(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＳ−Ｉ−６１８−２０（配列番号：１７６）の配列を含む約１００ヌクレオチド以下のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
該オリゴヌクレオチドが約５０ヌクレオチド以下である、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
該オリゴヌクレオチドが約３５ヌクレオチド以下である、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
ＡＳ−Ｉ−６１８−２０（配列番号：１７６）のヌクレオチド配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
低下したダイマー形成と低下した自己相補相互作用を示す、請求項１から４の何れか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
該オリゴヌクレオチドがヌクレアーゼ耐性である、請求項１から４の何れか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
該オリゴヌクレオチドが１以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、請求項１から４の何れか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
哺乳動物における新生物性細胞の腫瘍形成の阻害に使用するための、ＡＳ−Ｉ−６１８−２０（配列番号：１７６）の配列を含む約１００ヌクレオチド以下のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
哺乳動物における化学療法薬剤に対して耐性である新生物性細胞の腫瘍形成の阻害に使用するための、ＡＳ−Ｉ−６１８−２０（配列番号：１７６）の配列を含む約１００ヌクレオチド以下のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
哺乳動物における化学療法薬剤に対する新生物性細胞の感受性の増大に使用するための、ＡＳ−Ｉ−６１８−２０（配列番号：１７６）の配列を含む約１００ヌクレオチド以下のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
該化学療法薬剤が、５−フルオロウラシル、マイトマイシンＣ、メトトレキセート（ＭＴＸ）、ヒドロキシ尿素、Ｎ−（ホスホンアセチル）−Ｌ−アスパルテート（ＰＡＬＡ）、コルヒチン、ビンブラスチン及びドキソルビシンからなる群から選択される、請求項９又は１０に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
該化学療法薬剤が、メトトレキセート（ＭＴＸ）、ヒドロキシ尿素、又はＮ−（ホスホンアセチル）−Ｌ−アスパルテート（ＰＡＬＡ）である、請求項１１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
哺乳動物における新生物性細胞の転移の阻害に使用するための、ＡＳ−Ｉ−６１８−２０（配列番号：１７６）の配列を含む約１００ヌクレオチド以下のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
該オリゴヌクレオチドが約５０ヌクレオチド以下である、請求項８、９、１０又は１３の何れか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
該オリゴヌクレオチドが約３５ヌクレオチド以下である、請求項８、９、１０又は１３の何れか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
該オリゴヌクレオチドがＡＳ−Ｉ−６１８−２０（配列番号：１７６）のヌクレオチド配列を有する、請求項８、９、１０又は１３の何れか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
低下したダイマー形成と低下した自己相補相互作用を示す、請求項８、９、１０又は１３の何れか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１８】
該オリゴヌクレオチドがヌクレアーゼ耐性である、請求項８、９、１０又は１３の何れか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１９】
該オリゴヌクレオチドが１以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、請求項８、９、１０又は１３の何れか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２０】
該哺乳動物がヒトである。請求項８、９、１０又は１３の何れか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２１】
該新生物性細胞が、白血病、リンパ腫、肉腫、メラノーマ、腺腫、固体組織の癌腫、低酸素血症腫瘍、泌尿生殖器癌、造血癌、結腸癌、乳癌、膵臓癌、腎臓癌、肝臓癌、脳癌、皮膚癌、頭首部の癌、又は神経系の癌に由来するものである、請求項８、９、１０又は１３の何れか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２２】
該癌腫が、口、咽喉、喉頭又は肺の扁平上皮細胞癌腫である、請求項２１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２３】
泌尿生殖器癌が、頸部癌又は膀胱癌である、請求項２１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２４】
該新生物性細胞が、乳癌、肝臓癌、卵巣癌、脳癌、肺癌、膵臓癌、結腸癌、メラノーマ、又は腎臓癌である、請求項８、９、１０又は１３の何れか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２５】
脳癌が、脳グリア芽腫、又は脳星状細胞腫である、請求項２４に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２６】
該新生物性細胞が、前立腺癌、又はメラノーマに由来するものである、請求項８、９、１０又は１３の何れか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２７】
該新生物性細胞が、固形腫瘍に由来するものである、請求項８、９、１０又は１３の何れか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２８】
医薬の製造における、請求項１から２７の何れか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項２９】
請求項１から２７の何れか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、及び薬学的に許容しうる担体又は希釈剤を含む、医薬組成物。
【請求項３０】
請求項１から５の何れか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドをコードする配列に機能的に連結した転写開始領域を含む、単離されたＤＮＡ。
【請求項３１】
請求項３０に記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項３２】
医薬の製造における、請求項３０に記載のＤＮＡ又は請求項３１に記載のベクターの使用。
【請求項３３】
請求項３０に記載のＤＮＡ又は請求項３１に記載のベクター、及び薬学的に許容しうる担体又は希釈剤を含む、医薬組成物。
【請求項３４】
請求項１から７の何れか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドで遺伝的に加工された単離された宿主細胞。
【請求項３５】
請求項３０に記載のＤＮＡ又は請求項３１に記載のベクターで遺伝的に加工された単離された宿主細胞。
【請求項３６】
該宿主細胞がヒト細胞である、請求項３４又は３５の何れか１項に記載の宿主細胞。
【請求項３７】
有効量の請求項１から７の何れか１項に記載の１以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞にインビトロで接触させることを含む、哺乳動物から単離された新生物性細胞の腫瘍形成を阻害する方法。
【請求項３８】
有効量の請求項１から７の何れか１項に記載の１以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞にインビトロで接触させることを含む、哺乳動物から単離された化学療法薬剤に対して耐性である新生物性細胞の腫瘍形成を阻害する方法。
【請求項３９】
有効量の請求項１から７の何れか１項に記載の１以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞にインビトロで接触させることを含む、哺乳動物から単離された化学療法薬剤に対して耐性である新生物性細胞の感受性を増大させる方法。
【請求項４０】
該化学療法薬剤が、５−フルオロウラシル、マイトマイシンＣ、メトトレキセート（ＭＴＸ）、ヒドロキシ尿素、Ｎ−（ホスホンアセチル）−Ｌ−アスパルテート（ＰＡＬＡ）、コルヒチン、ビンブラスチン及びドキソルビシンからなる群から選択される、請求項３８又は３９に記載の方法。
【請求項４１】
該化学療法薬剤が、メトトレキセート（ＭＴＸ）、ヒドロキシ尿素、又はＮ−（ホスホンアセチル）−Ｌ−アスパルテート（ＰＡＬＡ）である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
有効量の請求項１から７の何れか１項に記載の１以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞にインビトロで接触させることを含む、哺乳動物から単離された新生物性細胞の転移を阻害する方法。
【請求項４３】
該哺乳動物がヒトである、請求項３７、３８、３９又は４２の何れか１項に記載の方法。
【請求項４４】
該オリゴヌクレオチドが、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メチル、２−プロピル及び他のアルキルアデニン、５−ハロウラシル、５−ハロシトシン、６−アザウラシル、６−アザシトシン及び６−アザチミン、偽ウラシル、４−チオウラシル、８−ハロアデニン、８−アミノアデニン、８−チオールアデニン、８−チオアルキルアデニン、８−ヒドロキシルアデニン、８−ハログアニン、８−アミノグアニン、８−チオールグアニン、８−チオアルキルグアニン、８−ヒドロキシルグアニン、５−トリフルオロメチルウラシル及び５−トリフルオロシトシンからなる群から選択される１以上の合成塩基を含んでいる、請求項１から４の何れか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項４５】
該オリゴヌクレオチドが、ペプチド核酸である、請求項１から４の何れか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項４６】
該オリゴヌクレオチドが、モルホリン骨格構造を含む、請求項１から４の何れか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項４７】
該オリゴヌクレオチドが、メチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、及びホスホトリエステルのヌクレオチド間結合からなる群から選択されるホスフェート骨格中に、１以上の修飾されたヌクレオチド内結合を含む、請求項１から４の何れか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項４８】
ホスホロチオエートヌクレオチド間結合が、オリゴヌクレオチドの４、５又は６個の３’−末端ヌクレオチドを連結している、請求項７に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項４９】
ホスホロチオエートヌクレオチド間結合が、オリゴヌクレオチドの全ヌクレオチドを連結している、請求項７に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項５０】
該オリゴヌクレオチドが、１以上のアルキル又はシクロアルキル糖間結合を含む、請求項１から４の何れか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項５１】
該オリゴヌクレオチドが、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）オリゴヌクレオチドである、請求項１から４の何れか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項５２】
該オリゴヌクレオチドが、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）オリゴヌクレオチドである、請求項１から４の何れか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】
発明の分野
本発明の分野は、新生物性細胞の腫瘍形成および／または転移を制御する方法に関する。より具体的には、本発明は哺乳動物のリボヌクレオチドレダクターゼのＲ１及びＲ２成分に対するアンチセンス配列の使用に関する。
【０００２】
文献
以下の文献、特許出願及び特許を本出願に引用する。
米国特許第5,034,506号
米国特許第5,023,252号（1991年6月11日発行）
国際特許出願PCT/US98/00540
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U.S. Application Serial No. 08/904,901 filed August 1. 1997, which in turn claims priority to U.S. Provisional Application No. 60/023,040 filed August 2, 1996 and U.S. Provisional Application No. 60/039,959 filed March 7, 1997
上記の文献、特許出願及び特許は全てそれらの全体として引用により本明細書中に取り込まれるものとし、これは、各々の文献、特許出願及び特許がその全体として引用により具体的かつ個別に本明細書中に取り込まれた場合と同様とする。
【０００３】
技術の水準
ＤＮＡ合成を誘導する最初の独特の工程は、リボヌクレオチドからそれに対応するデオキシリボヌクレオチドへの転換であり、ハウスキーピング遺伝子であるリボヌクレオチドレダクターゼによって細胞周期特異的な様式で触媒される反応である［Lewis他、1978；Reichard他、1993；Wright、1989a；Wright他、1990a；Stubbe、1989］。哺乳動物の酵素は、Ｒ１及びＲ２と称されることが多い２つの異なる二量体タンパク質成分から構成され、これらは異なる染色体上に位置する２つの異なる遺伝子によってコードされている［Bjorklund他、1993；Tonin他、1987］。哺乳動物のタンパク質Ｒ１は、約１７０ｋＤａの分子量を有するホモ二量体構造であり、基質部位および酵素活性及び基質特異性を制御するアロステリックエフェクター部位を有する［Wright、1989A；Thelander他、1980；Caras他、1985；Wright他、1990a］。タンパク質Ｒ２は、８８ｋＤａの分子量を有するホモ二量体であり、触媒作用に必要なチロシルフリーラジカルを安定化させる２つの均等な二核性鉄中心を形成する［Wright他、1990a；Thelander他、1985；McClarty他、1990］。Ｒ１及びＲ２タンパク質はそれらのＣ末端で相互作用し、活性なホロ酵素を形成する［Reichard、1993；Wright他、1990a；Davis他、1994］。
【０００４】
Ｒ１及びＲ２は細胞周期の間に別々に調節される。de novo合成から生じるＲ２タンパク質はＳ期に相関して増大する［Lewis他、1978；Mann他、1988］。リボヌクレオチドレダクターゼ、そしてそれに伴なうＤＮＡ合成及び細胞増殖の活性は、Ｒ２成分の合成および分解によって細胞周期の間に増殖細胞において制御される［Eriksson他、1984］。律速Ｒ２成分は、細胞周期の進行のＣＤＣ２及びＣＤＫ２タンパク質キナーゼメディエーターによってリン酸化され得るリンタンパク質であり［Chan他、1993］、酵素活性に必要な独特なチロシルフリーラジカルを安定化させる非ヘム鉄を含む［Reichard、1993；McClarty他、1990］。
【０００５】
Ｒ１タンパク質のレベルは、増殖細胞の細胞周期の間に実質的に変化しないようであり、細胞周期の全体を通じて検出することができる。Ｒ１ｍＲＮＡの合成は、Ｒ２ｍＲＮＡと同様、主としてＳ期の間に生じているようである［Eriksson他、1984；Choy他、1988；Mann他、1988］。細胞周期の間におけるＲ１タンパク質の分布がより広いことは、Ｒ２タンパク質と比較して、半減期がより長いことに起因している［Choy他、1988；Mann他、1988］。
【０００６】
リボヌクレオチドレダクターゼ、特にＲ２成分の調節は、腫瘍プロモーター又は増殖因子ＴＧＦ−βに露出した悪性細胞では変化する［Amara他、1994；Chen他、1993；Amara他、1995b；Hurta及びWright、1995A；Hurta他、1991］。非悪性細胞と比較した場合、培養悪性細胞では酵素活性のレベルがより高いことが観察され［Weber、1983；Takeda及びWeber、1981；Wright他、1989a］、正常対照組織試料と比較して、Ｒ２タンパク質及びＲ２ｍＲＮＡのレベルの増加が前悪性および悪性組織で観察された［Saeki他、1995；Jensen他、1994］。
【０００７】
ヒドロキシ尿素のような化合物は、Ｒ２タンパク質の鉄中心を脱安定化してチロシルフリーラジカルの破壊をもたらすことにより、リボヌクレオチドレダクターゼ活性を阻害し［McClarty他、1990］、細胞が細胞周期のＳ期を進行することを妨げる［Ashihara及びBaserga、1979］。
【０００８】
分子生物学及びヒトゲノムプロジェクトの進展により、哺乳動物遺伝子発現を用いた介入の標的化というかつて予測されなかった可能性の道が開けた［Blaese、1997］。これには、特異的遺伝子の破壊などのアプローチが含まれる。標的のｍＲＮＡ内の特異的配列とハイブリダイズするように設計したアンチセンス（ＡＳ）オリゴヌクレオチド（ＡＳ−ＯＮ）は、そのような標的化した介入の一例である。一般に、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、リン脂質膜とよく相互作用する［Akhter他、1991］。細胞質膜と相互作用した後、それらは能動的又は受動的に生細胞内に輸送される場合があり［Loke他、1989］、これは特異的受容体を包含することが予測される飽和機構によって生じる可能性がある［Yakubov他、1989］。
【０００９】
多くの優れた総説がアンチセンス技術およびその膨大な治療の可能性を論じてきた。この急速に発達した技術の化学的［Crooke、1995］、細胞［Wagner、1994］および治療的［Hanania他、1995；Scanlon他、1995；Gewirtz、1993］側面についての総説がある。比較的短期間内に、豊富な情報が、培養初代細胞及び細胞株におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドのインビトロでの使用、並びに特定の過程を抑制し体機能を一過的に変化させるためのそのようなオリゴヌクレオチドのインビボでの投与について蓄積されてきた。さらに、動物モデルにおいて十分な経験がインビトロ及びインビボで利用可能であり、ヒトでの効果を予測することができる。
【００１０】
上記に加えて、国際特許出願ＰＣＴ／ＣＡ９７／００５４０は、リボヌクレオチドレダクターゼのＲ１及びＲ２成分に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドが前悪性細胞又は悪性細胞における腫瘍形成態および／または転移能を制御するために有用であることを開示している。この文献に例示されている特定のオリゴヌクレオチドは良好な抗腫瘍形成性を示したが、腫瘍形成能および／または転移能を制御するための活性を増加したさらに別のアンチセンスオリゴヌクレオチドを見つけ出すことができれば有利である。
【００１１】
発明の概要
本発明は、ＡＳ−Ｉ−６１８−２０（配列番号：１７６）の配列を含む約５０ヌクレオチド未満のアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。この配列は、低下したダイマー形成と低下した自己相補相互作用とをさらに含んでいてもよい。
【００１２】
有効量のＡＳ−Ｉ−６１８−２０（配列番号：１７６）の配列を含む約５０ヌクレオチド未満のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、哺乳動物における腫瘍細胞増殖を阻害するための医薬組成物もまた提供される。
【００１３】
本発明の方法的側面の一つでは、本発明は、哺乳動物における新生物性細胞の腫瘍形成を阻害する方法であって、新生物性細胞に有効量のＡＳ−Ｉ−６１８−２０（配列番号：１７６）の配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを接触させることを含む上記の方法を提供する。
【００１４】
別の側面は、哺乳動物における化学療法薬剤に対して耐性である新生物性細胞の腫瘍形成を阻害する方法であって、化学療法薬剤に対して耐性である腫瘍を有する患者を同定し、該腫瘍に、該腫瘍が耐性である化学療法薬剤とＡＳ−Ｉ−６１８−２０（配列番号：１７６）の配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドとを接触させることを含み、該化学療法薬剤およびアンチセンスオリゴヌクレオチドの量が腫瘍細胞増殖を阻害するのに十分である、上記の方法である。アンチセンスオリゴヌクレオチド単独の量が腫瘍細胞増殖を阻害するのに不十分であってもよい。
【００１５】
別の側面は、腫瘍をＡＳ−Ｉ−６１８−２０（配列番号：１７６）の配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させることによって、哺乳動物における化学療法薬剤に対する新生物性細胞の感受性を増大させる方法である。
【００１６】
別の側面は、哺乳動物における腫瘍細胞の転移を阻害する方法であって、腫瘍細胞増殖を阻害するのに十分な量のＡＳ−Ｉ−６１８−２０（配列番号：１７６）の配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを該哺乳動物に投与することを含む上記の方法である。
【００１７】
別の側面は、転写開始領域、並びにＡＳ−Ｉ−６１８−２０（配列番号：１７６）の配列を含む約５０ヌクレオチド未満のアンチセンスオリゴヌクレオチドをコードする配列を含む配列を有する単離されたＤＮＡである。
【００１８】
発明の詳細な説明
定義
本明細書で使用する場合、以下の用語は以下の意味を有する。
【００１９】
本明細書で使用する用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、所望のｍＲＮＡに相補的なヌクレオチド配列を意味する。好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチドレダクターゼｍＲＮＡに相補的である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡの５’非翻訳領域、コード領域またはｍＲＮＡの３’非翻訳領域の何れかに相補的であってもよい。
【００２０】
用語「オリゴヌクレオチド」は、天然の塩基、糖及び糖内（主鎖）結合から成るヌクレオチドのオリゴマー又はポリマー又はヌクレオチドモノマーを言う。この用語はまた、同様に機能する非天然のモノマー又はその一部を含む修飾又は置換したオリゴマーを包含する。そのような修飾又は置換したオリゴマーは、細胞取り込みの増大、ヌクレアーゼの存在下での安定性の増加などの理由から、天然体よりも好ましい場合がある。この用語はまた、２以上の化学的に異なる領域を含むキメラオリゴヌクレオチドをも包含する。例えば、キメラオリゴヌクレオチドは、有益な性質（例えば、増加したヌクレアーゼ耐性、増加した細胞への取り込み）を付与する修飾したヌクレオチド領域の少なくとも１以上の領域を含んでいてもよく、本発明の２以上のオリゴヌクレオチドを結合してキメラオリゴヌクレオチドを形成してもよい。
【００２１】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、リボ核酸でもデオキシリボ核酸でもよく、アデニン、グアニン、シトシン、チミン及びウラシルを含む天然又は合成のモノマー塩基を含むことができる。オリゴヌクレオチドは、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メチル、２−プロピル及び他のアルキルアデニン、５−ハロウラシル、５−ハロシトシン、６−アザウラシル、６−アザシトシン及び６−アザチミン、偽ウラシル、４−チオウラシル、８−ハロアデニン、８−アミノアデニン、８−チオアデニン、８−チオアルキルアデニン、８−ヒドロキシアデニン及び他の８−置換アデニン、８−ハログアニン、８−アミノグアニン、８−チオールグアニン、８−チオアルキルグアニン、８−ヒドロキシグアニン及び他の８−置換グアニン、他のアザ及びデアザウラシル類、チミジン類、シトシン類またはグアニン類、５−トリフルオロメチルウラシル及び５−トリフルオロシトシンなどの修飾塩基を含んでいてもよい。修飾はまた、糖、塩基または主鎖成分を含むオリゴヌクレオチドの各部分に、メチル、エチル又はプロピル基などの他の化学基を付着させることを含む。
【００２２】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、リン主鎖、短鎖アルキル又はシクロアルキル糖内結合又は短鎖ヘテロ原子又はヘテロ環糖内結合中に、修飾したリン含有酸素ヘテロ原子を含んでいてもよい。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドはメチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル及びモルホリノオリゴマーを含んでいてもよい。本発明の一態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは４から６の３’末端ヌクレオチドの間を連結するホスホロチオエート結合を有する。別の態様では、ホスホロチオエート結合は全てのヌクレオチドを連結する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは糖模倣体を有していてもよい。
【００２３】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、ヌクレオチドの構造が基本的に変化しているヌクレオチド類縁体を含んでいてもよい。そのようなオリゴヌクレオチド類縁体の例は、ＤＮＡ（又はＲＮＡ）のデオキシリボース（又はリボース）ホスフェート主鎖がペプチドで見られるものと同様のポリアミド主鎖に置き換わっているペプチド核酸（ＰＮＡ）である（Nielsen他、1991；Good及びNielsen、1998；Buchardt（死去）他、米国特許5,766,855；Buchardt（死去）、米国特許5,719,262）。ＰＮＡ類縁体は酵素による消化に対して耐性であり、インビボ及びインビトロで生存期間が長いことが実証されている。ＰＮＡはまた、ＰＮＡ鎖とＤＮＡ鎖との間の電荷の反発の欠如のために、天然の核酸分子よりも相補ＤＮＡ配列に強く結合する。
【００２４】
本発明のオリゴヌクレオチドは、ポリマー主鎖、環状主鎖又は非環状主鎖を含む他のヌクレオチドを含んでいてもよい。例えば、ヌクレオチドはモルホリノ主鎖構造を含んでいてもよい（米国特許5,034,506）。
【００２５】
本発明のオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ及びＲＮＡヌクレアーゼによる分解を受けないように修飾されているか、あるいはＤＮＡ又はＲＮＡヌクレアーゼからオリゴヌクレオチドを保護する送達ビヒクル内に置かれている場合は、「ヌクレアーゼ耐性」である。ヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチドとしては、例えば、メチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロトリエステル、及びモルホリノオリゴマーが挙げられる。ヌクレアーゼ耐性を付与する好適な送達ビヒクルとしては、例えば、リポソームが挙げられる。
【００２６】
本発明のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの薬物動態性を改善する基、又はオリゴヌクレオチドの薬効性を改善する基などの基を含んでいてもよい。
【００２７】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは好ましくは、その配列が、二重鎖形成、ヘアピン形成及びホモオリゴマー／配列反復を示す可能性が最小になるようにし、かつリボヌクレオチドレダクターゼｍＲＮＡ又は遺伝子配列に結合する可能性が高度から適度になるような、リボヌクレオチドレダクターゼｍＲＮＡ又は遺伝子配列に相補的な配列から選択される。これらの性質は、コンピューターモデリングプログラムOLIGO Primer Analysis Software，Version3.4又は5.0（National Biosciences, Inc., Plymouth, MNより頒布）を用いて求めることができる。このコンピュータープログラムによりこれら５つのパラメーターの質的予測の決定が可能である。
【００２８】
あるいは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、その配列が２以上の哺乳動物種の間で何れかのリボヌクレオチドレダクターゼについて高度に保存されることに基づいて選択することもできる。これらの性質はウイスコンシン大学コンピューターグループ（ＧＣＧ）ソフトウエア（Devereux J.他、1994）のBLASTNプログラム（Altschul他）とNational Center for Biotechnology Information（ＮＣＢＩ）データベースを用いて測定することができる。
【００２９】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、置換、挿入及び欠失などの変異を含んでいてもよい。好ましくは、変異を有する配列は１０％未満である。
【００３０】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは一般的には、少なくとも約３のヌクレオチド又はヌクレオチド類縁体を含み、より好ましくは、それらは少なくとも約５のヌクレオチドであり、より好ましくは、それらは少なくとも約７のヌクレオチドであり、より好ましくは、それらは少なくとも約９のヌクレオチドであり、最も好ましくは、それらは少なくとも約１２のヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドは好ましくは、約１００未満のヌクレオチド又はヌクレオチド類縁体、より好ましくは、約５０未満のヌクレオチド又はヌクレオチド類縁体、最も好ましくは、約３５未満のヌクレオチド又はヌクレオチド類縁体である。
【００３１】
好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは表１、２及び３（下記）に記載する配列を含む。
【００３２】
表１：Ｒ２メッセージを標的とするように設計したアンチセンス配列
【００３３】
【表１】
0004424857.tif 000002
【００３４】
0004424857.tif 000003
【００３５】
0004424857.tif 000004
【００３６】
0004424857.tif 000005
【００３７】
0004424857.tif 000006
【００３８】
表１の脚注
名称は以下を含む：
ＡＳ＝アンチセンス
ＩＩ＝Ｒ２
最初の番号はＲ２ｍＲＮＡ配列中の最初のヌクレオチド位置を示す。
２番目の番号は配列断片の長さを示す。
表に示した配列ＡＳ−ＩＩ−２２２９Ａ及びテキストで示した配列ＡＳ−ＩＩ−２２２９Ｂは代替の配列であり、２２２９ＡはGENBANK（Pavloffにより提出）のＲ２のものから得たものであり、２２２９Ｂは、Pavloff他、1992で公開されたものから選択した。
部分的チオ化（Ｓ）を示さない限り、配列は完全にチオ化した。
ＴＭ℃＝形成したオリゴヌクレオチド二重鎖の融解温度
ｄＧ＝オリゴヌクレオチド相補二量体形成の自由エネルギー値
上記分析に加えて、二量体形成能（Ｄ）、自己相補相互作用能（Ｈ）及び標的配列以外のＲ２メッセージ中の配列への結合能（Ｂ）の予想を得た。上記した分析及び予想は、コンピューターモデリングプログラムOLIGO Primer Analysis Software，Version3.4（National Biosciencesにより頒布）を用いて取得した。プログラムによりＴｍ（℃）及びｄＧ値を測定することができ、「能力なし」、「多少の能力あり」又は本質的に「完全に能力あり」を示すＤ、Ｈ及びＢのパラメーターの定量的予想が提供される。オリゴヌクレオチド配列を選択する際、相補鎖へのアンチセンス分子の堅固な結合に重要な高いＴｍ（℃）及びｄＧ値を示す配列に高い優先度を付与し、Ｄ、Ｈ及びＢで能力を示さないものと予想されたアンチセンス配列に高い優先度を付与した。Ｂ（即ち、正確な標的配列に加えてＲ２ｍＲＮＡの他の領域への結合）はオリゴヌクレオチド活性を弱めるよりはむしろ増強するので、３種のカテゴリー（Ｄ、Ｈ、Ｂ）のうち最も重要なものはＤ及びＨである。表１に示した配列の大部分は、Ｄ及びＨカテゴリーにおいて能力を有さず、幾つかの配列はＤ又はＨにおいて「多少の能力」を示し、腫瘍細胞増殖阻害試験で有効であることが後に判明したので(表１３)、表１にも含めた。選択した配列の大部分は表１３に示す通り抗腫瘍性を示したことから、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤を選択するこの試みは非常に効果的であることが判明した。
【００３９】
表２：Ｒ１メッセージを標的とするように設計したアンチセンス配列
【００４０】
【表２】
0004424857.tif 000007
【００４１】
0004424857.tif 000008
【００４２】
0004424857.tif 000009
【００４３】
表２の脚注
名称は以下を含む：
ＡＳ＝アンチセンス
Ｉ＝Ｒ１
最初の番号はＲ１ｍＲＮＡ配列中の最初のヌクレオチド位置を示す。
２番目の番号は配列断片の長さを示す。
ＴＭ℃＝形成したオリゴヌクレオチド二重鎖の融解温度
ｄＧ＝オリゴヌクレオチド相補二量体形成の自由エネルギー値
上記分析に加えて、二量体形成能（Ｄ）、自己相補相互作用能（Ｈ）及び標的配列以外のＲ１メッセージ中の配列への結合能（Ｂ）の予想を得た。分析は表１の脚注に記載した通り行い、表２に示した配列を選択するのに使用した基準は表１の脚注に示した通りである。
【００４４】
表３：ヒトリボヌクレオチドレダクターゼＲ１遺伝子に相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド
【００４５】
【表３】
0004424857.tif 000010
【００４６】
0004424857.tif 000011
【００４７】
0004424857.tif 000012
【００４８】
表３において、「Ｔｍ」は最近接熱力学値に従って計算したオリゴヌクレオチド二重鎖の融解温度である。この温度で、５０％の核酸分子が二重鎖であり、５０％が変性している。「ｄＧ」はオリゴヌクレオチドの自由エネルギーであり、オリゴヌクレオチド二重鎖の安定性の測定である。コンピューターモデリングプログラムOLIGO Primer Analysis Software Version 5.0を使用した。
【００４９】
用語「アルキル」は、好ましくは１から２０個の炭素原子、より好ましくは１から６個の炭素原子を有する一価のアルキル基を意味する。この用語は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉｓｏ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉｓｏ−ブチル、ｎ−ヘキシルなどの基によって例示される。
【００５０】
用語「アリール」は、単環（例えば、フェニル）又は多環縮合（融合）環（例えば、ナフチル又はアントリル）を有する６から１４個の炭素原子の不飽和の芳香族炭素環式基を意味する。好ましいアリールとしては、フェニル、ナフチルなどが挙げられる。
【００５１】
用語「シクロアルキル」は、単環又は多環縮合環を有する３から２０個の炭素原子の環式アルキル基を意味する。そのようなシクロアルキル基としては、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロオクチルなどの単環構造、又はアダマンチルなどの多環構造が挙げられる。
【００５２】
用語「ハロ」又は「ハロゲン」は、フルオロ、クロロ、ブロモ及びヨードを意味し、好ましくはフルオロ又はクロロである。
【００５３】
用語「チオール」は、−ＳＨ基を意味する。
【００５４】
１以上の置換基を含有する上記の基の何れかについて、そのような基は、立体的に実施不能および／又は合成的に実行不能な置換または置換パターンは含まないものと理解されるのは当然である。また、本発明の化合物は、これらの化合物の置換から生じる全ての立体化学異性体を包含する。
【００５５】
用語「薬学的に許容しうる塩」とは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの生物学的有効性及び特性を保持し、生物学的又はその他の意味で望ましくないものではない塩を意味する。多くの場合、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、アミノ及び／又はカルボキシル基またはそれに類似する基の存在によって酸および／又は塩基塩を形成することができる。
【００５６】
薬学的に許容しうる塩基付加塩は、無機および有機塩基から調製することができる。無機塩基から誘導される塩としては、単なる例示として、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、及びマグネシウム塩などが挙げられる。有機塩基から誘導される塩としては、１級、２級及び３級アミンの塩、例えば、アルキルアミン、ジアルキルアミン、トリアルキルアミン、置換アルキルアミン、ジ（置換アルキル）アミン、トリ（置換アルキル）アミン、アルケニルアミン、ジアルケニルアミン、トリアルケニルアミン、置換アルケニルアミン、ジ（置換アルケニル）アミン、トリ（置換アルケニル）アミン、シクロアルキルアミン、ジ（シクロアルキル）アミン、トリ（シクロアルキル）アミン、置換シクロアルキルアミン、ジ置換シクロアルキルアミン、トリ置換シクロアルキルアミン、シクロアルケニルアミン、ジ（シクロアルケニル）アミン、トリ（シクロアルケニル）アミン、置換シクロアルケニルアミン、ジ置換シクロアルケニルアミン、トリ置換シクロアルケニルアミン、アリールアミン、ジアリールアミン、トリアリールアミン、ヘテロアリールアミン、ジヘテロアリールアミン、トリヘテロアリールアミン、ヘテロ環式アミン、ジヘテロ環式アミン、トリヘテロ環式アミン、混合したジ−及びトリ−アミン（ここで、アミン上の少なくとも２の置換基が異なり、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロ環などから成る基から選択される）の塩などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。２または３の置換基がアミノ窒素と一緒にヘテロ環又はヘテロアリール基を形成するアミンも含まれる。
【００５７】
好適なアミンの具体例としては、単なる例示として、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリ（イソプロピル）アミン、トリ（ｎ−プロピル）アミン、エタノールアミン、２−ジメチルアミノエタノール、トロメタミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、プロカイン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、エチレンジアミン、グルコサミン、Ｎ−アルキルグルカミン、テオブロミン、プリン、ピペラジン、ピペリジン、モルホリン、Ｎ−エチルピペリジンなどが挙げられる。本発明の実施においては、例えば、カルボキサミド、低級アルキルカルボキサミド、ジアルキルカルボキサミドなどを含むカルボン酸アミドなどの他のカルボン酸誘導体も有用であるものと理解すべきである。
【００５８】
薬学的に許容しうる酸付加塩は、無機及び有機酸から調製することができる。無機酸から誘導される塩としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などが挙げられる。有機酸から誘導される塩としては、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸などが挙げられる。
【００５９】
用語「リボヌクレオチドレダクターゼ遺伝子」とは、その産物が単独または複合体の一部として、リボヌクレオチドからデオキシリボヌクレオチドへの還元を触媒することができる任意の遺伝子を意味する。
【００６０】
用語「相補的」とは、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列が標的配列、即ち、リボヌクレオチドレダクターゼｍＲＮＡまたは遺伝子に結合することができることを意味する。好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列は標的配列と少なくとも約７５％の同一性、好ましくは少なくとも約９０％の同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の同一性を有し、幾つかの塩基のギャップ又はミスマッチを許容する。同一性は、例えば、ウイスコンシン大学コンピューターグループ（ＧＣＧ）ソフトウエアのBLASTNプログラムを用いて測定することができる。好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列は、本明細書に記載したOLIGO プログラムのVersion3.4又は5.0の何れかにより求めた場合で、少なくとも４０℃、より好ましくは少なくとも５０℃、最も好ましくは少なくとも約５３℃の融解温度でリボヌクレオチドレダクターゼｍＲＮＡとハイブリダイズする。
【００６１】
用語「増殖を阻害する」とは、少なくとも１種類の腫瘍細胞の増殖が少なくとも約１０％、より好ましくは少なくとも約５０％、最も好ましくは少なくとも約７５％減少することを意味する。増殖の減少は、マウスにおける腫瘍の大きさ又はインビトロで腫瘍細胞がコロニーを形成できないことを測定することによって腫瘍細胞について測定することができる。
【００６２】
用語「哺乳動物（mammal又はmammalian）」とは、ヒト、羊、牛、馬、豚、犬、猫、及びマウスなどを含む全ての哺乳動物を意味する。
【００６３】
用語「腫瘍を有することが疑われる哺乳動物」とは、哺乳動物が増殖異常又は腫瘍を有しているかもしれないか、増殖異常又は腫瘍を有していると診断されているか、または過去に増殖異常又は腫瘍を有していると診断されたことがあるか、腫瘍を手術により除去し、哺乳動物が多少の残存腫瘍細胞を保持していることが疑われるような場合を意味する。
【００６４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの調製
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは慣用及び周知の技術により調製することができる。例えば、オリゴヌクレオチドは、固相合成、及び特に、Applied  Biosystems Canada Inc., Mississauga, カナダから入手可能な装置などの市販の装置を用いて、調製することができる。オリゴヌクレオチドはまた、当分野で公知の方法によって天然のリボヌクレオチドレダクターゼＲ１又はＲ２遺伝子の酵素消化によっても調製することができる。
【００６５】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの単離及び精製
本明細書に記載したアンチセンスオリゴヌクレオチドの単離及び精製は、所望により、例えば、ろ過、抽出、結晶化、カラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、厚層クロマトグラフィー、調製低圧又は高圧液体クロマトグラフィー、またはこれらの操作の組み合わせなどの任意の好適な分離又は精製法により行うことができる。しかし、他の同等な分離及び単離法ももちろん使用することができる。
【００６６】
アンチセンスオリゴヌクレオチド配列を含む発現ベクターは、オリゴヌクレオチドの配列を考慮して当分野で公知の方法を用いて構築することができる。
【００６７】
ベクターは、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列の所望の転写を達成するのに必要な全ての発現要素を含むように当業者により構築することができる。従って、本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチドをコードする配列に機能的に連結した転写調節配列を含むベクターを提供する。好適な転写及び翻訳要素は、細菌、真菌、ウイルス、哺乳動物または昆虫の遺伝子を含む各種起源から得ることができる。適切な要素の選択は、選択した宿主細胞に依存する。
【００６８】
レポーター遺伝子をベクターに含めることもできる。好適なレポーター遺伝子としては、β−ガラクトシダーゼ（例えば、ｌａｃＺ）、クロラムフェニコール、アセチルトランスフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、又は免疫グロブリンもしくはその一部が挙げられる。アンチセンスオリゴヌクレオチドの転写は、レポーター遺伝子の発現をモニターすることによりモニターすることができる。
【００６９】
ベクターは当分野で公知の様々な方法の何れかにより細胞または組織内に導入することができる。そのような方法は、Sambrook他；Ausubel他；Chang他、1995；Vega他；及びVectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Usesに一般的な記載を見出すことができ、例えば、安定又は一過性のトランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、及び組み換えウイルスベクターによる感染などが挙げられる。
【００７０】
本発明を実施するのに適した宿主細胞としては、例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、２９３及びＨｅＬａなどが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。哺乳動物細胞のトランスフェクションの方法は当分野で周知であり、リン酸カルシウム仲介エレクトロポレーション、レトロウイルス及びプロトプラスト融合仲介トランスフェクションなどが挙げられる。
【００７１】
感染による核酸の導入は幾つかの利点を提供する。効率及び組織型に対する特異性をより高くすることができる。ウイルスは典型的には、特異的な細胞種に感染し、増殖する。即ち、ウイルスの特異性を使用して、インビボ又は組織又は細胞混合培養物中において特定の細胞種にベクターを標的化することができる。ウイルスベクターはまた特定の受容体又はリガンドで修飾して、受容体仲介事象を通じて特異性を標的化することもできる。
【００７２】
本発明のオリゴヌクレオチドは不溶化することができる。例えば、オリゴヌクレオチドは好適な担体に結合することができる。好適な担体の例としては、アガロース、セルロース、デキストラン、セファデックス（Sephadex）、セファロース（Sepharose）、カルボキシメチルセルロースポリスチレン、ろ紙、イオン交換樹脂、プラスチックフィルム、プラスチックチューブ、ガラスビーズ、ポリアミンメチルビニルエーテルマレイン酸コポリマー、アミノ酸コポリマー、エチレンマレイン酸コポリマー、ナイロン、生糸などが挙げられる。担体は、例えば、チューブ、試験プレート、ビーズディスク、球体などの形状でもよい。
【００７３】
不溶化したオリゴヌクレオチドは、既知の化学的又は物理的方法、例えば、臭化シアンカップリングを用いて材料を好適な不溶担体と反応することにより調製することができる。
【００７４】
本発明のオリゴヌクレオチドはｍＲＮＡを切断するリボザイムでもよいものと意図される。リボザイムは好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドの配列に相同な配列およびｍＲＮＡを切断するのに必要な触媒中心を有する。例えば、リボヌクレオチドレダクターゼｍＲＮＡを破壊する相同リボザイム配列を選択することができる。本発明で利用できるリボザイムの種類は当分野で公知の種類から選択することができる。グループＩイントロン、ＲＮａｓｅＰ、δ型肝炎ウイルスリボザイム、シュモクザメ（hammerhead）リボザイム、タバコ輪紋病ウイルスサテライトＲＮＡ（ｓＴＲＳＶ）（Sullivan 1994、米国特許5,225,347）のマイナス鎖に由来するヘアピンリボザイムを含む幾つかのリボザイム構造ファミリーが同定されている。シュモクザメ及びヘアピンリボザイムモチーフは遺伝子治療用のｍＲＮＡのトランス切断のために最もよく適合している（Sullivan 1994）。ヘアピンリボザイムは本発明で好ましく使用される。一般に、リボザイムは３０から１００ヌクレオチドの長さである。
【００７５】
医薬製剤
医薬として使用する場合、アンチセンスオリゴヌクレオチドは通常、医薬組成物の形態で投与される。これらの化合物は、経口、直腸、経皮、皮下、静脈内、筋肉内、及び鼻腔内を含む様々な経路により投与することができる。これらの化合物は、注射及び経口組成物の両方で効果的である。そのような組成物は、医薬分野で周知の方法で調製され、少なくとも1種の活性化合物を含む。医薬組成物は、例えば、静脈内投与される。医薬組成物は処置すべき腫瘍に直接投与してもよいことが意図される。
【００７６】
本発明はまた、薬学的に許容しうる担体又は賦形剤と結合した１種以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドを活性成分として含む、医薬組成物を包含する。本発明の組成物を製造する際、活性成分は通常、賦形剤と混合するか、賦形剤により希釈するか、またはカプセル、小容器、紙又は他の容器の形態であり得る担体内に封入される。賦形剤を希釈剤として使用する場合には、それは固体、半固体、または液体物質でもよく、これらは活性成分のためのビヒクル、担体または媒体として作用する。即ち、本組成物は、錠剤、丸剤、粉末、ドロップ、小容器、カシェー、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤、液剤、シロップ剤、エアロゾル剤（固体又は液体媒体）、例えば、１０重量％以下の活性化合物を含有する軟膏、軟及び硬ゼラチンカプセル、座剤、滅菌注射液剤、及び滅菌パック粉末剤の形態が可能である。
【００７７】
製剤を調製する際、他の化合物と混合する前に、活性化合物を粉砕して適当な粒子サイズにすることが必要となる場合がある。活性化合物が実質的に不溶性である場合、それは通常、２００メッシュ未満の粒子サイズに粉砕される。活性化合物が実質的に水溶性である場合は、粒子サイズは通常、製剤中で実質的に均一な分布を与えるように粉砕することによって調整され、例えば、約４０メッシュに調整される。
【００７８】
好適な賦形剤の幾つかの例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、でんぷん、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、トラガカントゴム、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、滅菌水、シロップ、及びメチルセルロースなどが挙げられる。製剤はさらにまた、タルク、ステアリン酸マグネシウム、及び鉱油などの滑剤；湿潤剤；乳化剤及び懸濁剤；メチル−及びプロピルヒドロキシ−ベンゾエートなどの保存剤；香料剤；及び香料剤を含んでもよい。本発明の組成物は、当分野で公知の方法を使用することによって、患者への投与後に活性成分の迅速、持続又は遅延した放出を供給するように製剤化することができる。
【００７９】
本組成物は好ましくは単位投与形態に製剤化され、各投与分は約１.５ｍｇから約３ｇ、より通常は約１０ｍｇから約３．０ｇの活性成分を含む。用語「単位投与形態」とは、ヒト被験者又は他の哺乳動物用の単位投与分として適した物理的に別個の構成単位を意味し、各構成単位は、所望の治療効果を発揮するように計算された所定量の活性物質を好適な薬学的賦形剤と一緒に含むものである。
【００８０】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは広範な投与範囲に渡り有効であり、薬学的有効量で一般的には投与される。有効量とは、その量を投与した際に症状を軽減することを言う。好ましくは有効量は腫瘍細胞増殖を阻害しうる量である。好ましくは、有効量は約０．０２ｍｇ／ｋｇ体重から約２０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。しかし、実際に投与されるアンチセンスオリゴヌクレオチドの量は、処理すべき状態、選択した投与経路、投与する実際の化合物、年齢、体重、患者個人の応答、患者の症状の重さなどを含む関連する状況を考慮に入れて、医者によって決定されるであろう。治療期間は、数日から数ヶ月、又は疾患の縮小が達成されるまで続けることができる。
【００８１】
錠剤などの固体組成物を調製するためには、主な活性成分／アンチセンスオリゴヌクレオチドを薬学的賦形剤と混合して、本発明の化合物の均質な混合物を含む固体原製剤組成物を形成する。これらの原製剤組成物を均質と言う場合、それは、活性成分が、組成物を錠剤、丸剤及びカプセル剤などの均等な有効単位投与形態に容易に分割できるように、組成物全体に均一に分散していることを意味する。
【００８２】
本発明の錠剤又は丸剤は被覆されていてもよく、あるいは作用延長の利点を付与する投与形態を供給するように調合することができる。例えば、錠剤又は丸剤は、内部投与及び外部投与成分を含むことができ、後者は前者を封入する形態である。２つの成分は、胃で崩壊するのに耐え、内部成分が無傷のまま十二指腸へと通過するあるいは放出を遅延させる役割を担う腸溶層により分離することができる。そのような腸溶の層又は被覆のためには各種の物質を使用することができ、そのような物質としては、多数のポリマー酸、ポリマー酸と、例えば、セラック、セチルアルコール、及び酢酸セルロース等との混合物が挙げられる。
【００８３】
本発明の新規組成物を経口又は注入投与のために取り込むことができる液体形態としては、水溶液、好適な風味のシロップ、水性又は油性懸濁液、及びトウモロコシ油、綿実油、ゴマ油、ココナッツ油又はピーナッツ油などの食用油で風味を付けた乳剤、並びにエリキシル剤及び同様の薬学ビヒクルが挙げられる。
【００８４】
吸入又は吹き入れのための組成物としては、薬学的に許容しうる水性又は有機溶媒中の液剤および懸濁剤、またはその混合物、及び粉末が挙げられる。液体又は固体組成物は、本明細書に記載したような好適な薬学的に許容しうる賦形剤を含んでいてもよい。好ましくは、本組成物は、局所又は全身効果のために経口または経鼻呼吸経路により投与される。好ましくは薬学的に許容しうる溶媒中の組成物は、不活性ガスの使用により霧状にすることができる。霧状の溶液は霧状化装置から直接吸入してもよいし、霧状化装置を顔面マスクテント又は断続的正圧呼吸器に付着させてもよい。溶液、懸濁液、又は粉末組成物は、適当な方法で製剤を送達する装置から、好ましくは経口または経鼻により投与することができる。
【００８５】
本発明の方法で使用される他の好ましい製剤は、経皮送達装置（「パッチ」）を使用する。そのような経皮パッチを使用して、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを制御された量で連続的または断続的に注入することができる。薬剤の送達のための経皮パッチの構築及び使用は当分野で周知である。例えば、本明細書に引用により取り込まれる米国特許5,023,252を参照。そのようなパッチは、薬剤の連続的、脈打ち的、又は要時の送達のために構築することができる。
【００８６】
他の好ましい送達方法としては、皮膚層を通過する裸のアンチセンスオリゴヌクレオチドの「ショットガン」送達が挙げられる。「裸」のアンチセンスオリゴヌクレオチドの送達は当分野で周知である。例えば、Felgner他、米国特許5,580,859を参照。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの「ショットガン」送達の前に脂質ベシクル中に封入してもよい。
【００８７】
以下の製剤例は本発明の代表的医薬組成物を例示する。
【００８８】
製剤例１
以下の成分を含有する硬ゼラチンカプセルを調製する：
成分                      量（ｍｇ／カプセル）
活性成分                  ３０．０
でんぷん                  ３０５．０
ステアリン酸マグネシウム  ５．０
上記成分を混合し、硬ゼラチンカプセルに３４０ｍｇの量で充填する。
【００８９】
製剤例２
以下の成分を使用して錠剤製剤を調製する：
成分                      量（ｍｇ／錠剤）
活性成分                  ２５．０
セルロース微結晶          ２００．０
コロイド二酸化ケイ素      １０．０
ステアリン酸              ５．０
成分を配合し、圧縮して各重量２４０ｍｇの錠剤を形成する。
【００９０】
製剤例３
以下の成分を含有する乾燥粉末吸入製剤を調製する：
成分                      重量％
活性成分                  ５
ラクトース                ９５
活性成分をラクトースと混合し、混合物を乾燥粉末吸入装置に添加する。
【００９１】
製剤例４
各々３０ｍｇの活性成分を含有する錠剤を以下の通り調製する：
成分                      量（ｍｇ／錠剤）
活性成分                  ３０．０ｍｇ
でんぷん                  ４５．０ｍｇ
セルロース微結晶          ３５．０ｍｇ
ポリビニルピロリドン
（滅菌水中１０％溶液）    ４．０ｍｇ
カルボキシメチル−
でんぷんナトリウム        ４．５ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム  ０．５ｍｇ
タルク                    １．０ｍｇ
全量                      １２０ｍｇ
活性成分、でんぷん及びセルロースをＮｏ．２０メッシュＵ．Ｓ．シーブに通し、十分に混合する。ポリビニルピロリドンの溶液を得られた粉末と混合し、これを１６メッシュＵ．Ｓ．シーブに通す。生成した顆粒を５０〜６０℃で乾燥し、１６メッシュＵ．Ｓ．シーブに通す。予めＮｏ．３０メッシュＵ．Ｓ．シーブを通したカルボキシメチルでんぷんナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、及びタルクを顆粒に添加し、混合後、錠剤器で圧縮し、各々１２０ｍｇの錠剤を産生する。
【００９２】
製剤例５
各々４０ｍｇの薬剤を含有するカプセル剤を以下の通り調製する：
成分                      量（ｍｇ／カプセル剤）
活性成分                  ４０．０ｍｇ
でんぷん                  １０９．０ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム  １．０ｍｇ
全量                      １５０ｍｇ
活性成分、でんぷん及びステアリン酸マグネシウムを配合し、Ｎｏ．２０メッシュＵ．Ｓ．シーブに通し、硬ゼラチンカプセルに１５０ｍｇの量で充填する。
【００９３】
製剤例６
各々２５ｍｇの活性成分を含有する座剤を以下の通り調製する：
成分                      量
活性成分                  ２５ｍｇ
飽和脂肪酸グリセリドにて２，０００ｍｇに
活性成分をＮｏ．６０メッシュＵ．Ｓ．シーブに通し、最小熱要求を用いて予め融解した飽和脂肪酸グリセリドに懸濁する。次いで、混合物を公称２．０ｇの容量の座剤型に注入して冷却する。
【００９４】
製剤例７
５．０ｍＬ投薬量当たり各々５０ｍｇの薬剤を含有する座剤を以下の通り調製する：
成分                              量
活性成分                        ５０．０ｍｇ
キサンタンガム                  ４．０ｍｇ
カルボキシメチルセルロースナトリウム（11％）
微結晶セルロース（89％）        ５０．０ｍｇ
スクロース                      １．７５ｇ
安息香酸ナトリウム              １０．０ｍｇ
香料及び着色料                  ｑ．ｖ．
精製水にて５．０ｍＬに
活性成分、スクロース及びキサンタンガムを配合し、Ｎｏ．１０メッシュＵ．Ｓ．シーブに通し、予め作製した微結晶セルロース及びカルボキシメチルセルロースナトリウムの水溶液と混合する。安息香酸ナトリウム、香料及び着色料を若干の水で希釈し、攪拌しながら添加する。次いで、十分な水を添加し、必要な量とする。
【００９５】
製剤例８
成分                      量（ｍｇ／カプセル剤）
活性成分                  １５．０ｍｇ
でんぷん                  ４０７．０ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム  ３．０ｍｇ
全量                      ４２５．０ｍｇ
活性成分、でんぷん及びステアリン酸マグネシウムを配合し、Ｎｏ．２０メッシュＵ．Ｓ．シーブに通し、硬ゼラチンカプセルに４２５．０ｍｇの量で充填する。
【００９６】
製剤例９
製剤を以下の通り調製することができる。
成分                    量
活性成分              ５．０ｍｇ
コーン油              １．０ｍＬ
製剤例１０
塗布製剤を以下の通り調製することができる。
成分                    量
活性成分              １〜１０ｇ
乳化ワックス          ３０ｇ
液体パラフィン        ２０ｇ
白色ソフトパラフィンにて１００ｇに
白色ソフトパラフィンを溶融するまで加熱する。液体パラフィン及び乳化ワックスを取り込み、溶解するまで攪拌する。活性成分を添加し攪拌を分散するまで続ける。次いで、混合物を固体になるまで冷却する。
【００９７】
本発明で使用するための他の好適な製剤は、Remington's Pharmaceutical Sciencesで見ることができる。
【００９８】
アンチセンスオリゴヌクレオチド又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する医薬組成物は、好適な容器に封入した必要な物質を供給する便宜的なキットに封入することができる。
【００９９】
本発明のオリゴヌクレオチド及びリボザイムは腫瘍細胞増殖を制御する。従って、腫瘍又は腫瘍細胞を本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させることを含む哺乳動物における腫瘍細胞増殖を妨げるか又は阻害する方法が提供される。
【０１００】
用語「接触する」とは、オリゴヌクレオチド、リボザイムなどを細胞懸濁物又は組織試料に添加すること、又はオリゴヌクレオチドなどを哺乳動物内の細胞又は組織に直接的又は間接的に投与することを言う。
【０１０１】
本方法を使用して、白血病、リンパ腫（ホジキン、及び非ホジキン）、肉腫、メラノーマ、腺腫、固体組織の癌腫、低酸素血症腫瘍、口、咽喉、喉頭及び肺の扁平上皮細胞癌腫、頸部及び膀胱癌などの泌尿生殖器癌、造血癌、結腸癌、乳癌、膵臓癌、腎臓癌、脳癌、皮膚癌、肝臓癌、頭首部の癌、及び神経系の癌、並びにパピローマなどの良性損傷などの各種形態の癌を含む増殖性の異常を処置することができる。乾癬などの他の増殖異常、及び関節硬化症、血管形成及びウイルス感染を含むものも含まれる。
【０１０２】
本発明のオリゴヌクレオチドを使用して薬剤耐性腫瘍を処置することもできる。薬剤耐性腫瘍の例としては、５−フルオロウラシル、マイトマイシンＣ、メトトレキセート又はヒドロキシ尿素などの化学療法剤に耐性の腫瘍、及びコルヒチン、ビンブラスチン及びドキソルビシンなどの複数の抗癌剤に対する耐性を付与することが公知の高濃度のＰ−グリコプロテインを発現する腫瘍；又は、Dreeley他に記載されているような複数の薬剤耐性タンパク質を発現する腫瘍である。従って、本発明のオリゴヌクレオチドは公知の抗癌性化合物または化学療法剤と一緒にまたはそれに加えて投与してもよいことが意図される。化学療法剤は、腫瘍の増殖を阻害する可能性のある化合物である。そのような薬剤としては、５−フルオロウラシル、マイトマイシンＣ、メトトレキセート又はヒドロキシ尿素が挙げられるが、これらに限定されない。化学療法剤の量は、有効量、即ち、腫瘍の増殖を阻害するのに十分な量、又は有効量未満でもよいことが意図される。
【０１０３】
本発明のオリゴヌクレオチドはまた、他の抗腫瘍処置、例えば、放射線治療と組み合わせて使用して、放射線治療の効果を高めることができる。
【０１０４】
本発明のオリゴヌクレオチドは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳腺癌、ＨＴ−２９結腸腺癌、Ｈ４６０肺癌腫、及びＡ２０５８メラノーマ癌細胞などの転移性である腫瘍の増殖を軽減することが判明した。本発明の一態様においては、リボヌクレオチドレダクターゼｍＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチド、又は表１、２及び３に示したオリゴヌクレオチドの一定量を投与することを含む、哺乳動物における転移性腫瘍の増殖を軽減する方法が提供される。
【０１０５】
オリゴヌクレオチドは、ウイルス又は非ウイルスベクターを使用して送達してもよい。本発明のオリゴヌクレオチドが細胞で発現するように配列をカセット又は構築物中に導入してもよい。好ましくは、構築物は、オリゴヌクレオチドが細胞内で転写されるように適当な転写調節領域を含む。
【０１０６】
従って、本発明は、本発明のオリゴヌクレオチドをコードする配列に機能的に連結した転写調節配列を含むベクターを提供する。本発明はさらに、これらのベクターで形質転換された好適な原核及び真核細胞から選択される宿主細胞を提供する。
【０１０７】
好適なベクターは公知であり、好ましくは、配列の所望の転写を達成するのに必要な全ての発現要素を含有する。ファージミドはプラスミドとして、またバクテリオファージベクターとして使用できるので、そのような有益なベクターの具体例である。ベクターの例としては、バクテリオファージ、バキュロウイルス、レトロウイルス、ＤＮＡウイルスなどのウイルス、リポソーム及び他の組み換えベクターが挙げられる。ベクターは、原核または真核宿主系の何れかで使用するための要素を含んでいてもよい。どの宿主系が特定のベクターに適合するのかは当業者に公知である。
【０１０８】
ベクターは、安定的又は一過性のトランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション及び組み換えウイルスベクターの感染によって細胞中に導入することができる。
【０１０９】
さらなる特徴をベクターに付与して、その安定性を確実にしたり、及び／又はその治療効果を増強することができる。そのような特徴としては、例えば、組み換えウイルスで感染した細胞に対してネガティブ選択するために使用できるマーカーなどが挙げられる。そのようなネガティブ選択マーカーの例は、抗ウイルスガンシクロビルに対する感受性を付与するＴＫ遺伝子である。特定の細胞種に発現を限定する特徴を含めてもよい。そのような特徴としては、例えば、所望の細胞種に特異的なプロモーター及び調節要素が挙げられる。
【０１１０】
レトロウイルスベクターは、横方向の感染及び標的特異性などの利点を付与するので、所望の核酸のインビボ導入のために有用なベクターの別の例である。横方向の感染とは、単一の感染細胞が隣接細胞に感染する多数の子孫ビリオンを産生する過程である。その結果、広い領域が急速に感染するようになる。
【０１１１】
本発明の方法で使用するためのベクターは、標的とする細胞種に応じて選択することができる。例えば、乳癌を処置する場合は、上皮細胞に特異的なベクターを使用すればよい。同様に、造血系の細胞を処置する場合は、血液細胞に特異的なウイルスベクターが好ましい。
【０１１２】
有用性
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは多様な目的のために使用することができる。それらを使用して哺乳動物細胞におけるリボヌクレオチドレダクターゼ遺伝子の発現を阻害して、細胞の増殖を阻害することができる。オリゴヌクレオチドはハイブリダイゼーションプローブとして使用し、哺乳動物細胞におけるリボヌクレオチドレダクターゼｍＲＮＡの存在を検出することもできる。そのように使用する場合、オリゴヌクレオチドは適当な検出可能な基（例えば、ラジオアイソトープ、リガンド、特異的結合対の他の因子、例えば、ビオチンなど）で標識してもよい。最後に、本発明のオリゴヌクレオチドは分子量マーカーとして使用することができる。
【０１１３】
本発明及びその利点をさらに例示するために、以下の具体的実施例を示すが、請求の範囲の範囲を限定することは決して意味しない。
実施例
以下の実施例において、温度は全て摂氏（度）であり（他に断りなき限り）、百分率は全て重量百分率である（他に断りなき限り）。
【０１１４】
以下の実施例において、以下の略号は以下の意味を有する。略号が定義されない場合、それは一般的に認められている意味を有する。
μＭ  ＝  マイクロモル濃度
ｍＭ  ＝  ミリモル濃度
Ｍ    ＝  モル濃度
ｍｌ  ＝  ミリリットル
μｌ  ＝  マイクロリットル
ｍｇ  ＝  ミリグラム
μｇ  ＝  マイクログラム
ＰＡＧＥ  ＝  ポリアクリルアミドゲル電気泳動
ｒｐｍ  ＝  １分当たりの回転数
ΔＧ  ＝  自由エネルギー、オリゴヌクレオチド二重鎖安定性の大きさ
ｋｃａｌ  ＝  キロカロリー
ＦＢＳ  ＝  胎児ウシ血清
ＤＴＴ  ＝  ジチオトレイトール
ＳＤＳ  ＝  ドデシル硫酸ナトリウム
ＰＢＳ  ＝  リン酸緩衝生理食塩水
ＰＭＳＦ  ＝  フェニルメチルスルホニルフルオリド
一般的方法
当分野で公知で具体的には記載しない標準分子生物学的技術は、一般的には、Sambrook他(1982、1992)；in Ausubel他、（1989）；及びPerbal(1988)の記載に従って行った。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は一般的には、PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications, Academic Press, San Diego, CA (1990)の記載に従って行った。
【０１１５】
免疫の一般的方法：
当分野で公知で具体的には記載しない免疫の標準的方法は、一般的には、Stites他（編）、Basic and Clinical Immunology (第8編)、Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994)及びMishell及びShugi(編)、Selected Methods in Cellular Immunology. W.H.Freeman and Co.New York (1980)の記載に従って行った。
【０１１６】
腫瘍形成および転移のアッセイ
悪性度は、既報の通り測定した［Wright、1989a；Egan他、1987a、1987b；Damen他、1989；Taylor他、1992；Stokoe他、1994］。６〜８週齢のＣ３Ｈ／ＨｅＮ同遺伝子マウス（Charles River, Quebec）を使用して、細胞の腫瘍形成能と転移能を評価した。細胞は、準集密（subconfluent）対数増殖培養物から調製し、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液で穏やかに処理して回収し、均衡塩溶液中で適当な濃度に調整した。
【０１１７】
腫瘍形成（腫瘍潜伏）アッセイのために、０．１ｍｌ容量中１×１０5細胞をマウスの背中に皮下注入し、触診で検出可能な腫瘍（２×２ｍｍ）を形成するのに要した時間を記録した。腫瘍の増殖はまた、腫瘍の直径を測定し、腫瘍出現の翌日の腫瘍基底面積を評価することによっても評価した［Damen他、1989］。腫瘍の大きさは、腫瘍の断面の直径を掛けることによって測定した。腫瘍をマウスから除去し、腫瘍重量を２１日後に記録した。腫瘍形成がない場合は、マウスは注入後２ヶ月間維持してから殺した。
【０１１８】
転移アッセイ実験（転移能の測定）のために、０．２ｍｌ容量中１×１０5細胞を６〜８週齢のＣ３Ｈ／ＨｅＮ同遺伝子マウスの尾部静脈に注入し、２１日後に肺腫瘍の数を評価した。マウスを殺し、Bouinの溶液（ピクリン酸、ホルムアルデヒド、酢酸（１５：５：１））を気管内に注入することによって肺を染色した［Egan他、1987b；Damen他、1989］。肺の腫瘍を解剖顕微鏡により計測した。同数の試験及び対照細胞を注入したことを確認するために、増殖培地を含有する二重の培養プレートに１プレート当たり約１００細胞を接種した。培養の１０日後、プレートをメチレンブルーで染色し、コロニーを計数した。
【０１１９】
リボヌクレオチドレダクターゼアッセイ：
細胞から調製した粗抽出物中のリボヌクレオチドレダクターゼ活性は既報の通りアッセイする［Lewis他、1978；Hurta及びWright、1992；Hurta及びWright、1995A］。酵素調製物を、３サイクルの凍結融解によって、１ｍＭのジチオトレイトール及び１ｍＭのプロテアーゼ阻害剤ＡＥＢＳＦ（Calbiochem，San Francisco, CA）を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）中に溶解した対数増殖期の細胞から得る。遠心後、上清を、既報の通り［Lewis他、1978；Hurta及びWright 1992；Fan他、1996A：Choy他、1998］、［14Ｃ］−ＣＤＰ（Moravek  Biomedical. Brea, CA）を用いる酵素活性アッセイのために使用した。
【０１２０】
ウエスタンブロット分析：
方法は既報である［Fan他、1996a；1996b；Choy他、1998］。簡単に言うと、細胞抽出物の調製後、全タンパク質含量を測定し、一部を１０％直線ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分析した。タンパク質を写しブロッキングした後、膜を抗−R2ウサギポリクローナル抗体［Fan他、1996A］と一緒にインキュベートした。アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ウサギIｇＧ（Sigma）をタンパク質Ｒ２の検出のために使用した。
【０１２１】
オリゴヌクレオチド：
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、その配列が二重鎖形成、ヘアピン形成及びホモオリゴマー／配列反復を示す可能性が最小になり、リボヌクレオチドレダクターゼｍＲＮＡへの高い結合能を有するように、リボヌクレオチドレダクターゼｍＲＮＡに相補的な配列から選択した。また、ヒトおよびマウスにおける他の高頻度または反復配列への間違ったプライミングを除去した。これらの性質は、コンピューターモデリングプログラムOLIGO（商標）Primer Analysis Software, Version 3.4又は5.0（International Biosciences, Inc. Plymouth MN）を用いて測定した。オリゴヌクレオチド配列は、部分的なチオエート化を表１及び２にｓで示す以外は、合成時に完全にチオエート化した。
【０１２２】
細胞株：
肺癌腫（Ｈ４６０）、卵巣腺癌（ＳＫ−ＯＶ−３）、肝細胞癌腫（ＨｅｐＧ２）、乳腺癌（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）、転移性膵腺癌（ＡｓＰＣ−１）、結腸腺癌（ＨＴ−２９）、ヒトメラノーマ細胞株（Ａ２０５８）、ヒト脳癌腫（Ｕ８７）細胞を含む異なるヒト癌細胞株をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から得た。細胞株は１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）を補充したα−ＭＥＭ培地（Gibco BRL、Gaithersburg、MD）で維持した。
実施例１：Ｒ２は活性化癌遺伝子と協働する。
【０１２３】
リボヌクレオチドレダクターゼの律速Ｒ２成分の脱調節した発現の悪性度を測定するために、マウスＲ２成分（Fan他、1996b）を有するレトロウイルス発現ベクター（ＳＨ／ｍＲ２）で安定的に感染させた細胞の性質を調べた。さらに、Ｒ２と活性化癌遺伝子の相互作用を探索した。
【０１２４】
発現ベクター：
ヒトＭｙｃエピトープタグ付きマウスＲ２成分、ＳＨ／ｍＲ２のレトロウイルス発現ベクターを、Fan他（1996b）に記載の通り構築してパッケージした。ウイルスストックの感染性は＞１×１０4コロニー形成単位／ｍｌであった。Ｔ−２４Ｈ−ｒａｓ及び選択マーカーｎｅｏを発現するプラスミドｐＨＯ６Ｔｉを悪性形質転換のために使用した［Egan他、1987a、1987b；Taylor他、1992］。活性化Ｒａｃ−１プラスミド（Ｖ１２Ｒａｃ−１）はM.Symonsから供与された［Stokoe他、1994］。
【０１２５】
細胞及び細胞培養：
マウス細胞株、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３、ＮＩＨ３Ｔ３、４種のＴ２４Ｈ−ｒａｓ形質転換１０Ｔ１／２細胞（Ｃ１、ＮＲ４、ｒ−２及びｒ−３と称する）は、Ｒ２レトロウイルスベクターのレシピエントとして以前使用されている［Fan他、1996b］。細胞は、１０％ウシ血清（Fetalclone III, Hyclone, Logan, UT）を補充したα−最小基礎培地（α−ＭＥＭ）（Gibco, Grand Island, NY）で通常通り培養した。ポリブレンの存在下でのＳＨ／ｍＲ２又は対照ウイルスＬＸＳＨによる細胞の感染を行い［Miller他、1993］、安定な感染体（＞１×１０4クローン）をハイグロマイシン選択で取得し、プールした［Fan他、1996b；Miller他、1993］。細胞分裂時間、プレーティング効率、及び相対コロニー形成率を測定することによるハイグロマイシン毒性に対する相対感受性の測定は既報の通り行った［Lewis他、1978；Egan他、1987a；Hards及びWright、1981］。
【０１２６】
軟寒天での増殖は、１５ｍｌの基礎寒天（１０％のウシ血清を含むα−ＭＥＭ中の０．５％バクトアガー）及び１０ｍｌの増殖寒天（１０％のウシ血清を含むα−ＭＥＭ中の０．３３％寒天）を含む１０ｃｍの組織培養プレートで測定した。細胞は準集密カルチャーから取得し、コロニーは１０〜１５日後に計数した［Egan他、1987a、1987b；Hards及びWright、1981］。形質転換は、細胞にＳＨ／ｍＲ２又はＬＸＳＨを感染するか、リン酸カルシウム沈殿によりＴ−２４Ｒａｓ又はＶ１２Ｒａｃ−１プラスミドをトランスフェクションした後にフォーカス形成を測定することによっても分析した［Taylor他、1992］。感染又はトランスフェクションの４０時間後、細胞を３枚の１０ｃｍ組織培養プレートに分割し、１０〜１４日間新鮮な完全培地（１０％牛血清を追加したα−ＭＥＭ）２０ｍｌを毎日供給し、メチレンブルーで染色し、フォーカスを計数した［Taylor他、1992］。全実験のトランスフェクション頻度を、大腸菌由来β−ガラクトシダーゼの哺乳動物発現プラスミドとＴ−２４Ｒａｓ又はＶ−１２Ｒａｃ−１プラスミドをコトランスフェクションし、細胞をＸ−ｇａｌで処理し、青色細胞の数を計数することによって通常通り測定した［Price他、1987］。幾つかの事例では、Ｔ−２４Ｒａｓプラスミドをトランスフェクションしたプレートをジェネシチンで選択し、薬物耐性コロニーをメチレンブルー染色の約14後に計数した。
【０１２７】
腫瘍形成及び転移性のアッセイ：
悪性度は本書中上記の通り測定した。
【０１２８】
タンパク質Ｒ２分析：
例えば、抗ｍｙｃマウスモノクローナル９Ｅ１０抗体（ATCC，Rockville，MD）［Fan他、1996b］又は抗Ｒ２ウサギポリクローナル抗体［Chan他、1993］の何れかを使用したウエスタンブロット分析の操作は既報である。細胞周期中の組み換えＲ２タンパク質の発現を測定するために、既報の通り９Ｅ１０フルオレセインイソチオシアネート抗体標識後、フローサイトメトリー分析を行った［Blosmanis他、1987；Chadee他、1995］。
【０１２９】
膜結合Ｒａｆ−１タンパク質の測定：
膜画分をQui他［1995］に記載の通り調製し、タンパク質含量を標準Bio−Radアッセイで測定後、Ｒａｆ−１タンパク質に特異的なポリクローナル抗体（Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA）を用いてウエスタンブロット分析に使用した。Ｒａｆ−１バンドの写真濃度分析を行い、各試料からのＲａｆ−１タンパク質の量を、クーマシーブルーで染色した平行ゲル上でよく分離したバンドの濃度分析により補正した。
【０１３０】
リボヌクレオチドレダクターゼアッセイ：
アッセイは本書中上記の通り行った。幾つかの実験では、精製組み換えＲ１タンパク質［Salem他、1993］と９E10抗体沈降Ｒ２タンパク質［Hurta及びWright、1992］を組み合わせて酵素アッセイを行った。この実施例では、２０μｇの９Ｅ１０抗体及び５０μｌのブドウ球菌プロテインＡアガロース（Sigma Chem. Co., St.Louis, MO）を遠心溶解細胞の上清１ｍｌに添加し、ロッカーに４℃で2時間置いた。ブドウ球菌プロテインＡアガロース免疫複合体を１ｍｇ／ｍｌの牛血清アルブミンを含む冷リン酸緩衝液１ｍｌで3回洗浄した。免疫複合体はリボヌクレオチドレダクターゼ活性についてアッセイした［Lewis他、1978；Hurta及びWright、1992；Fan他、1996b；Choy他、1988］。
【０１３１】
ＭＡＰＫ活性のアッセイ：
＞９０％の集密度を有する培養物を血清を含まない培地でストレスをかけ［Stokoe他、1994；Jelinek他、1994］、既報の通り抽出した［Alessi他、1995］。ＭＡＰＫ−２タンパク質を、タンパク質に対する非中和抗体（Santa Cruz Biotechnology, Inc.）を結合したアガロースビーズで免疫沈降し、免疫複合体のキナーゼ活性を、Upstate Biotechnology.Inc.(Lake Placid, NY)のＭＡＰＫアッセイキットを用いてミエリン塩基タンパク質をリン酸化する能力を測定することによってアッセイした。
【０１３２】
結果
生物学的に活性なＲ２タンパク質の発現
リボヌクレオチドレダクターゼの律速Ｒ２成分の脱調節した発現の悪性度を測定するために、マウスＲ２成分を有するレトロウイルス発現ベクター（ＳＨ／ｍＲ２）［Fan他、1996b］を安定に感染させた細胞の性質を調べた。発現ベクターの使用により、Ｒ２タンパク質の高い感染効率および安定な発現が可能になった。内生Ｒ２からベクター遺伝子産物を区別するために、１０アミノ酸とメチオニンをコードするヒトｃ−Ｍｙｃエピトープを、Ｒ２ｃＤＮＡの５’末端に追加した。図１Ａは、Ｍｙｃ−エピトープ配列を特異的に認識する９Ｅ１０抗体を用いるウエスタンブロットにより、ＳＨ／ｍＲ２を安定に感染したＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３及びＮＩＨ３Ｔ３細胞（各々Ｂ３／ｍＲ２及びＮ３／ｍＲ２と称する）では約４５ｋＤａのＲ２タンパク質が検出され、対照ベクター（ＬＸＳＨ）を感染したＢ３／ＳＨ及びＮ３／ＳＨ細胞では検出されないことを示す。Ｒ２特異的抗体は、発現ベクターで感染した細胞内で内生及び組み換えのＲ２タンパ質を検出でき、予測通り、内生のタンパク質のみが対照ベクターで感染した細胞では見られた（図１Ｂ）。
【０１３３】
９Ｅ１０フルオレセインイソチオシアネート抗体標識後のフローサイトメトリにより、組み換えＲ２タンパク質が細胞周期を通じて連続的に発現していることが実証された（図１Ｃ）。９Ｅ１０抗体を用いる間接顕微鏡分析により、Ｂ３／ｍＲ２及びＮ３／ｍＲ２集団の本質的に全細胞がＭｙｃエピトープタグ付きＲ２タンパク質を発現していることが示された。
【０１３４】
幾つかに実験を行って、ベクターで発現したＲ２が生物学的に活性であることを実証した。第１に、Ｂ３／ｍＲ２及びＮ３／ｍＲ２細胞は、Ｂ３／ＳＨ及びＮ３／ＳＨ細胞と比較した場合［Fan他、1996b］、Ｒ２タンパク質の阻害剤であるヒドロキシ尿素［Wright、1989A；Wright他、1989B］の細胞毒性作用に対する耐性をコロニー形成実験で示した。第２に、リボヌクレオチドレダクターゼ活性をアッセイし、３回の独立した実験でＢ３／ｍＲ２及びＮ３／ｍＲ２細胞中のＧＤＰレダクターゼ活性は各々１．９６±０．３２及び１．７１±０．１１ｎｍｏｌ／ｍｇタンパク質／時間であり、これはＢ３／ＳＨ及びＮ３／ＳＨ細胞の場合より（各々、０．７４±０．１４及び０．８３±０．０８ｎｍｏｌ／ｍｇ／時間）２．６倍及び２．１倍高いことが判明した。最後に、精製組み換えＲ１タンパク質［Salem他、1993］と９E10抗体沈降Ｒ２タンパク質を組み合わせて酵素アッセイを行った。Ｍｙｃエピトープタグ付きＲ２のための源としてＢ３／ｍＲ２及びＮ３／ｍＲ２細胞を使用した場合は、有意な値の活性（１５〜２０ｎｍｏｌｅ／ｍｇ／時間）が検出され、予想通り、Ｂ３／ＳＨ及びＮ３／ＳＨ細胞を使用した場合は、活性はなかった。
【０１３５】
異常Ｒ２遺伝子発現により測定したＲａｓ形質転換能
上記結果は、細胞が生物学的に活性なＲ２タンパク質の調節において変化する可能性があることを示す。従って、変化したＲ２発現を試験して、これがＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３又はＮＩＨ３Ｔ３などの細胞をさらに形質転換するかどうかを見た。対照Ｂ３／ＳＨ及びＮ３／ＳＨ細胞、並びに親の非感染株と同様に、Ｂ３／ｍＲ２及びＮ３／ｍＲ２培養物は、組織培養プレート上で平らな非形質転換の形態のままであり、接触及び密度により阻害された増殖を示した。レトロウイルスＳＨ／ｍＲ２ベクターでの感染後のＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３又はＮＩＨ３Ｔ３細胞では形質転換フォーカスは見られなかった（図２Ａ、ａ及びｂ）。
【０１３６】
この結果は、Ｒ２遺伝子発現の脱調節は、それ自体では、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３又はＮＩＨ３Ｔ３繊維芽細胞を形質転換しないことを示す。脱調節したＲ２発現がＨ−ｒａｓなどの癌遺伝子と協働するという仮説を試験するために、Ｔ２４Ｈ−ｒａｓを含有する発現プラスミドを、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３又はＮＩＨ３Ｔ３に由来する樹立した組み換えＲ２発現細胞集団にトランスフェクションした。Ｎ３／ＳＨ対照細胞と比較した場合、Ｈ−ｒａｓでトランスフェクションしたＮ３／ｍＲ２細胞で形成したフォーカスの数は安定かつ有意に増加（３．４倍）していた（図２Ｂのｃ及びｄ、及び図２Ｃ）。Ｈ−ｒａｓをトランスフェクションしたＢ３／ｍＲ２細胞をＢ３／ＳＨ細胞と比較した場合、約７０倍というさらに顕著な増加が見られた（図４Ｂのａ及びｂ、及び図２Ｃ）。Ｈ−ｒａｓを大腸菌β−ガラクトシダーゼの発現プラスミドと一緒にコトランスフェクションした後に、Ｇ４１８選択コロニーを計数し、及び／又は青色細胞を計数することにより測定したＮ３／ｍＲ２及びＢ３／ｍＲ２細胞による形質転換効率［Price他、1987］は、Ｎ３／ＳＨ及びＢ３／ＳＨ細胞の場合よりも実際に約５０％低かったとしても、上記増加は生じた。
【０１３７】
異常Ｒ２遺伝子発現により測定したＲａｓ悪性度：
変化したＲ２遺伝子発現及び活性化したＨ−ｒａｓの組み合わせは、ｒａｓを変化したＲ２発現細胞にトランスフェクションしたフォーカス形成実験で相乗作用を示したので、以前に同定されている4種の独立したＨ−ｒａｓ形質転換１０Ｔ１／２細胞株であるＣ１、ＮＲ４、ｒ−２及びｒ−３［Egan他、1987a、1987b；Taylor他、1992；Stokoe他、1994］にレトロウイルスベクターＳＨ／ｍＲ２を感染することによって、この遺伝子の組み合わせをさらに調べた。安定な感染体をハイグロマイシンで選択し、ウエスタンブロット分析及び酵素活性アッセイにより、これらの感染体が生物学的に活性なＭｙｃタグ付きＲ２タンパク質を発現していることを確認した。
【０１３８】
軟寒天増殖実験により、組み換えＲ２配列を含有するＨ−ｒａｓ形質転換細胞は未感染の親集団（例えば、ｒ−３）又は対照ベクター感染細胞（Ｃ１、ＮＲ４、ｒ−２）よりも半固体増殖寒天でコロニーを産生する効率が非常に高いことが判明した（表４）。
【０１３９】
表４：組み換えＲ２ベクターを含有するｒａｓ形質転換細胞による軟寒天におけるコロニー形成の増加
【０１４０】
【表４】
0004424857.tif 000013
【０１４１】
ａ：示したコロニー数は３回の独立した実験で得た結果であるが、但し、ｒ−２／ＳＨ及びｒ−２／ｍＲ２細胞について得た結果は、3枚のディッシュを用いた一回の実験の結果を示す。ＮＤ＝未測定
さらに、組み換えＲ２を感染した細胞で形成したコロニーの多くはサイズがより大きかった（図３Ａ）。各対の組み換えＲ２発現及び対照細胞集団は、固体表面で増殖させた場合、ほぼ同一の増殖速度（Ｃ１／ＳＨでは１２．９時間、Ｃ１／ｍＲ２では１２．２時間；ｒ−２／ＳＨでは１３．５時間、ｒ−２／ｍＲ２では１３．９時間；ｒ−３では１１．６時間、ｒ−３／ｍＲ２では１１．９時間；ＮＲ４／ＳＨでは１４．１時間、ＮＲ４／ｍＲ２では１４．３時間）、プレーティング効率（Ｃ１／ＳＨでは５８％、Ｃ１／ｍＲ２では５５％；ｒ−２／ＳＨでは５９％、ｒ−２／ｍＲ２では６３％；ｒ−３では９１％、ｒ−３／ｍＲ２では８８％；ＮＲ４／ＳＨでは７３％、ＮＲ４／ｍＲ２では７５％）、及び細胞周期分布（データは示さず）を有しているので、軟寒天及びフォーカス形成実験で見られた変化は、脱調節したＲ２発現及び活性化Ｈ−ｒａｓの組み合わせがより大きな悪性度をインビボで生じさせる可能性を示唆している。
【０１４２】
従って、Ｃ１／ｍＲ２及びＣ１／ＳＨ細胞の腫瘍形成能及び転移能を、同遺伝子Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウスと比較した。悪性度で顕著な相違が見られた。Ｃ１／ｍＲ２細胞は、Ｃ１／ＳＨ細胞と比較した場合、腫瘍潜伏期がより短く、腫瘍増殖速度が大きかった（図３Ｂ）。さらに、転移性アッセイにより、Ｃ１／ｍＲ２細胞がＣ１／ＳＨ細胞よりも悪性度が高く、有意に大きい肺腫瘍を生じることが明白に示された（図３Ｃ）。
【０１４３】
Ｒ２遺伝子発現及び癌遺伝子協働性：
上記結果は、変化したＲ２の発現がインビトロ形質転換及びインビボ悪性アッセイで活性化Ｈ−ｒａｓと協働しうることを示す。例えば、細胞周期調節における変化のような、この協働を説明するような増殖速度または細胞周期分布における明白な相違は見られなかったことから、以下の考え方を調べた。脱調節したＲ２発現が、Ｒａｓシグナル経路の活性を増大させることによってｒａｓと相乗作用を示すのであろうか？これは、ｒａｓ発現および悪性度との間の直接的相関を示す研究と一致する［Egan他、1987a、1987b；Wright他、1993；Bradley他、1986］。遺伝子発現を制御するための主要なＲａｓ経路はＲａｆ−１タンパク質キナーゼを包含する。活性化したＲａｓはＲａｆを形質膜に導き、そこでＲａｆ、及びＭＡＰＫ類などのような下流のシグナル分子が活性化する［Stokoe他、1994；Jelinek他、1994；Leevers他、1994］。
【０１４４】
Ｒａｆ−１特異的抗体を用いて、脱調節したＲ２発現を含む6種のＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３、ＮＩＨ３Ｔ３及び１０Ｔ１／２由来細胞株中における膜結合Ｒａｆ−１のレベルを内生Ｒ２タンパク質のみを含む対照細胞と比較した（図４Ａ）。６種の全ての場合で、脱調節したＲ２を含む細胞株は、膜結合Ｒａｆ−１の増加を示し、平均の増加は約３０％であり、これは有意に高かった（ｐ＜０．００１）。上記知見と一致して、脱調節したＲ２発現を示す細胞株は、ＭＡＰＫ−２活性の約７０％（ｐ＜０．００１）という安定した有意な増加を示した（図４Ｂ）。癌遺伝子Ｒａｓも、Ｒａｆ経路に平行なＲａｃ経路を活性化し、従って、構成的に活性なＲａｃ−１は悪性形質転換において膜標的化Ｒａｆ−1と協働する［Qiu他、1995］。
【０１４５】
Ｒａｆ−１再編成及び活性化により仲介されるＭＡＰＫ活性化が本実施例で上記したＲ２／ｒａｓ相乗作用において重要であるならば、異常なＲ２発現は細胞形質転換において活性化Ｒａｃ−１と協働すべきある。なぜならば、活性化Ｒａｆ−１及びＲａｃ−１は形質転換の機構で協働することが示されているからである［Qiu他、1995］。活性化Ｖ１２Ｒａｃ−１でトランスフェクションしたＮ３／ｍＲ２及びＮ３／ＳＨ細胞によるフォーカス形成によって測定した場合、活性化Ｒａｃ−１及びＲ２の間の形質転換における正の協働がＲａｓ及びＲ２と同様の様式で観察されたことから、図４Ｃは上記予測が正しいことを示す［Qiu他、1995］。これらの知見は、脱調節したＲ２遺伝子発現はＲａｆ再編成及びＭＡＰＫ経路活性を増大調節することによってｒａｓ又はｒａｃのような癌遺伝子と協働するという考え方と一致するが、ＲａｆはＭＡＰＫ非依存経路を介してある細胞活性を調節できるという証拠があるので、活性化Ｒａｆを含む他の伝達経路も関与しているという可能性を排除するものではない［Lenormand他、1996；Koong他、1994；Agarwal他、1995］。
【０１４６】
本実施例は、哺乳動物リボヌクレオチドレダクターゼのＲ２成分が活性化癌遺伝子と相乗作用して悪性度を変更しうる新規な悪性決定因子であることを初めて示すものである。本実施例以前に細胞内でのＲ２に帰せられていた唯一の役割はリボヌクレオチドレダクターゼの律速成分としてであることに注意することが重要である。本実施例は、Ｒ２が他の重要な細胞機能にも関与することができ、癌遺伝子協働性を通じて悪性度を決定する際に直接的役割を担いうることを実証するものである。
【０１４７】
実施例２  Ｒ２遺伝子発現及び薬物感受性及びゲノム安定性の変化
細胞株及び培養条件：
ヒドロキシ尿素耐性マウス細胞株、Ｈ−２、Ｈ−４、ＬＨＦ及びＳＣ２はマウスＬ細胞に由来するものであり、Choy他［1988］及びMcClarty他［1987］で特性決定されている。ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞を、Ｒ２レトロウイルス発現ベクター（Ｂ３／ｍＲ２及びＢ３／Ｒ２ｃ２細胞株）、及びＲ２配列を欠く同一のレトロウイルスベクター（Ｂ３／ＳＨ細胞）のレシピエントとして使用した［Fan他、1996a；1996b］。ＮＩＨ−３Ｔ３細胞も、既報の通り［Fan他、1996a；1996b］、Ｒ２レトロウイルス発現ベクター（Ｎ／Ｒ２−４細胞株）、及びＲ２配列を欠くこのレトロウイルスベクター（Ｎ／ＳＨ細胞）のレシピエントとして使用した。Ｎ／Ｒ２＋ＡＳＲ２細胞株は、LipofectAmine（Life Technologies, N.Y）を用いたコトランスフェクションを通じて、Ｒ２コード配列及びＲ２配列をアンチセンス方向に含むレトロウイルスベクターのレシピエントであった［Damen他、1991］。ＲＰ３及びＲＰ6細胞は、Ｔ−２４Ｈ−ｒａｓ癌遺伝子及び変異体癌形態のｐ５３遺伝子でトランスフェクションした１０Ｔ１／２マウス細胞であり［Taylor他、1992］、LipofectAmine試薬を用いたトランスフェクションを通じて、Ｒ２コード領域をアンチセンス方向に含むレトロウイルスベクターのレシピエントとして使用し［Fan他、1996b］、ＲＰ３／ＡＳＲ２及びＲＰ６／ＡＳＲ２細胞を取得した。ＩＢ細胞はｐ５３−／−であり、胎児繊維芽細胞に由来した［Lowe他、1994］。細胞は全て、５％ＣＯ2を含有する湿った雰囲気で３７℃で、１０％胎児ウシ血清（Intergen、Purchase, NY）及び抗生物質（１００ユニット／ｍｌのペニシリン及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン）を含有するα−最小基礎培地（Gibco, Grand island, NY）中で培養した。
【０１４８】
薬物選択：
５００から１〜２×１０5個の細胞を、薬物の不在下及び存在下において、１０％の透析胎児ウシ血清を含む増殖培地中の１００ｍｍ組織培養プレートに添加した［Huang他、1995a；Choy他、1988］。培養培地を２〜3週間の間、毎週新しい培地に交換した。生き残った細胞をメチレンブルー染色で可視化し、約50個以上のコロニーを計数した［Huang他、1995a］。相対コロニー形成率は、薬物の存在下でのコロニー形成能を薬物の非存在下での当該形成能で割った値と定義した。
【０１４９】
遺伝子増幅アッセイ：
ゲノムＤＮＡをフェノールクロロホルム抽出法により対数増殖細胞から抽出し［Blin及びStafford、1976］、遺伝子増幅事象能を、下記プローブとしてｃＤＮＡ断片を使用して、既報の通りサザンブロット分析により測定した［Huang他、1995a；Choy他、1988］。ＣＡＤタンパク質複合体をコードするＣＡＤｃＤＮＡを含有するｐＣＡＤ１４２プラスミド［Shigesada他、1985］を使用して、プローブとして６．３ｋｂHindIII断片を得た。マウスデヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子を含有するｐＬＴＲ  ＤＨＦＲ２６プラスミド［Chang他、1978］によりプローブとして１．３ｋｂのBamH１断片を得た。リボヌクレオチドレダクターゼＲ２のための１４８７ｂｐのSalI／PstIプローブをｃＤＮＡクローン１０から調製した［Huang他、1995a；Choy他、1988］。
【０１５０】
電気泳動ゲル移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）：
ＥＭＳＡを使用して野生型ｐ５３の存在を測定した。アッセイは基本的に既報の通り行い［Price及びCalderwood、1993］、以下の変更を加えた。１５０ｍｍプレート上の細胞を氷冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄し、１ｍｌのＰＢＳに粉砕した。細胞を４℃で１０分間１３００ｇで遠心することによりペレットにし、−８０℃で保存した。ペレットを３００μｌの緩衝液Ａ（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．６）、２０％グリセロール、１０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ2、０．２ｍＭのＥＤＴＡ及び０．１％のTritonX-100）で氷上で20分間溶解することにより核を調製した。緩衝液Ａには１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）及び１０ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）も含めた。４℃で10分間１３００ｇで遠心することにより核を単離した。核ペレットに５００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＰＭＳＦ及び１０ｍＭのＤＴＴを含有する緩衝液Ａを２０〜４０μｌ添加し、氷上で20分間インキュベートすることにより核溶解物を調製した。抽出した核を４℃で１６，０００ｇで遠心することによりペレットにした。上清を除去し、その一部を用いて、Bioradタンパク質アッセイ法（Biorad）を用いてタンパク質量を測定した。
【０１５１】
核溶解物を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Boehringer）を用いて［γ32Ｐ］−ＡＴＰで末端標識した過剰の二重鎖ｐ５３コンセンサス結合配列（ＧＧＡＣＡＴＧＣＣＣＧＧＧＣＡＴＧＴＣＣ）（配列番号：１６２）とインキュベートした。ＤＮＡ結合を、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．６）、２０％グリセロール、１．５ｍＭのＭｇＣｌ2、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＰＭＳＦ及び１０ｍＭのＤＴＴを含有する緩衝液中で行った。各結合反応は、全量２０μｌにおいて５μｇの細胞溶解物、１０μｇの二重鎖ポリ（ｄＩ−ｄＣ）（Pharmacia）、１．４ｎｇの標識コンセンサスプローブ及び１００ｎｇのモノクローナル抗体４２１（Santa Cruz）を含んだ。ＤＮＡ結合を室温で３０分間進行させ、混合物を５％非変性ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動により分離した。電気泳動は室温で、キシレンシアノール追跡染料がゲルの底まで流れ去り、遊離プローブがゲルを流れ出るまで行った。
【０１５２】
統計分析：
共分散の分析を使用して、有意値をα＝０．０５に設定して、異なる細胞株のグループ間の用量応答データを比較した［Huang他、1995a］。
【０１５３】
結果：
非選択的薬剤に対する感受性が減少しているヒドロキシ尿素耐性株
Ｈ−２、Ｈ−４、ＬＨＦ及びＳＣ２は、抗腫瘍剤、ヒドロキシ尿素の細胞毒性作用に対する耐性で選択したマウスＬ細胞株である。これら4種の細胞株は、コロニー形成率実験でヒドロキシ尿素に対する耐性を示し、それは、その細胞株が由来する野生型マウスＬ細胞株よりも約１８倍（Ｈ−２）から３０倍（ＳＣ２）高かった［Choy他、1988；McClarty他、1988］。それらは、２．２倍（Ｈ−２）から１７倍（ＬＨＦ及びＳＣ２）高い範囲のリボヌクレオチドレダクターゼ活性の上昇を示し、これは、増殖性マウス細胞における酵素活性及び細胞分裂を制限するリボヌクレオチドレダクターゼのＲ２成分の増加が主な原因であった。
【０１５４】
表５
相対コロニー形成率により測定した薬物選択性（×１０4）
Ａ．  ＰＡＬＡ
【０１５５】
【表５】
0004424857.tif 000014
【０１５６】
Ｂ．ＭＴＸ
【０１５７】
0004424857.tif 000015
【０１５８】
相対コロニー形成率は±ＳＥで示し、示した値は４から８回の測定である。統計的な有意差は、Ｈ２（ｐ＝０．０００４）、Ｈ４（ｐ≦０．０００１）、ＬＨＦ（ｐ≦０．０００１）及びＳＣ２（ｐ≦０．０００１）で得たデータを各々親野生型（Ｗ．Ｔ．）細胞株で得たデータと比較した場合に見られた。
【０１５９】
表５は、親野生型マウスＬ細胞と比較した場合、４種のヒドロキシ尿素耐性細胞株もまた、コロニー形成実験において、Ｎ−（ホスホンアセチル）−Ｌ−アスパルテート（ＰＡＬＡ）及びメトトレキセート（ＭＴＸ）の細胞毒性作用に対する感受性が小さいことを示す。これらの薬物感受性の相違は非常に有意であり、親野生型マウス細胞と比較した場合、各々の細胞株についてｐ値は＜０．０００１であった。
【０１６０】
薬物耐性を説明する多数の機構が記載されているが［Wright、1989；Kohn、1996］、ＭＴＸ及びＰＡＬＡに対する耐性は、各々、薬物の標的の遺伝子産物であるジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）又はＣＡＤ（カルバミルホスフェートシンターゼ、アスパルテートトランスカルバミラーゼ及びジヒドロオラターゼを含有する多機能性ポリペプチド）のレベルの増加を伴なうことが多く、これは遺伝子増幅の機構によって生じることが多い［Huang他、1995a；Livingston他、1992；Yin他、1992；Mai、1994；Stark、1993］。実際、マウス細胞におけるＰＡＬＡ耐性の最大のそしておそらく唯一の機構は、ＣＡＤ遺伝子増幅を介して生じる［Stark、1993］。そこで、通常の細胞毒性濃度のこれら２種の薬剤の存在下で発達したコロニーを遺伝子増幅現象の可能性について調べた。図５は、ＰＡＬＡまたはＭＴＸの存在下で増幅した細胞は、ＣＡＤ又はＤＨＦＲ遺伝子コピー数の増加を示すことを示す。過去の研究と一致して［Stark、1993；Huang他、1995b；Otto他、1989；Stark他、1990］、ＰＡＬＡ中で発達し、試験したコロニーは全て（１０／１０）ＣＡＤ遺伝子増幅を示した。さらに既報の通り［Huang他、1995b］、ＭＴＸの存在下で発達したコロニーの幾つかは全てではないが（３／６）、ＤＨＦＲ遺伝子増幅を示した。
【０１６１】
Ｒ２遺伝子発現及び薬物感受性の減少との関係のための直接的試験
ヒドロキシ尿素耐性マウス細胞はリボヌクレオチドレダクターゼの変化の他に他の生化学変化を含有するので［Wright他、1989B］、薬物感受性及び増加したＲ２レベルの関係を、マウスＲ２配列をコードするレトロウイルス発現ベクターを含有する細胞と、同一のレトロウイルスベクターを含有するがＲ２配列を欠く細胞とを用いて直接調べた。Ｂ３／ｍＲ２は、Ｒ２をコードするレトロウイルス発現ベクターの存在のために増加したＲ２タンパク質を含有するＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞の集団であり、Ｂ３／ＳＨは野生型のレベルのＲ２タンパク質を有し、対照として空のベクターを含有する細胞集団である。Ｂ３／Ｒ２ｃ２は、Ｂ３／ｍＲ２集団から選択した上昇したＲ２タンパク質を有するクローン化株である。
【０１６２】
Ｒ２遺伝子発現の増加がヒドロキシ尿素に対する耐性をもたらすことを示す過去の報告と一致して、表６は、Ｂ３／ｍＲ２及びＢ３／Ｒ２ｃ２細胞が、Ｂ３／ＳＨ細胞と比較して、ある濃度範囲のヒドロキシ尿素の細胞毒性作用に有意に高い耐性を有することを示す。これらの結果はさらに、Ｂ３／ｍＲ２及びＢ３／Ｒ２ｃ２細胞が、増加したレベルのリボヌクレオチドレダクターゼの活性Ｒ２成分を発現することを示す。Ｂ３／ｍＲ２及びＢ３／Ｒ２ｃ２細胞はまた、リボヌクレオチドレダクターゼ以外の部位で作用するＰＡＬＡ及びＭＴＸの細胞毒性作用に対して有意に感受性が低かった（表６）。これらの２種の薬剤に対する耐性は、１００ｎＭのＭＴＸの場合の約１０倍から、試験したＰＡＬＡの最大濃度における１００倍以上までの範囲に及んだ。
【０１６３】
表６
相対コロニー形成率により測定した薬物感受性×１０4
Ａ．ヒドロキシ尿素
【０１６４】
【表６】
0004424857.tif 000016
【０１６５】
Ｂ．ＰＡＬＡ
【０１６６】
0004424857.tif 000017
【０１６７】
Ｃ．ＭＴＸ
【０１６８】
0004424857.tif 000018
【０１６９】
相対コロニー形成率は±ＳＥで示し、示した値は４から１２回の測定である。統計的な有意差は、Ｂ３／ｍＲ２又はＢ３／Ｒ２ｃ２で得たデータを、Ｂ３／ＳＨで得たデータと比較した場合に見られた（ｐ値は全て、ヒドロキシ尿素、ＰＡＬＡ又はＭＴＸの存在下で得たデータについて≦０．０００１であった）。
【０１７０】
さらに、サザンブロット分析により、ＰＡＬＡ又はＭＴＸの存在下で発達したコロニーはＣＡＤ又はＤＨＦＲ遺伝子の増幅を含有したが（図６）、マウスＬ細胞で見られた通り（図５）、そして他の研究で報告されている通り［Hurta及びWright、1992；Hurta他、1991］、ＤＨＦＲ遺伝子増幅を示したのは、ＭＴＸ含有培地で発達した全てのコロニーではなかった。ＰＡＬＡ耐性と異なり、マウス細胞におけるＭＴＸ耐性は、多様な機構を介して生じ得る［Otto他、1989；Stark他、1990；Flintoff、1989］。
【０１７１】
上昇したレベルのリボヌクレオチドレダクターゼＲ２成分を含有する細胞によって示される化学治療化合物の感受性の変化をさらに、Ｒ２発現レトロウイルスベクターを含有するＮＩＨ−３Ｔ３細胞を使用して調べた（表７）。これらの細胞（Ｎ／Ｒ２−４）は、Ｒ２コード配列を欠くレトロウイルスベクターを含有する細胞(Ｎ／ＳＨ)と比較して、ヒドロキシ尿素に耐性であった。Ｎ／Ｒ２−４細胞もＭＴＸに対して有意に耐性が高かった。Ｎ／Ｒ２−４細胞は、Ｎ／ＳＨ細胞と比較して、ＰＡＬＡに対する耐性に向かう傾向を示したが、この傾向は統計的に有意ではなかった。この後者の知見は、増加したＲ２レベルに加えて、本研究で使用した細胞株間の遺伝的相違に固有の他の因子が、薬物感受性応答に影響しうることを示唆している。
【０１７２】
表７
相対コロニー形成率により測定した薬物感受性×１０4
Ａ．ヒドロキシ尿素
【０１７３】
【表７】
0004424857.tif 000019
【０１７４】
Ｂ．ＰＡＬＡ
【０１７５】
0004424857.tif 000020
【０１７６】
Ｃ．ＭＴＸ
【０１７７】
0004424857.tif 000021
【０１７８】
相対コロニー形成率は±ＳＥで示し、示した値は４から６回の測定である。０を示す場合、１試験当たり１×１０5細胞を使用した測定の数は４（ｎ＝４）として示す。統計的な有意差は、ヒドロキシ尿素の存在下（両方の場合でｐ＝０．０００１）又はＭＴＸの存在下（各々、ｐ＝０．０００２又は０．０３２）において、ＰＡＬＡの存在下でＮ／ＳＨで得たデータを、Ｎ／Ｒ２−４又はＮ／Ｒ２＋ＡＳＲ２で得たデータと比較した場合に見られた。統計的な有意差はまた、ＰＡＬＡの存在下でＮ／ＳＨでで得たデータを、Ｎ／Ｒ２＋ＡＳＲ２で得たデータと比較した場合にも見られたが（ｐ＝０．００２）、Ｎ／Ｒ２−４で得たデータに対しては得られなかった。
【０１７９】
従って、Ｒ２レベルが薬物感受性特性の決定に重要であるという仮説を、Ｎ／Ｒ２−４細胞に導入したＲ２アンチセンス構築物を発現してＮ／Ｒ２＋ＡＳＲ２集団を産生することによってＲ２のレベルを減少した後の薬物感受性を調べることによって試験した。図７は、Ｒ２タンパク質のレベルが、Ｎ／Ｒ２−４細胞と比較してＮ／Ｒ２＋ＡＳＲ２細胞で顕著に減少することを示す。Ｎ／Ｒ２＋ＡＳＲ２細胞は、Ｎ／Ｒ２−４細胞と比較して、ヒドロキシ尿素、ＰＡＬＡ及びＭＴＸに対する感受性が有意に高かった（表７）。さらに、Ｒ２アンチセンス発現細胞におけるこれら３種の薬物に対する感受性は、空のベクターを含有する対照Ｎ／ＳＨ細胞と比較して、有意に増加した（表７）。
【０１８０】
活性化ｒａｓ及び変異癌遺伝子型のｐ５３をトランスフェクションしたマウス１０Ｔ１／２細胞は、化学療法剤に対して感受性が高かった［Huang他、1995b］。Ｒ２アンチセンス発現がヒドロキシ尿素、ＰＡＬＡ及びＭＴＸに対するＮＩＨ−３Ｔ３細胞の感受性を増大させ得るという知見により、ｒａｓ及び変異ｐ５３を含有する細胞がＲ２アンチセンス配列の存在下で薬物耐性特性の減少を示すという可能性を調べることにした。表８はこれが正しいことを示す。Ｒ２アンチセンス配列を含有する細胞は、同一のベクターを含有するがアンチセンス方向のＲ２を含有しない細胞と比較して、ヒドロキシ尿素、ＰＡＬＡ及びＭＴＸに対する感受性が有意に高い。これらの知見は、これらの高度に形質転換した悪性細胞の薬物感受性に関連する決定因子の少なくとも１つがリボヌクレオチドレダクターゼＲ２のレベルであることを示唆している。
【０１８１】
表８
相対コロニー形成率により測定した薬物感受性×１０4
Ａ．ヒドロキシ尿素
【０１８２】
【表８】
0004424857.tif 000022
【０１８３】
Ｂ．ＰＡＬＡ
【０１８４】
0004424857.tif 000023
【０１８５】
Ｃ．ＭＴＸ
【０１８６】
0004424857.tif 000024
【０１８７】
相対コロニー形成率は±ＳＥで示し、示した値は４から１０回の測定である。統計的な有意差は、ＲＰ６／ＳＨで得たデータを、ＲＰ６／ＡＳＲ２で得たデータと比較した場合に見られた（ヒドロキシ尿素、ＰＡＬＡ及びＭＴＸの存在下において各々、ｐ＝０．０００１、０．０００１及び０．０００１）。統計的な有意差はまた、ＲＰ３／ＳＨでで得たデータを、ＲＰ３／ＡＳＲ２で得たデータと比較した場合にも見られた（ヒドロキシ尿素、ＰＡＬＡ及びＭＴＸの存在下において各々、ｐ＝０．０４、０．０００１及び０．００４）。
【０１８８】
ｐ５３タンパク質機能の損失はＲ２仲介薬物耐性及び遺伝子増幅に必要ではない証拠
ｐ５３の不活性化又は欠損は、腫瘍の発達、及び、自発的遺伝子増幅を受ける能力を含む悪性細胞に見られる付随する遺伝安定性の減少に伴う通常の現象である［Livingston他、1992；Yin他、1992；Takenaka他、1995］。従って、Ｒ２を過剰産生するＢ３／ｍＲ２及びＢ３／Ｒ２ｃ２細胞により示される薬物耐性特性の増加が、野生型ｐ５３活性の損失をもたらす機構を介して生じる可能性を調べた。ｐ５３は転写因子であり、変異型のｐ５３ではなく野生型のｐ５３によるトランス活性化が配列特異的であり、コンセンサスＤＮＡ配列へのその結合に相関していることが実証された［Takenaka他、1995；Kern他、1992］。ＰＡＬＡ、ＭＴＸ又はヒドロキシ尿素の存在下で発達した薬物耐性コロニーにおける野生型ｐ５３機能の存否を決めるために、細胞抽出物を電気泳動ゲル移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）［Price及びCalderwood、1993］を用いて、配列特異的ｐ５３結合アッセイを試験した。図８は、Ｒ２過剰発現細胞由来の薬物耐性クローンが野生型ｐ５３結合活性を示したことを示す。これらの知見は、通常の型の変異ｐ５３を特異的に検出するＰａｂ２４０モノクローナル抗体［Gannon他、1990］を用いた免疫沈降アッセイにおいて薬物耐性コロニーからの細胞で変異ｐ５３タンパク質を検出できなかったことと一致した。
【０１８９】
実施例３  リボヌクレオチドレダクターゼを標的としヒト腫瘍細胞に細胞毒性である、アンチセンスデオキシリボヌクレオチド配列
上記した実施例で示したように、Ｒ２の全長アンチセンス構築物は、腫瘍細胞の腫瘍形成性及び／又は転移能および化学療法剤に対する感受性に影響する。従って、本出願人は、Ｒ１及びＲ２のより短いアンチセンス構築物の腫瘍細胞に対する作用の能力を調べた。
【０１９０】
コロニー形成率およびアンチセンス構築物を用いた細胞の処理
コロニー形成率は既報の通り測定した［Huang及びWright、1994］。細胞は１０％胎児牛血清を補充した増殖培地中で３７℃で24時間培養した。細胞は、リポフェクチン＋／−オリゴヌクレオチド処理の前に一度、５ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）中で洗浄した。
【０１９１】
試験オリゴヌクレオチドを、２．５μｇのＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ（リポフェクチン、Life Technologies, Inc.）の存在下で４時間細胞培養物に添加した。オリゴヌクレオチドは、特に指示なき限り、０．２μＭで試験した。対照は、オリゴヌクレオチドなしのリポフェクチンで処理した培養物とした。４時間後、オリゴヌクレオチドを含有する培地を除去し、５ｍｌの増殖培地で洗浄した。次いで、細胞を１０％胎児ウシ血清を含有する増殖培地で７〜１０日間培養した。生き残った細胞をメチレンブルー染色で可視化し、コロニーを計数した。幾つかの実験で、細胞のアリコートを培養物から除去し、生存性をトリパンブルー除外試験［Philips、1973］を用いて測定した。結果は、対照細胞と比較した生き残り細胞の百分率として分析した。
【０１９２】
結果
リボヌクレオチドレダクターゼを標的とするアンチセンス分子が同定された。以下に示す通り、それらは、多様なヒト腫瘍細胞に対して細胞毒性であった。薬物耐性腫瘍細胞の薬物細胞毒性を容易にする配列が判明した。即ち、非常に低い非細胞毒性濃度で、リボヌクレオチドレダクターゼを標的とするアンチセンス配列は、臨床的に重要な化学治療化合物の細胞毒性活性に対して腫瘍細胞を感化することができる。
【０１９３】
最初の研究で、Ｒ２ｍＲＮＡに対する、ＡＳ−ＩＩ−３３６−２０及びＡＳ−ＩＩ−２２２９Ｂ−２０と命名した２０ｍｅｒの２種のアンチセンス配列を作製して調べた。先ず、ＡＳ−ＩＩ−３３６−２０は、配列５’−ＴＣＣ  ＴＧＧ  ＡＡＧ  ＡＴＣ  ＣＴＣ  ＣＴＣ  ＧＣ−３’（配列番号：１）を有し、Ｒ２ヌクレオチドの番号付けに基づいてヒトリボヌクレオチドレダクターゼのヌクレオチド３３６−３５５のＲ２メッセージを標的とする［Pavloff他、1992］。ＡＳ−ＩＩ−２２２９Ｂ−２０は、５’−ＴＣＣ  ＣＡＣ  ＡＴＡ  ＴＧＡ  ＧＡＡ  ＡＡＣ  ＴＣ（配列番号：２）を有し、ヌクレオチド２２２９−２２４８のＲ２メッセージを標的とする。ＡＳ−ＩＩ−３３６−２０及びＡＳ−ＩＩ−２２２９Ｂ−２０は共に、ヌクレアーゼ活性に対して保護されるようにホスホロチオエート配列として構築された［Anazodo他、1995］。
【０１９４】
アンチセンス構築物ＡＳ−ＩＩ−３３６−２０を、上記した通り相対コロニー形質率実験においてヒト腫瘍細胞（Ｈｅｌａ）の増殖阻害能について試験した。抗腫瘍剤、ヒドロキシ尿素［Wright他、1987］に対する耐性について先に選択したＨｅｌａＳ３細胞（American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, ATCC）及びHela細胞株（Hela １ｍＭ）を試験した（表９）。ＨｅｌａＳ３細胞を用いて２回の実験を行った。０．２μＭのアンチセンス構築物ＡＳ−ＩＩ−３３６−２０で４時間処理した場合、９２％及び８２％の阻害が、２回実験のコロニー形成率で各々見られた。Ｈｅｌａ１ｍＭ細胞株を用いて同じ実験を繰り返し、アンチセンス構築物ＡＳ−ＩＩ−３３６−２０の濃度を変化させた場合（表９）、同一の結果が得られ、コロニー形成を阻害する有効濃度は０．２μＭであった。
【０１９５】
これらのデータは、ＡＳ−ＩＩ−３６０−２０がヒト腫瘍細胞コロニー形成能の非常に有効な阻害剤であり、ヒト腫瘍細胞コロニー形成能の増殖の阻害、及び別の化学治療化合物に対する耐性を示すヒト腫瘍細胞の増殖の阻害の両方において有効であることを示す。同様に、図９に示す通り、アンチセンス構築物ＡＳ−ＩＩ−３３６−２０は、ヒドロキシ尿素高度耐性マウスＬ細胞株であるマウス腫瘍細胞株ＳＣ２を用いて行った実験において、有効な抗腫瘍化合物である［McClarty他、1988］。
【０１９６】
アンチセンス配列ＡＳ−ＩＩ−２２２９Ｂ−２０もまた、相対コロニー形成率実験でヒトＨｅｌａ腫瘍細胞の増殖阻害能について試験し、表９に示す通り、ＡＳ−ＩＩ−３６０−２０と同様の結果が得られた。これらのデータは、ＡＳ−ＩＩ−２２２９Ｂ−２０が、ＨｅｌａＳ３細胞及び薬物耐性Ｈｅｌａ１ｍＭ細胞株を用いて試験した場合、有効な抗腫瘍剤であることを示す。
【０１９７】
表９
Ｒ２アンチセンス構築物での処理後のコロニー形成率の減少
細胞株：ＨｅＬａ  Ｓ３
【０１９８】
【表９】
0004424857.tif 000025
【０１９９】
細胞株：ＨｅＬａ  １ｍＭ
【０２００】
0004424857.tif 000026
【０２０１】
細胞株；マウスＳＣ２
【０２０２】
0004424857.tif 000027
【０２０３】
アンチセンス構築物ＡＳ−ＩＩ−２２２９Ｂ−２０を、ヒト乳癌細胞株ＭＤＡ４３５の増殖阻害能について試験し、非常に効果的であることが判明した（表１０）。
【０２０４】
表１０
Ｒ２アンチセンス構築物による処理
【０２０５】
【表１０】
0004424857.tif 000028
【０２０６】
ヒトの腫瘍及び非腫瘍細胞集団で得た結果を比較することによって、ＡＳ−ＩＩ−２２２９Ｂ−２０と命名するリボヌクレオチドレダクターゼＲ２アンチセンス構築物の腫瘍細胞の細胞毒性について調べた。ＨｅｌａＳ３腫瘍細胞及びＷＩ３８正常非腫瘍形成性ヒト細胞を使用した。腫瘍細胞は、ＡＳ−ＩＩ−２２２９Ｂ−２０の細胞毒性作用に対して、正常非腫瘍形成性細胞よりも感受性が非常に高いことが判明した。例えば、アンチセンス露出の３日後の細胞の分析により、腫瘍細胞は、正常非腫瘍形成性細胞よりも、４から８回の測定の平均で、ＡＳ−ＩＩ−２２２９Ｂ−２０の細胞毒性作用に対して約５倍感受性が高かった。
【０２０７】
これらの結果は、アンチセンス方向の短いオリゴヌクレオチド配列は優れた抗腫瘍剤であることを示し、Ｒ２メッセージを標的とする他のアンチセンス構築物も同様の特性を有する場合があることを示唆する。最良の抗腫瘍剤は、相補鎖とのオリゴヌクレオチド二重鎖形成にとって重要な好適なエネルギー関連特性を示し、自己二量体化又は自己相補性の可能性が低いものである［Anazodo他、1996］。コンピュータープログラム（OLIGO，Primer Analysis Software, Version 3.4）を用いたＲ２ｍＲＮＡの分析を行って、アンチセンス配列溶融温度、自由エネルギー特性を測定し、Ｒ２メッセージを標的とするように設計した一連の追加のアンチセンス配列（表１、配列番号：３〜１０２）の自己二量体形成および自己相補性の可能性を評価した［Anazodo他、1996］。表１は、適当な性質を有する追加のＲ２アンチセンス阻害剤の一覧である。
【０２０８】
ホスホロチオエートデオキシリボヌクレオチドとしてのこれら多数の配列のアンチセンス効果を調べるために、一連のヒト腫瘍細胞株を用いて行った相対コロニー形成実験で調べた。予想通り、これらのアンチセンス構築物の多くはヒト腫瘍細胞増殖の有効な阻害剤である。膀胱、乳、肺、結腸、膵臓、前立腺、肝臓、及び頸部に由来する癌細胞で得た結果については、表１３を参照。また、表１４に報告する通り、ＡＳ−ＩＩ−６２６−２０を用いたインビボ実験をＣ３Ｈ／ＨｅＮマウスで行い、アンチセンスで処置したマウスでは転移の有意な減少が見られる。
【０２０９】
実施例２に基づいて、ヒト腫瘍細胞を非常に低濃度の短いアンチセンス配列で処理して試験し、これらの構築物が他の化学療法薬剤の阻害効果に対して細胞を感化するかどうかを測定した。使用した濃度は、表９に示す通り、それ自体、細胞毒性でなかった。０．０２μＭのＡＳ−ＩＩ−２２９Ｂ−２０アンチセンス構築物でＨｅｌａＳ３及びＨｅｌａ１ｍＭ細胞を処理することにより、表１１に示す通り、Ｎ−（ホスホンアセチル）−Ｌ−アスパルテート（ＰＡＬＡ）及びメトトレキセート（ＭＴＸ）に対するこれらの細胞の感受性が増大する。これらの知見は、Ｒ２メッセージを標的とするアンチセンス化合物が周知の化学療法剤と相乗的に作用しうることを示す。
【０２１０】
表１１
アンチセンス構築物としてのＡＳ−ＩＩ−２２２９Ｂ−２０の相乗作用
【０２１１】
【表１１】
0004424857.tif 000029
【０２１２】
ＰＡＬＡ  ＝  Ｎ−（ホスホンアセチル）−Ｌ−アスパルテート
ＭＴＸ    ＝  メトトレキセート
−      ＝  未処理
＋      ＝  処理あり
ｃ  値は２回の実験の平均である。
【０２１３】
リボヌクレオチドレダクターゼは、２つの別個の遺伝子Ｒ１及びＲ２でコードされる２種の異なるタンパク質成分から成る。従って、本書中上記した結果は、Ｒ１メッセージも、有効な抗腫瘍活性を有する短いアンチセンス分子を設計するための適用な標的となるかもしれないことを示唆する。この可能性を試験するために、ＡＳ−Ｉ−１３９５−２０と命名するアンチセンス方向の２０ｍｅｒのデオキシリボヌクレオチドホスホロチオエート配列を構築し、その抗腫瘍能を試験した。アンチセンス構築物ＡＳ−Ｉ−１３９５−２０は、配列５’−ＡＣＡ  ＧＧＡ  ＡＴＣ  ＴＴＴ  ＧＴＡ  ＧＡＧ  ＣＡ−３’（配列番号：１０３）を有し、ヌクレオチド１３９５−１４１４でＲ１メッセージを標的とする。
【０２１４】
表１２
Ｒ１アンチセンス構築物での処理後のコロニー形成率の減少
【表１２】
0004424857.tif 000030
【０２１５】
表１２に示す通り、ＨｅｌａＳ３細胞及びＨｅｌａ１ｍＭ薬物耐性細胞を使用した場合、それは腫瘍細胞増殖の有効な阻害剤である。これらの結果は、Ｒ１メッセージを標的とするアンチセンス配列を設計することの有用性を実証し、他の潜在的な部位もまた有効かもしれないことを示唆する。
【０２１６】
従って、Ｒ１ｍＲＮＡを、好適な特性を示すアンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチド配列のサーチにおいて分析した（Ｒ２ｍＲＮＡについて行った通りで、上記の通り）。表２は、追加のアンチセンス配列と特性の一覧であり、抗腫瘍剤と一致する。
【０２１７】
実施例４  Ｒ２アンチセンスによる形質転換の阻害
実施例１〜３に記載の方法を利用して、Ｒ２コード領域［Fan他、1996b］のＲ２アンチセンス配列で処理することにより哺乳動物細胞の形質転換の阻害を行った。Ｈ−ｒａｓ癌遺伝子を含有するＮＩＨ−３Ｔ３マウス細胞を、Ｒ２コード配列のアンチセンス方向またはＲ２コード配列のセンス方向の何れかでトランスフェクションした。図９に示した結果は、Ｒ２アンチセンス構築物の存在下では、対照細胞（図９、レーンａ）と比較して、形質転換フォーカスの減少及び軟寒天増殖の減少（図９、レーンｂ）が存在することを示す。上記した実施例１に示した通り、Ｒ２コード領域はＨ−ｒａｓと協働して、形質転換フォーカスの数の増加によって示される通り、悪性度を上昇させることができる（図９、レーンｃ）。
【０２１８】
さらに、本書中記載した通り軟寒天で行ったコロニー率アッセイも同様の結果を示した。Ｈ−ｒａｓ癌遺伝子を含有するＮＩＨ−３Ｔ３マウス細胞では１５．６±６．７３、Ｈ−ｒａｓ癌遺伝子及びＲ２アンチセンス配列を含有するＮＩＨ−３Ｔ３マウス細胞では４．４±２．６２、そしてＨ−ｒａｓ癌遺伝子およびＲ２のコード領域配列を含有するＮＩＨ−３Ｔ３マウス細胞では５１±１２．２９のコロニー形成率が示された。
【０２１９】
実施例５：Ｌ６０マウス腫瘍細胞におけるリボヌクレオチドレダクターゼＲ２タンパク質レベルのＡＳ−ＩＩ−６２６−２０阻害のウエスタンブロット分析
細胞を、リポフェクチンを添加し、アンチセンスオリゴヌクレオチドを添加しない増殖培地（図１０Ａ、レーンａ）、又は０．２μＭのＡＳ−ＩＩ−６２６−２０を含有するリポフェクチン培地（レーンｂ）で４時間処理した。追加の対照として、腫瘍細胞は、リポフェクチン、及びＡＳ−ＩＩ−６２６−２０のヌクレオチドと同じ割合を異なる順序で含む０．２μＭオリゴヌクレオチドスクランブル対照（ＡＣＧＣＡＣＴＣＡＧＣＴＡＧＴＧＡＣＡＣ、配列番号：１６４）（レーンｃ）、又は、ＡＳ−ＩＩ−６２６−２０と比較した場合に４つのヌクレオチドミスマッチ変異（ＴＣＧＣからＣＴＧＣに変化）を含む０．２μＭのミスマッチオリゴヌクレオチドＧＧＣＴＡＡＡＣＴＧＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧ（配列番号：１６３）（レーンｄ）を補充した増殖培地で４時間処理した。対照（レーンａ、ｃ及びｄ）と比較した場合、ＡＳ−ＩＩ−６２６−２０（レーンｂ）で処理した腫瘍細胞ではＲ２タンパク質が有意に減少していることに留意。
【０２２０】
ウエスタンブロット分析により測定した各種のＲ２アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理後のマウスＬ６０腫瘍細胞におけるＲ２タンパク質レベルの減少
細胞を、リポフェクチンの存在下で０．２μＭのオリゴヌクレオチド（図１０Ｂ、レーンｂからｆ）、又は対照としてオリゴヌクレオチドなしでリポフェクチンで（レーンａ）、４時間処理した。（レーンｂ）ＡＳ−ＩＩ−６６７−２０で処理した細胞；（レーンｃ）ＡＳ−ＩＩ−８１６−２０で処理した細胞；（レーンｄ）ＡＳ−ＩＩ−１２８８−２０で処理した細胞；（レーンｅ）ＡＳ−ＩＩ−１３３５−２０で処理した細胞；そして、（レーンｆ）ＡＳ−ＩＩ−１３３８−２０で処理した細胞。ヒト腫瘍細胞増殖の阻害能と一致して、Ｒ２ｍＲＮＡを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した細胞におけるＲ２タンパク質レベルの減少に留意（表１３）。
【０２２１】
表１３：  Ｒ２メッセージを標的とする０．２μＭの各種アンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチドホスホロチオエートで処理した後の、ヒト腫瘍細胞の相対コロニー形成率の減少、阻害％で表示
【０２２２】
【表１３】
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【０２２３】
0004424857.tif 000032
【０２２４】
0004424857.tif 000033
【０２２５】
0004424857.tif 000034
【０２２６】
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【０２２７】
0004424857.tif 000036
【０２２８】
表１３の注
アンチセンスオリゴヌクレオチドは指示しない限り（＊）、表１に記載したように十分にチオエート化した。
相対コロニー形成率の値は２から８回の測定から得た平均である。
ＮＤ＝未測定
各種細胞株は、American Type Culture Collection. Rockville Marylandから得た。
【０２２９】
これらのヒト癌細胞についての情報：
Ｔ２４        ＝  膀胱細胞癌腫
ＨＣＴ１１６  ＝  結腸細胞癌腫
Ａ５４９      ＝  肺細胞癌腫
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ＝  乳細胞腺癌
ＭＩＡＰａＣａ−２    ＝  膵臓細胞癌腫
ＰＣ−３      ＝  前立腺細胞腺癌
ＨｅｐＧ２    ＝  肝細胞癌腫
ＨｅＬａＳ３  ＝  頸部の癌腫から単離した細胞
Ｔ−４７Ｄ    ＝  乳ジュクタル（ductal）癌腫
Ｈ５９６      ＝  肺腺扁平癌腫細胞
Ｃｏｌｏ３２０  ＝  結腸細胞腺癌
【０２３０】
実施例６：アンチセンスオリゴヌクレオチドによる処理後の腫瘍細胞の転移特性
オリゴヌクレオチド添加なし（なし）のリポフェクチン、又は０．２μＭのＡＳ−ＩＩ−６２６−２０を含有するリポフェクチンの何れかで４時間処理した１０5細胞のマウス１０Ｔ１／２ｒ−３細胞株を、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ同遺伝子マウスに静脈内（尾部静脈）に注射し、肺腫瘍を既報の通り分析した（Damen他、1991）。ｒ−３細胞株は非常に悪性であり、既報である［Taylor他、1992］。ＡＳ−ＩＩ−６２６−２０で処理した群と未処理の群の間で見られた相違は統計的に有意であった（ｐ値＝０．０２７）。明らかに、ＡＳ−ＩＩ−６２６−２０で処理した腫瘍細胞は、転移能の顕著な減少を示した。表１４を参照。
【０２３１】
表１４
アンチセンスオリゴヌクレオチドＡＳ−ＩＩ−６２６−２０による処理後の同遺伝子マウスにおけるｒ−３マウス１０Ｔ１／２腫瘍細胞の転移特性
【０２３２】
【表１４】
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【０２３３】
実施例７：コロニー形成能の阻害
２８種の異なるアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理したＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞のコロニー形成能を既報の通り測定した（Choy他、1988）。細胞懸濁物のアリコートを６０ｍｍのペトリ皿に接種し、１０％胎児ウシ血清を補充したα−ＭＥＭ培地で３７℃で一晩インキュベートした。細胞を５ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）で洗浄し、０．２μＭのアンチセンス／リポフェクチンで４時間処理した。アンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する培地を除去し、細胞を一度洗浄し、増殖培地で７から１０日間培養した。コロニーを既報の通りメチレンブルーで染色し、計数した（Choy他、1988；Huang及びWright、1994）。阻害百分率を、アンチセンスオリゴヌクレオチドの非存在下で生育した培養物中に存在するコロニーの数と比較することにより計算した。実験は全て４重に行った。図１１は、各種アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理によるコロニー形成の阻害百分率のグラフである。これは、ヒトリボヌクレオチドレダクターゼＲ１に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドがヒト乳癌細胞のコロニー形成を阻害できることを示す。
【０２３４】
各種ヒト腫瘍細胞株のコロニー形成能を、相対コロニー形成率を求めることによって評価した［Choy他、1988］。各種細胞株からの細胞を５ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）で洗浄した。細胞を０．２μＭのＡＳ−Ｉ−６１８−２０アンチセンスオリゴヌクレオチド／リポフェクチンで４時間処理した。アンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する培地を除去し、細胞を５ｍｌの増殖培地で穏やかに洗浄した。細胞を１０％胎児ウシ血清を含有する増殖培地で７から１０日間培養した。生き残った細胞をメチレンブルー染色で可視化し、コロニーを計数した（Choy他、1988；Huang及びWright、1994）。図１２は、結果と標準偏差を示す。以下のヒト腫瘍細胞株を評価した：ＨｅｐＧ２（肝臓）、ＳＫ−ＯＶ−３（卵巣）、Ｕ８７（脳）、Ａ２０５８（メラノーマ）、Ｈ４６０（肺）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（乳）及びＡｓＰＣ−１（膵臓）。
【０２３５】
実施例８  用量依存性阻害のウエスタンブロット分析
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞を異なるアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理し、Ｒ１タンパク質レベルの変化をウエスタンブロッティングにより分析した。細胞を０．２μＭの濃度のオリゴヌクレオチドで処理し、全細胞タンパク質抽出物を２４時間インキュベーション後に調製し、Ｒ１タンパク質レベルを既報の通りウエスタンブロットにより測定した（Choy他、1988；Hurta及びWright、1995B；Fan他、1996A）。未処理の細胞から調製したタンパク質抽出物を対照として使用した。図１３は、各種のアンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理後のＲ１タンパク質発現のレベルを示すウエスタンブロットの写真である。
【０２３６】
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞を、未処理の対照（対照）、及び０．２μＭのＡＳ−Ｉ−６１８−２０のスクランブル対照アナログ（スクランブル）５’−ＡＣＴＧＣＡＧＣＣＴＡＴＡＴＧＣＡＧＣＴ−３’（配列番号：２１４）、及び４塩基置換を含有するＡＳ−Ｉ−６１８−２０のミスマッチ対照アナログ＋（ミスマッチ）５’−ＣＴＣＴＡＧＣＧＴＣＡＴＡＴＡＧＣＣＧＡ−３’（配列番号：２１５）と一緒に増加する濃度（０．０２５〜０．２μＭ）のＡＳ−Ｉ−６１８−２０で処理した。全細胞タンパク質抽出物を２４時間のインキュベーション後に調製し、ウエスタンブロット分析を既報の通り行った（Choy他、1988；Hurta及びWright、1994；Fan他、1996A）。図１４Ａは、ウエスタンブロットの写真である。図１４Ｂは、Image Quant Program(Molecular Dynamics)を用いて定量し、任意単位（相対強度）で表したウエスタンブロットにおけるＲ１タンパク質レベルのグラフである。
【０２３７】
実施例９：免疫沈降分析により測定した場合、ＡＳ−Ｉ−６１８−２０はＲ１標的を阻害する
細胞中のタンパク質レベルについての情報を得るための２つの一般的方法がある。ウエスタンブロット分析は、特定のタンパク質の定常状態のレベルについての情報を提供し（実施例８に示す）、免疫沈降分析は細胞内のタンパク質の合成についての情報を提供する。
【０２３８】
免疫沈降を、飽和量のＡＤ−２０３抗Ｒ１モノクローナル抗体を用いて、Choy他［1998］に従って多少の変更を加えて行った。免疫沈降は、全細胞抽出物及びホルマリン固定化Staphylococcus aureus細胞で行った。得られた沈降物はＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分析した。グリシンを含有する緩衝液中で平衡化した後、ゲルを乾燥し、フィルムに露光した。オートラジオグラムをスキャンし、ピーク領域を定量した。
【０２３９】
図１５では、ＳＣＲ細胞を、ＡＳ−Ｉ−６１８−２０のスクランブル型（ＧＴＡＣは同一割合であるが、完全に異なる配列）およびＭＩＳ＝４塩基ミスマッチを有するＡＳ−Ｉ−６１８−２０の変異型で処理した。
【０２４０】
（ヒト膵臓腫瘍に由来する）ＡｓＰＣ−１腫瘍細胞を用いた免疫沈降の結果は、ＡＳ−Ｉ−６１８−２０が腫瘍細胞においてＲ１タンパク質の合成を特異的に阻害することを実証する。
【０２４１】
実施例１０  ノーザンブロット分析
ＲＮＡを１％ホルムアルデヒドアガロースゲルで電気泳動にかけ、ナイロン膜に移した。ブロットを既報の通りプレハイブリダイズし、ハイブリダイズした（McClarty他、1990；Hurta及びWright、1994）。ハイブリダイゼーションはＲ１断片の存在下で生じた（McClarty他、1987）。プローブはα−32Ｐで標識し、洗浄し、オートラジオグラフィは既報の通り行った（McClarty他、1988；Hurta及びWright、1994）。既報の通り（Choy他、1989；Edwards  1985）、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ配列を含有するプラスミドを用いてローディングを評価した。
【０２４２】
図１６は、ＡＳ−Ｉ−６１８−２０で処理又は未処理の各種細胞に由来するｍＲＮＡのノーザンブロットのオートラジオグラフである。アンチセンス化合物に露出していない対照細胞と比較して、ＡＳ−Ｉ−６１８−２０で先に処理した細胞ではＲ１ｍＲＮＡの顕著な減少を示した。ＨＴ−２９はヒト結腸腺癌株であり、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１はヒト乳腺癌細胞株である。
【０２４３】
実施例１１  腫瘍形成アッセイ
腫瘍増殖速度及び腫瘍重量を既報の通り測定した（例えば、Egan他、1987A；Egan他、1987B；Damen他、1989；Fan他、1996A）。簡単に言うと、ヒト肺癌腫（Ｈ４６０）細胞を培養プレートから除去し、洗浄し、０．１ｍｌのアリコート（１０6から１０7細胞の範囲）を、Charles River, Montrealからの雌ＣＤ−１ヌードマウスの右横腹に皮下注入した。通常食塩水中のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、触診可能な腫瘍体の検出後２日毎に尾部静脈注入によって投与した。腫瘍を処理の約１４日後にマウスから除去し、腫瘍の重量を測定した。図１７は、アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理したマウスにおける腫瘍の重量の減少を示すグラフである。
【０２４４】
次に、各種ヒト腫瘍細胞株に対するＡＳ−Ｉ−６１８−２０の抗腫瘍効果を調べた。簡単に言うと、細胞を培養プレートから除去し、洗浄し、各細胞株の０．１ｍｌのアリコート（１０6から１０7細胞の範囲）を、Charles River, Montrealからの雌ヌードマウス、ＣＤ−１又はＢＡＬＢ／ｃ  ｎｕ／ｎｕの右横腹に皮下注入した。通常食塩水中のアンチセンスオリゴヌクレオチドＡＳ−Ｉ−６１８−２０（１０ｍｇ／ｋｇ）を、触診可能な腫瘍体の検出後２日毎に尾部静脈注入によって投与した。一部の動物はオリゴヌクレオチドなしの生理食塩水のみを投与した。図１８は、処理後の腫瘍重量を示すグラフである。明るい色で示した棒は未処理の対照から得た結果であり、暗い色の棒はＡＳ−Ｉ−６１８−２０で処理した動物から得た結果である。
【０２４５】
さらに、ＣＤ−１ヌードマウスにおけるヒト肺癌腫腫瘍の増殖を、アンチセンスＡＳ−Ｉ−６１８−２０での処理後に測定した。図１９は処理あり又はなしの場合の腫瘍の増殖速度を示す。
【０２４６】
実施例１２  ＨＴ−２９腫瘍におけるＲ１ｍＲＮＡレベルに及ぼすＡＳ−Ｉ−６１８−２０の効果
ＨＴ−２９ヒト結腸癌細胞をＣＤ−１ヌードマウスに皮下注入した。腫瘍の樹立後、生理食塩溶液中に調製したＡＳ−Ｉ−６１８−２０を１０ｍｇ／ｋｇの濃度で２日毎に尾部静脈注入によって投与した。対照動物には、生理食塩水のみを同じ間隔で投与した。マウスを８回の注入後に殺し、全ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ試薬（Gibco−BRL、Gaithersburg  MD）を用いて切除した腫瘍から抽出した。Ｒ１ｍＲＮＡレベルのノーザンブロット分析を既報の通り行った（Hurta及びWright 1994）。グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＤＰＨ）ｍＲＮＡレベルをＲＮＡ添加対照としてプローブ探査した。２組の独立した実験を示す。図２０は、ノーザンブロットのオートラジオグラフである。ＡＳ−Ｉ−６１８−２０の静脈内投与後に腫瘍組織におけるＲ１ｍＲＮＡの顕著な阻害が見られ、これは、ＡＳ−Ｉ−６１８−２０がインビボで腫瘍部位に到達し、アンチセンス機構によって作用していることを実証している。
【０２４７】
実施例１３  各種アンチセンス配列の抗腫瘍作用の比較
ヒト結腸癌腫（ＨＴ−２９）細胞、ヒトメラノーマ（Ａ２０５８）細胞またはヒト肺癌腫（Ｈ４６０）細胞を培養プレートから除去し、洗浄し、０．１ｍｌのアリコート（１０6から１０7細胞の範囲）をCharles River, Montrealからの雌ＣＤ−１ヌードマウスの右横腹に皮下注入した。アンチセンス配列は、以下の配列を含む十分にホスホチオエート化した化合物として製造した。
ｃ−ｒａｆ  ５’−TCCCGCCTGTGACATGCATT−３’（配列番号：２１６）
ＰＫＣ−α  ５’−GTTCTCGCTGGTGAGTTTCA−３’（配列番号：２１８）
Ｂｃｌ−２  ５’−TCTCCCAGCGTGCGCCAT−３’（配列番号：２１９）
ｃ−ｍｙｃ  ５’−AACGTTGAGGGGCAT−３’（配列番号：２２０）
ｃ−ｍｙｂ  ５’−TATGCTGTGCCGGGGTCTTCGGGC−３’（配列番号：２２１）
【０２４８】
通常食塩水中のアンチセンスオリゴヌクレオチド（１０ｍｇ／ｋｇ）を、触診可能な腫瘍体の検出後２日毎に２週間尾部静脈注入によって投与した。腫瘍を処理の約１４日後にマウスから除去し、腫瘍の重量を測定した（例えば、Egan他、1987A；Egan他、1987B；Damen他、1989；Fan他、1996A）。各オリゴヌクレオチドでの処理後の腫瘍重量を対照生理食塩水群の腫瘍重量と比較することによって有意度を求めた。
【０２４９】
図２１は、アンチセンスオリゴヌクレオチドＡＳ−ＩＩ−６２６−２０、ＡＳ−Ｉ−６１８−２０、Ｃ−ＲＡＦ、ＰＫＣ−α及びＢｃ１２で処理したＣＤ−１ヌードマウスにおけるヒト結腸癌腫（ＨＴ−２９）細胞に由来する腫瘍の重量を示すグラフである。各々の結果は５から１５頭のマウスの結果の平均であり、生理食塩水対照は３２頭のマウスの平均である。図２２は、同一のアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理したＣＤ−１ヌードマウスにおけるヒトメラノーマ（Ａ２０５８）細胞由来の腫瘍の重量を示すグラフである。各々の結果は、５から１０頭のマウスの結果の平均である。図２３は、アンチセンスオリゴヌクレオチドＡＳ−ＩＩ−６２６−２０、ＡＳ−Ｉ−６１８−２０、Ｃ−ＲＡＦ、ＰＫＣ−α、Ｂｃ１２、ｃ−ｍｙｃ及びｃ−ｍｙｂでの処理後のＣＤ−１ヌードマウスにおけるヒト肺癌腫Ｈ４６０細胞に由来する腫瘍の重量を示すグラフである。各々の結果は、１０から２０頭のマウスの結果の平均である。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  図１Ａ−Ｃは、モノクローナル抗Ｍｙｃエピトープ抗体９Ｅ１０（Ａ）、ポリクローナルウサギ抗Ｒ２血清（Ｂ）を用いたウエスタンブロット分析、並びに抗体９Ｅ１０（Ｃ）を用いた細胞周期中のフローサイトメトリーにより、安定な感染体からのＭｙｃエピトープのタグ付のＲ２発現の分析を示す、ゲルの写真（Ａ及びＢ）及び２枚のスキャン（Ｃ）である。
【図２】  図２Ａ−Ｃは、形質転換フォーカスを測定する実験の写真（Ａ及びＢ）及びグラフ（Ｃ）である。図中、（Ａ）は、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３（ａ）及びＮＩＨ３Ｔ３（ｂ）細胞のＳＨ／ｍＲ２による感染はフォーカス形成を導かなかったことを示す。（Ｂ）Ｔ２４Ｈ−ｒａｓプラスミドでのトランスフェクション後、Ｂ３／ＳＨ（ａ）及びＮ３／ＳＨ（ｃ）と比較して、Ｂ３／ｍＲ２（ｂ）及びＮ３／ｍＲ２（ｄ）を用いた場合にはフォーカス形成が増加した。（Ｃ）３回の独立したｒａｓトランスフェクション実験で形成したフォーカスの数をプロットした。
【図３】  図３Ａ−Ｃは、軟寒天増殖の写真（Ａ）及びグラフ（Ｂ及びＣ）である。図中、（Ａ）は、ｒａｓで形質転換した細胞中でのＭｙｃ−Ｒ２の発現は軟寒天中の増殖効率を増加させることを示す。示した例はｒ−３／ｍＲ２及び未感染のｒ−３細胞（表４を参照）である。（Ｂ）対数増殖培養物からの３×１０5細胞を回収し、続いて５回の同一遺伝子Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウス／細胞株／実験に供した場合、Ｃ１／ＳＨ対照細胞と比較して、Ｃ１／ｍＲ２細胞は腫瘍潜伏期が減少し、増殖速度が増加した。提示した結果は、２回の独立した実験からのものである。腫瘍増殖速度のｔ試験分析のｐ値を示し、２つの細胞株の増殖速度が有意に相違することが示される。（Ｃ）Ｃ１／ｍＲ２細胞は、増加した転移能を示した。
【図４】  図４Ａ−Ｃはグラフである。図中、（Ａ）は、Ｒ２過剰発現細胞中において膜に付随したＲａｆ−１タンパク質の量が増加することを示す。組み換えＲ２発現細胞株Ｂ３／ｍＲ２、Ｎ３／ｍＲ２、Ｃ１／ｍＲ２、ｒ−２／ｍＲ２、ｒ−３／ｍＲ２及びＮＲ４／ｍＲ２（Ｒ２）をそれらの各対照細胞、Ｂ３／ＳＨ、Ｎ３／ＳＨ、Ｃ１／ＳＨ、ｒ−２／ＳＨ、ｒ−３及びＮＲ４（対照）と比較した。全ての場合で、組み換えＲ２を発現する細胞は、膜付随Ｒａｆ−１タンパク質の増加を示し、２群の細胞株を比較した場合、ｔ試験分析により有意に相違することが判明した（ｐ＜０．００１）。（Ｂ）Ｒ２過剰発現細胞におけるマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ−２）の活性の増加を示す。組み換えＲ２発現細胞株Ｂ３／ｍＲ２、Ｎ３／ｍＲ２、１０Ｔ／ｍＲ２、Ｃ１／ｍＲ２、ｒ−２／ｍＲ２及びＮＲ４／ｍＲ２（Ｒ２）を、ＬＸＳＨを感染したそれらの各対照細胞株（対照）と比較した。試験した全ての場合で、組み換えＲ２を発現する細胞は酵素活性の増加を示し、２群の間の相違は非常に有意であった（ｐ＜０．００１）。（Ｃ）は、活性化Ｖ１２Ｒａｃ−１プラスミドによるトランスフェクション後の、Ｎ３／ＳＨ細胞と比較してＮ３／ｍＲ２細胞ではフォーカス形成が増加することを示す。示したフォーカスの数は、２回の独立した実験の平均±ＳＥを示す。
【図５】  図５Ａ−Ｂは、マウスＬ細胞を用いたＣＡＤ（Ａ）及びＤＨＦＲ（Ｂ）ＤＮＡのサザンブロット分析の例を示すゲルの写真である。図５Ａ：対照としての薬物に露出しなかったＨ−４細胞（ａ）、５０μＭのＰＡＬＡの存在下（ｂ）又は６０μＭのＰＡＬＡの存在下（ｃ）で発達したコロニーからのＨ−４細胞。ＤＮＡはＸｂａｌで完全に消    化した。図５Ｂ：対照としての薬物に露出しなかったＳＣ２細胞（ａ）、８０ｎＭのメトトレキセート（ＭＴｘ）の存在下（ｂ）及び（ｃ）で発達したコロニーからのＳＣ２細胞。ＤＮＡはＰｓｔｌで完全に消化した。
【図６】  図６Ａ−Ｂは、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞を用いたＣＡＤ（Ａ）及びＤＨＦＲ（Ｂ）ＤＮＡのサザンブロット分析の例を示すゲルの写真である。ＤＮＡはＰｓｔｌで完全に消化した。図６Ａ：ＰＡＬＡに露出しなかったＢ３／ｍＲ２細胞（ａ）、及び４０μＭのＰＡＬＡの存在下（ｂ）又は５０μＭのＰＡＬＡの存在下（ｃ）で発達したコロニーからのＢ３／ｍＲ２細胞。図６Ｂ：ＭＴＸに露出しなかったＢ３／ｍＲ２細胞（ａ）、６０ｎＭのＭＴｘの存在下（ｂ）又は８０ｎＭのＭＴｘの存在下（ｃ）で発達したコロニーからのＢ３／ｍＲ２細胞。
【図７】  図７は、Ｎ／Ｒ２−４（ａ）及びＮ／Ｒ２＋ＡＳＲ２（ｂ）細胞におけるＲ２タンパク質レベルのウエスタンブロット分析の写真である。トランスフェクション細胞中でベクターＲ２タンパク質を内生の遺伝子産物と区別するために、１０個のアミノ酸とメチオニンをコードするヒトｃ−ｍｙｃエピトープをＲ２のｃＤＮＡの５’末端に置換した。組み換え（上部のバンド）および内生（下部のバンド）のＲ２タンパク質がレーンａで検出され、Ｒ２アンチセンスを含有する細胞（レーンｂ）では顕著に減少した。両方の細胞株は約１６時間のほぼ同一の倍増時間で増殖した。
【図８】  図８は、ＰＡＬＡ、ＭＴＸ又はヒドロキシ尿素の存在下で発達したコロニーからの細胞におけるｐ５３−ＤＮＡ結合活性を示すゲルの写真である。（ａ）ｐ５３なしの対照ｌＢ細胞、（ｂ）２０μＭのＰＡＬＡの存在下で増殖したＢ３／ｍＲ２細胞、（ｃ）４０μＭのＰＡＬＡの存在下で増殖したＢ３／Ｒ２ｃ２細胞、（ｄ）４０ｎＭのＭＴＸの存在下で増殖したＢ３／ｍＲ２細胞、（ｅ）６０ｎＭのＭＴＸの存在下で増殖したＢ３／Ｒ２ｃ２細胞、（ｆ）０．２０ｍＭのヒドロキシ尿素の存在下で増殖したＢ３／ｍＲ２細胞、及び（ｇ）０．３０ｍＭのヒドロキシ尿素の存在下で増殖したＢ３／Ｒ２ｃ２細胞。細胞を、ＤＮＡ結合についてｐ５３を活性化する抗体４２１の存在下で32Ｐ標識ｐ５３コンセンサス結合配列と一緒にインキュベートした。ｌＢ対照ｐ５３なし細胞以外の全細胞株で複合体が存在する。低分子量の複合体形成がｐ５３−ＤＮＡ結合から生じ、高分子量の複合体形成が抗体スーパーシフトしたｐ５３−ＤＮＡ結合から生じる。
【図９】  図９は、（ａ）Ｈ−ｒａｓ癌遺伝子を含有するＮＩＨ−３Ｔ３マウス細胞、（ｂ）Ｈ−ｒａｓ癌遺伝子及びＲ２アンチセンス配列を含有するＮＩＨ−３Ｔ３マウス細胞、及び（ｃ）Ｈ−ｒａｓ癌遺伝子及びＲ２のコード領域配列を含有するＮＩＨ−３Ｔ３マウス細胞における形質転換フォーカスの数を示すグラフである。結果は３回の実験の平均である。
【図１０】  図１０Ａ−Ｂは、Ｌ６０マウス腫瘍細胞におけるリボヌクレオチドレダクターゼＲ２タンパク質レベルの、ＡＳ−ＩＩ−６２６−２０阻害（Ａ）及び各種のＲ２アンチセンスオリゴヌクレオチドによる阻害（Ｂ）のウエスタンブロット分析の写真である。図１０Ａ：マウス腫瘍細胞（ａ）；ＡＳ−ＩＩ−６２６−２０を有するマウス細胞（ｂ）；スクランブルしたＡＳ−ＩＩ−６２６−２０を有するマウス細胞（ｃ）；ミスマッチのＡＳ−ＩＩ−６２６−２０を有するマウス細胞（ｄ）。図１０Ｂ：マウス腫瘍細胞（ａ）、ＡＳ−ＩＩ−６６７−２０（ｂ）、ＡＳ−ＩＩ−８１６−２０（ｃ）、ＡＳ−ＩＩ−１２８８−２０（ｄ）、ＡＳ−ＩＩ−１３３５−２０（ｅ）、ＡＳ−ＩＩ−１３３８−２０（ｆ）で処理したマウス腫瘍細胞。
【図１１】  図１１は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞のコロニー形成における各種アンチセンスオリゴヌクレオチドによる阻害の百分率を示すグラフである。
【図１２】  図１２は、ＡＳ−Ｉ−６１８−２０によるコロニー形成の阻害を示すグラフである。細胞株は、ＨｅｐＧ２（肝臓）、ＳＫ−ＯＶ−２（卵巣）、Ｕ８７（脳）、Ａ２０５８（メラノーマ）、Ｈ４６０（肺）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（乳）及びＡｓＰＣ−１（膵臓）である。
【図１３】  図１３は、各種アンチセンスオリゴヌクレオチドでＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞を処理した後のＲ１タンパク質発現のウエスタンブロットの写真である。
【図１４】  図１４Ａは、ＡＳ−Ｉ−６１８−２０での処理後のＲ１タンパク質発現のウエスタンブロットの写真である。対照＝未処理細胞、スクランブル  −  ＡＳ−Ｉ−６１８−２０のスクランブル型で処理した細胞（ＧＴＡＣは同一割合であるが、完全に異なる配列）、そして、ミスマッチ  −  ４塩基ミスマッチを有するＡＳ−Ｉ−６１８−２０のミスマッチ型。図１４Ｂは、Image Quant プログラム（Molecular Dynamics）を用いて定量し、任意単位（相対強度）で表したウエスタンブロットでのＲ１タンパク質レベルのグラフである。
【図１５】  図１５は、免疫沈降ゲルの写真である。ＳＲＣ  −  ＡＳ−Ｉ−６１８−２０のスクランブル型、ＭＩＳ  −  ＡＳ−Ｉ−６１８−２０のミスマッチ型。
【図１６】  図１６は、ＡＳ−Ｉ−６１８−２０で処理した場合と処理しない場合の、各種細胞からのｍＲＮＡのノーザンブロットのオートラジオグラフである。ＨＴ−２９はヒト結腸腺癌細胞株であり、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１はヒト乳腺癌細胞株である。
【図１７】  図１７は、各種のアンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理後のマウスにおけるヒト肺癌腫（Ｈ４６０）腫瘍の重量を示すグラフである。
【図１８】  図１８は、ＡＳ−Ｉ−６１８−２０での処理後のマウスにおける各種腫瘍の重量を示すグラフである。明るい色の棒は未処理の対照から得た結果であり、暗い色の棒はＡＳ−Ｉ−６１８−２０で処理した動物からの結果である。
【図１９】  図１９は、１ｍｇ／ｋｇのＡＳ−Ｉ−６１８−２０で処理した場合と処理しない場合のヌードマウスにおけるヒト肺癌腫腫瘍の増殖速度を示すグラフである。
【図２０】  図２０は、ＡＳ−Ｉ−６１８−２０での処理後のマウスにおけるＨＴ−２９ヒト結腸腫瘍におけるリボヌクレオチドレダクターゼＲ１ｍＲＮＡのノーザンブロットのオートラジオグラフである。
【図２１】  図２１は、各種アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理後のＣＤ−１ヌードマウスにおけるヒト結腸癌腫（ＨＴ−２９）腫瘍の重量を示すグラフである。
【図２２】  図２２は、各種アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理後のＣＤ−１ヌードマウスにおけるヒトメラノーマ（Ａ２０５８）腫瘍の重量を示すグラフである。
【図２３】  図２３は、各種アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理後のＣＤ−１ヌードマウスにおけるヒト肺癌腫腫瘍の重量を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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