(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
(ａ)抗トロンビン−IIIを含む溶液に、１０から３０％の濃度のサッカライドと０.１から３Ｍの濃度のクエン酸塩を添加する；
(ｂ)不純物を沈殿させる；そして
(ｃ)沈殿不純物を除去し、それにより精製抗トロンビン−IIIを含む溶液を得る
段階を含む、抗トロンビン−IIIの精製法。
【請求項２】
サッカライドがモノサッカライドおよびジサッカライドからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
サッカライドがジサッカライドである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
サッカライドの濃度が１５から２５％である、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
サッカライドがスクロースである、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
クエン酸塩の濃度が０.５から１.５Ｍである、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
クエン酸塩の源がクエン酸ナトリウムである、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
得られた精製抗トロンビン−IIIを含む溶液の、安定化剤としての該サッカライドおよびクエン酸塩の存在下の滅菌段階が続く、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
更に凍結乾燥段階を含む、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
さらに再構築段階を含み、該再構築媒体が少なくとも０.０１％(w/w)の濃度の非イオン性界面活性剤である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
再構築媒体がポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
再構築媒体がポリソルベート２０、ポリソルベート２１、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート６１、ポリソルベート６５、ポリソルベート８０、ポリソルベート８１、ポリソルベート８５およびポリソルベート１２０のいずれか一つから選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
再構築媒体がポリソルベート８０である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
再構築媒体がソルビタン脂肪酸エステルである、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、抗トロンビン−III(ＡＴ−III)の、不純物の沈殿による精製法に関する。本発明はまた該方法により得られる医薬組成物にも関する。
【０００２】
背景技術
抗トロンビンIII(ＡＴ−III)は、セリンプロテアーゼを凝血カスケードにおいて阻害し、従って凝血の調節において重要な役割を担う、血漿糖タンパク質である。血中のＡＴ−III含量のわずかな減少が、血栓塞栓症の危険性の増加と関連する。ＡＴ−III濃縮物は後天的または遺伝的抗トロンビン欠乏症の患者における血栓塞栓症の予防および処置に使用されている。
【０００３】
一般に、ＡＴ−IIIはヒト血漿から単離され、患者の血流に投与される。結果として、ＡＴ−III濃縮物のウイルス不活性化が望まれる。ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)との沈殿が、タンパク質を濃縮するためおよびウイルスを沈殿させるために、ＡＴ−III精製において広く使用されている(例えば、Wickerhauser et al. (1979) Vox Sanguinis 36, 281参照)。ＰＥＧに加えて、また硫酸バリウム、エタノール、トリクロロ酢酸、デキストラン−およびアンモニウムスルフェートが、ＡＴ−IIIの精製中の沈殿剤として使用されている。多くのこれらの沈殿剤は、最終ＡＴ−III製剤に存在した場合、危険である。結果として、これらの薬剤の除去が必要であり、ＡＴ−IIIの回収率がそれにより減少する。
【０００４】
ＰＥＧ沈殿単独では肝炎ウイルスの完全な除去の保証に十分ではない。治療的使用のためのＡＴ−III濃縮物は、したがって、通常、＋６０℃で１０時間、通常、滅菌される。一般に、血漿タンパク質は熱処理中に活性を失う。この理由のため、安定化剤を滅菌中に使用する。
【０００５】
クエン酸塩およびスクロースのような炭水化物が滅菌中のＡＴ−IIIの安定化剤として使用されている(Mitra et al. (1982) Biotechnology and Bioengineering vol. XXIV, 97-107; Tengborn et al. (1987) Thrombosis Research 48, 701-711; Einarsson et al. (1989) Transfusion 29, 148-152)。しかし、これらの文献には、クエン酸塩およびサッカライドがＡＴ−IIIの精製における沈殿剤として使用できるという示唆はない。
【０００６】
ＡＴ−IIIの精製の最終段階として、製剤をしばしば凍結乾燥する。凍結乾燥ＡＴ−IIIの貯蔵寿命を延長させる種々の試みが成されている。
【０００７】
ＵＳ４,３４０,５８９(Uemura et al.)は、アミノ酸、サッカライド、ポリサッカライド等、より具体的にはアルブミン、ウロキナーゼ、ゼラチン、マンニトール、ヘパリン、グリシンおよびリジンから選択される少なくとも一つの物質で安定化した、ＡＴ−IIIの凍結乾燥調製物を記載する。
【０００８】
芦澤等(平成８年特許願第１９９５６６号)は、有機酸塩、サッカライド、アミノ酸および塩化ナトリウムから選択された１個以上の要素で安定化した修飾ＡＴ−IIIの凍結乾燥調製物を記載する。該有機酸塩は、琥珀酸ナトリウムまたはクエン酸ナトリウムである。該サッカライドはＤ−マンニトール、ラクトース、グルコースおよびＤ−ソルビトールである。この文献には、クエン酸塩をスクロースと組合わせて含む、凍結乾燥ＡＴ−III調製物の示唆はない。
【０００９】
多かれ少なかれ液体医薬調製物に伴う既知の問題は、製品をバイアルに充填した後のまたは凍結乾燥製品の溶液での再構築後の粒子(約２−７５μm)の形成である。特に、タンパク質のような大きな分子で作業する場合、比較的しばしば起こり、その原因の機構は明らかに理解されていない現象がある。恐らく、どのような量およびサイズの粒子が発生するかに影響する、製品の分子サイズ、製品の賦形剤、製品容器の材料および製品をその中に再構築する溶液を含む、因子の組合わせである。製品中のこの相対的に少ない量の粒子が危険であることは示されていない。しかし、全ての医薬製造者が、製品における粒子、特に目に見える粒子の量をできるだけ減少させることを目的としているのは明らかである。
【００１０】
本発明の記載
スクロースのようなサッカライドとクエン酸塩の組合わせが、ＡＴ−IIIの精製における、ウイルスおよびＡＴ−III以外のタンパク質を含む不純物の沈殿のための使用に有利であり得ることが、驚くべきことに判明した。本方法は、数個の利点を含む：
・本発明の沈殿段階は、高いウイルス不活性化、高い純度および最小限のＡＴ−III不活性化を確実にする。
・得られたＡＴ−III溶液は、更に安定化化合物の添加なしに直接滅菌に付すことができる。したがって、クエン酸塩とサッカライドの組合わせは、沈殿剤および滅菌中の安定化剤としての２つの目的を果たす。
・ＡＴ−IIIの精製中に更にサッカライドとクエン酸塩の薬学的に許容される組合わせを除去する必要がない。代わりに、この沈殿剤はまたＡＴ−IIIの凍結乾燥調製物の安定化剤としても有用である。
【００１１】
結果として、第１の態様において、本発明は：
(ａ)抗トロンビン−IIIを含む溶液に、該溶液における不純物は沈殿するが、抗トロンビン−IIIは本質的に溶液中に留まるのに十分な量でサッカライドとクエン酸塩を添加する；
(ｂ)不純物を沈殿させる；そして
(ｃ)沈殿不純物を除去し、それにより精製抗トロンビン−IIIを含む溶液を得る段階を含む、抗トロンビン−IIIの精製法を提供する。
【００１２】
本明細書において、“不純物”なる用語は、ＡＴ−IIIの精製中に使用した物質を含む、望ましくない物質を意味することを意図する(下記実施例１参照)。不純物は、例えば、ヒスチジン−リッチ糖タンパク質、ヘモペキシン(hemopexine)、リポタンパク質、ガンマグロブリン、トリトン−Ｘ−１００、トリ−ｎ−ブチルホスフェート、ウイルスおよびプリオンを含む。
【００１３】
本発明の方法に使用するＡＴ−IIIは、任意の適当な方法で得ることができ、哺乳類、例えばウシ、ブタ、または好ましくはヒト起源である。ＡＴ−IIIはまた、組換えＤＮＡ法によるような遺伝子操作により、またはトランスジェニック動物から、例えば、ＡＴ−IIIを乳中に産生するヒツジの乳から得られ得る。
【００１４】
起源に関係なく、ＡＴ−IIIは任意のイソ形、例えば、α−ＡＴ−IIIまたはβ−ＡＴ−IIIであり得、または任意のＡＴ−IIIの誘導体であり得る。α−ＡＴ−IIIとβ−ＡＴ−IIIの差は、例えば、Brennan et al. (FEBS Letters 219(2), 431-436, 1987)により記載されている。“ＡＴ−IIIの誘導体”なる用語は、ポリペプチドがＡＴ−IIIの生物学的活性を実質的に有する限り、例えば、置換、小欠失、挿入または介入のような修飾を担持するポリペプチドを意味する。
【００１５】
該サッカライドは、好ましくはスクロースまたはトレハロースのようなジサッカライド、またはグルコース、ソルビトール、マンニトール、グリコン酸またはマルトースのようなモノサッカライドである。スクロースが、体内におけるその有利なバイオアベイラビリティーのため、好ましい。
【００１６】
不純物の沈殿のために、サッカライドの濃度は約１０％(w/v)から約３０％(w/v)の範囲であり得る。好ましくは、サッカライド濃度は１５％から２５％(w/v)の間、最も好ましくは約２０％(w/v)である。
【００１７】
クエン酸塩の源はクエン酸または薬学的に許容されるその塩、例えば、アルカリ金属クエン酸塩およびアルカリ土類金属クエン酸塩であり得る。アルカリ金属クエン酸塩の例はクエン酸ナトリウムおよびクエン酸カリウムであり、一方アルカリ土類金属クエン酸塩の例はクエン酸マグネシウムおよびクエン酸カルシウムである。バイオアベイラビリティー、低価格および容易な取扱いの理由のため、クエン酸ナトリウムが好ましい。
【００１８】
不純物の沈殿のために、クエン酸塩の濃度は約０.１から約３Ｍの範囲であり得る。好ましくは、クエン酸塩濃度は０.５から１.５Ｍの間、最も好ましくは１Ｍから１.２５Ｍの間である。
【００１９】
不純物の沈殿の間、ｐＨは約６から約９の範囲であり得る。好ましくはｐＨは７から８の間、最も好ましくは中性(約７.５)である。沈殿は適当には＋１０℃から＋４０℃の温度、好ましくは＋１５℃から＋２５℃の間のような室温で行い得る。
【００２０】
好ましくは、クエン酸塩およびサッカライドは連続して、約３０分の間、撹拌下に溶液に添加する。この方法はサッカライドとクエン酸塩の濃度勾配を発生させる。不純物が沈殿剤の異なる濃度で沈殿する傾向を有するはずであるので、このような勾配は不純物の沈殿に最適である。沈殿剤のゆっくりした添加はまたクエン酸とサッカライドの高い局所濃度の危険性を少なくし、そしてそれによりＡＴ−IIIの沈殿の危険性を少なくする。
【００２１】
大規模製造のために、溶液を、適当には好ましくはサッカライドとクエン酸塩の最終濃度に到達した後、更に約１５分撹拌する。
【００２２】
沈殿不純物を、適当には溶液の濾過または遠心により除去する。典型的な濾過段階は、１−２０μmフィルターを通した予備濾過、続く０.２μmフィルターを通した滅菌濾過を含む。選択が遠心である場合、当業者はタンパク質精製の通常のテキストブックの助けにより適当な濃度を決定できるであろう。抗トロンビン−IIIを含む濾液または上清液体を次いで更なる処理に適当な形で回収する。
【００２３】
更なる態様において、本発明は、上記の沈殿段階の後に、精製抗トロンビン−IIIを含む得られた溶液の滅菌を、安定化剤としてのサッカライド、特にスクロースおよびクエン酸塩の存在下で行う、ＡＴ−IIIの精製の段階を含む。本発明の特に好ましい形において、既に添加された量のサッカライドとクエン酸塩が滅菌中の安定化剤として十分であり、結果として更なる安定化剤は添加しない。
【００２４】
更に別の態様において、本発明は上記のようなＡＴ−IIIの精製に関する工程を含み、加えて、安定化剤としてのサッカライド、特にスクロースおよびクエン酸塩の存在下の抗トロンビン−IIIの凍結乾燥を含む。沈殿および滅菌中の安定化のために先に使用したのと同じ薬剤が、簡便には凍結乾燥中の安定化剤としても使用できる。
【００２５】
当業者には、滅菌に続く更なる精製段階が、使用または凍結乾燥のために適した形でＡＴ−IIIを得るために望まれる可能性があることは理解されよう。このような段階は、例えば、任意の望ましい順番で：
・不活性化ＡＴ−IIIを除去するためのヘパリン−セファロース(登録商標)のような適当な媒体での親和性クロマトグラフィー；
・ＡＴ−IIIの濃縮および脱塩のための限外濾過；
・ウイルスの更なる除去のための濾過
を含み得る。
【００２６】
当業者は必要な更なる精製段階を、当分野で既知の方法により行うことができる。ＡＴ−III精製の例は下記実施例１に示す。
【００２７】
他の態様において、本発明は上記の方法により得ることができる医薬組成物を提供する。本発明の組成物は、更なる処理なしに液体調製物として使用し得る。しかし、投与前に、液体調製物を、適当には安定化剤の存在下、ＡＴ−IIIの乾燥により更に処理する。乾燥の適当な方法は、凍結乾燥である。乾燥のための他の可能性のある方法は、例えば、真空濃縮を含む。
【００２８】
結果として、本発明の好ましい形において、組成物は、既知のＡＴ−III組成物と比較して増加した安定性(延長した貯蔵寿命)を有する凍結乾燥ＡＴ−III組成物である。該組成物は(ｉ)抗トロンビン−III；および(ii)安定化剤としてのスクロースおよびクエン酸塩を含む。本組成物が、所望により更なる薬学的に許容される賦形剤および／または担体、例えば塩、例えば塩化ナトリウム；アミノ酸、例えばリジン、アラニン、グリシンまたはヒスチジン；界面活性剤、例えば、商品名Tween-80(登録商標)として既知のポリソルベート８０；およびポリエチレングリコール(ＰＥＧ４０００)またはグルコン酸のような他の賦形剤を含むことは当業者には理解されよう。
【００２９】
本発明の凍結乾燥ＡＴ−III組成物の製剤のために、安定化剤の所望の量を、適当な濃度を有するＡＴ−III(５０から１０００IU／ml、または５から２００mg／ml)の水性溶液に溶解、または好ましくはダイアフィルトレーションする。溶液のｐＨは６から９の間、好ましくは７から８の間に調節しなければならない。溶液を次いで滅菌濾過し、管状ガラスボトルのようなバイアルに充填し、凍結乾燥する。
【００３０】
組成物中のスクロースの相対的量は好ましくは抗トロンビンの重量部当り０.５から２.５、より好ましくは１.０から１.５重量部である。クエン酸塩、好ましくはクエン酸ナトリウムの相対的量は、好ましくは抗トロンビンの重量部当り１から４、より好ましくは２.５から３.０重量部である。
【００３１】
本発明のＡＴ−III組成物は、更に、アルブミンのような血漿由来タンパク質の添加無しで安定であることにより特徴付けられる。更なる血漿由来タンパク質が不存在であることは、本発明の組成物の純度およびウイルス安全性を増加させる。
【００３２】
本発明の医薬組成物を血栓塞栓症疾患に罹患した患者の処置に使用する場合、凍結乾燥調製物を生理的等張塩溶液または滅菌水に、例えば、０.５から２０％(w/v)ＡＴ−IIIとなるように溶解できる。溶液を全身作用を得るために静脈内に投与できる。しかし、また溶液を、例えば、冠状動脈のバルーン手術の間の局所作用を得るために、投与することも可能である。
【００３３】
上記のように、多かれ少なかれ液体医薬調製品に伴う問題は、バイアルに製品を充填した後に、特に凍結乾燥製品の再構築後に発生する目に見える粒子(約２−７５μm)の形成である。したがって、本発明の更なる目的は、本質的にこのような目に見える粒子がない再構築製品を得ることである。
【００３４】
本発明の発明者は、再構築製品への少なくとも０.０１％(w/w)の量の非イオン性界面活性剤の添加が、３ヶ月までの期間、本質的に目に見える粒子および望ましくない粒子がない再構築ＡＴ−III製品を提供することを、驚くべきことに発見した。非イオン性界面活性剤は、好ましくはポロキサマーのようなブロックコポリマー、またはポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、好ましくは商品名Tween80(登録商標)として既知のポリソルベート８０(ポリオキシエチレン２０ソルビタンモノオレエート)から、再構築媒体として選択する。任意のタイプのポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルを、それが薬学的におよび薬理学的に許容可能である限り、本発明にしたがった再構築媒体として使用し得る。本発明に従った使用に適したこのようなポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルの更なる例は、Tween20(登録商標)としても既知のポリソルベート２０(ポリオキシエチレン２０ソルビタンモノラウレート)；商品名Tween21(登録商標)としても既知のポリソルベート２１(ポリオキシエチレン(４)ソルビタンモノラウレート)；商品名Tween40(登録商標)としても既知のポリソルベート４０(ポリオキシエチレン２０ソルビタンモノパルミテート)；商品名Tween60(登録商標)としても既知のポリソルベート６０(ポリオキシエチレン２０ソルビタンモノステアレート)；商品名Tween61(登録商標)としても既知のポリソルベート６１(ポリオキシエチレン(４)ソルビタンモノステアレート)；商品名Tween65(登録商標)としても既知のポリソルベート６５(ポリオキシエチレン２０ソルビタントリステアレート)；商品名Tween81(登録商標)としても既知のポリソルベート８１(ポリオキシエチレン(５)ソルビタンモノオレエート)；商品名Tween85(登録商標)としても既知のポリソルベート８５(ポリオキシエチレン２０ソルビタントリオレエート)；および商品名Crillet6(登録商標)としても既知のポリソルベート１２０(ポリオキシエチレン２０ソルビタンモノイソステアレートである。このようなポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルは、本明細書に引用して包含させるHandbook of pharmaceutical excipients, 3rd edition, pp. 416-419, Arthur H Kibble編に記載されている。
【００３５】
本発明に従って有用な適当な界面活性剤の更に別のタイプは、ソルビタン脂肪酸エステルである。任意のタイプのソルビタン脂肪酸エステルを、それが薬学的におよび薬理学的に許容可能である限り、本発明にしたがった再構築媒体として使用し得る。本発明に従った再構築媒体として有用な適当なソルビタン脂肪酸エステルは、本明細書に引用して包含させるHandbook of pharmaceutical excipients, 3rd edition, pp. 511-514, Arthur H Kibble編に記載されている。
【００３６】
実験法
ＡＴ−IIIの生物学的活性(IU／ml)を、ヘパリンとＡＴ−IIIの存在下、トロンビンによる色原性基質Ｈ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｉｐ−Ａｒｇ−ｐＮＡ２ＨＣｌ(Chromogenix, Sweden)の開裂の追跡により、ヘパリン共同因子活性として測定した。Frantzen Handeland et al. (Scand. J. Haematol. 31, 427-436, 1983)およびvan Voorhuizen et al. (Thromb. Haemostas. 52(3), 350-353, 1984)参照。
【００３７】
総タンパク質濃度を２８０nmの吸光度測定(Ａ２８０)により測定した。ＡＴ−III溶液の濃度(mg／ml)を、６.４IU／mg  ＡＴ−IIIの吸光率を使用して計算した。
【００３８】
ＡＴ−IIIの特異的活性を、IU／mlとして計算したヘパリン共同因子とＡ２８０の間の比率として定義した。
【００３９】
ＡＴ−IIIのダイマーおよびポリマーの含量は、１０μM粒子およびプレカラム(Toyosoda)を備えたTSK G 3000 SWカラム(Toyosoda)での高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)ゲル濾過により測定した。
【００４０】
不純タンパク質の量を、標準条件を使用した抗全ヒト血清に対する交差免疫電気泳動により測定した。
【００４１】
再構築した液体医薬製品に本質的に目に見える粒子がないかを測定するために、サンプルを、レーザー源が光を通過させ、光センサーが通過する粒子を検出するものである検出器に通す。この原則は、いわゆる“光遮断原則”である。光センサーからの増幅したインパルスを粒子カウンター(Hiac Royco)により集め、その後粒子サイズおよび量に変換させる。
【００４２】
実施例
実施例１：ヒト血漿からの凍結乾燥ＡＴ−IIIの調製
段階１．血漿の沈殿。Cohn et al. (J. Am. Chem. Soc., 72, 465, 1950)に記載のように、ヒト血漿を冷却沈降させ、遠心分離物１を、８％エタノールでｐＨ７.２で得られた溶出液を沈殿させ、溶出液を回収することにより得る。
【００４３】
段階２．親和性クロマトグラフィー。遠心分離物１を、０.００１Ｍ  Ｎａ２ＰＯ３、０.１５Ｍ  ＮａＣｌで、中性ｐＨで平衡化したヘパリン−セファロース(登録商標)(ＨＳ)ゲルで処理する。ＨＳゲルは約１０−１５IU  ＡＴ−III／mlを結合する。ゲルを０.４Ｍ  ＮａＣｌ、０.０１Ｍ  Ｎａ２ＰＯ３、ｐＨ７.８で洗浄し、次いでＡＴ−IIIを２Ｍ  ＮａＣｌ、０.０１Ｍ  Ｎａ２ＰＯ３、ｐＨ７.８で溶出する。
【００４４】
段階３．限外濾過。ＡＴ−III溶出液を、０.０５Ｍ  Ｎａ２ＰＯ３、ｐＨ７.５での限外濾過により濃縮し、脱塩する。
【００４５】
段階４．Ｓ／Ｄ処理。ＡＴ−III濾液を、１％(w/w)トリトンＸ−１００および０.３％(w/w)トリ−ｎ−ブチル−ホスフェート(ＴＮＢＰ)で、New York Blood Centerで開発された溶媒／界面活性剤(Ｓ／Ｄ)技術にしたがって処理する(欧州特許ＥＰ−Ａ−０２３９８５９参照)。溶媒および界面活性剤を５％(w/w)ダイズ油での抽出により部分的に除去する。
【００４６】
段階５．沈殿。４０％スクロース、２.２Ｍクエン酸ナトリウム、０.０５Ｍ  Ｎａ２ＰＯ３、ｐＨ７.５含有沈殿緩衝液を、室温で、溶液に連続して３０分間、最終濃度２０％(w/v)スクロースおよび１.１Ｍクエン酸ナトリウムまで添加する。溶液を更に１５分撹拌し、沈殿を傾捨により除去し、集めた上清を、連続して結合した以下のフィルターで濾過する：２０−２μm(Pall)＋０.４５／０.２２μm(Sartorius)。この段階はウイルス；望ましくないタンパク質；および残った溶媒および界面活性化合物の除去を意図する(ＷＯ９４／２６２８７参照)。
【００４７】
段階６．滅菌。ウイルスを不活性化するために、ＡＴ−III調製物を１０時間、６０℃で滅菌する。滅菌は窒素ガス圧および連続した撹拌下で行う。滅菌中、２０％(w/v)スクロースおよび１.１Ｍクエン酸ナトリウムは、熱不活性化に対してＡＴ−IIIを安定化するために働く。
【００４８】
段階７．親和性クロマトグラフィー。濾液を水で１／１１に希釈する。ヘパリン−セファロースでの親和性クロマトグラフィーを繰り返し、滅菌中に不活性になったＡＴ−IIIを分離する。ヘパリン−セパロースクロマトグラフィーは段階２に記載のように行う。
【００４９】
段階８．限外濾過。ＡＴ−III溶出液を、０.１２Ｍ  ＮａＣｌ、０.００１Ｍ  Ｎａ２ＰＯ３、ｐＨ７.４で限外濾過することにより濃縮および脱塩する。
【００５０】
段階９．ウイルス濾過。ウイルス濾過を、ＷＯ９６／００２３７に記載のような“デッドエンド”技術を使用して、ＮａＣｌを１Ｍの濃度までＡＴ−III溶液に添加し、その後、Viresolve(登録商標)/70(Millipore)を通して濾過することにより行う。
【００５１】
段階１０．限外濾過および凍結乾燥。精製溶液を、０.２２mol／kgクエン酸ナトリウム、０.０７mol／kgスクロース、１.５mmol／kgクエン酸、ｐＨ７.０で限外濾過して濃縮および脱塩し、バイアルに充填し、凍結乾燥する。得られた凍結乾燥組成物はＡＴ−III  mg当り２.８mgクエン酸ナトリウムおよび１.３mgスクロースを含む。
【００５２】
血漿からのＡＴ−IIIの総回収率は約６０％である。得られた凍結乾燥ＡＴ−III濃縮物の９５％以上のタンパク質内容物がＡＴ−IIIである。更に、存在するＡＴ−IIIタンパク質は９５％以上の活性ＡＴ−IIIを含み、即ち、５％未満が不活性ＡＴ−IIIである。ＡＴ−III濃縮物は、ウイルスの除去および／または不活性化を指示する段階４、６および９のため更にウイルスセーフである。加えて、段階１、２、５および７が、ある程度のウイルスの不活性化または除去をもたらす。
【００５３】
実施例２：沈殿段階におけるウイルス不活性化
沈殿段階のウイルス除去効果をウイルス試験により測定した。本試験はその小さいサイズ(２０−２５nm)のために最も除去が困難なウイルスである、パルボウイルスで行った。
【００５４】
ＡＴ−IIIの溶液はパルボウイルスで汚染され、実施例１の沈殿段階、段階５を行った。溶液をパルボウイルス含量に関して、実施例１の段階５の前および後で分析した。結果は、沈殿段階が、少なくとも１０２の係数までパルボウイルスの含量を減少させることを示す。
【００５５】
実施例３：沈殿段階における精製および収率
不純物を含むＡＴ−IIIの溶液を２つのアリコートに分けた。一つはイオン交換クロマトグラフィー(CM-Sephrose(登録商標)、Amersham Pharmacia Biotech)に、一つは実施例１、段階５の沈殿段階に付した。精製段階の前および後に、アリコートをヘパリン共同因子活性およびＡＴ−III含量に関して分析した。表Ｉに示す結果は、両方の方法がＡＴ−III溶液に精製効果を有することを示す。残っているヘパリン共同因子活性として測定した収率は、沈殿段階のほうが幾分高かった。
【表１】
0004521143.tif 000002
【００５６】
実施例４：種々の沈殿剤の効果
ＡＴ−III溶液における不純物の沈殿に対する種々の塩の能力を測定した。実施例１、段階４で得たＡＴ−III溶液に、種々の塩を中性ｐＨおよび室温(＋２３℃)で添加した。沈殿(あれば)を除去し、上清溶液の特異的活性を測定した。
【００５７】
“精製”は、標準として１.２５Ｍクエン酸ナトリウムおよび２０％スクロース(“Ａ280inv”)で得たタンパク質濃度を使用して計算した。“精製係数”は、各サンプルについてＡ２８０の塩の添加前および塩を測定(各々“Ａ280ref”および“Ａ280sample”)し、式Ａ280ref(sample)−Ａ280sample×１００／Ａ280ref(inv)−Ａ280inv
を使用して得た。
【００５８】
結果として、精製係数０は不純物の沈殿がなかったことを示す。種々の塩で得られた精製係数を表IIに示す。
【００５９】
回収は、残った活性の割合(％)として測定した。回収率は全サンプルに関して９０％以上であった。したがって、結果は優れた精製および高回収率が、クエン酸ナトリウムおよびスクロースを使用して得られることを示す。
【００６０】
【表２】
0004521143.tif 000003
【００６１】
実施例５：凍結乾燥ＡＴ−IIIの安定性
種々の安定化剤で、＋２５℃または＋３７℃で、３または１２ヶ月の貯蔵中のＡＴ−IIIの安定性における効果を試験した。表IIIからVIに示す結果は、組合わせたクエン酸ナトリウムとスクロースが、ＡＴ−IIIの安定性に有利な効果を有することを示す。
【００６２】
凍結乾燥ＡＴ−IIIの安定化剤としてのクエン酸ナトリウムとスクロースの有利な組合わせは、ＡＴ−IIIの重量部当りクエン酸ナトリウム２.８重量部およびスクロース１.２重量部である。
【００６３】
【表３】
0004521143.tif 000004
【表４】
0004521143.tif 000005
【表５】
0004521143.tif 000006
【表６】
0004521143.tif 000007
【００６４】
実施例６：ＡＴ−IIIの凍結乾燥組成物の調製
２.８％(w/v)クエン酸ナトリウムおよび１.２％(w/v)スクロースを、ＡＴ−IIIの１％(w/v)水溶液に添加した。ｐＨを７.０に調節し、溶液を滅菌濾過し(Millipore)、バイアルに充填し、凍結乾燥させた。
【００６５】
実施例７：本発明の製剤とアルブミン含有ＡＴ−III製剤の比較
抗トロンビン−IIIを実施例１に従って精製した。二つの製剤を下記のように製剤した：
製剤Ａ：
１２５IU／ml抗トロンビン；０.４mgクエン酸ナトリウム／IU抗トロンビン；１μgクエン酸／IU抗トロンビン；０.２mgスクロース／IU抗トロンビン；ｐＨ７.０。
製剤Ｂ：
１２５IU／ml抗トロンビン；０.２mg塩化ナトリウム／IU抗トロンビン；０.２mgアルブミン／IU抗トロンビン；１μgリン酸ナトリウム／IU抗トロンビン；４μgアセチルトリプトファン／IU抗トロンビン；３μgカプリル酸ナトリウム／IU抗トロンビン；ｐＨ７.０。
【００６６】
サンプルを滅菌濾過し、管状ガラスボトルに、滅菌条件下で充填し、凍結乾燥した。ボトルを真空下で密閉し、その直ぐ後に分析した。
表VIIおよびVIIIに示す結果は、本発明の製剤Ａが、製剤Ｂと比較した場合、ＡＴ−III安定性に有利な効果を有することを示す。
【００６７】
【表７】
0004521143.tif 000008
【表８】
0004521143.tif 000009
n.d.  検出せず
【００６８】
実施例８：本発明の実施例７におけるＡＴ−III製剤の再構築後の、異なる再構築媒体の粒子の形成を阻害する能力の比較
実施例７の製剤Ａにしたがった抗トロンビン(５００IU)の凍結乾燥ボトルを、５０IU／mlに、以下の再構築媒体で再構築した(全ての媒体を使用前に滅菌濾過(Millipore)した)：
ａ)注射用水
ｂ)０.１５Ｍ塩化ナトリウム
ｃ)０.０２５Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７.４
ｄ)０.０１％ポリソルベート８０(Tween80(登録商標))
ｅ)０.１５Ｍリジン、ｐＨ７.４
ｆ)０.１５Ｍグリシン
ｇ)０.１５Ｍアラニン
【００６９】
ボトルを２２℃で２４時間静置し、次いで粒子の形成に関して目視検査した。粒子が検出されなかった唯一の媒体は０.０１％ポリソルベート８０(Tween80(登録商標))であり、残りの全ては同様の量の粒子発生であった。
【００７０】
実施例９：本発明の実施例７におけるＡＴ−III製剤の再構築後の、異なる濃度のポリソルベート８０(Tween80(登録商標))の粒子の形成を阻害する能力の比較
実施例７の製剤Ａの抗トロンビン(５００IU)の凍結乾燥ボトルを、以下の異なる濃度のポリソルベート８０(Tween80(登録商標))で５０IU／mlに再構築した(全ての媒体を使用前に滅菌濾過(Millipore)した)：
ａ)０.０１００％(w/w)ポリソルベート８０(Tween80(登録商標))
ｂ)０.００５０％(w/w)ポリソルベート８０(Tween80(登録商標))
ｃ)０.００１０％(w/w)ポリソルベート８０(Tween80(登録商標))
ｄ)０.０００１％(w/w)ポリソルベート８０(Tween80(登録商標))
ｅ)注射用水
【００７１】
ボトルを２２℃で静置させ、粒子の形成に関して、０時間、２時間、１６時間、４２時間、５日、１１日、１ヶ月、２ヶ月および３ヶ月後に目視検査した。
【表９】
0004521143.tif 000010
−粒子は検出されなかった
＋幾分粒子が検出された
＋＋粒子が検出された
＋＋＋大量の粒子が検出された
【００７２】
粒子が３ヶ月後に検出されなかった唯一の再構築媒体は０.０１％ポリソルベート８０(Tween80(登録商標))であり、残りの全てで幾分または大量の粒子が検出された。
【００７３】
実施例１０：本発明の実施例７におけるＡＴ−III製剤の再構築後の、０.０１％ポリソルベート８０(Tween80(登録商標))と水の粒子の形成を阻害する能力の比較
実施例７の製剤Ａの抗トロンビン(５００IU)の凍結乾燥ボトルを、０.０１％ポリソルベート８０(Tween80(登録商標))および注射用水で５０IU／mlに再構築した(全ての媒体を使用前に滅菌濾過(Millipore)した)。ボトルを２２℃に２４時間静置し、ついで粒子カウンター(Hiac Rpyco)を使用して粒子を計数し、サイズを決定した：
【表１０】
0004521143.tif 000011
【００７４】
上記表に示されるように、主阻害対象である目に見える粒子(２０μm以上)は、本発明の製品を０.０１％(w/w)ポリソルベート８０(Tween80(登録商標))で再構築した場合、完全に阻害された。