(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を細胞内に輸送するための融合タンパク質であって、
前記細胞の表面抗原に対する一本鎖抗体と、
核酸と結合するための部分ヒストンポリペプチドを含み、
前記部分ヒストンポリペプチドが、配列番号１〜３のいずれかの配列を有するポリペプチドであることを特徴とする、融合タンパク質。
【請求項２】
核酸を細胞内に輸送するための融合タンパク質であって、
前記細胞の表面抗原に対する一本鎖抗体と、
核酸と結合するための部分ヒストンポリペプチドを含み、
前記部分ヒストンポリペプチドが、配列番号１の部分配列であることを特徴とする、
融合タンパク質。
【請求項３】
前記一本鎖抗体がヒト型一本鎖抗体であることを特徴とする請求項１または２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
核酸を細胞内に輸送するための融合タンパク質の作製方法であって、
細胞表面抗原に対するモノクローナル抗体の産生能を有するハイブリドーマから単離したｍＲＮＡを用いて、前記表面抗原に対する一本鎖抗体をコードするｃＤＮＡを作製する工程と、
前記一本鎖抗体ｃＤＮＡに部分ヒストンポリペプチドをコードするｃＤＮＡを付加して融合ｃＤＮＡを作製する工程と、
前記融合ｃＤＮＡを発現させ、前記一本鎖抗体と前記部分ヒストンポリペプチドを含む融合タンパク質を単離する工程と、
を含み、
前記部分ヒストンポリペプチドが、配列番号１〜３のいずれかの配列または配列番号１の部分配列を有するポリペプチドであることを特徴とする、融合タンパク質の作製方法。
【請求項５】
核酸を細胞内に輸送するための核酸輸送方法であって、
請求項１〜３のいずれかに記載の融合タンパク質に前記核酸を混合し核酸−タンパク質混合物を作製する工程と、
前記核酸−タンパク質混合物を前記細胞に投与する工程（但し、ヒト個体内の細胞への投与を除く）と、
を含む核酸輸送方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、核酸を細胞内に輸送するための融合タンパク質、その製造方法、及びそれを用いた核酸輸送方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
核酸を細胞内に輸送する方法として、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション、レトロウイルスやアデノウイルスなどのウイルス感染、リポフェクション、細胞融合、等が知られている。最近、組換えイムノジーン法と呼ばれ、組換えイムノポーターを核酸輸送のキャリアとして利用する方法が開発された（例えば、特許文献１参照）。
【０００３】
組換えイムノポーターとは、荷電性ペプチドテイルを有する一本鎖抗体のことであり、特に、細胞表面抗原に対する一本鎖抗体と、核酸結合能を有するペプチドの融合タンパク質が効果的である。遺伝子輸送の際には、細胞内に輸送したい核酸を結合させた組換えイムノポーターを、その表面抗原を有する細胞に投与する。抗体部分がその表面抗原に結合し、細胞はエンドサイトーシスによって、組換えイムノポーターを、結合した核酸と共に細胞内に取り込む。このように組換えイムノポーターを用いて、目的の核酸を細胞内に輸送することができる。
【０００４】
【特許文献１】
特開２００１−３３３７８０号公報
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、組換えイムノジーン法において、核酸輸送効率の高いシステムを提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するための本発明の主たる発明の融合タンパク質は、核酸を細胞内に輸送するための融合タンパク質であって、前記細胞の表面抗原に対する一本鎖抗体と、核酸と結合するための部分ヒストンポリペプチドを含む。ここで、部分ヒストンポリペプチドとは、ヒストンタンパク質の一部であるポリペプチドをいう。ヒストンはＨ１であることが特に好ましいが、ヒストンは本来ＤＮＡ結合タンパク質であるため、核酸と結合するための部分ヒストンポリペプチドとしては、ヒストンＨ１に限らず、どのヒストンに由来しても良い。
【０００７】
また、本発明の融合タンパク質は、前記部分ヒストンポリペプチドが、配列番号１から３のいずれかのポリペプチドであることを特徴としてもよい。
【０００８】
また、本発明の融合タンパク質は、前記部分ヒストンポリペプチドが、配列番号１の部分配列であることを特徴としてもよい。
【０００９】
また、本発明の融合タンパク質は、前記一本鎖抗体がヒト型一本鎖抗体であることを特徴としてもよい。
【００１０】
また、上記いずれかの融合タンパク質において、１ないし数アミノ酸残基が欠失、置換、ないし付加された融合タンパク質であって、前記部分ヒストンポリペプチドが核酸と結合し、前記一本鎖抗体が前記細胞の表面抗原に特異的に結合し、前記核酸を細胞内に輸送するための融合タンパク質であってもよい。
【００１１】
さらに、本発明の融合タンパク質の作製方法は、核酸を細胞内に輸送するための融合タンパク質の作製方法であって、細胞表面抗原に対するモノクローナル抗体の産生能を有するハイブリドーマから単離したｍＲＮＡを用いて、前記表面抗原に対する一本鎖抗体をコードするｃＤＮＡを作製する工程と、前記一本鎖抗体ｃＤＮＡに部分ヒストンポリペプチドをコードするｃＤＮＡを付加して融合ｃＤＮＡを作製する工程と、前記融合ｃＤＮＡを発現させ、前記一本鎖抗体と前記部分ヒストンポリペプチドを含む融合タンパク質を単離する工程と、を含む。
【００１２】
さらに、本発明にかかる核酸輸送方法は、核酸を細胞内に輸送するための核酸輸送方法であって、上記いずれかの融合タンパク質に前記核酸を混合し核酸−タンパク質混合物を作製する工程と、前記核酸−タンパク質混合物を前記細胞に投与する工程と、を含む。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。
なお、 J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (2nd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1989); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集は、当業者が当然に参考にするものであり、そこに記載の方法は当業者であれば容易に実施できると考えられる。そこで、これら標準的なプロトコールに記載の方法や、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる場合は、本明細書の実施の形態及び実施例に特に詳細な説明をしていない。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合、当業者は通常それらに添付のプロトコールを用いるため、特に説明が無い場合は、添付のプロトコールを用いるものとする。
【００１４】
また、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに技術的範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００１５】
本発明に係る融合タンパク質は、組換えイムノポーターの一形態として、核酸を細胞内に輸送するための融合タンパク質を構成し、細胞の表面抗原に対する一本鎖抗体と、核酸と結合するためのペプチドテイルとして部分ヒストンポリペプチドを含む。この融合タンパク質に核酸を混合すると、電荷によって核酸は部分ヒストンポリペプチドの部分と結合する。この核酸ー組換えイムノポーター結合体を細胞に投与すると、組換えイムノポーターの一本鎖抗体の部分が、細胞の表面抗原を特異的に認識し、その表面抗原に結合する。細胞は、この抗原ー組換えイムノポーター複合体に対し、キャッピング（capping）を起こし、エンドサイトーシス（endocytosis）によって、その複合体を細胞内に取り込む。この時、同時に、組換えイムノポーターに結合した核酸も同時に細胞内に取り込まれる。
【００１６】
ここで、核酸は、ＤＮＡであっても、ＲＮＡであっても良い。ＤＮＡの場合、本発明により、例えば遺伝子導入、特に遺伝子治療のための遺伝子導入などを行うことができる。また、ＲＮＡの場合、例えばＲＮＡｉの導入などを行うことができ、一例として、癌細胞の増殖に関わる遺伝子をＲＮＡｉで抑制することにより、癌細胞増殖抑制などに利用することができる。これらの例のように、細胞は生体内にあっても良いが、組織培養系や細胞培養系における細胞にも適用可能である。
【００１７】
標的とする細胞表面抗原は、例えば、成長因子、増殖因子、サイトカインなどの拡散因子や膜タンパク質などのタンパク質因子に対する受容体や、神経伝達物質やニコチンなどの化学分子に対する受容体（receptor）、細胞接着や情報伝達などに機能する細胞間相互作用をになう膜タンパク質など、標的細胞の細胞膜上に発現しているタンパク質または糖鎖など抗体で認識できるものであれば何でも良い。さらには、細胞表面（抗原）を別の抗体やペプチドあるいはビオチンなどの低分子物質などで標識し、それを認識する抗体も利用可能である。以下の実施例では、ＥＧＦＲ（EGFreceptor；上皮細胞増殖因子受容体）を細胞膜上の標的タンパク質として用い、ＥＧＦＲに対する一本鎖抗体を作製した。
【００１８】
一本鎖抗体とは、抗体分子のＨ鎖及びＬ鎖から可変領域を取り出して、リンカーで結合することにより、一分子上にＨ鎖可変領域（ＶＨ）とＬ鎖可変領域（ＶＬ）を設け、Ｈ鎖及びＬ鎖からなる抗体分子と同じ抗体認識能を持たせた抗体のことである。
【００１９】
一本鎖抗体は、基本的には、目的のタンパク質を認識するモノクローナル抗体を発現しているマウス・ハイブリドーマよりｍＲＮＡを単離し、そのｍＲＮＡを用いて作製したｃＤＮＡライブラリーから、そのモノクローナル抗体のＨ鎖及びＬ鎖をコードするｃＤＮＡをそれぞれ単離して、遺伝子操作により一本鎖抗体をコードする組換えＤＮＡを構築し、培養細胞で発現させることにより得ることができる。また、ｃＤＮＡライブラリーを作製せず、直接ｍＲＮＡよりＲＴ−ＰＣＴを用いて、Ｈ鎖及びＬ鎖をコードする遺伝子の必要な部分を増幅させ、そうして増幅した断片を用いて、遺伝子操作により、一本鎖抗体をコードする組換えＤＮＡを構築することもできる。
【００２０】
また、特定のハイブリドーマではなく、末梢血や脾臓などを用いて、上記と同様の手法で、多様な一本鎖抗体をコードする組換えＤＮＡライブラリーを構築することができる。この組換えＤＮＡライブラリーを、例えば、ファージディスプレイ（phage display）法により、ファージ表面に提示させ、標的となる細胞膜表面抗原を用いて、その表面抗原に対する抗体を発現しているファージを同定し、そのファージが有する一本鎖抗体をコードする組換えＤＮＡを回収する。
【００２１】
このようにして作製する一本鎖抗体は、マウスに由来するマウス型抗体でも良いが、医薬組成物として人間に投与する場合など、異種タンパク質投与による拒絶反応の問題があるため、ヒトに由来するヒト型抗体が好ましい場合がある。その際、あらかじめ多様な一本鎖抗体をコードする組換えＤＮＡライブラリーを構築し、目的の抗体をスクリーニングする場合は、最初にｍＲＮＡのソースとして用いる組織をヒト由来のものにすればよい。
【００２２】
しかし、マウス・ハイブリドーマ由来のモノクローナル抗体を用いてヒト型一本鎖抗体を作製する場合、マウス型抗体をヒト型抗体に変換する必要がある。上述したように、一本鎖抗体はＶＨとＶＬとをリンカーで結合した分子であるが、それぞれの領域は、抗原に対する特異性を決定する超可変領域（ＣＤＲ）と、抗体分子の立体構造を保持する機能を持つ枠組み構造領域（ＦＷＲ）とが、FWR1-CDR1-FWR2-CDR2-FWR3-CDR3-FWR4というようにモザイク状に配置された構造を有する。ＦＷＲのアミノ酸配列は種によって保存されているため、この領域のアミノ酸配列をマウス型からヒト型に変えることにより、一本鎖抗体をマウス型配列からヒト型配列に変えることができる。
【００２３】
核酸結合部位である荷電性ペプチドテイルとして、本発明では、ヒストンＨ１の部分配列を用いた。核酸は負に荷電しているため、ヒストンＨ１部分配列のように正に帯電した荷電性ペプチドテイルを用いると、これらの分子は相互に結合し、組換えイムノポーターが細胞内に取り込まれるのとともに、核酸も細胞内に輸送される。
以下、具体的な実施例を挙げて、本発明を詳細に説明する。
【００２４】
【実施例】
＝＝一本鎖抗体遺伝子の作製＝＝
一本鎖抗体遺伝子は、組換え一本鎖抗体作製キット（ファルマシア社）を用い、以下のように作製した。ＥＧＦＲに対するモノクローナル抗体Ｂ４Ｇ７を産生するマウス・ハイブリドーマ細胞からｍＲＮＡを単離し、oligodTをプライマーとして逆転写を行い、ｃＤＮＡを合成した。そのｃＤＮＡに対し、ＨＢ１からＨＢ１９までの混合プライマーとＨＦ１からＨＦ４までの混合プライマーを用いて、Ｂ４Ｇ７のＶＨドメインをコードするＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅し、ＬＢ１からＬＢ１７及びlamdaBの混合プライマーと、ＬＦ１、ＬＦ２、ＬＦ４、ＬＦ５及びlamdaFの混合プライマーを用いて、ＶＬドメインをコードするＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅した。得られたＤＮＡ断片をゲル精製した後、ＶＨ断片の３’末端及びＶＬ断片の５’末端のそれぞれと、５’末端及び３’末端で相同性を持ちハイブリダイズできるリンカーを加えてＰＣＲを行い、ＶＨ−リンカー−ＶＬという組換えＤＮＡを作製し、pCANTAB5Eにクローニングした。
【００２５】
本来、Ｂ４Ｇ７というモノクローナル抗体由来の組換えＤＮＡなので、種類は一種だけのはずであるが、プライマーのdegeneracy及びＰＣＲのエラーが含有されているので、組み換えＤＮＡはヘテロな分子集団である。そこで、以下のように、ファージディスプレイ法を用い、マウス型一本鎖抗体遺伝子をクローニングした。まず、組換えＤＮＡをファージ表面に発現させたライブラリーを作製した。一方、ＥＧＦＲを過剰産生するＡ４３１細胞を１０％ホルマリン（３．６％ホルムアルデヒド）含有ＰＢＳで１０分固定し、洗浄後、３％ ＢＳＡ含有ＰＢＳでブロッキングしたＡ４３１細胞を吸着させたプラスティックディッシュを用いて、上記ファージライブラリーを５回パンニング（panning）し、ＥＧＦＲに対する抗体を提示しているファージを濃縮した。次に、濃縮した抗体提示ファージに対し、固定化Ａ４３１細胞を抗原としてＥＬＩＳＡ法でスクリーニングを行い、マウス型一本鎖抗体発現ファージｓｃＢＨをクローニングした。
【００２６】
表１： 一本鎖抗体の作製に用いたプライマー
VH back
HB1
GGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGATCCGAKGTRMAGCTTCAGGAGTC  [配列番号４]
HB2
GGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGATCCGAGGTBCAGCTBCAGCAGTC  [配列番号５]
HB3
GGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGATCCCAGGTGCAGCTGAAGSASTC  [配列番号６]
HB4
GGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGATCCGAGGTCCARCTGCAACARTC  [配列番号７]
HB5
GGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGATCCCAGGTYCAGCTBCAGCARTC  [配列番号８]
HB6
GGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGATCCCAGGTYCARCTGCAGCAGTC  [配列番号９]
HB7
GGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGATCCCAGGTCCACGTGAAGCAGTC  [配列番号１０]
HB8
GGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGATCCGAGGTGAASSTGGTGGAATC  [配列番号１１]
HB9
GGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGATCCGAVGTGAWGYTGGTGGAGTC  [配列番号１２]
HB10
GGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGATCCGAGGTGCAGSKGGTGGAGTC [配列番号１３]
HB11
GGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGATCCGAKGTGCAMCTGGTGGAGTC [配列番号１４]
HB12
GGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGATCCGAGGTGAAGCTGATGGARTC [配列番号１５]
HB13
GGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGATCCGAGGTGCARCTTGTTGAGTC [配列番号１６]
HB14
GGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGATCCGARGTRAAGCTTCTCGAGTC [配列番号１７]
HB15
GGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGATCCGAAGTGAARSTTGAGGAGTC [配列番号１８]
HB16
GGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGATCCCAGGTTACTCTRAAAGWGTSTG [配列番号１９]
HB17
GGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGATCCCAGGTCCAACTVCAGCARCC [配列番号２０]
HB18
GGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGATCCGATGTGAACTTGGAAGTGTC [配列番号２１]
HB19
GGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGATCCGAGGTGAAGGTCATCGAGTC [配列番号２２]
VH FOR
SCFOR    GGAATTCGGCCCCCGAG [配列番号２３]
HF1
GGAATTCGGCCCCCGAGGCCGAGGAAACGGTGACCGTGGT [配列番号２４]
HF2
GGAATTCGGCCCCCGAGGCCGAGGAGACTGTGAGAGTGGT [配列番号２５]
HF3
GGAATTCGGCCCCCGAGGCCGCAGAGACAGTGACCAGAGT [配列番号２６]
HF4
GGAATTCGGCCCCCGAGGCCGAGGAGACGGTGACTGAGGT [配列番号２７]
VL BACK
SCBACK    TTACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCGGACTACAAAG [配列番号２８]
LB1
GCCATGGCGGACTACAAAGAYATCCAGCTGACTCAGCC [配列番号２９]
LB2
GCCATGGCGGACTACAAAGAYATTGTTCTCWCCCAGTC [配列番号３０]
LB3
GCCATGGCGGACTACAAAGAYATTGTGMTMACTCAGTC [配列番号３１]
LB4
GCCATGGCGGACTACAAAGAYATTGTGYTRACACAGTC [配列番号３２]
LB5
GCCATGGCGGACTACAAAGAYATTGTRATGACMCAGTC [配列番号３３]
LB6
GCCATGGCGGACTACAAAGAYATTMAGATRAMCCAGTC [配列番号３４]
LB7
GCCATGGCGGACTACAAAGAYATTCAGATGAYDCAGTC [配列番号３５]
LB8
GCCATGGCGGACTACAAAGAYATYCAGATGACACAGAC [配列番号３６]
LB9
GCCATGGCGGACTACAAAGAYATTGTTCTCAWCCAGTC [配列番号３７]
LB10
GCCATGGCGGACTACAAAGAYATTGWGCTSACCCAATC [配列番号３８]
LB11
GCCATGGCGGACTACAAAGAYATTSTRATGACCCARTC [配列番号３９]
LB12
GCCATGGCGGACTACAAAGAYRTTKTGATGACCCARAC [配列番号４０]
LB13
GCCATGGCGGACTACAAAGAYATTGTGATGACBCAGKC [配列番号４１]
LB14
GCCATGGCGGACTACAAAGAYATTGTGATAACYCAGGA [配列番号４２]
LB15
GCCATGGCGGACTACAAAGAYATTGTGATGACCCAGWT [配列番号４３]
LB16
GCCATGGCGGACTACAAAGAYATTGTGATGACACAACC [配列番号４４]
LB17
GCCATGGCGGACTACAAAGAYATTTTGCTGACTCAGTC [配列番号４５]
LAMDAB
GCCATGGCGGACTACAAAGATGCTGTTGTACTCAGGAATC [配列番号４６]
VL FOR
LF1
GGAGCCGCCGCCGCCAGAACCACCACCACCAGAACCACCACCACCACGTTTGATTTCCAGCTTGG [配列番号４７]
LF2
GGAGCCGCCGCCGCCAGAACCACCACCACCAGAACCACCACCACCACGTTTTATTTCCAGCTTGG [配列番号４８]
LF4
GGAGCCGCCGCCGCCAGAACCACCACCACCAGAACCACCACCACCACGTTTTATTTCCAACTTTG [配列番号４９]
LF5
GGAGCCGCCGCCGCCAGAACCACCACCACCAGAACCACCACCACCACGTTTCAGCTCCAGCTTGG [配列番号５０]
LAMDAF
GGAGCCGCCGCCGCCAGAACCACCACCACCAGAACCACCACCACCACCTAGGACAGTCAGTTTGG [配列番号５１]
【００２７】
＝＝マウス型抗体ｓｃＢＨからヒト型抗体ＣａＣへの変換＝＝
マウス型一本鎖抗体ｓｃＢＨをコードする遺伝子の塩基配列を決定し、アミノ酸配列を推定した。マウスｓｃＢＨのＦＷＲのアミノ酸配列に類似したヒト抗体ＦＷＲをデータベースで検索し、ＣＤＲの構造に影響を与えるとされる残基及びＶＬ／ＶＨの境界面で保存されている残基はできるだけ保存されているヒト抗体配列を選択し、ｓｃＢＨのＦＷＲのアミノ酸配列をこのヒト型配列に変換したヒト型一本鎖抗体を作製する（図１参照）。このヒト型化一本鎖抗体の有するＶＬ領域とＶＨ領域をリンカーでつなぎ、ヒト型化一本鎖抗体ＣａＣとする。以下、ＣａＣの作製方法を詳細に述べる。
【００２８】
まず、プライマーBX-VH1（塩基番号４−１０７に対応）、プライマーBX-VH2r（塩基番号８７−１９２に対応）、プライマーBX-VH3（塩基番号１８２−２７６に対応）およびプライマーBX-VH4r（塩基番号２５４−３４５に対応）をそれぞれ1μＭ含むＰＣＲ反応液（Expand High Fidelity PCR システム、現ロッシュダイアグノスティクス社）５０μｌを調製し、９４℃ ２分処理した後、[94℃ 30秒、50℃ 20秒、68℃ 10秒] の反応サイクルを３０回行った。これらの反応によって、塩基番号２８−２１６に対応するＤＮＡ断片及び塩基番号２０６−３６９に対応するＤＮＡ断片が得られる。反応産物を２μｌずつ、及びプライマーfNcoHr（塩基配列１−２３に対応し、５’側にNcoI制限酵素部位及び開始コドンを有する）とプライマーVHBsp（塩基配列３２６−３５１に対応し、５’端にBspHI制限酵素部位を有する）を１μＭずつ、新たなＰＣＲ反応液５０μｌにいれ、９４℃２分処理後、[94℃ 30秒、50℃ 20秒、68℃ 20秒] の反応サイクルを３０回行った。この反応によって、塩基番号１−３５１に対応し、開始コドンを有するＶＨ断片が得られる。このＰＣＲ産物を３％アガロースゲル電気泳動で分離精製した。
【００２９】
ＶＬ断片も同様に作製した。すなわちプライマーBX-VL1（塩基番号４０６−４９９に対応）およびプライマーBX-VL2r（塩基番号４８０−５７３に対応）、プライマーBX-VL3（塩基番号５５４−６４９に対応）およびプライマーBX-VL4r（塩基番号６３０−７１７に対応）を用いてＰＣＲを行い、反応産物（塩基番号４０６−５７３及び塩基番号５５４−７１７に対応するＤＮＡ断片）とプライマーfBamVL（塩基番号４００−４２５に対応し、５’端にBamHI制限酵素サイトを有する）およびrHLkEco（塩基番号６９９−７５３に対応し、５’側にEcoRI制限酵素部位及び終止コドンを有する）を用いてＶＬ断片（塩基番号４００−７５３に対応）を増幅し、同様に精製した。
【００３０】
ＶＨ断片およびＶＬ断片をそれぞれ、NcoIとBspHI、BamHIとEcoRIで末端を消化した後、３％アガロースゲル電気泳動で分離精製した
次に、リンカーLk-UpとrLk-Dnを５０μｌの１０ｍＭ TrisHCL(pH7.4)−５０ｍＭ NaCl−１ｍＭ EDTA に各５μＭになるように混合し、９４℃に加熱後、室温まで自然冷却させることによりアニールさせ、二重鎖リンカーを作製した。末端消化したＶＨ、ＶＬのＤＮＡ断片および二重鎖リンカーを等モル混同し、NcoI-EcoRIで消化したpET22b(Novagen 社)と共にライゲーション（ligation）することにより、pET22bに全長ＣａＣをクローン化し、塩基配列を確認した。
【００３１】
表２； マウス型抗体ｓｃＢＨからヒト型化抗体ＣａＣへの変換に用いたプライマー配列（全て5'→3'）。大文字は、オリジナルの配列と同一の塩基、小文字は、リンカー、制限酵素部位導入、 及び変位導入等によりオリジナルの配列と異なる塩基を表す。
【００３２】
BX-VH1:
GTTCAACTTGTACAGTCTGGTGCTGAAGTTAAGAAACCAGGAGCTTCAGTTAAGGTATCTTGTAAGGCTTCCGGTTTCAACATCAAAGACACTCTGATGCATTG [配列番号５２]
BX-VH2r:
GAATTTGCGTACGTACTTGGTATTACCGTCTTCTGGATCAATCCATCCCATCCACTCAAGACCTTGTCCTGGAGCCTGACGAACCCAATGCATCAGAGTGTCTTTG [配列番号５３]
BX-VH3:
CCAAGTACGTACGCAAATTCCAGGGTCGTGTTACTATGACCCGTGACACTTCAACCTCTACTGTTTATATGGAGCTTTCTAGTCTGCGATCAGAAGATACCGCT [配列番号５４]
BX-VH4r[g/a]:
AGTAACAGTAGTACCTTGTCCCCAATAAGCCCAGTTACCGTAAGATCCACCACGARCACAATAGTATACAGCGGTATCTTCTGATCGCA [配列番号５５]
fNcoH:catgccATGGGAcatcaccatcaccatcacCAGGTTCAACTTGTACAGTCTGG [配列番号５６]
rVHBsp:acctccggaAGATACAGTAACAGTAGTACCTTGTC [配列番号５７]
Lk-Up:ccggaggtggcggatctggcggtggaggttcaggaggtggcg [配列番号５８]
rLk-Dn:gatccgccacctcctgaacctccaccgccagatccgccacct [配列番号５９]
fBamVL:ggcggatccGACATTCAGATGACCCAATCACCATC [配列番号６０]
rHLkEco:ggaattcTTAAGAACCGCCACCgtgatggtgatggtgatgTTTGATGTCAACAGTGGTGCCT [配列番号６１]
BX-VL1:
CAGATGACCCAATCACCATCTAGTCTGTCAGCTTCCGTTGGAGATCGTGTTACTATTACCTGTCGCACTTCTGAGAACATCTACTCCTACTTTG [配列番号６２]
BX-VL2r:
TACACCTTCAGCCAGGGTCTTAGCATTGTAAATAAGGAGCTTTGGAGCTTTTCCTGACTTCTGTTGATACCAAGCAAAGTAGGAGTAGATGTTC [配列番号６３]
BX-VL3:
AGACCCTGGCTGAAGGTGTACCGTCTCGTTTCAGTGGATCTGGTTCTGGAACTGAGTTCACCCTCACTATTTCATCCCTTCAACCAGAAGACTTCG [配列番号６４]
BX-VL4r:
GATGTCAACAGTGGTGCCTCCACCGAAAGTGTGCAGAGATCCGTAATGGTGCTGACAGAAATAGGTAGCGAAGTCTTCTGGTTGAAGG [配列番号６５]
【００３３】
＝＝部分ヒストンＨ１テイル型イムノポーター遺伝子の作製＝＝
（１）改変型α-factorシグナル配列を有する一本鎖抗体遺伝子断片の作製
ヒト型化一本鎖抗体遺伝子ＣａＣを用いて、合成オリゴＤＮＡとＰＣＲ法により部分ヒストンＨ１テイル型イムノポーター遺伝子を以下のように作製した。なお、イムノポーターのＣ末端には、分泌効率の改善を試み改変型α-factorシグナル配列を連結した。
【００３４】
まず、ヒト型一本鎖抗体遺伝子Ｃ末端リンカー配列の改変を行った。D4Sx5型テイルのヒト型一本鎖抗体遺伝子が組み込まれたpPIC9Kdel（特開２００１−３３３７８０参照）を鋳型にして、プライマーα-Factor-f及びVL-Lk-R、各1μＭを含むＰＣＲ反応液（Expand High Fidelity PCR システム、現ロッシュダイアグノスティクス社）５０μｌを作製し、９４℃２分処理後、[94℃ 30秒、50℃ 20秒、68℃ 10秒] の反応サイクルを３０回行った。
ＰＣＲ産物をNcoIで消化し、一本鎖抗体遺伝子断片を１％アガロースゲル電気泳動で分離精製した。
【００３５】
（２）ＤＮＡ断片1.3L-1の作製
プライマー1.3L-1f及び1.3L-1rを各５μＭ含むＰＣＲ反応液（Expand High Fidelity PCR システム、現ロッシュダイアグノスティクス社）５０μｌを作製し、９４℃２分処理後、[94℃ 30秒、50℃ 20秒、68℃ 10秒] の反応サイクルを３０回行い、下記配列を有する組換えＤＮＡ断片1.3L-1を得た。
1.3L-1配列：
CTACTTCCCATGGTTCTGGTAAATCTTCCGAAGGTACCCCGAAGAAAAGCATCAAAAAGACTCCTAAGAAGGTAAAGAAGCCAGCAACCGCTGCTGGGACCAAGAAAGTGGCCAAGAGTGCGAAAAAGGTGAAAACACCTCAGCCAAAAAAAGCTGCCA  [配列番号６６]
【００３６】
また、1.3L-1と同様に、プライマー、1.3L-2f、1.3L-2rを用いて下記配列を有する組換えＤＮＡ断片1.3L-2を得た。
1.3L-2配列：
GCGAAAAAGGTGAAAACACCTCAGCCAAAAAAAGCTGCCAAGAGTCCAGCTAAGGCCAAAGCCCCTAAGCCCAAGGCGGCCAAGCCTAAGTCGGGGAAGCCGAAGGTTACAAAGGCAAAGAAGGCAGCTCCGAAGAAAAAGAGTTGAGTTAACGAATTCGC  [配列番号６７]
【００３７】
ＤＮＡ断片1.3L-1および1.3L-2を含むＰＣＲ反応液２μｌずつ新規ＰＣＲ反応液５０μｌに混合し、プライマーcommon FおよびH1.3L-totalRを各１μＭ加え、９４℃２分処理後、[94℃ 30秒、50℃ 20秒、68℃ 20秒]の反応サイクルを３０回行った。
そして、ＰＣＲ産物1.3ＬをNcoIおよびEcoRIで消化し３％アガロースゲル電気泳動で分離精製した。
【００３８】
（３）改変型α-factorシグナル配列の作製
改変型α-factorシグナル配列は、pro1-fおよびpro1-r、pro2-fおよびpro2-rを用いたＰＣＲ反応産物を混合し、Pro/EcoRI-fおよびPro/AvrII-rを用いて改変型α-factorシグナル配列を増幅し、EcoRIで消化し３％アガロースゲル電気泳動で分離精製することにより、作製した。各段階の方法及び条件はＰＣＲ産物1.3Lの場合と同様であるので、詳細な説明は省略する。
【００３９】
（４）部分ヒストンH1テイル型イムノポーター遺伝子の作製
制限酵素処理済み一本鎖抗体遺伝子断片、ＰＣＲ産物1.3Lおよび改変型α-factorシグナル配列を等モル混同し、ライゲーションを行った。ライゲーション反応液をプライマー：α-Factor-fおよびPro/AvrII-r で同様に増幅し、XhoIおよびAvrIIで消化し３％アガロースゲル電気泳動で分離精製した。これを常法によりPPIC9Kdd（pPIC9Kよりneomycin耐性領域のXhoI切断部位およびHis4領域のNcoI切断部位をcttgagおよびccatagに置換したプラスミド：特開２００１−３３３７８０参照）のXhoI-AvrII部位に組み込み、クローン化して、塩基配列を確認した。このプラスミドをpPIC9Kdd-CaCH1.3Lproとした。
【００４０】
（５）２３アミノ酸残基ヒストンＨ１テイル型イムノポーター遺伝子（図３）及び２８アミノ酸残基ヒストンＨ１テイル型イムノポーター遺伝子（図４）の作製下記のプライマー、28a.a1st-Fおよび28a.a1st-Rを各５μＭ含むＰＣＲ反応液（Expand High Fidelity PCR システム、現ロッシュダイアグノスティクス社）５０μｌを作製し、９４℃２分処理後、[94℃ 30秒、50℃ 20秒、68℃ 10秒]のサイクルを３０回行い、下記のＤＮＡ断片28a.a1stを得た。このＤＮＡ断片28a.a1stを含む反応液２μｌおよび下記のプライマー、28a.a1st-F、28a.a2nd-R各１μＭを含むＰＣＲ反応液（Expand High Fidelity PCR システム）５０μｌを作製し、９４℃２分処理後、[94℃ 30秒、50℃ 20秒、68℃ 10秒] の反応サイクルを３０回行い、ＤＮＡ断片28a.a2ndを得た。
このＤＮＡ断片をNcoIで消化し３％アガロースゲル電気泳動で分離精製した。
【００４１】
制限酵素処理済み一本鎖抗体遺伝子断片（部分ヒストンＨ１テイル領域の作製時と同様に調製）および28a.a2nd配列を等モル混同し、ライゲーション反応を行った。反応液をプライマーα-Factor-fおよびFLAG/common R で同様に増幅し、XhoIおよびEcoRIで消化し１％アガロースゲル電気泳動で分離精製した。これを常法によりpPIC9Kdd-CaCH1.3LproのXhoI-EcoRI部位に組み込みクローン化して、塩基配列を確認した。このプラスミドをpPIC9Kdd-CaCH28aaとした。
【００４２】
同様に下記プライマー、23a.a1st-Fおよび23a.a1st-R、23a.a2nd-Rを利用し、DNA断片23a.a2ndを得た。その後も同様にa-Factor-fおよびFLAG/common R で増幅し、pPIC9Kdd-CaCH1.3Lproにクローニングして、プラスミドpPIC9Kdd-CaCH23aaを作製した。
【００４３】
表３  部分ヒストンＨ１テイル型イムノポーター遺伝子の作製に用いたＰＣＲプライマー（全て5'→3'）。大文字は、オリジナルの配列と同一の塩基、小文字は、リンカー、制限酵素部位導入、 及び変位導入等によりオリジナルの配列と異なる塩基を表す。
【００４４】
α-Factor-f：   TACTATTGCCAGCATTGCTGC  [配列番号６８]
VL-Lk-R：  aaccatgggaagtagaaccTTTGATGTCAACAGTGGTGC  [配列番号６９]
1.3L-1f:
CTACTTCCCATGGTTCTGGTAAATCTTCCGAAGGTACCCCGAAGAAAAGCATCAAAAAGACTCCTAAGAAGGTAAAGAAGCCAGCAACCGCTGCTG  [配列番号７０]
1.3L-1r:
TAAGAAGGTAAAGAAGCCAGCAACCGCTGCTGGGACCAAGAAAGTGGCCAAGAGTGCGAAAAAGGTGAAAACACCTCAGCCAAAAAAAGCTGCCA  [配列番号７１]
1.3L-2f:
GCGAAAAAGGTGAAAACACCTCAGCCAAAAAAAGCTGCCAAGAGTCCAGCTAAGGCCAAAGCCCCTAAGCCCAAGGCGGCCAAGCCTAAGTCGGGG  [配列番号７２]
1.3L-2r:
CCTAAGCCCAAGGCGGCCAAGCCTAAGTCGGGGAAGCCGAAGGTTACAAAGGCAAAGAAGGCAGCTCCGAAGAAAAAGAGTTGAGTTAACGAATTCGC  [配列番号７３]
common F：     ctacttcccatggTTCTGGTAAATCTTCCG  [配列番号７４]
H1.3L-totalR：  gcgaattcgttaactcaACTCTTTTTCTTCGGAGCT  [配列番号７５]
pro1-f:
CTAGtctaGAGGCTGAAGCTgcAccTgtTaaTacAacTacCgaGgaCgaaacTgcCcaaatCccAgcAgaagcAgtTatAggttaTAG  [配列番号７６]
pro1-r :
cAttGttAgtTGAAttACTGaaAggTaaGacTgcGacGtcAaaGtcGccttcCaaGtcACTAtaaccTatAacTgcttcTgcTggGatttg  [配列番号７７]
pro2-f:
gtCttAccTttCAGTaaTTCAacTaaCaaTggAttGttAttCatCaaCactacAatCgcTagTatCgctgcAaaGgaGgaaggTgtTtcA  [配列番号７８]
pro2-r:
ttccgcggccgctatggccgacGTCGACagcttcagcTtctctCttctcTagTgaAacAccttcCtcCttTgcagcGatActA  [配列番号７９]
Pro/EcoRI-f：
CCGGAATTCGAGGCTGAAGCTGCACCTGTTAATACAAC  [配列番号８０]
Pro/AvrII-r：
CACCTAGGTCAAGCTTCAGCTTCTCTCTTCTCTAGTGA  [配列番号８１]
改変型α-factorシグナル配列:
ccgGAATTCGAGGCTGAAGCTgcAccTgtTaaTacAacTacCgaGgaCgaaacTgcCcaaatCccAgcAgaagcAgtTatAggttaTAGTgaCttGgaaggCgaCttTgaCgtCgcAgtCttAccTttCAGTaaTTCAacTaaCaaTggAttGttAttCatCaaCactacAatCgcTagTatCgctgcAaaGgaGgaaggTgtTtcActAgagaaGagagaAgctgaagctTGACCTAGGtg  [配列番号８２]
28a.a1st-F: CTACTTCccatggTTCTGGTAAATCTTCCGAAGGTACCCCGAAGAAAAGCATCAAAAAGACTCCt  [配列番号８３]
28a.a1st-R:
GGCCACTTTCTTGGTCCcagcagcggttgctggcttctttaccttcttaGGAGTCTTTTTGATGC  [配列番号８４]
28a.a2nd-R:
ccgGAATTCcgTCATCAagagtcatctttataatcACTCTTGGCCACTTTCTTGGTCCc  [配列番号８５]
28a.a2nd配列： CTACTTCccatggTTCTGGTAAATCTTCCGAAGGTACCCCGAAGAAAAGCATCAAAAAGACTCCtaagaaggtaaagaagccagcaaccgctgctgGGACCAAGAAAGTGGCCAAGAGTgattataaagatgactctTGATGAcgGAATTCcgg  [配列番号８６]
23a.a1st-F:
CTACTTCccatggTTCTGGTAAATCTTCCGAAGGTACCCCGAAGAAAAGCATCAAAAAGACTCC  [配列番号８７]
23a.a1st-R:
AGACTTGGTCCcagcagcggttgctggcttctttaccttcttaGGAGTCTTTTTGATGC  [配列番号８８]
23a.a2nd-R:
ccgGAATTCcgTCATCAagagtcatctttataatcAGACTTGGTCCc  [配列番号８９]
FLAG/common R:ccgGAATTCcgTCATCAagagtc  [配列番号９０]
23a.a2nd配列：
CTACTTCccatggTTCTGGTAAATCTTCCGAAGGTACCCCGAAGAAAAGCATCAAAAAGACTCCtaagaaggtaaagaagccagcaaccgctgctgGGACCAAGTCTgattataaagatgactctTGATGAcgGAATTCcgg  [配列番号９１]
【００４５】
＝＝部分ヒストンＨ１テイル型イムノポーターの発現と調製＝＝
Pichia発現キット（InVitrogen社）を用い、 以下のように部分ヒストンＨ１テイル型イムノポーターを調製した。
上記のように作製した、部分ヒストンＨ１テイル型イムノポーターをコードするプラスミドを制限酵素BglIIで切断し、Pichia pastrisGS115株にエレクトロポレーション法によって導入し、最小培地で選択して形質転換株を得た。この形質転換株を、０．５％メタノールと０．５Ｍ NaClを含む液体培地で培養することにより、部分ヒストンＨ１テイル型イムノポーターの発現を誘導した。培地上清を２０ｍＭ Tris (ｐＨ７．５)-２５０ｍＭ NaClで３倍に希釈し、 部分ヒストンＨ１テイル型イムノポーターをイオン交換レジンDTREAMLINE-Sに吸着させ、同バッファーで洗浄後、 ２０ｍＭ Tris (pH 7.5)-１Ｍ NaClで溶出した。その後、部分ヒストンＨ１テイル型イムノポーターをＴＡＬＯＮレジン（クロンテック社）に再度吸着させ、今度は１００ｍＭ  EDTA (pH8.0) で溶出した。
【００４６】
濾過膜への吸着を防ぐため、溶出サンプルに1/9量の５Ｍ NaClを加え終濃度０．５Ｍ NaClになるように調整し、限外濾過濃縮（ultrafiltration）を行った。
【００４７】
レジンへの吸着を防ぐため、濃縮サンプルを、１Ｍ Arginine HCl-５％ Glycerolで平衡化したsuperdex75（ファルマシア社）のゲル濾過カラムで精製した。ゲル濾過で分画した各分画について、吸光度280nmを指標に各ピーク分画およびその前後数分画を１２％アクリルアミドゲルで ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、銀染色により目的のイムノポーターを含む分画を同定した。目的のイムノポーターを含む大きなピーク分画を３つ分取した。それぞれの分画を５０ｍＭ NaPO4−５００ｍＭ NaCl ｐＨ７．４に対して透析し、限外濾過濃縮を行った。
【００４８】
＝＝ 部分ヒストンＨ１テイル型イムノポーターによる遺伝子導入＝＝
平均分子量２５ｋＤのポリエチレンイミン（PEI:Aldrich社）４５ｍｇを１０ｍｌ 蒸留水に溶かし塩酸で中和し、フィルター滅菌を行い、１００ｍＭ溶液とした。遺伝子導入実験には、PEIを蒸留水で希釈して用いた。なお、１ｍＭ PEI ３μｌとＤＮＡ１μｇを混合したとき、（PEIの遊離アミノ基）／（核酸のリン酸基数）=N/P=１として計算した。遺伝子導入に用いるA431細胞は、実験前日に２４ウェルプレートを用いて約６０％コンフルエント（confluent）になるように播き、翌日実験に用いた。
【００４９】
ルシフェラーゼ発現ベクターpSRD-GL3の０．２５μｇとイムノポーター１μｇ（約５μｌ）を混合し、総量５０μｌになるように蒸留水で希釈し、室温で３０分放置した。その後、１ｍＭ PEIをそれぞれのN/P比になるように添加し、素早く混合し、さらに室温で３０分放置した。複合体溶液全量を１ｍｌの１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地が入った各ウェルに添加し、５％ＣＯ２存在下３７℃で培養し、遺伝子導入を行った。
【００５０】
２４時間後、ルシフェラーゼ活性を、ルシフェラーゼアッセイシステム（プロメガ社）およびルミノメーターMicroLumat Plus LB96V（Berthold社）を用いて測定した。各条件に対し、３〜４ウェルで実験を行い、平均値および標準偏差を計算した。
【００５１】
結果を図５及び図６に示す。
図５では、イムノポーターとして、部分ヒストンＨ１テイル型イムノポーターを用いた実験結果を示す。コントロールとしては、 イムノポーターのない条件で実験を行った。N/Pが大きくなるほど、細胞などに対する非特異的吸着性が大きくなり、遺伝子導入の標的細胞特異性が低下するので、N/Pは小さい方がよい。しかし、N/Pが小さくなるほど、細胞への遺伝子導入効率自体は低下する。従来、例えばペプチドテイルとして（AspAspAspAspSer）５を有するD4Sx5テイル型イムノポーター（以下CaCD20）では、N/P＝１０〜２０以上でしか十分な量（この例では１０５レベル以上）の遺伝子導入が観察されなかったのに対し、本実施例では、 N/P＝８のところで、１０５レベルの遺伝子導入が観察された。
【００５２】
図６では、２３アミノ酸残基ヒストンＨ１テイル型イムノポーター及び２８アミノ酸残基ヒストンＨ１テイル型イムノポーターを用いた実験結果を示す。コントロールには、従来型のCaCD20を用いた。N/P=３及び５においても１０５レベル以上の優れた遺伝子導入効率を示した。これは、本発明による核酸輸送効率がかなり高いことを示す。
【００５３】
【発明の効果】
本発明は、組換えイムノジーン法において、核酸輸送効率の高いシステムを提供することを目的とする。
【００５４】
【配列表】
0004521519.tif 000002
0004521519.tif 000003
0004521519.tif 000004
0004521519.tif 000005
0004521519.tif 000006
0004521519.tif 000007
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0004521519.tif 000065
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施例におけるヒト型一本鎖抗体ＣａＣをコードする組換えＤＮＡの塩基配列（配列番号９２）とＣａＣのアミノ酸配列（配列番号９３）を示す図である。
【図２】本発明の一実施例における部分ヒストンＨ１テイル型イムノポーターをコードする組換えＤＮＡの塩基配列（配列番号９４）とイムノポーターのアミノ酸配列（配列番号９５）を示す図である。
【図３】本発明の一実施例における２３アミノ酸残基ヒストンＨ１テイル型イムノポーター遺伝子をコードする組換えＤＮＡの塩基配列（配列番号９６）とイムノポーターのアミノ酸配列（配列番号９７）を示す図である。
【図４】本発明の一実施例における２８アミノ酸残基ヒストンＨ１テイル型イムノポーター遺伝子をコードする組換えＤＮＡの塩基配列（配列番号９８）とイムノポーターのアミノ酸配列（配列番号９９）を示す図である。
【図５】 本発明の一実施例における部分ヒストンＨ１テイル型イムノポーターを用いた遺伝子導入実験の結果を示すグラフである。ｙ軸は、単位量あたりのルシフェラーゼ活性測定値を示す。をＨ３Ｌ−の後の数字はゲル濾過におけるピーク分画を表し、第１の分画では遺伝子導入が観察されていないが、この分画は処理中に幾分か分解された分画であると思われる。
【図６】本発明の一実施例における２３アミノ酸残基及び２８アミノ酸残基ヒストンＨ１テイル型イムノポーターを用いた遺伝子導入実験の結果を示すグラフである。ｙ軸は、図５と同じ単位量あたりのルシフェラーゼ活性測定値を示す。本図でも、図５と同様、最後の数字はゲル濾過におけるピーク分画を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
0004521519.tif 000068
【図４】
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【図５】
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【図６】
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