(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
DNA鎖をRNA鎖に共有結合せしめる方法であって、
（a）トポイソメラーゼ切断部位を具備するDNA切断基質と、該部位に対して特異的なトポイソメラーゼとをインキュベートすることによって、一以上の5’一本鎖尾部を有するトポイソメラーゼ−DNA中間体を形成することと、
（b）トポイソメラーゼ−DNA中間体の共有結合したDNA鎖が、RNAアクセプター鎖に連結し、且つトポイソメラーゼが解離する条件下において、前記トポイソメラーゼ−DNA中間体に、前記5’一本鎖尾部に相補的なアクセプターRNA鎖を添加することにより、DNA鎖をRNA鎖に共有結合せしめることと
を具備する方法。
【請求項２】
請求項１の方法であって、トポイソメラーゼ切断部位を具備するDNA鎖を相補的DNA鎖にハイブリダイズすることによって、DNA切断基質を作出し、それによりトポイソメラーゼ切断部位及び切断容易な結合の3’に位置するオリゴヌクレオチド脱離基を有するDNA切断基質を形成する方法。
【請求項３】
請求項１の方法であって、当該DNA切断基質が、トポイソメラーゼ切断部位を具備する配列である方法。
【請求項４】
請求項１の方法であって、当該トポイソメラーゼ切断部位がCCCTTを具備する配列である方法。
【請求項５】
請求項１の方法であって、当該トポイソメラーゼがワクシニアトポイソメラーゼ酵素である方法。
【請求項６】
請求項１の方法であって、当該トポイソメラーゼ切断部位を具備するDNA鎖が放射性ラベルされている方法。
【請求項７】
請求項６の方法であって、当該放射性ラベルが、32P又は放射性ハロゲンである方法。
【請求項８】
請求項１の方法であって、トポイソメラーゼ切断部位を具備するDNA鎖が、ビオチン部分でラベルされている方法。
【請求項９】
請求項１の方法であって、当該トポイソメラーゼ結合DNA中間体とアクセプターRNA鎖がインビトロで連結される方法。
【請求項１０】
RNA分子の5’末端にタグ付加する方法であって、
（a）トポイソメラーゼ切断部位を具備するDNA切断基質と、該部位に対して特異的なトポイソメラーゼとをインキュベートすることによってトポイソメラーゼ−DNA中間体を形成することと、ここで、当該トポイソメラーゼ−DNA中間体は一以上の5’一本鎖尾部を有する、
（b）当該トポイソメラーゼ−DNA中間体の共有結合したDNAが、当該RNA分子に連結し、且つ当該トポイソメラーゼが解離する条件下において、前記トポイソメラーゼ−DNA中間体に、当該5’一本鎖尾部に相補的な5’−ヒドロキシル末端化されたRNA分子を添加し、それによって5’末端タグ付加DNA−RNA連結産物を形成することと
を具備する方法。
【請求項１１】
5’−ヒドロキシル末端化されたRNA分子が、インビトロ合成の産物又は細胞若しくは組織から単離した産物である請求項１０の方法。
【請求項１２】
合成又は単離後に、RNA分子が脱リン酸化される請求項１１の方法。
【請求項１３】
RNA分子をアルカリホスファターゼで処理することによって、当該脱リン酸化が達成される請求項１２の方法。
【請求項１４】
請求項１０の方法であって、トポイソメラーゼ切断部位を有するDNA鎖を相補的DNA鎖にハイブリダイズすることによって、当該DNA切断基質を作出し、それによりトポイソメラーゼ切断部位及び切断容易な結合の3’に位置するオリゴヌクレオチド脱離基を有するDNA切断基質を形成する方法。
【請求項１５】
当該トポイソメラーゼがワクシニアトポイソメラーゼ酵素である請求項１０の方法。
【請求項１６】
当該切断部位がCCCTTを具備する請求項１０の方法。
【請求項１７】
当該DNAが5’末端ラベルを具備する請求項１０の方法。
【請求項１８】
5’末端ラベルがビオチン部分、キチン結合ドメイン、又はグルタチオン-S-トランスフェラーゼ部分である請求項１７の方法。
【請求項１９】
5’−ヒドロキシル末端化されたRNA分子の添加に先立って、5’末端ラベルされたDNAを固相支持体上に固定化することをさらに具備する請求項１７の方法。
【請求項２０】
固相支持体がストレプトアビジン、アビジン、キチン、又はグルタチオンを具備する請求項１９の方法。
【請求項２１】
未修飾のRNAを具備する液相から5’末端ラベルされたDNA-RNA連結産物が固定化されている固相支持体を分離することにより、ビオチン化された5’末端タグ付加DNA-RNA連結産物を精製することをさらに具備する請求項１９の方法。
【請求項２２】
完全長mRNAポリヌクレオチドを単離する方法であって、
（a）当該薬剤による当該キャップ構造を除去する条件下で、RNAのサンプルをｍRNAの５’キャップ構造を除去する薬剤と接触すること；
（b）当該薬剤により脱キャップ化されたｍRNAを脱リン酸化する条件下で、（a）のサンプルを脱リン酸化剤と接触すること；
（c）トポイソメラーゼにより当該DNAと当該RNAとを連結する条件下で、（b）のサンプルを、DNA部分にアフィニティ標識を含むDNA−トポイソメラーゼ複合体と接触すること；および
（d）（c）の当該ＤＮＡ−mRNA連結産物をアフィニティ精製して、それにより完全長mＲＮＡポリヌクレオチドを単離すること。
【請求項２３】
請求項22に記載の方法であって、工程（c）のDNAが、DNAのポリメラーゼ連鎖反応により触媒される増幅での使用に適切なオリゴヌクレオチドプライマーとアニーリングするために適切な公知の配列を更に含む方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の方法であって、ポリメラーゼ連鎖反応により触媒される過程により、当該ｃDNAが当該DNA−RNA連結産物から合成される方法。
【請求項２５】
請求項２４に記載の方法であって、当該ポリメラーゼ連鎖反応において使用されるセンスプライマーが当該DNA−ｍRNA連結産物のDNA配列の部分に対して相補的であり、ポリメラーゼ連鎖反応において使用されるアンチセンスプライマーが、当該連結産物の3’末端のポリ（A）テールまたはｍRNA配列の何れかに対して相補的である方法。
【請求項２６】
請求項２２に記載の方法であって、工程（a）の当該薬剤がピロホスファターゼである方法。
【請求項２７】
請求項２２に記載の方法であって、工程（a）の当該薬剤が、過ヨウ素酸酸化又はβ脱離を介して作用する方法。
【請求項２８】
請求項２２に記載の方法であって、工程（b）の当該薬剤が、アルカリホスファターゼである方法。
【請求項２９】
請求項２２に記載の方法であって、工程（c）の当該DNAが、更に部位特異的制限エンドヌクレアーゼのための認識部位を含む方法。
【請求項３０】
請求項２２に記載の方法であって、当該トポイソメラーゼがワクシニアDNAトポイソメラーゼである方法。
【請求項３１】
請求項２４に記載の方法であって、当該合成されたcDNAを発現ベクター中に挿入することを更に具備する方法。
【請求項３２】
請求項２２に記載の方法であって、工程（c）の当該DNAが、直鎖状にされた発現ベクターを含む方法。
【発明の詳細な説明】
本出願は、同時係属中の米国仮出願番号第60/049,405号（1997年6月12日出願）の利益を請求する。
本発明は、米国保健社会福祉省国立衛生研究所によるグラント番号第GM46330号の下における助成で創作された。従って、アメリカ合衆国政府は、本発明における一定の権利を有する。
本出願を一貫して、種々の引用文献を括弧中に引用する。引用することにより、これらの出版物の開示はそっくり本出願中に組み込まれ、これにより本発明の属する当該技術の現状をより十分に記述する。これらの引用文献類の全文献の目録を、配列表および請求の範囲に先んじて本出願の末部に掲載した。
発明の背景
ワクシニアトポイソメラーゼ（Vaccinia topoisomerase）は、二本鎖DNAに結合し、配列5’-CCCTT↓での共有結合形DNA-（3’-ホスホチロシル）-タンパク付加物を形成する。該酵素は、DNA5’およびRNA3’よりなる切断容易な36-merCCCTT鎖（DNA-p-RNA）と、直ちに反応する。しかしながら、RNA5’およびDNA3’からなる、切断容易なホスフェート（RNA-p-DNA）である36-merは、共有結合形付加物の形成には不十分な基質である。ワクシニアトポイソメラーゼは、共有結合で維持されたCCCTT-含有DNAを、5’-OH末端化RNAアクセプターに効率的に転移する；これにより、トポイソメラーゼは、インビトロにおいて、RNAの5’末端のタグ付けに使用することが可能である。
そのアクセプターDNAが、トポイソメラーゼ-DNAドナー複合体の非切断DNA鎖に対して塩基の対合が可能である条件で、共有結合したCCCTT-含有DNA鎖を5’-OH末端化DNAアクセプターに再連結することは、有効であり、且つ即効性（Krel>0.5sec-1）である。DNAに対する鎖転移速度は、該アクセプター鎖の5’ヌクレオチドでの塩基のミスマッチによって、検出可能な影響を受けない。該アクセプターの5’末端でのヌクレオチドの欠失および挿入は、再連結の速度を遅らせる；観察された反応速度の序列は：+1挿入>-1欠失>+2挿入>>-2欠失：である。これらの研究結果は、エステル交換反応作用における5’OH末端に位置された性質が重要であることを強調するものであるが、しかしまた、DNA分子類と、誤って対合した末端または対合していない末端とを結合することにより、トポイソメラーゼが突然変異を起こす可能性をも高めてしまう。
ワクシニアトポイソメラーゼ、即ち314-アミノ酸真核性I型酵素は、特異的な標的配列である5’-（T/C）CCTT↓で、二本鎖DNAに結合し、切断する（1-3）。切断はエステル交換反応であり、この反応では、Tp↓Nホスホジエステルが前記酵素のTyr-274により攻撃され、その結果、DNA-（3’-ホスホチロシル）タンパク付加物が形成される（4）。該共有結合したトポイソメラーゼは、多様なDNA鎖の転移反応を触媒する。これは、最初に切断された同じ結合を横切るCCCTT含有鎖の再連結（超螺旋性DNAを緩和処理する間に生ずるような再連結）を可能にし、或いは該鎖を異種アクセプターDNA5’末端に対して連結することも可能であり、それによって組換え分子を創作する（5-7）。
シングルCCCTT標的部位を含有する二本鎖DNA基質は、該切断および鎖転移ステップを詳細に分析するために使用されてきた。切断−再連結平衡は、トポイソメラーゼが、切断部位の二本鎖DNA3’の
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18-bpを含有するDNAリガンドに対してエステル交換をする場合に確立される（8-11）。切断容易な鎖の5’-OH化末端の遠位の断片があるために、容易には切断されない鎖と安定して対合されているという事実の効果により、平衡にある該反応が、活性部位の近くで安定して維持されている。CCCTT含有鎖の約20%は、平衡に共有結合している（11）。「自殺」切断は、該CCCTT含有基質が、切断容易な結合の15塩基対以下の3’を含む場合に生じ、これは、短脱離鎖がタンパク-DNA複合体から分離されるからである。酵素過剰では、自殺基質の>90%が切断される（11）。
該自殺中間体は、切断されたCCCTT鎖をDNAアクセプターに転移することが可能である。該自殺中間体の非切断鎖の5’-OH末端が3’ホスホチロシル結合を攻撃する場合に、分子内鎖転移は生じ、Tyr-274を脱離基として放出する。この結果、ヘアピンDNAループが形成される（5）。自殺中間体が外因性5’-OH末端化アクセプター鎖を供給する場合に、分子内再連結が生じ、その配列は切断容易なホスフェートの直ぐ近くにおける非切断鎖の一本鎖テール（single-strand tail）に対して相補的である（5）。アクセプター鎖が不在である場合には、該トポイソメラーゼは、3’ホスフェート末端化加水分解産物を放出しながら、CCCTT鎖を水に転移することが可能であり、或いは、3’ホスホグリセロール誘導体を放出しながらグリセロールに転移することが可能である（12）。該加水分解およびグリセロール分解（glycerololysis）反応は、DNAアクセプター鎖に対する再連結よりも更に緩慢であるにも関わらず、非DNA求核試薬に対する鎖転移の程度は、15-40%にも達し得る。
DNA切断におけるワクシニアトポイソメラーゼの特異性、および鎖転移におけるその転用性は、ポリヌクレオチド合成［ここでは、CCCTT切断部位を含有するDNAオリゴヌクレオチドを、他のDNA分子と適切な末端とを結合するための活性化リンカーとして使用する］のためのトポイソメラーゼを基礎とする戦略に影響を与えてきた（13）。本研究は、RNA含有ポリヌクレオチド類を切断し再結合するワクシニアトポイソメラーゼの能力を試験している。該酵素は、CCCTT含有分子［ここで、切断容易鎖またはその相補鎖の何れかは、完全にRNAからなる］に対して共有結合しないことは、以前から明らかであった（9）。更に、該酵素の五炭糖特異性を探求するために、我々は、合成CCCTT含有基質［ここで、該切断容易鎖は、DNA含有する半分とRNAを含有する半分からなる］を製造した。このように、我々は、該酵素が切断の容易なホスフェートのRNA下流に対しては無作用であるが、しかし、その切断容易なホスフェートの領域５’がRNA形態にある場合には、共有結合形複合体を形成しないことを示した。また、該アクセプター鎖の5’末端による対合はDNA鎖転移反応速度に対して寄与していることが評価された。
発明の概要
本発明は、RNA鎖に対してDNA鎖を共有結合する方法であって、（ａ）トポイソメラーゼ切断部位を含有するDNA切断基質とその部位に特異的なトポイソメラーゼとをインキュベートすることにより、トポイソメラーゼ-DNA中間体を形成することと［ここで、前記トポイソメラーゼ−DNA中間体は１以上の５’一本鎖テールを有する］；並びに（ｂ）前記トポイソメラーゼ-DNA中間体の５’一本鎖テールをRNAアクセプター鎖に連結でき、且つ前記トポイソメラーゼを解離できる条件において、該トポイソメラーゼ-DNA中間体を、該5’一本鎖テールに対して相補的なアクセプターRNA鎖を添加することと、それにより該DNA鎖を該RNA鎖に共有結合することとを具備する方法を提供する。該DNA切断基質は、トポイソメラーゼ切断部位を有するDNA鎖を１以上の相補的なDNA鎖にハイブリダイズすることと、それによりトポイソメラーゼ切断部位とオリゴヌクレオチド脱離基（切断容易な結合の3’に位置する）とを有するDAN切断基質を形成することにより製作することが可能であり、或いはトポイソメラーゼ切断部位を含むプラスミドベクターであってもよい。
また、本発明は、5’一本鎖テールを有する共有結合形トポイソメラーゼ-DNA中間体も提供する。
本発明のもう一つの側面は、トポイソメラーゼ触媒により共有結合されたDNA-RNA分子を提供する。
本発明は、標識された5’末端を有する共有結合されたDNA-RNA分子を提供する。
本発明は更に、RNA分子の5’末端をタグ付けする方法であって；（ａ）トポイソメラーゼ切断部位を有するDNA切断基質とその部位に特異的なトポイソメラーゼとをインキュベートすることによりトポイソメラーゼ-DNA中間体を形成することと［ここで、前記トポイソメラーゼ-DNA中間体は１以上の5’一本鎖テールを有する］；並びに（ｂ）前記トポイソメラーゼ-DNA中間体の共有結合されたDNA鎖を前記RNA分子に連結でき、且つ前記トポイソメラーゼを解離できる条件において、その5’一本鎖テールに対して相補的な5’ヒドロキシ末端化RNA分子を、該トポイソメラーゼ-DNA中間体に添加することと、それにより5’末端にタグを付したDNA-RNA連結産物を形成することとを具備する方法を提供する。前記DNA切断基質は、例えば、トポイソメラーゼ切断部位を有したDNA鎖を相補的なDNA鎖にハイブリダイズし、それによりトポイソメラーゼ切断部位とオリゴヌクレオチド脱離基（切断容易な結合の3’に位置する）とを有するDNA切断基質を形成することにより作成することができる。
本発明のもう一つの側面は、5’末端タグ付加RNA分子を提供する。
もう一つの側面において、本発明はまた、トポイソメラーゼの使用によりインビトロで結合されたDNA-RNA分子を提供する。
本発明は更に、キャップを形成したメッセンジャーRNAの5’末端にタグを付す方法であって：ａ）細胞または組織からmRNAを単離することと；ｂ）単離されたmRNAからRNAキャップ構造を除去し、その結果、脱キャップRNAとすることと；ｃ）前記脱キャップRNAを脱リン酸化し、それにより脱キャップ脱リン酸化RNAを形成することと；ｄ）トポイソメラーゼ切断部位および相補鎖［前記相補鎖は前記トポイソメラーゼ切断部位の下流に混成、または任意の塩基組成物を有する］を有するトポイソメラーゼのためのDNA切断基質［前記DNA切断基質はDNA（N）基質として示す］を構築することと；ｅ）前記DNA-（N）基質をトポイソメラーゼで切断し、それにより非切断鎖に混成の、または任意の塩基組成物の5’テールを有する共有結合形トポイソメラーゼ-DNA-（N）M複合体を形成することと；並びにｆ）前記切断共有結合形トポイソメラーゼ-DNA-（N）M複合体を、ステップ（ｃ）において形成された脱キャップ脱リン酸化RNAと共にインキュベーションし、5’DNA-タグ付加DNA-RNA連結産物を形成することとを具備する方法を提供する。
ここで使用される通り、該DNA切断基質の塩基（N）の数は、DNA-（N）基質として上記に示すが、１から４塩基長が可能である。
本発明はまた、キャップのないRNAを排除した後に、キャップを形成したmRNAを単離し、クローニングする方法であって：ａ）細胞または組織からmRNAを単離することと；ｂ）該mRNAを脱リン酸化することと；ｃ）切断されたトポイソメラーゼ-BioDNA-（N）複合体と前記脱リン酸化mRNAとをインキュベートし、5’BioDNA-タグ付加DNA-RNA連結産物を形成することと；ｄ）ストレプトアビジンに対して吸着することにより、5’BioDNA-タグ付加DNA-RNA連結産物と何れの未反応切断トポイソメラーゼBioDNA-（N）複合体を除去することと、且つ何れの非吸着物質をも回収することと［前記物質は、キャップ形成5’末端を有したRNAを濃縮したものであり、且つステップ（ｂ）における脱リン酸化を妨害し、それにより前記切断トポイソメラーゼ-BioDNA-（N）複合体との反応を不可能にする］；ｅ）ステップ（ｄ）における非吸着物質から回収した濃縮されたRNAから5’末端キャップを除去することと；ｆ）キャップを除去したRNAを脱リン酸化し、それにより脱キャップ脱リン酸化RNAを形成することと；ｇ）切断されたトポイソメラーゼ-BioDNA-（N）複合体を前記脱キャップ脱リン酸化RNAとインキュベートし、5’BioDNA-タグ付加DNA-RNA連結産物を形成することと；ｈ）前記5’DNAタグ付加DNA-RNA連結産物をアフィニティー精製することと；並びにｉ）該切断部位のトポイソメラーゼ切断基質５’の切断容易鎖に一致するセンスプライマーと、アンチセンスプライマー［前記アンチセンスプライマーは、3’ポリ（A）テールまたは内在的なRAN配列の何れかに対して相補性を有する］とを使用して、DNA-RNA連結産物の脱キャップ脱リン酸化RNAをPCR増幅することとを具備する方法を提供する。
本発明はまた、完全長遺伝子配列を得る方法であって、単離したmRNA配列に対してDNAタグを結合することと、DNAを合成するためのテンプレートとして前記DNAタグ付加mRNAを使用することと具備する方法を提供する。DNAは、更に発現ベクターに挿入されてもよく、組換えタンパクを発現するために使用されてもよい。
【図面の簡単な説明】
図１Ａ−Ｂ．  DNA-p-RNAおよびRNA-p-DNA鎖のトポイソメラーゼ切断。（Ａ）該切断反応において使用された36bp基質を、黒丸（●）により示す32P標識化した切断容易なホスフェートと共に示す。切断容易なホスフェートに隣接する上鎖部分（DNAまたはRNAの何れかである）は、一括して括弧に入れる；下鎖は全てDNAである。（Ｂ）50mMのトリス-HCl（pH8.0）、0.2pmolの基質（DNA-p-RNAまたはRNA-p-DNAの何れか）および表示通りのトポイソメラーゼを含有する反応混合物（20μl）を37℃で10分間、インキュベートした。共有結合形付加物の形成（トポイソメラーゼに対して転移されたインプット標識の％）を、添加した酵素量の関数として表示する。
図２Ａ−Ｂ．  ＲＮＡ含有36-mer基質の切断の速度論。反応混合物（20μl当たり）は、50mMのTris-HCl（pH8.0）、0.2pmolの放射性標識した36-mer基質および1pmolのトポイソメラーゼを含有していた。共有結合形付加物の形成（トポイソメラーゼに対して転移されたインプット標識の％）を、37℃でのインキュベート時間の関数として表示する。（Ａ）DNA-p-DNAおよびDNA-p-RNAの切断；ｘ軸は秒単位。（Ｂ）RNA-p-DNAの切断；ｘ軸は分単位。
図３Ａ−Ｂ．  RNAアクセプターに対する鎖転移。（Ａ）共有結合形トポイソメラーゼ-DNA複合体（自殺中間体）および18merアクセプター鎖（DNAまたはRNA）の構造を示す。（Ｂ）再連結反応は、材料および方法の下に記述された通りのシングルターンオーバー条件の下で行われた。再連結の範囲（30-mer鎖転移産物に変換されたインプット標識化DNAのパーセンテージとして表示）は、インキュベーション時間の関数として表示する。
図４．  鎖転移反応産物の分析。50mMのトリス-HCl（pH8.0）、0.5pmolの5’標識化自殺DNA切断基質、および2.5pmolのトポイソメラーゼを含有する反応混合物（20μl）を、37℃で10分間インキュベートした。次に鎖転移を、50倍過剰量のアクセプターDNA（18-merD；レーン１および２）、またはアクセプターRNA（18-merR；レーン５および６）を添加し、同時に該混合物を0.3MのNaClに調整することにより開始した。再連結反応は、10分間のインキュベーションの後、SDSを0.2%まで添加することによって停止した。試料は、フェノール／クロロホルムで抽出し、且つエタノール沈澱を行った。そのペレットを、12μlの0.1MのNaOH、1mMのEDTA（NaOH+）、または12μlの10mMのトリス-HCl（pH8.0）、1mMのEDTA（NaOH-）の何れかの中に再攪拌した。これらの試料を、37℃で16時間インキュベートした、インプット18-mer DNA基質（トポイソメラーゼに対して暴露されていない）を含有するコントロール試料を並行して処理した（レーン３および４）。アルカリ処理をした試料を、1.2μlの1MのHClを添加することにより中和した。次に、全試料をエタノール沈澱し、ホルムアミド中に再懸濁し、5分間、95℃で加熱し、続いてTBE中で7Mの尿素を含有する17%ポリアクリルアミドゲルで電気泳動を行った。該ゲルのオートラジオグラフィを示す。30-mer再連結産物および18-merインプット鎖の位置を左側に示す。得られた該RNA鎖転移反応産物（レーン６）のアルカリ加水分解分離種をアスタリスクにより表示した。
図５Ａ−Ｂ．  T3RNAポリメラーゼにより転写されたRNAのDNA-タグ付け。（Ａ）共有結合形トポイソメラーゼ-DNAドナー複合体およびRNAアクセプターの構造を示す。該自殺中間体の5’シングル鎖テールは、T3転写産物の5’末端での18ヌクレオチドに対して相補的てある。反応混合物（15μl当たり）は、50mMのトリス−HCl（pH8.0）、0.3MのNaCl、および0.1pmolの32P-GMP標識T3転写産物を含有していた。（Ｂ）再連結は、予め形成したトポイソメラーゼ−DNAドナー（RNAアクセプターよりも10倍モル濃度過剰で）添加することにより開始した。インキュベートを37℃で行った。アリクウォット（15μl）を記述された時間で除去し、直ちにSDSおよびEDTAを添加することにより反応を停止した。該試料を、50%ホルムアミドに調整し、5分間、95℃で加熱し、TBE中で7Mの尿素を含有する12%ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。前記標識化36-merT3転写産物の5’末端への12ヌクレオチドDNAドナー鎖を転移することにより、標識化48-mer産物が得られた。インプット36-merの48-merへの転換を、リン画像化装置（phosphorimager）で該ゲルをスキャンすることにより数値化した。
図６Ａ−Ｃ．  DNA欠失および挿入を導くトポイソメラーゼ触媒鎖転移反応の速度論。（Ａ）予め形成したドナー複合体の構造を図の上部に示す。再連結反応は、材料および方法の下に記述された通りのシングルターンオーバー条件の下で行った。全DNAアクセプターを、インプットCCCTT-含有基質に対して50倍モル濃度過剰でインキュベートした。（Ｂ）欠失形成。完全な塩基対18-merアクセプターDNAオリゴヌクレオチド（白丸；○）、17-merオリゴヌクレオチド［該ドナー複合体にアニーリングして１ヌクレオチドのギャップを欠失した（黒四角；■）］および16-mer鎖［アニーリングして２ヌクレオチドギャップを脱離した（白四角；□）］の構造を示す。（Ｃ）挿入形成。完全な塩基対18-merアクセプター（白丸；○）、5’に余分な１ヌクレオチドを含む19-merオリゴヌクレオチド（黒三角；▲）、および5’に余分な２ヌクレオチドを含む20-merアクセプター（三角；△）の構造を示す。再連結の程度をインキュベーション時間の関数として表示する。
図７．  欠失および挿入DNA鎖転移産物の分析。アクセプターに対する陥没および突出5’末端による再連結は、図６の対する説明文中で記述された通りに行われた。該反応産物を、TBE中の7Mの尿素を含有した17%のポリアクリルアミドゲルを通した電気泳動により分析した。このゲルのオートラジオグラフィを示す。該アクセプター鎖は以下の通りである：アクセプターなし（レーン２）；完全に対合された18-mer（レーン３および８）；１ヌクレオチドギャップを有する17-mer（レーン４）；２ヌクレオチドギャップを有する16-mer（レーン５）；１ヌクレオチド挿入を有する19-mer（レーン６）；２ヌクレオチド挿入を有する20-mer（レーン７）。5’を標識した18-mer切断容易鎖は含有するがトポイソメラーゼは含有しないコントロール試料をレーン１および９で分析した。
図８．  シングル５’塩基ミスマッチを含むDNAアクセプターに対する鎖移転。再連結反応は、材料および方法の下で記述された通りのシングルターンオーバー条件下で実施された。全DNAアクセプターを、該インプットCCCTT-含有基質に対して50倍モル濃度の過剰量でインキュベートした。十分に相補的な18-merと、３つの末端ヌクレオチド変異体の構造を示す。
図９Ａ−Ｂ．  分子内ヘアピン形成の速度論。（Ａ）塩基対合の可能性のないペアピン形成。ＤＮＡ切断基質は、30-mer相補鎖（●）または18-mer相補鎖（○）に対して、5’32P標識18-mer切断容易鎖をアニーリングすることにより製造した；該基質類の構造を、矢印により示されるトポイソメラーゼ切断部位と共に示す。50mMのトリスHCl（pH7.5）、0.5pmolのDNA基質および1pmolのトポイソメラーゼを含有する反応混合物（20μl当たり）を、37℃で、10分間、インキュベートした。次に、この混合物を、0.3MのNaClに調整した。アリクウォット（20μl）を、塩の添加に先んじて（0時間）、および塩添加の後に種々の間隔をおいて、直ちに回収した；該反応は、停止溶液（1%のSDS、95%のホルムアミド、20mMのEDTA）を等容量で添加することにより直ちに停止した。該試料を、熱変性し、TBE中で7Mの尿素を含有する17%のポリアクリルアミドゲルを通して電気泳動した。分子内鎖転移の程度（ヘアピン産物に変化したインプット標識化基質のパーセントとして表示）を、NaClの添加後の時間の関数として表示する。（Ｂ）塩基対合の可能性を伴なうヘアピン形成。18-mer/30-mer切断基質の構造を、矢印により示されるトポイソメラーゼ切断部位と共に示す。50mMのトリスHCl（pH7.5）、0.5pmolのDNA基質および1pmolのトポイソメラーゼを含有する反応混合物（20μl当たり）を、37℃で、２分間、インキュベートした。次に、この混合物を0.3MのNaClに調整した。アリクウォット（20μl）を、塩添加に先んじて（0時間）、および塩添加後、および塩添加の後に種々の間隔をおいて、直ちに回収した。分子内鎖転移の程度は、NaClの添加後の時間の関数として表示される。
図１０Ａ−Ｂ．  ワクシニアトポイソメラーゼを使用したRNAのアフィニティータグ形成。（Ａ）鎖転移反応経路を図を用いて説明する。シングルトポイソメラーゼ認識部位を含むビオチン化DNA基質を、ダイナビーズ（Dynabeads;Dynal）ストレプトアビジン固体支持体上に固定した。ビオチン部分（黒四角により示す）を、自動オリゴヌクレオチド合成の標準的プロトコールを経て、CCCTT-含有鎖の5’末端で導入する。精製されたワクシニアトポイソメラーゼを、ビーズに結合したDNAと反応し、図解される通りに、共有結合形酵素-DNAドナー複合体を形成した。DNAに結合しない酵素は、緩衝液で該ビーズを洗浄することにより除去される。この鎖転移反応は、［32P］-CMP標識化T7転写産物（アルカリホスファターゼによる前処理により脱リン酸化されている）の添加により開始される。該ドナー複合体の5’一本鎖テールは、T7転写産物の５’末端の１２ヌクレオチドに対して相補的である。共有結合で維持されるビオチン化DNA鎖のT7転写産物に対する再連結は、30-merRNAの５０ヌクレオチド産物への転換として観察される。該混合物を、37℃で、15分間、インキュベートした。次に、ビーズを、遠心により回収し、洗浄し、並びに0.8%のSDSおよび80%のホルムアミドを含有する20μlの緩衝液に再懸濁した。前記試料を、95℃で、5分間加熱し、5分間遠心し、次にその上清をTBE緩衝液中で7M尿素を含有する12%のポリアクリルアミドゲルを通して電気泳動した。（Ｂ）前記ゲルのオートラジオグラフィを図中に示す。レーンＢ（Bound；結合）−ダイナビーズに結合した鎖転移反応産物；レーンＦ（Free；遊離）−鎖転移反応からの上清。インプット30-merT7転写物、および50-mer産物の位置を右側に示す。
図１１．  DNA−タグ付加mRNAを使用して完全長遺伝子配列を得る方法のスキーム表示。簡単には、固体支持体に対して吸着させることにより、即ち、ストレプトアビジンで結合した磁気ビーズに対してビオチン化したキャップ形成mRNAを結合することを用いる等の方法により、キャップを形成した完全長mRNAを単離する。この単離されたmRNAは、キャップを除去され（タバコ酸性ホスファターゼを使用する）、且つ脱リン酸化され（アルカリホスファターゼを使用する）、次に、以下に概説する方法を用いてDNAタグにより修飾する。DNA-タグ付加mRNAを使用して、逆転写酵素を使用した第一の鎖cDNAを生成し、且つPCRを用いて増幅した。増幅cDNAを、次に、プラスミドベクターに挿入する。
発明の詳細な説明
一貫して本出願には、以下の標準的な略語を使用して特定のヌクレオチドを示す：
Ｃ＝シトシン        Ａ＝アデノシン        Ｕ＝ウラシル
Ｔ＝チミジン        Ｇ＝グアノシン
本発明は、RNA鎖に対してDNA鎖を共有結合する方法であって、（ａ）トポイソメラーゼ切断部位を有するDNA切断基質と、その部位に対して特異的なトポイソメラーゼとをインキュベートすることにより、トポイソメラーゼ−DNA中間体を形成することと［ここで、前記トポイソメラーゼ−DNA中間体は１以上の5’一本鎖テールを有する］；並びに（ｂ）前記トポイソメラーゼ−DNA中間体の共有結合DNA鎖をRNAアクセプター鎖に連結でき、且つ前記トポイソメラーゼを解離できる条件において、該トポイソメラーゼ−DNA中間体に対して、該5’一本鎖テールに対して相補的なアクセプターRNA鎖を添加することと、それにより該DNA鎖を該RNA鎖に共有結合することとを具備する方法を提供する。前記DNA切断基質は、トポイソメラーゼ切断部位を有するDNA鎖を、１以上の相補的DNA鎖に対してハイブリダイズし、それによりトポイソメラーゼ切断部位とオリゴヌクレオチド脱離基（切断容易結合の3’に位置する）とを有するDNA切断基質を形成することにより作成してもよく、或いは、トポイソメラーゼ切断部位を有するプラスミドベクターであってもよい。
上述の方法の態様において、前記トポイソメラーゼ切断部位は、CCCTTを有する配列である。好ましい態様において、トポイソメラーゼは、ワクシニアトポイソメラーゼ酵素である。更なる態様において、ワクシニアトポイソメラーゼ酵素は、修飾されたワクシニアトポイソメラーゼ酵素である。もう一つの態様において、トポイソメラーゼ切断部位を有したDNA鎖は、放射性の標識がなされている。好ましい態様において、放射性標識は、32Pまたは放射性ハロゲンである。ヌクレオチドを放射性標識する手段は、当該技術分野において周知である（Ausubelら、分子生物学の簡単なプロトコール、第三版、Wiley、1995；米国特許5,746,997 05/05/98発行を参照されたい）。もう一つの好ましい態様において、トポイソメラーゼ切断部位を有したDNA鎖は、ビオチン部分で、または他のアフィニティ精製用タグ、例えば、キチン結合ドメイン、グルタチオン−Ｓ−転移酵素等で標識される。アフィニティー標識をヌクレオチドに付加する方法は、当該技術分野において周知である（Carniaciら、Genomics 37：327-336、1996；Ausubelら、上記文献を参照されたい）。態様において、前記トポイソメラーゼ結合DNA中間体および前記アクセプターRNA鎖は、インビトロにおいて結合する。
本発明は、5’一本鎖テールを有する共有結合形トポイソメラーゼ−DNA中間分子を提供する。前記共有結合形トポイソメラーゼ−DNA中間分子の態様において、該5’一本鎖テールは特定の配列を有する。もう一つの態様において、５’一本鎖テールを有する共有結合形トポイソメラーゼ−DNA中間分子は、RNA鎖にDNA鎖を共有結合するための上述した方法により生成される。5’一本鎖テールを上述の方法により生成した5’一本鎖テールを有する共有結合形トポイソメラーゼ−DNA中間分子の更なる態様において、5’一本鎖テールは特定の配列を有する。上述の方法のステップ（ａ）により生成した5’一本鎖テールを有する共有結合形トポイソメラーゼ−DNA中間分子のもう一つの態様において、前記DNA鎖は放射性標識化される。前記共有結合形トポイソメラーゼ−DNA中間分子の好ましい態様において、前記放射性標識は、32Pまたは放射性ハロゲンである。上述の方法のステップ（ａ）により生成した５’一本鎖テールを有する共有結合形トポイソメラーゼ−DNA中間分子のもう一つの態様において、前記DNA鎖は、アフィニティー標識を付される。前記共有結合形トポイソメラーゼ−DNA中間分子の好ましい態様において、前記アフィニティー標識は、ビオチン部分、またはキチン結合ドメイン、グルタチオン−Ｓ−転移酵素部分等である。
本発明は、更に、トポイソメラーゼ触媒により共有結合されたDNA-RNA分子を提供する。
本発明は、RNA鎖にDNA鎖を共有結合するための上述の方法により共有結合されたDNA-RNA分子を提供する。好ましい態様において、前記共有結合されたDNA-RNA分子は、5’末端標識を有する。更なる態様において、前記5’末端標識は、32Pまたは放射性ハロゲンである。もう一つの態様において、5’末端標識は、ビオチン部分、キチン結合ドメイン、グルタチオン−Ｓ−転移酵素部分等である。
本発明は、標識化5’末端を有した共有結合されたDNA-RNA分子を提供する。前記共有結合されたDNA-RNA分子の好ましい態様において、5’末端標識は、32Pまたは放射性ハロゲンである。前記共有結合されたDNA-RNA分子のもう一つの好ましい態様において、前記5’末端標識は、ビオチン部分、キチン結合ドメイン、グルタチオン−Ｓ−転移酵素部分等である。
本発明は、更に、RNA分子の5’末端にタグを付加する方法であって：（ａ）トポイソメラーゼ切断部位を有するDNA切断基質と、その部位に特異的なトポイソメラーゼとをインキュベートすることにより、トポイソメラーゼ−DNA中間体を形成することと［ここで、前記トポイソメラーゼ−DNA中間体は１以上の５’一本鎖テールを有する］；並びに（ｂ）前記トポイソメラーゼ−DNA中間体の5’一本鎖テールを、前記RNA分子に対して連結でき、且つ前記トポイソメラーゼを解離できる条件下において、前記トポイソメラーゼ−DNA中間体に、該5’一本鎖テールに対して相補的な5’−ヒドロキシ基末端化RNA分子を添加することと、それによって５’末端タグ付加DNA-RNA連結産物を形成することとを具備する方法を提供する。前記DNA切断基質は、例えば、トポイソメラーゼ切断部位を有するDNA鎖を、相補的なDNA鎖にハイブリダイズし、それによりトポイソメラーゼ切断部位と、オリゴヌクレオチド脱離基（切断容易な結合の3’に位置する）とを有するDNA切断基質を形成することにより作成することが可能である。
前記RNA分子は、インビトロにおける合成産物であってもよく、或いは、細胞または組織から単離されてもよい。インビトロにおけるRNAの合成方法は、当該技術分野において周知である（Ausubelら、上記文献を参照されたい）。また、細胞および／または組織からRNAを単離する方法も、当該技術分野において周知である（Ausubelら、上記文献を参照されたい）。本発明の実施に有用なRNAを得るための使用に適切な細胞および組織には、動物の細胞および植物の細胞の両者が含まれる。特に好ましい細胞には、哺乳動物の細胞（齧歯類の細胞、霊長類の細胞等）および昆虫の細胞が含まれる。また、RNAは細菌等の原核細胞から単離してもよい。
上述の方法の好ましい態様において、前記RNAは、合成または単離の後に脱リン酸化される。もう一つの好ましい態様において、前記脱リン酸化は、前記RNA分子をアルカリホスファターゼで処理することにより達成される。好ましい態様において、前記トポイソメラーゼはワクシニアトポイソメラーゼ酵素である。もう一つの好ましい態様において、前記ワクシニアトポイソメラーゼ酵素は、修飾されたワクシニアトポイソメラーゼ酵素である。好ましい態様において、前記切断部位は、CCCTTを有する。もう一つの好ましい態様において、更に前記方法は、ステップ（ａ）に先んじて、ビオチン部分、または他のアフィニティー精製用部分を、前記DNA切断基質に対して導入することを具備する。また、もう一つの好ましい態様において、前記方法は更に、ステップ（ａ）に先んじて、アフィニティー精製用タグ付加DNA切断基質を、固体支持体上に固定することを具備する。好ましい態様において、前記固体支持体は、それに結合したアビジン、ストレプトアビジン、キチン、グルタチオン等のアフィニティー精製用物質を有するセファロース樹脂または磁気ビーズである。そのような物質を製造するための方法は、当該技術分野において周知である。また、もう一つの好ましい態様において、前記方法は更に、分離用固体支持体［この支持体に対して、前記ビオチン化５’末端標識化DNA-RNA連結産物が固定されている］を修飾されていないＲＮＡを含む液体相から分離することにより、ビオチン化5’末端標識化DNA-RNA連結産物を精製することを具備する。好ましい態様において、前記DNA切断基質の5’末端は、アフィニティー標識を付される。好ましい態様において、前記アフィニティー標識はビオチン部分である。もう一つの好ましい態様において、前記方法は更に、ビオチン化5’末端アフィニティー標識DNA切断基質を固体支持体上に固定することを具備する。好ましい態様において、前記固体支持体は、ストレプトアビジンで修飾される。もう一つの好ましい態様において、前記方法は更に、前記ストレプトアビジン−修飾化固体支持体［この支持体に対して、前記5’末端タグ付加DNA-RNA連結産物が固定されている］を修飾されていないRNAを含む液体相から分離することにより、ビオチン化5’末端アフィニティー標識DNA-RNA連結産物を精製することを具備する。
ここで使用される通り、修飾されていないRNAは、DNA鎖に共有結合していないRNA鎖（単数または複数）として定義する。
本発明は、5’末端タグ付加RNA分子を提供する。前記5’末端タグ付加RNA分子の好ましい態様において、前記タグはDNA配列である。更に好ましい態様において、5’末端タグ付加RNA分子は更に、5’末端標識を含む。好ましい態様において、前記5’末端標識は、32Pまたは放射性ハロゲンである。もう一つの好ましい態様において、5’末端標識は、ビオチン部分、または他のアフィニティー精製用部分である。
態様において、前記5’末端タグ付加RNA分子は、RNA分子の5’末端にタグを付加する上述の方法により生成される。態様において、前記5’末端タグ付加RNA分子は更に、5’末端標識を含む。更なる態様において、5’末端標識は、32Pである。もう一つの態様において、5’末端標識は、ビオチン部分である。
もう一つの側面において、本発明は更に、トポイソメラーゼを使用することにより、インビトロにおいて結合されたDNA-RNA分子を提供する。
ここで使用される通り、前記DNA切断基質のヌクレオチドの数（N）［上述ではDNA-（N）−基質と称する］は、１から４ヌクレオチド長でよい。
本発明はまた、キャップを形成したメッセンジャーRNAの5’末端にタグを付加する方法であって：ａ）細胞または組織からmRNAを単離することと；ｂ）前記単離されたmRNAからRNAキャップ構造を除去し、その結果、脱キャップRNAを得ることと；ｃ）前記脱キャップRNAを脱リン酸化し、それにより脱キャップ脱リン酸化RNAを形成することと；ｄ）トポイソメラーゼ切断部位と相補鎖［前記相補鎖は混成または任意の塩基組成物を前記トポイソメラーゼ切断部位の下流に有する］とを有するトポイソメラーゼのDNA切断基質［前記DNA切断基質はDNA-（N）基質と称する］を構築することと；ｅ）前記DNA-（N）基質をトポイソメラーゼにより切断し、それにより非切断鎖における混成または任意な塩基組成物の5’テールを有する共有結合形トポイソメラーゼ−DNA−（N）複合体を形成することと；並びに、ｆ）前記切断された共有結合形トポイソメラーゼ−DNA-（N）複合体を、ステップ（ｃ）において形成した前記脱キャップ脱リン酸化RNAとインキュベートし、5’DNA-タグ付加DNA-RNA連結産物を形成することとを具備する方法を提供する。
前述した方法の態様において、前記RNAキャップ構造の除去は、前記mRNAをピロホスファターゼで酵素処理すること、または過ヨウ素酸酸化およびベータ脱離により化学的に脱キャップ化することの何れかにより行う。好ましい態様において、該ピロホスファターゼは、タバコ酸性ピロホスファターゼである。もう一つの好ましい態様において、該トポイソメラーゼ切断部位はCCCTTである。またもう一つの好ましい態様において、該DNA-（N）切断基質は、該切断の上流にビオチン部分を有し、これはBioDNA-（N）と示される。態様において、該方法は更に、ステップ（ｅ）に先んじた該ビオチン部分のストレプトアビジンへの結合による、ビオチン化5’DNA-タグ付加DNA-RNA連結産物のアフィニティー精製（affinity purification）を具備する。
本発明は、また、キャップ形成メッセンジャーRNAの5’末端にタグを形成する方法により生成された５’タグ付加DNA-RNA連結産物を提供する。態様において、5’末端タグ付加DNA-RNA連結産物は更に、５’末端標識を有する。５’末端タグ付加DNA-RNA連結産物の更なる態様において、該標識は32Pである。５’末端タグ付加DNA-RNA連結産物のもう一つの態様において、該標識はビオチン部分である。
本発明はまた、キャップのないRNAを除去した後に、キャップ形成mRNAを単離およびクローニングする方法であって：ａ）細胞または組織からmRNAを単離することと；ｂ）前記mRNAを脱リン酸化することと；ｃ）切断したトポイソメラーゼ−BioDNA-（N）複合体を該脱リン酸化したmRNAとインキュベートし、5’BioDNA-タグ付加DNA-RNA連結産物を形成することと；ｄ）ストレプトアビジンに吸着させることにより、5’BioDNA-タグ付加DNA-RNA連結産物、および何れの反応していない切断されたトポイソメラーゼ−BioDNA-（N）複合体をも除去することと、且つ何れの非吸着物質［前記物質は、キャップ形成5’を有するRNAに富む濃縮したものであり、且つステップ（ｂ）における脱リン酸化に対して抵抗性であるため、切断されたトポイソメラーゼ−BioDNA-（N）複合体と反応する能力を有していない］をも回収することと；ｅ）ステップ（ｄ）における非吸着物質から回収された濃縮RNAから5’末端キャップを除去することと；ｆ）脱キャップRNAを脱リン酸化し、それにより脱キャップ脱リン酸化RNAを形成することと；ｇ）切断されたトポイソメラーゼ−BioDNA-（N）複合体を脱キャップ脱リン酸化RNAとインキュベートし、5’BioDNA−タグ付加DNA-RNA連結産物を形成することと；ｈ）前記5’DNAタグ付加DNA-RNA連結産物をアフィニティー精製することと；およびｉ）前記DNA-RNA連結産物の脱キャップ脱リン酸化RNAを、切断部位の前記トポイソメラーゼ切断基質5’の切断容易鎖に相当するセンスプライマーと、アンチセンスプライマー［前記アンチセンスプライマーは、3’ポリ（A）テールまたは内在的RNA配列の何れかに対して相補的である］とを使用してPCR増幅を行うこととを具備する方法を提供する。上述の方法の好ましい態様において、ステップ’ｈ）におけるアフィニティー精製は、該5’BioDNA-タグ付加DNA-RNA連結産物をストレプトアビジンへ結合することによるものである。もう一つの好ましい態様において、該RNAキャップ構造の除去は、ピロホスファターゼによる該mRNAの酵素処理、または過ヨウ素酸塩酸化（periodate oxidation）およびベータ脱離（beta elimination）により化学的な脱キャップ化の何れかによるものである。またもう一つの好ましい態様において、該ピロホスファターゼはタバコ酸性ピロホスファターゼである。
DNA鎖をRNA鎖に共有結合する方法の態様において、該5’一本鎖テールは、特異的に設計された配列を有する。
本発明のもう一つの側面は、RNA鎖の混合物中の問題のRNA鎖の連結をターゲティングする方法を提供し、これは、RNA鎖にDNA鎖を共有結合する上述の方法を具備する。RNA鎖の混合物中の問題のRNA鎖の連結をターゲティングする方法（RNA鎖に対してDNA鎖を共有結合する方法を具備する）の態様において、該5’一本鎖テールは、共有結合したDNA-RNA連結産物の特性を提供する。
もう一つの好ましい態様において、完全長遺伝子配列を得るための方法であって；（ａ）完全長mRNAを単離することと；（ｂ）単離したmRNAに対してDNAタグ配列を結合することと；および（ｃ）テンプレートとしてタグ付加mRNAを使用したcDNA合成を行うこととを具備する方法が提供される。
完全長mRNAだけが、本発明の本側面において使用されることを保証するために（従って、完全長遺伝子配列の生成を保証すること）、キャップが形成されたmRNAだけを単離することが、一般的に望ましい。真核生物の一次転写産物は、その開始部位または5’、即ち、5’メチル化キャップの添加による該一次転写物のヌクレオチドが修飾され、これは、酵素的分解から該mRNAを保護する目的に適っている（Shatkin、Cell 9：645、1976）。完全長転写物だけが、そのように修飾されるであろう。該キャップ構造は、ビオチン、キチン結合ドメイン等のアフィニティー精製用タグの添加等により修飾されてよい（Carniciら、上記文献）。該アフィニティータグを付したキャップ形成mRNAは、次に、分解されたmRNA、またはポリAテールを有したRNA類（完全長をコードするmRNAではない）から単離され得る。
アフィニティー精製（例えば、ストレプトアビジン、アビジン、キチン、グルタチオン等を結合した固体支持体等のアフィニティー精製用物質と該タグ付加mRNAとを結合することによる）を使用し、タグの付加のないＲＮＡから、該アフィニティタグ付加mRNAを分離することができる。或いは、該キャップ形成mRNAと、例えば、フェニルボロン酸固体支持体等に結合した固体支持体とを接触させることにより、キャップを欠くRNA種から、修飾されてないキャップ形成mRNAを分離することができる［TheusおよびLiarakos、Biotechnique 9（5）：610-612、1990を参照されたい］。適切な固体支持体類には、セファロースおよびアガロース等の種々のカラムクロマトグラフィーゲル類、並びに磁気ビーズ類が含まれる。
何れの真核細胞種類も、動物細胞類と植物細胞類の両者を含む本発明の該方法の実施において使用されるべきmRNAの供給源として使用できる。適切な動物細胞には、哺乳動物細胞類（齧歯類、ヒト以外の霊長類、霊長類、ヤギ、ヒツジおよびウシ等）、並びに昆虫細胞（ガ、およびショウジョウバエ等）が含まれる。異なる細胞種からmRNAを抽出する方法は、当該分野において周知である（例えば、Ausubelらの上記文献を参照されたい）。
好ましくは、該単離したmRNAは、単離後に、脱キャップおよび脱リン酸化される。RNA類を脱キャップする方法は、当該分野において周知であり、酵素的方法（タバコピロホスファターゼのようなピロホスファターゼを使用すること等による）と化学的方法（過ヨウ素酸酸化およびベータ脱離等）の両法を含む。同様に、RNAを脱リン酸化する方法は当該分野において周知であり、例えばアルカリホスファターゼを使用することによる方法等である。
上述した方法を使用し、DNAタグ配列を、単離した完全長mRNAに結合することができる。二本鎖DNA切断基質として、および共有結合形トポイソメラーゼ−DNA中間体として、図１１に、好ましいDNAタグ配列を示している。該トポイソメラーゼ−DNA中間体の相補鎖は、１から４ヌクレオチドの3’オーバーハングを含み、これはアデニン、グアニン、シトシンまたはチミンの混合体の何れかであってよく、該図中にNとして示される。これらのヌクレオチド類は、該単離されたmRNA分子の5’末端の最初の１から４塩基と塩基対をなすものであり、これによりエステル交換反応（該DNAタグを該RNA配列の末端に結合する）に対する該共有結合形で結合したトポイソメラーゼの触媒作用が可能になる。該DNAタグ配列は、トポイソメラーゼ認識部位、即ち好ましくはCCCTTを具備し、更に加えて、発現ベクターへのcDNA分子の二次的挿入に有用な、EcoR1等の部位特異的制限エンドヌクレアーゼの認識部位を具備してもよい。
DNA-RNA分子は、好ましくはポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、当該技術分野において周知の技術を用いた、完全長cDNA配列の合成および増幅のためのテンプレートとして使用される（Ausubelら、上述の文献）。適切なプライマーは、該DNA-RNA分子の5’タグ配列の全部分または一部分、並びに遺伝子特異的3’プライマーまたはオリゴdTプライマーを含む。
増幅された遺伝子産物を、次に、該増幅反応混合物の他の成分から単離する。この精製はカラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動等のような種々の方法を使用して達成することが可能である。好ましい精製方法は、低融点アガロースゲル電気泳動を利用する。該反応混合物は、臭化エチジウム染色等の適切な手段類により分離され、視覚化される。正しいサイズの増幅産物を示すＤＮＡバンドを、該ゲルの残余から切り取り、９６ウェルマイクロタイタープレートの対応する適切なウェルの中に置く。続いて、これらの断片を溶解し、その中に含有されたDNAをクローニング挿入物として利用する。
精製し増幅した遺伝子配列を、次に、発現ベクターに挿入する。種々の発現ベクターは、本発明の実施における、原核生物の発現および真核生物の発現の何れの使用にも適切である。一般的に、該発現ベクターは、１以上の以下の特徴を有する：プロモーターエンハンサー配列、選択マーカー配列、複製起点、アフィニティー精製タグ配列、誘導要素配列およびエピトープ−タグ配列等。
プロモーター−エンハンサー配列は、RNAポリメラーゼが結合するDNA配列であり、且つ転写を開始する。該プロモーターは、どちらの鎖が転写されるかにより転写の極性を決定する。細菌性プロモーターは、コンセンサス配列、即ち転写の開始に関連する−３５および−１０ヌクレオチド（これは特異的なシグマ因子とRNAポリメラーゼとにより結合される）からなる。真核細胞性プロモーター類は更に複雑である。発現ベクター類において有利な大部分のプロモーター類は、RNAポリメラーゼIIにより転写される。基本転写因子（GTFs）は、初めに、該開始部分の近くの特異的な配列に結合し、続いてRNAポリメラーゼＩＩの結合を補充する。これらの最小プロモーター要素に加えて、小配列要素が、問題のプロモーターの活性を調節するモジュールDNA-結合／トランス−活性化タンパク（例えば、AP-1、SP-1）により特異的に認識される。ウイルス性プロモーターは、細菌または真核生物プロモーター類として同様の機能を供給し、並びに、トランス（バクテリオファージT7）における特異的なRNAポリメラーゼの提供、或いは細胞性因子およびRNAポリメラーゼ（SV40、RSV、CMV）の補充の何れかを行う。ウイルス性プロモーターは、それらが一般的に特に強力なプロモーターである場合に好ましい。
更に、プロモーターは構成的でもよく、更に好ましくは調節可能でもよく、その何れかである（即ち、誘導可能または抑制解除可能である）。誘導可能要素は、プロモーターとの接合において作用し、並びにリプレッサー（例えば、大腸菌のlacO/LAC Iqリプレッサーシステム）またはインデューサー（例えば、酵母のgal1/GAL4インデューサーシステム）の何れかと結合するDNA配列要素である。何れかの場合において、転写は、該プロモーターが抑制解除または誘導される（この時点において、転写が「開始」される）まで、事実上「遮断」される。
構成性プロモーターの例は、バクテリオファージλのintプロモーター、pBR322のβ−ラクタマーゼ遺伝子配列のblaプロモーター、pPR325のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子配列のCATプロモーター等を含む。誘導性の原核生物のプロモーターの例は、バクテリオファージの主要な右側および左側プロモーター（PLおよびPR）、大腸菌のtrp、reca、lacZ、LacI、AraCおよびgalプロモーター、α−アミラーゼ（Ulmanen Ett、J.Bacteriol.162：176-182、1985）およびＢ．スブチリス（B.subtilis）のシグマ−２８−特異的プロモーター（Gilmanら、遺伝子配列32：11-20（1984））、バチルス属（Bacillus）のバクテリオファージ類のプロモーター（Gryczan、バチルス類の分子生物学、Academic Press、Inc.、NY（1982））、ストレプトミセス属（Streptomyces）のプロモーター（Wardら、Mol.Gen.Genet.203：468-478、1986）等を含む。例えば、原核生物のプロモーター類は、グリック（Glick、J. Ind. Microtiot. 1：277-282、1987）；セナチエンポ（Cenatiempo、Biochimie 68：505-516、1986）；およびゴッテスマン（Gottesman、Ann. Rev. Genet. 18：415-442、1984）により概説されている。
好ましい真核生物のプロモーター類には、例えば、マウスメタロチオネインＩ遺伝子配列のプロモーター（Hamerら、J. Mol. Appl. Gen. 1：273-288、1982）；ヘルペスウイルスのTKプロモーター（McKnight、Cell 31：355-365、1982）；SV40初期プロモーター（Benoistら、Nature（London）290：304-310、1981）；酵母gal1遺伝子配列プロモーター（Johnstonら、Proc. Natl. Acad. Sci.（USA）79:6971-6975、1982）；Silverら、Proc. Natl. Acad. Sci.（USA）81：5951-5955、1984）、CMVプロモーター、EF-1プロモーター、エクジソン−反応プロモーター（単数または複数）等を含む。
ベクターを含有する細胞のみを成長させるための選択手段を提供する場合、発現ベクターにおける選択マーカー配列は、価値のある要素である。そのようなマーカーには、２つの種類がある：即ち、薬剤耐性および栄養要求性である。薬剤耐性マーカーは、細胞に対して、それなしではその細胞を殺してしまう外因的に添加した薬剤を解毒することを可能にする。栄養要求性マーカーは、細胞に対して、必須成分を合成することと同時に、その必須成分（通常はアミノ酸）を欠く培地中において成長することとを可能にする。
一般的な選択マーカー遺伝子配列は、アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン、ブレオマイシン、ストレプトマイシン、ヒグロマイシン、ネオマイシン、ゼオシンTM等の抗生物質に対する耐性を有する配列を含む。選択可能な栄養要求性遺伝子配列は、例えば、hisD（これは、ヒスチジノールの存在下の、ヒスチジンを含有しない培地中での成長を可能にする）を含む。
酵母発現システムにおいて使用するための好ましい選択可能なマーカー配列は、URA3である。オロチジン−5’−ホスフェートデカルボキシラーゼ（ウラシルの生合成に必須の酵素）をコードする遺伝子において突然変異を有する実験室用の酵母菌株は、外因性ウラシルが不在では成長できない。野生型遺伝子のコピー（S.pombeにおけるura4+およびS.cerevisiaeにおけるURA3）が、トランスにおけるこの欠失を捕捉するであろう。
発現ベクターにおいて有用な更なる要素は、複製起点配列である。複製の起点は、多重結合の起点−結合タンパクにより認識されるマルチプルショートリピート配列（multiple short repeated sequences）を含むユニークなＤＮＡ配列であり、該起点部位でのDNA複製酵素の集合において重要な役割を演じている。ここで使用される発現ベクターにおいて使用するために適切な複製起点は、大腸菌のoriC、2μおよびARS（共に酵母システムにおいて有用である）、sf1、SV40（哺乳動物システムにおいて有用である）等を含む。
本発明に従って使用される発現ベクターに含まれ得る追加的な要素は、アフィニティー精製タグ類またはエピトープタグ類をコードする配列である。アフィニティー精製タグ類は、一般的に、固体支持体上に固定された結合パートナーと相互作用できるペプチド配列である。ヒスチジン等の単一のアミノ酸が複数連続してコードされる合成DNA配列は、発現されたタンパクに融合される場合に、ニッケルセファロース等の樹脂カラムに対する高親和性結合によって組換えタンパクの１ステップ精製に使用されてよい。エンドペプチダーゼ認識配列は、ポリアミン酸タグおよび問題のタンパクとの間で強化され、結果として、エンテロキナーゼおよび他のプロテアーゼによる消化によるリーダーペプチドの除去を可能にする。キチン結合ドメイン（キチンに対して結合する）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（グルタチオンに対して結合する）、ビオチン（アビジンおよびストレプトアビジンに対して結合する）のようなペプチド類をコードする配列はまた、問題のタンパクの精製を促進するために使用することも可能である。アフィニティー精製タグは、当該技術で周知の方法［インテイン類の使用を含む（タンパク自己スプライシング要素、Chongら、Gene 192：271-281、1997）］により問題のタンパクから分離することが可能である。
エピトープタグ類は、エピトープ特異的抗体により認識される短ペプチド配列である。組換えタンパクとエピトープタグとを含有する融合タンパクは、クロマトグラフィー樹脂に結合した抗体を使用して、簡便且つ容易に精製することが可能である。該エピトープタグの存在は、更に、ウエスタンブロット等の二次的な評価において、その組換えタンパク自身に対して特異的な抗体を産生することなく、該組換えタンパクを検出することを可能にする。一般的に使用されるエピトープタグの例は、V5、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ（GST）、ヘマグルチニン（hemaglutinin；ＨＡ）、ペプチドPhe-His-His-Thr-Thr、キチン結合ドメイン等を含む。
発現ベクターにおける更なる使用可能な要素は、マルチプルクローニング部位またはポリリンカーである。一連の制限エンドヌクレアーゼ認識部位をコードする合成DNAは、該プロモーター要素の下流でプラスミドベクターに挿入される。これらの部位は、特異的な位置で該ベクターにDNAを都合よくクローニングするようにする。
前述の要素は、併用され、本発明のライブラリーの作成において有用な発現ベクターを産生することが可能である。適切な原核生物のベクターは、大腸菌において複製可能であるようなプラスミドを含む［例えば、pBR322、ColE1、pSC101、PACYC184、itVX、pRSET、pBAD（Invitrogen、Carlsbad、CA）等］。そのようなプラスミドはサンブロックにより開示されている（cf.「分子クローニング：実験室マニュアル」第二版、Sambrook、FritschおよびManiatisによる編集、Cold Spring Harbor Laboratory、（1989））。pC194、pC221、pT127等を含むバチルスプラスミドは、グリクザンにより開示されている（Gryczan、バチルス類の分子生物学、Academic Press、NY（1982）、pp.307-329）。適切なストレプトミセス（Streptomyces）プラスミド類は、PlJ101（Kendallら、J.Bacterilo. 169：4177-4183、1987）、およびφC31のようなストレプトミセスバクテリオファージ（Chaterら、Sixth International Symposium on Actinomycetales Biology、Akademiai Kaido、Budapest、Hungary（1986）、pp.45-54）を含む。シュードモナス（Pseudomonas）プラスミド類は、ジョンら（Johnら、Rev. Infect. Dis. 8：693-704、1986）、およびイザキ（Izaki、Jpn. J. Bacteriol. 33：729-742、1978）により概説されている。
適切な真核生物プラスミドは、例えば、BPV、ワクシニア、SV40、2-ミクロンサークル、pcDNA3.1、pcDNA3.1/GS、pYES2/GS、pMT、pIND、pIND（Sp1）、pVgRXR（Invitrogen）等、またはそれらの誘導体を含む。そのようなプラスミド類は当該技術において周知である（Botsteinら、Miami Wntr. Symp. 19：265-274、1982；Broach、「酵母サッカロミセスの分子生物学：生活環と遺伝」、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、NY、p.445-470、1981；Broach、Cell 28：203-204、1982；Dilonら、J.Clin.Hematol. Oncol. 10：39-48、1980；Maniatis：Cell Biology：A Comprehensive Treatise、Vol.3、Gene Sequence Expression、Academic Press、NY、pp.563-608、1980）。
正しい配向での遺伝子配列挿入を有するプラスミドが同定された場合、プラスミドDNAは、発現するホスト細胞の形質転換において使用するために製造される。プラスミドDNAを製造する方法および細胞を形質転換する方法は、当該技術における当業者に周知である。そのような方法は、例えば、上述のアウスベルら（Ausubelらの上述の文献）により記述される。
原核細胞のホストは、一般的に、組換えタンパクの生成に対して非常に効率的且つ便利なものであり、更に好ましい種類の発現システムの一つである。原核細胞は、非常に多くの場合、大腸菌の種々の菌株により代表される。しかしながら、また、他の細菌株を含む他の微生物も使用可能である。
認識された真核生物ホスト類は、大腸菌等の細菌、およびバチルス、ストレプトミセス、シュードモナス、サルモネラ、セラシア属等の種類を含む。しかしながら、そのような条件下では、該ポリペプチドはグルコシル化されることなないだろう。ここでの使用に選択される原核細胞のホストは、該発現プラスミドにおけるレプリコンおよびコントロール配列に適合していなくてはならない。
適切なホストは、多くの場合、真核細胞を含んでよい。好ましい真核細胞ホストは、例えば、インビボ或いは組織培養の何れかの状態にある酵母、真菌類、昆虫細胞類、および哺乳類細胞を含む。ホストとして有用であり得る哺乳類細胞は、HeLa細胞、VERO、3T3またはCHOK1等を起源とする繊維芽細胞、HEK293またはリンパ球起源の細胞（32D細胞等）、並びにそれらの誘導体類を含む。好ましい哺乳動物ホスト細胞は、CHO、32D等の非接着細胞を含む。好ましい酵母ホスト細胞は、Ｓ．ポンベ、ピチア・パストリス（Pichia pastoris）、Ｓ．セレビシアエ（INVSc1等）等を含む。
加えて、植物細胞もまた、ホストとして使用が可能であり、植物細胞に適合するコントロール配列［例えば、カリフラワーモザイクウイルス35Sおよび19S、ノパリン（nopaline）合成プロモーターおよびポリアデニレーションシグナル配列等］も使用可能である。。もう一つの好ましいホストは、キイロショウジョウバエ・ラルバエ（Drosophila larvae）を例とする昆虫細胞である。ホストとして昆虫細胞を使用する場合、キイロショウジョウバエアルコール脱水素酵素プロモーターを使用することが可能である（Rubin、Science 240：1453-1459、1988）。或いは、バキュロウイルスベクター類は、昆虫細胞における所望する遺伝子配列によりコードされるペプチドを多量に発現するように操作される（Jasny、Science 238：1653、1987）；Millerら、Genetic Engineering（1986）、Setlow、J.K.らによる編集、Plenum、Vol.8、pp.277-297）。本発明はまた、上述の方法により産生された発現遺伝子産物の精製され、単離され、または濃縮された改変物をも特徴とする。
本発明は、以下の実験の詳細により更に詳しく理解されるであろう。しかしながら、特定の方法および考察された結果が、その後に続くクレームにおいてより十分に記載される本発明を、ただ単に説明するものであることは、当該技術における当業者には容易に認識されるものである。
実験の詳細
方法と材料
タンデムRNA-p-DNA及びDNA-p-RNAオリゴヌクレオチドの調製
相補的な36マーDNA鎖にハイブリダイズされた２つの18マー鎖（合成RNA又はDNAオリゴヌクレオチド）を連結することによって、切断容易なホスフェートに単一の内部32Pラベルを含有するCCCTT含有36マーオリゴヌクレオチドを調製した。近位のCCCTT含有18マー鎖の配列は、DNAでは5′-CATATCCG TGTCGCCCTTであり、RNAでは5′-CAUAUCCGUGUCCCUUであった。遠位の18マー鎖の配列は、DNAでは5′-ATTCCGATAGTGACTACAであり、RNAでは5′-AUUCCGAUAGUGACUACAであった。遠位の18マー鎖は、［γ32P］ATPとT4ポリヌクレオチドキナーゼの存在下で5′ラベルした後、ゲルで精製した。36マー鎖の配列は、5′-TGTAGTCACTATCGGAATAAGGGCGACACGGATATGであった。65℃で2分間、0.2MNaCl中で加熱した後、徐々に室温まで冷却することによって、該鎖をアニーリングした。該ハイブリダイゼーション混合物中における、近位18マー及び36マー鎖に対する5′ラベルした遠位18マーのモル比は、1:4:4であった。単一のニックを有するアニーリング反応の産物は、精製された組換えワクシニアウイルスDNAリガーゼを用いて、インビトロで接着せしめた（14,15）。連結反応混合物（400μL）は、50mM Tris HCl（pH8.0），5mM DTT，10mM MnCl2，1mM ATP，5′32P-ラベルされたニックを有する基質10pmol、及びリガーゼ160pmolを含有していた。22℃で4時間インキュベートした後、最終濃度25mMになるようにEDTAを添加することによって、反応を停止した。フェノール−クロロフォルムで該サンプルを抽出し、エタノール沈殿によって、ラベルされた核酸を水相から回収した。36マーの二重構造体（duplex）をTE緩衝液（10mM tris HCl，pH8.0，1mM EDTA）中に溶解した。ラベルされた18マー遠位鎖を非ラベルCCCTT含有18マー鎖に連結すると、内部がラベルされた36マー産物が形成されることが、17%変性ポリアクリルアミドゲルを通して反応産物を電気泳動することによって確認された。連結の程度［36マー／（36マー＋18マー）］は以下のとおり：
DNA-p-DNA（88%）；DNA-p-RNA（67%）；RNA-p-DNA（66%）
であった。
内部ラベルされた36マー二重構造体へのトポイソメラーゼの共有結合
記載されているように（16,17）、細菌中で組換えワクシニアトポイソメラーゼを発現させ、ホスホセルロース及びSP5PWカラムクロマトグラフィーによって精製した。共有結合付加物形成をアッセイするための反応混合物は、（20μL当たり）50mM Tris-HCl（pH8.0），36マー二重構造体0.2pmol、及びトポイソメラーゼ1pmolを含有していた。トポイソメラーゼを加えることによって、反応を開始させ、最終濃度1%になるようにSDSを加えることによって停止させた。該サンプルをSDS-PAGEによって分析した。放射性ラベルされたポリヌクレオチドのトポイソメラーゼポリペプチドへの転移によって、共有結合複合体の形成が明らかとなった（3）。FUJIX BAS1000リン画像化装置を用いてゲルをスキャンすることによって、付加物形成の程度を定量し、共有結合でタンパク質に転移した5′32Pラベルされたインプット36マー基質のパーセントとして表した。
RNAアクセプターへのDNA鎖の転移
［γ32P］ATPとT4ポリヌクレオチドキナーゼの存在下で、18マーのCCCTT含有DNAオリゴヌクレオチド（5′-CGTGTCGCCCTTATTCCC）の5′末端をラベルした後、ゲルで精製し、30マーの相補鎖にハイブリダイズさせて18マー／30マー自殺切断基質を形成させた。（20μL当たり）50mM Tris-HCl（pH8.0），18マー／30マーDNA 0.5pmol、及びトポイソメラーゼ2.5pmolを含有する反応混合物中で、共有結合トポイソメラーゼ−DNA複合体を形成させた。該混合物を37℃で5分間インキュベートした。同時に該反応混合物が0.3M NaClになるように調整しながら、25pmol/20μLの濃度（すなわち、インプットDNA基質に対して50倍モル過剰）になるように18マーのアクセプター鎖5′-ATTCCGAT AGTGACTACA（DNA又はRNAの何れか）を加えることによって、鎖転移反応を開始させた。それぞれ最終濃度0.2%及び50%になるようにSDSとホルムアミドを加えることによって、該反応を停止させた。該サンプルを熱変性させた後、TBE（90mM Tris-ホウ酸、2.5mM EDTA）中の7M尿素を含有する17%ポリアクリルアミドを通して電気泳動を行った。鎖転移の程度（30マー鎖転移産物に転換された、ラベルされたインプットDNAのパーセントとして表した）は、リン画像化装置を用いて湿潤ゲルをスキャンすることによって定量した。
32Pラベルした36マーRNAの調製
エンドヌクレアーゼEagIで消化することによって直鎖状にしたpBluescript II-SK（-）プラスミドテンプレートから、T3 RNAポリメラーゼによって、36ヌクレオチドのランオフ転写物をインビトロで合成した。40mM Tris HCl（pH8.0），6mM  MgCl2，2mMスペルミジン，10mM NaCl，10mM DTT，0.5mM ATP，0,5mM CTP，0.5mM UTP，6.25μM［α32P］GTP,テンプレートDNA 5μg，及びT3 RNAポリメラーゼ100ユニット（Promega）を含有する転写反応混合物（100μL）は、90分間37℃でインキュベートした。該混合物を0.1% SDS，10mM EDTA，及び0.5M酢酸アンモニウムに調整することによって、反応を停止させた。該サンプルをフェノール−クロロホルムで抽出して、エタノールで沈殿せしめた。沈殿をホルムアミド中に再懸濁し、TBE中に7Mの尿素を含有する12%ポリアクリルアミドゲルを通して電気泳動を行った。該湿潤ゲルのオートラジオグラフィーによって、放射性ラベルした36マーRNAの位置を決定し、1M酢酸アンモニウム、0.2% SDS、及び20mM EDTAを含有する0.4mLの緩衝液中に、4℃で16時間浸すことによって、切り出したゲルのスライスから溶出した。溶出物をフェノール抽出して、エタノールで沈殿させた。該RNAをTE中に再懸濁した。RNA 5′末端の脱リン酸化は、10mM Tris HCl（pH7.9）、50mM NaCl、10mM MgCl2、1mM DTT、10pmolの36マーRNA、及び30ユニットのウシ腸アルカリホスファターゼ（New England Biolabs）を含有する反応混合物（30μL）中で行った。37℃で1時間インキュベートした後、該混合物をフェノール抽出して、エタノール沈殿した。上述のように、電気泳動によってホスファターゼ処理した36マー転写物を再精製した。
ワクシニアトポイソメラーゼを用いた、RNAへのアフィニティータグの付加
鎖転移反応経路を図10aに図示する。ダイナビーズ（Dynabeads；Dynal）ストレプトアビジン固相支持体上に、単一のトポイソメラーゼ認識部位を含有するビオチン化されたDNA基質を固定化する。自動化されたオリゴヌクレオチド合成の標準プロトコールによって、ビオチン部分（黒の四角で示されている）をCCCTT含有鎖の5′末端に導入する。精製されたワクシニアトポイソメラーゼをビーズに結合したDNAと反応させて、図に示したように、共有結合酵素−DNAドナー複合体を形成させる。ビーズを緩衝液で洗浄することによって、DNAに結合していない酵素を除去する。鎖転移反応は、アルカリホスファターゼによる前処理によって脱リン酸化せしめた［32P］-CMPラベルしたT7転写物を添加することにより開始する。ドナー複合体の5′一本鎖の尾部は、T7転写物の5′末端に存在する12のヌクレオチドと相補的である。共有結合によって固定されたビオチン化DNA鎖のT7転写物への再連結は、30マーRNAの50ヌクレオチド産物への転換として観察される。
実験の詳細：トポイソメラーゼ認識部位を含有するビオチン化25マー鎖を相補的な5′リン酸化された24マー鎖（4倍モル過剰で存在する）にアニーリングすることによって、DNA基質を形成した。該鎖は、0.2M NaClの存在下で10分間65℃で加熱した後、徐々に室温まで冷却することによってアニーリングした。50mM Tris-HCl（pH8.0）、1M NaClの中で、22℃で10分間、10μgのダイナビーズとともにDNA 10pmolをインキュベートすることによって、ビオチン化二重構造体をストレプトアビジンビーズ上に固定化した。1mLの50mM Tris-HCl（pH8.0）で該ビーズを2度洗浄した。20μLの50mM Tris-HCl（pH8.0）の中に、該洗浄したビーズを再懸濁した。ビーズに結合したDNA基質に5倍モル過剰量のトポイソメラーゼ（50pmol）を添加した。該混合物を37℃で、10分間インキュベートした。遠心によって、ビーズを回収し、1mLの50mM Tris-HClで二度リンスした後、18μLの50mM Tris-HCl，0.3M NaCl中に再懸濁した。［32P］-CMPラベルしたT7転写物1pmolを添加することによって、鎖転移反応を開始した。該混合物を37℃で15分間インキュベートした。該ビーズを遠心によって回収し、洗浄して、0.8% SDS及び80%ホルムアミドを含有する緩衝液20μL中に再懸濁した。
該サンプルを95℃で5分間加熱し、5分間遠心した後、TBE緩衝液中に7M尿素を含有する12%ポリアクリルアミドを通して上清を電気泳動した。ゲルのオートラジオグラフィーを図10Bに示す。レーンB（結合；Bound）−ダイナビーズに結合した鎖転移反応の産物；レーンF（free）−鎖転移反応の上清。インプット30マーT7転写物及び50マー産物の位置を右側に示す。
RNA基質：エンドヌクレアーゼXhoIで消化することによって直鎖状にしたpBluescript II-SK（-）プラスミドテンプレートから、T7 RNAポリメラーゼにより、30ヌクレオチドのランオフ転写物をインビトロで合成した。該転写物は、T3 RNA転写物の調製で述べた反応条件と同様の反応条件で、［α32P］-CTPでラベルした。30マーRNAをゲル精製し、続いて記載したように脱リン酸化した。
結果
切断容易なホスフェートの3′にRNAを含有する二重構造体基質へのトポイソメラーゼの共有結合
ワクシニアトポイソメラーゼは、CCCTT含有RNA二重構造体に、共有結合せず、且つ２つの鎖のうち一方がRNAであるRNA-DNAハイブリッド二重構造体上に、共有結合複合体も形成しない（9）。対照実験によって、CCCUU含有RNA鎖上に共有結合付加物を形成できないのは、CCCTT配列中のチミン塩基がウラシルで置換されているためであることが示された（9）。ワクシニアトポイソメラーゼが、全てのRNA鎖と共有結合を形成しない理由について理解を深めるために、我々は、切断容易な鎖がタンデムRNA-DNA又はDNA-RNA共重合体であり、切断されない鎖は全てがDNAである36bp二重構造体基質を調製した（図１）。これらの二重構造体の切断容易なホスホジエステルを32Pでユニークにラベルした。２つの18マーオリゴヌクレオチド（1つは、5′32Pでラベルされていた）を相補的な36マーDNA鎖にアニーリングさせ、単一のニックを有する二重構造体を形成させることによって、基質分子を構築した。次に、ワクシニアウイルスDNAリガーゼによって触媒される反応において、ラベルされていないCCCTT鎖（又はCCCUU鎖）に5′ラベルした18マー鎖を連結した。該36マー二重構造体産物を単離した後、ワクシニアDNAトポイソメラーゼ用の基質として用いた。我々は、ラベルしたホスフェートをpと表記し、これらの基質をDNA-p-DNA、DNA-p-RNA、RNA-p-DNAと称することにする。
トポイソメラーゼによるCCCTT部位へのエステル転移反応によって、3′32Pラベルされた18マーオリゴヌクレオチドが酵素に共有結合するであろう。10分で、DNA-p-RNA基質上に共有結合複合体が形成される程度は、インプットトポイソメラーゼに比例し；飽和量の酵素で、36マー鎖の80〜85%がトポイソメラーゼに転移された（図１）。同一レベルのトポイソメラーゼは、１%未満のRNA-p-DNA36マー鎖に共有結合した。このように、トポイソメラーゼは、切断容易なホスフェートの下流のRNA置換は許容したが、CCCTT配列がRNAの型であるときには、共有結合性付加物の形成は妨げられた。
飽和レベルのトポイソメラーゼでの共有結合反応の速度論を評価した（図２）。全てDNAである36マー（DNA-p-DNA）は、2分で21%の終末点に達するように結合した（図2A）。見かけの切断−再連結平衡定数（Kcl−共有結合複合体／非共有結合複合体）は0.26であり、これは5′末端ラベルされたCCCTT含有DNA基質の平衡切断について以前報告された0.2〜0.25という値と一致する（10,11）。DNA-p-RNA36マーは、5分で80%の終末点に達するように、共有結合した（図2A、他のデータは示されていない）。DNA-p-RNAに対する見かけの平衡定数は（Kcl＝4）、全てがDNAであるリガンドに対して観察されたものに比べて有意に高い。
きわめて遅いが、RNA-p-DNA 36マーはトポイソメラーゼに転移された。4時間後、4%のCCCUU含有RNA鎖が、酵素に共有結合した（図2B）。該実験では、終末点は確定されなかった。しかし、最も初期の時点において、DNA-p-RNA上に形成された付加物の量（10秒で12%）に対する、RNA-p-DNA上への共有結合性付加物の形成の初速度（１分当たりインプット基質の0.04%が切断された）を比較することによって、基質のCCCTT部分のRNA置換が、約103のオーダーで、共有結合複合体形成の速度を遅くしていると推測される。
RNAアクセプターへのDNA鎖の転移
切断された鎖の再結合は、Tyr-274とCCCTT部位との3′ホスホジエステル結合に、5′ヒドロキシ末端化されたポリヌクレオチドが攻撃することによって起こる。該エステル転移ステップは、生じたトポイソメラーゼ−DNA複合体が、共有結合で保持された鎖を別のアクセプター鎖に再連結する能力をアッセイすることによって、鎖切断とは独立して研究することができる（5,11）。共有結合トポイソメラーゼ−DNAドナー複合体を形成するために、まず、30マー鎖（CGTGTCGCCCTTATTCCC）にハイブリダイズされた5′32Pラベルした18マー切断容易鎖からなる自殺基質とともに、酵素をインキュベートした。
トポイソメラーゼによって該DNAを切断すると、6ヌクレオチドの脱離基（ATTCC）が解離する。再連結のために利用できるアクセプターがその場にないと、酵素は、自殺中間体として実質上DNAにトラップされる（図3）。酵素過剰での5分間の反応で、90%を超える5′32Pラベルされた鎖がタンパク質に共有結合する。同時にイオン強度を0.3M NaClまで増加させながら、共有結合ドナー複合体の5′一本鎖尾部に相補的な18マーアクセプター鎖（DNA又はRNAの何れか）を50倍モル過剰量添加することによって、鎖転移反応を開始した（図３）。再連結期の間に、NaClを添加すると、鎖が閉じた後のトポイソメラーゼの解離を促進し、鎖転移産物をの再切断を妨げる。共有結合で保持された12マーのCGTGTCGCCCTTを18マーに連結すると、32Pラベルされた30マーが得られる（図４、レーン１）。自殺中間体は、94%のインプットCCCTT含有鎖を18マーDNA鎖に転移した（図３）。最も初期の時点で（5秒）の再連結の程度は、終末値の90%であった。該データから、再連結の速度定数（Krel）は、0.5秒-1と算定された。以前には、Krel値は〜1.3秒-1と決定されている（37℃でのKcl及びKrelの実験値）（18）。
トポイソメラーゼは、共有結合で保持された12マーDNAを即座に18マーRNAアクセプターに連結して、30マーの産物を形成した（図４、レーン５）。インプットCCCTT鎖の89%がRNAに転移され、5秒で終末値の40%に達した。このデータを用いて、シングルターンオーバーのRNAへの鎖転移について0.1秒-1の速度定数を推定した。このように、DNAへの再連結は、RNAへの再連結の約10倍速かった。RNAの再連結速度が遅いことは、DNA-p-RNA 36マーに対する切断−再連結の平衡定数（Keq＝Kcl／Krel）の増加が観察されたことの説明になり得るかもしれない。
鎖転移反応産物の分析
RNAへの鎖転移によって予想される産物は、5′末端がユニークに32Pラベルされた30マーのタンデムDNA-RNA鎖（CGTGTCGCCCTTAUUCCGAUAGUG ACUACA）である。該分子の構造は、NaOHによる処理に対する該産物の感受性を分析することによって確かめた。ラベルされた30マーRNA連結産物は、インプット18マーCCCTT含有DNA鎖に比べてさらに早く移動する別の種に、ほぼ定量的に変換された（図４及びレーン６）。該産物の移動度は、13ヌクレオチドの長さの鎖と一致していた。RNA鎖転移産物の32Pラベルされた予想アルカリ水解産物は、13マー
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である。対照反応は、自殺基質の32Pラベルされた18マー切断容易鎖も、DNAへの鎖転移の30マー産物もアルカリに感受性でないことが示された（図４、レーン４及び２）。トポイソメラーゼは、インビトロでRNAをDNAに連結するために用いることができると結論付けられる。
T3 RNAポリメラーゼによってインビトロで合成されたRNA転写物へのDNAリガンドのタグ付加
トポイソメラーゼを介したRNAへの鎖転移の実用には、RNA転写物の5′タグ付加が含まれる。バクテリオファージRNAポリメラーゼは、フェーズ（phase）プロモーターを含有するプラスミドDNAテンプレートから、インビトロでRNAを合成するために、広く用いられてきた。このような転写物が、トポイソメラーゼに触媒される連結に対する基質であるかどうかをテストするために、我々は、トポイソメラーゼで切断された時に、pBluescriptベクターからT3 RNAポリメラーゼによって転写された任意のRNAの予想された5′配列と相補的な5′一本鎖尾部を含有すると思われるCCCTT含有自殺切断基質を構築した（図５）。［α32P］GTPを含有する転写反応で、36ヌクレオチドのT3転写物を合成した。5′末端を脱リン酸化するために、RNAをアルカリホスファターゼで処理した。トポイソメラーゼ−DNA共有結合中間体は、ラベルされていない自殺基質上に形成された。放射性ラベルされたT3転写物を自殺中間体とインキュベートすると、36マーRNAは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動における移動度が遅い（データは示していない）新規な種に変換された。該産物（48ヌクレオチド）の見かけのサイズは、12マーCCCTT DNA鎖への連結の指標であった。T3転写物へのDNAの連結の速度論は、図５に示されている。反応は、1分以内に、殆ど終了し、その終末点では、29%のインプットRNAがDNAに結合していた。アルカリホスファターゼで処理されていないT3転写物を含有する反応では、DNA-RNA連結産物は形成されなかった（データは示していない）。
挿入及び欠失の形成−速度論分析
上述の実験で用いられたアクセプターポリヌクレオチドは、トポイソメラーゼ−DNAドナー複合体の5′一本鎖尾部と完全にハイブリダイズすることができた。ワクシニアウイルストポイソメラーゼは、共有結合したドナー3′末端とアクセプターの5′末端の間に、単一のヌクレオチドギャップが残るようにハイブリダイズするアクセプターオリゴヌクレオチドに、CCCTT鎖を結合し得るということが以前に示されている。該ギャップを横切って再連結すると、インプット切断容易鎖と比べて、産物中に１塩基の欠失が生じた（5）。該酵素は、ハイブリダイズしたとき、ドナー3′末端とアクセプターの最後から2番目の塩基対合したヌクレオチドとの間に、余分のヌクレオチドを１つ導入するアクセプターオリゴヌクレオチドへの鎖転移も触媒する。この場合、再連結は１塩基の挿入をもたらすであろう（5）。インビトロでの欠失及び挿入の形成は、哺乳類I型トポイソメラーゼでも公表されている（19）。しかし、これらの酵素による鎖の結合速度に対する、アクセプター鎖のギャップ及び挿入の効果についての報告はない。
ワクシニアトポイソメラーゼ共有結合中間体によるアクセプターオリゴヌクレオチド（ドナー複合体と塩基対を形成して、完全な塩基対を成す3′二重構造体セグメント、又は１ヌクレオチドギャップを有する3′二重構造体、又は２ヌクレオチドギャップを生じせしめる）への鎖転移の速度論を評価した。最も速い分析時点である10秒で、84%のインプットDNA基質が、完全にペアリングしたアクセプターに連結した（図6A）。鎖転移産物のサイズは、予想通り30ヌクレオチドであった（図７、レーン３）。アクセプター鎖を添加しないと、30マー産物は全く形成されなかった（図７、レーン２）。
１ヌクレオチドギャップを横切った再連結は、遅いが、きわめて効率的であった。1ヌクレオチドのギャップを横切って、85%のインプット基質が結合し、予想された29ヌクレオチドの産物が得られた（図6A及び図７、レーン4）。図６の速度論データは、見かけの速度定数0.005秒-1の１次指数関数に良くフィットする。このように、トポイソメラーゼによる、１ヌクレオチドのギャップを横切った鎖の閉鎖のシングルターンオーバーは、完全なペアを成すニックを横切って結合する速度に比べて、102のオーダーで遅かった。ワクシニアウイルストポイソメラーゼによって触媒される２ヌクレオチドのギャップを横切った鎖転移は、予想された28ヌクレオチドの産物を形成したが（図７、レーン５）、該反応は弱かった（図6A）。２ヌクレオチドギャップ産物が直線的に蓄積されるのが、2時間のインキュベーションにわたって観察され、この時点で、インプットDNAのうち10%が結合されたにすぎなかった。初速度に基づいて、１ヌクレオチドギャップを横切る連結に比べて、２ヌクレオチドギャップを横切る再連結は、102のオーダーで遅いことが推測された（従って、ニックを横切った結合の速度に比べて、104のオーダーで遅い）。
5′末端に1又は２のヌクレオチドを余分に含有したDNAアクセプターを用いて、同様の実験を行った（図6C）。これらのアクセプターへの再連結によって、それぞれ31及び32ヌクレオチドのラベルされた鎖転移産物が得られた（図７、レーン６及び７）。インプットDNAの90%が再連結されて、１ヌクレオチド挿入産物を形成した（図6C）。１ヌクレオチドが挿入された再連結については、0.04秒-1の速度定数が算出された。２ヌクレオチド挿入産物の形成においても、同様の終末点が達成されたが、鎖転移速度は相当遅かった（図6C）。２ヌクレオチド挿入で観察された速度定数は、0.0001秒-1の速度、すなわちニックのKrelに比べて、103のオーダーで遅かった。
鎖転移に対する5′アクセプター塩基のミスマッチの影響
ドナー複合体の5′尾部の-2〜-18の位置（CCCTTエレメントの切断容易な+1 T:A塩基対に対して）と塩基対を形成し得るが、切断容易な結合のすぐ3′の位置（-1）に塩基のミスマッチを有している一群の18マーのアクセプターへの、トポイソメラーゼによる鎖転移を調べた。正常な-1A:T塩基対を有する対照アクセプターは、10秒で反応を完了し、5秒で終末点の89%に達した（図８）。-1の位置にT:T、C:T、又はG:Tというミスペアを含有するDNAは、同程度の鎖転移を維持し、各ケースにおいて、5秒で77%の終末点に達した（図８）。このように、本実験で検出した限りでは、-1の位置のミスマッチは、鎖転移反応に殆ど影響を与えなかった。鎖結合ステップの速度に対する塩基のミスマッチの影響と、単一ヌクレオチドの欠失の影響との間には、明確且つ有益な相違が存在する。
分子内ヘアピン形成の速度論
外部のアクセプターオリゴヌクレオチドが存在しない場合には、12マー／30マー共有結合複合体の非切断容易鎖の5′OH末端は、向きを変えて、求核試薬として作用し、DNA−（3-ホスホチロシル）結合を攻撃する（5）。反応産物は、12塩基対の基部と18ヌクレオチドのループを含有するヘアピン分子である。シングルターンオーバーの条件下で、該反応の速度論を調べた。図9Aに示した実験では、3時間で65%のインプットCCCTT鎖がヘアピン産物に転換された。観察された速度定数は、5.7×10-4秒-1であった。同時に、18塩基対の切断基質上に形成された共有結合複合体によるヘアピン形成速度を分析した（図9A）。この場合には、非切断容易鎖の5′-OHによる攻撃によって12塩基対の基部及び６ヌクレオチドのループを含有するヘアピン分子が生じた。10時間でインプットCCCTT鎖の69%がヘアピン産物に転換された。観察された速度定数は、8.2×10-3秒-1であった。このように、18ヌクレオチドの5′尾部は、シスの鎖転移に対して攻撃する求核試薬として、６マーの5′尾部に比べて約７倍効果的であった。これらの共有結合複合体によるヘアピン形成は、一本鎖尾部による塩基対合が全く存在しなくても起こることに注意されたい。
再連結の速度に対する、塩基対形成の寄与を調べるために、18マー／30マー基質の底鎖の5′末端と最後から2番目の塩基を5′-ATに変更した（図9B）。ここでは、底鎖の5′末端の３塩基（5′-ATT）は、脱離鎖（5′-ATTCCC）の5′末端の塩基と同一である。このため、一本鎖尾部は自己相補的であり、切断容易なホスフェートに隣接した３つの塩基対を形成することができる。該DNA上への分子内ヘアピン形成は極めて速く、反応は10〜20秒で完了した（図9B）。観察された再連結の速度定数は、0.2秒-1であった。この値を非相補的な18マー／30マー基質に対する再連結速度定数（図9A）と比較することによって、３塩基のペアにより約350倍加速されたと推測された。
CCCTT含有ヘアピン分子のシングルターンオーバー切断の速度論
42ヌクレオチドの5′32Pラベルされたヘアピン産物をゲルで精製し、ワクシニアトポイソメラーゼによる共有結合付加物を形成するための基質としてテストした。37℃15秒で、インプット放射能の55%がトポイソメラーゼポリペプチドに転移した。60秒で90%転移という終末点に達した（データは示されていない）。ヘアピン切断の見かけの速度定数は、0.06秒-1であった。このように、トポイソメラーゼは、切断容易なホスフェートの下流にペアを形成した標準的塩基が存在しないCCCTT含有分子を迅速且つ効率的に切断した。ヘアピン切断の速度定数は、CCCTT部位の3′の二重構造体DNAのペアリングした５つの塩基を含有する18マー／30マー自殺基質に対するkclの約1/5である。
考察
ワクシニアトポイソメラーゼは、様々なレパートリーの鎖転移反応を触媒する。完全な塩基対を成したアクセプターDNAオリゴヌクレオチドへの共有結合したDNAの再連結は、DNA弛緩反応の鎖閉鎖ステップに対するモデルを与える。ここで、代わりの核酸アクセプターへの鎖転移の速度論を分析する。該知見は、エステル転移速度に影響を与えるパラメーターに対する新しい洞察を提供し、トポイソメラーゼがインビボで突然変異を生成する可能性を明らかにし、RNA修飾酵素としてのワクシニアトポイソメラーゼの実用性を示唆する。
共有結合付加物形成のための糖の特異性は、CCCTTエレメントに存在する
ワクシニアトポイソメラーゼは、CCCUU含有RNA鎖には、共有結合できないようである。このことは、CCCUU鎖がRNA-RNA又はRNA-DNA二重構造体の一部であるときに当てはまる（9）。該酵素の糖特異性は、切断容易なホスフェートの5′側にDNAが存在することが厳格に必要とされることに起因する（すなわち、CCCTT部位がDNAでなければならない）ということが示されている。さらに、以前の実験によって、相補的RNA鎖にアニーリングしたときに、CCCTT鎖は切断されないことが示されたので（9）、CCCTTエレメントは、DNA-DNA二重構造体でなければならない。このことは、切断を受けるためには、CCCTT部位がB型のヘリックスコンフォメーションをとっていなければならないことを示唆するため、該RNA-DNAハイブリッドの結果は示唆に富むものである。RNA及びDNAポリヌクレオチド鎖は、RNA-DNAハイブリッドの内部では種々のコンホメーションをとり、DNA鎖が厳密なＡ又はBの何れでもなく、実際にはこれら２つの型の中間の特性を示すコンホメーションをとっているのに対し、RNA鎖はA型のヘリックスコンフォメーションを保持している（dsRNA中に見出される）（20,21）。ワクシニアトポイソメラーゼは、主溝中のCCCTT部位のヌクレオチド塩基と接触する（9,22）。これは、CCCTT部位の特異的なホスフェートとも接触する（23）。非BコンフォメーションのCCCTT部位をとることによって、これらの接触が弱められるか、又は失われるのかもしれない。ワクシニアトポイソメラーゼが、切断容易なホスフェートの下流に位置するヌクレオチドの糖の組成には相対的に影響を受けないという知見は、リガンドの該部分中のヘリックスのコンフォメーションが、部位の認識又は反応化学には重要でないことを示唆している。トポイソメラーゼは、脱離鎖がRNAであるDNA-p-RNA鎖を切断する。実際に、平衡時の切断程度は、DNA-p-DNA鎖に対して達成された程度に比べて有意に高い。
RNAへの鎖転移
DNA-p-RNA基質に対する切断−再連結の平衡定数Keq（=Kcl／Krel）は、RNA再連結のシングルターンオーバーの速度Krel/RNAが、Krel/DNAの約1/10であるという発見によって説明できる。それにもかかわらず、RNAへの再連結の程度はきわめて高く、インプットCCCTT鎖の約90%が、2分の反応で18マーのRNAアクセプター鎖に再連結される。CCCTT含有DNA鎖は、トポイソメラーゼによって、バクテリオファージRNAポリメラーゼによりインビトロで合成された転写物に素早く結合され得ることが示されている。約30%のRNAが、2〜5分の反応で、DNA鎖に転移される。該特性は、5′末端のRNA配列が知られた任意のRNAの5′にタグを付けるために（すなわち、非切断容易鎖が、意図したRNAアクセプターの5′配列に相補的であるワクシニアトポイソメラーゼ用の自殺DNA切断基質をデザインすることによって）利用することができる。いくつかの実用には、（1）RNAの5′末端の32Pラベリング、及び（2）例えば、ビオチン化トポイソメラーゼ切断基質を用いることによる、RNAの5′末端のアフィニティーラベリングが含まれる。（標準的なT4 RNAリガーゼ反応と比較した）トポイソメラーゼを介したRNA鎖の利点としては、研究者が、RNA分子の複雑な混合物中の所望のRNAにトポイソメラーゼによる連結をターゲッティングし得ることがあり得よう。
フレームシフト及びミスセンス突然変異導入
ワクシニアトポイソメラーゼは、窪んだ末端又は余分のヌクレオチドを含有する相補的なDNAアクセプターに再連結させることにより、フレームシフト突然変異の相同物を生成することが、以前に報告された（5）。細胞のI型トポイソメラーゼについても、HenningfeldとHecht（19）によって、同様の反応が記載されている。主要な問題は、これらの異常な再連結反応が、トポイソメラーゼをインビボで突然変異原にさせ得る程に強固なものかどうかということである。速度論的な分析は、これを肯定し、どの種のフレームシフト反応が最も起こりやすいか（トポイソメラーゼに固有な特性のみを考慮に入れる）という点について初めて手がかりを与える。ワクシニア酵素の場合、フレームシフトを生成する再連結反応の順序は、＋1の挿入＞-1の欠失＞+２の挿入>>-2の欠失である。
これらのトポイソメラーゼによって触媒される反応の中で最も遅いのは、２ヌクレオチドのギャップを横切った鎖の閉鎖である（初速度＝毎秒インプットされたDNAの0.002%が再連結）。この場合には、攻撃する求核試薬は、非切断容易鎖への塩基対合によって、DNA−タンパク質ホスホジエステルから幾らかの距離を隔てて配置されている。5′ヒドロキシルをホスホジエステルに１塩基対分近づけると、反応速度が100のオーダーで増加する。余分に塩基対が導入されたヌクレオチドは、鎖の結合に対する障害にはなりにくいようであり、1又は２ヌクレオチドの挿入を形成する。トポイソメラーゼの活性部位は、余分なヘリックスヌクレオチド（extrahelical nucleotide）を収容し得るのかもしれない。あるいは、トポイソメラーゼによって生じたニックでは、これらのヌクレオチドは、DNAヘリックス中に挿入されるのかもしれない。
トポイソメラーゼが、インビボでマイナスフレームシフトを形成する経路には、アクセプター鎖がどのように作られるかという点が異なる２つの経路が考えられる。（1）脱離鎖の5′末端は、ヌクレアーゼによってトリミングされ、その後、生じたギャップを横切って連結が起こり得る；又は（2）同種の（homologous）DNA一本鎖が共有結合中間体を攻撃する。第二の経路では、侵入鎖（invading strand）を形成するために（及びおそらく脱離鎖を除去するために）、ヘリカーゼが必要であろう。プラスフレームシフトの場合には、トポイソメラーゼに対して、後者の経路のみが利用可能であろう。何故なら、元の脱離鎖の5′にヌクレオチドを付加する機構は存在しないからである。何れの経路が採られるとしても、最も迅速に触媒される突然変異生成鎖−結合反応が、インビボで最も顕著なものとなる公算が高いと考えるのが妥当であろう。-２フレームシフトの場合のように、もし再連結反応が遅ければ、細胞は、突然変異による損傷が修復される（例えば、共有結合したトポイソメラーゼを除去することによって）機会がより多くなる。これには、（1）トポイソメラーゼが結合したDNA鎖の一部を切り出すこと；又は（2）トポイソメラーゼ−DNA付加物の加水分解が必要とされるであろう。後者の反応を触媒する酵素が、最近Yangらによって発見された（24）。
切断容易なホスフェートに直接隣接する-1位に塩基ミスマッチを導入しても、再連結速度には、殆ど影響を与えない。この結果は、1ヌクレオチドギャップの10-2という速度効果と著しい対照を成す。-1塩基のミスマッチは、酵素の活性部位に存在する切断容易なホスフェートと末端ヌクレオチドの5′-ヒドロキシル求核試薬との近さをあまり変化させないと推定される。該結果は、トポイソメラーゼがインビトロでミスセンス突然変異を生成する能力を有していることを明確に示している。フレームシフト突然変異導入に関与する上記の一本鎖侵入経路は、原理的には、トポイソメラーゼがインビボでミスセンス突然変異を作り出す機会を与える。インビトロでの連結の速度論からは、トポイソメラーゼが生成したミスセンス突然変異は、フレームシフトよりも顕著だと思われる。
塩基の相補性の速度的寄与度
ワクシニアトポイソメラーゼによる分子内ヘアピン形成の速度論的分析は、鎖閉鎖における塩基相補性の役割について、初めて定量的な評価を提供する。共有結合複合体に対してシスの位置に結合している18ヌクレオチドの非ペアリング一本鎖による、DNA-（3′-ホスホチロシル）結合への攻撃の速度定数は、5.7×10-4秒-1であった。-1、-2、及び-3の位置での塩基対形成を可能にするために、一本鎖尾部の末端塩基のみを変えると、ヘアピン形成の速度定数が350倍増加した。３つの潜在的な塩基対がシスの位置に連結する速度は、切断容易な結合の3′に18の塩基対を形成する共有結合されていないアクセプター鎖とほぼ同じ再連結速度であった。共有結合した酵素が、僅か３つの相補的ヌクレオチドのみを有するDNA鎖を取り込んで迅速に再結合するという能力は、ワクシニアトポイソメラーゼが、鎖の侵入を介して、又は２つのトポイソメラーゼ−DNA複合体間での相互的な鎖転移によって、インビボで組換え中間体の形成を触媒するという推測に信憑性を与える（25）。
遺伝子配列の生成
既知の配列の96塩基テストRNA断片（GGG AGA CCC AAG CTC GCC CGG TTC TTT TTG TCA AGA CCG ACC TGT CCG GTG CCC TGA ATG AAC TGC AGG ACG AGG CAG CGC GGC TAT CGT GGC TGG）を用いて、遺伝子配列をクローニングするためのDNAタグ付加RNA（DNA-tagged RNA）の使用を評価した。該テストRNAは、製造者が供与したプロトコールを利用して、アンビオン社（Ambion Co.）のT7インビトロ転写キット（Invitrotranscription kit）を用いて合成した。
トポイソメラーゼ−DNA中間体は、以下のように作成した。
エッペンドルフチューブ中の2×B&W緩衝液（10mM Tris pH7.5，1mM EDTA，2M NaCl）25Lで2度、25μLのストレプトアビジン結合ダイナビーズ（Dynal）を洗浄した後、50μLの1×B&W緩衝液中に再懸濁した。1.5μgのビオチン化オリゴ（TOPOB1）及び２つのアニーリングオリゴ（TOPOP2、TOPOP3）0.75μgを前記ビーズに加え、5分間70℃に加熱した後、氷上で2分間冷却した。次に、各々25μLのNEB #1緩衝液（New England Biolabs−10mM Bis Tris Propane-HCl，10mM MgCl2，1mM DTT，25℃でpH7.0）で該ビーズを２度洗浄して、アニーリングしなかった全てのオリゴヌクレオチドを除去した。オリゴヌクレオチドは、ドルトン・バイオケミカルズ（Dalton Biochemicals；Canada）によって合成され、以下の配列を有していた。
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TOPOB1の5′末端は、ビオチン化されたグアニンヌクレオチドを用いることによって、自動化された合成のラウンド中にビオチン化した。
アニーリングステップの後、DNA基質は、基本的に以前記載したように、ワクシニアトポイソメラーゼを用いて修飾した。25μLの1×NEB #1緩衝液中のビーズに、約2.5μgのワクシニアトポイソメラーゼ１を添加した。室温で５分間、該混合物を回転している輪の上に置いた後、25μLの1×NEB #1緩衝液中で3回洗浄した。洗浄されたトポイソメラーゼ-DNA中間体を結合したビーズ10μLに、約100〜200ngの96マーRNAを添加した後、15μLの0.5M NaClを添加し（最終濃度0.3M）、チューブを5分間室温で回転した。
次に、DNA付加RNAを結合したビーズを1×RT緩衝液で２度洗浄し（cDNAサイクルキット、インビトロゲン、カールスバッド、CA、cat. # L1310-01）、RT96でプライミングし（第一の鎖の合成）、製造者のマニュアルに従って、cDNAサイクルキット、並びにプライマーPCR96及びPCR53を用いてPCRを行った。
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反応サイクルは、以下の通りであった。94℃で2分、その後25〜35サイクル（10秒／サイクル）94℃、55℃、及び72℃の後、72℃で5分。製造者のマニュアル従い、TOPOTMTAクローニングキット（インビトロゲン、カールスバッド、CA、cat. #K4500-01）を用いて、生じた増幅されたcDNAをプラスミドベクター中に挿入した。
ここまでは、本発明の具体的な実施態様を参照してきたが、当業者であれば、以下の請求の範囲においてその範囲が定義されている本発明の原理及び精神から外れずに、これらの実施態様を変化させ得ることが理解できよう。
参照文献
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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