(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２価以上の結合性を有する被測定物質Ａを検出あるいは測定するためのキットであって、下記の受容体Ｉ、下記の受容体II、並びに受容体Ｉ、受容体II及び被測定物質からなる複合体を捕獲するための下記の固相複合体を包含することを特徴とするキット：
１）物質Ｂ１に対して結合性を有する物質Ｒ１にマーカーＭを結合させてなる化合物Ｒ１−Ｍと、被測定物質Ａに対して結合性を有するリガンドＬ１に物質Ｂ１を結合させてなる化合物Ｌ１−Ｂ１を結合させてなる化合物Ｌ１−Ｂ１−Ｒ１−Ｍで表される受容体Ｉ；  ２）被測定物質Ａに対して結合性を有するリガンドＬ２に被測定物質Ａとは異なる結合性を有する物質Ｂ２を導入してなる化合物Ｌ２−Ｂ２と、物質Ｂ２に対して結合性を有する物質Ｒ２に該物質Ｂ２とは異なる結合性を有する結合子Ｂ３を結合させてなる化合物Ｒ２−Ｂ３を予め結合させて得られた化合物Ｌ２−Ｂ２−Ｒ２−Ｂ３で表される受容体II；及び、
３）結合子Ｂ３に対して結合性を有する被結合子Ｒ３を固相に結合させてなる化合物Ｒ３−固相で表される固相複合体。
【請求項２】
タンパク質Ｐの一部を構成するリガンドＬ３に対して２価以上の結合性を有する被測定物質Ａを検出あるいは測定するためのキットであって、下記の受容体Ｉ、下記の受容体II、並びに受容体Ｉ、受容体II及び被測定物質からなる複合体を捕獲するための下記の固相複合体を包含することを特徴とするキット：
１）タンパク質ＰにマーカーＭを結合させた化合物Ｐ−Ｍで表される受容体Ｉ；
２）タンパク質ＰあるいはリガンドＬ３に被測定物質Ａとは異なる結合性を有する物質Ｂ２を導入してなる化合物Ｐ−Ｂ２あるいはＬ３−Ｂ２と、物質Ｂ２に対して結合性を有する物質Ｒ２に該物質Ｂ２とは異なる結合性を有する結合子Ｂ３を結合させてなる化合物Ｒ２−Ｂ３を結合させて得られた化合物Ｐ−Ｂ２−Ｒ２−Ｂ３あるいはＬ３−Ｂ２−Ｒ２−Ｂ３で表される受容体II；及び、
３）結合子Ｂ３に対して結合性を有する被結合子Ｒ３を固相に結合させてなる化合物Ｒ３−固相で表される固相複合体。
【請求項３】
２価以上の結合性を有する被測定物質Ａを検出あるいは測定するためのキットであって、下記の受容体Ｉ、下記の受容体II、並びに受容体Ｉ、受容体II及び被測定物質からなる複合体を捕獲するための下記の固相複合体を包含することを特徴とするキット：
１）物質Ｂ１に対して結合性を有する物質Ｒ１にマーカーＭを結合させてなる化合物Ｒ１−Ｍと、被測定物質Ａと結合性を有するリガンドＬ１と物質Ｂ１を結合させてなる化合物Ｌ１−Ｂ１を結合させてなる化合物Ｌ１−Ｂ１−Ｒ１−Ｍで表される受容体Ｉ；
２）被測定物質Ａと結合性を有するリガンドＬ２に被測定物質Ａとは異なる結合性を有する結合子Ｂ３を予め結合させて得られた化合物Ｌ２−Ｂ３で表される受容体II；及び、  ３）結合子Ｂ３に対して結合性を有する被結合子Ｒ３を固相に結合させてなる化合物Ｒ３−固相で表される固相複合体。
【請求項４】
前記物質Ｒ１は、前記物質Ｂ１との結合ポイントを複数個有し、物質Ｂ１を介して物質Ｒ１に前記リガンドＬ１が複数個結合されていることを特徴とする請求項１又は３記載のキット。
【請求項５】
前記複数個のリガンドＬ１の各々の反応性は複数種である請求項４記載のキット。
【請求項６】
前記物質Ｒ２は、前記物質Ｂ２との結合ポイントを複数個有し、物質Ｂ２を介して物質Ｒ２に前記リガンドＬ２又はリガンドＬ３が複数個結合されていることを特徴とする請求項１又は２記載のキット。
【請求項７】
前記複数個のリガンドＬ２又はリガンドＬ３の各々の反応性は複数種である請求項６記載のキット。
【請求項８】
前記固相複合体が、少なくもと前記受容体IIとは独立して存在している請求項１、２又は３記載のキット。
【請求項９】
前記２価以上の結合性を有する被測定物質Ａが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、抗原及び抗体の群から選ばれた物質である請求項１、２又は３記載のキット。
【請求項１０】
前記リガンドＬ１、リガンドＬ２又はリガンドＬ３が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、抗原、抗体、レクチン、糖タンパク質及び糖の群から選ばれた物質である請求項１、２又は３記載のキット。
【請求項１１】
前記リガンドＬ１及びリガンドＬ２が同一の物質である請求項１又は３記載のキット。
【請求項１２】
前記リガンドＬ１、Ｌ２及びリガンドＬ３が異なる配列を持つ物質である請求項１、２又は３記載のキット。
【請求項１３】
前記物質Ｂ１と物質Ｒ１、あるいは物質Ｂ２と物質Ｒ２の結合性は、解離定数として１０-8から１０-16 （Ｍ）で示されるものである請求項１、２又は３記載のキット。
【請求項１４】
前記物質Ｂ１及び／又は物質Ｂ２がビオチンである請求項１、２又は３記載のキット。
【請求項１５】
前記物質Ｂ１及び／又は物質Ｂ２がＤＮＡ、ＲＮＡ、抗原、抗体、レクチン、糖タンパク質及び糖の群から選ばれた物質である請求項１、２又は３記載のキット。
【請求項１６】
前記物質Ｒ１及び／又は物質Ｒ２がストレプトアビジン及びアビジンの群から選ばれた物質である請求項１、２又は３記載のキット。
【請求項１７】
前記物質Ｒ１及び／又は物質Ｒ２が抗原、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、レクチン、糖タンパク質及び糖の群から選ばれた物質である請求項１、２又は３記載のキット。
【請求項１８】
前記物質Ｒ１及び物質Ｒ２が同一物質である請求項１記載のキット。
【請求項１９】
前記物質Ｒ１及び物質Ｒ２が異なる物質である請求項１記載のキット。
【請求項２０】
前記結合子Ｂ３と被結合子Ｒ３は、ＤＮＡ又はＲＮＡの少なくとも一部分の相補的結合により結合可能なものである請求項１、２又は３記載のキット。
【請求項２１】
前記マーカーＭが着色色素、蛍光色素、発光性物質、金属コロイド、ラテックス、リポソーム、放射性同位元素、酵素、ＤＮＡ及びＲＮＡの群から選ばれた物質である請求項１、２又は３記載のキット。
【請求項２２】
前記固相がポリスチレン、ニトロセルロース、ナイロン、セルロース及びガラスの群から選ばれた物質である請求項１、２又は３記載のキット。
【請求項２３】
２価以上の結合性を有する被測定物質Ａを検出又は測定する方法であって、
１）被測定物質Ａを、
２）物質Ｂ１に対して結合性を有する物質Ｒ１にマーカーＭを結合させてなる化合物Ｒ１−Ｍと、上記被測定物質Ａと結合性を有するリガンドＬ１と物質Ｂ１を結合させてなる化合物Ｌ１−Ｂ１を結合させてなる化合物Ｌ１−Ｂ１−Ｒ１−Ｍで表される受容体Ｉ、並びに、
３）被測定物質Ａと結合性を有するリガンドＬ２に被測定物質Ａとは異なる結合性を有する物質Ｂ２を導入してなる化合物Ｌ２−Ｂ２と、物質Ｂ２に対して結合性を有する物質Ｒ２に該物質Ｂ２とは異なる結合性を有する結合子Ｂ３を結合させてなる化合物Ｒ２−Ｂ３を予め結合させて得られた化合物Ｌ２−Ｂ２−Ｒ２−Ｂ３で表される受容体IIと接触させて反応させて複合体を生成し、
４）前記生成した複合体を、結合子Ｂ３に対して結合性を有する被結合子Ｒ３を固相に結合させてなる化合物Ｒ３−固相で表される固相複合体により捕獲し、
５）捕獲された複合体中のマーカーＭを検出又は測定することを特徴とする被測定物質を検出又は測定する方法。
【請求項２４】
タンパク質Ｐの一部を構成するリガンドＬ３に対して２価以上の結合性を有する被測定物質Ａを検出又は測定する方法であって、
１）被測定物質Ａを、
２）タンパク質ＰにマーカーＭを結合させた化合物Ｐ−Ｍで表される受容体Ｉ、並びに  ３）タンパク質ＰあるいはリガンドＬ３に被測定物質Ａとは異なる結合性を有する物質Ｂ２を導入してなる化合物Ｐ−Ｂ２あるいはＬ３−Ｂ２と、物質Ｂ２に対して結合性を有する物質Ｒ２に該物質Ｂ２とは異なる結合性を有する結合子Ｂ３を結合させてなる化合物Ｒ２−Ｂ３を結合させて得られた化合物Ｐ−Ｂ２−Ｒ２−Ｂ３あるいはＬ３−Ｂ２−Ｒ２−Ｂ３で表される受容体IIと接触させて反応させて複合体を生成し、
４）前記生成した複合体を、結合子Ｂ３に対して結合性を有する被結合子Ｒ３を固相に結合させてなる化合物Ｒ３−固相で表される固相複合体により捕獲し、
５）捕獲された複合体中のマーカーＭを検出又は測定することを特徴とする被測定物質を検出又は測定する方法。
【請求項２５】
２価以上の結合性を有する被測定物質Ａを検出又は測定する方法であって、
１）被測定物質Ａを、
２）物質Ｂ１に対して結合性を有する物質Ｒ１にマーカーＭを結合させてなる化合物Ｒ１−Ｍと、上記被測定物質Ａと結合性を有するリガンドＬ１と物質Ｂ１を結合させてなる化合物Ｌ１−Ｂ１を結合させてなる化合物Ｌ１−Ｂ１−Ｒ１−Ｍで表される受容体Ｉ、並びに、
３）被測定物質Ａと結合性を有するリガンドＬ２に被測定物質Ａとは異なる結合性を有する結合子Ｂ３を予め結合させて得られた化合物Ｌ２−Ｂ３で表される受容体IIと接触させて反応させて複合体を生成し、
４）前記生成した複合体を、結合子Ｂ３に対して結合性を有する被結合子Ｒ３を固相に結合させてなる化合物Ｒ３−固相で表される固相複合体により捕獲し、
５）捕獲された複合体中のマーカーＭを検出又は測定することを特徴とする被測定物質を検出又は測定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体試料中に包含される２価以上の結合性を有する被測定物質を検出あるいは測定するキットであって、被測定物質に特異的に結合するリガンドに対して直接結合してマーカーにて標識するか、あるいは間接的に結合してマーカーにて標識してなるリガンド・マーカー複合体と、被測定物質に特異的に結合するリガンドを固相に結合するための結合子とを含むリガンド・結合子複合体と、該リガンド・結合子複合体を、固相に捕獲するための被結合子を結合させた固相とを含むことからなるキット、及び検出又は測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
液体試料中に包含される抗体などリガンドに対する２価以上の結合性を有する物質を検出あるいは測定する方法には、次の方法が知られている。すなわち、リガンドを酵素などのマーカーで標識したものと、固相にリガンドを結合させたものを準備しておき、前記リガンドをマーカーで標識したものと、液体試料中の抗体とを反応させる。次いでこの溶液を前記リガンド結合固相と反応させて、固相に結合したマーカーの有無を検出あるいは量を測定する方法である（例えば、特開平９−２２９９３８号公報）。この方法では、同じリガンドに対する抗体が標識リガンドに予め反応してしまうために、固相化されたリガンドに反応しなくなり、感度が高くない場合が多かった。
【０００３】
そのため、特許第２５３２７８８号公報にあるように、捕獲種（Ｒ）を固相に結合させておき、第一の免疫反応性物質（Ｉ１）と検出可能な同位体（Ｍ）との結合生成物からなる分散された第一の粒子の第一のバッチ（Ｍ−Ｉ１）と、第二の免疫反応性物質（Ｉ２）と捕獲可能種（Ｂ）との第二の結合生成物からなる分散された第二の粒子の第二のバッチ（Ｉ２−Ｂ）とを、免疫反応性分析物（Ｇ）を介して結合させて複合体（Ｍ−Ｉ１−Ｇ−Ｉ２−Ｂ）を形成させ、固相に結合させた捕獲種（Ｒ）と反応させて、免疫反応性分析物の介在あるいは量を評価する方法があった。この方法では、第一の免疫反応性物質（Ｉ１）と第二の免疫反応性物質（Ｉ２）を同一のものを用いることにより、第一の免疫反応性物質（Ｉ１）と検出可能な同位体（Ｍ）同志で免疫反応性分析物（Ｇ）が結合せずに、第一の免疫反応性物質（Ｉ１）と第二の免疫反応性物質（Ｉ２）が、同時に免疫反応性分析物（Ｇ）と反応するために感度が高いという特色がある。
【０００４】
さらに、特開平１０−２５３６３２号公報には、オリゴヌクレオチド（ＯＮ）を固相化しておき、そのオリゴヌクレオチド（ＯＮ）と相補的なオリゴヌクレオチド（ＯＮ’）で標識されたリガンド（ＯＮ’−Ｌ）（例えば、ＯＮ’−抗原又はＯＮ’−抗体）と、マーカー標識化リガンド（Ｍ−Ｌ）とを、リガンド（Ｌ）対して結合する分析物（Ａ）に対して反応させ、複合体（ＯＮ’−Ｌ−Ａ−Ｌ−Ｍ）を形成させて、オリゴヌクレオチド結合固相と該複合体中に含まれるオリゴヌクレオチド同志の相補的な結合により、固相に複合体を結合させることによりマーカー（Ｍ）の有無、量により分析物を評価する方法が示されている。この方法では、分析物（Ａ）とマーカー標識化リガンド（Ｍ−Ｌ）が先に複合体を形成せずに、ＯＮ’−ＬとＭ−Ｌが同時に分析物（Ａ）と反応するために、特許第２５３２７８８号公報の方法と同様に感度が高いという特性を有する。さらにこの方法では、固相化するオリゴヌクレオチド、対応するリガンド（Ｌ）に結合させるオリゴヌクレオチドをそれぞれ配列を変化させることにより複数の分析対象物を同時に測定することが可能になる。
【０００５】
前記特許第２５３２７８８号公報あるいは特開平１０−２５３６３２号公報の方法のように感度高く、測定対象物を検出あるいは測定するには、第一あるいは第二の免疫反応性物質、あるいは配位子を何らかの結合子で標識する必要がある。
しかしながら、前記免疫反応性物質あるいはリガンド（Ｌ）を直接結合子で標識する場合、標識化工程の途中における標識化リガンド（Ｌ）の精製過程で、リガンド（Ｌ）の物性が変化して不溶化しやすく、結合子標識化配位子（例えば、結合子で標識された抗原）の回収率が著しく低下する場合があった。
【０００６】
一方、低分子のペプチドをリガンド（Ｌ）として直接標識する際に標識されたペプチドは回収されるものの、立体配置による障害と思われる免疫化学的反応性の低下が起きることもあった。さらに、低分子のペプチドを金属コロイド、着色ラテックスなどで標識しようとした場合、低分子であるが故に、標識ができないといったこともあった。
【０００７】
特許第２５０１９６０号公報には、マーカーで標識化された特異的結合能を有する物質Ｐ２（例えば、アビジン、ストレプトアビジン）と、マーカーで標識化されていない特異的結合能を有する物質Ｐ２と、Ｐ２に対する１価の結合成分Ｐ１（例えば、ビオチン）とリガンドＲ１を結合させた化合物Ｐ１−Ｒ１、及び、前記マーカーで標識されていない物質Ｐ２が固相に結合されたものからなる試薬が示されている。該試薬は、複合体あたりのリガンド量を調整することができないため、あるいは、固相との反応がビオチン−アビジンによる結合性であり、強固な結合性であるため、試薬の感度をコントロールすることが困難という問題がある。そのため、他の要因による極微量な免疫物質に対しても反応してしまい、好ましくない判定結果をもたらす場合もある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで、本発明の目的は、抗体などのリガンドに対して２価以上の結合性を有する、液体試料中に包含される分析対象物質を検出あるいは測定するキットであって、簡易に検出あるいは測定でき、キットを製造する際の収率が高く、低分子量のリガンドや、高分子量のリガンドであっても、さらにはタンパク質の一部を構成するリガンドであって、容易に標識することができ、例えば、リガンドにマーカーを標識させる場合にリガンドが低分子化合物であっても、収率よくリガンド・マーカー複合体を製造することができ、キット中に含まれるリガンドの量の調整を可能とすることにより、あるいは、固相と複合体との結合性を変化させることができ、その結合性を変化させることにより試薬の感度をコントロールすることができるキットを提供すること、被測定物質の検出又は測定方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、上記課題を解決するために下記のようなキットを構成することからなる。
本発明の１番目の型式のキットは、２価以上の結合性を有する被測定物質Ａを検出あるいは測定するためのキットであって、下記の受容体Ｉ、下記の受容体II、並びに受容体Ｉ、受容体II及び被測定物質からなる複合体を捕獲するための下記の固相複合体を包含することを特徴とするキットである。
１）物質Ｂ１に対して結合性を有する物質Ｒ１にマーカーＭを結合させてなる化合物Ｒ１−Ｍと、被測定物質Ａに対して結合性を有するリガンドＬ１に物質Ｂ１を結合させてなる化合物Ｌ１−Ｂ１を結合させてなる化合物Ｌ１−Ｂ１−Ｒ１−Ｍで表される受容体Ｉ；  ２）被測定物質Ａに対して結合性を有するリガンドＬ２に被測定物質Ａとは異なる結合性を有する物質Ｂ２を導入してなる化合物Ｌ２−Ｂ２と、物質Ｂ２に対して結合性を有する物質Ｒ２に該物質Ｂ２とは異なる結合性を有する結合子Ｂ３を結合させてなる化合物Ｒ２−Ｂ３を予め結合させて得られた化合物Ｌ２−Ｂ２−Ｒ２−Ｂ３で表される受容体II；及び、
３）結合子Ｂ３に対して結合性を有する被結合子Ｒ３を固相に結合させてなる化合物Ｒ３−固相で表される固相複合体。
【００１０】
本発明の２番目の型式のキットは、タンパク質Ｐの一部を構成するリガンドＬ３に対して２価以上の結合性を有する被測定物質Ａを検出あるいは測定するためのキットであって、下記の受容体Ｉ、下記の受容体II、並びに受容体Ｉ、受容体II及び被測定物質からなる複合体を捕獲するための下記の固相複合体を包含することを特徴とするキットである。
１）タンパク質ＰにマーカーＭを結合させた化合物Ｐ−Ｍで表される受容体Ｉ；
２）タンパク質ＰあるいはリガンドＬ３に被測定物質Ａとは異なる結合性を有する物質Ｂ２を導入してなる化合物Ｐ−Ｂ２あるいはＬ３−Ｂ２と、物質Ｂ２に対して結合性を有する物質Ｒ２に該物質Ｂ２とは異なる結合性を有する結合子Ｂ３を結合させてなる化合物Ｒ２−Ｂ３を結合させて得られた化合物Ｐ−Ｂ２−Ｒ２−Ｂ３あるいはＬ３−Ｂ２−Ｒ２−Ｂ３で表される受容体II；及び、
３）結合子Ｂ３に対して結合性を有する被結合子Ｒ３を固相に結合させてなる化合物Ｒ３−固相で表される固相複合体。
【００１１】
本発明のキットにおいて、固相複合体は、少なくもと受容体IIとは独立して存在している。即ち、測定前では固相複合体は、受容体II及び受容体Ｉと独立した組み合わせのキットであるか、あるいは、受容体IIと独立し、受容体Ｉと同じ系の組み合わせのキットであってもよい。
【００１２】
本発明の３番目の型式のキットは、２価以上の結合性を有する被測定物質Ａを検出あるいは測定するためのキットであって、下記の受容体Ｉ、下記の受容体II、並びに受容体Ｉ、受容体II及び被測定物質からなる複合体を捕獲するための下記の固相複合体を包含することを特徴とするキットである。
１）物質Ｂ１に対して結合性を有する物質Ｒ１にマーカーＭを結合させてなる化合物Ｒ１−Ｍと、被測定物質Ａと結合性を有するリガンドＬ１と物質Ｂ１を結合させてなる化合物Ｌ１−Ｂ１を結合させてなる化合物Ｌ１−Ｂ１−Ｒ１−Ｍで表される受容体Ｉ；
２）被測定物質Ａと結合性を有するリガンドＬ２に被測定物質Ａとは異なる結合性を有する結合子Ｂ３を予め結合させて得られた化合物Ｌ２−Ｂ３で表される受容体II；及び、  ３）結合子Ｂ３に対して結合性を有する被結合子Ｒ３を固相に結合させてなる化合物Ｒ３−固相で表される固相複合体。
【００１３】
本発明のキットにおいて、２価以上の結合性を有する被測定物質Ａは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、抗原及び抗体の群から選ぶことができる。  本発明のキットにおいて、リガンドＬ１とリガンドＬ２が同一物質（例えば、アビジン同士、又はストレプトアビジン同士）であっても、異なる配列を持つ物質（例えば、配列の異なるＤＮＡ同士又はＲＮＡ同士の組み合わせ、あるいはアビジンとストレプトアビジンの組み合わせ）であってもよい。
本発明のキットにおいて、リガンドＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、抗原、抗体、レクチン、糖タンパク質及び糖の群から選ぶことができる。
【００１４】
本発明のキットにおいて、物質Ｒ１及び／又は物質Ｒ２は、ストレプトアビジン、アビジン、抗原、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、レクチン、糖タンパク質及び糖の群から選ぶことができる。
【００１５】
本発明のキットにおいて、物質Ｒ１と物質Ｒ２が同一物質（例えば、アビジン同士、又はストレプトアビジン同士）であっても、異なる物質（例えば、アビジンとストレプトアビジン）であってもよい。
【００１６】
本発明のキットにおける、物質Ｂ１及び／又は物質Ｂ２は、ビオチン、ＤＮＡ、ＲＮＡ、抗原、抗体、レクチン、糖タンパク質及び糖の群から選ばれた物質が使用できる。本発明のキットにおいて、代表的な例には、物質Ｂ１及び／又は物質Ｂ２にビオチンが使用される場合である。このような場合には、物質Ｒ１と物質Ｒ２にアビジン同士、及び／又はストレプトアビジン同士が使用される。
【００１７】
本発明のキットにおける、物質Ｂ１と物質Ｒ１、あるいは物質Ｂ２と物質Ｒ２の結合性は、解離定数として１０-8から１０-16 （Ｍ）の範囲が好ましい。
本発明のキットにおいて、マーカーには、例えば、着色色素、蛍光色素、発光性物質、金属コロイド、ラテックス、リポソーム、放射性同位元素、酵素、ＤＮＡ及びＲＮＡなる群から選ばれた物質を使用することができる。
本発明で使用される固相には、ポリスチレン、ニトロセルロース、ナイロン、セルロース及びガラスの群から選ばれた物質が好適に使用される。
【００１８】
本発明の被測定物質Ａを検出又は測定するための１番目の型式のキット使用する検出又は測定方法は、２価以上の結合性を有する被測定物質Ａを検出又は測定する方法であって、
１）被測定物質Ａを、
２）物質Ｂ１に対して結合性を有する物質Ｒ１にマーカーＭを結合させてなる化合物Ｒ１−Ｍと、上記被測定物質Ａと結合性を有するリガンドＬ１と物質Ｂ１を結合させてなる化合物Ｌ１−Ｂ１を結合させてなる化合物Ｌ１−Ｂ１−Ｒ１−Ｍで表される受容体Ｉ、並びに、
３）被測定物質Ａと結合性を有するリガンドＬ２に被測定物質Ａとは異なる結合性を有する物質Ｂ２を導入してなる化合物Ｌ２−Ｂ２と、物質Ｂ２に対して結合性を有する物質Ｒ２に該物質Ｂ２とは異なる結合性を有する結合子Ｂ３を結合させてなる化合物Ｒ２−Ｂ３を予め結合させて得られた化合物Ｌ２−Ｂ２−Ｒ２−Ｂ３で表される受容体IIと接触させて反応させて複合体を生成し、
４）前記生成した複合体を、結合子Ｂ３に対して結合性を有する被結合子Ｒ３を固相に結合させてなる化合物Ｒ３−固相で表される固相複合体により捕獲し、
５）捕獲された複合体中のマーカーＭを検出又は測定することを特徴とする方法である。
【００１９】
本発明の被測定物質Ａを検出又は測定するための２番目の型式のキットを使用する検出又は測定方法は、タンパク質Ｐの一部を構成するリガンドＬ３に対して２価以上の結合性を有する被測定物質Ａを検出又は測定する方法であって、
１）被測定物質Ａを、
２）タンパク質ＰにマーカーＭを結合させた化合物Ｐ−Ｍで表される受容体Ｉ、並びに  ３）タンパク質ＰあるいはリガンドＬ３に被測定物質Ａとは異なる結合性を有する物質Ｂ２を導入してなる化合物Ｐ−Ｂ２あるいはＬ３−Ｂ２と、物質Ｂ２に対して結合性を有する物質Ｒ２に該物質Ｂ２とは異なる結合性を有する結合子Ｂ３を結合させてなる化合物Ｒ２−Ｂ３を結合させて得られた化合物Ｐ−Ｂ２−Ｒ２−Ｂ３あるいはＬ３−Ｂ２−Ｒ２−Ｂ３で表される受容体IIと接触させて反応させて複合体を生成し、
４）前記生成した複合体を、結合子Ｂ３に対して結合性を有する被結合子Ｒ３を固相に結合させてなる化合物Ｒ３−固相で表される固相複合体により捕獲し、
５）捕獲された複合体中のマーカーＭを検出又は測定することを特徴とする方法である。
【００２０】
本発明の被測定物質Ａを検出又は測定するための３番目の型式のキット使用する検出又は測定方法は、２価以上の結合性を有する被測定物質Ａを検出又は測定する方法であって、
１）被測定物質Ａを、
２）物質Ｂ１に対して結合性を有する物質Ｒ１にマーカーＭを結合させてなる化合物Ｒ１−Ｍと、上記被測定物質Ａと結合性を有するリガンドＬ１と物質Ｂ１を結合させてなる化合物Ｌ１−Ｂ１を結合させてなる化合物Ｌ１−Ｂ１−Ｒ１−Ｍで表される受容体Ｉ、並びに、
３）被測定物質Ａと結合性を有するリガンドＬ２に被測定物質Ａとは異なる結合性を有する結合子Ｂ３を予め結合させて得られた化合物Ｌ２−Ｂ３で表される受容体IIと接触させて反応させて複合体を生成し、
４）前記生成した複合体を、結合子Ｂ３に対して結合性を有する被結合子Ｒ３を固相に結合させてなる化合物Ｒ３−固相で表される固相複合体により捕獲し、
５）捕獲された複合体中のマーカーＭを検出又は測定することを特徴とする被測定物質を検出又は測定する方法である。
【００２１】
上記の被測定物質Ａを検出又は測定する３つの方法において、前記各１）〜３）の要件による複合体を形成する方法は、１工程で同時に反応を進行させて実施してもよいし、複数工程で接触させる順序を変えて順次実施してもよい。
【００２２】
本発明の１番目の型式のキットに使用される化合物Ｌ１−Ｂ１−Ｒ１−Ｍ（受容体Ｉ）の実施の態様において、物質Ｒ１としてストレプトアビジン又はアビジンを使用し、マーカーＭとして金属コロイド又は酵素を結合させた物質を使用し、化合物Ｌ１−Ｂ１としてのビオチン結合リガンドなる物質を、ビオチンと、アビジン又はストレプトアビジンとの特異的結合反応により結合させてなる化合物は、新規物質として特徴がある。
【００２３】
本発明の１番目の型式のキットは、リガンドＬ１が水溶性の場合にも適用できるが、特に、不溶性が高い場合に好適である。不溶性の高いリガンドＬ１は、直接標識すると不溶性の性質が複合体に付与されてしまい、非特異反応の原因となる場合がある。しかしながら、例えば、親水性が比較的高いアビジンあるいはストレプトアビジンなどの物質Ｒ１又はＲ２と結合することにより、複合体となった化合物Ｌ１−Ｂ１−Ｒ１−Ｍ（受容体Ｉ）あるいは化合物Ｌ２−Ｂ２−Ｒ２−Ｂ３（受容体II）を全体として親水性にすることが可能となり、非特異反応の発生を防止できる。
【００２４】
なお、リガンドＬ１がどのような物質であっても、キットを構成する各複合体を調製するのに、ビオチン−アビジン反応を用いた場合には、複合体調製時の条件が一定にできる。このことにより、省力化が可能となる。本発明では予め複合体としてのＬ２−Ｂ２−Ｒ２−Ｂ３（受容体II）を調製している。そのため、複合体当たりリガンド量をコントロールできる。このことにより、試薬の感度をコントロールすることができる。
【００２５】
本発明の２番目の型式のキットは、リガンドＬ３が低分子ではなく、水溶性の高分子、例えば、水溶性タンパク質である場合に好適である。このようなタンパク質をリガンドＬ３とする場合には、リガンドＬ３はマーカーＭで直接標識可能である。
【００２６】
本発明の３番目の型式のキットは、被測定物質Ａが、ＤＮＡ又はＲＮＡのオリゴヌクレオチドの測定に好適であり、この場合、リガンドＬ１は被測定物質Ａのオリゴヌクレオチドの一方の端部の配列に対して少なくとも相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドであり、リガンドＬ２は被測定物質Ａのもう一方の端部の配列に対して少なくとも相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドである。さらに、この場合、リガンドＬ２の被測定物質Ａの結合側とは反対の端部の配列は、固相に結合されたＤＮＡ又はＲＮＡのオリゴヌクレオチドの配列に対して少なくとも相補的である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本発明の技術的意義を次に発明の実施の態様に基づいて説明する。
アビジン又はストレプトアビジンと、ビオチンの結合は１０-15 （Ｍ) という結合定数を示し一般的な免疫反応の結合定数の１００倍以上の良好な結合性を示す。この結合は６−８Ｍグアニジン、ｐＨ１．５、１２０℃の条件下１５分間で解離することが報告されており（Green, N.: Purification of Avidin, in Methods in Enzymology, XVIII, (McCormick, D., and Wright, L., eds.), Academic Press, NY, 414 (1970).）、常温では極めて安定な結合体が形成される。
【００２８】
Ｒ１又はＲ２としてアビジン又はストレプトアビジンを用いた、本発明の１番目の型式のキットの具体例について説明する。Ｒ１又はＲ２としてのアビジン又はストレプトアビジンと、Ｂ１又はＢ２としてのビオチン等の強固な結合を利用してリガンドＬ１とマーカーＭを結合させてなる化合物Ｌ１−Ｂ１−Ｒ１−Ｍで表される受容体Ｉ、あるいはリガンドＬ２と結合子Ｂ３としてのオリゴヌクレオチドを結合させてなる化合物Ｌ２−Ｂ２−Ｒ２−Ｂ３で表される受容体IIが使用できる。
【００２９】
前記受容体Ｉの調製は、あらかじめリガンドＬ１に物質Ｂ１としてのビオチンを導入したもの（化合物Ｌ１−Ｂ１）と、物質Ｒ１としてのアビジン又はストレプトアビジンにマーカーＭを結合させたもの（化合物Ｒ１−Ｍ）を調製しておき、これらの化合物におけるアビジン又はストレプトアビジンＲ１とビオチンＢ１との結合により、化合物Ｌ１−Ｂ１−Ｒ１−Ｍなる複合体（受容体Ｉ）を極めて容易に、安定に調製することが可能となる。このようにして得られた複合体は、実質的にリガンドＬ１をマーカーＭで標識したものである。
【００３０】
この方法により調製した複合体である化合物Ｌ１−Ｂ１−Ｒ１−Ｍ（受容体Ｉ）は、マーカーＭが、例えば、アビジン又はストレプトアビジン（Ｒ１）に結合し、さらに、例えば、アビジン又はストレプトアビジン（Ｒ１）にビオチン化リガンド（化合物Ｌ１−Ｂ１）が結合したものである。したがって、リガンドＬ１が低分子量のペプチドなどの立体障害的な影響を受けやすい物質であっても、マーカーＭは高分子であるアビジン又はストレプトアビジン（Ｒ１）を介在して結合しているので、こうした影響を受けにくい。また、リガンドＬ１がマーカーＭに直接結合できないような物質であっても、この方法によれば、確実にリガンドＬ１とマーカーＭの複合体が調製できる。
なお、リガンドＬ３が立体障害が生じないような比較的安定な物質である場合、即ち、タンパク質Ｐの一部を構成するリガンドＬ３には、マーカーＭはリガンドＬ３或いはリガンドＬ３を含むタンパク質Ｐに直接結合させて化合物Ｐ−Ｍをリガンド−マーカー複合体（受容体Ｉ）として用いることができる（本発明の２番目の型式のキット）。
【００３１】
物質Ｂ１と物質Ｂ２が同一で、リガンドＬ１とＬ２が同一の場合には、次の方法で、本発明の１番目の型式のキットの調製が容易となる。本発明における受容体II、即ち、リガンドＬ２と結合子Ｂ３とを複合させた化合物（Ｌ２−Ｂ２−Ｒ２−Ｂ３）を調製するには、結合子Ｂ３として、例えば、オリゴヌクレオチドＯＮを用いる場合には、予め、物質Ｒ２とオリゴヌクレオチドＯＮ（結合子Ｂ３）を結合させたもの（化合物Ｒ２−ＯＮ）を準備しておき、受容体Ｉ（Ｌ１−Ｂ１−Ｒ１−Ｍ）を調製したときに準備した化合物Ｌ１−Ｂ１（ただし、Ｌ１−Ｂ１はＬ２−Ｂ２と同一化合物である）を前記化合物Ｒ２−ＯＮと反応させて、化合物Ｌ２−Ｂ２−Ｒ２−ＯＮなる複合体（受容体II）を調製する。この方法によって、リガンドＬ２とヌクレオチドＯＮ（結合子Ｂ３）を含む複合体を調製することが可能となる。
【００３２】
この方法によれば、リガンドＬ２が低分子量のペプチドなどの標識が難しい物質であっても、物質Ｒ２（例えば、ストレプトアビジン、アビジン、抗原、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、レクチン、糖タンパク質及び糖の群から選ばれた物質）と、物質Ｂ２の介在により、確実にリガンドＬ２とヌクレオチドＯＮ（結合子Ｂ３）との複合体が調製できる。
【００３３】
本発明の１番目の型式のキットを構成するには、図３のフロー図に示すように、化合物Ｒ１−Ｍと化合物Ｒ２−Ｂ３（例えば、Ｒ２−ＯＮ）を予め準備しておき、且つ、化合物Ｌ１−Ｂ１（但し、化合物Ｌ１−Ｂ１と化合物Ｌ２−Ｂ２とは同一化合物の場合）を共通に使用して、リガンドＬ１とマーカーＭの複合体、即ち、Ｌ１−Ｂ１−Ｒ１−Ｍで表される受容体Ｉ、及びリガンドＬ２と結合子Ｂ３（例えば、オリゴヌクレオチドＯＮ）の複合体、即ち、化合物Ｌ２−Ｂ２−Ｒ２−Ｂ３で表される受容体IIの調製することにより、本発明の１番目の型式のキットを極めて容易に調製することができる。
【００３４】
さらに、物質Ｒ１又は物質Ｒ２として用いられるアビジン又はストレプトアビジンは物質Ｂ１又は物質Ｂ２としてのビオチンとの結合部位を１分子あたり４個保有しているため、リガンドＬ１又はリガンドＬ２の導入比を、アビジン又はストレプトアビジン当たり１から４個の間で変化させることが可能で、この導入率を制御することにより反応性、感度をコントロールすることも可能となる。
【００３５】
リガンドＬ１又はリガンドＬ２が疎水性の強い物質である場合、リガンドＬ１にマーカーＭを、あるいはリガンドＬ２にオリゴヌクレオチドＯＮなどの結合子Ｂ３を直接導入すると、さらに物性が変化し、疎水性がさらに強まり非特異的な結合の原因になる場合も少なくない。しかしながら、本発明の１番目の型式のキットのように、リガンド−ビオチンと、アビジン−マーカーあるいはアビジン−結合子とを結合させる場合には、リガンドとマーカーの複合体あるいはリガンドと結合子の複合体を調製する際には、アビジンが親水性に富んでいるためリガンドの疎水性をアビジンと結合することによって軽減でき、疎水性に由来する非特異的な反応を除去することも可能である。また、上述したようにアビジンとリガンド−ビオチンの導入比を変化させることにより、こちらの方からも反応性を制御することが可能である。
【００３６】
以上の説明は主として本発明の１番目の型式のキットについてのものであるが、本発明の２番目の型式のキットについては１番目の型式のキットと同様なことが言える。
本発明の検出又は測定のためのキット及びその検出又は測定方法によれば、固相に複合体を捕獲するために、結合子Ｂ３と被結合子Ｒ３を結合させたものを用いており、これらの結合を種々の結合性の異なる組み合わせの物質を採用することにより、結合性の強弱を変化させることができ、即ち、試薬の感度をコントロールすることができる。例えば、レクチン−糖の結合反応では、ビオチン−アビジン結合反応よりもはるかに反応性が低いため、Ｂ３とＲ３にレクチン−糖を用いれば、ビオチン−アビジン反応を用いたものよりも、より多くの抗原あるいは抗体が無ければ反応しないキットを構成することが可能となる。
【００３７】
結合子Ｂ３と被結合子Ｒ３を少なくとも一部が相補的な配列をもつＲＮＡ、ＤＮＡのオリゴヌクレオチドを使用して結合する場合には、オリゴヌクレオチドの相補的配列の長短を変化させることにより、結合性の強弱をコントロールすることができ、試薬の感度をコントロールすることができる。
【００３８】
本発明の検出又は測定のためのキット及びその検出又は測定方法によれば、固相化するオリゴヌクレオチド、対応する配位子に結合させるオリゴヌクレオチドの組み合わせを複数個用意し、それぞれの組み合わせに対応させた複数の分析対象物に特異的に結合するリガンドを選択してキットを構成することにより、複数の分析対象物を同時に検出又は測定することが可能になる。
【００３９】
図８は、リガンドＬ１とリガンドＬ２が異なる配列を持つ物質である場合の本発明のキットを用い、被測定物質Ａと反応させ、受容体Ｉ、受容体II及び被測定物質からなる複合体を固相複合体に捕獲した状態を示す。具体的には、図８で示す被測定物質Ａは、ＲＮＡ又はＤＮＡのオリゴヌクレオチドである。該オリゴヌクレオチドの両端の配列に対して相補的な配列を有する、一方のオリゴヌクレオチドをリガンドＬ１とし、他方のオリゴヌクレオチドをリガンドＬ２としている。図８の態様を構成するキットの構成要素は、前記本発明の１番目の型式のキットと同じである。
【実施例１】
【００４０】
オリゴヌクレオチドの合成
５‘末端にアミノ基を有する以下のようなオリゴヌクレオチドをパーキンエルマー社製ＤＮＡ合成装置３９１Ａを用いて、それぞれ合成した。一部のものは、サワディーテクノロジー社に合成を依頼した。
アミノ基−ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＣＣＧ  ＧＧＧ  ＡＴＣ  ＣＧＴ  ＣＧ（以下「ペア１＋」という）
アミノ基−ＣＧＡ  ＣＧＧ  ＡＴＣ  ＣＣＣ  ＧＧＧ  ＡＡＴ  ＴＣ（以下「ペア１−」という）
アミノ基−ＡＡＣ  ＧＧＡ  ＡＴＣ  ＴＡＡ  ＴＣＡ  ＧＧＡ  ＧＧ（以下「ペア８＋」という）
アミノ基−ＣＣＴ  ＣＣＴ  ＧＡＴ  ＴＡＧ  ＡＴＴ  ＣＣＧ  ＴＴ（以下「ペア８−」という）
アミノ基−ＣＣＧ  ＡＣＴ  ＡＣＡ  ＧＡＡ  ＧＡＧ  ＧＡＧ  ＡＡ（以下「ペア７＋」という）
【実施例２】
【００４１】
ＨＣＶ抗体、ＴＰ検出用オリゴヌクレオチド標識ＩｇＧの調製
ウサギＩｇＧにペア８−を導入した。すなわち、ウサギＩｇＧ  ２５ｍｇを含む０．１Ｍ  ホウ酸ナトリウム緩衝液２ｍｌと、ＩｇＧの５０〜１００倍モル過剰のＳＡＴＡ（ピアス社製）を３７℃で１時間反応させた。反応後、終濃度０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液、０．１Ｍヒドロキシルアミンになるようにそれぞれの試薬を添加して、３７℃で１時間反応させ、この後ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）を充填したカラムにアプライし、ＳＨ導入ウサギＩｇＧを調製した。一方、ペア８−１０００ｎｍｏｌを溶解した、５ｍＭＥＤＴＡを含む０．１ＭＭＯＰＳ緩衝液ｐＨ７．０に、オリゴヌクレオチドの５０倍モル過剰のＥＭＣＳ（同仁化学社製）を添加し、３７℃で１時間反応させた。反応後、常法に従ってエタノール沈殿、洗浄を行い、マレイミド基導入オリゴヌクレオチドを調製した。このマレイミド基導入オリゴヌクレオチドを、ＳＨ基導入ＩｇＧと３７℃で１時間反応させ、次いでＵｌｔｒｏｇｅｌ  ＡｃＡ３４（Ｂｉｏｓｅｐｒａ社製）にアプライし、ペア８−標識ウサギＩｇＧを調製した。
【実施例３】
【００４２】
金コロイド標識ストレプトアビジンの調製
粒径４０ｎｍの金コロイド（５３０ｎｍにおける吸光度）５ｍｌと１５０μｇストレプトアビジン（ベクター社製）を含む２ｍＭホウ酸緩衝液ｐＨ９．０  １ｍｌを混合して反応させた。この後、牛血清アルブミンを終濃度１％になるように添加してブロッキングを行い、遠心分離により金コロイド標識ストレプトアビジンを沈さとして回収し、牛血清アルブミン１％溶液で遠心洗浄を行い、同溶液で沈さを懸濁して、金コロイド標識ストレプトアビジンを調製した。
【実施例４】
【００４３】
オリゴヌクレオチド標識ストレプトアビジンの調製
ストレプトアビジン２ｍｇを溶解した０．２Ｍホウ酸緩衝液ｐＨ８．０  １ｍｌに、ストレプトアビジンの１００倍モル過剰のＳＡＴＡを添加して、３７℃で１時間反応させた。その後、終濃度０．１ＭＴｒｉｓ、及び０．１Ｍヒドロキシルアミンとなるように試薬を添加して、３７℃で３０分反応させた。この後、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５にアプライし、ＳＨ基導入ストレプトアビジンを得た。一方、ペア８＋  ２１６ｎｍｏｌを溶解した、５ｍＭＥＤＴＡを含む０．１ＭＭＯＰＳ緩衝液ｐＨ７．０に、オリゴヌクレオチドの１００倍モル過剰のＥＭＣＳを添加し、３７℃で１時間反応させた。反応後、常法に従ってエタノール沈殿、洗浄を行い、マレイミド基導入オリゴヌクレオチドを導入した。このマレイミド基導入オリゴヌクレオチドを、ＳＨ基ストレプトアビジンと３７℃で１時間反応させ、次いでＵｌｔｒｏｇｅｌ  ＡｃＡ３４にアプライし、ペア８＋標識ストレプトアビジンを調製した。
【実施例５】
【００４４】
ＨＣＶ  ｃｏｒｅ３ペプチド結合金コロイド標識ストレプトアビジンの調製
前記実施例３で調製した金コロイド標識ストレプトアビジン２００μｌとビオチン導入ＨＣＶ  ｃｏｒｅ３ペプチド（イノジェネティクス社製）  ５μｌを混合して３７℃で１時間反応させた後、金コロイド複合体を遠心分離により沈さとして回収し、牛血清アルブミン１％溶液で遠心洗浄を行い、同溶液で沈さを懸濁して、ＨＣＶ  ｃｏｒｅ３ペプチド結合金コロイド標識ストレプトアビジンを調製した。
【実施例６】
【００４５】
ＨＣＶ  ｃｏｒｅ３ペプチド結合オリゴヌクレオチド標識ストレプトアビジンの調製
前記実施例４で調製したオリゴヌクレオチド標識ストレプトアビジン２００μｇに前記実施例５で使用したビオチン導入ＨＣＶ  ｃｏｒｅ３ペプチド５６μｇを混合して３７℃で１時間反応させ、ＹＭ３０（ミリポア社製）を用いた限外濾過を行い、ＨＣＶ  ｃｏｒｅ３ペプチド結合オリゴヌクレオチド標識ストレプトアビジンを調製した。
【実施例７】
【００４６】
ペア８−標識ＩｇＧ結合ニトロセルロース膜の調製
前記実施例２で調製したペア８−標識ウサギＩｇＧを１ｍｇ／ｍｌとなるように希釈してＸＹ３０００（商品名、バイオドット社製、テストストリップ製造用ＸＹ分注システム）に充填し、ＰＥＴで裏打ちをしたニトロセルロース膜（ｍｄｉ社製）に塗布した。乾燥後、ブロックエース（商品名、雪印乳業社製、ブロッキング剤）で室温、３時間ブロッキングを行い、精製水で洗浄後、乾燥させた。この後、一端にセルロース製濾紙（ワットマン社製ＷＦ１．５あるいはｍｄｉ社製）を貼り付け、もう一端にはコンジュゲートリリースパッド（ｍｄｉ社製、グラスフィルター）を貼り付けた（一部は２重になるようにした）。これを幅５ｍｍになるように切断し、ハウジングに格納した。
【実施例８】
【００４７】
ＨＣＶ抗体陽性血清での反応性
前記実施例５で調製したＨＣＶ  ｃｏｒｅ３ペプチド結合金コロイド標識ストレプトアビジン５μｌと前記実施例６で調製したＨＣＶ  ｃｏｒｅ３ペプチド結合オリゴヌクレオチド標識ストレプトアビジン１５０ｎｇ、４．４％Ｔｗｅｅｎ８０、４４ｍＭＥＤＴＡを含む溶液１１．５μｌに、ＨＣＶ抗体陽性血清を１００μｌ添加し、混合して素早く、前記実施例７で調製したペア８−標識ＩｇＧ結合ニトロセルロース膜の試料添加窓に添加した。１５分後ペア８−標識ＩｇＧを塗布した部位に金コロイドの赤紫色のラインが観察された。一方、対照としてＨＣＶ抗体が含まれていないことがわかっている血清を添加した場合は、ラインが観察されなかった。以上の結果より、リガンドに対する特異的な抗体が含まれることが本発明の方法により判定できることが確認できた。
【実施例９】
【００４８】
金コロイド標識ＴＰ抗原の調製
４０ｎｍの粒径の金コロイド５ｍｌと１００μｇの遺伝子組み換え操作により得られたＴＰ１７Ｋ抗原（Ｌｅｅ  Ｌａｂｓ社製）を含む２ｍＭホウ酸緩衝液ｐＨ９．０  １ｍｌを混合して反応させた。この後、牛血清アルブミンを終濃度１％になるように添加してブロッキングを行い、遠心分離により金コロイド標識ＴＰ抗原を沈さとして回収し、牛血清アルブミン１％溶液で遠心洗浄を行い、同溶液で沈さを懸濁して、金コロイド標識ＴＰ抗原を調製した。
【実施例１０】
【００４９】
オリゴヌクレオチド標識アビジンの調製
アビジン１０ｍｇを溶解した０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．０  １ｍｌに、アビジンの１００倍モル過剰のＥＭＣＳを添加して、３７℃で１時間反応させた。この後、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５にアプライし、マレイミド基導入アビジンを得た。一方、ペア８＋３７５ｎｍｏｌを溶解した、５ｍＭＥＤＴＡを含む０．１ＭＭＯＰＳ緩衝液ｐＨ７．０に、オリゴヌクレオチドの１００倍モル過剰のＳＡＴＡを添加し、３７℃で１時間反応させた。反応後、終濃度０．１ＭＴｒｉｓ、及び０．１Ｍヒドロキシルアミンとなるように試薬を添加して、３７℃で３０分反応させた。次いで常法に従ってエタノール沈殿、洗浄を行い、ＳＨ基導入オリゴヌクレオチドを調製した。このＳＨ基導入オリゴヌクレオチドを、マレイミド基アビジンと３７℃で１時間反応させ、次いでＵｌｔｒｏｇｅｌ  ＡｃＡ４４にアプライし、ペア８＋標識アビジンを調製した。
【実施例１１】
【００５０】
ビオチン標識ＴＰ１７Ｋ抗原の調製
５００μｇのＴＰ１７Ｋ抗原（イノジェネティクス社製）と５ｍＭＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．０  ０．５ｍｌに、ＴＰ１７Ｋ抗原の１００倍モル過剰のＮＨＳ−ｂｉｏｔｉｎ（ピアス社製）を添加して３７℃で１時間反応させ、反応後ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５カラムにアプライして、ビオチン標識ＴＰ１７Ｋ抗原を調製した。ＴＰ１７Ｋ抗原の回収率は、７５％であった。
【実施例１２】
【００５１】
ビオチン化ＴＰ１７Ｋ抗原とオリゴヌクレオチド標識アビジンの反応によるオリゴヌクレオチド標識ＴＰ１７Ｋ抗原の調製
前記実施例１０で調製したオリゴヌクレオチド標識アビジンと前記実施例１１で調製したビオチン標識ＴＰ１７Ｋ抗原をモル比で、それぞれ１：８、１：４、１：２、１：１、１：０．５という混合比で３７℃で３０分間反応させ、４℃に保存した。
前記実施例１０で調製したオリゴヌクレオチド標識アビジンと前記実施例１１で調製したビオチン標識ＴＰ１７Ｋ抗原を混合しているだけであるので、ＴＰ１７Ｋ抗原の回収率は、７５％であった。
【実施例１３】
【００５２】
種々の混合比時のオリゴヌクレオチド標識ＴＰ１７Ｋ抗原の反応性
前記実施例１２で調製した、種々の混合比時のオリゴヌクレオチド標識ＴＰ１７Ｋ抗原の反応性を評価した。すなわち、前記実施例９で調製した金コロイド標識ＴＰ抗原を５μｌ、ビオチン１ｍｇ／ｍｌを５μｌ、ＴＰ抗体陰性血清９０μｌに、前記実施例１２で調製したオリゴヌクレオチド標識ＴＰ１７Ｋ抗原をそれぞれ２μｌ添加した。この反応系を２本調製し、ここにＴＰ抗体陽性血清を一方には添加し、もう一方には添加せずに、それぞれ速やかに混合し、前記実施例７で調製したペア８−標識ＩｇＧ結合ニトロセルロース膜を格納したハウジングの試料添加窓に全量をそれぞれアプライした。
【００５３】
アプライ後２０分後の、陽性検体でのラインの濃さは、１：２のものが最も濃く、次いで１：４と１：１がほぼ同等、これに次いで、１：０．５、１：８という順であった。一方ＴＰ抗体陰性血清を添加したものはいずれの混合比であってもラインは出現しなかった。
この成績は、オリゴヌクレオチド標識アビジンとビオチン標識抗原の混合比を変化させることによって、容易に検出感度を変化させることが可能であることを示している。
【実施例１４】
【００５４】
ＨＢｓ抗原検出用のオリゴヌクレオチド標識ＩｇＧの調製
ウサギＩｇＧにペア１−を導入した。方法は、前記実施例２と同様にした。
【実施例１５】
【００５５】
ＨＢｓ抗原検出用のオリゴヌクレオチド標識マウス抗ＨＢｓ−Ｆａｂ‘の調製  モノクローン抗ＨＢｓ−ＩｇＧ１０ｍｇを含む０．１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ３．５に、ＩｇＧの５％になるようにペプシン（ベーリンガーマンハイム社製）を添加して３７℃で一定時間反応させた。反応後、０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ６．０で平衡化したＵｌｔｒｏｇｅｌ  ＡｃＡ４４（商品名、バイオセプラ社製）カラムにアプライし、Ｆ（ａｂ‘）2 画分を収集した。
【００５６】
このＦ（ａｂ‘）2 ５．２ｍｇをＹＭ３０（ミリポア社製）による限外濾過で濃縮後、終濃度０．１Ｍになるようにメルカプトエチルアミン（ナカライテスク社製）を添加して、３７℃で９０分間還元した。この後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラム（商品名、アマシャムファルマシアバイオテク社製）にアプライしてマウス抗ＨＢｓ−Ｆａｂ‘  ２．６ｍｇを得た。
【００５７】
一方ペア１＋  １９１ｎｍｏｌを溶解した５ｍＭＥＤＴＡを含む０．１ＭＭＯＰＳ緩衝液ｐＨ７．０に、オリゴヌクレオチドの１００倍モル過剰のＥＭＣＳを添加し、３７℃で３０分反応させた。反応後、常法に従ってエタノール沈殿、洗浄を行い、マレイミド基導入オリゴヌクレオチドを調製した。
【００５８】
このマレイミド基導入オリゴヌクレオチドを、マウス抗ＨＢｓ−Ｆａｂ‘と３７℃で１時間反応させ、次いでＵｌｔｒｏｇｅｌ  ＡｃＡ４４にアプライし、ペア１＋標識マウス抗ＨＢｓ−Ｆａｂ‘を調製した。
【実施例１６】
【００５９】
ＨＢｓ抗原−ＴＰ抗体を同時に検出するためのニトロセルロース膜の調製
前記実施例２で調製したペア８−標識ウサギＩｇＧと前記実施例１４で調製したペア１−標識ウサギＩｇＧを１ｍｇ／ｍｌとなるように希釈して、それぞれＸＹ３０００（商品名、バイオドット社製）に充填し、ＰＥＴで裏打ちをしたニトロセルロース膜に、ペア１−は原点より３０ｍｍの位置に、ペア８−は原点より３５ｍｍの位置にそれぞれ塗布した。乾燥後、ブロックエース（商品名、雪印乳業社製）で室温、３時間ブロッキングを行い、精製水で洗浄後、乾燥させた。この後、一端にセルロース製濾紙（ワットマン社製ＷＦ１．５あるいはｍｄｉ社製）を貼り付け、もう一端にはコンジュゲートリリースパッド（アドバンスド  マイクロデバイス社製）を貼り付けた（一部は２重になるようにした）。これを幅５ｍｍになるように切断し、ハウジングに格納した。
【実施例１７】
【００６０】
ＨＢｓ抗原−ＴＰ抗体を同時に独立して検出できるかどうかの検討
ＨＢｓ抗原−ＴＰ抗体を同時に独立して検出できるかどうかの検討を次のようにして行った。すなわち、前記実施例９で調製した金コロイド標識ＴＰ抗原を５μｌ、ビオチン１ｍｇ／ｍｌを５μｌ、ＴＰ抗体及びＨＢｓ抗原陰性血清９０μｌに、前記実施例１２で調製した１：４の混合比で調製したオリゴヌクレオチド標識ＴＰ１７Ｋ抗原を１０倍希釈しその溶液を１μｌ添加した。これに前記実施例１５で調製したオリゴヌクレオチド標識マウス抗ＨＢｓ−Ｆａｂ‘を９０ｎｇ添加し、金コロイド標識抗ＨＢｓ抗体（ブリティッシュバイオセル  インターナショナル社製）を９μｌ添加した。この反応系を４本調製し、ここにＴＰ抗体陽性血清５μｌを一方には添加し、１本にはＴＰ抗体陰性、ＨＢｓ抗原陰性血清を５μｌ添加し、さらに、ＨＢｓ抗原５０ｎｇ／ｍｌ及び２２０μｇ／ｍｌをそれぞれ含む血清をそれぞれ５μｌ速やかに混合し、前記実施例１６で調製したペア８−標識ウサギＩｇＧ結合及びペア１−標識ウサギＩｇＧ結合ニトロセルロース膜を格納したハウジングの試料添加窓に全量をそれぞれアプライした。
【００６１】
アプライ後２０分の判定で、ＴＰ抗体陰性、ＨＢｓ抗原陰性血清を添加したものは、両方のラインは出現せず、ＴＰ抗体陽性血清を添加したものはペア８−が塗布された部分のみに、また、ＨＢｓ抗原を添加したものはペア１−が塗布された部分のみにラインが出現し、それぞれの項目が同じニトロセルロース膜上で独立して検出できた。
【実施例１８】
【００６２】
ビオチン標識ＴＰ１７Ｋ抗原の調製
５００μｇのＴＰ１７Ｋ抗原（Ｌｅｅ  Ｌａｂｓ社製）と５ｍＭＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．０  ０．５ｍｌに、ＴＰ１７Ｋ抗原の１００倍モル過剰のＮＨＳ−ｂｉｏｔｉｎを添加して３７℃で１時間反応させ、反応後ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５カラムにアプライして、ビオチン標識ＴＰ１７Ｋ抗原を調製した。ＴＰ１７Ｋ抗原の回収率は、７５％であった。このビオチン標識ＴＰ１７Ｋ抗原は、前記実施例１２に記載したように、前記実施例１０で調製したオリゴヌクレオチド標識アビジンと混合するだけであるので、最終的な回収率は７５％であった。
【００６３】
〔比較例〕
ＴＰ１７Ｋ抗原の直接標識によるオリゴヌクレオチド標識ＴＰ１７Ｋ抗原の調製
ＴＰ１７Ｋ抗原（Ｌｅｅ  Ｌａｂｓ社製）４７３μｇと５ｍＭＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．４に、ＴＰ１７Ｋ抗原の２０倍モル過剰のＳＡＴＡを添加し、３７℃で９０分反応させ、この後ヒドロキシルアミン、トリス緩衝液を添加して反応させた。次いでＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５カラム（商品名、アマシァムファルマシアバイオテク社製）にアプライし、ＳＨ基導入ＴＰ１７Ｋ抗原２００μｇ（回収率４２．２％）を得た。一方、ペア７＋  １３３ｎｍｏｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡを含む０．１Ｍ  ＭＯＰＳ緩衝液ｐＨ７．８５に、ペア７＋の２００倍モル過剰のＥＭＣＳを添加して、３７℃で２時間反応させた。この後、常法によりオリゴヌクレオチドをエタノール沈殿、洗浄し、マレイミド基導入オリゴヌクレオチド１０５ｎｍｏｌを得た。
ＳＨ基導入ＴＰ１７Ｋ抗原２００μｇとマレイミド基導入オリゴヌクレオチド１０５ｎｍｏｌを混合し、３７℃で２時間反応させた。この後、Ｕｌｔｒｏｇｅｌ  ＡｃＡ４４カラムにアプライし、オリゴヌクレオチド標識ＴＰ１７Ｋ抗原１５０μｇ（回収率３２％）を得た。
前記実施例１８と比較例を比較すると、比較例は、回収率が３２％であるのに対して、実施例１８の方が回収率は７５％と大幅に改善されることがわかった。
【実施例１９】
【００６４】
ＨＣＶ  ｃｏｒｅ２、ｃｏｒｅ３、ｃｏｒｅ６、ｃｏｒｅ１０の結合金コロイド標識ストレプトアビジンの調製
５３０ｎｍにおける吸光度が１０を示すように調製した金コロイド標識ストレプトアビジン（ブリティッシュバイオセルインターナショナル社製）５００μｌとビオチン化ＨＣＶ  ｃｏｒｅ２  ２μｇ、ビオチン化ＨＣＶ  ｃｏｒｅ３  ２μｇ、ビオチン化ＨＣＶ  ｃｏｒｅ６  ２μｇ、ビオチン化ＨＣＶ  ｃｏｒｅ１０  ２μｇ（何れもイノジェネディクス社製）を混合して、３７℃１時間反応させた。反応後、遠心分離により、ＨＣＶ  ｃｏｒｅ２、ｃｏｒｅ３、ｃｏｒｅ６、ｃｏｒｅ１０結合金コロイド標識ストレプトアビジンを沈さとして回収した。この沈さを、２％のウシ血清アルブミンを含む２０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液ｐＨ８．０で懸濁して、４℃で保存した。
【実施例２０】
【００６５】
オリゴヌクレオチド標識ＨＣＶ  ｃｏｒｅ２、ｃｏｒｅ３、ｃｏｒｅ６、ｃｏｒｅ１０結合ストレプトアビジンの調製
前記実施例４で調製した、ペア８＋標識ストレプトアビジン１００μｇにＨＣＶ  ｃｏｒｅ２、ｃｏｒｅ３、ｃｏｒｅ６、及びｃｏｒｅ１０  ３０μｇをそれぞれ別々に混合し、３７℃１時間反応させ、限外濾過により、ペア８＋標識ＨＣＶ  ｃｏｒｅ２結合ストレプトアビジン、ペア８＋標識ＨＣＶ  ｃｏｒｅ３結合ストレプトアビジン、ペア８＋標識ＨＣＶ  ｃｏｒｅ６結合ストレプトアビジン、ペア８＋標識ＨＣＶ  ｃｏｒｅ１０結合ストレプトアビジンをそれぞれ調製した。
【実施例２１】
【００６６】
オリゴヌクレオチド標識ＨＣＶ  ｃｏｒｅ２＋ｃｏｒｅ３＋ｃｏｒｅ６＋ｃｏｒｅ１０結合ストレプトアビジンの調製
前記実施例４で調製した、ペア８＋標識ストレプトアビジン１００μｇにＨＣＶ  ｃｏｒｅ２、ｃｏｒｅ３、ｃｏｒｅ６、又はｃｏｒｅ１０  ３０μｇを同時に混合し、３７℃１時間反応させ、限外濾過により、ペア８＋標識ＨＣＶ  ｃｏｒｅ２＋ｃｏｒｅ３＋ｃｏｒｅ６＋ｃｏｒｅ１０結合ストレプトアビジンを調製した。
【実施例２２】
【００６７】
ＨＣＶ抗体陽性血清との反応性
前記実施例８と同様に、前記実施例１９で調製したＨＣＶ  ｃｏｒｅ２、ｃｏｒｅ３、ｃｏｒｅ６、ｃｏｒｅ１０結合金コロイド標識ストレプトアビジンと、前記実施例２０で調製したペア８＋標識ＨＣＶ  ｃｏｒｅ２結合ストレプトアビジン  ３７．５ｎｇ、ペア８＋標識ＨＣＶ  ｃｏｒｅ３結合ストレプトアビジン  ３７．５ｎｇ、ペア８＋標識ＨＣＶ  ｃｏｒｅ６結合ストレプトアビジン  ３７．５ｎｇ、ペア８＋標識ＨＣＶ  ｃｏｒｅ１０結合ストレプトアビジン  ３７．５ｎｇを含む組み合わせ（組み合わせＡ）と、前記実施例１９で調製したＨＣＶ  ｃｏｒｅ２、ｃｏｒｅ３、ｃｏｒｅ６、ｃｏｒｅ１０結合金コロイド標識ストレプトアビジン  ５μｌと、前記実施例２１で調製したオリゴヌクレオチド標識ＨＣＶ  ｃｏｒｅ２＋ｃｏｒｅ３＋ｃｏｒｅ６＋ｃｏｒｅ１０結合ストレプトアビジン  １５０ｎｇを含む組み合わせ（組み合わせＢ）を比較したところ、組み合わせＡでは、ＨＣＶ抗体陽性血清との反応性が５分から、組み合わせＢでは反応性が７分から確認できた。また、前記実施例８で行った実験では反応性が１５分から確認できた。このことから、単一種のペプチドを標識ストレプトアビジンに結合させて反応系を構築するよりも、複数種のペプチドを標識ストレプトアビジンに結合させて反応系を構築した場合の方が反応性が高いことが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本発明の検出又は測定のためのキット及びその検出又は測定方法によれば、試薬の感度をコントロールすることができる。
例えば、本発明のキットは、受容体Ｉ及び受容体II当たりのリガンドＬ１又はリガンドＬ２の量を調整することができる。このことにより、測定感度の調整が可能となる。具体的には、物質Ｒ１は、物質Ｂ１との結合ポイントを複数個有するものが使用でき、物質Ｂ１を介して物質Ｒ１にリガンドＬ１を複数個結合させることができる。また、物質Ｒ２は、物質Ｂ２との結合ポイントを複数個有するものを使用することができ、物質Ｂ２を介して物質Ｒ２にリガンドＬ２又はリガンドＬ３を複数個結合させることができる。
【００６９】
具体的には、物質Ｒ１又はＲ２としてアビジン又はストレプトアビジンを使用する場合には、アビジン又はストレプトアビジンは物質Ｂ１としてのビオチンとの結合部位を１分子あたり４個保有しているため、リガンドＬの導入比を、アビジン又はストレプトアビジン当たり１から４個の間で変化させることが可能である。したがって、この導入率を制御することにより反応性、感度をコントロールすることも可能となる。さらに、この感度のコントロールは、化合物Ｌ−Ｂ１−Ｒ１−Ｍと化合物Ｌ−Ｂ１−Ｒ２−Ｂ３の双方に行えるので、きめ細かい感度のコントロールが可能となる。
【００７０】
結合子Ｂ３及び被結合子Ｒ３として、種々の結合性の異なる組み合わせの物質を選択することにより、結合性の強弱を変化させることができ、即ち、試薬の感度をコントロールすることができる。
結合子Ｂ３と被結合子Ｒ３として、少なくとも一部が相補的な配列をもつＲＮＡ、ＤＮＡのオリゴヌクレオチドを使用する場合には、オリゴヌクレオチドの長短を変化させることにより、結合性の強弱をコントロールすることができる。
【００７１】
本発明のキットにおいては、物質Ｒ１又はＲ２に結合させる複数のリガンドの各々の反応性を単一とするだけでなく、複数種としてもよい。この場合、リガンドの反応性が単一の場合よりも被測定物質Ａに対する反応性が高まる。
本発明の検出又は測定のためのキット及びその検出又は測定方法によれば、固相化させるための結合子Ｂ３及び被結合子Ｒ３にＲＮＡ又はＤＮＡ等のオリゴヌクレオチドを用い、少なくとも一部の相補的結合により複合体を固相に結合させる場合には、オリゴヌクレオチドの配列を変化させた複数種のものが使用できるので、それぞれの種類に対応させた複数の分析対象物を同時に測定することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】図１は、本発明の１番目の型式のキットの構成成分の実施の態様を図示したものである。各枠毎の成分は、キットの保存時には別体に保存されることを示す。
【図２】図２は、本発明の１番目の型式のキットを用いて被測定物質Ａを固相に捕獲した状態を示す。
【図３】図３は、本発明の１番目の型式のキットのうちの試薬成分を製造するためのフロー図であり、詳しくは、化合物Ｌ１−Ｂ１−Ｒ１−Ｍで表される受容体Ｉと、化合物Ｌ２−Ｂ２−Ｒ２−Ｂ３で表される受容体IIの調製フロー図である。
【図４】図４は、本発明の２番目の型式のキットの構成成分の実施の態様を図示したものである。各枠毎の成分は、キットの保存時には別体に保存されることを示す。
【図５】図５は、本発明の２番目の型式のキットを用いて被測定物質Ａを固相に捕獲した状態を示す。
【図６】図６は、本発明の３番目の型式のキットの構成成分の実施の態様を図示したものである。各枠毎の成分は、キットの保存時には別体に保存されることを示す。
【図７】図７は、本発明の３番目の型式のキットを用いて被測定物質Ａを固相に捕獲した状態を示す。
【図８】図８は、リガンドＬ１とリガンドＬ２が異なる配列を持つ物質である場合の本発明のキットを用い、被測定物質Ａと反応させ、受容体Ｉ、受容体II及び被測定物質からなる複合体を固相複合体に捕獲した状態を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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