(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子の単分子層を基板の表面上に形成する方法であって、スタンプにシード分子をロードするステップと、
前記シード分子を前記スタンプから前記表面に移動させるステップであって、前記スタンプ上にロードされた前記シード分子の一部を前記表面に移動させ、かつ、前記シード分子を前記スタンプに吸着させるステップと、前記シード分子を前記表面に吸着させるステップとを含み、前記スタンプへの前記シード分子の吸着が、前記表面への前記シード分子の吸着より強い、前記移動させるステップと、
増幅反応によって前記シード分子を増幅させて単分子層を生成するステップであって、前記ステップは均一な領域を形成し、前記均一な領域は、前記表面上の単分子層を含み、前記単分子層は、増幅反応後の位置選択性を悪化させるような拡散を引き起こす程の増幅された分子を含まない、前記生成するステップとを含む方法。
【請求項２】
前記増幅させるステップは前記シード分子の線形増幅を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記増幅させるステップは前記シード分子の指数関数的増幅を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記増幅させるステップは前記シード分子の方向性増幅を含む、請求項１に記載の方法
【請求項５】
前記シード分子が方向性をもって増幅され、導電性構造を形成する、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記方向性をもって増幅されたシード分子を金属で無電解めっきするステップを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記方向性増幅が前記シード分子の幾何学的形状によって制御される、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記方向性増幅が外力を加えることによって制御される、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記外力が電気力を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記外力が磁気力を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記外力が流体力を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記増幅させるステップがポリメラーゼ連鎖反応を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ポリメラーゼ連鎖反応は、少なくとも１つのプライマーを前記表面に結合させるステップを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ポリメラーゼ連鎖反応は、溶液中にプライマーを供給するステップを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記シード分子が無電解付着のための触媒中心を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
無電解付着のための触媒を前記シード分子に結合させるステップを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記単分子層が前記表面をエッチング液から保護する、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記単分子層がＤＮＡを含む、請求項１乃至請求項１６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１９】
前記スタンプにシード分子を再ロードする前に複数の表面上で前記移動するステップと前記増幅させるステップとを繰り返し行うことを含む、請求項１乃至請求項１７のいずれか１つに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に、表面処理に関し、具体的には、表面積を分子の単分子層で被覆する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
表面上の分子の単分子層は、表面の腐食、濡れ性又は付着特性の制御、不均一触媒作用の実行、溶液からの分析物の抽出又は精製を含む多くの用途において有用であり、バイオセンサ又はバイオチップの製造に役立つ。
【０００３】
分子を基板表面上に付着させる従来の方法は、過剰の分子を有する溶液内に該表面を浸漬させて、自己完結型単分子層を該表面上に形成するステップを含む。従来の浸漬ベースの単分子層処理技術の欠点は、これらが微細なパターン形成を行うことができないことである。さらに、従来の浸漬ベースの単分子層処理技術は、複雑で、費用と時間がかかり、化学的にも幾何学的にも不正確である。ＤＮＡ官能化されたバイオチップの従来の製造は、ＤＮＡテンプレートを用いてスポッティングするステップを含む。スポット（ＳＰＯＴ）内の表面張力を頼りにして、スポットの幾何学形状を定める。乾燥すると、スポット内の濃度が迅速に変わり、制御が困難になる。
【０００４】
分子を表面上に付着させる別の従来の方法は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製のスタンプのようなスタンプによって、表面上に単分子層を印刷するステップを含む。この印刷により、微量の分子を用いて表面をパターン形成することが可能になる。しかしながら、こうした印刷と関連して移動の変動が起こる。表面上の所定のスポットにおける適用範囲は、インク付け密度及び印刷効率の両方によって決まる。このことは、例えば、触媒又は生体分子の印刷において、単分子層としてしか分子をスタンプ上に置くことができない場合に特に問題である。ここでは、単一の分子の有無によって、受動表面と機能表面との間に差異が形成される。単一の分子の欠落が欠陥をもたらす。従来は、スタンプから表面への単分子層の移動は欠陥なしということにはならず、移動比率が印刷サイクルによって変わる。このことは大量生産環境には望ましいものでない。例えば、非特許文献１を参照されたい。
【０００５】
いわゆるバイオチップすなわちマイクロアレイ技術が、遺伝子活動の試験及び遺伝子突然変異の同定を含む、遺伝分析のような用途において、ますます重要になっている。遺伝情報を用いて、薬剤のスクリーニング、診断、投薬、及び同定を改善することができる。こうした用途のための典型的なバイオチップは、ガラス表面に付着された遺伝子断片又はたんぱく質の小型アレイを含む。典型的には、こうしたバイオチップの表面上の配列と蛍光試料との間のハイブリダイゼーション反応が、分析のために用いられる。ハイブリダイゼーションに続いて、典型的には、バイオチップが蛍光検出器で読み取られ、表面上のスポットの蛍光強度を定量化することができる。たんぱく質に特有の捕獲剤によって、たんぱく質マーカー、ウィルス、及びたんぱく質発現プロファイルを同様に検出することができる。バイオチップ上で生体分子をパターン形成する従来の方法が、非特許文献２及び非特許文献３に記載されている。従来の方法には、連続的パターン形成技術及び並列パターン形成技術が含まれる。連続的技術は、スポットを連続的に表面上に配置する（ａｄｄｒｅｓｓ）。これらの技術には、ピペット分注、毛管印刷、インクジェット印刷、及びピン・スポッティングが含まれる。並列技術は、多数の分子の領域を表面上に同時にパターン形成する。これらの技術には、微小流体網送出、毛管アレイ印刷、及びマイクロコンタクト印刷が含まれる。マイクロコンタクト印刷は、パターン形成されたスタンプのインク付けを含む。微小流体網（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｎｅｔｗｏｒｋ）を介してこうしたインク付けを行うことができる。
【０００６】
幾つかの用途では、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）をバイオチップ表面に適用することができる。ＤＮＡ内にエンコードされた情報が、生物体の細胞機能及び生化学機能を確立し、維持する。大部分の生物体において、ＤＮＡは、伸長された二本鎖高分子である。一方のＤＮＡのデオキシリボヌクレオチドの配列は、他方の鎖のものに対して相補的である。このことは、各々の鎖において、もとのＤＮＡ分子と同じ線形アレイのデオキシリボヌクレオチドを有するように、新しいＤＮＡ分子を合成することを可能にする。このプロセスは、一般にＤＮＡ複製と呼ばれる。ＤＮＡコードは、４つの塩基、すなわちアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、及びチミン（Ｔ）から構成される。ヌクレオチドは、４つの有機塩基のうちの１つ、五炭糖（ペントース）、及びリン酸基からなる。リン酸基及び有機塩基は、それぞれ糖成分の５’炭素原子及び１’炭素原子に付着される。３’炭素上にだけヒドロキシル基を有するので、ＤＮＡの糖は、２’デオキシリボースである。ＤＮＡのヌクレオチド間は、１つのヌクレオチドの５’炭素のリン酸基に隣接するヌクレオチドの糖のデオキシリボースの３’ＯＨが結合されたリン酸ジエステル結合によって結合される。このように、ポリヌクレオチドは、一端（３’末端）に３’ＯＨを有し、もう一方の端部（５’末端）に５’リン酸基を有する。ＤＮＡは、それぞれ２つ及び３つの水素結合を介して、塩基Ｔと対をなす塩基Ａと塩基Ｃと対をなす塩基Ｇとを有する二本鎖らせんを形成する。二重のＤＮＡの２本の鎖は反対方向に進み、慣例により、二本鎖ＤＮＡは、常に、左側の上部鎖の５’末端に書き込まれる。酵素複製プロセス中に、添加されたヌクレオチドのリン酸が、既存の配列の３’ＯＨに結合される。このように、非特許文献４に記載されるように、ＤＮＡは、常に５’の方向から３’の方向に複製される。
【０００７】
ＤＮＡ官能化されたバイオチップの製造は、通常は、異なるＤＮＡテンプレートでスポットを連続的にインク付けし、ＤＮＡターゲットを形成することを含む。これは、複雑で時間がかかり、よって費用のかかる方法である。従来は、遺伝子分析は、ニトロセルロース、ナイロン膜、又はリシンを被覆したスライドガラスのような支持表面に受動的に吸着されたＤＮＡターゲットへのラベル付きプローブのハイブリダイゼーションによって実行されていた。表面に対するＤＮＡの共有結合が、ハイブリダイゼーション条件下でも安定した付着を提供する。３’−末端又は５’−末端のいずれかから、ＤＮＡオリゴマーをその場で付着又は合成することができる。５’−末端オリゴヌクレオチドをガラスに付着させるためのプロセスは、非特許文献５に記載されているようなエポキシシラン被覆されたガラス上のエポキシ開環反応、非特許文献６に記載されているようなアミノ被覆されたガラス上に固定化された５’−スクシニル化ターゲット・オリゴヌクレオチド、及び非特許文献７に記載されているようなチオール被覆されたガラス上にジスルフィド結合を介して結合された５’−ジスルフィド変性オリゴヌクレオチドを含む。他のプロセスは、フェニルジイソシアン酸、無水マレイン酸、又はカルボジイミドのような架橋剤を用いており、例えば、非特許文献８、非特許文献９、非特許文献１０に記載されている。付着化学（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｉｅｓ）の概要が、非特許文献１１に掲載されている。特に、オリゴマーの再現可能な化学吸着が、非特許文献１２、特許文献１、及び特許文献２に記載されている。
【０００８】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、周知のＤＮＡ配列の２つの領域間にある特定のリボ核酸（ＲＮＡ）領域又はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）領域の指数関数的増幅を可能にするインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）技術である。ＰＣＲの従来の用途には、遺伝子特性評価、クローン作成、病原体検出のためのＤＮＡ診断、遺伝性疾患を引き起こす突然変異の同定、及びＤＮＡ指紋法が含まれる。ＰＣＲ増幅は、増幅プライマーとして周知のオリゴヌクレオチド・プライマーを介して達成される。これらは、ＤＮＡテンプレートの規定された配列の両端に相補的な短い一本鎖ＤＮＡ分子である。プライマーは、適切な反応条件のもとでデオキシヌクレオシド３リン酸（ｄＮＴＰ）の存在下で、熱安定ＤＮＡポリメラーゼによって、一本鎖変性ＤＮＡの３’方向に伸長される。二本鎖ＤＮＡの熱変性、混合物の冷却によるプライマーのアニール処理、及び酵素反応に適した温度におけるＤＮＡポリメラーゼによるプライマー伸長によって、鎖合成を繰り返すことができる。鎖合成の各繰返しは、増幅のサイクルを含む。合成された新しいＤＮＡ鎖の各々は、増幅のさらなるサイクルのためのテンプレートになる。このように、増幅されたターゲットＤＮＡは、指数関数的に増幅される。ＰＣＲに関するさらなる情報については、非特許文献１３、非特許文献１４、非特許文献１５、非特許文献１６、非特許文献１７、及び非特許文献１８を参照されたい。
【０００９】
単分子層を表面上にパターン形成するための上述の方法の全てが強固な限界を有し、パターン形成ステップ後にパターンを最適化することができない。こうした問題を解決し、インクの消費がより少なく、よって頻繁なインク付けを必要とせず、分子の移動のために必要とされる接触時間が短いために迅速な作動が可能になる、印刷プロセスを有することが望ましい。
【００１０】
【特許文献１】Ｋａｗａｓｈｉｍａ、Ｅ．他による「Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ」という名称の国際公開ＷＯ９８／４４１５１号パンフレット
【特許文献２】Ａｄｅｓｓｉ、Ｃ．他による「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」という名称の国際公開ＷＯ００／１８９５７号パンフレット
【非特許文献１】Ａ．Ｂｅｒｎａｒｄ他著、「Ｍｉｃｒｏｃｏｎｔａｃｔ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ａｄｖ．  Ｍａｔｅｒ．２０００（１６）、１０６７、２０００年
【非特許文献２】Ｍ．Ｓｃｈｅｎａ著、「Ｍｉｃｒｏ  ａｒｒａｙ  Ｂｉｏｃｈｉｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、Ｅａｔｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｎａｔｉｃｋ  ＭＡ、２０００年
【非特許文献３】Ｇ．Ｒａｍｓａｙ著、「ＤＮＡ  ｃｈｉｐｓ：Ｓｔａｔｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｒｔ」、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、１６、４０、１９９８年
【非特許文献４】Ｂ．Ｒ．Ｇｌｉｃｋ他著、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ」、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、１９９８年
【非特許文献５】Ｋ．Ｌ．Ｂｅａｔｔｉｅ他、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４１、７００−７０６、１９９５年
【非特許文献６】Ｊｏｏｓ、Ｂ．他、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４７、９６−１０１、１９９７年
【非特許文献７】Ｒｏｇｅｒｓ、Ｙ．Ｈ．他、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６６、２３―３０、１９９９年
【非特許文献８】Ｃｈｒｉｓｅｙ、Ｌ．Ａ．他、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４、３０３１−３０３９、１９９６年
【非特許文献９】Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ、Ｍ．Ｊ．他、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６９、２４３８−２４４３、１９９７年
【非特許文献１０】Ｃｈｅｅ、Ｍ．他著、「Ａｃｃｅｓｓｉｎｇ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ＤＮＡ  ａｒｒａｙｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４、６１０−６１４、１９９６年
【非特許文献１１】Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ著、「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、１９９６年
【非特許文献１２】Ａｄｅｓｓｉ、Ｃ．他著、Ｎｕｃｌｅｉｄ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２８（ｅ８７）１−８、２０００年
【非特許文献１３】Ｃ．Ｒ．Ｎｅｗｔｏｎ他、「ＰＣＲ」、Ｂｉｏｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｏｘｏｎ、Ｕ．Ｋ．、２０００年
【非特許文献１４】Ｅ．Ｓｏｕｔｈｅｒｎ他著、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｏｎ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ」、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２１、５、１９９９年
【非特許文献１５】Ｕ．Ｍａｓｋｏｓ他著、「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｇｌａｓｓ  ｓｕｐｐｏｒｔｓ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  ２０（７）、１６７９−１６８４、１９９２年
【非特許文献１６】Ｚ．Ｇｕｏ他著、「Ｄｉｒｅｃｔ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ｂｙ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｒｒａｙｓ  ｏｎ  Ｇｌａｓｓ  Ｓｕｐｐｏｒｔｓ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２２（２４）、５４５６−５４６５、１９９４年
【非特許文献１７】Ｊ．Ｌａｍｔｕｒｅ他著、「Ｄｉｒｅｃｔ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｏｆ  ａ  Ｃｈａｒｇｅ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｄｅｖｉｃｅ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２２（１１）、２１２１―２１２５、１９９４年
【非特許文献１８】Ｍ．Ｓｊｏｅｒｏｏｓ他著、「Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  ＰＣＲ  ｗｉｔｈ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｉｍｅ−Ｒｅｓｏｌｖｅｄ  Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｙ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＨＬＡ−Ｂ２７」、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍ．  ４７（３）、４９８、２００１年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、パターン形成後にパターンを最適化でき、インクの消費が少なく、よって頻繁なインク付けを必要としない、さらに、分子の移動に必要な接触時間が短く迅速な操作が可能な印刷プロセスによる、分子の単分子層を表面上に形成する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明によると、スタンプにシード分子をロード（ｌｏａｄ）するステップと、シード分子をスタンプから表面に移動させるステップと、増幅反応によってシード分子を増幅させて単分子層を生成するステップとを含む、分子の単分子層を表面上に形成する方法が提供される。
【００１３】
本発明の好ましい実施形態においては、上記の移動させるステップが、スタンプ上にロードされたシード分子の一部を表面に移動させるステップを含む。これは、シード分子をスタンプに吸着させるステップと、シード分子を表面に吸着させるステップとを含み、スタンプへのシード分子の吸着が、表面へのシード分子の吸着より強いことが好ましい。増幅させるステップは、たんぱく質の単分子層を生成するために、インビトロ・トランスレーション（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）を含むことができる。シード分子は、無電解付着のための触媒中心を含むことができる。この方法は、無電解付着のための触媒をシード分子に結合させるステップを含む。本発明の好ましい適用においては、単分子層がエッチング液から表面を保護する。本発明の特に好ましい実施形態においては、単分子層がＤＮＡを含む。この方法の好ましい例は、スタンプにシード分子を再ロードする前に複数の表面上で移動させるステップと増幅させるステップとを繰り返し行うことをさらに含む。本発明はまた、ここに前述されたような方法を用いて処理された表面を含むバイオセンサにも適用される。
【００１４】
本発明の好ましい実施形態実施において、不完全な分子の単分子層を表面に移動させるステップと、基礎として不完全な層を用い、増幅反応によって単分子層を完成させるステップとを含む表面処理方法が提供される。表面を溶液中に浸漬させることを含む増幅反応は、表面に不必要に適用されるのを防止するように、表面の所定の区域を選択できることが好ましい。区域の拡大を引き起こす反応を制限し、表面パターン形成の過剰な歪みを回避することが好ましい。本発明の特に好ましい実施形態において、プロセスは自己完結型であるため、上述の移動比率の変化の問題が解決する。このことは、表面のパターン形成を著しく歪めることなく、インクを節約し、より迅速に印刷するために、再インク付けするまでの間により多く印刷することを可能にする。後の反応によって、印刷された種を、他の技術によって印刷できない異なる種に変換することができる。本発明は、まばらなＤＮＡ単分子層のようなまばらな単分子層を増幅させるのに、特に有用である。
【００１５】
単分子層を完成させるための増幅スキームの例は、線形増幅、ＰＣＲ増幅のような指数関数的増幅、及び方向性増幅を含む。こうしたスキームは、一般的にパターン形成方法から独立したものとすることは、有利な結果をもたらす。線形増幅は、欠陥のある単分子層を完成させるのに有用である。しかしながら、指数関数的増幅は、比較的迅速に実行されるので、まばらな分子から単分子層を構築するのに好ましい。本質的に方向性をもつか、又は外部の場の適用による方向性増幅は、小さな隙間を架橋するナノ構造の形成を可能にする。こうした増幅スキームは、無機、有機、及び生体系において実施することができる。これらのスキームの各々を手短にさらに詳細に説明する。有利なことに、これらのスキームは、ＤＮＡオリゴマーを用いて実施することができる。ＰＣＲのような複写方法を用いてＤＮＡを検出し、増幅させることができる。大量生産のために、多数のＤＮＡを並行して増幅させることが望ましい。本発明の特に好ましい実施形態においては、並列増幅をソフトリソグラフィ印刷と組み合わせて大量生産を簡単化し、コストを減少させる。具体的には、スタンプを介してオリゴマーが表面上にパターン形成される。パターン形成の品質は、スタンプ上の捕獲オリゴマー及び表面上のプライマー・オリゴマーの化学吸着の効率によって決まる。テンプレート・オリゴマーは、制御された可逆的ハイブリダイゼーションを有することが好ましく、スタンプ上の捕獲オリゴマーへの結合が、表面上のプライマー・オリゴマーへの結合より強い。代替的に、ポリリシンを用いて、スタンプ上のテンプレートの捕獲を非特異的に達成することができる。有効な表面結合ＰＣＲの場合、オリゴマーは、スペーサ配列（９Ｔ）を有し、生体適合性スペーサ層（ＰＥＧ）上に結合され、熱サイクル中にオリゴマーを表面上に保持する熱安定の共有架橋結合を有することが好ましい。
【００１６】
本発明の特に好ましい実施形態においては、スポット状フィーチャからスタンプ上に印刷されたＤＮＡの量が、各々の印刷サイクルについて少なくなっている。このことは、再インク付けすることなく、スタンプを繰り返し使用することを可能にする。可能な印刷サイクルの数は、各々の印刷サイクル中に移動される逆分数に比例する。例えば、印刷サイクル当たり０．１％より少ない印刷は、交換又は再インク付けの前に約１０００回のスタンプを再使用することを可能にする。平方マイクロメートル当たり２５ＤＮＡ分子より多い印刷も可能である。これは、表面結合プライマーを用いるＰＣＲ増幅における使用に十分である。共通のプライマー領域を有し、配列が変化するＰＣＲ複製により、並行して何千もの異なる分子を複製することが可能になる。
【００１７】
本発明の好ましい実施形態においては、シード分子が方向性をもって増幅され、導電性構造を形成する。方向性をもって増幅されたシード分子を金属で電気めっきすることができる。方向性増幅は、シード分子の幾何学的形状によって制御することができる。代替的に、方向性増幅は、外力の適用によって制御することができる。適用可能な外力の例には、電気力、磁気力、及び流体力が含まれる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明の好ましい実施形態が、以下に、添付の図面を参照して単なる例として説明される。
【００１９】
図１を参照すると、本発明の好ましい実施形態による分子の単分子層を表面１上に形成する方法が提供される。この方法は、スタンプ２を介して、分子３、４のシード層を表面に移動させるステップを含む。このシード層は、分子３、４がまばらに存在する分子の単分子層を含む。次に、表面１上に付着されたシード層は、増幅反応によって成長され、該表面１上の単分子層を完成させる。スタンプ２の異なる活性区域５、６上に異なるタイプの分子３、４を付着させてもよい。この技術は、少なくとも触媒量の分子を移動させ、その後、表面１上に印刷された分子を飽和密度まで増幅させることによって、スタンプ２からの不完全な分子の移動の問題を解決する。詳細には、ステップ５０において、分子３、４で部分的にインク付けされたスタンプ２が表面１と接触させられる。この例においては、分子３の第１の基がスタンプ２のフィーチャ５上にインク付けされ、分子４の第２の基がスタンプ２のフィーチャ６上にインク付けされる。分子３及び４が異なる種であってもよい。スタンプ２は、インク付けされた分子３、４の一部を表面１に移動させる。ステップ５５において、増幅反応が行われる。増幅反応は、印刷された分子３、４を増幅し、完全な単分子層を生成する。その間に、ステップ５１において、スタンプ２が再利用され、残りの分子３、４の別の一部を別の表面１’上に印刷する。再びステップ５５において、増幅反応が、他の表面１’上に印刷された分子３、４を増幅し、完全な単分子層を生成する。同様に、ステップ５２において、スタンプ２が再利用され、残りの分子３、４の更に別の一部を更に別の表面１”上に印刷する。再びステップ５５において、増幅反応が、他の表面１”上に印刷された分子を増幅し、完全な単分子層を生成する。バッチプロセスにおいて、Ｎ番目の印刷において、スタンプ２上に残っている分子３、４がなくなるまで、付加的な表面を同様に処理することができる。次に、ステップ５３において、スタンプを再インク付けし、処理を繰り返すことができる。ステップ５５における増幅反応は、たんぱく質の単分子層を生成するためのインビトロ・トランスレーションを含むことができる。シード分子３、４は、無電解付着のための触媒中心を含むことができる。無電解付着のために、触媒を分子３、４に結合させることができる。本発明の好ましい実施形態において、単分子層は、表面１をエッチング液から保護する。分子３、４は、ＤＮＡオリゴマーとしてもよい。
【００２０】
完全な単分子層の移動に続いて、スタンプ２上で印刷可能なＤＮＡ分子の増幅を行うこともできる。しかしながら、リソグラフィ・スタンプは高価で熱に弱い物品なので、この方法は不利である。少なくとも１サイクルの増幅の間スタンプをふさぐので、この方法は、経済的に有用ではない。基板表面上で増幅が行われるときは、同じスタンプによって印刷される多数の基板を含むバッチプロセスにおいて増幅を行うことができる。
【００２１】
増幅反応は、線形増幅反応、指数関数的増幅反応、又は方向性増幅反応とすることができる。他の増幅反応も可能である。頭部基Ｘ、バックボーン、及び尾部基Ｙを有する、印刷された分子の不完全な単分子層の線形増幅の例が、図２Ａに関連して説明される。基Ｙは、表面１に結合する基Ｘも有する分子のＶ族部分にアンカーを提供する。反応は、Ｘ及びＶが表面１に対して不十分な親和力を有する印刷の縁部で停止する。詳細には、ステップ１０において、Ｘ−Ｙ分子の不完全な単分子層が表面１上に印刷される。ステップ２０において、尾部基Ｙが、Ｖ機能、バックボーン、及び前駆化学吸着基（Ｘ）を有する分子の溶液から、表面１に結合する。ステップ３０において、化学吸着基（Ｘ）の保護が取り除かれてＸが露出する。ステップ４０において、これにより、結合された分子が表面に化学吸着される。化学吸着は、表面１が既に覆われていない場合に限り生じる。結合ステップ、保護除去ステップ、及び増幅ステップを繰り返し、表面１が覆われるまで最初の印刷を徐々に増幅させることができる。したがって、このプロセスは自己制御式である。このプロセスは、単分子層が完成したとき、又はＹ末端に結合された分子の及ぶ範囲で、表面１に空いている場所が残っていないときに停止する。単分子層がパターン形成された場合、プロセスは僅かに広がり、よって解像度が維持され、ｍ回の増幅サイクル後に添加された分子の最大は、線形増幅に対応するｍとなる。
【００２２】
ここで図２Ｂを参照すると、頭部基Ｘ及び尾部基Ｙを有する分子を含む印刷された不完全な単分子層の指数関数的増幅の例において、錯体又は媒介物Ｍが、より多くの分子の結合を可能にし、表面１への吸着を促進する。新たに結合された、尾部基ＹがＭのための結合部位としても働くので、多数の分子Ｎが２Ｎに増える。このプロセスは、線形増幅と類似している。しかしながら、印刷ステップ１０の後、ステップ２１において、Ｙ末端が、原子又は分子Ｍと錯体を形成する。ステップ２２において、頭部基（Ｘ）及び尾部基Ｙを有する第２の分子がＭに結合される。ステップ３１において、第２の分子の頭部基（Ｘ）の保護が取り除かれてＸになり、表面１に化学吸着される。その後、第１の結合ステップ２１、第２の結合ステップ２２、及び保護除去ステップ３１を繰り返すことによって、増幅が進行する。表面上に付着されたあらゆる分子は、単分子層をさらに増幅させるように機能し得る。
【００２３】
ここで図２Ｃと関連して方向性増幅について説明する。方向性増幅は、ステップ３２において、第２の結合分子が、錯体ＹＭＹの幾何学的形状によって設定された方向性で、表面上に化学吸着される点を除いて、線形増幅に類似しているか、該線形増幅より迅速である。方向性をもってシード分子を増幅させ、導電性構造を形成することができる。方向性をもって増幅されたシード分子は、金属で電気めっきすることができる。シード分子の幾何学的形状によって、方向性増幅を制御することができる。代替的に、外力の適用によって方向性増幅を制御することができる。適用可能な外力の例には、電気力、磁気力、及び流体力が含まれる。
【００２４】
３つの増幅スキームを用いて、表面をＤＮＡオリゴマーで被覆することができる。とりわけ、指数関数的増幅は、表面をＤＮＡで被覆するのに特に有用である。ＰＣＲ増幅は、指数関数的増幅スキームの例である。本発明の好ましい実施形態において、ここで図１と関連して前述されたように、ＤＮＡ分子がスタンプから表面上にまばらに印刷され、次に、増幅され、固相ＰＣＲを介して完全な単分子層を生成する。ここに前述された３つの増幅スキームは、一般的には単分子層を、特定的には印刷された単分子層を増幅するのにも適しており、或いは、例えば、ナノ構造を作るために表面の優先的方向に沿って分子構造を成長させるために用いることができる。
【００２５】
ここで、表面プライマーのＰＣＲ複製のための方法が、図３乃至図１０に関連して説明される。図３を参照すると、テンプレート・オリゴマー８が、最初に、捕獲オリゴマー７によってスタンプ２上に保持される。次に、スタンプ２は、第１及び第２のプライマー・オリゴマー９が固定される表面と接触させられる。テンプレート８の一部が、プライマー９とハイブリダイズされ、よってスタンプ２から表面１に移動される。図４を参照すると、次に、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の緩衝液内にＤＮＡポリメラーゼと４つのＰＣＲヌクレオチド（ｄＮＴＰ）とを含むＰＣＲ混合物１１が添加される。ＤＮＡテンプレートにハイブリダイズされた固定化プライマーの各々が、ＰＣＲ混合物１１内のＤＮＡポリメラーゼによって表面１の全長まで増幅される。このことにより、合成された相補的なＤＮＡ鎖又は二本鎖ＤＮＡがもたらされる。図５を参照すると、ここで熱が加えられる。二本鎖ＤＮＡは融解し（ｍｅｌｔ）、表面１上の別のプライマー９とハイブリダイズされ、架橋分子を生成する。ここで図６を参照すると、さらに熱を加えることにより、架橋分子が融解する。このように、表面１に結合された２つの二本鎖ＤＮＡが生成される。ここで図７を参照すると、温度が下げられる。２つの二本鎖の各々が、マッチング・プライマー９と再ハイブリダイズされ、プライマー９が伸長される。このように、２つの架橋分子が生成される。ここで図８を参照すると、熱をさらに加えることにより、架橋分子が融解する。ここで、４つの二本鎖ＤＮＡが表面１に結合される。ここで図９を参照すると、全てのプライマー９が伸ばされるまで、融解ステップ及び再ハイブリダイゼーション・ステップが繰り返される。図１０を参照すると、次に、相補的な分子が、化学的に又は制限酵素によって表面１から切断される。
【００２６】
ここに前述されたＰＣＲ技術の改造によって、溶液においてアンチセンスＤＮＡプライマーを適用することにより、ＤＮＡの線形増幅を達成することができる。この改造が、図１１乃至図１５に関連して説明される。図１１を参照すると、テンプレート・オリゴマー８が、最初に、捕獲オリゴマー７によってスタンプ２上に保持される。次に、スタンプ２が、第１のプライマー９だけが固定されている表面と接触される。テンプレート８の一部が、固定されたプライマー９とハイブリダイズされ、よってスタンプ２から表面１に移動される。図１２を参照すると、次に、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の緩衝液中にＤＮＡポリメラーゼ及び４つのＰＣＲヌクレオチド（ｄＮＴＰ）を含むＰＣＲ混合物１１が添加される。ＤＮＡテンプレートにハイブリダイズされた固定化プライマーの各々が、ＰＣＲ混合物１１によって表面１の全長まで増幅される。これにより、合成された相補的なＤＮＡ鎖又は二本鎖ＤＮＡがもたらされる。ここで図１３を参照すると、第２のプライマー１２が溶液中に添加され、熱が加えられる。合成された鎖が融解され、再ハイブリダイズされる。図１４を参照すると、次に、第２世代の相補鎖が合成される。図１５を参照すると、全てのオリゴマーが伸長されるまで合成が繰り返される。この方法は、生成され分離されたテンプレート鎖の二次汚染を回避するために、密閉された容器内で行われることが好ましい。
【００２７】
本発明の好ましい実施形態において、分子の一部又は触媒量の分子が、乾燥又は湿潤状態で、表面１との機械的接触を介してスタンプ２から該表面１に移動される。このことは、移動されることになる分子によって達成され、この分子は、表面１に対してよりもスタンプ２に対して強い結合を有する。
【００２８】
表面１又はスタンプ２上への非特異的吸着を阻止する制御可能な化学吸着プロトコルを用いることが望ましい。こうした反応の例は、ＡＰＴＳ（３−アミノプロピルトリエトキシシラン）、及びＲａｐｐ  Ｐｏｌｙｍｅｒｅ社の（ａ、ｗ）ＮＨＳ−ＰＥＧ  ２０００のようなホモ二官能性ＰＥＧからのＮＨＳ（Ｎ−ヒドロシシスクシンイミド）−ＰＥＧ（ポリエチンレングリコール）−トリエトキシシランのようなヘテロ二官能性試薬を準備することを含み、これは、高温でスライドガラス間の隙間を充填することによってガラス表面に接触される。ＮＨＳ活性化された表面に適用されたＰＤＭＳ微小流体システムをアミノ官能化されたオリゴマーの水溶液で充填することによって、化学吸着が行なわれる。
【００２９】
図３乃至図１０に関連して前述された２つの表面結合プライマーを用いて、又は図１１乃至図１５に関連して前述された１つの表面結合プライマー及び１つの可溶性プライマーを用いて、ＰＣＲ増幅を行うことができる。しかしながら、後者の場合には、中間のテンプレートの痕跡が、その合成場所から遠ざかるように拡散し、隣接する領域内に拡散する。したがって、可溶性プライマー・ベースのＰＣＲ増幅を制限することが望ましい。バイオセンサ用途の場合には、表面１上に１つのセンス鎖だけが存在すべきであり、アンチセンス鎖が存在すべきではない。したがって、他方の鎖を表面から切断するか、或いは、例えば可溶性プライマーを用いて化学的付着を停止させることが好ましい。
【００３０】
再び図１を参照すると、前述のように、本発明の好ましい実施形態において、スタンプ２の活性区域５、６が、捕獲分子及びテンプレート鎖のようなインク付け分子で選択的に被覆される。こうした選択的被覆は、前述されたようなピペット分注、毛管印刷、インクジェット印刷、及びピン・スポッティングなどの様々な異なる方法を介して行うことができる。微小流体網又は選択的な開口部を有するステンシルを介するインクの適用といった、他の被覆技術も等しく可能である。トポグラフィ・パターン形成されたスタンプは、通常、インクでパターン形成された平坦なスタンプより正確なパターンを生成する。これは、活性区域５、６が、トポグラフィ分離されるためである。活性区域５、６が突出しているときも、くぼんでいるときも、この境界設定は有効である。
【００３１】
ここで図１６を参照すると、本発明の特に好ましい実施形態において、スタンプ２が、孔４２の形態の複数の活性区域を有する本体４１を含む。孔４２は、両端が開いているか、又は一端が閉じている。図１７を参照すると、各々の孔４２は、親水性ポリマーのゲル・マトリックス４３で充填されている。図１８を参照すると、各々の孔４２は、異なる種の分子４４で充填することができる。ステンシル４５又は微小流体網を用いて、充填中に各孔を他の孔からマスクすることができ、よって該孔４２の二次汚染が防止される。充填は、拡散又は電場によるものにすることもできる。図１９を参照すると、操作において、スタンプ２が表面１に接触する。分子が、孔４２内のゲルから表面１上に印刷される。図２０を参照すると、分子の印刷された領域４６が表面１上に残される。
【００３２】
本発明の特に好ましい実施形態において、孔４２にはそれぞれ、異なる種のテンプレートＤＮＡがロードされている。水４７又は緩衝液を取り込むことによって、ゲル４３は、１００％湿度環境においてその平衡まで膨張する。このように、ゲル４３は、スタンプ表面を超えて突出する。後でゲル４３が乾燥するのを防止するために、スタンプ２を湿潤環境内に保存することができる。ゲル中に約１重量％のＤＮＡをロード（ｌｏａｄ）した場合、移動のたびに触媒量のＤＮＡを用い、同じスタンプ２から無数の表面を印刷することができる。続いて、触媒シード層の増幅を用いて、ＤＮＡ単分子層を完成させることができる。スタンプ２がもはやシード層を移動させられなくなった時にだけ、スタンプ２の補充が必要である。シード層を付着させるために、スタンプ２を表面１と接触させ、所望の量のシード分子を移動させる。スタンプ２を液体中に浸漬させる必要がないので、印刷の複雑さが低減される。ゲル４３により、分子を完全に水和させることが可能になり、よって表面１への分子の化学吸着が向上する。ゲル４３は浸透性であるので、閉じ込められた水が逃げることが可能になる。このことは、第３の媒体の存在下で印刷表面が分離されることを回避する。ＤＮＡは、ゲル４３中でなく孔４２の表面上に保持できる。ここでは、互いから分離された孔４２を有する第３の媒体の中で、スタンプ２と表面１を接触させることが望ましい。接触後、温度を上げて、スタンプ２からのテンプレートＤＮＡ鎖の痕跡の解離及び表面１上への付着を促進させる。
【００３３】
本発明の好ましい実施形態において、図１に関連してここに前述されたスタンプ２の活性区域５、６にはそれぞれ、テンプレートＤＮＡ鎖を捕獲するためのオリゴマーが与えられる。次に、ほんの僅かの、典型的には０．１％より少ないＤＮＡ鎖の単分子層だけを移動させるように、ＤＮＡ鎖を表面１に露出させる。このことは、長さの短いハイブリダイズ・アンカーを表面１上に提供することによって達成される。移動されるＤＮＡ鎖の数は、０．１％の移動効率及び２ｎｍのＤＮＡ直径で、平方マイクロメートル当たり約２５とすることができる。このように、再インク付けが必要になる前に、数百回の印刷作業にスタンプ２を用いることができる。次に、表面上のＤＮＡ鎖の密度が、表面結合プライマーを含む上述のＰＣＲ増幅スキームによって飽和される。スタンプ２上の活性区域５、６のサイズは、ミクロンからミリメートルまでの範囲に及ぶことができる。
【００３４】
プライマー上へのＰＣＲのためのテンプレートのパターン形成は、微小流体網によっても達成できる。低い濃度のテンプレートを有する溶液及びテンプレートを表面に迅速に結合させるのに望ましくない条件の使用により、テンプレートの保存と表面上に均質な領域をパターン形成することが可能になる。印刷された単分子層における欠陥の修復、自触媒中心が印刷され、触媒反応が開始される状況に複製を適用することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】本発明を具体化する表面処理方法のブロック図である。
【図２】（Ａ）線形増幅のブロック図である。  （Ｂ）指数関数的増幅のブロック図である。  （Ｃ）方向性増幅のブロック図である。
【図３】ＰＣＲの表面プライマー増幅のための方法におけるステップのブロック図である。
【図４】ＰＣＲの表面プライマー増幅のための方法におけるステップのブロック図である。
【図５】ＰＣＲの表面プライマー増幅のための方法におけるステップのブロック図である。
【図６】ＰＣＲの表面プライマー増幅のための方法におけるステップのブロック図である。
【図７】ＰＣＲの表面プライマー増幅のための方法におけるステップのブロック図である。
【図８】ＰＣＲの表面プライマー増幅のための方法におけるステップのブロック図である。
【図９】ＰＣＲの表面プライマー増幅のための方法におけるステップのブロック図である。
【図１０】ＰＣＲの表面プライマー増幅のための方法におけるステップのブロック図である。
【図１１】ＰＣＲの可溶性プライマー増幅のための方法におけるステップのブロック図である。
【図１２】ＰＣＲの可溶性プライマー増幅のための方法におけるステップのブロック図である。
【図１３】ＰＣＲの可溶性プライマー増幅のための方法におけるステップのブロック図である。
【図１４】ＰＣＲの可溶性プライマー増幅のための方法におけるステップのブロック図である。
【図１５】ＰＣＲの可溶性プライマー増幅のための方法におけるステップのブロック図である。
【図１６】本発明を具体化する表面処理方法のためのスタンピング作業の断面図である。
【図１７】本発明を具体化する表面処理方法のためのスタンピング作業の断面図である。
【図１８】本発明を具体化する表面処理方法のためのスタンピング作業の断面図である。
【図１９】本発明を具体化する表面処理方法のためのスタンピング作業の断面図である。
【図２０】本発明を具体化する表面処理方法のためのスタンピング作業の断面図である。
【図１】
0004521280.tif 000002
【図２】
0004521280.tif 000003
【図３】
0004521280.tif 000004
【図４】
0004521280.tif 000005
【図５】
0004521280.tif 000006
【図６】
0004521280.tif 000007
【図７】
0004521280.tif 000008
【図８】
0004521280.tif 000009
【図９】
0004521280.tif 000010
【図１０】
0004521280.tif 000011
【図１１】
0004521280.tif 000012
【図１２】
0004521280.tif 000013
【図１３】
0004521280.tif 000014
【図１４】
0004521280.tif 000015
【図１５】
0004521280.tif 000016
【図１６】
0004521280.tif 000017
【図１７】
0004521280.tif 000018
【図１８】
0004521280.tif 000019
【図１９】
0004521280.tif 000020
【図２０】
0004521280.tif 000021