(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
全血、血漿又は血清のいずれかの生体由来試料そのものと、ｐＨ緩衝液、塩類、プライマー、デオキシリボヌクレオチド類、及び、熱安定性DNAポリメラーゼとしてTaq DNA ポリメラーゼを含み（但し、ホルムアミド、及び、T4 ジーン 32 プロテインを除く）、前記全血、血漿又は血清のいずれかの生体由来試料そのものと混合後のｐＨが８．８以上となる遺伝子増幅反応液を直接混合し反応させる、阻害物質存在下でのPCR法による核酸合成法において、前記反応液中に、界面活性剤の濃度が０．５〜５％となるようにTween20を添加することを特徴とするPCR法による核酸合成法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は核酸合成法、特に、ポリメラーゼ連鎖反応（Polymerase Chain Reaction ：以下ＰＣＲと略す）法による核酸合成法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＰＣＲ法は、ＤＮＡ鎖の中の特定の領域をはさんで、プライマーを結合させ、ＤＮＡポリメラーゼを作用させて、ＤＮＡ合成反応を繰り返すことによって、目的のＤＮＡ断片を数十万倍にも増幅できる方法である。ＰＣＲ法は、マリス氏らの発明である特開昭６１−２７４６９７号に述べられている。
【０００３】
ＰＣＲ法は、種々の試料中の核酸の高感度分析法として使用可能で、特に動物体液由来の試料中の核酸の分析法に使用できる。従って、ＰＣＲ法は、感染症や遺伝病やガンの診断等に利用される。さらに、ＰＣＲは移植や親子鑑定の際のＤＮＡタイピングの検査にも適した方法である。これらの場合末梢血液が検査対象に選ばれる場合が多い。
【０００４】
ＰＣＲ法の１つの欠点は色素、たんぱく、糖類あるいは未知の夾雑物が反応を阻害することである。すなわち、代表的な耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであるThermus aquaticus 由来のＴａｑＤＮＡポリメラーゼをはじめ、多くのＤＮＡポリメラーゼは、微量の体液由来の夾雑物がＰＣＲ反応液中に混在しても、ＰＣＲが強く阻害されることが良く知られている。通常、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ用の反応液を作製するためには、あらかじめ２５℃においてｐＨ８．３の１ＭTris-HCl等を用いて、１０倍濃度のＰＣＲ用緩衝液（100mM Tris-HCl,500mM KCl,10-40mMMgCl2 ）を作製しておく。そして、使用時に、この緩衝液を１倍濃度に希釈したものに、dATP,dCTP,dGTP,dTTP をそれぞれ 200μＭ、必要なプライマーを0.2-1.0 μＭ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを2.5units/100μl となるように添加し、さらに必要によっては、ゼラチンやＢＳＡや界面活性剤等の添加物を加え、鋳型ＤＮＡを加えてＰＣＲを行う。しかし、このような反応液を用いた場合、微量の体液由来の夾雑物がＰＣＲ反応液中に混在しても、ＰＣＲが強く阻害されることになる。
【０００５】
そこで、ＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅に先立つて被験物から細胞、細菌、ウィルス等（以下、遺伝子包含体と称する）を分離し、そして、その遺伝子包含体からのＤＮＡの抽出が必要である。阻害を除去するために、酵素、界面活性剤、カオトロピック剤等により遺伝子包含体を分解し、その後、フェノールあるいはフェノール・クロロホルム等を用いて、遺伝子包含体の分解物からＤＮＡを抽出する方法が従来より使用されている。
最近ではＤＮＡ精製法として、イオン交換樹脂、ガラスフィルターあるいはタンパク凝集作用を有する試薬が使用されている。
【０００６】
かような精製試薬キットの１つは「ＣＯＬＬＥＣＴＡＧＥＮＥ」（ＡＭＲＡＤ社）の名で市販されている。この試薬キットを用いて試料は以下の手順で前処理される。
１．抗凝固剤処理をした哺乳動物由来の全血を試験管中で「マグネティクパーティクル」とよく混合し、これにより白血球と「マグネティクパーティクル」を結合させる。
２．「マグネティクパーティクル」に結合した白血球をリン酸緩衝液で洗浄する。
３．「マグネティクパーティクル」に結合した白血球は、結合状態のままでプロテアーゼで分解し、これによりたんぱくは分解され、白血球中のＤＮＡが遊離される。
４．試験管内容物は、プロテアーゼ残査を不活性化するため加熱し、冷却後白血球由来の遊離ＤＮＡを含む溶液を得て、この溶液はそのまま次のＰＣＲに使用される。
【０００７】
一方、ＲＮＡ−ＰＣＲは、目的ＲＮＡを検出したり、その塩基配列の研究に使用され、従って、診断の他にも医学用途、産業用途、環境用途等に利用される。例えば、ＲＮＡ−ＰＣＲは、肝炎の原因となるＣ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）や後天性免疫不全症候群の原因となるＨＩＶウィルスの検出に使われる。
【０００８】
ＲＮＡ−ＰＣＲ法では、まず逆転写酵素の存在下で目的ＲＮＡを鋳型にして相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）が合成される。そして、このｃＤＮＡがＰＣＲで増幅される。従来の技術では、試料中のＲＮＡをＲＮＡ−ＰＣＲ法で取り扱う場合には、ＲＮＡの精製処理は必須である。基本的にＲＮＡは、ＤＮＡ精製法と同様な方法により精製される。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、これらの方法を用いて試料中のＤＮＡやＲＮＡの精製を行っても、不純物の完全な除去は困難であり、かつ、試料中の核酸の回収量が一定しない場合も多く、このため引き続く核酸合成が、とりわけ試料中の目的とする核酸の含量が少ない場合には、うまくできない場合もある。また、これら精製法は操作が煩雑で時間を要し、また操作中のコンタミネーションの機会が高い。
従って、これらの問題点を解決するためには、より簡便で、かつ効果的な試料前処理法が望まれる。
【００１０】
そこで、本発明は、生体由来試料中の目的とする遺伝子を直接増幅出来る核酸合成法を提供することを目的とする。言い換えれば、生体由来試料、特に動物体液由来試料もしくは試料中に含まれる遺伝子包含体の反応系への直接添加によっても遺伝子増幅が可能な反応法および反応試薬を提供することにある。
【００１１】
さらに本発明の他の目的は、上記の目的に適した試薬キットを提供することにある。
要約すれば本発明の目的は、動植物組織、体液および排泄物中に存在する遺伝子、とりわけＤＮＡの増幅に適したＰＣＲ改良法およびＰＣＲ反応試薬を提供することにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本件発明者は、ＰＣＲ反応液のｐＨを通常用いる場合より高くすることで、生体由来の夾雑物が多量に存在しても、さらには血液や唾液のような体液をＰＣＲ反応液に直接添加しても、ＰＣＲが可能になることを見いだしているが、更に本反応液中に界面活性剤を添加することにより、ＰＣＲが容易になる事を見出し、本発明をなすに至ったのである。すなわち、本発明は、全血、血漿又は血清のいずれかの生体由来試料そのものと、ｐＨ緩衝液、塩類、プライマー、デオキシリボヌクレオチド類、及び、熱安定性DNAポリメラーゼとしてTaq DNA ポリメラーゼを含み（但し、ホルムアミド、及び、T4 ジーン 32 プロテインを除く）、前記全血、血漿又は血清のいずれかの生体由来試料そのものと混合後のｐＨが８．８以上となる遺伝子増幅反応液を直接混合し反応させる、阻害物質存在下でのPCR法による核酸合成法において、前記反応液中に、界面活性剤の濃度が０．５〜５％となるようにTween20を添加することを特徴とする。
【００１３】
本発明において、生体由来試料とは、動植物組織、体液、排泄物等をいい、遺伝子包含体とは細胞、細菌、ウイルス等をいう。体液には血液や唾液が含まれ、細胞には血液から分離した白血球が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００１４】
遺伝子増幅反応液は、通常、ｐＨ緩衝液並びにＭｇＣｌ2 、ＫＣｌ等の塩類、プライマー、デオキシリボヌクレオチド類及び合成酵素を含むものである。また、上記の塩類は適宜他の塩類に変更して使用されている。また、ゼラチン、アルブミン等の蛋白、ジメチルスルホキシド等種々の物質が添加される場合がある。
本発明に使用することが望ましいｐＨ緩衝液は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンと塩酸、硝酸、硫酸等の鉱酸の組合せであり、鉱酸の中で望ましいものは塩酸である。また、トリシン、ＣＡＰＳＯ(3-N-Cyclohexylamino-2-hydroxypropanesulfonic acid) あるいはＣＨＥＳ(2-(Cyclohexylamino)ethanesulfonic acid)と苛性ソーダ、苛性カリとの組み合せによるｐＨ緩衝液等種々のｐＨ緩衝液が使用され得る。
ｐＨ調整された緩衝液は、ＰＣＲ反応液の中で１０ｍＭから１００ｍＭの間の濃度で使用される。
【００１５】
本明細書中でプライマーは、核酸と重合用試薬等の存在下に合成の開始点として働くオリゴヌクレオチドをいう。プライマーは一本鎖であることが望ましいが、二本鎖も使用できる。もし、プライマーが二本鎖の場合には、増幅反応に先立って一本鎖状にすることが望ましい。
プライマーは、公知の方法により合成することができるし、また、生物界から単離することもできる。
本明細書中で核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡの一本鎖、二本鎖およびＤＮＡとＲＮＡよりなる二本鎖を意味する。
核酸は種々の遺伝子包含体より入手できる。プライマーが準備できれば、核酸は本発明により増幅することができる。
【００１６】
また、“合成酵素”は、プライマー付加による核酸を合成する酵素あるいは、かような化学合成系を意味する。適切な合成酵素としては、Ｅ．coliのＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｅ．coliのＤＮＡポリメラーゼのクレノーフラグメント、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ．litoralis ＤＮＡポリメラーゼ、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼそして逆転写酵素などがあるが、これらにのみ限定されるものではない。
さらに、本明細書中で使用している“熱安定性”は、高温下好ましくは、６５〜９５℃でもその活性を保持する化合物の性質を意味する。
【００１７】
界面活性剤としては、Tween20が用いられる。反応液中の界面活性剤の濃度としては、0.5%〜５％である。特に５％のTween 20を含有したＰＣＲ反応液を用いることにより、１０％の血液を含有したＰＣＲ反応液からも十分な量のＰＣＲ産物を得ることができる。
【００１８】
なお、本発明は遺伝子増幅反応実施者が自身で反応液を調整して実施することもできるし、またこれらの反応液を構成する全部あるいは一部を試薬キットにして提供すれば、本発明の実施がより確実、容易になる。
【００１９】
試薬キットは、ｐＨ緩衝液並びにプライマー、デオキシリボヌクレオチド類及びポリメラーゼを含み試料中の目的とする遺伝子を増幅する核酸合成法に用いる試薬キットにおいて、界面活性剤を含有したことを特徴とする。
【００２０】
本発明によれば、生体由来試料、特に動物体液由来の試料の反応系への直接添加によっても遺伝子増幅が可能となる。つまり、動物体液由来の試料、例えば、全血、血漿、血清又はダ液はそのまま増幅反応用の試薬類と混合され遺伝子増幅反応が行われる。
【００２１】
本発明をＰＣＲに用いた場合、上述のいずれの試料を用いた場合も、ＰＣＲの一工程としてＰＣＲ反応液がＤＮＡの変性の目的で高温条件にさらされたときに、遺伝子包含体は破壊されＤＮＡが遊離される結果、プライマー等のＰＣＲに必要な試薬がＤＮＡに接触可能となる。この際、ＰＣＲ反応液中に血液成分やダ液成分等が存在するが、それにもかかわらず、この改良されたＰＣＲ法によればＤＮＡ増幅が生ずる。
【００２２】
【実施例】
本例は、血液を直接ＰＣＲ反応液に添加する系において、界面活性剤添加の効果について検討したものである。
試料はヒト血液を用いた。種々の濃度の界面活性剤を添加したＰＣＲ反応液にヒト血液を 1.25 〜５μｌ添加し（全50μｌ）、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応液は、10mM Tris-HCl,50mM KCl, 1.5mM MgCl2 ,200μM のdATP,dCTP,dGTP及びdTTP,1.0μM のprimer,2.5units/100 μl のTaq DNA ポリメラーゼ（TaKaRa Taq: Takara shuzo,Kyoto,Japan) を用い、界面活性剤添加後にｐＨ８．８に調整した。
なお、ＰＣＲのプライマーはヒトbeta-globin coding region 内に位置するplus鎖の塩基配列を持つオリゴヌクレオチド（Ｐ１）及び minus鎖の塩基配列を持つオリゴヌクレオチド（Ｐ２）であり、ＰＣＲにより 408bpの増幅産物を得ることができる（Saiki,R.K.,Gelfand,D.H.,Stoffel,S.,Scharf,S.J.,Higuchi,R.,Horn,G.T.,Mullis,K.B. and Erlich,H.A.(1988) Science 239,487-491.) 。
【００２３】
Ｐ１：５′ＧＡＡＧＡＧＣＣＡＡＧＧＡＣＡＧＧＴＡＣ３′
Ｐ２：５′ＧＧＡＡＡＡＴＡＧＡＣＣＡＡＴＡＧＧＣＡＧ３′
ＰＣＲは、９４℃、２分のプレヒーティングの後、９４℃  １分間、５５℃  １分間、７２℃  １分間の条件で４０サイクル、最後に７２℃  ７分間のポリメライゼーションを行った。ＰＣＲ終了後、反応液５μｌを用いて、３％アガロースを含む、０．５μｇ／ｍｌ臭化エチジウム添加ＴＡＥ（40mM Tris-acetate,1mM EDTA,pH8.0) 液中で電気泳動を行い検出した。
【００２４】
抗血液凝固剤としてクエン酸ナトリウムまたはＥＤＴＡ−２Ｋを用いて採血した血液を Tween 20 または NP40 を０．０５％含有したＰＣＲ反応液に添加し、ＰＣＲを行った時の増幅産物の電気泳動図を図１に示す。図中Ｍは分子量マーカー（制限酵素HincIIで切断した 250ngのφＸ174RFDNA）、１はヒト血液１．２５μｌ添加、２は２．５μｌ添加、３は５μｌ添加時のＰＣＲ産物の泳動レーンを示す。また、Ａは界面活性剤無添加、Ｂは Tween 20 添加、Ｃは NP40 添加時の反応液を用いてＰＣＲを行った時の結果を示している。
【００２５】
クエン酸ナトリウム含有血液を用いた場合においては、反応液中の界面活性剤の有無にかかわらず、ＰＣＲ反応液中に２．５μｌの血液を添加するとＰＣＲ産物が検出されなかった。
一方、ＥＤＴＡ−２Ｋ含有血液を用いた場合においては、界面活性剤を含有しない反応液を用いた時には、５μｌの血液添加でＰＣＲ産物が検出できなかったのに対し、界面活性剤を含有した反応液を用いた時には、５μｌの血液添加でもＰＣＲ産物が検出できた。
【００２６】
次に、クエン酸ナトリウムを用いて採血した血液を０．５％ Tween 20 または５％ Tween 20 を含有したＰＣＲ反応液に添加し、ＰＣＲを行った時の増幅産物の電気泳動図を図２および図３に示す。なお、図中の表示は、図１と同一である。図２において、界面活性剤を含有しない反応液を用いた時には、２．５μｌの血液添加でＰＣＲ産物が検出できなかったのに対し、０．５％ Tween 20 を含有した反応液を用いた時には、２．５μｌの血液添加でもＰＣＲ産物が検出できたことを示している。
【００２７】
また、図３において、界面活性剤を含有しない反応液を用いた時には、５μｌの血液添加でＰＣＲ産物が検出できなかったのに対し、５％ Tween 20 を含有した反応液を用いた時には、５μｌの血液添加でもＰＣＲ産物が検出できたことを示している。
【００２８】
なお、図２、図３において、界面活性剤を含有しない反応液を用いた時にＰＣＲ産物が検出できた血液の量が異なるのは、異なったヒトの血液を用いたために、ＰＣＲに対する阻害作用に差異が生じたためと考えられる。
【００２９】
【発明の効果】
本発明により、生体由来の試料から粗分離した遺伝子包含体を核酸合成用反応液系に直接添加しても、効率良く、目的の遺伝子を合成することが可能となる。従って、核酸合成の際の核酸を含む試料の前処理が簡便、迅速におこなえるようになる。特に血液試料の前処理が簡便、迅速におこなえるようになる。
また、本発明により、遺伝子包含体を含有する生体由来試料を直接核酸合成用反応液系に添加して、目的の遺伝子を効率良く合成することが可能となる。
【００３０】
更に、上述の試薬キットを使用すれば、本発明にかかる改良遺伝子増幅法が容易に実施される結果、本発明の効果である前処理の簡略化とあいまって、遺伝子増幅法が簡便に行なえるようになる。
【００３１】
【配列表】
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【００３２】
0004503712.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【図１】０．０５％の Tween 20 または NP-40を含有した反応液を用いて、ＰＣＲを行った後の増幅産物のゲル電気泳動の泳動図である。
【図２】０．５％の Tween 20 を含有した反応液を用いて、ＰＣＲを行った後の増幅産物のゲル電気泳動の泳動図である。
【図３】５％の Tween 20 を含有した反応液を用いて、ＰＣＲを行った後の増幅産物のゲル電気泳動の泳動図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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