(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
融合ポリペプチドをコードする核酸であって、該融合ポリペプチドは、アンギオポイエチン−１のフィブリノーゲンドメインの少なくとも１つのコピーを含む第１のサブユニットを含み、該第１のサブユニットは、多量体化成分のＮ末端に融合しており、該多量体化成分は、ＩｇＧのＦｃドメインあるいはＩｇＧの重鎖からなり、そのＣ末端で第２のサブユニットに融合しており、該第２のサブユニットは、第１のサブユニットと同様のアンギオポイエチン−１のフィブリノーゲンドメインの少なくとも１つのコピーを含む、核酸。
【請求項２】
融合ポリペプチドをコードする核酸であって、該融合ポリペプチドは、アンギオポイエチン−２のフィブリノーゲンドメインの少なくとも１つのコピーを含む第１のサブユニットを含み、該第１のサブユニットは、多量体化成分のＮ末端に融合しており、該多量体化成分は、ＩｇＧのＦｃドメインあるいはＩｇＧの重鎖からなり、そのＣ末端で第２のサブユニットに融合しており、該第２のサブユニットは、第１のサブユニットと同様のアンギオポイエチン−２のフィブリノーゲンドメインの少なくとも１つのコピーを含む、核酸。
【請求項３】
請求項１または２に記載の核酸分子によりコードされる、融合ポリペプチド。
【請求項４】
請求項３に記載の融合ポリペプチドの多量体。
【請求項５】
前記多量体が、二量体である、請求項４に記載の多量体。
【請求項６】
請求項１または２に記載の核酸分子をふくむ、ベクター。
【請求項７】
請求項１または２に記載の核酸分子を、発現制御配列に作動可能に連結して含む、発現ベクター。
【請求項８】
適切な宿主細胞中に、請求項７に記載の発現ベクターを含む、融合ポリペプチドの産生のための宿主ベクター系。
【請求項９】
前記適切な宿主細胞が、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞または哺乳動物細胞のいずれかである、請求項８に記載の宿主ベクター系。
【請求項１０】
前記適切な宿主細胞が、Ｅ．ｃｏｌｉ，ＣＯＳ細胞またはＣＨＯ細胞のいずれかである、請求項９に記載の宿主ベクター系。
【請求項１１】
融合ポリペプチドを産生するための方法であって、該方法は、融合ポリペプチドの産生を可能にする条件下で、請求項８〜１０のいずれかに記載の宿主ベクター系の細胞を増殖させる工程、およびそのように産生したポリペプチドを回収する工程、を包含する、方法。
【請求項１２】
融合ポリペプチドをコードする核酸であって、該融合ポリペプチドは、アンギオポイエチン−１のフィブリノーゲンドメインの１つより多いコピーを一列に含み、そしてＮ末端フィブリノーゲンドメインまたはＣ末端フィブリノーゲンドメインのいずれかがまた、多量体化成分に融合されており、該多量体化成分が、ＩｇＧのＦｃドメインあるいはＩｇＧの重鎖からなっている、核酸。
【請求項１３】
融合ポリペプチドをコードする核酸であって、該融合ポリペプチドは、アンギオポイエチン−２のフィブリノーゲンドメインの１つより多いコピーを一列に含み、そしてＮ末端フィブリノーゲンドメインまたはＣ末端フィブリノーゲンドメインのいずれかがまた、多量体化成分に融合されており、該多量体化成分が、ＩｇＧのＦｃドメインあるいはＩｇＧの重鎖からなっている、核酸。
【請求項１４】
前記フィブリノーゲンドメインが、連続的に融合されている、請求項１２または１３に記載の核酸。
【請求項１５】
請求項１２〜１４のいずれかに記載の核酸分子によりコードされる、融合ポリペプチド。
【請求項１６】
請求項１５に記載の融合ポリペプチドの多量体。
【請求項１７】
前記多量体が二量体である、請求項１６に記載の多量体。
【請求項１８】
請求項１２〜１４のいずれかに記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項１９】
請求項１２〜１４のいずれかに記載の核酸分子を、発現制御配列に作動可能に連結して含む、発現ベクター。
【請求項２０】
適切な宿主細胞中に、請求項１９に記載の発現ベクターを含む、融合ポリペプチドの産生のための宿主ベクター系。
【請求項２１】
前記適切な宿主細胞が、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞または哺乳動物細胞のいずれかである、請求項２０に記載の宿主ベクター系。
【請求項２２】
前記適切な宿主細胞が、Ｅ．ｃｏｌｉ，ＣＯＳ細胞またはＣＨＯ細胞のいずれかである、請求項２１に記載の宿主ベクター系。
【請求項２３】
融合ポリペプチドを産生するための方法であって、該方法は、融合ポリペプチドの産生を可能にする条件下で、請求項２０〜２２のいずれかに記載の宿主ベクター系の細胞を増殖させる工程、およびそのように産生したポリペプチドを回収する工程、を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、１９９８年１２月２３日出願の米国特許番号６０／１１３，３８７号の優先権を主張する。本出願を通じて、種々の刊行物が引用されている。それらの刊行物のそれぞれおよび全ての開示は、その全体が本出願中に参考として援用されている。
【０００２】
（序論）
本発明は、ポリペプチドリガンドのネイティブ形態と比べた場合、生物学的活性が増強している新規な融合ポリペプチドリガンドを産生するための新規な方法を提供する。本発明はまた、生物学的に活性な融合ポリペプチドリガンドを産生するために有用な核酸、および融合ポリペプチドリガンド自体を提供する。
【０００３】
（発明の背景）
ポリペプチドリガンドが細胞に結合して、それにより細胞増殖、細胞生存、または細胞分化のような表現型応答を誘発する能力は、しばしば、膜貫通チロシンキナーゼを通じて媒介される。各レセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の細胞外部分は、それがタンパク質にそのリガンド認識特徴を提供するということで、一般的に分子の最も特有の部分である。細胞外ドメインへのリガンドの結合は、細胞内チロシンキナーゼ触媒ドメイン（細胞内標的タンパク質に対して生物学的シグナルを伝達する）を介してシグナル伝達を生じる。この細胞質の触媒性ドメインの配列モチーフの特定のアレイは、潜在的なキナーゼ基質へのそのアクセスを決定する（Ｍｏｈａｍｍａｄｉら、１９９０、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１１：５０６８〜５０７８；Ｆａｎｔｌら、１９９２、Ｃｅｌｌ、６９：４１３〜４１３）。
【０００４】
ＲＴＫは、リガンド結合後に、二量体化またはいくつかの関連するコンフォメーション変化を受けるらしい（Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ、Ｊ．１９８８、Ｔｒｅｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１３：４４３〜４４７；ＵｌｌｒｉｃｈおよびＳｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ、１９９０、Ｃｅｌｌ、６１：２０３〜２１２；ＳｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒおよびＵｌｌｒｉｃｈ，１９９２、Ｎｅｕｒｏｎ  ９：３８３〜３９１）；二量体化している細胞質ドメイン間の分子相互作用はキナーゼ機能の活性化を導く。いくつかの場合（例えば、増殖因子である血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ））は、リガンドは、２つのレセプター分子に結合する二量体である（Ｈａｒｔら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０：１５２９〜１５３１；Ｈｅｌｄｉｎ、１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：８９０５〜８９１２）が、例えば、ＥＧＦの場合は、リガンドは、単量体である（Ｗｅｂｅｒら、１９８４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：１４６３１〜１４６３６）。
【０００５】
生物工学産業の歴史を通して、多くの新規な遺伝子および関連するタンパク質が、公知の遺伝子とのそれらの配列相同性によって同定されてきた。多くのこのようなタンパク質がレセプターであると主張されているが、それらの同系のリガンドは同定されていないので、それらは、オーファンレセプターと呼ばれている。これらの多くのオーファンレセプターのスクリーニングは、しばしば、レセプターに結合し得るリガンドの同定を導くが、この結合は、しばしば、どのような細胞内キナーゼの活性化または他の表現型変化にも関連しない。これは、Ｅｐｈレセプターファミリーのメンバーの場合である。明確化のため、本出願人は、Ｅｐｈ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ，１９９７（Ｃｅｌｌ、第９０巻：４０３〜４０３（１９９７）に発表）として引用された文書を本明細書において参考として組み込む。これは、ＥｐｈレセプターおよびＥｐｈリガンドファミリーのための命名法を示している。
【０００６】
１９９８年５月５日発行米国特許第５，７４７，０３３号に示されるような発見の前には、Ｅｐｈファミリーレセプターに対するリガンドの結合に応答する生物学的活性は、存在するとしても、ほとんど観察されていなかった。その特許は、「クラスター化（ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ）」の概念を記載する。これにより、リガンドの可溶性ドメインは、同系のレセプターを活性化し得る多量体を作製するために組み合わされた。本出願者は、いまや、Ｅｐｈファミリー以外のさらなるリガンド（例えば、アンギオポイエチンとして公知のＴｉｅ−２レセプターリガンド）に対してクラスター化の概念を伸展させており、そしてまたクラスター化されたリガンドの同種形態の産生のためのこの方法が、ネイティブ形態のリガンドに比較して、リガンドの親和性を改善するためおよび／またはリガンドの活性を増大するために広範に適用され得ることを発見した。
【０００７】
アンギオポイエチン−１（Ａｎｇ）は、Ｔｉｅ−２レセプターについての公知のリガンドの２つのうちの１つであり、そしてＴｉｅ−２についてのアゴニストであることが示されている（Ｄａｖｉｓら、１９９６、Ｃｅｌｌ  ８７：１１６１〜１１６９）が、第二の公知のリガンドであるアンギオポイエチン−２は、Ｔｉｅ−２レセプターの天然に存在するアンタゴニストであることが示されている（Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅら、１９９７、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７：５５〜６０）。Ａｎｇ１*は、アンギオポイエチン−１の変異型であり、これはコイル化したコイルドメインに融合したアンギオポイエチン−２のＮ末端ドメインおよびアンギオポイエチン−１のフィブリノーゲンドメインを含み、かつこれはアミノ酸２４５でＣｙｓからＳｅｒへの変異を有する。Ａｎｇ１*は、Ｔｉｅ−２レセプターの強力なアゴニストであることが示されている。
【０００８】
アンギオポイエチン−１およびアンギオポイエチン−２の変異体を用いる実験は、フィブリノーゲンドメイン（ＦＤ）がレセプター結合ドメインであること、およびその二量体化バージョン（例えば、Ａｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃ（すなわち、Ｆｃドメインに融合したＡｎｇ−１のフィブリノーゲンドメイン））が単量体型Ａｎｇ−１−ＦＤよりもかなり高い親和性でＴｉｅ−２レセプターに結合し得る（二量体化は、隣接する分子のＦｃ成分の間の相互作用に起因して生じる）ことを実証した。しかし、Ａｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃは、それがヤギ抗ヒトＦｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）とさらにクラスター化されない限り、内皮細胞上のＴｉｅ−２レセプターのリン酸化（活性化）を誘導し得ない。この理由により、本質的により高度にクラスター化された、Ａｎｇ−１―ＦＤおよびＡｎｇ−２−ＦＤの変異体バージョン（すなわち、Ａｎｇ−２のフィブリノーゲンドメイン）が設計された。
【０００９】
（発明の要旨）
本発明は、細胞上のレセプターに結合する、新規な、生物学的に活性な、可溶性形態のポリペプチドリガンドを提供する。このようなポリペプチドリガンドは、レセプター保有細胞の示差的機能を促進する、および／または表現型（例えば、成長および／または増殖）に影響するにおいて有用である。本発明はまた、このようなポリペプチドリガンドをコードする核酸、ならびにこのようなポリペプチドリガンドを産生するための原核生物発現系および真核生物発現系の両方を提供する。本明細書において記載される可溶性形態のポリペプチドリガンドは、本発明に従って、レセプター発現細胞中の生物学的応答を促進するために用いられ得る。詳細には、融合ポリペプチドリガンド（次いで、クラスター化され得る）を産生する一般的方法が本明細書に記載されている。この方法は、そうでなければ不活性である可溶性ポリペプチドリガンドを生物学的に活性にするように機能するか、またはこのようなクラスター化のない、生物学的活性のレベルが低いポリペプチドリガンドの生物学的活性を増強する。この方法を用いて、ネイティブ形態のリガンドと比較して、クラスターした場合に改善された親和性および／または増加した活性（すなわち、シグナル伝達能力）を有する、任意のリガンド由来の複数（１つより多い）のレセプター結合ドメインを、クラスター化し得る。
（発明の詳細な説明）
以下により詳細に説明するように、出願人は、ポリペプチドリガンドを「クラスター化」するための方法を発見した。この方法は、そうでなければ、不活性の可溶性ポリペプチドリガンドを、生物学的に活性化するように機能するか、またはそのようなクラスター化がなければ、より低いレベルの生物学的活性を有するポリペプチドリガンドの生物学的活性を増強する。この方法を用いて、そのリガンドのネイティブ形態に比較して、クラスター化したときに改善された親和性および／または増加した活性（すなわち、シグナル伝達能力）を有する任意のリガンドから複数の（１つより多い）レセプター結合ドメインをクラスター化し得る。
【００１０】
本発明は、融合ポリペプチドをコードする核酸を提供する。ここで、この融合ポリペプチドは、第一のサブユニットを包含する。この第一のサブユニットは、多量体化成分のＮ末端の末端に対して融合されており、この多量体化成分は、そのＣ末端で、あるリガンドのレセプター結合ドメインの少なくとも１つのコピーを含む第二のサブユニットに対して融合されている。
【００１１】
本発明の１つの実施形態において、第一のサブユニットおよび第二のサブユニットのレセプター結合ドメインは、同じリガンドのレセプター結合ドメインのコピーである。この第一のサブユニットおよび第二のサブユニットは、各々が、そのリガンドのレセプター結合ドメインの１つまたは１を超えるコピーを有し得る。本発明の特定の実施形態において、そのレセプター結合ドメインは、アンギオポイエチン−１またはアンギオポイエチン−２のフィブリノーゲンドメインである。あるいは、そのレセプター結合ドメインは、リガンドのＥＰＨファミリー（すなわち、エフリン（ｅｐｈｒｉｎ））からなる群より選択されるリガンド由来である。
【００１２】
本発明の別の実施形態において、この第一のサブユニットのレセプター結合ドメインは、その第二のサブユニットのレセプター結合ドメイン由来の異なるリガンドのレセプター結合ドメインのコピーである。例えば、その第一のサブユニットは、アンギオポイエチンのレセプター結合ドメインを含み得、そしてその第二のサブユニットは、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）のレセプター結合ドメインを含み得る。あるいは、その第一のサブユニットは、ＶＥＧＦのレセプター結合ドメインを含み得、そしてその第二のサブユニットは、レセプター結合ドメインおよび（ａｎ）アンギオポイエチンを含み得る。さらになお、その第一のサブユニットおよびその第二のサブユニットは、各々、そのそれぞれのリガンドのレセプター結合ドメインの１つまたは１つを超えるそのレセプターのコピーを有し得る。
【００１３】
「レセプター結合ドメイン」によって、そのレセプターに結合するために必要なリガンドの最小部分を意味する。
【００１４】
本発明の好ましい実施形態において、その多量体化成分は、免疫グロブリン由来のドメインを含む。より詳細には、その免疫グロブリン由来のドメインは、ＩｇＧのＦｃドメイン、ＩｇＧの重鎖およびＩｇＧの軽鎖からなる群より選択され得る。別の実施形態において、その多量体化成分は、Ｆｃドメインであり得、ここから、最初の５つのアミノ酸（システインを含む）が除去されて、Ｆｃ（ΔＣ１）と呼ばれる多量体化成分を生成する。
【００１５】
本発明はまた、本発明の核酸分子によってコードされる融合ポリペプチドを提供する。好ましくは、この融合ポリペプチドは、多量体化成分の機能に起因して、多量体形態である。好ましい実施形態において、その多量体は二量体である。適切な多量体化成分は、ＺｙｍｏＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．の欧州特許出願である出願番号ＥＰ  ０  ７２１  ９８３  Ａ１（１９９６年７月１７日公開）に記載され、そしてＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ抑制性酸ホスファターゼ（Ｍｉｚｕｎａｇａら、１９８８、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ）１０３：３２１−３２６）；Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ１型キラープレプロ毒素（Ｓｔｕｒｌｅｙら、１９８６、ＥＭＢＯ  Ｊ．５：３３８１−３３９０）；Ｓ．ｃａｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ  αガラクトシダーゼメリビアーゼ（ｍｅｌｉｂｉａｓｅ）（Ｓｕｍｎｅｒ−Ｓｍｉｔｈら、１９８５、Ｇｅｎｅ  ３６：３３３−３４０）；ならびにＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａオリニチンデカルボキシラーゼ（Ｄｉｇａｎｇｉ，ら、１９８７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：７８８９−７８９３）を包含する。以下をコードする配列：免疫グロブリン重鎖ヒンジ領域（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、１９８２、Ｃｅｌｌ  ２９：６７１−６７９）；Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＵＣ２遺伝子（Ｃａｒｌｓｏｎら、１９８３、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：４３９−４４７）；免疫グロブリン遺伝子配列およびその一部。本発明の好ましい実施形態において、免疫グロブリン遺伝子配列（特に、Ｆｃドメインをコードするもの）を使用して、多量体化成分をコードさせる。
【００１６】
本発明はまた、本明細書に記載される本発明の核酸分子を含むベクターを意図する。
【００１７】
また、本明細書に記載される本発明の核酸分子を含む発現ベクターが提供され、ここで、その核酸分子は、発現制御配列に作動可能に連結されている。その融合ポリペプチドの発現のために適切な、宿主細胞へ導入された本発明の発現ベクターを含む融合ポリペプチドの産生のための宿主ベクター系もまた、提供される。適切な宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌細胞、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓのような酵母細胞、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａのような昆虫細胞、またはＣＯＳ細胞もしくはＣＨＯ細胞のような哺乳動物細胞であり得る。
【００１８】
本発明はまた、本発明の融合ポリペプチドを産生する方法を提供する。この方法は、本明細書に記載される宿主ベクター系の細胞を、その融合ポリペプチドの産生を可能にする条件下で増殖させること、およびそのように産生された融合ポリペプチドを回収することによる。
【００１９】
本発明を実施するために有用な融合ポリペプチドは、原核生物または真核生物の発現系中での発現によって調製され得る。
【００２０】
多数の方法を利用して、組換え遺伝子は、発現され得、そしてそのポリペプチドが精製され得る。その遺伝子は、例えば、（これは、限定の目的ではない）ｐＣＰ１１０のような細菌発現ベクター中にサブクローニングされ得る。
【００２１】
その融合ポリペプチドは、安定な生物学的に活性なタンパク質の、続いての形成を可能にする任意の技術によって精製され得る。例えば（これは、限定の目的ではない）、その因子は、可溶性タンパク質としてまたは封入体としてのいずれかで細胞から回収され得、その封入体から、その因子は、８Ｍ塩酸グアニジニウムおよび透析によって定量的に抽出され得る。その因子をさらに精製するために、従来のイオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーまたはゲル濾過が使用され得る。
【００２２】
本発明はまた、その融合ポリペプチドが縦列に、リガンドのレセプター結合ドメインの１を超えるコピーを含む融合ポリペプチドをコードする核酸を提供する。ここで、そのＮ末端またはＣ末端のいずれかのレセプター結合ドメインはまた、多量体化成分に融合されている。本発明の１つの実施形態において、そのレセプター結合ドメインは、連続的に融合されている。本発明の別の実施形態において、そのレセプター結合ドメインは、リガンドのＥＰＨファミリーのメンバーではないリガンド（すなわち、エフリンではない）由来である。本発明の特定の実施形態において、そのレセプター結合ドメインは、アンギオポイエチン−１またはアンギオポイエチン−２のフィブリノーゲンドメインドメインである。代替の実施形態において、そのレセプター結合ドメインは、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）由来である。別の実施形態において、そのレセプター結合ドメインは、エフリン由来である。
【００２３】
「レセプター結合ドメイン」とは、そのレセプターに結合するために必要なリガンドの最小部分を意味する。
【００２４】
本発明の好ましい実施形態において、多量体化成分は、免疫グロブリン由来のドメインを含む。より詳細には、その免疫グロブリン由来のドメインは、以下からなる群より選択され得る：ＩｇＧのＦｃドメイン、ＩｇＧの重鎖、およびＩｇＧの軽鎖。別の実施形態において、その多量体化成分は、Ｆｃドメインであり得、そこからは、最初の５つのアミノ酸（システインを含む）が除去されて、Ｆｃ（ΔＣ１）と呼ばれる多量体化成分が生成する。
【００２５】
本発明はまた、本発明の核酸分子によってコードされる融合ポリペプチドを提供する。好ましくは、その融合ポリペプチドは、その多量体化成分の機能に起因して、多量体化形態で存在する。好ましい実施形態において、その多量体は、二量体である。適切な多量体化成分は、ＺｙｍｏＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．の欧州特許出願である出願番号ＥＰ  ０  ７２１  ９８３  Ａ１（１９９６年７月１７日公開）に記載され、そしてＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ抑制性酸ホスファターゼ（Ｍｉｚｕｎａｇａら、１９８８、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ）１０３：３２１−３２６）；Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ１型キラープレプロ毒素（Ｓｔｕｒｌｅｙら、１９８６、ＥＭＢＯ  Ｊ．５：３３８１−３３９０）；Ｓ．ｃａｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓαガラクトシダーゼメリビアーゼ（ｍｅｌｉｂｉａｓｅ）（Ｓｕｍｎｅｒ−Ｓｍｉｔｈら、１９８５、Ｇｅｎｅ  ３６：３３３−３４０）；ならびにＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａオリニチンデカルボキシラーゼ（Ｄｉｇａｎｇｉ，ら、１９８７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：７８８９−７８９３）を包含する。以下をコードする配列：免疫グロブリン重鎖ヒンジ領域（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、１９８２、Ｃｅｌｌ  ２９：６７１−６７９）；Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＵＣ２遺伝子（Ｃａｒｌｓｏｎら、１９８３、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：４３９−４４７）；免疫グロブリン遺伝子配列およびその一部。本発明の好ましい実施形態において、免疫グロブリン遺伝子配列（特に、Ｆｃドメインをコードするもの）を使用して、多量体化成分をコードさせる。
【００２６】
本発明はまた、本明細書に記載される本発明の核酸分子を含むベクターを意図する。
【００２７】
また、本明細書に記載される本発明の核酸分子を含む発現ベクターが提供され、ここで、その核酸分子は、発現制御配列に作動可能に連結される。その融合ポリペプチドの発現のために適切な、宿主細胞へ導入された本発明の発現ベクターを含む融合ポリペプチドの産生のための宿主ベクター系もまた、提供される。適切な宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌細胞、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓのような酵母細胞、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａのような昆虫細胞、またはＣＯＳ細胞もしくはＣＨＯ細胞のような哺乳動物細胞であり得る。
【００２８】
本発明はまた、本発明の融合ポリペプチドを産生する方法を提供する。この方法は、本明細書に記載される宿主ベクター系の細胞を、その融合ポリペプチドの産生を可能にする条件下で増殖させること、およびそのように産生された融合ポリペプチドを回収することによる。
【００２９】
本発明を実施するために有用な融合ポリペプチドは、原核生物または真核生物の発現系中での発現によって調製され得る。多数の方法を利用して、その組換え遺伝子は、発現され得、そしてそのポリペプチドが精製され得る。その遺伝子は、例えば、（これは、限定の目的ではない）ｐＣＰ１１０のような細菌発現ベクター中にサブクローニングされ得る。
【００３０】
その融合ポリペプチドは、安定な生物学的に活性なタンパク質の、続いての形成を可能にする任意の技術によって精製され得る。例えば（これは、限定の目的ではない）、その因子は、可溶性タンパク質としてまたは封入体としてのいずれかで細胞から回収され得、その封入体から、その因子は、８Ｍ塩酸グアニジニウムおよび透析によって定量的に抽出され得る。その因子をさらに精製するために、従来のイオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーまたはゲル濾過が使用され得る。
【００３１】
実施例は、Ｅｐｈ（Ｅｐｈ膜貫通型チロシンキナーゼファミリーリガンド）のリガンドファミリーのメンバー、またはＴｉｅ−２レセプターを結合し得るリガンドのアンギポエチンファミリーのメンバーのレセプター結合ドメインを含む新規ポリペプチドリガンドの調製を記載する。
【００３２】
新規Ｅｐｈファミリーリガンドの説明のために、それらを作製および使用する方法ならびにＥＨＫ−１Ｌ、Ｂ６１およびＥＬＫ−Ｌの配列に加えて、それらをクラスター化することによるＥＰＨファミリーリガンドの生物学的活性を増強する方法の説明について、出願人は、以下を参照する米国特許第５，７４７，０３３号（１９９８年５月５日発行）（これは、その全体が本明細書において参考として援用される）。出願人は、さらに、以下をも参照する：国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９３／１０８７９（ＷＯ  ９４／１１０２０として１９９４年５月２６日に公開）；および国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９６／１７２０１（ＷＯ  ９７／１５６６７として、発明の名称「Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  Ａｃｔｉｖｅ  ＥＰＨ  Ｆａｍｉｌｙ  Ｌｉｇａｎｄｓ」として公開）（これら各々は、その全体が、本明細書において参考として援用される）。
【００３３】
以前に報告されたように、ＴＩＥ−２レセプターについてのリガンドのファミリーが発見され、そしてアンギオポイエチン（ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ）と名づけられた。このファミリーは、ＴＩＥ−２リガンド１（Ａｎｇ−１）；ＴＩＥ−２リガンド２（Ａｎｇ−２）；ＴＩＥリガンド３（Ａｎｇ−３）；およびＴＩＥリガンド４（Ａｎｇ−４）からなり、これらは、広汎に特徴付けられている。アンギオポイエチンのクローニング、配列決定および特徴づけの説明、ならびにそれらを作製および使用する方法（その改変されたリガンドおよびキメラリガンドの産生および特徴付けを含む）については、以下の刊行物を本明細書において参照する（それら各々は、その全体が本明細書において参考として援用される）：米国特許第５，５２１，０７３号（１９９６年５月２８日発行）；米国特許第５，６４３，７５５号（１９９７年７月１日発行）；米国特許第５，６５０，４９０号（１９９７年７月２２日発行）；米国特許第５，８１４，４６４号（１９９８年９月２９日発行）；米国特許第５，８７９，６７２号（１９９９年３月９日発行）；米国特許第５，８５１，７９７号（１９９８年１２月２２日発行）；ＰＣＴ国際出願、発明の名称「ＴＩＥ−２  Ｌｉｇａｎｄｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｍａｋｉｎｇ  ａｎｄ  Ｕｓｅｓ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」（ＷＯ  ９６／１１２６９として、１９９６年４月１８日に発行、出願人はＲｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ）；ＰＣＴ国際出願、発明の名称「ＴＩＥ−２  Ｌｉｇａｎｄｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｍａｋｉｎｇ  ａｎｄ  Ｕｓｅｓ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」（ＷＯ  ９６／３１５９８として１９９６年１０月１０日に発行、出願人はＲｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ．）；ＰＣＴ国際出願、発明の名称「ＴＩＥ−２  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｌｉｇａｎｄｓ（ＴＩＥ  Ｌｉｇａｎｄ−３；ＴＩＥ  Ｌｉｇａｎｄ−４）Ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅｓ」、（ＷＯ  ９７／４８８０４として、１９９７年１２月２４日に発行、出願人はＲｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ）；ならびにＰＣＴ国際出願、発明の名称「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＴＩＥ−２  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｌｉｇａｎｄｓ」、（ＷＯ  ９８／０５７７９として、１９９８年２月１２日に発行、出願人は、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ）。
【００３４】
本明細書において使用される場合、融合ポリペプチドは、アミノ酸残基がその配列内における残基について置換されており、サイレントまたは保存的な変化を生じる機能的に等価な分子を包含する。例えば、その配列内の１つ以上のアミノ酸残基は、機能的等価物として機能する類似の極性の別のアミノ酸に置き換えられ得、サイレントまたは保存的な変更を生じる。その配列内のアミノ酸の置換は、そのアミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択され得る。例えば、その非極性（疎水性）アミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンを含む。極性中性アミノ酸は、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンを含む。正に荷電した（塩基性）アミノ酸は、アルギニン、リジンおよびヒスチジンを含む。負に荷電した（酸性）アミノ酸は、アスパラギン酸、およびグルタミン酸を含む。本発明の範囲内に含まれるのはまた、同じまたは類似の生物学的な活性を示すタンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体、および例えばグリコシル化、タンパク質溶解分解、抗体分子または他の細胞リガンドへの連結など、翻訳の間または後に示差的に改変された誘導体である。
【００３５】
本発明の融合ポリペプチドを発現する細胞は、遺伝子操作されて、例えば、トランスフェクション、形質誘導、エレクトロポレーションまたはマイクロインジェクションによってそれらを産生する。
【００３６】
本発明は、本発明の融合ポリペプチドをコードする核酸配列、および本発明の核酸配列に相補的な核酸配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を包含する。ストリンジェント条件は、例えば、以下に示されている：Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版第１巻、１０１−１０４頁、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）。さらに、本発明は、本発明の核酸配列とは異なるが、それにもかかわらず、遺伝コードの縮重に起因して本発明に融合ポリペプチドをコードする核酸配列を包含する。
【００３７】
さらに、本発明は、タグ化された形態での、本明細書に記載される融合ポリペプチドの使用を意図する。
【００３８】
ＤＮＡフラグメントのベクターへの挿入のための当業者に公知の方法のいずれかを用いて、適切な転写／翻訳制御シグナルおよびタンパク質コード配列を用いて、本発明の融合ポリペプチドをコードする発現ベクターを構築し得る。これらの方法は、インビトロの組換えＤＮＡおよび合成技術、ならびにインビボの組換え（遺伝子組換え）を包含し得る。本発明の融合ポリペプチドをコードする核酸配列の発現は、第二の核酸配列によって調節され得、その結果、その融合ポリペプチドは、その組換えＤＮＡ分子で形質転換された宿主において発現される。例えば、本発明に記載される融合ポリペプチドの発現は、当該分野で公知の任意のプロモーター／エンハンサーエレメントによって制御され得る。その融合ポリペプチドの発現を制御するのに使用され得るプロモーターとしては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：Ｓｑｕｉｎｔｏら、（１９９１、Ｃｅｌｌ  ６５：１−２０）に記載されるような長末端反復；ＳＶ４０初期プロモーター領域（ＢｅｒｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ、１９８１、Ｎａｔｕｒｅ  ２９０：３０４−３１０）、ＣＭＶプロモーター、ラウス肉腫ウイルスの３’長末端反復に含まれるＭ−ＭｕＬＶ  ５’末端反復プロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏ，ら、１９８０、Ｃｅｌｌ  ２２：７８７−７９７）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら、１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４−１４４５）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、１９８２、Ｎａｔｕｒｅ  ２９６：３９−４２）；原核生物発現ベクター（例えば、ｂ−ラクタマーゼプロモーター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆ，ら、１９７８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７５：３７２７−３７３１）、またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒ，ら、１９８３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：２１−２５）、（以下もまた参照のこと：「Ｕｓｅｆｕｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｂａｃｔｅｒｉａ」、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ、１９８０，２４２：７４−９４）；酵母または他の真菌由来のプロモーターエレメント（例えば、Ｇａｌ  ４プロモーター、ＡＤＨ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター、ならびに以下の動物転写制御領域（これは、組織特異性を示し、そしてトランスジェニック動物において利用されている）：エラスターゼＩ遺伝子制御領域（これは、膵臓腺房細胞において活性である）（Ｓｗｉｆｔら、１９８４、Ｃｅｌｌ  ３８：６３９−６４６；Ｏｒｎｉｔｚら、１９８６、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９−４０９；ＭａｃＤｏｎａｌｄ、１９８７、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ７：４２５−５１５）；インスリン遺伝子制御領域（これは、膵臓β細胞において活性である）（Ｈａｎａｈａｎ、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：１１５−１２２）、免疫グロブリン遺伝子制御領域（これは、リンパ細胞において活性である）（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら、１９８４、Ｃｅｌｌ  ３８：６４７−６５８；Ａｄａｍｅｓら、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ  ３１８：５３３−５３８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、１９８７、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：１４３６−１４４４）、マウス乳腺腫瘍ウイルス制御領域（これは、精巣、乳房、リンパ球およびマスト細胞において活性である）（Ｌｅｄｅｒら、１９８６、Ｃｅｌｌ  ４５：４８５−４９５）、アルブミン遺伝子制御領域（これは、肝臓において活性である）（Ｐｉｎｋｅｒｔら、１９８７、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．１：２６８−２７６）、α−フェトプロテイン遺伝子制御領域（これは、肝臓で活性である）（Ｋｒｕｍｌａｕｆら、１９８５、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１６３９−１６４８；Ｈａｍｍｅｒら、１９８７、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５：５３−５８）；α１−アンチトリプシン遺伝子制御領域（これは、肝臓において活性である）（Ｋｅｌｓｅｙら、１９８７、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．１：１６１−１７１）、βグロビン遺伝子制御領域（これは、骨髄細胞において活性である）（Ｍｏｇｒａｍら、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：３３８−３４０；Ｋｏｌｌｉａｓら、１９８６、Ｃｅｌｌ  ４６：８９−９４）；ミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（これは、脳内の稀突起神経膠細胞において活性である）（Ｒｅａｄｈｅａｄら、１９８７、Ｃｅｌｌ  ４８：７０３−７１２）；ミオシン軽鎖２遺伝子制御領域（これは、骨格筋において活性である）（Ｓｈａｎｉ、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：２８３−２８６）、ならびに性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御領域（これは、視床下部において活性である）（Ｍａｓｏｎら、１９８６、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３４：１３７２−１３７８）。
【００３９】
従って、本発明に従って、本明細書中に記載されるようなＥｐｈ融合ペプチドをコードする核酸、またはアンギオポイエチン融合ペプチドをコードする核酸を含む、細菌宿主または真核生物宿主において複製し得る発現ベクターを用いて、宿主をトランスフェクトし、それにより、次いで生物学的に活性な形態において回収され得る融合タンパク質を産生する、このような核酸の発現を指向する。本明細書中に記載される場合、生物学的に活性な形態は、関連のレセプターに結合し得る形態、および分化機能を生じ得る形態および／またはレセプターを発現する細胞の表現型に影響を与え得る形態を含む。このような生物学的に活性な形態は、例えば、Ｅｈｋ−１、Ｅｌｋ、またはＴｉｅ２レセプターのチロシンキナーゼドメインのリン酸化、あるいは細胞性ＤＮＡの合成の刺激を含む。
【００４０】
核酸挿入物を含む発現ベクターは、以下の３つの一般的アプローチによって同定され得る：（ａ）ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション、（ｂ）「マーカー」遺伝子機能の存在または非存在、および（ｃ）挿入された配列の発現。第一のアプローチにおいて、発現ベクターに挿入された外因性核酸の存在は、挿入核酸配列に相同な配列を含むプローブを用いる、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションによって検出され得る。第二のアプローチにおいて、組換えベクター／宿主系は、ベクター内の外因性核酸配列の挿入によって生じる特定の「マーカー」遺伝子機能（例えば、チミジンキナーゼ活性、抗生物質に対する耐性、形質転換表現型、バキュロウイルスにおける封入体（ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ  ｂｏｄｙ）形成など）の存在または非存在に基づいて同定および選択され得る。例えば、ｅｆｌ核酸配列がベクターのマーカー遺伝子内に挿入される場合、挿入物を含む組換え体は、マーカー遺伝子機能の非存在によって同定され得る。第三のアプローチにおいて、組換え体発現ベクターは、組換え体によって発現される外因性核酸産物をアッセイすることによって同定され得る。このようなアッセイは、例えば、検出可能な抗体もしくはその一部を用いて、タグ化され得るレセプターもしくはその一部に対するリガンドの結合、または目的のタンパク質もしくはその一部に対して産生された抗体への結合によるように、例えば、目的の核酸産物の物質的特性または機能的特性に基づき得る。
【００４１】
本発明の細胞は、本明細書中に記載されるようなエフリンまたはアンギオポエチン融合ポリペプチドを、一過性に、または好ましくは、安定的かつ永久的に発現し得る。
【００４２】
本発明のエフリン融合ポリペプチドは、神経学的疾患に罹患した患者の処置の方法に有用であり得る。この方法は、エフリン融合ポリペプチドの有効量を用いて、その患者を処置する工程を包含する。
【００４３】
例えば、Ｅｌｋレセプターは、主に脳に発現される。したがって、Ｅｌｋ結合エフリン融合ポリペプチドリガンドは、このレセプターを発現する神経細胞の増殖および／または生存のような、差示的な機能および／または表現型の影響の誘導を支持する。
【００４４】
本発明はまた、適切な薬理学的なキャリア中にエフリン融合ポリペプチドを含む薬学的組成物を提供する。この組成物は、全身性または局所的に投与され得る。当業者において公知の投与の任意の適切な様式が用いられ得、以下を含むが、これらに限定されない：静脈内、髄膜下、動脈内、鼻腔内、経口、皮下、腹腔内、または局所注射もしくは外科的移植。持続的放出処方物もまた提供される。
【００４５】
神経変性疾患／神経外傷の本発明者の理解が明らかになるにつれて、内因性Ｅｆｌ−６の効果が減少することが有益であることは、明白になり得る。従って、神経系の外傷の領域において、Ｅｌｋレセプターとの相互作用について、細胞結合リガンドと競合し得るＥｆｌ−６の融合ポリペプチド形態を含むが、これに限定されないＥｆｌ−６アンタゴニストを提供することは所望され得る。全身性よりも傷害部位に局所的にこのようなアンタゴニストを提供することが所望され得る。移植を提供するＥｌｆ−６アンタゴニストの使用が、所望され得る。
【００４６】
あるいは、特定の条件が、Ｅｌｆ−６感応性における増加から恩恵を受け得る。従って、このような条件に罹患した患者におけるＥｌｆ−６結合親和性の数値が増加することが有益であり得る。
【００４７】
本明細書中で、本発明はさらに、ＴＩＥ−２レセプターを発現する細胞、組織または器官を含む障害に罹患した患者の処置のための治療剤として、融合ポリペプチドの開発を提供する。このような分子は、ヒトまたは動物の身体の処置の方法、あるいは、診断の方法に使用され得る。
【００４８】
ＴＩＥ−２レセプターが内皮細胞に関して同定され、最近示されたように、ＴＩＥ−２リガンド１（Ａｎｇ−１）のようなレセプターのアゴニストのブロックは、血管新生を防ぐことが示されたので、本発明のＴＩＥ−２アゴニスト融合ポリペプチドが、このような血管新生が示される障害または疾患における血管新生の誘導に有用であり得ることを、出願人は予測する。このような疾患または障害は、創傷治癒、虚血、および糖尿病を含み得る。リガンドは、動物モデルにおいて試験され得、そして他の薬剤（例えば、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、血管由来の別の内皮細胞特異的因子）について記載されるように治療的に使用され得る。Ｆｅｒｒａｒａら、１９９４年７月２６日に発行された米国特許第５，３３２，６７１号。Ｆｅｒｒａｒａの参考文献、ならびに他の研究は、虚血心筋への血流の増加、創傷治癒の増加、および新血管形成が所望される他の治療的条件における、血管由来因子の効果を示すために用いられ得るインビトロおよびインビボの研究を記載する。（Ｓｕｄｏら、１９９３年７月７日に出願公開された欧州特許出願第０５５０２９６Ａ２；Ｂａｎａｉら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ８９：２１８３−２１８９（１９９４）；Ｕｎｇｅｒら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６６：Ｈ１５８８−Ｈ１５９５（１９９４）；Ｌａｚａｒｏｕｓら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９１：１４５−１５３（１９９５）を参照すること）。本発明に従って、アゴニスト融合ポリペプチドは、単独、または１以上のさらなる薬学的に活性な化合物（例えば、ＶＥＧＦまたは塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）のような）との組み合わせにおいて用いられ得る。
【００４９】
逆に、ＴＩＥ−２レセプターのアンタゴニスト（例えば、１９９６年１０月１０日に出願された国際特許出願ＷＯ９６／３１５９８の実施例９に記載されるようなＴＩＥ−２レセプター体またはＴＩＥ−２リガンド２（Ａｎｇ−２））はまた、血管新生を防止または減少することを示し、従って、例えば、腫瘍増殖の防止または減少に有用であることが期待される。次いで同様に、本発明のＴＩＥ−２アンタゴニスト融合ポリペプチドはまた、これらの目的に有用であり得る。これらのアンタゴニストは、単独または他の組成物（例えば、抗ＶＥＧＦ抗体）との組み合わせにおいて用い得、治療的意図が血管新生をブロックすることである状態の処置に有用であるべきである。
【００５０】
例えば、出願人は、ＴＩＥ−２リガンドが細胞において腫瘍内または腫瘍に近接して発現されることを決定した。例えば、ＴＩＥ−２リガンド２（Ａｎｇ−２）は、腫瘍内皮細胞に非常に会合するようである。従って、本発明のＴＩＥ−２アンタゴニスト融合ポリペプチドはまた、例えば、腫瘍増殖の防止または減少に有用であり得る。
【００５１】
他の実施形態において、本明細書中に記載される本発明のＴＩＥ−２アゴニスト融合ポリペプチドは、造血因子として用いられ得る。種々の造血因子およびそのレセプターは、血液に含まれる種々の細胞型の増殖および／または分化および／または移動に関与する。ＴＩＥ−２レセプターは、初期造血細胞に発現されることから、ＴＩＥ−２リガンドは発現され、これらの細胞の増殖または分化または移動において匹敵する役割を演じることが期待される。従って、例えば、ＴＩＥ−２アゴニスト融合ポリペプチド組成物が、調製され得、アッセイされ得、インビトロおよびインビボでの生物学的系において試験され得、そして以下の任意において記載されるように治療的に使用され得る：Ｓｏｕｓａ、米国特許第４,８１０，６４３号、Ｌｅｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４３６０−４３６４（１９８５）、Ｗｏｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２８：８１０−８１４（１９８５）；Ｙｏｋｏｔａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ（ＵＳＡ）８１：１０７０（１９８４）；Ｂｏｓｓｅｌｍａｎら、「Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒ」という発明の名称の１９９１年３月２日に公開されたＷＯ９１０５７９５；Ｋｉｒｋｎｅｓｓら、「Ｈａｅｍｏｐｅｉｅｔｉｃ  Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ」という発明の名称の１９９５年７月２７日に公開されたＷＯ９５／１９９８５。従って、この融合ポリペプチドを使用して、正常血管新生が抑制される状態（貧血、血小板減少症、白血球減少症および顆粒球減少症を含むが、これらに限定されない）を診断または処置し得る。好ましい実施形態において、この融合ポリペプチドを使用して、患者が、正常血球レベルの減少を生じる後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）のような疾患を有するような状態において、骨髄移植と関連するような、造血集団の増加が所望されるような臨床的設定において、または、照射、化学処理または化学療法によって生じた形成不全または骨髄抑制の処置における血液細胞前駆体の分化を刺激し得る。
【００５２】
本発明の融合ポリペプチドは、単独、または別の薬学的に活性な薬剤（例えば、サイトカイン、神経栄養因子、インターロイキンなど）との組み合わせにおいて用いられ得る。好ましい実施形態において、融合ペプチドは、幹細胞または他の造血前駆体増殖を誘導することが公知の変数の因子、または造血経路において造血前駆体細胞に作用因子（造血成熟因子、トロンボポイエチン、幹細胞因子、エリスロポイエチン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦなどを含むが、これらに限定されない）とともに用いられ得る。
【００５３】
代替の実施形態において、ＴＩＥ−２レセプターアンタゴニスト融合ポリペプチドを用いて、（例えば、血小板血症、赤血球増加症および白血病のような骨髄増殖性障害または血液形成器官の他の増殖性障害の処置のために）所望の結果が造血経路の阻害であるような患者を診断または処置するために使用される。このような実施形態において、処置は、本明細書中に記載されるような治療的な有効量の融合ポリペプチドの使用を含み得る。
【００５４】
これらまたは他の疾患または障害の処置に対して有用な有効量は、当業者に公知の方法を用いて決定され得る（例えば、Ｆｉｎｇｌら、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、ＧｏｏｄｍａｎおよびＧｉｌｍａｎ編、Ｍａｃｍｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１−４６頁（１９７５）を参照のこと）。本発明に従って用いるための薬学的組成物は、キャリアまたは標的分子（例えば、抗体、ホルモン、増殖因子など）に連結され、および／またはインビボでの投与前にリポソーム、マイクロカプセル、および制御された放出調製物内に組み込まれた上記の融合ポリペプチドを、薬理学的に受容可能な液体、固体または半固体のキャリア中に含む。例えば、この薬学的組成物は、水溶液中（例えば、滅菌水、生理食塩水、リン酸緩衝液またはデキストロース溶液）に融合ポリペプチドを含み得る。あるいは、活性薬剤は、このような処置の必要な患者へ移植され得る固体（例えば、ろう）または半固体（例えば、ゼラチン性）処方物の投与物中に含まれ得る。投与経路は、当該分野において公知の任意の様式の投与であり得、以下を含むが、これらに限定されない：静脈内、髄膜下、皮下、関連組織内への注射によって、動脈内、鼻腔内、または移植装置を介して。
【００５５】
投与は、身体全体かまたは局所領域において、本発明の活性薬剤の分配を生じ得る。例えば、神経系から離れた領域を含むいくつかの状態において、薬剤の静脈内投与または髄膜内投与が所望され得る。いくつかの状態において、活性薬剤を含む移植物は、障害の領域に、または障害の領域のそばに置かれ得る。適切な移植物は、ゲル発泡体、ろう、または微粒子ベース移植物を含むが、これらに限定されない。
【００５６】
本発明はまた、薬理学的に受容可能なビヒクル中に、本明細書中に記載の融合ポリペプチドを含む薬学的組成物を提供する。組成物は、全身にまたは局所的に投与され得る。当該分野における投与の任意の適切な様式が用いられ、以下を含むが、これらに限定されない：静脈内、髄膜内、動脈内、美腔内、経口、皮下、腹腔内、または局所注射もしくは外科的移植物による。持続的放出処方物もまた、提供され得る。
【００５７】
本発明は、本発明の特定の実施形態によって範囲を限定されない。さらに、本明細書中に記載されるものに加えて、本発明の種々の改変は、前述の記載および添付の図から当業者に明らかとなる。このような改変は、添付する特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。
【００５８】
（実施例）
（アンギオポイエチンリガンド）
前述に記載されるように、Ａｎｇ−１およびＡｎｇ−２の変異体を用いる実験は、フィブリノーゲンドメイン（ＦＤ）がレセプター結合ドメインであること、および二量体化バージョン（二量体化は、隣接する分子のＦｃ成分の間の相互作用に起因して生じる）（例えば、Ａｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃ）が、単量体Ａｎｇ−１ＦＤよりも高い親和性でＴｉｅ−２レセプターと結合し得ることを実証した。しかし、Ａｎｇ−ＦＤ−Ｆｃは、ヤギ抗ヒトＦｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いてさらにクラスター化しない場合、内皮細胞上のＴｉｅ−２レセプターのリン酸化（活性化）を誘導し得ない。この理由のために、Ａｎｇ−１−ＦＤおよびＡｎｇ−２−ＦＤの変異体バージョンを、元来より高くクラスター化するように設計した。
【００５９】
２つの一般的な型の核酸分子を構築した。Ａｎｇ−１−ＦＤの２つの直列のコピーからなる第一の型を、Ｆｃタグに融合し、その結果、Ｆｃタグに関して二量体であるが、Ａｎｇ−１−ＦＤに関して四量体である分泌ポリペプチド分子を導いた。同様に、Ｆｃタグに融合されたＡｎｇ−２−ＦＤの２つの直列のコピーは、この型の構築物のアンギオポイエチン２を構成した。これらの分子は、それぞれＡｎｇ−１−ＦＤ−ＦＤ−ＦｃおよびＡｎｇ−２−ＦＤ−ＦＤ−Ｆｃであると称した。。
【００６０】
第二の型の構築された核酸分子において、２つのコピーのＡｎｇ−１−ＦＤを、これらの間を架橋するＦｃタグによって連結した。従って、Ｆｃに関してまだ二量体であり、ならびにＡｎｇ−１−ＦＤに関して四量体である構造物Ａｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤを作製した。アンギオポイエチン２もまた構築し、そしてこれらの２つの分子を、それぞれＡｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤおよびＡｎｇ−２−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤと称した。
【００６１】
いずれかの型の構築物について、類似の特性が観察された：内皮細胞においてＴｉｅ−２を活性化しない二量体化Ａｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃに似ず、Ａｎｇ−１−ＦＤ−ＦＤ−ＦｃおよびＡｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤの両方は、ネイティブなリガンドの能力に匹敵する能力を有して、内皮細胞において容易にＴｉｅ−２を活性化し得る。また、ネイティブなアンギオポイエチン２に類似して、Ａｎｇ−２−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤは、ネイティブなアンギオポイエチン２に匹敵する能力を有し、そしてＡｎｇ−２−ＦＤ−Ｆｃダイマーのわずかなアンタゴニスト活性よりもはるかに高い能力を有して、アンギオポイエチン１活性をアンタゴナイズし得る。
【００６２】
（変異体アンギオポイエチン核酸分子の構築）
以下の核酸分子の全てを、標準組換えＤＮＡ技術（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌ．Ａｓｓｏｃ．，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＮＹ））により構築し、ＡＢＩ３７３Ａ  ＤＮＡ配列決定機およびＴａｑ  Ｄｉｄｅｏｘｙ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いる標準技術により配列確認し、そしてタンパク質翻訳を促進する５’端にコザック配列（Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，１９８７、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：８１２５−８１４８）を有する哺乳動物発現ベクターｐＭＴ２１（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．）にサブクローニングした。下に記載される、ブリッジする配列を導入し、都合のよい制限部位を提供し、そしてドメインの間の接合部に可撓性を与えたが、（これらのいくつかの構築物におけるリンカーの長さを変動させると、産生されるタンパク質の量におけるいくつかの変動を導いたが）これらのブリッジする配列に非常に重要な特徴があるという徴候はない。
【００６３】
（実施例１：Ａｎｇ−１−ＦＤ−ＦＤ−Ｆｃ、Ａｎｇ−２−ＦＤ−ＦＤ−Ｆｃ、Ａｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤおよびＡｎｇ−２−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤ核酸分子の構築）
（Ａｎｇ−１−ＦＤ−ＦＤ−Ｆｃ）
Ａｎｇ−１−ＦＤ−ＦＤ−Ｆｃは、そのアミノ末端において、分泌を許容するトリプシンシグナル配列（図１Ａの塩基１〜４５）、引き続くアンギオポイエチン１フィブリノーゲンドメイン（ＦＤ）（図１Ａ〜図１Ｂの塩基４６〜６９０）、アミノ酸Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ（図１Ｂの塩基６９１〜７０２）からなる短いブリッジ配列、第二のアンギオポイエチン１  ＦＤ（図１Ｂ〜図１Ｄの塩基７０３〜１７５０）、アミノ酸Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（図１Ｄの塩基１３５１〜１３５９）からなる別のブリッジ配列、およびヒトＩｇＧ１のＦｃ部分のコード配列（図１Ｄ〜図１Ｅの塩基１３６０〜２０５８）からなる。
【００６４】
（Ａｎｇ−２−ＦＤ−ＦＤ−Ｆｃ）
Ａｎｇ−２−ＦＤ−ＦＤ−Ｆｃ核酸分子を、同様に構築した。これは、トリプシンシグナル配列（図２Ａの塩基１〜４５）、アンギオポイエチン２ＦＤ（図２Ａ〜図２Ｂの塩基４６〜６９０）、ブリッジアミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ（図２Ｂの塩基６９１〜７０５）、第二のアンギオポイエチン２  ＦＤ（図２Ｂ〜図２Ｄの塩基７０６〜１３５３）、別のブリッジアミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（図２Ｄの塩基１３５４〜１３６２）、およびヒトＩｇＧ１のＦｃ部分のコード配列（図２Ｄ〜図２Ｅの塩基１３６３〜２０６１）からなる。
【００６５】
（Ａｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤ）
Ａｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤは、トリプシンシグナル配列（図３Ａの塩基１〜４５）、アンギオポイエチン１  ＦＤ（図３Ａ〜図３Ｂの塩基４６〜６９０）、ブリッジアミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（図３Ｂの塩基６９１〜６９９）、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分のコード配列（図３Ｂ〜図３Ｄの塩基７００〜１３９５）、別のブリッジアミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ（図３Ｄの塩基１３９６〜１４１９）、および第二のアンギオポイエチン１  ＦＤ（図３Ｄ〜図３Ｅの塩基１４２０〜２０６７）からなる。
【００６６】
（Ａｎｇ−２−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤ）
Ａｎｇ−２−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤ核酸分子は、トリプシンシグナル配列（図４Ａの塩基１〜４５）、アンギオポイエチン２  ＦＤ（図４Ａ〜図４Ｂの塩基４６〜６９０）、ブリッジアミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（図４Ｂの塩基６９１〜７０２）、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分のコード配列（図４Ｂ〜図４Ｄの塩基７０３〜１３９８）、ブリッジアミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ（図４Ｄの塩基１３９９〜１４２２）、および第二のアンギオポイエチン２  ＦＤ（図４Ｄ〜図４Ｅの塩基１４２３〜２０６７）からなる。
【００６７】
（実施例２：Ａｎｇ−１  ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤタンパク質の特徴付け）
（分子量分析）：Ａｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤタンパク質について予測される分子量を、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ  Ｐｒｏｇｒａｍ（Ｋｏｄａｋ、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ、ＣＴ）を使用して決定した。単量体形態（Ｆｃに関して）は、７６，３４９の予測分子量を有する。さらに、約２５００ＭＷ／部位の、３つの予測されるＮ連結型グリコシル化部位が存在し、これらは潜在的に、単量体タンパク質の分子量を８３，８４９まで増加させ得る。隣接する分子のＦｃ成分間の相互作用に起因して、このタンパク質は実際に、１６７，６９８の予測される分子量（可能なＮ連結型グリコシル化を含む）を有する二量体として存在する。以下に記載される、ＣＯＳ細胞由来のタンパク質の続いてのＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析によって、これらのおおよその分子量を確認した。バンドは、非還元条件下で約２１０ｋＤに流れ、そしてバンドは、還元条件下で約８５ｋＤに流れた（図５）。光散乱分析を実施して、この分子量をさらに確認し、そしてより重要なことに、タンパク質が均一な種であるか否かを決定した。光散乱は、分子の質量および濃度の関数である。分子量を決定するために、タンパク質サンプルをゲル濾過カラムに注入し、そして溶出物をオンライン光散乱検出器ならびに屈折率および／またはＵＶ検出器を用いてモニタリングした。光散乱検出器は、ＭｉｎｉＤａｗｎレーザ光散乱検出器であり、Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ、ＣＡ）から入手した。この装置は、定常光（ｓｔａｔｉｃ  ｌｉｇｈｔ）を３つの異なる角度で測定する。オンラインの屈折率検出器またはＵＶ検出器は、タンパク質濃度を測定するよう働く。Ａｓｔｒａ  ４．７  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ、ＣＡ）を使用して、ｄｎ／ｄｃ（ｄｎ＝屈折率の変化；ｄｃ＝濃度）またはタンパク質の消衰係数のいずれかに基づいて、タンパク質濃度を算出した。次いで、タンパク質の分子量を、光散乱の角度依存から算出した。図６は、ＣＯＳ細胞由来のタンパク質を使用するこの分析の結果を示す。この二量体タンパク質の分子量は、約２００ｋＤであるようであり、そして単一のピークの存在は、このタンパク質溶液が、実際に均一であることを示す。
【００６８】
（ＣＯＳ細胞中での発現レベル）：組換えＡｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤタンパク質を含むＣＯＳ細胞上清を、ＣＯＳ細胞を上記のＡｎｇ１−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤ  ＤＮＡ構築物で過渡的にトランスフェクトすることによって、生成した。全てのトランスフェクションを、当該分野において公知の標準的な技術を使用して実施した。このＣＯＳ細胞上清を、Ｂｉａｃｏｒｅ技術（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｉｎｃ．）を使用して分析し、この上清に存在するＡｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤタンパク質の量を定量した。この分析の結果は、７６５のＲＵ値であり、これは、０．９ｍｇの組換えタンパク質／ＣＯＳ細胞上清のリットルに等価である。これらの値は、非常に高いレベルの発現を表す。
【００６９】
（ＣＯＳ上清の精製）：Ａｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤタンパク質はＦｃドメインを含むので、精製は、標準的なプロテインＡカラムクロマトグラフィー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｉｎｃ．）を使用し、続いて標準的なサイズ排除クロマトグラフィー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｉｎｃ．）を使用して、比較的簡単であり、そして容易である。実際に、Ａｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤタンパク質の精製が比較的容易であることにより、このタンパク質が由来する親タンパク質（アンギオポイエチン−１）、ならびにＡｎｇ１*と呼ばれるアンギオポイエチン−１の変異型（これは、コイルドコイルドメインに融合されたアンギオポイエチン−２のＮ末端およびアンギオポイエチン−１のフィブリノーゲンドメインからなり、そしてアミノ酸２４５においてＣｙｓ→Ｓｅｒ変異を有する）に対して顕著な利点が与えられる。（１９９８年２月１２日に、出願人Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ．の、ＷＯ９８／０５７７９として公開された、発明の名称「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＴＩＥ−２  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｌｉｇａｎｄｓ」のＰＣＴ国際出願（特に、図２７）を参照のこと。これを、本明細書中に参考として援用する）。
【００７０】
アンギオポイエチン−１およびＡｎｇ１*の両方は、広範で、高価であり労力の激しい精製スキームを要求し、その結果、組換えタンパク質の収率が比較的乏しくなる。臨床的な使用を意図される生物学物質のための費用効果的な、簡単な精製スキームに対する必要性は、過度に強調され得ない。
【００７１】
ＣＯＳ細胞上清を上述のように精製し、そして約１ｍｇの精製されたＡｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤタンパク質を得、これを以下に記載する研究に使用して、このタンパク質をさらに特徴付けた。
【００７２】
（ＣＯＳ細胞由来のＡｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤタンパク質のＮ末端配列決定）：精製したＡｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤタンパク質を、標準的なＮ末端配列決定分析に供して、このタンパク質のいずれかの短縮型種が生成されつつあるか否かを決定した。変異体分子（Ａｎｇ１*）が１０〜２０％のＮ末端短縮型種を含む履歴を有することから、このことを考慮した。この分析は、１つのＮ末端配列（Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｘ−Ａｌａ−Ａｓｐであり、ここでＸはＣｙｓである）のみを明らかにした。この配列はまた、図３Ａのアミノ酸１６〜２０において見出され得、そして図３Ａのアミノ酸１〜１５に対応するこのタンパク質のシグナル配列の直後に続く。
【００７３】
（ＣＯＳ細胞由来のＡｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤのレセプター結合分析）：以前の研究は、アンギオポイエチン分子のフィブリノーゲンドメイン（ＦＤ）がリガンド／レセプター相互作用に必須であることを決定した。さらに、Ｔｉｅ−２レセプターに対する高い親和性の結合が生じるために、ネイティブなアンギオポイエチン−１、アンギオポイエチン−２、および変異体Ａｎｇ１*が、少なくとも四量体の多量体、可能であればより高次の多量体を形成しなければならない。ＣＯＳ細胞由来のＡｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤタンパク質（これは、ＦＤドメインに関して四量体である）がＴｉｅ−２に対して高い親和性で結合し得るか否かを決定するために、標準的なＢｉａｃｏｒｅ分析を実施した。簡単に言えば、Ｔｉｅ−２−Ｆｃレセプター体タンパク質（これは、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインに融合するＴｉｅ−２の表面ドメインを含む、融合タンパク質である）を、Ｂｉａｃｏｒｅチップに固定した。Ａｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤを含有する溶液に、このチップを通過させ、そしてＴｉｅ−２表面ドメインとＡｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤとの間の結合を生じさせた。この結合工程に続いて、０．５Ｍ  ＮａＣｌ高塩（ｈｉｇｈ  ｓａｌｔ）洗浄を行った。この高塩洗浄は、Ａｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤタンパク質とＴｉｅ−２レセプター表面ドメインとの間の相互作用を破壊し得なかった。このことは、変異体リガンドとレセプターとの間に強力な相互作用が存在することを示す。この結果は、Ａｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤの両方の親分子であるアンギオポイエチン−１および変異体Ａｎｇ１*分子の両方が、Ｔｉｅ−２−Ｆｃレセプターと強力に相互作用することを示した、初期のＢｉａｃｏｒｅの結果、ならびにこの相互作用が高塩によって破壊されないことと一致する。対照的に、親アンギオポイエチン−１分子から誘導されるいくつかの変異体分子は、高塩で処理される場合、Ｔｉｅ−２−Ｆｃレセプターから容易に解離する。この変異体異分子（Ａｎｇ−１／ＦＤ（ＦＤに関する単量体）、Ａｎｇ−１／ＦＤ−Ｆｃ（同様にＦＤに関しては単量体であるが、Ｆｃドメインの存在により二量体を形成し得る）、およびＡｎｇ−１／Ｃ／ＦＤ（ＦＤに関しては単量体であるが、アンギオポイエチン−１のコイルドコイルドメインをもまた含む）と称する）は、Ｔｉｅ−２レセプターに高親和性で結合するに十分には、多量体形態に存在しない。
【００７４】
（実施例３：ＣＯＳ細胞由来のＡｎｇ−２−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤタンパク質の特徴付け）
（分子量分析）：上にＡｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤに関して記載したように、Ａｎｇ−２−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤタンパク質について予測される分子量を、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ  Ｐｒｏｇｒａｍ（Ｋｏｄａｋ、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ、ＣＴ）を使用して決定した。Ａｎｇ−２−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤの単量体形態は、７６，０５２の予測分子量を有し、単量体タンパク質の分子量を８３，５５２まで潜在的に増加させ得る３つの予測されるＮ連結型グリコシル化部位を有した。Ａｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤと同様に、このタンパク質は、１６７，１０４の予測される分子量（可能なＮ連結型グリコシル化を含む）を有する二量体として存在する。ＣＯＳ細胞由来のタンパク質のＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析は、非還元条件下で約２００ｋＤに流れるバンド、および還元条件下で約８８ｋＤに流れるバンドによって、これらのおおよその分子量を確認した（図７）。光散乱分析は、この分子量（１７１ｋＤ）を確認し、そしてＡｎｇ−２−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤタンパク質が、Ａｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤと同様に、均一な種として存在することを明らかにした（図８）。
【００７５】
（ＣＯＳ細胞中での発現レベル）：組換えＡｎｇ−２−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤタンパク質を含むＣＯＳ細胞上清を、ＣＯＳ細胞を上記のＡｎｇ−２−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤ  ＤＮＡ構築物で過渡的にトランスフェクトすることによって、生成した。このＣＯＳ細胞上清を、Ｂｉａｃｏｒｅによって分析し、この上清に存在するＡｎｇ−２−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤタンパク質の量を定量した。この分析の結果は、６０６のＲＵ値であり、これは、０．７ｍｇの組換えタンパク質／ＣＯＳ細胞上清のリットルに等価である。これらの値は、比較的高いレベルの発現を表す。
【００７６】
（ＣＯＳ上清の精製）：Ａｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤと同様に、Ａｎｇ−２−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤタンパク質はＦｃドメインを含むので、精製は比較的簡単であり、そして標準的なプロテインＡカラムクロマトグラフィーを使用し、続いて標準的なサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、容易である。ＣＯＳ細胞上清を、Ａｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤに関して上述のように精製し、そして約２ｍｇの精製したＡｎｇ−２−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤタンパク質を得、これを以下に記載する研究に使用して、このタンパク質をさらに特徴付けた。
【００７７】
（Ｎ末端配列決定）：精製したＣＯＳ細胞由来のＡｎｇ−２−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤタンパク質を、標準的なＮ末端配列決定分析に供して、このタンパク質のいずれかの短縮型種が生成したか否かを決定した。この分析は、１つのＮ末端配列（Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｘ−Ａｌａ−Ｇｌｕであり、ここでＸはＣｙｓである）のみを明らかにした。この配列はまた、図４Ａのアミノ酸１６〜２０において見出され得、そして図４Ａのアミノ酸１〜１５に対応するこのタンパク質のシグナル配列の直後に続く。
【００７８】
（ＣＯＳ細胞由来のタンパク質のレセプター結合分析）：ＣＯＳ細胞由来のＡｎｇ−２−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤタンパク質がＴｉｅ−２レセプターに対して高い親和性で結合し得るか否かを決定するために、Ａｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤに関して上述した標準的なＢｉａｃｏｒｅ分析を実施した。Ａｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤと同様に、高塩洗浄は、Ａｎｇ−２−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤタンパク質とＴｉｅ−２−Ｆｃレセプターとの間の相互作用を破壊し得なかった。このことは、再度、変異体リガンドとレセプターとの間に強力な相互作用が存在することを示す。
【００７９】
（実施例４：ＥＡｈｙ９２６細胞におけるＴｉｅ−２レセプターリン酸化に対する、ＣＯＳ細胞由来のＡｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤおよびＡｎｇ−２−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤの効果）
Ａｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤはアゴニストアンギオポイエチン−１由来の変異体分子であり、そしてＡｎｇ−２−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤはアゴニストアンギオポイエチン−２由来の変異体分子であるので、本発明者らは、これら２つの変異体分子が、これらが由来する親分子に関連する活性を維持するか否かを決定することを欲した。
【００８０】
（アッセイ系）：以下に記載する全ての実験は、細胞株ＥＡｈｙ９２６（Ｅｄｇｅｌｌ，Ｃ．Ｊ．ら（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：３７３４〜３７３７）および標準的なリン酸化アッセイ、ならびに当業者に馴染み深い試薬を使用した。
【００８１】
（（Ａ）ＥＡｈｙ９２６細胞における、Ａｎｇ１*媒介Ｔｉｅ−２レセプターリン酸化対Ａｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤ媒介Ｔｉｅ−２レセプターリン酸化）：Ｅａｈｙ９２６細胞を、０．１μｇ／ｍｌ、０．２μｇ／ｍｌ、または０．８μｇ／ｍｌの、Ａｎｇ１*またはＡｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤタンパク質のいずれかで、刺激した。標準的なリン酸化アッセイは、Ａｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤが、ＥＡｈｙ９２６細胞においてＴｉｅ−２レセプターのリン酸化を刺激するその能力がＡｎｇ１*と等価であることを明らかにした（図９）。
【００８２】
（（Ｂ）Ａｎｇ−２−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤがＥＡｈｙ９２６細胞においてＡｎｇ１*媒介Ｔｉｅ−２レセプターリン酸化をブロックする能力）：ＥＡｈｙ９２６細胞を、０．４μｇ／ｍｌのＴｉｅ−２アゴニストＡｎｇ１*および１μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、４μｇ／ｍｌ、６μｇ／ｍｌ、または８μｇ／ｍｌのＡｎｇ−２−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤで処理した。図１０に示すように、Ａｎｇ−２−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤは、Ａｎｇ１*の少なくとも１０〜１５倍のモル濃度過剰で存在する場合に、Ｔｉｅ−２レセプターのＡｎｇ１*刺激をブロックし得る。
【００８３】
（（Ｃ）アンギオポイエチン−２がＥＡｈｙ９２６細胞においてＡｎｇ１*媒介Ｔｉｅ−２レセプターリン酸化をブロックする能力）：天然に存在するアンタゴニストアンギオポイエチン−２のブロッキング効果を、Ａｎｇ−２−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤのブロッキング効果と比較するために、Ａｎｇ−２−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤの代わりにアンギオポイエチン−２を用いて、上記（Ｂ）に記載の同じ実験を実施した。この実験の結果を図１１に示す。２０倍モル濃度過剰において、アンギオポイエチン−２は、リン酸化レベルを５０％まで減少させなかった。この結果は、上記（Ｂ）において記載した結果と組み合わせて、Ａｎｇ−２−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤがアンギオポイエチン−２より強力なＡｎｇ１*媒介Ｔｉｅ−２レセプターリン酸化のインヒビターであることを示す。
【００８４】
（（Ｄ）Ａｎｇ−２−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤがＥＡｈｙ９２６細胞においてアンギオポイエチン−１媒介Ｔｉｅ−２レセプターリン酸化をブロックする能力）：ＥＡｈｙ９２６細胞を、０．２μｇ／ｍｌの天然に存在するＴｉｅ−２アゴニストアンギオポイエチン−１および１μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、４μｇ／ｍｌ、６μｇ／ｍｌ、または８μｇ／ｍｌのＡｎｇ−２−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤで処理した。この実験の結果を図１２に示す。この結果は、これらの細胞内においてＴｉｅ−２レセプターのアンギオポイエチン−１媒介リン酸化をブロックする傾向がある一方で、Ａｎｇ−２−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤは、図１０に示し、上記（Ｂ）に記載したような、Ｔｉｅ−２のＡｎｇ１*媒介リン酸化をブロックする際に、より効果的であるらしいことを示す。
【００８５】
（（Ｅ）アンギオポイエチン−２がＥＡｈｙ９２６細胞においてアンギオポイエチン−１媒介Ｔｉｅ−２レセプターリン酸化をブロックする能力）：ＥＡｈｙ９２６細胞を、０．２μｇ／ｍｌのアンギオポイエチン−１および１μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、４μｇ／ｍｌ、６μｇ／ｍｌ、または８μｇ／ｍｌのアンギオポイエチン−２で処理した。この実験の結果を図１３に示す。この結果は、これらの細胞におけるＴｉｅ−２レセプターのアンギオポイエチン−１媒介リン酸化をブロックする傾向があるが、Ａｎｇ−２−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤと同様に、アンギオポイエチン−２は、図１１に示し、上記（Ｃ）に記載したような、Ｔｉｅ−２のＡｎｇ１*媒介リン酸化をブロックする際に、より効果的であるらしいことを示す。
【００８６】
（実施例５：Ａｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤ  ＣＨＯ細胞発現ベクターｐＲＧ７６３／Ａｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤの構築）
ｐＲＧ７６３／Ａｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤ  ＣＨＯ細胞発現ベクターを、プラスミドｐＣＤＮＡ３．１／Ａｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤ（Ａｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤを含む２１１５塩基対ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩフラグメント）から単離し、このフラグメントをＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで消化したｐＲＧ７６３ベクターへと連結することによって、構築した。ｐＲＧ７６３／Ａｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤプラスミドを有するＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂ細胞の大規模（２Ｌ）培養物を、ＴＢ＋アンピシリン中で一晩増殖させ、そしてプラスミドＤＮＡを、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｗｉｚａｒｄ  Ｐｌｕｓ  Ｍａｘｉｐｒｅｐキットを使用して、製造業者のプロトコルに従って抽出した。精製したプラスミドＤＮＡの濃度を、ＵＶ分光光度計および蛍光計で決定した。このプラスミドＤＮＡを、ＮｃｏＩおよびＨｉｎｃＩＩ制限酵素を含むアリコートで消化することによって、立証した。全ての制限酵素消化フラグメントは、１％アガロースゲルにおいて予測したサイズに対応した。
【００８７】
（実施例６：ＣＨＯ細胞におけるＡｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤの発現）
４０個の１５ｃｍペトリ皿に、ＣＨＯ−Ｋ１／Ｅ１Ａ細胞を、４×１０6細胞／プレートの密度で接種した。プレート培地は、Ｇｉｂｃｏ  ＨａｍのＦ−１２ｗ／１０％Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）＋ペニシリン／ストレプトマイシンであり、グルタミンを補充した。翌日に、各プレートを６μｇのｐＲＧ７６３／Ａｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤで、Ｇｉｂｃｏ  ＯｐｔｉｍｅｍおよびＧｉｂｃｏ  Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを使用して、１２ｍｌの体積で、製造業者のプロトコルに従ってトランスフェクトした。このトランスフェクション混合物を細胞に添加した４時間後に、１２ｍｌ／プレートのＯｐｔｉｍｅｍ  ｗ／１０％ＦＢＳを添加した。プレートを、５％ＣＯ2インキュベーター内で一晩、３７℃でインキュベートした。翌日に、この培地を各プレートから除去し、そして２５ｍｌの発現培地（Ｇｉｂｃｏ  ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ  ＩＩ  ｗ／グルタミン＋１ｍＭ酪酸ナトリウム）を添加した。これらのプレートを、３７℃で３日間インキュベートした。インキュベーションの３日後に、この培地を各プレートから吸引し、そしてスインギングバケットローター内で４００ｒｐｍで遠心分離して、細胞をペレット化した。この上清を滅菌したの１Ｌビンにデカンテーションし、そして以下に記載のように精製した。
【００８８】
（実施例７：Ａｎｇ−２−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤ  ＣＨＯ細胞発現ベクターｐＲＧ７６３／Ａｎｇ−２−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤの構築）
プラスミドｐＲＧ７６３／Ａｎｇ−２−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤを、プラスミドｐＣＤＮＡ３．１／Ａｎｇ−２−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤ（Ａｎｇ−２−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤを含む２０９７塩基対ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩフラグメント）から単離し、このフラグメントをＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで消化したｐＲＧ７６３ベクターへと連結することによって、構築した。ｐＲＧ７６３／Ａｎｇ−２−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤプラスミドを有するＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂ細胞の大規模（１Ｌ）培養物を、ＴＢ＋アンピシリン中で一晩増殖させ、そしてプラスミドＤＮＡを、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｗｉｚａｒｄ  Ｐｌｕｓ  Ｍａｘｉｐｒｅｐキットを使用して、製造業者のプロトコルに従って抽出した。精製したプラスミドＤＮＡの濃度を、ＵＶ分光光度計および蛍光計で決定した。このプラスミドＤＮＡをまた、ＮｃｏＩおよびＰｐｕ１０Ｉ制限酵素を含むアリコートでこのプラスミドＤＮＡを消化することによって、立証した。全ての制限酵素消化フラグメントは、１％アガロースゲルにおいて予測したサイズに対応した。
【００８９】
（実施例８：ＣＨＯ細胞におけるＡｎｇ−２−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤの発現）
４０個の１５ｃｍペトリ皿に、ＣＨＯ−Ｋ１／Ｅ１Ａ細胞を、４×１０6細胞／プレートの密度で接種した。プレート培地は、Ｇｉｂｃｏ  ＨａｍのＦ−１２ｗ／１０％Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）＋ペニシリン／ストレプトマイシンであり、グルタミンを補充した。翌日に、各プレートを６μｇのｐＲＧ７６３／Ａｎｇ−２−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤで、Ｇｉｂｃｏ  ＯｐｔｉｍｅｍおよびＧｉｂｃｏ  Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを使用して、１２ｍｌの体積で、製造業者のプロトコルに従ってトランスフェクトした。このトランスフェクション混合物を細胞に添加した４時間後に、１２ｍｌ／プレートのＯｐｔｉｍｅｍ  ｗ／１０％ＦＢＳを添加した。プレートを、５％ＣＯ2インキュベーター内で一晩、３７℃でインキュベートした。翌日に、この培地を各プレートから除去し、そして２５ｍｌの発現培地（Ｇｉｂｃｏ  ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ  ＩＩ、グルタミン＋１ｍＭ酪酸ナトリウムを有する）を添加した。これらのプレートを、３７℃で３日間インキュベートした。インキュベーションの３日後に、この培地を各プレートから吸引し、そしてスインギングバケットローター内で４００ｒｐｍで遠心分離して、細胞をペレット化した。この上清を滅菌した１Ｌビンにデカンテーションし、そして以下に記載のように精製した。
【００９０】
（実施例９：安定なＣＨＯクローン由来のＡｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤタンパク質の特徴付け）
（分子量分析）：安定なＣＨＯクローン由来のＡｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤタンパク質について予測される分子量を、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ  Ｐｒｏｇｒａｍ（Ｋｏｄａｋ、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ、ＣＴ）を使用して決定した。単量体形態（Ｆｃに関して）は、７６，３４９の予測分子量を有した。さらに、約２５００ＭＷ／部位の、３つの予測されるＮ連結型グリコシル化部位が存在し、これらは潜在的に、この単量体タンパク質の分子量を８３，８４９まで増加させ得る。隣接する分子のＦｃ成分間の相互作用に起因して、このタンパク質は実際に、１６７，６９８の予測される分子量（可能なＮ連結型グリコシル化を含む）を有する二量体として存在する。続くＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析は、非還元条件下で約２１０ｋＤに流れるバンド、および還元条件下で約８５ｋＤに流れるバンドによって、これらのおおよその分子量を確認した。光散乱分析を実施して、この分子量をさらに確認し、そしてより重要なことに、タンパク質が均一な種であるか否かを決定した。光散乱は、分子の質量および濃度の関数である。分子量を決定するために、タンパク質サンプルをゲル濾過カラムに注入し、そして溶出物をオンライン光散乱検出器ならびに屈折率および／またはＵＶ検出器を用いてモニタリングした。光散乱検出器は、ＭｉｎｉＤａｗｎレーザ光散乱検出器であり、Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ、ＣＡ）から入手した。この装置は、定常光を３つの異なる角度で測定する。オンラインの屈折率検出器またはＵＶ検出器は、タンパク質濃度を測定するよう働く。Ａｓｔｒａ  ４．７  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ、ＣＡ）を使用して、ｄｎ／ｄｃ（ｄｎ＝屈折率の変化；ｄｃ＝濃度）またはタンパク質の消衰係数のいずれかに基づいて、タンパク質濃度を算出した。次いで、タンパク質の分子量を、光散乱の角度依存から算出した。この分析の結果は、この二量体タンパク質が約１７３．９ｋＤであるらしく、そして単一のピークの存在は、このタンパク質溶液が、均一であることを示す。
【００９１】
（安定なＣＨＯクローンにおけるＡｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤの発現レベル）：ＣＨＯ細胞を上記のＡｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤ  ＤＮＡ構築物で安定にトランスフェクトすることによって、組換えＡｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤタンパク質を含むＣＨＯ細胞上清を生成した。このＣＨＯ細胞上清を、捕捉抗体として抗ヒトＩｇＧ抗体、およびレポーター抗体としてアルカリホスファターゼに結合体化させた抗ヒトＩｇＧ抗体を使用する、標準的ＥＬＩＳＡによって分析し、その上清に存在するＡｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤタンパク質の量を定量した。この分析によって、２〜３ｐｇ／細胞／日の発現レベルが示された。
【００９２】
（安定なＣＨＯクローン上清由来のＡｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤタンパク質の精製）：Ａｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤタンパク質はＦｃドメインを含むので、精製は、標準的なＰｒｏｔｅｉｎ  Ａカラムクロマトグラフィー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｉｎｃ．）、その後の標準的なサイズ排除クロマトグラフィー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｉｎｃ．）を使用して、比較的単純かつ簡易である。そのＣＨＯ細胞上清を上記のように精製し、そしてその精製されたＡｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤタンパク質を下記の研究において使用して、このタンパク質をさらに特徴付けた。
【００９３】
（安定なＣＨＯクローン由来Ａｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤタンパク質のＮ末端配列決定）：精製されたＡｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤタンパク質を、Ｎ末端配列分析に供し、そのタンパク質の任意の短縮化種が生成されているか否かを決定した。この分析によって、ただ１つのＮ末端配列、Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｘ−Ａｌａ−Ａｓｐ（ここで、ＸはＣｙｓである）が示された。この配列は、図３Ａのアミノ酸１６〜２０に見出され、そして図３Ａのアミノ酸１〜１５に対応するこのタンパク質のシグナル配列の直後に続く。
【００９４】
（実施例１０：安定なＣＨＯクローン由来のＡｎｇ−２−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤタンパク質の特徴付け）
（分子量分析）：上記の安定なＣＨＯクローン由来Ａｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤについて記載されたように、安定なＣＨＯクローン由来Ａｎｇ−２−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤタンパク質の推定分子量を、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ  Ｐｒｏｇｒａｍ（Ｋｏｄａｋ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）を使用して決定した。Ａｎｇ−２−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤ
の単量体形態は、７６，０５２の推定分子量を有し、これは、３つの推定Ｎ結合型グリコシル化部位を有し、これらは、この単量体タンパク質の分子量を８３，５５２に潜在的に増加し得た。Ａｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤと同様に、このタンパク質は、１６７，１０４の推定分子量（可能なＮ結合型グリコシル化を含む）を有する二量体として存在する。ＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析によって、非還元条件下で約２００ｋＤａに泳動されるバンド、および還元条件下で約８５ｋＤａに泳動されるバンドにより、これらのおよその分子量が確認された。光散乱分析によって、この分子量（１７６．６ｋＤａ）が確認され、そして安定なＣＨＯクローン由来のＡｎｇ−２−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤタンパク質が、安定なＣＨＯクローン由来のＡｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤと同様に、均質種として存在することが示された。
【００９５】
（安定なＣＨＯクローン由来のＡｎｇ−２−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤの発現レベル）：ＣＨＯ細胞を上記のＡｎｇ−２−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤ  ＤＮＡ構築物で安定にトランスフェクトすることによって、組換えＡｎｇ−２−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤタンパク質を含むＣＨＯ細胞上清を生成した。このＣＨＯ細胞上清を、捕捉抗体として抗ヒトＩｇＧ抗体、およびレポーター抗体としてアルカリホスファターゼに結合体化させた抗ヒトＩｇＧ抗体を使用する、標準的ＥＬＩＳＡによって分析し、その上清に存在するＡｎｇ−２−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤタンパク質の量を定量した。この分析によって、約１〜２ｐｇ／細胞／日の発現レベルが示された。
【００９６】
（細胞上清からの安定なＣＨＯクローン由来のＡｎｇ−２−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤの精製）：Ａｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤと同様に、Ａｎｇ−２−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤタンパク質はＦｃドメインを含むので、精製は、標準的なＰｒｏｔｅｉｎ  Ａカラムクロマトグラフィー、その後の標準的なサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、比較的単純かつ簡易である。そのＣＨＯ細胞上清を、安定なＣＨＯクローン由来のＡｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤ（前出）について上記されるように精製し、そして、それを下記の研究において使用して、このタンパク質をさらに特徴付けた。
【００９７】
（安定なＣＨＯクローン由来Ａｎｇ−２−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤタンパク質のＮ末端配列決定）：精製された安定なＣＨＯクローン由来Ａｎｇ−２−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤタンパク質を、標準的なＮ末端配列分析に供し、そのタンパク質の任意の短縮化種が生成されているか否かを決定した。この分析によって、ただ１つのＮ末端配列、Ａｓｐ−Ｘ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ（ここで、ＸはＣｙｓである）が示された。この配列は、図４Ａのアミノ酸１７〜２１に見出され、そして図４Ａのアミノ酸１〜１５に対応するこのタンパク質のシグナル配列の直後に続く。
【００９８】
（実施例１１：ＥＡｈｙ９２６細胞におけるＴｉｅ−２レセプターリン酸化に対する、安定なＣＨＯクローン由来のＡｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤおよびＡｎｇ−２−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤの効果）
（アッセイ系）：下記の全ての実験は、細胞株ＥＡｈｙ９２６（Ｅｄｇｅｌｌ，Ｃ．Ｊ．ら（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：３７３４−３７３７）、ならびに当業者に精通された標準的なリン酸化アッセイおよび試薬を使用した。
【００９９】
（（Ａ）ＥＡｈｙ９２６細胞における、Ａｎｇ１*媒介Ｔｉｅ−２レセプターリン酸化  対  安定なＣＨＯクローン由来Ａｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤ媒介Ｔｉｅ−２レセプターリン酸化）：ＥＡｈｙ９２６細胞を、０．４μｇ／ｍｌのＡｎｇ１*、あるいは０．２μｇ／ｍｌまたは０．４μｇ／ｍｌの安定なＣＨＯクローン由来Ａｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤタンパク質で刺激した。標準的なリン酸化アッセイによって、安定なＣＨＯクローン由来Ａｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤが、ＥＡｈｙ９２６細胞におけるＴｉｅ−２レセプターのリン酸化を刺激する能力において、Ａｎｇ１*と等価であることが示された（図１７）。
【０１００】
（（Ｂ）安定なＣＨＯクローン由来Ａｎｇ−２−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤが、ＥＡｈｙ９２６細胞における安定なＣＨＯクローン由来Ａｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤ媒介Ｔｉｅ−２レセプターリン酸化をブロックする能力）：ＥＡｈｙ９２６細胞を、０．２μｇ／ｍｌのＴｉｅ−２アゴニストＡｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤ、および２μｇ／ｍｌ、４μｇ／ｍｌ、８μｇ／ｍｌまたは１６μｇ／ｍｌの安定なＣＨＯクローン由来Ａｎｇ−２−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤで処理した。図１８に示されるように、Ａｎｇ−２−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤは、それが、安定なＣＨＯクローン由来Ａｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤの少なくとも４０倍のモル濃度過剰で存在する場合に、Ｔｉｅ−２レセプターの安定なＣＨＯクローン由来Ａｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤ刺激をブロックし得る。
【０１０１】
（Ｅｐｈｒｉｎリガンド）
以前の実験（Ｄａｖｉｓら、１９９４、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６６：８１６−８１９；Ｇａｌｅら、１９９６、Ｎｅｕｒｏｎ  １７：９−１９、ＧａｌｅおよびＹａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ，１９９７，Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２９０：２２７−２４１）において、可溶性の、クラスター化されていないＥｐｈｒｉｎ−Ｂ１−ＦｃおよびＥｐｈｒｉｎ−Ｂ２−Ｆｃ（これらは、それらの各Ｆｃドメインで二量体化し、従ってＥｐｈｒｉｎ−Ｂ１外部ドメインまたはＥｐｈｒｉｎ−Ｂ２外部ドメインのいずれかに関する二量体である）は、ＥｐｈＢ２レセプターリン酸化を誘導しない。しかし、いずれかの分子を、抗Ｆｃ抗体で予めクラスター化することによって多量体化した場合、これらは、ＥｐｈＢ２レセプターについての強力なアゴニストとなる（これは、ＣＯＳ細胞レポーターアッセイにおいてＥｐｈＢ２レセプターのチロシンリン酸化によって判断される場合である）。Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ１およびＥｐｈｒｉｎ−Ｂ２の両方の多量体化は、レセプターリン酸化の誘導に必要であるようなので、本発明者らは、Ｆｃドメインに融合されたＥｐｈｒｉｎ−Ｂ１またはＥｐｈｒｉｎ−Ｂ２の外部ドメインのいずれかの直列反復に含まれる分子（これは、Ｆｃドメインに関して二量体であるが、Ｅｐｈｒｉｎ外部ドメインに関して四量体である）は、十分にクラスター化されて、レセプターリン酸化を誘導し得ることを理論付けた。この仮説を試験するために、以下のＤＮＡ構築物を構築し、組換えタンパク質を産生し、そしてレポーターアッセイを行った。
【０１０２】
（直列Ｅｐｈｒｉｎ外部ドメイン／Ｆｃドメイン核酸分子の構築）
以下の核酸分子の全てを、標準的な組換えＤＮＡ技術（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌ．Ａｓｓｏｃ．，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＹ）を参照のこと）によって構築し、ＡＢＩ  ３７３Ａ  ＤＮＡシーケンサーおよびＴａｑ  Ｄｉｄｅｏｘｙ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用する標準的技術によって配列を確認し、そして哺乳動物発現ｐＪＦＥ１４（Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ１−Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ１−Ｆｃ）または（ｐＭＴ２１（Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２−Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２−Ｆｃ）（各々、５’末端にタンパク質翻訳を促進するためのＫｏｚａｋ配列（Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，１９８７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：８１２５−８１４８）を有する）のいずれかにサブクローニングした。下記のブリッジ（ｂｒｉｄｇｉｎｇ）配列を、簡便な制限酵素部位を提供するため、およびドメイン間の結合部に可撓性を与えるために導入した。しかし、これらのブリッジ配列に対する非常に重要な性質が存在するということは示されない（ただし、これらの構築物のいくつかにおけるリンカーの長さを変化することは、産生されるタンパク質の量にいくらかの変化を導く）。
【０１０３】
（実施例１２：Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ１−Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ１−Ｆｃ核酸分子およびＥｐｈｒｉｎ−Ｂ２−Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２−Ｆｃ核酸分子の構築）
（（Ａ）Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ１−Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ１−Ｆｃ）：Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ１−Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ１−Ｆｃ  ＤＮＡ分子は、Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ１（Ｄａｖｉｓら、同書）の外部ドメインのコード配列（これは、図１４Ａ〜図１４Ｂのヌクレオチド１〜７１１に対応する）、それに続くアミノ酸Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙからなるブリッジ配列のコード配列（図１４Ｂのヌクレオチド７１２〜７２０）、それに続くＥｐｈｒｉｎ−Ｂ１の外部ドメインの第２のコピーのコード配列（これは、図１４Ｂ〜図１４Ｄのヌクレオチド７２１〜１３４４に対応する）からなり、ただし、このＥｐｈｒｉｎ−Ｂ１外部ドメインのコピーにおいては、シグナル配列は除去されている。この第２のコピーに、第２のＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙアミノ酸架橋（図１４Ｄのヌクレオチド１３４５〜１３５３）が続き、それにヒトＩｇＧ１のＦｃ部分のコード配列（図１４Ｄ〜図１４Ｅのヌクレオチド１３５４〜２０４９）が続く。
【０１０４】
（（Ｂ）Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２−Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２−Ｆｃ）：Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２−Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２−Ｆｃ  ＤＮＡ分子は、Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２（Ｂｅｒｇｅｍａｎｎら、１９９５、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１５：４８２１−４９２９）の外部ドメインのコード配列（これは、図１５Ａ〜図１５Ｂのヌクレオチド１〜６７５に対応する）、それに続くアミノ酸Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙからなるブリッジ配列のコード配列（図１５Ｂのヌクレオチド６７６〜６８４）、それに続くＥｐｈｒｉｎ−Ｂ２の外部ドメインの第２のコピーのコード配列（これは、図１５Ｂ〜図１５Ｄのヌクレオチド６８５〜１２７０に対応する）からなり、ただし、このコピーにおいては、シグナル配列は除去されている。この第２のコピーに、第２のＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙアミノ酸架橋（図１５Ｄのヌクレオチド１２７０〜１２７８）が続き、それにヒトＩｇＧ１のＦｃ部分のコード配列（図１５Ｄ〜図１５Ｅのヌクレオチド１２７９〜１９７７）が続く。
【０１０５】
上記アンギオポイエチン核酸分子と同様に、ブリッジ配列を、簡便な制限酵素部位を提供するため、およびドメイン間の結合部に可撓性を与えるために導入した。
【０１０６】
（実施例１３：ＣＯＳ細胞における直列Ｅｐｈｒｉｎ組換えタンパク質の発現）
ＣＯＳ細胞を、当該分野で公知の標準的なトランスフェクション技術を使用して、上記のＥｐｈｒｉｎ−Ｂ１−Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ１−Ｆｃ核酸分子またはＥｐｈｒｉｎ−Ｂ２−Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２−Ｆｃ核酸分子で一過的にトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後、増殖培地（１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、２ｍＭグルタミンおよび１０％ウシ血清を補充したＤＭＥＭ）を吸引し、無血清培地（１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、２ｍＭグルタミンを補充したＤＭＥＭ）で置き換えた。細胞を、さらに３日間増殖し、次いで組換えタンパク質を含む無血清培地を収集した。組換えタンパク質濃度を、ドットブロットを行い、そして標準曲線から得られたシグナルを比較することにより決定した。一旦、およそのタンパク質濃度を決定し、Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ１−Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ１−ＦｃおよびＥｐｈｒｉｎ−Ｂ２−Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２−Ｆｃ組換えタンパク質を、下記の細胞レポーターアッセイにおいて使用した。
【０１０７】
（実施例１４：ＣＯＳ細胞由来直列Ｅｐｈｒｉｎ外部ドメイン／Ｆｃドメイン組換えタンパク質の特徴付け）
（レポーターアッセイ）：ＥｐｈファミリーレセプターＥｐｈＢ２（Ｇａｌｅら、１９９６、Ｎｅｕｒｏｎ  １７：９−１９）を内因的に発現するＣＯＳ細胞を、Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ１−Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ１−ＦｃおよびＥｐｈｒｉｎ−Ｂ２−Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２−Ｆｃがレセプターリン酸化を誘導する能力を評価するために、レポーターアッセイにおいて使用した。このアッセイは、以前に記載（Ｄａｖｉｓら、同書；Ｇａｌｅら、同書）のように行った。手短に言うと、ＣＯＳ細胞を、上記の標準的な増殖培地中で８０〜９０％にコンフルエントにまで増殖させた。増殖後、培地を吸引し、そしてＥｐｈｒｉｎ−Ｂ１−Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ１−ＦｃまたはＥｐｈｒｉｎ−Ｂ２−Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２−Ｆｃ組換えタンパク質のいずれかでの処理の前に、１〜２時間無血清培地（上記）で置き換えた。細胞を、アフィニティー精製したヒトＩｇＧ１  Ｆｃ特異的ヤギ抗ヒト抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）を最終濃度１７μｇ／ｍｌで含むかまたは含まない、５００ｎｇ／ｍｌのＥｐｈｒｉｎ−Ｂ１−Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ１−ＦｃまたはＥｐｈｒｉｎ−Ｂ２−Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２−Ｆｃで３７℃で３０分間刺激した。この抗体は、Ｆｃタグ化融合体をクラスター化し得る。処置後、ＣＯＳ細胞を回収し、そして細胞溶解物を、ＤａｖｉｓらおよびＧａｌｅら（前出）に記載のように調製した。ＥｐｈＢ２レセプタータンパク質を、抗ＥｐｈＢ２抗血清（Ｈｅｎｋｅｍｅｙｅｒら、１９９４、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ９：１００１−１０１４）を使用して細胞溶解物から免疫沈降させた。免疫沈降物を、標準的なＳＤＳ  ＰＡＧＥによって分離し、そしてウェスタンブロット分析のためにＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に転写させた。膜を、抗ホスホチロシン抗体４Ｇ１０（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ，ＮＹ）または抗ＥｐｈＢ２抗体（Ｈｅｎｋｅｍｅｙｅｒら、同書）のいずれかでプローブし、上記実験条件における、ＥｐｈＢ２リン酸化の程度およびＥｐＨＢ２の相対量を決定した。
【０１０８】
（結果）：Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ１−Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ１−ＦｃおよびＥｐｈｒｉｎ−Ｂ２−Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２−Ｆｃは、ＣＯＳ細胞レポーターアッセイにおけるＥｐｈＢ２レセプターリン酸化を誘導するそれらの能力において、抗Ｆｃ抗体クラスター化Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ１−Ｆｃとほぼ同様に活性であることが示された。さらに、これらのタンパク質のいずれかが、ヤギ抗Ｆｃヒト抗体とさらにクラスター化された場合、これらは、ＥｐｈＢ２レセプターリン酸化を誘導するそれらの能力は、なおさらに強力になった。図１６は、このリン酸化アッセイの結果を示す。
【０１０９】
（実施例１５：Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２−Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２−ＦｃＣＨＯ発現ベクターの構築）
Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２−Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２−Ｆｃ  ＤＮＡ分子は、Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２（Ｂｅｒｇｅｍａｎｎら、１９９５、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１５：４８２１−４９２９）の外部ドメインのコード配列（これは、図１５Ａ〜図１５Ｂのヌクレオチド１〜６７５に対応する）、それに続くアミノ酸Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙからなるブリッジ配列のコード配列（図１５Ｂのヌクレオチド６７６〜６８４）、それに続くＥｐｈｒｉｎ−Ｂ２の外部ドメインの第２のコピーのコード配列（これは、図１５Ｂ〜図１５Ｄのヌクレオチド６８５〜１２７０に対応する）からなり、ただし、このコピーにおいては、シグナル配列は除去されている。この第２のコピーに、第２のＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙアミノ酸ブリッジ（図１５Ｄのヌクレオチド１２７０〜１２７８）が続き、それにヒトＩｇＧ１のＦｃ部分のコード配列（図１５Ｄ〜図１５Ｅのヌクレオチド１２７９〜１９７７）が続く。この分子を、発現ベクターｐＲＧ７６３のＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩポリリンカー部位にサブクローニングし、そしてｐＲＧ７６３−ｍ（Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２）２−Ｆｃを設計した。上記アンギオポイエチン核酸分子と同様に、ブリッジ配列を、簡便な制限酵素部位を提供するため、およびドメイン間の結合部に可撓性を与えるために導入した。
【０１１０】
（実施例１６：ＣＨＯ−Ｋ１（Ｅ１Ａ）細胞におけるＥｐｈｒｉｎ−Ｂ２−Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２−Ｆｃの発現）
４０個の１５ｃｍペトリ皿に、４×１０6細胞／プレートの密度でＣＨＯ−Ｋ１／Ｅ１Ａ細胞を播種した。プレート培地は、Ｇｉｂｃｏ  Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２ｗ／１０％Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）＋ペニシリン／ストレプトマイシンであり、そしてこれにグルタミンを補充した。翌日、各プレートを、１２ｍｌの容量のＧｉｂｃｏ  Ｏｐｔｉｍｅｎ  およびＧｉｂｃｏ  Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを製造業者のプロトコルに従って使用して、６μｇのｐＲＧ７６３−ｍ（Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２）２−Ｆｃでトランスフェクトした。細胞にトランスフェクション混合物を添加した４時間後、１２ｍｌ／プレートのＯｐｔｉｍｅｎ  ｗ／１０％  ＦＢＳを添加した。プレートを、５％  ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、培地を各プレートから除去し、そして２５ｍｌの発現培地（Ｇｉｂｃｏ  ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ  ＩＩ  ｗ／グルタミン＋１ｍＭ  酪酸ナトリウム）を添加した。プレートを、３７℃で３日間インキュベートした。インキュベーションの３日後、培地を各プレートから吸引し、スイングバケットローター中で４００ｒｐｍで遠心分離して、細胞をペレット化した。上清を滅菌１Ｌボトルにデカントし、そして上記のように精製した。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】  図１Ａ：Ａｎｇ−１−ＦＤ−ＦＤ−Ｆｃの核酸配列および推定アミノ酸配列。
【図１Ｂ】  図１Ｂ：Ａｎｇ−１−ＦＤ−ＦＤ−Ｆｃの核酸配列および推定アミノ酸配列。
【図１Ｃ】  図１Ｃ：Ａｎｇ−１−ＦＤ−ＦＤ−Ｆｃの核酸配列および推定アミノ酸配列。
【図１Ｄ】  図１Ｄ：Ａｎｇ−１−ＦＤ−ＦＤ−Ｆｃの核酸配列および推定アミノ酸配列。
【図１Ｅ】  図１Ｅ：Ａｎｇ−１−ＦＤ−ＦＤ−Ｆｃの核酸配列および推定アミノ酸配列。
【図２Ａ】  図２Ａ：Ａｎｇ−２−ＦＤ−ＦＤ−Ｆｃの核酸配列および推定アミノ酸配列。
【図２Ｂ】  図２Ｂ：Ａｎｇ−２−ＦＤ−ＦＤ−Ｆｃの核酸配列および推定アミノ酸配列。
【図２Ｃ】  図２Ｃ：Ａｎｇ−２−ＦＤ−ＦＤ−Ｆｃの核酸配列および推定アミノ酸配列。
【図２Ｄ】  図２Ｄ：Ａｎｇ−２−ＦＤ−ＦＤ−Ｆｃの核酸配列および推定アミノ酸配列。
【図２Ｅ】  図２Ｅ：Ａｎｇ−２−ＦＤ−ＦＤ−Ｆｃの核酸配列および推定アミノ酸配列。
【図３Ａ】  図３Ａ：Ａｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤの核酸配列および推定アミノ酸配列。
【図３Ｂ】  図３Ｂ：Ａｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤの核酸配列および推定アミノ酸配列。
【図３Ｃ】  図３Ｃ：Ａｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤの核酸配列および推定アミノ酸配列。
【図３Ｄ】  図３Ｄ：Ａｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤの核酸配列および推定アミノ酸配列。
【図３Ｅ】  図３Ｅ：Ａｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤの核酸配列および推定アミノ酸配列。
【図４Ａ】  図４Ａ：Ａｎｇ−２−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤの核酸配列および推定アミノ酸配列。
【図４Ｂ】  図４Ｂ：Ａｎｇ−２−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤの核酸配列および推定アミノ酸配列。
【図４Ｃ】  図４Ｃ：Ａｎｇ−２−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤの核酸配列および推定アミノ酸配列。
【図４Ｄ】  図４Ｄ：Ａｎｇ−２−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤの核酸配列および推定アミノ酸配列。
【図４Ｅ】  図４Ｅ：Ａｎｇ−２−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤの核酸配列および推定アミノ酸配列。
【図５】  Ａｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤタンパク質の分子量分析。非還元的条件下での約２１０ｋＤで泳動しているバンド（レーン３）および還元条件下で約８５ｋＤで泳動しているバンド（レーン７）を示すＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析。
【図６】  Ａｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤの分子量を確認するため、およびこのタンパク質が均質であるか否かを決定するための光散乱分析。光散乱は、高分子の質量および濃度の関数である。分子量を決定するため、このタンパク質サンプルをゲル濾過カラム上に注入し、そして溶出物をオンライン光散乱検出器および屈折率ならびに／またはＵＶ検出器でモニターする。このオンライン屈折率検出器またはＵＶ検出器を使用してタンパク質濃度を測定する。Ａｓｔｒａ４．７Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡ）を用いてタンパク質濃度を算出する。次いで、光散乱の角依存性からタンパク質の分子量を算出する。二量体タンパク質の分子量は、約２００ｋＤであるとみられ、そして単一ピークの存在は、このタンパク質溶液が均質であることを意味する。
【図７】  Ａｎｇ−２−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤの分子量分析。非還元的条件下での約２００ｋＤで泳動しているバンド（レーン７および８）および還元条件下で約８８ｋＤで泳動しているバンド（レーン３および４）を示すＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析
【図８】  Ａｎｇ−２−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤの分子量を確認するため、およびこのタンパク質が均質種であるか否かを決定するための光散乱分析。光散乱は、高分子の質量および濃度の関数である。分子量を決定するため、このタンパク質サンプルをゲル濾過カラム上に注入し、そして溶出物をオンライン光散乱検出器および屈折率ならびに／またはＵＶ検出器でモニターする。このオンライン屈折率検出器またはＵＶ検出器を使用してタンパク質濃度を測定する。Ａｓｔｒａ４．７Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡ）を用いてタンパク質濃度を算出する。次いで、光散乱の角依存性からタンパク質の分子量を算出する。二量体タンパク質の分子量は、約１７１ｋＤであるらしく、そして単一ピークの存在は、このタンパク質溶液が均質であることを意味する。
【図９】  ＥＡｈｙ９２６細胞中のＡｎｇ１*媒介Ｔｉｅ−２レセプターリン酸化、対Ａｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤ媒介Ｔｉｅ−２レセプターリン酸化。標準的なリン酸化アッセイにより、Ａｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤが、ＥＡｈｙ９２６中のＴｉｅ−２レセプターのリン酸化を刺激する能力において、Ａｎｇ１*と、等価であることが示された。
【図１０】  Ａｎｇ−２−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤが、ＥＡｈｙ９２６細胞中のＡｎｇ１*媒介Ｔｉｅ−２レセプターリン酸化をブロックする能力。標準的なリン酸化アッセイにおいて、Ａｎｇ−２−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤは、それがＡｎｇ１*の少なくとも１０〜１５倍モル過剰存在する場合、Ｔｉｅ−２レセプターのＡｎｇ１*刺激をブロックし得る。
【図１１】  アンギオポイエチン−２が、ＥＡｈｙ９２６細胞中のＡｎｇ１*媒介Ｔｉｅ−２レセプターリン酸化をブロックする能力。標準的なリン酸化アッセイにおいて、２０倍モル過剰で、アンギオポイエチン−２は、Ａｎｇ１*媒介リン酸化レベルを５０％に低下させ得ない。この結果は、図１０に記載の結果と組み合わせて、Ａｎｇ−２−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤが、Ａｎｇ１*媒介Ｔｉｅ−２レセプターリン酸化の、アンギオポイエチン−２よりも強力なインヒビターであることを意味する。
【図１２】  Ａｎｇ−２−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤが、ＥＡｈｙ９２６細胞中のＴｉｅ−２レセプターのアンギオポイエチン−１−媒介リン酸化をブロックする能力。標準的なリン酸化アッセイにおいて、これらの細胞中にＴｉｅ−２レセプターのアンギオポイエチン−１媒介リン酸化ブロックに向かう傾向が存在することが示されるが、Ａｎｇ−２−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤは、図１０に示されるように、Ｔｉｅ−２のＡｎｇ１*媒介リン酸化をブロックにおいてより効果的であるようである。
【図１３】  アンギオポイエチン−２が、ＥＡｈｙ９２６細胞中のＴｉｅ−２レセプターのアンギオポイエチン−１−媒介リン酸化をブロックする能力。標準的なリン酸化アッセイにおいて、これらの細胞中にＴｉｅ−２レセプターのアンギオポイエチン−１媒介リン酸化ブロックに向かう傾向が存在することが示されるが、Ａｎｇ−２−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤ同様、アンギオポイエチン−２は、図１１に示されるように、Ｔｉｅ−２のＡｎｇ１*媒介リン酸化をブロックにおいてより効果的であるようである。
【図１４Ａ】  Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ１−Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ１−Ｆｃの核酸配列および推定アミノ酸配列。
【図１４Ｂ】  Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ１−Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ１−Ｆｃの核酸配列および推定アミノ酸配列。
【図１４Ｃ】  Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ１−Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ１−Ｆｃの核酸配列および推定アミノ酸配列。
【図１４Ｄ】  Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ１−Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ１−Ｆｃの核酸配列および推定アミノ酸配列。
【図１４Ｅ】  Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ１−Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ１−Ｆｃの核酸配列および推定アミノ酸配列。
【図１５Ａ】  Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２−Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２−Ｆｃの核酸配列および推定アミノ酸配列。
【図１５Ｂ】  Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２−Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２−Ｆｃの核酸配列および推定アミノ酸配列。
【図１５Ｃ】  Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２−Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２−Ｆｃの核酸配列および推定アミノ酸配列。
【図１５Ｄ】  Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２−Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２−Ｆｃの核酸配列および推定アミノ酸配列。
【図１５Ｅ】  Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２−Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２−Ｆｃの核酸配列および推定アミノ酸配列。
【図１６】  標準的ＥｐｈＢ２リン酸化アッセイにおける、Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ１−Ｆｃ、Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ１−Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ１−Ｆｃ、Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２−Ｆｃ、およびＥｐｈｒｉｎ−Ｂ２−Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２−Ｆｃの比較。ＣＯＳ細胞を血清飢餓させ、次いで、未処理（ＵＴ）のまま残すか（レーン１）、または、非クラスター化Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ１−Ｆｃおよびクラスター化Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ１−Ｆｃ（Ｅｆｎ−Ｂ１）で処理した（レーン２および３）。ＣＯＳ細胞をまた、非クラスター化Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ１−Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ１−Ｆｃおよびクラスター化Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ１−Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ１−Ｆｃ（Ｅｆｎ−Ｂ１  ＤＤ）で処理した（レーン４および５）。さらに、細胞を、同様に非クラスター化Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２−Ｆｃおよびクラスター化Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２−Ｆｃ（Ｅｆｎ−Ｂ２）で処理し（レーン６および７）、そして非クラスターＥｐｈｒｉｎ−Ｂ２−Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２−Ｆｃおよびクラスター化Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２−Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２−Ｆｃ（Ｅｆｎ−Ｂ２  ＤＤ）で処理した（レーン８および９）。抗ホスホチロシンウエスタンブロッティングにより、ＥｐｈＢ２リン酸化の程度を、アッセイし（上部パネル）、そして抗ＥｐｈＢ２ウエスタンブロッティングにより、各レーンのＥｐｈＢ２の相対的な量を決定した（下部パネル）。
【図１７】  ＥＡｈｙ９２６細胞中のＡｎｇ１*媒介Ｔｉｅ−２レセプターリン酸化、対安定なＣＨＯクローン由来Ａｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤ媒介Ｔｉｅ−２レセプターリン酸化。ＥＡｈｙ９２６細胞を、０．４μｇ／ｍｌ  Ａｎｇ１*または０．２μｇ／ｍｌもしくは０．４μｇ／ｍｌの安定なＣＨＯクローン由来Ａｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤタンパク質で刺激した。標準的なリン酸化アッセイにより、ＣＨＯクローン由来Ａｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤが、ＥＡｈｙ９２６中のＴｉｅ−２レセプターのリン酸化を刺激する能力において、Ａｎｇ１*と、等価であることが示された。
【図１８】  安定なＣＨＯクローン由来Ａｎｇ−２−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤが、ＥＡｈｙ９２６細胞中の安定なＣＨＯクローン由来Ａｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤ媒介Ｔｉｅ−２レセプターリン酸化をブロックする能力。ＥＡｈｙ９２６細胞を、０．２μｇ／ｍｌのＴｉｅ−２アゴニストＡｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤおよび２μｇ／ｍｌ、４μｇ／ｍｌ、８μｇ／ｍｌもしくは１６μｇ／ｍｌの安定なＣＨＯクローン由来Ａｎｇ−２−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤで刺激した。Ａｎｇ−２−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤが、安定なＣＨＯクローン由来Ａｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤの少なくとも４０倍モル過剰で存在する場合、Ａｎｇ−２−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤは、Ｔｉｅ−２レセプターの安定なＣＨＯクローン由来Ａｎｇ−１−ＦＤ−Ｆｃ−ＦＤ刺激をブロックし得る。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
0004493854.tif 000008
【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
0004493854.tif 000013
【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
0004493854.tif 000037
【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
0004493854.tif 000039
【図１５Ｅ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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