(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｉ型ＩＦＮ治療を必要とするヒト以外の動物に対し、Ｉ型ＩＦＮと、複合体のＩ型ＩＦＮと結合可能なヒトインターフェロンα／βレセプターのＩＦＮＡＲ２サブユニットの可溶性細胞外ドメインとの複合体を、そのようなＩＦＮ治療を提供するのに有効な量投与することを含む、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）のインビボ作用を延長する方法であって、
該Ｉ型ＩＦＮが以下の配列
ａ）天然Ｉ型ＩＦＮ；
ｂ）Ｉ型ＩＦＮの生物活性を持つａ）の断片；
ｃ）ａ）又はｂ）と少なくとも９０％の配列同一性を持ち、かつＩ型ＩＦＮ生物活性を持つａ）又はｂ）の変異体；
ｄ）極めてストリンジェントな条件下にａ）またはｂ）をコードする天然ＤＮＡ配列の相補体とハイブリダイズするＤＮＡ配列によりコードされ、Ｉ型ＩＦＮ生物活性を持つａ）またはｂ）の変異体；又は
ｅ）Ｉ型ＩＦＮ生物活性を持つａ）、ｂ）、ｃ）又はｄ）の塩
からなり；かつ
該ＩＦＮＡＲ２サブユニットが以下の配列
ｆ）天然のヒトＩＦＮＡＲ２ポリペプチド鎖；
ｇ）ＩＦＮＡＲ２生物活性を持つｆ）の断片、
ｈ）ｆ）又はｇ）と少なくとも９０％の配列同一性を持ち、かつＩＦＮＡＲ２生物活性を持つｆ）又はｇ）の変異体；
ｉ）極めて（ｈｉｇｈｌｙ）ストリンジェントな条件下にｆ）またはｇ）をコードする天然ＤＮＡ配列の相補体とハイブリダイズするＤＮＡ配列によりコードされ、ＩＦＮＡＲ２生物活性を持つｆ）またはｇ）の変異体；又は
ｊ）ＩＦＮＡＲ２生物活性を持つｆ）、ｇ）、ｈ）又はｉ）の塩
からなる、上記方法。
【請求項２】
複合体がＩ型ＩＦＮ及びＩＦＮＡＲ２の非共有結合型複合体を含む、請求項１の方法。
【請求項３】
Ｉ型ＩＦＮ及びＩＦＮＡＲ２が別々に投与され、複合体がインビボで形成される、請求項２の方法。
【請求項４】
複合体が、Ｉ型ＩＦＮがＩＦＮＡＲ２と共有結合により結合されている複合体を含む、請求項１の方法。
【請求項５】
複合体が、Ｉ型ＩＦＮがＩＦＮＡＲ２とペプチド結合により結合されている融合蛋白質を含む、請求項１の方法。
【請求項６】
Ｉ型ＩＦＮがＩＦＮＡＲ２とペプチドリンカーの方法により結合された請求項５の方法。
【請求項７】
Ｉ型ＩＦＮがＩＦＮα、ＩＦＮβ又はＩＦＮωである請求項１の方法。
【請求項８】
Ｉ型ＩＦＮがＩＦＮβである請求項７の方法。
【請求項９】
Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）及び、複合体のＩ型ＩＦＮと結合可能なヒトインターフェロンα／βレセプターのＩＦＮＡＲ２サブユニットの可溶性細胞外ドメインとの複合体であって、該Ｉ型ＩＦＮが該ＩＦＮＡＲ２に共有結合又はペプチド結合により結合され、
該Ｉ型ＩＦＮが以下の配列
ａ）天然Ｉ型ＩＦＮ；
ｂ）Ｉ型ＩＦＮの生物活性を持つａ）の断片；
ｃ）ａ）又はｂ）と少なくとも９０％の配列同一性を持ち、かつＩ型ＩＦＮ生物活性を持つａ）又はｂ）の変異体；
ｄ）極めてストリンジェントな条件下にａ）またはｂ）をコードする天然ＤＮＡ配列の相補体とハイブリダイズするＤＮＡ配列によりコードされ、Ｉ型ＩＦＮ生物活性を持つａ）またはｂ）の変異体；又は
ｅ）Ｉ型ＩＦＮ生物活性を持つａ）、ｂ）、ｃ）又はｄ）の塩
からなり、さらに
該ＩＦＮＡＲ２サブユニットが以下の配列
ｆ）天然のヒトＩＦＮＡＲ２ポリペプチド鎖；
ｇ）ＩＦＮＡＲ２生物活性を持つｆ）の断片、
ｈ）ｆ）又はｇ）と少なくとも９０％の配列同一性を持ち、かつＩＦＮＡＲ２生物活性を持つｆ）又はｇ）の変異体；
ｉ）極めて（ｈｉｇｈｌｙ）ストリンジェントな条件下にｆ）またはｇ）をコードする天然ＤＮＡ配列の相補体とハイブリダイズするＤＮＡ配列によりコードされ、ＩＦＮＡＲ２生物活性を持つｆ）またはｇ）の変異体；又は
ｊ）ＩＦＮＡＲ２生物活性を持つｆ）、ｇ）、ｈ）又はｉ）の塩
からなる、上記複合体
の形態であるか、または
ＩＦＮがＩＦＮＡＲ２と非共有結合により結合された複合体
の形態でインターフェロンを保存することを含む、Ｉ型インターフェロン保存期間改良法。
【請求項１０】
医薬品として許容される担体、及びＩ型インターフェロン
（ＩＦＮ）と複合体のＩ型ＩＦＮと結合可能なヒトインターフェロンα／βレセプターのＩＦＮＡＲ２サブユニットの可溶性細胞外ドメインとの複合体を含む医薬品であって、
該Ｉ型ＩＦＮが以下の配列
ａ）天然Ｉ型ＩＦＮ；
ｂ）Ｉ型ＩＦＮの生物活性を持つａ）の断片；
ｃ）ａ）又はｂ）と少なくとも９０％の配列同一性を持ち、かつＩ型ＩＦＮ生物活性を持つａ）又はｂ）の変異体；
ｄ）極めて（ｈｉｇｈｌｙ）ストリンジェントな条件下にａ）またはｂ）をコードする天然ＤＮＡ配列の相補体とハイブリダイズするＤＮＡ配列によりコードされ、Ｉ型ＩＦＮ生物活性を持つａ）またはｂ）の変異体；又は
ｅ）Ｉ型ＩＦＮ生物活性を持つａ）、ｂ）、ｃ）又はｄ）の塩
からなり、さらに
該ＩＦＮＡＲ２サブユニットが以下の配列
ｆ）天然のヒトＩＦＮＡＲ２ポリペプチド鎖；
ｇ）ＩＦＮＡＲ２生物活性を持つｆ）の断片、
ｈ）ｆ）又はｇ）と少なくとも９０％の配列同一性を持ち、かつＩＦＮＡＲ２生物活性を持つｆ）又はｇ）の変異体；
ｉ）極めてストリンジェントな条件下にｆ）またはｇ）をコードする天然ＤＮＡ配列の相補体とハイブリダイズするＤＮＡ配列によりコードされ、ＩＦＮＡＲ２生物活性を持つｆ）またはｇ）の変異体；又は
ｊ）ＩＦＮＡＲ２生物活性を持つｆ）、ｇ）、ｈ）又はｉ）の塩
からなる、上記医薬品。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明はヒトインターフェロンα／βレセプター（ＩＦＮＡＲ２）細胞外ドメインのポリペプチド配列、及びＩ型インターフェロン（ＩＦＮα、ＩＦＮβ及びＩＦＮω）より構成されるＩ型インターフェロン複合体に関する。これら複合体はインビボに於ける遊離型ＩＦＮの抗ウイルス、抗ガン及び免疫変調活性に関する安定性を改善し、作用を増強し、そして薬物動態を延長する。より特定すれば、複合体はＩ型インターフェロン（ＩＦＮα、ＩＦＮβ及びＩＦＮω）又は生物学的に活性であるその亜分画と複合している、ＩＦＮＡＲの全細胞外ドメイン又はそのインターフェロン結合亜分画のポリペプチド配列を含む、融合蛋白質、または共有結合複合体、または非共有結合複合体である。
発明の背景
インターフェロンは白血球及び繊維芽細胞由来のＩ型インターフェロン、又は突然変異誘発剤誘導型あるいは”免疫”型のII型インターフェロンのいずれかに分類される（Ｐｅｓｔｋａら、１９８７）。配列の同一性及び共通生物活性の分析より、Ｉ型インターフェロンはインターフェロンアルファ（ＩＦＮα）、インターフェロンベータ（ＩＦＮβ）及びインターフェロンオメガ（ＩＦＮω）を、一方II型インターフェロンはインターフェロンγ（ＩＦＮγ）を含む。ＩＦＮα、ＩＦＮβ及びＩＦＮω遺伝子は第９染色体短腕上にクラスターを形成している（Ｌｅｎｇｙｌ、１９８２）。少なくとも２５個の非対立性のＩＦＮα遺伝子と６個の非対立性ＩＦＮω遺伝子、そして１個のＩＦＮβ遺伝子が存在する。いずれもが単一の共通先祖遺伝子より進化したものと信じられている。種内ではＩＦＮα遺伝子はそれぞれの間で少なくとも８０％の配列同一性を持っている。ＩＦＮβ遺伝子はＩＦＮαとおよそ５０％の配列同一性を持ち；又ＩＦＮω遺伝子はＩＦＮαと７０％の相同性を持っている（Ｗｅｉｓｓｍａｎら、１９８６；Ｄｒｏｎら１９９２）。ＩＦＮαは分子量域１７−２３ｋＤａ（１６５−１６６アミノ酸）で、ＩＦＮβは〜２３ｋＤａ（１６６アミノ酸）であり、又ＩＦＮωは〜２４ｋＤａ（１７２アミノ酸）である。
【０００２】
Ｉ型インターフェロンはウイルスや寄生性の感染に対する宿主防御活性、抗ガンサイトカインとしての活性、及び免疫変調としての活性を持つ多面発現性のサイトカインである（Ｂａｒｏｎら、１９９４；Ｂａｒｏｎら、１９９１）。Ｉ型インターフェロンの生理反応には、正常及び形質転換細胞に対する抗増殖活性；リンパ細胞、ナチュラルキラー細胞及び貪色細胞中の細胞毒性活性の促進；細胞分化の変調；クラスＩＭＨＣ抗原の発現促進；クラスIIＭＨＣの阻害；及び各種細胞表面レセプターの変調が含まれる。正常生理条件下では、ＩＦＮα及びＩＦＮβ（ＩＦＮα／β）は、その発現を感染体（ウイルス、細菌、マイコプラズマ及び原虫）、ｄｓＤＮＡ及びサイトカイン（Ｍ−ＣＳＦ、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＴＮＦα）を含む各種インデューサーの添加によりアップレギュレートを受けるながら大部分の細胞から低レベルで持続性に分泌されている。Ｉ型インターフェロンのインビボでの作用は、代理マーカーであるネオプテリン、２’，５’オリゴアデニレート合成酵素、及びβ２ミクログロブリンを用いモニターできる（Ａｌａｍら、１９９７；Ｆｉｅｒｌｂｅｃｋら、１９９６；Ｓａｌｍｏｎら、１９９６）。
【０００３】
Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮα／β／ω）は、細胞表面レセプター複合体を介して作用し、抗ウイルス、抗ガン、及び免疫変調といった特異的な生物効果を誘導する。Ｉ型ＩＦＮレセプター（ＩＦＮＡＲ）は少なくとも２種類のポリペプチド鎖より構成されるヘテロ多量体レセプター複合体である（Ｃｏｌａｍｏｎｉｃｉら、１９９２；Ｃｏｌａｍｏｎｉｃｉら、１９９３；Ｐ；ａｔａｎｉａｓら、１９９３）。これら鎖に関する遺伝子は第２１染色体上に発見されており、又その蛋白質は多くの細胞上に表現される（Ｔａｎら、１９７３）。レセプター鎖は一般に、モノクローナル抗体ＩＦＮαＲ３及びＩＦＮａＲβ１でそれぞれ認識されることからアルファ及びベータと命名される。ごく最近、これらアルファサブユニットはＩＦＮＡＲ１と、ベータサブユニットはＩＦＮＡＲ２と命名し直された。大部分の細胞では、ＩＦＮＡＲ１（アルファ鎖、Ｕｚｅサブユニット）（Ｕｚｅら、１９９０）は分子量１００−１３０ｋＤａであり、一方ＩＦＮＡＲ２（ベータ鎖、ＢＬ、ＩＦＮα／βＲ）は分子量１００ｋＤａである。特定のタイプの細胞（単球細胞株及び正常骨髄細胞）では、ＩＦＮＡＲ２サブユニット（βS）は分子量５１ｋＤａの末端切断されたレセプターとして発現される、変形レセプター複合体が同定されている。ＩＦＮＡＲ１及びＩＦＮＡＲ２βS及びβLサブユニットはクローン化されている（Ｎｏｖｉｃｋら、１９９４；Ｄｏｍａｓｋｉら、１９９５）。ＩＦＮＡＲ２βS及びβLサブユニットは同一の細胞外及び膜貫通ドメインを持つが、しかし、細胞質ドメインは最初の１５アミノ酸のみ同一であるに過ぎない。ＩＦＮＡＲ２サブユニットは単独でＩＦＮα／βに結合できるが、一方ＩＦＮＡＲ１サブユニットはＩＦＮα／βに結合できない。ヒトＩＦＮＡＲ１レセプターサブユニットだけをマウスＬ−９２９繊維芽細胞内にトランスフェクトすると、ＩＦＮα８／ＩＦＮαＢを除きヒトＩＦＮαｓは細胞に結合できなかった（Ｕｚｅら、１９９０）。ヒトＩＦＮＡＲ１サブユニットが無い状態でＬ細胞にトランスフェクトされたヒトＩＦＮＡＲ２サブユニットは、結合Ｋｄおよそ０．４５ｎＭでヒトＩＦＮα２に結合する。ヒトＩＦＮＡＲ２サブユニットをヒトＩＦＮＡＲ１サブユニット存在状態でトランスフェクトすると、Ｋｄ０．０２６−０．１１４ｎＭの高い親和結合が観察された（Ｎｏｖｉｃｋら、１９９４；Ｄｏｍａｎｓｋｉら、１９９５）。多くの細胞では５００−２０，０００の高親和性ＩＦＮ結合部位及び２，０００−１００，０００の低親和性ＩＦＮ結合部位が存在すると考えられる。ＩＦＮＡＲ１／２複合体（α／βSまたはα／βL）サブユニットはＩＦＮαと高い親和性で結合するが、α／βLペアのみが機能的なシグナルレセプターであるらしい。
【０００４】
マウスＬ−９２９細胞へのＩＦＮＡＲ１及びＩＦＮＡＲ２βＬサブユニットのトランスフェクション、続くＩＦＮα２とのインキュベーションは、抗ウイルス状態を誘導し、細胞内の蛋白質のリン酸化を開始し、続いて細胞内キナーゼ（いＪａｋ１及びＴｙｋ２）及び転写因子（ＳＴＡＴ１、２、及び３）の活性化を引き起こす（Ｎｏｖｉｃｋら、１９９４；Ｄｏｍａｎｓｋｉら、１９９５）。対応する実験において、ＩＦＮＡＲ２βＳサブユニットのトランスフェクションは同様の反応を開始できなかった。即ち、機能活性（抗ウイルス反応）にはＩＦＮＡＲ２βLサブユニットが必要とされ、ＩＦＮＡＲ１サブユニットとの結合において最大の誘導を伴う。
【０００５】
膜結合型細胞表面ＩＦＮＡＲに加え、可溶性ＩＦＮＡＲがヒト尿及び血清中に見つかっている（Ｎｏｖｉｃｋら、１９９４；Ｎｏｖｉｃｋら、１９９５；Ｎｏｖｉｃｋら、１９９２；Ｌｕｔｆａｌｌａら、１９９５）。血清より単離された可溶性ＩＦＮＡＲはＳＤＳ−ＰＡＧＥ上では５５ｋＤａの見かけ上の分子量を有するが、尿に由来する可溶性ＩＦＮＡＲは４０−４５ｋＤａの見かけ上の分子量を有する（ｐ４０）。可溶性ｐ４０  ＩＦＮＡＲ２に関する転写体はｍＲＮＡレベルで存在しており、又カルボキシル末端に２個の新規アミノ酸を持つＩＦＮＡＲ２サブユニットの全細胞外ドメインの大部分を含む。可溶性ＩＦＮＡＲ２レセプター上には５ヶ所のグリコシル化可能部位がある。可溶性ｐ４０  ＩＦＮＡＲ２はＩＦＮα２及びＩＦＮβと結合し、インビトロにてＩＦＮα種混合体（”白血球ＩＦＮ”）及び個々のＩ型ＩＦＮの抗ウイルス活性を阻害することが示されている（Ｎｏｖｉｃｋら、１９９５）。組換え体ＩＦＮＡＲ２サブユニットＩｇ融合蛋白質は、Ｄａｕｉ細胞及びα／βSサブユニットを二重トランスフェクトしたＣＯＳ細胞への各種Ｉ型ＩＦＮ種（ＩＦＮα、ＩＦＮαβ、ＩＦＮαＤ、ＩＦＮβ、ＩＦＮα  Ｃｏｎｌ及びＩＦＮω）の結合を阻害することが示された。
【０００６】
Ｉ型ＩＦＮのシグナル伝達経路が最近特定された（Ｐｌａｔａｎｉａｓら、１９９６；Ｙａｎら、１９９６；Ｑｕｒｅｓｈｉら、１９９６；Ｄｕｎｃａｎら、１９９６；Ｓｈａｒｆら、１９９５；Ｙａｎｇら、１９９６）。シグナル伝達に至る最初の事象は、ＩＦＮα／β／ωのＩＦＮＡＲ２サブユニットへの結合と、それに続くＩＦＮＡＲ１サブユニット結合によるＩＦＮＡＲ１／２複合体の形成により起こると考えられる（Ｐｌａｔａｎｉａｓら１９９４）。ＩＦＮα／β／ωのＩＦＮＡＲ１／２複合体への結合により、ＩＦＮＡＲ１及びＩＦＮＡＲ２サブユニット上のリン酸化特異的チロシンと信じられている２種類のヤヌスキナーゼ（Ｊａｋ１及びＴｙｋ２）の活性化が起こる。これらサブユニットがリン酸化されると、ＳＴＡＴ分子（ＳＴＡＴ１、２及び３）がリン酸化され、その結果ＳＴＡＴ転写複合体の２量体化が起こり、続いて転写複合体の核への移動と特異的ＩＦＮ誘導遺伝子の活性化が起こる。
【０００７】
Ｉ型ＩＦＮの薬物動態又は薬力学作用は、ヒトにて検証されている（Ａｌａｎら、１９９７；Ｆｉｅｒｌｂｅｃｋら、１９９６；Ｓａｌｍｏｎら、１９９６）。ＴＦＮβの排泄は極めて迅速であり、ＩＦＮβの生物有効性はほとんどのサイトカインに期待されるものより低い。ＩＦＮβの薬力学作用はヒトで検証されているが、ＩＦＮβの生物有効性と臨床上の有用性との間の相関は確立されていない。正常健康人ボランティアでは、組換え体ＣＨＯ由来ＩＦＮβの単数回静脈（ｉｖ）大量投与（６ＭＩＵ）は、５分間の迅速な分布期と〜５時間の最終半減期をもたらした（Ａｌａｍら、１９９７）。ＩＦＮβの皮下（ｓｃ）または筋肉内（ｉｍ）投与後、血清レベルは全身投与量のほんの〜１５％で一定になる。ｉｖ、ｉｍ又はｓｃ投与後のＩＦＮβの薬物動態（ＰＢＭＣｓ中の２’５’−オリゴアデニレート合成酵素（３’，５’−ＡＳ）活性の変化として測定した）は最初の２４時間上昇し、その後４日間にわたりゆっくりとベースラインまで減少した。生物学的作用の強さと長さは、投与経路に関係なく同じであった。
【０００８】
２社（ＲＥＢＩＦ−ＳｅｒｏｎｏとＡＶＯＮＥＸ−Ｂｉｏｇｅｎ）が製造したＩＦＮβの薬物動態（ＰＫ）と薬力学作用（ＰＤ）について、６ＭＩＵの単一投薬量の組換え体ＩＦＮβをｉｍ注射し検討されている（Ｓａｌｍｏｎ，１９９６）。ＩＦＮβ及びＩＦＮβ代理マーカーであるネオプテリンの血清濃度が時間を追ってモニターされた。いずれのＩＦＮβ薬も同様のＰＫプロフィールを示し、〜１２〜１５時間で血清ＩＦＮβ値は最高に達したが、ＲＥＢＩＦの方が低い最大値を示した。ＲＥＢＩＦ及びＡＶＯＮＥＸは共にｉｍ注射後３６時間までこの高いＩＦＮβ値を保ち、４８時間のうちにベースラインより若干高い値まで低下した。ネオプテリンレベルはＲＥＢＩＦとＡＶＯＮＥＸ間で極めてよく似たプロフィールを示し、注射後〜４４−５０時間で最高ネオプテリンレベルに達し、注射後７２時間まで上昇したままであり、１４４のうちに漸次ベースラインまで減少した。
【０００９】
ＩＦＮβを多数回投与した場合の薬力作用研究は、ヒトメラノーマ患者を対象に、６ヶ月間にわたり、週３回、ＩＦＮβをｓｃ経路で３ＭＩＵ／投与して実施されている（Ｆｉｅｒｌｂｅｃｋら、１９９６）。薬力作用マーカーである２’，５’−合成酵素、β２−ミクログロブリン、ネオプテリン及びＮＫ細胞活性化は、２回目の注射後（４日目）にピークに達し、２８日目までに低下し、６ヶ月めまで殆ど評価できないレベルに維持された。
【００１０】
要約すると、ヒトに於けるＩ型インターフェロンの排泄は迅速である。長期作用型インターフェロン剤は臨床上の利点を改善すると思われる。
発明の要約
今回、可溶性ＩＦＮＡＲとＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）が結合したＩ型インターフェロン複合体は抗ウイルス、抗ガン及び免疫変調活性に関し、遊離型ＩＦＮに比べて優れた安定性と増強された効果、及び長いインビボでの薬物動態を持つことが判明した。
【００１１】
即ち本発明は、抗ウイルス、抗ガン及び免疫変調活性に関し、遊離型ＩＦＮに比べて優れた安定性と増強された効果、及びインビボに於ける長い薬物動態を持ち、ヒト型インターフェロンα／βレセプター（ＩＦＮＡＲ）サブユニット細胞外ドメインのポリペプチド配列とＩ型インターフェロンを含むＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）複合体を提供する。好ましくは、該複合体はＩＦＮＡＲ２サブユニット細胞外ドメインといずれかのＩ型インターフェロンの複合体、又はＩＦＮＡＲ１サブユニットとＩＦＮαの複合体である。
【００１２】
より特定すれば、該複合体はＩＦＮα又はＩＦＮβ又はＩＦＮω、又はそれらの生物学的に活性であるいずれかの亜分画と結合し、かつＩＦＮＡＲ、特にＩＦＮＡＲ２の全細胞外ドメイン又はそのインターフェロン結合亜分画のポリペプチド配列を含む、融合蛋白質または共有結合複合体、または非共有結合複合体である。
【００１３】
ＩＦＮＡＲは上記の既知細胞外ＩＦＮＡＲレセプターのいずれか、ならびにその活性断片のいずれかを包含することを意図する。ＩＦＮＡＲは別の蛋白質、例えばＩｇＧの様な免疫グロブリンと随意融合させることができる。ＩＦＮ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ及びＩＦＮωは現段階で同定されている２０以上あるＩ型インターフェロン、又は将来同定されるであろう別のＩ型インターフェロンの一つとして意図される。
【００１４】
本発明の実施態様の１つでは、複合体は化学結合を介してＩＦＮＡＲ２に共有結合により結合したＩＦＮαまたはＩＦＮβより成る。
【００１５】
別の実施態様では、ＩＦＮＡＲ２と非共有結合的に結合したＩＦＮα又はＩＦＮβから成る複合体を含む。この別の実施態様はＩ型ＩＦＮ及びＩＦＮＡＲ２をいずれかの比率で含む組成物も含む。Ｉ型ＩＦＮと過剰の上記ＩＦＮＡＲ２よりなる配合もまた本出願の”複合体”の定義に含まれる。２つの成分は別々に投与され、インビボにて複合体を形成させてもよい。即ち、別の実施態様では、複合体はＩＦＮα又はＩＦＮβ及び可溶性ＩＦＮＡＲ２の同時、又は逐次的な同時投与により得られるＩＦＮＡＲ２とＩＦＮの混合体である。更にＩＦＮＡＲは、ＩＦＮの併用投与なしに投与し、内因性の血中ＩＦＮと複合体を形成させ、それによって内因性ＩＦＮの作用を活性化させてよい。
【００１６】
特定の実施態様として、複合体は組換え体蛋白質としてＩＦＮＡＲ２と融合したＩＦＮα又はＩＦＮβ又はＩＦＮωからなるが、該ＩＦＮ及びＩＦＮＡＲ２成分はフレキシブルなペプチドリンカー分子を介して随意融合される。このペプチドリンカーはインビボで切断可能でも、または切断可能でなくても良い。
【００１７】
本発明は更にこれら融合蛋白質、これらＤＮＡを含むベクター、融合蛋白質を発現させる様式にこれらベクターで形質転換された宿主細胞、及びこれら宿主細胞を培養し、それにより発現した融合蛋白質を分離することでこれら融合蛋白質を生産する方法にも関する。
【００１８】
本発明の別の観点は、ＩＦＮのインビボ作用を延長するための本発明の複合体の使用であり、これはＩＦＮにより治療可能ないずれかの病気または状態の処置に有用である。
【００１９】
本発明の別の観点は、ＩＦＮ処方剤の安定化剤としてのＩＦＮＡＲの使用に関する。遊離型ＩＦＮβはオリゴマー化する傾向を有する。これはＩＦＮＡＲ、特にＩＦＮＡＲ２と複合体化することで防がれる。今日、組換え体ＩＦＮβの処方剤は酸性ｐＨを持たねばならず、これが投与時にいくらかの局所性の刺激の原因となるかもしれない。もしＩＦＮＡＲを安定化剤に使用すれば、非酸性組成物を処方することができる。
最適実施態様の詳細な説明
本発明のＩＦＮＡＲ／ＩＦＮ複合体、及び本複合体の製造に必要とされる可能な技術を以下に詳細記述する。結果の多くについては、ＩＦＮβを非限定例として選んでいる。
【００２０】
融合蛋白質． ＩＦＮＡＲ２のＣ末端、又はそのインターフェロン結合サブ配列を、ＩＦＮβ、又はその生物学的に活性な断片のＮ末端に結合したが、これは２つの分子間を架橋するために最短の距離を要求するからである。ＩＦＮβのＣ末端又はその断片をＩＦＮＡＲ２のＮ末端、又はそのサブ配列に結合した逆の構築体も製造することができる。
【００２１】
ＩＦＮＡＲ２／ＩＦＮβ複合体の分子モデルより、活性複合体モデルに於けるＩＦＮＡＲ２の束縛された（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ）Ｃ末端細胞外ドメインとＩＦＮβのＮ末端の間の推定距離は〜８０オングストロームである。活性型複合体が維持されるのを可能にするＩＦＮＡＲ２／ＩＦＮβ複合体を工作するために、例えばＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（ＧＧＧＧＳ）（配列番号１）リピートの様なフレキシブルリンカーを用いてよい。あるいは、リンカーはフレキシブルであり、かつ血清、膜結合、及び／又は細胞プロテアーゼにより蛋白質分解性切断のための標的であってよい。血清プロテアーゼ切断部位の例としては、工作されたＩＦＮＡＲ２／ＩＦＮβ複合融合体は第Ｘａ因子切断部位を持ってよい。第Ｘａ因子はプロトロンビンをＡｒｇ２７３及びＡｒｇ３２２の２ヶ所で切断し、そしてテトラペプチド認識シグナルＩｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ（配列番号２）（Ｎａｇａｉら、１９８４）を持つ。第Ｘａ因子自体は、組織因子を含む様々な活性化因子により内因性及び外因性経路により生成され、血管内皮細胞、マクロファージおよび好中球により放出される。
【００２２】
第Ｘａ因子は、第Ｘａ因子認識配列をリンカードメインに含むｓＩＦＮＡＲ２／ＩＦＮ融合蛋白質に作用し、非共有結合型複合体として機能できるようなＩＦＮＡＲ２／ＩＦＮ複合体を放出できる。
【００２３】
あるいは、ＩＦＮＡＲ２／ＩＦＮβ複合融合体は細胞膜プロテアーゼ（例えばヘプシン）切断部位を持ってよい。へプシンは肝臓組織において高いレベルで発現している５１ｋＤａの膜結合セリンプロテアーゼチモーゲンであるが、腎臓、膵臓、肺、甲状腺、脳下垂体及び精巣にも見いだされる。へプシンにより切断されることが分かっている配列の一つは第ＶＩＩ因子中のＡｒｇ１５２−Ｉｌｅ１５３ペプチド結合である。ヘプシンは腫瘍細胞に於けるトロンビンの形成において結び付けられてきた（Ｋａｚａｍら、１９９５）。
【００２４】
へプシンはリンカードメイン中にへプシン認識配列を含むｓＩＦＮＡＲ２／ＩＦＮ融合蛋白質に作用し、非共有結合型複合体として機能できるようなＩＦＮＡＲ２／ＩＦＮ複合体を放出できる。
【００２５】
あるいは、ＩＦＮＡＲ２／ＩＦＮβ融合複合体は細胞内プロテアーゼ切断部位を持ってよい。様々なプロテアーゼが細胞の壊死又はアポトーシスにより放出される。これらにはカスパーゼ類（インターロイキン１ベータ−変換酵素様プロテアーゼ）、メタロプロテアーゼ類、ライソゾーマルプロテアーゼ類（例えばカテプシンＢ）及びエラスターゼが含まれる。エラスターゼは疾患状態（例えば敗血症）に於いて顆粒細胞より放出され、アミノ酸切断配列に関し広範な特異性を持ち、トリプシンのそれに類似している（Ｅｒｔｅｌら、１９９４；Ｓｚｉｌａｇｙｉら、１９９５）。
【００２６】
細胞内プロテアーゼは、リンカードメイン内に細胞内プロテアーゼ配列を持つｓＩＦＮＡＲ２／ＩＦＮ融合蛋白質に作用し、非共有結合型複合体として機能できるＩＦＮＡＲ２／ＩＦＮ複合体を放出できる。
【００２７】
実際に、ｓＩＦＮＡＲ２（Ｐ４０−ＥＳＥＦＳ）のＣ末端がフレキシブルリンカーを介してＩＦＮβのＮ末端（ＭＳＹ）と結合した融合蛋白質構築体例が幾つか製造されている。ペプチドリンカーの例は以下のとおりである：ＥＳＥＦＳ（ＧＧＧＧＳ）nＭＳＹで、式中のｎは５（配列番号３）、４（配列番号４）、３（配列番号５）、２（配列番号６）又は１（配列番号７）である；ＥＳＥＦＳ（ｈＣＣＴＰ）ＭＳＹで、式中のｈＣＧ−ＣＴＰはＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（配列番号８）である；ＥＳＥＦＳ（ＥＦＭ）nＭＳＹで式中のｎは５（配列番号９）、４（配列番号１０）又は３（配列番号１１）である；ＥＳＥＦＳ（ＥＦＧＡＧＬＶＬＧＧＱＦＭ）ｎＭＳＹで、式中のｎは１（配列番号１２）又は２（配列番号１３）、および複合体モデル内のＩＦＮＡＲ２結合部位とＩＦＮβ間の距離のスパンを持ち、インターフェロンとレセプター成分間に免疫原性エピトープを形成しないいずれかの他の適当なリンカーである。好ましくは、これらリンカーの長さは約３０アミノ酸までである。
【００２８】
共有結合複合体．化学的架橋分子作製の１例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の様な生体分解性リンカーをシステイン存在下に反応させＩＦＮＡＲ２を部位特異的に変化させるか、又はＳｅｒ210からＣｙｓ、又はＡｓｎ89からＣｙｓ部位の様なアミノ酸置換を利用してＩＦＮＡＲ内に作製するものである（部位特異的変異導入）。以下の構築体が作製できるだろう：式中のｎが２０００、５０００又は１０，０００ドルトンであるＩＦＮＡＲ（Ｓ２１０Ｃ）−ＰＥＧｎ−ＩＦＮβ（Ｃｙｓ１７）、又はＩＦＮＡＲ（Ｎ８９Ｃ）−ＰＥＧｎ−ＩＦＮβ（Ｃｙｓ１７）である。
【００２９】
２つの異なる（任意に工作された）部分のＣｙｓの間の共有ジスルフィド結合の形成も本発明の範囲内である。
【００３０】
非共有結合複合体．ヒト型ＩＦＮＡＲ２は、活性複合体の生成が最大になる条件下にてＩＦＮβと複合体を形成する。インビトロでは、実施例に報告の如く、最大活性複合体を得るために、ＩＦＮβ１国際単位（ＩＵ）に対し２．５ｎｇのＩＦＮＡＲ２の最適比が求められる。インビボ活性に関する活性複合体の生成を最大化するＩＦＮβに対するＩＦＮＡＲ２の最適比率は、ＩＦＮβの濃度に依存すると考えられるが、ここに決定されたものである。即ち、例えばＩＦＮβ１０4ＩＵ／マウス／日に於ける抗腫瘍活性促進に関するＩＦＮＡＲ２：ＩＦＮβの最適比率は２．５ｎｇＩＦＮＡＲ２／ｐｇＩＦＮβであるが、一方５×１０4ＩＵ／マウス／日ＩＦＮβの濃度では０．３ｎｇＩＦＮＡＲ２／ｐｇＩＦＮβが最適である。同じ比率をインビトロに於ける活性複合体の生成を最大化するために用いると、インビボに於けるＩＦＮの薬理動態は延長する。
【００３１】
好ましくは、複合体作製に用いるＩＦＮＡＲ２及びＩＦＮβは組換え体分子である。インビトロに於ける抗ウイルスアッセイでは、インターフェロン／レセプター複合体はＩＦＮβ単独の活性に比べ高い活性を有する。一定濃度のＩＦＮβを各種濃度の組換え体ｓＩＦＮＡＲ２と混合し、この混合体（ＩＦＮＡＲ２／ＩＦＮ複合体）をＷＩＳＨ細胞（ヒト羊膜細胞）に加えた。続いてこれらＷＩＳＨ細胞に水疱性口腔炎ウイルス（ＶＳＶ）を攻撃させ、ＩＦＮの抗ウイルス活性を４８時間インキュベーション後の生存細胞の程度としてモニターした。各実験では、一定量のＩＦＮβに対するＩＦＮＡＲ２の添加により、用量依存的にＶＳＶで攻撃した細胞の生存率が増加し、最適なＩＦＮＡＲ２対ＩＦＮ比を示した。これらの結果は、ＩＦＮＡＲ２とＩＦＮβの複合体が抗ウイルスアッセイでは遊離型ＩＦＮβに比べ高い活性を持つことを証明する。これの事実上の意味は、ＩＦＮ自体が活性である各種治療応用に於いて、ＩＦＮＡＲ２／ＩＦＮβ複合体は遊離型ＩＦＮに比べ大きな効力と高い活性を持つということである。これらの兆候は、遊離型ＩＦＮが抗ウイルス、抗ガン及び免疫変調活性等のいくらかの治療活性を示す場合の兆候を含む。ＩＦＮＡＲ２／ＩＦＮ複合体は、その高い効力により活性を高め、及び／又は薬物動態を改善し（例えば半減期）、ウイルス、発がん及び免疫疾患の治療により効果的となることが期待される。
【００３２】
インビボで投与した場合、インターフェロンレセプター複合体はＩＦＮの生物利用度、薬物動態及び／又は薬力作用、換言すればＩＦＮの抗ウイルス、抗ガン及び免疫変調特性を高める。
【００３３】
複合体により促進されたＩＦＮの生物利用度は、ＩＦＮ／ＩＦＮＡＲ非共有結合型複合体の前形成、遊離型ＩＦＮとＩＦＮＡＲの同時投与、ＩＦＮ又はＩＦＮＡＲ成分の連続投与、ＩＦＮ／ＩＦＮＡＲ共有結合型複合体の投与、又はＩＦＮＡＲ／ＩＦＮ融合蛋白質の投与により得られる。
【００３４】
別の実施態様では、この様な促進された生物利用度はＩＦＮの付加無しに、ＩＦＮＡＲ成分の単独投与によっても達成できる。ＩＦＮＡＲはインビボに於いて内因性のＩＦＮと”複合体”を形成し、そして即ち内因性ＩＦＮの生物利用度、薬物動態及び／又は薬力作用を高めることになる。これは特に天然のＩＦＮを自然に誘導する病気又は状態、即ちＩＦＮが既にそれら病気や状態と戦うために循環している患者の治療に有用である。加えられたＩＦＮＡＲは天然ＩＦＮの効果を増強する。
【００３５】
本発明の複合体の利用に関する好適分子は、天然ＩＦＮとＩＦＮＡＲの配列を有する。天然配列とは、ヒト型ＩＦＮ又はＩＦＮＡＲに自然状態で存在する配列である。これら配列は公知であり、文献中に容易に見いだすことができる。天然に存在する対立遺伝子変異も天然配列と考えられる。
【００３６】
本発明はさらに、天然のＩＦＮＡＲ２及びＩＦＮの配列を本質的に有する複合体と同一の生物学的活性を本質的に保持している、本発明の上記ＩＦＮＡＲ２／ＩＦＮ複合体の類縁体にも関係する。この様な類縁体は、複合体のＩＦＮＡＲ２及び／ＩＦＮ成分中約３０アミノ酸残基までが欠失され、付加され、または別のものに置換されたものであって、この様な変更が複合体そのものと比べて該キメラ蛋白質の生物学的活性を本質的に変化させないようにしてよい。各種類縁体は、大部分が複合体中２つの成分が結合するリンカーペプチド部位について相互に、また基本の複合体分子（本質的に天然に生じるＩＦＮＡＲ２とＩＦＮ配列のみ）と異なっていてよい。上記の如く、この様なリンカーは長さが約３０アミノ酸であり、複合体中のＩＦＮＡＲ２とＩＦＮ成分を相互に分離するものであるものが好ましい。この様なリンカーに関しては、例えば複合体を不活性化したり、又は活性を高めなかったり、あるいは複合体類縁体に免疫原性を付与し治療対象の患者に於いて類縁体に対する抗体を惹起し、その結果少なくとも中期又は長期作用薬として無効に成るような不正確な折りたたみが複合体に生じない様に配列を選択することに（従って、同時に適当な標準的アッセイ方法で各類縁体を生物学的に試験することにも）注意を払うべきである。本発明の複合体の上記類縁体に関しては、これら類縁体は本発明の基本複合体と比較して得られた産物の活性が大きく変化しない状態で、本発明の基本複合体のアミノ酸残基の１またはそれ以上、および約３０アミノ酸残基までが別のアミノ酸残基に交換され、欠失され、あるいは１またはそれ以上約３０までのアミノ酸残基が本発明の複合体の本来の配列（本質的に天然のＩＦＮＡＲ２／ＩＦＮ配列のみ）に加えられたものである。これら類縁体は公知合成法及び／又は特定部位突然変異誘導技術、またはその他の好適技術により製造される。
【００３７】
この様な類縁体のいずれもが基本のＩＦＮＡＲ２／ＩＦＮ複合体の配列の十分な複製物であるアミノ酸配列を有することにより、例えば実質それに類似の活性を有することが好ましい。即ち、これら類縁体それぞれを下記実施例２−７に記す生物学的活性試験および安定性試験にかけることを含む通常の実験的手段によって、問題の類縁体が本発明の基本複合体と本質同一の活性及び／又は安定性を持つか否かを決定することができる。
【００３８】
本発明に従い使用可能な複合体の類縁体又はそれをコードする核酸配列には、ここに示された教示及び指導を基に実験することなく当業者により日常的に得ることのできる置換ペプチド又はポリペプチドである、実質対応配列の有限セットが含まれる。蛋白質化学及び構造の詳細な説明については、ここに参照され取り込まれているＳｃｈｕｌｚら、蛋白質構造の原理（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７８）；及びＣｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．Ｅ．，蛋白質：構造と分子特性（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ（１９８３）を、コドンの選択についてはＡｕｓｕｂｅｌら（１９８７，１９９２）、§§Ａ．１．Ｉ−Ａ．１．２４及びＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８７，１９９２）、§§６．３及び６．４、添付資料Ｃ及びＤを参照せよ。
【００３９】
本発明による類縁体に関し好適な変化は、”保存的”置換として知られるものである。実質的に天然に存在するＩＦＮＡＲ２及びＩＦＮ配列を含む複合体の中の保存的アミノ酸置換は、グループメンバー間の置換が分子の生物学的機能を保存するのに十分類似した物理化学的特性を持ったグループ内の同類アミノ酸を含んでよい（Ｇｒａｎｔｈａｍ，１９７４）。それらの機能を変えることなく上記配列内にアミノ酸の挿入及び欠失が可能であること、特に挿入又は欠失が例えば３０、好ましくは１０以下である少数のアミノ酸に限定され、機能的立体構造に重要なアミノ酸、例えばシステイン残基を除去、または置換しない場合には明瞭である（Ａｎｆｉｎｓｅｎ，１９７３）。この様な欠失、及び／又は挿入により生成された類縁体は本発明の範囲内である。
【００４０】
好ましくは、同類アミノ酸グループは表１に定義される。より好ましい同類アミノ酸グループは表IIに定義される；及び最も好ましい同類アミノ酸グループは表IIIに定義される。
【００４１】
【表１】
0004601163.tif 000002
【００４２】
【表２】
0004601163.tif 000003
【００４３】
【表３】
0004601163.tif 000004
【００４４】
本発明で使用するための複合ＩＦＮＡＲ２／ＩＦＮ同類体を獲得するのに使用可能な、蛋白質内にアミノ酸置換を作る例は、Ｍａｒｋらの米国特許第ＲＥ３３，６５３号；第４，９５９，３１４号；第４，５８８，５８５号及び第４，７３７，４６２号、Ｋｏｔｈｓらの第５，１１６，９４３号、Ｎａｍｅｎらの第４，９６５，１９５号；及びＬｅｅらの５，０１７，６９１号記述されている様ないずれかの公知方法、及び米国特許第４，９０４，５８４号（Ｓｈａｗら）記述のリジン置換蛋白質を含む。
【００４５】
本発明の別の好適実施態様では、本発明への利用のための複合体類縁体は、本発明の上記基本複合体のアミノ酸配列に本質的に対応するアミノ酸配列を持つ。”本質的に対応する”という語は、特に例えば癌細胞増殖を阻害する能力、又は骨髄移植を促進する能力に関する場合に、基本複合体の基本特性に影響しない程度に塩基性複合体の配列に微細な変化を持つ類縁体を包括することを意図する。”本質的に対応”するという語に該当すると一般的に考えられるタイプの変化は、保存的変異誘導技術により本発明の複合体をコードするＤＮＡに生じせしめ、微細な変更を生じさせ、そして上記開示方法によって所望活性に関しスクリーニングされたものである。
【００４６】
好ましくは、複合体のＩＦＮＡＲ２部分は、天然配列又はその生物学的に活性な断片と同一なコア配列を持つか、又は天然のアミノ酸配列に少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を持ち、天然配列の生物学的活性を保持するその変異体である。より好ましくは、これら配列は少なくとも天然配列に対し８５％の同一性を、少なくとも９０％の同一性を、あるいは最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を持つ。
【００４７】
複合体のＩＦＮ部分に関しては、利用可能なコア配列は天然配列、または生物学的に活性なその断片、又はそれに対し少なくとも７０％の同一である、より好ましくは少なくとも８５％または少なくとも９０％同一である、及び最も好ましくは少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を持つその変異体である。これら類縁体は天然ＩＦＮ配列又はその断片の生物学的活性を保持しているか、又は下記論ずる拮抗活性をもっていなければならない。
【００４８】
ここに用いられる”配列同一性”という語は、配列を以下の如く比較することを意味する。配列を遺伝子計算グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ）のＧＡＰ（グローバルアラインメントプログラム）のバージョン９を、ギャップオープペナルティーが−１２（ギャップの第１ヌルに関し）でギャップエクステンションペナルティーが−４（ギャップ内に加える連続ヌル当たり）であるデフォルト（ＢＬＯＳＵＭ６２）マトリックスで利用して並べた。配列後、クレームされている配列内のアミノ酸数のパーセンテージとして一致した数を表し、同一％を計算する。
【００４９】
本発明による類縁体は、以下の手順に従って決定してもよい。複合体のＩＦＮＡＲ部分、又は複合体のＩＦＮ部分のいずれについても、天然配列のＤＮＡは当業者公知であり、また本明細書の従来技術の部分内に引用された文献内に発見することも、又は当業者により容易に探し出すことも可能である。ＤＮＡ又はＲＮＡの様な、極めて又は適度にストリンジェントな条件下に天然のＤＮＡ又はＲＮＡとハイブリダイズできるいずれかの核酸にコードされたポリペプチドであって、該ポリペプチドが天然配列の生物学的活性を維持するもの、あるいはＩＦＮの場合には生物学的活性を維持するか、又は拮抗活性を保有するものは全て本発明の範囲である。
【００５０】
ストリンジェントな条件はハイブリダイズ実験に使用する温度、ハイブリダイゼーション液の１価カチオンのモル濃度及びフォルムアミドの％の関数である。特定の条件セットのストリンジェンシーの程度を決めるためには、まずＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの融解温度Ｔｍとして表される、１００％同一なバイブリッドの安定性を決定するためのＭｅｉｎｋｏｔｈらの式（１９８４）を当てはめる：Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６（ＬｏｇＭ）＋０．４１（％ＱＣ）−０．６１（％ｆｏｒｍ）−５００／Ｌ、式中のＭは１価カチオンのモル濃度であり、％ＧＣはＤＮＡ中のＧ及びＣのパーセンテージであり、％ｆｏｒｍはハイブリダイゼーション中のフォルムアミドのパーセンテージであり、又Ｌはハイブリッドの塩基対長である。１００％同一性のハイブリッドについて計算されたＴｍ値よりＴｍを１℃減じる毎に、許容ミスマッチ数は約１％増える。即ち、特定の塩濃度とフォルムアミド濃度で行うハイブリダイゼーション実験のＴｍが同一性１００％のハイブリッドについてＭｅｉｎｋｏｔｈの式により計算されたＴｍより１０℃低い場合には、ミスマッチが約１０％まで存在した状態でもハイブリダイゼーションが起こる。
【００５１】
本明細書で用いる、極めて（ｈｉｇｈｌｙ）ストリンジェントな条件とは、約１５％までの配列変動が許容される条件であり、適度に（ｍｏｄｅｒａｔｅｌｙ）ストリンジェント条件とは約２０％までの配列変動が許容される条件である。特に限定しない限り、極めてストリンジェントな条件（ハイブリッドのＴｍ計算値より１２−１５℃低い）及び適度なストリンジェント条件（ハイブリッドのＴｍ計算値より１５−２０℃低い）では、ハイブリッドのＴｍ計算値より低い適切な温度で２×ＳＳＣ（標準クエン酸生理食塩水）及び０．５％ＳＤＳの洗浄液を用いる。条件の最終的なストリンジェンシーは、特に使用するハイブリダイゼーション条件がより安定性の低いハイブリッドが安定したハイブリッドと共に形成できる場合には一次的には洗浄条件によって決まる。この場合、ストリンジェンシーの高い洗浄条件は安定の低いハイブリッドを除く。上記の極めてストリンジェントな洗浄条件から適度にストリンジェントな洗浄条件で利用可能な一般的なハイブリダイゼーション条件とは、６×ＳＳＣ（又は６×ＳＳＰＥ）、５×デンハルト試薬、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌの変性、断片化されたサケの精子ＤＮＡを含む溶液内、Ｔｍより約２０ないし２５℃低い温度でのハイブリダイゼーションである。混合プローブを用いる場合、ＳＳＣの代わりにテトラメチル塩化アンモニウム（ＴＭＡＣ）を使用することが好ましい（Ａｕｓｕｂｅｌ，１９８７，１９９８）。
【００５２】
本明細書に用いる”機能的誘導体”とは、公知の手段により残基又は、Ｎ−又はＣ−末端基上に側鎖として存在する官能基から製造される誘導体を包含しており、それらが薬物学的に許容されるかぎり、即ちそれらが本書記載の複合体の該当部分の生物学的活性を破壊せず、それを含む化合物又はそのための複合体に毒性を付与しないかぎり、本発明に含まれる。誘導体は同一の生物活性を有し、薬物的な許容性を保持する様な分画を提供する炭化水素塩又はリン酸塩残基の様な化学成分を有する。
【００５３】
例えば、誘導体はカルボキシル基のカルボキシルの脂肪族エステル、アンモニア又は１級又は２級アミンと反応させたカルボキシル基のアミド、アシル成分（例えば、アルカノイル又はカルボサイクリックアロイル基）と共に形成されたアミノ酸残基のＮ−アシル誘導体または遊離アミノ基、またはアシル成分と共に形成された遊離型ヒドロキシル基のＯ−アシル誘導体（例えばセリル又はスレオニル残基の誘導体）を含んでよい。この様な誘導体、例えば抗原性部位をマスクし、体液内での複合体又はその一部の耐性を拡大するポリエチレングリコール側鎖を含んでもよい。
【００５４】
本明細書中の用語”誘導体”という語は、あるアミノ酸を天然に存在する２０種類アミノ酸の別のものに変更しない誘導体のみを含むことを意図する。
【００５５】
本明細書中の用語”塩”とは、本発明の複合体又はその類縁体のカルボキシル基塩、及びアミノ基の酸付加塩の両方を指す。カルボキシル基の塩には、公知方法によって形成することができ、無機塩、例えば、ナトリウム、カルシウム、アンモニウム、鉄又は亜鉛塩等、及び例えばトリエタノールアミン、アルギニンまたはリジンの様なアミン、ピペラジン、プロカイン等と形成される有機塩基を持つ塩が含まれる。酸付加塩には、例えば塩化水素酸又は硫酸の様な鉱酸、及び例えば酢酸又はシュウ酸の様な有機酸の塩が含まれる。当然、この様な塩のいずれもが本発明の複合体またはその類縁体と実質的に同様な生物活性を持っていなければならない。
【００５６】
本明細書中での”生物学的活性”という用語は、以下のように解釈される。複合体のＩＦＮＡＲ２部分を考える場合、重要な生物学的活性とはＩ型インターフェロンに対する結合能力である。即ち、このインターフェロン結合能を保持する様に類縁体または変異体、塩及び機能的誘導体を選択しなければならない。これは、通常の結合アッセイ実験にて試験することができる。さらに、ＩＦＮＡＲ２の断片、又はその類縁体がそのインターフェロン−結合活性を保持する限り利用することができる。断片は、インターフェロン結合ポリペプチドいずれかの末端よりアミノ酸を除去し、得られた産物についてインターフェロン結合特性を試験することで容易に製造してよい。ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかより１度に１アミノ酸を除くプロテアーゼは公知であり、またインターフェロン結合能を保持する断片を決定することは通常の実験に含まれる。
【００５７】
更に、この様なインターフェロン結合活性を持つポリペプチド、ＩＦＮＡＲ２、ｓＩＮＦＡＲ２、類縁体または変異体、塩、機能的誘導体またはその断片は、インターフェロン結合ポリペプチドを周辺に有する追加のアミノ酸残基を含むこともできる。得られた分子がコアポリペプチドのインターフェロン結合能を持つ限り、これら周辺残基がコアペプチドの基本的かつ新規特性、例えばそのインターフェロン結合特性に影響をおよぼすか、通常の実験により決定することができる。”から本質的になる（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）”という語は、特定な配列を指し示す場合には、追加の周辺残基が特定配列の基本的かつ新規特性に影響しない状態で存在できることを意味する。この語は特定配列内の置換、欠失または付加を包含しない。
【００５８】
ＩＦＮＡＲ２またはｓＩＦＮＡＲ２が本明細書中、また実施例中に利用されているが、これは単に好ましい例であり、ＩＦＮＡＲ２が参照される本発明開示の箇所についてはＩＦＮＡＲ２をＩＦＮＡＲ１サブユニット、特にその細胞外ドメインに変えてよいことは理解されるべきである。ＩＦＮＡＲ１はそれが結合するインターフェロンと組み合わせた形でのみ使用できる。ＩＦＮＡＲはＩＦＮαに結合することが知られている。ＩＦＮＡＲ１を用いたいずれの複合体も、ＩＦＮＡＲ１が結合する種類のインターフェロンの種、好ましくはＩＦＮαの種を伴わなければならない。
【００５９】
本発明の複合体のインターフェロン部分に関して、いずれの類縁体又は変異体、塩、機能的誘導体または断片中に保持される生物活性は、目的とする利用に合致したインターフェロンの活性でなければならない。多くの例では、これは天然の細胞表面レセプターに結合し、レセプターを介したシグナル生成能力である。即ち、この様な類縁体、誘導体または断片は、この様な本発明の利用にして有用である、これらレセプターアゴニスト活性を保持しなければならない。一方、レセプターに対し拮抗活性を持つ分子を有し、その結果天然インターフェロンの生物活性を阻止することも時に有用である。この様な拮抗剤もまた、本発明の複合体の手法による有益作用を延長するのに利用できる。インターフェロンの持つ不要の作用を除くことを期待したこの様な利用に関して、レセプター及び複合体のＩＦＮＡＲ部分とは結合したまま、しかしシグナル伝達はせず、また受容体上にある天然インターフェロンにより作られるシグナルは阻止する類縁体も、本発明に於いて生物学的に活性であり、本発明の複合体に対し用いられる場合に於いてはインターフェロンという語の中に包含される。直接アッセイは、これら類縁体がこの様なレセプターアゴニスト活性を持つか、又はレセプター拮抗活性を持つか決定でき、従って本発明の有用性の一つとして有益であろう。
【００６０】
本発明は本発明の上記複合体及びその類縁体、ならびに好適な原核生物又は真核生物宿主細胞中での発現を目的とした、これらＤＮＡ配列を持つＤＮＡベクターにも関する。組換え体蛋白質発現システムを用いて異種蛋白質が大量に生産できる能力により、各種治療薬、例えばｔ−ＰＡやＥＰＯ（Ｅｄｉｎｇｔｏｎ，１９９５）が開発された。組換え体蛋白質が生成できる各種発現宿主は、原核生物に始まり（例えば細菌）（Ｏｌｉｎｓ，１９９３）から、下等真核生物（例えば酵母）（Ｒａｔｎｅｒ，１９８９）、そしてより高等な真核生物種（例えば昆虫や哺乳動物細胞（Ｒｅｕｖｅｎｙ，１９９３；Ｒｅｆｆ，１９９３）へと広がった。これらシステムはいずれも同一原理−所望蛋白質のＤＮＡ配列を選択した細胞に導入（組み込まれるか、エピゾーマルエレメントとして一過性、または安定的に）され、宿主の転写、翻訳、移送機序を使って導入されたＤＮＡ配列を異種蛋白質として過剰発現させる−に拠っている（Ｋｅｏｗｎ，１９９０）。
【００６１】
天然遺伝子配列の発現に加え、ヌクレオチドレベルでＤＮＡを操作する能力は天然の蛋白質をベースにするものの一次蛋白質構造中の変化の結果として新規活性を持つ、新規構築配列の開発に好都合である（Ｇｒａｚｉａ，１９９７）。
【００６２】
更に、ＤＮＡの選択配列は物理的に連結し、本来独立している蛋白質を１つのポリペプチドユニットとして発現される新規融合蛋白質にする転写体を作ることができる（Ｃｕｒｔｉｓ，１９９１）。
【００６３】
ヒトＩＦＮβは哺乳動物であるチャイニーズハムスターの卵巣細胞（ＣＨＯ）を用いた製造工程より得られる。１型インターフェロンは細菌（Ｕｔｓｕｍｉ、１９８７）、昆虫（Ｓｍｉｔｈ，１９８３）及びヒト（Ｃｈｒｉｓｔｏｆｉｎｉｓ，１９８１）を含む各種宿主細胞で発現できる。ヒトｓＩＦＮＡＲ２もＣＨＯ宿主細胞を利用し発現できる。あるいはｓＩＦＮＡＲ２の様な可溶性レセプターもまた細菌発現システムで良好に発現された（Ｔｅｒｌｉｚｚｅｓｅ，１９９５）。各遺伝子のＤＮＡはトランスフェクション法を利用しＣＨＯゲノム内に導入され、その結果組換え、及び発現ベクターの組み込みが起こる。その後、当業者公知の通常の産業手段により所望蛋白質を発現する細胞を単離し、培養し、蛋白質を回収し、精製した。
【００６４】
本発明は更に活性成分として、ＩＦＮＡＲ２／ＩＦＮ複合体またはその類縁体、あるいはその混合体、又はその塩、及び医薬品として許容される担体、希釈体または添加物を含む医薬組成物に関する。本発明の医薬組成物の実施態様は、ウイルス疾患、抗癌治療、免疫変調治療及びその他それらに関するインターフェロン及びサイトカインの応用に於ける、増強されたＩＦＮ型の作用に関する医薬品組成物を含む。
【００６５】
本発明の医薬品組成物は、複合体またはその類縁体を生理学的に許容される担体、及び／又は安定化剤、及び／又は添加剤と混合して製造し、投与形状に製造し、例えば投与バイアル中に凍結乾燥される。投与方法は、同様の薬剤の投与について受け入れられている様式のいずれでも良く、又治療対象である状態に依存し、例えば静脈、筋肉内、皮下により、局所注射または塗布、または点滴により連続的に投与することができる。投与される活性化合物両は投与経路、治療対象の病気、及び患者の状態に依存する。例えば局所注射は、静脈注射に比べ体重ベースでより少量の蛋白質を必要とする。
【００６６】
遊離型ＩＦＮβは多量体化する傾向がある。この傾向を抑えるために、現在のＩＦＮβ剤は酸性のｐＨを有しているが、これが投与時のいくらかの局所刺激の原因になるかもしれない。ＩＦＮＡＲはＩＦＮβの安定化因子としても機能でき、これによって多量体化を阻止することから、ＩＦＮβ剤中に利用することでＩＦＮβを安定化させ、酸性処方の必要性を無くすことができる。従って、その他の通常の医薬品として許容される添加物と共にＩＦＮβ、及びＩＦＮＡＲを含む非酸性の医薬品組成物も本発明の一部である。
【００６７】
本発明は更に本発明の複合体又はその類縁体、その混合体の、抗ウイルス、抗ガン及び免疫変調治療への利用に関する。具体的には、本発明のインターフェロンレセプター−インターフェロン複合体は、慢性肉芽腫病、尖形コンジローム、若年性咽頭パピローマ症、Ａ型肝炎、及びＢ型及びＣ型肝炎ウイルスの慢性感染といった治療適用症於ける抗ウイルス治療に有用である。
【００６８】
特に、本発明のインターフェロンレセプター−インターフェロン複合体は、ヒアリー細胞白血病、カポジ肉腫、多発性骨髄腫、慢性骨髄性白血病、非ホジキンリンパ腫及びメラノーマの様な治療適用症の抗ガン治療に有用である。
【００６９】
本発明のインターフェロンレセプター−インターフェロン複合体は、多発性硬化症、リューマチ関節炎、重症筋無力症、グラヴィス、糖尿病、ＡＩＤＳ、ループス等の免疫変調治療にも有用である。
【００７０】
同様に、本発明は上記病気治療用の医薬品の調整に利用するため、または上記適用に利用するための複合体、又はその類縁体、又はその混合体に関する。
【００７１】
以下、本発明を非限定的実施例及び添付資料により詳細に説明する。
実施例
材料と方法
抗ウイルスＷＩＳＨバイオアッセイ及び複合体の生成
ＷＩＳＨアッセイはＮｏｖｉｃｋら（１９８２）のプロトコールに基づき開発した。
【００７２】
材料
・ＷＩＳＨ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２５）
・水疱性口内炎ウイルス保存株（ＡＴＣＣ  Ｖ−５２０−００１−５２２）、−７０℃にて保管。
・ＩＦＮβ、ヒト型組換え体、ＩｎｔｅｒＰｈａｒｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＬＴＤ  ９０×１０6ＩＵ／ｍｌ、比活性：２６４．５×１０6ＩＵ／ｍｇ。
・可溶性ヒト型ＩＦＮＡＲ２、３７３μｇ／ｍｌＰＢＳ中保存濃度。
・ＷＩＳＨ増殖培地（Ｅａｒｌｓ塩入りＭＥＭ高グルコース＋１０％ＦＢＳ＋１．０％Ｌ−グルタミン＋ペニシリン／ストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍｌ，１００μｇ／ｍｌ））
・ＷＩＳＨアッセイ培地（Ｅａｒｌｓ塩入りＭＥＭ高グルコース＋５％ＦＢＳ＋１．０％Ｌ−グルタミン＋ペニシリン／ストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍｌ，１００μｇ／ｍｌ）、ＭＴＴ５ｍｇ／ｍｌＰＢＳ、−７０℃保存。
【００７３】
方法
・組換え体ヒト型ＩＦＮβをＷＩＳＨアッセイ培地で１９ＩＵ／ｍｌ（前もって測定されたＥＣ50投与量の４倍）に希釈する。
・９０μｇ／ｍｌより開始し、ＷＩＳＨアッセイ培地を用いてエッペンドルフチューブ内にヒト型組換え体ｓＩＦＮＡＲ２の３倍希釈体を１１作製する。１２番目のチューブはＷＩＳＨアッセイ培地のみを含む。
・平底型９６ウエルプレートの各ウエルにＩＦＮβを２５μｌ加える（ＩＦＮβを含まない、ＩＦＮＡＲ２の効果を見るための３×１２ウエルのコントロールには、ＷＩＳＨアッセイ培地のみを２５μｌ加える）。
・９６ウエルプレートの１２行に、３重形式にてｓＩＦＮＡＲ２（又は１２番目の行にはアッセイ培地のみを）の各希釈液２５μｌを加える。
・ＷＩＳＨ細胞を加える前に、ＩＦＮβとｓＩＦＮＡＲ２を３７℃のインキュベーターの中で１−４時間前インキュベーションさせる。
・対数増殖期にあるＷＩＳＨ細胞をトリプシン／ＥＤＴＡ液で集め、ＷＩＳＨアッセイ培地で洗浄、最終濃度を０．８×１０6細胞／ｍｌに調整した。
・ＷＩＳＨ細胞懸濁液５０μｌを各ウエルに加えた（４×１０4細胞／ウエル）。ＩＦＮβ及びＩＦＮＡＲ２の最終濃度は細胞が暴露される濃度であり、ＩＦＮβは４．７５ＩＵ／ｍｌ（１×）であり、また第１行めのｓＩＦＮＡＲ２の最終濃度は２２．５μｇ／ｍｌである。
・５％ＣＯ2加湿インキュベーター内で２４時間インキュベーション後、１：１０希釈液５０μｌ（ＷＩＳＨアッセイ培地による）またはＶＳＶ保存液（４８時間以内にＷＩＳＨ細胞を１００％溶解するために前もって決められた用量）をウイルスの入っていないコントロールウエル（これらには当量のアッセイ培地のみが加えられた）以外の全てのウエルに加えた。
・さらに４８時間後、２５μｌのＭＴＴ液を全ウエルに加え、その後プレートはインキュベーター内でさらに２時間インキュベートさせた。
・プレートを逆さまにして、ウエル内容物を除去し、１００％エタノールを２００μｌウエルに加えた。
・１時間後、Ｓｏｆｔ  ｍａｘ  Ｐｒｏソフトウエアーパッケージ及びＳｐｅｃｔｒａｍａｘ  分光光度計システム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いプレートを５９５ｎｍで測定した。
【００７４】
全ての配列反応はＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅＴＭ放射標識ターミネーターサイクルシークエンシングキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ；Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）を用いて行った。メーカー提供のプロトコールを用いた。全てのシークエンシング反応は、６％ポリアクリルアミド及び７Ｍ尿素を含むＣａｓｔＡｗａｙＴＭプレキャストシークエンシングゲル（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）で分析した。シークエンシング反応はＡ−Ｃ−Ｇ−Ｔの順番でおこなった。シークエンシングゲルのオートラジオグラフは手動で判読した。ＤＮＡ配列分析にはＧｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウエアーパッケージ及びＵＮＩＸワークステーションを用いた。
実施例１
ヒト型ＩＦＮＡＲ２／ＩＦＮβ複合体及びヒト型ＩＦＮＡＲ２Ｉｇ−ＩＦＮβ複合体の抗ウイルス活性を調べるために、一定濃度のＩＦＮβ（４．７５ＩＵ／ｍｌ）を各種濃度（０．２５−３００００ｎｇ／ｍｌ）のヒト型ＩＦＮＡＲ２（組換え体ｐ４０）またはヒト型ＩＦＮＡＲ２Ｉｇと３時間、３７℃で前インキュベートし、続いてＷＩＳＨ−ＶＳＶ細胞変性アッセイで試験した。ＩＦＮが無い状態では、抗ウイルス防御は認められなかった（データ未提示）。
【００７５】
およそ３０ｎｇ／ｍｌのｓＩＦＮＡＲ２が存在する状態でのＩ型インターフェロンの抗ウイルス活性（事前に測定したＥＣ50濃度）は、ＩＦＮβとともにある時最適なアゴニスト活性を示したが、単独では示さなかった。抗ウイルス活性はＶＳＶを作用させた４８時間後にＭＴＴ転換法により測定された。
【００７６】
ＩＦＮが推定ＥＤ５０濃度存在する時、防御が観察された（図１参照；吸光度は０．４５に等しく、防御なしの吸光度は〜０．０に等しく、完全に防御された時の吸光度は〜１．８である）。ＩＦＮＡＲ２又はＩＦＮＡＲ２Ｉｇを各種濃度で力価測定した場合、３２ｎｇ／ｍｌのＩＦＮＡＲ２及びＩＦＮＡＲ２Ｉｇまででは〜４×のＩＦＮβの活性の増強が認められた（実施例２及び図２も参照せよ）。３２ｎｇ／ｍｌ以上のＩＦＮＡＲ又はＩＦＮＡＲ２ＩｇではＩＦＮβの活性は予想通り低下したが、これは、ＩＦＮβを巡るｓＩＦＮＡＲと膜ベースのＩＦＮＡＲとの競合によると思われる。即ち、本実験より、ＩＦＮＡＲ２／ＩＦＮ複合体に於いてＩＦＮβの効果が上昇し、又活性が増強されることが支持された。
実施例２
ｓＩＦＮＡＲ２／ＩＦＮ複合体に対するＩＦＮβ濃度の変更の効果を、各種濃度のＩＦＮβをＥＤ50に加え検証した。図２に見られるように、４．７５ＩＵ／ｍｌのＩＦＮβでは、〜３２ｎｇ／ｍｌ濃度のＩＦＮＡＲ２との１時間の前インキュベーションによりＩＦＮβの活性は〜２×増強された。さらに高いＩＦＮβ濃度では、ＩＦＮβの抗ウイルス活性は既に最大値となっていたため、それ以上の増強は認められなかった。これらの結果も、ＩＦＮＡＲ２／ＩＦＮβ複合体が増強されたＩＦＮ活性を持つことを支持している。
実施例３
ＩＦＮＡＲ２／ＩＦＮβ複合体形成の動態を、各種濃度のＩＦＮＡＲ２と様々な時間前インキュベーションさせた時の半有効濃度のＩＦＮβ（０．９５ＩＵ／ｍｌ）の抗ウイルス活性を調べ検討した。図３に示すように、半有効用量のＩＦＮβの抗ウイルス活性を増強するには、４時間の前インキュベーションが必要であった。即ち、それのみでは不活性であるＩＦＮβのレベルでは、ＩＦＮＡＲ２の追加により複合体が形成されることで有意なＩＦＮ抗ウイルス活性が生まれる。この実験は、ＩＦＮＡＲ２／ＩＦＮβ複合体がＩＦＮの活性を増強することを更に支持する。
実施例４
ＩＦＮβの生物活性は３７℃でインビトロにて再調整（生理学的食塩緩衝液、ｐＨ７．４）された後に急速に減少することが知られている。少なくともその一部は、活性を低下させるＩＦＮβ多量体構造の形成に拠るものである。ＩＦＮＡＲ２が生理学的ｐＨに於いてＩＦＮβの安定性を増加させるか試験するために、各種濃度のＩＦＮβを単独、または一定のＩＦＮＡＲ２対ＩＦＮβ比でＩＦＮＡＲ２が存在する（２．５ｎｇ／ＩＵ）培地中でインキュベートさせる実験を行った。ＩＦＮβ（５００ＩＵ／ｍｌ）を当量のｓＩＦＮＡＲ２（１．２５μｇ／ｍｌ）またはＲＰＭＩのみのいずれかと３時間、３７℃で前インキュベートした。ＷＩＳＨ細胞を加える前に、９６ウエルのプレート中、ＷＩＳＨのアッセイ培地中で両方のＩＦＮβ液の力価測定を行った。ＶＳＶを２４時間後に加え、さらに４８時間培養した後ＭＴＴ転換により測定した。
【００７７】
図４に見られるように、ＩＦＮβ単独ではＥＤ５０は〜１０４ＩＵ／ｍｌであったが、ＩＦＮβと可溶性ＩＦＮＡＲ２を前インキュベーションさせると有意にＥＤ50は増加し〜７ＩＵ／ｍｌになった。ＩＦＮβ単独での高値ＥＤ50は、溶液中でのＩＦＮβの多量体化に拠ると考えられる。上記結果も、ＩＦＮβがＩＦＮＡＲ２と複合体を形成すると安定性が増すことを示している。
実施例５
ＩＦＮＡＲ２存在下でのＩＦＮβの活性増強がｓＩＦＮＡＲによる特異的保護によるものであるか検証するために、ＩＦＮＡＲ２又はその他無関係な蛋白質（ヒトＩｇＧ、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））を同一濃度組み合わせた後にＩＦＮβの活性を調べた。
【００７８】
図５に示すように、ＩＦＮβ（５００ＩＵ．ｍｌ）を当量の上記蛋白質（１．２５μｇ／ｍｌ）又はＲＰＭＩのみと４時間、３７℃で前インキュベートした。これらＩＦＮβ液のＷＩＳＨアッセイ培地中での力価を、ＷＩＳＨ細胞を加える前の９６ウエルプレート内で測定した。新たに調整したＩＦＮβを加え、ＩＦＮβ活性に及ぼす前インキュベーションの効果を調べた。ＶＳＶを２４時間後に加え、さらに４８時間培養した後ＭＴＴ転換により測定した。
【００７９】
ＩＦＮβと非特異的蛋白質２．５ｎｇ／ＩＵ  ＩＦＮβ（例えばＢＳＡ又はヒトＩｇＧ）との前インキュベーションは、再構成後のＩＦＮβの活性を保護しなかった。本アッセイに於けるＩＦＮＡＲ２／ＩＦＮβ複合体の活性は、新たに加えたＩＦＮβ時の活性に類似しており、ｓＩＦＮＡＲ２がＩＦＮβの活性を安定化するという所見を支持した。
実施例６
ＩＦＮＡＲ２／ＩＦＮβ複合体は、ＥＬＩＳＡ及びバイオアッセイ分析によればマウスに於いてＩＦＮβの薬物動態プロフィールを大きく延長した（図６及び７）。
【００８０】
Ｂ６Ｄ２Ｆ１株のマウスにヒト型ＩＦＮβ（２．５×１０6ＩＵ／ｋｇ）またはヒト型ＩＦＮＡＲ２（２．５μｇ／ＩＵ  ＩＦＮ）と１時間４℃で前インキュベートした同濃度のＩＦＮβのいずれかを単数回静脈投与した。投薬後０．０５から４８時間にかけて尾静脈より血清を採取し、ＩＦＮβ濃度とＩＦＮβの抗ウイルス活性をそれぞれＥＬＩＳＡ（図６）又はＷＩＳＨバイオアッセイ（図７）にて測定した。ＥＬＩＳＡアッセイのアッセイ感度（７．５５ＩＵ／ｍｌ）以下になった血清濃度はプロットしなかった。
【００８１】
複合体は薬物動態プロフィールを延長しただけでなく、ＷＩＳＨによる抗ウイルスアッセイによればマウスでは生物学的に活性なＩＦＮβのレベルも時間と共に大きく増加し、ＩＦＮβ単独に比べ本発明のＩＦＮＡＲ２／ＩＦＮβ複合体は高い安定性と延長された血漿半減期を示し。
実施例７
ＩＦＮＡＲ２／ＩＦＮα２ａ複合体は、ＥＬＩＳＡ及びバイオアッセイ分析によればマウスに於けるＩＦＮα２ａの薬物動態プロフィールを大きく延長した（図８及び９）。
【００８２】
Ｂ６Ｄ２Ｆ１株のマウスにヒト型ＩＦＮα（１．２５×１０6ＩＵ／ｋｇ）またはヒト型ＩＦＮＡＲ２（２．５μｇ／ＩＵ  ＩＦＮ）と１時間４℃で前インキュベートした同濃度のＩＦＮαのいずれかを単回静脈投与した。投薬後、指定時間に尾静脈より血清を採取し、ＩＦＮα濃度とＩＦＮαの抗ウイルス活性をそれぞれＥＬＩＳＡ（図８）又はＷＩＳＨバイオアッセイ（図９）にて測定した。
【００８３】
ＩＦＮαはヒト型ＩＦＮαに特異的なＥＬＩＳＡにより測定した。ＥＬＩＳＡアッセイのアッセイ感度（７．５５ＩＵ／ｍｌ）以下になった血清濃度はプロットしなかった。
【００８４】
複合体は薬物動態プロフィールを延長しただけでなく、ＷＩＳＨによる抗ウイルスアッセイによればマウスでは生物学的に活性なＩＦＮβのレベルも時間と共に大きく増加し、ＩＦＮα単独に比べ本発明のＩＦＮＡＲ２／ＩＦＮβ複合体は高い安定性と延長された血漿半減期を示した。
実施例８
ＩＦＮＡＲ２／ＩＦＮ融合蛋白質の作製
ＩＦＮＡＲ２の細胞外ドメインのＣ−末端が、Ｇ及びＳがそれぞれアミノ酸のグリシンとセリンを表す以下のペプチドリンカーを用いて成熟ＩＦＮのＮ−末端に融合した：
ＩＦＮＡＲ２細胞外（リンカー）成熟ＩＦＮβ
．．．ＥＳＥＦＳ（ＧＧＧＧＳ）nＭＳＹ．．．，式中ｎ＝０（配列番号５）、１（配列番号７）、２（配列番号６）、３（配列番号５）、４（配列番号４）及び５（配列番号３）
ｎ＝２のＩＦＮＡＲ２／ＩＦＮβ融合体の完全なアミノ酸配列を図１０に示す（配列番号１４）。
【００８５】
ヒト型組換え体ＩＦＮを発現する遺伝子を含む発現ベクターｐＳＶＥＩＦをＰＣＲの鋳型に用いた。合成プライマーをヒト型ＩＦＮ（ＭＳＹ．．．）の成熟蛋白質コーディング域だけを鋳型から増幅する用に設計した。５’プライマーは消化されたＳａｍＩ部位の配列、少なくとも７個のＩＦＮＡＲ２のアミノ酸（ＧＱＥＳＥＦＳ）（配列番号１４の残基３４４−３４９）及び（ＧＧＧＧＳ）1（配列番号１）リンカーを含む。ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ部位を５’ＰＣＲプライマーに導入し、その他のカセットのクローニングを促進することもできる。３’プライマーはｈＩＦＮβのＴＧＡ停止コドン直後にＡｖｒＩＩ部位を含む。ＰＣＲは１００μｌの反応容積中に、およそ１ｇの鋳型ＤＮＡと１ｇの各ＰＣＲプライマー、０．２ｍＭのｄＡＴＰ，ｄＴＣＰ，ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ、１×のＴｈｅｒｍｏＰｏｌ反応緩衝液（１０ｍＭ  ＫＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、（２５℃ｐＨ８．８）、１０ｍＭ（ＮＨ4）2ＳＯ4、２ｍＭ ＭｇＳＯ4 、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００；Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ；Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）、及び３ｍＭ  ＭｇＳＯ4（５ｍＭ  ＭｇＳＯ4、最終濃度）を含む。９９．９℃３０秒間のＶＥＮＴＲ初期インキュベーション後、２単位のＶＥＮＴＲ  ＤＮＡポリメラーゼを反応体に加えた。ＰＣＲは以下の２０サイクルから成る：（ａ）９９．９℃、３０秒、（ｂ）６５℃−５５℃、３０秒、サイクル毎に０．５℃づつ下げる、及び（ｃ）７５℃、４０秒間。さらにアニーリング温度を５５℃に固定した上記プロフィールを１５サイクル加える。ＰＣＲ反応体はＷｉｚａｒｄＴＭＰＣRＰｒｅｐｓＤＮＡ精製システム（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて精製した。ＰＣＲ産物をＡｖｒIIにて消化した後、反応体を低溶解温度アガロースゲルにて精製した。１ＧＳリンカーを持つｈＩＦＮβ成熟蛋白質配列を含むゲル精製断片をヒト型組換え体ＩＦＮＡＲ２の可溶型をコードする遺伝子を含む（ＳｍａＩ＋ＡｖｒII）−消化発現ベクターｐＣＭＶ−ｐ４０に連結した。連結反応を利用し、通常の方法により（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）コンピテントＥ．ｃｏｌｉＸＬ−１Ｂｌｕｅ細胞を形質転換した。ｐＣＭＶ−ＩＦＮＡＲ２／ＩＦＮＡβＧＳと呼ばれる構築体が正確に組み立てられていることは、”融合体”の制限酵素消化とＰＣＲ産物領域の配列を決定して確認した。続く構築体をＢａｍＨＩオーバーハング、適当な（ＧＧＧＧＳ）ｎリンカー（ｎ＝１の時配列番号１）及びＸｈｏＩオーバーハングを含むオリゴヌクレオチドカッセットを利用し構築した。０ＧＳカセットはＳｍａＩ及びＸｈｏＩオーバーハングを含む。ｐＣＭＶ−ＩＦＮＡＲ２／ＩＦＮＡβ１ＧＳベクターを確認した後、これをＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩで消化し、適当なカセットをこのベクターに接続した。０ＧＳ構築体については、カセットを接続するためにベクターをＳｍａＩ及びＸｈｏＩで消化した。
【００８６】
ｎが０，１，２，３，４，及び５のＧＧＧＧＳ（配列番号１）リンカーユニットを表すｐＣＭＶ−ＩＦＮＡＲ２／ＩＦＮβｎ（ＧＳ）ベクターを合計で６個作製した。これらの制限酵素消化の結果は図１１に示す。シークエンシングプライマーは、各構築体のカセットが完全に配列決定される様に設計した。構築体の確認の為に、市販キット及びメーカー提供のプロトコール（Ｑｉａｇｅｎ；Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）を利用して大規模にプラスミッドＤＮＡ培養体を製造した。
【００８７】
図１２はｐＣＭＶ−ＩＦＮＡＲ２／ＩＦＮＡβ”融合体”発現ベクターの代表的なプラスミッドマップである。ＩＦＮＡＲ２／ＩＦＮβ融合蛋白質の転写は、ヒト即時型ＣＭＶプロモータより行われる。ベクターにより提供されるヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニレーションシグナル配列はＩＦＮＡＲ２／ＩＦＮβ転写体の３’加工に利用した。
【００８８】
0004601163.tif 000005
ＩＦＮＡＲ２／ＩＦＮβ１ＧＳ融合体のＰＣＲ生成域について配列データを得た；このデータは、該配列が予想通りであることを示していた。その他の構築体のペプチドリンカー域について配列データを得た；該配列も予想通りであった。
【００８９】
各構築体をトランスフェクトした細胞についてノーザンブロット分析を行った。ＩＦＮＡＲ２プローブ及びＩＦＮβプローブの両方について、ＩＦＮＡＲ２／ＩＦＮβｎＧＳサンプルを含む全てのレーンには約１．４ｋｂの大きさのバンドが存在した。ＩＦＮβプローブについては、更に約０．９ｋｂのバンドが観察された。この大きさのバンドはＩＦＮＡＲ２のアミノ酸を少なくとも６個と、（ｎ）ＧＳリンカー及びｈＩＦＮ成熟蛋白質をコードする配列を含む、別の形にスプライスされた転写体に対応するものであろう。このことは実施例９に於いて一過性にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞より分離した総ＲＮＡより調製したｃＤＮＡの配列を決定し、確認された。
実施例９
一過性トランスフェクション．ＣＨＯ−ＤＵＫＸ細胞はジヒドロ葉酸還元酵素活性を欠いたチャイニーズハムスター卵巣細胞のクローナル突然変異体である（Ｕｒｌａｕｂら（１９８０）；Ｇｒａｆｆら（１９８２））。細胞はリボヌクレオシド及びデオキシリボヌクレオシドを加え、１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）と１％Ｌ−グルタミンを添加したアルファ最小限定培地（αＭＥＭ）（完全培地）中に維持された。一過性トランスフェクションは、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＰＬＵＳTM試薬（ＧｉｂｃｏＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）及びメーカー提供のプロトコールを利用して行った。トランスフェクション約２４時間前に、細胞を直径１００ｍｍの皿の中に２×１０6細胞／皿の密度で加えた。トランスフェクションするために、４μｇのスーパーコイルしたベクタープラスミドＤＮＡ（ｐＣＭＶ−ＩＦＮＡＲ２／ＩＦＮ  ｎ  ＧＳ、式中ｎ＝０，１，２，３，４または５）を利用した。メーカー提供の無血清培地を利用し、ＤＮＡ及びＰＬＵＳ試薬を希釈した。完全培地中、３７℃で４８時間培養した後、ＥＬＩＳＡ（ＩＦＮＡＲ２、ＩＦＮβ）及びウエスタンブロットゲル用に細胞上清を集めた。
【００９０】
ＲＮＡ抽出及びノーザンブロット分析．  一過性トランスフェクトされたＣＨＯ−ＤＵＫＸ細胞より全細胞ＲＮＡ（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉら、１９８７）を抽出した。レーン当たり１０ｇの全ＲＮＡｇを変性剤としてフォルムアルデヒドを含むアガロースゲル中に分子量分画した。サンプルは二重に分画にかけた。ＲＮＡは１０×ＳＳＣ（１．５Ｍ塩化ナトリウム、０．１５Ｍクエン酸ナトリウム）中、キャピラリーブロット法によってＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ  Ｐｌｕｓナイロン膜（ＤｕＰｏｎｔ／ＮＥＭ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ；Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）に移した。固定されたＲＮＡをＣｈｕｒｃｈとＧｉｌｂｅｒｔ（１９８４）の液を改良液中に32Ｐ標識ｈＩＦＮＡＲ２及びｈＩＦＮβＰＣＲ断片とハイブリダイズさせた。緩衝液は０．２５Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２、０．２５Ｍ塩化ナトリウム、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭエチレンジアミンテトラ酢酸及び１００μｇ／ｍｌのＥ．ｃｏｌｉｔＲＮＡを含んだ。３２Ｐ−標識プローブは、市販キット（”ＨＩｇｈ  Ｐｒｉｍｅ”Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ；Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）及び、キット中に記載のプロトコールを利用し作製された。非取り込み放射活性はＳｅｐｈａｄｅｘＧ−５０カラムによるクロマトグラフィーで除去した。ハイブリダイゼーション後、ブロットを洗浄した；使用した最もストリンジェントな条件は６５℃、０．２×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳであった。ブロットはオートラジオグラフィーにかけた。
融合蛋白質の発現．
各融合構築体を一過性にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞の上清について、ＩＦＮＡＲ２及びＩＦＮ発現レベルをそれぞれＩＦＮＡＲ２特異的ＥＬＩＳＡ及びＩＦＮβＥＬＩＳＡ（Ｔｏｒａｙ）を用いて分析した。分析結果は下記表ＩＶに示す。
【００９１】
【表４】
0004601163.tif 000006
【００９２】
上記の如く、リンカーの長さを長くするほど検出可能なＩＦＮＡＲ２及びＩＦＮβの減少が観察された。この時点では、これがリンカーの長さが増加することによる発現融合蛋白質量の減少によるものであるか、又はリンカーの長さが長くなったことにりＩＦＮβがＩＦＮＡＲ２結合部位に結合でき、その結果ＥＬＩＳＡアッセイによって完全に検出できなくなった事によるか決定することは不可能である。ＩＦＮβアッセイが非複合体化ＩＦＮβのみ検出することが知られている。
【００９３】
ＩＦＮＡＲ２／ＩＦＮβ融合蛋白質のウエスタンブロット分析．
融合蛋白質が適当な分子量で発現され、又遊離型ＩＦＮβは発現されないことを確認するために、トランスフェクトされた細胞の上清を抗ＩＦＮβ抗体を用いたウエスタンブロットで分析し、融合体を検出した。この分析の結果は図１３に示す。
【００９４】
ＩＦＮＡＲ２／ＩＦＮβ構築体（レーン１−６）又はＩＦＮＡＲ２構築体（レーン７）で一過性にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の培養上清、培地（レーン８）又はＩＦＮβ（レーン９）１５μｌを非還元条件下にＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた後、ＰＶＤＦ膜に電気転写した。膜をウサギ抗ＩＦＮβ抗体でプローブし、Ｗｅｓｔｅｒｎ−Ｓｔａｒ化学発光検出キットを用い、アルカリフォスファターゼ標識ヤギ抗ウサギ抗体で発光した。
【００９５】
いずれの融合構築体の上清についても遊離型ＩＦＮβは検出されなかった。同様に各構築体は、各融合体構築体についてウエスタンブロットによりそのＭＷが適当であった蛋白質を発現した。
実施例１０
融合分子の抗ウイルス活性．各融合体を含む培養上清について、ＷＩＳＨ細胞（ヒト羊膜細胞）がＩＦＮβ（コントロール）又は融合体添加後にＶＳＶにさらされる細胞変性アッセイにて抗ウイルス活性を試験した。結果は図１４に示す。
【００９６】
発現された組換え体蛋白質を含む（ＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロットで検出される）ＣＨＯ細胞上清、またはＣＨＯ培養培地のみを二重形式で９６ウエル型平底組織培養プレートの最上列に７５μｌ／ウエルづつ加えた。プレートの残りのウエルには５０μｌのＷＩＳＨ細胞アッセイ培地を加えた。上清を含むウエル（最上列）から２５μｌを取り、５０μｌのＷＩＳＨアッセイ培地を含む次の列のウエルに加え、各サンプルについて３倍希釈列を作製した。陽性コントロールのウエルには、最上列上清の代わりに１０００ＩＵ／ｍｌのヒト型ＩＦＮβを含むＷＩＳＨアッセイ培地を加え、同様にしてプレート長に沿って３倍希釈系列を作製した。続いて各ウエルにＷＩＳＨ細胞上清５０μｌ（ＷＩＳＨアッセイ培地中０．６×１０6細胞／ｍｌ）を加えたため、ＲＥＢＩＦを含む最上列の最終濃度は５００ＩＵ／ｍｌとなり、ＣＨＯ細胞上清の出発希釈は１：２である。５％ＣＯ2、３７℃で２４時間培養した後、各ウエル（未感染コントロールウエルに割り当てられたものを除き）に水疱性口内炎ウイルスを含むＷＩＳＨアッセイ培地（保存液の１：１０）５０μｌを加えた。さらに４８時間培養したのち、ＭＴＴ転換によりＷＩＳＨ細胞の生存率を測定した。
【００９７】
融合分子を介した抗ウイルス活性は、ＥＣ50が精製されたヒト型ＩＦＮβ標準物質について測定されたＥＣ50になるのに必要とされた上清の希釈係数で標準化して求めた。リンカーの長さが長くなるほど、融合構築体の抗ウイルス活性は大きくなった。
実施例１１
本実施例は静脈投与されたマウスに於けるヒトＩＦＮβ／ｓＩＦＮＡＲ２複合体の薬物動態研究である。複合体成分の注射及び、別々の注射について比較した。３６匹のＤ２Ｆ１株マウス（６−８週齢）（それぞれおよそ２０ｇ）を以下４群に分けた：
グループ１には、５０，０００ＩＵ／ｍｌのヒト型ＩＦＮβ溶液２００μｌを単回投与剤として静脈注射された９匹のマウスを含む（最終投与量１０，０００ＩＵ／マウス）。
【００９８】
グループ２には、５，０００ＩＵ／ｍｌのヒト型ＩＦＮβ及び１２５ｍｇ／ｍｌのｓＩＦＮＡＲ２の溶液（２．５ｎｇ／ＩＵ比）２００μｌを投与されたマウス（９匹）を含む。
【００９９】
グループ３は、（１）１２５ｍｇ／ｍｌの液２００μｌ、続いて（２）５，０００ＩＵ／ｍｌのヒト型ＩＦＮβの液２００ｍｌ（２．５ｎｇ／ＩＵ比）を投与された（マウス９匹）。
【０１００】
グループ４は、（１）６２５ｍｇ／ｍｌの液２００μｌ、続いて（２）５，０００ＩＵ／ｍｌのヒト型ＩＦＮβの液２００ｍｌ（１０ｎｇ／ＩＵ比）を投与された（マウス９匹）。
【０１０１】
血液サンプル（およそ２００μｌ／サンプル）を定められた時間に、キャピラリーチューブを使い尾静脈より採取した。各グループ３匹のマウスから、投与後０．０５、２及び１２時間後に血液サンプルを得た。各グループ３匹のマウスから、投与後０．５４及び２４時間後に血液サンプルを得、又各グループ３匹のマウスからは投与後１、８及び４８時間後に血液サンプルを得た。血液サンプルは約１時間室温に放置し、凝固させ、遠心分離した。それより取り出した血清は、全てのサンプルが採取されるまで−７０℃に保管された。血清は、Ｔｏｒａｙヒト型ＩＦＮβＥＬＩＳＡキット（ＴＦＢ，Ｉｎｃ，）を利用し、ＩＦＮβ特異的ＥＬＩＳＡによりヒト型ＩＦＮβの存在についてアッセイし、ＷＩＳＨ抗ウイルスアッセイを利用して生物活性をアッセイした。
【０１０２】
ＩＦＮβ特異的ＥＬＩＳＡの結果は図１５Ａに示し、ＷＩＳＨ抗ウイルスアッセイの結果は図１６Ｂに示す。
【０１０３】
ＩＦＮＡＲ２複合体として注射されたＩＦＮβの血清半減期は、ＩＦＮＡＲを別注射した後に注射されたＩＦＮβのそれに近似していた。これらの結果は、ＩＦＮβ／ＩＦＮＡＲ２複合体のインビボ形成に伴う半減期の延長と合致した。
実施例１２
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを”共通”ＩＦＮ（ヒト型ＩＦＮαＡ／Ｄ）及びｓＩＦＮＡＲ２の複合体で処理した。各種投与量の共通ＩＦＮ単独、またはコントロール投与例と比較し、細胞毒性としての防御作用を測定した。第１グループは、５×１０3ＩＵの共通ＩＦＮの投薬を５／ｎｇ  ＩＵのｓＩＦＮＡＲ２と組み合わせ受けた。第２グループは、５×１０3ＩＵの共通ＩＦＮの投薬を受けた。第３グループは５×１０4ＩＵの共通ＩＦＮの投薬を、第４グループはＰＢＳ／２％ＮＭＳの投薬を受けた。これらマウスそれぞれについて、ＮＫ標的細胞ＹＡＣ−１に対知る脾臓細胞の細胞毒性としてＮＫ活性を測定した。結果は図１６に示した。ＮＫ活性は、共通ＩＦＮのみで処理されたマウスに比べ、共通ＩＦＮ／ｓＩＦＮＡＲ２複合体で処理したマウスで有意に増加した
実施例１３
上記の如く、薬物動態研究よりＩＦＮレセプターサブユニットの可溶型であるｓＩＦＮＡＲ２と複合して投与すると、Ｉ型ＩＦＮｓの血清半減期は劇的に延長することが示された。インビトロの結果は、ＩＦＮＡＲ２との物理的不随が通常不安定なＩＦＮを安定化させることを示唆している。ＩＦＮＡＲ２の増強されたＰＫプロフィールと安定化作用がインビボに於けるＩＦＮ介在作用の増強と延長をもたらすのか調べるために、重症の複合免疫不全（ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄ）マウスに致死量のＩＦＮ感受性ＤｕｄｉヒトＢ細胞リンパ腫細胞株を接種するモデルが開発された（Ｇｈｅｔｉｅ，１９９１；Ｇｈｅｔｉｅ，１９９１）。これらマウスは腫瘍細胞注射後１４−２０日後に拡散したリンパ腫細胞の組織像を伴う麻痺を発症した。毎日ヒト型ＩＦＮβを皮下投与すると、明らかに用量依存的にこれらマウスの生存日数が延長された。このモデルをインビボに於ける１型ＩＦＮｓ関連生物活性の増強因子としてＩＦＮＡＲ２を評価するのに利用した。
【０１０４】
Ｄａｕｄｉ  ｓｃｉｄモデルに於ける麻痺発症までの平均時間とＩＦＮβの投与量との関連性を確立するために、４−５週齢、メスのＢＡＬＢ／ｃＢｙＪＳｍｎ−ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄ株マウス５匹よりなる５グループに０日から３０日まで毎日ヒト型ＩＦＮβを２００μｌ／マウス／日の割合で皮下投与した。凍結保存体より拡張したＤｕｄｉ細胞の標準投与量、５×１０6細胞／マウスをＰＢＳの形でマウスの首筋に皮下注射した。各グループのマウスは以下の量のＩＦＮを投与された。
グループ１：１３５×１０4ＩＵ／マウス（６７５×１０4ＩＵ／ｍｌ）
グループ２：４５×１０4ＩＵ／マウス（２２５×１０4ＩＵ／ｍｌ）
グループ３：１５×１０4ＩＵ／マウス（７５×１０4ＩＵ／ｍｌ）
グループ４：５×１０4ＩＵ／マウス（２５×１０4ＩＵ／ｍｌ）
グループ５：２％ＮＭＳ入りＰＢＳ
個別の麻痺に至る時間及びその平均値を表Ｖに示す。
【０１０５】
【表５】
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即ち、Ｄａｕｄｉ／ｓｃｉｄ外殖体モデルでは、麻痺発症までの時間は毎日ヒト型ＩＦＮβを皮下注射することで用量依存的に延長されることが示された。
実施例１４
ＩＦＮβの抗ガン作用が２．５ｎｇ／ＩＵのＩＦＮＡＲ２と複合化することで増強できるか調べるために、各グループに対する試験物質量が以下であることを除き実施例１３記載のプロトコールに同一なプロトコールで、５匹、７グループのマウスを処理した。
【０１０６】
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個別の麻痺に至る時間及びその平均値を下表に示す。
【０１０７】
【表６】
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＊１方向ＡＮＯＶＡによる測定によるペア形式のグループ間比較において、非複合化形式の同一濃度ＩＦＮβに比べて統計有意（ｐ値≦０．０５）。
【０１０８】
低用量のＩＦＮβ２×１０4ＩＵ／マウス／日及びＤａｕｄｉ／ｓｃｉｄ外殖体モデルの抗ガン活性は、ＩＦＮＡＲ２と複合化することで有意に増強されることが分かる。
【０１０９】
追加実験（データ未提示）にて平均麻痺発症時間に及ぼす注射の効果を調べた。Ｄａｕｄｉ／ｓｃｉｄ外殖体モデルでは、ＩＦＮβ／ＩＦＮＡＲＧ２複合体により処置した場合、注射が週１回の如く低頻度でも遊離型ＩＦＮβを１日１回の様に頻繁に注射した場合に比べ有意に増強された抗ガン活性が得られることが判明した。更に、追加実験に於いて（データ未提示）、ＩＦＮＡＲ対ＩＦＮβ最適比を調べた。単独のＩＦＮβ濃度（２×１０4／ＩＵ／マウス／日）での抗ガン活性増強に関するＩＦＮＡＲ２：ＩＦＮβの最適比率は２．５ｎｇＩＦＮＡＲ２／ｐｇＩＦＮβであることが見いだされた。
【０１１０】
第２実験では、ＩＦＮβの濃度が５×１０4／ＩＵ／マウス／日の場合、抗ガン活性増強に於けるＩＦＮＡＲ２：ＩＦＮβの最適比率は０．３ｎｇＩＦＮＡＲ２／ｐｇＩＦＮβであることが見いだされた。これら２つの実験より、最適比率はＩＦＮβ濃度に依存し、ＩＦＮβ濃度が高いと、必要とされる比率は低くなる様に思える。
【０１１１】
同一モデルを利用した別の実験に於いて、ＩＦＮＡＲ２単独投与は研究中おマウスの生存率を上げないことが判明した。
実施例１５
本実施例は単回大量静脈注射されたマウスに於ける、融合体５ＧＳの血清半減期を調べるための薬物動態研究である。２１匹のＢ６Ｄ２Ｆ１株マウス（６−８週齢）（それぞれおよそ２０ｇ）を以下３グループに分けた：
グループ１：１００，０００ＩＵ／ｍｌの融合体５ＧＳ溶液２００μｌを単回大量静脈投与された９匹のマウスを含む（最終投与量２０，０００ＩＵ／マウス又は５×１０6ＩＵ／ｋｇ）。
【０１１２】
グループ２：（マウス９匹）１００，０００ＩＵ／ｍｌのヒト型ＩＦＮβ溶液２００μｌを投与。
【０１１３】
グループ３：陰性コントロールとす未注射マウス３匹を含む。
およそ血液量を２ｍｌ／マウスと仮定すると、理論上のＣmax及びＴmaxはグループ１及び２については１０，０００ＩＵ／ｍｌである。グループ１及び２それぞれのマウス３匹から投与０．０５、２及び１２時間後に血液を採取した。グループ１及び２それぞれのマウス３匹から投与０．５、４及び２４時間後に血液を採取し、グループ１及び２それぞれのマウス３匹から投与１、８及び４８時間後に血液を採取した。血清をＷＩＳＨアッセイを利用して、生物活性ヒト型ＩＦＮβの存在について調べた。
【０１１４】
結果は図１７に示す。ＴＦＮβはほぼ即時的に排除されたのに対し、融合対分子は注射後も長期間血清に留まった。このことは、融合蛋白質は所望の安定化作用を持つことを示す。
【０１１５】
具体的実施例の前記内容は本発明の一般的性質を表したものでり、現在の知識を適用することで、特段の実験なしに、また一般的なコンセプトから逸脱することなしに、各種応用を目的としてこれら具体的実施態様を改良し、及び／又は適用することが可能であり、従ってこれら適用及び改良は開示された実施態様の趣旨及び等価の範囲内に包含されるべきであり、又包含されるものである。ここに使用された語句、または命名法は記述を目的とするものであり、限定を目的としたものではない。開示された各種機能を実施するための手段、材料及び工程は、本発明から逸脱することなしに様々な別の形を取ってよい。換言すれば、”する方法”及び”するための方法”または上記明細書中、及び／又は以下クレーム中に認められる方法工程を表す、機能表現を伴ういずれの語も、上記明細書に開示された実施態様に正確に等価であるか否かに関わらず、即ち同一機能を実施するために利用可能なその他の方法又は工程を問わず、引用された機能を実施する為の現存、または将来存在するであろういずれかの構造的、物理的、化学的又は電気的要素、又は構造、あるいはいずれかの方法工程を、規定し、包含することを意図するものである；又これら表現は広義に解釈されることを意図している。
文献
【０１１６】
【表７】
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【０１１７】
【表８】
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【０１１８】
【表９】
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【０１１９】
【表１０】
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【図面の簡単な説明】
本発明は以下の図面と結びつけることでより良く理解される。
【図１】  図１はＩＦＮβ存在下に於けるｓＩＦＮＡＲ２又はＩＦＮＡＲ２Ｉｇ（ヒトＩｇＧ１ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインと融合したｈＩＦＮＡＲ２の細胞外ドメインより構成される）の容量依存的な抗ウイルス活性を示す。
【図２】  図２は準最適用量のＩＦＮβに於けるｓＩＦＮＡＲ２及びＩＦＮβの抗ウイルス活性を示す図である。１時間の前インキュベーション後に、中間的ＩＦＮβ用量に於いてＩＦＮβ及びｓＩＦＮＲ２の相乗的抗ウイルス活性が認められる。
【図３】  図４は、前インキュベーション時間の関数として表したｓＩＦＮＡＲ２及び準有効量のＩＦＮβ（０．９５ＩＵ／ｍｌ）の抗ウイルス活性を示す図である。ＷＩＳＨ細胞をＩＦＮβ（０．９５ＩＵ／ｍｌ準有効量）とｓＩＦＮＡＲ２に曝し、続いて表示された時間前インキュベーションした。相乗的抗ウイルス活性は前インキュベーション４時間以後にのみ観察された。抗ウイルス活性はＶＳＶチャレンジ４８時間後のＭＴＴ変換により測定された。ＩＦＮβの準治療レベルでは、ＩＦＮＡＲ２／ＩＦＮ複合体の形成により抗ウイルス活性は増強された。
【図４】  図４はｓＩＦＮＡＲ２と前インキュベーション後の、ヒト型ＩＦＮβの増強抗ウイルス活性を示す図である。
【図５】  図５は、ｓＩＦＮＡＲに関連したヒト型ＩＦＮβの抗ウイルス活性がＩＦＮＡＲ２に特異的であり、他の蛋白質には特異性を持たないことを示す図である。
【図６】  図６は、ＥＬＩＳＡで測定されたマウスに於けるヒト型ＩＦＮβ、及びＩＦＮβ／ＩＦＮＡＲ２複合体の薬力作用の比較を示す図である。
【図７】  図７は、バイオアッセイで測定されたマウスに於けるヒト型ＩＦＮβ、及びＩＦＮβ／ＩＦＮＡＲ２複合体の薬力作用の比較を示す図である。
【図８】  図８は、ＥＬＩＳＡで測定されたマウスに於けるヒト型ＩＦＮα、及びＩＦＮα／ＩＦＮＡＲ２複合体の薬力作用の比較を示す図である。
【図９】  図９は、バイオアッセイで測定されたマウスに於けるヒト型ＩＦＮα、及びＩＦＮα／ＩＦＮＡＲ２複合体の薬力作用の比較を示す図である。
【図１０】  図１０は、ｎ＝２のＩＦＮＡＲ２／ＩＦＮβ融合蛋白質（配列番号１４）のアミノ酸配列を示す、（ＧＧＧＧＳ）2（配列番号１４の残基２４０−２４９）リンカーには下線を付けた。
【図１１】  図１１はｐＣＭＶ−ＩＦＮＡＲ２／ＩＦＮβの制限酵素分析を示すゲルである；１０％ＰＡＧ、レーン３−７：ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ消化；レーン２：ＳａｍＩ／ＸｈｏＩ消化；レーン１；ｐＢＲ３２２ＤＮＡ−ＭｓｐＩ消化マーカー；レーン２；ｐＣＭＶ−ＩＦＮＡＲ２／ＩＦＮβ、０ＧＳ；レーン３：１ＧＳ；レーン４：２ＧＳ；レーン５：３ＧＳ；レーン６：４ＧＳ；レーン７：５ＧＳ；レーン８：φＸ１７４  ＲＦＤＮＡ  ＨａｅIII消化マーカー。
【図１２】  図１２は、ＩＦＮＡＲ２／ＩＦＮβ発現ベクターの制限エンドヌクレアーゼマップである。
【図１３】  図１３は、ＩＦＮＡＲ２／ＩＦＮβ融合蛋白質のウエスタンブロット分析である。レーン１，リンカーを含まないＩＦＮＡＲ２／ＩＦＮβ構築体；レーン２、１Ｇｌｙ4Ｓｅｒ（配列番号１）リンカーを含むＩＦＮＡＲ２／ＩＦＮβ構築体；レーン３、２Ｇｌｙ4Ｓｅｒ（配列番号１）リンカーを含むＩＦＮＡＲ２／ＩＦＮβ構築体；レーン４、３Ｇｌｙ4Ｓｅｒ（配列番号１）リンカーを含むＩＦＮＡＲ２／ＩＦＮβ構築体；レーン５、４Ｇｌｙ4Ｓｅｒ（配列番号１）リンカーを含むＩＦＮＡＲ２／ＩＦＮβ構築体；レーン６、５Ｇｌｙ4Ｓｅｒ（配列番号１）リンカーを含むＩＦＮＡＲ２／ＩＦＮβ構築体。
【図１４】  図１４は、ＣＨＯ細胞上清中のＣＨＯ内に発現され、ＩＦＮβの標準活性にて基準化した混合分子の抗ウイルス活性を示す図である。
【図１５】  図１５Ａ−Ｂは、ＩＦＮＡＲ２の静脈内注射後に投与されたＩＦＮβの薬物動態を示す図。ＩＦＮβはＩＦＮＡＲ複合体として単独投与され、あるいはｓＩＦＮＡＲ２を別にＩ．Ｖ．注射した直後に注射された。血清半減期は、ＩＦＮβ特異的ＥＬＩＳＡ（１５Ａ）、及びＷＩＳＨ抗ウイルスアッセイでの生物活性として（図１５Ｂ）注射後の指定時間に測定された。
【図１６】  図１６は、汎用ＩＦＮを単独投与との、またはコントロールと比較し細胞毒性％で表した場合の、ｓＩＦＮＡＲ２と複合体形成した”汎用”ＩＦＮ（ヒト型ＩＦＮαＡ／Ｄ）の複合体の各種投与量に於ける保護作用を示す図。
【図１７】  図１７は、混合体ＧＳ５又はｈＩＦＮβを単独で単回静脈注射した後の、ＩＦＮβの血清濃度の時間経過を示す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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