(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
イオンチャンネル又はイオン輸送体に対する活性をもつ化合物の検出又はアッセイのための高処理量スクリーン方法に使用するための、高抵抗シールで多孔性支持体又は穿孔支持体に接着させた生物膜を含む構造物であって、ここで、
（ｉ）該生物膜は、イオンチャンネル又はイオン輸送体を主に発現するように遺伝子操作されている遺伝子操作された細胞を含み、そして
（ｉｉ）該支持体は、０．５μｍ〜１０μｍの間の直径の多孔をもつ、
前記構造物。
【請求項２】
イオンチャンネル又はイオン輸送体に対する活性をもつ化合物の検出又はアッセイのための高処理量スクリーン方法に使用するための、高抵抗シールで多孔性支持体又は穿孔支持体に接着させた生物膜を含む構造物であって、ここで、
（ｉ）該生物膜は、電位依存性（ｖｏｌｔａｇｅ  ｇａｔｅｄ）イオンチャンネルを含み、そして
（ｉｉ）該支持体は、０．５μｍ〜１０μｍの間の直径の多孔をもつ、
前記構造物。
【請求項３】
イオンチャンネル又はイオン輸送体に対する活性をもつ化合物の検出又はアッセイのための高処理量スクリーン方法に使用するための、高抵抗シールで多孔性支持体又は穿孔支持体に接着させた生物膜を含む構造物であって、ここで、
（ｉ）該生物膜は、ナトリウム、カリウム、カルシウム、及び塩化物からなる群から選ばれるイオンに特異性を示すイオンチャンネルを含み、そして
（ｉｉ）該支持体は、０．５μｍ〜１０μｍの間の直径の多孔をもつ、
前記構造物。
【請求項４】
前記生物膜は、高抵抗シールで支持体に接着できる細胞の連続層を含み、各細胞は、隣接する細胞と堅く結合し、その細胞膜中に局在化されたイオンチャンネル又はイオン輸送体を発現する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の構造物。
【請求項５】
前記細胞の連続層は、ガラス、プラスチックス、ゴム、ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）、PTFE/ガラス布帛、及びポリエチレンテレフタレート（PETP）からなる群から選ばれる支持体に高抵抗シールで接着できる、請求項４に記載の構造物。
【請求項６】
構成物が細胞を含み、これらの細胞が、その細胞膜に本来備わっている、或いはイオンチャンネル又はイオン輸送体をコードしているcDNA及び/又はcRNAによるトランスフェクションにより挿入されることができるイオンチャンネルを有する、請求項２又は３に記載の構造物。
【請求項７】
主として事前に選ばれた複数の着目のイオンチャンネル又はイオン輸送体を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の構造物。
【請求項８】
主としてイオンチャンネルを発現するように遺伝子工学的に作られている細胞を含む、請求項２又は３に記載の構造物。
【請求項９】
電位依存性（ｖｏｌｔａｇｅ  ｇａｔｅｄ）イオンチャンネルを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の構造物。
【請求項１０】
前記細胞が、HEK-293細胞、遺伝的に改質されたチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、海馬、背根神経節、上顎神経節の如き一次神経組織、骨格筋、平滑筋、心筋、免疫細胞、上皮、及び内皮からなる群から選ばれた細胞である、請求項４〜８のいずれか１項に記載の構造物。
【請求項１１】
急速活性化速度及び急速不活性化速度を有するイオンチャンネルを含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の構造物。
【請求項１２】
ナトリウム、カリウム、カルシウム、及び塩化物からなる群から選ばれるイオンに特異性を示すイオンチャンネルをもつ、請求項１又は２に記載の構造物。
【請求項１３】
前記細胞の連続層の一面に透過性を持たせ、それによりその細胞の内部へのアクセスを提供する、偽性上皮を含む、請求項１に記載の構造物。
【請求項１４】
前記細胞の連続層の一面が、アンフォテリシン及びナイスタチンからなる群から選ばれる抗生物質、ディギトニン及びサポニンからなる群から選ばれる界面活性剤、高電圧の場を用いた物理的分裂、又は適切な酵素を用いて膜の一部の酵素による消化により、透過性を持たされている偽性上皮を含む、請求項１３に記載の構造物。
【請求項１５】
前記支持体が穿孔されている、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の構造物。
【請求項１６】
穿孔されたカバースリップを含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の構造物。
【請求項１７】
前記多孔の直径が１〜７μmである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の構造物。
【請求項１８】
前記多孔の直径が１〜２μmである、請求項１７に記載の構成物。
【請求項１９】
格子状の多孔を有するカバースリップを含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の構造物。
【請求項２０】
ガラス、プラスチック、ゴム、ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）、PTFE/ガラス布帛、及びポリエチレンテレフタレート（PETP）からなる群から選ばれる材料で製作された穿孔された支持体を含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の構造物。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれかに記載の構造物を含む、電位依存性イオンチャンネルに対する活性を有する化合物を検出し評価するための高処理量スクリーン装置。
【請求項２２】
請求項２１に記載の高処理量スクリーン装置であって、
各々が生物膜用の支持体を与える透過性の外周面を有する複数のチャンバー；
各々がチェンバーと、生理的溶液中又はジメチルスルホキサイドを含む非生理的溶液中の試験化合物を受け入れることができる複数のウェル；
各ウェルと電気的接触を有する複数の参照電極；
少なくとも一の記録電極を担持する可動記録ヘッド；
上記記録電極と参照電極との間の電気抵抗又はインピーダンスを測定する手段、ここで、生物膜中のイオンチャンネル又はイオン輸送体を介してのみ、各チャンバーの透過性外周面を通して上記記録電極と参照電極の間に電流を流すことができる、
を含む、前記高処理量スクリーン装置。
【請求項２３】
前記ウェルがマルチウェルプレートにより提供される、請求項２２に記載の高処理量スクリーン装置。
【請求項２４】
多孔性支持体上の滴のアレーを含む、請求項２１に記載の高処理量スクリーン装置。
【請求項２５】
動かされて時系列的に各チェンバーを訪ねることができる単一記録電極を有する記録ヘッドを含む、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の高処理量スクリーン装置。
【請求項２６】
線状に配列された複数の記録電極を有する記録ヘッドを含む、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の高処理量スクリーン装置。
【請求項２７】
マトリックス状に配置された複数の記録電極を有する記録ヘッドを含む、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の高処理量スクリーン装置。
【請求項２８】
支持体を選択し、それに穿孔し、その支持体に生物膜を導入し、そして各多孔を生物膜でシールするステップを含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の構造物の製造方法。
【請求項２９】
支持体の穿孔と生物膜による多孔のシールを同時に行なうステップを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
細胞の型を選択するステップ、堅い結合の細胞の連続層を形成する能力について、及び少数の又は無視し得る数の電圧依存性イオンチャンネルについて、その細胞を評価するステップ、そして支持体上に該細胞を培養し、そして細胞の連続層が培養されていることを確かめるステップを含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の構造物に使用される生物膜の製造方法。
【請求項３１】
細胞の連続層の一表面に透過性を持たせ、細胞の内部にアクセスを与えるようにするステップを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記の細胞の連続層の一表面に透過性を持たせるステップは、該表面を、アンフォテリシン及びナイスタチンからなる群から選ばれた抗生物質、又はディギトニン及びサポニンからなる群から選ばれた界面活性剤との接触、高電圧の場を用いた物理的分裂、或いは適切な酵素を用いた細胞膜の一部の酵素による消化により行なわれる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
着目のイオンチャンネルをコードするcDNA又はcRNAで細胞をトランスフェクトするステップ、そして上記イオンチャンネルを発現する細胞をクローン化するステップを含む、請求項３０〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
着目のイオンチャンネル又はイオン輸送体を発現する生物膜を、生理溶液中又はジメチルスルホキサイドを含む非生理溶液中の試験化合物と接触させるステップ、及び試験化合物の影響下にある生物膜の抵抗又はインピーダンスを測定するステップを含む、イオンチャンネル又はイオン輸送体に対し活性を有する化合物の検出又は評価するためのスクリーニング方法であって、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の構造物を使用することを含む前記方法。
【請求項３５】
無傷の細胞層を横切って上皮を通した抵抗測定（TERM）によりイオンチャンネル活性をモニターする、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
連続した細胞層に透過性を持たせて、細胞内の電位及び電流の測定を可能にする細胞の内部へのアクセスを与えるステップを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
連続した細胞層が、アンフォテリシン及びナイスタチンからなる群から選ばれた抗生物質、ディギトニン及びサポニンからなる群から選ばれた界面活性剤、高電圧の場を用いた物理的分裂、或いは適切な酵素を用いて細胞膜の一部の酵素による消化により連続した細胞層に透過性を持たせ、それにより細胞内電圧又は電流の測定を可能にする、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
３８４個までの記録エレメントを、マルチプル電圧クランプ増幅器を利用したデータ取得システムに多重送信するステップを含む、請求項３４〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
着目のイオンチャンネル又はイオン輸送体を有する滴のアレーを有孔支持体上に置き、イオンチャンネル又はイオン輸送体に対する試験化合物の活性についてスクリーニングするステップを含む、請求項３４〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
着目のイオンチャンネル又はイオン輸送体を有する生物膜と、生理溶液中又はジメチルスルホキサイドを含有する非生理溶液中の試験化合物とを、複数のチェンバー内に置くステップ、及びイオンチャンネル又はイオン輸送体に対する試験化合物の活性についてスクリーニングするステップを含む、請求項３４〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、生物学的膜と多孔質または有孔性支持体を含んで成る構造体と、生物学的膜と、基体と、高処理量スクリーンと、前記構造体、膜および支持体の製造方法と、多数の試験化合物を短時間でスクリーニングする方法とに関する。本発明は、特に、多孔質または有孔性支持体に付着した生物学的膜を含んで成る構造体と、所要のイオンチャンネルまたはトランスポーターを主として有する薄膜を形成する能力をもって有孔性ガラス等の支持体に高抵抗シールで付着することのできる生物学的膜と、イオンチャンネルまたはトランスポーター活性に対する試験化合物の作用を決定するための高処理量スクリーンと、前記構造体、膜および支持体の製造方法と、膜中のイオンチャンネルまたはトランスポーター活性をモニターする方法とに関する。
【０００２】
本明細書の文脈において「含んで成る」という用語は「含む」の意味であって、「だけに限る」という意味ではない。
イオンチャンネルは、膜中に細孔を形成してイオンが片側から反対側へ通ることを可能にする膜内外蛋白質である（Hille, 1992)。それらはイオン特異性を示すことがあるので、特定のイオンがその電気化学的勾配を下るように膜中を受動的に拡散できるようになる。ある種のチャンネルは平均して何時も且つ全ての生理学的膜ポテンシャルで開いているが（いわゆるリークチャンネル）、多くのチャンネルは膜の特定の摂動に呼応して開く「ゲート」を有する。イオンチャンネルを開かせることが知られている摂動には、膜を横切る電位の変化（電圧ゲート型チャンネル）、機械的刺激（機械的ゲート型チャンネル）、または信号発生分子の結合（配位子ゲート型チャンネル）が含まれる。
【０００３】
トランスポーターは細胞膜中の蛋白質であって、Ｎａ＋やＫ＋等の無機イオンならびにいわゆる再摂取ポンプの場合の神経伝達物質、例えばＧＡＢＡ、ドパミン、グリシン等の有機イオンの運動を触媒的に引き起こす蛋白質である。
キャリア対細孔のはっきり区別できる二つの特徴は、（ｉ）運動論、即ち、トランスポーターを通るイオンの運動はイオンチャンネルの場合に見られる＞１０6 イオン/ 秒よりもはるかに遅いこと、および(ii ）イオンチャンネルが電気化学的勾配を下るように導くのに対して、トランスポーターは坂を上るように即ち濃度勾配に逆らって「汲み上げる」ことができること（Hille, 1992)である。後者の過程は化学量論的に供給されるエネルギーに直接的に依存するのが普通である。
【０００４】
本発明は主としてイオンチャンネル活性の測定に応用されるが、トランスポーターが電気発生的、例えばＮａ+／Ｋ+；Ｎａ+／Ｃａ2+；グルタメート再摂取トランスポーターの場合（Brew & Attwell, 1987) のトランスポーターの測定にも応用される。
イオンチャンネル活性はパッチクランプ法と呼ばれる技法で研究されてきた（Hamill et al, 1981) 。この技法によれば、細胞膜の小さなパッチは一般にマイクロピペットの先端を膜に押し付けることによってその先端部に単離される。もしもマイクロピペットと膜パッチとの間に緊密なシールが成立すれば、マイクロピペットを通る電流は膜パッチ内のイオンチャンネルを通してのみ流れることが示唆されている。これが達成されれば、イオンチャンネルの活性と膜電位、抵抗、電流に対するその作用をモニターすることができる。膜を横断する電位が一定であるなら、そこに供給される電流は膜内のイオンチャンネルを通る電流に等しい。膜内のイオンチャンネルが閉じれば、膜の抵抗は増大する。加えられる電流が一定ならば、抵抗の増加は膜を横断する電位の増加に比例する。
【０００５】
多くの薬物がイオンチャンネルを変調することによってその効果をもたらすことが知られているが、イオンチャンネルに作用する新規化合物の開発は活性に関する高処理速度でのスクリーニングの困難性のために大きく阻害される。パッチまたは電圧クランプ法のような従来の電気生理学的方法は明確な機械論的情報をもたらすが、それらは試験化合物の高速スクリーニングには適していないという問題をかかえている。
【０００６】
WO96/13721には、生物学的組織中のイオン移送チャンネルに対するある種の物質の作用を研究するために用いるパッチクランプ法を実行するための装置が記載されている。同文献にはＨＰＬＣ装置に使用されるような自動サンプラーを利用して従来のパッチクランプ法で達成されるものより高い処理量をもたらすパッチクランプ装置が開示されている。この装置は、パッチクランプ記録ではなく薬物デリバリーシステムを半自動化するに過ぎないという問題点をもっている。したがって、この装置は、伝統的パッチクランプ法と同様に化合物処理速度に関して限界があり、とても高処理量システムと考えることはできない。このシステムは未だに線型処理（すなわち、得られるデータを各細胞ごとに処理すること）を要する。全く対照的に、ここに記載される本発明は並列処理を提供するものであり、もって、真に化合物の高処理量を提供するものである。
【０００７】
ここで用いる「生物学的膜」という用語は, 脂質二重層や当業者に周知のその他の膜のような人工的膜をも含むものと解するものである。
本発明は、既知のスクリーンおよびスクリーニング方法に伴う問題点を扱う。  第１の面において、本発明は，多孔質または有孔性支持体に高抵抗シールで付着した生物学的膜を含んで成る高処理量スクリーン用構造物であって、前記生物学的膜がイオンチャンネルまたはトランスポーターを含んで成る構造物を提供する。
【０００８】
第２の面において、本発明は、高抵抗シールで支持体に付着することができる前記構造物用生物学的膜であって、各細胞が隣接細胞と緊密に結び付いて細胞膜内の位置にイオンチャンネルを形成する生物学的膜を提供する。
第３の面において、本発明は、高処理量スクリーンに用いる有孔性支持体を提供する。
【０００９】
第４の面において、本発明は、生物学的膜を含んで成り、電圧ゲート型イオンチャンネルに対して活性をもつ試験化合物を検出および分析検定するための高処理量（ＨｉＴ）スクリーンを提供する。
第５の面において、本発明は、有孔性支持体に高抵抗シールで付着した生物学的膜を含んで成る構造物の製造方法であって、支持体を選ぶ工程と、支持体に孔を設ける工程と、生物学的膜を支持体に導く工程と、各孔を生物学的膜でシールする工程とを含んで成る構造物製造方法を提供する。
【００１０】
第６の面において、本発明は、細胞タイプを選ぶ工程と、それを緊密な結び付きで細胞の連続層を形成する能力および小さいかまたは無視できる数の電圧ゲート型イオンチャンネルに関して評価する工程と、細胞を支持体上に培養する工程と、細胞の連続層が成長しているか確認する工程とを含んで成る生物学的膜の製造方法を提供する。
【００１１】
第７の面において、本発明は、あらかじめ選んだ焦点領域、出力または露光時間のレーザーをカバーグラスに照射してカバーグラスに孔を開ける工程を含んでなる有孔性支持体の製造方法を提供する。この方法は、さらに、孔の開いた部位をプラズマおよび／または局所加熱に晒して変更し、孔の平滑さを適当なレベルにする追加の工程を含んでもよい。
【００１２】
第８の面において、本発明は、イオンチャンネルに対して活性を有する化合物を検出または分析検定するためのスクリーニング方法であって、所要のイオンチャンネルを表現する生物学的膜をジメチルスルホキシド等の溶媒を含む非生理学的溶液または生理学的溶液の中で試験化合物と接触状態に置く工程と、試験化合物の影響の下で生物学的膜の抵抗またはインピーダンスを測定する工程を含んで成るスクリーニング方法を提供する。
【００１３】
好ましくは、前記生物学的膜の一実施態様は、イオンチャンネルまたはトランスポーターを含んで成る細胞であって、そのイオンチャンネルまたはトランスポーターはその細胞の細胞膜に生来的に存在するか、あるいは、イオンチャンネルまたはトランスポーターを符号化するｃＤＮＡおよび／またはｃＲＮＡでトランスフェクションによって挿入してもよい。このように、本発明は、精確なサブユニット組成が未知である場合または分子的正体が全く未知である（すなわち、未だにクローニングされていない）場合の生来的チャンネルまたはトランスポーターの研究を可能にするだけでなく、生来的チャンネルまたはトランスポーターの正体は既知である場合またはイオンチャンネルまたはトランスポーターの化学的部分および化合物構造の相互作用について精確な知識が求められる場合の、異種で表現されクローニングされたチャンネルまたはトランスポーターの研究をも可能にするという利点を有する。したがって、このシステムは既存のアプローチよりも実質的に汎用性に富むものであって、実際、既存のアプローチは感度が鈍く、高い細胞濃度の確保（ニューロンでは何時も可能ではない）と高い信号対ノイズ比に依存するので、その使用はある種の細胞およびイオンチャンネルに限られる。
【００１４】
好ましくは、前記生物学的膜の一実施態様は、複数のイオンチャンネルまたはトランスポーターを含んで成るものであって、それらは主として予め選ばれた所要のイオンチャンネルまたはトランスポーターである。このことによって、本発明は、異なるチャンネルの並列スクリーニングを可能にし、さらに高い化合物処理量の可能性を与えるという利点を有することになる。
【００１５】
さらに好ましくは、前記生物学的膜の一実施態様は主としてイオンチャンネルまたはトランスポーターを発現するように工学処理された遺伝子工学処理済み細胞を含んで成る。
好ましくは、前記イオンチャンネルは電圧ゲート型イオンチャンネルである。
好ましくは、前記生物学的膜の一実施態様はＨＥＫ−２９３細胞、遺伝子的に修飾されたチャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞、海馬、脊髄神経節、上頸神経節等の主神経組織；骨格筋；平滑筋；心筋；免疫細胞；上皮；内皮等を含んで成る群から選んだ細胞を含んで成る。
【００１６】
ＣＨＯ細胞ならびにＣＨＯ−ＫｌおよびＣＨＯ−ｄｈｆｒ（Ｄｕｋｘとしても知られる）等のＣＨＯサブクローンは、内因性イオンチャンネル表現のレベルが例外的に低いので、哺乳動物細胞環境において優れた信号対ノイズ特性を有するという利点が得られる。同様に、ＨＥＫ−２９３（ヒト胎児腎臓）細胞は、低レベルの生来的チャンネルを表現するので、ヒト表現の「背景」を提供する。これらの表現システムは、生来的チャンネルおよびサブユニットが豊富であるばかりでなく両性動物細胞環境は哺乳動物細胞と重要な点で異なる場合によく使用されるＸｅｎｏｐｕｓ母細胞法に対して極めて好ましい。
【００１７】
好ましくは、前記生物学的膜の一実施態様は、既存の高処理量スクリーニング方法では解明できない高速活性化及び不活性化運動論を持つイオンチャンネルを含んで成る。したがって、既存のシステムは、過渡イオンチャンネル信号が度々平均して多数秒の時間を超える。このようなシステムでは、ミリ秒のオーダーの時定数で不活性化して定常的に存在しないチャンネルを有効に検出することはできない。ところが、ここに提示する本発明は、このような運動論を伝統的パッチクランプ法と同様にしかし高処理量率で容易に解明することができるという利点を有する。
【００１８】
好ましくは、生物学的膜の一実施態様は、ナトリウム、カリウム、カルシウム、塩化物を含んで成る群から選んだイオンに対して特異性を示すイオンチャンネルを含んで成る。
好ましくは、前記生物学的膜の一実施態様は、有孔性ガラス、プラスチック、ゴム、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ），ＰＴＦＥ／ガラス布帛およびポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴＰ）を含んで成る群から選んだ基体に高抵抗シールで付着することができる細胞の連続層を含んで成る。
【００１９】
好ましくは、前記生物学的膜の一実施態様は、細胞の連続層の一面が透過性化されて細胞内部へアクセス可能となった擬似上皮を含んで成る。このことは、既存の高処理量スクリーニングシステムでは不可能であった電流および電圧クランプ法のための手段を提供するという大きな利点を有する。これによって、高時間分解能記録が可能となるばかりでなく、電圧ゲート型イオンチャンネルを精確で制御された様態で刺激または活性化する手段が提供される。たとえば、細胞を脱分極するべくＫ+ を高めるなどによってイオン性組成物を変化させる必要がない。そのようなことは、イオンチャンネル（例えばＫ+ チャンネル）の運動論を変調したり、イオンチャンネル結合部位での競合によって新規配位子の活性を不明瞭にしたりする可能性がある。このことは、全ての既存システムに対して非常に大きな利点である。また、透過性化は、分子量または物理化学的特性のために他の方法では不可能だった化合物のサイトゾルへの導入を可能にする。
【００２０】
好ましくは、前記生物学的膜の一実施態様は、透過性化した細胞の連続層を含んで成る。この場合、透過性化は、アンフォテリシンおよびナイスタチンを含んで成る群から選んだ抗生物質によって、または、ディギトニンおよびサポニンを含んで成る群から選んだ界面活性剤によって、または、高電圧場を用いる物理的分裂によって、または、適当な酵素を用いて膜の一部を酵素消化することによってなされる。
【００２１】
高電圧場を用いて膜を透過性化すること（電気透過性化）の一つの利点は、このような技法によって、ミトコンドリアや内質小網などのより小さな細胞内構造を助けながらプラスマ膜を透過性化し得ることである。この技法は、また、非常に精確に制御することができるとともに、記録装置の下のチャンバー内の溶液を交換する設備を必要としない。
【００２２】
好ましくは、前記支持体の一実施態様は、有孔カバーグラスを含んで成る。
好ましくは、前記支持体の一実施態様は、直径が０. ５μｍと１０μｍの間の細孔を有する。さらに好ましくは、細孔の直径は１μｍと７μｍの間である。さらに好ましくは、直径は１〜２μｍである。
好ましくは、前記支持体の一実施態様は、４より大で１０より小の数の細孔の格子を含んで成る。このことは、各処理において並列記録の統計的に許容できる数（すなわち、≧４）であり、しかも、十分に小さいという利点をもたらす。その小ささは、細孔対細胞の比を消失するほど小さくするのに十分であって、細孔が細胞でシールされ塞がれる確率が極めて高くなるのに十分である。
【００２３】
好ましくは、本発明による基体の一実施態様は、ガラス、プラスチック、ゴム、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ＰＴＦＥ／ガラス布およびポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴＰ）を含んで成る群から選んだ材料で作られる。
好ましくは、前記スクリーンの一実施態様は、
それぞれが透過性周囲面を有して生物学的膜のための支持体を提供する複数のチャンバーと、
それぞれがチャンバーとジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはその他の溶媒を含む非生理学的溶液または生理学的溶液中の試験化合物とを受容することができる複数のウェルと、
少なくともひとつが各ウェルに電気的接触をしている複数の参照電極と、
少なくともひとつの記録電極を担い、マルチウェルプレートフォーマットでのイオンチャンネル活性の自動記録のための基礎的要件をもたらす可動記録電極と、
前記記録電極と参照電極の間の電気抵抗またはインピーダンスを測定する手段とを含んで成り、
前記記録電極と参照電極との間で各チャンバーの透過性周囲面を通って電流が流れるにあたっては前記生物学的膜内のイオンチャンネルまたはトランスポーターを介してのみ流れるものである。
【００２４】
好ましくは、前記スクリーンの一実施態様は、マルチウェルプレートによって提供されるウェルを含んで成る。これの利点は、商業的に入手可能な自動装置またはロボット工学を用いて加工できる業界標準的な部品を使用して高処理量を達成できることである。使用者は、その既存のプレート加工装置を使うことができ、そうして、技術の現状に即した高処理量の電気生理学的スクリーンを確立する際のコストを節約することができる。
【００２５】
好ましくは、前記スクリーンの一実施態様は、生物学的膜のための有孔性支持体を含んで成る。
好ましくは、前記スクリーンのさらなる実施態様は、前述の構造体または生物学的膜であって、多孔質支持体上の液滴の列の形で所要のイオンチャンネルを有するものを含んで成る。好ましくは、記録電極を合体させる「蓋」を液滴のマトリックスの上に、液滴溶液のメニスカスが形成されるように置くことによって小さな記録チャンバーの列を作り出す。好ましくは、導電性溶液中の試験化合物を液滴の少なくともひとつに入れるか、または「蓋」のアクセスポートを経て適用し、生物学的膜の抵抗／インピーダンス（電流クランプ形態の場合）またはコンダクタンス（電圧クランプの場合）を試験化合物の影響下で測定する。この手法の利点は、基体の細片（例えば、円盤）をマルチウェルプレートへ移送する必要なく何枚もの基体を設計できることであり、また、シール、Ｏリング等による複雑なチャンバーのデザインを回避することもできる。本発明はまた、溶液の添加を許容するものでもあるので、非常に小体積すなわち少量の試薬および細胞を使用するという更なる利点を有する。隣り合う液滴の間のエアギャップによって、優れた絶縁がもたらされる。
【００２６】
好ましくは、前記記録ヘッドの一実施態様は、各チャンバーを順に巡視するように可動である単一の記録電極を含んで成る。さらに好ましくは、記録ヘッドの一実施態様は一列に並べた複数の記録電極を含んで成る。さらにもっと好ましくは、記録ヘッドはマトリックス状に配列した複数の記録電極を含んで成る。この形態の利点は、データ取得多重化システムを介して全てのウェルからの同時記録が可能なことである。
【００２７】
好ましくは、前記スクリーンの一実施態様は、多数の電圧クランプ増幅器を使用して３８４個までの記録要素をデータ取得システムに多重化することができる。これは、非常に高い時間分解能と、全てのウェルからの効果的な同時測定とをもたらすという利点がある。このことは、従来の蛍光に基づいた配位子リセプター結合分析検定で可能な最高レベル（≧150,000 化合物／週）と同様の処理量率を達成し得るＴＥＲＭシステムを提供するという利点がある。
【００２８】
好ましくは、前記構造体の製造方法の一実施態様は、カバーグラスに細孔を設けると同時にその細孔を生物学的膜でシールする工程を含んで成る。この実施態様は、最終形態を成立させる際の工程、すなわち有孔性支持体の細孔と細胞とのシールの確率を最適化するのに要する手続きを除くという利点を有する。このことは、最終製品の単純化という利点がある。
【００２９】
生物学的膜を作製する方法の一態様は、互いに接触した細胞からなる層の一方の表面を透過可能にするステップを含むことで細胞の内部にアクセス可能となっていることが好ましい。このようにすることには、既存のいかなる高処理能力スクリーニング・システムでも実現不能な電流／電位固定の手段を提供できるという大きな利点がある。これによって、時間分解能の優れた記録が可能となるだけでなく、正確かつ制御された方法で電位依存性イオンチャネルを刺激または活性化する手段が提供される。一例を挙げるならば、細胞を脱分極させるのに例えばＫ+の濃度を上昇させると、その操作によってイオンチャネル（例えばＫ+チャネル）のカイネティックス（動力学）が変わってしまう可能性があり、しかもイオンチャネルが結合サイトにおいて競合することによって新しいリガンドの活性がはっきりしなくなってしまう可能性もあるが、本発明ではそのような操作でイオン組成を変える必要がなくなる。このことが、既存のあらゆるシステムと比べた場合の非常に大きな利点となっている。また、透過可能にすることで、細胞質ゾルにさまざまな化合物を導入することも可能になるが、これ以外の方法では、分子量または物理化学的特性のためにそうすることはできなかった。
【００３０】
透過可能化は、アンフォテリシン（ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ）、ナイスタチン（ｎｙｓｔａｔｉｎ）を含むグループの中から選択された抗生物質、または、ディギトニン（ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ）、サポニン（ｓａｐｏｎｉｎ）を含むグループの中から選択された界面活性剤を表面に接触させるか、または、高電圧を用いて物理的に破壊するか、または、適切な酵素を用いて細胞膜の一部を消化させるかのいずれかを行なうステップによって実現することが好ましい。
【００３１】
膜を透過可能にするのに高電圧を用いること（電気的透過化）の１つの利点は、ミトコンドリアや小胞体といった相対的に小さな細胞内構造物はそのままの状態にして形質膜を透過可能にできる技術であるということにある。また、この技術は非常に正確に制御することが可能であり、この技術によって、記録装置の下部チェンバー内の溶液を交換する設備は必要なくなるであろう。
【００３２】
生物学的膜を作製する方法の一態様は、興味の対象であるイオンチャネルをコードするｃＤＮＡまたはｃＲＮＡを細胞にトランスフェクトし、そのイオンチャネルを発現させる細胞をクローニングするステップを含むことが好ましい。異種発現したクローニングされたチャネルに関しては、元々のチャネルのアイデンティティは既知であり、化合物の構造とイオンチャネルの化学的部分の間の相互作用に関する詳細な知識が必要とされるのだが、本発明は、このステップを含んでいることでそうした研究を可能にするという利点を有する。
【００３３】
穿孔された支持体を作製する方法の一態様は、孔の輪郭、先細りの程度、直径をレーザーで調節するステップを含むことが好ましい。
レーザー光源は、コンピュータで自動制御される台と倒立位相差顕微鏡によって制御されることが好ましい。顕微鏡には、孔の特性、例えば輪郭、先細りの程度、直径を目視検査することを可能にするという利点がある。
【００３４】
穿孔された支持体を作製する方法の一態様は、支持体のフォトエッチング、成形、物理的穿孔といったレーザーを用いない方法を含むことが好ましい。
スクリーニング法の一態様は、完全な細胞層を横断する経上皮抵抗測定（ＴＥＲＭ）の値をモニターすることによってイオンチャネルの活性を測定するステップを含むことが好ましい。
【００３５】
スクリーニング法のさらに別の態様では、互いに接触した細胞からなる層の一方の表面が透過可能にされていることで細胞の内部にアクセスできるようになっていることが好ましい。このようにすることには、既存のいかなる高処理能力スクリーニング・システムでも実現不能な電流／電位固定の手段を提供できるという大きな利点がある。これによって、時間分解能の優れた記録が可能となるだけでなく、正確かつ制御された方法で電位依存性イオンチャネルを刺激または活性化する手段が提供される。一例を挙げるならば、細胞を脱分極させるのに例えばＫ+の濃度を上昇させると、その操作によってイオンチャネル（例えばＫ+チャネル）のカイネティックス（動力学）が変わってしまう可能性があり、しかもイオンチャネルが結合サイトにおいて競合することによって新しいリガンドの活性がはっきりしなくなってしまう可能性もあるが、本発明ではそのような操作でイオン組成を変える必要がなくなる。このことが、既存のあらゆるシステムと比べた場合の非常に大きな利点となっている。また、透過可能にすることで、細胞質ゾルにさまざまな化合物を導入することも可能になるが、それ以外の方法では、分子量または物理化学的特性のためにそうすることはできなかった。
【００３６】
互いに接触した細胞からなる層の一方の表面は、アンフォテリシン、ナイスタチンを含むグループの中から選択された抗生物質、または、ディギトニン、サポニンを含むグループの中から選択された界面活性剤、または、高電圧を用いた物理的破壊、または、適切な酵素を用いた細胞膜の一部の消化によって透過可能にして、細胞内の電圧または電流を測定できるようにすることが好ましい。
【００３７】
膜を透過可能にするのに高電圧を用いること（電気的透過化）の１つの利点は、ミトコンドリアや小胞体といった相対的に小さな細胞内構造物はそのままの状態にして形質膜を透過可能にできる技術であるということにある。また、この技術は非常に正確に制御することが可能であり、この技術によって、記録装置の下部チェンバー内の溶液を交換する設備は必要なくなるであろう。
【００３８】
本発明の一態様は、最高で384個までの記録素子からのデータを、複数の電位固定増幅器を用いたデータ取得システムに多重送信するステップを含むことが好ましい。その利点は、極めて優れた時間分解能が得られることと、あらゆるウエルを実質的に同時に測定できるようになることである。この方法には、蛍光を利用した従来のリガンド−受容体結合アッセイで可能な最大の処理能力（一週間に150,000以上の化合物）と同程度の性能を実現できる可能性のあるＴＥＲＭシステムを提供できるという利点がある。
【００３９】
興味の対象であるイオンチャネルに作用する化合物の検出またはアッセイのためのスクリーニング法の一態様では、穿孔された支持体上に液滴をアレイにして配置することが好ましい。ミニチュア記録チェンバー・アレイは、記録用電極を組み込んだ“蓋（ｌｉｄ）”を、液滴マトリックスの上に、液滴溶液がメニスカスの状態になるようにして置くことによって作ることができる。導電性溶液に溶かしたテスト化合物は、液滴のうちの少なくとも１つの中に入れるか、または“蓋”の中のアクセス・ポートを通じて添加し、（電位固定配置において）生物学的膜の抵抗またはコンダクタンスをそのテスト化合物の影響下で測定する。
【００４０】
スクリーニング法の別の態様では、生物学的膜を複数のチェンバーに入れ、テスト化合物を生理溶液の中、または溶媒として例えばジメチルスルホキシドを含む非生理溶液の中に溶かしてチェンバーに添加する。
スクリーニング法の一態様は、ドラッグ・デリバリーとマルチウエル・プレートの洗浄を行なうステップを含むことが好ましい。
【００４１】
スクリーニング法の一態様は、光励起可能な“イオン・スカベンジャー”、例えばＫ+などのイオンを用いる細胞の刺激ステップを含むことが好ましい。高強度の光源、例えばレーザーまたはキセノン・ランプを用いて一度にプレート全体に光を当てることにより、活性化物を放出させることが可能である。このシステムの利点は、イオンの分布を非侵襲的かつ細かい時間制御のもとで変えることによって膜の電位を変えうるところにある。
【００４２】
驚くべきことに、生物学的膜は、イオンチャネルに作用するテスト化合物のための高処理能力スクリーンで使われる穿孔された支持体に、高抵抗シールを用いて付着させうることがわかった。これまでは、過度の負荷をかけることなく高抵抗シールを実現することはできなかったため、当業者にとってこのことが最初から明らかであるとは考えられていなかった。さらに、穿孔された支持体に生物学的膜をシールしたものを高処理能力スクリーンに用いることは、これまでに提案されたことはなかった。
【００４３】
驚くべきことに、高抵抗シールを用いて支持体に付着させうる生物学的膜は、高処理能力スクリーン用として製造できることがわかった。驚くべきことに、生物学的膜は、興味の対象であるイオンチャネルを多数有するように構成できることがわかった。さらに、驚くべきことに、高処理能力スクリーンは、テスト化合物の検出およびアッセイ用の構成にすること、またその目的で使用することが可能で、一週間に30000を超える処理能力にできることがわかった。
【００４４】
驚くべきことに、スクリーンは、機能的イオンチャネルの活性に関係した真正の電子的生理学データを得るのに使用することができる。
本発明の生物学的膜は、当業者にとって当初は明らかではなかった。穿孔されたガラスなどの支持体に対する高抵抗シールを有する生理学的膜は、これまで実現されたことはなく、過度の負荷をかけることなしに作製することが可能であるとは考えられていなかった。さらに、興味の対象であるイオンチャネルを多数有する膜を作製することが、過度の負荷をかけることなく可能であるとは考えられていなかった。
【００４５】
本発明の高処理能力スクリーンおよび本発明の方法は、過度の負荷をかけることなくテスト化合物を高い処理能力でスクリーニングすることが可能であるとはこれまで考えられていなかったという事実に照らしてみると、当業者にとって当初から明らかだったのではなく、本発明によって達成されたのである。
本発明の高処理能力スクリーンおよび本発明の方法には、テスト化合物を高い処理能力でスクリーニングすることが可能であるという利点に加え、機能的アッセイ（例えばリガンド結合アッセイと比較せよ）を提供できるという利点がある。この機能的アッセイとは、電位依存性イオンチャネルに対するテスト化合物の作用モード（例えば遮断、促進）を、膜の抵抗変化を通じて測定する、すなわち膜内のイオンチャネルを通って流れる電流を直接記録することにより測定するものである。
【００４６】
以下に、好ましい態様を示す実施例および添付の図面を参考にして本発明を記述する。
実施例
本発明のスクリーンの一態様は、記録装置が接続されたマルチウエル・プレートを備えている。こうすることにより、短時間（約１〜60秒）のうちに１つのプレート内の複数のウエルに対して大量並列電位固定（ＭＰＶＣ）を実現することができる。市販されている96または384ウエル・プレートを利用するか、96または384位置アレイ・フォーマットを用いることが好ましい。
【００４７】
本発明のスクリーンの一態様は、テスト化合物の処理能力が一週間に30,000を超えていて、しかも機能的イオンチャネルの活性の真正な電子的生理学データを“読み出せる”ことが好ましい。スクリーンの一態様においては、優れた時間分解能を提供することができる。例えば96ウエル・プレートについては、１ミリ秒／点／電位固定のセットアップとなる。モジュレーションに対するチャネル活性の感度は１％以上である。
【００４８】
本発明の一態様では、興味の対象であるイオンチャネルを優位に発現させる細胞が互いに接触している層を横断して経上皮電気抵抗の測定を行なうステップを含む方法が提供される。当業者には明らかであろうが、この方法は、支持体に対する細胞の付着状態に依存する。隣接した細胞間の密な接合がその支持体の上に形成されるようになって高抵抗シートが形成されるからである。個々の細胞膜において発現しているイオンチャネルの活性の変化は、シート全体を横断する抵抗の変化に反映される。本発明のこの態様の改良例では、シートを含む細胞の内部へのアクセスが、ポピュレーション電流と電位固定の記録を可能にする手段によって提供される。
【００４９】
経上皮抵抗の測定は、以下のようにして行なう。
ａ）上皮／内皮タイプの細胞
経上皮抵抗の全体値は、２つの主要な成分からなっている。それは、擬上皮を作り上げている個々の細胞の“ホールセル（ｗｈｏｌｅ−ｃｅｌｌ）”コンダクタンスの合計と、細胞内コンダクタンス経路群の合計である。
【００５０】
自然発生する上皮（と内皮）細胞は、互いに密な結合を形成する。この密なパッキングによって細胞間のイオン／溶質の漏れが減少し、その結果として、膜全体を貫通する細胞内コンダクタンス経路は比較的少数になる。したがって、密な結合が形成される条件であれば、経細胞膜コンダクタンスの変化を測定することが可能である。この方法への１つのアプローチは、適切な成長特性を有するホスト細胞を選択することであった。本来のイオンチャネルも低レベルで発現するタイプの細胞は、クローニングされたイオンチャネルの発現に適していると考えられる。このアプローチにおける当業者にとっての大きな障害は、後者の条件が当てはまる細胞を入手することである。
ｂ）非上皮細胞における経上皮抵抗測定
上に記述したアプローチの一代替手段は、選択したイオンチャネルを発現するクローニングされた細胞のための基本的発現システムとして、独自のイオンチャネルを無視できる程度しか発現しないことが知られている非上皮細胞を用いることである。この基準を満たすタイプの細胞はいくつかある。しかし、そうしたタイプの細胞は、培養しても互いに接触する細胞が密な結合を有する層を形成しないという点が、当業者にとっての大きな障害だった。本発明の一態様では、この障害を克服した高抵抗“上皮”層が提供される。
経上皮電流測定（大量並列電位固定（ＭＰＶＣ））
細胞層を形成している各細胞の一方の面を破壊するか透過可能にすることによって“上皮”内で細胞の内部にアクセスできるようにすることで、本発明の一態様が得られた。これは、化学的な方法または物理的破壊によって実現された。化学的な方法では、例えば、ある種の抗生物質（例えばアンフォテリシン）または界面活性剤（ディギトニン）を細胞表面の一方の面に接触させる。物理的破壊では、例えば高電圧を用いる（エレクトロポレーション／インテグラル・ザッパー）。
電気的記録システム
多数のシステムが開発されており、その概略を以下に示す。
試験システム
擬上皮（ｐｓｅｎｄｏ−ｅｐｉｔｈｏｌｉａｌ）層の完全性を試験するため、透過可能な組織を培養する支持体を入れたチェンバーを用いて経上皮抵抗を測定した（図１）。細胞は培養によってこの支持体上で成長し、集合体を形成した。穿孔した支持体の場合、材料（例えばカバースリップ）を専用の試験装置内に入れた。この装置のおかげで、下部コンパートメントおよび／または上部チェンバーの中の圧力変更と抵抗測定が可能になる（図２）。電極が分極するのを避けるため、振動する電圧信号を、細胞層が成長しつつある透過可能な支持体の上下に位置する直線形または円形の電極を通じ、その細胞層を横断するように印加し、その細胞層のインピーダンスを測定した。透過可能にした細胞層の場合には（図１ｂ、図２ｂ）、実験のプロトコルを制御するとともにデータを取得するコンピュータに接続した電位固定増幅器を用いて電圧／電流固定の記録を取った。
スケールアップと操作システム
ＴＥＲＭとＭＰＶＣのいずれにおいても、市販されているスクリーンにはマルチウエル・プレート測定システム（図３）またはそれと等価なシステム（例えばナノリットル・ピエゾ・ディスペンサーを用いて作る液滴マトリックスが利用されているシステム）が用いられている。これは、ある程度は上記の試験装置を基にしたものだが、総合記録ヘッドを別に設計する必要があった。本発明により可能な総合記録ヘッドの実施態様は多数ある。それらを以下に記述する。
【００５１】
ｉ）単一のウエルを順番に読んでいく単一の記録ヘッド（図４）。
ii）一列に並んだ移動式記録ヘッド（例えば96ウエル・システムでは12個、384ウエル・システムでは24個）で、８ステップ（96ウエルの場合）または16ステップ（384ウエルの場合）でプレートを横断する。
iii）プレートに組み込まれた電極マトリックスで、記録ヘッドとデータ取得システムのための多重送信機能を備えたもの。密集度がより大きいプレートの場合には、複数の電位固定を行なうことでサンプリング周波数を維持し、したがって時間分解能を維持する（図３）。
【００５２】
iv）液滴システム（図５）。
マルチウエル・プレートの改良
本発明のスクリーンの態様は、ＴＥＲＭとＭＰＶＣの現行実用バージョンにおける総合自動化ピペッターを含むことが好ましい。
本発明のスクリーンの態様は、別々の列で使用される隙間の時間に記録ヘッドを洗浄する設備を含むことが好ましい。
【００５３】
本発明の一態様によれば、生物学的膜の作製方法は、穿孔されたガラス製支持体（または他の支持体）に対する高抵抗シールを得るステップおよび／またはシート形成能力を有すると同時に本来のイオンチャネルの数が少ないか無視できる程度であるような細胞系を獲得するステップを含んでいる。
上皮細胞アプローチ
自然発生の細胞系および人工的な細胞系を開発した。それらを以下に記述する。
自然発生の細胞系
この明細書で言及した細胞系が“既製品”として適しているかどうかを評価した。最初の候補には、ＥＣＶ−304、ＲＢＥ４、Ｃ６グリオーマ細胞が含まれていた。使用の基準は以下のようであった。
【００５４】
ａ）互いに接触した細胞が密な結合となって層を形成する能力。経上皮抵抗が125Ωcm-2以上。
ｂ）標準的な方法でホールセル・パッチクランプを行なうことにより評価した場合に、背景の電位依存性イオンチャネルの数が少ないか、無視できる程度であること。コンダクタンスのレベルが細胞１個あたり２ｎＳ以下であることが好ましい。
人工的な細胞系
適切な細胞系を分子工学によって用意した。自然発生の細胞系の背景コンダクタンスが上のｂ）で与えた閾値を超えた場合には、その細胞系は、遺伝子がノックアウトされた可能性があり、新しい宿主細胞を作れると評価された。
人工的上皮
穿孔された支持体
穿孔された支持体を、以下のようにして開発した。
レーザーを利用して作製した支持体
ａ）プロトタイプ
コンピュータで自動制御される台と倒立光学顕微鏡に接続されたレーザー光源を用い、ガラス製のカバースリップに連続的に穿孔した（一度に孔１つ）。この操作により、焦点領域、レーザーパワー、露出時間といったパラメータを細かく制御してプロトタイプを製作することができた。このようにして製作したカバースリップを用いて、細胞と支持体の間に高抵抗のシーリングができるかどうかをテストした。
【００５５】
グリッド・パターンを、コンピュータを介してレーザーに接続されたコンピュータ制御の台を用いてさまざまなフォーマットで繰り返し生成した。ガラスやそれ以外のさまざまな材料（プラスチックや生体適合性のある材料）からなるカバースリップを使用した。その直径は、10mm（96ウエル・プレートの場合）または５mm（384ウエル・プレートの場合）で、厚さはさまざまである（約１〜20ミクロン）。直径が0.5〜10ミクロンの孔を開けた。孔の輪郭、先細りの程度、内径、外径を評価して、テスト細胞をシールするのに最適となるようにした。孔が適切な滑らかさになるようにすることが重要である。孔の密集度は、ＳＮ特性、電位固定の記録の忠実度、統計学的に考慮すべき事柄が最適になるよう決めた。
【００５６】
細胞と孔の間のシーリングがうまくいくようにするため、多くの方法を試した（図１）。その概略を以下に示す。
ｉ）下部液体コンパートメント内を負圧にする。そのためには、例えば中央部がくびれた孔を通過する流体および／または全体的に減圧した状態での流体供給によって起こされるベンチュリ効果を利用する。
【００５７】
ii）上部液体コンパートメント内を正圧にする。
iii）孔の形成プロセスを通じ、孔のある領域で非付着性材料を燃やし、その材料でスライドグラスをコーティングする（すなわちレーザーを用いた孔形成）。
iv）スライドグラスを揺らし、または振動させて、細胞が、孔でない位置で支持体に付着する前に孔を“見つけ”られるようにする。
【００５８】
ｖ）スライドグラスのカルーセルまたはマルチウエル・プレートのカルーセル（ｃａｒｏｕｓｅｌ）に遠心力を加えられるようにする。
vi）孔に電圧を印加し、細胞を孔の中に移動させる。
驚くべきことに、レーザーを用いて孔を形成したところ、顕著な成果がもたらされた。
【００５９】
図７は、この方法で形成した典型的な孔を示す。生理溶液を孔のいずれかの側に添加したとき、支持体を横断する抵抗が、常に、典型的には200ｋΩ〜400ｋΩの範囲の値になることが観察された。細胞を添加すると、観察された抵抗値は、この数値の約２倍になった。上に概略を示した方法の１つまたはそれ以上をさらに行なうと、抵抗の測定値がギガオームのオーダーに近づくことが観察された。ｂ）スケールアップ
大量穿孔と同時記録（シーリング）の評価を行なった。この方法には、マルチウエル・プレート（またはそれと等価なマトリックス）の底面全体を高エネルギーのレーザー光源で“フラッシュ”する操作が含まれる。ウエル構造が適切だと必要な孔の正確な位置がわかっているため、細胞密集度を適切に制御することで、細胞が“家にいる”確率を高くすることができる。プレートに孔を開け、それとほぼ同時に、中央部がくびれた細胞の表面を破る。そのためには、（上述の）プロトタイプで使ったよりもはるかに高いエネルギーのレーザーが必要とされる。
ｃ）細胞のタイプ
本発明をなすのにチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）の細胞を用いてきたが、当業者には明らかなように、さまざまな細胞系や初代細胞、例えば完全な組織から分離したニューロンなどを用いることができる。
他の穿孔方法
ガラスその他の材料からなるスライドスリップに穿孔する別の方法、例えばエッチングや、ガラスまたはプラスチックからなるシートの成形を評価した。
多孔性ゴム
多孔性ゴムからなる支持体が、細胞培養して細胞を成長させるのに市販されている。孔の割合を、本明細書に記述してある抵抗と電流の測定への応用という観点から評価した。
他の材料
当業者には明らかなように、本発明ではＰＴＦＥ、ＰＥＴＰなどの材料も用いることができる。これらの材料は、誘電率が大きいだけでなく、極めて薄いシートに加工できるという利点を有する。これは、システム全体の直列抵抗の最小値を下げると同時に、細胞の細胞質ゾルに外部からの物質を導入しやすくできるという利点を有する。
マルチウエル・プレート記録装置
基本となるマルチウエル・プレート記録装置は、96ウエル／位置フォーマットとなっていることが好ましい。複数の96ウエル・フォーマットを、最小限の拡張によって384ウエル・フォーマットにすることが好ましい。ウエルの密集度を高めることの１つの利点は、使用するテスト化合物の量が少なくてすむようになり、しかも使うプレートの数が少なくなるため、それに付随してテスト化合物あたりのランニング・コストを減らせることである。
【００６０】
以下の２通りの方法を評価した。
ａ）市販されているロボットとプレート・プロセッサに接続するよう設計されたＴΩＲＭワークステーション。
ｂ）プレートの処理、溶液の交換、ヘッド台の記録を行なう、完全統合型スタンド・アローン・システム。
流体マトリックス・システム
細胞を懸濁させた溶液を含有する液滴を、所定のパターンと密集度になるように記録用支持体上に分配して、ミニチュア記録チェンバー・アレイを作った（図５参照）。この支持体は、上に記述したいずれのタイプの支持体でもよく、例えば穿孔されたガラス、プラスチック、ゴムなどが可能である。完全な記録用配置は、記録用電極を備える“蓋”または移動可能な記録ヘッドを液滴マトリックスの上に置き、液滴溶液のメニスカスを図５に示したように実現することで完成する。穿孔された支持体の裏側にも液滴アレイを設け、少なくとも１つの参照用電極と、支持体の下部表面つまり細胞膜に物質を添加する手段への導電経路ができるようにしてもよい。同様に、図６に示したように、試薬を“記録用プレート”に設けられた別の液滴マトリックスを通じて添加することもできる。その場合、薬物溶液を記録“ヘッド”プレートの上に分配し、次いでそのプレートをひっくり返し、ひっくり返されたプレートを今度は細胞マトリックスにドッキングさせて薬物を細胞と接触させることができる。この方法の利点は、シート状の支持体を設計できるために円板状支持体をマルチウエル・プレートのところに移動させる必要がなくなり、しかもシールやＯリングなどを用いた複雑な設計のチェンバーが不要になることにある。本発明はさらに、溶液の追加を受け入れることができ、しかも、非常にわずかの容積しか使用せず、したがって試薬と細胞の量が少なくてすむというさらなる利点を有する。
参考文献
ブルー，Ｈとアットウェル，Ｄ（1987年）、「起電性グルタミン酸塩の取り込みが、アホロートルの網膜グリア細胞の膜における主要な電流担体である」、『ネイチャー』第327巻、707〜709ページ。
ハミル，Ｏ．Ｐ．，マーティ，Ａ．，ネーアー，Ｅ．，ザックマン，Ｂ．，シグワース，Ｆ．Ｊ．（1981年）、「細胞およびセルフリー膜パッチから高分解能で電流を記録するための、改良されたパッチクランプ技術」、『フリューガーズ・アーカイヴズ』、第391巻、85〜100ページ。
ヒル，Ｂ．編、「興奮性膜のイオンチャネル」、1992年。
シナウアー・アソシエイツ、サンダーランド。ザックマン，Ｂ．，ネーアー，Ｅ．編、「単一チャネル記録」、1995年、プレナム・プレス、ニューヨーク＆ロンドン。
マーゴルスキー，Ｒ．Ｆ．，マクヘンドリー−リンド，Ｂ．，ホーン，Ｒ．（1993年）、「電気生理学的研究のためにトランスフェクトされた細胞を選別する」、『バイオテクニックス』、第15巻、906〜911ページ。
シェング，Ｍ．（1996年）、「ＰＤＺと受容体／チャネル・クラスタリング：最新の疑問点を解決する」、『ニューロン』第17巻。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、本発明の一態様に従うスクリーンの上皮細胞バージョンを示す。
【図２】  図２は、穿孔された支持体を有する本発明のスクリーンの一態様を示す。
【図３】  図３は、市販されているマルチウエル・プレートを利用した本発明のスクリーンの一態様を示す。この図は、多重記録用総合電極ヘッド・クラスターを示す。
【図４】  図４は、単一の記録ヘッドがウエルを順番に１つずつ読んでいく移動式記録ヘッドを用いた一態様を示す。
【図５】  図５は、流体マトリックス・システムの一態様を示しており、ここでは所定のパターンおよび所定の密集度で記録用支持体上に液滴を分配することによってミニチュア記録チェンバー・アレイを作製する。図５（ｆ）は、サンドイッチ状態（記録用配置）になったこのシステムの全体を示す。
【図６】  図６は、液体マトリックス・システムの別の態様で、複数の液滴アレイがサンドイッチ状になっている状態を示す。
【図７】  図７は、本発明に従って支持体に開けられた１個の孔を示す。この光学顕微鏡写真は、薄いガラスからなる支持体に開けられた孔を示している。孔は直径が約２ミクロンで、レーザーのエネルギーを収束させたパルスを用いて孔を形成した後、火仕上げとプラズマによる調節を施したものである。スケールを示す棒は、長さが10ミクロンである。
【符号の説明】
１…細胞
２…透過可能にされた細胞表面
３…電位固定
４…孔が多数ある支持体
５…電極
６…ウエルの壁面
７…溶液還流チャネル
８…細胞系または初代細胞
９…透過可能にされた細胞
10…マルチウエル・プレート（例えば96ウエル）
11…総合記録ヘッド・クラスター
12…マルチプレクサ
13…ＡＤＣ／コンピュータ
14…液面レベル
15…孔
16…Ｏリング
17…記録装置
18…細胞用プレート
19…参照用プレート
20…記録用プレート
21…参照用電極
22…記録用電極
23…“半サンドイッチ”
24…完成したサンドイッチの全体（記録用配置）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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