(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下式の一般式（１）：
【化１】
0004493899.tif 000006
（式中、Ｚはエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、ジグリセリン、ペンタエリスリトール、トリグリセリン、テトラグリセリン、ペンタグリセリン、ヘキサグリセリン、ヘプタグリセリン、及びオクタグリセリンのいずれかより選択される化合物の残基を示し；ＡＯは炭素数２〜４のオキシアルキレン基を示し；Ｒ1は水素原子又は炭素数１〜３の炭化水素基を示し；Ｒ2は炭素数７〜２２の飽和若しくは不飽和の直鎖又は分枝の脂肪族炭化水素基、あるいは下記の一般式（２）：
【化２】
0004493899.tif 000007
（Ｒ3及びＲ4はそれぞれ独立に炭素数７〜２１の炭化水素基を示し；Ｒ5は炭素数２〜４の炭化水素基を示し、ｂは０または１である）で表される基を示し；Ｘはコハク酸イミド基、マレイミド基、アミノ基、カルボキシル基、アルデヒド基、グリシジル基、及びチオール基からなる群から選ばれる反応性官能基を１個以上含有する基を示し；ａは０又は１を示し；ｎ1、ｎ2、及びｎ3は炭素数２〜４のオキシアルキレン基の平均付加モル数を示し、かつｎ1、ｎ2、ｎ3、k1、k2、及びk3は下記の条件：
０≦ｎ1、ｎ2≦５００、２≦ｎ3≦５００であり、かつ
２≦ｎ1＋ｎ2＋ｎ3≦５００
０≦k1≦８、１≦k2≦４、１≦k3≦４であり、かつ
２≦k1＋k2＋k3≦１０
を満足する数である）
で表される両親媒性化合物と生理活性物質又はプローブとの反応生成物がアンカーリングによる非共有結合により細胞膜に結合した細胞。
【請求項２】
細胞が動物細胞である請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
Ｒ2が炭素数１１〜１８の直鎖の脂肪族炭化水素基を１個以上含有する化合物の残基である請求項１又は２に記載の細胞。
【請求項４】
Ｒ2がオレイル基または炭素数１７の不飽和脂肪族炭化水素基を１個以上有する化合物の残基である請求項１又は２に記載の細胞。
【請求項５】
生理活性物質又はプローブとの反応生成物を非共有結合により細胞膜に結合させるために用いる請求項１ないし４のいずれか１項に記載の両親媒性化合物からなる修飾剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生理活性物質又はプローブで修飾された細胞に関する。より詳しくは、本発明は生理活性物質又はプローブと両親媒性化合物との反応生成物を非共有結合により細胞膜に結合させた細胞に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
細胞膜表面の糖鎖やタンパク質からなる層は細胞間の認識等外部の環境に対しての応答発現の場である。ここでは分子認識と情報の変換が行われていることから、細胞膜表面を改質することにより細胞の認識の多様化が図れると考えられている。例えば、合成高分子によって細胞膜表面を修飾し、細胞を無個性化させる研究が行われている。
【０００３】
特表２０００−５０７８４９号公報には、細胞表面に存在する官能基に対して生体適合性ポリマーを反応させ、共有結合により表面を修飾する方法が報告されている。また、The FASEB Journal, 10, 574-586, 1996にはＧＰＩ−anchored proteinを用いた細胞表面の修飾方法が報告されている。さらにPolymer Preprints, Japan, 47, 10, 2499-2500, 1998及び蛋白質・核酸・酵素, 45, 11, 1859-1864, 2000には、水溶性高分子としてポリアクリルアミドを用いて、その高分子末端の反応性基と膜蛋白あるいは糖鎖とを反応させる工程を含む細胞表面の修飾方法、リガンドと細胞膜上のレセプターとの結合を介して細胞表面を修飾する方法、及び疎水性アンカーを用いて細胞表面を修飾する方法が開示されている。
【０００４】
このように、細胞膜蛋白及び糖鎖に高分子末端の反応性基を用いて結合させることにより細胞表面の修飾を行う方法はいくつか知られているが、このような化学修飾を直接細胞膜上に行うことは、細胞表面物質の性質を変化させ、細胞に障害を与えるおそれがある。また、ＧＰＩ−anchored proteinを用いる方法では、ＧＰＩ−anchored proteinそのものの入手が困難であり、適用範囲が限られるという問題がある。さらに、疎水性アンカーを用いる方法はポリアクリルアミド鎖のみを表面修飾するものであり、細胞の凝集の抑制は達成できるものの、修飾後の安定性が悪く、細胞膜表面にポリアクリルアミド鎖を固定化できることについての実証もない。また、この方法では生理活性物質を細胞表面に結合することは不可能である。
【０００５】
さらに、The Journal of Immunology, 2433-2443, 2000には、炭化水素基を含有するキレート化合物を用い、キレート化合物を細胞膜にアンカーリングした後、このキレート化合物に生理活性物質をイオン結合させる方法が開示されている。しかしながら、この方法では、生理活性物質と細胞膜との結合がイオン結合であるため、結合が塩濃度あるいはpHによって影響を受けやすく不安定であり、細胞への適用範囲も限られるという問題がある。また、このキレート化合物は親水性基を含有しないために親油性が強く、細胞への添加は困難であることから、リポソーム化によって細胞融合により細胞に取り込ませる手段等が採られているが、この手段による細胞膜修飾は簡便ではない。
以上のように、細胞に傷害を与えることなく、その細胞膜に生理活性物質などを共有結合により結合させて細胞膜を改質する方法は知られていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、生理活性物質又はプローブなどの修飾対象物質で細胞膜修飾された細胞を提供することにある。また、本発明の別の課題は、上記の従来の問題を回避でき、細胞に障害を与えることなく効率的に細胞を修飾するための手段を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究を行ったところ、生理活性物質又はプローブなどの修飾対象物質と両親媒性化合物とを反応させて得られる反応生成物を用いて非共有結合的に細胞膜を修飾することができること、及び脂肪族炭化水素基を有する特定の両親媒性化合物を用いることにより、細胞に傷害を与えることなく修飾を極めて効率的に行うことができることを見出した。本発明はこれらの知見を基にして完成されたものである。
【０００８】
すなわち、本発明は、下記の特徴：
(1)１つの末端に脂肪族炭化水素基を１個以上含有し、
(2)分子中に親水性基を含む部分を１個以上有し、及び
(3)修飾対象物質を共有結合しうる反応性官能基を上記(1)とは異なる末端に１個以上有する
を有する両親媒性化合物と修飾対象物質との反応生成物が非共有結合により細胞膜に結合した細胞を提供するものである。この発明の好ましい態様によれば、修飾対象物質が生理活性物質又はプローブである上記の細胞；及び細胞が動物細胞である上記の細胞が提供される。
【０００９】
本発明のさらに好ましい態様によれば、脂肪族炭化水素基が炭素数１１〜１８の脂肪族炭化水素基を１個以上含有する化合物の残基である上記の細胞；脂肪族炭化水素基がオレイル基または炭素数１７の不飽和脂肪族炭化水素基を１個以上有する化合物の残基である上記の細胞；及び親水性基がポリオキシアルキレン基を含有する化合物の残基である上記の細胞が提供される。
【００１０】
本発明の特に好ましい態様によれば、両親媒性化合物が、下式の一般式（１）：
【化３】
0004493899.tif 000002
（式中、Ｚは２〜１０個の水酸基を有する化合物の残基を示し；ＡＯは炭素数２〜４のオキシアルキレン基を示し；Ｒ1は水素原子又は炭素数１〜３の炭化水素基を示し；Ｒ2は炭素数７〜２２の脂肪族炭化水素基を含有する化合物の残基を示し；Ｘはコハク酸イミド基、マレイミド基、アミノ基、カルボキシル基、アルデヒド基、グリシジル基、及びチオール基からなる群から選ばれる反応性官能基を１個以上含有する基を示し；ａは０又は１を示し；ｎ1、ｎ2、及びｎ3は炭素数２〜４のオキシアルキレン基の平均付加モル数を示し、かつｎ1、ｎ2、ｎ3、k1、k2、及びk3は下記の条件：
０≦ｎ1、ｎ2≦５００、２≦ｎ3≦５００であり、かつ
２≦ｎ1＋ｎ2＋ｎ3≦５００
０≦k1≦８、１≦k2≦４、１≦k3≦４であり、かつ
２≦k1＋k2＋k3≦１０
を満足する数である）
で表される化合物である上記の細胞が提供される。
【００１１】
上記発明のさらに好ましい態様によれば、Ｒ2が炭素数１１〜１８の直鎖の脂肪族炭化水素基を１個以上含有する化合物の残基である上記の細胞；Ｒ2がオレイル基または炭素数１７の不飽和脂肪族炭化水素基を１個以上有する化合物の残基である上記の細胞；及びＲ2が下記の一般式（２）：
【化４】
0004493899.tif 000003
（Ｒ3及びＲ4はそれぞれ独立に炭素数７〜２１の炭化水素基を示し；Ｒ5は炭素数２〜４の炭化水素基を示し、ｂは０または１である）で表される基である上記の細胞が提供される。
【００１２】
別の観点からは、本発明により、生理活性物質又はプローブとの反応生成物を非共有結合により細胞膜に結合させるために用いる上記の両親媒性化合物；及び細胞膜の修飾のための上記両親媒性化合物の使用が提供される。また、本発明により、細胞膜の修飾方法であって、下記の工程：(1)生理活性物質又はプローブと上記の両親媒性化合物とを反応させる工程；及び(2)上記工程(1)で得られた反応生成物を非共有結合により細胞膜に結合させる工程を含む方法が提供される。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明の細胞は、修飾対象物質を共有結合しうる反応性官能基を有する両親媒性化合物と修飾対象物質との反応生成物を非共有結合により細胞膜に結合していることを特徴としている。細胞としては、リン脂質種から構成される細胞膜を持つものであればいかなるものを用いてもよいが、例えば、動物細胞、プロトプラスト化された植物細胞、及び微生物などが挙げられる。好ましくは動物細胞が挙げられる。例えば、免疫細胞の表面を生理活性物質で修飾することにより免疫活性化作用を誘導することができる。
【００１４】
細胞に結合させるべき修飾対象物質の種類は特に限定されず、両親媒性化合物と共有結合可能な官能基を少なくとも１つ有するものであれば、いかなるものを用いてもよい。共有結合可能な官能基としては、例えば、アミノ基、水酸基、チオール基、カルボキシル基などを挙げることができる。修飾対象化合物としては、好ましくは生理活性物質又はプローブなどを用いることができる。本発明の細胞には２種類以上の修飾対象物質を結合させることが可能である。例えば、生理活性物質とプローブとを組み合わせて細胞に結合させてもよい。
【００１５】
生理活性物質の種類は特に限定されないが、例えば、酵素阻害剤やレセプター・アンタゴニスト又はアゴニストなどの医薬の有効成分である化合物のほか、アミノ酸、オリゴペプチド、ポリペプチド、蛋白質、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、糖蛋白質、単糖類、多糖類、及びビタミン類など、低分子物質から高分子物質まで種々の物質を用いることができる。好ましい生理活性物質として、例えば、ゼラチンなどのポリペプチド、抗体、接着分子、レセプター、増殖因子などのサイトカイン等が挙げられる。本明細書において用いられる「生理活性物質」の用語は、少なくとも１つの生体反応を惹起できる物質や、生体内で利用可能な生体関連物質などを含めて最も広義に解釈すべきであり、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。
【００１６】
プローブとしては、例えば、アミノ酸、オリゴペプチド、ポリペプチド、蛋白質、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、酵素基質、金属イオンなどの検出のためのプローブを用いることができ、蛍光プローブ、発光プローブ、磁性プローブ、放射性プローブ、及び金コロイド等の微粒子プローブ等が用いられる。もっとも、利用可能なプローブは上記の物質を対象としたもの及び上記の検出手段を備えたプローブに限定されることはない。
【００１７】
該両親媒性化合物は、下記の特徴：
(1)１つの末端に脂肪族炭化水素基を１個以上含有し、
(2)分子中に親水性基を含む部分を１個以上有し、及び
(3)修飾対象物質を共有結合しうる反応性官能基を上記(1)とは異なる末端に１個以上有する
を有する化合物である。
【００１８】
親水性基としては、合成及び天然の水溶性化合物、好ましくは水溶性高分子化合物の残基を用いることができる。親水性基を与える水溶性化合物としては、例えば、ポリアルキレングリコール、ポリサッカライド、ポリ乳酸、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸及びポリアクリルアミド等が挙げられ、好ましくはポリアルキレングリコール、ポリサッカライド、ポリ乳酸、ポリビニルアルコール、より好ましくはポリアルキレングリコールである。
【００１９】
脂肪族炭化水素基としては合成又は天然の脂肪族炭化水素由来の基でもよく、好ましくは炭素数６〜２４の飽和又は不飽和の直鎖又は分枝の脂肪族炭化水素基（本明細書において「不飽和」という場合には分子又は官能基に存在する二重結合又は三重結合の数は特に限定されず、二重結合及び三重結合を組み合わせて含んでいてもよい）、さらに好ましくは炭素数１１〜１８の飽和又は不飽和の脂肪族炭化水素基を含有する基であり、より好ましくはオレイル基または炭素数１７の不飽和脂肪族炭化水素基を含有する基である。この炭化水素基は１種単独であってもよいし、２種以上が組み合わされていてもよい。２種以上を組み合わせる場合には、その組み合わせ方に制限はない。
【００２０】
両親媒性化合物中の反応性官能基は、好ましくは親水性部の末端に配置される。反応性官能基としては、生理活性物質のアミノ基、カルボキシル基、チオール基、及び水酸基などの官能基と反応しうるものならいかなる反応性官能基を用いてもよい。例えば、コハク酸イミド基、マレイミド基、アミノ基、カルボキシル基、アルデヒド基、グリシジル基又はチオール基等が挙げられる。
【００２１】
両親媒性化合物として、式（１）で表される化合物を用いることができる。Ｚが示す２〜１０個の水酸基を有する化合物の残基としては、具体的には、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、ジグリセリン、ペンタエリスリトール、トリグリセリン、テトラグリセリン、ペンタグリセリン、ヘキサグリセリン、ヘプタグリセリン、及びオクタグリセリンなどの化合物の残基を挙げることができる。Ｚとしては好ましくは２〜８の水酸基を有する化合物の残基を用いることができる。
【００２２】
ＡＯは炭素数２〜４、好ましくは炭素数２又は３のオキシアルキレン基であり、例えばオキシエチレン基、オキシプロピレン基、オキシトリメチレン基、オキシブチレン基、オキシテトラメチレン基などが挙げられる。これらの中で特にオキシエチレン基が好ましい。分子内にはｎの数だけオキシアルキレン基が存在するが、このオキシアルキレン基は１種単独であってもよく、あるいは２種以上が組み合わされていてもよい。２種以上が組み合わされる場合には、その組み合わせ方に制限はない。またオキシアルキレン基はブロック状であってもランダム状であってもよい。ただし、全オキシアルキレン基に対するオキシエチレン基の比率が低いと水溶性が低下する場合があるので、全オキシアルキレン基に対するオキシエチレン基の比率は５０〜１００モル％であることが好ましい。
【００２３】
式（１）においてｎ１＋ｎ２＋ｎ３はオキシアルキレン基の平均付加モル数を示し、この総和は例えば２〜５００の範囲であり、好ましくは８〜３００、より好ましくは１２〜２００である。付加モル数は、例えばＲ1あるいはＲ2の疎水性基との親水性及び疎水性のバランスによって決めることが可能である。ｋ２が２以上であるか、あるいはＲ2がリン脂質化合物残基である場合には、疎水性を示す脂肪族炭化水素基が２鎖以上存在し、オキシアルキレン基の平均付加モル数ｎ１＋ｎ２＋ｎ３が２０〜５００であることが好ましく、３０〜２００であることがさらに好ましい。
【００２４】
前記式（１）で示されるｋ１＋ｋ２＋ｋ３の値はＺの分岐数に対応しており、２〜１０、好ましくは２〜４の整数である。ｋ１＋ｋ２＋ｋ３の値が２より小さい場合には、一末端に脂肪族炭化水素基である疎水性基、他の一末端に反応性官能基を有する化合物が得られないため、細胞の表面修飾には不利になる場合がある。また、ｋ１＋ｋ２＋ｋ３の値が１０より大きい場合には、分子の三次元的な広がりが大きく嵩高くなるために、立体障害により安定な表面修飾を行うことができない場合がある。
【００２５】
前記式（１）において、ｋ１はポリアルキレンオキシドの分岐した末端の残基が水素原子又は炭素数１〜３の炭化水素基（具体的にはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、又はイソプロピル基）である残基の合計数であり、０〜８の範囲の整数である。前記式（１）において、ｋ２はポリアルキレンオキシドの末端の残基に炭素数７〜２２の脂肪族炭化水素基を含有する化合物の残基の結合数であり、１〜４の範囲の整数である。ｋ２が０の場合は疎水基が存在しないため細胞膜の修飾が達成できない場合があり、５以上の場合は、嵩高く細胞膜にアンカーリングされない場合がある。
【００２６】
前記式（１）においてａは０又は１であり、ａが０の場合には、Ｒ2で表される脂肪族炭化水素基を含有する化合物の残基がポリアルキレンオキシド残基の末端にエーテル結合していることを意味し、ａが１の場合はＲ2で表される脂肪族炭化水素基を含有する化合物の残基がポリアルキレンオキシド残基の末端にカルボニル基を介してエステル結合していることを意味している。
【００２７】
前記式（１）において、ｋ３はＸで示される反応性基を含有する基が末端残基に結合したポリアルキレンオキシド残基であり、１〜４の範囲の整数であり、好ましくは１〜３である。ｋ３が２以上の場合は、Ｘに含有される反応性基は一種単独でもよいし、２種以上組み合わされてもよい。２種以上の場合は同種あるいは異種の生理活性物質を結合させ、細胞膜に導入することができる。
【００２８】
前記式（１）においてＲ1は水素原子、メチル基、エチル基、あるいは直鎖又は分枝鎖のプロピル基である。ｋ２が１以上の場合には、Ｒ2の脂肪族炭化水素基を含有する化合物の残基が式（１）の化合物の疎水性基として作用する。
前記式（１）において、Ｒ2は炭素数７〜２２の脂肪族炭化水素基を含有する化合物の残基である。好ましくは炭素数７〜２２の飽和若しくは不飽和の直鎖又は分枝の脂肪族炭化水素基、あるいは炭素数７〜２２の飽和若しくは不飽和の直鎖又は分枝の脂肪族炭化水素基を１個以上有するリン酸基含有化合物の残基である。
【００２９】
Ｒ2の具体例としては、ａが０の場合、カプリル基、デシル基、ラウリル基、ミリスチル基、ミリストレイル基、パルミチル基、パルミトレイル基、ステアリル基、イソステアリル基、オレイル基、リノレイル基、アラキル基、アラキドニル基、ベヘニル基、エルカイル基などの飽和若しくは不飽和の直鎖又は分枝の炭化水素基が挙げられる。好ましくは炭素数１０〜２０の飽和若しくは不飽和の脂肪族炭化水素基あるいは炭素数１０〜２０の飽和若しくは不飽和の脂肪族炭化水素基を有するリン脂質残基、より好ましくは炭素数１１〜１８の飽和若しくは不飽和の直鎖の脂肪族炭化水素基あるいは炭素数１１〜１８の飽和若しくは不飽和の直鎖の炭化水素基を有するリン脂質残基、最も好ましくは炭素数１８の飽和若しくは不飽和の直鎖の脂肪族炭化水素基あるいは炭素数１７の飽和若しくは不飽和の直鎖の脂肪族炭化水素基を有するリン脂質残基である。リン脂質としては、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン等が挙げられる。また、ａが１の場合、Ｒ2ＣＯの具体例としては、例えば、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ミリストレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、イソステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、アラキン酸、ベヘン酸、エルカ酸などの飽和若しくは不飽和の直鎖又は分枝の脂肪酸由来のアシル基を挙げることができ、好ましくはオレイン酸由来のアシル基である。
【００３０】
前記式（１）において、Ｘはコハク酸イミド基、マレイミド基、アミノ基、カルボキシル基、アルデヒド基、グリシジル基、又はチオール基等の反応性官能基を含有する基である。ポリアルキレンオキシド残基の末端へのＸの結合様式については特に限定はなくJMS-REV. MACROMOL. CHEM. PHYS., C25(3), 325-372(1985)等に報告されているような一般的な結合様式を用いることができるが、上記反応基を簡便に導入するためには２価の炭化水素基、エステルあるいはアミド結合を介して導入を行うことが好ましい。この目的に用いられる炭化水素基としては、例えば、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基、ペンチレン基及びヘキシレン基等、又はフェニレン基等の環状化合物基が挙げられ、エステル結合はモノカルボン酸又はジカルボン酸由来のエステル結合でもよいが、ジカルボン酸としてはコハク酸、グルタル酸、及びマレイン酸等が挙げられ、アミド結合としてはエチルアミド及びプロピルアミド等由来のアミド結合が挙げられる。
【００３１】
前記式（２）は炭素数７〜２１の飽和若しくは不飽和の直鎖又は分岐の脂肪族炭化水素基を１個以上有するリン酸基含有化合物残基、すなわちホスファチジルエタノールアミン含有残基である。前記式（２）において、Ｒ3及びＲ4はそれぞれ独立に炭素数７〜２１の飽和若しくは不飽和の直鎖又は分枝の脂肪族炭化水素基、好ましくは炭素数１１〜１７の飽和若しくは不飽和の直鎖の炭化水素基、より好ましくは炭素数１７の不飽和脂肪族炭化水素基である。Ｒ3及びＲ4は通常Ｒ3ＣＯ及びＲ4ＣＯとして脂肪酸に由来するアシル基を用いることができる。Ｒ3ＣＯ及びＲ4ＣＯの具体的なものとしては、例えばカプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ミリストレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、イソステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、アラキン酸、ベヘン酸、エルカ酸などの飽和若しくは不飽和の直鎖又は分岐の脂肪酸由来のアシル基を挙げることができ、より好ましくはオレイン酸由来のアシル基である。
【００３２】
Ｒ3及びＲ4は同一であっても異なっていてもよい。Ｒ3及びＲ4の炭素数がそれぞれ２１を越える場合、疎水性が強く柔軟性が小さいため細胞膜への結合が困難になる場合があり、また炭素数が７より少ない場合には、細胞膜への結合後、疎水性が弱いために細胞膜から抜け落ちる場合がある。Ｒ2が式（２）で示されるリン脂質含有化合物の残基の場合には、アシル基が２本あるために細胞膜の修飾後の安定性が一本鎖より高く、細胞膜にアンカーリングした状態で分子の脱落が生じにくい。
【００３３】
前記式（２）において、Ｒ5は炭素数２〜４の２価の炭化水素基であり、直鎖状、分枝状、環状、又はそれらの組み合わせのいずれでもよく、飽和又は不飽和のいずれでもよい。具体的には−ＣＨ2ＣＨ2−、−(ＣＨ2)3−、又は−(ＣＨ2)4−基などが挙げられる。
ｂは０または１を示す。
【００３４】
本発明の細胞において、両親媒性化合物が１個以上の不斉炭素を有する場合には、両親媒性化合物として、任意の光学活性体又はジアステレオ異性体などの純粋な形態の立体異性体、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などの任意の物質を用いることができる。また、オレフィン性の二重結合を含む場合には、純粋な形態のＥ体又はＺ体、あるいはそれらの混合物のいずれを用いてもよい。
【００３５】
本発明により提供される細胞膜の修飾方法は、下記の工程：(1)生理活性物質又はプローブと上記の両親媒性化合物とを反応させる工程；及び(2)上記工程(1)で得られた反応生成物を非共有結合により細胞膜に結合させる工程を含むことを特徴としている。
【００３６】
前記工程(1)の反応工程で用いる溶媒の種類は、反応に関与しない溶媒であれば特に制限されないが、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸緩衝液、炭酸緩衝液、グッドの緩衝液等の緩衝液あるいはその等張液、あるいは有機溶剤又は上記の水性媒体と有機溶剤との混合物などを用いることができ、これらは単独溶媒系でも混合溶媒系でもどちらでもよい。生理活性物質などの修飾対象物質が変性ないし失活することがないように、反応に関与しないアセトニトリル、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド等の有機溶剤を使用することが好ましい。反応温度は、生理活性物質などの修飾対象物質が変性ないし失活しない温度であれば特に限定されないが、例えば、０〜１００℃、さらに０〜４０℃が好ましい。反応時間は通常は１分〜４８時間程度であり、０．５〜３時間が好ましい。反応後は、透析、限外ろ過、ゲルろ過等の通常の蛋白質精製法などを応用して反応生成物を精製することができるが、反応生成物の精製を行わずに工程(2)に用いてもよい。
【００３７】
工程(2)においては工程(1)で得られた反応生成物を培養細胞に添加すればよいが、細胞培養液または等張液で用いる上記工程(1)で得られた反応生成物は臨界ミセル形成濃度（以下ＣＭＣと略す）の０．１〜１０００倍、好ましくはそのＣＭＣの１〜５００倍、より好ましくはそのＣＭＣの１０〜１００倍に希釈して添加することができる。工程(1)で得られた反応生成物の細胞への結合は通常は０〜４０℃で行い、１秒間〜１２０分間、好ましくは２５〜３７℃で１０秒間〜２０分間行う。この工程において、工程(1)で得られた反応生成物以外の添加剤を添加してもよい。細胞膜に上記反応生成物を結合させた後、細胞に等張液を添加して洗浄することが好ましい。用いる等張液としては細胞に傷害を与えない溶媒であれば特に限定されないが、リン酸緩衝液生理食塩水、細胞培養液等の等張液を用いることができる。
【００３８】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。以下、修飾対象物質と両親媒性化合物との反応生成物を「コンジュゲート」と呼び、該コンジュゲートによる細胞膜修飾を「アンカーリング」と呼び、ポリエチレンオキシド末端のサクシンイミジルサクシネートを「活性化ポリエチレンオキシド」あるいは「ポリエチレンオキシドの活性体」と呼ぶ場合がある。
【００３９】
例１
ポリエチレンオキシドオレイルエーテル(ｎ＝９０、平均分子量４４００)-ビオチンコンジュゲートの調製
合成例１  活性化ポリエチレンオキシドオレイルエーテルの合成
４ｇ(１mmol)のポリエチレンオキシドオレイルエーテル(ｎ＝９０、平均分子量４４００)に酢酸ナトリウムを0.1mol%添加し、無水コハク酸を０．１２g（１．２mmol）加えて100℃で5時間反応を行い、その後ジメチルホルムアミドを５mL加えてN-ヒドロキシコハク酸イミド(NHSI)を０．１４g（1.2mmol）添加して４０℃で攪拌し、０．２１g（２mmol）のジシクロヘキシルカルボジイミドを加えて活性化体とした。反応終了後冷イソプロピルアルコール２５mLおよびヘキサン５０mLを用いて晶析を行い精製し３．５ｇの結晶を得た。
ポリエチレンオキシドオレイルエーテル(ｎ＝９０、平均分子量４４００)-ビオチンコンジュゲートの調製
【００４０】
４．４ｍｇ（１nmol）の活性化ポリエチレンオキシドオレイルエーテル（ｎ＝９０、平均分子量４４００）を0.1 mLのジメチルスルホキシドに溶解し、活性化ポリエチレンオキシドオレイルエーテル（ｎ＝９０、平均分子量４４００）溶液とした。1nmolのEZ-LinkTM Biotin-PEO-Amine (PIERCE社製；Cat# 21346)を0.1 mLのジメチルスルホキシドに溶解しBiotin-PEO-Amine溶液とし、そこにポリエチレンオキシドオレイルエーテル（ｎ＝９０、平均分子量４４００）溶液を添加し反応液とした。反応液を室温（約２５℃）で撹拌した後、１時間放置した。反応液に1Ｍトリス緩衝液 (pH8.0)を0.02 mL及び組織培養用 リン酸緩衝液生理食塩水（ダルベッコPBS(-) 組織培養用「ニッスイ」粉末（日水製薬（株）；Cat# 05913）より調製）を0.78 mL添加して、ポリエチレンオキシドオレイルエーテル(ｎ＝９０、平均分子量４４００)-ビオチンコンジュゲート溶液を得た。
【００４１】
例２：ポリエチレンオキシドオレイルエーテル(ｎ＝９０、平均分子量４４００) -ビオチンコンジュゲートのマウス線維芽細胞株NIH3T3へのアンカーリング
マウス線維芽細胞株NIH3T3の培養
マウス線維芽細胞 NIH3T3はGlass bottom Microwell Dishes（35mm dish, Uncoated, No.0 Coverslip）容器を用いて10％ウシ胎児血清を添加したダルベッコ変法イーグル培地を用い37℃、5％二酸化炭素濃度で培養した。約80％コンフルエントになるまで20時間から45時間培養した。例１で得られたポリエチレンオキシドオレイルエーテル(ｎ＝９０、平均分子量４４００) -ビオチンコンジュゲート原液を、ダルベッコ変法イーグル培地で1/100倍に希釈し、ポリエチレンオキシドオレイルエーテル(ｎ＝９０、平均分子量４４００) -ビオチンコンジュゲート液を調製した。NIH3T3細胞の付着したGlass bottom Microwell Dishes容器を濾過滅菌処理したリン酸緩衝液生理食塩水（同上）2 mLでリンスした後、ガラス表面に付着しているNIH3T3に0.1 mL のポリエチレンオキシドオレイルエーテル-ビオチンコンジュゲート液を添加し、37℃で５分間反応させた。反応後、リン酸緩衝液生理食塩水2 mLで2回細胞を洗浄し、6.7 nM Streptavidine, fluorescein conjugate (Molecular Probes; Cat# S-869) （以後、フルオレセイン標識ストレプトアビジンと称す）リン酸緩衝液生理食塩水溶液 0.1 mLを細胞に添加後37℃で20分間インキュベートした。
【００４２】
リン酸緩衝液生理食塩水2 mLで3回細胞を洗浄した後、リン酸緩衝液生理食塩水1 mLを細胞に添加し、ポリエチレンオキシドオレイルエーテル(ｎ＝９０、平均分子量４４００)-ビオチンコンジュゲートに結合したフルオレセイン標識ストレプトアビジンで膜修飾した細胞を得た。細胞膜修飾については、細胞を共焦点レーザースキャニング顕微鏡（ライカ(Leica)社製）で観察することにより確認した。結果を表１及び図１に示す。その結果、視野（1000倍）中すべての細胞の細胞膜にフルオレセイン由来の蛍光が観察された。ポリエチレンオキシドオレイルエーテル(ｎ＝９０、平均分子量４４００) -ビオチンコンジュゲートは５分間ですべての細胞膜にアンカーリングされることが確認された。またビオチンのストレプトアビジンへの結合も阻害されなかった。
細胞の３次元的観察
【００４３】
例２と同様にポリエチレンオキシドオレイルエーテル(ｎ＝９０、平均分子量４４００) -ビオチンコンジュゲートで処理したNIH3T3をフルオレセイン標識ストレプトアビシンで染色し共焦点レーザースキャニング顕微鏡を用いて高さ方向（Z軸方向）に2.3μm間隔で0.86μm幅の光学的切片を撮り観察した。その結果を図２に示す。すべての細胞において細胞膜のみ特異的にフルオレセイン由来の蛍光が観察され、３次元的細胞観察によって液相に露出している細胞膜のすべての部分にポリエチレンオキシドオレイルエーテル(ｎ＝９０、平均分子量４４００) -ビオチンコンジュゲートが結合していることが確認された。
【００４４】
例３
ポリエチレンオキシドオレイルエーテル(ｎ＝９０、平均分子量４４００)- 緑色蛍光蛋白質EGFPコンジュゲートの調製
合成例１と同様にして得られた1.5μmolの活性化ポリエチレンオキシドオレイルエーテル(分子量４０００)に0.1 mLのジメチルスルホキシドを添加して活性化体溶液とした。75μMの精製された緑色蛍光蛋白質EGFP（精製タグとしてproteinGの抗体結合ドメインの一部を含む融合蛋白質）リン酸緩衝液生理食塩水の溶液0.3 mLに活性化ポリエチレンオキシドオレイルエーテル(分子量４０００)溶液0.015 mLを添加して反応液とした。反応液を撹拌した後、室温（約２５℃）で１時間放置した。反応液に1Ｍトリス緩衝液 (pH8.0)を0.016 mL添加して、ポリエチレンオキシドオレイルエーテル(ｎ＝９０、平均分子量４４００)- EGFPコンジュゲート原液を得た。
【００４５】
例４
ポリエチレンオキシドオレイルエーテル（ｎ＝９０、平均分子量４４００）-EGFPコンジュゲートのマウス線維芽細胞株NIH3T3へのアンカーリング
ポリエチレンオキシドオレイルエーテル(ｎ＝９０、平均分子量４４００)- EGFPコンジュゲート原液をダルベッコ変法イーグル培地で1/20倍に希釈し、ポリエチレンオキシドオレイルエーテル(ｎ＝９０、平均分子量４４００)- EGFPコンジュゲート液を調製した。例２と同様にNIH3T3細胞膜にポリエチレンオキシドオレイルエーテル（ｎ＝９０、平均分子量４４００）- EGFPコンジュゲートをアンカーリングし、共焦点レーザースキャニング顕微鏡でEGFP由来の蛍光を観察することにより確認した。結果を表１に示す。その結果、緑色蛍光蛋白質EGFPもポリエチレンオキシドオレイルエーテルを用いて細胞膜にアンカーリングされることが確認された。
【００４６】
例５
ポリエチレンオキシドオレイルエーテル（ｎ＝９０、平均分子量４４００）- EGFPコンジュゲートのチャイニーズハムスター卵胞細胞株ＣＨＯへのアンカーリング
CHO細胞の培養
チャイニーズハムスター卵胞細胞株ＣＨＯはGlass bottom Microwell Dishes（35mm dish, Uncoated, No.0 Coverslip）容器と10％ウシ胎児血清を添加したF-12培地（F-12 Nutrient Mixture (GIBCO.BRL; Cat# 21700-075)を用い37℃、5％二酸化炭素濃度でほぼ100％コンフルエントになるまで培養した。
例４と同様にCHO細胞とポリエチレンオキシドオレイルエーテル（ｎ＝９０、平均分子量４４００）- EGFPコンジュゲートをインキュベートし共焦点レーザースキャニング顕微鏡で観察した。その結果を表１に示す。その結果、ポリエチレンオキシドオレイルエーテル（ｎ＝９０、平均分子量４４００）-EGFPコンジュゲート液で処理されたすべてのCHO細胞の細胞膜にEGFP由来の蛍光が観察され、マウス細胞以外の細胞にもアンカーリングできることが確認された。
【００４７】
例６
ポリエチレンオキシドオレイルエーテル（ｎ＝９０、平均分子量４４００）- EGFPコンジュゲートの浮遊細胞へのアンカーリング
32D、Ba/F3及び9E10細胞の培養
マウスミエロイド 細胞株32D及びマウスプロB 細胞株 Ba/F3は終濃度2ng/mLのインターロイキン-3及び10％ウシ胎児血清を添加したRPMI培地を用い37℃、5%二酸化炭素濃度で培養した。マウスハイブリドーマ 9E10は10％ウシ胎児血清を添加したRPMI1640培地（「ニッスイ」粉末、日水製薬、cat.#05918）を用い37℃、5%二酸化炭素濃度で培養した。ポリエチレンオキシドオレイルエーテル（ｎ＝９０、平均分子量４４００）- EGFPコンジュゲート原液をRPMI1640培地で1/20倍に希釈し、E290-EGFPコンジュゲート液を調製した。32D、Ba/F3及び9E10細胞（以下、「浮遊細胞」と総称する）を遠心して1×106 個の細胞をそれぞれ集めた。それぞれの細胞を13 mLのリン酸緩衝液生理食塩水で洗浄遠心した後、それぞれの細胞ペレットに0.1 mL のポリエチレンオキシドオレイルエーテル（ｎ＝９０、平均分子量４４００）-EGFPコンジュゲート液を添加後37℃で５分間インキュベートし、その後リン酸緩衝液生理食塩水13 mLで1回細胞を洗浄遠心した後、リン酸緩衝液生理食塩水1 mLをそれぞれの細胞ペレットに添加した。
【００４８】
それぞれの処理された細胞懸濁液をフローサイトメーター（コールター社、EPICS-C）で観察した。その結果を表２及び図３に示す。その結果、EGFPのみで処理された浮遊細胞に比較して、ポリエチレンオキシドオレイルエーテル-EGFPコンジュゲートで処理された場合は、より蛍光強度が強い細胞の数が増加していることが観察された。このことより、ポリエチレンオキシドオレイルエーテル-EGFPコンジュゲート処理によりすべての浮遊細胞膜にEGFPが付与されたことが分かり、浮遊細胞にポリエチレンオキシドオレイルエーテル-EGFPがアンカーリングできることが確認された。
【００４９】
例７
ポリエチレンオキシドオレイルエーテル（ｎ＝１５：平均分子量１１００）-ビオチンコンジュゲートのマウス線維芽細胞株NIH3T3へのアンカーリング
合成例１と同様にしてそれぞれのポリエチレンオキシドオレイルエーテル活性化体を得て、例１と同様にしてそれぞれのポリエチレンオキシドオレイルエーテル-ビオチンコンジュゲート原液を得た。さらに例２と同様にして、それぞれのポリエチレンオキシドオレイルエーテル-ビオチンコンジュゲートをNIH3T3細胞に反応させ、さらにフルオレセイン標識ストレプトアビジンを反応させて共焦点レーザースキャニング顕微鏡で観察し細胞膜修飾について確認した。その結果を表１に示す。その結果、ポリエチレンオキシドオレイルエーテル-ビオチンコンジュゲート液で処理されたすべてのNIH3T3の細胞膜にフルオレセイン由来の蛍光が観察された。
【００５０】
例８
ポリエチレンオキシドオレイルエーテル（ｎ＝４０：平均分子量２２５０）-ビオチンコンジュゲートのマウス線維芽細胞株NIH3T3へのアンカーリング
例７と同様にしてポリエチレンオキシドオレイルエーテル（ｎ＝４０：平均分子量２２５０）-ビオチンコンジュゲートを得て、同様にNIH3T3とインキュベートし、さらにフルオレセイン標識ストレプトアビジンを反応させて共焦点レーザースキャニング顕微鏡で観察し細胞膜修飾について確認した。
【００５１】
例９
ポリエチレンオキシドオレイルエーテル（ｎ＝１８０：平均分子量８４００）-ビオチンコンジュゲートのマウス線維芽細胞株NIH3T3へのアンカーリング
例７と同様にしてポリエチレンオキシドオレイルエーテル（ｎ＝１８０：平均分子量８４００）-ビオチンコンジュゲート得て、同様にNIH3T3とインキュベートし、さらにフルオレセイン標識ストレプトアビジンを反応させて共焦点レーザースキャニング顕微鏡で観察し細胞膜修飾について確認した。
例７から例９の結果を表１に示す。また、例９の結果を図４に示す。ポリエチレンオキシドオレイルエーテル-ビオチンコンジュゲート液で処理されたすべてのNIH3T3細胞の細胞膜にフルオレセイン由来の蛍光が観察され、ポリエチレンオキシドのエチレンオキサイドの付加モル数を１５から１８０まで変えてもいずれも細胞膜にアンカーリングできることが確認された。
【００５２】
例１０
ポリエチレンオキシドステアリルエーテル（ｎ＝１５、平均分子量１１００）-ビオチンコンジュゲートのマウス線維芽細胞株NIH3T3へのアンカーリング
合成例１と同様にポリエチレンオキシドステアリルエーテル（ｎ＝１５、平均分子量１１００）の活性化体を得て、実施例１と同様にしてポリエチレンオキシドステアリルエーテル（ｎ＝１５、平均分子量１１００）-ビオチンコンジュゲート原液を得た。さらに例２と同様にして、ポリエチレンオキシドステアリルエーテル（ｎ＝１５、平均分子量１１００）-ビオチンコンジュゲートをNIH3T3とインキュベートし、さらにフルオレセイン標識ストレプトアビジンを反応させて共焦点レーザースキャニング顕微鏡で観察し細胞膜修飾について確認した。その結果を表１に示す。その結果、ポリエチレンオキシドステアリルエーテル-ビオチンコンジュゲート液で処理されたNIH3T3細胞の細胞膜にフルオレセイン由来の蛍光が観察され、脂肪族炭化水素基の不飽和のオレイル基を飽和のステアリル基に変更しても細胞膜にアンカーリングすることが確認された。しかし、オレイル基化合物の方がステアリル基化合物に比べてより強い蛍光が観察されたことより、使用した細胞株にはオレイル基化合物の方がより好ましいことが分かった。
合成例２  蛍光標識（フルオレセイン）ポリエチレンオキシド修飾ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンの合成
【００５３】
合成例１と同様の方法にて蛍光標識（フルオレセイン）−ポリエチレンオキシド（ｎ＝１１３、平均分子量５０００）の末端活性化体５g（１mmol）を得て、クロロホルム１０ｍLに溶解し蛍光標識（フルオレセイン）−ポリエチレンオキシド活性化体溶液を得た。ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン０．８g（１．１mmol）とトリエチルアミン０．１g(１．１mmol)とをクロロホルム１０ｍLに溶解し、蛍光標識（フルオレセイン）−ポリエチレンオキシド活性化体溶液に添加し４０℃にて反応を行った。反応後ろ過して未反応のジオレオイルホスファチジルエタノールアミンを除去し、酢酸エチル１００ｍLおよびヘキサン１００ｍLを用いて晶析を行い、結晶４．８ｇを得た。
【００５４】
例１１
蛍光標識（フルオレセイン）-ポリエチレンオキシド（ｎ＝１１３、平均分子量５０００）修飾ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンのマウス線維芽細胞株NIH3T3へのアンカーリング
例２と同様にして、蛍光標識（フルオレセイン）-ポリエチレンオキシド修飾ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン溶液をNIH3T3とインキュベートし、共焦点レーザースキャニング顕微鏡で観察し細胞膜修飾について確認した。その結果を表１及び図５に示す。蛍光標識（フルオレセイン）-ポリエチレンオキシド修飾ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンで処理されたすべてのNIH3T3の細胞膜にフルオレセイン由来の蛍光が観察され、細胞膜にアンカーリングできることが確認された。また、ポリエチレンオキシドオレイルエーテル-ビオチンコンジュゲートを用いた場合に比べて、細胞膜へのアンカーリングの保持時間が長いことより、脂肪族炭化水素基が２本鎖であるポリエチレンオキシド修飾ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン化合物を用いた方がより安定に細胞膜に保持されることが確認された。
【００５５】
例１２
アミノポリエチレンオキシドオレイルエーテル（ｎ＝９０、平均分子量４４００）-ビオチンコンジュゲートのマウス線維芽細胞株NIH3T3へのアンカーリング
アミノポリエチレンオキシドオレイルエーテル(ｎ＝９０、平均分子量４４００)を用いて合成例１と同様の方法にて活性化アミノポリエチレンオキシドオレイルエーテルを得た。得られた活性化アミノポリエチレンオキシドオレイルエーテルを用いて例４と同様にしてアミノポリエチレンオキシドオレイルエーテル- ビオチンコンジュゲート原液を調製し、NIH3T3細胞膜にアンカーリングし、フルオレセイン標識ストレプトアビジンを反応させ細胞を共焦点レーザースキャニング顕微鏡で観察することにより確認した。結果を表１に示す。その結果、アミノポリエチレンオキシドオレイルエーテルを用いてビオチンとの結合様式をアミド結合としても細胞膜へのアンカーリングの効果は変わりなく良好であることが確認された。
【００５６】
例１３（比較例）
ポリエチレンオキシドオレイルエーテル(ｎ＝９０、平均分子量４４００)に対するフルオレセイン標識ストレプトアビジンの非特異的結合の有無の確認
合成例１で得られた活性化ポリエチレンオキシドオレイルエーテル溶液に1Ｍトリス緩衝液 (pH8.0)を0.02 mL及び組織培養用 リン酸緩衝液生理食塩水（同上）を0.78 mL添加し反応液とした。反応液を撹拌した後、室温（約２５℃）で１時間放置した。放置後、この反応液をポリエチレンオキシドオレイルエーテルサクシネート原液とした。例２と同様にポリエチレンオキシドオレイルエーテルサクシネート原液をダルベッコ変法イーグル培地で1/100倍に希釈し、ポリエチレンオキシドオレイルエーテルサクシネート溶液およびビオチン-NH2溶液を調製し、NIH3T3細胞を同様に処理してフルオレセイン標識ストレプトアビジンを反応させ共焦点レーザースキャニング顕微鏡で観察した。結果を表１に示す。その結果、ポリエチレンオキシドオレイルエーテルサクシネート溶液で処理されたすべての細胞においてフルオレセイン由来の蛍光は全く観察されなかった。このことよりポリエチレンオキシドオレイルエーテルサクシネートで処理した細胞に非特異的にフルオレセイン標識ストレプトアビジンが結合しないことが確認された。
【００５７】
例１４（比較例）
ビオチン-NH2の細胞膜への非特異的結合の有無の確認
1 nmolのEZ-Link(登録商標) Biotin-PEO-Amineを0.2 mLのジメチルスルホキシドに溶解し、Biotin-PEO-Amine溶液とした。Biotin-PEO-Amine溶液全量に1Ｍトリス緩衝液 (pH8.0)を0.02 mL及び組織培養用 リン酸緩衝液生理食塩水（同上）を0.78 mL添加し混合液とした。混合液を撹拌した後、室温（約２５℃）で１時間放置した。放置後、この混合液をビオチン-NH2原液とした。例２と同様にビオチン-NH2原液をダルベッコ変法イーグル培地で1/100倍に希釈し、ビオチン-NH2溶液を調製し、NIH3T3細胞を同様に処理してフルオレセイン標識ストレプトアビジンを反応させ共焦点レーザースキャニング顕微鏡で観察した。結果を表１に示す。
その結果、ビオチン-NH2溶液で処理されたすべての細胞においてフルオレセイン由来の蛍光は全く観察されなかった。このことよりビオチンそのものも細胞に結合しないことが確認された。
【００５８】
例１５（比較例）
オレイン酸-ビオチンのマウス線維芽細胞株NIH3T3へのアンカーリング
合成例３  オレイン酸-ビオチン溶液およびポリエチレンオキシド(ｎ＝１１４、平均分子量５０００)-ビオチン液の調製
合成例１と同様にオレイン酸（分子量３７９）の活性化体を得た。得られた活性化オレイン酸（分子量３７９）及び活性化ポリエチレンオキシド(ｎ＝１１４、平均分子量５０００)を用いて実施例１と同様に、オレイン酸-ビオチン液及びポリエチレンオキシド(ｎ＝１１４、平均分子量５０００)-ビオチン液を調製した。得られた活性化オレイン酸（分子量379）溶液および活性化ポリエチレンオキシド溶液を用いて例２と同様にNIH3T3とインキュベートし、さらにフルオレセイン標識ストレプトアビジンを反応させて共焦点レーザースキャニング顕微鏡で観察し細胞膜修飾について確認した。結果を表１に示す。その結果、オレイン酸-ビオチン溶液および活性化ポリエチレンオキシド溶液で処理されたすべての細胞においてフルオレセイン由来の蛍光は全く観察されなかった。
【００５９】
例１６（比較例）
ポリエチレンオキシド(ｎ＝１１４、平均分子量５０００)-ビオチンのマウス線維芽細胞株NIH3T3へのアンカーリング
ポリエチレンオキシド（ｎ＝１１４、平均分子量５０００）については、合成例１と同様に合成した後、イオン交換カラムにて精製し、その活性体を得た。
得られた活性化ポリエチレンオキシド(ｎ＝１１４、平均分子量５０００)を用いて例２と同様にNIH3T3とインキュベートし、さらにフルオレセイン標識ストレプトアビジンを反応させて共焦点レーザースキャニング顕微鏡で観察し細胞膜修飾について確認した。結果を表１及び図６に示す。その結果、ポリエチレンオキシド(ｎ＝１１４、平均分子量５０００)-ビオチン溶液で処理されたすべての細胞においてフルオレセイン由来の蛍光は全く観察されなかった。例１５および例１６の結果より、細胞膜修飾には脂肪族炭化水素基のみ、また親水性基のみ含有する化合物を用いることは困難であり、疎水性基と親水性基の両方の存在が必要であることが確認された。
【００６０】
例１７
ポリエチレンオキシドノニルフェニルエーテル（ｎ＝４０、平均分子量２１６０）-ビオチンコンジュゲートのマウス線維芽細胞株NIH3T3へのアンカーリング
合成例１と同様して活性化ポリエチレンオキシドノニルフェニルエーテル溶液を得て、例１と同様にしてポリエチレンオキシドノニルフェニルエーテル（ｎ＝４０、平均分子量２１６０）-ビオチンコンジュゲートを調製し、例２と同様にNIH3T3細胞に反応させ、さらにフルオレセイン標識ストレプトアビジンを反応させて共焦点レーザースキャニング顕微鏡で観察し細胞膜修飾について確認した。結果を表１に示す。その結果、ポリエチレンオキシドノニルフェニルエーテル（ｎ＝４０、平均分子量２１６０）-ビオチン溶液で処理されたすべての細胞においてフルオレセイン由来の蛍光は全く観察されなかった。その結果、ノニルフェニル基に代表されるバルキーな置換基を脂肪族炭化水素基に含有する化合物は細胞膜に安定に導入されないことが確認された。
【００６１】
【表１】
0004493899.tif 000004
【００６２】
表中、++は視野（１０００倍）中すべての細胞の細胞膜にかなり強い蛍光活性が観察されたことを示し；+は視野（１０００倍）中すべての細胞の細胞膜に蛍光活性が観察されたことを示し；-は視野（１０００倍）中すべての細胞の細胞膜に蛍光活性がほとんど観察されなかったことを示す。
【００６３】
【表２】
0004493899.tif 000005
【００６４】
【発明の効果】
本発明の細胞は、生理活性物質又はプローブなどの修飾対象物質で安定に細胞膜修飾されており、細胞膜修飾にあたって細胞への傷害も生じていないので、細胞膜修飾による所望の特性を安定かつ長期に発現できるという特徴がある。また、本発明により提供される細胞膜の修飾方法は、上記の特徴を有する細胞を効率的かつ安定に提供できるという特徴がある。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ポリエチレンオキシドオレイルエーテル(ｎ＝９０、平均分子量４４００) -ビオチンコンジュゲートに結合したフルオレセイン標識ストレプトアビジンで膜修飾されたマウス線維芽細胞株NIH3T3（例２）の顕微鏡写真である。
【図２】  ポリエチレンオキシドオレイルエーテル(ｎ＝９０、平均分子量４４００) -ビオチンコンジュゲートに結合したフルオレセイン標識ストレプトアビジンで膜修飾されたマウス線維芽細胞株NIH3T3（例２）の切片の顕微鏡写真である。
【図３】  ポリエチレンオキシドオレイルエーテル（ｎ＝９０、平均分子量４４００）- EGFPコンジュゲートにより膜修飾された浮遊細胞（例６）をフローサイトメーターで観察した結果を示した図である。
【図４】  ポリエチレンオキシドオレイルエーテル（ｎ＝１８０：平均分子量８４００）-ビオチンコンジュゲートに結合したフルオレセイン標識ストレプトアビジンで膜修飾されたマウス線維芽細胞株NIH3T3（例９）の顕微鏡写真である。
【図５】  蛍光標識（フルオレセイン）-ポリエチレンオキシド修飾ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンで膜修飾されたマウス線維芽細胞株NIH3T3（例１１）の顕微鏡写真である。
【図６】  ポリエチレンオキシド(ｎ＝１１４、平均分子量５０００)-ビオチンにより膜修飾を試みたマウス線維芽細胞株NIH3T3（例１６：比較例）の顕微鏡写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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