(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の化合物：
（ａ）白血病阻害因子（ＬＩＦ）；および
（ｂ）ＭＥＫのインヒビター；
の存在下で多能性幹細胞の培養物を維持する工程を含む、多能性幹細胞の培養方法。
【請求項２】
前記（ｂ）がＰＤ０９８０５９である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＬＩＦの濃度が約５Ｕ／ｍｌである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
非ヒト胚または胚様体から細胞を単離する工程、およびＭＥＫインヒビターの存在下で該細胞の培養物を維持する工程を含む、ＥＳ細胞を誘導する方法。
【請求項５】
得られた細胞を解離させる工程、およびＭＥＫインヒビターの存在下で該解離した細胞をさらに維持する工程を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
インビボで胚を発達させる工程、原始羊膜腔形成の前に該胚を採取する工程、および該採取物から細胞を単離する工程を含む、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
インビトロで非ヒト胚を発達させる工程、該胚の内部細胞塊から細胞を単離する工程、およびＭＥＫインヒビターの存在下で該単離した細胞を維持する工程を含む、ＥＳ細胞を誘導する方法。
【請求項８】
前記ＭＥＫインヒビターの存在下で培養前に原始内胚葉を除去する工程を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
（ａ）ＬＩＦ、および（ｂ）ＭＥＫインヒビターを含む、多能性幹細胞の選択的培養のための組成物。
【請求項１０】
前記（ｂ）がＰＤ０９８０５９である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
混合した細胞培養物から多能性幹細胞の実質的に純粋な培養物を得る方法における、ＭＥＫを阻害する化合物の使用。
【請求項１２】
前記化合物がＰＤ０９８０５９である、請求項１１に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、胚幹（ＥＳ）細胞の増殖および／または誘導およびそのための組成物に関する。
【０００２】
幹細胞自己再生は、哺乳動物胚の発達中の増殖および多様化ならびに成体における組織修復およびホメオスタシスの基礎を支持する。しかし、幹細胞生物学における研究は、インビトロで増殖され得る正常な非形質転換幹細胞が存在しないことによって妨げられている。この例外はマウスＥＳ細胞であり、これは、培地にサイトカインレセプターｇｐ１３０を活性化するリガンドが補充される場合、多能性幹細胞として無限に培養され得る。これらの幹細胞は、初期胚に一時的にのみ存在する。しかし、これらは本質的に腫瘍形成性であり、そして初期胚が異所部位に移植される場合、幹細胞腫瘍である奇形癌を発生する。さらに、マウス胚盤胞の外胚葉が培養物に外植される場合、不死胚幹（ＥＳ）細胞株が誘導され得る。
【０００３】
ＥＳ細胞の増殖は、サイトカインＬＩＦの存在に依存的であり、このサイトカインＬＩＦは、２つの関連するサイトカインレセプターであるｇｐ１３０および低親和性ＬＩＦレセプターであるＬＩＦ−Ｒを含むヘテロメリック複合体の活性化によって未分化幹細胞の増殖を促進する。
【０００４】
ｇｐ１３０を介するシグナル伝達は、ＪＡＫキナーゼ類の活性化に依存する。このキナーゼは、サイトカインレセプターの膜近位のｂｏｘ１／ｂｏｘ２領域と会合する非レセプターチロシンキナーゼの１つのクラスである。活性化されると、ＪＡＫ類は、ｇｐ１３０の細胞内ドメインにおいてチロシンをリン酸化し、Ｓｒｃ−ホモロジー−２（ＳＨ２）ドメインを含むタンパク質に対する結合部位を生成する。これらのタンパク質は、順番にリン酸化され得、その結果、種々のシグナリング分子を活性化する。これらのシグナリング分子としては、ＳＴＡＴ（シグナルトランスデューサーおよび転写のアクチベーター）１および３、チロシンホスファターゼＳＨＰ−２、マイトジェン活性化プロテインキナーゼＥＲＫ１およびＥＲＫ２、インスリンレセプター基質−１（ＩＲＳ−１）、Ｇｒｂ２関連ドッキングタンパク質（Ｇａｂ１）、およびホスファチジルイノシトール（ＰＩ）−３キナーゼ、ならびに非レセプターチロシンキナーゼｈｃｋおよびｂｔｋが挙げられる。これらの中でも、ＳＴＡＴおよびＭＡＰＫシグナリング経路は、種々の細胞タイプにおいてｇｐ１３０を活性化するリガンドに対する生物学的応答を媒介することに本質的な役割を果たすことが証明されている。
【０００５】
ＳＴＡＴは、レセプターへのリクルートメントの際にリン酸化され、ダイマー化し、次いで標的遺伝子の転写を調節する細胞核にトランスロケートする潜在性転写因子のファミリーである。発明者らは最近、ＳＴＡＴ３の活性化が、ＥＳ細胞の多能性表現型を維持するために必要とされることを示した。ＳＴＡＴ３を係合し得ないキメラｇｐ１３０レセプターは、シグナリング自己再生ができなかったが、変異体を妨害するＳＴＡＴ３の過剰発現はＥＳ細胞を分化させた。しかし、ＳＴＡＴ３の構成的活性形態の不在下で、発明者らは、このレギュレーターが単独で十分であるか、または他のシグナルもまた自己再生に必要とされるのかを決定できなかった。
【０００６】
ｇｐ１３０はまた、タンパク質チロシンホスファターゼと会合し得る。この広く発現した酵素はまた、レセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）からのシグナル伝達に関連しており、そしてＥＲＫシグナリングカスケードのポジティブエフェクターとみなされる。ＳＨＰ−２ホスファターゼについての生物学的に関連する基質は明確には同定されていないが、触媒的に不活性なＳＨＰ−２変異体の過剰発現が、ＥＲＫ経路のレセプターが介在した活性化を抑制し得ることは重要である。ｇｐ１３０レセプター複合体へのリクルートメントはまた、ＳＨＰ−２のチロシンリン酸化を生じる。これらのホスホチロシンは、アダプタータンパク質Ｇｒｂ２に対する結合部位として作用し得、これはＳＯＳおよびＲａｓとの相互作用によって、ＥＲＫ経路へのレセプターと潜在的にカップリングする。ＥＲＫ１およびＥＲＫ２の刺激は、増殖因子に対する細胞の細胞分裂促進性応答を媒介することに役割を果たすことが示されているが、この役割の正確な性質はまだ明確にされていない。
【０００７】
ＥＳ細胞の増殖を特異的に促進するある因子の存在下でＥＳ細胞の培養物を維持することは知られており、そしてＬＩＦはこのような１つの因子である。しかし、これは、分化を全く抑制しないわけではない；そのため分化した細胞がやがて過剰増殖になるこれらの培養物からの、ＥＳ細胞の持続的損失がある。したがって、このような公知の因子中で増殖する場合、ＥＳ細胞の小さい分化速度さえも低下するという問題が残る。
【０００８】
この技術分野でのさらなる問題は、培養物中で増殖し得るＥＳ細胞の範囲が、他の種からＥＳ細胞を誘導するために努力しているにもかかわらず、ほんの２、３のタイプ、主としてマウスＥＳ細胞のみに制限されることである。
【０００９】
（ｉ）ＥＳ細胞および（ｉｉ）ＥＳ細胞以外の細胞で区別して発現される選択可能マーカーをＥＳ細胞に導入することも知られている。次いで、選択は、分化した細胞を排除するために使用され得る。しかし、これはＥＳ細胞の遺伝子改変を必要とする。
【００１０】
本発明の目的は、ＥＳ細胞を得るおよび／または培養する代替方法を提供することである。本発明の他の目的は、公知の培養物においてＥＳ細胞の分化の速度を低下させることである。さらなる目的は、ＥＳ細胞の培養物の維持または誘導のための培養培地成分を提供することである。
【００１１】
本発明は、ＥＳ細胞の自己再生を選択的に促進するおよび／またはＥＳ細胞以外の細胞の増殖または生存を阻害する、すなわち、分化した細胞に選択的に作用する、化合物のクラスの発見に基づく。
【００１２】
したがって、本発明は、胚幹（ＥＳ）細胞の培養方法を提供し、この方法は、ＥＳ細胞以外の細胞の増殖または生存を選択的に阻害する化合物の存在下でＥＳ細胞を維持する工程を含む。
【００１３】
本発明は、分化した細胞に作用しそして分化した細胞の選択的除去または殺傷または増殖の遅延を可能にする化合物を使用する点で優れており、したがってＥＳ細胞の比較的純粋な培養物の保持を容易にする。これまで、公知のＥＳ増殖因子、例えばＬＩＦの使用により、かなり低レベルの分化したＥＳ細胞を生じた。公知の因子および本発明の化合物の両方を使用して、このレベルは、本発明によってさらに低下され得る。
【００１４】
本発明の化合物の効果は、選択的であり、阻害効果が、ＥＳ細胞におけるよりも分化した細胞においてより大きい程度まで見られる。化合物はＥＳ細胞における阻害効果を実質的に有さないことが好ましい。
【００１５】
好ましくは、化合物は、活性化されたまたは少なくとも維持された、すなわち、阻害されない場合、ＥＳ細胞以外の細胞を増殖させるまたは増殖を可能にするシグナリング経路を阻害する。このように、化合物は、もしあるなら、ＥＳ細胞における効果と比較して、分化した細胞に対して効果的に選択的に毒性である。分化した細胞は、死ぬかまたはその存在下で遅くなった増殖を有するかのいずれかである。阻害は、全体的または部分的であり得、そして経路に沿った種々の点で生じ得、そして経路を阻害する効果を有するあらゆる化合物がインヒビターとしてみなされるべきである。シグナリング経路を参照することにより、内因性または外因性物質が細胞機能、例えば、細胞分割、細胞周期、代謝における直接的効果を有する経路、ならびにレセプター媒介シグナリング経路によるような間接的効果による経路を含むことが意図される。
【００１６】
本発明のさらなる利点は、ＥＳ細胞の選択およびその培養物中での維持が、細胞の遺伝子操作を必要とせずに達成されることである。これは、特にヒト由来のＥＳ細胞の誘導に関連する主要な利点を表す。そのかわりに、本発明の好ましい実施態様では、ＥＳ細胞の選択および／または誘導は、シグナリング経路の発見によって達成される。この経路は、ブロックまたは阻害され得、その活性化または維持は、分化した細胞の増殖に必須であるがＥＳ細胞の増殖には必須ではない。「必須」とは、分化した細胞が少なくともひどいハンディキャップを受けることを意味し、例えば、その経路が阻害された場合、ひどく遅れた増殖となる、または他の基本的な機能が重大な不利な影響を受ける、ならびに経路が阻害される場合細胞増殖が停止するまたは細胞が死ぬことを意味する。経路の阻害が、実際に分化した細胞の死を生じないが、その代わりに、比較的増殖が遅く、培養物中でＥＳ細胞が選択的に増殖をすれば、本発明において所望の効果が達成される。好ましくは、分化した細胞は、ＥＳ細胞と比較して実質的に停止した増殖を有する。
【００１７】
本発明の１つの実施態様では、化合物は、ｒａｓ／ＭＡＰＫカスケードの成分の活性を阻害するかまたは低下させる。使用において、インヒビターは、非毒性レベルで培養培地中に存在し、レセプター媒介経路を阻害するこの経路は、活性化されたときには通常分化した細胞を増殖させるがＥＳ細胞の増殖に必要ではない。したがって、結果として、ＥＳ細胞の選択的増殖が得られる。
【００１８】
本発明の特定の実施態様では、化合物は、１つ以上のマイトジェン活性化プロテインキナーゼ、例えば、ＥＲＫ１およびＥＲＫ２を阻害する。本発明のもう１つの実施態様では、化合物は、類似の効果を有するＳＨＰ−２を、例えば、ｇｐ１３０へのこの酵素の結合を阻害することによって阻害する。さらなる実施態様では、このインヒビターはＭＥＫを阻害する。
【００１９】
以下の実施例に記載する、本発明の特定の実施態様では、ＭＥＫインヒビターＰＤ０９８０５９は、培養物中のＥＳ細胞を未分化状態のまま維持するために使用される。本発明のさらなる特定の実施態様は、ＭＥＫ−１およびＭＥＫ−２に選択的であるマイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼインヒビターＵ０１２６である（Ｆａｖａｔａら、１９９８）。炭疽病致死因子もまた、ＰＤ０９８０５９と同様のＭＡＰＫＫ阻害プロファイルを示すことが見出されている（Ｄｕｅｓｂｅｒｙら、１９９９）。これらの種々の化合物は、単独でまたは組み合わせてまたは他の因子とともに使用され得る。
【００２０】
本発明のインヒビターは、分化した細胞における細胞周期を阻害して、それによって細胞増殖を抑制または遅延させ得る。本発明の特定のインヒビターは、ＭＥＫを阻害し、そしてこの酵素の下流のサイクリンの誘導は、結果として中断される；したがって、細胞周期の種々の期が影響を受け、そして分化した細胞のＳ期へのサイクリン依存性エントリーが阻害される。本発明の別の選択的増殖は、ｒａｓ／ＭＡＰＫカスケードの成分のダウンレギュレーションによって達成され得る。ＭＫＰ−３は、ＭＡＰキナーゼホスファターゼおよびＥＲＫの公知のダウンレギュレーターの一例であり、そして本発明の特定の実施例では、ＭＫＰ−３は、導入遺伝子（transgene）によってＥＳ細胞に導入されている。これは、任意の２つ以上の本発明のインヒビターの組み合わせの使用によって得られるべきＥＳ細胞の選択的培養物に対するさらなる選択肢である。詳細には、ｒａｓ／ＭＡＰＫカスケードの成分およびＳＨＰ−２の両方とも、同時に阻害され得るが、一般的にインヒビターのあらゆる組み合わせが本発明に含まれる。
【００２１】
「増殖（propagation）」および対応する用語は、ＥＳ細胞が娘細胞を形成して、ＥＳ細胞の総数が増加する、すなわち、ＥＳ細胞が生存しそして増加することを意味することを意図する。「増殖（proliferation）」およびその対応する用語は、同じ意味を有することを意図する。「自己再生」およびその対応する用語は、少なくとも１つの娘細胞が親と同一であることを意味することを意図する。
【００２２】
本発明の第２の局面によれば、ＥＳ細胞の増殖を促進する第１の化合物および第１の化合物に対する細胞の応答を増強する第２の化合物の存在下でＥＳ細胞を維持する工程を含む、ＥＳ細胞の培養方法が提供される。
【００２３】
これは、増加したＥＳ細胞増殖が、所定量の第１の化合物に対して達成されるという利点を有する。この方法の例において、ＬＩＦは、当該技術分野で公知であるようにＥＳ細胞増殖を促進するために使用され、そしてある量の第２の化合物は、ＬＩＦの効果を増加させる。第１の化合物は、好ましくは、細胞表面レセプターを介して作用しそして少なくとも１つのレセプターサブユニットを介してその活性を発揮し、そして第２の化合物は、細胞内シグナリング経路を改変して第１の化合物に対するＥＳ細胞の応答を増加させる。
【００２４】
第２の化合物は、本発明の第１の局面によれば好ましくはインヒビターであり得る。第２の化合物はまた、第１の化合物からのＥＳ細胞増殖誘導シグナルを伝達する同じレセプターサブユニットに結合するかあるいは影響を与え得る。
【００２５】
本発明の第３の局面は、以下の化合物：
（ａ）ＥＳ細胞の増殖または生存を促進する化合物；および
（ｂ）ＥＳ細胞以外の細胞の増殖または生存を阻害する化合物；
の存在下でＥＳ細胞を維持する工程を含む、ＥＳ細胞の培養方法を提供する。
【００２６】
化合物（ａ）は、ＥＳ細胞増殖を促進する公知の化合物から選択され、特にＬＩＦであり、そして本発明の第１の局面の化合物から次に選択され得る化合物（ｂ）と組み合わせて使用され得る。
【００２７】
本発明の好ましい実施態様では、化合物（ａ）および（ｂ）の組み合わせは相乗作用的である。したがって、ＥＳ細胞は、自己再生するＥＳ細胞の割合をともに増加させる２つの因子の存在下で維持され、そしてこの増加は、２つの化合物を別々の培養物中で使用して組み合わせた自己再生の割合の増加よりも大きい。
【００２８】
化合物（ｂ）は、ＥＳ細胞以外の細胞の増殖に必須であるシグナリング経路を適切に選択的に阻害し、化合物（ａ）によって媒介される残存するＥＳ細胞の増殖と組み合わせて、分化した細胞の選択的死または増殖阻害に至る。本発明の第２の局面の１つの実施態様では、化合物（ｂ）は、本発明の第１の局面に関する上記および下記の阻害化合物から選択され、そして好ましくは、ｒａｓ／ＭＡＰＫカスケードのインヒビターである。化合物（ａ）は、代表的には、未分化ＥＳ細胞の増殖を促進する公知の化合物から選択され、例えば、ＥＳ細胞においてサイトカインレセプターｇｐ１３０を活性化するサイトカインである。ＬＩＦは１つの例である。もう１つは、ＩＬ−６とｓＩＬ−６Ｒとの組み合わせである。
【００２９】
本発明は、さらに、第４の局面において、ＥＳ細胞の培養のための培養培地を提供し、そしてこれはＥＳ細胞以外の細胞の増殖または生存を選択的に阻害する化合物を含む。
【００３０】
第５の局面では、本発明は、ＥＳ細胞の増殖または生存を促進する第１の化合物および第１の化合物に対するＥＳ細胞の応答を増強する第２の化合物を含む、ＥＳ細胞の培養のための培地を提供する。
【００３１】
第６の局面では、本発明は、ＥＳ細胞の培養のための培養培地を提供し、これは、（ａ）ＥＳ細胞の増殖または生存を促進する化合物、および（ｂ）ＥＳ細胞以外の細胞の増殖または生存を阻害する化合物を含む。
【００３２】
本発明の培養培地は、好ましくは、本発明の第１から第３の局面に関して記載したような成分によって特徴付けられ、そして好ましくは、従来の培養培地成分をさらに含む。
【００３３】
本発明は、さらに、本発明の第４から第６の局面のいずれかによる培養培地の存在下でＥＳ細胞を培養する工程を含む、ＥＳ細胞の実質的に純粋な培養物を得るおよび／または維持する方法を提供する。本発明は、ＥＳ細胞タイプに限定されることなく適用され、そして脊椎動物細胞、特に、哺乳動物細胞、霊長類細胞、齧歯類細胞、およびヒト細胞に適切に適用され得る。さらに詳細に以下に記載される特定の実施態様では、マウス細胞が使用されている。「ＥＳ」細胞とは、胚幹細胞、胚性癌腫細胞、胚生殖腺細胞、胚由来多能性幹細胞、および生殖腺由来幹細胞を含むことを意図する。
【００３４】
本発明のなおさらなる局面は、胚または胚様体から細胞を単離する工程、およびＥＳ細胞以外の細胞の増殖または生存を選択的に阻害する化合物の存在下で細胞の培養物を維持する工程を含む、ＥＳ細胞を誘導する方法を提供する。こうして得られた細胞は、次いで、ＥＳ細胞以外の細胞の増殖または生存を選択的に阻害する化合物またはさらなる化合物の存在下で維持され得る。以下に記載の特定の実施態様では、この方法は、インビボで胚を発達させる工程、原始羊膜腔形成の前に胚を採取する工程、および採取物から細胞を単離する工程を含み、そして単離された細胞からＥＳ細胞を誘導する工程、あるいは、そこからＥＳ細胞を単離する前に化合物の存在下でインビボで胚を培養する工程を含む。
【００３５】
本発明のよりさらなる局面は、インビトロで胚を発達させる工程、胚の内部細胞塊から細胞を単離する工程、およびＥＳ細胞以外の細胞の増殖または生存を選択的に阻害する化合物の存在下で単離した細胞を維持する工程を含む、ＥＳ細胞を誘導する方法を提供する。この方法は、化合物の存在下で培養前に原始内胚葉を除去する工程を含み得る。
【００３６】
ＥＳ細胞の誘導に関する本発明の上記２つの局面では、ＥＳ細胞以外の細胞の増殖または生存を選択的に阻害する化合物は、酵素ＳＨＰ−２の活性を阻害するか、ｒａｓ／ＭＡＰＫカスケードを阻害するか、ＭＥＫを阻害するか、マイトジェン活性化プロテインキナーゼを阻害するか、または非ＥＳ細胞のＳ期へのサイクリン依存性エントリーを阻害する化合物から選択される。したがって、本発明のＥＳ細胞−選択メカニズムを介してＥＳ細胞を誘導する可能性が開かれ、これがこれまで可能ではなかった種々の種について初めてＥＳ細胞を誘導することができた。
【００３７】
本発明の特定の実施態様では、ＥＳ細胞を、未分化胚芽細胞へ再導入するに際し、生殖系を含む発育中の動物のすべての細胞タイプに寄与するような能力を保持しながらインビトロで増殖した。したがって、これらの細胞は、幹細胞自己再生の調節を研究するために扱いやすい実験系を示す。ＥＳ細胞増殖を調節する基礎となるメカニズムの同定は、他の哺乳動物種からＥＳ細胞株を樹立するための改善された方策を開発し、そして体性幹細胞の自己再生の理解に寄与し得る。
【００３８】
分化した細胞においてｇｐ１３０のリガンド媒介係合により、ＳＴＡＴ３およびＳＨＰ−２シグナリング分子はリクルートメントおよびリン酸化する。内因性ｇｐ１３０またはキメラＧＲｇｐ（２７８）レセプターのいずれかによるＥＳ細胞の刺激は、ＳＨＰ−２のチロシンリン酸化を増加させた。この改変は、ｇｐ１３０のチロシン１１８がフェニルアラニンに変異した場合にブロックされ、この単一のチロシンがＳＨＰ−２のリクルートメントに必須であることを確認した。この欠損にもかかわらず、変異したレセプターは、ＥＳ細胞の自己再生を完全に指示し得、活性化リガンドが低濃度であっても効果的であることを証明した。興味深いことに、内因性ＳＨＰ−２遺伝子の両方のコピーとも変異されているＥＳ細胞は生存しており、そして自己再生を受ける。変異タンパク質がＮ末端ＳＨ２ドメインの欠失を有するので、これらのＥＳ細胞がｇｐ１３０と結合することが知られている領域は、ＬＩＦに対する異なる応答性を示すことが期待され得る−実際、細胞はインビトロで分化するための損なわれた能力を示した。
【００３９】
ＥＲＫ１およびＥＲＫ２の活性化も、ＥＳ細胞におけるｇｐ１３０の刺激に関連するので、発明者らは、キメラレセプターによるこれらのＭＡＰキナーゼの活性化を検討した。ＥＳ細胞におけるｇｐ１３０の刺激は、ＥＲＫ１およびＥＲＫ２リン酸化の増加の引き金となったが、Ｙ１１８Ｆキメラレセプターの係合の際に、応答は検出され得なかった。さらに、ＭＥＫインヒビターＰＤ０９８０５９の阻害濃度でのＥＳ細胞の処理は、ＥＳ細胞の自己再生をブロックせず、むしろわずかに増強したようである。しかし、明らかに、ＬＩＦの不在下では、ＰＤ０９８０５９はＥＳ細胞の分化を抑制しなかった。これらの結果は、本発明に従って、ＳＨＰ−２またはＳｈｃのようなもう１つの経路のいずれかを介する、ＥＲＫ１およびＥＲＫ２の活性化が、ＥＳ細胞の増殖を維持することに重要ではないことを証明する。ＥＳ細胞の選択的増殖を得るには、非ＥＳ細胞におけるこれらの酵素の活性化が相対的に大きな重要性を有している。
【００４０】
このｇｐ１３０依存性ＥＲＫ活性化が要求されないことは、ＥＳ細胞の準形質転換された性質に関連し得る。分化した細胞におけるＥＲＫの樹立した機能は、サイクリンＤの誘導によって少なくとも一部、Ｇ１／Ｓによる移行を調節することである。しかし、ＥＳは、非常に短いＧ１期を有し、そしてＧ１関連制御メカニズムをほとんど有していないようである（Ｓａｖａｔｉｅｒら、１９９４；Ｓａｖａｔｉｅｒら、１９９６）。さらに、ＥＲＫシグナリング依存性が低いことは、ＥＳ細胞が、血清、強力なマイトジェン、およびＥＲＫ活性のインデューサーの不在下で増殖し続けるという観察と一致する（ＪｏｈａｎｓｓｏｎおよびＷｉｌｅｓ、１９９５）。このように、本発明によるＳ期へのサイクリン依存性エントリーの阻害は、ＥＳ細胞の選択的増殖および／または生存を可能にする。
【００４１】
ＥＳ細胞のインビトロ分化は、Ｇ１サイクリン発現の誘導、長いＧ１期の樹立、および細胞分割の速度の低下に関連する（Ｓａｖａｔｉｅｒら、１９９６）。この移行は、おそらく、外胚葉細胞の初期の迅速な拡張後、原腸形成時に胚で正常に生じる変化を反映する。興味深いことに、アフリカツメガエルまたはマウスのいずれかの胚発達中のＳＨＰ−２活性の阻害は、中胚葉細胞株の形成における欠損のため正常に原腸形成できないことに関連する。したがって、外胚葉細胞の分化は、胚細胞が最初に正常な増殖制御メカニズムに役立つようになる点を示す。重要なことに、これはまた、胚組織の外植した移植片が悪性奇形癌を形成する能力を失う状態である。
【００４２】
したがって、ＳＨＰ−２／ＥＲＫ活性化は、ＥＳ細胞増殖に必須ではない。発明者らの結果は、チロシン１１８が、ｇｐ１３０レセプターの活性をダウンレギュレートして、ＧＲｇｐ（Ｙ１１８Ｆ）レセプターによって刺激された細胞において用量応答の劇的なシフトおよびＳＴＡＴ３の延長した活性化を引き起こすことを示唆する。最近まで、ＳＨＰ−２は、最初に、シグナリングのポジティブエフェクターとして、あるいはｓｒｃファミリーキナーゼのアダプタータンパク質または潜在的アクチベーターのいずれかとみなされてきた。しかし、ネガティブ調節機能は、ＳＨＰ−１（エリスロポエチンレセプター機能のサプレッサー）との相同性、およびＣＴＬＡ−４（Ｔ細胞レセプターのインヒビター）との相互作用の両方によって示唆された。チロシン１１８の変異が、神経芽腫細胞および肝癌細胞においてＳＴＡＴ３シグナリングを増加させることが、最近報告されている。ＳＴＡＴ３応答性プロモーター構築物からの転写も、触媒的に不活性なＳＨＰ−２タンパク質の過剰発現によって増加しており、このことはホスファターゼがこの効果のメディエーターであることを示した。この結論は、Ｙ１１８Ｆレセプターおよびその関連のＪＡＫキナーゼの両方の持続したリン酸化によって支持された。しかし、触媒的に不活性なＳＨＰ−２タンパク質の過剰発現は、トランスフェクトしたＥＳ細胞における用量応答のわずかなシフトのみを生じ（ＴＢ、ＣＳ未公表）、これは、ＳＨＰ−２のホスファターゼ活性の損失が、ＧＲｇｐ（Ｙ１１８Ｆ）レセプターの増加した活性に全体的に寄与し得ないことを示す。
【００４３】
ＥＳ細胞におけるｇｐ１３０依存性ＳＨＰ−２およびＥＲＫ活性化が必須の機能ではないことは、自己再生における傑出した役割をさらに強調する。しかし、高濃度のＧ−ＣＳＦにおけるＧＲｇｐ（Ｙ１１８Ｆ）トランスファクタントの制限された増殖は、過剰のシグナリングがＥＳ細胞増殖を妨害し得ることを示すので、興味深い。ＳＴＡＴ３の過剰活性化は、この表現型に関連があるが、それはＹ１１８Ｆレセプターの刺激が、ＳＴＡＴ３のチロシンリン酸化を持続させ、および内因性ＳＴＡＴ３標的遺伝子ＳＯＣＳ３の持続した活性化を生じるからである。さらに、ＳＴＡＴ３ドッキング部位のいくつかの組み合わせた変異誘発は、Ｙ１１８Ｆ置換の効果を抑制し得る。
【００４４】
チロシン１１８のさらに下流のシグナルはまた、ＥＳ細胞の増殖および分化に影響を与え得た。ＭＥＫインヒビターＰＤ０９８０５９での処理で観察される自己再生の増加は、ＥＲＫ活性化がＥＳ細胞の増殖を損なうことを意味する。興味深いことに、ＰＣ１２細胞のｇｐ１３０依存性調節および星状膠細胞分化の研究は、ＭＡＰＫ経路の活性化が、ＳＴＡＴ３を介して媒介されるシグナルと拮抗し得ることを示唆している。両方の場合とも、低下したＭＡＰＫ活性は、ＳＴＡＴ３依存性リポーター構築物からの転写を増強した。ＰＤ０９８０５９で処理したＥＳ細胞では、自己再生は、ＬＩＦの飽和レベルでさえ増強された。これは、本発明のインヒビターの効果が、ＬＩＦによって刺激されるＥＲＫ活性の阻害によるだけでなく、血清に存在する分化インデューサー、またはＥＳ細胞およびその分化した子孫によって分泌されるものの作用をブロックすることによって生じ得ることを示唆する。
【００４５】
本発明を、ここで、図面によって示した特定の実施態様で説明する：
図１は、ＥＳ細胞におけるＳＨＰ−２のｇｐ１３０依存性リン酸化を示す。
【００４６】
図２は、ＥＳ細胞のｇｐ１３０依存性自己再生および増殖におけるチロシン１１８の変異の効果を示す。
【００４７】
図３は、ＥＳ細胞におけるＥＲＫ１およびＥＲＫ２のｇｐ１３０依存性リン酸化を示す。
【００４８】
図４は、ＥＳ細胞自己再生およびＥＲＫ活性化におけるＭＥＫインヒビターＰＤ０９８０５９の効果を示す。
【００４９】
図５は、ＥＳ細胞多能性におけるＰＤ０９８０５９の効果を示す。
【００５０】
図６は、ｇｐ１３０およびキメラＧＲｇｐ１３０レセプターの刺激後の活性化したＳＴＡＴ３の衰退を示す。
【００５１】
図７は、ＥＳ細胞におけるＳＯＣＳ−３遺伝子発現のｇｐ１３０依存性誘導を示す。
【００５２】
図８は、幹細胞分化におけるＭＥＫインヒビターの効果を示す。
【００５３】
より詳細には、図１は、ＥＳ細胞におけるＳＨＰ−２のｇｐ１３０依存性リン酸化を示す。ＧＲｇｐ（２７８）またはＧＲｇｐ（Ｙ１１８Ｆ）キメラレセプターのいずれかを発現するＥＳ細胞を、ＩＬ−６（１００ｎｇ／ｍｌ＋ｓＩＬ−６Ｒ）またはＧ−ＣＳＦ（３０ｎｇ／ｍｌ）で１５分間誘導した。ＳＨＰ−２タンパク質を、未刺激または刺激した細胞のライセートから免疫沈降し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分画し、そしてニトロセルロースメンブランにトランスファーした。フィルターを、抗ホスホチロシン抗体（上のパネル）でプローブし、剥がして、そして抗ＳＨＰ−２抗体で再プローブした（下のパネル）。ＳＨＰ−２のチロシンリン酸化形態および２つの追加のタンパク質の位置を矢印で示す。
【００５４】
図２は、ＥＳ細胞のｇｐ１３０依存性自己再生および増殖におけるチロシン１１８の変異の効果を示す。
【００５５】
（Ａ）Ｇ−ＣＳＦに応じてＧＲｇｐ（２７８）およびＧＲｇｐ（Ｙ１１８Ｆ）キメラレセプターによって媒介される幹細胞再生。Ｏｃｔ−４遺伝子座からのβガラクトシダーゼ発現によって測定される自己再生を、Ｇ−ＣＳＦ（３００ｆｇ〜３０ｎｇ／ｍｌ）とともに培養し、６日後にアッセイした。２つの独立したクローンについてのデータを、ＩＬ−６（１００ｎｇ／ｍｌ＋ｓＩＬ−６Ｒ）との応答に関して標準化した３重の試料の２重測定について平均±ｓ．ｅ．ｍ．で表す。
【００５６】
（Ｂ）３００ｆｇ、３０ｐｇ、および３０ｎｇ／ｍｌのＧ−ＣＳＦとの６日培養後のＧＲｇｐ（２７８）およびＧＲｇｐ（Ｙ１１８Ｆ）トランスファクタントによって形成された、Ｘ−ｇａｌ染色した代表的なコロニーの顕微鏡写真。
【００５７】
（Ｃ）サイトカインなし、ＩＬ−６（１００ｎｇ／ｍｌ＋ｓＩＬ−６Ｒ）、Ｇ−ＣＳＦ（３０ｎｇ／ｍｌ）、またはＩＬ−６（１００ｎｇ／ｍｌ＋ｓＩＬ−６Ｒ）およびＧ−ＣＳＦ（３０ｎｇ／ｍｌ）と６日間培養した後のＧＲｇｐ（２７８）およびＧＲｇｐ（Ｙ１１８Ｆ）トランスファクタントによって形成された、代表的なコロニーの顕微鏡写真。
【００５８】
図３は、ＥＳ細胞におけるＥＲＫ１およびＥＲＫ２のｇｐ１３０依存性リン酸化を示す。ＧＲｇｐ（２７８）およびＧＲｇｐ（Ｙ１１８Ｆ）キメラレセプターのいずれかを発現するＥＳ細胞を、処理しないか、あるいはＩＬ−６（１００ｎｇ／ｍｌ＋ｓＩＬ−６Ｒ）またはＧ−ＣＳＦ（３０ｎｇ／ｍｌ）で１０または２０分間刺激するかのいずれかであった。細胞ライセートを、１０％ＳＤＳ−アクリルアミドゲル上で分離し、ニトロセルロースメンブラン上にエレクトロブロットし、そしてＥＲＫおよびＳＴＡＴ３の活性リン酸化形態に特異的な抗体で連続してプローブした。リン酸化および脱リン酸化ＥＲＫの両方に結合する抗体で、剥がしたフィルターを再プローブすることによって、等価量のタンパク質を試料中にロードしたことを確認した。
【００５９】
図４は、ＥＳ細胞自己再生およびＥＲＫ活性化における、ＭＥＫインヒビターＰＤ０９８０５９の効果を示す。
【００６０】
（Ａ）ＰＤ０９８０５９で処理したＥＳ細胞の自己再生。ＬＩＦの亜飽和レベル（５Ｕ／ｍｌ）で増殖したＤ０２７ＥＳ細胞を、ＰＤ０９８０５９で５日間処理し、そしてＯｃｔ−４遺伝子座からのβ−ガラクトシダーゼ発現についてアッセイした。データを、ＬＩＦとの応答に関して標準化した３重の試料の２重測定について平均±ｓ．ｅ．ｍで表す。
【００６１】
（Ｂ）ＥＲＫ活性化のＰＤ０９８０５９依存性阻害。ＧＲｇｐ（２７８）でトランスフェクトしたＤ０２７細胞を、ＬＩＦ（５Ｕ／ｍｌ）およびＰＤ０９８０５９の亜飽和レベルで４８時間培養した。次いで、細胞を、Ｇ−ＣＳＦ（３０ｎｇ／ｍｌ）で１０分間刺激し、試料緩衝液中で溶解し、そしてリン酸特異的抗ＥＲＫ抗体とのイムノブロッティングによってＥＲＫ活性化について分析した。次いで、このフィルターをリン酸化および脱リン酸化したＥＲＫの両方に結合する抗体でプローブすることによって、等価量のタンパク質をすべての試料においてロードしたことを確認した。
【００６２】
（Ｃ）ＬＩＦに対するＥＳ細胞の用量応答におけるＰＤ０９８０５９の効果。２５μＭ  ＰＤ０９８０５９またはベヒクル（０．０５％ＤＭＳＯ）中のＬＩＦに対するＤ０２７ＥＳ細胞の用量応答を、Ｏｃｔ−４遺伝子座からのβ−ガラクトシダーゼ発現によって測定した。データを、ＬＩＦ（１１１Ｕ／ｍｌ）＋ベヒクルでの処理に対する細胞の最大応答に関して標準化した３重の試料の２重測定について平均±ｓ．ｅ．ｍで表す。
【００６３】
図５は、ＥＳ細胞多能性におけるＰＤ０９８０５９の効果を示す。ＺＩＮ４０  ＥＳ細胞を、２５μＭ  ＰＤ０９８０５９＋５Ｕ／ｍｌ  ＬＩＦで４８時間処理し、ＬＩＦを含む培地をさらに２４時間再供給し、次いでＣ５７ＢＬ／６胚盤胞にマイクロインジェクションした。胚を、妊娠９．５日目に収集し、そしてβ−ガラクトシダーゼ活性について染色した。代表的な胚をパネルに示す。
【００６４】
図６は、ｇｐ１３０およびキメラＧＲｇｐ１３０レセプターで刺激した後の活性化ＳＴＡＴ３の衰退を示す。ＧＲｇｐ（２７８）およびＧＲｇｐ（Ｙ１１８Ｆ）ＥＳ細胞トランスファクタントを、ＩＬ−６（１００ｎｇ／ｍｌ＋ｓＩＬ−６Ｒ）またはＧ−ＣＳＦ（３０ｎｇ／ｍｌ）で２５分間刺激し（０＊）、サイトカインを含まない培地を再供給し、そして試料を４０分間隔で収集した。細胞ライセートのイムノブロットを、ＳＴＡＴ３の活性リン酸化形態に特異的な抗体で、次いでリン酸化および非リン酸化ＳＴＡＴ３の両方を認識する抗体と連続してプローブした。ＳＴＡＴ３の活性化が、より遅く移動するＳＴＡＴ３種の出現に関連し、おそらくＳＴＡＴ３のセリンリン酸化形態であることに留意すること。
【００６５】
図７は、ＥＳ細胞におけるＳＯＣＳ−３遺伝子発現のｇｐ１３０依存性誘導を示す。
【００６６】
（Ａ）未刺激（−）のあるいはＬＩＦ（Ｌ、１００ユニット／ｍｌ）またはＧ−ＣＳＦ（Ｇ、３０ｎｇ／ｍｌ）のいずれかで所定の時間（分）刺激した、ＧＲｇｐ（２７８）、ＧＲｇｐ（Ｙ１２６−２７５Ｆ）、およびＧＲｇｐ（Ｙ１１８Ｆ）レセプターを発現するＥＳ細胞から調製したトータルＲＮＡ（１０ｇ）について、ノーザン分析を行った。約３ｋｂ  ＳＯＣＳ−３  ｍＲＮＡのハイブリダイゼーションおよび１８Ｓ  ｒＲＮＡのエチジウムブロミド染色を、それぞれ上および下の３つのパネルに示す。
【００６７】
（Ｂ）パネルＡに示すＳＯＣＳ−３  ｍＲＮＡ発現の代表的な図。ＳＯＣＳ−３  ｍＲＮＡハイブリダイゼーションを、リン光分析（phosphorimage analysis）によって定量し、そしてシグナルを、ＬＩＦでの刺激後９０分に各細胞株で得られるシグナルに関して標準化した。
【００６８】
図８は、本発明のＭＥＫインヒビターが凝集培養物において未分化ＥＳ細胞を維持することを示す。
【００６９】
（実施例１）
材料および方法
細胞培養およびトランスフェクション
ＥＳ細胞を、１０％ウシ胎児血清、０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、およびＬＩＦを含むＧｌａｓｇｏｗ改変イーグル培地（ＧＭＥＭ）中で、フィーダーセルなしで維持した。Ｄ０２７細胞は、相同組換えによって不活性化したｌｉｆ遺伝子およびＯｃｔ−４遺伝子座内に挿入されたＩＲＥＳ−βｇｅｏリポーターの両方のコピーを有する。ＺＩＮ４０細胞は、分化した細胞タイプで広く発現される核局在化したβ−ガラクトシダーゼマーカー遺伝子を有する。トランスフェクションは、２×１０７細胞を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ遺伝子パルサーを使用して、０．４ｃｍキュベット中で０．８ｋＶおよび３μＦで１００μｇの直線にしたプラスミドＤＮＡとエレクトロポレートすることにより行った。安定にトランスフェクトしたクローンを、２０μｇ／ｍｌゼオシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む培地中で選択した。
【００７０】
プラスミド構築
ヒトＧ−ＣＳＦＲの細胞外ドメインをトランスメンブランドメインおよび完全な細胞質領域を含むマウスｇｐ１３０のＥｃｏＲＩフラグメントに融合することによって、ＧＲ／ｇｐ１３０キメラレセプターを生成した。チロシン１１８のフェニルアラニン置換を、ＰＣＲオーバーラップ変異誘発によってｇｐ１３０の細胞内ドメインに導入した。ＰＣＲ産物を、ＧＲｇｐ（２７８）キメラ中に置換し、そして配列決定した。レセプターｃＤＮＡを発現ベクターｐＣＡＧＩＺ内に挿入した。このベクターは、サイトメガロウイルスエンハンサー−ヒトβ−アクチンプロモーター、レセプターｃＤＮＡの挿入のための部位、内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）、およびゼオシン耐性遺伝子からなる、二シストロン発現カセットを含む。
【００７１】
自己再生アッセイ
Ｄ０２７細胞におけるＯｃｔ−４遺伝子座からのβ−ガラクトシダーゼの発現を、ＯＮＰＧアッセイで定量した。細胞を、２４ウェルディッシュ中でウェルあたり５０００でプレートし、そしてサイトカインの存在または不在下で６日間培養した。細胞をＰＤ０９８０５９で処理し、ウェルあたり２５００でプレートし、そしてインヒビターの添加前に通常の培養培地で一晩培養した。６日目に、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、そして０．４ｍｌの０．２５Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ  ７．５、０．５ｍＭ  ＤＴＴ、０．５％  ＮＰ４０で溶解した。ライセート（４０μｌ）を、マイクロタイタープレート中で１００μｌのＯＮＰＧ緩衝液（６０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、４０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、１．２ｍＭ  ＯＮＰＧ）と混合し、３７℃にて２〜４時間インキュベートし、そして４２０ｎｍの吸光度を読みとった。すべてのアッセイを３重で行った。
【００７２】
免疫沈降およびイムノブロッティング
プレーティング（１００ｍｍディッシュあたり２〜３×１０６細胞）１日後のＥＳ細胞に、１％ウシ胎児血清を含みそしてサイトカインを含まない培地を再供給した。翌日、細胞を、血清を含まない培地に移し、４時間後にＩＬ−６（１００ｎｇ／ｍｌ＋可溶性レセプター）またはＧ−ＣＳＦ（３０ｎｇ／ｍｌ）で１５分間刺激した。次いで、細胞を、氷冷したＰＢＳで１回洗浄し、そして掻き取って１ｍｌの氷冷した溶解緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ  ｐＨ  ７．４、０．５％  ＮＰ４０、１ｍＭ  ＮａＶＯ３、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ  ＰＭＳＦ）に入れた。澄明なライセートを、１μｇ抗ＳＨＰ−２抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）と４℃にて１時間インキュベートし、次いでプロテインＡセファロースを加え、そしてインキュベーションを一晩続けた。免疫沈降物を、２×ＳＤＳ試料緩衝液中で溶解し、１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルでの電気泳動によって分画し、そしてニトロセルロース上にエレクトロブロットした。ブロッキング緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ７．４、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０、１％  ＢＳＡ）で一晩処理した後、メンブランを、抗ホスホチロシン抗体４Ｇ１０（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）および抗ＳＨＰ−２抗体の順にプローブした。ブロットを、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ウサギＩｇＧとインキュベートし、そしてＥＣＬ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して発色した。抗体を、６２．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ  ｐＨ  ６．８、２％ＳＤＳ、１００ｍＭ  ２−メルカプトエタノール中５０℃での３０分間のインキュベーションによるプロービングの間にメンブランから剥がした。
【００７３】
ＳＴＡＴ３およびＥＲＫリン酸化の分析については、６ウェルディッシュのウェルあたり１×１０６ＥＳ細胞を、プレートした。細胞を、血清を欠乏させ、そして上記のようにサイトカインで処理し、次いで１００μｌのＳＤＳ試料緩衝液中で溶解した。１０μｌアリコートを、１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分画し、ニトロセルロース上にエレクトロブロットし、そして供給業者（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）によって提供される指示書に従って、抗ＥＲＫおよび抗ＳＴＡＴ３抗体でプローブした。
【００７４】
ノーザンブロッティング
ＲＮＡを上記と同様に調製したが、夾雑ＤＮＡを除去するために、第２のイソプロパノール沈降を２Ｍ  ＬｉＣｌ中４℃での一晩沈降に置きかえた。トータルＲＮＡ（１０μｇ）を、０．６６Ｍホルムアルデヒド／アガロースゲル上で分離し、そしてナイロンメンブラン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）にトランスファーした。ハイブリダイゼーションを、［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ標識したＤＮＡプローブを使用して、上記のように行った。プローブは、ＳＯＣＳ３  ＥＳＴプラスミド（ＩＭＡＧＥクローン番号８６４８０５、ＨＧＭＰから得られるＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡ４４４８２８）のＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩフラグメントであった。配列分析は、このプローブがＳＯＣＳ−３（Ｕ８８３２８）のヌクレオチド１６６６〜２１７６に対応することを確認した。
【００７５】
キメラ分析
ＺＩＮ４０  ＥＳ細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６胚盤胞に注入し、そして偽妊娠マウスにトランスファーした。マウスを、妊娠９．５日目で屠殺し、そして胚をＸ−ｇａｌで染色した。
【００７６】
結果
チロシン１１８はＥＳ細胞においてＳＨＰ−２のｇｐ１３０依存性リン酸化を必要とする
ＢＡＦプロＢ細胞株におけるこれまでの研究は、ＳＨＰ−２ならびにＭＡＰＫＥＲＫ１およびＥＲＫ２のｇｐ１３０依存性活性化が、ｇｐ１３０の細胞質領域におけるチロシン１１８（膜から１１８アミノ酸残基に位置する）によって媒介されることを示した。ＥＳ細胞におけるチロシン１１８の機能的役割を検討するために、発明者らは、ｇｐ１３０のトランスメンブラン領域および細胞質領域に融合した顆粒球コロニー刺激因子レセプター（Ｇ−ＣＳＦＲ）の細胞外ドメインからなるキメラレセプターをコードするｃＤＮＡを構築した。ＥＳ細胞はＧ−ＣＳＦＲを正常には発現せずそしてＧ−ＣＳＦに対する自己再生応答を示さないので（データは示さず）、これらのキメラレセプターは、内因性サイトカインレセプターの独立したシグナリングを検討するために使用され得る。非改変キメラレセプターのＧＲｇｐ（２７８）またはフェニルアラニンがチロシン１１８の代わりに置換されている変異レセプターのＧＲｇｐ（Ｙ１１８Ｆ）のいずれかをコードするｃＤＮＡを、ｐＣＡＧＩＺ発現ベクターにクローニングし、そしてエレクトロポレーションによってＤ０２７ＥＳ細胞に安定に導入した。
【００７７】
いくつかの分化した細胞タイプにおいて、ＳＨＰ−２は、チロシンリン酸化され、次いでチロシンリン酸化ｇｐ１３０レセプターサブユニットへリクルートメントする。ＳＨＰ−２がＥＳ細胞においてこの改変を受けるかどうかを検討するために、ＳＨＰ−２免疫沈降物を、ＧＲｇｐ（２７８）およびＧＲｇｐ（Ｙ１１８Ｆ）トランスフェクタントから調製し、次いでＩＬ−６（＋ｓＩＬ−６Ｒ）またはＧ−ＣＳＦのいずれかで刺激し、そしてウエスタンブロッティングによってホスホチロシンについてプローブした（図１Ａ）。内因性ｇｐ１３０またはＧＲｇｐ（２７８）レセプターのいずれかによって刺激された細胞でリン酸化されたＳＨＰ−２が増加したことが検出された。２つの追加のチロシンホスホプロテインが、リン酸化ＳＨＰ−２と同時沈降した。約１００ｋＤで移動するバンドは、リン酸化ＳＨＰ−２と関連することがすでに報告されているＩＲＳ−１関連アダプタータンパク質であるＧａｂ１を示し得る。ＳＨＰ−２のリン酸化の増加はＧＲｇｐ（Ｙ１１８Ｆ）レセプターの刺激後には検出されず、チロシン１１８が、ＥＳ細胞におけるこのホスファターゼの効果的なｇｐ１３０依存性リン酸化に必須であることを確認した。
【００７８】
ＳＨＰ−２活性化はＥＳ細胞自己再生に必要とされない
ＳＨＰ−２の活性化がＥＳ細胞の増殖に必要であるかどうかを決定するために、Ｇ−ＣＳＦに対するＧＲｇｐ１３０の応答を、自己再生アッセイで測定した。Ｄ０２７細胞は、幹細胞特異的遺伝子Ｏｃｔ−４内に挿入されたＬａｃＺ遺伝子を有する。結果として、この組み込まれたリポーター遺伝子の発現は、未分化ＥＳ細胞に制限され、そして得られるβ−ガラクトシダーゼ活性は、幹細胞自己再生の尺度を提供する。さらに、ＬＩＦ遺伝子の両方のコピーは、遺伝子ターゲティングによって不活性化されており、したがってＥＳ細胞増殖の自己分泌刺激を低下させる。各レセプター構築物についての２つの独立して単離したクローンからのβ−ガラクトシダーゼ活性を、３００ｆｇ〜３０ｎｇ／ｍｌ  Ｇ−ＣＳＦ処理６日後の中密度培養物中で測定した。
【００７９】
図２Ａに示されるデータは、ＧＲｇｐ（２７８）トランスフェクタントの自己再生が用量依存的様式で増加し、３〜３０ｎｇ／ｍｌ  Ｇ−ＣＳＦでプラトーに達したことを示す。逆に、ＧＲｇｐ（Ｙ１１８Ｆ）ＥＳ細胞の最大自己再生応答は、ちょうど３０ｐｇ／ｍｌ  Ｇ−ＣＳＦで達した。３０ｐｇ／ｍｌ  Ｇ−ＣＳＦで維持されたＧＲｇｐ（Ｙ１１８Ｆ）コロニーの形態は、未分化ＥＳ細胞を代表した（図２Ｂ）。この結果は、チロシン１１８によるＳＨＰ−２の活性化が、ＥＳ細胞自己再生を指示するために必要とされないことを証明する。両方のレセプターキメラとも同じレベルでＥＳ細胞トランスフェクタントの細胞表面に発現されたが、これは、１２５Ｉ標識したＧ−ＣＳＦとの結合によって測定した（データは示さず）。したがって、用量応答のシフトは、変異体レセプターが、シグナリング活性を増強し得たことを示唆する。
【００８０】
興味深いことに、より高濃度のＧ−ＣＳＦで、ＧＲｇｐ（Ｙ１１８Ｆ）トランスフェクタントは、一般に未分化ＥＳ細胞にみられるより平坦になったコロニー形態よりもむしろ細胞の小さい凝集体を形成した（図２Ｂ）。これらのコロニーは、β−ガラクトシダーゼを発現し、そして幹細胞マーカーのアルカリホスファターゼについて陽性に染色し（図２Ｂおよびデータを示さず）、ＥＳ細胞が未分化のままであったことを示した。これは、Ｇ−ＣＳＦでの最初の処理後、これらの培養物にＩＬ−６＋ｓＩＬ−６Ｒを含む培地を再供給した場合、代表的なＥＳ細胞増殖およびコロニー形態の再現によって確認した（データは示さず）。
【００８１】
高濃度のＧ−ＣＳＦでのＧＲｇｐ（Ｙ１１８Ｆ）の異常な出現は、単にＧ−ＣＳＦに対するＹ１１８Ｆレセプターの親和性が増加することのみではないようである（図２Ｃ）。なぜなら、この応答が、高レベルのＬＩＦで処理した野生型細胞で、または飽和レベルのＩＬ−６（＋ｓＩＬ−６Ｒ）、Ｇ−ＣＳＦ、もしくはＩＬ−６（＋ｓＩＬ−６Ｒ）＋Ｇ−ＣＳＦで処理したＧＲｇｐ（２７８）トランスフェクタントで、観察されないからである。さらに、細胞をＧ−ＣＳＦおよびＩＬ−６（＋ｓＩＬ−６Ｒ）で同時に刺激した場合に、高レベルのＧ−ＣＳＦでＧＲｇｐ（Ｙ１１８Ｆ）細胞の表現型を維持した。この観察は、異常なＥＳ細胞の形態が、自己再生シグナルの部分的損失によるという説明を排除し、そして表現型がｇｐ１３０の下流のシグナルの過剰活性化から生じることを示唆する。これらのデータをまとめると、ＥＳ細胞においてｇｐ１３０シグナリングをダウンレギュレートする点で、チロシン１１８の重要な役割を指摘する。
【００８２】
チロシン１１８はＥＲＫ１およびＥＲＫ２の活性化に必要である
ＳＨＰ−２の活性化がＥＲＫ経路にｇｐ１３０をカップリングし得るので、発明者らは、チロシン１１８がまた、ＥＳ細胞においてＥＲＫ１およびＥＲＫ２の活性化に必要とされるかどうかを検討した。Ｇ−ＣＳＦまたはＩＬ−６（＋ｓＩＬ−６Ｒ）で処理したＧＲｇｐ１３０トランスフェクタントにおけるＥＲＫの活性化を、ＥＲＫ１およびＥＲＫ２のリン酸化（活性化）形態に特異的な抗体でのイムノブロッティングによって評価した（図３）。活性化したＥＲＫの基礎レベルを、血清枯渇後の未処理細胞で一貫して検出した。増加したＥＲＫリン酸化を、内因性ｇｐ１３０およびＧＲｇｐ（２７８）レセプターによって刺激した細胞において観察した。これは、ＧＲｇｐ（Ｙ１１８Ｆ）キメラによる刺激の証拠ではなかった。ＳＴＡＴ３のチロシンリン酸化形態に特異的な抗体での再プロービングによって、両方のキメラレセプターがＳＴＡＴ３を活性化することに効果的であることを確認した。これらの結果は、チロシン１１８がＥＳ細胞においてＥＲＫ経路の活性化を媒介することを証明する。
【００８３】
ＰＤ０９８０５９でＥＲＫ活性化をブロッキングすることはＥＳ細胞増殖を損なわない
シグナル自己再生に対するＧＲｇｐ（Ｙ１１８Ｆ）の能力は、ＥＲＫ活性化がＥＳ細胞の増殖に必要とされないことを意味する。この仮説をテストするために、Ｄ０２７細胞を、特異的ＭＥＫインヒビターであるＰＤ０９８０５９の存在下で培養した。亜飽和濃度のＬＩＦ（５Ｕ／ｍｌ）をこれらの実験に使用して、自己再生シグナリングの変化に対するアッセイの感度を増加させた。驚くべきことに、３〜２５μＭのＰＤ０９８０５９でのＥＳ細胞の処理は、ベヒクル単独で培養した細胞と比較した場合、自己再生を阻害しなかった（図４Ａ）。さらに驚くべきことに、実際、自己再生のレベルは、１２〜２５μＭで達成されている最大レベルで用量依存的な様式で増加した。５０μＭ以上のＰＤ０９８０５９の濃度で、ＥＳ細胞の増殖は損なわれたが、これはおそらく薬物のいくつかの非特異的阻害効果の結果と考えられ、そしてＸ−ｇａｌ染色によるβ−ガラクトシダーゼに陽性に染色される小さい未分化コロニーを生じた（データは示さず）。
【００８４】
ｇｐ１３０によるＥＲＫ活性化がこれらの長期培養物において連続的に抑制されることを確認するために、ＧＲｇｐ（２７８）細胞を、インヒビター＋ＬＩＦとともに４８時間インキュベートし、次いでＧ−ＣＳＦでキメラレセプターによって刺激した。イムノブロットは、ＥＲＫ１およびＥＲＫ２のＧ−ＣＳＦ依存性リン酸化が、３〜１２μＭから次第に減少し、そして２５μＭのＰＤ０９８０５９で効果的にブロックされたことを示した（図４Ｂ）。ＰＤ０９８０５９の阻害濃度での未分化ＥＳ細胞の持続した増殖は、ＥＲＫ１およびＥＲＫ２のｇｐ１３０依存性活性化が、ＥＳ細胞の増殖に必要とされないことを確認する。
【００８５】
自己再生におけるＰＤ０９８０５９の効果は、インヒビターが、ＬＩＦに対するＥＳ細胞の用量応答を変化し得ることを示唆した。ＥＳ細胞の自己再生を、２５μＭのＰＤ０９８０５９またはベヒクル（０．２％ＤＭＳＯ）のいずれかの存在下で、０．１〜１００Ｕ／ｍｌ  ＬＩＦでの処理後にアッセイした（図４Ｃ）。ＰＤ０９８０５９での処理は、すべての濃度のＬＩＦでβ−ガラクトシダーゼ活性のレベルを増加させた。これは、薬物が、そのＬＩＦに対する応答を増強するよりもむしろＥＳ細胞の用量依存性を変化させないことを意味する。重要なことには、ＰＤ０９８０５９は、ＬＩＦの不在下でＥＳ細胞の分化をブロックしなかった。
【００８６】
ＰＤ０９８０５９中で増殖したＥＳ細胞は多能性を保持する
ＥＳ細胞コロニー形態およびＯｃｔ−４発現は、未分化表現型の信頼性のある指標であるが、細胞が多能性であることを証明していない。したがって、発明者らは、ｇｐ１３０依存性ＥＲＫシグナリングの不在下で増殖したＥＳ細胞が、発達中の胚に組み込まれそして適切に分化する能力を有するかどうかを検討した。細胞を、ＬＩＦ＋２５μＭ  ＰＤ０９８０５９の存在下で、またはＬＩＦの不在下で、４８時間低密度（１０００細胞／ｃｍ２）で培養した。次いで、これらに、ＬＩＦを含むがインヒビターを含まない培地をさらに２４時間再供給した後、マウス胚盤胞にマイクロインジェクションした。ＺＩＮ４０細胞は、分化した細胞タイプで広く発現される核局在化したβ−ガラクトシダーゼマーカーを有するので、この実験に使用した。β−ガラクトシダーゼについての妊娠中期の胚の染色は、ＰＤ０９８０５９で処理したＥＳ細胞がキメラに寄与することを示した（図５）。しかし、ＬＩＦの不在下で４８時間培養した細胞は、胚をコロニー化できなかった（データは示さず）。この結果は、ｇｐ１３０依存性ＥＲＫ活性が、ＥＳ細胞の多能性を維持することに必要とされないことを確認する。
【００８７】
ＳＴＡＴ３シグナルの減衰はチロシン１１８によって媒介される
発明者らは、これまでに、ＳＴＡＴ３の活性化が、ＥＳ細胞のｇｐ１３０依存性自己再生に必須であることを証明している。チロシン１１８を変異することがこの重要なレギュレーターに影響を与えるかどうかを検討するために、ＳＴＡＴ３の活性化を、ＧＲｇｐ（２７８）および（Ｙ１１８Ｆ）トランスフェクタントにおいて比較した。３０ｆｇ／ｍｌ〜３００ｎｇ／ｍｌのＧ−ＣＳＦでの２５分間の細胞の急激な刺激によっても、キメラレセプターによって誘導されるＳＴＡＴ３のチロシンリン酸化のレベル間に顕著な差は示されなかった（データは示さず）。しかし、レセプターを介するシグナリングは、ＳＴＡＴ３シグナル持続を検討した場合に区別された（図６）。細胞を、Ｇ−ＣＳＦまたはＩＬ−６（＋ｓＩＬ−６Ｒ）のいずれかで２５分間刺激し、サイトカインを含まない培地を再供給し、次いで試料を４０分間隔で収集した。リン酸化したＳＴＡＴ３の衰退についての類似のタイムコースが、内因性ｇｐ１３０レセプターまたはＧＲｇｐ（２７８）のいずれかによる刺激後に得られたが、シグナルは１２０分では検出不可能であった。逆に、ＳＴＡＴ３の活性化は、Ｇ−ＣＳＦ処理したＧＲｇｐ（Ｙ１１８Ｆ）細胞中で持続され、そして１６０分でも検出し得た。この結果は、チロシン１１８が、ＳＴＡＴ３の活性化を正常に減衰するシグナルを媒介することを示す。
【００８８】
チロシン１１８の置換は染色体標的遺伝子の過剰誘導に至る
ＳＴＡＴ３の延長した活性化がＥＳ細胞において遺伝子調節に影響を及ぼすかどうかを研究するために、発明者らは、ＳＯＣＳ遺伝子の発現を検討した。これらの遺伝子は、サイトカインによって迅速に誘導され、そしてサイトカインレセプター機能のネガティブレギュレーターとして機能し得るタンパク質をコードする。ＳＯＣＳ−１は、Ｍ１細胞におけるＳＴＡＴ３標的であるが、これは、ＬＩＦに応答するＳＯＣＳ−１発現のいかなる増加も観察されなかったので、ＥＳ細胞における場合ではあり得ない（データは示さず）。逆に、ＬＩＦとのＬＩＦＲ／ｇｐ１３０複合体によるかまたはＧＲｇｐ（２７８）キメラによるかのいずれかで刺激されたＥＳ細胞において、ＳＯＣＳ−３の発現が一時的に誘導された（図７）。この観察された発現のピークレベルは、サイトカインの添加後９０分で生じ、そして３時間目までに非誘導レベル近くに戻った。４つのＳＴＡＴ３ドッキング部位が部位特異的変異誘発によって排除されているキメラレセプターであるＧＲｇｐ（Ｙ１２６−２７５Ｆ）によって刺激したＥＳ細胞において、ＳＯＣＳ−３転写物の誘導はなかった。この結果は、ＥＳ細胞においてＳＯＣＳ−３遺伝子がＳＴＡＴ３の標的であることを意味する。重要なことには、ＧＲｇｐ（Ｙ１１８Ｆ）レセプターの活性化後、９０分で得られたＳＯＣＳ−３発現のピークレベルは増強され、そしてＬＩＦレセプターまたはＧＲｇｐ（２７８）による刺激とは逆に、ＳＯＣＳ−３  ｍＲＮＡレベルは、刺激後少なくとも６時間まで上昇し続けた。したがって、おそらく、ＳＴＡＴ３の延長した活性化がその標的遺伝子の増強された発現を生じるようである。これは、ＧＲｇｐ（Ｙ１１８Ｆ）トランスフェクタントについて観察されたＧ−ＣＳＦに対する用量応答でのシフトの基礎となり得る。
【００８９】
ＭＥＫインヒビターＰＤ０９８０５９は凝集培養物において未分化ＥＳ細胞を持続する
凝集は、ＥＳ細胞を誘導して、分化しそして多数の分化した細胞タイプを含む胚様体として知られる構造物を形成する。未分化細胞は、誘導された分化および／またはアポトーシスのため胚様体形成の間にほとんどまたは完全に排除される。
【００９０】
Ｏｃｔ４遺伝子座へのβｇｅｏの標的された組込みを有するＩＯＵＤ２ＥＳ細胞を使用して、β−ガラクトシダーゼに対する組織化学的染色によって未分化細胞の可視化を可能にした。凝集体を、０、２５、５０、７５、または１００μｍのＰＤ０９８０５９の存在下で１００細胞／２０μｌ液滴を播種することによって懸滴を形成した。凝集体を、６日間維持し、次いでゼラチンコーティングしたディッシュに移し、そして一晩付着させた。次いで、培養物を固定し、そしてβ−ガラクトシダーゼ活性に対して染色した。Ｍｅｋインヒビターの不在下で、胚様体は十分に分化され、そしてＯｃｔ４  β−ガラクトシダーゼ発現細胞は生育物中にほとんど存在しなかった（図８、上のパネル）。しかし、ＰＤ０９８０５９の存在下では、未分化のβ−ガラクトシダーゼポジティブ細胞の表示は、用量応答様式で増加した。７５〜１００μｍのＰＤ０９８０５９濃度で、大多数の細胞は分化しなかった（図８、下のパネル）。これらの条件における未分化細胞の数は、ＭＥＫインヒビターの不在下でのコントロール培養物に存在する数をはるかに超えており、したがって、この結果は、細胞の剥離によるだけではないことを示している。この所見は、ＥＲＫ活性化が、胚様体の分化のプロセスに重要であり、そして幹細胞の分化が、Ｍｅｋ活性を低下またはなくすことによって抑制され得ることを示す。
【００９１】
（実施例２）
幹細胞株の誘導
幹細胞株を単離するために、胚をインビボで発達させ、そして移植し、次いで原始羊膜腔形成前に採取した（６．５ｄｐｃ等価）。外胚葉を顕微解剖し、そしてＰＤ０９８０５９の存在下でＥＳ細胞培地中の懸濁培養物に入れた。数日懸濁培養した後、外胚葉を解離し、そして組織培養プラスチック上にプレートした。ＰＤ０９８０５９を、未分化幹細胞数が増加するまで、培養培地中に維持した。幹細胞株はまた胚から誘導されたが、この胚は、胚盤胞段階でＩＣＭの免疫手術的単離と、それに続く原始内胚葉の顕微手術除去およびＥＳ細胞培地＋ＰＤ０９８０５９中での培養によって、インビトロで発達させた胚である。
【００９２】
本発明によれば、ＥＳ細胞自己再生がＥＲＫ活性化から独立していることは、実際の応用において重要である。Ｒａｓ／ＭＡＰＫ経路のようなインヒビターは、未分化ＥＳ細胞の増殖を促進する。未分化細胞タイプの増殖および成熟を抑制することによって、このようなインヒビターは、ＥＳ細胞のルーチンの操作およびデノボ誘導を容易にする。
【００９３】
（実施例３）
ＭＫＰ−３導入遺伝子の発現
ＭＫＰ−３をコードする導入遺伝子をＥＳ細胞に挿入し、そしてそこから得たＥＳ細胞の培養物はＭＫＰ−３を発現した。ＥＳ細胞に関して高度に精製された培養物が維持され、そしてこれらのＥＳ細胞の分化が、ＭＫＰ−３導入遺伝子を発現しないコントロール培養物中のＥＳ細胞の分化と比較して実質的に低下したことを観察した。この実験はまた、本発明の支持において遺伝学的証拠を提供する。
【００９４】
（参考文献）
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Pages, G., P. Lenormand, G. L'Allemain, J.C. Chambard, S.Meloche, およびJ. Pouyssegur. 1993. Mitogen-activated protein kinases p42mapk and p44mapk are required for fibroblast proliferation. Proc Natl Acad Sci USA. 90:8319-8323。
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