(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
DNA型またはRNA型の生物学的標的の分析方法であって、
a)リン酸基を介して酵素Eの補因子Aで５’末端を標識したオリゴヌクレオチドプローブと分析する標的を接触させる段階であって、前記補因子は遊離オリゴヌクレオチドに固定されたとき酵素Eによって認識されるが、前記補因子が固定された前記オリゴヌクレオチドが相補的オリゴヌクレオチドとハイブリダイズすると、補因子Aが遊離オリゴヌクレオチドに固定されている場合と比較して酵素Eによって認識されにくくなるものである段階、
b)前記反応媒体に補因子Aに対応する酵素Eおよび酵素Eの基質Sを添加する段階であって、基質Sは酵素Eによって化合物Cに変換される段階、
c)基質Sに対する酵素Eの活性を表すシグナルを測定する段階、および
d)このシグナルを、同条件下であるが、標的なしで補因子Aで標識したオリゴヌクレオチドプローブを酵素Eおよび基質Sと接触させたとき得られるシグナルと比較する段階であって、2つのシグナルの間の差がオリゴヌクレオチドプローブの相補的標的の存在を示す段階
を含み、前記補因子Aが-(CH2)n-フラビン（n＝2〜8の範囲の自然数）であり、前記酵素Eがフラボ蛋白質である、方法。
【請求項２】
補因子Aで標識した前記オリゴヌクレオチドプローブが相補的生物学的標的とハイブリダイズすると、補因子Aは酵素Eによって認識されないか、相補的生物学的標的なしで補因子Aが酵素Eによって認識される場合と比較して酵素Eによって認識されにくくなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
段階c)で測定したシグナルが生物学的標的なしで得られたシグナルの50%以下を示す、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
基質Sに対する酵素Eの酵素活性を示すシグナルが光学的シグナルである、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
酵素Eおよび補因子Aが、補因子Aが酵素Eにそれ自身を共有結合によって固定しないものである、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
酵素Eが、その基質Sまたはこの基質Sの変換化合物Cを使用して、基質Sの消費または化合物Cの生成による光吸収または蛍光特性の変化によって酵素Eの酵素活性を測定するようなものである、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
酵素Eがフラビン還元酵素またはNAD(P)H酸化酵素であり、基質SがNADPHまたはNADHである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
測定したシグナルが460nmにおけるNADH蛍光の強度であるか、または340nmにおけるNADHの光吸収である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
補因子Aはフラビンであり、酵素Eはフラビン還元酵素であり、基質SはNADHまたはNADPHであり、酵素Eの活性を示すシグナルは第2酵素およびアルデヒドを使用することによって得られ、前記第2酵素は還元型フラビンとアルデヒドおよび酸素との反応を触媒することが可能であり、この反応は酵素Eの活性を示す蛍光発光を伴う、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
第2酵素がルシフェラーゼである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記2つのシグナルを比較することによって前記標的と補因子Aで標識した前記オリゴヌクレオチドプローブとの相補性の範囲の測定が可能である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
使用した基質の量が、酵素Eの活性を示すシグナルを増幅するような量である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
補因子Aで標識した前記オリゴヌクレオチドプローブを固相支持体に固定する、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
固相支持体に固定されたオリゴヌクレオチドプローブを含む分析用支持体の使用であって、前記オリゴヌクレオチドプローブは、前記プローブに固定された前記補因子Aは酵素Eによって認識されるが、前記オリゴヌクレオチドプローブが相補的オリゴヌクレオチドとハイブリダイズすると、相補的オリゴヌクレオチドなしで補因子Aが酵素Eによって認識される場合と比較して酵素Eによって認識されにくくなるように、リン酸基を介して酵素Eの補因子Aで５’末端を標識されており、酵素Eは、基質Sの消費または化合物Cの生成を示す光学シグナルによって酵素Eの酵素活性の測定を可能にする基質S、またはこの基質の変換化合物Cを有するものであり、前記補因子Aが-(CH2)n-フラビン（n＝2〜8の範囲の自然数）であり、前記酵素Eがフラボ蛋白質である、DNAまたはRNA型の標的分子のハイブリダイゼーションが標的分子の不在下で得られる光学シグナルを変化させるDNAまたはRNA型の生物学的標的の分析方法における使用。
【請求項１５】
前記オリゴヌクレオチドプローブが式-(CH2)n-R1の基で標識されており、式中、nは2から8の範囲の自然数であり、R1は
【化１】
0004468694.tif 000010
に合致する基を示す、請求項１４に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の主題は、DNA型またはRNA型の生物学的標的を測定するための方法および分析用支持体である。この支持体および方法は、多様な分野、特にゲノムの配列決定、変異の探索、新規医薬製品の開発などの生物学分野において応用される。
【背景技術】
【０００２】
この種類の方法および分析用支持体は一般的に、分析する生物学的標的とハイブリダイズできる複数のオリゴヌクレオチドを使用する。ハイブリダイゼーションとは、標的鎖と支持体上の正確な位置に配置された相補的DNA、すなわちプローブとが対になることである。したがって、標的の性質を測定するために、支持体上のどの部位が、したがってどのオリゴヌクレオチドでハイブリダイゼーションを行われるかを明確に定めることができることが必要である。
【０００３】
文献US-A-5925525では、生物学的標的のハイブリダイゼーションは、この生物学的標的に関連した蛍光マーカーによって支持体上で測定される。したがって、標識した標的とオリゴプローブを含む分析用支持体とを接触させた後、洗浄し、ハイブリダイゼーションが生じた部位は、すべての蛍光マーカーの励起を実施して、その後マーカーによって再発光した蛍光を検出して部位を探索することによって測定する。蛍光が検出された部位は標的分子が固定された部位である。
【０００４】
この技法は、分析用支持体と接触させる前に生物学的標的を標識する必要があることが欠点で、標識の定量化および/または収率ならびに必要な時間遅延に関して実用上さけられない問題が生じる。また、所定の段階で標識すると状態が凍結され、ハイブリダイゼーション反応を追跡するためのその後の動的測定ができなくなる。
【０００５】
US-A-54484832に記載された、ハイブリダイゼーション能力によって核酸(標的)を検出同定する別の技法は、これらのプローブの酵素標識、その後の酵素標識オリゴヌクレオチドと標的との接触から構成される。2重鎖からハイブリダイズしなかったオリゴヌクレオチドを分離するのは、ゲル電気泳動によって行う。移動後のハイブリダイゼーションの検出および測定は、適切な基質を使用してゲルを染色することによって行う。
【０００６】
このゲル技法では試験した標的の数が限定され、したがって酵素をオリゴヌクレオチドプローブに固定することが必要であり、いくつかの問題点が発生し、場合によってはオリゴヌクレオチドと相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを妨げる危険性が潜んでいる。
【特許文献１】US-A-5925525
【特許文献２】US-A-54484832
【非特許文献１】Frier et al, J. Org. Chem., 62, 1997, p.3520-3528
【非特許文献２】J. Fisher et al., Biochemistry, 1976, 15, p.1054-1063
【非特許文献３】J. Fisher et al., J. Bio. Chem., 1995, 270, p.30392-30400
【非特許文献４】Scott et al, J. Am. Chem. Soc., 92:3, 11 February 1970, p.687から695
【非特許文献５】Hastings et al., Advances in Microbial Physiology, vol. 26, 1985, p.235-291
【非特許文献６】Zenno et al., J. Bacteriol., 1994, p.3536-3543
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の主題は、酵素的に活性化できるマーカーを備えたプローブを使用するが、酵素をオリゴヌクレオチドプローブに固定する必要がない、生物学的標的の正確な分析方法および分析用支持体である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明では、DNA型またはRNA型の生物学的標的の分析方法は以下の段階、
a)分析する標的を酵素Eの補因子Aで標識したオリゴヌクレオチドプローブと接触させる段階であって、この補因子は遊離オリゴヌクレオチドに固定されたとき酵素Eによって認識されるが、補因子が固定されたオリゴヌクレオチドが相補的オリゴヌクレオチドとハイブリダイズすると酵素Eによって認識されにくくなる段階、
b)反応媒体に補因子Aに対応する酵素Eおよび酵素Eの基質Sを添加する段階であって、基質Sは酵素Eによって化合物Cに変換される段階、
c)基質Sに対する酵素Eの活性を表すシグナルを測定する段階、および
d)このシグナルを、同条件下であるが、標的なしで補因子Aで標識したオリゴヌクレオチドプローブを酵素Eおよび基質Sと接触させたとき得られるシグナルと比較する段階であって、2つのシグナルの間の差がオリゴヌクレオチドプローブの相補的標的の存在を示す段階
を含む。
【０００９】
この方法で、補因子Aで標識したオリゴヌクレオチドプローブが相補的標識とハイブリダイズしたとき、補酵素Aは酵素Eによって認識されにくいという事実が有利に働く。そのため、ハイブリダイゼーションが起こると基質Sに対する酵素Eの活性が減少する。
【００１０】
酵素Eの基質Sに対する酵素活性の比較が有意であるためには、補因子Aで標識したオリゴヌクレオチドプローブが相補的生物学的標的とハイブリダイズしたとき、補因子Aが酵素Eによって認識されないか、ほとんど認識されないことが好ましい。
【００１１】
段階c)で測定したシグナルが生物学的標的なしで得られたシグナルの50%以下であることがさらに好ましい。
【００１２】
したがって、本発明は標識オリゴヌクレオチドと相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションが生じると変化するシグナルが得られるという原理に基づいている。本発明の場合、このシグナルの変化は酵素効果の増幅およびこのシグナルの強度の両方についてシグナルを引き起こす酵素Eを使用することに基づいており、ノイズ対シグナル比の改善がもたらされる。
【００１３】
本発明の方法を実施するために、補因子A、酵素Eおよび基質Sの系は、光学的シグナルによって酵素活性の減少が検出可能なように選択することが好ましい。
【００１４】
活性の減少は、たとえば、酵素Eの作用下で基質Sを変換することによって得られる化合物Cの光吸収および/または蛍光特性とは異なる光吸収および/または特異的蛍光特性を有する基質Sを使用することによって検出することができる。
【００１５】
また、基質変換による化合物Cが光吸収および/または特異的蛍光特性を有するならば、形成された化合物Cの量を表す光学シグナルを測定することによって酵素活性の減少を検出することが可能である。
【００１６】
したがって、相補的標的オリゴヌクレオチドが存在しない場合、酵素Eはオリゴヌクレオチドプローブに固定された補因子Aを認識し、補因子Aで標識したオリゴヌクレオチドプローブが酵素Eおよび基質Sと接触させた後で酵素活性を測定することができる。この酵素反応は、以下に対応する。
【００１７】
【数１】
0004468694.tif 000002
【００１８】
基質Sは、化合物Cが光吸収も蛍光放出特性も示さない波長λ１で吸収極大を示すか、または波長λ2で蛍光極大を示す場合は、酵素活性は時間に関して波長λ1での光学密度の変化(△OD)または波長λ2での蛍光変化(△fluo)によって測定することができる。
【００１９】
補因子Aで標識したオリゴヌクレオチドプローブが相補的標的オリゴヌクレオチドとハイブリダイズしたとき、酵素Eは補因子Aを認識しないか、またはほとんど認識せず、基質Sは化合物Cに変換されないか、またはほとんど変換されない。その結果、△OD/分または△fluo/分は減少する。
【００２０】
この減少がA単独で標識した、すなわち相補的オリゴヌクレオチドなしでオリゴヌクレオチドプローブによって得られた最大△OD/分または△fluo/分の値の50%から100%を示すように、補因子A、酵素E、基質Sの系を使用することが好ましい。
【００２１】
オリゴヌクレオチドプローブに固定された補因子Aの酵素Eによる認識は、標的オリゴヌクレオチド上に存在する相補的塩基の数に関して変化する。結果として、この塩基数に関連して△OD/分と△fluo/分との間に関係が存在する。これにより分析する標的オリゴヌクレオチドと標識オリゴヌクレオチドプローブとの間の相補性の程度を細かく分析することが可能になる。
【００２２】
また、ハイブリダイゼーションの検出は、基質Sの消費と関連した酵素作用によって生じる光学シグナルの変化(ODまたは蛍光の変化)を測定することによって行うことができる。
【００２３】
さらに、Sの消費およびシグナル振幅は、酵素による増幅効果によってかなりなものになることが可能である。
【００２４】
本発明によれば、補因子Aと酵素Eとの間の認識過程はこれら2要素の間に共有結合が形成されることには基づかないこともまた重要で、すなわち補因子Aは酵素Eに共有様式で結合せず、その結果このような増幅効果を得ることができる。
【００２５】
本発明の方法の一実施形態では、補因子Aはフラビンまたはその誘導体の1つである。
【００２６】
一般的に、これらの化合物をたとえば-(CH2)n-型のスペーサアームによってオリゴヌクレオチドに固定し、フラビン-オリゴヌクレオチド複合体を形成する。この種の複合体の合成は、Frier et al, J. Org. Chem., 62, 1997, p.3520-3528に記載されている。
【００２７】
この合成は、ホスホルアミダイトまたはH-ホスホン酸結合方法を使用して、下式の誘導体であって、
【００２８】
【化１】
0004468694.tif 000003
【００２９】
式中、nは2から8までの自然数、たとえば6である誘導体を出発物質として、オリゴヌクレオチドにフラビン誘導体を固定することから成る。
【００３０】
自動オリゴヌクレオチド合成方法における計画を含めた合成計画によって、フラビン基の挿入が可能となる。
【００３１】
したがって、オリゴヌクレオチドは式-(CH2)n-R1の基で標識され、式中、nは2から8の範囲の自然数であり、R1は式
【００３２】
【化２】
0004468694.tif 000004
【００３３】
で表される。
【００３４】
この補因子と一緒に使用できる酵素Eは、様々な酸化酵素が発見されているフラボ蛋白質であってよい。本発明では、NAD(P)H酸化酵素およびフラビン還元酵素とも呼ばれるNAD(P)H:フラビン酸化還元酵素を使用することが好ましい。
【００３５】
NAD(P)H酸化酵素の一例として、旧黄色酵素と呼ばれ、J. Fisher et al., Biochemistry, 1976, 15, p.1054-1063に記載されている酵母から得られた酵素を挙げることができる。
【００３６】
フラビン還元酵素の一例として、J. Fisher et al., J. Bio. Chem., 1995, 270, p.30392-30400に記載されたものを挙げることができる。
【００３７】
これらの酵素と一緒に使用できる基質は、NADPHおよびNADHでありうる。
【００３８】
補因子としてフラビンを使用することは、これらがフラビン還元酵素、すなわち以下のスキーム、
【００３９】
【数２】
0004468694.tif 000005
【００４０】
に従って空気中の酸素によってNADPHまたはNADHの酸化を触媒する可溶性酵素の補因子として作用する分子であるので、非常に関心が持たれる。
【００４１】
このスキームでは、フラビン還元酵素はNAD(P)Hによるフラビンの還元を触媒する。その後、反応によって生じた還元フラビンは自然に空気中の酸素と反応して、最初の状態のフラビンを再形成する。このようにして数多くの変換サイクルを実施することができ、NADPHまたはNADHを大量に消費することが可能となる。この酵素的増幅現象によって、十分なシグナルを得ることが可能になる。
【００４２】
本発明では、基質としてNADPHまたはNADHを使用することは、これらの分子がそれらの酸化生成物であるNADP+およびNAD+が有さない特徴的な光吸収および蛍光を示すので、特に興味が持たれる。
【００４３】
NADHの蛍光放出特性は特に、Scott et al, J. Am. Chem. Soc., 92:3, 11 February 1970, p.687からp.695に記載されている。
【００４４】
したがって、NADHは波長460nmで蛍光極大を示し、波長340nmで吸収極大を示すが、一方NAD+酵素による変換生成物は蛍光も吸収も示さない。
【００４５】
また、フラビン酸化還元酵素は本発明で使用することが可能な酵素として優れた例である。これは可溶性で安定なモノマー蛋白質で、過剰産生株から容易に精製される。この酵素の調製については非特許文献3に記載されている。この酵素は専ら、フラビンのイソアロキサジン環を認識し、したがって非特許文献3に記載されているようなリビチル鎖に変更を有する広範囲のフラビン類縁体を補因子として使用することができる。
【００４６】
本発明によれば、オリゴヌクレオチド上に固定されたフラビン基はフラビン還元酵素によって認識され、その結果フラビン-オリゴヌクレオチド複合体が常に酵素によるNADPHまたはNADHの酸化の触媒を可能にする補因子を形成し、したがって340nmでの光吸収を減少させ、460nmでの蛍光を減少させることが発見された。
【００４７】
フラビン補因子Aが酵素E濃度に対して飽和状態ではないとき、単位時間当たりの蛍光のOD変化(△ODまたは△fluo)はフラビン補因子Aの量と比例する。これによって補因子A標識プローブの定量が可能になる。
【００４８】
本発明では、フラビン-オリゴヌクレオチド複合体が相補的オリゴヌクレオチドとハイブリダイズすると、フラビン基はフラビン還元酵素によって認識されなくなり、そのためNADPHまたはNADHの酸化はもはや触媒されず、340nmでの吸収および460nmでの蛍光の減少が引き起こされることが判明した。
【００４９】
結論としていえば、ハイブリダイゼーションさせずに、時間単位当たり、または固定時間、たとえば5分間の光学密度または蛍光の減少から成るシグナルを測定することによってフラビン-オリゴヌクレオチドプローブ(オリゴ-A)を検出する。このシグナルは、部分的または全体的に消失する傾向があり(△ODまたは△fluoは減少するか、または最良の場合ゼロになる)、非標識の相補標的とハイブリダイズすると特にその傾向がある。したがって光学密度または蛍光放出の減少の変化によってハイブリダイゼーションの証拠を掴むことができる。
【００５０】
この方法の1利点は、測定されたシグナルの変化は所与の分子の光学密度または蛍光の変化を反映していないが、補因子としてAを使用する酵素Aの基質S数分子を反映していることである。したがって、酵素反応によって、かなりこの応答を増幅させることが可能である。
【００５１】
フラビン(補因子A)フラビン還元酵素(酵素E)およびNADHまたはNADPH(基質)の系で使用することができる本発明の実施形態の1変種によれば、第2の酵素およびアルデヒドを使用することによって酵素Eの酵素活性を示すシグナルを得ることができ、この第2酵素は還元型フラビンとアルデヒドおよび酸素との反応を触媒することができ、この反応は酵素Eの活性を示す蛍光を伴う。この第2酵素はたとえばルシフェラーゼであり、アルデヒドはデカナールでありうる。
【００５２】
すでに説明したように、第1段階で、基質Sは第1酵素E(フラビン還元酵素)によって化合物Cに変換され、還元フラビンが形成される。第2段階では、第2酵素(ルシフェラーゼ)が以下の反応スキームに従って還元型フラビンとアルデヒド(RCHO)および酸素との反応を触媒する。
【００５３】
還元フラビン+RCHO+O2→RCOOH+酸化フラビン+(光)  (hv)
【００５４】
これは490nmでの蛍光発光に対応する。
【００５５】
この反応は、Hastings et al., Advances in Microbial Physiology, vol. 26, 1985, p.235-291およびZenno et al., J. Bacteriol., 1994, p.3536-3543に詳細に記載されている。
【００５６】
このように形成された酸化型フラビンは、フラビン還元酵素による基質Sの変換に使用されて、その後再度還元されることが可能である。
【００５７】
したがって、プローブが相補的標的とハイブリダイズすると、これらの反応はもはや起こらず、光も生じない。したがって、ハイブリダイゼーションしていなければオリゴフラビンによって光が生じ、ハイブリダイゼーションしていると光は生じない。
【００５８】
ルシフェラーゼによるハイブリダイゼーションの検出は、シグナルが特に化学反応と特異的に関連しており、使用した物体(手段)に固有に備わっている特性(吸収または蛍光)には関連していないので、興味深い。
【００５９】
したがって、わずかに蛍光を放ち、蛍光測定に影響を及ぼすことが可能な支持体として特異性の高いものが問題となる。他方、これらは化学発光ではない。
【００６０】
このような本発明の変種では、E.coliまたはV.harveyiのフラビン還元酵素およびV.harveyiのルシフェラーゼを使用することが可能である。
【００６１】
この場合、フラビン、フラビン還元酵素およびルシフェラーゼで標識したプローブにデカナールをたとえば0.001%vol/vol、NADPHまたはNADH  200μM、およびリン酸緩衝液、pH7.50mMを添加する。蛍光発光は、市販の蛍光光度計で490nmにおいて測定する。この操作を相補的標的オリゴヌクレオチドに繰り返すと、蛍光発光は生じない。
【００６２】
本発明によれば、補因子Aで標識したオリゴヌクレオチドプローブを固相支持体に固定することが好ましい。この固相支持体はプローブが固定されているマイクロディッシュを備えて提供されうる。
【００６３】
したがって、本発明のさらなる課題は、固相支持体に固定したオリゴヌクレオチドプローブを含むDNA型またはRNA型の生物学的標的用の分析用支持体であり、プローブ上の補因子Aは酵素Eによって認識されるが、オリゴヌクレオチドプローブが相補的オリゴヌクレオチドとハイブリダイズすると酵素Eによって認識されにくいようにオリゴヌクレオチドプローブが酵素Eの補因子Aで標識されており、酵素Eは基質Sの消費または化合物Cの生成を光学的シグナルで示すことによって酵素Eの活性を測定できるような、基質Sまたはこの基質の変換化合物Cを有することが特徴である。
【００６４】
補因子Aはフラビンまたはその誘導体の1つであることが好ましい。
【００６５】
したがって、オリゴヌクレオチドプローブを式-(CH2)n-R1の基で標識することが可能であり、式中nは2から8の範囲の自然数で、R1は式
【００６６】
【化３】
0004468694.tif 000006
【００６７】
に相当する基を表す。
【００６８】
本発明のその他の特徴および利点は、添付した図面を参照にして、明らかに例示的であり非限定的な例として挙げた以下の説明を読むとより明らかになるだろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６９】
以下の実施例では、以下のオリゴヌクレオチドを使用する。
1)フラビン-オリゴヌクレオチドプローブ
ISIS:配列番号1
3'-ctctcccctt caccaccccc-p-C6フラビン
2)フラビンオリゴヌクレオチドプローブの相補的標的
ICAM-20:配列番号2
5'-gcctgatgag aggggaagtg gtgggggaga catagcccca cc-3'
ICAM-17:配列番号3
5'-gcctgatgag aggggaagtg gtggcccaga catagcccca cc-3'
ICAM-14:配列番号4
5'-gcctgatgag aggggaagtg gattcccaga catagcccca cc-3'
3)非相補的オリゴヌクレオチド
NC:配列番号5
5'-ctcatcgtgt aaaaaaaaaa aggcagtact ggaagggcta attct-3'
【００７０】
ISISフラビン-オリゴヌクレオチドプローブは、非特許文献4に記載された方法を使用して合成した。
【００７１】
これらの実施例では、非特許文献6に記載された方法に従って調製したフラビン還元酵素を酵素Eとして使用する。
【００７２】
蛍光放出および励起スペクトルは、パルスキセノン光源、励起モノクロメータ、放出モノクロメータおよび温度調節システムを装備したLS 50B Perkin-Elmer分光蛍光計で記録した。
【実施例１】
【００７３】
この実施例では、フラビン還元酵素の酵素的活性の変化を、相補的標的オリゴヌクレオチドICAM-20(配列番号2)の量の増加に関連してISISプローブ(配列番号1)で調べる。
【００７４】
温度制御装置を装備したVarian-Cary分光蛍光計のタンクに、以下の化合物、Tris HCl緩衝液pH7.5 50mM、NaCl 10mM、ISISプローブ10μM、NADH 200μMおよびフラビン還元酵素0.1μm、および様々な量のICAM-20標的オリゴヌクレオチドを含有する全量100μlを添加する。
【００７５】
最初に、トリス緩衝液中でNaCl存在下において、室温でISISとICAM-20の間に2重らせんが形成され、次にNADHを添加する。次にこの反応をフラビン還元酵素0.1μm(アッセイ当たり0.3μm)を添加することによって開始させる。空気中で、25℃で数分間継続させる。
【００７６】
NADHの酸化の後、NADHに特徴的な吸収波長である340nmで電子分光計による測定を行う。
【００７７】
図1は、存在する標的ICAM-20当量数に関連してフラビン還元酵素の酵素的活性の変化(酸化NADPHのnmol/酵素mg)を示した図である。
【００７８】
図1で得られた結果は、標的ICAM-20当量数が増加すると酵素活性が迅速に減少することを示している。
【実施例２】
【００７９】
この実施例では、測定した酵素活性に対する標的の相補的塩基の数の影響について確かめる。
【００８０】
この実施例では、実施例1と同様の操作様式に従うが、さらにICAM-17(配列番号3)、ICAM-14(配列番号4)およびNC(配列番号5)から成るその他の標的オリゴヌクレオチドを使用する。それぞれの場合において、10当量の標的オリゴヌクレオチドを使用する。
【００８１】
酵素活性を実施例1のように測定する。
【００８２】
結果を表1および図2に示す。
【００８３】
【表１】
0004468694.tif 000007
【００８４】
図2および表1の結果から、相補的塩基数が14個から20個に増加すると1700nmol酸化NADH/分から200nmol酸化NADH/分に減少するので、標的オリゴヌクレオチドの相補的塩基数が増加すると、増加するにつれて酵素活性(酸化NADHのnmol/分)が非常に減少することが示される。
【００８５】
オリゴヌクレオチドプローブを単独で使用した場合に得られる酵素活性は5000から5800nmol/分である。
【実施例３】
【００８６】
この実施例では、NADH蛍光強度の変化を、フラビン還元酵素およびフラビン標識ISISプローブ単独の存在下で、および相補的オリゴヌクレオチドICAM-20とハイブリダイズしたフラビン標識ISISプローブの存在下で測定する。
【００８７】
図3は、340nmで励起したNADHの蛍光スペクトルを示した図である。この図で、蛍光極大波長は460nmであることがわかる。
【００８８】
この実施例では、Tris/HCl緩衝液pH7.6 50mM、NaCl 10mM、フラビン5μmで標識したISISプローブ、NADH 200μMを含有する全量400μlを、ICAM-20相補的標的、50μM、10当量の存在下で、または非存在下で使用する。
【００８９】
ISISプローブを単独で、またはICAM-20と対にして溶液に入れる。次にNADHを添加し、次にフラビン還元酵素(アッセイ当たり0.3μg)、すなわち0.1μMを添加することによって反応を25℃で開始させる。
【００９０】
460nm(NADHの蛍光極大波長)でのNADHの蛍光強度(I)を時間t(秒)に関連して記録する。
【００９１】
得られた結果を図4に示す。
【００９２】
この図で、直線(ISIS)はISISプローブ単独での蛍光強度変化に対応し、(ISIS+ICAM-20)線はICAM-20とハイブリダイズしたISISプローブの蛍光強度変化を示す。
【００９３】
図4で、ハイブリダイズしたプローブの蛍光強度は、時間に関連してほとんど変化しないことがわかる。
【実施例４】
【００９４】
この実施例では、NADHの蛍光強度の変化を相補的標的の塩基対数に関連して測定する。前述の実施例と同様の操作様式に従って、標的ICAM-20または標的ICAM-17または標的ICAM-14のいずれかをISISプローブに対して標的10当量の割合で使用する。任意の単位で表したNADHの蛍光強度Iをフラビン還元酵素の存在下で時間に関連して340nmの波長で励起し、460nmで記録する。得られたI=f(t)の直線を使用して、形成した2重鎖における結合塩基対の数に関連して分当たりの蛍光変化を測定する。表2に蛍光強度の変化を示し、図5に標的オリゴヌクレオチドの相補的塩基の数に関連させてこの変化を示す。この図で、任意の単位の値100はISISがハイブリダイズしていないときの時間単位当たりの蛍光強度変化を示す。
【００９５】
【表２】
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【００９６】
光学密度を測定した図2の結果と図5で得られた結果を比較すると、得られた結果が同様であることがわかる。
【実施例５】
【００９７】
この実施例では、フラビン還元酵素の酵素活性を、フラビン標識ISISプローブの濃度を増加させることによって測定する。Tris緩衝液、pH7.6、50mM、NaCl 50mM、NADH 200μMおよびフラビン還元酵素0.05g/lを使用して、相補的オリゴヌクレオチドを入れずにこの実験を実施する。使用したISISプローブの量は、0から7μMの範囲である。
【００９８】
図6は、酵素活性、すなわちISISプローブの濃度(μM)に関連した1分当たりの酸化NADHのナノモル数を示す。酵素活性は、ISISプローブ濃度、すなわちフラビン濃度と共に増加することがわかる。
「参考文献」
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【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】相補的標的オリゴヌクレオチドの量の増加に関連したフラビン還元酵素の酵素活性の変化を示す曲線である。
【図２】標的オリゴヌクレオチドの相補的塩基数に関連して測定された酵素活性を示した図である。
【図３】NADHの蛍光スペクトルを示した図である。
【図４】フラビン還元酵素存在下でのオリゴヌクレオチドプローブ単独(直線ISIS)、または相補的標的オリゴヌクレオチドとハイブリダイズした場合(直線ISIS+ICAM-20)のNADH蛍光強度の変化を示した図である。
【図５】フラビン還元酵素の活性によって誘導されるNADH蛍光の強度変化に対する、フラビンで標識したオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズした標的オリゴヌクレオチドの相補的塩基数の効果を示した図である。
【図６】フラビン標識プローブの量の増加に関連したフラビン還元酵素の酵素活性を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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