(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）微生物を、Ｄ−ソルビトール、Ｌ−ソルボース、またはＬ−ソルボソンを含有する水性栄養培地中で培養する工程であり、該微生物がグルコノバクターオキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）ＤＳＭ４０２５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３８１２）である工程と、
（ｂ）発酵培地から微生物により生産されたビタミンＣを直接単離しそして精製する工程とを含む、
Ｄ−ソルビトール、Ｌ−ソルボース、またはＬ−ソルボソンからのビタミンＣの製造方法。
【請求項２】
微生物を、Ｄ−ソルビトール、Ｌ−ソルボース、またはＬ−ソルボソンを含有する水性栄養培地中で培養し、微生物により生産されたビタミンＣを、発酵ブロスから直接単離し、そして慣用の方法で精製する、Ｄ−ソルビトール、Ｌ−ソルボース、またはＬ−ソルボソンからのビタミンＣの製造方法であって、
前記微生物が、グルコノバクターオキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）ＤＳＭ４０２５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３８１２）である方法。
【請求項３】
４．０〜９．０の範囲のｐＨで、かつ１３〜３６℃の温度範囲で１〜５日間行う、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
５．０〜８．０の範囲のｐＨで、かつ１８〜３３℃の温度範囲で１〜３日間行う、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物によるＬ−アスコルビン酸（ビタミンＣ）の製造に関する。
【０００２】
人間にとって非常に重要で必須の栄養因子の一つであるビタミンＣは、技術的に確立された方法として周知である、いわゆる「ライヒシュタイン法（Reichstein method）」により商業的に製造されている。しかし、この方法は、多数の複雑な工程を含んでおり、全体としての収率を向上させることは全く困難である。したがって、工程数の削減および／または全体としての収率の向上を意図して、多くの提案がなされてきた。
【０００３】
本発明は、グルコノバクターオキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）ＤＳＭ４０２５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３８１２）株、グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）属に属し、かつＧ．オキシダンスＤＳＭ４０２５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３８１２）の同定特性を有する微生物、およびそれらの変異体よりなる群から選択される微生物を、Ｄ−ソルビトール、Ｌ−ソルボース、Ｌ−ソルボソン、またはＬ−グロースを含有する水性栄養培地中で培養し、発酵培地からビタミンＣを単離そして精製することによる、Ｄ−ソルビトール、Ｌ−ソルボース、Ｌ−ソルボソン、またはＬ−グロースからのビタミンＣの製造方法を提供する。
【０００４】
より特定的には、本発明は、
（ａ）微生物を、Ｄ−ソルビトール、Ｌ−ソルボース、Ｌ−ソルボソン、またはＬ−グロースを含有する水性栄養培地中で培養する工程であり、該工程中、該微生物がグルコノバクターオキシダンスＤＳＭ４０２５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３８１２）、グルコノバクター属に属し、かつＧ．オキシダンスＤＳＭ４０２５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３８１２）の同定特性を有する微生物、およびそれらの変異体よりなる群から選択される工程と、
（ｂ）発酵培地からビタミンＣを単離そして精製する工程とを含む、
Ｄ−ソルビトール、Ｌ−ソルボース、Ｌ−ソルボソン、またはＬ−グロースからのビタミンＣの製造方法を提供する。
【０００５】
好ましい実施態様においては、ビタミンＣは、上記の方法により、Ｌ−グロースまたはＬ−ソルボソンから製造される。より好ましい実施態様は、
（ａ）微生物を、Ｌ−グロースを含有する水性栄養培地中で培養する工程であり、該工程中、該微生物がグルコノバクターオキシダンスＤＳＭ４０２５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３８１２）、グルコノバクター属に属し、かつＧ．オキシダンスＤＳＭ４０２５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３８１２）の同定特性を有する微生物およびそれらの変異体よりなる群から選択される工程と、
（ｂ）発酵培地からビタミンＣを単離そして精製する工程とを含む、
Ｌ−グロースからのビタミンＣの製造方法である。
【０００６】
本発明は、また、Ｇ．オキシダンスＤＳＭ４０２５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３８１２）株、グルコノバクター属に属し、かつＧ．オキシダンスＤＳＭ４０２５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３８１２）の同定特性を有する微生物、およびそれらの変異体から選択される微生物を、反応混合物中でＤ−ソルビトール、Ｌ−ソルボース、Ｌ−ソルボソン、またはＬ−グロースと接触させ、反応混合物からビタミンＣを単離そして精製することを含む、Ｄ−ソルビトール、Ｌ−ソルボース、Ｌ−ソルボソン、またはＬ−グロースからのビタミンＣの製造方法を提供する。
【０００７】
より特定的には、本発明は、グルコノバクターオキシダンスＤＳＭ４０２５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３８１２）株、グルコノバクター属に属し、かつＧ．オキシダンスＤＳＭ４０２５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３８１２）の同定特性を有する微生物、およびそれらの変異体から選択される微生物を、反応混合物中でＤ−ソルビトール、Ｌ−ソルボース、Ｌ−ソルボソン、またはＬ−グロースと接触させ、反応混合物からビタミンＣを単離そして精製することを含む、Ｄ−ソルビトール、Ｌ−ソルボース、Ｌ−ソルボソン、またはＬ−グロースからのビタミンＣの製造方法に関する。
【０００８】
Ｇ．オキシダンスＤＳＭ４０２５は、ブタペスト条約の規定に基づいて、１９８７年３月１７日にＤＳＭ番号４０２５で、ゲッチンゲン（ドイツ）の微生物および細胞培養物のドイツ収集機関（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ，  ＤＳＭＺ）に寄託された。寄託者は、Ｔｈｅ  Ｏｒｉｅｎｔａｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｍｐｏｒｔ  ａｎｄ  Ｅｘｐｏｒｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  Ａｃａｄｅｍｉａ  Ｓｉｎｉｃａ，（５２  Ｓａｎ−Ｌｉ−Ｈｅ  Ｒｄ．，北京、中華人民共和国）であった。実際上の寄託者は、上記の研究機関であり、その完全な宛名は、Ｔｈｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｃｈｉｎａ，（Ｈａｉｄｉａｎ，  Ｚｈｏｎｇｇｕａｎｃｕｎ，北京１０００８０、中華人民共和国）である。
【０００９】
また、その株の継代培養株は、また、ブタペスト条約の規定に基づいて、１９９２年３月３０日に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−３８１２で、産業技術総合研究所（ＡＩＳＴ）（日本国、３０５−８５６６  茨城県つくば市東１−１−１、つくば中央第６）に寄託された。寄託者は、日本ロッシュ（株）（日本国、１０５−８５３２  東京都港区芝２丁目６−１）である。この継代培養株も、本発明において使用することができる。
【００１０】
Ｇ．オキシダンスＤＳＭ４０２５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３８１２）またはグルコノバクター属に属し、かつＧ．オキシダンスＤＳＭ４０２５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３８１２）の同定特性を有する微生物の変異株は、例えば、紫外線もしくはＸ線照射またはナイトロジェンマスタードもしくはＮ−メチル−ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等の化学的突然変異原で細胞を処理することにより得ることができる。
【００１１】
「グルコノバクターオキシダンス」は、また、原核生物命名国際コードにより定義されるように、同じ物理化学特性を有するそのような種の同義語またはバソニムを包含すると解される。
【００１２】
任意のタイプの微生物、例えば、静止細胞、アセトン処理細胞、凍結乾燥細胞、固定化細胞等を、基質に直接作用させるために用いることができる。インキュベーションに関連する方法としてそれ自体公知の任意の手段を、通気の使用によって採用することができ、攪拌下の液中発酵槽が特に好ましい。反応を行うための好ましい細胞濃度範囲は、１ｍｌ当たりに湿潤細胞重量約０．０１〜約０．７ｇ、好ましくは１ｍｌ当たりに湿潤細胞重量約０．０３〜約０．５ｇである。
【００１３】
培養は、ｐＨ４．０〜９．０で行うことができ、約５．０〜８．０のｐＨ値が好ましい。培養時間は、使用されるｐＨ、温度、および栄養培地により変化するが、好ましくは約１〜５日間、最も好ましくは約１〜３日間である。培養を行うのに好ましい温度範囲は、約１３〜約３６℃、最も好ましくは１８〜３３℃である。好ましい結果は、液体ブロス培地を利用するインキュベーションから得られる。
【００１４】
そこで、本発明の一つの態様は、
（ａ）微生物を、Ｄ−ソルビトール、Ｌ−ソルボース、Ｌ−ソルボソン、またはＬ−グロースを含有する水性栄養培地中で培養する工程であり、該工程中、該微生物がグルコノバクターオキシダンスＤＳＭ４０２５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３８１２）、グルコノバクター属に属し、かつＧ．オキシダンスＤＳＭ４０２５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３８１２）の同定特性を有する微生物、およびそれらの変異体よりなる群から選択される工程と、
（ｂ）発酵培地からビタミンＣを単離そして精製する工程とを含む、
Ｄ−ソルビトール、Ｌ−ソルボース、Ｌ−ソルボソン、またはＬ−グロースからのビタミンＣの製造方法であって；
約４．０〜約９．０の範囲のｐＨで、かつ約１３℃〜約３６℃の温度範囲で１〜５日間行うものである、
方法を提供することである。
【００１５】
好ましい実施態様においては、前記方法は、約５．０〜約８．０の範囲のｐＨで、かつ約１８℃〜約３３℃の温度範囲で１〜３日間行われる。
【００１６】
微生物のインキュベーションのための栄養培地として、炭素源、窒素源、他の無機塩類、少量の他の栄養素などを含み、微生物により利用されうる無機物およびビタミンを含む任意の水性栄養培地を使用することができる。微生物のより良好な増殖のために一般的に使用される種々の適切な栄養物質を培地中に含むことができる。
【００１７】
培養培地が、資化しうる炭素源、例えば、ビタミンＣに変換される炭素源の他に、グリセリン、Ｄ−マンニトール、エリスリトール、リビトール、キシリトール、アラビトール、イノシトール、ズルシトール、Ｄ−リボース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−グルコース、およびスクロース；有機物質等の消化しうる窒素源、例えば、ペプトン、酵母エキス、パン酵母、尿素、アミノ酸、およびコーンスティープ液のような栄養素を含有することが、通常求められる。種々の無機物質、例えば、硝酸塩およびアンモニウム塩を、同様に、窒素源として使用することができる。更に、培養培地は、通常、無機塩、例えば、硫酸マグネシウム、リン酸カリウム、および炭酸カルシウムを含有する。
【００１８】
インキュベーションを有利に行うために、最終生産物の生成を促進できる任意の適切な要素を培地に添加してもよい。そのような要素として、溶媒、洗浄剤、消泡剤、通気条件（例えば反応に適用される酸素濃度）が挙げられるが、これらに限定はされない。
【００１９】
Ｄ−ソルビトール、Ｌ−ソルボース、Ｌ−ソルボソン、またはＬ−グロースの濃度はまた、培養条件により変わりうるが、約２〜１２０ｇ／Ｌの濃度が一般に適用可能である。４〜１００ｇ／Ｌの濃度が好ましい。
【００２０】
培地または反応混合物中でこのようにして生産され蓄積されたビタミンＣは、生産物の特性を適切に利用したそれ自体公知の任意の慣用の方法により分離、精製することができ、遊離酸として、またはナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム等の塩として分離することができる。
【００２１】
具体的には、分離は以下の工程：塩の生成による工程、溶解度、吸収能および溶媒間の分配係数等の、生産物とその周りの不純物との間の特性の違いを用いることによる工程、吸着、例えばイオン交換樹脂上への吸着による工程、の任意の適切な組合せまたは繰返しにより行うことができる。これらの方法のいずれかの単独または組合せが、生産物を単離するための好都合な手段を構成する。このようにして得られた生産物は、慣用の方法、例えば、再結晶またはクロマトグラフィーにより、更に精製することができる。
【００２２】
本発明の方法により得られるビタミンＣの同定は、例えば、元素分析ならびに赤外吸収スペクトル、マススペクトル、ＮＭＲ等の物理化学的特性の測定により行うことができる。
【００２３】
本発明によれば、それは、基質Ｄ−ソルビトール、Ｌ−ソルボース、Ｌ−ソルボソン、またはＬ−グロースのいずれか一つからのビタミンＣの製造を目ざした一工程経路をもたらしているため、工程数削減の観点から、改善は極めて大きな意義を有するものである。
【００２４】
以下の実施例において、本発明の方法をより詳細に説明する。
【００２５】
実施例１：  Ｄ−ソルビトールのビタミンＣへの変換
５．０％Ｄ−マンニトール、０．２５％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．７５％コーンスティープ液、５．０％パン酵母、０．５％尿素、０．５％ＣａＣＯ３および２．０％寒天を含有する寒天培地上で、２７℃で４日間培養されて増殖したＧ．オキシダンスＤＳＭ４０２５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３８１２）の一白金耳を、８．０％Ｄ−ソルビトール、５．０％パン酵母、０．０５％グリセリン、０．２５％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．７５％コーンスティープ液、０．５％尿素、１．５％ＣａＣＯ３および消泡剤１滴を含有する試験管中の種培養培地５ｍｌに接種し、次いで、往復振盪器上で３０℃、２４０ｒｐｍで２０時間培養した。
【００２６】
種培養物３ｍｌを、８．０％Ｄ−ソルビトール、５．０％パン酵母、０．０５％グリセリン、０．２５％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、３．０％コーンスティープ液、１．５％ＣａＣＯ３および０．１５％消泡剤を含有する生産培地５０ｍｌを含有する５００ｍｌのエーレンマイヤーフラスコに移した。培養は、回転振盪器上で３０℃、１８０ｒｐｍで４５時間行った。次いで、生産されたビタミンＣの濃度を、ＵＶ検出器（東ソーＵＶ８０００；東ソー株式会社、日本国東京都中央区京橋３−２−４）、デュアルポンプ（東ソーＣＣＰＥ；東ソー株式会社）、積算計（島津Ｃ−Ｒ６Ａ；島津製作所、日本国京都市中京区西ノ京桑原町１）およびカラム（ＹＭＣ−パックポリアミドＩＩ；ＹＭＣ社、３２３３  Ｂｕｒｎｔ  Ｍｉｌｌ  Ｄｒｉｖｅ  Ｗｉｌｉｍｉｎｇｔｏｎ，  ＮＣ２８４０３，  ＵＳＡ）で構成されたシステムを有する、ＨＰＬＣ（波長２６４ｎｍで）で測定した。その結果、ビタミンＣ１１８．１ｍｇ／Ｌが生産された。
【００２７】
実施例２：  Ｌ−ソルボースのビタミンＣへの変換
５．０％Ｄ−マンニトール、０．２５％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．７５％コーンスティープ液、５．０％パン酵母、０．５％尿素、０．５％ＣａＣＯ３および２．０％寒天を含有する寒天培地上で、２７℃で４日間培養されて増殖したＧ．オキシダンスＤＳＭ４０２５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３８１２）の一白金耳を、８．０％Ｌ−ソルボース、５．０％パン酵母、０．０５％グリセリン、０．２５％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．７５％コーンスティープ液、０．５％尿素、１．５％ＣａＣＯ３および消泡剤１滴を含有する試験管中の種培養培地５ｍｌに接種し、次いで、往復振盪器上で３０℃、２４０ｒｐｍで２０時間培養した。
【００２８】
種培養物３ｍｌを、８．０％Ｌ−ソルボース、５．０％パン酵母、０．０５％グリセリン、０．２５％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、３．０％コーンスティープ液、１．５％ＣａＣＯ３および０．１５％消泡剤を含有する生産培地５０ｍｌを含有する５００ｍｌのエーレンマイヤーフラスコに移した。培養は、回転振盪器上で３０℃、１８０ｒｐｍで２０時間行った。その結果、ビタミンＣ４０７．１ｍｇ／Ｌが生産された。
【００２９】
実施例３：  静止細胞系でのＤ−ソルビトール、Ｌ−ソルボース、Ｌ−ソルボソン、またはＬ−グロースからのビタミンＣの生産
Ｇ．オキシダンスＤＳＭ４０２５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３８１２）を、８．０％Ｌ−ソルボース、０．２５％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．７５％コーンスティープ液、５．０％パン酵母、０．５％尿素、０．５％ＣａＣＯ３および２．０％寒天を含有する寒天培地上で２７℃で４日間培養した。上記の培地で増殖したＧ．オキシダンスＤＳＭ４０２５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３８１２）の細胞を５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に移し、同じ緩衝液で２回洗浄した。６００ｎｍでの細胞懸濁液の光学濃度は２１．９であった。それは、１ｍｌ当たり０．０５７ｇの湿潤細胞重量を含有していた。
【００３０】
反応混合物（試験管中５ｍｌ）は、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中に細胞懸濁液ならびに８．０％Ｄ−ソルビトール、８．０％Ｌ−ソルボース、０．５％Ｌ−ソルボソン、または１．０％Ｌ−グロースを含有していた。反応は、細胞懸濁液の接種により開始され、３０℃で、往復振盪器上で１８０ｒｐｍで行った。ビタミンＣ含有量は、反応時間４，２０および２４時間において、ＨＰＬＣで測定した。表１は、各々の基質からＧ．オキシダンスＤＳＭ４０２５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３８１２）により生産されたビタミンＣの量を示す。
【００３１】
【表１】
0004471841.tif 000002