(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の式（Ｉ）で表される
ＨＳ＝（ＣＨ２）ｍ−（ＣＨ２ＣＨ２）ｎ−Ｒ１    （Ｉ）
（（Ｉ）中Ｒ１はアセタール基、ｎは２から１００００の任意の整数、ｍは１〜１０の任意の整数を示す。）
α−末端にメルカプト基、ω−末端にアセタール基を有するポリエチレングリコールと金、銀又はアルミニウムの金属コロイドとの金属超微粒子複合体。
【請求項２】
金属コロイドが金であることを特徴とする請求項１に記載の金属コロイド複合体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、α−末端にメルカプト基、ω−末端に機能性化合物反応性官能基、例えばタンパク質に反応性アルデヒドを生成するアセタール基を有するヘテロテレケリックポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を金属コロイド担持せしめた金属超微粒子複合体、特に金または銀コロイドに担持せしめ、ＰＥＧのω−末端に機能性化合物反応性官能基を有する安定な金属超微粒子分散物に関する。なお、このような技術は金属酸化物コロイド（マグネタイトなどの磁性粒子）或いは半導体超微粒子（CdSeなどの無機蛍光発光粒子）等の超微粒子分散物ににも応用でできる。
【０００２】
【従来の技術】
従来、金属或いは金属酸化物コロイド（超微粒子）は、医療〔医薬（超微粒子の細内網系への浸透）として、各種検査薬、ＤＤＳとして〕）、染料（塗料）、食品や触媒など、様々な分野で広く応用されている重要な工業材料の一つである〔例えば、文献：「超微粒子−創造科学技術−」林 主税他編、三田（1988)参照、「超微粒子応用技術」日本粉体工業技術協会編、日刊工業新聞社（1986)、参照〕。特に数十から数百ナノメートルサイズ（サブミクロン：メソサイズ等とも呼ばれている。）で、かつサイズのそろった金属粒子はラマンスペクトル、マイクロ波を利用した医療用診断剤や電子顕微鏡ラベル剤など高機能材料として期待されている。例えば、金属コロイド粒子を使用するアッセイ方法が開発されている。該方法は、金属コロイドを標識として利用するために標識すべき特異の結合部分を、吸着により金属コロイド上に結合させ、前記標識物質を検出、測定するものである。その原理は、超微粒子が共鳴ラマン散乱を表面増感効果により更に増大させることが知られており〔表面−強化ラマン光散乱（Surface Enhanced Raman Scattering)、表面強化共鳴ラマン散乱（ＳＥＲＲＳ：Surface Enhanced Resonance Raman Scattering）〕、また、金属コロイドが前記シグナル増強効果を示すことが発見され、このような金属コロイドの特性を利用するものである。このようにラマン光に対して前記効果を持つ金属コロイドなどを標識に用い、これに反応する種々の被検出物、例えば抗体またはリガンドとの反応生成物を前記効果を利用して検出することができる。また、被検物に特異的結合部位およびラマン標識物質（金属コロイドなど）に反応性の基の両方を有する物質、換言すれば媒介分子（intervening molecule）で前記予めラマン標識物質（金属コロイドなど）で処理しておけば、そのような標識物質を用いて被検物を検出することができる。
【０００３】
ただ、このような金属微粒子は表面のイオンの反発力によって水のような媒体中で分散状態を維持できるが、反対電荷の基を持ったものが存在すると中和して凝集してしまう等、極めて不安定であり、凝集が起こりやすいのが欠点であった。このような問題点を解決するため、ポリエチレングリコール（ＰＥＧと記載する場合もある）のような水溶性でしかもモビリティの高い高分子の片末端を金属粒子に担持させ、その反発力に基づく安定化法が報告されている〔たとえばW.PWuelfingら、J.Am．Chem.．Soc.120（48）,12696-12697（1998）〕。しかしながら、たとえば珍断用微粒子を考えたとき、ＰＥＧを微粒子表面に担持させると、抗体等の機能集団（反応特異性の基）との反応ができず、その利用が極めて制限されていた。このような問題点を解決するため、本発明者らはＰＥＧの片末端（例えば、α−末端）に金属、金属酸化物或いは半導体超微粒子に担持しうる官能基（反応する）を導入し、他末端（ω−末端）に抗体、タンパク質、染料など機能性化合物等と反応しうる官能基を導入したＰＥＧ誘導体を合成し、金属、金属酸化物または半導体超微粒子（これらをまとめて「金属超微粒子等」と表現する場合もある。）を前記官能基を導入したＰＥＧ誘導体を用いて分散安定性を改善すると共に、超微粒子表面から広がったＰＥＧ鎖他末端の機能性化合物等への反応性を持つ新しい分散安定複合体を調製することを考えた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は金属超微粒子等の分散安定性を向上させるとともに様々な機能性化合物と反応可能な反応基を導入したＰＥＧ誘導体−金属超微粒子等の複合体を提供することにある。 本発明者らは上述した分散安定でかつ反応性を有する金属微粒子等／ＰＥＧ複合体を調製するために、各種ヘテロテレケリツクＰＥＧ誘導体の合成及び様々な金属微粒子等との複合化を研究してきたところ、片末端（例えば、α−末端）にメルカプト基を有するヘテロテレケリツクＰＥＧは、そのメルカプト基によって容易に金や銀などと金属と複合化することに成功した。さらは、片末端（例えば、α−末端）にシラノール基を有するヘテロＰＥＧを設計することによって、様々な超微粒子酸化金属等への複合化にも成功し、利用できる超微粒子の領域を広めることができることを発見した。超微粒子として半導体、例えばＣｄＳを用いると、更に機能性を広げることができる。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、請求項1に記載のα−末端にメルカプト基、ω−末端に機能性化合物反応性官能基であるを有するポリエチレングリコールと金、銀又はアルミニウムの金属コロイドとの超微粒子複合体であり、好ましくは、金属コロイドが金であることを特徴とする前記金属コロイド複合体である。好ましくは、ω−末端の官能基がアセタールであることを特徴とする前記金属コロイドとの超微粒子複合体である。
【０００６】
【本発明の実施の態様】
本発明をより詳細に説明する。
Ａ．本発明で使用する、α−末端にメルカプト基、ω−末端に機能性化合物反応性官能基を有するポリエチレングリコール誘導体は、下記の一般式（１）で表すことができる。
ＨＳ−（ＣＨ2）m−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n−Ｒ1 （Ｉ）
（式中ｍは１〜１０の任意の整数、ｎは２から１００００の任意の整数、Ｒ1は水素、アセタール基、アルデヒド基、アミノ基、カルポキシル基、メタクリロイル基、アリル基を有するアルキル基より選ばれる）で示されるヘテロＰＥＧ、または、
（Ｒ2Ｏ）3Ｓｉ−（ＣＨ2）m−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n−Ｒ1 （II）
（式中Ｒ２は水素または炭素数１〜５のアルキル基を示す。また、ｍは１〜１０の任意の整数、ｎは２〜１０００の任意の整数、Ｒ1は水素、アセタール基、アルデヒド基、アミノ基、カルボキシル基、メタクリロイル基、アリル基を有するアルキル基より選ばれる）で示されるヘテロＰＥＧ（ＩＩ）のポリマーが用いられる。本発明者らは上述の目的を達成するポリマーとして、これまですでに片末端にメルカプト基を有し、他末端に様々な官能基を有するヘテロテレケリックＰＥＧの合成法を確立してきている〔特願平１０−１４２０９８号（特開平１１−３２２９１７号公報）、特開平７−４８４４９号公報、特開平５−２７９４６９号公報（アミノ基）〕。他末端（ω−末端）の官能基としては、原理的にはどんな官能基も可能であるが、特に溶媒に反応しないものが好ましい。これまでの検討から、アセタール、アルデヒド、水酸基、アミノ基、カルボキシル基、活性エステルアジド基、メルカプト基、ビオチン基、単糖や２糖などのオリゴ糖、アミノ酸、核酸、アリル基、ビニルペンジル基、メタクリロイル基、アクリロイル基などが可能である。これらと金属コロイドとを反応させることによって本発明の金属コロイドの超微粒子複合体を調製することができる。
【０００７】
Ｂ．金属微粒子は、市販品〔アルドリッチ、シグマ、ワコー社製など〕としても入手できるし、またはＨＡｕＣｌ4、Ｈ2ＰｔＣｌ6、Ｎａ2ＰｔＣｌ4、ＲｈＣｌ3などの金属の希釈塩溶液を還元、シトレート還元または水素ガス還元などによって製造することもできる。平均粒径５０ｎｍ〜２００ｎｍ程度の金コロイドの溶液は５２０ｎｍ付近に吸収極大を有する光学特性を示す。
【０００８】
Ｃ．複合体の調製
前記メルカプト基あるいはシラノール基を有するヘテロテレケリックＰＥＧを金、銀やアルミ超微粒子と混合することにより微粒子表面とメルカプト基が反応し、安定な超微粒子−ＰＥＧ複合体が調製できる。調製に用いる超微粒子としては様々な物質のものが使用可能であるが、金、銀やアルミニウムからのものはメルカブト基ときわめて安定に結合するため用いやすい。なお、ケイ素やチタン、パラジウム、白金などのような触媒金属等の他、無機蛍光化合物として注目されているＣｄＳや光触媒として脚光を浴びている酸化チタンなどの酸化物等の化合物粒子を使用する場合は、メルカプト基に代えてシラノール基を有する（Ｒ２Ｏ）３Ｓｉ−ＣＨ“）ｍ−（ＣＨ”ＣＨ“Ｏ）ｎ−Ｒ１（ＩＩ）ＰＥＧ（ＩＩ）（式中Ｒ２は水素または炭素数１〜５のアルキル基を示す。また、ｍは１〜１０の任意の整数、ｎは２〜１００００に任意の整数、Ｒ１はアセタール基である。）と混合することにより、安定な本発明の複合体が調製できる。
【０００９】
本発明の複合体は様々な液体中で安定なため、調製溶剤は限定されないが、水やＴＨＦ、アルコールや芳香族化合物など、ＰＥＧの溶解性の高い溶剤が好ましい。調製する温度は液体の融点から沸点の間で可能であるが簡便のためには室温付近が適当である。粒子の径に関しては特に限定はないが、好ましい分散安定化のためには０．５ｎｍ〜５００μｍ、より好ましくは１ｎｍ〜１μｍである。複合体調製のためには通常前記ＰＥＧ量を粒子に対して過剰量用いる。粒子数に対して通常３倍以上用いる必要があり、好ましくは１０倍〜１０14倍、より好ましくは１０3倍〜１０10倍が適当である。前記ＰＥＧの分子量には上限がないが、通常分子量１００以上のものが使われる。好ましくは分子量２００〜１０００００、より好ましい分子量は３００〜２００００程度である。調製後に遠心分離等を行い、過剰のＰＥＧを除去することにより、純粋な金属超微粒子等の複合体が調製される。
【００１０】
【実施例】
具体例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する。当業者であればこれらの例及び上述の実施の態様に記載の具体例を参考に、所望の金属超微粒子等／ＰＥＧ複合体を提供できる。
１．α−末端にメルカプト基、ω−末端にアセタール基を有するヘテロテレケリツクＰＥＧの合成。
開始剤に３，３−ジエトキシ−1−プロパノール（3,3-Diethoxy-1-propanol）、停止剤にメチルスルフォニルクロライド（Methylsulfonylchloride）を用いてアセタール基とメチルスルホニル基を有するヘテロ二官能性ＰＥＧ（Ｉ）をアニオン重合により合成した。さらに、ＴＨＦ中でカリウムオルトエチルジチオカルボネート（potassium o-etbyldithiocarbonat）と室温で３時間反応させることによってポリマー（２）を得た。その後、同じくＴＨＦ中でプロピルアミン（propylamine）との反応によってα−末端にメルカブト基を有するヘテロ二官能性ＰＥＧ（３）を合成した。前記合成反応を反応式１に示す。
【００１１】
【化１】
0004518220.tif 000002
【００１２】
また、得られた（１）〜（３）の化合物の1Ｈ−ＮＭＲ（溶媒ＤＭＳＯ、４００ＭＨｚ）スペクトル図1に示す。
【００１３】
実施例１：金属超微粒子（金属コロイド）複合体の調製；
アセタール−ＰＥＯ−ＳＨ（Ｍｎ＝３２００）とアセタール−ＰＥＯ−ＯＨ（比較例）（Ｍｎ＝３０００）を金粒子とのモル比が５．０×１０６になるように測りとり純水２．０ｍＬに溶解させた。そして、ＮａＯＨ溶液にてｐＨ６．５に調製し、金コロイド１．０ｍＬ（2.58×10-13mol，pH6.5）を加え室温で３時間激しく撹拌させた。遠心分離〔42,000g（ｇは重力加速度）、30分〕後上着みを取り除き、残った溶液をＴＨＦ３ｍＬに滴下し撹拌した。これらのサンプルについて吸収スペクトルを取り、特性解析を行った。このポリマーを用いた金粒子の調製においては、遠心分離後、ＴＨＦ溶液に再分散させたときのＵＶ−ｖｉｓスペクトルから、未修飾の金粒子のＵＶスペクトル（図２ｂ）は、粒子の擬集に基づく６００ｎｍ以上に大きな吸収ピークを示していることが確認できた。アセタール−ＰＥＯ−ＯＨ（ｃ）は、未修飾の金粒子のＵＶスペクトルのように６００ｎｍ以上に大きなピークを持たなかったものの、全体的にピークが高波長側ヘシフトし多少微粒子分散が不安定化していることが確認された（図２）。また、遠心操作後、ｐＨ３の水溶液中に再分散させた時もアセタール−ＰＥＯ−ＳＨ（図２ａ）のみが非常に安定であり、ベンゼンを用いた凍結乾燥後の再分散性もよいことが確認できた。
【００１４】
〔粒子調製、酸系（塩酸を加えて酸性にした液体中における）分散安定性〕
アセタール−ＰＥＯ−ＳＨ（Ｍｎ＝３２００）を１６．０ｍｇ、０．４１３ｍｇ（モル比：２×１０7、６．０×１０5）とアセタール−ＰＥＯ−ＯＨ（Ｍｎ＝３０００）を１５．５ｍｇ（モル比：２×１０7）測りとり、純水２．０ｍＬに溶解させ、ＮａＯＨ溶液を加えてｐＨを６．６に調製した。そして、金コロイドを１．０ｍＬ（２．５８×１０-13ｍｏｌ、ｐＨ６．５）加えて室温で３時間撹拌させた。その後、遠心分離（42,000g、30分）をおこない溶液を取り除き、ｐＨ３のＨＣｌ水溶液３ｍＬを加えて超音波をかけ再分散させた。その後、ｖｉｓスペクトルの測定を行った。遠心分離３回操作では金粒子単独及び水酸基末端ＰＥＧではその吸光度が減少していることから、擬集により溶液から分離されているのに対し、メルカプト末端ＰＥＧでは強い強度を保ち、安定化が確認された。（図３）
【００１５】
本発明の分散粒子の特性（ゼータ電位）
通常の金微粒子の水溶液分散系では粒子表面を負に荷電させることによりそのチャージ反発により分散安定化させているのに対し、ＰＥＧ化金微粒子ではその表面に全くチャージがないことがゼータ電位測定（大塚電子：ＥＬＳ−８０００）により確認された。すなわち、市販の金微粒子は−３４．５ｍＶであるのに対し、今回作成した金微粒子−ヘテロＰＥＧ複合体（アセタール−ＰＥＧ−ＳＨ／Ａｕ）では−０．８６ｍＶとなっており、殆ど誤差の範囲で粒子表面にチャージがないといえ、表面がＰＥＧ鎖で覆われているものと推測される。測定データを表１に示す。
【００１６】
【表１】
0004518220.tif 000003
【００１７】
本発明の超微粒子複合体の利用例得られた金超微粒子（コロイド）／ＰＥＧ複合体は酸性下でアセタールが加水分解し、アルデヒド化している。この溶液にアルデヒドの蛍光試薬であるＤＤＢ（4、5-Dimethoxy-1,2-diaminobenzen・2HCl）を添加したところ４００ｎｍ付近に強い蛍光を発し（励起３３８ｎｍ）粒子表面にアルデヒドが存在していることが確認された。アルデヒド基はタンパクのアミノ基と還元アミノ化で結合するので、タンパク質の検出に利用できる。
【００１８】
【発明の効果】
以上述べたように、本発明で得られた金属或いは金属酸化物コロイド（超微粒子）複合体は、凝集を起こしやすい環境において、金属或いは金属酸化物コロイド（超微粒子）を安定に保ち、超微粒子の特性を生かした、医療〔医薬（超微粒子の細内網系への浸透）として、各種検査薬、ＤＤＳとして〕）、染料（発色性の変化）（塗料としての、例えば酸化チタンでは光触媒性の変化、マグネタイトなどの磁性粒子では記憶性の変化など）、食品（吸収性）、や触媒（機能の変化）など、様々な分野で広く利用できることが期待できるという、優れた作用・効果がもたらされる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 反応式１による、化合物（１）〜（３）の1Ｈ−ＮＭＲ（溶媒ＤＭＳＯ、４００ＭＨｚ）スペクトル
【図２】 （ａ）本発明の複合体、（ｂ）未修飾金微粒子、（ｃ）α−末端ＯＨのＰＥＧとの複合体、のＵＶ吸収（凝集性）
【図３】図２の（ａ）〜（ｃ）に対応する複合体または超微粒子の酸系（ｐＨ３：ＨＣｌ）における分散安定性（ＵＶ吸収測定）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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