(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アクロレインで修飾したカギアナカサガイから得たヘモシアニンを抗原として調製した抗血清であって、次式：
【化１】
0004602488.tif 000005
〔式中、Ｒ1 、Ｒ2 は蛋白質残基、ペプチド残基、もしくはＲ1 ＝Ｒ2 ＝Ｈを示す。〕
で示されるホルミルデヒドロピペリジン−リジン構造を認識し、
炭素数２−６のアルキル鎖を有する第１級アミンとアクロレインからなるホルミルデヒドロピペリジン構造を有するアクロレイン−アミン付加体に対して親和性を有し、
マロンジアルデヒド、４−ヒドロキシノネナール、グリオキサール、メチルグリオキサール、グリセルアルデヒド、グルタルアルデヒド、グリコアルデヒド、ヒドロキシアセトン、ジヒドロキシアセトン、グルコソン、フラクトース、アラビノース、グルコール−６−リン酸およびフラクトース−６−リン酸から選ばれたアルデヒドで修飾した蛋白質に対して抗原−抗体反応を示さない抗血清。
【請求項２】
炭素数が２以上のアルキル鎖を有するホルミルデヒドロピペリジン−リジン構造を認識する請求項１記載の抗血清。
【請求項３】
（１）アクロレインで修飾したカギアナカサガイから得たヘモシアニンを抗原とし、
（２）恒温動物（ヒトを除く）に免疫して、次式：
【化２】
0004602488.tif 000006
〔式中、Ｒ1 、Ｒ2 は蛋白質残基、ペプチド残基、もしくはＲ1 ＝Ｒ2 ＝Ｈを示す。〕
で示されるホルミルデヒドロピペリジン−リジン構造を認識し、
炭素数２−６のアルキル鎖を有する第１級アミンとアクロレインからなるホルミルデヒドロピペリジン構造を有するアクロレイン−アミン付加体に対して親和性を有し、
マロンジアルデヒド、４−ヒドロキシノネナール、グリオキサール、メチルグリオキサール、グリセルアルデヒド、グルタルアルデヒド、グリコアルデヒド、ヒドロキシアセトン、ジヒドロキシアセトン、グルコソン、フラクトース、アラビノース、グルコール−６−リン酸およびフラクトース−６−リン酸から選ばれたアルデヒドで修飾した蛋白質に対して抗原−抗体反応を示さない抗血清を採取することを特徴とする抗血清の製造方法。
【請求項４】
炭素数が２以上のアルキル鎖を有するホルミルデヒドロピペリジン−リジン構造を認識する請求項３記載の抗血清の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、抗血清およびその製造方法に関する。詳しくは、食用油あるいはプラスチックなどの分解物であるアクロレイン（略語：ＡＣＲ）と生体内蛋白質の複合体に対して、高い特異性を有する抗血清とその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体内の脂質成分としては、トリグリセライド、リン脂質、コレステロールエステルあるいは遊離型脂肪酸などが知られており、特にこれらの化合物が高度不飽和脂肪酸残基を有する場合、生体に作用する様々な酸化ストレスによって、過酸化を受け易く、更に、二次酸化により生じた分解物が、様々な病態に関与していることが明らかにされつつある。
【０００３】
前記高度不飽和脂肪酸残基を有する化合物としては、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸などが代表的なものである。その過酸化分解物としては、マロンジアルデヒド、４−ヒドロキシノネナールおよび４−ヒドロキシヘキセナールなどのアルデヒドが知られている。これらのアルデヒドは生体内の蛋白質、ペプチドあるいはアミノ酸等と反応して付加体を形成し、様々な疾病との関与が盛んに研究されている。特に、マロンジアルデヒドあるいは４−ヒドロキシノネナールと蛋白質との付加体が動脈硬化層に多く存在することが確認されており、動脈硬化症との因果関係が非常に注目されている。
【０００４】
一方、ＡＣＲは、食用油の加熱、あるいは、ガソリンあるいはプラスチックの燃焼によって生成することが知られているアルデヒドの１種である。前記の高度不飽和脂肪酸から生成するとされるマロンジアルデヒド、４−ヒドロキシノネナールあるいは４−ヒドロキシヘキセナールなどとは異なって、生体内で生成する直接的な証明は未だなされていないが、食用油あるいは食品の包装材料等に用いられているプラスチックの分解によって生じ、経口などの経路で生体内に移行し、生体に対して様々な毒性を示す事が危惧されている。
【０００５】
このように生体に対してＡＣＲが及ぼすと考えられる毒性としては、強い発癌性が挙げられ、これはＡＣＲの反応性の高いアルデヒドとしての性質によるものである〔H.Esterbauer.et al.,Naturforsch.30,466(1975)、J.C.Gan et al.,Res.Commun.Chem.Pathol.Pharmacol.419,55(1987)〕。具体的には、ＡＣＲは、生体内の蛋白質、ペプチドあるいはアミノ酸等が含有するアミンあるいはチオールなどの求該基と非常に反応性が高いことがその原因と考えられている。ＡＣＲとアミノ酸のアミノ基との反応は、次式（１）に示す反応機構が知られており、アミノ基１個に対してＡＣＲ２個が付加反応し、ホルミルデヒドロピペリジン構造を有する化合物が生成する。
【０００６】
【化３】
0004602488.tif 000002
【０００７】
〔式中、Ｒ1 、Ｒ2 は蛋白質残基、ペプチド残基、もしくはＲ1 ＝Ｒ2 ＝Ｈを示す。〕
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
この様に、生体の疾病との相関が注目されているＡＣＲに関連して、ＡＣＲと、蛋白質、ペプチドあるいはアミノ酸との付加体（略語：ＡＣＲ付加体）の定性あるいは定量を免疫学あるいは生化学的に行うことが非常に重要である。臨床診断学的あるいは臨床医学的な見地からこれらを可能にする技術が強く求められているものの、具体的手段あるいは技術は未だ確立されていない。
【０００９】
そこで本発明は、ＡＣＲと蛋白質あるいはペプチドの構成アミノ酸の１つであるリジン（略語：Ｌｙｓ）の付加体に関して着目し、このＡＣＲ付加体が有するホルミルデヒドロピペリジン−リジン構造に対して認識特異性の高い抗血清と、その製造方法を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記問題点に鑑み鋭意検討した結果、アクロレイン（略語：ＡＣＲ）で修飾したカギアナカサガイのヘモシアニンを抗原として調製した、次式（２）で示されるホルミルデヒドロピペリジン−リジン構造に対して高い認識特異性を有する抗血清を見出した。
【００１１】
【化４】
0004602488.tif 000003
【００１２】
〔式中、Ｒ1 、Ｒ2 は蛋白質残基、ペプチド残基、もしくはＲ1 ＝Ｒ2 ＝Ｈを示す。〕
また、本発明の抗血清の製造方法は、（１）アクロレインで修飾したカギアナカサガイから得たヘモシアニンを抗原とし、（２）恒温動物に免疫して、次式：
【００１３】
【化５】
0004602488.tif 000004
【００１４】
〔式中、Ｒ1 、Ｒ2 は蛋白質残基、ペプチド残基、もしくはＲ1 ＝Ｒ2 ＝Ｈを示す。〕
で示されるホルミルデヒドロピペリジン−リジン構造に対して高い認識特異性を有する抗血清を採取する抗血清の製造方法を確立した。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明の実施の形態を詳しく説明する。
【００１６】
本発明に用いることができる抗原は、蛋白質とＡＣＲの反応物であれば良く、蛋白質としては、例えば、牛血清アルブミン、卵白アルブミン、血清リポタンパク、カギアナカサガイのヘモシアニンなどが挙げられ、好ましくはカギアナカサガイのヘモシアニンが用いられる。
【００１７】
抗原を調製するための蛋白質とＡＣＲの反応は、緩衝液中で混合攪拌して実施することができる。用いる緩衝液としては、トリス、リン酸塩、炭酸塩、酢酸塩緩衝液が挙げられ、緩衝液の濃度は、例えば、１ｍＭから０．２Ｍ、好ましくは、１０〜１００ｍＭ（リン酸緩衝液）である。この反応の終点は、蛋白質中のアミノ酸の減少率で検出することが可能である。アミノ酸の減少率は、例えば、反応前後の試料のＡＣＲと反応していないアミノ酸をアミノ酸自動分析装置（ＪＥＯＬ  ＪＬＣ−３００）で測定することによって求める。アミノ酸減少率による反応終点は、例えば、リジン減少率が５０％以上となる時点が挙げられ、好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７５％以上減少する時点である。このようなリジン減少率となる反応条件は、例えば、２５〜４５℃で１〜７２時間が挙げられ、好ましくは３０〜４０℃で２〜６時間である。
【００１８】
本発明の抗血清の作製は、前記抗原により恒温動物（ヒトを除く）を免疫し、該恒温動物から血液を採取し、採取した血液から本発明の抗血清を分離・精製することにより行うことができる。例えば、マウス、ハムスター、モルモット、ニワトリ、ラット、ウサギ、イヌ等の恒温動物を免疫するには通常の免疫の方法を用いて、例えば、７ないし３０日、特に１２ないし１６日間隔で２または３回の投与等が好ましい。投与量は１回につき、例えば抗原約０．０５から２ｍｇ程度を目安とする。投与経路は、皮下投与、皮内投与、腹膜腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与等を選択することができるが、静脈内、腹膜腔内もしくは皮下に行われうる注射が好ましい投与形態である。さらに皮下注射と腹膜腔内注射の組み合わせが特に好ましい。
【００１９】
なおこの場合、抗原は適当な緩衝液、例えば完全フロイントアジュバンド、水酸化アルミニウム等の通常用いられるアジュバントの１種を含有するナトリウム系リン酸緩衝液、生理食塩水等に溶解して用いられるが、投与経路や条件等によっては、上記のようなアジュバントを使用しないこともある。ここでアジュバントとは抗原とともに投与した時、非特異的にその抗原に対する免疫反応を増強する物質を意味する。そして、上記の恒温動物の０．５ないし４ヶ月間処置せずに放置した後、該恒温動物の血清を耳静脈等から少量サンプリングし、抗体価を測定する。抗体価が上昇してきたら、状況に応じて抗原の投与を適当回数実施する。例えば、１００μｇないし１０００μｇ、特に５０μｇないし５００μｇの抗原の投与量でもう１回の投与が行われる。最後の投与の１週間ないし２ヶ月間後に免疫した恒温動物から通常の方法により血液を採取して、該血液を、例えば遠心分離することによって本発明の抗血清を得ることができる。
【００２０】
本発明で得られた抗血清を、必要に応じて、例えば、硫酸アンモニウムまたはポリエチレングリコールを用いることによる沈殿、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の通常の方法によって分離・精製し、抗体画分、即ちポリクローナル抗体を得ることができる。この様な本発明の抗血清を更に精製することは、本発明の抗血清の有する高い認識特異性に悪影響を与えない範囲において、実施することが可能である。
【００２１】
ホルミルデヒドロピペリジン−リジン構造に対する認識特異性の測定方法は、酵素免疫測定の原理に基づく。その測定方法の概略は次の▲１▼〜▲６▼である。
【００２２】
▲１▼イムノプレートに抗原を吸着させる。▲２▼洗浄後、ブロッキング剤を加える。▲３▼洗浄後、ホルミルデヒドロピペリジン−リジン抗体（１次抗体）を含有する抗血清を加え、抗原と結合させる。▲４▼洗浄後、酵素標識抗体（２次抗体）を加え、１次抗体と結合させる。▲５▼洗浄後、標識酵素の基質と発色試薬を加え発色させる。▲６▼硫酸を加えて発色反応を停止させ、マイクロプレートリーダーを使い吸光度を測定する。
【００２３】
本発明の抗血清は、炭素数が２以上のアルキル鎖を有するホルミルデヒドロピペリジン−リジン構造を認識する特異性を有し、好ましくは炭素数が６のアルキル鎖を有する場合である。
【００２４】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
【００２５】
抗原の調製
カギアナカサガイのヘモシアニン抗原（以下ＫＬＨと略す）（２ｍｇ／ｍｌ）とＡＣＲ（１０ｍＭ）を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）１ｍｌ中で３７℃、２４時間反応させた。アミノ酸分析でＡＣＲ修飾ＫＬＨ中の減少したアミノ酸を調べたところ、リジン（略語：Ｌｙｓ）が８０％減少していた。ＡＣＲ修飾ＫＬＨ（１ｍｇ／ｍｌ）を１．５倍量のアジュバントとよく混合後、エマルジョンにし、抗原とした。粘性は増し白く濁った溶液になった。アジュバントは、初回免疫の時はフロイント完全アジュバントを用い、２回以後の免疫には、フロイント不完全アジュバントを用いた。
【００２６】
抗血清の調製
予め一週間飼育して変化した環境に慣らしたＮｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  Ｗｈｉｔｅ  ｒａｂｂｉｔ（体重２ｋｇ前後、オス）を用いて免疫を開始した。足の３〜５箇所に約４００μｌずつ、アジュバント−抗原混合物を１ｍｌ筋肉注射した。４、６、８、１０週後さらに追加免疫した。免疫した１週間後に耳の静脈より約１ｍｌ採血した。採った血液は４℃で一晩保存した後、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した上清を抗血清として得、本発明の抗血清とした。
【００２７】
抗体産生の応答は、前記「抗原の調製」で修飾したのと同様な方法でＡＣＲ修飾したＢＳＡを抗原として用い、Ｔｗｅｅｎ−トリス緩衝液（ＴＴＢＳ）で１０００倍希釈したものを１次抗体としてウエスタンブロットにより確認した。２回目免疫後に得られた血清より抗体の産生が確認され、免疫３回目以降の血清ではさらに抗体価が上がっていた。
【００２８】
最終免疫した８〜１０日後に心臓より全採血を行い、採った血液を４℃で一晩保存した後、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を本発明による抗血清として採取した。抗血清は使用するまでの間、短期間の場合は４℃、長期間の場合は−７０℃で保存した。
【００２９】
抗血清の特性評価法
アクロレイン付加体等を抗原とし、以下の酵素免疫測定にて本発明の抗血清を評価した。
【００３０】
（１）９６穴イムノプレートに被検抗原をウエル当たり５μｇ／ｍｌを０．１ｍｌ加え、プレートに吸着させた。
【００３１】
（２）ＴＷＥＥＮ−トリス緩衝液（略語：ＴＴＢＳ）で３回洗った後、１％ＢＳＡを０．１ｍｌ加えて３７℃、１時間インキュベートし、ＢＳＡを吸着させることでプレートの非特異吸着を防止した。
【００３２】
（３）ＴＴＢＳで３回洗った後、ＴＴＢＳで１０００倍希釈した本発明の抗血清を０．１ｍｌ加えて、３７℃、３時間インキュベートし抗原と結合させた。この時、ブランク用にはＴＴＢＳのみを加えた。
【００３３】
（４）ＴＴＢＳで３回洗った後、ホースラデイシュパーオキシダーゼ（略語：ＨＲＰ）標識されている抗Ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ抗体（２次抗体）をＴＴＢＳで５０００倍希釈し、０．１ｍｌ加え、３７℃、１時間インキュベートして１次抗体と結合させた。
【００３４】
（５）ＴＴＢＳで３回洗った後、０．４ｍｇ／ｍｌ（０．１Ｍクエン酸緩衝液、ｐＨ５．０）のο−フェニレンジアミン＋０．００３％Ｈ2 Ｏ2 を１ｍｌ加え、室温で約１５〜２０分間インキュベートして発色させた。
【００３５】
（６）２Ｎ  Ｈ2 ＳＯ4 を５０μｌ加え、発色反応を停止させた。
【００３６】
（７）マイクロプレートリーダーを使って、４９２ｎｍの波長で吸光度を測定し、アクロレイン修飾蛋白質を定量した。
【００３７】
抗血清の反応特異性評価
種々のアルデヒドで修飾した特定の蛋白質に対する本発明の抗血清の抗原−抗体反応の特異性を評価した。本発明で検討を加えたＡＣＲに加え、マロンジアルデヒド（略語：ＭＤＡ）、４−ヒドロキシノネナール（略語：ＨＮＥ）、グリオキサール、メチルグリオキサール、グリセルアルデヒド、グルタルアルデヒド、グリコアルデヒド、ヒドロキシアセトン、ジヒドロキシアセトン、グルコソン、フラクトース、アラビノース、グルコール−６−リン酸およびフラクトース−６−リン酸を用いて、牛血清アルブミン（略語：ＢＳＡ）を常法に従って修飾した化合物を調製し、前記「抗血清の特性評価法」の酵素免疫測定法により交差性を検討した。
【００３８】
その結果を図１に示した。ＡＣＲ以外のアルデヒドで修飾した蛋白質は、抗原−抗体反応性を示さないことが明らかとなった。本発明の抗血清は、アクロレインで修飾した蛋白質に対してのみ特異的に抗原−抗体反応性を有することが明らかとなった。
【００３９】
抗血清のエピトープ解析
アルキル鎖の異なる１級アミンとＡＣＲの１対２のホルミルデヒドロピペリジン構造を有するＡＣＲ−アミン付加体を調製し、これら化合物についての交差性を検討した。一級アミンとしては、メチルアミン（略語：ＭｅＮＨ2 ）、エチルアミン（略語：ＥｔＮＨ2 ）、ノルマルプロピルアミン（略語：ＰｒＮＨ2 ）、ノルマルブチルアミン（略語：ＢｕＮＨ2 ）およびノルマルヘキシルアミン（略語：ＨｅＮＨ2 ）を用い、前記付加体の調製条件に従って各ＡＣＲ−アミン付加体、即ち、ＡＣＲ−ＭｅＮＨ2 、ＡＣＲ−ＥｔＮＨ2 、ＡＣＲ−ＰｒＮＨ2 、ＡＣＲ−ＢｕＮＨ2 、ＡＣＲ−ＨｅＮＨ2 を調製した。加えてＡＣＲ−Ｎ−α−アセチルリジン付加体（略語：ＡＣＲ−Ｌｙｓ）を常法に従って作製し、上記の各ＡＣＲ−アミン付加体の対照系とした。これらの付加体に対する本発明の抗血清の交差性を評価しエピトープ解析を行った。
【００４０】
尚、交差性の評価については、前記「抗血清の特性評価法」において、９６穴イムノプレートに前記「抗血清の反応特異性評価」で調製したＡＣＲ−ＢＳＡ付加体を吸着させてＴＴＢＳで１０００倍希釈した本発明の抗血清（１次抗体）に上記の各種ＡＣＲ−アミン付加体を加えて測定する競合酵素免疫測定法に基づいて行った。その結果を縦軸に競合物質の阻害率（Ｂ／Ｂ0 ：尚、ＢとＢ0 はそれぞれ競合物質の存在下、非存在下における吸光度を示す）、横軸に競合物質の濃度を採ったグラフとして図２に示す。
【００４１】
図２よれば、アルキル鎖の炭素数が２〜６のものは本発明の抗血清と高い親和性を有し、炭素数２以上のアルキル鎖を認識するエピトープであることが明らかである。
【００４２】
抗血清の有用性−１
２０μＭのＬＤＬ溶液０．５ｍｌと１００μＭの銅イオン溶液０．１ｍｌを混合し、５０ｍＭリン酸緩衝液で１ｍｌとした後、３７℃で２４時間インキュベートし、酸化ＬＤＬを調製した。この試料を用い、本抗血清を用いた酵素免疫測定を前記「抗血清の特性評価法」に従って実施し、その結果を縦軸に吸光度、横軸にインキュベーション時間を採ったグラフとして図３に示す。
【００４３】
図３によれば、銅イオン処理による酸化ＬＤＬ中には、ＡＣＲ付加体すなわちホルミルデヒドロピペリジン−リジン構造を有する化合物が存在することが明らかであり、生体中でのＡＣＲ付加体分析への研究に有用である。
【００４４】
抗血清の有用性−２
２０ｍＭのアラキドン酸溶液１ｍｌ、１０ｍＭアラキドン酸溶液と１０ｍＭグルコース溶液の１：１混合液１ｍｌ、１００ｍＭのグルコース溶液１ｍｌ、１０ｍＭのグルコース溶液１ｍｌおよび１０ｍＭのアスコルビン酸溶液１ｍｌに、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を１ｍｇ／ｍｌとなるように加え、３７℃で１〜４週間インキュベートした。この試料を用い、本発明の抗血清を用いた酵素免疫測定を前記「抗血清の特性評価法」に従って実施し、その結果を縦軸に吸光度、横軸にインキュベーション時間を採ったグラフとして図４に示す。
【００４５】
図４によれば、アラキドン酸系のみに、ＡＣＲ付加体すなわちホルミルデヒドロピペリジン−リジン構造を有する化合物が存在することが明らかである。生体内で、不飽和脂肪酸であるアラキドン酸からのＡＣＲ付加体生成は未だ証明されていないが、これらの研究において本発明の抗血清は有用であり、また、今後、ＡＣＲ付加体生成が証明されれば、本発明の抗血清はその応用において有用となる。
【００４６】
【発明の効果】
本発明は、ホルミルデヒドロピペリジン−リジン構造を持つアクロレイン−リジン付加体を特異的に認識する特徴を有する。本発明の抗血清は、アクロレインで修飾したカギアナカサガイから得たヘモシアニンを抗原とし、恒温動物に免疫して抗血清を採取することにより本発明の抗血清を簡便に効率よく製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】特定の蛋白質への種々のアルデヒド付加修飾物に対する本発明の抗血清の交差性について、酵素免疫測定法により測定したグラフである。
【図２】抗ホルミルデヒドロピペリジン−リジン抗体を含有する本発明の抗血清の認識部位について、種々のアミンをＡＣＲ修飾したものを競合物質として用い、競合酵素免疫測定法により測定した結果を示すグラフである。
【図３】酸化ＬＤＬに対する本発明の抗血清の親和性を示すグラフである。
【図４】酸化アラキドン酸に対する本発明の抗血清の親和性を示すグラフである。
【図１】
0004602488.tif 000007
【図２】
0004602488.tif 000008
【図３】
0004602488.tif 000009
【図４】
0004602488.tif 000010