(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織、血液、血漿、血清および尿から成る群から選ばれるサンプルと抗ヒト血漿ヒアルロニダーゼ（ｈｐＨＡｓｅ）抗体とを、抗ｈｐＨＡｓｅ抗体−ｈｐＨＡｓｅ複合体を形成するのに十分な時間接触させる工程；
該サンプル中に存在するｈｐＨＡｓｅの量を検出する工程；及び
該サンプル中で検出されたｈｐＨＡｓｅ量を正常レベルのｈｐＨＡｓｅと相関する既知量のｈｐＨＡｓｅを含むコントロールサンプル中のｈｐＨＡｓｅ量と比較する工程、を有し、
前記ｈｐＨＡｓｅが、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるか、または配列番号１で表されるアミノ酸配列をアミノ酸置換、欠失、または付加により改変したアミノ酸配列であって、ヒアルロニダーゼ活性を有するアミノ酸配列からなるｈｐＨＡｓｅであって、患者から得たサンプル中のｈｐＨＡｓｅ検出量がコントロールサンプル中のｈｐＨＡｓｅ量未満の場合、ＬｕＣａ−１の欠陥に付随する症状を有するか又はその疑いがある患者から得たサンプルであることを示唆する、配列番号４で表されるＬｕＣａ−１遺伝子の欠陥に付随する症状を有するか又はその疑いがある患者から得たサンプルを特定する方法。
【請求項２】
配列番号４で表されるＬｕＣａ−１遺伝子の欠陥に付随する症状をもつ患者にヒト血漿ヒアルロニダーゼ（ｈｐＨＡｓｅ）を投与するための医薬製剤であって、
ａ）治療上有効量の、精製された、少なくとも７５％の純度を有するｈｐＨＡｓｅポリペプチド；および
ｂ）医薬上許容可能な担体、
を含有し、前記ｈｐＨＡｓｅポリペプチドが、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるか、または配列番号１で表されるアミノ酸配列をアミノ酸置換、欠失、または付加により改変したアミノ酸配列であって、ヒアルロニダーゼ活性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドである医薬製剤。
【請求項３】
前記ｈｐＨＡｓｅポリペプチドが、ホスホリパーゼＣ、ホスホリパーゼＤおよびＮ−グリコシダーゼ−Ｆによる切断に耐性を有する脂肪酸部分を有する、請求項２に記載の医薬製剤。
【請求項４】
ａ）治療上有効量の、精製された、酵素活性があるヒト血漿ヒアルロニダーゼ（ｈｐＨＡｓｅ）ポリペプチドを含有する組成物；および
ｂ）医薬上許容可能な担体、
を含有する医薬製剤であって、前記ｈｐＨＡｓｅポリペプチドが、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるか、または配列番号１で表されるアミノ酸配列をアミノ酸置換、欠失、または付加により改変したアミノ酸配列であって、ヒアルロニダーゼ活性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドである医薬製剤。
【請求項５】
前記ｈｐＨＡｓｅポリペプチドが、少なくとも６０％の純度を有し、ポリペプチドが通常付随するタンパク質および天然に存在する有機分子を含まず、糖付加されており、２５℃より高い温度で非イオン性洗剤濃厚相へ分配される、請求項４に記載の医薬製剤。
【請求項６】
前記糖付加されたｈｐＨＡｓｅポリペプチドが、Ｎ−グリコシダーゼ−Ｆ処理に感受性である、請求項５に記載の医薬製剤。
【請求項７】
前記糖付加されたｈｐＨＡｓｅポリペプチドがマンノース残基を有する、請求項５または請求項６に記載の医薬製剤。
【請求項８】
前記ｈｐＨＡｓｅポリペプチドが、さらに脂肪酸修飾を有する、請求項４から請求項７のいずれか１項に記載の医薬製剤。
【請求項９】
前記脂肪酸修飾がホスホリパーゼＣ、ホスホリパーゼＤ、およびＮ−グリコシダーゼ−Ｆによる切断に耐性を示す、請求項８に記載の医薬製剤。
【請求項１０】
前記ｈｐＨＡｓｅポリペプチドの酵素比活性が少なくとも６×１０5相対的濁度減少単位（ＴＲＵ）／ｍｇタンパク質を示す、請求項４から請求項９のいずれか１項に記載の医薬製剤。
【請求項１１】
前記ｈｐＨＡｓｅポリペプチドの酵素比活性が少なくとも２×１０5相対的濁度減少単位（ＴＲＵ）／ｍｇタンパク質を示す、請求項４から請求項９のいずれか１項に記載の医薬製剤。
【請求項１２】
前記ｈｐＨＡｓｅポリペプチドがＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動で決定した相対分子量が５７ｋＤａである、請求項４から請求項１１のいずれか１項に記載の医薬製剤。
【請求項１３】
前記ｈｐＨＡｓｅポリペプチドが少なくとも７５％の純度を有する、請求項４から請求項１２のいずれか１項に記載の医薬製剤。
【請求項１４】
前記ｈｐＨＡｓｅポリペプチドが少なくとも９０％の純度を有する、請求項４から請求項１２のいずれか１項に記載の医薬製剤。
【請求項１５】
前記ｈｐＨＡｓｅポリペプチドが少なくとも９９％の純度を有する、請求項４から請求項１２のいずれか１項に記載の医薬製剤。
【請求項１６】
前記ｈｐＨＡｓｅポリペプチドが組換え体である、請求項４から請求項１５のいずれか１項に記載の医薬製剤。
【請求項１７】
前記ｈｐＨＡｓｅポリペプチドが天然に存在するｈｐＨＡｓｅである、請求項４から請求項１５のいずれか１項に記載の医薬製剤。
【請求項１８】
前記担体がリポソームである請求項４から請求項１７のいずれか１項に記載の医薬製剤。
【請求項１９】
非癌性細胞のヒト血漿ヒアルロニダーゼ活性のレベルと比べて低いレベルのヒト血漿ヒアルロニダーゼ活性を有する癌の患者において腫瘍の成長および転移のうち少なくとも一つを抑制するための、請求項４から請求項１８のいずれか１項に記載の医薬製剤。
【請求項２０】
皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射、または腫瘍周辺内注射による投与用に製剤化されている請求項１９記載の医薬製剤。
【請求項２１】
前記癌が乳癌、小型肺細胞癌、有棘肺細胞癌、脳の癌、頭部の癌および頚部の癌から選ばれる請求項１９記載の医薬製剤。
【請求項２２】
配列番号４で表されるＬｕＣａ−１遺伝子の欠陥に付随する癌の処置または予防のための組成物であって、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるか、または配列番号１で表されるアミノ酸配列をアミノ酸置換、欠失、または付加により改変したアミノ酸配列であって、ヒアルロニダーゼ活性を有するアミノ酸配列からなる、精製されたヒト血漿ヒアルロニダーゼ（ｈｐＨＡｓｅ）を含む組成物。
【請求項２３】
前記ｈｐＨＡｓｅが、ホスホリパーゼＣ、ホスホリパーゼＤおよびＮ−グリコシダーゼ−Ｆによる切断に耐性を有する脂肪酸部分を有し、少なくとも７５％の純度を有する、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
非癌性細胞のヒト血漿ヒアルロニダーゼ活性のレベルと比べて、低いレベルのヒト血漿ヒアルロニダーゼ活性を有する癌の患者において腫瘍成長および転移のうち少なくとも一つを抑制するための請求項２２または請求項２３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２５】
非癌性細胞のヒト血漿ヒアルロニダーゼ活性のレベルと比べて、低いレベルのヒト血漿ヒアルロニダーゼ活性を有する癌の患者において腫瘍の成長および転移のうち少なくとも一つを抑制するための薬剤の調合における精製されたヒト血漿ヒアルロニダーゼ（ｈｐＨＡｓｅ）の使用であって、前記ｈｐＨＡｓｅが、ホスホリパーゼＣ、ホスホリパーゼＤおよびＮ−グリコシダーゼ−Ｆによる切断に耐性を有する脂肪酸部分を有し、少なくとも７５％の純度を有し、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるか、または配列番号１で表されるアミノ酸配列をアミノ酸置換、欠失、または付加により改変したアミノ酸配列であって、ヒアルロニダーゼ活性を有するアミノ酸配列からなるｈｐＨＡｓｅである使用。
【請求項２６】
配列番号４で表されるＬｕＣａ−１遺伝子の欠陥に付随する癌の処置のための薬剤の調合における精製されたヒト血漿ヒアルロニダーゼ（ｈｐＨＡｓｅ）の使用であって、前記ｈｐＨＡｓｅが、ホスホリパーゼＣ、ホスホリパーゼＤおよびＮ−グリコシダーゼ−Ｆによる切断に耐性を有する脂肪酸部分を有し、少なくとも７５％の純度を有し、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるか、または配列番号１で表されるアミノ酸配列をアミノ酸置換、欠失、または付加により改変したアミノ酸配列であって、ヒアルロニダーゼ活性を有するアミノ酸配列からなるｈｐＨＡｓｅである使用。
【請求項２７】
配列番号４で表されるＬｕＣａ−１遺伝子の欠陥に付随する癌の処置または予防のための医薬組成物であって、ヒト血漿ヒアルロニダーゼ（ｈｐＨＡｓｅ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列およびそれに機能可能に連結した真核細胞性プロモーター配列を含有する構築物を含み、前記ｈｐＨＡｓｅポリペプチドが、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるか、または配列番号１で表されるアミノ酸配列をアミノ酸置換、欠失、または付加により改変したアミノ酸配列であって、ヒアルロニダーゼ活性を有するアミノ酸配列からなる医薬組成物。
【請求項２８】
前記構築物がウイルスベクターである、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
前記構築物が被包化されてない構築物である、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
前記ウイルスベクターがアデノウイルスベクターである、請求項２８に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
非癌性細胞のヒト血漿ヒアルロニダーゼ（ｈｐＨＡｓｅ）活性のレベルと比べて、低いレベルのヒト血漿ヒアルロニダーゼ活性を有する癌の患者において腫瘍の成長および転移のうち少なくとも一つを抑制するための医薬組成物であって、ｈｐＨＡｓｅポリペプチドをコードするヌクレオチド配列およびそれに機能可能に連結した真核細胞性プロモーター配列を含有する構築物を含み、前記ｈｐＨＡｓｅポリペプチドが、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるか、または配列番号１で表されるアミノ酸配列をアミノ酸置換、欠失、または付加により改変したアミノ酸配列であって、ヒアルロニダーゼ活性を有するアミノ酸配列からなる医薬組成物。
【請求項３２】
皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射、または腫瘍周辺内注射による投与用に製剤化されている請求項３１記載の医薬組成物。
【請求項３３】
前記癌が乳癌、小型肺細胞癌、有棘肺細胞癌、脳の癌、頭部の癌および頚部の癌から選ばれる請求項３１記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
関連出願との相互参照
本願は、米国特許出願第08/733360号（1996年10月17日出願、該出願は参照により本明細書に含まれる）の一部継続出願である。
合衆国連邦政府支援研究または支援開発に関する記述
本発明は、アメリカ予防衛生研究所のグラントCA44768号、CA58207号およびGM46765号の下、政府の支援を受けて達成された。合衆国政府は本発明に関して一定の権利を有するであろう。
発明の分野
本発明は、一般にβ-1,4-エンドグリコシダーゼ類、特にヒアルロニダーゼ類に関する。
発明の背景
ヒアルロニダーゼ（ＨＡｓｅ）類（E.C.3.1.25）は、微生物（例えばストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）、トレポネーマ・パラジウム（Treponema palladium）および線虫）、ミツバチ、ジガバチ、スズメバチ、クモ、サソリ、魚類、ヘビ、トカゲおよびホ乳類のような多様な生物において動物界全体で見出される、中性活性および酸活性の酵素である。ヒアルロニダーゼ類はヒアルロナン（ＨＡ；ヒアルロン酸としても知られている）を分解し、さらに分解度は低いがコンドロイチン硫酸も分解する（概説として、Kreilら、Protein Sci.,4:1666-9（1995）を参照のこと）。脊椎動物のヒアルロニダーゼ類は大きく２つの種類に分けられる。１）中性ヒアルロニダーゼ、例えば主に精液関連タンパク質ＰＨ２０（Liuら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:7832-7（1996）;Primakoffら、J.Cell Biol.,101:2239-44（1985）;Liuら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:10071-5（1993））;および２）酸活性ヒアルロニダーゼ、これはｐＨ3.5〜4.0で明瞭な最適ｐＨを示し、以下の臓器の抽出物で報告されている。肝臓（Fiszer-Szafarzら、Acta Biochim Pol.,42:31-3（1995））、腎臓（Komenderら、Bull.Acad.Pol.Sci.［Biol.］21:637-41（1973））、肺臓（Thetら、Biochem.Biophys.Res.Commun.,117:71-7（1983））、脳（Margolisら、Neutrochem.,19:2325-32（1972））、皮膚（Cashmanら、Arch.Biochem.Biophys.,135:387-95（1969））、胎盤、マクロファージ、線維芽細胞（Lienら、Biochim Biophys.Acta,1034:318-25（1990）;Ruggieroら、J.Dent.Res.,66:1283-7（1987））、尿（Fiszer-Szafarzら、上掲書）およびヒト血漿（De Saleguiら、Arch.Biochem.Biophys.,120:60-67（1967））。酸活性ヒアルロニダーゼ活性はまたホ乳類の血清でも報告されているが、いくつかの種では検出可能な活性は全く示されなかった（Fiszer-Szafarzら、Biol.Cell,68:95-100（1990）;De Saleguiら、（1967）上掲書）。
ヒアルロナン、ヒアルロニダーゼの主要基質は、［GlcNAcβ 1-4GlcUAβ 1-3］nの繰り返し二糖類で、インビボでは高分子直鎖多糖類として存在する。ヒアルロニダーゼによるヒアルロナンの分解は、β-N-アセチル-ヘキソサミン-［１→４］-グリコシド結合での切断またはβ-グルコノレート-［１→３］-N-アセチルグルコサミン結合での切断のいずれかによって達成される。
ヒアルロナンはホ乳類の主に結合組織、皮膚、軟骨および滑液で見出される。ヒアルロナンはまた目の硝子体の主要な構成成分である。結合組織では、ヒアルロナンに結合している水和水が組織間に空隙を作りだし、したがって細胞運動および細胞増殖に役立つ環境を造る。ヒアルロナンは、迅速な成長、再生、修復、胚形成、胚の発育、創傷治癒、脈管形成、および腫瘍形成を含む細胞の自動運動性に付随する生物学的現象に中心的役割を果たす（Toole,Cell Biol.Extracell.Matrix,Hay編、Plenum Press刊、New York、1384-1386（1991）;Bertrandら、Int.J.Cancer,52:1-6（1992）;Knudsonら、FASEB J.,7:1233-1241（1993））。さらに、ヒアルロナンレベルは腫瘍の攻撃性と相関する（Ozelloら、Cancer Res.,20:600-604（1960）;Takeuchiら、Cancer Res.,36:2133-2139（1976）;Kimataら、Cancer Res.,43:1347-1354（1983））。
ヒアルロニダーゼは、ヒアルロナン過剰を伴う疾患処置の治療薬として、さらに生理的液体の循環の強化のために、および／または投与部位での治療薬剤として有用である。例えば、ヒアルロニダーゼを用いて、硝子体液内のヒアルロナンの分解を通して緑内障患者の目の眼圧を低下させている（USPN 4,820,516号、1989年4月11日発行）。ヒアルロニダーゼはまた、化学療法剤の活性を高めるために、および／または腫瘍を化学療法剤にアクセスさせ易くするために“分散剤”として癌治療において用いられている（Schullerら、Proc.Amer.Assoc.Cancer Res.,32:173（1991）,アブストラクト番号1034;Czejkaら、Pharmazie,45:H.9（1990））。さらにヒアルロニダーゼは、膀胱癌（Hornら、J.Surg.Oncol.,28:304-307（1985））、有棘細胞癌（Kohnoら、J.Cancer Res.Oncol.,120:293-297（1994））、乳癌（Beckenlehnerら、J.Cancer Res.Cocol.,118:591-596（1992））および胃腸系癌（Scheithauerら、Anticancer Res.,8:391-396（1988））を含む多様なの治療で他の化学療法剤と組み合わせて用いられている。また、ヒアルロニダーゼの投与により、以前に化学療法耐性であった膵臓、胃、大腸、卵巣、乳房の腫瘍の応答性が誘発される（Baumgartnerら、Reg.Cancer Treat.,1:55-58（1988）;Zankerら、Proc.Amer.Assoc.Cancer Res.,27:390（1986））。血清ヒアルロニダーゼは、マウスに移植した腫瘍の増殖を防止する（De Maeyerら、Int.J.Cancer,51:657-660（1992））一方、ヒアルロニダーゼを注射することにより、発癌剤暴露によって惹起される腫瘍形成が抑制される（Pawlowskiら、Int.J.Cancer,23:105-109（1979）;Habermanら、第17回アメリカ臨床腫瘍学会総会議事録（Proceedings of the Annual Meeting of the American Society of Clinical Oncology）、ワシントンD.C.,22:105（アブストラクト番号415））。ヒアルロニダーゼの静脈内注射または筋肉内注射は脳腫瘍（神経膠腫）の治療に有効である（PCT公開出願WO88/02261号、1988年4月7日公開）。
ヒアルロニダーゼの発現、およびヒアルロンレベルは、腫瘍の発生と進行に関係を有する。卵巣（Miuraら、Anal.Biochem.225:333-40（1995））、前立腺（Lokeshwarら、Cancer Res.,56:651-7（1996））、脳、メラニン細胞、および大腸（Liuら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:7832-7837（1996））に由来する癌腫で分泌された中性ヒアルロニダーゼ活性のレベルは正常組織のものより高い。この分泌中性ヒアルロニダーゼ活性は、精子ヒアルロニダーゼＰＨ２０の中性ヒアルロニダーゼ活性と類似しているかまたは同一であるらしい。中性活性とは対照的に、酸活性の血清ヒアルロニダーゼ活性は、肺臓、乳房および大腸の転位性癌では顕著に減少する（Northrupら、Clin.Biochem.,6:220-8（1973）;Kolarovaら、Neoplasma,17:641-8（1970））。さらに、低レベルの血清ヒアルロニダーゼ活性に付随するｈｙａ１−１対立遺伝子座をもつマウスは、３倍高いヒアルロニダーゼ活性レベルを付随するｈｙａ１−１対立遺伝子座をもつマウスより速い移植腫瘍増殖速度を示す（Fiszer-Szafarzら、Somat.Cell.Mol.Genet.,15:79-83（1989）;De Maeyerら、上掲書）。
現時点で、臨床用途のために利用できる唯一のヒアルロニダーゼ活性は、ウシの精巣抽出物から単離されたヒアルロニダーゼ（WYDASE（登録商標）、Wyeth-Ayerst製）である。ウシの抽出物は、それが非ヒト由来であるだけでなく抽出物が多数のタイプのヒアルロニダーゼおよび未特定の他の成分を含んでいるために最適ではない。ヒト血清中の酸活性ヒアルロニダーゼ活性は投与に好ましいであろうが、このヒアルロニダーゼはこれまで単離または精製されたことがない。これまでの研究では血清中の酸活性のヒアルロニダーゼ活性は、血漿中のヒアルロニダーゼ活性が血清で見出されたものに匹敵するので、血小板の成分ではないと決定できたが、ヒト血清からのこの酸活性ヒアルロニダーゼ活性を単離する試みは、一部には精製活性の安定性のため、および適度に高い比活性を得ることが困難なため、成功は限られていた。免疫精製の試みは、血漿中の天然形の活性と特異的に結合する抗体を同定し単離することができないために妨げられている。通常のＥＬＩＳＡ技術によって特定されるモノクローナル抗体はＥＬＩＳＡスクリーニングアッセイで変性ヒト血漿ヒアルロニダーゼと結合し、天然の折り畳まれた構造のタンパク質とは結合しない（Harrisonら、J.Reprod.Fertil.,82:777-85（1988））。
ヒアルロニダーゼ活性のための通常の方法にはＥＬＩＳＡ様アッセイが含まれる（Delpechら、J.Immunol.Methods,104:223-9（1987）;Sternら、Matrix,12:397-403（1992）;Afifyら、Arch.Biochem.Biophys.,305:434-41（1993）;Reissigら、J.Biol.Chem.,217:956-966（1955））。このアッセイでは、ヒアルロニダーゼを含むサンプルを、ヒアルロナンまたはヒアルロネクチンを非共有結合によってその表面に結合させたマイクロタイター盤のウェルに塗布する。サンプル中に存在するＨＡｓｅはＨＡ基質を分解する。続いてプレートを洗浄し、残余のＨＡ基質についてプレートを検査してＨＡｓｅ活性を検出する。
ヒアルロニダーゼ活性は、基質ゲルザイモグラフィーによっても検出できる（Guentenhonerら、Matrix,12:388-396（1992））。このアッセイでは、サンプルはヒアルロナンを含むＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに適用され、サンプル中のタンパク質を電気泳動によて分離する。続いてゲルを酵素アッセイ緩衝液中でインキュベートし、その後で染色してゲル中のヒアルロナンを検出する。ヒアルロニダーゼ活性は基質ゲル中に鮮明なゾーンとして可視化される。
ヒアルロニダーゼ活性を検出するのこれらの従来の方法は、検出可能に標識化したヒアルロン酸基質を製造することの難しさ、および迅速で高感度でさらに再現性を有するヒアルロニダーゼ活性検出を達成する技術的困難の双方によって妨げられている。例えば、ＥＬＩＳＡ様アッセイで使用するヒアルロン酸のビオチン標識は、ＨＡが遊離アミノ基、即ち活性化ビオチンが共有結合する部分を含まないので、ビオチン付加には不向きであることが分かった。この問題を解決しようとする従来の試みは、ウシ鼻軟骨由来のビオチン付加ＨＡ結合アグリカン（aggrecan）ペプチドを用いることに集中していた（Levvyら、Method Enzymol.,8:571-584（1966））が、この方法は単調で時間のかかる工程を必要とする。
さらに、従来のヒアルロニダーゼアッセイは、ＨＡ基質がプレート表面に非共有結合によって結合したアッセイプレートを使用するが、これは偽陽性および偽陰性結果をもたらす可能性がある。ＨＡ基質はプレート表面に非共有結合によって結合されるので、ＨＡｓｅ含有サンプルにプレートを暴露した後の洗浄工程でしばしばプレート上の非分解ＨＡ基質の非特異的除去が生じる。したがって、従来のヒアルロニダーゼアッセイの感度は高くない。ゲルザイモグラフィーを用いるＨＡｓｅ活性は、ＥＬＩＳＡ様アッセイに伴うこの問題を回避することができるが、時間がかかり（例えばテストサンプルとＨＡ含有ゲルを通常約18〜24時間インキュベートする）、ゲルに過剰なタンパク質サンプルが適用されると人工産物を生じる可能性がある。さらにまた、粗調製物の分析はゲルザイモグラフィーでは不可能である。
したがって、好ましい酸活性血漿ヒアルロニダーゼ活性が存在するにもかかわらず、さらにヒトの血液と同じように貴重で稀少な資源から得られる一切の有用な成分を得ようとするヒト血液製剤メーカーの経済的動機にもかかわらず、この酸活性ヒアルロニダーゼ活性を含むヒト血漿分画は、その単離と精製に許容可能な方法が無いために廃棄されている。
化学療法におけるヒアルロニダーゼの価値を考えれば、ヒト血清中の酸活性ヒアルロニダーゼ活性と結びついたポリペプチドを同定し単離する方法が当分野で切望されている。
発明の要旨
本発明は、ヒト血漿で見出される酸活性ヒアルロニダーゼ（ｈｐＨＡｓｅ）の精製方法の発見に基づいており、該方法は生化学的精製法および免疫親和性精製法の双方を含む。本発明の免疫親和性精製法は、天然のｈｐＨＡｓｅと特異的に結合する抗体（抗天然ｈｐＨＡｓｅ抗体）を同定する方法、およびこのスクリーニング方法によって同定される抗天然ｈｐＨＡｓｅ抗体の発見に基づいている。本発明の特徴はまた、ビオチン付加ヒアルロン酸（ｂＨＡ）を用いる感度の高いＨＡｓｅ活性の検出アッセイである。ｈｐＨＡｓｅの精製および性状決定によって、発明者らは、ｈｐＨＡｓｅはＬｕＣａ−１遺伝子によってコードされるという新たな発見に到達した。この遺伝子はヒト染色体の３ｐ２１．３、即ち腫瘍抑制に関連する領域に位置する。
したがって、ある面として、本発明は、不溶性支持体および該支持体に共有結合させたビオチン付加ヒアルロン酸（ｂＨＡ）を有するヒアルロニダーゼ活性検出アッセイ装置に特徴を有する。好ましくは、ｂＨＡはヒアルロン酸、1-エチル-ジメチルアミノプロピルカルボジアミド（ＥＤＣ）およびビオチンヒドラジドの一工程反応で調製される。好ましい態様として、ｂＨＡは、ヒアルロン酸部分の二糖類100単位毎に少なくとも１つのビオチン部分を含み、ｂＨＡは、ヒアルロン酸部分の二糖類50単位毎に少なくとも１つの共有結合によって支持体に共有結合されている。
他の面として、本発明は、サンプルから天然の酸活性ヒアルロニダーゼ（ａａＨＡｓｅ）を精製する方法に特徴を有する。本方法は以下の工程を有する。（a）ａａＨＡｓｅを含んでいると思われるサンプルを、実質的に室温より低温の溶液であって非イオン性洗剤を含有する溶液に溶かす；（b）溶液の温度を実質的に室温より高温に上昇させ、温度上昇によってａａＨＡｓｅを含有する洗剤濃厚相および洗剤希薄相を形成し；さらに（c）当該洗剤濃厚相からａａＨＡｓｅを単離する。ａａＨＡｓｅはｈｐＨＡｓｅであるのが好ましく、工程（a）〜（c）を２度繰り返すのが好ましい。
また、他の面として、本発明は、天然のａａＨＡｓｅとの結合に関して候補抗体をスクリーニングする方法に特徴を有し、以下の工程を有する。（a）候補抗体を天然のａａＨＡｓｅを含有するサンプルと、抗体−ａａＨＡｓｅ複合体を形成するのに十分な時間、インキュベートし；（b）抗抗体及びそれに検出可能な標識化したヒアルロン酸を有する不溶性支持体にサンプルを、抗抗体−候補抗体−ｈｐＨＡｓｅ複合体を形成するために十分な時間、接触させ；さらに（c）支持体に接触させているサンプルを酸性ｐＨ約3.4〜3.7に曝露し、それによって抗体−ａａＨＡｓｅ複合体中のｈｐＨＡｓｅにより検出可能に標識化したヒアルロン酸を分解させる。ここでヒアルロン酸分解を伴うサンプルは抗ａａＨＡｓｅ抗体を含有する。これに関連する面として、本発明は、抗天然ｈｐＨＡｓｅ抗体、そのような抗体を分泌するハイブリドーマ細胞系、および抗ｈｐＨＡｓｅ抗体を結合させたｈｐＨＡｓｅの免疫精製用および／または検出用アッセイ装置に特徴を有する。
また他の面として、本発明は、サンプルからｈｐＨＡｓｅを精製する方法に特徴を有し、該方法は、ｈｐＨＡｓｅを含有するサンプルを抗ｈｐＨＡｓｅ抗体と接触させることを有する。好ましい態様として、サンプルはヒト血液、血清、血漿もしくは尿であり、またはｈｐＨＡｓｅが組換えｈｐＨＡｓｅである。
さらに他の面として、本発明は、ホスホリパーゼＣ、ホスホリパーゼＤおよびＮ−グリコシダーゼ−Ｆによる切断に耐性を有する脂肪酸部分により特徴づけられる実質的に精製された天然のｈｐＨＡｓｅに特徴を有する。これに関連する面として、本発明は、天然ｈｐＨＡｓｅ、特にリポゾーム製剤を含有する製剤である。
さらに他の面として、本発明は、組換えによってｈｐＨＡｓｅを発現させる方法に特徴を有する。本発明の組換え発現系は、ｈｐＨＡｓｅの工業的製造および治療的用途で使用するｈｐＨＡｓｅの製造に適した高レベルでの分泌ｈｐＨＡｓｅを提供する。これに関連する面として本発明は、組換えｈｐＨＡｓｅおよび組換えｈｐＨＡｓｅの製造方法に特徴を有する。
さらに関連する面として、本発明は、ヒアルロニダーゼ投与が所望される症状を有するか、またはその疑いがある患者を処置する方法である。具体的な態様として、本発明は、不完全なｈｐＨＡｓｅ発現に関連する癌をもつかまたは癌の疑いがある患者にヒト血漿ヒアルロニダーゼを投与することに特徴を有し、ｈｐＨＡｓｅポリペプチドを患者に腫瘍増殖を抑制するのに有効な量投与することを含む。さらなる態様として、本発明は、心筋梗塞発症後の患者またはリソソーム貯蔵系疾患を罹患している患者を処置する方法に特徴を有する。
本発明は、他の面として、不完全なＬｕＣａ−１遺伝子に関連する癌をもつかまたは癌の疑いがある患者を処置する方法を特徴とする。本方法は、ヒト血漿ヒアルロニダーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列およびそれらに機能可能に連結した真核細胞性プロモーター配列を有する構築物を患者の細胞に導入し、それによって該ヌクレオチド配列がｈｐＨＡｓｅを発現できるように該細胞を遺伝的に形質転換させることを有する。
本発明はまた、不完全なヒト血漿ヒアルロニダーゼ活性に関連する症状をもつかまたはその疑いがある患者を同定する方法に特徴を有する。本方法は、該患者の血漿サンプルを抗天然ヒト血漿ヒアルロニダーゼ抗体と接触させ、その酵素と抗体との複合体を検出する工程を含む。
本発明の主要な目的は、精製ヒアルロニダーゼ（ｈｐＨＡｓｅ）を提供することである。精製ヒアルロニダーゼは、癌治療、特に腫瘍抑制遺伝子ＬｕＣａ−１の欠陥に関連する癌治療を含む様々な臨床治療に用いることができる。
本発明の利点は、精製ｈｐＨＡｓｅが現在利用可能な市販ヒアルロニダーゼ製剤より治療的利用により適しているということである。この市販ヒアルロニダーゼは、非ヒト由来であり、（１種ではなく）２種のヒアルロニダーゼを含み、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で測定すると、極めて不純な混合物で、多様なタンパク質を含有する。これら多様なタンパク質には、数種の未同定タンパク質および抗凝固活性を含む種々の生物学的活性を有するタンパク質（Doctorら、Thrombosis Res.,30:565-571））が含まれる。精製ｈｐＨＡｓｅは、“清浄”なヒアルロニダーゼ供給源を提供し、現在利用できる市販の製剤に付随する副作用のいくつかを誘発する可能性が少なく、さらに特定の用量と結びついた活性レベルの制御を容易にする。
本発明の別の利点は、現在の工業的製造では廃棄される血漿の脂質分画からｈｐＨＡｓｅを精製することができることである。
本発明のＨＡｓｅアッセイの利点は、従来のＥＬＩＳＡ様アッセイよりも少なくとも1000倍感度が高いＨＡｓｅ活性のアッセイを提供することにある。さらに、本発明は、容易かつ効率的に調製できるビオチン付加ヒアルロン酸を提供する。
本発明の抗天然ａａＨＡｓｅアッセイの利点は、天然のａａＨＡｓｅと結合する抗体の迅速なスクリーニングを提供することにある。
本発明の別の利点は、ｈｐＨＡｓｅを特異的に検出することにより、ＬｕＣａ−１発現およびＬｕＣａ−１欠陥に関連する疾患（例えば小細胞型肺細胞癌のような癌）に対する感受性を有する患者の血清もしくは尿中ｈｐＨＡｓｅレベルと該疾患との相関性を測定する特異的な手段が可能となることである。
本発明のこれらの目的および他の目的、並びに特徴は、以下にさらに完全に記述する本発明の詳細を通読するにしたがって当業者には明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
図1は、ビオチン付加ＨＡの共有結合のための表面の化学的物理的構造を示す模式図である。
図2は、ビオチン付加ＨＡの化学構造を示す模式図である。
図3は、本発明の抗天然酸活性ＨＡｓｅ抗体アッセイの工程を示す模式図である。
図4は、種々の濃度の抗天然ｈｐＨＡｓｅ１７Ｅ９抗体（白丸）または結合コントロール抗体（白四角）で免疫沈澱させた後のヒト血漿の上清に付随するヒアルロニダーゼ活性を示すグラフである。
図5は、ＬｕＣａ−１の推定アミノ酸配列（配列番号：３）と天然のＨＡｓｅＰＨ２０のアミノ酸配列（配列番号：11）との整合を示す模式図である。同一のアミノ酸残基は黒地で示す。
図6は、ＬｕＣａ−１／ｈｐＨＡｓｅのハイドロパシー・プロットである。
図7Aは、ＬｕＣａ−１発現ｃｏｓ−７細胞と条件付け培養液（黒塗り棒）および偽トランスフェクト細胞と条件付け培養液（白棒）の洗剤抽出物の酸活性ＨＡｓｅ活性を示すグラフである。
図7Bは、ＬｕＣａ−１発現Ｈｅｋ２９３細胞と条件付け培養液（黒塗り棒）および偽トランスフェクト細胞と条件付け培養液（白棒）の洗剤抽出物の酸活性ＨＡｓｅ活性を示すグラフである。
図8は、ヒト血漿（白四角と実線）、ｃｏｓ−１細胞で発現させた組換えＬｕＣａ−１（黒四角と点線）、およびＶＩ−Ｓ型精巣ヒアルロニダーゼ（黒丸と点線）から精製したｈｐＨＡｓｅのＨＡｓｅ活性の最適ｐＨを示すグラフである。
図9は、正常なヒトケラチノサイト及び幾つかの癌細胞系の細胞層及び条件付け培養液でのｈｐＨＡｓｅの発現を示すグラフである。
図10は、ＨＳＣ−３頭部および頸部有棘細胞癌細胞の動物モデルでの成長に対するｈｐＨＡｓｅの腫瘍周囲への注射の効果を示すグラフである。
図11は、動物モデルでの腫瘍成長に対する形質転換ＨＳＣ−３細胞のｈｐＨＡｓｅ発現の効果を示すグラフである。
図12は、動物モデルでの悪液質に対する形質転換ＨＳＣ−３細胞のｈｐＨＡｓｅ発現の効果を示すグラフである。
好ましい態様の詳細な説明
本発明の精製ヒアルロニダーゼおよびそれをコードするＤＮＡについて述べる前に、本発明は、記載されている特定の方法、プロトコル、細胞株、ベクターおよび試薬そのものに限定されず、もちろん変更可能であることを理解すべきである。さらにまた、本明細書で使用する用語は、具体的な態様を説明することを目的としており、本発明の範囲を限定しようとするものではないことを理解すべきである。本発明の範囲は添付の請求の範囲によってのみ限定されるであろう。
本明細書および添付の請求の範囲で用いるとき、不定冠詞”a”および定冠詞”the”の単数形は、文脈が明らかに別のものを指す場合を除いて複数の対象物を含むことに留意しなければならない。したがって、例えば“１個のヒアルロニダーゼをコードするＤＮＡを含む１個の形質転換細胞”といえば、複数のそのような細胞を含み、“１個の該形質転換ベクター”といえば、１つまたは２つ以上の形質転換ベクターおよび当業者に既知の複数のその均等物を含む等々である。
特記しない限り、本明細書で使用される全ての技術的および学術的用語は、本発明が属する分野の通常の技術を有する者が一般に理解するものと同じ意味を有する。本明細書に記載したものと類似または均等のいずれの方法、装置および材料も本発明の実施または試験で用いることができるが、好ましい方法、装置および材料をこれから述べる。
本明細書に記載する全ての刊行物は、本発明に関連して用いることが可能な当該文献に記載されている細胞系、ベクターおよび方法を説明し開示する目的のために参照として本明細書に含まれる。
定義
“酸活性ヒアルロニダーゼ”または“ａａＨＡｓｅ”とは、ヒアルロナンの切断でβ-1,4-エンドグリコシダーゼ活性を有し、かつＨＡｓｅ活性の最適ｐＨが約ｐＨ3.7であるヒアルロニダーゼを意味する。本明細書で使用されるａａＨＡｓｅはヒト血漿ヒアルロニダーゼを含む。
“ヒト血漿ヒアルロニダーゼ”、“ヒト血漿酸活性ヒアルロニダーゼ”および“ｈｐＨＡｓｅ”とは、ヒト血漿に天然に見出され、以下の特性を有するヒアルロニダーゼを意味する。１）ヒアルロンの切断でβ-1,4-エンドグリコシダーゼ活性；２）ＨＡｓｅ活性における最適ｐＨが約ｐＨ3.7；３）12.5％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ非還元型ゲル電気泳動で決定した分子量が約57ｋＤａ；４）酵素比活性が約2×105から8×105濁度減少単位（turbidity reducing unit（TRU））／ｍｇ精製後タンパク質；５）モノ-P f.p.l.c.上でクロマトフォーカシングで溶出して決定したとき等電点がｐＨ6.5；６）温度誘発洗剤相抽出でトリトンＸ−１１４洗剤濃厚相へ分配される；７）ホスホリパーゼＣ、ホスホリパーゼＤ、およびＮ−グリコシダーゼ−Ｆによる切断に耐性を示す脂肪酸翻訳後修飾（例えば脂質アンカー）；８）少なくとも２つのN-連結糖付加部位；および９）下記のアミノ酸配列（配列番号：１）を有すること；
0004503708.tif 000002
式中、ＭＡＧＨＬＬＰＩＣＡＬＦＬＴＬＬＤＭＡＱＧ（配列番号：２）は、翻訳後修飾時に切断されるシグナル配列である。本明細書で使用される“ｈｐＨＡｓｅ”は、天然に存在するｈｐＨＡｓｅのアミノ酸配列を有するｈｐＨＡｓｅポリペプチドとともに、アミノ酸置換、欠失および／または付加（例えば融合タンパク質）などにより、天然に存在するアミノ酸配列に対して改変されているｈｐＨＡｓｅを包含する。“ｈｐＨＡｓｅ”は、生物学的に活性な（例えば抗ｈｐＨＡｓｅ抗体と結合し、および／またはヒアルロニダーゼ活性を示すことができる）ｈｐＨＡｓｅポリペプチドを包含するのが好ましい。
“ｈｐＨＡｓｅの尿型”または“尿ｈｐＨＡｓｅ”とは、ヒトの尿中に見出され、以下の特性を有するｈｐＨＡｓｅの形態を意味する。１）ヒアルロンの切断でβ-1,4-エンドグリコシダーゼ活性；２）ＨＡｓｅ活性における最適ｐＨが約ｐＨ3.7；３）12.5％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ非還元型ゲル電気泳動を用いるゲルザイモグラフィーで決定したとき分子量が約57ｋＤａ；４）ＬｕＣａ−１に特異的な抗天然ｈｐＨＡｓｅモノクローナル抗体で免疫沈澱；５）モノ-P f.p.l.c.上でクロマトフォーカシングで溶出して決定したとき等電点がｐＨ6.5；及び６）温度誘発洗剤相抽出でトリトンＸ−１１４洗剤濃厚相へ分配される。
“天然ｈｐＨＡｓｅ”とは、その天然に存在する構造で折り畳まれた（すなわちｈｐＨＡｓｅは変性していない）ｈｐＨＡｓｅを意味する。天然のｈｐＨＡｓｅが天然に存在するｈｐＨＡｓｅの完全なアミノ酸配列（配列番号：１）を含まない場合、天然のｈｐＨＡｓｅポリペプチドは、折り畳まれたときに、天然のｈｐＨＡｓｅと結合する抗体が該ｈｐＨＡｓｅポリペプチドと結合するように天然の完全長のｈｐＨＡｓｅの三次元エピトープに極めて類似するポリペプチドである。“天然のｈｐＨＡｓｅ”は、ヒトの血漿、血液、血清および尿中に天然に見出されるｈｐＨＡｓｅ、並びに組換えによって（例えばホ乳類細胞での発現によって）産生されるｈｐＨＡｓｅの双方を包含する。
“ポリペプチド”とは、長さに関係なく、又は翻訳後修飾（例えば糖付加、リン酸化または脂肪酸鎖の修飾）に関係なく、一切のアミノ酸の鎖を意味する。
“実質的に純粋なポリペプチド”とは、該ポリペプチドに天然に付随する成分から分離されたポリペプチドを意味する（例えば、ヒトの血漿から精製した実質的に純粋なｐｈＨＡｓｅポリペプチドは、ヒト血漿に通常付随する成分を実質的に含まない）。典型的には、ポリペプチドは、少なくとも60重量％のときに実質的に純粋であり、該ポリペプチドに通常付随するタンパク質および天然に存在する有機分子を実質的に含まない。好ましくは、調製物は、ｈｐＨＡｓｅポリペプチドが少なくとも75重量％、より好ましくは少なくとも90重量％、最も好ましくは少なくとも99重量％である。実質的に純粋なｈｐＨＡｓｅポリペプチドは、例えば天然の供給源（例えばホ乳類の血漿、好ましくはヒト血漿）からの抽出によって；ｈｐＨＡｓｅをコードする組換え核酸の発現によって；または該タンパク質を化学的合成することによって得ることができる。純度は、適切ないずれかの方法、例えばクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはＨＰＬＣ分析によって測定できる。
タンパク質は、天然の状態で該タンパク質に付随する不純物から分離されているとき、天然に付随する成分を実質的に含まない。したがって、化学的に合成されたタンパク質、または天然にそれが生成される細胞とは異なる細胞系で産生されるタンパク質は、それに天然に付随する成分を実質的に含まないであろう。したがって、実質的に純粋なポリペプチドは、真核生物に由来するものだけでなく、大腸菌または他の原核細胞で合成されたポリペプチドを含む。
“抗体”とは、抗原と結合できる免疫グロブリンペプチドを意味する。本明細書で使用される抗体には完全な抗体、並びに問題のエピトープ、抗原または抗原フラグメントと結合できる一切の抗体フラグメント（例えばＦ（ａｂ’）2、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ）を含む。本発明の抗体は、天然ｈｐＨＡｓｅポリペプチドに対して免疫応答性または免疫特異的であるため、該天然ｈｐＨＡｓｅと特異的かつ選択的に結合する。抗ｈｐＨＡｓｅ抗体は好ましくは免疫特異的である（すなわち、関連物質と実質的に交差反応性をもたない）。抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよいが、好ましくはモノクローナルである。
“特異的に結合する”とは、特異的ポリペプチド、即ちｈｐＨＡ抗体のエピトープとの抗体の高いアビディティ結合および／または高い親和性結合を意味する。この特異的ポリペプチド上での抗体とそのエピトープとの結合は、好ましくは同じ抗体と他の一切のエピトープとの結合（特にサンプルに付随するかまたは同じサンプル中の分子に存在するエピトープ）よりも強い。なぜならば、例えば問題の特異的ポリペプチドはヒト血漿中の他の成分よりもｈｐＨＡｓｅとより強力に結合するからである。問題のポリペプチドと特異的に結合する抗体は、弱いながら検出可能なレベル（問題のポリペプチドに対して示される結合の例えば10％またはそれ未満）で結合することが可能であろう。そのような弱い結合またはバックグラウンド結合は、問題の化合物またはポリペプチドと結合する特異的な抗体と、例えば適切なコントロールの使用によって、容易に判別できる。一般に、107リットル／モルまたはそれ以上、好ましくは108リットル／モルまたはそれ以上、さらに好ましくは109ｌ／モルまたはそれ以上の結合親和性で天然のｈｐＨＡｓｅと結合する本発明の抗体はｈｐＨＡｓｅと特異的に結合すると言える。一般に、104ｌ／モルまたはそれ未満の結合親和性をもつ抗体は、現在用いられる通常の方法で検出できるレベルで抗原と結合しないということで有用ではない。
“抗天然ｈｐＨＡｓｅ抗体”または“抗ｈｐＨＡｓｅ抗体”とは、天然の（非変性）ｈｐＨＡｓｅと特異的に結合する抗体を意味する。好ましくは、そのような抗体を用いて、ヒトの血漿および／または例えばホ乳類細胞によって発現された組換えｈｐＨＡｓｅから天然に存在するｈｐＨＡｓｅを（例えば免疫沈澱または免疫親和性カラムクロマトグラフィーによって）免疫精製することができる。
“機能可能に連結された”とは、適切な分子（例えば転写アクチベータータンパク質）が調節配列に結合し、したがって例えばｈｐＨＡｓｅポリペプチド、組換えタンパク質、またはＲＮＡ分子の産生を促進するときに問題のＤＮＡの遺伝子発現を可能にする態様で、その問題のＤＮＡ（例えばｈｐＨＡｓｅポリペプチドをコードするＤＮＡ）および調節配列が連結されることを意味する。
“形質転換”とは、新規なＤＮＡ（すなわち当該細胞にとって外因性ＤＮＡ）の取り込みに続いて細胞内で誘発される永久的遺伝的変化を意味する。細胞がホ乳類細胞の場合、永久的遺伝的変化は一般に、そのＤＮＡを細胞ゲノム内に導入することによって達成される。
“ベクター”とは、本発明のｈｐＨＡｓｅポリペプチドをコードするＤＮＡによるホスト細胞の形質転換を促進する一切の生物学的または化学的合成物を意味する。
“実質的に同一”とは、ポリペプチドまたは核酸が、参照アミノ酸配列または核酸配列に対して少なくとも50％、好ましくは85％、より好ましくは90％、最も好ましくは95％の相同性を示すことを意味する。ポリペプチドについては、比較配列の長さは一般に、少なくとも16アミノ酸、好ましくは少なくとも20アミノ酸、より好ましくは少なくとも25アミノ酸、最も好ましくは35アミノ酸であろう。核酸については、比較配列の長さは、一般に少なくとも50ヌクレオチド、好ましくは少なくとも60ヌクレオチド、最も好ましくは110ヌクレオチドであろう。
配列同一性は典型的には配列分析ソフト（配列分析ソフトは、例えばウィスコンシン大学、バイオテクノロジー・センターのジネティクス・コンピュータ・グループ（Genetics Computer Group,University of Wisconsin Biotechnology Center,1710 University Avenue,マジソン、ウィスコンシン州、53705）による配列分析ソフトパッケージ（Sequence Analysis Software Oackage））を用いて測定される。そのようなソフトは、種々の置換、欠失、およびその他の変更に対して相同性の度合いを決定することによって類似の配列を整合させる。典型的には、保存的置換は以下のグループ内の置換を含む。グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。
“処置”及び“処置する”という用語は、一般に所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを意味するのに本明細書では使用される。この効果は、疾患またはその症状を完全にまたは部分的に予防するという意味で予防的であってもよく、並びに／または、疾患及び／もしくはその疾患をもたらす有害な作用を部分的または完全に治癒させるという意味で治療的であってもよい。本明細書で使用される“処置”とは、ホ乳類、特にヒトの疾患の一切の処置を包含し、これには（a）ある疾患（例えば癌）に罹患する傾向を有するが未だ罹患していると診断されていない対象者で当該疾患の発生を防止すること；（b）該疾患を抑制すること、即ちその進行を停止させること；または（c）該疾患を緩和させること、即ち該疾患を退行させること（例えば腫瘍容積の減少、悪液質の鈍化）が含まれる。本発明は、ＬｕＣａ−１遺伝子（ｈｐＨＡｓｅをコードする遺伝子）欠陥に付随する癌を有するか、またはその疑いのある患者の処置に関する。
“治療上有効量の実質的に純粋なｈｐＨＡｓｅポリペプチド”とは、所望の治療効果を促進させるのに有効な、実質的に純粋なｈｐＨＡｓｅポリペプチドの量を意味する。所望する正確な治療効果は処置すべき症状にしたがって変化するであろう。例えば、ヒアルロナンの所望の分解は、過剰ヒアルロナン、不所望の細胞運動性（例えば腫瘍細胞の転移）に付随する症状の処置において、および／または投与部位の生理的液体の循環を強化させるために、および／または腫瘍成長または進行を抑制するために、患者にｈｐＨＡｓｅが投与される場合に所望される治療効果である。ＬｕＣａ−１欠陥に関連する癌をもつかまたはその疑いがある患者を処置するのにｈｐＨＡｓｅが投与される場合、望ましい治療効果の１つには、腫瘍細胞の成長抑制およびアポプトシスに対する腫瘍細胞の閾値の低下（すなわちプログラムされた細胞死の引き金となるものへの細胞の感受性の増強）が含まれるが、ただしこれらに限定されない。ｈｐＨＡｓｅの治療効果は、ｈｐＨＡｓｅのヒアルロニダーゼ活性、コンドロイタナーゼ活性またはその両方に付随しているであろう。
“ＬｕＣａ−１欠陥”または“ｈｐＨＡｓｅ欠陥”とは、細胞の染色体3p.21.3部位における遺伝的欠陥を意味する。この欠陥は、正常細胞のｈｐＨＡｓｅ活性レベルと比較してｈｐＨＡｓｅ活性レベルの低下、および／または罹患患者の血清または血漿中のｈｐＨＡｓｅ活性レベルの低下（例えばｈｐＨＡｓｅ発現の低下または欠陥ｈｐＨＡｓｅの発現のため）を伴う。“ＬｕＣａ−１欠陥”または“ｈｐＨＡｓｅ欠陥”はまた、罹患患者の血清または血漿中のｈｐＨＡｓｅ活性レベルの低下を伴う細胞性欠陥（例えばｈｐＨＡｓｅの血流中への輸送における欠陥）も包含する。例えば、ＬｕＣａ−１欠陥に関連する肺癌をもつ患者由来の血漿は、通常の患者（すなわちＬｕＣａ−１欠陥に関連する癌をもたない患者）の血漿より約50％未満のｈｐＨＡｓｅ活性を示す。健常人の血漿は、本発明のＨＡｓｅアッセイを用いて測定したとき、ｈｐＨＡｓｅ活性が約15ｒＴＲＵ／ｍｇを示す。ＬｕＣａ−１欠陥に関連する肺癌患者の血漿のｈｐＨＡｓｅ活性は約7.5ｒＴＲＵ／ｍｇである。
“ＬｕＣａ−１欠陥に関連する症状をもつか、またはその疑いがある”とは、ＬｕＣａ−１遺伝子座におけるヘテロ接合型、ホモ接合型または後成型（epigenetic）欠陥を有するか、および／または通常の患者（すなわちｈｐＨＡｓｅレベルの変化をもたらすＬｕＣａ−１欠陥をもたない患者）のｈｐＨＡｓｅレベルと較べてｈｐＨＡｓｅレベル（例えば血清ｈｐＨＡｓｅまたは尿ｈｐＨＡｓｅ、好ましくはｈｐＨＡｓｅ）の低下を伴うＬｕＣａ−１遺伝子座外のなんらかの遺伝的欠陥をもつ患者を意味する。ＬｕＣａ−１欠陥に付随する症状をもつか、その疑いがある典型的な患者は、正常レベルのｈｐＨＡｓｅを発現しない癌または前癌細胞（例えば転移性癌）をもつ患者である。
これからさらに詳細に本発明について説明する。
ヒアルロニダーゼ活性のアッセイ
本発明のＨＡｓｅアッセイは、1-エチル-ジメチルアミノプロピルカルボジアミド（ＥＤＣ、ClCH2CH2Cl、Sigma）およびビオチンヒドラジド（Pierce）を用いる簡単な一工程反応を介して、フリーのカルボキシル基のビオチン付加によるＨＡの標識化を必要とする。簡単に記せば、溶解ＨＡおよび溶解ビオチンヒドラジドを含んでなる溶液をＥＤＣと混合する。ビオチンは、ＥＤＣおよびＨＡに対して過剰に存在するのが好ましい。存在するＥＤＣのモル量は、ＨＡの二糖類単位のカルボキシル基とビオチン部分のＮＨ基との間に見出されるべき所望の共有結合の数（すなわちＨＡ二糖類単位数に対する所望のビオチン部分の数）にしたがって変動する。ＨＡ二糖類単位：ＥＤＣのモル比は、85：１である一方、ビオチンヒドラジド：ＥＤＣのモル比は38：１であるのが好ましい。得られるＨＡ−ｂＨＡ化合物の代表的な化学構造を図１に示す。
ＨＡ−ＥＤＣ−ビオチンヒドラジド反応の完了後、非共役ビオチンを透析、好ましくは蒸留水に対して透析して除去することができる。得られたビオチン付加ＨＡ基質（ｂＨＡ）は、ＨＡ分子に共有結合したＥＤＣ−ビオチン部分を、ＨＡ分子中に二糖類部分200単位毎に、好ましくは二糖類部分150単位毎に、より好ましくは二糖類部分85〜100単位毎に１つのＥＤＣ-ビオチン比で有する。ＥＤＣ−ビオチン：ＨＡのモル比は、１：１（例えば二糖類１単位に対して１つのＥＤＣ−ビオチンが結合）〜５：１（例えば二糖類100単位を含むＨＡ分子に対して１つのＥＤＣ−ビオチンが結合）の範囲であろう。ｂＨＡ試薬は好ましくは-20℃で使用まで保存できる。
ＨＡｓｅ活性の検出用アッセイ装置は、例えば共有結合部ＮＨ−ＣＨ3を有する微量定量ウェル（例えばコバリンク（Covalink）−ＮＨ微量定量プレート、NUNC,ニュージャージ州、Placerville）の表面にｂＨＡを接合させることによって調製する。共有結合のための表面の代表的な化学的および物理的構造を図２に示す。そのような基質の調製方法及び化合物を共有結合により固定するのにそのような基質を用いることは、当技術分野で周知である（例えば米国特許第5,427,779号明細書（1996年6月27日発行）およびＰＣＴ公開出願第WO8905329号（1989年6月15日公開）を参照のこと）。ｂＨＡをアッセイ装置に接合することは、例えば製造元の説明書にしたがってコバリンク−ＮＨウェル中でＥＤＣとともにｂＨＡをインキュベートすることによって達成される。未結合ｂＨＡはウェルを緩衝液で洗浄して除去される。プレートのウェルに残留するｂＨＡは該ウェルの表面に共有結合している。得られたアッセイ装置は、テストサンプルに曝されるべき表面に共有結合したｂＨＡを含み、このｂＨＡは、少なくとも１つの共有結合、好ましくはｂＨＡ分子中の二糖類単位200毎に少なくとも１つの共有結合、より好ましくは二糖類単位100毎に少なくとも１つの共有結合、最も好ましくはｂＨＡ分子中の二糖類単位50毎に少なくとも１つの共有結合によって該表面に結合している。プレートを調製後約１週間から10日以内に使用するのが好ましい。
ＨＡｓｅ活性アッセイを、共有結合ｂＨＡを有するアッセイ装置のウェルにテストサンプルを配置し、テストサンプル中のｈｐＨＡｓｅがウェル中のｂＨＡを分解するのに十分な時間、サンプルをインキュベートすることによって行う。テストサンプルは、ＨＡｓｅ活性を有すると考えられるいずれのサンプル（例えば生物学的サンプル（例えば血液、血清、血漿、尿、または組換え供給源に由来するサンプル）または生化学的精製中の工程で得られるサンプル）でもよい。既知量のｈｐＨＡｓｅ活性を有するサンプルをコントロールとして該アッセイを行うのが好ましい。
インキュベーション緩衝液のｐＨは、サンプル中のＨＡｓｅ活性の最適ｐＨにしたがって調節できる（例えば、中性ＨＡｓｅ活性（ｐＨ約7.0〜7.5）、酸活性ＨＡｓｅ活性（ｐＨ約4.5より低く、好ましくは約ｐＨ3.0〜3.7である）。インキュベーション後、ウェルを洗浄して分解ｂＨＡを除去し、例えば残留ｂＨＡとアビジンペルオキシダーゼとの反応及びマイクロプレート読み取り装置による検出によって残留する未分解ｂＨＡを検出する。ｂＨＡがアッセイ装置に共有結合することによって、未分解ｂＨＡがプレートから流出することを防止し、したがってアッセイの感度および精度が高まる。さらに、本アッセイは完了までにわずか60分またはそれ未満を必要とするだけで、さらに感度は通常の比色アッセイ（Afifyら、上掲書）より1,000倍高く、ＳＤＳ式ゲルザイモグラフィーよりも約1,000〜5,000倍高い。本発明のＨＡｓｅアッセイは、サンプル中の酸活性または中性ＨＡｓｅ活性の有無を（定性的または定量的に）決定しようとする種々の用途に用いることができる。ある態様として、本発明のＨＡｓｅ活性アッセイは、ＨＡｓｅ活性における欠陥（例えばｈｐＨＡｓｅの血漿活性低下を伴うＬｕＣａ−１／ｈｐＨＡｓｅにおける欠陥）を有する患者の同定に有用である。
ヒアルロニダーゼの比活性は濁度減少単位（ＴＲＵ）で表される。１ＴＲＵは、ヒアルロナンの酸性溶液の濁度を減少させるために必要なヒアルロニダーゼ活性の量と定義され、U.S.P./国民医薬品集（NF XIII）単位（ＮＦＵ）に相当する。上記のアッセイを用いて得られた結果は、U.S.P.によって標準化したヒアルロニダーゼサンプル（例えばWYDASE（登録商標）、Wyeth-Ayerst）の標準曲線を介してＴＲＵ、ＮＦＵおよびU.S.P.単位と相関させることができる。例えば、標準曲線をウシ精巣ヒアルロニダーゼ（WYDASE（登録商標））の段階的希釈物を同時にインキュベートすることによって作成し、４種のパラメーター曲線で内挿した既知サンプルの活性を適合させて、相対的ＴＲＵ（ｒＴＲＵ）／ｍｌにおける値を得ることができる（Dorfmanら、J.Biol.Chem.,172:367（1948））。
生化学的ｈｐＨＡｓｅ精製方法
酸活性ヒアルロニダーゼ活性は、非イオン性洗剤（例えばトリトンＸ−１１４）による温度誘発洗剤相抽出によって顕著に濃縮および／または精製することができる。一般に、例えばｈｐＨＡｓｅのような酸活性ＨＡｓｅ（ａａＨＡｓｅ）を含むサンプルまたは含むと思われるサンプルを、低温（例えば実質的に室温より低い温度、好ましくは約15℃未満、より好ましくは約４℃）で非イオン性洗剤を含む溶液に溶解する。サンプルは、例えば未加工ヒト血漿、血小板脱顆粒のない古くなったヒト血漿（例えばクエン酸塩添加による）、ヒト血漿の脂質分画、ヒト血液、ヒト血清、ヒトの尿、または組換えａａＨＡｓｅを発現する細胞（例えばホ乳類、昆虫、細菌または酵母細胞、好ましくはホ乳類細胞）の条件づけ培養液もしくは該細胞溶解物とすることができる。好ましくは、該サンプルはヒト血漿またはヒトの尿であり、これらは特にｈｐＨＡｓｅの豊富な供給源である。血漿からの精製は、血漿分画が血清または全血よりも総タンパク量が少ないので、全血または血清から精製するより有利である。
サンプルを溶解した後、溶液の温度を少なくとも室温またはそれより高い温度（好ましくは約25℃より高く、より好ましくは約37℃）に上昇させ、それによって洗剤濃厚相および洗剤希薄相を生成させる。ａａＨＡｓｅは洗剤濃厚相へ分配される。この洗剤濃厚相は、洗剤濃厚相の除去および温度誘発洗剤相抽出の繰り返しによってさらにａａＨＡｓｅが濃縮される。この温度誘発洗剤相抽出を３回繰り返すことによって、出発材料のａａＨＡｓｅ活性に対して少なくとも約10倍、好ましくは少なくとも約20倍、より好ましくは少なくとも約60倍ａａＨＡｓｅが濃縮される。洗剤濃厚相のａａＨＡｓｅ活性は、例えば陽イオン交換クロマトグラフィーおよび／またはヒドロキシルアパタイト樹脂によってさらに濃縮および精製できる。
抗天然ａａＨＡｓｅ抗体の製造と特定
ある任意の抗原から抗体を製造する方法は知られているが、これまで抗天然ａａＨＡｓｅ抗体（例えば抗天然ｈｐＨＡｓｅ抗体）を製造する試みは失敗に終わっている。変性抗ａａＨＡｓｅと結合する抗体は製造されたことがあるが、通常の方法および通常のＥＬＩＳＡアッセイを用いて製造されたこれらの抗体は、天然の（すなわち非変性）ａａＨＡｓｅとは結合しなかった（Harrisonら、J.Reprod.Fertil.,82:777-85（1988））。本明細書に開示する方法に従うことによって、天然のａａＨＡｓｅ（例えば天然のｈｐＨＡｓｅ）と結合する抗体が得られた。同様に、当業者は本明細書に概略した方法にしたがって、他の抗天然ｈｐＨＡｓｅ抗体を含む他の抗天然ａａＨＡｓｅ抗体を生成することができる。一般に本発明は、天然のａａＨＡｓｅと結合する抗体を検出するスクリーニングアッセイを提供することによって、ａａＨＡｓｅ抗体の製造に付随する問題を克服した。
抗ｈｐＨＡｓｅ抗体の作製
当技術分野で周知であり日常的となっている方法にしたがって、ホ乳類（例えばマウス、ラット、ウサギ、ヤギ）の免疫およびハイブリドーマ細胞系の製造にａａＨＡｓｅを抗原として用いることができる（例えばHarlow & Lane,Antibodies:A Laboratory Manual（1988）,Cold Spring Harbor Laboratory刊、ニューヨーク州、Cold Spring Harbor;及びSchrierら、Hybridoma Techniques（1980）,Cold Spring Harbor Laboratory刊、ニューヨーク州、Cold Spring Harborを参照のこと）。抗原調製体に用いられるａａＨＡｓｅは、該ａａＨＡｓｅが天然に存在する供給源（例えばヒト血漿から精製したｈｐＨＡｓｅ）、組換えａａＨＡｓｅ、生物学的に活性な（例えば抗原的におよび／または酵素的に活性な）ａａＨＡｓｅポリペプチド、天然のａａＨＡｓｅ、および／または変性ａａＨＡｓｅポリペプチドから精製できる。該ａａＨＡｓｅが組換えａａＨＡｓｅの場合、該組換えａａＨＡｓｅは天然に存在するａａＨＡｓｅのアミノ酸配列を有していてもよいか、または天然のａａＨＡｓｅに対して（例えばアミノ酸置換、欠失、または付加（例え融合タンパク質）によって）修飾されていてもよい。抗原調製体は、天然のａａＨＡｓｅ（例えばａａＨＡｓｅが天然に存在する供給源から精製されたａａＨＡｓｅまたは完全長の組換えａａＨＡｓｅ）であるのが好ましい。ａａＨＡｓｅはいずれの酸活性ヒアルロニダーゼでもよいが、好ましくはａａＨＡｓｅはｈｐＨＡｓｅである。
抗ａａＨＡｓｅ抗体のためのアッセイ
ハイブリドーマ細胞系によって分泌された抗体は、本発明の抗天然ａａＨＡｓｅ抗体アッセイでスクリーニングされる。一般に、このアッセイは、１）抗抗体；および２）検出可能に標識化したヒアルロン酸（ＨＡ）が結合した不溶性支持体を必要とする。抗抗体は、抗原の特異性に関係なくａａＨＡｓｅ免疫化ホ乳類ホストによって産生された抗体に結合することができる。例えば、免疫化ホストがマウスの場合、抗抗体はヤギの抗マウス抗体（すなわちマウスの抗体で免疫したヤギから得られた抗体）である。抗抗体は、ａａＨＡｓｅで免疫化したホ乳類ホストによって産生された抗体のＦｃ部分と結合するのが好ましく、かつ免疫グロブリンのクラスまたはサブクラスに特異的に結合（例えばＩｇＧまたはＩｇＧサブクラス（例えばＩｇＧ1またはＩｇＧ2）と特異的に結合）することができる。抗抗体は、不溶性支持体の表面と共有結合するのが好ましい。検出可能に標識化したＨＡは、上記のＨＡｓｅアッセイにおいてビオチン付加ＨＡ（ｂＨＡ）であるのが好ましく、上記のように不溶性プレートの表面に共有結合されているのが好ましい。
本発明の抗ａａＨＡｓｅアッセイの模式図を図３に示す。本発明の抗ａａＨＡｓｅ抗体アッセイは、非酸性条件下で（即ちａａＨＡｓｅが酵素的に活性でない条件下で）、ａａＨＡｓｅはそれらのＨＡ基質と結合しないという本発明者らの観察を利用する。一般に、本アッセイは、候補抗体を天然のａａＨＡｓｅ（例えば天然のｈｐＨＡｓｅ）を含有するサンプルと接触させて天然ａａＨＡｓｅ／抗体複合体を生成させることによって実施される。この接触工程を非酸性、好ましくは中性ｐＨで行うのが好ましい。続いて、非酸性（好ましくは中性）条件下で、結合抗抗体及び検出可能に標識化したＨＡを有する不溶性支持体とサンプルを接触させ、抗抗体を該候補抗体に結合させることによって天然ａａＨＡｓｅ／抗体／抗抗体複合体を生成させる。過剰または未結合物質を非酸性（好ましくは中性）溶液で洗い流すのが好ましい。
この洗浄緩衝液を、ａａＨＡｓｅの酵素活性を許容するｐＨを有する酸性溶液と置換する。この酸性溶液は、ａａＨＡｓｅのＨＡ分解活性に最適なｐＨに近いｐＨであるのが好ましい。例えば、ａａＨＡｓｅがｈｐＨＡｓｅである場合、酸性溶液は、ｐＨ3.7であるのが好ましい。天然ａａＨＡｓｅ／抗体／抗抗体複合体中に結合した免疫沈澱させたａａＨＡｓｅにより、検出可能に標識化したＨＡが分解されるのに十分な時間、好ましくは60分間、サンプルを不溶性支持体と共にインキュベートする。その後、サンプルを洗浄し分解ＨＡを除去し、未分解ＨＡをその標識によって検出する。例えば、検出可能標識がビオチンである場合、未分解ｂＨＡは上記のＨＡｓｅアッセイで上述したように検出される。ＨＡの分解はサンプル中のａａＨＡｓｅの存在と相関し、該酵素の存在はさらに抗天然ａａＨＡｓｅ抗体の存在と相関する。本発明の抗体の一般的性状を以下に説明する。
抗体／抗原結合力
抗原と抗体を一緒に保持する力は、４つの一般的領域に分類される。即ち、（1）静電気力；（2）水素結合；（3）疎水性；及び（4）ファンデルワールス力である。静電気力は２つのタンパク質側鎖上の反対に荷電したイオン群の間の引力による。引力（Ｆ）は電荷間の距離（ｄ）の二乗に反比例する。水素結合力は、親水基間、例えば−ＯＨ、−ＮＨ2および−ＣＯＯＨ間の可逆性水素ブリッジの形成による。これらの力は、これらの基を有する２つの分子が近接配置されているか否かにもっぱら依存する。疎水力は、水中油滴が合流してただ１つの大きな油滴を形成するのと同じ態様で作用する。したがって、非極性疎水基、例えばバリン、ロイシンおよびフェニルアラニンの側鎖は水性環境中で結合しようとする。最後に、ファンデルワールス力は外部電子雲間の相互作用によって分子間で生じる力である。異なるタイプの力についての更なる知見は当技術分野では既知である（例えば、Essential Immunology（1988、I.M.Roitt編、第6版、Blackwell Scientific Publications刊）を参照のこと）。
本発明の有用な抗体はこれらの力を全て示す。これらの力を大量に蓄積させることによって、天然のａａＨＡ酵素に対して高度の親和性または結合力を有する抗体、特にａａＨＡｓｅが天然に存在する材料（例えばヒト血漿）中でａａＨＡｓｅに対して強い結合力を有する抗体を得ることができる。
抗体／抗原結合強度の測定
抗体と抗原間の結合親和性は、上述の力の全ての測定値を合計したものである。そのような測定を実施する標準的な手順は当技術分野で既知であり、本発明の抗天然ａａＨＡｓｅ抗体の親和性を測定するのに直接利用することができる。
抗体／抗原結合親和性を測定する標準的方法の１つは、抗原を透過させることができるが抗体を透過させない物質で構成された透析サックを使用する。抗体と完全にまたは部分的に結合する抗原を透析サック内の溶媒（例えば水）中に入れる。続いてこのサックを、抗体も抗原も含まないが溶媒のみを含むさらに大きな容器に入れる。抗原のみが透析膜を通過して拡散することができるので、透析サック内の抗原濃度と外側の大きな容器内の抗原濃度は平衡に到達しようとする。透析サック内の抗体と結合したままの抗原量と抗体から解離した量を、透析サック内の抗原濃度および透析サック外の溶媒内の抗原濃度を測定することによって算出する。周囲の容器内の溶媒（例えば水）を定常的に更新して一切の拡散抗原を除去することによって、透析サック内の抗原から抗体を完全に解離させることが可能である。周囲の溶媒が更新されない場合、この系は平衡に達し、反応、即ち抗体と抗原間の結合と解離の平衡定数（Ｋ）を計算できる。平衡定数（Ｋ）は、透析サック内の抗原に結合した抗体濃度を遊離抗体の結合部位濃度と遊離抗原濃度とを掛けたもので割った値に等しい量である。平衡定数即ち“Ｋ”値は一般にリットル／モルで測定される。Ｋ値は、抗原と抗体との複合形で比較したときの遊離状態の抗原と抗体間の遊離エネルギーの差（ΔＧ）の測定値である。107ｌ／モル〜109ｌ／モルまたはそれ以上の親和性またはＫ値を有する抗天然ａａＨＡｓｅ抗体が好ましい。
抗体結合活性
上記で指摘したように、“親和性（affinity）”という用語はただ１つの抗原決定基と抗体との結合をいう。“結合活性（avidity）”という用語は抗体と多価抗原との相互作用をいうために用いられる。結合活性に寄与する因子は複雑であり、抗原上の各決定基に対して関連するある血清中の抗体の不均一性および決定基それ自体の不均一性の双方が含まれる。ほとんどの多価抗原では、抗体による２つの抗原分子の結合は個々の抗体の結合の算術的総和よりも常に大きく、通常は何倍も大きい興味深い“ボーナス”効果をもたらす。したがって、抗血清と多価抗原との間で測定される結合活性は、抗体と単一の抗原決定基との間の親和性よりもいくぶん大きいであろうことは理解されるところである。
抗天然ａａＨＡｓｅ抗体の使用
抗天然ａａＨＡｓｅ抗体は、免疫精製技術および免疫検出技術を含む種々の免疫的技術で有用である。そのような免疫的技術で有用な抗天然ａａＨＡｓｅ抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよいが、好ましくはモノクローナル抗体である。
免疫的技術で有用な抗天然ａａＨＡ抗体は、平衡定数または親和性定数（Ｋd）が少なくとも107ｌ／モル〜109ｌ／モルまたはそれ以上を示すのが好ましい。107ｌ／モルまたはそれ以上の結合親和性は、（1）ただ１種のモノクローナル抗体（すなわち一種類の抗体が多数存在）、（2）複数の異なるモノクローナル抗体（例えば５種の異なるモノクローナル抗体の各々が多数存在）または（3）多数のポリクローナル抗体によるであろう。（1）〜（3）の組合わせを使用することもまた可能である。
好ましい抗体は、サンプル中の天然のａａＨＡｓｅの50％以上と結合する。しかしながら、これは上記の（1）〜（3）によって示されたとおり幾つかの異なる抗体を用いることによって達成できる。サンプル中のより多くの割合の抗原と結合させる場合、異なる抗体の数を増加させる方がただ１種の抗体よりも一般により効果的である。したがって、天然のａａＨＡｓｅと結合する２種以上の抗体を一緒に組み合わせることによって、即ち天然のａａＨＡｓｅに対して結合親和性Ｋaが107ｌ／モル以上である２種以上の抗体を一緒に組み合わせることによって、相乗効果を得ることができる。
抗天然ａａＨＡｓｅ抗体を用いた免疫精製
抗天然ａａＨＡｓｅは、例えばａａＨＡｓｅが天然に存在する供給源（例えばヒト血液、血漿、血清または尿由来ｈｐＨＡｓｅ）、または組換えａａＨＡｓｅの供給源（例えばｈｐＨＡｓｅを発現する形質転換細胞の上清または細胞溶解物）からａａＨＡｓｅを免疫精製する場合に用いることができる。本発明の抗天然ａａＨＡｓｅ抗体を用いる有用な免疫精製技術には、免疫沈澱、ビーズ上での免疫親和性単離、免疫親和性カラムクロマトグラフィー、および当技術分野で周知の他の方法が含まれるが、これらに限定されるものではない。抗天然ａａＨＡｓｅ抗体は免疫精製技術で有用である。本発明の抗体を用いる免疫精製法では、ただ１種の抗天然ａａＨＡｓｅ抗体（例えばモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、好ましくはモノクローナル抗体）または多数の抗天然ａａＨＡｓｅ抗体を用いることができる。
さらに、本発明の抗天然ａａＨＡｓｅ抗体を用いて、天然のａａＨＡｓｅ、好ましくは天然のｈｐＨＡｓｅの免疫精製のための装置を調製することができる。一般に、そのような装置は、抗天然ａａＨＡｓｅ抗体を不溶性支持体（例えばビーズ、親和性カラム成分（例えば樹脂）または免疫親和性精製で用いられる他の不溶性支持体）に共有結合させることによって調製される。または、磁化カラムを用いることによって抗天然ａａＨＡｓｅ−ａａＨＡｓｅ複合体を溶液から分離させることができる金属粒子に該抗体を結合させてもよい。該抗ａａＨＡｓｅ抗体はモノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよいが、好ましくはモノクローナル抗体である。不溶性支持体に結合させた抗体（また別には精製で用いられる）はまた、サンプル中の天然のａａＨＡｓｅの少なくとも50％と結合することができる装置を提供するために抗ａａＨＡｓｅ抗体の混合物を含んでいてもよい。そのような免疫精製装置を用いて、ａａＨＡｓｅが天然に存在する供給源（例えば未加工血清、未加工血漿または尿由来ｈｐＨＡｓｅ）から、または組換えによって製造されたａａＨＡｓｅからａａＨＡｓｅを単離することができる。
抗天然ａａＨＡｓｅ抗体を用いる定性的および定量的免疫検出
抗天然ａａＨＡｓｅ抗体を、免疫検出アッセイを用いて、サンプル中のａａＨＡｓｅを検出（所望の場合には定量）することができる。抗天然ａａＨＡｓｅ抗体を用いる免疫検出アッセイは種々の態様でデザインすることが可能である。例えば、抗天然ａａＨＡｓｅ抗体を用い、不溶性支持体（例えば免疫アッセイカラム、ビーズ、または微量定量プレートのウェル）に結合させた抗天然ａａＨＡｓｅ抗体を有するアッセイ装置を製造することができる。抗体を不溶性支持体に共有結合または非共有結合によって付着させる方法は当技術分野で周知である。続いて、ａａＨＡｓｅを含むと思われるサンプルをアッセイ装置と接触させ、抗天然ａａＨＡｓｅ抗体−ａａＨＡｓｅ複合体を形成させる。その後、上記の抗天然ａａＨＡｓｅアッセイで述べたように、該複合体に結合したａａＨＡｓｅ活性によって、または該複合体を検出可能に標識化した第二の抗天然ａａＨＡｓｅ抗体と接触させることによって、抗天然ａａＨＡｓｅ−ａａＨＡｓｅ複合体を検出することができる。
“検出可能に標識化した抗体”、“検出可能に標識化した抗ａａＨＡｓｅ”または“検出可能に標識化した抗ａａＨＡｓｅフラグメント”とは、検出可能標識を結合させた抗体（または抗原結合特異性を保持している抗体フラグメント）を意味する。検出可能標識を通常、化学的接合によって結合する。標識がポリペプチドの場合、標識を遺伝子工学技術によって結合する。検出可能標識は当技術分野で既知の多様な標識から選択できるが、通常は、放射性同位元素、蛍光発光団、常磁性標識、酵素（例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ）もしくは検出シグナル（例えば放射能活性、蛍光、発色）を放出するか、又は該標識をその基質に暴露した後検出可能なシグナルを放出する他の分子部分または化合物である。種々の検出可能な標識／基質の対（例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ／ジアミノベンジジン、アビジン／ストレプトアビジン、ルシフェラーゼ／ルシフェリン）、抗体を標識する方法、および標識化抗体を使用する方法は当技術分野で周知である（例えば、Harlow & Lane編、Antibodies:A Laboratory Manual（1988,Cold Spring Harbor Laboratory刊、ニューヨーク州、Cold Spring Harbor）を参照のこと）。
または、検出可能に標識化した抗天然ａａＨＡｓｅ抗体を直接用いて、サンプル中のａａＨＡｓｅを検出および／または定量することができる。例えば、検出可能に標識化した抗天然ａａＨＡｓｅ抗体をＬｕＣａ−１／ｈｐＨＡｓｅ欠陥を有すると思われる組織サンプル（乳房、卵巣又は肺由来の組織サンプル）と十分な時間接触させて、抗天然ｈｐＨＡｓｅと組織サンプル中のｈｐＨＡｓｅ（例えば組織サンプル中の細胞形質膜内のｈｐＨＡｓｅ）との複合体を形成させることができる。続いて、該抗天然ｈｐＨＡｓｅ抗体と結合した検出可能標識によって、抗天然ｈｐＨＡｓｅ抗体の結合を検出および／または定量することができる。または、抗天然ｈｐＨＡｓｅ抗体の結合、抗天然ｈｐＨＡｓｅ抗体と結合する抗体を用いて検出してもよい。続いて、抗天然ｈｐＨＡｓｅ抗体の組織サンプルとの結合を、コントロールサンプル（例えば、ＬｕＣａ−１／ｈｐＨＡｓｅ欠陥をもたない正常サンプルおよび／またはＬｕＣａ−１／ｈｐＨＡｓｅ欠陥に関連する組織を含むサンプル）との抗天然ｈｐＨＡｓｅ抗体の結合、および患者のＬｕＣａ−１／ｈｐＨＡｓｅ欠陥の有無と相関する抗体結合と比較することができる。
本明細書で提供される開示を読み進むにしたがって当業者には明らかなように、ａａＨＡｓｅの免疫検出アッセイは種々のサンプルを用いて種々の異なる態様で用いることができる。例えば、ａａＨＡｓｅの免疫検出アッセイを用いて、ｈｐＨＡｓｅ治療を受けている患者の血清または血漿サンプル中のｈｐＨＡｓｅを検出し、および／または患者の腫瘍進行、治療への応答および／または患者の身体へのｈｐＨＡｓｅの取り込みに関して患者の血清または血漿中のｈｐＨＡｓｅを相関させることができる。
ｈｐＨＡｓｅが血清または尿中で検出される場合、ｈｐＨＡｓｅレベルは、ＬｕＣａ−１欠陥に関連する症状に対する感受性および／または該症状の存在および／または該疾患の重篤度と相関させることができる。例えば、ＬｕＣａ−１においてヘテロ接合型欠陥に関連する肺癌をもつ患者のｈｐＨＡｓｅレベルは正常なｈｐＨＡｓｅレベルの50％に近い。一方、ＬｕＣａ−１におけるホモ接合型欠陥をもつ患者は、非常に低いかまたは検出不能のｈｐＨＡｓｅレベルを示す。したがって、本発明のａａＨＡｓｅアッセイで検出されるように、または本発明の抗天然ｈｐＨＡｓｅ抗体を用いて検出されるように、ｈｐＨＡｓｅレベルは腫瘍の進行と相関させることができるだけでなく、ＬｕＣａ−１における遺伝的欠陥と直接的に相関させることが可能であり、したがってＬｕＣａ−１欠陥に関連する症状（例えば癌）の疑いのある患者の特定が可能である。したがって、本発明は、ｈｐＨＡｓｅレベルを患者の機能的対立遺伝子の数と直接相関させ、さらに血液、血漿、血清または尿中のｈｐＨＡｓｅレベルを単純に確認することによって遺伝的欠陥の検出を可能にする。
ｈｐＨＡｓｅの製造方法
上記に概略した精製手順の他に、ｈｐＨＡｓｅヒアルロニダーゼポリペプチドは、標準的合成技術、または組換えＤＮＡ技術を用い、さらに細菌、酵母もしくはホ乳類細胞で標準的技術により発現させることによって、製造できる。本明細書で用いるとき、“ｈｐＨＡｓｅ”という用語は、該用語が用いられている内容が明瞭に別の意味を指している場合を除いて、該タンパク質の天然型、組換え型および修飾形を含む。
化学合成
ｈｐＨＡｓｅは、本明細書に記載したアミノ酸配列およびその変種配列を基にして、Clark-Lewisら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:3574-3577（1993）;及びClark-Lewisら、Biochemistry,30:3128-3135（1991）に記載されたtert−ブチルオキシ−カルボニル及びベンジル保護法を用いる標準的固相法によって合成できる。フッ化水素による脱保護の後で、該タンパク質は空気酸化によって折り畳まれ、逆相ＨＰＬＣによって精製される。純度は、逆相ＨＰＬＣおよび等電点フォーカシングによって決定される。アミノ酸の取り込みは合成の間モニターされ、最終組成はアミノ酸分析によって決定される。タンパク質の正確な共有結合構造はイオンスプレー質量分析法（SCIEX APIII）を用いて確認できる。
ｈｐＨＡｓｅポリペプチドの合成のための組換えＤＮＡ技術
下記実施例で考察するように、ＬｕＣａ−１（配列番号：３）およびｈｐＨＡｓｅ（配列番号：１）は同一である。ｈｐＨＡｓｅのアミノ酸配列（配列番号：１）とＬｕＣａ−１のアミノ酸配列（配列番号：３）との間の唯一の変化は、２７番目のアミノ酸残基のＮ末端におけるＬｅｕがＶａｌに置換されていることである（この場合シグナル配列のＮ末端のＭｅｔが最初のアミノ酸残基として数えられている）。しかしながらこの２つのタンパク質はそれ以外ではアミノ酸配列並びに免疫学的および生化学的性状は同一である。ｈｐＨＡｓｅをコードするヌクレオチド配列はＬｕＣａ−１をコードする配列（配列番号：４）と同一であるが、ただし、２７番目のアミノ酸残基（ＬｕＣａ−１でＬｅｕ、ｈｐＨＡｓｅでＶａｌ）に対応するコドンの第三の残基のシトシンがグアニンに置換されている点を除く。したがって、ＬｕＣａ−１をコードするヌクレオチド配列（配列番号：４）はｈｐＨＡｓｅをコードするヌクレオチド配列である。ＬｕＣａ−１／ｈｐＨＡｓｅ遺伝子は単離され、配列が決定されている（Baderら、GenBank受託番号U03056,NIDG532973,1993年11月1日提出；GenBank受託番号U96078も参照されたい）。Baderらが報告したＬｕＣａ−１のアミノ酸およびヌクレオチド配列を下記に示す。
0004503708.tif 000003
ｈｐＨＡｓｅをコードするヌクレオチド配列は、当技術分野で周知の種々の方法のいずれによっても単離できる。例えば、ｈｐＨＡｓｅをコードするＤＮＡは、ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリーからハイブリダイゼーションによる方法で単離できる。または、例えばムリスら（Mullisら、米国特許第4800159号明細書）が記載したように、合成オリゴヌクレオチドプライマーの標準的なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、または当技術分野で周知の発現クローニング法（例えばSambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第２版（1989）、Cold Spring Harbor Laboratory Press刊、ニューヨーク州、Cold Spring Harbor）を参照のこと）を用いて単離することができる。ｈｐＨＡｓｅをコードするＤＮＡを特定するためにハイブリダイゼーションまたはＰＣＲが用いられる場合は、オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーの配列は、上記に提示したＬｕＣａ−１のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を基にすることができる。ｈｐＨＡｓｅポリペプチドをコードする単離ＤＮＡの配列は当技術分野で周知の方法を用いて決定できる（例えばSambrookら、上掲書を参照のこと）。配列を確認した後で、得られたクローンを用いて、例えばｈｐＨＡｓｅの類似体（例えば、ｈｐＨＡｓｅをコードする他のヒト対立遺伝子またはホ乳類の別の種（例えばイヌ、ラット、マウス、霊長類、ウシ）の酸活性血清ヒアルロニダーゼ）を同定するか、および／またはｈｐＨＡｓｅをコードするＤＮＡを発現させる目的で（例えばホスト細胞、好ましくは患者の癌性細胞でのｈｐＨＡｓｅポリペプチド発現による抗癌療法の場合のように）ホストの標的細胞を形質転換させることができる。
ｈｐＨＡｓｅをコードする構築物の作製とｈｐＨＡｓｅポリペプチドの発現
ｈｐＨＡｓｅをコードする構築物の作製およびｈｐＨＡｓｅ発現のために多数のベクターが利用できる（例えば、American Type Culture Collection,メリーランド州、ロックビルを参照のこと）。好ましくは、ベクターは真核細胞性ホストでも原核細胞性ホストでも増殖が可能であり、一般に細菌由来の複製点と問題のＤＮＡに機能可能に連結された真核細胞性プロモーターを含んでなり、それによってｈｐＨＡｓｅをコードする構築物の製造が可能となる。適切なホスト細胞、並びに安定的に形質転換されたホスト細胞系を構築する方法は、公共に供されている。例えば、Pouwelsら、（1985）Cloning Vectors:A Laboratory Manual;Ausubelら、（1989）Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons刊、ニューヨーク；Sambrookら、上掲書；Kormalら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84:2150-2154（1987）を参照のこと。これらの文献の各々は、問題のＤＮＡを操作するための方法および組成物についての参考のため本明細書に含まれる。
構築物中のプロモーターが当該ｈｐＨＡｓｅコード配列と機能的に連結されるように、ｈｐＨＡｓｅポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を核酸ベクターに挿入することによって、ｈｐＨＡｓｅポリペプチドの発現を達成する。その後、その構築物は、ホスト細胞を形質転換するために用いられる。ｈｐＨＡｓｅ発現は、一時的発現、構成型発現または誘発型発現のいずれかによってホ乳類細胞系で達成することができる。好ましい態様の１つとして、ホスト細胞はホ乳類細胞、好ましくはｃｏｓ−７細胞系またはｃｏｓ−７細胞由来細胞系である。より好ましくは、ｈｐＨＡｓｅ製造用ホスト細胞は、ｈｐＨＡｓｅ発現に対して防御されているホ乳類細胞である（即ち、該ホスト細胞に悪影響（例えば細胞成長遅延、細胞死）を与えることなく該細胞が高レベルでｈｐＨＡｓｅを産生できる）。ある態様として、ｈｐＨＡｓｅ耐性細胞はＳＶ−形質転換細胞系またはアデノウイルス形質転換細胞系（すなわち切断アデノウイルスで形質転換した細胞系）、好ましくはＨＥＫ細胞系（ＨＥＫ２９３）である。例えば、強力なプロモーター（例えばＣＭＶ）で起動されるｈｐＨＡｓｅをコードするＤＮＡによるＨＥＫ細胞の形質転換によって、驚くほど高いｈｐＨＡｓｅ発現および培養液中への分泌がもたらされる（約2.9×10-10ｍｇ／細胞／24時間）（＞100ｒＴＲＵ）。そのような細胞系を使用することにより、例えばタンパク質治療で使用することができる十分量のｈｐＨＡｓｅを製造することができる。
ｈｐＨＡｓｅに耐性をもたない腫瘍細胞系での発現が望まれる場合、ｈｐＨＡｓｅをコードするＤＮＡは、好ましくは誘発性プロモーター、好ましくは形質転換されたｈｐＨＡｓｅ構築物含有細胞の近辺の他のホ乳類細胞には顕著な影響を与えない誘発剤に応答性を有する誘発性プロモーターの制御下に置かれる。例えば、ｈｐＨＡｓｅをコードするＤＮＡは、ステロイド誘発性プロモーター下に置くことができる（例えば、エクジソン発現系ではムリステロン（muristeron）によって誘発することができる）。標的細胞は形質転換され、誘発剤に暴露されたときにｈｐＨＡｓｅを発現する。
腫瘍をもつ患者の処置を目的として腫瘍細胞を形質転換するためにｈｐＨＡｓｅコードＤＮＡが使用される場合、該ｈｐＨＡｓｅをコードするＤＮＡは一過性、構成的または誘発的に発現できるが、好ましくは一過性または構成的に発現され、より好ましくは構成的に発現される。これに加えて、またはこれとは別に、腫瘍周囲の細胞（例えば腫瘍細胞の近傍の細胞）またはｈｐＨＡｓｅを発現し分泌することができる他の細胞（例えば肝細胞または単球）を形質転換させてもよい。
組換えｈｐＨＡｓｅポリペプチドの発現（例えば本明細書で開示する発現系のいずれかによる産生）は、免疫学的手順、例えば組換え細胞抽出物のウェスタンブロットまたは免疫沈澱分析によって、または本明細書で開示する本発明のＨＡｓｅ活性アッセイによってアッセイすることができる。例えば、本発明のｈｐＨＡｓｅポリペプチドは、適切な発現担体中のｈｐＨＡｓｅポリペプチドをコードするヌクレオチド配列によって適切なホスト細胞を形質転換し、さらに該コードポリペプチドの発現を促進し、さらに好ましくは培養液中へのｈｐＨＡｓｅの分泌を促進する条件下で該形質転換細胞を培養することによって産生できる。形質転換の方法および発現担体の選択は選択したホストシステムに左右される。分子生物学分野の通常の技術を有する者にとって、種々の原核細胞および真核細胞発現系を用いて本発明のｈｐＨＡｓｅポリペプチドを産生することができることは理解されよう。
生物学的に活性なｈｐＨＡｓｅポリペプチドの同定
ｈｐＨＡｓｅポリペプチドをコードするＤＮＡは、ｈｐＨＡｓｅの全部または一部をコードすることができる。ｈｐＨＡｓｅポリペプチドは生物学的に活性であるのが好ましく、例えばヒアルロナンの切断で酸活性ヒアルロニダーゼ活性を示し、および／または抗天然ｈｐＨＡｓｅ抗体により結合することができる。一般に、あるタンパク質の抗体を誘発する能力に関する知見および／または問題のタンパク質の酵素的または他の生物学的活性に関する知見がいったん得られれば、完全長のタンパク質の生物学的に活性なポリペプチドを同定する方法は、特に本発明の場合のように問題のタンパク質（ここではｈｐＨＡｓｅ）をコードするヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列が提供されている場合、当業者には日常的なことである。
生物学的に活性なｈｐＨＡｓｅポリペプチドは、本発明のＨＡｓｅアッセイを用いることによって、または通常のＨＡｓｅアッセイ（例えばＥＬＩＳＡ様ヒアルロナンアッセイ（Sternら、Matrix,12:391-403（1992））もしくは基質ゲルザイモグラフィー（Guentenhoenerら、Matrix,12:388-396（1992）））を用いることによって同定できる。または、生物学的に活性なｈｐＨＡｓｅポリペプチドは、形質転換ホスト細胞の上清および／または細胞溶解物の成分に抗天然ｈｐＨＡｓｅ抗体を結合させることによって検出できる。ｈｐＨＡｓｅポリペプチドは、好ましくは天然のｈｐＨＡｓｅ活性の少なくとも25％、より好ましくは50％、さらに好ましくは75％、一層好ましくは95％を示す。
ｈｐＨＡｓｅと同種のヒアルロニダーゼの同定
ｈｐＨＡｓｅと同種のヒアルロニダーゼをコードするＤＮＡ（例えば、天然ｈｐＨＡｓｅに対して保存的アミノ酸置換を含む）は、ｈｐＨＡｓｅのＤＮＡ配列および／またはアミノ酸配列（例えば、ＬｕＣａ−１／ｈｐＨＡｓｅ配列）を基にしたオリゴヌクレオチドを用いたハイブリダイゼーションまたはＰＣＲによって、種々のｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングして得ることができる。または、使用するオリゴヌクレオチドは、例えば選択したｈｐＨＡｓｅのアミノ酸配列を基にして縮退させるか、または保存的アミノ酸置換を有するｈｐＨＡｓｅ様アミノ酸配列をコードするＤＮＡの検出または増幅を可能にするためおよび／またはスクリーニングされるべきホ乳類種のＤＮＡにおけるコドン使用頻度を考慮するためにデザインしてもよい。そのような“縮退オリゴヌクレオチドプローブ”は、ハイブリダイゼーションスクリーニングの感度を高めるため、かつ他の種のｈｐＨＡｓｅ類似体またはｈｐＨＡｓｅをコードするヒトの対立遺伝子変種を同定し単離するために組み合わせて用いることができる。アミノ酸および／またはヌクレオチド配列がコードするタンパク質を特定するために縮退オリゴヌクレオチドプローブをデザインし使用する方法、並びに同種ＤＮＡのスクリーニングおよび単離のためのハイブリダイゼーション方法およびＰＣＲ技術は、当技術分野では日常的であり周知である（例えば上掲書（Sambrookら）を参照されたい）。
または、ｈｐＨＡｓｅをコードするＤＮＡは、当技術分野で周知の発現クローニング法によって単離できる（例えば上掲書（Sambrookら）を参照のこと）。例えば、ホ乳類細胞をｃＤＮＡ発現ライブラリー、即ち、真核細胞プロモーターに機能可能に連結された種々のｃＤＮＡフラグメントを含むクローン集合物で形質転換できる。ｈｐＨＡｓｅ類似体またはその生物学的に活性なフラグメントの発現は、本発明のＨＡｓｅ活性アッセイを用いて培養上清および／または細胞溶解物を分析して検出できる。
ｈｐＨＡｓｅポリペプチドを用いる治療法
本発明の実質的に純粋な天然のｈｐＨＡｓｅポリペプチド（例えばｈｐＨＡｓｅが精製された血漿の成分を伴わないｈｐＨＡｓｅポリペプチド）は、ヒトおよび動物の治療を含む多様な用途において、単独または他の治療薬とともに用いることができる。処置すべき症状が過剰なヒアルロン酸と関連を有する場合、および／または治療が一般にＨＡｓｅ活性を高めるためにデザインされている場合、本発明の精製ｈｐＨＡｓｅは一般に、中性ＨＡｓｅ製剤即ちWYDASETM（商標）の代わりに用いることができる（すなわち、従来の中性ヒアルロニダーゼ含有製剤は、中性ＨＡｓｅ活性における特定の欠陥を処置するためには用いられず、むしろＨＡｓｅ（中性または酸活性）活性を提供する）。酸活性ｈｐＨＡｓｅはＨＡ基質の制御された分解を提供し、患者の細胞外マトリックスの全成分を分解するわけではないので、酸活性ｈｐＨＡｓｅを使用する方が中性ＨＡｓｅを使用するより好ましい。
ｈｐＨＡｓｅを過剰なヒアルロンに付随する疾患の処置に用いて、投与部位での生理学的液体の循環を高めることができる（例えば分散剤として、例えば皮下または局所施用（例えば化粧用クリームのような化粧品製剤の場合）によって、および／または単独または化学療法剤と併用する抗癌剤として）。例えば、ｈｐＨＡｓｅを患者に投与し、注入、特に皮下注入を促進することができる。ｈｐＨＡｓｅはまた、卒中または心筋梗塞を発症した患者に（例えば輸液によって）投与できる。好ましくは、ｈｐＨＡｓｅは、ヘパリン、強力なヒアルロニダーゼ抑制物質、の非存在下または極めて低レベル下で投与される。心筋梗塞の治療のための投与方法および投与されるｈｐＨＡｓｅ量は、ウシの精巣ヒアルロニダーゼの投与方法および投与量を基準にすることができる（例えばWolfら、J.Pharmacol.Exper.Therap.,222:331-7（1982）;Braunwaldら、Am.J.Cardiol.,37:550-6（1976）;DeGiovanniら、Br.Heart J.,45:350（1961）;DeOliveiraら、Am.Heart J.,57:712-22（1959）;Klonerら、Circulation,58:220-6（1978）;Klonerら、Am.J.Cardiol.,40:43-9（1977）;Kovenら、J.Trauma,15:992-8（1975）;Macleanら、J.Clin.Invest.,61:541-51（1978）;Macleanら、Science,194:199-200（1976）;Marokoら、Ann.Intern.Med.,82:516-20（1975）;Marokoら、N.Engl.J.Med.,296:896-903（1977）;Marokoら、Circulation,46:430-7（1972）;Salete,Clin.Biochem.,13:92-94（1980）;Snellら、J.Clin.Invest.,50:2614-25（1971）;Wolfら、Circ.Res.,48:88-95（1981）を参照のこと）。
さらに、ｈｐＨＡｓｅはまた、ヒアルロニダーゼにおける欠陥に付随するある種のリソソーム貯蔵疾患をもつ患者に投与するとき治療効果を示すことができる（Natowiczら、N.Engl.J.Med.,335:1029-33（1996））。ｈｐＨＡｓｅは、シャント経路の形態としてヒアルロニダーゼの直接投与（例えば細胞内または静脈内）によって、及び／または遺伝子治療（例えば、Ｌｕｃａ−１遺伝子の欠陥複製物を置換する）によって治療的に用いることができる。ｈｐＨＡｓｅ治療法が効果を発揮するリソソーム貯蔵性疾患は、不完全なマンノース−６−ホスフェート経路による［GlcNAcβ 1-4GlcUAβ 1-3］n（GAGs）の蓄積をもたらす疾患である。ＨＡｓｅ活性はマンノース−6-ホスフェート経路に依存しないので、ｈｐＨＡｓｅはこれらの蓄積ＧＡＧｌｓを非機能的細胞系の下で分解することができる（Herdら、Proc.Soc.Experim.Biol.Med.,151:642-9（1976））。
ｈｐＨＡｓｅはまた、脳腫瘍に付随する浮腫、特にグリア芽細胞腫の多形性型に付随するものの処置に用いることができる。脳腫瘍に付随する浮腫は、腫瘍近辺の脳の非癌性部分のヒアルロナンの蓄積によって生じる。ヒアルロナン蓄積部位にヒアルロニダーゼを（例えば静脈内注射またはシャント形成による）投与することにより、これらの部位で過剰なヒアルロナンを分解することによってそのような悪性疾患に付随する浮腫を軽減する。したがって、ヒアルロニダーゼは、腫瘍塊の減少および腫瘍成長および／または転移の抑制において、脳腫瘍の処置で有効であるだけでなく、悪性疾患に付随する浮腫の軽減に有用である。ｈｐＨＡｓｅは、浮腫の処置のためのウシ精巣ヒアルロニダーゼを投与する場合と同様な態様で浮腫を処置する目的として投与できる（SaEarp,Arq.Braz.Med.,44:217-20を参照のこと）。
特に興味深いことは、非癌性（正常）細胞と比較して検出不可能ｈｐＨＡｓｅ活性が低下した転位性および非転位性癌、特に転位性癌の処置においてｈｐＨＡｓｅポリペプチドの使用である。ｈｐＨＡｓｅは、種々の癌、特に侵襲性腫瘍の一切の処置において、化学療法剤として（単独または他の化学療法剤と一緒に）用いることができる。例えば、ｈｐＨＡｓｅポリペプチドは、小型肺細胞癌及び有棘肺細胞癌、並びに乳房、卵巣、頭部および頸部の癌に用いることができるか、又はｈｐＨＡｓｅのレベル低下もしくは不完全ＬｕＣａ−１（ｈｐＨＡｓｅ）遺伝子（例えば、適切なレベルのｈｐＨＡｓｅの発現を提供しないか、または適切なレベルのヒアルロニダーゼ活性を提供できない不完全なｈｐＨＡｓｅをコードするＬｕＣａ−１遺伝子）またはｈｐＨＡｓｅ活性の減少を伴う他の欠陥に関連する他の一切の癌の処置に用いることができる。
ｈｐＨＡｓｅはまた、通常の化学療法に耐性を示す腫瘍の感受性を高めるために使用することができる。ある態様として、ｈｐＨＡｓｅは、ＬｕＣａ−１欠陥に関連する腫瘍をもつ患者に、腫瘍部位周辺の拡散を高めるため（例えば、化学療法剤の循環を高めるため（例えば腫瘍部位または腫瘍部位周辺の化学療法剤の循環および／または濃度を高めるため）、腫瘍細胞の運動性を抑制するため（例えばＨＡ分解によって）および／または腫瘍細胞のアポプトシスの閾値を下げるため（即ち腫瘍細胞をアノイキスの状態に置くため、すなわち、細胞死を促進することができる、好ましくはアノイキス状態の細胞のプログラム化された細胞死をもっぱら促進することができる化学療法剤または他の薬剤の作用に対して腫瘍細胞の感受性を高める状態に置くため）ために有効な量で投与される。本明細書で用いられるとき、化学療法剤は、腫瘍細胞成長の抑制を促進する、より好ましくはもっぱら腫瘍細胞死を促進する全ての分子、合成（例えばシスプラチン）並びに天然に存在する（例えば腫瘍壊死因子（ＴＮＦ））分子を包含する。
ｈｐＨＡｓｅによる処置が有効な疾患もしくは症状を有するかまたはそれらに感受性を有する患者は、種々の通常の方法または本発明のアッセイ装置を用いて特定できる。本発明の装置は、血液、血漿、血清または尿ｈｐＨＡｓｅレベル、好ましくは血液、血漿または血清レベルを決定し、該レベルをＬｕＣａ−１欠陥と相関させるために上記で述べたように抗天然ｈｐＨＡｓｅ抗体が結合されている。例えば、患者がｈｐＨＡｓｅ活性の低下に付随する症状を有すると疑われるか、またはそのような状態に感受性を有すると疑われる場合、生物学的サンプル（例えば血液、血清または血漿）を患者から得て、上記のように抗天然ｈｐＨＡｓｅ抗体を用いてＨＡｓｅアッセイおよび／または免疫アッセイによって分析することができる。
または、患者がＬｕＣａ−１／ｈｐＨＡｓｅ欠陥に関連する癌を有するかまたはその疑いがある場合に特に、抗天然ｈｐＨＡｓｅ抗体を用いて、組織サンプル中のｈｐＨＡｓｅレベル（例えば、腫瘍組織に付随する細胞の形質膜、これら細胞内又はその周囲細胞に存在するｈｐＨＡｓｅ）を決定することができる。正常（すなわち非癌性）組織サンプルに付随するｈｐＨＡｓｅレベルと比較して組織サンプル中のｈｐＨＡｓｅレベルが低下していれば、ＬｕＣａ−１／ｈｐＨＡｓｅ欠陥に関連する癌が示唆される。
ｈｐＨＡｓｅの投与ルートおよび投与される量は、処置すべき疾患、並びに大きさ、体重、年令、疾患の重篤度および治療への応答性を含む患者の種々の変動因子にしたがって大きく変動するであろう。適切な投与ルートおよび用量を決定する方法は、一般に担当医によってケースバイケースで決定される。そのような決定は当技術分野で通常の技術を有する者には日常的である（例えば、Harrison’s Principles of Internal Medicine（第11版、1987）を参照のこと）。例えば、ｈｐＨＡｓｅを用いて皮下注入を促進させる場合、ｈｐＨＡｓｅを含む溶液を皮下注射によって投与し、該溶液（例えば栄養剤、体液補充液または血圧上昇溶液）の吸収を促進する。ｈｐＨＡｓｅは、注射、例えば皮下、筋肉内、眼窩内、嚢内、腫瘍周辺内および静脈内注射を含む非経口注射によって投与されるのが好ましい。
好ましい態様として、例えば、ｈｐＨＡｓｅを腫瘍周辺に注射するか、腫瘍塊に直接ｈｐＨＡｓｅを注射するか、及び／又はｈｐＨＡｓｅを発現し分泌することができる腫瘍細胞、腫瘍周囲細胞もしくは他の細胞（例えば肝細胞または単球）にｈｐＨＡｓｅコードＤＮＡを導入することによって、直接ｈｐＨＡｓｅポリペプチドを腫瘍部位に送達することにより、ｈｐＨＡｓｅで処置可能な腫瘍をもつ患者にｈｐＨＡｓｅポリペプチドを投与する。ｈｐＨＡｓｅは脂肪酸（例えば脂質部分）が修飾されているので、ｈｐＨＡｓｅの作用が必要とされている部位に注射された後、ｈｐＨＡｓｅは容易に細胞の形質膜に取り込まれる（例えば、J.Cell Bio.,131（3）:669-77（1995）を参照のこと）。さらに、ｈｐＨＡｓｅはまた、ＬＤＬ（低密度リポタンパク質）レセプターと複合体を形成し、レセプター仲介エンドサイトーシスによって細胞内に内在化される。
ある好ましい態様として、ｈｐＨＡｓｅはリポソーム製剤で患者に投与され、標的細胞（例えばＬｕＣａ−１／ｈｐＨＡｓｅ欠陥をもつ癌細胞）へのｈｐＨＡｓｅの細胞内薬剤送達および／またはそのような標的細胞の形質膜へのｈｐＨＡｓｅ取り込みをもたらす。リポソーム製剤は、リポソーム内に取り込まれたｈｐＨＡｓｅの特異的な標的指向性薬剤送達を標的細胞に提供するために調製されるのが好ましい。ｈｐＨＡｓｅは水溶液にかなり不溶性であるので（例えば、ＮａＣｌ濃度が50ｍＭ未満のときｈｐＨＡｓｅは水溶液で沈澱する）、リポソームへの取り込みは、ｈｐＨＡｓｅの脂肪酸鎖の翻訳後修飾に付随するｈｐＨＡｓｅの生化学的性状のために一層可溶性の調製物を作出する。さらに、ｈｐＨＡｓｅを循環系に導入することによって、ｈｐＨＡｓｅは血漿のこれらの脂質分画と同時に精製されるので、ｈｐＨＡｓｅと高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）複合体との結合をもたらすおそれがある。
本発明者らによって同定された生化学的性状は、ｈｐＨＡｓｅがリポソームに容易に取り込まれることができることを示唆している。リポソームの調製方法およびそれを投与する方法は当技術分野では周知である。例えば、ｈｐＨＡｓｅ含有リポソームは、Liposome Technology,G.Gregoriadis編、（1984）CRC Press刊、フロリダ州、Boca Ratonに記載されるように、洗剤を含まない免疫親和性精製（ＩＡＰ）ｈｐＨＡｓｅとリポソーム製剤とを混合することによって調製できる。本発明のリポソーム製剤は、ｈｐＨＡｓｅ活性を増大させる化合物を含有するのが好ましい。好ましい態様として、ｈｐＨＡｓｅリポソーム製剤は、コレステロールおよび／またはカルジオリピン、より好ましくはカルジオリピンを含有する。理論に支えられていないが、カルジオリピンは、ｈＨＡｓｅの変性を防ぎ、したがって酵素の安定性を維持しかつ標的細胞の形質膜へのその取り込みを増大させることによってｈｐＨＡｓｅの活性を高める。本発明者らが発見したように、ｈｐＨＡｓｅ活性は、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリンの存在下では増大されない。コレステロールおよびカルジオリピンを含有するリポソーム製剤が特に好ましい。
ｈｐＨＡｓｅが治療、例えば化学療法に用いられる場合は特に、１つまたは２つ以上の所望の性状を提供する目的でｈｐＨＡｓｅを修飾するのが望ましい。例えば、ｈｐＨＡｓｅは血清タンパク質であり、したがって血清中では十分な半減期を本質的に備えているが、例えばポリペプチドを修飾してその生物学的半減期（例えば血清半減期）を増加させるのが望ましいであろう。タンパク質の半減期を増加させる種々の方法が当技術分野ではよく知られているが、例えば以下の方法が含まれる。ポリエチレングリコール部分へのタンパク質の接合、即ちＰＥＧ付加（PEGylation）（例えば、USPN 4,179,337号；USPN 5,166,322号；USPN 5,206,344;Nucciら、Adv.Drug Delivery Rev.,4:133-151（1991）;Zalipskyら、Polymeric Drugs and Drug Delivery Systems,ACSを参照のこと）、デキストランへのタンパク質の共役（Maksimenko,Bull.Exp.Biol.Med.,（ロシヤ語）52:567-569（1986））、およびエンドグリコシダーゼＦでの処理によるタンパク質の糖除去（Laceら、Carbohydrate Res.,208:306-311（1990））。
一般に、これらの方法は、タンパク質の分子量を増加させ、タンパク分解酵素に対するタンパク質の感受性を低下させ、および／または処置すべき対象者からタンパク質が排除される速度を低下させるようにデザインされる。修飾ｈｐＨＡｓｅポリペプチドの半減期の増加によって、有効量として必要とされるタンパク質の量が減少し、必要な投与頻度が減少し、患者がこのタンパク質に曝される機会が減少し、したがってアレルギー反応、毒性作用または他の副作用の可能性が減少する。半減期が増加した修飾ｈｐＨＡｓｅポリペプチドのこれらの性状によって、タンパク質の免疫原性および／または毒性に関連する望ましくない副作用の可能性を抑えて該タンパク質の長期使用が可能になる。好ましくは、これらの方法は、タンパク質の生物学的活性を実質的に損なうことなく、タンパク質の半減期を増加させるように用いることができる。ｈｐＨＡｓｅの酵素活性は例えば本発明のｈｐＨＡｓｅ活性アッセイを用いて分析できる。タンパク質の生物学的半減期を検査する方法は当技術分野で周知である。
投与に適した具体的な用量は、上記で考察した要素にしたがって当業者によって容易に決定することができる（例えばHarrison’s Principles of Internal Medicine（11版、1987）を参照のこと）。さらに、ヒトでの適切な用量の概算は、ｈｐＨＡｓｅのインビトロでの酵素活性レベルの決定および／または動物実験で有効な用量から推論することができる。例えば、70〜300ＴＲＵのヒアルロニダーゼはscidマウスの腫瘍負荷を減少させるのに有効である。このデータが与えられた場合、平均70ｋｇのヒトでの対応する用量は約250,000〜1,200,000ＴＲＵの範囲のヒアルロニダーゼであろう。ヒトの患者に投与されるｈｐＨＡｓｅポリペプチドの量は一般に、１ＴＲＵから5,000,000ＴＲＵの酵素活性、好ましくは約1,000ＴＲＵから2,500,000ＴＲＵ、より好ましくは約100,000ＴＲＵから1,500,000ＴＲＵの範囲、通常は約250,000ＴＲＵから1,200,000ＴＲＵで、平均処方用量は約725,000ＴＲＵである。
ある態様として、ｈｐＨＡｓｅポリペプチドは、約150,000ＴＲＵ／ｃｃの濃度でのｈｐＨＡｓｅを含む0.15Ｍ食塩水溶液として調剤される。続いてこの製剤を15,000ＴＲＵ／（ｋｇ患者の体重）で静脈内注射する。または、該酵素製剤を皮下注射して、ヒアルロニダーゼを腫瘍部位の周辺に灌流させる。好ましい態様として、ｈｐＨＡｓｅは腫瘍周辺にまたは腫瘍塊の中に注射される。また別の好ましい実施態様では、ｈｐＨＡｓｅをリポソームとして製剤化し、静脈内注射するかまたはＬｕＣａ−１（ｈｐＨＡｓｅ）遺伝子の欠陥に関連する癌細胞部位近くに注射する。ｈｐＨＡｓｅを静脈内注射することにより、腫瘍部位にｈｐＨＡｓｅがもたらされる。
癌細胞または前癌細胞におけるｈｐＨＡｓｅの発現による抗癌療法
ヒト染色体の３ｐ２１．３における欠陥と癌との付随性は、いくつかの組織で報告されている。ＬｕＣａ−１遺伝子（配列番号：４）は３ｐ２１．３でのいくつかの腫瘍抑制遺伝子候補の１つである。ＬｕＣａ−１およびｈｐＨＡｓｅの同一性、並びにヒアルロニダーゼの発現がマウスでの腫瘍進行および腫瘍形成の抑制と密接に関連するという観察（De Maeyerら、上掲書；Pawloeskiら、上掲書）は、ｈｐＨＡｓｅをコードするＬｕＣａ−１遺伝子が腫瘍抑制遺伝子としての活性を有することを示唆する。したがって、ＬｕＣａ−１／ｈｐＨＡｓｅ欠陥を有する細胞の染色体にＬｕＣａ−１／ｈｐＨＡｓｅをコードするヌクレオチド配列を導入することによって欠陥を修復し、それによって腫瘍の発育および／または進行を防止または抑制することが可能である（例えば置換遺伝子療法）。導入されたｈｐＨＡｓｅをコードする配列は、標的細胞の形質転換時に構成的にまたは誘発的に発現される。または、ＬｕＣａ−１／ｈｐＨＡｓｅの欠陥は、ｈｐＨＡｓｅの発現を強化することができる遺伝的成分を導入（例えばｈｐＨＡｓｅの転写または翻訳の抑制に必要な因子の抑制物質を導入）することによって修復できる。この後者のアプローチは、ｈｐＨＡｓｅをコードする配列自体は不完全ではないが、該欠陥がｈｐＨＡｓｅの発現低下によって生じる場合に有用であろう。例えば、腫瘍細胞または腫瘍細胞近傍の細胞（例えば、引き続いて腫瘍細胞に暴露されるｈｐＨＡｓｅを発現することができる細胞）の形質転換は、小型肺細胞癌、有棘肺細胞癌、並びに乳房、卵巣、頭部および頸部の癌、または低レベルｈｐＨＡｓｅもしくは不完全ＬｕＣａ−１（ｈｐＨＡｓｅ）遺伝子（例えば適切なレベルのｈｐＨＡｓｅの発現を提供できないＬｕＣａ−１または適切なレベルのヒアルロニダーゼ活性を提供できない不完全なｈｐＨＡｓｅをコードするＬｕＣａ−１遺伝子）もしくはｈｐＨＡｓｅ活性低下に伴うその他の欠陥に関連する一切の他の癌の処置に用いることができる。
遺伝子治療を実施するために問題の配列をホスト細胞に導入する方法は当技術分野では周知である。一般に、そのような遺伝子治療法には生体外と生体内での方法が含まれる。本発明の生体外遺伝子治療は、例えば患者から単離した細胞をｈｐＨＡｓｅポリペプチドをコードする配列で形質転換すること、該形質転換細胞を患者に移植することを含み、それによってｈｐＨＡｓｅ産生の貯蔵器官を、好ましくは腫瘍内の部位にまたは腫瘍の近くに提供する。したがって、この移植細胞は分泌ｈｐＨＡｓｅを提供し、患者の腫瘍の進行と戦う。生体外遺伝子治療を実施する方法は当技術分野では周知である（例えば、Morganら、Science,237:1476（1987）;Gerrardら、Nat.Genet.,3:180（1993）を参照のこと）。本発明の生体内遺伝子治療は、ｈｐＨＡｓｅポリペプチドをコードする核酸を生体内送達し、細胞（例えば癌細胞、前癌細胞、腫瘍周囲細胞、またはｈｐＨＡｓｅの発現および分泌が可能な細胞、好ましくは癌細胞または前癌細胞）内に該核酸を導入し、かつ患者の形質転換細胞によりｈｐＨＡｓｅを発現し、それによってｈｐＨＡｓｅ欠陥を修復することによって、患者の体内でｈｐＨＡｓｅの欠陥の修復を達成する。
生体外トランスフェクション法または生体内トランスフェクション法のいずれかにしたがって、細胞を形質転換させるいくつかの異なる方法を用いることができる。例えば、遺伝的物質を送達するために種々の機械的方法を用いることができるが、これらには融合誘発性脂質小胞（リポフェクチンのような陽イオン性脂質を取り込んだリポソーム、Felgnerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84:7413-7417（1987））を参照のこと；ＤＮＡの直接注入（Wolffら、Science,247:1465-1468（1990））；遺伝子銃と称される装置を用いるＤＮＡ被覆金粒子の空気送達（Yangら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:1568-1572（1990））；および種々のウイルスベクター（例えばアデノウイルス、レトロウイルス、アデノ付随ウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ワクシニアウイルスおよびポリオウイルスの非複製性変異体／変種）が含まれる。各分野における多数の刊行物の引用とともに種々の技術の概略はヒトの遺伝子治療に関する最近の記事に含まれている（Morsyら、JAMA,270:2338-2345（1993）を参照のこと）。
遺伝子治療を実施するための製剤は、用いられる遺伝子治療の方法、投与ルート（例えば全身的遺伝子治療用投与または特定の標的細胞の形質転換用投与）および形質転換のために標的とされる部位（例えば肺、乳房または卵巣）によって変動するであろう。ｈｐＨＡｓｅポリペプチドをコードする核酸配列は裸出状態であるか（すなわち被包化されていない）、ＤＮＡと陽イオン化合物（例えば硫酸デキストラン）との製剤として提供されているか、またはリポソーム内に包含されていてもよい。また別には、問題のＤＮＡは、“遺伝子銃”および当技術分野で周知の関連技術を用いて圧縮空気によって送達してもよい（Fynanら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:11478-11482（1993））。標的細胞内でのｈｐＨＡｓｅの発現のための構築物の種々の成分（例えば選択プロモーター、発現促進用成分の存在）もまた、細胞の種類および所望するｈｐＨＡｓｅの発現レベルにしたがって変動するであろう。
投与されるＤＮＡの量は、標的細胞の形質転換に対する感受性、対象者の大きさおよび体重、所望されるｈｐＨＡｓｅの発現レベルおよび処置すべき症状を含む多数の要因によって大きく変動するであろう。例えばヒトの乳癌に注射されるＤＮＡの量は、一般に約１μｇ〜200ｍｇ、好ましくは約100μｇ〜100ｍｇ、より好ましくは約500μｇ〜50ｍｇ、最も好ましくは約10ｍｇであろう。一般に、ヒトの遺伝子治療のためのＤＮＡの量は、動物モデルにおける遺伝子治療に有効なＤＮＡ量から推論できる。例えば、ヒトの遺伝子治療のためのＤＮＡ量は大雑把に、ラットの遺伝子治療のＤＮＡ有効量の100倍である。細胞の形質転換を達成するために必要なＤＮＡの量は、用いられる形質転換の方法の効率が増加するにしたがって減少するであろう。
ｈｐＨＡｓｅ、抗ｈｐＨＡｓｅ抗体、およびｈｐＨＡｓｅポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を用いる他の多くの用途は当業者には明白であろう。ｈｐＨＡｓｅポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ハイブリダイゼーションスクリーニング法で用いて、ｈｐＨＡｓｅと相同性を有する他のヒアルロニダーゼを検出できる。
寄託
ハイブリドーマ細胞系１７Ｅ９および４Ｄ５（これらは、天然ｈｐＨＡｓｅと結合する抗ｈｐＨＡｓｅ抗体を産生する）は、特許を目的としてカリフォルニア大学評議員（300 Lakeside Drive,22nd floor,Oakland,California,94612）に代わってアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection（ATCC）,Rockville,Maryland,USA）に寄託されている。ハイブリドーマ細胞系１７Ｅ９の寄託は、ＡＴＣＣによって1996年10月17日に受領された（ATCC番号、ATCC HB-12213）。ハイブリドーマ細胞系４Ｄ５の寄託は、ＡＴＣＣによって1996年10月17日に受領された（ATCC番号、ATCC HB-12214）。これらハイブリドーマ細胞は、微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約（ブダペスト条約）に規定された条件にしたがって寄託された。
この寄託物質を利用することができるということを、当局がその特許法に基づいて付与した権限に違反して本発明を実施するライセンスと解してはならない。
実施例
以下の実施例は、本発明を実施する方法を完全に開示し説明するために当業者に提供するものであって、本発明の範囲を制限することを目的とするものではない。使用された数字（例えば量、温度など）に関しては正確を期するように努めたが、ある程度の実験的誤差および偏差は存在する。特記しない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏であり、圧力は大気圧またはほぼ大気圧である。
実施例１：共有結合ビオチン付加ヒアルロン酸を用いるヒアルロニダーゼ（ＨＡｓｅ）活性アッセイ
ヒト臍帯ヒアルロン酸（ＨＡ；ＩＣＮ）を、ビオチンヒドラジド（Pierce）で遊離カルボキシル基を介して1-エチル−ジメチルアミノプロピルカルボジアミド（ＥＤＣ，Sigma）を用いて結合させてビオチン付加した。ヒアルロン酸（ＨＡ）100ｍｇを0.1Ｍ Ｍｅｓ（ｐＨ5.0）に溶解し、ＤＭＳＯに溶解させたビオチンヒドラジド（Pierce）を最終濃度１ｍＭで添加した。ＥＤＣはＨＡ／ビオチン溶液に最終濃度0.03ｍＭで溶解し、4℃で一晩攪拌した。続いて蒸留水（ｄＨ2Ｏ）に対して徹底的に透析して未結合ビオチンを除去し、最終濃度１ｍｇ／ｍｌで-20℃で保存した。
続いてヒアルロニダーゼアッセイを行う約10日前までに、スルホ−ＮＨＳ（Pierce）9.2μｇ／ウェルおよび新しいＥＤＣ６μｇ／ウェルを用いてビオチン付加ヒアルロン酸（ｂＨＡ）を最終濃度５μｇｂＨＡ／ウェルでコバリンク−ＮＨ微量定量プレート（NUNC，ニュージャージ州、Placerville）に４℃で一晩共有結合によって結合した。未結合ＨＡを、洗浄緩衝液（２Ｍ ＮａＣｌ、50ｍＭ ＭｇＳＯ4、0.05％トゥイーン２０を含むＰＢＳ）で洗浄して除去した。血漿ヒアルロニダーゼ活性を調べるためのインキュベーションは、ヒト血漿をアッセイ緩衝液（0.1Ｍギ酸塩（ｐＨ3.7）、0.1Ｍ ＮａＣｌ、１％トリトンＸ−１００、0.02％アジド、５ｍＭ ＣａＣｌ2および５ｍＭサッカロラクトン（エキソグリコシダーゼ活性を抑制するため））で１：400に希釈し、ｂＨＡプレートでサンプル100μｌを37℃で30分間インキュベートして実施した。反応は、６ＭグアニジンＨＣｌを添加して終了させ、ＰＢＳ洗浄緩衝液で３回洗浄した。
プレートに共有結合したままの残留未消化ヒアルロン酸wo、基質としてo-フェニレンジアミンを用いてアビジンペルオキシダーゼ（ＡＢＣキット、Vectastain）と反応させた。ｂＨＡと結合した蛍光を微量定量プレート読み取り装置を用いて492ｎｍで検出した。段階希釈したウシ精巣ヒアルロニダーゼ（WYDASETM（商標））を一緒にインキュベートして標準曲線を作成し、未知サンプルの活性を４種パラメーター曲線に合わせて内挿し、ヒアルロニダーゼの標準化市販調製物に対して相対的濁度減少単位（ｒＴＲＵ）／ｍｌで与えられる値を得た。
ｂＨＡヒアルロニダーゼ活性アッセイは、従来の比色アッセイ（Afifyら、上掲書）よりも約1,000倍感度がよく、完了まで60分を要するだけである。さらにまた、本アッセイは、従来のＥＬＩＳＡ様アッセイで用いられるウシ鼻軟骨からの長々と時間を要するビオチン付加ＨＡ結合アグリカンペプチドの調製（Sternら、上掲書；Delpechら、上掲書）を必要としない。本アッセイはまた、より長いインキュベーション時間を用いることによって非常に低いレベルの活性を産生する細胞培養のＨＡｓｅ活性の検出に用いることができる。
実施例２：本発明の生化学的精製方法を用いるヒト血漿ヒアルロニダーゼの精製
ｈｐＨＡｓｅを３工程の生化学的手順で精製した。１）ヒト血漿の温度誘発洗剤ｈｐＨＡｓｅ抽出；２）ファストフローＳ（Fast Flow-S）陽イオン交換クロマトグラフィー；及び３）ヒドロキシルアパタイト樹脂。ヒアルロニダーゼ活性およびタンパク質濃度を各精製段階で求めて、ヒアルロニダーゼ比活性を算出した。ヒアルロニダーゼ活性は実施例１のアッセイを用いて決定した。タンパク質濃度を、280ｎｍでの吸収および標準物質として結晶化ウシ血清アルブミンを使用し且つ595ｎｍで読み取った96ウェルプレートによるバイオラド（Biorad）（Burlingame，カリフォルニア州）タンパク微量アッセイキット（Tengblad,Biochem.Biophys.Acta,578:281-289（1979））の双方で決定した。
１）温度誘発洗剤相抽出
ＵＣＳＦまたはアービン・メモリアル（Irwin Memorial）血液ドナーセンターのいずれかから入手した期限切れヒト血漿２リットルを酵素精製のために日常的に用いた。冷蔵ヒト血漿２リットルを0.02％アジ化ナトリウム、50ｍＭ ＮａＣｌ、５％ショ糖および7.5％トリトンＸ−１１４（Boehringer Mannheim）の溶液に攪拌しながら４℃で溶解させ、続いて10,000×ｇで30分間遠心沈殿して不溶性物質を除去した。続いて、血漿を37℃で温度誘発相抽出に付し、洗剤濃厚相および洗剤希薄相を分離させた。抽出物を37℃で10,000×ｇで30分間遠心沈殿して２つの相を透明にした。洗剤濃厚相を取り出し、冷50ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ7.5）と0.15Ｍ ＮａＣｌで２リットルに希釈した。続いてこの溶液を氷上で十分に混合し、その後37℃で再度分配を実施し遠心した。洗剤相に分配されるヒアルロニダーゼの比活性を高めるためにこの操作を３回繰り返した。最終洗剤濃厚相では、実施例１のＨＡｓｅ活性アッセイで求めたときヒト血漿出発材料と比較してｈｐＨＡｓｅの比活性は60倍濃縮された。
２）ファストフローＳ陽イオン交換クロマトグラフィー
25ｍＭ Ｍｅｓ（ｐＨ6.0）中の平衡化ＳＰ−セファロース陽イオン交換樹脂（Pharmacia）20ｍｌで、工程１の最終洗剤濃厚相を６倍希釈し、4℃で一晩攪拌した。ビーズを遠心沈殿して採集し、46ｍｍオクチルグリコシド（Boehringer Mannheim）を含む25ｍＭ Ｍｅｓ（ｐＨ6.0）で徹底的に洗浄した。ヒアルロニダーゼを、Ｍｅｓ（ｐＨ6.0）緩衝液に0.3Ｍ ＮａＣｌを添加して数回洗浄しつつビーズから溶出させた。ＳＰ−セファロース溶出液をＹＭ３（Amicon）膜上で濃縮し、f.p.l.c.ファスト脱塩カラム上で25ｍＭ ＮａＣｌ、46ｍＭオクチルグルコシドを含む10ｍＭ ＰＯ4（ｐＨ7.4）中に脱塩した。
３）ヒドロキシル−アパタイト樹脂
工程２）のヒアルロニダーゼ調製物を平衡化ヒドロキシルアパタイト樹脂（Biorad）10ｍｌと混合し、4℃で一晩攪拌台に放置した。ｈｐＨＡｓｅはこのような条件下では樹脂に吸着されず、上清から回収された。上清から回収したｈｐＨＡｓｅを、ファルマシア・ファストゲルシステム（Pharmacia Phast Gel System）の銀染色12.5％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動分析により測定したとき均一になるまで精製した。
表１は、上記の各精製工程のｈｐＨＡｓｅ含有分画のヒアルロニダーゼ活性、タンパク質濃度および比活性をまとめたものである。
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生化学的ｈｐＨＡｓｅ精製の結果の要約
上述の生化学的な方法を用いるｈｐＨＡｓｅの精製によって、ｈｐＨＡｓｅは温度誘発洗剤相への分配について固有の特性を有することが明らかになった。洗剤濃厚相へのｈｐＨＡｓｅ分配は、通常ある種の内在性膜タンパク質（integral membrane proteins）または脂質固着タンパク質とともに観察される（Bordier,J.Biol.Chem.,256:1604-7（1981））。ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣ（これはグリコシル−ホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーを切断する）またはN-グリコシダーゼＦ（これはＮ連結糖付加部分を切断する）によりｈｐＨＡｓｅを処理しても、ｈｐＨＡｓｅのｈｐＨＡｓｅ分配特性が変化しない（しかしゲルザイモグラフィーと組み合わせたN-グリコシダーゼＦ処理は、ｈｐＨＡｓｅが少なくとも２つのＮ連結糖付加部位をもつことを示した）。
これらの実験から、ｈｐＨＡｓｅが内在性膜タンパク質であるか、またはヒト赤血球アセチルコリンエステラーゼのＧＰＩアンカーと同様なホスホリパーゼ耐性アンカーをもつことが示唆される（Robertsら、J.Biol.Chem.,263:18766-75（1988））。ＧＰＩアンカーは、形質膜の細胞外領域上に存在するタンパク質と通常は結合しているが、血清に存在するＧＰＩ固着タンパク質の例もある（例えばＣＤ５９、Vakevaら、Immunology,82:28-33（1994））。さらに、中性ＰＨ２０精子ヒアルロニダーゼのいくつかはＧＰＩ特異的ホスホリパーゼＣ感受性アンカーを有する（Gmachlら、FEBS Lett.,336:545-8（1993）;Thalerら、Biochemistry,34:7788-95（1995））が、ＧＰＩアンカー様翻訳後修飾は酸活性ヒアルロニダーゼでは報告されていない。のみならず、そのような翻訳後修飾は、アミノ酸配列またはそのような酸活性ヒアルロニダーゼをコードするヌクレオチド配列からは明らかではないだろう（すなわち、脂肪酸またはＧＰＩアンカーの付加による翻訳後修飾の特異的部位は報告されていない）。例えば、ＧＰＩ固着タンパク質についてコンセンサス配列は現在のところ知られていない。イソプレニル化タンパク質のコンセンサス配列（ＣＡＡＸ；配列番号：10）は知られているが、ｈｐＨＡｓｅはこの配列を含まない。
ｈｐＨＡｓｅは他の強力な両親媒性性状を示した。例えば、ｈｐＨＡｓｅを溶解させた溶液のイオン強度が透析によって低下するとき、ｈｐＨＡｓｅは溶液から沈澱した。ｈｐＨＡｓｅは、0〜30％の硫酸アンモニウム分画に豊富であった。ｈｐＨＡｓｅのコンカバリンＡ結合特性から、ｈｐＨＡｓｅがマンノース含有糖タンパク質であることがわかった。
中性ｐＨでのS200-f.p.l.c.カラム（Pharmacia）によるゲル濾過クロマトグラフィーは、約120ｋＤａでボイド容積内にＨＡｓｅ活性のピークを溶出させた。ゲル濾過クロマトグラフィーを非イオン性洗剤の非存在下で実施したとき、ＨＡｓｅ活性のピークは約60ｋＤａで溶出した。ｈｐＨＡｓｅ活性に付随する分子量におけるこの違いは、おそらく洗剤の存在下でのｈｐＨＡｓｅの凝集またはオリゴマー化（例えば分子内結合による）によるものであろう。ｈｐＨＡｓｅは非イオン製洗剤の存在下で37℃で非常に安定であり、したがってトリトンＸ−１１４相抽出は、ほとんどの血漿タンパク質が洗剤濃厚相に分配されないので特に、最初の分画工程として理想的である。
洗剤を除去しさらにｈｐＨＡｓｅを精製する陽イオン交換クロマトグラフィーの間、非イオン性洗剤を添加することおよび少なくとも50ｍＭでＮａＣｌを維持することは酵素の沈澱を防止するために必須である、バッチ吸着クロマトグラフィーはカラムクロマトグラフィーと比較して活性を保存した。興味深いことには、60ｍＭオクチルグリコシドの存在下、10ｋＤａカットオフ膜でｈｐＨＡｓｅ含有調製物を濃縮したとき、ｈｐＨＡｓｅ活性は保持されなかった。しかしながら、３ｋＤａカットオフ膜を用いることによってｈｐＨＡｓｅ活性は保持された。これらの結果から、ｈｐＨＡｓｅのストークス径は球形モデルから実質的に逸れていることが示唆される。これらのデータから、ほとんどの球形タンパク質について考えられているように、ｈｐＨＡｓｅはオクチルグルコシド洗剤の存在下で球形をもたず、むしろロッド状形態をとるらしいことを示している。ｈｐＨＡｓｅは、１つの寸法では57ｋＤａタンパク質より6〜7ｋＤａタンパク質の分子量を有するようである。したがって、一つの寸法ではこのタンパク質は、小型タンパク質およびペプチドのために設けられた障壁を通過することができ、このことから血漿酵素がヒト尿中で見出されることが説明できるであろう（下記参照、通常腎臓は50〜60ｋＤａ未満（＜50〜60ｋＤａ）のタンパク質を排除する）。したがって、患者は、ｈｐＨＡｓｅがリポソームまたはリポソーム様構造に取り込まれない場合、尿中に大量のｈｐＨＡｓｅを排出するかもしれない。
ｈｐＨＡｓｅのＳＰ−セファロース後調製物は、不純物タンパク質をヒドロキシアパタイト樹脂に吸着させて均一になるまで精製して、全体として150万倍の精製度が得られた。この最終精製工程から得たｈｐＨＡｓｅサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動および銀染色によって単一バンドが得られ、このことは、ｈｐＨＡｓｅは電気泳動上均一になるまで精製されたことを示している。精製した酵素の比活性（実施例１で述べたアッセイを用いて検査したとき600,000rTRU/mg）は、精子ヒアルロニダーゼＰＨ２０で報告された値のほぼ６倍であった。最終調製物中の非イオン性洗剤レベルによって分子質量分析は変動したが、精製した酵素はＳＤＳ電気泳動ゲルで相対分子質量57ｋＤａで移動した。
実施例３：抗天然酸活性ＨＡｓｅ（ａａＨＡｓｅ）抗体のためのスクリーニングアッセイ
ビオチン付加ＨＡ（ｂＨＡ）を実施例１で述べたように調製した。ｂＨＡ約５μｇ／ウェルおよびヤギ抗マウスＩｇＧ（Jackson Immunolabs）1.25μｇ／ウェルを、スルホ−ＮＨＳ（Pierce）9.2μｇ／ウェルおよび新しいＥＤＣ ６μｇ／ウェルを有するコバリンク−ＮＨ微量定量プレート（NUNC，ニュージャージ州、Placerville）に4℃で一晩共有結合によって接合した。未結合ＨＡおよびヤギ抗体は、洗浄緩衝液（２Ｍ ＮａＣｌ、50ｍＭ ＭｇＳＯ4、0.05％トウィーン２０を含むＰＢＳ）でプレートを洗浄して除去した。
抗天然酸活性ＨＡｓｅ（抗天然ａａＨＡｓｅ）抗体は、候補抗体を酸活性ＨＡｓｅを含むサンプルと中性ｐＨ緩衝液（これはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に１％トリトンＸ−１００を含む）中でインキュベートしてスクリーニングした。サンプルが希釈サンプルの場合（例えば希釈血漿サンプル）、中性ｐＨ緩衝液はさらに５ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含んでいた。ａａＨＡｓｅ含有サンプルを候補抗体とインキュベートして、天然ａａＨＡｓｅ−抗体複合物を形成させた。続いてサンプルをｂＨＡ／抗マウス抗体ウェルに入れてインキュベートし、中性ｐＨ緩衝液中で抗マウス抗体／抗天然ａａＨＡｓｅ／ａａＨＡｓｅ抗体を形成させた。ａａＨＡｓｅを結合しない抗体を含むサンプルは陰性コントロールとして用いることができる。
天然ａａＨＡｓｅと結合する抗体の検出は、先ず未結合物質を中性ｐＨ緩衝液で洗浄し、続いて中性ｐＨ緩衝液を実施例１で述べたＨＡｓｅ活性アッセイで用いた酸性アッセイ緩衝液（0.1Ｍギ酸塩（ｐＨ3.7）、0.1Ｍ ＮａＣｌ、１％トリトンＸ−１００、0.02％アジド、５ｍＭ ＣａＣｌ2および５ｍＭサッカロラクトン）で置き換えて実施した。中性から酸性へのｐＨシフトによって、一切の結合ａａＨＡｓｅのＨＡｓｅ活性が共有結合ｂＨＡを分解する。反応を６ＭグアニジンＨＣｌを添加することによって終了させ、ＰＢＳ洗浄緩衝液（ＰＢＳ、２Ｍ ＮａＣｌ、50ｍＭ ＭｇＳＯ4、0.05％トゥイーン２０）で３回洗浄した。ｂＨＡの分解は、基質としてo-フェニレンジアミンを用いてアビジンペルオキシダーゼとウェルを反応させ、実施例１で述べたように492ｎｍでプレートを読み取って検出した。抗天然ａａＨＡｓｅ抗体はｂＨＡの分解によって同定された。本アッセイは、ａａＨＡｓｅがｐＨ4.5以上ではＨＡ基質に対して親和性をもたない（これはｈｐＨＡｓｅによるＨＡ−セファロース親和性クロマトグラフィーによって決定されたが、結果は示されていない）というａａＨＡｓｅの特性を利用している。
実施例４：抗ｈｐＨＡｓｅモノクローナル抗体の生成と同定
実施例２の精製法のヒドロキシアパタイト後工程から単離したｈｐＨＡｓｅを用いて、当技術分野で周知の方法にしたがって５匹の６週齢雌Ｂａｌｂ−ｃマウスを免疫した（例えば上掲書（Harlow & Lane）参照）。簡単に記せば、ｈｐＨＡｓｅをフロイントの完全アジュバントと混合しマウスに腹腔内注射した。21日間隔で、タンパク質＋フロイントの不完全アジュバントを動物に追加免疫した。フロイントの不完全アジュバントにｈｐＨＡｓｅを含む第４回目と最終追加免疫は静脈内注射した。血清サンプルを採り、マウスを殺処分して周知の方法（Harlow & Lane、上掲書；Schrierら、上掲書）にしたがってハイブリドーマ細胞系を調製するために５匹のうちの２匹から脾臓細胞を単離した。ｂａｌｂ／ｃ細胞の融合はｓｐ２／０ミエローマを用いて実施した。
抗体分泌ハイブリドーマを、実施例３で述べた本発明の抗天然ａａＨＡｓｅ抗体アッセイを用いてスクリーニングした。簡単に記せば、20の融合プレートのハイブリドーマ上清を希釈ヒト血漿と37℃で60分間インキュベートし、続いてｂＨＡ／抗マウスＩｇＧプレート中で37℃で60分間インキュベートした。１％トリトンＸ−１００および10ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡを含むＰＢＳでプレートを５回洗浄し、免疫沈澱しなかったヒアルロニダーゼを除去した。続いて酸性ギ酸塩アッセイ緩衝液（ｐＨ3.7）をウェルに添加し、37℃で60分間インキュベートした。６Ｍグアニジンで反応を停止させた後、実施例３で述べたように、基質としてo-フェニレンジアミンを用いアビジンペルオキシダーゼとウェルを反応させ、492ｎｍでプレートを読み取ってウェルに残留する未分解ｂＨＡを検出した。
８クローンを最初の20ハイブリドーマ融合プレートから同定した。２クローン、１７Ｅ９（ＩｇＧ2αクラス抗体、カッパ鎖を産生）および４Ｄ５（ＩｇＧ1クラス抗体、カッパ鎖を産生）を用いて腹水を得た。単一細胞によってクローン化したハイブリドーマ系の腹水由来免疫グロブリンをＢａｌｂ／ｃマウスで生成し、タンパクＡ親和性クロマトグラフィーによって精製した。１７Ｅ９抗体も４Ｄ５抗体もｈｐＨＡｓｅ活性をブロックしなかった。１７Ｅ９抗体は免疫親和性精製および免疫沈澱での使用が好ましい。４Ｄ５抗体は免疫組織化学での使用が好ましい。
実施例５：１７Ｅ９モノクローナル抗体を用いるｈｐＨＡｓｅの免疫沈澱
１７Ｅ９抗天然ｈｐＨＡｓｅクローン由来精製ＩｇＧ2aまたはコントロールＩｇＧ2a非特異的抗体のいずれかを用いて、ｈｐＨＡｓｅをヒト血漿から免疫沈澱させた。ヒト血漿をR.I.P.A.緩衝液（１％ＮＰ４０、１％デオキシコレート、１％トリトンＸ−１００、５ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ）で希釈した。コントロールＩｇＧ2a抗体または１７Ｅ９抗体のいずれかの段階希釈と接合させたタンパク質Ａセファロースをサンプルに加えた。未結合物質を遠心沈殿によってビーズから分離し、上清に残留するＨＡｓｅ活性を実施例１で述べたアッセイを用いて検出した。図４に示すように、１７Ｅ９抗体による免疫沈澱によって本質的に全ての検出可能な酸活性ヒアルロニダーゼ活性が除去された。さらに、１７Ｅ９抗体はウシ精巣ヒアルロニダーゼ（ＰＨ２０）とは結合しなかった。このことは、１７Ｅ９が、ＰＨ２０及びｈｐＨＡｓｅと共有する炭化水素部分または他の部分とは結合しないことを示唆している。
実施例６：ｈｐＨＡｓｅの免疫親和性精製
親和性クロマトグラフィーカラムに結合させた１７Ｅ９抗体を用いて、ｈｐＨＡｓｅを単一工程で未加工ヒト血漿から均質となるまで精製した。１７Ｅ９ハイブリドーマクローンの腹水から得た精製ＩｇＧ約３ｍｇをハイトラップＮＨＳ（High Trap-NHS）活性化カラム（Pharmaci）１ｍｌに製造元の指示にしたがって結合させた。ｈｐＨＡｓｅ血漿をR.I.P.A.緩衝液で１：２に希釈し１７Ｅ９ＩｇＧ抗体カラムに通した。続いてカラムを２Ｍ ＮａＣｌと100ｍＭオクチルグルコシドを含むＰＢＳで洗浄し、続いて100ｍＭクエン酸塩（ｐＨ4.0）で洗浄した。ｈｐＨＡｓｅを150ｍＭ ＮａＣｌを含む100ｍＭクエン酸塩（ｐＨ3.0）で溶出させた。ｈｐＨＡｓｅは明瞭な均一ピークとしてｐＨ3.0で溶出した。免疫親和性精製ｈｐＨＡｓｅの比活性は約4.0×105ｒＴＲＵ／ｍｇの範囲であった。したがって、生化学的精製工程と比較して存在するとしても極めてわずかな活性が免疫親和性精製工程で失われる。さらにまた、免疫親和性精製は、サンプル中のｈｐＨＡｓｅの約100％のｈｐＨＡｓｅの回収をもたらした。すなわち、ＨＡｓｅアッセイでは未結合分画中に残留するＨＡｓｅ活性は検出されなかった。
実施例７：ｈｐＨＡｓｅのアミノ酸配列決定
実施例６の免疫親和性精製ｈｐＨＡｓｅ約50μｇをＬｙｓ−Ｃ（Ｎ末端フラグメントを生成するため）またはトリプシン（内部フラグメントを生成するため）で消化し、Vydac C-18逆相カラム上でクロマトグラフィーを実施してフラグメントを分離した。精製ペプチドの配列をガス相エドマンシークェンサーで配列決定した。Ｎ末端アミノ酸の配列決定のためには、精製タンパク質をプロソーブ（Prosorb）膜（ABI）に固定した。Ｎ末端アミノ酸の配列決定は、ガス相エドマン分解を用いて自動化タンパク配列決定によって実施した。精製ｈｐＨＡｓｅ（配列番号：１）のＬｙｓ−Ｃ消化物に由来するＮ末端のアミノ酸配列および５つの分断内部アミノ酸配列のファスタ調査（Pearsonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:2444-8（1988））から、ＬｕＣａ−１遺伝子（配列番号：３、GenBank受託番号u03056）の予想アミノ酸配列と同一であることを明らかにした。
実施例８：ＬｕＣａ−１／ｈｐＨＡｓｅの性状
上記の実施例７で述べたように、ｈｐＨＡｓｅはＬｕＣａ−１と同一である。ＬｕＣａ−１遺伝子は、小型細胞肺癌系では100％のヘテロ接合型消失を示す染色体3p.21.3に位置する17個の配列を含む一群の中の１つである（Dietrichら、Clin.Chim.Acta,13:746-52（1966））。ＬｕＣａ−１を含む領域に広がる３ｐ．２１の欠失はまた、非小型細胞肺癌、乳癌、前立腺、並びに頭部および頸部の癌でも報告されている。モノ−Pf.p.l.cシステム上でのｈｐＨＡｓｅのクロマトフォーカシングは、ｈｐＨＡｓｅ（配列番号：１）およびＬｕＣａ−１（配列番号：３）の同一性に関して更なるデータを提供した。ｈｐＨＡｓｅはｐＨ6.5で溶出し、これはＬｕＣａ−１の算出等電点理論値6.58と非常に近い。
ＬｕＣａ−１（配列番号：３）およびヒト精巣ヒアルロニダーゼＰＨ２０（配列番号：11）のアミノ酸配列のピアソン・リップマンアラインメント（Pearsonら、上掲書）は、ＬｕＣａ−１およびＰＨ２０が40％を越える配列同一性および60％相同性を共有することをわかった（図５）。ＰＨ２０はもっぱら精子特異的中性ヒアルロニダーゼであり、ミツバチおよびスズメバチ（yellow jacket vespid）の毒液中に見出される毒液ヒアルロニダーゼと顕著な相同性を共有する（Gmachlら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:3569-73（1993））。厳格な酸活性をもつ血漿ヒアルロニダーゼ（ＬｕＣａ−１／ｈｐＨＡｓｅ）とＰＨ２０との間の際立った相同性は、それらの最適ｐＨが非常に異なることを考えるならば驚くべきことであり、このことから、全てのホ乳類のβ，1-4ヒアルロニダーゼが、中性も酸性も双方共に高度に保存された酵素類の構成メンバーであることが示唆される。
ＬｕＣａ−１／ｈｐＨＡｓｅのハイドロパシープロットは疎水性に富むドメイン（例えば内在性膜タンパク質に付随しているようなもの）を全く示さず、これにより、実施例２で述べたｈｐＨＡｓｅの相分配特性が説明できるであろう。したがって、これらのデータは、ＬｕＣａ−１／ｈｐＨＡｓｅの洗剤濃厚相への分配は翻訳後修飾（例えば脂肪酸鎖の修飾またはホスホリパーゼＣ／ホスホリパーゼＤ／Ｎ−グリコシダーゼＦ耐性ＧＰＩアンカー）のためであるということを示唆している。
実施例９：ＬｕＣａ−１／ｈｐＨＡｓｅをコードするＤＮＡの単離
λ gt10  5’-STRETCH PLUSヒト肝ｃＤＮＡライブラリー（Clontech Laboratories,Inc.,アメリカ、カリフォルニア州、パロアルト）を用いてネストＰＣＲ反応を２巡し、ＬｕＣａ−１コード配列をコードするｃＤＮＡを単離した。１巡目のＰＣＲ（ここではＬｕＣａ−１ ｃＤＮＡの590から1948までのヌクレオチドを増幅させた）では以下のプライマーを用いた。ＬｕＣａＦ１（5’-CAGGTTGTCCTGCACCAGTC-3’）（配列番号：５）およびＬｕＣａＲ１（5’-ATGTGCAACTCAGTGTGTGGC-3’）（配列番号：６）。ＰＣＲ反応は、肝ｃＤＮＡライブラリー１ｍｌ、25ｍＭプライマー各１ｍｌ、10ｍＭ ｄＴＮＰ１ｍｌ（Gibco BRL，アメリカ、ニューヨーク州、グランドアイランド）、２単位のＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene Cloning Systems，アメリカ、カリフォルニア州、ラホイヤ）を含み、10ｍＭトリス−ＨＣｌ、50ｍＭ ＫＣｌおよび２ｍＭ ＭｇＣｌ2で緩衝化させた全反応容積50ｍｌ中で実施した。ＰＣＲ反応条件は、95℃で１分間の変性工程、60℃で１分間のアニーリング工程、および74℃で１分間の伸長を37サイクル、続いて最後に74℃で７分間の伸長を含んでいた。
第２巡目のＰＣＲ増幅は、以下のネストＰＣＲプライマーを用いてＬｕＣａ−１コードｃＤＮＡの612〜1925ヌクレオチドを増幅させるために用いた。ＬｕＣａＦ２（5’-GTGCCATGGCAGGCCACC-3’）（配列番号：７）およびＬｕＣａＲ２（5’-ATCACCACATGCTCTTCCGC-3’）（配列番号：８）。プライマーＬｕＣａＦ２は、その後のＰＣＲ生成物の一方向性クローニングを促進するためにＰＣＲ反応の前にリン酸化した。リン酸化は、25ｍＭ ＬｕＣａＦ２ ２ｍｌを10単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ、10ｍＭ ＡＴＰ（50ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ7.5）、10ｍＭ ＭｇＣｌ2、５ｍＭジチオスレイトールで緩衝）１ｍｌおよび最終容積９ｍｌの0.1ｍＭスペルミジンとともにインキュベートすることによって実施した。反応は、鋳型として最初のＰＣＲ反応から得た最終生成物の１ｍｌ、リン酸化ＬｕＣａ−１Ｆ２ ４ｍｌ、25ｍＭ ＬｕＣａＲ２ １ｍｌ、10ｍＭ ｄＮＴＰ １ｍｌ（Gibco BRL）（10ｍＭトリス−ＨＣｌ、50ｍＭ ＫＣｌおよび1.5ｍＭ ＭｇＣｌ2で緩衝）、および0.5単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Gibco BRL）を含む全容積50ｍｌ中で実施した。第二のＰＣＲ反応は、95℃で１分間の変性、58℃で１分間のアニーリングおよび72℃で１分間の伸長から成るものを７サイクル、さらに72℃で７分間の最終伸長が続いた。
一方向性のＴＡ発現ベクターpCR3.1-Uni（Invitrogen，アメリカ、カリフォルニア州、サンディエゴ）２μｌにＰＣＲ反応の生成物をＴ４ ＤＮＡリガーゼで連結した。この連結ベクターを用いてワン・ショット（One ShotTM）ＴＯＰ１０Ｆ’（Invitrogen）コンピテント細胞を形質転換し、これを50μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天平板に播種し37℃で一晩インキュベートした。コロニーは、50μｇ／ｍｌのアンピシリン含有10ｍｌＬＢブロスでコロニーを一晩培養し、さらにウィザード（商標）プラスミニプレップＤＮＡ精製システム（WizardTM Plus Miniprep DNA Purification System,Promega Corporation,アメリカ、ウィスコンシン州、マジソン）によってプラスミドを精製し、続いてDraIIIエンドヌクレアーゼ（Boehringer Manheim，アメリカ、インディアナ州、インディアナポリス）でベクターの制限地図を作製し、ＡＢＩプリズム（PrismTM）ＤＮＡシークェンサーで自動蛍光配列決定を実施することによってＬｕＣａ−１挿入物の存在について検査した。
DraIIIにより制限地図作製およびプラスミドの配列決定によって、このクローン化された配列が、Ｎ末端に見出されたVal27−Leuの置換を除いてGenBankデータベースで入手できるＬｕＣａ−１配列と同一であることが示された。肝λgt10 ｃＤＮＡライブラリーから得られた活性ＰＣＲ生成物の配列決定によって、27番目のアミノ酸残基に対応する位置における得られた配列と既に報告されたＬｕＣａ−１配列との間のＧ−Ｃ不一致が明らかになった。したがって、既に報告されたＬｕＣａ−１配列がエラーを含むのか、本明細書で配列決定したクローンが対立遺伝子変種であるのかのいずれかである。
実施例10：Ｃｏｓ−７細胞での組換えＬｕＣａ−１の発現
インスリン、トランスフェリンおよびセレニウム（Gibco BRL）を含む非必須アミノ酸（UCSF細胞培養施設）を有するＤＭＦ／Ｆ１２の50／50混合物20ｍｌ中にリポフェクタミン（Lipofectamine）60μｌとともにＤＮＡ９μｇを用いて、Ｔ７５フラスコ内の細胞密集度50％のｃｏｓ−７細胞に、pCR3.1-Uni発現プラスミド内の精製ＬｕＣａ−１をコードするｃＤＮＡを５時間トランスフェクトさせた。続いてこのトランスフェクト細胞を10％ウシ胎児血清含有ＤＭＥ／Ｆ１２の50／50混合物中でさらに48時間増殖させた。
実施例11：Ｃｏｓ−７細胞で発現した組換えＬｕＣａ−１の精製と性状決定
抗天然ｈｐＨＡｓｅ抗体と結合する能力および酸活性ＨＡｓｅ活性を示す能力によってＬｕＣａ−１がｈｐＨＡｓｅと同一であるということをさらに証明するために、組換えＬｕＣａ−１の性状をさらに調べた。上述したように組換えＬｕＣａ−１をｃｏｓ−７細胞で発現させ、以下の実験に付した。１）抗ｈｐＨＡｓｅ抗体を用いたＨＡｓｅ活性アッセイ；２）抗天然ｈｐＨＡｓｅ抗体を用いたＬｕＣａ−１の免疫沈澱；３）抗天然ｈｐＨＡｓｅ抗体沈澱ＬｕＣａ−１のゲルザイモグラフィー；および４）ＬｕＣａ−１付随酸活性ＨＡｓｅ活性の最適ｐＨの決定。陰性コントロールとして機能するクロラムフェニコールトランスフェラーゼ遺伝子を含むpCR3.1-Uniベクターの９μｇを細胞にトランスフェクトした（偽トランスフェクション細胞）。
酵素捕捉アッセイで抗ｈｐＨＡｓｅ抗体を用いる組換えＬｕＣａ−１のＨＡｓｅ活性
ｈｐＨＡｓｅを発現するｃｏｓ−７細胞およびそれらの細胞の条件付け培養液を別々に、実施例２で述べたように２％トリトンＸ−１１４で抽出し、続いて温度誘発洗剤相を分離した。実施例１の酵素免疫捕捉アッセイを用いて、洗剤濃厚相抽出物をＨＡｓｅ活性について分析した。細胞層および条件付け培養液の両方のトリトンＸ−１１４洗剤相抽出物が、本発明のアッセイで検出したとき酸活性ＨＡｓｅ活性を含んでいた（図７Ａ）。偽トランスフェクションコントロール細胞は、低レベルの検出可能な酸活性ＨＡｓｅ活性を示した（図７）。
組換えｈｐＨＡｓｅのＨＡｓｅ活性をさらに評価するために、Ｃｏｓ−７細胞の形質転換について上述したものと同様な態様で、ＨＥＫ２９３細胞をｈｐＨＡｓｅコードＤＮＡで安定的にトランスフェクトした。簡単に記せば、リポフェクチン60μｌを有するＤＮＡ９μｇを用いてｈｐＨＡｓｅをコードする構築物をＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。48時間後、限界希釈法を用いて500μｇ／ｍｌ Ｇ４１８を有する24ウェルプレートに細胞を播種した。14日後に、耐性コロニーの条件付け培養液を上記ようにヒアルロニダーゼ活性についてアッセイした。高レベルの発現を有するコロニーを更なる性状決定のために増殖させた。組換えｈｐＨＡｓｅの分析は、血清非含有培養液中でｈｐＨＡｓｅをコードする構築物を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞系を48時間増殖させることによって行った。条件付け培養液は１７Ｅ９抗ｈｐＨＡｓｅ免疫親和性カラムに通した。組換えｈｐＨＡｓｅを上記のプロトコルを用いて溶出させた。図７Ｂに示すように、細胞層も条件付け培養液も酸活性ｈｐＨＡｓｅ活性を含んでいた。偽トランスフェクション細胞は検出可能なヒアルロニダーゼ活性を示さなかった。
これらのデータはＬｕＣａ−１が酸活性ＨＡｓｅ活性を示すため、ｈｐＨＡｓｅとＬｕＣａ−１は同一であるという観察がさらに支持される。
抗ｈｐＨＡｓｅ抗体による組換えＬｕＣａ−１の免疫沈澱
タンパクＡセファロースに結合させた実施例４で述べた１７Ｅ９抗ｈｐＨＡｓｅモノクローナル抗体を用いて、抗天然ｈｐＨＡｓｅ抗体とＬｕＣａ−１との結合を実施例５で述べた免疫沈澱法で調べた。１７Ｅ９抗体は、ＬｕＣａ−１発現細胞由来のＬｕＣａ−１も条件付け培養液由来のＬｕＣａ−１も免疫沈澱させた。しかしながら、偽トランスフェクション細胞の酸活性ＨＡｓｅ活性は１７Ｅ９抗体−タンパクＡセファロースビーズでは免疫沈澱しなかった。これらの実験から、ｈｐＨＡｓｅ及びＬｕＣａ−１は１７Ｅ９抗天然ｈｐＨＡｓｅ抗体が結合する抗原エピトープを共有することがわかる。さらに、１７Ｅ９が偽トランスフェクションｃｏｓ−７細胞によって発現される酸活性ＨＡｓｅとは結合しなかったので、このエピトープはｈｐＨＡｓｅおよびＬｕＣａ−１に固有である。
抗ｈｐＨＡｓｅ抗体で免疫沈澱させたＬｕＣａ−１のゲルザイモグラフィー
１７Ｅ９抗天然ｈｐＨＡｓｅ抗体で免疫沈澱させた組換えＬｕＣａ−１も、当技術分野で周知の方法（Afifyら、上掲書）にしたがって基質ゲルザイモグラフィーで酸活性ＨＡｓｅ活性について調べた。簡単に記せば、ＬｕＣａ−１トタンスフェクション細胞（テストサンプル）および偽トランスフェクション細胞（クロラムフェニコールトランスフェラーゼをコードするプラスミド；陰性コントロール）の細胞溶解物および条件付け培養液を、タンパクＡセファロースビーズに結合させた抗天然ｈｐＨＡｓｅで免疫沈澱させた。サンプルをＳＤＳサンプル緩衝液に懸濁し、40μｇ／ｍｌ ＨＡを含む10％ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動した。免疫沈澱ｈｐＨＡｓｅ（実施例５）を含むサンプルおよびウシ精巣ヒアルロニダーゼ（WYDASETM（商標）150rTRU/ml）は陽性コントロールとして作用した。インキュベーションはAfifyら（上掲書）の記載にしたがって実施し、消化ＨＡは、アルシアンブルー（Alcian blue）／酢酸で染色し続いてアルシアン／炭水化物染色を強化し、タンパク質を可視化するためにクマシー染色を実施することによって検出した。
ＳＤＳ−ＨＡゲルの透明領域は、免疫親和性精製ｈｐＨＡｓｅ調製物と同じ相対分子質量に相当した。透明帯（したがって免疫沈澱酸活性ヒアルロニダーゼ活性）は偽トランスフェクション細胞サンプルでは観察されなかった。
組換えＬｕＣａ−１のＨＡｓｅ活性の最適ｐＨ
実施例１で述べたＨＡｓｅ活性アッセイを用いて組換えＬｕＣａ−１ＨＡｓｅ活性の最適ｐＨを決定した。アッセイ緩衝液が、0.1Ｍギ酸塩（ｐＨ3〜4.5）、酢酸塩（ｐＨ5.0）、Ｍｅｓ（ｐＨ6.0）、Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ7.0〜8.0）、0.1Ｍ ＮａＣｌ、１％トリトンＸ−１００、0.02％アジド、５ｍＭ ＣａＣｌ2および５ｍＭサッカロラクトンで構成されていたことを除いて、実施例１のＨＡｓｅ活性アッセイを既に記載したように実施した。シグマＶＩ−Ｓ型精巣ヒアルロニダーゼ（3,000TRU/mg固形）（これは中性ＨＡｓｅＰＨ２０（ｐＨ7.5で最大ＨＡｓｅ活性）を含む）を比較として用いた。このサンプルのためのアッセイ緩衝液を、ＮａＣｌを含まないで調製したという点を除き（ＮａＣｌは中性ＨＡｓｅ活性を抑制する）、ＶＩ−Ｓ型サンプルを同じように処理した。図８に示したように、組換えＬｕＣａ−１の最適ｐＨ曲線は、免疫親和性精製ｈｐＨＡｓｅと同じ厳密な酸活性プロファイルを示した。ＬｕＣａ−１もｈｐＨＡｓｅもｐＨ4.5より上ではＨＡｓｅ活性を示さず、対照的にＶＩ−Ｓ型精巣ヒアルロニダーゼはｐＨ7.5より上でのみＨＡｓｅ活性を示した。
要約すれば、生化学的、分子的および免疫学的基準から、ＬｕＣａ−１およびｈｐＨＡｓｅが同一であることが強く示唆される。
実施例12：ＬｕＣａ−１／ｈｐＨＡｓｅの器官調査とＬｕＣａ−１／ｈｐＨＡｓｅの一過性発現
ＬｕＣａ−１ ｃＤＮＡの1.3ｋｂのコード領域を増幅するために用いた実施例11で述べたプライマーを用いて、当技術分野で周知の方法にしたがってＬｕＣａ−１／ｈｐＨＡｓｅ転写物の組織分布を調べた。種々の組織のλgt10 ｃＤＮＡライブラリーから得た増幅ＰＣＲ生成物は、心臓、腎臓、肝臓、肺、胎盤および骨格筋で検出されたが、脳では検出されなかった。心臓組織は、最も高レベルのＬｕＣａ−１／ｈｐＨＡｓｅ転写物産生の１つであることを示した。
上述したものと同様な手順にしたがって、本発明のｈｐＨＡｓｅと実質的に同じ配列を有する他のヒアルロニダーゼを精製し、クローニングし、さらに発現させることができる。
実施例13：尿由来のｈｐＨＡｓｅ型の生化学的精製
期限切れヒト血漿に代わってサンプルとして濃縮尿を用いた点を除いて、実施例２で述べた生化学的精製方法にしたがって尿型ｈｐＨＡｓｅをヒトの尿から精製した。尿ｈｐＨＡｓｅは、ｈｐＨＡｓｅと同様な態様で洗剤濃厚トリトンＸ−１１４相に分配される。これは、尿ｈｐＨＡｓｅがｈｐＨＡｓｅの脂質修飾と同様な脂質修飾を含むことを示唆している。尿ｈｐＨＡｓｅの等電点は、モノ−Ｐf.p.l.cでのクロマトフォーカシングで溶出させて決定したとき6.5である。ヒト尿ｈｐＨＡｓｅは抗天然ｈｐＨＡｓｅ抗体１７Ｅ９で免疫沈澱した。
ゲルザイモグラフィーでは粗血漿および尿サンプルで２本のＨＡｓｅ活性のバンドが示された。血漿では、ＨＡｓｅ活性は57ｋＤａおよび46〜47ｋＤａに相当する２本のバンドとして検出された。57ｋＤａバンドが主要な種であった。尿では、ＨＡｓｅ活性はまた57ｋＤａおよび46〜47ｋＤａに相当する本のバンドとして検出された。しかしながら、いずれの種も優勢ではなかった（すなわちバンドは尿サンプルでは等しい濃さで出現した）。これらのデータから、ｈｐＨＡｓｅおよび尿ｈｐＨＡｓｅがそれぞれ血漿および尿に２つの異なる修飾形で存在するか、または尿および血漿に存在する２つの異なる酸活性ＨＡｓｅがあるということを示唆している。
実施例14：転移由来癌におけるｈｐＨＡｓｅの発現
上記実施例５で述べた免疫沈澱アッセイを用いて１７Ｅ９免疫反応性ｈｐＨＡｓｅ活性レベルの性状を調べることによって、ヒト血漿ヒアルロニダーゼの産生についていくつかの癌腫系（SCC 10A,SCC 10B,HSC-3,NIC H740,およびDMS 153）を調査した。ｈｐＨＡｓｅレベルを条件付け培養液および細胞層自体の両方で調べた。ヒトの正常な包皮のケラチノサイトを陽性コントロールとして用いた。SCC 10A細胞株は原発性喉頭癌腫瘍に由来し、SCC 10B細胞株は同じ患者のリンパ節転移に由来する。HSC-3細胞株はリンパ節転移由来であり、NIC H740細胞株はｈｐＨＡｓｅをコードする染色体3p21.3の領域のホモ接合型欠損を含む小型細胞肺癌である。ＤＭＳ１５３細胞株は古典的小型肺細胞癌株（小型肺細胞癌変種細胞株とは異なる）である。
図９に示すように、SCC 10A細胞株は、正常なｈｐＨＡｓｅケラチノサイトのｈｐＨＡｓｅ活性レベルに匹敵する活性レベルを産生するが、同じ患者のリンパ節転移（SCC 10B）の活性レベルは細胞層でも条件付け培養液でも完全に存在しない。HSC-3由来細胞株は検出可能なｈｐＨＡｓｅ活性を示さなかった（用いたｈｐＨＡｓｅ活性アッセイは正常なケラチノサイトで見出された活性の少なくと１／100を正確に検出することができる）。小型細胞肺癌株は、NIC H740もDMS 153も検出可能な活性を示さなかった。NIC H740およびDMS 153細胞はまた検出可能なｈｐＨＡｓｅコード転写物を一切産生しなかった（結果は示さず）。これらのデータから、ｈｐＨＡｓｅの消失が腫瘍発生と強力に関係していることが示唆される。本発明者らは、機能的な血漿ヒアルロニダーゼ遺伝子産物を生成する転移性癌を全く同定できなかった。原発性癌由来のいくつかの非転移性株は機能的な活性を有する。このことから酵素機能の完全な消失は腫瘍転移に付随していることが示唆される。
実施例14：収量が改善された組換えｈｐＨＡｓｅ発現系
培養上清に高収量のｈｐＨＡｓｅを産生する組換えｈｐＨＡｓｅ発現系を開発した。ｈｐＨＡｓｅをコードするＤＮＡを、ＣＭＶプロモータ駆動PCR3.1Uniベクター（Invitrogen）に機能可能に挿入した。続いてこのｈｐＨＡｓｅをコードする構築物を用いて当技術分野で周知の方法にしたがってＨＥＫ細胞を形質転換した。その後、37℃、５％ＣＯ2でＤＭＥ Ｈ２１（4.5ｇ／ｌグルコース）、10％ＦＢＳ培養液中でＨＥＫ細胞をＴ２25ｃｍ2フラスコで増殖させた。条件付け培養液を細胞から採集しｈｐＨＡｓｅレベルを調べた。
未加工血漿に匹敵する収量をもつ組換え血漿生成物を製造するにはしばしば固有の困難が存在するが、ここで述べる本組換えｈｐＨＡｓｅ発現系は、未加工ｈｐＨＡｓｅ血漿のコーン（Cohn）分画Ｉ相（当技術分野で周知の冷アルコール沈澱によって調製）に存在するヒアルロニダーゼの量の30倍を産生する（表１）。比較として、Ｃｏｓ−７細胞の一過性ｈｐＨＡｓｅ発現ではＨＥＫ細胞で達成されるレベルの約10％が発現された。理論に支持されないが、アデノウイルスで形質転換されるホ乳類細胞が好ましい。
0004503708.tif 000005
ホ乳類発現系由来の組換えｈｐＨＡｓｅは、いくつかの基準を用いて調べたとき生化学的に精製された酵素と区別できない。免疫親和性精製組換えｈｐＨＡｓｅは生化学的に精製したｈｐＨＡｓｅと同じ分子量で移動する。免疫親和性精製組換えｈｐＨＡｓｅのアミノ酸配列は、天然の血漿酵素と同じように加工されたＮ末端を有する（FRGPLLVP）（配列番号：９）。さらに、Ｎ末端の配列決定によって、組換えｈｐＨＡｓｅは我々の発現系で適切に処理されることが示唆された。組換えｈｐＨＡｓｅは、ゲルザイモグラフィーで調べたとき生化学的に精製したｈｐＨＡｓｅと同等の比活性を有する。組換えｈｐＨＡｓｅ、生化学的精製ｈｐＨＡｓｅおよび“最純性”市販精巣ヒアルロニダーゼ調製物の10Ｕサンプルは、高分子量ＨＡ100μｇを10分間で解重合させることができる。さらに、組換えｈｐＨＡｓｅは生化学的に精製したｈｐＨＡｓｅと同じ洗剤相分配特性を示す。これは、本発現系が組換えｈｐＨＡｓｅの正確な翻訳後処理を促進することを示唆している。
実施例15：動物モデルにおけるｈｐＨＡｓｅの腫瘍成長抑制活性
組換えｈｐＨＡｓｅの腫瘍増殖抑制能力をHSC-3頭部頸部有棘細胞癌モデル（正所性腫瘍異種移植（本来の器官／組織への移植腫瘍））で調べた。簡単に記せば、Ｎｕ／Ｎｕマウスの口腔床にマトリゲル（Matrigel）中の５×106個のＨＳＣ−３ヒト有棘細胞癌細胞を正所性移植した。この細胞を７日間成長させた。その後、動物をランダムに２つのグループに分けた。
１７Ｅ９ ＩｇＧ２ａ抗体をＮＨＳセファロースに結合させた免疫親和性カラムを用いて、ＣＭＶプロモーターの下、ｈｙａｌ−１を過発現しているＨＥＫの条件付け培養液から組換えｈｐＨＡｓｅを調製した。溶出ｈｐＨＡｓｅをウシＨＤＬ複合体（Sigma）中に置換し、バイオビーズ（Biobeads）に対して透析した。ｈｐＨＡｓｅを含まないＨＤＬ複合体担体を陰性コントロールとして用いた。この物質を容量100μｌでマウスの腫瘍周囲（原発性性腫瘍部位から約10ｍｍ）に注射した。１回の注射につき約400rTRUのｈｐＨＡｓｅを投与した。注射を48時間毎に繰り返した。球形モデルを用いて腫瘍容積を３寸法で測定した。図10に示すように、ｈｐＨＡｓｅの投与は腫瘍容積を顕著に減少させた。
実施例16：動物モデルにおけるｈｐＨＡｓｅをコードするＤＮＡの発現による腫瘍成長抑制
腫瘍細胞におけるｈｐＨＡｓｅ発現の腫瘍成長に対する影響を、機能的なｈｐＨＡｓｅ遺伝子を癌株に導入することによって調べた。ここでｈｐＨＡｓｅをコードする配列は、誘発性プロモーターの制御下にある。適切なステロイド応答性プラスミドを含むホ乳類細胞のみが刺激ホルモン（ムリステロン）の注射に応答するので、ステロイド応答性発現プラスミド、エクジソン（ecdysone）をこの実験のために選んだ。したがって、この系により、腫瘍細胞内でｈｐＨＡｓｅをコードする遺伝子の特異的再活性化効果の調査およびインビボ効果の評価が可能となる。
HSC-3口腔有棘細胞癌細胞に、Ｔ７５フラスコあたりリポフェクチン（Gibco）60μｌ、９μｇプラスミドをトランスフェクトした。このプラスミドは、エクジソンレセプタープラスミドを含むムリステロン誘発性遺伝子構築物であって、ｈｐＨＡｓｅ（誘発性ステロイドの制御下）並びにＧ４１８Ｓおよびゼオシン（zeocin）耐性をコードするムリステロン誘発性遺伝子構築物（エクジソン系、Invitogen）を有する。ｈｐＨＡｓｅをコードするＤＮＡを含まないムリステロン誘発性構築物で形質転換した細胞をコントロールとして用いた。形質転換細胞を５×106細胞／注射でｎｕ／ｎｕマウスの口腔床に実施例15で述べたように注射した。７日間腫瘍を成長させた後、マウスの腹腔にムリステロン（５ｍｇ）を72時間毎に注射して構築物の発現を誘発した。腫瘍容積は上記実施例15で述べたように測定した。さらに、悪液質に陥る時間（動物の体重が出発重量より15％減少することにより規定）を測定した。生存％よりむしろ悪液質％を用いてカプラン・メイヤー（Kaplan Meyer）分析によって生存曲線を作成した。
図11に示すように、ｈｐＨＡｓｅをコードする構築物で形質転換したHSC-3細胞を有するマウスは、コントロールマウスと比較して腫瘍成長が著しく減少した。さらに、ｈｐＨＡｓｅ発現腫瘍細胞をもつ殆どのマウスは、39日間にわたって悪液質を進行させなかった。
本発明をこれまで十分に説明してきたが、多くの変更および修飾が添付の請求の範囲を逸れることなく実施しえることは当業者には明白であろう。
配列表
（１）一般情報：
（ｉ）出願人：ザ・リージェント・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・カリフォルニア
（ｉｉ）発明の名称：ヒト血漿ヒアルロニダーゼ
（ｉｉｉ）配列の総数：10
（ｉｖ）郵便物の宛先：
（Ａ）名宛人：Robbins,Berliner & Carson,LLP
（Ｂ）街：201 N.Figueroa Street,5loor
（Ｃ）市：ロサンゼルス
（Ｄ）州：カリフォルニア
（Ｅ）国：アメリカ合衆国
（Ｆ）ＺＩＰ：90012-2628
（ｖ）コンピューター解読形式：
（Ａ）媒体型：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭＰＣコンパチブル
（Ｃ）作動システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフト：PatentIn Release #1.0,バージョン#1.25
（ｖｉ）現在の出願状況：
（Ａ）出願番号：
（Ｂ）出願日：
（Ｃ）分類：
（ｖｉｉｉ）代理人情報：
（Ａ）氏名：Robert Berliner
（Ｂ）登録番号：20121
（Ｃ）リファレンス／ドケット番号：5555-458C1-XPC
（ｉｘ）通信に関する情報：
（Ａ）電話：213-977-1001
（Ｂ）ファックス：213-977-1003
（２）配列番号１の情報：
（ｉ）配列の性状：
（Ａ）長さ：４３５アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子の型：タンパク質
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：１
0004503708.tif 000006
0004503708.tif 000007
（２）配列番号２の情報：
（ｉ）配列の性状：
（Ａ）長さ：２１アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子の型：ペプチド
（ｘｉ）配列の記載：配列番号２
0004503708.tif 000008
（２）配列番号３の情報：
（ｉ）配列の性状：
（Ａ）長さ：４３５アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子の型：タンパク質
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：３
0004503708.tif 000009
0004503708.tif 000010
（２）配列番号４の情報：
（ｉ）配列の性状：
（Ａ）長さ：２５１７塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：４
0004503708.tif 000011
0004503708.tif 000012
（２）配列番号５の情報：
（ｉ）配列の性状：
（Ａ）長さ：２０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：５
0004503708.tif 000013
（２）配列番号６の情報：
（ｉ）配列の性状：
（Ａ）長さ：２１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：６
0004503708.tif 000014
（２）配列番号７の情報：
（ｉ）配列の性状：
（Ａ）長さ：１８塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：７
0004503708.tif 000015
（２）配列番号８の情報：
（ｉ）配列の性状：
（Ａ）長さ：２０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：８
0004503708.tif 000016
（２）配列番号９の情報：
（ｉ）配列の性状：
（Ａ）長さ：８アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子の型：ペプチド
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：９
0004503708.tif 000017
（２）配列番号１０の情報：
（ｉ）配列の性状：
（Ａ）長さ：４アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｉｉ）分子の型：ペプチド
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：１０
0004503708.tif 000018
（２）配列番号１１の情報：
（ｉ）配列の性状：
（Ａ）長さ：５０９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：１１
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0004503708.tif 000021
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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