(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
1以上の保護された開始部分を含んでなる支持体上の特定の反応部位で1以上の選択される多量体を合成する方法であって、
(a)酸前駆体および塩基前駆体からなる群から選択される1以上の光試薬前駆体を含む溶液と支持体とを接触させて、溶液が開始部分と接触するようにし、
(b)特定の反応部位を流体的に独立させ、
(c)選択される複数の独立した反応部位を、フォトリソグラフィー用マスクを用いずに、光源と、デジタルマイクロミラー装置を含むコンピューター制御された立体光学モジュレーターとを含む光学系を用いて照射し、照射された反応部位において開始部分を直接脱保護し脱保護された開始部分を作る少なくとも1種の光生成試薬を生成させること、
(d)支持体と1以上の単量体（単量体は保護されていない反応部位と保護された反応部位を含む）を、脱保護された開始部分と結合した単量体の保護されていない反応部位が、結合した単量体と共に新たな開始部分をつくるような条件下で接触させること、および
(e)選択される多量体が合成されるまで、工程(a)-(d)を繰り返すことを含んでなる方法。
【請求項２】
選択される多量体がDNAである、請求項1記載の方法。
【請求項３】
DNAがヌクレオチドホスホルアミダイトおよびその類似体からなる群から選択される、請求項2記載の方法。
【請求項４】
選択される多量体がオリゴヌクレオチドである、請求項1記載の方法。
【請求項５】
開始部分がリンカー分子を含み、それぞれのリンカー分子は酸不安定保護基で保護された反応性官能基を含む、請求項1記載の方法。
【請求項６】
リンカー分子の反応性官能基がヒドロキシル基を含む、請求項5記載の方法。
【請求項７】
ステップ(d)において保護された反応部位が酸不安定保護基によって保護されている、請求項1記載の方法。
【請求項８】
ステップ(d)において保護された反応部位が塩基不安定保護基によって保護されている、請求項1記載の方法。
【請求項９】
ステップ(d)において脱保護された開始部分と単量体の結合が98%以上の収率でおこる、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
支持体上の1以上の保護された開始部分を含んでなる特定の反応部位で1以上の選択される多量体を、溶液中で、合成する方法であって、
(a)支持体を、1以上の光生成試薬（ここで光生成試薬は、フォトリソグラフィー用マスクを用いずに、光源と、特定の流体的に独立した反応部位を照射するためのデジタルマイクロミラー装置を含むコンピューター制御された立体光学モジュレーターとを含む光学系を用いて生成される）を含む溶液と接触させ、溶液を選択される複数の開始部分と接触させることにより開始部分を直接脱保護して脱保護された開始部分を作るようにすること、
(b)支持体と1以上の単量体（単量体は保護されていない反応部位と保護された反応部位を含む）を、脱保護された開始部分と結合した単量体の保護されていない反応部位が、結合した単量体と共に新たな開始部分をつくるような条件下で接触させること、および
(c)選択される多量体が合成されるまで、工程(a)-(b)を繰り返すことを含んでなる方法。
【請求項１１】
選択される多量体がDNAである、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
DNAがヌクレオチドホスホルアミダイトおよびその類似体からなる群から選択される、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
選択される多量体がオリゴヌクレオチドである、請求項10記載の方法。
【請求項１４】
1以上の保護された開始部分を含む独立した反応部位を含んでなる支持体上で選択される多量体のアレイを並行合成する方法であって、
(a)独立した反応部位を、デジタルマイクロミラー装置を含む空間光学的モジュレーターを用いて選択的に照射して、照射された独立した反応部位において脱保護された開始部分を生成させ、ここで脱保護された開始部分は
(i)支持体を、1以上の光試薬前駆体を含む溶液と接触させ、溶液を開始部分と接触させること、および
(ii)独立した反応部位を選択的に照射し、照射された独立した反応部位において開始部分を脱保護するのに有効な1以上の光生成試薬を生成させること、
によって生成され、
(b)1以上の単量体を脱保護された開始部分に結合させて新たな保護された開始部分を生成させ、
(c)選択される多量体のアレイが合成されるまで、工程(a)-(b)を繰り返すことを含み、選択される多量体のアレイを合成するための結合反応が98%以上の収率で起こる方法。
【請求項１５】
選択される多量体がDNAである、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
DNAがヌクレオチドホスホルアミダイトおよびその類似体からなる群から選択される、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
選択される多量体がオリゴヌクレオチドである、請求項14記載の方法。
【請求項１８】
光試薬前駆体が酸前駆体および塩基前駆体からなる群から選択される、請求項14記載の方法。
【請求項１９】
単量体が保護されていない反応部位および保護された反応部位を含む、請求項14記載の方法。
【請求項２０】
保護された開始部分が酸不安定基により保護されている、請求項14記載の方法。
【請求項２１】
保護された開始部分がリンカー分子を含み、それぞれのリンカー分子は酸不安定基により保護された反応性官能基を含む、請求項14記載の方法。
【請求項２２】
支持体上の溶液中で光生成反応を発生させる方法であって、
(a)光源と、デジタルマイクロミラー装置を含むコンピューター制御された空間光学的モジュレーターとを含む光学装置系を用いて光線を発生させること、および
(b)デジタルマイクロミラー装置を含む空間光学的モジュレーターを用いて、前記支持体上で溶液が開始部分と接触するような光生成反応が起こるような条件下で（ここで前記光生成反応は前記支持体を1以上の光試薬前駆体を含む液体と接触させることを含み、前記前駆体は酸前駆体および塩基前駆体からなる群から選択される）光線を支持体上の流体的に独立した反応部位に向け、流体的に独立した反応部位を前記マイクロミラー装置を用いて選択的に照射して、照射された流体的に独立した反応部位において開始部分を脱保護する1以上の光生成試薬を生成させることを含む、前記方法。
【請求項２３】
デジタルマイクロミラー装置が複数の小型の鏡を含む、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
小型の鏡が個別の個々の揺動鏡である、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
1以上の保護された開始部分を含む独立した反応部位を含んでなる支持体上で選択される多量体のアレイを並行合成する方法であって、
(a)流体的に独立した反応部位をデジタルマイクロミラー装置を含む空間光学的モジュレーターを用いて選択的に照射して、照射された独立した反応部位において脱保護された開始部分を生成し、ここで脱保護された開始部分の生成は
(i)支持体を、1以上の光試薬前駆体（前記前駆体は酸前駆体および塩基前駆体から選択される）を含む溶液と接触させて、溶液を開始部分と接触させること、および
(ii)流体的に独立した反応部位を選択的に照射し、照射された流体的に独立した反応部位において開始部分を脱保護する1以上の光生成試薬を生成させること、
を含み、
(b)1以上の単量体を脱保護された開始部分と結合させて新たな保護された開始部分を生成させ、
(c)選択される多量体のアレイが合成されるまで、工程(a)-(b)を繰り返すことを含み、選択される多量体のアレイを合成するための結合反応が98%以上の収率で起こる方法。
【請求項２６】
選択される多量体がDNAである、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
DNAがヌクレオチドホスホルアミダイトおよびその類似体からなる群から選択される、請求項25記載の方法。
【請求項２８】
選択される多量体がオリゴヌクレオチドである、請求項25記載の方法。
【請求項２９】
単量体が保護されていない反応部位および保護された反応部位を含む、請求項25記載の方法。
【請求項３０】
保護された開始部分が酸不安定基により保護されている、請求項25記載の方法。
【請求項３１】
保護された開始部分がリンカー分子を含み、それぞれのリンカー分子は酸不安定基により保護された反応性官能基を含む、請求項14記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
本出願は、1998年2月11日に出願された米国仮特許出願第60/074,368号の利益を請求するものである。
【０００２】
発明の分野
本発明は、化学的反応および生化学的反応の分野に関する。より詳細には、本発明は、予め設定された空間分布パターンに従った支持体表面上での多数の有機分子および生物有機分子の並行合成およびアッセイに関する。本発明の方法および装置は、DNAおよびRNAオリゴヌクレオチド、ペプチド、オリゴ糖、リン脂質ならびに他の生物ポリマーおよび生物学的サンプルの非常に大規模なアレイを、支持体表面上で製造およびアッセイするのに有用である。
【０００３】
従来技術
現代の医薬、農薬および材料の開発には、化学的および生物学的分析におけるサンプルのスクリーニングを加速するための技術的および方法的な進歩が大きく迫られている。微小規模における同様の方法の開発は、そのような進歩にとって決定的に重要である。この領域においては、並行合成、ロボットによるスポッティング、インクジェット印刷およびマイクロフルイディクスを用いて多くの進歩が為されてきた(Marshallら、Nature Biotech. 16, 27-31(1988))。より信頼でき、柔軟な、迅速な、そして安価な技術のためには、たゆまぬ努力が要求される。
【０００４】
高スループットのスクリーニングへの応用のための有望な手法は、分子マイクロアレイ(MMA)チップ、特に固体表面上に固定化された生物ポリマーの高密度アレイを含有するバイオチップの使用である。これらのバイオチップは、分子遺伝学的情報および配列情報を探査するための有力な道具になりつつある(Marshallら、Nature Biotech. 16, 27-31(1998)およびRamsay、Nature Biotech. 16, 40-44(1998))。ヌクレオチド配列の決定、核酸の複数の相互作用の探査、遺伝子突然変異の同定、遺伝子発現のモニター、および病原体の検出のためには、標的分子をバイオチップ上のDNAオリゴヌクレオチドおよびcDNAプローブにハイブリダイズさせてきた。Schenaら、Science 270, 460-467(1995); Lockhartら、Nature Biotech. 14, 1675-1680; Weiler、Nucleic Acids Res. 25, 2792-2799(1997); de Saizieuら、Nature Biotech. 16, 45-48; Drmancら、Nature Biotech. 16, 54-58を参照されたい。バイオチップ技術の継続的な開発は、生物学、医学、および臨床診断学の分野に重大な影響を与えるであろう。
【０００５】
従来のバイオチップ製造は、インクジェットを用いた直接オンチップ合成（同時に複数の配列を作製する）、フォトリソグラフィーを用いた直接オンチップ並行合成（全アレイの配列を同時に作製する）、およびロボットによるスポッティングを用いた予め合成された分子のライブラリーの固定化 (Ramsay、Nature Biotech. 16, 40-44(1998)) を含む。1個のチップ上に最大100万もの配列という非常に大規模のオリゴヌクレオチドアレイの製造には、光制御オンチップ並行合成が用いられてきた。
【０００６】
２つの主要な方法が開示されてきた。すなわち、光により不安定化される基に保護されるモノマーを用いた合成（Pirrungら、米国特許第5,143,854号(1992)；Fodorら、米国特許第5,424,186号(1995)）および化学的伸長化学反応を用いた合成（Beecherら、国際特許出願公開第WO98/20967号(1997)）である。双方の方法とも、脱保護、モノマーの結合、酸化、およびキャッピング(capping)の繰り返し工程を含む。固体支持体表面の所定の領域における選択的な露光を達成するには、フォトマスクを用いる。そこではオリゴヌクレオチドアレイが合成される。
【０００７】
光不安定保護基を含む合成法のためには、光をあてた表面領域において伸長するオリゴヌクレオチド分子から光不安定保護基を開裂させるが、光をあてていない表面領域においては、オリゴヌクレオチド分子上の該保護基は影響を受けない。続いて、該支持体表面を、保護されていない第１の活性中心および光不安定保護基により保護された第２の活性中心を有するモノマーを含有する溶液に接触させる。光をあてた表面領域においては、モノマーは、脱保護されたオリゴヌクレオチド分子に保護されていない第１の活性中心を介して結合する。しかし、光をあてていない表面領域においては、オリゴヌクレオチドは光不安定保護基で保護されたままであり、従って、結合反応は全く起こらない。結合後に得られるオリゴヌクレオチド分子は、モノマーの第２の活性中心上の光不安定保護基により保護されている。従って、所望のオリゴヌクレオチド全てが合成されるまで、上記の光活性化連鎖伸長反応を続けることができる。
【０００８】
化学的伸長化学反応を含む合成法のためには、プレーナー支持体表面をオリゴヌクレオチド分子と結合させ（適当なリンカーを介して）、そしてオリゴヌクレオチド分子の最上部の上に薄い（2、3μm）ポリマーまたはフォトレジスト層を用いて該支持体表面を被覆する。各オリゴヌクレオチド分子の遊離末端を酸不安定基で保護する。該ポリマー／フォトレジスト層は、光−酸前駆体およびエステル（エンハンサー）を含有する。これはH+の存在下で解離し、酸を形成する。合成工程中、酸が、光をあてた表面領域においてポリマー／フォトレジスト層内で生成し、オリゴヌクレオチド分子の末端にある酸不安定保護基が開裂する。次いで、下部のオリゴヌクレオチド分子を露光するために、溶媒または除去溶液を用いてポリマー／フォトレジスト層を除去する。次いで、該支持体表面を、酸不安定保護基により保護された活性中心を有するモノマーを含有する溶液に接触させる。モノマーは、保護されていない第１の活性中心を介して、光をあてた領域の脱保護されたオリゴヌクレオチド分子のみに結合する。光照射されていない領域においては、オリゴヌクレオチド分子は依然としてその保護基を有しており、従って、結合反応に関与しない。次いで、ポリマー／フォトレジストを含有する光−酸前駆体で支持体を再び被覆する。光をあてること、脱保護、結合、およびポリマー／フォトレジスト被覆工程を、所望のオリゴヌクレオチドが得られるまで繰り返す。
【０００９】
光不安定保護基を含む方法には重大な欠点がある。すなわち、(a)用いる化学反応は通常のものではなく、工程全体が極端に複雑であるという点、(b)化学反応の複雑さにより、配列の厳密さが低いという欠点をこの技術が有するという点である。
【００１０】
化学的伸長化学反応を用いる方法にも、同様に制限がある。すなわち、(a)その方法にはポリマー／フォトレジスト層を用いる必要があり、それは化学的および生化学的な反応において日常的に用いられる溶液中で行われる反応には適していない。何故なら、固体表面上での反応部位を分離するための手段が全くないからである。(b)特定の状況においては、加熱前および加熱後ならびにポリマー／フォトレジスト層の除去に要求される過酷な化学的条件により固体表面上でのオリゴヌクレオチドの分解が引き起こされる。(c)工程全体は労働集約的であり、自動化することが困難である。これは、フォトレジスト被覆、加熱、整列、露光および除去という多くのサイクル（20-merを合成する場合、最大で80サイクル！）が要求されることによるものである。(d)この方法は、光により生成する試薬を適用すべき生物学的サンプルまたは広範囲の生化学反応には適用不可能である。何故なら、ポリマー／フォトレジスト層中に生物学的サンプルを包埋することは不可能であるからである。
【００１１】
上記の２つの方法において、フォトマスクを使用することに関するさらなる制限がある。すなわち、(a)新しいチップを作製するための装備は、非常に高価である。これは、作製すべきフォトマスクの数が非常に多いことによるものである。(b)フォトリソグラフィー装置は高価であり、従って、多くの関心のあるユーザーには利用できる機会がない。(c)フォトリソグラフィー工程は、高価なクリーンルーム施設の中で行う必要があり、熟練した技術者を要する。(d)工程全体が複雑であり、自動化するのが難しい。これらの制限により、オリゴヌクレオチドチップの応用および種々のMMAチップの開発が弱められる。
【００１２】
従って、単純で、用途が多く、費用効率が高く、操作しやすく、そして分子アレイの純度を改善できる、化学的方法および合成装置の開発がまさに必要である。
【００１３】
発明の概要
本発明は、in situで生成した光生成物を試薬または共試薬として用いて溶液中の化学反応および生化学反応を実施するための方法および装置を提供する。これらの反応は、UVまたは可視光線などの照射により制御される。特に指摘しない限り、本明細書に記載された全反応は、少なくとも１つの共通の溶媒の溶液中で、または２つ以上の溶媒の混合物の溶液中で起こるものとする。溶媒は化学反応において伝統的に用いられる任意の従来の溶媒であり得る。そのような溶媒としては、限定するものではないが、CH2Cl2、CH3CN、トルエン、ヘキサン、CH3OH、H2O、および／または添加溶質（例えばNaCl、MgCl2、リン酸塩など）を少なくとも１つ含有する水溶液が挙げられる。溶液は反応部位のアレイを含む固体表面上の規定の領域内に含まれる。少なくとも１つの光生成試薬(PGR)前駆体（照射に際して少なくとも１つの中間体または生成物を形成する化合物）を含む溶液を、該固体表面上に加え、続いてデジタルディスプレイプロジェクターを通して光パターンを固体表面上に投射すると、PGRが光をあてた部位で形成する。暗い（すなわち、光をあてていない）部位では、反応は起こらない。PGRは反応条件を改変し、限定的な領域においては、さらなる所望の反応を経過し得る。従って、少なくとも１つの光生成試薬(PGR)の存在下では、固体表面上の特定部位における多段階反応のうちの少なくとも１つの段階は、光、照射などの放射により制御され得る。このように、本発明は並行反応の応用に大きな可能性を秘めている。この反応においては、反応の各段階で、マトリックス中またはアレイの選択された部位のみを反応可能とすることができる。
【００１４】
本発明はまた、上記の光制御反応を実施するための装置を提供する。該装置の１つの応用は、ウェル（反応容器）などの多数の分離された反応部位を含有する固体表面上の反応を制御することである。コンピューターおよびデジタル光学プロジェクター（光学モジュール）を用いて、該反応をもたらすための光パターンを作製する。パターン化された光は、反応容器の特定部位上に投射され、そこで光制御反応が起こる。
【００１５】
本発明の１つの応用は、化学的／生化学的試薬のin situにおける生成を提供する。該試薬は、多くの反応性部位が存在するうちで特定の選択部位における、続いて起こる化学的および生化学的反応に用いられる。本発明の１態様は、制御された方法で酸または塩基の光生成により溶液のpHを変化させることである。選択されたサンプルのpH条件は、存在する光生成された酸または塩基の量により制御され得る。pH条件の変化は、酵素を活性化させること、ならびにリガンド分子と対応するその受容体との間の共有または非共有結合形成を介して結合および架橋を誘導することなどにより、化学反応または生化学反応に影響を及ぼす。
【００１６】
本発明の別の態様においては、光生成試薬自身が溶液中で他の分子と相互作用し得る結合分子として作用する。結合分子の濃度は、光照射の用量により決定される。従って、２つ以上の系におけるリガンド結合の親和性および特異性を、並行して試験することができる。従って、本発明の方法および装置により、複数の工程を同時に精査および／またはモニターすること、ならびに化学的、生化学的および生物学的サンプルの高スループットスクリーニングが可能となる。
【００１７】
本発明の別の重要な態様は、オリゴヌクレオチドおよびペプチドなどの生物ポリマーの並行合成である。並行合成においては、選択的脱保護または結合反応のために本発明の方法および装置を用いる。これらの反応により、固体表面上での様々な生物ポリマーの制御された製造が可能となる。これらの分子マイクロアレイチップ(MMAチップ)は、機能遺伝学、診断、治療および遺伝子農学などの幅広い分野において用いられ、また、遺伝子配列および遺伝子配列の他の分子（抗生物質、抗腫瘍剤、オリゴ糖、およびタンパク質など）との相互作用を検出および分析するために用いられる。これらの態様および他の態様は、本発明の特徴および利点を説明している。さらなる詳細は、本明細書の他の部分および添付された図面を参照することにより明確になる。
【００１８】
本発明の方法は、DNAオリゴヌクレオチドアレイの並行合成に関する従来の方法(Pirrungら、米国特許第5,143,854号(1992); Fodorら、米国特許第5,424,186号(1995); Beecherら、国際特許出願公開第WO 98/20967号(1997))と比較して根本的な改良を示す。本発明は、１つの反応において少なくとも１つの試薬を光試薬前駆体に置換えて、現存の化学反応を有利に用いるものである。従って、光不安定保護基またはポリマー被覆層を反応媒体として含有するモノマーを要する従来の方法とは異なり、本発明の方法は、従来の化学反応のモノマーを用い、かつ従来の合成化学反応およびプロトコルを最小限に変化させるだけでよい。
【００１９】
本発明により可能となった改良は、重要な意義を有する。すなわち、(a)本発明の方法を用いた配列アレイの合成は、自動化DNA/RNA合成機に容易に組み込むことができ、本発明の工程はより単純化され、費用もより低くなる。(b)本発明により採用された従来の化学反応は、ステップ当り98%を超える収率のオリゴヌクレオチド合成をルーチンで達成する。それは、光不安定保護基を用いる従来の方法により得られる85〜95%という収率よりも遥かに優れている。Pirrungら、J. Org. Chem. 60, 6270-6276(1995); McGallら、J. Am. Chem. Soc. 119, 5081-5090(1997); McGallら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 13555-13560(1996)を参照されたい。改良された段階収率は、診断用途および臨床用途のための高品質なオリゴヌクレオチドアレイを合成するのに決定的に重要である。(c)光生成物(PGR)の収率は、光不安定保護基の不完全な脱保護が重大な懸念であった従来の方法とは対照的に、本発明の方法においては主要な懸念事項ではない。(d)品質制御について、本発明の合成工程を従来の化学を用いてモニターすることができる。従来の方法を用いた場合、これは不可能である。(e)本発明の方法は、修飾残基を含有するオリゴヌクレオチド、3’−オリゴヌクレオチド（通常の合成において得られる5’−オリゴヌクレオチドとは反対に）、ペプチド、オリゴ糖、組み合わせの有機分子などの他の型の分子マイクロアレイの合成にまで容易に拡張することができる。これらは、光不安定保護基を含有するモノマーを要する従来技術を用いては克服できない仕事であろう。従来の方法では、モノマーの型それぞれについて新しい合成法が必要である。本発明においては、市販の修飾残基および種々のモノマーを用いることができる。(f)本発明は、あらゆる型の反応に適用することができ、化学的伸長反応を用いる従来の方法のようにポリマー反応媒体に限らない。(g)さらに、従来のオリゴヌクレオチド化学反応を用いる合成の各ステップの反応時間(1ステップあたり5分)は、光不安定な保護されたモノマーを用いる方法(1ステップあたり＞15分)よりも非常に短い。
【００２０】
従来のバイオチップ製造においては、光学的パターン化には標準的なフォトマスクに基づくリソグラフィーの道具を用いる。Karlら、米国特許第5,593,839号(1997)を参照されたい。一般に、マスクの数およびパターンの複雑さは、オリゴマーの長さおよび多様性が増すにつれて増大する。例えば、12ヌクレオチドのサブセットを合成するには4×12=48マスクが必要である。この数は、カスタムチップの選択に依存してより大きくなり得る。新しいセットの配列を作製するためには、新しいセットのマスクを調製する必要がある。より重要なことは、連続的なフォトマスクの高度に厳密なアラインメント（<10μmのオーダーの解像度）である。この仕事は、特殊な設備および技術的な専門知識がなければ達成不可能である。該技術は半自動的なものに過ぎず、該方法は明らかに柔軟性に欠け、高価である。さらに、フォトマスク製造工程には、高価なクリーンルーム施設が必要であり、マイクロエレクトロニクスの分野における特殊な技術的専門知識が要求される。従って、完全なチップ製造工程は、ほとんどの研究団体にとって利用できる機会がない。
【００２１】
本発明は、フォトマスクをコンピューター制御された空間光学的モジュレーターに置換え、コンピューターの画面上に黒白の画像を表示するのと同じ方法で、フォトリソグラフィーのための光パターンをコンピューターにより作製することを可能にする。この改変は、任意の所望の配列アレイを合成するための最大限の柔軟性をもたらし、時間がかかりアラインメント誤差が生じがちな従来のフォトリソグラフィーのようにマスクのアラインメントを行う必要が無くなることにより製造工程を単純化する。さらに、本発明の光学系および反応容器系の双方は、コンパクトであり、１つのデスクトップ内に統合することができる。そのような装置はパーソナルコンピューターにより完全に制御することができ、全ての実験化学者が、合成機を用いた生物オリゴマーの合成と同様な方法で、自分自身の配列設計のバイオチップを作製することができるようになる。さらに、該装置は、クリーンルームの必要がなくあらゆる標準的な化学実験室で操作することができる。また、本発明を採用して、自動化した生産ラインによる特殊なバイオチップの固定数生産または標準的なバイオチップの大量生産を容易に合理化することができる。明らかに、本発明の方法および装置によりバイオチップの製造費用が有意に削減され、従って、研究団体および生物医学団体にとってのバイオチップ技術の利用可能性を有意に増大させ得る。
【００２２】
最も重要なことは、光生成試薬をコンピューター制御された空間光学モジュレーターと組み合わせて用いる本発明の方法により、MMAチップ製造が日常的な製法となり、従来技術の方法の制限を克服できるということである。
【００２３】
発明の説明
光生成試薬（PGR）を用いた化学／生化学反応法
本発明は、照射によりin situで生成される試薬に関与する、溶液に基づいた光化学反応法を提供する。通常の化学／生化学反応は、以下に描写するように少なくとも1つの反応物（一般的に「A」と表示する）と、少なくとも1つの試薬（一般的に「R」と表示する）との間に起こり、少なくとも1つの生成物を生じる：
Ａ＋Ｒ  →  Ａ’＋Ｒ’
本発明は、光を用いた照射により制御される反応条件を提供するものである。主に、上記反応中のRは、光により生成される。光により生成される試薬（光生成試薬：PGR）は、通常用いられている試薬と同様に機能し、それゆえ上記反応は他の通常の様式で進む。光で制御される反応の全体を以下に描写する。
【００２４】
0004503828.tif 000002
本発明のいくつかの実施形態において、PGR前駆体（表１）は、以下に挙げる形でH+を生じる光により生成される酸前駆体（光生成酸前駆体）である：R1CO2H、R1PO3H、R1SO3H、H+X−(R1＝H、アルキル(C1−C12)、アリール（フェニルを含む芳香族構造）、またはこれらの置換誘導体（置換基＝ハロゲン原子、NO2、CN、OH、CF3、C(O)H、C(O)CH3、C(O)R2、SO2CH3、SO2R2、OCH3、OR2、NH2、NHR2、NR2R3（R2およびR3＝アルキル若しくはアリール(C1−C12)）；X＝ハロゲン原子、無機塩イオン）など。光生成酸はまた、照射で形成されるMmXn（ルイスの酸、mおよびnは原子数である）などの複合体でもある。本発明の他の実施形態において、PGR前駆体（表１）は、照射において、アミン、酸化物などの塩基を生じる光により生成される塩基前駆体（光生成塩基前駆体）である。
【００２５】
【表１】
0004503828.tif 000003
0004503828.tif 000004
0004503828.tif 000005
0004503828.tif 000006
0004503828.tif 000007
0004503828.tif 000008
a置換誘導体は、ハロゲン、NO2、CN、OH、SH、CF3、C(O)H、C(O)CH3、C1−C3アシル、SO2CH3、C1−C3−SO2R2、OCH3、SCH3、C1−C3−OR2、C1−C3−SR2、NH2、C1−C3−NHR2、C1−C3−N(R2)2（R2＝アルキル、該式中に生じる場合毎に同一または異なりうる）が含まれるがこれらに限定されない、少なくとも1つの置換基を含む。
【００２６】
本発明のいくつかの実施形態では、PGR前駆体を放射線増感剤のような補助試薬と併用する。1つの特定の例は光増感剤を使用するものであり、それは用いるPGRよりも励起エネルギーが低い化合物である。照射によって光増感剤が励起し、それによってPGR前駆体の変換が順次開始され、PGRが得られる。光増感剤の効果は光化学反応に用いる励起波長をシフトさせ、光生成試薬の生成効率を高めることである。従って、1つの実施形態において、本発明は、限定されるものではないが、PGR反応において補助試薬として光増感剤を使用する。多くの放射線増感剤が当業者に公知であり、前述のものが含まれる。当業者ならば本開示に基づいてさらなる放射線増感剤を容易に確認できることが分かる。
【００２７】
本発明の好ましい実施形態では、支持体表面は固体であり、かつ実質的に平坦である。限定されるものではないが、例として、支持体はガラス、パイレックスまたは石英のようなある種のケイ酸塩、ポリプロピレンまたはポリエチレンのようなある種の重合物質などであってもよい。この支持体表面は本発明に適用するように製作し、誘導体化する。
【００２８】
光生成酸(PGA)の脱保護およびオリゴヌクレオチド合成
本発明の１つの実施形態(図1および2)によれば、オリゴヌクレオチド配列アレイが合成される支持体表面にリンカー分子を結合させる（リンカーは「開始部分」であり、この用語は他の単量体をそれに付加することができる単量体またはオリゴマーを広く含む）。オリゴヌクレオチドの合成方法はMcBrideら, Tetrahedron Letter 24, 245-248 (1983)で知られている。それぞれのリンカー分子は酸に不安定な保護基によって保護された5’-OHのような反応性官能基を含んでいる(100)。次に、光-酸前駆体、または光-酸前駆体およびその光増感剤（表1）を支持体に塗布する。次いで所定の光パターンを支持体表面に投射する(110)。照射された部位で酸が生成し、その結果として5’-OHから(DMTのような)酸に不安定な保護基の開裂が起こり、末端のOH基が入ってくる単量体と反応することができる（図2、以後用いられる「単量体」は、化学物質として広く定義され、これは化学構造によって定義される単量体もしくはオリゴマーまたはそれらの誘導体であってもよい）。暗所（すなわち非照射部位）では酸は生成せず、それゆえリンカー分子の酸に不安定な保護基はそのまま残っている（隣接部位間のH+の拡散を防ぐ方法は後に説明する）。次いで支持体表面を洗浄し、続いて第1単量体（例えば、ヌクレオホスホロアミダイト、ヌクレオホスホネートまたは鎖伸長が可能な類似化合物）と接触させると、それは通常のカップリング反応条件下で、脱保護されたリンカー分子のみに付加する(120)。従ってリンカー分子のOH基と単量体の保護されていない反応部位（例えばリン）との間に、化学結合、例えば亜リン酸結合が形成される。適当な洗浄、酸化およびキャッピング工程の後、第1の残基の付加が完了する。
【００２９】
結合したヌクレオチド単量体もまた、酸に不安定な基によって保護された末端反応性官能基を含んでいる。次いで伸長中の配列のアレイを含む支持体に第2のバッチの光-酸前駆体を供給し、所定の第２の光パターンに曝す(130)。選択された配列を脱保護して支持体を洗浄し、続いて第2の単量体を供給する。ここでも第2の単量体は露光した表面部位でのみ伸長中のオリゴマーを増加させる。伸長配列に付加された第2の残基もまた酸に不安定な基によって保護された末端反応性官能基を含んでいる(140)。この鎖伸長工程は所望の長さおよび所望の化学配列の重合体が選択された表面部位全体において形成されるまで繰り返される(150)。任意の指定された配列パターンのオリゴヌクレオチドアレイを含むチップについて、その反応工程の最大数は4 x nである（ここでnは鎖長であって、4は天然のヌクレオチドに対する定数である）。修飾配列を含むアレイでは4 x nより多い工程を必要とし得る。
【００３０】
PGA活性化カップリング反応およびオリゴヌクレオチド合成
本発明のもう１つの実施形態（図3）によれば、光不安定基と結合したテトラゾールを含む化合物のような光活性剤の前駆体を用いる。リンカー分子をオリゴヌクレオチド配列アレイが合成されることになる支持体表面上に結合させる(300)。リンカー上の酸に不安定な保護基を脱保護する(310)。次に光活性剤の前駆体、または光活性剤の前駆体およびその光増感剤（表1）を支持体に塗布する。次いで所定の光パターンを支持体表面に投射する(320)。照射された部位で活性剤分子が生成し、単量体をリンカーに結合させる。非照射部位では活性剤分子は生成せず、それゆえ反応は起こらない（隣接部位間の活性剤の拡散を防ぐ方法は後に記載する）。適当な洗浄、酸化およびキャッピング工程の後、第1の残基の付加が完了する。
【００３１】
結合したヌクレオチド単量体もまた保護された末端官能基を含んでいる。次いで伸長中の配列のアレイを含む支持体に第2のバッチの酸と接触させる(330)。配列を脱保護して支持体を洗浄し、続いて第2の単量体と接触させる。ここでも第2の単量体は露光した表面部位でのみ伸長する(340)。この鎖伸長工程を所望の長さおよび所望の化学配列をもつ重合体が選択された表面部位全体において形成されるまで繰り返す(350)。
【００３２】
光生成試薬を用いるオリゴヌクレオチド合成の別の実施形態
本発明のある実施形態では、カップリング工程120、140、150、320、340および350に用いられる適切な単量体はヌクレオチド類似体である。これらの単量体の反応は図1および3に記載されたように進行し、修飾残基を含むオリゴヌクレオチドが得られる。
【００３３】
本発明のある実施形態では、カップリング工程120、140、150、320、340および350に用いられる適切な単量体は、3’-OH位においてDMTのような酸に不安定な保護基を含むものである。これらの単量体の反応は図1および3に記載されたように進行するが、配列は5’-OH保護化単量体を用いたものとは反対方向に伸長した。かかる合成によって末端3’-OHを含むオリゴヌクレオチドが生成され、これはin situポリメラーゼ連鎖反応(PCR)用のプライマーとして特に使用される。
【００３４】
光生成試薬および光増感剤
本発明においてPGRを使用することによって通常の条件下での化学／生化学反応が可能になる。しかしながら照射下での少なくとも1つの試薬のin situ生成によって反応の生起が制御される。ある実施形態では、照射は紫外線および可視光を放射する光源に由来する。熱、赤外線およびX線照射もまた照射源である。PGR前駆体または光増感剤（これはそのエネルギーを順々にPGR前駆体に転移する）の照射によってPGRが生成される。化学変化が起こって少なくとも1つの生成物(PGR)を生ずるが、それは中間体または安定な化合物である。PGRはPGR前駆体の親構造または転位構造から解離したPGR前駆体分子の一部に由来する。PGRは酸、塩基、求核試薬、求電子試薬またはその他の特定の反応性をもつ試薬であってもよい（表1）。
【００３５】
本発明のある実施形態では、他の反応物と混合する前に予備照射して少なくとも1つのPGRを活性化することによって、反応収率の向上および／または副反応の抑制が達成される。予備照射による活性化によって、照射中に発生したフリーラジカル種のような活性反応中間体が減少してH+のような生成物が安定した濃度に達する時間が与えられる。また少なくとも1つの適当な安定剤を用いるならば、反応収率の向上および／または副反応の抑制が達成される。1つの例は照射中に発生したフリーラジカル種のような活性反応中間体の寿命を短縮する少なくとも1種の試薬を提供し、低エネルギー源の水素を提供するものである。スルホニウム塩(Ar3S+X-)からH+を発生させる以下の反応によってこれを例示する。
0004503828.tif 000009
上記式中のRH化合物は安定しており、優れたH供与体である。かかる化合物の例としては、プロピレンカーボネート（UVI 6974およびUVI 6990の主成分の1つ）、t-ブタン、シクロヘキセンなどが挙げられる（表1C）。
【００３６】
本発明の範囲内にある光-酸前駆体には、照射下でPGAを生成する化合物のいずれもが含まれる。かかる化合物の例としては、ジアゾケトン、トリアリールスルホニウム、ヨードニウム塩、o-ニトロベンジルオキシカーボネート化合物、トリアジン誘導体などが挙げられる。これらの化合物の代表的な例を表1Aに示す。この表は以下の参考文献中で見られるデータに基づいて編集されている： Susら, Liebigs Ann. Chem. 556, 65-84 (1944); Hisashi Sugiyamaら, 米国特許第5,158,885号 (1997); Cameronら, J. Am. Chem. Soc. 113, 4303-4313 (1991); Frechet, Pure & Appl. Chem. 64, 1239-1248 (1992); Patchormikら, J. Am. Chem. Soc. 92, 6333-6335 (1970)。
【００３７】
光-酸前駆体の例としては、ヘキサフルオロアンチモン酸トリアリールスルホニウム誘導体がある(Dektarら, J. Org. Chem. 53, 1835-1837 (1988); Welshら, J. Org. Chem. 57, 4179-4184 (1992); DeVoeら, Advances in Photochemistry 17, 313-355 (1992))。この化合物は、直接または感光性の光分解を受けてフリーラジカル種を形成し、最終的にはジアリールスルフィドおよびH+を生成するオニウム塩の一群に属する（上記を参照）。
【００３８】
光-酸前駆体のもう１つの例としては、ジアゾナフトキノンスルホン酸トリエステルエステルがあり、これはλ>350nmの紫外線照射下でインデンカルボン酸を生成する。酸の生成は、ケトン中間体を生成するカルベン種を経たウォルフ転位、それに続くケテンの水和によるものである(Susら, Liebigs Ann. Chem. 556, 65-84 (1944); Hisashi Sugiyamaら, 米国特許第5,158,885号 (1997))。
【００３９】
【化１】
0004503828.tif 000010
これらの光分解中間体および生成物は、高解像度微細画像フォトリソグラフィー用の陽イオン性およびラジカル触媒重合に広く用いられてきた。
【００４０】
光-酸前駆体化合物はフォトレジスト製剤の成分として印刷業およびマイクロエレクトロニクス工業において長年にわたり広く用いられてきた(Willson, in “Introduction to microlithography”, Thompsonら編, Am. Chem., Soc.: Washington D.C., (1994))。これらの反応は一般的に速く（およそ数秒または数分で完了する）、穏やかな条件下で（室温、中性溶液）進行し、また光反応に用いる溶媒（ハロアルカン、ケトン、エステル、エーテル、トルエン、およびその他のプロトン性または非プロトン性極性溶媒）またはその他の有機溶液化学に用いる溶媒は、オリゴヌクレオチドと適合性がある(McBrideら, Tetrahedron Letter 24, 245-248 (1983))6。表1に挙げた光生成酸の中で、副反応を最少にするために化学適合性について選択を行う。光生成酸の酸性度のような化学特性を環部分または鎖部分上の異なる置換基によって調整することができる。例えば、生成したインデンカルボン酸中の電気的陰性のスルホン酸基は、同じ環部分に結合したカルボン酸基の負電荷を安定化させるのを助けて、通常のトリクロロ酢酸(TCA)を用いるのと同じように5’-O-DMT基（図2）を効果的に脱保護する酸を与える。一般に、O2SOR、NO2、ハロゲン、C(=O)R(R=アリール、アルキル、およびそれらの置換誘導体、またはXR1(X=S、O、N; R1=アリール、アルキル、およびそれらの置換誘導体)のような電子求引性基は対応する酸の強度を高める。OR(R=アリール、アルキル、およびそれらの置換誘導体)のような電子供与性基は対応する酸の強度を低下させる。異なる強度の酸が利用できることで、ある範囲の酸触媒性脱保護反応に対する試薬のレパートリーが提供される。
【００４１】
本発明の範囲内にある光-塩基前駆体には照射下でPGBを生成する化合物のいずれもが含まれる。かかる化合物の例としては、表1に挙げたo-ベンゾカルバミン酸塩、ベンゾイニルカルバミン酸塩、ニトロベンジルオキシアミン誘導体などが挙げられる。一般に、光不安定基によって保護されたアミノ基を含む化合物は、定量的な収量でアミンを放出することができる。これらの反応の光生成物、すなわちin situで生成されたアミン化合物は、本発明においてそれ以後の反応に有用な塩基性試薬である。
【００４２】
本発明の範囲内にある光試薬前駆体には、照射下での化学／生化学反応によって必要な試薬を生成する化合物のいずれもが含まれる。かかる化合物の例としては、1-(ジメトキシルベンゾイニル)テトラゾール（複素環式化合物テトラゾールはPGRである）、ジメトキシルベンゾイニルOR1(R1OHはPGR、R1=アルキル、アリール、およびそれらの置換誘導体)、スルホニウム塩（チオールエーテルAr2SはPGR）などが挙げられる。
【００４３】
本発明の範囲内にある光増感剤には、照射感受性があり、その励起波長のシフトおよび照射効率の向上によってPGRの励起プロフィールを改良し得る化合物のいずれもが含まれる。かかる化合物の例としては、ベンゾフェノン、アントラセン、チオキサントン、それらの誘導体（表1B）、などが挙げられる。
【００４４】
PGRの別の応用
本発明の1つの実施形態では、光生成試薬（表1）を、t-Boc（酸不安定性）またはFmoc(塩基不安定性)基によって保護された反応性官能基を含むアミノ酸単量体を用いてペプチドアレイのチップ上での並行合成に使用する(図4)。ペプチド合成法はSterwartおよびYoung, “Solid phase peptide synthesis”, Pierce Chemical Co.; Rockford, IL. (1984); Merrifield, Science 232, 341-347 (1986); Pirrungら, 米国特許第5,143,854号 (1992)で知られている。本発明の1つの実施形態によれば、ペプチド配列アレイが合成されることになる支持体表面にリンカー分子を結合させる。それぞれのリンカー分子は酸に不安定なt-Boc基によって保護された-NH2基のような反応性官能基を含んでいる(500)。次に、光-酸前駆体、または光-酸前駆体およびその光増感剤を支持体に塗布する。次いで所定の光パターンを支持体表面に投射する(505)。照射された部位では酸が生成し、t-Bocのような酸に不安定な保護基がN末端NH2から開裂し、それによって入ってくる単量体と反応することが可能になる(図4)。暗部位では酸は生成せず、それゆえリンカー分子の酸に不安定な保護基はそのまま残っている。次いで支持体表面を洗浄し、続いて第1の単量体（保護されたアミノ酸、その類似体、またはオリゴマー）を供給すると、該単量体は通常のカップリング反応条件下で脱保護されたリンカー分子にのみ付加する(510)。従って化学結合がリンカー分子のNH2基と単量体のカルボニル炭素との間に形成されてアミド結合を与える。適当な洗浄工程の後に第1の残基の付加が完全なものになる。結合したアミノ酸単量体もまた酸に不安定なt-Boc基によって保護された反応性官能基を含んでいる。次いで伸長中の配列のアレイを含む支持体に第2のバッチの光-酸前駆体を供給し、所定の第２の光パターンに曝す(515)。選択した配列を脱保護して支持体を洗浄し、続いて第2の単量体を供給する。ここでも第2の単量体は露光した表面部位でのみ伸長する。伸長中の鎖に付加した第2の残基もまた酸に不安定な基によって保護された反応性官能基を含んでいる(520)。この鎖伸長工程を所望の長さおよび化学配列をもつ重合体が選択された表面部位全体に形成されるまで繰り返す(525)。任意の指定された配列パターンをもつペプチドアレイを含むチップについては、反応工程の最大数は20 x nである（ここでnは鎖長であり、20は定数であって天然に存在するアミノ酸数である）。修飾アミノ酸を含むアレイは20 x nより多い工程を必要とし得る。
【００４５】
本発明のもう１つの好ましい実施形態では(図6)、光不安定基によって保護されたアミンのような光-塩基前駆体を、リンカーを載せた固体表面に塗布する(600)。それぞれのリンカー分子は塩基に不安定な基によって保護されたNH2のような反応性官能基を含んでいる。次に(((2-ニトロベンジル)オキシ)カルボニル)-ピペリジン(CameronおよびFrechet, J. Am. Chem. Soc. 113, 4303-4313 (1991))8のような光-塩基前駆体を支持体に塗布する。次いで所定の光パターンを支持体表面に投射する(605)。照射された部位では塩基が生成し、その結果リンカー分子から塩基に不安定な保護基の開裂が生じ、末端NH2基が入ってくる単量体と反応することができる。暗部位では塩基は生成せず、それゆえリンカー分子の塩基に不安定な保護基はそのまま残っている。次いで支持体表面を洗浄し、続いてカルボン酸基を含む第1の単量体を供給すると、それは通常のカップリング反応条件下で脱保護されたリンカー分子にのみ付加してアミド結合を与える(610)。適当な洗浄の後に第1の残基の付加は完全なものになる。結合したアミノ酸単量体もまた塩基に不安定な基によって保護された末端反応性官能基を含んでいる。次いで伸長中の配列のアレイを含む支持体に第2のバッチの光-塩基前駆体を供給し、所定の第２の光パターンに曝す(615)。選択した配列を脱保護して支持体を洗浄し、続いて第2の単量体を供給する。ここでも第2の単量体は露光した表面部位でのみ伸長する。伸長中の配列に付加した第2の残基もまた塩基に不安定な基によって保護された末端反応性官能基を含んでいる(620)。この鎖伸長工程を、所望の長さおよび所望の化学配列をもつ重合体が選択された表面部位全体に形成されるまで繰り返す(625)。
【００４６】
本発明はオリゴヌクレオチドおよびペプチドのアレイの並行合成に限定されるものではない。この方法は、鎖伸長合成のそれぞれの工程で複雑な合成様式が必要とされる、分子アレイの固相合成において一般的に使用されるものである。1つの特定の例は多様な炭化水素ユニットおよび分枝鎖の配列を含むオリゴ糖類アレイの合成である(図7)。本発明によれば、光-酸前駆体を保護された炭化水素を含む固体表面に塗布する。それぞれの炭化水素分子はいくつかの反応性OH基を含み、そのそれぞれは保護基によって保護されている。これらの保護基のそれぞれは異なる脱保護条件を必要とする。次いで所定の光パターンを支持体表面に投射する。照射された部位では酸が生成し、一連の特定の条件下で不安定な保護基が開裂する。脱保護されたOH基は入ってくる分子と反応することができる。暗部位では酸は生成せず、それゆえ炭化水素分子の酸に不安定な保護基はそのまま残っている。次いで支持体表面を洗浄し、続いて単量体(炭化水素またはオリゴ糖類)を供給すると、単量体は通常の反応条件下で、脱保護されたOHにのみ付加してグリコシド結合を与える。Wongら, J. Am. Chem. Soc. 120, 7137-7138 (1998)。これらの工程を繰り返すと最初に脱保護されたOH位に種々のグリコシド結合を含むオリゴ糖類が得られる。次に光-塩基前駆体を支持体に塗布する。次いで所定の第2の光パターンを支持体表面に2回目の投射をする。照射された部位では塩基が生成し、この条件下で不安定な保護基が開裂する。第2のバッチの脱保護されたOH基は入ってくる分子と反応することができる。暗部位では塩基は生成せず、それゆえ炭化水素分子の塩基に不安定な保護基はそのまま残っている。次いで支持体表面を洗浄し、続いて第2の単量体を供給すると、それは通常の反応条件下で2回目の第2の脱保護されたOHにのみ付加してグリコシド結合を与える。これらの工程を繰り返すと第2の脱保護されたOH位に種々のグリコシド結合を含むオリゴ糖類が得られる。分枝したオリゴ糖類が形成される。さらに継続した合成において種々のPGRを用いて所望のオリゴ糖類アレイが合成されるまでOH保護基の選択的脱保護を達成する。
【００４７】
本発明は、単に脱保護反応だけでなくより多くの場合において、光生成試薬を使用することにより十分に発達した従来化学の方法を変えることなく、所定の様式に従い選択的反応を達成することができる。さらに本発明は脱保護反応に限定されるのものではなく、アルコール(ROH、R=アルキル、アリールおよびそれらの置換誘導体)のような光生成反応性化合物を、エステル化、求核置換および脱離反応のような種々の化学変換用の試薬として用いることができる。これらの反応はカスタムメイドのMMAチップを製作するための重要な工程である。
【００４８】
合成装置
図8A〜8Cは本発明のプログラム可能な光制御合成装置の3つの実施形態を示している。図8Aに示すように、装置は4つの部分：試薬マニホールド812、光学系、反応器アセンブリ、およびコンピュータ814からなる。
【００４９】
試薬マニホールド
図8Aの試薬マニホールド812は標準試薬の計量、供給、循環、および廃棄を行う。それは試薬容器、電磁弁または空気弁、計量弁、チューブ材料、および工程制御装置からなる（図8Aでは示していない）。また試薬マニホールド812には溶媒／溶液の輸送およびラインパージ用の不活性ガス処理系も含まれている。かかるマニホールドの設計および構築は流体および／または気体処理の当業者には周知である。多くの場合において、市販のDNA/RNA、ペプチド、およびその他のタイプの合成装置を、本発明の試薬マニホールド812として使用することができる。
【００５０】
光学系
図8Aに示されている光学系の機能は、支持体表面810a上の所定の位置で光化学反応を開始させるためのパターン化光線または光パターン807cを発生させることである。図8Aに示されている光学系は光源802、1以上のフィルター803、1以上のコンデンサーレンズ804、レフレクター805、デジタルマイクロミラー装置(DMD)801、および映写レンズ806からなる。操作の際に光線807aは光源802によって発生し、フィルター803を透過して所望の波長をもつ光線807bになる。コンデンサーレンズ804およびレフレクター805を用いて光線807bをDMD801上に向ける。映写レンズ806によって、DMDは光パターン807cを反応器810の支持体表面810a上に投射する。DMD801についての詳細は後に記載する。
【００５１】
光源802は、水銀ランプ、キセノンランプ、ハロゲンランプ、レーザーおよび発光ダイオード、または他のいずれかの適当な発光体のような広範囲の発光装置から選択できる。光源802の波長は当該光化学反応の励起波長の範囲にわたるかまたはその中に含まれるべきである。当該光化学反応のほとんどに好ましい波長は280nm〜500nmである。光源802の動力は妥当な時間内に反応器810の中で当該光化学反応を完了させるに十分な強さの光パターン807cを発生させるために十分でなければならない。ほとんどの使用では支持体表面810aの位置での好ましい光度は0.1〜100mW/cm2である。多くの使用のためにはその広い波長および種々の動力の利用可能性により水銀ランプが好ましい。
【００５２】
フィルター803の選択基準は、当該光化学反応の励起波長およびその他の考慮すべき事項に基づく。例えば、反応器810中での望まない光分解反応および加熱を避けるために光線807aから望ましくない短いおよび長い波長を取り除くことが多くの場合望ましい。例えば、オリゴヌクレオチドおよびその他の生物関連分子の合成においては340nmより短い波長を取り除くことが好ましい。加熱を避けるために、赤外線遮断フィルターを用いて700nmを超える波長を取り除くことが好ましい。したがって２以上のフィルターを必要とし得る。
【００５３】
図8Aに示されている光学系中の基本構成要素はデジタルマイクロミラー装置801であり、これは光パターン807bを発生させるために使用される。DMDは電子制御されたディスプレー装置であり、コンピュータモニターと同様の方法でグラフィック像およびテキスト像を表示することができる。この装置は映写ディスプレー装置として、Texas Instruments Inc., Dallas, Texas USAから市販されている(Hornbeck, L. J., “Digital light processing and MEMS, reflecting the digital display needs of the networked society,” SPIE Europe Proceedings, 2783, 135-145 (1996))。各DMD 801は複数の小型で、かつ個々に制御可能な揺動鏡801aを含んでおり、それは光線を操作して像または光パターン807cを発生させる。
【００５４】
DMD 801はいくつかの理由により本発明において光パターンを発生させるのに好ましい手段である。第1に、それは当該光化学反応を開始させるために必要である比較的短い波長の取り扱いが可能である。第2に、この装置は高い光学効率を有している。第3に、それは高いコントラスト比をもつ光パターンを発生させることが可能である。さらに高解像度型(1920x1080まで)の装置が実証されてきた。これらの特長によって、本発明に記載されている光化学を用いることにより実用上所望される任意の分子配列アレイを合成するための光学パターンを都合よく発生させることが可能となる。この態様において、本発明の装置はフォトマスクを用いて配列アレイを作製する先行技術の方法と比べ、非常に柔軟性がある。
【００５５】
光パターンの発生のために、その他の型の電子制御されたディスプレー装置を用いてもよい。図8Bは反射液晶アレイディスプレー(LCD)装置821を用いる本発明の典型的な実施形態を示している。反射LCD装置はDisplaytech, Inc., Longmont, Colorado USAのような多くの会社から市販されている。各反射LCD装置821は、画像または光パターンを発生させるために、各レフレクターの前に液晶シャッター821aが置かれた複数の小型レフレクター(示されていない)を含んでいる。最高1280X1024の高解像度装置はすでにDisplaytechから入手可能である。図8Bに示されている光学系は、ディスプレー装置へ光を向ける光学装置を除いて図8Aの装置と同様である。光線スプリッター825は、平坦な反射鏡上で効率的に光を一緒にしてそこから出すために、図8Bに示されている光学系において用いられる。
【００５６】
本発明のもう１つの実施形態では、透過LCDディスプレー841を用いて、図8Cに示されているように光パターンを発生させる。透過LCDディスプレー841には、図8Cで短い横棒として示されている複数の液晶光弁841aが含まれている。液晶光弁841aをオンにすると光が通過し、液晶光弁をオフにすると光は遮断される。それゆえ、通常のフォトマスクを標準フォトリソグラフィー方法で用いるのと同じように透過LCDディスプレーを用いることが可能である(L. F. Thompsonら, “Introduction to Microlithography”, American Chemical Society, Washington, DC (1994))。図8Cではレフレクター845を用いて光線847bを透過LCDディスプレー841に向けている。
【００５７】
DMD、反射LCD、および透過LCDを含む多くの市販のディスプレー装置は可視光(400nm〜700nm)を取り扱うように設計されている。それゆえこれらの市販のディスプレー装置を用いると、光試薬前駆体の励起波長が400nm〜700nmである場合には本発明のプログラム可能な光制御合成装置の最良の操作様式が達成される。しかしながら、本発明の機器および方法の使用は前記波長の範囲を超えて拡張される。
【００５８】
図8A〜8Cは一度に1つのアレイチップを作製するための装置設計を示している。本発明はまた複数のチップを作製する装置も包含する。図12は本発明の合成装置の処理量および効率を上げるための機械的／光学的ステッピング機構を模式的に示している。このステッピング機構において、光線1204aはディスプレー装置から投射され（図では示されていない）、映写レンズ1202を通過し、それをレフレクター1203によって反応器1201aの方に向けて像または光パターン1204bを形成させる。レフレクター1203は光パターン1204bをいくつかある周囲の反応器1201a〜1201fのいずれか1つに向けることができる回転機構を有している。例えばオリゴヌクレオチドの通常の合成方法では、光化学脱保護反応工程の間だけ光パターン1204bを特定の反応器、例えば1201aの方に向ける。次いで反応器1201aがフラッシング、カップリング、キャッピングなどのような残りの合成工程を行っている間に光パターン1204bを他の反応器に向ける。
【００５９】
他のステッピング機構も本発明で用いてもよい。例えば、半導体のフォトリソグラフィーに常用されているステップ-リピート露光スキームを使用してもよい。ステップ-リピートフォトリソグラフィーの一般的な記載はL. F. Thompson らのIntroduction to Microlithography, American Chemical Society, Washington, DC (1994)に見られる。このスキームでは、複数の反応ウェルアレイを含む大型の支持体を使用する。この支持体をx-y平行移動台に取り付ける。各工程において1回の光学暴露が1つまたはいくつかのアレイに及ぶ。次いで支持体を次の位置に移動させて別の光学暴露を行う。この工程を全ての反応ウェルアレイが露光するまで繰り返す。
【００６０】
本発明は、電子制御ディスプレー装置をフォトリソグラフィーパターンを発生させる手段として使用することに限定されるものではない。型押しクロムまたは他の適当なフィルムで被覆したガラスプレートから作製された通常のフォトマスクを同様に使用してもよい。この場合には、図8Cに示されている透過LCDディスプレー841を通常のフォトマスクと置き換えているが、残りの装置はそのままである。通常のフォトマスクの使用は同一生成物の大量生産には好ましい。通常のフォトマスクは多数のアレイパターンを含んでいるため、多数の分子アレイを並行合成することが可能である。しかしながら、種々の異なるアレイ生成物を小バッチで作製するには電子制御ディスプレー装置を使用することがその柔軟性によりずっと好ましい。
【００６１】
反応器配置
前節に記載されるように、本発明に関連する光生成試薬(Photogenerated reagent)は溶液相にある。試薬を用いてアレイのような空間的に規定される型を生成する場合、適正に計測をするには個々のエレメントを空間的に分離させればよい。図9Aないし9Cでは本発明の分離機構の3つの好ましい実施形態を模式的に示している。9Aに示された実施形態では、透明支持体901およびキャップ902で反応槽または反応器を形成し、これに1以上の光試薬(photo-reagent)前駆体を含む溶液を充填する。遮断壁903で結ばれる反応ウェルをキャップ902上に型押しする。キャップ902は反応に関連するあらゆる化学薬品に対して不活性なプラスチックまたはエラストマー材料で作製することが好ましい。光分解反応が起こる前に、キャップ902で支持体901を押して、遮断壁903と支持体を接触させ、個々の反応ウェルを分離させる。次いで図9Aの工程3に示されるように、選択された多くの反応ウェル904aおよび904cへ光線を映写する。光分解および他の光試薬誘導反応が露光反応ウェル904aおよび904cで起こるが、未露光反応ウェル904bでは光活性化反応は起こらない。正確に構築され、作動する場合、記載される分離機構により個々の反応ウェル間の試薬の拡散が妨げられる。さらに隣接した反応ウェル904aおよび904c間の空間を緩衝領域904dに提供することで、さらに反応ウェル間のいずれの内部混合をも妨げられる。
【００６２】
図9Aに示されるように、緩衝領域904dは個々の反応ウェル間の干渉を防ぐ付加的な機構のための空間を提供する。図10では三次元透視図において本発明の反応ウェルについての詳細な構造を示している。この図では緩衝領域（図10では1006と表示）が全体を相互連結していることを示している。この相互連結構造により、全ての反応ウェルを閉じている間に、適当な溶液で緩衝領域を洗い流すことが可能となる。好ましい実施形態では、光分解および光試薬誘導反応完了後およびキャップ902を上げる前に、露光反応ウェル904aおよび904c内で光試薬誘導化学反応をクエンチするか、または光生成試薬を中和するいずれかの溶液で緩衝領域904dを洗い流す。従って、キャップ902を上げた後、他の領域で露光反応ウェル904aおよび904cからの過剰な光生成試薬による望ましくない化学反応は起こらないであろう。光生成酸を中和するには、CH2Cl2中のピリジンなどの弱塩基性溶液を用いればよい。ヌクレオチド結合反応をクエンチするには、アセトニトリルまたは他の適当な溶媒を用いてよい。
【００６３】
図9Bでは本発明の分離機構についてのもう1つの実施形態を示している。この実施形態では、反応ウェル構造または反応ウェル遮断壁913が透明支持体911上に構築され、キャップ912が平坦な内面を有している。支持体911はガラス製であることが好ましい。キャップ912は反応に関連するあらゆる化学薬品に対して不活性なプラスチックまたはエラストマー材料で作製することが好ましい。密封機構および好ましい作動モードは、9Aに示される実施形態に関して先に記載されたものと同様である。
【００６４】
図9Cでは本発明の分離機構についての第3の実施形態を示している。この実施形態では、１パターンの透明支持体931の表面上を非湿潤フイルム933で覆う。作動中、反応器をまず溶液934で充填する。次いで溶液が非湿潤フイルム933ではなく、支持体931表面上を湿らせるため、溶液934を反応器から排出し、支持体931表面上に液体粒子を形成させる。液体粒子を互いに分離させる。次いで所定の液体粒子934aおよび934cへ光線935を発射して、光分解および他の光試薬誘導反応を開始する。この実施形態では密封機構の必要性を排除し、大型の支持体を用いる大規模バイオチップの生産に好適である。液体を閉じ込める非湿潤フイルムの使用は当技術分野では十分に公知であり、インクジェット式印刷法を用いるDNAオリゴマーの合成についての米国特許第5,474,596号のThomas M. Brennanにより記載されている。
【００６５】
本発明の反応器は、図10に示されるカートリッジ型に集成することが好ましい。図に示される設計では図9Bに示される分離機構を使用する。図9Aおよび図9Cに示されるもののような他の分離機構を容易に同様のカートリッジ型とすることができる。図10に示されるように各カートリッジには透明支持体1001が含まれており、これはガラスまたは好適な化学的および光学的特性をもつ重合物質からなってよい。支持体上部には独立した反応ウェル1004のアレイを形成する複数の開口部を有する遮断層1003がある。原則的には、反応ウェルはいずれの適当な形態およびサイズであってよい。円形および方形ウェルが好ましい。ウェルが直径10ないし1,000μmおよび深さ5ないし100μmをもつ円形であることが最も好ましい。例えば、特殊な設計では、円形反応ウェルは直径140μmおよび深さ20μmであり、中心間距離200μmを均等に有する直交配列として配置される。この設計に関しては、2,500反応ウェルが1平方センチメートルの面積に納まっている。固定された隣接分子間の平均距離が20Å(オングストローム)であると仮定すれば、各反応ウェルでは約6.4fmol分子が合成されると考えられる。十分な容量が反応に必要であるという場合には、反応ウェルの容量は約300ピコリットルである。遮蔽層1003は個々の反応ウェルを互いに光学的に分離させために、金属または黒くした重合体のような不透明材料で作製する。3番目の層は反応器キャップ1002である。キャップ1002は3つの機能：反応器封入、試薬連絡／分配および反応ウェル分離、を有している。キャップ1002は軟質、かつ関連する合成工程に必要な化学薬品／溶媒に耐性ある重合物質で作製することが好ましい。この物質は、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン−ポリプロピレン共重合体を含む重合体、フッ素化重合体、および様々な他の適当なものの群から選択してよい。試薬入口1012および出口1013は反応器の2つの相対する末端に配置されている。枝分かれチャンネル1011により、試薬を反応器中で均等に分配を行わせる。キャップの中心部分はパッド1015であり、これを押し下げることで下部で反応ウェル1004を密閉できる。反応器の直前に機械作動器（図10では示されていないが、図8Aないし8Cでは811、831およ
び851で示されている）があり、これは例えばソレノイド、または空気圧のいずれかで作動し得る。作動器は反応器キャップのパッドを押して全ての反応ウェルを密閉するか、または収縮して全ての反応ウェルを開くかのいずれかが可能である。この操作は図9Aおよび9Bで示される密封機構を調整しようとするものである。図10の挿入図は密封を容易にする押出リム1005を含む反応ウェル構造の拡大図を示している。図10では示されていないが、反応器支持体には本発明の光学的リソグラフィー系において反応器の整合を可能にする整合マークが含まれている。
【００６６】
図10で示される反応器カートリッジは通常の化学および生化学実験室環境での使用には最適である。カートリッジの閉鎖構造により環境からの化学薬品および粒子汚染を防ぐ。最良で一貫した結果をもたらすために、カートリッジは制御された環境において製造し、カートリッジ内部の化学的保全性を確実にすることが好ましい。次いでカートリッジをArなどの不活性ガスで満たし、反応器の入口および出口をふさぐことで密閉する。さらにカートリッジを保管し、および／または使用者実験室へ輸送することが可能である。
【００６７】
反応器の作製
本発明の反応器（図9Aないし9Cおよび10）を、フォトリソグラフィー、薄膜付着、電気メッキ、および成形のような種々の十分に公知なマイクロ製作工程を用いて製作することが可能である(M. Madou, Fundamentals of Microfabrication, CRC Press, New York, (1997))。これらの手法は多くのマイクロ流体工学装置、電気機械装置、化学センサー、および光学的マイクロ装置の作製に広く用いられている。例えば、図10で示される反応ウェル構造を、ガラス支持体を好適な金属フィルムで電気メッキすることで製作してもよい。この記載の最後に実施例を与え、関連する製作工程を例示している。またガラス支持体上の反応ウェル構造は、多くのマイクロ流体工学装置の作製に広く用いられてきた化学エッチングを用いて製作してもよい(Peter C. Simpson et al. Proc. Natl. Acad. Sci., 95: 2256-2261(1998))。
【００６８】
図10で示される反応器キャップ1002は精密成形工程を用いて製作してよい。かかる工程はプラスチック製作産業において広く利用可能である。用いる重合物質は露光中の光の反射および散乱を最小にする黒色であることが好ましい。溶接および接着法を用いて、プラスチックキャップ1002および支持体1001を組み込まれたカートリッジに集成してもよい。
【００６９】
ガラスおよび他の支持体上の非湿潤フィルム型の作製は多くの分野で十分に公知な技術である(Uthara Srinivasanら, Proc. IEEE Solid-State Sensors and Actuators, June 1991, 1399-1402)。このフィルムは通常、自己集合分子の単層(SAM)またはテフロンなどの低表面エネルギー物質の重合薄膜により作製される。最も頻用されるガラス支持体上のSAMには様々な炭化水素アルキルシランおよびオクタデシルトリクロロシランおよび1H,1H,2H,2H-ペルフルオロデシルトリクロロシランのようなフルオロアルキルシランが挙げられる。型押工程にはフォトレジストおよびフォトリソグラフィーの使用が含まれる。この記載の最後にある実施例VIIにより詳細な型押手法が提供される。スクリーン印刷法を用いて、テフロンなどの重合薄膜をガラスおよびプラスチック表面に型押ししてもよい。スクリーン印刷法は印刷産業および電子工業分野で十分に公知な技術である。マイクロ製作を使用するためのスクリーン印刷の一般的手法はFundamentals of Microfabrication, CRC Press, New York, (1997)のM. Madou,により記載されている。さらに疎水性プリントスライドはEric Scientific Company, Portsmouth, New Hampshire USAなどの販売元から市販されている。非湿潤フイルムを型押しした支持体を用いる場合、図8Aないし8Cおよび図10に示される反応ウェル密封機構がもはや必要でないため、反応器配置を簡易にしてもよい。
【００７０】
装置の制御
図8Aに例示される本発明の合成装置は、DMD801、反応器810の密封作動器811および試薬マニホールド812の機能を調整するコンピューター814により制御される。オリゴヌクレオチドを合成する場合、ほとんどの合成工程中、合成装置は通常の合成装置として作動し、コンピューター814が試薬マニホールド812を制御して、様々な試薬を反応器810へ供給する。光制御脱保護工程では試薬マニホールド812により光酸前駆体を反応器810へ送達する。コンピューター814により密封作動器811を作動させて反応ウェルを分離し、次いでデータをDMD801に送信して光パターン807cを反応器810へ投影する。光反応の完了時に、光パターン807c を切り、クエンチ溶液を反応器810へ送達し、密封作動器811を上げて、合成制御系により通常の合成工程を再開する。
【００７１】
変形および変更
本発明についての多くの変形および応用が可能である。図11Aでは反応ウェル構造の変形を例示している。マスク層1103を反応ウェルの底に加える。全体で反応ウェル表面積の10分の1ないし2分の1を占める1以上の開口部を、通過する光1104用のマスク上に作製する。マスク層1103はCrのような薄く、かつ耐薬品性の金属フイルムで作製されることが好ましい。金属フイルムの上部にSiO2フイルム（示さず）を付着させて、リンカー分子の固定化を容易にする。反応ウェル設計より光化学反応と光生成試薬誘導化学反応との空間的分離が可能になる。図11Aでは光酸誘導化学反応を例示している。露光状態において、開放面で光酸前駆体からプロトンH+を生成する。次いでプロトンをウェルの周囲部分に拡散させ、固定化オリゴマー分子1106上の酸に不安定な保護基Paを開裂する。この配置は、光生成ラジカル中間体とオリゴマーとの接触を最小限にし、従ってラジカル中間体が存在するために起こるであろう、望ましくない副反応を抑制する助けとなる。
【００７２】
図11Bでは反応ウェル構造および露光戦略のもう1つの変形を例示している。またこの実施形態では、ラジカル中間体による望ましくない副反応の可能性を小さくするよう設計されている。反応ウェル表面の1部分だけを光1114に暴露させる。その結果として、他の部分での望ましくない副反応の機会が減少する。
【００７３】
本発明の化学的方法および装置（図8Aないし8C）の使用は、分子アレイの製作の範囲を超えて拡張される。例えば、図8Aに示されるDMD801を用いる装置を、化学および生化学反応を研究するための汎用アッセイ装置として用いてもよい。デジタルマイクロミラー装置801は、正確かつ同時に反応器810の個々の反応ウェル全ての光線量を制御する。この態様により、全ての反応ウェルにおける光生成試薬の生成を精密に制御でき、それゆえに大規模、並行アッセイを行うことが可能になる。
【００７４】
前記教示の観点から、本発明についての多くの改良および変形が可能なことが明らかである。従って特に断りのない限り、本発明は添付の請求項の範囲内で実施され得ることことが理解される。
【００７５】
以下、本発明を下記の実施例により説明するが、これは例示のためのものであって、本発明を限定するものではない。当業者には、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、以下の実施例の変形がなされることが理解されよう。
【００７６】
実施例I
光酸生成(Photo-acid generation)
本試験では光照射時間の関数としてのH2Oシグナルの化学シフト値の増加によってモニターするPGAの光照射下でのH+の効率よい生成を例示する。
【００７７】
0.5mL CD2Cl2中のスルホニウム塩（プロピレンカーボネート中、50%ヘキサフルオロリン酸トリアリールスルホニウムの0.4%, Secant Chemicals, Boston, MA）を含む６サンプルを核磁気共鳴(NMR)管に入れた。これらのサンプルの参照1次元(1D)スペクトルを、当業者に十分に公知な方法を用いて記録した(600MHz NMR 分光計, Bruker, Karlsruhe, Germany)。次いでサンプルの1つを平行光源(22mW, Oriel, Stanford, CA)を用い、規定時間、365nmで照射し（図13）、照射後、直ちに1D NMRスペクトルを記録した。次いで2番目のサンプルを2番目の規定時間、365nmで照射し（図13）、照射後、直ちに1D NMRスペクトルを記録した。準備したサンプル各々について、これらの試験を繰り返した。各NMRスペクトルに対し、H2Oの化学シフトを測定した。無光下では、H2Oシグナルは1.53ppmで見られた。照射下では、H+の生成によってこのシグナルが高ppm値（下位フィールドがシフト）へ移動した。
【００７８】
図13ではH2Oシグナルの化学シフトの変化と照射時間の相関をプロットする。使用した条件下でのH+の形成は一次動力学関係に従い、誘導されたH+の形成についての見掛けの速度定数は1.3x10-2±0.06s-1である。
【００７９】
実施例II
PGAを用いるヌクレオシド単量体の脱保護
これらの試験ではPGAを用いるヌクレオシドの5’-OH上でのDMT基の効率よい脱保護を例示する。
【００８０】
特殊多孔質ガラス(CPG)0.2μmolに結合させたDMT-Gを0.5mL CH2Cl2中のスルホニウム塩（プロピレンカーボネート中、50%ヘキサフルオロリン酸トリアリールスルホニウムの0.4%, Secant Chemicals, Boston, MA）に加えた2サンプルを準備した。一方のサンプルをUVランプ(UVGL-25、0.72mW)を用いて365nmで2分間照射し、他方のサンプルを対照として照射しなかった。照射完了時にCPGをCH2Cl2およびCH3CNで洗浄し、次いで濃NH4OH水溶液(1mL)により55℃で2時間処理した。溶液は便宜に真空蒸発させた。バッファー溶液(0.1M酢酸トリエチルアンモニウム(TEAA)、CH3CN中15%)をCPGサンプルに加え、得られた溶液をC18逆相(10μm、μ−bondapak、Waters)HPLCカラムに注入した。CH3CN中の1M TEAAの勾配を用いてサンプルを溶出させた。DMT-dGおよびdGの標準サンプルを参照として用い、PGAにより脱保護されたdGおよび標準dGの同時注入によりPGA反応の結果を確認する。図14Aの1400および1410ではDMT-GおよびPGAにより脱保護されたdGのHPLCプロフィールを示している。
【００８１】
同様の手法をDMT-dC、DMT-dG、DMT-dAおよびDMT-rUについても行った。図14Bの1420および1430ではDMT-rUおよびPGAにより脱保護されたrUのHPLCプロフィールを示している。
【００８２】
また2,1,4-ジアゾナフトキノンスルホン酸トリエステル、ヘキサフルオロリン酸トリアリールスルホニウムならびにヘキサフルオロリン酸(Secant Chemicals, Boston, MA）、およびペルハロゲン化トリアジン(Midori Kagaku)のような他の光酸前駆体もこれらの脱保護反応に用いた。DMT基の完全な脱保護はこれらの光酸前駆体を用いて達成された。
【００８３】
実施例III
予め活性化したPGAを用いるヌクレオシド単量体の脱保護
本試験ではPGA前駆体の予備活性化がPGAを用いる脱保護における副反応の有効な低減方法であることを示すものである。酸性条件下におけるヌクレオチドのグリコシド結合の切断による脱プリン化は公知の問題である。反応の開始時にH+量を高めるのに時間を要するため、脱保護についてのPGAの使用にはこの問題が悪化する。次の試験は、予め活性化したPGAを用いることでこの問題が多少とも解消し得ることを示すものである。
【００８４】
本試験に使用したサンプルおよび試験条件は、CPG結合DMT-ヌクレオシドを加える前に、まずPGA溶液（プロピレンカーボネート中、50%ヘキサフルオロアンチモン酸トリアリールスルホニウムの0.4%）を365nmで2分間照射することを除き、実施例IIに記載したとおりであった。
【００８５】
365nmで2分間の予備照射(UVGL-25、0.72mW)はPGA溶液（プロピレンカーボネート中、50%ヘキサフルオロアンチモン酸トリアリールスルホニウムの0.4%）を用いて行った。次いで照射した溶液を粉末DMT-dA（約1μmol）に加えた。この溶液をさらに2分間インキュベートした。1D NMRスペクトルを、当業者に十分に公知な方法を用いて記録した。DMT-dA（1μmol）の別のサンプルをPGA溶液（プロピレンカーボネート中、50%ヘキサフルオロアンチモン酸トリアリールスルホニウムの0.4%）と混合し、混合物を365nmで2分間照射(UVGL-25、0.72mW)した。1D NMRスペクトルを記録した。脱プリン化によってdAシグナルが徐々に消失することとなる。これらの試験で記録された2つのNMRスペクトルの比較により、予め活性化したPGAを用いる反応では副反応が少ないことが示される。
【００８６】
実施例IV
PGAを用いるオリゴヌクレオチド合成
これらの試験ではPGAを用いるCPG支持体上でのオリゴヌクレオチドの効率よい合成を例示する。様々な配列(A,C,GおよびT)および鎖長(n=2-8) をもつオリゴヌクレオチドを、光酸前駆体を用いてPerspective合成装置(Perspective Biosystems, Framingham, MA)で合成した。
【００８７】
DMT-TTTT(図15の1510)の合成は、表2のプロトコールに従い、0.2μmlスケールで行った。これは工程2に若干の改変があるが、通常のホスホルアミダイト合成を直接採用するものである。この工程ではPGA（プロピレンカーボネート中、50%ヘキサフルオロリン酸トリアリールスルホニウムの0.4%）を加え、反応カラムを365nm光で2分間照射した。光脱保護反応後、カラムを溶媒で広く洗浄した。合成の完了時に配列をCPGから切断し、濃NH4OHを用いて脱保護した。サンプルを、CH3CN中のTEAA勾配を用いるC18逆相HPLCを使用して試験した。PGAを用いて合成したDMT-TTTT粗生成物のHPLCプロフィールを示している(図15Aの1510)。図15の1500では通常のTCA脱保護化学を用いるDMT-TTTTを示している。図15Bの1520および1530ではPGAアプローチを用いて合成した粗オクタヌクレオチドのHPLCプロフィールを示している。
【００８８】
【表２】
0004503828.tif 000011
0004503828.tif 000012
0004503828.tif 000013
【００８９】
実施例V
PGAを用いるアミノ酸脱保護およびペプチド合成
これらの試験ではペプチド合成における、PGAを用いるアミノ保護基の効率よい脱保護を例示する。
【００９０】
t-Boc-Tyrを含むHMBA樹脂(Nova Biochem, La Jolla, CA)のサンプル10mgを使用した。脱保護はPGA溶液（プロピレンカーボネート中、50%ヘキサフルオロアンチモン酸トリアリールスルホニウムの10%）を含むCH2Cl2溶液中、同溶液を365nmで15分間照射して行った。この反応物をさらに15分間インキュベートし、樹脂をCH2Cl2溶液で洗浄した。ニンヒドリン試験変色試験を用いて、可能性ある残留アミノ基の存在を検出した結果、検出されなかった。次いで樹脂を洗浄し、アミノ酸をNaOH(CH3OH中0.1M)を用いて樹脂から切断した。図16の1610ではPGAにより脱保護されたTyrのHPLCプロフィールを示している。図16の1600では通常のトリフルオロ酢酸(TCA)脱保護を用いて得られるTyrのHPLCプロフィールを示している。
【００９１】
ペンタペプチド、Leu-Phe-Gly-Gly-Tyrの合成をMerrifield樹脂100mgを用いて行った。t-Boc基のPGA脱保護を行い、樹脂を、ニンヒドリンを用いて変色が無くなるまで試験した。当業者に十分に公知な条件を用い、カップリング反応を行った。五量体の合成が完了するまで、PGA脱保護およびカップリング反応を繰り返した。この配列を樹脂から切断し、そのHPLCを通常のペプチド化学を用いて合成した同配列のものと十分に比較した。
【００９２】
実施例VI
マイクロウェルの製作
本実施例では本発明の製法を用いるマイクロウェルの成形を示す。図17Aでは使用した製作工程を模式的に示している。第1の製作工程ではCr/Cu 200/1000A(オングストローム)厚の薄いバイメタルフィルム1702をガラス支持体1701上でスパッターエバポレーターにより蒸発させた。バイメタルフィルム1702 Crはガラス表面に対し優れた付着性を与え、Cuは後の電気メッキにおける優れた支持体を提供する。次いで表面を18μm厚のポジフォトレジスト1703でスピンコートした。さらにフォトレジストフィルム1703をフォトリソグラフィーを用いて型取った（フォトマスク調整装置を用いる紫外線への暴露および現像）。Niのメッキ液を使用する電気メッキを用いて、露光Cu表面上に18μm厚のNiメッキフィルムを付着させ、マイクロウェル遮断壁1704を得た。溶液処方およびメッキ条件は次の通りである。NiSO4・6H2O: 300g/l、NiCl2・6H2O: 30-40g/l、硼酸: 40g/l、サッカリンナトリウム: 2-5g/l、ブチンジオール（2-ブチン-1,4-ジオール）: 100mg/l、ラウリル硫酸ナトリウム: 50ppm、pH: 3.0-4.2、電流密度: 10A/dm2、温度: 50℃。次いでフォトレジストフィルム1703を取り外した。CuフィルムをHNO3:H3PO4:CH3COOH=0.5:50.0:49.5（容量）溶液を用いてエッチングし、Crフィルムをアルミニウム棒により活性化したHCl:H3PO4:CH3COOH=5:45:50（容量）溶液を用いてエッチングした。次いでガラス上のスピンフィルムをサンプル表面上で被覆し、SiO2フィルム1705を形成させた。図17Bでは得られたマイクロウェルサンプルの写真を示している。
【００９３】
実施例VII
型押非湿潤フイルムを用いる溶液の分離
本実施例では、本発明で教示された方法を用い、非湿潤フイルムで型押ししたガラス表面上に有機溶媒液体粒子のアレイを形成することを示している。図18Aではガラス支持体1801上で型押非湿潤フイルムを被覆するための製作工程を模式的に示している。ガラス支持体1801を温めたH2SO4:H2O=1:1（容量）溶液で十分に清浄した。次いで支持体1801を約2.7μm厚のポジフォトレジストでスピン被覆した。フォトレジストフィルム1802をフォトマスク調整装置を用いて紫外線へ暴露させ、現像した。本実施例では、円形ドットのマトリックスを含むフォトマスクを使用するため、フォトレジストフィルム1802に同じパターンを形成した。型押ガラス支持体をドライボックス中、1mM FDTS(1H,1H,2H,2H-ペルフルオロデシルトリクロロシリアン)無水イソオクタン溶液に浸し、少なくとも10分間浸透させた。次いで支持体をイソオクタンで2-3回すすぎ、続いて入念に水ですすいだ。フォトレジストを取り外し、FDTSフイルムを非湿潤フイルムとしてガラス表面に残した。
【００９４】
湿潤効果の試験は、揮発性溶媒の蒸発を避けるために密閉槽で行った。試験中、槽に試験溶媒および溶液を充填し、次いで排出した。CH2Cl2、CH3CN、CH3OH、CH3CH2OHのような様々な有機／無機溶媒ならびに溶液、TCA/ CH2Cl2溶液、I2／テトラヒドロフラン−水−ピリジン溶液、およびオリゴヌクレオチド合成に関連する他の溶液について試験した。各試験溶媒／溶液について、液体粒子アレイの形成を観察した。図18Bでは非湿潤フイルム型押ガラスプレート上に形成したメタノール液体粒子アレイの写真を示している。
【００９５】
実施例VIII
PGAを用いる型押ガラス支持体上でのアレイ合成
これらの試験では、マイクロアレイチップの作製における本発明の方法および器具の使用を例示している。
【００９６】
実施例VIに記載される特定部分に独立した反応ウェルを有する製作ガラス支持体を使用した。ガラスプレートを遊離OH基(free OH groupes)を含むリンカー分子（エタノール中、10% N-(3-トリエトキシシリルプロピル)-4-ヒドロキシルブチルアミド）により誘導体化した。ガラス支持体上での合成は本明細書に記載される反応器ならびにデジタル光プロジェクター、およびDNA合成装置(Perspective)を用いて行われた。オリゴヌクレオチド合成は表2に示されるプロトコールに従って達成された。ガラス表面をまず、DMT-T ホスホルアミダイトと接触させ、第1の残基を結合させた。この配列を後の工程において、キャッピングおよび酸化試薬によって処理し、反応の各工程の前後にCH3CNで洗浄した。次いでガラスプレートを合成装置により送達されるPGA（CH2Cl2中、50%ヘキサフルオロリン酸トリアリールスルホニウムの0.4%）で処理し、365nmおよび光源強度3mwで平行光源からのコンピューター発生パターン光照射(30s)に暴露させた (Stanford, CA)。さらに表面をCH3CNで広く洗浄した。露光部分では遊離ヒドロキシル基が生成した。酸化および洗浄工程後、第2のカップリング工程で表面に蛍光標識ホスホルアミダイト単量体を接触させた。合成された分子アレイをNaOH水溶液(0.1M)で処理した。蛍光標識二量体を含むこのアレイを蛍光顕微鏡で視覚化した(Bio-Rad, Richmond, CA)。その結果を図19で示している。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、光生成酸を用いるオリゴヌクレオチド合成の図である。L−リンカー基；Pa−酸不安定保護基；H+−光生成酸；T、A、CおよびG−ヌクレオチドホスホルアミダイトモノマー；hv−露光。
【図２】  図２は、オリゴヌクレオチド合成において光生成酸を用いる脱保護過程の図である。
【図３】  図３は、光生成試薬を用いるオリゴヌクレオチド合成の図である。この過程は、ジメトキシベンゾイニルテトラゾールなどの光生成活性化剤を用いる他は図１に示される過程と同じであるが、該脱保護工程は、通常の酸を用いて行う。
【図４】  図４は、光生成酸または光生成塩基を用いるアミノ酸脱保護の図である。Boc＝ブチルオキシルカルボニル；Fmoc＝フルオロエニルメチルオキシカルボニル。
【図５】  図５は、光生成酸を用いるペプチド合成の図である。L−リンカー基；Pa−酸不安定保護基；F、Q、D、Y、SおよびA−Boc保護された代表的なアミノ酸；hv−露光。
【図６】  図６は、光生成塩基を用いるペプチド合成の図である。L−リンカー基；Pb−塩基不安定保護基；F、Q、D、Y、SおよびA−Fmoc保護された代表的なアミノ酸；hv−露光。
【図７】  図７は、様々な反応ステップで光生成酸および光生成塩基の両方を用いる炭水化物合成の図である。
【図８】  図８Aは、マイクロミラーアレイモジュレーターを用いる合成装置の概略図である。
図８Bは、反射LCDアレイモジュレーターを用いる合成装置の概略図である。
図８Cは、伝達LCDアレイモジュレーターを用いる合成装置の概略図である。
【図９】  図９Aは、背面カバー上でマイクロウエル構造を用いる単離機構を図示する。
図９Bは、支持体上でマイクロウエル構造を用いる単離機構を図示する。
図９Cは、支持体上でパターン化非湿潤フィルムを用いる単離機構を図示する。
【図１０】  図１０は、反応装置のカートリッジの分解図、および反応ウエルの拡大図である。
【図１１】  図１１Aは、部分的に遮蔽した反応ウエル中の脱保護反応の概略図である。
図１１Bは、部分的に反応ウエルを照射した脱保護反応の概略図である。
【図１２】  図１２は、複数のアレイの並行合成について段階的機構を図示している。
【図１３】  図１３は、光酸前駆体を含むサンプルを測定して得た、H3O+化学シフト（ppm）対 光照射時間（分）のプロットである。
【図１４】  図１４は、光生成酸を用いて脱保護されたDNA（図１４A）およびRNA（図１４B）ヌクレオシドのHPLCプロフィルを示す。
【図１５】  図１５は、光生成酸を用いて合成されたDNAオリゴマーのHPLCプロフィルを示す。
【図１６】  図１６は、光生成酸を用いて脱保護されたアミノ酸のHPLCプロフィルを示す。
【図１７】  図１７Aは、平面支持体上でマイクロウエルを作製する製造法を図示する。
図１７Bは、ガラス支持体上のマイクロウエルの拡大写真である。
【図１８】  図１８Aは、平面支持体上で非湿潤フィルムのパターンを作製する製造法を図示する。
図１８Bは、非湿潤フィルムパターンを含むガラス表面上で形成されたメタノール液滴の拡大写真である。
【図１９】  図１９は、非湿潤フィルムのパターン化ガラスプレート上で伸長されたフルオレセイン標識化チミンの蛍光画像である。
【図１】
0004503828.tif 000014
【図２】
0004503828.tif 000015
【図３】
0004503828.tif 000016
【図４】
0004503828.tif 000017
【図５】
0004503828.tif 000018
【図６】
0004503828.tif 000019
【図７】
0004503828.tif 000020
【図８】
0004503828.tif 000021
0004503828.tif 000022
0004503828.tif 000023
【図９】
0004503828.tif 000024
0004503828.tif 000025
【図１０】
0004503828.tif 000026
【図１１】
0004503828.tif 000027
【図１２】
0004503828.tif 000028
【図１３】
0004503828.tif 000029
【図１４】
0004503828.tif 000030
0004503828.tif 000031
【図１５】
0004503828.tif 000032
0004503828.tif 000033
【図１６】
0004503828.tif 000034
【図１７】
0004503828.tif 000035
0004503828.tif 000036
【図１８】
0004503828.tif 000037
0004503828.tif 000038
【図１９】
0004503828.tif 000039