(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
耐熱性好酸性菌検出用の選択培地であって、該選択培地が溶媒と栄養成分とを含有し、前記栄養成分が酵母エキス、グルコース及びペプトンと、微量成分としての有機栄養成分または無機栄養成分とからなるものであり、且つ該選択培地のｐＨが４．０±０．１であることを特徴とする選択培地。
【請求項２】
耐熱性好酸性菌検出用の選択培地であって、該選択培地が溶媒と栄養成分とを含有し、前記栄養成分が酵母エキス、グルコース及びペプトンと、微量成分としての無機栄養成分とからなるものであり、且つ該選択培地のｐＨが４．０±０．１であることを特徴とする選択培地。
【請求項３】
耐熱性好酸性菌検出用の選択培地であって、該選択培地が溶媒と栄養成分とを含有し、前記栄養成分が酵母エキス、グルコース及びペプトンのみからなり、且つ該選択培地のｐＨが４．０±０．１であることを特徴とする選択培地。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の選択培地に検査試料を供給する第１の工程と、
前記検査試料が供給された選択培地を耐熱性好酸性菌が繁殖可能な条件下で静置する第２の工程と、
前記静置された選択培地中の耐熱性好酸性菌の有無を検出する第３の工程と、
を含むことを特徴とする耐熱性好酸性菌の検出方法。
【請求項５】
前記静置する際の温度が３０〜７０℃であり、且つ前記静置する時間が１０〜５０時間であることを特徴とする請求項４に記載の耐熱性好酸性菌の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、耐熱性好酸性菌を検出するための選択培地に関するものであり、より詳しくは、果汁中または果汁を含む飲料中等で増殖性を有する耐熱性好酸性菌を検出するための選択培地に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
果実から得られた果汁を利用した飲料においては、その液性が酸性領域にあるため、一般的には細菌が生育し難い。しかしながら、このような酸性条件下においても生育することができる細菌種が存在することが知られていた。
【０００３】
また、前述したような酸性条件下において生育する細菌であって、且つ高温条件下であっても生育可能な細菌が存在することが知られており、耐熱性好酸性菌と総称されている。耐熱性好酸性菌は果実飲料を加熱処理したとしても死滅しないため、果実飲料の製造過程や製造後の品質管理の際にこのような細菌種の有無を高感度に検出する方法が望まれていた。
【０００４】
これまでに、前述したような細菌を検出する方法としては、検査すべき溶液（果実飲料等）を予め熱処理（通常７０〜８０℃）した後、好酸性菌用培地にて４５℃程度の比較的高温で生育を確認し、さらに果汁または果汁を含む飲料中での増殖性を確認するためにこのような果汁または果汁を含む飲料等に植菌し、増殖の有無を確認するという方法が採られていた。しかしながら、この方法は手間と時間がかかり、耐熱性好酸性菌の迅速な検出は困難であった。
【０００５】
これに対して、特開平８−１４０６９７号公報には、耐熱性好酸性菌を検出するための酵母エキス、グルコース及び澱粉からなる培地、及び、前記培地を用いた耐熱性好酸性菌の検出方法が記載されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、特開平８−１４０６９７号公報に記載の培地を用いた場合でも耐熱性好酸性菌の検出感度は必ずしも十分ではなく、また、培養日数が約３日間と時間がかかるという問題があった。
【０００７】
本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、果汁中や果汁を含む飲料中に存在する耐熱性好酸性菌を高感度且つ短時間に検出するために用いられる選択培地及び前記選択培地を用いた耐熱性好酸性菌の検出方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、栄養成分が実質的に酵母エキス、グルコース及びペプトンのみからなり且つｐＨが４．０±０．１に調整された選択培地を用いることにより、比較的短時間の培養で耐熱性好酸性菌を高感度に検出することが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明の選択培地は、耐熱性好酸性菌検出用の選択培地であって、前記選択培地が溶媒と栄養成分としての酵母エキス、グルコース及びペプトンとを含有し、酵母エキス、グルコース及びペプトンの合計量が前記選択培地に含まれる全栄養成分の総重量の９０重量％以上であり、且つ前記選択培地のｐHが４．０±０．１であることを特徴とする選択培地である。本発明の選択培地においては、前記選択培地が実質的に酵母エキス、グルコース及びペプトンのみからなることが好ましい。
【００１０】
また、本発明の耐熱性好酸性菌の検出方法は、上記の選択培地に検査試料を供給する第１の工程と、前記検査試料が供給された選択培地を耐熱性好酸性菌が繁殖可能な条件下で静置する第２の工程と、前記静置された選択培地中の耐熱性好酸性菌の有無を検出する第３の工程と、を含むことを特徴とするものである。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
【００１２】
本発明の選択培地は、耐熱性好酸性菌検出用の選択培地であって、前記選択培地が溶媒と栄養成分としての酵母エキス、グルコース及びペプトンとを含有し、酵母エキス、グルコース及びペプトンの合計量が前記選択培地に含まれる全栄養成分の総重量の９０重量％以上であり、且つ前記選択培地のｐHが４．０±０．１であることを特徴とする選択培地である。ここで、選択培地とは、微生物の集団の中からある特定の性質を示す細胞を選択的に増殖させる培地をいい、特定の微生物以外の増殖を抑える物質を添加したり、栄養要求性の違いを利用したりすることによって目的とする微生物のみを選択的に増殖させることを可能とするものである。
【００１３】
本発明の選択培地は、培養する耐熱性好酸性菌の栄養成分として酵母エキス、グルコース及びペプトンを含有するものである。ここで、前記酵母エキス、グルコース及びペプトンの合計量は本発明の選択培地に含まれる全栄養成分の総重量の９０重量％以上を占めるものであり、９５重量％以上を占めることがより好ましく、本発明の選択培地に含有される栄養成分が実質的に酵母エキス、グルコース及びペプトンのみからなることが特に好ましい。
【００１４】
また、本発明の選択培地は、前記酵母エキス、グルコース及びペプトン以外にこれらの成分を溶解する溶媒が含まれる。このような溶媒としては、例えば、水や緩衝液が挙げられるが、水を用いることが好ましい。
【００１５】
また、前記酵母エキスとは、ビール酵母またはパン酵母の自己消化または低温浸出によって得た水溶性成分を低温乾燥して粉末化したもので、アミノ酸、ビタミン、その他の栄養成分を豊富に含み、多くの種類の培地に栄養素を補うために添加される。本発明の選択培地において、酵母エキスの配合量は特に制限されないが、１０００ｍｌの溶媒に対して２．０〜３．０ｇであることが好ましく、２．５ｇであることがより好ましい。前記酵母エキスの配合量が２．０ｇより少ない場合、栄養分が不足し、耐熱性好酸性菌の増殖性が低くなる傾向にあり、３．０ｇより多い場合、栄養分が過剰となり耐熱性好酸性菌以外の一般細菌等が増殖可能となる傾向にある。
【００１６】
また、グルコースは、微生物培養用培地の炭素源として用いられる。本発明の選択培地において、グルコースの配合量は特に制限されないが、１０００ｍｌの溶媒に対して０．５〜１．５ｇであることが好ましく、１．０ｇであることがより好ましい。前記グルコースの配合量が０．５ｇより少ない場合、栄養分が不足し、耐熱性好酸性菌の増殖性が低くなる傾向にあり、１．５ｇより多い場合、栄養分が過剰となり耐熱性好酸性菌以外の一般細菌等が増殖可能となる傾向にある。
【００１７】
さらに、ペプトンとは、牛乳カゼイン、獣肉、大豆タンパク質等をペプシン、トリプシン、パパイン等のプロテアーゼまたは酸で加水分解して乾燥、粉末化したものであり、オリゴペプチドやアミノ酸を主な成分とするものである。ペプトンの中でもカゼインペプトンと獣肉ペプトンの混合物はポリペプトンと呼ばれ、一般的な微生物培養用培地において窒素源として使用される。本発明の選択培地において、ペプトンはポリペプトンであることが好ましい。また、ペプトンの配合量は特に制限されないが、１０００ｍｌの溶媒に対して４．５〜５．５ｇであることが好ましく、５．０ｇであることがより好ましい。前記ペプトンの配合量が４．５ｇより少ない場合、栄養分が不足し、耐熱性好酸性菌の増殖性が低くなる傾向にあり、５．５ｇより多い場合、栄養分が過剰となり耐熱性好酸性菌以外の一般細菌等が増殖可能となる傾向にある。
【００１８】
また、本発明の選択培地には、酵母エキス、グルコース及びペプトン以外に微量成分として有機栄養成分または無機栄養成分（硫酸マグネシウム等）を含有していてもよい
本発明の選択培地は、そのｐＨが４．０±０．１の範囲にあることを特徴とする。前記培地のｐＨがこの範囲にある場合には、果汁中または果汁を含む飲料中等に存在する耐熱性好酸性菌の増殖性が顕著に高い。一方、前記培地のｐＨが上記下限より低い場合及び上記上限より高い場合には耐熱性好酸性菌の増殖性が著しく低下する傾向にある。
【００１９】
また、本発明の選択培地の形状としては液体、半流動体、固体のいずれであってもよいが、耐熱性好酸性菌の検出が容易である固体、中でも平板固形培地であることが好ましい。前記選択培地の形状が液体の場合、上記の酵母エキス、グルコース及びペプトンを水等の溶媒に溶解し、ｐＨを調整した後、オートクレーブ滅菌等により滅菌し、使用すればよい。
【００２０】
前記のｐＨの調整は微生物培養用培地のｐＨ調整に使用される酸であれば特に制限されないが、例えば、塩酸または硫酸が挙げられ、中でも塩酸であることが好ましい。この場合、前記選択培地のｐＨが４．０±０．１に調節可能であれば用いられる塩酸の濃度は特に制限されない。
【００２１】
また、前記選択培地の形状が固体の場合、前記液体の選択培地に固化剤、例えば寒天、ゼラチン、アガロースを添加した後、滅菌、固化し、使用すればよい。
この場合、前記固化剤は寒天であることが好ましく、添加量は１０００ｍｌの溶媒に対して１３〜２０ｇであることが好ましい。
【００２２】
また、前記選択培地の形状が半流動体の場合、前記液体の選択培地に固化剤、例えば寒天、ゼラチン、アガロースを添加した後、滅菌、固化し、使用すればよい。この場合、前記固化剤は寒天であることが好ましく、添加量は１０００ｍｌの溶媒に対して８〜１２ｇであることが好ましい。
【００２３】
次に、前述した本発明の選択培地を用いて耐熱性好酸性菌を検出する方法について説明する。
【００２４】
本発明の耐熱性好酸性菌の検出方法は、前述の選択培地に検査試料を塗抹または添加する第１の工程と、前記検査試料が塗抹または添加された選択培地を静置する第２の工程と、前記静置された選択培地中の耐熱性好酸性菌の有無を検出する第３の工程と、からなることを特徴とする耐熱性好酸性菌の検出方法である。
【００２５】
先ず、本発明にかかる検査対象である果汁または果汁を含む飲料について説明する。
【００２６】
前記検査対象となる検査試料は、果汁、例えば、アップル果汁、レモン果汁、グレープ果汁、パイナップル果汁及びグレープフルーツ果汁や、これらを含む飲料であり、中でもアップル果汁であることが好ましい。ここで、このような果汁を含む飲料とは、例えば、果汁を水または無機塩類溶液等で希釈した飲料の他、野菜汁、発酵乳、乳類が含有された飲料であってもよい。
【００２７】
前記検査試料は、本発明の選択培地に供給し、耐熱性好酸性菌が繁殖可能な条件下で静置すればよいが、耐熱性菌のみを効率よく分離するために前記検査試料を予め熱処理しておいてもよい。前記熱処理の条件としては、７０〜８０℃で５〜１５分間行うことが好ましい。
【００２８】
また、このような果汁または果汁を含む飲料等から耐熱性好酸性菌を検出するにあたり、これらの原液を検査試料として用いることができるが、前記検査試料に含まれる菌類の濃度が低い場合等には必要に応じてメンブランフィルターを用いて前記検査試料をろ過することにより前記検査試料に含有される細菌をメンブランフィルター上に捕捉した後、検査試料としてもよい。また、前記検査試料を遠心分離することにより前記検査試料に含有される細菌を集菌し、検査試料としてもよい。
【００２９】
次に、本発明にかかる第１の工程について説明する。本発明にかかる第１の工程は、前述の選択培地に検査試料を供給する工程である。
【００３０】
本発明にかかる第１の工程において、用いる選択培地が液体である場合には選択培地に前記の検査試料をそのまま、またはメンブランフィルターや遠心分離によって濃縮した検査試料を少量の培地や水に懸濁して前記選択培地に添加すればよい。また、用いる選択培地が固形である場合には、検査試料をそのまま、または濃縮したものを白金耳等で塗抹すればよい。
【００３１】
次に、本発明にかかる第２の工程について説明する。本発明にかかる第２の工程は、前記検査試料が供給された選択培地を耐熱性好酸性菌が繁殖可能な条件下で静置する工程である。静置する際の条件は、検出対象である耐熱性好酸性菌が増殖可能である条件であれば特に制限されないが、温度が３０〜７０℃であることが好ましく、４０〜６０℃であることがより好ましい。温度が前記下限より低い場合、または前記上限より高い場合には耐熱性好酸性菌の増殖速度が低下する傾向にある。また、静置する時間は、検出対象である耐熱性好酸性菌が検出可能であれば特に制限されないが、１０〜５０時間であることが好ましく、２０〜４０時間であることがより好ましい。静置する時間が１０時間より短い場合には耐熱性好酸性菌が検出可能なまで増殖せず、検出が困難な傾向にあり、５０時間より長い場合には耐熱性好酸性菌が増殖しすぎ、正確な菌体数の測定が困難になる傾向にある。
【００３２】
本発明にかかる第３の工程は、前記静置された選択培地中の耐熱性好酸性菌の有無を検出する工程である。
【００３３】
前述した静置後の選択培地が液体である場合、選択培地中に増殖した耐熱性好酸性菌の検出方法は特に制限されないが、例えば、静置後の選択培地の濁度を吸光光度計等で測定すればよい。また、選択培地が固体である場合、選択培地上に増殖した耐熱性好酸性菌の検出方法は特に制限されないが、例えば、コロニーの有無を目視で検出すればよい。
【００３４】
【実施例】
以下、実施例及び比較例により本発明の内容を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３５】
実施例１及び比較例１〜３
先ず、本発明の選択培地（ＹＰＧ培地）を調製した。ＹＰＧ培地の組成を表１に示す。表１の組成物を混合し、塩酸を用いてｐＨを４．０に調整した。混合した溶液はオートクレーブ滅菌（１２１℃、１５分）し、以下の実験に用いた。
【００３６】
【表１】
0004601148.tif 000002
【００３７】
本発明の選択培地（ＹＰＧ培地）（実施例１）、ＹＳＧ培地（特開平８−１４０６９７号公報に記載の培地）（比較例１）、ＰＤＢ培地（比較例２）及びＴＡ基礎培地（比較例３）を準備した（全て液体培地）。ここで、ＴＡ基礎培地は表２に示す組成を有し、ｐＨは塩酸を用いて４．０に調整した。また、ＰＤＢ培地は表３に示す組成を有し、ｐＨは塩酸を用いて４．０に調整した。さらに、ＹＳＧ培地は表４に示す組成を有し、ｐＨは塩酸を用いて４．０に調整した。
【００３８】
【表２】
0004601148.tif 000003
【００３９】
【表３】
0004601148.tif 000004
【００４０】
【表４】
0004601148.tif 000005
【００４１】
このようにして調製した培地を準備し、それぞれに１×１０2個の耐熱性好酸性菌４種類（ＳＡ−６(Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．（サッポロビール飲料（株）保有株）、ＪＣＭ５２６０（＝ＡＴＣＣ２７００９）（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）、ＤＳＭ２４９８（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）及びＩＦＯ１５３１０（＝ＤＳＭ４００６）（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓｃｙｃｌｏｈｅｐｔａｎｉｃｕｓ））を接種した。５０℃で２４時間静置培養後、それぞれの菌体数をカウントした。得られた結果を表５に示す。
【００４２】
【表５】
0004601148.tif 000006
【００４３】
表５に示された結果より、ＹＰＧ培地を用いた場合、ＴＡ基礎培地、ＰＤＢ培地またはＹＳＧ培地を用いた場合と比較して耐熱性好酸性菌の増殖性が高いことが確認された。特に、果汁中での増殖能が非常に高く、検出の必要性が高い菌株であるＤＳＭ２４９８（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）においては、本発明の選択培地を用いた場合にＹＳＧ培地の１０倍以上の感度で検出可能であることが確認された。従って、本発明の選択培地が果汁中または果汁を含む飲料中において高い増殖性を示す耐熱性好酸性菌を選択的に検出するために非常に有効であることが確認された。
【００４４】
実施例２
（ｐＨ調整に用いる塩酸及び硫酸の耐熱性好酸性菌の増殖に及ぼす影響）
ＹＰＧ培地に耐熱性好酸性菌であるＳＡ−６(Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．（サッポロビール飲料（株）保有株）、ＪＣＭ５２６０（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）、ＤＳＭ２４９８（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）及びＩＦＯ１５３１０（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｙｃｌｏｈｅｐｔａｎｉｃｕｓ）の４種類をそれぞれ１×１０2菌体ずつ接種し、５０℃で１２時間静置培養後、菌体数をカウントした。得られた結果を表６に示す。
【００４５】
【表６】
0004601148.tif 000007
【００４６】
実施例３
（ｐＨ調整に用いる塩酸及び硫酸の耐熱性好酸性菌の増殖に及ぼす影響）
ｐＨの調整に硫酸を用いた以外は実施例２と同様にして４種類の耐熱性好酸性菌の菌体数をカウントした。得られた結果を表６に示す。
【００４７】
表６に示された結果より、本発明の選択培地のｐＨ調製に塩酸を用いた場合、硫酸を用いた場合より耐熱性好酸性菌の増殖性は１．５〜３倍程度高いことが確認された。
【００４８】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明の選択培地及び検出方法によれば、果汁中や果汁を含む飲料中等に存在する耐熱性好酸性菌を高感度且つ短時間に検出することが可能となる。