(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
テストデバイス（１）を環境中に設置し、
ここに、該テストデバイスは
流体流入口（１２）および流出口（１４）を有する容器（１０）を有しており、
該容器内に位置した複数の毛細管内微小生態系(capillary microcosms)を形成可能な毛細管（１６）を含み、
該容器は、環境への進入、現場での使用、および該環境からの脱出に適した形状であり、
該毛細管の各々は、該毛細管（１６）を通っての流体の流動を可能とするように配置された毛細管流入口（１８）および流出口（２０）を有し、
該毛細管の各々は、さらに、該毛細管の流入口（１８）および流出口（２０）を被覆して、該毛細管を通っての流動を妨げるための手段を有し、
周囲の環境からの流体が該毛細管を通る場合、該周囲の環境に固有の微生物の収集を促進するための手段を該毛細管の少なくとも１つに取り付け、
該毛細管被覆手段を開けて、該周囲の環境からの流体を該容器および毛細管に流動させ、
該毛細管（１６）内の微小生態系で起こる現象を調べるのに十分な一時的な間、該テストデバイス（１）を該環境中に放置し、
該テストデバイス（１）を回収し、次いで、
該毛細管（１６）内の微小生態系で起きている現象を分析する；
工程を含むことを特徴とする、特定の環境内の微生物についての環境モニタリング又は生物資源調査（bioprospecting）方法。
【請求項２】
前記テストデバイス（１）が、さらに、前記容器に連結されたポンプ（４０）を有しており、
該ポンプは、前記周囲の環境からの流体が、前記毛細管流入口（１８）を通っての前記毛細管（１６）内への流動を引き起こすように配置され、該毛細管を通って流動する該流体を収集するための手段、および
該流体の前記容器（１０）への逆流を防止するための、該容器の下流に連結されたチェックバルブ（４４）を含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記複数の毛細管（１６）が、商業的に入手可能なロボットを用いての該毛細管の自動分析を可能とするように配置された請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記複数の毛細管（１６）が迅速に交換可能なマイクロタイタープレートの形態で配置される請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記マイクロタイタープレートの内容物が凍結乾燥され、真空シールされる請求項４に記載の方法。
【請求項６】
さらに前記テストデバイス（１）を前記環境に設置する前に、前記毛細管（１６）を通って流動する流体へ拡散することができる特定のテスト物質を含有する手段を毛細管（１６）の少なくとも１つに入れる工程を含む請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
さらに、前記テストデバイス（１）を前記環境に設置する前に、下記（ａ）〜（ｗ）から選択されるいずれかの解析方法又は評価方法に適合する前記複数の毛細管内微小生態系を形成可能な毛細管（１６）を配置する工程を含む請求項１〜６のいずれかに記載の方法；
（ａ） 該環境で系統発生的に起こる微生物機能の同定および関連付けのための方法であって、かつ毛細管（１６）の少なくとも１つは、その中にＳＩＰ（stable isotope probing：安定な同位体プロービング）法で用いるための同位体標識テスト化合物が添加されている方法、
（ｂ） 該環境で系統発生的に起こる微生物機能の同定および関連付けのための方法であって、かつ毛細管（１６）の少なくとも１つは、その中に質量分析法で用いるための同位体標識テスト化合物が添加されている方法、
（ｃ）  特定の微生物の該環境における生存能を確認する方法であって、かつ毛細管（１６）の少なくとも１つは、その中に該特定の微生物が添加されている方法、
（ｄ）  特定の遺伝子工学的に作成された微生物の該環境における動態を解析する方法であって、かつ毛細管（１６）の少なくとも１つは、その中に該遺伝子工学的に作製された微生物が添加されている方法、
（ｅ）  特定の病原体の該環境における動態を解析する方法であって、かつ毛細管（１６）の少なくとも１つは、その中に該病原体が添加されている方法、
（ｆ）  該環境における特定のプロセスについて、特定の各種テスト物質の該プロセスを加速する能力の有効性を評価する方法であって、かつ該テスト物質が複数の毛細管（１６）中のそれぞれに添加されている方法、
（ｇ）  該環境における各種バイオレメディエーション（生物による環境修復：bioremediation)を担う該環境に固有の微生物を同定する方法、
（ｈ）  該環境に対する各種バイオレメディエーションの有効性を評価する方法であって、かつ該各種バイオレメディエーションに代表的な物質が複数の毛細管（１６）中のそれぞれに添加されている方法、
（ｉ）  該環境についての各種バイオオーギュメンテーション（微生物添加法；bioaugmentation）の有効性を評価する方法であって、かつ該各種バイオオーギュメンテーションに代表的な微生物が複数の毛細管（１６）中のそれぞれに添加されている方法、
（ｊ）  該環境についての各種化学的処理方法の有効性を評価する方法であって、かつ該各種化学的処理方法に代表的な化学物質が複数の毛細管（１６）中のそれぞれに添加されている方法、
（ｋ）  該環境が特定の汚染物で汚染された場合における、該環境での固有の汚染物分解速度測定方法、
（ｌ）  該環境が特定の汚染物で汚染された場合における、該環境での汚染物分解が特定の栄養素により促進されるかどうかを評価する方法であって、かつ被検栄養素が複数の毛細管（１６）中のそれぞれに添加されている方法、
（ｍ）  該環境に固有の微生物群の分析方法、
（ｎ）  該環境に固有の微生物群のプロテオーム解析法(proteomic analysis)、
（ｏ） 産業上の有用性がある新規な微生物の該環境内での発見、
（ｐ） 産業上の有用性がある新規な生化学プロセスの該環境内での発見、
（ｑ） 産業上の有用性がある新規な自然産物の該環境内での発見、
（ｒ）  化学物質リスク評価のために該環境における特定の化合物の動態を評価する方法であって、かつ毛細管（１６）の少なくとも１つの中に該化合物が添加されている方法、
（ｓ）  化学物質リスク評価のために該環境の微生物群に対する特定の化合物の効果を評価する方法であって、かつ毛細管（１６）の少なくとも１つの中に該化合物が添加されている方法、
（ｔ）  生物学的リスク評価のために特定の微生物の動態を評価する方法であって、かつ毛細管（１６）の少なくとも１つの中に該微生物が添加されている方法、
（ｕ）  生物学的リスク評価のために該環境の微生物群に対する特定の微生物の効果を評価する方法であって、かつ毛細管（１６）の少なくとも１つの中に該特定の微生物が添加されている方法、
（ｖ）  特定の微生物の該環境におけるイン・サイチュ代謝活性(in situ metabolic activity)を解析するための方法であって、かつ毛細管（１６）の少なくとも１つの中に置かれた、該微生物中の標識されていない、および標識されたバイオマーカーの比率について分析するための同位体標識テスト化合物が添加されている方法、
（ｗ）  該環境における特定の微生物の検出方法において、イン・サイチュバイオマーカー増幅に続く質量分光分析の際に該微生物の特徴的なバイオマーカーのシグナル対ノイズ比率を増加させるのに適した被検化合物を評価する方法であって、かつ毛細管（１６）の少なくとも１つの中に当該化合物が添加されている方法。
【請求項８】
前記テストデバイス（１）を用いて得られた解析結果又は評価結果について、時間的及び／又は位置的な補正を行うために、前記毛細管（１６）の少なくとも１つは、前記結果を補正することができる内部標準として働くように配置されている、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記テストデバイス（１）中の前記複数の毛細管（１６）における特定の微生物の増殖又は生存状態を質量分光分析により解析する際に、そのシグナル対ノイズ比率(signal-to-noise ratio)を増加させる手段として、該毛細管（１６）の少なくとも１つは、該特定の微生物以外の微生物の増殖および生存を制限しつつ、該特定の微生物の増殖を促進するための物質が添加されている、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
前記テストデバイス（１）を用いて該環境における特定の剤に対する効果を評価するために、前記毛細管（１６）の少なくとも１つの中に該特定の剤を入れる際に、該剤を該毛細管（１６）中の微小生態系から回収可能なように入れることを特徴とする請求項７〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記テストデバイス（１）を用いて該環境における特定の剤に対する効果を評価するために、前記毛細管（１６）の少なくとも１つの中に該特定の剤を入れる際に、該テストデバイス（１）は、該毛細管内の微小生態系における該剤と接触する周囲の環境からの前記流体が回収可能なように配置されていることを特徴とする請求項７〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記テストデバイス（１）を用いて前記環境における特定の生化学プロセス(biochemical process)の効果を評価するために、前記毛細管（１６）の被覆手段が、該毛細管内の微小生態系に対する該プロセスの持続が制御できるように被覆されていることを特徴とする請求項７〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
複数の毛細管（１６）が物理的に分離された状態で、かつ該毛細管（１６）を通っての流体の流動を可能とするように配置され、
環境に該毛細管（１６）が放置される間に、該環境内の微小生態系を該毛細管（１６）内に供するための手段、
該環境内の微生物生態系を該毛細管（１６）内に収集し保護するための手段であって、かつ周囲の環境からの流体が該毛細管（１６）に入り、それを通るように該周囲の環境からの流体の流動を可能とする手段、および
該毛細管（１６）を通っての該流体の流動を調節するための流体流動経路を被覆する手段；
を含むことを特徴とする、特定の環境内での微生物につき環境モニタリング又は生物資源調査をするためのテストデバイス（１）。
【請求項１４】
前記複数の毛細管（１６）が、商業的に入手可能なロボットを用いての前記微小生態系の自動分析を可能とするように配置された請求項１３記載のテストデバイス（１）。
【請求項１５】
さらに、前記周囲の環境からの、前記毛細管（１６）を通っての流体流動を引き起こすための手段、
該毛細管（１６）を通っての該流体流動を収集し、保持するための手段、および
該流体の該毛細管（１６）への逆流を妨げるための該毛細管の下流にある手段；
を含む請求項１３又は１４記載のテストデバイス（１）。
【請求項１６】
さらに、前記毛細管（１６）に入る前記微生物生態系の収集を促進するように配置された手段を毛細管（１６）の少なくとも１つに含む請求項１３〜１５のいずれかに記載のテストデバイス（１）。
【請求項１７】
前記毛細管（１６）の少なくとも１つは、該毛細管内微小生態系を通って流動する流体に拡散できる特定の被検物質を含有するための手段を有する請求項１３〜１６のいずれかに記載のテストデバイス（１）。
【請求項１８】
前記複数の毛細管（１６）が迅速に交換可能なマイクロタイタープレートの形態で配置された請求項１３〜１７のいずれかに記載のテストデバイス（１）。
【請求項１９】
前記マイクロタイタープレートの内容物が凍結乾燥され、真空シールされる請求項１８に記載のテストデバイス（１）。
【請求項２０】
前記複数の毛細管（１６）が、下記（ａ）〜（ｗ）から選択されるいずれかの毛細管内微小生態系に対応するように配置されている請求項１３〜１９のいずれかに記載のテストデバイス（１）；
（ａ） 前記環境で系統発生的に起こる微生物機能の同定および関連付けのための毛細管内微小生態系であって、かつ前記毛細管（１６）の少なくとも１つは、その中にＳＩＰ（stable isotope probing：安定な同位体プロービング）法で用いるための同位体標識テスト化合物を有している毛細管内微小生態系、
（ｂ） 該環境で系統発生的に起こる微生物機能の同定および関連付けのための毛細管内微小生態系であって、かつ毛細管（１６）の少なくとも１つは、その中に質量分析法で用いるための同位体標識テスト化合物を有している毛細管内微小生態系、
（ｃ）  特定の微生物の該環境における生存能を確認するための毛細管内微小生態系であって、かつ毛細管（１６）の少なくとも１つは、その中に該特定の微生物を有している毛細管内微小生態系、
（ｄ）  特定の遺伝子工学的に作成された微生物の該環境における動態を解析するための毛細管内微小生態系であって、かつ毛細管（１６）の少なくとも１つは、その中に該遺伝子工学的に作成された微生物を有している毛細管内微小生態系、
（ｅ）  特定の病原体の該環境における動態を解析するするための毛細管内微小生態系であって、かつ毛細管（１６）の少なくとも１つは、その中に該病原体を有している毛細管内微小生態系、
（ｆ）  該環境における特定のプロセスについて、特定の各種テスト物質の該プロセスを加速する能力の有効性を評価するための毛細管内微小生態系であって、かつ該テスト物質が複数の毛細管（１６）中のそれぞれに添加されている毛細管内微小生態系、
（ｇ）  該環境における各種バイオレメディエーション（生物による環境修復：bioremediation)を担う該環境に固有の微生物を同定するための毛細管内微小生態系、
（ｈ）  該環境に対する各種バイオレメディエーションの有効性を評価するための毛細管内微小生態系であって、かつ該各種バイオレメディエーションに代表的な物質が複数の毛細管（１６）中のそれぞれに添加されている毛細管内微小生態系、
（ｉ）  該環境についての各種バイオオーギュメンテーション（微生物添加法；bioaugmentation）の有効性を評価するための毛細管内微小生態系であって、かつ該各種バイオオーギュメンテーションに代表的な微生物が複数の毛細管（１６）中のそれぞれに添加されている毛細管内微小生態系、
（ｊ）  該環境についての各種化学的処理方法の有効性を評価するための毛細管内微小生態系であって、かつ該各種化学的処理方法に代表的な化学物質が複数の毛細管（１６）中のそれぞれに添加されている毛細管内微小生態系、
（ｋ）  該環境が特定の汚染物で汚染された場合における、該環境での固有の汚染物分解速度を測定するための毛細管内微小生態系、
（ｌ）  該環境が特定の汚染物で汚染された場合における、該環境での汚染物分解が特定の栄養素により促進されるかどうかを評価するための毛細管内微小生態系であって、かつ被検栄養素が複数の毛細管（１６）中のそれぞれに添加されている毛細管内微小生態系、
（ｍ）  該環境に固有の微生物群を分析するための毛細管内微小生態系、
（ｎ）  該環境に固有の微生物群をプロテオーム解析するための毛細管内微小生態系、
（ｏ） 産業上の有用性がある新規な微生物を該環境内で発見するための毛細管内微小生態系、
（ｐ） 産業上の有用性がある新規な生化学プロセスを該環境内で発見するための毛細管内微小生態系、
（ｑ） 産業上の有用性がある新規な自然産物を該環境内で発見するための毛細管内微小生態系、
（ｒ）  化学物質リスク評価のために該環境における特定の化合物の動態を評価するための毛細管内微小生態系であって、かつ毛細管（１６）の少なくとも１つはその中に該化合物が添加されている毛細管内微小生態系、
（ｓ）  化学物質リスク評価のために該環境の微生物群に対する特定の化合物の効果を評価するための毛細管内微小生態系であって、かつ毛細管（１６）の少なくとも１つはその中に該化合物が添加されている毛細管内微小生態系、
（ｔ）  生物学的リスク評価のために特定の微生物の動態を評価するための毛細管内微小生態系であって、かつ毛細管（１６）の少なくとも１つはその中に該微生物が添加されている毛細管内微小生態系、
（ｕ）  生物学的リスク評価のために該環境の微生物群に対する特定の微生物の効果を評価するための毛細管内微小生態系であって、かつ毛細管（１６）の少なくとも１つはその中に該特定の微生物が添加されている毛細管内微小生態系、
（ｖ）  特定の微生物の該環境におけるイン・サイチュ代謝活性(in situ metabolic activity)を解析するための毛細管内微小生態系であって、かつ毛細管（１６）の少なくとも１つは、その中に該微生物中の標識されていない、および標識されたバイオマーカーの比率について分析するための同位体標識テスト化合物が添加されている毛細管内微小生態系、
（ｗ）  該環境における特定の微生物を検出するための毛細管内微小生態系であって、イン・サイチュバイオマーカー増幅に続く質量分光分析の際に該微生物の特徴的なバイオマーカーのシグナル対ノイズ比率を増加させるのに適した被検化合物を評価するために、毛細管（１６）の少なくとも１つの中に当該化合物が添加されている毛細管内微小生態系。
【請求項２１】
得られた解析結果又は評価結果について、時間的及び／又は位置的な補正を行うことができるテストデバイスであって、前記毛細管（１６）の少なくとも１つは、前記結果を補正することができる内部標準として働くように配置されている、請求項１３〜２０のいずれかに記載のテストデバイス（１）。
【請求項２２】
前記テストデバイス（１）を用いて特定の微生物の増殖又は生存状態を質量分光分析により解析する際のシグナル対ノイズ比率(S/N比)を増加させるために、該特定の微生物の増殖又は生存状態を解析するために配置する複数の毛細管（１６）のうち、少なくともその１つの中には、該特定の微生物以外の微生物の増殖および生存を制限しつつ、該特定の微生物の増殖を促進するための物質が添加されている、請求項１３〜２１のいずれかに記載のテストデバイス（１）。
【請求項２３】
前記テストデバイス（１）を用いて該環境における特定の剤に対する効果を評価するために、前記毛細管（１６）の少なくとも１つの中に添加する該特定の剤を、該毛細管（１６）中の微小生態系から回収可能なように入れることを特徴とする請求項１３〜２２のいずれかに記載のテストデバイス（１）。
【請求項２４】
前記テストデバイス（１）を用いて前記環境における特定の剤に対する効果を評価するために、前記毛細管（１６）の少なくとも１つの中に添加する該特定の剤を入れる際に、該テストデバイス（１）は、該毛細管内の微小生態系における該剤と接触する周囲の環境からの前記流体が回収可能なように配置されていることを特徴とする請求項１３〜２３のいずれかに記載のテストデバイス（１）。
【請求項２５】
前記テストデバイス（１）を前記環境における特定の生化学プロセス(biochemical process)の効果を評価するために用いる際に、前記毛細管（１６）の被覆手段が、該毛細管内の微小生態系に対する該生化学プロセスの持続が制御できるように被覆されていることを特徴とする請求項１３〜２４のいずれかに記載のテストデバイス（１）。
【請求項２６】
さらに、前記毛細管（１６）を通っての流体流動を妨げるための被覆操作を遠隔制御するための手段を含む請求項１３〜２５のいずれかに記載のテストデバイス（１）。
【請求項２７】
さらに、前記毛細管（１６）を通っての流体流動を引き起こすための操作を遠隔制御するための手段を含む請求項１３〜２６のいずれかに記載のテストデバイス（１）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本出願は、以下の米国仮特許出願：２００３年３月１０日に出願された第６０／４５３，４１１号；２００３年４月１６日に出願された第６０／４６３，３９４号；２００３年７月８日に出願された第６０／４８５，４７５号；２００３年１２月９日に出願された第６０／５２８，２５６号および２００４年２月４日に出願された第６０／５４１，７８１号の利益を主張し；全てのこれらの出願はＲｏｌｆ  Ｕ．Ｈａｌｄｅｎによって出願され、Ｔｈｅ  Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙに譲渡されたものである。      
【０００２】
（技術分野）    
本発明は、環境的および生物学的現象の測定およびテストに関する。さらに詳しくは、本発明は、環境モニタリングおよび生物資源調査のための方法および装置に関する。
【背景技術】
【０００３】
生物改善は、汚染された環境からの有機および無機汚染物を除去するための効果的で安価なバイオテクノロジーである。溶解された金属および放射性核種を標的とする場合には、目標は、水溶性毒性の種を不溶性で毒性が低い生成物に変換することである。例えば、ウランは汚染された地下水から除去することができ、不溶性Ｕ（ＩＶ）の形態で溶解されたＵ（ＶＩ）の微生物誘導沈殿を刺激する炭素源の注入を介して表面下に固定化することができる。この場合、汚染物は「所定の位置」で処理され、該プロセスはイン・サイチュ生物改善とよばれる。
【０００４】
イン・サイチュ生物改善戦略を策定する場合には、特定の浄化部位に存在する表面下微生物のタイプ、活動および栄養要件の理解を得ることが必須である。微生物群の情報もまた、汚染物が地下水に希釈されるか、または分散されるよりはむしろ除去される（または、金属の場合には、表面下に首尾よく固定化される）のを取締当局および係争物受寄者に説得するのが重要である。
【０００５】
現在、所定の部位において潜在的な生物改善の評価は骨が折れ、かつコスト高である。生物改善を行うための典型的なアプローチは以下の２つの工程を含む：（１）固有の生物改善の程度を決定し、およびイン・サイチュ生物改善プロセスを加速するのに必要であろう炭素源注入のタイプ、量および頻度を突き止めるための実験室で行われる微小生態系スクリーニング実験；これらの実験は、汚染除去速度を見積もるが、実験室的「ボトル効果」によって導入される偏りのため現実のイン・サイチュ除去速度を正確には反映しないように働く、および（２）所望の生物変換反応を担う微生物を決定するには、微生物群プロフィールは微小生態系および現場での試料から得られる；ほとんどの微生物は実験室媒体では成長しないので、培養−独立性プロファイリング技術が通常は用いられる（例えば、１６Ｓ  ｒＤＮＡ−ベースの分析）。
【０００６】
地下水は容易に入手でき、かつ安価であるので、それは微生物群のプロファイリングのための通常の好ましい試料マトリックスである。残念ながら、所定の標的生物のライフスタイルは、このマトリックスにおいてそれを検出するその能力に対してかなりのインパクトを与える。極端に言えば、その存在を通じて定着したライフスタイルを追及する標的生物は、もしそれが極端に高い密度で存在する場合でさえ、ある部位で地下水中に検出するのは不可能であろう。このように、地下水モニタリング単独では、微生物群の組成および表面下環境の力学を正確には反映させることができない。最近、固相試料は、これらの制限のいくつかを克服するための有用なツールとして再発見された。
【０００７】
その最も単純な配置において、固相試料は、微生物による集落化を可能とするのに十分長い間、注目する環境でインキュベートされた物理的表面以外の何者でもない。埋められた、または沈んだスライドガラスは、土壌、バイオリアクターおよび他の環境からの微生物を収集するのにかなり用いられてきた。そのような試料の回収に続き、微生物は抽出され、ＤＮＡ、リン脂質、脂肪酸および呼吸器系キノンを含めたバイオマーカーの検出を介して同定される。サンプリングデバイスは、捕獲すべき微生物による活発な物理的付着を必要とするので、固相サンプラーで収集された微生物は、地下水サンプリングによって得られたものよりも代謝的に活性な微生物群をより象徴するという議論をなすことができる。しかしながら、死亡した微生物、細胞デブリスおよびＤＮＡもまた捕獲することができる。高感度のあるツール（例えば、ポリメラーゼ鎖反応、ＰＣＲ）は、生きていない材料におけるバイオマーカーならびに代謝的に活性な微生物群メンバーのそれを検出することができる。
【０００８】
最近、代謝的に活性な微生物を休眠しているかまたは生きていない微生物から区別するのに、安定な同位体マーカーが用いられてきた。安定な同位体プロービング（ＳＩＰ）は、炭素１３が豊富な炭素源で成長する生物のＤＮＡが１３Ｃ−標識され（「より重い」）、それにより、密度勾配遠心によって全社会ＤＮＡからのそのＤＮＡを解明するのが可能となる事実を利用する。強力な研究ツールを象徴しつつ、安定な同位体プロービングは、ルーチン的生物学的モニタリングのために適用されるには制限された能力を有するようである。というのは、該技術は非常に時間がかかり、骨が折れるからである。
【０００９】
微生物の同定のための別のアプローチは、その特徴的なＤＮＡ配列よりはむしろ遺伝子発現産物（すなわち、蛋白質）を探すことである。これは、分析プロセスの完全な自動化を可能としつつ、十分なスピードおよび感度を供する質量分析機器の最近の創製を用いて成すことができる。
【００１０】
無傷細菌、真菌、胞子およびウイルスからの蛋白質バイオマーカーの脱着を誘導する能力を持つ、マトリックス援助レーザー脱着イオン化（ＭＡＬＤＩ）時間飛行（ＴＯＦ）質量分光測定（ＭＳ）は、速く、携帯可能かつ頑強な微生物同定のための強力かつ迅速に出現する技術を提供する。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ技術は非常に速く（試料当たり＜５分分析時間）、低試料容量要件（＜１ｍＬ）を有し、かつ微生物を同定するための一般的能力を有する。
【００１１】
ロボットデバイスは、最近、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ機器と一体化されて、この分析技術の自動化を提供してきた。商業的に入手可能なロボットの最近の創製は、２Ｄゲルの調製およびイメージング、蛋白質スポットの収穫および消化、および消化物の、分析用の多数試料ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ標的への適用を含めた、十分に自動化された試料の調製および分析を可能とする。
【００１２】
この分野における全ての先行技術にもかかわらず、改良されたテスト方法および装置に対する継続した要求が依然として存在する。例えば、一つの工程のより低いコストのプロセスで微生物群プロファイルおよび微小生態系スクリーニング実験双方を提供するように前記技術を統合できる方法および技術は、この分野に大いに寄与するであろう。理想的には、そのような十分に開発された方法および技術は、いずれのタイプの生物が存在するか、いずれが生存し、かつ代謝的に活動的であるか、いずれのタイプの栄養素および栄養素用量を、生物改善を加速するのに用いるべきか、およびいずれのイン・サイチュ生物改善速度が得られるかについての情報を生じるであろう。
【００１３】
また、そのような新しい方法および技術は、例えば、飽和したメディアにおける生物資源調査において、すなわち、新規な微生物、生化学反応、および自然産物の発見のために、他のイン・サイチュ適用ではかなり価値がある傾向がある。見積もられた環境微生物の１パーセント未満が、実験室条件下で増殖し、機能できると考えられているので、イン・サイチュ微生物プロセスを開発するための新しい方法およびツールは、未知の微生物世界のかなりの割合に対して研究門戸を効果的に開くことができよう。
【００１４】
そのような発明の基礎となる理念は、微生物の大部分はその元の生息地から実験室への移動には耐えられないので、実験室を微生物が存在するところへ送ることである。そのような発明のインパクトは、新規な微生物、酵素および代謝プロセスの発見を加速することによって、ヒトおよび環境双方の健全に役立つであろう。
【００１５】
本発明者は、この技術分野において、そのような改良された方法の開発に向けて、ある期間研究を行ってきた。彼の初期の研究の多くは、本明細書中に記載される方法に適用可能である。この研究のほとんどは、科学刊行物に記載されてきた。例えば、１０３回ＡＳＭ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，２００３年５月１８ないし２２日に提出された：Ｆｒａｎｋｌｉｎ，  Ｍ．Ｐ．，Ｖ．Ｍａｄｒｉｄ，Ｓ．Ｇｒｅｇｏｒｙ，  ａｎｄ  Ｒ．Ｕ．Ｈａｌｄｅｎ，  "Ｓｐａｔｉａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ  Ｍｅｄｉａｔｉｎｇ  Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  Ｒｅｄｕｃｔｉｖｅ  Ｄｅｃｈｌｏｒｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＴＣＥ  ｔｏ  ｃｉｓ−ＤＣＥ  ａｔ  ａ  ＤＯＥ  Ｓｕｐｅｒｆｕｎｄ  Ｓｉｔｅ，"；  Ｈａｌｄｅｎ，  Ｒ．Ｕ．，Ｂ．Ｇ．Ｈａｌｄｅｎ，  ａｎｄ  Ｄ．Ｆ．Ｄｗｙｅｒ，  "Ｒｅｍｏｖａｌ  ｏｆ  ｄｉｂｅｎｚｏｆｕｒａｎ，  ｄｉｂｅｎｚｏ−ｐ−ｄｉｏｘｉｎ，ａｎｄ  ２−ｃｈｌｏｒｏｄｉｂｅｎｚｏ−ｐ−ｄｉｏｘｉｎ  ｆｒｏｍ  ｓｏｉｌｓ  ｉｎｃｕｂａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ  ＲＷ１．"  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６５：２２４６−２２４９（１９９９）；  Ｈａｌｄｅｎ，  Ｒ．Ｕ．，Ｅ．Ｇ．Ｐｅｔｅｒｓ，  Ｂ．Ｇ．Ｈａｌｄｅｎ，  ａｎｄ  Ｄ．Ｆ．Ｄｗｙｅｒ，  "Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｎｏ−ａｎｄ  ｄｉｃｈｌｏｒｉｎａｔｅｄ  ｐｈｅｎｏｘｙｂｅｎｚｏａｔｅｓ  ｂｙ  ｐｈｅｎｏｘｙｂｅｎｚｏａｔｅ−ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ  ｉｎ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ＰＯＢ３１０  ａｎｄ  ａ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｄｉａｒｙｌｅｔｈｅｒ−ｍｅｔａｂｏｌｉｚｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ，"  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｅｎｇ．  ６９：１０７−１１２（２０００）；  Ｈａｌｄｅｎ，  Ｒ．Ｕ．，Ｓ．Ｍ．Ｔｅｐｐ，Ｂ．Ｇ．Ｈａｌｄｅｎ，  ａｎｄ  Ｄ．Ｆ．Ｄｗｙｅｒ，  "Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ３−ｐｈｅｎｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｉｎ  ｓｏｉｌ  ｂｙ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ＰＯＢ３１０（ｐＰＯＢ），"  Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６５：３３５４−３３５９（１９９９）；  Ｃｏｌｑｕｈｏｕｎ，  Ｄ．，Ｅ．Ｓ．Ｗｉｓｎｉｅｗｓｋｉ，  Ｄ．，Ａ．Ｋａｌｍｙｋｏｖ，  ａｎｄ  Ｒ．Ｕ．Ｈａｌｄｅｎ，  "Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｗｉｔｔｉｃｈｉｉ  ＲＷ１  Ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  Ｄｉｏｘｉｎ  Ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｕｓｉｎｇ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．  １０４ｔｈ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｎｅｗ  Ｏｒｌｅａｎｓ，  ＬＡ，Ｍａｙ２３−２７（２００４）；  Ｈａｌｄｅｎ，  Ｒ．Ｕ．，Ｒ．Ｎ．Ｃｏｌｅ，  Ｃ．Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｄ．Ｃｈｅｎ，ａｎｄ  Ｋ．Ｊ．Ｓｃｈｗａｂ，"Ｒａｐｉｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｏｒｗａｌｋ  Ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ＭＡＬＤＩ��ＴＯＦ  ＭＳ  ａｎｄ  ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ”，５１ｓｔ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，  Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ，Ｊｕｎｅ  ８−１２，２００３，http://www.inmerge.com/aspfolder/ASMSSchedule2.asp; Ｌｏｗｅ，  Ｍ．、Ｅ．Ｌ．Ｍａｄｓｅｎ，  Ｋ．Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒ，  Ｃ．Ｓｍｉｔｈ，  Ｓ．Ｅｍｒｉｃｈ，  Ｆ．Ｒｏｂｂ，  ａｎｄ  Ｒ．Ｕ．Ｈａｌｄｅｎ，  "Ｇｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｔｒｉｃｈｌｏｒｏｅｔｈｅｎｅ−ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｅｄ  Ｓｕｐｅｒｆｕｎｄ  ｓｉｔｅ  ｕｎｄｅｒｇｏｉｎｇ  ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｒｅｄｕｃｔｉｖｅ  ｄｅｃｈｌｏｒｉｎａｔｉｏｎ，"  ＦＥＭＳ  Ｍｉｒｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｅｃｏｌｏｇｙ  ４０：１２３−１３４  （２００２）；  Ｖａｎｃｈｅｅｓｗａｒａｎ，  Ｓ．，Ｒ．Ｕ．Ｈａｌｄｅｎ，  Ｋ．Ｊ．Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ，  Ｊ．Ｄ．Ｉｎｇｌｅ，  ａｎｄ  Ｌ．Ｓｅｍｐｒｉｎｉ，  "Ａｂｉｏｔｉｃ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｅｔｒａａｌｋｏｘｙｓｉｌａｎｅｓ  ａｎｄ  ｔｒｉｃｈｌｏｒｏｅｔｈｅｎｅ／ｃｉｓ−１，２−ｄｉｃｈｌｏｒｏｅｔｈｅｎｅ  ｃｏｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｄｒｉｖｅｎ  ｂｙ  ｔｅｔｒａｂｕｔｏｘｙｓｉｌａｎｅ−ｄｅｇｒａｄｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ，"  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．３３：１０７７−１０８５（１９９９）；およびＶａｎｃｈｅｅｓｗａｒａｎ，  Ｓ．，Ｓ．Ｈ．Ｙｕ，Ｐ．Ｄａｌｅｙ，Ｒ．Ｕ．Ｈａｌｄｅｎ，  Ｋ．Ｊ．Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ，  Ｊ．Ｄ．Ｉｎｇｌｅ，  ａｎｄ  Ｌ．Ｓｅｍｐｒｉｎｉ，  "Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  ｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒｉｃｈｌｏｒｏｅｔｈｅｎｅ  ｄｒｉｖｅｎ  ｂｙ  ｔｅｔｒａａｌｋｏｘｙｓｉｌａｎｅｓ  ａｓ  ｃｏ−ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｔｓ：  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｆｒｏｍ  ｍｉｃｒｏｃｏｓｍ  ａｎｄ  ｆｉｅｌｄ  ｓｔｕｄｉｅｓ，"Ｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎ  １３／１４：７−２５（２００３）参照。これらの研究の教示および開示は、ここに引用して援用する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明の意味が良好に理解され、認識できるように、本発明に関連する背景を前記にて、かなり広くまとめた。この点に関し、本発明の目的および利点を考えるのにそれは役に立つ。
【００１７】
本発明の目的は、環境モニタリングおよび生物資源調査のための改良されたより低いコストの方法を提供することにある。
【００１８】
本発明のもう１つの目的は、環境回復および汚染された部位の長期管理をより効果的に裏付けるための改良された生物改善評価方法およびツールを提供することにある。
【００１９】
本発明のさらにもう１つの目的は、生物改善部位の自動化された、大容量の高スループット分析を可能とする改良された生物改善評価方法およびツールを提供することにある。
【００２０】
本発明のさらなる目的は、以下のパラメーター：（１）流体の質および毒性、（２）固有の生物改善能力、（３）栄養修正に続く加速された生物改善能力、（４）環境浄化用の効果的な生物増加戦略、（５）自然および促進条件下での自然化合物および環境汚染物の代謝回転速度、（６）イン・サイチュＤＮＡ合成および蛋白質発現、（７）自然および改変された環境条件下での自然および導入された生物学的剤のイン・サイチュ増殖／死滅速度および代謝活性、（８）自然環境に固有の微生物群の構造および力学、および（９）バイオテクノロジーで用いるための潜在的価値のある微生物の同一性および活性の自動化された、迅速かつ同時の決定を可能とするモニタリング方法、ツールおよび分析戦略を提供することにある。
【００２１】
本発明の目的は、非固有微生物、病原体および遺伝子工学により作成された微生物の自然環境への放出に由来する潜在的危険性を評価するために適用できるモニタリング方法およびツールを提供することにある。
【００２２】
本発明のもう１つの目的は、医薬産業およびバイオテクノロジーセクターに関連性のある微生物、酵素および自然産物を発見するための潜在的価値を有する方法およびツールを提供することにある。
【００２３】
本発明のこれらのおよび他の目的ならびに利点は、これに続く添付の発明の概要、図面および詳細な記載を参照して本発明が良好に理解され、容易に明らかとなろう。
【００２４】
環境モニタリングおよび生物資源調査のための改良された方法および装置の開発に対する要求を認識し、本発明は、一般には、前記した要求を満たし、および先行技術のデバイスおよび方法で特定された不利を克服することに向けられる。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
第一の好ましい実施形態において、そのような方法は（ａ）調査すべき環境にサンプリングデバイスを入れ、ここに、このデバイスは（ｉ）流体流入口および流出口を有する容器、（ｉｉ）該容器内に位置する複数の毛細管微小生態系、これらの毛細管の各々は、毛細管を通っての流体流動を可能とするように配置された流入口および流出口を有し、これらの毛細管の各々は、さらに、その流入口および流出口を被覆して、毛細管を通っての流動を妨げるための手段を有し、（ｉｉｉ）容器流入口に連結されたポンプ、該ポンプは、該容器の流出口に連結された、それに従って、毛細管を通って容器の流入口に入れられる、周囲の環境からの流体を吸い取るように配置され、（ｉｖ）容器の流出口に連結され、ポンプによって毛細管を通っての流動を収集するための手段、および（ｖ）容器への流体の逆流を妨げるために容器の下流に連結されたチェックバルブを含み、この複数の毛細管は、商業的に入手可能なロボットを用いて毛細管の自動分析を可能とするように配置され、（ｂ）周囲の環境からの流体が容器および毛細管を通って流動できるように毛細管被覆手段を開け、（ｃ）毛細管微小生態系内で起こる現象を調べるのに十分な一時的な持続のインキュベーションの間、該デバイスを現場に残し、（ｄ）テストデバイスを回収し、次いで、（ｅ）リアルタイムセンサー、自動分析スキームおよび商業的に入手可能なロボットを用い、毛細管微小生態系で起こる現象を分析する工程を含む。
【００２６】
もう１つの好ましい実施形態において、本発明は、前記方法と、これに加えて、対象環境において特定の生物改善プロセスを加速するそれらの推定された能力につき、毛細管に添加された特異的テスト物質についてのスクリーニング実験を該デバイスで行う工程の形態を採る。
【００２７】
なおさらなる好ましい実施形態において、本発明は、特定の環境内の微生物についての環境モニタリングおよび生物資源調査のためのテストデバイスの形態を採る。この実施形態は（ａ）流体流入口および流出口を有する容器、（ｂ）容器内に位置する複数の毛細管微小生態系、毛細管の各々は、毛細管を通っての流体流動を可能とするように配置された毛細管流入口および流出口を有し、毛細管の各々は、さらに、毛細管流入口および流出口を被覆して、毛細管を通っての流動を妨げるための手段を有し、（ｃ）容器流入口に連結されたポンプ、該ポンプは、周囲の環境から流体を吸い取り、それを、容器の流入口および毛細管に入れるように配置されており、（ｄ）容器の流出口に連結された、ポンプによって毛細管を通る流体を収集するための手段、および（ｅ）容器への流体の逆流を妨げるための容器の下流に連結されたチェックバルブを含み、ここに、該複数の毛細管は、商業的に入手可能なロボットを用いて毛細管の自動分析を可能とするように配置されている。
【００２８】
なおもう１つの好ましい実施形態において、本発明は、前記したテストデバイスの形態を採り、ここに、複数の毛細管が、容器のイン・サイチュ位置を囲う環境に固有な微生物の同定を助けるように配置される。
【００２９】
このように、以下の詳細な記載が良好に理解され、認識されるように、本発明を前記にてかなり広くまとめてきた。勿論、後に記載され、本発明に対するいずれかの最終的な請求の範囲の主題を形成する発明のさらなる特徴がある。
【００３０】
（発明の実施するための最良の手段）
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用において、以下の記載に記載された、または図面で説明された構成の詳細、および構成要素の配置に制限されないことが理解されるべきである。本発明は他の実施形態が可能であり、種々の方法で実行し、行うことができる。また、本明細書中で用いたフレーズおよび用語は記載目的のためであり、限定的であると見なされるべきではないことが理解されるべきである。
【００３１】
前記したように、本発明は：汚染された部位の管理および生物改善、地球および地球外環境における微生物の検出、自然環境に導入された微生物の危険評価、およびバイオテクノロジーに適用可能な新規な微生物、酵素および／または化合物についてのサーチを含めた多くの目的を発揮することができる。
【００３２】
本発明は、モニタリングツールおよび分析の戦略または方法双方を提供する。これらは、多くの鍵となる生物改善パラメーターの自動化された、迅速かつ同時の決定、および自然土壌および水環境に固有の微生物群の同定、およびバイオテクノロジーで用いられる潜在的価値の微生物の発見を可能とする。
【００３３】
本発明は、最初に、その自然環境における微生物の培養、選択的豊富化、および包括的な生化学的特徴付けを可能とする。その技術において：
（ａ）以下のツール／アプローチを組み合せ：固相サンプリング技術、イン・サイチュ豊富化および生化学スクリーニング、電子ドナー／アクセプター対の使用、同位体標識、および自動化分析との大量平行スクリーニング、
（ｂ）培養−非依存性微生物群分析と組み合わせてイン・サイチュ微小生態系アレイを利用して、微生物群の包括的な実態を獲得し、
（ｃ）数百または数千の仮定的環境シナリオのためのデータを提供することができ、それにより、これらの摂動によって誘導された環境変化の起こりうる速度を迅速かつ自動様式で決定するのを可能とし、
（ｄ）コンピュータ援助減算プロファイリング技術によって特異的微生物を観察された反応にリンクさせるのに適しており、
（ｅ）現存のロボットシステムを十分に適合し、それにより、化学、物理学、生物学、ゲノムおよびプロテオミック分析技術を用いる迅速かつ十分な自動分析を可能とし、
（ｆ）物理、生物学および／または化学ストレッサーに直面する場合に、どのようにして非自然微生物が自然環境に対処するかの判断を可能とし、
（ｇ）専らイン・サイチュ適用、エクス・サイチュ適用、またはその２つの組合せにつき最適化でき、および
（ｈ）迅速かつ十分な自動化分析でプロテオミックアプローチが用いられるのを可能とする（例えば、マトリックス援助レーザー脱着／イオン化飛行質量分光測定（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）およびタンデム質量分光測定（ＭＳ／ＭＳ）を用いる酵素消化物の蛋白質配列決定）。
【００３４】
本発明の１つの実施形態は、イン・サイチュ微小生態系アレイ（ＩＳＭＡ）サンプラーまたはテストデバイス１の形態を採る。図１ないし４に示すように、その主な構成要素は：流体流入口１２および流出口１４を有するハウジングまたは容器１０、このハウジング内に位置する複数の毛細管微小生態系１６、これらの毛細管１６は微小生態系アレイというものを構成し、これらの毛細管１６の各々は、毛細管１６を通っての流体流動を可能とするように配置された流入口１８および流出口２０を有し、これらの毛細管の各々は、個々の毛細管における微生物収集を促進するその能力につき選択される濾過材料２２を含有し、毛細管流入口１８および流出口２０と整列可能なように配置された開口２８を有する上方２４および下方２６バルブプレート、カップリング手段３２およびスプリング３４の組合せと共に空気シリンダー３０は、これらのバルブが横方向に移動して、毛細管の流入口１８および流出口２０を開き、または閉じるのを可能とし、ガスケッティングパッド３６、３８はこれらの開口からの漏れを妨げるように働き、ポンプ４０は容器の流入口１４に連結され、かつ容器１６を囲う環境からの流体を吸い、それを容器の流入口１２を通って、および毛細管を通って押すことができるようなサイズであり、収集デバイスまたはブラダー４２はポンプの流出口に連結され、これを用いて容器１６を通っての流動を収集し、ポンプ４０およびブラダー４２の間に連結されたチェックバルブ４４は容器１６を通っての流体の逆流を妨げ、錘４６は、アンビリカルケーブル４８を介してサンプラー１を、目標の領域まで延びる適当に穴開けされたウェルまで下へ吊るすためのバラスを供するように働く。
【００３５】
本発明の初期ＩＳＭＡプロトタイプのサンプラーは、商業的に入手可能な９６位置（８×１２）マイクロタイタープレート（例えば、Ｗｈｅａｔｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）に基づくものであった；同様な３８４、１５３６（またはそれ以上の）プレート様式を用いることができたであろう。初期プロトタイプのサンプラーの各ウェルまたは「ミクロ環境」は、個々の微小生態系毛細管（１．１２ｍＬ；０．２９５インチ［直径］×１インチ［長さ］）を表す９６ドリル穴を持つテフロンブロックよりなるものであった。
【００３６】
ポンプ４０のＩＳＭＡサンプラー１に、クロージャーメカニズムバルブプレート２４、２６、および半透膜を含めると、まず、その自然環境から寄生微生物を除去（および潜在的に損傷）することなく環境中でデバイスを摂取し、次いで、それをインキュベートすることが可能となる。図面に示されたもの以外のポンプ配置は、限定されるものではないが、流体を、１以上の個々の微小生態系毛細管の流入口へ送達するマルチ−チャネルポンプおよびポンプアレイを含む。
【００３７】
本発明のＩＳＭＡサンプラー１には、収集デバイスまたはブラダー４２を備えることができる。アレイを通って流動する流体は容器を出て、ブラダーに収集される。収集デバイスからの空気の置き換えは望ましく、流体取込口上方にいくらか距離をおいた位置へ、アンブリカルケーブルに沿って上昇するチューブのピースを介して空気を逃がすことを可能とするブリードバルブを収集デバイスに含めることによって達成することができる。
【００３８】
流体がデバイスを流動するにつれ、微生物および化学物質は毛細管微小生態系１６に捕獲され得る。収集デバイスが満杯となると、フロートはパワーをポンプに与え、クロージャーメカニズムのバルブプレート２４、２６を作動させることができ、それにより、アレイをシールする。直ちに、またはバッジ様式でのさらなるインキュベーション時間の後、デバイス１はさらなる分析のために環境から取り出すことができる。
【００３９】
本発明のＩＳＭＡサンプラー１は再使用のために設計することができる。この目的では、本発明には、マイクロタイタープレートの迅速な交換を可能とする手段を備えることができる。
【００４０】
交換可能なマイクロタイタープレートは、使用に先立って長期保管を可能とするように製造することができる。この目的では、特注マイクロタイタープレートの内容物を凍結乾燥し、真空シールすることができる。真空の開放およびマイクロタイター内容物の再水和によりテスト用デバイスの準備が整う。マイクロタイターの内容物は、限定されるものではないが、特定のテスト物質、テスト化合物、およびテストオルガネラまたは微生物を含む手段を含む。
【００４１】
本発明のＩＳＭＡサンプラー１には、関心のある微生物および化学物質を捕獲するための手段を備えることができる。そのような手段は収着、沈殿、沈積、凝固、濾過、歪み、抽出、クロマトグラフィー、アフィニティー分離、サイズ排除分離、提示された表面への受動的付着、および提示された表面への能動的付着よりなる群から選択することができる。
【００４２】
本発明のＩＳＭＡサンプラー１には、化学化合物に対して非浸透性、半透性、または完全に浸透性のあるバリアーを介して、捕獲された検体の物理的および／または化学的封じ込めに先立って、小液体容量および規定された量のオルガネラのテストチャンバーへの送達を可能とするミクロフルイディックシステムを備えることができる。この態様は、例えば、未培養または「培養不能」細菌を、生化学特徴付けおよび同定を行うのに十分に大きな数まで培養するのを可能とする。
【００４３】
このサンプラーは、自然環境における有益なまたは有害な化学剤いずれかの運命を調べるのに適合させることができる。この適用においては、サンプラー１は、注目する物理的、化学的および生物学的環境を各テスト区画または微小生態系内でできる限り密接に反映するように修飾される（例えば、局所的沈積を備えたフロースルーセル等）。テスト化学物質はその展開に先立ってサンプラーに含ませ、サンプラー内から雰囲気流体へ拡散させる。局所的環境との相互作用に続き、全ての化学物質はブラダーに捕獲される。
【００４４】
また、このサンプラーは、自然環境における有益なまたは有害な生物学的剤いずれかの運命を調べるのに適合させることができる。この適用においては、注目する物理的、化学的および生物学的環境を各テスト区画または微小生態系内にできる限り近く反映させるようにサンプラー１を修飾する（例えば、局所沈積を備えたフロースルーセル等）。その展開に先立ってテスト生物をサンプラーに接種し、サンプラーをイン・サイチュでインキュベートして、その放出を可能とすることなくテスト生物種と環境との相互作用を可能とする。
【００４５】
サンプラーのクロージャーバルブプレート２４、２６の修飾は、その微小生態系区画の連続する開放および閉塞を可能とする。リアルタイムおよびモニタリング機器（ｐＨ、Ｅｈ、温度、ＤＯなど）をサンプラー１に添加して、標的環境の変化（例えば、激しい雨）によって適時に選択された特異的点において、機能を増加させ、反応をトリガーすることができる。ラジオ周波数シグナリングおよび遠隔制御の使用は、サンプラー１と連絡し、インキュベーションの間に起こる化学的変化を測定するのに用いられる標準的アンブリカルコード４８を置き換えることができる。
【００４６】
デバイスの設計を改変して、限定されるものではないが、地球のそれとは異なる極端なｐＨ、温度、圧力、放射線、重力条件を含めた極端な条件を特徴とする環境にデバイスを展開するのを可能とすることができる。加えて、多くのタイプのミクロフルイディック、フィルター、収着材料、半透膜および別のクロージャーメカニズムをサンプラーに組み込んで、適時に、サンプラー１内で化学的変化が起こるのを可能とするインキュベーション時間からその接種を分離することができる。
【００４７】
さらに、該方法およびデバイスは、限定されるものではないが、表面下環境、表面環境、空間中の飽和環境、および死滅したまたは生きているマクロ生物を含めたいずれの流体含有環境においても生物資源調査および環境モニタリングのために用いることができることは注意されるべきである。
【００４８】
光学的および／または電気的検出システムをサンプラー１のミクロフルイディック配置に組み込んで、単一細胞が微小生態系に送達されると同時にこの微小生態系をシールして、新規な微生物を単離する速度を首尾よく大幅に増大させることができる。
【００４９】
例えば、個々の微生物のデバイスへの進入を検出する光学センサーは、バルブプレートの平行移動をトリガーして、「開いた」位置から「閉じた」位置まで移動させることができる。異なる表面を「閉じた」位置に提示することができる。もし提示された表面が微生物および水の流動にとって不浸透性であるならば、完全な封じ込めが達成される。もし提示された表面が半透膜であるならば、微生物を封じ込めつつ、水を継続的にデバイスに流すことができる。
【００５０】
微生物の同定のための本発明のアプローチは、遺伝子発現産物（すなわち、蛋白質）ならびにその特徴的なＤＮＡ配列を探すことを含む。例えば、リボソーム蛋白質をバイオマーカーとして用いて、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳにより微生物を同定する。
【００５１】
ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳによる特異的微生物の迅速な自動化検出のために、個々の微小生態系を、特異的微生物の増殖のみを支持するように配置することができる。これは、非標的微生物の増殖および生存を抑制しつつ、標的微生物の増殖を促進する化学物質を微小生態系に含めることによって達成される。例えば、選択的基質および抗体の組合せはこの目的で働かせることができる。このタイプの選択的培養、微生物学研究所における通常の戦略は、今日、イン・サイチュで行われつつある。そうすることによって、特異的微生物の増殖および鍵となる生態分子の発現を達成することができる。次いで、特異的微生物の選択的イン・サイチュ培養は、質量分光分析によるこれらの生物学的剤の直接的検出および同定を可能とする。それは、豊富化された試料の増強されたシグナル対ノイズ特徴のため、広範な試料調製および浄化に対する必要性を不要とする。
【００５２】
また、このイン・サイチュ培養技術を用いて、イン・サイチュでの微生物での代謝および異化活性を測定することができる。この目的では、提示された化学物質は炭素１２の同位体（例えば、１３Ｃ、１４Ｃ）のような同位体標識を含むことができる。
【００５３】
ＳＩＰおよび非培養依存性微生物群プロファイリングツールと組み合わせた本発明の使用は、もう１つの重要な適用である。
【００５４】
このプロセスの利点は、ウランを含む飽和された表面下環境の生物改善に適用される図５Ａないし５Ｃで説明される。慣用的な微生物群分析は図５Ａに示される図を作成し、該技術は全ての細菌の存在を検出するが、それはその代謝活性についての情報を供しない。同位体標識栄養素の使用は、検出された微生物のいずれが代謝的に活性であるかを明らかにすることができる（図５Ａで示された群の右半分）。
【００５５】
ＩＳＭＡサンプラー１の使用は、種々の環境条件下で測定された９６以上の群プロファイルの測定を可能とする（例えば、ウランが種々の条件で呈されつつあるスクリーニング実験）。図５Ｂ参照。減算群プロファイリングを用いる得られたデータのコンピュータによる解析は、活性な微生物の大きな群内で重要な汚染物変換微生物を同定するのを可能とする（全ての代謝的に活性な細菌が生物改善プロセスに加わるのではない）。
【００５６】
サンプラーにおける環境条件は、汚染物分解細菌の選択的豊富化を可能とし、これらのいくつかは最初に検出することができる（図５Ｃ参照）。適当な条件下で、不十分に示された集団を、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳ−ベースの検出／同定を可能とするレベルまで豊富化することができる。
【００５７】
与えられた部位で検出可能な潜在的に関連する微生物のいずれが所望の反応を行っているかを区別するためには、ＳＩＰ方法を用いることができる。安定な同位体を化学レポーターとして用いて、代謝的に活性な細菌を、休眠しているまたは死滅している群メンバーから、および所望の生物改善または生物刺激に無関係な機能を行っているものから区別するのを助ける。  
【００５８】
同位体標識基質（例えば、１３Ｃ標識アセテート）を、小型化された現場で展開可能なダウンウェルＩＳＭＡにおいて生物変換活性の化学的レポーターとして用いることができる。既に述べたように、これらのデバイスの各々は異なる物理的に分離されたテスト環境、「テストウェル」または毛細管微小生態系を保持する。
【００５９】
本発明の方法は、調べるべき環境に適切に配置されたＩＳＭＡを入れることで開始する（例えば、モニタリングウェルが接近する汚染された地下部位）。一旦ＩＳＭＡがモニタリングウェルに所望の深さまで低下したならば、それは、ワイヤーによって（またはプログラムされた内蔵メカニズムのような他の手段を介して）行われる電気的シグナルを介して表面からトリガーされる。デバイスのトリガリングは、「テストウェル」の各々を地下水の流れに晒す。地下水に懸濁された微生物はそれ自体が提示された表面に付着し、デバイスに捕獲されるようになる。さらなる遊離生微生物は、一旦デバイスがシグナルを受信して再度閉じれば、捕獲されるようになる。
【００６０】
テストウェルのいくらかは、関心のある汚染を含むことができる。個々のテストウェルは、前述したごとく、微生物の増殖および活性に対するその効果を測定するために１つの安定な同位体標識栄養素を含むことができる。今や閉じたデバイスはイン・サイチュでインキュベートされて、標識された基材上での微生物の増殖を可能とする。
【００６１】
このインキュベーションの間に、同位体標識電子ドナーの利用に直接的にまたは間接的に関与する全ての細菌は、同位体−標識ＤＮＡで豊富化する。ウェルからのツールの回収に続き、微生物をデバイスから収集し、その同位体で標識されたより高い密度のＤＮＡは、密度勾配遠心によってバックグラウンドＤＮＡから分離される。次いで、公知の分子技術を用い、このより高い密度のＤＮＡ（および非標識ＤＮＡ）を分析する。
【００６２】
オリゴヌクレオチドマイクロアレイは標的−特異的生物を同定し、計数するように働き、他方、クローンライブラリーを用いて、新規な培養されていない微生物を同定することができる。デバイスは、理想的には、ＤＮＡの自動抽出のために商業的に入手可能なロボットと組み合わせて用いることができる。
【００６３】
金属／放射性核種の微生物学的に誘導された腐食の程度は、レーザーでＩＳＭＡ内に置かれた金属表面をスキャンすることによって光学的に測定することができ、別法として、汚染生物変換は、染料／レポーターの添加を介して生化学的に、あるいは電気抵抗の測定を解して電気化学的に検出することができる。測定は、デバイス中に取り込まれ、デバイスに吸われた流体と化学的に相互作用する機会を有した毛細管内容物、ブラダー内容物、および収着材料の分析を介して、イン・サイチュまたは展開後にリアルタイムに行うことができる。
【００６４】
もしウランが関心のある汚染物であるならば、ウラン被覆表面の分析は、ウラン減少の程度、およびイン・サイチュ条件下で起こる汚染物除去速度の計算を決定することができる。
【００６５】
既に述べたように、デバイスのテストウェルには、化学物質（例えば、外部炭素およびエネルギー源；他の栄養素；ｐＨまたはレドックス剤のようなコンディショニング剤）のゆっくりとした連続的放出を可能とするためのマトリックスを備えることもできる。該マトリックスは、問題とする栄養素を含有するポリマーまたは膜小胞であり得る。マトリックス／膜の拡散特徴は、所望であれば、テストウェルの各々において異なる栄養素レベルを達成するように選択される。呈された栄養素は固体、液体または気体状態で添加することができる。エネルギー源は、汚染物コーティングの存在下および不存在下で呈することができる。
【００６６】
テストウェルのいくつかは、イン・サイチュにて連続的フロースルー操作用に配置することができる。デバイスを通っての流動は受動的、または能動的であってよい。活性なデバイスにおいては、小さなポンプ４０は地下水の移動を容易とし、他方、種々の長さおよび配置のチューブを用いて、１つのテストウェルのエフルエントがもう１つのインフルエントとなるのを妨げる。
【００６７】
図６は、点源からの燃料炭化水素、およびジベンゾフランで汚染された地下水を含有する仮定的部位における環境モニタリングおよび生物資源調査用に配置された９６ウェルマイクロタイタープレートの１つの可能な配置を示し、ピレスロイドは非点源からの３−フェノキシ安息香酸（３−ＰＯＢ）を分解する。９６の微小生態系毛細管は１２行（「Ａ」ないし「Ｌ」および８列（「ｉ」ないし「ｖｉｉｉ」））にて平行に整列させる。この部位のための特注マイクロタイタープレートにおいては、全ての毛細管が、微生物を捕獲するための皮膜状材料を含む。各微小生態系毛細管の前方半分における流入口の近くでは、皮膜状材料は不活性拡散性マトリックスとして働く耐化学薬品性寒天ビーズを含む。各微小生態系毛細管の後ろ側半分における流出口の近くでは、皮膜状材料は、それに汚染物が収着できる収着剤ビーズを含む。毛細管Ａｉはいずれのテスト物質または微生物も含まない。ＩＳＭＡが汚染した透水層においてフロースルー様式で展開されるならば、リアルタイムセンサーによって微小生態系Ａｉにつき報告された化学的条件は、雰囲気地下水の質を反映する。同様に、微小生態系Ａｉに含まれた収着剤ビーズの科学的分析により、局所的地下水における展開の間に微小生態系を通過した汚染物質量の時間積分尺度が得られる。フロースルー様式の間にＩＳＭＡでの微生物の捕獲の後、バルブプレートは平行移動してデバイスを閉じる。今やバッチ様式でインキュベートされた微小生態系Ａｉについてのリアルタイム検知データは、雰囲気条件（固有の生物改善速度；時間の関数としての汚染物の喪失）下での汚染物分解の力学について知らせるであろう。
【００６８】
もし微小生態系Ａｉを通過する地下水が嫌気性であるならば（ＩＳＭＡ展開位置；漏れる燃料タンクの直ぐの下方勾配）、燃料炭化水素の生物分解は遅く、かつ不完全である。生物分解プロセスを加速するためには、多数の電子アクセプターを考えることができる。通常の電子アクセプター化合物の迅速な同時スクリーニングは、列「Ｉ」（ＢｉないしＩｉ）における微小生態系でのＩＳＭＡ内で達成される。これらの微小生態系に呈された個々の電子アクセプター化合物は、高度に酸化性条件からより還元性の条件の範囲のレドックス勾配を反映する：Ｂｉ、酸素放出処方（ａ）；Ｃｉ、ニトレート（ｂ）；Ｄｉ、ナイトライト（ｃ）；Ｅｉ、酸化マンガン（ＭｎＯ２）（ｄ）；Ｆｉ、鉄（Ｆｅ（ＩＩＩ））（ｅ）；Ｇｉ、ウラン（Ｕ（ＶＩ））（ｆ）；Ｈｉ、クロム（Ｃｒ（ＶＩ））（ｇ）；およびＩｉ、スルフェート（ｈ）。汚染物に対して過剰濃度で存在するこれらの電子アクセプターと共にバッチ様式でＩＳＭＡをインキュベートすることによって、微小生態系ＢｉないしＩｉからのリアルタイムセンサーは、種々のレドックス条件下で、燃料炭化水素の生物分解のこのスクリーニング実験の結果について直接的に報告するであろう。一旦最適なレドックス条件が同定されたならば、いずれの用量が必要であるかを判断するのは興味深い。汚染物代謝回転が、酸素−放出処方（ａ）を含む微小生態系Ｂｉで最も迅速であると仮定し、この「栄養素」の最適用量は、微小生態系Ｂｉに対する５倍（Ｊｉ）、１０倍（Ｋｉ）および５０倍（Ｌｉ）高いレベルの酸素−放出処方を含む微小生態系で得られた分解速度を比較することによって推定することができる。かくして、頂部列の微小生態系で既に得られたデータにより、固有および増強された生物分解速度の見積もりが得られ、その結果、最も好都合なレドックス条件、ならびに電子アクセプターの最適な用量が同定される。他の栄養素および条件は同様にスクリーニングすることができる。
【００６９】
燃料が零れた部位における地下水の浄化についての化学的処理の有効性は、第二の列の微小生態系ＡｉｉないしＦｉｉを用いて調べられる。フェントン試薬（ｍ）および過マンガン酸カリウム（ｎ）による炭化水素の除去が見積もられる。示した配置では、微小生態系ＡｉｉおよびＢｉｉは不活性膜フィルターで被覆され、これは、液体が毛細管を通るのを可能とし、他方、微生物の進入は妨げられる。フロー−スルーおよびバッチ様式でのこれらの微生物の続いてのインキュベーションは、２つの酸化剤および化学的処理戦略の直接的イン・サイチュ比較を可能とする。微小生態系ＣｉｉおよびＤｉｉは不活性な膜でシールされないが、各々、ＡｉｉおよびＤｉｉと同一である。これらの２つの微小生態系対からの化学的データの直接的比較により、生物変換および化学的酸化プロセスが同時に起こり得るか否かを見積もることができる。
【００７０】
部位評価目的では、同一のＩＳＭＡサンプラーを、与えられた部位において種々の位置で展開する。ここで議論する仮定的部位については、展開位置２は、炭化水素汚染物羽状物の外部の放出部位からはるかに下向き勾配である。この位置においては、地下水は好気性であると予測され、非−点源からの汚染物のみを含むであろう。この場合、これらは３−フェノキシ安息香酸およびジベンゾフランによって呈される。
【００７１】
生きた微生物（水和されたまたは凍結乾燥されたもの）でのＩＳＭＡサンプラーの接種は、病原体および非−病原体微生物の生物増加および環境危険性評価を見積もるのに有用である。ここに考えられる特注ＩＳＭＡサンプラーは微小生態系当たり特定の種類の一千万微生物で接種されている（ＥｉｉないしＨｉｉ）：Ｅｉｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｏ１５７：Ｈ７、病原体（ｏ）；Ｆｉｉ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｗｉｔｔｉｃｈｉｉ  ＲＷ１、ジベンゾフラン−分解細菌（ｐ）；Ｇｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ株ＰＯＢ３１０、３−フェノキシ安息香酸−分解微生物（ｑ）；およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．株Ｂ１３−Ｄ５、３−フェノキシ安息香酸を迅速かつ完全に分解するように特別に設計された遺伝子工学作成微生物（ｒ）。
【００７２】
標的環境におけるこれらの微生物の生存を見積もる１つの方法は、展開、インキュベーション、およびＩＳＭＡサンプラーの回収に続いて培養可能な細胞を計数することである。接種された微生物の生存に対する環境条件の効果は、異なる位置でインキュベートされた同一微小生態系で得られた微生物カウントを比較することによって見積もることができ、例えば、展開位置１および２における病原性Ｅ．ｃｏｌｉ株の生存性は、微小生態系Ｅｉｉで得られた２つの生きたカウントを比較することによって評価することができる。
【００７３】
株ＲＷ１は、炭素およびエネルギー源としてジベンゾフランを利用することができる自然に生じる細菌である。ジベンゾフラン−汚染透水層におけるその検出は、該部位でのこの化学物質についての固有の生物改善能力を示すことができるであろう。微生物についての１つの検出技術は、株−特異的ＰＣＲプライマーおよびプローブの使用である。別法として、質量分光測定によって細菌を検出することができる。しかしながら、もし株ＲＷ１が部位地下水に存在すれば、その環境密度は、この仕事で必要とされるよりも大きさが低いオーダーであろう。ＩＳＭＡ区画Ｉｉｉは、この制限を克服するように配置される。微小生態系Ｉｉｉは選択的基質ジベンゾフラン（ｓ）を含む。好気性地下水におけるバッチ様式での微小生態系Ｉｉｉのイン・サイチュインキュベーションの間に、株ＲＷ１は、ジベンゾフランの犠牲において増殖させることによって非−検出可能から検出可能レベルに密度が増加する。ジベンゾフランの存在は２つの目的を発揮する。まず、それは標的細菌（ＲＷ１）を、質量分光測定による検出で十分に高いレベルまで増殖させる（微小生態系当たり＞１０∧７細胞合計）；第二に、それはジオキシンジオキシゲナーゼ、ＲＷ１の質量分光測定同定のための標的として働く特徴的酵素の発現を増加させる。ＲＷ１のイン・サイチュ増殖およびＲＷ１の細胞におけるジオキシンジオキシゲナーゼの高レベルの誘導の組合せ効果は、質量分光測定分析の間に増強されたシグナル対ノイズ比率である（イン・サイチュバイオマーカー増幅）；ジオキシンジオキシゲナーゼのレベルは、環境微生物の混合物に含まれる非標的蛋白質のバックグラウンドに対して高い。
【００７４】
飢餓条件下では、微生物は数回分裂して、超−ミクロ細菌を形成することができ；これらの場合には、生きた細胞のカウントは細菌の成長（増殖）を示し、他方、現実には、局所的細菌集団は滅亡に瀕している。ＩＳＭＡは、真の微生物増殖と前記した飢餓効果の間を区別するにおいて援助することができる。この目標は、微生物ＲＷ１（ｐ）およびジベンゾフラン（Ｓ）の安定な同位体標識（１３Ｃ含有）アナログを含む微小生態系Ｊｉｉで達成される。イン・サイチュでの微小生態系のインキュベーションに続き、その内容物は質量分光分析によって分析することができる。株ＲＷ１の成功したイン・サイチュ増殖は、ジオキシンジオキシゲナーゼの軽い（標識されていない）および重い（同位体標識）ペプチドの混合物の検出によって明らかにされるであろう；質量分光測定によって検出された重い同位体−対−低い同位体の比率は、イン・サイチュでの１３Ｃ−ジベンゾフラン接種の速度、同位体標識化合物のかなりの注入はコストの面で禁じられ、規則的な障害に直面する故に、現場でのテストで得ることができない測定について知らせる。
【００７５】
微小生態系Ｋｉｉを用いて、標準微小生態系をＩＳＭＡサンプラーに取り込むことによって達成できるデータ正規化の利点を説明することができる。微小生態系Ｋｉｉは、固有の地下水微生物の進入を排除する不活性半透膜でシールされている以外はＪｉｉと同一である。この微小生態系は、サンプリング位置における代謝活性についてのベンチマークとして働くことができる。例えば、ＩＳＭＡサンプラーが、展開位置２の狭い透水層において一年中展開される場合、１３Ｃ−ジベンゾフランの代謝回転および１３Ｃの同化は水温の微妙な変化の結果として季節的変動を受けるであろう。空間および時間において異なる点で展開された同一に配置されたＩＳＭＡで得られたデータ組の直接的比較は、Ｋｉｉのような標準微小生態系からの読出しを用いて結果を正規化することを介して達成することができる。そのようにすることによって、年にわたって得られる列「ｉ」における微小生態系についての結果は、単一値に崩壊し得る。もしそうならなければ、これは、透水層における炭化水素分解活性の相対的喪失を示し得る。
【００７６】
ＩＳＭＡサンプラーの展開および回収に続き、各毛細管微小生態系の微生物群は、ＤＮＡ抽出、１６Ｓ  ＲＮＡ遺伝子の増幅、変性グラジエントゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）による増幅産物の分離、バンドの配列決定、続いての系統発生的配列分析のような培養−非依存性技術を用いて分析することができる。微生物の機能および系統発生のリンクは、重要な目標である。減算群プロファイリング、すなわち、相互からの複数データ組を差し引くことにより大きなデータ組からの無関係な情報の排除は、非常に多数の微生物内で、注目する生化学プロセスを担うものを同定する１つの可能な方法を表す（図５ＡないしＣ）。
【００７７】
この目標を達成するためのもう１つのアプローチは、安定な同位体プロービングの使用である。ＩＳＭＡ技術は、3つの理由で、この技術の利用性を大いに高める。１つは、それは、広範な同位体標識化合物でスパイクされることが必要な液体の容量を最小化することによって、安価なＳＩＰ分析を容易とする。２つめは、それは、開いたシステムにおける標識と比較した場合、標識効率を劇的に増加させるバッチインキュベーションを可能とする。３つめは、それは、現場テストの間に、同位体−標識化合物を標的環境に注入することに関連する規則的なハードルを回避する。
【００７８】
ＳＩＰでの使用のためのＩＳＭＡ技術の利用性を、微小生態系ＡｉｉｉおよびＢｉｉｉによって説明する。微小生態系Ａｉｉｉは、その中に含まれたジベンゾフランを１３Ｃで標識するという事実を除いて、微小生態系Ｉｉｉと同一である。展開位置２におけるＩＳＭＡサンプラーの使用に続き、微小生態系Ｉｉｉの培養−非依存性微生物群分析により、そのいくつかが、自然に生じるジベンゾフラン−分解微生物に対応し得る非常に多数のＤＮＡ配列を生じる。しかしながら、これらは、他の細菌の大きなバックグラウンドから容易に区別することができない。ＳＩＰによる微小生態系Ａｉｉｉの分析は、それらの同定を助けるであろう。ＩＳＭＡサンプラーのイン・サイチュ展開に続き、ＤＮＡは微小生態系Ａｉｉｉから抽出される。得られたＤＮＡを塩化セシウム密度勾配で遠心して、１３Ｃ−ＤＮＡから１２Ｃ−ＤＮＡを分離する。ＰＣＲ、ＤＧＧＥおよびＤＮＡ配列決定による１３Ｃ−ＤＮＡの分析は、ジベンゾフランの代謝回転に関与する微生物の同一性を明らかにするであろう。
【００７９】
単一１３Ｃ−標識微生物に対応する配列は検出され、かつそのＤＮＡ配列情報はＲＷ１のものから異なると推定し、ジベンゾフランを代謝することができる新規な微生物はＩＳＭＡ技術で発見されてきた。もし微小生態系Ａｉｉｉで検出可能な１３Ｃ−標識代謝産物が、株ＲＷ１で報告されたものとは異なるならば、新規な生化学プロセスが検出されており、他方、代謝産物それ自体は潜在的商業的価値の新規な自然産物を表すことができる。同様に、（１３Ｃ−標識スクロース；Ｔを含有する）微小生態系Ｂｉｉｉにおける有意な真菌増殖の検出、およびグラム−陰性菌に対応する１３Ｃ−標識ＤＮＡの検出の同時欠如は、動物およびヒトにおけるグラム−陽性感染の処置に適当な真菌自然産物の存在を明らかにすることができる。
【００８０】
個々のテストシステムの複製は、１２×８マイクロタイター様式内でランダムに分布させることができる。複製システムの分析は、得られた実験データの精度について知らせる。図６で示した複製は：Ａｉについては−ＣｉｉｉないしＬｉｉｉ、列ｉについては−列ｉｖ、ｖｉおよびｖｉｉｉ、列ｉｉについては−列ｖおよびｖｉｉを含む。
【００８１】
本明細書中に開示されたテストシステムは固有の（生物改善）生物腐食能力および速度について報告するであろう。減算プロファイリングを用いる得られたデータ組のコンピューターによる分析は、表面下環境における微生物群の組成および機能双方の分析に、従来の達成されていない区別パワーを加える。
【００８２】
本発明の技術は、種々の証明された技術、および新規で自明でない方法のテクノロジーを用いて、支配的な条件下で、およびイン・サイチュで作り出されて生物改善プロセスを加速することができる条件下で、所望の目標：微生物群組成についての現場試料の迅速な自動分析、分解能力、および分解活性を達成する。本発明に一体化される技術／テクノロジーは：
１） モニタリングウェルについてのサンプリング用のダウンウェルツール、
２） マイクロタイタープレートテストおよび十分に自動化された分析、
３） 微生物栄養素の連続的放出のための徐放化合物、
４） 栄養素の送達のための膜テクノロジー、
５） ミクロフルイディック、
６） 微生物により誘導された腐食のレーザー検出、
７） 自動ＤＮＡ抽出、
８） 微生物の同位体標識、
９） 高密度標識ＤＮＡの分離用の密度勾配分析、
１０） マイクロアレイおよびバイオインフォーマティックスを用いる微生物群分析、
１１） 関連微生物の同定のための減算群プロファイリング、
１２） 個々のテスト区画における流体の化学的組成を測定するのに分析することができる収着剤材料；
を含む。
【００８３】
本発明の分析方法の有用性は、さらに、（ａ）混合培養中の微生物の同定のための質量分光測定技術の開発、および（ｂ）リボソームバイオマーカーおよび微生物のＭＡＬＤＩ  ＴＯＦマススペクトルを解釈するための微生物−同定データベースソフトウェアおよびサーチアルゴリズムの創製によって助けることができる。
【００８４】
本発明のための分析のスピードおよび容易性は、同位体分布を認識するのに適当な他のより便利な測定技術で分子−遺伝分析を置き換えることによって達成される（例えば、自動微生物同定用のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳおよびバイオインフォーマティックスデータベースサーチの使用）。試料処理は、酵素消化工程（例えば、トリプシン消化）と組み合わせた、迅速な試料の浄化および処理（例えば、Ｇｙｒｏｌａｂ  ＭＡＬＤＩ  ＳＰ１等）のために商業的に入手可能なロボット（例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓロボットを用いる）。
【００８５】
中心的実験室設備は、イン・サイチュで展開されたサンプラーを分析するのに推奨される。これは、自動分析、および高度な標準化を可能とする。標準化された分析は、今度は、測定の精度を改良し、測定精度を制限し得る（「ボトル効果」による）技術のシステム的偏りを測定するのを可能とする。一旦同定されれば、これらの偏りは、高い精度および非−正確性でもって、エンジニアリング介入に続いて観察されるべき環境変化を予測するのを可能とすることを説明し、それを修正する。
【００８６】
本発明のテストデバイスの構成要素での概念実験の証拠は以下のものを証明した：
１． 情報的微生物群データは、慣用的地下水試料および生物改善微小生態系の分析を用い、非培養依存性ツールで得ることができる。
２． 微小生態系における電子アクセプターおよびドナーのスクリーニングは微生物群プロファイリングについての区別／予測パワーを加える。
３． 安定な同位体標識電子ドナー化合物の微小生態系設計への取込は、代謝的に活性な微生物の同定を助ける。
４． 微生物特異的蛋白質の質量分光測定分析の適合を用いて、時間および労働が度が過ぎる分離技術の必要性なくして、環境混合培養において微生物を直接的に同定することができる。
５． 現存の蛋白質同定データベースソフトウェアに含まれた微生物同定アルゴリズムの適合は、混合培養の分析を可能とする。
【００８７】
これまでの開示は本発明の好ましい実施形態に関するが、これらの詳細は明瞭性のみの目的で掲げられたことは理解される。本発明の種々の変形および修飾は、本発明の精神および範囲を逸脱することなく当業者に明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】図１は、本発明の好ましい実施形態の模式図である。
【図２】図２は、その開いたおよび閉じた位置双方における毛細管流入口に隣接したバルブプレートの拡大図と共に、図１に示されたハウジングの断面図である。
【図３】図３は、図１のバルブプレート、およびそれを横方向に移動させて、毛細管の流入口を開き、閉じるのに用いられる構成要素を示す分解図である。
【図４】図４は、地下水モニタリングウェルまで拡大される本発明の好ましい実施形態の模式図である。
【図５Ａ】図５は、ウラン汚染部位における微生物群分析のための本発明の利用を示すもので、慣用的な微生物群分析は、図５Ａに示される絵を作成する。
【図５Ｂ】図５は、ウラン汚染部位における微生物群分析のための本発明の利用を示すもので、本発明によって、図５Ｂに示されるように種々の環境条件下で測定された９６％又はそれ以上の群プロフィールの測定が可能となる。
【図５Ｃ】図５は、ウラン汚染部位における微生物群分析のための本発明の利用を示すもので、本発明の試料における環境条件は、汚染物−分解細菌の選択された豊富化を可能とし；これらのいくつかは、図５Ｃに示すように最初に検出することができる。
【図６】図６は、点源（point source）からの燃料炭化水素、およびジベンゾフランで汚染された地下水を含む仮定的な観点においての環境モニタリングおよび生物資源調査のために配置された９６ウェルマイクロタイタープレートの１つの可能な配置を示し、ピレスロイドは非点源（non-point sources）からの３−フェノキシ安息香酸（３−ＰＯＢ）を分解する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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