(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウシの脳若しくはそのホモジェネート、又はヒトの頭脊柱液をストレプトマイシンと接触させることを特徴とするＰｒＰｓｃの検出方法。
【請求項２】
ａ）ストレプトマイシンをウシの脳ホモジェネート、又はヒトの頭脊柱液の懸濁液に添加し、溶液を生成し、
ｂ）前記溶液に緩衝液を添加して、加熱し、次に得られた溶液を遠心分離し、上清から残渣を分離し、
ｃ）電気泳動ゲル上での遊走、転移及び免疫検出後にＰｒＰｓｃを検出することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ａ）プロテイナーゼＫをウシの脳ホモジェネート、又はヒトの頭脊柱液の懸濁液に添加し、
ｂ）ストレプトマイシンを前記懸濁液に添加し、
ｃ）得られた懸濁液を緩衝液に添加して、加熱し、次に得られた溶液を遠心分離し、上清から残渣を分離し、
ｄ）電気泳動ゲル上での遊走、転移及び免疫検出後にＰｒＰｓｃを検出することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ストレプトマイシンと接触させる前に、ウシの脳ホモジェネート、又はヒトの頭脊柱液をブドウ糖溶液中で均質化させることを特徴とする請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
加熱ステップは、６０〜１５０℃の温度上昇に相当することを特徴とする請求項２から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ウシの脳若しくはそのホモジェネート、又はヒトの頭脊柱液中のＰｒＰｓｃを沈降又は検出するための薬剤であって、ストレプトマイシンを含有することを特徴とする薬剤。
【請求項７】
ウシの脳ホモジェネート、又はヒトの頭脊柱液中のＰｒＰｓｃを除去するための薬剤であって、ストレプトマイシンを含有することを特徴とする薬剤。
【請求項８】
ウシの脳若しくはそのホモジェネート、又はヒトの頭脊柱液中のＰｒＰｓｃを沈降又は検出するためのキットであって、ストレプトマイシンを含有することを特徴とするキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、硫酸ストレプトマイシンによる全ＰｒＰｓｃ沈降法、及び液体又は溶液からのＰｒＰｓｃ免疫検出又は除去のためのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰｒＰ又は細胞プリオン蛋白に関してＰｒＰｃと示される天然又は正常プリオン蛋白は、哺乳動物のリンパ系及びニューロン細胞中で広く発現する糖タンパクである。
【０００３】
ＰｒＰｃの構造変化は、プロテイナーゼＫに耐性を有する病原蛋白ＰｒＰｓｃの出現及び増殖に至らせる。この病原蛋白は、ＰｒＰｓｃ又はＰｒＰｒｅｓと差別なく呼ぶことができる。動物器官中にＰｒＰｓｃが蓄積することは、多数の疾病、特に小型反芻動物の振戦病、大鹿及び羚羊の慢性消耗病（又はｃｈｒｏｎｉｃ  ｗａｓｔｉｎｇ  ｄｉｓｅａｓｅ「ＣＷＤ」）、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）及びヒトにおけるクロイツフェルト・ヤコブ病の原因である。
【０００４】
ＢＳＥに感染した家畜において、２〜６年の潜伏期後に遅発出現すること、及び症状発展が遅いことにより、疫学的モデルの発展は、著しく遅れた。ＢＳＥは、摂取によってヒトに伝染可能であり、かつクロイツフェルト・ヤコブ病の新規な形状（ｖＭＣＪ）の出現に至らせた。
【０００５】
病原蛋白ＰｒＰｓｃの検出は、感染した健康な動物において、疾病の発展前には困難であり、かつ特に病気の動物において血液及び尿中では困難である。現在のところ、ヒトの食料用の動物において存在するＰｒＰｓｃは、感染した組織の摂取時にヒトに伝達することが明らかである。従って公衆衛生の主要な目標は、ヒトの消費用の動物において、それらを食物連鎖から取り出すために、ＰｒＰｓｃを検出して、この伝染を回避することである。
【０００６】
従って、生体試料又は動物におけるＰｒＰｓｃの存在検出は、極めて重要になっており、幾つもの研究者チームが、免疫学的検出方法を発展させている（国際公開第０２／０８６５１１号パンフレット）。その上、ｖＭＣＪ治療のためにペプチド、小分子又は阻害物質のＰｒＰｓｃでの複合体生成方法が、活発な研究の対象となっている。しかしながら、先行技術の方法は、ＰｒＰｓｃが、生体試料中で少量である時、ＰｒＰｓｃを信頼に値するように同定するという困難な問題に絶えず遭う。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明者らは、アミノグリコシド、及び特にＩＩ群のアミノグリコシド、及び更に特にはストレプトマイシンの新規な特性を明らかにし、かつＰｒＰｓｃにより複合体を生成し、かつそれを沈降させるこれら抗生物質の能力を証明した。
【０００８】
このようにして、発明者らは、種々の動物起源に由来し、かつプリオンを含む生体試料中にアミノグリコシドを添加することは、結果として、プリオンの３つのバンドの見かけ分子量の増大をもたらすことを観察した。この観察及び続く実験によって、アミノグリコシドが、ＰｒＰｓｃにより複合体生成すること、かつこの複合体生成が、結果として当業者が従来使用した方法と比べ、ＰｒＰｓｃの沈降、及びＰｒＰｓｃを検出する可能性の著しい増加をもたらすことを、発明者らが証明することが可能になった。
【０００９】
従って、本発明は、プリオンによる疾病の診断の際に使用する、又は生物学的液中に存在するプリオンを除去するためのＰｒＰｓｃ沈降による濃縮方法であって、動物又はヒト生体に由来する、又はそれから得られた組織又は生物学的流体の懸濁液を、好ましくはアミノグリコシド系から選択された抗生物質、好ましくはストレプトマイシンと接触させることを特徴とする方法を対象とする。
【００１０】
より正確には、本発明による方法は、次のステップを含む：
ａ）アミノグリコシドを動物又はヒト生体に由来する、又はそれから得られた組織又は生物学的流体の懸濁液に添加し、溶液を生成し、
ｂ）前記溶液に緩衝液を添加して、加熱し、次に得られた溶液を遠心分離し、上清から残渣を分離し、
ｃ）電気泳動ゲル上での遊走、転移及び免疫検出後にＰｒＰｓｃを検出する。
【００１１】
本発明の方法は、プロテイナーゼ、及び特にプロテイナーゼＫによって定量する試料の消化による追加のステップを含むことも同様に可能である。このようにして、本発明の方法は、次のステップを含む：
ａ）プロテイナーゼ、例えばプロテイナーゼＫを動物又はヒト生体に由来する、又はそれから得られた組織又は生物学的流体の懸濁液に添加し、
ｂ）アミノグリコシドを前記懸濁液に添加し、
ｃ）得られた懸濁液を緩衝液に添加して、加熱し、次に得られた溶液を遠心分離し、上清から残渣を分離し、
ｄ）電気泳動ゲル上での遊走、転移及び免疫検出後にＰｒＰｓｃを検出する。
【００１２】
より正確には、本発明による方法は、次のステップを含む：
ａ）５％のブドウ糖溶液での動物又はヒト生体から得られた生物学的流体又は組織の均質化による１０％の懸濁液の調製をし、
ｂ）プロテイナーゼＫを得られた１００μｌの懸濁液に添加し、次に３７℃で１時間インキュベートし、
ｃ）アミノグリコシドを懸濁液に添加し、次に３７℃で２時間目にインキュベートし、
ｄ）得られた懸濁液を緩衝液に添加して、加熱し、次に得られた溶液を遠心分離し、上清から残渣を分離し、
ｅ）Ｌａｅｍｍｌｉ、Ｎａｔｕｒｅ  ２２７（１９７０）、６８０−６８５によって記載されたように、Ｌａｅｍｍｌｉの変性緩衝液及び５０％ｖ／ｖの尿素８Ｍの溶液５０μｌ中で残渣を懸濁する。強い渦状の攪拌後、５分間１００℃で加熱し、１２０００ｇで遠心分離し、上清をＳＤＳ  ＰＡＧＥに対して遊走させるために、上清を回収する。
ｆ）Ｌａｅｍｍｌｉ、Ｎａｔｕｒｅ  ２２７（１９７０）、６８０−６８５によって記載されたように、電気泳動ゲルに対する遊走、特にドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル１５％（ＳＤＳ  ＰＡＧＥ）に対する一次元電気泳動後、蛋白は、ニトロセルロース膜上の電気泳動によって転移し、かつアミノ酸１２６−１６０からなる特異エピトープを認識するモノクローナル抗体により、周囲温度で６０分間、免疫ブロットされる。二次抗体（１／５０００）は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＩｇＧ  Ｈ＋Ｌ）と結合したマウス免疫グロブリンの重及び軽鎖に向けられるヤギ抗体である。ブロットは次に洗浄され、かつ信号が、フィルム（Ｂｉｏｍｅｘ  ｌｉｇｈｔ、Ｋｏｄａｋ）上にＥＣＬキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）によるか、ｓｕｐｅｒ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｕｌｔｒａ（Ｐｉｅｒｃｅ）、及びＦｌｕｏｒ  Ｓ．Ｍｕｌｔｉｍａｇｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）上の視覚化による化学発光で検出される。
【００１３】
本発明による方法は、超遠心分離を必要としないという利点を有する。本発明による方法は、プリオン蛋白によるアミノグリコシド複合体生成、及びアミノグリコシドによるプリオン蛋白の沈降にも同様に関する。
【００１４】
本発明の実施態様によれば、生物学的組織は、脳、又は他の動物若しくはヒトの組織、又は頭脊柱液若しくは血清のような生物学的流体に由来するか、又はそれから得られる。
【００１５】
本発明による方法において使用されるプロテイナーゼは、プリオン蛋白の正常形状を含む、存在する蛋白を消化することが可能であること、及びこの蛋白の病理学的形状を消化することが不可能であることのために選択されたプロテイナーゼである。好適には、プロテイナーゼＫのことである。
【００１６】
本発明の好ましい実施態様に従えば、前記アミノグリコシドと接触させる前に組織は、ブドウ糖溶液中で均質化される。好ましくは、５％のブドウ糖溶液を使用する。
【００１７】
プロテイナーゼＫ及びアミノグリコシドと生体試料を接触させた結果生じる懸濁液に、１００μｌのＬａｅｍｍｌｉの緩衝液を加えた後の、加熱ステップは、６０〜１５０℃、好ましくは約１００℃の温度上昇に相当する。
【００１８】
本発明の好ましい実施態様に従えば、アミノグリコシドは、ＩＩ群のアミノグリコシド、及び好ましくはストレプトマイシン又はその誘導体の１種である。
【００１９】
本発明は、ＰｒＰｓｃの沈降、検出、免疫組織化学での検出でさえも、及び／又は診断のためのかかるアミノグリコシドの使用も同様に対象とする。
【００２０】
本発明は、生物学的流体からのＰｒＰｓｃ除去のためのかかるアミノグリコシドの使用を更に対象とする。
【００２１】
最後に、本発明は、ＰｒＰｓｃの存在に関連する疾患の診断キットであって、かかるアミノグリコシドを含むことを特徴とするキットに同様に関する。
【００２２】
本発明のその他の利点及び特徴は、生体試料がアミノグリコシドと接触する時のＰｒＰｓｃ検出増大に関する以下に続く実施例を読めば現れるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下の実施例２及び３が行われた生体試料は、５％のブドウ糖溶液中に置かれたウシの脳のホモジェネートから得られた。１０ｍｇの脳組織に対応する、この懸濁液の１００μｌの容量が、以下に続く実験で使用される。従って各試料は、プロテイナーゼＫを添加する１００μｌからなる。３７℃で１時間後、ストレプトマイシンを添加する又は添加しない。溶液は渦状に攪拌され、かつ更に１時間３７℃でインキュベートされる。１００μｌのＬａｅｍｍｌｉの変性緩衝液を添加した後、５分間１００℃で加熱し、かつ５分間１２０００ｇで遠心分離し、次に上清をＳＤＳ  ＰＡＧＥに対して遊走させるために、上清を回収する。残渣は、同様に回収され、かつそれらに、５０％ｖ／ｖの尿素８Ｍの溶液５０μｌ及びＬａｅｍｍｌｉの緩衝液を添加する。強い渦状の攪拌後、５分間１００℃で加熱し、かつ５分間１２０００ｇで遠心分離し、次に上清をＳＤＳ  ＰＡＧＥに対して遊走させるために、上清を回収する。
【実施例１】
【００２４】
実施例１は、漸増濃度（０μｇ；６２．５μｇ；１２５μｇ；５００μｇ及び２０００μｇ）のストレプトマイシンが、振戦病に罹患したヒツジの脳当量９２０μｇから抽出された一定量のＰｒＰｓｃに添加され、次に混合物が遠心分離される、テストに関する図１Ａ及び１Ｂを参照する。上清が、ウェスタンブロットによる免疫検出（図１Ａ）及びＰｒＰｓｃのバンドの平均分子量測定（図１Ｂ）に関して使用される。結果は、ストレプトマイシン量の増加、すなわち０；６２、５、１２５、５００、１０００及び２０００μｇの添加により、最低のストレプトマイシン濃度で、非グリコシル化蛋白のバンドが、見かけ分子量の増大を最初に示すことを確認することが可能になることを示している。次に、複合体生成は、モノグリコシル化蛋白のバンドに関し、かつ最後にビグリコシル化蛋白は、ストレプトマイシン濃度が、より高い時に複合体生成される。
【００２５】
一定濃度でのＰｒＰｓｃの各バンドに関連したストレプトマイシン分子数は、各バンドの分子量を測定して、算定される。発明者らは、２０００μｇのストレプトマイシン存在下でのＰｒＰｓｃの各バンドの見かけ分子量の増大が、ＰｒＰｓｃのバンド当たり１０〜１２個のストレプトマイシン分子の引っ掛かり（ａｃｃｒｏｃｈａｇｅ）に対応すると評価した。
【実施例２】
【００２６】
実施例２は、漸増濃度（０μｌ；５μｌ；１０μｌ；２０μｌ）のストレプトマイシン１ｇ／ｍｌが、上記に示すように調製された一定量の生体試料に添加される、テストに関する図２を参照する。ストレプトマイシンの非存在下で、ＰｒＰｓｃの全バンドが、上清中にあるように同定された。かつ徐々に、それらは、残渣及び上清中で同時に検出されるようになる。上清中に存在するＰｒＰｓｃ量は、沈降物中で量が徐々に増加する間に、徐々に減少する。２０μｌのストレプトマイシンの添加により、その時には沈降物中でしか検出されないＰｒＰｓｃを完全に沈降させる。
【実施例３】
【００２７】
実施例３は、図３を参照する。
【００２８】
実施例２の実験を反復するが、実施例２と比べて１／２５に希釈された同一の脳試料により、かつ脳懸濁液へのプロテイナーゼＫ及びストレプトマイシンの同時添加後の１時間に、インキュベーション期間を減少させる。結果は、ＰｒＰｓｃのバンドが、ストレプトマイシンの非存在下で上清中で、かついかなる濃度であろうとストレプトマイシンの存在下で残渣中でしか検出されないということである。
【実施例４】
【００２９】
実施例４は、図４Ａ、４Ｂ及び４Ｃを参照する。
【００３０】
５％のブドウ糖溶液中の、ＢＳＥに感染したウシの脳の１０％のホモジェネートの一連の１：２の原希釈溶液から、各々が１００μｌの同じ希釈溶液を含む３セットの管を調製する。
【００３１】
（純粋から１／６４の）第１の希釈溶液セットの各管に、１０μｌの容量における１μｇのプロテイナーゼＫを添加する。
【００３２】
（１／２から１／２５６の）第２のセットの各管に、１０μｌの容量における５μｌのストレプトマイシン及び１μｇのプロテイナーゼＫを同時に添加する。
【００３３】
（１／２から１／２５６の）第３のセットの各管に、１０μｌの容量における１０μｌのストレプトマイシン及び１μｇのプロテイナーゼＫを同時に添加する。
【００３４】
全ての管は、１時間３７℃でインキュベートされ、次に１００μｌのＬａｅｍｍｌｉの変性緩衝液を添加する。５分間１００℃で加熱し、５分間１２０００ｇで遠心分離し、かつＳＤＳ  ＰＡＧＥに対し沈殿させるために、第１管セットから上清を回収する。第２及び第３管セットの管の上清は、除去され、かつ各管に５０μｌの５０％ｖ／ｖの尿素８Ｍ及びＬａｅｍｍｌｉの変性緩衝液を添加する。強い渦状の攪拌後、５分間１００℃で加熱し、１２０００ｇで遠心分離し、かつ第２及び第３管セットに関して上清を回収する。
【００３５】
図４Ａは、ストレプトマイシン非存在下で検出されたＰｒＰｓｃの検出限界が、１／１６であることを示す。
【００３６】
図４Ｂは、５μｌのストレプトマイシン存在下で沈降したＰｒＰｓｃ量を示す。ＰｒＰｓｃは、１／１２８の希釈まで検出可能であり、このことは、検出閾値が著しく増加したことを示す。
【００３７】
図４Ｃは、１０μｌのストレプトマイシン存在下で沈降したＰｒＰｓｃ量を示す。図４Ｃは、最も希釈した（１／２５６）試料に対しても、検出が可能であり、かつ代表的であることを示す。
【実施例５】
【００３８】
比較例
基準技術は、１．２ｍｌの脳ホモジェネートからのＰｒＰｓｃ抽出に基づく（Ｍａｄｅｃ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ、２８（２０００）３５３−３６２）。ホモジェネートは、１００ｍｇの脳組織当たり１０μｇのプロテイナーゼＫにより３７℃で１時間処理される前に、直径０．４ｍｍの針を通して押し込められる。サルコシル（１０％）及び１０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．４）を添加した後、試料は、周囲温度で１５分間インキュベートされ、次に１０％のショ糖クッションに対し４時間２０℃で２４５０００ｇで遠心分離される（Ｂｅｃｋｍａｎ  ＴＬ  １００  ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅｕｓｅ）。最終的に残渣は、５０μｌのＬａｅｍｍｌｉの変性緩衝液中で溶液懸濁状態に戻し、５分間１００℃で加熱し、かつ更に５分間１２０００ｇで遠心分離する。ＳＤＳ  ＰＡＧＥに対する遊走のために、上清を回収する。
【００３９】
本発明の技術によれば、基準技術に記載された脳の破砕後に得られた１００μｌの脳懸濁液を使用する。１μｇのプロテイナーゼＫを添加し、かつ１時間、最初にインキュベートする。次に２０μｌのストレプトマイシンを添加し、かつ１時間、２回目にインキュベートする。次に１００μｌのＬａｅｍｍｌｉの変性緩衝液を添加する。５分間１００℃での加熱後、２分間１２０００ｇで遠心分離する。上清を除去し、次に５０μｌの５０％ｖ／ｖの尿素８Ｍ、及びＬａｅｍｍｌｉの変性緩衝液を添加する。強い渦状の攪拌後、５分間１００℃で加熱され、かつ更に２分間１２０００ｇで遠心分離する。ＳＤＳ  ＰＡＧＥに対する遊走のために、上清を回収する。
【００４０】
表１にある結果：結論として、硫酸ストレプトマイシンの使用は、僅かに陽性の場合のより良い検出を可能にし、かつその上、時間が掛かり、かつ高価な超遠心分離を回避することを可能にする。
【実施例６】
【００４１】
ｒｅｃＰｒＰ（組み換えプリオン蛋白）の試料は、ｒｅｃＰｒＰ溶液（４２μＭ）を当量の水又はストレプトマイシン溶液（１ｇ／ｍｌ）で希釈して調製する。ストレプトマイシンのみに関する基準は、０．５ｇ／ｍｌの溶液を使用して調製する。
【００４２】
試料は、新たに分割された雲母に対する１０μｌのこれらの溶液の沈殿及び２４時間３７℃での乾燥によって調製される。
【００４３】
非接触モードで、三脚スキャナ１００μｍを備えた、１Ｈｚの走査周波数のシリコーンプローブを有する、高い共振周波数（Ｆ０＝３２０ｋＨｚ）のピラミッド型カンチレバを使用するＴｈｅｒｍｏｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  ＡＦＭを用いた映像技術による解析を行う。映像処理は、ソフトウェアＳＰＭｌａｂ  ５．１によって行い、かつフィルタをかけずに示す。
【００４４】
図６から、ｒｅｃＰｒＰの映像のみが、特徴を示す円形凝集体の構造を示しているということになる。ストレプトマイシンフィルムのみが、擬似結晶質表面組織を示している。混合物を含むフィルムは、非晶質表面を示す。いかなる結晶質又は球形組織も確認されない。従ってストレプトマイシン及びＰｒＰの間の相互作用は、混合物の２つの成分の表面組織の特性を阻害する。
【実施例７】
【００４５】
好ましくは非溶血、かつ細胞片のない頭脊柱液（ＬＣＲ）の死後採取試料を、ＭＪＣに罹患していない患者、及びＭＣＪに罹患した患者において採取する。ＭＪＣに罹患していない患者のＬＣＲ試料、及びＭＣＪに罹患した患者のＬＣＲ試料は、０．０５ｇ／ｍＬ〜０．２ｇ／ｍＬ（０．０５−０．１〜０．２ｇ／ｍＬ）の広範囲な濃度により、ストレプトマイシン溶液と接触させる。渦での均質化後、試料を、１時間３７℃でインキュベートし、次に５分間１２０００ｇで遠心分離する。
【００４６】
得られた残渣は、蛋白抽出緩衝液に取る。１０分間１００℃での加熱後、試料は、再び５分間１２０００ｇで遠心分離する。１５μＬの各上清が、１２％のビス−トリスアクリルアミドＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルに対して沈殿する。並行して、変性緩衝液中で１／１００に希釈した５μＬの脳ＰｒＰｓｃ抽出物が、陽性対照で沈殿した。この抽出物は、クロイツフェルト・ヤコブ病の診断に使用する基準手順により調製した。電気泳動遊走は、一旦濃縮した遊走緩衝液中で４０分間定電圧（２００Ｖ）で行われる。次に蛋白を、１時間定電力（１Ｗ）で２つの黒鉛電極間の半乾燥系によって活性化したＰＶＤＦ膜に転移する。次に直接的免疫学的表示は、西洋ワサビペルオキシダーゼと結合した０．５μｇ／ｍｌの（ヒトＰｒＰのアミノ酸１４５−１５４によって定義される領域、及び動物ＰｒＰの相同的領域を認識する）抗プリオン抗体ＡＣ２３によって確実に行われる。
【００４７】
図７Ａは、ストレプトマイシンが、プロテイナーゼＫによる消化の非存在下でプリオン蛋白に良好に結合されることを示す。実際、０．１ｇ／ｍＬ及び０．２ｇ／ｍＬのストレプトマイシンによる処理後、唯一のバンドが観察され、かつその見かけ分子量は、ストレプトマイシン濃度に比例して変化する。このバンドの見かけの大きさは、０．１ｇ／ｍＬのストレプトマイシンに関して約５０ｋＤａであり、かつ０．２ｇ／ｍＬのストレプトマイシンに関しておおよそ８０ｋＤａである。その上、バンドのプロフィール（湾曲した外観、尾引き（ｔｒａｉｎａｇｅ））は、分子凝集であることを示唆している。
【実施例８】
【００４８】
ＭＪＣに罹患していない患者のＬＣＲ、及びＭＣＪに罹患した患者のＬＣＲは、０．５μｇ／ｍＬ又は１μｇ／ｍＬで使用するプロテイナーゼＫによって消化される。並行して、各試料のアリコートは、プロテイナーゼＫによる消化を受けない。消化は、緩やかに攪拌して、３７℃で１時間行われる。消化後、試料は、最終濃度５０ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシンの存在下で、１時間３７℃でインキュベートし、次に５分間１２０００ｇで遠心分離を行う。
【００４９】
次に蛋白が抽出され、かつ蛋白変性緩衝液の存在下で、加熱によって変性され、次にそれらは、実施例７の手順に従い、ウェスタンブロットで解析される。直接的免疫学的表示は、西洋ワサビペルオキシダーゼと結合した（０．５μｇ／ｍｌで使用する）抗体ＡＣ２３を用いて行われる。
【００５０】
図８Ａは、試料が、ストレプトマイシンによって処理される時、低い強度の唯一のバンドが、観察されることを示す。約３５ｋＤａの見かけ分子量のこのバンドは、専らプロテイナーゼＫによる消化の非存在下で（ＬＣＲ（−）ゲルのトラック５）、陰性試料として見られ、他方で、使用するプロテイナーゼＫ濃度がどのようなものであろうと（ＬＣＲ（＋）ゲルのトラック５、６及び７）、陽性試料として見られ、プリオン蛋白の耐性形状の特徴を示す。
【００５１】
ＬＣＲ中でのプリオン蛋白検出は、ストレプトマイシンの使用によって可能になる。実際、プロテイナーゼＫによる消化の非存在下で、（細胞及び病理学的）全ＰｒＰ検出は、ストレプトマイシンの存在下で増大し、かつ予期せぬことに、ＰｒＰｓｃが、好ましくは検出される。プロテイナーゼＫによる消化後、この技術により、クロイツフェルト・ヤコブ病に罹患していない患者由来のＬＣＲ、及びこの同じ疾病に罹患した患者由来のＬＣＲの間で著しく異なる信号を明らかにすることが可能になる。従って、ストレプトマイシンは、生物学的流体中のＰｒＰｒｅｓ検出に関して、有用性を示す。
【００５２】
その上、ストレプトマイシンのようなアミノグリコシドは、アミノグリコシドとの接触後にＰｒＰｓｃが沈降するために、ＰｒＰｓｃの除去に使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１Ａ】振戦病に罹患し、かつ次第に多くなる量のストレプトマイシンと接触した、ヒツジの脳の試料におけるＰｒＰｓｃの、１５％のポリアクリルアミドゲルに対する電気泳動、転移及び免疫検出後の検出の比較例である。
【図１Ｂ】漸増量のストレプトマイシンとの混合前及び後の、図１ＢのＰｒＰｓｃの各バンドの測定された平均分子量の比較グラフである。
【図２】可変量のストレプトマイシンの非存在下及び存在下での、ＰｒＰｓｃ蛋白が非常に豊富な懸濁液の２時間目のインキュベーションの結果得られた、それぞれ上清及び沈降物におけるＰｒＰｓｃの、１５％のポリアクリルアミドゲルに対する電気泳動、転移及び免疫検出後の検出の比較例である。
【図３】少量のＰｒＰｓｃを含む懸濁液への、プロテイナーゼＫ及びストレプトマイシンの同時添加が、結果として上清からのＰｒＰｓｃ消失及び沈降物中のその出現をもたらすことを示す。
【図４Ａ】１５％のポリアクリルアミドゲルに対する電気泳動、転移及び免疫抑制後の、漸増量のストレプトマイシン添加の際のＰｒＰｓｃの検出閾値の増加を示す。
【図４Ｂ】１５％のポリアクリルアミドゲルに対する電気泳動、転移及び免疫抑制後の、漸増量のストレプトマイシン添加の際のＰｒＰｓｃの検出閾値の増加を示す。
【図４Ｃ】１５％のポリアクリルアミドゲルに対する電気泳動、転移及び免疫抑制後の、漸増量のストレプトマイシン添加の際のＰｒＰｓｃの検出閾値の増加を示す。
【図５】表は、実施例５を参照し、かつ本発明による技術によって得られた９７例の動物の脳に対するＰｒＰｓｃ診断結果の、基準技術によって得られたそれとの比較を示す。
【図６】組み換えプリオン蛋白（ｒｅｃＰｒＰ）のみ（Ａ）、ストレプトマイシン存在下のｒｅｃＰｒＰ（Ｂ）及びストレプトマイシンのみ（Ｃ）の乾燥フィルムに関する非接触モードでの走査型プローブ顕微鏡（ＳＰＭ）の映像を示す。
【図７Ａ】広範囲のストレプトマイシンによって治療した、クロイツフェルト・ヤコブ病に罹患した患者（ＭＣＪ＋）及びＭＣＪに罹患していない患者（ＭＪＣ−）の頭脊柱液（ＬＣＲ）の試料におけるプリオン蛋白の、１２％のビス−トリスアクリルアミドゲルに対する電気泳動、転移及び免疫検出後の検出の比較例である。
【図７Ｂ】図７Ａのトラックにおいて行われた沈殿を要約する。
【図８Ａ】広範囲の濃度に応じたプロテイナーゼＫによって消化された又は消化されない、かつストレプトマイシンによって治療された又は治療されないＭＪＣでのＬＣＲ（＋）及びＬＣＲ（−）の試料の、ウェスタンブロットの結果を示す。免疫学的表示は、抗プリオン抗体によって確実に行われる。
【図８Ｂ】図８Ａのトラックにおいて行われた沈殿を要約する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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