(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
未熟なヒト造血幹細胞を認識し、ＣＤ３４+Ｊｕｒｋａｔ細胞を認識しないことを特徴とする、受託番号がＦＥＲＭ  Ｐ−１７７８９であるハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体。
【請求項２】
マウスモノクローナル抗体である請求項１記載の抗体。
【請求項３】
蛍光標識、放射性同位元素標識又は酵素標識されている請求項１又は２記載の抗体。
【請求項４】
請求項１、２又は３記載の抗体が結合してなることを特徴とする固体支持体。
【請求項５】
請求項１又は２記載の抗体の免疫反応性フラグメント。
【請求項６】
蛍光標識、放射性同位元素標識又は酵素標識されている請求項５記載の免疫反応性フラグメント。
【請求項７】
請求項５又は６記載の免疫反応性フラグメントが結合してなることを特徴とする固体支持体。
【請求項８】
未熟なヒト造血幹細胞を認識し、ＣＤ３４+Ｊｕｒｋａｔ細胞を認識しないモノクローナル抗体を産生することを特徴とする、受託番号がＦＥＲＭ  Ｐ−１７７８９であるハイブリドーマ。
【請求項９】
急性骨髄性白血病患者由来ヒト骨髄芽球様細胞であるＫＧ−１細胞で免疫した哺乳動物の抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させて得られることを特徴とする請求項８記載のハイブリドーマ。
【請求項１０】
請求項１若しくは２記載の抗体又は請求項５記載の免疫反応性フラグメントを用いることを特徴とする、ヒト骨髄細胞、臍帯血及び顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）処理でヒト造血幹細胞を大量に動員させた血液中から未熟な造血幹細胞を分離精製する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＣＤ３４陽性（ＣＤ３４+；以下ＣＤ抗原の陽性の記載は同様にして表記する）造血幹細胞に存在し、分子量が約１１０ｘ１０3のタンパク質である新規なＨＳＣＡ−３抗原、並びに、この抗原を識別するモノクローナル抗体ＨＳＣＡ−３（以下、ＨＳＣＡ−３抗体と称する）に関する。本発明のＨＳＣＡ−３抗体は、１）抗体の標識によりイムノアッセイ、フローサイトメトリーへの利用、２）ヒト骨髄細胞、臍帯血およびＧ−ＣＳＦ処理でヒト造血幹細胞を大量に動員させた血液中からの未熟な造血幹細胞の分離精製に活用できる。
【０００２】
【従来の技術】
ヒト造血幹細胞及び造血前駆細胞の表面抗原マーカーとして、ＣＤ３４分子が知られている（アメリカ特許第４７１４６８０号）。ＣＤ３４分子はヒト骨髄の未分化細胞に発現している細胞表面抗原であり、純化したＣＤ３４+細胞の移植によって、すべての系統の血液系細胞の速やかな再構築が得られること、ＣＤ３４+細胞比率と造血幹細胞の同定に最もよく用いられているコロニーアッセイ法（奈良信雄、血液病学第２版、文光堂（１９９５）ｐｐ．１５５８）の成績とがよく相関することから、ＣＤ３４+細胞分画に造血幹細胞が存在すると考えられている。ＣＤ３４分子は造血前駆細胞において、最も早期のマーカータンパク質である。ＣＤ３４分子はＩ型細胞膜貫通型細胞表面糖タンパク質で、分子量１０５×１０3〜１２０×１０3である。ＣＤ３４分子と同様なヒト造血幹細胞の表面抗原マーカーとして、ＡＣ１３３分子も知られている（アメリカ特許第５８４３６３３号）。ＡＣ１３３分子に対する抗体は、ＣＤ３４+細胞の２０〜６０％に反応し、未分化なＣＤ３４+細胞のすべてに反応するとされている。これは、５回細胞膜貫通型細胞表面糖タンパク質で、分子量１１７×１０3である。また、ＣＤ９０分子もヒト造血幹細胞の表面抗原マーカーとして知られている（アメリカ特許第５０６１６２０号）。ヒト造血幹細胞の表面抗原マーカーとして知られているタンパク質は以上のものが主なもので、知られているものは数少ない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、未熟な造血幹細胞に存在する新規なＨＳＣＡ−３抗原、並びに、この抗原を識別するモノクローナル抗体を、１）抗体の標識によりイムノアッセイ、フローサイトメトリーへの利用、２）ヒト骨髄細胞、臍帯血およびＧ−ＣＳＦ処理でヒト造血幹細胞を大量に動員させた血液中からの未熟な造血幹細胞の分離精製に活用することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ＫＧ−１細胞をＢＡＬＢ／ｃマウスに免疫することにより調製したモノクローナル抗体が、新規なＨＳＣＡ−３抗原を識別することを見い出し、上記目的を達成すべく鋭意検討を重ねた結果、本抗体が、上記目的を満たし得るものであることを確認し、本発明を完成するに至った。
【０００５】
すなわち、本発明は、未熟なヒト造血幹細胞を認識し、ＣＤ３４+Ｊｕｒｋａｔ細胞を認識しないモノクローナル抗体又は免疫反応性フラグメントである。また、これらモノクローナル抗体又は免疫反応性フラグメントが結合してなる固体支持体でもある。
【０００６】
また、本発明は、未熟なヒト造血幹細胞を認識し、ＣＤ３４+Ｊｕｒｋａｔ細胞を認識しないモノクローナル抗体を産生することを特徴とするハイブリドーマ、又は、急性骨髄性白血病患者由来ヒト骨髄芽球様細胞であるＫＧ−１細胞で免疫した哺乳動物の抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させて得られることを特徴とするハイブリドーマでもある。
【０００７】
さらに、本発明は、分子量が約１１０×１０3のタンパク質であり、ＣＤ３４+造血幹細胞に存在するＨＳＣＡ−３抗原でもある。
さらにまた、本発明は、蛍光標識、放射性同位元素標識又は酵素標識によるイムノアッセイ又はフローサイトメトリーにおいて、上記抗体又は上記免疫反応性フラグメントを用いて、上記抗原を測定する方法でもある。
さらにまた、本発明は、上記抗体又は上記免疫反応性フラグメントを用いて、ヒト骨髄細胞、臍帯血およびＧ−ＣＳＦ処理でヒト造血幹細胞を大量に動員させた血液中からの未熟な造血幹細胞を分離精製する方法でもある。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を詳述する。
【０００９】
本発明においては、特に記載のない限り、当該分野で公知であるモノクローナル抗体の作製及び分析方法が採用される。
【００１０】
以下に、本発明を説明する上で用いられる用語を説明する。
「ＨＳＣＡ−３抗原」とは、ヒト造血幹細胞に存在し、分子量が約１１０×１０3のタンパク質である新規な抗原である。
【００１１】
また、「ＨＳＣＡ−３抗体」とは、上記ＨＳＣＡ−３抗原を識別するモノクローナル抗体である。ＨＳＣＡ−３抗体は、急性骨髄性白血病患者由来ヒト骨髄芽球様細胞であるＫＧ−１細胞で免疫された哺乳動物の脾臓細胞とミエローマ細胞とを融合して得られるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体である。
【００１２】
「造血幹細胞」とは、赤血球、白血球、巨核球などの細胞のみならず、Ｔ細胞、Ｂ細胞などのリンパ系を含めた全ての血液系細胞への分化能を有する多能性の細胞であって、かつ、自己増殖可能な細胞をいう。造血幹細胞は、ＣＤ３４抗原が陽性でかつＣＤ３８抗原が陰性である（ＣＤ３４+ＣＤ３８-；以下ＣＤ抗原の陽性、陰性の記載は同様にして表記する）ことにより特徴付けられる。
【００１３】
以下、さらに本発明の詳細について説明する。
本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、ＫＧ−１細胞を感作抗原として使用して、基本的には、これを通常の免疫法を応用して免疫し、通常の細胞融合法を応用して細胞融合させ、通常のクローン化法を応用して、クローン化することによって作製することができる。
【００１４】
より具体的には、ＫＧ−１細胞を感作抗原として使用して、被免疫哺乳動物として、ヒト以外のマウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリなどの腹腔内、皮下、フットパッドなどに投与する。細胞融合相手となるミエローマ細胞が、通常はマウス由来のものであるため、特にマウスを免疫することが好ましい。免疫は、一般的な方法により、例えば、前記ＫＧ−１細胞をＰＢＳ（−）（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ、ｐＨ７．２）や生理食塩水などで適当量に希釈、懸濁したものを、動物に毎週、１〜３ヶ月投与することが好ましい。
【００１５】
被免疫動物から、脾臓細胞、リンパ球、末梢血などの抗体産生細胞を採取し、これらと腫瘍細胞株であるミエローマ細胞とを細胞融合させてハイブリドーマを作製する。抗体産生細胞としては、上記ＫＧ−１細胞を最終投与後に摘出した脾臓細胞を使用するのが好ましい。ミエローマ細胞としては、公知の細胞株、例えば、Ｐ３−ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１細胞（略称ＮＳ−１細胞）（ケーラーら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、６：５１１（１９７６））、ＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（略称ＳＰ２細胞）（シュルマンら、Ｎａｔｕｒｅ、２７６：２６９（１９７８））、ＦＯ細胞（デサントグロスら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．、３５：１（１９８０））などがよく用いられる。ハイブリドーマの培養上清から目的の抗体の取得を容易にするために、ミエローマ細胞としての固有の免疫グロブリンを分泌しない株を使用することが望ましい。この点で、ＮＳ−１細胞が望ましい。
【００１６】
抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、基本的には、通常の方法、例えば世界で最初に実施したケーラーとミルシュタインの方法（ケーラーら、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５（１９７５））に準じて行うことができる。
【００１７】
より具体的には、細胞融合促進剤の存在下に、通常の栄養培地中で実施される。細胞融合促進剤としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルスなどが用いられる。細胞融合は、抗体産生細胞とミエローマ細胞との所定量を、例えばミエローマ細胞に対して抗体産生細胞を約１〜１０倍程度用いて行われる。細胞融合時の培地としては、ミエローマ細胞の増殖に適した培地、例えばＲＰＭＩ  １６４０培地、が例示できる。このような培地中で両細胞を混合し、３７℃に保ったポリエチレングリコール（例えば、平均分子量１，０００〜６，０００のもの）溶液を培地に３０〜６０％（Ｗ／Ｖ）の濃度で添加し、混合することで細胞融合を開始する。さらに、適当な培地を添加し、遠心分離による上清の除去を繰り返すことにより、目的とするハイブリドーマが得られる。
【００１８】
このハイブリドーマは、通常の選択培地、例えば、ヒポキサンチン（Ｈ）、アミノプテリン（Ａ）及びチミジン（Ｔ）を含有するＨＡＴ培地で培養することにより選択される。ＨＡＴ培地では、目的のハイブリドーマ以外の細胞が死滅するまで数日間〜数週間培養する。ハイブリドーマのコロニーが確認できるようになったら、その培養上清中の抗体をスクリーニングする。培養上清中の抗体のスクリーニングは、例えば、固定した細胞を抗原とするエライザ（ＥＬＩＳＡ）法により培養上清中の抗体活性を測定することにより実施できる（安東民衛ら、単クローン抗体実験操作入門、講談社サイエンティフィック（１９９３）ｐｐ．１２６）。これによりスクリーニングした目的の抗体を産生するハイブリドーマは、常法により限界希釈法を繰り返すことにより、最終的に単一のハイブリドーマクローンからなるコロニーとして得ることができる。
【００１９】
こうして得られる本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常のハイブリドーマと同様に、公知の培地、例えば、ＲＰＭＩ  １６４０や、ダルベッコ改変培地で、培養、継代できる。また、液体窒素中で長期間保存することもできる。
【００２０】
本発明のハイブリドーマを大量に１５％牛胎児血清（ＦＣＳ）−ＲＰＭＩ  １６４０培地で培養することにより、本発明のモノクローナル抗体を培養上清から調製することもできる。また、マウスの腹腔にハイブリドーマを注射して生じた腹水から、本発明のモノクローナル抗体を調製することもできる。
【００２１】
こうして調製したモノクローナル抗体は、通常の抗体の精製方法によって精製してもよい。抗体の精製方法としては、硫酸アンモニウムなどによる塩析、ジエチルアミノエステル（ＤＥＡＥ）誘導体及びカルボキシメチル（ＣＭ）誘導体などを用いたイオン交換クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、プロテインＡ又はプロテインＧを用いたアフィニティークロマトグラフィーなどの方法があり、これらの方法を組み合わせて精製することができる。
【００２２】
上記のようにして得られる本発明のモノクローナル抗体の免疫グロブリンクラスは、特に限定されるものではないが、免疫グロブリン（以下Ｉｇと表記する）Ｇ１、カッパ鎖が例示される。
【００２３】
また、本発明のモノクローナル抗体を、抗原結合部位（Ｆａｂ）を分解しないタンパク質分解酵素、例えば、パパイン、ペプシンなどで消化し、さらに、タンパク質の単離精製を常法により行い得られた、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ′）2などの、抗体の免疫反応性フラグメントであっても、本発明のモノクローナル抗体と同様の性質を保持する限り、本発明のモノクローナル抗体と同様に使用することができる。
【００２４】
本発明のモノクローナル抗体を抗原と反応させた後、さらに２次抗体として、フルオレッセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）などの蛍光標識物質、125Ｉなどの放射性同位元素、又は、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼなどの酵素によって標識した免疫グロブリンを反応させることにより、抗原を検出することができる。また、本発明のモノクローナル抗体そのものを、ＦＩＴＣなどの蛍光標識物質、125Ｉなどの放射性同位元素、又は、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼなどの酵素によって標識することにより、抗原を検出することもできる。
【００２５】
また、本発明のモノクローナル抗体を固体支持体（例えば、プロテインＡ若しくはプロテインＧを固定化したセファロースやアガロースなどの樹脂、又は、臭化シアン活性化セファロースやアガロースなどの樹脂）に固定化することにより、細胞分離用カラムを作製することができる。このカラムへ、ヒト骨髄細胞、臍帯血およびＧ−ＣＳＦ処理でヒト造血幹細胞を大量に動員させた血液を流してやると、未熟な造血幹細胞はカラムに吸着したままになるので、他の細胞と分離することができる。
【００２６】
【実施例】
以下、本発明におけるＨＳＣＡ−３抗原及びこの抗原を識別するモノクローナル抗体についてさらに具体的に説明する。本発明は以下の実施例によって限定されるものではない。
（実施例１：ＨＳＣＡ−３抗体産生ハイブリドーマの調製、及び、ＨＳＣＡ−３抗体の産生）
（ａ）感作抗原
感作抗原として、急性骨髄性白血病患者由来ヒト骨髄芽球様細胞であるＫＧ−１細胞（ＪＣＲＢ細胞バンク）を用いた。ＫＧ−１細胞を、１．０×１０5／ｍｌの濃度になるように、１５％牛胎児血清（ＦＣＳ）−ＲＰＭＩ  １６４０培地（株式会社日研生物医学研究所製）１５ｍｌに懸濁し、カルチャーディッシュ（グライナー社製）（直径１０ｃｍ）に入れ、５％ＣＯ2インキュベーターで、３７℃で培養を行った。培養４〜５日目に、細胞を４℃、２４０Ｇで１０分間遠心分離して回収し、ＰＢＳ（−）（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ，ｐＨ７．２；株式会社日研生物医学研究所製）で２回洗浄後、１．０×１０7個の細胞を２００μｌのＰＢＳ（−）に懸濁し、これを感作抗原として用いた。
【００２７】
（ｂ）免疫
免疫するマウスは、ＢＡＬＢ／ｃのメス（８週齢）を用いた。上述のＫＧ−１細胞を感作抗原とし、マウスに皮下注射した。以後、同様の細胞（１．０×１０7個）を７日目、１４日目、２１日目、２９日目、５４日目、６１日目、６８日目、７４日目、８５日目、そして９２日目に皮下注射し、最終免疫として、９６日目に同様の細胞（１．０×１０7個）を腹腔内に注射した。
【００２８】
（ｃ）ハイブリドーマの調製
最終免疫から４日後すなわち最初の免疫から１００日目に、マウスから脾臓を摘出し、ＰＢＳ（−）を入れたディッシュに入れ、スライドグラス２枚のすりガラス部分を用いて、脾臓をつぶし、脾臓細胞を回収した。細胞をチューブに入れ、４℃、２４０Ｇで１０分間遠心分離し、上清を捨てた。
【００２９】
これに対し、融合相手のＸ６３細胞由来の骨髄腫細胞であるＮＳ−１細胞を、以下のように調製した。ＮＳ−１細胞を、１．０×１０5／ｍｌの濃度になるようにし、１５％牛胎児血清（ＦＣＳ）−ＲＰＭＩ  １６４０培地１５ｍｌに懸濁し、カルチャーディッシュ（直径１０ｃｍ）に入れ、５％ＣＯ2インキュベーター中、３７℃で培養を行った。培養４〜５日目に細胞を、４℃、２４０Ｇで１０分間遠心分離して回収した。次に、脾臓細胞およびＮＳ−１細胞を、それぞれＲＰＭＩ  １６４０培地３０ｍｌで３回洗浄した後、脾臓細胞（合計２．８９×１０8個）およびＮＳ−１細胞（合計８．０７×１０7個）を混合した。ＲＰＭＩ  １６４０培地を加え、１０ｍｌにし、ガラスチューブに入れ、４℃、３００Ｇで１０分間遠心分離し、上清を除去した。ＰＥＧ溶液［ポリエチレングリコール４，０００をＰＢＳ（−）に溶解して５０％にしたもの（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）１ｍｌ＋ジメチルスルフォキシド０．１ｍｌ＋ＲＰＭＩ  １６４０培地０．１ｍｌ］１ｍｌをガラスチューブに１分間かけて加え、１分間攪拌し、次にＲＰＭＩ  １６４０培地１ｍｌを１分間の間に加え、さらに、ＲＰＭＩ  １６４０培地１ｍｌを１分間かけて加え、最後に、ＲＰＭＩ  １６４０培地７ｍｌを３分間かけて加え、１５０Ｇ、１０分間室温で遠心分離し、上清を完全に除去した。
【００３０】
こうして得られたペレットをほぐして、１５％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ  １６４０培地を適量入れて、細胞濃度を１×１０7個／ｍｌにした。この細胞を９６ウェル平底プレート（コーニング社製）に、１００μｌ／ウェルまいた。その翌日に、５０倍濃縮ヒポキサンチン＋アミノプテリン＋チミジン（ＨＡＴ）溶液（大日本製薬社製）を１５％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ  １６４０培地で希釈して２％にしたもの（ＨＡＴ２％溶液）を、１００μｌ／ウェル加え、さらにその翌日、そのうち１００μｌを上記のＨＡＴ２％溶液１００μｌに交換した。同様にして、細胞融合の日から、３、５、８、１１、１４日目にウェル中の１００μｌを上記のＨＡＴ２％溶液１００μｌに交換した。次に、下記のエライザ（ＥＬＩＳＡ）法により培養上清中の抗体活性を測定した。
【００３１】
（ｄ）エライザ法を用いた抗体アッセイ
以下に示すポリ−Ｌ−リジン処理エライザ用９６ウェルプレートを準備した。エライザ用９６ウェルプレートとしてＥＩＡ／ＲＩＡ高結合型平底プレート（コースター社製）を用い、ポリ−Ｌ−リジン溶液（５０μｇ／ｍｌ）５０μｌを、プレートの各ウェルに入れた。プレートミキサーで攪拌後、室温で５〜３０分間放置し、ポリ−Ｌ−リジン溶液を吸引除去した。さらに、洗浄のために、滅菌超純水１００μｌをプレートの各ウェルに入れ、吸引除去した。この洗浄操作はさらに２回繰り返し、クリーンベンチ内にプレートを放置して乾燥させた。こうしてポリ−Ｌ−リジン処理エライザ用９６ウェルプレートを準備した。次に、免疫原に用いたＫＧ−１細胞（４．８×１０6個／９６ウェルプレート）を、アールの緩衝塩類溶液（ＥＢＳＳ）（株式会社日研生物医学研究所製）で、３回洗浄し、ＰＢＳ（−）で、１×１０6個／ｍｌの細胞濃度として、上記のプレートの各ウェルに、５０μｌずつ分注した。室温で１５分間放置して、細胞が底面に接着するのを待ち、９０Ｇで遠心分離した。上清を吸引除去後、０．０５％のグルタルアルデヒド−ＰＢＳ（−）５０μｌずつ静かに各ウェルに入れ、室温で３分間放置した後、ＰＢＳ（−）１００μｌを各ウェルに入れ、吸引除去した。さらに、ＰＢＳ（−）で３回洗浄後、ブロッキング溶液（０．２％ゼラチン、０．１％ＢＳＡ、１００ｍＭグリシン、０．１％アジ化ナトリウム添加ＰＢＳ（−））１００μｌを各ウェルに入れ、吸引除去した。もう一度、ブロッキング溶液１００μｌを各ウェルに入れ、室温で１時間静置した後、吸引除去し、ハイブリドーマの培養上清１００μｌを各ウェルに入れ、室温で２時間以上反応させた。ウェルを０．１％ゼラチン添加ＰＢＳ（−）−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０溶液１５０μｌで、３回洗浄した。
【００３２】
次に、１，５００倍希釈したヤギＩｇＧ抗体（マウスＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭに対する抗体；カッぺル社製）１００μｌを各ウェルに入れ、室温で１時間以上反応させた。ここでウェルを０．１％ゼラチン添加ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０溶液１５０μｌで、３回洗浄した。オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）−過酸化水素溶液（０．３％ＯＰＤ、０．０２％過酸化水素を０．０５Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）に溶解したもの）１００μｌを各ウェルに入れ、室温で１０分間放置し、発色を確認後、１Ｎ硫酸−２ｍＭアジ化ナトリウム溶液１００μｌをさらにウェルに加え、攪拌した。最後に、４９２ｎｍの波長の吸光度（ＯＤ４９２）をプレートリーダー（大日本製薬社製）で読み、発色色素量を測定し、抗体の活性を判定した。本実験の陽性対照として、ＫＧ−１細胞を免疫したマウスの脾臓細胞採取前の血清をＰＢＳ（−）で５００倍希釈した溶液を用い、陰性対照として、通常のマウスの血清をＰＢＳ（−）で５００倍希釈した溶液を用いた。ＨＳＣＡ−３抗体の培養上清のＯＤ４９２は、０．１９５、陰性対照のＯＤ４９２は０．０１９、陽性対照のＯＤ４９２は０．４５３であった。
【００３３】
（ｅ）シングルセルクローニング
上記実施例１（ｄ）で得られたＫＧ−１細胞結合活性を有するモノクローナル抗体ＨＳＣＡ−３を、限界希釈法によりシングルセルクローニングした。すなわち、ハイブリドーマが、１個／ウェルとなるように、クローニング培地［１５％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ  １６４０培地に５％（ｗ／ｗ）の濃度になるようにブライクローン（大日本製薬社製）を添加したもの］に懸濁し、その懸濁液を１００μｌずつ、胸腺細胞をフィーダー細胞としてまいた９６ウェル平底プレート（コーニング社製）に分注して、３７℃、５％ＣＯ2存在下で培養した。フィーダー細胞の調製の仕方は、以下のようにした。ＢＡＬＢ／ｃマウスから、胸腺を摘出し、ピペッティングで細胞をばらばらにして、ヒポキサンチン／チミジン（ＨＴ）を含む、１５％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ  １６４０培地に懸濁した。その細胞濃度を５×１０6個／ｍｌに合わせ、１００μｌずつ各ウェルに分注した。約２週間後に、ウェル当たり、1個のハイブリドーマが生育している培養上清を１００μｌ回収して、抗体活性の有無を上記（ｄ）エライザ法を用いた抗体アッセイにて調べた。こうして陽性クローンに対して、上記と同様のシングルセルクローニングを合計５回行い、抗体産生が安定でかつ完全にＨＳＣＡ−３抗体を産生しているハイブリドーマクローンを得た。このＨＳＣＡ−３抗体産生ハイブリドーマは、Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ＨＳＣＡ−３として、独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センターに寄託した。受託番号は、ＦＥＲＭ Ｐ−１７７８９である。
（ｆ）ＨＳＣＡ−３抗体の大量調製と精製
ＨＳＣＡ−３抗体を大量調製するために、ハイブリドーマをマウス腹腔に注射して、ＨＳＣＡ−３抗体を大量に含む腹水を調製した。すなわち、ＢＡＬＢ／ｃマウスに１×１０7個／ＰＢＳ（−）１ｍｌのＨＳＣＡ−３ハイブリドーマを腹腔内に注射し、１〜２週間でマウスの腹部が肥大し、腹水が最大に達した頃に、腹水１０．０ｍｌを採取した。これに等量のＰＢＳ（−）１０．０ｍｌを加えた後、さらに等量のＳＡＳ溶液（７５ｇの硫酸アンモニウムを１００ｍｌの純水に５０℃に温めて溶かし、４℃に１晩放置して、過剰の硫酸アンモニウムを沈殿除去して、上清を使用した）２０．０ｍｌを添加、氷中３０〜６０分放置した。８、０００Ｇ、１０分間、４℃で遠心分離後、沈殿にＰＢＳ（−）４．０ｍｌを加え懸濁し、ＳＡＳ溶液１ｍｌも加え、氷中３０〜６０分放置した。８、０００Ｇ、１０分間、４℃で遠心分離した後、上清にＳＡＳ溶液２．５５ｍｌ加え（３３％飽和）、氷中３０〜６０分放置した。８、０００Ｇ、１０分間、４℃で遠心分離した後、沈殿を回収し、ＰＢＳ（−）４．０ｍｌに溶解した。さらに、４℃にて、３ＬのＰＢＳ（−）に対して透析した。この硫安分画法で精製した４６．６ｍｇ（溶液で４ｍｌ）の中、約１０ｍｇを使用して、プロテインＧセファロース（アマシャムファルマシアバイオテク社製）２ｍｌで、さらに精製した。プロテインＧセファロースカラムをバインディングバッファー（ＭＡＰＳＩＩキット；日本バイオラッドラボラトリーズ社製）１０ｍｌで平衡化した後、抗体サンプルをカラムにアプライし、３０ｍｌバインディングバッファーで洗浄した。カラムからの溶出は、０．２Ｍグリシン／ＨＣｌ（ｐＨ２．２）１０ｍｌで行った。クーマシーブリリアントブルー法のキット（日本バイオラッドラボラトリーズ社製）で回収した抗体溶液のタンパク質濃度を測定すると、０．３５ｍｇ／ｍｌで、合計２．８ｍｇであった。
【００３４】
（実施例２：抗体のサブクラスの決定）
エライザ法により、ＨＳＣＡ−３抗体の免疫グロブリンクラス及びサブクラスを決定した。そのために、マウスハイブリドーマサブタイピングキット（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を用いた。抗マウス免疫グロブリン（ヒツジ由来）をコーティング緩衝液（５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液／０．０１％アジ化ナトリウム（ｐＨ９．４−９．７））で５００倍に希釈し、９６平底プレートウェル当たり、５０μｌを入れ、３７℃で、３０分間放置し、洗浄溶液（０．９％塩化ナトリウム／０．１％ツイーン２０）２００μｌ／ウェルで、２回洗浄した。後コーティング緩衝液（ゼラチンの分解により得られたペプチドをトリス塩酸緩衝液と塩化ナトリウムで溶解したもの）２００μｌ／ウェルで、３７℃で、１５分間放置後、洗浄溶液２００μｌ／ウェルで、２回洗浄した。次に、ＨＳＣＡ−３抗体の培養上清を５０μｌ／ウェルアプライし、３７℃で３０分間放置後、洗浄溶液２００μｌ／ウェルで２回洗浄した。さらに、サブクラス特異的抗マウス免疫グロブリン−ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）コンジュゲート（抗マウスＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ラムダ鎖及びカッパ鎖）を１０倍希釈して、５０μｌ／ウェルアプライし、３７℃で、３０分間放置した後、洗浄溶液２００μｌ／ウェルで、２回洗浄した。基質溶液［２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）タブレット１個を５ｍｌの基質緩衝液（過ほう酸塩をクエン酸／リン酸ナトリウム緩衝液に溶解）に溶解した］１００μｌ／ウェルアプライし、室温で、３０分以内反応させた。陽性対照サンプル（抗マウスＩｇＧ１）が濃い緑色を呈したら、４ｍＭアジ化ナトリウム溶液１００μｌ／ウェル加えて、反応を停止させた。プレート各ウェルの４０５ｎｍの吸光度を分光光度計（Ｕ２０００；日立製作所製）で測定した。
【００３５】
結果は、陽性対照サンプル（ＩｇＧ１、カッパ鎖）の抗マウスＩｇＧでの４０５ｎｍの吸光度は１．４２２、抗マウスＩｇＧ１では２．５２５、抗マウスＩｇＧ２ａでは０．０８７、抗マウスＩｇＧ２ｂでは０．０４９、抗マウスＩｇＧ３では０．０６３、抗マウスＩｇＭでは０．０６４、抗マウスＩｇＡでは０．０５７、ラムダ鎖では０．０７７、カッパ鎖では０．５７２であった。それに対して、陰性対照サンプルの抗マウスＩｇＧでの４０５ｎｍの吸光度は０．１０９、抗マウスＩｇＧ１では０．１２６、抗マウスＩｇＧ２ａでは０．０９３、抗マウスＩｇＧ２ｂでは０．０５２、抗マウスＩｇＧ３では０．０６０、抗マウスＩｇＭでは０．０７９、抗マウスＩｇＡでは０．０６１、ラムダ鎖では０．０５８、カッパ鎖では０．１２２であった。ＨＳＣＡ−３抗体の抗マウスＩｇＧでの４０５ｎｍの吸光度は１．７３７、抗マウスＩｇＧ１では２．５５０、抗マウスＩｇＧ２ａでは０．０８６、抗マウスＩｇＧ２ｂでは０．０４７、抗マウスＩｇＧ３では０．０５６、抗マウスＩｇＭでは０．０６５、抗マウスＩｇＡでは０．０５７、ラムダ鎖では０．０５９、カッパ鎖では０．３２５であった。すなわち、ＨＳＣＡ−３抗体の免疫グロブリンクラス及びサブクラスは、ＩｇＧ１であり、軽鎖（Ｌ鎖）のタイプは、カッパ鎖であった。
【００３６】
（実施例３：ＨＳＣＡ−３抗体反応抗原の免疫沈降による解析）
１５％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ  １６４０培地で培養した、対数増殖期にあるＫＧ−１細胞を５．０×１０7個集めて、ＰＢＳ（−）で３回洗浄した。１５ｍｌポリプロピレン製チューブ（ファルコン社製）に細胞のペレットを集め、そこに１５０μｌＰＢＳ（−）を入れ、懸濁し、氷上に放置した。これは使用前に３０℃のインキュベーターで、３０℃にした。これに、ラクトペルオキシダーゼ（シグマ社製；ＰＢＳ（−）に溶解して、２ｍｇ／ｍｌにした）５０μｌと、０．５Ｍリン酸緩衝液（０．５Ｍリン酸二水素ナトリウム溶液１．９５ｍｌに対して、０．５Ｍリン酸水素二ナトリウム約３〜４ｍｌを加え、ｐＨ７．０にした）１０μｌを入れ、さらに、ヨウ化ナトリウム−１２５（ＮＥＮ社製；低ｐＨ、全２ｍＣｉ）約１ｍＣｉ分を入れ、速やかに、過酸化水素水（３０％過酸化水素水をＰＢＳ（−）で１、０００倍希釈した）２０μｌを加え、混合し、３０℃で、４分間インキュベーションした。そこに再度、過酸化水素水（３０％過酸化水素水をＰＢＳ（−）で１、０００倍希釈した）２０μｌを加え、混合し、室温で、１０分間放置した。次に、４℃に冷やした洗浄緩衝液（０．０２％アジ化ナトリウム／２ｍＭヨウ化カリウム／ＰＢＳ（−））５ｍｌを加え、３００Ｇで、７分間、室温で遠心分離した。この洗浄操作を３回繰り返した。遠心分離用のチューブに、牛胎児血清２ｍｌを入れて、その上に、洗浄緩衝液１ｍｌに懸濁した細胞懸濁液を静かに上層し、３００Ｇで１０分間遠心分離した。これを洗浄緩衝液で２回洗浄した。このヨウ化ナトリウム−１２５ラベルした細胞の遠心分離ペレットに、０．５ｍｌノニデットＰ（ＮＰ）−４０緩衝液（ＮＰ−４０ １ｇ、トリス塩酸０．１２ｇ、食塩０．８７ｇ、アジ化ナトリウム０．０２ｇに蒸留水８０ｍｌを入れて、塩酸でｐＨを７．２に調製し、１００ｍｌに合わせた）を入れて、ボルテックスミキサーで混合した（氷上で１５分間放置）。１０，０００Ｇで２０分間遠心分離し、上清を回収した。このヨウ化ナトリウム−１２５ラベルしたＫＧ−１細胞の抽出液を８０μｌ（／全量５００μｌ）取り、ＨＳＣＡ−３抗体を１．５μｇ、対照のＩｇＧ１抗体（イムノテック社製）も１．５μｇ用い、上記抽出液に加え、氷上で３０分間放置した。一方、プロテインＧ−セファロースをＮＰ−４０緩衝液で３回洗浄した後、プロテインＧ−セファロース１０ｍｌに対して、ＮＰ−４０緩衝液１０ｍｌを加え、このうち２０μｌを、上記抗体を添加したＫＧ−１細胞の抽出液に添加して、氷上で１時間インキュベーションした。ＮＰ−４０緩衝液１ｍｌを加えて、８、０００Ｇで３分間遠心分離して、上清を除去し、さらにこれを４回繰り返し洗浄した。これにＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動サンプル溶解緩衝液（１５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ６．８）、４％ＳＤＳ、１４％グリセロール）３０μｌを加え、このうち１５μｌをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（１０％ポリアクリルアミドゲル）を作製し、上述のサンプル１５μｌをアプライした。レーン１には、対照のＣＤ３４（クラスＩＩＩ）抗体（イムノテック社製）をアプライし、レーン２には、ＨＳＣＡ−３抗体をアプライした。レーン３には、ベンチ���ークプレステインドプロテインラダー（ギブコビーアルエル社製）を５μｌアプライした。１００ボルト一定電圧下、１時間電気泳動後、ゲルを５０％トリクロロ酢酸で、３０分間固定後、蒸留水で３０分間ずつ、合計３回洗浄した。スタンダードタンパク質の電気泳動位置を確認し、ゲルをゲル乾燥機で乾燥し、オートラジオグラフィーに供した。結果は、図１に示した。
【００３７】
ＣＤ３４（クラスＩＩＩ）抗体は広範なバンドを示しており、分子量１０５〜１２０×１０3のタンパク質と反応していた。それに対してＨＳＣＡ−３抗体は、分子量約１１０×１０3のタンパク質と反応していた。
【００３８】
（実施例４：ＫＧ−１細胞におけるＨＳＣＡ−３抗原の発現）
ＫＧ−１細胞１×１０5個を３本のチューブに入れ、それぞれＰＢＳ（−）（ＦＣＳ  １％、アジ化ナトリウム０．０１％を含む）で２回洗浄した後、第１のチューブ（Ａ）にＩｇＧ１−ＦＩＴＣ抗体[ＦＩＴＣ標識されたＩｇＧ１抗体（イムノテック社製）］及びＩｇＧ１−ＰＥ抗体［フィコエリスリン（ＰＥ）標識されたＩｇＧ１抗体（イムノテック社製）］、第２のチューブ（Ｂ）にＣＤ３４（クラスＩＩＩ）−ＦＩＴＣ抗体（イムノテック社製）及びＣＤ３８−ＰＥ抗体（イムノテック社製）をそれぞれ０．５μｇ加えて攪拌した後、氷上で３０分間放置した。ＰＢＳ（−）（ＦＣＳ１％、アジ化ナトリウム０．０１％を含む）で２回洗浄した後、ヨウ化プロピジウム（シグマアルドリッチジャパン社製）を最終濃度１０μｇ／ｍｌになるように加えて細胞を染色した。第３のチューブ（Ｃ）にはＨＳＣＡ-３抗体を０．５μｇ加えて氷上で３０分間放置した。ＰＢＳ（−）（ＦＣＳ１％、アジ化ナトリウム０．０１％を含む）で２回洗浄した後、ＰＢＳ（−）（ＦＣＳ１％、アジ化ナトリウム０．０１％を含む）で２，５００倍希釈したＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇ抗体（ノルディック社製）を５０μｌ加えて、氷上で３０分間放置した後、ＰＢＳ（−）（ＦＣＳ１％、アジ化ナトリウム０．０１％を含む）で１回洗浄した。さらにＰＢＳ（−）（ＦＣＳ１％、アジ化ナトリウム０．０１％を含む）で５０倍希釈した正常マウス血清（ロックランド社製）を５０μｌ加えて、氷上で１５分間放置した。次にＣＤ３８-ＰＥ抗体を０．５μｇ加えて氷上で３０分間放置し、ＰＢＳ（−）（ＦＣＳ１％、アジ化ナトリウム０．０１％を含む）で２回洗浄した後、ヨウ化プロピジウムを最終濃度１０μｇ／ｍｌになるように加えて細胞を染色した。
【００３９】
染色された細胞をフローサイトメーターＦＡＣＳｃａｎ（ベクトンディッキンソン社製）で励起波長４８８ｎｍ、最大蛍光波長５３０ｎｍで測定した。その結果を図２に示す。図の（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）は、それぞれ、上記チューブ（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）に対応する結果である。
【００４０】
図２の（Ａ）において、横軸はマウスＩｇＧ１−ＦＩＴＣ抗体の蛍光強度、そして縦軸はマウスＩｇＧ１−ＰＥ抗体の蛍光強度を示した。十字の線は、マウスＩｇＧ１−ＦＩＴＣ抗体およびマウスＩｇＧ１−ＰＥ抗体で処理して得られたフローサイトメトリー図に引いた縦軸と横軸の、それぞれの陽性陰性を区分する線を示した。ドットは細胞を示している。また、同様に、図２の（Ｂ）では、右下の象限はＣＤ３４（クラスＩＩＩ）+ＣＤ３８-を示し、右上の象限はＣＤ３４（クラスＩＩＩ）+ＣＤ３８+を示し、左上の象限はＣＤ３４（クラスＩＩＩ）-ＣＤ３８+を示し、そして左下の象限はＣＤ３４（クラスＩＩＩ）-ＣＤ３８-を示した。この結果から、ＫＧ−１細胞はＣＤ３４（クラスＩＩＩ）+であることがわかる。。同様に、図２の（Ｃ）の結果から、ＫＧ−１細胞がＨＳＣＡ−３+であることがわかった。ＣＤ３４（クラスＩＩＩ）−ＦＩＴＣ抗体を他のＣＤ３４分子のクラスを認識するＣＤ３４−ＦＩＴＣ抗体にして、すなわちＣＤ３４（クラスＩ）−ＦＩＴＣ抗体及びＣＤ３４（クラスＩＩ）−ＦＩＴＣ抗体を用いて同様に実施した結果、ＣＤ３４（クラスＩＩＩ）−ＦＩＴＣ抗体の場合と同様にＫＧ−１細胞を認識できた。
（実施例５： ＣＤ３４+Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＨＳＣＡ−３抗体の発現）
ＣＤ３４+Ｊｕｒｋａｔ細胞１×１０5個を３本のチューブに入れ、それぞれＰＢＳ（−）（ＦＣＳ  １％、アジ化ナトリウム０．０１％を含む）で２回洗浄した後、第１のチューブ（Ａ）にＩｇＧ１−ＦＩＴＣ抗体及びＩｇＧ１−ＰＥ抗体、第２のチューブ（Ｂ）にＣＤ３４（クラスＩＩＩ）−ＦＩＴＣ抗体及びＣＤ３８−ＰＥ抗体をそれぞれ０．５μｇ加えて攪拌した後、氷上で３０分間放置した。ＰＢＳ（−）（ＦＣＳ１％、アジ化ナトリウム０．０１％を含む）で２回洗浄した後、ヨウ化プロピジウム（シグマアルドリッチジャパン社製）を最終濃度１０μｇ／ｍｌになるように加えて細胞を染色した。第３のチューブ（Ｃ）にはＨＳＣＡ-３抗体を０．５μｇ加えて氷上で３０分間放置した。ＰＢＳ（−）（ＦＣＳ１％、アジ化ナトリウム０．０１％を含む）で２回洗浄した後、ＰＢＳ（−）（ＦＣＳ１％、アジ化ナトリウム０．０１％を含む）で２，５００倍希釈したＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇ抗体を５０μｌ加えて、氷上で３０分間放置した後、ＰＢＳ（−）（ＦＣＳ１％、アジ化ナトリウム０．０１％を含む）で１回洗浄した。さらにＰＢＳ（−）（ＦＣＳ１％、アジ化ナトリウム０．０１％を含む）で５０倍希釈した正常マウス血清を５０μｌ加えて、氷上で１５分間放置した。次にＣＤ３８-ＰＥ抗体を０．５μｇ加えて氷上で３０分間放置し、ＰＢＳ（−）（ＦＣＳ１％、アジ化ナトリウム０．０１％を含む）で２回洗浄した後、ヨウ化プロピジウムを最終濃度１０μｇ／ｍｌになるように加えて細胞を染色した。染色された細胞をフローサイトメーターＦＡＣＳｃａｎで測定した。その結果を図３に示す。図の（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）は、それぞれ、上記チューブ（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）に対応する結果である。
【００４１】
図３の（Ａ）において、横軸はマウスＩｇＧ１−ＦＩＴＣ抗体の蛍光強度、そして縦軸はマウスＩｇＧ１−ＰＥ抗体の蛍光強度を示しているこれを参考にしてフローサイトメトリー図に縦軸と横軸の、それぞれの陽性陰性を区分する線を引いた。図３の（Ｂ）の結果から、ＣＤ３４+Ｊｕｒｋａｔ細胞は、ＣＤ３４（クラスＩＩＩ）+であることがわかった。図３の（Ｃ）からは、ＣＤ３４+Ｊｕｒｋａｔ細胞がＨＳＣＡ−３-であることがわかった。  ＣＤ３４（クラスＩＩＩ）−ＦＩＴＣ抗体を他のＣＤ３４分子のクラスを認識するＣＤ３４−ＦＩＴＣ抗体にして、すなわちＣＤ３４（クラスＩ）−ＦＩＴＣ抗体及びＣＤ３４（クラスＩＩ）−ＦＩＴＣ抗体を用いて同様に実施したが、結果は、ＣＤ３４（クラスＩＩＩ）−ＦＩＴＣ抗体の場合と同様でＣＤ３４+Ｊｕｒｋａｔ細胞を認識できた。
【００４２】
（実施例６：各種株化細胞によるＨＳＣＡ−３抗原の発現）
ＫＧ−１細胞及びＣＤ３４+Ｊｕｒｋａｔ細胞以外の株化細胞、（１）ＫＵ８１２、（２）ＫＵ８１２（ＣＤ３４+）、（３）ＨＥＬ、（４）Ｊｕｒｋａｔ（ＣＤ２+ＣＤ３４-）、（５）ＭＯＬＴ１４、（６）ＭＯＬＴ４、（７）ＲＡＪＩ、（８）ＮＡＬＭ６、（９）ＤＡＵＤＩ、（１０）Ｋ５６２、（１１）ＴＨＰ−１、（１２）ＨＬ６０、（１３）Ｕ９３７、（１４）ＮＳ−１を用いて、ＨＳＣＡ−３抗体による染色を行った。上記の株化細胞１×１０5個に、ＨＳＣＡ-３抗体を０．５μｇ加えて氷上で３０分間放置した。ＰＢＳ（−）（ＦＣＳ１％、アジ化ナトリウム０．０１％を含む）で２回洗浄した後、ＰＢＳ（−）（ＦＣＳ１％、アジ化ナトリウム０．０１％を含む）で２，５００倍希釈したＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇ抗体を５０μｌ加えて、氷上で３０分間放置した後、ＰＢＳ（−）（ＦＣＳ１％、アジ化ナトリウム０．０１％を含む）で１回洗浄した。さらにＰＢＳ（−）（ＦＣＳ１％、アジ化ナトリウム０．０１％を含む）で５０倍希釈した正常マウス血清を５０μｌ加えて、氷上で１５分間放置した。ＰＢＳ（−）（ＦＣＳ１％、アジ化ナトリウム０．０１％を含む）で２回洗浄した後、ヨウ化プロピジウムを最終濃度１０μｇ／ｍｌになるように加えて細胞を染色した。染色された細胞をフローサイトメーターＦＡＣＳｃａｎで測定した。
【００４３】
測定結果は、
（１）ＫＵ８１２＝  ＋
（２）ＫＵ８１２（ＣＤ３４+）＝  ＋＋
（３）ＨＥＬ＝  ＋
（４）Ｊｕｒｋａｔ（ＣＤ２+ＣＤ３４-）＝  −
（５）ＭＯＬＴ１４＝  −
（６）ＭＯＬＴ４＝  −
（７）ＲＡＪＩ＝  −
（８）ＮＡＬＭ６＝  −
（９）ＤＡＵＤＩ＝  −
（１０）Ｋ５６２＝  −
（１１）ＴＨＰ−１＝  −
（１２）ＨＬ６０＝  −
（１３）Ｕ９３７＝  −
（１４）ＮＳ−１＝  −
であった。ここで、＋＋は強陽性、＋は弱陽性、−は陰性を示す。
【００４４】
ＣＤ３４抗体で陽性の細胞は、ＨＳＣＡ−３抗体においても陽性であった。実施例５の結果と合わせて考えると、ＣＤ３４抗体とＨＳＣＡ−３抗体との違いは、ＣＤ３４抗体ではＣＤ３４+Ｊｕｒｋａｔを認識できるのに対して、ＨＳＣＡ−３抗体では認識しない点にあることがわかった。
【００４５】
（実施例７：ＨＳＣＡ−３抗体のビオチン-ヒドラジドによる標識）
ＨＳＣＡ−３抗体２．２７ｍｇを０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）に一晩透析した後、２０ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウムを加えて最終１０ｍＭにし、氷上で２０分間攪拌した。トータル反応液１ｍｌ当たり１１μｌの１０％グリセロール溶液を加えて、５分間攪拌し、０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）に室温で一晩透析した。ビオチン−ヒドラジド粉末を最終１０ｍＭになるように加え、室温で２時間攪拌を続け、１，２００Ｇで１０分間遠心分離して沈殿を除去した。ＰＢＳ（−）（アジ化ナトリウム０．０１％を含む）に１日透析して標識抗体を作製した。
【００４６】
（実施例８：臍帯血単核球細胞におけるＨＳＣＡ−３抗原及びＣＤ３４抗原の発現）
臍帯血単核球細胞を以下のように調製した。すなわち、１５ｍｌポリプロピレン製チューブ（コーニング社製）にヘパリンナトリウム注射液（１０、０００Ｕ／ｍｌ）０．０５ｍｌを入れ、産婦人科からインフォームドコンセントにて供与された、ヒト臍帯血４ｍｌを加え、さらにＰＢＳ（−）／Ｈ（ＰＢＳ（−）に１％ヘパリンナトリウム注射液（１、０００Ｕ／ｍｌ）を加えた）を５ｍｌ加え、よく混ぜた。そこに、リンフォサイトセパレーションメディウム（オルガノンテクニカ社製）３．５ｍｌをチューブ底に入れて、４００Ｇで３０分間、遠心分離した。ここで、単核球細胞層を集め、ＰＢＳ（−）／ＨＦ（ＰＢＳ（−）に１％ヘパリンナトリウム注射液（１、０００Ｕ／ｍｌ）および２．５％ＦＣＳを加えた）を１５ｍｌポリプロピレン製チューブに加えて１５ｍｌにして、５１０Ｇで１０分間、遠心分離した。沈殿にＰＢＳ（−）／ＨＦ１５ｍｌを加えて、懸濁し、２４０Ｇで１０分間、遠心分離した。今度は沈殿に１０％ＦＣＳ／ＲＰＭＩ  １６４０ ０．５ｍｌに懸濁し、細胞数を約１×１０7個／ｍｌにした。これに凍結保存用培地（２０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）／１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ  １６４０）０．５ｍｌを加え、懸濁し、液体窒素中に凍結保存した。これを、使用開始時に凍結融解後、１５％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ  １６４０にて洗浄して使用した。
【００４７】
臍帯血単核球細胞１×１０6個を３本のチューブに入れ、第１のチューブ（Ａ）にＩｇＧ１−ＦＩＴＣ抗体及びＩｇＧ２−ＰＥ抗体（イムノテック社製）、第２のチューブ（Ｂ）にＣＤ３４（クラスＩＩ）−ＦＩＴＣ抗体（イムノテック社製）及びＣＤ３４（クラスＩＩＩ）−ＰＥ抗体（イムノテック社製）をそれぞれ０．５μｇ加えて攪拌した後、氷上で３０分間放置した。ＰＢＳ（−）（ＦＣＳ１％、アジ化ナトリウム０．０１％を含む）で２回洗浄した後、ヨウ化プロピジウムを最終濃度１０μｇ／ｍｌになるように加えて細胞を染色した。第３のチューブにはビオチン-ヒドラジドによって標識したＨＳＣＡ-３抗体を５μｇ加えて氷上で３０分間放置した。ＰＢＳ（−）（ＦＣＳ１％、アジ化ナトリウム０．０１％を含む）で２回洗浄した後、ＦＩＴＣ標識アビジン（ベクトンディッキンソン社製）１μｇを加えて氷上で３０分間放置した。ＰＢＳ（−）（ＦＣＳ１％、アジ化ナトリウム０．０１％を含む）で２回洗浄した後、ＣＤ３４（クラスＩＩＩ）−ＰＥ抗体をそれぞれ０．５μｇ加えて攪拌した後、氷上で３０分間放置した。ＰＢＳ（−）（ＦＣＳ１％、アジ化ナトリウム０．０１％を含む）で２回洗浄した後、ヨウ化プロピジウムを最終濃度１０μｇ／ｍｌになるように加えて細胞を染色した。染色された細胞をフローサイトメーターＦＡＣＳｃａｎで測定した。結果を図４に示す。図の（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）は、それぞれ、上記チューブ（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）に対応する結果である。
【００４８】
図４の（Ａ）において、横軸はマウスＩｇＧ１−ＦＩＴＣ抗体の蛍光強度、そして縦軸はマウスＩｇＧ２−ＰＥ抗体の蛍光強度を示している。これを参考にしてフローサイトメトリー図に縦軸と横軸の、それぞれの陽性陰性を区分する線を引いた。図４の（Ｂ）では、縦軸はＣＤ３４（クラスＩＩＩ）−ＰＥ抗体の蛍光強度、そして横軸はＣＤ３４（クラスＩＩ）−ＦＩＴＣ抗体の蛍光強度を示した。その結果、臍帯血単核球細胞に、ＣＤ３４（クラスＩＩ）+ＣＤ３４（クラスＩＩＩ）-画分及びＣＤ３４（クラスＩＩＩ）+ＣＤ３４（クラスＩＩ）-画分は存在しなかった。図４の（Ｃ）では、縦軸はＣＤ３４（クラスＩＩＩ）−ＰＥ抗体の蛍光強度、そして横軸はＨＳＣＡ−３抗体（ＦＩＴＣアビジン結合）の蛍光強度を示した。その結果、臍帯血単核球細胞に、ＨＳＣＡ−３+ＣＤ３４（クラスＩＩＩ）-画分が存在していた。従って、ＨＳＣＡ−３抗体は、ＣＤ３４（クラスＩＩＩ）抗体とは異なる抗原を認識していると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ＨＳＣＡ−３抗体反応抗原の免疫沈降による解析を示したオートラジオグラフィー図
【図２】  ＫＧ−１細胞におけるＨＳＣＡ−３抗原の発現を示したフローサイトメトリー図
【図３】  ＣＤ３４+Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＨＳＣＡ−３抗原の発現を示したフローサイトメトリー図
【図４】  臍帯血単核球細胞におけるＨＳＣＡ−３抗原及びＣＤ３４抗原の発現を示したフローサイトメトリー図
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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