(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一定の温度で試料中の特定塩基配列を含む１本鎖ＲＮＡを標的とし、前記特定塩基配列からなるＲＮＡを増幅後、分析するための簡便で精度の高い方法であって、少なくとも以下（Ａ）〜（Ｉ）の試薬を用い、試料にこれらを順次添加するか、これらの２以上を一度に添加するか又はこれらを一度に添加する操作（（Ａ）〜（Ｉ）は、この順に添加することを要しない）と、少なくとも試薬（Ａ）〜（Ｈ）を添加後に試薬（Ｉ）共存下で蛍光信号を１度以上測定する操作を含む方法；
（Ａ）前記１本鎖ＲＮＡを切断し、その切断部の５’末端から前記特定塩基配列が始まるようにするための、前記特定塩基配列の５’側隣接配列に相補的な配列を有する第１の１本鎖オリゴ核酸、
（Ｂ）特定塩基配列３’末端配列に相補的な配列を有する第２の１本鎖オリゴＤＮＡ、
（Ｃ）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース、
（Ｄ）デオキシリボヌクレオシド三燐酸、
（Ｅ）５’末端側から順に
（１）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレースのプロモーター配列、（２）該プロモーターのエンハンサー配列及び（３）特定塩基配列の５’末端配列と同一の塩基配列を有する第３の１本鎖オリゴＤＮＡ、
（Ｆ）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース、
（Ｇ）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレース、
（Ｈ）リボヌクレオシド三燐酸、及び、
（Ｉ）特定塩基配列に相補的な配列を有し、該配列を有する核酸と結合した場合に測定可能な蛍光信号を発するように標識された第４の１本鎖オリゴＤＮＡ。
【請求項２】
試薬（Ａ）における第１の１本鎖オリゴ核酸としてＤＮＡを用いること、及び、ＲＮａｓｅＨを添加する操作と、該操作の後でかつ試薬（Ｂ）の添加に先立ち、昇温によりＲＮａｓｅＨを失活させる操作又はＲＮａｓｅＨを失活させる阻害剤を添加する操作を行うことを特徴とする請求項１の方法。
【請求項３】
試薬（Ａ）の添加後、試薬（Ｂ）〜（Ｈ）を一度に添加し、更に試薬（Ｉ）を添加することを特徴とする請求項２の方法。
【請求項４】
試薬（Ａ）の添加後、試薬（Ｂ）〜（Ｉ）を一度に添加することを特徴とする請求項３の方法。
【請求項５】
更にジメチルスルホオキサイド及び／又はＤＮＡ−ＲＮＡ２本鎖中のＲＮＡを分解する酵素を用いることを特徴とする請求項１の方法。
【請求項６】
ジメチルスルホオキサイドが５〜２０％の濃度範囲であることを特徴とする請求項５の方法。
【請求項７】
ＤＮＡ−ＲＮＡ中のＲＮＡを分解する酵素として、試薬（Ｃ）におけるＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースを用いることを特徴とする請求項５の方法。
【請求項８】
試薬（Ｃ）及び（Ｆ）におけるＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースとＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースとして両ポリメレース活性を有する同一の酵素を用い、これにより試薬（Ｃ）又は（Ｆ）の添加操作を省略することを特徴とする請求項１の方法。
【請求項９】
前記酵素がトリ筋芽細胞腫ウイルスポリメレースであることを特徴とする請求項８の方法。
【請求項１０】
試薬（Ｂ）及び（Ｅ）における第２のオリゴＤＮＡ及び第３のオリゴＤＮＡとして、それぞれ０．０２〜１μＭのＤＮＡを用いることを特徴とする請求項１の方法。
【請求項１１】
試薬（Ｇ）におけるＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレースとしてファージＳＰ６ポリメレース、ファージＴ３ポリメレース又はファージＴ７ポリメレースから選ばれる１種以上の酵素を用いることを特徴とする請求項１の方法。
【請求項１２】
試薬（Ｉ）における第４のオリゴＤＮＡとして、インターカレーター性蛍光色素が結合されたＤＮＡを用い、ここで該インターカレーター性蛍光色素は、該ＤＮＡが核酸と相補結合を形成すると２本鎖部分にインターカレーションして蛍光特性が変化するものであることを特徴とする請求項１の方法。
【請求項１３】
試薬（Ｉ）における第４のオリゴＤＮＡが、その３’末端部分に特定塩基配列に非相補的な配列を含み、又は、その３’末端部分が修飾されたＤＮＡであることを特徴とする請求項１又は１２の方法。
【請求項１４】
測定された蛍光信号又は測定された蛍光信号の経時的変化から試料に存在した１本鎖ＲＮＡの存在を検出し又はその存在量を推定する操作を含む請求項１の方法。
【請求項１５】
添加される試薬がいずれも塩化物を含まない試薬であることを特徴とする請求項１の方法。
【請求項１６】
更に酢酸塩を用いることを特徴とする請求項１の方法。
【請求項１７】
酢酸塩が５〜２０ｍＭの濃度範囲の酢酸マグネシウム又は５０〜２００ｍＭの濃度範囲の酢酸カリウムであることを特徴とする請求項１６の方法。
【請求項１８】
更にソルビトールを用いることを特徴とする請求項１の方法。
【請求項１９】
一定の温度で特定塩基配列の核酸を製造するための簡便な方法であって、少なくとも以下（Ａ）〜（Ｇ）の試薬を用い、５’末端側から順に（１）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレースのプロモーター配列、（２）該プロモーターのエンハンサー配列及び（３）特定塩基配列を有する１本鎖ＤＮＡ、又は、該ＤＮＡと該ＤＮＡの相補鎖からなる２本鎖ＤＮＡにこれらを順次添加するか、これらの２以上を一度に添加するか又はこれらを一度に添加する操作（（Ａ）〜（Ｈ）は、この順に添加することを要しない）と、少なくとも試薬（Ａ）〜（Ｇ）の添加後に試薬（Ｈ）の共存下で蛍光信号を１度以上測定する操作を含む方法；
（Ａ）特定塩基配列３’末端配列に相補的な配列を有する１本鎖オリゴＤＮＡ、
（Ｂ）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース、
（Ｃ）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース、
（Ｄ）デオキシリボヌクレオシド三燐酸、
（Ｅ）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレース、
（Ｆ）リボヌクレオシド三燐酸、
（Ｇ）５’末端側から順に
（１）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレースのプロモーター配列、（２）該プロモーターのエンハンサー配列及び（３）特定塩基配列の５’末端配列と同一の塩基配列を有する１本鎖オリゴＤＮＡ、及び、
（Ｈ）特定塩基配列に相補的な配列を有し、該配列を有する核酸と結合した場合に測定可能な蛍光信号を発するように標識された１本鎖オリゴＤＮＡ。
【請求項２０】
測定された蛍光信号又は測定された蛍光信号の経時的変化が所定量の特定塩基配列核酸が製造されたことを示した場合に、ＤＮａｓｅを添加して特定塩基配列の１本鎖ＲＮＡを得ることを特徴とする請求項１９の方法。
【請求項２１】
測定された蛍光信号又は測定された蛍光信号の経時的変化が所定量の特定塩基配列核酸が製造されたことを示した場合に、ＲＮａｓｅを添加して特定塩基配列のＤＮＡとその相補鎖からなる２本鎖ＤＮＡを得ることを特徴とする請求項１９の方法。
【請求項２２】
請求項１又は１９の方法を実施するための試薬であって、少なくとも、
１本鎖ＲＮＡを切断し、その切断部の５’末端から特定塩基配列が始まるようにするための、特定塩基配列の５’側隣接配列に相補的な配列を有する第１の１本鎖オリゴ核酸を含む第１試薬、
トリス酢酸塩、酢酸マグネシウム、酢酸カリウム、ソルビトール及びジメチルスルホオキシドを含む第２試薬、
ジチオスレイトール、デオキシリボヌクレオシド三燐酸、リボヌクレオシド三燐酸、牛血清アルブミン、特定塩基配列３’末端配列に相補的な配列を有する第２の１本鎖オリゴＤＮＡ及び５’末端側から順に（１）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレースのプロモーター配列、（２）該プロモーターのエンハンサー配列及び（３）特定塩基配列の５’末端配列と同一の塩基配列を有する第３の１本鎖オリゴＤＮＡを含む第３試薬、
ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレース及びＲＮａｓｅ阻害剤を含む第４試薬、そして
特定塩基配列に相補的な配列を有し、該配列を有する核酸と結合した場合に測定可能な蛍光信号を発するように標識された第４の１本鎖オリゴＤＮＡを含む第５試薬、
から構成される、前記試薬。
【請求項２３】
請求項１又は１９の方法を実施するための試薬であって、少なくとも、
１本鎖ＲＮＡを切断し、その切断部の５’末端から特定塩基配列が始まるようにするための、特定塩基配列の５’側隣接配列に相補的な配列を有する第１の１本鎖オリゴ核酸を含む第１試薬、
トリス酢酸塩、酢酸マグネシウム、酢酸カリウム、ソルビトール及びジメチルスルホオキシドを含む第２試薬、
ジチオスレイトール、デオキシリボヌクレオシド三燐酸、リボヌクレオシド三燐酸、牛血清アルブミン、特定塩基配列３’末端配列に相補的な配列を有する第２の１本鎖オリゴＤＮＡ、５’末端側から順に（１）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレースのプロモーター配列、（２）該プロモーターのエンハンサー配列及び（３）特定塩基配列の５’末端配列と同一の塩基配列を有する第３の１本鎖オリゴＤＮＡ及び特定塩基配列に相補的な配列を有し、該配列を有する核酸と結合した場合に測定可能な蛍光信号を発するように標識された第４の１本鎖オリゴＤＮＡを含む第３試薬、そして、
ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレース及びＲＮａｓｅ阻害剤を含む第４試薬、
から構成される、前記試薬。
【請求項２４】
請求項１又は１９の方法を実施するための試薬であって、少なくとも、
１本鎖ＲＮＡを切断し、その切断部の５’末端から特定塩基配列が始まるようにするための、特定塩基配列の５’側隣接配列に相補的な配列を有する第１の１本鎖オリゴ核酸を含む第１試薬、
トリス酢酸塩、酢酸マグネシウム、酢酸カリウム、ソルビトール及びジメチルスルホオキシドを含む第２試薬、
ジチオスレイトール、デオキシリボヌクレオシド三燐酸、リボヌクレオシド三燐酸、牛血清アルブミン、特定塩基配列３’末端配列に相補的な配列を有する第２の１本鎖オリゴＤＮＡ及び５’末端側から順に（１）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレースのプロモーター配列、（２）該プロモーターのエンハンサー配列及び（３）特定塩基配列の５’末端配列と同一の塩基配列を有する第３の１本鎖オリゴＤＮＡを含む第３試薬、そして、
特定塩基配列に相補的な配列を有し、該配列を有する核酸と結合した場合に測定可能な蛍光信号を発するように標識された第４の１本鎖オリゴＤＮＡ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレース及びＲＮａｓｅ阻害剤を含む第４試薬、
から構成される、前記試薬。
【請求項２５】
請求項１又は１９の方法を実施するための試薬であって、少なくとも、
１本鎖ＲＮＡを切断し、その切断部の５’末端から特定塩基配列が始まるようにするための、特定塩基配列の５’側隣接配列に相補的な配列を有する第１の１本鎖オリゴ核酸、特定塩基配列３’末端配列に相補的な配列を有する第２の１本鎖オリゴＤＮＡ、５’末端側から順に（１）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレースのプロモーター配列、（２）該プロモーターのエンハンサー配列及び（３）特定塩基配列の５’末端配列と同一の塩基配列を有する第３の１本鎖オリゴＤＮＡ、特定塩基配列に相補的な配列を有し、該配列を有する核酸と結合した場合に測定可能な蛍光信号を発するように標識された第４の１本鎖オリゴＤＮＡ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレース、デオキシリボヌクレオシド三燐酸、リボヌクレオシド三燐酸、トリス酢酸塩、酢酸マグネシウム、酢酸カリウム、ソルビトール、ジメチルスルホオキシド、ジチオスレイトール、牛血清アルブミン及びＲＮａｓｅ阻害剤を含む、前記試薬。
【請求項２６】
少なくとも、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース及びＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースとして両ポリメレース活性を有する同一の酵素を含むことを特徴とする請求項２２〜２５いずれかの試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、試料中の特定塩基配列を含む１本鎖ＲＮＡを分析するための方法に関するものであり、ウイルスのＲＮＡや細菌のｍＲＮＡの定性・定量を可能とし、感染症の診断やその治療を目的とした薬剤の効果の判定に有効な方法である。また本発明は、特定の核酸塩基配列からなるＤＮＡやＲＮＡを大量に製造する方法に関するものであり、有用遺伝子のクローニングや未知遺伝子の探索等に有効な方法である。更に本発明は、これら方法に用いる試薬セット等に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
生体成分の分析には高い特異性と感度が求められる。特定塩基配列を含む核酸（標的核酸）の分析では、該核酸が特定塩基配列に相補的な配列を有する核酸  （核酸プローブ）と配列特異的に複合体を形成する性質が利用される。
【０００３】
標的核酸の定量には、形成された複合体の量に関連した測定可能な信号を得る手段が重要であるが、一般的に臨床診断等の目的においては、試料中に存在し得る標的核酸量は極微量であることから、該手段は高感度なものでなければならない。
【０００４】
従来より、試料中の標的核酸を定量する方法として、膜、ビーズ、ゲル等の固相の表面上に測定可能な信号を発するように標識した核酸プローブと標的核酸との複合体を形成する工程を含むサンドイッチアッセイと呼ばれる方法が用いられてきた。具体的には、それぞれ標的核酸中の異なる特定塩基配列に配列特異的な２種類の核酸プローブを用い、その第１の核酸プローブは、測定可能な信号を発するよう、例えば可視部に色を持つ色素、蛍光物質又はこれらを生成し得る酵素等で標識し、第２のプローブは固相表面に固定し、試料にこれらの核酸プローブを添加し、試料中の標的核酸を第１及び第２の核酸プローブと相補結合させて固相表面に複合体を形成させ、引き続き反応液中の上清と固相とを分離して上記複合体形成に関与していない未反応の第１プローブを分離し（Ｂ／Ｆ分離工程）、しかる後に固相表面上の標識物質を測定して標的核酸量を決定する。ここで、標識物として可視部に色を持つ色素や蛍光物質を生成し得る酵素を用いた場合は、上記Ｂ／Ｆ分離工程後、それらの前駆体である酵素基質を反応液に添加し、その反応産物である色素や蛍光物質を測定することになる。
【０００５】
特にウイルス感染症の診断では、臨床試料中の標的核酸（ウイルス核酸）は極微量であることが多いため、高感度かつ良好な再現性の測定を実現するために信号強度を向上し高感度化する目的から、酵素基質として化学発光物質を用いたり、ポリメレースチェインリアクション（ＰＣＲ）法等によって標的核酸を予め増幅しておき、これを試料としてサンドイッチアッセイ法に適用する方策が試みられている。
【０００６】
他のＰＣＲを用いた標的核酸の分析法として、競合ＰＣＲ法が知られている。この方法は、既知濃度の標的核酸に類似した配列を有する核酸（コンペティター）を試料に添加してＰＣＲを実施し、コンペティターにより競合的に阻害された標的核酸の増幅程度から試料中の標的核酸濃度を推定するものである。より具体的には、末端にプライマーと相補的な配列有し、しかも電気泳動等の分離手段によって標的核酸の増幅産物とは識別可能な（例えば鎖長が異なる等）核酸を用意し、これを各種濃度となるように試料に混合し、それらについて同時にＰＣＲを実施するのである。
【０００７】
ＰＣＲを用いた標的核酸の定量方法として、他に担体を用いない均一系での分析法も提案されている。例えば本出願人は、インターカレーター性蛍光色素の存在下でＰＣＲを行い、反応液の蛍光を各ＰＣＲサイクルごとに測定してその変化から標的核酸の初期量を決定する分析法が知られている（特開平５−２３７０００号公報；医学のあゆみ、１７３（１２）、９５９−９６３（１９９５年）；Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２２９、２０７−２１３（１９９５年）参照）。この分析法では、ＰＣＲによる増幅産物が二本鎖ＤＮＡであることから、二本鎖核酸にインターカレーションして蛍光強度が増大する等、その蛍光特性が変化する性質を有するインターカレーター性蛍光色素を用い、これをＰＣＲによる増幅操作前に予め試料溶液に添加し、反応溶液の蛍光強度を経時的に測定してその立ち上がりサイクル等から標的核酸の初期量を決定するのである。更にこの方法には、密閉した反応容器内部の反応液の蛍光強度の測定から標的核酸の増幅の様子を観察することが可能で、試料容器内部から反応液を採取して分析する必要がないため、増幅産物の飛散に由来する擬陽性の惹起という課題を回避できるという効果もある。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
前記サンドイッチ法では、比較的高感度といわれる酵素化学発光法において、発光物質を大量に生産するよう多数の酵素分子を第１プローブに標識したとしても、現状では１０５コピー程度の標的核酸が定量及び検出の限界である。これは、反応液中で第１のプローブがこの不溶性担体に非特異的に吸着して大きな背景信号（バックグラウンド）を発生し、その結果、固相表面上に形成された複合体の測定結果に誤差を与えることとなるからである。
【０００９】
第１プローブの不溶性担体への非特異的吸着を回避する目的で、担体表面を親水化処理、蛋白質等による担体表面の吸着点ブロッキング、そしてＢ／Ｆ分離工程に続いて不溶性担体を十分洗浄したり、洗浄効果を向上するために界面活性剤を含む洗浄液をすること等が試みられている。
【００１０】
しかし、担体表面の化学的な親水化処理等は全ての担体で可能なわけでなく、担体の材質によっては処理できないうえ、技術的に必ずしも容易ではない。また担体表面の吸着点をブロッキングする目的で該表面を蛋白質で被覆しても、被覆蛋白質が第１プローブの核酸部分又は標識と相互作用し、担体への新たな非特異的吸着を招く可能性がある。Ｂ／Ｆ分離工程において担体の洗浄回数を増やすことには操作上の限界があり、洗浄液に界面活性剤を添加する等した場合は担体上に形成された複合体の分解を促す可能性もある。
【００１１】
競合ＰＣＲ法では、１検体を分析するため、想定核酸濃度を含む各種濃度のコンペティターを調製し、これを添加した試料についてＰＣＲを実施する必要がある。しかもＰＣＲの終了後には、試料を反応容器から取り出して電気泳動等の分離操作を行わなければならない。このため自動化が困難であり、多数の検体を迅速に処理する必要性の高い臨床検査に適用するには不適当である。また、試料を反応容器から取り出さなければならないことから、ＰＣＲ法の実際的な応用における課題とされている増幅産物の飛散に由来する擬陽性の惹起という課題を解決し得ない。
【００１２】
インターカレーター性蛍光色素の存在下でＰＣＲを実施する方法では、インターカレーター性蛍光色素が二本鎖核酸にインターカレーションすることを原理としているため、試料中に特定核酸以外の２本鎖ＤＮＡ、例えば大量のゲノムＤＮＡ等、が混在する場合、インターカレーター性蛍光色素がこれらにもインターカレーションして大きなバックグラウンドを生じてしまうという課題がある。また、ＰＣＲ法では特定核酸配列に相補的な一対のオリゴＤＮＡを伸長反応用プラマーとして用いるが、このプライマーの配列によってはこれらが互いに相補結合し、この結果、互いに他方のプライマーを鋳型としてプライマーダイマーが生産されることがある。インターカレーター性蛍光色素は２本鎖核酸に非特異的にインターカレーションするため、このようなプライマーダイマーの生産に由来してバックグラウンドが増加するという課題もある。
【００１３】
また特に臨床診断の分野では、大量の検体について迅速かつ再現性の良い分析を実現するため、今後ますます自動化の要求が高まると考えられる。ところがＰＣＲでは、反応液の急激な昇温・降温操作を繰り返す必要があり、しかも該操作の正確さと再現性が結果に影響を及ぼすことがあるため、厳重に温度を管理しつつ、かかる昇温・降温操作を行わなければならないが、このような仕様を満足するインキュベーション機能を具備し、なおかつ十分な処理能力を有する全自動機を提供することは容易ではない。
【００１４】
また、ウイルス核酸はＲＮＡである場合が多いが、その場合はＲＮＡを鋳型として逆転写酵素の作用によって一旦ｃＤＮＡを合成してからＰＣＲを行うこととなり、実質的に２段階の工程を行わなければならない。
【００１５】
一定温度で標的核酸を増幅する方法として、いわゆるＮＡＳＢＡ法が知られている。ＮＡＳＢＡ法は昇温・降温という操作を必要としない点で自動化が容易と考えられるものの、増幅されたＲＮＡを分析するために上記サンドイッチ法や電気泳動による分離が必要であるため、これら操作に起因する課題を解決するものではない。
【００１６】
そこで本発明の目的は、概ね一定の温度で試料中の特定塩基配列を含む１本鎖ＲＮＡを分析するための簡便で精度の高い方法であって、ＰＣＲのように反応液の急激な昇温・降温操作を繰り返す操作や増幅されたＲＮＡの測定に際して担体を使用する必要がなく、特に好適な態様においては密閉した容器中で全操作を完了し得る方法を提供することにある。また本発明の他の目的は、概ね一定の温度で特定塩基配列の核酸を製造するための簡便な方法を提供することにある。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
本出願人は、標的核酸中の特定塩基配列特定塩基配列に相補的な配列を有し、標的核酸と結合した場合に測定可能な蛍光信号を発するようにインターカレーター性蛍光色素で標識した核酸プローブを開発した（特願平７−１８５５９９号公報／ＥＰ公開第７１４９８６号公報／Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２４（２４）、４９９２−４９９７（１９９６））参照）。この核酸プローブは、標的核酸と相補結合を形成するとで測定可能な蛍光信号を発するため、相補結合を形成していないものと分離することなしに相補結合の形成の有無及び形成された相補結合体の定量を可能とするものである。ここで本発明者らは、この核酸プローブの共存状態で核酸プライマー及び核酸ポリメレースの作用により特定塩基配列からなるＲＮＡを一定温度にて合成し得ること、言い換えれば、実質的な標的ＲＮＡの増幅とその分析を、一定温度条件下で、担体を使用することなく、しかも好適には密閉条件で行い得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１８】
即ち本願請求項１の発明は、概ね一定の温度で試料中の特定塩基配列を含む１本鎖ＲＮＡを分析するための簡便で精度の高い方法であって、少なくとも以下  （Ａ）〜（Ｉ）の試薬を用い、試料にこれらを順次添加するか、これらの２以上を一度に添加するか又はこれらを一度に添加する操作（（Ａ）〜（Ｉ）は、この順に添加することを要しない）と、少なくとも試薬（Ａ）〜（Ｈ）を添加後に試薬（Ｉ）共存下で蛍光信号を１度以上測定する操作を含む方法である。
【００１９】
（Ａ）前記１本鎖ＲＮＡ中の特定塩基配列の５’側隣接配列に相補的な配列を有する第１の１本鎖オリゴ核酸、
（Ｂ）特定塩基配列３’末端配列に相補的な配列を有する第２の１本鎖オリゴＤＮＡ、
（Ｃ）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース、
（Ｄ）デオキシリボヌクレオシド三燐酸、
（Ｅ）５’末端側から順に（１）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレースのプロモーター配列、（２）該プロモーターのエンハンサー配列及び（３）特定塩基配列の５’末端配列と同一の塩基配列を有する第３の１本鎖オリゴＤＮＡ、
（Ｆ）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース、
（Ｇ）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレース、
（Ｈ）リボヌクレオシド三燐酸、及び、
（Ｉ）特定塩基配列に相補的な配列を有し、該配列を有する核酸と結合した場合に測定可能な蛍光信号を発するように標識された第４の１本鎖オリゴＤＮＡ。
そして本願請求項２３の発明は、概ね一定の温度で特定塩基配列の核酸を製造するための簡便な方法であって、少なくとも以下（Ａ）〜（Ｈ）の試薬を用い、５’末端側から順に（１）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレースのプロモーター配列、（２）該プロモーターのエンハンサー配列及び（３）特定塩基配列を有する１本鎖ＤＮＡ、又は、該ＤＮＡと該ＤＮＡの相補鎖からなる２本鎖ＤＮＡにこれらを順次添加するか、これらの２以上を一度に添加するか又はこれらを一度に添加する操作（（Ａ）〜（Ｈ）は、この順に添加することを要しない）と、少なくとも試薬（Ａ）〜（Ｇ）の添加後に試薬（Ｈ）共存下で蛍光信号を１度以上測定する操作を含む方法である。
【００２０】
（Ａ）特定塩基配列３’末端配列に相補的な配列を有する１本鎖オリゴＤＮＡ、  （Ｂ）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース、
（Ｃ）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース、
（Ｄ）デオキシリボヌクレオシド三燐酸、
（Ｅ）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレース、
（Ｆ）リボヌクレオシド三燐酸、
（Ｇ）５’末端側から順に（１）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレースのプロモーター配列、（２）該プロモーターのエンハンサー配列及び（３）特定塩基配列の５’末端配列と同一の塩基配列を有する１本鎖オリゴＤＮＡ、及び、
（Ｈ）特定塩基配列に相補的な配列を有し、該配列を有する核酸と結合した場合に測定可能な蛍光信号を発するように標識された１本鎖オリゴＤＮＡ。
【００２１】
そして本願請求項２６〜２９の発明は、以上の発明を実施するための試薬又は試薬セットであり、具体的に請求項２６は、少なくとも、第１の１本鎖オリゴ核酸を含む第１試薬、トリス酢酸塩、酢酸マグネシウム、酢酸カリウム、ソルビトール及びジメチルスルホオキシドを含む第２試薬、ジチオスレイトール、デオキシリボヌクレオシド三燐酸、リボヌクレオシド三燐酸、牛血清アルブミン、第２の１本鎖オリゴＤＮＡ及び第３の１本鎖オリゴＤＮＡを含む第３試薬、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレース及びＲＮａｓｅ阻害剤を含む第４試薬、そして第４の１本鎖オリゴＤＮＡを含む第５試薬から構成される、請求項１又は２３の方法を実施するための試薬セットである。
【００２２】
また具体的に請求項２７は、少なくとも、第１の１本鎖オリゴ核酸を含む第１試薬、トリス酢酸塩、酢酸マグネシウム、酢酸カリウム、ソルビトール及びジメチルスルホオキシドを含む第２試薬、ジチオスレイトール、デオキシリボヌクレオシド三燐酸、リボヌクレオシド三燐酸、牛血清アルブミン、第２の１本鎖オリゴＤＮＡ、第３の１本鎖オリゴＤＮＡ及び第４の１本鎖オリゴＤＮＡを含む第３試薬、そして、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレース及びＲＮａｓｅ阻害剤を含む第４試薬から構成される、請求項１又は２３の方法を実施するための試薬セットである。
【００２３】
更に具体的に請求項２８は、少なくとも、第１の１本鎖オリゴ核酸を含む第１試薬、トリス酢酸塩、酢酸マグネシウム、酢酸カリウム、ソルビトール及びジメチルスルホオキシドを含む第２試薬、ジチオスレイトール、デオキシリボヌクレオシド三燐酸、リボヌクレオシド三燐酸、牛血清アルブミン、第２の１本鎖オリゴＤＮＡ及び第３の１本鎖オリゴＤＮＡを含む第３試薬、そして、第４の１本鎖オリゴＤＮＡ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレース及びＲＮａｓｅ阻害剤を含む第４試薬から構成される、請求項１又は２３の方法を実施するための試薬セットである。
【００２４】
そして具体的に請求項２９は、少なくとも、第１の１本鎖オリゴ核酸、第２の１本鎖オリゴＤＮＡ、第３の１本鎖オリゴＤＮＡ、第４の１本鎖オリゴＤＮＡ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレース、デオキシリボヌクレオシド三燐酸、リボヌクレオシド三燐酸、トリス酢酸塩、酢酸マグネシウム、酢酸カリウム、ソルビトール、ジメチルスルホオキシド、ジチオスレイトール、牛血清アルブミン及びＲＮａｓｅ阻害剤を含む、請求項１又は２３の方法を実施するための試薬、即ちこれらが全て混合された一種類の試薬である。
【００２５】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２６】
本願請求項１の発明は、試料中の特定塩基配列を含む１本鎖ＲＮＡ（標的ＲＮＡ）を分析する方法である。ここで分析とは、試料中に該ＲＮＡが存在するか否かを分析することと、試料中に存在する該ＲＮＡの存在量を分析することの両方を含む。
【００２７】
特定塩基配列とは、５’末端が後述する第３の１本鎖オリゴＤＮＡにおける  （３）の配列で始まり、３’末端が後述する第２の１本鎖オリゴＤＮＡと相補的な配列で終わる、前記１本鎖ＲＮＡ中に存在する塩基配列部分である。特定塩基配列は任意に決定することができるが、標的ＲＮＡを他の核酸から区別し得る程度に特異的な配列部分を含むようにすることが重要である。特に特定塩基配列として、その５’末端部分及び３’末端部分の配列が標的核酸以外の核酸と十分に区別可能な配列を選択することにより、本発明による特定塩基配列からなる１本鎖ＲＮＡ合成の特異性を向上することができる。更にはこれら部分の間に標的核酸以外の核酸と十分に区別可能な配列を有する配列を選択することにより、本発明における測定の特異性を向上することができる。
【００２８】
本願請求項１の発明では、試料中に標的ＲＮＡが存在している場合、最終的に特定塩基配列からなる大量のＲＮＡが合成される。
【００２９】
試薬（Ａ）は、標的ＲＮＡ中の特定塩基配列の５’側隣接配列に相補的な配列を有する第１のオリゴ核酸である。該試薬は標的ＲＮＡを５’側で切断し、その５’末端を特定塩基配列で始まるようにし、これにより、後述する試薬（Ｂ）〜（Ｄ）の共存下で第２の１本鎖オリゴＤＮＡの標的ＲＮＡへの結合とＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースによる該ＲＮＡを鋳型とするｃＤＮＡ合成が行われる際に、該ｃＤＮＡの３’側末端に特定塩基配列に相補的な配列が位置するようにするためのものである。具体的には、例えば第１オリゴ核酸としてＤＮＡを用い、これをＲＮａｓｅＨとともに添加する等すれば、標的ＲＮＡは第１のオリゴ核酸との結合部分で切断され、特定塩基配列の最初の塩基が５’末端に位置するようになる。この他に、例えば１本鎖核酸の特定部位を切断する、触媒活性を有するＤＮＡザイムやリボザイム（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４、４２６２−４２６６（１９９７年）等参照）を第１のオリゴ核酸として使用することもできる。
【００３０】
ＲＮａｓｅＨは、ＲＮＡ中のＤＮＡとの相補結合部分を非特異的に切断する。このため、ＲＮａｓｅＨを使用する場合は、後述する試薬（Ｂ）の添加に先立ち、昇温や又は公知のＲＮａｓｅＨ阻害剤を添加する等、ＲＮａｓｅＨ活性を実質的に失活し得る操作を行う。昇温は、例えば６０〜７０℃へ加温すれば十分であるが、該温度に昇温している時間は極めて短時間で良い。このため、ＲＮａｓｅＨを用いる場合には、例えば試薬（Ａ）とＲＮａｓｅＨを別個に又は同時に添加して適当時間のインキュベーションを行った後に試薬（Ｂ）〜（Ｉ）を添加することになる。これに対し、ＤＮＡザイムやリボザイムを用いる場合は昇温や阻害剤の添加等の操作は不要であり、単にこれらを試薬（Ａ）として単独で又は他の試薬と同時に添加することができる。
【００３１】
試薬（Ｂ）は、特定塩基配列３’末端配列に相補的な配列を有する第２の１本鎖オリゴＤＮＡである。該試薬は標的ＲＮＡに相補結合し、後述する試薬（Ｃ）及び（Ｄ）の共存下で、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースによる該ＲＮＡを鋳型とするｃＤＮＡ合成が行われる際に、該ｃＤＮＡの５’側末端に特定塩基配列の３’末端と相補的な配列が位置するようにするためのものである。第２のオリゴＤＮＡは、０．０２〜１μＭが標的核酸と共存するように添加すれば良い。
【００３２】
試薬（Ｃ）はＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースであり、試薬（Ｄ）はその基質となるデオキシリボヌクレオシド三燐酸である。試薬（Ｂ）〜（Ｄ）の共存下で、標的ＲＮＡ中の特定塩基配列３’末端に相補的な配列を５’末端にもつｃＤＮＡが合成される。
【００３３】
このｃＤＮＡは、鋳型となったＲＮＡとＤＮＡ−ＲＮＡ２本鎖の状態であるが、後述する試薬（Ｅ）における第３の１本鎖オリゴＤＮＡが相補結合を形成し得る状態にする。この目的のためには、ジメチルスルホオキサイド（以下、ＤＭＳＯ）を添加して５〜２０％のＤＭＳＯをＤＮＡ−ＲＮＡ２本鎖と共存させ、２本鎖間の相補結合力を弱めることが例示できる。ＤＭＳＯは本発明における他の試薬の作用を妨害するものではなく、少なくとも試薬（Ｄ）〜（Ｆ）によるＤＮＡ合成前にＤＮＡ−ＲＮＡ２本鎖と共存するように添加されれば良い。また、トリ筋芽細胞腫ウイルスポリメレース（以下、ＡＭＶ逆転写酵素）に代表されるＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースには、前述のＲＮａｓｅＨと比較して微弱ではあるものの、ＤＮＡ−ＲＮＡ２本鎖中のＲＮＡを切断する活性を有するものがある。そこで、前記した試薬（Ｃ）としてこのようなＲＮＡ分解活性を有する酵素を用いても良い。いずれか一方の作用を利用するのみでも十分であるが、ＤＭＳＯの作用とＣＭＶ逆転写酵素等のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース作用の両方を利用することが特に好ましい。ＤＭＳＯ及び／又はＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースの作用により前記ＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖は、ＲＮＡ部分が分解及び／又は乖離され、１本鎖のＤＮＡが得られることとなる。
【００３４】
試薬（Ｅ）は、５’末端側から順に（１）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレースのプロモーター配列、（２）該プロモーターのエンハンサー配列及び（３）特定塩基配列の５’末端配列と同一の塩基配列を有する第３の１本鎖オリゴＤＮＡである。第３のオリゴＤＮＡは、０．０２〜１μＭが標的核酸と共存するように添加すれば良い。第３のオリゴＤＮＡにおいて、（３）の部分は試薬（Ｂ）〜（Ｄ）が共存することで合成されるＤＮＡの３’末端に結合する。従って試薬（Ｄ）と（Ｆ）の共存により、第３のＤＮＡの３’末端からは該ＤＮＡを鋳型として、また同時に該ＤＮＡの３’末端から該第３のオリゴＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースによりそれぞれの相補鎖が合成され、完全な２本鎖ＤＮＡが合成される。
【００３５】
試薬（Ｆ）は、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースである。本発明においては試薬（Ｃ）におけるＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースと該ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースの両ポリメレース活性を有する同一の酵素を用いることにより、使用する試薬種類を減少することが特に好ましい。例えば、ＡＭＶ逆転写酵素は両活性を有する酵素であるが、前述の通り、両ポリメレース活性に加え、ＤＮＡ−ＲＮＡ２本鎖中のＲＮＡを分解する活性を有しおり、しかも商業的に入手可能であることから、本発明で使用するうえで特に好ましい酵素として例示できる。
【００３６】
試薬（Ｇ）は、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレースであり、試薬（Ｈ）はその基質となるリボヌクレオシド三燐酸である。試薬（Ｄ）〜（Ｆ）の共存により合成される２本鎖ＤＮＡはＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレースのプロモーター領域を末端に有する。このため、試薬（Ｇ）及び（Ｈ）の共存下では該ＤＮＡ合成後、直ちに特定塩基配列からなる１本鎖ＲＮＡの合成が開始される。試薬（Ｇ）におけるＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレースとしては、具体的に例えばＴ７  ＲＮＡポリメレースやＴ３  ポリメレース、ＳＰ６  ＲＮＡポリメレース等を例示することができる。
【００３７】
試薬（Ｇ）〜（Ｈ）の共存により合成される１本鎖ＲＮＡは特定塩基配列からなるＲＮＡである。従って、これらが合成されて試薬（Ｂ）〜（Ｆ）と共存することにより、上述した一連の反応が繰り返し生じることになる。このように、本発明では、昇温等の自動化が困難な操作を行うことなく、試料に各試薬を添加するという操作のみで、試料中に存在する極微量の標的ＲＮＡをもとにして前記の如きプロモーター領域を末端にもつ２本鎖ＤＮＡが合成され、これが特定塩基配列からなる１本鎖ＲＮＡの合成源となる。合成された１本鎖ＲＮＡは新たな２本鎖ＤＮＡの合成に寄与し、結果として時間の経過とともに特定塩基配列からなる１本鎖ＲＮＡ量は飛躍的に増大していくこととなる。
【００３８】
ここで、合成される特定の塩基配列からなる１本鎖ＲＮＡの合成される速度及び合成される最終的な量は、試料中に含まれていた標的ＲＮＡ量に依存する。そこで本発明では、試薬（Ｉ）を用いて試料中に含まれていた標的ＲＮＡについて分析するのである。
【００３９】
試薬（Ｉ）は、特定塩基配列に相補的な配列を有し、該配列を有する核酸と結合した場合に測定可能な蛍光信号を発するように標識された第４の１本鎖オリゴＤＮＡである。第４のオリゴＤＮＡは、例えばインターカレーター性蛍光色素が結合されたＤＮＡであれば良い。該ＤＮＡ部分は、特定塩基配列の特異的分析のため、６〜１００ヌクレオチド、更に好ましくは１０〜３０ヌクレオチドとすることが好ましい。むろん該ＤＮＡ部分は、特定塩基配列中に存在する配列であって、標的核酸以外の核酸と十分に区別可能な配列部分と相補的な配列であることが重要である。
【００４０】
ＤＮＡ部分は、合成された特定塩基配列からなる１本鎖ＲＮＡと相補結合を形成した場合に、既に添加されている試薬（Ｃ）におけるＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースが作用してその３’末端からの伸長が生じないように、該３’末端が特定塩基配列と非相補的な配列が付加されているか、又は、その３’末端が化学的に修飾されていることが好ましい。
【００４１】
インターカレーター性蛍光色素は、ＤＮＡ部分が他の核酸と相補結合を形成すると２本鎖部分にインターカレーションして蛍光特性が変化するものである。この目的のためには、インターカレーター性蛍光色素を、２本鎖部分へのインターカレーションを妨げない程度の適当な分子長リンカーを介してＤＮＡと結合することが例示できる。かかるリンカーとしては、インターカレーター性蛍光色素が２本鎖部分にインターカレーションすることを妨げない分子であれば特に制限はない。特に、両末端に官能基を有する二官能性炭化水素から選択されるリンカー分子は、オリゴヌクレオチドへの修飾を行う上で簡便で好ましい。また例えば、市販の試薬セット（Ｃ６−Ｔｈｉｏｌｍｏｄｉｆｉｅｒ、商品名、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）等を使用することもできる。
【００４２】
インターカレーター性蛍光色素としては、２本鎖にインターカレーションすることで例えば発する蛍光のピーク波長が変動したりする等、その蛍光特性が変化するものであれば特に制限はないが、測定の容易さ等の観点からインターカレーションにより蛍光強度が増加する性質を有するものが特に好ましい。より具体的には、特に蛍光強度の変化が著しいチアゾールオレンジ、オキサゾールイエロー又はそれらの誘導体を特に好ましいインターカレーター性蛍光色素として例示できる。
【００４３】
インターカレーター性蛍光色素をリンカーを介して結合させるＤＮＡの位置は、ＤＮＡの５’末端、３’末端又は中央部分等、インターカレーター性蛍光色素の２本鎖へのインターカレーションが妨げられず、かつ、ＤＮＡ部分のＲＮＡとの相補結合を阻害しない限り特に制限はない。
【００４４】
前記２本鎖ＤＮＡ、試薬（Ｇ）及び（Ｈ）共存下で合成される、特定塩基配列を有する１本鎖ＲＮＡは、試薬（Ｉ）共存下で測定可能な蛍光信号を発する。ここで驚くべきことに、合成された１本鎖ＲＮＡと第４のオリゴＤＮＡが相補結合を形成し、蛍光信号を発した場合であっても、このＲＮＡは試薬（Ｂ）〜（Ｄ）共存下でＤＮＡ合成の際の鋳型として機能することが明らかとなった。即ち本発明では、各試薬の共存状態においてＲＮＡからのＤＮＡ合成、ＤＮＡ２本鎖の合成、ＤＮＡ２本鎖からのＲＮＡ合成という一連の現象が、第４のオリゴＤＮＡ共存下で生じるのである。
【００４５】
従って、少なくとも試薬（Ａ）〜（Ｈ）の添加完了後に試薬（Ｉ）を添加して蛍光信号を１度以上測定する操作を行えば、該測定結果から試料中の標的核酸を分析することが可能となるのである。ここで、前述したように第４のオリゴ核酸の共存は最終的には特定塩基配列からなる１本鎖ＲＮＡの合成に何ら障害を与えないため、試薬（Ｉ）を他の試薬と同時に添加することも可能である。
【００４６】
蛍光信号を１度だけ測定する場合は、少なくとも試薬（Ａ）〜（Ｈ）の添加後、特定塩基配列からなる１本鎖ＲＮＡが合成されるのに十分な時間インキュベーションを行った後に測定を行えば良い。試薬（Ｉ）は他の試薬と同時に添加する等、測定前に添加する。このような測定はいわゆるエンドポイント法とよばれる方式であり、例えば既知量の標的核酸を含む溶液について同様の操作を行って得られる結果との比較を行うことで、試料中の標的核酸を分析することが可能となる。本願発明における蛍光信号の測定は、好ましくは試薬（Ａ）〜（Ｈ）の添加後直後から、又は、試薬（Ａ）〜（Ｈ）の添加後所定時間経過後から経時的に行う。第４のＤＮＡは、１本鎖ＲＮＡの合成過程において、合成されたＲＮＡと結合・解離を繰り返すが、結合時に測定される蛍光信号は各測定時における該ＲＮＡの存在量を反映するため、１本鎖ＲＮＡの増加する様子を経時的に追跡することが可能となるのである。なお測定自体は連続的なものであっても一定時間毎の間欠的なものであっても良い。このように経時的測定を行うと、蛍光信号の経時変化が得られるが、例えば試薬（Ａ）〜（Ｈ）添加後、一定強度の蛍光信号が得られるまでに要した時間や、例えば試薬（Ａ）〜（Ｈ）添加後の蛍光信号強度が劇的に増大した時間等を手がかりに、試料中の標的ＲＮＡ量（初期量）を分析することが可能となる。
【００４７】
後述の実施例で示されるように、本発明においては、前記した試薬（Ａ）〜  （Ｉ）はいずれも塩化物を含まないことが好ましい。また試薬（Ａ）〜（Ｉ）の他に、酢酸塩を用いることが好ましい。酢酸塩としては、例えば酢酸マグネシウム又は酢酸カリウムを例示することができる。酢酸塩は、少なくとも試薬（Ｂ）〜（Ｄ）の共存による１本鎖ＤＮＡの合成時に共存させれば良いが、その濃度は酢酸マグネシウムでは５〜２０ｍＭ、酢酸カリウムでは５０〜２００ｍＭが好ましい。本発明においては、更にソルビトールを用いることが好ましい。ソルビトールは、少なくとも試薬（Ｂ）〜（Ｄ）の共存による１本鎖ＤＮＡの合成時に共存させれば良い。また、牛血清アルブミン等の蛋白質やジチオスレイトール等の還元剤を用いることや、ＲＮａｓｅによる合成された１本鎖ＲＮＡ等の分解を阻害する目的でＲＮａｓｅ阻害剤を用いることが好ましい。更には、用いる各オリゴ核酸が相補配列と結合可能で、かつ、用いる各種酵素が活性を発揮し得るｐＨ範囲に反応溶液を維持する目的で緩衝剤を用いることが好ましい。緩衝剤としては特にトリス酢酸塩が好適な緩衝剤として例示できる。これらの試薬も、少なくとも試薬（Ｂ）〜（Ｄ）の共存による１本鎖ＤＮＡの合成時に共存させれば良い。これら好ましい試薬を用いることで、合成産物である１本鎖ＲＮＡの合成量を向上させることができる。
【００４８】
本発明の分析方法では、試料中の標的ＲＮＡの分析を、昇温等操作を行うことなく一定温度で行い得る。該一定温度は、本発明で使用する試薬（Ａ）、（Ｂ）、（Ｅ）及び（Ｉ）における各オリゴ核酸が相補配列と結合可能な温度で、かつ、試薬（Ｃ）、（Ｆ）及び（Ｇ）が酵素活性を発揮し得る温度であれば制限はない。より具体的には、３５〜６０℃の範囲から選ばれる温度を例示できる。なお温度は厳密に一定である必要はなく、概ね一定であれば良い。
【００４９】
以上の説明から明らかなように、本願請求項１の分析方法では、用いる試薬を順次添加しても、その２以上を一度に添加しても、又は、その全てを一度に添加しても得るものである。特に、用いる全試薬を一度に試料に添加する形態によれば、密閉した容器中で標的ＲＮＡの分析を可能とするものであり、これにより容器の開閉に伴う合成された１本鎖ＲＮＡの飛散という課題を解決し得る。
【００５０】
本願請求項２３の発明は、概ね一定の温度で特定塩基配列の核酸を製造するための簡便な方法である。この方法では、少なくとも以下（Ａ）〜（Ｇ）の試薬を用い、５’末端側から順に（１）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレースのプロモーター配列、（２）該プロモーターのエンハンサー配列及び（３）特定塩基配列を有する１本鎖ＤＮＡ、又は、該ＤＮＡと該ＤＮＡの相補鎖からなる２本鎖ＤＮＡにこれらを順次添加するか、これらの２以上を一度に添加するか又はこれらを一度に添加する操作（（Ａ）〜（Ｈ）は、この順に添加することを要しない）と、少なくとも試薬（Ａ）〜（Ｇ）の添加後に試薬（Ｈ）共存下で蛍光信号を１度以上測定する操作を含む方法である。
【００５１】
（Ａ）特定塩基配列３’末端配列に相補的な配列を有する１本鎖オリゴＤＮＡ、  （Ｂ）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース
（Ｃ）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース、
（Ｄ）デオキシリボヌクレオシド三燐酸、
（Ｅ）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレース、
（Ｆ）リボヌクレオシド三燐酸、
（Ｇ）５’末端側から順に（１）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレースのプロモーター配列、（２）該プロモーターのエンハンサー配列及び（３）特定塩基配列の５’末端配列と同一の塩基配列を有する１本鎖オリゴＤＮＡ、及び、
（Ｈ）特定塩基配列に相補的な配列を有し、該配列を有する核酸と結合した場合に測定可能な蛍光信号を発するように標識された１本鎖オリゴＤＮＡ。
【００５２】
これまでの説明からも理解されるように、本願請求項２３の発明は、請求項１の発明における１本鎖ＲＮＡ合成の合成源である２本鎖ＤＮＡを出発材料として特定塩基配列からなる核酸を製造するものである。ここで、特定塩基配列とは、請求項１における特定塩基配列とは異なり、標的ＲＮＡに由来する配列であることを要しない。
【００５３】
出発材料である２本鎖ＤＮＡは、ＰＣＲやＤＮＡ合成装置等を用いる公知の方法により調製することができる。なお、試薬（Ａ）、（Ｃ）及び（Ｄ）共存下では、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレースのプロモーター配列、（２）該プロモーターのエンハンサー配列及び（３）特定塩基配列を有する１本鎖ＤＮＡに試薬（Ａ）における第１のオリゴＤＮＡが相補結合後該ＤＮＡを鋳型とする伸長反応が生じて前記２本鎖ＤＮＡが合成され、出発材料として機能することになる。また更には、特定塩基配列を含む１本鎖ＲＮＡに対して請求項１の発明で説明した各種操作を実施することにより、出発材料である２本鎖ＤＮＡを調製することもできる。  試薬（Ａ）における１本鎖オリゴＤＮＡは請求項１の発明における第２のオリゴＤＮＡに該当し、試薬（Ｇ）における１本鎖オリゴＤＮＡは第３のオリゴＤＮＡに該当し、試薬（Ｈ）における１本鎖オリゴＤＮＡは第４のオリゴＤＮＡに該当する。従って、これらの添加の形態や作用等、各種ポリメレースの好適な例示、（Ａ）〜（Ｈ）以外の好ましく用いられる試薬や操作については、前述の説明を参照することで容易に理解される。即ち、出発材料である２本鎖ＤＮＡ、試薬  （Ｅ）及び（Ｆ）の共存により特定塩基配列からなる１本鎖ＲＮＡを合成させ、合成された１本鎖ＲＮＡ、試薬（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｄ）の共存により特定塩基配列と相補的な配列からなる１本鎖ＤＮＡを合成させ、このＤＮＡ、試薬（Ｃ）及び（Ｄ）の共存により出発材料である２本鎖ＤＮＡを合成させるのである。なお、請求項１の発明における試薬（Ａ）と昇温操作等の試薬（Ａ）に関連して実施される操作は、特定塩基配列を含む１本鎖ＲＮＡであって、その５’末端が特定塩基配列から開始していないＲＮＡから出発材料となる２本鎖ＤＮＡを調製する場合以外、この方法では必要でない。
【００５４】
蛍光信号を１度だけ測定する場合は、少なくとも試薬（Ａ）〜（Ｇ）の添加後、十分な時間インキュベーションを行った後、試薬（Ｉ）の共存下で行う。また経時的に測定を行う場合は、試薬（Ａ）〜（Ｇ）の添加後直後から、又は、試薬（Ａ）〜（Ｇ）の添加後所定時間経過後から経時的に行う。そして測定された蛍光信号又は測定された蛍光信号の経時的変化が所定量の特定塩基配列核酸が製造されたことを示した場合には、製造された核酸の抽出操作を行う。
【００５５】
最終的に特定塩基配列からなる１本鎖ＲＮＡを得る場合には、例えばＤＮａｓｅ等のＤＮＡ分解酵素を添加した後にＲＮＡ抽出操作を行えば良い。最終的に特定塩基配列を含む１本鎖ＤＮＡ又は該ＤＮＡと該ＤＮＡの相補鎖からなる２本鎖ＤＮＡを得る場合には、例えばＲＮａｓｅ等のＲＮＡ分解酵素を添加した後にＤＮＡ抽出操作を行えば良い。むろん、このようなＲＮＡとＤＮＡの混合物を得る場合には、核酸分解酵素を添加することなしに核酸抽出操作を行えば良い。ＤＮＡ及び／又はＲＮＡの抽出は、例えばエタノールを添加してこれらを沈殿させる等、公知の手法に従うことにより容易に実施できる。
【００５６】
上記した本願請求項１又は２３の発明を実施する場合、少なくとも、第１の１本鎖オリゴ核酸を含む第１試薬、トリス酢酸塩、酢酸マグネシウム、酢酸カリウム、ソルビトール及びジメチルスルホオキシドを含む第２試薬、ジチオスレイトール、デオキシリボヌクレオシド三燐酸、リボヌクレオシド三燐酸、牛血清アルブミン、第２の１本鎖オリゴＤＮＡ及び第３の１本鎖オリゴＤＮＡを含む第３試薬、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレース及びＲＮａｓｅ阻害剤を含む第４試薬、そして第４の１本鎖オリゴＤＮＡを含む第５試薬から構成される試薬セットを用い、これらを試薬番号の順に順次試料等に添加することが例示できる。なお請求項２３の発明では、前述した通り第１の１本鎖オリゴ核酸を用いる必要のない場合がある。この場合には第１試薬を除けば良い。
【００５７】
また上記した本願請求項１又は２３の発明を実施する場合、少なくとも、第１の１本鎖オリゴ核酸を含む第１試薬、トリス酢酸塩、酢酸マグネシウム、酢酸カリウム、ソルビトール及びジメチルスルホオキシドを含む第２試薬、ジチオスレイトール、デオキシリボヌクレオシド三燐酸、リボヌクレオシド三燐酸、牛血清アルブミン、第２の１本鎖オリゴＤＮＡ、第３の１本鎖オリゴＤＮＡ及び第４の１本鎖オリゴＤＮＡを含む第３試薬、そして、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレース及びＲＮａｓｅ阻害剤を含む第４試薬から構成される試薬セットを用い、これらを試薬番号の順に順次試料等に添加することが例示できる。なお請求項２３の発明では、前述した通り第１の１本鎖オリゴ核酸を用いる必要のない場合がある。この場合には第１試薬を除けば良い。
【００５８】
更に上記した本願請求項１又は２３の発明を実施する場合、少なくとも、第１の１本鎖オリゴ核酸を含む第１試薬、トリス酢酸塩、酢酸マグネシウム、酢酸カリウム、ソルビトール及びジメチルスルホオキシドを含む第２試薬、ジチオスレイトール、デオキシリボヌクレオシド三燐酸、リボヌクレオシド三燐酸、牛血清アルブミン、第２の１本鎖オリゴＤＮＡ及び第３の１本鎖オリゴＤＮＡを含む第３試薬、そして、第４の１本鎖オリゴＤＮＡ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレース及びＲＮａｓｅ阻害剤を含む第４試薬から構成される試薬セットを用い、これらを試薬番号の順に順次試料等に添加することが例示できる。なお請求項２３の発明では、前述した通り第１の１本鎖オリゴ核酸を用いる必要のない場合がある。この場合には第１試薬を除けば良い。
【００５９】
そして上記した本願請求項１又は２３の発明を実施する場合、最も好ましくは、少なくとも、第１の１本鎖オリゴ核酸、第２の１本鎖オリゴＤＮＡ、第３の１本鎖オリゴＤＮＡ、第４の１本鎖オリゴＤＮＡ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレース、デオキシリボヌクレオシド三燐酸、リボヌクレオシド三燐酸、トリス酢酸塩、酢酸マグネシウム、酢酸カリウム、ソルビトール、ジメチルスルホオキシド、ジチオスレイトール、牛血清アルブミン及びＲＮａｓｅ阻害剤を含む試薬を用い、これを試料に添加することが例示できる。なお請求項２３の発明では、前述した通り第１の１本鎖オリゴ核酸を用いる必要のない場合がある。この場合には第１の１本鎖オリゴＤＮＡを除けば良い。特にこの試薬は、他の試薬セットとは異なり、必要な試薬全てが混合された一種類の試薬である。従って試料に対して１回のみ、該試薬の添加を行えば良い。
【００６０】
上記した試薬セット又は試薬中の各試薬は、試料等に添加した状態で必要量が試料等と共存し得るように試薬セット又は試薬中の濃度を調製する。なお、前述の通りＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース及びＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースとして両ポリメレース活性を有する同一の酵素を用いることも可能である。
【００６１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
【００６２】
実施例１  ２本鎖ＤＮＡの調製
５’末端にＳＰ６プロモーター配列を持つＤＮＡと該ＤＮＡに相補的なＤＮＡからなる２本鎖DNA を調製した。
【００６３】
まず、以下の組成の反応液７０μｌをＰＣＲ用チューブに分注した。
【００６４】
１０．７ｍＭトリス・塩酸バッファー（ｐＨ８．３）
５３．６ｍＭ塩化カリウム
２．３６ｍＭ塩化マグネシウム
各０．２６８ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ
０．２５７μＭの、第３の１本鎖オリゴＤＮＡ
0004438110.tif 000002
０．２５７μＭの、第２の１本鎖オリゴＤＮＡ
0004438110.tif 000003
０．０３２Ｕ／μｌの、市販のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース（ＡｍｐｌｉＴａｑ、商品名、パーキンエルマー社製）
次に、１０6コピー／５μｌのＤＮＡ標準を５μｌ添加した。なおＤＮＡ標準は、ヒトＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ｃＤＮＡの塩基番号１〜１８６３を含む、１８６５塩基対の２本鎖ＤＮＡである。また塩基番号については、文献（加藤ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、１９９０年、８７、９５２４〜９５２８）に従って記載する。
【００６５】
次に、反応液を９５℃に昇温して９分間放置し、引き続いて以下（１）〜（３）の操作を１サイクルとして、４０サイクル繰り返した。
【００６６】
（１）９５℃で３０秒間維持する操作、
（２）６５℃で３０秒間維持する操作、そして、
（３）７２℃で１分間維持する操作。
【００６７】
４０サイクル終了後、反応液をとり、２％アガロース電気泳動を行った後、エチジウムブロマイド染色して確認した。
【００６８】
エチジウムブロマイド染色の結果を図１に示す。図１から明らかなように、約３２０塩基対のＤＮＡに由来する単一バンドが認められる。このことは、以上の操作によって５’末端にSP6 プロモーター配列（下線）を持った、以下ような塩基配列のＤＮＡとその相補鎖が調製されたことを示すものである。
【００６９】
0004438110.tif 000004
実施例２  酢酸マグネシウム濃度の影響
本発明における酢酸マグネシウムの最適濃度を検討した。まず、以下のような組成の反応液を調製し、各１４μｌずつＰＣＲ用チューブに分注した。
【００７０】
８５．７ｍＭトリス酢酸（ｐＨ８．１）
１６．１、３２．１又は４８．２ｍＭ酢酸マグネシウム
２１４．３ｍＭ酢酸カリウム
２１．４％  ＤＭＳＯ
３２．１％ソルビトール
各２．１ｍＭの、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ
各２．１ｍＭの、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ
２１４μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ
０．１２μＭの、第２の１本鎖オリゴＤＮＡ
0004438110.tif 000005
次に、１０4コピー、１０5コピー、１０6コピー又は１０7コピー／１０μｌのＤＮＡ標準１０μｌ、又は、陰性標準としてＤＮＡを含まないＴＥ緩衝液  （１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）及び０．１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む緩衝液）１０μｌを添加した。なおＤＮＡ標準は以下の配列からなるＤＮＡとそれに相補的なＤＮＡからなる２本鎖ＤＮＡである。
【００７１】
0004438110.tif 000006
反応液表面にミネラルオイル１００μｌを重層した後、４５℃で５分間加温し、続いて以下の酵素混合液を５μｌ添加し、４５℃で１時間反応させた。
【００７２】
３０Ｕ／μｌの、市販のＳＰ６ＲＮＡポリメレース（宝酒造（株）製）
１２Ｕ／μｌの、市販のＲＮａｓｅ阻害剤（宝酒造（株）製）
次に、２．７５μＭの、第３の１本鎖オリゴＤＮＡを０．６μｌ添加した。
【００７３】
0004438110.tif 000007
引き続き３７Ｕ／μｌのＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ・ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼであるＡＭＶ逆転写酵素（宝酒造（株）製）を０．４μｌ添加し、４５℃で２時間放置した後、反応液の５μｌをとり、２％アガロース電気泳動を行った。泳動後、アガロースゲルを１００００倍希釈したＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩＩ（宝酒造（株）製）で３０分染色した。
【００７４】
染色されたゲルの様子を図２に示す。最終濃度１５ｍＭの酢酸マグネシウム共存により、最大量の産物が得られることが分かる。
【００７５】
実施例３  酢酸カリウムの影響
本発明における酢酸カリウムの最適濃度を検討した。まず、以下のような組成の反応液を調製し、各１４μｌずつＰＣＲ用チューブに分注した。
【００７６】
８５．７ｍＭトリス酢酸（ｐＨ８．１）
２８．９ｍＭ酢酸マグネシウム
２１４．３、２３５．７、２５７．１又は２７８．６ｍＭ酢酸カリウム
２１．４％  ＤＭＳＯ
３２．１％ソルビトール
各２．１ｍＭの、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ
各２．１ｍＭの、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ
２１４μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ
０．１２μＭの、第２の１本鎖オリゴＤＮＡ
0004438110.tif 000008
次に、１０3コピー、１０4コピー、１０5コピー又は１０6コピー／１０μｌのＤＮＡ標準１０μｌ、又は、陰性標準としてＤＮＡを含まないＴＥ緩衝液１０μｌを添加した。なおＤＮＡ標準は以下の配列からなるＤＮＡとそれに相補的なＤＮＡからなる２本鎖ＤＮＡである。
0004438110.tif 000009
反応液表面にミネラルオイル１００μｌを重層した後、４５℃で５分間加温し、続いて以下の酵素混合液を５μｌ添加し、４５℃で１時間反応させた。
【００７７】
３０Ｕ／μｌの、市販のＳＰ６ＲＮＡポリメレース（宝酒造（株）製）
１２Ｕ／μｌの、市販のＲＮａｓｅ阻害剤（宝酒造（株）製）
次に、２．７５μＭの、第３の１本鎖オリゴＤＮＡを０．６μｌ添加した。
【００７８】
0004438110.tif 000010
引き続き３７Ｕ／μｌのＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ・ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼであるＡＭＶ逆転写酵素（宝酒造（株）製）を０．４μｌ添加し、４５℃で２時間放置した後、反応液の５μｌをとり、２％アガロース電気泳動を行った。泳動後、アガロースゲルを１００００倍希釈したＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩＩ（宝酒造（株）製）で３０分染色した。
【００７９】
染色されたゲルの様子を図３に示す。酢酸カリウムが最終濃度で１２０ｍＭ共存することにより、初期の標的核酸量が１０3コピーであっても産物が得られることが分かる。このように、最終濃度１１０〜１３０ｍＭの酢酸カリウム共存により、反応効率が最大になることが分かる。
【００８０】
実施例４  ソルビトールの影響
本発明におけるソルビトールの最適濃度を検討した。まず、以下のような組成の反応液を調製し、各２０μｌずつＰＣＲ用チューブに分注した。
【００８１】
６０ｍＭトリス酢酸（ｐＨ８．１）
２０．３ｍＭ酢酸マグネシウム
１８７．５ｍＭ酢酸カリウム
１５％  ＤＭＳＯ
２２．５、１６．８、１３．５、１１．３％ソルビトール
（最終濃度はそれぞれ１５、１１．３、９又は７．５％）
各１．５ｍＭの、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ
各１．５ｍＭの、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ
１５０μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ
０．３μＭの、第２の１本鎖オリゴＤＮＡ
0004438110.tif 000011
０．３μＭの、第３の１本鎖オリゴＤＮＡ
0004438110.tif 000012
次に、１０3コピー、１０4コピー、１０5コピー又は１０6コピー／５μｌのＲＮＡ標準５μｌ、又は、陰性標準としてＲＮＡを含まないＴＥ緩衝液５μｌを添加した。なおＲＮＡ標準は以下の配列からなる。
0004438110.tif 000013
反応液表面にミネラルオイル１００μｌを重層した後、６５℃で１０分間加温した後、チューブを氷水中に移して５分間静置した。続いて以下の酵素混合液を５μｌ添加し、４５℃で４時間反応させた。
【００８２】
３６Ｕ／μｌの、市販のＳＰ６ＲＮＡポリメレース（宝酒造（株）製）
１２Ｕ／μｌの、市販のＲＮａｓｅ阻害剤（宝酒造（株）製）
９Ｕ／μｌのＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ・ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼであるＡＭＶ逆転写酵素（宝酒造（株）製）
反応液の５μｌをとり、アガロース電気泳動を行った。泳動後、アガロースゲルを１００００倍希釈したＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩＩ（宝酒造（株）製）で３０分染色した。
【００８３】
染色されたゲルの様子を図３に示す。その結果、ソルビトールが最終濃度で７．５〜１１．３％共存することにより、初期の標的核酸量が１０3コピーであっても３００塩基対の位置にはっきりとバンドが認められることが分かる。産物が得られることが分かる。このように、最終濃度７．５〜１１．３％のソルビトール共存により、反応効率が最大になることが分かる。
【００８４】
実施例５  ２本鎖ＤＮＡを標的核酸とした核酸増幅
各種濃度の２本鎖ＤＮＡを標的核酸として増幅産物量を検討した。まず、以下のような組成の反応液を調製し、各１９μｌずつＰＣＲ用チューブに分注した。
６３．２ｍＭトリス酢酸（ｐＨ８．１）
２１．３ｍＭ酢酸マグネシウム
１９７．４ｍＭ酢酸カリウム
２２．５％  ＤＭＳＯ
２２．５％ソルビトール
各１．６ｍＭの、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ
各１．６ｍＭの、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ
１５７．９μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ
０．０５５μＭの、第２の１本鎖オリゴＤＮＡ
0004438110.tif 000014
次に、１０3コピー、１０4コピー、１０5コピー又は１０6コピー／５μｌのＤＮＡ標準５μｌ、又は、陰性標準としてＲＮＡを含まないＴＥ緩衝液５μｌを添加した。なおＤＮＡ標準は以下の配列からなるＤＮＡとそれに相補的なＤＮＡからなる２本鎖ＤＮＡである。
0004438110.tif 000015
反応液表面にミネラルオイル１００μｌを重層した後、４５℃で５分間加温し、続いて以下の酵素混合液を５μｌ添加し、４５℃で１時間反応させた。
【００８５】
３０Ｕ／μｌの、市販のＳＰ６ＲＮＡポリメレース（宝酒造（株）製）
１２Ｕ／μｌの、市販のＲＮａｓｅ阻害剤（宝酒造（株）製）
次に、２．７５μＭの、第３の１本鎖オリゴＤＮＡを０．６μｌ添加した。
【００８６】
0004438110.tif 000016
引き続き３７Ｕ／μｌのＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ・ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼであるＡＭＶ逆転写酵素（宝酒造（株）製）を０．４μｌ添加し、４５℃で２時間放置した後、反応液の５μｌをとり、２％アガロース電気泳動を行った。泳動後、アガロースゲルを１００００倍希釈したＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩＩ（宝酒造（株）製）で３０分染色した。
【００８７】
染色されたゲルの様子を図５に示す。初期の標的核酸量が１０3コピー／５μｌ以上の場合、全ての場合で約３００塩基対の位置にバンドが認められ、しかも認められたバンドは、初期核酸量に依存して黒化度を示した。この結果から、２本鎖ＤＮＡを標的核酸とした場合には、高感度の分析が可能であることが分かる。  実施例６  第１の１本鎖オリゴ核酸とＲＮａｓｅＨ用いたＲＮＡの特異的切断  第１の１本鎖オリゴ核酸とＲＮａｓｅＨを用いてＲＮＡを特定塩基配列の５’側隣接部分で切断した。
【００８８】
まず、以下のような組成の反応液を調製し、各７．２μｌずつＰＣＲ用チューブに分注した。
【００８９】
４０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）
４ｍＭ塩化マグネシウム
１ｍＭジチオスレイトール
１μＭの、第１の１本鎖オリゴＤＮＡ（１１ｍｅｒ）
0004438110.tif 000017
次に、５．７μＭのＲＮＡ（１３３ｍｅｒ）を１．８μｌ添加し、６５℃で１０分間加熱した後、氷水中に移して急冷した。１３３ｍｅｒ  ＲＮＡの配列は以下の通りである。
0004438110.tif 000018
（下線部は１１ｍｅｒのＤＮＡと相補的な配列部分である）
３７℃で５分間加温した後、各０．０１、０．００１、０．０００１又は０．００００１Ｕ／μｌのＲＮａｓｅＨ（宝酒造（株）製）を１μｌずつ添加し、３７℃で１時間反応させた。反応液にゲル・ローディング緩衝液（０．１Ｍトリス塩酸（ｐＨ８．０）、６０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２５％ブロモフェノールブルー及び４０％ショ糖を含む緩衝液）を２μｌを加えた後、ホルムアミド１２μｌを添加し、６５℃で５分間加温した後、反応液の１２μｌをとり、１２％尿素変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。
【００９０】
アクリルアミドゲルを5 分間水洗する操作を３回繰り返した後、ゲルを１００００倍希釈ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩＩ（宝酒造（株）製）で３０分染色した。一方、以下のような組成の反応液を調製し、各１０．８μｌずつＰＣＲ用チューブに分注した。
【００９１】
４０ｍＭトリス酢酸緩衝液（ｐＨ８．１）
３７ｍＭ酢酸マグネシウム
３４７ｍＭ酢酸カリウム
２２％ソルビトール
１ｍＭジチオスレイトール
０．９μＭの、第１の１本鎖オリゴ核酸（１１ｍｅｒ）
0004438110.tif 000019
次に、５．７μＭのＲＮＡ（１３３ｍｅｒ）を１．８μｌ添加し、６５℃で１０分間加熱した後、氷水中に移して急冷した。
【００９２】
３７℃で５分間加温した後、各０．０１、０．００１、０．０００１又は０．００００１Ｕ／μｌのＲＮａｓｅＨ（宝酒造（株）製）を１μｌずつ添加し、３７℃で１時間反応させた。反応液にゲル・ローディング緩衝液を２μｌを加えた後、ホルムアミド１２μｌを添加し、６５℃で５分間加温した後、反応液の１２μｌをとり、１２％尿素変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。
【００９３】
アクリルアミドゲルを5 分間水洗する操作を3 回繰り返した後、ゲルを１００００倍希釈ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩＩ（宝酒造（株）製）で３０分染色した。各組成の反応液を用いた結果を図６に示す。トリス塩酸緩衝液では最終濃度が０．０００００１及び０．００００１Ｕ／μｌのＲＮａｓｅＨ共存により１３３ｍｅｒのバンドは消え、６０〜７０ｍｅｒのバンドが認められた。ＲＮａｓｅＨの最終濃度を上げると１３３ｍｅｒの更なる分解が認められた。一方トリス酢酸緩衝液では、最終濃度が０．０００７Ｕ／μｌのＲＮａｓｅＨ共存により１３３ｍｅｒのバンドは消え、６０〜７０ｍｅｒのバンドが認められた。このバンドの位置は、１３３ｍｅｒのＲＮＡが第１の１本鎖オリゴ核酸の結合部位で切断された場合に出現するＲＮＡの位置と一致する。
【００９４】
このことから、第１の１本鎖オリゴ核酸とＲＮａｓｅＨを用いることにより、標的ＲＮＡを特定塩基配列の５’側で特異的に切断可能であることが分かる。
【００９５】
実施例７  ＲＮＡを標的とした核酸増幅
各種濃度の標的ＲＮＡを用いて本発明を実施し、増幅産物を確認した。まず、以下のような組成の反応液を調製し、各２０μｌずつＰＣＲ用チューブに分注した。
【００９６】
６０ｍＭトリス酢酸（ｐＨ８．１）
２０．３ｍＭ酢酸マグネシウム
１８７．５ｍＭ酢酸カリウム
２２．５％  ＤＭＳＯ
２２．５％ソルビトール
各１．５ｍＭの、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ
各１．５ｍＭの、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ
１５０μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ
０．３μＭの、第３の１本鎖オリゴＤＮＡ
0004438110.tif 000020
０．３μＭの、第２の１本鎖オリゴＤＮＡ
0004438110.tif 000021
次に、１０2コピー、１０3コピー、１０4コピー、１０5コピー又は１０6コピー／５μｌのＲＮＡ標準５μｌ、又は、陰性標準としてＲＮＡを含まないＴＥ緩衝液５μｌを添加した。なおＲＮＡ標準は以下の配列からなる。
0004438110.tif 000022
反応液表面にミネラルオイル１００μｌを重層し、６５℃で１０分間加温した後、チューブを氷水中に移して５分間静置した。続いて以下の酵素混合液を５μｌ添加し、４５℃で４時間反応させた。
【００９７】
３６Ｕ／μｌの、市販のＳＰ６ＲＮＡポリメレース（宝酒造（株）製）
１２Ｕ／μｌの、市販のＲＮａｓｅ阻害剤（宝酒造（株）製）
９Ｕ／μｌのＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ・ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼであるＡＭＶ逆転写酵素（宝酒造（株）製）
反応液の５μｌをとり、アガロース電気泳動を行った。泳動後、アガロースゲルを１００００倍希釈したＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩＩ（宝酒造（株）製）で３０分染色した。
【００９８】
染色されたゲルの様子を図７に示す。図７から、初期濃度が１０3コピー／５μｌ以上の標的RNA を用いた場合は、約３００塩基対の位置にバンドが認められることが分かる。しかも認められたバンドは、初期RNA 量に対応した黒化度を示した。この結果から、本発明によって高感度に標的ＲＮＡを検出できることが分かる。ここで増幅産物は、標的ＲＮＡの初期量に応じて経時的に増幅されていることも分かる。
【００９９】
実施例８  増幅産物の同定
増幅産物をＤＮａｓｅ又はＲＮａｓｅで処理した後、増幅産物を同定した。陰性対象としてのＴＥ緩衝液及び、１０5コピー又は１０6コピー／５μｌの標準ＲＮＡを５μｌ用い、酵素を用いる反応までを実施例７と同様の反応を行った。  ＲＮＡ標準は以下のＲＮＡである。
0004438110.tif 000023
反応後、それぞれの反応液を６５℃で３０分間加温した。上記３種類の反応液、標準ＲＮＡ（６９ｎｇ／μｌ）及び標準ＤＮＡ（６ｎｇ／μｌ）を各６μｌずつ各３本のチューブに分注し、うち１本には０．６μｌの０．５ｍｇ／ｍｌのＲＮａｓｅＡを、他の１本には０．６μｌの１ｍｇ／ｍｌ  ＤＮａｓｅ  Ｉを添加し、残りの１本には何も添加しなかった。これらを３本とも３７℃で１時間反応させた後、反応液を５μｌとり、２％アガロースゲルで電気泳動を行った。泳動後、アガロースゲルを１００００倍希釈したＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩＩ（宝酒造  （株）製）で３０分染色した。なお、標準ＲＮＡ（６９ｎｇ／μｌ）及び標準ＤＮＡ（６ｎｇ／μｌ）についての反応液組成は、酵素を含まない以外は実施例７における組成と同一である。
【０１００】
電気泳動の結果を図８に示す。図８から、１０6コピーのＲＮＡ標準を標的として反応後、ＤＮａｓｅ  Ｉ処理によってＤＮＡ産物を消化した場合、ＲＮＡ産物の黒化度は３４５ｎｇngのＲＮＡ標準に匹敵するものだった。また、ＤＮａｓｅ  Ｉ処理したＲＮＡ産物のバンドの位置はＲＮＡ標準と一致した。
【０１０１】
一方、１０6コピーのＲＮＡ標準を標的として反応後、ＲＮａｓｅＡ処理によってＲＮＡ産物を消化した場合、ＤＮＡ標準と同位置にバンドがみられた。
【０１０２】
この結果から、標的ＲＮＡからＲＮＡ産物とＤＮＡ産物が同時に合成されていることが分かる。
【０１０３】
実施例９  ＲＮＡ産物及びＤＮＡ産物の経時的変化
ＤＮＡ産物量及びＲＮＡ産物量の経時変化を調べた。まず、以下のような組成の反応液を調製し、各３３μｌずつ１０本のＰＣＲ用チューブに分注した。
【０１０４】
６１ｍＭトリス酢酸（ｐＨ８．１）
２０．５ｍＭ酢酸マグネシウム
１８９．２ｍＭ酢酸カリウム
２１．７％  ＤＭＳＯ
１２％ソルビトール
１５ｍＭジチオスレイトール
各１．５ｍＭの、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ
各１．５ｍＭの、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ
１５１μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ
０．３μＭの、第３の１本鎖オリゴＤＮＡ
0004438110.tif 000024
０．３μＭの、第２の１本鎖オリゴＤＮＡ
0004438110.tif 000025
次に、１０6コピー／５μｌのＲＮＡ標準と、陰性標準としてＴＥ緩衝液をそれぞれ８．３μｌずつ、各５本のチューブに添加した。なおＲＮＡ標準は以下の配列からなる。
0004438110.tif 000026
反応液表面にミネラルオイル１００μｌを重層し、６５℃で１０分間加温した後、チューブを氷水中に移して５分間静置した。続いて４４℃で１０分間加温後、以下の酵素混合液を８．６μｌ添加し、４４℃で０、１、２、３、４時間反応させた後にＲＮＡ標準及び陰性標準をそれぞれ１本ずつとり、氷中に移した。。
【０１０５】
３２．８Ｕ／μｌの、市販のＳＰ６ＲＮＡポリメレース（宝酒造（株）製）
１１．８Ｕ／μｌの、市販のＲＮａｓｅ阻害剤（宝酒造（株）製）
８．２Ｕ／μｌのＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ・ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼであるＡＭＶ逆転写酵素（宝酒造（株）製）
全チューブから反応液の５μｌをとり、２％アガロース電気泳動を行った。泳動後、アガロースゲルを１００００倍希釈したＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩＩ（宝酒造（株）製）で３０分染色し写真を撮影した。そしてデンシトメーターを用いて電気泳動写真からバンドの黒化度（ＯＤ値）を測定した。
【０１０６】
残ったそれぞれの反応液を６５℃で２０分間加温後、各反応液を１０μｌずつ３本のチューブに分注し、１本には１μｌの０．５ｍｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅＡを、他の１本には１μｌの１ｍｇ／ｍｌ  ＤＮａｓｅＩを、残りの１本には１μｌのＴＥ緩衝液を添加した。これらを３本とも３７℃で１時間反応させ、反応液の５μｌをとり、２％アガロースゲルで電気泳動を行った。泳動後、ゲルを１００００倍希釈したＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩＩ（宝酒造（株）製）で３０分染色し写真を撮影した。そしてデンシトメーターを用いて電気泳動写真からバンドの黒化度（ＯＤ値）を測定した。
【０１０７】
電気泳動写真からのバンド黒化度から定量したＤＮＡ産物及びＲＮＡ産物量の経時的変化を図９に示す。ＲＮＡ産物量はＤＮＡ産物量の約４０倍であった。また、ＲＮＡ産物量もＤＮＡ産物量も、ともに反応開始２時間以降で急激に増加する（立ち上がる）ことが分かる。この結果は、本発明の方法によるＲＮＡ産物及びＤＮＡ産物の増加はとも類似した増幅曲線を描くことが分かる。
【０１０８】
実施例１０  第４の１本鎖オリゴＤＮＡを用いた増幅産物量の測定
第４の１本鎖オリゴＤＮＡを用いて、反応液について蛍光信号測定を行い、合成されたＲＮＡ量を分析した。まず、以下の組成の反応液２０μｌを３０本のＰＣＲ用チューブに分注した。
【０１０９】
６０ｍＭトリス酢酸（ｐＨ８．１）
２０．３ｍＭ酢酸マグネシウム
１８７．５ｍＭ酢酸カリウム
２２．５％  ＤＭＳＯ
１２％ソルビトール
各１．５ｍＭの、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ
各１．５ｍＭの、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ
１５０μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ
０．３μＭの、第３の１本鎖オリゴＤＮＡ
0004438110.tif 000027
０．３μＭの、第２の１本鎖オリゴＤＮＡ
0004438110.tif 000028
次に、１０6コピー／５μｌのＲＮＡ標準と、陰性標準としてＴＥ緩衝液をそれぞれ５μｌずつ、各１５本のチューブに添加した。なおＲＮＡ標準は以下の配列からなる。
0004438110.tif 000029
反応液表面にミネラルオイル１００μｌを重層し、６５℃で１０分間加温した後、チューブを氷水中に移して５分間静置した。続いて４４℃で１０分間加温後、以下の酵素混合液を５μｌ添加し、４４℃で０、１、２、３、４時間反応させた後にＲＮＡ標準及び陰性標準をそれぞれ３本ずつとり、氷中に移した。
【０１１０】
３６Ｕ／μｌの、市販のＳＰ６ＲＮＡポリメレース（宝酒造（株）製）
１２Ｕ／μｌの、市販のＲＮａｓｅ阻害剤（宝酒造（株）製）
９Ｕ／μｌのＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ・ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼであるＡＭＶ逆転写酵素（宝酒造（株）製）
全チューブから反応液の５μｌをとり、２％アガロース電気泳動を行った。泳動後、各時間で取り出した３本のチューブ中の反応液を混合し、その中から５μｌとり２％アガロース電気泳動を行った。泳動後、アガロースゲルを１００００倍希釈したＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩＩ（宝酒造（株）製）で３０分染色し写真を撮影した。
【０１１１】
混合後の反応液５０μｌに以下の組成の測定用緩衝液１００μｌを添加した。４０ｍＭトリス酢酸（ｐＨ８．１）
１３ｍＭ酢酸マグネシウム
１２５ｍＭ酢酸カリウム
１０ｍＭジチオスレイトール
２Ｕ／μｌ  ＲＮａｓｅ阻害剤
３７．５ｎＭの、第４の１本鎖オリゴＤＮＡ（以下、ＹＯ−２７１）
0004438110.tif 000030
（＊はインターカレーター性蛍光色素であるオキサゾールイエローの結合位置を示す。ＤＮＡ部分の第１〜１１番目の塩基がＨＣＶ  ｃＤＮＡの塩基番号２２３〜２３３に相補的である。なお蛍光色素のＤＮＡ部分への結合等については、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２４（２４）、４９９２−４９９７（１９９６年）におけるＹＯ−ＹＰＦ−２７１と同一である。参考のため、ＹＯ−２７１の構造を図１９に示す）
６５℃で１５分間加温後、氷水中で急冷し、５分間静置した。引き続き３７℃で１０分間加温した後、予め３７℃に加温した蛍光測定用セルに移し、励起波長４９０ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍで蛍光強度を測定した。
【０１１２】
電気泳動の結果を図１０に、第４の１本鎖オリゴＤＮＡ（ＹＯ−２７１）からの蛍光信号の測定結果を図１１に示す。図１１から明らかなように、ＹＯ−２７１からの蛍光信号はＲＮＡ標準では２時間以降に急激な立ち上がりを見せたが、陰性対象では蛍光強度の増加はみられなかった。この結果は、第４の１本鎖オリゴＤＮＡを用いることで増幅産物量を特異的に測定できることを示す。
【０１１３】
実施例１１  第４の１本鎖オリゴＤＮＡの３’末端修飾
第４の１本鎖オリゴＤＮＡ共存下で１本鎖ＲＮＡを合成させる場合に、共存するＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースの作用によって該ＤＮＡの３’末端から伸長反応が起こり、結果的に非特異的な蛍光信号が増加する恐れがある。そこで、ターミナルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）で処理してオリゴＤＮＡの３’末端を修飾（ｄｄＴＴｐの付加）し、その効果を確認した。
【０１１４】
以下の組成の反応液（総量５０μｌ）で、３７℃、１時間のＴｄＴ処理を行った。
【０１１５】
１００ｍＭカコジル酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）
１ｍＭ塩化コバルト
０．１ｍＭジチオスレイトール
０．５ｍＭ  ｄｄＴＴＰ
０．６Ｕ/ μｌ  ＴｄＴ（宝酒造（株）製）
３７．３μＭの、第４の１本鎖オリゴＤＮＡ（ＹＯ−２７１）
引き続き、フェノール：クロロホルム抽出を行い、水層を回収し、市販のカラム（クロマ・スピン−１０、商品名、東洋紡（株）製）で精製後、ＯＤ２６０で定量した。
【０１１６】
得られたＴｄＴ処理ＹＯ−２７１と未処理ＹＯ−２７１を用いて、本発明における蛍光信号の測定を行った。
【０１１７】
まず、以下の組成の反応液５０μｌ（未処理ＹＯ−２７１を添加又はＴｄＴ処理ＹＯ−２７１を添加）をそれぞれ１０本のチューブに分注した。
【０１１８】
６９ｍＭトリス酢酸（ｐＨ８．１）
２０．３ｍＭ酢酸マグネシウム
１８７．５ｍＭ酢酸カリウム
２１．５％  ＤＭＳＯ
１２％ソルビトール
１５ｍＭジチオスレイトール
各１．５ｍＭの、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ
各１．５ｍＭの、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ
１５０μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ
０．３μＭの、第３の１本鎖オリゴＤＮＡ
0004438110.tif 000031
０．３μＭの、第２の１本鎖オリゴＤＮＡ
0004438110.tif 000032
１１２．５ｎＭのＴｄＴ処理ＹＯ−２７１又は未処理ＹＯ−２７１
次に、１０6コピー／５μｌのＲＮＡ標準と、陰性標準としてＴＥ緩衝液をそれぞれ１２．５μｌずつ、各５本のチューブに添加した。なおＲＮＡ標準は以下の配列からなる。
0004438110.tif 000033
反応液表面にミネラルオイル１００μｌを重層し、６５℃で１０分間加温した後、チューブを氷水中に移して５分間静置した。続いて４４℃で１０分間加温後、以下の酵素混合液を１２．５μｌ添加し、４４℃で０、１、２、３、４時間反応させた後にＲＮＡ標準及び陰性標準のチューブをとり、氷中に移した。
【０１１９】
３４．２Ｕ／μｌの、市販のＳＰ６ＲＮＡポリメレース（宝酒造（株）製）
１２Ｕ／μｌの、市販のＲＮａｓｅ阻害剤（宝酒造（株）製）
８．４Ｕ／μｌのＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ・ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼであるＡＭＶ逆転写酵素（宝酒造（株）製）
それぞれの反応液５０μｌに下記組成の希釈緩衝液１００μｌを添加し、４４℃で５分間加温した後、予め４４℃に加温した蛍光測定用セルに移し、励起波長４９０ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍで蛍光強度を測定した。
【０１２０】
４０ｍＭトリス酢酸（ｐＨ８．１）
１３ｍＭ酢酸マグネシウム
１２５ｍＭ酢酸カリウム
１０ｍＭジチオスレイトール
２Ｕ／μｌ  ＲＮａｓｅ阻害剤
未処理及びＴｄＴ処理ＹＯ−２７１を用いた結果を図１２及び図１３に示す。
未処理ＹＯ−２７１を用いた場合は陰性標準で蛍光信号の増加が見られ、ＲＮＡ標準との有為な差は認められなかった。これに対してｄｄＴＴｐ処理したＹＯ−２７１では、両者に有意な差が見られた。この結果から、本発明における第４の１本鎖オリゴＤＮＡ共存下でＲＮＡを合成させる場合には、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースの作用によってＤＮＡの３’末端から伸長反応が起こらないよう、当該３’末端を修飾等することが好ましいことが分かる。
【０１２１】
実施例１２  第４の１本鎖オリゴＤＮＡ共存下でのＲＮＡ又はＤＮＡの合成
実施例１１で調製したｄｄＴＴｐ処理ＹＯ−２７１を用いて、第４の１本鎖オリゴＤＮＡ共存下でＲＮＡ又はＤＮＡの合成が影響を受けるか否かを調査した。まず、以下の組成の反応液５０μｌを１０本のチューブに分注した。
【０１２２】
６０ｍＭトリス酢酸（ｐＨ８．１）
２０．３ｍＭ酢酸マグネシウム
１８７．５ｍＭ酢酸カリウム
２１．５％  ＤＭＳＯ
１２％ソルビトール
１５ｍＭジチオスレイトール
各１．５ｍＭの、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ
各１．５ｍＭの、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ
１５０μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ
０．３μＭの、第３の１本鎖オリゴＤＮＡ
0004438110.tif 000034
０．３μＭの、第２の１本鎖オリゴＤＮＡ
0004438110.tif 000035
１１２．５ｎＭのＴｄＴ処理ＹＯ−２７１
次に、１０6コピー／５μｌのＲＮＡ標準と、陰性標準としてＴＥ緩衝液をそれぞれ１２．５μｌずつ、各５本のチューブに添加した。なおＲＮＡ標準は以下の配列からなる。
0004438110.tif 000036
反応液表面にミネラルオイル１００μｌを重層し、６５℃で１０分間加温した後、チューブを氷水中に移して５分間静置した。続いて４４℃で１０分間加温後、以下の酵素混合液を１２．５μｌ添加し、４４℃で０、１、２、３、４時間反応させた後にＲＮＡ標準及び陰性標準のチューブをとり、氷中に移した。。
【０１２３】
３４．２Ｕ／μｌの、市販のＳＰ６ＲＮＡポリメレース（宝酒造（株）製）
１２Ｕ／μｌの、市販のＲＮａｓｅ阻害剤（宝酒造（株）製）
８．４Ｕ／μｌのＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ・ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼであるＡＭＶ逆転写酵素（宝酒造（株）製）
全チューブの反応液５μｌをとり、２％アガロースで電気泳動を行った。泳動後、アガロースゲルを１００００倍希釈したＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩＩ（宝酒造（株）製）で３０分染色し写真を撮影した。そしてデンシトメーターを用いて電気泳動写真からバンドの黒化度（ＯＤ値）を測定した。
【０１２４】
電気泳動の結果を図１４に、電気泳動写真から黒化度を測定した結果を図１５に示す。ＲＮＡ標準では経時的な増幅産物量の増加がみられたが、陰性標準では特異産物の増加はみられなかった。この結果から、本発明の第４の１本鎖オリゴＤＮＡが共存しても、ＲＮＡの合成等は阻害されないことが分かる。
【０１２５】
実施例１３  第４の１本鎖オリゴＤＮＡ用いる増幅産物量の経時的変化の分析実施例１１で調製したｄｄＴＴｐ処理ＹＯ−２７１を用いて、第４の１本鎖オリゴＤＮＡ共存下で合成されたＲＮＡ量を経時的に測定し、モニターした。まず、以下の組成の反応液５０μｌを１０本のチューブに分注した。
【０１２６】
６０ｍＭトリス酢酸（ｐＨ８．１）
２０．３ｍＭ酢酸マグネシウム
１８７．５ｍＭ酢酸カリウム
２１．５％  ＤＭＳＯ
１２％ソルビトール
１５ｍＭジチオスレイトール
各１．５ｍＭの、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ
各１．５ｍＭの、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ
１５０μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ
０．３μＭの、第３の１本鎖オリゴＤＮＡ
0004438110.tif 000037
０．３μＭの、第２の１本鎖オリゴＤＮＡ
0004438110.tif 000038
１１２．５ｎＭのＴｄＴ処理ＹＯ−２７１
次に、１０6コピー／５μｌのＲＮＡ標準と、陰性標準としてＴＥ緩衝液をそれぞれ１２．５μｌずつ、各５本のチューブに添加した。なおＲＮＡ標準は以下の配列からなる。
0004438110.tif 000039
反応液表面にミネラルオイル１００μｌを重層し、６５℃で１０分間加温した後、チューブを氷水中に移して５分間静置した。続いて４４℃で１０分間加温後、以下の酵素混合液を１２．５μｌ添加し、４４℃で０、１、２、３、４時間反応させた後にＲＮＡ標準及び陰性標準のチューブをとり、氷中に移した。。
【０１２７】
３４．２Ｕ／μｌの、市販のＳＰ６ＲＮＡポリメレース（宝酒造（株）製）
１２Ｕ／μｌの、市販のＲＮａｓｅ阻害剤（宝酒造（株）製）
８．４Ｕ／μｌのＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ・ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼであるＡＭＶ逆転写酵素（宝酒造（株）製）
それぞれの反応液５０μｌに下記組成の希釈緩衝液１００μｌを添加し、４４℃で５分間加温した後、予め４４℃に加温した蛍光測定用セルに移し、励起波長４９０ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍで蛍光強度を測定した。
【０１２８】
４０ｍＭトリス酢酸（ｐＨ８．１）
１３ｍＭ酢酸マグネシウム
１２５ｍＭ酢酸カリウム
１０ｍＭジチオスレイトール
２Ｕ／μｌ  ＲＮａｓｅ阻害剤
蛍光測定の結果を図１６に示す。ＲＮＡ標準では蛍光強度の経時的な増加がみられたが、陰性対象では蛍光増加は認められなかった。蛍光増加の様子（プロファイル）は実施例１２の電気泳動による定量結果とほぼ一致した。この結果から、第４の１本鎖オリゴＤＮＡを使用することにより、特異的な増幅産物量（合成されたＲＮＡ量）の経時変化を測定できることが分かる。
【０１２９】
実施例１４  第４の１本鎖オリゴＤＮＡを用いた蛍光信号の経時的変化測定による分析
既知濃度の標的ＲＮＡについて、実施例１１で調製したｄｄＴＴｐ処理ＹＯ−２７１を用いて蛍光強度の経時的変化を調べた。まず、以下の組成の反応液５０μｌを１７本のＰＣＲ用チューブに分注した。
【０１３０】
６０ｍＭトリス酢酸（ｐＨ８．１）
２０．３ｍＭ酢酸マグネシウム
１８７．５ｍＭ酢酸カリウム
２１．５％  ＤＭＳＯ
１２％ソルビトール
１５ｍＭジチオスレイトール
各１．５ｍＭの、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ
各１．５ｍＭの、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ
１５０μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ
０．３μＭの、第３の１本鎖オリゴＤＮＡ
0004438110.tif 000040
０．３μＭの、第２の１本鎖オリゴＤＮＡ
0004438110.tif 000041
１１２．５ｎＭのＴｄＴ処理ＹＯ−２７１
次に、１０4コピー又は１０5コピー／５μｌのＲＮＡ標準と、陰性標準としてＴＥ緩衝液をそれぞれ１２．５μｌずつ、各４本のチューブに添加した。更に１０6コピー／５μのＲＮＡ標準１２．５μｌをそれぞれ５本のチューブに添加した。なおＲＮＡ標準は以下の配列からなる。
0004438110.tif 000042
反応液表面にミネラルオイル１００μｌを重層し、６５℃で１０分間加温した後、チューブを氷水中に移して５分間静置した。続いて４４℃で１０分間加温後、以下の酵素混合液を１２．５μｌ添加し、４４℃で０、１時間（１０6コピー／５μｌのＲＮＡ標準の場合のみ）、２、３、４時間反応させた後にＲＮＡ標準及び陰性標準のチューブを１本とり、氷中に移した。。
【０１３１】
３４．２Ｕ／μｌの、市販のＳＰ６ＲＮＡポリメレース（宝酒造（株）製）
１２Ｕ／μｌの、市販のＲＮａｓｅ阻害剤（宝酒造（株）製）
８．４Ｕ／μｌのＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ・ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼであるＡＭＶ逆転写酵素（宝酒造（株）製）
それぞれの反応液５０μｌに下記組成の希釈緩衝液１００μｌを添加し、４４℃で５分間加温した後、予め４４℃に加温した蛍光測定用セルに移し、励起波長４９０ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍで蛍光強度を測定した。
【０１３２】
４０ｍＭトリス酢酸（ｐＨ８．１）
１３ｍＭ酢酸マグネシウム
１２５ｍＭ酢酸カリウム
１０ｍＭジチオスレイトール
１Ｕ／μｌ  ＲＮａｓｅ阻害剤
各時点で測定された蛍光強度からバックグラウンドの蛍光強度を差し引いた結果を図１７に示す。得られた蛍光増加の増幅曲線について、反応時間３時間目の蛍光増加を標的ＲＮＡの初期濃度に対してプロットしたところ（図１８）、初期濃度に依存した蛍光増加が認められた。この結果から、蛍光強度の経時変化を測定することによって得られた増幅曲線をもとに、標的ＲＮＡの初期濃度と蛍光増加から検量線を作成できることが分かる。同様に未知濃度試料についても蛍光増加を測定することによって、標的ＲＮＡの初期量を算出可能であることが分かる
【０１３３】
。
【発明の効果】
以上の説明から明らかなように、本発明によれば、試料中の特定塩基配列を含む１本鎖ＲＮＡについて、反応液を急激に昇温・降温するという操作を繰り返すことなく、概ね一定温度で分析することが可能となる。しかも本発明の分析方法では、担体を使用せずに均一系で高感度かつ特異的に標的核酸を分析することができる。
【０１３４】
本発明では、試料中の微量の１本鎖ＲＮＡをもとにして、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレースのプロモーター領域を末端にもつ２本鎖ＤＮＡが合成され、これが多量の１本鎖ＲＮＡの合成源となり、さらに合成された１本鎖ＲＮＡは新たな２本鎖ＤＮＡの合成に寄与する。この結果、時間の経過とともに中間体として反応に介在する１本鎖ＲＮＡ量は飛躍的に増大することになるが、該ＲＮＡの合成速度及び最終的な合成量は、試料中にそもそも含まれていた標的ＲＮＡ量に依存することから、該ＲＮＡ量を測定することにより標的ＲＮＡの分析が可能となるのである。
【０１３５】
本発明における第４の１本鎖オリゴＤＮＡは、反応液中の１本鎖ＲＮＡと結合し蛍光強度を増大等することから、反応液について蛍光強度を測定することにより、試料中の標的ＲＮＡの初期量を分析することが可能となる。
【０１３６】
このように本発明の分析方法では、１本鎖のＲＮＡ及びＤＮＡが反応中間体として合成され、これらにプライマーが結合して反応が進行することから一定温度での実施が可能で、ＰＣＲのようにプライミングを目的とした反応液の急激な昇温・降温を多数回にわたって繰り返す必要がないため、自動化することも容易である。また本発明では第４の１本鎖オリゴＤＮＡの使用により、１本鎖ＲＮＡ合成過程での蛍光強度を測定すれば、合成されたＲＮＡ量等をモニターすることが可能であり、反応生成物について電気泳動を行ったりサンドイッチ法等を行う必要が無く、標的ＲＮＡの有無及び量を高精度かつ迅速に均一系で分析することが可能な臨床診断等で用いるのに極めて簡便な一段階の分析方法が提供される。
【０１３７】
一方、本発明は、一定温度での反応で特定塩基配列からなるＲＮＡを大量に製造できることから、従来の化学合成法によるものやＲＴ−ＰＣＲ法による場合に比較して、穏和な条件下で実施可能でしかも簡便なＲＮＡの製造方法も提供する。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１の結果を示す図である。第２及び第３の１本鎖オリゴＤＮＡを用いてＰＣＲを行った後、合成産物を２％アガロースゲル電気泳動した結果であり、レーン番号２〜４は既知濃度の対象ＤＮＡを、レーン番号５〜７はＰＣＲ産物０．２〜５μｌである。
【図２】実施例２の結果を示す図である。酢酸マグネシウムの濃度を変えて反応を行った後、２％アガロースゲル電気泳動を行った結果であり、図中矢印の位置（約３００塩基対）に特異的産物のバンドが出現した。なお酢酸マグネシウム濃度は最終濃度を示した。
【図３】実施例３の結果を示す図である。酢酸カリウムの濃度を変えて反応を行った後、２％アガロースゲル電気泳動を行った結果であり、図中矢印の位置（約３００塩基対）に特異的産物のバンドが出現した。なお酢酸カリウム濃度は最終濃度を示した。
【図４】実施例４の結果を示す図である。ソルビトールの濃度を変えて反応を行った後、２％アガロースゲル電気泳動を行った結果であり、図中矢印の位置（約３００塩基対）に特異的産物のバンドが出現した。
【図５】実施例５の結果を示す図である。各種濃度のDNA 標準を用いて反応を行った後、２％アガロースゲル電気泳動を行った結果であり、図中矢印の位置（約３００塩基対）に特異的産物のバンドが出現した。
【図６】実施例６の結果を示す図である。１３３ｍｅｒ  ＲＮＡ、該ＲＮＡの特定塩基配列の５’側隣接配列に相補的な配列を有する第１の１本鎖オリゴＤＮＡ及び各種濃度のＲＮａｓｅＨを反応させた後、１２％尿素変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った結果であり、図中矢印は１３３ｍｅｒ及び７２ｍｅｒの位置を示す。
【図７】実施例７の結果を示す図である。各種濃度のＲＮＡ標準を用いて反応を行った後、２％アガロースゲル電気泳動を行った結果であり、図中矢印の位置（約３００塩基対）に特異的産物のバンドが出現した。
【図８】実施例８の結果を示す図である。１０6コピー／５μｌのＲＮＡ標準を用いて反応を行った後、産物をＲＮａｓｅＡ又はＤＮａｓｅＩで処理し、２％アガロースゲル電気泳動を行った結果であり、図中にはＤＮＡ産物とＲＮＡ産物のバンドの位置を示した。
【図９】実施例９の結果を示す図である。１０6コピー／５μｌのＲＮＡ標準を用い、時間を変化させて反応を行った後、ＲＮａｓｅＡ又はＤＮａｓｅＩで処理し、２％アガロースゲル電気泳動を行い、デンシトメーターで定量した結果を示す。
【図１０】実施例１０の結果を示す図である。１０6コピー／５μｌのＲＮＡ標準を用い、時間を変化させて反応を行った後、２％アガロースゲル電気泳動を行った結果である。
【図１１】実施例１０の結果を示す図である。図１０で得られた産物に第４の１本鎖オリゴＤＮＡを添加し、蛍光強度を測定した結果を示す。
【図１２】実施例１１の結果を示す図である。第４の１本鎖オリゴＤＮＡの存在下で１０6コピー／５μｌのＲＮＡ標準を用い、時間を変化させて反応を行った後、蛍光強度を測定した結果を示す。
【図１３】実施例１１の結果を示す図である。３’末端を処理（ｄｄＴＴＰを付加）した第４の１本鎖オリゴＤＮＡ共存下、１０6コピー／５μｌのＲＮＡ標準を用い、時間を変化させて反応を行った後、蛍光強度を測定した結果を示す。
【図１４】実施例１２の結果を示す図である。３’末端を処理（ｄｄＴＴＰを付加）した第４の１本鎖オリゴＤＮＡ共存下、１０6コピー／５μｌのＲＮＡ標準を用い、時間を変化させて反応を行った後、２％アガロースゲル電気泳動を行った結果を示す。
【図１５】実施例１２の結果を示す図である。図１４の電気泳動を行った結果をデンシトメーターで定量した結果を示す。
【図１６】実施例１３の結果を示す図である。３’末端を処理（ｄｄＴＴＰを付加）した第４の１本鎖オリゴＤＮＡ共存下、１０6コピー／５μｌのＲＮＡ標準を用い、時間を変化させて反応を行った後、蛍光強度を測定した結果を示す。
【図１７】実施例１４の結果を示す図である。３’末端を処理（ｄｄＴＴＰを付加）した第４の１本鎖オリゴＤＮＡ共存下、１０4コピー、１０5コピー又は１０6コピー／５μｌのＲＮＡ標準を用い、時間を変化させて反応を行った後、蛍光強度を測定した結果を示す。
【図１８】実施例１４の結果を示す図である。図１７で得られた増幅曲線から、ＲＮＡ標準の初期濃度に対する3 時間目蛍光増加をプロットした結果を示す。
【図１９】実施例で使用した第４の１本鎖オリゴＤＮＡであるＹＯ−２７１の構造を示す。図中左の分子はＤＮＡ部分であり、右の分子はインターカレーター性蛍光色素であるオキサゾールイエローであり、両者は図にしめしたようなリンカーを介して結合され、ＤＮＡ部分が２本鎖を形成した場合、蛍光色素が該２本鎖部分にインターカレーション可能にされている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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