(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アガリクス・ブラゼイ・ムリル（Agaricus blazei Murill）から調製されたβ−グルカンを含有する素材と、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）の加熱処理菌体とを有効成分として含有することを特徴とする病原菌感染抑制用組成物。
【請求項２】
前記β−グルカンを含有する素材を０．５〜９９．５質量％、前記エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）の加熱処理菌体を９９．５〜０．５質量％含有する、請求項１に記載の病原菌感染抑制用組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、β−グルカンを含有する素材と乳酸産生菌の加熱処理菌体とを有効成分として含有する病原菌感染抑制用組成物及びそれを含有する飲食品に関する。
【０００２】
【従来の技術】
担子菌類ハラタケ科のキノコであるアガリクス・ブラゼイ・ムリル（Agaricus blazei Murill、日本名「カワリハラタケ」）は、ガン、アレルギー、糖尿、高血圧等の予防・改善効果を有することが知られており、例えば、抗腫瘍活性成分として、その子実体から酸性多糖体（特開昭６４−６７１９４号公報）、中性多糖体（特開昭６４−６７１９５号公報）及び蛋白多糖体（特開平２−７８６３０号公報）が、菌糸体から蛋白多糖体（特開昭６１−４７５１８号公報）が、更に菌糸体の培養濾液から蛋白多糖体（特開昭６１−４７５１９号公報）がそれぞれ分画されている。
【０００３】
アガリクス・ブラゼイ・ムリルは、健康食品素材として広く利用されており、例えば、特開２００１−１０３９２７号公報には、アガリクス茸を加圧下、水性溶媒を用いて抽出し、該抽出物を５０％エタノールで分別して得られるアガリクス茸エキスを配合した食用組成物が開示されている。
【０００４】
特開２００１−１７１３０号公報には、アガリクス茸煎じ液に酢と蜂蜜を混合したことを特徴とするアガリクス含有健康飲料食品が開示されている。
【０００５】
特開平１１−３２７２３号公報には、アガリクスブラゼイの菌糸体、子実体及びその混合物、又はこれらの培養残液をヘミセルラーゼが主体の酵素剤で分解処理し、そのときに得られるβ−グルカン類が多量に含まれる生理活性物質を主材とする健康食品が開示されている。
【０００６】
また、乳酸菌やビフィズス菌等の乳酸産生菌も従来から健康食品として広く摂取されており、腸内フローラのバランスを改善し、腸内腐敗産物の低減、糞便性状の改善効果のほか、免疫賦活効果を有することが知られている。例えば、特開２００１−４８７９６号公報には、Enterococcus faecalis AD101菌株の死菌体を主成分とする免疫調整剤が開示されている。
【０００７】
特開平１０−２９９４６号公報には、乳酸菌又はその処理物を有効成分とする、薬剤によって低下した液性免疫機能を回復する作用を有する液性免疫回復剤が開示されている。
【０００８】
特開平６−８０５７５号公報には、乳酸菌菌体及び／又は菌体含有物を有効成分として含有することを特徴とする経口免疫賦活剤が開示されている。
【０００９】
特開平５−２５２９００号公報には、乳酸菌菌体の細胞質画分及び／又は細胞質画分含有物を含有することを特徴とする免疫賦活組成物が開示されている。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
上記のように、アガリクス・ブラゼイ・ムリルや乳酸菌等は、健康食品として広く利用されているものの、それぞれを単独で摂取した場合の生理効果は充分満足できるものではなかった。
【００１１】
したがって、本発明の目的は、経口摂取することにより、優れた病原菌等の感染抑制効果を示す病原菌感染抑制用組成物及びそれを含有する飲食品を提供することにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意研究した結果、β−グルカンを含有する素材と乳酸産生菌の加熱処理菌体とを併用することにより、それらを単独で用いた場合に比べて非常に強く病原菌等の感染を抑制できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち、本発明の病原菌感染抑制用組成物は、アガリクス・ブラゼイ・ムリル（Agaricus blazei Murill）から調製されたβ−グルカンを含有する素材と、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）の加熱処理菌体とを有効成分として含有することを特徴とする。
【００１４】
本発明の病原菌感染抑制用組成物は、経口摂取することにより、β−グルカンによる免疫賦活活性効果と乳酸産生菌の加熱処理菌体による免疫賦活活性との相乗効果により、病原菌等の感染を強く抑制することができる。
【００１５】
本発明の病原菌感染抑制用組成物は、前記β−グルカンを含有する素材を０．５〜９９．５質量％、前記エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）の加熱処理菌体を９９．５〜０．５質量％含有することが好ましい。この態様によれば、より効果的に病原菌等の感染を抑制できる病原菌感染抑制用組成物を提供できる。
【００２０】
本発明の病原菌感染抑制用組成物は、飲食品の成分とされていてもよい。これによれば、該飲食品を摂取することにより、安全かつ効果的に病原菌等の感染を抑制することができる。
【００２１】
飲食品の成分としては、前記病原菌感染抑制用組成物を１食分当たり０．０１〜１０ｇ含有することが好ましい。この態様によれば、１食分の飲食品で充分な量の病原菌感染抑制用組成物を摂取することができる。
【００２２】
本発明の病原菌感染抑制用組成物による感染抑制効果の作用機序は、現在のところ明らかではないが、β−グルカンと乳酸菌の加熱処理菌体とを併用して摂取することにより、マクロファージ、ＮＫ細胞及びＴ細胞を中心とした細胞性免疫機構が活性化され、病原菌等の排除が効率よく行なわれるためであると考えられる。
【００２３】
【発明の実施の形態】
本発明において、β−グルカンとは、グルコースから構成される多糖類のうち、グルコースがβ型の構造で結合したものをいい、具体的にはβ−１，４グルカン（セルロース）、β−１，３グルカン、β−１，６グルカン等が挙げられる。
【００２４】
例えば、担子菌の子実体、担子菌の菌糸体、酵母、細菌、藻類、地衣類等の細胞壁等にはβ−グルカンが多く含まれている。
【００２５】
上記担子菌としては、例えば、アガリクス・ブラゼイ・ムリル（Agaricus blazei Murill）、メシマコブ、マイタケ、エノキタケ、ハナビラタケ、シイタケ、霊芝、ヤマブシタケ、アワビタケ、オオヒラタケ、カワラタケ、白樺タケ、白キクラゲ、梅寄生茸、タモギタケ、マツタケ、シメジ、エリンギ、ナメコタケ、フクロタケ、マンネンタケ等が好ましく挙げられる。本発明においては、中でもアガリクス・ブラゼイ・ムリルが用いられる。これらの担子菌は、従来より食品として摂取されているものであり、容易に入手でき、安全性も非常に高い。
【００２６】
β−グルカンを調製する方法は、特に制限はなく、熱水抽出、アルコール等の有機溶媒抽出、酵素分解等の公知の方法で行なうことができる。例えば、生あるいは乾燥したアガリクス・ブラゼイ・ムリルの子実体やアガリクス・ブラゼイ・ムリルの種菌を炭素源及び窒素源を含む培地で培養して得られる菌糸体培養物を、水、アルコール等の溶媒で抽出することにより調製することができる。具体的には、例えば、乾燥したアガリクス・ブラゼイ・ムリルの子実体の質量の約２０倍量の水を加え、１２０℃で３０分間抽出し、得られた抽出液を適宜濃縮、乾燥することにより得ることができる。
【００２７】
なお、上記のようにして得られる抽出物は、通常、β−グルカンを１〜５０質量％含んでおり、そのまま用いてもよく、必要に応じて更に精製してから用いてもよい。また、市販のものを用いることもできる。
【００２８】
また、本発明において乳酸産生菌の加熱処理菌体とは、乳酸菌、ビフィズス菌等の乳酸産生菌を加熱処理して得られる死菌体であり、例えば、以下のようにして得ることができる。
【００２９】
乳酸産生菌を、ロゴサ培地にて３０〜４５℃、１２〜７２時間培養した後、遠心分離等の適当な手段で菌体を回収する。回収した菌体を、水洗、濃縮し、この濃縮菌体懸濁液を８０〜１１５℃、３０分〜３秒間加熱処理した後、噴霧乾燥、凍結乾燥等の適当な手段により乾燥して得ることができる。
【００３０】
上記乳酸菌としては、例えば、Enterococcus faecalis、Enterococcus faecium、Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus casei、Lactobacillus lactis、Lactobacillus herveticus、Streptococcus thermophilus等が挙げられる。また、上記ビフィズス菌としては、例えば、Bifidobacterium Longum、Bifidobacterium breve等が挙げられる。本発明においては、中でもより強い免疫賦活活性を有するエンテロコッカス・フェカリスEnterococcus faecalis（例えばATCC 19433、ATCC 14508、ATCC 23655等）が用いられる。Enterococcus faecalisの加熱処理菌体は、例えば「ＥＦパワー」、「ＥＦ−２００１」（いずれも商品名、コンビ株式会社製）、「ＦＫ−２３」（商品名、ニチニチ製薬製）等として市販されており、これらを用いてもよい。
【００３２】
本発明の病原菌感染抑制用組成物は、アガリクス・ブラゼイ・ムリル（Agaricus blazei Murill）から調製されたβ−グルカンを含有する素材を０．５〜９９．５質量％（β−グルカン換算で０．５〜５０質量％）、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）の加熱処理菌体を９９．５〜０．５質量％含むことが好ましく、β−グルカンを含有する素材を１０〜９０質量％（β−グルカン換算で５〜５０質量％）、乳酸産生菌の加熱処理菌体を９０〜１０質量％含むことがより好ましい。各有効成分が上記範囲外であると相乗的な感染抑制効果が得られないため好ましくない。
【００３３】
本発明の病原菌感染抑制用組成物は、上記の基本的成分の他に、賦形剤、甘味料、酸味料、ビタミン類、ミネラル類等を含むことができる。また、その形態は特に制限はなく、粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤、液体等、その使用目的に合わせて適宜選択できる。
【００３４】
本発明の病原菌感染抑制用組成物の有効摂取量は、成人１日当たり０．０１〜１０ｇが好ましく、０．０５〜２ｇがより好ましい。
【００３５】
本発明の病原菌感染抑制用組成物は様々な飲食品、例えば、飲料、ゼリー、キャンディー、ガム、レトルト食品、インスタント食品等に添加することができる。上記病原菌感染抑制用組成物の添加量は、１食分当たり０．０１〜１０ｇが好ましく、０．０５〜２ｇがより好ましい。病原菌感染抑制用組成物の添加量が０．０１ｇ未満であると摂取しても充分な感染抑制効果が得られず、１０ｇ超であるとコスト的に高くなりすぎるため好ましくない。
【００３６】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。なお、以下の例においては、アガリクス・ブラゼイ・ムリルの子実体の抽出物として商品名「仙生露」（協和エンジニアリング社製）、乳酸球菌（Enterococcus faecalis）の加熱処理菌体として商品名「ＥＦ−２００１」（コンビ株式会社製）を用いた。
【００３７】
試験例（乳酸球菌の加熱処理菌体の急性経口毒性試験）
OECD Guidelines for the Chemicals 401(1981)に準拠し、マウスを用いた急性経口毒性試験を行った。
【００３８】
具体的には、乳酸球菌の加熱処理菌体を精製水に懸濁して、試験液（２５０ｍｇ／ｍＬ）を調製した。
【００３９】
４週齢のＩＣＲ系マウス（雌雄各２０匹ずつ、日本エスエルシー株式会社より購入）を約１週間の予備飼育を行なった後、試験群（雌雄各１０匹ずつ）とコントロール群（雌雄各１０匹ずつ）に分け、試験群には、上記試験液を乳酸球菌の加熱処理菌体換算で５，０００ｍｇ／ｋｇ体重となるように胃ゾンデを用いて強制単回経口投与した。また、コントロール群には精製水（雄：０．７ｍＬ、雌：０．６ｍＬ）を同様にして投与し、室温２３±２℃、照明時間１２時間／日に設定した飼育室で飼育した。なお、試験期間中、水と飼料（商品名「マウス、ラット用固形飼料；ラボＭＲストック」、日本農産工業株式会社製）は自由に摂取させた。
【００４０】
投与後、１日１回の観察（観察期間１４日間）を行なったが、いずれの群においても死亡例は見られなかった。そして、観察期間終了時に全てのマウスを剖検したところ、主要臓器に異常は見られなかった。また、投与後７、１４日に体重を測定し、ｔ−検定により有意水準５％で群間の比較を行なった。その結果を表１に示す。
【００４１】
【表１】
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【００４２】
表１から、雌雄ともに各群間で体重増加に差は見られなかった。以上の結果から、乳酸球菌の加熱処理菌体のマウスにおける単回経口投与によるＬＤ50値は５，０００ｍｇ／ｋｇ体重以上であると考えられた。
【００４３】
実施例１
７週齢のBALB/cマウス（雌）４０匹（日本クレア（株）より購入）を４群（各群１０匹）に分け、試験群にはアガリクス・ブラゼイ・ムリルの子実体抽出エキス（乾燥子実体として０．３ｍｇ／匹）と乳酸球菌の加熱処理菌体（１０μｇ／匹）との混合物、比較群１には乳酸球菌加熱処理菌体（２０μｇ／匹）、比較群２にはアガリクス・ブラゼイ・ムリルの子実体抽出エキス（乾燥子実体として０．６ｍｇ／匹）、コントロール群にはＰＢＳ（０．２ｍＬ／匹）をそれぞれ胃ゾンデで１週間毎日１回強制経口投与した。
【００４４】
その後、リステリア菌（Listeria monocytogenes）を２×１０5ＣＦＵ／匹となるようにマウスの腹腔内に注射し、その後の各群のマウスの生存率を観察した。なお、試験期間中、水及び飼料（商品名「粉末飼料ＣＥ−２」、日本クレア製）は自由摂取とした。
【００４５】
その結果を図１に示す。図１から、試験群、比較群１、２はコントロール群に比べて非常に高い生存率を示すことが分かる。特に、試験群のマウスは１匹も死亡しておらず、リステリア菌の感染・増殖を抑制していることが分かる。
【００４６】
実施例２
実施例１と同様にして、試験開始１週間前から毎日１回、各群のマウスに試験サンプルを強制経口投与した後、リステリア菌を感染させた。その後、マウスの脾臓を採取し、脾臓に感染したリステリア菌数の変化を測定した。具体的には、感染後、１、３、５、７日目に脾臓を採取し、この脾臓をすりつぶしてＰＢＳ中に懸濁し、この懸濁液を段階希釈して「リステリア増菌培地」（商品名、MERCK社製）に移して培養（２５℃、４８時間）し、出現したコロニーの数を測定した。その結果を図２に示す。
【００４７】
図２から、感染後３日目以降ではコントロール群ではリステリア菌数が増えているのに対して、試験群、比較群１、２では減少していることが分かる。特に、試験群ではその減少の割合が大きいことが分かる。
【００４８】
これらの結果から、アガリクス・ブラゼイ・ムリルの子実体抽出エキスと乳酸球菌の加熱処理菌体とを併用して経口摂取することにより、それぞれを単独で摂取した場合に比べてより優れた感染抑制効果を示すことが分かる。
【００４９】
実施例３
アガリクス・ブラゼイ・ムリルの子実体抽出エキスと乳酸球菌の加熱処理菌体とを併用して経口摂取することによる感染抑制効果の作用機序について、以下の方法により調べた。
【００５０】
（１）CD3陽性αβ型Ｔ細胞の表面抗原解析
検疫・検収の終了後、１週間予備飼育を行ったBALB/cマウス（雌、７週齢、日本チャールズリバー（株）より購入）を２群（１群３匹）に分け、試験群にはアガリクス・ブラゼイ・ムリルの子実体抽出エキス（乾燥子実体として０．２ｍｇ／匹）と乳酸球菌の加熱処理菌体（２０μｇ／匹）との混合物（０．２ｍＬ／匹）、コントロール群にはＰＢＳ（０．２ｍＬ／匹）を、それぞれ胃ゾンデで１日１回１週間連続経口投与した後、リステリア菌（Listeria monocytogenes）を１．４×１０4ＣＦＵ／匹となるようにマウスの尾静脈内に注射した。なお、飼育期間中、水及び飼料（商品名「粉末飼料ＣＥ−２」、日本クレア製）は自由摂取とした。
【００５１】
リステリア菌接種後５日目に各群のマウスを屠殺して腸管膜リンパ節を採取した。この腸管膜リンパ節をすりガラスで挟んで、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０培養液（商品名、Invitrogen製）に懸濁させて洗浄し、ステンレスメッシュにて余分な組織片を除去して試験群及びコントロール群の腸管膜リンパ節細胞（以下、ＭＬＮという）をそれぞれ調製した。
【００５２】
各ＭＬＮを、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０培養液中に５×１０5個／ｍＬとなるように懸濁して、６穴プレート（Corning Costar Co. 製）に１ウエル当たり１ｍＬずつまいた。そして、Stimulatorとして、１ウエル当たりに、マイトマイシンＣ（協和醗酵工業製）処理した、未処理BALB/cマウス由来の脾細胞（５×１０5個）及びリステリア菌加熱死菌体（１．０×１０6ＣＦＵ）を加えて混合し、３７℃、５％ＣＯ2存在下で４８時間培養した。なお、上記未処理マウスとは、被験物質の投与及び菌接種を行なっていないマウスを意味する。
【００５３】
そして、各ＭＬＮを下記の３種類の標識抗体（抗体は全てBecton Dickinson PharMingen社より購入）を用いて染色し、細胞表面抗原の解析を行なった。
【００５４】
▲１▼Cy-chrome(Cy)標識抗CD3εmAb/FITC標識抗TCRαβmAb/PE標識抗CD4mAb/biotin標識抗CD8mAb
▲２▼Cy標識抗CD3εmAb/FITC標識抗TCRαβmAb/PE標識抗CD69mAb/biotin標識抗CD8mAb
▲３▼Cy標識抗CD3εmAb/FITC標識抗TCRαβmAb/PE標識抗CD122mAb/biotin標識抗CD8mAb
すなわち、１．０×１０5個に調製したＭＬＮ浮遊液に、上記▲１▼に示す標識抗体を５μＬ添加し、４℃で４５分間インキュベートした。その後、５％ＦＢＳ含有Hank's緩衝液で２回洗浄し、SA-RED613（商品名、Invitrogen社製）を５μＬ添加し、４℃で４５分間インキュベートして、５％ＦＢＳ含有Hank's緩衝液で３回洗浄した。そして、フローサイトメータ（型式「Epics XL」、Beckman Coulter Inc.製）によりＭＬＮの表面抗原を解析し、CD4+CD8-細胞に対するCD4-CD8+細胞の割合を求め、CD8陽性率を比較した。その結果を表２に示す。
【００５５】
【表２】
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【００５６】
表２から、試験群のCD8陽性率はコントロール群に比べて約２倍高く、アガリクス・ブラゼイ・ムリルの子実体抽出エキスと乳酸球菌の加熱処理菌体とを摂取することにより、CD8陽性率が高くなることが分かる。
【００５７】
また、CD8陽性Ｔ細胞の活性化の有無をCD69（初期活性マーカー）及びCD122（ＩＬ−２受容体β鎖）を指標に検討した。すなわち、上記▲２▼、▲３▼に示す標識抗体を用いて、上記と同様の方法で細胞の表面抗原を解析した。その結果を表３に示す。
【００５８】
【表３】
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【００５９】
表３から、試験群のCD69及びCD122陽性率はコントロール群に比べて高く、アガリクス・ブラゼイ・ムリルの子実体抽出エキスと乳酸球菌の加熱処理菌体とを摂取することにより、CD8陽性Ｔ細胞の活性化が促進されることが示唆された。
【００６０】
（２）サイトカイン産生量
上記と同様にして、コントロール群及び試験群のＭＬＮを調製し、Stimulatorを加えて３７℃、５％ＣＯ2存在下で４８時間培養した。
【００６１】
培養終了後、培養上清を回収して、培養上清中のサイトカイン量（ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ）をＥＬＩＳＡ法で測定した。なお、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γの測定はEndogen Inc.より購入した測定キットを用い、ＩＬ−１０の測定はAN'ALYZA TECHNE Co.より購入した測定キットを用いた。その結果を図３に示す。
【００６２】
図３から、試験群はT helper 1（Th-1）型サイトカインであるＩＦＮ−γ及びＩＬ−１２の産生量が非常に高く、T helper 2（Th-2）型サイトカインであるＩＬ−１０の産生量は非常に低いことが分かる。
【００６３】
また、サイトカイン特異的ｍＲＮＡの発現量をＲＴ−ＰＣＲ法により調べたところ、試験群においてTh-1型サイトカインであるＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αのｍＲＮＡの発現量が増強されていることが分かった。一方、Th-2型サイトカインであるＩＬ−１０のｍＲＮＡの発現量に差異は認められなかった。
【００６４】
一般的に、リステリア菌等の細胞内寄生細菌に感染した生体内ではマクロファージやＮＫ細胞が活性化され、それぞれＩＬ−１２及びＩＦＮ−γを産生することが知られている。これらのサイトカインはさらに細菌抗原特異的CD8陽性Ｔ細胞を活性化し、その結果として細胞障害活性（ＣＴＬ）を有するCD8陽性Ｔ細胞による菌排除が行なわれる。また、Ｔ細胞によって産生されるＴＮＦ−αは、好中球やマクロファージ等の食細胞を感染局所に集合させる作用を有する。
【００６５】
すなわち、上記の各結果から、アガリクス・ブラゼイ・ムリルの子実体エキスと乳酸球菌とを併用して投与することにより、マクロファージやＮＫ細胞の活性化がより促進されてＩＬ−１２及びＩＦＮ−γ等の産生量が増大した結果、リステリア菌特異的CD8陽性細胞の活性化も促進され、コントロール群よりも菌排除が早まったものと考えられる。
【００６６】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によれば、β−グルカンを含有する素材と、乳酸産生菌の加熱処理菌体とを有効成分として含有させることにより、優れた感染抑制効果を有する組成物を提供できる。また、本発明の病原菌感染抑制用組成物を飲食品に添加することにより、病原菌等の感染を予防する飲食品を提供できる。
【００６７】
本発明の病原菌感染抑制用組成物の有効成分は食品由来であるので安全性が高く、この病原菌感染抑制用組成物を摂取することにより、細胞性免疫を中心とした生体防御機構の活性化が促進され、病原菌等の感染予防効果が期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  リステリア菌感染後のマウスの生存率を示す図表である。
【図２】  リステリア菌感染後のマウスの脾臓中におけるリステリア菌数の測定結果を示す図表である。
【図３】  腸管膜リンパ節細胞（ＭＬＮ）培養液上清中のサイトカイン量（ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ）をＥＬＩＳＡ法で測定した結果を示す図表である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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