(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体試料の分析方法において、前記方法が：
(１)  試料流として溶媒及び検体を含む試料溶液を提供する工程；
(２)  前記試料流にドーパントを与える工程；
(３)  前記溶媒及び前記検体の蒸気化を促進するために、前記試料流の小滴の噴霧を形成する工程；
(４)  前記噴霧内の前記小滴を蒸気化し、よって前記試料を気態にする工程；
(５)  前記工程(２)の後、大気圧にある領域において、前記ドーパントをイオン化するために前記試料流を光で照射し、よって前記イオン化されたドーパントと前記検体との間の連続衝突及び中間体としてはたらく溶媒分子との前記検体の間接衝突の内の少なくとも１つが、前記検体のイオン化を生じさせる工程；及び
(６)  前記イオンを、前記イオンの質量分析のために、質量分析計の質量分析器に通す工程；
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記工程(５)において、液態での照射を実行するために、前記工程(４)の前に前記試料流を照射する工程を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記工程(５)において、気態での照射を実行するために、前記工程(４)の後に前記試料流を照射する工程を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
ドーパントを与える前記工程(２)が、ドーパントを独立に添加する工程及び前記溶媒を前記ドーパントとして利用する工程の内の１つを含み、前記ドーパントが液態または気態の内の１つで与えられることを特徴とする請求項２または３記載の方法。
【請求項５】
前記工程(３)、(４)及び(５)において前記試料流及び前記イオンを誘導するためのガイドを備える工程を含むことを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記イオンの集束を促進するための形状につくられた末端をもつガイドを備える工程を含むことを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項７】
補助静電集束素子を備える工程及び、前記工程(５)において前記試料流が照射される域と前記質量分析計の流入口との間に電位差を与える工程を含むことを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項８】
前記工程(３)、(４)及び(５)において前記試料流を第１の方向に流し、前記工程(６)において前記イオンを、前記第１の方向に概ね直交する第２の方向で、前記質量分析器に通す工程を含むことを特徴とする請求項５，６または７記載の方法。
【請求項９】
前記工程(３)、(４)、(５)及び(６)の全てにおいて前記試料流を基本的に同じ方向に通す工程を含むことを特徴とする請求項５，６または７記載の方法。
【請求項１０】
前記工程(５)において陽イオン及び陰イオンの内の１つを形成する工程を含むことを特徴とする請求項２，３，４，５または６記載の方法。
【請求項１１】
請求項４記載の方法において、複数の検体を含む試料溶液に前記方法を実施し、よって前記検体の全てが少なくともある程度イオン化される工程を含み、前記方法が前記相異なる検体を分離して弁別するために前記検体イオンを質量分析工程にかける工程をさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項１２】
少なくとも前記工程(５)において前記検体が照射される域と前記質量分析計の流入口との間に集束電位差を与える工程を含むことを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項１３】
前記試料溶液に熱噴霧器プローブを通過させることにより前記工程(３)及び(４)を実施する工程及並びに前記溶媒及び前記検体の小滴の形成及び蒸気化を促進し、さらに、前記蒸気の前記イオン化領域への輸送及び前記イオン化領域の通過も促進するための補助ガス流を与える工程を含むことを特徴とする請求項１から１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
前記ドーパントを含む補助ガスを前記熱噴霧器プローブに供給することによる、前記工程(２)における前記ドーパントを添加する工程を含むことを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記工程(３)の前に、前記検体をその他の物質から分離するために、前記試料流に液相分離を受けさせる工程を含むことを特徴とする請求項１，３，５または１３記載の方法。
【請求項１６】
前記工程(６)が実質的に大気圧より低い圧力で作動される質量分析計に前記イオンを通す工程を含むことを特徴とする請求項１から１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
比較的大量のいくつかのイオン化可能種及び比較的少量のイオン化されるべき検体を含む試料溶液から形成された試料流の光照射のための装置において、前記装置が：
前記試料流の蒸気化のために前記試料流から小滴の噴霧を形成するための噴霧形成手段；
前記試料流にドーパントを供給するためのドーパント供給手段；
前記イオン化可能種をイオン化するために大気圧にある領域において前記試料流を光照射し、よって、前記イオン化された種と前記検体との間の連続衝突及び前記イオン化された種と前記検体との間の中間反応の内の少なくとも１つにより前記検体の電荷移動及びイオン化を生じさせるための手段；及び
前記試料流の光照射により形成された前記イオンの質量荷電比を決定するための質量分析計；
を備えることを特徴とする装置。
【請求項１８】
光照射するための前記手段が、前記イオン化可能種をイオン化するに十分なエネルギーを有する光子を供給するために選ばれたランプを含むことを特徴とする請求項１７記載の装置。
【請求項１９】
噴霧を形成するための前記手段が、噴霧器ガスの供給のための流入口を備える、噴霧器を含むことを特徴とする請求項１７記載の装置。
【請求項２０】
前記噴霧器が補助ガスのための流入口を備えることを特徴とする請求項１９記載の装置。
【請求項２１】
前記ドーパントが液相で供給され、前記試料溶液と混合されることを特徴とする請求項１７記載の装置。
【請求項２２】
前記ドーパントが気相で供給され、蒸気化された前記試料流と混合されることを特徴とする請求項１７記載の装置。
【請求項２３】
前記噴霧器が：前記小滴の噴霧を形成するための流出口を有する、前記試料流を受け取るための毛管；前記蒸気化された試料流を誘導するための、前記毛管の前記流出口から伸びるチャネル；並びに溶媒及び前記検体の蒸気化を促進するための、前記毛管の前記流出口に近接して前記チャネルを囲むヒーターを備えることを特徴とする請求項１９または２０記載の装置。
【請求項２４】
前記蒸気化された試料流及び前記イオンのための前記チャネルを定め、前記噴霧器と前記質量分析計との間に伸びる接続ブラケット、並びに、前記接続ブラケットと前記質量分析計との間に集束電位差を与えるための、前記接続ブラケットに接続された高電圧電源手段を備えることを特徴とする請求項２３記載の装置。
【請求項２５】
光照射するための前記手段がレーザを含むことを特徴とする請求項１７記載の装置。
【請求項２６】
前記小滴の噴霧を形成する前に前記試料溶液に液相分離を受けさせるための、前記噴霧形成手段に接続された、液体分離手段を備えることを特徴とする請求項１７記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の属する技術分野
本発明は液体クロマトグラフィ(ＬＣ)及び質量分析法(ＭＳ)に関する。さらに詳しくは、本発明は光イオン化(ＰＩ)をＬＣ及びＭＳとともに使用することによる改善されたイオンの生成及び検出を提供するための方法及び装置のいずれにも関する。
【０００２】
発明の背景
大気圧光イオン化(ＡＰＰＩ)は知られているが、液体クロマトグラフィ−質量分析法(ＬＣ−ＭＳ)にはこれまで適用されていなかった。さらに、光イオン化検出(ＰＩＤ)がガスクロマトグラフィ(ＧＣ)とともに長年使用されてきているにもかかわらず、ＬＣと組み合わせられたＰＩの報告は非常に少ない。
【０００３】
ＧＣにおける光イオン化検出は一般に、真空紫外(ＶＵＶ)光子を発生する放電ランプの使用を含む。これらの光子の内の１つが、その光子のエネルギーより低い第一イオン化ポテンシャル(ＩＰ)をもつ、カラム溶離剤内の分子に吸収されると、単光子イオン化がおこり得る。これにより生成された光イオンは適当な捕集電極を通って流れる電流として検出され；クロマトグラフィ試験の間に検出される電流を時間に対してプロットすることによりクロマトグラムを得ることができる。ＰＩＤ−ＧＣに対しては、放電ランプは通常、光子のエネルギーが検体のＩＰより大きいがキャリヤガスのＩＰよりは低くなるように選ばれる(ほとんどの有機分子は７〜１０ｅＶの範囲のイオン化ポテンシャルをもち；通常のＧＣキャリヤガスはこれより高い値を示し、例えばヘリウムでは２３ｅＶである)。したがって、検体のイオン化が選択的におこることができ、低バックグラウンド電流を達成することができる。
【０００４】
数少ない初期の報告がＬＣとＰＩとの組合せに関する文献にある(Ｊ.Ｔ.シェルムンド(Schermund)，Ｄ.Ｃ.ロック(Locke)，Anal. Lett.誌，第８巻，６１１〜６２５ページ(１９７５年)；Ｄ.Ｃ.ロック，Ｂ.Ｓ.ディングラ(Dhingra)，Ａ.Ｄ.ベイカー(Baker)，Anal. Chem.誌，第５４巻，４４７〜４５０ページ(１９８２年)；Ｊ.Ｎ.ドリスコル(Driscoll)，Ｄ.Ｗ.コンロン(Conron)，Ｐ.フェリオリ(Ferioli)，I.Ｓ.クラル(Krull)，Ｋ.-Ｈ.ズィー(Xie)，J. Chromatogr.誌，第３０２号，４３〜５０ページ(１９８４年)；Ｊ.Ｓ.Ｍ.デ・ウィット(De Wit)，Ｊ.Ｗ.ヨルゲンソン(Jorgenson)，J. Chromatogr.誌，第４１１号，２０１〜２１２ページ(１９８７年))。しかし、これらの報告はまた、質量分析無しの、光イオン電流の直接検出に依存していた。一般的なＬＣ溶媒も比較的高いＩＰを有している(水，ＩＰ＝１２．６ｅＶ；メタノール，ＩＰ＝１０．８ｅＶ；アセトニトリル，ＩＰ＝１２．２ｅＶ)から、選択的イオン化は上記報告の実験でも可能であった。すなわち、上記報告の方法はＧＣで用いられるような光イオン化検出と同様であった。大多数の場合、ＬＣカラムからの液体溶離剤は、イオン化領域に入る前に完全に気化され、イオン化は気相でおこっていた。しかし、上記の研究の内の１つは液相溶離剤の直接光イオン化に関わっていた(Ｄ.Ｃ.ロック，Ｂ.Ｓ.ディングラ，Ａ.Ｄ.ベイカー，Anal. Chem.誌，第５４巻，４４７〜４５０ページ(１９８２年))。
【０００５】
トレースレベルの検体が大量のキャリヤガスまたは溶媒の存在の下で検出されなければならず、またイオン電流だけが測定されている場合、光イオン化が選択的であることが肝要である。そうでなければ、キャリヤガスまたは溶媒から生成されたイオンが注目する検体のイオンを覆い隠すことになり得るであろう。しかし、検出の前に光イオンを分離するために、すなわち所望の検体イオンを溶媒分子またはいずれかの不純物から生じるイオン化種のようなその他のイオン化種から分離するように、質量分析器が用いられれば、上記要件を排除できる。
【０００６】
少数であるが質量分析法と組み合わされたＡＰＰＩの報告もある。イオン移動度分光法(ＩＭＳ)と結び付けられたＡＰＰＩには非常に多くの例があったが(Ｍ.Ａ.ベイム(Baim)，Ｒ.Ｌ.イーサートン(Eatherton)，Ｈ.Ｈ.ヒル(Hill)ジュニア，Anal. Chem.誌，第５５巻，１７６１〜１７６６ページ(１９８３年)；Ｃ.Ｓ.レジャー(Leasure)，Ｍ.Ｅ.フライシャー(Fleischer)，Ｇ.Ｋ.アンダーソン(Anderson)，Ｇ.Ａ.アイスマン(Eiceman)，Anal. Chem.誌，第５８巻，２１４２〜２１４７ページ(１９８６年)；Ｇ.Ｅ.スパングラー(Spangler)，Ｊ.Ｅ.ロエール(Roehl)，Ｇ.Ｂ.ペイテル(Patel)，Ａ.ドルマン(Doeman)，米国特許第５，３３８，９３１号(１９９４年)；Ｈ.-Ｒ.ドーアリング(Doering)，Ｇ.アーノルド(Arnold)，Ｊ.アドラー(Adler)，Ｔ.レーベル(Roebel)，Ｊ.リーメンシュナイダー(Riemenschneider)，米国特許第５，９６８，８３７号(１９９９年))、発明者等が知り得た、大気圧で生成された真の光イオン質量分析に関する報告は３つしかない(Ｉ.Ａ.レベルスキー(Revel'skii)，Ｙ.Ｓ.ヤシン(Yashin)，Ｖ.Ｎ.ボスネセンスキー(Vosnesenskii)，Ｖ.Ｋ.クロッチキン(Kurochkin)，Ｒ.Ｇ.コスティヤノフスキー(Kostyanovskii)，Izv. Akad. Nauk SSSR, Ser. Khim 誌，第９号，１９８７〜１９９２ページ(１９８６年)；Ｉ.Ａ.レベルスキー，Ｙ.Ｓ.ヤシン，Ｖ.Ｋ.クロッチキン，Ｒ.Ｇ.コスティヤノフスキー，Zavodskaya Laboratoiya誌，第５７巻，１〜４ページ(１９９１年)から訳載された、「分析の化学的及び物理的方法(Chemical and Physical Method of Analysis)」，２４３〜２４８ページ(１９９１年)；Ｉ.Ａ.レベルスキー，Ｙ.Ｓ.ヤシン，Ｖ.Ｎ.ボスネセンスキー，Ｖ.Ｋ.クロッチキン，Ｒ.Ｇ.コスティヤノフスキー，旧ソビエト社会主義共和国連邦発明者証第１１５９４１２号(１９８５年))。ＡＰＰＩとＭＳの組合せが実行可能であることを確立したＡＰＰＩ−ＭＳ実験を述べている上記の３論文では、ヘリウムキャリヤガス流内のガス状試料混合物の直接分析が行われた。四重極質量分析計による分析のためにガス状混合物からイオンを生成するため、水素放電ランプ(ｈｎ＝１０．２ｅＶ)が用いられた。重要なことには、試料混合気について得られたスペクトル内の試料イオンの相対存在量は試料濃度に依存することがわかった。高試料濃度では、イオン−分子反応、特に電荷(電子)移動が質量スペクトルの外観形状を歪ませた：この電荷移動は、最低のＩＰをもつ種への電荷の大部分の移動を生じさせた。他に、優勢な分子または擬分子のイオンが大気圧におけるＰＩにより生成され、イオン化過程中にフラグメンテーションがほとんどおこらないことを示していることが分かった。最後に、溶媒蒸気(水またはメタノール)がヘリウム流内を運ばれる試料混合気に入ると、この方法に関して感度の低下が見られた。
【０００７】
ＡＰＰＩのＬＣ−ＭＳとの組合せの展望に関して、溶媒蒸気の存在がイオン形成効率を低下させるという知見は問題である。この効果は、気化した溶媒分子がどのように光子を吸収し、よって試料からの光イオンの生成に利用できる光子束を減少させるかを述べた、ＰＩＤ−ＬＣの最後の研究者等には知られていた(Ｊ.Ｓ.Ｍ.デ・ウィット，Ｊ.Ｗ.ヨルゲンソン，J. Chromatogr.誌，第４１１号，２０１〜２１２ページ(１９８７年))。初期のＡＰＰＩ−ＭＳ研究による別の興味深い観察結果は、電荷移動反応がスペクトルの最終外観形状に与える効果である。この観察結果は、ＡＰＰＩスペクトルにおけるイオンの相対存在量が、元来の光イオンが質量分析の前に受ける反応に依存するであろうという事実を告げている。大気圧イオン化法では一般に当てはまるように、高い衝突頻度のため、かなりの反応がおこる前にイオン源からイオンをサンプリングするようにスペクトル測定がなされない限り、得られる陽イオンスペクトルには高い陽子親和性及び／または低いイオン化ポテンシャルをもつ種が優勢になる傾向が確実に生じる(陰イオン大気圧イオン化の場合には、高い気相酸性度または高い電子親和性をもつ分子が陰イオンスペクトルで優勢になる)。
【０００８】
従来のＬＣ−ＭＳ機器の多くは、コロナ放電に依存してイオン化を促進する。通常の構成は、液体クロマトグラフィ過程に続いて試料が導入される、試料溶液の霧化及び気化のための、当業者には既知の、熱噴霧器を備える。試料は、別の液相試料分離法に続いて、あるいは分離過程を含まない液体供給装置から導入することもできる(以下の好ましい実施形態に関する議論を参照されたい)。
【０００９】
コロナ放電(ＣＤ)には独自の要件がある。ＣＤ源においては、放電の開始及び維持に高電位が必要であり、このことは独立のイオン輸送機構の使用に制限を課す。ＣＤからイオンを輸送するために管を用いることはできない。それは、輸送管が何らかの効果をもつためには輸送管がイオン源の極めて近くになければならず、実際上イオン源を取り囲んでいなければならないからである。しかし、ＣＤ源が機能するためにはニードル先端に強電場が存在しなければならず、この電場がニードルと輸送管との間への電位差の印加により維持されるならば、生成されたイオンは、電場による加速により輸送管に向かい、急速に失われてしまうであろう；逆に、輸送管がニードルの電位に近い電位に保たれていれば、上記の機構によるイオン損失は最小限に抑えられるであろうが、ニードルの周りに適当な高電場がないために、少数のイオンしか生成されないであろう。
【００１０】
ＡＰＣＩ(大気圧化学イオン化)は、ＧＣ用電子捕獲検出器と同様の配置で、細管内におかれた放射性６３Ｎｉ箔から放出される高エネルギー電子によって開始させることもできる。６３Ｎｉ箔は、ＬＣ用検出器としての大気圧イオン化−質量分析法の初期の応用の１つで用いられて成功している(Ｅ.Ｃ.ホーニング(Horning)，Ｄ.Ｉ.キャロル(Carroll)，Ｉ.ズィディック(Dzidic)，Ｋ.Ｄ.ヘーゲル(Haegele)，Ｍ.Ｇ.ホーニング(Horning)，Ｒ.Ｎ.スティルウエル(Stillwell)，J. Chromatogr. Science誌，第１２巻，７２５〜７２９ページ(１９７４年))。しかし、６３Ｎｉ箔の重大な実用上の欠点は、放射性物質に関する予防措置及び法規制にしたがう必要があることである。
【００１１】
大気圧光イオン化は装置が維持される電位とは無関係であり、放射性物質は使用されないから、ＡＰＰＩ源にはそのような制限は存在しない。このため、(ＣＤ源の別の制限要因である)安定放電の維持にかかわりなく、輸送管の位置及び形状を選択することができる。さらに、サンプリングオリフィスに向かうイオンの輸送を最適化するために輸送管の電位を独立に制御できる。１つまたは複数の補助静電イオン集束素子をイオン化過程に影響することなくイオン源に付加することもでき、これは(コロナ放電または電子スプレーイオン化では実際的でない)ＡＰＰＩ独自の特徴である。
【００１２】
ＡＰＰＩでは、イオン−分子反応は、輸送管内においてドーパント光イオン、溶媒分子及び検体分子間でおこり、正味の結果は(有利な熱力学的条件が存在すれば)電荷が検体分子に移されることである。
【００１３】
ＡＰＰＩによるイオン形成効率を高めるためにドーパントを使用するという考えは、大気圧イオン化にドーパントが用いられた例がいくつか報告されているので、全く先例がないわけではない。例えば、ＰＩ−ＩＭＳの感度を高めるためのドーパントとしてのアセトン及びトルエンの使用が、国際特許出願(ＷＯ第９３／２２０３３号)及び米国特許第５，９６８，８３７号に述べられている。また、ベンゼンが関与する電荷交換反応を利用して、陽子親和性が低い試料に対してコロナ放電イオン化の感度を高めることに成功している(Ｓ.Ｎ.ケットカー(Ketkar)，Ｊ.Ｇ.デュラック(Dulak)，Ｓ.ディーンドハヌー(Dheandhanoo)，Ｗ.Ｌ.フィテ(Fite)，Anal. Chim. Acta誌，第２４５号，２６７〜２７０ページ(１９９１年))。発明者等の知る限り、液体クロマトグラフィの溶離剤からの光イオンの生成を強めるためにドーパントがこれまでに用いられたことは全くない。
【００１４】
発明の概要
本発明の発明者等が気付いたことは、イオン化後反応がＡＰＰＩ質量スペクトルの解析を複雑にし得るが、高められた感度を得るためにこれらの反応を利用できることである。上述したように、気化ＬＣ溶離剤のＰＩを試みる場合、限られた光子束をやはり吸収できる過剰な溶媒分子のため、検体分子の直接ＰＩは統計的におこりそうもない事象である。これまでＰＩ−ＬＣに用いられていたランプは全て、最も一般的に用いられるＬＣ溶媒のほとんどのＩＰより低い光子エネルギーをもっていた。これにより、溶媒のイオン化は実質的に防止されるが、それでもなお、溶媒は光を吸収して所望の検体のイオン化を妨げる。したがって、上記の実験における総イオン生産率は極めて低かった。
【００１５】
本発明の発明者等はさらに、気化ＬＣ溶離剤中のイオン化可能分子の割合を全体のかなりの率を占めるまで高めれば、放電ランプにより生成されるイオンの数を大きく増加させ得ることに気付いた。これを達成できる２つの手段：１) 溶媒分子自体がイオン化されるような、より高エネルギーの放電ランプの使用；及び２) 液体溶離剤への、または溶離剤から生成された蒸気への、大量の、光子エネルギーより低いＩＰを有するドーパントの添加がある。選ばれたイオン化可能分子の再結合エネルギーが比較的高いか、またはその陽子親和性が低ければ、その分子の光イオンはイオン化領域に存在する種と陽子すなわち電荷の移動により反応することができる。負の検体イオン形成に対しては他の機構、とりわけ、共鳴電子捕獲、解離をともなう電子捕獲、イオン対形成、陽子移動及び電子移動が原因となり得る。イオン化領域は大気圧にあるから、熱力学的に有利であれば、光イオンの電荷が検体に効率的に移されることが高い衝突率により保証されるであろう(明らかに、反応領域内に存在する不純物に依存して、いかなる数の競合反応もおこり得る)。
【００１６】
イオン生成率を高めるための上述した第１の方法(１)の使用には実用上の問題がある；問題とは、必要な高エネルギー光子に透明であり、かつ水の存在の下で安定である窓材料が現在存在しないことである。また、イオン化における感度低下にともない、さらに高エネルギーのランプも必要である。しかし、用途の多くに対して、未知の試料組成の場合には、普遍的な、非選択的イオン化法が望ましいから、高感度は望ましくない。本発明は、適当なランプを用いることによる溶媒自体の励起を図る。上述した第２の方法(２)の利点は、ランプ窓の安定性の他に、初期試薬イオンを選択できることである；これは方法(１)でも可能ではあるが、かなりわずかな可能性しかない。
【００１７】
さらに本発明では、全ての、パルス出力型及び連続出力型のいずれのタイプのランプもＰＩに使用できる；好ましい実施形態は連続出力型ランプを利用する。したがって、ＰＩは、いずれか適当な(３段四重極、単段四重極、ＴＯＦ(飛行時間)、四重極−ＴＯＦ、四重極イオントラップ、ＦＴ−ＩＣＲ(フーリエ変換−イオンサイクロトロン共鳴)、扇形等の)質量分析器とともに、ＬＣ(分離が含まれているかまたはいない、全ての液体試料法)に適用される。
【００１８】
すなわち、可能なイオン化機構には：気化検体の直接ＰＩ、溶離剤内のドーパントのＰＩに続くイオン−分子反応によるイオン化、溶媒がドーパントとしてはたらく場合に溶媒のＰＩに続くイオン−分子反応によるイオン化等がある。ランプのエネルギーが、溶離剤の、または溶離剤から生成された蒸気(ドーパントはガスとして別に導入することができる)の少なくとも１つの主要成分をイオン化するに十分であれば、どのランプが上記のいずれに対して用いられようとも問題ではない。
【００１９】
フッ化リチウムでつくられた窓は約１１．８ｅＶまで光学的に透明であり、(ランプの設計に依存して)１１．２，１１．６及び１１．８ｅＶの光子を与えることができるアルゴンランプに用いられる。しかし、フッ化リチウムは吸湿性であり、フッ化リチウム窓は湿気にさらされると急速に劣化し、高温により事態は一層悪化する。したがって、ほとんどのＬＣ溶媒システムにおける高水分含有及び溶媒を気化するに必要な高温により、フッ化リチウム窓を装着したランプには限られた実用寿命しかないと考えることができる。それにもかかわらず、ＬＣに対する光イオン源として、ただし、ドーパントが存在しない場合に、溶媒の主要成分(例えばメタノール、エタノールまたはイソプロパノール)がランプによりイオン化可能である場合にのみ、さらにランプ窓を保護するために特別な予防措置がとられる場合にのみ、アルゴン放電ランプを使用できると考えられる。アルゴンランプは、溶媒自体の主要成分自体はランプによるイオン化が可能ではないが、ドーパントが添加される、方法(２)の態様に用いることもできる。現在のフッ化リチウム窓の限界を克服する、新しい窓材料が利用可能になり得ることも認識されるべきである。またＰＩはおそらく、無窓光源とともに、これらが利用可能になれば、運用されることになろう。
【００２０】
ＡＰＰＩによるイオン生成を強めるための上述した第２の方法は、ＩＰがより低いドーパント種を選び、よって異なる光源を用い得るようにすることにより、フッ化リチウム窓をもつランプのための要件を排除できる。例えば、適当な高い再結合エネルギーまたは低い陽子親和性をもつ、１０ｅＶの光子でイオン化可能なドーパントに対しては、クリプトン放電ランプを用いることができる。クリプトンランプには通常、水蒸気の存在の下でより一層安定であり、１１．３ｅＶまで光学的に透明なフッ化マグネシウム窓が装着されている。クリプトンランプを用いれば、溶媒分子の存在の下でドーパントを選択的にイオン化することが可能であり、よって、イオン源におけるイオン−分子化学反応をある程度制御する機会が与えられる。本手法で与えられる選択性は、フッ化マグネシウム窓を装着したランプに予期されるより長い寿命とあいまって、フッ化マグネシウム窓をもつランプと組み合わせたドーパントの使用を、ＬＣ−ＭＳとともにＡＰＰＩを実施する好ましい方法とする。
【００２１】
アルゴンまたはクリプトンが満たされたランプは市販されており、上記の議論では例として与えられている；所望の光子エネルギーを作り出す、その他のガスで満たされたランプも同様に、十分に使用することができる。
【００２２】
本発明の方法の利点は、感度が、ランプ寿命とは逆の関係にあるランプ電流に大きくは依存しないこと、すなわち感度を大きく低下させずに低電力でランプを運転できることである(０．４ｍＡと２ｍＡでの感度差はおそらく１０〜１５％)。したがって、本方法は比較的に経済的であるという予期されていなかった利点を提供する。ドーパントがなければ感度はランプ電流に比例する；この違いの原因となる機構はまだ解明されていない。
【００２３】
試料への光照射は通常は気相で行われるであろうし、これがほとんどの試料に対して最も効率的な手法であろうと思われる。しかし、噴霧化及び気化の前に液体を光イオン化することが可能である(Ｄ.Ｃ.ロック，Ｂ.Ｓ.ディングラ，Ａ.Ｄ.ベイカー，Anal. Chem.誌，第５４巻，４４７〜４５０ページ(１９８２年))。考慮すべきいくつかの要因がある：１) 液相溶媒分子は単離された気相溶媒分子より低いＩＰを有し、ほとんどの溶媒の直接ＰＩは１０ｅＶ光子により生じるであろう；したがって、ＬｉＦ窓は必要とされない；２) イオン−電子再結合が液相ではかなり速く、よっておそらく感度に問題が生じるであろう；及び３) 液体とランプ窓の直接接触により窓の劣化速度が速まり得る。これらの要因に基づけば、本発明の方法はおそらく、噴霧化及び気化が後におこる液体の直接ＰＩを利用するか、あるいは気化が後におこる噴霧化によりつくられた小滴のＰＩを利用する態様で適用できる。気化過程中に、サイエックス(SCIEX)ターボイオンスプレーイオン源で利用される集成装置と同様のある集成装置において、イオンを小滴から遊離させることができる。しかし、以下に説明するように、発明者等は上記の方法が本発明の好ましい実施形態ほどうまくはたらくとは考えていない。
【００２４】
本発明の第１の態様にしたがえば、検体試料の分析方法が提供され、この方法は：
(１)  試料流として溶媒及び検体を含む試料溶液を提供する工程；
(２)  試料流にドーパントを与える工程；
(３)  溶媒及び検体の気化を促進するために、試料流の小滴の噴霧を形成する工程；
(４)  噴霧内の小滴を気化する工程；これにより試料は気態になる；
(５)  工程(２)の後、大気圧にある領域において、ドーパントをイオン化するために試料流を光で照射する工程；これにより、イオン化されたドーパントと検体との間の連続衝突及び中間体としてはたらく溶媒分子との検体の間接衝突の少なくとも１つが検体のイオン化を生じる；及び
(６)  イオンの質量分析のために質量分析計の質量分析器にイオンを通す工程；
を含む。
【００２５】
本方法は、工程(５)において、液態において照射を行うために工程(４)の前に試料流を照射する工程、あるいは気態において照射を行うために工程(４)の後に試料流を照射する工程を含むことができる。
【００２６】
ドーパントを与える工程(２)は、独立したドーパントを添加する工程及び溶媒をドーパントとして利用する工程の内の１つを含むことができ、ドーパントは液態及び気態の内の１つで与えることができる。
【００２７】
本方法は、工程(３)、(４)及び(５)において試料流を誘導するためのガイドを備える工程を含むことが好ましく、ガイドはイオンの集束を促進するような形につくられた末端を備えることができる。
【００２８】
本方法は、補助静電集束素子を備える工程及び工程(５)における試料流照射域と質量分析計の流入口との間に電位差を与える工程を含むことができる。
【００２９】
工程(３)、(４)及び(５)において試料流を第１の方向に流し、工程(６)において一般には第１の方向に直交する第２の方向でイオンを質量分析器に通すことが好ましいと考えられる。しかし、本方法は、工程(３)、(４)、(５)及び(６)の全てにおいて試料流を基本的に同じ方向に通す工程を含む。
【００３０】
本方法は工程(５)において陽イオンまたは陰イオンの形成に用いることができる。
【００３１】
本方法は複数の検体を含む試料溶液について実行でき、これにより全ての検体が少なくともある程度イオン化される。本方法は、相異なる検体を分離し、弁別するために、検体イオンに質量分析を受けさせる工程をさらに含む。
【００３２】
検体を他の物質から分離するために、工程(３)の前に、試料流を液相分離にかける工程を含む本方法を、試料溶液に実施することができる。
【００３３】
本発明の別の態様は、比較的大量のいくつかのイオン化可能種及び比較的少量のイオン化されるべき検体を含む試料溶液から形成される試料流の光照射のための装置を提供し、この装置は：
試料流の気化のために試料流から小滴の噴霧を形成するための噴霧手段；
試料流にドーパントを供給するためのドーパント供給手段；
イオン化可能種を大気圧でイオン化し、イオン化種と検体の間の連続衝突及びイオン化種と検体との間の中間反応の内の少なくとも１つが検体の電荷移動及びイオン化を生じるように、試料流を大気圧にある領域で光照射するための手段；
及び
試料流を光照射することにより形成されたイオンの質量荷電比を決定するための質量分析計；
を備える。
【００３４】
光照射のための手段は、イオン化可能種をイオン化するに十分なエネルギーを有する光子を与えるように選ばれたランプを含むことが好ましい。
【００３５】
光照射のための手段はレーザを含むことが可能である。
【００３６】
好ましい実施形態の詳細な説明
本発明のよりよい理解のため及び本発明をどのように実施できるかをより明確に示すため、本発明の好ましい実施形態を示す添付図面を、例として、ここで参照する。
【００３７】
初めに図１を参照すれば、本発明にしたがう装置は質量分析計１０(ここではパーキン−エルマー(Perkin-Elmer)(ＰＥ)サイエックスＡＰＩ３６５−３段四重極質量分析計)を備える。装置の液体クロマトグラフィ部は自動サンプラー１４(ここではＰＥ シリーズ２００自動サンプラー)から供給を受ける液体クロマトグラフィカラム１２を備える。自動サンプラー１４は続いて２台のポンプ１６，１８(ここではＰＥ シリーズ２００マイクロＬＣポンプ)に接続され、これらのポンプ１６，１８から供給を受ける。
【００３８】
カラム１２(ここではベータベーシック−１８(Batabasic-18)；キーストーンサイエンティフィック社(Keystone Scientific, Inc.)；粒径３μｍ；長さ５０ｍｍ；内径２ｍｍ)は、図１に２０で簡略に示され、以下でより詳細に説明される、熱噴霧器プローブに接続された流出口を有する。熱噴霧器プローブ２０は、図１にやはり簡略に示され、以下でより詳細に説明される、大気圧光イオン化イオン源部２２を介して接続される。
【００３９】
既知の態様で、噴霧器ガス供給源２４が熱噴霧器プローブ２０に接続される。質量分析計１０と熱噴霧器プローブ２０との間に補助ガス配管２６が備えられる。ＡＰＰＩイオン源部２２へのドーパント供給のために、溶媒ポンプ２８(ここではハーバードアパラタス(Harvard Apparatus)モデル２４００−００１シリンジポンプ)も熱噴霧器プローブ２０に接続される。
【００４０】
トーパントは相異なる様々な方法で添加できると考えられる。例えば、ドーパント蒸気を、噴霧器ガスまたは補助ガスに添加するか、あるいは独立配管を通して供給することができるであろう。また、(以下で詳説されるように)ランプを透明に保つためにフラッシングガスが与えられる場合には、ドーパント蒸気をおそらくフラッシングガスとともに供給できるであろう。さらに、ドーパントを液態溶媒自体とすることができ(次の段落を参照されたい)、あるいはドーパントを液態溶媒に溶解させるかまたは混合することができる；この混合はプロセスのどのような段階(例えば、カラムの前、カラムの後、または熱噴霧器プローブ内)においても行うことができる。
【００４１】
本発明において、“ドーパント”は：入射ＶＵＶ光子を吸収し、この光子によりイオン化され、さらに、最終結果として電荷を所望の検体に移動させることができる反応を行う、いかなる種も意味する。したがって、いくつかの応用に対しては、溶媒自体(例えばメタノール)がある種の状況(高エネルギーランプ)の下でドーパントとして機能できる；さらに、本明細書で説明されるドーパントの２つの例である、トルエン及びアセトンはいずれもいくつかの応用のためにＬＣ溶媒として用いることができる。別の応用では、ドーパントを液体とするか、または液体溶離剤に溶解させた揮発性固体とすることができる。絶対的な要件は、ドーパントが検体のイオン化過程における中間体であること、すなわちドーパントが光イオン化に対して高効率を示し、所望の検体への電荷移動に高効率を示すことである。
【００４２】
ランプ４６の保持及び取付のための器具並びに(図２ａ及び２ｂには示されていない)筐体を備える、熱噴霧器プローブ２０及びＡＰＰＩイオン源２２の両者の詳細を示す図２ａ及び２ｂに移る。ＡＰＰＩイオン源２２には、基本的には非改造の熱噴霧器プローブ２０を使用するが、サイエックスＡＰＩ３６５質量分析計とともに提供される熱噴霧器(ＨＮ)大気圧化学イオン化(ＡＰＣＩ)源で一部を構成したＡＰＰＩイオン源２２も用いた。ＨＮ−ＡＰＣＩ源は本発明の手法を実行可能にするために改造されている。ＨＮ−ＡＰＣＩ源は、ＡＰＰＩが実行可能であるためにはＡＰＣＩと同じ態様でのＬＣ溶離剤の気化が必要であると考えられるため、便宜がよい。付加的な利点は、質量分析器の真空インターフェースを改造する必要なしに新しいイオン源２２を質量分析計１０に直接接続できることである。さらに、これにより、新しいイオン源と標準の熱噴霧器−ＡＰＣＩ源との間の比較が、２つのイオン源のための筐体が基本的に同じであるから、容易に可能になる。
【００４３】
熱噴霧器プローブにドーパントを与えるために、簡単な集成配管を利用した。熱噴霧器内で補助ガス送気管にシリンジポンプからの石英ガラス毛管を入れた。この領域は高温であり、よってドーパントは直ちに気化し、補助ガス流により気化領域、次いでイオン化領域に沿って押し流される。ドーパント輸送管をＨＮプローブとインターフェースできる方法は数多くあるが、これを達成する厳密な手段は重要ではない。
【００４４】
熱噴霧器プローブ２０は石英管３０及び石英管を囲むヒーター３２を有する。石英管３０内には、クロマトグラフィカラム１２からの溶離剤のための毛管３４がある。毛管３４を囲んで、噴霧器ガスのための環状チャネルを定める、管３６があり、図２ａ及び２ｂでも噴霧器ガス供給源は２４で示されている。
【００４５】
外管３６と石英管３０との間には、やはり２６で示される、補助ガス供給源が接続された別の環状チャネルがある。このチャネルを通して、ドーパントがシステムに導入される。
【００４６】
噴霧器気化室は全体として３８で示される。
【００４７】
集成噴霧器気化部全体はステンレス鋼製円筒３３内に収められ、円筒３３は一端でＨＮプローブの基部(ここを通して様々なガス及び液体配管がなされる)に取り付けられ、他端には蒸気流が入れるように石英管がそこから若干伸び出す開口がある。
【００４８】
円筒３３の末端を囲んで、石英管３０の末端と接続ブラケット４２との間に、絶縁スリーブ４０が備えられる。スリーブ４０は(デュポン(DuPont)社から供給される)ベスペル(Vespel)(商標)でつくられることが、必須ではないが、好ましい。スリーブ４０により、接地されている熱噴霧器プローブ２０の電位に対して接続ブラケット４２を高電位に保つことができる。断熱ではなく電気絶縁がスリーブの一義的な機能である。
【００４９】
ランプホルダ４４も、やはりベスペル(商標)であることが好ましい、電気絶縁材料でつくられ、接続ブラケット４２の対応する寸法につくられた内腔に取り付けられる。ランプ４６はランプホルダ４４に取り付けられ、陰極への電気接続部４８を備える。ランプ電源５０がランプ陰極接続部４８及び接続ブラケット４２に接続される。接続ブラケット４２は適当な導電材料、ここではステンレス鋼でつくられる。ランプ陽極４９が接続ブラケット４２に電気的に接続している。既知の態様で、高電圧電源５２がランプ電源と接地との間に接続される。
【００５０】
スリーブ４０は、アーク放電を防止するため、またベスペル(商標)の何らかの熱劣化がスリーブ４０の機械的強度及び／または絶縁能力を低下させる可能性を最小限に抑えるためにも、比較的厚く、すなわち４ｍｍにつくられる。接続ブラケット４２及びスリーブ４０はＨＮプローブ２０の所定の位置に固定される。
【００５１】
この好ましい実施形態において、ランプ４６は、カソーデオン社(Cathodeon Ltd.)(英国ケンブリッジ(Cambridge))のモデルＰＫＳ１００直流(ＤＣ)毛管クリプトン放電ランプとした。高電圧電源５０は同じくカソーデオン社のモデルＣ２００電源である。この公称１０．０ｅＶランプには、１０．０及び１０．６ｅＶ光子の透過を可能にするフッ化マグネシウム窓５６が装着されている。孔５４(直径４ｍｍ，厚さ０．５ｍｍ)がブラケット４２に設けられている。この孔５４により、ランプ窓５６からブラケットの、本実施形態では内径が７ｍｍの、それを通して蒸気が流れる中心孔４３内への光子の通過が可能になる。２つのイオン化波長におけるランプ発光の絶対強度及び相対強度はいずれも測定しなかった。
【００５２】
試料が比較的汚れている、すなわち汚染物質が混じっていることがあり得る、いくつかの応用では、ランプ窓を清浄に保つために、ブラケット４２を改造して孔５４の上をまたは孔５４を通って持続的に流れるフラッシングガスとしての何らかのガスの通路を設けることが望ましいであろう。
【００５３】
電源５０には、電源５０をランプ４６及び接続ブラケット４２とともに、接地に対して、高電圧電源５２により決定される、±６ｋＶまでの電圧でフローティング状態におけるように、改造及び絶縁を施した。
【００５４】
カソーデオンに推奨されているように、電源５０の負リードとランプ４６の陰極との間に直列に、ランプ電流、したがって光子束の制御を可能にする電流制限抵抗器５１を挿入した。本明細書で説明されるＡＰＰＩ実験に対しては、この抵抗を０．７０ｍＡのランプ電流が得られる１ＭΩに設定した(例えば、外部抵抗器がなければ、ランプはほぼ２．２ｍＡで駆動されることになろう)。
【００５５】
接続ブラケット４２には、噴霧器２０で生成されるイオン流を誘導するための誘導管６０が備えられる。図２ａの第１の実施形態は、サンプリングオリフィスと直面して配された誘導管を示す；すなわち、ガス流は一直線にサンプリングオリフィスに誘導される。これは、以下で詳述される、実験作業を行った実施形態である。好ましい、第２の実施形態が図２ｂに示され、ガス流の方向がカーテンプレートに一直線の向きではなく、カーテンプレートの前面に平行になるように、カーテンプレート及びサンプリングオリフィスに対して直交する向きに、誘導管６０が配されている。この好ましい配置には、中性汚染種がサンプリングオリフィスを汚すことはおそらくないであろうという利点がある。ガス流の方向がカーテンプレートに平行または垂直である必要はない；(好ましい実施形態は結局、ほとんど直交関係になるが)考え得るいかなる向きも用いることができる。検体イオンの軌跡はサンプリングオリフィスに向けて曲げるが、影響を受けない中性汚染種は曲げないために、１つまたはそれより多い補助静電集束素子を、直交またはその他の好ましい配置を利用するいずれのＡＰＰＩ源にも導入することができる。さらに、本方法はカーテンプレートを利用する機器に限定されない；本方法は、通常は大気圧の、高圧領域から真空領域への間のインターフェースを利用するいかなる質量分析器にも、インターフェースが達成される手段にかかわらず、適用することができる。
【００５６】
簡単のため、図２ａ及び２ｂにおいては、同様のコンポーネントには同じ参照数字が与えられ、それらのコンポーネントの説明は繰り返されない。
【００５７】
図２ａ及び２ｂは、ＰＥ−サイエックス３段四重極質量分析計の通常のコンポーネントもいくつか示す。すなわち、カーテンプレート６２があり、またカーテンプレート６２の背後にオリフィスプレート６４がある。既知の態様で、質量分析計の真空への溶媒の流入を阻止する(あるいは少なくとも減じる)ために、通常は乾燥窒素の、カーテンガスをカーテンプレートとオリフィスプレートとの間に供給することができる。すなわち、既知の態様で、イオンはカーテン及びオリフィスプレート６２，６４を通過して、分析のための質量分析計に入る。カーテンプレート、カーテンガス、及びオリフィスプレートは、サイエックス質量分析計で実施され、参考として与えられる、大気圧イオン化源から質量分析計の真空内にイオンを誘導するための構成要素である。大気圧イオン化源から真空内にイオンを輸送するためのその他の要素を装備した質量分析計も同様に、大気圧におけるイオン化により、上述したようにまた本発明にしたがって、生成されたイオンの質量分析に十分用いることができる。
【００５８】
新しいイオン源を用いて、ドーパントの使用により様々なタイプの試料に対して達成することができる、ＡＰＰＩ−ＬＣ−ＭＳ感度の増大を示すために実験を行った；２種のドーパント、トルエン及びアセトンを、この点での有用性に関して試験した。さらに、ＡＰＰＩ法の相対感度を評価するために、ＡＰＰＩ実験に用いた試料の全てを、別の非改造ＨＮ−ＡＰＣＩ源でも分析した。最後に、溶媒組成がイオン化効率に影響しうる重要な変数であるから、ＬＣ−ＭＳ実験の全てを、２種の最も普通に用いられる複合溶媒である、メタノール／水及びアセトニトリル／水を用いて繰り返した。
【００５９】
本方法の感度は、質量分析計１０のカーテンプレート６２に対してランプ４６及び接続ブラケット４２に印加されるオフセット電位に依存することがわかった。誘導管６０は実効的にブラケット４２の延長であるから、要素４２，４６及び６０には同じオフセット電位がかけられる。ＡＰＩ３６５質量分析計の通常動作時には、カーテンプレートに印加する電位の設定値を接地に対して１．０ｋＶとし、極性は分析されるイオンの極性と同じとした。ランプオフセット電位を与えるために、別の高電圧電源、ネアマグ(Nermag)(フランス国)モデルＩＮＰ１５６を用いた。一般に、ランプオフセット電位の最適値は、ランプオフセット電位の大きさがカーテンプレート６２の電位の大きさより少なくとも若干高いという条件下で、接続ブラケット４２とカーテンプレート６２との間隔に関係し、重要なパラメータが電場強度であることを示すように見えた。この特性は完全には研究されておらず、証明されておらず、まだ完全には理解されていない。本明細書で説明される実験については、誘導管６０の末端をカーテンプレート６２の前面のわずか数ｍｍの位置に固定し、最適オフセット電位は陽イオンに対して＋１．２ｋＶ，すなわちカーテンプレートの電位より２００Ｖ高い値であった。陰イオンモードでは、ランプオフセット電位の大きさを陽イオン分析に対して最適化した後に、単にその極性を切り換えることにより高感度を得ることができた。誘導管６０の形状は、プレート６４のオリフィスへのイオン輸送を最適化するため及び／またはオリフィスへのイオン化されていない溶媒または検体または汚染物材料の侵入を低減または排除するために、多くの流儀で変えることができる。
【００６０】
ランプへの電気接続は、ＡＰＰＩ源２０の筐体の側面を通して行った。本来のコロナ放電ニードルのための高電圧接続部を２ピンコネクタと取り替えた；一方(電源５０からの負高電圧)の接続は電気接続部４８を介してランプのリング陰極に行い、他方(電源５０からの高電圧帰線)はランプ４６の基部で陽極４９に電気接続されている接続ブラケット４２本体に行った。
【００６１】
これらの実験に用いたＰＥサイエックスＡＰＩ３６５−３段四重極質量分析計１０は、上述したように、ＨＮイオン源の１つに重要な変更を行っただけで、基本的に改造はしていない。マスクローム(MassChrom)バージョン１．０データシステムを用いて、システム制御及びデータ取得を行った。本明細書で説明される実験については、単ＭＳモードだけを用いた。質量分析計は、直接試料注入及び選択イオンモニタリング(ＳＩＭ)を用いてそれぞれの検体について最適感度を得るために、ＬＣ２Ｔｕｎｅ−１．３機器制御及びデータ取得ソフトウエアを用いて調整した。また、ＬＣ２Ｔｕｎｅソフトウエアを用い、最適化中に確立した機器状態ファイルを利用して、それぞれの検体について全走査スペクトルを得た。全走査実験には以下のパラメータ：始点質量，３０ａｍｕ；終点質量，５００ａｍｕ；ステップ，１ａｍｕ；滞留時間，５ミリ秒；ピークホッピング，オン；及び走査間休止時間，５ミリ秒、を用いた。混合検体実験については、サンプルコントロール(Sample Control)ソフトウエア(バージョン１．３)を用いた。混合検体実験においては、４種の検体のそれぞれのＳＩＭを、それぞれの質量における滞留時間を２００ミリ秒として行った；モニタしたイオンのそれぞれについて、質量分析計の電圧を、ＬＣ２Ｔｕｎｅソフトウエアを用いてあらかじめ決定した最適値に設定した。
【００６２】
ＡＰＰＩイオン化法とＡＰＣＩイオン化法とを比較する実験中は、それぞれの熱噴霧器プローブに対する温度及びガス流量設定を含む、質量分析計の動作パラメータを変更していない。ＡＰＣＩ実験に利用したニードル電流は、２．５μＡに設定した。
【００６３】
熱噴霧器プローブのヒーター温度は４５０℃に維持した。
【００６４】
化学薬品
カルバマゼピン、アクリジン、ナフタレン、硫化ジフェニル及び５−フッ化ウラシル(５ＦＵ)をオルドリッチ(Aldrich)社から購入し、純化をさらに行うことなく使用した。上記試料のそれぞれについて、濃メタノール原溶液を作成した。
【００６５】
それぞれの試料が個々に分析される全走査実験については、希釈メタノール／水溶液(体積で５０／５０)を試料のそれぞれについて作成した。カルバマゼピン溶液の濃度はアクリジン溶液と同じく、０．２μＭとした；同様に、ナフタレン溶液及び硫化ジフェニル溶液の濃度はともに２０μＭとした。５ＦＵ溶液の濃度は１μＭとした。ＳＩＭ混合検体実験については、(５ＦＵを除く)上記試料の全てを含む別のメタノール／水(５０／５０)溶液を、カルバマゼピン、アクリジン、ナフタレン及び硫化ジフェニルの最終濃度がそれぞれ、０．２μＭ，０．２μＭ，２０μＭ及び２０μＭになるように作成した。
【００６６】
液体クロマトグラフ
本明細書に説明される実験の全てに対して、溶離剤流は、既知の態様で、２台のＰＥマイクロ−ＬＣポンプ１６，１８からなる高圧混合勾配ＨＰＬＣシステムにより供給した。ポンプ１６は水を送るために用い、ポンプ１８はメタノールまたはアセトニトリルの有機移動相のために用いた。溶媒は全て、実験前及び実験中にヘリウムでスプレーした。本明細書で提示される実験にはバッファまたはその他の添加剤を用いていないが、これはバッファ及び添加剤が一般にＡＰＰＩに適合しないことを意味するものではない。２００μｌ／分の全流量を内径２ｍｍのＨＰＬＣカラムと組み合わせて用いた。自動サンプラー１４に組み込まれた５μｌ試料ループを用い、既知の態様で、試料を注入した。
【００６７】
カラムには、キーストーンサイエンティフィック社の、粒径３μｍ，長さ５０ｍｍ，内径２ｍｍの、ベータベーシック-１８を用いた。ドーパントは、ハーバードアパラタス・シリンジポンプにより、１ｍｌハミルトン(Hamilton)気密シリンジから２５μｌ／分で送った。ドーパントも含めて、用いた溶媒の全てはＨＰＬＣ級とした。
【００６８】
全走査実験について、試料をカラムに注入し、アイソクラチック条件を用いて溶離した。データが本明細書に提示される全走査実験に用いた移動相はメタノール／水である；それぞれの分析に対するメタノール／水比は、許容できるピーク形状及び短い保持時間が得られるように設定した。カルバマゼピン、アクリジン、ナフタレン、硫化ジフェニル及び５ＦＵのそれぞれに対し、６０／４０，７０／３０，７５／２５，８０／２０及び７０／３０のメタノール／水比を用いた。
【００６９】
混合物分析実験には勾配溶離を既知の態様で採用し、メタノール／水とアセトニトリル／水を一日おきに用いた。データ取得は、注入の瞬間に自動サンプラーからコンピュータに送られるトリガでＬＣ勾配プログラムと同期させた。
【００７０】
結果及び考察
ＡＰＰＩ質量スペクトル
上に挙げた５種の検体のそれぞれについての全走査ＡＰＰＩ質量スペクトルが図３ａ〜３ｅに示される。これらのスペクトルは、カラム上での、単成分溶液のアイソクラチック分析により得られた。ドーパントとしてトルエンを用いた。それぞれの試料について示されるスペクトルはクロマトグラムのピーク頂からとられたものであり、バックグラウンドが差し引かれている。完全には差し引かれなかった溶媒イオンではなく、検体イオンがスペクトルで卓越するように、ｍ／ｚが３０から１００の質量範囲は図から省略されている。
【００７１】
図３ａ及び３ｂはそれぞれカルバマゼピン(ｍ／ｚ＝２３６)及びアクリジン(ｍ／ｚ＝１７９)のスペクトルであり、それぞれの試料のＭＨ＋イオンを明瞭に示している。カルバマゼピンは、ｍ／ｚ＝１９４にあるフラグメントからの卓越信号から明らかなように、ＡＰＰＩまたはＡＰＣＩでは熱減成を誘起することなしに分析することはできない、比較的脆弱な分子である。カルバマゼピン及びアクリジンの分子イオン(ラジカル陽イオンＭ＋)に対するどのような信号も、ほとんど得られない。逆に、図３ｃ及び３ｄに示されるように、ナフタレン(ｍ／ｚ＝１２８)及び硫化ジフェニル(ｍ／ｚ＝１８６)のスペクトルは分子イオン(ラジカル陽イオンＭ＋)だけを示す。それぞれの種に帰すことができる信号強度は同様であるが、ナフタレン及び硫化ジフェニルのスペクトルは、カルバマゼピン及びアクリジンより濃度が１００倍高い試料からとられたことに注意されたい。これらのデータから、ＡＰＰＩ法の効率がナフタレン及び硫化ジフェニルに対しては、現在のところ、カルバマゼピン及びアクリジンに対する効率よりかなり低いことは明らかである。
【００７２】
上記の種について観測されたイオン化効率の相違を説明するため、イオン化がドーパントの光イオンにより開始される反応に第一義的に依存することを初めに証明する必要がある。この知識は、ドーパント無しでのイオン生成はほとんど無視できる(以下の図４と図５を比較されたい)という観測に由来する。すなわち、検体の光イオン化断面積の差の効果は弱められ、イオン化効率がＡＰＰＩ源におけるドーパントの光イオン化後におこるイオン−分子反応に強く支配されると推測できる。いくつかの種の優先イオン化の原因となる機構に関しては、分析のために選ばれた分子間の最も明白な差がそれぞれの相対陽子親和性にある；カルバマゼピン及びアクリジンはいずれも陽子を受け入れることができる窒素を少なくとも１つ有するが、ナフタレン及び硫化ジフェニルはそのような塩基性部位をもたない。したがって、陽子親和性が高い種が優先的にイオン化されるという観測は、ＡＰＰＩ源においては陽子移動反応が電荷交換反応より卓越しているという経験的結論を指し示している。予備検討によれば、観測された結果の原因となる反応経路が少なくともいくつかあることが示される；重要な過程の１つにはドーパント光イオンの溶媒分子との反応が関与し、溶媒分子は続いて陽子親和性が高い検体との陽子移動による反応を行うことができる。
【００７３】
一連のスペクトルの最後である図３ｅは、５−フッ化ウラシルの陰イオン走査である。ｍ／ｚ＝１２９にある卓越ピークは検体のＭＨ−イオンに対応する。この図は、本明細書で提出されるＡＰＰＩ法が陰イオンモードでも用い得ることを示すために含められた。今までのところ、陰イオンモードでなされた研究は少ししかない。
【００７４】
ＡＰＰＩクロマトグラム
図４ａ及び４ｂに提示されるＡＰＰＩクロマトグラムは、選択イオンモニタリング(ＳＩＭ)により検出された、ｍ／ｚ＝２３７，１８０，１２８及び１８６のイオン電流を合わせて示したものである。４つのピークは、溶離順に、カルバマゼピン(１ｐＭ注入)、アクリジン(１ｐＭ)、ナフタレン(１００ｐＭ)及び硫化ジフェニル(１００ｐＭ)についての信号に対応する。これらのクロマトグラムはいずれも、添加ドーパントの恩恵を受けずに得られた(これらの実験に対しては、ＡＰＰＩ源から集成ドーパント導入部品が取り外され、熱噴霧器への補助ガス配管が標準的な方式でなされた)。図４ａはＬＣ溶媒がメタノール及び水からなる場合に得られた代表的なクロマトグラムを示し、図４ｂはアセトニトリル／水実験について得られた代表的クロマトグラムである。この実験では、有機移動相にメタノールが用いられた場合にナフタレン及び硫化ジフェニルについて２〜３倍の感度増大が見られたことを除けば、溶媒の組成はクロマトグラムにほとんど影響していない。しかし、いずれの溶媒系に対しても、カルバマゼピン及びアクリジンに対するイオン化効率が、陽子親和性が低い種に対するイオン化効率よりかなり高いことがここでもわかる(検体毎に試料を注入していることに注意されたい)。これらの分子の光イオン化断面積にそれほど顕著な差があるとは思えない(これらの分子は全て芳香環を含み、光子エネルギーより低いＩＰを有している)から、光イオン化は明らかに、上記事例で観測されたイオン化の原因となるただ１つの機構ではなく、あるいは主要な機構でさえない。したがって、検体のイオン化は主として、トルエンについて観測された態様と同様の態様で反応する、溶媒中のトレースレベルの量の不純物から形成された光イオン中間体を介しておこっているのかもしれない。イオン化機構が何であるかを確信をもって言うために利用できる十分な証拠は現在のところないが、これらのデータは、ともかく、ＬＣ−ＭＳのためのイオン化方法としての直接光イオン化の効率が極めて低いことを説明するために確実に役立つ。
【００７５】
図５のクロマトグラムは、図４ａ及び４ｂに提示したデータを収集するために分析した試料溶液と同じ試料溶液から得られたものであるが、勾配に用いた有機溶媒はメタノールである。アセトニトリル／水について得られた結果は非常に似ているが、(図６ａ及び６ｂのＡＰＰＩクロマトグラムに示されるように)アクリジンについては若干弱い信号が得られた。図５には２つのクロマトグラムが重ね合わされている；１つはドーパントとしてトルエンを用い、もう１つはアセトンを用いて収集された。初めにトルエンの例を考察すれば、ドーパントのない場合に比べて感度(及び信号対雑音比)の増大が顕著である(ドーパントがない図４のイオン／秒の倍率をドーパントがある図５の倍率と比較されたい)；カルバマゼピン及びアクリジンについてはピーク域がほぼ１００倍増大している。ナフタレン及び硫化ジフェニルに関する増大はそれほど顕著ではないが、それでも約２５倍とかなりの増大になっている。これらのデータは、ドーパントとして用いたトルエンが、陽子親和性が低い種と高い種のいずれに対しても、陽子移動または電荷交換反応を介してＡＰＰＩの感度を強め得ることを示す。陽子移動反応がはるかに卓越しているように見えることに改めて注意されたい。一方、アセトンを用いて得られたＡＰＰＩクロマトグラムは、アセトンが高い陽子親和性をもつ化合物に対してのみ有効なドーパントであることを示す；ナフタレン及び硫化ジフェニルについては感度の増大が全く見られない。したがって、ドーパントの選択がＡＰＰＩの感度及び選択性に影響する重要な要因である。
【００７６】
ＡＰＰＩとＡＰＣＩとの比較
ＡＰＰＩと標準的ＡＰＣＩ源とを比較する実験の結果が図６ａ及び６ｂに提示される。図６ａのメタノールが有機溶媒の場合には、ＡＰＰＩによりカルバマゼピン及びアクリジンについて得られた信号がＡＰＣＩ源で得られた信号より少なくとも８倍大きかった；陽子親和性の低い種に対するＡＰＣＩのメタノールの存在下における感度がほとんどゼロであることがわかったので、ナフタレン及び硫化ジフェニルに関する増大はさらに高い。図６ｂのアセトニトリルを用いた場合には、カルバマゼピン及びアクリジンについてはＡＰＰＩのＡＰＣＩに対する優位性が維持されるが、ナフタレン及び硫化ジフェニルに対するＡＰＣＩの感度がかなり向上し、ＡＰＰＩの感度よりそれほど低くはなかった。
【００７７】
本発明の好ましい実施形態を示し、説明したが、様々な変更及び改変がなされ得ることが当業者には明らかであろう。
【００７８】
例えば、上述した実験は標準大気圧(すなわち約１バール)で行われたが、動作圧力をある範囲にわたって変え得ることが当業者には理解されよう。概略の上限は約２バールすなわち２気圧であろうし、適当な装置を用いれば、概略の下限は約０．１バール、すなわち１０分の１気圧であろうと考えられる。１０分の１気圧の動作圧力でさえ、真空またはほぼ真空の条件でＰＩが一般に行われる、従来技術で見られる代表的な動作圧力より数桁高いことが理解されよう。全般には、本発明の趣旨は、試料溶液源(すなわちＬＣ)とほぼ同じ動作圧力にあり、質量分析計の隣接流入チャンバに適した圧力にある領域で、気化及びイオン化がおこるであろうということにある。
【００７９】
したがって、特許請求の範囲は、本発明の精神及び範囲内にあるような変更及び改変を包含するとされる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明にしたがう装置の略図である
【図２ａ】  本発明にしたがう装置の第１の実施形態の側断面図である
【図２ｂ】  本発明にしたがう装置の第２の実施形態の側断面図である
【図３ａ】  カルバマゼピンのイオン化を示す、図２ａの装置で得られた質量スペクトルである
【図３ｂ】  アクリジンのイオン化を示す、図２ａの装置で得られた質量スペクトルである
【図３ｃ】  ナフタレンのイオン化を示す、図２ａの装置で得られた質量スペクトルである
【図３ｄ】  硫化ジフェニルのイオン化を示す、図２ａの装置で得られた質量スペクトルである
【図３ｅ】  ５−フッ化ウラシル(５−ＦＵ)のイオン化を示す、図２ａの装置で得られた質量スペクトルである
【図４ａ】  ドーパントがない状態における、選ばれた物質について検出された、選ばれたイオン電流を合わせて示すイオン電流クロマトグラムである
【図４ｂ】  ドーパントがない状態における、選ばれた物質について検出された、選ばれたイオン電流を合わせて示すイオン電流クロマトグラムである
【図５】  相異なるドーパントの効果を示す、図４ａに用いたものと同じ試料溶液からのクロマトグラムである
【図６ａ】  ＡＰＰＩをＡＣＰＩと比較しているクロマトグラムである
【図６ｂ】  ＡＰＰＩをＡＣＰＩと比較しているクロマトグラムである
【符号の説明】
１０    質量分析計
１２    液体クロマトグラフィカラム
１４    自動サンプラー
１６，１８    ポンプ
２０    熱噴霧器プローブ
２２  大気圧光イオン化イオン源部
２４  噴霧器ガス供給源
２６    補助ガス配管
２８    シリンジポンプ
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
0004600909.tif 000006
【図３ｃ】
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【図３ｄ】
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【図３ｅ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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