(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌を治療するための医薬の製造のための抗体またはその断片の使用であって、前記抗体が配列番号2または配列番号4のポリペプチドに結合する、使用。
【請求項２】
前記癌が胃腺癌である、請求項１に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、病変細胞中で差次的に発現されるポリヌクレオチドおよびポリペプチド、ならびにそれらに関係する疾患の診断、評価、治療、および予防の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は、心疾患にのみ先行を許す米国で第2位の死亡原因である。2002年、米国癌学会は、1,284,900件の新規な症例が診断され、癌と共に生きる1.600万人のうち550,000人の死亡が予想されると推定した。癌は、細胞内の遺伝子の遺伝的変化または機能不全によって生じ、それによって異常細胞が無制御に増殖して腫瘍塊または新生物が形成される。細胞の無制御な増殖の主要な要因の1つは、癌原遺伝子の過剰な発現および/または腫瘍サプレッサ遺伝子の発現の不足である。これらの両遺伝子は、癌の病因に中心的役割を果たし、これら2つのポリヌクレオチドクラスのポリヌクレオチドの発現の不均衡が癌の不滅化を永続させる。発癌遺伝子クラスおよび腫瘍サプレッサ遺伝子クラスならびにポリペプチドには、上皮細胞成長因子(EGF)やトランスフォーミング成長因子α(TNF-α)などの成長因子および対応するその受容体、細胞内シグナル伝達ポリペプチド(チロシンキナーゼ)、ポリヌクレオチド転写因子、細胞周期制御ポリペプチド、および細胞-細胞間もしくは細胞-マトリックス間相互作用ポリペプチドが含まれる。
【０００３】
無制御細胞増殖によって局在化腫瘍細胞塊の形成がもたらされ、その細胞塊の生存は細胞への栄養素の橋渡しに不可欠な毛細血管などの新生脈管構造の形成によって維持される。したがって、血管形成は腫瘍の生存、増殖、および転移における主要な要素である。血管形成できわめて重要な役割を果たすことが知られているポリペプチドは、EGFやTGF-αを含む成長因子および対応するその受容体、ならびに血管内皮細胞成長因子(VEGF)である。
【０００４】
急速に細胞増殖を続ける局在化した腫瘍塊は、腫瘍細胞が元の腫瘍塊から分裂し、血液またはリンパ系によって体内の局所リンパ節および遠位主要構造へ遊走し、最終的に隣接組織に浸潤する。腫瘍細胞が浸潤するには、細胞外マトリックスへの細胞の付着と、それに続くその分解、最後に腫瘍細胞の遊走が必要とされる。好ましい部位へのある種の癌の播種は、細胞表面上のある種のポリペプチドの存在によって決定されることが示されており、このポリペプチドは標的細胞上の選択した細胞表面マーカーにホーミングすることができる。
【非特許文献１】Kunkelら、(1987) Meth. Enzymol.、154:367〜382頁
【非特許文献２】Shimaokaら、(2002) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struc.、31:485〜516頁
【非特許文献３】WangおよびSpringer、(1998) Immunol. Rev.、163:197〜215頁
【非特許文献４】Cassanovaら、(1998) J. Virol.、72:6244〜6246頁
【非特許文献５】AmzelおよびPoljak、(1979) Annu. Rev. Biochem.、48:961〜997頁
【非特許文献６】Garcia、(1999) Annu. Rev. Immunol.、17:369〜397頁
【非特許文献７】HenneckeおよびWiley、(2001) Cell、104:1〜4頁
【非特許文献８】de Vosら、(1992) Science、255:306〜312頁
【非特許文献９】DellerおよびJones、(2000) Curr. Opin. Struc. Biol.、10:213〜219頁
【非特許文献１０】ChothiaおよびJones、(1997) Annu. Rev. Biochem.、66:823〜862頁
【特許文献１】米国特許第5,464,764号
【非特許文献１１】Kaufman、Meth. Enzymol.、(1990)、185:537頁
【非特許文献１２】Cappecchi、Science (1989)、244:1288〜1292頁
【非特許文献１３】Wagner、Development (2002)、129:1377〜1386頁
【非特許文献１４】Chongら、(2001) Gene、275:241:252頁
【非特許文献１５】McCaffertyら、(1990) Nature、348:552〜554頁
【非特許文献１６】Aujameら、(1997) Hum. Antibodies、8:155〜168頁
【非特許文献１７】Griffithsら、(1994) EMBO、13:3245〜3260頁
【非特許文献１８】Vaughanら、(1998) Nat. Biotechnol.、16:535〜539頁
【非特許文献１９】Jonesら、(1996) Nature、321:522〜525頁
【非特許文献２０】Riechmanら、(1988) Nature、332:323〜327頁
【特許文献２】米国特許第5,530,101号
【非特許文献２１】Queenら、(1989) Proc. Natl. Acad. Sci.、86:10029〜10033頁
【非特許文献２２】Padlan、(1991) Mol. Immunol.、28:489〜498
【非特許文献２３】LoBuglioら、(1989) Proc. Natl. Acad. Sci.、86:4220〜4224頁
【非特許文献２４】Sambrook、Jら、(1989) Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press.
【非特許文献２５】Phillipsら、(2000) Science、288:1635〜1640頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、無制御細胞増殖、血管形成、および細胞伝播を阻害することは、腫瘍の進行および再発を巧みに処理するための薬物療法の開発におけるいくつかの主要な標的である。癌および癌療法の分野では多大な進歩がなされてきたが、今日開発の治療の多くは満足するまでには至っておらず、こうした特異的腫瘍型の多くのために代替のアジュバント療法が依然として必要とされている。本出願は、ある種の腫瘍細胞中で差次的に発現され、癌の診断、評価、治療、および予防で使用することができるポリペプチドをコードする新規なポリヌクレオチドの発見に関与する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、単離および/または精製した、ヒトおよびマウスのS30-21616/DEGAポリヌクレオチド(それぞれ、hS30-21616/DEGAまたはmS30-21616/DEGA)、詳細には配列番号1および配列番号3、またはその断片を提供する。本発明は、単離および/または精製したヒトおよびマウスのS30-21616/DEGAポリペプチド(hS30-21616/DEGAおよびmS30-21616/DEGA)、詳細には配列番号2および配列番号4、ならびにその断片も提供する。さらに、本発明は、そのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドを使用し、疾患を診断、評価、治療、および予防するための方法および組成物を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明は、肺癌細胞系、A549cDNA(BD Biosciences/Clonentech、米国カリフォルニア州Palo Alto)から、1569ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを有する新規なポリヌクレオチド配列を単離することに関する。このヒトヌクレオチド配列は、hS30-21616と称し、または胃腺癌のその差次的発現プロフィール(Differential Expression Profile in Gastric Adenocarcinoma)のためにhS30-21616/DEGAと称する。このポリヌクレオチド配列のマウス同等体mS30-2161/DEGAも単離しており、この同等体は造血幹細胞サブトラクティブcDNAライブラリーおよびマウス腎臓癌細胞系で差次的に発現する。したがって、本発明は、ヒト(hS30-21616/DEGA)およびマウス(mS30-21616/DEGA)のS30-21616/DEGAポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【０００８】
本発明のポリヌクレオチドは、DNA、RNA、DNA/RNA二重鎖、ポリペプチド-核酸(PNA)、またはその誘導体であってよい。ポリヌクレオチド配列には、mRNAまたはDNA分子の全てまたは一部を識別し、クローニングし、増幅するためのよく知られた、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)または様々なハイブリダイズ技術で使用するのに十分な長さの断片またはセグメントが含まれる。たとえば、高度にストリンジェントな条件下でのハイブリダイズは、以下の核酸ハイブリダイズおよび洗浄条件を意味する。50%ホルムアミドの存在下42℃でのハイブリダイズ、65℃で1%SDSを含む2×SSCを用いる1回目の洗浄、それに続く65℃で0.1×SSCを用いる2回目の洗浄。さらに、本発明のポリヌクレオチドは、上記のヌクレオチドまたはペプチド、たとえば、cDNAおよびmRNAのいずれかの相補体を含む。
【０００９】
本明細書では、「単離した」または「精製した」は、分子、たとえば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、細胞物質または自然にそれらに随伴する他の成分から分離されることを意味する。典型的には、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドはそれと自然に関連する蛋白質および他の天然の有機分子を除いて、少なくとも60(重量)%である場合、このポリヌクレオチドまたはポリペプチドは実質上純粋である。調製物の純度は、好ましくは少なくとも75(重量)%が、より好ましくは少なくとも90%が、最も好ましくは少なくとも99重量%である。実質上純粋なポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、たとえば、天然源からの抽出、ポリペプチドをコードする組換え核酸を発現、または化学合成によって得ることができる。純度は、任意の適切な方法、たとえば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはHPLC分析によって測定することができる。用語、単離または精製したは、他の無数の配列断片を含むライブラリー型調製物をさすものではないと理解されたい。化学合成ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはそれが自然に生じた細胞型以外の細胞型で産生した組換えポリヌクレオチドもしくはポリペプチドは、定義により、それに自然に随伴する成分を実質上含まない。したがって、実質上純粋なポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、真核生物に由来するが、大腸菌または他の原核生物中では産生しない配列を含むポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含む。
【００１０】
本発明の単離した核酸またはポリヌクレオチドは、配列番号1(hS30-21616/DEGA)および配列番号3(mS30-21616/DEGA)のヌクレオチド配列、またはその断片を含むことが好ましい。あるいは、ポリヌクレオチドは、配列番号2(hS30-21616/DEGA)および配列番号4(mS30-21616/DEGA)のアミノ酸配列、または少なくとも8アミノ酸長のその断片を有するポリペプチドをコードすることも好ましい。
【００１１】
さらに、ポリヌクレオチドには、前記ポリヌクレオチド配列の縮重変異体(degenerate variant)、相同体、または変異体が含まれる。用語、縮重変異体は、ポリヌクレオチド配列、特にコドンの第3塩基の変化（この変化はヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列に影響を与えない）をさす。用語、相同体は、同等の構造および/または機能を有する異なる種に由来するポリヌクレオチド配列をさす。変異体は、当技術分野で周知の組換えDNA技術を使用し、または自然に選択されている1個または複数のヌクレオチドの付加、欠失、または置換など、ポリヌクレオチド配列の変化をさす。Kunkelら、(1987) Meth. Enzymol.154:367〜382頁。
【００１２】
本発明の範囲内に含まれるポリヌクレオチド配列は、上記の配列番号1または配列番号3のポリヌクレオチド配列に実質上同等なヌクレオチド配列を含む。上記発明のポリヌクレオチド配列は、配列番号1または配列番号3に記載したポリヌクレオチドに少なくとも約80%、好ましくは90%、より好ましくは95%同一である配列を有していてよい。
【００１３】
本発明のポリヌクレオチドは、ポリペプチド(S30-21616/DEGAポリペプチド)をコードする。したがって、本発明は、単離および/または精製したS30-21616/DEGAポリペプチドを提供する。本発明の一実施形態では、S30-21616/DEGAポリヌクレオチドは、約523個のアミノ酸を含むS30-21616/DEGAポリペプチドをコードする。別の実施形態では、ポリペプチドは細胞表面上に発現する。本発明のS30-21616/DEGAポリペプチドは、配列番号2(hS30-21616/DEGA)および配列番号4(mS30-21616/DEGA)のアミノ酸配列、または少なくとも8アミノ酸長のその断片を含むことが好ましい。
【００１４】
これらのポリペプチドには、ポリヌクレオチド配列の機能性同等体、相同体、または変異体が含まれる。用語、機能性同等体は、付加、欠失、および置換を含むアミノ酸配列の変異体をさし、この変異体は、ポリペプチドの特性、たとえば、電荷、IEF、親和性、結合活性、高次構造、溶解度などを実質上変化させずに、そのポリペプチドの特異的機能、または免疫学的交差反応性を保持する。用語、機能性同等体には保存的アミノ酸置換体が含まれ、この置換体はポリペプチドのアミノ酸を、一般に同様の特性、たとえば、酸性、塩基性、芳香性、寸法、正の電荷または負の電荷、極性、非極性を有するアミノ酸と置換することによってアミノ酸配列を変化させることを含む。用語、相同体は、同等の特性および/または機能を有する異なる種に由来するポリペプチド配列をさす。変異体は、スプライシング、多型、または他の事象により生じるポリペプチド配列の変化、ならびに自然に選択されたであろうポリペプチド配列の変化をさす。
【００１５】
本発明の範囲内に含まれるポリペプチド配列には、上記の配列番号2または配列番号4のポリペプチド配列に実質上同等のアミノ酸配列が含まれる。上記発明のポリペプチド配列は、配列番号2または配列番号4に記載したポリペプチドに、少なくとも約80%、好ましくは90%、より好ましくは95%同一である配列を有していてよい。
【００１６】
本発明のポリペプチドは、連続方式で細胞外N末端ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内C末端ドメインを含むことが好ましい。たとえば図5を参照のこと。そのようなポリペプチドは、全長かつ任意のS30-21616/DEGAポリペプチドの細胞外または細胞内変異体をも含み、たとえば、膜貫通型ドメインの欠失の結果生じた溶解性変異体を含む(配列番号5)。
【００１７】
このS30-21616/DEGAポリペプチドの一機能は、決して唯一の機能ではないが、細胞表面膜貫通型受容体である。膜貫通型受容体には、たとえばポリペプチドキナーゼが含まれ、このキナーゼはATPから標的基質ポリペプチドの特異的アミノ酸残基へのリン酸基の移送を触媒する酵素である。これらの酵素は、シグナル伝達から膜輸送に及ぶ範囲の様々な細胞事象に重要である。チロシンポリペプチドキナーゼは、分裂促進的なシグナル伝達に関与し、このシグナル伝達が迅速なシグナル伝達を開始する一方で、セリン/トレオニンキナーゼが広く統合されシグナルを増幅する。
【００１８】
さらに、S30-21616/DEGAポリペプチドは、細胞接着分子(CAM)としても機能し得る。CAMは、細胞型、細胞活性化状態、および細胞機能に依存して特有のパターンであらゆる細胞型の表面に発現するグリコポリペプチドおよび糖分子の多様な群である。これらの分子は、細胞間の接着および細胞と細胞外マトリックス分子との間の接着を媒介して「VELCRO(登録商標)効果」を提供し、細胞がその環境を調査できるようにするために互いを選択的に認識し結合する(Shimaokaら、(2002) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struc.、31:485〜516頁、WangおよびSpringer、(1998) Immunol. Rev.、163:197〜215頁を参照のこと)。CAMは、様々な細胞過程で役割を担うことが知られており、それだけには限らないが以下の過程が含まれる:(1)臓器/組織の発生および統合、(2)免疫応答の開始および拡大、(3)免疫細胞および炎症性細胞の炎症部位への遊走または往来、(4)創傷治癒、(5)癌転移、(6)細胞シグナル伝達、および(7)ウイルス性および細菌性病原体による侵入選択部位として(Cassanovaら、(1998) J. Virol.、72:6244〜6246頁)。
【００１９】
CAMのいくつかの例には、それだけには限らないが、糖類を認識するセレクチン、主として白血球および血小板上に発現するインテグリン、内皮細胞および白血球上に発現する免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーが含まれる。免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーには、細胞内接着分子-1(ICAM-1)、血管性細胞接着分子-1(VCAM-1)、および神経接着分子のL-1ファミリーが含まれる。CAM結合は、カルシウム依存性またはカルシウム非依存性であってよい。カルシウム依存性接着分子の例には、カドヘドリン(上皮E-およびP-カドヘドリン、表皮および胎盤中のデスモソーム型カドヘドリン、および神経細胞、筋肉細胞、およびレンズ細胞に多く見出されるN-カドヘドリン)、セレクチン、およびインテグリン(同様にマグネシウム依存性)が含まれる。非カルシウム依存性CAMは、免疫グロブリン(Ig)スーパーファミリーに属する。そのリガンドへのCAM結合は、しばしば、シグナル伝達カスケードを誘発し、このカスケードにはポリペプチドキナーゼC(PKC)、分裂促進因子活性化ポリペプチドキナーゼ(MAPK)、局所接着キナーゼ(FAK)、およびホスホリパーゼC(PLC)などの様々なキナーゼが関与する。
【００２０】
したがって、本発明の一実施形態では、たとえば、腫瘍細胞の増殖を制御するために、CAMとそのリガンドの間の相互作用を撹乱し、またはそのキナーゼを阻害することができる薬剤または小分子を使用することができる。小分子のスクリーニング方法の例は以下に説明する。本発明の別の実施形態では、細胞接着に重要な役割を果たすことが確認されたポリペプチドのドメインをコードするヌクレオチド配列は、変異していてよく、それによって分子をその正常な標的に結合できないようにする。本発明の別の実施形態は、リガンドへ結合する様々な程度の細胞接着を強化するためのそのようなドメインの設計を含む。
【００２１】
本発明のポリペプチドの定義では、本発明の範囲内にその変異体(variant)または類似体も含まれる。用語、変異体は、アミノ酸が付加されたポリペプチドを含むものとし、それだけには限らないが、翻訳および分泌を促進するためのメチオニンおよび/またはリーダー配列の付加、精製を容易に行うためのアミノ酸配列またはタグの付加(たとえばポリヒスチジン配列)、および融合ポリペプチドを産生するための他のポリペプチド配列の付加を含む。用語「変異体」は、アミノ末端またはカルボキシル末端、あるいはそれだけには限らないが、ポリペプチド配列S30-21616/DEGAの膜貫通型領域などの保持を担う領域のアミノ酸が欠失しているポリペプチドも含むものとする。本発明は、溶解性ポリペプチドである、膜貫通型領域が欠損したポリペプチド変異体または類似体を含む。用語「変異体」は、前記ポリペプチドの機能および構造に矛盾しない、1個または複数のアミノ酸残基に修飾を加えたポリペプチドも含むものとする。そのような修飾には、グリコシル化、リン酸化、硫酸化、および脂質化が含まれる。
【００２２】
企図するポリペプチド変異体または類似体は、腫瘍細胞などの天然源から精製、単離したポリペプチド、または組換え手法で合成したポリペプチド、すなわち（たとえば、配列番号2および配列番号4のアミノ酸配列の）保存性置換の結果としてその正確なアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有する変異体ポリペプチドを含む。当業者によって認識されるように保存的アミノ酸置換は、ポリペプチドの機能および構造の維持に矛盾しないアミノ酸配列の変化である。
【００２３】
本発明の好ましい実施形態では、S30-21616/DEGAポリペプチドは、ロイシンリッチ細胞外N末端部分、すなわち、配列番号6、7、8、9、10、11、または12のロイシンリッチリピート(LRR)および配列番号13のIgドメインを含む。たとえば、図1を参照のこと。一般に、ロイシンリッチポリペプチドは、細胞マトリックス中でまたは細胞表面上で、ポリペプチド-ポリペプチド間相互作用において重要な役割を果たすことが知られている。ポリペプチド-ポリペプチド間相互作用の特異性および多様性は、配列に隣接する非コンセンサス残基から起こり得る。
【００２４】
その用語が暗示する通り、免疫グロブリンすなわちIgドメインは、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖に類似する、全てβ鎖対またはサンドウィッチからなる十分に限定された領域であるポリペプチドクラス内のドメインである。これらのβ鎖(シート)またはサンドウィッチは、分子間認識のための潜在的部位として働く。一般に、Igドメインは、構造足場(structural scaffold)として機能し、または他のポリペプチド、DNA、もしくはリン脂質との特異的分子間相互作用を媒介する。構造足場として、一連のIgドメインは、分子間結合特性を有する一つのドメイン、および隣接するドメインと相互に作用する他のドメインによって構成単位として働き得る。構造足場としてIgドメインを有するポリペプチドの例には、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖(AmzelおよびPoljak、(1979) Annu. Rev. Biochem.、48:961〜997頁)、T細胞受容体およびB細胞受容体の細胞外ドメイン(Garcia、(1999) Annu. Rev. Immunol.、17:369〜397頁)、主要組織適合複合体(HenneckeおよびWiley、(2001) Cell、104:1〜4頁)、成長因子(de Vosら、(1992) Science、255:306〜312頁)、サイトカイン受容体(DellerおよびJones、(2000) Curr. Opin. Struc. Biol.、10:213〜219頁)、および接着分子(ChothiaおよびJones、(1997) Annu. Rev. Biochem.、66:823〜862頁)が含まれる。S30-21616/DEGAポリペプチドのIgドメインは、配列番号13のアミノ酸配列を含むことが好ましい。たとえば、図5Bを参照のこと。
【００２５】
本発明の別の実施形態では、S30-21616/DEGAポリペプチドは、少なくとも1個のLRRを含むIgドメインを含み得る溶解性ポリペプチドである。一般に、LRRモチーフは、保存性11残基のコンセンサスセグメント(LXXLXLXXLXL)を収容する20〜29残基を含むことが好ましく、その場合Xは任意のアミノ酸であってもよく、Lはロイシン、バリン、イソロイシン、またはフェニルアラニン残基でよい。そのようなポリペプチドは少なくともモノマーであり、ポリペプチドは多量体でもよいが二量体が好ましい。別の実施形態では、二量体または多量体はホモ二量体またはホモ多量体であってよい。別の好ましい実施形態では、二量体または多量体は、ヘテロ二量体またはヘテロ多量体であってよい。あるいは、S30-21616/DEGAポリペプチドは、少なくとも1個のLRRおよびIgドメインを含む膜結合S30-21616/DEGAポリペプチドである。
【００２６】
本発明のS30-21616/DEGAポリペプチドのC末端ドメインは、セリンおよびトレオニンリン酸化部位を含み、この部位は様々なキナーゼの結合部位、たとえば、カゼインキナーゼII(CKII)やポリペプチドキナーゼC(PKC)リン酸化部位として働くことができ、したがってシグナル伝達受容体として機能し得る。たとえば、図1を参照のこと。しばしば、どちらかまたは両方のCKII部位およびPKC部位のリン酸化によって、たとえば無制御細胞増殖につながる細胞内シグナル伝達がもたらされる。本発明は、リン酸化を調節し、したがってシグナル伝達を調節することができるように、特にC末端CKIIおよびPKC部位に変異を有するポリペプチドの変異体または類似体を含む。
【００２７】
さらに、図1の予想される開始メチオニンおよび周囲の配列(ACCATAATGT)は、Kozakコンセンサス配列に類似する。潜在的ポリアデニル化配列を下線で示す。S30-21616/DEGA蛋白質配列の特徴は、以下の通りである:シグナルペプチド配列(太字)、膜貫通型ドメイン(太字下線)、推定グリコシル化部位(丸で囲んだアミノ酸)、および推定リン酸化セリンおよびトレオニン(四角で囲んだアミノ酸)。
【００２８】
本発明の一実施形態では、組換え構築体を提供する。これらの構築体は、S30-21616/DEGAポリヌクレオチド、特に配列番号1および配列番号3またはその断片を含み、かつ発現、複製、プローブの生成、および配列決定目的に有用な、プラスミドもしくはウイルスベクター、ファージミド、コスミド、ファージベクター、または誘導体を含むがそれだけには限らない適当なベクターを含む。そのような構築体を使用してS30-21616/DEGAの機能を調節することができる。
【００２９】
S30-21616/DEGA機能は、細胞の核酸の転写制御または翻訳制御を調整することによって上方または下方調節することができ、S30-21616/DEGAポリヌクレオチドの発現を阻害し、またはS30-21616/DEGAのポリペプチド量を変化させる。上方調節によってS30-21616/DEGAに関連する活性の強化が意味される一方、下方調節によってこの活性の減退または阻害が意味される。S30-21616/DEGAポリヌクレオチドの発現制御は、DNAまたはRNAレベルでよい。DNAレベルで阻害され得る機能には複製または転写が含まれる。干渉RNAの機能には、ポリペプチド翻訳部位へのRNAの移行、RNAからポリペプチドへの翻訳、1種または複数のmRNA種を得るためのRNAのスプライシング、およびRNAが関わり得る、またはRNAによって促進され得る触媒活性が含まれる。
【００３０】
S30-21616/DEGAポリヌクレオチドの発現を阻害することができる一つの薬剤または構築体はアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、これはDNAもしくはRNAまたはそのハイブリッドの形をしていてよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、cDNA、ゲノムDNA、または合成RNAもしくは合成DNAであってよい。DNAは、2本鎖または1本鎖でよく、1本鎖はコード鎖または非コード鎖であってよい。アンチセンスは、オリゴマーとその標的核酸を特異的にハイブリダイズさせ、核酸の正常な機能に干渉する。複製および転写を含むDNAの機能は全て、アンチセンスによって干渉を受ける可能性がある。さらに、RNAの機能は全て、アンチセンスによって干渉を受ける可能性があり、たとえば、蛋白質翻訳部位へのRNAの移行、mRNAから蛋白質への翻訳、1種または複数のmRNA種を得るためのRNAのスプライシング、およびRNAが関わり得る、またはRNAによって促進され得る触媒活性が含まれる。そのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドの全体的作用により、細胞中でのS30-21616/DEGAの発現が阻害され、それによってDNA転写、RNA翻訳、およびポリペプチドの産生が低減され得る。
【００３１】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号1および配列番号3のヌクレオチド配列部分、またはその相補体を含むことが好ましい。またアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号2および配列番号4のS30-21616/DEGAポリペプチドの全てまたは一部をコードするヌクレオチド配列部分に相補的であることが好ましい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、20〜30ヌクレオチド長のS30-21616/DEGA核酸の短い遺伝子特異的配列を含むことが好ましく、12〜25ヌクレオチド長がより好ましい。
【００３２】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、受容体媒介エンドサイトーシス、マイクロインジェクション、およびDNA蛋白質複合体、またはカチオン性リポソームのカプセル化媒介を含む任意の適当な方法によっても細胞中に送達することができる。送達を改善する別の方法は、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列に受容体リガンドまたは細胞特異的抗体を結合させて、それらを特定の標的細胞および/または組織領域に指し向け誘導する際の援助をさせることによる。
【００３３】
治療分子としてのアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用に伴う大きな問題の1つは、血液および細胞中でのオリゴヌクレオチドの迅速な酵素的分解である。一解決策は、オリゴヌクレオチドの極性を末端で逆転させることである。この概念は、細胞内分解が主としてエクソヌクレアーゼによるものであり、したがってオリゴヌクレオチド末端を修飾することは配列を安定させるはずであるという仮説に基づく。
【００３４】
提案されている別の解決策は、たとえば、ホスホロチオ酸結合を形成するために、ヌクレオチド塩基間のリン酸ジエステル結合を改変することによるもので、この改変は、リン酸塩主鎖の1個または複数の非結合酸素を硫黄原子に置換して、たとえば、モノチオリン酸塩およびジチオリン酸塩を形成することによる。これらの改変オリゴヌクレオチドは、半減期が増加することが示されている。硫黄修飾の他に、アンチセンスオリゴヌクレオチドの糖リン酸主鎖の他の型の修飾には、それだけには限らないが、3'アミノ基をそのDNAの2'デオキシリボース環中の3'ヒドロキシル基に置換すること(ホスホラミダート修飾)、2'O-メチルオリゴ-リボヌクレオシドリン酸ジエステル、メチルホスホン酸塩(リン酸ジエステル主鎖中の非結合酸素にメチル基を付加)、およびホスホトリエステルが含まれる。
【００３５】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの第2世代には、混合主鎖オリゴヌクレオチドが含まれ、このオリゴヌクレオチドには、オリゴヌクレオチドの3'および5'末端でのモノチオリン酸塩修飾を含めてもよい。修飾の他の例には、たとえば、3'-デオキシ-3'-(2-N,N-ジフェニルイミニダゾリジノ)-チミジン-5'-N,N,-ジイソプロピル-O-メチルホスホラミダイト、3'-デオキシ-3'-(2-N,N-ジフェニルイミニダゾリジノ)-チミジン-5'-O-メチルホプライトが含まれる。潜在的修飾因子の例には、たとえば、それだけには限らないが、ヒドラキシン、スクシナート、エチレンジアミン、他にも多くのものが含まれる。あるいは、未修飾リン酸ジエステル結合の3'位置をP-O結合の炭素と置換して、3'メチレン結合または3'-ヒドロキシメチレン結合を形成することができる。
【００３６】
アンチセンスオリゴヌレオチドの使用の副作用の1つは、免疫系による、アンチセンスオリゴヌクレオチドが外来分子、特に、メチル化されていないCpG(シトシン-リン酸-グアニン) （このCpGは一般に細菌DNA中に見出され、哺乳動物DNA中には見出されない）である2塩基配列を含むオリゴヌクレオチドであるという認識に関係する。潜在的解決策は、そのようなオリゴヌクレオチドをメチル化することである。オリゴヌクレオチド治療の副作用を最小限度に抑える他の方法は、オリゴヌクレオチドを(高用量で短時間のうちに投与する代わりに)低用量で連続静脈内注入することによって徐々に投与すること、および表皮を通してのオリゴヌクレオチドの十分な送達を可能にする局所送達ビヒクルの開発が含まれる。
【００３７】
S30-21616/DEGAポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を不活性化し、したがってポリペプチドの発現を低減しまたは阻害することによって、S30-21616/DEGAの発現を阻害することも可能である。そのような不活性化は、細胞中でそのヌクレオチド配列を除去することによって、またはヌクレオチド配列中に欠失または変異を導入し、それによってヌクレオチド配列を不活性化することによって起こり得る。ポリヌクレオチド中に別のDNA断片を挿入することによってヌクレオチド配列を不活化し、その結果内在性S30-21616/DEGAの発現が生じないようにすることもできる。真核細胞遺伝子中に欠失や挿入などの変異を導入する方法は、当技術分野で周知であり、たとえば、米国特許第5,464,764号で知られている。細胞中の遺伝子の突然変異に使用可能なオリゴヌクレオチドおよび発現ベクターは、当技術分野で知られている方法および本明細書に示した指針に従って製造することができ、たとえば、アンチセンスオリゴヌクレオチドの製造および発現に有用な方法を使用して、オリゴヌクレオチドおよび発現ベクターを細胞中で遺伝子に変異を起こさせるために使用可能にすることができる。
【００３８】
本発明の別の実施形態では、S30-21616/DEGAの機能または発現は、上方調節しまたは細胞中で誘発することができる。上方調節の例には、それだけには限らないが、組換え手法で生成したポリペプチドを含め、裸核酸(オリゴヌクレオチドまたはプラスミドなどの裸DNAベクター)またはポリペプチドを細胞に投与することが含まれる。組換え手法で生成したポリペプチドは、S30-21616/DEGAをコードするDNA配列が適当な発現ベクター中に配置されたことを意味し、これは以下に詳述する。
【００３９】
組換え構築体中の本発明のS30-21616/DEGAポリヌクレオチドは、発現制御配列またはプロモーターに機能的に結合させることができ、そのような制御配列は、当技術分野で知られている。Kaufman、Meth. Enzymol.、(1990)、185:537頁。また組換えベクターは、ベクターの維持を確実にするための複製起点、1個または複数の選択マーカー、翻訳されたポリペプチドを宿主細胞のペリプラズマ空間または細胞外培地に分泌するのに有用なリーダー配列を含むことになる。
【００４０】
標的とする変異誘発および外来性ヒトポリヌクレオチドを非ヒト哺乳動物(たとえばマウス)に遺伝子交換することによって、ポリヌクレオチドの生化学的および生理学的機能を研究および理解するためのin vivo研究用ツールを提供する。さらに、遺伝子組換え非ヒト哺乳動物によって、分子標的、制御因子、および前記ポリヌクレオチドに関連する疾患または状態を治療し予防するための治療的戦略を同定することも可能になる。したがって、本発明は、たとえば、組換えDNA技術によって別の生物体からの非天然ヌクレオチド配列をそのゲノム中に挿入した遺伝子組換え哺乳動物(たとえばマウス)に関し、この技術を本明細書ではS30-21616/DEGA遺伝子組換え技術という。さらに、本発明は、本明細書ではS30-21616/DEGAノックアウトと称する、機能性mS30-21616/DEGAポリヌクレオチドが欠損している哺乳動物に関し、このノックアウトは当技術分野で周知の方法を使用し産生することができる。Cappecchi、Science (1989)、244:1288〜1292頁。
【００４１】
本発明の一実施形態では、mS30-21616/DEGAの両対立遺伝子が完全に細胞から欠如している、従来のノックアウト非ヒト哺乳動物を開発する。遺伝子組換え非ヒト哺乳動物の別の実施形態では、mS30-21616/DEGAが完全に交換され、hS30-21616/DEGAポリヌクレオチドしか発現していない。本発明の好ましい実施形態では、mS30-21616/DEGAポリヌクレオチドが特定の臓器、細胞型、または発生段階で欠失している条件的なノックアウトが想像される。Wagner、Development (2002)、129:1377〜1386頁。
【００４２】
ヒトS30-21616/DEGAは、胃癌や甲状腺癌など、ある種の型の腫瘍細胞では上方調節されるが、乳癌、肺癌、および卵巣癌では一般に下方調節されることが判明している。一般に、発現は、正常組織または非新生物組織試料中では低く、したがって様々な癌の診断の分子マーカーとして使用することができる。したがって、本発明の目的は、それだけには限らないが、たとえば、動物、好ましくはヒト対象の胃癌などの特異的な癌の素質を判定するために、このポリヌクレオチドの発現または発現の欠如を使用できることである。具体的に企図されるのは、癌の診断または予後に使用可能なキットであり、このキットはS30-21616/DEGAポリヌクレオチド配列およびその変異体に由来するDNA、またはアンチセンスDNAもしくはRNAプローブを当技術分野で周知の試薬の混合物中に含む。
【００４３】
本発明の別の実施形態では、S30-21616/DEGAポリヌクレオチドおよび/またはS30-21616/DEGAポリペプチドは、上方調節および/または下方調節することができる。疑われる癌を確証または否定するために、たとえば、S30-21616/DEGAを細胞表面上で上方調節もしくは下方調節すること、または癌患者の血清中に分泌させることを診断に利用することができる。血清生物マーカーまたは細胞表面生物マーカーとして、診断時のポリペプチドの発現レベルは、段階付けのみに比べて、正確な予後を提供することもできる。たとえば、前記ポリペプチドに対する抗体または前記ポリペプチドに結合するリガンド由来のペプチドを含むイムノアッセイキットが本発明のために想定される。アッセイのためのデータの読み取りには、当技術分野で周知の標準的なイムノアッセイを利用できる。そのようなアッセイの例には、それだけには限らないが、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、ラジオイムノ標識アッセイ(RIA)、免疫ブロット法、および蛍光標示式細胞分取器(FACs)が含まれる。
【００４４】
本発明は、全長のポリペプチドの細胞外または細胞内変異体を精製および産生するための方法も開示している。たとえば、本発明の一実施形態は、配列番号1および配列番号3の核酸を含む組換え構築体（そのポリヌクレオチド配列またはその断片、および原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞中で発現させるために、プロモーターおよびリーダー配列に機能的に結合させた適切な発現ベクターを含む）を提供する。適当な原核生物宿主には、たとえば、大腸菌HB101、大腸菌W3110、大腸菌DH1αなどの大腸菌類、シュードモナス属、枯草菌などのバシラス属、ストレプトミセス属が含まれる。適当な真核生物宿主細胞には、酵母や他の真菌類、昆虫、CHO細胞やCOS細胞などの動物細胞、組織培養のヒト細胞や植物細胞が含まれる。したがって、本発明は、たとえば、発現制御配列に作動的に連結させた配列番号1および配列番号3のS30-21616/DEGAポリヌクレオチドを含む発現構築体によってトランスフェクトした細胞を提供する。そのようなトランスフェクトした細胞は、S30-21616/DEGAポリペプチド、たとえば、配列番号2および配列番号4を発現することが好ましい。
【００４５】
本発明のポリペプチド、変異体もしくは類似体、およびその断片は、当技術分野で周知の方法によって精製することができる。たとえば、このポリペプチドもしくは変異体およびその断片は、精製および同定を容易に行うことができる適切な融合パートナーと共に、切断可能な融合ポリペプチドとして発現させることができる。有用な融合パートナーポリペプチドには、それだけには限らないが、ヒスチジンタグ、グルタチオンS-トランスフェラーゼ、すなわちGST、インテイン[IMPACT(商標)、すなわち親和性キチン結合タグによるインテイン媒介精製(Intein Mediated Purification with an Affinity Chitin-binding Tag)、New England Biolabs社製、米国マサチューセッツ州Beverly在、Chongら、(2001) Gene、275:241:252頁]、およびβ-ガラクトシダーゼが含まれる。融合ポリペプチドは、β-ガラクトシダーゼ融合を使用する場合は抗β-ガラクトシダーゼ抗体カラムなど、抗体カラムを使用しアフィニティクロマトグラフィーによって精製することができる。
【００４６】
本発明のポリペプチド、変異体、またはその類似体は、1種または複数の推定リガンド、ポリペプチド結合パートナー、またはDNA結合パートナーの発見および単離に有用である。本発明の別の実施形態では、これらの推定リガンド、ポリペプチド結合パートナー、またはその断片は、阻害(アンタゴニスト)因子、または刺激(アゴニスト)因子として機能することができ、それだけには限らないが、ペプチドまたは、抗原および、オリゴヌクレオチド、または病変細胞のS30-21616/DEGAポリペプチドに対して活性な、それだけには限らないが、アンタゴニストなどの小分子などの生体分子の設計でも機能することができる。本発明は、S30-21616/DEGAアンタゴニストも提供し、これはS30-21616/DEGAの受容体活性または受容体様活性を低減することができる薬剤または化合物である。本発明は、S30-21616/DEGAアゴニストも提供し、これは、S30-21616/DEGAの望ましい薬理活性を強化する化合物または薬剤である。
【００４７】
本発明の別の実施形態では、これらの免疫薬剤は、この細胞表面分子またはその変異体の発現、相互作用、および/または機能の阻害に有効で有り得る。これらの免疫薬剤は、それだけには限らないが、免疫グロブリン(Ig)様領域、またはポリペプチドのLRR、または、たとえば、ポリペプチドキナーゼC、カゼインキナーゼIIリン酸化部位、または他のリン酸化部位によって表されるこのポリペプチドのシグナル伝達経路など、ポリペプチドの1個または複数の部位を標的とし得る。
【００４８】
本発明のS30-21616/DEGAポリペプチドに結合するリガンド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストなどの小分子は、任意の適当な方法によっても得ることができる。当業者によって理解されるように、例を以下に記載する適当な小分子をスクリーニングするための様々なそのような方法がある。
【００４９】
たとえば、S30-21616/DEGAポリペプチドを発現する細胞系に結合する化合物のスクリーニングを使用して、適当なリガンドまたは小分子を同定することができる。そのような1つのスクリーニング方法は、細胞をスクリーニングすべき化合物にマイクロアレイ型形式を使用し接触させる工程、およびそのような化合物が、それだけには限らないが、シグナル伝達またはpHの変化などのシグナルを生じ、すなわちポリペプチド機能を活性化しまたは阻害するかどうかを判定する工程を含む。これらの変化を測定してその化合物がポリペプチドを活性化しまたは阻害するかどうか判定する。
【００５０】
リガンドまたは小分子をスクリーニングする別の方法は、指標染料を乗せた細胞系の使用を含む。それだけには限らないがカルシウムなどのイオン種の存在下または不在下で試験化合物に結合させたとき、蛍光シグナルを産生する。蛍光シグナルの変化は、たとえば、蛍光分光光度計または蛍光イメージングプレート読取装置を使用し経時測定する。蛍光の変化は、リガンドの標的ポリペプチドへの結合を示し、化合物がこのポリペプチドにとって潜在的にアンタゴニストまたはアゴニストであることを示す。
【００５１】
リガンドまたは小分子をスクリーニングする別の方法は、本発明のポリペプチドおよびポリペプチドの活性化に結合させたレポータポリヌクレオチド構築体にトランスフェクトさせた細胞系の使用が含まれる。そのようなレポータ遺伝子の例には、それだけには限らないが、β-ガラクトシダーゼ、緑色蛍光ポリペプチド(GFP)、クロラムフェニコールアセチル基転移酵素(CAT)、ルシフェラーゼ(LUC)、およびβグルクロニダーゼが含まれる。細胞を試験化合物および既知のアゴニストと接触させた後、レポータポリヌクレオチドによって生成されたシグナルを、蛍光計、分光光度計、ルミノメータ、または使用したレポータポリヌクレオチドに適切ないくつかの他の器具を使用し、ある一定時間測定することができる。シグナルの減少は、化合物がポリペプチドの機能を阻害し、したがってポリペプチドの潜在的アンタゴニストであることを示す。
【００５２】
アンタゴニストであり、したがってポリペプチドの活性化を阻害する化合物をスクリーニングする別の方法は、受容体学についての研究で周知の結合アッセイを含む。細胞表面またはその細胞から隔てられた細胞膜上にポリペプチドまたは受容体を発現する細胞を、既知の標識したリガンドの存在下で潜在的アンタゴニストと接触させる。リガンドを放射性核種または蛍光分子で標識することができる。結合した標識リガンドの量を測定、すなわち、細胞または細胞膜に関連する放射能または蛍光によって測定する。試験化合物がポリペプチドに結合し、受容体に結合した標識リガンドの減少が測定された場合、したがって化合物は天然リガンドに対抗することができ、よって潜在的アンタゴニストである。
【００５３】
本発明の別の実施形態は、抗体（特に、中和またはポリペプチド-ポリペプチド間の相互作用を阻害する、S30-21616/DEGAポリペプチドおよびその類似体に特異的な抗体、アンチセンス分子、ペプチド、または小分子）を産生しまたはスクリーニングする方法に関する。本発明の抗体は、完全な抗S30-21616/DEGA抗体、ならびにS30-21616/DEGA結合部位もしくはIgドメインおよびLRRを含む抗体フラグメントおよび抗体誘導体を含む。抗体フラグメントには、それだけには限らないが、Fab、F(ab')2、FvおよびscFv、dibody、またはシングルドメイン抗体が含まれる。本発明の別の実施形態では、ポリペプチド受容体またはその変異体に対する抗体およびその断片は、当技術分野で周知のファージディスプレイライブラリーによって選択することができる(McCaffertyら、(1990) Nature、348:552〜554頁、Aujameら、(1997) Hum. Antibodies、8:155〜168頁を参照のこと)。可変領域の組合せは、通常、FabまたはscFvの形態で、繊維状ファージ上に表示される。所望の抗原結合特性を有する可変領域の組合せを有するファージをえるために、ライブラリーをスクリーニングする。好ましい可変領域の組合せは、S30-21616/DEGAに対する高親和性によって特徴付けられる。好ましい可変領域の組合せは、S30-21616/DEGAに対する高い特異性によって特徴付けることもでき、他の関連抗原とはほとんど交差反応しない。抗体フラグメントの非常に大きなレパートリー(2〜10×1010、Griffithsら、(1994) EMBO、13:3245〜3260頁を参照のこと)からスクリーニングすることによって、非常に様々な高親和性モノクローナル抗体を単離することができ、その多くはS30-21616/DEGAに対してナノモル以下の親和性を有することが推定される。
【００５４】
本発明の抗体は、げっ歯類、ヒト、またはヒト化抗体もしくはキメラ抗体に由来するモノクローナル抗体(MAb)またはポリクローナル抗体でよい。げっ歯類MAbの大きな欠点は、それらは診断のためまたは治療目的で患者に投与することができるが、免疫系によって外来抗原として認識され連続使用には適さない。ヒト免疫系によって外来抗原として認識されない抗体は、診断および治療に高い可能性を有している。ヒト抗体は、本質的にヒトの配列からなる抗体であり、ヒトの重鎖および軽鎖可変領域の組合せがファージ表面上に示されるファージディスプレイライブラリーによって得ることができる。ヒト抗体およびヒト型化抗体を生成する方法は現在当技術分野でよく知られている。抗体のヒト型化および抗体領域および部位に適用された名称の概説は、たとえば、Vaughanら、(1998) Nat. Biotechnol.、16:535〜539頁を参照のこと。
【００５５】
非ヒトMAb領域がそのヒトの対照とする部位で置き換えられているキメラ抗体を構築することができる。好ましいキメラ抗体は、ヒト定常領域と共に発現するマウスまたはラットの可変領域など、非ヒト抗体の可変領域全体を有する抗体である。そのような抗体を作製する方法は当技術分野で周知である(たとえば、Jonesら、(1996) Nature、321:522〜525頁、Riechmanら、(1988) Nature、332:323〜327頁、米国特許第5,530,101号、およびQueenら、(1989) Proc. Natl. Acad. Sci.、86:10029〜10033頁を参照のこと)。本発明のより好ましいキメラ抗体はヒト型化抗体である。ヒト型化抗体は、たとえば、hS30-21616/DEGAに結合する非ヒト抗体V領域の相補性決定領域(CDR)が、ヒトフレームワーク(FW)領域に移植された抗体である(Padlan、(1991) Mol. Immunol.、28:489〜498)。CDRおよびFWに対応するアミノ酸残基は当業者に知られている。キメラ抗体は、一部または全ての非ヒト定常領域がヒトの対照物で置換されている抗体を含むことができる(たとえば、LoBuglioら、(1989) Proc. Natl. Acad. Sci.、86:4220〜4224頁を参照のこと)。
【００５６】
本発明の好ましい実施形態では、予防し、治療し、または医学的状態を改善するための治療方法が開示される。この方法では、新たに単離した抗体、ヒト抗体もしくはヒト型化抗体、およびその断片は、それだけには限らないが、細胞障害性でありまたは化学療法薬であるイットリウム-90など、ラジオアイソトープに結合することができる。結合された抗体またはその断片は、手術または化学療法後に、微小転移を破壊し、または疾患の再発を遅延もしくは予防することができる有効量を患者に注射することによって患者に投与することができる。抗体およびその断片は、ヒトまたは動物などの患体の細胞中の腫瘍を診断する方法としても使用することができる。
【００５７】
本発明の抗体は、本発明のポリペプチドおよび特定の組織もしくは体液中のポリペプチドの検出にも使用可能である。イムノアッセイは、アッセイする抗原の一つのエピトープを標的とするモノクローナルまたはポリクローナル抗体試薬を使用することができる。あるいは、1個を超えるエピトープを標的とするモノクローナルまたはポリクローナル抗体の組合せを使用することもできる。プロトコルは、たとえば、競合、直接的抗原抗体反応、またはサンドウィッチ型アッセイを基にすることができる。プロトコルは、たとえば、固体支持体法または免疫沈降法を使用することができる。本発明の抗体は、検出を容易にするためにレポータ分子で標識することができる。結合した試薬からシグナルを増幅するアッセイも知られている。例としてアビジンおよびビオチン、または酵素標識抗体もしくは抗原コンジュゲートを利用する、ELISAアッセイなどのイムノアッセイが含まれる。
【００５８】
本発明の別の好ましい実施形態では、新生物疾患の予防、治療、または改善するヒト対象の免疫応答を引き起こし、刺激する方法に関する。当該方法は、対象に抗体応答などの免疫応答、より好ましくは細胞免疫応答を引き出すことができる抗原分子を含む組成物を投与することを含む。本明細書で使用される「抗原分子」は、当技術分野で知られている標準的イムノアッセイを使用し、ペプチドまたはポリペプチド断片が抗体またはMHC分子(抗原性)に結合し免疫応答(免疫原性)を生じる能力を検出することによって識別されるポリペプチドのペプチドまたは断片である。一態様では、本明細書で開示した抗体のいずれかを、免疫応答を引き出し刺激するために使用することができ、たとえば、S30-21616/DEGAポリペプチドを発現している細胞を死滅させる。さらに、抗原分子は、続いてin vivoで抗原ポリペプチドに翻訳されるポリヌクレオチドとして投与することができることが理解されよう。さらに、抗原分子が少なくとも8個のアミノ酸のペプチドを含む免疫原であることが理解されよう。
【００５９】
任意の適当な新生物疾患、すなわち、たとえば、胃癌、甲状腺癌、乳癌、卵巣癌、腎臓癌、または肺癌を含む癌も本発明の方法を使用し治療することができる。
【００６０】
治療用組成物の抗原分子は、薬剤として許容される担体または別のポリペプチドとの非共有結合複合体と、それだけには限らないが、インターフェロン、(IFN-α、IFNγ)、インターロイキン、(IL-2、IL-4、IL-6)、または腫瘍壊死因子(TNF-α、TNF-β)などのサイトカインを含むが、ただしそれだけには限らない、免疫増強物質または生物学的応答調節物質の存在または不在下で投与することができる。
【００６１】
ヒトの免疫応答強化のための本発明の別の実施形態は、ヒト対象にin vitroで抗原分子により感作させた抗原提示細胞(APC)を投与することを含む。APCは、それだけには限らないが、Bリンパ球、樹状細胞、マクロファージ、Tリンパ球、およびそれらの組合せを含む、当技術分野で知られている抗原提示細胞の中から選択することができ、マクロファージが好ましく、樹状細胞がより好ましい。
【００６２】
本発明のポリヌクレオチドは、転移性癌の治療に使用することができる。治療には、ポリヌクレオチド切断、ポリヌクレオチド交換、ポリヌクレオチド発現、およびアンチセンスポリヌクレオチドの抑制が含まれる。本発明の好ましい実施形態では、転移性癌の治療方法は、有効量のS30-21616/DEGAポリヌクレオチドまたはその断片を、センスおよびアンチセンスメッセージを発現するためのプロモーター、遺伝子を標的にするための組換え配列、トランスフェクションおよび選択または複製のための選択マーカー、または原核生物細胞、真核生物細胞、細菌細胞、昆虫細胞、酵母細胞中で継代培養するための起点などの追加の配列と共に含む薬剤媒組成物を投与することを含む。使用する核酸は、1本鎖または2本鎖DNA、RNA、またはPNAでよい。核酸の変異体には、欠失、置換、付加などの改変、または自然に見出される、または設計された非保存性改変を含めてよい。
【００６３】
診断または治療目的で人体に使用される本発明の抗体および抗体接合体、ポリヌクレオチドおよび断片、ポリペプチド、および類似体、アゴニストおよびアンタゴニストを含む小分子は、さらに薬剤として許容される担体を含む組成物の形で投与されることは理解されよう。そのような担体は、平均的な当業者の技術者にはよく知られている。投与方式には、それだけには限らないが、皮下経路、筋肉内経路、静脈内経路、腹腔内経路、皮内経路、または粘膜経路が含まれる。
【００６４】
本発明のヒトS30-21616/DEGAポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、造血幹細胞中で差次的に発現し(実施例2を参照のこと)、造血調節に使用することができる。したがって、本発明のS30-21616/DEGAポリヌクレオチドおよびポリペプチド、またはそのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドを標的とする薬剤は、幹細胞関連疾患、特に骨髄細胞やリンパ細胞の欠損などの造血性疾患、たとえば、白血病の治療に、あるいは赤血球前駆細胞幹細胞の成長および増殖の支持に使用することができる。本発明のポリペプチドアゴニストおよびアンタゴニストも幹細胞関連疾患の治療に想定される。
【００６５】
本発明の別の実施形態は、幹細胞を単離するための、特に移植で使用するための造血幹細胞を単離するためのマーカーとしての、当該核酸またはポリペプチドの使用に関する。造血幹細胞は、赤血球、骨髄細胞、リンパ球などの様々な異なる造血細胞に成熟することができるからである。これらの単離した幹細胞は、それだけには限らないが、in vivoまたはex vivoでの骨髄移植の照射または化学療法後に幹細胞の再増殖に使用することができる。
【００６６】
本発明のS30-21616/DEGAポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、単独でまたは他のサイトカインと組み合わせて、それだけには限らないが様々な貧血を治療するために、または前駆体もしくは赤血球の産生を刺激するための照射もしくは化学療法と併用するために、単球、マクロファージ、巨核球などの骨髄細胞の成長および増殖の支持に、ならびに造血幹細胞の成長および増殖の支持に、薬剤として許容される組成物で投与することができる。本発明の別の実施形態では、阻害分子を使用して、支持間質細胞と相互に作用させて造血幹細胞を変化させることができる。
【００６７】
したがって、本発明は、in vivoおよびin vitroで研究方法、診断方法、予防方法、または治療方法に使用することができ、これらの方法は当技術分野でよく知られている。以下の実施例によりさらに本発明を説明するが、決して本発明の範囲を制限するものではないと解釈すべきである。本発明の他の実施形態および使用は、本明細書で開示した明細書の考察および本発明の実施から当業者に明白であるものとする。ベクターおよびプラスミドの構築、ポリペプチドをコードする遺伝子をそのようなベクターおよびプラスミドに挿入すること、プラスミドの宿主細胞への導入、遺伝子およびポリヌクレオチド産生物の発現および定量で使用される方法など、従来の方法の詳細な説明は、Sambrook、Jら、(1989) Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press. を含め、多数の刊行物から得ることができる。本明細書に記載した参照文献は全て、その全体を組み込むものとする。
【実施例】
【００６８】
細胞培養
使用した細胞系は、American Type Culture Collection(ATCC、米国バージニア州Manassas)から入手し、その増殖に使用した培地は、ギブコ社、米国ニューヨーク州Grand Island、から購入した。細胞系およびそのそれぞれの増殖培地(括弧に示す)は以下の通りであった:AGS、ヒト胃腺癌細胞系、(F-12);293、アデノウイルス5 DNAで形質転換したヒト腎臓上皮細胞系(ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM));KKVR(イスコフのDMEM);RF-1、ヒト胃腺癌細胞系(LeibovitzのL-15);NCI-SNU-1、NCI-SNU-16、NCI-N87、ヒト肝臓胃悪性腫瘍細胞系およびKatoIII、ヒト胃悪性腫瘍(RPMI)。培地は全て、2mMのL-グルタミン(ギブコ、米国ニューヨーク州Grand Island)および10%ウシ胎仔血清(FBS、Hyclone、米国ユタ州Logan)を補充した。しかし、KatoIIIおよびKKVRは、20%FBSおよびNCI-N87中で増殖させ、KKVR増殖培地にはさらに1.5g/Lの炭酸水素ナトリウムを補充した。
【００６９】
(実施例1)
本実施例は、差次的に発現した新規な癌遺伝子の同定を示す。手短に言えば、マウス造血幹細胞サブトラクティブcDNAライブラリーを使用した。Phillipsら、(2000) Science、288:1635〜1640頁。このライブラリーから約7,500個のESTをDNAマイクロアレイ上に置き、様々なマウス癌細胞系および対応する正常組織から調製したcDNAとハイブリダイズさせた。
【００７０】
正常な腎臓組織に対してマウス腎臓細胞系RAGで差次的に7.6倍発現したマウスESTの1つであるS30-21616/DEGAを同定した。このESTを配列決定し、その522bpsを NCBI非重複性配列データベースのBLAST用に使用した。現時点ではS30-21616/DEGAは、任意の既知のマウス配列に対しても相同性を示さなかった。しかし、S30-21616/DEGAは、まさに、ヒト染色体12BACクローンに対して、およびヒト子宮内膜癌部分cDNAクローンの一部に対して約85%の類似性を示した(IMAGE:3625286)。IMAGE:3625286DNA配列を使用して5'RACE ORFおよび3'UTR PCR産生物を生成し、最終的には3769bpのcDNA(hS30-21616/DEGA)(図1)を得た。cDNAの転写によって2.2および3.5KBの様々な寸法の転写物がもたらされ、代替スプライシングが暗示された。
【００７１】
(実施例2)
本実施例は、正常組織および癌組織でのhS30-21616/DEGAの発現を示す。手短に言えば、multiple tissue Northern(BD Biosciences/Clonetech、米国カリフォルニア州Palo Alto)を使用するノーザンブロット分析を実施して正常組織および癌組織でのhS30-21616/DEGAの発現を評価した。スクリーニングした正常組織には、脳、心臓、骨格筋、大腸、胸腺、脾臓、腎臓、肝臓、小腸、胎盤、肺、末梢血白血球、副腎、膀胱、骨髄、リンパ節、前立腺、脊髄、胃、甲状腺、気管、子宮、および舌が含まれる。これらの組織の大部分で、hS30-21616/DEGAの発現は非常に低かった。
【００７２】
癌細胞系の発現に関して、本発明者らは、ノーザンブロット分析によりhS30-21616/DEGAの発現をHL-60(前骨髄球性白血病)、HeLa(子宮頚癌)、K562(慢性骨髄性白血病)、Molt-4(急性リンパ芽球性白血病)、RajiおよびDaudi(バーキットリンパ腫)、SW480(結腸直腸腺癌)、G361(メラノーマ)、A549(肺悪性腫瘍)細胞、AGS(ヒト胃腺癌)、NCI-SNU-1、NCI-SNU 16、およびNCI-N87(ヒト肝臓胃悪性腫瘍)で評価した。
【００７３】
ヒトS30-21616/DEGAは、A549細胞(データ図示せず)、ならびにAGS細胞およびNCI-SNU-16細胞で(図3を参照のこと、以下をチェックし参照のこと)で2〜3.5KBの多数の大きさの転写物として発現した。これらのサイズの転写物は、精巣、胃、肺、および子宮で発現したGenBank(登録商標)のcDNAでも認められる。胃腺癌でのその差次的発現プロフィールのために、今後、S30-21616のcDNAをS30-21616/DEGAと呼ぶ。
【００７４】
(実施例3)
本実施例は、cDNAドットブロットを使用し患者試料におけるS30-21616/DEGAの発現の癌プロファイリングアレイ(CPA)分析を示す。手短に言えば、メーカー指示書に従って、様々な腫瘍および正常組織において、(CPA)IおよびII(BD Biosciences Clontech、米国カリフォルニア州Palo Alto)を、ORFヌクレオチド1540〜2045(図1に基づいて番号付け)を包含するcDNA断片によってプローブした。プローブは、[α-32P]-dCTP(PerkinElmer Life Sciences、Inc.、米国マサチューセッツ州ボストン)を使用して標識し、Prime-It(登録商標)IIキット(Stratagene Cloning Systems、米国カリフォルニア州La Jolla)を使用して単離した。CPA IおよびIIは、それぞれ個々の癌患者から得た241個および160個の腫瘍組織および対応する正常組織から得た規準化cDNAを含むナイロンアレイである。CPA Iによって表される組織は以下を含む:乳房、子宮、大腸、胃、卵巣、肺、腎臓、直腸、甲状腺、子宮頚部、小腸、膵臓、および前立腺。これらの組織の他に、CPA IIは、膀胱、精巣、および皮膚組織を含む。これらのアレイは、正負の対照および9種の癌細胞系:HeLa、Daudi、K-562、HL-60、G-361、A549、Molt-4、SW480、およびRajiから単離したcDNAも含む。
【００７５】
図2A(CPA I)および2B(CPA II)のアレイプロフィールの結果は、再度、DEGAは一部の正常な肺、大腸、および直腸試料で発現したが、一般に発現は女性の生殖組織のものよりも低いことを示した。ほとんど全ての患者の正常な乳房組織でDEGAの強力な発現が示された。それに反して、腫瘍試料でのDEGAの発現は、甲状腺56%(9/16、CPA Iで5/6、およびCPA IIで4/10)および胃癌45%(17/38、CPA Iで14/28およびCPA IIで3/10)と差次的に発現した。CPA I(図2A)およびCPA II(図2B)で試験した癌細胞系のうち、A549はDEGAのcDNAを高濃度で発現し、K562はDEGAのcDNAをA549細胞の約10分の1発現した。発現は、Molt-4、G361、およびHeLa細胞で最小であった。
【００７６】
表1は、さらに、アレイを使用しDEGAが様々な組織から調節されて差次的に発現したことの概要を提供する。発現レベルは、個々の患者の241個の腫瘍組織および対応する正常組織由来のcDNAに対して規準化した。
【００７７】
【表１】
0004416650.tif 000002
【００７８】
プロファイリングした胃癌の28個および甲状腺癌6個で、hS30-21616/DEGAは、それぞれ、正常な試料に対して腫瘍の試料の45%および83%で上方調節された。しかし、類別した乳癌の50個、卵巣癌14個、および肺癌21個で、hS30-21616/DEGAは、それぞれ、正常な試料に対して腫瘍試料で70%、43%、および57%下方調節された。結果は、hS30-21616/DEGAは、異なる腫瘍型で差次的に発現し、腫瘍増殖を調節する役割をすることができることを示した。
【００７９】
(実施例4)
本実施例は、胃腺癌細胞でのDEGAの発現のノーザンブロット分析を示す。胃癌患者試料の45%がその腫瘍中でDEGAの差次的発現を示したが、隣接する正常な胃組織でわずかな発現が示された観察から、DEGAは胃腺癌の少なくとも下位画分の発生または進行で中心的役割を果たし得ることがが示唆される。DEGAが腺癌細胞系、AGS、NCI-SNU-1、NCI-SNU-16、NCI-N87、KATOIII、KKVR、およびRF-1で発現したかどうか判定するためにノーザンブロット分析を実施した。
【００８０】
図3のオートラジオグラフは、AGS細胞(レーンA)およびNCI-SNU-16細胞(レーンF)での発現を示し、AGSはNCI-SNU-16よりも8倍高く発現している。
【００８１】
(実施例5)
本実施例は、他の非胃腺癌癌細胞系でのS30-21616/DEGAの発現の癌プロファイリングアレイ(CPA)分析を示す。cDNAドットブロットを使用し、CPA IおよびIIに使用したS30-21616/DEGAプローブおよび条件もまた使用してBD Bioscience社の癌細胞系プロファイリングアレイとハイブリダイズさせた。このアレイは、以下の癌を表す細胞系から得たcDNAを含む:肺(A549、NCI-H-460、NCI-H1299)、大腸(HCT-116、HCT-15、HT-29)、乳(MDA-MB4355、MDA-MB231、MCF7)、卵巣(SK-OV-3)、子宮頚部(HeLa)、前立腺(DU-145、PC-3)、皮膚(SK-MEL-28、SK-MEL-5、SK-NSH、IMR-32、U-87MG)、脳(IMR-32、U-87MG)、腎臓(786-O、ACHN)、肝臓(Hep-G2)、大腸(Colo589)、骨肉腫(U2-OS)、および表皮(A-431)。
【００８２】
結果は、最高の発現が、肺NCI-H1299細胞およびA549細胞(図4、左パネル)、腎臓ACHN細胞、および骨肉腫細胞U2-OS(図4、右パネル)で観察されたことを示した。少ないが有意な発現が、腎臓細胞系786-O(図4、右パネル)、乳癌細胞MDA-MB-231、および卵巣癌細胞系SKOV-3(図4、左パネル)で観察された。
【００８３】
(実施例6)
本実施例は、S30-21616/DEGAのcDNAクローニングを示す。手短に言えば、ヒトS30-21616/DEGA cDNAをMarathon-Ready(商標)A549、ヒト肺細胞悪性腫瘍系および脾臓のcDNA調製物(BD Biosciences/Clonetech、米国カリフォルニア州Palo Alto)に由来するRT-PCR産生物として増幅した。当該ポリヌクレオチドを増幅するために使用したPCRプライマーは、配列5'ATG TCG TTA CGT GTA CAC ACT CTG3'(配列番号14)のフォワードPCRプライマー1号、および5'TTA AGT GGA CGC CAC AAA AGG TGT G3'(配列番号15)のレバースPCRプライマー2号(Bio-Synthesis Incorporated、米国テキサス州Lewisville、開始コドンおよび終止コドンに下線を引く)である。PCR反応は、使用したポリメラーゼがチタンTaqポリメラーゼ(BD Biosciences/Clonetech、米国カリフォルニア州Palo Alto)であることを除き、当技術分野で周知の標準的RT-PCRプロトコルを使用し実施し、具体的にはMarathon-Ready(商標)のcDNAマニュアルに記載されたRT-PCR条件:94℃で30秒、68℃で2分間を使用した。
【００８４】
S30-21616/DEGA ORF PCR産生物(1569bp)をpCR2.1(In Vitrogen Corporation、TOPO TA(登録商標)クローニングキット、米国カリフォルニア州Carlsbad)中にクローン化し配列を確認した(Molecular Genetics Instrumentation Facility、ジョージア大学、米国ジョージア州Athens、GENEWIZ Inc、米国ニュージャージー州North Brunswick)。S30-21616/DEGAの開始コドン上流のDNA配列を得るために、先に説明したように、A549Marathon-Ready(商標)のcDNAを使用して、1つ、2つの修正点とともに5'RACEを実施した。フォワードプライマーAP1(Marathon-Ready(商標)のcDNAと共に含めた)、およびS30-21616/DEGA遺伝子特異的リバースプライマー(5'AAC TCA GGT CCA GTC TCT TAA TCA G3'、配列番号16)によって、35回の増幅(94℃で30秒、57℃で30秒、68℃で2分)後にPCR産生物が産生し、この産生物をpCR2.1にサブクローン化し配列決定し確認した。S30-21616/DEGAの3'UTRを表す配列を最初にコンピュータを使用しヒト染色体12BACクローン、GS1〜99H8(GenBank(登録商標)登録番号AC004010)から求めた。続いて、一連のPCRプライマーは、A549cDNA調製中に存在する最長の3'UTR配列を決定するように設計した。以下のプライマーセットを使用して最長の3'UTRセグメントを同定した:開始コドンに下線を引いたフォワードプライマー5'ATG TCG TTA CGT GTA CAC ACT CTG3'(配列番号17)、リバースプライマー5'CAA AAT GAA AAG ACA GGC AAA CAA ATG3'(配列番号18)、このプライマーはS30-21616/DEGAのORFのXヌクレオチド3'で開始する。
【００８５】
図5Aは、S30-21616/DEGAの遺伝子産物の構造的特徴を図示する。この蛋白質は、シグナル配列および膜貫通型ドメインを含み、細胞表面に局在化することができることを示唆する。その推定細胞外部分は、IgドメインおよびLRR-N末端(LRR-NT)ドメインとLRR-C末端(LRR-CT)ドメイン中に存在するシステイン残基を両側に有する5つのロイシンリッチリピート(LRR)を含む。したがって、S30-21616/DEGAは、LRRスーパーファミリーに属すると思われる。S30-21616/DEGAの推定サイトゾル部分は、102個のアミノ酸を含み、任意の既知の蛋白質ドメインも存在しない。約1/5または20個のサイトゾルの残基は、セリンまたはトレオニンであり、S30-21616/DEGAが、細胞中でシグナル分子として機能することができることを示唆する。総合すると、配列分析の蛋白質は、S30-21616/DEGA遺伝子産物が、シグナル伝達細胞接着分子として機能することができることを示唆する。この蛋白質の対応するアミノ酸配列は図5Bに例示する。
【００８６】
(実施例7)
本実施例は、293細胞中でのS30-21616/DEGA-EGFP融合構築体の安定した発現、および蛋白質の細胞内局在化を示す。手短に言えば、融合蛋白質を設計し、それによって増幅緑色蛍光蛋白質(enhanced green fluorescent protein, EGFP)をそのC末端に融合した。S30-21616/DEGA ORFをPCR増幅し、pEGFP-N1(BD Biosciences Clontech、米国カリフォルニア州Palo Alto)のXhoI/AgeI部位中にクローン化した。PCR反応は、フォワードプライマー(5'ATC CTC GAG GCG ACC ATA ATG TCG TTA CGT GTA CAC ACT3'、配列番号19) （天然Kozak配列およびXhoI部位(下線)を含み、5'から開始コドンを太字で示した）を使用したことを除いて、S30-21616/DEGAのcDNAクローニングの節に記載されている通りに実施した。使用したリバースプライマー(5'GAT CAC CGG TGC AGT GGA CGC CAC AAA AGG TGT GTC3'、配列番号20)は太字で示した終止コドンのAge I部位(下線)3'を含む。
【００８７】
S30-21616/DEGA-EGFP構築体は、FuGENE6トランスフェクション試薬(Roche Molecular Biochemicals、米国インディアナ州インディアナポリス)を使用しメーカーによる概説の通りに安定的に293細胞中にトランスフェクトした。FuGENE6:DNA比2:1を使用した。トランスフェクトした細胞は、限界希釈法でプレートした後37℃で2日間放置し、800μg/mlのジェネテシン(Sigma-Aldrich Corp.、米国ミズーリ州セントルイス)によって選択にかけた。個々のクローンは、クローニングリングを使用しトリプシン処理によって単離し放置して増殖させた。
【００８８】
S30-21616/DEGA-EGFP融合蛋白質の細胞内局在化を定量するために、クローンは、Zeiss Axioskop蛍光顕微鏡(200×倍率)を使用し評価した。図7に示す蛍光顕微鏡写真によりS30-21616/DEGA蛋白質の細胞表面局在化を確かめた。
【００８９】
(実施例8)
本実施例は、AGS細胞中でS30-21616/DEGAアンチセンス構築体安定して発現することを示す。S30-21616/DEGAの発現プロフィールは、これが発生またはヒト胃腺癌のサブセットの進行において機能的役割を果たし得ることを示唆する。S30-21616/DEGAの機能的役割に取り組むために、著しいレベルのS30-21616/DEGAのmRNAを発現することが示されているヒトAGS細胞系にトランスフェクトしてアンチセンスS30-21616/DEGA構築体または空ベクターを安定的に発現させた。確立された細胞系を細胞周期、増殖、および腫瘍形成能アッセイでのクローン比較研究に使用した。
【００９０】
S30-21616/DEGAアンチセンスクローンを産生させるために、S30-21616/DEGAのORF全体、およびそのORFの最も5'側の608ヌクレオチドを含めたものを包含するヌクレオチド断片(pCR2.1-S30-21616/DEGAを部分的Eco-RI消化して生成)をpIRES PURO2(BD Biosciences Clontech、米国カリフォルニア州Palo Alto)中に逆向きにクローン化し、AGS細胞中に安定的にトランスフェクトさせた。同時に、pIRES PURO2もこれらの細胞中に安定的にトランスフェクトさせて空ベクター対照として利用した。細胞を400μg/mlピューロマイシン(Sigma-Aldrich Corp.、米国ミズーリ州セントルイス)で選択したことを除き、トランスフェクションおよびクローンの単離は、S30-21616/DEGA-EGFP融合について記載されている通り厳密に実施した。
【００９１】
(実施例9)
本実施例は、ノーザンブロット分析によってAGS/DEGAアンチセンスクローンおよび空ベクタークローンの比較発現を示す。胃腺癌細胞系でのS30-21616/DEGAの発現の効果を判定するために、AGSをアンチセンスS30-21616/DEGAおよび空ベクターによって安定的にトランスフェクトし、標準ノーザンブロッティング手順を実施した。全RNAをMicro-to-Midi Total RNAシステム(InVitrogen Corporation、米国カリフォルニア州Carlsbad)を使用してメーカーによって推奨された通り厳密に単離し、5μgを1.2%の変性ホルムアルデヒドゲル上に溶解し、Nytran(登録商標)SuPerChargeメンブレン(SchleicherおよびSchuell、Inc.、Keene、NH)に移し取った。CPA IおよびII cDNAブロットをプローブするために使用した32Pランダム標識S30-21616/DEGA C末端プローブとブロットをハイブリダイズした。ハイブリダイズは、ExpressHyb(商標)溶液(BD Biosciences Clontech、米国カリフォルニア州Palo Alto)を使用し68℃で1時間実施した。10分ずつ3回の室温洗浄(2×SSC、0.05%SDS)および20分ずつ2回の50℃での洗浄(0.1×SSC、0.1%SDS)を行った。メンブレンを2×SSCで洗い、-70℃で終夜Kodak BioMax MRフィルムに曝露した(Eastman Kodak Company、米国ニューヨーク州ロチェスター)。
【００９２】
AGS/DEGAアンチセンスクローンのノーザンブロット分析によって、S30-21616/DEGAの発現の著しくかつ安定した下方調節が示された。図8は、トランスフェクトしていないもしくは野生型(WT)AGS親細胞(レーン1)およびAGS空ベクタークローン15号(レーン2)と比較して、AGS/DEGAアンチセンスクローン6号(レーン3)およびクローン11号(レーン4)のmRNA発現レベルの低減を示す。下パネルは、対照として試験した細胞でのβ-アクチンのmRNA発現を示す。
【００９３】
(実施例10)
本実施例は、AGS/DEGAアンチセンスクローンおよび空ベクタークローンのDNA含有量/細胞周期プロフィールをフローサイトメトリ分析によってを示す。DNA含有量、したがって細胞周期プロフィールを測定するためにフローサイトメトリを使用した。AGS空ベクターおよびS30-21616/DEGAアンチセンスクローンを同時に起こらないように血清含有増殖培地で増殖し、トリプシン処理し、PBSで1回洗浄し、DNA QC Particlesキット(カタログ番号349523、Becton Dickinson)に含まれていたヨウ化プロピジウム溶液によって室温暗所で10分間染色した。続いて、Becton Dickinson FACSVantage(商標)フローサイトメータによりDNA QC particlesキットに記載されたパラメータを使用し細胞を分析した。細胞サイズを光学顕微鏡によって評価した。
【００９４】
ヨウ化プロピジウム染色細胞のフローサイトメトリ分析によって、AGS/空ベクター細胞は、G0/G1において細胞の大部分が存在し、量の面でG2/MおよびS期の細胞が続くという、増殖細胞の典型的なDNA含有量/細胞周期相プロフィールであることが確認されたことが示された(図9を参照のこと、左パネル、上ヒストグラム)。それに反してAGS/DEGAアンチセンスクローン6号(図9を参照のこと、左パネル、中ヒストグラム)および11号(図9を参照のこと、左パネル、下ヒストグラム)は、細胞周期プロフィールの劇的な変化を示した。ほぼ全ての細胞は、細胞周期のG2/M期への移行を示した。クローン11号は、クローン6号よりもわずかに大きなG2/M期へ移行を示した。このG2/Mへの移行は、AGS/空ベクター細胞で観察された細胞サイズと比較して(図9を参照のこと、上右パネル)、AGS/DEGAアンチセンスクローン6号および11号に観察された(図9を参照のこと、下2右パネル) 細胞サイズの増大にも相関していた。
【００９５】
(実施例11)
本実施例は、DEGA発現細胞のin-vivo腫瘍形成能研究を示す。AGS/空ベクターとAGS/DEGAアンチセンスクローンとの間に観察された細胞周期プロフィールの差より、in vivoでの細胞増殖の差も推定される。AGS細胞は、ヌードマウスで腫瘍性であるので、S30-21616/DEGAの発現を抑制するS30-21616/DEGAアンチセンスの効果、したがってAGS細胞の腫瘍化の可能性への負の影響を以下に実施した。AGSクローンを増殖培地に懸濁させ、氷冷し、MATRIGEL(商標)(Collaborative Research Biochemicals、米国マサチューセッツ州Bedford)と1:1(v/v)の割合で完全に混合した。MATRIGEL(商標)は、Engelbroth-Holm-Swarmマウス肉腫に由来し、この肉腫は、ECM蛋白質:ラミニン、コラーゲンIV、ナイドジェン/エナクチン、およびプロテオグリカンの豊かな供給源であることが判明している(12)。細胞系と混合すると、MATRIGEL(商標)は腫瘍形成(27)を強化する。各胸腺欠損(nu/nu)マウス(Charles River Laboratories、米国マサチューセッツ州Wilmington)に、1000万個の細胞を皮下注射し、ノギスを使用し腫瘍体積(mm3)を11週間毎週測定した。
【００９６】
図10は、マウスでの腫瘍増殖研究の結果を示す。75日後、12/12頭のAGS細胞注入マウスおよび19/19頭のAGS/空ベクタークローン15号注入マウスで、平均腫瘍体積約800mm3の腫瘍が発生した。際立って対照的に、AGS/DEGAアンチセンスクローン6号を注入したマウスの6/12頭、およびAGS/DEGAアンチセンスクローン11号を注入したマウスの6/19頭で平均腫瘍体積約20mm3腫瘍しか発生しなかった。
【００９７】
配列番号１：hS30-21616/DEGA cDNA配列
オープンリーディングフレームは、大文字で示す。太文字は開始コドンおよび停止コドンである。配列の更なる情報は、図１を参照せよ。
【００９８】
[配列表１Ａ]
0004416650.tif 000003
【００９９】
[配列表１Ｂ]
0004416650.tif 000004
【０１００】
配列番号２：hS30-21616/DEGAアミノ酸配列
【０１０１】
[配列表２]
0004416650.tif 000005
【０１０２】
配列番号３：マウスS30-21616、mS30-21616/DEGAのポリヌクレオチド配列
【０１０３】
[配列表３]
0004416650.tif 000006
【０１０４】
配列番号４：マウスS30-21616、mS30-21616/DEGAのアミノ酸配列
【０１０５】
[配列表４]
0004416650.tif 000007
【０１０６】
配列番号５：膜貫通（TM）ドメインが欠失したヒトS30-21616/DEGAポリペプチド、-TMhS30-21616/DEGA
【０１０７】
[配列表５]
0004416650.tif 000008
【０１０８】
配列番号６：ロイシンジッパーモチーフ
【０１０９】
[配列表６]
0004416650.tif 000009
【０１１０】
配列番号７：ロイシンリッチ反復1
【０１１１】
[配列表７]
0004416650.tif 000010
【０１１２】
配列番号８：ロイシンリッチ反復2
【０１１３】
[配列表８]
0004416650.tif 000011
【０１１４】
配列番号９：ロイシンリッチ反復3
【０１１５】
[配列表９]
0004416650.tif 000012
【０１１６】
配列番号１０：ロイシンリッチ反復4
【０１１７】
[配列表１０]
0004416650.tif 000013
【０１１８】
配列番号１１：ロイシンリッチ反復5
【０１１９】
[配列表１１]
0004416650.tif 000014
【０１２０】
配列番号１２：ロイシンリッチ反復6
【０１２１】
[配列表１２]
0004416650.tif 000015
【０１２２】
配列番号１３：イムノグロブリン（IgG）ドメイン
【０１２３】
[配列表１３]
0004416650.tif 000016
【０１２４】
配列番号１４：PCRプライマー1
【０１２５】
[配列表１４]
0004416650.tif 000017
【０１２６】
配列番号１５：PCRプライマー2
【０１２７】
[配列表１５]
0004416650.tif 000018
【０１２８】
配列番号１６：S30-21616/DEGA 遺伝子特異的リバースプライマー
【０１２９】
[配列表１６]
0004416650.tif 000019
【０１３０】
配列番号１７：フォワードプライマー
【０１３１】
[配列表１７]
0004416650.tif 000020
【０１３２】
配列番号１８：リバースプライマー
【０１３３】
[配列表１８]
0004416650.tif 000021
【０１３４】
配列番号１９：S30-21616/DEGA-EGFP融合構築体のためのフォワードプライマー
【０１３５】
[配列表１９]
0004416650.tif 000022
【０１３６】
配列番号２０：S30-21616/DEGA-EGFP融合構築体のためのリバースプライマー
【０１３７】
[配列表２０]
0004416650.tif 000023
【図面の簡単な説明】
【０１３８】
【図１】図１は、S30-21616/DEGA(cDNA=3769bp、ORF=1569bp、522個のアミノ酸のポリペプチドをコードする)のヌクレオチドおよび導き出されたアミノ酸配列を示す図である。この配列は、以下の特徴を有する:シグナルペプチド配列(太字)、膜貫通型領域(太字下線)、推定グリコシル化部位(丸で囲んだアミノ酸)、および推定リン酸化セリンとトレオニン(四角で囲んだアミノ酸)。
【図２Ａ】図２Ａは、BD Biosciences Cancer Profiling Arrays Iを使用した、個々の患者の腫瘍組織試料および正常組織試料のS30-21616/DEGAのcDNA発現レベルのドットブロット分析を示す図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、BD Biosciences Cancer Profiling Arrays IIを使用した、個々の患者の腫瘍組織試料および正常組織試料のS30-21616/DEGAのcDNA発現レベルのドットブロット分析を示す図である。
【図３】図３は、胃腺癌細胞系、AGS(レーンA)、NCI-N87(レーンB)、RF-1(レーンC)、KatoIII(レーンD)、KKVR(レーンE)、NCI-SNU-16(レーンF)、およびNCI-SNU-1(レーンG)でのS30-21616/DEGAの発現のノーザンブロット分析を示す図である。下パネルは、それぞれの細胞系でのβ-アクチンmRNAレベルを示す。
【図４】図４は、一般的な、非胃腺癌細胞系のS30-21616/DEGAの発現のドットブロット分析を示す図である。
【図５Ａ】図５Ａは、S30-21616/DEGA蛋白質を示す模式図である。S30-21616/DEGA蛋白質中に存在する領域は、以下に示すそれらアミノ酸境界で示される:SP=シグナルペプチド、LRR=ロイシンリッチリピート、LRR-NT=システインリッチ領域N末端フランキングLRR、LRR-CT=システインリッチ領域C末端フランキングLRR、IgG=免疫グロブリン領域、TM=膜貫通型領域、およびS/Tリッチ=セリン/トレオニンリッチ領域。黒色ダイヤは、推定N結合グリコシル化部位を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、S30-21616/DEGAポリヌクレオチドのアミノ酸配列を示す図であり、LRRを太字で、免疫グロブリン様領域を下線で、膜貫通型領域を四角で、およびカゼインキナーゼリン酸化部位およびポリペプチドキナーゼCリン酸化部位をそれぞれ[]および()で示す。
【図６】図６は、S30-21616/DEGA-EGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein)融合蛋白質の細胞内局在化を示す図である。この融合蛋白質を293細胞中で安定的に発現させ、蛍光顕微鏡(倍率200倍)を使用し評価した。
【図７】図７は、AGS親細胞または野生型細胞(レーン1)、空ベクターでトランスフェクトしたAGSであるAGS/空ベクタークローン15号(レーン2)、S30-21616/DEGAアンチセンスでトランスフェクトしたAGSであるAGS/DEGAアンチセンスクローン6号(レーン3)、およびAGS/DEGAアンチセンスクローン11号(レーン4)におけるS30-21616/DEGAの発現のノーザンブロット分析を示す図である。下パネルは、それぞれの細胞型(内部標準)でのβ-アクチンmRNAの内在性発現を示す。
【図８】図８は、左パネルは、AGS空ベクタークローン15号(左上パネル)、AGS/DEGAアンチセンスクローン6号(中左パネル)、およびAGS/DEGAアンチセンスクローン11号(下左パネル)のDNA内容物/細胞周期プロフィールのフローサイトメトリのヒストグラムである。右パネルは、AGSアンチセンスクローン6号(中右パネル)およびクローン11号(右下パネル)の細胞サイズを、AGS/空ベクタークローン15号(上右パネル)と比較した光学顕微鏡図である。
【図９】図９は、アンチセンスDEGA構築体または空ベクターによって安定的にトランスフェクトしたAGSクローンの腫瘍化成長曲線である。この曲線は、以下:AGS WT(12/12)、AGS/空ベクタークローン15号(19/19)、AGS/DEGAアンチセンスクローン6号(6/12)、およびAGS/DEGAアンチセンスクローン11号(6/19)を注入した延べマウス数に対する腫瘍マウス数よって定量した。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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