(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ型１倍体酵母のＣＡＲ１遺伝子を遺伝子破壊操作してなるＣＡＲ１遺伝子破壊ａ型１倍体酵母と、α型１倍体酵母のＣＡＲ１遺伝子を遺伝子破壊操作してなるＣＡＲ１遺伝子破壊α型１倍体酵母を交雑してなる、流加培養した場合に菌体内にグルタミン酸を高蓄積するａ／α型２倍体冷凍生地耐性実用パン酵母。
【請求項２】
２倍体にしたとき実用パン酵母となるａ型１倍体酵母のＣＡＲ１遺伝子を遺伝子破壊操作してなるＣＡＲ１遺伝子破壊ａ型１倍体酵母と、２倍体にしたとき実用パン酵母となるα型１倍体酵母のＣＡＲ１遺伝子を遺伝子破壊操作してなるＣＡＲ１遺伝子破壊α型１倍体酵母を交雑してなる、流加培養した場合に菌体内にグルタミン酸を高蓄積するａ／α型２倍体冷凍生地耐性実用パン酵母。
【請求項３】
該１倍体酵母のＣＡＲ１遺伝子の遺伝子破壊操作がＣＡＲ１遺伝子内への栄養要求性マーカー遺伝子の挿入であることを特徴とする請求項１又は２に記載の酵母。
【請求項４】
流加培養した場合に菌体内にグルタミン酸を高蓄積する２倍体冷凍生地耐性実用パン酵母、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＣＡ１１８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７０４２）。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載した２倍体冷凍生地耐性実用パン酵母を流加培養した菌体を用いてパン生地を作り、これを前発酵し、次いで冷凍してなる２倍体冷凍生地耐性実用パン酵母含有冷凍パン生地。
【請求項６】
請求項５に記載した冷凍パン生地を、解凍し、発酵し、焼成して得られた２倍体冷凍生地耐性実用パン酵母含有冷凍パン生地からのパン。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規にしてきわめて有用な冷凍生地耐性実用パン酵母に関するものである。本発明に係る実用パン酵母は、冷凍耐性にすぐれ、凍結融解における生地発酵力の低下が少ないという特徴を有し、冷凍パン生地からすぐれた品質のパンを製造するのに有利に使用できる。
【０００２】
【従来の技術】
近年、製パン業界においては、製パン工程の合理化及び焼きたてパンの供給という生産者及び消費者サイドからの要求から、冷凍生地によるパンの製造が注目され、一部は既に実施されている。そして、この場合、パン酵母としては従来のパン酵母を使用したのでは所期の目的を達成することはできず、冷凍耐性を有するパン酵母が使用されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、従来から知られている冷凍耐性酵母は、未だ冷凍耐性が充分であるとはいえず、改良の余地が残されており、現時点において、最終的に美味なパンを作ることのできる冷凍生地耐性実用パン酵母は未だ得られていないのが現状である。本発明は、このような技術の現状に鑑み、冷凍耐性にすぐれた新規な冷凍生地耐性実用パン酵母を創製し、また、このパン酵母を用いて冷凍生地を創製し、更にまたこの冷凍生地を用いて美味なパンを製造するトータルシステムを新たに構築する目的でなされたものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記目的を達成するためになされたものであって、すぐれた冷凍生地耐性実用パン酵母を開発するために各方面から検討した結果、本発明者らは、酵母の冷凍耐性に菌体内アミノ酸蓄積量が影響する点に着目した。そして、アミノ酸の内、アルギニンにはじめて着目し、アルギニン代謝酵素のひとつであるアルギナーゼをコードする遺伝子（ＣＡＲ１遺伝子）を破壊した酵母を創製したところ、このアルギナーゼ遺伝子（ＣＡＲ１）破壊株は、グルタミン酸やアルギニン蓄積量が野生型株に比して高く、凍結融解における生地発酵力の低下が野生型株に比して顕著に少いという新知見を得た。
【０００５】
本発明は、この新規ＣＡＲ１遺伝子破壊株が卓越した冷凍耐性を示すという上記した有用新知見に基づき、更に研究の結果、遂に完成されたものである。以下、本発明について詳述する。
【０００６】
現在わが国で市販されている実用パン酵母は２倍体がほとんどであり、しかもその大半がａ／α型である。このような当業界の現状において本発明はなされたものであって、本発明は、２倍体にしたとき実用パン酵母となる１倍体酵母のＣＡＲ１遺伝子を遺伝子破壊操作してなるＣＡＲ１遺伝子破壊１倍体酵母に関するものであり、また、ＣＡＲ１遺伝子の遺伝子破壊操作方法を新たに提供するものである。更に、本発明は、このＣＡＲ１遺伝子破壊１倍体酵母を１もしくは２以上用いて交雑してなる２倍体以上の倍数体冷凍生地耐性実用パン酵母に関するものである。
【０００７】
更に本発明は、上記した２倍体以上の倍数体冷凍生地耐性実用パン酵母を用いてパン生地を作り、これを前発酵し、次いで冷凍してなる冷凍生地耐性実用パン酵母含有冷凍パン生地、及びこの冷凍パン生地を常法にしたがって解凍、発酵、焼成してなる風味のすぐれたパンに関するものである。
【０００８】
本発明を実施するには、先ず、２倍体にしたとき実用パン酵母となる１倍体酵母を選別する必要があるが、これは常法にしたがって行えばよく、型のきまった１倍体酵母との接合の有無により、ａ型かα型を確定する。
【０００９】
ＣＡＲ１遺伝子の遺伝子破壊操作は、１倍体酵母が有するＣＡＲ１遺伝子（アルギナーゼ遺伝子）内に、ＵＲＡ３（ウリジル酸合成酵素）（Gene 29 : 113-124(1984))やＡＤＥ２、ＬＹＳ２などの栄養要求性マーカー遺伝子を挿入すればよい。その結果、ＣＡＲ１遺伝子は破壊されて発現しなくなり、代りに挿入されたＵＲＡ３や栄養要求性マーカー遺伝子が発現して、遺伝子破壊を確認することができる。なお、挿入するＵＲＡ３や他のマーカー遺伝子は、セルフクローニングを達成するために、サッカロミセス・セレビシエ、特にパン酵母のものが好ましい。
【００１０】
１倍体菌株からｕｒａ３（遺伝子マーカーとしてのＵＲＡ３欠損株）を選択するには、５−フルオロオロチン酸含有培地で選択すればよく、この培地で生育した菌株は、自然突然変異によってＵＲＡ３遺伝子を欠損している。これらの菌株は、ウラシルを除く培地上では生育しないが、ＵＲＡ３を含有するプラスミド、ＹＣｐ５０等によって形質転換することにより、ウラシルを除く培地上で生育出来るようになるので、ＵＲＡ３の欠損が確認できる。
【００１１】
ＣＡＲ１遺伝子の破壊は、ＣＡＲ１遺伝子が発現してアルギナーゼを作り、これがアルギニンを分解することを防止すれば、その結果、アミノ酸高蓄積株になって目的を達成することができるので、ＣＡＲ１の全部もしくは１部を削除してもよいし、本発明実施例に詳述するようにＵＲＡ３をＣＡＲ１遺伝子全部ないし一部領域内に挿入することによって、ＣＡＲ１遺伝子の破壊を行ってもよい。
【００１２】
ＣＡＲ１遺伝子としては、酵母から切り出したり、化学合成法やＰＣＲ法等によって製造したＣＡＲ１遺伝子の全部領域又は一部領域を使用する。このクローニングした領域をプラスミドに挿入し、次いでこの領域にＵＲＡ３遺伝子を挿入し、得られたプラスミドを必要に応じて大腸菌等で大量にふやした後、このプラスミドから挿入遺伝子のＤＮＡ断片のみを切り出し、単離したものをそのまま酢酸リチウム法によって、２倍体にしたとき実用パン酵母となる１倍体酵母（例えば、上記によって得たｕｒａ３株（ＵＲＡ３遺伝子欠損株））に形質転換する（図１）。
【００１３】
ＣＡＲ１遺伝子は、アルギニン代謝酵素のひとつであるアルギナーゼをコードするアルギナーゼ遺伝子であって、その塩基配列は、配列表の配列番号１、図２に示される。また、それに対応する蛋白質（アルギナーゼ）のアミノ酸配列は配列番号２、及び、図３、図４に示される。またＵＲＡ３遺伝子は、ウリジル酸合成酵素をコードする遺伝子であって、その塩基配列は、配列番号３、及び、図５、図６（上段）に示され、それに対応する蛋白質（ウリジル酸合成酵素）のアミノ酸配列は、配列番号４、及び図５、図６（下段）に示される。
【００１４】
１倍体酵母に入ったＣＡＲ１（前部）−ＵＲＡ３−ＣＡＲ１（後部）は、細胞分裂に際し、１倍体酵母のＣＡＲ１（全部ないしは一部領域）にＵＲＡ３を余すように結合・組換えをおこし、これらの結合が切断されて分かれてしまい（つまり、ＣＡＲ１を前部と後部に、ＵＲＡ３をはさんで完全にわけてしまい）、遺伝子破壊は完成する。したがって、ＣＡＲ１遺伝子が発現することはない。
【００１５】
ここに得られるＣＡＲ１遺伝子破壊１倍体酵母は、既にａ型かα型かは定まっており、また、２倍体にしたとき実用パン酵母になるすぐれた性質は有するもので、遺伝子破壊操作ではＣＡＲ１遺伝子のみが破壊され、その他のすぐれた性質を生む遺伝子はそのままである。本発明では、２倍体にしたとき実用パン酵母となる１倍体酵母のＣＡＲ１遺伝子を遺伝子破壊操作してなる酵母を１もしくは２以上用いて交雑し、２倍体以上の倍数体冷凍生地耐性実用パン酵母を得る。
【００１６】
これらの内、好ましい酵母としては、例えばａ型ＣＡＲ１遺伝子破壊１倍体酵母とα型ＣＡＲ１遺伝子破壊１倍体酵母を交雑して得られた２倍体酵母が非限定的に例示される。得られた２倍体パン酵母の内の１株（ＣＡ１１８株）を、Saccharomyces cerevisiae CA118と命名し、これを工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ  ＢＰ−７０４２として国際寄託した。
【００１７】
このようにして造成した新規な倍数体冷凍生地耐性実用パン酵母は、ＣＡＲ１遺伝子が破壊されており、冷凍耐性、特にパン生地を前発酵したものを冷凍した冷凍パン生地における冷凍耐性にきわめてすぐれている。したがって、本発明に係る実用パン酵母は、前発酵した生地中でも凍結状態によく耐え、解凍して発酵させたとき、よくその能力を発揮し、これを焼上げたとき、美味な各種パンを得ることができる。
【００１８】
本発明に係る冷凍パン生地は、上記した倍数体冷凍生地耐性実用パン酵母を使用するほかは常法にしたがって製造すればよいし、パンの製造も、本発明に係る冷凍パン生地を使用するほかは冷凍生地製パンの常法にしたがって行えばよい。
以下、本発明の実施例について述べる。
【００１９】
【実施例１】
（１）実用パン酵母１倍体株のｕｒａ３（ＵＲＡ３欠損株）株の取得
交雑して二倍体株とした場合、市販のパン酵母となりうる性能を保有する野生型の１倍体株（実用パン酵母１倍体株）について、そのｕｒａ３株を取得した。
すなわち、１倍体株をＹＰＤ培地（１％イーストエキス、２％ペプトン、２％グルコース）で培養した後、５−フルオロオロチン酸を含む培地（０．７％  ＹＥＡＳＴ  ＮＩＴＲＯＧＥＮ  ＢＡＳＥ（ＤＩＦＣＯ）、２％グルコース、０．１％５−フルオロオロチン酸、０．０５％ウラシル、２％寒天）に塗沫した後、３０℃で３日間培養し、生育したコロニーを選別した。
【００２０】
（２）ＣＡＲ１遺伝子のクローニング
ＣＡＲ１遺伝子を破壊するために、ＣＡＲ１遺伝子の一部領域をクローニングした。クローニングはＰＣＲ法により行った。すなわち酵母染色体ＤＮＡを鋳型として、下記の配列をプライマーとして用いた。９４℃で５分間インキュベートした後に、９４℃１分、４５℃１分、７２℃１分の条件で３０サイクルのＰＣＲ反応を行った。これらのプライマーは配列表の配列番号５、６に示した。
0004580055.tif 000002
【００２１】
（３）ＣＡＲ１破壊用ベクターの作成（図７）
ＰＣＲ反応で得られた約０．５ｋｂのＤＮＡ断片を市販されているプラスミドベクターｐＧＥＭ−Ｔに挿入し、プラスミドｐＡＲＧ１を作製した。ここに、公知のプラスミドＹＥｐ２４を制限酵素ＨｉｎｄIIIで消化して得られるＵＲＡ３遺伝子のＤＮＡ断片を挿入することにより、プラスミドｐＡＲＧ２を作製した。
【００２２】
（４）ＣＡＲ１遺伝子破壊１倍体株の作成
プラスミドｐＡＲＧ２を制限酵素ＰｖｕIIで消化することにより得られる挿入遺伝子のＤＮＡ断片のみを切り出し、単離したものを酢酸リチウム法により１倍体酵母（ｕｒａ３）に導入した。ここでウラシル要求性を示さない株を選抜することにより、形質転換によりＣＡＲ１遺伝子が破壊された株を選別することができた。
【００２３】
（５）交雑による２倍体株の作成
こうして得られたＣＡＲ１遺伝子破壊された１倍体株を交雑することにより２倍体の実用パン酵母を得た。同様に野生型株の１倍体を交雑することにより親株となる２倍体の実用パン酵母を得た。すなわち野生型株の１倍体同士を掛け合わせたＴ１１８株と、遺伝子組換えによりＣＡＲ１遺伝子が破壊された１倍体同士を掛け合わせたＣＡ１１８株を造成した。
【００２４】
上記した菌株は、下記に示すとおりである。これらの菌株は、いずれも農林水産省  食品総合研究所  酵母研究室に保管されており、希望者は容易に入手することができるだけでなく、ＣＡ１１８株は生命研にＦＥＲＭ  ＢＰ−７０４２として寄託されている。また、親株であるＴ１１８株も、Saccharomyces cerevisiae T118として同じく生命研に寄託されているので（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６０９６）、本実施例その他本明細書の記載によれば、容易に本発明を実施することができ、本発明の効果を確認することができる。
【００２５】
（菌株）
0004580055.tif 000003
【００２６】
【実施例２】
（２倍体株の培養試験）
流加培養試験は、ＹＭＰＤ培地（０．３％、イーストエキス、０．３％マルトエキス、０．５％ペプトン、３％グルコース）で培養した酵母菌体１．２ｇを種酵母として糖蜜、ウレア、リン酸１ナトリウム２水和物を用いて、糖蜜を連続流加した。
バッチ培養試験はＹＭＰＤ培地で３０℃４８時間培養することにより、酵母菌体を得た。
【００２７】
（１）アミノ酸含量
培養した菌体を集菌した後、熱水抽出（１００℃、５分）を行い、菌体内のアミノ酸をアミノ酸アナライザーにて測定した。得られた結果を図８に示す。なお、図中、各株におけるアミノ酸含量の測定結果は、それぞれ、左から順にＧｌｕ、Ａｒｇ、Ｐｒｏの結果を示す。
【００２８】
流加培養した場合にはＴ１１８株とＣＡ１１８株を比較すると遊離のグルタミン酸の含量が増大していることがわかる。
また、実験室レベルで行われるＹＭＰＤ培地における培養試験を実施し、同様にアミノ酸含量を測定した。このときは培地中の窒素源の形態が違うため、細胞内の遊離アミノ酸のバランスが流加培養時とまったく異なることがわかる。
Ｂａｔｃｈ培養時にはＣＡＲ１遺伝子破壊により菌体内のアルギニン含量が増大していた。
このように培養法の違いにより菌体内遊離アミノ酸のバランスはまったく異なるため、実用化に即した冷凍耐性を判定するためには実用レベルを模した培養条件で試験を行う必要がある。
【００２９】
（２）発酵過程
流加培養により得られた菌体を用いて、液系での発酵試験を行った。すなわち、酵母菌体をＧ１０培地（１０％グルコース）に接種し、３０℃で振とう培養した。ここで１０分おきに菌体をサンプリングして、アミノ酸含量を測定した。
【００３０】
実際冷凍生地における製パン時には、冷凍前に一度パン生地中で発酵する過程（前発酵）が入る。このとき当然菌体内の遊離アミノ酸含量は変化することが考えられ、特に凍結直前の遊離アミノ酸含量が冷凍生地耐性を左右すると考えられる。そこで培養終了時に最も蓄積量の差が大きいグルタミン酸について発酵過程における消長を観察した。得られた結果を図９に示す。Ｔ１１８株とＣＡ１１８株を比較すると、初発でグルタミン酸の含量の差が最も大きく、発酵が進むにしたがいその差は縮まっていくことが判る。
【００３１】
【実施例３】
実施例１で造成したＣＡＲ１遺伝子破壊株とその野生型株の２倍体の流加培養試験で得られた菌体について、冷凍生地耐性について評価した。
実施例１の実験結果において、実験室レベルで行われるバッチ培養と実際にパン酵母製造時に行われる糖蜜を用いた流加培養とでは、酵母細胞内の遊離アミノ酸の構成比がまったく異なるため、バッチ培養した菌体を用いた冷凍生地試験は無意味であるため、今回流加培養した菌体を用いて冷凍生地耐性を評価した。
【００３２】
（冷凍生地試験）
凍結区：低糖生地の配合（小麦粉１００ｇ、イースト２ｇ、砂糖６ｇ、塩２ｇ、水６５ｍｌ）で混合したパン生地を４０ｇずつ分割し、３０℃の恒温槽で６０分または１２０分発酵させた後、−２０℃で凍結保存した。凍結２週間後、生地を３０℃で１時間解凍し、ファーモグラフ（ＡＴＴＯ社製）で炭酸ガス発生量（ｍｌ／１２０分）を測定した。
【００３３】
非凍結区：低糖生地の配合で混合したパン生地を４０ｇずつ分割し、３０℃の恒温槽で６０分または１２０分発酵させた後、ファーモグラフ（ＡＴＴＯ社製）で炭酸ガス発生量（ｍｌ／１２０分）を測定した。冷凍生地耐性については非凍結区の２時間発酵で生成した炭酸ガス量に対する凍結区の２時間発酵で生成した炭酸ガス量の百分率で表した。得られた結果を下記表１に示す。
【００３４】
0004580055.tif 000004
【００３５】
上記結果から明らかなようにＴ１１８株とＣＡ１１８株を比較した場合、ＣＡＲ１遺伝子の破壊によりグルタミン酸の蓄積が向上したＣＡＲ１遺伝子破壊株は、野生型株に比較して冷凍生地耐性が向上していた。
また前発酵時間が短いときのほうがより遺伝子破壊効果が顕著であり、これは発酵過程において、初発でグルタミン酸の含量の差が最も大きく、発酵が進むにしたがいその差は縮まっていく事実と一致する。
【００３６】
以上の結果より、ＣＡＲ１遺伝子を破壊することにより酵母細胞中のグルタミン酸含量を増大させることに成功し、結果、冷凍生地耐性を向上させることができた。
【００３７】
【実施例４】
（冷凍生地耐性実用パン酵母含有冷凍パン生地）
本発明に係るパン酵母ＣＡ１１８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７０４２）及びその親株であるＴ１１８を圧搾して市販イーストと同様の形状となし、これを用いて下記の配合及び製パン条件にて冷凍生地製パン試験をおこなった。
【００３８】
（配合割合）
小麦粉          １００ｇ
砂糖                ５ｇ
食塩                ２ｇ
イースト            ２ｇ
ショートニング      ５ｇ
水                ６７ｍｌ
【００３９】
（製パン条件）
凍結前発酵      ６０分
冷凍期間        １週間
解凍            ３０℃、９０分
丸め、ベンチ    ３０分
成型
ホイロ          ５５分
焼成            ２５分
【００４０】
焼成したパンを比較すると、親株であるＴ１１８株を用いて製造したパンに比して、アルギナーゼ遺伝子破壊株であるＣＡ１１８株を用いて製造したパンは明らかに品質が優れており、高い冷凍生地耐性を示した。
【００４１】
【発明の効果】
本発明に係る冷凍生地耐性実用パン酵母は、ＣＡＲ１が破壊されているため、アミノ酸蓄積量が高く、凍結融解における生地発酵力の低下がきわめて少なく、すぐれた冷凍耐性を示す。
【００４２】
【配列表】
0004580055.tif 000005
0004580055.tif 000006
0004580055.tif 000007
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0004580055.tif 000010
【図面の簡単な説明】
【図１】ＣＡＲ１遺伝子破壊株の作成図である。
【図２】ＣＡＲ１遺伝子の塩基配列を示す。
【図３】ＣＡＲ１遺伝子の塩基配列に対応するアミノ酸配列１を示す。
【図４】ＣＡＲ１遺伝子の塩基配列に対応するアミノ酸配列２を示す。
【図５】ＵＲＡ３遺伝子の塩基配列及びそれぞれ対応するアミノ酸配列１を示す。
【図６】ＵＲＡ３遺伝子の塩基配列及びそれぞれ対応するアミノ酸配列２を示す。
【図７】ＣＡＲ１遺伝子破壊用ベクターの作成図である。
【図８】アミノ酸蓄積量を示す。
【図９】グルタミン酸の消長を示す。
【図１】
0004580055.tif 000011
【図２】
0004580055.tif 000012
【図３】
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【図４】
0004580055.tif 000014
【図５】
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【図６】
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【図７】
0004580055.tif 000017
【図８】
0004580055.tif 000018
【図９】
0004580055.tif 000019