(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜５、７および９〜３３ならびに配列番号４１〜４３で表される塩基配列から選ばれる塩基配列を有するＩｇＡ腎症関連ＤＮＡ。
【請求項２】
配列番号３〜５、７および９〜３３で表される塩基配列から選ばれる塩基配列中の連続した５〜６０塩基と同じ配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡ。
【請求項３】
ＤＮＡが、配列番号４７〜１０６で表される塩基配列から選ばれる塩基配列を有するＤＮＡである、請求項２記載のＤＮＡ。
【請求項４】
以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のＤＮＡを用いる、ＩｇＡ腎症関連遺伝子のｍＲＮＡを検出する方法。
（ａ）配列番号１〜３３および配列番号４１〜４３で表される塩基配列から選ばれる塩基配列を有するＩｇＡ腎症関連ＤＮＡまたは該ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
（ｂ）配列番号１〜３３で表される塩基配列から選ばれる塩基配列中の連続した５〜６０塩基と同じ配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号４５〜１０６で表される塩基配列から選ばれる塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡ
【請求項５】
以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のＤＮＡを含む、ＩｇＡ腎症診断薬。
（ａ）配列番号１〜３３および配列番号４１〜４３で表される塩基配列から選ばれる塩基配列を有するＩｇＡ腎症関連ＤＮＡまたは該ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
（ｂ）配列番号１〜３３で表される塩基配列から選ばれる塩基配列中の連続した５〜６０塩基と同じ配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号４５〜１０６で表される塩基配列から選ばれる塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡ
【請求項６】
以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡを用いる、ＩｇＡ腎症関連遺伝子の転写またはＩｇＡ腎症関連遺伝子のｍＲＮＡの翻訳を抑制する方法。
（ａ）配列番号１〜３３で表される塩基配列から選ばれる塩基配列中の連続した５〜６０塩基と同じ配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡ
（ｂ）配列番号４５〜１０６で表される塩基配列から選ばれる塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡ
【請求項７】
ディファレンシャル・ディスプレイ法を用い、ＩｇＡ腎症患者白血球より請求項１記載のＩｇＡ腎症関連ＤＮＡを取得する方法。
【請求項８】
配列番号３４〜３８および４０で表されるアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列を有する蛋白質、または該蛋白質の有するアミノ酸配列とは１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加したアミノ酸配列からなり、かつＩｇＡ腎症に関連する活性を有する蛋白質。
【請求項９】
請求項８記載の蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項１０】
請求項９記載のＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡ。
【請求項１１】
請求項１０記載の組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
【請求項１２】
請求項１１記載の形質転換体を培地に培養し、培養液中に請求項８記載の蛋白質を生成蓄積させ、該培養物から該蛋白質を採取することを特徴とする蛋白質の製造方法。
【請求項１３】
請求項８記載の蛋白質を認識する抗体。
【請求項１４】
配列番号３４〜４０で表されるアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列を有する蛋白質、または該蛋白質の有するアミノ酸配列とは１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加したアミノ酸配列からなり、かつＩｇＡ腎症に関連する活性を有する蛋白質の免疫学的検出方法であって、当該蛋白質を認識する抗体を用いる、前記方法。
【請求項１５】
配列番号３４〜４０で表されるアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列を有する蛋白質、または該蛋白質の有するアミノ酸配列とは１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加したアミノ酸配列からなり、かつＩｇＡ腎症に関連する活性を有する蛋白質を認識する抗体を含有する、ＩｇＡ腎症の診断薬。
【請求項１６】
以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のＤＮＡおよび診断に許容される担体からなる組成物。
（ａ）配列番号１〜３３および配列番号４１〜４３で表される塩基配列から選ばれる塩基配列を有するＩｇＡ腎症関連ＤＮＡまたは該ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
（ｂ）配列番号１〜３３で表される塩基配列から選ばれる塩基配列中の連続した５〜６０塩基と同じ配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号４５〜１０６で表される塩基配列から選ばれる塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡ
【請求項１７】
配列番号３４〜４０で表されるアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列を有する蛋白質、または該蛋白質の有するアミノ酸配列とは１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加したアミノ酸配列からなり、かつＩｇＡ腎症に関連する活性を有する蛋白質を認識する抗体および診断に許容される担体からなる組成物。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、健常人の白血球と比較してＩｇＡ腎症患者の白血球で発現が変動する新規ＤＮＡ、該ＤＮＡの取得方法、該ＤＮＡによりコードされる新規蛋白質、該蛋白質を認識する抗体、該蛋白質および該ＤＮＡの検出方法、ならびにＩｇＡ腎症の診断および治療法に関する。
背景技術
ＩｇＡ腎症とは、血中由来と考えられるＩｇＡ免疫複合体が腎臓の糸球体内に沈着することを特徴とする慢性糸球体腎炎である。日本では原発性腎疾患の３０％以上を占め、単一の腎疾患としては最も多く、そのうちの１５〜３０％は予後不良で腎不全へ移行する。しかしながら、ＩｇＡ腎症の疾患の原因はまだ不明であるため、根本的な治療法はない。また、ＩｇＡ腎症の確定診断は、腎臓の一部を生検し、メサンギウムにおけるＩｇＡ免疫複合体の沈着を免疫学的染色により確認する方法であるため、患者への負担は大きい。
約５０％のＩｇＡ腎症の患者において血中ＩｇＡの値が高いことが報告されている［ディジージズ・オブ・ザ・キドニー（Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｋｉｄｎｅｙ）第５版（１９９３）、ネフロン（Ｎｅｐｈｒｏｎ），２９，１７０（１９８１）］。血液中のＩｇＡの産生はＢ細胞が、その産生の制御はＴ細胞が担っているといわれており、また、ＩｇＡ患者の末梢Ｔ細胞において、サイトカインであるインターロイキン４、インターロイキン５、インターロイキン６あるいはＴＧＦ−β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−β）の産生が健常人に比べて高いという報告［クリニカル・アンド・エクスペリメンタル・イムノロジー（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ＆  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｏｎｌｏｇｙ），１０３，１２５（１９９６）、キドニー・インターナショナル（Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ），４６，８６２（１９９４）〕、末梢リンパ球において、インテグリンであるＶＬＡ（ｖｅｒｙ  ｌａｔｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）−４およびＶＬＡ−５がより強く活性化しているという報告〔ネフロロジー、ダイアリシス、トランスプランテーション（Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ，Ｄｉａｌｙｓｉｓ，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ），１０，１３４２（１９９５）〕がなされている。これらのことから、ＩｇＡ腎症は免疫系の異常によりＩｇＡの産生が過剰となり、血液中のＩｇＡ免疫複合体が糸球体に沈着し、それによる補体系の活性化等が糸球体の障害に影響を及ぼしていると考えられているが、ＩｇＡ腎症の原因についての報告はこれまでのところない。
発明の開示
ＩｇＡ腎症の疾患原因の解明、治療あるいは患者に負担のかからない診断が望まれている。
ＩｇＡ腎症に関与する新規ＤＮＡ、該ＤＮＡの取得方法、ＩｇＡ腎症に関与する新規蛋白質、該蛋白質の製造方法、該蛋白質を認識する抗体、および該蛋白質あるいは上記ＤＮＡ、蛋白質、抗体を用いた治療薬・診断薬が望まれている。
本発明はこれらの課題に対し有用である。
本発明は、以下（１）〜（２１）に関する。
（１）配列番号１〜３３および配列番号４１〜４４で表される塩基配列から選ばれる塩基配列を有するＩｇＡ腎症関連ＤＮＡまたは該ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
（２）配列番号１〜３３で表される塩基配列から選ばれる塩基配列中の連続した５〜６０残基と同じ配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡ。
（３）配列番号４５〜１０６で表される塩基配列から選ばれる塩基配列を有するＤＮＡ。
（４）上記（１）、（２）または（３）のＤＮＡを用いる、ＩｇＡ腎症関連遺伝子のｍＲＮＡを検出する方法。
（５）上記（１）、（２）または（３）のＤＮＡを含む、ＩｇＡ腎症診断薬。
（６）上記（２）または（３）のＤＮＡを用いる、ＩｇＡ腎症関連遺伝子の転写またはＩｇＡ腎症関連遺伝子のｍＲＮＡの翻訳を抑制する方法。
（７）上記（２）または（３）のＤＮＡを含む、ＩｇＡ腎症治療薬。
（８）ディファレンシャル・ディスプレイ法を用い、ＩｇＡ腎症患者白血球よりＩｇＡ腎症関連ＤＮＡを取得する方法。
（９）配列番号３４〜４０で表されるアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列を有する蛋白質、または該蛋白質の有するアミノ酸配列とは１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加したアミノ酸配列からなり、かつＩｇＡ腎症に関連する活性を有する蛋白質。
（１０）上記（９）の蛋白質をコードするＤＮＡ。
（１１）上記（１０）のＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡ。
（１２）上記（１１）の組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
（１３）上記（１２）の形質転換体を培地に培養し、培養物中に上記（９）の蛋白質を生成蓄積させ、該培養物から該蛋白質を採取することを特徴とする蛋白質の製造方法。
（１４）上記（９）の蛋白質を認識する抗体。
（１５）上記（１４）の抗体を用いる、上記（９）の蛋白質の免疫学的検出方法。
（１６）上記（１４）の抗体を含有する、ＩｇＡ腎症の診断薬。
（１７）上記（１４）の抗体を含有する、ＩｇＡ腎症の治療薬。
（１８）上記（１）、（２）または（３）のＤＮＡおよび診断に許容される担体からなる組成物。
（１９）上記（１）または（３）のＤＮＡおよび薬理学的に許容される担体からなる組成物。
（２０）上記（１４）の抗体および診断に許容される担体からなる組成物。
（２１）上記（１４）の抗体および薬理学的に許容される担体からなる組成物。
本発明のＤＮＡはＩｇＡ腎症関連ＤＮＡであり、例えば、配列番号１〜３３および配列番号４１〜４４で表される塩基配列から選ばれる塩基配列を有するＤＮＡ、および、該ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡをあげることができる。
配列番号１〜３３および配列番号４１〜４４で表される塩基配列から選ばれる塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとは、配列番号１〜３３および配列番号４１〜４４で表される塩基配列から選ばれる塩基配列を有するＤＮＡをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０Ｍの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１５ｍＭ  クエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。
ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）（以下、モレキュラー・クローニング  第２版と略す）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９５）等に記載されている方法に準じて行うことができる。ハイブリダイズ可能なＤＮＡとして具体的には、配列番号１〜３３および配列番号４１〜４４で表される塩基配列から選ばれる塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは８０％以上の相同性を有するＤＮＡ、更に好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。
更に、本発明のＤＮＡとして、ＩｇＡ腎症関連ＤＮＡの一部の配列を有するオリゴヌクレオチドおよびアンチセンス・オリゴヌクレオチドも含まれる。
該オリゴヌクレオチドとして、例えば、配列番号１〜３３および配列番号４１〜４４で表される塩基配列から選ばれる塩基配列中の連続した５〜６０残基、好ましくは１０〜５０残基の塩基配列と同じ配列を有するオリゴヌクレオチドをあげることができ、アンチセンス・オリゴヌクレオチドとして、例えば、該オリゴヌクレオチドのアンチセンス・オリゴヌクレオチドをあげることができる。該オリゴヌクレオチドとして、例えば、配列番号４５〜１０６で表される塩基配列から選ばれる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをあげることができる。
本発明の蛋白質として、ＩｇＡ腎症に関連する活性を有する蛋白質をあげることができ、具体的には、配列番号３４〜４０で表されるアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列を有する蛋白質、または該蛋白質の有するアミノ酸配列とは１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加したアミノ酸配列からなり、かつＩｇＡ腎症に関連する活性を有する蛋白質をあげることができる。
配列番号３４〜４０で表されるアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列を有する蛋白質のアミノ酸配列とは１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加したアミノ酸配列からなり、かつＩｇＡ腎症に関連する活性を有する蛋白質は、モレキュラー・クローニング  第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）等に記載の方法に準じて調製することができる。欠失、置換もしくは付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、１個から数十個、特に１個から数個のアミノ酸であることが好ましい。また、本発明のポリペプチドがＩｇＡ腎症に関連する活性を有するためには、配列番号３４〜４０で表されるアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列を有する蛋白質のアミノ酸配列と少なくとも６０％以上、通常は８０％以上、特に９５％以上の相同性を有していることが好ましい。
本発明の抗体は、上述の蛋白質を認識する抗体をあげることができる。
以下、本発明を詳細に説明する。
１．ＩｇＡ腎症関連ＤＮＡの調製
ＩｇＡ腎症患者および健常人の白血球におけるｍＲＮＡの発現量の差異に注目し、ディファレンシャル・ディスプレイ法〔ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，３５１，２３１（１９９４）〕を利用し、ＩｇＡ腎症関連ＤＮＡを取得する。即ち、細胞から抽出した全ＲＮＡあるいはｍＲＮＡと、各種プライマーとを用い、ポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）を行い、健常人の白血球に比べＩｇＡ腎症患者の白血球で、その発現量が顕著に増加あるいは減少する新規な遺伝子（以降ＩｇＡ腎症関連遺伝子と呼ぶ）のｃＤＮＡ増幅断片を取得する。
以下、該方法について述べる。
ＩｇＡ腎症患者の白血球および健常人の白血球から全ＲＮＡあるいはｍＲＮＡを調製する。
全ＲＮＡを調製する方法としては、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法〔Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４，３（１９８７）〕等をあげることができる。
全ＲＮＡからポリ（Ａ）＋ＲＮＡを調製する方法としては、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法（モレキュラー・クローニング  第２版）等をあげることができる。
更に、ファースト・トラック・ｍＲＮＡ・アイソレーション・キット〔Ｆａｓｔ  Ｔｒａｃｋ  ｍＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ；インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ）社製〕、クイック・プレップ・ｍＲＮＡ・ピュリフィケーション・キット（Ｑｕｉｃｋ  Ｐｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ；ファルマシア社製）等のキットを用いてｍＲＮＡを調製することもできる。
ＩｇＡ腎症患者の白血球および健常人の白血球から上記方法により抽出したＲＮＡから、アンカープライマーを用いて常法によりｃＤＮＡを合成し、該ｃＤＮＡに対して５’末端を蛍光標識したアンカープライマーと任意のプライマーを用いてＰＣＲを行い、ｃＤＮＡを増幅する。
アンカープライマーとは、ｍＲＮＡの３’末端ポリＡ配列に会合する、オリゴｄＴ配列の３’末端に、チミジンを除くアデニン、グアニンあるいはシトシンのオリゴヌクレオチドを付加したプライマーであり、パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）社製のＤＮＡ合成機モデル（ｍｏｄｅｌ）３９２等を用いて合成することができる。
任意のプライマーとしては、多種類のｃＤＮＡの配列に対して増幅し、かつ一度の反応で多数のＤＮＡ増幅断片を得ることができるオリゴヌクレオチドのことであり、オペロン・テクノロジーズ（Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社製のＯＰＤ−１〜２０、ＯＰＥ−１〜２０、ＯＰＶ−１〜２０等をあげることができる。任意プライマーは１０塩基程度の長さのものが好ましい。
ＰＣＲにより増幅された上記各々のＤＮＡを、ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、それぞれについて、得られたバンドの蛍光量をフルオロイメージャー（モレキュラー・ダイナミックス社製）を用いて測定する。
各々のバンドの蛍光量を比較し、ＩｇＡ腎症患者および健常人とで蛍光量の変動しているバンドの位置に相当する領域のゲルを切り出し、ゲルに含まれるＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅する。
該増幅ＤＮＡ断片をそのままあるいはＤＮＡポリメラーゼで末端を平滑化後、常法によりベクターに組み込み、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，５４６３（１９７７）〕あるいは３７３Ａ・ＤＮＡシークエンサー〔Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製〕等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定する。
該増幅ＤＮＡ断片を組み込むベクターとしては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、ｐＤＩＲＥＣＴ〔Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１８，６０６９（１９９０）〕、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ  ＡｍｐＳＫ（＋）〔Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５，６２６４（１９９２）〕、ｐＴ７Ｂｌｕｅ〔Ｎｏｖａｇｅｎ社製〕、ｐＣＲＩＩ〔インビトロジェン社製、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，６５７（１９９１）〕、ｐＣＲ−ＴＲＡＰ〔Ｇｅｎｅｈｕｎｔｅｒ社製〕、ｐＮｏＴＡＴ７（５’→３’社製）などをあげることができる。
このようにして決定された塩基配列の新規性は、ｂｌａｓｔ等の相同性検索プログラムを用いて、ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬおよびＤＤＢＪなどの塩基配列データベースを検索することにより、データベース中の塩基配列と一致すると考えられるような明らかな相同性を示す塩基配列がないことにより確認できる。
このようにして得られた、ＩｇＡ腎症関連遺伝子のｃＤＮＡの部分ＤＮＡ断片として、例えば、配列番号８〜３３および配列番号４１〜４４で表される塩基配列を有するＤＮＡ等をあげることができる。
上述の方法で得られたＤＮＡが、ＩｇＡ腎症関連ｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡの部分ＤＮＡ断片であった場合には、上述の方法で得られたＤＮＡを用いて、下記（１）または（２）の方法によりｃＤＮＡ全長を得ることができる。
（１）ｃＤＮＡライブラリーの利用
上記ＤＮＡ断片をプローブとして、各種ｃＤＮＡライブラリーを用いたハイブリダイゼーションによるスクリーニングを行うことにより、ｃＤＮＡ全長を得ることができる。
以下にｃＤＮＡライブラリーの作製法について述べる。
ｃＤＮＡライブラリー作製法としては、モレキュラー・クローニング  第２版やカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）等に記載された方法、あるいは市販のキット、例えばスーパースクリプト・プラスミド・システム・フォー・ｃＤＮＡ・シンセシス・アンド・プラスミド・クローニング〔ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社製〕やザップーｃＤＮＡ・シンセシス・キット〔ＺＡＰ−ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ、ストラタジーン社製〕を用いる方法などがあげられる。更に、市販のｃＤＮＡライブラリー、例えばＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製のヒト白血球ｃＤＮＡライブラリー等を利用することもできる。
ｃＤＮＡライブラリーを作成するためのクローニングベクターとしては、大腸菌Ｋ１２株中で自立複製できるものであれば、ファージベクター、プラスミッドベクター等いずれでも使用できる。具体的には、ＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ〔Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５，５８（１９９２）〕、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）〔Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７，９４９４（１９８９）］、λ  ｚａｐ  ＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、λｇｔ１０、λ  ｇｔ１１〔ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，１，４９（１９８５）〕、λ  ＴｒｉｐｌＥｘ（クローンテック社製）、λ  ＢｌｕｅＭｉｄ（クローンテック社製）、λＥｘＣｅｌｌ（ファルマシア社製）、ｐＴ７Ｔ３１８Ｕ（ファルマシア社製）、ｐｃＤ２〔Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，３，２８０（１９８３）〕、ｐＵＣ１８〔Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）〕等をあげることができる。
ｃＤＮＡを組み込んだベクターを導入する大腸菌としては、大腸菌に属する微生物であればいずれでも用いることができる。具体的には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ〔Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５，８１（１９９２）〕、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｃ６００〔Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、３９，４４０（１９５４）〕、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｙ１０８８〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２，７７８（１９８３）〕、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｙ１０９０〔Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２２，７７８（１９８３）〕、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＮＭ５２２〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６（１９８３）〕、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｋ８０２〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６，１１８（１９６６）〕、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＪＭ１０５〔Ｇｅｎｅ，３８，２７５（１９８５）〕等を用いることができる。
ｃＤＮＡライブラリーからのｃＤＮＡクローンの選択としては、アイソトープあるいはジゴキシゲニン（ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ）標識したプローブを用いたコロニー・ハイブリダイゼーション法あるいはプラーク・ハイブリダイゼーション法（モレキュラー・クローニング  第２版）により選択することができる。
選択されたクローンより常法により目的とするＤＮＡを取得することができる。
（２）上述の方法によりｍＲＮＡよりｃＤＮＡを合成し、該ｃＤＮＡの両端にアダプターを付加し、このアダプターの塩基配列と増幅断片の塩基配列に基づいたプライマーでＰＣＲを行う５’−ＲＡＣＥ（ｒａｐｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｅｎｄｓ）および３’−ＲＡＣＥ〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，８９９８（１９８８）〕により目的とするＤＮＡを取得することができる。
これらの方法により取得されたＤＮＡの塩基配列は、上述の塩基配列の決定法により決定することができる。該配列の新規性に関しても上述の方法により確認することができる。
上記のようにして取得された、新規な塩基配列を有するＩｇＡ腎症関連全長ＤＮＡとして、例えば、配列番号１〜７で表される塩基配列を有するＤＮＡ等をあげることができる。
以上のようにして、一旦ＩｇＡ腎症関連全長ＤＮＡが取得されその塩基配列が決定された後は、塩基配列に基づいたプライマーを調製し、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡあるいはｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、ＰＣＲ法（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）〕により目的とするＤＮＡを取得することができる。また、決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、ＤＮＡ合成機で化学合成することにより目的とするＤＮＡを調製することもできる。ＤＮＡ合成機としては、フォスフォアミダイト法を利用したパーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）社製のＤＮＡ合成機モデル（ｍｏｄｅｌ）３９２等をあげることができる。
上述の方法で取得した本発明のＤＮＡおよびＤＮＡ断片を用いて、モレキュラー・クローニング第２版等に記載の常法により、あるいは該ＤＮＡの塩基配列情報よりＤＮＡ合成機により、ＩｇＡ腎症関連ＤＮＡの一部の配列を有するオリゴヌクレオチドおよびアンチセンス・オリゴヌクレオチドを調製することができる。
該オリゴヌクレオチドとしては、上記ＤＮＡの有する塩基配列中の連続した５〜６０塩基と同じ配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡをあげることができ、具体的には、配列番号１〜７で表される塩基配列中の連続した５〜６０塩基と同じ配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡをあげることができる。
センスプライマーおよびアンチセンスプライマーとして用いる場合には、両者の融解温度（Ｔｍ）および塩基数が極端に変わることのない上記記載のオリゴヌクレオチドが好ましい。具体的には、配列番号４５〜１０６等に示された塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをあげることができる。
更に、これらオリゴヌクレオチドの誘導体（以下、誘導体オリゴヌクレオチドという）も本発明のオリゴヌクレオチドとして利用することができる。
該誘導体オリゴヌクレオチドとしては、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスフォロチオエート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスフォアミデート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合がペプチド核酸結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、あるいはオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチド等をあげることができる〔細胞工学，１６，１４６３（１９９７）〕。
２．ＩｇＡ腎症に関連する活性を有する蛋白質の製造
１．に記載の方法により取得したＩｇＡ腎症関全長ＤＮＡは、ＩｇＡ腎症に関連する活性を有する蛋白質（以下、ＩｇＡ腎症関連蛋白質と呼ぶ）をコードしている。
本発明のＩｇＡ腎症関連蛋白質は、モレキュラー・クローニング第２版やカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された方法等を用い、例えば以下の方法により、上記ＩｇＡ腎症関連遺伝子を宿主細胞中で発現させて、製造することができる。
全長ｃＤＮＡをもとに、必要に応じて、該蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片（以下、ＩｇＡ腎症蛋白質コードＤＮＡと呼ぶ）を調製する。
また、必要に応じて、本発明の蛋白質をコードする部分の塩基配列を、宿主細胞の発現に最適なコドンとなるように塩基を置換したＤＮＡを調製する。該ＤＮＡは本発明の蛋白質の効率的製造に有用である。
該ＤＮＡ断片、あるいは全長ｃＤＮＡを発現ベクター内のプロモーターの下流に挿入することにより、該蛋白質の発現プラスミドを造成する。
宿主細胞としては、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込みが可能で、ＩｇＡ腎症蛋白質コードＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
細菌等を宿主細胞として用いる場合は、ＩｇＡ腎症蛋白質コードＤＮＡ発現ベクターは該細菌中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、ＩｇＡ腎症蛋白質コードＤＮＡおよび転写終結配列より構成された組換えベクターであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
発現ベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもベーリンガーマンハイム社より市販）、ｐＫＫ２３３−２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＳＥ２８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ｐＱＥ−８（ＱＩＡＧＥＮ社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４）〕、ｐＬＳＡｌ〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）〕、ｐＧＥＬｌ〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）〕、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、ｐＴｒｓ３０〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０７）より調製〕、ｐＴｒｓ３２〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０８）より調製〕、ｐＧＨＡ２〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＩＧＨＡ２（ＦＥＲＭ  Ｂ−４００）より調製、特開昭６０−２２１０９１〕、ｐＧＫＡ２〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＩＧＫＡ２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７９８）より調製、特開昭６０−２２１０９１〕、ｐＴｅｒｍ２（ＵＳ４６８６１９１、ＵＳ４９３９０９４、ＵＳ５１６０７３５）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＥＧ４００〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，，１７２，２３９２（１９９０）〕、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＥＴシステム（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）等を例示することができる。
プロモーターとしては、宿主細胞中で機能するものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐ  ｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐ  ｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、Ｔ７プロモーター等の大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等をあげることができる。またＰ  ｔｒｐを２つ直列させたプロモーター（Ｐ  ｔｒｐ  ｘ２）、ｔｒｃプロモーター、ｌｅｔＩプロモーター〔Ｇｅｎｃ，４４，２９（１９８６）〕、ｌａｃＴ７プロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
本発明のＩｇＡ腎症関連遺伝子の発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、好適には構造遺伝子直下に転写終結配列を配置することが望ましい。
宿主細胞としては、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、シュードモナス属等に属する微生物、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＫＹ３２７６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｎｏ．４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＮＹ４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＧＩ６９８、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＴＢ１、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｎｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｃｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６６、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６７、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１３８７０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１５３５４、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｃｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．Ｄ−０１１０等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．６９，２１１０（１９７２）〕、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４）、またはＧｅｎｅ、１７，１０７（１９８２）やＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８，１１１（１９７９）に記載の方法等をあげることができる。
酵母を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等を例示することができる。
プロモーターとしては、酵母中で発現できるものであればいかなるものでもよく、例えば、ヘキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターｇａｌ  １プロモーター、ｇａｌ  １０プロモーター、ヒートショック蛋白質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ  １プロモーター等をあげることができる。
宿主細胞としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ属、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｃａｎｄｉｄａ属等に属する微生物、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕｖｉｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０〕、スフェロプラスト法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）〕、酢酸リチウム法〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３）〕、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）記載の方法等をあげることができる。
動物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＭ８（フナコシ社製）、ｐＡＧＥ１０７〔特開平３−２２９７９；Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３，（１９９０）〕、ｐＡＳ３−３（特開平２−２２７０７５）、ｐＣＤＭ８〔Ｎａｔｕｒｅ，３２９，８４０，（１９８７）〕、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＡＧＥ１０３〔Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７）〕、ｐＡＧＥ２１０等を例示することができる。
プロモーターとしては、動物細胞中で機能するものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ヒトＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等をあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
宿主細胞としては、ヒトの細胞であるナマルバ（Ｎａｍａｌｗａ）細胞、サルの細胞であるＣＯＳ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）等をあげることができる。
動物細胞への組換えベクターの導入法としては、動物細胞にＤＮＡを導入できるいかなる方法も用いることができ、例えば、エレクトロポーレーション法〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）〕、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）〕、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３）に記載の方法等を用いることができる。形質転換体の取得および培養は、特開平２−２２７０７５号公報あるいは特開平２−２５７８９１号公報に記載されている方法に準じて行なうことができる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばバキュロウイルス・エクスプレッション・ベクターズ，ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７（１９８８）等に記載された方法によって、蛋白質を発現することができる。
即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、蛋白質を発現させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（ともにインビトロジェン社製）等をあげることができる。
バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）等を用いることができる。
昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１〔バキュロウイルス・エクスプレッション・ベクターズ、ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、ダブリュー・エイチ・フリーマン・アンド・カンパニー（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、（１９９２）〕、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵巣細胞であるＨｉｇｈ５（インビトロジェン社製）等を用いることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）〕等をあげることができる。
植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベクター等をあげることができる。
プロモーターとしては、植物細胞中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、イネアクチン１プロモーター等をあげることができる。
宿主細胞としては、タバコ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、ダイズ、アブラナ、アルファルファ、イネ、コムギ、オオムギ等の植物細胞等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（特開昭５９−１４０８８５、特開昭６０−７００８０、ＷＯ９４／００９７７）、エレクトロポレーション法（特開昭６０−２５１８８７）、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（特許第２６０６８５６、特許第２５１７８１３）等をあげることができる。
遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合蛋白質発現等を行うことができる。
酵母、動物細胞、昆虫細胞または植物細胞により発現させた場合には、糖あるいは糖鎖が付加された蛋白質を得ることができる。
上記で取得された本発明の形質転換体を培地に培養し、培養物中にＩｇＡ腎症関連蛋白質を生成蓄積させ、該培養物より該蛋白質を採取することにより、ＩｇＡ腎症関連蛋白質を製造することができる。
本発明のＩｇＡ腎症関連蛋白質製造用の形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
本発明の形質転換体が大腸菌等の原核生物、酵母等の真核生物である場合、これら形質転換体を培養する培地は、該形質転換体が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれでもよい。
炭素源としては、該形質転換体が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩、その他含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等を用いることができる。
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常１６時間〜７日間である。培養中ｐＨは、３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。
また培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸（ＩＡＡ）等を培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地〔Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７）〕、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）〕、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８．３９６（１９５９）〕、１９９培地〔Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．７３，１（１９５０）〕またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、５％ＣＯ２存在下等の条件下で１〜７日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地〔Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製〕、Ｓｆ−９００ＩＩ  ＳＦＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ＥｘＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５〔いずれもＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製〕、Ｇｒａｃｅ’ｓ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｅｄｉｕｍ〔Ｎａｔｕｒｅ，１９５，７８８（１９６２）〕等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６〜７、２５〜３０℃等の条件下で、１〜５日間行う。
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
植物細胞を宿主として得られた形質転換体は、細胞として、または植物の細胞や器官に分化させて培養することができる。該形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ（ＭＳ）培地、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）培地、またはこれら培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ５〜９、２０〜４０℃の条件下で３〜６０日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
上記のとおり、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ベクターを保有する微生物、動物細胞、あるいは植物細胞由来の形質転換体を、通常の培養方法に従って培養し、該蛋白質を生成蓄積させ、該培養物より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を製造することができる。
遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合蛋白質発現等を行うことができる。
本発明の蛋白質の生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞や、生産させる蛋白質の構造を変えることにより、該方法を選択することができる。
本発明の蛋白質が宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，，２６４，１７６１９（１９８９）〕、ロウらの方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）〕、または特開平０５−３３６９６３、特開平０６−８２３０２１等に記載の方法を準用することにより、該蛋白質を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
即ち、遺伝子組換えの手法を用いて、本発明の蛋白質の活性部位を含む蛋白質の手前にシグナルペプチドを付加した形で発現させることにより、本発明の蛋白質を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
また、特開平２−２２７０７５に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
さらに、遺伝子導入した動物または植物の細胞を再分化させることにより、遺伝子が導入された動物個体（トランスジェニック非ヒト動物）または植物個体（トランスジェニック植物）を造成し、これらの個体を用いて本発明の蛋白質を製造することもできる。
形質転換体が動物個体または植物個体の場合は、通常の方法に従って、飼育または栽培し、該蛋白質を生成蓄積させ、該動物個体または植物個体より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を製造することができる。
動物個体を用いて本発明の蛋白質を製造する方法としては、例えば公知の方法〔Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，６３，６３９Ｓ（１９９６）、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，６３，６２７Ｓ（１９９６）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．９．８３０（１９９１）〕に準じて遺伝子を導入して造成した動物中に本発明の蛋白質を生産する方法があげられる。
動物個体の場合は、例えば、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡを導入したトランスジェニック非ヒト動物を飼育し、該蛋白質を該動物中に生成・蓄積させ、該動物中より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を製造することができる。該動物中の生成・蓄積場所としては、例えば、該動物のミルク（特開昭６３−３０９１９２）、卵等をあげることができる。この際に用いられるプロモーターとしては、動物で発現できるものであればいずれも用いることができるが、例えば、乳腺細胞特異的なプロモーターであるαカゼインプロモーター、βカゼインプロモーター、βラクトグロブリンプロモーター、ホエー酸性プロテインプロモーター等が好適に用いられる。
植物個体を用いて本発明の蛋白質を製造する方法としては、例えば本発明の蛋白質をコードするＤＮＡを導入したトランスジェニック植物を公知の方法〔組織培養，２０（１９９４）、組織培養，２１（１９９５）、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５，４５（１９９７）〕に準じて栽培し、該蛋白質を該植物中に生成・蓄積させ、該植物中より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を生産する方法があげられる。
本発明の形質転換体により製造された本発明のＩｇＡ腎症に関連する活性を有する蛋白質を単離精製するためには、通常の酵素の単離精製法を用いることができる。
例えば、本発明の蛋白質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰＡ−７５（三菱化成社製）等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（ファルマシア社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
また、該蛋白質が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、細胞を回収後、破砕し、遠心分離することにより、沈殿画分として蛋白質の不溶体を回収する。
回収した該蛋白質の不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。
該可溶化液を、希釈あるいは透析し、該可溶化液中の蛋白質変性剤の濃度を下げることにより、該蛋白質の構造を正常な立体構造に戻す。該操作の後、上記と同様の単離精製法により該蛋白質の精製標品を得ることができる。
本発明の蛋白質あるいはその糖修飾体等の誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清から、該蛋白質あるいはその糖鎖付加体等の誘導体を回収することができる。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により培養上清を回収し、該培養上清から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
このようにして取得される蛋白質として、例えば、配列番号３４〜４０に表されるアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列を有する蛋白質をあげることができる。
また、上記方法により発現させた蛋白質を、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、桑和貿易（米国Ａｄｖａｎｃｅｄ  ｃｈｅｍ  Ｔｅｃｈ社製）、パーキンエルマージャバン（米国Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製）、ファルマシアバイオテク（スウューデンＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）、アロカ（米国Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製）、クラボウ（米国Ｓｙｎｔｈｅｃｅｌｌ−Ｖｅｇａ社製）、日本パーセプティブ・リミテッド（米国ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ社製）、島津製作所等のペプチド合成機を利用し合成することもできる。
３．本発明の蛋白質を認識する抗体の調製
（１）抗原の調製
上記２．の方法により取得した蛋白質の全長または部分断片精製標品、あるいは本発明の蛋白質の一部のアミノ酸配列を有するペプチドを抗原として用いる。
抗原用部分ペプチドとしては、５〜３０残基程度の蛋白質部分配列が選択される。変性していない天然の構造を有している状態の該蛋白質を認識する抗体を取得するためには、立体構造上蛋白質の表面に存在している部分配列を抗原ペプチドとして選択することが好ましい。立体構造上蛋白質表面に存在する部分は、ＫｙｔｅとＤｏｏｌｉｔｔｌｅの方法〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），１５７，１０５−１３２（１９８２）〕などにより、親水性の高い部分配列を予測することで推測することができる。即ち、一般的に親水性の低い部分は立体構造上蛋白質の内部に存在する場合が多く、親水性の高い部分は蛋白質表面に存在する場合が多いためである。また、蛋白質のＮ末端、Ｃ末端は蛋白質表面に存在する場合が多い。しかしながら、このように選択した部分ペプチドが目的通りの抗体を確立する抗原となるとは限らない。
部分ペプチドを抗原として用いる場合には、末端にシステインを付加することにより、他の蛋白質と架橋することができる。蛋白質の内部配列を選択した場合には、必要に応じペプチドのＮ末端はアセチル化、Ｃ末端はアミド化する。
部分ペプチドは一般的な液相、固相ペプチド合成法およびそれらを適宜組み合わせる方法、またはそれらに準じる方法によって合成することができる〔Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．３５，１６１−２１４（１９９０）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２８９，（１９９７）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３５，（１９９４）〕。
また、自動ペプチド合成機を用いることもできる。ペプチド合成機によるペプチドの合成は、島津製作所製ペプチド合成機、アドバンスト・ケムテック社  （Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ  Ｉｎｃ．，ＵＳＡ、以後ＡＣＴ社と略称する）製ペプチド合成機等の市販のペプチド合成機上で、適当に側鎖を保護したＮａ−Ｆｍｏｃ−アミノ酸あるいはＮａ−Ｂｏｃ−アミノ酸等を用い、それぞれの合成プログラムに従って実施することができる。原料となる保護アミノ酸および担体樹脂は、ＡＢＩ社、島津製作所、国産化学（株）、ノバビオケム社（ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ）、渡辺化学（株）、ＡＣＴ社、アナスペック社（ＡｎａＳｐｅｃ  Ｉｎｃ．）、またはペプチド研究所（株）等から入手することができる。
（２）動物の免疫と抗体の調製
（ｉ）ポリクローナル抗体の作製
上記の方法により取得した抗原を動物に投与することによりポリクローナル抗体を作製することができる。
投与する動物として、ウサギ、ヤギ、ラット、マウス、ハムスター等を用いることができる。
該抗原の投与量は動物１匹当たり５０〜１００μｇが好ましい。
免疫は、動物の皮下あるいは静脈内あるいは腹腔内に、適当なアジュバント〔例えば、フロインドの完全アジュバント（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  Ａｄｊｕｖａｎｔ）や水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチンなど〕とともに抗原を投与することにより行う。抗原が部分ペプチドである場合には、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）やＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）などのキャリア蛋白質とコンジュゲートを作製し、これを免疫原として用いる。
抗原の投与は、１回目の投与の後１〜２週間おきに３〜１０回行う。各投与後３〜７日目に眼底静脈叢より採血し、その血清が抗原と反応することを酵素免疫測定法〔Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８〕等で確認する。
免疫に用いた抗原に対し、その血清が充分な抗体価を示した非ヒト哺乳動物より血清を取得し、該血清を分離、精製することによりポリクローナル抗体を取得することができる。
分離、精製する方法としては、遠心分離、４０〜５０％飽和硫酸アンモニウムによる塩析、カプリル酸沈殿〔Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８８）〕、またはＤＥＡＥ−セファロースカラム、陰イオン交換カラム、プロテインＡまたはＧ−カラムあるいはゲル濾過カラム等を用いるクロマトグラフィー等を、単独または組み合わせて処理する方法があげられる。
（ｉｉ）モノクローナル抗体の作製
モノクローナル抗体は、該抗体産生細胞と非ヒトほ乳動物由来の骨髄腫細胞とを融合させてハイブリドーマを作製し、該ハイブリドーマを培養するか、動物に投与して該動物を腹水癌化させ、該培養液または腹水を分離、精製することにより調製することができる。
抗体産生細胞としては、脾細胞、リンパ節、末梢血中の抗体産生細胞、特に脾細胞が好適に用いられる。
以下、脾細胞を用いるモノクローナル抗体の作製法について詳述するが、他の抗体産生細胞についても同様の方法で実施することができる。
該抗体価を示したラットに抗原物質を最終投与した後３〜７目目に、脾臓を摘出する。
該脾臓をＭＥＭ培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を捨てる。
得られた沈殿画分の脾細胞をトリス−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６５）で１〜２分間処理し赤血球を除去した後、ＭＥＭ培地で３回洗浄し、得られた脾細胞を抗体産生細胞として用いる。
（ｂ）骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスまたはラットから取得した株化細胞を使用する。例えば、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１（以下、Ｐ３−Ｕ１と略す）〔Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８１，１（１９７８）、Ｅｕｒｏｐ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６，５１１（１９７６）〕、ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ−２）〔Ｎａｔｕｒｅ，２７６，２６９（１９７８）〕、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３（６５３）〔Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２３，１５４８（１９７９）〕、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）〔Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５（１９７５）〕等を用いることができる。これらの細胞株は、８−アザグアニン培地〔ＲＰＭＩ−１６４０培地にグルタミン（１．５ｍＭ）、２−メルカプトエタノール（５×１０−５Ｍ）、ジェンタマイシン（１０μｇ／ｍｌ）および牛胎児血清（ＦＣＳ）（ＣＳＬ社製、１０％）を加えた培地（以下、正常培地という）に、さらに８−アザグアニン（１５μｇ／ｍｌ）を加えた培地〕で継代するが、細胞融合の３〜４日前に正常培地で培養し、融合には該細胞を２×１０７個以上用いる。
（ｃ）ハイブリドーマの作製
（ａ）で取得した抗体産生細胞と（ｂ）で取得した骨髄腫細胞をＭＥＭ培地またはＰＢＳ（リン酸二ナトリウム１．８３ｇ、リン酸一カリウム０．２１ｇ、食塩７．６５ｇ、蒸留水１リットル、ｐＨ７．２）でよく洗浄し、細胞数が、杭体産生細胞：骨髄腫細胞＝５〜１０：１になるよう混合し、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を捨てる。
得られた沈澱画分の細胞群をよくほぐし、該細胞群に、攪拌しながら、３７℃で、１０８抗体産生細胞あたり、ポリエチレングライコール−１０００（ＰＥＧ−１０００）２ｇ、ＭＥＭ２ｍｌおよびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）０．７ｍｌを混合した溶液を０．２〜１ｍｌ添加し、さらに１〜２分間毎にＭＥＭ培地１〜２ｍｌを数回添加する。
添加後、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍｌになるように調製する。該調製液を９００ｒｐｍで５分間遠心分離後、上清を捨てる。得られた沈殿画分の細胞を、ゆるやかにほぐした後、メスピペットによる吸込み、吹出しでゆるやかにＨＡＴ培地〔正常培地にヒポキサンチン（１０−４Ｍ）、チミジン（１．５×１０−５Ｍ）およびアミノプテリン（４×１０−７Ｍ）を加えた培地〕１００ｍｌ中に懸濁する。
該懸濁液を９６穴培養用プレートに１００μｌ／穴ずつ分注し、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で７〜１４日間培養する。
培養後、培養上清の一部をとりアンチボディイズ〔Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １４（１９８８）〕等に述べられている酵素免疫測定法により、本発明の蛋白質の部分断片蛋白質に特異的に反応するハイブリドーマを選択する。
酵素免疫測定法の具体的例として、以下の方法をあげることができる。
免疫の際に用いた抗原を９６穴のＥＩＡ用プレートに１〜５０μｇ／ｍｌで１０〜１００μｌ／穴ずつ分注し、４℃で一晩放置してプレートにコートする。
放置後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液（以下、ＢＳＡ−ＰＢＳと略す）を１００〜２００μｌ／穴分注し、室温１〜２時間または、４℃で１〜２晩放置して、プレート上に残った蛋白質との結合残基をブロック（ブロッキング）する。
ブロッキング後、ＢＳＡ−ＰＢＳを捨て、ＰＢＳでプレートをよく洗浄する。
被免疫動物血清、抗血清より精製して得られたポリクローナル抗体、ハイブリドーマ培養上清もしくは後述の（ｄ）で得られる精製抗体を第一抗体として用い、該抗体１〜１０μｇ／ｍｌを該プレートに２０〜１００μｌ／穴分注し、室温で２〜３時間または、４℃で一晩放置する。
ＰＢＳまたは、ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎで、よく洗浄した後、第二抗体としてビオチン、酵素、化学発光物質あるいは放射線化合物等で標識した抗イムノグロブリン抗体１〜５０μｇ／ｍｌを５０〜１００μｌ／穴ずつ分注し、室温１〜２時間反応させる。
ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎでよく洗浄した後、第二抗体の標識物質に応じた反応を行なう。
該反応により、本発明の蛋白質に特異的に反応するものを本発明のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマとして選択する。
該ハイブリドーマを用いて、限界希釈法によりクローニングを２回繰り返し〔１回目は、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノブテリンを除いた培地）、２回目は、正常培地を使用する〕、安定して強い抗体価の認められたものを本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ株として選択する。
（ｄ）モノクローナル抗体の調製
プリスタン処理〔２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ）０．５ｍｌを腹腔内投与し、２週間飼育する〕した８〜１０週令のマウスまたはヌードマウスに、（ｃ）で取得した本発明の蛋白質モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞５〜２０×１０６細胞／匹を腹腔内に注射する。１０〜２１日間でハイブリドーマは腹水癌化する。
該腹水癌化したマウスから腹水を採取し、３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して固形分を除去する。
得られた上清より、ポリクローナルで用いた方法と同様の方法でモノクローナル抗体を精製、取得することができる。
抗体のサブクラスの決定は、マウスモノクローナル抗体タイピングキットまたはラットモノクローナル抗体タイピングキットを用いて行う。蛋白質量は、ローリー法あるいは２８０ｎｍでの吸光度より算出する。
４．ＩｇＡ腎症関連の、ＤＮＡ、蛋白質または抗体の利用
（１）１．記載のＤＮＡを用い、ノーザン・ハイブリダイゼーション法（モレキュラー・クローニング  第２版）、ＰＣＲ法〔ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）〕、ＲＴ（ｒｅｖｅｒｓｅ−ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ）−ＰＣＲ法等により、本発明のＩｇＡ腎症関連遺伝子のｍＲＮＡを検出することができる。特にＲＴ−ＰＣＲ法は簡便であり、ＩｇＡ腎症の診断に利用することができる。
例えば、検出したいｍＲＮＡに対応する１．記載のＤＮＡを一組のオリゴヌクレオチドプライマーとして用い、ＰＣＲを行い、増幅断片を検出することによりＩｇＡ腎症を診断する方法をあげることができる。この場合、増幅させる塩基配列部分としてはｍＲＮＡのいかなる塩基配列領域でもよいが、塩基配列の長さが５０ｂｐから２ｋｂｐであり、反復配列あるいはＧＣ（グアニン・シトシン）塩基に富む配列を含まない塩基配列領域が好ましい。
（２）１．記載のアンチセンス・オリゴヌクレオチド（ＲＮＡ／ＤＮＡ）を用いて〔化学、４６，６８１（１９９１）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，３５８（１９９２）〕、ＤＮＡの転写もしくはｍＲＮＡの翻訳を抑制することにより、ＩｇＡ腎症の治療に利用することができる。
この場合に使用する、１．記載のアンチセンス・オリゴヌクレオチド（ＲＮＡ／ＤＮＡ）として、例えば、２．記載の蛋白質をコードするＤＮＡの一部の塩基配列、好ましくは翻訳開始領域にある１０〜５０塩基配列を有するアンチセンス・オリゴヌクレオチドをあげることができる。
（３）１．記載のＤＮＡを用い、２．記載の方法により本発明のＩｇＡ関連蛋白質を取得することができる。
（４）２．記載の蛋白質を抗原として用い、３．記載の方法により抗体を製造することができる。
（５）３．記載の抗体を用いて、ＩｇＡ腎症関連蛋白質を免疫学的に検出または定量することができる。
免疫学的に検出する方法として、マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法等をあげることができる。
免疫学的に定量する方法としては、液相中で本発明の蛋白質と反応する抗体のうちエピトープが異なる２種類のモノクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法、１２５Ｉ等の放射性同位体で標識した本発明の蛋白質と本発明の蛋白質を認識する抗体とを用いるラジオイムノアッセイ法等があげられる。
（６）３．記載の抗体を用いて、健常者および被験者の白血球細胞に存在するＩｇＡ腎症関連蛋白質を免疫学的に検出または定量し、その量を健常者と被験者とで比較し、その量的な変動を調べることにより被験者がＩｇＡ腎症に罹病しているか否かを診断することができる。具体的に検体としては、健常者および被験者から末梢血液を採取し、その血液から分離した白血球細胞を用いることができる。また、検出するＩｇＡ腎症関連蛋白質が白血球細胞外に分泌される蛋白質の場合は健常者および被験者の血漿を検体として、血漿中の該蛋白質の量を免疫学的に検出または定量し、その量を健常者と被験者とで比較し、その量的な変動を調べることにより被験者がＩｇＡ腎症に罹病しているか否かを検出・診断することができる。
（７）３．記載の抗体をＩｇＡ腎症の治療または予防に利用することができる。
本発明のＤＮＡ、蛋白質および抗体を、診断、治療、予防に用いる場合、診断または薬理学的に許容される担体を添加してもよい。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明の実施例を示す。
実施例１  ＩｇＡ腎症患者および健常人の白血球のディファレンシャル・ディスプレイ
（１）ＩｇＡ腎症患者および健常人の白血球からの全ＲＮＡの取得
ＩｇＡ腎症の患者５名および健常人５名より各々２０ｍｌ採血した。
１０００単位／ｍｌヘパリン５００μｌを添加し、凝固を抑制後、遠心チューブに移し、室温で３，３００ｒｐｍ、１５分間遠心後、白血球画分として中間層のバフィーコートを別の遠心チューブに移した。
ＡＧＰＣ法〔実験医学９，１９３７，（１９９１）〕またはＲＮＡ回収用キットＲＮＡｅａｓｙ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い全ＲＮＡを取得した。
（２）ＩｇＡ腎症患者および健常人の白血球全ＲＮＡを用いた蛍光ディファレンシャル・ディスプレイ
上記（１）で取得した全ＲＮＡ２．５μｇ各々について蒸留水を全体が９μｌになるように添加し、５’末端をフルオレセインイソチオシアネート（以下、ＦＩＴＣと称す）で蛍光標識したアンカープライマー〔サワディー・テクノロジー（Ｓａｗａｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）社製、５０μＭ〕１μｌを加えて７０℃で５分間加熱後、直ちに氷冷した。
５’末端蛍光標識アンカープライマーとして、ＦＡＨ（塩基配列を配列番号１０７に示した。）、ＦＧＨ（塩基配列を配列番号１０８に示した。）、ＦＣＨ（塩基配列を配列番号１０９に示した。）の３種類をそれぞれ用い、Ｉサンプルの全ＲＮＡについて計３組の反応を行った。
５×逆転写酵素反応用緩衝液〔２５０ｍＭ  トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、３７５ｍＭ  ＫＣｌ、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２〕４μｌ、１００ｍＭ  ジチオスレイトール（ＤＴＴ）２μｌ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰ）１μｌ、蒸留水１μｌ、逆転写酵素ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ  ＩＩ  ＲＮａｓｅ  Ｈ−Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｃ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）１μｌ（２００単位）を添加して混合し、室温で１０分間静置後、４２℃で５０分間反応させてｃＤＮＡを合成し、９０℃で５分間加熱して反応を停止させた。
反応後、該反応液にＴＥ緩衝液〔１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）（ｐＨ８．０）〕４０μｌを添加した。
上記により合成された各々のｃＤＮＡ  １μｌに、蒸留水１４．７μｌ、１０×ＰＣＲ用緩衝液〔１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、５００ｍＭ  ＫＣｌ、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００〕２μｌ、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ  ０．８μｌ、５０μＭ蛍光標識アンカープライマー（ＦＡＨ、ＦＧＨ、ＦＧＨのうちｃＤＮＡ合成時に用いたのと同じ種類のもの）０．３μｌ、１０μＭ任意プライマー（Ｏｐｅｒｏｎ社製）１μｌ、ＤＮＡポリメラーゼＧｅｎｅ  Ｔａｑ（ニッポンジーン社製、５単位／μｌ）０．２μｌを添加し、サーマルサイクラーにセットしＰＣＲを行った。
ＰＣＲは、９４℃で３分間、４０℃で５分間、７２℃で５分間反応させた後、９５℃で１５秒間、４０℃で２分間、７２℃で１分間からなる工程を１サイクルとして２７サイクル反応を行い、最後に７２℃で５分間反応させる条件で行った。
蛍光標識アンカープライマーとしては前述した３種類のうちから１種類、任意プライマーとしては、オペロン・テクノロジーズ社製のＯＰＤ−１〜２０、ＯＰＥ−１〜２０およびＯＰＶ−１〜２０の６０種類のうちから１種類を組み合わせた合計１８０組の反応、および、蛍光標識アンカープライマーＦＧＨと任意プライマーＯＰＢ−２（オペロン・テクノロジーズ社製）の反応の合計１８１組の反応を、１つの全ＲＮＡについて行った。
各々のＰＣＲ反応液４μｌに電気泳動サンプル用溶液（９５％ホルムアミド、０．１％キシレンシアノール、０．１％ブロムフェノールブルー）３μｌを添加し、９５℃で２分間加熱後すぐ氷冷し、６％アクリルアミドゲル、１５００Ｖ、２．５時間で電気泳動を行った。電気泳動用緩衝液としては８９ｍＭ  Ｔｒｉｓ、８９ｍＭ  ホウ酸、２ｍＭ  ＥＤＴＡを用いた。フルオロイメージャー（モレキュラー・ダイナミックス社製）を用いて電気泳動後のゲルの蛍光を測定することにより、ＰＣＲで増幅した断片を検出し、比較した。健常人５例に比較して、ＩｇＡ腎症患者の白血球５例で共通して顕著に増加あるいは減少したバンドを記録した。
ＩｇＡ腎症の患者３名および健常人３名について、同様に上記（１）の全ＲＮＡの取得、および（２）の蛍光ディファレンシャル・ディスプレイを行った。
健常人と比較して、上記２度のディファレンシャル・ディスプレイでともに増加あるいは減少がみられた１９７バンドをゲルから切り出した。
切り出したゲルの約１／４に蒸留水３８μｌ、１０×ＰＣＲ用緩衝液５μｌ、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ４μｌ、アンカープライマー（蛍光標識なし：サワディー・テクノロジー社製  ３４μＭ）０．６μｌ、１０μＭ任意プライマー２μｌ、ＤＮＡポリメラーゼＧｅｎｅ  Ｔａｑ  ０．５μｌを添加し、９４℃で３分間加熱後、９５℃で１５秒間、４０℃で２分間、７２℃で１分間からなる工程を１サイクルとして３０サイクル反応を行い、最後に７２℃で５分間反応させてＰＣＲを行った。
反応後の液をフェノール−クロロホルム（１：１）抽出し、さらにクロロホルム−イソアミルアルコール（２４：１）抽出後、エタノール沈殿を行った。
得られた沈殿（ＤＮＡ増幅断片）をＴＥ緩衝液に溶解後、１．５％低融点アガロースゲル〔シープラークＧＴＧ（ＳＥＡ  ＰＬＡＱＵＥ  ＧＴＧ：ＦＭＣ  バイオプロダクツ社製）〕電気泳動にかけた。
泳動後、エチジウムブロマイド染色し、増幅断片部分のゲルを切り出した。
該ゲルを６５℃で１５分間加熱してアガロースを融解後、フェノール−クロロホルム抽出およびクロロホルム−イソアミルアルコール抽出を行った。
得られた抽出液を用い、エタノール沈殿を行った後、得られた沈殿（増幅断片）を１０μｌのＴＥ緩衝液に溶解させた。
該増幅断片１μｌとＰＣＲ断片クローニング用ベクターｐＴ７ＢｌｕｅＴ−Ｖｅｃｔｏｒ（ノバジェン社製）１μｌを混合し、ＤＮＡライゲーションキット  ｖｅｒ．１（宝酒造社製）を用いて、キット添付のマニュアルに従い、プラスミドに増幅断片を組み込んだ。
得られた組換え体プラスミドを用い、公知の方法に従って大腸菌ＤＨ５α（ギブコＢＲＬ社製）を形質転換し、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３７℃で一晩培養した。
生育してきたアンピシリン耐性の形質転換体を蒸留水２０μｌに懸濁し、１０×ＰＣＲ用緩衝液  ２．５μｌ、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ  ２μｌ、３４μＭ  アンカープライマー  ０．３μｌ、１０μＭ  任意プライマー１μｌ、ＤＮＡポリメラーゼＧｅｎｅ  Ｔａｑ  ０．５μｌを添加し、増幅断片の上記再増幅と同じ条件でＰＣＲおよび電気泳動を行い、最初のディファレンシャル・ディスプレイ時と同じ長さの断片が増幅することを確認した。
増幅断片の塩基配列はＤＮＡシークエンサー（パーキンエルマー社製）を用いて決定した。塩基配列決定において、パーキンエルマー社のダイプライマーサイクルシークエンンシング（Ｄｙｅ  ｐｒｉｍｅｒ  ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）キットおよびキットに添付のマニュアルの方法を用いた。
決定された塩基配列中に存在する制限酵素部位を切断できる制限酵素を用い、上記ディファレンシャル・ディスプレイ時で得られた反応物を切断後、電気泳動を行い、切り出した増幅断片に相当する電気泳動のバンドの泳動位置が変化することを確認した。
得られた塩基配列を塩基配列データベースＧｅｎＢａｎｋと比較し、一致する塩基配列がデータベース中の既存の塩基配列にはないもの、データベースの塩基配列の中でｃｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔａｇとのみ一致するものを６６クローン選択した。
実施例２  ＲＴ−ＰＣＲによるｍＲＮＡの発現の特異性の検出
実施例１においてＩｇＡ腎症の患者５名および健常人５名より取得した全ＲＮＡ各々２μｇに対して、一本鎖ｃＤＮＡ合成キットＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（ＢＲＬ社製）を用いて、キットに添付のマニュアルの方法に従い、一本鎖ｃＤＮＡを合成した。
得られた一本鎖ｃＤＮＡを含む溶液２１μｌに、４２０μｌになるように蒸留水を添加した。
得られた溶液１０μｌを用いて、以下の方法でＲＴ−ＰＣＲを行い、各増幅断片に対応するｍＲＮＡの発現量を検出した。
即ち、白血球一本鎖ｃＤＮＡ  １０μｌに、蒸留水１５．８μｌ、１０×ＰＣＲ用緩衝液４ｕｌ、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ  ３．２μｌ、ＤＭＳＯ  ２μｌ、１０μＭ  遺伝子特異的５’末端側センスプライマー２μｌ、１０μＭ  遺伝子特異的３’側アンチセンスプライマー２μｌ、１単位／μｌに希釈したＤＮＡポリメラーゼＧｅｎｅ  Ｔａｑ  ２μｌを添加し、９７℃５分間加熱し、氷中で５分間冷却した後、９４℃で３０秒間、６５℃で１分間、７２℃で２分間からなる工程を１サイクルとして２８サイクルのＰＣＲを行った。
ＰＣＲ後、２％アガロースゲル電気泳動を行い、０．０１％サイバーグリーン（宝酒造社製）で染色し、染色された増幅断片の量をフルオロイメージャーで定量し、ｍＲＮＡの相対発現量とした。
ｍＲＮＡの量を校正するために、ハウスキーピング遺伝子であるグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）遺伝子について特異的プライマー（配列番号１１２、配列番号１１３）を用いて上記と同様の反応を行い、各遺伝子のｍＲＮＡの発現量をＧ３ＰＤＨ  ｍＲＮＡの発現量に対する比で校正した後、ＩｇＡ腎症患者５例の平均値と健常者５例の平均値を比較し、その値に差のある遺伝子３０クローンについてＩｇＡ腎症患者で発現量が変化している遺伝子として選択した。第１−１表および第１−２表に選択された遺伝子についてまとめた。
0004474496.tif 000002
0004474496.tif 000003
これらの遺伝子についてのプライマーと、検体白血球のｍＲＮＡ由来ｃＤＮＡとを、ＲＴ−ＰＣＲ法により反応させて、遺伝子増幅を観察することで、ＩｇＡ腎症の診断が可能となる。
実施例３  完全長ｃＤＮＡのクローン化と各ｃＤＮＡクローンの解析
（１）完全長ｃＤＮＡのクローン化
ディファレンシャル・ディスプレイで得られた増幅断片の塩基配列を含むｃＤＮＡを、ジーントラッパー法、ｃＤＮＡライブラリーのプラークハイブリダイゼーション、５’−ＲＡＣＥ法を適宜用いることによりクローン化することにした。以下にその方法について記載する。
（Ａ）ジーントラッパー法
ベクターにｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いたヒト白血球ｃＤＮＡ  ライブラリー（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）から、ＧＥＮＥ  ＴＲＡＰＰＥＲ  ｃＤＮＡ  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｙｔｅｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて、以下のようにしてｃＤＮＡクローンを取得した。
即ち、ｃＤＮＡライブラリーをＧｅｎｅＩＩ蛋白とエクソヌクレアーゼＩＩＩを用いて、一本鎖ＤＮＡ（ｃＤＮＡのアンチセンス鎖側に相当する）にした後、各遺伝子特異的なビオチン化したオリゴヌクレオチド（実施例２でＲＴ−ＰＣＲに用いた各遺伝子に特異的な５’側センスプライマーを用いた）をプローブとしてハイブリダイズさせた。
ストレプトアビジンを結合させたマグネティックビーズにビオチン化プローブを結合させることにより、プローブとハイブリダイズしていた上記一本鎖ｃＤＮＡクローンを単離した。
該一本鎖ｃＤＮＡクローンをプローブからはずした後、ＤＮＡポリメラーゼを用い二本鎖ＤＮＡにし、該二本鎖ＤＮＡを用いて大腸菌を形質転換することにより、ｃＤＮＡクローンを含有する形質転換株を取得した。
具体的方法はキットに添付のマニュアルの方法に従った。
得られた形質転換株を蒸留水１８μｌに懸濁し、１０×ＰＣＲ用緩衝液２．５μｌ、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ  ２μｌ、１０μＭ  遺伝子特異的５’側センスプライマー１μｌ、１０μＭ  遺伝子特異的３’側アンチセンスプライマー１μｌ、ＤＮＡポリメラーゼＧｅｎｅ  Ｔａｑ  ０．５μｌを添加し、ＲＴ−ＰＣＲと同じ条件でＰＣＲを行った後、電気泳動を行い、プライマーの位置から推定される長さの断片の増幅した形質転換株をｃＤＮＡクローンとして単離した。
（Ｂ）ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
ＩｇＡ腎症患者白血球のｃＤＮＡライブラリー、神経芽細胞腫系セルラインＮＢ−１のｃＤＮＡライブラリーを用いて、プラークハイブリダイゼーションによるｃＤＮＡクローンのスクリーニングを行った。
なお、各ライブラリーに対してプラークハイブリダイゼーションを行う前に、ｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、実施例２で用いた各遺伝子特異的なＲＴ−ＰＣＲのプライマーを用いて実施例２と同様にして、ＰＣＲを行い、プライマーの位置から推定される長さの断片が増幅するライブラリーを目的の遺伝子のｃＤＮＡクローンを含むライブラリーとして選択した。
該ライブラリーについて、プラークのＤＮＡをナイロンメンブレンＨｙｂｏｎｄ  Ｎ＋（アマシャム社製）にブロッティングした。
鋳型として実施例１のディファレンシャル・ディスプレイで得られた、各遺伝子の増幅断片を含有するプラスミドを、プライマーとして実施例２のＲＴ−ＰＣＲで用いた各遺伝子特異的なプライマーを用い、ＰＣＲ  ＤＩＧ  ラベリング・ミックス（Ｂｏｈｅｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）を添加して、ＰＣＲを行い、各遺伝子特異的な断片を、増幅し標識した。
該増幅標識した各遺伝子特異的な断片をプローブとして用い、ベーリンガー・マンハイム社のマニュアルに従ってハイブリダイゼーションおよび、ポジティブプラークの検出を行った。
検出にはＤＩＧ  核酸検出キット（ベーリンガー・マンハイム社製）を用いた。
（Ｂ−１）ＩｇＡ腎症患者白血球ｃＤＮＡライブラリーの作製
ＩｇＡ腎症患者４名から５０ｍｌずつ血液を採取し、それぞれの血液に対し、Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｐｒｅｐを用いて遠心し白血球画分を単離した。具体的な方法はＰｏｌｙｍｏｒｐｈｐｒｅｐに添付のマニュアルに従った。
単離した白血球に対し、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法〔Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５４，３（１９８７）〕により、全ＲＮＡを調製した。計２００ｍｌの血液から３２０．７μｇの全ＲＮＡを取得した。
得られた全ＲＮＡ２７２．６μｇをオリゴ  ｄＴ  セルロースカラムに通塔することにより、ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡとしてｍＲＮＡ  １０．７μｇを取得した。
同様に、別のＩｇＡ腎症患者４名からｍＲＮＡ  ６．９μｇを取得した。
取得したｍＲＮＡ各々１０．０μｇ、６．４μｇについて、ｕｎｉＺＡＰ−ｃＤＮＡ合成キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて、ｃＤＮＡ合成、ＥｃｏＲＩアダプターの付加、ＸｈｏＩ切断反応を行い、λ  ＺａｐＩＩのＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ間にライゲーションすることにより、ｃＤＮＡの５’端が常にベクターのＥｃｏＲＩサイト側にあるような方向性で挿入されたｃＤＮＡライブラリーを作製した。
以上の具体的な方法はＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社のマニュアルに従った方法である。
λファージパッケージングキットＧｉｇａｐａｃｋ  ＩＩＩ  Ｇｏｌｄ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｅｘｔｒａｃｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いてパッケージング後、大腸菌ＸＬｌ−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦに感染させて最終的なｃＤＮＡライブラリーとして用いた。パッケージングと感染の具体的な方法は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のマニュアルに従った。
（Ｂ−２）ニューロブラストーマ系セルラインＮＢ−１  ｃＤＮＡライブラリーの作製
１０％ウシ胎児血清（Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）、２％ペニシリン（５，０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）・ストレプトマイシン（５ｍｇ／ｍｌ）溶液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）および０．１９％  ＮａＨＣＯ３（Ｓｉｇｍａ社製）、４ｍＭ  グルタミンを含むＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬製）を用い、５％ＣＯ２、３７℃の条件で、ニューロブラストーマ系セルラインＮＢ−１〔Ｔｈｅ  Ａｕｔｏｎｏｍｉｃ  Ｎｅｒｖｏｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  １０，１１５（１９７３）、ヒューマンサイエンス研究資源バンクより入手可能ＪＣＲＢ０６２１〕の培養および継代を行い、１．２５×１０８個のコンフルエント状態の細胞を回収した。
回収した細胞をＰＢＳで洗浄後、Ｆａｓｔ  Ｔｒａｃｋ  ｍＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてｍＲＮＡ  １０．２μｇを精製、取得した。
取得したｍＲＮＡ  ６μｇおよびＮｏｔＩ−プライマー−アダプター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）１．５μｇを入れた容器に蒸留水を添加して７μｌとし、７０℃で１０分間加熱後、氷中に移し急冷した。
急冷した該溶液に、５×逆転写酵素反応用緩衝液（酵素に添付されていたもの）４μｌ、１００ｍＭ  ＤＴＴ  ２μｌ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  １μｌ、トレーサーとして〔α−３２Ｐ〕ｄＣＴＰ（１１０ＴＢｑ／ｍｍｏｌ；Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）１μｌを添加し、３７℃で２分間加温後、逆転写酵素ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＮａｓｅ  Ｈ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ５μｌ（１０００単位）を添加して４４℃で１時間反応させ、ｃＤＮＡを合成した。
該反応液に蒸留水８２μｌ、５×反応用緩衝液〔１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５００ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭ  ＤＴＴ、２５０ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、７５０ｍＭβ−ニコチンアミドジヌクレオチド〕３２μｌ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  ２．７５μ１、〔α−３２Ｐ〕ｄＣＴＰ  ２．７５μｌ、１００ｍＭ  ＤＴＴ  ５．５μｌ、６単位／μｌ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）２．５μｌ、３．５単位／μｌ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）１１．５μｌ、０．６単位／μｌ  Ｅ．ｃｏｌｉ  リボヌクレアーゼＨ（宝酒造社製）２μｌを添加し、１６℃で３時間反応させ、ｍＲＮＡを分解しｃＤＮＡを２本鎖にした。
該反応液に、１単位／μｌ  Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）４．８μｌを添加し、１６℃で５分間反応させて、両端を平滑化した。
該反応液に、５００ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）２μｌと１０％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）２μｌを添加して反応を停止し、フェノール−クロロホルム抽出を行った。該抽出で変成した酵素を除き、水層を取得した。
４００ｂｐ以下の長さのｃＤＮＡおよび未反応のＮｏｔＩ−プライマー−アダプターとヌクレオチドを除くため、ＴＥ緩衝液で平衡化させたＳｉｚｅＳｅｐ−４００スパンカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）に該水層を乗せて４００ｇで２分間遠心分離し、溶出液をエタノール沈殿しｃＤＮＡを回収した。
該ｃＤＮＡにＥｃｏＲＩアダプター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）５μｌ（５０ｐｍｏｌ）を添加して溶解させ、ライゲーションキット  Ｖｅｒ．１（宝酒造社製）の（Ａ）液４０μｌを添加後、（Ｂ）液５μｌを添加して１５℃で２時間反応させ、ＥｃｏＲＩアダプターをｃＤＮＡの両末端に付与した。
該反応液に、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）４０μｌを添加し６５℃で１５分間加熱して反応を停止し、エタノール沈殿によりｃＤＮＡを回収した。
該ｃＤＮＡを蒸留水３６μｌに溶解させ、１０×反応用緩衝液［５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２〕５μｌ、１００ｍＭ  ＤＴＴ  ２．５μｌ、１０ｍＭ  ＡＴＰ  ２．５μｌ、６単位／μｌ  Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社製）４μｌを添加し、３７℃で３０分間反応させ、付与したＥｃｏＲＩアダプターの５’末端をリン酸化した。
該反応液に、蒸留水７．２μｌ、５Ｍ  ＮａＣｌ  １．８μｌ、ＮｏｔＩ  ８単位（１μｌ）を添加し、３７℃で２時間反応させ、ＮｏｔＩ−プライマー−アダプター内のＮｏｔＩサイトを切断した。
該反応液に、５００ｍＭ  ＥＤＴＡ  ６μｌを添加して反応を停止させ、２０μｇ／μｌ  ｔＲＮＡ  １μｌを添加後フェノール−クロロホルム抽出を行った。該抽出で変成した酵素を除き、水層を取得した。
未反応のＥｃｏＲＩアダプターを除くため、ＴＥ緩衝液で平衡化させたＳｉｚｅＳｅｐ−４００スパンカラムに該水層を乗せて４００ｇで２分間遠心分離し、溶出液を回収した。
５〜２０％濃度勾配を有する酢酸カリウム溶液上に、該溶出液を乗せ、５０，０００ｒｐｍで３時間超遠心分離し、底からペリスタポンプを用いて２１に分画して分取した。
それぞれの分画をエタノール沈殿してｃＤＮＡを回収し、それらの一部をアガロースゲル電気泳動後オートラジオグラフィーをすることにより各分画に含まれるｃＤＮＡの長さを測定し、約３ｋｂ以上のｃＤＮＡを含む画分（Ｈ）、１〜３ｋｂのｃＤＮＡを含む画分（Ｍ）、１ｋｂ以下のｃＤＮＡを主に含む画分（Ｌ）の３画分に分けて集めた。
クローニングベクターＺＡＰ  ＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）９μｇ（９μｌ）に１０×Ｈ制限酵素緩衝液（宝酒造社製）１０μｌ、蒸留水７５μｌ、ＥｃｏＲＩ  ９０単位（６μｌ）を添加し、３７℃で２時間反応させた。
該反応液に、５Ｍ  ＮａＣｌ  １μｌとＮｏｔＩ  ４０単位（５μｌ）を添加し、さらに３７℃で２時間反応させ、さらにＮｏｔＩ  ８単位（１μｌ）を添加して３７℃で１時間反応させ、ベクターのＥｃｏＲＩサイトとＮｏｔＩサイトを切断した。
該反応液に、２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１００μｌとＥ．ｃｏｌｉ  Ｃ７５由来アルカリフォスファターゼ（宝酒造社製）１単位（２μｌ）を添加し、６０℃で３０分間反応させてベクターのＥｃｏＲＩ切断末端とＮｏｔＩ切断末端の５’端を脱リン酸化後、フェノール−クロロホルム抽出を２回繰り返して行い酵素を除いた。
酵素を除去後、クロロホルム抽出をし、水層をエタノール沈殿してベクターＤＮＡを回収し、ＴＥ緩衝液に溶解させた。
３画分に分けて集めたｃＤＮＡそれぞれにベクターＤＮＡ  １μｇ分を加えてエタノール沈殿を行い、回収したベクターＤＮＡとｃＤＮＡをリガーゼ緩衝液〔１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、３００ｍＭ  ＮａＣｌ〕４μｌに溶解させ、ライゲーションキット  Ｖｅｒ．１の（Ｂ）液４μｌを添加して２６℃で１０分間反応させ、ベクターＤＮＡにｃＤＮＡを結合させた。
該反応液を４μｌずつλ  ｐｈａｇｅ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｋｉｔ  Ｇｉｇａ−Ｐａｃｋ  Ｇｏｌｄ  ＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いてパッケージングを行った。具体的試薬および方法は、キットに付与されているマニュアルに記載されているものを用いた。
得られたファージを大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’株に感染させてタイターを測定した。さらに、ファージをプレート上で増殖させた後にＳＭ緩衝液中に回収することによりｃＤＮＡライブラリーを１回増幅し、最終的なｃＤＮＡライブラリーとした。タイターの測定およびライブラリー増幅の具体的な方法は、λファージパッケージングキットに付与されているマニュアルに従った。本発明のスクリーニングには約３ｋｂ以上のｃＤＮＡを含む画分（Ｈ）由来のライブラリーを用いた。
（Ｃ）５’−ＲＡＣＥ
（Ｂ）で作製したＩｇＡ腎症患者ｃＤＮＡに対して、５’ＲＡＣＥ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｖｅｒ．２（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて５’−ＲＡＣＥを行った。具体的な方法は、キットに添付のマニュアルにしたがった。
以上の（Ａ）〜（Ｃ）の方法を用いて、第２表に示す７種類の遺伝子について、ｃＤＮＡをクローン化することができた。
0004474496.tif 000004
得られたそれぞれのｃＤＮＡクローンのｃＤＮＡ部分の塩基配列は、パーキンエルマー社の３７７ＤＮＡシークエンサーを用いて決定した。塩基配列決定のための具体的試薬および方法はパーキンエルマー社のダイプライマーサイクルシークエンシングＦＳレディーリアクション（Ｄｙｅｐｒｉｍｅｒ  ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｓｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）キットを使用し、キットに添付のマニュアルに従った。また、この塩基配列を３フレームでアミノ酸配列に翻訳し１００アミノ酸以上からなるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在するかどうかを調べた。
（１）ＩＮＰ３０３Ａ
ジーントラッパー法でｃＤＮＡクローンＧＴＩＮＰ３０３Ａ−４１ａが得られたが、そのｃＤＮＡの塩基配列中には１００アミノ酸以上からなるＯＲＦはなく、非完全長のｃＤＮＡクローンと考えられた。
完全長のｃＤＮＡクローンを取得するために、ＧＴＩＮＰ３０３Ａ−４１ａのｃＤＮＡの５’端に近い部分に対応する特異的プライマー（配列番号１１０，１１１に塩基配列を示した）を用いて５’−ＲＡＣＥを行い、ｃＤＮＡクローンＩＮＰ３０３Ａ−Ｒ１を取得した。また、ＧＴＩＮＰ３０３Ａ−４１ａのｃＤＮＡの塩基配列は一部決定できなかったため、ＮＢ−１のｃＤＮＡライブラリーからプラークハイブリダイゼージョンにより別のｃＤＮＡクローンＩＮＰ３０３Ａｐｈ１−３を取得した。
これら取得されたｃＤＮＡクローンの塩基配列を組み合わせることにより、配列番号１に示した４２７６ｂｐからなるＩＮＰ３０３ＡのｃＤＮＡの塩基配列を決定した。
ディファレンシャル・ディスプレイにより得られた断片の塩基配列（配列番号４１）は配列番号１の２７９７〜３１０１番目に相当する相補鎖の塩基配列と一致した。このことから、アンカープライマーはｍＲＮＡの３’末端のｐｏｌｙ  Ａ配列ではなく、配列番号１の２７８２〜２７９５番目に存在するＴが連続する配列の相補鎖にアニーリングしたものと考えられた。
ＩＮＰ３０３Ａ−Ｒ１のｃＤＮＡの塩基配列には、２３０アミノ酸からなるＯＲＦ（配列番号１の５３〜７４２番目に相当する。アミノ酸配列を配列番号３４に示した。）が見出された。
該ＯＲＦのアミノ酸配列をアミノ酸配列のデータベースと比較したところ、線虫のゲノム遺伝子クローンＣ４０Ｈｌがコードしていると推定された蛋白質の一つであるＣ４０Ｈｌ．１、マウスｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ  ｅｌｅｍｅｍｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＣＰＥＢＰ）、ショウジョウバエｏｒｂ遺伝子と相同性をもつことがわかった。
また、これらの蛋白質がＩＮＰ３０３Ａ蛋白質と相同性を示している部分の直後のアミノ酸配列は、配列番号１の３３４６〜３５７７番目の塩基配列がコードするアミノ酸配列と相同性を示すことがわかった。このことからＩＮＰ３０３Ａの塩基配列には、本来はイントロンと考えられる２６３９ｂｐの塩基配列（配列番号１の７１３〜３３５２番目に相当）が残ったままの異常なスプライシングを起こしたｃＤＮＡであると推定された。
ディファレンシャル・ディスプレイにより得られた、ＩｇＡ腎症患者で発現量が上昇していた断片の塩基配列はこの挿入配列中にあり、ＩｇＡ腎症患者ではこのような異常なスプライシングを起こしたｍＲＮＡが上昇していることがわかった。該異常なスプライシングを起こしたｍＲＮＡから翻訳された蛋白質は、本来のＩＮＰ３０３Ａ遺伝子がコードする蛋白質、即ち相同性から推定したイントロンを除いた塩基配列がコードする蛋白質（２９５アミノ酸）とは２２０番目以降のアミノ酸配列が異なっており、本来の機能を発揮していない可能性が高い。
（２）ＩＮＰ３７７Ａ
ジーントラッパー法ｃＤＮＡクローンＧＴＩＮＰ３７７Ａ−４６ＣのｃＤＮＡの塩基配列を決定し、得られた塩基配列を配列番号２に示した。
ＩＮＰ３７７ＡのｃＤＮＡの塩基配列を塩基配列データベースと比較したところ、ショウジョウバエのガン抑制遺伝子Ｓｘｌと相同性をもつヒトの遺伝子ＬＵＣＡ１５（ＧｅｎＢａｎｋ；ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｕ２３９４６）の１〜５５２番目の配列が、ＧＴＩＮＰ３７７Ａ−４６Ｃの塩基配列の５０〜５２７番目、および１０１０〜１０８３番目の塩基配列と一致することがわかった。従ってＧＴＩＮＰ３７７Ａ−４６ＣはＬＵＣＡ１５のイントロンが残った異常なスプライシングを起こしたｃＤＮＡクローンであると推定された。
ディファレンシャル・ディスプレイにより得られた断片の塩基配列（配列番号４２）は配列番号２の７５９〜１０１４番目に相当する相補鎖の塩基配列と一致した。このことから、アンカープライマーはｍＲＮＡの３’末端のｐｏｌｙ  Ａ配列ではなく、配列番号２の７４５〜７５７番目に存在するＴが連続する配列の相補鎖にアニーリングしたものと考えられた。該断片の配列はＬＵＣＡ１５のイントロンと考えられる塩基配列中に存在していると考えられるため、ＩｇＡ腎症患者ではこのような異常なスプライシングを起こしたｍＲＮＡが上昇していること考えられた。
ＧＴＩＮＰ３７７Ａ−４６Ｃがコードする蛋白質は１４３アミノ酸であり（配列番号３５にアミノ酸配列を示した。）は、本来のＬＵＣＡ１５  ｃＤＮＡがコードする蛋白質（８１５アミノ酸）とは１３７番目以降のアミノ酸配列が異なっており、本来の機能を発揮していない可能性が高い。
（３）ＩＮＰ３７９Ａ
ＩｇＡ腎症患者の白血球ｃＤＮＡライブラリーのプラークハイブリダイゼーションにより、ＩＮＰ３７９Ａ  ｃＤＮＡクローンＰＨＩＮＰ３７９Ａ−１６−２を取得した。
該ｃＤＮＡの塩基配列を決定したところ、５’末と考えられた側にＸｈｏＩサイトおよびｐｏｌｙＴ配列があり、ｃＤＮＡがベクターに逆向きに挿入されたクローンであると考えられた。
従って、本来のｃＤＮＡの塩基配列である、得られた塩基配列に相補的な塩基配列を配列番号３に示した。
ディファレンシャル・ディスプレイにより得られた断片の塩基配列（配列番号４３）は配列番号３の２７０６〜２９４９番目の塩基配列と一致した。この塩基配列中には１０４アミノ酸からなるＯＲＦ（アミノ酸配列を配列番号３６に示した。）が存在した。
アミノ酸配列データベース中には、このアミノ酸配列と相同性のある配列は見出されず、新規な蛋白質をコードする遺伝子と考えられた。
（４）ＩＮＰ４０１Ａ
ＩｇＡ腎症患者の白血球ｃＤＮＡライブラリーのプラークハイブリダイゼーションによりＩＮＰ４０１Ａ  ｃＤＮＡクローンＰＨＩＮＰ４０１Ａ−８−１およびＰＨＩＮＰ４０１Ａ−１４−１を取得した。
両者のｃＤＮＡの塩基配列を決定したところ、両者は１塩基だけが異なり、１アミノ酸が異なる以外は同一の１３３アミノ酸からなるＯＲＦが存在することがわかった。また両者は、５’非翻訳領域および３’非翻訳領域の塩基配列も異なっており、遺伝子のポリモルフィズムおよびスプライシングの異なったｍＲＮＡの存在が推定された。
ＰＨＩＮＰ４０１Ａ−８−１の塩基配列を配列番号４に、ＰＨＩＮＰ４０１Ａ−１４−１の塩基配列を配列番号５に示し、ＰＨＩＮＰ４０１Ａ−８−１がコードする蛋白質のアミノ酸配列を配列番号３７に、ＰＨＩＮＰ４０１Ａ−１４−１がコードする蛋白質のアミノ酸配列を配列番号３８に示した。
ディファレンシャル・ディスプレイにより得られた断片の塩基配列（配列番号４４）は配列番号４の９６０〜１２１７番目、および配列番号５の１３１３〜１５７０番目に相当する相補鎖の塩基配列と一致した。このことから、アンカープライマーはｍＲＮＡの３’末端のｐｏｌｙ  Ａ配列ではなく、配列番号４の９４７〜９５９番目あるいは配列番号５の１３０２〜１３１２番目に存在するＴが連続する配列の相補鎖にアニーリングしたたものと考えられた。
ディファレンシャル・ディスプレイで得られたＩｇＡ腎症患者で発現量の上昇している断片の塩基配列はＰＨＩＮＰ４０１Ａ−８−１およびＰＨＩＮＰ４０１Ａ−１４−１の塩基配列と相補的な塩基配列を有していた。
ＰＨＩＮＰ４０１Ａ−８−１およびＰＨＩＮＰ４０１Ａ−１４−１がコードする蛋白質の相同性を調べたが、アミノ酸配列データベース中には相同性のある配列は見出されず、新規な蛋白質をコードしていると考えられた。
アミノ酸配列から推定した親水性の解析から、ＩＮＰ４０１Ａのコードする蛋白質は分泌蛋白質である可能性があり、その場合、配列番号３７あるいは３８の１〜１５番目のアミノ酸配列がシグナルペプチドと推定された。
（５）ＧＴＩＮＰ３３２Ａ−２１
ジーントラッパー法により、ＩＮＰ３３２ＡのｃＤＮＡクローンの取得を試みたが、得られたｃＤＮＡクローンＧＴＩＮＰ３３２Ａ−２１の塩基配列中には、ＩＮＰ３３２Ａのディファレンシャル・ディスプレイ増幅断片と一致する塩基配列はなく、別の遺伝子のｃＤＮＡクローンと考えられた。
ＧＴＩＮＰ３３２Ａ−２１については、その塩基配列にもとづいたプライマー（配列番号１０５および１０６に塩基配列を示した。）を用いて実施例２に記載の方法で健常人とＩｇＡ腎症患者の白血球についてＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子の発現量を調べたところ、ＩｇＡ腎症の患者白血球で健常人と比較して４．６倍の発現量の上昇が見られた。
ＧＴＩＮＰ３３２Ａ−２１のｃＤＮＡ部分をプローブにして、ＩｇＡ腎症患者白血球のｃＤＮＡライブラリーのプラークハイブリダイゼーションによりｃＤＮＡクローンＰＨＧＴＩＮＰ３３２Ａ−２１−２８−１を取得した。
該クローンのｃＤＮＡの塩基配列を決定したところ１２８アミノ酸からなるＯＲＦが存在することがわかった。配列番号６にＰＨＧＴＩＮＰ３３２Ａ−２１−２８−１のｃＤＮＡの塩基配列を、配列番号３９にＯＲＦのコードする蛋白質のアミノ酸配列を示した。
該ＯＲＦのアミノ酸配列はリン酸化チロシンと結合する機能を持つ、フォスファチジルイノシトール３，４，５−３リン酸５−フォスファターゼ等のＳＨ２ドメインと相同性を持つことがわかった。
（６）ＩＮＭ０６３−７
完全長のｃＤＮＡクローンを取得するために、ＮＢ−１のｃＤＮＡライブラリーからプラークハイブリダイゼーションにより３つのｃＤＮＡクローン（ＩＮＭ０６３−７  ｐｈ５−１、ＩＮＭ０６３−７  ｐｈ４−１、ＩＮＭ０６３−７  ｐｈ９−１）を取得した。
これら取得されたｃＤＮＡクローンの塩基配列を組み合わせることにより、配列番号７に示した４３４３ｂｐからなるＩＮＭ０６３−７のｃＤＮＡの塩基配列を決定した。
ディファレンシャル・ディスプレイにより得られた断片の塩基配列（配列番号８）は配列番号７の２８０９〜２９６４番目に相当する相補鎖の塩基配列と一致した。このことから、アンカープライマーはｍＲＮＡの３’末端のｐｏｌｙ  Ａ配列ではなく、配列番号７の２９６５〜２９７４番目に存在するＴが連続する配列の相補鎖にアニーリングしたものと考えられた。
４３４３ｂｐからなるＩＮＭ０６３−７のｃＤＮＡの塩基配列には、３４３アミノ酸からなるＯＲＦ（配列番号７の１〜１０２９番目に相当する。アミノ酸配列を配列番号４０に示した。）が見出された。
該ＯＲＦのアミノ酸配列をアミノ酸配列のデータベースと比較したところ、ｉｒｏｎ−ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ２（ＩＲＰ２）のスプライシングバリアントであることがわかった。
ＩＮＭ０６３−７の塩基配列には、本来はイントロンと考えられる２８０８ｂｐの塩基配列（配列番号７の１０２４〜３８３２番目に相当）が存在していることから、ＩＮＭ０６３−７は異常なスプライシングの結果生じたｃＤＮＡであると推定された。
ディファレンシャル・ディスプレイにより得られたＩｇＡ腎症患者で発現量が上昇していた断片の塩基配列は、上記イントロン由来の配列中にあることから、ＩｇＡ腎症患者ではこのような異常なスプライシングを起こしたｍＲＮＡが上昇していることがわかった。この異常なスプライシングを起こしたｍＲＮＡから翻訳される蛋白質は、本来のＩＮＰ０６３−７遺伝子がコードする蛋白質（９６３アミノ酸）とは３４２番目以降のアミノ酸配列が異なっており、本来の機能を発揮していない可能性が高い。
実施例４  本発明の蛋白質に対するポリクローナル抗体の作製
（１）抗原の調製
各蛋白質のアミノ酸配列を解析し、親水性の高い部分、Ｎ末端およびＣ末端のアミノ酸配列の中からペプチド抗原として適当と考えられる部分を選択して、化合物１から８（配列番号１１４から１２１）を合成した。化合物の理化学的性質は次の方法により測定した。
質量分析は、日本電子ＪＭＳ−ＨＸ１１０Ａを用いＦＡＢ−ＭＳ法により行った。アミノ酸分析は、コーエン（Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．Ａ．）らの方法〔Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２２２，１９（１９９４）〕により行った。加水分解は塩酸蒸気中１１０℃で２０時間行い、加水分解物のアミノ酸組成はウォーターズ・アキュ・タグ（Ｗａｔｅｒｓ  ＡｃｃＱ−Ｔａｇ）アミノ酸分析計（Ｗａｔｅｒｓ社製）を用い分析した。
（ｉ）  配列番号１１４に記載のアミノ酸配列を有するペプチド（化合物１）の合成
配列番号３７、３８の蛋白質に対する抗体を作製するために、該蛋白質のＣ末端１４アミノ酸残基に相当するアミノ酸配列を有するペプチドを下記の方法で合成した。
Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｌ−イソロイシン（以下、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅと略す）２５μｍｏｌが結合した担体樹脂（Ｗａｎｇ  樹脂、ノバビオケム社製）５２．１ｍｇを自動合成機（ＡＣＴ社製）の反応容器に入れ、０．５ｍｌのＤＭＦを加えて３分間攪拌した後溶液を排出し、続いて以下の操作を行った。
（ａ）  Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（以下、ＤＭＦと略す）にピペリジンを２５％添加した溶液（以下、２５％ピペリジン−ＤＭＦ溶液と略す）１ｍｌを加えて混合物を２分間攪拌し、該溶液を排出した。再度２５％ピペリジン−ＤＭＦ溶液１ｍｌを加えて混合物を１０分間攪拌し、該溶液を排出した。
（ｂ）  担体樹脂に１ｍｌのＤＭＦを加え１分間攪拌し、該溶液を排出した。この操作を６回繰り返した後、０．５ｍｌのＤＭＦで樹脂と反応容器を洗浄した。
こうして、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（以下、Ｆｍｏｃと略す）基を除去したＨ−Ｉｌｅの結合した担体樹脂を得た。
（ｃ）  得られた担体樹脂に対して、５００μｌのＤＭＦ、Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｌ−アスパラギン酸−β−ｔ−ブチルエステル〔以下、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨと略す〕とＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（以下、ＨＯＢｔと略す）・１水和物をそれぞれ０．５Ｍの濃度で含むＮ−メチルピロリドン（以下、ＮＭＰと略す）溶液２５０μｌおよびＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（以下、ＤＩＰＣと略す）を０．５Ｍの濃度で含むＮＭＰ溶液１２５μｌを加えて１０分間攪拌し、１分間静置した。１０分攪拌、１分静置のサイクルを４回繰り返した後、該溶液を排出した。
（ｄ）  担体樹脂に１ｍｌのＤＭＦを加え１分間攪拌し、該溶液を排出した。この操作を２回繰り返した。
（ｅ）  担体樹脂に対して、３７５μｌのＤＭＦ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨとＨＯＢｔ・１水和物をそれぞれ０．５Ｍの濃度で含むＮＭＰ溶液２５０μｌ、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム・ヘキサフルオロホスフェート（以下、ＨＢＴＵと略す）を０．５Ｍの濃度で含むＤＭＦ溶液２５０μｌおよびジイソプロピルエチルアミン（以下、ＤＩＥＡと略す）を２Ｍの濃度で含むＤＭＦ溶液１２５μｌを加えて１０分間攪拌し、１分間静置した。１０分間攪拌、１分間静置のサイクルを３回繰り返した後、該溶液を排出した。
（ｆ）  担体樹脂に１ｍｌのＤＭＦを加え１分間攪拌し、該溶液を排出した。この操作を２回繰り返した後、０．５ｍｌのＤＭＦで樹脂と反応容器を洗浄した。
該操作により、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｉｌｅの結合した担体樹脂を得た。
上記（ｆ）行程終了後、（ａ）（ｂ）のＦｍｏｃ基除去工程を行った。Ｆｍｏｃ基除去後、（ｃ）の工程でＦｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨのかわりにＮα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｏ−ｔ−ブチル−Ｌ−スレオニン〔以下、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨと略す〕を用いて縮合反応を行った。縮合反応後、（ｄ）の洗浄工程を経、（ｅ）の工程で再度Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨのかわりにＦｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨを用いて縮合反応を行い、（ｆ）の洗浄工程を行うことにより、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｉｌｅを担体上に合成した。
以下、工程（ｃ）（ｅ）において、Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｎｇ−２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル−Ｌ−アルギニン〔以下、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＯＨと略す〕、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｌ−フェニルアラニン（以下、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨと略す）、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｌ−グリシン（以下、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨと略す）、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミン酸−γ−ｔ−ブチルエステル〔以下、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（Ｏｔ−Ｂｕ）−ＯＨと略す〕、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＯＨ、Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｎε−ｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−リジン〔以下、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨと略す〕、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｌ−ロイシン（以下、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨと略す）、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｌ−プロリン（以下、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨと略す）、Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｓ−トリチル−Ｌ−システイン〔以下、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨと略す〕を順次用いて、（ａ）〜（ｆ）工程を繰り返した後、（ａ）（ｂ）のＦｍｏｃ基除去工程を行った。
得られた樹脂をメタノール、ブチルエーテルで順次洗浄し、減圧下１２時間乾燥して、側鎖保護ペプチドの結合した担体樹脂を得た。これに、トリフルオロ酢酸（以下、ＴＥＡと略す）８２．５％、チオアニソール５％、水５％、エチルメチルスルフィド３％、１，２−エタンジチオール２．５％およびチオフェノール２％からなる混合溶液１ｍｌを加えて室温で８時間放置し、側鎖保護基を除去するとともに樹脂よりペプチドを切り出した。樹脂を濾別後、得られた溶液にエーテル約１０ｍｌを加え、生成した沈澱を遠心分離およびデカンテーションにより回収し、粗ペプチドとして４９．０ｍｇを取得した。この粗生成物を２Ｍ酢酸水溶液に溶解後、逆相カラム（資生堂製、ＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫ  Ｃ１８  ３０ｍｍＩ．Ｄ．Ｘ２５０ｍｍ）を用いたＨＰＬＣで精製した。０．１％ＴＥＡ水溶液に、ＴＥＡ  ０．１％を含む９０％アセトニトリル水溶液を加えていく直線濃度勾配法で溶出し、２２０ｎｍで検出し、化合物１を含む画分を得た。この画分を凍結乾燥して、化合物１を１８．０ｍｇ得た。
質量分析〔ＦＡＢＭＳ〕；ｍ／ｚ＝１７９７．４（Ｍ＋Ｈ＋）
アミノ酸分析；Ａｓｘ  ２．１（２），Ｇｌｘ  １．１（１），Ｇｌｙ  １．０（１），Ａｒｇ  １．８（２），Ｔｈｒ  ２．０（２），Ｐｒｏ  ０．９（１），Ｃｙｓ  １．３（１），Ｌｙｓ  １．０（１），Ｉｌｅ  １．０（１），Ｌｅｕ  １．０（１），Ｐｈｅ  １．９（２）
（ｉｉ）  配列番号１１５に記載のアミノ酸配列を有するペプチド（化合物２）の合成
配列番号３７、３８の蛋白質に対する抗体を作製するために、該蛋白質の７３〜８７番目の１５アミノ酸残基に相当するアミノ酸配列を有するペプチドを下記の方法で合成した。
Ｆｍｏｃ−ＮＨ、２５μｍｏｌが結合した担体樹脂（Ｒｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ  ＭＢＨＡ樹脂、ノバビオケム社製）４５．５ｍｇを出発物質として、（１）‐（ｉ）と同様にして、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｏ−ｔ−ブチル−Ｌ−セリン〔以下、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨと略す〕、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｎγ−トリチル−Ｌ−アスパラギン〔以下、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨと略す〕、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨを順次縮合した後に、Ｆｍｏｃ基除去、洗浄、乾燥を経て、側鎖保護ペプチドの結合した担体樹脂を得た。（１）‐（ｉ）と同様にして側鎖保護基の切断ならびに樹脂からの切り出しを行い、粗ペプチド、６７．１ｍｇを取得し、逆相方ラムを用いたＨＰＬＣで精製し、化合物２を３０．８ｍｇ得た。
質量分析［ＦＡＢＭＳ〕；ｍ／ｚ＝２０１３．１（Ｍ＋Ｈ＋）
アミノ酸分析；Ａｓｘ  １．０（１），Ｓｅｒ  １．８（２），Ｇｌｘ  ３．２（３），Ａｒｇ  １．９（２），Ｃｙｓ  １．３（１），Ｌｙｓ  ３．０（３），Ｌｅｕ  １．９（２），Ｐｈｅ  ２．０（２）
（ｉｉｉ）  配列番号１１６に記載のアミノ酸配列を有するペプチド（化合物３）の合成
配列番号３７、３８の蛋白質に対する抗体を作製するために、該蛋白質の１０４〜１１６番目の１４アミノ酸残基に相当するアミノ酸配列を有するペプチドを下記の方法で合成した。
Ｆｍｏｃ−ＮＨ、２５μｍｏｌが結合した担体樹脂（Ｒｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ  ＭＢＨＡ樹脂、ノバビオケム社製）４５．５ｍｇを出発物質として、（１）‐（ｉ）と同様にして、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｌ−バリン（以下、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨと略す）、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｎｉｎｄ−ｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−トリプトファン〔以下、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨと略す〕、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｎｉｍ−トリチル−Ｌ−ヒスチジン〔Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ〕、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｌ−アラニン（以下、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨと略す）、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨを順次縮合した後に、Ｆｍｏｃ基除去、洗浄、乾燥を経て、側鎖保護ペプチドの結合した担体樹脂を得た。これに２−メチルインドールを５ｍｇ／ｍｌの濃度で含むＴＦＡ（９０％）、チオアニソール（５％）、１，２−エタンジチオール（５％）からなる混合溶液１ｍｌを加えて室温で２時間放置し側鎖保護基の切断ならびに樹脂からの切り出しを行った。その後は（１）‐（ｉ）と同様にして粗ペプチド、５０．６ｍｇを取得し、逆相カラムを用いたＨＰＬＣで精製し、化合物３を６．６ｍｇ得た。
質量分析〔ＦＡＢＭＳ〕；ｍ／ｚ＝１７９２．５（Ｍ＋Ｈ＋）
アミノ酸分析；Ｓｅｒ  １．０（１），Ｇｌｘ  ３．０（３），Ｇｌｙ  ２．２（２），Ｈｉｓ  ０．８（１），Ａｌａ  ０．８（１），Ｃｙｓ  １．１（１），Ｖａｌ  １．１（１），Ｌｙｓ  ２．１（２），Ｐｈｅ  １．１（１），Ｔｒｐは分析せず
（ｉｖ）  配列番号１１７に記載のアミノ酸配列を有するペプチド（化合物４）の合成
配列番号３４の蛋白質に対する抗体を作製するために、該蛋白質のＣ末端１５アミノ酸残基に相当するアミノ酸配列を有するペプチドを下記の方法で合成した。Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ、２５μｍｏｌが結合した担体樹脂（Ｗａｎｇ樹脂、ノバビオケム社製）４９．０ｍｇを出発物質として、（１）‐（ｉ）と同様にして、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨを順次縮合した後に、Ｆｍｏｃ基除去、洗浄、乾燥を経て、側鎖保護ペプチドの結合した担体樹脂を得た。（１）‐（ｉ）と同様にして側鎖保護基の切断ならびに樹脂からの切り出しを行い、粗ペプチド、４１．２ｍｇを取得し、逆相方ラムを用いたＨＰＬＣで精製し、化合物４を１４．６ｍｇ得た。
質量分析〔ＦＡＢＭＳ〕；ｍ／ｚ＝１９０５．８（Ｍ＋Ｈ＋）
アミノ酸分析；Ａｓｘ  １．０（１），Ｓｅｒ  ０．９（１），Ｇｌｘ  １．０（１），Ｇｌｙ  １．１（１），Ｈｉｓ  １．１（１），Ａｒｇ  ０．９（１），Ｃｙｓ  １．３（１），Ｖａｌ  １．０（１），Ｌｙｓ  ２．１（２），Ｉｌｅ  １．８（２），Ｌｅｕ  １．９（２），Ｐｈｅ  ２．２（２）
（ｖ）  配列番号１１８に記載のアミノ酸配列を有するペプチド（化合物５）の合成
配列番号３５の蛋白質に対する抗体を作製するために、該蛋白質のＣ末端１４アミノ酸残基に相当するアミノ酸配列を有するペプチドを下記の方法で合成した。
Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、２５μｍｏｌが結合した担体樹脂（Ｗａｎｇ樹脂、ノバビオケム社製）４２．４ｍｇを出発物質として、（１）‐（ｉ）と同様にして、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｌ−メチオニン（以下、Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨと略す）、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨを順次縮合した後に、Ｆｍｏｃ基除去、洗浄、乾燥を経て、側鎖保護ペプチドの結合した担体樹脂を得た。（１）‐（ｉ）と同様にして側鎖保護基の切断ならびに樹脂からの切り出しを行い、粗ペプチド、４８．４ｍｇを取得し、逆相カラムを用いたＨＰＬＣで精製し、化合物５を１９．０ｍｇ得た。
質量分析〔ＦＡＢＭＳ〕；ｍ／ｚ＝１７０８．９（Ｍ＋Ｈ＋）
アミノ酸分析；Ｓｅｒ２．８（３），Ｇｌｘ  １．１（１），Ｇｌｙ  １．１（１），Ａｒｇ  ２．１（２），Ｔｈｒ  １．０（１），Ｃｙｓ  １．３（１），Ｍｅｔ  ０．４（１），Ｌｙｓ  ２．１（２），Ｌｅｕ  ３．０（３）
（ｖｉ）  配列番号１１９に記載のアミノ酸配列を有するペプチド（化合物６）の合成
配列番号４０の蛋白質に対する抗体を作製するために、該蛋白質のＣ末端１３アミノ酸残基に相当するアミノ酸配列を有するペプチドを下記の方法で合成した。
Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、２５μｍｏｌが結合した担体樹脂（Ｗａｎｇ樹脂、ノバビオケム社製）４２．４ｍｇを出発物質として、（１）‐（ｉ）と同様にして、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨを順次縮合した後に、Ｆｍｏｃ基除去、洗浄、乾燥を経て、側鎖保護ペプチドの結合した担体樹脂を得た。これにＴＦＡ（９０％）、チオアニソール（５％）、１，２−エタンジチオール（５％）からなる混合溶液１ｍｌを加えて室温で２時間放置し、側鎖保護基の切断ならびに樹脂からの切り出しを行った。その後は（１）‐（ｉ）と同様にして粗ペプチド３２．８ｍｇを取得し、逆相カラムを用いたＨＰＬ２Ｃで精製し、化合物６を１１．０ｍｇ得た。
質量分析〔ＦＡＢＭＳ〕；ｍ／ｚ＝１４３４．７（Ｍ＋Ｈ＋）
アミノ酸分析；Ａｓｘ  １．１（１），Ｓｅｒ  １．９（２），Ｇｌｙ  １．１（１），Ｔｈｒ  ２．０（２），Ｃｙｓ  １．２（１），Ｖａｌ  ２．１（３），Ｌｙｓ  １．１  （１），Ｉｌｅ  ２．３（２），Ｌｅｕ  １．１（１）
（ｖｉｉ）  配列番号１２０に記載のアミノ酸配列を有するペプチド（化合物７）の合成
配列番号３９の蛋白質に対する抗体を作製するために、該蛋白質の６５〜７９番目の１５アミノ酸残基に相当するアミノ酸配列を有するペプチドを下記の方法で合成した。
Ｆｍｏｃ−ＮＨ、２５μｍｏｌが結合した担体樹脂（Ｒｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ  ＭＢＨＡ樹脂、ノバビオケム社製）４５．５ｍｇを出発物質として、（１）‐（ｉ）と同様にして、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｏ−ｔ−ブチル−Ｌ−チロシン〔以下、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨと略す〕、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｌ−アラニン（以下、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨと略す）、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨを順次縮合した後に、Ｆｍｏｃ基除去、洗浄、乾燥を経て、側鎖保護ペプチドの結合した担体樹脂を得た。（１）‐（ｉ）と同様にして側鎖保護基の切断ならびに樹脂からの切り出しを行い、粗ペプチド４２．４ｍｇを取得し、逆相カラムを用いたＨＰＬＣで精製し、化合物７を１２．１ｍｇ得た。
質量分析〔ＦＡＢＭＳ〕；ｍ／ｚ＝１８４９．７（Ｍ＋Ｈ＋）
アミノ酸分析；Ｓｅｒ  ０．９（１），Ｇｌｘ  １．０（１），Ｇｌｙ  １．０（１），Ｈｉｓ  ０．７（１），Ａｒｇ  ２．０（２），Ｔｈｒ  ０．９（１），Ａｌａ  １．９（２），Ｐｒｏ  １．０（１），Ｃｙｓ  １．４（１），Ｔｙｒ  １．７（１），Ｖａｌ  ０．７（１），Ｌｙｓ  ２．１（２），Ｐｈｅ  １．１（１）
（ｖｉｉｉ）  配列番号１２１に記載のアミノ酸配列を有するペプチド（化合物８）の合成
配列番号３６の蛋白質に対する抗体を作製するために、該蛋白質のＣ末端１５アミノ酸残基に相当するアミノ酸配列を有するペプチドを下記の方法で合成した。
Ｈ−Ｐｒｏ、２５μｍｏｌが結合した担体樹脂（クロロトリチル樹脂、ノバビオケム社製）６１．０ｍｇを出発物質として、ジクロロメタン１ｍｌで樹脂を洗浄した後に（１）‐（ｉ）の工程（ｃ）から合成を始める以外は（１）‐（ｉ）と同様にして、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｎε−トリチル−Ｌ−グルタミン〔以下、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨと略す〕、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（Ｂｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨを順次縮合した後に、Ｆｍｏｃ基除去、洗浄、乾燥を経て、側鎖保護ペプチドの結合した担体樹脂を得た。Ｉ−６と同様にして側鎖保護基の切断ならびに樹脂からの切り出しを行い、（１）‐（ｉ）と同様に粗ペプチド５３．１ｍｇを取得し、逆相カラムを用いたＨＰＬＣで精製し、化合物８を２３．４ｍｇ得た。
質量分析〔ＦＡＢＭＳ〕；ｍ／ｚ＝１８３３．６（Ｍ＋Ｈ＋）
アミノ酸分析；Ａｓｘ  ２．１（２），Ｇｌｘ  ２．１（２），Ｇｌｙ  １．１（１），Ｔｈｒ  ０．９（１），Ｐｒｏ  １．０（１），Ｃｙｓ  １．４（１），Ｔｙｒ  １．０（１），Ｖａｌ  ０．９（１），Ｌｙｓ  １．９（２），Ｉｌｅ  １．０（１），Ｌｅｕ  ２．９（３）
（２）免疫原の調製
免疫原性を高める目的で、上記（１）で得られた化合物１〜８とＫＬＨ（カルビオケム社製）とのコンジュゲートを、以下の方法で作製し、免疫原として用いた。
即ち、ＫＬＨをＰＢＳに溶解して１０ｍｇ／ｍｌに調整し、１／１０容量の２５ｍｇ／ｍｌ  ＭＢＳ（ナカライテスク社製）を滴下して３０分間撹拌反応させた。
予めＰＢＳで平衡化しておいたセファデックスＧ−２５カラムを用い、未反応のＭＢＳを除いた。
得られた２．５ｍｇのＫＬＨ−ＭＢを、化合物１〜８各々１ｍｇを溶解した０．１Ｍりん酸ナトリウムバッファー（ＰＨ７．０）に添加、混合し、室温で３時間、攪拌反応させた。
反応後、該反応液をＰＢＳ中で透析した。
（３）動物の免疫とポリクローナル抗体の作製
上記（２）で調製した各化合物のＫＬＨコンジュゲート１００μｇをアルミニウムゲル２ｍｇおよび百日咳ワクチン（千葉県血清研究所製）１×１０９細胞とともに５週令雌ラット（ＳＤ）に投与し、２週間後より１００μｇのコンジュゲートを１週間に１回、計４回投与した。眼底静脈叢より採血し、その血清抗体価を以下に示す酵素免疫測定法で調べ、十分な抗体価を示したラットから全採血により血清を採取した。
（４）酵素免疫測定法
アッセイ用の抗原には上記（１）で得られた各化合物をサイログロブリン（以下、ＴＨＹと略す。）とコンジュゲートしたものを用いた。作製方法は上記（２）に記した通りであるが、架橋剤にはＭＢＳの代わりにＳＭＣＣ（シグマ社製）を用いた。９６穴のＥＩＡ用プレート（グライナー社製）に、上述のように調製したコンジュゲートを１０μｇ／ｍｌ、５０μｌ／穴で分注し、４度で一晩放置して吸着させた。洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳを１００μｌ／穴で加え、室温１時間反応させて残っている活性基をブロックした。１％ＢＳＡ−ＰＢＳを捨て、被免疫ラット抗血清を５０μｌ／穴で分注し２時間反応させた。ＰＢＳにＴｗｅｅｎを０．０５％添加した溶液（以下０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳと略す）で洗浄後、ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ラットイムノグロブリン（ダコ社製）を５０μｌ／穴で加えて室温、１時間反応させ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後ＡＢＴＳ基質液〔２．２−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾール−６−スルホン酸）アンモニウム〕を用いて発色させＯＤ４１５ｎｍの吸光度をプレートリーダー（Ｅ−ｍａｘ；和光純薬）で測定した。
結果を第１〜８図に示した。いずれの抗血清も免疫原として用いた化合物に特異的な反応性を示した。
産業上の利用可能性
本発明により得られるＤＮＡ、蛋白質および抗体を用いることによりＩｇＡ腎症の診断、治療が可能である。
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配列番号１１３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１１４−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号１１５−アミデーション、クルタミン酸アミド
配列番号１１６−アミデーション、グリシンアミド
配列番号１１７−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号１１８−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号１１９−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号１２０−アミデーション、リジンアミド
配列番号１２１−人工配列の説明：合成ペプチド
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図は、配列番号１１４に記載のアミノ酸配列を有するペプチド（化合物１）とＫＬＨ（カルビオケム社製）とのコンジュゲートで免疫し、取得したラット抗血清の該化合物１に対する結合反応性を、酵素免疫測定法により調べた結果を示す図である。左に化合物１に対する結合反応性、右にコントロールペプチドに対する結合反応性の結果を示した。Ｒ１〜３は化合物１で免疫した３匹のラットの抗血清を、ＮＲＳは正常ラット血清をそれぞれ示す。
第２図は、配列番号１１５に記載のアミノ酸配列を有するペプチド（化合物２）とＫＬＨとのコンジュゲートで免疫し、取得したラット抗血清の該化合物２に対する結合反応性を、酵素免疫測定法により調べた結果を示す図である。左に化合物２に対する結合反応性、右にコントロールペプチドに対する結合反応性の結果を示した。Ｒ１〜３は化合物２で免疫した３匹のラットの抗血清を、ＮＲＳは正常ラット血清をそれぞれ示す。
第３図は、配列番号１１６に記載のアミノ酸配列を有するペプチド（化合物３）とＫＬＨとのコンジュゲートで免疫し、取得したラット抗血清の該化合物３に対する結合反応性を、酵素免疫測定法により調べた結果を示す図である。左に化合物３に対する結合反応性、右にコントロールペプチドに対する結合反応性の結果を示した。Ｒ１〜３は化合物３で免疫した３匹のラットの抗血清を、ＮＲＳは正常ラット血清をそれぞれ示す。
第４図は、配列番号１１７に記載のアミノ酸配列を有するペプチド（化合物４）とＫＬＨとのコンジュゲートで免疫し、取得したラット抗血清の該化合物４に対する結合反応性を、酵素免疫測定法により調べた結果を示す図である。左に化合物４に対する結合反応性、右にコントロールペプチドに対する結合反応性の結果を示した。Ｒ１〜３は化合物４で免疫した３匹のラットの抗血清を、ＮＲＳは正常ラット血清をそれぞれ示す。
第５図は、配列番号１１８に記載のアミノ酸配列を有するペプチド（化合物５）とＫＬＨとのコンジュゲートで免疫し、取得したラット抗血清の該化合物５に対する結合反応性を、酵素免疫測定法により調べた結果を示す図である。左に化合物５に対する結合反応性、右にコントロールペプチドに対する結合反応性の結果を示した。Ｒ１〜３は化合物５で免疫した３匹のラットの抗血清を、ＮＲＳは正常ラット血清をそれぞれ示す。
第６図は、配列番号１１９に記載のアミノ酸配列を有するペプチド（化合物６）とＫＬＨとのコンジュゲートで免疫し、取得したラット抗血清の該化合物６に対する結合反応性を、酵素免疫測定法により調べた結果を示す図である。左に化合物６に対する結合反応性、右にコントロールペプチドに対する結合反応性の結果を示した。Ｒ１〜３は化合物６で免疫した３匹のラットの抗血清を、ＮＲＳは正常ラット血清をそれぞれ示す。
第７図は、配列番号１２０に記載のアミノ酸配列を有するペプチド（化合物７）とＫＬＨとのコンジュゲートで免疫し、取得したラット抗血清の該化合物７に対する結合反応性を、酵素免疫測定法により調べた結果を示す図である。左に化合物７に対する結合反応性、右にコントロールペプチドに対する結合反応性の結果を示した。Ｒ１〜３は化合物７で免疫した３匹のラットの抗血清を、ＮＲＳは正常ラット血清をそれぞれ示す。
第８図は、配列番号１２１に記載のアミノ酸配列を有するペプチド（化合物８）とＫＬＨとのコンジュゲートで免疫し、取得したラット抗血清の該化合物８に対する結合反応性を、酵素免疫測定法により調べた結果を示す図である。左に化合物８に対する結合反応性、右にコントロールペプチドに対する結合反応性の結果を示した。Ｒ１〜３は化合物８で免疫した３匹のラットの抗血清を、ＮＲＳは正常ラット血清をそれぞれ示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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