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−樹脂を得た。引き続き、上記と同様にして、Ｆｍｏｃ基の除去、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（Ｏ−ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ及びＦｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）のカップリングを繰り返して、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ―樹脂からなる生成物を得た。
【００４２】
この樹脂を、５％アニソール及び５％水を含有するトリフルオロ酢酸中、室温で１時間反応させ、ペプチドを樹脂から遊離させた。その後、ジエチルエーテルを添加することによりペプチドを沈殿させ、粗ペプチド１５０ｍｇを得た。これをオクタデシルシラン（ＯＤＳ）逆相カラム（ナカライテスク株式会社製、Ｃｏｓｍｏｓｉｌ５Ｃ１８−ＡＲII）を用いた逆相クロマトグラフィーにより精製し、最終生成物４０ｍｇを得た。そのアミノ酸組成（モル比）は、Ｔｙｒ：Ｐｒｏ：Ｌｅｕ：Ａｓｐ：Ｌｅｕ：Ｐｈｅ＝1：1：１：１：１：１であった。
【００４３】
この生成物について、更に、実施例１で使用したのと同じプロテインシーケンサーにより分析したところ、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドであることが判明した。
【００４４】
【実施例３】
本発明のペプチドの生理活性
（１）オピオイド活性の測定上記の実施例１における各画分のオピオイド活性、及び実施例２で合成した配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド、ならびに既知のオピオイドペプチドのオピオイド活性は、いずれも次のようにして測定した。
【００４５】
ＩＣＲ系雄性マウス（体重３０〜３５ｇ）から輸精管を摘出した。アイソトニックトランスデューサー（日本光電工業株式会社製：ＴＢ６１２−Ｔ）に摘出した２本の輸精管を接続して、０．４ｇの張力をかけた。
【００４６】
２ｍｌ容量のマグヌス管に、Ｋｒｅｂｓ等張液（ＮａＣｌ１１８ｍＭ、ＫＣｌ４．７５ｍＭ、ＣａＣｌ2 ２．５４ｍＭ、ＮａＨＣｏ3 ２５ｍＭ、ＫＨ2ＰＯ4 １．１９ｍＭ、グルコース１１ｍＭ）を満たし、３６℃で保温しておいた。この液中に前記輸精管を浸し、ボンベから通気（Ｏ2 ９５％：ＣＯ2 ５％）を行なった。通気を約２時間行って安定化させた後、３０Ｖで１ｍｓｅｃの電気刺激を与え、マウス輸精管を電気収縮させた。
【００４７】
電気収縮が安定した後、ペプチダーゼによるペプチドの分解を避けるためにL−Ｌｅｗ−L−Ｌｅｗ（２ｍＭ）、ベスタチン（３０μＭ）、チオファン（０．３μＭ）、カプトプリル（１０μＭ）共存下で試料を添加し、マウス輸精管の電気収縮の変化をレコーダーで記録した。オピオイド活性は、試料添加後の電気収縮の抑制と、１０-4Ｍナロキソン２０μｌ添加による抑制の解除によって判定した。そしてマウス輸精管の電気収縮を５０％抑制する濃度（ＩＣ50）を測定した。
【００４８】
その結果、実施例１で得られた活性画分、及び実施例２で得られたペプチドのＩＣ50は３０μＭであることが判明した。対照として、既知のオピオイド活性を有するペプチド、グルテンエキソルフィン（gluten exorphin ）A（小麦グルテン由来、配列番号２）、α−カゼインエキソルフィン（α-casein exorphin（牛乳α−カゼイン由来、配列番号３）、グリアドルフィン（小麦α−グリアジン由来、配列番号４）のオピオイド活性を、上記と同様にして測定した時のＩＣ50を合せて表１に示した。
【００４９】
【表１】
0004424805.tif 000002
【００５０】
表１の結果から、本発明のオピオイドペプチドは、低濃度でオピオイド活性を有することがわかる。
【００５１】
（２）鎮痛作用
体重２５ｇ前後のｄｄＹ系マウスを、痛覚が正常であることを確認した後、実験に供した。マウスの痛覚の確認は、尾の付け根を、挟み強度を２５０ｇに調節した長さ３ｃｍの動脈クリップで挟んだ際に、２秒以内にそのクリップに対して、噛む等の反応を示すか否かで判定した。あらかじめ痛覚が正常であることを確認したマウス２４匹を6匹ずつ４群に分け、１群には生理的濃度の食塩水を１０μｌ、他の３群には、実施例１又は実施例２で得られたペプチドをそれぞれ、１０、３０、１００ｎｍｏｌずつ、１０μｌの生理食塩水に溶解させ、脳室内に投与した。そして、投与前および投与より５、１０、１５、２０、２５、３０分後に上記クリップでマウスの尾を挟み、クリップに対して反応を示すまでの時間を記録した。なお、６秒以上反応を示さなかった個体の記録は、一律６秒とした。
【００５２】
マウスが反応を示すまでの時間（秒）を縦軸に、投与からの経過時間（分）を横軸にとり、各測定時間の結果を試験群ごとに線で結び、それぞれの群について、その線の下側の面積（作用曲線下面積）を算出して図２に示した。生理食塩水を投与した対照と比較して、実施例１又は実施例２で得られたペプチドを投与した群においては曲線下面積が顕著に大きく、本発明のペプチドは、実際に脳内において鎮痛作用を示すことが判明した。
【００５３】
【実施例４】
抹茶の尿素可溶性タンパク質のペプシン及びパンクレアチン加水分解物からのオピオイドペプチドの調製
（１）抹茶粉末２ｇを７Ｍ尿素液２００ｍｌに分散溶解させた後、３，５００Ｇで２０分間遠心分離して不溶物を除き、透析を行なって尿素を除いたうえで、１Ｎ塩酸を加えてｐＨ２．０に調整した。
【００５４】
この溶液に、ペプシン（米国シグマ社製）５，０００ユニットを加えて３７℃で５時間インキュベートした。反応終了後、１Ｎ水酸化ナトリウムを加えてｐＨを７．５に調整した。この溶液に、パンクレアチン（米国シグマ社製）５，０００ユニットを加えて３７℃で５時間インキュベートした。反応終了後、９０℃で１０分間加熱してペプシン及びパンクレアチンを失活させ、３，５００Ｇで２０分間遠心分離して不溶物を除き、得られた上澄液を凍結乾燥して、ペプシン及びパンクレアチンによる、抹茶の尿素可溶性タンパク質の加水分解物約０．２ｇを得た。
【００５５】
（２）上記（１）で得た抹茶の尿素可溶性タンパク質の加水分解物１ｍｇをオクタデシルシラン（ＯＤＳ）逆相カラム（ナカライテスク社製、Ｃｏｓｍｏｓｉｌ５Ｃ１８−ＡＲII、内径４．６ｍｍ、長さ１５０ｍｍ）に注入した。次いで０．１％トリフルオロ酢酸水溶液（Ａ液）及び０．１％トリフルオロ酢酸を含有するアセトニトリル溶液（Ｂ液）を使用して、Ｂ液の濃度を０％から５０％まで５０分間かけて直線的に増加する濃度勾配にて、１ｍｌ／分の流速で溶出させた。溶出液を経時的に採取し、各画分のオピオイド活性を測定したところ、アセトニトリル濃度が約３７．５〜３８．５％の範囲で溶出してくる画分において、オピオイド活性が認められた。尚、本実施例において、オピオイド活性は実施例３に示す方法によって測定した。
【００５６】
【発明の効果】
本発明のペプチド又はその塩は、オピオイド活性を有しているので、該ペプチド又はその塩を有効成分とする医薬組成物は、極めて少量の投与で、鎮痛又は麻酔作用；情動、呼吸、脈動、体温、消化管機能、摂食、免疫等の整調；インシュリンやソマトスタチン等のホルモンの分泌調節、電解質の吸収促進、心筋の収縮調節等の作用を示す可能性があり、鎮痛麻酔剤、催眠剤、消化管ホルモン分泌促進剤、電解質の吸収促進剤、胃腸輸送筋収縮による下痢改善剤としての利用が期待できる。
【００５７】
その場合に、本発明のペプチドおよびその塩は、水溶性の白色粉末であるため、そのままで、または水  等に溶解させて経口および非経口のいずれかの方法によっても極めて簡単に投与する事ができる。
【００５８】
さらに、本発明のペプチドおよびその塩は、６個のアミノ酸が配列しただけの極めて簡単な構造を有する低分子量化合物であるため、化学合成によっても簡単に製造することができる。また、本発明のペプチドは、茶葉中のリブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼの酵素による加水分解物として得られるために安全性が高い。
【００５９】
上記ペプチドは、本発明の方法に基づいて、茶葉から抽出、精製することにより、又は、化学合成することにより、製造することができる。
【００６０】
【配列表】
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【００６１】
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【００６２】
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【００６３】
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【００６４】
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【００６５】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  抹茶の尿素可溶性蛋白質をペプシンで加水分解して得られたペプチド混合物のＯＤＳ逆相カラムクロマトグラフィーおける、２３０ｎｍの吸収によるクロマトグラム。左側縦軸は溶出液の２３０ｎｍにおける吸光度を、右側縦軸は溶離液中のアセトニトリル濃度を示す。
【図２】  本発明のペプチドをマウス脳室内に投与した際の作用曲線下面積の平均値と標準偏差を示す。作用曲線下面積（秒×分）は、投与時から投与３０分後まで、５分間隔で痛覚に対する反応時間（秒）を測定し、各試験群の反応時間の平均値を投与後の時間経過に沿って３０分まで積分することにより算出したものであり、鎮痛作用の強弱を示す。
【図１】
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【図２】
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