(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
或る化合物が、カルボキシメチルリジン修飾後生的糖化最終産物（ＡＧＥ）と後生的糖化最終産物受容体（ＲＡＧＥ）の相互作用を阻害することが可能かどうかを決定する方法であって、
(a)(i) カルボキシメチルリジン修飾ＡＧＥ、
(ii) カルボキシメチルリジン修飾ＡＧＥに結合するＲＡＧＥ又はその断片、および
(iii) 前記化合物
を混合することと；
(b) 前記ＲＡＧＥ又はその断片と結合した前記カルボキシメチルリジン修飾ＡＧＥの量を測定することと；
(c) 工程（b）で測定されたカルボキシメチルリジン修飾ＡＧＥの結合量を、前記カルボキシメチルリジン修飾ＡＧＥが前記化合物の非存在で前記ＲＡＧＥ又はその断片と混合されたときに測定された量と比較することにより、前記化合物が前記カルボキシメチルリジン修飾ＡＧＥとＲＡＧＥ又はその断片との相互作用を阻害することができるかどうかを決定することとを含み、
前記化合物の存在下で前記結合量が減少することによって、前記化合物が前記相互作用を阻害することができることが示される方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記工程(a)(ii)のＲＡＧＥ又はその断片はＲＡＧＥの断片である方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、前記ＲＡＧＥの断片はＲＡＧＥのＶ領域のアミノ酸配列を含んでなる方法。
【請求項４】
請求項２に記載の方法であって、前記ＲＡＧＥの断片はＲＡＧＥのＶ領域のアミノ酸配列である方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、前記工程(a)(ii)のＲＡＧＥ又はその断片は合成されたものである方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、前記化合物は天然に存在する後生的糖化最終産物の可溶型受容体（ｓＲＡＧＥ）の断片を含む方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって、前記化合物は有機分子である方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、前記化合物はポリペプチド、核酸、又は無機化学物質である方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法であって、前記化合物は抗体又はその断片である方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、前記抗体はポリクローナル又はモノクローナル抗体である方法。
【請求項１１】
請求項９に記載の方法であって、前記抗体はヒト化、キメラ化、又は霊長類化された抗体である方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法であって、前記カルボキシメチルリジン修飾ＡＧＥは固相表面に固定された方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の方法であって、前記ＲＡＧＥ又はその断片が固相表面に固定された方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の方法であって、前記カルボキシメチルリジン修飾ＡＧＥは検出可能にラベルされた方法。
【請求項１５】
請求項１に記載の方法であって、前記ＲＡＧＥまたはその断片は検出可能にラベルされた方法。
【請求項１６】
請求項１４または１５に記載の方法であって、前記検出可能なラベルは、蛍光、ビオチン、又は放射能を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】
この出願は、1998年10月5日出願の米国出願 SN.09/166,649の優先権を主張する。この親出願の内容は参照によりこの開示に援用される。
【０００２】
ここに開示される発明は、合衆国保健社会福祉省からのNIH交付番号AG00602による政府支援によってなされた。従って、合衆国政府は本発明に関して一定の権利を有する。
【０００３】
【発明の背景】
本発明を通して、様々な刊行物が、著者及び日付によって本文中に引用されている。これら刊行物の完全な引用は、本明細書の最後にアルファベット順で列挙されている。これら刊行物の開示の全体は、ここに開示し且つ請求範囲に記載の発明がなされた日に当業者に公知であった技術の状態をさらに完全に記述するために、本明細書の一部として本願に援用される。
【０００４】
タンパク質の糖化及び酸化による産物である後生的糖化最終産物（AGEs）は、老化、糖尿病、及び腎不全などの硬化で蓄積する構造をした不均一な群である（1-2）。AGEsはミエロペルオキシダーゼ経路によって始動され、オイグリセミックな炎症性の環境で形成され得ることが報告されている（3）。AGEsは、細胞の完全性及びバリヤー特性の減弱（たとえば進行性のグリコキシデーション(glycoxidation)及びタンパク質の重要な構造の架橋によって媒介される）を起こすことを含む、細胞特性の変化と関連していた。さらに、AGEsは、特異的な細胞表面結合部位と相互作用して、炎症性細胞のシグナル伝達経路、特に細胞のオキシダントストレスの増強に反応する経路の活性化に連動した方法で、細胞の特性を調節する。細胞表面のAGEs相互作用部位は多数同定されたが、細胞の最も特徴づけられたAGE相互作用部位は、免疫グロブリンスーパーファミリーの一員であるAGE受容体（RAGE）である(4-9)。
【０００５】
AGEがRAGEに結合することにより細胞の特性が乱されて、結果として血管病巣の発達を助長する環境を生じ、並びに糖尿病などの病気で起こる合併症の一因となるであろう前炎症性の宿主応答を悪化させる（10-23）。
【０００６】
【発明の概要】
本発明は、或る化合物が、ペプチドと後生的糖化最終産物受容体（RAGE）の相互作用を阻害することが可能かどうかを決定する方法であって、
(a)(i) 前記ペプチドのアミノ基が化学的な誘導体化によって不活化された
ペプチド、
(ii) RAGE又はその断片、および
(iii) 前記化合物
を混合することと；
(b) 前記RAGE又はその断片と結合した前記ペプチドの量を測定することと；
(c) 工程（b）で測定されたペプチドの結合量を、前記ペプチドが前記化合物の非存在で前記RAGE又はその断片と混合されたときに測定された量と比較することにより、前記化合物が前記ペプチドとRAGE又はその断片との相互作用を阻害することができるかどうかを決定することとを含み、
前記化合物の存在下で前記結合量が減少することによって、前記化合物が前記相互作用を阻害することができることが示される方法を提供する。
【０００７】
また、本発明は、患者において、後生的糖化最終産物（AGE）と後生的糖化最終産物受容体（RAGE）の相互作用を阻害する方法であって、患者においてAGEとRAGEの相互作用を阻害するのに有効な、上記スクリーニング法によって同定された化合物のある量を患者に投与することを含む方法も提供する。本発明は、前記スクリーニング法によって同定され、且つ糖尿病患者の治療に有用な化合物も提供する。
【０００８】
【発明の詳細な記述】
以下の略語がここで使用される。：CML―カルボキシメチル-リジン；AGE―後生的糖化最終産物；RAGE―後生的糖化最終産物受容体；sRAGE―可溶型後生的糖化最終産物受容体。
【０００９】
本発明は、化合物がペプチドと後生的糖化最終産物受容体（RAGE）の相互作用を阻害することが可能かどうかを決定する方法であって、
(a)(i) 前記ペプチドのアミノ基が化学的な誘導体化によって不活化されたペプチド、
(ii) RAGE又はその断片、および
(iii) 前記化合物
を混合することと；
(b) 前記RAGE又はその断片と結合した前記ペプチドの量を測定することと；
(c) 工程（b）で測定されたペプチドの結合量を、前記ペプチドが前記化合物の非存在で前記RAGE又はその断片と混合されたときに測定された量と比較することにより、前記化合物が前記ペプチドとRAGE又はその断片との相互作用を阻害することができるかどうかを決定することとを含み、
前記化合物の存在下で前記結合量が減少することによって、前記化合物が前記相互作用を阻害することができることが示される方法を提供する。
【００１０】
本発明は、化合物がペプチドと後生的糖化最終産物受容体（RAGE）の相互作用を阻害することが可能な化合物をスクリーニングする方法であって、
(a)(i) 前記ペプチドのアミノ基が化学的な誘導体化によって不活化されたペプチド、
(ii) RAGE又はその断片、および
(iii) 前記化合物
を混合することと；
(b) 前記RAGE又はその断片と結合した前記ペプチドの量を測定することと；
(c) 工程（b）で測定されたペプチドの結合量を、前記ペプチドが前記化合物の非存在で前記RAGE又はその断片と混合されたときに測定された量と比較することにより、前記ペプチドとRAGE又はその断片との相互作用を阻害することができる化合物を同定することとを含む方法を提供する。
【００１１】
一つの態様において、前記ペプチドは後生的糖化最終産物（AGE）、又はその断片である。他の態様において、前記ペプチドはカルボキシメチル修飾ペプチドである。たとえば、ペプチドはカルボキシメチルリジン修飾AGEであってもよい。他の態様において、前記ペプチドは合成ペプチドである。
【００１２】
ここで使用する「RAGE又はその断片」は、Neeper et al.(1992)に示されたRAGEの全長アミノ酸配列を有するペプチドを包含する。前記RAGEの「断片」は、長さが少なくとも5アミノ酸、好ましくは長さが7アミノ酸以上であるが、Neeper et al.(1992)に示された全長よりも短い。一つの態様において、前記RAGEの断片は、Neeper et al.(1992)に記述された120アミノ酸領域のV-領域を含む。たとえば、前記RAGEの断片は、RAGEのV-領域のアミノ酸配列を有してもよい。
【００１３】
前記スクリーニング法の一つの態様として、ペプチドの誘導体化による不活性化は化学的修飾による。工程(a)(i)の他のペプチド誘導体はアリル誘導体を含み、アリル誘導体の一例にはベンゾイル誘導体を含む。工程(a)(i)の他のペプチド誘導体はアルキル誘導体を含み、アルキル誘導体の例にはアセチル誘導体、プロピル誘導体、イソプロピル誘導体、ブチル誘導体、イソブチル誘導体又はカルボキシメチル誘導体を含む。
【００１４】
一つの態様として、前記スクリーニング方法の工程(a)(ii)におけるRAGE又はその断片は、合成されたものである。他の態様において、前記化合物は実効陰電荷又は実効陽電荷を持つ。さらなる態様において、前記化合物は天然に存在する後生的糖化最終産物の可溶型受容体（sRAGE）の断片を含む。
【００１５】
前記スクリーニング法によって同定された化合物は、様々なタイプの化合物を含む。たとえば、一つの態様において、前記化合物は擬似ペプチドである。他の態様において、前記化合物は有機分子である。さらなる態様において、前記化合物は、ポリペプチド、核酸、又は無機化学物質である。さらに、前記化合物は、分子量が10000ダルトンよりも小さい。他の態様において、前記化合物は、抗体又はその断片である。前記抗体はポリクローナル又はモノクローナル抗体であってよい。さらに、前記抗体は、ヒト化、キメラ化、霊長類化されてもよい。他の態様において、化合物は変異AGEもしくはその断片、又は変異RAGEもしくはその断片である。
【００１６】
前記スクリーニング法はインビトロで行われてもよく、その場合、一以上の成分を固相表面に付着するかもしくは固定するか、又は前記工程aの化合物は細胞内で混合されるか、又は前記工程（a）の化合物は生体（特にトランスジェニックマウス）内で混合される。たとえば、前記ペプチドは固相表面に固定されてもよい。他の態様において、前記RAGE又はその断片は固相表面に固定される。
【００１７】
一つの態様においては、前記ペプチドが検出可能にラベルされる。他の態様においては、前記RAGE又はその断片が検出可能にラベルされる。前記検出可能なラベルは、蛍光、ビオチン、又は放射能を含む。
【００１８】
前記スクリーニング法の他の態様において、工程（a）の混合は細胞内で起こる。前記スクリーニング法の他の態様において、工程（a）の混合は動物内で起こる。たとえば、前記動物はRAGEを過剰発現するトランスジェニックマウス、又はRAGEを発現しないトランスジェニックマウスである。
【００１９】
本発明は、患者において、後生的糖化最終産物（AGE）と後生的糖化最終産物受容体（RAGE）の相互作用を阻害する方法であって、患者においてAGEとRAGEの相互作用の阻害に有効な該患者のAGEとRAGEの相互作用を効果的に阻害する、上記スクリーニング法によって同定された化合物のある量を患者に投与することを含む方法も提供する。
【００２０】
一例として、前記患者はヒト、霊長類、マウス、ラット、又はイヌである。他の態様において、前記投与は、病変局部内、腹腔内、筋肉内、もしくは静脈内への注射；輸液；リポソームを介したデリバリー；又は局所的、鼻腔内、経口、眼内、もしくは耳内デリバリーである。さらなる例として前記化合物が毎時、毎日、毎週、毎月、又は毎年投与される。他の例として、前記化合物の有効量は約0.000001mg/kg体重〜約100mg/kg体重である。
【００２１】
一つの態様において、前記患者は腎臓疾患に罹患している。他の態様において、前記患者は糖尿病に罹患している。さらなる態様において、前記患者は全身性エリテマトーデス、または炎症性腎炎に罹患している。他の態様において、前記患者は、肥満患者（たとえば、アメリカ医学界の推薦する身長/体重の表を越えている）である。他の態様において、前記患者は、老人患者である（たとえば50歳、又は好ましくは60歳を越えた人）である。他の態様において、前記患者は、アミロイドーシスに罹患している。さらなる態様において、前記患者は炎症に罹患している。
【００２２】
他の態様において、患者において、後生的糖化最終産物（AGE）と後生的糖化最終産物受容体（RAGE）の相互作用を阻害する方法には、患者に化合物を投与する際に、薬学的に許容可能なキャリアを患者に投与することをさらに含む。
【００２３】
一つの態様において、前記キャリアは賦形剤を含む。他の態様において、前記キャリアは、ウイルス、リポソーム、マイクロカプセル、ポリマーで包まれた細胞、又はレトロウイルスベクターを含む。他の態様において、前記キャリアはエアロゾル用、静脈内用、経口用、又は局所用キャリアである。たとえば、前記化合物はタイムリリース移植で投与される。
【００２４】
本発明は、前記スクリーニングによって同定され、且つ糖尿病患者の治療に有用な化合物も提供する。本発明は、前記スクリーニングによって同定された、全身性エリテマトーデス、又は炎症性腎炎の患者の治療に有用な化合物も提供する。本発明は、前記スクリーニングによって同定された、アミロイドーシスの患者の治療に有用な化合物も提供する。本発明は、前記スクリーニングによって同定された、炎症の患者の治療に有用な化合物も提供する。さらに、本発明は、前記スクリーニングによって同定された、以前に知られていない化合物を提供する。
【００２５】
RAGEの核酸配列及びアミノ酸配列は、Neeper, M., Schmidt, A. M., Brett, J., Yan, S.D., Wang, F., Pan, Y.C., Elliston, K., Stern, D.,及びShaw, A. Cloning and expression of RAGE: a cell surface receptor for sdvenced glycosylation end products of proteins. J. Biol. Chem. 267:14998-15004, 1992、として出版されており、前記内容は本明細書の一部として援用される。ヒトRAGEcDNAは1406塩基対であり、404アミノ酸の成熟タンパク質をコードする。Neeper et al .(1992)を参照。ここで使用される「RAGEのV−領域」は、Neeper et al .(1992)によって図4に示された1位から120位のアミノ酸を含む、図5に示されたV-領域にある免疫グロブリン様の可変領域をいう。RAGEタンパク質のAGEタンパク質結合部位を定義するために最小限必要とされるアミノ酸配列は、120アミノ酸よりもかなり少ないであろう。
【００２６】
可溶型RAGE（sRAGE）は、細胞膜から遊離したRAGEタンパク質である。たとえば、sRAGEは細胞膜に埋め込まれていない。一つの態様において、sRAGEは、膜結合型RAGEのアミノ酸配列のうち、細胞外にある3分の2を含む。
【００２７】
ここで使用される「誘導体化によって不活化される」とは、ペプチドのアミノ基に化学修飾がある場合に、このような化学修飾がない場合よりも反応性が小さくなるような、ペプチドの化学的な修飾を含む。このような化学的修飾の例には、ペプチドのアリル誘導体、又はペプチドのアルキル誘導体を作ることが含まれる。他の誘導体には、アセチル誘導体、プロピル誘導体、イソプロピル誘導体、ブチル誘導体、イソブチル誘導体、カルボキシメチル誘導体、ベンゾイル誘導体が含まれる。他の誘導体は、当業者の知るところであろう。
【００２８】
本発明の態様の一つは、ペプチドと、RAGEのAGE結合部位との相互作用を阻害することが可能な化合物（たとえば、V-領域又はAGEと結合するために必要とされる最小必要なアミノ酸配列）を同定するためのスクリーニングアッセイであって、(a)前記ペプチドと、RAGEのAGE結合部位の配列を有する第二のペプチドと、前記化合物とを混合することと、； (b) 前記第二のペプチドと結合した前記ペプチドの量を測定することと；(c) 工程（b）で測定されたペプチドの結合量を、前記ペプチドが前記化合物の非存在で測定された量と比較することにより、前記ペプチドと、RAGEのAGE結合部位との相互作用を阻害することができる前記化合物同定するスクリーニングアッセイである。
【００２９】
前記スクリーニングアッセイは、前記化合物の一方を固相表面に結合し且つ固定して実施してもよい。一つの態様においては、前記ペプチドが固相表面に固定される。他の態様においては、前記RAGEのAGE結合部位の配列を有する第二のペプチドが、固相表面に結合されるか、又は固定される。本態様に有用な固相表面は、当業者の知るところであろう。たとえば、固相表面の一つの態様は、ビーズ、カラム、プラスチックディッシュ、顕微鏡スライド、ナイロン膜などである。一つの態様において、前記固相表面を構成する材料は合成によるものである。
【００３０】
前記スクリーニングアッセイの工程（a）における成分の一方を、検出可能にラベルしてもよい。前記成分（前記化合物、前記ペプチド、又はRAGEもしくはその断片のいずれか）は、蛍光ラベル、ビオチン、ディグオキシジェン、放射活性原子、常磁性イオン、及び化学発光ラベルを含む検出可能な成分でラベルしてもよい。工程（a）の前記成分は、化学的、酵素的などの共有結合手段または他の適切な手段によって、酵素もしくは放射性同位体などでラベルしてもよい。
【００３１】
一つの態様において、前記患者はほ乳類である。他の態様において、前記患者は脊椎動物である。好ましい態様において、前記ほ乳類はヒトである。一例として、前記患者は糖尿病患者である。本発明の他の例では、前記患者は糖尿病、腎臓疾患、アミロイドーシス、老化、又は炎症に罹患している。前記患者は、アメリカ医学界の身長と体重基準によって定義される肥満患者でもよい。前記患者は、老人でもよい。前記患者は、ヒト、霊長類、ウマの患者、オピン患者、鳥類の患者、ウシ患者、ブタ、イヌ、ネコ、又はネズミの患者でもよい。
【００３２】
一つの態様において、前記患者は、AGE関連疾患に罹患している。他の態様において、このようなAGE関連疾患は脳、網膜、腎臓、血管系、心臓、又は肺に表れる。他の態様において、前記患者は、アルツハイマー病、又は患者内にAGEsが蓄積することによって表れる病気に罹患している。他の態様において、前記患者は、軟組織障害、視力の減退、心臓血管疾患、腎臓疾患などのような糖尿病の兆候に罹患している。このような兆候は、当業者の知知るところであろう。
【００３３】
前記化合物はポリペプチドである。前記ポリペプチドは、ペプチド、擬似ペプチド、合成ペプチド、天然ポリペプチドの誘導体、修飾ポリペプチド、ラベルされたポリペプチド、又は非天然ペプチドを含むポリペプチドであることができる。前記擬似ペプチドは、加速性アテロームに罹り易い患者の加速性アテロームを妨害することができる化合物を決定するために、様々な化合物の大規模なライブラリーをスクリーニングして同定しすればよい。前記ポリペプチドは、天然に見出されないキラリティー、特にD−アミノ酸又はL−アミノ酸を有する、非天然ポリペプチドであってもよい。
【００３４】
一つの態様において、前記化合物はアンタゴニストであり、この場合、前記アンタゴニストはAGEsよりも高い親和性でRAGEと結合して、AGEsの結合効果を競合的になくしてしまうことができる。
【００３５】
他の態様において、前記化合物は、RAGEの発現を阻害することができるリボザイムである。他の態様において、前記化合物は抗−RAGE抗体、抗−AGE抗体、抗−RAGEのV-領域抗体である。前記抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体でもよい。前記化合物は、このような抗体の断片であってもよい。
【００３６】
本発明の他の態様において、前記方法は、前記ポリペプチドを投与する際、患者に薬学的に許容可能なキャリアを投与することをさらに含んでもよい。前記投与は、病変局部内、腹腔内、筋肉内、もしくは静脈内への注射；輸液；リポソームを介したデリバリー；又は局所的、鼻腔内、経口、眼内、もしくは耳内デリバリーを含んでいてよい。さらなる態様において、前記投与は、気管支内投与、肛門又はクモ膜下内投与を含む。
【００３７】
前記化合物は、毎時、毎日、毎週、毎月、又は毎年（たとえばタイムリリース形式で）、又は一回のデリバリーとしてデリバリーされてもよい。前記デリバリーは持続的な、たとえば静脈内デリバリーでもよい。
【００３８】
前記化合物の有効量は、約0.000001mg/kg体重〜約100mg/kg体重を含んでよい。一つの態様において、前記有効量には、約0.001mg/kg体重〜約50mg/kg体重を含んでよい。他の態様において、前記有効量には、約0.01mg/kg体重〜約10mg/kg体重を含んでよい。実際の有効量は、前記化合物のサイズ、前記化合物の生物分解活性、前記化合物の生物活性、及び前記化合物の生体利用性に基づくであろう。前記化合物が急速に分解しないのであれば、生体利用性で且つ高い活性を持ち、効果を持つために少量しか必要とされないであろう。前記有効量は当業者の知るところであろう；また、それは前記化合物の形態、前記化合物のサイズ、及び前記化合物の生物活性にも依存するであろう。当業者は、化合物の活性テストをルーチンで実施して、バイオアッセイにおいて生物活性を測定ことにより、前記有効量を決定するであろう。
【００３９】
本発明の他の態様において、前記方法はさらに、前記ポリペプチドを投与する際に、患者に薬学的に許容可能なキャリアをさらに投与することを含んでもよい。前記投与は、病変局部内、腹腔内、筋肉内、もしくは静脈内への注射；輸液；リポソームを介したデリバリー；又は局所的、鼻腔内、経口、眼内、もしくは耳内デリバリーを含んでいてよい。
【００４０】
前記化合物は、毎時、毎日、毎週、毎月、又は毎年（たとえばタイムリリース形式で）、又は一回のデリバリーとしてデリバリーされてもよい。前記デリバリーは期間が連続したデリバリー、たとえば静脈内デリバリーでもよい。
【００４１】
前記化合物は、sRAGEの類似体ポリペプチドのようなsRAGEポリペプチドでもよい。このような類似体は、sRAGEの断片を含む。公開されたAlton et al.による出願(WO83/04053)の方法に従って、一致性又は一以上の残基位置（たとえば置換、末端及び中間付加、及び、欠失）の点で、ここで特定されるものとは異なる一次構造を有する微生物発現用のポリペプチドをコードする遺伝子を、容易に設計および製造することができる。あるいは、cDNA及びゲノム遺伝子の修飾は、周知の部位特異的突然変異技術により実施でき、sRAGEポリペプチドの類似体及び誘導体を作製するために使用できる。このような産物は、少なくともsRAGEの生物学的特性を共有しているが、他の特性は異なるであろう。例として、本発明の産物は、たとえば欠失によって短縮された産物；又は加水分解に対して安定な産物（したがって、天然に存在するものよりも長期に亘る効果または持続的な効果を有する）；或いは、一以上の潜在的なO-グリコシレーション、及び/又はN-グリコシレーション部位の欠失もしくは付加により改変された産物、又は一以上のシステイン残基が欠失され、又はたとえばアラニンもしくはセリン残基で置換されて、さらに容易に微生物系から活性型として単離され得る産物；又は一以上のチロシン残基がフェニルアラニンで置換されて、標的タンパク質もしくは標的細胞の受容体にさらに容易にもしくはより少なく結合する産物を含む。連続したアミノ酸配列、又はsRAGEの二次構造の一部のみを複製したポリペプチド断片も含まれ、このような断片は、sRAGEの特性を一つ有し、他の特性を有さない。本発明のポリペプチドの何れか一以上が治療上の有用性、又はその他の状況（たとえばsRAGEの拮抗作用の解析）において有用性を持つためには、活性を必要としないことは注目に値する。競合的アンタゴニストは、たとえばsRAGEの過剰生産を引き起こすには、非常に有用であろう。
【００４２】
天然に存在するタンパク質、糖蛋白質、及び核タンパク質のアミノ酸配列を実質上複製した合成ペプチドの免疫学的特性の報告は、本発明のペプチド類似体にも適応可能である。即ち、比較的低分子量のポリペプチドは、生理学的に重要なタンパク質（たとえばウイルス抗原、ポリペプチドホルモンなど）による免疫反応と同様の持続時間及び範囲をもった免疫反応に関与することが示された。このようなポリペプチドの免疫応答には、合成ペプチド類の生物学的及び免疫学的特性に関連して、免疫学的に活性な動物内で特異的抗体を形成させる刺激が含まれ[Lerner et al., Cell, 23, 309-310(1981); Ross et al., Nature, 294, 654-658(1981); Walter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA ,78, 4882-4886(1981); Wong et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA ,79,5322-5326(1982); Waron et al., Cell, 28, 395-404(1982); Dressman e al., Nature, 295, 185-160(1982); and Lerner, Scientific American, 248, 66-74(1983).Kaiser et al. Science, 223, 249-255(1984)も参照]、前記合成ペプチド類はペプチドホルモンの二次構造をほぼ共有するが、一次構造コンホメーションは共有しなくてもよい。
【００４３】
本発明の化合物は、少なくとも一部が非天然であり得る擬似ペプチド化合物でもよい。前記擬似ペプチド化合物は、sRAGEのアミノ酸配列の一部に似せた小分子でもよい。この擬似性によって、前記化合物は、増大した安定性、効能、有効性、及び生物有用性を有していてもよい。さらに、前記化合物は毒性が減少されていてもよい。前記擬似ペプチド化合物は腸粘膜透過性が増強されていてもよい。前記化合物は合成によって調製されてもよい。本発明の化合物は、L−、D−又は非天然のアミノ酸、アルファ、アルファ二置換アミノ酸、N-アルキル化アミノ酸、乳酸（アラニンの等電子類似体）を含んでもよい。前記化合物は、さらにトリフルオロチロシン、p-Cl−フェニルアラニン、p−Br−フェニルアラニン、ポリ−L−プロパルギルグリシン、ポリ−D,L-アリルグリシン、又はポリ−L−アリルグリシンを含んでもよい。
【００４４】
本発明の一つの態様は擬似ペプチド化合物であり、ここで該化合物は適切な擬似体で置換された結合、ペプチド骨格、又はアミノ酸を有する。適切なアミノ酸擬似体でもよい非天然アミノ酸の例には、β−アラニン、L−αー−アミノ酪酸、L−γ−アミノ酪酸、L−α−アミノイソ酪酸、L−ε−アミノカプロン酸、7−アミノヘプタン酸、L−アスパラギン酸、L−グルタミン酸、システイン（アセトアミンドメチル）、N-ε−Boc−N-α−CBZ−L−リジン、L−ノルバリン、N-α−Boc−N-δCBZ−L−オルニチン、N-α−Boc−N-CBZ−L−オルニチン、Boc−p−ニトロ−L−フェニルアラニン、Boc−ヒドロキシプロリン、Boc−L−チオプロリンが含まれる（Blondelle, et al.1994; Pinilla, et al. 1995）。
【００４５】
一つの態様において、前記化合物はペプチドであって、フリーのアミノ基が誘導体化によって不活化された化合物である。たとえば、前記ペプチドは、アリル誘導体、アルキル誘導体、又は酸無水物誘導体であってもよい。前記ペプチドはアセチル化されてもよい。前記ペプチドはその実効電荷が中和されるように誘導体化される。
【００４６】
他の態様において、前記化合物は、可溶型RAGE（sRAGE）又はその断片でよい。可溶型RAGEは、細胞表面に位置せず、且つ細胞膜に結合していない。
【００４７】
前記患者は、ほ乳類又は非ほ乳類でよい。前記患者はヒトでもよい。前記患者は、マウス、ラット、ウシ、サル、ウマ、ブタ、又はイヌであってよい。前記患者は、糖尿病患者でもよい。
【００４８】
前記化合物の投与は、病変局部内、腹腔内、筋肉内、もしくは静脈内への注射；輸液；リポソームを介したデリバリー；又は局所的、鼻腔内、経口、肛門、眼内、もしくは耳内デリバリーを含んでいてよい。前記投与は、一定の期間又は周期で、及び一定の間隔で、絶えず行ってもよい。前記キャリアは賦形剤、エアロソル用、局所用キャリア、水溶液、非水溶液、又は固体キャリアでもよい。
【００４９】
本発明は、患者において、後生的糖化最終産物（AGE）と後生的糖化最終産物受容体（RAGE）の相互作用を阻害する方法であって、該患者のAGEとRAGEの相互作用を阻害するのに有効なキニーネ、又はその誘導体のある量を患者に投与することを含む方法を提供する。一つの態様において、前記キニーネ及び前記誘導体は、全体の電荷がキニーネと同じである。
【００５０】
本発明は、患者において、後生的糖化最終産物（AGE）と後生的糖化最終産物受容体（RAGE）の相互作用を阻害する方法であって、該患者のAGEとRAGEの相互作用を阻害するのに有効なキニジン、又はその誘導体のある量を患者に投与することを含む方法も提供する。一つの態様において、前記誘導体は、キニジンとは異なる化学構造を有し、前記誘導体は全体の電荷がキニジンと同じである。
【００５１】
本発明の前記方法のいずれかの実施、又は前記医薬組成物のいずれかの調製において、「治療上有効な量」は、患者においてAGE/RAGEの相互作用を妨害することができる量である。従って、前記有効な量は、治療される患者、並びに治療される症状により変化するであろう。本発明の目的のために、前記投与方法は、皮膚投与、皮下、静脈内、非経口、経口、局所的、又はエアロゾルによるものが含むが、これらに限定されない。
【００５２】
ここで使用される、「適切な薬学的に許容可能なキャリア」の用語は、標準的な薬学的に許容可能なキャリア、たとえばリン酸緩衝溶液、水、油/水のエマルジョン又はトリグリセリドエマルジョンのようなエマルジョン、様々なタイプの湿潤剤、錠剤、コートされた錠剤、及びカプセルのいずれかを含む。静脈内、及び腹腔内投与に有用な許容可能であるトリグリセリドの一例は、イントラリピッド（Intralipid）として商業的に知られるトリグリセリドエマルジョンである。
【００５３】
一般に、このようなキャリアは、賦形剤、たとえば澱粉、ミルク、砂糖、あるタイプの粘土、グリコール、又はその他の既知の賦形剤を含む。このようなキャリアは、フレーバー、及び染色剤、又は他の成分を含んでいてもよい。
【００５４】
本発明は医薬組成物であって、適切な賦形剤、防腐剤、安定化剤、乳化剤、アジュバント及び/又はキャリアと共に、治療上有効な量のポリペプチド組成物及び化合物を含む医薬組成物を提供する。このような組成物は、液体、又は凍結乾燥、又は別の方法で乾燥された調合物であってもよく、様々な緩衝液（たとえばTris-HCl、酢酸、リン酸）、pH、及びイオン強度の希釈液、表面への吸着を妨げるためのアルブミン又はゲラチンのような添加物、界面活性剤（Tween20、Tween80、Pluronic F68、胆汁酸塩）、可溶化剤（たとえばグリセロール、ポリエチレングリセロール）、抗酸化剤（たとえばアスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、防腐剤（たとえば、チメロサール、ベンジルアルコール、パラベン）、増量物質又は浸透圧調節剤（たとえばラクトース、マンニトール）、前記化合物へのポリエチレングリコールのようなポリマーの共有結合付加、金属イオンとの錯体形成、或いはポリ乳酸、ポリグリコール酸（polglycolic acid）、及びヒドロゲルなどのポリマー化合物粒子製剤内へ又はリポソーム、マイクロエマルジョン、ミセル、単層状もしくは層状担体、赤血球ゴースト、又はスフェロプラスト製剤上への前記化合物の取り込みを含んでもよい。このような組成物は、物理的状態、溶解性、安定性、前記化合物もしくは組成物のインビボ放出の効率、及びインビボクリアランスの効率に影響を与えるであろう。組成物の選択は、前記化合物の物理的及び化学的特性に依存するであろう。
【００５５】
放出が制御され又は持続される組成物は、親油性デポ剤（たとえば、脂肪酸、ロウ、油）中の調合物を含む。ポリマー（たとえばポロクサマー(poloxamer)又はポロクサミン(poloxamine)）でコートされた微粒子状組成物、及び組織特異的受容体、リガンド、もしくは抗原に対する抗体に結合され、又は組織特異的受容体のリガンドに結合された前記化合物も本発明に含まれる。本発明の組成物の他の態様には、粒子形態の保護コーティング、プロテアーゼ阻害剤、又は非経口、肺動脈、鼻腔、経口を含む様々な投与経路のための透過性増強剤が組込まれる。
【００５６】
投与されたとき、化合物はしばしば急速に循環系から除去されることから、薬理活性は比較的短命であることが明らかであろう。従って、治療効果を維持するためには、比較的大量の生物活性な化合物を頻繁に接種することが必要とされるであろう。ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン又はポリプロリンのような水溶性ポリマーの共有結合付加によって修飾された化合物は、静脈内注射後の血液内で、未修飾の化合物の場合よりも実質的に長い半減期を示すことが知られている（Abuchowaki et al., 1981; Newmark et al., 1982; and Katre et al., 1987）。このような修飾は、水溶液中の化合物の溶解性、凝集の除去、前記化合物の物理的及び化学的安定性を増加させ、前記化合物の免疫原性及び反応性も劇的に減少するであろう。その結果、所望されるインビボにおける生物学的活性は、このようなポリマー／化合物付加物の投与により、未修飾化合物よりも少ない回数又は低い濃度で実施されるであろう。
【００５７】
ポリエチレングリコール（PEG）は、ほ乳類では非常に毒性が低いため、化合物へのPEGの付加は特に有用である（Carpenter et al/.1971）。たとえば、アデノシンデアミナーゼのPEG付加物は、合衆国において、重度の複合免疫欠損症候群の治療に使用することが認可されている。PEGの結合によって得られる第二の有用性は、異種化合物の免疫原性及び抗原性を効果的に減少することである。たとえば、ヒトタンパク質のPEG付加物は、重度の免疫反応を引き起こす危険がなく、他のほ乳類種疾患の治療に有用であろう。本発明のポリペプチド又は組成物は、前記ポリペプチドに対する、もしくは前記ポリペプチドを産生するであろう細胞に対する宿主免疫反応を減少するか又は妨げるように、マイクロカプセルデバイス内でデリバリーしてもよい。本発明のポリペプチド又は組成物は、リポソームなどの膜内にマイクロカプセル化してデリバリーされてもよい。
【００５８】
PEGのようなポリマーは、タンパク質中の一以上の反応性アミノ酸残基、たとえばアミノ末端アミノ酸のα−アミノ基、リジン側鎖のεアミノ基、システイン側鎖のスルフヒドリル基、アスパルチル及びグルタミル側鎖のカルボキシル基、カルボキシ末端アミノ酸のαカルボキシル基、チロシン側鎖に容易に付加することができ、又は一定のアスパラギン、セリン、もしくはスレオニン残基に付加された糖鎖の活性型誘導体に容易に付加することができる。
【００５９】
タンパク質との直接反応に適した活性型PEGの多くは、すでに記載されている。タンパク質のアミノ基との反応に有用なPEG試薬は、カルボン酸又は炭酸誘導体の活性型エステル、特に、脱離基がN-ヒドロキシスクシニミド、p−ニトロフェノール、イミダゾール又は1−ヒドロキシ−2−ニトロベンゼン−4−スルホネートのものを含む。マレイミド又はハロアセチル基を含むPEG誘導体は、スルフヒドリル基の修飾に有用な試薬である。同様に、アミノヒドラジン、又はヒドラジド基を含むPEG試薬は、タンパク質の含水炭素基を過ヨウ素酸塩で酸化することによって発生するアルデヒドとの反応に有用である。
【００６０】
＜キャリアと医薬＞
好ましい態様において、前記医薬キャリアは液体であってよく、且つ前記医薬組成物は溶液の形態であろう。他の同等に好ましい態様において、前記薬学的に許容可能なキャリアは、固体であり、且つ前記組成物は粉末又は錠剤である。さらなる態様において、前記医薬キャリアはゲルであり、且つ前記組成物は座薬又はクリームである。さらなる態様において、前記活性成分は、薬学的に許容可能な経皮パッチの一部として処方されてもよい。
【００６１】
固体キャリアは、香味剤、潤滑剤、安定化剤、縣濁剤、充填剤、潤滑剤、圧縮補助剤、成形剤又は錠剤崩壊剤（マイクロカプセル化剤であってもよい）として機能し得る一以上の物質を含むことができる。粉末の場合、前記キャリアは、微細化された活性成分と混合された微細固体である。錠剤では、前記活性成分は、必要な圧縮性を有するキャリアと混合されて、所望の形、及びサイズに圧縮される。前記粉末及び錠剤は、好ましくは、99％以下の活性成分を含む。適切な固形キャリアは、たとえばリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、滑石、ショ糖、ラクトース、デキストリン、澱粉、ゲラチン、セルロース、ポリビニルピロリジン、低融点ロウ、及びイオン交換樹脂を含む。
【００６２】
液体キャリアは、溶液、縣濁液、エマルジョン、シロップ、エリキシル、及び加圧された組成物の調製に使用される。前記活性成分は、水、有機溶媒、両者の混合物、又は薬学的に許容可能な油もしくは脂肪などの薬学的に許容可能な液体キャリアに溶解するか、又は縣濁することができる。前記液体キャリアは、可溶化剤、乳化剤、緩衝剤、防腐剤、甘味料、香味剤、縣濁剤、増粘剤、色素、粘度調節剤、安定化剤又は浸透圧調節剤のような、他の適切な医薬添加物を含むことができる。経口及び非経口投与のための液体キャリアに適した例には、水（特に上記の添加物を含み、たとえばセルロース誘導体、好ましくはカルボキシメチルナトリウムセルロース溶液）、アルコール（一価アルコール及び多価アルコール、たとえばグリセロール）及びそれらの誘導体、並びに油（たとえば精留されたヤシ油及びラッカセイ油）が含まれる。非経口投与の場合、前記キャリアは、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピルのような油状エステルでもよい。滅菌された液体キャリアは、非経口投与のための滅菌液状組成物に有用である。圧縮された組成物用の液体キャリアは、ハロゲン化炭化水素又はその他の薬学的に許容可能な推進剤でもよい。
【００６３】
滅菌された溶液又は縣濁液である液体医薬組成物は、たとえば、筋肉内、髄腔内、硬膜外、腹腔内、又は皮下注射により利用することができる。滅菌溶液は、静脈内に投与することもできる。前記活性成分は、滅菌水、生理食塩水、又は他の適切な滅菌注射可能な媒質を使用して投与時に溶解又は縣濁させるように、滅菌された固形組成物として調整されてもよい。キャリアは、必須の又は不活性な成形剤、縣濁試薬、潤滑剤、香味剤、甘味料、防腐剤、色素、及びコーティング剤を含むものである。
【００６４】
本発明の活性成分は、（特に前記スクリーニング法によって同定された化合物またはそれの組成物）は、他の溶質又は縣濁剤、たとえば等張液を作るのは十分な食塩水又はグルコース、胆汁塩、アラビアゴム、ゲラチン、ソルビタンモノオレートポリソルベート80（ソルビトールのオレアートエステル及びエチレンオキシドで共重合化されたその酸無水物）などを含有する滅菌溶液、又は縣濁液の形態で経口的に投与できる。
【００６５】
活性成分は、液体又は固体のどちらの形態の組成物でも、経口で投与することができる。経口投与に適した組成物には、固形状組成物、たとえば、丸薬、カプセル、顆粒、錠剤、及び粉末を、並びに液状組成物、たとえば、溶液、シロップ、エリキシル剤及び縣濁液が含まれる。非経口投与に有用な形態には、滅菌溶液、エマルジョン、及び縣濁液を含む。
【００６６】
本発明の他の態様において、前記患者は、糖尿病を保有していてもよい。前記患者は、糖尿病に関連する合併症を示してもよい。このような合併症のいくつかの例は、内皮及びマクロファージのAGE受容体の活性化、リポタンパク質、マトリクス、及び基底膜タンパク質の変化；血管平滑筋の収縮性及びホルモン応答性の変化、；内皮細胞透過性の変化、；ソルビトールの蓄積、神経系のミオイノシトール欠乏、又はNa-K ATPase活性の変化を含む。このような合併症は、Porte and Schwartzによる最近の刊行物で論じられている（糖尿病合併症：なぜグルコースは潜在的に毒性があるのか。Science, Vol. 272, pages699-700）。
【００６７】
この発明を、以下の実験の詳細の項においてさらに説明する。この項は、この発明の理解を補助するために提示されるものであり、いかなる点においても、特許請求の範囲に記載される発明を限定することを意図するものではなく、そのように解釈されるべきものでもない。
【００６８】
【実験の詳細】
例1：タンパク質のカルボキシメチル−リジン付加物（CML）は、後生的糖化最終産物受容体（RAGE）と結合して細胞シグナル経路を活性化し、且つ遺伝子発現を調整する後生的糖化最終産物（AGE）である。
【００６９】
後生的糖化最終産物（AGE）、即ち、グリコキシデーションの過程で生じる修飾化合物群は、構造が不均一な群であって、その血漿及び組織への蓄積が、老化、糖尿病、腎不全、及び炎症などの疾患で起こる合併症に関連している。AGEsは、多くの方法で病原性の効果を付与する。；そのうちの一つでは、RAGEなどの細胞表面受容体に結合して、細胞の摂動及び機能異常を生じさせる多様な機構を引き起こす。既知のAGE構造のうちでRAGEと相互作用するものを決定するために、我々は、一連の合成AGEsを作製して、それらがRAGEと相互作用する能力をテストした。CMLで修飾されたBSA（遊離BSAではない）は、濃度依存的に、Kd＝76±3.7nMでRAGEと結合したが、ペントシジン又はメチルグリオキサル修飾タンパク質では結合しなかった。競合実験により、CML修飾体との相互作用部位を含むIg−タイプ領域として、RAGEのV-領域が同定された。細胞培養研究において、CML修飾型のタンパク質が、ヒト臍静脈内皮細胞(HUVECs)の細胞表面VCAM-1の機能的活性を増加し、且つヒト末梢血由来単核球ファゴサイト（MPs）の遊走をRAGE依存的に増加した。さらに、CML-修飾タンパク質とHUVECのインキュベーションは、NF−kBの活性化を引き起こすが、ペントシジン修飾体では起こらず、プロセスは、抗−RAGE IgG、抗体過剰のRAGEの存在下で、又は細胞内末端欠損RAGEの形質導入（ドミナントネガティブ効果）により阻害された。正常マウスにCML-修飾BSAを輸液することにより、肺のVCAM-1 mRNAが増加した。CML-及びRAGEエピトープの両者は、糖尿病又は全身性エリテマトーデスに特徴的な細胞の摂動におけるそれらの相互作用が果たす役割と一致して、糖尿病又は全身性エリテマトーデスのヒト患者由来の腎臓組織で増加し、且つコローカライズされた。我々の研究により、細胞の摂動、及び、おそらくはAGE（CML）の蓄積疾患の特徴である血管系及び炎症性細胞の合併症をブロックする試薬を設計するための重要な標的として、CML-修飾構造及びRAGEのV-領域を同定した。
【００７０】
これまでに多くの重要なAGE構造が同定され、特徴づけられ、且つ組織にローカライズされた。しかし、どのグリコキシデーション産物が受容体非依存的及び受容体依存的な効果を媒介するのか明らかではない。脂質の過酸化、及びグリコキシデーション産物であるNe−（カルボキシメチル）リジン（CML）は、老化及び糖尿病において主要なAGEであることが報告されている（24-27）。Schleicherら（25）は、糖尿病患者の血清中のCML含量が増加していたことを示した。さらに、皮膚、肺、心臓、肝臓、腎臓、結腸、椎間円板、及び特に老化した動脈で、CML含量が増加した：（糖尿病で加速されるプロセスである）。高レベルのCML修飾体が、アテローム性動脈硬化症斑及び泡沫細胞でも観測された。ペントシジンは、グリコキシデーションの産物でもあり、リジンとアルギニンの架橋によって形成され、アマドリ転位産物のグリコキシデーション、又はグルコースの自己酸化生産物であるアラビノースの反応により生じる可能性がある（27）。ペントシジンの蓄積は、糖尿病及び老人の組織で見出された（27-28）。ピラリンは、3−デオキシグルコソンとタンパク質の相互作用によって生じる糖化産物であって、アマドリ転位産物の生成により生じる構造であり、最近糖尿病の腎臓で同定された（27，29）。メチルグリオキサル化によるAGE修飾がインビボに存在する証拠が示された。メチルグリオキサル化合物は、メイラード反応の主要な中間体であり、糖化及び糖の自動酸化を含む、多くの代謝経路で形成され得る（30）。Nagarajらは、コントロール、並びに老人患者由来の角膜間質領域と比較して、糖尿病患者の血清中ではMGに対する免疫応答性が増加していたことを見出した（30）。基礎となる分子機構は未だに同定されていないが、実際に、MG−修飾タンパク質がマクロファージ様の細胞と培養液中で相互作用して、インターロイキン−1βなどのサイトカイン産生を誘導し得ることが最近示された。
【００７１】
AGEに共通な構造、たとえばCML-、ペントシジン、及びメチルグリオキサル修飾タンパク質が多数報告されているが、CML修飾タンパク質は少なくとも一部分がRAGEのリガンドであることをここで初めて報告する。さらに、我々の以前の観測と一致して、CML-修飾タンパク質は、RAGEのV-タイプ免疫グロブリン領域と相互作用する（31）。
【００７２】
これらのデータは、CML修飾体のような病原性AGEsとRAGEの相互作用を阻害する構造を同定するためのスクリーニング戦略を開発するための骨組みを提供する。このような構造は、CMLのようなAGEsが生じる疾患（糖尿病、腎不全、アミロイドーシス、老化、アルツハイマー病及び炎症を含むが、これらに限定されない）治療的のための基礎を形成する可能性がある。
【００７３】
材料と方法。
【００７４】
放射性リガンド結合アッセイ。
【００７５】
CML（遊離）、CML-修飾タンパク質、ペントシジン（遊離）、ペントシジン修飾タンパク質、メチルグリオキサール修飾タンパク質を、以前に出版公表された方法に従って調製した（24−30）。全ての材料は、Detoxi-gel system(PIERCE)を使用してエンドトキシンを除き、カブトガニ変形細胞アッセイ（SIGMA）で陰性であることをテストした。ガスクロマトグラフィー／マススペクトロスコピー及びHPLC解析を行って、調整したAGEsの一致性を確認した。特異的AGE又はコントロールタンパク質（5μg）の炭酸ナトリウム/重炭酸ナトリウム緩衝液（pH9.8）溶液をNUNC MAXISORPディッシュのウェルに乗せて4℃で一晩おいた。次の朝、ウェルを吸引し、ウシ血清アルブミン（1％）を含むリン酸緩衝化生理食塩水（カルシウム/マグネシウムを含む）で2時間、37℃でブロックした。次にウェルを、Tween20（0.05％）を含むリン酸緩衝化生理食塩水（カルシウム/マグネシウムを含まない）で一回洗浄した；0.150ml/ウェル。放射性リガンド結合アッセイは、放射性ラベル（125I ; Iodogen（PIERCE）を使用して）された可溶型全長RAGE(100nM；比活性7000-8000 cpm/ng)を、非ラベル可溶型RAGE（50×過剰モル）もしくは指示した過剰モルの競合物質の存在下、又は非存在下で使用して、ウシ血清アルブミン（0.2％）を含むリン酸緩衝化生理食塩水中で2時間、37℃で行った。ウェルを、NP-40(1%)とNaCl（0.15M）を含むバッファーで上記のように洗浄後、溶出した。次に、回収した物質をガンマカウンター（LKB）で計測した。いくつかの実験では、示したように、指示したアッセイにおいて競合する能力をテストするために、抗体又は過剰の可溶型RAGEを使用した。
【００７６】
構築物
GST融合タンパク質システムを可溶型V-領域、及び可溶型C1およびC2−領域を調整するために、製造者（PHARMACIA）の指示に従って利用した。
【００７７】
Molt-4結合アッセイ
Molt-4結合アッセイは、Maruiら（32）の一般的な方法に従って実施した。ヒト臍静脈内皮細胞を、競合物質の存在下又は非存在下において、37℃で6時間、指示した化合物で刺激した。VCAM-1のリガンドであるVLA-4を発現するMolt-4細胞(ATCC)をウシ胎児血清（10％）を含むRPMI1640で培養した。放射性ラベルは、Molt-4細胞（2×107細胞/ml）を、51-Cr（0.2mCi/ml）を含む上記培地中において、16時間37℃でインキュベートすることにより行った。結合アッセイの前に、ハンク緩衝食塩水で細胞を洗浄して、取り込まれていない放射性活性を除き、次に、4×106細胞/mlとなるように、ウシ胎児血清（10％）を含むRPMIに再び懸濁した。Molt-4細胞を内皮細胞と共に37℃で1時間インキュベートし、ウシ胎児血清（1％）を含むMedium199で二回洗浄して接着していない細胞を除去し；接着細胞をSDS（1％）で可溶化し；放射性活性をガンマーカウンターで計測した。
【００７８】
走化性アッセイ
走化性アッセイは、ポリカーボネート膜を含む48穴のマイクロケモタクシスチャンバー（Neuro-Probe）内で行い、以前に記載したように（15）実施した。本研究では、細胞表面にRAGEを持つヒト末梢血由来単核球ファゴサイトを使用した。
【００７９】
電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）
核抽出物を、Schreiber（33）の方法に従って、HUVECsから調製した。タンパク質濃度は、Bradford試薬（BIO-RAD）を使用して測定した。NF−kB部位を含むヒトVCAM-1プロモータの一部に相当する二本鎖オリゴヌクレオチドを合成した（Life-Technologies）。オリゴヌクレオチドは、以下のようにプローブとして使用した。：NF−kB：5’CCTTGAAGGGATTTCCCTCC3’(配列番号1)。プローブは、5’末端を、g−[32P]およびポリヌクレオチドリン酸化酵素でラベルされた。各反応には、10fmolのプローブと2-5μl（1.5μl）の核抽出物が含められた。結合反応は以前に記載したように（19）バッファー中で実施した。複合体は、トリス（50mM）、ホウ酸（45mM）及びEDTA（0.5mM）溶液（0.5×TEバッファー；最終pH7.5）中で、非変性ポリアクリルアミドゲル（６％）により分割した。10V/cmで2時間、サンプルの電気泳動を行った。スーパーシフトアッセイでは、複合体を抗−p65 IgG、抗−p50 IgG又はその両者共に、又は非免疫IgGと共に、前反応液20μlで前インキュベートした。
【００８０】
ノーザンブロット解析
VCAM-1及びG3PDHのノーザンブロット解析は以前に記載したように（19）実施した。
【００８１】
免疫組織化学
アフィニティー精製された抗−CML及び抗−ペントシジンIgGは、AGE/キーホールリンペットヘモシアニンをウサギに接種して調製した。前記IgGをプロテインAカラム（PIERCE）で精製し、未修飾KLHに対する抗体のみを、アフィニティーカラムクロマトグラフィー（Bio-Rad）によりKLH（SIGMA）を吸収させて除去した。カラムに接着しなかった物質を、指示したAGE-BSAが吸着されたアフィゲルカラムクロマトグラフィーにかけた。次に、NaCl（1M）で材料を溶出して、特異性をELISAでテストした。RAGEの免疫組織化学は、単一特異性ポリクローナル抗−RAGE IgGを使用して行った。全ての抗体はウサギで調製し、免疫組織化学は、以前に記載したように、ホルマリン固定されてパラフィン包理された組織で実施した（10、14、17、20）。
【００８２】
結果
放射性リガンド結合実験
我々は上記のように、特異的AGEsを合成して調製した。ガスクロマトグラフィー／マススペクトロスコピー及びHPLC解析を行って、CML-及びペントシジン修飾タンパク質を検査した。放射性リガンド結合アッセイは、CML-BSA、ペントシジン−BSA又メチルグリオキサル−ヒト血清アルブミンをプラスチックウェルに吸着させて実施した。放射性リガンド結合アッセイは、記載されたように実施して、結合平衡のデータをKlotzとHunstonの式に従って解析した。CML-BSA（黒丸）のみが、濃度依存的に、Kd＝76±.7nMでsRAGEに結合した（RAGEに結合する異種AGEで観測された場合と同様の50-75nMである（4、15）。）。逆にペントシジン−BSA（白丸）はsRAGEと特異的な結合を示さなかった（図1）。さらに、メチルグリオキサル−HASはRAGEと特異的に結合しなかった。抗−CML IgG又は抗−RAGE IgGとインキュベートすると、CML-BSAとRAGEの結合を有意に減少するという実験から、CML-修飾体とRAGEの結合は特異的であり、CMLによるペプチドの修飾が必要とされることが示された。逆に、免疫前IgG、遊離CML又は遊離ペントシジンでは全く効果がなかった（図2）。CML-BSAとRAGEの結合は、RAGEのV-タイプIg領域との相互作用を介して起こっており、RAGEの第一の又は第二のC−タイプIg領域のいずれかとの相互作用にるものではない（図3）。
【００８３】
細胞の活性化実験
内皮細胞
インビトロのグリコキシデーション又は患者由来のAGEsから調製されたAGEsの混合物が細胞表面のRAGEと結合すると、細胞の活性化を誘導する。CML-オボアルブミン又はペントシジン−オボアルブミンのインキュベーションがECを活性化するかどうかをテストするために、特異的AGEsをエンドトキシンフリーにして（デトキシゲルカラム（PIERCE））、エンドトキシンが存在しないことをカブトガニ変形細胞アッセイ（SIGMA）によってテストした。培養HUVECをCML-オボアルブミンに暴露すると、放射性ラベルされた51Cr−Molt4細胞（VCAM-1，VLA-4のカウンターリガンドを持つ；参照24）とHUVECの結合が2.3倍に有意に増加した。；増加は、抗−RAGE  F（ab’）によって（濃度依存的に）阻害されたが、免疫前F（ab’）では阻害されたかった。逆に、天然のオボアルブミン及びペントシジン−オボアルブミンでは、効果がなかった（図4）。さらに、過剰のsRAGEとCML-オボアルブミンのインキュベーションでも、Molt-4細胞とHUVECの結合が減少した（未修飾オボアルブミンと細胞をインキュベーションした場合に観測された値と一致した）。これらのデータは、CML-オボアルブミンとHUVECのインキュベーションが、細胞表面のVCAM-1の増加を生じることを示唆する。
【００８４】
単核球ファゴサイト
CML-オボアルブミンがヒト末梢血由来単核球の走化性増加を媒介するかどうかを測定するために、上記の修正走化性チャンバーで実験を行った。走化性チャンバーの下段のウェルに静置した場合、CML-オボアルブミンで刺激されたモノサイトは濃度依存的に走化性を示した。逆に、天然のオボアルブミン又はペントシジンBSAでは効果がなかった（図5）。さらに、抗−RAGE  F（ab’） 過剰のsRAGEの存在下では、CML-オボアルブミンを介したモノサイトの走化性は完全に阻害された。
【００８５】
CML-オボアルブミン−RAGEの相互作用は、HUVECにおいてNF−kBを活性化する。
【００８６】
これらのデータは、EC及びMP RAGEとCML-修飾タンパク質の相互作用が、特異的細胞のシグナル経路を活性化することを示唆する。我々は、異種AGEsがRAGEに結合すると、細胞の酸化ストレスの増強を生じることを以前に示した。この増強は、主としてNADPHオキシダーゼの活性化によって媒介されて（14、20）、NF−kB活性化に関するオキシダント感受性な近接事象としてp21ras及びerk1／erk2リン酸化酵素活性の増加をともなう（20）。我々は、CML-オボアルブミンがRAGEに結合して、細胞シグナル経路を活性化する能力をテストした。HUVECをCML-オボアルブミンとインキュベーションすると、NF−kBの核内移行の増加を起こしたが、天然のオボアルブミン又はペントシジンオボアルブミンでは起こさなかった（それぞれ図6のレーン1、2、及び3）。これが細胞のRAGEとCML−オボアルブミンの相互作用によることを、高濃度の抗−RAGE IgGの前処理をするとNF−kBの活性化を阻害したが低濃度では活性化しなかったという実験によって示された（それぞれ図6のレーン6、及びレーン5）。免疫前IgGの前処理しても効果がなかった（図6、レーン4）。過剰のsRAGEとCML-オボアルブミンのインキュベーションでも、NF−kBの活性化を阻害した。CML-オボアルブミンがRAGEに結合することによって誘導される核複合体は、スーパーシフトアッセイによると、p50/p65 NF−kBのヘテロダイマーである（図6、レーン8-11）。CML-オボアルブミンを介した現象におけるRAGEの主要な役割は、細胞質領域を欠損したRAGEをコードする構築物が一過性に形質導入されたHUVECの実験により、さらに詳述された。HUVECに一過性に形質導入すると、CML-オボアルブミンを介したNF−kBの活性化が、有意に減少した。；ベクターのみを形質導入した場合は効果がなかった（それぞれ図6のレーン13、及び12）。
【００８７】
CML-BSAを正常マウスに輸液すると、血管細胞接着分子−1のmRNAを増加する。
【００８８】
CML修飾型タンパク質が、インビボで遺伝子発現を調節するという重要な役割と一致して、CML-BSAをCD−1に輸液すると、肺組織のVCAM-1のmRNAが増加する結果となった（ノーザンブロット解析による）（図7、レーン2）。逆に、未修飾BSAの輸液では効果がなかった（図7、レーン1）。
【００８９】
ヒト糖尿病腎臓におけるCML-エピトープ及びペントシジンエピトープの同定。
【００９０】
我々の以前の研究において、アフィニティー精製された異種AGEsに対するIgGを使用して、我々は、糖尿病の腎臓では血管内REGEとAGEsが著しく増加し、且つ共在していたことを示した（13）。従って、我々はこれらAGE修飾型KLH（キーホールリンペットヘモシアニン；潜在的免疫原）を使用して、アフィニティー精製された抗−CMLと抗−ペントシジンIgGを調製した（25）。これらの抗体を使用して、我々はヒト糖尿病腎症患者由来の腎臓組織で、ペントシジン及びCMLに対する免疫反応性が増加していることを確認した（図8A及び8B）。特に有足細胞（図8C）、血管ECs及びSMCsにおいて、RAGEの発現が目立ってアップレギュレートされており、且つ蓄積が増加されたCML-修飾体と共在していた。ペントシジンを染色すると、対応する年齢の腎臓におけるCML及びRAGEはほとんど陰性であった。総合して、これらのデータはさらに、インビボにおいてCML-修飾AGEsと細胞のRAGEの間に重要な関係が存在するであろうことを示唆する。
【００９１】
炎症性腎炎において、CML及びRAGEが増加される。
【００９２】
我々の研究室のみ出版されていない観測において、高レベルなRAGEの発現が、一時的なアレルギー及び全身性エリテマトーデス（SLE）のヒト患者の血管組織で示された。我々は最近、ECs及びVSCMsにおけるRAGEの発現が、LPS処理によって増加することを報告した（34）。RAGEプロモーターの調査により、二箇所の機能的なNF−kB結合部位が明らかとなった。；これらを同時に変異させると、炎症性刺激によるRAGEの発現増強が阻止される結果となった。CMLの形成が炎症過程（ミエロペルオキシダーゼ経路による）と関連する（3）という最近の情報を総合して、我々は、RAGEが炎症性刺激による細胞の摂動を媒介する役割を果たしているであろうという仮説を設けた。この仮説と一致して、活性型腎炎のヒト患者由来腎臓組織では、特に有足細胞（図9b）及び血管系内において、RAGE発現が増加すること、及び共在することに加えて、CMLに対する免疫応答性が増加することが示された（図9）。
【００９３】
考察
予想されるように、広範囲のAGEsがインビボで形成され、蓄積される可能性がある。しかし、特異的AGEそれぞれの正確な生物学的関係が、さらに同定されなければならない。我々は以前に、アルドースショ糖、たとえばグルコース、グルコース−6−リン酸又はリボース、不均一混合物と共にタンパク質をインキュベーションすることによりインビトロで調製したAGEs（又はスクリーニング試薬として抗−AGE IgGを使用したインビボ由来AGEs）が、細胞シグナル経路及び遺伝子発現の調節に関連した方法によりAGE（RAGE）受容体と結合することができる構造を含むことを示した。本研究において、我々は、我々の所見を拡張して、糖尿病及び老化の最も影響を与えるAGE（24−25）であるタンパク質のカルボキシメチル−リジン付加物が、RAGE（V-タイプIg領域）と相互作用することができ、細胞シグナル伝達を開始して、遺伝子発現を変化させることを示した。逆に、他のAGEであるペントシジンは結合せず、また摂動及び機能不全に関連した方法では細胞を活性化しない。
【００９４】
しかし、今回、我々の発見はRAGEのリガンドとして、他のAGEsを除外しないことに留意しなければならない。。しかし、共通して実験されたペントシジン−及びメチルグリオキサール付加物などのAGEsは、大部分が考慮から除かれた。それでも、これに関連して、他のAGEsを合成し、特徴づけし、テストするための研究が現在進行中である。
【００９５】
結論として、インビボで形成／蓄積して、血管及び炎症性細胞の摂動に連動していそうな経路に導く細胞を活性化できるAGEsの理解において、我々の今回の発見は極めて重要な飛躍である。重要なことに、これらのデータは、細胞の受容体RAGEと病原性AGE（CML付加物）の相互作用をブロックできる試薬を発見するために計画された方法の開発を目指した骨組みを提供することによって、AGE（CML−）関連疾患、たとえば糖尿病、老化、炎症、及び腎不全で発生する合併症の発生に関与していそうな病原性AGEsについての我々の知識を拡大した。。
【００９６】
スクリーニングアッセイを実施して、AGEとRAGEの相互作用を阻害することができる二種の各化合物として、キニーネ及びキニジンを同定した。前記アッセイは以下のように実施された。：CML-修飾AGE-BSAをプラスチックディッシュに、適切な結合溶液中で固定した。放射性ラベルされたRAGEのV-領域を未ラベルのキニーネ又はキニジンのいずれかの溶液と混合した。前記アッセイの結果は、キニーネとキニジンの両者がAGEとRAGEのV-領域の結合を減少できることを示した。本発明は、患者において後生的糖化最終産物と受容体の相互作用を阻害する方法であって、キニーネ又はその誘導体又はキニジンもしくはその誘導体を、患者のAGEとRAGEの相互作用を阻害するための有効量投与することを含む方法を提供する。たとえば、キニーネの誘導体は、キニーネの化学修飾によって調製されてもよく、前記化学修飾はキニーネの構造を変化させるが、キニーネ分子の電荷は変化させない。たとえば、前記分子の総電荷の分布は同じままであろう。しかし、その化学構造は変化してもよい。さらに、キニジンの誘導体は上記キニーネの記載と同様に調製してよい。さらに、前記キニジン分子のチャージは、化学修飾後にも変化しないであろう。しかし、前期分子の化学構造は変化してもよい。
【００９７】
例2
細胞シグナル伝達経路を活性化するRAGEリガンドである、カルボキシメチル−リジン（CML）後生的糖化最終産物（AGE）の修飾。
【００９８】
後生的糖化最終産物（AGE）は、高血糖、高酸化的環境、及び腎不全で形成される不均一化合物である。AGEsは、糖尿病患者の血漿及び組織に蓄積する。；その存在は、医学的に合併症の発生に関連していた。AGE受容体（RAGE）とAGEsの相互作用は、血管系／炎症性細胞で合併症の発生を助長するように、内皮細胞（Ecs）及び単球（Mps）などの細胞を活性化する。AGEsは、カルボキシメチル−リジン及びペントシジン（遊離型及びタンパク質結合型の両方で）などの構造から成る。どちらのAGEがRAGEとの相互作用を形成するのか調査するために、我々は、遊離型のCML及びペントシジン、並びにCML-−及びペントシジン−、ウシ血清アルブミン（BSA）及びオボアルブミン（OVA）を調製した。CML-BSA及びCML-OVAは、固定化されたRAGEを濃度依存的に、及び飽和可能な方法で結合し、Kd＝60nMであり、結合は抗−RAGE IgG及び可溶型RAGE（sRAGE）の存在下で阻害されるが、非免疫IgG、BSA、OVA、遊離CML、遊離ペントシジンでは阻害されない。EcsをCML-OVAにさらすと、NF−kBが活性化され、Molt-4細胞（VCAM-1，VLA-4のカウンターリガンドにさらしたもの）の結合が増加した。；増加は、抗−RAGE IgGの存在下ではブロックされる。さらに、CML-BSA又はCML-OVAに MPsをさらすとRAGE依存的にNF-kBを活性化した。ペントシジンBSAでは効果がなかった。これらのデータは、RAGEのリガンドとしてのCML修飾タンパク質が、細胞シグナル伝達経路を活性化し、且つ遺伝子発現を変化させることを証明する。総合して、これらのデータは、糖尿病などの疾患における病原性AGEsの理解に改善をもたらし、標的とされる阻害剤を同定するための骨組みを提供する。
【００９９】
【参照文献】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  放射性リガンド結合研究：濃度応答性実験
CML-又はペントシジンBSA（5μg）をプラスチックウェルに固定して、過剰量の非ラベルsRAGE（50倍モル過剰）+/-において、精製された125-I sRAGEの濃度を増加させていき放射性ラベルアッセイを行った。結合したトレーサーは、NP40（1％）、及びNaCl（0.15M）を含むバッファーで溶出し、実験の詳細の説に記載されたようにデータを解析した。CML-BSA（黒丸）のみが、sRAGEと特異的に結合した（KD=±3.7nM）。ペントシジンBSAは、sRAGEと特的な結合を示さなかった（白丸）。
【図２】  放射性リガンド結合研究：競合実験
CML-BSAをウェルに固定した。；結合は、示した競合物質と共に125-I sRAGE（100nM）を用いて行った。過剰のsRAGE、抗-CML IgG、及び抗-RAGE IgGは、sRAGEとCML-BSAの結合を阻害した。最大結合％は、競合物質の非存在下（100％）において、固定されたCML-BSAとの結合を比較して報告した。
【図３】  放射性リガンド結合研究：CML付加物は、RAGEのV−タイプIg領域と相互作用する。
CML-BSAをウェルに固定した。；結合は、過剰(100倍)の非ラベルV−タイプIg領域、C1 Ig領域、もしくはC2 Ig領域の存在下又は非存在下において、125-I sRAGE（100nM）を用いて実施した。最大結合％は、競合物質の非存在下（100％）において、固定されたCML-BSAとの結合を比較して報告した。
【図４】  細胞の活性化研究：内皮細胞
HUVECを示されたメディエーターの存在下で6時間培養した。示した中で、いくつかの細胞を抗−RAGE/免疫前IgGと1時間、プレインキュベートした。細胞を洗い、51Cr-Molt-4細胞(bear VLA-4)を1時間インキュベートした。結合した放射性活性をSDS（1％）の存在下で溶出し、ガンマカウンターで計測した。結果は、天然のオボアルブミンにさらした細胞に結合したMolt-4（「1」と定義した）と比較して報告した。
【図５】  細胞の活性化研究：単核球ファゴサイト
ヒトモノサイト（5×104）を修正走化性チャンバーのウェル上段に、示したメディエータをウェルの下段に入れて3時間静置した。膜をギムザで染色して、走化性刺激に向かって膜を通過して移動した細胞をhpf毎に計測した。
【図６】  電気泳動移動度シフト解析(electrophoretic mobility shift assay)
ヒト臍静脈内皮細胞（HUVEC）をメディエーターと6時間インキュベートした。；核抽出物を調整し、電気泳動移動度シフト解析は、32PラベルされたNF-kB用のプローブを用いて行った。レーンには上記のメディエーターを含む（全てのAGEsは50μg/mlで添加した。）。レーンには、：レーン1、CML-オボアルブミン；レーン2、天然のオボアルブミン；レーン3、ペントシジンオボアルブミン；レーン4、非免疫IgGとCMLオボアルブミン；レーン5、抗−RAGE IgG：7μg/ml；レーン6、抗−RAGE IgG：70μg/ml、レーン7、CML-オボアルブミン/100倍過剰の非ラベルNF−kB、スーパーシフトアッセイ（レーン8：抗-p50 IgG；レーン9：抗−p65 IgG；レーン10、抗−p50 IgGと抗−p65 IgG；レーン11、免疫前IgG）、全て+CML-オボアルブミン。レーン12：CML-オボアルブミン：ベクター単独/13：末端欠失されたRAGEをのせる。
【図７】  インビボ研究：マウスへのCML-BSAの輸液は遺伝子発現を調整する。
CML-BSA（レーン2）又は天然のBSA（レーン1）（どちらも100μg）を正常CD1マウスに輸液した。LPS（100μg）をポジティブコントロールとして輸液した（レーン3）。6時間後、マウスを人道的に犠牲にして、RNA調整のために即座に肺を除去した。ノーザンブロット解析を、上記のVCAM−1に記載したように行った。；次に膜をはがして、32-P-ラベルされたG3PDHのcDNAの再プローブとした。
【図８】  ヒト糖尿病腎臓の免疫組織化学
アフィニティー精製されたCML-及びペントシジンに対する抗体を上記のように調整した。腎組織を糖尿病のヒト患者から得て、上記のように免疫組織化学を行った。
A.  ペントシジンを間質コラーゲンで検出した。
B.  CMLエピトープは基底膜及び小節で検出された。
C.  RAGEは糖尿病の有足突起でアップレギュレートされた。免疫前IgGによるコントロールではネガティブだった。非糖尿病の腎臓染色は最小であった。
【図９】ヒト糖尿病腎臓の免疫組織化学（活性型ループス腎炎）
A.  CMLエピトープは、活性型ループ巣腎炎のヒト患者由来腎臓組織において糸球体の病巣及び脊髄半月の証拠とされた。
B.  RAGE発現の増加は、有足突起で検出された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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