(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
キャンディダ・マグノリエ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｇｎｏｌｉａｅ）ＩＦＯ  ０７０５由来の野生型カルボニル還元酵素に、次の変異：Ｓ４１Ａ、Ｓ４２Ａ、Ｓ４３Ｑ、Ｗ６３Ｉ、Ｙ６４Ｄ、Ｎ６５Ｉ、Ｓ６６Ｎが導入されている酵素変異体であって、次に示す理化学的性質を有するカルボニル還元酵素変異体：
（１）作用：
還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを補酵素として、４−クロロアセト酢酸エチルに作用し、（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルを生成する、
（２）基質特異性：
・４−クロロアセト酢酸エチルに対して強い活性を示し、アセト酢酸エチルには実質的に活性を示さない、・４−クロロアセト酢酸エステルに対して強い活性を示すが、４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルに対して実質的に脱水素酵素活性を有しない、および
（３）補酵素依存性：
補酵素として、還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを与えた場合に強い活性を示すが、還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を与えた場合には実質的に活性を示さない。
【請求項２】
キャンディダ・マグノリエ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｇｎｏｌｉａｅ）ＩＦＯ  ０７０５由来の野生型カルボニル還元酵素に、次の変異：Ｓ４１Ａ、Ｓ４２Ａ、Ｓ４３Ｑ、Ｗ６３Ｉ、Ｙ６４Ｄ、Ｎ６５Ｖ、Ｓ６６Ｌが導入されている酵素変異体であって、次に示す理化学的性質を有するカルボニル還元酵素変異体：
（１）作用：
還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを補酵素として、４−クロロアセト酢酸エチルに作用し、（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルを生成する、
（２）基質特異性：
・４−クロロアセト酢酸エチルに対して強い活性を示し、アセト酢酸エチルには実質的に活性を示さない、・４−クロロアセト酢酸エステルに対して強い活性を示すが、４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルに対して実質的に脱水素酵素活性を有しない、および
（３）補酵素依存性：
補酵素として、還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを与えた場合に強い活性を示すが、還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を与えた場合には実質的に活性を示さない。
【請求項３】
キャンディダ・マグノリエ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｇｎｏｌｉａｅ）ＩＦＯ  ０７０５由来の野生型カルボニル還元酵素に、次の変異：Ｓ４１Ａ、Ｓ４２Ａ、Ｓ４３Ｇ、Ｗ６３Ｉ、Ｙ６４Ｄ、Ｎ６５Ｉ、Ｓ６６Ｌが導入されている酵素変異体であって、次に示す理化学的性質を有するカルボニル還元酵素変異体：
（１）作用：
還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを補酵素として、４−クロロアセト酢酸エチルに作用し、（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルを生成する、
（２）基質特異性：
・４−クロロアセト酢酸エチルに対して強い活性を示し、アセト酢酸エチルには実質的に活性を示さない、・４−クロロアセト酢酸エステルに対して強い活性を示すが、４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルに対して実質的に脱水素酵素活性を有しない、および
（３）補酵素依存性：
補酵素として、還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを与えた場合に強い活性を示すが、還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を与えた場合には実質的に活性を示さない。
【請求項４】
キャンディダ・マグノリエ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｇｎｏｌｉａｅ）ＩＦＯ  ０７０５由来の野生型カルボニル還元酵素に、次の変異：Ｓ４１Ａ、Ｓ４２Ａ、Ｓ４３Ｒ、Ｗ６３Ｉ、Ｙ６４Ｄ、Ｎ６５Ｉ、Ｓ６６Ｎが導入されている酵素変異体であって、次に示す理化学的性質を有するカルボニル還元酵素変異体：
（１）作用：
還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを補酵素として、４−クロロアセト酢酸エチルに作用し、（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルを生成する、
（２）基質特異性：
・４−クロロアセト酢酸エチルに対して強い活性を示し、アセト酢酸エチルには実質的に活性を示さない、・４−クロロアセト酢酸エステルに対して強い活性を示すが、４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルに対して実質的に脱水素酵素活性を有しない、および
（３）補酵素依存性：
補酵素として、還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを与えた場合に強い活性を示すが、還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を与えた場合には実質的に活性を示さない。
【請求項５】
キャンディダ・マグノリエ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｇｎｏｌｉａｅ）ＩＦＯ  ０７０５由来の野生型カルボニル還元酵素に、次の変異：Ｓ４１Ａ、Ｓ４２Ａ、Ｓ４３Ｑ、Ｙ４７Ｒ、Ｗ６３Ｉ、Ｙ６４Ｄ、Ｎ６５Ｉ、Ｓ６６Ｎが導入されている酵素変異体であって、次に示す理化学的性質を有するカルボニル還元酵素変異体：
（１）作用：
還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを補酵素として、４−クロロアセト酢酸エチルに作用し、（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルを生成する、
（２）基質特異性：
・４−クロロアセト酢酸エチルに対して強い活性を示し、アセト酢酸エチルには実質的に活性を示さない、・４−クロロアセト酢酸エステルに対して強い活性を示すが、４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルに対して実質的に脱水素酵素活性を有しない、および
（３）補酵素依存性：
補酵素として、還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを与えた場合に強い活性を示すが、還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を与えた場合には実質的に活性を示さない。
【請求項６】
キャンディダ・マグノリエ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｇｎｏｌｉａｅ）ＩＦＯ  ０７０５由来の野生型カルボニル還元酵素に、次の変異：Ｓ４１Ａ、Ｓ４２Ａ、Ｓ４３Ｒ、Ｙ４７Ｒ、Ｗ６３Ｉ、Ｙ６４Ｄ、Ｎ６５Ｉ、Ｓ６６Ｎが導入されている酵素変異体であって、次に示す理化学的性質を有するカルボニル還元酵素変異体：
（１）作用：
還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを補酵素として、４−クロロアセト酢酸エチルに作用し、（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルを生成する、
（２）基質特異性：
・４−クロロアセト酢酸エチルに対して強い活性を示し、アセト酢酸エチルには実質的に活性を示さない、・４−クロロアセト酢酸エステルに対して強い活性を示すが、４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルに対して実質的に脱水素酵素活性を有しない、および
（３）補酵素依存性：
補酵素として、還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを与えた場合に強い活性を示すが、還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を与えた場合には実質的に活性を示さない。
【請求項７】
キャンディダ・マグノリエ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｇｎｏｌｉａｅ）ＩＦＯ  ０７０５由来の野生型カルボニル還元酵素に、次の変異：Ｓ４１Ａ、Ｓ４２Ｒ、Ｗ６３Ｉ、Ｙ６４Ｄ、Ｎ６５Ｉ、Ｓ６６Ｎが導入されている酵素変異体であって、次に示す理化学的性質を有するカルボニル還元酵素変異体：
（１）作用：
還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを補酵素として、４−クロロアセト酢酸エチルに作用し、（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルを生成する、
（２）基質特異性：
・４−クロロアセト酢酸エチルに対して強い活性を示し、アセト酢酸エチルには実質的に活性を示さない、・４−クロロアセト酢酸エステルに対して強い活性を示すが、４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルに対して実質的に脱水素酵素活性を有しない、および
（３）補酵素依存性：
補酵素として、還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを与えた場合に強い活性を示すが、還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を与えた場合には実質的に活性を示さない。
【請求項８】
キャンディダ・マグノリエ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｇｎｏｌｉａｅ）ＩＦＯ  ０７０５由来の野生型カルボニル還元酵素に、次の変異：Ｓ４１Ａ、Ｓ４２Ｒ、Ｙ４７Ｒ、Ｗ６３Ｉ、Ｙ６４Ｄ、Ｎ６５Ｉ、Ｓ６６Ｎが導入されている酵素変異体であって、次に示す理化学的性質を有するカルボニル還元酵素変異体：
（１）作用：
還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを補酵素として、４−クロロアセト酢酸エチルに作用し、（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルを生成する、
（２）基質特異性：
・４−クロロアセト酢酸エチルに対して強い活性を示し、アセト酢酸エチルには実質的に活性を示さない、・４−クロロアセト酢酸エステルに対して強い活性を示すが、４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルに対して実質的に脱水素酵素活性を有しない、および
（３）補酵素依存性：
補酵素として、還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを与えた場合に強い活性を示すが、還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を与えた場合には実質的に活性を示さない。
【請求項９】
キャンディダ・マグノリエ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｇｎｏｌｉａｅ）ＩＦＯ  ０７０５由来の野生型カルボニル還元酵素に、次の変異：Ｓ４１Ａ、Ｓ４２Ａ、Ｓ４３Ｑ、Ｗ６３Ｉ、Ｙ６４Ｄ、Ｎ６５Ｉ、Ｓ６６Ｎ、Ａ６９Ｅが導入されている酵素変異体であって、次に示す理化学的性質を有するカルボニル還元酵素変異体：
（１）作用：
還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを補酵素として、４−クロロアセト酢酸エチルに作用し、（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルを生成する、
（２）基質特異性：
・４−クロロアセト酢酸エチルに対して強い活性を示し、アセト酢酸エチルには実質的に活性を示さない、・４−クロロアセト酢酸エステルに対して強い活性を示すが、４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルに対して実質的に脱水素酵素活性を有しない、および
（３）補酵素依存性：
補酵素として、還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを与えた場合に強い活性を示すが、還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を与えた場合には実質的に活性を示さない。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載の酵素変異体をコードするＤＮＡ。
【請求項１１】
請求項１０に記載のＤＮＡを有するプラスミド。
【請求項１２】
前記プラスミドがFERM BP-8059が保有するｐＮＴＳ１Ｍ１、FERM P-18389が保有するｐＮＴＳ１Ｍ２、FERM P-18390が保有するｐＮＴＳ１Ｍ３、FERM BP-8060が保有するｐＮＴＳ１Ｍ４、およびFERM P-18648が保有するｐＮＴＳ１Ｍ６である請求項１１に記載のプラスミド。
【請求項１３】
請求項１１に記載のプラスミドにより形質転換された形質転換細胞。
【請求項１４】
前記形質転換細胞が大腸菌である、請求項１３に記載の形質転換細胞。
【請求項１５】
前記形質転換細胞が、FERM BP-8059で特定されるＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＳ１Ｍ１）、FERM P-18389で特定されるＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＳ１Ｍ２）、FERM P-18390で特定されるＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＳ１Ｍ３）、FERM BP-8060で特定されるＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＳ１Ｍ４）、およびFERM P-18648で特定されるＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＳ１Ｍ６）である請求項１４に記載の形質転換細胞。
【請求項１６】
請求項１３〜１５のいずれかに形質転換細胞を培養・増殖させる工程を含む請求項１〜９のいずれかに記載のカルボニル還元酵素変異体の製造方法。
【請求項１７】
以下の一般式：
【化１】
0004493333.tif 000010
（式中、Ｒ１はハロゲン原子であり、Ｒ２は水素であり、Ｒ３は置換または非置換のアルキル基またはアリール基を表す）で表される（Ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルの製造方法であって、該方法は、以下の一般式：
【化２】
0004493333.tif 000011
（式中、Ｒ１はハロゲン原子であり、Ｒ２は水素であり、Ｒ３は置換または非置換のアルキル基またはアリール基を表す）で示される４−ハロアセト酢酸エステルと請求項１〜９のいずれかに記載の酵素変異体、あるいは該酵素変異体の産生能を有する微生物の培養物あるいはその処理物とを反応させる工程を包含する、方法。
【請求項１８】
前記ハロゲン原子が塩素または臭素であり、前記Ｒ３が炭素数１〜４のアルキル基である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記４−ハロアセト酢酸エステルが、４−クロロアセト酢酸メチル、４−クロロアセト酢酸エチル、４−ブロモアセト酢酸メチル、または４−ブロモアセト酢酸エチルである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記微生物が、請求項１３〜１５のいずれかに記載の形質転換細胞である、請求項１７〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
光学活性アルコールの製造方法であって、請求項１〜９のいずれかに記載の酵素変異体と、該酵素変異体が依存する補酵素を再生する能力を有する酵素および／又はその変異体と、カルボニル化合物とを反応させる工程、ならびに生成した光学活性アルコールを採取する工程を包含する、方法。
【請求項２２】
前記補酵素を再生する能力を有する酵素がグルコース脱水素酵素およびその変異体である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記補酵素を再生する能力を有する酵素がギ酸脱水素酵素およびその変異体である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１〜９のいずれかに記載の酵素変異体をコードするＤＮＡおよび該酵素変異体が依存する補酵素を再生する能力を有する酵素をコードするＤＮＡを有するプラスミドで形質転換された形質転換細胞と、カルボニル化合物とを反応させる工程、ならびに生成した光学活性アルコールを採取する工程を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、酸化還元酵素の補酵素依存性の改変法、特にカルボニル化合物を不斉的に還元して光学活性アルコールを生成する活性を有する酵素（以下、ＣＲＤ酵素という）の補酵素依存性の改変法、補酵素依存性が、還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以下、ＮＡＤＰＨと省略）から還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤＨと省略）への変換である酵素改変法に関する。また、本発明は、該改変法により得られるＮＡＤＨ依存性を有するＣＲＤ酵素変異体、該酵素変異体をコードするＤＮＡ、このＤＮＡを有するプラスミド、このプラスミドで形質転換された形質転換細胞、該酵素の製造方法、ならびに該酵素またはこの形質転換細胞を用いる光学活性アルコールの製造方法に関する。
背景技術
光学活性な（Ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルは、医薬品などの中間体に利用される化合物であり、光学的に純粋な対掌体をいかにして製造するかが、産業上重要な課題となっている。そのため、４−ハロアセト酢酸エステルなどのカルボニル化合物を不斉的に還元するＣＲＤ酵素を用いて、（Ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルなどの光学活性アルコールを製造するためプロセス開発が盛んに行われている。
４−ハロアセト酢酸エステルから（Ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルを生成するＣＲＤ酵素として、３α−ヒドロキシステロイド脱水素酵素（特開平１−２７７４９４）、グリセロール脱水素酵素（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２９、２４５３−２４５４（１９８８））、シュードモナス・エスピーＰＥＤ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＰＥＤ）由来のアルコール脱水素酵素（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５７、１５２６−１５３２（１９９２））、キャンディダ・マセドニエンシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｃｅｄｏｎｉｅｎｓｉｓ）由来のケトパントテン酸エステル還元酵素（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２９４、４６９−４７４（１９９２））、ゲオトリカム・キャンディダム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｃａｎｄｉｄｕｍ）由来の４−クロロアセト酢酸エチルエステル還元酵素（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１４、７３１−７３８（１９９２））、クライベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）由来のカルボニル還元酵素（特願平９−３５７９６９）、クラベロマイセス・アエスチュアリ（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ａｅｓｔｕａｒｉｉ）由来のカルボニル還元酵素（特開平２０００−２３６８８３）などが報告されている。
これら酵素の中には、還元反応だけでなく、酸化（脱水素）反応も行うものもあり、生成物である（Ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルの光学純度、蓄積濃度が低いなどの問題がある場合が多かった。本発明者の一部らが報告しているキャンディダ・マグノリアエ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｇｎｏｌｉａｅ）由来のＣＲＤ酵素（以下、ＣＭＣＲＤ酵素という）によって、初めて実用的な（Ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルの製造法が提供されるようになった（ＷＯ  ９８／３５０２５）。このＣＭＣＲＤ酵素は、熱安定性、有機溶剤耐性に優れ、また酵素活性の高さも満足のいくものである。しかしながら、補酵素としてＮＡＤＰＨを利用する還元酵素であるため、より安価な（Ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステル製造法を確立するためには、高価でかつ化学的に不安定なＮＡＤＰＨの替わりに、安価で化学的に安定な他の補酵素、例えばＮＡＤＨを利用できることが望ましいと考えられる。
一般的に、酸化還元酵素を用いた光学活性アルコール類の製造においては、酸化還元酵素が利用する補酵素の効率的な再生もまた、重要な課題である。例えば、β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以下、ＮＡＤＰという）やβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤという）などのピリジンジヌクレオチド補酵素を再生する方法として、例えば、グルコース脱水素酵素（以下、ＧＤＨという）、ギ酸脱水素酵素（以下、ＦＤＨという）、アルコール脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素、有機酸脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素など）などを含む微生物、その処理物、ならびに部分精製もしくは精製酵素を用いる方法が知られている。ここで、例えばＧＤＨにはＮＡＤＰを再生できるものとＮＡＤを再生できるものとがあり、ＦＤＨはＮＡＤしか再生できないなど、補酵素の種類によってそれを再生する酵素の組み合わせにはある程度の制限がある。
すなわち、ＣＭＣＲＤ酵素のような優れた物性（安定性、溶剤耐性、酸化耐性）、比活性を有する酵素の補酵素依存性を、上記補酵素を再生する酵素の補酵素依存性に最適化することが可能となれば、光学活性アルコール等の製造におけるプロセスの最適化が容易となり、より効率的な製造方法を提供し得ると考えられる。優れた物性、比活性を有し、かつ所望の基質特異性および補酵素依存性を有する酵素をスクリーニングすることは、膨大な労力を要するが、すでに知られている優れた酵素の補酵素依存性、基質特異性などの機能を自在に制御することができれば、迅速にかつ効率よく製造方法の改良、確立が可能となる。
これまでにも、酵素の基質特異性や補酵素依存性を改変しようとする試みが行われており、酸化還元酵素の補酵素依存性を変換した例として、バチルス・ステアロサーモフィラス由来の（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の乳酸脱水素酵素（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１６６、６６７−６７２（１９９０）、大腸菌由来のグルタチオン還元酵素（Ｎａｔｕｒｅ、３４３、３８−４３（１９９０））、大腸菌由来のイソクエン酸脱水素酵素（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２、１１６６６−１１６７０（１９９５））、サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のイソプロピルリンゴ酸脱水素酵素（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３、１２１７１−１２１７６（１９９６））、シュードモナス・メバロニイ（Ｐｅｓｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｖａｌｏｎｉｉ）由来のＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、５５，１１９４５−１１９５０（１９９６））、サーモアクチノマイセス・インターメダス（Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）由来のロイシン脱水素酵素（Ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｅｎｇ．１０、６８７−６９０（１９９７））、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｅｓｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）由来のｐ−ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９２、８７−９６（１９９９））などの酵素に関するものについて報告されている。
しかしながら、これら報告例の多くはアミノ酸配列から得られる配列類似性の情報を中心とした試行錯誤的なアミノ酸変異によって行われている。一般に、酵素の有する機能および物理化学的性質は、立体構造と密接なつながりを持っているため、アミノ酸配列から得られる情報を中心とした試行錯誤的なアミノ酸変異方法では、反応性を厳密に制御するような改変を酵素に施す場合には、極めて非効率的な方法であると言わざるを得ない。
酵素の立体構造に基づいた合理的なアミノ酸変異の設計を唱っている酵素改変の報告例もあるが、所望の補酵素依存性を有する類縁酵素の補酵素結合部位と入れ替える（キメラ酵素を作成する手法）、結合に関与する残基をその立体構造から推定し、置換するアミノ酸残基種の選択においては類縁酵素とのアミノ酸配列の類似性を参考にして行う方法が採用されていることが多い。このような例では、置換するアミノ酸残基を選択する指標は、設計者の経験、主観に左右される。また、特定した各アミノ酸残基の寄与を客観的な指標に基づいて見積もることは行っておらず、真に合理的な酵素改変設計と言えるものではない。そのため、得られた変異体が所望の機能を有しない、あるいは不十分な場合は、試行錯誤の実験を繰り返す必要が生じ、極めて効率が悪いと考えられる。
このような技術的な問題から、従来の改変方法では補酵素依存性に変化が見られるものの、得られた改変酵素が、実用的に十分な酵素活性を有してなかったり、例えば、ＮＡＤＰとＮＡＤの両方を補酵素として利用できる変異体が得られ、補酵素依存性を厳密に制御することができないなどの課題が残されており、工業利用に供される実用的な改変酵素の取得は達成されていない。これら課題を解決するために有効な合理的な酵素改変設計法、より好ましくは客観的な自動設計手法の開発が望まれている。
発明の開示
本発明は、上述したような課題を解決するための、酸化還元酵素の補酵素依存性を変換する合理的な酵素改変方法の提供を目的とする。また本発明は、該改変方法によりＮＡＤＨを補酵素として利用しうるＣＲＤ酵素変異体、該ＣＲＤ酵素変異体をコードするＤＮＡおよびそれを導入した組み換え体を提供し、それらを用いた光学活性（Ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルの製造方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、酸化還元酵素の補酵素依存性を変換する酵素改変方法を新に開発し、該酵素改変方法によりＮＡＤＨを補酵素として利用しうるＣＲＤ酵素変異体の作製に成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、酸化還元酵素の補酵素依存性を変換させるための酵素改変方法であって、該酸化還元酵素のあらかじめ選択された部位の単数または複数の任意のアミノ酸残基を置換、挿入もしくは欠失またはそれらを組み合わせることにより、補酵素分子の結合エネルギーの大きさを制御することを特徴とする酵素改変方法に関する。
その好ましい実施態様としては、酸化還元酵素の活性部位を特定する工程と、該活性部位近傍において補酵素分子と相互作用するアミノ酸残基を決定する工程と、該決定残基に対して補酵素分子の結合エネルギーの大きさを制御するための変異処理を行う工程を包含する上記酵素改変方法に関する。
さらに好ましい実施態様としては、前記活性部位を特定する工程において、分子モデリング法による立体構造予測を行い、補酵素分子を収容するために可能な体積を有するクレフト部を検索し、さらに、類縁酵素タンパク質とのアミノ酸配列比較を行い、該クレフト部を構成するアミノ酸残基の中から酵素と補酵素分子の結合に重要であると推定されるアミノ酸残基を抽出する処理をさらに包含する、上記酵素改変方法に関する。
別の好ましい実施態様としては、酸化還元酵素が、補酵素分子としてピリジンヌクレオチド補酵素を利用する酸化還元酵素である上記酵素改変方法に関する。
さらに別の好ましい実施態様としては、酸化還元酵素が、カルボニル還元酵素である上記酵素改変方法に関し、特に好ましくは、キャンディダ・マグノリエ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｇｎｏｌｉａｅ）ＩＦＯ  ０７０５由来のカルボニル還元酵素である上記酵素改変方法に関する。
また本発明は、野生型カルボニル還元酵素から、アミノ酸残基の置換、挿入もしくは欠失またはそれらの組合せによって得られ、そして、次に示す理化学的性質を有するカルボニル還元酵素変異体：
（１）作用：
ＮＡＤＨを補酵素として、４−クロロアセト酢酸エチルに作用し、（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルを生成する、
（２）基質特異性：
・４−クロロアセト酢酸エチルに対して強い活性を示し、アセト酢酸エチルには実質的に活性を示さない、
・４−クロロアセト酢酸エステルに対して強い活性を示すが、４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルに対して実質的に脱水素酵素活性を有しない、および
（３）補酵素依存性
補酵素として、ＮＡＤＨを与えた場合に強い活性を示すが、ＮＡＤＰＨを与えた場合に実質的に活性を示さない。に関し、好ましくはさらに、以下の（４）から（７）の理化学的性質を有するカルボニル還元酵素変異体：
（４）至適ｐＨ：ｐＨ４．０−７．０、
（５）熱安定性：ｐＨ７．０で３０分間処理したときに約４５℃まで安定である、
（６）有機溶剤耐性：酢酸エチル、酢酸ブチル、またはジイソプロピルエーテルで、ｐＨ７．０、２５℃、３０分間処理したときに、少なくとも８５％の酵素活性を保持している、および
（７）分子量：ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド電気泳動分析において、約３２，０００に関し、さらに好ましくは、上記野生型カルボニル還元酵素が、キャンディダ・マグノリエＩＦＯ  ０７０５由来のカルボニル還元酵素であるカルボニル還元酵素変異体に関する。
さらに本発明は、上記酵素改変方法により得られた酸化還元酵素変異体、その酵素変異体をコードするＤＮＡ、そのＤＮＡを有するプラスミド、そのプラスミドにより形質転換された形質転換細胞に関する。
さらに本発明は、上記形質転換細胞を培養・増殖させる工程を含むカルボニル還元酵素変異体の製造方法に関する。
さらに本発明は、上記酵素変異体と、該酵素変異体が依存する補酵素を再生する能力を有する酵素および／又はその変異体と、カルボニル化合物とを反応させる工程、ならびに生成した光学活性アルコールを採取する工程を包含する光学活性アルコールの製造方法に関する。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を詳細に説明する。
本明細書中において、「酸化還元酵素」とは、酸化還元反応を触媒する酵素であって、酸化還元反応の電子（水素）供与体として、例えばＮＡＤＰ、ＮＡＤなどのピリジンジヌクレオチド補酵素、ユビキノンなどのキノン類、グルタチオンなどのジスルフィド化合物、シトクロム類、プテリジン化合物、酸素、過酸化水素などを利用する酵素をいう。本明細書中において、「カルボニル還元酵素」とは、カルボニル化合物を不斉的に還元して光学活性アルコールを生成する活性を有する酵素（ＣＲＤ酵素）をいう。
本明細書において、アミノ酸、ペプチド、タンパク質は下記に示すＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会（ＣＢＮ）で採用された略号を用いて表される。また、特に明示しない限りペプチド及びタンパク質のアミノ酸残基の配列は、左端から右端にかけてＮ末端からＣ末端となるように、またＮ末端が１番になるように表される。アミノ酸残基のつながりは“−”により表される。例えば、Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕのように示される。同じアミノ酸残基が連続する場合には、例えば（Ａｌａ）３と表され、これはＡｌａ−Ａｌａ−Ａｌａと同義である。
Ａ＝Ａｌａ＝アラニン、Ｃ＝Ｃｙｓ＝システイン、Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸、Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸、Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン、Ｇ＝Ｇｌｙ＝グリシン、Ｈ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン、Ｉ＝Ｉｌｅ＝イソロイシン、Ｋ＝Ｌｙｓ＝リシン、Ｌ＝Ｌｅｕ＝ロイシン、Ｍ＝Ｍｅｔ＝メチオニン、Ｎ＝Ａｓｎ＝アスパラギン、Ｐ＝Ｐｒｏ＝プロリン、Ｑ＝Ｇｌｎ＝グルタミン、Ｒ＝Ａｒｇ＝アルギニン、Ｓ＝Ｓｅｒ＝セリン、Ｔ＝Ｔｈｒ＝スレオニン、Ｖ＝Ｖａｌ＝バリン、Ｗ＝Ｔｒｐ＝トリプトファン、Ｙ＝Ｔｙｒ＝チロシン、Ｂ＝Ａｓｘ＝ＡｓｐまたはＡｓｎ、Ｚ＝Ｇｌｘ＝ＧｌｕまたはＧｌｎ、Ｘ＝Ｘａａ＝任意のアミノ酸。
本発明により、作製されまたは考慮されるＣＲＤ酵素変異体を記述するに際して、参照を容易にするため、（もとのアミノ酸；位置；置換したアミノ酸）の命名法を適用する。従って、位置６４におけるチロシンのアスパラギン酸への置換はＴｙｒ６４Ａｓｐ、またはＹ６４Ｄと示される。多重変異については、スラッシュ記号（“／”）により分けることで表記する。例えば、Ｓ４１Ａ／Ｙ６４Ｄとは、位置４１のセリンをアラニンへ、かつ、位置６４のチロシンをアスパラギン酸へ置換することを示す。
本明細書において、酵素の「変異体」とは、もとの酵素のアミノ酸配列のアミノ酸が少なくとも１つ以上置換、付加、もしくは欠失、または修飾されたアミノ酸配列を有し、もとの酵素の活性の少なくとも一部を保持する改変された酵素をいう。
本明細書中において、変異体の設計に利用されるアミノ酸変異としては、アミノ酸の置換のほかに、アミノ酸の付加、欠失、または修飾もまた挙げられる。アミノ酸の置換とは、もとのペプチドを１つ以上、例えば、１〜２０個、好ましくは１〜１０個のアミノ酸で置換することをいう。アミノ酸の付加とは、もとのペプチド鎖に１つ以上、例えば、１〜２０個、好ましくは１〜１０個のアミノ酸を付加することをいう。アミノ酸の欠失とは、もとのペプチドから１つ以上、例えば、１〜２０個、好ましくは１〜１０個のアミノ酸を欠失させることをいう。
以下、変異体を生成するためのタンパク質のアミノ酸の変異について説明する。アミノ酸の置換などを実施する方法は、化学合成、または遺伝子工学を利用する技術においてアミノ酸をコードするＤＮＡ配列のコドンを変化させることを含むが、これらに限定されない。
本明細書において、変異体分子の「設計方法」または「分子設計手法」とは、変異前のタンパク質またはポリペプチド分子（例えば、天然型分子）のアミノ酸配列および立体構造を解析することによって、各アミノ酸がどのような特性（例えば、触媒活性、他の分子との相互作用など）を担うかを予測し、所望の特性の改変（例えば、触媒活性の向上、タンパク質の安定性の向上など）をもたらすために適切なアミノ酸変異を算出することをいう。この設計方法は、好ましくはコンピューターを用いて行われる。このような設計方法で用いられるコンピュータープログラムの例としては、変異導入モデリングのためのプログラムとして、Ｓｗｉｓｓ−ＰＤＢＶｉｅｗｅｒ（Ｓｗｉｓｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（ＳＩＢ）、ＥｘＰＡＳｙ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｓｅｒｖｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／  より入手可能））、タンパク質のエネルギー極小化、分子動力学計算を含む構造最適化のためのプログラムとして、ＡＭＢＥＲ（Ｄ．Ａ．Ｐｅａｒｌｍａｎ  ｅｔａｌ．、ＡＭＢＥＲ４．１、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｓｉｃｏ、１９９５）、ＰＲＥＳＴＯ（Ｍｏｒｉｋａｍｉ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．、Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．、１６、２４３−２４８（１９９２））、最適アミノ酸変異を算出するプログラムとして、Ｓｈｒｉｋｅ（特願平１１−３６８４９８：特開２００１−１８４３８１）などが挙げられる。    本発明における酸化還元酵素の補酵素依存性を変換する酵素改変方法について、ＣＭＣＲＤ酵素を例にして下記に詳しく説明する。なお、本発明は、特に下記に詳述するＣＭＣＲＤ酵素に限定されるものではなく、同様の方法を用いれば、ＣＲＤ酵素をはじめとする種々の酸化還元酵素に適用できることは、当業者には明らかである。
ところで、ＣＭＣＲＤ酵素の立体構造に関して、Ｘ線結晶構造解析をはじめとする構造解析等の実験は行われておらず、その立体構造は未知である。本発明の酵素改変方法は、酵素の立体構造を利用することにより、より効率的な酵素変異体の分子設計を達成している。したがって、まず野生型ＣＭＣＲＤ酵素と補酵素分子の結合した複合体の立体構造を得る必要があるため、本発明では分子モデリングによるＣＭＣＲＤ酵素の立体構造予測、およびモデリングを行う。
ＣＭＣＲＤ酵素と補酵素との複合体の立体構造は、以下の手順で構築しうる。（ステップ１）  ＣＭＣＲＤ酵素のアミノ酸配列を元に、アミノ酸配列ホモロジーを有し、かつ立体構造がプロテインデータバンク（ＰＤＢ）に登録されている酵素との多重アミノ酸配列アラインメントを、プログラムＣｌｕｓｔａｌＸ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２２、４６７３−８０（１９９４））により作成する。分子モデリングに利用するＣＭＣＲＤ酵素とアミノ酸配列ホモロジーを有するタンパク質は、ＰＤＢに登録されたタンパク質のアミノ酸配列を対象に、プログラムＦＡＳＴＡ（Ｐｅｒａｓｏｎ  Ｗ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、４６、２４−３６（１９９７））やＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｆ．ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５、３３８９−３４０２（１９９７））を用いたアミノ酸配列ホモロジーの検索を行うことで選択しうる。多重アミノ酸配列アラインメントに利用する立体構造既知のタンパク質としては、ＣＭＣＲＤ酵素のアミノ酸配列と少なくともホモロジースコア（プログラムＢＬＡＳＴでのＥ値）が、１×１０−５以下、より好ましくはＥ値が１×１０−１０以下のものが用い得る。例えば、ＰＤＢコードが、１ＡＥ１、２ＡＥ２、１ＦＭＣ、１ＣＹＤ、１ＨＤＣ、１ＹＢＶ、１ＢＤＢ、１ＥＤＯであるタンパク質が用いられ得る。
（ステップ２）  次にこれら立体構造既知のタンパク質の３次元アラインメント（立体構造アラインメント）をプログラムＭＡＰＳ（Ｇ．Ｌｕ、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔ．（２０００）、３３：１７６−１８３）により行い、先にアミノ酸配列のみから得られた多重アラインメントを立体構造の類似性に基づいて修正し、分子モデリングに用いる最終多重配列アラインメントを得ることができる。配列アラインメント修正は、立体構造の類似性を元に、α−ヘリックスやβ−シートなどの２次構造に挿入や欠失が入らないように施すことが望ましい。
（ステップ３）  得られた配列アラインメントに基づいて、挿入、欠失部位ができるかぎり少なく立体構造の類似性が高いと推定されるタンパク質を分子モデリングの雛形タンパク質として選択しうる。例えば、ＰＤＢコードが１ＡＥ１、２ＡＥ２、１ＦＭＣ、１ＣＹＤ、１ＨＤＣ、１ＹＢＶ、１ＢＤＢ、１ＥＤＯ等の酵素、より好ましくは１ＹＢＶ、１ＥＤＯおよび１ＦＭＣの立体構造が雛形として利用し得る。これら雛形タンパク質を３次元グラフィックスプログラムＳｗｉｓｓ  ＰＤＢ−Ｖｉｅｗｅｒで表示させ、ステップ２で得られた配列アラインメントに従って、ＣＭＣＲＤ酵素のアミノ酸配列にアミノ酸残基の置換を行いうる。（ステップ４）  挿入、欠失部位については、ＰＤＢから最適な類似部分構造を検索し、その部分構造に置換することにより立体構造モデルを構築することができる。挿入、欠失部位の分子モデリングは、ＰＤＢに登録されている高分解能の立体構造、好ましくは分解能２．０Å以下のタンパク質の立体構造に対して、挿入、欠失部位の周辺を含む雛形タンパク質の主鎖の部分構造に、最も適合する部分構造を探索することで行うことができる。例えば、雛形タンパク質の主鎖の部分構造の原子座標に対して、最小自乗重ね合わせ操作を行った場合の、最小自乗偏差（ＲＭＳＤ）が２．０Å以下となるタンパク質の部分構造を用いることができる。
（ステップ５）  ＣＭＣＲＤ酵素に結合しうる補酵素ＮＡＤＰの構造については、ＣＭＣＲＤ酵素の立体構造上でＮＡＤＰ分子を収容可能な体積を有する空間、すなわちクレフト部を同定、さらにクレフト部に存在するアミノ酸残基群とＮＡＤＰ分子の相互作用を同定することで、ＮＡＤＰの原子座標を決定しうる。
ＮＡＤＰの原子座標を決定する方法として、例えば、上記立体構造類似のタンパク質の中から、ＮＡＤＰを結合しているもの、ＰＤＢコード、１ＡＥ１、２ＡＥ２、１ＣＹＤ、１ＹＢＶおよび１ＥＤＯを選択し、好ましくは１ＹＢＶを選択し、このＮＡＤＰの原子座標を代用する方法が挙げられる。また、補酵素の結合していないＣＭＣＲＤ酵素のみの立体構造モデルを構築した後、Ａｕｔｏｄｏｃｋ（（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）、Ｇｕｅｘ、Ｎ，およびＰｅｉｔｓｃｈ，Ｍ．Ｃ．（１９９７））等の分子ドッキングのプログラムを用いて、構造エネルギー等を指標にＮＡＤＰ分子を収容可能な体積を有する空間、すなわちクレフト部の同定、クレフト部に存在するアミノ酸残基群とＮＡＤＰ分子の相互作用を同時に同定し、ＮＡＤＰ分子の原子座標を決定することができる。これら方法により、ＣＭＣＤＲ酵素−ＮＡＤＰ複合体の立体構造モデルを構築することができる。
（ステップ６）  最終的に構築した立体構造モデルは、エネルギー極小化計算および分子動力学計算により、構造最適化を行うことができる。構造最適化プログラムとしては、プログラムＡＭＢＥＲ、ＰＲＥＳＴＯ等を用いることができる。
前記立体構造予測、モデリングの手法を適用することによって、ＣＭＣＲＤ酵素のアミノ酸配列と３０％以上、より好ましくは５０％以上、さらにより好ましくは７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むＣＭＣＲＤ酵素の酵素改変方法に供する立体構造モデルを構築しうる。
次にＣＭＣＲＤ酵素の活性部位（触媒部位および結合部位）の特定、該活性部位近傍において、補酵素分子と相互作用するアミノ酸残基の特定を、以下の方法によって行うことができる。
野生型ＣＭＣＲＤ酵素−補酵素複合体の立体構造モデルおよび類縁酵素の多重配列アラインメントから、アミノ酸配列の保存性が高い補酵素（ＮＡＤおよび／またはＮＡＤＰ）結合に関与する共通アミノ酸配列、ＮＡＤ（ＮＡＤＰ）結合モチーフを見出した。ＣＭＣＲＤ酵素および類縁のＣＲＤ酵素の共通アミノ酸配列は、（ＧｌｙまたはＡｌａ）−（Ｘａａ）３−（Ｇｌｙ、ＡｌａまたはＴｈｒ）−（ＩｌｅまたはＬｅｕ）−（Ｇｌｙ、ＡｌａまたはＳｅｒ）−（Ｘａａ）１０−（ＧｌｙまたはＡｓｎ）であり得る。さらに、３次元グラフィックスを用いて、この共通アミノ酸配列を含む領域に複合体の立体構造上で近接する領域、言い換えれば、酵素と補酵素の結合に重要な領域を同定することができる。酵素と補酵素の結合に重要な領域に変異を導入することで、補酵素依存性を改変することができる。このようにして選択した部位として、ＣＭＣＲＤ酵素のアミノ酸残基位置４０〜６９、位置８７〜９２および位置２２５〜２２８、より好ましくは位置４０〜６９が挙げられる。さらにより好ましくは、アミノ酸残基位置４１〜４３、位置４７、位置６３〜６６、位置６９が選択部位として挙げられる。また、距離を指標にして、補酵素分子と相互作用するアミノ酸残基を選択することも可能である。例えば、補酵素結合部位から１２Å以内、より好ましくは８Å以内の距離を指標にして、変異を導入する部位を選択することも可能である。
次に、同定した選択領域に存在するアミノ酸残基の中から、補酵素ＮＡＤＰもしくはＮＡＤＰＨの結合に対する寄与の大きいアミノ酸残基を、構造エネルギー計算による補酵素分子との非結合相互作用の評価、静電相互作用に注目した静電ポテンシャル計算等により同定する。例えば、以下に示す静電ポテンシャル計算によって、補酵素ＮＡＤＰもしくはＮＡＤＰＨの結合に対する選択領域の各アミノ酸残基の寄与を見積もることができる。
まず、ＣＭＣＲＤ酵素−ＮＡＤＰ複合体構造において、ＮＡＤＰの２’リン酸残基（ＮＡＤの場合、このリン酸残基は存在しない）のリン原子の位置にマイナス１の負電荷のみ（その他のすべての原子の点電荷はゼロ）を置き、この電荷のつくる静電ポテンシャルを求める（静電ポテンシャル計算（中村ら、（１９８７）、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．５６，１６０９−１６２２）。次に、求めた静電ポテンシャルに対して、すべてのアミノ酸残基の原子に点電荷を与え、ＮＡＤＰの２’リン酸以外のすべての残基のリン酸残基に置かれたマイナス１の電荷に対する静電的な寄与を計算する。この計算により、各アミノ酸残基のＮＡＤＰの結合安定化の大きさを求めることができる。例えば、Ｓｅｒ４２、Ｔｙｒ６４、Ａｓｎ６５、Ｓｅｒ６６は、ＮＡＤＰの２’リン酸残基に対して正の静電場を形成し、ＮＡＤＰとの結合の安定化に寄与することが推定しうる。
これらＮＡＤＰ結合の安定化に寄与していると推定された残基を、ＮＡＤ結合に適したアミノ酸に置換すれば、ＣＭＣＲＤ酵素の補酵素依存性を変換することが可能となる。アミノ酸置換の候補は、上記残基部位について、ＣＭＣＲＤ酵素−ＮＡＤＰ複合体およびＣＭＣＲＤ酵素−ＮＡＤ複合体構造モデルに対して、例えば、プログラムＳｈｒｉｋｅ（特願平１１−３６８４９８：特開２００１−１８４３８１）を用いた計算機スクリーニングにより行いうる。計算変異実験では、ＮＡＤＰに対する結合エネルギーとＮＡＤに対する結合エネルギーの差、およびアミノ酸置換に伴う酵素の（熱）安定性の指標である変性自由エネルギーを指標にアミノ酸変異候補を算出しうる。また、立体構造既知のＣＲＤ酵素の補酵素結合部位の多重アミノ酸配列アラインメントもアミノ酸置換の参考に利用しうる。
本発明の酵素改変方法によれば、ＣＲＤ酵素に組み合わせる補酵素再生に供する酵素の補酵素依存性もまた改変しうる。さらに、着目する分子を補酵素から基質に変えれば、同様の設計手法を適用することによって、ＣＲＤ酵素の基質特異性の変換もまた可能となることは明らかである。
ＣＭＣＲＤ酵素において、本方法により設計したアミノ酸置換残候補のうち、ＮＡＤに対する結合が強くなると推定された各部位での変異候補は、
−位置４１において、Ａ、Ｇ、またはＳ；
−位置４２において、Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｔ、ＲまたはＫ；
−位置４３において、Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｑ、ＲまたはＫ；
−位置６４において、Ｄ；
−位置４７において、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｌ、Ｑ、Ｅ、ＲまたはＫ；
−位置６３において、Ａ、Ｓ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｃ、Ｔ、Ｓ、ＮまたはＧ；
−位置６５において、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ａ、Ｃ、ＳまたはＴ；
−位置６６において、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ａ、Ｃ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、ＲまたはＫ；
−位置６９において、Ａ、Ｅ、ＤまたはＳである。
好ましくは、Ｓ４１Ａ、Ｓ４２Ａ、Ｓ４２Ｒ、Ｓ４３Ｑ、Ｓ４３Ｇ、Ｓ４３Ｒ、Ｗ６３Ｉ、Ｗ６３Ｌ、Ｗ６３Ｖ、Ｗ６３Ｆ、Ｗ６３Ｍ、Ｙ６４Ｄ、Ｎ６５Ｉ、Ｎ６５Ｖ、Ｓ６６Ｎ、Ｓ６６Ｌ、Ｙ４７Ｒ、Ａ６９Ｅが変異候補として挙げられ、さらに好ましくは、ＣＲＤ酵素変異体として、上記単数の変異を組み合わせた変異体が設計されうる。
本発明における好ましいＣＭＣＲＤ酵素変異体として、天然のＣＭＣＲＤ酵素から、アミノ酸残基の置換、挿入もしくは欠失またはそれらの組合せによって得られる次の変異体が挙げられる。
・ＣＭＣＲＤ酵素変異体Ｓ４１Ａ／Ｓ４２Ａ／Ｓ４３Ｑ／Ｗ６３Ｉ／Ｙ６４Ｄ／Ｎ６５Ｉ／Ｓ６６Ｎ。
・ＣＭＣＲＤ酵素変異体Ｓ４１Ａ／Ｓ４２Ａ／Ｓ４３Ｑ／Ｗ６３Ｉ／Ｙ６４Ｄ／Ｎ６５Ｖ／Ｓ６６Ｌ。
・ＣＭＣＲＤ酵素変異体Ｓ４１Ａ／Ｓ４２Ａ／Ｓ４３Ｇ／Ｗ６３Ｉ／Ｙ６４Ｄ／Ｎ６５Ｉ／Ｓ６６Ｌ。
・ＣＭＣＲＤ酵素変異体Ｓ４１Ａ／Ｓ４２Ａ／Ｓ４３Ｒ／Ｗ６３Ｉ／Ｙ６４Ｄ／Ｎ６５Ｉ／Ｓ６６Ｎ。
・ＣＭＣＲＤ酵素変異体Ｓ４１Ａ／Ｓ４２Ａ／Ｓ４３Ｑ／Ｙ４７Ｒ／Ｗ６３Ｉ／Ｙ６４Ｄ／Ｎ６５Ｉ／Ｓ６６Ｎ。
・ＣＭＣＲＤ酵素変異体Ｓ４１Ａ／Ｓ４２Ａ／Ｓ４３Ｒ／Ｙ４７Ｒ／Ｗ６３Ｉ／Ｙ６４Ｄ／Ｎ６５Ｉ／Ｓ６６Ｎ。
・ＣＭＣＲＤ酵素変異体Ｓ４１Ａ／Ｓ４２Ｒ／Ｗ６３Ｉ／Ｙ６４Ｄ／Ｎ６５Ｉ／Ｓ６６Ｎ。
・ＣＭＣＲＤ酵素変異体Ｓ４１Ａ／Ｓ４２Ｒ／Ｙ４７Ｒ／Ｗ６３Ｉ／Ｙ６４Ｄ／Ｎ６５Ｉ／Ｓ６６Ｎ。
・ＣＭＣＲＤ酵素変異体Ｓ４１Ａ／Ｓ４２Ａ／Ｓ４３Ｑ／Ｗ６３Ｉ／Ｙ６４Ｄ／Ｎ６５Ｉ／Ｓ６６Ｎ／Ａ６９Ｅ。
以上の方法によって得られる本発明のＣＲＤ酵素変異体は、以下の（１）〜（３）の理化学的性質を有する：
（１）作用：
ＮＡＤＨを補酵素として、４−クロロアセト酢酸エチルに作用し、（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルを生成する、
（２）基質特異性：
・４−クロロアセト酢酸エチルに対して強い活性を示し、アセト酢酸エチルには実質的に活性を示さない、
・４−クロロアセト酢酸エステルに対して強い活性を示すが、４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルに対して実質的に脱水素酵素活性を有しない、および
（３）補酵素依存性：
補酵素としてＮＡＤＨを与えた場合に強い活性を示すが、ＮＡＤＰＨを与えた場合には実質的に活性を示さない。
一つの実施態様において、前記ＣＲＤ酵素変異体は、さらに付加的に、次の理化学的性質（４）〜（７）を有する：
（４）至適ｐＨ：ｐＨ４．０−７．０、
（５）熱安定性：ｐＨ７．０で３０分間処理したときに約４５℃まで安定である（４５℃で３０分処理したときに７５％以上の酵素活性を保持している）、
（６）有機溶剤耐性：酢酸エチル、酢酸ブチル、またはジイソプロピルエーテルで、ｐＨ７．０、２５℃、３０分間処理したときに、少なくとも８５％の酵素活性を保持している、および
（７）分子量：ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド−ポリアクリルアミド電気泳動分析において、約３２，０００。
本発明のＣＲＤ酵素変異体は、
ａ）ＣＲＤ酵素についてコードする遺伝子に１以上の変異、好ましくは上記変異を導入し、
ｂ）工程ａ）で得られた変異遺伝子をクローニングベクターにクローン化し、
ｃ）工程ｂ）で得られた組換えベクターで宿主株を形質転換し、
ｄ）工程ｃ）のように形質転換された宿主株を適切な培地で培養し、最後に、
ｅ）こうして得られたＣＲＤ酵素変異体を分離、精製することを含む方法で該変異体を製造することができる。
遺伝子への変異の導入は、特に限定されないが部位特異的変異法などの公知のインビトロ変異技術の１つを利用して行うことができる。例えば上記ＣＭＣＲＤ酵素変異体の場合、変異導入は以下のように行いうる。導入されるべきアミノ酸変異は、すべて、野生型ＣＭＣＲＤ酵素遺伝子の長さ約１７０ｂｐの制限酵素ＥｃｏＯ１０９Ｉ−ＥｃｏＯ１０９Ｉ部位間に存在する。従って、この部位に相当する変異導入されたＤＮＡ断片を合成し、野生型ＣＭＣＲＤ酵素の遺伝子を含む組換えプラスミドｐＮＴＳ１（Ｗ０９８／３５０２５）のＥｃｏＯ１０９Ｉ−ＥｃｏＯ１０９Ｉ部位を該ＤＮＡ断片で置換することで変異を導入しうる。そのようにして得られた、配列番号１〜９のヌクレオチド配列を有するＤＮＡを合成、ｐＵＣ１８のＰｓｔＩサイトにサブクローニングしたプラスミドｐＵＣＳＹＮ１８１〜ｐＵＣＳＹＮ１８９を用いて、大腸菌ＪＭ１０９またはＨＢ１０１を形質転換し得る。目的のＤＮＡ断片は、得られた形質転換体からプラスミドを回収、ＥｃｏＯ１０９Ｉで消化後、分取用ポリアクリルアミド電気泳動で単離しうる。一方、プラスミドｐＮＴＳ１をＥｃｏＯ１０９Ｉで消化後、分取用アガロースゲル電気移動により、約３．２ｋｂのＤＮＡ断片を回収しうる。両ＤＮＡ断片をライゲーションすることにより、ｐＮＴＳ１のＥｃｏＯ１０９Ｉ−ＥｃｏＯ１０９Ｉ部位に変異遺伝子を挿入した組換えプラスミドｐＮＴＳ１Ｍ１、ｐＮＴＳ１Ｍ２、ｐＮＴＳ１Ｍ３、ｐＮＴＳ１Ｍ４、ｐＮＴＳ１Ｍ５、ｐＮＴＳ１Ｍ６、ｐＮＴＳ１Ｍ７、ｐＮＴＳ１Ｍ８およびｐＮＴＳ１Ｍ９を構築しうる。導入されるアミノ酸変異は、組換えプラスミドに対して、ＰＣＲにより変異部位を含むＤＮＡ断片を調製し、塩基配列を確認することにより行い得る。ＣＭＣＲＤ酵素遺伝子は、プラスミドｐＮＴＳ１のＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＩ部位に挿入されているので、ＮｄｅＩサイト上流の塩基配列を有するプライマーが、塩基配列解析用のＤＮＡ断片の調製に好適に用いられ得る。
得られたＣＲＤ酵素遺伝子を有する組換えプラスミドは、常法により宿主細胞に導入され得る。宿主細胞としては、特に限定されず、細菌、酵母、糸状菌、植物細胞、動物細胞などが使用されるが、大腸菌の使用が特に好ましい。宿主へのプラスミドの導入は、当業者に周知の方法、例えば、コンピテント（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）状態にされた宿主細胞と組換えプラスミドとを混合する工程を包含する方法、ヘルパー・プラスミドを用いて接合伝達により移入する工程を包含する方法などが挙げられる。例えば、大腸菌ＪＭ１０９またはＨＢ１０１を、上記プラスミドで形質転換し、ＣＲＤ酵素変異体を生産する形質転換体を得ることができる。
本発明において、４−クロロアセト酢酸エステルに対する還元活性は、次のようにして確認することができる。４−クロロアセト酢酸エステルに対する還元活性測定法：０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ−０．１６７ｍＭ、４−クロロアセト酢酸エチル−１ｍＭ及び酵素を合む反応液中３０℃で反応させ、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの減少にともなう３４０ｎｍの吸光度の減少を測定する。１Ｕは、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの減少を触媒する酵素量とする。一方、補酵素としてＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを利用しえない場合には、この条件では３４０ｎｍにおける吸光度の減少はわずかしか観察されない。また、タンパク質の定量は、バイオラッド社製タンパク質アッセイキットを用いた色素結合法により行う。
本発明の酵素改変方法を用いて、補酵素としてＮＡＤＨを与えるときに高い酵素活性を示すが、ＮＡＤＰＨを与えるときにはまったく酵素活性を示さない、すなわち、補酵素としてＮＡＤＨを厳格に認識、利用することを特徴とする、ＣＲＤ酵素変異体を得ることができる。
上記ＣＲＤ酵素変異体は、４−クロロアセト酢酸エステルに対して高い還元活性を有する一方、４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルのいずれの光学異性体に対しても実質的に脱水素酵素活性（すなわち酸化活性）を示さない。脱水素酵素活性を実質的に示さないことは、基質となる４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルにＮＡＤ存在下で接触させたときに、ＮＡＤＨの増減にともなう３４０ｎｍの吸光度の単位時間当たりの変化率が４−クロロアセト酢酸エステルを１００とする相対活性として５％以下、より望ましくは１％以下である場合に、脱水素酵素活性を実質的に示さないと言うことができる。
また上記ＣＲＤ酵素変異体は、アセト酢酸エステルに対する還元酵素活性を実質的に示さない。これらの酵素活性の指標についても先に述べたものと同様に、４−クロロアセト酢酸エステルを１００とする相対活性として５％以下、より望ましくは１％以下である場合に、脱水素酵素活性、あるいは還元酵素活性を実質的に示さないと言うことができる。
本発明において、ＣＲＤ酵素変異体の酵素活性および補酵素依存性の解析は、例えば、該酵素をコードするＤＮＡが導入された形質転換体を用いて、次のようにして行いうる。一例として、形質転換体が組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＳ１Ｍ１）の場合は、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む適切な組成の培地、好ましくはＬＢ培地および２×ＹＴ培地、より好ましくは２×ＹＴ培地で培養しうる。遠心分離などにより集菌後、適切なｐＨを示す緩衝液、例えば１０〜１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ６〜８、１０〜１００ｍＭトリス緩衝液ｐＨ６〜８、より好ましくは１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁し、超音波破砕により無細胞抽出液を調製しうる。無細胞抽出液中のＣＭＣＲＤ酵素活性を、上記測定法により行い、同様の方法で調製した野生型ＣＭＣＲＤ酵素遺伝子を有するプラスミドで形質転換した大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＳ１）の活性を測定、これらを比較する。例えば、上記ＣＭＣＲＤ酵素変異体は、補酵素としてＮＡＤＨを利用して４−クロロアセト酢酸エステルの還元反応を行い、補酵素としてＮＡＤＰＨを用いた場合、まったく還元活性を示さない。このことから、目的の補酵素依存性の変換（反転）に成功したことを確認しうる。
得られた培養物からの酵素の抽出および精製のためには、当業者に通常用いられ得る酵素の抽出精製法が用いられ得る。例えば、培養液から菌体を遠心分離後、菌体を適当な緩衝液中に懸濁し、該菌体をグラスビーズ、超音波等の物理的手法、酵素等の生化学的手法等を用いて破砕または溶解し、さらに遠心分離により該溶液中の固形物を除去することにより、酵素の粗酵素液を得ることができる。上記粗酵素液を当業者が通常用いる手法、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、透析、クロマトグラフィーを単独でまたは組み合わせて用いてさらに精製し得る。クロマトグラフィーは、疎水クロマトグラフィー（例えば、フェニルセファロース）、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、ＤＥＡＥセファロース）、ゲル濾過等の各種クロマトグラフィーを単独で、または組み合わせて用いることにより、本発明のＣＲＤ酵素変異体を得ることができる。
本発明では、前記ＣＲＤ酵素変異体を利用して、ケトンを還元してアルコールを製造することができる。例えば、本発明のＣＲＤ酵素変異体は、ＮＡＤＰＨに比べて安価で安定なＮＡＤＨを補酵素として利用しうることから、工業的な利用において有利である。酵素分子、その処理物、酵素分子を含む培養物、あるいは酵素を生成する微生物等の形質転換体が生きた状態で反応溶液と接触させることにより、目的とする酵素反応を行わせることができる。なお、酵素と反応溶液の接触形態はこれらの具体例に限定されるものではない。反応溶液は、基質や酵素反応に必要な補酵素であるＮＡＤＨを酵素活性の発現に望ましい環境を与える適当な溶媒に溶解したものである。本発明におけるＣＲＤ酵素変異体を含む微生物の処理物には、具体的には界面活性剤やトルエンなどの有機溶媒処理によって細胞膜の透過性を変化させた微生物、あるいはガラスビーズ、超音波や酵素処理によって菌体を破砕した無細胞抽出液やそれを部分精製したものなどが含まれる。
本発明によるアルコールの製造方法における原料となるケトンとしては、隣接するジケトンを有する２、３−ブタンジオンや４−ハロアセト酢酸エステル誘導体が好適に用いられる。４−ハロアセト酢酸エステル誘導体のハロゲンとしては、臭素、塩素、ヨウ素があげられ、特に塩素が好適に用いられる。エステルとしては、メチルエステル、エチルエステル、プロピルエステル、イソプロピルエステル、ブチルエステル、オクチルエステル、ベンジルエステルなどの直鎖、分岐鎖、芳香族置換を含むアルコールのエステルがあげられるが、エチルエステルがもっとも好適に用いられる。４−ハロアセト酢酸エステル誘導体としては、２位に直鎖もしくは分岐鎖を含むアルキル基、塩素、臭素、ヨウ素などのハロゲンを含む誘導体などがあげられる。
光学活性アルコールの一種である光学活性４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルは、例えば以下のようにして取得される。基質としては、以下の一般式：
0004493333.tif 000002
（式中、Ｒ１はハロゲンであり、Ｒ２は水素であり、そしてＲ３は置換または非置換のアルキル基またはアリール基を表す）で表される４−ハロアセト酢酸エステルが用いられ得る。Ｒ３がアルキル基である場合、Ｒ３は例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、およびイソプロピル基などである。Ｒ３がアリール基である場合、Ｒ３は例えば、フェニル基またはトリル基等である。これらのＲ３が置換されたアリール基である場合、Ｒ３は例えば、フルオロフェニル基、クロロフェニル基などである。
好適にはＲ１が塩素または臭素であり、Ｒ３が炭素数１〜４のアルキル基である。より好適には、前記基質が、４−クロロアセト酢酸メチル、４−クロロアセト酢酸エチル、４−ブロモアセト酢酸メチル、または４−ブロモアセト酢酸エチルである。また、前記基質として、４−ヨードアセト酢酸エチル、４−ヒドロキシアセト酢酸エチル、２−クロロ−３−オキソ酪酸エチル、２−メチル−３−オキソ酪酸エチル、４−アジドアセト酢酸エチルなども用いることができる。
この４−ハロアセト酢酸エステルは、例えば、特開昭６１−１４６１９１に記載の方法により調製され得る。例えば４−ハロアセト酢酸エステルは、ジケテンを出発原料として、これにハロゲンを反応させ、４−ハロ−アセト酢酸ハライドとした後、これにアルコールを作用させる方法、あるいは、アセト酢酸エステルを出発原料として、アセト酢酸エステルの４位を直接ハロゲン化する方法などにより調製される。
反応は、水中もしくは水に溶解しにくい有機溶媒、たとえば、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、ｎ−ヘキサンなどの有機溶媒中、もしくは、水性媒体との２相系などの適当な溶媒中に、基質４−ハロアセト酢酸エステル、補酵素ＮＡＤＨ、および該形質転換微生物の培養物またはその処理物等を添加し、ｐＨ調整下撹拌することにより行い得る。反応は温度１０℃〜７０℃、ｐＨ４〜１０で行う。また、基質の仕込み濃度は０．１％〜９０％（ｗ／ｖ）であるが、基質を連続的に添加し得る。反応はバッチ方式または連続方式で行い得る。本発明の反応は、固定化酵素、膜リアクターなどを利用して行うことも可能である。
ここで、微生物の処理物等とは、例えば、粗抽出液、培養菌体、凍結乾燥生物体、アセトン乾燥生物体、またはそれらの菌体の磨砕物等を意味する。更にそれらは、酵素自体あるいは菌体のまま公知の手段で固定化されて用いられ得る。固定化は、当業者に周知の方法（例えば、架橋法、物理的吸着法、包括法など）で行い得る。
これら還元反応に付随してＮＡＤＨから生成するＮＡＤの、ＮＡＤＨへの再生は、微生物の持つＮＡＤ還元能（解糖系、メチロトローフのＣ１化合物資化経路など）を用いて行うことができる。これらＮＡＤ還元能は、反応系にグルコースやエタノール、ギ酸などを添加することにより増強することが可能である。また、ＮＡＤからＮＡＤＨを生成する能力を有する微生物やその処理物、酵素を反応系に添加することによっても行うことができる。たとえば、ＧＤＨ、ＦＤＨ、アルコール脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素、又は有機酸脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素など）などの部分精製もしくは精製酵素、これら酵素を含む微生物、並びにその処理物を用いてＮＡＤＨの再生を行うことができる。
一つの実施態様において、高価な補酵素の使用量を大幅に減少させるための代表的なＮＡＤＨ再生系としては、例えば、ＧＤＨおよびグルコースを用いる方法が挙げられる。反応条件は用いる酵素、微生物またはその処理物、基質濃度などによって異なるが、基質濃度約０．１〜９０重量％、反応温度１０〜５０℃、ｐＨ４〜８、反応時間、１〜６０時間である。
ＣＲＤ酵素変異体遺伝子およびこの酵素が依存する補酵素を再生する能力を有する酵素（例えば、ＧＤＨやＦＤＨ）の遺伝子を同一宿主微生物内に導入した形質転換微生物の培養物またはその処理物等を用いて同様の反応を行えば、別途に補酵素の再生に必要な酵素源を調製する必要がないため、より低コストで（Ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルが製造され得る。
反応で生じた４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルは、常法により精製され得る。例えば、４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルは、微生物を用いた場合などには必要に応じ遠心分離、濾過などの処理を施して菌体等の懸濁物を除去し、次いで酢酸エチル、トルエン等の有機溶媒で抽出し、硫酸ナトリウム等の脱水剤で脱水し、有機溶媒を減圧下で除去し、そして減圧蒸留またはクロマトグラフィー等（例えば、シリカゲルカラムクロマトグラフィー）の処理を行うことにより、精製され得る。
４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルはガスクロマトグラフィーで定量され得る。例えば、４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルの定量は、ＰＥＧ−２０Ｍ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｒｂ  ＷＡＷＤＭＣＳ  １０％  ８０／１００ｍｅｓｈ（ジーエルサイエンス社製）を充填したガラスカラム（ＩＤ  ３ｍｍ×１ｍ）を用い、１５０℃でクロマトグラフィーを行い、ＦＩＤにより検出することにより行い得る。
（Ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルの光学純度の測定は、光学分離カラムＣＨＩＲＡＬＣＥＬ  ＯＢ（ダイセル化学社製）を用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により行い得る。
以上のように、本発明に従って、ＣＭＣＲＤ酵素変異体の大量生産が可能である。さらに、この酵素変異体を利用することにより、（Ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルをはじめとする光学活性アルコールの優れた製造法が提供される。
以下の実施例にて、本発明をさらに詳細に説明するが、これらは本発明の例示の目的で提供されるものであり、なんら本発明を限定するものではない。
（実施例１）  キャンディダ・マグノリエＩＦＯ  ０７０５由来のＣＲＤ酵素の立体構造モデリング
キャンディダ・マグノリエＩＦＯ  ０７０５由来のＣＲＤ酵素（ＣＭＣＲＤ酵素）のアミノ酸配列（ＷＯ９８／３５０２５）を元に、プロテインデータバンク（ＰＤＢ）に登録されている立体構造既知の還元酵素（ＰＤＢコード：１ＡＥ１、２ＡＥ２、１ＦＭＣ、１ＣＹＤ、１ＨＤＣ、１ＹＢＶ、１ＢＤＢ））との多重アミノ酸配列アラインメントを、プログラムＣｌｕｓｔａｌＸ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、Ｊ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２２、４６７３−８０（１９９４））により作成した。次にこれら構造既知の還元酵素の３次元アラインメント（立体構造アラインメント）をプログラムＭＡＰＳ（Ｇ．Ｌｕ、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔ．（２０００）、３３：１７６−１８３）により行い、立体構造が類似している部分のアミノ酸配列との対応を調べた。先にアミノ酸配列のみから得られた多重アラインメントを、この立体構造情報に基づいて修正し、モデリングに用いる最終多重配列アラインメントを得た。修正は、立体構造情報を元に、α−ヘリックスやβ−シートなどの２次構造に挿入や欠失が入らないように行った。得られたアラインメントに基づいて、元になる立体構造にｌ１ＹＢＶと１ＦＭＣの２つの酵素の立体構造を選択し３次元グラフィックスプログラムＳｗｉｓｓ  ＰＤＢ−Ｖｉｅｗｅｒ（Ｓｗｉｓｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（ＳＩＢ）、ＥｘＰＡＳｙ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｓｅｒｖｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／  より入手可能））上で、アミノ酸残基の置換を行い、挿入、欠失部位については、ＰＤＢから最適な類似部分構造を検索し、その部分構造に置換することにより原子座標を構築した。補酵素ＮＡＤＰの原子座標については、１ＹＢＶのＮＡＤＰの原子座標を代用することで構築した。最終的に構築した立体構造モデルは、エネルギー極小化計算および分子動力学計算により、構造最適化を行った。以下、分子モデリングの詳細な手順を示す。
（１）１ＹＢＶの位置１４−２１５のアミノ酸配列（ＣＭＣＲＤ酵素の位置１８−２２７に対応）をＣＭＣＲＤ酵素の配列にＳｗｉｓｓ  ＰＤＢ−Ｖｉｗｅｒでアミノ酸置換を行った。アミノ酸側鎖のコンフォメーションについては、周辺残基との接触のないものをＳｗｉｓｓ  ＰＤＢ−Ｖｉｗｅｒが保有するロータマーライブラリーからグラフィックス上で選択した。
（２）プログラムＭＡＰＳにて、１ＦＭＣの立体構造を１ＹＢＶの立体構造に最小自乗重ね合わせ操作を行った。
（３）１ＦＭＣの位置１９７−２４９のアミノ酸配列（ＣＭＣＲＤ酵素の位置２２８−２７９に対応）をＣＭＣＲＤ酵素のアミノ酸配列にＳｗｉｓｓ  ＰＤＢ−Ｖｉｗｅｒでアミノ酸置換を行った。アミノ酸置換においては、近傍残基との立体障害を考慮して、ＳｗｉｓｓＰＤＢ−Ｖｉｅｗｅｒが内蔵しているアミノ酸側鎖のコンフォメーションデータベース（ロータマーライブラリー）から、最も接触エネルギーの少ない側鎖コンフォメーションを選択した。
（４）ＣＭＣＲＤ酵素のＣ末端領域（位置２８０−２８３）は、１ＨＤＣのＣ末端領域（位置２４２−２４５）の主鎖構造を利用して、ＣＭＣＲＤ酵素のアミノ酸配列にＳｗｉｓｓ  ＰＤＢ−Ｖｉｗｅｒでアミノ酸置換を行った。
（５）次に、以下の部位での挿入、欠失部位のモデリングを行った。挿入、欠失は、ＰＤＢから最適な類似部分構造を検索し、その部分構造に置換することにより主鎖原子座標を構築した。
・ＣＭＣＲＤ酵素の位置６４−６５間での１残基の欠失
・ＣＭＣＲＤ酵素の位置１１９−１３８の２残基の欠失
・ＣＭＣＲＤ酵素の位置１５４−１７１での７残基の挿入
・ＣＭＣＲＤ酵素の位置１８１−１９０での１残基の挿入
・ＣＭＣＲＤ酵素の位置２０７−２１５での１残基の欠失
・ＣＭＣＲＤ酵素の位置２３３−２３４での１残基の欠失
（６）挿入、欠失を終えた１ＹＢＶからモデリングしたＣＭＣＲＤ酵素の前半部分、１ＦＭＣからのＣＭＣＲＤ酵素の後半部分、１ＨＤＣからのＣ末端領域の原子座標をマージすることで、初期立体構造モデルを構築した。
（１）再度すべての残基について、アミノ酸側鎖のコンフォメーションをチェックして、立体障害などを取り除いた。
（２）最終的には、プログラムＡＭＢＥＲ４．１（Ｄ．Ａ．Ｐｅａｒｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．、ＡＭＢＥＲ４．１、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｓｉｃｏ、１９９５）を用いて、ＣＭＣＲＤ酵素（位置１４−２８３）とＮＡＤＰＨ複合体を水中でのエネルギー極小化計算および分子動力学計算により、モデルの構造最適化を行い、これを分子設計に供した。図１に、ＣＭＣＲＤ酵素−ＮＡＤＰ複合体の立体構造を模式図で示した。
（実施例２）  ＣＲＤ酵素変異体の設計
実施例１で得られた野生型ＣＭＣＲＤ酵素（ＮＡＤＰＨ依存）の立体構造モデルおよび類縁酵素の立体構造から、補酵素結合領域にＮＡＤ（ＮＡＤＰ）結合モチーフ（Ｇｌｙ−（Ｘ）３−Ｇｌｙ−（Ｉｌｅ／Ｌｅｕ）−Ｇｌｙ−（Ｘ）１０−Ｇｌｙ）を同定した。さらに、この結合ループ上に存在するアミノ酸残基の中から、ＮＡＤＰの結合に対する寄与の大きいアミノ酸残基を、静電ポテンシャル計算により、以下の手順で同定した。まず、ＣＭＣＲＤ酵素−ＮＡＤＰ複合体構造において、ＮＡＤＰの２’リン酸残基のリン原子の位置にマイナス１の負電荷のみ（その他のすべての原子の点電荷はゼロ）を置き、この電荷のつくる静電ポテンシャルを求めた。次に、求めた静電ポテンシャルに対して、すべてのアミノ酸残基の原子に点電荷を与え、ＮＡＤＰの２’リン酸以外のすべての残基のリン酸残基に置かれたマイナス１の電荷に対する静電的な寄与を計算した。マイナスの寄与の大きい順に並べ替え、上位、下位それぞれ５番目までを表１に示した。
Ｓｅｒ４２、Ｔｙｒ６４、Ａｓｎ６５、Ｓｅｒ６６は、ＮＡＤＰの２’リン酸残基に対して正の静電場をつくることから、ＮＡＤＰとの結合を安定化するのに寄与していることが推定された。これら残基を、ＮＡＤ結合に適したアミノ酸に置換するれば、ＣＭＣＲＤ酵素の補酵素依存性を変換することが可能となる。アミノ酸置換の候補は、上記部位について、ＣＭＣＲＤ酵素−ＮＡＤＰ複合体構造モデルに対して、プログラムＳｈｒｉｋｅ（特開２００１−１８４３８１）を用いた計算機スクリーニングにより行った。計算変異実験では、ＮＡＤＰに対する結合エネルギーとＮＡＤに対する結合エネルギーの差、およびアミノ酸置換に伴う酵素の（熱）安定性の指標である変性自由エネルギーを指標にアミノ酸変異候補を算出した。また、表２に示す立体構造既知のカルボニル還元酵素の補酵素結合部位の多重アミノ酸配列アラインメントもアミノ酸置換の参考に利用した。
本方法により、設計したアミノ酸置換残候補のうち、ＮＡＤに対する結合が強くなると推定された上位のものは、Ｓ４１Ａ、Ｓ４２ＡまたはＳ４２Ｒ、Ｓ４３Ｑ、Ｓ４３ＧまたはＳ４３ＧまたはＳ４３Ｒ、Ｗ６３Ｉ、Ｗ６３Ｌ、Ｗ６３Ｖ、Ｗ６３ＦまたはＷ６３Ｍ、Ｙ６４Ｄ、Ｎ６５ＩまたはＮ６５Ｖ、Ｓ６６ＮまたはＳ６６Ｌ、Ｙ４７Ｒ、Ａ６９Ｅなどである。これらアミノ酸置換残基候補のＣα炭素原子位置は、ＣＭＣＲＤ酵素−ＮＡＤＰ複合体構造において、補酵素分子ＮＡＤＰの２’リン酸残基のリン原子から、それぞれＳ４１では６．９Å、Ｓ４２では５．１Å、Ｓ４３では６．１Å、Ｙ４７では９．２Å、Ｗ６３では８．３Å、Ｙ６４では５．１Å、Ｎ６５では４．５Å、Ｓ６６では４．３Å、Ａ６９では８．０Åの距離であり、いずれも補酵素分子から１２Å以内の距離にあるアミノ酸残基である。最終的に、これら変異を組み合わせたＳ４１Ａ／Ｓ４２Ａ／Ｓ４３Ｑ／Ｗ６３Ｉ／Ｙ６４Ｄ／Ｎ６５Ｉ／Ｓ６６Ｎ変異体（Ｓ１Ｍ１）、Ｓ４１Ａ／Ｓ４２Ａ／Ｓ４３Ｑ／Ｗ６３Ｉ／Ｙ６４Ｄ／Ｎ６５Ｖ／Ｓ６６Ｌ変異体（Ｓ１Ｍ２）、Ｓ４１Ａ／Ｓ４２Ａ／Ｓ４３Ｇ／Ｗ６３Ｉ／Ｙ６４Ｄ／Ｎ６５Ｉ／Ｓ６６Ｌ変異体（Ｓ１Ｍ３）、Ｓ４１Ａ／Ｓ４２Ａ／Ｓ４３Ｒ／Ｗ６３Ｉ／Ｙ６４Ｄ／Ｎ６５Ｉ／Ｓ６６Ｎ変異体（Ｓ１Ｍ４）、Ｓ４１Ａ／Ｓ４２Ａ／Ｓ４３Ｑ／Ｙ４７Ｒ／Ｗ６３Ｉ／Ｙ６４Ｄ／Ｎ６５Ｉ／Ｓ６６Ｎ変異体（Ｓ１Ｍ５）、Ｓ４１Ａ／Ｓ４２Ａ／Ｓ４３Ｒ／Ｙ４７Ｒ／Ｗ６３Ｉ／Ｙ６４Ｄ／Ｎ６５Ｉ／Ｓ６６Ｎ変異体（Ｓ１Ｍ６）、Ｓ４１Ａ／Ｓ４２Ｒ／Ｗ６３Ｉ／Ｙ６４Ｄ／Ｎ６５Ｉ／Ｓ６６Ｎ変異体（Ｓ１Ｍ７）、Ｓ４１Ａ／Ｓ４２Ｒ／Ｙ４７Ｒ／Ｗ６３Ｉ／Ｙ６４Ｄ／Ｎ６５Ｉ／Ｓ６６Ｎ変異体（Ｓ１Ｍ８）、Ｓ４１Ａ／Ｓ４２Ａ／Ｓ４３Ｑ／Ｗ６３Ｉ／Ｙ６４Ｄ／Ｎ６５Ｉ／Ｓ６６Ｎ／Ａ６９Ｅ変異体（Ｓ１Ｍ９）を設計した。
0004493333.tif 000003
0004493333.tif 000004
ＩＤは、プロテインデータバンク（ＰＤＢ）の登録番号を表す。上段４種のカルボニル還元酵素はＮＡＤ依存性、ＣＭＣＲＤ酵素を含む下段５種のカルボニル還元酵素は、ＮＡＤＰ依存性の酵素である。
（実施例３）  ＣＲＤ酵素変異体の作製
配列番号１のヌクレオチド配列を有するＤＮＡを合成、ｐＵＣ１８のＰｓｔＩサイトにサブクローニングしたプラスミドｐＵＣＳＹＮ１８１（宝酒造社製）０．２μｇを用いて、大腸菌ＪＭ１０９（宝酒造社製）を形質転換した。得られた形質転換体からＦｌｅｘｉＰｒｅｐ（ファルマシア社製）を用いてプラスミドを回収、ＥｃｏＯ１０９Ｉで消化後、分取用ポリアクリルアミド電気泳動で１６７ｂｐのＤＮＡ断片を単離した。一方、プラスミドｐＮＴＳ１（ＷＯ０９８／３５０２５）をＥｃｏＯ１０９Ｉで消化後、分取用アガロースゲル電気移動により、約３．２ｋｂのＤＮＡ断片を回収、ＢＡＰ処理を行った。両ＤＮＡ断片をＴａｋａｒａ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いてライゲーションすることにより、ｐＮＴＳ１のＥｃｏＯ１０９Ｉ−ＥｃｏＯ１０９Ｉ部位に変異遺伝子を挿入した組換えプラスミドｐＮＴＳ１Ｍ１を得た。このプラスミドを用いて、大腸菌ＨＢ１０１（宝酒造社製）を形質転換し、大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＳ１Ｍ１）を得た。同様に、配列番号２〜９のヌクレオチド配列を有する合成ＤＮＡを用いて、ｐＮＴＳ１のＥｃｏＯ１０９Ｉ−ＥｃｏＯ１０９Ｉ部位変異遺伝子を挿入したプラスミドを調製し、各々から組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＳ１Ｍ２）、ＨＢ１０１（ｐＮＴＳ１Ｍ３）、ＨＢ１０１（ｐＮＴＳ１Ｍ４）、ＨＢ１０１（ｐＮＴＳ１Ｍ５）、ＨＢ１０１（ｐＮＴＳ１Ｍ６）、ＨＢ１０１（ｐＮＴＳ１Ｍ７）、ＨＢ１０１（ｐＮＴＳ１Ｍ８）およびＨＢ１０１（ｐＮＴＳ１Ｍ９）を得た。こうして得られた形質転換体のうち、大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＳ１Ｍ１）、ＨＢ１０１（ｐＮＴＳ１Ｍ２）およびＨＢ１０１（ｐＮＴＳ１Ｍ３）は、それぞれ、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８３８８、ＦＥＲＭ  Ｐ−１８３８９およびＦＥＲＭ  Ｐ−１８３９０として、２００１年６月２２日付けで、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６）に寄託され、ＦＥＲＭ  Ｐ−１８３８８については、２００２年５月２７日付けでＦＥＲＭ  ＢＰ−８０５９としてブタペスト条約に基づく寄託に移管されている。また、大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＳ１Ｍ４）およびＨＢ１０１（ｐＮＴＳ１Ｍ６）は、それぞれ、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８６４７およびＦＥＲＭ  Ｐ−１８６４８として、２００１年１２月４日付けで、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６）に寄託され、ＦＥＲＭ  Ｐ−１８６４７については、２００２年５月２７日付けでＦＥＲＭ  ＢＰ−８０６０としてブタペスト条約に基づく寄託に移管されている。
導入したアミノ酸変異は、組換えプラスミドに対して、ＮｄｅＩサイト上流の塩基配列を有するプライマーを用いてＰＣＲにより、変異部位を含むＤＮＡ断片を調製し、ＡＢＩ３７３Ａ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（アプライドバイオシステム社製）を用いて塩基配列を確認した。
（実施例４）  組換え大腸菌におけるＣＭＣＲＤ酵素変異体の発現
実施例３で得た組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＳ１Ｍ１）、ＨＢ１０１（ｐＮＴＳ１Ｍ２）、ＨＢ１０１（ｐＮＴＳ１Ｍ３）、ＨＢ１０１（ｐＮＴＳ１Ｍ４）、ＨＢ１０１（ｐＮＴＳ１Ｍ５）、ＨＢ１０１（ｐＮＴＳ１Ｍ６）、ＨＢ１０１（ｐＮＴＳ１Ｍ７）、ＨＢ１０１（ｐＮＴＳ１Ｍ８）およびＨＢ１０１（ｐＮＴＳ１Ｍ９）を、それぞれ、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地で培養し、集菌後、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁し、超音波破砕により無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液のＣＭＣＲＤ酵素活性を以下のように測定した。酵素活性の測定は、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に、基質４−クロロアセト酢酸エチル１ｍＭ、補酵素ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ０．１６７ｍＭおよび酵素を添加し、３０℃で波長３４０ｎｍの吸光度の減少を測定することにより行った。この反応条件において、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＨ（ＮＡＤＰＨ）をＮＡＤ＋（ＮＡＤＰ＋）に酸化する酵素活性を１ｕｎｉｔと定義した。この様に測定した無細胞抽出液中のＣＭＣＲＤ酵素活性を比活性（抽出液に含まれる蛋白質１ｍｇ当たりの酵素活性）として表し、同様の方法で調製した野生型ＣＭＣＲＤ酵素遺伝子を有するプラスミドで形質転換した大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＳ１）の活性についても同様に比較した。それらの結果を表３に示す。得られたＣＭＣＲＤ酵素変異体はすべて、ＮＡＤＨを補酵素として４−クロロアセト酢酸エチルを還元する酵素活性を有していた。一方、ＮＡＤＰＨを補酵素として場合には、上記測定条件において測定したものはすべて、全く還元活性を示さなかった。このことから、本発明の酵素改変方法によって、ＣＭＣＲＤ酵素の補酵素依存性の変換が達成されたことが確認できた。
0004493333.tif 000005
（実施例５）  ＣＲＤ酵素変異体Ｓ１Ｍ１の精製
実施例４において得た組換え大腸菌のうち、大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＳ１Ｍ１）を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２Ｌの２×ＹＴ培地（バクトトリプトン１６ｇ、バクトイーストエキス１０ｇ、食塩５ｇ／Ｌ）で培養し、遠心分離により菌体を調製した。得られた湿菌体を１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）、１００μＭフオイパイン（ＦＯＩ、小野薬品工業社製）に懸濁し、超音波破砕後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。この上清に硫安を４０％飽和になるまで添加し、これを溶解させ、次いで生じた沈殿を遠心分離により除去した。この上清に、さらに硫安を７０％飽和になるまで添加、溶解し、生じた沈殿を遠心分離により集めた。この沈殿を、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解し（４５ｍｌ）、これを１００μＭＦＯＩを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に対して透析した。これを同一緩衝液で予め平衡化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ファルマシア社製）カラム（３．２×２２ｃｍ、１７５ｍｌ）に供し、酵素変異体を吸着させた後、同一緩衝液約６００ｍｌでカラムを洗浄した。同一緩衝液を用い、食塩（０から０．２Ｍまで）のリニアグラジエントにより、活性画分を溶出させた。活性画分２５０ｍｌを集め、これに硫安を７０％飽和になるまで添加、溶解し、生じた沈殿を遠心分離により集めた。この沈殿を、４Ｍ食塩を含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解し（３０ｍｌ）、同一緩衝液で予め平衡化したＰｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ファルマシア社製）カラム（３×２０ｃｍ、１６０ｍｌ）に供して、酵素変異体を吸着させた。同一緩衝液（約３００ｍｌ）で洗浄した後、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を用い、食塩（４Ｍから０Ｍまで）およびエチレングリコール（０％から５０％（ｗ／ｖ）まで）のリニアグラジエントにより、活性画分を溶出させた。活性画分（約２２０ｍｌ）を集め、限外濾過膜ＹＭ−１０（アミコン社製）にて、０．２Ｍ食塩を含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）へ緩衝液の交換を行った後、９ｍｌにまで濃縮し、精製酵素変異体標品（約２８０ｍｇ）を得た。ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により、純度を解析した結果、単一バンドであった。また、タンパク質の定量は、バイオラッド社製タンパク質アッセイキットを用いた色素結合法により行った。精製酵素Ｓ１Ｍ１の比活性は、約３Ｕ／ｍｇであった。
（実施例６）  ＣＭＣＲＤ酵素変異体の性質の測定
実施例５において得られたＣＭＣＲＤ酵素変異体（Ｓ１Ｍ１）の酵素学的性質について検討した。
酵素活性の測定は、実施例３に記載の測定条件を用いて行った。
（１）作用：ＮＡＤＨを補酵素として、４−クロロアセト酢酸エチルに作用し、光学純度９９％ｅ．ｅ．以上の（Ｓ）−４−ヒドロキシ酪酸エチルを生成した。酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）に依存した（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチル脱水素酵素活性は、ＮＡＤ＋を０．３３〜３ｍＭ、（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルを２〜２０ｍＭ、ｐＨを７．０および８．０に変化させて、波長３４０ｎｍの吸光度の増加を測定することで行ったが、脱水素酵素活性は全く認められなかった。
（２）ｐＨプロフィール：緩衝液としてリン酸カリウム緩衝液を用いてｐＨ５．０〜８．０の範囲で、上記方法で酵素活性を測定した。その結果、（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルに作用する至適ｐＨは５．０付近であり、酸性側でより高い酵素活性を示した（図２）。
（４）作用至適温度：２０℃〜６０℃の温度で１分間の、４−クロロアセト酢酸エチルを基質とした場合の本願発明の酵素の活性を測定して、至適温度を求めた。その結果、至適温度は４０℃〜５５℃であった。
（５）熱安定性：本酵素をｐＨ７．０で３０℃、３５℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃および６０℃の温度で３０分間放置した後、４−クロロアセト酢酸エチルの還元活性を測定した。結果は、未処理の活性を１００とした残存活性で表し、図３に示した。本発明によるカルボニル還元酵素は、４０℃まで８５％、４５℃まで７５％以上の残存活性を示した。
（６）分子量
酵素の分子量の測定はＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷカラムを用い、溶離液として０．１ＭＮａ２ＳＯ４、０．０５％ＮａＮ３を含む０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を用いた場合、約７６，０００であった。酵素のサブユニットの分子量は、２％（ｖ／ｖ）の２−メルカプトエタノール存在下、１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、そして標準タンパクの相対移動度から算出することにより決定した。その結果、本酵素のサブユニットの分子量は約３２，０００であった。
（７）有機溶媒耐性：本酵素変異体が溶解しているｐＨ７．０のリン酸カリウム緩衝液に等量の酢酸エチル、酢酸ブチルまたはジイソプロピルエーテルを添加し、２５℃で３０分間振とうした後、遠心分離を行い、水相中の酵素の残存活性を、４−クロロアセト酢酸エチルを基質として測定した。その結果、酢酸エチルを添加した場合では８９％、酢酸ブチルを添加した場合では９４％、ジイソプロピルエーテルの場合では１００％の活性が残存していた（図４）。
（実施例７）  ＣＭＣＲＤ酵素変異体遺伝子を導入した組換え大腸菌による４−ハロアセト酢酸エステルからの（Ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルの合成
実施例３で得た組換え大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＳ１Ｍ１）を、５００ｍｌ容坂口フラスコ（４本）中で滅菌した１００ｍｌの２×ＹＴ培地に接種し、３７℃で４４時間振とう培養し、遠心分離により菌体を調製した。得られた湿菌体を２５ｍｌの１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に澱懸し超音波破砕し、酵素液を得た。酵素液１０ｍｌに、グルコース脱水素酵素（ＧＤＨ、天野エンザイム社製）溶液１０ｍｌ、グルコース７．１ｇ、ＮＡＤ＋３．２ｍｇ、４−クロロアセト酢酸エチル５ｇを添加し、イオン交換水５ｍｌ、酢酸ブチル２５ｍｌを加えて総量５０ｍｌに調製した。５Ｍの水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ６．５に調製しつつ３０℃で撹拌しながら、５．５時間反応を行った。反応終了後、反応液を酢酸エチルで抽出し、脱溶剤した後抽出物の分析を行ったところ、転換率９８％で９９％ｅ．ｅ．以上の（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルが生成していた。
４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルの定量はガスクロマトグラフィーにより行った。ＰＥＧ−２０Ｍ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｒｂ  ＷＡＷ  ＤＭＣＳ  １０％８０／１００ｍｅｓｈ（ジーエルサイエンス社製）を充填したガラスカラム（ＩＤ３ｍｍ×１ｍ）を用い、１５０℃でクロマトグラフィーを行い，検出はＦＩＤにより行った。（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルの光学純度の測定は光学分離カラムＣＨＩＲＡＬＣＥＬ  ＯＢ（０．４６×２５ｃｍ）（ダイセル化学会社製）を用いたＨＰＬＣにより行った。移動相としてヘキサン：イソプロパノール＝９：１の混合溶媒を用い，移動相の流速は０．８ｍｌ／ｍｉｎでクロマトグラフィーを行った。検出は、２１５ｎｍの吸光度を測定することにより行った。
（実施例８）  ＣＲＤ酵素変異体Ｓ１Ｍ４の精製
実施例４において酵素活性が高かった大腸菌ＨＢ１０１（ｐＮＴＳ１Ｍ４）を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５００ｍｌの２×ＹＴ培地（バクトトリプトン１６ｇ、バクトイーストエキス１０ｇ、食塩５ｇ／Ｌ）で培養し、遠心分離により菌体を調製した。得られた湿菌体から実施例５と同様の手順により精製酵素変異体標品を得た。精製酵素は、ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により、純度を解析した結果、単一バンドであった。また、タンパク質の定量は、バイオラッド社製タンパク質アッセイキットを用いた色素結合法により行った。精製酵素Ｓ１Ｍ４の比活性は、約１０Ｕ／ｍｇであった。
（実施例９）  ＣＭＣＲＤ酵素変異体の性質の測定（２）
実施例８において得られたＣＭＣＲＤ酵素変異体（Ｓ１Ｍ４）の酵素学的性質について検討した。
酵素活性の測定は、実施例３に記載の測定条件を用いて行った。
（１）作用：ＮＡＤＨを補酵素として、４−クロロアセト酢酸エチルに作用し、光学純度９９％ｅ．ｅ．以上の（Ｓ）−４−ヒドロキシ酪酸エチルを生成した。酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）に依存した（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチル脱水素酵素活性は、ＮＡＤ＋を０．３３〜３ｍＭ、（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルを２〜２０ｍＭ、ｐＨを７．０および８．０に変化させて、波長３４０ｎｍの吸光度の増加を測定することで行ったが、脱水素酵素活性は全く認められなかった。
（２）ｐＨプロフィール：緩衝液としてリン酸カリウム緩衝液を用いてｐＨ５．０〜８．０の範囲で、上記方法で酵素活性を測定した。その結果、（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルに作用する至適ｐＨは５．０付近であり、ＣＭＣＲＤ酵素変異体（Ｓ１Ｍ１）と同様に酸性側でより高い酵素活性を示した（図５）。
（４）作用至適温度：２０℃〜６０℃の温度で１分間の、４−クロロアセト酢酸エチルを基質とした場合の本願発明の酵素の活性を測定して、至適温度を求めた。その結果、ＣＭＣＲＤ酵素変異体（Ｓ１Ｍ１）と同様に至適温度は４０℃〜５５℃であった。
（５）熱安定性：本酵素をｐＨ７．０で３０℃、３５℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃および６０℃の温度で３０分間放置した後、４−クロロアセト酢酸エチルの還元活性を測定した。結果は、未処理の活性を１００とした残存活性で表し、図６に示した。本発明によるカルボニル還元酵素は、ＣＭＣＲＤ酵素変異体（Ｓ１Ｍ１）と同様に４５℃まで７５％以上の残存活性を示した。
（６）分子量：酵素の分子量の測定はＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷカラムを用い、溶離液として０．１ＭＮａ２ＳＯ４、０．０５％ＮａＮ３を含む０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を用いた場合、約７６，０００であった。酵素のサブユニットの分子量は、２％（ｖ／ｖ）の２−メルカプトエタノール存在下、１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、そして標準タンパクの相対移動度から算出することにより決定した。その結果、本酵素のサブユニットの分子量は約３２，０００であった。
（７）有機溶媒耐性：本酵素変異体が溶解しているｐＨ７．０のリン酸カリウム緩衝液に等量の酢酸エチル、酢酸ブチルまたはジイソプロピルエーテルを添加し、２５℃で３０分間振とうした後、遠心分離を行い、水相中の酵素の残存活性を、４−クロロアセト酢酸エチルを基質として測定した。その結果、酢酸エチルを添加した場合では８４％、酢酸ブチルを添加した場合では１０３％、ジイソプロピルエーテルの場合では１０６％の活性が残存しており、ＣＭＣＲＤ酵素変異体（Ｓ１Ｍ１）と同等の有機溶媒耐性を示した（図７）。
産業上の利用の可能性
補酵素の結合エネルギーを制御することを特徴とする酸化還元酵素の酵素改変方法、工業生産に有利なＮＡＤＨ依存性のカルボニル還元酵素変異体ならびにそれらをコードするＤＮＡ、このＤＮＡを有するプラスミド、このプラスミドで形質転換された形質転換細胞、ならびにこの酵素変異体および／またはこの形質転換細胞を用いる光学活性アルコールの製造方法が提供された。さらには、本酵素改変方法は、本発明のカルボニル還元酵素と類縁関係にある酵素群の補酵素依存性の変換に有意義に応用され得ることは明らかである。
なお、本件明細書には、本件出願の優先権基礎出願である日本国特許出願２００１−２００４１７号及び特許出願２００２−００６３０３号の明細書及び又は図面に記載された内容を引用により含めるものである。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、ＣＭＣＲＤ酵素−ＮＡＤＰ複合体の立体構造モデルの模式図。ただし、Ｎ末端領域である位置１−１７の残基を除く。
図２は、ＣＭＣＲＤ酵素変異体Ｓ１Ｍ１のｐＨプロフィール。
図３は、ＣＭＣＲＤ酵素変異体Ｓ１Ｍ１の温度安定性。
図４は、ＣＭＣＲＤ酵素変異体Ｓ１Ｍ１の有機溶剤耐性。
図５は、ＣＭＣＲＤ酵素変異体Ｓ１Ｍ４のｐＨプロフィール。
図６は、ＣＭＣＲＤ酵素変異体Ｓ１Ｍ４の温度安定性。
図７は、ＣＭＣＲＤ酵素変異体Ｓ１Ｍ４の有機溶剤耐性。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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