(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビスフェノールＡを単一炭素源として資化することのでき、かつ貧栄養条件下でビスフェノールＡを分解することができる細菌であって、Sphingobium sp. ＳＯ−１株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８６０６）、Sphingobium yanoikuyae ＳＯ−４株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８６０９）および Novosphingobium subarcticum ＳＯ−１１株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８６１３）から選ばれる細菌。
【請求項２】
請求項１の細菌を、ビスフェノールＡを含む培養液に作用させることを特徴とするビスフェノールＡの分解方法。
【請求項３】
ビスフェノールＡを含有する土壌、水質またはその他の廃棄物中のビスフェノールＡの分解方法であって、該土壌、水質またはその他の廃棄物に、請求項１の細菌を含む培養物または菌体を付着させた保持担体を含む培養液を添加する請求項２の分解方法。
【請求項４】
培養物が生菌体の培養物である請求項３の分解方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ビスフェノールＡなどの芳香族化合物を貧栄養条件下においても効率よく分解することのできる微生物および該微生物を用いた土壌や水質中のビスフェノールＡなどの芳香族化合物の分解方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、プラスチック等の樹脂製品の工業的利用の増加にともない、次世代に及ぼす催奇形性等の深刻な影響が懸念されるビスフェノールＡ等の環境ホルモン様作用を持つ物質の環境への流出による水質汚染が問題となっている。例えばビスフェノールＡはプラスチック製品や飲料缶などから溶出するとされている。ビスフェノールＡがプラスティック容器から熱湯により溶出するということで学校給食のポリカーボネート製食器が一掃された。
室内実験によるビスフェノールＡの環境ホルモン様作用に関する報告では、ビスフェノールＡを2 または 20 μg/kg/dayの摂取量で妊娠マウスに経口投与したところ、生まれてきたオスの前立腺重量は対照群より重かったとの報告がある (Nagel et al., Environ Health Perspect, 105, 70-6, 1997)。また、ビスフェノールＡを2.4 μg/kg/dayの摂取量で妊娠マウスに経口投与したところ、生まれてきたマウスの思春期が早まったとの報告もある (Howdeshell et al., Nature, 401, 763-4, 1999)。
また、環境中のビスフェノールＡ濃度についての報告は、国土交通省（旧建設省）の河川調査において256地点のうち147地点で環境ホルモンが検出され、日本の河川が広範囲に汚染されていることが明らかになっている。そのうち河川中のビスフェノールＡの最高濃度は1.4μg/lであったという(1998.10.26毎日新聞)。同省では今後環境ホルモンを減少させる処理施設の建設を検討するとしている(1999.06.23毎日新聞)。また、廃棄物の採取処分場の中に滲みだしてくる水の中に、最高17.2mg/lという高濃度のビスフェノールＡが含まれ、処分場の廃プラスチック製品の一部からこれらの物質が溶けだしている(1998.5.31神戸新聞)。
このような広く水系や土壌中に拡散した汚染物質の除去には微生物による分解が最も実用的可能性が高いと考えられているが、いまのところフィールドレベルでの汚染除去技術は確立されていない。
公知のビスフェノールＡ分解菌としては、未同定のMV1株(Applied and Environmental Microbiology, 58: 1823-1831, 1992)と Pseudomonus paucimobilis FJ-4 株(後に、Sphingomonas paucimobilis と変更)(Japanese Journal of Water Treatment Biology, 31 203-212, 1995)の2株のみ知られている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
MV1株は好気条件でビスフェノールＡを分解すると、4−ヒドロキシアセトフェノンが蓄積し、これが1.5mM以上になると増殖できなくなる欠点があった。また、分解副生成物として難分解性の4-ヒドロキシ-3-メチルアセトフェノンや4-ヒドロキシ-3-メチル安息香酸、さらに 2、2−ビス(4-ヒドロキシ-3-メチルフェニル)−1−プロパノールが生成して培地中に蓄積する(Applied and Environmental Microbiology、 58: 1823-1831, 1992)。一方、FJ4株は、飽和濃度のビスフェノールＡ(約1.5mM)は分解できず、初期濃度として最大で1mM のビスフェノールＡを培養液中で分解する程度であった。また、本発明者らが先に特願2000-190560にて特許出願した、Sphingomonas sp. AO-1 株(FERM P-17794)は、迅速にビスフェノールＡを分解するが、分解培地中にグルコースなどの基質を加えないと貧栄養条件では十分な分解を示さない欠点があった。実際に、処理する廃液等には栄養塩類が含まれていないことが多いので、貧栄養条件で十分な分解を示す菌株の取得が望まれていた。
従って、本発明は、ビスフェノールＡなどの芳香族化合物を、従来から知られている微生物よりも効率よく分解することができる新規微生物および該微生物を使用したビスフェノールＡなどの芳香族化合物の分解方法を提供するものである。
【０００４】
【発明が解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく種々検討した結果、従来知られている微生物よりも非常に高いビスフェノールＡなどの芳香族化合物の分解能を有し貧栄養条件下においても効率よく分解することのできる新規な微生物を単離することに成功し、本発明を完成させた。
従って本発明は、Sphingobium 属、Pseudomonas 属または Novosphingobium 属に属し、かつ芳香族化合物を単一炭素源として資化することのできる細菌である。
更に本発明は、該細菌を芳香族化合物に作用させることを特徴とする芳香族化合物の分解方法である。
【０００５】
【発明の実施の形態】
本発明のSphingobium 属、Pseudomonas 属または Novosphingobium 属に属し、かつ芳香族化合物を単一炭素源として資化することのできる細菌は、更には次の性質：
形態            ：桿菌
グラム染色性    ：−
胞子            ：−
運動性          ：＋
酸素に対する態度：好気性
を有する。また、麦芽エキス・酵母エキス・ペプトン培地（組成1000ml当たり、麦芽エキス3g、酵母エキス3g、ポリペプトン5g、ぶどう糖10g：pH6.8）で室温で培養できる。更には、Sphingobium 属に属する細菌は、16S rRNA 遺伝子として例えば配列表の配列番号1、4、5、6または9に示す塩基配列を有する遺伝子を持ち、Pseudomonas 属に属する細菌は、16S rRNA 遺伝子として例えば配列表の配列番号2または3に示す塩基配列を有する遺伝子を持ち、Novosphingobium 属に属する細菌は、16S rRNA 遺伝子として例えば配列表の配列番号7または8に示す塩基配列を有する遺伝子を持つ。これらの16S rRNA 遺伝子の塩基配列に基づいてこれらの細菌の種名を相同検索（新しい分類学に判走する細菌同定法、日本細菌学会教育委員会編、平成2年6月1日発行；International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (2001), 51, 1405-1417)により調べた結果は以下の通りである。
配列番号１または９の塩基配列を持つ細菌：Sphingobium sp.
配列番号２または３の塩基配列を持つ細菌：Pseudomonas stutzeri
配列番号４または５の塩基配列を持つ細菌：Sphingobium yanoikuyae
配列番号６の塩基配列を持つ細菌：Sphingobium herbicidovorans
配列番号７または８の塩基配列を持つ細菌：Novosphingobium subarcticum
【０００６】
本発明の細菌は以下のような集積培養法を用いて分離することができる。例えば、土壌、活性汚泥等の分離源をビスフェノールＡを単一炭素源として20μg/ml含有する培地中で培養し、増殖してきた培養液を更にビスフェノールＡを40, 60, 100, 300μg/ml含有する培地と段階的に高い濃度の培地中にて培養する。その後、ビスフェノールＡを単一炭素源として300μg/ml含有する寒天培地にて、分解能を有する微生物を選択する。上記のようにして、実際にビスフェノールＡを単一炭素源として資化することができるビスフェノールＡの有効な分解菌が９株得られた。これらの細菌は、上記した16S rRNA 遺伝子の塩基配列に基づく相同検索によりそれらの属名および種名が以下の通り決定された。それらの９株はそれぞれ、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに平成13年11月20日付けで寄託されて、以下に示す受託番号が付されている。
Sphingobium sp. SO-1株  （ＦＥＲＭ  Ｐ−18606）
Pseudomonas stutzeri SO-2株  （ＦＥＲＭ  Ｐ−18607）
Pseudomonas stutzeri SO-3株  （ＦＥＲＭ  Ｐ−18608）
Sphingobium yanoikuyae SO-4株  （ＦＥＲＭ  Ｐ−18609）
Sphingobium yanoikuyae SO-5株  （ＦＥＲＭ  Ｐ−18610）
Sphingobium herbicidovorans SO-9株  （ＦＥＲＭ  Ｐ−18611）
Novosphingobium subarcticum SO-10株  （ＦＥＲＭ  Ｐ−18612）
Novosphingobium subarcticum SO-11株  （ＦＥＲＭ  Ｐ−18613）
Sphingobium sp. P1-2株  （ＦＥＲＭ  Ｐ−18614）
【０００７】
本発明の細菌は、ビスフェノールＡなどの芳香族化合物を単一炭素源として資化することができ、ビスフェノールＡなどの芳香族化合物を貧栄養条件下で分解することができる。本発明で対象とする芳香族化合物としては、ビスフェノールＡ、ビスフェノールＢなどのビスフェノール系化合物；トランス−スチルベン、スチルベン染料（クリソフェニレンＧなど）などのスチルベン骨格を有する化合物；フェノール、ニトロフェノール、ノニルフェノール、オクチルフェノールなどのフェノール系化合物；ヒドロキシ安息香酸、ヒドロキシアセトフェノンなどの安息香酸系化合物；カテコール、フタル酸ジメチル、フタル酸ジブチルなどのフタル酸エステル；ナフタレン、アントラセンなどのピレン系化合物などが挙げられる。なかでも、ビスフェノール系化合物、スチルベン骨格を有する化合物、フェノール系化合物、安息香酸系化合物が好適であり、特にビスフェノール系化合物、スチルベン骨格を有する化合物が適している。
【０００８】
本発明では、本発明の細菌をビスフェノールＡなどの芳香族化合物に作用させることにより、該化合物を分解させることができる。具体的には、該化合物を含有する土壌、水質またはその他の廃棄物中の芳香族化合物を分解することができ、該土壌、水質またはその他の廃棄物に、本発明の細菌の培養物また菌体を付着させた保持担体を添加することにより行われる。細菌の培養物としては、本発明の細菌を培養して得られる培養液それ自体または培養液から分離した培養菌体、あるいは培養液それ自体または分離された培養菌体を死滅させたもの、等が用いられる。培養液から培養菌体を製造する方法は、通常の遠心分離等により菌体を分離し、凍結菌体もしくは乾燥菌体にすることもできる。この場合、菌体を乾燥するためには、例えば凍結乾燥、噴霧乾燥等を用いることができる。また、環境への影響を抑える場合は、滅菌処理した培養物を用いることができる。滅菌処理方法としては、濾過滅菌、紫外線照射、エチレンオキサイド処理、放射線照射等がある。保持担体としては木炭等の多孔質担体が好ましい。
本発明の細菌の培養物を添加する場合、処理対象物に対して104〜1010個／ｇの生菌体またはそれに相当する培養濾液を添加するのが好ましい。本発明の細菌を土壌等の固体又は水質に含有されるビスフェノールＡやスチルベン骨格を持つ芳香族化合物に作用させる方法としては、処理対象物に本発明の培養物を添加・混合すればよい。
本発明の細菌を培養するには、該細菌が増殖することができる任意の培地を用いることができる。培地は炭素源として、例えばグルコース、シュクロース等を含有し、有機窒素源として酵母エキスペプトン、肉エキス等または無機窒素源としてアンモニウム塩、硝酸塩等を含有する。さらに、カリウムイオン、ナトリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン等の陽イオンおよび塩素イオン、硫酸イオン、リン酸イオン等の陰イオンとから成る無機塩類を含有することができる。炭素源の濃度は、その種類により異なるが0.1〜1％程度であり、窒素源の濃度はその種類により異なるが0.01〜1％程度である。また、無機塩類の濃度は、種類により異なるが0.001〜0.1％程度である。培養は好気的液体培養によるのが好ましく、好気的条件は通気、撹拌、通気と撹拌、振とう等の常用の手段による。唯一の炭素源としてビスフェノールＡやスチルベン骨格を持つ芳香族化合物を用いてもよい。培地中のビスフェノールＡやスチルベン骨格を持つ芳香族化合物の添加量は1ppm〜1000ppm程度が好ましい。
【０００９】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく具体的に説明するが本発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。
実施例１
ビスフェノールＡ分解株の単離と同定
本発明の微生物の単離は、以下の通り行った。全国の廃棄物処分場、不法廃棄物投棄場所、化学工場内の土壌および畑土、河川底泥より適当量のサンプルを採取し、以下の集積培養に供試した。BSM培地（1リットル中に1.0g K2HPO4、1.0g(NH4)2SO4、0.2gMgSO4 7H2O、0.01g FeCl3、0.05gNaCl、0.05g CaCl2)にビスフェノールＡを単一炭素源として20μg/ml添加した培地に、先の汚泥を１ｇ添加し、30℃で約7日間培養した。目視により微生物による培地の懸濁が認められた培養液を、40μg/ml, 60μg/ml, 100μg/mlのように段階的にビスフェノールＡ濃度を高くしたBSM培地中で培養した。最終的にビスフェノールＡを300μg/ml含有するBSM培地中で培養した。その後、ビスフェノールＡを単一炭素源として300μg/ml含有し、1.5%の寒天を加えたBSM平板寒天培地上に培養液を塗沫後、30℃で3-7日間培養し、出現したコロニーを単離した。これらのコロニーを同寒天培地上にて2、3回単離作業を繰り返し、MYPG等の栄養培地にて単一かどうかをチェックした後に、単一であった場合は、そのままビスフェノールＡを300μg/ml含有するBSM平板寒天培地にて継代培養を行った。単一でなかった場合は、栄養培地で単離した後、再び単一かどうかのチェックを行い、ビスフェノールＡを300μg/ml含有するBSM平板寒天培地にて継代培養を行った。
【００１０】
上記で単離した約100種類のコロニーそれぞれについて、ビスフェノールＡの分解活性を以下の方法で測定した。直径18cm の試験管に入れたビスフェノールＡ 300μg/mlを含むBSM培地7mlに、単離時の寒天培地からコロニーを白金耳にて釣菌して接種した。これを30℃で3〜7日間培養後、以下の方法で培地中のビスフェノールAの定量を行った。
高速液体クロマトグラフィーはWaters 社製 Alliance2690を用いた。カラムは関東化学(株)のMightysil RP18 GP150-4.6 (5μm)を用い、溶出液は70%アセトニトリル水溶液を用い、カラム槽温度は40℃にした。検出器は、フォトダイオードアレイを用い、217nmの吸光度で定量した。
その結果、単離したコロニー約100種類のうち、分解速度が速かった9菌株を選別した。これらの同定をするために、本発明の微生物について16S rRNA遺伝子の約400塩基の配列を決定した。決定された9菌株の塩基配列を配列表の配列番号１から９に示した。これらの配列から類推される属名及び種名を相同性検索により得、それぞれの菌を独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに平成１３年１１月２０日付けで寄託し受託番号が付された。それらの結果は以下の通りである。
配列番号１：Sphingobium sp. SO-1株（ＦＥＲＭ  Ｐ−18606）
配列番号２：Pseudomonas stutzeri SO-2株（ＦＥＲＭ  Ｐ−18607）
配列番号３：Pseudomonas stutzeri SO-3株（ＦＥＲＭ  Ｐ−18608）
配列番号４：Sphingobium yanoikuyae SO-4株（ＦＥＲＭ  Ｐ−18609）
配列番号５：Sphingobium yanoikuyae SO-5株（ＦＥＲＭ  Ｐ−18610）
配列番号６：Sphingobium herbicidovorans SO-9株（ＦＥＲＭ  Ｐ−18611）
配列番号７：Novosphingobium subarcticum SO-10株（ＦＥＲＭ  Ｐ−18612）
配列番号８：Novosphingobium subarcticum SO-11株（ＦＥＲＭ  Ｐ−18613）
配列番号９：Sphingobium sp. P1-2株（ＦＥＲＭ  Ｐ−18614）
【００１１】
実施例２
BSM培地中でのビスフェノールＡ分解菌の増殖とビスフェノールＡ分解活性  BSM培地（1リットル中に1.0g K2HPO4、1.0g(NH4)2SO4、0.2gMgSO4 7H2O、0.01g FeCl3、0.05gNaCl、0.05g CaCl2）に300μg/mlのビスフェノールＡを添加した培地（以後300μg/ml BPAM培地という）上で継代培養したビスフェノールＡ分解菌である実施例１で得た9菌株のそれぞれのコロニーを釣菌し、直径18mmの試験管中のMYPG培地7mlに植菌した。
これらを30℃・100rpmで17時間振とう培養した後、菌体を3000rpm・10分間の遠心分離で回収し、生理食塩水で2回洗浄後、生理食塩水に懸濁し、菌体懸濁液とした。この菌体懸濁液を 300 ml 三角フラスコ中のビスフェノールＡ 300 μg/ml BPAM培地 100mlに600nmの吸光度が0.05になるように混合した。30℃で200 時間以上にわたり振とう培養し、適宜1.5mlをサンプリングし、菌体量の目安として 600 nm の吸光度を測定した。また、培地中のビスフェノールAの定量を、菌体を高速遠心 ( 15000 rpm 5分)で除去したのち、高速液体クロマトグラフィー（Waters 社製 Alliance2690）を用いて、以下の条件で行った。カラムは、関東化学(株)のMightysil RP18 GP150-4.6 (5μm)、溶出液は70%アセトニトリル水溶液、カラム槽温度は40℃で行った。検出器は、フォトダイオードアレイを用い、217nmの吸光度を用いて定量した。
上記の高速液体クロマトグラフィーでの分析では、ビスフェノールＡが修飾を受けたもの全てが検出されるため、必ずしも水と二酸化炭素に完全に分解されていないものも検出される。そこで、ビスフェノールＡが完全に分解されたかどうかを調査するために、培養液中の全炭素量を全有機炭素量測定装置（平沼製作所製 TOC-2000)で測定した。
結果は図１〜図９に示したとおりである。また、これらの結果をまとめたのが、以下の表である。
【００１２】
【表１】
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【００１３】
図２、５および８から明らかな通り、本発明の菌株はビスフェノールＡを唯一の炭素源とするBPAM培地でビスフェノールＡを完全に分解することができる。また、表１に示されたとおり、最もビスフェノールＡの分解および培地中の全炭素量の減少が早いのが、SO-11株であった。最も分解速度の遅いSO-2株、3株でも256時間の培養でビスフェノールＡを完全に分解し培地中の全炭素量も減少していることが明らかになった。
【００１４】
【発明の効果】
以上に詳述したように、本発明により、ビスフェノールＡなどの芳香族化合物を単一炭素源として資化することができ貧栄養条件下においても効率よく分解することのできる微生物が得られた。該微生物は土壌や水質中のビスフェノールＡなどの芳香族化合物を分解するのに用いることができ、ビスフェノールＡなどの環境汚染物質の除去等に極めて有効である。
【００１５】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、Sphingobium sp. SO-1株、Pseudomonas stutzeri SO-2株、Pseudomonas stutzeri SO-3株、Sphingobium yanoikuyae SO-4株およびSphingobium sp.P1-2株の培養培地の600nm吸光度の経時変化を示す。
【図２】図２は、Sphingobium sp. SO-1株、Pseudomonas stutzeri SO-2株、Pseudomonas stutzeri SO-3株、Sphingobium yanoikuyae SO-4株およびSphingobium sp.P1-2株の培養培地中のビスフェノールＡの残存量の経時変化を示す。
【図３】図３は、Sphingobium sp. SO-1株、Pseudomonas stutzeri SO-2株、Pseudomonas stutzeri SO-3株、Sphingobium yanoikuyae SO-4株およびSphingobium sp P1-2株の培養培地中の全炭素量の残存量の経時変化を示す。
【図４】図４は、Sphingobium herbicidovorans SO-9株、Novosphingobium subarcticum SO-10株およびNovosphingobium subarcticum SO-11株の培養培地の600nm吸光度の経時変化を示す。
【図５】図５は、Sphingobium herbicidovorans SO-9株、Novosphingobium subarcticum SO-10株およびNovosphingobium subarcticum SO-11株の培養培地中のビスフェノールＡの残存量の経時変化を示す。
【図６】図６は、Sphingobium herbicidovorans SO-9株、Novosphingobium subarcticum SO-10株およびNovosphingobium subarcticum SO-11株の培養培地中の全炭素量の残存量の経時変化を示す。
【図７】図７は、Sphingobium yanoikuyae SO-5株の培養培地の600nm吸光度の経時変化を示す。
【図８】図８は、Sphingobium yanoikuyae SO-5株の培養培地中のビスフェノールＡの残存量の経時変化を示す。
【図９】図９は、Sphingobium yanoikuyae SO-5株の培養培地中の全炭素量の残存量の経時変化を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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