(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
それを必要とする動物におけるBVDVタイプ１抗原性グループの非相同的ウイルスでの曝露後の胎児感染の予防方法であって、BVDVタイプクローン（Ａ）又はBVDV粒子（Ｂ）を前記動物に投与することを含む前記予防方法：
ここで、BVDVタイプクローン（Ａ）は、RNAへの転写の鋳型として作用する能力を有する単離された感染性BVDVクローンであって、前記RNAは、感受性のある宿主細胞に導入した場合に、感染性BVDV粒子の産生を誘導し、かつ、前記RNA配列は単離されたDNA分子（Ｃ）によってコードされるヌクレオチド配列に相補的である、感染性BVDVクローンであり、
BVDV粒子（Ｂ）は、DNA分子（Ｃ）又はBVDVタイプクローン（Ａ）を転写することによって産生されるBVDVタイプ２粒子であり、
DNA分子（Ｃ）は、以下からなる群より選ばれるヌクレオチド配列を含む単離されたDNA分子であって：
（ａ）配列番号１の全長、及び
（ｂ）縮重核酸コードに基づく配列番号１の変異体の全長、
BVDVタイプ１抗原性グループの非相同的曝露ウイルスによる曝露後の胎児感染を防止するのに有効なBVDVタイプ２クローンであって、配列番号１のErns領域のヒスチジンコドンH349の欠失によって弱毒化されたBVDVタイプ２クローンを産生するために使用できる前記DNA分子である。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は動物の健康、特にウシウイルス性下痢ウイルス（BVDV）の分野に属する。本発明は感染性BVDVクローン及び前記BVDVクローンを産生するための方法を提供する。本発明は、さらに前記クローンを弱毒化する方法、弱毒化したクBVDVローン及び前記弱毒化したクローンを含むワクチンに関する。
【０００２】
発明の背景
ウシウイルス性下痢ウイルス（BVDV）はBVD及びウシの粘膜病の原因である病原体である（Baker, 1987; Moennig及びPlagemann, 1992; Thielら, 1996）。妊娠中の胎児の感染は結果として胎児の吸収、流産及びBVDVに永続的に感染した免疫トレランスの子ウシの誕生となる。これらの子ウシは中和抗体力価を欠いているか、又は非常に低い中和抗体力価を有し、継続的に多量のウイルスを発散する。急性感染ウシの次に、これらの子ウシは、ウイルスが広がる主な源であり、従ってこの疾病の疫学において最も重要である。BVDの最も経済的な影響は、結果として流産の高い確率、死産、胎児再吸収、ミイラ化、先天性奇形、及び弱く小型の子ウシの出産を生じる。病原性を詳細に吟味するために、本明細書で1995年のMoennig及びLiessの文献を参照する。
限定交差中和抗体反応（Ridpathら, 1994）を表すBVDVの2つの主な抗原のグループ（タイプ１及び２）が記載される（Becherら, 1999）。BVDV感染の予防及び治療用の現在のワクチンは、依然として欠点を有している（Oirschotら, 1999）。古典的なBVDVタイプ１に対するワクチンは、タイプ２感染から部分的にのみ保護し、ワクチン接種母獣は毒性BVDVタイプ２に持続的に感染する子ウシを生む（Bolinら, 1991; Ridpathら, 1994）。この問題は、おそらく糖蛋白質E2（主要な抗原）で最も述べられるタイプ１株とタイプ２株の間の抗原性の大きな多様性による（Tijssenら, 1996）。タイプ１株に対する大抵のモノクローナル抗体はタイプ２ウイルスと結合できない（Ridpathら, 1994）。
【０００３】
死滅したワクチン（全不活性化ウイルス）又はサブユニットワクチン（従来法で精製された、又は非相同的に発現した精製されたウイルス蛋白質）は、アジュバントの存在下でさえ、完全感染防御免疫応答を生成するその効力における生ワクチンよりも大抵の場合劣る。
生BVDVワクチンは、弱毒化されているが、大抵の場合安全性の問題と関係がある。上述のように、それらは子を宿している牛の胎盤を通り、胎児に臨床症状及び／又は持続的に感染した子ウシの誘導をもたらす。従って、それらは子を宿している牛を含む繁殖ウシの群れに適用できない。子を宿しているウシは、胎児を保護するためにワクチン接種ウシから分離されなければならず、それ自体ワクチン接種されてはならない。さらに、弱毒化された生BVDVの復帰突然変異体はウシに深刻な脅威をもたらす。弱毒化が従来の複数の継代によって達成される従来法で誘導された弱毒化ウイルスについて、弱毒化の分子起源及び遺伝的安定性は依然として不明であり、毒性の野生型への復帰突然変異は予測不可能である。
弱毒化の根拠として定義される突然変異を有する生ワクチンは、弱毒化されたワクチンの現在の生成の不利益を克服するであろう。前記弱毒化突然変異の別の利点は、野外からのペスチウイルスと区別するために弱毒化ペスチウイルスに特有の標識として使用できるその定義された分子の特異性にある。
当該技術において、野生型ウイルスによく似ている定義された遺伝的同一性のBVDVは、特にタイプ２BVDVについては、ほとんど知られていない。当該技術において、前記BVDVを産生する方法は、長い間必要とされていた。従って、本発明の根底にある技術的課題は、定義された遺伝的同一性のBVDV、特にBVDVタイプ２を提供することであった。
【０００４】
発明の開示
詳細な説明で使用した用語の定義
本発明の実施態様の前に、本明細書及び特許請求の範囲で使用される通り、単数形「a」、「an」、及び「the」は、文脈上明らかに他の意味を示している場合を除き、複数の参照を含むことに留意しなければならない。従って、例えば「BVDVウイルス」への言及は複数の前記BVDVウイルスを含み、「細胞」への言及は1つ以上の細胞及び当業者に知られているその等価物への言及である。他に定義しない場合、本明細書で使用されるすべての技術及び科学用語は、本発明が属する技術常識の1つによって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様の、又は均等の方法及び材料は、本発明の方法又は検査で使用してもよく、好ましい方法、装置、及び材料は本明細書に記載される。本明細書に記載されるすべての刊行物は、本発明に関連して使用してもよい刊行物に報告された細胞株、ベクター、及び方法論を記載及び開示する目的で参照により本明細書に組み込まれるものとする。本明細書において、いずれも、本発明が先願発明の効力による前記開示の日付を早める権利を付与されないことの自認と解釈されるべきではない。
【０００５】
本明細書で使用される用語「BVDV」は、フラビウイルス科に含まれるペスチウイルス属の種BVDV 1及びBVDV 2に属するすべてのウイルスを参照する（Becherら, 1999）。しかし、より古典的なBVDVタイプ１株及びつい最近明らかにされたBVDVタイプ２株は、ヌクレオチド及びアミノ酸配列にいくつかの限られた特徴的な相違を示す。
「クローン」はDNAベクター又は前記ベクターが導入される宿主細胞株である。好ましくは、DNAベクターはプラスミドである。
「感染性クローン」は、感受性のある細胞に導入される場合にウイルスの産生を誘導するRNAへの転写のための鋳型として機能する能力を有するDNAベクターである。好ましくは、RNAは当業者に知られたインビトロ転写によって産生され、トランスフェクション技術によって細胞に導入される。
本明細書で使用される「BVDV粒子」又は「ウイルス粒子」は、RNAを介して「感染性クローン」から産生されるBVDウイルスに関し、前記RNAは、感受性のある細胞に導入される場合に前記BVDV粒子の産生を誘導する。
本明細書で使用される「弱毒化BVDV粒子」又は「弱毒化ウイルス粒子」は本発明の方法によって弱毒化されるBVDV粒子に関する（以下参照）。
「感染力」は、ウイルス又はウイルス粒子のプラーク検査においていくらかのプラーク又はエンドポイント検査においてあるTCID50スコアを誘導する能力である。
全長RNAは、野生型単離物で生じるRNAの配列の少なくとも98％を含むRNAである。全長相補的DNAは、野生型単離物で生じるRNAの少なくとも98％に相補的な配列を含むDNAである。
本明細書で使用される「子ウシ」は生後6ヶ月以下のウシに関する。
【０００６】
ウイルス：本明細書で使用される「真正の病原性」は、少なくとも1つの主な臨床パラメータについて、本発明の感染性BVDV粒子の病原性とBVDV RNA、好ましくはタイプ２RNAに相補的なヌクレオチド配列を含む前記DNA分子が誘導される野生型BVDV単離物の間に統計学的に有意な相違がないことを意味する。前記主な臨床パラメータの例としては、下痢、発熱及び／又は死亡率が挙げられる。
弱毒化：本明細書で使用される「弱毒化されたBVDV粒子」は、同じ投与量、好ましくは6×106TCID50で感染させた動物の主な臨床パラメータである下痢、発熱及び死亡率について、本発明の弱毒化されたBVDV粒子の病原性（前記弱毒化されたBVDV粒子は本発明の方法により弱毒化される。）と前記弱毒化されたBVDV粒子が誘導される野生型BVDV単離物の間に統計学的に有意な相違があることを意味する。従って、前記弱毒化されたBVDV粒子は下痢、発熱及び死亡率を生じず、故にワクチンで使用してもよい。
【０００７】
本明細書で使用される「RACE」はcDNA末端の急激な増幅を意味し、当該技術においてそれ自体で知られている（Frohmanら, Proc. Natl. Acad. Sci USA 1988, 85: 8998-9002）。
本明細書で使用される「感受性のある細胞」は、BVDウイルスに感染した、又はBVDV RNAをトランスフェクションされ得る細胞であり、前記ウイルス又はRNAは、前記感受性のある細胞に導入される場合に感染性BVDVの産生を誘導する。
【０００８】
本発明の「断片」は、本発明のDNA分子又は感染性BVDVクローンの任意のサブユニット、すなわちRNAに転写され得る開示されたものよりも短い核酸分子によってコードされることを特徴とする任意のサブセットである。
本発明のDNA分子又は感染性BVDVクローンの「機能変異体」は、本発明のDNA分子又は感染性BVDVクローンと実質的に類似である生物活性（機能的又は構造的）を有するDNA分子又は感染性BVDVクローンである。用語「機能変異体」は、また「断片」、「機能変異体」、「縮重核酸コードに基づく変異体」又は「化学誘導体」を含む。前記「機能変異体」は、例えば1つ以上の核酸置換、欠失又は挿入を有してもよい。前記置換、欠失又は挿入は全配列の10％を占めてもよい。前記機能変異体は、感染性クローン又はワクチン株としてその生物活性、例えば機能を少なくとも部分的に残し、又は改善された生物活性を示す。
「遺伝コードの変性に基づく変異体」は、ある特定のアミノ酸がいくつかの異なるヌクレオチドトリプレットによってコードされてもよい事実の結果生じる変異体である。前記変異体はその生物活性を少なくとも部分的に残し、又は改善された生物活性を示す。
【０００９】
「融合分子」は、例えば識別に用いる放射性同位元素のようなレポーター、蛍光標識等の化学分子又は当該技術において知られる任意のその他の分子と融合した本発明のDNA分子又は感染性BVDVクローンであってもよい。
本明細書で使用される本発明の「化学誘導体」は、化学修飾された、又は一般に分子の一部でない追加の化学成分を含む本発明のDNA分子又は感染性BVDVクローンである。前記成分は分子の溶解性、吸収、生物学的半減期等を改善する場合がある。
両方の分子が実質的に類似のヌクレオチド配列又は生物活性を有する場合、分子はもう一方の分子と「実質的に類似」である。従って、2つの分子が類似の活性を有する場合、それらは、ヌクレオチド配列が同一でないときにその用語が本明細書で使用される変異体であるとみなされ、類似のヌクレオチド配列を有する2つの分子は、その生物活性が同一でないときでさえ、その用語が本明細書で使用される変異体であるとみなされる。
【００１０】
本明細書で使用される用語「ワクチン」は、動物における免疫学的応答を誘導する少なくとも1つの免疫学的活性成分及びあるいは必要ないかもしれないが前記活性成分の免疫学的活性を高める1つ以上の追加の成分を含む医薬組成物を参照する。ワクチンは、医薬組成物に典型的な別の成分をさらに含んでもよい。ワクチンの免疫学的活性成分は、その本来の形態で、又はいわゆる変性生ワクチン（MLV）の弱毒化粒子若しくはいわゆる死滅ワクチン（KV）の適切な方法によって不活化された粒子として完全なウイルス粒子を含んでもよい。別の形態で、ワクチンの免疫学的活性成分は、前記生物体の適切な成分（サブユニットワクチン）を含んでもよく、それによってこれらの成分は、全粒子を破壊すること若しくは前記粒子を含む成長培養及び必要に応じて続く所望の構造体を得る精製工程によって、又は例えば細菌、昆虫、哺乳類又はその他の種に基づく適したシステムを用いた適切な操作を含む合成方法及び必要に応じて続く単離及び精製方法によって、又は適した医薬組成物を用いる遺伝材料の直接組み込み（ポリヌクレオチドワクチン接種）によってワクチンを必要とする動物における前記合成方法の誘導によって産生される。ワクチンは上述の成分の1つ又は1つ以上を同時に含んでもよい。
本明細書で使用される用語「ワクチン」は、抗原性物質を含む獣医学用途のワクチンであり、BVDVによって誘発される疾病に対して特異的な能動免疫を誘導する目的で投与される。本発明のBVDVクローンは、それが含む免疫原に対する、及びしばしば抗原性に関する生物体に対する母性抗体を介して受動的に導入されてもよい能動免疫を与える。
免疫応答を高める追加の成分は、アジュバントと一般に呼ばれる構成物質、同様に例えば水酸化アルミニウム、鉱油又はその他の油、又はワクチンに加えられ、又は前記追加の成分によるそれぞれの誘導後に身体で生成される補助的分子、同様にこれに制限されないがインターフェロン、インターロイキン又は成長因子である。
「医薬組成物」は、それが投与される生物体、又は前記生物体中又は上で生きている生物体の生理学的、例えば免疫学的機能を変性することができる1つ以上の成分から本質的になる。その用語は、これに限定されないが、抗生物質又は駆虫薬、同様にこれに限定されないが形質を処理すること、無菌、安定性、経口、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内又はその他の適した経路等の経腸的又は非経口的経路を介して前記組成物を投与する可能性、投与後の耐性、徐放特性のようなその他の特定の目的を達成するために一般に使用されるその他の構成物質を含む。
【００１１】
発明の開示
上記技術的課題の解決は、詳細な説明及び特許請求の範囲に記載された実施態様によって達成される。
当該技術における長い間の必要性は、定義された配列の生BVDV（ウシウイルス性下痢ウイルス）について克服され、例えばワクチンで用いる特定の弱毒化されたBVDVを産生するために使用できる病原性と特異的に関係付けられた。本発明者らは、初めて野生型ウイルスに非常に似ている病原性を有すると同時に定義された遺伝的同一性の感染性クローン及びそれから誘導される感染性BVDV粒子を産生する方法を提供した。さらに、本発明者らは、初めて感染性タイプ２クローン及びそれから誘導される感染性タイプ２BVDV粒子を開示した。第3に、定義された配列の感染性生BVDV粒子を発明して、また本発明者らは、ただ1つの定義された遺伝マーカー部位での変性によって弱毒化される場合がある遺伝的同一性を有する弱毒化されたBVDV粒子を産生する方法を発明した。本発明は、ゲノム変性と弱毒化の間の因果関係を生み出し、それは弱毒化の機能メカニズムを理解するために必須であり、従ってワクチンとしての使用における品質を評価するのに役立つ。
【００１２】
第1の重要な実施態様において、本発明は、BVDV RNAに相補的なヌクレオチド配列を含むDNA分子に関し、前記RNAは、感受性のある宿主細胞に導入した場合に、
a）6×106TCID50の投与量で感染させたときに、少なくとも1日間子ウシのウイルス血症及び白血球減少症、並びに少なくとも1日持続する下痢及び／又は発熱を含む群のその後の臨床症状の少なくとも1つを誘導する能力を有する感染性BVDV粒子、及び／又は
b）前記DNA分子が誘導された野生型BVDV単離物と比べて真正の病原性を有する感染性BVDV粒子（上記で定義される）、及び／又は
c）BVDV未処置の子ウシを6×106TCID50の投与量で前記粒子に感染させたときに、21日以内に前記子ウシの少なくとも30％に対して致死的である感染性BVDV粒子、及び／又は
d）配列番号１と相補的な配列を有するRNAを含むBVDV粒子の90％以上の病原性を有する感染性BVDV粒子、及び／又は
e）配列番号１と相補的な配列を含む感染性BVDV粒子の産生を誘導する。
工程a）の6×106TCID50の前記投与量は、6×106の全投与量を得るために、好ましくは2×106筋肉内（i.m.）（臀部筋肉）、2×106鼻腔内、及び2×106皮下（肩甲骨を覆って）として投与される。工程a）の前記臨床症状は、好ましくはすべての感染動物の少なくとも3分の2で観測されるべきである。工程a）の前記白血球減少症は、少なくとも連続二日間、ベースラインよりも少なくとも35％低下すべきであり、ここで「ベースライン」は感染の10日前のすべての動物の平均値に関する。下痢はBVDVの感染の典型的な症状である。
好ましくは、上に記載される本発明のDNA分子において、工程a）の発熱は少なくとも40℃である。
【００１３】
第2の重要な実施態様において、本発明は、RNAへの転写の鋳型として作用する能力を有する感染性BVDVクローンに関し、前記RNAは、感受性のある宿主細胞に導入した場合に、
f）6×106TCID50の投与量で感染させたときに、少なくとも1日間子ウシのウイルス血症及び白血球減少症、並びに少なくとも1日持続する下痢及び／又は発熱を含む群のその後の臨床症状の少なくとも1つを誘導する能力を有する感染性BVDV粒子、及び／又は
g）前記DNA分子が誘導された野生型BVDV単離物と比べて真正の病原性を有する感染性BVDV粒子、及び／又は
h）月齢3〜6ヶ月のBVDV未処置の子ウシを6×106TCID50の投与量で前記粒子に感染させたときに、感染後21日以内に前記子ウシの少なくとも30％に対して致死的である感染性BVDV粒子、及び／又は
i）配列番号１と相補的な配列を有するRNAを含むBVDV粒子の90％以上の病原性を有する感染性BVDV粒子、及び／又は
j）配列番号１と相補的な配列を含む感染性BVDV粒子の産生を誘導する。
工程f）の6×106TCID50の前記投与量は、6×106の全投与量を得るために、好ましくは2×106筋肉内（i.m.）（臀部筋肉）、2×106鼻腔内、及び2×106皮下（肩甲骨を覆って）として投与される。工程a）の前記臨床症状は、好ましくはすべての感染動物の少なくとも3分の2で観測されるべきである。工程f）の前記白血球減少症は、少なくとも連続二日間、ベースラインよりも少なくとも35％低下すべきであり、ここで「ベースライン」は感染の10日前のすべての動物の平均値に関する。
前記感染性BVDVクローンは、好ましくはタイプ１又はタイプ２クローンである。
前記感染性BVDVクローンが真正の病原性であることは重要であるため、前記クローンを構成するための起源として作用するウイルスは、好ましくは野外単離物から直接得られ、又は動物に再導入し、続いてもっとも強い臨床症状を有する動物から単離され、続いて細胞培養で2回まで培養され、好ましくは1回又は培養しない。実施例（実施例１）はこれを例示する。実施例は、いくつかの細胞培養の培養後、ウシに再導入され、再単離され、再単離されたウイルスの2回までの細胞培養の培養後にRNA調製物及びcDNAクローニングで使用されるウイルスNY93/CのcDNAクローニングを示す。
【００１４】
本発明の別の重要な実施態様は、本発明のDNA分子又はBVDVクローンを用いる転写、適した細胞又は細胞株の前記RNAによるトランスフェクション及び前記細胞によって産生される結果として得られるBVDV粒子の収集によって産生されるBVDV粒子である。さらに別の実施態様は、本発明のDNA分子又はBVDVクローンを適したDNAウイルスのゲノム（前記DNAウイルスは当業者に知られている）へのクローニング、続く適した細胞によって産生されるBVDV粒子の産生を生じる前記細胞の感染によって産生されるBVDV粒子である。また、好ましくは、本発明のDNA又は感染性クローンは、T7ポリメラーゼを安定に発現する細胞についてvan Gennipら（1999）によって古典的ブタ発熱ウイルス（CSFV）について開示されるRNAを産生する適した細胞にトランスフェクションしてもよい。また、好ましくは、本発明のDNA又は感染性クローンは、真核細胞から分泌される得る感染性BVDV粒子の産生をもたらす前記細胞の真核プロモーターの制御下で発現されてもよい（ポリオウイルスについてV. Racaniello及びD. Baltimoreによって例示される（1981））。
【００１５】
本発明のとても重要な実施態様は感染性BVDVタイプ２クローンである。好ましくは、RNAへの転写のための鋳型として作用できる前記感染性BVDVタイプ２クローンであり、感受性のある宿主細胞に導入した場合に、前記RNAは、
k）6×106TCID50の投与量で感染させたときに、少なくとも1日間子ウシのウイルス血症及び白血球減少症、並びに少なくとも1日持続する下痢及び／又は発熱を含む群のその後の臨床症状の少なくとも1つを誘導する能力を有する感染性BVDV粒子、及び／又は
l）前記DNA分子が誘導された野生型BVDV単離物と比べて真正の病原性を有する感染性BVDV粒子、及び／又は
m）月齢3〜6ヶ月のBVDV未処置の子ウシを6×106TCID50の投与量で前記粒子に感染させたときに、感染後21日以内に前記子ウシの少なくとも30％に対して致死的である感染性BVDV粒子、及び／又は
n）配列番号１と相補的な配列を有するRNAを含むBVDV粒子の90％以上の病原性を有する感染性BVDV粒子、及び／又は
o）配列番号１と相補的な配列を含む感染性BVDV粒子の産生を誘導する。
好ましくは、本発明は、以下の工程によって特徴付けられる方法によって得ることができるBVDVタイプ２クローンに関する：
aaa）野生型BVDVタイプ２株を単離する；
bbb）前記野生型BVDVタイプ２株を細胞培養で培養する；
ccc）前記細胞培養で培養したBVDVタイプ２株を使用してウシに感染させ、BVDV株を最も激しく感染した動物から再単離する；
ddd）前記再単離したBVDVタイプ２株を2回まで、好ましくは1回細胞培養で培養する；
eee）前記再単離したBVDVタイプ２株を逆転写及びクローンし、得られる全長cDNAクローン、好ましくは5'及び3'末端を、RACE技術を用いてクローンする。
前記感染性DNAクローンを、次いで適切な条件下でRNAに転写してもよく、前記RNAを適した細胞又は細胞株に導入して得られるBVDVタイプ２粒子を収集する。
前記クローンは非限定的実施例１に例示され、cDNA配列（配列番号１）によって特徴付けられる。従って、好ましい実施態様は、配列番号１のDNA配列又はその断片、機能変異体、縮重核酸コードに基づく変異体、融合分子若しくは化学誘導体によって特徴付けられる本発明の感染性BVDVタイプ２クローンに関する。非限定的実施例は実施例１で与えられる。
本発明は、さらにRNAへの本発明のBVDVクローンのインビトロ転写、適した細胞又は細胞株の前記RNAによるトランスフェクション及び前記細胞によって産生される結果として得られるBVDV粒子の収集によって産生されるBVDVタイプ２粒子に関する。また、好ましくは、本発明のDNA又は感染性クローンは、T7ポリメラーゼを安定に発現する細胞についてvan Gennipら（1999）によって古典的ブタ発熱ウイルス（CSFV）について開示されるRNAを産生する適した細胞にトランスフェクションしてもよい。また、好ましくは、本発明のDNA又は感染性クローンは、真核細胞から分泌され得る感染性BVDV粒子の産生をもたらす前記細胞の真核プロモーターの制御下で発現されてもよい（ポリオウイルスについてV. Racaniello及びD. Baltimoreによって例示される（1981））。
【００１６】
本発明のとても重要な別の局面は、全長BVDVタイプ２RNAに相補的なヌクレオチド配列を含むDNA分子である。好ましくは、前記DNA分子は配列番号１によって特徴付けられる。従って、本発明は、さらに配列番号１又はその断片、機能変異体、縮重核酸コードに基づく変異体、融合分子若しくは化学誘導体によって特徴付けられる本発明のDNA分子に関する。非限定的実施例は実施例１で与えられる。
最も好ましくは、本発明は配列番号１によって特徴付けられる配列からなる本発明のDNA分子に関する。
【００１７】
本発明は、さらに上記される本発明のDNA分子、又は上記される本発明のBVDVクローンに相補的なRNA分子に関する。
本発明は、また上記される本発明のDNA分子、又は上記される本発明のBVDVクローンの転写によって得ることができるRNA分子に関する。
【００１８】
本発明の別の重量な局面は、野生型BVDV単離物から感染性BVDVクローンを産生する方法であり、前記感染性BVDVクローンは前記野生型単離物と比べて真正の病原性を有するRNAに相補的であり、前記方法は、
p）感染した動物からウイルス粒子を単離する工程、
好ましくは適した細胞培養細胞で2回まで培養する工程、
q）ウイルス粒子からRNAを調製する工程、
r）RNAの逆転写後に全長相補的RNAを産生する工程、ここで逆転写はRNAの二次構造を分解又は変形するのに充分な高温での工程、及びこの工程のための熱安定な酵素の使用を含み、前記酵素は前記高温で活性であり、
s）BVDV cDNAのRNAへの転写を適した細胞の感染によって誘導することができるプラスミドベクター又はDNAウイルスに前記相補的DNA（cDNA）を組み込む工程を含む。
前記ウイルス粒子は、好ましくはウイルス血症の際（工程k））に単離される。工程m）の全長相補的DNA（cDNA）は、重複する部分的cDNA断片を構築することによって産生してもよい（また、実施例１参照）。
【００１９】
別の好ましい実施態様は野生型BVDV単離物から感染性BVDVクローンを産生する方法に関し、前記感染性BVDVクローンは前記野生型単離物と比較して真正の病原性を有するRNAに相補的であり、前記方法は、
ppp）ウイルス血症の際に感染した動物の細胞から、又は必要に応じて前記動物の死後、その器官からRNAを単離する工程；
qqq）好ましくは、RNAの逆転写後DNA断片から構築される全長相補的BVDV DNAを産生する工程；ここで、逆転写は、RNAの二次構造を分解又は変生するのに充分な高温での工程、及びこの工程のための熱安定な酵素の使用を含み、前記酵素は前記高温で活性であり；
rrr）BVDV cDNAのRNAへの転写を適した細胞の感染によって誘導することができるプラスミドベクター又はDNAウイルスに相補的DNA（cDNA）を組み込む工程を含む。
細胞培養に適した細胞は、マディン-ダービー-ウシの腎臓（MDBK）細胞、RD（ウシの精巣）細胞又はウシの鼻甲介（Turbinat）（BT）細胞である。さらに適した細胞は当業者に知られている。
本発明の方法により産生される感染性クローンは、タイプ１クローン、又は好ましくはタイプ２クローンである。
【００２０】
本発明の別の重要な局面は、野生型BVDV単離物から感染性BVDVクローンを産生する方法であり、前記感染性BVDVクローンは前記野生型単離物の90％以上の病原性を有するRNAに相補的であり、前記方法は、
t）感染した動物からウイルス粒子を単離する工程；
u）適した細胞培養細胞で2回まで培養する工程、好ましくは1回又は培養しない；
v）ウイルス粒子からRNAを調製する工程；
w）RNAの逆転写後に全長相補的RNAを産生する工程；ここで逆転写はRNAの二次構造を分解又は変形するのに充分な高温での工程、及びこの工程のための熱安定な酵素の使用を含み、前記酵素は前記高温で活性であり；
x）BVDV cDNAのRNAへの転写を適した細胞の感染によって誘導することができるプラスミドベクター又はDNAウイルスに前記相補的DNA（cDNA）を組み込む工程を含む。
前記ウイルス粒子は、好ましくはウイルス血症の際（工程t））に単離される。工程x）の全長相補的DNA（cDNA）は、重複する部分的cDNA断片を構築することによって産生してもよい（また、実施例１参照）。
【００２１】
感染性BVDVの5'及び3'領域をクローンすることは当該技術において特に困難であった。本発明者らは、真正の5'及び3'領域を得る本発明の方法を開発した。驚いたことに、これはRACE技術を適用することによって可能であった。しかしながら、この技術の本発明者らによる修正のみが、真正の病原性のBVDVクローンの予期しない産生を導いた。好ましくは、本発明は、RNAの5'末端はRACEを用いて産生される本発明の方法に関する。驚いたことに、熱安定なポリメラーゼとともにRACE技術を適用することによってのみ、ゲノムの二次構造をうまく分解することができた。
標準的な分子生物学的方法は当業者に知られており、また、例えばSambrookら, (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York及びBertram, S. and Gassen, H.G. Gentechnische Methoden, G. Fischer Verlag, Stuttgart, New York, (1991)に見ることができる。
好ましくは、本発明は、RACEが少なくとも48℃、好ましくは50〜55℃、また好ましくは56〜60℃の反応温度を可能にする熱安定なポリメラーゼにより行う本発明の方法に関する。
定義した配列の感染性生BVDV粒子を発明すると、また本発明者らは、好ましくはただ1つの定義された遺伝子マーカーで弱毒化される定義された遺伝的同一性を有する弱毒化されたBVDV粒子を産生する方法も発明した。遺伝子マーカー部位の存在のみが当業者に公知の分子生物学的方法によって決定される必要があるため、このことは、意外にも復帰突然変異体又は成功した弱毒化の簡単な測定法を与える。実施例１のXIKE-B及びXIKE-Cは定義された配列の前記弱毒化されたBVDV粒子の非限定的実施例である。
【００２２】
本発明の別の重要な局面は、1つ以上の突然変異を上述の本発明のDNA分子又は上述の感染性BVDVクローンに導入することによってBVDウイルス弱毒化の方法であり、前記1つ以上の突然変異は回収したBVDウイルスの弱毒化された表現型を導き、又は増加させる。
本発明のさらに別の重要な局面はBVDV株の弱毒化方法であり、
y）1つ以上の突然変異を上述の本発明ののDNA分子、又は上述の本発明の感染性BVDVクローンに導入する工程、
z）突然変異したDNAを感受性のある宿主細胞に導入する工程であって、前記DNAはRNAに転写される前記工程又は前記DNAから転写されるRNAを前記細胞に導入する工程、及び
aa）前記細胞によって産生されるウイルス粒子を回収する工程を含み、
前記1つ以上の突然変異は弱毒化を生じる。
本発明の好ましい局面は、1つ以上の突然変異がヌクレオチド置換、欠失、挿入、付加、又はその組み合わせである上述の本発明の弱毒化方法である。
本発明によれば、「突然変異」は別のもの（例えばTの代わりのC）によるヌクレオチドの置き換え、いわゆる「置換」又は「欠失」若しくは「挿入」等の任意のその他の突然変異を意味する。「欠失」は1つ又は複数のヌクレオチド又はアミノ酸の除去を意味する。
本発明のこれらの感染性BVDVクローンは、野生型ウイルスによく似ている真正の病原性及び同時に定義された表現型を有するウイルスであり、前記ウイルスは動物実験におけるポジティブコントロールとして使用されなければならない。前記感染性クローンは、例えばワクチンのために使用される特異的に弱毒化されたBVDVクローンを産生する優れたツールである。本発明はBVDVクローンを含み、糖蛋白質ERNSで生じるRNアーゼ活性は不活性化される。好ましくは、前記RNアーゼ活性は、欠失及び／又は置換等のその他の突然変異によって不活性化される。好ましくは、前記欠失及び／又はその他の突然変異は、位置295〜307及び／又は位置338〜357のアミノ酸で示される。
従って、本発明のより好ましい局面は、1つ以上の突然変異が糖蛋白質Ernsであり、突然変異された蛋白質の機能を弱め、又は喪失させる本発明の弱毒化の方法である。
本発明のより好ましい局面は本発明の弱毒化の方法であり、前記変異は、
bb）糖蛋白質Ernsのすべて又は一部の欠失、及び／又は
cc）配列番号１の位置300のヒスチジンの欠失又は置換、及び／又は
dd）配列番号１の位置349のヒスチジンの欠失又は置換からなる。
最も好ましくは、さらに別の重要な実施態様はBVDVの弱毒化方法であり、位置300及び／又は349のヒスチジンで、本発明のBVDVクローンの突然変異を含み、コードトリプレットは欠失又は置換される。
さらに別の重要な実施態様は本発明のBVDVの弱毒化方法であり、ヒスチジン300のコドンはロイシンのコドンによって置換される。
さらに別の重要な実施態様は本発明のBVDVの弱毒化方法であり、ヒスチジン349のコドンは欠失される。
【００２３】
本発明の別の重要な実施態様は、本発明の方法によって得ることができる弱毒化されたBVDVクローン又はBVDV株である。
本発明の別の重要な実施態様は、必要に応じて薬剤的に許容されるキャリア又は賦形剤と組み合わせた本発明の弱毒化されたBVDVクローン又は株を含むワクチンである。
本発明は、さらにBVDV感染の予防及び治療用ワクチンの製造における本発明の弱毒化されたBVDVクローン又は株の使用に関する。
好ましくは、本発明のワクチンは上で定義されたワクチンに関し、1つの免疫学的に活性な成分は生BVDVであり、その蛋白質ERNSにおけるRNアーゼ活性は不活化される。用語「生ワクチン」は、複製の能力がある粒子、特に複製活性ウイルス成分を含むワクチンを参照する。
好ましくは、本発明のワクチンは、本発明の弱毒化されたBVDウイルスタイプ２又は任意のその他の抗原性グループ及び薬剤的に許容されるキャリア又は賦形剤と組み合わせた本発明の弱毒化されたBVDウイルスタイプ１を含む。前記ワクチンは混合ワクチンとして投与してもよい。最も好ましくは、本発明の前記弱毒化されたBVDウイルスタイプ１を最初に投与し、続いて3〜4週間後本発明の弱毒化されたBVDウイルスタイプ２を投与してもよい。
好ましくは、本発明のワクチンは、本発明の弱毒化されたBVDウイルスタイプ１（ここで、その蛋白質ERNSにおけるRNアーゼ活性は不活化される）を、本発明の弱毒化されたBVDウイルスタイプ２（ここで、その蛋白質ERNSにおけるRNアーゼが不活化される）又は任意のその他の抗原性グループ（ここで、その蛋白質ERNSにおけるRNアーゼは不活化される）及び薬剤的に許容されるキャリア又は賦形剤と組み合わせて含む。前記ワクチンは混合ワクチンとして投与してもよい。最も好ましくは、上述の本発明の前記弱毒化されたBVDウイルスタイプ１を最初に投与し、続いて3〜4週間後上述の本発明の弱毒化されたBVDウイルスタイプ２を投与してもよい。
本発明は、好ましくはBVDV感染したウシを上述の本発明の弱毒化されたBVDVで治療する方法に関し、ここで前記弱毒化されたBVDV又は上述のワクチン組成物は、それを必要とするウシに当業者に公知の適した投与量で投与され、ウイルス血症及び白血球減少症及び／又は発熱及び／又は下痢等のBVDV症状の低減がモニターされる。前記治療は、好ましくは繰り返してもよい。
以下の実施例は本発明をさらに説明するために提供されるが、これらは本明細書に開示される発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【００２４】
実施例１
材料及び方法
細胞及びウイルス
MDBK細胞をアメリカンタイプカルチャーコレクション（American Type Culture Collection）（ロックヴィル, メリーランド）から得た。10％ウシ胎児血清（FCS; ペスチウイルス及びペスチウイルスに対する抗体の欠如について試験された）及び非必須アミノ酸で補充されたダルベッコ修正イーグル培地で細胞を増殖させた。
ウシウイルス性下痢株ニューヨーク（New York）'93（野外単離物VLS＃399）はE. J. Dubovi（ニューヨーク州立獣医学カレッジ（New York State College of Veterinary Medicine）, コーネル大学, イサカ）によって提供された。ウイルスは1回動物培養された（以降、「ニューヨーク（New York）'93/C」と呼ぶ）。
【００２５】
細胞の感染、免疫蛍光検定及びウイルスペルオキシダーゼアッセイ
ペスチウイルスはその宿主細胞と強く関係しているため、感染細胞の溶解物を培養細胞の再感染のために使用した。感染の3〜5日後細胞を凍結及び解凍することによって、溶解物を調製し、-70℃で保存した。本明細書において他に示さない限り、0.1の感染の多重度（m.o.i）を培養細胞の感染で使用した。免疫蛍光検定及びペルオキシダーゼアッセイのために、感染細胞を氷冷アセトン：メタノール（1:1）で15分間-20℃で固定し、風乾し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で再水和した。次いで、E2に対して作られる抗-BVDV単一特異的抗体の混合物（Weilandら, 1989）で細胞をインキュベートした。PBSによる3回の洗浄後、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）-共役ラビット抗-マウス抗体（Dianova, ハンブルグ, ドイツ）を免疫蛍光検定で結合した抗体を検出するために使用した。ペルオキシダーゼアッセイのために、ペルオキシダーゼ-共役ヤギ抗-マウス抗体（Dianova）を第二抗体として使用した。1時間室温でインキュベートした後、細胞をPBSで3回洗浄した。結合した抗体を50mMの酢酸ナトリウム緩衝剤（pH5.0）、1μMのアミノエチルカルバゾール及び0.1％のH2O2を含む溶液により検出した。
【００２６】
ノーザン（RNA）ハイブリダイゼーション
感染の48時間後に、先に述べたようにセシウム密度勾配遠心沈殿法によりRNAを調製した（Rumenapfら, 1989）。ゲル電気泳動、プローブの放射性標識、ハイブリダイゼーション、及びポストハイブリダイゼーション洗浄を先に記載したように行った（Rumenapfら, 1989）。株ニューヨーク（New York）93/C由来の放射性のある標識化PCR生成物（ヌクレオチド4301〜5302）をプローブとして使用した。
【００２７】
PCR及びRT-PCR
製造業者の推奨に従って、約50〜100ngのDNA鋳型及び25pmolの各プライマーを用いて、PCRをTfl-ポリメラーゼ（プロメガ, マンハイム, ドイツ）又はTaq-ポリメラーゼ（Appligene, ハイデルベルク, ドイツ）のいずれかで行った。ゲノムの5'末端の増幅で使用したプライマーの配列は、上流、T25Vプライマー（Display Systems Biotech, コペンハーゲン, デンマーク）、及び下流、第1回についてCM79: CTCCATGTGCCATGTACAGCAGAG及びネステッド（nested）PCRについてCM86: CTCGTCCACATGGCATCTCGAGACであった。ゲノムの3'末端の増幅で使用したプライマーは上流、第1回についてCM46: GCACTGGTGTCACTCTGTTG及びネステッド（nested）PCRについてCM80: GAGAAGGCTGAGGGTGATGCTGATG及び下流、nls-: GACTTTCCGCTTCTTTTTAGGであった。鋳型として2μgの全RNAを用いて、製造業者説明書に従って、逆転写PCR（RT-PCR）をTitan（登録商標）One Tube RT-PCRシステム（ベーリンガーマンハイム, ドイツ）で行った。Ernsコード領域の増幅用プライマーは、上流、CM28: GGAGAGAATATCACCCAGTG、及び下流、CM21: CTCCACTCCGCAGTATGGACTTGCであった。
増幅したRT-PCR生成物を調製用アガロースゲル電気泳動及び製造業者によって推奨されるNucleotrapキット（Macherey-Nagel, デューレン, ドイツ）による溶出によって精製した。
【００２８】
DNA-オリゴヌクレオチドのRNAの3'末端とのリン酸化及びライゲーション
DNAプライマーとウイルスゲノムの3'末端とのライゲーションのために、プライマーをリン酸化した。10μgのオリゴヌクレオチドnls+: CCTAAAAAGAAGCGGAAAGTCをT4-ポリヌクレオチドキナーゼ（New England Biolabs, Schwalbach, ドイツ）の5単位で30μlキナーゼ-ミックス（2mMのATP、50mMのトリス-HCl pH 7.5、10mMのMgCl2、10mMのジチオスレイトール、25μg/mlのウシ血清アルブミン）中40分間37℃でインキュベートした。プライマーをセファデックスG-15スピンカラム（Sambrookら, 1989）に通し、さらにフェノール／クロロホルム抽出物及びエタノール沈殿により精製した。
感染した培養細胞から調製される5μgの総RNA及び20ユニットのT4-RNA-リガーゼ（New England Biolabs, Schwalbach, ドイツ）でリン酸化された150pmolのオリゴヌクレオチドを用いて、50μlのリガーゼ-ミックス（50mMのトリス-HCl pH7.8, 10mMのMgCl2, 10mMのジチオスレイトール, 1mMのATP, 40％ポリエチレングリコール及び50ユニットのRNAガード（アマシャム, フライブルク, ドイツ））中16時間17℃でライゲーションを行った。生成物をフェノール／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿により精製した。
【００２９】
一本鎖DNAの合成及びテーリング
感染細胞由来の2μgの総RNA及び100pmolのプライマーCM79（「PCR及びRT-PCR」参照）を用い、製造業者の説明書（反応: 65℃10分, 42℃40分, 65℃15分）に従って、ウイルスゲノムの5'末端由来の一本鎖 (-) DNAをDisplayThermo-RT逆転写酵素（Display Systems Biotech, コペンハーゲン, デンマーク）により産生した。DNAを2つの連続したフェノール／クロロホルム抽出及び1/4容量の10M酢酸アンモニウムを含むエタノール沈殿により精製した（Schaefer 1995）。
製造業者に推奨される50％の「第1鎖」生成物、50ユニットの末端トランスフェラーゼ、6.25μMのdATP及び1.5mMのCoCl2を用いて50μlのTdT緩衝剤中で、ポリ-dAテールを末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（TdT）（ロッシュモレキュラーバイオケミカルズ, マンハイム, ドイツ）を有する第1cDNA鎖に付加した。37℃で30分間インキュベーションした後、生成物をフェノール／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿により精製した。
【００３０】
cDNAライブラリーの作成及びヌクレオチド配列決定
cDNAの合成、クローニング及びライブラリースクリーニングを先に記載したように行った（Meyersら, 1991）。cDNA合成をオリゴBVD13、BVD14及びBVD15（Meyersら, 1991）及びB22.1R（GTTGACATGGCATTTTTCGTG）、B12.1R（CCTCTTATACGTTCTCACAACG）、BVD33（GCATCCATCATXCCRTGATGAT）、N7-3-7（CAAATCTCTGATCAGTTGTTCCAC）、B23-RII（TTGCACACGGCAGGTCC）、及びB-3'（GTCCCCCGGGGGCTGTTAAGGGTTTTCCTAGTCCA）により初回抗原刺激した。ライブラリーをスクリーニングのために使用したプローブは、BVDV株cp7（GenBank受入番号U63479, Meyersら, 1996b）由来のcDNAクローンのXhoI/AatII挿入断片であり; ハイブリダイゼーションを52℃で行った。
エキソヌクレアーゼIII及びヌクレアーゼS1を使用してcDNAクローンの欠失ライブラリーを確立した（Henikoff, 1987）。二本鎖DNAのヌクレオチド配列をBigDye Terminator Cycle Sequencingキット（PE Applied Biosystems, Weiterstadt, ドイツ）により行った。一般に、cDNAクローンの両方のDNA鎖を配列決定し; 非依存性cDNAクローン間の重なりを少なくとも2つのクローンで配列決定する。全体で、全ゲノムについて約3.8の全被覆と等しい約47,000のヌクレオチドを分析した。配列分析及びアラインメントをGenetics Computer Group Software（Devereuxら, 1984）で行った。
【００３１】
全長cDNAクローンの作成
制限、クローニング及びその他の標準手順を他で記載した通りに行った（Sambrookら, 1989）。制限及び変更酵素をNew England Biolabs（Schwalbach, ドイツ）、ファルマシア（フライブルク, ドイツ）、ギブコBRL（Eggenstein, ドイツ）、及びベーリンガーマンハイム（ドイツ）から得た。
ライブラリー由来の5つのcDNAクローンを全長cDNAクローンの作成のために使用した: プラスミドC3/8（ヌクレオチド35〜2411）、プラスミドC5/11（ヌクレオチド22〜2400）、プラスミド8/11（ヌクレオチド3400〜7814）、プラスミド13/27（ヌクレオチド4783〜9910）及びプラスミドC4/24（ヌクレオチド8658〜12322）。ヌクレオチド位置2144〜位置4447に及ぶ断片「RT-E2」を、鋳型として野外単離物VLS＃399に感染したMDBK細胞由来の総RNAを用いてプライマーCM29（GATGTAGACACATGCGACAAGAACC）及びCM51（GCTTCCACTCTTATGCCTTG）によるRT-PCRによって得た。以下の記載において、ウイルス性cDNA挿入断片の側にあるプラスミド制限部位に下線を引く。
第1に、クローンC3/8をAatII及びHindIIIでカットし、cDNA挿入断片を同じ酵素でカットしたpACYC177に導入した。得られたプラスミドをpKANE5と呼ぶ。RT-PCR生成物「RT-E2」を同じ酵素で制限した後このプラスミドのNdeI/HindIII部位に挿入し; 得られたプラスミドをpKANE8と呼ぶ。次いで、クローンC5/11由来のAatII断片をpKANE8のAatII部位に導入し、プラスミドpKANE14を得た。
組換えcDNAクローンの5'末端を、第1cDNAヌクレオチドの上流のT7プロモーター配列を導入するプライマーCM87（GCTCTAGACGGCCGTAATACGACTCACTATAGGTATACGAGATTAGCTAAAGAACTCGTATATGGATTGGACGTCAAC）及びCM79によりPCRによって産生し（「PCR及びRT-PCR」参照）、プラスミドC5/11をPCR鋳型として使用した。PCR生成物をcDNAクローンC5/9のXbaI及びBsrGI部位に結合し、プラスミドpKANE22を生じる。その後、オリゴCM87は偽ヌクレオチドを含み、pKANE22はオリゴCM88（GACGGCCGTAATACGACTCACTATAGTATACG）及びCM79によりPCRによって修復されたことが分かった。PCR生成物を大腸菌DNA-ポリメラーゼＩ（クレノー断片）により処理して平滑末端を生成し、次いでBsrGIにより制限した。それをpKANE22のSpelblunt/BsrGI部位にクローンし、プラスミドpKANE22Aを得た。
CDNAクローン8/11の挿入断片をXhoI及びBamHIでカットし、同じ酵素でカットされたpACYC177にクローンし; 得られたプラスミドをpKANE6と呼ぶ。cDNAクローン13/27のAvrII/BamHI断片をpKANE6に導入し、プラスミドpKANE15を生じる。次いで、pKANE14由来のEcoRV/MfeI断片を同じ酵素で消化したpKANE15に挿入した。得られたプラスミドはpKANE21であった。pKANE21をSacII及びEcoRVで消化し、pKANE14由来の対応する断片をこれらの部位にクローンし、プラスミドpKANE24を導く。次いで、pKANE22A由来のSacII/SacII断片を同じ酵素でカットしたpKANE24にクローンした。得られたプラスミドはpKANE28AIIであった。
ゲノムの3'末端を、プライマーB2-11500（CCTAACCATGATATATGCCTTCTG）及びゲノムの3'末端にSrfI部位を付加するCM81（CGGAATTCGCCCGGGCTGTTAGAGGTCTTCCCTAGT）を用いるPCRによって産生した。PCR生成物をBamHI及びEcoRIでカットし、pACYC177にクローンし、プラスミドpKANE17を得た。次いで、cDNAクローンC4/24のSacI/Kpn2I断片をpKANE17に導入し; プラスミドをpKANE20と呼ぶ。StuI/EcoRI断片をpKANE20から切除し、EcoRIで消化し、StuIで部分的に消化すたプラスミドpKANE21にクローンした。得られたプラスミドはpKANE23であった。最後に、pKANE28AII由来のXbaI/PshAI断片を同じ酵素でカットされたプラスミドpKANE23に挿入し、全長cDNAクローンpKANE40を誘導した。
【００３２】
部位特異的突然変異誘発
すべての突然変異をQuikChange部位特異的突然変異誘発キット（ストラタジーン, アムステルダム, オランダ）を用いて、製造業者説明書に従ってPCRにより産生した。Ernsをコードする領域に突然変異を導入するために使用したプラスミドは、初期cDNAライブラリーから得られたクローンC5/9であった（ヌクレオチド50〜2411）。変異体H"346"Δを産生するオリゴヌクレオチドはCM126（GAGTGGAATAAAGGTTGGTGTAAC）及びCM127（GTTACACCAACCTTTATTCCACTC）であり、変異体H"297"LのオリゴヌクレオチドはCM128（AACAGGAGTCTATTAGGAATTTGGCCA）及びCM129（TGGCCAAATTCCTAATAGACTCCTGTT）であった。所望の突然変異の存在及び第2部位突然変異の非存在をヌクレオチド配列決定により検証した。
【００３３】
インビトロ転写及びRNAトランスフェクション
RNAの転写及びMDBK細胞のトランスフェクションを本質的に先に記載される通りに行った（Meyersら, 1996a）。簡単に、2μgのそれぞれのcDNA作成物をSrfIで直線化し、フェノール抽出及びエタノール沈殿によって精製した。15ユニットのRNAガード（ファルマシア, フライベルク, ドイツ）の存在下で50ユニットのT7 RNAポリメラーゼを含む50μlの転写ミックス（40mMのトリス-HCl pH 7.5、6mMのMgCl2、2mMのスペルミジン、10mMのNaCl、0.5mMの各ATP、GTP、CTP及びUTP、10mMのジチオスレイトール、100μg/mlのウシ血清アルブミン）の総容量でT7 RNAポリメラーゼ（NEB, Schwalbach, ドイツ）による転写を行った。37℃で1時間インキュベーションした後、反応混合物をSephadex G-50スパンカラムに通し、さらにフェノール抽出及びエタノール沈殿により精製した。
他に明記されていない場合、トランスフェクションを約3×106のMDBK細胞及びDEAE-デキストラン（ファルマシア, フライベルク, ドイツ）と結合した約0.5μgのインビトロ転写したRNAの懸濁液で行った。100μlのHBSS（1リットル当たり5gのHepes、8gのNaCl、0.37gのKCl、0.125gのNa2HPO4・2H2O及び1gのブドウ糖、pH 7.05）に溶解したRNAと100μlのDEAE-デキストランとの混合（HBSS中に1mg/ml）及び30分間氷上でのインキュベーションによりRNA/DEAE-デキストラン複合体を調製した。ペレット状細胞をFCSを含まないDMEMで1度洗浄し、遠心分離し、次いでRNA/DEAE-デキストラン混合物中に再懸濁した。37℃で30分間のインキュベーション後、20μlのジメチルスルホキシドを加え、混合物を2分間室温でインキュベートした。2mlのHBSSの追加後、細胞をペレットにし、HBSSで1度洗浄し、FCSを含まない培地で1度洗浄した。細胞をFCSを含むDMEM中に再懸濁し、10.0-cm-径の皿に播種した。トランスフェクションの48〜72時間後、細胞を分裂させ、後の分析のために必要に応じて播種した。
エレクトロポレーションをRNAの特異的感染力の測定のために使用した。マグネシウム及びカルシウムを含まない5mlのリン酸緩衝食塩水（PBS）中の3×106のMDBK細胞をRNAの適切な量と混合し、2mmのエレクトロポレーションキュベットに導入した。エレクトロポレーションをHoefer PG200 Progenetor IIで960μF180ボルトの1つのパルスで行った。その後、細胞を3.5cmの皿に播種し、約20時間後免疫蛍光により分析した。
【００３４】
RNアーゼ活性の測定
MDBK細胞を組換えウイルスに感染させ、48時間増殖した。野生型ウイルスに感染させた細胞をポジティブコントロールとして使用し、非感染細胞をネガティブコントロールとして使用した。より長いインキュベーションはMDBK細胞でかなりのバックグラウンド活性を生じるため、37℃でのプローブのインキュベーションが1時間でなく30分間であることを除いて先に記載した通りに、細胞調製及びRNアーゼ活性の測定を行った（Meyersら, 1999）。
【００３５】
動物実験
組換えウイルスを検査するために、2つの動物実験を行った。最初の実験において、2つのグループの3頭の斑点のある雌ウシ（生後8〜10ヶ月）に105TCID50を鼻腔内に接種した。第2の実験において、6頭のホルスタイン種及びホルスタイン雑種ウシ（生後7〜10週）に5×105TCID50を鼻腔内に感染させた。検証実験において、動物に5×106TCID50を接種した。感染前にBVDV特異的抗原及び抗体のないすべての動物を検査した。異なるグループを離れた隔離ユニットに閉じこめた。結果セクションで示されるように、臨床パラメータを毎日記録した。結果セクションに示される時点で、血液を頚静脈外部から採取し、血清の生成で使用されるまでヘパリン（約35I.U./ml）で安定化した。
血液中に存在するウイルスを測定するために、軟膜をすべての血液サンプルから調製した。5mlの氷冷溶解緩衝剤をヘパリンで安定化した血液（約107の白血球を含む）の一定分量に加え、10分間氷上でインキュベートし、続いて遠心分離した。2mlのPBSで再懸濁する前に、ペレットを1回溶解緩衝剤で洗浄し、Ca2+及びMg2+を含まないPBSで2回洗浄した。24-ウエルプレートに播種したMDBK細胞を200μlの軟膜プレパラートを接種し、5日間インキュベートした。BVDV E2 mAbミックスでの免疫蛍光顕微鏡検査法によりウイルス性抗原を測定した（上記参照）。
56℃で30分間のインキュベーションにより不活化した血清サンプルでウイルス中和抗体の存在を検査した。血清を96ウエルマイクロタイタープレートで1:2づつ希釈し、株ニューヨーク（New York）'93/C（ウエル当たり100TCID50）の上澄みを1時間37℃で接種した。101.75のMDBK細胞を各ウエルに添加し、5日間インキュベートした。感染を免疫蛍光により分析し、Kaerberの方法により計算し（Mayrら, 1974）、約100TCID50を中和する希釈を50％終点として表した。
鼻汁中のウイルスを検出するために、鼻スワブを結果セクションで示される時点で採取し、2mlの輸送緩衝剤（5％FCS、100I.U./mlのペニシリンG、0.1mg/mlのストレプトマイシン及び2.5μg/mlのアンフォテリシンBを補充したPBS）で希釈し、0.2μmのフィルタを通した。MDBK細胞を100μlのこれらの製剤を含む24ウエルプレートに接種し、5日後直接免疫蛍光顕微鏡検査法により分析した。
【００３６】
結果
ゲノム分析
株NY'93/Cは完全に配列決定された第2BVDVタイプ２ゲノムである。ノーザンブロット分析は、株890（Ridpath及びBolin, 1995）とは反対に、NY'93/Cのゲノムが長い挿入又は欠失を含まない（データは示さない）ことを示した。ヌクレオチド配列分析は、ゲノムが12332ヌクレオチドの長さであり、3913アミノ酸のポリ蛋白質をコードする1つのオープンリーディングフレームを含むことを明らかにした。
5'非翻訳領域（位置1〜385）をRACE法によって決定し、位置21を除いてTopliff及びKelling（1998）によって作られたニューヨーク（New York）'93配列と同一であることが分かった。その他の公知のタイプ２ゲノム（Ridpath, 1995; Topliff及びKelling, 1998）と対照的に、株NY'93/Cはこの位置にチミンの代わりにアデニンを有する。
【００３７】
NY'93/Cの感染性cDNAクローンの作製及び分析
多くの感染性cDNAクローンがCSFV及びBVDVタイプ１について作られているが（Mendezら, 1998; Meyersら, 1996a及び1996b; Moormannら, 1996; Vassilevら, 1997; Kummerer及びMeyers, 2000）、これはBVDVタイプ２株由来の感染性クローンの最初の報告である。クローンをT7 RNAポリメラーゼを有する流出（runoff）転写のためにデザインし、非相同的な付加なしにゲノム様RNAを生じる。
全長クローンを初期ファージライブラリーから選択される4つのcDNAプラスミド及び位置2265と4301の間の領域を含む1つのRT-PCR生成物から作った。5'末端で、T7プロモーターの配列はインビトロ転写で付加され、SrfI部位は3'末端にプラスミド直線化のために付加された（図１）。全長クローンをpKANE40Aと呼ぶ。
MDBK細胞に直線化pKANE40A鋳型からインビトロ転写により産生したRNAをトランスフェクションした。NS5Bコード領域の上流の19コドンを終結するプラスミドpKANE28AII由来の流出（runoff）転写物はネガティブコントロールとして与えた。トランスフェクションの3日後、コントロールではないがpKANE40A由来のRNAをトランスフェクションした細胞の免疫蛍光染色後、BVDV-特異的シグナルを検出した。感染性クローンpKANE40Aから産生されるウイルスをXIKE-Aと呼ぶ。トランスフェクションした細胞を2回培養し、2回目の培養のストックをすべてのさらなる実験のために使用した。ウイルスをRT-PCR配列決定により分析し、XIKE-Aの同定の証拠として位置1630のCからTへのヌクレオチド置換を得た。
pKANE40Aから誘導されるRNAの特異的感染力を野生型ウイルスNY'93/Cを感染した細胞から調製したRNAとの比較により決定した。このため、ノーザンブロット及びハイブリダイゼーション後、ホスホイメージャーを用いて、MDBK細胞のトランスフェクションで使用したサンプル中のウイルスRNAの濃度をインビトロ転写したRNAの定義された量との比較により測定した。MDBK細胞に同じ量の両方のRNAをトランスフェクションし、トランスフェクションの3日後プラークを数えた。平均で、pKANE40Aから誘導されたRNAの感染力は4.32×102pfu/μgであり、野生型RNAは4×102pfu/μgであった。
同じ実験におけるコントロールとして最初の野外単離物VLS#399を用いて、組換えウイルスの増殖特性を成長曲線により分析した（図２）。MDBK細胞に0.1のm.o.i.を感染させ、サンプルを感染後2〜96時間の7つの時点で得た。組換えXIKE-Aの成長曲線はVLS#399よりも多少スムーズであるが、96時間後両方のウイルスは106.39の力価に達する。XIKE-Aは、従ってさらなる実験に適していると考えられた。
【００３８】
Erns突然変異体の作製及び分析
CSFVによる先の実験（Meyersら, 1999）は糖蛋白質ErnsのRNアーゼ活性がヒスチジン297又は346（CSFV株Alfort/Tubingenにおける残基位置を表す数）のロイシン又はリジンによる置換、又はコドン「H346」の欠失によって破壊されることを示した。突然変異体ウイルスは生存可能であるが、臨床的に弱毒化されている。BVDV株NY'93/Cにおいて、2つのヒスチジン残基は、それぞれ位置300及び349に位置する。これらの位置の突然変異の効果がBVDVタイプ２ゲノムのCSFVと同じであるかどうかを試験するために、2つの感染性クローンをコドン「H349」の欠失又はコドン「H300」のロイシンによる置換により操作した。得られた組換えウイルス突然変異体をXIKE-B（H349Δ）及びXIKE-C（H300L）と呼ぶ。
両方の突然変異体はErnsコード領域を含むRT-PCR生成物のヌクレオチド配列決定によって決定されるように少なくとも5つの増殖についてMDBK細胞で安定であった。2つの突然変異体ウイルスの増殖特性を野生型感染性クローンXIKE-Aから誘導されるウイルスと比較した（図３）。
XIKE-A、XIKE-B及びXIKE-CのRNアーゼ活性を、感染の2日後のウイルスの同じm.o.iを感染させた細胞の未精製細胞抽出物で決定した。プレパラートの一定分量を、ポリ(U)を分解する能力について試験し、野生型株NY'93/Cを感染させた細胞をポジティブコントロールとして与え、非感染性細胞をネガティブコントロールとして使用した。30分のインキュベーション後、残留する高分子量RNAを沈殿させ、上澄みのOD260測定は分解した低分子量のRNA断片の存在を明らかにした（Meyersら, 1999）。高いRNアーゼ活性はNY'93/C及びXIKE-Aサンプルで見られ、2つの突然変異体XIKE-B及びXIKE-Cはネガティブコントロールと同じ程度であった（図４）。
【００３９】
XIKE-A及びNY'93/Cによる動物実験
最初の動物実験の目的は野生型株NY'93/Cによる感染性cDNAクローンから誘導される組換えウイルスXIKE-Aの毒性及び病原性を比較することであった。3頭の動物（生後8〜9ヶ月）の2つのグループにそれぞれ105TCID50のXIKE-A（動物＃615、＃377、＃091）又はNY'93/C（動物＃275、＃612、＃1610）を感染させた。各グループを別々の隔離ユニットに閉じこめた。体温及び臨床的症状を毎日記録し、血液サンプルを白血球の数及びウイルス血症の検出のために感染後0、2〜16及び21日に採取した。すべてのウシからの血清をNY'93/Cに対する中和抗体の検出のために感染後0、7、14、21、29及び35日に収集した。
【００４０】
【表１】
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表１：ニューヨーク（New York）'93/C又はXIKE-Aに感染させた動物の軟膜プレパラート及び鼻スワブからのウイルス単離物
+ 検出されたウイルス
- 検出されたウイルスがない
bac = 細菌
* 動物を感染後13日で安楽死させた。
【００４１】
両方のグループにおいてすべての動物は発熱（図５）並びに呼吸器症状及び胃腸疾患等の広範囲の臨床的症状を生じた。動物＃091を安楽理由で感染後13日で殺した。両方のグループのすべてのウシは感染後3日で始まり、感染後15日まで持続する白血球減少症を示した（図６）。5日間NY'93/C及び7日間XIKE-Aに感染させた動物由来の軟膜プレパラートで、ウイルスを検出した。鼻分断（shedding）は1又は2日間見られた（表１）。
ウイルスの同定をすべての動物由来の軟膜プレパラートから調製されたRNAからのRT-PCR生成物のヌクレオチド配列決定によってチェックした。全Ernsコード領域（位置1140〜1780）を配列決定し、それぞれNY'93/C又はXIKE-Aの公知の配列と同一であることを見つけた。中和抗体を感染後14日に始まるすべてのウシで見られた（表２）。
【００４２】
【表２】
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* 動物を感染後13日で安楽死させた。
表２：中和抗体力価は、ニューヨーク（New York）'93/C又はXIKE-Aによる実験的な感染後すべてのウシの血清サンプルで決定した。結果は、ニューヨーク（New York）'93/Cに対する血清BVDV-特異的中和抗体力価の逆数として表される（102.07TCID50）。
【００４３】
この研究の結果は、組換えウイルスXIKE-Aが病原性及び自然宿主における免疫応答の誘導の両方に関して野生型ウイルスNY'93/Cと極めて類似性が高いことを示した。従って、感染性クローンpKANE40Aに基づいて産生されるウイルス突然変異体で観測されるかもしれないこの臨床像からの誘導が所望の突然変異によって実際には生じていると仮定することはもっともらしい。
【００４４】
XIKE-B及びXIKE-Aによる動物実験
第2の動物実験において、RNアーゼ陰性突然変異体XIKE-Bの臨床特性及び免疫学的特性をXIKE-Aと比較して分析した。H349Δ突然変異体は、野生型へのゲノム復帰突然変異の危険を最小限にするH300L突然変異に対して優位に立つ。
3頭のウシ（生後7〜10ヶ月）の2つのグループをそれぞれ5×105TCID50のXIKE-A（動物＃387、＃388、＃418）又はXIKE-Bウイルス（動物＃415、＃417、＃419）の投与量で接種した。グループを別々の隔離ユニットに閉じこめた。直腸の温度及び臨床症状を毎日モニターし、鼻スラブ及び血液サンプルを-8、0、2〜14、17及び21日に採取した。血清サンプルを0、8、12/14、21、28及び38/40日に収集した。
感染の9〜10日後、XIKE-Aに感染したウシは最大3日間発熱し、さらに動物＃387は下痢及び呼吸器症状を伴った感染後3日に発熱を有した（図７）。ウシ＃388は痙攣を示した。記しをつけたうつ病及び摂食障害の状態のグループを感染後12日で安楽理由により安楽死させた。XIKE-Bに感染したウシはいずれも体温は上昇しなかった（図７）。ただ緩やかな呼吸器症状が最大6日間観測された。白血球減少症はすべての動物で見られたが、白血球の数の減少は、XIKE-Bのグループよりも野生型XIKE-Aに感染したウシでより明白であった（図８）。
ウイルスは感染後4日で始まるすべての動物の軟膜プレパラートで見られたが、ウイルス血症は野生型配列によるウイルスに対して（φ8日）よりもErns突然変異体に対して（φ4日）より短かった。ウイルスの鼻分断（shedding）はXIKE-A動物により最大8日間観測されたが（φ4.7）XIKE-B動物で最大の1日間（φ0.7）で観測された（表３）。
【００４５】
【表３】
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表３：組換えウイルスXIKE-A（動物＃387、＃388、＃418）又はErns突然変異体XIKE-B（動物＃415、＃417、＃419）に感染した動物の軟膜プレパラート及び鼻スワブからのウイルス単離物
+ 検出されたウイルス
- 検出されたウイルスがない
* 動物を感染後12日で安楽死させた。
【００４６】
再度、全Ernsコード領域を含むRT-PCR生成物のヌクレオチド配列決定を軟膜プレパラートでのウイルス同定で使用した。予想通り、動物＃387、＃388及び＃418由来の単離物は野生型であった。「H349」コドンの欠失は動物＃415、＃417及び＃419で確認された。興味深いことに、追加の点突然変異はこれらの動物のうち2頭（＃415及び＃419）からのRT-PCR生成物で見られ、ヌクレオチド位置1246はグアニンからチミンに置換され、アミノ酸置換Q287Hを生じた。中和抗体は、XIKE-Aに感染したウシの血清で感染後12日で、及びErns突然変異体に感染したウシの血清で感染後14日で最初に観測された（表４）。
【００４７】
【表４】
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* 動物を12日で安楽死させた。
表４：中和抗体力価は、XIKE-A（野生型配列）又はXIKE-B（H346？）による実験的な感染後すべてのウシの血清サンプルで決定した。結果は、ニューヨーク（New York）'93/Cに対する血清BVDV-特異的中和抗体力価の逆数として表される（101.7TCID50）。
【００４８】
実施例２
実験計画
12頭の妊娠中の雌ウシをBVDV陰性のウシの群れから選択した。5/7頭の雌ウシの以下のグループを試験に盛り込んだ。
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雌ウシを接種の8日前に実験施設に移した。実験施設に移した後、妊娠状態を確認した。雌ウシは接種の日に妊娠60日から90日の間であった。接種は、すべての動物に対してある時点で6mlの組織培養上澄みに適用される2.5×104TCID50/mlの各ウイルスにより行った。
観察期間中に流産等のBVDV感染の臨床的症状の存在について、雌ウシをモニターした。実験は、感染後9週間で終了した。非流産の雌ウシを屠殺し、子宮を調べ、収集した。ルーチンの検死の際に、胎児の器官サンプルを収集し、BVDV感染について調べた。
胎児感染の存在は主な評価パラメータであり、BVDV-関連雌ウシの死亡率の数、BVDV-関連流産の数及び終了時のBVD陽性胎児の数から構成される。
【００４９】
結果：
グループ１
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グループ２
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【００５０】
実施例３：
研究は胎児感染に対するBVDV単離物の有効性を評価することを目的とする。E（RNS）蛋白質XIKE-B（H349Δ）におけるRNアーゼ機能の欠失を有するNY93感染性コピー誘導BVDV組換体（タイプII）の有効性を、非相同的タイプI誘発後、胎児感染を防止するために調べた。
60〜90日の間は、BVDVにさらされた胎児の最も感受性の高い期間である。従って、この試験において、BVDVのない農場からの雌ウシ（BVDVについて血清陰性であることを確認した）は、XIKE-Bの1回の曝露（i.m.）で免疫にされる。その後、雌ウシを受精させ、60〜90日の動物とし、動物がBVDV胎児感染に対する感受性が高いと想像される場合、野生型野外ウイルスによる誘導感染を行った。誘導の鼻腔内経路は、これが最もよい野外における感染の通常の経路を模倣するとして選択された。
【００５１】
実験計画：
雌ウシをBVDV陰性のウシの群れから選択した。雌ウシはBVDVについて血清学的及びウイルス学的陰性を試験された。雌ウシの以下のグループを試験に盛り込んだ。
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グループ１は曝露まで起源のウシの群れにおいて処置されないままであった。血液サンプルは軟膜プレパラート及び血清学のためにワクチン接種後収集した。
媒精はすべてのグループについて免疫化の4週間後に始めた。グループ１は曝露前に実験施設に移された。
雌ウシはワクチン接種の4ヶ月10日後曝露した。接種の日に、妊娠の状態は妊娠60〜90日であった。
胎児感染の予防は主な評価パラメータであった。
【００５２】
イベントの順序とタイムスケジュール
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【００５３】
BVDV曝露ウイルス
ウイルスは必要に応じてBVDVのない培地で増殖し、等分し、-70℃［±10℃］で凍結した。
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【００５４】
ワクチン接種
ワクチン接種スケジュールは実験計画セクションに記載される。
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【００５５】
結果：
直腸温度
温度値は、1つを除いてすべての場合に39℃未満であり、特有のゆらぎは観察期間中見られなかった。雌ウシNo.1249（グループ１）は14DPI（感染後日数）で39.1℃の温度を有したが翌日には通常の値に戻った。
【００５６】
白血球の数
0DPI値は比較のための個々のベースラインと評価された。白血球の下限は研究プロトコルで定義されなかった。しかしながら、40％以上の白血球の数の減少、すなわちベースライン値（曝露の日に作られる）の60％以下に達する値は生物学的に重要であると考えられた。
個々の平均白血球の数を下記表１に示す。
【００５７】
【表５】
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【００５８】
ベースラインの白血球の数はすべてのグループで同じであった。グループ１（タイプI株に感染）の両方の雌ウシは曝露後（最大量は4-8DIPを示す）の白血球の数の生物学的に重要な減少を示したが（灰色で協調された値）、対応するワクチン接種した雌ウシ（グループ２）は白血球の目立った低下を示さなかった。例外は、感染の14日後に、一日だけ明らかな減少を示した雌ウシNo.1197のみである。その翌日、白血球の数は通常と考えられる値に戻った（ベースラインから40％未満の差）。
【００５９】
ウイルス単離データ
ウイルス単離物研究に適用した方法は、前の実施例に説明される。軟膜由来のウイルス単離物のデータ（ワクチン候補（XIKE B）に感染した後の日数（＝DPIで表す）：
【００６０】
【表６】
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【００６１】
すべての雌ウシは、XIKE Bのワクチン接種後、BVDV感染に典型的な臨床症状は何も示さなかった。曝露後、グループ１の雌ウシは少なくとも1日ウイルス血症を有したが、グループ２では、曝露後いずれの日もウイルス血症は検出できなかった。
グループ１の雌ウシからのすべての胎児はBVDVに対して陽性であり、以下の器官のすべてはウイルス単離物によってBVDVについて試験され（腸間膜リンパ節、小腸、脾臓、胸腺、腎臓、胸骨、骨髄、小脳）、グループ２の雌ウシからの胎児はBVDVに対してすべて陰性であった（一貫して試験されたすべての器官：腸間膜リンパ節、小腸、脾臓、胸腺、腎臓、胸骨、骨髄、小脳において）。
従って、感染性コピー誘導ウイルスはうまく弱毒化され、胎児感染を予防するためのワクチンウイルスとしての使用の可能性が示された。
XIKE BウイルスはBVDVタイプIIウイルスに抗原性において属し、BVDVタイプI抗原性グループに属する非相同的曝露ウイルスによる曝露後、胎児感染を防止するのに有効である。
【００６２】
参考文献
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【００６３】
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【００６４】
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【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】感染性cDNAクローンの構成である。上段はBVDVゲノム（kB）及びコード化ポリ蛋白質を概略的に示す。中段は、感染性cDNAクローンを操作するために使用されるcDNAクローン（白）、RT-PCR生成物（ライトグレー）及びPCR生成物（ダークグレー）を示し、下段はゲノムcDNA配列の末端（下線）及びインビトロ転写の5'及び3'末端に付加される配列を示す。
【図２】組換えウイルスXIKE-A及び野生型BVDV単離物VLS＃399の成長曲線である。MDBK細胞を0.1のm.o.iでウイルスに感染させ、示した時点で凍結及び解凍により収集した。力価は、感染後（p.i.）72時間免疫蛍光染色によって、新しいMDBK細胞の感染後決定した。
【図３】組換えウイルスXIKE-A並びにErms突然変異体XIKE-B（H349Δ）及びXIKE-C（H300L）の成長曲線である。MDBK細胞を0.1のm.o.iでウイルスに感染させ、示した時点で凍結及び解凍により収集した。力価は、感染後（p.i.）72時間免疫蛍光染色によって、新しいMDBK細胞の感染後決定した。
【図４】それぞれのウイルスに感染させたMDBK細胞の未精製細胞抽出物由来の野生型株ニューヨーク'93/Cと比較した組換えウイルスXIKE-A（野生型配列）、XIKE-B（H349Δ）及びXIKE-C（H300L）のRNアーゼ活性の測定である。感染していないMDBK細胞をネガティブコントロール（n.i.）として用いた。低分子量RNA断片の上澄みへの放出のマーカーとしてOD260を測定することによって、ポリ（U）の酵素分解を決定した。
【図５】ニューヨーク'93/C（動物＃275、＃612及び＃1610、破線）又はXIKE-A（動物＃615、＃377及び＃091、実線）に感染した動物の体温である。
【図６】ニューヨーク'93/C（動物＃275、＃612及び＃1610、破線）又はXIKE-A（動物＃615、＃377及び＃091、実線）に感染した動物の白血球（WBC）の数である。
【図７】XIKE-A（動物＃387、＃388及び＃418、破線）又はXIKE-B（動物＃415、＃417及び＃419、実線）に感染した動物の体温である。
【図８】XIKE-A（動物＃387、＃388及び＃418、破線）又はXIKE-B（動物＃415、＃417及び＃419、実線）に感染した動物の白血球（WBC）の数である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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