(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
インスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートの合成方法であって、
（ａ）インスリンのＡ鎖及びＢ鎖と、リーダーペプチドと、
前記Ａ鎖及びＢ鎖を互いに接続する非インスリン連結ポリペプチド又はアミノ酸残基と
を含むプロインスリンポリペプチドと、
親水性成分及び／又は親油性成分を含むオリゴマーとを、前記プロインスリンポリペプチドへ前記オリゴマーを結合させてプロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを得るのに十分な条件下で接触させるステップと、ここで、リーダーペプチドを含み、前記Ａ鎖及びＢ鎖が非インスリン連結ポリペプチド又はアミノ酸残基により接続された前記プロインスリンポリペプチドは、
（１）Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｂ鎖−Ａｒｇ−Ａ鎖
（２）Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｂ鎖−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａ鎖
（３）リーダーペプチド−Ａｒｇ−Ｂ鎖−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａ鎖
（４）リーダーペプチド−Ａｒｇ−Ｂ鎖−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａ鎖
であり、
（ｂ）前記プロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートから一以上の非インスリンポリペプチド及び／又はアミノ酸残基を切断して、インスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを得るステップと
を含む、方法。
【請求項２】
（ｃ）前記プロインスリンポリペプチドは、そのインスリンポリペプチド部分上に一以上のコンジュゲーション部位を含み、
（ｄ）ステップ１（ａ）は、そのインスリンポリペプチド部分上に一以上のオリゴマーを含むプロインスリンポリペプチド−オリゴマーを産生する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ１（ａ）は、プロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを産生し、非インスリンポリペプチドはコンジュゲートではない、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記オリゴマーは脂肪酸であり、ステップ１（ａ）は脂肪酸によるアシル化を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
（ｃ）前記プロインスリンポリペプチドは、Ｂ２９に単一のリジンを有し、
（ｄ）前記インスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートは、Ｂ２９モノコンジュゲートである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
（ｃ）前記リーダーペプチドは、リジンを含み、
（ｄ）ステップ１（ａ）は、前記リーダーペプチドのリジンがオリゴマーに結合している、プロインスリンポリペプチド−オリゴマーを産生する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記リーダーペプチドにリジン残基が欠けている、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
（ｃ）前記インスリンポリペプチドがＡ鎖ポリペプチドとＢ鎖ポリペプチドとを含み、
（ｄ）Ｂ鎖ポリペプチドのＣ末端が非インスリン連結ポリペプチド又はアミノ酸残基を介してＡ鎖ポリペプチドのＮ末端に結合している、
請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記オリゴマーが、前記インスリンのＢ２９位でリジンに結合している、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記インスリンポリペプチドは、ＧｌｙＡ２１インスリン、ヒト；ＧｌｙＡ２ｌＧｌｎＢ３インスリン、ヒト；ＡｌａＡ２１インスリン、ヒト；ＡｌａＡ２ｌＧｌｎＢ３インスリン、ヒト；ＧｌｎＢ３インスリン、ヒト；ＧｌｎＢ３０インスリン、ヒト；ＧｌｙＡ２１ＧｌｕＢ３０インスリン、ヒト；ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０インスリン、ヒト；ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０インスリン、ヒト；ＡｓｐＢ２８インスリン、ヒト；ＬｙｓＢ２８インスリン、ヒト；ＬｅｕＢ２８インスリン、ヒト；ＶａｌＢ２８インスリン、ヒト；ＡｌａＢ２８インスリン、ヒト、ＡｓｐＢ２８ＰｒｏＢ２９インスリン、ヒト；ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９インスリン、ヒト；ＬｅｕＢ２８ＰｒｏＢ２９インスリン、ヒト；ＶａｌＢ２８ＰｒｏＢ２９インスリン、ヒト；ＡｌａＢ２８ＰｒｏＢ２９インスリン、ヒトからなる群から選択されるインスリン類似体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記親水性成分は、ポリアルキレングリコール成分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ポリアルキレングリコール成分は、ポリエチレングリコール成分である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ポリアルキレングリコール成分は、ポリアルキレングリコールサブユニット１〜５０個を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ポリアルキレングリコール成分は、ポリアルキレングリコールサブユニット２〜１０個を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ポリアルキレングリコール成分は、ポリアルキレングリコールサブユニット少なくとも２個を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記親油性成分は、アルキル又は脂肪酸成分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記親油性成分は、炭素原子１〜２８個を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記親油性成分は、炭素原子２〜２４個を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記親油性成分は、炭素原子３〜１８個を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記切断ステップ１（ｂ）により、トリプシン切断部位を含む一以上の部位で、プロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを切断する、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記切断ステップは、アルギニン切断部位を含む一以上の部位で、プロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを切断する、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
一以上の非インスリンポリペプチド及び／又はアミノ酸残基を、プロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートから切断するステップは、一以上の非インスリンポリペプチド及び／又はアミノ酸残基とインスリンポリペプチドとの間の結合を切断できる一以上の酵素と、プロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートとを、プロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートから一以上の非インスリンポリペプチド及び／又はアミノ酸残基を切断するのに十分な条件下に、接触させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記一以上の酵素は、トリプシン、カルボキシペプチダーゼＢ及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インスリンコンジュゲート、そのようなコンジュゲートの合成方法、およびそれを用いた糖尿病を含む疾患の治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
インスリンポリペプチドは、身体内のグルコースの輸送、利用および貯蔵を制御することに責任を果たす主要ホルモンである。膵島のβ細胞はプロインスリンとして知られるインスリンの一本鎖前駆物質を分泌する。プロインスリンのタンパク質溶解は、プロインスリン鎖内の連結ペプチド（Ｃ−ペプチド）に沿って特定の塩基性アミノ酸の除去を生じさせ、そして生物学的に活性なポリペプチドインスリンを提供する。
【０００３】
インスリン分子は進化において高度に保存されており、概してジスルフィド結合により連結された２本のアミノ酸鎖からなる。天然ヒト二本鎖インスリン分子（分子量  ５，８００ダルトン）では、Ａ鎖は２１アミノ酸残基から構成され、アミノ末端にグリシンを有する。そしてＢ鎖は３０アミノ酸残基を有し、アミノ末端にフェニルアラニンを有する。
【０００４】
インスリンは、モノマーとして存在することもある。または集合して二量体に、もしくは３つの二量体から形成される六量体になる。モノマーには、生物学的活性、すなわちレセプターに結合してインスリンの生物学的作用を刺激する能力が存在する。
【０００５】
糖尿病は、不都合な炭水化物代謝に伴って生じる生物学的障害である。糖尿病は、インスリンの不十分な産生、またはインスリンに対する感受性の低下の結果として生じる。糖尿病のあるヒトでは、ブドウ糖を使用する正常な能力が阻害され、血糖値が上昇する（高血糖症）。ブドウ糖が血液中に蓄積するにつれて尿中へ過剰なレベルの糖が排出される（糖尿）。糖尿病のその他の症状には、尿量の増加および頻尿、口渇、掻痒、空腹感、体重減少および衰弱が含まれる。
【０００６】
糖尿病には２つのタイプがある。Ｉ型はインスリン依存型真性糖尿病、もしくはＩＤＤＭである。ＩＤＤＭは、以前は「若年型糖尿病」と呼ばれていた。ＩＤＤＭでは、膵臓からインスリンが分泌されないため、外部の供給源からインスリンを供給しなければならない。ＩＩ型もしくは成人発症型糖尿病は、通常は食事療法でコントロールできるが、一部の進行した症例ではインスリンの投与が必要になる。
【０００７】
糖尿病を治療しないままでおくと、血液中で脂肪破壊産物のケトンの蓄積であるケトーシスを引き起こす。ケトーシスの後には悪心および嘔吐を伴って血液中の酸の蓄積（アシドーシス）が生じる。炭水化物および脂肪の代謝障害の毒性産物が増加するにつれて、患者は糖尿病性昏睡に陥るが、これは死につながる。１９２０年代にインスリンが単離される以前は、大多数の患者は発症後短期間以内に死亡した。
【０００８】
糖尿病の治療法としてのインスリンの使用は、Ｂａｎｔｉｎｇら，（「真性糖尿病の治療における膵抽出物」，Ｃａｎ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．Ｊ．，１２：１４１−１４６（１９２２））が、膵臓の活性抽出物が糖尿病の犬において治療作用を有することを証明した１９９２年に始まる。同年に、膵抽出物を用いた糖尿病患者の治療は飛躍的な、生命を救うほどの臨床的改善を生じさせた。
【０００９】
近年まで、ヒトにおける糖尿病の治療にはほとんどウシインスリンおよびブタインスリンしか使用されていなかった。しかし現在では、インスリンには種間で多数の変異があることが知られている。各変異は、Ａ鎖および／またはＢ鎖における１以上の位置でアミノ酸置換を有することで天然ヒトインスリンとは相違している。これらの相違にもかかわらず、ほとんどの哺乳動物インスリンは類似の生物学的活性を有する。組み換え技術の進歩は、天然ヒトインスリンに匹敵する生物学的活性を有するヒトインスリン（例えば、インディアナ州インディアナポリスのＥｌｉ  Ｌｉｌｌｙ社から市販で入手できるＨｕｍｕｌｉｎ（商標）インスリン）または遺伝子組み換えインスリンの商業的大規模製造を可能にする。
【００１０】
糖尿病の治療は、典型的にはインスリンの定期的な注射を必要とする。インスリン注射は不便であるため、インスリンの投与および生体内同化を改良するために数多くの努力が重ねられてきた。
【００１１】
インスリンを経口投与により送達する試みがなされてきた。糖尿病患者において正常血糖を達成するためのインスリンの経口投与に関連する問題は、製薬学や医学の文献で詳細に記録されている。消化管の消化酵素はインスリンを急速に分解し、生物学的に不活性な分解産物を生じさせる。例えば、胃の中では、経口投与されたインスリンは酵素分解および酸性分解を受ける。匹敵するインスリンのタンパク質溶解性分解は腸で生ずる。腔内では、インスリンは胃および膵臓の酵素、エキソペプチダーゼおよびエンドペプチダーゼ、ならびに刷子縁ペプチダーゼを含む様々な酵素によって攻撃される。インスリンがこの酵素攻撃を切り抜けたとしても、インスリンの経口投与後には、インスリンがインビボのレセプターに到達できる前に越えなければならない生物学的障壁がそのバイオアベイラビリティを制限する可能性がある。例えば、インスリンは低い膜透過性を有し得るので、これは腸内腔から血流内へ通過する能力を制限する。
【００１２】
インスリンの経口投与形を得るための一部の努力は、インスリン−オリゴマーコンジュゲート類を得ることに集中してきた。ヒトインスリンおよび治療的に使用される多数の密接に関係があるインスリンは遊離の一次アミノ基を有する３つのアミノ酸残基を含有する。３つの一次アミノ基すべて、つまりＡ鎖およびＢ鎖（ＧｌｙＡ１およびＰｈｅＢ１）のＮ末端（αアミノ基）およびＬｙｓＢ２９のε−アミノ基は、オリゴマーとのコンジュゲーションによって修飾できる。反応条件に依存して、非保護インスリンのＮアシル化はモノコンジュゲート、ジコンジュゲート、およびトリコンジュゲートの複合混合物をもたらす（例えば、ＧｌｙＡ１でモノコンジュゲートしたインスリン、ＰｈｅＢ１でモノコンジュゲートしたインスリン、ＬｙｓＢ２９でモノコンジュゲートしたインスリン、ＧｌｙＡ１およびＰｈｅＢ１でジコンジュゲートしたインスリン、ＧｌｙＡ１およびＬｙｓＢ２９でジコンジュゲートしたインスリン、ＰｈｅＢ１およびＬｙｓＢ２９でジコンジュゲートしたインスリン、およびＧｌｙＡ１、ＰｈｅＢ１、およびＬｙｓＢ２９でトリコンジュゲートしたインスリン）。例えばＬｙｓＢ２９でモノコンジュゲートしたインスリンのような特定コンジュゲートが所望の場合は、所望のコンジュゲートを入手するためにそのようなコンジュゲートの複合混合物を分離（または精製）することは厄介である、および／または費用が高くつくことがある。
【００１３】
その結果として、所望のインスリンコンジュゲートを選択的に合成するために様々な努力がなされてきた。例えば、Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ  ａｎｄ  Ｋｉｓｏは日本国特許出願第１−２５４，６９９号において脂肪酸インスリン誘導体を調製するための５段階合成を提案している。インスリンのＡ１およびＢ１アミノ基はｐ−メトキシベンズオキシアジ化カルボニル（ｐＭＺ）を用いて保護（またはブロック）されている。脂肪酸エステルによるアシル化後に、脂肪酸を用いてＬｙｓ（Ｂ２９）でモノアシル化されたインスリンを得るために保護（ブロック）基が除去される。また別の例として、Ｈａｖｅｌｕｎｄらへの米国特許第５，７５０，４９７号は、（Ａ１，Ｂ１）−ｄｉＢｏｃヒトインスリン、すなわちＡ鎖およびＢ鎖のＮ末端がＢｏｃ基によって保護されているヒトインスリンを形成するためにＢｏｃ−試薬（例えば、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボネート）を用いてヒトインスリンを処理することを提案している。例えばＨＰＬＣによる任意の精製後に、産物を式Ｘ−ＯＳｕ（式中、Ｘは導入されるべき親油性アシル基である）のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと反応させることによって親油性アシル基がＬｙｓＢ２９のε−アミノ基内に導入される。最終ステップでは、トリフルオロ酢酸を使用してＢｏｃ基が除去され、産物のＮεＢ２９−Ｘヒトインスリンが単離される。
【００１４】
所望のインスリンコンジュゲートが好ましい産物であるコンジュゲートの混合物を得るために所望のインスリンコンジュゲートを優先的に合成するために様々な他の努力が企てられてきた。例えば、Ｂａｋｅｒらへの米国特許第５，６４６，２４２号は、アミノ保護基を使用せずに実施される反応を提案している。Ｂａｋｅｒは、極性溶媒中の塩基性条件下で活性化脂肪エステルとインスリンのε−アミノ基との反応を提案している。ε−アミノ基のアシル化は、反応の塩基性に左右される。９．０を超えるｐＨでは、この反応はαアミノ基よりもＢ２９リジンのε−アミノ基を優先的にアシル化する。実施例１〜４では、インスリンの初期量に対する百分率としてモノコンジュゲートインスリンの６７．１％〜７５．５％の反応収率が報告されている。実施例５では、ＢａｋｅｒはさらにまたＮ−スクシンイミジルパルミテートを用いたヒトプロインスリンのアシル化を提案している。ε−アミノアシル化種対α−アミノアシル化種の正確な比率は計算されなかった。クロマトグラム内のすべてのε−アミノアシル化種の合計は全領域の８７〜９９％を占めていたが、他方全関連物質の合計（おそらくいずれかのα−アミノアシル化種を含んでいるであろう）はいずれかの所定の時点について、総面積の＜７％を占めた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
従来型方法より面倒ではなく、および／または費用効果的である特定インスリン−オリゴマーコンジュゲートを部位特異的に合成する方法を提供することにより、本発明は、技術における従来の限界を克服する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
部位特異的なコンジュゲーションが望ましい場合（例えば、インスリン分子のＢ−２９Ｌｙｓに結合したオリゴマーを有するインスリンモノコンジュゲートを得ることが望ましい場合）に、本発明の実施形態は、上述の従来型スキームと比較すると、インスリン−オリゴマーコンジュゲートを生成するための商業的に高価ではなく、および／またはより高収率の製造スキームを提供する。例えばｐ−メトキシベンズオキシアジ化カルボニルのような化合物を用いてインスリンのＮ末端をブロックすること（Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ  ａｎｄ  Ｋｉｓｏ）による、またはインスリンのＮ末端でのコンジュゲーションを排除するのではなく減少させるように反応条件を制御することを試みること（Ｂａｋｅｒ）によるインスリンの選択的なコンジュゲーションを提案する従来型スキームとは相違して、本発明の実施形態はオリゴマーをプロインスリン、または人工プロインスリン（例えば、そのＢ鎖のＮ末端でリーダーペプチドに結合したプロインスリン）、または単鎖インスリン前駆体（ＳＣＩＰ）（その中でＢ鎖のカルボキシ末端が、アミド結合によりＡ鎖のアミノ末端に結合されている）のＢ−２９Ｌｙｓに結合させる。存在するＣ−ペプチドおよび、（存在する場合は）リーダーペプチドは、オリゴマーとＢ−２９Ｌｙｓでモノコンジュゲートしたインスリンを得るために、その後、プロインスリン−オリゴマーコンジュゲートから開裂される。本発明の実施形態は、Ｂ−２９Ｌｙｓ修飾に対する高い部位特異性を提供できる。プロインスリンポリペプチドを利用する本発明の実施形態による方法は、従来型インスリン経路を介して入手されたものと比較して、例えば８０％以上という高い収率で、転化率の高いＢ−２９修飾産物を得ることができる。
【００１７】
ある実施形態により、本発明は、インスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートの合成方法を提供し、この方法は、開裂させてインスリンポリペプチドを産生させることができるペプチド結合によって１以上のペプチドに結合したインスリンポリペプチドを含むプロインスリンポリペプチドとオリゴマーとを、プロインスリンポリペプチドのインスリンポリペプチド部分へオリゴマーを結合させてプロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを得るのに十分な条件下で接触させるステップと、プロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートから１以上のペプチドを開裂させて、インスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを得るステップとを含む。
【００１８】
本発明の他の実施形態により、プロインスリンポリペプチド−アシルオリゴマーコンジュゲートから１以上のペプチドを酵素的に開裂させて、インスリンポリペプチド−アシルオリゴマーコンジュゲートを得るステップを含む、インスリンポリペプチド−アシルオリゴマーコンジュゲートの合成方法が提供される。
【００１９】
本発明の他の実施形態により、プロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートの合成方法が提供され、これは、開裂させることによりインスリンポリペプチドを産生させることができるペプチド結合によって１以上のペプチドに結合したインスリンポリペプチドを含むプロインスリンポリペプチドとオリゴマーとを、プロインスリンポリペプチドのインスリンポリペプチド部分へオリゴマーを結合させてプロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを得るのに十分な条件下で接触させるステップを含む。
【００２０】
さらにまた別の実施形態により、本発明は、プロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを提供し、これには、インスリンポリペプチドを含むプロインスリンポリペプチドと、プロインスリンポリペプチドのインスリンポリペプチド部分に結合したオリゴマーとが含まれる。
【００２１】
本発明のさらにまた別の実施形態により、Ｃ−ペプチドポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートの合成方法が提供される。この方法には、一般に、Ｃ−ペプチドポリペプチドを産生させるために開裂させることのできるペプチド結合によって１以上のペプチドに結合したＣ−ペプチドポリペプチドを含むプロ−Ｃ−ペプチドポリペプチドとオリゴマーとを、プロ−Ｃ−ペプチドポリペプチドのＣ−ペプチドポリペプチド部分へオリゴマーを結合させてプロ−Ｃ−ペプチドポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを得るのに十分な条件下で接触させるステップと、プロ−Ｃ−ペプチドポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートから１以上のペプチドを開裂させて、Ｃ−ペプチドポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを得るステップとが含まれる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下に本発明の様々な実施形態が示されている添付の図面を参照して本発明について十分に説明する。しかしながら、本発明は多数の様々な形態で具体化することができ、本明細書に記載した実施形態に限定されると解釈してはならない。むしろ、これらの実施形態は、この開示が完全かつ完璧であり、そして当業者に本発明の範囲を十分に伝えるように提供される。
【００２３】
本開示に使用したすべてのアミノ酸の略語は、米国特許法施行規則第１章８２２条ｂ項に記載されているように米国特許商標庁に許容されている略語である。
【００２４】
ここで使用する様々な範囲を記述するための用語「〜と〜の間」は、記載した範囲の終点を含むと解釈されなければならない。
【００２５】
ここで使用する用語「実質的に単分散」とは、混合物中の化合物の少なくとも約９５％が同一分子量を有する化合物の混合物を説明するために使用される。
【００２６】
ここで使用する用語「単分散」とは、混合物中の化合物の約１００％が同一分子量を有する化合物の混合物を説明するために使用される。
【００２７】
ここで使用する用語「インスリンポリペプチド」とは、インスリンの生物学的活性（例えば、インスリンの一次作用機序を介して身体に影響を及ぼす能力）の少なくとも一部を有するポリペプチドを意味する。例えば、インスリンポリペプチドは、Ａ鎖ポリペプチドと、ジスルフィド結合によってＡ鎖ポリペプチドに結合したＢ鎖ポリペプチドとを有するインスリンのようなポリペプチドであってよい。本発明の様々な実施形態では、インスリンポリペプチドはインスリンの生物学的活性の大多数を有し、インスリンの生物学的活性の実質的に全部を有し、一部の実施形態ではインスリンの生物学的活性のすべてを有することができる。本発明のある実施形態では、インスリンポリペプチドは、インスリンの増強された生物活性を有し得る。例えば、投与がインスリンの相当する量のグルコース低下効果より大きいグルコース低下効果を生じる時に、インスリンと比較して増強された活性が存在する。
【００２８】
ここで使用する用語「プロインスリンポリペプチド」とは、インビトロまたはインビボで開裂させることのできるペプチド結合により１以上の非インスリンポリペプチド（例えば、リーダーペプチドおよび／または連結もしくはＣ−ペプチド）に結合したインスリンポリペプチドを意味する。例えば、プロインスリンポリペプチドは、ジスルフィド結合のような結合によってＢ鎖ポリペプチドに結合したＡ鎖ポリペプチドと、Ｂ鎖ポリペプチドのＣ末端に結合し、またインビトロおよび／またはインビボで開裂できるペプチド結合によってＡ鎖ポリペプチドのＮ末端に結合した連結ペプチド（connecting peptide）とを有するインスリンポリペプチド、例えばインスリン、を含むことができる。また別の例として、プロインスリンポリペプチドは、ジスルフィド結合のような結合によってＢ鎖ポリペプチドに結合したＡ鎖ポリペプチドと、Ｂ鎖ポリペプチドのＣ末端に結合し、インビトロおよび／またはインビボで開裂できるペプチド結合によってＡ鎖ポリペプチドのＮ末端に結合した連結ペプチドと、Ｂ鎖ポリペプチドのＮ末端に結合したリーダーペプチドとを有するインスリンポリペプチド、例えばインスリンを含むことができる。代表的なプロインスリンポリペプチドには、プロインスリン、プロインスリン類似体、プロインスリンフラグメント、プロインスリン類似体フラグメント、またはリーダーペプチドを有するプロインスリン、プロインスリン類似体、プロインスリンフラグメント、プロインスリン類似体フラグメントのいずれか；プレプロインスリン、プレプロインスリン類似体、プレプロインスリンフラグメント、プレプロインスリンフラグメント類似体、ミニプロインスリン、および融合タンパク質が含まれるがそれらに限定されない。
【００２９】
ここで使用する用語「インスリン」は、次の種、ヒト、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、イヌ、トリ、アヒルまたはクジラ、そしてインスリンを製造することが公知であるか又は後に識別される任意の他の種のうちの任意の１つ又は複数のインスリンを含むが、これに限定されることはない。本発明のインスリンは、天然、合成、または遺伝子操作（例えば組み換え）源により提供される、本発明の様々な実施形態では、インスリンはヒトインスリンであってよい。
【００３０】
ここで使用される「ＳＣＩＰ」の「単鎖インスリン前駆体」は、Ｃ−ペプチドが欠けているインスリンポリペプチド前駆体を含む。ＳＣＩＰは、Ａ−鎖ポリペプチド及びＢ−鎖ポリペプチドを有し、ここで、Ａ−鎖のＮ−又はＣ−末端は、下限−１０、−９、−８、−７、−６、−５、−４、−３、−２、−１、０、１、２、３、４、５、６、７、８又は９から上限０、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０までのアミノ酸残基を有する連結ペプチドにより、Ｂ−鎖のＣ−末端又はＮ−末端と結合される。ＳＣＩＰは、リーダー配列も含むことができる。
【００３１】
ここで使用する用語「インスリン類似体」は、アミノ酸の１以上が置換されているがインスリンの活性の一部または全部が保持されているインスリンを含む。類似体は、後にインスリンの説明を伴う上付き文字として置換位置とともに置換アミノ酸を指摘することによって記載される。例えば、「ＰｒｏＢ２９インスリン、ヒト」は、典型的にはヒトインスリン分子のＢ２９位で見いだされたリジンがプロリンと置換されていることを意味する。本発明のインスリン類似体は、天然のインスリンに存在するアミノ酸数より多い数のアミノ酸を有するインスリンポリペプチドを含んでもよい。そのような類似体の例は、インスリン−ＡｒｇＢ３１（プロインスリンからＣ−ペプチドのトリプシン開裂の後、又はカルボキシペプチダーゼ開裂前に、本明細書の例１４に記載されるように製造される）、Ａ−鎖からのリーダーペプチドの下位開裂から生じるインスリン−ＡｒｇＡ０、及びインスリン−ＸａａＢ０（但し、Ｘａａは、例えば、下位開裂された非天然Ｃ−ペプチドの使用から生じうる任意のアミノ酸である）を含むがこれらに限定はされない。本発明のインスリン類似体は、アミノ酸の欠失のため天然のインスリン中にあるアミノ酸数より少ない数のアミノ酸を有するインスリンポリペプチド及び／又はインスリンポリペプチドのアミノ酸鎖へ挿入された追加のアミノ酸のために天然のインスリン中にあるアミノ酸数より多い数のアミノ酸を有するインスリンポリペプチドも含む。本発明のインスリン類似体は、本発明のために記載されたインスリン類似体の任意の組合せを含んでもよい。
【００３２】
インスリン類似体は、当業者には理解されるように、様々な手段によって入手することができる。例えば、あるアミノ酸は、例えば基質分子上の抗体の抗原結合領域または結合部位のような構造によって相互作用結合する能力をそれほど損失することなく、インスリン構造において他のアミノ酸と置換することができる。インスリンの相互作用能力および性質がその生物学的機能的活性を規定するので、アミノ酸配列内で一定のアミノ酸配列置換を作成することができ、それでも同様の特性を備えるポリペプチドであり続けることができる。
【００３３】
そのような置換を作成する際に、アミノ酸の疎水親水指数もまた考慮に入れることができる。ポリペプチドに相互作用的生物学的機能を与える際の疎水親水性アミノ酸指数の重要性は一般に当分野において理解されている。アミノ酸の相対的疎水親水特性が結果として生じるポリペプチドの二次構造に貢献し、これが順にタンパク質と他の分子、例えば酵素、基質、レセプター、ＤＮＡ、抗体、抗原等との相互作用を規定することは容認されている。各アミノ酸には、その疎水性および荷電特性に基づいて疎水親水度指数が下記のように指定されている。イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸塩（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸塩（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）。当業者に理解されるように、あるアミノ酸は類似の疎水親水度指数もしくはスコアを有する他のアミノ酸によって置換することができ、さらに類似の生物学的活性を有するポリペプチドを生じさせる、すなわち生物学的機能が同等のポリペプチドを入手できる。そのような変化を生じさせる際に、その疎水親水度指数が相互の±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、相互の±１以内であるアミノ酸の置換が特に好ましく、そして相互の±０．５以内であるアミノ酸の置換がいっそう特に好ましい。
【００３４】
さらにまた当分野においては、類似のアミノ酸の置換は、親水性に基づいて効果的に生じさせることができることも理解されている。その開示が、その全体を引用することにより本明細書の一部をなす米国特許第４，５５４，１０１号は、隣接アミノ酸の親水性によって支配されるように、タンパク質の最大局所平均親水性がタンパク質の生物学的特性と相関することを提供している。米国特許第４，５５４，１０１号に詳述されたように、アミノ酸残基には以下の親水性値が指定されている。アルギニン（＋３．０）；リジン（±３．０）；アスパラギン酸塩（＋３．０±１）；グルタミン酸塩（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。当業者には理解されるように、アミノ酸は類似の親水性値を有する別のアミノ酸と置換することができ、さらに生物学的に同等に、そして特に、免疫学的に同等のポリペプチドを入手できる。そのような変化では、その親水性値が相互に±２以内であるアミノ酸どうしの置換が好ましく、相互に±１以内であるアミノ酸どうしの置換が特に好ましく、そして相互に±０．５以内であるアミノ酸どうしの置換がいっそう特に好ましい。
【００３５】
上記に略述したように、このためアミノ酸置換／組込みは一般に、例えばそれらの疎水性、親水性、電荷、サイズ等のようなアミノ酸側鎖置換基の相対類似性に基づいている。様々な上述の特徴を考慮に入れた代表的な置換（すなわち、ポリペプチドの生物学的活性を有意に変化させずに置換することのできるアミノ酸）は当業者には周知であり、例えば次のものが含まれる。アルギニンとリジン、グルタミン酸塩とアスパラギン酸塩、セリンとトレオニン、グルタミンとアスパラギン、およびバリン、ロイシンとイソロイシン。
【００３６】
当業者に理解されるように、インスリン類似体は古典的（溶液）法、固相法、半合成法、および組み換えＤＮＡ法を含むがそれらに限定されない様々な広く認められたペプチド合成法によって調製することができる。
【００３７】
ヒトインスリン類似体の例には次のものが含まれるがそれらに限定されない。ＧｌｙＡ２１インスリン、ヒト；ＧｌｙＡ２ｌＧｌｎＢ３インスリン、ヒト；ＡｌａＡ２１インスリン、ヒト；ＡｌａＡ２ｌＧｌｎＢ３インスリン、ヒト；ＧｌｎＢ３インスリン、ヒト；ＧｌｎＢ３０インスリン、ヒト；ＧｌｙＡ２１ＧｌｕＢ３０インスリン、ヒト；ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０インスリン、ヒト；ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０インスリン、ヒト；ＡｓｐＢ２８インスリン、ヒト；ＬｙｓＢ２８インスリン、ヒト；ＬｅｕＢ２８インスリン、ヒト；ＶａｌＢ２８インスリン、ヒト；ＡｌａＢ２８インスリン、ヒト、ＡｓｐＢ２８ＰｒｏＢ２９インスリン、ヒト；ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９インスリン、ヒト；ＬｅｕＢ２８ＰｒｏＢ２９インスリン、ヒト；ＶａｌＢ２８ＰｒｏＢ２９インスリン、ヒト；ＡｌａＢ２８ＰｒｏＢ２９インスリン、ヒト、並びに現在公知であるか又は後に識別される任意の他のインスリン類似体。本発明のインスリン類似体は、添加された追加のリジンを備えるＢ−鎖を有するインスリン分子を含んでもよい。
【００３８】
ここで使用する用語「インスリンフラグメント」は、インスリンの活性の一部または全部が保持されているインスリン内で見いだされるアミノ酸配列のセグメントを含む。インスリンフラグメントは、アミノ酸配列内の位置を記載し、その後にアミノ酸の説明を記して表示する。例えば、「Ｂ２５−Ｂ３０ヒトインスリン」フラグメントは、ヒトインスリンアミノ酸配列内のＢ２５、Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９およびＢ３０位に対応する６アミノ酸配列であろう。
【００３９】
ここで使用する用語「インスリンフラグメント類似体」は、セグメント内の１以上のアミノ酸は置換されている、挿入されている及び／又は削除されている、及び／又は1以上の外生的アミノ酸が挿入されているが、インスリンの活性の一部または全部が保持されているインスリン分子内で見いだされるアミノ酸配列の１セグメントを含む。
【００４０】
ここで使用する用語「プロインスリン」は、次の種、ヒト、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、イヌ、トリ、アヒルまたはクジラ、並びにプロインスリンを生じることが現在公知であるか又は後に確認される任意の他の種、のうちの任意の１つ以上のプロインスリンを含む。本発明のプロインスリンは、天然、合成、または遺伝子組み換え操作源により提供され得る。一般に、プロインスリンはインスリンのＡ鎖のＮ末端をインスリンのＢ鎖のＣ末端へ連結するＣ−ペプチドを有するインスリンを含む。本明細書に記載した本発明の様々な実施形態では、プロインスリンはヒトプロインスリンであってよい。
【００４１】
ここで使用する用語「プロインスリン類似体」は、インスリン類似体に関連して前に説明したように、プロインスリン内のアミノ酸の１以上が置換されている、挿入されている及び／又は削除されている、及び／又は1以上の外生的アミノ酸が挿入されているが、プロインスリンのインスリン部分の活性の一部または全部が保持されているプロインスリンを含む。置換されているプロインスリン類似体は、上付き文字としての置換位置を伴う置換アミノ酸であることを示し、その後にプロインスリンの説明を記すことによって記載する。例えば、「ＰｒｏＢ２９プロインスリン、ヒト」は、典型的にはヒトプロインスリン分子のＢ２９位で見いだされるリジンがプロリンと置換されていることを意味する。
【００４２】
ここで使用する用語「プロインスリンフラグメント」は、プロインスリンフラグメントのインスリン、インスリン類似体またはインスリンフラグメント部分の生物学的活性の一部または全部が保持されているプロインスリン内で見いだされるアミノ酸配列の１セグメントを含む。プロインスリンフラグメントは、アミノ酸配列内の位置を記載し、その後にアミノ酸の説明を記して表示する。例えば、「Ｂ２５−Ｂ３５ヒトプロインスリン」フラグメントは、ヒトプロインスリンアミノ酸配列内のＢ２５、Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９、Ｂ３０、Ｂ３１、Ｂ３２、Ｂ３３、Ｂ３４およびＢ３５位に対応する１１アミノ酸配列であろう。
【００４３】
ここで使用する用語「プロインスリンフラグメント類似体」は、インスリン類似体に関連して上記で説明されたように、セグメント内の１以上のアミノ酸は置換されている、挿入されている及び／又は削除されている、及び／又は1以上の外生的アミノ酸が挿入されているが、プロインスリンフラグメントのインスリン、インスリン類似体、インスリンフラグメント、またはインスリンフラグメント類似体部分の活性の一部または全部が保持されているプロインスリン分子内で見いだされるアミノ酸配列の１セグメントを含む。
【００４４】
ここで使用する用語「プレプロインスリン」は、次の種、ヒト、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、イヌ、トリ、アヒルまたはクジラ、並びにプレプロインスリンを生じることが現在公知であるか又は後に確認される任意の他の種のうちの任意の１つ以上のプレプロインスリンを含む。本発明のプレプロインスリンは、天然、合成、または遺伝子組み換え操作源により提供され得る。一般に、プレプロインスリンは、例えばジスルフィド結合によってＡ鎖がＢ鎖に結合している一本鎖ポリペプチド（例えば、インスリンのＢ鎖のＮ末端に結合したリーダーペプチドを有し、さらに連結ペプチドによってＡ鎖のＮ末端に結合したＢ鎖のＣ末端を有するポリペプチド）である。本明細書に記載した本発明の様々な実施形態では、プレプロインスリンはヒトプレプロインスリンであってもよい。
【００４５】
ここで使用する用語「プレプロインスリン類似体」は、上記でインスリン類似体に関連して説明したように、プレプロインスリン内のアミノ酸の１以上が置換されている、挿入されている及び／又は削除されている、及び／又は1以上の外生的アミノ酸が挿入されているが、プレプロインスリン類似体のインスリンまたはインスリン類似体部分の活性の一部または全部が保持されているプレプロインスリンを含む。置換された類似体は、上付き文字としての置換位置を伴う置換アミノ酸であることを示し、その後にインスリンの説明を記すことによって記載する。
【００４６】
ここで使用する用語「プレプロインスリンフラグメント」は、プレプロインスリンフラグメントのインスリンまたはインスリンフラグメント部分の生物学的活性の一部または全部が保持されているプレプロインスリン内で見いだされるアミノ酸配列の１セグメントを含む。プレプロインスリンフラグメントは、アミノ酸配列内の位置を記載し、その後にアミノ酸の説明を記して表示する。
【００４７】
ここで使用する用語「プレプロインスリンフラグメント類似体」は、インスリン類似体に関連して上記で説明したように、セグメント内の１以上のアミノ酸は置換されている、挿入されている及び／又は削除されている、及び／又は1以上の外生的アミノ酸が挿入されているが、プレプロインスリンフラグメント類似体のインスリン、インスリン類似体、インスリンフラグメント、またはインスリンフラグメント類似体部分の活性の一部または全部が保持されているプレプロインスリン分子内で見いだされるアミノ酸配列の１セグメントを含む。
【００４８】
ここで使用する用語「ミニプロインスリン」は、Ａ鎖ポリペプチドおよびＢ鎖ポリペプチドを有する一本鎖インスリンプロポリペプチドを意味するが、このときＡ鎖のＮまたはＣ末端が、−１０、−９、−８、−７、−６、−５、−４、−３、−２、−１、０、１、２、３、４、５、６、７、８、もしくは９個のアミノ酸残基（下限）と０、１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個のアミノ酸残基（上限）との間の連結ペプチドによってＢ鎖のＣ末端またはＮ末端に結合しており、そしてこのときＡ鎖ポリペプチドはジスルフィド結合のような結合によってＢ鎖ポリペプチドに結合している。ミニプロインスリンは、それら各々の開示がそれらの全体を引用することにより本明細書の一部をなす、Ｂａｌｓｃｈｍｉｄｔらへの米国特許第５，１５７，０２１号および米国特許第５，２０２，４１５号に記載されているものを含むがそれらに限定されない、当業者に理解されるような様々なミニプロインスリンであってよい。
【００４９】
ここで使用する用語「Ｃ−ペプチド」は、天然、合成、または遺伝子組み換え操作源により提供される次の種、ヒト、サル、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、イヌ、トリ、アヒルまたはクジラの１つのプロインスリンのＣ−ペプチドのアミノ酸配列を有するペプチドを意味する。本明細書に記載した本発明の様々な実施形態では、Ｃ−ペプチドはヒトＣ−ペプチドであってよい。
【００５０】
ここで使用する用語「Ｃ−ペプチド類似体」は、上記でインスリン類似体に関連して説明したように、Ｃ−ペプチド内のアミノ酸の１以上が置換されている、挿入されている及び／又は削除されている、及び／又は1以上の外生的アミノ酸が挿入されているが、Ｃ−ペプチドの生物学的活性の一部または全部が保持されているＣ−ペプチドを意味する。Ｃ−ペプチド類似体はＣ−ペプチドのＣ末端でのペンタペプチドセグメントおよび／またはＣ−ペプチドの１１〜１９位で見いだされるノナペプチドセグメントを含み得る。Ｃ−ペプチド類似体がペンタペプチドセグメントを含む場合は、ペンタペプチドセグメントはＣ−ペプチド類似体のＣ末端にあってよい。一部の実施形態では、Ｃ−ペプチド類似体はＣ−ペプチドのＣ末端でのテトラペプチドセグメントおよび／またはＣ−ペプチドの１１〜１９位で見いだされるノナペプチドセグメントを含む。Ｃ−ペプチド類似体がテトラペプチドセグメントを含む場合は、テトラペプチドセグメントはＣ−ペプチド類似体のＣ末端にあってよい。上記のＣ−ペプチドの１１〜１９位で見いだされるノナペプチドセグメントは、ヒトＣ−ペプチドの１１〜１９位で見いだされるノナペプチドセグメントであってよい。
【００５１】
ここで使用する用語「Ｃ−ペプチドフラグメント」は、Ｃ−ペプチドの一部、実質的に全部、または全部の生物学的活性を保持しているＣ−ペプチドのアミノ酸配列の１セグメントを意味する。Ｃ−ペプチドフラグメントはＣ−ペプチドのＣ末端でのペンタペプチドセグメントおよび／またはＣ−ペプチドの１１〜１９位で見いだされるノナペプチドセグメントを含んでよい。Ｃ−ペプチドフラグメントがペンタペプチドセグメントを含む場合は、ペンタペプチドセグメントはＣ−ペプチドフラグメントのＣ末端にあってよい。Ｃ−ペプチドフラグメントはＣ−ペプチドのＣ末端でのテトラペプチドセグメントおよび／またはＣ−ペプチドの１１〜１９位で見いだされるノナペプチドセグメントを含んでもよい。Ｃ−ペプチドフラグメントがテトラペプチドセグメントを含む場合は、テトラペプチドセグメントはＣ−ペプチドフラグメントのＣ末端にあってよい。ある実施形態では、Ｃ−ペプチドフラグメントは、Ｃ−ペプチドのＣ末端のペンタペプチドセグメント、Ｃ−ペプチドの１１〜１９位で見いだされるノナペプチドセグメント、およびＣ−ペプチドのＣ末端のテトラペプチドセグメントからなる群から選択されるペプチドからなる。上記のＣ−ペプチドの１１〜１９位で見いだされるノナペプチドセグメントは、ヒトＣ−ペプチドの１１〜１９位で見いだされるノナペプチドセグメントであってよい。
【００５２】
ここで使用する用語「Ｃフラグメント類似体」は、上記でインスリン類似体に関連して説明したように、セグメント内のアミノ酸の１以上が置換されている、挿入されている及び／又は削除されている、及び／又は1以上の外生的アミノ酸が挿入されているが、インスリンの生物学的活性の一部、実質的に全部、または全部が保持されているＣ−ペプチドのアミノ酸配列の１セグメントを意味する。Ｃ−ペプチドフラグメント類似体はＣ−ペプチドのＣ末端でのペンタペプチドセグメントおよび／またはＣ−ペプチドの１１〜１９位で見いだされるノナペプチドセグメントを含んでよい。Ｃ−ペプチドフラグメント類似体がペンタペプチドセグメントを含む場合は、ペンタペプチドセグメントはＣ−ペプチドフラグメント類似体のＣ末端にあってよい。一部の実施形態では、Ｃ−ペプチドフラグメント類似体はＣ−ペプチドのＣ末端でのテトラペプチドセグメントおよび／またはＣ−ペプチドの１１〜１９位で見いだされるノナペプチドセグメントを含んでよい。Ｃ−ペプチドフラグメント類似体がテトラペプチドセグメントを含む場合は、テトラペプチドセグメントはＣ−ペプチドフラグメント類似体のＣ末端にあってよい。上記のＣ−ペプチドの１１〜１９位で見いだされるノナペプチドセグメントは、ヒトＣ−ペプチドの１１〜１９位で見いだされるノナペプチドセグメントであってよい。
【００５３】
ここで使用する用語「Ｃ−ペプチドポリペプチド」は、引用することにより本明細書の一部をなすものとするＷａｈｒｅｎら，「ヒト生理学におけるＣ−ペプチドの役割」，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．，２７８：Ｅ７５９〜Ｅ７６８（２０００）および／またはＦｏｒｓｔら，「ＩＤＤＭ患者におけるＣ−ペプチドの生物学的活性に関する新規解釈」，Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ，１０６：２７０〜２７６（１９９８）に記載されているＣ−ペプチドおよび／またはＣ−ペプチドフラグメントについての治療的有用性および生物学的機能性に類似する治療的有用性および生物学的活性を有するポリペプチドを意味する。例えば、Ｃ−ペプチドポリペプチドは、糸球体超濾過の減少、全身および／または骨格筋グルコース利用率増強、自律神経機能の向上、および／または微小血管皮膚血流の再配分を含むがそれらに限定されない治療的有用性を有する。Ｃ−ペプチドポリペプチドは、Ｎａ＋−Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅ活性を刺激する能力、内皮一酸化窒素シンターゼ活性を刺激する能力、および／またはＣａ２＋依存性細胞内シグナリング経路の引き続いての活性化を伴う細胞表面に（例えば、Ｇ−タンパク質結合表面レセプターで）特異的に結合する能力を含むがそれらに限定されない生物学的活性を有する。Ｃ−ペプチドポリペプチドは、〜３×１０９Ｍ−１の内皮細胞、腎尿細管細胞、および線維芽細胞に結合するための結合速度定数を有し得る。Ｃ−ペプチドポリペプチドは、Ｃ−ペプチド、Ｃ−ペプチド類似体、Ｃ−ペプチドフラグメント、またはＣ−ペプチドフラグメント類似体であってよい。
【００５４】
ここで使用する用語「プロ−Ｃ−ペプチドポリペプチド」は、Ｃ−ペプチドポリペプチドを得るために開裂できる１以上のペプチドに結合したＣ−ペプチドポリペプチドを意味する。
【００５５】
ここで使用する用語「Ａ鎖ポリペプチド」は、インスリン分子のＡ鎖と実質的に生物学的に同等であるポリペプチドを意味する。例えば、Ａ鎖ポリペプチドは上記でインスリン類似体、Ａ鎖フラグメント、またはＡ鎖類似体フラグメントに関連して説明したようなＡ鎖類似体であってよい。
【００５６】
ここで使用する用語「Ｂ鎖ポリペプチド」は、インスリン分子のＢ鎖に実質的に生物学的に同等であるポリペプチドを意味する。例えば、Ｂ鎖ポリペプチドは、上記でインスリン類似体、Ｂ鎖フラグメント、またはＢ鎖類似体フラグメントに関連して説明したようなＢ鎖類似体であってよい。
【００５７】
ここで使用する用語「ペプチド又はポリペプチド」は、少なくともアミノ酸残基のアミノ酸配列を意味する。
【００５８】
ここで使用する用語「両親媒性に平衡した」は、実質的に水に溶解させることができ、そして生体膜に浸透できることを意味する。
【００５９】
ここで使用する用語「ポリアルキレングリコール」は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、およびポリブチレングリコールのような直鎖または分岐ポリアルキレングリコールポリマーを意味しており、そしてポリアルキレングリコールのモノアルキルエーテルが含まれる。用語「ポリアルキレングリコールサブユニット」は、単一ポリアルキレングリコールユニットを意味する。例えば、ポリエチレングリコールサブユニットは、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−であろう。
【００６０】
ここで使用する用語「親油性」は、脂質中に溶解する能力および／または生体膜に浸透する、生体膜と相互作用するおよび／または生体膜を横断する能力を意味しており、そして用語「親油性部分」または「親油性」は親油性である、および／または他の化学実体に付加したときにそのような化学実体の親油性を増加させる部分を意味する。親油性部分の例には、アルキル、脂肪酸、脂肪酸のエステル、コレステリル、アダマンチル等が含まれるがそれらに限定されない。
【００６１】
ここで使用する用語「低級アルキル」は、１〜５個の炭素原子を有する置換もしくは未置換アルキル部分をいう。
【００６２】
ここで使用する用語「高級アルキル」は、６個以上の炭素原子を有する置換もしくは未置換アルキル部分をいう。
【００６３】
本発明は、インスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートの合成方法も提供し、この方法は、開裂させることによりインスリンポリペプチドを産生させることのできるペプチド結合によって１以上のペプチドに結合したインスリンポリペプチドを含むプロインスリンポリペプチドとオリゴマーとを、プロインスリンポリペプチドのインスリンポリペプチド部分にオリゴマーを結合させてプロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを得るのに十分な条件下で接触させるステップと、プロインスリン−ポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートから１以上のペプチドを開裂させて、インスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを得るステップとを含む。例えば、インスリン−オリゴマーコンジュゲートは、下記に示す実施例に記載した通りに合成できる。合成経路の１つの実施形態は図１に示す。
【００６４】
プロインスリンポリペプチドは、当業者には理解されるであろうように、インスリンポリペプチドを産生するために開裂させることのできるペプチド結合によって１以上のペプチドに結合したインスリンポリペプチドを含む様々なプロインスリンポリペプチドであってよく、プロインスリン、プロインスリン類似体、プロインスリンフラグメント、プロインスリンフラグメント類似体、ミニプロインスリン、ＳＣＩＰまたは融合タンパク質を含むがそれらに限定されない。一部の実施形態では、プロインスリンポリペプチドはリーダーペプチドを有するプロインスリン類似体である。リーダーペプチドを有するプロインスリン類似体は、例えば日本の茨城県所在の伊藤ハム食品社から市販されている。プロインスリン類似体のリーダーペプチドおよびＣ−ペプチドには、各々、リジン残基が欠けている。他の実施形態では、プロインスリンポリペプチドは、例えばブラジルのベロオリゾンテ所在のＢｉｏｂｒａｓ社から市販されるプロインスリンポリペプチドである。プロインスリンポリペプチドは、プロインスリンのＢ鎖のＮ末端に結合したリーダーペプチドを有する。このリーダーペプチドにはリジン残基が欠けている。
【００６５】
インスリンポリペプチドは、Ａ鎖ポリペプチドおよびＢ鎖ポリペプチドを有してよい。Ａ鎖ポリペプチドに、リジン残基が欠けていることがある。Ｂ鎖ポリペプチドは、単一リジン残基を備えていてよい。Ａ鎖ポリペプチドおよびＢ鎖ポリペプチドは、架橋していてよく、１以上のジスルフィド結合を使用して架橋していてよい。一部の実施形態では、Ａ鎖ポリペプチドおよびＢ鎖ポリペプチドは各々システイン残基を備えており、それらの１以上はＡ鎖ポリペプチドをＢ鎖ポリペプチドと架橋させるために１以上のジスルフィド結合を使用して結合されている。インスリンポリペプチドはインスリン、インスリン類似体、インスリンフラグメント、またはインスリン類似体フラグメントでってよい。
【００６６】
一部の実施形態では、インスリンポリペプチドに結合した１以上のペプチドは、Ｂ鎖ポリペプチドのＣ末端に第１端で結合し、Ａ鎖ポリペプチドのＮ末端に第２端で結合した連結ペプチドを備えている。一般に、連結ペプチドのアミノ酸配列は決定的に重要ではなく、そして連結ペプチドは、当業者には理解されるであろうように、様々な連結ペプチドであってよく、ミニプロインスリンにおける連結ペプチド、Ｃ−ペプチドポリペプチド及びＣ−ペプチドを含むがそれらに限定されない。一部の実施形態では、連結ペプチドにはリジン残基が欠けている。これらの実施形態は、プロインスリンポリペプチド分子上の可能性のあるコンジュゲーション部位の数を減少させることによりオリゴマー試薬の利用を少なくできる。
【００６７】
他の実施形態では、インスリンポリペプチドに結合した１以上のペプチドはＢ鎖ポリペプチドのＮ末端に結合したリーダーペプチドを含む。一般に、リーダーペプチドのアミノ酸配列は決定的に重要ではない。一部の実施形態では、リーダーペプチドにはリジン残基が欠けている。これらの実施形態は、プロインスリンポリペプチド分子上のコンジュゲーション部位数を限定することにより使用するオリゴマー試薬の量を減少させることができる。
【００６８】
さらにまた別の実施形態では、インスリンポリペプチドに結合した１以上のペプチドは上述の連結ペプチドおよび上述のリーダーペプチドの両方を含む。１以上のペプチドは、本質的に連結ペプチドおよびリーダーペプチドから構成されてよい、または連結ペプチドおよびリーダーペプチドから構成されてよい。
【００６９】
ペプチド結合は、当業者には理解されるように、様々な方法で開裂できる結合である。ペプチド結合はトリプシン、カルボキシペプチダーゼＢ、トロンビン、ペプシン、およびキモトリプシンを含むがそれらに限定されない酵素によって酵素開裂させることのできる結合であってよい。酵素により開裂できるペプチド結合は当業者には理解されるであろうし、またＡｒｇ−Ａｒｇ、Ｔｈｒ−Ａｒｇ、Ａｌａ−Ａｒｇ、Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ｔｈｒ−Ｌｙｓ、Ａｒｇ−Ｇｌｙ、およびＡｒｇ−Ｐｈｅを含むがそれらに限定されない。
【００７０】
オリゴマーは、当業者には理解されるように、様々なオリゴマーであってよい。一般に、オリゴマーは、当業者には理解されるように、ポリペプチドに結合することのできるどのオリゴマーであってもよい。例えば、オリゴマーは、引用することにより本明細書の一部をなすものとするＤａｖｉｓらへの米国特許第４，１７９，３３７号；Ｇｒｅｅｎｗａｌｄへの米国特許第５，５６７，４２２号；Ｅｋｗｕｒｉｂｅへの米国特許第５，３５９，０３０号；Ｅｋｗｕｒｉｂｅへの米国特許第５，４３８，０４０号；Ｅｋｗｕｒｉｂｅへの米国特許第５，６８１，８１１号；およびＥｋｗｕｒｉｂｅらへの米国特許第６，３０９，６３３号に記載されているように多分散オリゴマーであってよい。別の実施例として、オリゴマーは、引用することにより本明細書の一部をなすものとするＥｋｗｕｒｉｂｅらによって２００１年６月４日に出願された「ポリエチレングリコール混合物を有するポリマーの実質的単分散混合物の合成方法」と題する米国特許出願第０９／８７３，７３１号；Ｅｋｗｕｒｉｂｅらによって２００１年６月４日に出願された「ポリアルキレングリコールを含む薬物−オリゴマーコンジュゲートの混合物、それらの使用、およびそれらの製造方法」と題する米国特許出願第０９／８７３，７９７号；およびＥｋｗｕｒｉｂｅらによって２００１年６月４日に出願された「ポリアルキレングリコールを含むインスリン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物、それらの使用、およびそれらの製造方法」と題する米国特許出願第０９／８７３，８９９号に記載されているように非多分散オリゴマーであってよい。
【００７１】
一部の実施形態では、オリゴマーは、ブロックコポリマーの親水性が保持されていることを条件に、ポリエチレングリコールもしくはポリプロピレングリコールのようなポリアルキレングリコール、ポリオキシエチレン化ポリオール、それらのコポリマーおよびそれらのブロックコポリマーを含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような親水性成分を含む、親水性成分から本質的になる、または親水性成分からなる。親水性成分は、ポリアルキレングリコール成分であってよい。ポリアルキレングリコール成分は、少なくとも１、２、３、４、５、６もしくは７ポリアルキレングリコールサブユニットを有する。ポリアルキレングリコール成分は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の下限と、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０個又はそれ以上の上限との間のポリアルキレングリコールサブユニットを有してよい。ポリアルキレングリコール成分は、２、３、４、５、または６個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の上限との間のポリアルキレングリコールサブユニットを有してもよく、及び／又は３、４、５、または６個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個の上限との間のポリアルキレングリコールサブユニットを有してもよい。一部の実施形態では、ポリアルキレングリコール成分は、４、５、または６個の下限と、６、７、または８個の上限との間のポリアルキレングリコールサブユニットを有することもあり、ある実施形態では、ポリアルキレングリコール成分は、７個のポリアルキレングリコールサブユニットを有することもある。オリゴマーのポリアルキレングリコール成分は、ポリエチレングリコール成分、ポリプロピレングリコール成分、またはポリブチレングリコール成分のような低級アルキルポリアルキレングリコール成分であってよい。ポリアルキレングリコール成分がポリプロピレングリコール成分である場合、前記成分は均一な（すなわち、ランダムではない）構造を有してよい。均一な構造を有する代表的なポリプロピレングリコール成分は次の通りである。
【化１】
0004602968.tif 000002
この均一なポリプロピレングリコール構造は、ポリプロピレングリコール鎖において各酸素原子に隣接して唯一のメチル置換炭素原子を有すると表現できる。このような均一なポリプロピレングリコール成分は親油性および親水性両方の特性を示すことができる。
【００７２】
オリゴマーは、追加の親水性成分、親油性成分、スペーサー成分、リンカー成分および末端成分を含むがそれらに限定されない当業者に理解されるような成分１以上を備えていてよい。オリゴマー内の様々な成分は、加水分解性結合または非加水分解結合のいずれかによって相互に共有結合している。
【００７３】
オリゴマーは、さらにまた糖、ポリアルキレングリコール、およびポリアミン／ＰＥＧコポリマーを含むがそれらに限定されない追加の親水性成分（すなわち、ポリアルキレングリコール成分へ追加する成分）１以上を備えていてよい。隣接ポリアルキレングリコール成分は、それらがエーテル結合によって結合している場合は同一成分であると見なされるであろう。例えば、成分
【化２】
0004602968.tif 000003
は、６個のポリエチレングリコールサブユニットを有する単一ポリエチレングリコール成分である。この成分がオリゴマー内の唯一の親水性成分であった場合、オリゴマーは追加の親油性成分を含有していないであろう。隣接するポリエチレングリコール成分は、それらがエーテル結合以外の結合によって結合している場合は相違する成分であると見なされるであろう。例えば、成分
【化３】
0004602968.tif 000004
は、４個のポリエチレングリコールサブユニットを有するポリエチレングリコール成分および２個のポリエチレングリコールサブユニットを有する追加の親水性成分である。本発明の一部の実施形態によるオリゴマーは、ポリアルキレングリコール成分を備え、追加の親水性成分を備えていないこともある。
【００７４】
オリゴマーは、さらに当業者には理解されるように、１以上の親油性成分を含むこともある。親油性成分は、少なくとも１、２、３、４、５、もしくは６個の炭素原子を有する。親油性成分は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の上限との間の炭素原子を有してよい。親油性成分は、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１個の上限との間の炭素原子を有してもよく、及び／又は３、４、５、６、７、８、または９個の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個の上限との間の炭素原子を有してもよい。一部の実施形態では、親油性成分は、３、４、５、６、または７個の下限と、６、７、８、９、または１０個の上限との間の炭素原子を有することもある。ある実施形態では、親油性成分は、６個の炭素原子を有する。親油性成分は、限定はしないが、飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖アルキル成分、飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖脂肪酸成分、コレステロール、およびアダマンタンであってよい。代表的なアルキル成分には、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、ノナデシルおよびエイコシルのような飽和直鎖アルキル成分；イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、２−メチルブチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、２−メチル−ペンチル、３−メチルペンチル、２−エチルヘキシル、２−プロピルペンチルのような飽和分岐鎖アルキル成分；ならびにビニル、アリル、１−ブテニル、２−ブテニル、エチニル、１−プロピニル、および２−プロピニルを含むがそれらに限定されない上記の飽和アルキル成分から誘導された不飽和アルキル成分が含まれるがそれらに限定されない。代表的な脂肪酸成分には、ラウロレート、ミリストレート、パルミトレート、オレエート、エライデート、エルケート、リノレート、リノレネート、アラキドネート、エイコサペンタエントエート、およびドコサヘキサエノエートのような不飽和脂肪酸成分；およびアセテート、カプロエート、カプリレート、カプレート、ラウレート、アラキデート、ベヘネート、リグノセラート、およびセロテートのような飽和脂肪酸成分が含まれるがそれらに限定されない。
【００７５】
オリゴマーは、当業者に理解されるように、１以上のスペーサー成分をさらに含むことができる。スペーサー成分は、例えば親油性成分から親水性成分を分離するため、プロインスリンポリペプチドから親油性成分もしくは親水性成分を分離するため、第２親水性成分もしくは親油性成分から第１親水性成分もしくは親油性成分を分離するため、またはリンカー成分から親水性成分もしくは親油性成分を分離するために使用できる。スペーサー成分は、糖、コレステロールおよびグリセリン成分であってよいが、これらに限定はされない。糖成分は、単糖成分および二糖成分を含むがそれらに限定されない当業者に理解されるような様々な糖成分であってよい。単糖成分は、４〜６個の炭素原子を有してよい。
【００７６】
オリゴマーは、当業者には理解されるように、オリゴマーをプロインスリンポリペプチドと結合させるために使用される１以上のリンカー成分を、さらに含むことができる。リンカー成分は、アルキルおよび脂肪酸成分であってよいが、これに限定はされない。アルキルリンカー成分は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、ノナデシル、エイコシル、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、２−メチルブチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、２−メチル−ペンチル、３−メチルペンチル、２−エチルヘキシル、２−プロピルペンチル、ビニル、アリル、１−ブテニル、２−ブテニル、エチニル、１−プロピニル、および２−プロピニルを含むがそれらに限定されない当業者に理解されるような飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖アルキル成分であってよい。アルコキシ成分は、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、ヘプチルオキシ、オクチルオキシ、ノニルオキシ、デシルオキシ、ウンデシルオキシ、ドデシルオキシ、トリデシルオキシ、テトラデシルオキシ、ペンタデシルオキシ、ヘキサデシルオキシ、オクタデシルオキシ、ノナデシルオキシ、エイコシルオキシ、イソプロポキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、２−メチルブトキシ、ｔｅｒｔ−ペンチルオキシ、２−メチル−ペンチルオキシ、３−メチルペンチルオキシ、２−エチルヘキシルオキシ、２−プロピルペンチルオキシ、ビニルオキシ、アリルオキシ、１−ブテニルオキシ、２−ブテニルオキシ、エチニルオキシ、１−プロピニルオキシ、および２−プロピニルオキシを含むがそれらに限定されない様々なアルコキシ成分であってよい。アルキルリンカー成分は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の上限との間の炭素原子を有してよく、１、２、３、４、または５個から８、９、１０、１１、または１２個の間の炭素原子を有することもある。脂肪酸リンカー成分は、ラウロレート、ミリストレート、パルミトレート、オレエート、エライデート、エルケート、リノレート、リノレネート、アラキドネート、エイコサペンタエントエート、ドコサヘキサエノエート、アセテート、カプロエート、カプリレート、カプレート、ラウレート、アラキデート、ベヘネート、リグノセレート、およびセロテートを含むがそれらに限定されない当業者に理解されるような飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖脂肪酸成分であってよい。脂肪酸リンカー成分は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の上限との間の炭素原子を有してよく、１、２、３、４、または５個から８、１０、１２、１４、または１６個の間の炭素原子を有することもある。
【００７７】
オリゴマーは、さらにまたオリゴマーの１以上の端に、１以上の末端成分（terminating moiety）を有していてよいが、それらはインスリンポリペプチドに結合していない。末端成分は、アルキルまたはアルコキシ成分であってよい。アルキルまたはアルコキシ成分は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の上限との間の炭素原子を有してよい。アルキルまたはアルコキシ成分は、１、２、３、４、５、６、または７個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個の上限との間の炭素原子を有してもよく、及び／又は１、２、３、４、または５個の下限と、５、６、７、８、９、または１０個の上限との間の炭素原子を有することもある。一部の実施形態では、アルキルまたはアルコキシ成分は、１、２、３、または４個の下限と、５、６、または７個の上限との間の炭素原子を有してよい。アルキル成分は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、ノナデシル、エイコシル、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、２−メチルブチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、２−メチル−ペンチル、３−メチルペンチル、２−エチルヘキシル、２−プロピルペンチル、ビニル、アリル、１−ブテニル、２−ブテニル、エチニル、１−プロピニル、および２−プロピニルを含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような直鎖もしくは分岐鎖の飽和もしくは不飽和のアルキル成分であってよい。アルコキシ成分は、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、ヘプチルオキシ、オクチルオキシ、ノニルオキシ、デシルオキシ、ウンデシルオキシ、ドデシルオキシ、トリデシルオキシ、テトラデシルオキシ、ペンタデシルオキシ、ヘキサデシルオキシ、オクタデシルオキシ、ノナデシルオキシ、エイコシルオキシ、イソプロポキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、２−メチルブトキシ、ｔｅｒｔ−ペンチルオキシ、２−メチル−ペンチルオキシ、３−メチルペンチルオキシ、２−エチルヘキシルオキシ、２−プロピルペンチルオキシ、ビニルオキシ、アリルオキシ、１−ブテニルオキシ、２−ブテニルオキシ、エチニルオキシ、１−プロピニルオキシ、および２−プロピニルオキシを含むがそれらに限定されない様々なアルコキシ成分であってよい。末端成分は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、もしくはｔｅｒｔ−ペンチルのような低級アルキル成分、またはメトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペンチルオキシ、もしくはｔｅｒｔ−ペンチルオキシのような低級アルコキシ成分であってよい。ある実施形態では、末端成分はメチルまたはメトキシである。末端成分はアルキルまたはアルコキシ成分であってよいが、末端成分は、糖、コレステロール、アルコール、脂肪酸及びｍＰＥＧ成分を含むがそれらに限定されない、当業者には理解されるような様々な成分であってよいと理解すべきである。
【００７８】
本発明の他の実施形態によると、オリゴマーは、式Ｉ： 
【化４】
0004602968.tif 000005
（式中、
Ａは活性化可能な成分であり、
Ｌはリンカー成分であり、
Ｇ、Ｇ’およびＧ’’は個別に選択されるスペーサー成分であり、
Ｒは親油性成分でありＲ’はポリアルキレングリコール成分である、またはＲ’は親油性成分でありＲはポリアルキレングリコール成分であり（Ｒ又はＲ’のうちの１つのみは存在すべきであり、一般に、Ｒ’が不在の時にはＧ”も不在であり、Ｒが不在の時にはＧも不在である）、
Ｔは末端成分であり、
ｊ、ｋ、ｍおよびｎは個別に０または１である）の構造を有する。
【００７９】
本発明の種々の実施形態によると、ポリアルキレングリコール成分は、少なくとも１、２、３、４、５、６もしくは７個のポリアルキレングリコールサブユニットを有してよい。ポリアルキレングリコール成分は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の下限と、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０個又はそれ以上の上限との間のポリアルキレングリコールサブユニットを有してよい。ポリアルキレングリコール成分は、２、３、４、５、または６個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の上限との間のポリアルキレングリコールサブユニットを有してもよく、及び／又は３、４、５、または６個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個の上限との間のポリアルキレングリコールサブユニットを有することもある。ある実施形態では、ポリアルキレングリコール成分は、４、５、または６個の下限と、６、７、または８個の上限との間のポリアルキレングリコールサブユニットを有し、かつ７個のポリアルキレングリコールサブユニットを有してもよい。オリゴマーのポリアルキレングリコール成分は、ポリエチレングリコール成分、ポリプロピレングリコール成分、またはポリブチレングリコール成分のような低級アルキルポリアルキレングリコール成分であってよい。ポリアルキレングリコール成分がポリプロピレングリコール成分である場合、前記成分は均一な（すなわち、ランダムではない）構造を有してよい。均一な構造を有する代表的なポリプロピレングリコール成分は次の通りである。
【化５】
0004602968.tif 000006
この均一なポリプロピレングリコール構造は、ポリプロピレングリコール鎖において各酸素原子に隣接して唯一のメチル置換炭素原子を有すると表現できる。このような均一なポリプロピレングリコール成分は親油性および親水性両方の特性を示すことができる。
【００８０】
本発明のこれらの実施形態によると、親油性成分は当業者には理解されるような親油性成分である。親油性成分は、少なくとも１、２、３、４、５、もしくは６個の炭素原子を有する。親油性成分は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の上限との間の炭素原子を有してよい。親油性成分は、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１個の上限との間の炭素原子を有してもよく、及び／又は３、４、５、６、７、８、または９個の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個の上限との間の炭素原子を有してよい。ある実施形態では、親油性成分は、３、４、５、６、または７個の下限と、６、７、８、９、または１０個の上限との間の炭素原子を有し、６個の炭素原子を有することもある。親油性成分は、飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖アルキル成分、飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖脂肪酸成分、コレステロール、およびアダマンタンであってもよいが、これらに限定はされない。代表的なアルキル成分には、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、ノナデシルおよびエイコシルのような飽和直鎖アルキル成分；イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、２−メチルブチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、２−メチル−ペンチル、３−メチルペンチル、２−エチルヘキシル、２−プロピルペンチルのような飽和分岐鎖アルキル成分；およびビニル、アリル、１−ブテニル、２−ブテニル、エチニル、１−プロピニル、および２−プロピニルを含むがそれらに限定されない上記の飽和アルキル成分から誘導された不飽和アルキル成分が含まれるがそれらに限定されない。代表的な脂肪酸成分には、ラウロレート、ミリストレート、パルミトレート、オレエート、エライデート、エルケート、リノレート、リノレネート、アラキドネート、エイコサペンタエントエート、およびドコサヘキサエノエートのような不飽和脂肪酸成分；およびアセテート、カプロエート、カプリレート、カプレート、ラウレート、アラキデート、ベヘネート、リグノセラート、およびセロテートのような飽和脂肪酸成分が含まれるがそれらに限定されない。
【００８１】
本発明のこれらの実施形態によると、スペーサー成分のＧ、Ｇ’、Ｇ’’は当業者には理解されるようなスペーサー成分である。スペーサー成分は、糖成分、コレステロールおよびグリセリン成分であってよいが、それらに限定されない。糖成分は、単糖成分および二糖成分を含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような様々な糖成分であってよい。単糖成分は、４〜６個の炭素原子を有してよい。ある特定の実施形態のオリゴマーはスペーサー成分を含んでいない（すなわち、ｋ、ｍおよびｎは０である）。
【００８２】
本発明のこれらの実施形態によると、リンカー成分のＬは、当業者に理解されるようにオリゴマーを薬物（例えばインスリン薬物）と結合させるために使用できる。リンカー成分は、アルキルおよび脂肪酸成分であってよいが、それらに限定されない。アルキルリンカー成分は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、ノナデシル、エイコシル、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、２−メチルブチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、２−メチル−ペンチル、３−メチルペンチル、２−エチルヘキシル、２−プロピルペンチル、ビニル、アリル、１−ブテニル、２−ブテニル、エチニル、１−プロピニル、および２−プロピニルを含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖アルキル成分であってよい。アルコキシ成分は、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、ヘプチルオキシ、オクチルオキシ、ノニルオキシ、デシルオキシ、ウンデシルオキシ、ドデシルオキシ、トリデシルオキシ、テトラデシルオキシ、ペンタデシルオキシ、ヘキサデシルオキシ、オクタデシルオキシ、ノナデシルオキシ、エイコシルオキシ、イソプロポキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、２−メチルブトキシ、ｔｅｒｔ−ペンチルオキシ、２−メチル−ペンチルオキシ、３−メチルペンチルオキシ、２−エチルヘキシルオキシ、２−プロピルペンチルオキシ、ビニルオキシ、アリルオキシ、１−ブテニルオキシ、２−ブテニルオキシ、エチニルオキシ、１−プロピニルオキシ、および２−プロピニルオキシを含むがそれらに限定されない様々なアルコキシ成分であってよい。アルキルリンカー成分は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０個の上限との間の炭素原子を有してよく、１、２、３、４または５個と、８、９、１０、１１または１２個との間の炭素原子を有することもある。脂肪酸リンカー成分は、ラウロレート、ミリストレート、パルミトレート、オレエート、エライデート、エルケート、リノレート、リノレネート、アラキドネート、エイコサペンタエントエート、ドコサヘキサエノエート、アセテート、カプロエート、カプリレート、カプレート、ラウレート、アラキデート、ベヘネート、リグノセレート、およびセロテートを含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖脂肪酸成分であってよい。脂肪酸リンカー成分は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０個の上限との間の炭素原子を有してよく、１、２、３、４または５個と、８、１０、１２、１４または１６個との間の炭素原子を有することもある。
【００８３】
本発明の多様な実施形態によると、末端成分のＴは、アルキルまたはアルコキシ成分であってよい。アルキルまたはアルコキシ成分は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の上限との間の炭素原子を有してよい。アルキルまたはアルコキシ成分は、１、２、３、４、５、６、または７個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個の上限との間の炭素原子を有してもよく、及び／又は１、２、３、４、または５個の下限と、５、６、７、８、９、または１０個の上限との間の炭素原子を有することもある。ある実施形態では、アルキルまたはアルコキシ成分は、１、２、３、または４個の下限と、５、６、または７個の上限との間の炭素原子を有してよい。アルキル成分は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、ノナデシル、エイコシル、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、２−メチルブチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、２−メチル−ペンチル、３−メチルペンチル、２−エチルヘキシル、２−プロピルペンチル、ビニル、アリル、１−ブテニル、２−ブテニル、エチニル、１−プロピニル、および２−プロピニルを含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような様々な直鎖もしくは分岐鎖の飽和もしくは不飽和のアルキル成分であってよい。代表的なアルコキシ成分は、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、ヘプチルオキシ、オクチルオキシ、ノニルオキシ、デシルオキシ、ウンデシルオキシ、ドデシルオキシ、トリデシルオキシ、テトラデシルオキシ、ペンタデシルオキシ、ヘキサデシルオキシ、オクタデシルオキシ、ノナデシルオキシ、エイコシルオキシ、イソプロポキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、２−メチルブトキシ、ｔｅｒｔ−ペンチルオキシ、２−メチル−ペンチルオキシ、３−メチルペンチルオキシ、２−エチルヘキシルオキシ、２−プロピルペンチルオキシ、ビニルオキシ、アリルオキシ、１−ブテニルオキシ、２−ブテニルオキシ、エチニルオキシ、１−プロピニルオキシ、および２−プロピニルオキシを含むがそれらに限定されない様々なアルコキシ成分であってよい。末端成分は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、もしくはｔｅｒｔ−ペンチルのような低級アルキル成分、またはメトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペンチルオキシ、もしくはｔｅｒｔ−ペンチルオキシのような低級アルコキシ成分であってよい。一部の実施形態では、末端成分はメチルまたはメトキシである。末端成分はアルキルまたはアルコキシ成分であってよいが、末端成分は糖成分、コレステロール、アルコール、脂肪酸成分及びｍＰＥＧ成分を含むがそれらに限定されない当業者に理解されるような様々な成分であってよいと理解しなければならない。
【００８４】
本発明のこれらの実施形態によると、活性化可能な成分のＡは、プロインスリンポリペプチドと結合することのできる活性化されたオリゴマーを生成するためにオリゴマーの活性化剤への結合を可能にする成分である。活性化可能な成分は、−Ｃ（Ｏ）−ＯＨ、Ｃ（Ｓ）−ＯＨ、−Ｃ（Ｓ）−ＳＨ、−ＯＨ、−ＳＨおよびＮＨ２を含むがそれらに限定されない,
当業者に理解されるような様々な活性化可能な成分であってよい。
【００８５】
さらに別の実施形態によると、オリゴマーは、式ＩＩの構造を有する。
【化６】
0004602968.tif 000007
式中、
Ａは−Ｃ（Ｏ）−ＯＨ、Ｃ（Ｓ）−ＯＨ、−Ｃ（Ｓ）−ＳＨ、−ＯＨ、−ＳＨ、またはＮＨ２であり、
Ｘは、酸素原子であるか、またはＡが−ＯＨであるときにＸが酸素ではないことを条件に共有結合であり、
Ｙは、エステル、エーテル、カルバメート、カルボネート、またはアミド結合部分であり、エーテル結合部分であってもよい、
ｍは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０の上限との間であり、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、または２２の上限との間であってよく、３、４、５、６、７、８、または９の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４の上限との間であってもよく、及び／又は３、４、５、６、または７の下限と、６、７、８、９、または１０の上限との間のこともあり、
ｎは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の下限と、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０の上限との間であり、２、３、４、５、または６の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の上限との間であってよく、３、４、５、または６の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２の上限との間のポリアルキレングリコールサブユニット数であってもよく、及び／又は４、５、または６の下限と、６、７、または８の上限との間のポリアルキレングリコールサブユニット数であってもよく、ある実施形態では７であり、
ｍとｎは、両方が０ではなく、
Ｒは、アルキル成分、糖成分、コレステロール、アダマンタン、アルコール成分、または脂肪酸成分である。アルキル成分は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、ノナデシル、エイコシル、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、２−メチルブチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、２−メチル−ペンチル、３−メチルペンチル、２−エチルヘキシル、２−プロピルペンチル、ビニル、アリル、１−ブテニル、２−ブテニル、エチニル、１−プロピニル、および２−プロピニルを含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような直鎖もしくは分岐鎖の飽和もしくは不飽和のアルキル成分であってよい。アルキル成分は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、またはｔｅｒｔ−ペンチルのような低級アルキル成分であってよい。アルキル成分は、Ｃ１〜Ｃ３アルキルであってもよい。ある実施形態では、アルキル成分はメチルである。脂肪酸成分は、ラウロレート、ミリストレート、パルミトレート、オレエート、エライデート、エルケート、リノレート、リノレネート、アラキドネート、エイコサペンタエントエート、ドコサヘキサエノエート、アセテート、カプロエート、カプリレート、カプレート、ラウレート、アラキデート、ベヘナート、リグノセラート、およびセロテートを含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖脂肪酸成分であってよい。
【００８６】
さらに別の実施形態によると、オリゴマーは、式ＩＩＩの構造を有する。
【化７】
0004602968.tif 000008
式中、
Ａは、−Ｃ（Ｏ）−ＯＨ、Ｃ（Ｓ）−ＯＨ、−Ｃ（Ｓ）−ＳＨ、−ＯＨ、−ＳＨ、またはＮＨ２であり、
ｍは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０の上限との間であり、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、または２２の上限との間であってよく、３、４、５、６、７、８、または９の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４の上限との間であってもよく、及び／又は３、４、５、６、または７の下限と、６、７、８、９、または１０の上限との間であることもあり、
ｎは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の下限と、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０の上限との間であり、２、３、４、５、または６の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の上限との間であってよく、３、４、５、または６の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２の上限との間のポリアルキレングリコールサブユニット数であってもよく、及び／又は４、５、または６の下限と、６、７、または８の上限との間のポリアルキレングリコールサブユニット数であってもよく、ある実施形態では７であり、
ｍとｎの両方が０になることはなく、
Ｒは、アルキル成分、糖成分、コレステロール、アダマンタン、アルコール成分、または脂肪酸成分である。アルキル成分は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、ノナデシル、エイコシル、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、２−メチルブチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、２−メチル−ペンチル、３−メチルペンチル、２−エチルヘキシル、２−プロピルペンチル、ビニル、アリル、１−ブテニル、２−ブテニル、エチニル、１−プロピニル、および２−プロピニルを含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような直鎖もしくは分岐鎖の飽和もしくは不飽和のアルキル成分であってよい。アルキル成分は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、またはｔｅｒｔ−ペンチルのような低級アルキル成分であってよい。アルキル成分は、Ｃ１〜Ｃ３アルキルであってもよい。特定の実施形態では、アルキル成分はメチルである。脂肪酸成分は、ラウロレート、ミリストレート、パルミトレート、オレエート、エライデート、エルケート、リノレート、リノレネート、アラキドネート、エイコサペンタエントエート、ドコサヘキサエノエート、アセテート、カプロエート、カプリレート、カプレート、ラウレート、アラキデート、ベヘナート、リグノセラート、およびセロテートを含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖脂肪酸成分であってよい。
【００８７】
さらにまた別の実施形態によると、オリゴマーは、式ＩＶの構造を有する。
【化８】
0004602968.tif 000009
式中、
ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０の上限との間であり、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、または２２の上限との間であってよく、３、４、５、６、７、８、または９の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４の上限との間であってもよく、及び／又は３、４、５、６、または７の下限と、６、７、８、９、または１０の上限との間であってもよく、
ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の下限と、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０の上限との間であり、２、３、４、５、または６の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の上限との間であってよく、３、４、５、または６の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２の上限との間のポリアルキレングリコールサブユニット数であってもよく、及び／又は４、５、または６の下限と、６、７、または８の上限の間のポリアルキレングリコールサブユニット数であってもよく、特定の実施形態では７であり、
Ｒは、アルキル成分、糖成分、コレステロール、アダマンタン、アルコール成分、または脂肪酸成分である。アルキル成分は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、ノナデシル、エイコシル、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、２−メチルブチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、２−メチル−ペンチル、３−メチルペンチル、２−エチルヘキシル、２−プロピルペンチル、ビニル、アリル、１−ブテニル、２−ブテニル、エチニル、１−プロピニル、および２−プロピニルを含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような直鎖もしくは分岐鎖の飽和もしくは不飽和のアルキル成分であってよい。アルキル成分は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、またはｔｅｒｔ−ペンチルのような低級アルキル成分であってよい。アルキル成分は、Ｃ１〜Ｃ３アルキルであってもよい。特定の実施形態では、アルキル成分はメチルである。脂肪酸成分は、ラウロレート、ミリストレート、パルミトレート、オレエート、エライデート、エルケート、リノレート、リノレネート、アラキドネート、エイコサペンタエントエート、ドコサヘキサエノエート、アセテート、カプロエート、カプリレート、カプレート、ラウレート、アラキデート、ベヘナート、リグノセラート、およびセロテートを含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖脂肪酸成分であってよい。
【００８８】
さらに別の実施形態では、オリゴマーは、式Ｖの構造を有する。
【化９】
0004602968.tif 000010
上述の様々な実施形態では、オリゴマーは、インスリン薬物としてインスリンポリペプチドに共有結合している。例えば本発明のオリゴマーは、構造Ｖａ：
【化１０】
0004602968.tif 000011
を含んでよく、インスリン薬物は、本明細書中に記載されるインスリンポリペプチドである。インスリン薬物はヒトインスリンであり、かつ式Ｖａのコンジュゲートは、ヒトインスリンのＢ２９位置でリジンと結合した単一オリゴマーからなる場合、インスリンオリゴマーコンジュゲートは、ＨＩＭ２と呼ばれる。
【００８９】
一部の実施形態では、オリゴマーは加水分解性結合（例えば、エステルまたはカルボネート結合）を利用してインスリンポリペプチドに結合することができる。加水分解性結合は、プロドラッグとして機能するインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを提供できる。場合によっては、例えばインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートが生物学的に不活性である（すなわち、このコンジュゲートにはインスリンポリペプチドの一次作用機序を通して身体に影響を及ぼす能力が欠けている）場合には、加水分解性結合は、それらの各生物学的に不活性なインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートから１以上のオリゴマーが開裂されて、生物学的に活性なインスリンポリペプチドが得られるように所定の期間にわたり生物学的に活性なインスリンポリペプチドを提供する、徐放性もしくは放出制御性作用を提供できる。一部の実施形態では、オリゴマーは、プロインスリンポリペプチド又はインスリンポリペプチドから開裂されて、インスリンを生じることができる。加水分解性結合は、オリゴマー内に含まれ、コンジュゲートされた活性成分（conjugated active moiety）を生じるプロドラッグを産生することができる。
【００９０】
他の実施形態では、オリゴマーは非加水分解性結合（例えば、カルバメート、アミド、またはエーテル結合）を利用してインスリンポリペプチドに結合している。非加水分解性結合の使用は、生物学的に不活性なインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートが好ましくは少なくとも２時間の長時間にわたり血流内を循環することを可能にすることが望ましい場合に好ましいことがある。オリゴマーが、エステル、カルバメート、カルボネート、またはアミド結合成分のようなカルボニル成分を含む結合成分を利用してインスリンポリペプチドに結合している場合は、結果として生じるインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートはインスリンポリペプチド−アシルオリゴマーコンジュゲートである。
【００９１】
上述の様々な実施形態に使用したオリゴマーは、市販で入手できる、または当業者に理解されるような様々な方法によって合成できる。例えば、多分散オリゴマーは以下の参考文献の１以上に提供された方法によって合成できる。Ｄａｖｉｓらへの米国特許第４，１７９，３３７号；Ｇｒｅｅｎｗａｌｄへの米国特許第５，５６７，４２２号；Ｅｋｗｕｒｉｂｅへの米国特許第５，３５９，０３０号；Ｅｋｗｕｒｉｂｅへの米国特許第５，４３８，０４０号；Ｅｋｗｕｒｉｂｅへの米国特許第５，６８１，８１１号、Ｅｋｗｕｒｉｂｅらへの米国特許第６，３０９，６３３号。非多分散（例えば、実質的に単分散および単分散）オリゴマーは、その開示が、全体として引用することにより本明細書の一部をなす以下の参考文献の１以上に提供された方法によって合成できる。Ｅｋｗｕｒｉｂｅらによって２００１年６月４日に出願された「ポリエチレングリコール混合物を有するポリマーの実質的単分散混合物の合成方法（Methods of Synthesizing Substantially Monodispersed Mixtures of Polymers Having Polyethylene Glycol Mixture）」と題する米国特許出願第０９／８７３，７３１号；Ｅｋｗｕｒｉｂｅらによって２００１年６月４日に出願された「ポリアルキレングリコールを含む薬物−オリゴマーコンジュゲートの混合物、それらの使用、およびそれらの製造方法(Mixtures of Drug-Oligomer Conjugates Comprising Polyalkylene Glycol,Use There of,and Methods of Making Same)」と題する米国特許出願第０９／８７３，７９７号；およびＥｋｗｕｒｉｂｅらによって２００１年６月４日に出願された「ポリアルキレングリコールを含むインスリン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物、それらの使用、およびそれらの製造方法(Mixtures of Insulin Drug-Oligomer Conjugates Comprising Polyalkylene Glycol,Use There of,and Methods of Making Same)」と題する米国特許出願第０９／８７３，８９９号。本発明の実施形態によるオリゴマーは、実質的単分散であってよく、単分散であってもよい。単分散オリゴマーを合成するための代表的な方法を本明細書中に記載の実施例に示す。
【００９２】
プロインスリンポリペプチドとオリゴマーとを、プロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを得るのに十分な条件下で接触させるステップは、当業者には理解されるように様々な条件を利用して実施できる。プロインスリンポリペプチドとオリゴマーとを、プロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを得るのに十分な条件下で接触させるステップは、オリゴマーと活性化剤とを、活性化されたオリゴマーを得るのに十分な条件下で接触させるステップと、活性化されたオリゴマーとプロインスリンポリペプチドとを、プロインスリンポリペプチドコンジュゲートを得るのに十分な条件下で接触させるステップとを含む。活性化されたオリゴマーはエクスサイチューまたはインサイチューで生成できる。
【００９３】
活性化剤は、オリゴマーが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ｐ−ニトロフェニルクロロホルメート、１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド、およびヒドロキシベンゾトリアジドを含むがそれらに限定されない当業者には理解されるようなプロインスリンポリペプチド内の求核性ヒドロキシル基および／またはアミノ基と反応できるように、上記の１以上のオリゴマーを活性化できる様々な活性化剤であってよい。
【００９４】
当業者であれば、活性化剤をオリゴマーに結合させて、活性化されたオリゴマーを得るのに十分な条件を理解するであろう。例えば、当業者であれば、活性化剤をオリゴマーに結合させることの教示のために、全体として引用することにより本明細書の一部をなすものとするＲ．Ｃ．Ｌａｒｏｃｋ，「ＣＯＭＰＲＥＨＥＮＳＩＶＥ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＴＲＡＮＳＦＯＲＭＡＴＩＯＮＳ．  Ａ  ＧＵＩＤＥ  ＴＯ  ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ  ＧＲＯＵＰ  ＰＲＥＰＡＲＡＴＩＯＮＳ」，（第２版，ニューヨーク，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，１９９９）を参照することができる。
【００９５】
活性化されたオリゴマーをプロインスリンポリペプチドに結合させるために十分な条件は、当業者には理解されるであろう。例えば、プロインスリンポリペプチドは、プロインスリンポリペプチド溶液を得るために、ジメチルスルホキシドのような双極性非プロトン溶媒中に溶解させることができる。プロインスリンポリペプチド溶液には、トリエチルアミンのような緩衝剤を添加できる。プロインスリンポリペプチド溶液には、その後アセトニトリルのような無水溶媒中に溶解させた活性化されたオリゴマーを添加できる。当業者であれば、同様にＲ．Ｃ．Ｌａｒｏｃｋ，「ＣＯＭＰＲＥＨＥＮＳＩＶＥ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＴＲＡＮＳＦＯＲＭＡＴＩＯＮＳ．  Ａ  ＧＵＩＤＥ  ＴＯ  ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ  ＧＲＯＵＰ  ＰＲＥＰＡＲＡＴＩＯＮＳ」，（第２版，ニューヨーク，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，１９９９）を参照することができる。活性化されたオリゴマー対プロインスリンポリペプチドのモル比は、約１：１より大きくてよく、約２：１より大きくてよく、約３：１より大きくてよく、約４：１より大きくてよく、及び／又は約５：１より大きくてよい。
【００９６】
上述の様々な実施形態では、２つ以上のオリゴマー（すなわち、複数のオリゴマー）をプロインスリンポリペプチドのインスリンポリペプチド部分に結合させることができる。あるいは、オリゴマーは、例えばコンジュゲートされたインスリンの精製を促進するために、プロインスリンポリペプチドの非インスリンポリペプチド部分に結合させることができる。複数のオリゴマーは、同一であることもある。しかし、複数のオリゴマーは相互に相違していてもよい、あるいはまた、複数のオリゴマーの一部は同一で、一部は相違していてもよいことは理解すべきである。複数のオリゴマーがプロインスリンポリペプチドのインスリンポリペプチド部分に結合している場合は、加水分解性結合を用いて１以上のオリゴマーをプロインスリンポリペプチドのインスリンポリペプチド部分に結合させ、そして非加水分解性結合を用いて１以上のオリゴマーをプロインスリンポリペプチドのインスリンポリペプチド部分に結合させることができる。あるいはまた、複数のオリゴマーをプロインスリンポリペプチドのインスリンポリペプチド部分に結合させる結合の全部が加水分解性であってよいが、例えば、１以上のオリゴマーが身体内の加水分解によってインスリンポリペプチドまたはプロインスリンポリペプチドのインスリンポリペプチド部分から迅速に除去され、そして１以上のオリゴマーが身体内の加水分解によってインスリンポリペプチドまたはインスリンポリペプチド部分から緩徐に除去されるように、相違する加水分解度を有し得る。
【００９７】
上述の様々な実施形態では、オリゴマーは求核性ヒドロキシル基および／またはアミノ基を含むがそれらに限定されないインスリンポリペプチド部分及び／又は非インスリンポリペプチド部分の様々な求核性残基でプロインスリンポリペプチドのインスリンポリペプチド部分及び任意にはプロインスリンポリペプチドの非インスリンポリペプチド部分に結合されてよい。求核性ヒドロキシル基は、例えばセリンおよび／またはチロシン残基で見いだすことができ、そして求核性アミノ基は、例えばヒスチジンおよび／またはリジン残基で、および／またはポリペプチドの１以上のＮ末端で見いだすことができる。オリゴマーがプロインスリンポリペプチドの１以上のＮ末端に結合している場合は、その結合は第２級アミンを形成することができる。プロインスリンポリペプチドがＢ鎖ポリペプチドのＮ末端に結合したリーダーペプチドを有している場合、インスリン分子のＮ末端はコンジュゲーション（例えば、アシル化）から保護できる。プロインスリンポリペプチドがＢ鎖のＮ末端に結合したリーダーペプチドを有するヒトプロインスリンである場合、例えば、オリゴマーはプロインスリンの３つのアミノ基：リーダーペプチドのＮ末端、Ｃ−ペプチドのＬｙｓ残基のアミノ基、およびＬｙｓＢ２９のアミノ基に結合させることができる。リーダーペプチドおよびＣ−ペプチドが開裂すると、オリゴマーがインスリンのＬｙｓＢ２９へ部位特異的に結合して、ＬｙｓＢ２９でオリゴマーとモノコンジュゲートしたインスリンである単一インスリンコンジュゲートが得られることが見いだされる。
【００９８】
インスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを得るためのプロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートから１以上のペプチドを開裂させるステップは、当業者には理解されるように様々な工程によって実施できる。一部の実施形態では、プロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートから１以上のペプチドを開裂させるステップは、プロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートと、１以上のペプチドとインスリンポリペプチドの間の結合を開裂させることのできる１以上の酵素とを、プロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートから１以上のペプチドを開裂させるために十分な条件下で接触させるステップを含む。様々な参考文献、例えば全体として引用することにより本明細書の一部をなす、Ｋｅｍｍｌｅｒ等，「プロインスリンからインスリンへの転換に関する研究(Studies on the Conversion of Proinsulin to Insulin)」，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４６：６７８６−６７９１（１９７１）に記載されているように、当業者であれば開裂される特定ペプチド結合に照らして適切な酵素を選択する方法およびプロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートから１以上のペプチドを開裂させるために十分な条件を提供する方法を理解するであろう。１以上の酵素は、例えば、トリプシン、キモトリプシン、カルボキシペプチダーゼＢ、およびそれらの混合物を含むがそれらに限定されない様々な酵素を含むことができる。特定の実施形態では、１以上の酵素は、トリプシン、カルボキシペプチダーゼＢ、およびそれらの混合物である。
【００９９】
連結ペプチドを有する上述のような一部の実施形態では、連結ペプチドは第１端に末端アミノ酸残基を有する。これらの実施形態の一部では、プロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートから連結ペプチドを開裂させるステップは、プロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートと第１酵素とを、末端アミノ酸残基−インスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを得るのに十分な条件下で接触させるステップと、および末端アミノ酸残基−インスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートと第２酵素とを、インスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを得るのに十分な条件下で接触させるステップとを含む。プロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートと第１酵素とを接触させるステップおよび末端アミノ酸残基−インスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートと第２酵素とを接触させるステップは、例えば第１酵素および第２酵素が混合物または反応混液として提供される場合には、実質的に同時に発生させることができる。特定の実施形態では、第１酵素は、トリプシンおよび第２酵素はカルボキシペプチダーゼＢであってよい。末端アミノ酸残基は、アルギニン残基又はｇｌｕ−残基のような様々な残基のうちの任意のものであってよく、ｇｌｕ−残基は、ｇｌｕ−Ｃ−ペプチダーゼで開裂され得る。例えば、末端アミノ酸残基は、インスリンポリペプチドがインスリンであり、連結ペプチドがヒトＣ−ペプチドである場合は、アルギニン残基である。
【０１００】
プロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートから１以上のペプチドを開裂させるステップは、単一インスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲート（すなわち、実質的に追加のインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートが欠けている）からなるインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲート産物を得る。インスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲート産物は、単一インスリンポリペプチド−オリゴマーモノコンジュゲートからなっていてもよい。例えば、上述の実施形態において、プロインスリンポリペプチドは、リジン残基が欠けているＡ鎖ポリペプチドおよび単一リジン残基を有するＢ鎖ポリペプチドを有するインスリンポリペプチドを含むが、インスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲート産物は、オリゴマーがＢ鎖ポリペプチドのリジン残基に結合している場合に単一インスリンポリペプチド−オリゴマーモノコンジュゲートからなっていてよい。別の例として、プロインスリンポリペプチドがリーダーペプチドを備えるプロインスリンである場合は、プロインスリン−オリゴマーコンジュゲートからＣ−ペプチドおよびリーダーペプチドを開裂させるステップはインスリン−オリゴマーモノコンジュゲートを提供するが、このときインスリンはＬｙｓＢ２９でモノコンジュゲートしている。
【０１０１】
上述のインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートの合成方法の実施形態は、７５、７６、７７、７８、または７９％より大きいインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲート及び／又はジコンジュゲートの収率を生じることができる。特定の実施形態では、収率は、８０、８１、８２、８３、８４、または８５％より大きい。特定の他の実施形態では、収率は、８６、８７、８８、８９、または９０％より大きい。さらに他の実施形態では、収率は、９１、９２、９３、９４、または９５％より大きい。プロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートが活性化されたオリゴマーとプロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートとを接触させるステップによって提供される場合は、より高い収率を達成するのに過剰の活性化されたオリゴマーを使用することができる。例えば、ここに記載の収率は、種々の実施形態で、約２：１より大きく、約３：１より大きく、約４：１より大きく、及び／又は約５：１より大きい活性化されたオリゴマー対プロインスリンポリペプチドのモル比を使用することによって得ることができる。一部の実施形態では、９１、９２、９３、９４、もしくは９５％より高い収率は、約４：１より大きく、一部の実施形態では約５：１より大きい活性化されたオリゴマー対プロインスリンポリペプチドのモル比を使用することによって得られる。
【０１０２】
本発明の他の実施形態により、プロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートの合成方法が提供され、これには、インスリンポリペプチドを産生させるために開裂させることのできるペプチド結合によって１以上のペプチドに結合したインスリンポリペプチドを含むプロインスリンポリペプチドとオリゴマーとを、プロインスリンポリペプチドのインスリンポリペプチド部分へオリゴマーを結合させてプロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを得るのに十分な条件下で接触させるステップが含まれる。例えば、プロインスリン−オリゴマーコンジュゲートは下記に示す実施例に記載した通りに合成できる。合成経路の１つの実施形態は図１に示した。
【０１０３】
プロインスリンポリペプチドは、当業者には理解されるように、インスリンポリペプチドを産生するために開裂させることのできるペプチド結合によって１以上のペプチドに結合したインスリンポリペプチドを含む様々なプロインスリンポリペプチドであってよく、プロインスリン、プロインスリン類似体、プロインスリンフラグメント、プロインスリンフラグメント類似体、ミニプロインスリン、ＳＣＩＰまたは融合タンパク質を含むがそれらに限定されない。一部の実施形態では、プロインスリンポリペプチドはリーダーペプチドを有するプロインスリン類似体である。リーダーペプチドを有するプロインスリン類似体は、例えば、日本の茨城県所在の伊藤ハム食品社から市販されている。プロインスリン類似体のリーダーペプチドおよびＣ−ペプチドにはそれぞれリジン残基が欠けている。他の実施形態では、プロインスリンポリペプチドは、例えば、ブラジルのベロオリゾンテ所在のＢｉｏｂｒａｓ社から市販されているプロインスリンポリペプチドである。プロインスリンポリペプチドは、プロインスリンのＢ鎖のＮ末端に結合したリーダーペプチドを有する。このリーダーペプチドにはリジン残基が欠けている。
【０１０４】
インスリンポリペプチドは、Ａ鎖ポリペプチドおよびＢ鎖ポリペプチドを有してよい。Ａ鎖ポリペプチドに、リジン残基が欠けていることがある。Ｂ鎖ポリペプチドは、単一リジン残基を備えていることがある。Ａ鎖ポリペプチドおよびＢ鎖ポリペプチドは、架橋していてよく、１以上のジスルフィド結合を使用して架橋していてよい。特定の実施形態では、Ａ鎖ポリペプチドおよびＢ鎖ポリペプチドは各々システイン残基を備えており、それらの１以上はＡ鎖ポリペプチドをＢ鎖ポリペプチドと架橋させるために１以上のジスルフィド結合を使用して結合されている。インスリンポリペプチドはインスリン、インスリン類似体、インスリンフラグメント、またはインスリン類似体フラグメントであってよい。
【０１０５】
一部の実施形態では、インスリンポリペプチドに結合した１以上のペプチドはＢ鎖ポリペプチドのＣ末端に第１端で結合し、Ａ鎖ポリペプチドのＮ末端に第２端で結合した連結ペプチドを備えている。一般に、連結ペプチドのアミノ酸配列は決定的に重要ではなく、そして連結ペプチドは、ミニプロインスリンにおける連結ペプチド、Ｃ−ペプチドポリペプチド及びＣ−ペプチドを含むがそれらに限定されない当業者には理解されるであろう様々な連結ペプチドであってよい。一部の実施形態では、この連結ペプチドにはリジン残基が欠けている。これらの実施形態は、プロインスリンポリペプチド分子上の可能性のあるコンジュゲーション部位の数を減少させることによりオリゴマー試薬の利用を減じることができる。
【０１０６】
他の実施形態では、インスリンポリペプチドに結合した１以上のペプチドはＢ鎖ポリペプチドのＮ末端に結合したリーダーペプチドを含む。一般に、リーダーペプチドのアミノ酸配列は決定的に重要ではない。一部の実施形態では、このリーダーペプチドにはリジン残基が欠けている。これらの実施形態は、プロインスリンポリペプチド分子上のコンジュゲーション部位数を限定することにより使用するオリゴマー試薬の量を減少させることができる。
【０１０７】
さらにまた別の実施形態では、インスリンポリペプチドに結合した１以上のペプチドは上述の連結ペプチドおよび上述のリーダーペプチドの両方を含む。１以上のペプチドは、本質的に連結ペプチドおよびリーダーペプチドから構成されてよい、または連結ペプチドおよびリーダーペプチドから構成されてよい。
【０１０８】
ペプチド結合は、当業者には理解されるように、様々な方法で開裂できる結合である。ペプチド結合はトリプシン、カルボキシペプチダーゼＢ、トロンビン、ペプシン、およびキモトリプシンを含むがそれらに限定されない酵素によって酵素開裂させることのできる結合である。酵素により開裂できるペプチド結合は当業者には理解されるものであり、Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ｔｈｒ−Ａｒｇ、Ａｌａ−Ａｒｇ、Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ｔｈｒ−Ｌｙｓ、Ａｒｇ−Ｇｌｙ、およびＡｒｇ−Ｐｈｅを含むがそれらに限定されない。
【０１０９】
オリゴマーは、当業者には理解されるように、様々なオリゴマーであってよい。一般に、オリゴマーは、当業者には理解されるように、ポリペプチドに結合することのできるあらゆるオリゴマーであってよい。例えば、オリゴマーは、Ｄａｖｉｓらへの米国特許第４，１７９，３３７号；Ｇｒｅｅｎｗａｌｄへの米国特許第５，５６７，４２２号；Ｅｋｗｕｒｉｂｅへの米国特許第５，３５９，０３０号；Ｅｋｗｕｒｉｂｅへの米国特許第５，４３８，０４０号；Ｅｋｗｕｒｉｂｅへの米国特許第５，６８１，８１１号；およびＥｋｗｕｒｉｂｅらへの米国特許第６，３０９，６３３号に記載されているように多分散オリゴマーであってよい。別の実施例として、オリゴマーは、Ｅｋｗｕｒｉｂｅらによって２００１年６月４日に出願された「ポリエチレングリコール混合物を有するポリマーの実質的単分散混合物の合成方法」と題する米国特許出願第０９／８７３，７３１号；Ｅｋｗｕｒｉｂｅらによって２００１年６月４日に出願された「ポリアルキレングリコールを含む薬物−オリゴマーコンジュゲートの混合物、それらの使用、およびそれらの製造方法」と題する米国特許出願第０９／８７３，７９７号；およびＥｋｗｕｒｉｂｅらによって２００１年６月４日に出願された「ポリアルキレングリコールを含むインスリン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物、それらの使用、およびそれらの製造方法」と題する米国特許出願第０９／８７３，８９９号に記載されているように非多分散オリゴマーであってよい。代わりの実施形態では、オリゴマーのポリアルキレングリコールのみが実質的に非分散である。
【０１１０】
オリゴマーは、ブロックコポリマーの親水性が維持されていることを条件に、ポリエチレングリコールもしくはポリプロピレングリコールのようなポリアルキレングリコール、ポリオキシエチレン化ポリオール、それらのコポリマーおよびそれらのブロックコポリマーを含むがそれらに限定されない、当業者には理解されるような親水性成分を含んでよい。親水性成分は、ポリアルキレングリコール成分であってよい。ポリアルキレングリコール成分は、少なくとも１、２、３、４、５、６もしくは７個のポリアルキレングリコールサブユニットを有してよい。ポリアルキレングリコール成分は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の下限と、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０個又はそれ以上の上限との間のポリアルキレングリコールサブユニットを有してもよい。ポリアルキレングリコール成分は、２、３、４、５、または６個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の上限との間のポリアルキレングリコールサブユニットを有してもよい。一部の実施形態により、ポリアルキレングリコール成分は、３、４、５、または６個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個の上限との間のポリアルキレングリコールサブユニットを有してよい。ポリアルキレングリコール成分は、４、５、または６個の下限と、６、７、または８個の上限との間のポリアルキレングリコールサブユニットを有してもよく、特定の実施形態では、７個のポリアルキレングリコールサブユニットを有する。オリゴマーのポリアルキレングリコール成分は、ポリエチレングリコール成分、ポリプロピレングリコール成分、またはポリブチレングリコール成分のような低級アルキルポリアルキレングリコール成分であってよい。ポリアルキレングリコール成分がポリプロピレングリコール成分である場合、成分は均一な（すなわち、ランダムではない）構造を有してよい。均一な構造を有する代表的なポリプロピレングリコール成分は次の通りである。
【化１１】
0004602968.tif 000012
この均一なポリプロピレングリコール構造は、ポリプロピレングリコール鎖において各酸素原子に隣接して唯一のメチル置換炭素原子を有すると表現できる。このような均一なポリプロピレングリコール成分は親油性および親水性両方の特性を示すことができる。
【０１１１】
オリゴマーは、追加の親水性成分、親油性成分、スペーサー成分、リンカー成分および末端成分を含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような他の成分１以上を備えていてよい。オリゴマー内の様々な成分は、加水分解性結合または非加水分解結合のいずれかによって相互に共有結合している。
【０１１２】
オリゴマーは、さらにまた、糖、ポリアルキレングリコール、およびポリアミン／ＰＥＧコポリマーを含むがそれらに限定されない１以上の追加の親水性成分（すなわち、ポリアルキレングリコール成分へ追加する成分）を備えていてよい。隣接ポリアルキレングリコール成分は、それらがエーテル結合によって結合している場合は同一成分であると見なされる。例えば、以下の成分
【化１２】
0004602968.tif 000013
は６個のポリエチレングリコールサブユニットを有する単一ポリエチレングリコール成分である。この成分がオリゴマー内の唯一の親水性成分であった場合、オリゴマーは追加の親水性成分を含有していないであろう。隣接するポリエチレングリコール成分は、それらがエーテル結合以外の結合によって結合している場合は相違する成分であると見なされるであろう。例えば、成分
【化１３】
0004602968.tif 000014
は、４個のポリエチレングリコールサブユニットを有するポリエチレングリコール成分および２個のポリエチレングリコールサブユニットを有する追加の親水性成分である。本発明の一部の実施形態によるオリゴマーは、ポリアルキレングリコール成分を備えており、そして追加の親水性成分を備えていなくてよい。
【０１１３】
オリゴマーは、当業者には理解されるように、１以上の親油性成分をさらに含んでよい。親油性成分は、少なくとも１、２、３、４、５、もしくは６個の炭素原子を有する。親油性成分は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の上限との間の炭素原子を有してよい。親油性成分は、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１個の上限との間の炭素原子を有してもよく、及び／又は３、４、５、６、７、８、または９個の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個の上限との間の炭素原子を有してもよい。一部の実施形態では、親油性成分は、３、４、５、６、または７個の下限と、６、７、８、９、または１０個の上限との間の炭素原子を有してよく、特定の実施形態では、６個の炭素原子を有する。親油性成分は、飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖アルキル成分、飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖脂肪酸成分、コレステロール、およびアダマンタンであってよい。代表的なアルキル成分には、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、ノナデシルおよびエイコシルのような飽和直鎖アルキル成分；イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、２−メチルブチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、２−メチル−ペンチル、３−メチルペンチル、２−エチルヘキシル、２−プロピルペンチルのような飽和分岐鎖アルキル成分；およびビニル、アリル、１−ブテニル、２−ブテニル、エチニル、１−プロピニル、および２−プロピニルを含むがそれらに限定されない上記の飽和アルキル成分から誘導された不飽和アルキル成分が含まれるがそれらに限定されない。代表的な脂肪酸成分には、ラウロレート、ミリストレート、パルミトレート、オレエート、エライデート、エルケート、リノレート、リノレネート、アラキドネート、エイコサペンタエントエート、およびドコサヘキサエノエートのような不飽和脂肪酸成分；およびアセテート、カプロエート、カプリレート、カプレート、ラウレート、アラキデート、ベヘネート、リグノセラート、およびセロテートのような飽和脂肪酸成分が含まれるがそれらに限定されない。
【０１１４】
オリゴマーは、当業者には理解されるように、１以上のスペーサー成分をさらに含むことができる。スペーサー成分は、例えば親油性成分から親水性成分を分離するため、プロインスリンポリペプチドから親油性成分もしくは親水性成分を分離するため、第２親水性成分もしくは親油性成分から第１親水性成分もしくは親油性成分を分離するため、またはリンカー成分から親水性成分もしくは親油性成分を分離するために使用できる。スペーサー成分は、糖、コレステロールおよびグリセリン成分であってよいが、それらに限定されない。糖成分は、単糖成分および二糖成分を含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような様々な糖成分であってよい。単糖成分は、４〜６個の炭素原子を有してよい。
【０１１５】
オリゴマーは、当業者には理解されるように、オリゴマーとプロインスリンポリペプチドとを結合させるために使用されるリンカー成分１以上をさらに含むことができる。リンカー成分は、例えば、アルキルおよび脂肪酸成分であってよい。アルキルリンカー成分は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、ノナデシル、エイコシル、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、２−メチルブチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、２−メチル−ペンチル、３−メチルペンチル、２−エチルヘキシル、２−プロピルペンチル、ビニル、アリル、１−ブテニル、２−ブテニル、エチニル、１−プロピニル、および２−プロピニルを含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖アルキル成分であってよい。アルコキシ成分は、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、ヘプチルオキシ、オクチルオキシ、ノニルオキシ、デシルオキシ、ウンデシルオキシ、ドデシルオキシ、トリデシルオキシ、テトラデシルオキシ、ペンタデシルオキシ、ヘキサデシルオキシ、オクタデシルオキシ、ノナデシルオキシ、エイコシルオキシ、イソプロポキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、２−メチルブトキシ、ｔｅｒｔ−ペンチルオキシ、２−メチル−ペンチルオキシ、３−メチルペンチルオキシ、２−エチルヘキシルオキシ、２−プロピルペンチルオキシ、ビニルオキシ、アリルオキシ、１−ブテニルオキシ、２−ブテニルオキシ、エチニルオキシ、１−プロピニルオキシ、および２−プロピニルオキシを含むがそれらに限定されない様々なアルコキシ成分であってよい。アルキルリンカー成分は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の上限との間の炭素原子を有してよく、１、２、３、４、または５個から８、９、１０、１１、または１２個の間の炭素原子を有してよい。脂肪酸リンカー成分は、ラウロレート、ミリストレート、パルミトレート、オレエート、エライデート、エルケート、リノレート、リノレネート、アラキドネート、エイコサペンタエントエート、ドコサヘキサエノエート、アセテート、カプロエート、カプリレート、カプレート、ラウレート、アラキデート、ベヘネート、リグノセレート、およびセロテートを含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖脂肪酸成分であってよい。脂肪酸リンカー成分は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の上限との間の炭素原子を有してよく、１、２、３、４、または５個から、８、１０、１２、１４、または１６個までの間の炭素原子を有していてよい。
【０１１６】
オリゴマーは、またオリゴマーの１以上の端部に１以上の末端成分をさらに含んでいてよいが、それらはインスリンポリペプチドに結合していない。末端成分は、アルキルまたはアルコキシ成分であってよい。アルキルまたはアルコキシ成分は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の上限との間の炭素原子を有してよい。アルキルまたはアルコキシ成分は、１、２、３、４、５、６、または７個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個の上限との間の炭素原子を有してもよく、及び／又は１、２、３、４、または５個の下限と、５、６、７、８、９、または１０個の上限との間の炭素原子を有してもよい。一部の実施態様では、アルキルまたはアルコキシ成分は、１、２、３、または４個の下限と、５、６、または７個の上限との間の炭素原子を有してよい。アルキル成分は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、ノナデシル、エイコシル、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、２−メチルブチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、２−メチル−ペンチル、３−メチルペンチル、２−エチルヘキシル、２−プロピルペンチル、ビニル、アリル、１−ブテニル、２−ブテニル、エチニル、１−プロピニル、および２−プロピニルを含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような直鎖もしくは分岐鎖の飽和もしくは不飽和のアルキル成分であってよい。アルコキシ成分は、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、ヘプチルオキシ、オクチルオキシ、ノニルオキシ、デシルオキシ、ウンデシルオキシ、ドデシルオキシ、トリデシルオキシ、テトラデシルオキシ、ペンタデシルオキシ、ヘキサデシルオキシ、オクタデシルオキシ、ノナデシルオキシ、エイコシルオキシ、イソプロポキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、２−メチルブトキシ、ｔｅｒｔ−ペンチルオキシ、２−メチル−ペンチルオキシ、３−メチルペンチルオキシ、２−エチルヘキシルオキシ、２−プロピルペンチルオキシ、ビニルオキシ、アリルオキシ、１−ブテニルオキシ、２−ブテニルオキシ、エチニルオキシ、１−プロピニルオキシ、および２−プロピニルオキシを含むがそれらに限定されない様々なアルコキシ成分であってよい。末端成分は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、もしくはｔｅｒｔ−ペンチルのような低級アルキル成分、またはメトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペンチルオキシ、もしくはｔｅｒｔ−ペンチルオキシのような低級アルコキシ成分であってよい。一部の実施形態では、末端成分はメチルまたはメトキシである。末端成分はアルキルまたはアルコキシ成分であってよいが、末端成分は糖、コレステロール、アルコール、および脂肪酸を含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような様々な成分であってよいと理解しなければならない。
【０１１７】
本発明の他の実施形態によると、オリゴマーは、式ＶＩの構造を有する。
【化１４】
0004602968.tif 000015
式中、
Ａは活性化可能な成分であり、
Ｌはリンカー成分であり、
Ｇ、Ｇ’およびＧ’’は個別に選択されるスペーサー成分であり、
Ｒは親油性成分でありＲ’はポリアルキレングリコール成分であるか、またはＲ’は親油性成分でありＲはポリアルキレングリコール成分であり、Ｒ又はＲ’のうちの１つのみが必要であり、
Ｔは末端成分であり、
ｊ、ｋ、ｍおよびｎは個別に０または１である。
【０１１８】
本発明のこれらの実施形態によると、ポリアルキレングリコール成分は、少なくとも１、２、３、４、５、６もしくは７個のポリアルキレングリコールサブユニットを有してよい。ポリアルキレングリコール成分は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の下限と、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０個又はそれ以上の上限との間のポリアルキレングリコールサブユニットを有してよい。ポリアルキレングリコール成分は、２、３、４、５、または６個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の上限との間のポリアルキレングリコールサブユニットを有してもよく、及び／又は３、４、５、または６個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個の上限との間のポリアルキレングリコールサブユニットを有してもよい。一部の実施形態では、ポリアルキレングリコール成分は、４、５、または６個の下限と、６、７、または８個の上限との間のポリアルキレングリコールサブユニットを有してもよく、特定の実施形態では、ポリアルキレングリコール成分は、７個のポリアルキレングリコールサブユニットを有する。オリゴマーのポリアルキレングリコール成分は、ポリエチレングリコール成分、ポリプロピレングリコール成分、またはポリブチレングリコール成分のような低級アルキルポリアルキレングリコール成分であってよい。ポリアルキレングリコール成分がポリプロピレングリコール成分である場合、成分は均一な（すなわち、ランダムではない）構造を有してよい。均一な構造を有する代表的なポリプロピレングリコール成分は次の通りである。
【化１５】
0004602968.tif 000016
この均一なポリプロピレングリコール構造は、ポリプロピレングリコール鎖において各酸素原子に隣接して唯一のメチル置換炭素原子を有すると表現できる。このような均一なポリプロピレングリコール成分は親油性および親水性両方の特性を示すことができる。
【０１１９】
本発明のこれらの実施形態によると、親油性成分は当業者に理解されるような親油性成分である。親油性成分は、少なくとも１、２、３、４、５、もしくは６個の炭素原子を有する。親油性成分は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の上限との間の炭素原子を有してよい。親油性成分は、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１個の上限との間の炭素原子を有してもよく、及び／又は３、４、５、６、７、８、または９個の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個の上限との間の炭素原子を有してもよい。一部の実施形態では、親油性成分は、３、４、５、６、または７個の下限と、６、７、８、９、または１０個の上限との間の炭素原子を有してよく、特定の実施形態では、親油性成分は、６個の炭素原子を有する。親油性成分は、飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖アルキル成分、飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖脂肪酸成分、コレステロール、およびアダマンタンであってよいが、それらに限定されない。代表的なアルキル成分には、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、ノナデシルおよびエイコシルのような飽和直鎖アルキル成分；イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、２−メチルブチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、２−メチル−ペンチル、３−メチルペンチル、２−エチルヘキシル、２−プロピルペンチルのような飽和分岐鎖アルキル成分；およびビニル、アリル、１−ブテニル、２−ブテニル、エチニル、１−プロピニル、および２−プロピニルを含むがそれらに限定されない上記の飽和アルキル成分から誘導された不飽和アルキル成分が含まれるがそれらに限定されない。代表的な脂肪酸成分には、ラウロレート、ミリストレート、パルミトレート、オレエート、エライデート、エルケート、リノレート、リノレネート、アラキドネート、エイコサペンタエントエート、およびドコサヘキサエノエートのような不飽和脂肪酸成分；およびアセテート、カプロエート、カプリレート、カプレート、ラウレート、アラキデート、ベヘネート、リグノセラート、およびセロテートのような飽和脂肪酸成分が含まれるがそれらに限定されない。
【０１２０】
本発明のこれらの実施形態によると、スペーサー成分のＧ、Ｇ’、Ｇ’’は当業者に理解されるようなスペーサー成分である。スペーサー成分は、糖成分、コレステロールおよびグリセリン成分であってよい。糖成分は、単糖成分および二糖成分を含むがそれらに限定されない、当業者に理解されるような様々な糖成分であってよい。単糖成分は、４〜６個の炭素原子を有してよい。特定の実施形態では、これらの実施形態のオリゴマーはスペーサー成分を含んでいない（すなわち、ｋ、ｍおよびｎは好ましくは０である）。
【０１２１】
本発明のこれらの実施形態によると、リンカー成分のＬは当業者には理解されるようにオリゴマーと薬物とを結合させるために使用できる。リンカー成分は、アルキルおよび脂肪酸成分であってよい。アルキルリンカー成分は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、ノナデシル、エイコシル、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、２−メチルブチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、２−メチル−ペンチル、３−メチルペンチル、２−エチルヘキシル、２−プロピルペンチル、ビニル、アリル、１−ブテニル、２−ブテニル、エチニル、１−プロピニル、および２−プロピニルを含むがそれらに限定されない当業者に理解されるような飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖アルキル成分であってよい。アルコキシ成分は、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、ヘプチルオキシ、オクチルオキシ、ノニルオキシ、デシルオキシ、ウンデシルオキシ、ドデシルオキシ、トリデシルオキシ、テトラデシルオキシ、ペンタデシルオキシ、ヘキサデシルオキシ、オクタデシルオキシ、ノナデシルオキシ、エイコシルオキシ、イソプロポキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、２−メチルブトキシ、ｔｅｒｔ−ペンチルオキシ、２−メチル−ペンチルオキシ、３−メチルペンチルオキシ、２−エチルヘキシルオキシ、２−プロピルペンチルオキシ、ビニルオキシ、アリルオキシ、１−ブテニルオキシ、２−ブテニルオキシ、エチニルオキシ、１−プロピニルオキシ、および２−プロピニルオキシを含むがそれらに限定されない様々なアルコキシ成分であってよい。アルキルリンカー成分は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の上限との間の炭素原子を有してよく、１、２、３、４、または５個から８、９、１０、１１、または１２個までの炭素原子を有していてよい。脂肪酸リンカー成分は、ラウロレート、ミリストレート、パルミトレート、オレエート、エライデート、エルケート、リノレート、リノレネート、アラキドネート、エイコサペンタエントエート、ドコサヘキサエノエート、アセテート、カプロエート、カプリレート、カプレート、ラウレート、アラキデート、ベヘネート、リグノセレート、およびセロテートを含むがそれらに限定されない当業者に理解されるような飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖脂肪酸成分であってよい。脂肪酸リンカー成分は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の上限との間の炭素原子を有してよく、１、２、３、４、または５個から８、１０、１２、１４、または１６個の間の炭素原子を有していてよい。
【０１２２】
本発明の様々な実施形態によると、末端成分のＴは、アルキルまたはアルコキシ成分であってよい。アルキルまたはアルコキシ成分は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の上限との間の炭素原子を有してよい。アルキルまたはアルコキシ成分は、１、２、３、４、５、６、または７個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個の上限との間の炭素原子を有してもよい。アルキルまたはアルコキシ成分は、１、２、３、４、または５個の下限と、５、６、７、８、９、または１０個の上限との間の炭素原子を有してもよく、及び／又は１、２、３、または４個の下限と、５、６、または７個の上限との間の炭素原子を有してもよい。アルキル成分は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、ノナデシル、エイコシル、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、２−メチルブチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、２−メチル−ペンチル、３−メチルペンチル、２−エチルヘキシル、２−プロピルペンチル、ビニル、アリル、１−ブテニル、２−ブテニル、エチニル、１−プロピニル、および２−プロピニルを含むがそれらに限定されない当業者に理解されるような様々な直鎖もしくは分岐鎖の飽和もしくは不飽和のアルキル成分であってよい。代表的なアルコキシ成分は、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、ヘプチルオキシ、オクチルオキシ、ノニルオキシ、デシルオキシ、ウンデシルオキシ、ドデシルオキシ、トリデシルオキシ、テトラデシルオキシ、ペンタデシルオキシ、ヘキサデシルオキシ、オクタデシルオキシ、ノナデシルオキシ、エイコシルオキシ、イソプロポキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、２−メチルブトキシ、ｔｅｒｔ−ペンチルオキシ、２−メチル−ペンチルオキシ、３−メチルペンチルオキシ、２−エチルヘキシルオキシ、２−プロピルペンチルオキシ、ビニルオキシ、アリルオキシ、１−ブテニルオキシ、２−ブテニルオキシ、エチニルオキシ、１−プロピニルオキシ、および２−プロピニルオキシを含むがそれらに限定されない様々なアルコキシ成分であってよい。末端成分は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、もしくはｔｅｒｔ−ペンチルのような低級アルキル成分、またはメトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペンチルオキシ、もしくはｔｅｒｔ−ペンチルオキシのような低級アルコキシ成分であってよい。特定の実施形態では、末端成分はメチルまたはメトキシである。末端成分は、アルキルまたはアルコキシ成分であってよいが、末端成分は糖成分、コレステロール、アルコール、および脂肪酸成分を含むがそれらに限定されない当業者に理解されるような様々な成分であってよいと理解しなければならない。
【０１２３】
本発明のこれらの実施形態によると、活性化可能な成分のＡは、プロインスリンポリペプチドと結合することのできる活性化されたオリゴマーを生成するためにオリゴマーの活性化剤への結合を可能にする成分である。活性化可能な成分は、−Ｃ（Ｏ）−ＯＨ、Ｃ（Ｓ）−ＯＨ、−Ｃ（Ｓ）−ＳＨ、−ＯＨ、−ＳＨおよびＮＨ２を含むがそれらに限定されない当業者に理解されるような様々な活性化可能な成分であってよい。
【０１２４】
さらに別の実施形態によると、オリゴマーは、式ＶＩＩの構造を有する。
【化１６】
0004602968.tif 000017
式中、
Ａは−Ｃ（Ｏ）−ＯＨ、Ｃ（Ｓ）−ＯＨ、−Ｃ（Ｓ）−ＳＨ、−ＯＨ、−ＳＨ、またはＮＨ２であり、
Ｘは、酸素原子であるか、またはＡが−ＯＨであるときにＸが酸素ではないことを条件に共有結合であり、
Ｙは、エステル、エーテル、カルバメート、カルボネート、またはアミド結合成分であり、かつエーテル結合成分のこともあり、
ｍは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０の上限との間であり、かつ２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、または２２の上限との間であり、かつ３、４、５、６、７、８、または９の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４の上限との間であってもよく、及び／又は３、４、５、６、または７の下限と、６、７、８、９、または１０の上限との間のこともあり、
ｎは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の下限と、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０の上限との間であり、かつ２、３、４、５、または６の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の上限との間であってよく、３、４、５、または６の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２の上限との間のポリアルキレングリコールサブユニット数であってもよい。一部の実施形態では、ｎは４、５、または６の下限と、６、７、または８の上限との間のポリアルキレングリコールサブユニット数であってよく、特定の実施形態では、ｎは７であり、
ｍとｎは両方０になることはなく、
Ｒは、アルキル成分、糖成分、コレステロール、アダマンタン、アルコール成分、または脂肪酸成分である。アルキル成分は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、ノナデシル、エイコシル、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、２−メチルブチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、２−メチル−ペンチル、３−メチルペンチル、２−エチルヘキシル、２−プロピルペンチル、ビニル、アリル、１−ブテニル、２−ブテニル、エチニル、１−プロピニル、および２−プロピニルを含むがそれらに限定されない当業者に理解されるような直鎖もしくは分岐鎖の飽和もしくは不飽和のアルキル成分であってよい。アルキル成分は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、またはｔｅｒｔ−ペンチルのような低級アルキル成分であってよい。アルキル成分は、Ｃ１〜Ｃ３アルキルであってもよい。特定の実施形態では、アルキル成分はメチルである。脂肪酸成分は、ラウロレート、ミリストレート、パルミトレート、オレエート、エライデート、エルケート、リノレート、リノレネート、アラキドネート、エイコサペンタエントエート、ドコサヘキサエノエート、アセテート、カプロエート、カプリレート、カプレート、ラウレート、アラキデート、ベヘナート、リグノセラート、およびセロテートを含むがそれらに限定されない当業者に理解されるような飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖脂肪酸成分であってよい。
【０１２５】
さらに別の実施形態によると、オリゴマーは、式ＶＩＩＩの構造を有する。
【化１７】
0004602968.tif 000018
式中、
Ａは、−Ｃ（Ｏ）−ＯＨ、Ｃ（Ｓ）−ＯＨ、−Ｃ（Ｓ）−ＳＨ、−ＯＨ、−ＳＨ、またはＮＨ２であり、
ｍは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０の上限との間であり、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、または２２の上限との間であってよく、３、４、５、６、７、８、または９の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４の上限との間であってもよく、一部の実施形態では、３、４、５、６、または７の下限と、６、７、８、９、または１０の上限との間であってよく、
ｎは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の下限と、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０の上限との間であり、かつ２、３、４、５、または６の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の上限との間であってよく、かつ３、４、５、または６の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２の上限との間のポリアルキレングリコールサブユニット数であってもよい。一部の実施形態では、ｎは、４、５、または６の下限と、６、７、または８の上限との間のポリアルキレングリコールサブユニット数であってよく、特定の実施形態では、７であり、
ｍとｎは両方とも０になることはなく、
Ｒは、アルキル成分、糖成分、コレステロール、アダマンタン、アルコール成分、または脂肪酸成分である。アルキル成分は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、ノナデシル、エイコシル、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、２−メチルブチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、２−メチル−ペンチル、３−メチルペンチル、２−エチルヘキシル、２−プロピルペンチル、ビニル、アリル、１−ブテニル、２−ブテニル、エチニル、１−プロピニル、および２−プロピニルを含むがそれらに限定されない当業者に理解されるような直鎖もしくは分岐鎖の飽和もしくは不飽和のアルキル成分であってよい。アルキル成分は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、またはｔｅｒｔ−ペンチルのような低級アルキル成分であってよい。アルキル成分は、Ｃ１〜Ｃ３アルキルであってよい。一部の実施形態では、アルキル成分はメチルである。脂肪酸成分は、ラウロレート、ミリストレート、パルミトレート、オレエート、エライデート、エルケート、リノレート、リノレネート、アラキドネート、エイコサペンタエントエート、ドコサヘキサエノエート、アセテート、カプロエート、カプリレート、カプレート、ラウレート、アラキデート、ベヘナート、リグノセラート、およびセロテートを含むがそれらに限定されない当業者に理解されるような飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖脂肪酸成分であってよい。
【０１２６】
さらにまた別の実施形態によると、オリゴマーは、式ＩＸの構造を有する。
【化１８】
0004602968.tif 000019
式中、
ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０の上限との間であり、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、または２２の上限との間であってよく、３、４、５、６、７、８、または９の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４の上限との間であってもよく、及び／又は３、４、５、６、または７の下限と、６、７、８、９、または１０の上限との間であってもよい、
ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の下限と、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０の上限との間であり、２、３、４、５、または６の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の上限との間であってよく、３、４、５、または６の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２の上限との間のポリアルキレングリコールサブユニット数であってもよい。一部の実施態様では、ｎは４、５、または６の下限と、６、７、または８の上限との間のポリアルキレングリコールサブユニット数であってよく、特定の実施形態では、ｎは７であり、
Ｒは、アルキル成分、糖成分、コレステロール、アダマンタン、アルコール成分、または脂肪酸成分である。アルキル成分は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、ノナデシル、エイコシル、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、２−メチルブチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、２−メチル−ペンチル、３−メチルペンチル、２−エチルヘキシル、２−プロピルペンチル、ビニル、アリル、１−ブテニル、２−ブテニル、エチニル、１−プロピニル、および２−プロピニルを含むがそれらに限定されない当業者に理解されるような直鎖もしくは分岐鎖の飽和もしくは不飽和のアルキル成分であってよい。アルキル成分は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、またはｔｅｒｔ−ペンチルのような低級アルキル成分であってよい。アルキル成分は、Ｃ１〜Ｃ３アルキルであってもよい。一部の実施形態では、アルキル成分はメチルである。脂肪酸成分は、ラウロレート、ミリストレート、パルミトレート、オレエート、エライデート、エルケート、リノレート、リノレネート、アラキドネート、エイコサペンタエントエート、ドコサヘキサエノエート、アセテート、カプロエート、カプリレート、カプレート、ラウレート、アラキデート、ベヘナート、リグノセラート、およびセロテートを含むがそれらに限定されない当業者に理解されるような飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖脂肪酸成分であってよい。
【０１２７】
さらに別の実施形態によると、オリゴマーは、式Ｘの構造を有する。
【化１９】
0004602968.tif 000020
上述のプロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートの合成方法の様々な実施形態では、オリゴマーはインスリンポリペプチドに共有結合している。一部の実施形態では、オリゴマーは加水分解性結合（例えば、エステルまたはカルボネート結合）を利用してインスリンポリペプチドに結合している。加水分解性結合は、プロドラッグとして機能するインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを提供できる。場合によっては、例えばインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートが生物学的に不活性である（すなわち、前記コンジュゲートにはインスリンポリペプチドの一次作用機序を通して身体に影響を及ぼす能力が欠けている）場合には、加水分解性結合は、それらの各生物学的に不活性なインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートから１以上のオリゴマーが開裂されて、生物学的に活性なインスリンポリペプチドが得られるように所定の期間にわたり生物学的に活性なインスリンポリペプチドを提供することで徐放性もしくは放出制御性作用を提供できる。他の実施形態では、オリゴマーは非加水分解性結合（例えば、カルバメート、アミド、またはエーテル結合）を利用してインスリンポリペプチドに結合している。非加水分解性結合の使用は、生物学的に不活性なインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートが好ましくは少なくとも２時間の長時間にわたり血流内を循環することを可能にすることが望ましい場合に好ましいことがある。エステル、カルバメート、カルボネート、またはアミド結合成分のようなカルボニル成分を含む結合成分を利用して、オリゴマーがインスリンポリペプチドに結合している場合は、結果として生じるインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートはインスリンポリペプチド−アシルオリゴマーコンジュゲートである。
【０１２８】
上述のプロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートの合成方法の実施形態に使用したオリゴマーは、市販されているか、または当業者に理解されるように様々な方法によって合成できる。例えば、多分散オリゴマーは以下の参考文献の１以上に提供された方法によって合成できる。Ｄａｖｉｓらへの米国特許第４，１７９，３３７号；Ｇｒｅｅｎｗａｌｄへの米国特許第５，５６７，４２２号；Ｅｋｗｕｒｉｂｅへの米国特許第５，３５９，０３０号；Ｅｋｗｕｒｉｂｅへの米国特許第５，４３８，０４０号；Ｅｋｗｕｒｉｂｅへの米国特許第５，６８１，８１１号、Ｅｋｗｕｒｉｂｅらへの米国特許第６，３０９，６３３号。非多分散（例えば、実質的単分散および単分散）オリゴマーは、以下の参考文献の１以上に提供された方法によって合成できる。Ｅｋｗｕｒｉｂｅらによって２００１年６月４日に出願された「ポリエチレングリコール混合物を有するポリマーの実質的単分散混合物の合成方法」と題する米国特許出願第０９／８７３，７３１号；Ｅｋｗｕｒｉｂｅらによって２００１年６月４日に出願された「ポリアルキレングリコールを含む薬物−オリゴマーコンジュゲートの混合物、それらの使用、およびそれらの製造方法」と題する米国特許出願第０９／８７３，７９７号；およびＥｋｗｕｒｉｂｅらによって２００１年６月４日に出願された「ポリアルキレングリコールを含むインスリン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物、それらの使用、およびそれらの製造方法」と題する米国特許出願第０９／８７３，８９９号。本発明の実施形態によるオリゴマーは、実質的単分散であってよく、また単分散であってよい。単分散オリゴマーを合成するための代表的な方法を、本明細書に記載の実施例セクションに示す。
【０１２９】
プロインスリンポリペプチドとオリゴマーとを、プロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを得るのに十分な条件下で接触させるステップは、当業者に理解されるように様々な条件を利用して実施できる。プロインスリンポリペプチドとオリゴマーとを、プロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを得るのに十分な条件下で接触させるステップは、オリゴマーを活性化剤と、活性化されたオリゴマーを得るのに十分な条件下で接触させるステップと、活性化されたオリゴマーとプロインスリンポリペプチドとを、プロインスリンポリペプチドコンジュゲートを得るのに十分な条件下で接触させるステップとを含む。活性化されたオリゴマーはエクスサイチューまたはインサイチューで生成できる。
【０１３０】
活性化剤は、オリゴマーが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ｐ−ニトロフェニルクロロホルメート、１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド、およびヒドロキシベンゾトリアジドを含むがそれらに限定されない当業者に理解されるようなプロインスリンポリペプチド内の求核性ヒドロキシル基および／またはアミノ基と反応できるように、上記の１以上のオリゴマーを活性化できる様々な活性化剤であってよい。
【０１３１】
当業者であれば、活性化剤をオリゴマーに結合させて、活性化されたオリゴマーを得るのに十分な条件を理解するであろう。例えば当業者であれば、同様にＲ．Ｃ．Ｌａｒｏｃｋ，「ＣＯＭＰＲＥＨＥＮＳＩＶＥ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＴＲＡＮＳＦＯＲＭＡＴＩＯＮＳ．  Ａ  ＧＵＩＤＥ  ＴＯ  ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ  ＧＲＯＵＰ  ＰＲＥＰＡＲＡＴＩＯＮＳ」，（第２版，ニューヨーク，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，１９９９）を参照することができる。
【０１３２】
活性化されたオリゴマーとプロインスリンポリペプチドとを結合させるために十分な条件は、当業者に理解されるであろう。例えば、プロインスリンポリペプチドは、プロインスリンポリペプチド溶液を得るために、ジメチルスルホキシドのような双極性非プロトン溶媒中に溶解させることができる。プロインスリンポリペプチド溶液には、トリエチルアミンのような緩衝剤を添加できる。プロインスリンポリペプチド溶液には、その後アセトニトリルのような無水溶媒中に溶解させた活性化されたオリゴマーを添加できる。当業者であれば、同様にＲ．Ｃ．Ｌａｒｏｃｋ，「ＣＯＭＰＲＥＨＥＮＳＩＶＥ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＴＲＡＮＳＦＯＲＭＡＴＩＯＮＳ．  Ａ  ＧＵＩＤＥ  ＴＯ  ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ  ＧＲＯＵＰ  ＰＲＥＰＡＲＡＴＩＯＮＳ」（第２版，ニューヨーク，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，１９９９）を参照することができる。活性化されたオリゴマー対プロインスリンポリペプチドのモル比は、約１：１より大きくてよく、約２：１より大きくてよく、約３：１より大きくてよく、約４：１より大きくてよく、約５：１より大きくてもよい。
【０１３３】
上述のプロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートの合成方法の様々な実施形態では、２つ以上のオリゴマー（すなわち、複数のオリゴマー）をプロインスリンポリペプチドのインスリンポリペプチド部分に結合させることができる。複数のオリゴマーは、同一であってもよい。しかし、複数のオリゴマーは相互に相違していてもよい、あるいはまた、複数のオリゴマーの一部は同一で一部は相違していてもよいことを理解すべきである。複数のオリゴマーがプロインスリンポリペプチドのインスリンポリペプチド部分に結合している場合は、加水分解性結合を用いて１以上のオリゴマーをプロインスリンポリペプチドのインスリンポリペプチド部分に結合させ、そして非加水分解性結合を用いて１以上のオリゴマーをプロインスリンポリペプチドのインスリンポリペプチド部分に結合させるのが好ましいことがある。あるいはまた、複数のオリゴマーをプロインスリンポリペプチドのインスリンポリペプチド部分に結合させる結合の全部が加水分解性であってよいが、例えば１以上のオリゴマーが身体内の加水分解によってインスリンポリペプチドまたはプロインスリンポリペプチドのインスリンポリペプチド部分から迅速に除去され、そして１以上のオリゴマーが身体内の加水分解によってインスリンポリペプチドまたはインスリンポリペプチド部分から緩徐に除去されるように、相違する加水分解度を有していてよい。
【０１３４】
上述のプロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートの合成方法の様々な実施形態では、オリゴマーは、求核性ヒドロキシル基および／またはアミノ基を含むがそれらに限定されないインスリンポリペプチド部分の様々な求核性残基で、プロインスリンポリペプチドのインスリンポリペプチド部分に結合されてよい。求核性ヒドロキシル基は、例えばセリンおよび／またはチロシン残基で見いだすことができ、そして求核性アミノ基は例えばヒスチジンおよび／またはリジン残基で、および／またはポリペプチドの１以上のＮ末端で見いだすことができる。オリゴマーがプロインスリンポリペプチドの１以上のＮ末端に結合している場合は、その結合は第２級アミンを形成することができる。プロインスリンポリペプチドがＢ鎖ポリペプチドのＮ末端に結合したリーダーペプチドを有している場合、インスリン分子のＮ末端はコンジュゲーション（例えば、アシル化）から保護できる。プロインスリンポリペプチドがＢ鎖のＮ末端に結合したリーダーペプチドを有するヒトプロインスリンである場合、例えば、オリゴマーはプロインスリンの３つのアミノ基：リーダーペプチドのＮ末端、Ｃ−ペプチドのＬｙｓ残基のアミノ基、およびＬｙｓＢ２９のアミノ基、に結合させることができる。リーダーペプチドおよびＣ−ペプチドが開裂すると、インスリンのＬｙｓＢ２９へ部位特異的にオリゴマーが結合して、ＬｙｓＢ２９でオリゴマーとモノコンジュゲートしたインスリンである単一インスリンコンジュゲートが得られることが見いだされる。
【０１３５】
本発明のさらにまた別の実施形態によると、プロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートには、インスリンポリペプチドを産生するために開裂できるペプチド結合によって１以上のペプチドに結合したインスリンポリペプチドを含むプロインスリンポリペプチドと、プロインスリンポリペプチドのインスリンポリペプチド部分に結合したオリゴマーとが含まれる。
【０１３６】
インスリンポリペプチドを産生するために開裂できるペプチド結合によって１以上のペプチドに結合したインスリンポリペプチドを含むプロインスリンポリペプチドは、プロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートの合成方法に関連して前記したプロインスリンポリペプチドを含むがそれらに限定されない様々なプロインスリンポリペプチドであってよい。オリゴマーは、プロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートの合成方法に関連して前記したオリゴマーを含むがそれらに限定されない様々なオリゴマーであってよい。オリゴマーは、親水性成分および親油性成分を含んでよい。本発明によるプロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートは、本明細書に記載のプロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートの合成方法を含むがそれらに限定されない当業者に理解されるような様々な方法によって合成できる。
【０１３７】
さらにまた別の実施形態により、Ｃ−ペプチドポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートの合成方法が提供され、この方法には、Ｃ−ペプチドポリペプチドを産生させるために開裂させることのできるペプチド結合によって１以上のペプチドに結合したＣ−ペプチドポリペプチドを含むプロ−Ｃ−ペプチドポリペプチドとオリゴマーとを、プロ−Ｃ−ペプチドポリペプチドのＣ−ペプチドポリペプチド部分にオリゴマーを結合させて、プロ−Ｃ−ペプチドポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを得るのに十分な条件下で接触させるステップと、Ｃ−ペプチドポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを得るためにプロ−Ｃ−ペプチドポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートから１以上のペプチドを開裂させるステップとが含まれる。
【０１３８】
プロ−Ｃ−ペプチドポリペプチドは、当業者に理解される様々なプロ−Ｃ−ペプチドポリペプチドであってよい。プロ−Ｃ−ペプチドポリペプチドは、プロインスリンポリペプチドであってよく、一部の実施形態では、プロ−Ｃ−ペプチドポリペプチドはプロインスリンである。
【０１３９】
Ｃ−ペプチドポリペプチドは、当業者に理解されるように様々なＣ−ペプチドポリペプチドであってよい。一部の実施形態では、Ｃ−ペプチドポリペプチドはＣ−ペプチドである。
【０１４０】
Ｃ−ペプチドポリペプチドに結合した１以上のペプチドは、当業者に理解されるように様々なペプチドであってよい。１以上のペプチドはインスリンポリペプチドを含んでよく、及び／又は１以上のポリペプチドはインスリンポリペプチドであってよい。インスリンポリペプチドはリジン残基を含んでいないことがあり、それはプロ−Ｃ−ペプチドポリペプチドをコンジュゲートさせるために使用するオリゴマー試薬の量を減少させることができる。１以上のペプチドはインスリン、またはＢ鎖のＮ末端でリーダーペプチドに結合したインスリンであってもよい。
【０１４１】
ペプチド結合は、当業者には理解されるように、様々な方法で開裂できる結合である。ペプチド結合はトリプシン、カルボキシペプチダーゼＢ、トロンビン、ペプシン、およびキモトリプシンを含むがそれらに限定されない酵素によって酵素開裂させることのできる結合であってよい。酵素により開裂できるペプチド結合は当業者には理解されるであろうし、Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ｔｈｒ−Ａｒｇ、Ａｌａ−Ａｒｇ、Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ｔｈｒ−Ｌｙｓ、Ａｒｇ−Ｇｌｙ、およびＡｒｇ−Ｐｈｅを含むがそれらに限定されない。
【０１４２】
オリゴマーは、当業者に理解されるように、様々なオリゴマーであってよい。一般に、オリゴマーは、当業者に理解されるように、ポリペプチドに結合することのできるあらゆるオリゴマーであってよい。例えば、オリゴマーは、Ｄａｖｉｓらへの米国特許第４，１７９，３３７号；Ｇｒｅｅｎｗａｌｄへの米国特許第５，５６７，４２２号；Ｅｋｗｕｒｉｂｅへの米国特許第５，３５９，０３０号；Ｅｋｗｕｒｉｂｅへの米国特許第５，４３８，０４０号；Ｅｋｗｕｒｉｂｅへの米国特許第５，６８１，８１１号；およびＥｋｗｕｒｉｂｅらへの米国特許第６，３０９，６３３号に記載されているような多分散オリゴマーであってよい。別の実施例として、オリゴマーは、Ｅｋｗｕｒｉｂｅらによって２００１年６月４日に出願された「ポリエチレングリコール混合物を有するポリマーの実質的単分散混合物の合成方法」と題する米国特許出願第０９／８７３，７３１号；Ｅｋｗｕｒｉｂｅらによって２００１年６月４日に出願された「ポリアルキレングリコールを含む薬物−オリゴマーコンジュゲートの混合物、それらの使用、およびそれらの製造方法」と題する米国特許出願第０９／８７３，７９７号；およびＥｋｗｕｒｉｂｅらによって２００１年６月４日に出願された「ポリアルキレングリコールを含むインスリン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物、それらの使用、およびそれらの製造方法」と題する米国特許出願第０９／８７３，８９９号に記載されているような非多分散オリゴマーであってよい。
【０１４３】
オリゴマーは、ブロックコポリマーの親水性が維持されていることを条件に、ポリエチレングリコールもしくはポリプロピレングリコールのようなポリアルキレングリコール、ポリオキシエチレン化ポリオール、それらのコポリマーおよびそれらのブロックコポリマーを含むがそれらに限定されない当業者に理解されるような親水性成分を含む、親水性成分から本質的に構成される、又は親水性成分から構成され得る。親水性成分は、ポリアルキレングリコール成分であってよい。ポリアルキレングリコール成分は、少なくとも１、２、３、４、５、６もしくは７個のポリアルキレングリコールサブユニットを有してよい。ポリアルキレングリコール成分は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の下限と、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０個又はそれ以上の上限との間のポリアルキレングリコールサブユニットを有してよい。ポリアルキレングリコール成分は、２、３、４、５、または６個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の上限との間のポリアルキレングリコールサブユニットを有してもよく、及び／又は３、４、５、または６個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個の上限との間のポリアルキレングリコールサブユニットを有してもよい。ポリアルキレングリコール成分は、４、５、または６個の下限と、６、７、または８個の上限との間のポリアルキレングリコールサブユニットを有してもよく、一部の実施形態では、ポリアルキレングリコール成分は、７個のポリアルキレングリコールサブユニットを有する。オリゴマーのポリアルキレングリコール成分は、ポリエチレングリコール成分、ポリプロピレングリコール成分、またはポリブチレングリコール成分のような低級アルキルポリアルキレングリコール成分であってよい。ポリアルキレングリコール成分がポリプロピレングリコール成分である場合、前記成分は均一な（すなわち、ランダムではない）構造を有してよい。均一な構造を有する代表的なポリプロピレングリコール成分は次の通りである。
【化２０】
0004602968.tif 000021
この均一なポリプロピレングリコール構造は、ポリプロピレングリコール鎖において各酸素原子に隣接して唯一のメチル置換炭素原子を有すると表現できる。このような均一なポリプロピレングリコール成分は親油性および親水性両方の特性を示すことができる。
【０１４４】
オリゴマーは、追加の親水性成分、親油性成分、スペーサー成分、リンカー成分および末端成分を含むがそれらに限定されない当業者に理解されるような１以上の成分を含んでいてよい。オリゴマー内の様々な成分は、加水分解性結合または非加水分解性結合のいずれかによって相互に共有結合している。
【０１４５】
オリゴマーは、糖、ポリアルキレングリコール、およびポリアミン／ＰＥＧコポリマーを含むがそれらに限定されない１以上の追加の親水性成分（すなわち、ポリアルキレングリコール成分へ追加する成分）をさらにまた含んでいてもよい。隣接するポリアルキレングリコール成分は、それらがエーテル結合によって結合している場合は同一成分であると見なされるであろう。例えば、成分
【化２１】
0004602968.tif 000022
は、６個のポリエチレングリコールサブユニットを有する単一ポリエチレングリコール成分である。この成分がオリゴマー内の唯一の親水性成分であった場合、オリゴマーは追加の親水性成分を含有していないであろう。隣接するポリエチレングリコール成分は、それらがエーテル結合以外の結合によって結合している場合は相違する成分であると見なされる。例えば、成分
【化２２】
0004602968.tif 000023
は、４個のポリエチレングリコールサブユニットを有するポリエチレングリコール成分および２個のポリエチレングリコールサブユニットを有する追加の親水性成分である。本発明の様々な実施形態によるオリゴマーは、ポリアルキレングリコール成分を含んでおり、かつ追加の親水性成分を備えていない。
【０１４６】
オリゴマーは、当業者に理解されるように、１以上の親油性成分をさらに含んでよい。親油性成分は、少なくとも１、２、３、４、５、もしくは６個の炭素原子を有する。親油性成分は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の上限との間の炭素原子を有してよい。親油性成分は、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１個の上限との間の炭素原子を有してもよく、及び／又は３、４、５、６、７、８、または９個の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個の上限との間の炭素原子を有してもよい。親油性成分は、３、４、５、６、または７個の下限と、６、７、８、９、または１０個の上限との間の炭素原子を有してもよく、特定の実施形態では、親油性成分は、６個の炭素原子を有する。親油性成分は、飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖アルキル成分、飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖脂肪酸成分、コレステロール、およびアダマンタンであってよいが、それらに限定されない。代表的なアルキル成分には、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、ノナデシルおよびエイコシルのような飽和直鎖アルキル成分；イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、２−メチルブチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、２−メチル−ペンチル、３−メチルペンチル、２−エチルヘキシル、２−プロピルペンチルのような飽和分岐鎖アルキル成分；およびビニル、アリル、１−ブテニル、２−ブテニル、エチニル、１−プロピニル、および２−プロピニルを含むがそれらに限定されない上記の飽和アルキル成分から誘導された不飽和アルキル成分が含まれるがそれらに限定されない。代表的な脂肪酸成分には、ラウロレート、ミリストレート、パルミトレート、オレエート、エライデート、エルケート、リノレート、リノレネート、アラキドネート、エイコサペンタエントエート、およびドコサヘキサエノエートのような不飽和脂肪酸成分；およびアセテート、カプロエート、カプリレート、カプレート、ラウレート、アラキデート、ベヘネート、リグノセラート、およびセロテートのような飽和脂肪酸成分が含まれるがそれらに限定されない。
【０１４７】
オリゴマーは、当業者に理解されるように、１以上のスペーサー成分をさらに含むことができる。スペーサー成分は、例えば親油性成分から親水性成分を分離するため、Ｃ−ペプチドポリペプチドから親油性成分もしくは親水性成分を分離するため、第２親水性成分もしくは親油性成分から第１親水性成分もしくは親油性成分を分離するため、またはリンカー成分から親水性成分もしくは親油性成分を分離するために使用できる。スペーサー成分は、糖、コレステロールおよびグリセリン成分であってよいが、それらに限定されない。糖成分は、単糖成分および二糖成分を含むがそれらに限定されない当業者に理解されるような様々な糖成分であってよい。単糖成分は、４〜６個の炭素原子を有してよい。
【０１４８】
オリゴマーは、当業者に理解されるように、オリゴマーをＣ−ペプチドポリペプチドと結合させるために使用される１以上のリンカー成分をさらに含むことができる。リンカー成分は、アルキルおよび脂肪酸成分であってよいが、それらに限定されない。アルキルリンカー成分は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、ノナデシル、エイコシル、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、２−メチルブチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、２−メチル−ペンチル、３−メチルペンチル、２−エチルヘキシル、２−プロピルペンチル、ビニル、アリル、１−ブテニル、２−ブテニル、エチニル、１−プロピニル、および２−プロピニルを含むがそれらに限定されない当業者に理解されるような飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖アルキル成分であってよい。アルコキシ成分は、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、ヘプチルオキシ、オクチルオキシ、ノニルオキシ、デシルオキシ、ウンデシルオキシ、ドデシルオキシ、トリデシルオキシ、テトラデシルオキシ、ペンタデシルオキシ、ヘキサデシルオキシ、オクタデシルオキシ、ノナデシルオキシ、エイコシルオキシ、イソプロポキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、２−メチルブトキシ、ｔｅｒｔ−ペンチルオキシ、２−メチル−ペンチルオキシ、３−メチルペンチルオキシ、２−エチルヘキシルオキシ、２−プロピルペンチルオキシ、ビニルオキシ、アリルオキシ、１−ブテニルオキシ、２−ブテニルオキシ、エチニルオキシ、１−プロピニルオキシ、および２−プロピニルオキシを含むがそれらに限定されない様々なアルコキシ成分であってよい。アルキルリンカー成分は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の上限との間の炭素原子を有してよく、１、２、３、４、または５個と８、９、１０、１１、または１２個との間の炭素原子を有してもよい。脂肪酸リンカー成分は、ラウロレート、ミリストレート、パルミトレート、オレエート、エライデート、エルケート、リノレート、リノレネート、アラキドネート、エイコサペンタエントエート、ドコサヘキサエノエート、アセテート、カプロエート、カプリレート、カプレート、ラウレート、アラキデート、ベヘネート、リグノセレート、およびセロテートを含むがそれらに限定されない当業者に理解されるような飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖脂肪酸成分であってよい。脂肪酸リンカー成分は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の上限との間の炭素原子を有してよく、１、２、３、４、または５個と８、１０、１２、１４、または１６個との間の炭素原子を有してもよい。
【０１４９】
オリゴマーは、さらにまた、オリゴマーの１以上の端部に１以上の末端成分を有してよいが、それらはＣ−ペプチドポリペプチドに結合していない。末端成分は、アルキルまたはアルコキシ成分であってよい。アルキルまたはアルコキシ成分は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の上限との間の炭素原子を有してよい。アルキルまたはアルコキシ成分は、１、２、３、４、５、６、または７個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個の上限との間の炭素原子を有してもよく、及び／又は１、２、３、４、または５個の下限と、５、６、７、８、９、または１０個の上限との間の炭素原子を有してもよい。特定の実施形態では、アルキルまたはアルコキシ成分は、１、２、３、または４個の下限と、５、６、または７個の上限との間の炭素原子を有してよい。アルキル成分は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、ノナデシル、エイコシル、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、２−メチルブチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、２−メチル−ペンチル、３−メチルペンチル、２−エチルヘキシル、２−プロピルペンチル、ビニル、アリル、１−ブテニル、２−ブテニル、エチニル、１−プロピニル、および２−プロピニルを含むがそれらに限定されない当業者に理解されるような直鎖もしくは分岐鎖の飽和もしくは不飽和のアルキル成分であってよい。アルコキシ成分は、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、ヘプチルオキシ、オクチルオキシ、ノニルオキシ、デシルオキシ、ウンデシルオキシ、ドデシルオキシ、トリデシルオキシ、テトラデシルオキシ、ペンタデシルオキシ、ヘキサデシルオキシ、オクタデシルオキシ、ノナデシルオキシ、エイコシルオキシ、イソプロポキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、２−メチルブトキシ、ｔｅｒｔ−ペンチルオキシ、２−メチル−ペンチルオキシ、３−メチルペンチルオキシ、２−エチルヘキシルオキシ、２−プロピルペンチルオキシ、ビニルオキシ、アリルオキシ、１−ブテニルオキシ、２−ブテニルオキシ、エチニルオキシ、１−プロピニルオキシ、および２−プロピニルオキシを含むがそれらに限定されない様々なアルコキシ成分であってよい。末端成分は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、もしくはｔｅｒｔ−ペンチルのような低級アルキル成分、またはメトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペンチルオキシ、もしくはｔｅｒｔ−ペンチルオキシのような低級アルコキシ成分であってよい。特定の実施形態では、末端成分はメチルまたはメトキシである。末端成分はアルキルまたはアルコキシ成分であってよいが、末端成分は糖、コレステロール、アルコール、脂肪酸及びＰＥＧ成分を含むがそれらに限定されない当業者に理解されるような様々な成分であってよいと理解しなければならない。
【０１５０】
本発明の他の実施形態によると、オリゴマーは、式ＸＩの構造を有する。
【化２３】
0004602968.tif 000024
式中、
Ａは活性化可能な成分であり、
Ｌはリンカー成分であり、
Ｇ、Ｇ’およびＧ’’は個別に選択されるスペーサー成分であり、
Ｒは親油性成分でありＲ’はポリアルキレングリコール成分であるか、またはＲ’は親油性成分でありＲはポリアルキレングリコール成分であり、Ｒ又はＲ’のうちの１つのみが存在すべきであり、
Ｔは末端成分であり、
ｊ、ｋ、ｍおよびｎは個別に０または１である。
【０１５１】
本発明のこれらの実施形態によると、ポリアルキレングリコール成分は、少なくとも１、２、３、４、５、６もしくは７個のポリアルキレングリコールサブユニットを有してよい。ポリアルキレングリコール成分は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の下限と、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０個又はそれ以上の上限との間のポリアルキレングリコールサブユニットを有してよい。ポリアルキレングリコール成分は、２、３、４、５、または６個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の上限との間のポリアルキレングリコールサブユニットを有してもよく、及び／又は３、４、５、または６個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個の上限との間のポリアルキレングリコールサブユニットを有してもよい。一部の実施形態では、ポリアルキレングリコール成分は、４、５、または６個の下限と、６、７、または８個の上限との間のポリアルキレングリコールサブユニットを有してよく、特定の実施形態では、ポリアルキレングリコール成分は、７個のポリアルキレングリコールサブユニットを有する。オリゴマーのポリアルキレングリコール成分は、ポリエチレングリコール成分、ポリプロピレングリコール成分、またはポリブチレングリコール成分のような低級アルキルポリアルキレングリコール成分であってよい。ポリアルキレングリコール成分がポリプロピレングリコール成分である場合、前記成分は均一な（すなわち、ランダムではない）構造を有してよい。均一な構造を有する代表的なポリプロピレングリコール成分は次の通りである。
【化２４】
0004602968.tif 000025
この均一なポリプロピレングリコール構造は、ポリプロピレングリコール鎖において各酸素原子に隣接して唯一のメチル置換炭素原子を有すると表現できる。このような均一なポリプロピレングリコール成分は親油性および親水性両方の特性を示すことができる。
【０１５２】
本発明のこれらの実施形態によると、親油性成分は当業者に理解されるような親油性成分である。親油性成分は、少なくとも１、２、３、４、５、もしくは６個の炭素原子を有する。親油性成分は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の上限との間の炭素原子を有してよい。親油性成分は、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１個の上限との間の炭素原子を有してもよく、及び／又は３、４、５、６、７、８、または９個の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個の上限との間の炭素原子を有してもよい。一部の実施形態では、親油性成分は、３、４、５、６、または７個の下限と、６、７、８、９、または１０個の上限との間の炭素原子を有してよく、特定の実施形態では、親油性成分は６個の炭素原子を有する。親油性成分は、飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖アルキル成分、飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖脂肪酸成分、コレステロール、およびアダマンタンであってよいが、それらに限定されない。代表的なアルキル成分には、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、ノナデシルおよびエイコシルのような飽和直鎖アルキル成分；イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、２−メチルブチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、２−メチル−ペンチル、３−メチルペンチル、２−エチルヘキシル、２−プロピルペンチルのような飽和分岐鎖アルキル成分；およびビニル、アリル、１−ブテニル、２−ブテニル、エチニル、１−プロピニル、および２−プロピニルを含むがそれらに限定されない上記の飽和アルキル成分から誘導された不飽和アルキル成分が含まれるがそれらに限定されない。代表的な脂肪酸成分には、ラウロレート、ミリストレート、パルミトレート、オレエート、エライデート、エルケート、リノレート、リノレネート、アラキドネート、エイコサペンタエントエート、およびドコサヘキサエノエートのような不飽和脂肪酸成分；およびアセテート、カプロエート、カプリレート、カプレート、ラウレート、アラキデート、ベヘネート、リグノセラート、およびセロテートのような飽和脂肪酸成分が含まれるがそれらに限定されない。
【０１５３】
本発明のこれらの実施形態によると、スペーサー成分のＧ、Ｇ’、Ｇ’’は当業者に理解されるようなスペーサー成分である。スペーサー成分は、糖成分、コレステロールおよびグリセリン成分であってよいが、それらに限定されない。糖成分は、単糖成分および二糖成分を含むがそれらに限定されない当業者に理解されるような様々な糖成分であってよい。単糖成分は、４〜６個の炭素原子を有してよい。特定の実施形態のオリゴマーはスペーサー成分を含んでいない（すなわち、ｋ、ｍおよびｎは０である）。
【０１５４】
本発明の様々な実施形態によると、リンカー成分のＬは、当業者に理解されるように、オリゴマーをＣ−ペプチドポリペプチドと結合させるために使用できる。リンカー成分は、アルキルおよび脂肪酸成分であってよいが、それらに限定されない。アルキルリンカー成分は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、ノナデシル、エイコシル、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、２−メチルブチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、２−メチル−ペンチル、３−メチルペンチル、２−エチルヘキシル、２−プロピルペンチル、ビニル、アリル、１−ブテニル、２−ブテニル、エチニル、１−プロピニル、および２−プロピニルを含むがそれらに限定されない当業者に理解されるような飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖アルキル成分であってよい。アルコキシ成分は、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、ヘプチルオキシ、オクチルオキシ、ノニルオキシ、デシルオキシ、ウンデシルオキシ、ドデシルオキシ、トリデシルオキシ、テトラデシルオキシ、ペンタデシルオキシ、ヘキサデシルオキシ、オクタデシルオキシ、ノナデシルオキシ、エイコシルオキシ、イソプロポキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、２−メチルブトキシ、ｔｅｒｔ−ペンチルオキシ、２−メチル−ペンチルオキシ、３−メチルペンチルオキシ、２−エチルヘキシルオキシ、２−プロピルペンチルオキシ、ビニルオキシ、アリルオキシ、１−ブテニルオキシ、２−ブテニルオキシ、エチニルオキシ、１−プロピニルオキシ、および２−プロピニルオキシを含むがそれらに限定されない様々なアルコキシ成分であってよい。アルキルリンカー成分は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の上限との間の炭素原子を有してよく、１、２、３、４、または５個から８、９、１０、１１、または１２個までの間の炭素原子を有してもよい。脂肪酸リンカー成分は、ラウロレート、ミリストレート、パルミトレート、オレエート、エライデート、エルケート、リノレート、リノレネート、アラキドネート、エイコサペンタエントエート、ドコサヘキサエノエート、アセテート、カプロエート、カプリレート、カプレート、ラウレート、アラキデート、ベヘネート、リグノセレート、およびセロテートを含むがそれらに限定されない当業者に理解されるような飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖脂肪酸成分であってよい。脂肪酸リンカー成分は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の上限との間の炭素原子を有してよく、１、２、３、４、または５個から８、１０、１２、１４、または１６個までの間の炭素原子を有していてよい。
【０１５５】
本発明のこれらの実施形態によると、末端成分のＴは、アルキルまたはアルコキシ成分であってよい。アルキルまたはアルコキシ成分は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の上限との間の炭素原子を有してよい。アルキルまたはアルコキシ成分は、１、２、３、４、５、６、または７個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個の上限との間の炭素原子を有してもよく、及び／又は１、２、３、４、または５個の下限と、５、６、７、８、９、または１０個の上限との間の炭素原子を有してもよい。一部の実施形態では、アルキルまたはアルコキシ成分は、１、２、３、または４個の下限と、５、６、または７個の上限との間の炭素原子を有してよい。アルキル成分は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、ノナデシル、エイコシル、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、２−メチルブチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、２−メチル−ペンチル、３−メチルペンチル、２−エチルヘキシル、２−プロピルペンチル、ビニル、アリル、１−ブテニル、２−ブテニル、エチニル、１−プロピニル、および２−プロピニルを含むがそれらに限定されない当業者に理解されるような様々な直鎖もしくは分岐鎖の飽和もしくは不飽和のアルキル成分であってよい。代表的なアルコキシ成分は、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、ヘプチルオキシ、オクチルオキシ、ノニルオキシ、デシルオキシ、ウンデシルオキシ、ドデシルオキシ、トリデシルオキシ、テトラデシルオキシ、ペンタデシルオキシ、ヘキサデシルオキシ、オクタデシルオキシ、ノナデシルオキシ、エイコシルオキシ、イソプロポキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、２−メチルブトキシ、ｔｅｒｔ−ペンチルオキシ、２−メチル−ペンチルオキシ、３−メチルペンチルオキシ、２−エチルヘキシルオキシ、２−プロピルペンチルオキシ、ビニルオキシ、アリルオキシ、１−ブテニルオキシ、２−ブテニルオキシ、エチニルオキシ、１−プロピニルオキシ、および２−プロピニルオキシを含むがそれらに限定されない様々なアルコキシ成分であってよい。末端成分は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、もしくはｔｅｒｔ−ペンチルのような低級アルキル成分、またはメトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペンチルオキシ、もしくはｔｅｒｔ−ペンチルオキシのような低級アルコキシ成分であってよい。特定の実施形態では、末端成分はメチルまたはメトキシである。末端成分はアルキルまたはアルコキシ成分であってよいが、末端成分は糖成分、コレステロール、アルコール、脂肪酸成分およびｍＰＥＧ成分を含むがそれらに限定されない当業者に理解されるような様々な成分であってよいと理解しなければならない。
【０１５６】
本発明のこれらの実施形態によると、活性化可能な成分のＡは、プロインスリンポリペプチドと結合できる活性化されたオリゴマーを生成するためにオリゴマーの活性化剤への結合を可能にする成分である。活性化可能な成分は、−Ｃ（Ｏ）−ＯＨ、Ｃ（Ｓ）−ＯＨ、−Ｃ（Ｓ）−ＳＨ、−ＯＨ、−ＳＨおよびＮＨ２を含むがそれらに限定されない当業者に理解されるような様々な活性化可能な成分であってよい。
【０１５７】
さらに別の実施形態によると、オリゴマーは、式ＸＩＩの構造を有する。
【化２５】
0004602968.tif 000026
式中、
Ａは−Ｃ（Ｏ）−ＯＨ、Ｃ（Ｓ）−ＯＨ、−Ｃ（Ｓ）−ＳＨ、−ＯＨ、−ＳＨ、またはＮＨ２であり、
Ｘは、酸素原子であるか、またはＡが−ＯＨであるときにＸが酸素ではないことを条件に共有結合であり、
Ｙは、エステル、エーテル、カルバメート、カルボネート、またはアミド結合成分であり、かつエーテル結合成分のこともあり、
ｍは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０の上限との間であり、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、または２２の上限との間であってよく、３、４、５、６、７、８、または９の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４の上限との間であってもよく、及び／又は３、４、５、６、または７の下限と、６、７、８、９、または１０の上限との間であってもよい、
ｎは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の下限と、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０の上限との間であり、２、３、４、５、または６の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の上限との間であってよく、３、４、５、または６の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２の上限との間のポリアルキレングリコールサブユニット数であってもよい。一部の実施形態では、ｎは、４、５、または６の下限と、６、７、または８の上限との間のポリアルキレングリコールサブユニット数であってよく、特定の実施形態では、ｎは７であり、
ｍとｎは両方とも０ということはなく、
Ｒは、アルキル成分、糖成分、コレステロール、アダマンタン、アルコール成分、または脂肪酸成分である。アルキル成分は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、ノナデシル、エイコシル、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、２−メチルブチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、２−メチル−ペンチル、３−メチルペンチル、２−エチルヘキシル、２−プロピルペンチル、ビニル、アリル、１−ブテニル、２−ブテニル、エチニル、１−プロピニル、および２−プロピニルを含むがそれらに限定されない当業者に理解されるような直鎖もしくは分岐鎖の飽和もしくは不飽和のアルキル成分であってよい。アルキル成分は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、またはｔｅｒｔ−ペンチルのような低級アルキル成分であってよい。アルキル成分は、Ｃ１〜Ｃ３アルキルであってもよい。特定の実施形態では、アルキル成分はメチルである。脂肪酸成分は、ラウロレート、ミリストレート、パルミトレート、オレエート、エライデート、エルケート、リノレート、リノレネート、アラキドネート、エイコサペンタエントエート、ドコサヘキサエノエート、アセテート、カプロエート、カプリレート、カプレート、ラウレート、アラキデート、ベヘナート、リグノセラート、およびセロテートを含むがそれらに限定されない当業者に理解されるような飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖脂肪酸成分であってよい。
【０１５８】
さらに別の実施形態によると、オリゴマーは、式ＸＩＩＩの構造を有する。
【化２６】
0004602968.tif 000027
式中、
Ａは−Ｃ（Ｏ）−ＯＨ、Ｃ（Ｓ）−ＯＨ、−Ｃ（Ｓ）−ＳＨ、−ＯＨ、−ＳＨ、またはＮＨ２であり、
ｍは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０の上限との間であってよく、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、または２２の上限との間であってよく、３、４、５、６、７、８、または９の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４の上限との間であってもよく、及び／又は３、４、５、６、または７の下限と、６、７、８、９、または１０の上限との間であってもよい、
ｎは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の下限と、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０の上限との間であってよく、２、３、４、５、または６の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の上限との間であってよく、３、４、５、または６の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２の上限との間のポリアルキレングリコールサブユニット数であってもよい。一部の実施形態では、ｎは４、５、または６の下限と、６、７、または８の上限との間のポリアルキレングリコールサブユニット数であってよく、特定の実施形態ではｎは７であり、
ｍとｎは両方が０ということはなく、
Ｒは、アルキル成分、糖成分、コレステロール、アダマンタン、アルコール成分、または脂肪酸成分である。アルキル成分は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、ノナデシル、エイコシル、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、２−メチルブチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、２−メチル−ペンチル、３−メチルペンチル、２−エチルヘキシル、２−プロピルペンチル、ビニル、アリル、１−ブテニル、２−ブテニル、エチニル、１−プロピニル、および２−プロピニルを含むがそれらに限定されない当業者に理解されるような直鎖もしくは分岐鎖の飽和もしくは不飽和のアルキル成分であってよい。アルキル成分は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、またはｔｅｒｔ−ペンチルのような低級アルキル成分であってよい。アルキル成分は、Ｃ１〜Ｃ３アルキルであってもよい。一部の実施形態では、アルキル成分は、メチルである。脂肪酸成分は、ラウロレート、ミリストレート、パルミトレート、オレエート、エライデート、エルケート、リノレート、リノレネート、アラキドネート、エイコサペンタエントエート、ドコサヘキサエノエート、アセテート、カプロエート、カプリレート、カプレート、ラウレート、アラキデート、ベヘナート、リグノセラート、およびセロテートを含むがそれらに限定されない当業者に理解されるような飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖脂肪酸成分であってよい。
【０１５９】
さらにまた別の実施形態によると、オリゴマーは、式ＸＩＶの構造を有する。
【化２７】
0004602968.tif 000028
式中、
ｍは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０の上限との間であってよく、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、または２２の上限との間であってよく、３、４、５、６、７、８、または９の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４の上限との間であってもよく、及び／又は３、４、５、６、または７の下限と、６、７、８、９、または１０の上限との間であってもよい、
ｎは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の下限と、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０の上限との間であってよく、２、３、４、５、または６の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の上限との間であってよく、３、４、５、または６の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２の上限との間のポリアルキレングリコールサブユニットの数であってもよい。一部の実施形態では、ｎは、４、５、または６の下限と、６、７、または８の上限の間のポリアルキレングリコールサブユニット数であってよく、特定の実施形態ではｎは７であってよい、
ｍとｎは両方が０ということはなく、
Ｒは、アルキル成分、糖成分、コレステロール、アダマンタン、アルコール成分、または脂肪酸成分である。アルキル成分は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、ノナデシル、エイコシル、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、２−メチルブチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、２−メチル−ペンチル、３−メチルペンチル、２−エチルヘキシル、２−プロピルペンチル、ビニル、アリル、１−ブテニル、２−ブテニル、エチニル、１−プロピニル、および２−プロピニルを含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような直鎖もしくは分岐鎖の飽和もしくは不飽和のアルキル成分であってよい。アルキル成分は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、またはｔｅｒｔ−ペンチルのような低級アルキル成分であってよい。アルキル成分は、Ｃ１〜Ｃ３アルキルであってもよい。特定の実施形態では、アルキル成分はメチルであってよい。脂肪酸成分は、ラウロレート、ミリストレート、パルミトレート、オレエート、エライデート、エルケート、リノレート、リノレネート、アラキドネート、エイコサペンタエントエート、ドコサヘキサエノエート、アセテート、カプロエート、カプリレート、カプレート、ラウレート、アラキデート、ベヘナート、リグノセラート、およびセロテートを含むがそれらに限定されない当業者に理解されるような飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖脂肪酸成分であってよい。
【０１６０】
上述のＣ−ペプチドポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートの合成方法の様々な実施形態では、オリゴマーはＣ−ペプチドポリペプチドに共有結合している。一部の実施形態では、オリゴマーは加水分解性結合（例えば、エステルまたはカルボネート結合）を利用してＣ−ペプチドポリペプチドに結合している。加水分解性結合は、プロドラッグとして機能するＣ−ペプチドポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを提供できる。特定の場合、例えばＣ−ペプチドポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートが生物学的に不活性である（すなわち、このコンジュゲートにはＣ−ペプチドポリペプチドの一次作用機序を通して身体に影響を及ぼす能力が欠けている）場合には、加水分解性結合は、それらの各生物学的に不活性なＣ−ペプチドポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートから１以上のオリゴマーを開裂させて、生物学的に活性なＣ−ペプチドポリペプチドが得られることで、所定の期間にわたり生物学的に活性なＣ−ペプチドポリペプチドを提供する、徐放性もしくは放出制御性作用を提供できる。他の選択的実施形態では、オリゴマーは開裂されて、Ｃ−ペプチドを生じる。他の実施形態では、オリゴマーは非加水分解性結合（例えば、カルバメート、アミド、またはエーテル結合）を利用してＣ−ペプチドポリペプチドに結合している。非加水分解性結合の使用は、生物学的に不活性なＣ−ペプチドポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートに、好ましくは少なくとも２時間の長時間にわたり血流内を循環することを可能にすることが望ましい場合に好ましいことがある。オリゴマーがエステル、カルバメート、カルボネート、またはアミド結合成分のようなカルボニル成分を含む結合成分を利用してＣ−ペプチドポリペプチドに結合している場合は、結果として生じるＣ−ペプチドポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートはＣ−ペプチドポリペプチド−アシルオリゴマーコンジュゲートである。
【０１６１】
上述のＣ−ペプチドポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを合成する様々な方法に使用したオリゴマーは、市販されているか、または当業者に理解されるように様々な方法によって合成できる。例えば、多分散オリゴマーは以下の参考文献の１以上に提供された方法によって合成できる。Ｄａｖｉｓらへの米国特許第４，１７９，３３７号；Ｇｒｅｅｎｗａｌｄへの米国特許第５，５６７，４２２号；Ｅｋｗｕｒｉｂｅへの米国特許第５，３５９，０３０号；Ｅｋｗｕｒｉｂｅへの米国特許第５，４３８，０４０号；Ｅｋｗｕｒｉｂｅへの米国特許第５，６８１，８１１号、Ｅｋｗｕｒｉｂｅらへの米国特許第６，３０９，６３３号。非多分散（例えば、実質的に単分散および単分散）オリゴマーは、以下の参考文献の１以上に提供された方法によって合成できる。Ｅｋｗｕｒｉｂｅらによって２００１年６月４日に出願された「ポリエチレングリコール混合物を有するポリマーの実質的単分散混合物の合成方法」と題する米国特許出願第０９／８７３，７３１号；Ｅｋｗｕｒｉｂｅらによって２００１年６月４日に出願された「ポリアルキレングリコールを含む薬物−オリゴマーコンジュゲートの混合物、それらの使用、およびそれらの製造方法」と題する米国特許出願第０９／８７３，７９７号；およびＥｋｗｕｒｉｂｅらによって２００１年６月４日に出願された「ポリアルキレングリコールを含むインスリン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物、それらの使用、およびそれらの製造方法」と題する米国特許出願第０９／８７３，８９９号。本発明の実施形態によるオリゴマーは、実質的単分散であってよく、単分散であることもある。単分散オリゴマーを合成するための代表的な方法を本明細書中に記載の実施例に示す。
【０１６２】
プロ−Ｃ−ペプチドポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを得るのに十分な条件下でプロ−Ｃ−ペプチドポリペプチドとオリゴマーとを接触させるステップは、当業者に理解されるように、様々な条件を利用して実施できる。プロ−Ｃ−ペプチドポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを得るのに十分な条件下で、プロ−Ｃ−ペプチドポリペプチドとオリゴマーとを接触させるステップは、活性化されたオリゴマーを得るのに十分な条件下でオリゴマーを活性化剤と接触させるステップと、プロ−Ｃ−ペプチドポリペプチドコンジュゲートを得るのに十分な条件下で、活性化されたオリゴマーをプロ−Ｃ−ペプチドポリペプチドと接触させるステップとを含む。活性化されたオリゴマーはエクスサイチューまたはインサイチューで生成できる。
【０１６３】
活性化剤は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ｐ−ニトロフェニルクロロホルメート、１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド、およびヒドロキシベンゾトリアジドを含むがそれらに限定されない当業者に理解されるようなプロインスリンポリペプチド内の求核性ヒドロキシル基および／またはアミノ基と、オリゴマーとが反応できるように、上記の１以上のオリゴマーを活性化できる様々な活性化剤であってよい。
【０１６４】
当業者であれば、活性化されたオリゴマーを得るために活性化剤をオリゴマーに結合させるのに十分な条件を理解するであろう。例えば当業者であれば、同様にＲ．Ｃ．Ｌａｒｏｃｋ，「ＣＯＭＰＲＥＨＥＮＳＩＶＥ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＴＲＡＮＳＦＯＲＭＡＴＩＯＮＳ．  Ａ  ＧＵＩＤＥ  ＴＯ  ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ  ＧＲＯＵＰ  ＰＲＥＰＡＲＡＴＩＯＮＳ」（第２版，ニューヨーク，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，１９９９）を参照することができる。
【０１６５】
活性化されたオリゴマーをプロ−Ｃ−ペプチドポリペプチドに結合させるために十分な条件は、当業者には理解されるであろう。例えば、プロ−Ｃ−ペプチドポリペプチドは、プロ−Ｃ−ペプチドポリペプチド溶液を得るために、ジメチルスルホキシドのような双極性非プロトン溶媒中に溶解させることができる。プロ−Ｃ−ペプチドポリペプチド溶液には、トリエチルアミンのような緩衝剤を添加できる。プロ−Ｃ−ペプチドポリペプチド溶液には、その後アセトニトリルのような無水溶媒中に溶解させた活性化されたオリゴマーを添加できる。当業者であれば、同様にＲ．Ｃ．Ｌａｒｏｃｋ，「ＣＯＭＰＲＥＨＥＮＳＩＶＥ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＴＲＡＮＳＦＯＲＭＡＴＩＯＮＳ．  Ａ  ＧＵＩＤＥ  ＴＯ  ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ  ＧＲＯＵＰ  ＰＲＥＰＡＲＡＴＩＯＮＳ」，（第２版，ニューヨーク，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，１９９９）を参照することができる。活性化されたオリゴマー対プロ−Ｃ−ペプチドポリペプチドのモル比は、約１：１より大きく、約２：１より大きく、約３：１より大きく、約４：１より大きく、及び／又は約５：１より大きくてよい。
【０１６６】
上述のＣ−ペプチドポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートの合成方法の様々な実施形態では、２つ以上のオリゴマー（すなわち、複数のオリゴマー）を、プロ−Ｃ−ペプチドポリペプチドのＣ−ペプチドポリペプチド部分に結合させることができる。他の実施形態では、例えば、分離を促進するために、オリゴマーを、プロ−Ｃ−ペプチドポリペプチドのＣ−ペプチド及びインスリンポリペプチド部分にコンジュゲートさせることができる。複数のオリゴマーは、同一であってよい。しかし、複数のオリゴマーは相互に相違していてもよい、あるいはまた、複数のオリゴマーの一部は同一で、一部は相違していてもよいことは理解すべきである。複数のオリゴマーがプロ−Ｃ−ペプチドポリペプチドのＣ−ペプチドポリペプチド部分に結合している場合は、加水分解性結合を用いて１以上のオリゴマーをプロ−Ｃ−ペプチドポリペプチドのＣ−ペプチドポリペプチド部分に結合させることができ、そして非加水分解性結合を用いて１以上のオリゴマーをプロ−Ｃ−ペプチドポリペプチドのＣ−ペプチドポリペプチド部分に結合させることができる。あるいはまた、複数のオリゴマーをプロ−Ｃ−ペプチドポリペプチドのＣ−ペプチドポリペプチド部分に結合させる結合の全部が加水分解性であってもよいが、例えば１以上のオリゴマーが身体内の加水分解によってＣ−ペプチドポリペプチドまたはプロ−Ｃ−ペプチドポリペプチドのＣ−ペプチドポリペプチド部分から迅速に除去され、そして１以上のオリゴマーが身体内の加水分解によってＣ−ペプチドポリペプチドまたはＣ−ペプチドポリペプチド部分から緩徐に除去されるように、相違する加水分解度を有していてよい。
【０１６７】
上述のＣ−ペプチドポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートの合成方法の様々な実施形態では、求核性ヒドロキシル基および／またはアミノ基を含むがそれらに限定されないＣ−ペプチドポリペプチド部分の様々な求核性残基で、プロ−Ｃ−ペプチドポリペプチドのＣ−ペプチドポリペプチド部分（及び任意にはインスリンポリペプチド部分及び／又は存在する場合はリーダーポリペプチド部分）にオリゴマーが結合されてよい。求核性ヒドロキシル基は、例えばセリンおよび／またはチロシン残基で見いだすことができ、そして求核性アミノ基は例えばヒスチジンおよび／またはリジン残基で、および／またはポリペプチドの１以上のＮ末端で見いだすことができる。オリゴマーがプロインスリンポリペプチドの１以上のＮ末端に結合している場合は、その結合は第２級アミンを形成する。
【０１６８】
Ｃ−ペプチドポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを得るためのプロ−Ｃ−ペプチドポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートから１以上のペプチドを開裂させるステップは、当業者に理解されるように、様々な工程によって実施できる。プロ−Ｃ−ペプチドポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートから１以上のペプチドを開裂させるステップは、プロ−Ｃ−ペプチドポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートと、１以上のペプチドとＣ−ペプチドポリペプチドとの間の結合を開裂させることのできる１以上の酵素とを、プロ−Ｃ−ペプチドポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートから１以上のペプチドを開裂させるために十分な条件下で接触させるステップを含む。例えばＫｅｍｍｌｅｒら，「プロインスリンからインスリンへの転換に関する研究」，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４６：６７８６〜６７９１（１９７１）のような様々な参考文献に記載されているように、当業者であれば開裂される特定ペプチド結合に照らして適切な酵素を選択する方法、およびプロ−Ｃ−ペプチドポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートから１以上のペプチドを開裂させるために十分な条件を提供する方法を理解するであろう。１以上の酵素は、トリプシン、キモトリプシン、カルボキシペプチダーゼＢ、およびそれらの混合物を含むがそれらに限定されない様々な酵素を含んでよい。一部の実施形態では、１以上の酵素は、トリプシン、カルボキシペプチダーゼＢ、およびそれらの混合物であってよい。
【０１６９】
1実施形態において、本発明は、インスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートの合成方法を提供し、この方法は、
（ａ）（ｉ）インスリンポリペプチドと、
（ｉｉ）開裂によりインスリンポリペプチドを産生できるペプチド結合によりインスリンポリペプチドに結合された１つ以上の非インスリンポリペプチドと
を含むプロインスリンポリペプチドと、親水性成分及び／又は親油性成分を含むオリゴマーとを、プロインスリンポリペプチドへオリゴマーを結合させてプロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを得るのに十分な条件下で接触させるステップと、
（ｂ）プロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートから１以上の非インスリンポリペプチドを開裂させて、インスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを得るステップと
を含む。例えば、投与により、対応するインスリン量によるグルコース低下効果より大きいグルコース低下効果を生み出す場合は、インスリンと比較して、増加された活性度が存在する。
【０１７０】
本発明の方法において、プロインスリンポリペプチドは、複数のコンジュゲーション部位を含んでよく、かつ複数のオリゴマーを含むプロインスリンポリペプチド−オリゴマーを製造できる、及び／又はプロインスリンポリペプチドは、そのインスリンポリペプチド部分上に複数のコンジュゲーション部位を含んでよく、そのインスリンポリペプチド部分上に１以上のオリゴマーを含むプロインスリンポリペプチド−オリゴマーを製造できる。他の実施形態では、本発明の方法は、非インスリンポリペプチド１以上がアンコンジュゲートである（unconjugated）プロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを含んでよい。本発明の方法のプロインスリンポリペプチドは、そのインスリンポリペプチド部分上に少なくとも1つのコンジュゲーション部位、及びその1以上の非インスリンポリペプチド部分上に少なくとも1つのコンジュゲーション部位を含んでよく、かつそのインスリンポリペプチド部分に結合したオリゴマー少なくとも１つと、その非インスリンポリペプチド部分１つ以上と結合したオリゴマー少なくとも１つとを含み得るプロインスリンポリペプチド−オリゴマーを生産することができる。
【０１７１】
本発明の方法は、更に、オリゴマーと活性化剤とを、プロインスリンポリペプチド上の求核性基に結合することができる活性化されたオリゴマーを得るのに十分な条件下で接触させるステップと、活性化されたオリゴマーとプロインスリンポリペプチドとを、プロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを得るのに十分な条件下で接触させるステップとを含むことができる。特定の実施形態では、本発明の方法は、インサイチューで実施することができる。
【０１７２】
本発明方法の一部の実施形態では、プロインスリンポリペプチドに対する活性化オリゴマーのモル比は、約１：１より大きく、約３：１より大きく、及び／又は約４：１より大きくてよい。
【０１７３】
本発明の方法におけるオリゴマーは、ポリエチレングリコール成分を含んでよく、一部の実施形態では、オリゴマーは、本質的にポリエチレングリコール成分からなっていてよい。
【０１７４】
本発明の方法において、インスリンポリペプチドがＡ鎖ポリペプチドとＢ鎖ポリペプチドとを含んでよく、かつ第１端でＢ鎖ポリペプチドのＣ末端に結合し、第２端でＡ鎖ポリペプチドのＮ末端に結合した連結ペプチドを含む非インスリンポリペプチド１以上を含んでよい。一部の実施形態では、Ｂ鎖が、Ｂ２９にコンジュゲーション部位を有してよく、インスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートが、Ｂ２９コンジュゲーション部位でコンジュゲートされ得る。他の実施形態では、プロインスリンポリペプチドは、Ｂ２９に単一のリジンを有してよく、インスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートは、Ｂ２９モノコンジュゲートであってよい。補足の実施形態において、オリゴマーは、インスリンのＢ２９位でリジンと、インスリンのＢ１位でフェニルアラニンと結合でき、それによりＢ１，Ｂ２９ジコンジュゲートを形成することができる。オリゴマーは、また、インスリンのＢ鎖のＢ１のコンジュゲーション部位で結合し、Ｂ１コンジュゲーション部位でコンジュゲートされたインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを生じることができる。更に追加の実施形態では、連結ペプチドは、リジンを有し得るＣ−ペプチドポリペプチドであってよく、本発明の方法は、Ｃ−ペプチドポリペプチドのリジンが、オリゴマーに結合したプロインスリンポリペプチド−オリゴマーを製造することができる。他の実施形態では、連結ペプチドにリジン残基が欠けていることもある。
【０１７５】
本発明の方法でも、プロインスリンポリペプチドは、Ｂ鎖ポリペプチドのＮ末端に結合したリーダーペプチドを含んでよく、リーダーペプチドは、リジンを含んでよく、リーダーペプチドのリジンがオリゴマーに結合しているプロインスリンポリペプチド−オリゴマーを製造することができる。一部の実施形態では、リーダーペプチドにリジン残基が欠けていることもある。
【０１７６】
本発明の方法の一部の実施形態において、リーダーペプチドのＮ末端に結合したオリゴマーを含むプロインスリンポリペプチド−オリゴマーを製造でき、また一部の実施形態では、1以上の非インスリンポリペプチドは、Ｂ鎖ポリペプチドのＮ末端に結合したリーダーペプチドを含んでよい。リーダーペプチドは、リジンを含んでよく、Ｃ−ペプチドのリジンがオリゴマーに結合しているプロインスリンポリペプチド−オリゴマーを製造することができる。他の実施形態で、リーダーペプチドにリジン残基が欠けていることもある。
【０１７７】
本発明の方法の他の実施形態において、プロインスリンポリペプチドがＡ鎖ポリペプチドとＢ鎖ポリペプチドとを有し、Ｂ鎖ポリペプチドのＣ末端は、Ａ鎖ポリペプチドのＮ末端に結合されていてよい。
【０１７８】
本発明の一部の実施形態では、プロインスリンポリペプチドは、Ｂ鎖のＮ末端で、開裂可能なペプチド結合によりリーダーペプチドに結合できる。他の実施形態では、インスリンポリペプチドは、インスリンであってよく、オリゴマーは、インスリンのＢ２９位でリジンと結合できるか、又はオリゴマーは、インスリンのＢ１位及びＢ２９位で結合して、ジコンジュゲートを形成することができる。
【０１７９】
本発明の方法のさらに他の実施形態では、インスリンポリペプチドは、限定はしないが、ＧｌｙＡ２１インスリン、ヒト；ＧｌｙＡ２ｌＧｌｎＢ３インスリン、ヒト；ＡｌａＡ２１インスリン、ヒト；ＡｌａＡ２ｌＧｌｎＢ３インスリン、ヒト；ＧｌｎＢ３インスリン、ヒト；ＧｌｎＢ３０インスリン、ヒト；ＧｌｙＡ２１ＧｌｕＢ３０インスリン、ヒト；ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０インスリン、ヒト；ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０インスリン、ヒト；ＡｓｐＢ２８インスリン、ヒト；ＬｙｓＢ２８インスリン、ヒト；ＬｅｕＢ２８インスリン、ヒト；ＶａｌＢ２８インスリン、ヒト；ＡｌａＢ２８インスリン、ヒト、ＡｓｐＢ２８ＰｒｏＢ２９インスリン、ヒト；ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９インスリン、ヒト；ＬｅｕＢ２８ＰｒｏＢ２９インスリン、ヒト；ＶａｌＢ２８ＰｒｏＢ２９インスリン、ヒト；ＡｌａＢ２８ＰｒｏＢ２９インスリン、ヒトであり得るインスリン類似体であってよい。
【０１８０】
本発明の方法の様々な実施形態において、インスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートが、両親媒性で平衡していてよく、及び／又はオリゴマーは実質的に単分散の混合物として存在していてよく、及び／又はオリゴマーは単分散の混合物として存在していてよい。
【０１８１】
本発明の方法の一部の実施形態では、オリゴマーの水性成分は、ポリアルキレングリコール成分であってよく、及び／又はポリアルキレングリコール成分は、ポリエチレングリコール成分であってよい。ポリアルキレングリコール成分は、ポリアルキレングリコールサブユニット１〜５０個、ポリアルキレングリコールサブユニット３〜５０個、ポリアルキレングリコールサブユニット２〜１０個、ポリアルキレングリコールサブユニット４〜１０個、及び／又はポリアルキレングリコールサブユニット少なくとも２個を有することができる。
【０１８２】
本発明の方法の一部の実施形態では、親油性成分は、アルキル又は脂肪酸成分であってよく、親油性成分は、炭素原子１〜２８個、炭素原子２〜２４個、炭素原子３〜１８個、炭素原子４〜１２個、炭素原子５〜７個、及び／又は炭素原子４〜１４個を有してよい。
【０１８３】
本発明方法の様々な実施形態において、非インスリンポリペプチド１つ以上を、プロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートから開裂させるステップは、非インスリンポリペプチド１つ以上とインスリンポリペプチドとの間の結合を切断できる酵素１つ以上と、プロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートとを、プロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートから非インスリンポリペプチド１つ以上を開裂させるのに十分な条件下に、接触させるステップを含んでよい。１つ以上の酵素は、例えば、トリプシン、カルボキシペプチダーゼＢ及び／又はこれらの混合物であってよい
【０１８４】
本明細書中に挙げられた一部の実施形態では、連結ペプチドは、第１端に末端アミノ酸残基を有しており、プロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートから連結ペプチドを開裂させるステップが、プロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートと第１酵素とを、末端アミノ酸残基−インスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを得るのに十分な条件下で接触させるステップと、末端アミノ酸残基−インスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートと第２酵素とを、インスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを得るのに十分な条件下で接触させるステップとを含むことができる。末端アミノ酸残基は、アルギニン残基であってよく、インスリンポリペプチドはインスリンであってよく、連結ペプチドは、ヒトＣ−ペプチドであってよい。これらの実施形態では、プロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートと第１酵素との接触及び末端アミノ酸残基−インスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートと第２酵素との接触は、実質的に同時に起こる。更に、第１酵素及び第２酵素は、第１酵素と第２酵素を含む混合物で用意でき、一部の実施形態では、第１酵素はトリプシンであり、第２酵素はカルボキシペプチダーゼＢであってよい。
【０１８５】
本発明の方法は、インスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートのオリゴマー１種以上を化学的に修飾するステップ、インスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートのオリゴマー１種以上を活性化させるステップ、インスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートのオリゴマー１種以上を延長させるステップ、及び／又はインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートのオリゴマー１種以上を短縮するステップを更に含む
【０１８６】
本発明の方法において、インスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートの収率は、７５％より大、８５％より大、約９０％より大、９５％より大、及び／又は９９％より大であってよい。
【０１８７】
本発明の方法は、更に、インスリンポリペプチドの合成方法を含み、この方法は、本明細書に記載のようにしてインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを合成するステップと、ポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートからオリゴマーを加水分解し、インスリンポリペプチドを産生するステップとを含む。
【０１８８】
本明細書中に、インスリンの合成方法も提供され、この方法は、本明細書に記載のようにしてインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを合成するステップと、ポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートからオリゴマーを加水分解し、インスリンを産生するステップとを含む。
【０１８９】
更に他の実施形態では、本発明は、インスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートの合成方法を提供し、この方法は、
開裂することによりインスリンポリペプチドを産生できるペプチド結合によって１以上の非インスリンポリペプチドに結合したインスリンポリペプチドを含むプロインスリンポリペプチドと、式Ｉ：
【化２８】
0004602968.tif 000029
（式中、Ａは活性化可能な成分であり、
Ｌは、任意のリンカー成分であり、
Ｇ、Ｇ’およびＧ’’は、各々任意のスペーサー成分であり、
Ｒは親油性成分であってＲ’はポリアルキレングリコール成分であるか、またはＲ’は親油性成分であってＲはポリアルキレングリコール成分であり、但し、（ｉ）Ｒ及びＲ’は共に存在するか、又は（ｉｉ）Ｒ及びＧが欠けており、ＬはＧ’が存在する場合はＧ’に結合し、Ｇ’が存在しない場合はＲ’に結合しているか、又は（ｉｉｉ）Ｒ’及びＧ”が欠けており、ＴはＧ’が存在する場合はＧ’に結合し、Ｇ’が存在しない場合はＲに結合しており、
Ｔは末端成分であり、
ｊ、ｋ、ｍおよびｎは個別に０または１である）の構造を有するオリゴマーとを、プロインスリンポリペプチドのインスリンポリペプチド部分へオリゴマーを結合させてプロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを得るのに十分な条件下で、接触させるステップと、
プロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートから１以上の非インスリンポリペプチドを開裂させて、インスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを得るステップと
を含む。
【０１９０】
本発明の方法のある実施形態では、Ｒ及びＲ’の両方が存在してもよい；Ｒ及びＧが欠けていてよく、ＬはＧ’が存在する場合はＧ’に結合し、Ｇ’が存在しない場合はＲ’に結合していてよい；Ｒ’がポリエチレングリコール成分であってよい；Ｒ’及びＧ”が欠けていてよく、ＴはＧ’が存在する場合はＧ’に結合し、Ｇ’が存在しない場合はＲに結合してよい；Ａは−Ｃ（Ｏ）−ＯＨ、Ｃ（Ｓ）−ＯＨ、−Ｃ（Ｓ）−ＳＨ、−ＯＨ、−ＳＨ、及び／又はＮＨ２であってよい；Ｌは、アルキル成分および脂肪酸成分であってよい；Ｇ、Ｇ’およびＧ’’は、糖成分、コレステロールおよびグリセリン成分から個別に選択されてよく、及び／又はＴは、アルキル及びアルコキシであってよい。
【０１９１】
本発明方法の特定の実施形態では、Ａは、カルボン酸成分であってよく、Ｒは、炭素原子３〜８個を有するアルキル成分であってよく、Ｒ’は、ポリエチレングリコールサブユニット４〜１０個を有するポリエチレングリコールであってよく、Ｔは、低級アルキル又は低級アルコキシであってよく、ｊ、ｋ、ｍ及びｎは０であってよい。他の実施形態では、Ａは、カルボン酸成分であってよく、Ｒは、炭素原子３〜８個を有するアルキル成分であってよく、Ｒ’は、ポリエチレングリコールサブユニット７個を有するポリエチレングリコールであってよく、Ｔは、メトキシであってよく、ｊ、ｋ、ｍ及びｎは０であってよい。
【０１９２】
更に本発明において、インスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートの合成方法が提供され、この方法は、
開裂することによりインスリンポリペプチドを産生することができるペプチド結合によって１以上の非インスリンポリペプチドに結合したインスリンポリペプチドを含むプロインスリンポリペプチドと、式ＩＩ：
【化２９】
0004602968.tif 000030
（式中、Ａは−Ｃ（Ｏ）−ＯＨ、Ｃ（Ｓ）−ＯＨ、−Ｃ（Ｓ）−ＳＨ、−ＯＨ、−ＳＨ、またはＮＨ２であり、
Ｘは、酸素原子であるか、またはＡが−ＯＨであるときにＸが酸素原子ではないことを条件に共有結合であり、
Ｙは、エステル、エーテル、カルバメート、カルボネート、またはアミド結合成分であり、
ｍは０〜３０であり、
ｎは０〜５０であり、
ｍとｎは両方が０にはならず、
Ｒは、アルキル成分、糖成分、コレステロール、アダマンタン、アルコール成分、または脂肪酸成分である）の構造を有するオリゴマーとを、プロインスリンポリペプチドのインスリンポリペプチド部分へオリゴマーを結合させてプロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを得るのに十分な条件下で、接触させるステップと、
プロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートから１以上の非インスリンポリペプチドを開裂させて、インスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを得るステップと
を含む。
【０１９３】
また、インスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートの合成方法が提供され、この方法は、
開裂することによりインスリンポリペプチドを産生することができるペプチド結合によって１以上の非インスリンポリペプチドに結合したインスリンポリペプチドを含むプロインスリンポリペプチドと、式ＩＩＩ：
【化３０】
0004602968.tif 000031
（式中、Ａは−Ｃ（Ｏ）−ＯＨ、Ｃ（Ｓ）−ＯＨ、−Ｃ（Ｓ）−ＳＨ、−ＯＨ、−ＳＨ、またはＮＨ２であり、
ｍは０〜２５であり、
ｎは０〜２５であり、
ｍとｎは両方が０にはならず、
Ｒはアルキルである）の構造を有するオリゴマーとを、プロインスリンポリペプチドのインスリンポリペプチド部分へオリゴマーを結合させてプロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを得るのに十分な条件下で、接触させるステップと、
プロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートから１以上の非インスリンポリペプチドを開裂させて、インスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを得るステップと
を含む。
【０１９４】
更に、インスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートの合成方法が提供され、この方法は、
Ａ鎖ポリペプチドとリジン残基を備えたＢ鎖ポリペプチドとを有するインスリンポリペプチドと、第１端でＢ鎖ポリペプチドのＣ末端に結合し、第２端でＡ鎖ポリペプチドのＮ末端に結合した連結ペプチドと、Ｂ鎖ポリペプチドのＮ末端に結合したリーダーペプチドとを含むプロインスリンポリペプチドと、式ＩＶ：
【化３１】
0004602968.tif 000032
（式中、ｍは０〜３０であり、
ｎは０〜５０であり、
ｍとｎは両方が０にはならず、
Ｒはアルキルである）の構造を有するオリゴマーとを、プロインスリンポリペプチドのインスリンポリペプチド部分のＢ鎖ポリペプチドのリジン残基へオリゴマーを結合させてプロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを得るのに十分な条件下で、接触させるステップと、
プロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートから、連結ペプチド及びリーダーペプチドを酵素により開裂させて、インスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを得るステップと
を含む。
【０１９５】
本明細書中に記載の方法において、ｍは、３〜１６、４〜１４、及び／又は５〜１０であってよい。一部の実施形態では、ｎは、３〜１８、４〜１４、及び／又は５〜１０であってよく、Ｒは、低級アルキルであってよく、Ｒは、Ｃ１〜Ｃ３アルキルであってよく、及び／又はＲは、メチルであってよい。
【０１９６】
本発明は、更に、インスリン−オリゴマーコンジュゲートの合成方法を提供し、この方法は、
そのＮ末端でリーダーペプチドに結合したプロインスリンを含むプロインスリンポリペプチドと、式Ｖ：
【化３２】
0004602968.tif 000033
の構造を有するオリゴマーとを、プロインスリンのＢ２９リジン残基へオリゴマーを結合させてプロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを得るのに十分な条件下で、接触させるステップと、
プロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートから、Ｃ−ペプチド及びリーダーペプチドを酵素により開裂させて、インスリン−オリゴマーコンジュゲートを得るステップと
を含む。
【０１９７】
本明細書中に記載の方法において、プロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートからＣ−ペプチド及びリーダーペプチドを酵素により開裂させるステップは、プロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートと、第１酵素とを、（Ａｒｇ３１）−インスリン−オリゴマーコンジュゲートを得るのに十分な条件下に接触させるステップと、（Ａｒｇ３１）−インスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートと、第２酵素とを、インスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを得るのに十分な条件下に接触させるステップとを含んでよい。第１酵素はトリプシンであってよく、第２酵素はカルボキシペプチダーゼＢであってよい。
【０１９８】
本明細書中に、インスリンポリペプチド−アシルオリゴマーコンジュゲートを合成する方法も提供され、この方法は、プロインスリンポリペプチド−アシルオリゴマーコンジュゲートから非インスリンポリペプチド１以上を酵素により開裂させて、インスリンポリペプチド−アシルオリゴマーコンジュゲートを得るステップを含む。
【０１９９】
もう１つの実施形態において、本発明は、インスリン−アシルオリゴマーコンジュゲートの合成方法を提供し、この方法は、以下の構造：
【化３３】
0004602968.tif 000034
を有するプロインスリンポリペプチド−アシルオリゴマーコンジュゲートからリーダーペプチド及びＣ−ペプチドを酵素により開裂させて、以下の構造：
【化３４】
0004602968.tif 000035
を有するインスリン−アシルオリゴマーコンジュゲートを得るステップを含む。
【０２００】
本明細書に記載の方法において、リーダーペプチドにリジン残基が欠けていることもあり、及び／又はプロインスリンポリペプチド−アシルオリゴマーコンジュゲートからＣ−ペプチド及びリーダーペプチドを酵素により開裂させるステップは、プロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートと、第１酵素とを、（Ａｒｇ３１）−インスリン−オリゴマーコンジュゲートを得るのに十分な条件下に、接触させるステップと、（Ａｒｇ３１）−インスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートと、第２酵素とを、インスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを得るのに十分な条件下に接触させるステップとを含んでよい。第１酵素は、トリプシンであってよく、第２酵素はカルボキシダーゼＢであってよい。
【０２０１】
プロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを得るのに十分な条件下に、プロインスリンポリペプチドと、親水性成分及び親油性成分を含むオリゴマーとを接触させるステップを含む、プロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを合成する方法も本明細書中で提供される。
【０２０２】
更に、Ｃ−ペプチドポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを合成する方法が提供され、この方法は、開裂によりＣ−ペプチドポリペプチドを産生できるペプチド結合により１以上の非インスリンポリペプチドに結合されたＣ−ペプチドポリペプチドを含むプロ−Ｃ−ペプチドポリペプチドと、オリゴマーとを、プロ−Ｃ−ペプチドポリペプチドのＣ−ペプチドポリペプチド部分へオリゴマーを結合させてプロ−Ｃ−ペプチドポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを得るのに十分な条件下で接触させるステップと、プロ−Ｃ−ペプチドポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートから１以上の非インスリンポリペプチドを開裂させて、Ｃ−ペプチドポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを得るステップとを含む。Ｃ−ペプチドポリペプチドは、Ｃ−ペプチドであってよく、プロ−Ｃ−ペプチドポリペプチドは、プロインスリンポリペプチドであってよく、及び／又はプロ−Ｃ−ペプチドポリペプチドは、プロインスリンであってよい。
【０２０３】
前記議論は主としてインスリンポリペプチド等に焦点を当てているが、本発明の原則が他のプロポリペプチドの製造にも等しく適用できることは認識されよう。従って、例えば、本発明の原則は、プロ−Ｘポリペプチドにも適用でき、ここで、限定はされないが、Ｘは、インスリン、上皮小体ホルモン（１−３４）（ＰＴＨ（１−３４））、ヒトＢ−タイプナトリウム利尿ペプチド（ｈＢＮＰ）、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ１）、管腔内（luminal）コレシストキニン放出因子（ＬＣＲＦ）、Ｃ−ペプチド、ロイエンケファリン、メトエンケファリン及びリジンーロイエンケファリンであってよく、同様に、本発明により、そのプロポリペプチドが製造できる及び／又はポリペプチドが、プロポリペプチドから製造できることが現在公知であるか又は後に確認される任意の他のポリペプチド又はポリペプチド類似体であってもよい。
【０２０４】
従って、１実施形態で、本発明はＸポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートの合成方法を提供する。合成方法は、一般に、プロ−Ｘポリペプチドと、親水性成分及び／又は親油性成分を含むオリゴマーとを接触させることを含む。接触ステップは、一般に、オリゴマーと、プロ−Ｘポリペプチドとを結合させてプロ−Ｘポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを得るのに十分な条件下で行う。プロ−Ｘポリペプチドは、１つのＸポリペプチドと、開裂によりＸポリペプチドを産生できるペプチド結合によりＸポリペプチドに結合された１以上の非Ｘポリペプチドとを含む。コンジュゲーション後、この方法は、一般に、プロ−Ｘポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートから１以上の非Ｘポリペプチドを開裂させて、Ｘポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを得るステップを含む。
【０２０５】
プロ−Ｘポリペプチドは、複数のコンジュゲーション部位を含んでよく、かつ複数のオリゴマーを含むプロ−Ｘポリペプチド−オリゴマーを産生できる。プロ−Ｘポリペプチドは、そのＸポリペプチド部分上に１以上のコンジュゲーション部位を含んでよく、そのＸポリペプチド部分上に１以上のオリゴマーを含むプロ−Ｘポリペプチド−オリゴマーを産生できる。本発明の方法は、非Ｘポリペプチド１以上がアンコンジュゲートであるプロ−Ｘポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを製造するために使用することもできる。
【０２０６】
プロ−Ｘポリペプチドは、そのＸポリペプチド部分上に少なくとも１つのコンジュゲーション部位を含んでよい。プロ−Ｘポリペプチドは、その１以上の非Ｘポリペプチド部分上に少なくとも１つのコンジュゲーション部位を含んでよい。そのＸポリペプチド部分に結合されたオリゴマー少なくとも１つ及びその非Ｘポリペプチド部分１以上に結合されたオリゴマー少なくとも１つを含み得るプロ−Ｘポリペプチド−オリゴマーを生産できる。
【０２０７】
本発明の方法は、更に、オリゴマーと活性化剤とを、プロ−Ｘポリペプチド上の求核性基に結合できる活性化オリゴマーを得るのに十分な条件下に接触させるステップと、活性化オリゴマーとプロ−Ｘポリペプチドとを、プロ−Ｘポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを生じるのに十分な条件下に接触させるステップとを含む。本発明の方法は、インサイチューで実施することができる。
【０２０８】
本発明方法の一部の実施形態では、プロ−Ｘポリペプチドに対する活性化オリゴマーのモル比は、約１：１より大、約３：１より大、及び／又は約４：１より大であってよい。
【０２０９】
一部の実施形態では、オリゴマーは、加水分解部位１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０アミノ酸（加水分解後に残存する最後のペプチドを加水分解部位の１アミノ酸であるとみなす）以内であるコンジュゲーション部位で、プロ−Ｘポリペプチドに結合している。
【０２１０】
本発明の方法で使用されるオリゴマーは、ポリエチレングリコール成分を含んでよく、一部の実施形態では、オリゴマーは、本質的にポリエチレングリコール成分からなっていてよい。ポリエチレングリコール成分は、一部の実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０のポリエチレングリコールサブユニットを含んでよく、かつ直線状、分岐状及び／又はループ状であってよい。
【０２１１】
本発明の方法において、Ｘポリペプチドは、２以上のポリペプチド鎖を含んでよく、又ポリペプチド鎖に結合した非Ｘポリペプチドを１以上含んでよい。ポリペプチド鎖は、コンジュゲーション部位、例えばアミノ末端及び／又はコンジュゲート可能官能基、例えばリジン側鎖を含んでよい。Ｘポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートは、１つ以上のコンジュゲーション部位でコンジュゲートされていてよい。一部の実施形態では、プロ−Ｘポリペプチドは、単一リジンを有してよく、Ｘポリペプチドオリゴマーコンジュゲートは、モノコンジュゲートであってよい。更に他の実施形態では、プロ−Ｘポリペプチドは、プロ−Ｘポリペプチドの１つ以上のサブユニットを接続させる連結ペプチド又はＣ−ペプチドポリペプチドを含んでよい。本発明の方法は、連結ペプチド又はＣ−ペプチドポリペプチドのリジンがオリゴマーに接続しているプロ−Ｘポリペプチド−オリゴマーを産生できる。他の実施形態では、連結ペプチド又はＣ−ペプチドにリジン残基が欠けていることがある。
【０２１２】
プロ−Ｘポリペプチドは、プロ−Ｘポリペプチド又はそのサブユニットポリペプチドのＮ末端に結合したリーダーペプチドを含んでよい。リーダーペプチドは、リジン１以上を含んでよく、又、リーダーペプチドのリジンがオリゴマーに結合したプロ−Ｘポリペプチド−オリゴマーを産生できる。一部の実施形態では、リーダーペプチドにリジン残基が欠けていることがある。
【０２１３】
本発明方法の一部の実施形態では、リーダーペプチドのＮ末端で結合したオリゴマーを含むプロ−Ｘポリペプチド−オリゴマーを産生することができる。１以上の非Ｘポリペプチドは、ＸポリペプチドのＮ末端に結合したリーダーペプチドを含んでよい。リーダーペプチドは、リジンを含んでよく、かつＣ−ペプチドのリジンがオリゴマーに結合したプロ−Ｘポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを産生できる。他の実施形態では、リーダーペプチドにリジンが欠けていることもある。
【０２１４】
本発明の方法の他の実施形態では、プロ−Ｘポリペプチドは、Ａ鎖ポリペプチド及びＢ鎖ポリペプチドを含んでよく、Ｂ鎖ポリペプチドのＣ末端は、Ａ鎖ポリペプチドのＮ末端に結合していてよい。
【０２１５】
本発明の方法の一部の実施形態では、プロ−Ｘポリペプチドは、Ｂ鎖のＮ末端で、リーダーペプチドに、開裂可能なペプチド結合により結合することができる。他の実施形態では、Ｘポリペプチドは、インスリンであってよく、オリゴマーは、インスリンのＢ２９位でリジンに結合することができる。
【０２１６】
本発明の方法を使用して、複合天然ペプチド並びに天然ペプチドの複合類似体を生産することができる。
【０２１７】
本発明の方法の様々な実施形態において、Ｘポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートは、両親媒性で平衡していてよい。Ｘポリペプチド−オリゴマーは、水はもとより有機溶剤にも可溶であってよい。オリゴマーは、実質的単分散混合物として存在し得る、及び／又はオリゴマーは、単分散混合物として存在し得る。オリゴマーの親水性成分は、ポリアルキレングリコール成分を含んでよい、基本的にポリアルキレングリコール成分からなっていてよい又はポリアルキレングリコール成分からなっていてよい及び／又はポリアルキレングリコール成分はポリエチレングリコール成分であってよい。ポリアルキレングリコール成分は、１〜５０個のポリアルキレングリコールサブユニット、３〜５０個のポリアルキレングリコールサブユニット、２〜１０個のポリアルキレングリコールサブユニット、４〜１０個のポリアルキレングリコールサブユニット及び／又は少なくとも２個のポリアルキレングリコールサブユニットを有してよい。
【０２１８】
本発明方法の一部の実施形態では、親油性成分はアルキル又は脂肪酸成分であってよく、親油性成分は１〜２８個の炭素原子、２〜２４個の炭素原子、３〜１８個の炭素原子、４〜１２個の炭素原子、５〜７個の炭素原子及び／又は４〜１４個の炭素原子を有してよい。
【０２１９】
本発明方法の様々な実施形態では、非Ｘポリペプチド１以上をプロ−Ｘポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートから開裂させるステップは、非Ｘポリペプチド１以上とＸポリペプチドとの間の結合を切断できる酵素１つ以上と、プロ−Ｘポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートとを、プロ−Ｘポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートから非Ｘポリペプチド１以上を開裂させるのに十分な条件下に、接触させるステップを含む。１以上の酵素は、トリプシン、カルボキシペプチダーゼＢ及び／又はこれらの混合物であってよい。
【０２２０】
本明細書中に記載の方法の一部の実施形態では、連結ペプチドが第１端に末端アミノ酸残基を有してよく、かつプロ−Ｘポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートから連結ペプチドを開裂させるステップが、プロ−Ｘポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートと第１酵素とを、末端アミノ酸残基−Ｘポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを得るのに十分な条件下で接触させるステップと、末端アミノ酸残基−Ｘポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートと第２酵素とを、Ｘポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを得るのに十分な条件下で接触させるステップとを含む。末端アミノ酸残基が、アルギニン残基であってよく、Ｘポリペプチドは、インスリンであってよく、連結ペプチドは、ヒトＣ−ペプチドであってよい。
【０２２１】
プロ−Ｘポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートと第１酵素との接触ステップ及び末端アミノ酸残基−Ｘポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートと第２酵素との接触ステップは、実質的に同時に起こってよい。更に、第１酵素及び第２酵素は、第１酵素と第２酵素を含む混合物で提供されてよく、一部の実施形態では、第１酵素はトリプシンであり、第２酵素はカルボキシペプチダーゼＢであってよい。
【０２２２】
本発明の方法は、Ｘポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートのオリゴマー１以上を化学的に修飾するステップと、Ｘポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートのオリゴマー１以上を活性化させるステップと、Ｘポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートのオリゴマー１以上を延長させるステップと、及び／又はＸポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートのオリゴマー１以上を短縮するステップとを更に含む。
【０２２３】
本発明の方法において、Ｘポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートの収率は、７５％より大、８５％より大、約９０％より大、９５％より大、及び／又は９９％より大であってよい。
【０２２４】
本発明の方法は、更に、Ｘポリペプチドの合成方法を含み、これは、本明細書中に記載されるようにＸポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを合成するステップと、ポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートからオリゴマーを加水分解してＸポリペプチドを産生するステップとを含む。
【０２２５】
本明細書中に、Ｘポリペプチドの合成方法も提供され、これは、ここに記載されるようにＸポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを合成するステップと、ポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートからオリゴマーを加水分解してＸポリペプチドを産生するステップとを含む。
【０２２６】
本発明のさらなる実施形態では、本発明の方法の産物が、部分的に開裂された複合プロインスリン又はプロ−Ｘ−ペプチド、例えばＣ−ペプチド又は連結ペプチドの部分開裂物であってよい。
【０２２７】
プロ−Ｘポリペプチドをコンジュゲートするのに有用なオリゴマーは、本明細書に記載のオリゴマー、例えば前記の式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ及びＶＩのオリゴマーを含む。
【０２２８】
本発明のさらに他の実施形態により、医薬組成物が提供され、これは、（ｉ）インビトロ又はインビボで開裂して、生理活性ポリペプチドを産生する、ペプチド結合によりペプチドに結合された生理活性ポリペプチドを含むプロポリペプチドを含むポリペプチド−オリゴマーコンジュゲート及び（ｉｉ）薬剤認容性賦形剤を含む。うせいトたるＶＩのプチダーゼＢ及び
【０２２９】
本発明の実施形態により、プロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを含む医薬組成物も提供される。前記プロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートは、公知技術により、医薬担体中で、投与用に処方されてよい。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（第９版、１９９５）参照。
【０２３０】
本発明の実施形態による医薬組成物の製造において、プロポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートは、通常は、特に薬剤認容性担体と混合される。担体は、当然ながら、医薬組成物中の他の成分のどれにも適合するという意味で、認容性であるべきであり、かつ被検者に有害であってはならない。担体は固体又は液体又は両方であってよく、好ましくは、プロポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートと共に、単位用量（unit-dose）処方物、例えば、プロポリペプチド−オリゴマーコンジュゲート約０．０１又は０．５重量％から約９５重量％又は９９重量％までを含有してよい錠剤、として処方される。医薬組成物は、任意には1種以上の補助成分を含む成分を混合することを含むが、それに限定されない、調剤の公知技術の何れかにより調製することができる。
【０２３１】
一部の実施形態において、プロポリペプチドは、プロインスリン、プロインスリン類似体、プロインスリンフラグメント、プロインスリンフラグメント類似体、プレプロインスリン、プレプロインスリン類似体、プレプロインスリンフラグメント又はプレプロインスリンフラグメント類似体であり、治療できる病気は、インスリン欠乏症、例えばＩ型又はＩＩ型糖尿病である。
【０２３２】
本発明は更に、本発明のインスリン−オリゴマー及び／又はＣ−ペプチドリゴマーコンジュゲート及び／又はインスリンプロペプチド−オリゴマーコンジュゲートを薬剤認容性担体中に含む医薬組成物を提供し、かつインスリン欠乏症又はインスリンス欠乏症に付随する障害を治療するために前記医薬組成物を被検者へ投与する方法を提供する。
【０２３３】
本明細書中で使用されるように、本発明による「薬剤認容性担体」は、組成物の他の成分に適合する組成物の担体、希釈剤又は賦形剤のような成分であり、組成物中で、これは、化合物又は組成物の生理活性を失わせずに本発明の化合物及び／又は組成物と結合でき、かつ過度の不都合な副作用（例えば毒性、刺激性、アレルギー性応答及び死亡）無しで、本明細書中に挙げられた被検者への使用に好適である。そのリスクが、医薬組成物により提供される恩恵を超える場合には、副作用は「過度」である。薬剤認容性成分の非限定例は、標準医薬担体、例えば、リン酸緩衝化生理食塩水溶液、水、エマルジョン、例えば油／水エマルジョン又は水／油エマルジョン、マイクロエマルジョン及び様々なタイプの湿潤剤を含むが、これらに限定されない。
【０２３４】
本発明の実施形態による医薬組成物は、当業者に理解されるであろうように、様々な好適な賦形剤を含んでよく、例えば、これらは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ  １９,２４０４〜２４０６頁（２０００）に見られ、２４０４〜２４０６頁の記載は、これらの教示のために、全体に、引用することにより、本明細書の一部を構成している。例えば、医薬組成物は、潤滑剤、例えばタルク、ステアリン酸マグネシウム及び鉱油；湿潤剤；乳化剤及び懸濁剤；結合剤、例えばデンプン類、アラビアゴム、微晶質セルロース、セルロース、メチルセルロース及びシロップ；抗固化剤、例えばケイ酸カルシウム；コーティング剤、例えばメタクリレート及びシェラック；保存剤、例えばメチル−およびプロピルヒドロキシベンゾアート；甘味剤；又は香味を含んでよい。ポリオール及び不活性充填剤を使用することもできる。ポリオールの例は、マニトール、ソルビトール、キシリトール、スクロース、マルトース、グルコース、ラクトース、デキストロース等々を含むが、これらに限定はされない。使用できる他の不活性充填剤は、当技術で公知であり、様々な投薬形の製造で有用であるものを包含する。所望の場合に、固体処方物は、他の成分、例えば増量剤及び／又は造粒剤等々、を含むことができる。本発明の製剤を、当技術で公知の方法を使用して被検者に投与した後、活性成分を迅速に、持続させて又は遅延させて放出させるように処方することができる。
【０２３５】
本発明は、本発明の実施形態による医薬組成物も提供し、この医薬組成物は、経口、直腸、局所的、吸入（例えばエアロゾルによる）、頬側（例えば舌下）、膣、非経口（例えば、皮下、筋肉内、皮内、関節内、胸内、腹腔内、大脳内、動脈内又は静脈内）、局所的（即ち、気道表面を含む皮膚及び粘膜の両方の表面）及び経皮投与に好適なものを含むが、任意の所定の場合のその最も好適な投与ルートは、治療すべき病気の性質及び重症度並びに使用される特定のインスリン薬−オリゴマーコンジュゲートの性質により決まる。
【０２３６】
経口投与に好適な医薬組成物は、分離した単位、例えばカプセル、カシェ剤、ロゼンジ又は錠剤で提供されてよく、それぞれは所定量のインスリン薬−オリゴマーコンジュゲートを粉末もしくは顆粒として、水性もしくは非水性液体中の溶液もしくは懸濁液として、又は水中油もしくは油中水のエマルジョンとして含有する。そのような処方物は、インスリン薬−オリゴマーコンジュゲート及び好適な担体（前記したような補助成分1種以上を含んでよい）を結合させるステップを含む任意の好適な調剤方法により調製することができる。一般に、本発明の実施形態による医薬組成物は、インスリン薬−オリゴマーコンジュゲートと液体又は微分砕された固体担体又はその両方と均一かつ徹底的に混合し、次いで必要ならば生じた混合物を成形することにより調製される。
【０２３７】
本発明の一部の実施形態では、医薬組成物は、経口投与に好適な液体医薬組成物である。医薬組成物が液体医薬組成物である場合に、組成物は前記のような緩衝剤を含んでよい。本発明の実施形態による液体医薬組成物は、生理的に適合するｐＨを有する。本発明の実施形態による液体医薬組成物は、６．２〜９．０のｐＨを有する。一部の実施形態では、本発明の実施形態による液体医薬組成物は、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６又は７．７の下限と７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８又は８．９の上限の間のｐＨを有する。一部の実施形態では、本発明の実施形態による液体医薬組成物は、７．０と８．５の間のｐＨを有する。他の実施形態では、本発明の実施形態による液体医薬組成物は、７．４と８．２の間のｐＨを有する。
【０２３８】
本発明の他の実施形態では、医薬組成物は、経口投与に好適な固体医薬組成物である。固体医薬組成物は、当業者に理解されるであろうように、様々な方法により調製することができる。例えば、インスリン薬−オリゴマーコンジュゲートを含有する粉末又は顆粒を、任意に1以上の補助成分と共に圧縮又は成形することにより錠剤を調製することができる。圧縮錠剤は、例えば、任意には結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤及び／又は界面活性／分散剤と混合された粉末又は顆粒などのフリーフローイング形の混合物を好適な機械で圧縮することにより調製することができる。成形錠剤は、不活性液体結合剤で湿らせた粉末混合物を、好適な機械で成形することにより製造することができる。
【０２３９】
頬側（舌下）投与に好適な医薬組成物は、風味付けされたベース、通常は人工甘味剤、アカシア又はトラガカンタ中にインスリン薬−オリゴマーコンジュゲートを含むロゼンジ、及び例えばゼラチン及びグリセリン又はスクロース及びアカシア等の不活性ベース中にインスリン薬−オリゴマーコンジュゲートを含むトローチを包含する。
【０２４０】
非経口投与に好適な本発明の実施形態による医薬組成物は、インスリン薬−オリゴマーコンジュゲートを含む水性及び非水性無菌注射溶液を含んでよく、その製剤は、対象とするレシピエントの血液と等張であってよい。これらの製剤は、抗酸化剤と、緩衝液と、静菌薬と、組成物を対象とするレシピエントの血液と等張にする溶質とを含有してよい。水性及び非水性無菌懸濁液は、懸濁剤及び濃厚化剤を含んでもよい。組成物は、単位用量又は複数用量容器、例えば密封アンプル及びバイアル中に入れて提供されることもあり、また組成物は、使用直前に無菌液体担体、例えば生理食塩水又は注射用水、の添加だけが必要である凍結乾燥状態で貯蔵することができる。
【０２４１】
即席注射溶液及び懸濁液は、前記種類の無菌粉末、顆粒及び錠剤から調製することができる。例えば、密封容器中の単位投薬量形（unit dosage form）の、インスリン薬−オリゴマーコンジュゲートを含む注射可能で安定な無菌組成物を提供することができる。インスリン薬−オリゴマーコンジュゲートは、好適な薬剤認容性担体でもどして、被検者へ注射するのに好適な液体組成物を形成できる、凍結乾燥物の形で提供される。
【０２４２】
本発明による医薬組成物は、更に、緩衝成分を含むことができる。緩衝成分は、当業者に理解されるであろうように、様々な緩衝剤を含んでよい。典型的な緩衝剤は、無機酸（例えばリン酸）、有機酸（例えばクエン酸）、有機塩基（例えば、トリス塩基（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）、トロラミン（トリエタノールアミン）又はヒスタジン）及びこれらの混合物を含むが、これらに限定はされない。緩衝成分は、有機塩基を含んでよく、トリス塩基、トロラミン又はこれらの混合物を含んでよい。一部の実施形態では、緩衝成分は、有機酸及び有機塩基を含み、かつクエン酸及びトリス塩基、トロラミン又はこれらの混合物を含んでよい。緩衝剤は、当業者に理解されるであろうように、消化管中で経験し得る酸性環境に対して医薬組成物を緩衝するであろう量で存在してよい。
【０２４３】
本発明の組成物の単位投薬量形は、インスリン薬−オリゴマーコンジュゲートを約１．０μｇから約１０ｇまでの範囲で含んでよい。インスリン薬−オリゴマーコンジュゲートが実質的に水不溶性である場合は、水性媒体中のインスリン薬−オリゴマーコンジュゲートを乳化させるのに十分な量で、生理的認容性の乳化剤を使用してよい。そのように有用な乳化剤の１つは、ホスファチジルコリンである。
【０２４４】
直腸投与に好適な医薬組成物は、単位用量座薬として提供され得る。これらは、インスリン薬−オリゴマーコンジュゲートと慣用の固体担体、例えばココア油、１つ以上と混合し、次いで生じた混合物を成形することにより調製することができる。
【０２４５】
皮膚への局所適用に好適な医薬組成物は、軟膏、クリーム、ローション、ペースト、ゲル、スプレー、エアゾール、経皮パッチ又は油の形状をとってよい。使用できる担体は、黄色ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、アルコール、経皮促進剤、及びこれらの２つ以上の組合せを含むが、これらに限定はされない。
【０２４６】
経皮投与に好適な医薬組成物は、レシピエントの外皮に長時間ぴったりと接触したままであるのに適合された分離独立したパッチとして提供することができる。経皮投与に好適な組成物は、微小電気泳動法により送達されてもよく（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ３（６）：３１８（１９８６）を参照）、かつ通常は、状況に応じて緩衝されたインスリン薬−オリゴマーコンジュゲートの水溶液の形をとる。好適な処方物は、クエン酸塩又はビス／トリス緩衝剤（ｐＨ６）又はエタノール／水を含み、かつ例えば活性成分０．１〜０．２Ｍを含有してよい。
【０２４７】
本発明の様々な医薬組成物の何れかを治療に有効な量で投与することにより、そのような治療を必要とする被検者におけるインスリン欠乏症及び／又はインスリン欠乏症に付随する障害を治療する方法も提供される。その使用が本発明の範囲の中にあるインスリン薬−オリゴマーコンジュゲートの有効量は、コンジュゲート毎に、また被検者毎に多少変化するだろうし、かつ例えば、被検者の年齢及び病状、治療すべき病気の重症度及び／又は送達経路等の因子に左右されるであろう。任意の個々の場合の適切な「治療有効量」は、関連するテキスト及び文献を参照して、及び／又はルーチンの実験（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（１９９５年第９版）参照）を用いて、当業者により決定されることができる。本発明の医薬組成物の治療有効量は、当業者に公知であろうように、通常の範囲の血液グルコースレベルを生じる又は保持する量を含んでよい。
【０２４８】
本発明の被検者は、インスリンを分泌し、そのため、インスリン欠乏症及び／又はインスリン欠乏症にめ、インスリン関連する障害に罹患しやすく、かつ本発明の組成物で治療できるだろう任意の動物であってよい。被検者は、任意の哺乳類であってよく、該哺乳類はヒトであってよい。ん
【０２４９】
そのような治療を必要とする被検者において、生物活性ポリペプチドにより治療できる病気を治療する方法も、本明細書中に提供され、この方法は、被検者に、インビボで開裂して生物活性ポリペプチドを生じることができるペプチド結合によりペプチドに結合された生物活性ポリペプチドを含むプロポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートの有効量を投与することを含む。プロポリペプチドの生物活性ポリペプチド部分に結合したオリゴマーも提供される。
【０２５０】
例として、約１．０μｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇまでの任意の投薬量範囲を含む投薬量は、治療的効能を有し、但し、全ての重量は、インスリン及び／又はインスリン薬−オリゴマーコンジュゲートの重量に基づいて計算される。より高いレベルでの毒性に関する懸念は、静脈内投与を、例えば約１０ｍｇ／ｋｇまでの低レベルに限定することもあり、但し、全ての重量は、活性塩基の重量に基づいて計算される。経口投与のために、約１０ｍｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇまでの投薬量を使用することができる。通常、筋肉内注射のためには、約０．５ｍｇ／ｋｇから５ｍｇ／ｋｇまでの投薬量を使用することができる。投与頻度は、例えば、１日当り１、２、３又はそれ以上の回数であってよく又は症状をコントロールするための必要に応じた回数であってよい。症状のコントロール及び治療の効力については、インスリン欠乏症及び／又はその関連障害を研究及び／又は治療する分野の熟練者が容易に決定することができる。あるいは、本発明の医薬組成物は、連続注入により投与することができる。治療の持続時間は、治療されるインスリン欠乏症のタイプにより決まり、被検者の生涯にわたることもある。治療されるれる。るきるゴマーコンジュゲートュゲート
【０２５１】
今度は、以下の実施例を参照しながら本発明について説明する。これらの実施例は本発明の態様を具体的に示すことを目的としており、請求の範囲によって規定した本発明の範囲を限定するものではないと認識すべきである。
【実施例１】
【０２５２】
６−（２−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−メトキシエトキシ）エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−ヘキサン酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステル（８）の合成
ヘキサエチレングリコールモノベンジルエーテル（１）
水４ｍＬに３．９９ｇ（１００ｍｍｏｌ）のＮａＯＨを溶解させて調製した水酸化ナトリウム水溶液を単分散ヘキサエチレングリコール（２８．１７５ｇ，２５ｍＬ，１００ｍｍｏｌ）へ緩徐に添加した。塩化ベンジル（３．９ｇ，３０．８ｍｍｏｌ，３．５４ｍＬ）を添加し、この反応混合液を攪拌しながら１００℃へ１８時間加熱した。この反応混合液をその後冷却し、食塩液（２５０ｍＬ）により希釈し、塩化メチレン（２００ｍＬ×２）により抽出した。結合した有機層を食塩液により１回洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４の上方に通して乾燥させ、濾過し、真空中で暗褐色油へ濃縮した。粗生成物混合液をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチルから９／１の酢酸エチル／メタノールへの勾配溶離）により精製して、黄色油として、８．０９９ｇ（７０％）の単分散化合物１を入手した。
【０２５３】
エチル６−メチルスルホニルオキシヘキサノエート（２）
無水ジクロロメタン（７５ｍＬ）中の単分散エチル６−ヒドロキシヘキサノエート（５０．７６ｍＬ，５０．４１ｇ，２２７ｍｍｏｌ）の溶液を氷浴中で冷やし、窒素大気下に置いた。トリエチルアミン（３４．４３ｍＬ，２４．９９ｇ，２４７ｍｍｏｌ）を添加した。無水ジクロロメタン（７５ｍＬ）中のメタンスルホニルクロリド（１９．１５ｍＬ，２８．３ｇ，２４７ｍｍｏｌ）の溶液を添加用漏斗から滴下法で添加した。この混合物を氷浴が溶けるにつれて緩徐に室温になるに任せながら３時間半攪拌した。この混合物はシリカゲルに通して濾過し、濾液は、逐次、水、飽和ＮａＨＣＯ３、水および食塩液を用いて洗浄した。有機相をＮａ２ＳＯ４の上方に通して乾燥させ、濾過し、真空中で浅黄色油へ濃縮した。粗生成物の最終精製をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、１／１ヘキサン／酢酸エチル）により実施して透明な無色油として単分散化合物２（４６．１３ｇ，８５％）を得た。ＦＡＢ  ＭＳ：ｍ／ｅ  ２３９（Ｍ＋Ｈ），１９３（Ｍ−Ｃ２Ｈ５Ｏ）。
【０２５４】
６−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−ベンジルオキシエトキシ）エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−ヘキサン酸エチルエステル（３）
水素化ナトリウム（３．２２５ｇまたは６０％油分散液，８０．６ｍｍｏｌ）を８０ｍＬの無水トルエン中に懸濁させ、窒素大気下に置き、氷浴中で冷却した。８０ｍＬの無水トルエン中の単分散アルコール９（２７．３ｇ，７３．３ｍｍｏｌ）の溶液をＮａＨ懸濁液に添加した。この混合液を０℃で３０分間攪拌し、室温になるに任せ、さらに５時間攪拌すると、その間に混合液は透明な褐色液になった。８０ｍＬの無水トルエン中の単分散メシレート１０（１９．２１ｇ，８０．６ｍｍｏｌ）を、ＮａＨ／アルコール混合液に添加し、そして結合溶液は室温で３日間攪拌した。この反応混合液は５０ｍＬのメタノールにより急冷し、塩基性アルミナに通して濾過した。濾液は真空中で濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、３／１酢酸エチル／ヘキサンから酢酸エチルの勾配溶離）により精製して浅黄色油として単分散化合物３（１６．５２ｇ，４４％）を得た。ＦＡＢ  ＭＳ：ｍ／ｅ  ５１５（Ｍ＋Ｈ）。
【０２５５】
６−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−ヒドロキシエトキシ）エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−ヘキサン酸エチルエステル（４）
実質的単分散ベンジルエーテル３（１．０３ｇ，２．０ｍｍｏｌ）は２５ｍＬのエタノール中に溶解させた。この溶液に２７０ｍｇの１０％のＰｄ／Ｃを添加し、この混合液を水素大気下に置いて４時間攪拌すると、この時間でＴＬＣは出発物質の完全な消失を示した。この反応混合液はセライト５４５に通して濾過することで触媒を除去し、濾液を真空中で濃縮すると透明な油として単分散化合物４が得られた（０．６７ｇ，７９％）。ＦＡＢ  ＭＳ：ｍ／ｅ  ４２５（Ｍ＋Ｈ），４４７（Ｍ＋Ｎａ）。
【０２５６】
６−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−メチルスルホニルエトキシ）エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−ヘキサン酸エチルエステル（５）
単分散アルコール４（０．８３５ｇ，１．９７ｍｍｏｌ）を３．５ｍＬの無水ジクロロメタン中に溶解させ、窒素大気下に置いた。トリエチルアミン（０．３０１ｍＬ，０．２１９ｇ，２．１６ｍｍｏｌ）を添加し、この混合液を氷浴中で冷却した。２分後、メタンスルホニルクロリド（０．１６ｍＬ，０．２４８ｇ，２．１６ｍｍｏｌ）を添加した。この混合液を０℃で１５分間、その後室温で２時間攪拌した。この反応混合液はシリカゲルに通して濾過することで塩化トリエチルアンモニウムを除去し、濾液は、逐次、水、飽和ＮａＨＣＯ３、水および食塩液を用いて洗浄した。有機相をＮａ２ＳＯ４の上方に通して乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮した。残留物をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、９／１  酢酸エチル／メタノール）により精製して透明な油として単分散化合物５（０．８１９ｇ，８３％）を得た。ＦＡＢ  ＭＳ：ｍ／ｅ  ５０３（Ｍ＋Ｈ）。
【０２５７】
６−（２−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−メトキシエトキシ）エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−ヘキサン酸エチルエステル（６）
ＮａＨ（油中の６０％分散液８８ｍｇ、２．２ｍｍｏｌ）をＮ２下で無水トルエン（３ｍＬ）中に懸濁させ、０℃に冷却した。トルエンによる共沸蒸留を介して乾燥させた単分散ジエチレングリコールモノメチルエーテル（０．２６ｍＬ，０．２６ｇ，２．２ｍｍｏｌ）を添加した。この反応混合液を室温へ加温するに任せて４時間攪拌すると、その間に濁った灰色懸濁液は透明かつ黄色になり、その後、褐色に変色した。２．５ｍＬの無水トルエン中のメシレート５（０．５０ｇ，１．０ｍｍｏｌ）を添加した。室温で一晩攪拌した後、この反応液は２ｍＬのメタノールを添加することにより急冷し、結果として生じた溶液はシリカゲルに通して濾過した。この濾液を真空中で濃縮した。ＦＡＢ  ＭＳ：ｍ／ｅ  ４９９（Ｍ＋Ｈ），５２１（Ｍ＋Ｎａ）。分取クロマトグラフィー（ｐｒｅｐａｒａｔｏｒｙ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ:シリカゲル、１９／３  クロロホルム／メタノール）による追加の精製で、透明な黄色油として単分散化合物６（０．３０２ｇ，５７％）を得た。ＦＡＢ  ＭＳ：ｍ／ｅ  ５２７（Ｍ＋Ｈ），５４９（Ｍ＋Ｎａ）。
【０２５８】
６−（２−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−メトキシエトキシ）エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−ヘキサン酸（７）
単分散エステル６（０．２５ｇ，０．４６ｍｍｏｌ）を０．７１ｍＬの１ＮのＮａＯＨ中で１８時間攪拌した。１８時間後、混合液を真空中で濃縮してアルコールを除去し、残留物をさらに１０ｍＬの水中に溶解させた。この水溶液は２ＮのＨＣｌを用いてｐＨ２へ酸性化し、生成物をジクロロメタン中で抽出した（３０ｍＬ×２）。次いで、結合有機相を食塩液（２５ｍＬ×２）により洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４の上方に通して乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮すると黄色油として単分散化合物１５が得られた（０．１４７ｇ，６２％）。ＦＡＢ  ＭＳ：ｍ／ｅ  ４９９（Ｍ＋Ｈ），５２１（Ｍ＋Ｎａ）。
【０２５９】
６−（２−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−メトキシエトキシ）エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−ヘキサン酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステル（８）
単分散酸７（０．２０９ｇ，０．４２ｍｍｏｌ）を４ｍＬの無水ジクロロメタン中に溶解させ、すでにＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）（５７．８ｍｇ，０．５０２ｍｍｏｌ）およびＥＤＣ（１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドヒドロクロリド）（９８．０ｍｇ，０．５０２ｍｍｏｌ）を含有する乾燥フラスコへ、Ｎ２大気下で添加した。この溶液を室温で一晩攪拌し、シリカゲルに通して濾過することで余分な試薬およびＥＤＣから形成された尿素を除去した。濾液を真空中で濃縮すると暗黄色油として活性化単分散オリゴマー８が得られた（０．２３５ｇ，９４％）。ＦＡＢ  ＭＳ：ｍ／ｅ  ５９６（Ｍ＋Ｈ），６１８（Ｍ＋Ｎａ）。
【実施例２】
【０２６０】
活性化されたＭＰＥＧ７−Ｃ８（１４）の合成
トリエチレングリコールモノメチルエーテルのメシレート（９）
氷浴中で０℃に冷却したＣＨ２Ｃｌ２の溶液（１００ｍＬ）に、単分散トリエチレングリコールモノメチルエーテル（２５ｇ，０．１５ｍｏｌ）を添加した。その後、トリエチルアミン（２９．５ｍＬ，０．２２ｍｏｌ）を添加し、この溶液を０℃で１５分間攪拌し、この後、メタンスルホニルクロリド（２０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２に溶解させた１３．８ｍＬ，０．１８ｍｏｌ）を滴下法で添加した。この反応混合液を０℃で３０分間攪拌し、室温へ加温するに任せ、その後２時間攪拌した。粗反応混合液をセライト（〜２００ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で洗浄）に通して濾過し、その後、Ｈ２Ｏ（３００ｍＬ）、５％のＮａＨＣＯ３（３００ｍＬ）、Ｈ２Ｏ（３００ｍＬ）、飽和ＮａＣｌ（３００ｍＬ）を用いて洗浄し、ＭｇＳ０４で乾燥させ、乾燥するまで蒸発させた。次いで、確実に乾燥させるためにこの油を〜２時間真空ライン上に置き、黄色油として単分散化合物９を得た（２９．１５ｇ，収率８０％）。
【０２６１】
ヘプタエチレングリコールモノメチルエーテル（１０）
ＴＨＦ（１Ｌ）中の単分散テトラエチレングリコール（５１．５ｇ，０．２７ｍｏｌ）の溶液にカリウムｔ−ブトキシド（１４．８ｇ，０．１３ｍｏｌ、〜３０分にわたり少量宛て）を添加した。次いで、この反応混合液を１時間攪拌し、その後、ＴＨＦ（９０ｍＬ）に溶解させた９（２９．１５ｇ，０．１２ｍｏｌ）を滴加し、この反応混合液を一晩攪拌した。粗反応混合液をセライト（〜２００ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２により洗浄）に通して濾過し、乾燥するまで蒸発させた。油はその後ＨＣｌ（２５０ｍＬ，１Ｎ）中に溶解させ、酢酸エチル（２５０ｍＬ）により洗浄して余分な９を除去した。残留している９を除去するために酢酸エチル（１２５ｍＬ）による追加の洗浄が必要になることがある。水相から化合物１８のほとんどが除去されるまで、水相をＣＨ２Ｃｌ２（容量１２５ｍＬ）により繰り返し洗浄した。第１抽出物は９、１０および二結合（dicoupled）副産物を含有しているので、ＨＣｌ（１２５ｍＬ，１Ｎ）を用いて逆抽出しなければならない。有機層を集めて、乾燥するまで蒸発させた。次いで、結果として生じた油はＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）中に溶解させ、１０が除去されるまでＨ２Ｏ（容量５０ｍＬ）により繰り返し洗浄した。水性分画を総量５００ｍＬとなるように集め、この溶液が濁るまでＮａＣｌを添加し、その後ＣＨ２Ｃｌ２（２×５００ｍＬ）により洗浄した。有機層をあわせて、ＭｇＳＯ４で乾燥し、乾燥するまで蒸発させると油として単分散化合物１０（１６．９ｇ，４１％収率）が得られた。高純度を保証するためには精製方法の１以上のステップを繰り返すのが望ましいことがある。
【０２６２】
８−ブロモオクタネート（１１）
エタノール（１００ｍＬ）中の単分散８−ブロモオクタン酸（５．０ｇ，２２ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｈ２ＳＯ４（０．３６ｍＬ，７．５ｍｍｏｌ）を添加し、この反応液を攪拌しながら３時間加熱して環流させた。粗反応混合液を室温へ冷却し、Ｈ２Ｏ（１００ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ３（２×１００ｍＬ）、Ｈ２Ｏ（１００ｍＬ）を用いて洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、乾燥するまで蒸発させて透明油１１を得た（５．５ｇ，収率９８％）。
【０２６３】
ＭＰＥＧ７−Ｃ８エステル（１２）
エーテル（９０ｍＬ）中の単分散化合物１０（３．０ｇ，８．８ｍｍｏｌ）の溶液に、カリウムｔ−ブトキシド（１．２ｇ，９．６ｍｍｏｌ）を添加し、この反応混合物を１時間攪拌した。次いで、エーテル（１０ｍＬ）に溶解させた単分散化合物１１（２．４ｇ，９．６ｍｍｏｌ）の滴加液を添加し、この反応混合液を一晩攪拌した。粗反応混合液をセライト（〜２００ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２により洗浄）に通して濾過し、乾燥するまで蒸発させた。結果として生じた油を酢酸エチル中に溶解させ、Ｈ２Ｏ（２×２００ｍＬ）により洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、乾燥するまで蒸発させた。カラムクロマトグラフィー（シリカ、酢酸エチル対酢酸エチル／メタノール、１０：１）を実施し、透明な油として単分散化合物１２を得た（０．８４３ｇ，収率１９％）。
【０２６４】
ＭＰＥＧ７−Ｃ８酸（１３）
単分散化合物１２（０．７０ｇ，１．４ｍｍｏｌ）の油に、１ＮのＮａＯＨ（２．０ｍＬ）を添加し、この反応混合液を４時間攪拌した。粗反応混合液を濃縮し、酸性化し（ｐＨ〜２）、ＮａＣｌにより飽和させ、そしてＣＨ２Ｃｌ２（２×５０ｍＬ）により洗浄した。有機層を合わせて、飽和ＮａＣｌにより洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、乾燥するまで蒸発させると透明な油として単分散化合物１３（０．３５ｇ，収率５３％）が得られた。
【０２６５】
ＭＰＥＧ７−Ｃ８酸の活性化
単分散ｍＰＥＧ７−Ｃ８酸１３（０．３１ｇ，０．６４ｍｍｏｌ）を３ｍＬの無水塩化メチレン中に溶解させ、無水塩化メチレン中のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（０．０７９ｇ，０．６９ｍｍｏｌ）およびＥＤＣＩ−ＨＣｌ（１３５．６ｍｇ，０．７１ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。この反応液を数時間攪拌し、次いで、１ＮのＨＣｌ、水により洗浄し、ＭｇＳＯ４の上方で乾燥させ、濾過し、濃縮させた。粗物質をカラムクロマトグラフィーにより精製し、濃縮させて、透明な油として単分散活性化ｍＰＥＧ７−Ｃ８１４が得られ、これを真空により乾燥させた。
【実施例３】
【０２６６】
活性化されたＭＰＥＧ７−Ｃ１０（１９）の合成
１０−ヒドロキシデカノエート（１５）
エタノール（１００ｍＬ）中の単分散１０−ヒドロキシデカン酸（５．０ｇ，２６．５ｍｍｏｌ）の溶液にＨ２ＳＯ４（０．４３ｍＬ，８．８ｍｍｏｌ）を添加し、この反応液を攪拌しながら３時間加熱環流させた。粗反応混合液を室温に冷却し、Ｈ２Ｏ（１００ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ３（２×１００ｍＬ）、Ｈ２Ｏ（１００ｍＬ）を用いて洗浄しＭｇＳＯ４で乾燥し、乾燥するまで蒸発させて透明な油として単分散化合物１５を得た（６．９ｇ，収率９８％）。
【０２６７】
１０−ヒドロキシデカノエートのメシレート（１６）
ＣＨ２Ｃｌ２の溶液（２７ｍＬ）に単分散１０−ヒドロキシデカノエート１５（５．６ｇ，２６ｍｍｏｌ）を添加し、氷浴中で０℃に冷却した。その後、トリエチルアミン（５ｍＬ，３７ｍｍｏｌ）を添加し、この反応混合液を０℃で１５分間攪拌した。ＣＨ２Ｃｌ２（３ｍＬ）中に溶解させたメタンスルホニルクロリド（２．７ｍＬ，２４ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合液を０℃で３０分間攪拌し、氷浴を除去し、この反応液を室温でさらに２時間攪拌した。粗反応混合液をセライト（８０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で洗浄）に通して濾過し、濾液をＨ２Ｏ（１００ｍＬ）、５％のＮａＨＣＯ３（２×１００ｍＬ）、Ｈ２Ｏ（１００ｍＬ）、飽和ＮａＣｌ（１００ｍＬ）を用いて洗浄し、ＭｇＳ０４で乾燥させ、乾燥するまで蒸発させて黄色がかった油として単分散化合物１６を得た（７．４２ｇ，収率９７％）。
【０２６８】
ＭＰＥＧ７−Ｃ１０エステル（１７）
テトラヒドロフラン（１００ｍＬ）中の実質的単分散ヘプタエチレングリコールモノメチルエーテル１０（２．５ｇ，７．３ｍｍｏｌ）の溶液に水素化ナトリウム（０．１９４ｇ，８．１ｍｍｏｌ）を添加し、この反応混合液を１時間攪拌した。テトラヒドロフラン（１０ｍＬ）に溶解させた単分散１０−ヒドロキシデカノエート１６のメシレート（２．４ｇ，８．１ｍｍｏｌ）の滴加液を添加し、この反応混合液を一晩攪拌した。粗反応混合液をセライト（〜２００ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２により洗浄）に通して濾過し、乾燥するまで蒸発させた。結果として生じた油を酢酸エチル中に溶解させ、Ｈ２Ｏ（２×２００ｍＬ）により洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、乾燥するまで蒸発させ、クロマトグラフ（シリカ、酢酸エチル／メタノール、１０：１）にかけ、さらにクロマトグラフ（シリカ、酢酸エチル）にかけて透明な油として単分散化合物１７を得た（０．５７０ｇ，収率１５％）。
【０２６９】
ＭＰＥＧ７−Ｃ１０酸（１８）
単分散ｍＰＥＧ７−Ｃ１０エステル１７（０．５７０ｇ，１．１ｍｍｏｌ）の油に、１ＮのＮａＯＨ（１．６ｍＬ）を添加し、この反応混合液を一晩攪拌した。粗反応混合液を濃縮し、酸性化し（ｐＨ〜２）、ＮａＣｌにより飽和させ、そしてＣＨ２Ｃｌ２（２×５０ｍＬ）により洗浄した。有機層を合わせて、飽和ＮａＣｌ（２×５０ｍＬ）により洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、乾燥するまで蒸発させると透明な油として単分散化合物１８（０．３４０ｇ，収率６２％）が得られた。
【０２７０】
ＭＰＥＧ７−Ｃ１０酸の活性化
単分散酸１８は、活性化ｍＰＥＧ７−Ｃ１０オリゴマー１９を得るために、本明細書中に記載した方法を使用して活性化した。
【実施例４】
【０２７１】
活性化されたＣ１８（ＰＥＧ６）オリゴマー（２２）の合成
Ｃ１８（ＰＥＧ６）オリゴマー（２０）の合成。単分散ステアロイルクロリド（０．７ｇ，２．３１ｍｍｏｌ）をベンゼン中の単分散ＰＥＧ６（５ｇ，１７．７ｍｍｏｌ）およびピリジン（０．９７ｇ，１２．４ｍｍｏｌ）の混合液へゆっくりと添加した。この反応混合液を数時間（〜５時間）攪拌した。この反応の後に、展開剤として酢酸エチル／メタノールを使用するＴＬＣを実施した。この反応混合液を水で洗浄し、ＭｇＳＯ４の上方で乾燥させ、濃縮させて、真空により乾燥させた。ＦＡＢ  ＭＳにより精製単分散化合物２０を分析した。ｍ／ｅ  ５４９／Ｍ＋Ｈ。
【０２７２】
Ｃ１８（ＰＥＧ６）オリゴマーの活性化
単分散Ｃ１８（ＰＥＧ６）オリゴマーの活性化は２つのステップで実施した。
【０２７３】
１）単分散ステアロイル−ＰＥＧ６２０（０．８ｇ，１．４６ｍｍｏｌ）をトルエン中に溶解させ、ホスゲン液（１０ｍＬ，トルエン中で２０％）に添加し、これを氷浴で冷却した。この反応混合液を０℃で１時間攪拌し、その後、室温で３時間攪拌した。次いで、ホスゲンおよびトルエンを蒸留により除去し、残留した実質的単分散ステアロイル−ＰＥＧ６クロロホルメート２１をＰ２Ｏ５の上方で一晩かけて乾燥させた。
【０２７４】
２）無水塩化メチレン中の単分散ステアロイル−ＰＥＧ６クロロホルメート２１（０．７８ｇ，１．２７ｍｍｏｌ）およびＴＥＡ（１２８ｍｇ，１．２７ｍｍｏｌ）の溶液に、塩化メチレン中のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）溶液を添加した。この反応混合液を１６時間攪拌し、次いで、水により洗浄し、ＭｇＳＯ４の上方で乾燥させ、濾過し、濃縮し、真空により乾燥させて単分散の活性化されたＣ１８（ＰＥＧ６）オリゴマー２２を得た。
【実施例５】
【０２７５】
活性化されたＣ１８（ＰＥＧ８）オリゴマー（２８）の合成
テトラエチレングリコールモノベンジルエーテル（２３）。単分散テトラエチレングリコール（１９．４ｇ，０．１０ｍｏｌ）の油にＮａＯＨの溶液（４．０ｍＬ中の４．０ｇ）を添加し、この反応混合液を１５分間攪拌した。次いで、塩化ベンジル（３．５４ｍＬ，３０．８ｍｍｏｌ）を添加し、この反応混合液を１００℃まで加熱し、一晩攪拌した。この反応混合液を室温まで冷却し、飽和ＮａＣｌ（２５０ｍＬ）により希釈し、ＣＨ２Ｃｌ２（２×２００ｍＬ）により洗浄した。有機層を合わせて、飽和ＮａＣｌにより洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、クロマトグラフ（シリカ、酢酸エチル）にかけると、黄色油として単分散化合物２３（６．２１ｇ、収率７１％）が得られた。
【０２７６】
テトラエチレングリコールモノベンジルエーテルのメシレート（２４）
ＣＨ２Ｃｌ２の溶液（２０ｍＬ）へ単分散テトラエチレングリコールモノベンジルエーテル２３（６．２１ｇ，２２ｍｍｏｌ）を添加し、氷浴中で０℃に冷却した。その後、トリエチルアミン（３．２ｍＬ，２４ｍｍｏｌ）を添加し、この反応混合液を０℃で１５分間攪拌した。ＣＨ２Ｃｌ２（２ｍＬ）中に溶解させたメタンスルホニルクロリド（１．７ｍＬ，２４ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合液を０℃で３０分間攪拌し、氷浴を除去し、この反応液を室温でさらに２時間攪拌した。粗反応混合液をセライト（８０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で洗浄）に通して濾過し、Ｈ２Ｏ（１００ｍＬ）、５％のＮａＨＣＯ３（２×１００ｍＬ）、Ｈ２Ｏ（１００ｍＬ）、飽和ＮａＣｌ（１００ｍＬ）を用いて洗浄し、ＭｇＳ０４で乾燥させた。結果として生じた黄色油は、活性炭素（１０ｇ）を含有するシリカパッド上でクロマトグラフにかけて透明な油として単分散化合物２４（７．１０ｇ，収率８９％）が得られた。
【０２７７】
オクタエチレングリコールモノベンジルエーテル（２５）
水素化ナトリウム（０．４３ｇ，１８ｍｍｏｌ）を含有するテトラヒドロフラン溶液（１４０ｍＬ）にテトラヒドロフラン（１０ｍＬ）中の単分散テトラエチレングリコール（３．５ｇ，１８ｍｍｏｌ）の溶液を滴下法で添加し、この反応混合液を１時間攪拌した。テトラヒドロフラン（１０ｍＬ）に溶解させた単分散テトラエチレングリコールモノベンジルエーテル２４（６．０ｇ，１６．５ｍｍｏｌ）のメシレートを滴下法で添加し、この反応混合液を一晩攪拌した。粗反応混合液をセライト（２５０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２により洗浄）に通して濾過し、濾液をＨ２Ｏで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、乾燥するまで蒸発させた。結果として生じた油をクロマトグラフィー（シリカ、酢酸エチル／メタノール、１０：１）にかけ、さらにクロマトグラフィー（シリカ、クロロホルム／メタノール、２５：１）にかけて透明な油として単分散化合物２５を得た（２．６２ｇ，収率３４％）。
【０２７８】
ステアレート−ＰＥＧ８−ベンジル（２６）の合成
単分散オクタエチレングリコールモノベンジルエーテル２５（０．９９８ｇ，２．０７ｍｍｏｌ）およびピリジン（１６３．９ｍｇ，２．０７ｍｍｏｌ）の撹拌混合液へベンゼン中の単分散ステアロイルクロリド（６２７．７ｍｇ，２．０７ｍｍｏｌ）を添加した。この反応混合液を一晩（１８時間）攪拌した。翌日、この反応混合液を水で洗浄し、ＭｇＳＯ４の上方で乾燥させ、濃縮させて、真空により乾燥させた。その後、粗生成物は、１０％メタノール／９０％クロロホルムを使用するフラッシュシリカゲル・カラムのクロマトグラフにかけた。生成物を含有するフラクションをあつめ、濃縮し、真空により乾燥させて単分散化合物２６を得た。
【０２７９】
ステアレート−ＰＥＧ８−ベンジルの水素添加分解
単分散ステアレート−ＰＥＧ８−Ｂｚｌ２６のメタノール溶液（０．８５４ｇ，１．１３８ｍｍｏｌ）に、Ｐｄ／Ｃ（１０％）（パラジウム，活性炭素上で１０重量％）を添加した。この反応混合液を水素下で一晩（１８時間）攪拌した。その後、この溶液を濾過し、濃縮し、１０％メタノール／９０％クロロホルムを使用したフラッシュカラム・クロマトグラフィーにより精製し、Ｒｔ＝０．６のフラクションを収集し、濃縮し、乾燥させて単分散の酸２７を得た。
【０２８０】
Ｃ１８（ＰＥＧ８）オリゴマーの活性化
単分散ステアレート−ＰＥＧ８オリゴマー２７の２段階活性化を上述の実施例４においてステアレート−ＰＥＧ６について記載した通りに実施し、単分散活性化されたＣ１８（ＰＥＧ８）オリゴマー２８を得た。
【実施例６】
【０２８１】
活性化されたトリエチレングリコールモノメチルオリゴマーの合成
２０％のホスゲン（１００ｍＬ，約１８．７ｇ，１８９ｍｍｏｌのホスゲン）を含有するトルエンの溶液をＮ２大気下で０℃に冷却した。単分散ｍＴＥＧ（トリエチレングリコール、モノメチルエーテル、７．８ｇ，４７．５ｍｍｏｌ）を２５ｍＬの無水酢酸エチル中に溶解させ、冷却したホスゲン溶液に添加した。この混合液を０℃で１時間攪拌し、次いで、室温へ加温するに任せ、さらに２時間半攪拌した。残留しているホスゲン、酢酸エチルおよびトルエンを真空蒸留により除去して、透明な油性残留物として単分散ｍＴＥＧクロロホルメートを残した。
【０２８２】
単分散ｎＴＥＧクロロホルメートを５０ｍＬの無水ジクロロメタン中に溶解させ、これにＴＥＡ（トリエチルアミン，６．６２ｍＬ，４７．５ｍｍｏｌ）およびＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド，５．８ｇ，５０．４ｍｍｏｌ）を添加した。この混合液を室温の乾燥大気下で２０時間撹拌すると、その間に大量の白色沈降物が生じた。この混合液を濾過してこの沈降物を除去し、真空中で濃縮した。残留油をジクロロメタン中に取り出し、冷脱イオン水で２回、１ＮのＨＣｌで２回、そして食塩液で１回洗浄した。有機相をＭｇＳＯ４の上方で乾燥させ、濾過し、濃縮して透明な淡黄色油として単分散標題化合物を得た。必要であれば、溶離剤としてＥｔＯＡｃを使用したシリカゲルのフラッシュ・クロマトグラフィーによりさらに精製することができた。
【実施例７】
【０２８３】
活性化されたパルミテート−ＴＥＧオリゴマーの合成
単分散パルミチン酸無水物（５ｇ；１０ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦ（２０ｍＬ）中に溶解させ、室温で撹拌した。この撹拌溶液に、３モル過剰のピリジンを添加し、その後、単分散トリエチレングリコール（１．４ｍＬ）を添加した。この反応混合液を１時間撹拌した（反応の進行は、ＴＬＣ（酢酸エチル−クロロホルム；３：７）により監視した）。反応の終了時にＴＨＦを除去し、生成物を１０％Ｈ２ＳＯ４酸と混合し、酢酸エチルを用いて抽出した（３×３０ｍＬ）。集められた抽出物は、水、食塩液で、逐次、洗浄し、ＭｇＳＯ４の上方を通して乾燥させ、蒸発させて単分散のパルミテート−ＴＥＧオリゴマーを得た。
【０２８４】
ＤＭＦ（〜１０ｍＬ）中のＮ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカルボネート（３ｍｍｏｌ）の溶液を１０ｍＬの無水ＤＭＦ中の単分散パルミテート−ＴＥＧオリゴマー（１ｍｍｏｌ）の溶液に撹拌しながら添加した。水素化ナトリウム（３ｍｍｏｌ）をこの反応混合液にゆっくり添加した。この反応混合液を数時間（例えば、５時間）攪拌した。ジエチルエーテルを添加し、単分散の活性化された標題化合物オリゴマーを沈降させた。この工程を３回繰り返し、最後に生成物を乾燥させた。
【実施例８】
【０２８５】
活性化されたヘキサエチレングリコールモノメチルオリゴマーの合成
単分散の活性化されたヘキサエチレングリコールモノメチルエーテルは、本明細書中に記載の単分散トリエチレングリコールと同様にして調製した。トルエン溶液中の２０％ホスゲン（３５ｍＬ，６．６６ｇ，６７．４ｍｍｏｌのホスゲン）は氷／塩水浴中のＮ２大気下で冷却した。単分散ヘキサエチレングリコール（１．８５ｍＬ，２．０ｇ，６．７４ｍｍｏｌ）を５ｍＬの無水ＥｔＯＡｃ中へ溶解させ、シリンジによりホスゲン溶液へ添加した。この反応混合液を１時間氷浴中で撹拌し続け、除去し、さらに室温で２．５時間撹拌した。ホスゲン、ＥｔＯＡｃおよびトルエンを真空蒸留により除去して、透明な油性残留物として単分散のメチルヘキサエチレングリコールクロロホルメートを残した。
【０２８６】
この単分散クロロホルメートを２０ｍＬの無水ジクロロメタン中に溶解させ、乾燥した不活性大気下に置いた。トリエチルアミン（０．９４ｍＬ，０．６８ｇ，６．７ｍｍｏｌ）およびその後にＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド，０．８２ｇ，７．１ｍｍｏｌ）を添加し、この反応混合液を室温で１８時間撹拌した。この混合液をシリカゲルに通して濾過して白色沈降物を除去し、真空中で濃縮した。残留物をジクロロメタン中に取り出し、冷水で２回、１ＮのＨＣｌで２回、そして食塩液で１回洗浄した。有機相をＮａ２ＳＯ４の上方に通して乾燥させ、濾過し、濃縮した。フラッシュ・クロマトグラフィー（シリカゲル、ＥｔＯＡｃ）により最終精製して活性化単分散ヘキサエチレンモノメチルエーテルを得た。
【実施例９】
【０２８７】
活性化されたヘプタエチレングリコールモノメチルエーテルの合成
８−メトキシ−１−（メチルスルホニル）オキシ−３，６−ジオキサオクタン（２９）
無水ジクロロメタン（５０ｍＬ）中の単分散トリエチレングリコールモノメチルエーテル分子（４．００ｍＬ，４．１９ｇ，２５．５ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（４．２６ｍＬ，３．０９ｇ，３０．６ｍｍｏｌ）を氷浴中で冷やし、窒素大気下に置いた。無水ジクロロメタン（２０ｍＬ）中のメタンスルホニルクロリド（２．３７ｍＬ，３．５１ｇ，３０．６ｍｍｏｌ）の溶液を添加用漏斗から滴加した。塩化物添加の完了１０分後に、反応混合液を氷浴から除去し、室温になるに任せた。この混合物をさらに１時間撹拌し、その時点のＴＬＣ（溶離剤として１５％のＭｅＯＨとともにＣＨＣ１３を使用して）は、トリエチレングリコールモノメチルエーテルの残留を示さなかった。
【０２８８】
反応混合液を別の７５ｍＬのジクロロメタンで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３、水および食塩液で、逐次、洗浄した。有機相をＮａ２ＳＯ４の上方に通して乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮して透明な油として化合物２９の単分散混合物を得た（５．３１ｇ，８６％）。
【０２８９】
ヘプタエチレングリコールモノメチルエーテル（３０）
無水ＤＭＦ（２５．７ｍＬ）中の単分散テトラエチレングリコール（３５．７ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、Ｎ２下で鉱油中のＮａＨの６０％分散液を少量ずつ添加し、この混合液を室温で１時間撹拌した。結果として生じたテトラエチレングリコールのナトリウム塩に無水ＤＭＦ（４ｍＬ）中の単分散メシレート２９（２３．３６）の溶液を１回で添加し、その混合液を室温で３．５時間撹拌した。この反応の進行は、ＴＬＣ（１２％のＣＨ３ＯＨ−ＣＨＣ１３）により監視した。この反応混合液は等量の１ＮＨＣｌにより希釈し、酢酸エチル（２×２０ｍＬ）により抽出して廃棄した。水溶液の抽出およびワークアップにより単分散のヘプタエチレングリコールモノメチルエーテル３０が得られた（収率８２〜８４％）。油；Ｒｆ  ０．４６（メタノール：クロロホルム＝３：２２）；ＭＳ  ｍ／ｚ  Ｃ１５Ｈ３２Ｏ８の計算値３４０．２１（Ｍ＋＋１）、実測値３４１．２。
【０２９０】
へプタエチレングリコールモノメチルエーテルの活性化
トリエチレングリコールモノメチルエーテルを活性化する本明細書中に記載された方法により、単分散ヘプタエチレングリコールモノメチルエーテル３０を活性化して、活性化されたヘプタエチレングリコールモノメチルエーテルを得た。
【実施例１０】
【０２９１】
活性化されたデカエチレングリコールモノメチルエーテル（３３）の合成
２０−メトキシ−１−（メチルスルホニル）オキシ−３，６，９，１２，１５，１８−ヘキサオキサエイコサン（３１）。単分散化合物３１は、２９について本明細書に記載したように、化合物３０およびメタンスルホニルクロリドから定量的収率で油として得られた；Ｒｆ  ０．４（酢酸エチル：アセトニトリル＝１：５）；ＭＳ  ｍ／ｚ  Ｃ１７Ｈ３７Ｏ１０に対する計算値４３３．２１（Ｍ＋＋１）、実測値４３３．４６９。
【０２９２】
デカエチレングリコールモノメチルエーテル（３２）
単分散化合物３２は、本明細書に記載した方法を使用して、化合物３１および単分散トリエチレングリコールから調製した。油：Ｒｆ  ０．４１（メタノール：クロロホルム＝６：１０）；ＭＳ  ｍ／ｚ  Ｃ２１Ｈ４４Ｏ１１に対する計算値４７２．２９（Ｍ＋＋１）、実測値４７２．２９。
【０２９３】
デカエチレングリコールモノメチルエーテルの活性化
トリエチレングリコールモノメチルエーテルを活性化する本明細書に記載された方法により、単分散デカエチレングリコールモノメチルエーテル３２を活性化して、活性化デカエチレングリコールモノメチルエーテル３３を得た。
【実施例１１】
【０２９４】
ＬｙｓＢ２９−オリゴマーをコンジュゲートしたインスリンの調製
組み換えプロインスリンＩのコンジュゲーション。組み換えプロインスリンＩ（分子量１０，６４２ダルトン）は、ブラジルのベロホリゾンテ所在のＢｉｏｂｒａｓ社から入手した。プロインスリンＩの２．３２×１０−３ｍｍｏｌ部分を１０ｍＬのＤＭＳＯ中に溶解させた。この溶液に３２４μＬのトリエチルアミンを添加した。結果として生じた溶液を５分間撹拌し、その後、アセトニトリル中の活性化メチルへプタエチレングリコール（（ＰＥＧ７）−ヘキシルオリゴマー）の溶液（９．３０×１０−３ｍｍｏｌ）を添加した。コンジュゲーション（アシル化）反応の進行はＨＰＬＣにより監視した。反応が完了したように見えたとき、３．５４ｍＬの５％トリフルオロ酢酸水溶液の添加により反応を停止させた。この反応混合液をその後処理し、ｐＨ７．６の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中へ移した。生成物の混合液であるオリゴマーをコンジュゲートした組み換えプロインスリンＩのＨＰＬＣプロファイルは図１１に示した。
【０２９５】
（ｂ）オリゴマーをコンジュゲートした組み換えプロインスリンＩの酵素反応混液による開裂
実施例１（ａ）からの生成物混合液のＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶液のアリコートをＨＰＬＣにより解析してポリペプチド濃度を決定した。トリプシンの溶液（ＴＰＣＫ処理；ウシ膵臓から）はｐＨ７．６の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中で調製した。カルボキシペプチダーゼＢの溶液（ブタ膵臓から）はｐＨ７．６の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中で調製した。実施例１１（ａ）からの生成物混合物（０．４２４μｍｏｌ／ｍＬ）はその後トリプシン（５．９７×１０−４μｍｏｌ／ｍＬ）およびカルボキシペプチダーゼＢ（１．９３×１０−４μｍｏｌ／ｍＬ）と反応させた。３０分後、この反応はアセトニトリル中の１％トリフルオロ酢酸１．５８ｍＬの添加により停止させた。主要生成物はＨＰＬＣ保持時間（既知の対照標準物質の保持時間に比較して）および質量スペクトル分析により同定した。インスリン（１０％）およびＬｙｓＢ２９−ヘキシル−ＰＥＧ７−オリゴマーをコンジュゲートしたインスリン（８４％）が、このようにして得られた（図１１〜１３）。
【実施例１２】
【０２９６】
組み換えプロインスリンＩのオリゴマーコンジュゲーション生成物の単離
逆相ＨＰＬＣを使用して、実施例１１（ａ）に記載したコンジュゲーション反応から得られた生成物混合物から主要生成物を単離した。ＨＰＬＣカラム（内径１．０ｃｍ×長さ２５ｃｍ）へ、ペプチドとタンパク質を分離するために有用であることが知られている市販のＣ１８固定相を充填し、その後ＨＰＬＣシステム内へ組み込んだ。このシステムを、５ｍＬ／ｍｉｎの流量で送達した７２％の移動相Ａ（０．１％トリフルオロ酢酸を含むＨ２Ｏ）および２８％の移動相Ｂ（０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル）を含む混合物である溶離緩衝液を用いて平衡化した。ｐＨ７．６の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中の生成物混合物の溶液を逆相カラムへ適用し、生成物を分離し、かつ以下のように溶離用緩衝液のアセトニトリル成分（移動相Ｂ）を増加させた勾配を使用して溶出した。
６０分間にわたり２８％〜３０％移動相Ｂ、その後
３０分間にわたり３０％〜３２％移動相Ｂ、その後
４０分間にわたり３２％〜３６％移動相Ｂ。
フラクションを収集し、ＨＰＬＣにより個別に分析して、その中に含まれる生成物を識別し、純度を決定した。その後、４種の生成物（モノコンジュゲート−Ａ（「プロインスリンＩモノコンジュゲート−Ａ」）、モノコンジュゲート−Ｂ（「プロインスリンＩモノコンジュゲート−Ｂ」）、ジコンジュゲート（「プロインスリンＩジコンジュゲート」）およびトリコンジュゲート（「プロインスリンＩトリコンジュゲート」）の１つを含有する共通フラクションをプールし、溶媒を回転蒸発により除去した。ＨＰＬＣ（図１４）および質量スペクトル分析を使用して、各単離物のアイデンティティおよび純度を決定した。
【実施例１３】
【０２９７】
組み換えプロインスリンの単離されたコンジュゲート（Ｉ）の酵素反応混液による開裂
実施例１２に記載した方法を使用して単離した各コンジュゲート（プロインスリンＩモノＡ、モノＢ、ジ、またはトリ）をｐＨ７．６の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中に溶解させ、分析用ＨＰＬＣを使用して結果として生じた溶液のポリペプチド濃度を決定した。トリプシンの溶液（ＴＰＣＫ処理；ウシ膵臓から）は、ｐＨ７．６の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中で調製した。カルボキシペプチダーゼＢの溶液（ブタ膵臓から）はｐＨ７．６の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中で調製した。粗混合物（１ｍｍｏｌ）は、その後トリプシン（１．３９×１０−３ｍｍｏｌ）およびカルボキシペプチダーゼＢ（４．５６×１０−４ｍｍｏｌ）と反応させた。３０分後、この反応はアセトニトリル中の１％トリフルオロ酢酸の添加により停止させた。各反応からの生成物混合液を処理し、ＨＰＬＣによって分析した。対照標準物質の保持時間に比較したＨＰＬＣ保持時間および質量スペクトル分析を使用して、各生成物のアイデンティティおよび純度を決定した（表１）。
【０２９８】
【表１】
0004602968.tif 000036
【実施例１４】
【０２９９】
プロインスリンＩの単離されたコンジュゲートのトリプシンによる開裂
実施例１２に記載した方法を使用して単離した各コンジュゲート（プロインスリンＩモノＡ、モノＢ、ジ、またはトリ）をｐＨ７．６の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中に溶解させ、結果として生じた溶液をＨＰＬＣにより解析してポリペプチド濃度を決定した。トリプシンの溶液（ＴＰＣＫ処理；ウシ膵臓から）はｐＨ７．６の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中で調製した。各コンジュゲート（３００ｍｍｏｌ）は、その後トリプシン（１ｍｍｏｌ）と反応させた。２０分後、この反応はアセトニトリル中の１％トリフルオロ酢酸の添加により停止させた。この反応の生成物を単離し、ＨＰＬＣ保持時間および質量スペクトル分析によって分析してアイデンティティを決定した。予測される生成物は表２に示すインスリン（Ａｒｇ３１）またはＬｙｓＢ２９−ヘキシル−ＰＥＧ７−オリゴマーをコンジュゲートしたインスリン（Ａｒｇ３１）である。
【０３００】
【表２】
0004602968.tif 000037
【実施例１５】
【０３０１】
トリプシン開裂生成物混合物のカルボキシペプチダーゼＢ開裂
ｐＨ７．６の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中のＬｙｓＢ２９−ヘキシル−ＰＥＧ７−オリゴマーをコンジュゲートしたインスリン（Ａｒｇ３１）（３００ｍｍｏｌ）（実施例１４から）を含有する反応混合液のアリコートを除去した。カルボキシペプチダーゼＢの溶液（ブタ膵臓から）はｐＨ７．６の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中で調製した。カルボキシペプチダーゼＢ（１ｍｍｏｌ）をこの反応混合液に添加した。この反応を１５時間持続させ、その後、アセトニトリル中の１％トリフルオロ酢酸の添加により停止させた。各反応の予測生成物は表３に示す。
【０３０２】
【表３】
0004602968.tif 000038
【実施例１６】
【０３０３】
ＬｙｓＢ２９−オリゴマーをコンジュゲートしたインスリンの調製
（ａ）組み換えプロインスリンＩＩのコンジュゲーション。組み換えプロインスリンＩＩ（分子量１１，１３３ダルトン）は日本の茨城県所在の伊藤ハム食品社から入手した。組み換えプロインスリンＩＩは、各々にリジン残基が欠けているリーダーペプチドおよびＣ−ペプチドを有していた。組み換えプロインスリンＩＩの２．５５×１０−３ｍｍｏｌ部分を１０ｍＬのＤＭＳＯ中に溶解させた。この溶液に３５５μＬのトリエチルアミンを添加した。結果として生じた溶液を５分間撹拌し、その後、アセトニトリル中の活性化メチルポリエチレングリコール（（ＰＥＧｎ）−ヘキシルオリゴマー）（ｎ＝７±３またはｎ＝７）の溶液（５．１０×１０−３ｍｍｏｌ）を添加した。反応の進行はＨＰＬＣにより監視した。反応が完了したように見えた後、３．７ｍＬの５％トリフルオロ酢酸水溶液の添加により反応を停止させた。この反応混合液をその後処理し、ｐＨ７．６の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中へ移した。オリゴマーをコンジュゲートした組み換えプロインスリンＩＩ生成物混合物のＨＰＬＣプロファイルは図２に示した。
【０３０４】
（ｂ）オリゴマーをコンジュゲートした組み換えプロインスリンＩＩの酵素反応混液による開裂
実施例１６（ａ）からの生成物混合液のＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶液をＨＰＬＣにより解析してポリペプチド濃度を決定した。トリプシンの溶液（ＴＰＣＫ処理；ウシ膵臓から）はｐＨ７．６の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中で調製した。カルボキシペプチダーゼＢの溶液（ブタ膵臓から）はｐＨ７．６の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中で調製した。生成物混合物（０．３９９μｍｏｌ／ｍＬ）はトリプシン（５．５７×１０−４μｍｏｌ／ｍＬ）およびカルボキシペプチダーゼＢ（１．８２×１０−４μｍｏｌ／ｍＬ）と反応させた。３０分後、この反応はアセトニトリル中の１％トリフルオロ酢酸５５０μＬの添加により停止させた。主要生成物はＨＰＬＣ保持時間（既知の対照標準物質の保持時間に比較して）および質量スペクトル分析により同定した。こうしてインスリン（２３％）およびＬｙｓＢ２９−ヘキシル−ＰＥＧｎ−オリゴマーをコンジュゲートしたインスリン（６０％）およびその他（１７％）が得られた（図９〜１０）。
【実施例１７】
【０３０５】
組み換えプロインスリンＩＩのオリゴマーコンジュゲーションの生成物の単離
実施例１６（ａ）に記載したコンジュゲーション反応からの各主要生成物は逆相ＨＰＬＣを使用して単離した。ポリペプチドとタンパク質を分離するために有用であることが知られている市販のＣ１８固定相をカラム（内径１．０ｃｍ×長さ２５ｃｍ）に充填し、その後、ＨＰＬＣシステム内へ組み込んだ。このシステムを、５ｍＬ／ｍｉｎの流量で送達した７５％移動相Ａ（０．１％のトリフルオロ酢酸を含むＨ２Ｏ）および２５％移動相Ｂ（０．１％のトリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル）の混合物である溶離緩衝液を用いて平衡化した。実施例１６（ａ）からの生成物混合物のＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶液をカラムに適用し、主要生成物を分離し、溶離緩衝液の組成が２５％移動相Ｂから３５％移動相Ｂまで１２０分間にわたり変更された勾配溶離を使用して溶出した。収集したフラクションをＨＰＬＣにより個別に分析して、その中に含まれる生成物のアイデンティティおよび純度を決定した。次いで、各生成物の共通フラクション（プロインスリンＩＩモノコンジュゲート（「プロインスリンＩＩモノ」）およびジコンジュゲート（「プロインスリンＩＩジ」）をプールし、回転蒸発により溶媒を除去した。各生成物のアイデンティティおよび純度はＨＰＬＣおよび質量スペクトル分析によって決定した（図２〜４）。
【実施例１８】
【０３０６】
組み換えプロインスリンＩＩの単離されたコンジュゲートの酵素反応混液による開裂
実施例１７に記載した方法を使用して単離した各プロインスリンＩＩコンジュゲート（プロインスリンＩＩモノ、ジ、またはトリ）をｐＨ７．６の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中に溶解させ、その溶液のアリコートをＨＰＬＣにより解析してその中のポリペプチド濃度を決定した。トリプシンの溶液（ＴＰＣＫ処理；ウシ膵臓から）は、ｐＨ７．６の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中で調製した。カルボキシペプチダーゼＢの溶液（ブタ膵臓から）はｐＨ７．６の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中で調製した。コンジュゲート（０．１２７μｍｏｌ／ｍＬ）はトリプシン（１．７７×１０−４μｍｏｌ／ｍＬ）およびカルボキシペプチダーゼＢ（５．７７×１０−５μｍｏｌ／ｍＬ）と反応させた。３０分後、この反応はアセトニトリル中の１％トリフルオロ酢酸２５０μＬの添加により停止させた。主要生成物の単離およびその後の対照標準物質に対するＨＰＬＣ保持時間および質量スペクトル分析による同定によれば、インスリンまたはＢ−２９アシル化インスリン−ヘキシル−ＰＥＧ７が反応において産生したことがわかった。各反応の生成物および収率は表４に示す。
【０３０７】
【表４】
0004602968.tif 000039
【実施例１９】
【０３０８】
プロインスリンＩＩの単離されたコンジュゲートのトリプシン開裂
実施例１７からの各コンジュゲート（プロインスリンＩＩモノ、ジ、またはトリ）をｐＨ７．６の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中に溶解させ、結果として生じた溶液をＨＰＬＣにより解析してその中のポリペプチド濃度を決定した。トリプシンの溶液（ＴＰＣＫ処理；ウシ膵臓から）は、ｐＨ７．６の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中で調製した。各コンジュゲート（０．１２７μｍｏｌ／ｍＬ）はその後トリプシン（４．２３×１０−４μｍｏｌ／ｍＬ）と反応させた。２０分後、この反応はアセトニトリル中の１％トリフルオロ酢酸２５０μＬの添加により停止させた。主要生成物の単離及びその後のＨＰＬＣ保持時間および質量スペクトル分析による同定から、インスリン（Ａｒｇ３１）またはＬｙｓＢ２９−ヘキシル−ＰＥＧ−オリゴマーをコンジュゲートしたインスリン（Ａｒｇ３１）が反応において産生したことがわかった。各反応の生成物および収率は表５に示す。
【０３０９】
【表５】
0004602968.tif 000040
【実施例２０】
【０３１０】
トリプシン開裂混合物のカルボキシペプチダーゼＢによる開裂
実施例１９からのＬｙｓＢ２９−ヘキシル−ＰＥＧ７−オリゴマーをコンジュゲートしたインスリン（Ａｒｇ３１）（３．１０×１０−５ｍｍｏｌ）の反応混合液のアリコートを除去した。カルボキシペプチダーゼＢの溶液（ブタ膵臓から）は、ｐＨ７．６の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中で調製した。カルボキシペプチダーゼＢ（１．０３×１０−７）をこの反応混合液に添加した。この反応を１５時間持続させ、その後、アセトニトリル中の１％トリフルオロ酢酸の添加により停止させた。処理後、反応の生成物をＨＰＬＣによって分析した。アイデンティティを決定するためには保持時間および質量スペクトル分析を使用した。プロインスリンＩＩモノコンジュゲートの反応からインスリン（２３％）およびＬｙｓＢ２９−ヘキシル−ＰＥＧｎ−オリゴマーをコンジュゲートしたインスリン（６０％）（図５、７〜８）を得た。プロインスリンＩＩジコンジュゲート反応の予測生成物は表６に示す。
【０３１１】
【表６】
0004602968.tif 000041
【実施例２１】
【０３１２】
ＬｙｓＢ２９−オリゴマーをコンジュゲートしたインスリンの調製
（ａ）天然ヒトプロインスリンのコンジュゲーション。天然ヒトプロインスリン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社）（３．２０×１０−４ｍｍｏｌ）を５ｍＬのＤＭＳＯに溶解させた。この溶液に４５μＬのトリエチルアミンを添加した。この溶液を５分間撹拌し、その後アセトニトリル中の活性化ＰＥＧ７−ヘキシルオリゴマー（６．４×１０−４ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。プロインスリンが消費される（またはプロインスリンの濃度がもはや減少しない）ことをＨＰＬＣ解析が示すように反応が進行した後、この反応は０．５ｍＬの５％トリフルオロ酢酸水溶液の添加により停止させた。この反応混合液をその後処理し、ｐＨ７．６の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中へ移した。
【０３１３】
（ｂ）オリゴマーをコンジュゲートした天然プロインスリンの酵素反応混液による開裂実施例２１（ａ）からの生成物混合液のＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶液のアリコートをＨＰＬＣにより解析してその中のポリペプチド濃度を決定した。トリプシンの溶液（ＴＰＣＫ処理；ウシ膵臓から）はｐＨ７．６の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中で調製した。カルボキシペプチダーゼＢの溶液（ブタ膵臓から）はｐＨ７．６の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中で調製した。粗混合物（１モル等量）は、その後トリプシン（１．３９×１０−３ｍｍｏｌ等量）およびカルボキシペプチダーゼＢ（４．５６×１０−４モル等量）と反応させた。３０分後、この反応はアセトニトリル中の１％トリフルオロ酢酸の添加により停止させた。この反応の生成物混合液を処理し、ＨＰＬＣによって分析した。アイデンティティを決定するためには保持時間（対照標準物質に対して）および質量スペクトル分析を使用した。反応の予測生成物はインスリンおよびＬｙｓＢ２９−ヘキシル−ＰＥＧ７−オリゴマーをコンジュゲートしたインスリンである。
【実施例２２】
【０３１４】
天然ヒトプロインスリンのコンジュゲーションの生成物の単離
実施例２１（ａ）に記載したコンジュゲーション反応から入手した各主要生成物は逆相ＨＰＬＣを使用して単離した。カラム（内径１．０ｃｍ×長さ２５ｃｍ）へポリペプチドとタンパク質を分離するために有用であることが知られている市販のＣ１８固定相を充填し、その後ＨＰＬＣシステム内へ組み込んだ。このシステムを、７５％移動相Ａ（０．１％トリフルオロ酢酸を含むＨ２Ｏ）および２５％移動相Ｂ（０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル）の混合物を含む溶離緩衝液を用いて平衡化した。実施例２１（ａ）からの生成物混合物のＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶液をカラムに適用し、主要生成物を分離し、アセトニトリルのパーセンテージを１２０分間にわたり２５％〜３５％へ変更させられた勾配溶離液を使用して溶出した。フラクションを収集し、ＨＰＬＣにより分析して、その中に含まれる生成物のアイデンティティおよび純度を決定した。各生成物の共通フラクションをプールし、そして回転蒸発により溶媒を除去した。各生成物ピークのアイデンティティおよび純度はＨＰＬＣおよび質量分析法によって決定した。予測生成物は、２つのヒトプロインスリンモノコンジュゲート（Ｌｙｓ２９又はＬｙｓ６４）、１つのヒトプロインスリンジコンジュゲート（ＬｙｓＢ２９，Ｌｙｓ６４）および１つのヒトプロインスリントリコンジュゲート（ＰｈｅＢ１，ＬｙｓＢ２９，Ｌｙｓ６４）からなる。例２１の修飾コンジュゲーション条件を使用して、３つのヒトプロインスリンモノコンジュゲート（ＰｈｅＢ１又はＬｙｓ２９又はＬｙｓ６４）が得られる。
【実施例２３】
【０３１５】
単離された天然ヒトプロインスリンのコンジュゲートの酵素反応混液による開裂
実施例２２に記載した方法を使用して入手した各コンジュゲートをｐＨ７．６の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中に溶解させ、結果として生じた溶液をＨＰＬＣにより解析してその中のポリペプチド濃度を決定した。トリプシンの溶液（ＴＰＣＫ処理；ウシ膵臓から）は、ｐＨ７．６の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中で調製した。カルボキシペプチダーゼＢの溶液（ブタ膵臓から）はｐＨ７．６の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中で調製した。粗混合物（１モル等量）はその後トリプシン（１．３９×１０−３モル等量）およびカルボキシペプチダーゼＢ（４．５６×１０−４モル等量）と反応させた。３０分後、この反応をアセトニトリル中の１％トリフルオロ酢酸の添加により停止させた。これらの生成物を処理し、ＨＰＬＣにより解析した。アイデンティティを決定するためには保持時間（対照標準物質に対して）および質量スペクトル分析を使用した。反応の予測生成物はインスリンまたはＬｙｓＢ２９−ヘキシル−ＰＥＧ７−オリゴマーをコンジュゲートしたインスリンまたはＬｙｓＢ２９もしくはＰｈｅＢ１−ジ［ヘキシル−ＰＥＧ７−オリゴマー］をコンジュゲートしたインスリンまたはＬｙｓ６４−ヘキシル−ＰＥＧ７−オリゴマーをコンジュゲートしたＣ−ペプチドまたはＰｈｅＢ１−ヘキシル−ＰＥＧ７−オリゴマーをコンジュゲートしたインスリンもしくはＬｙｓＢ２９もしくはＣ−ペプチドである。
【実施例２４】
【０３１６】
単離された天然ヒトプロインスリンのコンジュゲートのトリプシン開裂
実施例２２に記載のようにして入手した各コンジュゲートをｐＨ７．６の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中に溶解させ、結果として生じた溶液をＨＰＬＣにより解析してその中のポリペプチド濃度を決定した。トリプシンの溶液（ＴＰＣＫ処理；ウシ膵臓から）はｐＨ７．６の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中で調製した。コンジュゲート（３００モル等量）はその後トリプシン（１モル等量）と反応させた。２０分後、この反応はアセトニトリル中の１％トリフルオロ酢酸の添加により停止させた。これらの生成物を処理し、ＨＰＬＣにより解析した。アイデンティティを決定するためには保持時間および質量スペクトル分析を使用した。この反応の予測生成物はインスリン（Ａｒｇ３１）またはｄｅｓ  Ｔｈｒ−インスリンまたはＬｙｓＢ２９−ヘキシル−ＰＥＧ７−オリゴマーをコンジュゲートしたインスリン（Ａｒｇ３１）またはＬｙｓＢ２９，ＰｈｅＢ１−ジ［ヘキシル−ＰＥＧ７−オリゴマー］をコンジュゲートしたインスリン−Ａｒｇ３１またはＰｈｅＢ１−ヘキシル−ＰＥＧ７−オリゴマーをコンジュゲートしたインスリン−Ａｒｇ３１またはＬｙｓ６４−ヘキシル−ＰＥＧ７−オリゴマーをコンジュゲートしたＣ−ペプチドまたはＣ−ペプチドＡｒｇである。
【実施例２５】
【０３１７】
トリプシン開裂混合物のカルボキシペプチダーゼＢ開裂
実施例２４からの各コンジュゲート（３００ｍｍｏｌ）のトリプシン反応混合液のアリコートを除去した。カルボキシペプチダーゼＢの溶液（ブタ膵臓から）はｐＨ７．６の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中で調製した。カルボキシペプチダーゼＢ（１ｍｍｏｌ）をこの反応混合液に添加した。この反応を１５時間持続させ、その後、アセトニトリル中の１％トリフルオロ酢酸の添加により停止させた。これらの生成物を処理し、ＨＰＬＣにより解析した。アイデンティティを決定するためには保持時間および質量スペクトル分析を使用した。予測生成物はインスリンまたはｄｅｓ  Ｔｈｒ−インスリンまたはＬｙｓＢ２９−ヘキシル−ＰＥＧ７−オリゴマーをコンジュゲートしたインスリンまたはＰｈｅＢ１−ヘキシル−ＰＥＧ７−オリゴマーをコンジュゲートしたインスリンまたはＬｙｓＢ２９，ＰｈｅＢ１−ジ［ヘキシル−ＰＥＧ７−オリゴマー］をコンジュゲートしたインスリンまたはＬｙｓ６４−ヘキシル−ＰＥＧ７−オリゴマーをコンジュゲートしたＣ−ペプチドまたはＣ−ペプチドである。
【実施例２６】
【０３１８】
ＬｙｓＢ２９−オリゴマーをコンジュゲートしたインスリンの最適化された調製
実施例１１からの実験データの分析は、ＬｙｓＢ２９−ヘキシル−ＰＥＧ７−オリゴマーをコンジュゲートしたインスリンおよびＬｙｓ−ヘキシル−ＰＥＧ７−オリゴマーをコンジュゲートしたＣ−ペプチドは（ａ）プロインスリン原料上に存在する全リジン残基のε−アミノ基をアシル化するステップと、（ｂ）結果として生じる完全なオリゴマーをコンジュゲートしたプロインスリンをトリプシンおよびカルボキシペプチダーゼＢから作製した酵素反応混液を用いて開裂させるステップと、によって高い収率および高純度で入手できることを示した。この仮説の実験による確証は下記の通りにして得られた。
【０３１９】
（ａ）組み換えプロインスリンＩのコンジュゲーション
組み換えプロインスリンＩ（分子量１０，６４２ダルトン）はブラジルのベロホリゾンテ所在のＢｉｏｂｒａｓ社から入手した。プロインスリンＩの２．３２×１０−３ｍｍｏｌ部分を１０ｍＬのＤＭＳＯ中に溶解させた。この溶液に３２４μＬのトリエチルアミンを添加した。結果として生じた溶液を５分間撹拌し、その後アセトニトリル中の活性化メチルへプタエチレングリコール（（ＰＥＧ７）−ヘキシルオリゴマー）（４〜６モル等量；全プロインスリンＩをトリコンジュゲートへ転換させるために十分な量）の溶液を添加した。コンジュゲーション（アシル化）反応の進行はＨＰＬＣにより監視した。反応が完了したように見えたとき（すなわちアンコンジュゲートのプロインスリンＩがＨＰＬＣにより観察されない）、３．５４ｍＬの５％トリフルオロ酢酸水溶液の添加により反応を停止させた。この反応混合液をその後処理し、ｐＨ７．６の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中へ移した。生成物混合液であるオリゴマーをコンジュゲートした組み換えプロインスリンＩのＨＰＬＣプロファイルはトリコンジュゲート（コンジュゲートした全ＬｙｓおよびＮ末端）およびジコンジュゲートだけに対応するピークを示すと予想される。
【０３２０】
（ｂ）オリゴマーをコンジュゲートした組み換えプロインスリンＩの酵素反応混液による開裂
実施例１６（ａ）からの生成物混合液のＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶液のアリコートをＨＰＬＣにより解析してポリペプチド濃度を決定した。トリプシンの溶液（ＴＰＣＫ処理；ウシ膵臓から）はｐＨ７．６の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中で調製した。カルボキシペプチダーゼＢの溶液（ブタ膵臓から）はｐＨ７．６の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中で調製した。実施例１６（ａ）からの生成物混合物（０．４２４μｍｏｌ／ｍＬ）はその後トリプシン（５．９７×１０−４μｍｏｌ／ｍＬ）およびカルボキシペプチダーゼＢ（１．９３×１０−４μｍｏｌ／ｍＬ）と反応させた。３０分後、この反応はアセトニトリル中の１．５８ｍＬの１％トリフルオロ酢酸の添加により停止させた。主要生成物はＨＰＬＣ保持時間（既知の参照標準物質の保持時間に比較して）および質量スペクトル分析により同定した。存在する唯一のインスリンコンジュゲートであるＬｙｓＢ２９−ヘキシル−ＰＥＧ７−オリゴマーをコンジュゲートしたインスリンは、ほぼ９５％収率で入手されると予測される。Ｌｙｓ１−ヘキシル−ＰＥＧ７−オリゴマーをコンジュゲートしたＣ−ペプチドもまた、近い量的収率で入手した。
【実施例２７】
【０３２１】
ＬｙｓＢ２９−オリゴマーをコンジュゲートしたインスリン−２０ｇスケール−アップの調製
（ａ）組換えプロインスリンＩのコンジュゲーション
組換えプロインスリンＩ（ＭＷ  １０，６４２  Ｄａｌｔｏｎ）は、Ｂｅｌｏ  Ｈｏｒｉｚｏｎｔｅ、ブラジルのＢｉｏｂｒａｓ社から入手した。プロインスリンＩの２０ｇ（１．８５  ｍｍｏｌ）部分を５０  ｍＭホウ酸の５４０  ｍＬに溶解した。４Ｎ水酸化ナトリウム溶液で溶液をｐＨ９．３にし、１２０  ｍＬのエタノールに添加し、水酸化ナトリウムでｐＨ１０．２に調節した。上記の撹拌溶液に、１４  ｍＬエタノール中の活性化メチルヘプタエチレングリコール（（ＰＥＧ７）−ヘキシルオリゴマー）（４×１．８５  ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。コンジュゲーション（アシル化）反応の経過はＨＰＬＣによってモニターし、４Ｎ水酸化ナトリウムを使用して、ｐＨをｐＨ  １０．２に維持した。２０分後反応が完了したと思われたら、４Ｎ塩酸をｐＨ  ６．８まで添加することによって反応を停止させた。次いで、反応混合物を処理し、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社のＰｅｌｌｉｃｏｎ  ＩＩシステムを使用したダイアフィルトレーションによって１００  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ  ７．６中で交換した。生成物混合物のＨＰＬＣプロファイルは、組換えプロインスリンＩのジおよびトリオリゴマーコンジュゲートが＞８０％であることを示した。
【０３２２】
（ｂ）オリゴマーをコンジュゲートした組換えプロインスリンＩの酵素反応混液による切断
生成物混合物のＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶液のアリコートをＨＰＬＣで分析して、ポリペプチド濃度を決定し、１５ｍｇ／ｍｌインスリン当量に希釈した。トリプシン溶液（ＴＰＣＫ処理；ウシ膵臓由来）を１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．６で調製した。カルボキシペプチダーゼＢ溶液（ブタ膵臓由来）を１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．６で調製した。次いで、１５℃において、生成物混合物（２．６４  ｍｍｏｌ）をトリプシン（３．６８×１０−３  ｍｍｏｌ）およびカルボキシペプチダーゼＢ（１．２０×１０−３  ｍｍｏｌ）と反応させた。５５分後、４Ｎの塩酸をｐＨ〜３まで添加することによって反応を停止させた。主要な生成物をＨＰＬＣの保持時間（既知の対照標準物質の保持時間と比較）および質量スペクトル分析によって同定した。このようにしてＬｙｓＢ２９−ヘキシル−ＰＥＧ７−オリゴマーをコンジュゲートしたインスリン（８０％）およびインスリン（７％）が得られた。Ｌｙｓ６４−ヘキシル−ＰＥＧ７−オリゴマーをコンジュゲートしたＣ−ペプチドは、プロインスリンＩのコンジュゲートのＣ−ペプチド部分由来の主要な副産物として得られた。
【０３２３】
（ｃ）組換えプロインスリンＩのオリゴマー−コンジュゲーションの酵素反応混液による切断生成物の単離
逆相ＨＰＬＣを使用して、コンジュゲーション反応から得られる生成物の混合物から主要な生成物を単離した。ＨＰＬＣカラム（内径１０ｃｍ×長さ２５ｃｍ）に、ペプチドおよびタンパク質の分離に有用であることが既知の市販のＣ１８固定相を充填し、次いでＨＰＬＣシステムに組み込んだ。８０％移動相Ａ（１０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液）および２０％移動相Ｂ（アセトニトリル）を含む混合物である溶離緩衝液を１２０ｍＬ／分の流速で送達してシステムを平衡させた。生成物混合物の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．６溶液を逆相カラムに適用し、溶離緩衝液（移動相Ｂ）のアセトニトリル成分を以下のように増加する勾配を使用して生成物を分離し、溶出した：
３０分間にわたり、２０％〜２７％移動相Ｂ、次いで
３０分間にわたり、２７％〜２９％移動相Ｂ、次いで
１２分間にわたり、２９％〜３２％移動相Ｂ、次いで
６分間にわたり、３２％〜３５％移動相Ｂ、次いで
１３分間にわたり、３５％〜４５％移動相Ｂ、。
【０３２４】
分画を回収し、ＨＰＬＣによって個別に分析して、含有される生成物のアイデンティティおよび純度を求めた。次いで、３つの生成物（ＬｙｓＢ２９−ヘキシル−ＰＥＧ７−オリゴマーをコンジュゲートしたインスリン（「ＰＥＧ７  ＨＩＭ２」）、インスリン（「インスリン」）およびＬｙｓ６４−ヘキシル−ＰＥＧ７−オリゴマーをコンジュゲートしたＣ−ペプチド（「ＰＥＧ７  Ｌｙｓ−Ｃ−ペプチド」）の１つを含有する共通の分画をプールし、各プールを水で１０％アセトニトリルに希釈し、次いで処理し、１０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液、ｐＨ  ７．４で交換し、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社のＰｅｌｌｉｃｏｎ  ＩＩシステムを使用するダイアフィルトレーションによって濃縮した。ＰＥＧ７  ＨＩＭ２およびＰＥＧ７−Ｌｙｓ  Ｃ−ペプチドの濃縮溶液をトレイ凍結乾燥機で凍結乾燥して、ＰＥＧ７  ＨＩＭ２（４．８６ｇインスリン当量）およびＰＥＧ７−ＬｙｓＣ−ペプチド（３．７ｇ）の白色粉末を得た。ＨＰＬＣおよび質量スペクトル分析を使用して、各単離物のアイデンティティおよび純度を求めた。ＰＥＧ７  ＨＩＭ２の凍結乾燥物質試料をさらに追加の試験、ペプチドマッピングおよび生物作用能（マウス血中グルコースアッセイ（ＭＢＧＡ）による）によって特徴付けて、ＵＳＰインスリンを使用するコンジュゲーションによって得られたＵＳＰインスリンおよびＰＥＧ７  ＨＩＭ２と比較した。
【実施例２８】
【０３２５】
インスリンから製造したＰＥＧ７  ＨＩＭ２に対するプロインスリンから製造したインスリンＰＥＧ７  ＨＩＭ２のＬｙｓＢ２９−ＰＥＧ７−ヘキシル−オリゴマーコンジュゲートのペプチドマッピング、化学的および効力比較
Ａ．ペプチドマッピング方法：
エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ（黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）Ｖ８プロテアーゼ）消化によるペプチドマッピング：
使用する手法は、ヒトインスリンのＵＳＰモノグラフに記載されている方法に基づいている。
試料調製：
〜０．５ｍｇ／ｍＬの濃度のインスリンおよびインスリンコンジュゲート溶液は、希釈剤として１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液を使用して調製した。溶液は、ＨＰＬＣにより、インスリンおよびＰＥＧ７  ＨＩＭ２を分析するためのＨＰＬＣ方法を使用して、インスリン標準品に対する濃度を決定した。溶液を＋５℃で保存した。２ｍｇ／ｍＬの濃度のエンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ（黄色ブドウ球菌Ｖ８由来）溶液を水で調製した。
【０３２６】
試験アッセイ：
０．３７５ｍＬのタンパク質溶液をバイアルに入れ、３０μＬのエンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ溶液を添加し、バイアルを閉じて密閉し、次いで２５℃で約４時間インキュベーションした（振とう水浴）。２．０Ｍ硫酸アンモニウム／０．５Ｍ硫酸の５０：５０（ｖ／ｖ）溶液４０５μＬをバイアルに添加して反応を停止させた。試料を凍結した。
【０３２７】
分析：
ＰＥＧ７  ＨＩＭ２およびインスリンを分析するために、ストック試料をＨＰＬＣ方法によって分析した。消化試料全てをＶ８ＭＡＰ１  ＨＰＬＣ方法（以下）によって分析した。
カラム：Ｗａｔｅｒｓ  ＤｅｌｔａＰａｋ  Ｃ１８カラム、長さ１５０ｍｍ×内径３．９ｍｍ；粒子サイズ５μm、孔径３００Å固定相
カラム温度：＋４０℃
検出波長：２２０ｍｍ
移動相Ａ：０．１％ＴＦＡを含有する１０％（ｖ／ｖ）メタノール水溶液
移動相Ｂ：０．１％ＴＦＡを含有する１０％（ｖ／ｖ）メタノールのアセトニトリル溶液
流速：１ｍＬ／分。
濃度勾配：  
【表７】
0004602968.tif 000042
【０３２８】
【表８】
0004602968.tif 000043
表７の注記
注記１：フラグメント３’は、ヒトインスリンのフラグメント３とは異なるＰＥＧ７  ＨＩＭ２のペプチドマップにおいて観察されるピークをいう。
注記２：ＨＰＬＣクロマトグラムは、このフラグメントの異なる保持時間を示しており、フラグメントがヘキシル−オリゴマーによって修飾されていることを示唆している。１５５４原子質量単位（ａｍｕ）のｍ／ｚ（「質量」）を有する擬分子イオンを示す質量スペクトルにより、このフラグメントの構造が［Ｂ２２−Ｂ３０＋単一分子量ヘキシル−オリゴマー］であると確認する。
注記３：ＨＰＬＣクロマトグラムは、このフラグメントの異なる保持時間を示しており、フラグメントがヘキシル−オリゴマーで修飾されていることを示唆している。１５５４のｍ／ｚを有するイオンを示す質量スペクトルは、このフラグメントの構造が［Ｂ２２−Ｂ３０＋単一分子量ヘキシル−オリゴマー］であると裏付けている。
【０３２９】
図１７ａおよび１７ｂは、インスリンのＬｙｓＢ２９−ＰＥＧ７−ヘキシル−オリゴマーコンジュゲート（ＰＥＧ７  ＨＩＭ２）のＧｌｕ−Ｃペプチダーゼ（ＶＸプロテアーゼ）消化のＨＰＬＣプロファイルを示す。「ｕｎｋ」と同定されているピークは、酵素消化条件下で形成される少量の副産物と思われる未知のフラグメントである。未同定のフラグメントもＨＩＭ２のクロマトグラム中に存在するが、名称をつけて同定していない。
【０３３０】
【表９】
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【０３３１】
Ｃ．生物作用能方法：ＭＢＧＡ
拡張マウス血中グルコースアッセイ（ＭＢＧＡ）
５匹の雄ＣＦ−１マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；２５−３０ｇ）からなる６つの対投与群にインスリンコンジュゲート（被検物質）または組換えヒトインスリンのどちらかを皮下注射した。被検物質は脱イオン水でもどして、１００、６６．６、４３．３、３０、２０および１３．３オｇ／ｋｇを投与した。インスリンは脱イオン水でもどして、５０、３３．３、２１．７、１５、１０および６．７オｇ／ｋｇを投与した。大腿および鼠径部に形成したポケットに皮下投与後、動物をケージに戻して室温において３０分間おき、次いで迅速に麻酔して、末端で出血させた。血液試料はヘパリン管に採取し、グルコースアッセイに使用した。グルコースアッセイをすぐに実施しない場合には、管を氷水中に保存し、アッセイの前に室温に加温した。
【０３３２】
血漿グルコースはグルコメーター（例えば、Ｏｎｅ  Ｔｏｕｃｈ（登録商標）Ｂａｓｉｃ；Ｌｉｆｅｓｃａｎ）で測定し、グルコメーターは、製造業者の取扱説明書により各使用日の最初に較正した。次いで、組換えヒトインスリン応答について作製した標準曲線と比較してインスリンコンジュゲートの効力を算出した。算出は、組換えヒトインスリンは２７．４ＩＵ／ｍｇの効力であるという仮定に基づいた。
【０３３３】
図１８ａ＆ｂおよび１９ａ＆ｂは、インスリンおよびＰＥＧ７  ＨＩＭ２インスリンのＭＢＧＡ生物作用能プロファイルを示す。
【表１０】
0004602968.tif 000045
【実施例２９】
【０３３４】
実施例２１に記載するようにして、ＬｙｓＢ２９−オリゴマーをコンジュゲートしたインスリンおよびＬｙｓＢ２９，ＰｈｅＢ１−ジ（オリゴマー）をコンジュゲートしたインスリンの調製
（ａ）天然ヒトプロインスリンのコンジュゲーション
天然ヒトプロインスリン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ）（３．２０  ｘ  １０−４  ｍｍｏｌ）を５ｍＬのＤＭＳＯに溶解した。この溶液に４５μＬのトリエチルアミンを添加した。この溶液を５分間撹拌してから、活性化ＰＥＧ７−ヘキシルオリゴマー（６．４  ｘ  １０−４  ｍｍｏｌのアセトニトリル溶液を添加した。反応が進行して、プロインスリンが消費された（またはプロインスリンの濃度が低下しなくなった）ことをＨＰＬＣ分析が示したら、５％トリフルオロ酢酸水溶液０．５ｍＬを添加して反応を停止させた。次いで、反応混合物を処理して、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  緩衝液、ｐＨ  ７．６中へ移した。
【０３３５】
（ｂ）オリゴマーをコンジュゲートした天然プロインスリンの酵素反応混液による切断
生成物混合物のＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶液のアリコートをＨＰＬＣで分析して、その中のポリペプチド濃度を測定した。トリプシン溶液（ＴＰＣＫ処理；ウシ膵臓由来）を１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ  ７．６で調製した。カルボキシペプチダーゼＢ（ブタ膵臓由来）溶液を１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ  ７．６で調製した。次いで、粗混合物（１ｍｏｌ当量）をトリプシン（１．３９  ｘ  １０  −３  ｍｏｌ当量）およびカルボキシペプチダーゼＢ（４．５６  ｘ  １０−４  ｍｏｌ当量）と反応させた。３０分後、１％トリフルオロ酢酸のアセトニトリル溶液を添加して反応を停止させた。反応の生成物混合物を処理して、ＨＰＬＣで分析した。保持時間（対照標準物質の保持時間に対して）および質量スペクトル分析を使用して、アイデンティティを判定した。反応生成物および予測される反応生成物は、インスリン、ＬｙｓＢ２９−ヘキシル−ＰＥＧ７−オリゴマーをコンジュゲートしたインスリン、ＰｈｅＢ１,ＬｙｓＢ２９  ジ（ヘキシル−ＰＥＧ７−オリゴマー）をコンジュゲートしたインスリンおよびＬｙｓ−ヘキシル−ＰＥＧ７−オリゴマーＣ−ペプチドであった（表８）。
【０３３６】
【表１１】
0004602968.tif 000046
【実施例３０】
【０３３７】
単分散型ＬｙｓＢ２９−オリゴマーをコンジュゲートしたインスリンの作製
（ａ）組換えプロインスリンＩＩのコンジュゲーション
組換えプロインスリンＩＩ（ＭＷ  １１，１３３  Ｄａｌｔｏｎｓ）は、日本の茨城県所在の伊藤ハム食品社から入手した。組換えプロインスリンＩＩは、各々リジン残基を欠損しているリーダーペプチドおよびＣ−ペプチドを有した。組換えプロインスリンＩＩの２．５５  ｘ  １０−３  ｍｍｏｌ部分を１０ｍＬのＤＭＳＯに溶解した。この溶液に３５５μＬのトリエチルアミンを添加した。生じた溶液を５分間撹拌し、次いで０．６ｍＬアセトニトリル中の活性化メチルヘプタエチレングリコール（（ＰＥＧ７）−ヘキシルオリゴマー）（５．１０  ｘ  １０−３  ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。反応経過をＨＰＬＣでモニターした。反応が終了したと思われたら、５％トリフルオロ酢酸水溶液３．７ｍＬを添加して反応を停止させた。次いで、反応混合物を処理して、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ  ７．６中に移した。
【０３３８】
（ｂ）オリゴマーをコンジュゲートした組換えプロインスリンＩＩの酵素反応混液による切断
生成物混合物のＴｒｉ−ＨＣｌ溶液をＨＰＬＣで分析して、その中のポリペプチド濃度を決定した。トリプシン溶液（ＴＰＣＫ処理；ウシ膵臓由来）を１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ  ７．６で調製した。カルボキシペプチダーゼＢ（ブタ膵臓由来）溶液を１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ  ７．６で調製した。生成物混合物（０．３９９  オｍｏｌ／ｍＬ）をトリプシン（５．５７  ｘ  １０−４  オｍｏｌ／ｍＬ）およびカルボキシペプチダーゼＢ（１．８２  ｘ  １０−４  オｍｏｌ／ｍＬ）と反応させた。３０分後、１％トリフルオロ酢酸のアセトニトリル溶液５５０μＬを添加して反応を停止させた。主要生成物をＨＰＬＣの保持時間（既知の対照標準物質の保持時間と比較）および質量スペクトル分析によって同定した。インスリン（８％）およびＬｙｓＢ２９−ヘキシル−ＰＥＧ７−オリゴマーをコンジュゲートしたインスリン（６０％）および他の物質（３０％）がこのようにして得られた。
【実施例３１】
【０３３９】
組換えプロインスリンＩＩのオリゴマーコンジュゲーション生成物の単離
実施例３０（ａ）に記載するコンジュゲーション反応の各主要生成物を、逆相ＨＰＬＣを使用して単離した。ポリペプチドおよびタンパク質の分離に有用であることが既知の市販のＣ１８固定相をカラム（内径１．０ｃｍ×長さ２５ｃｍ）に充填し、ＨＰＬＣシステムに組み入れた。流速５ｍＬ／分で送達した７５％移動相Ａ（０．１％トリフルオロ酢酸を含有するＨ２Ｏ）および２５％移動相Ｂ（０．１％トリフルオロ酢酸を含有するアセトニトリル）の混合物である溶離緩衝液でシステムを平衡させた。実施例３０（ａ）からの生成物混合物のＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶液をカラムに適用し、溶離緩衝液の組成を１２０分かけて２５％移動相Ｂから３５％移動相Ｂまで変化させた濃度勾配溶出を使用して主要な生成物を分離し、溶出した。回収した分画の各々をＨＰＬＣで分析して、その中に含有される生成物のアイデンティティおよび純度を求めた。次いで、各生成物（プロインスリンＩＩモノコンジュゲート（「プロインスリンＩＩモノ」）およびジコンジュゲート（「プロインスリンＩＩジ」）の共通の分画をプールして、回転蒸発により溶媒を留去した。各生成物のアイデンティティをＨＰＬＣおよび質量分光分析で求めた。
【実施例３２】
【０３４０】
単離した組換えプロインスリンＩＩのコンジュゲートの酵素反応混液による切断
実施例３０に記載する手法を使用して単離した各プロインスリンＩＩコンジュゲート（プロインスリンＩＩモノ、ジまたはトリ）を１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．６に溶解し、この溶液のアリコートをＨＰＬＣで分析して、ポリペプチド濃度を求めた。トリプシン溶液（ＴＰＣＫ処理；ウシ膵臓由来）を１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ  ７．６で調製した。カルボキシペプチダーゼＢ（ブタ膵臓由来）溶液を１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ  ７．６で調製した。コンジュゲート（０．１２７  オｍｏｌ／ｍＬ）をトリプシン（１．７７  ｘ  １０−４  オｍｏｌ／ｍＬ）およびカルボキシペプチダーゼＢ（５．７７  ｘ  １０−５  オｍｏｌ／ｍＬ）と反応させた。３０分後、１％トリフルオロ酢酸のアセトニトリル溶液２５０μＬを添加して反応を停止させた。主要な生成物を単離し、次に対照標準物質に対するＨＰＬＣ保持時間および質量スペクトル分析により同定すると、インスリン、Ｂ−２９アシル化インスリン−ヘキシル−ＰＥＧ７およびＮ−アミノアシル化人工Ｃ−ペプチドが反応で生成されたことが判明した。各反応の生成物および収率を単分散型について表９に例示する。
【０３４１】
【表１２】
0004602968.tif 000047
【実施例３３】
【０３４２】
ＬｙｓＢ２９−オリゴマーをコンジュゲートしたインスリンの調製
（ａ）組換えプロインスリンＩＩＩのコンジュゲーション
組換えプロインスリンＩＩＩ（９９９０Ｄａｌｔｏｎｓ）は別の供給源（Ｃｈｕｎｇ  Ｋｕｎ  Ｄａｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  （ＣＫＤ））から入手した。プロインスリンの作製の教示のためにその全体の内容が引用することにより本明細書の一部を構成する米国特許第５，９５２，４６１号を参照されたい。また、プロインスリン並びに種々のプロインスリンおよびＣ−ペプチド類似体の製造の教示のために各々の全体の内容が引用することにより本明細書の一部を構成する以下の米国特許も参照されたい：米国特許第６，３４８，３２７号、米国特許第５，９６２，２６７号、米国特許第５，９５２，４６１号、米国特許第５，８４０，５４２号、米国特許第５，４７３，０４９号、米国特許第５，４６０，９５４号、米国特許第５，３０４，４７３号、米国特許第５，１３０，２３６号、米国特許第４，７９２，６０２号、米国特許第４，７６４，５９２号、米国特許第４，６５４，３２４号、米国特許第４，６５２，５４８号、米国特許第４，６５２，５４７号、米国特許第４，６１６，０７８号、米国特許第４，４３１，７４０号、米国特許第４，３２７，０７２号および米国特許第３，９５３，４１８号。
【０３４３】
プロインスリンＩＩＩの２．３２  ｘ  １０−３  ｍｍｏｌ部分をホウ酸緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ  ９．５）１０ｍＬに溶解する。生じた溶液に、３〜６ｍＬアセトニトリル中の活性化メチルヘプタエチレングリコール（（ＰＥＧ７）−ヘキシルオリゴマー）（９．３０  ｘ  １０−３  ｍｍｏｌ）の溶液を添加する。コンジュゲーション（アシル化）反応経過をＨＰＬＣでモニターする。反応が終了したと思われたら、希塩酸で溶液のｐＨをｐＨ＜６に調節して反応を停止させる。次いで、反応混合物を処理して、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ  ７．６中に移す。
【０３４４】
（ｂ）オリゴマーをコンジュゲートした組換えプロインスリンＩＩＩの酵素反応混液による切断
生成物混合物のＴｒｉ−ＨＣｌ溶液のアリコートをＨＰＬＣで分析して、ポリペプチド濃度をもとめる。トリプシン溶液（ＴＰＣＫ処理；ウシ膵臓由来）を１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ  ７．６で調製する。カルボキシペプチダーゼＢ（ブタ膵臓由来）溶液を１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ  ７．６で調製する。次いで、生成物混合物（０．４２４  オｍｏｌ／ｍＬ）をトリプシン（５．９７  ｘ  １０−４  オｍｏｌ／ｍＬ）およびカルボキシペプチダーゼＢ（１．９３  ｘ  １０−４  オｍｏｌ／ｍＬ）と反応させる。３０分後、１％トリフルオロ酢酸のアセトニトリル溶液１．５８ｍＬを添加して反応を停止させる。主要な生成物をＨＰＬＣの保持時間（既知の対照標準物質の保持時間に対して）および質量スペクトル分析によって同定する。このようにしてインスリンおよびＬｙｓＢ２９−ヘキシル−ＰＥＧ７−オリゴマーをコンジュゲートしたインスリンが得られる。反応からの生成物混合物を処理して、ＨＰＬＣで分析する。対照標準物質の保持時間と比較したＨＰＬＣの保持時間および質量スペクトル分析を使用して、各生成物のアイデンティティおよび純度を求める（表１０）。
【０３４５】
【表１３】
0004602968.tif 000048
【実施例３４】
【０３４６】
ｄｅｓＴｈｒ単鎖インスリン前駆体からのＬｙｓＢ２９−オリゴマーをコンジュゲートしたｄｅｓＴｈｒインスリンの調整
（ａ）ｄｅｓＴｈｒミニプロインスリンのコンジュゲーション
組換えｄｅｓＴｈｒ単鎖インスリン前駆体（ｄｅｓＴｈｒミニプロインスリン）（ＭＷ  ５６８８  Ｄａｌｔｏｎｓ）を入手する（Ｗｏｃｋｈａｒｄｔ）。ある量（０．０１９５ｍｍｏｌ）をホウ酸緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ  ９．５）５ｍＬに溶解し、ｐＨを９．９７に調節する。生じた溶液に１ｍＬエタノール中の活性化メチルヘプタエチレングリコール（（ＰＥＧ７）−ヘキシルオリゴマー）（０．０２４ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。コンジュゲーション（アシル化）反応の経過をＨＰＬＣでモニターする。反応が終了したと思われたら、希塩酸で溶液のｐＨをｐＨ＜６に調節して反応を停止させる。次いで、反応混合物を処理して、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ  ７．６に移す。最終反応混合物のＨＰＬＣクロマトグラムは、以下の組成を示す：未反応のミニプロインスリン（２０．７％）、ＬｙｓＢ２９をコンジュゲートしたミニプロインスリン（７１．１％）およびＰｈｅＢ１，ＬｙｓＢ２９をジコンジュゲートしたミニプロインスリン（６．２％）。
【０３４７】
上記の反応混合物の一部から、逆相ＨＰＬＣを使用して、上記のコンジュゲーション反応から主要生成物各々を単離する。ポリペプチドおよびタンパク質の分離に有用であることが既知の市販のＣ１８固定相をカラム（内径１．０ｃｍ  ｘ  長さ２５ｃｍ）に充填し、次いでＨＰＬＣシステムに組み入れる。流速５ｍＬ／分で送達した７５％移動相Ａ（０．１％１５  ２０  ２５  ３０トリフルオロ酢酸を含有するＨ２Ｏ）および２５％移動相Ｂ（０．１％トリフルオロ酢酸を含有するアセトニトリル）の混合物である溶離緩衝液でシステムを平衡させる。生成物混合物のＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶液をカラムに適用し、溶離緩衝液の組成を１２０分かけて２５％移動相Ｂから３５％移動相Ｂまで変化させた濃度勾配溶離を使用して主要生成物を分離し、溶出する。回収した分画の各々をＨＰＬＣで分析して、含有される生成物のアイデンティティおよび純度を求める。次いで、各生成物（未反応のミニプロインスリン、ミニプロインスリンモノコンジュゲートおよびミニプロインスリンジコンジュゲート）の共通の分画をプールして、回転蒸発で溶媒を留去する。各生成物のアイデンティティ及び純度をＨＰＬＣおよび質量分光分析で求める。
【０３４８】
（ｂ）オリゴマーをコンジュゲートした組換えｄｅｓＴｈｒミニプロインスリンの酵素反応混液による切断
生成物混合物のＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶液のアリコートをＨＰＬＣで分析して、ポリペプチド濃度を求める。トリプシン溶液（ＴＰＣＫ処理；ウシ膵臓由来）を１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ  ７．６で調製する。カルボキシペプチダーゼＢ（ブタ膵臓由来）溶液を１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ  ７．６で調製する。次いで、生成物混合物（０．４２４  オｍｏｌ／ｍＬ）をトリプシン（５．９７  ｘ  １０−４  オｍｏｌ／ｍＬ）およびカルボキシペプチダーゼＢ（１．９３  ｘ  １０−４  オｍｏｌ／ｍＬ）と反応させる。６０分後、１％トリフルオロ酢酸のアセトニトリル溶液１．５８ｍＬを添加して反応を停止させる。主要生成物をＨＰＬＣ保持時間（既知の対照標準物質の保持時間と比較）および質量スペクトル分析によって同定する。ＬｙｓＢ２９−ヘキシル−ＰＥＧ７−オリゴマーをコンジュゲートしたｄｅｓＴｈｒインスリン、ＬｙｓＢ２９，ＰｈｅＢ１−ジ（ヘキシル−ＰＥＧ７−オリゴマー）をコンジュゲートしたｄｅｓＴｈｒインスリンおよびｄｅｓＴｈｒインスリンがこのようにして得られる。反応の生成物混合物を処理し、ＨＰＬＣで分析する。対照標準物質の保持時間と比較したＨＰＬＣ保持時間および質量スペクトル分析を使用して、各生成物のアイデンティティおよび純度を求める（表１１）。
【０３４９】
【表１４】
0004602968.tif 000049
【実施例３５】
【０３５０】
プロ−Ｃ−ペプチドからのＬｙｓ６４−オリゴマーをコンジュゲートしたＣ−ペプチドの調製
（ａ）合成プロ−Ｃ−ペプチドのコンジュゲーション
合成プロ−Ｃ−ペプチド（３１〜６５）（Ａｒｇ−Ａｒｇ−ヒトＣ−ペプチドＬｙｓ−Ａｒｇ）（ＭＷ  ３６１７Ｄａｌｔｏｎｓ）はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ＵＳＡから購入する。Ｃ−ペプチドの２．３２  ｘ  １０−３  ｍｍｏｌ部分をホウ酸緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ  ９．５）１０ｍＬに溶解する。得られた溶液に、３〜６ｍＬアセトニトリル中のＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性化メチルヘプタエチレングリコール（（ＰＥＧ７）−ヘキシルオリゴマー）（９．３０  ｘ  １０−３  ｍｍｏｌ）の溶液を添加する。コンジュゲーション（アシル化）反応の経過をＨＰＬＣでモニターする。反応が終了したと思われたら、希塩酸で溶液のｐＨをｐＨ＜６に調節して反応を停止させる。次いで、反応混合物を処理して、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ  ７．６中へ移す。
【０３５１】
（ｂ）オリゴマーをコンジュゲートしたプロ−Ｃ−ペプチド（３１〜６５）の酵素反応混液による開裂
生成物混合物のＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶液のアリコートをＨＰＬＣで分析して、ポリペプチド濃度を求める。トリプシン溶液（ＴＰＣＫ処理；ウシ膵臓由来）を１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ  ７．６で調製する。カルボキシペプチダーゼＢ（ブタ膵臓由来）溶液を１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ  ７．６で調製する。次いで、生成物混合物（０．４２４  オｍｏｌ／ｍＬ）をトリプシン（５．９７  ｘ  １０−４  オｍｏｌ／ｍＬ）およびカルボキシペプチダーゼＢ（１．９３  ｘ  １０−４  オｍｏｌ／ｍＬ）と反応させる。３０分後、１％トリフルオロ酢酸のアセトニトリル溶液１．５８ｍＬを添加して反応を停止させる。主要生成物をＨＰＬＣ保持時間（既知の対照標準物質の保持時間に対して）および質量スペクトル分析によって同定する。このようにしてヒトＣ−ペプチド（３３〜６３）およびＬｙｓ６４−ヘキシル−ＰＥＧ７−オリゴマーをコンジュゲートしたＣ−ペプチドが得られる。反応の生成物混合物を処理し、ＨＰＬＣで分析する。対照標準物質の保持時間と比較したＨＰＬＣ保持時間および質量スペクトル分析を使用して、各生成物のアイデンティティおよび純度を求める（表１２）。
【０３５２】
【表１５】
0004602968.tif 000050
【実施例３６】
【０３５３】
他のＬｙｓＢ２９−オリゴマーをコンジュゲートしたインスリンのプロインスリン調製を使用してアシル化インスリンポリペプチドを合成する方法
（ａ）組換えプロインスリンＩＩのコンジュゲーション
組換えプロインスリンＩＩ（ＭＷ  １１１３４  Ｄａｌｔｏｎｓ）を入手した。プロインスリンＩＩの一部（１．７９  ｘ  １０−３  ｍｍｏｌ）を１ｍＬのＤＭＳＯに溶解し、トリエチルアミン０．２５ｍＬに添加し、この溶液を２０分撹拌した。得られた溶液に、１ｍＬＴＨＦ中の活性化ヘキサエチレングリコールモノヘキサデシルエーテル（ヘキサデシル−ＰＥＧ６オリゴマー、図２０）（４．４９  ｘ  １０−３  ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。コンジュゲーション（アシル化）反応の経過をＨＰＬＣでモニターした。反応が終了したと思われたら、１％ＴＦＡ溶液で反応を停止させた。次いで、反応混合物を処理して、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ  ７．６中に移した。
【０３５４】
１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ  ７．６に移す前の反応混合物の少量を処理して、ＨＰＬＣで分析した。主要生成物をＨＰＬＣで精製して、質量分析法で分析した。プロインスリンＩＩの２つのモノコンジュゲートおよび１つのジコンジュゲートが得られた。対照標準物質の保持時間と比較したＨＰＬＣ保持時間および質量スペクトル分析を使用して、各生成物のアイデンティティおよび純度を求めた（表１３）。
【０３５５】
【表１６】
0004602968.tif 000051
【０３５６】
（ｂ）ヘキサデシルＰＥＧ６オリゴマーをコンジュゲートした組換えプロインスリンＩの酵素反応混液による開裂
生成物混合物のＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶液のアリコートをＨＰＬＣで分析して、ポリペプチド濃度を決定した。トリプシン溶液（ＴＰＣＫ処理；ウシ膵臓由来）を１００  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ  ７．６で調製した。カルボキシペプチダーゼＢ溶液（ブタ膵臓由来）を１００  Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．６で調製した。次いで、生成物混合物（０．０５  オｍｏｌ／ｍＬ）をトリプシン（１．５６  ｘ  １０−４  オｍｏｌ／ｍＬ）およびカルボキシペプチダーゼＢ（０．７８  ｘ  １０−４  オｍｏｌ／ｍＬ）と反応させた。３０分後、０．１％トリフルオロ酢酸のアセトニトリル溶液９ｍＬを添加することによって反応を停止させた。主要生成物をＨＰＬＣの保持時間および質量スペクトル分析によって同定した（図２５および２６）。インスリンおよびＬｙｓＢ２９−ヘキサデシル−ＰＥＧ６−オリゴマーをコンジュゲートしたインスリンを得た。反応の生成物混合物を処理し、ＨＰＬＣで分析した。対照標準物質の保持時間と比較したＨＰＬＣ保持時間および質量スペクトル分析を使用して、各生成物のアイデンティティおよび純度を求めた（表１４）。
【０３５７】
【表１７】
0004602968.tif 000052
【０３５８】
この手法を使用して、活性化テトラエチレングリコールモノヘキサデシルエーテル（Ｃ１６−ＰＥＧ４）（図  ２７）および活性化オクタエチレングリコールモノヘキサデシルエーテル（Ｃ１６−ＰＥＧ８）（図  ２７）にプロインスリンＩＩをコンジュゲートさせ、本明細書に記載する酵素反応混液で処理し、それぞれ最終生成物ＬｙｓＢ２９−ヘキサデシル−ＰＥＧ４−オリゴマーをコンジュゲートしたインスリンおよびＬｙｓＢ２９−ヘキサデシル−ＰＥＧ８−オリゴマーをコンジュゲートしたインスリンを得た。
【実施例３７】
【０３５９】
ＬｙｓＢ２９−アシル化インスリンの調製
（ａ）組換えプロインスリンＩのアシル化
組換えプロインスリンＩ（ＭＷ  １０，６４２  Ｄａｌｔｏｎｓ）を入手する。プロインスリンＩの一部（１．７９  ｘ  １０−３  ｍｍｏｌ）を１ｍＬのＤＭＳＯに溶解し、トリエチルアミン０．２５ｍＬに添加し、溶液を２０分間撹拌する。生じた溶液に、１ｍＬ  ＴＨＦ中のパルミチン酸（ＣＨ３（ＣＨ２）１４ＣＯ２Ｈ）のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（９．３０  ｘ  １０−３  ｍｍｏｌ）の溶液を添加する。コンジュゲーション（アシル化）反応の経過をＨＰＬＣでモニターする。反応が終了したと思われたら、１％ＴＦＡ溶液で反応を停止させる。次いで、反応混合物を処理して、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ  ７．６で交換する。
【０３６０】
１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ  ７．６で交換する前の反応混合物の少量を処理して、ＨＰＬＣで分析する。主要生成物をＨＰＬＣで精製して、質量分析法で分析する。このようにしてプロインスリンＩの２つのモノアシル化生成物、１つのジアシル化生成物および１つのトリアシル化生成物が得られる。対照標準物質の保持時間と比較したＨＰＬＣ保持時間および質量スペクトル分析を使用して、各生成物のアイデンティティおよび純度を求める（表１５）。
【０３６１】
【表１８】
0004602968.tif 000053
【０３６２】
（ｂ）パルミトイル組換えプロインスリンＩの酵素反応混液による切断
生成物混合物のＴｒｉ−ＨＣｌ溶液のアリコートをＨＰＬＣで分析して、ポリペプチド濃度を決定する。トリプシン溶液（ＴＰＣＫ処理；ウシ膵臓由来）を１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ  ７．６で調製する。カルボキシペプチダーゼＢ（ブタ膵臓由来）溶液を１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ  ７．６で調製する。次いで、生成物混合物（０．０５  オｍｏｌ／ｍＬ）をトリプシン（１．５６  ｘ  １０−４  オｍｏｌ／ｍＬ）およびカルボキシペプチダーゼＢ（０．７８  ｘ  １０−４  オｍｏｌ／ｍＬ）と反応させる。３０分後、０．１％トリフルオロ酢酸のアセトニトリル溶液９ｍＬを添加して反応を停止させる。主要生成物をＨＰＬＣの保持時間および質量スペクトル分析によって同定する。インスリン、ＬｙｓＢ２９−パルミトイルインスリンおよびＬｙｓ６４−パルミトイルＣ−ペプチドが得られる。反応の生成物混合物を処理して、ＨＰＬＣで分析する。対照標準物質の保持時間と比較したＨＰＬＣの保持時間および質量スペクトル分析を使用して、各生成物のアイデンティティおよび純度を求める。
【０３６３】
実施例３７（ａ）の手法を使用して、アシル鎖（Ｃ２〜Ｃ１８）の活性化エステルをプロインスリンＩと反応させ、実施例３７（ｂ）でのように酵素反応混液で処理し、アシル鎖に対応する最終生成物ＬｙｓＢ２９アシル化インスリンおよびＬｙｓ６４アシル化Ｃ−ペプチドを得る。
【実施例３８】
【０３６４】
カルボニル化プロインスリンからインスリンの調整
（ａ）組換えプロインスリンＩのカルボニル化
組換えプロインスリンＩ（ＭＷ  １０，６４２  Ｄａｌｔｏｎｓ）を入手する。プロインスリンＩの一部（１．７９  ｘ  １０−３  ｍｍｏｌ）を１ｍＬのＤＭＳＯに溶解し、トリエチルアミン０．２５ｍＬに添加し、溶液を２０分間撹拌する。得られた溶液に、１ｍＬ  ＴＨＦ中のアリールカルボネートエステル（９．３０  ｘ  １０−３  ｍｍｏｌ）（フェノールのＮ−ヒドロキシスクシンイミドカルボネートエステル）（９．３０  ｘ  １０−３  ｍｍｏｌ）の溶液を添加する。コンジュゲーション（カルボニル化）反応の経過をＨＰＬＣでモニターする。反応が終了したと思われたら、１％ＴＦＡ溶液で反応を停止させる。次いで、反応混合物を処理して、溶媒、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドおよびフェノールを除去して、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ  ７．６中に移す。
【０３６５】
１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ  ７．６中に移す前の反応混合物の少量を処理して、ＨＰＬＣで分析した。主要生成物をＨＰＬＣで精製して、質量分析法で分析する。このようにしてプロインスリンＩの２つのモノカルボニル化生成物、１つのジカルボニル化生成物および１つのトリカルボニル化生成物が得られる。対照標準物質の保持時間と比較したＨＰＬＣ保持時間および質量スペクトル分析を使用して、各生成物のアイデンティティおよび純度を求める（表１６）。
【０３６６】
【表１９】
0004602968.tif 000054
【０３６７】
（ｂ）カルボニル化組換えプロインスリンＩの酵素反応混液開裂
生成物混合物のＴｒｉ−ＨＣｌ溶液のアリコートをＨＰＬＣで分析して、ポリペプチド濃度を測定する。トリプシン溶液（ＴＰＣＫ処理；ウシ膵臓由来）を１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ  ７．６で調製する。カルボキシペプチダーゼＢ（ブタ膵臓由来）溶液を１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ  ７．６で調製する。次いで、生成物混合物（０．０５  オｍｏｌ／ｍＬ）をトリプシン（１．５６  ｘ  １０−４  オｍｏｌ／ｍＬ）およびカルボキシペプチダーゼＢ（０．７８  ｘ  １０−４  オｍｏｌ／ｍＬ）と反応させる。３０分後、０．１％トリフルオロ酢酸のアセトニトリル溶液９ｍＬを添加して反応を停止させる。次いで、反応混合物を処理して、１０ｍＭ  リン酸緩衝液、ｐＨ  ７．２で交換する。
【０３６８】
１０ｍＭ  リン酸緩衝液、ｐＨ  ７．２で交換する前の反応混合物の少量を処理して、ＨＰＬＣで分析する。主要な生成物をＨＰＬＣで精製して、質量分析法で分析する。主要生成物をＨＰＬＣの保持時間および質量スペクトル分析により同定する。インスリン、インスリンのＬｙｓＢ２９−フェニルカルバメートおよびＣ−ペプチドのＬｙｓ６４−フェニルカルバメートが得られる。反応の生成物混合物を処理して、ＨＰＬＣにより分析する。対照標準物質の保持時間と比較したＨＰＬＣ保持時間および質量スペクトル分析を使用して、各生成物のアイデンティティおよび純度を求める。
【０３６９】
（ｃ）カルボニル化インスリンの膵臓エラスターゼ酵素切断
生成物混合物の０．０１Ｍリン酸緩衝液溶液のアリコートをＨＰＬＣで分析してポリペプチド濃度を求める。膵臓エラスターゼ（ＩＩＩ型；ブタ膵臓由来）の溶液を１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ  ７．２で調製する。次いで、生成物の混合物（５ｘ１０−３Ｍ）を室温において膵臓エラスターゼ（２．５６ｘ１０−４Ｍ）と反応させる。６０分後、等容量の０．０２Ｍクエン酸を添加して反応を停止させる。このステップは、制御された条件下において、例えば、ｐＨ  １０以上のアルカリ性緩衝液などの塩基性加水分解によって達成されうる。
【０３７０】
主要生成物をＨＰＬＣ保持時間および質量スペクトル分析によって同定する。インスリンおよびＬｙｓ６４−Ｃ−ペプチドを得た。反応からの生成物混合物を処理して、ＨＰＬＣで分析する。対照標準物質の保持時間と比較したＨＰＬＣ保持時間および質量スペクトル分析を使用して、各生成物のアイデンティティおよび純度を求める。
【実施例３９】
【０３７１】
酵素トランスフォーメーション過程の最適化
本発明の一実施形態において、プロインスリンポリペプチド分子からペプチドを切断してインスリンを作製するのに必要な酵素濃度は、効果的および特異的な切断活性を維持しつつ、最高４０００×まで低下することができる。ポリペプチドを切断してインスリンを作製するために本明細書に記載するプロトコールによりトリプシン−ＣＰＢ反応混液を使用し、トリプシン酵素は、プロインスリンの１モルに対して＞７００モルのトリプシンの量で存在し、例えば、以下の比、即ちプロインスリン１モル：トリプシン１／２０００モルで存在してもよい。カルボキシペプチダーゼＢ（ＣＰＢ）は、プロインスリンと比較したとき、＞２０００〜２２００モルＣＰＢの量がカクテルに存在し、例えば、以下の比、即ちプロインスリン１モル：ＣＰＢ１／４０００モルで存在してもよい。従って、トリプシンおよびＣＰＢの酵素反応混液は以下のように使用することができる：基質１モル：トリプシン１／＞７００モル：ＣＰＢ１／＞２０００〜２２００モルおよび例えば、基質１モル：トリプシン１／２０００モル：ＣＰＢ１／４０００モル。トリプシンおよびＣＰＢに対するプロインスリンなどの基質の比は本明細書に記載する値より大きいまたは小さい任意の値であってもよく、例えば、基質１モル：トリプシン１／７５０モル、基質１モル：トリプシン１／８００モル、基質１モル：トリプシン１／８５０モル、基質１モル：トリプシン１／９００モル、基質１モル：トリプシン１／９５０モル、基質１モル：トリプシン１／１０００モル、基質１モル：トリプシン１／１２００モル、基質１モル：トリプシン１／１４００モル、基質１モル：トリプシン１／１５００モル、基質１モル：トリプシン１／１６００モル、  基質１モル：トリプシン１／１７００モル、基質１モル：トリプシン１／１８００モル、基質１モル：トリプシン１／１９００モル、基質１モル：トリプシン１／２０００モル、基質１モル：トリプシン１／２２００モル、基質１モル：トリプシン１／２４００モル、基質１モル：トリプシン１／２５００モル、基質１モル：トリプシン１／２６００モル、基質１モル：トリプシン１／２８００モル、  基質１モル：トリプシン１／３０００モル、基質１モル：ＣＰＢ１／２１００モル、基質１モル：ＣＰＢ１／２２００モル、基質１モル：ＣＰＢ１／２４００モル、基質１モル：ＣＰＢ１／２５００モル、基質１モル：ＣＰＢ１／２６００モル、基質１モル：ＣＰＢ１／２８００モル、基質１モル：ＣＰＢ１／３０００モル、基質１モル：ＣＰＢ１／３２００モル、１モル基質：ＣＰＢ１／３４００モル、基質１モル：ＣＰＢ１／３６００モル、基質１モル：ＣＰＢ１／３８００モル、基質１モル：ＣＰＢ１／４０００モル、基質１モル：ＣＰＢ１／４２００モル、基質１モル：ＣＰＢ１／４４００モル、基質１モル：ＣＰＢ１／４６００モル、基質１モル：ＣＰＢ１／４８００モル、基質１モル：ＣＰＢ１／５０００モル等および／または基質、トリプシンおよびＣＰＢの比に関するこれらの任意の組み合わせであってもよい。
【０３７２】
従って、本発明はまた、プロインスリンポリペプチドからインスリンを作製する方法も提供し、この方法は、
ｃ）カルボキシペプチダーゼ−様酵素に対するトリプシン−様酵素のモル比が１／＞７００：１／＞２０００である
条件下で、プロインスリンポリペプチドに酵素反応混液を接触させてプロインスリンポリペプチドからＣ−ペプチドおよびリーダーペプチドを切断するステップを含み、但し、酵素反応混液は、トリプシン−様酵素（例えば、トリプシン、トロンビン、アクロモバクター・リティクス（Ａｃｈｒｏｍｂａｃｔｅｒ  ｌｙｔｉｃｕｓ）由来の酵素）およびカルボキシペプチダーゼ−様酵素（例えば、カルボキシペプチダーゼＡ、カルボキシペプチダーゼＢ）を含む。
【０３７３】
本発明のいくつかの実施形態において、基質がプロインスリンポリペプチドである場合には、ＣＰＢ酵素に対するトリプシン酵素の比は、プロインスリンポリペプチドの切断が、Ｂ−鎖をリーダーペプチドに接続し、Ｂ−鎖をＣ−ペプチドに接続し、Ａ−鎖をＣ−ペプチドに接続するＡｒｇ３１およびＡｒｇ残基において生じるが、プロインスリンポリペプチドのＡｒｇＢ２２では大きな程度で生じない（例えば、１％未満、５％未満または１０％未満である）酵素比である。
【実施例４０】
【０３７４】
ペプチド転移反応過程を生じないでインスリン誘導体を作製するための単鎖インスリン前駆体の用途
Ｂ−鎖のＢ−２９Ｌｙｓアミノ残基におけるインスリンのコンジュゲーション（アシル化）は、選択した反応媒体において、未処理のインスリンを活性化された物体（例えば、オリゴマーのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）（図３３）と反応させることによって生じる。Ｂ−２９  Ｌｙｓへの反応の選択性は、主に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルへのＡ−１  ＧｌｙおよびＢ−１  Ｐｈｅ  アミノ基でのアシル化により低下する。これらの条件下では、反応はＢ−２９並びにＡ−１  ＧｌｙおよびＢ−Ｐｈｅでの修飾を含むインスリンコンジュゲートの混合物を生ずる。その後、Ｂ−２９  Ｌｙｓコンジュゲートは、クロマトグラフィーによって低収率で他の生成物から精製される。有機媒体および有機塩基および化学量論量のＮ−ヒドロキシスクシンイミドに関係する最適条件の使用により、Ａ−１  ＧｌｙよりＢ−２９  Ｌｙｓを選ぶアシル化の選択性が改善されたことが判明している。しかし、他の部位での修飾の問題は、保護されていないインスリンを使用する場合には避けることができない。
【０３７５】
天然および人工プロインスリン（図３４および３５）を使用して、インスリン経路の場合より大きい選択性でＢ−鎖のＬｙｓ側鎖で修飾またはコンジュゲートされているインスリン誘導体を作製するユニークな経路を提供することが本発明において示されている。プロインスリンでは、インスリンのＡ−鎖のアミノ末端、Ａ−１  Ｇｌｙは、Ｃ−ペプチドを介してＢ−鎖のカルボキシ末端に接続されている。Ａ−１  Ｇｌｙアミノ側鎖はＣ−ペプチドで保護されているので、プロインスリンとＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの反応（アシル化）は、選択的に、Ｂ−鎖のＬｙｓアミノ側鎖（例えば、Ｂ−２９ヒトインスリン）を修飾すると思われる。トリプシンおよびカルボキシペプチダーゼによる酵素切断の結果、コンジュゲートはＢ−２９  Ｌｙｓアシル化インスリンを提供すると思われる。Ｃ−ペプチドのＬｙｓ（例えば、天然プロインスリンのＬｙｓ６４）がＢ−２９  Ｌｙｓと共にアシル化されている場合でも、リーダーペプチドのＮ−末端のトリプシンおよびカルボキシペプチダーゼによる酵素切断はＡｒｇ６３、Ａｒｇ３２およびＡｒｇ３１において生じ、Ｂ鎖Ｌｙｓアシル化インスリンを提供するので、プロインスリンをインスリンの代わりに出発物質として使用できると思われる。
【０３７６】
短いＣ−ペプチド（Ｃ＝０、−１、−２、−３、−４、−５等）の結果として、新規配列も酵母系（例えば、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、Ｐ．モルファ（Ｐ．  ｍｏｒｐｈａ等）から発現されうる。
【０３７７】
Ｌｙｓ修飾インスリン（図３６および３７）を提供する出発物質としてこれらの新規配列を使用する利点は以下のとおりである。
１．Ａ−１  Ｇｌｙアミノ末端はアシル化から保護されているので、プロインスリンを使用することによりＢ−２９  Ｌｙｓ修飾の選択性が高くなる。
２．Ｂ−１  Ｐｈｅ部位も、Ｂ−１にリーダー配列が存在することによりコンジュゲーションからブロックされうる。
３．Ｂ−２９  ＬｙｓにおけるコンジュゲーションはトリプシンによるＢ−３０  Ｔｈｒの除去を防止するので、Ｂ−３０にＴｈｒを導入するためにペプチド転移反応過程が必要ないと思われる。
４．両コンジュゲート、モノＢ−２９  Ｌｙｓコンジュゲートおよびジコンジュゲート、Ｂ２９およびＬ−１（リーダーペプチド−１）は、切断の結果単一の生成物、Ｂ−２９修飾インスリンを生ずる。
５．リーダーペプチドを使用しないで単鎖インスリン前駆体を使用してＢ−２９  ＬｙｓおよびＢ−１  Ｐｈｅにおいてコンジュゲートしたジコンジュゲートは、切断の結果単一生成物、Ｂ−２９およびＢ−１修飾インスリンを生ずる。
６．この経路は、インスリンを使用するコンジュゲーションにより得られるものと比較して、Ｂ−２９生成物への変換率が高い（＞８０％）。
７．この経路は、Ａ鎖とＢ鎖の間のスペーサー（ミニＣ−ペプチド）の非切断部分またはリーダーペプチドの配列にかかわらず、任意の種類のプロインスリンに使用することができる。
８．この経路は、Ｂ−鎖のＬｙｓの位置にかかわらずＬｙｓ側鎖に修飾を生じるために使用することができる。従って、この経路は、任意の種類のプレ−プロインスリン（リーダーペプチドまたは融合タンパク質を有するプロインスリン）またはミニプロインスリン（短いＣ−ペプチド鎖を有するプロインスリン）またはプロインスリン様分子（例えば、プロＬｙｓＰｒｏ）に使用することができる。
９．この経路は、リーダーペプチドを使用しないで、単鎖インスリン前駆体を使用してＢ−２９Ｌｙｓ，Ｂ−１Ｐｈｅジ−アシル化（修飾）インスリンへの直接経路を提供する（例えば、構成１）。
１０．この経路は、単鎖インスリン前駆体を含有するインスリンまたは非−Ｔｈｒを使用するよりも、Ｂ−２９  Ｌｙｓ修飾インスリン（例えば、ＨＩＭ２）を生ずる市販の安価で、収率の高い製造スキームを提供する。
【０３７８】
ペプチド転移の無いインスリン単鎖前駆体の配列：
構成  １：  Ｂ−鎖−Ａｒｇ−Ａ−鎖  
構成  ２：  Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｂ−鎖−Ａｒｇ−Ａ−鎖  
構成  ３：  Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｂ−鎖−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａ−鎖  
構成  ３：  リーダーペプチド−Ａｒｇ−Ｂ−鎖−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａ−鎖  
構成  ４：  リーダーペプチド−Ａｒｇ−Ｂ−鎖−Ａｒｇ−プロ−Ａｒｇ−Ａ−鎖  
構成  ５：  Ｂ−鎖−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａ−鎖
【０３７９】
Ｂ−鎖およびＡ−鎖：ヒトおよび他の（例えば、ウシ、ブタ、マウス等）インスリン配列のＢ−およびＡ−鎖、または任意のインスリン配列の修飾（例えば、Ｌｙｓ２８Ｐｒｏ２９インスリン）を備えたＢ−およびＡ−鎖または１以上のアミノ酸を含まないインスリン類似体（例えば、ｄｅｓＴｈｒ  Ｂ−鎖）または１以上のアミノ酸の置換体。
【０３８０】
本発明を、様々な実施形態を参照して本明細書に記載した。これらの実施形態は本発明を限定するものではなく、具体的に説明する目的で記載されている。本発明の範囲は前記の特許請求の範囲によって規定される。
【図面の簡単な説明】
【０３８１】
【図１】リーダーペプチドを有するプロインスリンを使用してＢ−２９Ｌｙｓ修飾インスリンを調製するための合成経路の実施形態を示す図である。
【図２】プロインスリンＩＩコンジュゲーションのＨＰＬＣプロファイルを示す図である。
【図３】精製プロインスリンＩＩモノコンジュゲートの質量スペクトルを示す図である。
【図４】精製プロインスリンＩＩジコンジュゲートの質量スペクトルを示す図である。
【図５】インスリン−ヘキシル−ＰＥＧ７モノコンジュゲート産生のＨＰＬＣプロファイルを示す図である。
【図６】プロインスリンＩＩモノコンジュゲートのトリプシンによる開裂産物の質量スペクトルを示す図である。
【図７】カルボキシペプチダーゼＢによるインスリン（Ａｒｇ３１）−ヘキシル−ＰＥＧ７開裂のＨＰＬＣプロファイルを示す図である。
【図８】Ｂ−２９アシル化インスリン（Ａｒｇ３１）−ヘキシル−ＰＥＧ７コンジュゲートのカルボキシペプチダーゼによる開裂産物の質量スペクトルを示す図である。
【図９】カルボキシペプチダーゼＢおよびトリプシンの酵素反応混液により開裂されたプロインスリンＩＩモノコンジュゲートからのインスリン−ヘキシル−ＰＥＧ７（多分散）の産生のＨＰＬＣプロファイルを示す図である。
【図１０】プロインスリンＩＩを経たインスリン−ヘキシル−ＰＥＧｎ（多分散）の質量スペクトルを示す図である。
【図１１】プロインスリンＩを介したＢ−２９アシル化インスリン−ヘキシル−ＰＥＧ７の産生のＨＰＬＣプロファイルを示す図である。
【図１２】プロインスリンＩを経たＢ−２９アシル化インスリン−ヘキシル−ＰＥＧ７の質量スペクトルを示す図である。
【図１３】プロインスリンＩコンジュゲート混合物由来のインスリン（副産物）の質量スペクトルを示す図である。
【図１４】プロインスリンＩモノコンジュゲートＡ、プロインスリンＩモノコンジュゲートＢおよびプロインスリンＩジコンジュゲートのＨＰＬＣプロファイルを示す図である。
【図１５】プロインスリンＩジコンジュゲートとカルボキシペプチダーゼＢおよびトリプシンの酵素反応混液との反応からのインスリン−ヘキシル−ＰＥＧ７モノコンジュゲートの産生のＨＰＬＣプロファイルを示す図である。
【図１６】プロインスリンＩモノコンジュゲートＡとカルボキシペプチダーゼＢおよびトリプシンの酵素反応混液との反応からのインスリン（副産物）の産生のＨＰＬＣプロファイルを示す図である。
【図１７ａ−１７ｂ】インスリンから産生されたＰＥＧ７ＨＩＭ２及びプロインスリンから産生されたＰＥＧ７ＨＩＭ２のペプチドマッピングからのＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。
【図１８ａ−１８ｂ】インスリンから産生された本発明のオリゴマーコンジュゲートのＭＢＧＡ生物作用能特性を示す図である。
【図１９ａ−１９ｂ】プロインスリンから産生された本発明のオリゴマーコンジュゲートのＭＢＧＡ生物作用能特性を示す図である。
【図２０】活性化ヘキサエチルグリコールモノヘキサデシルエーテル（ヘキサデシル−ＰＥＧ６活性化オリゴマー）の構造を示す図である。
【図２１】ヘキサデシルＰＥＧ６のプロインスリンＩＩモノＢコンジュゲートの質量スペクトルを示す図である。
【図２２】ヘキサデシルＰＥＧ６のプロインスリンＩＩモノＡコンジュゲートの質量スペクトルを示す図である。
【図２３】ヘキサデシルＰＥＧ６のプロインスリンＩＩジコンジュゲートの質量スペクトルを示す図である。
【図２４】活性化ヘキサデシルＰＥＧ６とプロインスリンＩＩとのコンジュゲーション反応のＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。
【図２５】ＬｙｓＢ２９−ヘキサデシル−ＰＥＧ６−オリゴマーをコンジュゲートしたインスリンのＥｓ−質量スペクトルを示す図である。
【図２６】ヘキサデシル−ＰＥＧ６をコンジュゲートしたプロインスリン−ＩＩの混合物の酵素反応混液反応のＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。
【図２７】活性化オクタエチレングリコールモノヘキサデシルエーテル（Ｃ１６−ＰＥＧ８）及び活性化テトラエチレングリコールモノヘキサデシルエーテル（Ｃ１６−ＰＥＧ４）の構造を示す図である。
【図２８】天然プロインスリンのヘキシル−ＰＥＧ７−オリゴマーコンジュゲートと酵素反応混液との反応からのＬｙｓＢ２９−ヘキシル−ＰＥＧ７−オリゴマーコンジュゲートのＭＡＬＤＩ−質量スペクトルを示す図である。
【図２９】天然プロインスリンのヘキシル−ＰＥＧ７−オリゴマーコンジュゲートと酵素反応混液との反応からのＰｈｅＢ１，ＬｙｓＢ２９ジ（ヘキシル−ＰＥＧ７−オリゴマー）コンジュゲートのＭＡＬＤＩ−質量スペクトルを示す図である。
【図３０】ヘキシル−ＰＥＧ７−オリゴマーのプロインスリンＩＩモノコンジュゲート（プロインスリンモノ）と酵素反応混液との反応から単離されたヒトインスリンのＭＡＬＤＩ−質量スペクトルを示す図である。
【図３１】ヘキシル−ＰＥＧ７−オリゴマーのプロインスリンＩＩモノコンジュゲート（プロインスリンＩＩモノ）の酵素反応混液との反応からのインスリンのＬｙｓ２９−ヘキシル−ＰＥＧ７−オリゴマーコンジュゲートのＭＡＬＤＩ−質量スペクトルを示す図である。
【図３２】ヘキシル−ＰＥＧ７−オリゴマーのプロインスリンＩＩジコンジュゲート（プロインスリンＩＩジ）の酵素反応混液との反応からのインスリンのＬｙｓ２９−ヘキシル−ＰＥＧ７−オリゴマーコンジュゲートのＭＡＬＤＩ−質量スペクトルを示す図である。
【図３３】ＤｅｓＴｈｒ単鎖前駆体へのコンジュゲーションを示す図である。
【図３４】単鎖インスリン前駆体の非ペプチド転移反応構成１を示す図である。
【図３５】リーダーペプチドを有する単鎖インスリン前駆体の非ペプチド転移反応構成を示す図である。
【図３６】ペプチド転移反応無しで単鎖インスリン前駆体−３からＢ−２９Ｌｙｓ修飾インスリンコンジュゲートへ到る直接の経路を示す図である。
【図３７】酵素反応混液により、ペプチド転移反応無しで単鎖インスリン前駆体からＢ−２９Ｌｙｓ修飾インスリンコンジュゲートへ到る直接の経路を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７ａ】
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【図１７ｂ】
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【図１８ａ】
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【図１８ｂ】
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【図１９ａ】
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【図１９ｂ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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