(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，２４，２６，２８，又は３０に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡを、ホウ酸耐性付与遺伝子として使用する方法。
【請求項２】
配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，２４，２６，２８，又は３０に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつホウ酸耐性付与活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを、ホウ酸耐性付与遺伝子として使用する方法。
【請求項３】
配列番号１，３，５，７，９，１１，１３，１５，１７，１９，２１，２３，２５，２７，又は２９に示される塩基配列からなるＤＮＡを、ホウ酸耐性付与遺伝子として使用する方法。
【請求項４】
配列番号１，３，５，７，９，１１，１３，１５，１７，１９，２１，２３，２５，２７，又は２９に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつホウ酸耐性付与活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを、ホウ酸耐性付与遺伝子として使用する方法。
【請求項５】
配列番号１，３，５，７，９，１１，１３，１５，１７，１９，２１，２３，２５，２７，又は２９に示される塩基配列若しくはその相補的配列からなるホウ酸耐性付与遺伝子ＤＮＡとストリンジェントな条件下である、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍のＳＳＣ溶液を用い、６５℃条件下で洗浄することでハイブリダイズし、かつ前記塩基配列のいずれかと９０％以上の相同性を有する、ホウ酸耐性付与活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを、ホウ酸耐性付与遺伝子として使用する方法。
【請求項６】
ホウ酸耐性付与遺伝子として使用する方法が、ホウ酸耐性が付与された植物又は酵母を作製することであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の使用する方法。
【請求項７】
ホウ酸耐性付与遺伝子として使用する方法が、ホウ酸耐性付与活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを含みかつホウ酸付与タンパク質を発現することができる組換えベクターを作製することであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の使用する方法。
【請求項８】
ホウ酸耐性が付与された植物又は酵母が、ホウ酸耐性付与活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを含みかつホウ酸付与タンパク質を発現することができる組換えベクターが導入された、形質転換体であることを特徴とする請求項６記載の使用する方法。
【請求項９】
配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，２４，２６，２８，又は３０に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質を、ホウ酸耐性付与活性を有するタンパク質として使用する方法。
【請求項１０】
配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，２４，２６，２８，又は３０に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつホウ酸耐性付与活性を有するタンパク質を、ホウ酸耐性付与活性を有するタンパク質として使用する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シロイヌナズナにおけるホウ酸耐性付与タンパク質及びその遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター、該組換えベクターが導入された形質転換体、並びにホウ酸耐性付与遺伝子のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ホウ素は高等植物の微量必須元素の一つである（例えば、非特許文献１参照）。ホウ素は毒性も持っており、過剰に摂取すると植物の生育が阻害されたり、動物では急性中毒で死亡したりする。土壌溶液中でホウ素は無電荷の分子状で存在する。そのため比較的容易に溶脱し、農作物において欠乏症が発生しやすい。ホウ素欠乏症による農業上の収量、品質の低下は１３０品種、日本を含む世界８０カ国以上で報告されている（例えば、非特許文献２参照）。また、ホウ素は他の元素と比較して至適濃度範囲が狭いことが知られており、欠乏症状を示すようになる濃度と過剰症状が現われる濃度との差が小さい。そのため、農業においてホウ素の施肥はその量の調節が難しいとされている。特に、過剰量のホウ素を施肥した場合、ホウ素の除去は困難であり、その農地での作物生産に支障をきたすこととなる。また、水道水にはホウ素が含まれているため、乾燥地で灌漑により農業を行う場合もホウ素過剰害が問題になることが多い。このようにホウ素が過剰に投与された農地に加え、世界にはホウ素濃度の高い地域が広く分布しており、それらの地域を含む国々ではホウ素の過剰害への対策が農業政策上重要な課題となっている。また、ホウ素は金属表面処理剤や漂白剤中にも存在し、これらを用いる工場からの排水には大量のホウ素が含まれる。ヒトにおけるホウ素の致死量は１５〜２０ｇであるが、それよりも少量のホウ素でも消化器官や神経系に様々な障害を引き起こすことが知られている。現在、工業排水に含まれるホウ素量が問題になりつつある。【０００３】
最近になり植物におけるホウ素の役割が明らかにされてきた。ホウ素が細胞壁のペクチン質多糖を架橋することが明らかとなり（例えば、非特許文献３参照）、この架橋が植物の生育に必須であることが示された（例えば、非特許文献４参照）。これが植物におけるホウ素の生理機能に関する最初の分子レベルの知見である。その一方で植物体でのホウ素輸送機構には不明な点が多く残されている。ホウ素は長い間、脂質二重膜の受動拡散によって細胞内に入り、蒸散流によって植物体内を輸送されると考えられていた（例えば、非特許文献５参照）。一方、生育に適したホウ素栄養条件は種間や品種間で大きく異なることが知られていた。吸収や転流、利用効率の違いがその原因の可能性として挙げられていたものの、その要因となる分子は不明であった。近年になりチャネルを介した輸送が提唱された（例えば、非特許文献６参照）が、その根拠はアフリカツメガエルの卵母細胞での発現系や膜小胞を用いたin vitroの実験にすぎず、実際の植物個体でそれらチャネル分子がホウ素輸送に関与するかは示されていなかった。また、ヒマワリの根の吸収実験から輸送体による能動輸送の存在が示唆された（例えば、非特許文献７参照）ものの、それを担う輸送体の同定には至っていなかった。【０００４】
本発明者らは、生物界で初めて排出型ホウ素耐性タンパク質ＢＯＲ１をモデル植物であるシロイヌナズナより単離した（例えば、特許文献１参照）。ＢＯＲ１は低ホウ素栄養条件下で導管への積極的なホウ素輸送を担うと考えられている（例えば、非特許文献８参照）。また、ホウ素輸送を担う耐性としてＢＯＲ１以外には、酵母のＹＮＬ２７５ｗが知られている（例えば、非特許文献９参照）。【０００５】
また、上述のように、ホウ素（Ｂ）は植物（例えば、非特許文献１０参照）及び動物（例えば、非特許文献１１参照）に必須の微量栄養素であるが、高濃度では有毒である（例えば、非特許文献１２，１３参照）。自然発生する高濃度ホウ素を含む土壌は世界中に分布し、ホウ素の施肥、化石燃焼、ホウ素を含む水を用いた灌漑等の人間の活動が、高濃度ホウ素の環境を作り上げた（例えば、非特許文献１２，１３参照）。【０００６】
植物におけるホウ素の毒性による症状としては、葉縁の萎黄病（例えば、非特許文献１３参照）、果物の異常及び／又は樹皮ネクロシス(例えば、非特許文献１４参照)が含まれる。過剰量のホウ素は、作物の収量及び質を減少させる。ホウ素の毒性は、世界的に、農業生産の大きな障害となっている。ホウ素は、高濃度で、動物や微生物に対して有毒である。ホウ素の致死量は、大人で約１４０ｍｇ／ｋｇ、幼児で約２７０ｍｇ／ｋｇであると推定される（例えば、非特許文献１５，１６参照）。長期間にわたり高濃度のホウ素を摂取すると、ヒトにおいて食欲不振、嘔気、体重の減少、性欲の減退を誘因する（例えば、非特許文献１７参照）。現在、許容できるホウ素の安全摂取量は大人で１３ｍｇ／日であると示されている（例えば、非特許文献１８参照）。ホウ素は微生物に対する殺菌効果があるため、食品の保存料に含まれてきた（例えば、非特許文献１９参照）。さらに、ホウ素は長年、殺虫剤として、特にゴキブリ殺虫剤に使用されてきた（例えば、非特許文献２０参照）。【０００７】
ここ数十年、ホウ素の毒性が認識されて以来、ホウ素の毒性の影響を調べるための研究が行われてきた。その多くは、生理学的な研究であった。例えば、大豆の葉において、allantoate  アミド加水分解酵素の活性はホウ酸によって減退する（例えば、非特許文献２１参照）。オオシャジクモ（Chara corallina）では、ホウ素によるリンゴ酸脱水素酵素及びイソクエン酸脱水素酵素活性の阻害が観察された（例えば、非特許文献２２参照）。また、胎盤でのホウ素量と、ポルフォビリノーゲン（ポルフィリン合成の媒介物）の合成に関与する新生児におけるデルタアミノレブリン酸脱水酵素活性との負の相関も報告されている（例えば、非特許文献２３参照）。【０００８】
可溶化ホウ酸塩は、ホウ素の毒性に重要な役割を演じると思われている。細胞内のホウ酸は、内部ｐＨが高いために部分的にホウ酸塩に転換する。高濃度ホウ酸が細胞に提供されると、細胞内ホウ酸塩濃度が上昇し、細胞内の分子を含む各種ｃｉｓ−ｄｉｏｌとホウ酸塩複合体が形成される。分子を含むかかるｃｉｓ−ｄｉｏｌには、ＮＡＤ＋、ＡＴＰ、Ｓ−Ａｄｏ  Ｍｅｔ、ＲＮＡ及びいくつかの糖が含まれる（例えば、非特許文献２４，２５参照）。これらの分子は、数々の酵素の補酵素及び／又は基質として用いられているので、ホウ酸塩の結合は、機能の欠失又は、酵素活性の改変、生化学反応の阻害や最終的に代謝異常を誘導するようである。生化学的及び生理学的な分析、並びにホウ素の毒性影響に関する推測が累積しているにもかかわらず、細胞死を誘くホウ素の毒性の分子メカニズムは、解明されていない。【０００９】
【特許文献１】特開２００２−２６２８７２号公報
【非特許文献１】Loomis, W.D.; Durst, R. W. (1992) Chemistry and biology of boron. Biofactors 3: 229-239
【非特許文献２】Shorrocks, V. M. (1997) The occurrence and correction of boron deficiency. Plant and Soil 193: 121-148
【非特許文献３】Matoh, T.; Ishigaki, K. I.; Ohno, K.; Azuma, J. I. (1993) Isolation and characterization of a boron-polysaccharide complex from radish roots. Plant Cell Physiol. 34: 639-642
【非特許文献４】O'Neill, M. A.; Eberhard, S.; Albersheim, P.; Darvill, A. G. (2001) Requirement of borate cross-linking of cell wall rhamnogalacturonan II for Arabidopsis growth. Science 294: 846-849
【非特許文献５】Marschner, H. (1995) Mineral Nutritin of Higher Plants, 2nd ed. Academic Press, San Diego, CA
【非特許文献６】Dordas, C.; Chrispeels, M. J.; Brown, P. H. (2000) Permeability and channel-mediated transport of boric acid across membrane vesicles isolated from Squash roots. Plant Physiol. 124: 1349-1362
【非特許文献７】Dannel, F.; Heidrun, P; Romheld, V. (2000) Characterization of root boron pools, boron uptake and boron translocation in sunflower using the stable isotope 10B and 11B. Aust. J. Plant Physiol. 156: 756-761
【非特許文献８】Takano, J.; Noguchi, K.; Yasumori, M.; Kobayashi, M.; Gajdos, Z.; Miwa, K.; Hayashi, H.; Yoneyama, T.; Fujiwara, T. (2002) Arabidopsis boron transporter for xylem loading. Nature 420 (6913): 337-340
【非特許文献９】Zhao, R. M.; Reithmeier, R. A. F. (2001) Expression and characterization of the anion transporter homologue YNL275w in Saccharomyces cerevisiae. American Journal of Physiology-Cell Physiology 281 (1): C33-C45
【非特許文献１０】Warington, K. (1923) Ann. Bot. 37, 629-672.
【非特許文献１１】Park, M., Li, Q., Shcheynikov, N., Zeng, W., & Muallern, S. (2004) Mol. Cell 16, 331-341.
【非特許文献１２】Gupta, U.C., Jame, Y.W., Campbell, C.A., Leyshon, A.J., & Nicholaichuk, W. (1985) Can. J. Soil Sci.65, 381-409.
【非特許文献１３】Nable, R.O., Banuelos, G.S., & Paull, J.G. (1997) Plant Soil 193, 181-198.
【非特許文献１４】Brown, P.H., & Hu, H. (1996). Ann. Bot. 77, 497-505.
【非特許文献１５】Young, E.G., Smith, R.P., & MacIntosh, O.C. (1949) Can. Med. Assoc. J. 61, 447-450.
【非特許文献１６】Arena, J.M., & Drew, R.H. (1986) in Poisoning, (C.C. Thomas, Splingfield). pp. 131.
【非特許文献１７】Hunt, C.D. (1993) in Encyclopedia of Food Science, Food Technology and Nutrition, vol. 1,eds. Macrae, R., Robinson, R.K. & Sadler, MJ. (Academic Press, London), pp 440-447.
【非特許文献１８】WHO/FAO/IAEA (1996) in Trace Elements in Human Nutrition and Health, (World Health Organization, Geneva), pp. 175-179.
【非特許文献１９】Nielsen, F.H. (1997) Plant Soil 193, 199-208.
【非特許文献２０】Cochran, D.G. (1995) Experientia51, 561-563.
【非特許文献２１】Lukaszewski, K.M., Blevins, D.G., & Randall, D.D. (1992) Plant Physiol. 99, 1670-1676.
【非特許文献２２】Reid R.J., Hayes J.E., Post A., Stangoulis J.C.R., & Graham R.D. (2004) Plant Cell Environ. 27, 1405-1414.
【非特許文献２３】Huel, G., Yazbeck, C., Burnel, D., Missy, P., & Kloppmann. W. (2004) Toxicol. Sci. 80,304-309.
【非特許文献２４】Ralston, N.V.C., & Hunt, C.D. (2000) FASEB J. 14, A538.
【非特許文献２５】Ricardo, A., Carrigan, M.A., Olcott, A.N., & Benner, S.A. (2004) Science 303, 196.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
酵母にホウ酸耐性を付与する遺伝子を植物に導入することにより、ホウ素過剰に耐性を持つ植物が作出できる可能性がある。ホウ素耐性植物はホウ素過剰害に苦しむ地域での作物増産に寄与しうると考えられる。また、これらの遺伝子を導入しホウ酸耐性の上昇した藻類やバクテリアを用いることにより、工業用水に含まれるホウ素をそれらに吸収させることにより除去するといった環境浄化にも使用できる可能性がある。本発明の課題は、ホウ素過剰に耐性を持つ植物を作出することができる可能性がある、生物にホウ酸耐性を付与する遺伝子やタンパク質を提供することにある。また、ホウ酸の毒性メカニズムを解明することにより、ホウ酸耐性を付与する遺伝子を効率よくスクリーニングする方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは上記課題を解決するため鋭意研究し、高等植物シロイヌナズナのいくつかの遺伝子を真核生物のモデル生物である酵母で発現させることにより、酵母にホウ酸耐性を付与しうる５種類の遺伝子、すなわちＡｔＰＡＢ２，ＡｔＲＢＰ４７，ＡｔＲＰＳ２０Ｂ，ＡｔＭＹＢ１３，及びＡｔＭＹＢ６８の各遺伝子を見い出し、本発明を完成するに至った。また、ホウ酸の毒性メカニズムの鍵が、スプライシングの特異的阻害にあり、スプライシング効率の亢進に関連する遺伝子は、ホウ酸耐性を付与する遺伝子であることを見い出し、本発明を完成するに至った。【００１２】
すなわち本発明は、（１）配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，２４，２６，２８，又は３０に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡを、ホウ酸耐性付与遺伝子として使用する方法や、（２）配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，２４，２６，２８，又は３０に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつホウ酸耐性付与活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを、ホウ酸耐性付与遺伝子として使用する方法や、（３）配列番号１，３，５，７，９，１１，１３，１５，１７，１９，２１，２３，２５，２７，又は２９に示される塩基配列からなるＤＮＡを、ホウ酸耐性付与遺伝子として使用する方法や、（４）配列番号１，３，５，７，９，１１，１３，１５，１７，１９，２１，２３，２５，２７，又は２９に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつホウ酸耐性付与活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを、ホウ酸耐性付与遺伝子として使用する方法や、（５）配列番号１，３，５，７，９，１１，１３，１５，１７，１９，２１，２３，２５，２７，又は２９に示される塩基配列の相補的配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下である、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍のＳＳＣ溶液を用い、６５℃条件下で洗浄することでハイブリダイズし、かつ前記塩基配列のいずれかと９０％以上の相同性を有する、ホウ酸耐性付与活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを、ホウ酸耐性付与遺伝子として使用する方法や、（６）ホウ酸耐性付与遺伝子として使用する方法が、ホウ酸耐性が付与された植物又は酵母を作製することであることを特徴とする上記（１）〜（５）のいずれか記載の使用する方法や、（７）ホウ酸耐性付与遺伝子として使用する方法が、ホウ酸耐性付与活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを含みかつホウ酸付与タンパク質を発現することができる組換えベクターを作製することであることを特徴とする上記（１）〜（５）のいずれか記載の使用する方法や、（８）ホウ酸耐性が付与された植物又は酵母が、ホウ酸耐性付与活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを含みかつホウ酸付与タンパク質を発現することができる組換えベクターが導入された、形質転換体であることを特徴とする上記（６）記載の使用する方法や、(９）配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，２４，２６，２８，又は３０に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質を、ホウ酸耐性付与活性を有するタンパク質として使用する方法や、（１０）配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，２４，２６，２８，又は３０に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつホウ酸耐性付与活性を有するタンパク質を、ホウ酸耐性付与活性を有するタンパク質として使用する方法に関する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のホウ酸耐性を付与する遺伝子を植物に導入することにより、ホウ素過剰に耐性を持つ植物が作出できる可能性がある。ホウ素耐性植物はホウ素過剰害に苦しむ地域での作物増産に寄与しうると考えられる。また、これらの遺伝子を導入しホウ酸耐性の上昇した藻類やバクテリアを用いることにより、工業用水に含まれるホウ素をそれらに吸収させることにより除去するといった環境浄化にも使用できる可能性がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明の遺伝子ＤＮＡとしては、（Ａ）配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，２４，２６，２８，又は３０に示されるアミノ酸配列からなるホウ酸耐性付与活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；（Ｂ）配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，２４，２６，２８，又は３０に示されるアミノ酸配列からなり、かつホウ酸耐性付与活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；（Ｃ）配列番号１，３，５，７，９，１１，１３，１５，１７，１９，２１，２３，２５，２７，又は２９に示される塩基配列若しくはその相補的配列からなる（シロイヌナズナ由来の）ホウ酸耐性付与遺伝子ＤＮＡ；（Ｄ）配列番号１，３，５，７，９，１１，１３，１５，１７，１９，２１，２３，２５，２７，又は２９に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつホウ酸耐性付与活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；又は（Ｅ）配列番号１，３，５，７，９，１１，１３，１５，１７，１９，２１，２３，２５，２７，又は２９に示される塩基配からなるホウ酸耐性付与遺伝子ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつホウ酸耐性付与活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；からなるホウ酸耐性付与遺伝子であれば特に制限されず、また、本発明のホウ酸耐性付与タンパク質としては、（Ａ）配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，２４，２６，２８，又は３０に示されるアミノ酸配列からなるホウ酸耐性付与活性を有するタンパク質；又は（Ｂ）配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，２４，２６，２８，又は３０に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつホウ酸耐性付与活性を有するタンパク質；であれば特に制限されず、ここで、「ホウ酸耐性付与遺伝子」とは生体にホウ酸耐性を付与しうる遺伝子をいい、「ホウ酸耐性付与タンパク質」とは生体にホウ酸耐性を付与しうるタンパク質をいう。【００１５】
上記「ホウ酸耐性付与活性を有するタンパク質」とは、酵母、植物などの生体のホウ酸に対する耐性を付与しうる活性を有するタンパク質をいい、かかるタンパク質を高発現する植物や酵母は、高濃度ホウ酸の存在下でも生育することができる。【００１６】
配列番号１に示される塩基配列からなるホウ酸耐性付与遺伝子としてはＡｔＰＡＢ２遺伝子を、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるホウ酸耐性付与タンパク質としてはＡｔＰＡＢ２を、配列番号３に示される塩基配列からなるホウ酸耐性付与遺伝子としてはＡｔＲＢＰ４７ｃ’遺伝子を、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるホウ酸耐性付与タンパク質としてはＡｔＲＢＰ４７ｃ’を、配列番号５に示される塩基配列からなるホウ酸耐性付与遺伝子としてはＡｔＲＰＳ２０Ｂ遺伝子を、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるホウ酸耐性付与タンパク質としてはＡｔＲＰＳ２０Ｂを、配列番号７に示される塩基配列からなるホウ酸耐性付与遺伝子としてはＡｔＭＹＢ１３遺伝子を、配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるホウ酸耐性付与タンパク質としてはＡｔＭＹＢ１３を、配列番号９に示される塩基配列からなるホウ酸耐性付与遺伝子としてはＡｔＭＹＢ６８遺伝子を、配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなるホウ酸耐性付与タンパク質としてはＡｔＭＹＢ６８を、配列番号１１に示される塩基配列からなるホウ酸耐性付与遺伝子としてはＡｔＲＢＰ４５ａ遺伝子を、配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるホウ酸耐性付与タンパク質としてはＡｔＲＢＰ４５ａを、配列番号１３に示される塩基配列からなるホウ酸耐性付与遺伝子としてはＡｔＲＢＰ４５ｂ遺伝子を、配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなるホウ酸耐性付与タンパク質としてはＡｔＲＢＰ４５ｂを、配列番号１５に示される塩基配列からなるホウ酸耐性付与遺伝子としてはＡｔＲＢＰ４５ｃ遺伝子を、配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなるホウ酸耐性付与タンパク質としてはＡｔＲＢＰ４５ｃを、配列番号１７に示される塩基配列からなるホウ酸耐性付与遺伝子としてはＡｔＲＢＰ４５ｄ遺伝子を、配列番号１８に示されるアミノ酸配列からなるホウ酸耐性付与タンパク質としてはＡｔＲＢＰ４５ｄを、配列番号１９に示される塩基配列からなるホウ酸耐性付与遺伝子としてはＡｔＲＢＰ４７ａ遺伝子を、配列番号２０に示されるアミノ酸配列からなるホウ酸耐性付与タンパク質としてはＡｔＲＢＰ４７ａを、配列番号２１に示される塩基配列からなるホウ酸耐性付与遺伝子としてはＡｔＲＢＰ４７ｂ遺伝子を、配列番号２２に示されるアミノ酸配列からなるホウ酸耐性付与タンパク質としてはＡｔＲＢＰ４７ｂを、配列番号２３に示される塩基配列からなるホウ酸耐性付与遺伝子としてはＡｔＲＢＰ４７ｃ遺伝子を、配列番号２４に示されるアミノ酸配列からなるホウ酸耐性付与タンパク質としてはＡｔＲＢＰ４７ｃを、配列番号２５に示される塩基配列からなるホウ酸耐性付与遺伝子としてはＡｔＵＢＰ１ａ遺伝子を、配列番号２６に示されるアミノ酸配列からなるホウ酸耐性付与タンパク質としてはＡｔＵＢＰ１ａを、配列番号２７に示される塩基配列からなるホウ酸耐性付与遺伝子としてはＡｔＵＢＰ１ｂ遺伝子を、配列番号２８に示されるアミノ酸配列からなるホウ酸耐性付与タンパク質としてはＡｔＵＢＰ１ｂを、配列番号２９に示される塩基配列からなるホウ酸耐性付与遺伝子としてはＡｔＵＢＰ１ｃ遺伝子を、配列番号３０に示されるアミノ酸配列からなるホウ酸耐性付与タンパク質としてはＡｔＵＢＰ１ｃを、それぞれ挙げることができる。【００１７】
上記「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を意味する。また、上記「１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を意味する。【００１８】
例えば、これら１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるＤＮＡ（変異ＤＮＡ）は、化学合成、遺伝子工学的手法、突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法により作製することもできる。具体的には、配列番号１，３，５，７又は９に示される塩基配列からなるＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的な手法等を用いて、これらＤＮＡに変異を導入することにより、変異ＤＮＡを取得することができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989.(以後 "モレキュラークローニング第２版" と略す)、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38,John Wiley & Sons (1987-1997)等に記載の方法に準じて行うことができる。この変異ＤＮＡを適切な発現系を用いて発現させることにより、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質を得ることができる。【００１９】
上記「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列」とは、ＤＮＡ又はＲＮＡなどの核酸をプローブとして使用し、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られる塩基配列を意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡまたは該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍程度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラークローニング第２版等に記載されている方法に準じて行うことができる。【００２０】
例えば、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡが挙げることができ、例えば６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡを好適に例示することができる。【００２１】
本発明の遺伝子の取得方法や調製方法は特に限定されるものでなく、本明細書中に開示した配列番号１，３，５，７，９に示される塩基配列情報又は配列番号２，４，６，８，１０に示されるアミノ酸配列情報に基づいて適当なブローブやプライマーを調製し、それらを用いて当該遺伝子が存在することが予測されるｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより目的の遺伝子を単離したり、常法に従って化学合成により調製することができる。【００２２】
具体的には、本発明の遺伝子が単離されたシロイヌナズナより、常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを調製し、次いで、このライブラリーから、本発明の遺伝子に特有の適当なプローブを用いて所望クローンを選抜することにより、本発明の遺伝子を取得することができる。上記ｃＤＮＡの起源としては、上記植物由来の各種の細胞または組織を例示することができ、また、これらの細胞又は組織からの全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡの取得とそのクローニングなどはいずれも常法に従って実施することができる。本発明の遺伝子をｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングする方法は、例えば、モレキュラークローニング第２版等に記載の方法等、当業者により常用される方法を挙げることができる。【００２３】
また、上記（Ｂ）〜（Ｆ）のいずれかに示される塩基配列からなる本発明の変異遺伝子又は相同遺伝子としては、配列番号１，３，５，７又は９に示される塩基配列又はその一部を有するＤＮＡ断片を利用し、他の生物体等より、該ＤＮＡのホモログを適当な条件下でスクリーニングすることにより単離することができる。その他、前述の変異ＤＮＡの作製方法により調製することもできる。【００２４】
本発明のタンパク質の取得・調製方法は特に限定されず、天然由来のタンパク質でも、化学合成したタンパク質でも、遺伝子組換え技術により作製した組み換えタンパク質の何れでもよい。天然由来のタンパク質を取得する場合には、かかるタンパク質を発現している細胞又は組織からタンパク質の単離・精製方法を適宜組み合わせることにより、本発明のタンパク質を取得することができる。化学合成によりタンパク質を調製する場合には、例えば、Fmoc法(フルオレニルメチルオキシカルボニル法)、tBoc法(t−ブチルオキシカルボニル法)等の化学合成法に従って本発明のタンパク質を合成することができる。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して本発明のタンパク質を合成することもできる。遺伝子組換え技術によりタンパク質を調製する場合には、該タンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡを好適な発現系に導入することにより本発明のタンパク質を調製することができる。これらの中でも、比較的容易な操作でかつ大量に調製することが可能な遺伝子組換え技術による調製が好ましい。【００２５】
例えば、遺伝子組換え技術によって、本発明のタンパク質を調製する場合、かかるタンパク質を細胞培養物から回収し精製するには、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法、好ましくは、高速液体クロマトグラフィーが用いられる。特に、アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば、本発明のタンパク質に対するモノクローナル抗体等の抗体を結合させたカラムや、上記本発明のタンパク質に通常のペプチドタグを付加した場合は、このペプチドタグに親和性のある物質を結合したカラムを用いることにより、これらのタンパク質の精製物を得ることができる。また、本発明のタンパク質が細胞膜に発現している場合は、細胞膜分解酵素を作用させた後、上記の精製処理を行うことにより精製標品を得ることができる。【００２６】
さらに、配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，２４，２６，２８，又は３０に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，２４，２６，２８，又は３０に示されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質は、配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，２４，２６，２８，又は３０に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の一例をそれぞれ示す配列番号１，３，５，７，９，１１，１３，１５，１７，１９，２１，２３，２５，２７，又は２９に示される塩基配列の情報に基づいて当業者であれば適宜調製又は取得することができる。例えば、配列番号１，３，５，７，９，１１，１３，１５，１７，１９，２１，２３，２５，２７，又は２９に示される塩基配列又はその一部を有するＤＮＡをプローブとしてシロイヌナズナ以外の生物より、該ＤＮＡのホモログを適当な条件下でスクリーニングすることにより単離することができる。このホモログＤＮＡの全長ＤＮＡをクローニング後、発現ベクターに組み込み適当な宿主で発現させることにより、該ホモログＤＮＡによりコードされるタンパク質を製造することができる。【００２７】
本発明の組換えベクターとしては、前記本発明の遺伝子を含み、かつホウ酸耐性付与タンパク質を発現することができる組換えベクターであれば特に制限されず、本発明の組換えベクターは、本発明の遺伝子を発現ベクターに適切にインテグレイトすることにより構築することができる。発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製可能であるものや、あるいは宿主細胞の染色体中へ組込み可能であるものが好ましく、また、本発明の遺伝子を発現できる位置にプロモーター、エンハンサー、ターミネーター等の制御配列を含有しているものを好適に使用することができる。発現ベクターとしては、酵母用発現ベクター、植物細胞用発現ベクター、細菌用発現ベクター、動物細胞用発現ベクター等を用いることができるが、酵母用発現ベクターや植物細胞用発現ベクターを用いた組換えベクターが好ましい。【００２８】
酵母用の発現ベクターとして、例えば、ｐＹＥＳ２（Invitrogen）、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、Ｙｃｐ５Ｏ（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等を例示することができる。酵母用のプロモーターとしては、例えば、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ１０プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター等のプロモーターを具体的に挙げることができる。【００２９】
植物細胞用の発現ベクターとしては、例えば、Ｔｉプラスミド（Tumor inducing plasmid）、ｐＳＰＯＲＴ１、ｐＴ７Blue-Ｔベクター、ｐＩＧ１２１−Ｈｍ〔Plant Cell Report, 15, 809-814(1995)〕、ｐＢＩ１２１〔EMBO J. 6, 3901-3907(1987)〕などのプラスミド、あるいはタバコモザイクウイルス、カリフラワーモザイクウイルス、ジェミニウイルスなどの植物ウイルスベクター等を例示することができる。植物細胞用のプロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター〔Mol.Gen.Genet (1990) 220, 389-392〕、ルブロースビスフォスフェートカルボキシラーゼスモールサブユニットプロモーター等を挙げることができ、ターミネーターとしては、例えばノパリン合成酵素遺伝子のターミネーターを挙げることができる。【００３０】
また、本発明の形質転換体としては、上記本発明の組換えベクターが導入され、かつホウ酸耐性付与タンパク質を発現する形質転換体であれば特に制限されず、形質転換酵母、形質転換植物（細胞、組織、個体）、形質転換細菌、形質転換動物（細胞、組織、個体）を挙げることができるが、形質転換酵母や形質転換植物（細胞、組織、個体）が好ましい。【００３１】
形質転換酵母の作製に用いられる宿主酵母としては、サッカロミセス・セレビシェ(Saccharomyces cerevisae)、シゾサッカロミセス・ボンベ(Schizosaccharomyces pombe)、クリュイベロミセス・ラクチス(Kluyveromyces lactis)、トリコスポロン・プルランス(Trichosporon pu11ulans)、シュワニオミセス・アルビウス(Schwanniomyces a11uvius)等を挙げることができる。酵母宿主への組み換えベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロブラスト法、酢酸リチウム法等を挙げることができる。【００３２】
形質転換植物（細胞、組織、個体）の作製に用いられる宿主植物（細胞、組織、個体）としては、その種類は特に限定されず、花卉、果実植物、野菜、根菜、穀類、観葉植物、果樹を含む樹木などの植物、例えばナス科、イネ科、アブラナ科、キク科、ゴマ科、モクセイ科、フトモモ科、バラ科、マメ科、ヤシ科又はアカネ科に属する植物や、それら植物の培養細胞、組織（種子、カルスなど）のうちから適宜選択することができる。この形質転換植物を作製するには、本発明の遺伝子を含有した上記本発明の組換えベクターを用い、この組換えベクターを植物細胞内に導入し、植物細胞内のゲノムＤＮＡ中に本発明の遺伝子ＤＮＡを導入する方法を採用することができる。植物の形質転換は、植物の種類等に応じて、リーフディスク共存培養法、エレクトロポレーション法、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法等の公知の方法を適宜用いて行うことができる。その他、物理的または化学的に植物細胞の透過性を高めて本発明の組換えベクターを受容体細胞内に直接取り入れて形質転換植物を作製する方法を採用することもできる。【００３３】
本発明のホウ酸耐性付与遺伝子のスクリーニング方法としては、各種植物、酵母等の遺伝子ライブラリーを用いて、ＹＮＬ２７５ｗ遺伝子が欠損し、ＹＮＬ２７５ｗを発現しないＹＮＬ２７５ｗ破壊酵母を形質転換し、得られた形質転換ＹＮＬ２７５ｗ破壊酵母をホウ酸含有培地で培養し、該形質転換ＹＮＬ２７５ｗ破壊酵母のホウ酸耐性付与活性を測定・評価する方法であれば特に制限されるものではなく、ホウ酸耐性付与活性の測定・評価としては、ホウ酸含有培地における形質転換酵母の生育・増殖の程度の測定・評価を挙げることができる。また、ＹＮＬ２７５ｗの破壊株としては、サッカロミセス・セレビシェ１１６９株（Winzeler, E. A.; Shoemaker, D. D.; Astromoff, A.; Liang, H.; Anderson, K.; Andre, B.; Bangham, R.; Benito, R.; Boeke, J. D.; Bussey, H.; Chu, A. M.; Connelly, C.; Davis, K.; Dietrich, F.; Dow, S. W.; El Bakkoury, M.; Foury, F.; Friend, S. H.; Gentalen, E.; Giaever, G.; Hegemann, J. H.; Jones, T.; Laub, M.; Liao, H.; Liebundguth, N.; Lockhart, D. J.; Lucau-Danila, A.; Lussier, M.; M'Rabet, N.; Menard, P.; Mittmann, M.; Pai, C.; Rebischung, C.; Revuelta, J. L.; Riles, L.; Roberts, C. J.; Ross-MacDonald, P.; Scherens, B.; Snyder, M.; Sookhai-Mahadeo, S.; Storms, R. K.; Veronneau, S.; Voet, M.; Volckaert, G.; Ward, T. R.; Wysocki, R.; Yen, G. S.; Yu, K. X.; Zimmermann, K.; Philippsen, P.; Johnston, M.; Davis, R. W. (1999) Functional characterization of the Saccharomyces cerevisiae genome by gene deletion and parallel analysis. Science 285: 901-906）を好適に例示することができる。スクリーニングに用いる酵母はＹＮＬ２７５ｗの破壊株にかぎらず、野生型のものを用いることもできる。【００３４】
また、本発明のホウ酸耐性付与遺伝子のスクリーニング方法としては、ホウ酸によるスプライシングの特異的阻害を標的とし、スプライシング効率の亢進の程度を測定・評価する方法を挙げることができ、例えば、被検物質を酵母細胞内で発現させ、ホウ酸の存在下に、被検物質発現を培養し、酵母におけるイントロン含有遺伝子のホウ酸によるスプライシングの特異的阻害の改善の程度を、スプライシング効率の亢進の程度として測定・評価する方法を例示することができる。酵母におけるイントロン含有遺伝子としては、サッカロミセス・セレビシェゲノム内の必須リボソームのラージサブユニットタンパク質をコードする遺伝子であるＲＰＬ７Ｂ遺伝子（配列番号３３）を具体的に例示することができる。ホウ酸によるスプライシングの特異的阻害の改善の程度は、例えば、ＲＴ−ＰＣＲにより測定することができ、また、その際、ホウ酸耐性付与遺伝子であるＡｔＲＢＰ４７ｃ’ 遺伝子をポジティブコントロールとすることが好ましい。【００３５】
本発明には、上記本発明のＤＮＡのホウ酸耐性付与遺伝子としての使用（方法）や、上記本発明のＤＮＡのホウ酸耐性が付与された植物又は酵母作製のための使用（方法）や、上記本発明のタンパク質のホウ酸耐性付与活性を有するタンパク質としての使用（方法）や、上記本発明のタンパク質のホウ酸耐性が付与された植物又は酵母作製のための使用（方法）が包含される。したがって、上記本発明のホウ酸耐性付与遺伝子やホウ酸耐性付与活性を有するタンパク質（ホウ酸耐性付与タンパク質）を、ホウ酸耐性が付与された植物や酵母の作製に用いることは本発明の実施形態に含まれる。
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３６】
［供試酵母及びプラスミド］
酵母としては、サッカロミセス・セレビシェ１１６９株(Research Genetics社から購入)とサッカロミセス・セレビシェＢＹ４７４１株(Research Genetics社から購入)を用いた。それぞれの遺伝子型は１１６９株が、MATa; his3Δ1; leu2Δ0; met15Δ0; ura3Δ0; YNL275w::kanMX4、ＢＹ４７４１株がMATa; his3Δ1; leu2Δ0; met15Δ0; ura3Δ0である。また、プラスミドはｐＹＥＳ２(Invitrogen Genetics社から購入)とｐＦＬ６１(ドイツ、ホーヘンハイム大学のNicolaus von Wiren博士から供与；Minet M., Dufour M.-E., and Lacroute F. (1992) Complementation of Saccharomyces cerevisiae auxotrophic mutants by Arabidopsis thaliana cDNAs. Plant J. 2; 417-422.)を用いた。ｐＦＬ６１はシロイヌナズナ発現ライブラリーを作製するために用いた。【００３７】
［酵母１１６９株のホウ酸耐性試験］
使用した酵母１１６９株のホウ酸耐性能の検定を行った。ｐＹＥＳ２およびｐＹＥＳ２−ＢＯＲ１（ｐＹＥＳ２ベクターのＧＡＬ１プロモーターの下流にシロイヌナズナのホウ素耐性遺伝子ＢＯＲ１のＣＤＳを挿入したもの）で形質転換した酵母１１６９株のシングルコロニーを白金耳でかきとり、ＳＤ液体培地でＯＤ６００の値が約１．０になるまで振とう培養した。培養液を０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、および１００ｍＭのホウ酸を含むＳＤ固形培地にそれぞれストリークした。２６．５℃で１６日間培養し各培地上で酵母がコロニーを形成することができるか否かを検定した。【００３８】
［ホウ酸耐性付与遺伝子のスクリーニング］
シロイヌナズナの発現ライブラリー（ドイツ、ホーヘンハイム大学のNicolaus von Wiren博士から供与；Schaaf G., Catoni E., Fits M., Schwacke R., Schneider A., von Wiren N., and Frommer W.B. (2002) A putative role for the vacuoler calcium/manganese proton antiporter AtCAX2 in heavy metal detoxification. Plant Biol. 4; 612-618.）を用いて酢酸リチウム法により、酵母１１６９株を形質転換した。形質転換酵母は８０ｍＭホウ酸を加えたＳＤ培地（6.7g/l yeast nitrogen base without amino acids, 5g/l ammonium sulfate, 20g/l glucose, 2g/l histidine, 2g/l methionine, 3g/l leucine, 20g/l agar, pH5.5）にストリークし、２６．５℃で培養した。１０日から１４日後、コロニーを形成した酵母からプラスミドを回収した。回収したプラスミドは再度酵母に導入し、ホウ酸耐性能の再現性を確認した。【００３９】
［ホウ酸耐性試験］
スポットアッセイと液体培養による検定を行った。スポットアッセイは次のような手順で行った。各酵母をＳＤ液体培地でＯＤ６００の値が０．５から１．０になるまで３０℃で振とう培養した。各酵母のＯＤ６００の値が等しくなるようにＳＤ培地で希釈した。ＯＤ６００の値をそろえた各酵母培養液について１／５、１／２５、１／１２５、および１／６２５希釈した希釈液を調製した。それぞれの希釈液をホウ酸を加えたＳＤ固形培地と対照としてホウ酸を加えないＳＤ固形培地にピペットマン（Gilson）で５μｌづつ、同一の酵母に関しては左から右へと濃度が薄くなるようにスポットした。酵母をスポットしたプレートは３０℃で約１０日間培養し、酵母の生育状況を観察した。【００４０】
液体培養による検定は以下のように行った。各酵母をＳＤ培地でＯＤ６００の値が約１．０になるまで３０℃で振とう培養した。それぞれの培養液をＯＤ６００の値が０．１となるようにホウ酸を含むＳＤ液体培地と対照としてホウ酸を含まないＳＤ液体培地に植え継いだ。３０℃で振とう培養し、２４時間ごとにＯＤ６００の値を測定した。【００４１】
［ホウ酸耐性付与遺伝子のシークエンス］
スクリーニングにより得られた６つのｃＤＮＡクローンの塩基配列の解析は以下のように行った。蛍光ダイターミネーター法でシークエンス反応を行い、ABI 310 genetic analyzerを用いて塩基配列を解析した。得られた塩基配列から、ＴＡＩＲ(http://www.arabidopsis.org/)のＢＬＡＳＴサーチによりその塩基配列のコードする遺伝子を特定した。【００４２】
［ホウ酸耐性付与遺伝子のスクリーニング結果］
まず、本実験で使用した酵母１１６９株のホウ酸耐性能の検定を行った。ｐＹＥＳ２およびｐＹＥＳ２−ＢＯＲ１で酵母１１６９を形質転換した。ｐＹＥＳ２とｐＹＥＳ２−ＢＯＲ１を用いて形質転換したのはこれらのベクターが、次のスクリーニングで用いるシロイヌナズナ発現ライブラリーに使われているベクターｐＦＬ６１と同じＵＲＡ３をセレクションマーカーとして保持しているためである。また、ＳＤ培地ではｐＹＥＳ−ＢＯＲ１のＢＯＲ１遺伝子の発現は誘導されないので、ｐＹＥＳ２で形質転換したものと同程度のホウ酸耐性を示すはずである。ｐＹＥＳ２およびｐＹＥＳ２−ＢＯＲ１で形質転換した酵母をそれぞれ“２”および“７”と命名した。“２”および“７”をＳＤ液体培地で振とう培養し、０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０および１００ｍＭのホウ酸を含むＳＤ固形培地にストリークした。その結果、どちらのベクターで形質転換したものも８０ｍＭ以上のホウ酸を含むＳＤ培地上ではほとんど生育できないことが明らかになった（図１）。【００４３】
ホウ酸耐性を付与する遺伝子を単離するために、本実験では酵母１１６９株で発現させることによりその酵母を８０ｍＭのホウ酸を含むＳＤ培地上で生育を可能にすることができるシロイヌナズナ遺伝子を探索することにした。そこで、シロイヌナズナの発現ライブラリーで形質転換した約１２０万の酵母を、８０ｍＭのホウ酸を含むＳＤ培地にストリークした。その結果、８０ｍＭのホウ酸に耐性を示す４６、６６、７２、８４、８６、および８７の６つの形質転換酵母を得ることができた。スポットアッセイによる４６、７２、８４、８６、および８７の形質転換酵母のホウ酸耐性能を図２に示す（６６については下記のように４６と同じ遺伝子をコードしていたので、結果は４６のみ示すこととする）。酵母１１６９株は図２の上段で示すように８０ｍＭのホウ酸を含むＳＤ培地上ではほとんどコロニーを形成できない。一方、これらの形質転換酵母はいずれも１１６９株よりも多くのコロニーを形成することができた。次に液体培養による試験を行った。液体培養では図３で示すように、４６、７２、８６、８７ではホウ酸培地中で１１６９株に比べ約３倍の増殖能を示した。しかし８４では生育速度のばらつきが大きくホウ酸耐性について１１６９株と有為差が見られなかった。また、これらの遺伝子は酵母ＢＹ４７４１株に導入した場合にも１１６９株に導入した場合と同様にホウ酸耐性を付与することができた。図４にスポットアッセイの結果を図５に液体培養の結果を示す。ＢＹ４７４１株に導入した場合にはすべての形質転換酵母で、液体培養においてもホウ酸耐性に有為差が見られた（図５）。【００４４】
［ホウ酸耐性付与遺伝子のシークエンス］
スクリーニングにより得られた６つのｃＤＮＡクローンの塩基配列を決定し、ＢＬＡＳＴサーチによりそれらのコードしている遺伝子を特定した。その結果、４６と６６はＡｔＰＡＢ２を、７２はＡｔＭＹＢ６８を、８４はＡｔＭＹＢ１３を、８６はＡｔＲＰＳ２０Ｂを、８７はＡｔＲＢＰ４７と一致することが明らかになった。それぞれの遺伝子の配列は下記の配列表に示す。ＡｔＰＡＢ２はポリアデニル酸結合タンパク質を、ＡｔＭＹＢ１３とＡｔＭＹＢ６８はＭＹＢ様転写因子を、ＡｔＲＰＳ２０はリボソームタンパク質を、ＡｔＲＢＰ４７はＲＮＡ結合タンパク質をコードする遺伝子である。
【実施例２】
【００４５】
［酵母株及びスクリーニング］
本研究には、サッカロミセス・セレビシェ株ＢＹ４７４１（ＭＡＴａ  ｈｉｓ３Ｄ１ ｌｅｕ２D０  ｍｅｔ１５Ｄ０ ｕｒａ３Ｄ０）, Ｙ０１１６９（ＭＡＴａ  ｈｉｓ３Ｄ１ Ｌｅｕ２Ｄ０  ｍｅｔ１５Ｄ０  ｕｒａ３Ｄ０ ＹＮＬ２７５Ｗ:：ｋａｎＭＸ４）、Ｙ０４４４３（ＭＡＴａ  ｈｉｓ３Ｄ１ ｌｅｕ２Ｄ０ ｍｅｔ１５Ｄ０ ｕｒａ３Ｄ０ ＹＧＬ０７６Ｃ：：ｋａｎＭＸ４）、及びＹ０１０９４（ＭＡＴａ  ｈｉｓ３Ｄ１ ｌｅｕ２Ｄ０  ｍｅｔ１５Ｄ０ ｕｒａ３Ｄ０  ＹＰＬ１９８Ｗ：：ｋａｎＭＸ４）を用いた。Ｙ０１１６９、Ｙ０４４４３、Ｙ０１０９４株は挿入性変異誘発（insertional mutagenesis）によりＢＹ４７４１から構築し（Winzeler et al., 1999）、ＥＵＲＯＳＣＡＲＦより入手した。【００４６】
酵母コンピタント細胞は、酢酸リチウム法で(Gietz and Schiestl, 1995)、発現プラスミドpFL61にクローニングされたシロイヌナズナｃＤＮＡライブラリーと転換した（Minet et al., 1992）。排出型のホウ素トランスポーターであり、対応する野生型株と比較してホウ酸に感受性を有するＹＮＬ２７５Ｗ（以下ＢＯＲ１）が欠如しているため、Ｙ０１１６９株は宿主として用いられる（データは示されていない）。形質転換体は、８０ｍＭのホウ酸を含むＳＤ固形培地（Sherman, 1991）で、２６．５℃でスクリーニングした。ＳＤ培地は、変異体の成長に必要な２％グルコース、０．６７％アミノ酸不含酵母ニトロゲンベース、及び０．０５％硫酸アンモニウム、変異体の生育に必要なアミノ酸（２０ｍｇ／ＬのＨｉｓ、３０ｍｇ／ＬのＬｅｕ、２０ｍｇ／ＬのＭｅｔ）を含み、ｐＨはＴｒｉｓで５．５に調整した。固形の培地を形成するために、寒天（２％ｗ/ｖ）を添加した。非形質転換Ｙ０１１６９（Δｂｏｒ１）細胞のコロニー形成は、８０ｍＭのホウ酸の添加によって、完全に抑制された。転換細胞のうち、２６．５℃での２週間のインキュベーション後に８０ｍＭのホウ酸を含む培地でコロニーを形成した細胞を選択し、８０ｍＭのホウ酸の存在下でその生育を検査して、耐性を確認した。表現型がプラスミドによって付与されていることを確認するために、プラスミドを陽性単離物（positive isolate）から単離し、酵母株Ｙ０１１６９へと再転換した。耐性分離物は、フルオロオロト酸誘導プラスミドロス（fluoro-orotic acid-induced plasmid loss）を行い（Boeke, J.D., LaCroute, F., & Fink, G.R. (1984) Mol. Gen. Genet. 197, 345-346.）、プラスミド依存性のホウ酸耐性を示すクローンだけを選択した。【００４７】
［プラスミドの構築］
ＡｔＲＢＰ４７ｃ’’関連遺伝子及びＲＰＬ７ＢのＯＲＦ配列（配列番号３４参照）を、表１記載のプライマーセットを用いて、ＰＣＲにより増幅した。増幅産物は、pGEM-T easyベクターにサブクローニングした（Promega社製）。これらのプラスミドをNotIで処理し、結果として生じるＡｔＲＢＰ４５ａ、 ＡｔＲＢＰ４７ｂ、ＡｔＲＢＰ４７ｃ、ＡｔＲＢＰ４７ｃ’ 及び ＡｔＵＢＰ１のＯＲＦ断片を、発現ベクターpFL61のNotI部位内にクローニングした（Minet et al, 1992）。またＲＰＬ７ＢのＯＲＦ断片は、発現ベクターpDR195のNotI部位にクローニングした（Rentsch et al., 1995）。pFL61及びpDR195は、発現のためにそれぞれＰＧＫ及びＰＭＡ１プロモーターを保有している。【００４８】
【表１】
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【００４９】
［ホウ酸耐性分析］
ＡｔＲＢＰ４７ｃ’’関連ファミリー遺伝子のホウ酸耐性を分析するために、発現プラスミドをサッカロミセス・セレビシェ株ＢＹ４７４１に導入した。コントロールとして、挿入のない空ベクターも、ＢＹ４７４１に導入した。形質変換体を、ＳＤ液体培地で定常期まで生育させ、培養物の細胞密度を、ＯＤ６００＝１．０に調整した。細胞密度を調整した培養物を、ＳＤ液体培地で１／５、１／２５、１／１２５及び１／６２５に希釈し、希釈した培養液を１０μｌ、８０ｍＭのホウ酸含有若しくは非含有のＳＤ培地に滴下し、３０℃で７日間インキュベートした。【００５０】
培養液内の分析をするために、形質変換体をＳＤ液体培地で定常期まで生育させ、ＳＤ液体培地に、８０ｍＭのホウ酸含有若しくは非含有液体培地に希釈し、高濃度ホウ酸の耐性能を検査するためにＤ６００を０．１に調整した。
Δｒｐｌ７ａ（Ｙ０４４４３）変異体及びΔｒｐｌ７ｂ（Ｙ０１０９４）変異体のホウ酸耐性を分析するために、２％グルコース、０．６７％アミノ酸不含酵母ニトロゲンベース及び０．０５％の硫酸アンモニウムを含むＳＤ培地を使用しＴｒｉｓでｐＨを５．５に調整し、必要なアミノ酸（２０ｍｇ／ＬのＨｉｓ、３０ｍｇ／ＬのＬｅｕ、２０ｍｇ／ＬのＭｅｔ及び２０ｍｇ／ＬのＵｒａ）を追加した。変異体は、ＥＵＲＯＳＣＡＲＦより入手した。ホウ酸耐性におけるＲＰＬ７Ｂの役割をさらに調べるために、ＲＰＬ７Ｂを酵母株Ｙ０４４４３で過剰発現させた。ホウ酸耐性分析は、上記の通り行った。【００５１】
［ＲＴ−ＰＣＲによる非スプライシング転写物の検出］
酵母細胞を、ＳＤ液体培地で対数期（ＯＤ６００＝０．５〜１．０）まで生育し、ホウ酸を最終濃度で８０ｍＭ添加した。３０℃で２４時間インキュベートした後、１ｍｌのサンプルを取り出し、細胞を遠心分離により回収し、液体窒素内で凍結し、使用するまで−８０℃で保存した。【００５２】
全ＲＮＡは、RNeasy Mini Kit（Qiagen社製）を使用して酵母細胞より抽出し、１μｇの全ＲＮＡをＭｕＬＶ逆転写酵素（Applied Biosystem 社製）及びオリゴ（ｄＴ）１６プライマーを使用して逆転写した。ＲＴ産物の１／１５を、次のサイクルでＰＣＲを行った：９４℃で３０秒、４５℃で３０秒、７２℃で１分間を４０〜５０回。ＰＣＲは、Smart Cycler (Cepheid社製)で、ＤＮＡポリメラーゼＥｘＴａｑ（Takara社製）を使用して行った。この分析で使用したプライマーセットは、表２に記載され、ＰＮＡＳのウェブサイトで補足情報として発表されている。増幅した転写物を、２％アガロースゲル上で分離し、Ｅｔｄ臭素で染色後検出した。【００５３】
【表２】
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【００５４】
［塩耐性分析］
塩耐性分析は、１．７５Ｍ又は２ＭのＮａＣｌを含むＳＤ培地を使用した以外は、上記のホウ酸耐性分析の通りに行った。【００５５】
［アクセッション番号］
実施例２に記載の配列の、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号は、以下の通りである。シロイヌナズナ配列ＡｔＲＢＰ４５ａ，ＭＮ１２４８７２；ＡｔＲＢＰ４５ｂ，ＭＮ１０１０３７；ＡｔＲＢＰ４５ｃ，ＭＮ１１８８３４；ＡｔＲＢＰ４５ｄ，ＭＮ１２１９４０；ＡｔＲＢＰ４７ａ，ＭＮ１０３８４８；ＡｔＲＢＰ４７ｂ，ＭＮ１１２８００；ＡｔＲＢＰ４７ｃ，ＭＮ１０３６４２；ＡｔＲＢＰ４７ｃ’，ＭＮ１０３６４３；ＡｔＵＢＰ１ａ，ＭＮ１０４２８５；ＡｔＵＢＰ１ｂ，ＭＮ１０１５９８；ＡｔＵＢＰ１ｃ，ＭＮ１１２２６６； 及びサッカロミセス・セレビシェ配列 ＲＰＬ７Ａ，Ｘ６２６２７；ＲＰＬ７Ｂ、Ｚ７３５５。【００５６】
［酵母に高濃度ホウ酸耐性を付与するシロイヌナズナｃＤＮＡクローンの単離結果］
サッカロミセス・セレビシェ株Ｙ０１１６９株をシロイヌナズナｃＤＮＡ発現ライブラリー（Minet, M., Dufour, M.-E., & Lacroute, F. (1992) Plant J. 2, 417-422.）で形質転換し、これら形質変換体を８０ｍＭのホウ酸を含むディッシュで選択した。この濃度のホウ酸は、２６．５℃での２週間のインキュベーション後も、Ｙ０１１６９細胞のコロニー形成を完全に抑制した。このスクリーニングで、ホウ酸耐性の亢進を示した酵母のいくつかのコロニーを単離した。ｃＤＮＡクローンの１つが、ＲＮＡ結合タンパク質であるＡｔＲＢＰ４７ｃ’をコードすることを示した。【００５７】
［シロイヌナズナ由来のＡｔＲＢＰ４７ｃ’関連遺伝子の発現は、酵母にホウ酸耐性を付与する］
ＡｔＲＢＰ４７ｃ’は、３個のＲＮＡ認識モチーフ（ＲＲＭ）を有する。シロイヌナズナゲノムには、３個のＲＲＭ、及びＡｔＲＢＰ４７ｃ’に対してＢＬＡＳＴＰプログラムで１００以上の配列同一性スコアを有するタンパク質をコードする遺伝子が１１種類ある。これらのＡｔＲＢＰ４７ｃ’関連ファミリータンパク質の系統樹を図６Ａに示す。【００５８】
これらのシロイヌナズナ遺伝子の発現が、酵母にホウ酸耐性を付与するか否かを調べるために、６種類の遺伝子に対応するＯＲＦ配列（ＡｔＲＢＰ４５ａ、ＡｔＲＢＰ４７ａ、ＡｔＲＢＰ４７ｂ、ＡｔＲＢＰ４７ｃ、ＡｔＲＢＰ４７ｃ’及び ＡｔＵＢＰ１a）を、発現ベクターpFL61にクローニングした。プラスミドを酵母株ＢＹ４７４１に導入し、これらの形質変換体のホウ酸耐性を調べた。図６Ｂに示すように、６種類のコンストラクト全てが、様々な範囲で、８０ｍＭホウ酸含有ＳＤ培地で生育する能力を酵母株に付与した。これらの形質変換体のホウ酸耐性レベルを比較するために、ホウ酸の存在下での生育率を、液体培養で分析した。全ての形質変換体は、コントロールよりも早い生育率を示した。グラフの中で、ＡｔＲＢＰ４７ｃ’を発現するものがもっとも早い生育率を示した（図６Ｃ）。【００５９】
［ホウ酸処理は、酵母においてＲＰＬ７Ｂのスプライシングを阻害するが、ＲＰＬ７Ａのスプライシングは阻害しない］
本発明者らは、ＡｔＲＢＰ４７ｃ’関連遺伝子の過剰発現がホウ酸耐性を付与することを見い出した。シロイヌナズナのこれらの遺伝子の役割はまだ解明されていないが、他の植物種の類似の遺伝子が特徴づけられた。ニコチアナ・プルギニフォリア（Nicotiana  plumbaginifolia）ＲＢＰ４５（Simpson, C.G., Jennings, S.N., Clark, G.P., Thow, G., & Brown, J.W.S. (2004) Plant J.  37, 82-91）及びＵＢＰ１  (Lambermon, M.H., Simpson, G.G., Wieczorek Kirk, D.A., Hemmings-Mieszczak, M., Klahre, U., & Filipowicz, W. (2000) EMBO J. 19,1638-1649)がスプライシング効率を亢進することが示されている。そこで、ＲＴ−ＰＣＲにより任意に選択したサッカロミセス・セレビシェの２０種類のイントロン含有遺伝子で、スプライシングに対するホウ酸の影響を調べることにした。サッカロミセス・セレビシェゲノム内の６３１７種類の核遺伝子の内、２３１種類の遺伝子だけがイントロンを含む（Munich Information Center for Protein Sequences: http://mips.gsf.de/genre/proj/yeast）。調べた２０種類の遺伝子のうち、蓄積された非スプライシング断片とスプライシング断片とを比較すると、ホウ酸処理による非スプライシング断片の増加は、必須リボソームのラージサブユニットタンパク質をコードする遺伝子であるＲＰＬ７Ｂで観察された。これは、ホウ酸で処理した酵母においてＲＰＬ７Ｂのスプライシングが阻害されていたことを示唆している（図７Ｂ）。【００６０】
ＲＰＬ７Ｂは２個のイントロンを含んでいる。非スプライシング断片のサイズは、これらの断片が、第１又は第２いずれかのイントロンのスプライシングによって派生していることを示している（図７Ａ参照）。どのイントロンが、ホウ酸に対しより感受性があるかを調べるために、非スプライシング断片をクローニングし、８個のクローンのＤＮＡ配列を決定した。６個及び２個のクローンがそれぞれ第１及び第２のイントロンを含んでいた。これは、阻害が第１及び第２のイントロンの両方で生じ、第１イントロンが第２イントロンよりも、高濃度ホウ酸に対し感受性があることを示唆した。これらの結果は、２個のイントロンのうち１個が正しくスプライシングされたこと、すなわち、これらの非スプライシング断片がゲノムＤＮＡの汚染によって派生したものではなく、ＲＮＡの逆転写反応によるものであることも示している。【００６１】
さらにホウ酸によるＲＰＬ７Ｂのスプライシング阻害は、ＡｔＲＢＰ４７ｃ’を発現する酵母では観察されなかった（図７Ｂ）。この結果は、ＡｔＲＢＰ４７ｃ’が、高濃度ホウ酸の存在下で、ＲＰＬ７Ｂのスプライシング効率を上昇させることを示唆している。スプライシング効率の亢進が、酵母におけるホウ酸耐性の原因である可能性もある。【００６２】
ＲＰＬ７Ｂは酵母ゲノムにパラログＲＰＬ７Ａ（配列番号３２）を有する。ＲＰＬ７Ａ遺伝子（配列番号３１）は、ＲＰＬ７Ｂ遺伝子のように２個のイントロンを有する。ＲＰＬ７Ａのスプライシングに対するホウ酸の影響を調べた。ＲＰＬ７Ｂの場合と異なり、ホウ酸によるスプライシング阻害は観察されなかった（図７Ｃ）。【００６３】
［酵母におけるＲＰＬ７Ａの破壊によりホウ酸耐性が減少する］
ＲＰＬ７Ａ及びＲＰＬ７Ｂ二重破壊された変異体は致死性であり（Saccharomyces Genome Database: http://db.yeastgenome.org）、ＲＰＬ７タンパク質が酵母の生育に必須であることを示している。２つの遺伝子におけるスプライシングに対するホウ酸感受性の相違を考慮すると、ＲＰＬ７Ａ破壊変異体とＲＰＬ７Ｂ破壊変異体のホウ酸耐性が異なる可能性がある。Δｒｐｌ７ｂ（Ｙ０１０９４）は、野生型サッカロミセス・セレビシェと同等のホウ酸耐性レベルを示したが、Δｒｐｌ７ａ（Ｙ０４４４３）のホウ酸耐性は、野生型よりも低かった（図８Ａ）。ホウ酸耐性の相違は、液体培養でも明らかであった（図８B）。これらの結果は、ホウ酸によるＲＰＬ７Ｂスプライシング阻害は、Δｒｐｌ７ａのホウ酸耐性の減少によるものであることを示唆している。【００６４】
［ＲＰＬ７Ａ破壊酵母におけるイントロンレスＲＰＬ７Ｂの発現によりホウ酸耐性が上昇する］
Δｒｐｌ７ａのホウ酸耐性の減少が、ＲＰＬ７Ｂスプライシング阻害によるＲＰＬ７タンパク質レベルの減少によるものだとすれば、イントロンレスＲＰＬ７ＢｃＤＮＡの発現は、Δｒｐｌ７ａの耐性を上昇させるはずである。
Δｒｐｌ７ａにおけるイントロンレスＲＰＬ７Ｂの発現が、ホウ酸耐性を上昇させるかどうかを調べた。ＲＰＬ７ＢのＯＲＦ配列を、発現ベクターpDR195にクローニングした。次にプラスミドをΔｒｐｌ７ａに導入し、形質変換体のホウ酸耐性を調べた。図８Ｃに示すように、イントロンレスＲＰＬ７Ｂの発現は、Δｒｐｌ７ａのホウ酸耐性を上昇させた。この結果は、ＲＰＬ７Ｂスプライシングの阻害が、Δｒｐｌ７ａの高濃度ホウ酸による生育休止の原因であることを示している。【００６５】
［ホウ酸処理による、非典型的分岐点配列（noncanonical branchpoint sequnce）を含む遺伝子におけるスプライシング阻害の分析結果］
ＲＰＬ７Ｂは、第１イントロンに非典型的分岐点配列を有する（表３参照）。２３１種類の核イントロン含有遺伝子の内、このような非典型的分岐点配列を含む遺伝子を２８種類見い出した。この２８種類の遺伝子の内、スプライシング断片と比較して、ホウ酸処理による非スプライシング断片のレベルの上昇は、９種類の遺伝子で観察された（図９）。これらの遺伝子は、ＥＲＶ１、ＥＲＶ４１、ＮＹＶ１、ＲＰＳ９Ａ、ＲＰＳ９Ｂ、ＳＲＢ２、ＹＯＬ０４８Ｃ、ＹＰＲ０９８Ｃ及びＹＲＡ１である。【００６６】
【表３】
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【００６７】
表３には、酵母において確認された３個のコンセンサス配列、５’スプライス部位、分岐点及び３’スプライス部位が示されている。第１イントロンの分岐点でのAからGへのトランジション点を、黒地に白い文字で示す。Yは、ピリミジンリボヌクレオチド（Ｃ又はＵ）を指す。【００６８】
ホウ酸による、これらの遺伝子のスプライシング阻害に対するＡｔＲＢＰ４７ｃ’の過剰発現の影響を分析した。図９に示すように、ＮＹＶ１及びＳＲＢ２のスプライシング阻害のレベルは、ＡｔＲＢＰ４７ｃ’を発現する酵母で障害された。ＮＹＶ１及びＳＲＢ２は、それぞれｖ−ＳＮＡＲＥタンパク質及びＲＮＡポリメラーゼIIホロ酵素タンパク質をコードしている。これらの結果は、ＡｔＲＢＰ４７ｃ’の過剰発現が酵母にホウ酸耐性を付与するメカニズムは、スプライシング効率の亢進であることを強く示唆している。【００６９】
［塩処理による影響は、ホウ酸処理による影響と異なる］
スプライシング因子遺伝子の過剰発現は、酵母及び／又は植物に塩耐性を付与する（Forment, J., Naranjo, M.A., Roldan, M., Serrano, R., & Vicente, O. (2002) Plant J. 30,511-519., 2002; Serrano, R., Gaxiola, R., Rios, G., Forment, J., Vicente, O., & Ros, R. (2003) Monatsh. Chem. 134, 1445-1464.）。ＡｔＲＢＰ４７ｃ’関連遺伝子も、酵母に塩耐性を付与するか否かを調べた。本研究で検査した６種類のＡｔＲＢＰ４７ｃ’関連遺伝子全てで、酵母における塩耐性が上昇しなかった（図１０Ａ）。さらに、高濃度の塩（high salt）に曝された細胞ではＲＰＬ７Ｂのスプライシング阻害は観察されなかった（図１０Ｂ）。これらの結果は、ＡｔＲＢＰ４７ｃ’関連遺伝子が塩耐性では機能せず、ＲＰＬ７Ｂスプライシングの阻害がホウ酸処理に独特なものであるかのようである。【００７０】
［考察］
ＡｔＲＢＰ４７ｃ’は、酵母の補完によって酵母細胞にホウ酸耐性を付与する遺伝子としてシロイヌナズナから単離した。酵母ゲノムにおいて、３個のＲＲＭ、及びＡｔＲＢＰ４７ｃ’に対してＢＬＡＳＴＰプログラムで１００以上の配列同一性スコアを有するタンパク質をコードする遺伝子が７種類ある。これらの遺伝子のうち、ＡｔＲＢＰ４７ｃ’にもっとも類似した遺伝子は、ＮＡＭ８である。ＮＡＭ８は、本来ミトコンドリアのスプライシング欠如の抑制剤として単離されたが（Ekwall, K., Kermorgant, M., Dujardin, G., Groudinsky, O., & Slonimski, P.P. (1992) Mol. Gene. Genet.233, 136-144.）、その後の分析により、ＮＡＭ８がＵ１ｓｎＲＮＡと相互作用し、非典型的な５’スプライス部位の存在によって、このプロセスが障害されている場合に、ＮＡＭ８が５’スプライス部位の効率的な認識に必須であることを示した（Gottschalk, A., Tang, J., Puig, O., Salgado, J., Neubauer, G., Colot, H.V., Mann, M., Seraphin, B., Rosbash, M., Luhrmann, R., & Fabrizio, P. (1998) RNA 4, 374-393.; Puig, O., Gottschalk, A., Fabrizio, P., & Seraphin, B. (1999) Gene. Dev.13, 569-580.）。これらの観察結果より、ＡｔＲＢＰ４７ｃ’がホウ酸耐性においてＮＡＭ８と同様の役割をすると仮定した。しかし、ＮＡＭ８の過剰発現は、酵母にホウ酸耐性を付与せず、ＮＡＭ８破壊変異体は、野生型と同様、ホウ酸耐性を示し、AＡｔＲＢＰ４７ｃ’が、スプライシングプロセスの他の段階及び／又はホウ酸耐性の他の反応（１又は複数）に関与している可能性を示した。  
本研究において、酵母内で任意に選択した２０種類の遺伝子で、ホウ酸がＲＰＬ７Ｂのスプライシングを阻害することができることを見い出した（図７Ｂ）。この遺伝子の第１イントロンのＤＮＡ配列分析により、第１イントロンが分岐点のコンセンサス配列にトランジションを有することが明らかになった。表１に示すように、分岐点コンセンサス配列における２番目のＡは、ＲＰＬ７Ｂの第１イントロンでＧに転換されている。分岐点架橋タンパク質（Branchpoint bridging protein（ＢＢＰ）の分岐点への結合は、スプライシングの進行における重要なステップである（Abovich and Rosbash, 1997）。ＢＢＰと分岐点配列間の親和性は、スプライシング効率の重要な要因であることが知られている（Champion-Arnaud, et al., 1995）。特に、このような、分岐点配列の第２ヌクレオチドにおけるＡからＧへの転換は、ＢＢＰとの親和性を約１０％減少させることが報告されている（Berglund, J.A., Chua, K., Abovich, N., Reed, R., & Rosbash, M. (1997) Cell 89, 781-787.）。したがって、ＲＰＬ７Ｂは、スプライシング効率の低い遺伝子の一つであるようである。【００７１】
Hela細胞のインビトロスプライシングシステムにおいて、スプライシングの第２ステップが、ホウ酸処理によって阻害されていることが報告されている（Shomron, N., & Ast, G. (2003) FEBS Lett. 552, 219-224.）。スプライシングの第２ステップは、処理されたエクソンの３’末端が、次のエクソンの５’末端に結紮するプロセスである。ホウ酸が、ｃｉｓ−ｄｉｏｌとリボースで結合すること（Ralston, N.V.C., & Hunt, C.D. (2000) FASEB J. 14, A538.; Nicholas et al., 2001; Ricardo, A., Carrigan, M.A., Olcott, A.N., & Benner, S.A. (2004) Science303, 196.）を考慮すると、スプライシングの第２ステップにおける結紮反応は、ホウ酸のエクソンの３’末端への結合により阻害されているようである。上記Shomron and Ast (2003)  は、５つの異なるmＲＮＡ前駆物質が同様の阻害を示したため、第２ステップにおけるホウ酸によるスプライシング阻害が一般的な現象であると考えられると報告している。その場合、酵母におけるスプライシング阻害は、同様に全てのイントロンで起きるはずである。しかし、本研究の最初のステップで検査した２０種類の遺伝子のうち、阻害が観察された遺伝子は、ＲＰＬ７Ｂだけであった（図７Ｂ）。【００７２】
この特異的な阻害は以下のように説明することができる。第２ステップにおけるホウ酸によるスプライシング阻害は、酵母の全てのイントロン含有遺伝子で起きる。このステップにおいて、イントロン含有スプライシング媒介物は、スプライシングが通常に進行した場合に即座に減少しなければならないところ、累積する。媒介物の累積は、通常の代謝回転を阻害する。このような場合、スプライシング効率の低いイントロンを有する遺伝子は、ホウ酸によるスプライシング阻害に対する感受性が強いようである。このような遺伝子の１つの例として、ＲＰＬ７Ｂのような、非典型的分岐点配列を含む遺伝子が挙げられる。この推測を、同じ特徴を持つ他の遺伝子で、高濃度ホウ酸によるスプライシング阻害を分析して、確かめた（図９）。この分析で、高濃度ホウ酸処理は、ＲＰＬ７Ｂ以外の非典型的分岐点配列を含む９種類の遺伝子でスプライシングを阻害することを見い出した。この結果は、ホウ酸の毒性のメカニズムの１つが、スプライシング効率の低いイントロンを有する遺伝子のスプライシング阻害であることを明確に示した。さらに、これら９種類の遺伝子の内、２種類の遺伝子のスプライシング阻害が、ＡｔＲＢＰ４７ｃ’の過剰発現により障害されていることを見い出した（図９）。この結果は、ＡｔＲＢＰ４７ｃ’の過剰発現によるホウ酸耐性が、高濃度ホウ酸処理中にスプライシングが阻害されている複数の遺伝子の一部の遺伝子のスプライシング効率の亢進によって達成されるかもしれないことを示唆している。したがって、限定された数の遺伝子のスプライシング阻害は、生育阻害の原因であるかもしれない。【００７３】
ＡｔＲＢＰ４７ｃ’関連タンパク質は、３個のＲＲＭを有する。ＲＢＰ４５、ＲＢＰ４７及びN. plumbaginifolia  のＵＢＰ１のＲＮＡ結合活性が確認された。これらのタンパク質全てが、U−ｒｉｃｈ配列と結合する傾向にある(Lambermon, M.H., Simpson, G.G., Wieczorek Kirk, D.A., Hemmings-Mieszczak, M., Klahre, U., & Filipowicz, W. (2000) EMBO J. 19, 1638-1649.: Lorkovi?, Z.J., Wieczorek Kirk, D.A., Klahre, U., Hemmings-Mieszczak, M., & Filipowicz, W. (2000). RNA 6, 1610-1624.)。さらに、N. plumbaginifoliaのＲＢＰ４５の欠失分析は、ＲＮＡとの相互作用に少なくとも２個のＲＲＭが必要であることを示した（Lorkovic et al., 2000）。ＲＲＭがＲＮＡ結合に関与していると思われてきたが、一定のタンパク質のＲＲＭが他のタンパク質との相互作用に参画していることが示された（Kielkopf, C.L., Lucke, S., & Green, M.R. (2004) Gene Dev. 18, 1513-1526.）。特に、３個のＲＲＭを含むスプライシング因子である酵母Ｕ２ＡＦ65は、３番目のＲＲＭがＢＢＰに結合することが報告されている（Rain, J.C., Rafi, Z., Rhani, Z., Legrain, P., & Kramer, A. (1998) RNA 4, 551-565.）。これらの結果は、ＡｔＲＢＰ４７ｃ’がＢＢＰとも相互作用する可能性を示唆している。さらにＲＢＰ７Ｂの第１イントロン及びＳＲＢ２イントロン配列の分析は、分岐点の３’末端側にU−ｒｉｃｈ配列があることを明らかにした。これらの結果を合わせると、ＡｔＲＢＰ４７ｃ’はＢＢＰと結合して、ＢＢＰと分岐点の相互作用を安定化し、分岐点のU−ｒｉｃｈ配列を安定化すると仮定した。その結果、スプライシング効率が増加する。【００７４】
スプライシングが、塩ストレスによって阻害されることが報告されている。さらに、ＳＲタンパク質等の複数のスプライシング因子の過剰生産が、酵母や植物における塩耐性を増加することも報告されている（Forment, J., Naranjo, M.A., Roldan, M., Serrano, R., & Vicente, O. (2002) Plant J. 30,511-519.., 2002; Serrano, R., Gaxiola, R., Rios, G., Forment, J., Vicente, O., & Ros, R. (2003) Monatsh. Chem. 134, 1445-1464.）。本研究においては、ＡｔＲＢＰ４７ｃ’関連遺伝子の過剰発現は、酵母に塩耐性を付与せず（図１０Ａ）、ＲＰＬ７Ｂのスプライシング阻害は、塩処理後に検出されなかった（図１０Ｂ）。これらの結果は、スプライシング阻害のメカニズムは、塩処理とホウ酸処理とでは異なることを示唆している。【００７５】
実施例２は、ホウ酸の毒性メカニズムの鍵が、スプライシングの特異的阻害であり、スプライシング効率の亢進に関連する遺伝子は、ホウ酸耐性を導くことを示す最初の報告である。しかし、スプライシングの阻害以外の毒性のメカニズムが存在するはずである。なぜなら、ホウ酸の毒性の影響が、スプライシングを行わない原核生物でも観察されるからである。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】酵母１１６９株を用いたホウ酸耐性能の結果を示す図である。酵母１１６９株をｐＹＥＳ２“２”およびｐＹＥＳ２−ＢＯＲＩ“７”で形質転換した。それぞれの酵母を０から１００ｍＭのホウ酸を含むＳＤ培地にストリークした。２６．５℃で１６日間培養した結果を示す。
【図２】ホウ酸過剰培地での酵母１１６９株の生育の結果を示す図である。酵母１１６９株を４６，７２，８４，８６および８７で形質転換した。それぞれの酵母を液体培養後、８０ｍＭのホウ酸を含むＳＤ培地にスポットした。スポットは左から右に１／５づつ希釈している。２６．５℃で９日間培養した結果を示す。
【図３】液体培地での酵母１１６９株のホウ酸耐性試験の結果を示す図である。酵母１１６９株を４６，７２，８４，８６および８７で形質転換した。それぞれの酵母を液体培養後、ＯＤ６００の値が０．１となるように８０ｍＭのホウ酸を含むＳＤ培地に植え継いだ。３０℃で４日間培養し、ＯＤ６００の値を測定した。実験は３回行った。平均値と標準偏差のグラフで示す。
【図４】ホウ酸過剰培地での酵母ＢＹ４７４１株の生育の結果を示す図である。酵母ＢＹ４７４１株を４６，７２，８４，８６および８７で形質転換した。それぞれの酵母を液体培養後、１００ｍＭのホウ酸を含むＳＤ培地にスポットした。スポットは左から右に１／５づつ希釈している。２６．５℃で１０日間培養した結果を示す。
【図５】液体培地での酵母ＢＹ４７４１株のホウ酸耐性試験の結果を示す図である。酵母ＢＹ４７４１株を４６、７２，８４、８６，および８７で形質転換した。それぞれの酵母を液体培養後、ＯＤ６００の値が０．１となるように８０ｍＭのホウ酸を含むＳＤ培地に植え継いだ。３０℃で４日間培養し、ＯＤ６００の値を測定した。実験は３回行った。平均値と標準偏差をグラフで示す。
【図６】ＡｔＲＢＰ４７ｃ’関連遺伝子軽質転換酵母細胞のホウ酸耐性の結果を示す図である。（Ａ）ＡｔＲＢＰ４７ｃ’関連ファミリー遺伝子の系統樹。デンドログラムは、ＡｔＲＢＰ４７ｃ’関連ファミリータンパク質の、相対的な進化距離を示し、ＮＪ法を用いて作成した。バーは、０．１アミノ酸置換／部位の遺伝的距離を示す。（Ｂ）固形培地におけるホウ酸耐性。酵母細胞をＯＤ６００が１．０になるまで生育し、連続的に希釈し、次に１０μｌを０又は８０ｍＭのホウ酸を添加したＳＤ皿に滴下した。生育は、１０日間の培養後記録した。空ベクターpFL61で転換した酵母細胞を、コントロールとして用いた。（Ｃ）液体培地におけるホウ酸耐性。酵母細胞をＯＤ６００が１．０になるまで生育し、０又は８０ｍＭのホウ酸を添加したＳＤ培地内でＯＤ６００が０．１になるまで希釈した。希釈した酵母細胞を、３０℃で培養し、希釈後の記載された時間ＯＤ６００の値を記録した。縦のバーは、３回の測定の平均値±平均値の標準偏差を示す。
【図７】スプライシングにおけるホウ酸の影響を示す図である。（Ａ）ＲＰＬ７Ｂのスプライシングの略図。３種類のｍＲＮＡを、スプライシングによってＲＰＬ７Ｂのｐｒｅ−ｍＲＮＡから産出できる。矢頭は、ＲＴ−ＰＣＲに使用したプライマーの位置を指している。（Ｂ）ＲＰＬ７Ｂのスプライシングに対するホウ酸の影響。酵母細胞をＯＤ６００が１．０になるまで生育し、最終濃度が８０ｍＭとなるようホウ酸を添加した。２４時間後、酵母細胞を回収し、全ＲＮＡを単離した。ｃＤＮＡは、全ＲＮＡから合成し、ＰＣＲによるスプライシング分析のテンプレートとして用いた。この分析では、空ベクターpFL61で転換した酵母株ＢＹ４７４１（野生型）又はＡｔＲＢＰ４７ｃ’発現ベクター（ＡｔＲＢＰ４７ｃ’）を用いた。（Ｃ）ＲＰＬ７Ａのスプライシングに対するホウ酸の影響。ＲＰＬ７ＡのスプライシングをPFL61で転換したＢＹ４７４１で、ＲＴ−ＰＣＲにより分析した。
【図８】ＲＰＬ７Ａ又はＲＰＬ７Ｂ破壊酵母細胞のホウ酸耐性の結果を示す図である。（Ａ）固形培地におけるホウ酸耐性。酵母細胞をＯＤ６００が１．０になるまで生育し、連続的に希釈し、次に１０μｌを０又は８０ｍＭのホウ酸を添加したＳＤ皿に滴下した。生育は、７日間の培養後記録した。（Ｂ）液体培地におけるホウ酸耐性。酵母細胞をＯＤ６００が１．０になるまで生育し、０又は８０ｍＭのホウ酸を添加したＳＤ培地内でＯＤ６００が０．１になるまで希釈した。希釈した酵母細胞を、希釈後３０℃で２１時間（ＳＤ）及び６０時間（ＳＤ＋８０ｍＭのホウ酸）培養し、その後ＯＤ６００の値を記録した。縦のバーは、３回の測定の平均値±平均値の標準偏差を示す。Δｒｐｌ７ａ及びΔｒｐｌ７ｂは、それぞれ、ＲＰＬ７Ａ破壊変異体（Ｙ０４４３）及びＲＰＬ７Ｂ破壊変異体（Ｙ０１０９４）を表す。（Ｃ）ＲＰＬ７Ａ破壊酵母におけるホウ酸耐性に対するＲＰＬ７Ｂの過剰発現の影響。酵母細胞をＯＤ６００が１．０になるまで生育し、連続的に希釈し、次に１０μｌを０又は８０ｍＭのホウ酸を添加したＳＤ皿に滴下した。生育は、５日間の培養後記録した。空ベクターpFL61で転換した酵母細胞を、コントロールとして用いた。
【図９】非典型的分岐点配列を含む遺伝子のスプライシングに対するホウ酸の影響を示す図である。  酵母をＯＤ６００が１．０になるまで生育し、次にホウ酸を最終濃度が８０ｍＭとなるよう添加した。２４時間後、酵母細胞を回収し、全ＲＮＡを単離し、ＰＣＲによるスプライシング分析のテンプレートとして用いた。この分析では、空ベクターpFL61で転換した酵母株ＢＹ４７４１（野生型）又はＡｔＲＢＰ４７ｃ’発現ベクター（ＡｔＲＢＰ４７ｃ’）を用いた。白と黒の矢頭は、それぞれ、非スプライス断片、スプライス断片を指す。
【図１０】ＡｔＲＢＰ４７ｃ’関連遺伝子転換酵母細胞の生育と、ＲＰＬ７Ｂのスプライシングに対する塩の影響を示す図である。（Ａ）固形培地における塩耐性。酵母細胞をＯＤ６００が１．０になるまで生育し、連続的に希釈し、次に１０μｌを０、１．７５又は２ＭのＮａＣＬを含むＳＤ皿に滴下した。生育を培養７日後に記録した。空ベクターpFL61で転換した酵母細胞を、コントロールとして用いた。（Ｂ）ＲＰＬ７Ｂのスプライシングに対する塩の影響。酵母細胞をＯＤ６００が１．０になるまで生育し、最終濃度がそれぞれ２Ｍ又は８０ｍＭとなるよう、ＮａＣｌ又はホウ酸を添加した。２４時間後、酵母細胞を回収し、全ＲＮＡを単離した。ｃＤＮＡを全ＲＮＡより合成し、ＰＣＲによるスプライシング分析のテンプレートとして使用した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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