(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的細胞中にインターナライズされるポリペプチドを選択する方法であって、該方法は以下の工程：
ｉ）１以上の該標的細胞を、１以上のポリペプチドを提示するファージディスプレイライブラリーの１以上のメンバーと接触させる工程；
ｉｉ）前記ファージディスプレイライブラリーのうちインターナライズされるライブラリーのメンバーが、インターナライズされないライブラリーのメンバーに比べて少なくとも３０倍富化される条件下で前記１以上の標的細胞を培養し、前記インターナライズされるライブラリーのメンバーを富化させる工程であって、前記少なくとも３０倍の富化が工程ｉ）及びｉｉ）の１回の繰り返しで達成される前記工程；および
ｉｉｉ）前記ファージディスプレイライブラリーのインターナライズされるライブラリーのメンバーを同定することで、前記標的細胞にインターナライズされるポリペプチドを選択する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記ファージディスプレイライブラリーが抗体ファージディスプレイライブラリーである、方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、前記抗体ファージディスプレイライブラリーが単鎖抗体Ｆｖ領域を提示する、方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、前記同定する工程が、以下：
インターナライズされたファージを回収する工程、および
前記（ｉ）から（ｉｉｉ）までの工程を反復して、インターナライズする結合部分についてさらに選択する工程、
を包含する、
方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、前記回収する工程が、以下：
（ａ）前記標的細胞を溶解して前記インターナライズされたファージを放出させる工程；および
（ｂ）細菌宿主に、該インターナライズされたファージを感染させて、選択の次の回のためのファージを産生する工程、
を包含する、方法。
【請求項６】
請求項４に記載の方法であって、前記回収する工程が、前記ファージディスプレイされる抗体をコードする核酸を回収する工程を包含する、方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって、前記同定する工程が、レポーター遺伝子または選択マーカーの発現を検出する工程を包含する、方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、前記ファージディスプレイライブラリーのメンバーをサブトラクティブ細胞株の細胞と接触させる工程を更に包含する、方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法であって、前記標的細胞が、該方法における接着層を形成する、方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法であって、該標的細胞を、該ファージディスプレイライブラリーのメンバーが、インターナライズするマーカーに結合したときにインターナライズされ得る条件下で培養する工程を更に包含し、前記工程（ｉ）が、前記培養する工程よりも低い温度で行われる、方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、前記工程（ｉ）が、約４℃で行われ、そして前記培養する工程が約３７℃で行われる、方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法であって、前記ファージが、選択マーカーを発現する、方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって、前記選択マーカーが蛍光タンパク質、抗生物質耐性遺伝子および色素形成遺伝子からなる群より選択される、方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法であって、前記色素形成遺伝子が、西洋ワサビペルオキシダーゼ、βラクタマーゼ、ルシフェラーゼおよびβガラクトシダーゼからなる群より選択される、方法。
【請求項１５】
請求項１に記載の方法であって、前記標的細胞が、固形腫瘍細胞、ｃＤＮＡ発現ライブラリーのメンバー、サイトカインレセプターを過剰発現する細胞、増殖因子レセプターを過剰発現する細胞、転移性細胞、形質転換された細胞株の細胞、特定の表面標的レセプターをコードする遺伝子またはｃＤＮＡを用いて形質転換された細胞、および固形腫瘍の外側に由来する新生物細胞からなる群より選択される、方法。
【請求項１６】
請求項８に記載の方法であって、前記サブトラクティブ細胞株の細胞が、前記標的細胞と同じ組織型から選択される、方法。
【請求項１７】
請求項８に記載の方法であって、前記サブトラクティブ細胞株の細胞が、線維芽細胞、単球、幹細胞およびリンパ球からなる群より選択される、方法。
【請求項１８】
標的細胞にインターナライズされるポリペプチドを選択する方法であって、該方法は以下の工程：
ｉ）１以上の標的細胞を、１以上のポリペプチドを提示するファージディスプレイライブラリーの１以上のメンバーと接触させる工程；
ｉｉ）インターナライズするマーカーに結合した該ファージディスプレイライブラリーのメンバーが、インターナライズされる条件下で、該１以上の標的細胞を培養する工程；
ｉｉｉ）細胞外マトリクス中に捕獲されたファージを取り除くことにより、前記ファージディスプレイライブラリーのうちインターナライズされないメンバーを除去する工程；及び
ｉｖ）１以上の該標的細胞にインターナライズされる該ファージディスプレイライブラリーのメンバーを同定する工程であって、前記ファージディスプレイライブラリーのうちインターナライズされるライブラリーメンバーは各々、標的細胞にインターナライズされるポリペプチドを提示する、前記同定する工程；
を包含する、方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法であって、さらに、前記メンバーが結合する前記同一の標的細胞または異なる標的細胞の成分を単離する工程を包含する、方法。
【請求項２０】
請求項１８に記載の方法であって、前記ファージディスプレイライブラリーが、抗体ファージディスプレイライブラリーである、方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法であって、前記抗体ファージディスプレイライブラリーが、単鎖抗体Ｆｖ領域を提示する、方法。
【請求項２２】
請求項１８に記載の方法であって、前記同定する工程が、インターナライズされるファージを回収する工程、および前記工程（ｉ）から（ｉｖ）を反復して、インターナライズする結合部分についてさらに選択する工程、を包含する、方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の方法であって、前記回収する工程が、以下：（ａ）前記標的細胞を溶解してインターナライズされたファージを放出させる工程；および（ｂ）細菌宿主に該インターナライズされたファージを感染させて、選択の次の回のためのファージを産生させる工程、を包含する、方法。
【請求項２４】
請求項１８に記載の方法であって、前記ファージディスプレイライブラリーのメンバーをサブトラクティブ細胞株の細胞と接触させる工程を更に包含する、方法。
【請求項２５】
請求項１８に記載の方法であって、前記標的細胞が、該方法における接着層を形成する、方法。
【請求項２６】
請求項１８に記載の方法であって、該標的細胞を、該ファージディスプレイライブラリーのメンバーが、インターナライズするマーカーに結合したときにインターナライズされ得る条件下で培養する工程を更に包含し、前記工程（ｉ）が、前記培養する工程よりも低い温度で行われる、方法。
【請求項２７】
請求項２６に記載の方法であって、前記工程（ｉ）が、約４℃で行われ、そして前記培養する工程が約３７℃で行われる、方法。
【請求項２８】
請求項２６に記載の方法であって、前記サブトラクティブ細胞株の細胞が、前記標的細胞と同じ組織型から選択される、方法。
【請求項２９】
請求項１８に記載の方法であって、前記標的細胞が、固形腫瘍細胞、ｃＤＮＡ発現ライブラリーのメンバー、サイトカインレセプターを過剰発現する細胞、増殖因子レセプターを過剰発現する細胞、転移性細胞、形質転換された細胞株の細胞、および固形腫瘍の外側に由来する新生物細胞からなる群より選択される、方法。
【請求項３０】
請求項１に記載の方法であって、前記標的細胞を培養し、インターナライズされるライブラリーのメンバーを富化させる工程が、前記標的細胞を低ｐＨ洗浄液と接触させる工程を包含する、方法。
【請求項３１】
請求項８に記載の方法であって、前記標的細胞を培養し、インターナライズされるライブラリーのメンバーを富化させる工程が、前記標的細胞を低ｐＨ洗浄液と接触させる工程を包含する、方法。
【請求項３２】
請求項１に記載の方法であって、前記標的細胞を培養し、インターナライズされるライブラリーのメンバーを富化させる工程が、前記標的細胞をトリプシン処理する工程を包含する、方法。
【請求項３３】
請求項８に記載の方法であって、前記標的細胞を培養し、インターナライズされるライブラリーのメンバーを富化させる工程が、前記標的細胞をトリプシン処理する工程を包含する、方法。
【請求項３４】
請求項１３に記載の方法であって、前記標的細胞が、標的レセプターをコードし発現させる核酸により形質転換された細胞であり、前記サブトラクティブ細胞株が形質転換されていない細胞株である、方法。
【請求項３５】
請求項１８に記載の方法であって、前記標的細胞が、標的レセプターをコードし発現させる核酸により形質転換された細胞であり、前記サブトラクティブ細胞株が形質転換されていない細胞株である、方法。
【請求項３６】
請求項１８に記載の方法であって、細胞外マトリクス中に捕獲されたファージを取り除く工程が、前記１以上の標的細胞を、５０ｍＭ グリシン ｐＨ２．８、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２Ｍ 尿素、２％ ポリビニルピロリドンを含んだストリッピング緩衝液を用いて洗浄する工程を包含する、方法。
【請求項３７】
請求項１８に記載の方法であって、細胞外マトリクス中に捕獲されたファージを取り除く工程が、前記１以上の標的細胞をトリプシン処理する工程を包含する、方法。
【請求項３８】
請求項２３に記載の方法であって、前記ファージディスプレイライブラリーが抗体ファージディスプレイライブラリーである、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく仮出願米国特許仮出願番号６０／０８２，９５３（１９９８年４月２４日出願）（これは、本明細書において参考としてその全体がその全ての目的について援用される）に対する利益を主張する。
【０００２】
（連邦政府が支援した研究および開発の下でなされた発明に対する権利についての陳述）
本研究は、部分的に、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｄｅｆｅｎｓｅ  Ｇｒａｎｔｓ  ＤＡＭＤ１７−９６−１−６２４４およびＤＡＭＤ１７−９４−４４３３によって支援された。米合衆国政府は、本発明においていくらかの権利を有し得る。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は、免疫診断および免疫治療の分野に関する。本発明は、インターナライズする抗体およびインターナライズするレセプターリガンドを同定する方法、ならびに結合したインターナライズされたレセプター結合を提供する。
【０００４】
（発明の背景）
増殖（成長）因子レセプターおよび他のシグナル伝達レセプターは、しばしば、ヒトのガンおよび他の疾患において過剰発現され、従って、標的化された治療の開発について利用されている。例えば、ＨＥＲ２／ｎｅｕ遺伝子は、ヒトアデノガン腫のいくつかの型（特に、乳房および卵巣の腫瘍）において増幅し（Ｓｌａｍｏｎら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：７０７−７１２）、これは、対応する増殖因子ＥｒｂＢ２の過剰発現をもたらす。ＥｒｂＢ２過剰発現細胞の標的化は、主に、異なる形式における抗ＥｒｂＢ２抗体を用いて達成されている。この形式としては、化学療法剤を含むリポソームとの結合体（Ｋｉｒｐｏｔｉｎら（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３６：６６−７５）、毒素遺伝子を送達するＤＮＡキャリアタンパク質との融合物（ＦｏｒｍｉｎａｙａおよびＷｅｌｓ（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１０５６０−１０５６８）、および毒素との直接融合物（Ａｌｔｅｎｓｃｈｍｉｄｔら（１９９７）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７３：１１７−１２４）が挙げられる。
【０００５】
これらの標的化されたアプローチの多くについて、エフェクター分子を細胞膜を横切って細胞質ゾルへと送達することが必要である。いくつかの場合において、これは、レセプター媒介性のエンドサイトーシスの利点を利用することによって容易にされ得る（ＵｌｌｒｉｃｈおよびＳｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ（１９９０）Ｃｅｌｌ  ６１：２０３−２１２）。レセプター媒介性のエンドサイトーシスは、しばしば、リガンドとの結合が、ホモ二量化またはヘテロ二量化を介するレセプター活性化を引き起こす場合に、二価リガンドについて直接的にか、または一価のリガンドについてレセプターにおけるコンホメーション変化を引き起こすことのいずれかによって起こる。抗体は、このプロセスを模倣し得、エンドサイトーシスを刺激し得、インターナライズされ得、そしてその負荷物を細胞質ゾルへと送達する。さらに、抗体がインターナリゼーションを媒介する効率は、その抗体の型（例えば、抗体全体、フラグメント、単鎖抗体、モノマー、ダイマーなど）に依存し、そして認識されるエピトープに依存して有意に異なる（Ｙａｒｄｅｎ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２５６９−２５７３；Ｈｕｒｗｉｔｚら（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：３３５３−３３５７）。従って、いくつかの適用（例えば、リポソーム標的化）について、特異的なエピトープに結合する抗体のみが迅速にインターナライズされ、そして機能的な標的化ビヒクルを生成する。
【０００６】
インターナライズする抗体はまた、認識されるエピトープに依存して、細胞増殖阻害または細胞増殖の増強を引き起こすことが示されている。従って、インターナリゼーションについての選択は、増殖阻害性または増殖刺激性（アゴニスト性）の抗体の単離をもたらすはずである。そのような阻害性抗体は、ガン処置として使用され得るか、または細胞の過剰増殖によって特徴付けられる他の状態の処置のため、および炎症の処置（抗炎症）のために使用され得る。アゴニスト性抗体は、関連する細胞（例えば、幹細胞）の増殖を刺激するために使用され得る。遺伝子送達のためにガン以外の細胞を標的化することはまた、多くの適用を有する。
【０００７】
現在、インターナリゼーションを媒介する抗体は、ハイブリドーマをスクリーニングすることによって同定される。しかし、ハイブリドーマが産生する抗体のスクリーニングは骨が折れ、時間がかかり、そして高価である。
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、部分的に、レセプター媒介性のエンドサイトーシス後に細胞内から感染性のファージ粒子を回収することによって大きな非免疫ファージライブラリーからインターナライズする抗体を直接選択することが可能であるとの発見に基づく。
【０００９】
従って、１つの実施態様において、本発明は、標的細胞中にインターナライズされるポリペプチドまたは抗体結合部分を選択する方法を提供する。この方法は、好ましくは、以下の工程を包含する：ｉ）１つ以上のこの標的細胞を、ファージディスプレイライブラリーの１以上のメンバーと接触させる工程；ｉｖ）この標的細胞を、このディスプレイライブラリーのメンバーが、インターナライズするマーカーに結合する場合にインターナライズされ得る条件下で培養する工程；およびｖ）このファージディスプレイライブラリーのメンバーが１以上の標的細胞中にインターナライズされる場合にこのファージディスプレイライブラリーのインターナライズされたメンバーを同定する工程。この方法はまた、必要に応じて、および好ましくは、さらに以下の工程を包含する：該ファージディスプレイライブラリーのメンバーを、サブトラクティブ細胞株の細胞と接触させる工程；および次いで該標的細胞を洗浄して、サブトラクティブ細胞株の該細胞を取り除き、そして該標的細胞に非特異的に結合するかまたは弱く結合している該ファージディスプレイライブラリーのメンバーを除去する工程。好ましい実施態様において、このファージディスプレイは、抗体ファージディスプレイライブラリーであり、より好ましくは、単鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂなど）を提示する抗体ファージディスプレイライブラリーである。
【００１０】
好ましい実施態様において、「同定する」工程は、インターナライズされたファージを回収すること、および上記プロセスの工程を再び反復して、インターナライズする結合部分についてさらに選択することを包含する。１つの実施態様において、「回収する」工程は、その標的細胞を溶解してインターナライズされたファージを放出させる工程；および細菌宿主にそのインターナライズされたファージを感染させて、選択の次の回のためのファージを産生する工程を包含する。この回収する工程は、感染性ファージを回収する工程、および／またはファージに提示された抗体をコードする核酸を回収する工程、および／または選択マーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子またはｃＤＮＡ）を発現するファージの選択を包含する。この同定する工程は、レポーター遺伝子の発現を検出する工程、特定の核酸の存在／非存在または量を検出する工程、または選択マーカーを介したファージの選択を包含し得る。好ましい方法において、サブトラクティブ細胞株の細胞は、その標的細胞よりも少なくとも２倍過剰で存在する。好ましい方法において、標的細胞は、接着層を形成する。好ましい方法において、この標的細胞株は、組織培養プレートに接着して増殖され、そして単一の細胞培養フラスコにおける懸濁物中でサブトラクトする細胞株とともに同時インキュベートされる。特に好ましい方法において、サブトラクティブ細胞株との接触は、インターナリゼーション培養条件（例えば、３７℃）よりも低い温度（例えば、４℃）で行われる。
【００１１】
特に好ましい実施態様において、ファージは、選択マーカーおよび／またはレポーター遺伝子を発現する。好ましい選択マーカーとしては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：蛍光タンパク質、抗生物質耐性の遺伝子もしくはｃＤＮＡをコードする遺伝子（またはｃＤＮＡ）および色素形成性の遺伝子またはｃＤＮＡ（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、βラクタマーゼ、ルシフェラーゼおよびβガラクトシダーゼ）。特定の実施態様において、その標的細胞は、固形腫瘍細胞、ｃＤＮＡ発現ライブラリーのメンバー、サイトカインレセプターを過剰発現する細胞、増殖因子レセプターを過剰発現する細胞、転移性細胞、形質転換された細胞株の細胞、特定の表面標的レセプターをコードする遺伝子またはｃＤＮＡを用いて形質転換された細胞、および固形腫瘍の外側に由来する新生物細胞を含み得る。１つの特に好ましい実施態様において、サブトラクティブ細胞株のこの細胞は、その標的細胞と同じ組織型から選択される。適切なサブトラクティブ細胞株の細胞としては、線維芽細胞、単球、幹細胞、およびリンパ球が挙げられるがそれらに限定されない。
【００１２】
本発明の方法はまた、インターナライズするレセプターおよび／またはインターナライズするレセプターエピトープ（結合した場合にその結合部分のインターナリゼーションを誘発する、レセプターの領域）を同定し得る。この方法は、一般に、本明細書において記載されるインターナライズする抗体またはポリペプチドを同定する方法のいずれかを、さらなる工程（これによって、同定されたインターナライズする抗体またはポリペプチドがもとの標的細胞または異なる細胞をプローブするために使用される）とともに包含する。インターナライズする抗体またはポリペプチドがそのように結合する場合、それらは、インターナライズするレセプターを有する細胞の単離を可能にし、そしてそのレセプターおよび／またはレセプターエピトープ自体の単離を可能にする。従って、１つの実施態様において、この方法は以下を包含する：ｉ）１つ以上のその標的細胞を、ファージディスプレーライブラリーの１つ以上のメンバーとを接触させる工程；ｉｉ）必要に応じて、しかし、好ましくは、そのファージディスプレイライブラリーのメンバーを、サブトラクティブ細胞株の細胞と接触させる工程；ｉｉｉ）必要に応じて、しかし好ましくは、ｉｉｉ）この標的細胞を洗浄して、このサブトラクティブ細胞株の細胞を除去し、そして、この標的細胞に非特異的に結合しているか、または弱く結合しているこのファージディスプレイライブラリーのメンバーを除去する工程；ｉｖ）このファージディスプレイライブラリーのメンバーが、インターナライズするマーカーに結合したときにインターナライズされ得る条件下で、この細胞を培養する工程；ｖ）このファージディスプレイライブラリーのメンバーが１以上のこの標的細胞にインターナライズされる場合、このファージディスプレイのインターナライズされるメンバーを同定する工程；ｖｉ）同一のまたは異なる標的細胞を、この工程（ｖ）のこの同定されたインターナライズされるメンバー、またはそれから増殖されたメンバーと接触させ、それによって、このメンバーがこの同一または異なる標的細胞の表面に結合する工程。この方法は、そのメンバーが結合する、同じかまたは異なる標的細胞の成分を単離する工程をさらに包含し得る。いくつかの方法において、この「同定する」工程は、インターナライズするファージを回収する工程、および工程（ｉ）〜（ｖ）までの工程を反復して、インターナライズする結合部分についてさらに選択する工程を包含する。
【００１３】
この接触工程、洗浄工程、培養工程および同定工程は、好ましくは、本明細書において記載されるように行われ、そしてその標的細胞およびサブトラクティブ細胞は、本明細書において記載される細胞を含む。
【００１４】
なお別の実施態様において、本発明は、多価抗体ファージディスプレイライブラリーを提供する。このライブラリーは、好ましくは、複数のファージを含み、ここで、このファージは、平均して、少なくとも２コピーの単鎖抗体を提示し、そしてこのライブラリーは、複数の種の単鎖抗体を含む。好ましい実施態様において、このファージは、平均して、ファージ粒子１つあたり少なくとも３つ、少なくとも４つまたは少なくとも５つのコピーの単鎖抗体を、提示する。特に好ましいライブラリーは、平均して、少なくとも１０5、好ましくは少なくとも１０6、より好ましくは少なくとも１０7、および最も好ましくは少なくとも１０8の異なる種の単鎖抗体を含む。最も好ましい実施態様において、この抗体は、ファージ（ファージミドではない）ベクターである核酸によってコードされる。
【００１５】
特定の実施態様において、このライブラリーは、インターナライズする細胞表面レセプターに特異的に結合するメンバー（例えば、ｅｒｂＢ２、ＥＧＦレセプター、ＰＤＧＦレセプター、ＶＥＧＦレセプター、トランスフェリンレセプターなど）について選択される。この単鎖抗体は、好ましくは、単鎖抗体Ｆｖ（ｓｃＦｖ）または単鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）抗体である。糸状ファージが、好ましくは、本発明のライブラリーにおいて使用され、そしてこの抗体は、好ましくは、ＰＩＩＩのマイナー外被タンパク質との融合物として発現される。このファージはまた、選択マーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子またはｃＤＮＡ）および／またはレポーター遺伝子もしくはｃＤＮＡ（例えば、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、Ｆｆｌｕｘ、β−ｇａｌ、β−ラクタマーゼなど）を発現し得る。
【００１６】
さらになお別の実施態様において、本発明は、本明細書において記載されるファージディスプレイ抗体ライブラリーの１つをコードする核酸ライブラリーを提供する。この核酸ライブラリーは、少なくとも１０5、より好ましくは少なくとも１０6、および最も好ましくは少なくとも１０7の異なるファージまたはファージミドベクターを包含する。
【００１７】
本発明はまた、本明細書において記載される方法を実施するためのキットを提供する。このキットは、好ましくは、本明細書に記載されるファージディスプレイライブラリー（またはその一部）を含む１つ以上の容器を備える（このキットは、そのライブラリーをコードする核酸および／または単鎖抗体（好ましくは多価ライブラリー）を発現するファージ粒子、および／またはそのファージからのインタクトなファージまたは核酸を含む細胞を備え得る。
【００１８】
（定義）
本明細書において使用される場合、「抗体」とは、イムノグロブリン遺伝子またはイムノグロブリン遺伝子のフラグメントによって実質的にコードされる１つ以上のポリペプチドからなるタンパク質をいう。認識されるイムノグロブリン遺伝子は、κ、λ、α、γ、δ、εおよびμの定常領域遺伝子、ならびに多数のイムノグロブリンの可変領域遺伝子を含む。軽鎖は、κまたはλのいずれかと分類される。重鎖は、γ、μ、α、δまたはεと分類される。次いで、これらは、イムノグロブリンクラスである、それぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥを決定する。
【００１９】
代表的なイムノグロブリン（抗体）の構造単位は、テトラマーを含むことが知られる。各テトラマーは、ポリペプチド鎖の２つの同一の対から構成され、ここで、各対は１つの「軽」鎖（約２５ｋＤ）および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤ）を有する。各鎖のＮ末端は、約１００〜１１０以上のアミノ酸の可変領域を規定し、これらは主に、抗原認識を担う。用語可変軽鎖（ＶL）および可変重鎖（ＶH）とは、それぞれ、これらの軽鎖および重鎖をいう。
【００２０】
抗体は、インタクトなイムノグロブリンまたは種々のペプチダーゼを用いた消化により生成された多数の充分に特徴付けられたフラグメントとして存在する。従って、例えば、ペプシンは、ヒンジ領域におけるジスルフィド結合の下の抗体を消化して、ＦａｂのダイマーであるＦ（ａｂ）’２（これは、それ自体がジスルフィド結合によってＶH−ＣH１に結合した軽鎖である）を生成する。Ｆ（ａｂ）’2は、緩和な条件下で還元されて、ヒンジ領域におけるジスルフィドを結合を破壊され、それによって、（Ｆａｂ’）2ダイマーをＦａｂ’モノマーへと変換し得る。Ｆａｂ’モノマーは、本質的にヒンジ領域の部分を有するＦａｂである（他の抗体フラグメントのより詳細な説明について、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ編、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．（１９９３）を参照のこと）。種々の抗体フラグメントは、インタクトな抗体の消化に関して規定されるが、当業者は、そのようなＦａｂ’フラグメントがデノボで、化学的または組換えＤＮＡ方法論を利用することによるかのいずれかによって合成され得ることを理解する。従って、用語「抗体」はまた、本明細書において使用される場合、抗体全体の改変によって産生されたか、または組換えＤＮＡ方法論を用いてデノボ合成されたのいずれかの抗体フラグメントを包含する。好ましい抗体としては、単鎖抗体、（単鎖ポリペプチドとして存在する抗体）、より好ましくは単鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖまたはｓｃＦｖ）が挙げられ、ここで、可変重鎖および可変軽鎖は一緒に結合されて（直接またはペプチドリンカーを介して）、連続的なポリペプチドを形成する。単鎖Ｆｖ抗体は、共有結合されたＶH−ＶLヘテロダイマーであり、これは、直接結合されているか、またはペプチドコードリンカーによって結合されるかのいずれかであるＶHコード配列およびＶLコード配列を含む核酸から発現され得る。Ｈｕｓｔｏｎ，ら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：５８７９−５８８３。ＶＨおよびＶＬが各々単鎖ポリペプチドとして結合されている間、このＶＨドメインおよびＶＬドメインは、非共有結合的に会合する。糸状ファージの表面に発現されるべき第一の機能的な抗体分子は、単鎖Ｆｖ’（ｓｃＦｖ）であるが、別の発現戦略もまた、首尾よく行われている。例えば、Ｆａｂ分子は、鎖（重鎖または軽鎖）のうちの１つがｇ３キャプシドタンパク質に融合され、そして相補鎖が可溶性分子としてペリプラズムへと輸送される場合にファージにおいて提示され得る。この２つの鎖は、同じまたは異なるレプリコン上にコードされ得る；重要な点は、各々Ｆａｂ分子におけるこの２つの抗体鎖が、翻訳後にアセンブルし、そしてこのダイマーが、ｇ３ｐへのその鎖の一方の連結を介して、そのファージ粒子へと取り込まれることである（例えば、米国特許第５７３３７４３号を参照のこと）．ｓｃＦｖ抗体および多数の他の構造（これは、天然に凝集するが、抗体Ｖ領域からの化学的に分離された軽鎖ポリペプチドおよび重鎖ポリペプチドを、抗体結合部位の構造に実質的に類似する三次元構造へと変換する）は、当業者に公知である（例えば、米国特許第５，０９１，５１３号、同第５，１３２，４０５号、および同第４，９５６，７７８号を参照のこと）。特に好ましい抗体としては、ファージＩ上に提示された抗体すべてが挙げられるが、好ましい抗体は、ファージ上に提示された抗体をすべて含むべきである（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂおよびジスルフィド結合Ｆｖ（Ｒｅｉｔｅｒら（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８：１３２３−１３３１）。
【００２１】
「抗体結合部位」または「抗体部分」とは、抗原結合に関与するイムノグロブリン分子の部分をいう。抗原結合部位は、重鎖（「Ｈ」）および軽鎖（「Ｌ」）のＮ末端可変（「Ｖ」）領域のアミノ酸残基によって形成される。重鎖および軽鎖のＶ領域内の３つの高度に多岐にわたるストレッチは、「超可変領域」いわれる。この領域は、より保存的な隣接するストレッチ（「フレームワーク領域」または「ＦＲ」として知られる）の間に挿入されている。従って、用語「ＦＲ」とは、イムノグロブリンにおける超可変領域の間および近位に天然に見出されるアミノ酸配列をいう。抗体分子では、軽鎖の３つの超可変領域および重鎖の３つの超可変領域が、互いに三次元空間上で抗原結合「表面」を形成するように配置される。この表面は、標的抗原の認識および結合を媒介する。重鎖および軽鎖の各々の３つの超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」と呼ばれ、そして例えば、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第４版．Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９８７）によって特徴付けられている。
【００２２】
本明細書において使用される場合、用語「免疫学的結合」および「免疫学的結合特性」とは、イムノグロブリン分子とそのイムノグロブリンが特異的である抗原との間に生じる型の非共有結合性の相互作用をいう。免疫学的な結合相互作用の強度または親和性は、相互作用の解離定数（Ｋｄ）で表され得、ここで、より小さなＫｄは、より大きな親和性を表す。選択されたポリペプチドの免疫学的結合特性は、当該分野で周知の方法を用いて定量され得る。１つのそのような方法は、抗原結合部位／抗原複合体形成および解離の速度を測定する工程を包含し、ここで、これらの速度は、複合体パートナーの濃度、相互作用の親和性および両方の方向における速度に等量に影響を与える幾何パラメータに依存する。従って、「オン速度定数」（ｋon）および「オフ速度定数」（ｋoff）の両方は、会合および解離の濃度および実際の速度の計算によって決定され得る。ｋoff／ｋonの比は、親和性に関連しないすべてのパラメータの除去を可能にし、従って、解離定数Ｋdと等価である（一般には、Ｄａｖｉｅｓら（１９９０）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５９：４３９−４７３を参照のこと）。
【００２３】
句「タンパク質に特異的に結合する」または「〜と特異的に免疫反応性である」とは、抗体に対して言及する場合、タンパク質および他の生物学的物質の異種集団の存在下で、タンパク質の存在の決定因子である結合反応をいう。従って、指定されたイムノアッセイ条件下で、特定された抗体は、特定のタンパク質に結合し、そしてそのサンプルに存在する他のタンパク質には有意な量で結合しない。そのような条件下でのタンパク質に対する特異的な結合は、特定のタンパク質の特異性について選択された抗体を必要とし得る。例えば、Ｆ５抗体またはＣ１抗体は、ｃ−ｅｒｂＢ−２タンパク質に対して惹起され得る。これらの抗体は、ｃ−ｅｒｂＢ−２に結合し、そして、組織サンプルに存在する他のタンパク質には結合しない。種々のイムノアッセイ形式を使用して、特定のタンパク質と特異的に免疫反応性の抗体を選択し得る。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイは、あるタンパク質と特異的に免疫反応性であるモノクローナル抗体を選択するために慣用的に使用される。特異的な免疫反応性を決定するために使用され得るイムノアッセイの形式および条件の記載については、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと。
【００２４】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」または「タンパク質」は、本明細書において交換可能に使用されて、αアミノ基と隣接する残基のカルボキシ基との間のペプチド結合によって、一方から他方へと結合されたアミノ酸残基の直鎖状のシリーズをいう。このアミノ酸残基は、好ましくは、天然の「Ｌ」イソ型形態で存在する。しかし、「Ｄ」イソ型形態における残基は、所望の機能的特性がそのポリペプチドによって維持される限り、任意のＬアミノ酸残基に置き換わり得る。さらに、このアミノ酸は、２０の「標準的な」アミノ酸に加えて、改変されたアミノ酸および異常なアミノ酸を含み、これには、米国特許法規則１．８２２条（ｂ）（４）に列挙されるものが含まれるがそれらに限定されない。さらに、アミノ酸残基配列の開始部または末端のダッシュは、１以上のアミノ酸残基のさらなる配列へのペプチド結合を示すか、またはカルボキシル末端基もしくはヒドロキシル末端基への共有結合を示す。
【００２５】
用語「結合するポリペプチド」とは、抗体が抗原に対して結合するものと類似の様式で、標的分子（例えば、細胞レセプター）に特異的に結合するポリペプチドをいう。結合するポリペプチドは、結合するポリペプチドがイムノグロブリン遺伝子またはイムノグロブリン遺伝子のフラグメントには最終的に由来しないという点において抗体とは区別される。
【００２６】
用語「保存的置換」は、タンパク質またはペプチドに関して使用されて、その分子の活性（特異性または結合親和性）を実質的に変更しないアミノ酸置換を反映する。代表的には保存的アミノ酸置換は、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する別のアミノ酸と１つのアミノ酸の置換を包含する。以下の６つのグループは、互いについて代表的な保存的置換であるアミノ酸を各々含む：
１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；および
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
【００２７】
用語「核酸」とは、一本鎖または二本鎖の形態のいずれかの、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそれらのポリマーをいう。特に限定しない限り、この用語は、参照核酸と類似の結合特性を有し、そして天然に存在するヌクレオチドと類似の様式で代謝される天然のヌクレオチドの公知のアナログを含む形態を包含する。他に言及しない限り、特定の核酸配列はまた、暗示的に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換）および相補配列、ならびに明示的に示された配列を包含する。
【００２８】
詳細には、縮重コドン置換は、１つ以上の選択される（またはすべての）コドンの第三位が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基に置換された配列を生成することによって達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１；Ｏｈｔｓｕｋａら（１９８５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８；およびＣａｓｓｏｌら（１９９２）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、（１９９４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８）。用語核酸は、遺伝子、遺伝子にコードされるｃＤＮＡおよびｍＲＮＡと交換可能に使用される。
【００２９】
用語「単離された」または「生物学的に純粋な」とは、そのネイティブな状態において見出される場合に通常付随する成分が実質的または本質的にない物質をいう。しかし、用語「単離された」とは、電気泳動ゲルまたは他の分離媒体に存在する成分をいうことは意図しない。単離された成分は、そのような分離媒体を含まず、そして別の適用における使用について用意された形態であるか、または新たな適用／環境においてすでに使用されている状態にある。
【００３０】
キメラ分子は、それらのネイティブ状態では別個に存在する２以上の分子が一緒になって結合されて、その成分分子のすべての所望の機能性を有する単一の分子を形成する分子をいう。キメラ分子は、各々別個に合成された２つの分子を共有結合することによって調製され得るが、当業者は、キメラ分子が融合タンパク質である場合、そのキメラは、デノボで単一の「結合された」分子として調製され得ることを認識する。
【００３１】
融合タンパク質は、成分分子がすべてポリペプチドであり、そして互いに末端のペプチド結合を介して接着（融合）し、その結果そのキメラ分子が連続した単鎖ポリペプチドであるキメラ分子である。種々の成分が、直接互いに接着され得るか、または１以上のペプチドリンカーを通じて結合され得る。
【００３２】
エフェクター部分または分子は、代表的に、標的細胞（例えばｃ−ｅｒｂＢを過剰発現する腫瘍）に送達されることが所望される特徴的な活性を有する分子または分子である。エフェクター分子としては、細胞毒素、標識、放射性核種、リガンド、抗体、薬物、リポソームおよびウイルス外被タンパク質（これらは、そのウイルスを、ｃ−ｅｒｂＢ２発現細胞に感染し得るようにさせる）が挙げられる。
【００３３】
「標的」細胞とは、本発明のファージディスプレイライブラリーのメンバーまたはキメラ分子によって特異的に結合される細胞または細胞型をいう。好ましい標的細胞は、インターナライズする抗体または結合ポリペプチドが探索される細胞である。この標的細胞は、代表的に、その細胞型に特徴的な標的分子の発現または過剰発現によって特徴付けられる。従って、例えば、標的細胞は、ｃ−ｅｒｂＢ−２のようなマーカーを過剰発現する、腫瘍細胞のような細胞であり得る。
【００３４】
「標的化する部分」とは、標的分子に特異的に結合する部分（例えば、分子）をいう。標的分子が細胞表面上の分子であり、そしてその標的分子がキメラ分子の成分である場合、その標的化部分は、その標的を有する細胞に対するキメラ分子を特異的に結合する。その標的化部分がポリペプチドである場合、その部分は、「標的化ポリペプチド」といわれ得る。
【００３５】
用語「インターナライズする」または「インターナライズ（される）（された）」とは、細胞について言及する場合、ある部分（例えば、ファージ）の細胞の外側から内側への輸送をいう。インターナライズされる部分は、細胞内画分（例えば、その細胞自体の液胞、リソソーム、小胞体、ゴルジ装置または細胞質ゾル）に配置され得る。
【００３６】
インターナライズするレセプターまたはマーカーは、抗体または結合タンパク質によって特異的に結合される場合にその抗体または結合タンパク質の細胞内へのインターナリゼーションをもたらす、外部の細胞表面に存在する分子である。インターナライズするレセプターまたはマーカーとしては、レセプター（例えば、ホルモン、サイトカインまたは増殖（成長）因子レセプター）、リガンドおよびそれとの結合がインターナリゼーションをもたらす他の細胞表面マーカーが挙げられる。
【００３７】
用語「異種核酸」とは、その核酸が見出される細胞にとってネイティブではないか、またはその最終的な起源が、その「異種核酸」が現在見出される細胞もしくは細胞株にはない核酸をいう。
【００３８】
イディオタイプは、抗体の高度に可変性の抗原結合部位を表し、そしてそれ自体が、免疫原性である。抗体媒介性の免疫応答の生成の間、個体は、その抗原、ならびに抗イディオタイプ抗体（この免疫原性結合部位（イディオタイプ）は、その抗原を模倣する）に対する抗原を発達させる。抗イディオタイプ抗体はまた、抗体またはそのフラグメントを用いる免疫化によって生成され得る。
【００３９】
「ファージディスプレイライブラリー」とは、ファージ（例えば、糸状ファージ）の収集物をいい、ここで、そのファージは、外部（代表的には異種）タンパク質を発現する。この外部タンパク質は、そのファージが接触する他の部分との相互作用（結合）はしない。外部タンパク質を提示する各々のファージは、このファージディスプレイライブラリーの「メンバー」である。
【００４０】
「抗体ライブラリー」とは、抗体（１つ以上の抗体遺伝子またはｃＤＮＡによってコードされる結合するタンパク質）を提示するファージディスプレイライブラリーをいう．この抗体ライブラリーは、ファージの集団またはそのようなファージの集団をコードするベクターの集団、あるいはファージまたはベクターのそのような集団を有する細胞を含む。このライブラリーは、一価であり得、１ファージ粒子あたり平均して１つの単鎖抗体を提示するか、または１つのウイルス粒子あたり平均して２つ以上の単鎖抗体を提示する。好ましい抗体ライブラリーは、平均して１０6を超える。好ましくは１０7を超える、より好ましくは１０8を超える、そして最も好ましくは１０9の異なる種のメンバー（すなわち、その多くの異なる抗体をコードする）を含む。
【００４１】
用語「糸状ファージ」とは、その表面上に異種ポリペプチドを提示し得るウイルス粒子をいう。当業者は、種々のバクテリオファージが本発明において使用され得ることを理解するが、好ましい実施態様において、そのベクターは、糸状バクテリオファージ（例えば、ｆ１、ｆｄ、Ｐｆ１、Ｍ１３などのような）であるか、またはそれに由来する。糸状ファージは、テトラサイクリンのような選択マーカーを含み得る（例えば、「ｆｄ−ｔｅｔ」）。種々の糸状ファージディスプレイ系は、当業者に周知である（例えば、Ｚａｃｈｅｒら、（１９８０）Ｇｅｎｅ９：１２７−１４０、Ｓｍｉｔｈら、（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１３１５−１３１７（１９８５）；ならびにＰａｒｍｌｅｙおよびＳｍｉｔｈ（１９８８）Ｇｅｎｅ  ７３：３０５−３１８を参照のこと）。
【００４２】
「ウイルスパッケージングシグナル」は、ウイルスキャプシドへの核酸の組み込みを指向するに必要かつ十分な核酸配列である。
【００４３】
アセンブリ細胞は、核酸がウイルスコートタンパク質（キャプシド）にパッケージングされ得る細胞である。アセンブリ細胞は、１つ以上の異なるウイルス粒子（例えば、通常のファージまたは衰弱化ファージおよびヘルパーファージ）を感染させ得これらのウイルス粒子は、個々に、または核酸のウイルスキャプシドへのパッケージングと合わせて指向する。
【００４４】
用語「検出可能な標識」は、検出可能な物理的特性または化学的特性を有する任意の物質をいう。このような検出可能な標識は、イムノアッセイの分野で十分に開発されてきており、一般に、このような方法において有用な任意の標識は、本発明に適用され得る。従って、標識は、分光学的手段、光化学的手段、生物化学的手段、免疫化学的手段、電子的手段、光学的手段または化学的手段によって検出可能ないずれかの組成物である。本発明において有用な標識としては、磁性ビーズ（例えば、ＤｙｎａｂｅａｄｓＴＭ）、蛍光染料（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、テキサスレッド、ローダミンなど）、放射性標識（例えば、3Ｈ、125Ｉ、35Ｓ、14Ｃ、または32Ｐ）、酵素（例えば、ＬａｃＺ、ＣＡＴ、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど、検出可能な酵素として、マーカー遺伝子産物として、またはＥＬＩＳＡにおいてのいずれかとして、一般に使用される）、および比色標識（例えば、コロイド金または着色ガラスもしくはプラスティック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）のビーズ）が挙げられる。核酸によって発現され得るこれらの検出可能な標識は、「レポーター遺伝子」または「レポーター遺伝子産物」といわれる。
【００４５】
蛍光標識は、単一種の有機分子（しかし、無機分子も含む）、有機分子および／または無機分子の複数分子混合物、結晶、ヘテロポリマーなどに限定されないことが認識される。従って、例えば、シリカ殻に囲まれるＣｄＳｅ−ＣｄＳコア殻ナノ結晶は、生物学的分子とカップリングするために容易に誘導体化され得る（Ｂｒｕｃｈｅｚら（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８１：２０１３−２０１６）。同様に、高度に蛍光性の量子ドット（ｑｕａｎｔｕｍ  ｄｏｔ）（硫化亜鉛キャップ化セレン化カドミウム）を、超高感度生物学的検出における使用のための生体分子に共有結合した（ＷａｒｒｅｎおよびＮｉｅ（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８１：２０１６−２０１８）。
【００４６】
以下の略語が本明細書中で使用される：ＡＭＰ、アンピシリン；ｃ−ｅｒｂＢ−２  ＥＣＤ、ｃ−ｅｒｂＢ−２の細胞外ドメイン；ＣＤＲ、相補性決定領域；ＥＬＩＳＡ、酵素結合免疫吸着アッセイ；ＦＡＣＳ、蛍光活性化セルソーター；ＦＲ、フレームワーク領域；Ｇｌｕ、グルコース；ＨＢＳ、ｈｅｐｅｓ緩衝化生理食塩水（１０ｍＭ  ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）；ＩＭＡＣ、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー；ｋon、結合速度定数；ｋoff、解離速度定数；ＭＰＢＳ、ＰＢＳ中スキムミルク粉末；ＭＴＰＢＳ、ＴＰＢＳ中のスキムミルク粉末；ＰＢＳ、リン酸緩衝化生理食塩水（２５ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4、１２５ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）；ＰＣＲ、ポリメラーゼ連鎖反応；ＲＵ、共鳴単位；ｓｃＦｖ、単鎖Ｆｖフラグメント；ＴＰＢＳ、ＰＢＳ中の０．０５％  ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ２０；ＳＰＲ、表面プラズモン共鳴；Ｖκ、免疫グロブリンκ軽鎖可変領域；Ｖλ、免疫グロブリンλ軽鎖可変領域；ＶL、免疫グロブリン軽鎖可変領域；ＶH、免疫グロブリン重鎖可変領域；ｗｔ、野生型。
【００４７】
（詳細な説明）
（Ｉ．緒言）
本発明は、特定の標的細胞によりインターナライズされる特異的結合ポリペプチドおよび／または抗体についてスクリーニングする新たな方法を提供する。細胞に対する外部標的（例えば、レセプター）への結合を単に検出する先行技術のアッセイ法とは異なり、本発明のアッセイは、結合し、そして細胞へ（すなわち、小胞および／もしくは小胞体へ、ならびに／または細胞質ゾル自体へ）輸送される分子を明らかに同定する。
【００４８】
多くの特異的抗体の利用性は、インターナライズするレセプター（例えば、ｃ−ｅｒｂＢ−２）に結合することが一般に公知である抗体ですら、結合した抗体のインターナリゼーションがしばしば欠如すること、または受容しがたい緩慢なインターナリゼーション速度により制限されてきた。このような抗体は、細胞表面に対して一部分を送達するために有用である一方、一般には、エフェクター分子（活性については、細胞への侵入を得なければならない）の送達が満足いかないことが証明された。
【００４９】
対照的に、本発明の方法により同定された結合ポリペプチドおよび／または抗体は、細胞へ迅速にインターナライズされる。従って、それらは、標的細胞へエフェクター部分を送達するためにきわめて有用である。さらに、一旦インターナライズする抗体またはポリペプチドが同定されると、これを使用して１つ以上の細胞または細胞株を再プローブし、これまで未知だったインターナライズする細胞標的（例えば、レセプター）を同定し得る。
【００５０】
さらに、インターナリゼーションについて選択することはまた、生物学的機能について選択する。多くのレセプター（例えば、増殖因子レセプター）は、リガンドの効果を調整し、そして調節する方法としてインターナリゼーションを利用する。例えば、リガンド結合は、シグナル伝達およびレセプターインターナリゼーションを生じ得る。次いで、レセプターの数の減少は、さらなるリガンドの効果のダウンレギュレーションを引き起こす。同様のことが、増殖因子レセプターを結合する抗体を用いて生じる（Ｈｕｒｗｉｔｚら（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：３３５３−３３５７）。例えば、「増殖因子は、それらの細胞表面レセプターに結合し、そしてそれらの固有触媒活性を活性化することによって作用し、このことによって、細胞応答を導くシグナル伝達カスケードを開始する。増殖因子／レセプター複合体は、細胞表面膜に静的に存在しないが、エンドサイトーシス的な輸送プロセスのインターナリゼーションならびに再使用および分解の選別を受ける。結論として、増殖因子は、細胞外媒体から枯渇され、そしてそれらのレセプターは、ダウンレギュレーションを受ける。これらの輸送プロセスは、増殖因子／レセプター複合体のシグナル伝達の速度論に対するそれらの影響によって、細胞挙動応答の重要なモジュレーターである」（Ｒｅｄｄｙら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：１６９６−１６９９）。
【００５１】
ＥｒｂＢ２系においては、ＥｒｂＢ２結合抗体が増殖を阻害する１つの機構は、レセプターインターナリゼーションを引き起こし、そしてダウンレギュレートすることである（Ｈｕｒｗｉｔｚら（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：３３５３−３３５７）。増殖因子レセプターを結合し、そして増殖阻害を引き起こすインターナライズする抗体を増殖刺激抗体へ向ける（ｔｕｒｎ）こともまた可能である。例えば、ＥＧＦのマイトジェン特性は、ＥＧＦのＥＧＦレセプターに対する親和性を低下させることによって増加される。親和性が低くなるにつれて、ＥＧＦは、レセプターシグナル伝達を引き起こすが、（より低い親和性から推測すると）野生型ＥＧＦより低減されたインターナリゼーションおよびダウンレギュレーションを引き起こす（Ｒｅｄｄｙら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：１６９６−１６９９）。従って、増殖を阻害する、インターナライズする抗体の親和性の低下は、増殖因子へそれらを向け得る。従って、インターナライズする抗体の同定は、増殖阻害および増殖刺激の両方についてのリード化合物／薬物を提供し得る。
【００５２】
（ＩＩ．インターナライズする抗体および／またはレセプターを同定する方法）
（Ａ）インターナリゼーションポリペプチド／抗体の同定）
１つの実施態様において、本発明は、インターナライズする抗体またはポリペプチドを同定する方法を提供する。この方法は、「標的」細胞と、抗体もしくは結合ポリペプチドを提示するファージディスプレイライブラリーの１つ以上のメンバーとを接触させる工程を包含する。このファージディスプレイライブラリーは、好ましくは、多価ファージディスプレイライブラリーであり、そして本発明は、多価抗体ファージディスプレイライブラリーの始めての記載を提供すると考えられる。
【００５３】
適切なインキュベーション期間の後、細胞を洗浄して、外部に結合したファージ（ライブラリーメンバー）を除去する。次いで、インターナライズしたファージを細胞から遊離する（例えば、細胞溶解により）。インターナライズしたファージが依然として生存している（感染性）ことが本発明の発見であった。従って、細胞溶解においてインターナライズしたファージが回収され、そしてインターナライズしたファージを含む溶解物を使用して細菌宿主に感染させることにより増殖され得る。感染細菌の増殖は、選択のさらなるラウンドのために使用され得るファージの増殖を導く。選択の各ラウンドによって、さらに効率的にインターナライズするか、標的細胞に対してより特異的であるか、または改善した結合特性を有するファージを富化する。
【００５４】
ファージディスプレイライブラリーは、好ましくは、サブトラクティブ細胞株と接触されて（すなわち、サブトラクティブ細胞株は、標的細胞および培養培地に添加される）、「標的」細胞に対して特異的でないファージディスプレイライブラリーのメンバーを除去する。サブトラクティブ細胞株は、好ましくは、ファージディスプレイライブラリーの非特異的結合メンバーが、サブトラクティブ細胞株によって差し引きされ得る前にインターナライズされない（封鎖されない（ｓｅｑｕｅｓｔｅｒｅｄ））ように、このライブラリーのメンバーがインターナライズされない条件下で（例えば、約４℃〜２０℃の温度で、より好ましくは、約４℃の温度で）添加される。
【００５５】
非特異的結合抗体を差し引きした後に、「標的」細胞を洗浄して、サブトラクティブ細胞株を除去し、そして非特異的に結合したか、または弱く結合したファージを除去する。
【００５６】
次いで、標的細胞をインターナリゼーションが生じ得る条件下で（例えば、約３５℃〜約３９℃の温度で、より好ましくは、約３７℃の温度で）培養する。インターナリゼーション培養期間は、抗体（ファージディスプレイメンバー）のインターナリゼーション速度を決定する。このために選択が生じる。インターナリゼーション期間がより短くなるにつれて、より迅速なインターナライズする抗体が選択されるが、その一方で、インターナリゼーション期間が長くなるにつれて、より緩慢な、インターナライズする抗体が選択される。インターナリゼーション期間は、好ましくは、約１２０分未満であり、より好ましくは、約６０分未満であり、そして最も好ましくは、約３０分未満、または約２０分未満ですらある。
【００５７】
インターナリゼーション期間の間に、インターナリゼーションが生じ得る条件下で標的細胞が増殖されることに注意のこと。多くの細胞株について、このことは、培養プレート上に接着して細胞株を培養することを包含する。
【００５８】
インターナリゼーションが生じるようにした後、標的細胞を洗浄して、インターナライズしていないファージ（例えば、表面結合ファージ）を除去する。
【００５９】
次いで、細胞をきれいな培地に移し得る。好ましい実施態様において、細胞が接着性である場合、それらは、トリプシン処理されて、細胞外マトリクス（これは、細胞外マトリクスと結合するファージ抗体を含み得る）から遊離される。洗浄を介して細胞を溶液へ遊離することが、さらに可能になり、そして細胞を新たな培養フラスコへ移すことによって、組織培養ディッシュへ固着してい得る任意のファージを組織培養ディッシュへ残す。
【００６０】
次いで、細胞を大容量のＰＢＳで洗浄し、そしてインターナライズしたファージを遊離するために溶解し得る。次いで、これを増殖し得る（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉを感染するために使用して、次のラウンドの選択のためにファージを生成し得る）。インターナライズしたファージを実際に可視化する必要はないことに注意のこと。単純な細胞溶解および正式にインターナライズしたファージの増殖は、インターナライズするファージディスプレイメンバーを回収するに十分である。
【００６１】
（Ｂ）インターナライズするレセプターの同定）
一旦、細胞へインターナライズされる抗体またはポリペプチドが同定されると、同定された抗体またはポリペプチドを用いて１つ以上の細胞型をプローブして、抗体によって認識され、そして結合される標的を同定することが可能である。この抗体はインターナライズする抗体であるため、このような標的は、それ自体インターナライズする標的であるようである（例えば、インターナライズするレセプターのメンバーまたはその一部）。
【００６２】
１つの実施態様において、この抗体は、以下に記載のように標識され得る。次いで、細胞は、抗体と接触され（すなわち、インビボまたはインビトロ）、そして抗体が結合する細胞または細胞領域を単離し得る。
【００６３】
あるいは、この抗体を、例えば、アフィニティーマトリクス（例えば、アフィニティーカラム）において使用して、それらが結合する標的（例えば、レセプターまたはレセプターサブユニット）を単離し得る。簡潔には、１つの実施態様において、アフィニティークロマトグラフィーは、本発明の方法に従って同定された、インターナライズする抗体の１つ以上の種を（例えば、個体支持体上に）固定化する工程を包含する。次いで、細胞、細胞溶解物、または細胞ホモジネートを、この固定化した抗体と接触させ、次いで、これを、そのコグネイトリガンドに結合させる。次いで、残りの物質を洗い流し、次いで結合した／単離されたコグネイトリガンドをさらなる使用のために、抗体から遊離させ得る。アフィニティークロマトグラフィーを行う方法は、当業者に周知である（例えば、米国特許第５，７１０，２５４号、同第５，４９１，０９６号、同第５，２７８，０６１号、同第５，１１０，９０７号、同第４，９８５，１４４号、同第４，３８５，９９１号、３，９３８，００１号などを参照のこと）。
【００６４】
別の実施態様において、この抗体を使用して、細胞溶解物から標的を免疫沈降し得る。次いで、沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動し、これをニトロセルロース上にウェスタンブロットする。このブロットを沈降させた抗体でプローブして、標的の位置を同定する。次いで、標的を含むブロットの一部分は、Ｎ末端タンパク質配列決定に供され得る。次いで、Ｎ末端配列を使用して、標準データベースから標的を同定し得るか、またはＤＮＡプローブを合成して、ゲノムもしくはｃＤＮＡライブラリーをプローブし得る。このアプローチを使用してファージ抗体に結合した抗原を同定する。ファージ抗体ライブラリーの選択は、インタクトなＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ（クラミジア症を引き起こす細菌様生物）上で行われた。次いで、選択した抗体を上記のように使用して、結合した抗原を同定した。
【００６５】
（Ｃ）機能的ゲノム）
別の実施態様において、本発明のアッセイを使用して、ライブラリーをスクリーニングし、以前は未知だった結合因子を同定し得る。このタンパク質分析（ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ）または機能的ゲノム分析に対する２つの好ましいアプローチが存在する。最初にファージディスプレイされたｃＤＮＡライブラリーを作製する。ｍＲＮＡ（おそらく差し引きされた）を細胞株または目的の組織から作製する。第１鎖ＤＮＡを合成し、そしてＤＮＡｓｅで処理するか、またはいくつかの他の方法でフラグメント化する。これは、５’および３’ＵＴＲならびに３’停止コドンを除去する。次いで、ファージライブラリーを作製し、そして細胞に対するインターナライズについて選択する。
【００６６】
細胞表面レセプターに結合し、そしてインターナライズするリガンド（またはリガンドのドメイン）が同定される。このアプローチを使用して、例えば、インターナライズする増殖因子レセプターを結合するオーファン増殖因子を同定し得る。レセプターが公知であるが、リガンドは公知でない場合、レプセター遺伝子を細胞株へトランスフェクトし得、そしてトランスフェクトした細胞株を選択のために使用し得る。選択はまた、レポーター遺伝子の送達と組み合わせられ得る。この場合、ファージライブラリーを作製するために使用されるファージベクターは、レポーター遺伝子を含む。選択後に、例えば、レポーター遺伝子ＧＦＰを発現する緑色細胞を、（細胞を全て溶解して、インターナライズしたファージを回収するよりむしろ）ＦＡＣＳによって単離し得る。このことは、選択の特異性を改善するために予測される。
【００６７】
第２のアプローチについては、第２段落：このファージライブラリーを、上記のように、標的細胞株に対するインターナリゼーションについて選択する。次いで、選択したポリクローナルまたはモノクローナルファージを使用して、ｃＤＮＡライブラリーでトランスフェクトした細胞（例えば、ＣＯＳ細胞）をフロー選別する。ｃＤＮＡライブラリープラスミドを選別した細胞から回収し、そして標準的技術を使用して細菌において増幅する。増幅したプラスミドｃＤＮＡライブラリーを使用して細胞（例えば、ＣＯＳ細胞）をトランスフェクトし、再びファージを使用して選別する。数ラウンドの選択後に、選別した細胞は、インターナライズしたファージに結合した細胞表面レセプターをコードするプラスミドのみを含むはずである。これらは、ＤＮＡ配列決定によりそして各プラスミドＤＮＡをファージの結合について試験することにより、このプラスミドＤＮＡを使用して、ＣＯＳ細胞をトランスフェクトした後に、同定され得る。
【００６８】
（ＩＩＩ．アッセイ成分）
（Ａ）ファージディスプレイライブラリー）
（１）一価抗体ライブラリーおよびポリペプチドライブラリー）
細菌に感染するウイルス（バクテリオファージまたはファージ）の表面上でポリペプチドおよび抗体フラグメントを発現する能力は、１０10の非結合クローンを越えるライブラリーから単一の結合ポリペプチドまたは抗体フラグメントを単離することを可能にする。ファージ表面上でポリペプチドまたは抗体フラグメントを発現させる（ファージディスプレイ）ために、ポリペプチドまたは抗体フラグメント遺伝子をファージ表面タンパク質（ｐＩＩＩ）をコードする遺伝子に挿入し、そして抗体フラグメント−ｐＩＩＩ融合タンパク質をファージ表面上に提示する（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２−５５４；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：４１３３−４１３７）。ファージ表面上の抗体フラグメントは機能的であるので、抗原結合ポリペプチドまたは抗体フラグメントを有するファージは、抗原アフィニティークロマトグラフィーにより非結合ファージから分離され得る（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２−５５４）。抗体フラグメントの親和性に依存して、２０倍から１，０００，０００倍の富化因子が、１回の親和性選択について得られる。しかし、溶出したファージで細菌を感染させることによって、より多くのファージが増殖し得、そして別の回の選択に供され得る。このようにして、１回において１，０００倍の富化により、２回の選択で１，０００，０００倍になる（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２−５５４）。従って、富化が少ない場合ですら（Ｍａｒｋｓら（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７）、複数ラウンドのアフィニティー選択によりまれなファージの単離が導かれ得る。ファージ抗体ライブラリーの抗原に対する選択は、富化を生じるので、クローンの大部分は、４回の選択後に抗原を結合する。従って、比較的少数のクローン（数百）は、抗原に対する結合について分析する必要がある。
【００６９】
好ましい実施態様において、結合についての分析は、抗体フラグメント遺伝子と遺伝子ＩＩＩとの間にアンバーコドンを含めることによって簡単される。このアンバーコドンによって、宿主細菌株を単に変更することによって、提示された抗体フラグメントと可溶性（ネイティブな）抗体フラグメントとの間を簡単にスイッチすることができるようになる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：４１３３−４１３７）。
【００７０】
非常に大きく、そして多様なＶ遺伝子レパートリーをファージ上で提示することによって、予備免疫を行うことなく、ヒト抗体が生成され得る（Ｍａｒｋｓら（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７）。第１の実施例において、ヒト末梢血リンパ球に存在する天然のＶHおよびＶLレパートリーは、免疫していないドナーからＰＣＲにより単離された。Ｖ遺伝子レパートリーは、ＰＣＲを使用してランダムに、ともにスプライスされて、ｓｃＦｖ遺伝子レパートリーを作製する。これは、ファージベクターにクローニングされて、３０００万のファージ抗体（同定）のライブラリーを作製する。この単一の「未処理」ファージ抗体ライブラリーから、結合抗体フラグメントを、１７を越える異なる抗原（ハプテン、ポリサッカライドおよびタンパク質を含む）に対して単離した（Ｍａｒｋｓら（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７；Ｍａｒｋｓら（１９９３）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１０：７７９−７８３；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：７２５−７３４；Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ．３５２：６２４−６２８）。抗体は、自己タンパク質（ヒトサイログロブリン、免疫グロブリン、腫瘍壊死因子およびＣＥＡを含む）に対して生成された（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：７２５−７３４）。インタクトな細胞上で直接選択することによって細胞表面抗原に対する抗体を単離することもまた可能である。例えば、４つの異なる赤血球細胞表面抗原に対する抗体フラグメントを、赤血球上で直接選択することによって生成した（Ｍａｒｋｓら（１９９３）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１０：７７９−７８３）。抗体を、血液型抗原（表面密度が５，０００部位／細胞ほどの低さ）に対して生成した。抗体フラグメントは、選択に使用した抗原に対して高度に特異的であり、そして凝集アッセイおよび免疫蛍光アッセイにおいて機能的であった。より低密度の抗体に対する抗体を、目的の抗原を欠失した高度に関連する細胞型上でファージ抗体ライブラリーを最初に選択することによって生成した。このネガティブ選択によってより高密度の抗原に対する結合物が除去され、そして枯渇したファージ抗体ライブラリーを、目的の抗原を発現する細胞上で引き続き選択することによって、その抗原に対する抗体の単離を生じた。ライブラリーのこの大きさと多様性があれば、いくつかの結合物に対して少なくとも１つは、そのときのタンパク質抗原の７０％に対して単離され得る。抗体フラグメントは、選択に使用された抗原に対して高度に特異的であり、そして１：Ｍ〜１００ｎＭ範囲の親和性を有する（Ｍａｒｋｓら（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：７２５−７３４）。より大きなファージ抗体ライブラリーは、抗原のより大きな割合に対してより高い結合親和性のより多くの抗体の単離を生じた。
【００７１】
適切な大きなファージディスプレイ抗体ライブラリーの作製は、実施例１に詳細に記載される。
【００７２】
（２）多価抗体ファージディスプレイライブラリー）
ファージディスプレイ抗体ライブラリーから、インターナライズする抗体を選択する可能性は、ディスプレイされた抗体の価数を増加させることによって増加される。このアプローチは、正常な細胞表面レセプター生物学を利用する。しばしば、細胞表面レセプター（例えば、増殖因子レセプター）は、ホモまたはヘテロの二量体化（または三量体化、または四量体化など）のプロセスを通じてそれらのコグネイトリガンドを結合させることに際して活性化する。このプロセスにおけるレセプターサブユニットの会合は、直接的に（例えば、二価リガンドにより結合される場合）か、またはレセプター中のコンフォメーション変化を引き起こすことにより間接的に媒介され得る。
【００７３】
ディスプレイライブラリー（例えば、ファージディスプレイライブラリー）中の多価抗体が、このプロセスを模倣し得、エンドサイトーシスを刺激し得、インターナライズされるようになり得、そしてそれらの有効荷重（ｐａｙｌｏａｄ）を細胞質ゾルに送達し得ることが、本発明の発見であった。従って、インターナライズする抗体を同定するかまたはインターナライズするエプトープを認識する可能性を増大させるために、本発明の好ましい実施態様は、多価ファージディスプレイ抗体ライブラリーを利用する。多価ファージディスプレイ抗体ライブラリーは、本発明以前にはまだ作製されていなかったと考えられる。多価提示ペプチドファージライブラリーとは異なり、ファージ抗体ライブラリーは、代表的には、ファージミド系を使用するファージ表面上の単コピーとして、ｐＩＩＩに融合されたモノマー単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）またはＦａｂ抗体フラグメントを提示する（Ｍａｒｋｓら、（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７；Ｓｈｅｅｔｓら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：６１５７−６１６２）。
【００７４】
本明細書中で使用されるように、多価ファージディスプレイ抗体ライブラリーは、各メンバー（例えば、ファージ粒子）が平均して２以上の結合ドメインを提示するライブラリーを意味し、ここで、各結合ドメインは、可変の重鎖領域および可変の軽鎖領域を含む。より一般的には、多価ファージディスプレイライブラリーは、平均して、ページ（ｐａｇｅ）粒子当たり２以上のｐＩＩＩ融合物を提示する。多価ファージディスプレイは、ダイアボディー（ｄｉａｂｏｄｙ）（すなわち、２つの単鎖抗体の融合または結合体化によって形成されたタンパク質（例えば、ｓｃＦｖ））を発現させることによるか、または各ファージ粒子上における平均して２つ以上の抗体の提示によって達成され得る。対して、単価ライブラリーは、平均して、ウイルス粒子当たり１つの単鎖抗体を提示する。
【００７５】
（ａ）ダイアボディー発現）
ダイアボディーは、各鎖が、同じ鎖上のドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカー（例えば、ペプチドリンカー）を用いて連結された重鎖（ＶH）および軽鎖（ＶL）可変ドメインからなるｓｃＦｖダイマーである。結果的に、対合は、２つの異なる鎖の相補的ドメイン間で生じ、２つの結合部位を有する安定な非共有結合ダイマーを作製する（Ｈｏｌｌｉｇｅｒら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０：６４４４−６４４８）。Ｃ６．５ダイアボディーを、Ｉｇ  ＶHおよびＶLドメイン間のペプチドリンカーを１５アミノ酸から５アミノ酸に短縮することにより構築した。そしてこれは、Ｃ６．５（４．０×１０-10Ｍ）（Ａｄａｍｓら（１９９８）Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．７７：１４０５−１４１２、１９９８）よりも約４０倍低いＫdで、ＳＫＢＲ３細胞上でＥｒｂＢ２に二価的に結合する。
【００７６】
本明細書中に記載の実施例５において、Ｃ６．５ダイアボディー遺伝子を、ファージミドｐＨＥＮ−１におけるｐＩＩＩ融合物としての発現のためにサブクローニングした（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：４１３３−４１３７）。このことは、ヘルパーファージでのレスキュー後に主に単一のｓｃＦｖまたはダイアボディー−ｐＩＩＩ融合物を発現するファージミドを生じた（Ｍａｒｋｓら（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１６００７−１６０１０）。ダイアボディーファージミドは、１つのｓｃＦｖ−ｐＩＩＩ融合分子および１つのネイティブのｓｃＦｖ分子の分子間対合から生じるダイアボディーフラグメントを提示する。本明細書中で提供された教示を使用して、当業者は、他のダイアボディーを慣用的に生成し得る。
【００７７】
ｓｃＦｖの二価ダイアボディーまたは多重コピーを提示するファージは、モノマーｓｃＦｖを提示するファージより効率的にエンドサイトーシスされ、そして感染性ファージの回収を、細胞をクロロキンとプレインキュベートすることにより増大させた。
【００７８】
この結果は、１０9メンバーのライブラリーにおいて、単一のファージ抗体メンバーについて存在する低い濃度でさえも、エンドサイトーシス可能な抗体について選択することが可能であることを示す。
【００７９】
（ｂ）単鎖抗体の多価ディスプレイ）
ダイアボディーの使用に対する代替として、各ウイルス粒子が、平均して、少なくとも２コピー、好ましくは少なくとも３コピー、より好ましくは少なくとも４コピー、そして最も好ましくは少なくとも５コピーの単鎖抗体を発現する抗体ファージディスプレイライブラリーが、作製される。
【００８０】
原則的には、ページ上のｐＩＩＩの各コピー（そして、１ファージ当たりに３コピーまたは５コピーのｐＩＩＩが存在するかに関して論争がある）は、抗体を発現しているはずである。しかし、タンパク質溶解が起こり、そして実際に提示される数は代表的には低い。従って、好ましい多価抗体ライブラリーは、ファージベクター中で構築されるが、ファージミド（ｐｈａｇｅ  ｍｉｄ）ベクター中では構築されない。このことは、ヘルパーファージがファージを作製するために添加される必要がないことを意味する。ヘルパーファージは、ｓｃＦｖ−ｐＩＩＩ融合物と競合するＥ．ｃｏｌｉ野生型ｐＩＩＩになる。従って、ファージミドベクターにおいて、この競合により、平均して、ファージ当たりたった１つ（またはそれ未満）の抗体に至る。
【００８１】
多価抗体ライブラリーを生成するために、単鎖抗体（代表的にはファージミドで発現された）は、ファージミドベクターからファージベクターにサブクローン化される。ヘルパーファージは必要とされず、そして野生型ｐＩＩＩと融合ｓｃＦｖ  ｐＩＩＩ融合物との間には競合は存在せず、従って、平均して、ファージは、２つ以上のｐＩＩＩ融合物を提示する。従って、例示のために、実施例５は、Ｃ６．５  ｓｃＦｖ遺伝子のファージベクターｆｄ−Ｓｆｉ／Ｎｏｔへのサブクローン化を記載する。これは、３〜５コピーの各ｓｃＦｖ−ｐＩＩＩ融合タンパク質を有するファージを生じる。
【００８２】
（Ｂ）標的細胞）
本発明の標的細胞は、インターナライズするポリペプチドまたは抗体を同定することが所望されるか、またはインターナライズするマーカー（例えば、レセプター）を同定することが所望される任意の細胞を包含する。この細胞は、多細胞真核生物、単細胞真核生物（植物および真菌を含む）の細胞、および原核生物細胞でさえも包含し得る。好ましい標的細胞は、真核生物、より好ましくは、脊椎動物細胞、および最も好ましくは哺乳動物細胞（例えば、マウス、ウシ、霊長類（ヒトを含む）、大型動物（ｌａｒｇｏｍｏｒｐｈ）、イヌ、ネコなどに由来する細胞）である。細胞は、正常な健常細胞であり得るか、または特定の病状によって特徴付けられる細胞（例えば、腫瘍細胞）であり得る。
【００８３】
標的細胞は、以下に有用である場合の任意の細胞型を包含し得る：１）細胞型または関連した細胞型を特異的に認識する抗体を有する（例えば、細胞選別、細胞染色、または他の診断手順のために）；２）細胞型または関連した細胞型に特異的にインターナライズされるリガンドを有する（例えば、毒性または治療用の遺伝子もしくはタンパク質を送達するために）。さらなる標的細胞は、分化細胞（すなわち、組織（例えば、前立腺、乳房）になるように分化された細胞）を包含するが、これらに限定されない。従って、前立腺細胞を認識し、そして殺傷した抗体は、たとえそれが正常な前立腺細胞を殺傷しようと、前立腺癌に良好である（前立腺は、必須の器官ではない）。標的細胞は、組織特異的細胞、および所定の発生段階の細胞を包含し得る。標的細胞はまた、前駆細胞（例えば、骨髄幹細胞）を含み得、これは、単離、おそらく分化について刺激することについて有用である。
【００８４】
標的細胞はまた、公知のレセプター（例えば、ＥｒｂＢ２）の遺伝子でトランスフェクトされた細胞株を包含し得る。このレセプターは、インターナライズする抗体を有するために有用である。
【００８５】
多くのＥｒｂＢ２抗体は、インターナライズしていない。組換えタンパク質で免疫するか、または組換えタンパク質についてファージライブラリーを選択するよりむしろ、インターナリゼーションについてのＥｒｂＢ２トランスフェクト細胞の選択は、所望の特徴（インターナリゼーション）を有する抗体を正確に生じるはずである。最後に、ｃＤＮＡライブラリーは、所望の標的細胞株または組織由来の細胞株（例えば、ＣＯＳ）にトランスフェクトされ得、そしてファージ抗体は、インターナリゼーションについて選択され得る。数回の選択後、ファージは、トランスフェクト細胞を（例えば、ＦＡＣＳによって）染色および選別するために使用され得る。ＤＮＡは、細胞から回収され得る。これは、インターナライズするレセプターの配列、ならびにそれらに結合するファージ抗体を生じる。
【００８６】
（Ｃ）サブトラクティブ細胞株の細胞）
本発明のアッセイの好ましい実施態様では、ファージディスプレイライブラリーを、「サブトラクティブ」細胞株由来の細胞と接触させる。この工程は、細胞に非特異的に結合するか、または標的に対して結合するポリペプチドもしくは抗体を得るために所望される標的以外の標的に結合するかのいずれかであるファージディスプレイライブラリーのメンバーを枯渇または除去することが意図される。「サブトラクティブ」細胞株由来の細胞との接触は、標的細胞が、ファージディスプレイライブラリーのメンバーと接触される前、間、もしくは後に生じ得る。しかし、好ましい実施態様では、サブトラクティブ細胞株の細胞との接触は、標的細胞の接触と同時である。従って、例えば、好ましい実施態様では、標的細胞株（組織培養プレートに付着して増殖）を、単一細胞培養フラスコ中のサブトラクティング細胞株（懸濁中）と同時インキュベートさせる。
【００８７】
事実上任意の細胞が、サブトラクティブ細胞として作用し得る。しかし、好ましい実施態様では、サブトラクティブ細胞は、標的細胞上に全てのマーカーを提示する。但し、所望の結合抗体または結合ポリペプチドの選択のために標的として作用するマーカー（例えば、レセプター）を除く。従って、特に好ましい細胞は、共通のインターナライズする細胞表面レセプター（例えば、トランスフェリン）を有することによって標的細胞に密接に関連する（例えば、線維芽細胞）。腫瘍細胞株において選択する場合（例えば、胸部腫瘍細胞株）、正常な胸部細胞株に対してネガティブに選択し得る。しかし、このことは、過剰発現した抗原に結合する抗体について枯渇し得、そのため再度、並行した経路は線維芽細胞においてネガティブ選択することである。トランスフェクト細胞を使用しようとした場合、非トランスフェクト細胞がサブトラクティブ細胞株として使用され得る。腫瘍が上皮起源である場合、好ましいサブトラクティブ細胞もまた上皮であり、なおより好ましくは同じ組織または器官由来である。
【００８８】
特に好ましいサブトラクティブ細胞は、未分化細胞株、非トランスフェクト細胞、未分化細胞および非トランスフェクト細胞の混合物を包含するが、これらに限定されない。腫瘍細胞上でのインターナリゼーションについて選択する場合、好ましいサブトラクティブ細胞株は、好ましくは、同じ組織の非腫瘍細胞である（例えば、胸部腫瘍細胞、対、正常胸部上皮細胞）。また、ｃＤＮＡ発現ライブラリーのために、サブトラクティブ細胞株は、ライブラリー構築のために使用される非形質転換細胞株である（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯなど）。
【００８９】
１つの特に好ましい実施態様では、「標的」細胞は、特異的標的レセプターの遺伝子またはｃＤＮＡで形質転換された細胞である。この場合、サブトラクティブ細胞株は、好ましくは、非トランスフェクト細胞株である。従って、例えば、ＣＨＯ細胞がＥＧＦレセプターの遺伝子を含むベクターで形質転換された場合、ＥＧＦ発現細胞は、標的細胞株として使用され、そしてサブトラクティブ細胞株は、形質転換されていないＣＨＯ細胞である。このアプローチを使用して、インターナライズする抗ＥＧＦレセプター抗体が得られた。
【００９０】
サブトラクティブ細胞は、標的細胞に対して過剰に提供された場合、より効果的である。過剰は、好ましくは少なくとも約２倍から約１０００倍過剰であり、より好ましくは、約３倍から約１００倍過剰であり、そして最も好ましくは約５倍から５０倍過剰である。１つの実施態様では、５倍過剰で十分である。
【００９１】
（Ｄ）洗浄工程）
上記のように種々の洗浄工程が、本発明の方法において使用される。特に、「弱い」洗浄工程が使用されて、サブトラクティブ細胞、およびファージディスプレイライブラリーの弱く結合するメンバーまたは非特異的結合メンバーを除去し得る。第２の強い洗浄工程は、好ましくは、ファージディスプレイライブラリーのメンバーのインターナリゼーション後に使用される。「強い」洗浄工程は、強固に結合した表面ファージおよび弱く結合した表面ファージを取り除くことを意図する。
【００９２】
弱いおよび強い洗浄工程を行なうための緩衝液および方法は、当業者に周知である。例えば、弱い洗浄は、標準的な緩衝液または培養培地（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水（緩衝液）ＤＭＥＭ（培養培地）など）を用いて行われ得る。
【００９３】
（Ｅ）インターナライズする条件下での培養）
上記で説明したように、細胞は、好ましくは、「インターナライズする」条件下で培養される。インターナライズする培養条件とは、細胞が、適切な（例えば、インターナライズする）部位またはレセプターでファージディスプレイライブラリーのメンバーにより結合される場合、細胞中へ結合メンバーを輸送する条件である。これは、小胞へ、小胞体へ、ゴルジ複合体へ、または細胞自身の細胞質中への輸送を含み得る。
【００９４】
インターナライズする条件は、細胞が、そのネイティブな状態の細胞の状態を模倣する条件下で培養される場合、最も容易に達成される。したがって、多くの細胞（例えば、上皮細胞）は、好ましくは、基底膜に結合された接着層として増殖する。そのような細胞は、それらが接着性の単層として培養される場合、結合ポリペプチドおよび結合抗体をより有効にインターナライズする。クロロキンおよび血清を含まない培地の両方は、非特異的インターナリゼーションを回避し、そして特異的インターナリゼーション（目的のレセプターのインターナリゼーションを誘導し、そしてその隣にある非特異的ファージを取りこむ血清中のリガンド）を増強する。さらに、インターナリゼーションを生じるために、細胞は、インターナリゼーションを可能にする温度およびｐＨで培養されるべきである。適切な温度およびｐＨは、ぞれぞれ約３５℃〜約３９℃およびｐＨ６〜約ｐＨ８、より好ましくは、約ｐＨ６．５〜約ｐＨ７．５、好ましい温度とｐＨは、約３７℃およびｐＨ７．５である。好ましい実施態様において、細胞は、ファージおよび競合（サブトラクション）細胞を添加する約２時間前に血清培養培地中で、予めインキュベートされる。
【００９５】
（Ｆ）インターナライズしたファージの同定）
インターナライズしたファージディスプレイライブラリーのメンバーは、直接的または間接的に同定され得る。直接的同定は、単に細胞内のファージを可視化することにより（例えば、免疫蛍光または共焦点顕微鏡を介して）達成され得る。ファージのインターナリゼーションは、細胞中で発現されるレポーター遺伝子を送達するそれらの能力により同定され得る。レポーター遺伝子は、検出可能なシグナル（例えば、蛍光シグナル（例えば、ｌｕｘ、緑色蛍光タンパク質など）または比色シグナル（例えば、ＨＲＰ、β−ガラクトシダーゼ）あるいは、それ自身が選択マーカーであり得る（例えば、抗生物質耐性遺伝子））を産生する遺伝子であり得る。そのようなファージにおけるβ−ガラクトシダーゼおよびＧＦＰの両方のレポーター遺伝子としての使用は、本明細書中に記載される。
【００９６】
あるいは、ファージディスプレイのメンバーは、マーカー（例えば、標識）を有し得、そして単に標識の検出（例えば、フローサイトメトリー）により検出され得るインターナライズされたファージを含有する細胞を検出し得る。直接的な方法は、好ましくは、選択が行なわれた後に結合しているレセプターまたは細胞の同定のために使用される。セルソーティングアプローチ（ＦＡＣＳ）は、表面結合またはインターナライズされたファージのいずれかの同定に働くことが注目される。しかし、特異性のさらなるレベルは、細胞が溶解前にインターナライズされたファージの存在についてまず選別される場合、達成され得る。直接的な方法はまた、選択されたファージが実際にインターナライズされることを実証するための分析期の間に使用される。
【００９７】
あるいは、インターナライズされたファージディスプレイライブラリーのメンバーが、間接的に同定され得る。間接的検出方法において、ファージディスプレイライブラリーのメンバーは、それらが細胞内に存在する間に検出される必要はない。それらは単に、インターナライズされるだけで十分である。
【００９８】
間接的同定は、例えば、以下に記載されるような細胞中にインターナライズされたファージを、単離および拡大することにより達成される。間接的同定は、同定されたファージディスプレイライブラリーのメンバーが、引き続く選択工程において使用されるか、または続くモノクローナルファージの特徴付け（選択の結果についての分析のため）をするためのモノクローナルファージゲノムを有する細菌を単離する場合、特によく適している。
【００９９】
（Ｇ）インターナライズしたファージの同定および拡大）
本発明の発見は、標的細胞（例えば、哺乳動物腫瘍細胞）中にインターナライズされたファージディスプレイライブラリーのメンバーが生存し続け、そして回収され得、そして続く選択および／または単離の工程、ならびに特定のメンバーの特徴づけに適切な「選択された」ライブラリー中へ拡大され得るということである。
【０１００】
本明細書中で使用する場合、用語「回収」は、感染ファージの回収ならびに／あるいはファージ抗体遺伝子の回収および／または抗体遺伝子を伴う異種核酸の回収を含むことを意図する。
【０１０１】
インターナライズされたファージは、標準的な方法を用いて、単離および拡大され得る。代表的には、それらは、細胞の溶解（例えば、１００ｍＭのトリエチルアミン（高ｐＨ）を用いて）および適切な細菌宿主（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１）に感染する溶解物を使用することを含む。次いで、ファージ含有細菌は、標準的な方法に従って、培養される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）、Ｍａｒｋｓら、（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７を参照のこと）
（ＩＶ．インターナライズする抗体の調製および改変）
以下に記載するように、一旦インターナライズする抗体が同定されると、抗体のさらなるコピーが、化学合成手段または組換え発現系のいずれかを使用することにより調製され得る。さらに、他の「関連した」インターナライズする抗体は、同じエピトープに結合する抗体についてスクリーニングすることにより、および／または改変された抗体のライブラリーを産生する同定されたインターナライズする抗体の改変により同定され得、次いでライブラリーのインターナリゼーションにおいて抗体を再スクリーニングする。
【０１０２】
（Ａ）抗体合成）
（１）化学合成）
インターナライズする抗体は、本発明の方法により一旦同定されると、ペプチド合成の周知の方法を使用して化学的に合成され得る。配列のＣ末端アミノ酸が不溶性支持体に結合され、その後に配列中の残るアミノ酸の連続的な付加をする、固相合成は、単鎖抗体の化学合成のための１つの好ましい方法である。固相合成のための技術は、以下により記載される：ＢａｒａｎｙおよびＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；３−２８４頁、Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｂｉｏｌｏｇｙ．第２巻：Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｐａｒｔ  Ａ．、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄら（１９６３）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、８５：２１４９−２１５６、およびＳｔｅｗａｒｔら、（１９８４）Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第２版、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．、Ｒｐｃｋｆｏｒｄ、ＩＩＩ。
【０１０３】
（２）インターナライズする抗体の組換え発現）
好ましい実施態様において、インターナライズする抗体は、本発明の方法により一旦同定されると、当業者に周知の標準的な技術により調製される。インターナライズする抗体をコードする核酸配列が決定される（例えば、Ｓａｎｇｅｒ配列決定を介して）。配列情報を使用して、核酸は、当業者に公知の多くの標準的な方法により化学的に合成され得る。オリゴヌクレオチド合成は、好ましくは、市販の固相オリゴヌクレオチド合成機（Ｎｅｅｄｈａｍ−ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒら（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：６１５９−６１６８）を実行するか、またはＢｅａｕｃａｇｅら（Ｂｅａｕｃａｇｅら（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｓ．２２（２０）：１８５９−１８６２）により記載される固相ホスホロアミダイトトリエステル法を用いて手動で合成される。あるいは、抗体をコードする核酸は、標準的な方法により増幅および／またはクローニングされ得る。
【０１０４】
これらの目的を達成するための分子クローニング技術は、当該分野で公知である。広範な種々のクローニング方法およびインビトロ増幅方法が、組換え核酸の構築に適切である。多くのクローニング実施を通して、当業者を指示するのに十分なこれらの技術および説明の例は、ＢｅｒｇｅｒおよひＫｉｍｍｅｌ、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  第１５２巻  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（Ｂｅｒｇｅｒ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版）１−３巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）；およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．およびＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．との間の合弁会社（１９９４遺補）（Ａｕｓｕｂｅｌ）、に見出される。組換え免疫グロブリンの産生の方法もまた、当該分野において公知である。Ｃａｂｉｌｌｙ、米国特許第４，８１６，５６７号；およびＱｕｅｅｎら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１００２９−１００３３を参照のこと。さらに、抗体の単離およびクローニングの詳細なプロトコルは、本明細書中の実施例およびＳｃｈｉｅｒら（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２６３：５５１−５６７において提供される。
【０１０５】
（Ｂ）同じ「インターナライズする」エピトープに結合する他の抗体の同定）  一旦、１つ以上のインターナライズする抗体が、本発明のスクリーニング方法により同定されると、他の「関連する」インターナライズする抗体は、同定されたインターナライズする抗体と、抗体により結合されるエピトープにおいて、またはインターナライズする抗体に対して惹起されるイディオタイプ抗体と結合するエピトープのいずれかで交叉反応する抗体をスクリーニングすることにより、同定され得る。
【０１０６】
（１）抗イディオタイプ抗体との交差反応性）
イディオタイプは、抗体の高度に可変性である抗原結合部位を表し、そしてこれ自身免疫原性である。抗体媒介性免疫応答の生成の間に、個体は、抗原に対する抗体、ならびに抗イディオタイプ抗体（この免疫原性結合部位（イディオタイプ）は、抗原を模擬する）を発達させる。
【０１０７】
抗イディオタイプ抗体は、当業者に周知の標準的な方法を使用する本発明のスクリーニングシステムにおいて同定されたインターナライズする抗体の可変領域に対して惹起され得る。簡潔には、抗イディオタイプ抗体は、本発明のインターナライズする抗体、またはそのフラグメント（例えば、ＣＤＲ）を動物に注射し、それによって抗体上の種々の抗原決定基（イディオタイプ領域における決定基を含む）に対する抗血清を誘発することによって作製され得る。
【０１０８】
抗被分析物抗体の産生のための方法は、当該分野において周知である。大きな分子量の抗原（約５０００ダルトンより大きい）は、動物に直接的に注射され得るが、小さな分子量の化合物（約５０００ダルトン未満）は、それらを免疫原性にするために、好ましくは、高分子量の免疫原性キャリア（通常は、タンパク質）と結合される。免疫化に応答して産生される抗体は、血清、腹水、免疫グロブリン（Ｉｇ）画分、ＩｇＧ画分として、またはアフィニティ精製された単一の特異性の物質として利用され得る。
【０１０９】
ポリクローナル抗イディオタイプ抗体は、上記のように調製される本発明の抗体を用いて動物を免疫することによって調製され得る。一般的には、この抗体（例えば、ファージディスプレイライブラリー）が由来する動物の種であり、かつアロタイプがその動物と適合した動物を免疫化することが所望され得る。このことは、非イディオタイプ決定基に対して指向された抗体の産生を最小化する。次いで、上記のように得られた抗血清は、通常、ファージディスプレイライブラリーが由来するのと同じ種由来の正常な血清に対して大量に吸収され、それによって、非イディオタイプ決定基に対して指向された抗体を排除する。吸収は、正常な（非免疫）血清タンパク質をグルタルアルデヒドと架橋することによって形成されるゲルに対して抗血清を通過させることによって達成され得る。抗イディオタイプ特異性を有する抗体は、直接ゲルを通過するが、非イディオタイプ決定基についての特異性を有する抗体は、ゲルと結合する。不溶性ポリサッカリド支持体（例えば、セファロース）上での非免疫血清タンパク質の固定化もまた、吸収のための適切なマトリックスを提供する。
【０１１０】
モノクローナル抗イディオタイプ抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５の方法を用いて生成され得る。特に、モノクローナル抗イディオタイプ抗体は、ハイブリドーマ技術を使用して調製され得る。この技術は、（１）目的の抗原またはハプテンキャリア結合体で免疫されたマウス由来の脾臓細胞（すなわち、本発明の抗体またはその部分配列）、（２）薬剤（例えば、８−アザグアニン）に対する耐性について選択されたマウス骨髄腫細胞株との融合を含む。一般に、免疫グロブリンを分泌しない骨髄腫細胞株の使用が所望される。いくつかのそのような株が、当該分野で公知である。好ましい細胞株は、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３である。この細胞株は、ＣＲＬ−１５８０のようにアメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託される。
【０１１１】
融合は、確立された方法（例えば、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｒ．Ｋｅｎｎｅｔｔ、Ｊ．ＭｃＫｅａｒｎおよびＫ．Ｂｅｃｈｔｏｌ編、Ｎ．Ｙ．、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、１９８０、およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ＆  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第８１巻、Ｆ．Ｍｅｌｃｈｅｒｓ，Ｍ．ＰｏｔｔｅｒおよびＮ．Ｌ．Ｗａｒｎｅｒ編、Ｎ．Ｙ．、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、１９７８を参照のこと）に従って、ポリエチレングリコールの存在下で実施され得る。細胞と融合されたおよび融合されなかった、得られた混合物をヒポキサンチンアミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）選択培地にプレートする。これらの条件下で、ハイブリッド細胞のみが増殖する。
【０１１２】
十分な細胞増殖が生じた時に（代表的には、融合後１０〜１４日）、培養培地を採取し、そして固相ＲＩＡおよび酵素結合イムノソルベント検定法を含む多くの方法のいずれか１つにより、モノクローナルイディオタイプ抗被分析物抗体の存在についてスクリーニングする。次いで、所望の特異性の抗体を含む培養ウェルからの細胞は、拡大されそして再クローニングされる。次いで、目的に抗体に対して陽性を維持する培養物由来の細胞は、通常、感受性であり、組織適合性であり、プリスタンで感作されたマウスにおいて腹水腫瘍として継代される。
【０１１３】
腹水は、腹腔の穿刺により採取され、抗体について再検査され、そして上記のように精製される。非分泌骨髄腫株が融合に使用される場合、モノクローナル抗体のアフィニティー精製は、通常必要がない。なぜなら、抗体は、すでにその抗原結合特性に対して均質だからである。腹水の夾雑タンパク質からそれを単離すること（すなわち、免疫グロブリン画分を産生すること）が必要なことの全てである。
【０１１４】
あるいは、目的のハイブリッド細胞株は、血清を含まない組織培養物中で増殖され得、そして抗体は、培養培地から採取される。一般に、これは、大量の抗体を得るのには、あまり望ましくない方法である。なぜなら、収量が低いからである。細胞をマウスの静脈に通過させることおよび血清から抗体を採取することがまた、可能である。この方法は、一般的に好ましくない。なぜなら、採血あたりの得られ得る血清の量が少なく、そして他の血清成分からの非常に広範な精製が必要だからである。しかし、いくつかのハイブリドーマは、腹水腫瘍として増殖しない。従って、抗体を得る代替的なこれらの方法の１つを使用しなければならない。
【０１１５】
（２）Ｆ５またはＣ１エピトープとの交差反応性）
抗イディオタイプ抗体の代わりに、他のインターナライズする抗体は、元々の選択において使用したエピトープに対する同定された「プロトタイプの」抗体との交差反応性によって同定され得る。エピトープマッピング形式における「プロトタイプの」インターナライズする抗体と新たな候補との間の競合は、その抗体が同じエピトープに対して競合していることを確立する。
【０１１６】
（Ｃ）他の「関連する」インターナライズする抗体を選択するためのファージ）ディスプレイ法
（１）鎖シャッフリング法）
より高親和性の抗体を作製するために、同定されたインターナライズする抗体の結合の配列に基づく変異体ｓｃＦｖ遺伝子レパートリーは、ファージの表面上で作製され、そして発現される。より高い親和性ｓｃＦｖは、上記および実施例で記載されるように、抗原上で選択される。
【０１１７】
改変された単鎖抗体（ｓｃＦｖ）遺伝子レパートリーを作製する１つのアプローチは、新たなパートナーを作製するために、元々のＶHまたはＶL遺伝子をＶ遺伝子のレパートリーで置換することであった（鎖シャッフリング）（Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ．３５２：６２４−６２８）。鎖シャッフリングおよびファージディスプレイを使用して、ハプテンフェニルオキサゾロン（ｐｈＯｘ）を結合したヒトｓｃＦｖ抗体フラグメントの親和性は、３００ｎＭから１ｎＭまで（３００倍）増大した（Ｍａｒｋｓら（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３）。
【０１１８】
従って、例えば、インターナライズする抗体の親和性を変更するために、変異体ｓｃＦｖ遺伝子レパートリーは、インターナライズする抗体のＶH遺伝子およびヒトＶL遺伝子レパートリーを含有して作製され得る（軽鎖シャッフリング）。ｓｃＦｖ遺伝子レパートリーは、ファージディスプレイベクターｐＨＥＮ−１中にクローニングされ得（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．，１９：４１３３−４１３７）、そして形質転換の後、形質転換体のライブラリーが得られる。
【０１１９】
同様に、重鎖シャッフリングのために、インターナライズする抗体ＶH  ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３ならびに軽鎖は、ファージ抗体ライブラリー形質転換体を作製するために、ヒトＶH遺伝子レパートリーを含有するベクター中にクローニングされる。抗体親和性を作製するための鎖シャッフリングの詳細な説明については、Ｓｃｈｉｅｒら（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５５：２８−４３，１９９６を参照のこと。
【０１２０】
（２）結合親和性を改善するための部位特異的変異誘発）
アミノ酸側鎖に接触する抗原の大部分は、相補性決定領域（ＣＤＲ）に位置し、３つはＶH（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）に、そして３つはＶL（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）に位置している（Ｃｈｏｔｈｉａら（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１−９１７；Ｃｈｏｔｈｉａら（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３３：７５５−８；Ｎｈａｎら（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１７：１３３−１５１）。これらの残基は、抗原に対する抗体親和性を担う結合エネルギー論の大部分に寄与する。他の分子において、リガンドに接触するアミノ酸を変異させることは、その結合パートナーに対する１つのタンパク質分子の親和性を増大させる有効な手段であることが示されている（Ｌｏｗｍａｎら（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２３４：５６４−５７８；Ｗｅｌｌｓ（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２９：８５０９−８５１６）。ＣＤＲの部位特異的変異誘発およびｃ−ｅｒｂＢ−２に対するスクリーニングは、改善された結合親和性および／または公知のインターナライズする抗体のインターナリゼーションを有するＣ６抗体を作製するために使用され得る。
【０１２１】
（３）より高い親和性ヒトｓｃＦｖを産生するためのＣＤＲ無作為化）
単純な部位特異的変異誘発の延長において、部分ＣＤＲまたはＣＤＲ全体が無作為化される変異体抗体ライブラリーが、作製され得る（ＶL  ＣＤＲ１およびＣＤＲ２、ならびにＶH  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）。１つの実施態様において、各ＣＤＲは、公知のインターナライズする抗体を鋳型として使用して、別々のライブラリーにおいて無作為化される。各ＣＤＲライブラリーからの最も親和性の高いアフィニティー変異体のＣＤＲ配列が、相加的な親和性の増大を得るために組み合わせられる。同様のアプローチが、３．４×１０-10から９．０×１０-13Ｍまで１５００倍にわたって、成長ホルモンレセプターに対するヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の親和性を増大するために使用されてきた（Ｌｏｗｍａｎら（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２３４：５６４−５７８）。
【０１２２】
ＶH  ＣＤＲ３は、しばしば、結合ポケットの中心を占有し、従って、この領域における変異は、親和性の増大を生じるようである（Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６７：３８３−３８６）。１つの実施態様において、４つのＶH  ＣＤＲ３残基は、ヌクレオチドＮＮＳを使用して一度に無作為化される（例えば、Ｓｃｈｉｅｒら（１９９６）Ｇｅｎｅ，１６９：１４７−１５５；ＳｃｈｉｅｒおよびＭａｒｋｓ（１９９６）Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ．７：９７−１０５，１９９６；およびＳｃｈｉｅｒら（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：５５１−５６７，１９９６）。
【０１２３】
（４）ホモダイマーの作製）
（ｓｃＦｖ’）2抗体を作製するために、２つのインターナライズするｓｃＦｖが、リンカー（例えば、炭素リンカー、ペプチド、など）か、または例えば、２つのシステイン間のジスルフィド結合を介してのいずれかで連結される。従って、例えば、ジスルフィド結合したｓｃＦｖを作製するためには、システイン残基が、ｍｙｃタグと本明細書に記載される抗体のカルボキシ末端のヘキサヒスチジンタグとの間での部位特異的変異誘発によって導入される。正確な配列の導入は、ＤＮＡ配列決定によって確認され得る。その構築物が、ｐＵＣ１１９中にある場合、ｐｅｌＢリーダーは、発現されたｓｃＦｖをペリプラズムに指向し、そしてクローニング部位（Ｎｃｏ１およびＮｏｔ１）は、Ｆ５またはＣ１変異体ｓｃＦｖを導入するために存在する。発現されたｓｃＦｖは、ｍｙｃタグをＣ末端に有し、続いて２つのグリシン、システイン、および次いで６個のヒスチジンが続き、ＩＭＡＣによる精製を容易にする。２つのシステイン残基間のジスルフィド結合形成後、その２つのｓｃＦｖを、互いに約２６アミノ酸（２つの１１アミノ酸ｍｙｃタグおよび４つのグリシン）だけ分離する。
【０１２４】
ｓｃＦｖは、この構築物から発現され得、ＩＭＡＣによって精製され得、そしてゲル濾過によって分析され得る。（ｓｃＦｖ’）2ダイマーを作製するために、システインは、１ｍＭ  βメルカプトエタノールとともにインキュベートすることによって還元され、そしてｓｃＦｖの半分は、ＤＴＮＢの添加によって遮断される。遮断されたｓｃＦｖおよび遮断されていないｓｃＦｖは、（ｓｃＦｖ’）2を形成するために互いにインキュベートされ、そして得られる物質が、ゲル濾過によって分析され得る。Ｆ５およびＣ１  ｓｃＦｖ’モノマー、ならびにＦ５およびＣ１（ｓｖＦｖ’）2ダイマーの親和性は、ＢＩＡｃｏｒｅによって決定される。
【０１２５】
特に好ましい実施態様において、（ｓｃＦｖ’）2ダイマーは、ｓｃＦｖ’フラグメントをリンカーを介して、より好ましくは、ペプチドリンカーを介して結合することによって作製される。これは、広範な種々の当業者に周知の手段によって達成され得る。例えば、１つの好ましいアプローチは、Ｈｏｌｌｉｇｅｒら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：６４４４−６４４８（ＷＯ９４／１３８０４もまた参照のこと）に記載される。
【０１２６】
（５）抗体／ポリペプチド結合親和性の測定）
上記に説明されるように、増大したアビディティーについての選択は、標的抗原（例えば、ｃ−ｅｒｂＢ−２）についての抗体の親和性を測定することを含む。このような測定を行う方法は、同時係属中の出願ＵＳＳＮ０８／６６５，２０２に詳細に記載される。簡単には、例えば、Ｆ５、Ｃ１の、またはＦ５由来またはＣ１由来の抗体のＫd、ｃ−ｅｒｂＢ−２への結合の速度反応論は、ＢＩＡｃｏｒｅ（表面プラズモン共鳴に基づくバイオセンサ）において決定される。この技術のために、抗原は、質量の変化を検出し得る誘導体化センサチップに結合される。抗体がセンサチップを通過するとき、抗体はその抗原に結合し、定量可能な質量の増大を生じる。抗体濃度の関数としての会合速度の測定は、会合速度定数（ｋon）を計算するために使用され得る。会合相の後、緩衝液を、そのチップ上に流し、そして抗体の乖離の速度（ｋoff）を決定する。Ｋonは、代表的には、１．０×１０2〜５．０×１０6の範囲において測定され、そしてｋoffは、１．０×１０-1〜１．０×１０-6の範囲である。平衡定数Ｋdは、しばしばｋoff／ｋonとして計算され、従って、代表的には、１０-5〜１０-12の範囲で測定される。このようにして測定された親和性は、蛍光消光滴定によって溶液中で測定された親和性と良好に相関する。
【０１２７】
（Ｖ．ライブラリーおよびベクター）
別の実施態様において、本発明は、本明細書に記載される方法の実施のためのライブラリーおよびベクターを提供する。このライブラリーは、好ましくは、多価のライブラリーであり、ダイアボディー（ｄｉａｂｏｄｙ）ライブラリーを含み、そしてより好ましくは、多価単鎖抗体ライブラリー（例えば、ｓｃＦｖ）（例えば、ファージにより発現された）を含む。
【０１２８】
このライブラリーは、多くの形態をとり得る。従って、１つの実施態様において、このライブラリーは、ファージディスプレイライブラリーのメンバーを含む細胞の集団であるが、一方、別の実施態様において、そのライブラリーは、単離されたファージの集団からなり、そしてなおライブラリーは、多価ファージディスプレイライブラリーをコードする核酸のライブラリーからなる。核酸は、抗体をコードするファージミドベクターであり得、そしてファージベクター中へのサブクローニングの準備ができているか、または核酸は、サブクローン化された抗体をコードする核酸をすでに保有しているファージミドの集団であり得る。
【０１２９】
（ＶＩ．インターナライズする抗体を選択するためのキット）
別の実施態様において、本発明は、本明細書に記載される方法の実施のためのキットを提供する。そのキットは、好ましくは、ファージディスプレイライブラリーのメンバーを含む（例えば、ファージ粒子として、ベクターとして、またはファージを含む細胞として）。このアッセイキットは、さらに、本発明のアッセイの実施のために本明細書に記載される任意の他の成分を含み得る。このような材料は、好ましくは、ヘルパーファージ、１つ以上の細菌または哺乳動物細胞株、緩衝液、抗生物質、標識などを含むが、これらに限定されない。
【０１３０】
さらに、キットは、必要に応じて、本明細書に記載される選択方法を開示する指示（すなわち、プロトコル）を含む説明資料を含み得る。説明資料は、代表的には、記述されたか、または印刷された資料を含むが、これらはこのようなものに限定されない。このような説明書を保存し得る、およびそれらとエンドユーザーとをコミュニケーションさせ得る任意の媒体が、本発明によって意図される。このような媒体には、電子的保存媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒体（例えば、ＣＤ  ＲＯＭ）などが含まれるが、これらに限定されない。このような媒体は、このような説明資料を提供するインターネットサイトへのアドレスを含み得る。
【０１３１】
（実施例）
以下の実施例は、本願発明を例証するために提供するが、限定するためではない。
【０１３２】
（実施例１：１０9〜１０11メンバーを含む非免疫ヒトＦａｂファージ抗体ライブラリーの作製）
以前の１０7メンバーのファージディスプレーライブラリーの操作は、主に２つの制限を示した：１）Ｆａｂの発現レベルは、低すぎて特徴付けに適切な物質を生成しなかった、および２）このライブラリーは、比較的不安定であった。これらの制限は、ファージベクターにおけるライブラリの作製、およびｃｒｅ−ｌｏｘ組換え系の使用の結果である。従って、本発明者らは、この計画に最適なアプローチは、ファージミドベクターを用いて、非常に大きなｓｃＦＶライブラリーを作製することであると判断した。この目的は、本発明者らの以前の３．０×１０7メンバーｓｃＦＶライブラリーよりも少なくとも１００倍大きいライブラリーを作製することであった。取られたアプローチは、別々のレプリコン上のＶHおよびＶLライブラリーをクローン化し、オーバーラップエクステンションによるスプライシングによって、これらをｓｃＦｖ遺伝子レパートリーへと合わせ、そしてこのｓｃＦｖ遺伝子レパートリーをファージディスプレーベクターｐＨＥＮ１中にクローン化することであった。ヒト末梢血リンパ球ＲＮＡおよび脾臓ＲＮＡを、ＩｇＭ重鎖定常領域プライマー、ならびにκ軽鎖定常領域プライマーおよびλ軽鎖定常領域プライマーを用いてプライミングし、そして第１鎖ｃＤＮＡを合成した。第１鎖ｃＤＮＡを、ＶＨ  Ｖκｋ遺伝子およびＶλ遺伝子のレパートリーのＰＣＲ増幅のためのテンプレートとして用いた。
【０１３３】
ＶH遺伝子レパートリーを、Ｎｃｏ１−ＮｏｔＩフラグメントとしてベクターｐＣＵ１１９Ｓｆｉ−Ｎｏｔ中にクローン化して、８．０×１０8メンバーのライブラリーを作製した。このライブラリーは、ＰＣＲフィンガープリント法によると多様であった。一本鎖リンカーＤＮＡを、ＰＣＲを用いてＶL遺伝子レパートリー上に重ね継ぎ、そしてこのレパートリーをＸｈｏＩ−ＮｏｔＩフラグメントとしてベクターｐＨＥＮＩＸｓｃＦｖ中にクローン化して、７．２×１０6メンバーのライブラリーを作製した。このＶHおよびＶL遺伝子レパートリーをこれらのそれぞれのベクターから増幅し、そしてＰＣＲを用いて共に重ね継いで、ｓｃＦｖ遺伝子レパートリーを作製した。このｓｃＦｖ遺伝子レパートリーをＮｃｏＩ−ＮｏｔＩフラグメントとしてこのベクター中にクローン化して、７．０×１０9メンバーのｓｃＦｖファージ抗体ライブラリーを作製した。このライブラリーは、ＢｓｔＮ１フィンガープリント法によって決定した場合に多様であった。
【０１３４】
このライブラリーの質を検証するために、ファージを調製し、そして１４の異なるタンパク質抗原上で選択した。この結果を表１に示す。ｓｃＦｖ抗体を、選択に用いた全ての抗原（ここで、１抗原あたり３〜１５の特有のｓｃＦｖが単離された（平均８．７）を有する）に対して得た（表１）。
【０１３５】
【表１】
0004493845.tif 000002
これは、より小さいｓｃＦｖライブラリーから得た結果に遜色がない（選択に用いた抗原の７０％のみに対して１〜数個のバインダーを得た）。４つの抗ＥｒｂＢ−２  ｓｃＦｖおよび４つの抗ボツリヌス菌ｓｃＦｖの親和性を、ＢＩＡｃｏｒｅにおける表面プラスモン共鳴を用いて測定し、そして抗ＥｒｂＢ２  ｓｃＦｖについては４．０×１０-9Ｍ〜２．２×１０-10Ｍの範囲内にあること、そして抗ボツリヌス菌ｓｃＦｖについては２．６×１-8〜７．１５×１０-8Ｍの範囲内にあることを見出した（表２）。ｓｃＦｖは、選択に用いた抗体に非常に特異的であった（図２）。このライブラリーもまた、抗原の複合体混合物において首尾よく選択し得た。
【０１３６】
【表２】
0004493845.tif 000003
例えば、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ基本小体（クラミジア疾患の病原生物）における選択によって、クラミジアを特異的に認識した７つを得た（表１）。ｓｃＦｖは、ＥＬＩＳＡ、免疫蛍光法、ウエスタンブロット法、エピトープマッピング法および免疫沈降法を含む多数の免疫学的アッセイに首尾よく用いられ得る。各抗原に対する結合抗体の数および結合ｓｃＦｖの親和性は、最良のファージ抗体ライブラリーから得た結果に匹敵する（表３）。従って、このライブラリーを、マウスの二次応答と少なくとも等価な親和性を有する、任意の抗原に対するヒト抗体のパネルの供給源として確立した。
【０１３７】
【表３】
0004493845.tif 000004
これらの実験は、高親和性ヒトｓｃＦｖのパネルが任意の精製された抗原に対して産生され得る、非常に複雑なヒトｓｃＦｖファージ抗体ライブラリーの作製を実証する。このようなライブラリーは、新規の細胞表面マーカーを同定するために細胞の表面をプローブするのに理想的である。
【０１３８】
（実施例２：レセプターを媒介したエンドサイトーシスによる、細胞へのｓｃＦｖの取り込み、そして引き続く回収。）
上記の７．０×１０9メンバーｓｃＦｖファージディスプレーライブラリーを、悪性乳房腫瘍細胞株ＭＢ２３１およびＺＲ−７５−１において、正常な乳房細胞株ＨＢＬ１００におけるネガティブ選択の有り無しの両方で選択した。上節に記載したのと同様の結果を得た。非悪性細胞株と悪性細胞株とを区別し得ない、ｓｃＦｖを単離した。
【０１３９】
選択の特異性を増加させるために、細胞表面レセプターに結合するファージを、スレセプターを媒介したエンドサイトーシによって細胞へ取り込み得、次いでその細胞を溶解することによって細胞から回収し得ることを仮定した。これは、以下のことを仮定した：１）ファージは、レセプターを媒介したエンドサイトーシスによってインターナライズされ得、そして２）このファージはリソソーム分解の前に細胞内から感染状態において回収され得る。インターナライズされたファージ抗体について選択する能力は、２つの利点を有する：１）インターナライズし得るレセプターへ結合する抗体の同定、および２）選択プロセスにおける、さらなるレベルの特異性。インターナライズされる抗体の同定は、インターナリゼーションが必須である場合に、（例えば、免疫毒素、標的化されたリポソーム、標的化された遺伝子治療ベクターなど）多くの標的とした治療的アプローチに非常に有用である。
【０１４０】
（Ａ）Ｆ５またはＣ１ファージのレセプターを媒介したインターナリゼーション）
原理の証拠を決定するために、本発明者らは、Ｃ６．５ファージおよびＣ６．５ダイアボディーファージを利用した（同時係属中の出願の米国特許出願第０８／６６５，２０２号を参照のこと）。本発明者らは、以前にｓｃＦｖはインターナライズされるが、低速であること、そしてＣ６．５ダイアボディーは、幾分良くインターナライズされる（おそらく、このダイアボディーがレセプター二量体化を引き起こすため）ことを示した。Ｃ６．５ファージ、Ｃ６．５ダイアボディーファージ、または無関係な抗ボツリヌス菌ファージをＳＫＢＲ３細胞（ＥｒｂＢ２発現乳房腫瘍細胞株）と共に３７℃または４℃のいずれかでインキュベートし、そしてインターナライズされているファージを、ＰＢＳおよび低ｐＨグリシン緩衝液を用いて連続的に洗浄することによって除去した。次いで、細胞を透過処理し、そしてビオチン化抗Ｍ１３抗体を添加し、次いでストレプトアビジンＴｅｘａｓ  Ｒｅｄを添加した。次いで、細胞を共焦点顕微鏡によって検査した。Ｃ６．５ファージおよびＣ６．５ダイアボディーファージの両方を、細胞質内で観測した。約１％の細胞が、Ｃ６．５ファージをインターナライズし、そして２０％の細胞が、Ｃ６．５ダイアボディーファージをインターナライズしていた。抗ボツリヌス菌ファージのインターナリゼーションは存在しなかった。
【０１４１】
感染性ファージが、特異的に取り込まれ得、そして細胞内から回収され得たか否かを決定するために、Ｃ６．５ファージまたはＣ６．５ダイアボディーファージをＳＫＢＲ３細胞とともに３７℃でインキュベートした。非結合ファージを、ＰＢＳを用いて取り除き、そして細胞表面に結合したファージを、低ｐＨグリシンを用いて２度洗浄することによって溶出した。次いで、この細胞を溶解し、そして各画分（初回および２回目のグリシン洗浄液、ならびに細胞質画分）を用いてＥ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１に感染させた。抗ボツリヌス菌ファージ（グリシンで１回洗浄）の、２０倍（Ｃ６．５）または３０倍（Ｃ６．５ダイアボディー）のファージが細胞表面に結合していた（表４）。２回目のグリシン洗浄の後、細胞表面由来の感染性ファージの力価は低下していた。このことは、洗浄が、表面結合ファージを除去することに効果的であったことを示した（表４）。細胞溶解の後、力価は、２回目のグリシン洗浄液の１０倍（Ｃ６．５ファージ）または５０倍（Ｃ６．５ダイアボディーファージ）を超えて増加した。本発明者らは、この力価は、細胞内から回収したファージを示すと考える。この細胞内からのファージの回収は、抗ボツリヌス菌ファージについてよりも、ＥｒｂＢ２結合Ｃ６．５について１００倍高く、Ｃ６．５ダイアボディーファージについて２００倍高かった（表４）。
【０１４２】
【表４】
0004493845.tif 000005
まとめると、これらの結果は以下のことを示す：１）細胞表面レセプターに結合するファージは、細胞によって取り込まれ得、そして感染性ファージが細胞質から回収され得た。取り込みの量は、非結合ファージの取り込みよりも有意に多く、そしてこの１００〜２００倍の差異が、ライブラリーから富化し得る十分な範囲内である。この結果からは未知であることは、このファージ抗体が、レセプター媒介性のインターナリゼーションを媒介しているか否か、またはファージ抗体が、膜の代謝回転によって結合した後に、単に取り込まれるか否かである。
【０１４３】
（Ｂ）ファージ抗体ライブラリーからのインターナライズ抗体の選択および特徴付け）
上記の結果は、本発明者らを、上記のファージ抗体ライブラリーの選択を試み、インターナライズされた新規なファージ抗体を同定するよう駆り立てた。ファージ抗体をライブラリーからレスキューし、そしてＳＫＢＲ３細胞上で選択した。選択のために、ファージを３７℃で細胞と共にインキュベートし、非結合ファージを、ＰＢＳで細胞を洗浄することによって除去し、そして細胞表面抗原に結合したファージを、低ｐＨグリシンでの連続的な洗浄によって除去した。次いで、細胞を、インターナライズされたファージを放出するために溶解し、そして溶解物を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１を感染させ、次回の選択のためのファージを調製した。３回の選択を行った。各回の選択由来の１００のクローンを、ＳＫＢＲ３細胞への結合について、およびＥｒｂＢ２細胞外ドメインへの結合について、ＥＬＩＳＡによって分析した。本発明者らは、ＳＫＢＲ３細胞がＥｒｂＢ２を高レベルで発現することが公知であり、そしてＥｒｂＢ２が、インターナライズされることが公知であるレセプターであることから、ＥｒｂＢ２に対するバインダーを獲得するようであると仮説した。各回の選択後、細胞質から回収したファージの力価は増加した（表５）。３回目後、クローンの４５％が、ＳＫＢＲ３細胞結合に陽性であり、そして１７％が、ＥｒｂＢ２に結合した（表５）。
【０１４４】
【表５】
0004493845.tif 000006
独特なバインダーの数を推定するため、ＥＬＩＳＡ陽性クローンからｓｃＦｖ遺伝子をＰＣＲ増幅し、ＢｓｔＮ１での消化によって、フィンガープリントした。２つの独特な制限パターンを同定した。ｓｃＦｖ遺伝子を配列決定し、そして２つの独特なＥｒｂＢ２結合ｓｃＦｖを同定した。ＥｒｂＢ２に結合しなかったＳＫＢＲ３  ＥＬＩＳＡ陽性クローンの同様の分析によって、さらなる１１の独特なｓｃＦｖが同定された。
【０１４５】
ファージ抗体がＳＫＢＲ３細胞に特異的であることを確証するために、ファージを、各独特なクローンから調製し、そしてＳＫＢＲ３細胞（高ＥｒｂＢ２発現）および２つの他の上皮腫瘍細胞株（ＳＫ−ＯＶ−３（中程度のＥｒｂＢ２発現）およびＭＣＦ７（低ＥｒｂＢ２発現））ならびに正常乳房細胞株（ＨＳ５７８Ｂ）への結合について分析した。各独特なクローンは、腫瘍細胞株を特異的に染色したが、正常乳房細胞株は染色しなかった。
【０１４６】
ＳＫＢＲ３細胞およびＭＣＦ７細胞を、ファージ抗体Ｃ６．５（陽性コントロール）、３ＴＦ５および３ＧＨ７と共にインキュベートした。後者２つのクローンをライブラリーから単離した（３ＴＦ５はＥｒｂＢ２および３ＧＨ７に結合する抗原（未知）に結合する）。３つ全てのファージ抗体は、ＳＫＢＲ３細胞（選択細胞株でかつ高ＥｒｂＢ２発現因子）を強く染色する。Ｃ６．５ファージは、ＭＣＦ７細胞（低ＥｒｂＢ２発現因子）を弱く染色する。ライブラリー由来の抗ＥｒｂＢ２クローン３ＴＦ５は、３ＧＨ７同様、Ｃ６．５よりＭＣＦ７細胞をかなりより強く染色する。
【０１４７】
ＳＫＢＲ３、ＳＫ−ＯＶ−３、ＭＣＦ７およびＨＳＴ５７８細胞を、ネイティブの精製ｓｃＦｖ  ３ＴＦ５および３ＧＨ７を使用して研究した。これらの研究のために、ｓｃＦｖ遺伝子を、ｓｃＦｖのＣ末端にヘキサヒスチジンタグを融合するベクター内へ、サブクローニングした。次いで、ｓｃＦｖを発現し、細菌ペリプラズムから収集し、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーによって精製した。２つのｓｃＦｖは、ＳＫＢＲ３細胞を強く染色し、そして正常乳房細胞株ＨＳＴ５７８を染色しない。低いＥｒｂＢ２発現細胞株ＭＣＦ７についてはわずかな染色、およびＳＫ−ＯＶ−３細胞（中程度のＥｒｂＢ２発現因子）については中程度の染色である。一般に、染色の強度は、ファージによって確認されるよりも低い。このことは予測されることである。なぜなら、ファージ染色のための二次抗体は、相当なシグナル増幅を生じる主要コートタンパク質（２５００コピー／ファージ）を認識するからである。
【０１４８】
抗ＥｒｂＢ２ファージ抗体３ＴＦ５をさらに研究して、それが実際にインターナライズされるか否かを決定した。この抗体を、そのインターナライズがＥｒｂＢ２結合Ｃ６．５と比較され得るので、最初の研究のために選択した。５．０×１０11の３ＴＦ５またはＣ６．５ファージを、ＳＫＢＲ３細胞と共に、３７℃または４℃でインキュベートした。ＰＢＳでの洗浄後、３ＴＦ５ファージは、Ｃ６．５ファージよりも強く細胞を染色した。低ｐＨグリシンでの洗浄後、共焦点顕微鏡によって、３ＴＦ５ファージは、９５％よりも多くの細胞によってインターナライズされる一方、Ｃ６．５は、ほんの数パーセントの細胞にしかインターナライズされないことが明らかになった。いずれかの抗体の４℃でのインキュベーションは、インターナライズを導かなかった。
【０１４９】
ネイティブの精製３ＴＦ５  ｓｃＦｖを、同様に分析し、そしてこれもまた、ＳＫＢＲ３細胞によって効率的にインターナライズされた。ネイティブ３ＴＦ５  ｓｃＦｖは、ゲル濾過によって決定されるように、明らかな二量体化または凝集化を有さないモノマーとしてのみ存在した。
【０１５０】
これらの実験は、ファージ抗体が細胞によってインターナライズされ得、そして細胞質から回収され得ることを実証する。インターナライズする細胞表面レセプターに結合するファージは、非結合ファージより１００倍を超えて富化され得る。この富化のレベルは、細胞表面上で選択することによって達成される富化よりも多い。本発明者らは、このアプローチをライブラリー選択に適用し、そしてＳＫＢＲ−３細胞に結合し、インターナライズされるファージ抗体を単離した。これらの抗体のいくつかは、ＥｒｂＢ２に結合するが、純粋な抗原上で選択することによって生成される抗体（例えば、Ｃ６．５）よりも、より効率的にインターナライズされる。ＳＫＢＲ−３および他の乳房腫瘍細胞株に特異的に結合し、そして効率的にインターナライズされる、他の多くの抗体を単離した。これらの抗体は、腫瘍の標的化、および潜在的な、新規なインターナライジング腫瘍細胞レセプターを同定するために有用であることが明らかであるはずである。
【０１５１】
（実施例３：変異ファージ抗体ライブラリーの作製および適切な乳房腫瘍細胞株についての選択による、所望の結合特性を有する抗体フラグメントの親和性の増加）
ファージディスプレイは、従来のハイブリドーマ技術を使用して産生され得ない親和性を有する抗体を産生するための可能性を有する。超高親和性ヒト抗体フラグメントは、優れた腫瘍貫入、長期の腫瘍滞留および循環からの迅速なクリアランスを生じ得、高い特異性を導く。従って、本発明者らは、超高親和性ヒト抗体フラグメントを生成するための方法論を発展させるために一連の実験を行った。実験を、以下の疑問に答えるために行った：１）より低い親和性バインダーのバックグラウンド中で、希少なより高い親和性のファージ抗体について選択およびスクリーニングするための最も効果的な方法は何であるか；２）最も高い親和性のファージ抗体の選択を確実にするために、抗原から結合ファージを除去するための最も効果的な手段は何であるか；３）変異ファージ抗体ライブラリーを作製するための最も効果的な技術（ランダム変異誘発または部位特異的変異誘発）は何であるか；４）抗体分子のどの領域が、抗体フラグメントの親和性を最も効果的に増加するための変異誘発について選択されるべきか。
【０１５２】
これらの疑問に答えるために、本発明者らは、ヒトｓｃＦｖ  Ｃ６．５を研究した。このヒトｓｃＦｖ  Ｃ６．５は、腫瘍抗原ＥｒｂＢ−２（３２）の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に、１．６×１０-8ＭのＫdおよび６．３×１０-3Ｓ-1のＫoffで、結合する（Ｓｃｈｉｅｒら（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１：６３−７１）。Ｃ６．５の単離および特徴付けは、以下に間単に記載され、同時継続出願である米国特許出願第０８／６６５，２０２号に詳細に記載される。
【０１５３】
インビボにおける優れた腫瘍：正常組織の比にもかかわらず、Ｃ６．５の定量的送達は、放射免疫療法を使用して動物において腫瘍を治癒するのに適切ではなかった（Ｓｃｈｉｅｒら（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１：６３−７１）。腫瘍への抗体の定量的送達を改善するために、Ｃ６．５の親和性を増加した。最初に、差示的なＥ．ｃｏｌｉ内での増殖または宿主株の毒性よりむしろ、親和性に基づいてファージ抗体の選択を可能にする技術を開発した（Ｓｃｈｉｅｒら（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５５：２８−４３；Ｓｃｈｉｅｒら（１９９６）Ｇｅｎｅ  １６９：１４７−１５５；Ｓｃｈｉｅｒら（１９９６）Ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ７：９７−１０５）。次いで、本発明者らは、親和性の最大の増大を達成するためにｓｖＦｃ遺伝子のどの位置を変異させるかを決定した（Ｓｃｈｉｅｒら（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５５：２８−４３；Ｓｃｈｉｅｒら（１９９６）Ｇｅｎｅ；Ｓｃｈｉｅｒら（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：５５１−５６７）。ランダム変異誘発は、抗原が接触するアミノ酸を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）の部位特異的変異誘発と同様大きさの親和性の増大を生じなかった。ＣＤＲの多様化から得られた結果は、以下のことを示した：１）親和性の最大の増大は、結合ポケット（ＶLおよびＶH  ＣＤＲ３）の中心に位置するＣＤＲを変異させることにより達成された；２）ＣＤＲ残基の半分は、ｓｃＦｖにおける構造的役割を有し、そして変異した場合、野生型のように復帰する；および３）これらの構造的残基は、相同な原子結晶構造上でのモデリングによって、ライブラリーの構築の前に同定され得る。これらの観察は、相同モデリングによって構造的役割を有すると仮定された残基を保存して、変異が、ランダムにＶLおよびＶH  ＣＤＲ３内に連続的に導入される、抗体の親和性を増加するための一般的なストラテジーの開発を導いた（Ｓｃｈｉｅｒら（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：５５１−５６７）。このアプローチを使用して、Ｃ６．５の親和性は、１．３×１０-11ＭのＫdへ、１２００倍に増加した（同書）。
【０１５４】
体内分布研究によって、親和性と２４時間での腫瘍１グラムあたりのｓｃＦｖの注入用量パーセント（％ＩＤ／ｇ）との間の密接な相関が明らかになった（Ａｄａｍｓら（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：４８５−４９０）。最大程度の腫瘍滞留が、125Ｉ−Ｃ６ＭＬ３−９（１．４２％ＩＤ／ｇ、Ｋd＝１．０×１０-9Ｍ）で観察された。有意により少ない腫瘍滞留が、125Ｉ−Ｃ６．５（０．８０％ＩＤ／ｇ、Ｋd＝１．６×１０-8）およびＣ６Ｇ９８Ａ（０．１９％ＩＤ／ｇ、Ｋd＝３．２×１０-7Ｍ）で達成された。腫瘍：正常器官の比もまた、親和性の差異を反映した（例えば、２４時間でのＣ６ＭＬ３−９、Ｃ６．５およびＣ６Ｇ９８Ａについて、それぞれ、腫瘍：血液の比が１７．２、１３．３、３．５および２．６、ならびに腫瘍：肝臓の比が２６．２、１９．８、４．０および３．１）。より高い親和性のｓｃＦｖの研究は、継続中である。この結果は、ハイブリドーマ技術からは達成可能でない値へ、抗体の親和性を増加する本研究者らの能力を実証し、腫瘍標的化における親和性の重要性を確証した。
【０１５５】
（実施例４：Ｃ６．５ベースの乳癌治療の前臨床開発）
Ｃ６．５ベースの乳癌治療を開発するために、２つのアプローチを共同的に追求した。Ｃ６．５ベースの分子を、放射免疫療法のために操作している。定量的腫瘍送達および抗体フラグメントの滞留を増加するために、二量体ｓｃＦｖ「ダイアボディー」を、ＶHおよびＶLドメインの間のリンカーを１５アミノ酸から５アミノ酸に短縮することによって作製した。結果として、対形成が、２つの異なる鎖の相補的ドメイン間で生じ、２つの結合部位を有する、安定な非共有結合的に結合した二量体を作製する。インビトロで、Ｃ６．５のＶ遺伝子から生成されるダイアボディーは、Ｃ６．５  ｓｃＦｖに比べて、ＳＫ−ＯＶ−３細胞の表面上での有意により高い見かけの親和性およびより長い滞留を有する（Ｔ1/2＞５時間  対  ５分）（Ａｄａｍｓら（１９９８）Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．）。Ｃ６．５ダイアボディーの体内分布研究により、２４時間で６．５％ＩＤ／ｇ（対して、Ｃ６．５  ｓｃＦｖについては、たった１％ＩＤ／ｇ）が明らかになった。ダイアボディーの滞留を７２時間にわたって試験して、そして累積曲線下面積（ＡＵＣ）値を測定した場合、得られた腫瘍：器官のＡＵＣ比は、他の一価または二価のｓｃＦｖ分子について報告された比より大きかった。これらの分子の治療的可能性を、ヌードマウスにおける放射免疫療法研究において試験している。Ｃ６．５ベースの分子のインビボでの特徴付けは、正式には技術目的の１つではないので、本発明者らは、Ｃ６．５およびＣ６．５ベースのダイアボディーの親和性変異体を使用し続け、抗体親和性、大きさおよび結合価の間の関係、ならびにＮＩＨ  Ｒ０１  １  ＣＡ６５５５９−０１Ａ１の一部としての特異的腫瘍標的化を研究した。
【０１５６】
別の共同研究において、Ｃ６．５ベースの分子を、充填リポソームを含有するドキソルビシンをＥｒｂＢ２発現乳癌に対して標的するために使用している（Ｋｉｒｐｏｔｉｎら（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．３６：６６−７５）。ｓｃＦｖのリポソームへの化学的カップリングを促進するために、Ｃ６．５遺伝子を、ｓｃＦｖのＣ末端で遊離のシステイン残基の付加を生じるＥ．ｃｏｌｉ発現ベクター内へサブクローニングした。精製Ｃ６．５ｃｙｓ  ｓｃＦｖを、リポソームに結合体化し、インビトロでの取り込みを、ＳＫＢＲ３細胞を使用して決定した。取り込みの全量は、６時間で３．４ｍｍｏｌリン脂質／１０6細胞であり、取り込みの７０％がインターナライズされた。この取り込みは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈの４Ｄ５抗ＨＥＲ２  Ｆａｂ’を使用して達成された取り込みに匹敵する。非結合体化リポソームの取り込みは、存在しなかった。結果は、Ｃ６．５がＥｒｂＢ２エピトープに結合し、この結合が、ハイブリドーマ（４Ｄ５）から産生される抗体の最良のインターナリゼーションと匹敵する割合でインターナリゼーションを生じることを示す。ＳＣＩＤマウスにおけるインビボ治療研究は、Ｃ６．５標的化リポソームが、非標的リポソーム、または非標的化リポソームおよび全身性４Ｄ５抗体との組み合わせよりも、より大きな程度の腫瘍の緩解、およびより高い治癒比率を生じることを示した。
【０１５７】
（結論）
本明細書中に記載された実験は、マウスの免疫化によって産生される抗体の親和性に匹敵する親和性を有する精製された抗体に対するヒト抗体のパネルを提供し得る、大量の（７．０×１０9メンバー）ファージ抗体ライブラリーが作製されたことを実証する。細胞表面レセプターに結合するファージ抗体は、細胞によってインターナライズされ、そして細胞内から感染性状態において回復され得る。非インターナライズ抗体を１００倍より超えるインターナライズファージ抗体の富化を可能にする方法論が開発された。次いで、これらの方法論を適用して、ＳＫＢＲ−３細胞上のインターナライズレセプターに結合する新規なｓｃＦｖ抗体を選択した。これらの抗体のいくつかは、ＥｒｂＢ２に結合するが、Ｃ６．５ベースのｓｃＦｖよりも効率的にインターナライズされる。より多くの抗体は、未知のインターナライズレセプターに結合する。これらｓｃＦｖの全ては、ＳＫＢＲ−３細胞または関連する腫瘍細胞株に特異的に結合する。これらの結果は、この選択アプローチが、１つの細胞型（悪性）と別の細胞型（非悪性）を区別し得る抗体を生成するための強力なアプローチであることを示す。さらに、本発明者らは、結合について選択することが可能なだけでなく、機能（インターナリゼーション）について選択することも可能であることを実証した。近々、本発明者らはさらに、単離した抗体を特異性に関して特徴付けし、そしてＥｒｂＢ２結合ｓｃＦｖの場合においては、親和性に関して特徴付けする。より長期的には、本発明者らは、以下のためにこれらの試薬を使用する：１）インターナリゼーションの割合に対する親和性および結合価の効果を研究する；そして２）免疫沈降を使用して結合された抗原を同定する。これらの結果は、有用な治療標的である、新規なインターナライズする腫瘍細胞表面レセプターの同定を導くであろう。このアプローチは有用であると証明された場合、本発明者らは、このアプローチを原発性腫瘍細胞およびＤＣＩＳに対して適用する予定である。本発明者らはまた、リポソーム標的化について３ＴＦ５（ＥｒｂＢ２結合ｓｃＦｖがＣ６．５より速くインターナライズされる）を評価するつもりである。３ＴＦ５は、Ｃ６．５より効果的である可能性がある。
【０１５８】
さらに、これらの実験は、インビトロでの抗体親和性を、インビボで以前に達成されなかった値に増加するための方法論の実証する。本発明者らは、これらの方法論を適用し、新規なＥｒｂＢ２結合ｓｃＦｖを生成した。
【０１５９】
（実施例５：ファージライブラリーよりのインターナライズ抗体の選択）
この実施例において、本発明者らはＥｒｂＢ２に結合するヒトｓｃＦｖ（Ｃ６．５）を研究し、ファージライブラリーからインターナライズ抗体を直接選択する可能性を決定し、最も効果的なディスプレイ型式を同定した。ファージミド上に一価で提示された野生型Ｃ６．５ｓｃＦｖを使用して、本発明者らは、抗ＥｒｂＢ２ファージ抗体がレセプター媒介性エンドサイトーシスを行い得ることを実証する。単一のコピーとしてファージミド上に提示されるか、またはファージ上に複数のコピーとして提示されるかのいずれかである、Ｃ６．５の親和性変異体および二価のダイアボディー（ｄｉａｂｏｄｉｉｅｓ）を使用して、本発明者らは、ファージエンドサイトーシスにおける親和性、価、および提示型式の役割を規定し、そしてインターナリゼーションについて最も大きな富化をもたらす因子を同定する。二価のダイアボディーまたはｓｃＦｖの複数のコピーを提示するファージは、一価のｓｃＦｖを提示するファージよりも効率的にエンドサイトーシスし、そして感染性のファージの回収率は、クロロキンと細胞とのプレインキュベーションによって増加した。アプライしたファージ力価の関数としての細胞質内からのファージの回収の測定は、１０9のライブラリー中に単一のファージ抗体のメンバーについて存在する低濃度であっても、エンドサイトーシスし得る抗体を選択することが可能である。
【０１６０】
（Ａ）材料および方法）
（１）細胞）
ＳＫＢＲ３胸部腫瘍細胞株を、ＡＴＣＣより得て、１０％ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を補充したＲＰＭＩ培地中で、５％  ＣＯ２中で３７℃で増殖した。
【０１６１】
（２）抗体および抗体ファージ調製物）
Ｃ６．５ｓｃＦｖファージベクターを、ｓｃＦｖ  Ｃ６．５  ｐＨＥＮ１（Ｓｃｈｉｅｒら、（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １：６３〜７１）由来のＳｆｉＩ／ＮｏｔＩフラグメントとしてのＣ６．５遺伝子を、ファージベクターｆｄ／ＳｆｉＩ／ＮｏｔＩ（Ａｎｄｒｅｗ  Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ、ＭＲＣ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫより贈呈）中にサブクローニングすることにより構築した。Ｃ６．５ダイアボディーファージミドベクターを、ＮｃｏＩ／ＮｃｏＩフラグメントとしてのＣ６．５ダイアボディー遺伝子（Ａｄａｍｓら、（１９９８）Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．７７：１４０５〜１４１２、１９９８）を、ｐＨＥＮ１（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：４１３３〜４１３７）中にサブクローニングすることにより構築した。ｐＨＥＮ１中の抗ボツリヌスｓｃＦｖファージミド（クローン３Ｄ１２）（Ａｍｅｒｓｄｏｒｆｅｒら、（１９９７）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６５：３７４３〜３７５２）Ｃ６．５  ｓｃＦｖファージミド（Ｓｃｈｉｅｒら、（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １：６３〜７１）およびｓｃＦｖ  Ｃ６ＭＬ３−９  ｓｃＦｖファージミド（Ｓｃｈｉｅｒら、（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：５５１〜５６７）は以前に記載されている。ファージを、適切なベクターから調製し（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９９０）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ｐＨＥＮ１中の構築物の滴定についてアンピシリン耐性（１００μｇ／ｍｌ）を使用し、そしてｆｄ中の構築物の滴定についてテトラサイクリン（５０μｇ／ｍｌ）を使用し、以前に記載されたように（Ｍａｒｋｓら、（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１〜５９７）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１において滴定した。可溶性Ｃ６．５  ｓｃＦｖ、Ｃ６．５ダイアボディーおよび抗ボツリヌスｓｃＦｖを、ベクターｐＵＣ１１９ｍｙｃＨｉｓ（Ｓｃｈｉｅｒら（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １：６３〜７１）より発現し、そして他に記載される（同書）固定化金属アフィニティークロマトグラフィーによって精製した。
【０１６２】
（３）インターナライズされたネイティブ抗体フラグメントおよびファージ抗体の検出）
ＳＫＢＲ３細胞を６ウェル培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ）中のカバーガラス上で、５０％コンフルエンスまで増殖させた。培養培地を、５．１０11ｃｆｕ／ｍｌのファージ調製物（最大１／１０の培養培地容量を表すファージ調製物）、またはリン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．４（ＰＢＳ））中の２０μｇ／ｍｌの精製ｓｃＦｖもしくはダイアボディーの添加の２時間前に新しくした。３７℃でのインキュベーションの２時間後、ウェルを氷冷ＰＢＳを用いて６回迅速に洗浄し、そして４ｍＬのストリッピング（ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ）緩衝液（５０ｍＭ  グリシン  ｐＨ２．８、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、２Ｍ  尿素、２％  ポリビニルピロリドン）を用いて室温で、各１０分間３回洗浄した。２回のさらなるＰＢＳ洗浄の後、細胞を４％パラホルムアルデヒド（室温で１０分）中で固定化し、ＰＢＳで洗浄し、−２０℃でアセトンを用いて透過化し（３０秒）、そしてＰＢＳ中で再度洗浄した。カバーガラスをＰＢＳ−１％  ＢＳＡ（室温、２０分）で飽和した。ファージ粒子をビオチン化抗−Ｍ１３免疫グロブリン（５Ｐｒｉｍｅ−３Ｐｒｉｍｅ、Ｉｎｃ．、３００倍希釈）（室温、４５分）、およびＴｅｘａｓ  ｒｅｄ結合体化ストレプトアビジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ、３００倍希釈）（室温、２０分）で検出した。Ｃ末端ｍｙｃペプチドタグを含有する可溶性ｓｃＦｖおよびダイアボディーを、マウスｍＡｂ９Ｅ１０（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、１００倍希釈）（室温、４５分）、抗マウスビオチン化免疫グロブリン（Ａｍｅｒｓｈａｍ、１００倍希釈）およびＴｅｘａｓ  ｒｅｄ結合体化ステレプトアビジンを用いて検出した。光学的共焦点切片を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＭＲＣ  １０２４走査型レーザー共焦点顕微鏡を使用して得た。あるいは、スライドを、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｓｋｏｐ  ＵＶ  蛍光顕微鏡を用いて分析した。
【０１６３】
（４）細胞表面結合またはインターナライズされたファージの回収および滴定）
コンフルエント未満のＳＫＲＢ３細胞を６ウェルプレート上で増殖した。培養培地を実験の２時間前に再び新しくした。細胞を、３７℃で、異なる濃度のファージ調製物を用いて、異なる時間、インキュベートした。ＰＢＳおよびストリッピング緩衝液の洗浄後、インターナライズされたネイティブの抗体フラグメントおよびファージ抗体の検出について、正確に上記のように行い、細胞を再度２回ＰＢＳで洗浄し、そして１ｍＬ〜１００ｍＬ  トリエチルアミン（ＴＥＡ）を用いて溶解した。ストリッピング緩衝液を洗浄し、ＴＥＡ溶解物を１／２容量のＴｒｉｓ−ＨＣｌ  １Ｍ、ｐＨ７．４を用いて中和した。いくつかの実験について、３回のストリッピング緩衝液洗浄の後に、細胞をトリプシン処理し、１５ｍｌ  Ｆａｌｃｏｎチューブに回収し、ＰＢＳで２回洗浄し、次にＴＥＡで溶解した。クロロキンの存在下で行った実験において、ＳＫＢＲ３細胞を、ファージの添加前に、５０μＭのクロロキンを含有する完全培地の存在下で２時間プレインキュベートした。クロロキンの非存在下で、対応するコントロールサンプルを同時に調製した。全ての実験について、ファージを、上記のように、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１上で滴定した。
【０１６４】
（Ｂ）結果）
（１）ファージ抗体インターナリゼーションを研究するために利用したモデル系）
ヒト抗ＥｒｂＢ２  ｓｃＦｖ  Ｃ６．５を、組換えＥｒｂＢ２細胞外ドメイン（１３）上のヒトｓｃＦｖファージ抗体ライブラリーを選択することにより、得た。Ｃ６．５  ｓｃＦｖは、Ｋd＝１．６×１０-8ＭでＥｒｂＢ２と結合し、そして自発的に二量体化または凝集する傾向をともなわずに、溶液中で、安定な単量体ｓｃＦｖである（Ｓｃｈｉｅｒら、（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １：６３〜７１）。インターナリゼーションに対する親和性の影響を決定するために、本発明者らは、Ｃ６．５と３アミノ酸異なるｓｃＦｖ（Ｃ６ＭＬ３−９）を研究した（Ｓｃｈｉｅｒら、（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：５５１〜５６７）。Ｃ６ＭＬ３−９  ｓｃＦｖはまた、溶液中で安定な単量体であり、そしてＣ６．５  ｓｃＦＶと同一のエピトープに結合するが、１６倍低いＫdである（１．０×１０-9Ｍ）（Ｓｃｈｉｅｒら、（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：５５１〜５６７；Ａｄａｍｓら、（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：４８５〜４９０）。レセプターのホモ二量体化は、代表的に抗体のインターナリゼーションを必要とするようなので、本発明者らはまた、二量体Ｃ６．５ダイアボディーを研究した（Ａｄａｍｓら、（１９９８）Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．７７：１４０５〜１４１２、１９９８）。ダイアボディーは、各鎖が、同一鎖のドメイン間での対形成をさせない程度に短いペプチドリンカーを使用して連結される、重鎖（ＶH）可変ドメインおよび軽鎖（ＶL）可変ドメインからなるｓｃＦｖ二量体である。結果として、対形成は、２つの異なる鎖の相補ドメイン間に生じ、２つの結合部位を有する安定な非共有結合二量体を生じる（Ｈｏｌｌｉｇｅｒら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、  ９０：６４４４〜６４４８）。Ｃ６．５ダイアボディーをＩｇのＶHおよびＶLドメイン間のペプチドリンカーを１５から５アミノ酸に短縮し、そしてＳＫＢＲ３細胞上のＥｒｂＢ２に対して、二価で、Ｃ６．５の約４０分の１のＫdで結合する（４．０×１０-10Ｍ）（Ａｄａｍｓら（１９９８）Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．７７：１４０５〜１４１２、１９９８）。
【０１６５】
ネイティブのＣ６．５  ｓｃＦｖおよびＣ６．５ダイアボディーを発現し、そしてＥ．ｃｏｌｉから精製し、そして免疫蛍光共焦点顕微鏡によってＥｒｂＢ２を発現するＳＫＢＲ３胸部腫瘍細胞中へのエンドサイトーシスについて分析した。予測されたように、単量体のＣ６．５  ｓｃＦｖは、有意にインターナライズされないが、二量体Ｃ６．５ダイアボディーは、全ての可視化された細胞の細胞質中において検出され得る。
【０１６６】
引き続いての実験のために、Ｃ６．５およびＣ６ＭＬ３−９  ｓｃＦｖおよびＣ６．５ダイアボディー遺伝子を、ファージミドｐＨＥＮ−１中にｐＩＩＩ融合物としの発現のために、サブクローニングした（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：４１３３〜４１３７）。このことは、ヘルパーファージを用いたレスキューの後に、単一のｓｃＦｖまたはダイアボディーｐＩＩＩ融合物をもっぱら発現するファージミドを生じるはずである（Ｍａｒｋｓら、（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１６００７〜１６０１０）（図２Ａおよび図２Ｂ）。ダイアボディーファージミドは、１つのｓｃＦｖ−ｐＩＩＩ融合分子と１つのネイティブｓｃＦｖ分子との分子間対形成より生じる二価の抗体フラグメントを提示する（図２Ｂ）。Ｃ６．５  ｓｃＦｖ遺伝子もまた、ファージベクターｆｄ−Ｓｆｉ／Ｎｏｔ中にサブクローニングされた。このことは、ｓｃＦｖ−ｐＩＩＩ融合タンパク質の各々の３〜５コピーを有するファージを生じる（図２Ｃ）。ヒト乳癌細胞株ＳＫＢＲ３をエンドサイトーシスの標的細胞として使用した。その表面ＥｒｂＢ２密度は、１細胞当たり約１．０×１０6である（Ｈｙｎｅｓら、（１９８９）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３９：１６７〜１７３）。
【０１６７】
（２）Ｃ６．５ファージミドは、ヒト細胞によってエンドサイトーシスされる）
Ｃ６．５  ｓｃＦｖファージミドを３７℃でカバーガラス上でＳＫＢＲ３細胞とともに２時間インキュベートし、インターナリゼーションを活性化させた。細胞をＰＢＳを用いて広範に洗浄し、非特異的結合を除去し、そして高塩−低ｐＨ（ストリッピング）緩衝液を用いてさらに３回洗浄し、細胞表面レセプターに特異的に結合したファージを除去した。インターナライズされたファージミドを、主要コートファージタンパク質ｐＶＩＩＩを認識するビオチン化Ｍ１３抗血清を用いて検出した。抗ボツリヌス毒素ファージミドをネガティブコントロールとして使用した。染色を免疫蛍光顕微鏡を使用することにより分析した。Ｃ６．５  ｓｃＦｖファージミドとインキュベートした約１％の細胞は、エンドソームの局在と一致する強力な細胞内染色を示したが、一方、抗ボツリヌスファージミドについては染色が観察されなかった。さらに、インキュベーションを３７℃の代わりに４℃で２時間おこなった場合、染色は見られなかった（データ示さず）。ＰＢＳ洗浄の後であるが、ストリッピング緩衝液での洗浄前に行った染色は、全ての細胞の膜染色を示した。このことは、ストリッピング緩衝液を用いる複数回の洗浄が、表面に結合したファージミドの除去に必要であることを示した。結果はまた、細胞に結合したファージの画分のみがエンドサイトーシスされることを示す。
【０１６８】
（３）増加した親和性および二価性は、増加したファージエンドサイトーシスをもたらす）
本発明者らは、免疫蛍光を用いて、Ｃ６．５  ｓｃＦｖ、Ｃ６ＭＬ３−９  ｓｃＦｖおよびＣ６．５ダイアボディーファージミドおよびＣ６．５  ｓｃＦｖファージのインターナリゼーションを比較した。Ｃ６ＭＬ３−９  ｓｃＦｖおよびＣ６．５ダイアボディーファージミドの両方、ならびにＣ６．５  ｓｃＦｖファージは、Ｃ６．５  ｓｃＦｖファージミドと比較して、細胞表面において観察された、増加された免疫蛍光の強度を生じた。Ｃ６ＭＬ３−９  ｓｃＦｖファージミドについて、約１０％の細胞が、２時間のインキュベーションの後に、細胞内蛍光を示した。この値は、二量体のＣ６．５ダイアボディーファージミドについて細胞の約３０％まで増加し、多価のＣ６．５  ｓｃＦｖファージについて細胞の１００％まで増加した。
【０１６９】
（３）感染性ファージは、細胞内から回収し得、そしてその力価は、免疫蛍光を使用して観察された取り込みレベルと相関する）
感染性ファージ抗体粒子が、細胞内から回収され得るか否か決定するために、本発明者らは約５．０×１０5ＳＫＢＲ３細胞を、異なるファージミドまたはファージの３．０×１０11ｃｆｕとともに、３７℃で２時間インキュベートした。６回のＰＢＳ洗浄を使用して、非特異的結合したファージを除去し、そして特異的に結合したファージを、ストリッピング緩衝液を用いる３回の継続する洗浄によって細胞表面から取り除いた（それぞれ、洗浄Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ、表６）。次に細胞を１ｍＬの１００ｍＭ  トリエチルアミン溶液（ＴＥＡ）を用いて溶解した（細胞内ファージを示す）。３回のストリッピングで洗浄し、そして細胞溶解液を中和し、そしてそのファージ力価をＥ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１での感染によって決定した。ファージ回収の力価を、表６に報告する。
【０１７０】
【表６】
0004493845.tif 000007
かなりのバックグラウンド結合を、抗ボツリヌスファージについて、６回のＰＢＳ洗浄の後でさえも、最初のストリッピング洗浄において観察した（２．８×１０7ｃｆｕ、表６）。この値は、細胞表面に対するファージの非特異的結合、ならびに細胞外マトリックスに捕獲されたファージを表すようである。表面に結合したファージの量は、Ｃ６．５  ｓｃＦｖファージミドについてのこのバックグラウンドを２．１倍のみ超えて増加した（表６および７）。提示されたＣ６．５抗体フラグメントの親和性およびアビディティの増加にともない、細胞表面に結合したファージミドまたはファージの力価が増加した（表６）。継続するストリッピング洗浄におけるファージの力価は、各洗浄において約１０分の１に減少した。これらのさらなるストリッピング洗浄は、抗ボツリヌスファージのバックグラウンド結合と比べて、溶出した特異的ファージの力価のわずかな増加をもたらした（Ｃ６．５  ｓｃＦｖファージミドについて２．７倍〜Ｃ６．５  ｓｃＦｖファージについて２０倍、表７）。唯一の例外は、Ｃ６．５  ｓｃＦｖダイアボディーファージミドの力価であり、ここでその比は６．４倍から４．６倍に実際に減少した。このことは、ダイアボディー中において単一の結合部位を有するＶHおよびＶLドメインが、ペプチドリンカーを介してお互いに共有結合しないという事実に起因するようである。この増加は、ストリンジェントな溶出（グリシンのような）が、ＶLからＶHを解離し、抗原への結合を抑止し得る可能性を増加する。
【０１７１】
【表７】
0004493845.tif 000008
３つのストリッピング洗浄は、細胞溶解の後に回収されたファージの力価が、最後のストリッピング洗浄における力価よりも大きかったことを確実にするために、必要であった（表６）。本発明者らは、３回のストリッピング洗浄の後に、溶出されたファージの大半が、細胞表面の感染性粒子よりもむしろ細胞内由来の感染性粒子を示すと推定した。実際、非特異的抗ボツリヌスファージを用いて観察された細胞溶解物の力価は、かなりのものであり（１．５×１０6）、そして最後のストリッピング洗浄において観察されたものより大きかった。そのため、多くのファージが細胞外マトリックス内に捕獲されたままであり、そしてストリッピング緩衝液洗浄に対して比較的近づきにくいようである。いくつかの抗ボツリヌスファージもまた、細胞によって非特異的エンドサイトーシスされ得るが、免疫蛍光の結果を考慮すると、これは少量のようである。ＴＥＡ画分中のファージの力価は、Ｃ６．５の親和性およびアビディティの増加とともに増加し、最高の力価は、二量体Ｃ６．５ダイアボディーファージミドおよび多価Ｃ６．５  ｓｃＦｖファージについて観察された（表６）。この値は、抗ボツリヌスファージと比べた力価において、３０倍（Ｃ６．５ダイアボディーファージミド）および１４６倍（Ｃ６．５  ｓｃＦｖファージ）の増加を示す（表６）。本発明者らは、最後のストリッピング洗浄と比較した細胞溶解物中のファージ力価における増加は、エンドサイトーシスされたファージに起因すると推定した。実際、これらファージのいくつかは、細胞表面または細胞内マトリックスに由来し得た。このことは、細胞溶解物に由来するファージの画分に当てはまり得るが、免疫蛍光の結果は、少なくともいくつかのファージがエンドサイトーシスされることを示す。異なるＣ６．５分子について、エンドサイトーシスされたファージの相対的画分の１つの指標は、細胞溶解前に細胞表面に残存するファージの量（最後のストリッピング洗浄）を、細胞溶解後に回収された量と比較することである。この比は、抗ボツリヌスファージミド（５．４）と比較して、多価Ｃ６．５  ｓｃＦｖまたはＣ６ＭＬ３−９  ｓｃＦｖファージミドのほんの微量な増加（それぞれ６．８倍および８．４倍）を示す（表７）。対照的に、二量体Ｃ６．５ダイアボディーファージミドと多価Ｃ６．５  ｓｃＦｖファージの比が、抗ボツリヌスファージミドと比較して、大量に増加する（それぞれ３５および３９）。
【０１７２】
（４）特異的にエンドサイトーシスされたファージの富化比の増加）
上記の結果は、ファージ抗体が、レセプター媒介性エンドサイトーシスを受け得ること、および細胞溶解物中で感染性を保持し得ることを示す。ファージライブラリー由来のインターナライズされたファージの選択は、非特異的ファージに対する特異的にインターナライズされるファージの富化を増加する方法の最適化を必要とする。２つのパラメーターを改善し得る：（１）非特異的またはインターナライズされないファージの回収の減少、および（２）インターナライズされたファージの感染性の保持。これらのパラメーターを試験するために、本発明者らは、野生型Ｃ６．５  ｓｃＦｖファージミドを研究した。本発明者らは、この分子を選択した。なぜなら、この分子が最少の程度の特異的エンドサイトーシスを受けるにもかかわらず、それは共焦点顕微鏡に基づいて、明らかにエンドサイトーシスされるからである。Ｃ６．５  ｓｃＦｖファージミドもまた、非免疫ファージ抗体ライブラリーのディスプレーのために最も一般に利用される型式を表し（ファージミドベクター中の１コピーのｐＩＩＩ）、そして親和性で成熟したＣ６ＭＬ３−９  ｓｃＦｖよりもそのようなライブラリーに由来するｓｃＦｖのＫｄのより代表的な親和性（１６ｎＭ）を有する（Ｓｈｅｅｔｓら、（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、  ９５：６１５７〜６１６２；Ｖａｕｇｈａｎら、（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：３０９〜３１４）。
【０１７３】
（ａ）インターナライズされないファージのバックグラウンドの減少）
非特異的ファージ回収のバックグラウンドを減少するために、本発明者らは、ＴＥＡ溶解前の細胞のトリプシン処理の効果を研究した。このことは、細胞外マトリックスに捕獲されたファージを除去するはずである。トリプシン処理もまた、細胞培養フラスコから細胞を解離させ、新しい容器へ移すこと、および細胞培養フラスコに結合した任意のファージの除去を可能にする。これらの実験のために、Ｃ６．５  ｓｃＦｖファージミド（５．０×１０8アンピシリン耐性ｃｆｕ）を、１０００倍過剰の野生型ｆｄファージ（５．０×１０11テトラサイクリン耐性ｃｆｕ）と混合した。ファージミドとＳＫＢＲ−３細胞との２時間の３７℃でのインキュベーションの後、細胞をＰＢＳで洗浄し、３回ストリッピング緩衝液で洗浄した。次に細胞を、直接ＴＥＡで溶解するか、またはトリプシン処理し、２回ＰＢＳで洗浄し、次にＴＥＡで溶解した。最初のストリッピング洗浄液中のファージミドおよび細胞溶解液を、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１の感染によって力価測定し、そしてアンピシリンおよびテトラサイクリンプレートにプレートした。細胞表面から回収したｆｄファージおよびＣ６．５  ｓｃＦｖファージミドの力価は、２つの実験群について同様であった（図３）。細胞表面画分中のｆｄファージ／Ｃ６．５  ｓｃＦｖファージミドの比（１６０／１および２５０／１）は、最初の１０００倍の比からの、特異的細胞表面結合によって達成される４〜６倍の富化を生じる。トリプシン処理を行わない場合、細胞溶解物中のｆｄファージ／Ｃ６．５  ｓｃＦｖファージミドの比は、６．１倍にのみ増加し、対照的に、トリプシン処理した場合、２０９倍に増加する（図３）。このことは、特異的ファージ回収の量におけるほんのわずかの減少をともなう、非特異的結合の６０分の１の減少より生じる（図３）。
【０１７４】
（ｂ）感染性インターナライズファージの回収の改善）
感染性インターナライズファージの回収を増加するために、本発明者らは、クロロキンの使用を介するリソゾームの酸性化の阻止がエンドサイトーシスされるファージをエンドソーム分解から保護するのか否か、研究した（Ｂａｒｒｙら、（１９９６）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２：２９９〜３０５）。ＳＫＢＲ３細胞を、クロロキンおよびＣ６．５  ｓｃＦｖファージミドまたは抗ボツリヌスファージミドのいずれかととともにインキュベートした。細胞溶解物を、種々の時点で力価測定し、細胞内ファージミドの数を測定した。Ｃ６．５  ｓｃＦｖファージミドは、２０分の時点で存在し、ファージミドの量は、クロロキンの添加の有無において、類似していた。より後の時点で、約２倍の感染性ファージミドがクロロキンの使用により回収された。対照的に、抗ボツリヌスファージのかなり少ない量が存在し、そしてクロロキンは、力価に対する効果を有さなかった。このことは、このファージミドが、エンドソームへの非特異的エンドサイトーシスよりもむしろ、非特異的表面結合より生じることを示唆する。全体として、これらの結果は、リソソームの酸性化の阻止が、２０分より長いインキュベーションについて回収される感染性ファージの量を増加することを示す。
【０１７５】
（５）低ファージ濃度でのインターナライズされたファージの回収）
５．０×１０9より多いメンバーを含む極めて大きなファージ抗体ライブラリーのみが、全ての抗原に対する抗体の高い親和性のパネルを生成し得る（１０、２３、２４）。ファージは、ただ約１０13ｃｆｕ／ｍｌに濃縮され得るので、大きなライブラリーからの代表的なファージ調製物は、各メンバーにつき１０4のコピーのみ含む。従って、エンドサイトーシスのためのライブラリーの選択は、ファージが１０4と同じくらい低い力価で細胞に適用する時にファージが回収され得る場合のみ、行い得る。従って、本発明者らは、適用したファージの力価の関数として、ＳＫＢＲ３細胞内からの感染性ファージの回収率を決定した。ＳＫＢＲ３細胞を、Ｃ６．５ｓｃＦｖ、Ｃ６ＭＬ３−９ｓｃＦｖもしくはＣ６．５ダイアボディー（ｄｉａｂｏｄｙ）ファージミドまたはＣ６．５  ｓｃＦｖファージとともに、３７℃で２時間インキュベートした。細胞を回収用緩衝液で３回洗浄し、トリプシン処理し、そしてＰＢＳで２回洗浄した。細胞を溶解し、そして細胞内ファージをＥ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１において滴定した。研究した全てのファージについてのファージ力価が増大するにつれてファージの回収率が増大した（図５）。一価を示した抗体について、ファージミドは、３．０×１０5（Ｃ６．５  ｓｃＦｖ）から３．０×１０6（Ｃ６ＭＬ３−９  ｓｃＦｖ）未満の投入力価では、細胞内から回収され得なかった。この閾値は、二価および多価ディスプレイ（Ｃ６．５ダイアボディーファージミドおよびＣ６．５  ｓｃＦｖファージについては３．０×１０4）について減少した。
【０１７６】
（Ｃ）考察）
本発明者らは、抗レセプター抗体を提示するファージは、レセプター発現細胞により特異的にエンドサイトーシスされ得、そして感染形態において細胞質ゾルから回収され得ることを、初めて実証する。この結果は、大きな非免疫ファージライブラリーからインターナライズする抗体を直接的に選択する可能性を実証し、そして首尾良い選択をもたらす因子を同定する。抗ＥｒｂＢ２抗体フラグメントを提示するファージは、ＥｒｂＢ２を発現するＳＫＢＲ３細胞によって特異的にエンドサイトーシスされ、細胞質ゾル内で可視化され得、そしてその細胞内から感染形態で回収され得る。一価のｓｃＦｖ抗体フラグメントがファージミド系において一価的に提示された場合、インターナライズされたファージの回収は、バックグラウンドのたった３．５〜１８倍上回ったのみであった。二価のダイアボディーのディスプレイ、またはファージベクター中のｓｃＦｖの多価ディスプレイは、インターナライズされたファージの回収が、バックグラウンドより３０〜１４６倍上回って増大した。この結果は、天然のモノマーＣ６．５  ｓｃＦｖおよびダイマーのＣ６．５ダイアボディーの本発明者らの研究、ならびに他のモノクローナル抗ＥｒｂＢ２抗体の研究（モノマーＦａｂではなくダイマーＩｇＧが二量体化し、かつレセプターを活性化させ、そしてエンドサイトーシスを受ける（Ｙａｒｄｅｎ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２５６９〜２５７３；Ｈｕｒｗｉｔｚら（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２：３３５３〜２２５７））と一致する。実際、Ｃ６．５およびＣ６ＭＬ３−９  ｓｃＦｖファージミドのエンドサイトーシスは、２つ以上のｓｃＦｖを提示するファージの小さな割合を反映するようである（Ｍａｒｋｓら（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１６００７〜１６０１０）。高い結合活性の結合またはレセプター架橋のいずれか、および続くエンドサイトーシスを媒介する際の価数の重要性は、特異的なファージエンドサイトーシスを示す唯一の他の報告によって確認される。ｐＶＩＩＩ上での高い親和性Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐインテグリン結合ペプチドの約３００コピーを提示するファージは、哺乳動物細胞によって効率良くエンドサイトーシスされた（Ｈａｒｔら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１２４６８〜１２４７４）。エンドサイトーシス後のファージの回収はまた、細胞表面からのファージの回収と比較して、細胞選択の特異性を増大させる。従って、非特異的表面結合に対する特異的表面結合の濃縮率は、２〜２０倍の範囲である。これらの値は、一回の細胞表面選択について、他に報告されたものの約１０倍濃縮に匹敵する（Ｐｅｒｅｉｒａら（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２０３：１１〜２４；Ｗａｔｔｅｒｓら（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ３：２１〜２９）。対照的に、本発明者らの、非特異的エンドサイトーシスに対する特異的エンドサイトーシスの濃縮割合は、３．５〜１４６倍の範囲である。
【０１７７】
これらの結果に基づくと、ファージ抗体ライブラリーからのインターナライズする抗体の選択は、ファージベクターを用いて、ファージミドベクターまたは多価ｓｃＦｖのいずれかのホモダイマーダイアボディーで最も成功するはずである。このようなライブラリーは公開されていないが、一方それらの構築を妨げる技術的障壁は存在しない。多価ライブラリーは、レセプターを架橋させ、そしてエンドサイトーシスをもたらすと思われる形態で抗体フラグメントを提示する。このようなライブラリーからの抗体は、エンドサイトーシスを媒介するために二価である必要がある。あるいは、モノマーレセプターリガンドは、ダイマー形態を好むレセプターにおけるコンホメーションの変化を引き起こすことによってか、または２つのレセプターを同時に結合することによってのいずれかでレセプターを活性化し、そしてエンドサイトーシスをもたらし得る。同様の様式でレセプターを結合したモノマーｓｃＦｖもまた、エンドサイトーシスされ得た。従って、ファージミドベクター中の一価ｓｃＦｖのライブラリーの選択により、レセプターを活性化し、かつモノマーとしてエンドサイトーシスされるリガンド模倣物の選択を生じ得た。このようなｓｃＦｖは、薬物、毒素またはＤＮＡの細胞質への送達のための融合分子の構築に、特に有用であり得た。レセプターのインターナライゼーションを媒介する抗体は、レセプターのダウンレギュレーションおよび増殖阻害をもたらし得るので（Ｈｕｒｗｉｔｚら（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２：３３５３〜３３５７；Ｈｕｄｚｉａｋら（１９８９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌ．．Ｂｉｏｌ．９：１１６５〜１１７２；Ｓｔａｎｃｏｖｓｋｉら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：８６９１〜８６９８）；Ｌｅｗｉｓら（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ、３７：２５５〜２６３）、エンドサイトーシスし得る抗体についての選択もまた、細胞増殖を直接的に阻害または調節する抗体を想定し得る。
【０１７８】
（実施例５：細胞のトランスフェクション）
制限酵素ＳｆｉＩおよびＮｏｔＩを用いてファージミドＤＮＡを消化することにより、ｐＨＥＮ１−Ｆ５からＦ５  ｓｃＦｖ遺伝子を取り出した。ｆｄＤＯＧ１（前述の参考文献を参照のこと）に基づくが、ＳｔｉＩ部位を遺伝子ＩＩＩリーダー配列に挿入するように改変したファージベクターを、ＳｆｉＩおよびＮｏｔＩで消化し、そして消化したＦ５遺伝子を消化したファージＦｄベクターＤＮＡに連結させた。組換え形質転換体を同定した。Ｆ５組換えファージを含むＥ．ｃｏｌｉを、培養物中で増殖させ、Ｆ５−Ｆｄファージを産生した（ファージ調製についてＭａｎｉａｔｉｓを参照のこと）。次いで、Ｆ５ファージを用いて、哺乳動物プロモーター（ＣＭＶ）、続いて∃−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｐｃＤＮＡ３．１／ＨｉｓＢ／ＬａｃＺ、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏｇｅｎ）または増強させたグリーン蛍光タンパク質についての遺伝子（ｐＮ２ＥＧＦＰ、Ｃｌｏｎｅｔｃｈプラスミド）のいずれか、および真核生物のポリアデニル化配列を含むファージミドを保有するＥ．ｃｏｌｉに感染させた。細菌を一晩、テトラサイクリン１５μｇ／ｍＬ、およびアンピシリン１００μｇ／ｍＬ（ｐｃＤＮＡ３．１／ＨｉｓＢ／ＬａｃＺを含む細菌）かまたはカナマイシン３０μｇ／ｍＬ（ｐＮ２ＥＧＦＰを含む細菌）のいずれかの存在下で増殖させた。Ｆ５−Ｆｄコートの混合物の上清から調製されたファージは、単鎖形式でのレポーター遺伝子（ファージの約５０％）か、またはＦ５−Ｆｄファージゲノム（ファージの約５０％）のいずれかを含む。１０7ｐｆｕファージ混合物とのＥｒｂＢ２陽性細胞５．１０５  ＳＫＢＲ３のインキュベーション（滅菌するまで０．４５μｍフィルターを２回通して濾過する）により、細胞の１％においてレポーター遺伝子が発現し得る。１０倍より陰性のコントロールファージ（すなわち、野生型Ｆｄ中のレポーター遺伝子パッケージング）とともにインキュベートされた細胞は、レポーター遺伝子の発現を示さなかった。ＥｒｂＢ２高細胞（ＳＫＢＲ３）とＥｒｂＢ２低細胞（ＭＣＦ７）の混合集団（Ｌｅｗｉｓら（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ３７：２５５〜２６３）をＦ５−Ｆｄ−ＥＧＦＰファージとともに２日間インキュベートした実験において、本発明者らは、ｅｒｂＢ２陽性細胞（ＦＡＣＳによるそれらのＥｒｂＢ２レベルより分化した細胞）においてのみ、レポーター遺伝子の発現を得た。
【０１７９】
（実施例６：糸状バクテリオファージによる哺乳動物細胞への標的化遺伝子送達）
本実施例において、本発明者らは、原核動物ウイルスが、真核生物細胞に感染するように再操作され得、バクテリオファージゲノムの一部分の発現を生じることを示す。増殖因子レセプターＥｒｂＢ２を発現する哺乳動物細胞を結合し得、そしてレセプター媒介エンドサイトーシスを引き起こし得るファージを、乳腫瘍細胞上でのファージ抗体ライブラリーを選択することおよびその細胞内から感染性ファージを回収することにより単離した。免疫蛍光により決定した場合、Ｆ５ファージは、ＥｒｂＢ２を発現するＳＫＢＲ３細胞の１００％に効率的にエンドサイトーシスされた。このファージゲノムの一部分の発現を達成するために、Ｆ５ファージを操作して、ＣＭＶプロモーターにより駆動されるグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）レポーター遺伝子をパッケージングした。これらのファージは、細胞に適用される場合、ＥｒｂＢ２媒介エンドサイトーシスを引き起こし、ＧＦＰ発現を導いた。ＥｒｂＢ２を過剰発現する細胞においてのみ生じるＧＦＰ発現は、用量依存性であり、６０時間後、細胞の４％に達成し、そして２．０×１０7ｃｆｕ／ｍｌ程の低さのファージ力価で検出された（５００ファージ／細胞）。この結果は、適切な抗体を提示する細菌性ウイルスが、哺乳動物レセプターに結合し得、そして嚢胞内膜性経路を利用して真核生物細胞に感染し、そしてウイルス遺伝子発現を生じ得る。このことは、ファージ抗体を直接的にスクリーニングすることによって遺伝子発現のための正確な輸送経路に、細胞内で遺伝子を送達し得る、標的化された分子を発見するための新規の方法を示す。このことは、細胞質ゾルへの送達が必要である遺伝子治療または他の適用のための適切な標的物および標的化分子の同定を有意に容易にすべきである。このアプローチはまた、標的化された遺伝子発現のためのファージ抗体をスクリーニングするよりもむしろ直接選択するために適用され得る。この結果はまた、ファージ抗体の、インビトロまたはインビボでの標的化された遺伝子送達ビヒクルとしての可能性を実証する。
【０１８０】
（Ａ)導入）
遺伝子治療の広範な適用は、高い効率で、治療遺伝子を適切な細胞もしくは組織型に標的化する能力を必要とする（ＭｉｃｈｅａｌおよびＣｕｒｉｅｌ（１９９４）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１：２２３〜２３２）。レトロウイルスベクターの標的化は、レセプターリガンドまたは単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体フラグメントをウイルスエンベロープタンパク質に挿入することにより報告されている（Ｋａｓａｈａｒａら（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：１３７３〜１３７６）。アデノウイルスベクターの標的化は、アデノウイルスノブを結合する抗体フラグメント、およびレセプターリガンドまたは抗体のような細胞標的化分子からなる「アダプター」融合分子の使用により達成された（Ｄｏｕｇｌａｓら（１９９６）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：１５７４〜１５７８；Ｗａｔｋｉｎｓら１９９７）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．４（１０）：１００４〜１０１２）。細胞表面レセプターリガンドまたは抗体を用いた非ウイルスベクターの標的化もまた、報告されている（ＦｏｍｉｎａｙａおよびＷｅｌｓ（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（１８）：１０５６０〜１０５６８；ＭｉｃｈｅａｌおよびＣｕｒｉｅｌ（１９９４）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１：２２３〜２３２）。これらのアプローチの全ては、細胞表面レセプターに結合し、続いてＤＮＡを核へ送達する遺伝子送達ビヒクルのインターナリゼーションをもたらす標的化分子の使用に依存する。適切な標的化分子の同定は、主に、レセプターリガンドまたは抗体を個々にスクリーニングすることによって実施されている。ｓｃＦｖ抗体フラグメントの場合、これは、代表的には、ハイブリドーマのＶ遺伝子からのｓｃＦｖの構築、標的化された遺伝子送達ビヒクルの構築、およびインビトロでの標的化能力の評価を必要とする。
【０１８１】
より最近では、糸状ファージライブラリーから、細胞表面レセプターに結合するペプチドおよび抗体フラグメントを直接選択することが可能であることが証明された（Ａｎｄｅｒｓｅｎら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３（５）：１８２０〜１８２４；Ｂａｒｒｙら（１９９６）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２：２９９〜３０５；ＣａｉおよびＧａｒｅｎ（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２（２４）：６５３７〜６５４１；ｄｅ  Ｋｒｕｉｆら（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２（６）：３９３８〜３９４２；Ｍａｒｋｓら（１９９３）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１（１０）：１１４５〜１１４９）。このことは、潜在的な標的化分子の数の目立った増加を導いた。バクテリオファージがレセプター媒介エンドサイトーシスをもたらす能力（Ｂａｒｒｙら（１９９６）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２：２９９〜３０５；Ｈａｒｔら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｈｍ．２６９（１７）：１２４６８〜１２４７４）は、ファージライブラリーが細胞結合のためにだけでなく、哺乳動物細胞中にインターナリゼーションするためにも選択され得ることを示す。ファージ単鎖ファージゲノムが転写され、そして翻訳され得る場合、エンドサイトーシスおよび発現を導く正確な輸送経路へのファージゲノムの送達を導く様式でレセプターを結合するファージについてスクリーニングおよび選択することが、可能であることが分かるはずである。ファージが、細胞膜の化学的変化後、哺乳動物細胞中に侵入し、レポーター遺伝子の発現を導き得ることが以前に示されている（ＯｋａｙａｍａおよびＢｅｒｇ（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５（５）：１１３６〜１１４２；Ｙｏｋｏｙａｍａ−ＫｏｂａｙａｓｈｉおよびＫａｔｏ（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９３（２）：９３５〜９３９）。より最近、Ｌａｒｏｃｃａらは、間接的なバクテリオファージ媒介遺伝子送達は、ビオチン化ファージを、ストレプトアビジンおよびビオチン化線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を介してＦＧＦレセプターを発現する哺乳動物細胞に対して標的化することによって起こり得ることを示した（Ｌａｒｏｃｃａら（１９９８）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９：２３９３〜２３９９）。
【０１８２】
この報告において、本発明者らは、ファージマイナータンパク質ｐＩＩＩとの遺伝子融合物として抗ＥｒｂＢ２  ｓｃＦｖ  Ｆ５を提示する糸状ファージが、ＥｒｂＢ２を発現する哺乳動物細胞に直接感染し、ファージゲノム中に含まれるレポーター遺伝子の発現を導き得ることを示す。これは、細胞内薬物送達または遺伝子治療のための標的化分子を、ファージ抗体を直接スクリーニングして、エンドサイトーシスを引き起こし、そして遺伝子を遺伝子発現のための正確な輸送経路に細胞内送達し得る分子を同定することによって発見する、新規の方法を与える。これは、細胞質ゾルへの送達が必要とされる遺伝子治療または他の適用のための適切な標的および標的化分子の同定を有意に容易にするはずである。本発明者らはまた、このアプローチを用いて標的化された遺伝子発現のためにファージ抗体を直接選択する方法を議論する。最終的には、本発明者らは、インビトロまたはインビボでの標的化遺伝子送達ベクターのためのファージ抗体それ自体の使用についての可能性を議論する。
【０１８３】
（Ｂ）材料および方法）
（１）抗ＥｒｂＢ２  Ｆ５  ｓｃＦｖ）
ベクターｐＨＥＮ−１中の抗ＥｒｂＢ２  ｓｃＦｖ（Ｆ５）（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９（１５）：４１３３〜４１３７）（ｐＨＥＮ−Ｆ５）を、ＥｒｂＢ２を発現するＳＫＢＲ３細胞上の非免疫ファージ抗体ライブラリー（Ｓｈｅｅｔｓら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５（１１）：６１５７〜６１６２）を選択し、続いて組換えＥｒｂＢ２細胞外ドメイン（ＥＣＤ）上での結合をスクリーニングすることによって得られた。天然のＦ５  ｓｃＦｖは、ＥｒｂＢ２  ＥＣＤと、Ｋd＝１．６×１０-7Ｍ（先に記載されるような（Ｓｃｈｉｅｒら（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５５（１）：２８〜４３）ＢＩＡコアにおける表面プラズモン共鳴により決定した）で結合する。
【０１８４】
（２）ファージおよびファージミドベクター）
ｐＮ2ＥＧＦＰ（４．７Ｋｂｐ）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｏｔＩフラグメントを、ｐｃＤＮＡ３−ＨｉｓＢ／ＬａｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｏｔＩ骨格中にサブクローニングすることによって、ｐｃＤＮＡ３−ＧＦＰ（６．１Ｋｂｐ）を得た。ｐＨＥＮ−１からのＳｆｉＩ／ＮｏｔＩ  ｓｃＦｖ−Ｆ５挿入物を、ｆｄ−Ｓｆｉ／ＮｏｔのＳｆｉＩ／ＮｏｔＩ部位（これは、遺伝子ＩＩＩリーダー中のＡｐａＬ１クローニング部位をＳｆｉＩに変化させることによってｆｄ−ｔｅｔ−ＤＯＧ（Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２（６３３６）：６２４〜６２８）から構築された）にサブクローニングすることによって、ｆｄ−Ｆ５−ファージベクターを構築した。１．６ＫｂｐのｐＮ2ＥＧＦＰの平滑末端化したＡｓｅ  Ｉ／Ａｆｌ  ＩＩフラグメントを、ｐＨＥＮ−Ｆ５の平滑末端化したＥｃｏＲ  Ｉ部位にサブクローニングすることによって、ｐＨＥＮ−Ｆ５−ＧＦＰファージミドベクター（６．８Ｋｂｐ）を得た。挿入物の配向をＮｏｔＩ制限消化により分析した。
【０１８５】
（３）細胞株の培養およびトランスフェクション）
ＳＫＢＲ３およびＭＣＦ７を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を補充したＲＰＭＩ中で増殖させた。６ウェルプレート中で増殖させた５０％コンフルエントなＳＫＢＲ３細胞を、製造業者により推奨されるように、リポフェクタミン（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を用いて１ウェルあたり１μｇのＤＮＡでトランスフェクトした。Ｍａｘｉｐｒｅｐ  Ｑｉａｇｅｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．）を用いたアルカリ溶解により、ｐＮ2ＥＧＦＰ  ｄｓＤＮＡを調製した。５００μｌのファージミド調製物（以下を参照のこと）から、２回のフェノール抽出続いてエタノール沈殿により、ｓｓＤＮＡを抽出した。ｓｓＤＮＡについて４０μｇ／ｍｌまたはｄｓＤＮＡについて５０μｇ／ｍｌに等しい、１．０Ａ260ｎｍでの吸光度の測定により、ＤＮＡを定量した。ＧＦＰの検出について、トリプシンＥＤＴＡｍｉｘ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を用いて細胞を剥離し、そしてＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で分析した。
【０１８６】
（４）ファージミドおよびファージの調製）
ｐＨＥＮ−Ｆ５、ｐＨＥＮ−Ｆ５−ＧＦＰ、ｐｃＤＮＡ３−ＧＦＰまたはｐＮ2ＥＧＦＰファージミドを、以前に記載されるように（Ｍａｒｋｓら（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２（３）：５８１〜５９７）、ＶＣＳ−Ｍ１３ヘルパーファージ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いた重感染により、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１より調製した。Ｆｄ−Ｆ５−ファージを、以前に記載されるように（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ  ３４８（６３０１）：５５２〜５５４）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１から調製した。ｐｃＤＮＡ３−ＧＦＰを含むＥ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１をｆｄ−Ｆ５−ファージで重感染させることによって、Ｆ５−ＧＦＰ−ファージおよびＦ５−ＬａｃＺ−ファージを調製した。培養物上清から、２回のポリエチレングリコール沈殿（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９９０）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ−ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）によりウイルス粒子を精製し、リン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．４）（ＰＢＳ）中に再懸濁し、０．４５μｍのフィルターで濾過し、そして４℃で保存した。あるいは、この調製物は、さらなるＣｓＣｌ超遠心分離工程に供した（ＳｍｉｔｈおよびＳｃｏｔｔ（１９９３）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：２２８〜２５７）。ファージミドＤＮＡに対するパッケージングされたヘルパーファージＤＮＡの比を、アンピシリンおよびカナマイシン耐性（ヘルパーファージレスキューｐＨＥＮ−Ｆ５について）、またはアンピシリンおよびテトラサイクリン耐性（ｆｄ−Ｆ５ファージレスキューｐｃＤＮＡ３−ＧＦＰについて）についてファージを滴定することによって（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出）決定した。
【０１８７】
（５）ファージＦＡＣＳ）
細胞をトリプシン処理し、１％ＦＢＳ含有ＰＢＳ（ＦＡＣＳ緩衝液）で洗浄し、そして同じ緩衝液に１０6細胞／ｍｌで再懸濁した。染色手順をＦＡＣＳ緩衝液で希釈された試薬を用いて氷上で実行した。細胞の１００μｌのアリコートを円錐形の９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）に分配し、３００ｇで遠心分離し、そして細胞ペレットを１００μｌのファージまたはファージミド調製物の階段希釈物に再懸濁し、そして１時間インキュベートした。細胞を２回、遠心分離し、そして洗浄し、細胞ペレットを１００μｌの抗Ｍ１３抗体（５Ｐｒｉｍｅ，３Ｐｒｉｍｅ  Ｉｎｃ．）（１／４００希釈）に再懸濁し、そして４５分間インキュベートした。細胞を上記のように洗浄し、１００μｌのストレプトアビジン−フィコエリトリン（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｎｃ．）（１／４００希釈）に再懸濁し、そして２０分間インキュベートした。最後の洗浄後、細胞をＦＡＣＳで分析した。
【０１８８】
（６）免疫蛍光検査）
細胞を６ウェルプレートで５０％コンスルエンスまでカバーガラスにおいて増殖した。ファージ調製物（培養培地の１０％未満）を添加し、そして細胞を１６時間インキュベートした。カバーガラスを６回ＰＢＳで、グリシン緩衝液（５０ｍＭグリシン、ｐＨ２．８、ＮａＣｌ  ５００ｍＭ）で１０分間３回洗浄し、ＰＢＳで中和し、そしてＰＢＳ−４％パラホルムアルデヒドで、室温で５分間固定した。細胞を３０秒間、冷アセトンで透過性にし、ＰＢＳ−１％  ＢＳＡで飽和し、そして抗Ｍ１３抗体（飽和溶液において１／３００希釈）と、その後ストレプトアビジン−テキサスレッド（Ａｍｅｒｓｈａｍ）（飽和溶液において１／３００希釈）とともにインキュベートした。カバーガラスをＡｘｉｏｓｋｏｐ蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）で分析した。
【０１８９】
（７）バクテリオファージ媒介細胞感染）
ＣｓＣｌファージ調製物を培養培地で少なくとも１０倍に希釈し、０．４５μｍフィルターを通して濾過し、そして３０％〜８０％コンフルエントな細胞に添加した。インキュベーション後、細胞をトリプシン処理し、ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、そしてＦＡＣＳによりＧＦＰ発現について分析した。ＭＣＦ７およびＳＫＢＲ３が同時培養される実験において、ＥｒｂＢ２発現を、ＥｒｂＢ２  ＥＣＤ（１０μｇ／ｍｌ）に結合する抗ＥｒｂＢ２マウスｍＡｂ  ４Ｄ５（１時間）、ビオチン化ヒツジ抗マウス免疫グロブリン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）およびストレプトアビジン−フィコエリトリンを用いてＦＡＣＳにより定量した。
【０１９０】
Ｃ）結果
（１）ＥｒｂＢ２発現細胞による一価Ｆ５ファージ粒子および多価Ｆ５ファージ粒子に結合するＥｒｂＢ２のインターナリゼーション）
本発明者らは、ＥｒｂＢ２発現ＳＫＢＲ３乳房腫瘍細胞での選択、および細胞内での感染性ファージの回収（Ｍ．Ｐｏｕｌら、ｍａｎｕｓｃｒｉｐｔ  ｉｎ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）により、ｐＩＩＩへの融合物として、バクテリオファージの表面で提示されたｓｃＦｖのライブラリーから抗ＥｒｂＢ２  ｓｃＦｖ−Ｆ５を単離した（Ｓｈｅｅｔｓら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５（１１）：６１５７〜６１６２）。この選択ストラテジーを、レセプター結合の際に、エンドサイトーシスを被り得るｓｃＦｖを選択するために使用した。ｐＨＥＮ−Ｆ５ファージミドベクターがＶＣＳ−Ｍ１３ヘルパーファージでレスキューされる場合、得られたウイルス粒子（Ｆ５−ファージミド）は、平均１コピーのｓｃＦｖ−ｐＩＩＩ融合タンパク質、およびヘルパーファージからの３〜４コピーの野生型ｐＩＩＩ型の非主要コートタンパク質を提示する（Ｍａｒｋｓら（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７（２３）：１６００７〜１６０１０）。結果として、ファージミドは一価で結合する。ＥｒｂＢ２発現細胞へのウイルス粒子の結合を改善するため、多価ファージ抗体は、Ｆ５  ｓｃＦｖＤＮＡを、ｐＩＩＩタンパク質との融合のためファージベクターｆｄ−Ｓｆｉ／Ｎｏｔにサブクローニングすることにより作製した。ｆｄ−Ｆ５ファージといわれるウイルス粒子は、４〜５コピー数のｓｃＦｖ−ｐＩＩＩ融合タンパク質（Ｉｄ．）を提示する。
【０１９１】
Ｆ５ファージ抗体が哺乳動物細胞によりインターナライズされ得るか否かを決定するために、ＥｒｂＢ２を過剰発現するＳＫＢＲ３細胞をｆｄ−Ｆ５ファージ（１０9コロニー形成単位／ｍｌ、ｃｆｕ／ｍｌ）、Ｆ５ファージミド（１０11  ｃｆｕ／ｍｌ）、または陰性のコントロールとして、無関係の抗ボツリヌス菌ｓｃＦｖ−ｐＩＩＩ融合タンパク質（１０12  ｃｆｕ／ｍｌ）（Ａｍｅｒｓｄｏｒｆｅｒら、１９９７）を提示するファージミドとともに１６時間インキュベートした。細胞表面を低いｐＨのグリシン緩衝液を用いてファージ抗体を剥がし、細胞を透過性にし、そして固定し、そして細胞内ファージを抗Ｍ１３抗体を用いて検出した。著しいことに、全ての細胞は、ｆｄ−Ｆ５ファージ、またはＦ５ファージミドでインキュベートされた場合、強力な細胞内染色を示したが、抗−ボツリヌス菌ファージミドとインキュベートされた場合は示さなかった。これは、ｐＩＩＩに融合したｓｃＦｖの特異性に対するファージ侵入の依存を実証する。
【０１９２】
（２）真核生物細胞における発現のためのレポーター遺伝子をパッケージングするＥｒｂＢ２結合ファージおよびファージミドの調製）
Ｆ５ファージが発現を誘導する哺乳動物細胞にレポーター遺伝子を送達し得るか否かを研究するために２つのストラテジーを用いた。レポーター遺伝子を含有する一価ファージを作製するため、本発明者らは、ＣＭＶプロモーターにより駆動されたグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の遺伝子を、ベクターｐＨＥＮ−Ｆ５−ＧＦＰを生成するファージミドベクターｐＨＥＮ−Ｆ５へクローニングした（図６、左側）。ｐＨＥＮ−Ｆ５−ＧＦＰ（アンピシリン耐性）を含有するＥｓｃｈｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＴＧ１をヘルパーファージ（カナマイシン耐性）で感染し、そして高い力価の一価Ｆ５−ＧＦＰファージミドを得た（培養上清の５．０×１０10アンピシリン耐性ｃｆｕ／ｍｌ）。パッケージングされたファージミドＤＮＡ対ヘルパーファージＤＮＡの比（アンピリシン耐性ｃｆｕ対カナマイシン耐性ｃｆｕ）は１００：１と決定された。レポーター遺伝子を含有する多価ファージを作製するため、ｐｃＤＮＡ３−ＧＦＰファージミド（アンピシリン耐性）を保有するＥ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１を、ｆｄ−Ｆ５−ファージ（テトラサイクリン耐性）で感染することにより（従ってヘルパーファージとしてｆｄ−Ｆ５ファージを用いて）、ｆｄ−Ｆ５−ＧＦＰファージを生成した。ｆｄ−Ｆ５−ＧＦＰファージの力価は、約５．０×１０8アンピシリン耐性ｃｆｕ／ｍｌ  培養上清であった。ｆｄをヘルパーファージとして用いた場合、より低いファージ力価が生じるのは、それがファージミドｆ１起点から干渉を生じるプラスミドの複製起点を欠失するからである（ＣｌｅａｒｙおよびＲａｙ（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７（８）：４６３８〜４６４２）。パッケージングされたレポーター遺伝子ＤＮＡ対ファージＤＮＡの比（アンピシリン耐性ｃｆｕ対テトラサイクリン耐性ｃｆｕ）は１：１であった。ｆｄをヘルパーファージとして用いる場合のレポーター遺伝子／ヘルパーゲノムのより低い比は、ＶＣＳ−Ｍ１３における変異したパッケージングシグナルと比較して、ｆｄゲノム上の完全に機能的なパッケージングシグナルの存在に起因する（ＶｉｅｉｒａおよびＭｅｓｓｉｎｇ（１９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：３〜１１）。ファージ調製物およびファージミド調製物の両方は、ＳＫＢＲ３細胞結合について評価された（図７）。両方の調製物がＳＫＢＲ３細胞に結合したが、結合は、１０10  ｃｆｕ／ｍｌのＦ５−ＧＦＰファージミド（１５ピコモル）に対して、ｆｄ−Ｆ５−ＧＦＰファージでは１０8  ｃｆｕ／ｍｌ（１６０フェムトモル）程度と決定され得た。従って、多価結合は、ウイルス粒子の結合定数の明白な上昇を導く。
【０１９３】
（３）ＥｒｂＢ２発現乳癌細胞への標的化されたファージミドおよびファージ媒介型の遺伝子トランスファー）
ＥｒｂＢ２結合ファージミドが遺伝子送達を標的され得るか否かを決定するため、２．０×１０5のＳＫＢＲ３細胞（高いレベルのＥｒｂＢ２を発現する乳房腫瘍細胞株）または２．０×１０5のＭＣＦ７細胞（低いＥｒｂＢ２を発現する乳房腫瘍細胞株）を、３７℃で、５．０×１０11ｃｆｕ／ｍｌのＦ５−ＧＦＰファージミドとインキュベートした。細胞を４８時間後ＦＡＣＳにより、ＧＦＰ発現について分析した（図８Ａ）。ＳＫＢＲ３細胞の１．３７％は、Ｆ５−ＧＦＰファージミドでのインキュベーション後、ＧＦＰを発現した（図８Ａ６）。ＧＦＰ発現は、ｆ１パッケージングシグナルの方向にかかわらず同一であった（データ示さず）。これは、転写／翻訳が相補的ＤＮＡ鎖の合成を介して進行していたことを示す。ＧＦＰ発現は、ファージなしで、またはレポーター遺伝子をパッケージングするヘルパーファージとともにインキュベートされたＳＫＢＲ３細胞において検出されなかった（図８Ａ４および８Ａ５）。発現はまた、ファージ、ヘルパーファージまたはｐＨＥＮ−Ｆ５−ＧＦＰなしにインキュベートされたＭＣＦ７細胞においても見られなかった。これは、標的された遺伝子送達のためのＥｒｂＢ２発現の必要性を示す（図８Ａ１、８Ａ２および４Ａ３）。遺伝子トランスファー適用が異種の細胞集団における特定の細胞の標的化に関するようなので、本発明者らは、ＳＫＢＲ３細胞およびＭＣＦ７細胞の同時培養において同じ実験を実行した（図８Ｂ）。細胞をＳＫＢＲ３細胞からＭＣＦ７細胞を識別するためにＥｒｂＢ２発現について染色した。そしてそれぞれの小集団のＧＦＰ発現をＦＡＣＳにより分析した。ＳＫＢＲ３細胞のみ（１．９１％）がＧＦＰを発現した。同様の結果がＦ５−ＧＦＰファージミドの代わりにＦ５−ＧＦＰファージを用いて見出された（データ示さず）。これらのデータは、ｆｄ−Ｆ５−ＧＦＰファージおよびＦ５−ＧＦＰファージミド媒介型の遺伝子送達が、ＥｒｂＢ２過剰発現細胞に制限されること、そして非発現細胞の存在下でこのような細胞に標的され得ることを確認する。
【０１９４】
（４）ファージ媒介型の遺伝子トランスファーの特徴づけ）
ファージ媒介型の遺伝子トランスファーの用量応答性の特徴を決定するため、ＳＫＢＲ３細胞を、漸増量のｆｄ−Ｆ５−ＧＦＰファージまたはＦ５−ＧＦＰファージミドとともに６０時間インキュベートし、そしてＧＦＰ陽性細胞のパーセントを決定した（図９Ａおよび９Ｂ）。有意な数のＧＦＰ陽性細胞（図９Ａ）の検出のために必要な最小のファージ濃度（図９Ａ）は、ｆｄ−Ｆ５−ＧＦＰファージについては約４．０×１０7ｃｆｕ／ｍｌ（０．１３％）、そしてＦ５−ＧＦＰファージミドについては１．０×１０10ｃｆｕ／ｍｌ（０．１２％）であった。この価は、結合曲線と密接に関係し（図７）、そして遺伝子発現について、多価ファージは、ファージミドよりも１００〜１０００倍より有効であることを示す。有意な数の陽性細胞は、レポーター遺伝子をパッケージングするヘルパーファージの４．０×１０13ｃｆｕ／ｍｌまででは観察されなかった。ファージおよびファージミドの両方について、ＧＦＰ陽性細胞のパーセントは、ファージ濃度にともない増加した（プラトーの証拠はない）。得られた最大の値はｆｄ−Ｆ５−ＧＦＰファージについては細胞の２％であり、そしてＦ５−ＧＦＰファージミドについては４％であり、そして適用されたファージの力価（それぞれ、１．５×１０9ｃｆｕ／ｍｌおよび４．０×１０12ｃｆｕ／ｍｌ）により限定されるようである。１細胞あたりの発現されるＧＦＰの量（平均蛍光強度（ＭＦＩ）により評価される、図９Ｂ）はまた、ファージ濃度にともない増加し、少数の細胞が２．０×１０7ｃｆｕ／ｍｌ（ｆｄ−Ｆ５−ＧＦＰファージ）〜１．０×１０10ｃｆｕ／ｍｌ（Ｆ５−ＧＦＰファージミド）の低いファージミド力価で発現を示す。
【０１９５】
ファージで得られた遺伝子発現の収量と伝統的なトランスフェクション方法を比較するため、一本鎖（ｓｓＤＮＡ）または二本鎖（ｄｓＤＮＡ）をリポフェクタミンを用いてＳＫＢＲ３にトランスフェクトした。ｓｓＤＮＡの１μｇあたり、ファージミド媒介型の遺伝子送達の効率（約１％）は、ｓｓＤＮＡ（０．９８％）およびｄｓＤＮＡ（１．２７％）のリポフェクタミントランスフェクションに匹敵した（表８）。効率は、ファージ媒介型のトランスフェクションについて約５００倍高く、２．２５ｎｇのｓｓＤＮＡで、細胞の０．８７％のトランスフェクションを生じた。
【０１９６】
【表８】
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遺伝子発現の時間経過を決定するため、５．０×１０11ｃｆｕ／ｍｌのＦ５−ＧＦＰファージミドをＳＫＢＲ３細胞とインキュベートした。４８時間後、培養培地を新鮮な培地で置換した。ＧＦＰ発現細胞は、ファージの適用後２４時間内に検出され得、そして陽性細胞のパーセンテージは、１２０時間の４．５％の最大値まで時間の増加とともに直線的に増加した（図９Ｃ）。ＭＦＩで評価されるように、陽性細胞のＧＦＰ含量は、９６時間まで増加する（図９Ｄ）。９６時間後、ＧＦＰ陽性細胞の数は増加し続けるが、おそらく、細胞分裂時の娘細胞へのＧＦＰ分子の配分の起因して、ＭＦＩは低下する。
【０１９７】
（Ｃ）考察）
本発明者らは、非主要コートタンパク質ｐＩＩＩとの遺伝的融合物として抗ＥｒｂＢ２  ｓｃＦｖ抗体フラグメントを提示する糸状ファージが、ｓｃＦｖの特異性を発現する哺乳動物細胞に直接標的され得ることを実証する。このようなファージは、レセプター媒介型のエンドサイトーシスを被り、そして最終的にレポーター遺伝子発現を導く細胞内輸送経路に侵入する。これは、原核生物のウイルスをが再操作して、真核生物細胞を感染させ、その結果、バクテリオファージゲノムの一部の発現を生じ得ることを実証する顕著な知見である。遺伝子発現は、２．０×１０7ｃｆｕ程度のファージで検出され、そして細胞の４％までファージの力価を増大するにつれて増大された。多価提示は、一価提示と比べて、検出可能な遺伝子発現についての閾値を５００倍低下した。このことは、機能性の親和性における上昇およびレセプター架橋からのレセプター媒介型エンドサイトーシスの上昇した速度にもっとも起因するようである。しかし、トランスフェクトされた細胞の最大パーセントは、産生された有意により高いファージの力価に起因して、一価提示（ファージミド）について、より高かった。多価ファージのより低い力価は、レポーターファージミドに対するｆ１複製起点のｆｄファージ抗体複製起点での妨害に起因する（ＣｌｅａｒｙおよびＲａｙ（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７（８）：４６３８〜４６４２）。
【０１９８】
エンドサイトーシス可能レポーターに結合するファージを用いる哺乳動物細胞の標的された感染は、一般的な現象のようである。例えば、ｐＨＥＮ−ＧＦＰの遺伝子ＩＩＩへの抗トレンスフェリンレセプターＳｃＦｖの融合は、ＭＣＦ７細胞の１０％、ＳＫＢＲ３細胞の４％、ＬＮＣａＰ細胞の１％、および初代黒色腫細胞の１％においてＧＦＰ発現を生じる。同様に、ビオチン化ファージおよびストレプトアビジンＦＧＦ融合分子を用いるＦＧＦレセプター発現細胞への標的されたＧＦＰ遺伝子の送達は、現在報告されている（Ｌａｒｏｃｃａら（１９９８）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．９：２３９３〜２３９９）。しかし、遺伝子ＩＩＩを介する標的分子の直接の遺伝的融合は、アダプター分子を用いるよりもより有効であり得る。従って、ＦＧＦ−アダプター分子を用いてトランスフェクトされた細胞の最大パーセントは、報告されていないが、本発明者らは、それが感染された細胞の数、感染後の遺伝子発現の測定までの時間、およびＧＦＰを発現する細胞の数に基づいてＦＧＦ発現Ｌ６ラット筋原細胞のわずか０．０３％であることを評価する。発現のより大きい頻度（０．５％）がＣＯＳ−１細胞で見られたが、これは、ラージＴ抗原およびＳＶ４０媒介型ＤＮＡ複製の存在から生じ、従って、ほとんどの細胞には一般化されない。
【０１９９】
本発明者らの記載するアプローチは、標的化された細胞内薬物または遺伝子送達のためのリガンドを発見するための新規な方法を示す。ファージ抗体またはペプチドのライブラリーは、まず哺乳動物細胞によるエンドサイトーシスについて（Ｂａｒｒｙら、（１９９６）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２：２９９〜３０５）、または精製された抗原、細胞、組織もしくは器官への結合について、選択される。選択されたｓｃＦｖ遺伝子のｐＨＥＮ−ＧＦＰベクターへのサブクローニング後、個々のコロニーから産生されたファージは、遺伝子発現について直接スクリーニングされ得る。発現が１．０×１０10ｃｆｕ程度のプラスミドの少なさで検出され得るので、これは、可能である。これは、エンドサイトーシスされたｓｃＦｖの直接の同定を可能にするだけでなく、遺伝子発現のための適切な輸送を被るレセプター抗体のサブセットも可能にする。多価提示が効率的なエンドサイトーシスに必要である場合、ｓｃＦｖ遺伝子はｆｄ−Ｓｆｉ−Ｎｏｔにサブクローニングされ得、次いでこれはレポーターファージミドのレスキューに用いられる。ｓｃＦｖ−ｆｄファージの使用はまた種々の発現ベクターにおける多数の異なるレポーター遺伝子の標的化を可能にする。なぜなら、多数の市販の哺乳動物ベクターは、ｆ１複製起点を含むからである。この場合、抗体標的ファージは、特に標準的技術によりトランスフェクトすることが困難な細胞について、有用なトランスフェクション試薬であると証明され得る。
【０２００】
このアプローチを、標的化遺伝子送達のための抗体の、スクリーニングよりも直接選択に用いることが可能であることも証明されている。例えば、哺乳動物の細胞はＧＦＰ遺伝子を含むファージ抗体ライブラリーとともにインキュベートされ、次いでＦＡＣＳを用いてＧＦＰの発現に基づいてソートされる。ファージ抗体ＤＮＡは、細胞溶解により哺乳動物の細胞質から回収され、そしてＥ．ｃｏｌｉをトランスフェクトするために用いられ、そして選択の別の回のためのさらなるファージを調製する。回収可能なファージＤＮＡの量が不十分である場合、ｐＨＥＮ−ＧＦＰベクター中のネオマイシン遺伝子の包含がＧ４１８を用いるＧＦＰ発現哺乳動物細胞の選択を可能にする（Ｌａｒｏｃｃａら、前出）。
【０２０１】
最後に、この系は、標的可能なインビトロまたはインビボにおける遺伝子治療ビヒクルとして見込まれる。主な制限は感染の効率、薬物動態および免疫原性である。感染効率に関しては、この報告において標的されたファージにより得られた値（ファージ調製物の８．０×１０4ｍｌ）は、標的化レトロウイルスについて報告された値（１０3〜１０5／ｍｌのウイルス）（Ｋａｓａｈａｒａら（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：１３７３〜１３７６；Ｓｏｍｉａら（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２（１６）：７５７０〜７５７４）と異ならないが、アデノウイルス標的化ストラテジーについて報告された（Ｄｏｕｇｌａｓら（１９９６）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：１５７４〜１５７８；Ｗａｔｋｉｎｓら、１９９７）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．４（１０）１００４〜１０１２）よりは低い。しかし、より高い感染効率を制限する因子は、系の間で異なるようである。従って、レトロウイルスにより感染された細胞のパーセンテージは、バクテリオファージについて観察されたものよりも有意に高いが、感染は、細胞に侵入し得る多数のウイルス産生に遭遇する問題により制限される。すべての細胞は、標的化ファージを取り込むので、遺伝子発現は１つまたはいくつかの取りこみ後事象（例えば、ＤＮＡを放出するためのファージの分解、エンドソームのエスケープ、核標的化または転写）により制限される。ファージおよびそのＤＮＡの運命のより詳細な研究は、感染効率を増大するためのファージの操作を可能にするブロックがどこに存在するかを示唆するようである。例えば、エンドソームのエスケープは、複製欠陥アデノウイルスの同時投与（Ｃｕｒｉｅｌら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃｉＵＳＡ  ８８（１９）：８８５０〜８８５４）または、ファージの主要コートタンパク質ｐＶＩＩＩへの、エンドソームエスケープペプチド（Ｗａｇｕｅｒら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９（１７）：７９３４〜７９３８）もしくはエンドソームエスケープタンパク質（ＦｏｍｉｎａｙａおよびＷｅｌｓ（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（１８）：１０５６０〜１０５６８）の組み込みにより増強され得る。あるいは、感染効率は、ｐＶＩＩＩ変異体のｓｃＦｖ標的ライブラリーを作製すること、および増加した遺伝子発現について選択することにより複合的に上昇され得る。薬物動態に関しては、徹底的に研究されてはいないが、ファージの生体分布は血管内の腔に制限されるようである。これは、インビトロのファージ遺伝子治療に影響しないが、血管系を標的するものへのインビボ使用を制限し得る。これはなお、癌のような血管新生が役割を果たすものを含む多くの適用を残す。免疫原性に関しては、ファージは免疫原性であるらしく、従ってこれは、ファージがインビボで投与され得る回数を制限する。あるいは、例えば、免疫血清でのｐＶＩＩＩライブラリーのネガティブ選択により、免疫原性を軽減または排除するために主要コートタンパク質ｐＶＩＩＩを進化することが可能であることが証明され得る（Ｊｅｎｎｅら（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１（６）：３１６１〜３１６８）。
【０２０２】
本明細書で記載される実施例および実施態様は、例証的な目的のみのためであり、そしてそれらの観点から種々の改変および変化が当業者に示唆され、そして本出願の思想および本文ならびに添付の特許請求の範囲に含まれることが理解される。本明細書に引用される全ての刊行物、特許および特許出願は、すべての目的のためにその全体が参考として本明細書に援用される。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、大きなヒトｓｃＦｖファージ抗体ライブラリーの構築の方法を示す。ライブラリー構築のストラテジーは、ライブラリー構築の個々の工程を最適化して、ｓｃＦｖ遺伝子アセンブリの効率およびアセンブリしたｓｃＦｖ遺伝子のクローニングの効率の両方を増大させる工程を包含した。（Ａ）最初に、リンパ球由来のｍＲＮＡを使用して、ＶHおよびＶL遺伝子レパートリーをＲＴＰＣＲにより作製し、これは、異なるベクターにクローニングされ、それぞれ、８．０×１０8および７．２×１０6のメンバーのＶHおよびＶL遺伝子ライブラリーが作製される。クローニングされたＶ遺伝子ライブラリーは、ｓｃＦｖアセンブリのためのＶHおよびＶL遺伝子の安定かつ制限のない供給源を提供した。ペプチド（Ｇ4Ｓ）3をコードするＤＮＡを、ＶLライブラリーの５’末端に組み込んだ。このことによって、ｓｃＦｖ遺伝子の作製が、２つのＤＮＡフラグメントをＰＣＲスプライシングすることにより可能になった。以前に、ｓｃＦｖ遺伝子レパートリーは、ＶH、ＶL、およびリンカーＤＮＡからなる３つの別個のＤＮＡフラグメントからアセンブリされた。（Ｂ）ＶHおよびＶL遺伝子レパートリーを別個のライブラリーから増幅し、そして重複伸長ＰＣＲ（ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ＰＣＲ）を使用してｓｃＦｖ遺伝子レパートリーにアセンブリした。プライマーを使用して、ＶH遺伝子の５’末端の２００ｂｐ上流およびＶL遺伝子の２００ｂｐ下流にアニールしたＶHおよびＶL遺伝子レパートリーを再増幅した。これらの長い突出部は、効率的な制限酵素消化を確実にした。（Ｃ）ｓｃＦｖ遺伝子レパートリーを、ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩで消化し、そしてプラスミドｐＨＥＮ１に、Ｍ１３遺伝子ＩＩＩコートタンパク質遺伝子との融合物として、ファージディスプレイのためにクローニングした。
【図２】図２Ａ、２Ｂ、および２Ｃは、抗体ファージディスプレイを示す模式図を示す：（２Ａ）単一のｓｃＦｖ、（２Ｂ）単一のダイアボディー、または（２Ｃ）多重ｓｃＦｖを提示するファージのカーツーン。ｓｃＦｖ＝単鎖Ｆｖ抗体フラグメント；ＶH＝Ｉｇ重鎖可変領域ドメイン；ＶL＝Ｉｇ軽鎖可変領域ドメイン；ｐＩＩＩ＝ファージマイナーコートタンパク質ｐＩＩＩ；Ａｇ＝ｓｃＦｖに結合される抗原。
【図３】図３は、抗原特異的ファージの富化に対するトリプシン処理の効果を示す。ｆｄファージ（５．０×１０11ｃｆｕ）およびＣ６．５  ｓｃＦｖファージミド（５．０×１０8ｆｕ）の混合物をＳＫＢＲ３細胞とともに３７℃で２時間インキュベートした。表６に記載されたように洗浄した（−）か、または細胞を細胞溶解前にトリプシン処理した（＋）。第１のストリッピング緩衝液洗浄物中に存在するファージ（細胞表面ファージ）および細胞溶解物（細胞内ファージ）を、アンピシリン（Ｃ６．５ファージミド）またはテトラサイクリン（ｆｄファージ）の存在下で力価測定した。
【図４】図４は、抗原特異的ファージの回収に対するインキュベーション時間およびクロロキンの効果を示す。ＳＫＢＲ３細胞を、抗ボツリヌスファージミド（白四角、黒四角）またはＣ６．５  ｓｃＦｖファージミド（白丸、黒丸）（１．５×１０9ｃｆｕ／ｍｌ）を添加する前に、クロロキン（５０μＭ）の存在下（黒四角、黒丸）または非存在下（白四角、白丸）で２時間インキュベートした。細胞サンプルを、ファージ添加の０分後、２０分後、１時間後、または３時間後に採取し、図４に記載されるように洗浄し（トリプシン処理工程を包含する）、そして細胞内ファージを力価測定した。
【図５】図５は、細胞内ファージの回収に対するファージ濃度の効果を示す。種々の濃度のＣ６．５  ｓｃＦｖファージミド、Ｃ６ＭＬ３−９  ｓｃＦｖファージミド、Ｃ６．５ダイアボディーファージミドまたはＣ６．５  ｓｃＦｖファージ（投入ファージ力価）を、６ウェルプレート中２時間３７℃で増殖させたコンフルエント未満のＳＫＢＲ３細胞とともにインキュベートした。細胞を図４に記載にように処理（トリプシン処理を包含する）し、そして細胞内ファージを力価測定する（産生ファージ力価）。
【図６】図６は、抗ＥｒｂＢ−２ファージミドおよび真核生物レポーター遺伝子をパッケージングするファージを生成するためのストラテジーを示す。左列：ヘルパーファージを使用して、ＴＧ１含有ｐＨＥＮ−Ｆ５−ＧＦＰ、ｆｌ複製起点（ｆｌ  ｏｒｉ）、遺伝子ＩＩＩに融合した抗ＥｒｂＢ−２  Ｆ５  ｓｃＦｖ遺伝子、およびＣＭＶプロモーターにより駆動される真核生物ＧＦＰレポーター遺伝子から構成されるファージミドを感染させる。培養上清から回収したファージは、平均１つのｓｃＦｖ−ｐＩＩＩ融合タンパク質を提示し、そしてそれらの９９％は、ＧＦＰレポーター遺伝子をパッケージングする。右列：抗ＥｒｂＢ２  Ｆ５  ｓｃＦｖ遺伝子をｆｄファージゲノムに、ｓｃＦｖ−ｐＩＩＩ融合物として発現のためにクローニングする。ｆｄ−Ｆ５ファージを使用して、ＴＧ１含有ＧＦＰレポーターファージミドベクター（ｐｃＤＮＡ３−ＧＦＰ）を感染させる。培養上清から精製したファージは、多重ｓｃＦｖ−ｐＩＩＩ融合タンパク質を提示し、そして約５０％がＧＦＰレポーター遺伝子をパッケージする。
【図７】図７は、細胞に対する抗ＥｒｂＢ２ファージミドおよびファージの結合の比較を示す。１０5のＥｒｂＢ２発現ＳＫＢＲ３細胞を、漸増濃度のＦ５−ファージミド（白丸）またはｆｄ−Ｆ５ファージ（白四角）とともに４℃で１時間インキュベートした。ファージを結合した細胞表面を、ビオチン化抗Ｍ１３およびストレプトアビジン−ＰＥを用いて検出した。結合をＦＡＣＳにより検出し、そして結果を平均蛍光強度（ＭＦＩ）として表した。
【図８】図８Ａおよび８Ｂは、乳癌細胞株におけるファージミド媒介性遺伝子移入を示す。（図８Ａ）６ウェルプレート中で増殖させた（１，２，３）２×１０5ＭＣＦ７細胞（低ＥｒｂＢ２発現）または（４，５，６）２．０×１０5ＳＫＢＲ３細胞（高ＥｒｂＢ２発現）を、（１，４）ファージなし、（２，５）５．０×１０12ｃｆｕ／ｍｌのＧＦＰをパッケージングするヘルパーファージ、または（３，６）５．０×１０11ｃｆｕ／ｍｌのＦ５−ＧＦＰ−ファージミドのいずれかと、４８時間インキュベートした。細胞をトリプシン処理し、そしてＧＦＰをＦＡＣＳにより検出した。（図８Ｂ）等量のＭＣＦ７およびＳＫＢＲ３細胞（１×１０5）を、ともに増殖させ、そして５．０×１０11ｃｆｕ／ｍｌのＦ５−ＧＦＰ−ファージミドととともに４８時間インキュベートした。細胞をトリプシン処理し、そして４Ｄ５抗体およびローダミン結合体化ヒツジ抗マウスＩｇを使用してＥｒｂＢ２発現について染色し、ＳＫＢＲ３細胞（領域Ｒ１）とＭＣＦ７細胞（領域Ｒ２）を区別した。各亜集団のＧＦＰ含量を、ＦＡＣＳ により決定した。
【図９】図９Ａ、９Ｂ、９Ｃ、および９Ｄは、ＳＫＢＲ３細胞におけるファージミド媒介性ＧＦＰ発現の濃度依存性および時間経過を示す。図９Ａおよび９Ｂは、ファージミドの濃度依存性およびＳＫＢＲ３細胞におけるファージ媒介ＧＦＰ発現を示す。５．０×１０4細胞を２４ウェルプレート中で増殖させ、そして漸増濃度のＦ５−ＧＦＰファージミド（四角）、ｆｇ−Ｆ５−ＧＦＰ−ファージ（菱形）またはＧＦＰ−ヘルパーファージ（丸）とともにインキュベートした。６０時間後、細胞をトリプシン処理し、そしてＧＦＰ発現についてＦＡＣＳで分析した。図９Ｃおよび９Ｄは、ＳＫＲＢ３細胞におけるファージミド媒介性ＧＦＰ発現の時間依存性を示す。５．０×１０4細胞を、５×１０11ｃｆｕ／ｍｌのＦ５−ＧＦＰ−ファージミドとともにインキュベートし、そしてＧＦＰ発現についてＦＡＣＳで分析した。４８時間を超えるインキュベーション時間にわたり、ファージを２．５×１０4細胞に添加し、そして培養培地を４８時間のインキュベーション後に新鮮培地と置き換えた。結果を、（９Ａおよび９Ｃ）ＧＦＰ陽性細胞の％ならびに（９Ｂおよび９Ｄ）ＧＦＰ陽性細胞のＭＦＩとして表す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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