(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
移植片拒絶を予防するための医薬の製造のための有効量のＦｇｌ２のインヒビターの使用であって、該インヒビターがＦｇｌ２に結合する抗体であるところの使用。
【請求項２】
胎児喪失を予防または治療するための医薬の製造のための有効量のＦｇｌ２のインヒビターの使用であって、該インヒビターがＦｇｌ２に結合する抗体であるところの使用。
【請求項３】
抗体が配列番号２に示すアミノ酸配列を有するヒトＦｇｌ２に結合するモノクローナル抗体である請求項１または２記載の使用。
【請求項４】
抗体がアミノ酸ＤＲＹＰＳＧＮＣＧＬＹＹＳＳＧを含むヒトＦｇｌ２のエピトープに結合する請求項３記載の使用。
【請求項５】
動物から採取した生物学的試料中においてＦｇｌ２タンパク質またはＦｇｌ２核酸を検出することからなる、動物における移植片拒絶の有無をイン・ビトロで試験する方法であって、Ｆｇｌ２の増加が移植片拒絶を示すところの方法。
【請求項６】
動物から採取した生物学的試料中においてＦｇｌ２タンパク質またはＦｇｌ２核酸を検出することからなる、動物における胎児喪失の有無をイン・ビトロで試験する方法であって、Ｆｇｌ２の増加が胎児喪失を示すところの方法。
【請求項７】
（ａ）配列番号１または３に示される配列を有する核酸分子またはそのフラグメント、または（ｂ）配列番号２または４に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質またはそのフラグメントを検出することからなる請求項５または６記載の方法。
【請求項８】
試料中のＦｇｌ２に結合した後に検出することができるＦｇｌ２に結合する抗体と試料とを接触させて、Ｆｇｌ２タンパク質を検出することからなる請求項７記載の方法。
【請求項９】
ハイブリダイゼーション産物の形成を可能にする条件下で、核酸分子とハイブリダイズしてハイブリダイゼーション産物を形成することができるヌクレオチドプローブと試料とを接触させ、ハイブリダイゼーション産物を検出して、Ｆｇｌ２をコードする核酸分子を検出することからなる請求項７記載の方法。
【請求項１０】
さらに、増幅配列の形成を可能にする条件下で試料をポリメラーゼ連鎖反応において核酸分子を増幅できるプライマーで処理して、増幅配列を形成させ、増幅配列を検出することからなる請求項７記載の方法。
【請求項１１】
Ｆｇｌ２タンパク質に特異的な抗体と適当な希釈剤または担体とを混合して含む、動物における移植片拒絶の阻害に使用するための組成物。
【請求項１２】
Ｆｇｌ２タンパク質に特異的な抗体と適当な希釈剤または担体とを混合して含む、動物における胎児喪失の阻害に使用するための組成物。
【請求項１３】
移植片拒絶を予防するための医薬の製造のための治療上有効量の請求項１１記載の組成物の使用。
【請求項１４】
胎児喪失を予防または治療するための医薬の製造のための治療上有効量の請求項１２記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、新規な抗体および免疫性凝固を調節する化合物を用いて免疫性凝固を調節する方法に関する。
発明の背景
凝固経路の活性化は、免疫性および炎症性反応の重要な部分であり、細菌およびウイルス感染（例えば、内毒素性ショック、ウイルス肝炎）、糸球体腎炎（ＧＮ）、癌、いくつかの胃腸疾患、同種異系移植片および異種移植片拒絶および自然発生的またはストレスによって引き起こされる胎児喪失（fetal loss）に関連する。免疫性凝固は、それが引き起こされると、特異的リガンドを活性化して分解を生じるいくつかのコアグラント（coagulant）、およびフィブリン沈着に導く凝固経路の活性化によって媒介される。免疫性コアグラントの発現へ導く分子事象は、内皮細胞上の抗原とマクロファージおよび内皮細胞上のＦｃレセプターの両方に結合する自然抗体を伴う。付加的なメカニズムは、免疫複合体によって媒介されるマクロファージプロコアグラント（procoagulant）の誘導である。これらの事象は、血小板活性化を起こし、最終的にフィブリン沈着を引き起こすトロンビン生産を導く。
肝炎患者の５０％において、中程度から重症の肺病性凝固障害、または散在性血管内凝固障害が劇症肝炎に関連して見られる。壊死領域周辺に血栓形成が観察される（Sinclairら、1990およびLee,W.M.,1993）。肝炎の結果として、因子ＩＩ、Ｖ、ＶＩＩおよびＸのレベルが肝臓において減少し、肺病性凝固障害と肝臓総合機能の減少の両方に反映する。また、トロンビン−抗トロンビン複合体のレベルは高く、血小板数は低い（Lee,W.M.,1993）。これらの結果は、凝固経路を包含する宿主免疫系がＨＢＶ感染の結果として破壊されることを示す。ＨＢＶの限られた宿主範囲および組織培養においてウイルスを増殖させることの困難が、ＨＢＶおよび肝炎Ｂの解明を妨げてきた。
単核食細胞およびマクロファージは、凝固におけるそれらの役割のため、すなわち、それらは、組織因子のような必須凝固因子のいくつかを合成し、それらの表面はフィブリン沈着の部位として役立つので、プロコアグラント活性の肝炎特異的誘導の病因に関係する。凝固カスケードに関係する因子は、不活性チモーゲンとして放出され、活性化において、前記の活性化因子によって、それらはそれらの活性型に変換する。因子は、主にセリンプロテアーゼである（Davieら、1991）。因子ＶＩＩａ、ＸＩＩａ、ＸＩａ、Ｘａ、ＩＸａ、トロンビン、カリクレインおよびプラスミノーゲンは、ファミリー１セリンプロテアーゼの下に類別される（Davieら、1991;BarrettおよびRawlings,1995;RawlingsおよびBarrett,1994;Nduwinmanaら、1995）。凝固カスケードを開始するためには、プロコアグラントが発現されなければならない。RueggおよびPytelaは、１９９５年に、ネズミフィブリノーゲン様タンパク質（Koyamaら、1987）に相同のタンパク質をコードするｃＤＮＡを単離した。しかしながら、彼らは、該タンパク質の機能を決定せず、または免疫性凝固の調節におけるその使用を理解しなかった。
凝固経路の活性化に関連する多くの疾患を考慮して、プロコアグラントを同定および特徴付ける必要があり、細菌およびウイルス感染、糸球体腎炎（ＧＮ）、癌、いくつかの胃腸疾患、同種異系移植片および異種移植片拒絶および自然発生的またはストレスによって引き起こされる胎児喪失を包含する免疫性凝固に関連した疾患の予防、治療および診断において有用な、免疫性凝固を調節するための方法を開発する必要がある。
発明の概要
本発明者らは、免疫性プロコアグラント、ならびにその生産を導く分子および細胞事象を同定および特徴づけた。詳細には、マウスおよびヒトの直接的プロトロンビナーゼ遺伝子（本明細書において、各々、「ｍＦｇｌ２」および「ｈＦｇｌ２」という）をクローン化し、配列決定した。ヒトおよびマウスＦｇｌ２の核酸配列は、各々、配列番号１および３に示す。遺伝子は、機能的プロトロンビナーゼ活性を有する膜貫通型セリンプロテアーゼをコードする。該遺伝子によってコードされるタンパク質を、ヒトおよびマウスの両方で配列決定した。タンパク質は、約７０ｋＤの分子量を有する。ｈｆｇｌ２遺伝子は、染色体７に位置決定され、ｍＦｇｌ２は染色体５に位置決定された。発明者らは、ヒトプロトロンビナーゼをコードするゲノムＤＮＡをクローン化し、配列決定した。ｈＦｇｌ２をコードするゲノムＤＮＡの構成を図１に概略図で示す。プロモーター領域、エキソン１、エキソン２および３’ＵＴＲの核酸配列を各々、図８、２、３および４に示す。ヒトおよびマウスＦｇｌ２タンパク質のアミノ酸配列を各々、図５ならびに配列番号２および４に示す。
Ｆｇｌ２が直接的プロトロンビナーゼであるという発明者らによる決定は、免疫性凝固に関する病状の診断方法および治療の発展を可能にする。
したがって、本発明は、免疫性凝固を阻害する方法であって、Ｆｇｌ２の活性または発現を阻害することからなる方法を提供する。該方法は、細菌およびウイルス感染、糸球体腎炎（ＧＮ）、癌、いくつかの胃腸疾患、同種異系移植片および異種移植片拒絶および自然発生的またはストレスによって引き起こされる胎児喪失のような免疫性凝固の減少を必要とする病状を治療するために、イン・ビボで用いることができる。
１の態様において、Ｆｇｌ２に結合する抗体を用いてＦｇｌ２の活性を阻害してもよい。本発明者らは、Ｆｇｌ２を中和し、内毒素性ショック、ウイルス肝炎、同種異系移植片および異種移植片拒絶に関連するフィブリン沈着を防止するモノクローナルおよびポリクローナル抗体のパネルを発展させた。抗体は、細胞浸潤、フィブリン沈着および組織損傷を防止し、生存を増加させることが示された。特に、直接的プロトロンビナーゼ（Ｆｇｌ２）に対する抗体は、同種異系移植片および異種移植片拒絶ならびにストレスまたはサイトカインによって誘導される胎児喪失を包含する大規模なフィブリン沈着および凝固性壊死に関連することが知られた疾患の予防に非常に有用であることがわかった。
１の具体例において、本発明は、有効量のＦｇｌ２に対する抗体をその必要のある動物に投与することからなる移植片拒絶を予防または減少させる方法を提供する。
もう１つの具体例において、本発明は、有効量のＦｇｌ２に対する抗体をその必要のある動物に投与することからなる胎児喪失を予防または減少させる方法を提供する。
抗体は、全Ｆｇｌ２タンパク質またはその免疫原部分を用いて調製できる。好ましくは、かかる部分は、少なくとも約１０6Ｌ／モルのアフィニティーで、Ｆｇｌ２に対して生じた抗体に結合する。特に、本発明者らは、アミノ酸残基３００〜４００を含むペプチドが生じる抗体に有用であることを示した。したがって、本発明は、（ａ）図５におけるおよその位置３００〜４００のアミノ酸を含むペプチドと免疫反応し；（ｂ）ｈＦｇｌ２のプロトロンビナーゼ活性を中和する抗体を意図する。本発明は、また、モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞系統ならびにそのインヒビターおよびアクチベーターに関する。
もう１つの態様において、Ｆｇｌ２の発現は、Ｆｇｌ２遺伝子由来の核酸配列に相補的なアンチセンス分子を用いて阻害され得る。特に、図２または３に示されるＦｇｌ２の核酸配列は、転写のためのそれらの正常な提示に対して逆転して、アンチセンス核酸分子を生じ得る。
Ｆｇｌ２の付加的なインヒビターは、Ｆｇｌ２のプロトロンビナーゼ活性を阻害する物質を試験することによって同定してもよい。特に、本発明は、Ｆｇｌ２のプロトロンビナーゼ活性に影響を及ぼす物質についてアッセイする方法であって、（ａ）基質が分解して生産物を生じることのできる条件下で、Ｆｇｌ２、Ｆｇｌ２によって分解されて生産物を生じることのできる基質および試験物質を反応させ；（ｂ）生産物についてアッセイし；（ｃ）物質の不在下で得られた生産物と比較して、Ｆｇｌ２タンパク質のプロトロンビナーゼ活性に対する物質の影響を決定する方法を意図する。
本発明のＦｇｌ２をコードする核酸分子、Ｆｇｌ２タンパク質およびモノクローナル抗体は、診断的およびモニター的応用を有する。特に、それらを細菌およびウイルス感染（例えば、内毒素性ショック、ウイルス肝炎）、同種異系移植片拒絶、糸球体腎炎、癌、いくつかの胃腸疾患および胎児喪失のような病状をモニターまたは診断するために、通常のアッセイに使用してもよい。
１の具体例において、本発明は、動物由来の生物学的試料中においてＦｇｌ２タンパク質またはＦｇｌ２核酸を検出することからなる、動物において免疫性凝固の増加に関する病状を診断またはモニターする方法を提供する。
本発明は、また、（ａ）本発明のハイブリドーマ細胞系統によって生産されるモノクローナル抗体；（ｂ）モノクローナル抗体のインヒビターおよびアクチベーター；（ｃ）Ｆｇｌ２に対する抗体；（ｄ）ｆｇｌ２に対するアンチセンス核酸分子；および（ｅ）本発明の方法を用いて同定される物質（例えば、本発明の核酸分子の発現のインヒビターおよびアクチベーター；および本発明のＦｇｌ２タンパク質の活性のインヒビターおよびアクチベーター）を含んでなる組成物、および（ａ）本発明のハイブリドーマ細胞系統によって生産されるモノクローナル抗体；（ｂ）モノクローナル抗体のインヒビターおよびアクチベーター；（ｃ）Ｆｇｌ２に対する抗体；（ｄ）ｆｇｌ２に対するアンチセンス核酸分子；および（ｅ）本発明の方法を用いて同定される物質（例えば、本発明の核酸分子の発現のインヒビターおよびアクチベーター；および本発明のＦｇｌ２タンパク質の活性のインヒビターおよびアクチベーター）の使用法を意図する。
本発明の組成物は、プロコアグラント活性の減少を必要とする病状の予防または治療に使用してもよい。したがって、本発明は、治療上有効量の１以上のＦｇｌ２のインヒビターを含んでなる、プロコアグラント活性の減少を必要とする病状の治療のための組成物を意図する。インヒビターは、Ｆｇｌ２に特異的な抗体；本発明のアンチセンス核酸分子；本発明の方法によって同定される物質または本発明のハイブリドーマ細胞系統によって生産されるモノクローナル抗体であってもよい。プロコアグラント活性の減少を必要とする病状は、細菌およびウイルス感染（例えば、内毒素性ショック、ウイルス肝炎）、同種異系移植片および異種移植片拒絶、糸球体腎炎、癌、いくつかの胃腸疾患および胎児喪失を包含する。
本発明は、また、移植片拒絶に対する保護を提供するのに十分な量のＦｇｌ２タンパク質を含んでなる、移植片拒絶を予防するワクチンも意図する。
本発明は、また、胎児喪失に対する保護を提供するのに十分な量のＦｇｌ２タンパク質を含んでなる、胎児喪失を予防するワクチンも意図する。
本発明の他の目的、特徴および利益は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、詳細な説明および本発明の好ましい具体例を示す特別の実施例は、単に例示として与えられるものであり、本発明の精神および範囲内の種々の変更および修飾は、詳細な説明から当業者に明らかになろう。
図面の説明
本発明は、図面の引用によってより良く理解されるであろう。
図１は、ｈｆｇｌ２遺伝子を示す概略図である。
図２は、マウスおよびヒトＦｇｌ２遺伝子のエキソン１のヌクレオチド配列を示す。
図３は、マウスおよびヒトＦｇｌ２遺伝子のエキソン２のヌクレオチド配列を示す。
図４は、ｈＦｇｌ２の３’ＵＴＲのヌクレオチド配列を示す。
図５は、ボックスで囲まれたセリンプロテアーゼ部位を有するマウスおよびヒトＦｇｌ２タンパク質のアミノ酸配列を示す。
図６は、下線を付した５個のグリコシル化部位を有するマウスおよびヒトＦｇｌ２タンパク質のアミノ酸配列である。
図７は、ｈＦｇｌ２タンパク質の予想される第２構造を示す。
図８は、マウスおよびヒトＦｇｌ２遺伝子プロモーター領域のヌクレオチド配列を示す。
図９は、ｈｆｇｌ２の推定プロモーター領域における転写結合部位の核酸配列を示す。
図１０Ａは、ＣＨＥＦゲル上におけるＰＡＣクローンの電気泳動の試料である。
図１０Ｂは、標準のゲル上におけるＰＡＣクローンの電気泳動の試料である。
図１１は、３個のＰＡＣクローンの制限地図である。
図１２は、ＣｓＡ単独または免疫性コアグラントに対する抗体との組み合わせによるＣｓＡ移植片拒絶の防止を示すグラフである。
図１３は、ｐＧＬ２−Ｂａｓｉｃ−ｆｇｌ２プロモーター領域構築物の地図である。
図１４は、異種血清対自己血清におけるＦｇｌ２誘導を示す。
図１５は、異種血清対自己血清におけるｆｇｌ−２誘導に対する用量応答曲線を示す。
図１６は、一連の５’欠失およびｐＬ３’２７４についてルシフェラーゼ活性のＦＢＳ誘導を示す。
図１７は、Ｆｇｌ−２プロモーターＤＮＡ配列を示す。
図１８は、モノクローナル抗体３Ｄ４．３による胎児喪失の防止を示すグラフである。
図１９は、ネズミｆｇｌ２の発現の時間経過を示すゲルである。
図２０は、発現したｆｇｌ２を示すウェスタンブロットである。
図２１は、発現したｆｇｌ２を示すクーマシーブルー染色したゲルである。
図２２は、125Ｉ標識したｆｇｌ２を示す放射能写真である。
発明の詳細な説明
以下の標準的なアミノ酸残基の省略形を明細書を通じて使用する。Ａ，Ａｌａ−アラニン；Ｃ，Ｃｙｓ−システイン；Ｄ，Ａｓｐ−アスパラギン酸；Ｅ，Ｇｌｕ−グルタミン酸；Ｆ，Ｐｈｅ−フェニルアラニン；Ｇ，Ｇｌｙ−グリシン；Ｈ，Ｈｉｓ−ヒスチジン；Ｉ，Ｉｌｅ−イソロイシン；Ｋ，Ｌｙｓ−リジン；Ｌ，Ｌｅｕ−ロイシン；Ｍ，Ｍｅｔ−メチオニン；Ｎ，Ａｓｎ−アスパラギン；Ｐ，Ｐｒｏ−プロリン；Ｑ，Ｇｌｎ−グルタミン；Ｒ，Ａｒｇ−アルギニン；Ｓ，Ｓｅｒ−セリン；Ｔ，Ｔｈｒ−スレオニン；Ｖ，Ｖａｌ−バリン；Ｗ，Ｔｒｐ−トリプトファン；Ｙ，Ｔｙｒ−チロシン；およびｐ．Ｙ．，Ｐ．Ｔｙｒ−ホスホチロシン。
本明細書に前記したように、発明者らは、タンパク質Ｆｇｌ２をコードするヒトおよびマウス遺伝子をクローン化し、配列決定した。発明者らは、Ｆｇｌ２タンパク質を特徴付けし、それが直接的プロトロンビナーゼであることを示した。直接的トロンビナーゼであるという決定は、免疫性凝固に関する病状の治療および診断方法ならびに該病状のための組成物の開発を可能にする。
１．治療的応用
（Ａ）免疫性凝固を阻害する方法
１の態様において、本発明は、Ｆｇｌ２の活性または発現を阻害することによって免疫性凝固を阻害する方法を包含する。免疫性凝固を阻害する方法は、細菌およびウイルス感染（例えば、内毒素性ショック、ウイルス肝炎）、同種異系移植片および異種移植片拒絶、糸球体腎炎、癌、いくつかの胃腸疾患および胎児喪失を包含する、プロコアグラント活性の減少を必要とする病状の治療に有用であり得る。
したがって、本発明は、有効量のＦｇｌ２のインヒビターをその必要のある動物に投与することからなる、免疫性凝固の減少を必要とする病状の予防または治療法を提供する。
「有効量」の本発明の化合物の投与は、所望の結果を達成するために必要な投与量および時間で、所望の結果を達成するのに有効な量として定義される。有効量の本発明の化合物（例えば、Ｆｇｌ２のインヒビター）は、動物の病態、年齢、性別および体重のような因子によって変化させてもよい。投与計画は、最適な治療応答を提供するように調整してもよい。例えば、１日に投与量を数回に分けて投与するか、または治療状況の緊急性に比例して、投与量を減らしてもよい。本明細書で使用される場合、「動物」なる語は、ヒトを含む動物界の全てのメンバーを包含する。好ましくは、治療されるべき動物はヒトである。
Ｆｇｌ２のインヒビターは、Ｆｇｌ２遺伝子の転写および翻訳を阻害する物質ならびにＦｇｌ２タンパク質のプロトロンビナーゼ活性を阻害する物質を包含する。
（ｉ）抗体
Ｆｇｌ２タンパク質のプロトロンビナーゼ活性を阻害することのできる物質の例は、Ｆｇｌ２に結合し、中和するポリクローナルおよびモノクローナル抗体である。
したがって、本発明は、有効量のＦｇｌ２に対する抗体をその必要のある動物に投与することからなる、免疫性凝固の減少を必要とする病状の予防または治療法を提供する。有効量の抗体とは、Ｆｇｌ２タンパク質のプロトロンビナーゼ活性を中和または阻害するのに十分な抗体量を意味する。
発明者らは、Ｆｇｌ２の活性を中和するモノクローナル抗体を調製した。特に、発明者らは、Ｆｇｌ２に対する抗体が同種異系移植片および異種移植片モデルの両方において移植片拒絶を阻害できることを示した。したがって、本発明は、有効量のＦｇｌ２に対する抗体をその必要のある動物に投与することからなる、移植片拒絶を予防または減少させる方法を提供する。１の具体例において、動物はヒトであり、抗体はヒトＦｇｌ２に結合する。
発明者らは、また、Ｆｇｌ２に対する抗体がストレスまたはサイトカインによって生じる胎児喪失を予防または減少できることを示した。したがって、本発明は、また、有効量のＦｇｌ２に対する抗体をその必要のある動物に投与することからなる、胎児喪失を予防または減少させる方法を提供する。
本発明は、また、図５における位置３００〜４００のアミノ酸を含むｈＦｇｌ２のエピトープに結合する抗体を提供する。好ましい具体例において、本発明は、図５における位置３６４−３７８（ＤＲＹＰＳＧＮＣＧＬＹＹＳＳＧ）のアミノ酸を含むｈＦｇｌ２のエピトープに結合する抗体を提供する。
Ｆｇｌ２に結合する抗体は、出典明示により本明細書の一部とされるKohlerおよびMilsteinによるNature 256,495（1975）および米国特許第ＲＥ３２，０１１号、４，９０２，６１４号、４，５４３，４３９号および４，４１１，９９３号に記載のような当該分野で既知の技術を用いて調製できる（また、Monoclonal Antibodies,Hybridomas:A New Dimension in Biological Analyses,Plenum Press,Kennett,McKearnおよびBechtol（編）,1980,およびAntibodies:A Labolatory Manual,HarlowおよびLane（編）,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1988を参照のこと（また、これらは出典明示により本明細書の一部とされる））。
本発明の文脈の範囲内で、抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体フラグメント（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）2）および組換え操作により生じた結合パートナーを包含するものと考えられる。抗体は、１０-6Ｍ以上のアフィニティーでＦｇｌ２に結合する場合、本発明の核酸分子によりコードされるタンパク質に対して反応性であると考えられる。通常の当業者にとって明らかなように、該タンパク質に結合する抗体だけでなく、該タンパク質のレギュレーターに結合する抗体および該タンパク質の生物学的活性を遮断する抗体も、開発され得る。
ポリクローナル抗体は、通常の当業者によって、ウマ、ウシ、種々の家禽、ウサギ、マウスまたはラットのような種々の定温動物から容易に生産することができる。簡単に言えば、本発明のＦｇｌ２タンパク質またはその部分を動物を免疫するために用いてもよい。該タンパク質の好ましい部分は、図５に示されるアミノ酸残基３００〜４００、より好ましくは３６４−３７８を含む。動物は、腹膜内、筋内、眼内または皮下注射によって、フロイント完全または不完全アジュバントのようなアジュバントと共に免疫されてもよい。数回の追加免疫の後、血清試料を収集し、タンパク質に対する反応性について試験する。特に好ましいポリクローナル抗血清は、これらのアッセイの１つに対してバックグラウンドより少なくとも３倍以上のシグナルを与えるであろう。一旦、動物のタイターがタンパク質に対するその反応性に関して安定水準に到達すると、週１回の採血によるかまたは動物の全血採取のいずれかによって、より大量の抗血清が容易に得られる。
モノクローナル抗体は、また、本明細書に記載の通常の技術を用いて容易に生産することができる。一般に、ハイブリドーマ細胞系統は、不滅細胞系統と所望の抗体を生産するように適当に免疫された動物由来の脾臓細胞を適当な条件下で融合することからなる過程によって調製される。不滅細胞系統は、ネズミ起源であってもよいが、ラット、ウシ、イヌ、ヒト起源などの細胞系統を包含する他の哺乳動物種の細胞系統を用いてもよい。不滅細胞系統は、たいてい腫瘍起源であり、特にミエローマ細胞だけでなく、例えば、エプスタイン・バーウイルスで形質転換された正常な細胞も包含する。いずれかの不滅細胞を用いて、本発明のハイブリドーマを調製してもよい。
抗体生産細胞は、脾臓細胞または末梢血リンパ球のような融合パートナーとして用いてもよい。細胞の起源となるべき動物は、Ｆｇｌ２由来のペプチドで間隔をあけて免疫してもよい。一例として、動物は、図５におけるおよその位置３００〜４００、好ましくは位置３６４〜３７８のアミノ酸を含むペプチドで免疫する。
不滅細胞とリンパ性細胞を融合して、ポリエチレングリコールを融合剤として用いる標準的なよく知られた技術にしたがって、ハイブリドーマを形成させてもよい。別法では、電気融合によって融合を達成してもよい。
ハイブリドーマは、本明細書に記載の方法を用いて、腹水から精製した上清またはタンパク質を反応性についてアッセイすることによって適当なモノクローナル抗体分泌について選別する。ハイブリドーマは、所望の特性を有する、例えば、Ｆｇｌ２のプロトロンビナーゼ活性を中和する抗体について選別する。
本発明のハイブリドーマ細胞系統によって生産されるモノクローナル抗体もまた、本発明の一部である。本発明の具体例にしたがって、モノクローナル抗体は、図５における位置３００〜４００、好ましくは３６４〜３７８のアミノ酸を含むペプチドと免疫反応する。
図５における位置３００〜４００のアミノ酸を含むペプチドと免疫反応するモノクローナル抗体は、免疫グロブリンの同種群を包含する。免疫グロブリンは、それらのアミノ酸組成および環境に依存して酸性、塩基性または中性形態で存在してもよく、それらは糖類または脂質のような他の分子と結合して見出されることがわかっている。本発明のハイブリドーマ細胞系統によって生産されたモノクローナル抗体は、Ｆｇｌ２の１以上のエピトープに対して向けられていてもよい。Ｆｇｌ２に関連するいずれかの特徴のエピトープは、必須の抗原決定子を提供し得る。ハイブリドーマ細胞系統によって生産されたモノクローナル抗体は、それらがＦｇｌ２由来のペプチド、好ましくは図５におけるおよその位置３００−４００、最も好ましくは３６４〜３７８のアミノ酸を含むペプチドと選択的に反応することができるかぎり、本発明の範囲内にあると解釈される。
本明細書に記載のモノクローナル抗体によって認識される抗原もまた、本発明の一部である。通常の免疫細胞化学法を用いて、本発明のハイブリドーマ細胞系統によって生産されるモノクローナル抗体によって認識される抗原の局在性を特異的細胞および組織に対して決定してもよい。クリオスタットセクションを本発明のモノクローナル抗体と一緒にインキュベートし、アビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ技術（ABC Vectastain）によって処理してもよい。これにより、Ｆｇｌ２の抗原を発現する一連の細胞が決定されるであろう。
本発明は、また、本発明のハイブリドーマ細胞系統によって生産されたＦｇｌ２に対するモノクローナル抗体のアクチベーターまたはインヒビターの存在についてアッセイする方法であって、マクロファージ、既知濃度のモノクローナル抗体および該モノクローナル抗体の推定アクチベーターまたはインヒビターを混合し、プロコアグラント活性についてアッセイすることからなる方法を提供する。本発明の方法により、プロコアグラント活性の刺激物質またはインヒビターの可能性を同定することができる。
本発明は、組換え体またはキメラ抗体分子を包含する。かかる抗体または結合パートナーは、特異的結合抗体をコードする遺伝子の可変領域を組み込むための組換えＤＮＡ技術を利用して、構築してもよい。１の具体例において、可変領域に対するヌクレオチドプライマーを用いて、関連するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ由来の可変領域をコードする遺伝子を増幅する。これらのプライマーは、通常の当業者が合成するか、または商業上利用できる供給源から購入できる。マウスおよびヒト可変領域に対するプライマー、とりわけ、ＶHa、ＶHb、ＶHc、ＶHd、ＣHl、ＶLおよびＣL領域に対するプライマーは、Stratacyte（La Jolla,Calif）から入手できる。これらのプライマーを用いてＨ鎖またはＬ鎖可変領域を増幅し、次いで、それらを各々、ＩｍｍｕｎｏＺＡＰ ＨまたはＩｍｍｕｎｏＺＡＰ Ｌ（Stratacyte）のようなベクター中に挿入してもよい。次いで、これらのベクターを発現用のイー・コリ（E.coli）中に導入してもよい。これらの技術を用いて、ＶＨおよびＶＬドメインの融合を含有する大量の１本鎖タンパク質を製造することができる（Birdら、Science 242:423-426,1988参照）。さらに、かかる技術を用いて、抗体の結合特異性を変化させることなく、「ヒト」抗体を製造してもよい。
（ｉｉ）アンチセンス分子
Ｆｇｌ２遺伝子由来の核酸配列に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドもまた、Ｆｇｌ２活性を阻害するために本発明の方法に用いることができる。
したがって、本発明は、有効量のＦｇｌ２遺伝子由来の核酸配列に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドをその必要のある動物に投与することからなる、免疫性凝固の減少を必要とする病状の予防または治療法を提供する。
本明細書で使用する場合、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」なる語は、その標的に相補的なヌクレオチド配列を意味する。
本発明の１の具体例において、本発明は、図２および図３に示される配列（ここに、ＴはＵであることもできる）を有する核酸分子またはそのフラグメントに相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
「オリゴヌクレオチド」なる語は、ヌクレオチドまたは天然の塩基、糖および糖間（骨格）結合からなるヌクレオシドモノマーのオリゴマーまたはポリマーをいう。また、該用語は、同様に機能する非天然モノマーまたはその部分を含む修飾または置換オリゴマーも包含する。かかる修飾または置換オリゴヌクレオチドは、細胞の取り込みが増加し、またはヌクレアーゼの存在下での安定性が向上するなどの特性のため、天然形態よりも好ましい。また、該用語は、２以上の化学的に異なる領域を含有するキメラオリゴヌクレオチドも包含する。例えば、キメラオリゴヌクレオチドは、有益な特性（例えば、ヌクレアーゼ耐性の増加、細胞への取り込みの増加）を与える少なくとも１領域の修飾ヌクレオチドを含有してもよく、または本発明の２以上のオリゴヌクレオチドを連結させて、キメラオリゴヌクレオチドを形成させてもよい。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、リボ核酸またはデオキシリボ核酸であってもよく、アデニン、グアニン、シトシン、チミジンおよびウラシルを包含する天然塩基を含有してもよい。また、オリゴヌクレオチドは、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メチル、２−プロピルおよび他のアルキルアデニン、５−ハロウラシル、５−ハロシトシン、６−アザウラシル、６−アザシトシンおよび６−アザチミン、擬似ウラシル、４−チオウラシル、８−ハロアデニン、８−アミノアデニン、８−チオールアデニン、８−チオールアルキルアデニン、８−ヒドロキシルアデニンおよび他の８−置換アデニン、８−ハログアニン、８−アミノグアニン、８−チオールグアニン、８−チオールアルキルグアニン、８−ヒドロキシルグアニンおよび他の８−置換グアニン、他のアザおよびデアザウラシル、チミジン、シトシン、アデニンまたはグアニン、５−トリフルオロメチルウラシルおよび５−トリフルオロシトシンのような修飾塩基を含有してもよい。
本発明の他のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、修飾リン酸、リン酸塩骨格における酸素ヘテロ原子、短鎖アルキルもしくはシクロアルキル糖間結合または短鎖ヘテロ原子もしくは複素環状糖間結合を含有してもよい。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、モノチオリン酸塩、リン酸トリエステル、ホスホン酸メチルおよびジチオリン酸塩を含有してもよい。本発明の具体例において、４〜６個の３’−末端塩基間にモノチオリン酸結合が存在する。もう１つの具体例において、モノチオリン酸結合は全てのヌクレオチドを連結している。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、また、治療または実験試薬としてより適したヌクレオチド類似体を含んでもよい。オリゴヌクレオチド類似体の例は、ＤＮＡ（またはＲＮＡ）におけるリン酸デオキシリボース（またはリボース）骨格がペプチドに見られる骨格に類似のポリアミド骨格で置換されているペプチド核酸（ＰＮＡ）である（P.E.Nielsenら、Science1991,254,1497）。ＰＮＡ類似体は、酵素による分解に対して耐性があり、イン・ビボおよびイン・ビトロでの寿命が長いことが示された。ＰＮＡはまた、ＰＮＡ鎖およびＤＮＡ鎖間の電荷反発がないため、相補的ＤＮＡ配列により強く結合する。他のオリゴヌクレオチドは、ポリマー骨格、環状骨格または非環状骨格を含有するヌクレオチドを含有してもよい。例えば、ヌクレオチドは、モルホリノ骨格構造を有してもよい（米国特許第５，０３４，５０６号）。オリゴヌクレオチドは、また、レポーター基、オリゴヌクレオチドの薬力学特性を改善するための基、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドの薬力学特性を改善するための基のような基を含有してもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、また、糖擬似体を有してもよい。
アンチセンス核酸分子は、当該分野で既知の手法を用いて、化学的合成および酵素的連結反応を用いて構築してもよい。本発明のアンチセンス核酸分子またはそのフラグメントは、天然ヌクレオチド、あるいは分子の生物学的安定性が向上するように、またはｍＲＮＡもしくは自然のままの遺伝子と一緒に形成される２本鎖分子の物理的安定性が向上するように設計された種々の修飾ヌクレオチド、例えば、モノチオリン酸誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドを用いて、化学的に合成してもよい。アンチセンス配列は、組換えプラスミド、ファージミドまたは減弱させたウイルスの形態の細胞に導入される発現ベクターを用い、ベクター中で、高い効率の調節領域の制御下でアンチセンス配列を生産させることによって、生物学的に生産してもよく、その活性は、ベクターを導入させた細胞型によって決定し得る。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ベクター（レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターおよびＤＮＡウイルスベクター）または物理的技術、例えば、ミクロ注入を包含する当該分野における技術を用いて、組織または細胞内に導入してもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、直接、イン・ビボで投与してもよく、またはイン・ビトロで細胞をトランスフェクトするのに用い、次いで、それをイン・ビボで投与してもよい。１の具体例において、アンチセンスオリゴヌクレオチドをリポソーム処方においてマクロファージおよび／または内皮細胞にデリバーしてもよい。
（ｉｉｉ）他のＦｇｌ２インヒビター
抗体およびアンチセンスオリゴヌクレオチドに加えて、Ｆｇｌ２を阻害する他の物質を単離してもよい。したがって、本発明は、また、本発明のＦｇｌ２タンパク質のプロトロンビナーゼ活性を阻害する物質についてアッセイする方法であって、本発明のタンパク質、該タンパク質によって分解されて生産物を生じることができる基質および試験物質を、基質の分解を可能にする条件下で反応させ、生産物についてアッセイし、試験物質の不在下で得られた生産物と比較して、該タンパク質のプロトロンビナーゼ活性に対する物質の影響を決定することからなる方法を意図する。適当な基質は、プロトロンビンまたはＣｈｒｏｍａｚｙｍ  ＴＨ（Boehringer Mannheim,Laval,PQ）のような合成基質を包含する。基質の分解を可能にする条件は、物質、基質の性質および量、およびタンパク質の量のような因子を考慮して選択され得る。
ｈｆｇｌ２のｍＲＮＡは、多数のＡＵＵＵＡ反復配列を３’末端に有し、該モチーフは、安定にメッセージを翻訳する一連のＲＮＡ結合タンパク質を結合する。該エレメントの除去はｍＲＮＡ安定性を減少させる。したがって、本発明は、また、ＡＵＵＵＡとＲＮＡ結合タンパク質の相互作用を破壊し、それにより、ｍＲＮＡを不安定にする物質を意図する。ｈｆｇｌ２メッセージに対する試験物質の影響は、常法を用いてアッセイしてもよい。
（Ｂ）Ｆｇｌ２を誘導する方法
別の具体例において、本発明は、Ｆｇｌ２の活性または発現を増加させることによって免疫性凝固を誘導する方法を包含する。免疫性凝固を誘導する方法は、凝固活性の増加を必要とする病状の治療に有用であり得る。かかる方法は、また、胎児喪失を誘導するために用いることができる。
したがって、本発明は、Ｆｇｌ２をコードする核酸配列またはＦｇｌ２タンパク質をその必要のある動物に投与することからなる、免疫性凝固を誘導する方法を提供する。
１の具体例において、本発明は、（ａ）図２または３に示される配列を有する核酸分子またはそのフラグメントあるいは（ｂ）図５に示される配列を有するタンパク質またはそのフラグメントを投与することからなる、免疫性凝固を誘導する方法を提供する。
（Ｃ）組成物
Ｆｇｌ２タンパク質および核酸配列抗体と同様に、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは本明細書に記載の方法を用いて同定されるＦｇｌ２のインヒビターを、単独または他の活性物質と一緒に、物質を含有する医薬組成物中に混合させてもよい。
１の態様において、本発明は、（ａ）Ｆｇｌ２タンパク質に特異的な抗体；（ｂ）Ｆｇｌ２に相補的なアンチセンス核酸分子；または（ｃ）前記の方法を用いて同定されたインヒビターを適当な希釈剤または担体と混合して含む、動物においてプロコアグラント活性を阻害するのに用いるための組成物を提供する。
もう１つの態様において、本発明は、Ｆｇｌ２をコードする核酸配列またはＦｇｌ２タンパク質を適当な希釈剤または担体と混合して含む、動物においてプロコアグラント活性を阻害するのに用いるための組成物を提供する。
かかる医薬組成物は、経口、局所（topical）、直腸、非経口、局部（local）、吸入または皮下、皮内、筋内、鞘内、膣、経腹膜、胎盤および大脳内で使用できる。それらは、液体、固体または半固体形態、例えば、丸剤、錠剤、クリーム、ゼラチンカプセル、カプセル、坐剤、ソフトゼラチンカプセル、ゲル、膜、チューブ（tubelet）、溶液または懸濁液であることができる。
本発明の医薬組成物は、ヒトまたは動物への投与を目的とすることができる。投与すべき投与量は、個々の要望、所望の効果および選択した投与経路に依存する。
医薬組成物は、有効量の活性物質を医薬上許容されるビヒクルと混合して合わせるような、患者に投与できる医薬上許容される組成物の調製のための既知方法自体によって調製できる。適当なビヒクルは、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences（Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,Pa.,USA 1985）に記載されている。
これに基づいて、医薬組成物は、たとえ独占的でなくとも、１以上の医薬上許容されるビヒクルまたは希釈剤と一緒に、適当なｐＨを有し、生理学的液体と等浸透圧の緩衝化用液中に含有された活性化合物または物質を包含する。医薬組成物は、付加的に、アジュバントのような免疫応答を増幅させる他の薬剤を含有してもよい。
本発明のアンチセンス核酸分子は、免疫性プロコアグラント活性を阻害するための遺伝子治療に用いてもよい。レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターおよびＤＮＡウイルスベクターのようなデリバリービヒクルを用いて、アンチセンス配列またはそのオリゴヌクレオチドフラグメントを含む組換え分子を直接、イン・ビボで細胞または組織に導入してもよい。それらは、また、ミクロ注入およびエレクトロポレーションのような物理的技術または共沈およびＤＮＡのリポソームへの取り込みのような化学的方法を用いて、イン・ビボで細胞に導入してもよい。組換え分子は、また、エーロゾルの形態で、または洗浄によってデリバーしてもよい。本発明のアンチセンス核酸分子は、また、例えば、細胞への直接注入によるように細胞外で適用してもよい。
（Ｄ）ワクチン
本発明は、また、Ｆｇｌ２に対する免疫応答を誘導するのに十分な量のＦｇｌ２タンパク質またはペプチドを含んでなる、免疫性凝固に関連する疾患に対するワクチンを意図する。「Ｆｇｌ２タンパク質またはペプチド」なる語は、免疫応答の誘導に有用な全長タンパク質（図５に示される）および該タンパク質の部分（ペプチド）を包含する。１の具体例において、ワクチンは、図５に示されるアミノ酸３００〜４００、好ましくはアミノ酸３６４〜３７８を有するペプチドを含んでなる。
１の具体例において、本発明は、有効量のＦｇｌ２タンパク質またはペプチドを適当な希釈剤または担体と混合して含む、移植片拒絶を予防するためのワクチンを提供する。ワクチンは、移植前または移植と同時に投与するとき、移植片拒絶を防止するのに有用である。
もう１つの態様において、本発明は、有効量のＦｇｌ２タンパク質またはペプチドを適当な希釈剤または担体と混合して含む、胎児喪失を予防するためのワクチンを提供する。
ワクチンは、多価ワクチンであってもよく、付加的に、予防上または治療上有効な方法において他の疾患に関連する免疫原を含有してもよい。
ワクチンは、また、免疫学上許容される担体、例えば、水性希釈剤、懸濁補助剤、賦形剤および当該分野で既知の１以上のアジュバントを含んでもよい。アジュバントの例は、グラム陰性細菌内毒素の脂質Ａ部分、マイコバクテリアのトレハロースジマイコレート、リン脂質リゾレシチン、ジメチルジクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡ）、線状ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレン（ＰＯＰ−ＰＯＥ）ブロックポリマーおよびリポソームを包含する。ワクチンは、また、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＴＮＦおよびＩＦＮγを包含する免疫応答を増幅できるサイトカインを含有してもよい。ワクチンは、また、アジ化ナトリウム、チメロサール、ベータプロピオラクトンおよび二元エチレンジアミンのような保存剤を含有してもよい。
本発明のワクチンは、哺乳動物、鳥類および魚類；好ましくはヒトおよびウシ、ウマおよびブタを含め、種々の他の哺乳動物を包含する動物への投与を目的とすることできる。
本発明のワクチンは、静脈内、筋内、皮下、腹膜内、鼻腔内または経口等による都合のよい方法で投与してもよい。投与量は、疾患の性質、所望の効果および選択した投与経路、ならびに当業者に既知の他の因子に依存するであろう。
本明細書に記載の方法を用いて調製されるワクチンは、関連する疾患の予防または活性免疫化および治療におけるそれらの効力を確かめるために、適当な投与量および投与経路を決定するために、イン・ビボでの動物系において試験してもよい。
本発明は、また、受動免疫化の方法として、本発明のｆｇｌ２タンパク質およびその部分に結合する抗体の使用を包含する。
本発明は、また、Ｆｇｌ２遺伝子またはその部分を用いるＤＮＡ免疫化を包含する。Ｆｇｌ２遺伝子は、図２または３あるいは配列番号１または３に示される配列を有する。Ｆｇｌ２遺伝子の部分は、好ましくは、図５における位置３００〜４００のアミノ酸残基を含むペプチドをコードする核酸分子を包含する。
２．イン・ビトロ試験および動物モデル
本発明のインヒビター、抗体、アンチセンス核酸分子、Ｆｇｌ２タンパク質および核酸分子ならびに組成物の有用性は、イン・ビトロ系および動物モデル系において確認してもよい。例えば、免疫性コアグラントの増殖、転写および／または発現を、抗体の存在下または不在下で行う１および２元リンパ球混合アッセイで決定してもよい。肝炎に関連したプロコアグラント活性に対する物質の影響は、劇症肝炎のネズミモデルにおいて試験してもよい（MacPheeら、1985）。
一致（concordant）および不一致（discordant）異種移植モデルもまた、本発明の物質、抗体、アンチセンス核酸分子および組成物の有用性を確認するために用いてもよい。例えば、以下の一致および不一致モデルを用いてもよい。
げっ歯類モデル−一致（Lewisラット対Balb／ｃマウス）
げっ歯類モデル−不一致（モルモット対ラット）（血管新生したヘテロトロピック心臓を用いる）
霊長類モデル−不一致（モルモット対ラット）（腎臓移植モデルを用いる）
モノクローナル抗体を試験するための一致および不一致モデルにおいて、以下のプロトコールを用いてもよい。レシピエント動物は、約１００μｇの精製抗体を移植２日前および１０〜１４日後に受ける。組織は、モノクローナル抗体のフィブリン沈着、血小板付着および細胞浸潤を防止する能力について試験してもよい。ドナーとしてＤＡＦおよび非ＤＡＦブタを用いるブタ対霊長類異種移植において、さらなる試験を行うことができる。これらの試験動物の場合、約５ｍｇ／ｋｇ／動物／日の抗体を与えてもよい。一致げっ歯類研究動物の場合、抗体に加えて、ネオラル（Neoral）（１０ｍｇ／ｋｇ／筋内）および／またはシクロホスファミド（４０ｍｇ／ｋｇ）を与えてもよい。対照動物には、類似の同位体の無関係な抗体を与える。不一致移植において、動物のいくつかには、抗体に加えて、コブラ毒因子および／またはネオラルおよびシクロホスファミドを与えてもよい。ブタ対霊長類の実験は、同様なプロトコールを用いて処理してもよい。
本発明は、また、本発明の核酸分子によりコードされるＦｇｌ２タンパク質の機能を試験するための方法を提供する。該タンパク質の発現を欠損しているかまたは部分的に欠損している細胞、組織およびヒト以外の動物を、本発明の核酸分子において特異的欠失または挿入変異を有する本発明の組換え分子を用いて開発してもよい。組換え分子は、相同組換えによって内在遺伝子を不活性化または改変させるために用いてもよく、それにより、不完全な細胞、組織または動物を創造し得る。かかる変異細胞、組織または動物は、通常、本発明の核酸分子によってコードされるタンパク質に依存する特異的細胞群、発達的なパターンおよびイン・ビボ過程を定義付けるために用いてもよい。
翻訳におけるＦｇｌ２タンパク質のの重要性を確認するために、Ｆｇｌ２ノックアウトマウスを調製できる。一例として、標的とされる組換え策法を内在性ｆｇｌ２遺伝子を不活性化するために用いてもよい。終止コドンを全リーディングフレーム内に導入し、プロトロンビナーゼの生物学的活性を破壊する遺伝子をフィブリノーゲン様タンパク質のゲノムコピー中に挿入してもよい。変異フラグメントを未発達の幹細胞中に導入し、陽性（ネオマイシン）／陰性（ガンシクロビル、チミジンキナーゼ）耐性遺伝子での相同組換えについてコロニーを選択してもよい。微生物系統の伝播を確立するために、１つの対立遺伝子に破壊されたプロトンビナーゼ遺伝子を担持する２つのクローンをＣ５７／Ｂ１６マウスの芽細胞中に注入し、Ｂ６／ＳＪＬ養母中に移入させてもよい。キメラをＣ７Ｂ１／６マウスと交配し、子孫を変異（プロトロンビナーゼ−／−）についてホモ接合体の動物を検出するために分析してもよい。変異していない対照と比較した免疫応答（同種異系および異種移植、ウイルス肝炎）に対する変異の影響を決定し、疾患の生存および組織学的パターンを分析してもよい。
（３）診断的応答
Ｆｇｌ２が免疫性凝固に関する直接的プロトンビナーゼであるという本発明者らによる知見は、Ｆｇｌ２プロトンビナーゼの増加に関する病状の検出を可能にする。
したがって、本発明は、（ａ）Ｆｇｌ２タンパク質をコードする核酸分子またはそのフラグメントあるいは（ｂ）Ｆｇｌ２タンパク質またはそのフラグメントについて試料をアッセイすることからなる、免疫性凝固に関連する病状の検出方法を提供する。
（ｉ）核酸分子
Ｆｇｌ２をコードする核酸分子またはそのフラグメントにより、当業者は、試料、好ましくは、細胞、組織および体液のような生物学的試料中におけるｆｇｌ２をコードするヌクレオチド配列またはそのフラグメントの検出に使用するためのヌクレオチドプローブを構築することができる。プローブは、免疫性凝固に関連する病状の存在を検出するか、またはかかる病状の進行をモニターするのに有用である。したがって、本発明は、ハイブリダイゼーション産物の形成が可能な条件下で、試料を核酸分子とハイブリダイズしてハイブリダイゼーション産物を形成することができるヌクレオチドプローブと接触させ、該ハイブリダイゼーション産物についてアッセイすることからなる、Ｆｇｌ２をコードする核酸分子を検出する方法を提供する。
前記の方法で使用され得るプローブの例は、図２および３または配列番号１もしくは３に示される核酸配列のフラグメントを包含する。ヌクレオチドプローブは、３２Ｐ、３Ｈ、１４Ｃ等のように十分なシグナルを提供し、十分な半減期を有する放射能標識などの検出可能な物質で標識してもよい。使用され得る他の検出可能な物質は、特異的な標識抗体によって認識される抗原、蛍光化合物、酵素、標識抗原に特異的な抗体および化学ルミネセンスを包含する。適当な標識は、ハイブリダイゼーション率および検出されるべき核酸へのプローブの結合率ならびにハイブリダイゼーションに有効な核酸の量を考慮して選択される。標識したプローブは、一般にはSambrookら、1989,Molecular Cloning,A Laboratory Manual（第２版）に記載のように、ニトロセルロースフィルターまたはナイロン膜のような固体支持体上で核酸にハイブリダイズする。ヌクレオチドプローブは、好ましくはヒト細胞中で、本発明の核酸分子にハイブリダイズする遺伝子、好ましくは、本明細書に記載のように、ストリンジェントな条件下で、本発明の核酸分子にハイブリダイズする核酸分子を検出するのに使用してもよい。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法およびｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを用いて、Ｆｇｌ２タンパク質をコードする核酸分子を試料中で選択的に増幅できる。ＰＣＲに使用するために、図２および図３に示されるヌクレオチド配列由来の合成的オリゴヌクレオチドプライマーを設計することが可能である。オリゴヌクレオチドプライマーおよび標準ＰＣＲ増幅技術を用いて、核酸をｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡから増幅することができる。増幅した核酸は、適当なベクター中でクローン化でき、ＤＮＡ配列分析によって特徴付けることができる。ｃＤＮＡは、種々の技術、例えば、Chrgwinら、Biochemistry,18,5294-5299（1979）のグアニジニウム−チオシアネート抽出法を用いることにより、全細胞ｍＲＮＡを単離することによって、ｍＲＮＡから調製できる。次いで、逆転写酵素（例えば、Gibco/BRL,Bethesda,MDから入手可能なMoloney MLV逆転写酵素またはSeikagaku America,Inc.,St.Petersburg,FLから入手可能なAMV逆転写酵素）を用いて、ｃＤＮＡをｍＲＮＡから合成する。
（ｉｉ）タンパク質
前記に詳細に記載したように、タンパク質に結合する抗体を用いて、Ｆｇｌ２タンパク質を試料中で検出してもよい。したがって、本発明は、試料中でＦｇｌ２に結合後に検出可能なＦｇｌ２に結合する抗体と試料とを接触させることからなる、Ｆｇｌ２タンパク質を検出する方法を提供する。
Ｆｇｌ２タンパク質への抗体の結合は、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイまたは組織化学試験を包含する種々の既知技術を用いて検出してもよい。したがって、該タンパク質の役割、特に細胞事象または病態を決定するために、およびかかる病態を診断し、治療するために、試料中のタンパク質量を定量するのに抗体を用いてもよい。
特に、Ｆｇｌ２に対するポリクローナルおよびモノクローナル抗体を免疫−組織化学分析において、例えば、細胞および亜細胞性レベルで、本発明のタンパク質を検出するために、特定の細胞および組織ならびに特異的な亜細胞性位置でのその局在性を決定するために、および発現レベルを定量するために用いてもよい。
光学および電子顕微鏡を用いる抗原の局在性を決定するための当該分野で既知の細胞化学技術を本発明のタンパク質の検出に用いてもよい。一般に、タンパク質に特異的な抗体を、本明細書に記載のうように検出可能な物質で標識し、検出可能な物質の存在に基づいて、組織中の局在性を決定してもよい。
第一抗原−抗体反応が本発明の核酸分子によりコードされるタンパク質に対して反応する抗体に対して特異性を有する第２抗体の導入により増幅される間接的な方法もまた、用いてもよい。
４．ＦＧＬ２遺伝子およびタンパク質
本明細書に前記したように、本発明者らは、ゲノムｈＦｇｌ２をクローン化し、配列決定した。この点に関して、全ゲノム配列ならびに図８に示されるプロモーター領域の配列および図４に示される３’ＵＴＲは、本発明の範囲内に包含される。
したがって、本発明の１の具体例において、本発明は、（ａ）図８に示される配列（ここに、ＴはＵであることもできる）；（ｂ）（ａ）と実質的な配列同一性を有する核酸配列；および（ｃ）（ａ）または（ｂ）のフラグメントを含む単離核酸分子を提供する。
もう１つの具体例において、本発明は、（ａ）図４に示される配列（ここに、ＴはＵであることもできる）；（ｂ）（ａ）と実質的な配列同一性を有する核酸配列；および（ｃ）（ａ）または（ｂ）のフラグメントを含む単離核酸分子を提供する。
本発明は、また、前記の方法および組成物において特別の有用性を有する図２および３あるいは配列番号１または３に示される核酸配列のフラグメントを包含する。フラグメントは、一般に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、図２または３あるいは配列番号１または３に示される配列にハイブリダイズするであろう少なくとも１５塩基を有する核酸配列を含む。
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、特異性を提供し、ミスマッチの数を減少させ、いまだ、許容される割合で安定なハイブリッドを形成させるのに十分に順応性のあるほどストリンジェントな条件である。かかる条件は、当業者に知られており、例えば、Sambrookらによって（1989,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor）記載されている。ほんの一例として、短いヌクレオチドでのストリンジェントなハイブリダイゼーションを、０．０１−１．０ピコモル／ｍｌほどの高濃度のプローブを用いて５−１０以下のＴｍで行ってもよい。
ヒトＦｇｌ２タンパク質の免疫原部分をコードする核酸分子のフラグメントは、特に本発明の範囲内とされる。好ましくは、かかるフラグメントは、ヒトＦｇｌ２に対して生じた抗体に少なくとも約１０6Ｌ／モルのアフィニティーで結合するヒトＦｇｌ２タンパク質の部分をコードする。本発明は、特に、図５に示されるアミノ酸配列中において位置３００〜４００、好ましくは３６４〜３７８のアミノ酸をコードする核酸を意図する。
本発明は、さらに、本明細書に記載のように、ヒトｆｇｌ２遺伝子によってコードされるタンパク質の末端切断型をコードする核酸分子、ならびに該タンパク質およびその末端切断型の類似体および相同物を包含する。また、本発明のｃＤＮＡに対応するｍＲＮＡの選択的スプライシングによって生じる本発明の核酸分子の変異型が本発明に包含されることも明らかになろう。また、挿入または欠失変異のような変異を有する本発明の核酸分子、例えば、ヒトＦｇｌ２タンパク質の類似体をコードする核酸分子が調製されるであろうことも、意図される。
さらに、本発明が、図２、４および８に示される核酸配列ならびにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でこれらの配列にハイブリダイズするであろう少なくとも１５個の塩基を有するそのフラグメントと実質的な配列同一性を有する核酸配列を含む核酸分子を包含することが明らかになろう。「実質的な配列同一性を有する配列」なる語は、図２および３に開示される配列由来のわずかなまたは取るに足らない配列変異型を有する核酸配列を意味し、すなわち、これらの配列は、Ｆｇｌ２について本明細書に記載されるのと実質的に同じ活性を生じるように、実質的に同じ方法で機能する。変異型は、局所変異または構造的修飾に帰因し得る。実質的な同一性を有する核酸配列は、図２および図３に示される核酸配列と少なくとも７２％、好ましくは少なくとも７５−９５％の同一性を有する核酸配列を包含する。
本明細書に記載のヒトＦｇｌ２の活性を有するタンパク質をコードし、遺伝コードの縮重のため、図２および図３に示される核酸配列と異なる配列を有する単離および精製核酸分子もまた、本発明の範囲内である。かかる核酸は、機能的に等価のタンパク質（例えば、ヒトＦｇｌ２プロトロンビナーゼ活性を有するタンパク質）をコードするが、遺伝コードの縮重のため、図２および図３の配列とは配列が異なる。
ヒトＦｇｌ２の核酸配列内のＤＮＡ配列多形は、コードされるアミノ酸に影響を与えないＤＮＡにおけるサイレント変異を生じ得る。しかしながら、ＤＮＡ配列多形は、集団内でヒトＦｇｌ２のアミノ酸配列において変化をもたらし得る。ヒトＦｇｌ２の活性を有するタンパク質をコードする核酸の１以上（ヌクレオチドの約３−４％まで）のヌクレオチドにおけるこれらの変異は、自然の対立遺伝子変異のため、集団内の個体のなかに存在し得る。かかるヌクレオチド変異およびその結果生じるアミノ酸多形は、本発明の範囲内である。
本発明の核酸は、Ｆｇｌ２を他の種から単離するために用いることができる。例えば、図２および３に示される核酸配列の全てまたは一部に基づく標識された核酸プローブを調製でき、適当なＤＮＡライブラリー（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリー）をスクリーンするのに使用できる。ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリーのスクリーニングにより単離された核酸は、標準的な技術によって配列決定することができる。
ｃＤＮＡを転写して、Ｆｇｌ２プロトロンビナーゼ活性を示すタンパク質をコードするＲＮＡ分子を生じることが可能な適当なベクター中で、ヒトＦｇｌ２タンパク質をコードするｃＤＮＡをクローニングすることによって、ＲＮＡを単離できる。例えば、ベクター中、ｃＤＮＡをバクテリオファージプロモーター（例えば、Ｔ７プロモーター）の下流でクローン化でき、Ｔ７ポリメラーゼを用いてイン・ビトロでｃＤＮＡを転写でき、標準的な技術によって、得られたＲＮＡを単離できる。
フラグメントを包含する本発明の核酸分子は、また、標準的な技術を用いて化学的に合成してもよい。化学的にポリデオキシヌクレオチドを合成する種々の方法が知られており、それらは、ペプチド合成など、商業上入手可能なＤＮＡ合成機において完全に自動化された固相合成を包含する（例えば、Itakuraら、米国特許第４，５９８，０４９号；Caruthersら、米国特許第４，４５８，０６６号；およびItakura、米国特許第４，４０１，７９６号および４，３７３，０７１号参照）。
特定の核酸分子がヒトＦｇｌ２の活性を有するタンパク質をコードするかどうかの決定は、標準的な技術により、適当な宿主細胞中でｃＤＮＡを発現させ、本明細書に記載のように、発現タンパク質のプロトロンビナーゼ活性を示す能力を試験することによって達成できる。そのように単離されたヒトＦｇｌ２の生物学的活性を有するｃＤＮＡは、ジデオキシヌクレオチド・チェーン・ターミネーション法またはマクサム−ギルバート（Maxam-Gilbert）化学的配列決定法のような標準的技術によって配列決定して、核酸配列およびコードされるタンパク質の予想アミノ酸配列を決定できる。
ヒトＦｇｌ２の開始コドンおよび非翻訳配列は、その目的で設計された現在利用可能なコンピューターソフトウェア（例えば、PC/Gene（IntelliGenetics Inc.,Calif）を用いて決定してもよい。ｈｆｇｌ２の３’非翻訳領域の核酸配列を図４に示す。ヒトＦｇｌ２をコードする遺伝子のイントロン−エキソン構造および転写調節配列は、ヒトＦｇｌ２をコードする本発明の核酸分子を用いて、ゲノムＤＮＡクローンライブラリーをプローブすることによって、同定してもよい。調節エレメントは、通常の技術を用いて同定できる。エレメントの機能は、それらを用いて、エレメントに操作可能に結合する細菌性遺伝子ｌａｃＺのようなレポーター遺伝子を発現させることにより確認できる。これらの構築物を、標準的手法を用いて培養細胞、またはヒト以外のトランスジェニック動物モデルに導入してもよい。また、かかる構築物を用いて、当該分野で既知の技術により、エレメントと相互作用する核タンパク質を同定してもよい。
全長アミノ酸配列（図５）に加えて、本発明のタンパク質は、本明細書に記載のように、末端切断型および類似体、ならびに該タンパク質の相同物およびその末端切断型を包含する。末端切断されたＦｇｌ２タンパク質またはヒトＦｇｌ２タンパク質のフラグメントは、１以上のアミノ酸残基が欠失した全長Ｆｇｌ２アミノ酸配列の部分である。アミノ酸残基の欠失は、Ｎ末端またはＣ末端または内部を含め、ポリペプチドのどこにでも起こり得る。Ｆｇｌ２フラグメントは、典型的に、ヒトＦｇｌ２の配列に同一の少なくとも１０、１５、２０、２５、３０または４０個のアミノ酸残基の連続配列を有するであろう。Ｆｇｌ２タンパク質の末端切断型または部分は、その配列が図５に示されるＦｇｌ２タンパク質に対して生じた抗体と交差反応できる抗原部位を含んでもよい。したがって、ヒトＦｇｌ２タンパク質の免疫原性部分またはフラグメントは、本発明の範囲内である（例えば、図５におけるアミノ酸３００〜４００）。好ましくは、該タンパク質の末端切断されたタンパク質または部分は、少なくとも約１０6Ｌ／モルのアフィニティーでヒトＦｇｌ２に対して生じた抗体と結合する。
アミノ酸末端にて、末端切断されたタンパク質は、アミノ基（−ＮＨ2）、疎水性基（例えば、カルボベンゾキシル、ダンシルまたはＴ−ブチルオキシカルボニル）、アセチル基、９−フルオレニルメトキシ−カルボニル（ＰＭＯＣ）基、または脂質−脂肪酸結合体、ポリエチレングリコールもしくは炭水化物を包含するがそれらに限定するものではない高分子を有してもよい。末端切断されたタンパク質は、カルボキシル基、アミド基、Ｔ−ブチルオキシカルボニル基、脂質−脂肪酸結合体、ポリエチレングリコールまたは炭水化物を包含するまたは高分子をカルボキシ末端に有してもよい。
本発明のタンパク質は、また、１以上のアミノ酸置換、挿入および／または欠失を含む、図５に示されるようなヒトＦｇｌ２の類似体および／または本明細書に記載のようなその末端切断型を包含してもよい。アミノ酸置換は、保存されるか、または保存されない性質であってもよい。保存アミノ酸置換は、１以上のアミノ酸の同様な電荷、サイズおよび／または疎水性の特徴のアミノ酸での置換を含む。保存置換のみが起こる場合、得られる類似体は、本明細書に記載のようにヒトＦｇｌ２に機能的に等価であるべきでる。非保存置換は、１以上のアミノ酸の異なる電荷、サイズおよび／または疎水性の特徴を有する１以上のアミノ酸での置換を含む。
１以上のアミノ酸挿入を、図５に示されるようなアミノ酸配列中に導入してもよい。アミノ酸挿入は、単一のアミノ酸残基または２〜１５個のアミノ酸長の連続のアミノ酸からなってもよい。例えば、タンパク質のプロトロンビナーゼ活性を破壊するために、アミノ酸挿入を用いてもよい。
欠失は、図５に示されるようなヒトＦｇｌ２アミノ酸配列からの１以上のアミノ酸または不連続な部分（例えば、アミノ酸）の除去からなってもよい。欠失されるアミノ酸は、隣接していてもよく、または隣接していなくてもよい。短く限定される長さの欠失変異を有する得られる類似体は、約１０アミノ酸、好ましくは１００アミノ酸である。
本発明のタンパク質は、図５に示されるようなヒトＦｇｌ２の相同物および／または本明細書に記載のようなその末端切断型を包含する。かかる相同物は、そのアミノ酸配列が、ストリンジェントな条件下（本明細書のストリンジェントな条件の記載を参考のこと）で図５に示されるようなヒトＦｇｌ２を得るために使用されるプローブとハイブリダイズする他の種由来のヒトＦｇｌ２領域のアミノ酸配列からなるタンパク質である。図５に示されるアミノ酸配列と少なくとも７２％、好ましくは７５〜９０％類似のアミノ酸配列を含むタンパク質がプロトロンビナーゼ活性を示すであろうことが予想される。
本発明は、また、本発明のヒトＦｇｌ２タンパク質のイソ型を意図する。イソ型は、本発明のタンパク質と同じ数および種類のアミノ酸を含有するが、イソ型は異なる分子構造を有する。本発明により意図されるイソ型は、本明細書に記載のような本発明のタンパク質と同じ特性を有するものである。
本発明は、また、選択されたタンパク質、または選択マーカータンパク質（後記参照）と結合して、融合タンパク質を生じるヒトＦｇｌ２タンパク質を包含する。
本発明の核酸分子によりコードされるタンパク質またはその部分は、組換えＤＮＡ法を用いて調製してもよい。したがって、本発明の核酸分子またはそのフラグメントを既知方法で、タンパク質の良好な発現を保証する適当な発現ベクター中に導入してもよい。可能な発現ベクターは、ベクターが使用される宿主細胞に適合可能であるかぎり、コスミド、プラスミドまたは修飾されたウイルスを包含するがそれらに限定するものではない。
したがって、本発明は、本発明の核酸分子またはそのフラグメント、ならびに挿入配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含有する本発明の組換え分子を意図する。適当な転写および翻訳エレメントは、種々の供給源由来のものであってもよく、細菌性、真菌性、ウイルス性、哺乳動物性または昆虫の遺伝子を包含する。適当な転写および翻訳エレメントの選択は、後記のように選択される宿主細胞に依存し、通常の当業者によって容易に成し遂げられ得る。かかるエレメントの例は、翻訳開始シグナルを包含する、転写プロモーターおよびエンハンサーまたはＲＮＡポリメラーゼ結合配列、リボソーム結合配列を包含する。さらに、選択される宿主細胞および使用するベクターによって、他の遺伝エレメント、例えば、複製起点、付加的なＤＮＡ制限部位、エンハンサーおよび転写の配列授与誘導性を発現ベクター中に導入してもよい。また、必要な転写および翻訳エレメントが天然遺伝子および／またはそのフランキング領域によって供給され得ることは、明らかであろう。
本発明の組換え分子は、また、本発明の組換え分子で形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞の選択を容易にする選択マーカータンパク質をコードするレポーター遺伝子を含有してもよい。レポーター遺伝子の例は、β−ガラクトシダーゼ（例えば、ｌａｃＺ）、クロラムフェニコール、アセチル−トランスフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼまたは免疫グロブリンもしくは免疫グロブリン、好ましくはＩｇＧのＦｃ部分のようなその部分である。レポーター遺伝子の転写は、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコール、アセチルトランスフェラーゼまたはホタルルシフェラーゼのようなレポータータンパク質濃度の変化によってモニターされる。これは、本発明の組換え分子の発現について視覚化し、アッセイを可能にし、特に、発現および表現型に対する変異の影響を決定することを可能にする。
形質転換、トランスフェクション、感染、エレクトロポレーション等によって、組換え分子を宿主細胞中に導入することができる。宿主細胞を形質転換、トランスフェクト等して、外来ＤＮＡを発現させる方法は、当該分野でよく知られている（例えば、Itakuraら、米国特許第４，７０４，３６２号；Hinnenら、PNAS USA 75:1929-1933,1978;Murrayら、米国特許第４，８０１，５４２号；Upshallら、米国特許第４，９３５，３４９号；Hagenら、米国特許第４，７８４，９５０号；Axelら、米国特許第４，３９９，２１６号；Goeddelら、米国特許第４，７６６，０７５号；およびSambrookら、Molecular Cloning A Laboratory Manual,第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989（その全てが出典明示により本明細書の一部とされる）参照）。
適当な宿主細胞は、細菌、哺乳動物、酵母または他の真菌、ウイルス植物または昆虫細胞を包含する多種の原核および真核宿主細胞を包含する。
本発明の核酸分子によりコードされるタンパク質またはその部分は、ヒト以外のトランスジェニック動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジおよびブタ中で発現させてもよい（Hammerら、（Nature 315:680-683,1985）,Palmiterら、（Science 222:809-814,1983）,Brinsterら、（Proc Natl.Acad.Sci.USA 82:44384442,1985）,PalmiterおよびBrinster（Cell 41:343-345,1985）および米国特許第４，７３６，８６６号参照）。
本発明のタンパク質およびその部分は、また、固相合成（Merrifield,1964,J.Am.Chem.Assoc.85:2149-2154）または均一溶液中の合成（Houbenwey,1987,Methods of Organic Chemistry,E.Wansch編,Vol.15 IおよびII,Thieme,Stuttgart）のようなタンパク質の化学においてよく知られた技術を用いて、化学的合成によって調製してもよい。
本発明のタンパク質は、タンパク質またはポリペプチドのような他の分子と結合していてもよい。これは、例えば、Ｎ末端またはＣ末端融合タンパク質の合成によって成し遂げられ得る。したがって、融合タンパク質は、組換え技術によって、タンパク質のＮ末端またはＣ末端と所望の生物学的機能を有する選択されたタンパク質を融合することによって調製され得る。得られる融合タンパク質は、選択されたタンパク質に融合したタンパク質またはその部分を含有する。
以下の非限定的な実施例は、本発明の例示である。
実施例
実施例１
１．ヒトプロトロンビナーゼ遺伝子（ｈｆｇｌ２）のクローニング
方法
ａ）ＰＡＣライブラリーのスクリーニングおよびクローンの確認
マウスｆｇｌ２遺伝子のエキソン２に対応するＧｅｎＢａｎｋから入手したヒトｃＤＮＡ配列に特異的なプライマーを用いて、肝臓由来のヒトゲノムＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応によって増幅した；センスプライマーＣＡＡ ＡＡＧ ＡＡＧ ＣＡＧ ＴＧＡ ＧＡＣ ＣＴＡ ＣＡ（ｈｕｆｐ１７）はヒトｃＤＮＡの位置６９２であり、アンチセンスプライマーＴＴＡ ＴＣＴ ＧＧＡ ＧＴＧ ＧＴＧ ＡＡＡ ＡＡＣ ＴＴ（ｈｕｆｌｐ８）はヒトｃＤＮＡの位置１１３３である。Genome Systems Inc.（St.Louis,Missouri）から入手したＰＡＣライブラリーを、前記のポリメラーゼ連鎖反応から生産された長さ約３００ヌクレオチドの単一アンプリコンを用いてスクリーンした。３つのクローン、すなわち６３５９、６３６０および６３６含有するプラスミドを、Ｑｉａｇｅｎ ｍａｘｉｐｒｅｐ ＤＮＡ精製プロトコールを用いて精製した。精製ＤＮＡの定量およびインサートの存在は、Ｎｏｔ １制限酵素（Canadian Life,Burlington,Canada）でプラスミドを消化させ、角度１２０度、６ボルト、１−２０秒ランプ間隔、０．５ｘＴＢＥ、泳動時間１８時間にて、試料をClamped Homogenous Electric Field（ＣＨＥＦ）ゲル電気泳動に付すことによって確認した。
ｂ）Ｓａｕ ３Ａライブラリーの調製
ドットブロット分析において、一貫して、位置１００のセンスプライマーＧＣＡ ＡＡＣ ＡＡＴ ＧＡＡ ＡＣＡ ＧＡＧ ＧＡＡ Ａ（ｈｕｆｌｐ１）および位置１４００のアンチセンスプライマーＡＴＴ ＧＣＣ ＣＴＡ ＴＴＡ ＧＡＴ ＡＡＣ ＧＡＡ ＴＡＣ（ｈｕｆｌｐ２）にハイブリダイズしたので、クローン６３６０を残りの研究のために選択した。ＤＮＡを操作するのに便利なサイズ範囲である５〜１０ｋｂのフラグメントに減少させるために、最適以下の条件下で、制限酵素Ｓａｕ ３Ａ（Canadian Life,Burlington,Canada）で６３６０クローンを消化させた。適当な消化条件は、５μｇのＤＮＡを全反応容量２０μｌ中３７℃で、１μｌの２μ／μｌ、０．５μ／μｌおよび０．１μ／μｌのＳａｕ ３Ａと一緒に１時間インキュベートし、ＣＨＥＦゲル（泳動条件は、１〜１０秒ランプ間隔、４．５ボルト、角度１２０度、０．５ｘＴＢＥおよび泳動時間１６時間である）上のＤＮＡフラグメントのサイズ範囲を観察することによって見出された。６３６０クローンは、各々、１０μｇ、４０μｇおよび２μｇであるＤＮＡ量、反応容量および酵素量の増加に比例して、大きなスケールで制限消化した。制限消化の最終産物を前記の条件でＣＨＥＦゲル電気泳動に付した。６−９ｋｂに相当するＤＮＡバンドを切り取り、Gene Clean DNA精製キット（Bio/Can Scientific,Mississauga,Ontario）を用いてフラグメントを抽出した。フラグメントをアルカリホスファターゼ（Pharmacia,Uppsala,Sweden）で処理したＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩベクター（Stratagene）のＢａｍＨ１部位に連結し、エレクトロポレーションによってＤＨ１０Ｂコンピテント細胞中にトランスフェクトした。ｈｕｆｌｐ１および２プライマーを用いて、該Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩライブラリーをスクリーンした。酵素ポリヌクレオチド・キナーゼ（Pharmacia,Uppsala,Sweden）を用いて、ガンマＰ３２で５末端にてプライマーを標識し、これらのプライマーを用いてＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔライブラリーをスクリーンした。クローンＪ１４は、これらのプライマーの両方にハイブリダイズし、次に続く操作に用いた。
ｃ）配列決定
Ｊ１４クローンをサンガー（Sanger）・ジデオキシ・チェーン・ターミネーション法（Pharmacia,Uppsala,Sweden）および適当なプライマーによって配列決定した。Helixx配列読み取り装置（Helixx Technologies Inc.,Scarborough,Ontario）を用いて、配列を放射能写真から読み取った。手動の配列決定の結果および公表されているｃＤＮＡ配列に基づいて、新たなプライマーを設計する。
ｈｆｇｌ２のクローニングの結果および考察：
Ｊ１４クローンの構成を図１に要約する。コーディング領域を広範囲に分析し、マウス遺伝子と比較した。該遺伝子の機能的特性を洞察するために、タンパク質配列をゲノム配列から予測し、マウスｆｇｌ２（直接的プロトロンビナーゼ）タンパク質および他の関連する凝固プロテアーゼと比較した。
ｉ）転写領域：
報告されているｃＤＮＡ配列は、翻訳開始部位の上流３５塩基で開始する（RueggおよびPytela,1995）。報告されているｃＤＮＡの最初のヌクレオチドは、推定転写開始部位と考えられる。真核生物において、転写開始部位（＋１）は、ｐｙＣ−１ Ａ＋１ ＮＴ／Ａｐｙｐｙの弱いコンセンサスを有する（ここに、第３位置のアデニンは転写開始部位である）（Javaheryら、1994）。−１位置のシトシンは＋１位置のアデニンよりも保存される（Bucher,P.,1990;BucherおよびTrifonov,1986）。ｈｆｇｌ２ｃＤＮＡにおいて、最初のヌクレオチドはシトシンであり、転写開始部位は前記のコンセンサスに従わない。コーディング領域において、長い範囲の保持配列が存在する。ｆｇｌ２およびｈｆｇｌ２のエキソンＩの配列において、マウス配列においてギャップが存在し、これらのギャップはマウスタンパク質に欠失しているアミノ酸に対応する（図２）。図２において、ｆｇｌ２およびｈｆｇｌ２の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）が包含されないことに注目する。多くのミスマッチはコドンの３番目のヌクレオチドにあり、コドンの重複のため、これらのヌクレオチドの相違はアミノ酸レベルでの相違に翻訳されない。タンパク質のカルボキシル末端に対応する第２のエキソンは、エキソン１よりも保存される（図３）。図３において、マウスおよびヒトｆｇｌ２配列は翻訳終止部位後に異なるので、エキソン２は、翻訳終止部位までを包含するのみである。５スプライス接合点のためのコンセンサスは、Ａ／ＣＡＧ（−１）Ｇ（＋１）ＴＡＡＧＴである（ここに、−１と＋１の間に切断が起こる）（BreathnackおよびChambon,1981）。該スプライス部位コンセンサスは、ヒトｆｇｌ２遺伝子に観察される。３スプライス部位コンセンサスは（ｐｙ）ｎＮｐｙＡＧ（−１）Ｇ（＋１）である（BreathnackおよびChambon,1981）。ヒト遺伝子において、イントロンの３末端配列は保存されるが、エキソン配列は保存されず；ｈｆｇｌ２はグアノシンの代わりにチミジンを有する。ゲノムＤＮＡの５ＵＴＲの位置１４の付加的なグアノシンを除いて、ゲノムのコーディング領域およびｃＤＮＡは、ｃＤＮＡの最後の３９ヌクレオチドまで同一である。該領域に基づいて設計されたプライマーｈｕｆｌｐ１５は、３個のＰＡＣにハイブリダイズしない。マウスｆｇｌ２において、イントロン２の存在の証拠がなく、また、ｈｆｇｌ２の該領域はイントロンスプライシングのためのコンセンサスを有さないので、該領域はエキソンＩＩＩではないようである。（Koyamaら、1987）。図４は、ｈｆｇｌ２の不完全に配列決定した３ＵＴＲである。
ｉｉ）タンパク質構造：
ｈｆｇｌ２タンパク質は、４３９個のアミノ酸長である。最初の２０４個のアミノ酸は、エキソン１によってコードされる。２０５番目のアミノ酸であるバリンは、エキソン１の１個のヌクレオチドとエキソン２の２個のヌクレオチドの両方によってコードされる。残りの２３４個のアミノ酸は、エキソン２によってコードされる。ヒトタンパク質は、マウスタンパク質よりもアミノ酸が７個長く、余分のアミノ酸はエキソン１によってコードされている。マウスおよびヒトタンパク質配列を比較すると、カルボキシル末端がアミノ末端よりも保存されている（図５）。５個のグリコシル化部位が存在し、それらの１つ１つがマウスおよびヒトタンパク質において保存されている（図６）。アミノ末端は、タンパク質の最も疎水性の領域である。位置１２および２３におけるアラニンの間の領域は、非常に疎水性である。位置３のロイシンおよび位置１１のセリンの間のアミノ酸は、適度に疎水性である。アミノ酸の短い疎水性範囲のため、ｈｆｇｌ２が膜貫通型タンパク質または分泌タンパク質であるかどうかは、断定できない。後記の理由のため、分泌タンパク質よりもＩＩ型外表タンパク質であるようである。膜貫通領域は、ヘリックス構造に従う傾向があり、それは図７に示される。ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニンおよびバリンは、いまだ脂質二重層のような非常に無極性の環境において、強力なβシート形成基として分類され、これらの残基は、安定な最大の水素結合構造を創造するために、アルファ・ヘリックスコンホメーションをとることになるであろう（ReithmeierおよびDeber,1992）。特に、シグナルペプチド切断部位はなく；シグナルペプチドにおいて、小型脂肪族残基のカルボキシル部位にて切断が起こり、最も一般的な切断部位はアラニンであり（５０％）、次いで、グリシン（２４％）、セリン（１２％）およびシステイン（８％）である（ReithmeierおよびDeber,1992）。膜タンパク質の配向は、最初の疎水性セグメントの両側に位置する残基の電荷の差に依存することが提唱されてきた。塩基性残基は、膜の細胞質側に見られる傾向があり、それはｈｆｇｌ２に見出される（ReithmeierおよびDeber,1992）。
触媒作用部位に基づいて、プロテアーゼをセリン、システイン、アスパラギン酸塩または金属プロテアーゼに分類する（Nduwimanaら、1995）。それらの活性型において、全ての必須凝固因子およびそれらのレギュレーターはセリンプロテアーゼであり；それらはクランＳＡのファミリー１に属する（Davieら、1991）。ＤＥＰ（ジイソプロピルフルオロホスフェート）阻害アッセイは、ｆｇｌ２、マウス直接的プロトロンビナーゼがセリンプロテアーゼであることを示唆する（Levyら、1983）。予測アミノ酸配列もまた、ｈｆｇｌ２がシステインプロテアーゼの代わりにセリンプロテアーゼであるより大きな可能性を有することを示す（表１および２）。ｈｆｇｌ２において、凝固カスケードのセリンプロテアーゼの触媒的セリン残基と同じ関係、ＧＤＳＧＧでセリンは存在しない（BarrettおよびRawlings,1995;RawlingsおよびBarrett,1994）。ｈｆｇｌ２およびｆｇｌ２の両方とも、表２のような、クランＳＥセリンプロテアーゼであった（RawlingsおよびBarrett,1994）。ｆｇｌ２タンパク質は、また、表２のような、クラン１システインプロテアーゼといくつかの類似性を有する。
位置２１２のシステインの後、タンパク質の残りのカルボキシル末端は、機能上の相違を有するいくつかの異なるタンパク質において見られるＦＲＥＤ（フィブリノーゲン関連ドメイン）に相同なドメインからなる。これらのタンパク質のいくつかは、フィブリノーゲン、テナシン、フィコリン、ＨＦＲＥＰ−１等の３つの鎖である（RueggおよびPytela,1995;Koyamaら、1987;Doolittle,R.F.,1984）。
２．プロモーター領域のキャラクタリゼーション：
方法
Ｊ１４クローンは、ｈｆｇｌ２のコーディング領域の上流に約１３５０個のヌクレオチドを含有する。該全領域をサンガー・ジデオキシ・チェーン・ターミネーション法（Pharmacia,Uppsala,Sweden）によって配列決定した。Helixx配列読み取り機（Helixx Technologies Inc.,Scarborough,Ontario）を用いて、配列を放射能写真から読み取った。表３に、ｈｆｇｌ２の該推定プロモーター領域を配列決定するために用いたプライマーを列挙する。配列は、ウィンドウズ用の配列分析ソフトウェアであるＤＮＡＳＩＳ（Hitach Software Engineering America Ltd.,San Bruno,CA）を用いて、推定転写因子結合部位について分析した。
ｈｆｇｌ２推定プロモーター領域の配列分析の結果および考察：
プロモーター領域は、典型的なＴＡＴＡボックス、ＴＡＴＡＡＡＡ（ここに、２番目および６番目の位置のアデニンならびに３番目の位置のチミジンは、全体的に真核生物遺伝子において、残りのＴＡＴＡボックスヌクレオチドよりも保存される）を有していない（Bucher,P.,1990;BucherおよびTrifonov,1986）。ｈｆｇｌ２遺伝子は、翻訳開始部位の上流の約５０個のヌクレオチドのＴＡＴＡ様配列、ＴＡＴＴＡＡＡを有し（図８および９）；典型的なＴＡＴＡボックスは、転写開始部位の上流の２５〜３０個のヌクレオチドである（Bucher,P.,1990;BucherおよびTrifonov,1986）。ＴＡＴＡおよびその関係はマウスおよびヒトｆｇｌ２において同一であるので、該領域は機能的に重要であることが示唆される。
ＡＰ１部位は、ＴＡＴＡボックスから約２０個のヌクレオチドに位置する（図８および９）。ＡＰ１モチーフのコンセンサスはＴＧＡＳＴＣＡ（ここに、Ｓはグアニンまたはシトシンである）である。中央のＳ、ヒトにおけるシトシンおよびマウスにおけるグアニンを除いて、ＡＰ１部位はマウスおよびヒト直接的プロトロンビナーゼ遺伝子において同一である。ＡＰ１はＦｏｓおよびＪｕｎプロトオンコジーンファミリーのタンパク質の２量体より構成される。Ｊｕｎファミリーメンバーは、ＤＮＡ結合タンパク質であり；それらはＦｏｓメンバーとのホモ２量体またはヘテロ２量体としてＡＰ１部位に結合する。活性化において、ＪｕｎはＤＮＡ結合ドメインに隣接する部位にて脱リン酸化し、そのＤＮＡ結合能を獲得する（CurranおよびFranza,1988;Woodgettら、1995）。さらに、ＦｏｓおよびＪｕｎのトランス活性化ドメインはリン酸化し、転写機構と相互に作用できる（Woodgettら、1995）。組織因子遺伝子のような特定の遺伝子において、ＡＰ１は構成的および誘導的の発現の両方に必要とされる（Mackmanら、1989;Ｍｏｌｌら、1995）。
興味深いことに、ｈｆｇｌ２は５つの核因子ＩＬ６（ＮＦ ＩＬ６）結合部位を有する。該転写因子結合部位のためのコンセンサスは、Ｔ（Ｔ／Ｇ）ＮＮＧＮＡＡ（Ｔ／Ｇ）である。該領域は、ＩＬ６遺伝子のプロモーターにおいて初めて同定された；それは転写開始部位の上流の約３５０個のヌクレオチドに位置し、ＩＬ６遺伝子の転写をアップレギュレートする（Akiraら、1995）。ｈｆｇｌ２において、最初のＮＦ ＩＬ６結合部位は、転写開始部位から約３００個のヌクレオチドに位置する。ＮＦ ＩＬ６は、転写因子のファミリーのＣＡＡＴエンハンサー結合タンパク質であるＣ／ＥＢＰに属し、いずれかのＣ／ＥＢＰは前記のコンセンサス配列に結合できる（WedelおよびZiegler-Heitbrock,1995）。これらのタンパク質のカルボキシル末端は保存され、ＤＮＡ結合塩基性領域および二量化ロイシンジッパー（zipper）領域を含有する。アミノ末端は、トランス活性化ドメインを含有する（WedelおよびZiegler-Heitbrock,1995）。Ｃ／ＥＢＰαは、含脂肪細胞特異的遺伝子の転写および肝臓特異的遺伝子、例えば、アルブミンおよびトランスフェリンの構成的発現の原因となる。Ｃ／ＥＢＰｂおよびｄは、肝臓の急性相応答遺伝子およびマクロファージのサイトカイン遺伝子の誘導において役割を果たす（Akiraら、1992;WedelおよびZieｇler−Heitbrock,1995;AkiraおよびKishimoto,1992）。Ｃ／ＥＢＰｂまたはＮＦ ＩＬ６ ｍＲＮＡのレベルは、サイトカイン誘導の結果として、マクロファージにおいて迅速に誘導される。また、Ｃ／ＥＢＰａおよびｂのレベルは、逆に関連するようである（Akiraら、1992;AkiraおよびKishimoto,1992）。よって、適当なＣ／ＥＢＰの割合は、ｈｆｇｌ２の発現に影響を及ぼし得る。特定の血友病Ｂ患者において、因子ＩＸ遺伝子のＣＣＡＡＴボックスに変異が見られ、それは該シスエレメントの重要性を示す（Petersonら、1990）。
ＴＣＦ−１（Ｔ細胞因子１）は、Ａ／ＴＡ／ＴＣＡＡＡＧモチーフに結合する。該転写因子の発現は、完全にＴ細胞系統に限定されるようであり、核に限定される（Castropら、1995;Verbeekら、1995）。ＤＮＡＳＩＳソフトウェアパッケージは、１０個のＴＣＦ１結合部位をｈｆｇｌ２遺伝子のプロモーター領域中において選択した。ＴＣＦ１結合モチーフの存在は、Ｔ細胞における該遺伝子の報告されている構成的発現の原因であった（RueggおよびPytela,1995;Koyamaら、1987）。
ｅｔｓ１プロトオンコジーンファミリーのメンバーは、コンセンサス配列ＡＧＧＡＡＧを有するポリオーマウイルス・エンハンサー・アクチベーター３であるＰＥＡ３ドメインに結合する（Xinら、1992;Wasylykら、1990）翻訳開始部位から約１２００ｂｐにＰＥＡ３部位が存在する（図８および９）。ＡＰ１およびＰＥＡ３の間に共同の相互作用の証拠がある（Wasylykら、1990）。ＰＥＡ３モチーフを有するプロモーターのいくつかは、それらの転写を活性化するインデューサーの型、ｉ）急性相応答、ｉｉ）ガンマインターフェロンおよびｉｉｉ）マイトジェンおよびオンコジーンにしたがって、分類できる（Xinら、1992）。ｆｇｌ２遺伝子発現がウイルス感染によって誘導されるので、ｈｆｇｌ２遺伝子産物は、また、急性相応答タンパク質であり得る。ＣＡＸＸＴＧのコンセンサスを有する多くの推定ｂＨＬＨ（塩基性ヘリックス・ループ・ヘリックス）ドメインの存在は、該遺伝子が多くのＤＮＡ結合転写アクチベーターの影響下にあることを意味する（Murreら、1994）。これらの転写アクチベータータンパク質は、ヘリックス−ループ−ヘリックスタンパク質をＤＮＡに結合させる主に塩基性の残基の領域を含有する。主に疎水性の残基によって特徴付けられる第２の領域、ＨＬＨドメインは、これらのタンパク質を相互に反応させ、ホモまたはヘテロ２量体のいずれかを形成させる（Murreら、1994）。
３．ＰＣＲによるｈｆｇｌ２イントロンのサイズ測定：
方法：
ｈｕｆｌｐ３と６およびｈｕｆｌｐ５と６のプライマーの組み合わせを用いて、イントロン１をＰＣＲにより増幅した（表３）。増幅の鋳型として、Ｊ１４、６３５９、６３６０および６３６１クローンを用いた。前記のように、６３５９、６３６０および６３６１は、ｈｆｇｌ２を含有するＰＡＣクローンであり、Ｊ１４はＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩベクター（Strategene）中における６３６０のサブクローンである。各プライマー２５ピコモル、各ｄＮＴＰ２００βＭ、１ＸＰＣＲ、３または５ｍＭ ＭｇＣｌ2およびＴａｑポリメラーゼ２．５Ｕ（Canadian Life,Burlington,Canada）を含有する全量５０μｌ中で反応を行った。反応は、９５℃で５分間の変性、次いで９５℃で１分の変性、６０℃で１分アニーリング、７２℃で２分伸長のサイクルを３０サイクルに付した。ＰＣＲ産物を０．８％アガロース、０．５Ｘ ＴＢＥおよび０．５μｇ／ｍｌエチジウムブロミド中で電気泳動した。
ｈｆｇｌ２イントロンのサイズ測定の結果および考察：
プライマーセットｈｕｆｌｐ３および６を用いた場合、２８００ｂｐアンプリコンが合成された。ｈｕｆｌｐ５および６を用いた場合、アンプリコンのサイズは２４００ｂｐであった。エキソン領域を引き算すると、イントロン１は約２２００ｂｐであり、それはマウスでも観察される（Koyamaら、1987）。前記のように、ヒトｆｇｌ２の該イントロンは、イントロンスプライシングのためのコンセンサスを有する。５スプライス接合点のためのコンセンサスは、Ａ／ＣＡＧ（−１）Ｇ（＋１）ＴＡＡＧＴである（ここに、−１と＋１の間に切断が起こる）（BreathnachおよびChambon,1981）。該スプライス部位は、ヒトｆｇｌ２遺伝子において観察される。３スプライス部位コンセンサスは、（Ｐｙ）ｎＮｐｙＡＧ（−１）Ｇ（＋１）である（BreathnachおよびChambon,1981）。ヒト遺伝子において、イントロンの３末端配列は保存されるが、エキソンの配列は保存されず；ｈｆｇｌ２はグアニジンの代わりにチミジンを有する。
４．ヒト小腸全ＲＮＡ由来のｈｆｇｌ２のＲＴ−ＰＣＲ：
方法：
ヒト小腸全ＲＮＡ由来の１本鎖ｃＤＮＡを合成するために、４μｇの全ＲＮＡ（Bio/Can Scientific,Mississauga,Canada）、１μｇ／μｌ貯蔵濃度の２μｌのランダム６量体（Pharmacia,Uppsala,Sweden）、２０ＵのＲＮＡｓｅインヒビター（Pharmacia,Uppsala,Sweden）および容量を１２μｌにするためにＤＥＰＣ処理水を一緒に加え、６５℃で５分間インキュベートし、氷上で素早く冷却した。次いで、１ｍＭの各ｄＮＴＰ（２０ｍＭ貯蔵液１μｌ）、１０ｍＭ ＤＴＴ（０．１Ｍ ＤＴＴの２μｌ）、４μｌの５Ｘ１本鎖バッファー（Canadian Life,Burlington,Canada）および２００Ｕ ＭＭＬＶ−ＲＴａｓｅバッファー（Canadian Life,Burlington,Canada）を３７℃で１．５時間インキュベートした。反応混合物を９５℃で５分間加熱し、８０μｌのＤＥＰＣ処理水で５倍に希釈した。
１０μｌの前記ＲＴ混合物、１０ピコモル／μｌのセンスおよびアンチセンスプライマー２．５μｌ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、１ＸＴａｑバッファー、３ｍＭ ＭｇＣｌ2および５ＵのＴａｑポリメラーゼ（Canadian Life,Burlington,Canada）を用いて、５０μｌの反応容量でポリメラーゼ連鎖反応を行った。ＰＣＲ反応に用いたプライマーセットは、ｈｕｆｌｐ１および２、ｈｕｆｌｐ１および６、ｈｕｆｌｐ５および２、ｈｕｆｌｐ１３および２６、ｈｕｆｌｐ１３および２８、ｈｕｆｌｐ１５および２６、ｈｕｆｌｐ１５および２８ならびにｈｕｆｌｐ１１および２８であった。反応条件は、９５℃で５分間、ならびに９５℃で１分間、４７または５７℃（プライマーセットによる）で１分間および７２℃で２分間のサイクルを３０サイクルであった。ＰＣＲ産物は、０．８％アガロース、０．５Ｘ ＴＢＥおよび０．５μｇ／ｍｌのエチジウムブロミド中で電気泳動した。
ヒト小腸全ＲＮＡにおけるＲＴ−ＰＣＲの結果および考察：
RueggおよびPytelaは、マウスフィブリノーゲン様タンパク質をコードする遺伝子に相同であるヒト小腸由来のｃＤＮＡのクローニングを報告した（RuggeおよびPytela,1995）。ＲＴ−ＰＣＲの結果は、ヒト小腸において構成的に発現されるｈｆｇｌ２が本当に存在することを示す。プライマーｈｕｆｌｐ２６および２８は、プライマーｈｕｆｌｐ１３および１５の下流に位置し；４つのプライマー全てが３ＵＴＲに位置する。プライマーの組み合わせｈｕｆｌｐ１３および２６ならびにｈｕｆｌｐ１３および２８がアンプリコンを生じるので、Ｊ１４クローンの３末端は実際にエキソンの一部であることを示す。ｈｕｆｌｐ１５は、アンチセンスプライマーを用いてアンプリコンを合成しないので、RueggおよびPytelaによって報告された最後の３９個のヌクレオチドはクローニング人工産物であるにちがいない。
５．ＰＡＣクローンの制限マッピング：
方法：
適当な制限酵素を見出すために、ＰＡＣクローン６３５９、６３６０および６３６１を頻度の多いおよび頻度の少ないカッターの両方で、すなわち、ＥｃｏＲ１、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩ、ＢｇＩＩＩ、ＰｖｕＩＩ、ＫｐｎＩ、ＳｃａＩ、ＸｂａＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＥｃｏＲＶ、ＳｍａＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｌＩ、ＮｃｏＩ、ＮｏｔＩ、ＭｌｕＩ、Ｂｐｕ１１０２１、Ｂｇｌ１、ＳｓｔＩ、ＸｈｏＩ、ＣｌａＩ、ＳｆｉＩおよびＳａｃＩＩで制限消化した。切断する頻度の少ない制限酵素Ｎｏｔ１、Ｓｍａ１およびＳａｌ１、および切断する頻度の多い酵素ＥｃｏＲ１、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＰｓｔＩおよびＰｖｕＩＩを用いて、最終的なマッピングを行った。前記のＰＡＣクローンはいずれの内部ＮｏｔＩ部位も持たなかったので、マッピングの過程を容易にするため、それらをＮｏｔＩと一緒に、ＳｍａＩおよびＳａｌＩを別々に用いて消化した。全ての制限消化において、約２μｇのＤＮＡを適当な制限酵素と共に２０μｌ容量で用いた。２重の消化の場合、適当なバッファー条件下、ＤＮＡを１０μｌ反応容量中、ＮｏｔＩで一晩、次の日に２０μｌ容量中、ＳａｌＩまたはＳｍａＩで消化した。頻度の少ないカッターでの消化後、ＤＮＡをＣＨＥＦ電気泳動に付した。最もよい結果の場合、泳動条件は、角度１２０度、６ボルト、１−１０秒ランプ間隔、２．７リットルの０．５ｘＴＢＥバッファー、２５０ｍｌの１％アガロース（SeaKemMe）および泳動時間２２時間であった。ＤＮＡを頻度の多いカッターで消化後、ＤＮＡを０．５Ｘ ＴＢＥおよび０．７％アガロース中、３０ボルトで約５０時間、標準のゲル電気泳動に付した。
制限マッピングの結果および考察：
図１０Ａは、頻度の多いカッターで消化後、ＣＨＥＦ装置におけるＰＡＣクローンのゲル電気泳動の例である。図１０Ｂは、頻度の多いカッターで消化後、ＰＡＣクローンの標準的なゲル電気泳動の例である。高Ｇ＋Ｃ含量を有するより長い配列を認識する稀なカッターでさえもクローンを本当に頻繁に消化するので、これらのクローンは、高Ｃ＋Ｇ含量を有するにちがいない。図１１は、ＰＡＣクローンの制限地図である。ｈｆｇｌ２遺伝子内のＳｍａＩ部位の存在は、ＰＡＣクローン内でのｈｆｇｌ２のマッピング過程を促進した。３つのＰＡＣクローン、６３５９、６３６０および６３６１のおよそのサイズは、各々、１５９ｋｂ、１３９ｋｂおよび１１６ｋｂである。最も正確に制限地図を作成されたクローンは、６３６０である。大量のＳａｌ１およびＳｍａ１部位の存在により、クローン６３５９および６３６１のマッピングの正確さが制限された。図１１は、６３５９におけるインサートの配向が６３６０および６３６１のそれと反対であることを示す。
ｈｆｇｌ２の一過性発現：
ｆｇｌ２とｈｆｇｌ２の間のタンパク質配列相同性は、ｈｆｇｌ２もまた、直接的プロトロンビナーゼをコードすることを示唆する。発現研究に用いることができるｈｆｇｌ２のｃＤＮＡを合成するために、原型を開発した。ヒト小腸全ＲＮＡ（Bio/Can Scientific,Mississauga,Canada）を１本鎖合成の鋳型として用い、ランダム６量体（Pharmacia,Uppsala,Sweden）をプライマーとして用いる。ＰＣＲ反応の場合、ｈｕｆｌｐ２９および３０をプライマーとして用いる。ＰＣＲ産物は、ベクターＰＣＲ２．１（Invitrogen,San Diego,CA）中でクローン化する。制限酵素ＥｃｏＲ１を用いて、インサートをベクターから回収する。ｈｆｇｌ２のコーディング領域を含有する該インサートをベクターｐｃＤＮＡ３．１-（ｈｉｓ，ｍｙｃ）（Invitrogen,San Diego,CA）のＥｃｏＲ１部位中でクローン化する。一過性のトランスフェクション効率を上げるために、ベクターを線状化し、リポフェクションを用いてＣＯＳ細胞中にトランスフェクトする。最初に、標準的な凝血促進アッセイを用いて細胞をスクリーンする。次いで、因子が欠乏した血漿中で凝固アッセイを行って、それらが直接的プロトロンビナーゼ活性を示す可能性を担時するかどうかを調べる。最後に、抗組織因子および抗因子Ｘの存在下、放射能ヨウ素標識したプロトロンビンの分解をモニターすることによって、プロトロンビン分解アッセイを行う。
ヒト小腸全ＲＮＡのノーザン・ブロット：
２５μｇのヒト小腸全ＲＮＡ（Bio/Can Scientific,Mississauga,Canada）をアガロースゲル上で泳動し、ナイロン膜に転写し、ｈｆｇｌ２のエキソン１およびＧＡＢＤＨで別々にプローブする。該アッセイは、ｈｆｇｌ２ｍＲＮＡのサイズを同定するため、また、該遺伝子のために１種より多くのｍＲＮＡが存在するかどうかを検出するために行う。
実施例２
Ｆｇｌ２に対する抗体による移植片拒絶の防止
（ａ）同種異系移植片
げっ歯類ｆｇｌ２に対するモノクローナル抗体の同種異系移植片拒絶を防止する能力を研究するために、ドナーＬｅｗｉｓ Ｂｒｏｗｎ Ｎｏｒｗａｙ Ｆ１（ＬＢＮＦ１）由来の腸およびレシピエントＬｅｗｉｓラットを用いて、異所性小腸移植を行った。手術の手法は、以前に記載されている（Effect of Cyclosporine Metabolites in Experiental Small Intestinal Transplantation,P.C.W.Kim,Z.Cohen,P.Y.Wong,E.Cole,J.Cullen,K.Skoreckiら、Transplantation 1990;49:1403-1050）。
簡単に言えば、体重２００−２５０グラムの成体Ｌｅｗｉｓ（ＬＥＷ）およびＬｅｗｉｓ ｘ Ｂｒｏｗｎ ＮｏｒｗａｙＦ１ハイブリッド（ＬＢＮＦ１）雌ラットを全実験に用いた。外科手術前の２４時間、動物を空腹にし、手術の２４および１２時間前に、各々、ドナーをネオマイシン６０ｍｇ／ｋｇおよびエリスロマイシン４０ｍｇ／ｋｇを胃管を通して摂取させた。滅菌環境において、MonchikおよびRusselの記載した方法の修飾を用いて、異所性小腸移植を行った（Monchik,G.J.,Russel,P.Transplantation of Small Bowel in the Rat:Technical and Immunological Considerations,Surgery 1971;70:633）。
ラットは４つの群：
群Ｉ        ｎ＝５；処理を受けない
群ＩＩ      ｎ＝５；７．５ｍｇ／ｋｇのＣｓＡを１日目に受ける
群ＩＩＩ    ｆｇｌ２に対するモノクローナル抗体１ｍｇ／ｋｇを受ける
群ＩＶ      ＣｓＡ（７．５ｍｇ／ｋｇ）の１回の皮下注射およびｆｇｌ２に対するモノクローナル抗体（１ｍｇ／ｋｇを１０日間）の毎日の注射を受ける
に分けた。
日に２回、動物を進行について注意深くモニターし、死亡時に、組織（腸）を取り出し、慣例的な組織学およびフィブリン沈着の存在に対する免疫蛍光に付した。２８日目に、生存動物を殺し、同種異系移植片を組織学およびフィブリン沈着の存在について分析した。
未処理の対照動物は全て、移植の４日以内に死亡し、全ての同種異系移植片がフィブリン沈着を有する重症の壊死を示した。シクロスポリンＡの１回の注射を受けた７０パーセント（６０％）の動物が４日目に死亡し、１４日目まで、たった１匹の動物（２０％）が生き残った。全ての動物由来の組織の分析は、同種異系移植片の顕著から重症の壊死を示した。ｆｇｌ２に対するモノクローナル抗体の毎日の注射を受けた動物は、生存数が増加し、１４日目まで、これらの動物の６０％（３／５）が生き残った（図１２）。同種異系移植片の分析は、フィブリン沈着の形跡のない穏かから中程度の拒絶を示した。最後に、シクロスポリンＡの１回の注射およびｆｇｌ２に対するモノクローナル抗体を１０日間受けた全ての動物（５／５）は生残り、２８日目のそれらの移植片の分析は、正常な組織学を示した。
（ｂ）異種移植片
ｆｇｌ２プロトロンビナーゼに対する抗体の超急性異種移植片拒絶を防止する能力を研究するために、単離肝臓灌流装置中、１００ｍｇのｆｇｌ２抗体の存在下または不在下で、モルモット由来の血液でＷｉｓｔｅｒラット由来の肝臓を灌流した。Ｗｉｓｔｅｒ同系交配ラットの３つの群から無菌状態で肝臓を取り出した。次いで、１００ｍｇの正常マウスＩｇＧ１（群１）；１００ｍｇの正常ラット血液（群２）；または１００ｍｇのｆｇｌ２プロトロンビナーゼに対する抗体のいずれかを加えたモルモット由来の酸素化した血液で、単離灌流チャンバー中、１２０分間、肝臓を還流した。
正常なマウスＩｇＧ１およびアルブミンで灌流した肝臓は、１０分以内にフィブリン様壊死の領域が豊富な暗色になり、３０分までに、血液がこれらの肝臓中を灌流できなくなった。対照的に、ｆｇｌ２に対する抗体を加えた血液で灌流した肝臓は、形態学的に正常であり、灌流圧が正常のままであり、灌流は全１２０分間持続し、その後、肝臓を取り出し、慣例的な組織学および電子顕微鏡によって調べた。群１および２由来の肝臓において、血清アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）レベルが、２０分で４５ＩＵ／Ｌのベースラインから１２，４００ＩＵ／Ｌに急速に上昇し、肝臓を灌流装置から取り出した場合、３０分で１８，７００ＩＵ／Ｌに上昇した。対照的に、群３由来の肝臓中の血清ＡＬＴレベルは、ほぼ正常なままであった：２０分でＡＬＴ５５ＩＵ／Ｌ；９０分で６８ＩＵ／Ｌおよび１２０分で９０ＩＵ／Ｌ。群１および２由来の肝臓の組織学は、密集した洞様血管中のフィブリン沈着を伴う顕著な壊死および出血の領域を示した。電子顕微鏡写真は、血小板接着、フィブリン沈着および内皮細胞破壊を示した。対照的に、肝臓構造は、群３の肝臓において、ごく少量の血小板およびフィブリン沈着を伴っただけで、ほぼ正常であった。
これらの結果は、ｆｇｌ２プロトロンビナーゼに対する抗体が超急性異種移植片拒絶を防止することができることを示す。
実施例３
異種血清によるＦｇｌ２プロモーターの誘導
材料および方法：
ベクター構築物
プロモーター構築物を作成するために用いられた制限酵素は、GIBCO BRL,Life Technologies,Grand Island,N.Y.,USAから入手した。全てのプラスミドはQuinogen Maxiprepキットを用いて精製し、ＤＨ５イー・コリ細菌（GIBCO BRL）中で生育させた。
−３．５ｋｂ／＋９ｂｐおよび−１．３ｋｂ／＋９ｂｐ ｆｇｌ−２プロモーター領域ｐＧＬ−２−Ｂａｓｉｃルシフェラーゼ構築物（ｐＬ−３５００、ｐＬ−１３００）由来のＤＮＡを、Levy博士の研究室で以前に構築されたクローンから得た（データは公表されていない）。付加的な一連の５’末端切断型プラスミドおよび３’ｐＬ３’２７４ルシフェラーゼベクターを最初、ＰＣＲを用い、次いで、ＰＣＲ２．１プラスミド（Invitrogen）中でのクローニングによって構築した。ｐＬ−３５００クローンの特異的部分を、９５℃１分、５８℃１分、７２℃２分の３５サイクルで増幅した。ｐＧＬ２−Ｂａｓｉｃ中に存在する下流３’逆方向のプライマーは、全ての５’末端切断型のために決定され、５’−ＧＡＡ ＡＴＡ ＣＡＡ ＡＡＡ ＣＣＧ ＣＡＧ ＡＡＧ Ｇ−３’であった（Promega）。ｐＬ−９９５を構築するために使用された上流プライマーは、５’ＴＣＴ ＴＧＧ ＧＡＡ ＡＴＣ ＴＧＧ ＴＴＡ ＧＡＧ−３であった。ｐＬ−６８１のための上流プライマーは、５’−ＧＡＧ ＣＴＧ ＡＧＴ ＧＡＴ ＧＧＧ ＧＡＡ ＧＧＡ−３’であった。ｐＬ−２９４のための上流プライマーは、５’−ＧＧＧ ＣＡＣ ＴＧＧ ＴＡＴ ＴＡＣ ＡＡＣ ＴＧＴ−３’であり、ｐＬ−１１９のための５’プライマーは、５’−ＣＴＣ ＣＴＣ ＣＴＧ ＴＧＴ ＧＧＣ ＧＴＣ ＴＧＡ−３’であった。３’末端切断型のための決定された５’進行方向プライマーは、５’−ＧＧＡ ＴＡＡ ＧＧＡ ＧＧＧ ＣＡＧ ＧＧＴ ＧＡＡ−３’であった。ｐＬ３’２７４のための下流アンチセンスプライマーは、５’−ＡＣＡ ＧＴＴ ＧＴＡ ＡＴＡ ＣＣＡ ＧＴＧ ＣＣＣ−３’であった。ＰＣＲ後、ＰＣＲ産物を連結し、ＰＣＲ２．１ベクター中でクローン化した。ＰＣＲ２．１クローンを配列決定して、配向についてチェックし、ＤＮＡを所望のクローンから得た。５’末端切断型の場合、ＰＣＲ２．１クローンをＫｐｎＩおよびＳａｌＩで消化し、次いで、連結し、ＫｐｎＩおよびＸｈｏＩで切断したｐＧＬ２−Ｂａｓｉｃルシフェラーゼベクター（Promega）中でクローン化した。各最終構築物を特異的な診断的な消化でチェックした後、ＤＮＡの長い調製物を作製した。ｐＬ３’２７４の場合、ＰＣＲ２．１クローンをＥｃｏＲＶおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、次いで、連結し、ＳｍａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断したｐＧＬ２−Ｂａｓｉｃ中でクローン化した。生じた異なる構築物の概要を図１３に示す。
細胞培養および血清
ＳＶＥＣ４−１０細胞（Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ成体マウス由来のＳＶ４０形質転換腋窩リンパ節、血管内皮細胞）を米国メリーランド州のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ））から入手した。ＡＴＣＣにより指示されるように、６０ｍｍのプレート（Corning）中で細胞培養を行い、二次培養した。３７℃、５％ＣＯ2にて１６継代未満で、細胞培養を維持した。
ブタ血清、ラット血清および胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）をGIBCO BRLより入手した。ヒト血清はヒト血漿（Levy博士の親切な提供）から得；血液試料を室温後に回収した。自己Ｃ３Ｈ血清をJackson Laboratory,Bar Harbor,Maine,USAより入手した。全ての血清を５６℃で４５分間加熱インキュベーションし、アリコートに分け、−２０℃で貯蔵した。
ＤＮＡトランスフェクション
全てのトランスフェクションは、リポフェクタミン（Lipofectamine）（GIBCO BRL）を用いて行った。トランスフェクション前に、１−３ｘ１０５ ＳＶＥＣ４−１０細胞を１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン−ストレプトマイシン（GIBCO BRL）を含有するダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）（GIBCO BRL）２ｍｌ中、６ウェル（３５ｍｍ）プレートのウェルごとに接種した。細胞が７０−８０％集密になるまで細胞をインキュベートし、次いでトランスフェクトした。各ウェルをトランスフェクトする場合、２μｌのリポフェクタミンを１００μｌＤＭＥＭ中で希釈した。次いで、該溶液を０．５μｇのｐＧＬ２−ルシフェラーゼベクター構築物および０．２５μｇのｐＲＳＶ−ｆ１−Ｇａｌベクター（Promega）を含有するＤＭＥＭ１００μｌ中で希釈した溶液に加えた。一般に、４つのウェルに対する溶液を１度に調製した。次いで、リポフェクタミン／ＤＮＡ溶液を穏かに攪拌し、１５００ＲＰＭで５秒間遠心分離し、３０分間平衡を保たせた。この間、ＳＶＥＣ４−１０細胞をＤＭＥＭで２回洗浄した。次いで１ｍｌのＤＭＥＭ中のリポソームを各ウェルに加えた。トランスフェクト細胞を３７℃で５−６時間インキュベートし、その後、トランスフェクション培地を新しい２ｍｌのＤＭＥＭで置き換えた。全て、細胞は、ＤＭＥＭ中で１５−２０時間飢餓状態にさせた後、ＤＭＥＭ中種々の濃度で種々の異種血清および自己血清と一緒に８−１０時間インキュベートした。したがって、血清を与えられていない細胞は、合計２３−３０時間飢餓状態にあった。各実験ウェルは、２連で行った。
トランスフェクションアッセイ（ルシフェラーゼおよびｆｌ−Ｇａｌアッセイ）
タンパク質抽出：
血清刺激後、細胞をタンパク質抽出のために採収した。細胞を最初、２ｍｌのＰＢＳ（GIBCO BRL）で１回洗浄し、次いで２００μｌのレポーター溶菌バッファー（Analytical Luminescence Laboratory,MI,USA）で溶菌した。培養プレートを氷上に維持し、細胞を削り取り、１．５ｍｌエッペンドルフチューブ中に収集した。これらの抽出物を−７０℃で保管した。トランスフェクションアッセイの日に、細胞内タンパク質の放出を助けるため、３回の液体窒素から３７℃への凍結および解凍サイクルを行って細胞を溶菌した。次いで、タンパク質抽出物を１４０００ｒｐｍ、４℃で６分間遠心分離し、細胞破片をペレット化した。トランスフェクションアッセイに使用するまで、ｆｌ−ガラクトシダーゼおよびルシフェラーゼを含有する上清を氷上で維持した。
ｆｌ−ガラクトシダーゼ（ｆｌ−ｇａｌ）アッセイ：
各試料をアッセイする場合、３μｌの１００Ｘ Ｍｇ溶液（０．１Ｍ ＭｇＣｌ2、４．５Ｍ ｆｌ−メルカプトエタノール）を３３μｌの２Ｘ Ｏ−ニトロフェニルｆｌ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Sigma Chemical Co.,St.Louis,Mo.,USA）、３０μｌの細胞抽出物および０．１Ｍリン酸ナトリウム（５０％ｗ／ｖＨ2Ｏ中の４１％ ｗ／ｖ０．２Ｍ Ｎａ2ＨＰＯ4 ２Ｈ2Ｏ，９％ｗ／ｖ０．２Ｍ Ｎａ2Ｈ2ＰＯ4 ２Ｈ2Ｏ）と９６ウェルミクロタイタープレート（Costar）中で混合した。反応物を３７℃で３０分間インキュベートし、ミクロタイター分光光度計を用いて、最適な密度を４１４ｎｍで読み取った。溶菌バッファー対照を用いてバックグラウンドのｆｌ−ｇａｌを測定し、他の試料から引き算した。ｆｌ−ｇａｌアッセイは、トランスフェクション効率を標準化するために用いた。
ルシフェラーゼアッセイ：
ＭｏｎｏＬｉｇｈｔ ２０１０Ｃ照度計（Analytical Luminescence Laboratory,MI,USA）を用いて、細胞抽出物をルシフェラーゼ活性についてアッセイした。ルシフェラーゼ試薬を−２０℃から室温に解凍した。次いで、３０μｌのタンパク質抽出物を１０ｍｌ照度計キュベット（Analytical Luminescence Laboratory,MI,USA）中の２０μｌの１Ｘ補酵素Ａ（sigma）に加え、照度計に装填した。次いで、１００μｌの１ｍＭ Ｄ−ルシフェリン（Analytical Luminescence Laboratory,MI,USA）および１００μｌのルシフェラーゼ溶菌バッファー（３０ｍＭトリシン（Tricine）、３ｍＭＡＴＰ、１５ｍＭ ＭｇＳＯ4、１０ｍＭ ＤＴＴ）を照度計によって自動的に注入する。放射された光を１０秒間にわたって測定した。ｐＧＬ２−エンハンサーベクター（Promega）を正の対照として用い、ｐＧＬ２−Ｂａｓｉｃベクターを負の対照として用いた。出力データは、未処理のルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ）で表される。標準化したルシフェラーゼデータは、ＲＬＵをｆｌ−ｇａｌ吸光度で割り、ｐＧＬ２−Ｂａｓｉｃの正味のバックグラウンド発光を引き算することによって得た。
統計分析：
定量データは、平均±標準偏差として表した。統計分析は、スチューデントｔ検定を用いて行い、０．０２未満のＰ値を統計学的に有意であるとみなした。
結果
Ｆｇｌ−２プロモーター活性は、内皮細胞において、異種血清によって誘導されるが、自己血清においてほんのわずかに誘導されるのみである。
ＳＶＥＣ４−１０は、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウス由来のネズミ内皮細胞系統である。これらの細胞は、種々のインターロイキンを包含する種々のサイトカインに対して正常な内皮細胞のような応答を示すので（ＴＮＦ−（J.Immunol.144:521）；ＩＦＮ−ガンマは、正常な内非細胞と同一の時間経過でＭＨＣクラスＩＩを誘導する（J.Immunol.144:521））、ｆｇｌ−２プロモーター応答を研究するために選択された。さらに、内皮細胞は、異種移植の成功に対する障壁であると予想され、異種移植片拒絶に活発に関係するので、これらの細胞におけるｆｇｌ−２転写の分析は異種移植片系のイン・ビトロモデルを示し得る。
異種血清対自己血清に応答するｆｇｌ−２プロモーターの転写活性を測定するために、ｐＬ−１３００をＳＶＥＣ４−１０細胞中にトランスフェクトし、その後、それらを２０％異種血清か、２０％自己血清と一緒にまたは血清なしでインキュベートした。誘導に用いられた種々の異種血清は、ＦＢＳ、ブタ血清、ラット血清およびヒト血清を包含した。自己血清は、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスから得た。血清無しの状態は、ＤＭＥＭのみを含有した。使用した種々の血清供給源の各々について相対的ルシフェラーゼ活性を算出し、血清無しの状態に相対的なパーセントとして図１４に示す。ｆｌ−ガラクトシダーゼ構築物を内部対照として用いて、ルシフェラーゼ活性をＤＮＡ取り込み量について標準化した。各トランスフェクションは、ｐＬ−１３００を用いて２連で、少なくとも３回行った。２０％異種血清（ＦＢＳ、ブタ、ラット、ヒト）および２０％自己Ｃ３Ｈ血清での誘導については、平均値および標準偏差を示す。ＦＢＳ、ブタ血清およびラット血清は全て、血清無しの状態よりも平均約４倍でルシフェラーゼ発現を誘導した。２０％ヒト血清は、平均２．６±０．３倍でｆｇｌ−２プロモーター転写活性を誘導した。自己Ｃ３Ｈ血清は、ｆｇｌ−２プロモーター活性をわずかに増加させたのみで、統計学的にヒト血清誘導より少ない（Ｐ＜０．０２）。
異種血清対自己血清についての用量応答曲線を作成した。これらの実験において、ＳＶＥＣ４−１０細胞をｐＬ−１３００でトランスフェクトし、その後、０．１％、１％、３％、５％、１０％、２０％、５０％および１００％ＦＢＳまたはブタ血清の存在下で誘導させた。さらに、ルシフェラーゼ活性を血清無しの状態に相対的なパーセントとして表した。ＦＢＳ、ブタ血清およびＣ３Ｈ血清についての用量応答曲線を図１５に示す。ＦＢＳおよびブタ血清の両方が用量に依存してルシフェラーゼ活性を血清無しの状態の少なくとも最高４００％まで誘導した。自己Ｃ３Ｈ血清は、試験した全ての用量でｆｇｌ−２プロモーターからの転写を誘導しなかった。また、ルシフェラーゼ活性が一貫して、１００％ブタまたはＦＢＳでのインキュベーションに応答して３％異種血清に匹敵するレベルまで低下したことは、興味深い。プロモーター活性におけるこの低下は、高血清レベルに関連するある程度の毒性を示す。
胎仔ウシ血清誘導は、転写開始部位の上流の最初の１１９ｂｐに位置する。
異種血清に応答するｆｇｌ−２プロモーター領域における位置を決定するために、プロモーターの連続した５’末端切断型を有するプラスミドを構築した（図１３参照）。各構築物をＳＶＥＣ４−１０細胞中にトランスフェクトし、２０％ＦＢＳで誘導させるかまたは誘導させなかった（ＤＭＥＭのみ）。次いで、各構築物について血清無しの状態に対して何倍増加したかを算出し、パーセンテージ増加として表した。結果を図１６に要約する。転写開始部位の上流３．５ｋｂｐを含有するｐＬ−３５００は、対応する非誘導試料の約２１５％（２．１５倍誘導）まで誘導できた。−３５００〜−１３００のプロモーター領域の欠失は、ルシフェラーゼ誘導においてほとんど２倍の増加をもたらし、これは、該領域が異種血清に誘導される転写を阻害する調節因子に結合し得ることを示唆する。ｆｇｌ−２プロモーター領域の連続した５’末端切断型からヌクレオチド−１１９までを有する構築物（ｐＬ−１３００、ｐＬ−９８６、ｐＬ−６８１、ｐＬ−２９４、ｐＬ−１１９）は全て、ＦＢＳによって最大レベル（非誘導試料の約３５０％）まで誘導された。したがって、ｆｇｌ−２の転写開始部位の上流の最初の１１９ｂｐだけが、ＦＢＳによるｆｇｌ−２転写の最適な誘導を維持するのに必要であった。この観察は、重要なＤＮＡ配列エレメントが異種血清によるｆｇｌ−２プロモーター誘導の原因である該領域に存在することを示す。最も注目すべきは、プロモーターの該領域が−３２位置に予測ＴＡＴＡボックス、−５１にＡＰ−１結合部位（５’−ＴＧＡＧＴＣＡＧ−３’）および−７９にＳＰ１結合部位（５’−ＣＣＧＣＣＣ−３’）を含有することである（図１７Ｅ参照）。転写開始部位の上流の最初の２７４ｂｐが欠失した場合（ｐＬ３’２７４）、ＦＢＳによるルシフェラーゼ活性の誘導は得られなかった。該プラスミドは、ＦＢＳ誘導における隣接するプロモーター領域の重要性を強める。
考察
前記の結果は、ｆｇｌ−２プロモーター領域の１．３ｋｂ部分が、誘導の８−１０時間後、用量に依存して異種血清によってＥＣにおいて選択的に誘導されることを示唆する（図１４、図１５）。いくらかの可能性の結果として、該研究において選択的異種血清誘導が観察され得る。１の可能性は、選択的誘導が異種反応性自然抗体（ＸＮＡ）によって維持されることである。この考えにより、自己Ｃ３Ｈ血清は、そのＥＣ表面に結合できるＸＮＡがないので、ｆｇｌ−２プロモーター活性を有意に誘導しないであろう。わずかなＸＮＡ結合がｆｇｌ−２転写を活性化するために細胞へデリバーされる刺激をわずかにもたらすか、または全くもたらさないであろう。４つの異種血清（ＦＢＳ、ブタ、ラット、ヒト）の全ては、ネズミＥＣ上のいくつかは同定されていない種々のエピトープに対するＸＮＡを含有することが知られており、該研究において見出されたｆｇｌ−２プロモーター活性化を媒介し得る、。使用された最も系統発生論上遠い異種血清、およびＧａｌ １−３Ｇａｌに対するＸＮＡを含有する１個（ヒト血清）だけが、ｆｇｌ−２プロモーターからの最も低い転写誘導を生じたことは、興味深い。このことは、異種血清によるｆｇｌ−２プロモーター誘導がおそらく、補体の不在下でＧａｌ １−３Ｇａｌに対するＸＮＡによって引き起こされなかったことを示唆する。Ｇａｌ １−３Ｇａｌに対するＸＮＡがネズミＥＣ上に補体を固定するように、加熱不活性化されないヒト血清または補体成分が加えられたヒト血清を用いて、種々の時点でｆｇｌ−２プロモーター誘導を試験することは、いまだに興味深いことである。
異種血清によるＥＣにおけるｐＬ−１３００の選択的誘導の説明を助けるもう１つの可能性は、プロ炎症性サイトカインの存在である。血管異種移植片拒絶の部位に、高レベルのプロ炎症性サイトカイン、および病状の媒介を助けるためにＥＣ上で作用する生産された可溶性因子が存在する。これらのいくつかは、Ｃ５ａ、ＩＬ−１、ＩＬ−ｆｌ、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−ガンマおよびＴＮＦ−（Platt,J.L.1996;Parker,W.ら、1996;Bach,F.H.ら、1996）を包含する。使用された異種血清中のサイトカインは、ｆｇｌ−２プロモーター誘導に寄与したかもしれない。この仮定に味方して、ｆｇｌ−２遺伝子が単球中でＩＦＮ−ガンマによって誘導されるという近年の知見が知られている（Lafuse,W.P.ら、1995）。発明者らの研究室では、また、ＩＬ−１およびＴＮＦ−の両方がＥＣにｆｇｌ−２の転写を誘導できることを示した（Parr,R.L.ら、1995）。サイトカイン作用は、また、ヒト血清を誘導に用いて得られるより低いルシフェラーゼ活性の原因であり得る。特定のサイトカインは、遠い種の障壁に対して機能しないことが明らかにされた。例えば、ヒトＩＬ−ｆｌおよびＩＦＮ−ガンマはブタＥＣを刺激しない（Bach,F.H.ら、1996）。高用量のサイトカインは、また、応答において、それらのシグナル変換を減少させようとする細胞に対する毒性を示すことが知られている。この考えは、用量応答曲線から１００％異種血清において示されたｆｇｌ−２プロモーター活性のダウンレギュレーションを説明し得る（図１５）。
異種血清（ＦＢＳ）によるｆｇｌ−２プロモーター誘導は、転写開始部位の上流の最初の１１９ｂｐに位置決定された（図１６）。該領域は、調節因子を結合するコンセンサス配列が豊富で、ＡＰ−１結合部位を−５１位置に、Ｓｐ１結合部位を−７９位置に包含する（図１７）。ＡＰ−１およびＳｐ１のどちらも、異種移植片拒絶において発現される重要な凝血促進分子である組織因子の高レベル血清誘導において重要であることが示された（Mackman,N.ら、1990）。ＡＰ−１部位およびＡＰ−１様部位は、また、重要なアゴニスト応答エレメントであることが示された。例えば、ヒトＩＬ−２遺伝子内にＡＰ−１様結合部位が存在し、それはＩＬ−１刺激に対して応答する（Muegge,K.ら、1989）。したがって、これらの部位は、異種移植片拒絶の部位に存在する種々のサイトカインによるｆｇｌ−２プロモーター誘導において役割を果たし得る。
実施例４
再発性の不明な胎児喪失の治療としてのＦｇｌ２に対するモノクローナル抗体
研究は、ストレスによって引き起こされる胎児喪失の治療において、プロトロンビナーゼ（ｆｇｌ２）に対するモノクローナル抗体の有用性の可能性を研究するために行われた。動物にストレスを与えると、生殖能力、交配行為、排卵、着床、胎児成長および乳汁分泌の減少を生じることが示された（P.Arck,F.S.Morali,J.Manuel,G.ChaquatおよびD.A.Clark,Stress Triggered Abortion Inhibition of Protective Suppression and Promotion of Tumor Necrosis Alpha（TNF-α）Release a Mechanism Triggering Resorptions in Mice,American Journal of Reproductive Immunology 1995;33:74-80）。
マウスを密集した囲い状態で、毎日手に触れ、水泳の強要、大きな騒音、加熱、明るい光および物理的な束縛にさらすと、げっ歯類における妊娠結果に対して有害な影響を与えることが示された。ストレスの種類およびその影響は、系統に依存するようである。ＣＢＡ／ＪｘＤＢＡ／２Ｊ交配において、超音波音が胎児喪失率を上昇させることが示された。子宮の実験において、誘導される胎児喪失の強い病原性の特徴はフィブリン沈着の存在であることが示された。
したがって、研究は、ｆｇｌ２に対するモノクローナル抗体の効力および胎児吸収および胎児喪失を防止するその能力を決定するために行われた。
方法は、よく定義されている。簡単に言うと、６−８週齢の雌（ＣＢＡ／Ｊ）を（ＤＢＡ／２Ｊ）雄と一晩一緒に棲息させた後、膣栓を有する雌を分離し、未処理かまたは１０μｇのｆｇｌ２ ＩＶに対するモノクローナル抗体を１０日間毎日与えた。どちらの群の動物も（１群あたりｎ＝１０）、電池式のげっ歯類に不愉快な装置の場合、超音波音ストレスに曝すことからなるストレスに付した。妊娠１３．５日目に、雌を頚部脱臼によって安楽死させ、子宮を取り出し、開け、記録したいくつかの吸収部位における着床の全数について調べた。
結果を図１８に示す。未処理の動物は、７０％吸収部位以上で、３０％着床以下であった。対照的に、モノクローナル抗体の注射を毎日受けた動物は、１０％吸収部位以下で９０％着床であった。胎児喪失率におけるこの減少は、ｐ＜０．００１で統計学的に有意であった。さらに、未処理動物における子宮の分析において、モノクローナル抗体で処理した動物には検出されなかった密集したフィブリン沈着が存在した。
実施例５
自然発生的な胎児喪失ならびにＴＮＦ−αおよびγ−インターフェロンによって誘導される胎児喪失の治療としてのＦｇｌ２に対するモノクローナル抗体
研究は、ＤＢＡ／２と交配したＣＢＡ／Ｊマウスにおいて、自然発生的胎児喪失ならびにＴＮＦ−αおよびγ−インターフェロンによって誘導される胎児喪失の危険性を減少させることにおける、ｆｇｌ２プロトロンビナーゼに対するモノクローナル抗体の有用性の可能性を研究するために行われた。
胎児喪失におけるｆｇｌ２プロトロンビナーゼに対するモノクローナル抗体の役割を研究するために、イン・ビボ細胞除去技術およびインターフェロンに対して応答しないマウスを用いて、胎児喪失の発生におけるＴＮＦ−αおよびγ−インターフェロン、ＮＫ細胞およびマクロファージの役割を直接的に試験した。
サイトカインＴＮＦ−αおよびγ−インターフェロンは、それらの投与量が胎児喪失の危険性を増加させ、特異的アンタゴニストが胎児喪失の危険性を減少させるように、胎児喪失において重要な役割を果たす（Chaouat,G.,ら、J.Repord.Fert.89:447（1990）;Arck,P.C.,ら、Amer.J.Reprod.Immunol.37:262（1997）;Chaouat,G.ら、J.Immunol.154:4261（1995）;Gendron,R.L.ら、J.Repord.Fertil.90:447（1990））。
以下の実験において、本発明者らは、誘導された胎児喪失において、血栓症および炎症を引き起こす血管内皮細胞プロコアグラントの活性化のため、虚血によって胎児喪失が引き起こされることを明らかにする。
方法
系統ＣＢＡ／ＪおよびＤＢＡ／２の同系交配マウスをIffa Credoから入手した。Ｆｒａｎｃｅ Ｃ５７Ｂ１／６ＪマウスをJackson Laboratories,Bar Harbor,MEから入手した。インターフェロン応答エレメントＩＲＦ−１のノックアウトを有するＣ５７Ｂ１／６マウスを以前の記載のように作製し（Duncan,G.Sら、J.Exp.Med.184:2043（1996））、トロントのオンタリオ・キャンサー・インスティチュート（Ontario Cancer Institute）で育てた。ＣＢＡ／Ｊマウスは、食物および水を無制限に与え、１２時間明所−暗所サイクルの通常の上部が開いたワイヤーケージ条件下、パリのコロニーで維持された。トロントのコロニーのマウスは柵で囲んだ施設内で維持された。雌ＣＢＡ／Ｊ、Ｃ５７Ｂ１／６またはＣ５７Ｂ１／６ ＩＲＦ−／−マウスをＤＢＡ／２Ｊ雄と一晩一緒に棲息させることによって交配させ、膣栓を見つけた朝を妊娠０．５日として定義した。
妊娠したＣＢＡ／Ｊマウスは、妊娠６．５日目に１ｍｌウサギＩｇＧ抗−アシアロＧＭ１抗体（Immunocorp,Richmond,VA）の腹膜内注射によってＮＫ細胞を除去し；非免疫ウサギＩｇＧに対して等価であることが以前に示されているので（Clark,D.A.,Crit.Rev.Immunol.11:215（1991））、リン酸緩衝化セーラインを対照として用いた。マクロファージ除去は、Baek,H-SおよびJ-W.Yoon（J.Virol.64:5708（1990））の記載のように、交配前の４週間、週に２回の１００ｍｇ／ｋｇ二酸化珪素の腹膜内注射によって行われた。マウスプロコアグラント（ｆｇｌ２−プロトロンビナーゼ）に対する抗体を中和するアフィニティー精製ウサギＩｇＧは、以前の記載（Ding,J.W.ら、J.Exp.Med.（1997）;Dackiw,A.P.B.ら、Arch.Surg.131:1273（1996））のように調製し、妊娠３．５日目の始めに、マウスに、２００μｌの１／５０希釈の５．５ｍｇ／ｍｌ抗プロトロンビナーゼまたは対照ウサギ抗体の調製物を腹膜内注射した。卵巣機能を代替するのに十分な妊娠のホルモン援助は、いくつかの実験において、妊娠４．５日目の初めに、０．１ｍｌ油中の６．７ｎｇ１７β−エストラジオール＋１ｍｇプロゲステロンを筋内注射することによって提供された（Michael,S.D.ら、Biol.Repord.12:400（1975））。１００ｇのラットモノクローナルＩｇＧ２ｂ抗−マウス顆粒球抗体ＲＢ６−８Ｃ５（Pharmingen）（Stoppacciaro,A.ら、J.Exp.Med.178:151（1993））またはイソ型対照を妊娠６．５日目または８．５日目のいずれかの日に腹膜内注射した。ＴＮＦ−α（６およびR&D Systems）１０００または２０００単位および／またはネズミ組換えγ−インターフェロン（６およびR&D Systems）１０００単位を妊娠７．５日目に腹膜内注射した。妊娠１３．５日目に、マウスを殺し、吸収されたおよび健康な胎児の数を数えた。いくつかの実験において、子宮を急冷凍し、５ミクロンのセクションを切断し、組織をマクロファージに対するラットモノクローナルＦ４／８０抗体（Catag,Tebu,France）で染色した。簡単に言うと、組織セクションを１／３０希釈のＦ４／８０と一緒にＰＢＳ中で３０分間インキュベートし、ビオチン標識した抗ラットＩｇＧ２ｂ２次抗体（Secrotec）（Kachkache,M.ら、Biol.Repord.45:860（1991））を有するペルオキシダーゼ−ストレプトアビジンを用いて、結合を検出した。
処理群あたり４〜１０匹の交配したマウスを使用した。まとめられた吸収率における差異の有意度は、適当なフィッシャー精密検定のｃ2によって試験した。
結果および考察
ＮＫおよびマクロファージ除去および胎児喪失
実施例１、表４は、ＴＮＦ−αの腹膜内注射が、用量に依存してＤＢＡ／２に交配したＣＢＡ／Ｊマウスの胎児喪失率を上昇させることを示す。マウスが抗−アシアロＧＭ１抗体処理を受けた場合、予想通り、胎児喪失のバックグラウンドは減少し（Clark,D.A.,Crit.Rev.Immunol.11:215（1991）;Clark,D.A.ら、Ann.New York Acad.Sci.626:524（1990）;Chaouat,G.ら、J.Repord.Fert.89:447（1990））、ＴＮＦ−αはもはや有意な影響を及ぼさなかった。これらのデータは、ＴＮＦ−α→ＮＫ→活性化ＮＫ→胎児を殺すというモデルを支持した。内在性マクロファージ誘導ＴＮＦ−αの十分なレベルを確実にするために、発明者らは、実験を繰り返し、γ−インターフェロンを加えた。実施例２は、γ−インターフェロンが単独で、ＰＢＳで前処理したマウスの胎児喪失率をＴＮＦ−αで達成されるレベルまで上昇させ、ＴＮＦ−αの添加が有意な付加的な影響を及ぼさなかったことを示す。ＮＫ細胞除去マウスにおいて、γ−インターフェロンは胎児喪失率を上昇させなかった。このことは、γ−インターフェロン→マクロファージ→活性化してＮＯを生じる→胎児の死亡というモデルが正しくなかったことを示唆する。しかしながら、γ−インターフェロンおよびＴＮＦ−αを一緒に投与したとき、８０％以上の着床した胎児が流産した。このことは、義務的な共同作用／共依存を示唆する、すなわち、ＮＫ細胞除去マウスにおいて、γ−インターフェロンのＮＫ細胞供給源が除去されたので、ＴＮＦ−αは作用せず、ＮＫ細胞誘導γ−インターフェロンに依存するマクロファージがＴＮＦ−αの生産を止めたので、γ−インターフェロンは欠乏し、腹膜内注射したサイトカインは、両方のサイトカインが同時に存在するほど迅速にＴＮＦ−α生産を刺激しない。直接的なＮＫまたはマクロファージ殺害メカニズムは、胎児喪失を説明しそうにないようである。この考えをさらに試験するために、マクロファージ除去マウスを用いて実験を繰り返した。実施例３は、マクロファージ除去が胎児喪失率を減少させたことを示す。マクロファージ除去は、ＴＮＦ−α＋γ−インターフェロンの注射によって生じた８０％胎児喪失率に対して有意な影響を及ぼさなかったことが解る。Ｆ４／８０+マクロファージの組織染色は、シリカ処理が有効であり、サイトカイン処理がマクロファージ浸潤を引き起こさなかったことを確かにした（データを示さない）。ＴＮＦ−α＋γ−インターフェロンは、共同的に作用して、卵巣による必須妊娠ホルモンの生産を抑制し（Teranova,P.F.およびV.M.Rice,Repord.Immunol.37:50（1997））、かかる阻害が胎児喪失を引き起こした（Deansly.R.,J.Reprod.Fertil.35:183（1973）;Kaplanski G.ら、J.Immnol.158:5435（1997）;Michael,S.D.ら、Biol.Repord.12:400（1975））。しかしながら、卵巣の阻害は、１００％胎児喪失を引き起こすべきである（Deansly,R.J.Repord.Fertil.35:183（1973））。さらに、発明者らが前記のようにホルモン置換療法を与えた場合（Michael,S.D.ら、Biol.Repord.12:400（1975））、胎児喪失率のバックグラウンドまたは２０００μ ＴＮＦ−α＋１０００μ γ−インターフェロンによって生じた高い胎児喪失率の何れに対しても影響を及ぼさなかった（３５／４１、８６％Ｎ＝５対照群対３７／４５、８２％Ｎ＝５サイトカイン処理群、統計学的に差異はない）。
ＩＲＦ１−／−マウスにおいてサイトカインによって引き起こされる胎児喪失
ＴＮＦ−αおよびγ−インターフェロンは、共同的に作用して、ヒトトロホブラスト細胞培養においてアポトーシスを誘導する（Yui,J.ら、Placenta 15:819（1994））。表４に示される結果は、トロホブラストにおける直接的アポトーシス作用によって説明できた。しかしながら、サイトカインＣＳＦ−１はイン・ビボで存在し、これは、ＴＮＦ−αおよびγ−インターフェロンのアポトーシス作用を排除し得る（Yui,J.ら、Placenta 15:819（1994）;Pollard,J.W.ら、Nature 330:484（1987））。マウスにおいてトロホブラストに対する直接的影響を試験するために、ＩＲＦ１−／−雌をＤＢＡ／２（＋／＋）雄に交配させた。ここに、胎児トロホブラストはＩＲＦ１を発現するが、母体の組織は発現しない。表５に示すように、妊娠したＩＲＦ１−／−雌は、低いバックグラウンドの胎児喪失率を有し、ＴＮＦ−α＋γ−インターフェロンに対して完全に耐性であった。ＩＲＦ１−／−マウスと共同同系のＣ５７Ｂ１／６（＋／＋）雌もまた、低い吸収率を有したが、サイトカイン処理した場合、劇的に流産した。これらのデータは、サイトカインが母体に作用し、トロホブラストに作用せず、胎児喪失を誘導することを示した。
抗−ｆｇｌ２プロトロンビナーゼ抗体は、胎児喪失を阻害し、顆粒球は内皮破壊の過程に寄与する
マクロファージもＮＫ細胞もＴＮＦ−α＋γ−インターフェロンが作用するのに必要でないようなので、多くの論理学上の標的は血管内皮細胞であるようであった。これらのサイトカインは、プロコアグラント（組織因子と異なるｆｌｇ／２−プロトロンビナーゼ）の表面発現を刺激し、続く凝固過程は、肝炎および内毒素性ショックのような種々の炎症性疾患モデルにおいて虚血性損傷を導くことが知られている（Ding,J.W.ら、J.Exp.Med.（1997）;Dackiw A.P.B.ら、Arch.Surg.131:1273（1996）;Levi,M.ら、J.Clin.Invest.93:114（1994））。
ＤＢＡ／２で交配したＣＢＡ／Ｊマウスのｆｇｌ２プロトロンビナーゼに対する抗体での処理の結果を表６に示す。ｆｇｌ２プロトロンビナーゼに対する抗体での処理は、胎児喪失のバックグラウンドの危険性を３８％から４．５％に減少させ；該減少はｐ＜０．００１で統計学的に有意であった。マウス胎児における染色体異常の頻度は、４％である（Smith,W.B.ら、J.Immunol.157:360（1996））。
また、表６は、ｆｇｌ２プロトロンビナーゼに対する抗体での処理がＴＮＦ−α＋γ−インターフェロンによって誘導される胎児喪失の危険性を８７％から１３％に著しく減少させたことを示す（ｐ＜０．００１）。ＴＮＦ−α＋γ−インターフェロンおよびｆｇｌ２プロトロンビナーゼに対する抗体を与えられたマウスにおける胎児喪失の危険性（１３％）とＴＮＦ−α＋γ−インターフェロンを与えられなかったが、ｆｇｌ２プロトロンビナーゼに対する抗体を与えられたマウスにおける胎児喪失の危険性（４．５％）の間に統計学的に有意な差異はない。したがって、ｆｇｌ２プロトロンビナーゼに対する抗体は、ほとんど完全にＴＮＦ−α＋γ−インターフェロンによって誘導される胎児喪失を防止した。
したがって、該研究において、ＮＫ細胞もマクロファージも胎児喪失に必要ではないこと、ＣＢＡｘＤＢＡ／２マウスにおけるサイトカイン依存性胎児喪失は、プロコアグラントｆｇｌ２プロトロンビナーゼによって媒介され、サイトカインは母体に作用し、胎児のトロホブラストに作用しないこと、および胎児は、血栓症を引き起こす血管内皮細胞プロコアグラントｆｇｌ２の活性化のため、虚血により死亡することがわかった。本発明者らは、ＤＢＡ／２−で交配したＣＢＡ／Ｊマウスのｆｇｌ２プロトロンビナーゼに対する抗体での処理が胎児喪失のバックグラウンドの危険性を減少させ、ＴＮＦ−α＋γ−インターフェロンによって誘導される胎児喪失をほとんど完全に防止することを明らかにした。
実施例６
バキュロウイルス発現系を用いるｆｇｌ２プロトロンビナーゼの発現
実施例は、ｆｇｌ２タンパク質がバキュロウイルス発現系を用いて発現され得ることを明らかにする。
ネズミｆｇｌ２のｃＤＮＡをベクターｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２Ａ中でサブクローン化した。次いで、これを用いて、野生型バキュロウイルスＡｃＭＮＰＶとの相同組換えにより組換えバキュロウイルスを作製した。昆虫細胞（Ｓｆ９またはＨｉｇｈ５）を組換えウイルスで感染させることにより、Ｎ末端にエンテロキナーゼ部位が次に位置する６個のヒスチジン残基を有する融合ｍｆｇｌ２タンパク質を発現させた。ポリクローナルウサギ抗マウスｆｇｌ２抗体を用いるウェスタンブロットによって、組換えウイルスで感染させたＨｉｇｈ５細胞由来のライゼートをｍｆｇｌ２タンパク質の存在について分析した。未感染Ｈｉｇｈ５細胞および野生型ＡｃＭＮＰＶで感染させた細胞を全ての研究の対照として用いた。タンパク質発現の条件を最適化し（結果のセクションを参照）、融合タンパク質をヒスチジン残基を結合するためのニッケルを含有するＰｒｏＢｏｎｄ樹脂を用いて精製した。
ｍｆｇｌ２遺伝子配列を含有する組換えウイルスをＰＣＲによりスクリーンし、推定クローンを選抜した。数回のプラーク精製の後、純粋なウイルスクローンを得た。ポリクローナルウサギ抗ｍｆｇｌ２抗体を用いてウェスタンブロット分析を行って、ｍｆｇｌ２融合タンパク質の発現を証明した。タンパク質発現の最適条件を決定するために、予備的な実験を行った。Ｓｆ９およびＨｉｇｈ５昆虫細胞によって発現されたタンパク質の量を比較した。Ｈｉｇｈ５細胞は、Ｓｆ９細胞と比較して、より大量のタンパク質を発現した。組換えタンパク質生産は、４８時間で検出でき、７２時間で最高レベルに達し、感染後５日まで同じレベルのままであった。ｍＦｇｌ２発現の時間経過を図１９に示す。ＭＯＩは、５または９ｐｆｕ／細胞で、同様のレベルのタンパク質発現を生じた。これらの観察に基づいて、発明者らは、５ｐｆｕ／細胞のＭＯＩでウイルスでＨｉｇｈ５細胞を感染させることに決定し、最適なタンパク質生産のために感染後３日目に細胞を採収した。
発明者らが前記したように、ｍｆｇｌ２融合タンパク質をＮ末端でポリＨｉｓタグに結合させた。変性条件下、Ｐｒｏｂｏｎｄ樹脂を用いてタンパク質の精製を行った。自然条件下で行った場合、成功しなかった。ウェスタンおよびクーマシーブルー染色を用いて、発現したプロトロンビナーゼを検出した（各々、図２０および２１）。タンパク質は、分子量〜６０ｋＤａであることがわかった。ネズミｆｇｌ２融合タンパク質は、培地中に検出されなかった。
実施例７
ｍｆｇｌ２融合タンパク質の機能的分析
実施例６で調製した発現したｍｆｇｌ２融合タンパク質のプロコアグラント活性の機能的分析を行って、発現した融合タンパク質が、天然タンパク質のような直接的プロトロンビナーゼとして作用することを確認した。
実験的アプローチ
１段階凝固アッセイ
ｆｇｌ２プロトロンビナーゼについてのアッセイを用いて、プロコアグラント活性を直接的に測定した。ｍｆｇｌ２融合タンパク質を発現する組換えウイルスで感染されたＨｉｇｈ５細胞を凍結解凍サイクルに付した。次いで、以前の記載のように、それらをカルシウム添加した血小板−欠乏正常ヒト血漿の自然発生的凝固時間を促進させるそれらの能力についてアッセイした（Levy & Edgington,1980）。結果は、標準ウサギ脳トロンボプラスチンの連続希釈と比較することによって定量化した。組換えウイルスで感染された細胞由来の活性を未感染細胞および野生型ウイルス感染細胞ならびに精製タンパク質単独の場合と比較した。凝固経路に関連するタンパク質は、機能的活性のためにリン脂質２重層を必要とし；したがって、精製タンパク質を昆虫細胞およびマクロファージ中に再構築して、それらのＰＡＣ活性を測定した。凝固因子ＩＩ、Ｖ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＸおよびＸＩＩを欠乏したヒト血漿を用いて、付加的なＰＡＣアッセイを行って、発現したＰＣＡの性質（因子依存性）を決定した。
プロトロンビン分解アッセイ
発現した融合タンパク質が直接的プロトロンビナーゼとして作用するかどうかを決定するために、プロトロンビン分解アッセイを以前の記載のように行った（Schwartzら、1982）。１２５Ｉ−プロトロンビンを組換えウイルスで感染したまたは未感染のＨｉｇｈ５細胞と一緒にインキュベートした。また、精製ｍｆｇｌ２融合タンパク質をそのプロトロンビン分解能を決定するために研究した。ラッセルクサリヘビ毒（ＲＶＶ）の存在下、ヒト因子Ｘａを正の対照として用いた。１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに試料を泳動し、放射能写真によって１２５Ｉ−プロトロンビンおよびそれらの分解産物について分析した。
１段階凝固アッセイ
未感染細胞、野生型−および組換えウイルス感染細胞、および可溶性タンパク質についてＰＣＡを測定した（表７）。組換えウイルスで感染された細胞のみＰＣＡを発現し、精製可溶性タンパク質から活性は検出されなかった。この結果は、ｍｆｇｌ２融合タンパク質のＮ−末端での６個のヒスチジン残基およびエテロキナーゼ部位の存在がその凝固能に完全に影響を与えなかったことを示唆した。因子欠乏血漿を用いるＰＣＡの結果を表８に示す。組換えウイルス感染細胞により発現されたＰＣＡは、ＩＩ（プロトロンビン）を除く全ての因子に非依存性であり、それは、発現したｍｆｇｌ２融合タンパク質が直接的プロトロンビナーゼであるべき天然タンパク質と同様に作用することを示唆する。
第２セットの凝固アッセイを行って、可溶性ｍｆｇｌ２タンパク質の添加が組換えウイルスで感染された細胞によるＰＣＡ発現を防止するかどうかを決定した。発明者らの結果は、可溶性タンパク質が細胞ライゼートにより誘導される凝固を防止できないことを示唆した。にもかかわらず、精製タンパク質の昆虫細胞中での再構築由来の予備的な結果は、部分的なＰＣＡ活性の回復を示す（表９）。
プロトロンビン分解アッセイ
プロトロンビン分解アッセイを用いて、プロトロンビンをトロンビンに分解するｍｆｇｌ２融合タンパク質の能力を試験した。図２２において、バッファーおよびカルシウム単独でのインキュベーション後の無傷１２５Ｉ−プロトロンビンの単一高分子量種に注目した（最初のパネル）。カルシウムおよび因子Ｖの存在下でのヒト因子Ｘの添加は、プロトロンビンの既知誘導体に対応する分解産物を生じた（第２のパネル）。１２５Ｉ−プロトロンビンを組換えウイルス感染細胞由来のホモジネートと一緒にインキュベートする場合に、同様な産物が見られた（第４のパネル）。しかしながら、未感染Ｈｉｇｈ５細胞ホモジネートまたは精製タンパク質との１２５Ｉ−プロトロンビンのインキュベーションは、プロトロンビン分解を示さなかった（各々、３および第４のパネル）。これらの結果は、発明者らの１段階凝固アッセイからの知見と一致した。１２５Ｉ−プロトロンビンを野生型ウイルス感染細胞由来のホモジネートと一緒にインキュベートした場合、低分子量産物が見られた（データは示さない）。このことは、野生型感染昆虫細胞におけるプロテアーゼの発現によって説明され得る（Vialardら、1995）。
好ましい具体例における本発明の原理の例示および記載から、かかる原理から逸脱することなく、組み合わせおよび細部において本発明を修飾できることは、当業者には明らかであろう。本発明者らは、以下の請求の範囲の範囲内での全修飾を主張する。
全ての出版物、特許および特許出願は、あたかも、個々の出版物、特許または特許出願が特別におよび個々に出典明示により完全に本明細書の一部とされることが指示されたかのように、その同じ範囲まで完全に、出典明示により本明細書の一部とする。
後記の全ての引用文献は、明細書中に引用される引用文献のために示され、図面のいくつかのための詳細な凡例を提供する。
明細書内に引用された参考文献の全列記
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配列表
（１）一般的情報
（ｉ）出願人：レビー、ゲイリー
（ｉｉ）発名の名称：免疫性凝固を調節する方法
（ｉｉｉ）配列の数：４
（ｉｖ）送付先：
（Ａ）宛先：ＢＥＲＥＳＫＩＮ ＆ ＰＡＲＲ
（Ｂ）通り名：キング・ストリート・ウェスト４０番
（Ｃ）市名：トロント
（Ｄ）州名：オンタリオ
（Ｅ）国名：カナダ
（Ｆ）ＺＩＰ：Ｍ５Ｈ ３Ｙ３
（Ｖ）コンピューター判読形態
（Ａ）媒体型：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ ＰＣ互換機
（Ｃ）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウェア：ＰａｔｅｎｔＩｎ Ｒｅｌｅａｓｅ ＃１．０，バージョン＃１．３０
（Ｖｉ）現出願データ：
（Ａ）出願番号：
（Ｂ）出願日：
（Ｃ）分類：
（Ｖｉｉｉ）代理人等の情報：
（Ａ）氏名：グラヴァル、ミシュラン
（Ｂ）登録番号：４０，２６１
（Ｃ）リファレンス／事件番号：９５７９−００６
（ｉｘ）電気通信情報
（Ａ）電話：（４１６）３６４−７３１１
（Ｂ）テレファックス：（４１６）３６１−１３９８
（２）配列番号１の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：４６３０塩基対
（Ｂ）配列の種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ｉｉ）分子の型：他の核酸
（ｖｉ）原型の供給源：
（Ａ）起源：ホモサピエンス
（ｘｉ）配列の記載：配列番号１：
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（２）配列番号２の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：４３９アミノ酸
（Ｂ）配列の種類：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ｉｉ）分子の型：ペプチド
（ｘｉ）配列の記載：配列番号２：
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（２）配列番号３の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：５４０３塩基対
（Ｂ）配列の種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ｉｉ）分子の型：他の核酸
（ｘｉ）配列の記載：配列番号３：
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（２）配列番号４の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：４３２アミノ酸
（Ｂ）配列の種類：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ｉｉ）分子の型：ペプチド
（ｘｉ）配列の記載：配列番号４：
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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