(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポテト塊茎、サツマイモまたはキャッサバの塊茎、ポテト、トマトおよび豆の葉および果実、プロテイナーゼインヒビター遺伝子を発現する、すべての植物種の種子ならびに遺伝子操作された生物から、熱安定性プロテイナーゼインヒビタータンパク質を得るための方法であって、以下の工程：
水性／アルコール溶媒中で該植物組織由来のプロテイナーゼインヒビタータンパク質を抽出して、可溶化されたプロテイナーゼインヒビタータンパク質を含むアルコール抽出物を生成する工程；
該アルコール抽出物を第１の温度まで加熱し、続いて第２の温度まで冷却して、不溶性の沈澱物相および可溶性相を生成する工程；および
酸性透析溶液に対する透析により、該可溶性相から該プロテイナーゼインヒビタータンパク質を沈澱させる工程、
を包含し、
ここで、該第１の温度は、５０℃と７０℃とからなる群より選択され、該第２の温度は、２７℃と５０℃とからなる群より選択される、方法。
【請求項２】
前記植物組織がポテト塊茎である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プロテイナーゼインヒビタータンパク質がポテトプロテイナーゼインヒビターIIである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記プロテイナーゼインヒビタータンパク質が、ポテトプロテイナーゼインヒビターII、優勢なキモトリプシン阻害活性を有するクーニッツファミリーキモトリプシン／トリプシンインヒビター、および優勢なトリプシン阻害活性を有するクーニッツファミリートリプシン／キモトリプシンインヒビターの混合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記水性／アルコール溶媒が最終濃度で0.2％ギ酸、0.3Ｍ NaCl、および20％エタノールを含み；前記第１の温度が70℃であり；前記第２の温度が50℃であり；そして前記水性透析溶液が0.22％ギ酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記水性／アルコール溶媒が0.2％ギ酸、0.3Ｍ NaCl、および20％エタノールを含み；前記第１の温度が50℃であり；前記第２の温度が27℃であり；そして前記水性透析溶液が最初は水からなり；そして水に対する透析の期間の後で、前記可溶性相または該水性透析溶液の少なくとも一方が0.88％ギ酸を含むように調整される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
熱安定性プロテイナーゼインヒビタータンパク質を含むポテト塊茎から、該プロテイナーゼインヒビタータンパク質を得るための方法であって、以下の工程：
0.2％ギ酸および0.3Ｍ NaClを含む媒体中で該ポテト塊茎をホモジナイズすることによって該ポテト塊茎を抽出し、粗抽出物を生成する工程；
１容量のエタノールを４容量の該粗抽出物に添加して、アルコール抽出物を生成する工程；
該アルコール抽出物を濾過して、濾過された抽出物を生成する工程；
該濾過された抽出物を50℃の第１の温度まで加熱し、続いて27℃の第２の温度まで冷却して、不溶性の沈澱物相および可溶性相を含む熱処理抽出物を生成する工程；
該熱処理抽出物を多孔性フィルターを通して濾過すること、または該熱処理抽出物を4,000×ｇで５分間遠心分離することのうちの少なくとも一方によって、該可溶性相から該不溶性の沈澱物相を分離して、清澄化された可溶性相を生成する工程；
12,000ダルトンの分子量カットオフを有する透析膜を使用して、水道水または0.2％ギ酸のいずれかを含む透析媒体に対する透析によって、該清澄化された可溶性相から不純物を除去して、透析された抽出物を生成する工程；
該透析媒体中に0.22％ギ酸を含むこと、または0.88％までギ酸を添加することの少なくとも一方によって、該透析された抽出物からプロテイナーゼインヒビタータンパク質を沈澱させて、沈澱混合物を生成する工程；
該沈澱混合物を多孔性フィルターを通して濾過すること、または該沈澱混合物を4,000×ｇで５分間遠心分離することの少なくとも一方によって、沈澱したプロテイナーゼインヒビタータンパク質を回収して、プロテイナーゼインヒビタータンパク質の混合物を得る工程、
を包含する、方法。
【請求項８】
前記水性／アルコール溶媒が、最終濃度0.2％ギ酸、最終濃度0.3Ｍ NaCl、および最終濃度20％エタノールを含み；前記第１の温度が少なくとも50℃であり；前記第２の温度が室温以下であり；そして前記水性透析溶液が0.22％ギ酸を含む、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は一般的には、植物組織からのプロテイナーゼインヒビタータンパク質の単離方法に関し、そしてより詳細には、ポテト塊茎からの熱安定性プロテイナーゼインヒビタータンパク質の単離に関する。
発明の背景
ポテトのようなナス科植物からの塊茎は、プロテイナーゼインヒビタータンパク質の広範なクラスの豊富な供給源である。これらのタンパク質の多くが、昆虫および哺乳動物の両方において天然に存在する、トリプシンおよびキモトリプシンのような消化性プロテイナーゼの活性を阻害する。天然の消化プロセスを妨害することによって、プロテイナーゼインヒビターは、草食動物による採集に対する植物の天然の防御の一部を生成する。同じ理由によって、プロテイナーゼインヒビターは、アリ（fire ant）のような昆虫の制御についての害虫制御産業における適用を有する。さらに、これらはヒト消化性プロテイナーゼをもまた阻害するので、これらのインヒビターは肥満および糖尿病の制御についての製薬産業において価値を有する。
ポテト塊茎は、プロテイナーゼインヒビターの研究および調製物の主要な供給源である。ポテト塊茎に存在するいくつかのプロテイナーゼインヒビターは、熱安定性の種である。これらの中に、トリプシンおよびキモトリプシンの両方を阻害し、約20および20.5kDのサブユニット分子量（Mr）を有する、２つのクーニッツ型プロテイナーゼインヒビターがある（WalshおよびTwichell、Plant Physiol. 97: 15-18, 1991）。より小さいタンパク質はキモトリプシンの強力なインヒビターであり、そしてトリプシンの弱いインヒビターである。より大きいタンパク質は、トリプシンの強力なインヒビターである。他の熱安定性プロテイナーゼインヒビターは、約9.5kDのサブユニット分子量を有するもの（プロテイナーゼインヒビターIと名付けられている）を含み、これはキモトリプシンの強力なインヒビターであり（MelvilleおよびRyan、J. Biol. Chem. 247:3445-3453, 1972）、さらに、約10.5kDのサブユニット分子量を有する別のもの（プロテイナーゼインヒビターIIと名付けられている）を含み、これはキモトリプシンおよびトリプシンの両方の強力なインヒビターである（Bryant, Green, およびRyan、Biochemistry 15:3418-3424, 1976）。
これらの熱安定性プロテイナーゼインヒビターの以前の調製方法は、以下の工程：ジチオン酸塩の存在下での抽出、熱処理、硫酸アンモニウム沈澱、およびクロマトグラフィーを含む、多数の工程を組み込んでいた（WalshおよびTwichell、Plant Physiol. 97: 15-18, 1991; MelvilleおよびRyan、J. Biol. Chem. 247: 3445-3453, 1972; Bryant, GreenおよびRyan, Biochemistry 15: 3418-3424, 1976; RyanおよびKassell、Methods in Enz. XIX: 883-889, 1970; PearceおよびRyan、Anal. Biochem. 130: 223-225, 1983）。残念ながら、これらの方法は厄介で、手間がかかり、時間を浪費し、高価で、そして熱安定性プロテイナーゼインヒビターを相対的に低収率でしか産生しない。主要な問題は、最初の抽出物が、乏しい流動特性を有するペースト状のホモジネートを生成し、続く処理の工程、とりわけろ過、硫酸アンモニウム沈澱、および再可溶化に困難さを生ずることである。ペースト状の粘稠度は、ときには、続く工程の間に、とくに大規模抽出において加圧ろ過の使用を必要とする（RyanおよびKassell、1970）。さらに、ペースト状の粘稠度は、ペーストからの物質の完全な回収の困難さにより、収率を減少させる。以前のこれらの方法はまた、それらが遂行のために熟練した労働を必要とし、そしてしばしば完了までに数日を要するので不利である。
従って、当該分野において、ペースト状の抽出物の問題を克服し、硫酸アンモニウム沈澱の必要性を除去し、迅速で、安価で、行うのが単純で、そして実験室スケールから大規模工業プロセスにいたるまで、任意のスケールで達成するのが容易である、植物組織、特にポテト塊茎からのプロテイナーゼインヒビターを単離する方法の必要性が存在する。本発明は、これらの必要性を満たし、そして他の関連する利点を提供する。
発明の要旨
手短にいえば、本発明は、熱安定性プロテイナーゼインヒビタータンパク質を、当該タンパク質を含む植物組織（特にポテト塊茎）から、迅速かつ単純に単離する方法に関する。本方法は３つの工程を含む。第１に、ポテト塊茎からのタンパク質は、水性／アルコール抽出媒体（例えば、希ギ酸および20％エタノール）で可溶型で抽出される。抽出媒体中のエタノールの存在は、それがない場合でのペースト状ホモジネートを、操作するのが容易で、そして特にろ過が容易である滑らかな流動性のアルコール抽出液に変換させる。第２に、アルコールは、第１の温度まで加熱され、次いで第２の温度まで冷却される。アルコールの存在下の加熱によって、アルコール抽出液中の所望でないタンパク質の大部分は変性し、そして続く冷却により細片（debris）を構成する沈澱物相および熱安定性プロテイナーゼインヒビタータンパク質を含む可溶性相の形成に導く。第３に、熱安定プロテイナーゼインヒビタータンパク質は、適切な透析媒体（例えば、希ギ酸、または水、次いで希ギ酸）に対する透析によって可溶性相から沈澱される。沈澱されたタンパク質は、単一のインヒビタータンパク質（プロテイナーゼインヒビターII）であるか、またはプロテイナーゼインヒビターIIおよび２つのクーニッツプロテイナーゼインヒビター（１つはトリプシンに対して最も活性であり、他方はキモトリプシンに対して最も活性である）の混合物であり得る。沈澱したプロテイナーゼインヒビタータンパク質は、もともと塊茎に存在する、他のタンパク質および他の構成成分の大部分を含まない。
沈澱したタンパク質が単一のインヒビターから構成されるか、またはインヒビターの混合物から構成されるかは、単一の改変によって決定される。この改変は、変性工程のために選択される過熱温度に関する。単一のインヒビターは、70℃まで加熱すること、50℃まで冷却すること、そして続いて0.22％ギ酸に対する透析において得られ得る。インヒビター混合物は、50℃まで加熱すること、室温まで冷却すること、次いで水に対する透析であって、ここで水透析に続いてさらに0.88％までのギ酸が添加される透析によって得られ得る。
以前の方法に必要とされた数日と比較して、透析時間を除外した全体の方法は１時間より少ない時間で行われ得る。本方法は単純であり、熟練していない技術者によって行われ得、そしていかなるスケールでの実行も受け入れられる。本方法は、高価な硫酸アンモニウムおよびクロマトグラフィー工程の使用を避け、そしてエタノールさえ回収され得、これは本方法の処理コストをさらに下げる。本方法は、１ポンド（約454ｇ）のポテトから300mgの実質的に純粋なプロテイナーゼインヒビタータンパク質を産生し得、これは以前の方法を使用しての、100ポンドのポテトからの、より純粋でないタンパク質の150mg収量に対して、非常に優れている。
本発明のこれらのおよび他の局面は、下記の詳細な説明および図面の参照において明白である。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明に従って調製された、透析前の代表的な熱処理した水性／アルコール抽出物のHPLC分析である。
図２は、本発明に従って調製された、第１の、透析後の、プロテイナーゼインヒビタータンパク質混合物のHPLC分析である。
図３は、本発明に従って調製された、第１のプロテイナーゼインヒビタータンパク質混合物のゲル電気泳動分析を図示する。
図４は、本発明に従って調製された、第１のプロテイナーゼインヒビタータンパク質混合物のプロテイナーゼインヒビター活性を図示する。
図５は、本発明に従って調製された、第２のプロテイナーゼインヒビタータンパク質混合物のプロテイナーゼインヒビター活性を図示する。
図６は、本発明に従って調製された、第２のプロテイナーゼインヒビタータンパク質混合物のHPLC分析である。
図７は、本発明に従って調製された、第２のプロテイナーゼインヒビタータンパク質混合物のゲル電気泳動分析を図示する。
発明の詳細な説明
上記で述べたように、本発明は、熱安定性プロテイナーゼインヒビタータンパク質を含む植物組織からの、１つ以上の当該タンパク質の単離に関する。ポテト塊茎は、特によく研究されている植物組織であり、いくつかのクラスの熱安定性プロテイナーゼインヒビターを豊富に含むことが公知である。それゆえに、本発明の１つの実施態様において、ポテト塊茎からの熱安定性プロテイナーゼインヒビタータンパク質の単離の方法が開示される。この方法が、インヒビターが熱安定性であり、そしてアルコールおよび水を含む溶液中に可溶性である場合、他の植物組織からの他のプロテイナーゼインヒビターの抽出に適用され得ることも、当業者には明らかである。ポテト塊茎に加えて、代表的な組織は、サツマイモまたはキャッサバの塊茎、ポテト、トマト、および豆の葉および果実、すべての植物種の種子、ならびにプロテイナーゼインヒビター遺伝子を発現する、遺伝子操作された生物を含むが、これらに限定されない。
本発明の実施において、植物組織からプロテイナーゼインヒビタータンパク質を調製する方法は、３つの工程を含む。
第１の工程において、タンパク質は、水性／アルコール抽出媒体中で組織から抽出され、アルコール抽出物を得る。「抽出」は、植物組織の細胞構造を破壊して、抽出媒体内に細胞内容物を放出させそして可溶化することをいう。抽出の最初の工程は、当該分野で一般的に「ホモジナイゼーション」として知られており、これは破壊的で機械的なプロセス（例えば、粉砕、研磨、混合、超音波処理、または他の技術）であり得る。本発明において、抽出媒体は水性部分およびアルコール部分を有する溶液からなる。水性部分は、理想的には、優先的にプロテイナーゼインヒビターを可溶化するが、同時に組織から放出された所望でないタンパク質および他の高分子の沈澱を促進するものから選択されるべきである。酸性溶液および高濃度の塩（0.3Mより高い）を含む溶液は、タンパク質および核酸のような多くの高分子を沈澱させる傾向を有するが、しかるにいくつかのプロテイナーゼインヒビターは同じ溶液に可溶性である。それゆえに、本発明の１つの実施態様では、希ギ酸および高濃度の塩からなる水性部分を使用する。アルコールもまた、高分子を沈澱させる傾向を有し、そして本発明は、いくつかのプロテイナーゼインヒビターがアルコールを含む溶液中に可溶性で残存することを開示する。それゆえ抽出媒体はまた、アルコール部分を含む。アルコールは、植物組織のホモジナイゼーションの間または後で、結果を実質的に変えることなく、抽出媒体の水性部分に添加され得る。本明細書中に開示される実施態様において、アルコールは、ホモジナイゼーションプロセスの間に、水性溶液に添加される。
エタノールは、本明細書に記載の好ましい実施態様において、約20％v/vで使用される。しかし、他のアルコール（メタノール、プロパノール、またはフェノールを含むが、これらに限定されない）ならびに他の水混和性有機物で代替され得る。代替アルコールは、種々の濃度において種々のアルコールを含む媒体を使用して、植物組織を抽出することによって評価され得る。細片を遠心分離後、上清中のタンパク質レベルおよび特異的なプロテイナーゼインヒビター活性の測定は、最も高い比活性を産生するアルコールのタイプおよび濃度を決定する。
最初のホモジネートは、希ギ酸および塩の溶液中で調製され得る。例えば、ポテト塊茎は、約0.2％ギ酸および0.3M NaClの最終濃度を有する媒体中でブレンダー中でホモジナイズし得る。エタノールを、ホモジナイゼーションプロセスの間に添加する。この様式におけるエタノールの添加は、ポテト塊茎から調製される抽出物にとって特に有用である。なぜなら、エタノールは、ホモジネートの粘稠度を、濃厚なデンプン性のペーストから、滑らかな流動性のアルコール抽出物へと変化させるからである。このことは、荒い細片の除去のような、アルコール抽出物の続く操作を容易にする。本明細書中に記載される実施態様において、細片は、チーズクロスを通して、アルコール抽出物を絞ることによって除去される。細片の除去を達成するための他の方法は、遠心分離、珪藻土のような天然の物質を通すろ過、合成フィルターを通すろ過、篩目を通しての押し出しおよび他の技術を含むが、これらに限定されない。
第２の工程において、アルコール抽出物は第１の温度まで加熱され、次いで第２の温度まで冷却される。この操作は、抽出物中に存在する多くの所望でないタンパク質の変性および沈澱を引き起こし、そして不溶性の沈澱相および可溶性相を生じる。変性は、タンパク質の二次構造および三次構造を破壊するプロセスであり、タンパク質の折り畳みをほどくか、または別の様式でタンパク質のネイティブな特性の喪失を引き起こす。変性は、タンパク質が後でそのネイティブな特性を取り戻し得ない場合、不可逆的である。アルコールは、とりわけ、熱の存在下において、多くのタンパク質の変性を促進する。冷却に際して、変性したタンパク質は凝集しやすく、不溶性の沈澱物を生成する。本発明の実施において、いくつかのプロテイナーゼインヒビターは、アルコールの存在下で加熱されず、そして冷却された場合、不可逆的に変性され、そして可溶性のままであるが、大部分の他のタンパク質は沈澱する。特に、本明細書に記載される実施態様は、ポテト塊茎由来のいくつかのプロテイナーゼインヒビターが、第１の温度まで加熱され、そして第２の温度まで冷却された、20％エタノールを含むアルコール抽出物の中で、活性かつ可溶性のままであることを示す。
一般的に、アルコール抽出物は、所望でないタンパク質を変性させるに十分熱いが、プロテイナーゼインヒビターを不可逆的に変性させるほど熱くはない、第１の温度まで加熱されるべきである。次いで、抽出物は、沈澱の凝集を促進するに十分低い第２の温度まで冷却させるべきである。冷却後、変性したタンパク質および他の細片を含む不溶性の沈澱相が発生する。沈澱相は、遠心分離、ろ過、または他の等価な方法によって残存する可溶性相から分離され得、清澄な可溶性相を与える。可溶相は、プロテイナーゼインヒビタータンパク質を含む。
異なるプロテイナーゼインヒビターは、異なる変性および／または沈澱特性を有するので、加熱工程の第１および第２の温度の選択は、得られるインヒビターのタイプの決定要因であり得る。ポテト塊茎のアルコール抽出物を使用する１つの実施態様において、第１の温度は70℃であり、そして第２の温度は50℃である。これは、プロテイナーゼインヒビターIIを含む調製物を産生する。ポテト塊茎の同じアルコール抽出物を使用する別の実施態様において、第１の温度は50℃であり、あそして第２の温度は室温である。これは、３つの異なるインヒビター（プロテイナーゼインヒビターII、および２つのクーニッツプロテイナーゼインヒビター、１つはトリプシンに対して最も活性であり、そして他方はキモトリプシンに対して最も活性である）を含む混合物を産生する。
本方法は、加熱工程のための第１および第２の温度の選択が、植物組織の特定の種について、特定のタイプのプロテイナーゼインヒビタータンパク質の最良の収量を得るために必要なように改変されることを可能にする。例えば、１つの実施態様内で、特定の植物組織由来のアルコール抽出物は、一連の異なる第１および第２の温度まで処理され得る。細片の遠心分離後、上清中のタンパク質レベルおよび特定のプロテイナーゼインヒビター活性の測定は、最高の比活性を産生する熱処理を決定する。
アルコールは、アルコール抽出物を熱処理した後、可溶性相から回収され得る。１つの実施態様において、エタノールは、アルコール抽出物が冷却された第２の温度においてエバポレーションによって回収され得る。別の実施態様において、アルコールは回収される必要はない。いずれの場合においても、アルコールの存在または不在は、本方法の続く工程に効果を与えない。
本方法の第３の工程において、プロテイナーゼインヒビターは、インヒビターの沈澱を促進する媒体（好ましくは、プロトン性の酸、例えば有機酸を使用する酸性透析溶液、最も好ましくはギ酸）に対する透析を介する沈澱によって可溶性相から回収される。透析は、タンパク質の回収のための沈澱を促進するだけではなく、また、先の工程から持ち越されたより小さいタンパク質および他の分子を除去する。透析媒体の選択は、部分的には、単離されるプロテイナーゼインヒビターによって決定される。１つの実施態様において、約0.22％の希ギ酸がポテト塊茎由来のプロテイナーゼインヒビターIIを回収するために使用される。別の実施態様において、水道水が、ポテト塊茎由来の３つのプロテイナーゼインヒビターの混合物を回収するために好適である。水道水が透析媒体として使用される場合、タンパク質は、続くギ酸の約0.88％までの添加によって沈澱され得る。いずれの場合においても、透析は、12,000〜14,000ダルトンのカットオフ分子量を有する膜を横切る。可溶性抽出物中に存在する塩残留アルコールおよび他の低分子は除去される一方で、プロテイナーゼインヒビターを含む白い沈澱物が生成する。実験室スケールの実施態様において、20〜24時間の透析は、完全な沈澱生成に十分である。しかし、より良好な、またはより迅速なプロテイナーゼインヒビターの回収を生じ得る透析の他の方法、溶質交換、または沈澱形成で代替され得る。
沈澱したタンパク質は、ろ過、遠心分離、または他の方法によって回収され得る。沈澱したタンパク質は、種々の程度の純度のプロテイナーゼインヒビタータンパク質の混合物を含む。１つ以上のプロテイナーゼインヒビタータンパク質は、沈澱物中の全タンパク質の90％を超える部分を構成し得る。このような沈澱物は、プロテイナーゼインヒビタータンパク質の実質的に純粋な混合物とみなされ得る。沈澱物は、意図する使用またはプロテイナーゼインヒビターの続く処方に適切な溶媒において溶解され得る。本明細書に提供される実施態様において、沈澱物は0.1M炭酸水素アンモニウム中で溶解され、これは可溶化および続く凍結乾燥（プロテイナーゼインヒビターの安定な貯蔵の公知の方法）に適切である。
本明細書に記載される一般的な方法論は、インヒビターが、アルコールおよび熱の存在下での不可逆的な変性に耐性である場合、種々の植物組織からの種々の熱安定性プロテイナーゼインヒビタータンパク質の調製に適切である。この方法は、使用される特定の組織、存在するプロテイナーゼインヒビター、ならびに当該方法のために使用される特定のアルコール、温度、および透析媒体に依存する、種々の程度の純度を有するプロテイナーゼインヒビタータンパク質の混合物を産生する。所定の組織について最適化された場合、プロテイナーゼインヒビターの実質的に純粋な組成物が高収量で、下記のポテト塊茎プロテイナーゼインヒビターについて実施例によって示されるように、得られ得る。この目的のために、以下の実施例は、例示の目的のために提供され、限定のためではない。
実施例
実施例１
ポテトプロテイナーゼインヒビターIIの調製
Russet Burbankポテトの１ポンド（lb）を、100ml 0.88％ギ酸および1.5 NaClの存在下で2分間、ブレンダー中でホモジナイズした。ブレンディングの間、125mlの95％エタノールをゆっくりとホモジネートに添加して、最終エタノール濃度を約20％にした。これは、ホモジネートをペーストから、ろ過を容易にする液体混合物に変化させた。荒い不溶性の細片を、８層のチーズクロスを通して液体を絞ることによって除去した。液体のろ液を回収して、アルコール抽出物とした。
アルコール抽出物を、エバポレーターフラスコに移し、そしてフラスコを、攪拌しながら、沸騰水バス中に沈めることにより、温度が70℃に到達するまで加熱した。その時点で、フラスコを、バス温度が50℃のフラッシュエバポレーターに取りつけた。エバポレーターを使用して、エタノールを回収した。しかし、本方法を継続するために、エタノールを回収する必要はなかった。生じる液体を、4000×ｇで遠心分離し、生成した過剰のデンプンおよび沈澱した不溶性相を除去し、可溶性相を示す清澄な上清を回収した。
可溶性相は、12,000〜14,000分子量カットオフ透析バンドに置いて、10リットルの0.22％ギ酸に対して少なくとも12時間、ギ酸溶液を数回交換して透析した。この時点までに白色の沈澱がバッグ中で生成した。沈澱物は、純粋なプロテイナーゼインヒビターIIであり、これは4000×ｇの遠心分離で回収した。沈澱物は、0.1M炭酸水素アンモニウム中で溶解し、凍結乾燥した。収量は、ポテト１ポンド（1b.）あたり約57mgインヒビターであった。より良好な収量は、新しく収穫したポテト、またはより高いレベルのプロテイナーゼインヒビターIIを有するポテト品種で開始することにより達成され得る。
図１および図２は、この手順から回収した物質のHPLC分析を示す。両方の図は、セミ分取C18カラム（Vydac, カタログ番号#218TP510, 5, 10×250mm）から溶出した物質の280nmでの分光学的な吸光度を示し、このカラムは、20％溶媒Ａ（0.1％トリフルオロ酢酸）から50％溶媒Ｂ（0.1％トリフルオロ酢酸／アセトニトリル）の直線勾配を使用して、45分間にわたって、2ml/minで展開した。図１は、透析前の、工程２におけるアルコール抽出物の熱変性後に回収した清澄な可溶性相中に存在する可溶性物質を示す。図２は、工程３における透析後に生成した沈澱物中に存在する物質を示す。沈澱物は、分析のために溶媒Ａに溶解した。
図３は、図２のHPLC分析からのピーク＃１中の物質のゲル電気泳動分析を示す。レーン１は、エタノールを添加する前の、最初のポテトホモジネートの試料である。レーン２、３および４は、それぞれ、ピーク＃１の前部、中間部、後部の試料である。ピーク１を、さらに免疫学的分析に供して、この物質をポテトプロテイナーゼインヒビターIIとして同定した。
図４は、図２からのピーク＃１のプロテイナーゼインヒビターII活性を示す。この物質は、トリプシン（T）およびキモトリプシン（C）の両方の強力なインヒビターであることが示された。トリプシン阻害について、4.0μgの物質が2μgのトリプシンを阻害した。キモトリプシン阻害について、1.4μgの物質が1.5μgのキモトリプシンを阻害した。この二重の阻害活性は、プロテイナーゼインヒビターIIに特徴的である。
実施例２
ポテトからのポテトプロテイナーゼインヒビターの混合物の調製
アルコール抽出物を、上記の実施例１のように調製した。アルコール抽出物を、攪拌しながら、フラスコを沸騰水バス中に沈めることにより、温度が50℃に到達するまで加熱した。
その時点で、フラスコを冷たい流水のウォーターバスに沈め、温度を室温まで下げた。生じる液体を、4000×ｇで遠心分離し、過剰のデンプンおよび沈澱した不溶性相を除去し、可溶性相を示す清澄な上清を回収した。
可溶性相を、12,000〜14,000分子量カットオフ透析バンドに置いて、流れる水道水に対して、24時間透析した。このあと、バッグ中の溶液を0.88％ギ酸に調整したか、または代替的に透析溶液を0.88％ギ酸に調整し、そして透析をさらなる4時間継続した。この時点までに白色の沈澱がバッグ中で生成した。沈澱物は、以下の図５または図６に示されるように、プロテイナーゼインヒビターIIおよび２つのクーニッツファミリープロテイナーゼインヒビターを含んだ。沈澱物を回収し、溶解し、そして実施例１のように凍結乾燥した。収量は、ポテト1ポンド（1b.）あたり約300mgインヒビターであった。やはり、より良好な収量は、新しく収穫したポテト、またはより高いレベルのプロテイナーゼインヒビターIIを有するポテト品種で開始することにより達成され得る。
図５は、回収された沈澱混合物のプロテイナーゼインヒビター活性を示す。この物質は、トリプシン（T）およびキモトリプシン（C）の両方の強力なインヒビターであることが見出された。トリプシン阻害について、3.2μgの物質が2.0μgのトリプシンを阻害した。キモトリプシン阻害について、2.2μgの物質が1.5μgのキモトリプシンを阻害した。
図６は、この手順から回収された、最終的に沈澱した物質のHPLC分析を示す。条件は図２に記載されたものと同じである。３つの同定されたピークを、図７に示されたようにゲル電気泳動分析に供した。レーン１、２、および３は、それぞれ図６のピーク＃１、＃２、および＃３からの物質である。前記のように、免疫学的分析は、ピーク＃１中の物質がプロテイナーゼインヒビターIIであると同定した。ピーク２および３からの物質を、アミノ酸配列決定分析に供した。この分析により、ピーク２の物質は、強力なキモトリプシン阻害活性および弱いトリプシン阻害活性を有する、クーニッツファミリーインヒビターであると同定された。ピーク３は、強力なトリプシン阻害活性を有する、クーニッツファミリーインヒビターであると同定された。
上記により、本発明の特定の実施態様は、本明細書中で例示の目的のために記載されたが、本発明の精神および範囲から離れることなく、種々の改変がなされ得ることが理解される。従って、本発明は添付の請求の範囲によって以外では限定されない。
【図１】
0004416188.tif 000002
【図２】
0004416188.tif 000003
【図３】
0004416188.tif 000004
【図４】
0004416188.tif 000005
【図５】
0004416188.tif 000006
【図６】
0004416188.tif 000007
【図７】
0004416188.tif 000008