(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定の抗原／寛容原に対して免疫寛容を誘導するための経口投与用医薬であって、該特定の抗原／寛容原に結合したコレラ毒素のＢサブユニットおよび大腸菌の非耐熱エンテロトキシンのＢサブユニットから選ばれる粘膜結合性分子を含む、前記医薬。
【請求項２】
特定の寛容原が、個体において望ましくない免疫応答を引き起こす特定の抗原から選択される、請求項１に記載の医薬。
【請求項３】
前記望ましくない免疫応答が全身性抗体産生に関係している、請求項２に記載の医薬。
【請求項４】
前記望ましくない免疫応答が遅延型過敏症反応に関係している、請求項２に記載の医薬。
【請求項５】
前記望ましくない免疫応答が、自己免疫疾患、アレルギー疾患、組織若しくは細胞移植片拒絶反応および／または急性若しくは慢性炎症反応若しくは障害に関係している、請求項２に記載の医薬。
【請求項６】
前記抗原が、タンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質および核酸から成る群より選択される、請求項１に記載の医薬。
【請求項７】
前記抗原がインシュリンまたはそのフラグメントであり、および前記自己免疫疾患が自己免疫性糖尿病である、請求項５または６に記載の医薬。
【請求項８】
前記抗原がミエリン塩基性タンパク質またはそのフラグメントであり、および前記自己免疫疾患が自己免疫性脳炎である、請求項５または６に記載の医薬。
【請求項９】
前記抗原／寛容原および前記粘膜結合性分子が互いに直接的にまたは間接的に結合している、請求項１に記載の医薬。
【請求項１０】
前記抗原／寛容原および前記粘膜結合性分子が、スペーサー分子；該寛容原／抗原含有保護ビヒクル；または融合遺伝子若しくはヌクレオチド配列の発現に由来する、該スペーサー分子と該寛容原／抗原とのハイブリッド分子から成る群のメンバーの助けによって互いに間接的に結合している、請求項９に記載の医薬。
【請求項１１】
前記スペーサー分子が、前記抗原／寛容原または抗原／寛容原含有ビヒクルおよび前記粘膜結合性分子のどちらかまたは両方に対して結合親和性を有する分子から選択される、請求項１０に記載の医薬。
【請求項１２】
前記スペーサー分子が抗体である、請求項１１に記載の医薬。
【請求項１３】
前記スペーサー分子が、ＧＭ１ガングリオシドのコレラ毒素結合性構造であるガラクトシル−Ｎ−アセチルガラクトサミニル−（シアリル）−ガラクトシルグルコシルセラミドであるか、またはそれに由来する、請求項１１に記載の医薬。
【請求項１４】
特定の自己抗原／寛容原に結合したコレラ毒素のＢサブユニットおよび大腸菌の非耐熱エンテロトキシンのＢサブユニットから選ばれる粘膜結合性分子を含む、免疫寛容誘導剤。
【請求項１５】
前記特定の自己抗原／寛容原が、個体において望ましくない免疫応答を引き起こす特定の抗原から選択される、請求項１４に記載の誘導剤。
【請求項１６】
前記望ましくない免疫応答が全身性抗体産生に関係している、請求項１５に記載の誘導剤。
【請求項１７】
前記望ましくない免疫応答が遅延型過敏症反応に関係している、請求項１５に記載の誘導剤。
【請求項１８】
前記望ましくない免疫応答が、自己免疫疾患、アレルギー疾患、組織若しくは細胞移植片拒絶反応および／または急性若しくは慢性炎症反応若しくは障害に関係している、請求項１５に記載の誘導剤。
【請求項１９】
前記自己抗原／寛容原が、タンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質および核酸から成る群より選択される、請求項１４に記載の誘導剤。
【請求項２０】
前記抗原がインシュリンまたはそのフラグメントであり、および前記自己免疫疾患が自己免疫性糖尿病である、請求項１８または１９に記載の誘導剤。
【請求項２１】
前記抗原がミエリン塩基性タンパク質またはそのフラグメントであり、および前記自己免疫疾患が自己免疫性脳炎である、請求項１８または１９に記載の誘導剤。
【請求項２２】
前記抗原／寛容原および前記粘膜結合性分子が互いに直接的にまたは間接的に結合している、請求項１４に記載の誘導剤。
【請求項２３】
前記抗原／寛容原および前記粘膜結合性分子が、スペーサー分子；該寛容原／抗原含有保護ビヒクル；または融合遺伝子若しくはヌクレオチド配列の発現に由来する、該スペーサー分子と該寛容原／抗原とのハイブリッド分子から成る群のメンバーの助けによって互いに間接的に結合している、請求項２２に記載の誘導剤。
【請求項２４】
前記スペーサー分子が、前記抗原／寛容原または抗原／寛容原含有ビヒクルおよび前記粘膜結合性分子のどちらかまたは両方に対して結合親和性を有する分子から選択される、請求項２３に記載の誘導剤。
【請求項２５】
前記スペーサー分子が抗体である、請求項２４に記載の誘導剤。
【請求項２６】
前記スペーサー分子が、ＧＭ１ガングリオシドのコレラ毒素結合性構造であるガラクトシル−Ｎ−アセチルガラクトサミニル−（シアリル）−ガラクトシルグルコシルセラミドであるか、またはそれに由来する、請求項２４に記載の誘導剤。
【発明の詳細な説明】
本発明は、免疫寛容誘導剤に関する。具体的には、特定の寛容原に結合したこのような粘膜結合性分子を含む薬剤および個体においてハプテンを含む特異的抗原に対して免疫寛容を誘導する方法に関する。
発明の背景および先行技術の論及
ハプテンを含めて以下抗原（Ａｇ）と称する外来物質の脊椎動物中への注射による導入は、該Ａｇと相互作用することができる特異的抗体（Ｂリンパ球の生産物）の産生を特徴とする免疫応答の誘導並びに／または該Ａｇとの遭遇部位でのエフェクターＴリンパ球の発生およびリンホカインと称する可溶性媒介物質の生産を引き起こすことができる。抗体およびＴリンパ球は、明らかに、対抗するＡｇに対して防御する場合に本質的な役割を果たしているが、宿主組織の破壊をもたらす有害な過程に関与することもある。これは、抗体および／またはＴリンパ球が自分自身の組織のＡｇと反応し且つこれらを損傷する自己免疫疾患の場合である。これはまた、ある種の環境物質に対する過度の免疫応答を特徴とするアレルギー反応の場合でもあり、それは組織破壊をもたらす炎症反応を引き起こすことがある。更に、これは、ある種の感染の場合（例えば、結核症、住血吸虫症）または外来粒子（例えば、石綿）の導入後のように外来物質の排除が無効な結果として生じる慢性の炎症反応の場合である。これはまた、同種移植片の体内導入に伴う且つその拒絶をもたらす免疫増殖反応の場合でもある。
望ましくないすなわち組織損傷性免疫反応によって引き起こされた疾患、例えば、同種移植片拒絶、自己免疫疾患、感染性微生物に対するまたは環境抗原に対する組織破壊的アレルギー反応に対する有効な療法を開発する場合の主要な目的の一つは、有害な免疫過程の強さを、他の残りの免疫系に影響を及ぼすことなく許容水準まで特異的に抑制するまたは低下させることである。
免疫寛容の対象は、自分自身の生体成分（「自己抗原」）に対するまたは任意の与えられた外来物質に対する破壊的免疫応答の不存在を確実にする全ての機序に関する。
長い間認められた免疫寛容を誘導する方法は、鶏卵タンパク質についてウェルス（Ｗｅｌｌｓ）によって最初に実証された抗原の経口投与である（ウェルス，Ｈ．、１９９１年。アナフィラキシーの化学の研究ＩＩＩ。単離タンパク質、特に、鶏卵の単離タンパク質による実験。Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．９：１４７）。しばしば「経口寛容」と称される（Ａｇの経口投与の作用によって最初に実証されたので）現象は、ある抗原を摂食したまたは吸入した動物が、注射などの全身性経路によって導入された該Ａｇに対して再度暴露された場合に無反応性になるかまたは全身性免疫応答を生じる能力を低下していることを特徴とする。広義において、腸、肺、口、生殖路、鼻または眼である粘膜上または粘膜組織中への抗原の付着は、全身性免疫寛容の現象を引き起こすことができる。これとは反対に、全身性免疫感作と称される非粘膜組織、すなわち例えば皮膚または血液中への抗原の導入は、上述の特徴を有する免疫応答を引き起こすことが多く、全身性免疫応答と称される。該現象は、低応答性が前記摂食されたまたは吸入されたＡｇの注射後のみにおこり、構造的に関係のあるＡｇの注射後には実証されることがない（但し、後者は以前に粘膜部分で遭遇したことがないという条件である）という点で、粘膜経路によって導入されたＡｇに極めて特有である。
摂取された抗原は、腸関連リンパ様組織中において上皮腸細胞およびペイアーズ（Ｐｅｙｅｒ′ｓ）パッチＭ細胞を含む特殊化した細胞によって吸収され且つ処理されると考えられる（オーウェン（Ｏｗｅｎ），Ｒ．Ｌ．およびＰ．ネマニク（Ｎｅｍａｎｉｃ）、１９７８年。哺乳動物腸管の抗原処理構造：リンパ上皮器官のＳＥＭ研究。Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃ．２：３６７〜３７８。）。更に、吸入された抗原は、気道上皮における同様の種類の細胞によって取込まれると考えられる（リチャードソン（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ）Ｊ．、ブシャール（Ｂｏｕｃｈａｒｄ）Ｒ．およびファーガソン（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ）ＣＣ．、１９７６年。呼吸器上皮による外因性タンパク質の取込みおよび輸送。Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．３５：３０７〜３１４）。腸および肺粘膜の局部的微環境における補助細胞並びに同族ヘルパーＴ細胞および／またはＢリンパ球と抗原との相互作用に続いて免疫応答が起こることがあり、その特性は、抗原の性状、関与した補助細胞およびリンパ球の種類、並びに宿主の遺伝学的背景を含むいくつかの因子に影響されることがある。しかしながら、抗原の摂取または吸入は、更に、消化管粘膜または呼吸器粘膜において最初に遭遇した抗原が非経口注射などの非粘膜経路によって生物中に再導入されたとしても、非粘膜組織における免疫応答が生じないということを特徴とする場合である末梢性免疫寛容の状態の発生を引き起こすことがある。この現象は、最初に摂取されまたは吸入された抗原に極めて特有であり、したがって他の抗原に対する全身性免疫応答の発生に影響を及ぼさないので、その使用は、非粘膜組織で遭遇した特異的抗原に対する不都合なおよび／または過度の免疫反応の発生に関係したまたは起因した疾患を予防するおよびおそらくは治療する益々魅力的な方策になってきている。
粘膜誘導された全身性寛容の現象は、Ａｇに対する抗体の産生および細胞性免疫応答の発生のような、Ａｇの全身性導入によって誘導可能であることが知られている全ての種類の免疫応答に関与しうる。したがって、粘膜誘導された免疫寛容は、化学薬品に対するアレルギー反応を防止するまたはその強さを低下させる方策として提案されてきている（チェイス（Ｃｈａｓｅ），ＭＷ．、１９４６年。増感剤の前摂食による実験的薬剤アレルギーの阻害。Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．６１：２５７〜２５９）。更に、実験動物およびヒトにおいて、赤血球の経口投与によって赤血球などの全身的に導入された可溶性タンパク質抗原および粒子抗原に対する免疫反応を防止するまたはその強さを低下させることは可能であった（トーマス（Ｔｈｏｍａｓ）ＨＣ．およびパロット（Ｐａｒｒｏｔ）ＤＭＶ．、１９７４年。経口投与による可溶性タンパク質抗原に対する寛容の誘導。Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２７：６３１〜６３９；マティングリー（Ｍａｔｔｉｎｇｌｙ），Ｊ．およびワクスマン（Ｗａｋｓｍａｎ）Ｂ．、１９７８年。抗原の経口投与後の免疫抑制。ヒツジ赤血球の経口投与後のラットペイアーズパッチで見られる特定のサプレッサー細胞およびそれらの全身性移動。Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２１：１８７８；ビアム（Ｂｉｅｒｍｅ），Ｓ．Ｊ．；ブラン（Ｂｌａｎｃ），Ｍ．；アバル（Ａｂｂａｌ），Ｍ．；フルニエ（Ｆｏｕｒｎｉｅ），Ａ．、１９７９年。重症免疫感作母体の経口Ｒｈ処置。Ｌａｎｃｅｔ，１：６０５〜６０６）。
粘膜誘導された全身性寛容の現象は、外来抗原に対するのみならず自己抗原、すなわち宿主組織に由来する成分に対する免疫応答を減少または抑制させるのにも用いることができる。このように、種々の動物系において腸（摂食による）または呼吸器粘膜上への（抗原のエーロゾル投与または鼻腔内点滴注入による）自己抗原の粘膜付着によって実験的に誘導された自己免疫疾患の強さを減少させることは可能になっている。例えば、コラーゲンＩＩ型（関節軟骨で見出されるコラーゲンの顕著な種類）の経口投与は、齧歯類動物のある種の系統においてコラーゲンＩＩ型をフロイント完全アジュバントと一緒に注射することによってまたはヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（以前のアジュバントの成分）単独の注射によって誘導することができる疾患である実験的自己免疫性関節炎の強さを抑制するまたは減少させることが示されている（トンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ），ＨＳＧ．およびステインズ（Ｓｔａｉｎｅｓ），ＮＡ．、１９８６年。ＩＩ型コラーゲンの胃投与はラットのコラーゲン誘導関節炎の開始および苛酷さを遅らせる。Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６４：５８１；ナグラー・アンダーソン（Ｎａｇｌｅｒ−Ａｎｄｅｒｓｏｎ），Ｃ．、ボバー（Ｂｏｂｅｒ）ＬＡ．、ロビンソン（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ），ＭＥ．、シスキンド（Ｓｉｓｋｉｎｄ）ＧＷ．、トーベック（Ｔｈｏｒｂｅｃｋｅ）ＧＪ．、１９８６年。可溶性ＩＩ型コラーゲンの胃内投与によるＩＩ型コラーゲン誘導関節炎の抑制。Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：７４４３；ヅァン（Ｚｈａｎｇ），ＪＺ．、リー（Ｌｅｅ），ＣＳＹ．、リダー（Ｌｉｄｅｒ），Ｏ．およびワイナー（Ｗｅｉｎｅｒ）ＨＬ．、１９９０年。ＩＩ型コラーゲンの経口投与によるルイスラットのアジュバント関節炎の抑制。Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４５：２４８９〜２４９３）。同様に、動物に注射された場合にある形のブドウ膜網膜炎を誘導することができるレチナール自己抗原であるＳ−抗原の経口投与によって実験上の形の自己免疫性ブドウ膜網膜炎を抑制することが可能である（ヌセンブラット（Ｎｕｓｓｅｎｂｌａｔｔ），ＲＢ．、カスピ（Ｃａｓｐｉ），ＲＲ．、マーディ（Ｍａｈｄｉ），Ｒ．、チャン（Ｃｈａｎ），ＣＣ．、ロバージ（Ｒｏｂｅｒｇｅ），Ｒ．、リダー，Ｏ．、ワイナー，ＨＬ．、１９９０年。Ｓ−抗原による寛容の経口誘導によるＳ−抗原誘導実験的自己免疫性ブドウ膜網膜炎の阻害。Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４４：１６８９〜１６９５）。齧歯類動物のある種の系統において精製ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）または粗製脊髄ホモジネートとアジュバンドとを一緒に注射することによって誘導することができる慢性再発性脱髄障害である実験的自己免疫性脳炎は、動物に経口（摂食）または呼吸（エーロゾル）経路によってＭＢＰまたはＭＢＰフラグメントを与えるならば、部分的にまたは完全に抑制することができる（バイター（Ｂｉｔａｒ）ＤＭ．およびホイッタカー（Ｗｈｉｔａｃｒｅ）ＣＣ．、１９８８年。ミエリン塩基性タンパク質の経口投与による自己免疫性脳脊髄炎の抑制。Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１２：３６４；ヒギンス（Ｈｉｇｇｉｎｓ）ＰＪ．およびワイナーＨＬ．、１９８８年。ミエリン塩基性タンパク質およびそのフラグメントの経口投与による実験的自己免疫性脳炎の抑制。Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：４４０〜４４５；ワイナー  ＨＬ．、アル・サバー（Ａｌ−Ｓａｂｂａｇｈ）Ａ．およびソーベル（Ｓｏｂｅｌ）Ｒ．、１９９０年。抗原作動末梢免疫寛容。ミエリン塩基性タンパク質のエーロゾル投与による実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の抑制。ＦＡＳＥＢ  Ｊ（アブストラクト）４（７）：２１０２）。更に、インスリンの経口投与は、マウスの自己免疫性糖尿病を抑制することが報告されている（ヅァン  ＺＪ．、デービッドソン（Ｄａｖｉｄｓｏｎ）Ｌ．、アイゼンバース（Ｅｉｓｅｎｂａｒｔｈ）Ｇ．およびワイナー  ＨＬ．、１９９１年。ブタインスリンの経口投与による非肥満糖尿病マウスの糖尿病の抑制。Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８８：１０２５２〜１０２５６）。更に最近では、実験的自己免疫性重症筋無力症の抑制が、アセチルコリン受容体の経口投与後に達成された（ワーンク（Ｗａｎｋ）ＺＹ．、キアオ（Ｑｉａｏ）Ｊ．およびリンク（Ｌｉｎｋ）Ｈ．、１９９３年。アセチルコリン受容体の経口投与による実験的自己免疫性重症筋無力症の抑制。Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．４４：２０９〜２１４）。
更に、マウスにおける住血吸虫卵の腸投与は、寄生虫住血吸虫属（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ）による外寄生の際に住血吸虫卵の周りに生じる慢性Ｔ細胞性炎症性免疫反応である肝および腸肉芽腫性反応の発生を防止しうるしまたはその強さを減少させうることが分っている（ワインストック（Ｗｅｉｎｓｔｏｃｋ）ＪＶ．、ブルム（Ｂｌｕｍ）ＡＭ．およびカサブ（Ｋａｓｓａｂ）ＪＴ．、１９８５年。住血吸虫卵に対する腸暴露によるネズミマンソン住血吸虫症の肉芽腫転形の誘導。Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３５：５６０〜５６３）。
ほぼ同様に、抗原の経口投与は、ハウスダスト成分または草花粉に存在する物質などの一般的なアレルゲンに対するアレルギー反応を予防するおよび／または治療するのに提案されている（レビーン（Ｒｅｂｉｅｎ）Ｗ．、プトネン（Ｐｕｔｔｏｎｅｎ）Ｅ．、マーシュ（Ｍａａｓｃｈ）ＨＪ．、スティクス（Ｓｔｉｘ）Ｅ．およびワーン（Ｗｈａｎ）Ｕ．、１９８２年。草花粉抽出物による経口および皮下免疫療法に対する臨床的および免疫学的応答。将来の研究。Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒｙ  １３８：３４１〜３４４；ウォートマン（Ｗｏｒｔｍａｎｎ）Ｆ．、１９７７年。花粉症またはハウスダスト喘息の子供の経口低感作。Ａｌｌｅｒｇｏｌ  ｅｔ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．５：１５〜２６）。
上記の例は、外来抗原の粘膜投与も自己抗原の粘膜投与も特定の免疫寛容を誘導するのに好都合な方法を与えるが、ヒト用および獣医学的医薬品の大規模な療法に対する適応性は実際的な問題によって制限されたままである。
実際に、臨床的に広範囲に適応可能であるためには、粘膜誘導された免疫寛容は、疾患経過が既に実証されているおよび／または潜在的に組織損傷性の免疫細胞が既に存在している患者においても有効でなければならない。これは、自己免疫疾患、アレルギー症状または永続型微生物に対する慢性炎症反応に苦しんでいるまたは罹患しやすい患者での寛容誘導の方策を考える場合に特に重要である。粘膜誘導される寛容の現行プロトコルは、既に確立された状態の全身性免疫感作の発現を抑制する場合には結果が限られている（ハンソン（Ｈａｎｓｓｏｎ）ＤＧ．、バズ（Ｖａｚ）ＮＭ．、ローリングス（Ｒａｗｌｉｎｇｓ）ＬＡ．およびリンチ（Ｌｙｎｃｈ）ＪＭ．、１９７９年。タンパク質抗原を摂取することによる特異的免疫応答の阻害。ＩＩ．前受動および能動免疫感作の効果。Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２２：２２６１２２６６）。
最も重要なことに、そして感染性病原体に対して免疫応答を誘導するための粘膜ワクチンから類推して、大部分の抗原の粘膜適用による全身性免疫寛容の誘導はかなりの量の寛容原／抗原を必要とし、そして寛容原／抗原を長期間にわたって反復投与しなければ持続期間が比較的短い。おそらくは、大部分の抗原は粘膜組織に入る前にほとんど分解されおよび／または不十分な量でしか吸収されないと説明される。したがって、既知の粘膜結合性を有する分子（粘膜結合性分子の例は以下の表Ｉに記載されており、ミアルマン（Ｍｉｒｅｌｍａｎ）Ｄ．、１９８６年。微生物レクチンおよび凝集素、性質および生物学的活性（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｌｅｃｔｉｎｓ  ａｎｄ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎｓ，Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ），８４〜１１０頁，ウィリー（Ｗｉｌｅｙ），ニューヨークなどの論評も参照されたい）のみが、経口経路などの粘膜経路によって投与された場合に、全身性免疫寛容を誘導することなく局所および全身性免疫応答を引き起こすことができると広範囲に仮定されている（デ・アイズプルア（ｄｅ  Ａｉｚｐｕｒｕａ）ＨＪ．およびラッセル・ジョーンズ（Ｒｕｓｓｅｌｌ−Ｊｏｎｅｓ）ＧＪ．、１９８８年。経口ワクチン接種。経口摂取によって免疫応答を引き起こすタンパク質のクラスの同定。Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６７：４４０〜４５１）。顕著な例は、これまでに知られている最も強力な粘膜免疫原の一つであり（エルソン（Ｅｌｓｏｎ）ＣＯ．およびイールディング（Ｅａｌｄｉｎｇ）Ｗ．、１９８４年。コレラ毒素による粘膜刺激後のマウスにおける汎化全身性および粘膜性免疫。Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３２：２７３６）、しかも経口経路によって無関係の抗原と一緒に同時投与された場合に、該抗原に対する全身性免疫寛容の誘導を妨げることもある（エルソン  ＣＯ．およびイールディング  Ｗ．、１９８４年。コレラ毒素はマウスにおいて経口寛容を引き起こさなかったし且つ無関係の抗原に対する経口寛容を破棄した。Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：２８９２）コレラ毒素である。
これらの知見に基いて、コレラ毒素またはその粘膜結合性フラグメントであるコレラ毒素Ｂサブユニットなどの粘膜結合性分子に結合した抗原の粘膜投与は、全身性寛容よりもむしろ局所および全身性免疫応答を誘導するための方策として提案されている（マッケンジー（ＭｃＫｅｎｚｉｅ）ＳＪ．およびホールジー（Ｈａｌｓｅｙ）ＪＦ．、１９８４年。粘膜性免疫応答を刺激する担体タンパク質としてのコレラ毒素Ｂサブユニット。Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：１８１８〜１８２４；ネドラド（Ｎｅｄｒｕｄ）ＪＧ．、リァン（Ｌｉａｎｇ）Ｘ．、ハーグ（Ｈａｇｕｅ）Ｎ．およびラム（Ｌａｍｍ）ＭＥ．、１９８７年。組合せ経口／鼻腔免疫感作は、センダイウイルス感染からマウスを防護する。Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３４８４〜３４９２；チェルキンスキー（Ｃｚｅｒｋｉｎｓｋｙ）Ｃ．、ラッセル  ＭＷ．、リッケ（Ｌｙｃｋｅ）Ｎ．、リンドブラド（Ｌｉｎｄｂｌａｄ）Ｍ．およびホルムグレン（Ｈｏｌｍｇｒｅｎ）Ｊ．、１９８９年。コレラ毒素Ｂサブユニットに結合した連鎖球菌性抗原の経口投与は、唾液腺および粘膜外組織において強い抗体応答を引き起こす。Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５７：１０７２〜１０７７；デ・アイズプルア  ＨＪ．およびラッセル・ジョーンズ  ＧＪ．、１９８８年。経口ワクチン接種。経口摂取によって免疫応答を引き起こすタンパク質のクラスの同定。Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６７：４４０〜４５１；レーナー（Ｌｅｈｎｅｒ）Ｔ．、ベルグマイアー（Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ）ＬＡ．、パナギオティディ（Ｐａｎａｇｉｏｔｉｄｉ）Ｃ．、タオ（Ｔａｏ）Ｌ．、ブルックス（Ｂｒｏｏｋｅｓ）Ｒ．、クラビンスキス（Ｋｌａｖｉｎｓｋｉｓ）ＬＳ．、ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）Ｐ．、ウォーカー  Ｊ．、ワード（Ｗａｒｄ）ＲＧ．ら、１９９２年。組換えサル免疫欠損ウイルスタンパク質に対する粘膜性および全身性免疫の誘導。Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５８（５０３６）：１３６５〜１３６９）。
発明の説明
粘膜結合性分子に結合した抗原の粘膜投与が局所および全身性免疫応答を引き起こすという確証された見解に対立するものとして、本発明者は、意外にも、各種粘膜性（経口、鼻内、膣、直腸）経路によって投与された抗原は、粘膜結合性分子に対して結合した場合、該抗原に対する全身性免疫寛容の誘導を促進したことを見出した。
したがって、本発明は、特定の寛容原に結合した粘膜結合性分子を含む免疫寛容誘導剤に関する。
ここにおいて、「免疫寛容」という用語は、１種類または複数の特定の寛容性のある抗原に対する宿主の免疫学的反応性の減少として定義される。このような寛容性のある抗原を本明細書および請求の範囲において寛容原と称し、これは確立された専門用語と一致している。
本発明の一つの実施態様において、前記粘膜結合性分子は、細菌毒素、細菌線毛、ウイルス付着タンパク質および植物レクチンの粘膜結合性構造に由来する粘膜結合性分子から選択される。好ましくは、細菌毒素の前記粘膜結合性構造は、コレラ毒素および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の非耐熱エンテロトキシンから成る群より選択される。好ましい実施態様において、前記粘膜結合性構造は、毒素（特に、コレラ毒素または大腸菌の非耐熱エンテロトキシンのＢサブユニット）の結合性フラグメントである。
本発明の免疫寛容誘導剤で用いることができる粘膜結合性分子のクラスおよび種類の例を表Ｉに記載する。
表Ｉ
粘膜結合性分子のクラスおよび種類の例
Ａ．  細菌毒素およびそれらの結合性サブユニットまたはフラグメント
例えば、
コレラ毒素、コレラＢサブユニット；
大腸菌非耐熱エンテロトキシン（ＬＴ）、ＬＴ  Ｂサブユニット；
百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）毒素、サブユニットＳ２、Ｓ３、Ｓ４および／またはＳ５；
ジフテリア毒素（ＤＴ）、ＤＴ  Ｂフラグメント；
シガ（Ｓｈｉｇａ）毒素、シガ様毒素およびＢサブユニット
Ｂ．  細菌線毛
例えば、
大腸菌；Ｋ８８、Ｋ９９、９８７Ｐ、Ｆ４１、ＣＦＡ／Ｉ、ＣＦＡ／ＩＩ、（ＣＳ１、ＣＳ２および／またはＣＳ３）、ＣＦＡ／ＩＶ（ＣＳ４、ＣＳ５および／またはＣＳ６）、Ｐ線毛等；
コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）毒素相互調節的線毛（ｔｏｘｉｎ−ｃｏｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｐｉｌｕｓ；ＴＣＰ）、マンノース感受性赤血球凝集素（ＭＳＨＡ）、フコース感受性赤血球凝集素（ＦＳＨＡ）等；
百日咳菌糸状赤血球凝集素；
Ｃ．  ウイルス付着タンパク質
例えば、
インフルエンザおよびセンダイウイルス赤血球凝集素
ＨＩＶ  ｇｐ１２０；
Ｄ．動物レクチンおよびレクチン様分子
例えば、
免疫グロブリン；
カルシウム依存性（Ｃ型）レクチン；
可溶性ラクトース結合性（Ｓ型）レクチン；
セレクチン；
コレクチン；
ヘリックス・ポマティア（Ｈｅｌｉｘ  ｐｏｍａｔｉａ）赤血球凝集素
Ｅ．  植物レクチン
例えば、
コンカナバリンＡ
コムギ胚芽凝集素
植物凝集素
アブリン
リシン
本発明のもう一つの実施態様において、本発明の免疫寛容誘導剤中の粘膜結合性分子に結合している特定の寛容原は、個体において望ましくない免疫応答を引き起こすハプテンを含む特異的抗原から選択される。本発明の好ましい実施態様において、該抗原は、タンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質および核酸から成る群より選択される。
言及された望ましくない免疫応答は、全身的抗体産生および／または遅延型過敏症に関係していることがあり、そしてしばしば、自己免疫疾患、アレルギー疾患、組織若しくは細胞移植片拒絶反応および／または急性若しくは慢性炎症反応若しくは障害に関係している。
本発明による免疫寛容誘導剤において、特定の寛容原および粘膜結合性分子は、互いに直接的にまたは間接的に結合している。
本発明の実施態様において、該寛容原および該粘膜結合性分子は、スペーサー分子；ハプテンを含めた該寛容原／抗原含有保護ビヒクル；または融合遺伝子若しくはヌクレオチド配列の発現に由来する、該スペーサー分子とハプテンを含めた該寛容原／抗原とのハイブリッド分子から成る群からのメンバーの助けによって互いに間接的に結合している。本発明の好ましい実施態様において、該スペーサー分子は、該寛容原または寛容原含有ビヒクルおよび該粘膜結合性分子のどちらかまたは両方に対して結合親和性を有する分子から選択される。このようなスペーサー分子の具体的な例は抗体である。本発明の好ましい実施態様において、スペーサー分子は、ガラクトシル−Ｎ−アセチル−ガラクトサミニル−（シアリル）−ガラクトシルグルコシルセラミドであるＧＭ１ガングリオシドのコレラ毒素結合性構造であるかまたはそれに由来している。
本発明の免疫寛容誘導剤中の粘膜結合性分子に特定の寛容原を結合させる方法は、該寛容原および該分子がそれぞれの機能を果たしうる限りにおいて重要ではない。したがって、それらは単純な化学的方法で互いに直接的に結合していてよい。コレラ毒素のＢサブユニット（ＣＴＢ）または大腸菌の非耐熱エンテロトキシン（ＬＴＢ）などのタンパク質を、脂質、ハプテン、炭水化物、核酸、更には、抗体および合成ペプチドを含む他のタンパク質に対して結合する化学的方法は、当該技術分野において周知である（例えば、カールソン（Ｃａｒｌｓｓｏｎ）Ｊ．ら、１９７８年。Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１７３：７２３〜７３７；カンバー（Ｃｕｍｂｅｒ）ＪＡ．ら、１９８５年。Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １１２：２０７〜２２４；ワルデン（Ｗａｌｄｅｎ）Ｐ．ら、１９８６年。Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：１９１〜１９７；ゴードン（Ｇｏｒｄｏｎ）ＲＤ．ら、１９８７年。Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８４：３０８〜３１２；エイブラミアス（Ａｖｒａｍｅａｓ）Ｓ．およびテルニンク（Ｔｅｒｎｙｎｃｋ）Ｔ．、１９６９年。Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６：５３；ジョセフ（Ｊｏｓｅｐｈ）ＫＣ．、キム（Ｋｉｍ）ＳＵ．、スティーバー（Ｓｔｉｅｂｅｒ）Ａ．、ゴナタス（Ｇｏｎａｔａｓ）ＮＫ．、１９７８年。Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：２８１５〜２８１９；ミドルブルック（Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ）ＪＬ．およびコーン（Ｋｏｈｎ）ＬＤ．（監修）、１９８１年。毒素およびホルモンの受容体媒介結合および内在化。アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、３１１〜３５０頁を参照されたい）。寛容原は、更に、ＣＴＢ（またはＬＴＢ）遺伝子に対して遺伝子融合させることができ（サンチェス（Ｓａｎｃｈｅｚ）Ｊ．、スヴェンナホルム（Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ）Ａ−Ｍ．およびホルムグレン（Ｈｏｌｍｇｒｅｎ）Ｊ．、１９８８年。コレラ毒素Ｂサブユニットに対する無毒性耐熱エンテロトキシン関連デカペプチド抗原の遺伝子融合。ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２４１：１１０〜１１４）、そして次に、得られたキメラ遺伝子を、細菌、酵母またはウイルスなどの適当な発現系において発現させることができる。或いは、寛容誘導剤は、粘膜結合性分子に対して化学結合し且つ粘膜経路によって投与される寛容原をコードしている核酸配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ）のフラグメントまたは合成ポリヌクレオチドを含むことができ、対応する遺伝子の成熟タンパク質中への転写および／または翻訳を確実にする宿主粘膜組織由来細胞の能力を利用することができる（ロールボー（Ｒｏｈｒｂａｕｇｈ）ＭＬ．およびマゴーン（ＭｃＧｏｗａｎ）ＪＪ．、１９９３年。ＨＩＶ−１感染の治療および予防のための遺伝子転移。Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６８５巻，６９７〜７１２頁；ナベル（Ｎａｂｅｌ）ＧＪ．およびフェルグナー（Ｆｅｌｇｎｅｒ）ＰＬ．、１９９３年。免疫療法および免疫感作のための直接遺伝子転移。Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１巻，５号，２１１〜２１５頁；ロビンソン（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）ＨＬ．、ハント（Ｈｕｎｔ）ＬＡ．、ウェブスター（Ｗｅｂｓｔｅｒ）ＲＧ．、１９９３年。赤血球凝集素発現プラスミドＤＮＡによる免疫感作による致死インフルエンザウイルス刺激に対する防御。Ｖａｃｃｉｎｅ  １１：９５７〜９６０；マーティノン（Ｍａｒｔｉｎｏｎ）Ｆ．、クリシュナン（Ｋｒｉｓｈｎａｎ）Ｓ．、レンゼン（Ｌｅｎｚｅｎ）Ｇ．、マグニ（Ｍａｇｎｅ）Ｒ．、ゴマード（Ｇｏｍａｒｄ）Ｅ．、ギレ（Ｇｕｉｌｌｅｔ）ＪＧ．、レヴィ（Ｌｅｖｙ）ＪＰ．およびムリーン（Ｍｅｕｌｉｅｎ）Ｐ．、１９９３年。Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：１７１９〜１７２２）。また他に提案された形は、リポソームなどの保護ビヒクルまたは、改良された寛容原効能のために粘膜表面に対して寛容原含有ビヒクルを効率よく結合させるように粘膜結合性物質を結合しているかまたは結合するであろう同等の生分解性ビヒクル中に寛容原またはその核酸前駆物質を組込むことでありうる。この種類の提案された形では、寛容原は遊離していてよいしまたは別の分子に結合していてよい。
本発明は、更に、個体において望ましくない免疫応答を引き起こすハプテンを含む特異的抗原に対して該個体において免疫寛容を誘導する方法であって、免疫学的有効量の本発明による免疫寛容誘導剤を該個体に対して粘膜経路によって投与することを含む上記方法に関する。個体において望ましくない免疫応答を引き起こし且つ本発明の免疫寛容誘導剤中で特定の寛容原を生成しうる具体的な抗原の例は、
合成ペプチドまたは対応する核酸遺伝情報を含むインスリンまたはそのフラグメントであり、そしてその本発明の免疫寛容誘導剤は、粘膜経路によって投与されてインスリンに対する免疫応答を妨げまたは抑制し、それによって自己免疫性糖尿病を予防するまたは治療することができ；
合成ペプチドまたは対応する核酸遺伝情報を含むミエリン塩基性タンパク質またはそのフラグメントであり、そしてその本発明の薬剤は、ミエリン塩基性タンパク質に対する免疫応答を妨げまたは抑制し、それによって多発性硬化症を予防するまたは治療するのに用いることができ；
一本鎖または二本鎖ＤＮＡであり、そしてその本発明の薬剤を投与して、疾患の免疫学的特徴が自己ＤＮＡに対する自己抗体の産生である全身性エリテマトーデスの予防および／または治療のために自己ＤＮＡに対する免疫応答を阻害することができ；
合成ペプチドまたは対応する核酸遺伝情報を含む抗体またはそのフラグメントであり、そしてその本発明の薬剤は、該抗体に対する免疫応答を妨げるのに用いることができ；該抗体はＩｇＧ分子またはそのフラグメントであってよく、そして寛容原としてＩｇＧ全体またはフラグメントを含む免疫寛容誘導剤は、自己ＩｇＧ分子と反応するリウマチ因子と称される自己抗体の存在を特徴とする慢性関節リウマチおよび関連症状の患者の場合と同様に、ＩｇＧ分子に対する免疫応答を妨げるまたは減少させるように粘膜経路によって投与することができ；
合成ペプチドまたは対応する核酸遺伝情報を含むγグロブリンまたはそのフラグメントであり、そしてその本発明の薬剤は、γグロブリンを静脈内注射する前のような好都合であると考えられる状況において該γグロブリンに対する免疫応答を妨げるまたは減少させるように粘膜経路によって投与することができ；
合成ペプチド若しくは対応する核酸遺伝情報を含む移植抗原若しくはそのフラグメント、または該移植抗原を発現する細胞、例えば、赤血球、血小板若しくはリンパ球であり、そしてその本発明の薬剤は、該移植抗原に対する免疫応答を妨げまたは減少させて、それによって同種移植片の拒絶を防止するようにおよび／またはその生存を延長するように粘膜経路によって投与することができ；
ブタクサ花粉などのアレルギー物質であり、そしてその本発明の薬剤は、該アレルギー物質に対する免疫応答を妨げおよび／または減少させて、それによってアレルギーを予防するまたは治療するように粘膜経路によって投与することができ；
合成ペプチドまたは対応する核酸遺伝情報を含む細菌毒素またはそのフラグメントであり、そしてその本発明の薬剤は、炎症および組織損傷を生じることがある全身部分において遭遇される該毒素に対する免疫応答を妨げるように粘膜経路によって投与することができ；このような場合の例は、内毒素（グラム陰性細菌によって生産されたリポ多糖群）およびある種の外毒素、例えば、ブドウ球菌エンテロトキシンの全身投与によって引き起こされた敗血症様毒素ショック症候群である。このような場合、本発明の薬剤中の粘膜結合性分子に結合した該毒素またはそのフラグメントの粘膜投与を用いて、組織損傷性免疫応答の発生を避けることができる。
実験
本発明を、粘膜結合性分子としてＣＴＢおよびＬＴＢ、並びに抗原／寛容原としてヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）およびヒトγグロブリン（ＨＧＧ）の使用によって例証する。本発明は、ＳＲＢＣまたはＨＧＧに対する寛容誘導に限定されないが、これらの抗原は、抗体生成に関しても、典型的な遅延型過敏症（ＤＴＨ）反応で代表される細胞性免疫反応に関しても最も特徴付けられた経口寛容原であるので、それぞれ粒子および可溶性抗原のモデルとして選択される。これらの種類の免疫反応は、自己免疫疾患、アレルギー反応、移植片拒絶および他の炎症症状の発生に関与している。本発明を更に、ＣＴＢに対して結合され且つ経口投与経路によって与えられた場合に実験的自己免疫性脳炎を抑制することができるミエリン塩基性タンパク質の使用によって、およびＣＴＢに対して結合され且つ経口によって与えられた場合に同種移植片生存を延長することができる同種異系マウス胸腺細胞の使用によって例証する。
以下の実験は、本発明を例証する目的で提供されるが、いずれにせよ発明の範囲を制限するものではない。
材料および方法
マウス：近交系Ｂａｌｂ／ｃ雌マウスは、スウェーデンのイェーテボリ大学、医学微生物学免疫学科動物管理施設（ｔｈｅ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）から入手された。６〜８週令のマウスを用いた。
粘膜結合性分子ＣＴＢおよびＬＴＢの精製：
組換え体コレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴＢ）は、コレラ毒素遺伝子を欠失したコレラ菌の突然変異株において生産され且つＣＴＢサブユニットをコードしているプラスミドによってトランスフェクトされた（サンチェス  Ｊ．およびホルムグレン  Ｊ．、１９８９年。ワクチン開発の基礎としてのコレラ菌におけるコレラ毒素Ｂサブユニットの過発現のための組換え体システム。Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：４８１〜４８５）。大腸菌非耐熱エンテロトキシンの組換え体Ｂサブユニット（ＬＴＢ）は、コレラ毒素遺伝子を欠失したコレラ菌の突然変異株において同様に生産され且つ大腸菌ＬＴＢをコードしているプラスミドによってトランスフェクトされた（ヒルスト（Ｈｉｒｓｔ）Ｔ．Ｒ．、サンチェス  Ｊ．、カパー（Ｋａｐｅｒ）Ｊ．Ｂ．、ハーディ（Ｈａｒｄｙ）Ｓ．Ｊ．Ｓ．およびホルムグレン  Ｊ．、１９８４年。大腸菌の非耐熱エンテロトキシンをコードするプラスミドを包含する菌株で研究されたコレラ菌による毒素分泌機序。Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：７７５２〜７７５６）。これらの実験系において、ＣＴＢおよびＬＴＢは、細菌増殖培地から分泌タンパク質として回収される。細菌培養物を８０００ｒｅｖ／分で２０分間遠心分離し、そして上澄みを集め且つ希ＨＣｌによってｐＨ４．５に調整した。ヘキサメタリン酸（最終濃度２．５ｇ／ｌ）を用いて２３℃で２時間沈澱させた後に８０００ｒｅｖ／分で遠心分離した後、ペレットを０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ８．０によって溶解させ、そして０．０１Ｍリン酸緩衝溶液ｐＨ７．２に対して透析した。次に、透析物を１５０００ｒｅｖ／分で遠心分離して残留する不溶性物質を除去し、そして０．２２μｍフィルター（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ベッドフォード、ＭＡ）を介する濾過によって上澄みを更に透明にした。最後に、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−１００（ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、スウェーデン）のカラムを介する標準的なゲル濾過クロマトグラフィーによってＣＴＢおよびＬＴＢを精製した。
ヒトγグロブリン（ＨＧＧ）の精製：
ＨＧＧは、ヒト血清のプールから、（ＮＨ4）2ＳＯ4（最終濃度４０％  容量：容量）の溶液による逐次的沈澱の後、リン酸緩衝溶液（０．２Ｍリン酸ナトリウム、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．５）によって予め平衡されたセファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）Ｓ−３００ＨＲ（ファーマシア、スウェーデン）のカラムでのゲル濾過クロマトグラフィーによって精製された。得られたＨＧＧ標品を１５ｍｇ／ｍｌまで希釈した。
ＣＴＢ結合ヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ−ＣＴＢ）の精製：
ヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）をアルセビア（Ａｌｓｅｖｉｅｒ′）溶液中において４℃で使用するまで貯蔵した。使用する前に、ＳＲＢＣをリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）（０．０１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を用いて３０００ｒｅｖ／分で１０分間の遠心分離によって３回洗浄した後、ＰＢＳ中にＳＲＢＣ  ５ｘ１０9個／ｍｌの細胞濃度で再懸濁させた。ＳＲＢＣに対するＣＴＢの結合を容易にするために、ＳＲＢＣを最初にＧＭ１ガングリオシドに対して結合させた。ＧＭ１ガングリオシド（シグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）、セント・ルイス、ＭＯ）３００ナノモル／ｍｌを含むＰＢＳの溶液を、ラトップ（ｒａｔｏｐ）ｐｆ  １：２（容量／容量）で充填されたＳＲＢＣに対して加え、そしてインキュベーションを振とう水浴中において３７℃で２時間行った。ＰＢＳによって３回洗浄して過剰のＧＭ１を除去した後、ＧＭ１被覆赤血球をＰＢＳ中にＳＲＢＣ  ５ｘ１０9個／ｍｌの濃度まで再懸濁させ、そして組換え体ＣＴＢ（サンチェス  Ｊ．およびホルムグレン  Ｊ．、１９８９年。ワクチン開発の基礎としてのコレラ菌におけるコレラ毒素Ｂサブユニットの過発現のための組換え体システム。Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：４８１〜４８５）（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）と混合した。振とう水浴中において３７℃で２時間インキュベーションしてＣＴＢをＧＭ１被覆ＳＲＢＣに対して結合させた後、赤血球懸濁液をＰＢＳによって２回洗浄して非細胞結合ＣＴＢを除去し、そして１ｘ１０10／ｍｌ（ＰＢＳ）の細胞濃度で再懸濁させた。ＣＴＢ分子がＧＭ１結合ＳＲＢＣに対して結合していて且つ追加のＧＭ１分子をなお結合することができることを確かめるために、プラスチックウェル上に固定されたＧＭ１を用いる固相赤血球吸着検定を用いた。赤血球懸濁液のアリコートを、０．１％（重量／容量）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（シグマ）を補足したＰＢＳ中において１％（充填された容量／容量）の最終濃度まで希釈し且つプラスチック微量滴定プレート（コスター（Ｃｏｓｔａｒ））のＧＭ１被覆Ｕ字型ウェルに加えた。周囲（２２℃）温度でインキュベーション後、ウェルの赤血球吸着の外観を調べた。検定の特異性は、ＧＭ１によって被覆されなかった対照ウェルにおける赤血球吸着の不存在によっておよび用量依存方式で赤血球吸着を妨げた赤血球とのインキュベーション中のＧＭ１被覆ウェルに対する細胞不含ＣＴＢの添加によって確証された。
ＬＴＢ結合ヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ−ＬＴＢ）の精製：
ＣＴＢに対するＳＲＢＣの結合について上記に記載の通りに、ＧＭ１被覆ＳＲＢＣ（ＧＭ１−ＳＲＢＣ  ５ｘ１０9個／ｍｌ）を組換え体ＬＴＢ（５０μｇ／ｍｌ）に対して結合させた。
ＣＴＢ結合ヒトγグロブリン（ＨＧＧ−ＣＴＢ）の精製：
ＣＴＢおよびＨＧＧをそれぞれ、Ｎ−スクシンイミジル（３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）（ファーマシア、ウプサラ、スウェーデン）（カールソン，Ｊ．、Ｈ．ドルーウィン（Ｄｒｅｗｉｎ）およびＲ．アクセン（Ａｘｅｎ）、１９７８年。タンパク質チオレーションおよび可逆タンパク質−タンパク質結合。Ｎ−スクシンイミジル（３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート：新規のヘテロ二価性試薬。Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１７３：７２３〜７３７．１）に対してそれぞれ１：５および１：１０のモル比で結合させた。ＳＰＤＰをＨＧＧに対して加え、混合物を２３℃で撹拌しながら３０分間インキュベートした。過剰のＳＰＤＰを、酢酸緩衝液（０．１Ｍ酢酸ナトリウム、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．５）によって平衡させたセファデックスＧ−２５のカラム（ファーマシア、スウェーデン）上のゲル濾過によって除去した。ＳＰＤＰ誘導体ＨＧＧをジチオトレイトール（ＤＴＴ）（最終濃度５０ｍＭ）によって２３℃で２０分間還元し、そして得られた標品を、リン酸緩衝溶液（０．２Ｍリン酸ナトリウム、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．５）によって平衡させたセファデックスＧ−２５のカラムに通過させて、過剰のＤＴＴおよびＳＰＤＰ誘導体ＨＧＧの還元の際に遊離したピリジン−２−チオンを除去した。ＣＴＢをリン酸緩衝溶液（０．２Ｍリン酸ナトリウム、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．５）中で２ｍｇ／ｍｌまで希釈し且つ上記にＨＧＧについて記載のようにであるが５：１のモル比（ＳＰＤＰ：ＣＴＢ）でＳＰＤＰによって誘導体にした。得られたＳＰＤＰ誘導体ＣＴＢを、同様の緩衝液中で平衡させたセファデックスＧ−２５のカラムに通過させて、過剰の未反応ＳＰＤＰを除去した。ＳＰＤＰ誘導体ＨＧＧおよびＣＴＢを等モル比で混合し且つ２３℃で１６時間インキュベートした。得られたＣＴＢ−ＨＧＧ結合体を、セファクリルＳ−３００のカラムを介するゲル濾過によって精製して遊離ＣＴＢおよび／またはＨＧＧを除去した。得られた結合体は、ＧM1（シグマ、セント・ルイス、ＭＯ）を固相捕捉系（スヴェンナホルム，Ａ．−Ｍ．およびＪ．ホルムグレン、１９７８年。ガングリオシド免疫吸着検定（ＧM1−エリザ（ＥＬＩＳＡ））法による大腸菌非耐熱エンテロトキシンの同定。Ｃｕｒｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１：１９〜２３）として、およびＣＴＢおよびＨＧＧに対する単クローン性および多クローン性抗体を検出試薬（以下を参照されたい）として用いるエリザによって、ＧM1ガングリオシド結合能力を有し且つＣＴＢおよびＨＧＧ両方の血清学的反応性を維持していることが分った。結合体並びに精製ＣＴＢ−およびＨＧＧ−ＳＰＤＰ誘導体の連続２倍希釈を、ＧＭ１ガングリオシドによって予め被覆されたポリスチレンウェル中で、およびＨＧＧに対するウサギ多クローン性ＩｇＧ抗体；次に、０．０５％トゥイーン２０含有ＰＢＳ中で適当に希釈された西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ウサギ抗ＨＧＧまたはマウス単クローン性抗ＣＴＢ抗体によって被覆されたウェル中でインキュベートし、そして酵素基質を連続的に加えて、固相に結合したＨＧＧおよびＣＴＢを検出した。遊離および結合ＨＧＧおよびＣＴＢの量は、既知の量のＳＰＤＰ誘導体抗原によって検定された標準曲線に関して決定された。概して、上記のＳＰＤＰ結合法および精製プロトコルは、無視しうる量の遊離ＨＧＧおよび１０％未満の遊離ＣＴＢを含む標品を生成した。
免疫感作プロトコル：
ＳＲＢＣによる免疫感作：
一次全身性感作：マウスの左後足裏に、ＳＲＢＣ１０7個を含む発熱物質不含食塩水４０μｌを注射した。
二次全身性感作：一次免疫感作から５日後に、マウスの右後足裏に、ＳＲＢＣ１０8個を含む発熱物質不含食塩水４０μｌを注射することによって刺激した。
ＨＧＧによる免疫感作：
免疫感作の前に、ＨＧＧを６３℃で３０分間加熱することによって凝集させた。
一次全身性感作：マウスに、フロイント完全アジュバント（ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）、セント・ルイス、ＭＯ）中に乳化させた凝集ＨＧＧ（５００μｇ）０．２ｍｌを与え、側腹部への皮下注射によって投与した。
二次全身性免疫感作：一次免疫感作から５日後に、マウスの右後足裏に、１ｍｇのＨＧＧを含む発熱物質不含食塩水４０μｌを注射することによって刺激した。
経口寛容誘導プロトコル：
ＳＲＢＣによる一次全身性免疫感作前または後の様々な時点で、１回用量または毎日の連続用量のＳＲＢＣまたはＳＲＢＣ−ＣＴＢをマウスに投与した。それぞれの用量は、乳児用カテーテル栄養管を用いて胃内経路によって与えられるＰＢＳ  ０．５ｍｌ中２．５ｘ１０9個のＳＲＢＣまたはＳＲＢＣ−ＣＴＢから成った。対照動物にはＰＢＳ  ０．５ｍｌのみを与えた。
ＨＧＧに対する寛容の誘導のために、マウスに、胃内経管によって投与される１回経口用量の非結合ＨＧＧまたはＣＴＢ結合ＨＧＧを、ＨＧＧによる一次全身性免疫感作の１週間前に与えた。非結合ＨＧＧ  １ｍｇおよび５ｍｇ並びにＣＴＢ結合ＨＧＧ  ６０μｇの用量を検査した。
遅延型過敏症（ＤＴＨ）反応の評価：
ＳＲＢＣに対するＤＴＨ：
右足裏の厚みを、ダイヤルゲージカリパーを用いて、二次全身性免疫感作の直前並びに２時間、４時間、２４時間および４８時間後に測定した（オディテスト（Ｏｄｉｔｅｓｔ）、Ｈ．Ｃ．ケプリン
0004447657.tif 000002
シュルフタン、エッセン、ドイツ）。ＤＴＨ反応の強さは、刺激前に得られた値を刺激後の様々な時点で得られた値から差し引くことによって個々の動物についてそれぞれ決定された。
ＨＧＧに対するＤＴＨ：
右足裏に注射されたＨＧＧに対するＤＴＨ反応の強さは、上記のＳＲＢＣの場合のように評価された。
血清抗体反応の評価：
血清抗ＳＲＢＣ抗体反応：
左足裏に投与されたＳＲＢＣによる一次全身性免疫感作の直前および二次全身性免疫感作の１〜２週間後に、血液試料を個々のマウスの尾部静脈から採取し且つ室温で６０分間凝固させた。血清を５６℃で４５分間加熱して補体を失活させた後、直接および間接赤血球凝集検定によってＳＲＢＣに対する抗体レベルを検定した。直接赤血球凝集反応用には、０．１％（重量／容量）ウシ血清アルブミンを補足したＰＢＳ（ＰＢＳ−ＢＳＡ）中の連続２倍希釈の血清試料を、微量滴定プレートのＵ底ウェル中で調製した。ＰＢＳ−ＢＳＡ中０．５％（充填された容量／容量）ＳＲＢＣ懸濁液５０μｌを全ウェルに加え、そしてプレートを周囲温度で１時間インキュベートした後、４℃で一晩中インキュベートした。次に、ウェルの赤血球凝集反応について調べた。
ＳＲＢＣに対して結合した非赤血球凝集抗体を検出するために、マウスＩｇＧおよびマウスＩｇＡに対する熱失活（５６℃４５分間）ウサギ抗血清の混合物を含むＰＢＳ２５μｌ（最終濃度１：５０）を、直接赤血球凝集検定において負の血清希釈に対応するウェルに加えた。次に、プレートを振とうさせてＳＲＢＣを再懸濁させ且つ４℃で２時間静かにインキュベートした。次に、ウェルの赤血球凝集反応について調べた。直接的にかまたは抗マウス抗血清の添加後に（間接赤血球凝集検定において）ＳＲＢＣの赤血球凝集反応を引き起こしたいずれかの与えられたマウス血清の最高希釈の逆数を決定し、そして前記マウス血清の抗ＳＲＢＣ抗体力価として定義した。
血清抗ＨＧＧ抗体反応：
ＨＧＧに対する血清ＩｇＭおよびＩｇＧ抗体レベルを、固相捕捉系としてＨＧＧによって並びに検出試薬としてマウスＩｇＧおよびマウスＩｇＭに対するＨＲＰ結合アフィニティー精製ヤギ抗体（サザン・バイオテクノロジー・アソシエーツ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）、バーミンガム、ＡＬ）によって被覆されたポリスチレンマイクロウェルを用いる標準的な固相エリザによって決定した。連続５倍希釈のマウス血清を、０．０５％トゥイーン２０含有ＰＢＳ中で調製し且つＨＧＧ被覆ウェル中において２３℃で２時間インキュベートした。０．０５％トゥイーン２０含有ＰＢＳによって５回洗浄後、適当に希釈されたマウスＩｇＭまたはＩｇＧに対するＨＲＰ抗体を加えた。２時間後、プレートをＰＢＳによって濯ぎ洗浄し、そしてクエン酸−リン酸緩衝液、ｐＨ５．０中に溶解したＡＢＴＳ錠剤（サザン・バイオテクノロジー・アソシエーツ）から成り且つＨ2Ｏ2を含む色素原基質を加えることによって固相結合酵素活性が示された。吸光度を自動分光光度計（タイタースキャン（Ｔｉｔｅｒｓｃａｎ）、フロー・ラボラトリーズ（Ｆｌｏｗ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））によって３０分後に監視した。マウス血清の抗ＨＧＧ抗体力価は、血清の代わりに緩衝液のみに暴露された対照ウェルの吸光度の少なくとも２倍の吸光度を与える最高希釈の逆数として定義された。
インビトロリンパ球増殖検定：
二次全身性免疫感作から２週間後に得られたリンパ節をイスコヴ（Ｉｓｃｏｖｅ′ｓ）培地（ギブコ・ヨロプ（Ｇｉｂｃｏ  Ｅｕｒｏｐｅ）、英国）中で切り刻み、滅菌ナイロンメッシュスクリーンを介して圧搾して単細胞懸濁液を生成した。５％熱失活ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、Ｌ−グルタミン（１％）、ピルビン酸ナトリウム（１％）、非必須アミノ酸（１％）、２−メルカプトエタノール（５ｘ１０-5Ｍ）およびゲンタマイシン（２０μｇ／ｍｌ）を補足したイスコヴ培地中で細胞を２回洗浄し且つ細胞２ｘ１０6個／ｍｌで再懸濁させた。リンパ節細胞を、全容量２００ｍｌ中に予め滴定された量のＳＲＢＣが入っている平底マイクロタイター（ヌンク（Ｎｕｎｃ）、デンマーク）ウェルに加えた。次に、プレートを空気中５％ＣＯ2中において３７℃で３日間インキュベートした。培養物を最後の１６時間中に3Ｈ−チミジン（２．０ｍＣｉ／ｍＭ、アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、ストックホルム）に暴露し、一つ一つのウェルを９６ウェル自動細胞採取器（イノテク（Ｉｎｏｔｅｃｈ）、バーゼル、スイス）を用いて採取し、そして放射性ヌクレオチド取込みをアルゴン活性化シンチレーション計数計（イノテク）によって測定した。
3Ｈ−チミジン取込み量は、刺激指数（Ｓ．Ｉ．）＝リンパ節細胞のＣＰＭ＋リンパ節細胞単独のＳＲＢＣ／ＣＰＭとして計算された。
実施例１
コレラ毒素のＢサブユニット（ＣＴＢ）に結合したヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）の経口投与による初期および後期遅延型過敏症（ＤＴＨ）反応の予防：
マウスに、１回用量のＳＲＢＣ−ＣＴＢ、ＳＲＢＣ単独または食塩水を摂取させ、それは、左後足裏に注射されたＳＲＢＣによる一次全身性免疫感作の１〜８週間前に与えられた。この注射の５日後に、右後足裏にＤＴＨ反応を引き起こすように刺激した。ＳＲＢＣ単独摂取のマウスで引き起こされたＤＴＨ反応の強さは、食塩水のみ摂取の対照マウスで記録された強さと同様であった（表２）。対照的に、粘膜結合性分子ＣＴＢに結合したＳＲＢＣを摂取したマウスで記録されたＤＴＨ反応は、記録された全ての時点においてかなり減少した。例えば、ＳＲＢＣによる刺激から２時間後に、すなわち対照（食塩水摂取のみ）動物で見られたＤＴＨ反応の初期ピークに対応する時点で、１回用量のＳＲＢＣ−ＣＴＢを予め摂取したマウスには足裏膨潤がなかった。更に、刺激後２４時間でピークに達するマウスでの後期ＤＴＨ反応は、食塩水摂取対照動物と比較してもＳＲＢＣ単独摂取動物と比較しても有意に減少した。
第２組の実験において、マウスに１回または毎日の連続用量のＳＲＢＣ−ＣＴＢまたはＳＲＢＣを摂取させた。最後の経口投与から１週間後、マウスは、左足裏に続いて５日後に右足裏にＳＲＢＣを全身性注射することによって上記のように感作され且つ刺激された。ＳＲＢＣの３〜４週間の毎日の経口投与は、ＣＴＢに結合したＳＲＢＣの１回投与によって達成されるのと同様のレベルまで２４時間ＤＴＨ反応を抑制するのに必要であることが分った（表３）。しかしながら、２０回もの４週間にわたるＳＲＢＣの連続摂取が、初期（２〜４時間）のＤＴＨ反応の発生に対して、１回用量のＣＴＢ結合ＳＲＢＣを摂取した動物によって見られる初期ＤＴＨ反応を生じることができなかった場合とは対照的に影響を与えなかったことは注目すべきである。
実施例２
免疫マウスにおけるコレラ毒素のＢサブユニット（ＣＴＢ）に結合したヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）の経口投与による初期および後期ＤＴＨ反応の阻止：
ＣＴＢ結合抗原の粘膜投与が、該抗原に対して予め全身的に感作された動物においてＤＴＨ反応を抑制するかどうかを確認するために、ＳＲＢＣをマウスの左後足裏に最初に注射して一次全身性免疫の状態を誘導した。４日後に、動物に１回経口用量のＣＴＢ結合ＳＲＢＣ、ＳＲＢＣ単独または食塩水を摂食させた。摂食して２日後に、動物の右足裏に２回目のＳＲＢＣ注射を行ってＤＴＨ反応を引き起こした。そのＤＴＨ反応を、この二次全身性免疫感作後の種々の時点で監視した。ＳＲＢＣを単独摂取したマウスは、食塩水のみを摂取した対照動物で見られるのと区別がつかないＤＴＨ反応を示したが、ＣＴＢに結合したＳＲＢＣを摂食したマウスは、ＳＲＢＣに対するかなり減少した初期および後期ＤＴＨ反応を示した。したがって、ＣＴＢに結合したＳＲＢＣの経口投与は、ＳＲＢＣに対して全身的に予め感作された（抗原刺激された）動物においても、全身的に注射されたＳＲＢＣに対する初期および後期両方のＤＴＨ反応の抑制を誘導しうると考えられる。
実施例３
コレラ毒素のＢサブユニット（ＣＴＢ）に結合したヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）の経口投与によるリンパ球増殖の阻止：
ＣＴＢ結合抗原の経口投与が、該抗原に対するリンパ節細胞の減少した増殖反応を引き起こすかどうかを確認するために、マウスに１回用量のＣＴＢ結合ＳＲＢＣ摂食させた後、左足裏にＳＲＢＣを注射した（一次全身性インビボ免疫感作）。１週間後、同種抗原（ＳＲＢＣ）に対するインビトロ暴露後に増殖するリンパ節細胞の能力を調べた。食塩水のみを摂食した対照動物および１回用量のＳＲＢＣを単独摂食した動物と比較して、ＣＴＢに結合したＳＲＢＣを摂食した動物からのリンパ節細胞は、ＳＲＢＣと一緒に培養された場合に減少した増殖反応を示した（表４）。この減少は、マイトジェンコンカナバリンＡに対するリンパ節細胞の増殖反応が、ＳＲＢＣ−ＣＴＢ、ＳＲＢＣまたは食塩水のみを摂取した動物において同様であったのと同程度で投与された抗原に特有であった（表４）。
実施例４
コレラ毒素のＢサブユニット（ＣＴＢ）に結合したヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）の経口投与による血清抗体反応の阻止：
ＣＴＢに結合した抗原の経口投与が、全身的に投与された抗原に対する減少した抗体反応を引き起こすかどうかを確認するために、マウスに１回用量のＳＲＢＣ−ＣＴＢ、ＳＲＢＣ単独または食塩水を摂食させ、これは、左後足裏に注射されたＳＲＢＣによる一次全身性免疫感作の１〜８週間前に与えられた。この注射から５日後に、右後足裏に刺激し、そして１週間後に尾部静脈から血液を採取した。ＳＲＢＣに対する血清抗体レベルを直接および間接赤血球凝集検定によって決定した。表５で見られるように、ＳＲＢＣに対する血清抗体反応は、食塩水のみまたは１回用量のＳＲＢＣのみを摂取した動物と比較して、１回用量のＳＲＢＣ−ＣＴＢを摂取した動物で減少した。ＳＲＢＣの３週間の毎日の経口投与は、全身的に投与されたＳＲＢＣに対する血清抗体反応を、ＣＴＢに結合したＳＲＢＣの１回投与によって達成されるのと同様のレベルまで抑制するのに必要であった（表５）。
実施例５
大腸菌非耐熱エンテロトキシンＢサブユニットのＢサブユニット（ＬＴＢ）に結合したヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）の経口投与による初期および後期ＤＴＨ反応の阻止：
もう一つの粘膜結合性分子である大腸菌非耐熱エンテロトキシンＢサブユニットのＢサブユニット（ＬＴＢ）に結合したＳＲＢＣの粘膜投与もまた、全身的に投与されたＳＲＢＣに対するＤＴＨ反応を抑制するかどうかを確認するために、マウスに１回用量のＳＲＢＣ−ＬＴＢまたは食塩水を摂食させ、これは、ＳＲＢＣによる一次足裏注射の１週間前に与えられた。比較するために、更に別の群のマウスにＳＲＢＣ−ＣＴＢを摂食させた。一次注射から５日後に、ＤＴＨ反応を引き起こすように全部のマウスの反対側の足裏にＳＲＢＣによって刺激した。刺激後２４時間に、ＳＲＢＣ−ＬＴＢを摂食したマウスで記録されたＤＴＨ反応は、食塩水摂食対照マウスと比較して有意に減少した（表６）。しかしながら、初期（２〜４時間）ＤＴＨ反応は、ＳＲＢＣ−ＬＴＢを摂食したマウスにおいて減少しなかった。これは、ＳＲＢＣ−ＣＴＢを摂取したマウスで記録された刺激後２〜４時間で存在しない且つ２４〜４８時間で有意に減少したＤＴＨ反応と対照的であった（表６）。これらの知見は、ＬＴＢに結合したＳＲＢＣの経口投与が、全身的に注射されたＳＲＢＣに対する後期ＤＴＨ反応の抑制を誘導しうるがこのような反応の初期成分には影響を及ぼさないことを示している。
実施例６
コレラ毒素のＢサブユニット（ＣＴＢ）に結合したヒトγグロブリン（ＨＧＧ）の経口投与によるＨＧＧに対する初期および後期遅延型過敏症（ＤＴＨ）反応の阻止：
ＣＴＢ結合抗原の粘膜投与が、可溶性タンパク質抗原に対するＤＴＨ反応を抑制するかどうかを確認するために、マウスに１回用量のＣＴＢ結合ＨＧＧ、ＨＧＧ単独または食塩水を摂食させた。これらは、別個の群のマウスに対して、皮下注射されたフロイント完全アジュバント中のＨＧＧによる一次全身性免疫感作の１週間前に与えられた。この注射から５日後に、ＤＴＨ反応を引き起こすように右後足裏にＨＧＧによって刺激した。ＨＧＧ  １ｍｇを単独摂食したマウスで引き起こされたＤＴＨ反応の強さは、刺激後の検査された全時点において食塩水のみを摂食した対照マウスでの強さと同様であった（表７）。ＨＧＧ  ５ｍｇ摂食マウスは２４〜４８時間においてＤＴＨ反応を減少させたが、これらの反応の初期（２〜４時間）の強さには影響がなかった。対照的に、１５μｇ程度のＣＴＢ結合ＨＧＧ、すなわち３００倍より少ない量のＨＧＧを摂食したマウスで監視されたＤＴＨ反応は同様の効果があり、より早い時間（２および４時間）ではなく２４時間において対照（食塩水摂食）動物での対応する反応よりも有意に低かった。しかしながら、ＣＴＢ結合ＨＧＧ  ６６μｇ摂取マウスは、記録された全時点でＤＴＨ反応をかなり減少させた。例えば、初期（２および４時間）および後期（２４〜４８時間）ＤＴＨ反応は、ＣＴＢ結合ＨＧＧ  ６６μｇを摂取したマウスにおいて事実上廃止された。これらの知見は、粘膜結合性分子ＣＴＢに結合した可溶性タンパク質抗原の少量の経口投与が、該タンパク質抗原による引続きの全身的注射に対する初期および後期両方のＤＴＨ反応の抑制を誘導しうることを実証している。
実施例７
ＣＴＢに結合したミエリン塩基性タンパク質の経口投与による実験的自己免疫性脳炎（ＥＡＥ）の抑制。
ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）の精製：
ＭＢＰは、デイブラー（Ｄｅｉｂｌｅｒ）ら（デイブラー  ＧＥ．、マルテンソン（Ｍａｒｔｅｎｓｏｎ）ＲＥ．、キース（Ｋｉｅｓ）ＭＷ．、１９７２年。数種類の哺乳動物種の中枢神経組織からのミエリン塩基性タンパク質の大規模製造。Ｐｒｅｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２：１３９〜１６５）によって記載のように、モルモット脊髄および脳から得られた。ＭＢＰの純度は、約２０ｋＤで単一バンドを示した標準ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドによって決定された。ＣＴＢに対してＨＧＧを結合するために記載されたのと同様の条件下のＳＰＤＰ法によってＭＢＰをＣＴＢに対して結合させた。結合された材料中のＭＢＰの存在は、ＦＣＡ中のＭＢＰによって免疫感作されたラットからの血清を用いるＧＭ１−エリザによって確認された。結合体中のＭＢＰおよびＣＴＢの相対比率は、抗ＭＢＰおよびＧＭ１を固相捕捉試薬として、並びに捕捉されたＭＢＰおよびＣＴＢをそれぞれ検出するためにＨＲＰ結合ラット抗ＭＢＰ抗血清およびマウス抗ＣＴＢ単クローン性抗体を用いる標準的な固相サンドイッチエリザ（ＭＢＰについて）およびＧＭ１−エリザ（ＣＴＢについて）によって平行して検定されたＣＴＢおよびＭＢＰの精製標品との比較によって決定された。
実験的自己免疫性脳炎（ＥＡＥ）の誘導：
ＥＡＥを誘導するために（キース  ＭＷ．、マーフィー（Ｍｕｒｐｈｙ）ＪＢ．、アルボード（Ａｌｖｏｒｄ）ＥＣ．、１９６０年。脳炎誘発活性によるモルモットタンパク質の分別。Ｆｅｄ．Ｐｒｏｃ．１９：２０７）、８〜１０週令（体重１７０〜２４０ｇ）の雌ルイスラット（ツェントラルインスティトゥート・フュア・フェアズフスティアツフト
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ハノーバー、ドイツ）の両後足裏に、エーテル麻酔下において、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）（ディフコ、デトロイト、ＭＩ、米国）中に乳化されたモルモットＭＢＰ（１：１、容量：容量）の全１００マイクログラム（すなわち、足裏につき約５０マイクログラム）を注射した。この注射後、動物３０日間毎日観察した。１日おきに、動物の臨床症状外観を調べ且つ体重を測定した。病気の強さは、標準的な臨床的等級付けシステム（ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）Ａ、リダー（Ｌｉｄｅｒ）Ｏ、アルサバー（ＡｌＳａｂｂａｇｈ）Ａ、ワイナー  ＨＬ、１９９２年。ミエリン塩基性タンパク質の経口投与による実験的自己免疫性脳脊髄炎の抑制。Ｖ．異種由来ミエリン塩基性タンパク質による抑制の順位関係。Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．３９：２４３〜２５０）を用いて決定された。
等級０：無症状
等級１：しまりのない尾
等級２：軽症の後足麻痺
等級３：足を外側に広げた重症の後足麻痩
等級４：４本全部の足裏が冒された完全な後足麻痺
等級５：死亡
経口寛容プロトコル：
ＭＢＰの足裏注射によるＥＡＥの誘導前に、別々の群の動物に以下の養生法を与えた。
群１：０．６Ｍ重炭酸塩緩衝液中のＭＢＰ  ２０マイクログラムおよびＣＴＢ
１００マイクログラムに相当するＭＢＰ−ＣＴＢ結合体０．５ｍｌをＭＢＰの足裏注射前の−７日に与えられる（以下０日と称する）；
群２：ＭＢＰ  ５ｍｇおよびＭＢＰのタンパク質分解を最小限にするためのダイズトリプシン阻害剤（ＳＴＩ）１０ｍｇを含む０．６Ｍ重炭酸塩緩衝液０．５ｍｌ（ホイッタカー  ＣＣ．、ジーナプ（Ｇｉｅｎａｐ）ＩＥ．、オロス（Ｏｒｏｓｚ）ＣＧ．、バイター（Ｂｉｔａｒ）Ｄ．、１９９１年。実験的自己免疫性脳炎における経口寛容。ＩＩＩ．クローンアネルギーの徴候。Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：２１５５〜６３）、ＭＢＰの足裏注射前の−１１日、−９日、−７日、−５日および−３日の５回の連続時点で；
群３：群２に規定した計画表による５回の連続時点に食塩水（対照）０．５ｍｌ；
群４：群２に記載の計画表による５回の連続時点にダイズトリプシン阻害剤（ＳＴＩ）１０ｍｇを含む０．６Ｍ重炭酸塩０．５ｍｌ。
ＣＴＢに結合したＭＢＰの経口投与によるＥＡＥの抑制：
５匹の成体雌ルイスラットから成る群には、ＦＣＡ中に乳化させたＭＢＰまたはＦＣＡのみを後足裏に注射した。ＭＢＰ＋ＦＣＡの足裏注射の１１日前、９日前、７日前、５日前および３日前に与えられるダイズトリプシン阻害剤（ＳＴＩ）を予め摂食した対照動物（群４）において、発症した神経学的症状は注射後１２日目または１４日目に最大であり、全動物が重症の麻痺を生じた（表８）。１回用量で投与される２０マイクログラム程度のＣＴＢ結合ＭＢＰを摂食した動物（群１）は、全く発症しない（５匹のラットの内の４匹）かまたは軽症（別のラットでの右後足裏不全麻痺に関連した一過性尾部不全麻痺）であった（表８）。５回の連続時点でＳＴＩと一緒にＭＢＰ  ５ｍｇ、すなわちＭＢＰ  ２５ｍｇ、すなわち群１の動物よりも１２５０倍高用量のＭＢＰを摂食した動物もまた、重症のＥＡＥ疾患の発症から防護された（群２）（表８）。したがって、少量のＣＴＢ結合ＭＢＰの経口投与はＥＡＥを抑制することができる。
実施例８
コレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴＢ）に結合した同種異系胸腺細胞の経口投与によるマウス同種移植片生存の延長。
マウス胸腺細胞とＣＴＢとの結合：
マウスリンパ球に対するＣＴＢの結合を促進するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）ハプロタイプＨ−２b）からの胸腺細胞を、最初に、胸腺細胞５ｘ１０7個と１０ナノモルＧＭ１ガングリオシドとを全容量０．５ｍｌのイスコヴ最小必須培地（ＩＭＥＭ）中において３７℃で２時間混合することによって、ＧＭ１ガングリオシドによる誘導体にした。次に、発熱物質不含滅菌食塩水によって細胞を３回洗浄して非結合ＧＭ１を除去し、そして最終容量０．５ｍｌ中においてＣＴＢ  ２５マイクログラムと一緒に３７℃更に２時間インキュベートした。最後に、細胞を食塩水で洗浄して非結合過剰ＣＴＢを除去し且つ使用まで氷上で維持した。ＧＭ１およびＣＴＢのこれらの濃度は、種々の量のＧＭ１によって誘導され且つ種々の濃度のテトラメチルローダミン標識ＣＴＢに対して暴露されたマウス胸腺細胞の流動血球計算分析によって決定される最大飽和の胸腺細胞を達成するのに必要であった（リスト・バイオロジカル・ラボラトリーズ・インコーポレーテッド（Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）、キャンベル、ＣＡ、米国）。
異所性マウス心臓移植片：
提供者心臓は、新生児（生後３６時間未満）Ｃ５７ＢＬ／６マウスから集められ、そして心室中隔に沿って切断された。半分の心臓をそれぞれ、６〜８週令のＢａｌｂ／ｃマウス（ＭＨＣハプロタイプＨ−２d）の片方の耳または両耳の背部の皮下ポケット中に挿入した。比較のために、別個の群のＢａｌｂ／ｃ受容者マウスに同系Ｂａｌｂ／ｃ新生児マウスからの心臓を与えた。移植片機能は、テクトロニクス（Ｔｅｋｔｒｏｎｉｘ）心臓鏡によって移植の電気活性を毎日測定することによって評価された。拒絶時間は、心筋収縮の完全な停止が生じた日として定義された。
経口寛容プロトコル：
同種移植片植込み前におよび／または後の種々の時点で、成体Ｂａｌｂ／ｃマウス受容者に乳児用カテーテル栄養管によって
−移植の３日前並びに１日後および４日後に与えられる新生児Ｃ５７ＢＬ／６マウスからの非結合胸腺細胞；
−移植の７日前、４日前、および１日前に与えられる新生児Ｃ５７ＢＬ／６マウスからの非結合胸腺細胞；
−移植の７日前、４日前、および１日前に与えられる新生児Ｃ５７ＢＬ／６マウスからのＣＴＢ結合胸腺細胞；
−移植直前（３０〜６０分間）に与えられる新生児Ｃ５７ＢＬ／６マウスからのＣＴＢ結合胸腺細胞；かまたは
−食塩水のみ
を含む０．５ｍｌ容量の発熱物質不含食塩水
を摂食させた。
コレラ毒素Ｂサブユニットに結合した同種異系胸腺細胞の経口投与によるマウス異所性心臓同種移植片の生存の延長：
Ｈ−２遺伝子座において組織不適合性の新生児Ｃ５７ＢＬ／６提供者マウスからの異所性心臓移植片を受容したＢａｌｂ／ｃマウスは、平均８週間以内にそれらの移植片を拒絶した（表９）。対照的に、Ｈ−２組織適合性心臓移植片を受容したマウスは、２か月間を越えて機能性移植を維持した。心臓同種移植片の植込み前（−７、−４および−１日）および／かまたは後（−３、＋１および＋４）の、提供者マウスと同種の新生児Ｈ−２組織不適合性マウスからの胸腺細胞の経口投与は、Ｂａｌｂ／ｃマウス受容者における移植片生存を延長しなかったし、多くの場合、減少させもしなかった（表９）。対照的に、同種移植片植込み前（−７、−４および−１日）の３回用量のＣＴＢ結合胸腺細胞の経口投与は、心臓移植片の生存を実質的に増加させた（平均５６％）（表９）。更に、移植直前に与えられた１回経口用量のＣＴＢ結合Ｃ５７ＢＬ／６胸腺細胞は、同種異系心臓移植のマウス受容者における移植片生存を延長した（平均３９％）（表９）。総合すると、これらの実験結果は、ＣＴＢを結合した組織不適合性リンパ球の経口投与が同種移植片生存を延長しうることを実証する。
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上記実施例から明らかであるように、本発明の免疫寛容誘導剤は、全身性免疫応答の誘導の抑制および発現の防止に有効である。更に、それは、経口誘導寛容の報告されたプロトコルによって必要であると考えられる抗原／寛容原の絶対量および／または投与回数を最小限にする。上記実施例から推論されるように、本発明の免疫寛容誘導剤は、初期および後期の遅延型過敏症反応、自己免疫疾患（実施例８）および同種移植片の拒絶反応（実施例９）に関係した炎症性免疫応答の発生を防止するまたは遅延させるのに用いることができる。