(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１以上の有効成分ＡＰを保持するために使用することができるサブミクロン構造化粒子の水性の安定コロイド懸濁液であって、これらの粒子が、
・  −ペプチド結合を有し、各タイプのアミノ酸が互いに同一又は異なる少なくとも２つの異なるタイプの、アスパラギン以外の親水性繰り返し中性アミノ酸ＡＡＮＩ及び疎水性繰り返し中性アミノ酸ＡＡＮＯから本質的になる線状両親媒性ポリアミノ酸（ＰＡＡ）と
−水と
から本質的になり；
・未溶解状態においてコロイド懸濁液中の少なくとも１つのＡＰと自発的に会合することができ、且つインビボで持続及び／又は遅延した様式でそれを放出することができ；
・界面活性剤の非存在下にｐＨ４〜１３の水相中で安定である
個別化された超分子配列である、懸濁液であって、
前記粒子の成分ＰＡＡが、「ブロック」ＰＡＡであるときに、
・ＡＡＮＯ／（ＡＡＮＩ＋ＡＡＮＯ）のモル比が≧６％であり、および
・ＡＡＮＯブロックの絶対長さが≧５であり、
前記粒子の成分ＰＡＡが、「ランダムコポリマー」ＰＡＡであるときに、
・ＡＡＮＩ／（ＡＡＮＩ＋ＡＡＮＯ）のモル比が≧１０％であり、
・分子量Ｍｗが≧２０００Ｄａである
懸濁液。
【請求項２】
前記親水性ＡＡＮＩが、
・セリン、スレオニン、ヒドロキシプロリン、及びグルタミンから選択される天然中性アミノ酸；
・メチオニンＳ−オキシド及びＯ−グリコシジルセリンから選択される希少又は合成中性アミノ酸；及び
・Ｎ−ヒドロキシエチルグルタミン、Ｎ−ヒドロキシプロピルアスパラギン、Ｎ−ヒドロキシエチルアスパラギン、及びＮ−ヒドロキシプロピルグルタミンから選択される中性アミノ酸誘導体
を含む群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の懸濁液。
【請求項３】
前記疎水性ＡＡＮＯが、
・Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、及びＰｈｅから選択される天然中性アミノ酸；
・ノルロイシン及びノルバリンから選択される希少又は合成中性アミノ酸；及び
・グルタミン酸メチル、グルタミン酸エチル、アスパラギン酸ベンジル、及びＮ−アセチルリジンから選択される極性アミノ酸誘導体
を含む群から選択されることを特徴とする、請求項１または２に記載の懸濁液。
【請求項４】
懸濁液が含む前記キャリア粒子（ＣＰ）が、０．０１〜０．５μｍの平均サイズを有することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の懸濁液。
【請求項５】
前記粒子が少なくとも１種の有効成分を含むことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の懸濁液。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の懸濁液から得られることを特徴とする粉末状固体。
【請求項７】
請求項６に記載の粉末状固体、又は１種以上の有効成分ＡＰを運搬するために使用することができるサブミクロン構造化粒子の安定コロイド懸濁液から得られる粉末状固体の調製方法であり、これらの粒子が、
・  −ペプチド結合を有し、各タイプのアミノ酸が互いに同一又は異なる少なくとも２種の異なるタイプの、アスパラギン以外の親水性繰り返し中性アミノ酸ＡＡＮＩ、及び疎水性繰り返し中性アミノ酸ＡＡＮＯから本質的になる、線状両親媒性ポリアミノ酸（ＰＡＡ）と
−水と
から本質的になり；
・未溶解状態においてコロイド懸濁液中の少なくとも１種のＡＰを会合することができ、且つ、インビボにおいて持続及び／又は遅延した様式でそれを放出することができ；
・界面活性剤の非存在下にｐＨ４〜１３の水相中で安定な、
個別化された超分子配列である、調製方法であって、
前記粒子の成分ＰＡＡが、「ブロック」ＰＡＡであるときに、
・ＡＡＮＯ／（ＡＡＮＩ＋ＡＡＮＯ）のモル比が≧６％であり、および
・ＡＡＮＯブロックの絶対長さが≧５であり、
前記粒子の成分ＰＡＡが、「ランダムコポリマー」ＰＡＡであるときに、
・ＡＡＮＩ／（ＡＡＮＩ＋ＡＡＮＯ）のモル比が≧１０％であり、
・分子量Ｍｗが≧２０００Ｄａであり、
１）次の少なくとも２種の異なるタイプのアミノ酸Ｎ−カルボキシ無水物（ＮＣＡ）から形成されるモノマー間で共重合を行い：
・一方は、ＮＣＡ−Ｇｌｕ−ＯＲ及び／又はＮＣＡ−Ａｓｐ−ＯＲ及び／又はＮＣＡ−ＡＡＮＩを含む開始ＮＣＡモノマー、
・他方は、
−  少なくとも１種の非芳香族極性溶媒；
−  及び非プロトン性溶媒及び／又はプロトン性溶媒、水及びアルコールから選択される少なくとも１つの共溶媒；
の存在下にあるＮＣＡ−ＡＡＮＯ；
２）前記開始ＮＣＡモノマーがＮＣＡ−Ｇｌｕ−ＯＲ及び／又はＮＣＡ−Ａｓｐ−ＯＲ（Ｒ＝アルキル）の場合に、ステップ１で得られたコポリマーを、少なくとも１種のアミンを含む水相と接触させることからなり、Ｇｌｕ−ＯＲをＧｌｎに、Ａｓｐ−ＯＲをＡｓｎに転換させることを可能にするアミノ分解を行う；
３）前記反応媒体を透析して構造化粒子の水性懸濁液を精製する；
４）ステップ３の懸濁液を濃縮する；且つ
５）前記粒子を含む粉末状固体を収集するために液体媒体を除去する
ことを特徴とする調製方法。
【請求項８】
請求項６に記載の粉末状固体及び／又は請求項７に記載の方法によって得られる粉末状固体を水性媒体と接触させることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の懸濁液の調製方法
【請求項９】
請求項５に記載の懸濁液又は１種以上の有効成分ＡＰを載荷したサブミクロン構造化粒子の安定コロイド懸濁液の調製方法であり、これらの粒子が、
・  −ペプチド結合を有し、各タイプのアミノ酸が互いに同一又は異なる少なくとも２つの異なるタイプの、親水性繰り返し中性アミノ酸ＡＡＮＩ、及び疎水性繰り返し中性アミノ酸ＡＡＮＯから本質的になる、線状両親媒性ポリアミノ酸（ＰＡＡ）と、
−水と
から本質的になり；
・未溶解状態においてコロイド懸濁液中の少なくとも１種のＡＰを会合することができ、且つ、持続及び／又は遅延した様式でそれを放出することができ；
・界面活性剤の非存在下にｐＨ４〜１３の水相中で安定な、
個別化された超分子配列であり、
ここで、
前記粒子の成分ＰＡＡが、「ブロック」ＰＡＡであるときに、
・ＡＡＮＯ／（ＡＡＮＩ＋ＡＡＮＯ）のモル比が≧６％であり、および
・ＡＡＮＯブロックの絶対長さが≧５であり、
前記粒子の成分ＰＡＡが、「ランダムコポリマー」ＰＡＡであるときに、
・ＡＡＮＩ／（ＡＡＮＩ＋ＡＡＮＯ）のモル比が≧１０％であり、
・分子量Ｍｗが≧２０００Ｄａである
調製方法であって、
当該ＡＰを含有する液相を、前記粒子のコロイド懸濁液及び／又は請求項７に記載の方法により得られた粉末固体と接触させることによって、前記ＡＰを前記粒子と会合させることを特徴とする調製方法。
【請求項１０】
請求項５に記載の懸濁液又は１種以上の有効成分ＡＰを載荷するサブミクロン構造化粒子の安定コロイド懸濁液の調製方法であり、これらの粒子が、
・  −ペプチド結合を有し、各タイプのアミノ酸が互いに同一又は異なる少なくとも２つの異なるタイプの親水性繰り返し中性アミノ酸ＡＡＮＩ、及び疎水性繰り返し中性アミノ酸ＡＡＮＯから本質的になる、線状両親媒性ポリアミノ酸（ＰＡＡ）、
から本質的になり；
・未溶解状態においてコロイド懸濁液中の少なくとも１種のＡＰを会合することができ、且つ、インビボで持続及び／又は遅延した様式でそれを放出することができ；
・且つ、界面活性剤の非存在下にｐＨ４〜１３の水相中で安定な、
個別化された超分子配列であり、
ここで、
前記粒子の成分ＰＡＡが、「ブロック」ＰＡＡであるときに、
・ＡＡＮＯ／（ＡＡＮＩ＋ＡＡＮＯ）のモル比が≧６％であり、および
・ＡＡＮＯブロックの絶対長さが≧５であり、
前記粒子の成分ＰＡＡが、「ランダムコポリマー」ＰＡＡであるときに、
・ＡＡＮＩ／（ＡＡＮＩ＋ＡＡＮＯ）のモル比が≧１０％であり、
・分子量Ｍｗが≧２０００Ｄａである
調製方法であって、
固体状態のＡＰを、前記粒子のコロイド懸濁液と接触させることによって、前記ＡＰを前記粒子と会合させることを特徴とする、調製方法。
【請求項１１】
請求項５に記載の懸濁液又は１種以上の有効成分ＡＰを載荷するサブミクロン構造化粒子の安定コロイド懸濁液の調製方法であり、これらの粒子が、
・  −ペプチド結合を有し、各タイプのアミノ酸が互いに同一又は異なる少なくとも２つの異なるタイプの親水性繰り返し中性アミノ酸ＡＡＮＩ、及び疎水性繰り返し中性アミノ酸ＡＡＮＯから本質的になる、線状両親媒性ポリアミノ酸（ＰＡＡ）、
から本質的になり；
・コロイド懸濁液中の未溶解状態の少なくとも１つのＡＰを会合することができ、且つ、持続及び／又は遅延した様式でそれを放出することができ；
・且つ、界面活性剤の非存在下にｐＨ４〜１３の水相中で安定な、
個別化された超分子配列であり、
ここで、
前記粒子の成分ＰＡＡが、「ブロック」ＰＡＡであるときに、
・ＡＡＮＯ／（ＡＡＮＩ＋ＡＡＮＯ）のモル比が≧６％であり、および
・ＡＡＮＯブロックの絶対長さが≧５であり、
前記粒子の成分ＰＡＡが、「ランダムコポリマー」ＰＡＡであるときに、
・ＡＡＮＩ／（ＡＡＮＩ＋ＡＡＮＯ）のモル比が≧１０％であり、
・分子量Ｍｗが≧２０００Ｄａである
請求項６に記載の粉末状固体及び／又は請求項７に記載の方法によって得られる粉末状固体を、前記ＡＰを含む液相と接触させることを特徴とする、調製方法。
【請求項１２】
請求項６に記載の粉末状固体及び／又は請求項７に記載の方法によって得られる粉末状固体を、固形の前記ＡＰと接触させ、この固体混合物を液相に分散させることを特徴とする、請求項５に記載の懸濁液の調製方法。
【請求項１３】
請求項７の方法の粒子前駆体であるＰＡＡコポリマー。
【請求項１４】
請求項５に記載の懸濁液及び／又は請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法によって得られる懸濁液、及び／又は請求項６に記載の粉末状固体及び／又は請求項７に記載の方法によって得られる粉末状固体であって、
・ワクチン；
・タンパク質及び／又はペプチド；
・多糖体；
・核酸；
・非ペプチドタンパク質分子
から選択される少なくとも１つの有効成分を含有する、懸濁液及び／又は粉末状固体。
【請求項１５】
請求項１４に記載の懸濁液であって、
・ワクチン
・ヘモグロビン、チトクロム、アルブミン、インターフェロン、抗原、抗体、エリスロポエチン、インシュリン、成長ホルモン、第ＶＩＩＩ因子及び第ＩＸ因子、インターロイキンまたはその混合物、および造血刺激因子；
・ヘパリン
・ＲＮＡ及び／又はＤＮＡオリゴヌクレオチド
・アントラサイクリン及びタキソイド及びその混合物から選択される抗癌化学療法の分子
から選択される少なくとも１の有効成分を含有する懸濁液。
【請求項１６】
請求項５に記載の懸濁液及び／又は請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法によって得られる懸濁液、及び／又は請求項６に記載の粉末状固体又は請求項７に記載の方法によって得られる粉末状固体であって、少なくとも１種の栄養、植物の健康又は化粧品用有効成分を含む、懸濁液及び／又は粉末状固体。
【請求項１７】
請求項１４、１５又は１６に記載の懸濁液及び／又は粉末状固体を含有することを特徴とする医薬、栄養、植物の健康又は化粧用の組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、活性成分（ＡＰ）の投与に有用な担体粒子（ｃａｒｒｉｅｒ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ、ＣＰ）の分野に関する。活性成分は、経口又は経鼻、経膣、経眼、皮下、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、脳内、非経口、又は他の経路で動物又はヒトの生体へ投与する薬物、又は栄養分であることが好ましい。しかし、これらは、化粧品、又は除草剤、農薬、殺虫剤、殺菌剤などの植物用薬品でもよい。これらの化学的性質の観点から、本発明がより具体的に関連するＡＰは、これらに限定されるものではないが、例えば、タンパク質、糖タンパク質、ペプチド、多糖体、リポ多糖、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、及び有機分子である。
【０００２】
より正確には、本発明は、ポリアミノ酸（ＰＡＡ）を基礎とした（有利にはサブミクロンタイプの）キャリア粒子のコロイド懸濁液に関する。
【０００３】
本発明は、裸の粒子自体、及び前記ＡＰが載荷された（ｌｏａｄｅｄ）粒子からなるＡＰキャリアシステムの両者に関する。
【０００４】
さらに、本発明は、これらのＣＰを含む粉末状固体に関する。
【０００５】
さらに、本発明は、ＡＰを含む又は含まない粒子の前記コロイド懸濁液を調製する方法に関する。
【０００６】
【従来の技術】
ＡＰをＣＰ中に封入又は吸着させる目的は、特に、これらの作用持続時間を加減し、及び／又は処置部位にこれらを運搬し、及び／又は前記ＡＰの生物学的利用能を増加させることである。多数の封入技術がすでに提案されている。このような技術の目的は、一方では、生体の攻撃（加水分解、酵素による消化など）からそれを保護しつつＡＰをその治療作用部位に輸送することを可能にし、他方で、生体が利用できる量を所望のレベルに維持するようにＡＰのその作用部位での放出を制御することである。生体内での輸送及び滞留のかかる変化に関与するＡＰは、例えば、タンパク質であるが、合成又は天然由来の有機分子とは全く異なる生成物である可能性もある。Ｍ．Ｊ．ＨＵＭＰＨＲＥＹ（Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｄｒｕｇｓ、Ｓ．ＤＡＶＩＳ及びＬ．ＩＬＬＵＭ編、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．１９８６）による総説では、ＡＰの生物学的利用能の改善に関連する問題、及びキャリアと制御放出システムの利点について考察している。
【０００７】
本発明によるＣＰは、ＡＰがその上に吸着されるタイプのものである。
【０００８】
ＣＰを形成するために検討し得る全ての材料のうちで、ポリマーはその固有の諸特性のためにますます広範に使用されている。ＣＰが獲得することが望ましい仕様書は、個々に要求が厳しく、特に以下の仕様を含んでいる。
【０００９】
１  ＣＰに求められる第１の仕様は、ＣＰを構成するポリマーが生体適合性であり、排除可能（排泄によって）及び／又は生分解可能であり、特に生体に無毒の産物に代謝されるということである。さらに、生体内での生分解は十分に短時間であるべきである。
【００１０】
２  有機溶剤及び／又は界面活性剤を使わずに、ＣＰが安定な水性懸濁液を形成することができれば有利であろう。
【００１１】
３  ＣＰが、液体懸濁液中で、細孔直径が０．２μｍ以下のフィルターを用いた滅菌濾過を行うことができる十分な小ささであることも望ましいであろう。
【００１２】
４  ＡＰを変質させない方法によってＣＰ及びＣＰ−ＡＰシステムが得られることが望ましい。
【００１３】
５  ＣＰは、有利には、ＡＰの放出速度の制御を可能にすべきである。
【００１４】
６  別の重要な仕様は、ＣＰ−ＡＰシステムが優れた注射用薬物を構成できることである。この注射投与（例えば静脈内又は筋肉内注射）に対する適合性の向上、すなわち「注射適性（ｉｎｊｅｃｔａｂｉｌｉｔｙ）」は、
（ｉ）注射容量の減少（所与の治療量に対する）、及び
（ｉｉ）低粘度
によって特定される。この２つの特性は、治療量のＡＰが最少量のＣＰと結び付いたときに充足される。換言すれば、ＣＰのＡＰ載荷ファクター（ｌｏａｄｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）は高くなければならない。
【００１５】
７  注射用製剤中のＣＰ固有のコストは低減されなければならず、ここでもまた、ＣＰは高いＡＰ載荷ファクターを持つべきである。実際、小径と高載荷ファクターがＣＰに求められる主要な仕様である。
【００１６】
８  ＣＰの構成ポリマーが免疫応答を誘発しなければ、これもまた有利である。
【００１７】
以下に記述するこれまでの技術的な提案は、これらのすべての仕様を満たそうとしたものである。これまでの提案（ａ）〜（ｈ）を、説明のために示す。
【００１８】
（ａ）  米国特許第５  ２８６  ４９５号は、反対の電荷を有する材料、すなわちアルギネート（負に帯電）とポリリジン（正に帯電）を利用して、水相中のタンパク質を気化させて封入する方法に関する。この製造方法によって、約３５μｍを上回る大きさの粒子が生産される。
【００１９】
（ｂ）  また、ＡＰを載荷する微粒子の調製に、乳化技術が一般に使用される。例えば、国際出願第９１／０６２８６号、同９１／０６２８７号、及び同８９／０８４４９号は、ポリマー（例えば、ポリ乳酸型）を可溶化するために有機溶剤を用いるそのような乳化技術を開示している。しかし、その溶媒が、特にペプチド又はポリペプチドＡＰを変性させ得ることが判明した。
【００２０】
（ｃ）  プロテイノイド（ｐｒｏｔｅｉｎｏｉｄ）と称される生体適合性ＣＰも知られており、１９７０年以降、Ｘ．ＦＯＸ及びＫ．ＤＯＳＥによって「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｏｒｉｇｉｎ  ｏｆ  ｌｉｆｅ」（Ｍａｒｃｅｌ  ＤＥＫＫＥＲ  Ｉｎｃ．によって出版された（１９７７））に記載された。例えば、国際出願第８８／０１２１３号は、その溶解度がｐＨに依存する合成ポリペプチド混合物に基づく系を提案している。この発明によるマトリックス微粒子を得るために、発明者らはポリペプチド混合物を可溶化し、次いで、ｐＨ変化によってプロテイノイド粒子を沈殿させている。ＡＰの存在下で沈殿が起こると、ＡＰが粒子中に封入される。
【００２１】
（ｄ）  米国特許第４  ３５１  ３３７号は、本発明特有のＡＰ輸送分野とは異なる分野に関係するものであるが、関心のため引用する。この特許は、生体中の極めて特異的な場所に固定され、局在化された多数の移植片を開示している。これらの移植片は、アミノ酸Ｎ−カルボキシ無水物（ＮＣＡ）モノマーを共重合して得られるポリアミノ酸コポリマー、例えばポリ（グルタミン酸／ロイシン）又はポリ（グルタミン酸ベンジル／ロイシン）コポリマーからなる、顕微鏡サイズ（１６０μｍ、長さ２０００μｍ）の管又は中空カプセルである。溶媒蒸発技術によって、ポリマーとＡＰの混合物からＡＰを含有させる。米国特許第４  ４５０  １５０号は、先に考察した米国特許第４  ３５１  ３３７号と同じ系統に属し、主題が本質的に同じある。成分ＰＡＡは、ポリ（グルタミン酸／グルタミン酸エチル）コポリマーである。
【００２２】
（ｅ）  欧州特許第０  ７３４  ７２０号は、ＡＰの保持に有用なポリアミノ酸粒子に関する。この粒子は、１０〜５００ｎｍ、好ましくは３０〜４００ｎｍの大きさである。欧州特許第０  ７３４  ７２０号による粒子は、ＰＡＡが水溶液と接触すると自発的に形成される。ＰＡＡとしては、疎水性の中性アミノ酸モノマー、ＡＡＮＯ（Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ）、及び親水性のイオン性モノマー、ＡＡＩ（Ｇｌｕ、Ａｓｐ）が挙げられる。これらのＰＡＡは、ＡＡＩ前駆体（例えば、Ｇｌｕ−ＯＭｅ）のＮＣＡとＡＡＯ（例えば、Ｌｅｕ）のＮＣＡとをジオキサン／トルエン混合溶液中で共重合して調製される。溶液中で得られるポリ（Ｇｌｕ−ＯＭｅ／Ｌｅｕ）コポリマーを、水中で沈殿させ、濾過し、乾燥して回収する。次いで、このコポリマーを、これが溶解するトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中に導入することによって、酸加水分解させる。ポリ（Ｇｌｕ−Ｏ−Ｎａ／Ｌｅｕ）コポリマーを、中和、透析、濾過及び凍結乾燥後に回収する。
【００２３】
ｃｏＰＡＡを、ＮａＣｌ水溶液中に分散すると、ナノ粒子の懸濁液が自発的に形成される。水性懸濁液中のこれらのＣＰがＡＰと接触するとすぐに、ＡＰは、自発的にＣＰに吸着して会合する。ＣＰは、疎水性アミノ酸で形成された疎水性のコアと、親水性アミノ酸に基づく親水性外部「格子」を有する。
【００２４】
欧州特許第０  ７３４  ７２０号によるキャリア粒子は、負の安定化電荷を有するイオン性アミノ酸（Ｇｌｕ）を含有し、粒子ＣＰの凝結及び凝集を防止することを可能にしている。
【００２５】
（ｆ）  フランス公開特許ＦＲ−Ａ−２  ７４６  ０３５号は、物理化学的に安定で、一体型の、活性成分キャリアとして使用することが可能な、複合ゲルの微粒子に関する。この微粒子は、油（Ｉ）、水相（II）及び少なくとも２つの異なるタイプのアミノ酸コモノマー（親水性ＡＡＩと疎水性ＡＡＯ）を含有する少なくとも１つの線状非架橋合成コポリアミノ酸（III）からなる。ＡＡＩは、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｏｒｎ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ及びそれらの会合物とすることができる。ＡＡＯコモノマーは、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ、Ｉｌｅ及びそれらの会合物とすることができる。特に２７頁８〜１８行で、フランス公開特許ＦＲ−Ａ−２  ７４６  ０３５号は、ポリアミノ酸の水性コロイド懸濁液、例えばポリ（ロイシン／グルタミン酸ナトリウム）コポリマー、を記述している。
【００２６】
しかし、フランス公開特許ＦＲ−Ａ−２  ７４６  ０３５号は、ＡＰを保持するナノ粒子医薬システムとしてのコポリマー単独の利用を開示していない。
【００２７】
フランス公開特許ＦＲ−Ａ−２  ７４６  ０３５号のＡＡＩは、
・次の天然の中性アミノ酸：セリン、スレオニン、ヒドロキシプロリン、グルタミン；
・次の希少又は合成中性アミノ酸：メチオニンＳ−オキシド、Ｏ−グリコシジルセリン；及び
・次の中性アミノ酸誘導体：Ｎ−ヒドロキシエチルグルタミン、Ｎ−ヒドロキシプロピルアスパラギン
を含む群から選択される親水性中性アミノ酸ではない。
【００２８】
これら上述のこれまでの技術的提案はすべて、
・上記仕様書の仕様、特に、濾過による滅菌に対する適合性、高分解速度、注射による薬物投与の制約に対する適応性、低コスト及び高ＡＰ載荷ファクター、を不完全にしか満足しないか、
・新規な利点を提供できる新規な技術的解決手段（従来技術参照用欧州特許第０  ７３４  ７２０号）によって置き換えることができる。
【００２９】
発明の簡単な開示
【発明が解決しようとする課題】
これらの既成事実に対して、一つの本質的目的は、界面活性剤又は有機溶剤を利用せずに、ＣＰの安定水性懸濁液を自発的に形成する新規なＣＰを提供できることである。
【００３０】
本発明の別の本質的目的は、安定な水性コロイド懸濁液又は粉末状の、ポリアミノ酸（ＰＡＡ）に基づく新規なＣＰを提供することであって、これらの新規なＣＰは上述の仕様書の仕様１〜８に適合することが好ましい。
【００３１】
本発明の別の本質的目的は、ＰＣＴ特許出願ＷＯ９６／２９９９１号に開示されている粒子を改善することである。
【００３２】
本発明の別の本質的目的は、特にＡＰ載荷ファクター及びＡＰ放出動力学の制御の点で、その特徴が完全に制御された新規なＣＰの懸濁液を提供することである。
【００３３】
本発明の別の本質的目的は、注射用薬用懸濁液を提供することである。このような懸濁液に必要な仕様は、注射用量が少ないことと、粘度が低いことである。治療効力を損なわないようにこれらの粒子によって輸送される活性成分ＡＰの量を制限することなく、注射用量当たりのコロイド粒子の質量が可能な限り少ないことが重要である。
【００３４】
本発明の別の本質的目的は、前述の仕様に適合する活性成分キャリア粒子を含み、ヒト又は動物への、例えば経口的な、投与に適した適切なガレン製剤（ｇａｌｅｎｉｃａｌ  ｆｏｒｍ）を構成する水性コロイド懸濁液又は粉末固体を提供することである。
【００３５】
本発明の別の本質的目的は、滅菌の目的で０．２μｍフィルターによって濾過できる活性成分キャリア粒子を含むコロイド懸濁液を提供することである。
【００３６】
本発明の別の本質的目的は、特に活性成分キャリアとして有用なＰＡＡ粒子（乾燥した又は液体懸濁液の）を調製する方法であって、簡単に実施でき、活性成分を変性させず、さらに得られる粒子の平均サイズを常に微調整することができる方法を提案することである。
【００３７】
本発明の別の本質的目的は、
・薬物（例えば、ワクチン）、特に経口、経鼻、経膣、経眼、皮下、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、脳内、又は非経口投与用薬物（特に、これらの薬物の活性成分は、タンパク質、糖タンパク質、ペプチド、多糖体、リポ多糖、オリゴヌクレオチド、及びポリヌクレオチドであり得る）；
・及び／又は栄養分；
・及び／又は化粧（ｃｏｓｍｅｔｉｃ）又は植物健康製品（ｐｌａｎｔ  ｈｅａｌｔｈｈ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ）
・及び／又は薬用有機分子
の調製に対して、水性懸濁液又は固体状の前述の粒子を使用することである。
【００３８】
本発明の別の本質的目的は、ＡＰ、特に、ヒト又は動物生体への投与用の薬用ＡＰ、或いは栄養、植物健康又は化粧用のＡＰ、のキャリアとして作用し得るＰＡＡを基礎としたサブミクロンのＣＰの懸濁液を提供することである。
【００３９】
本発明の別の目的は、生産が容易且つ経済的であり、生体適合性でもあり且つＡＰの極めて高レベルの生物学的利用能を確保することもできる、活性成分の持続放出用システムからなるタイプの薬を提供することである。
【００４０】
本発明の別の本質的目的は、本来非免疫原性であり、１以上の抗原と併用されるワクチンキャリアシステムを提供することである。
【００４１】
（中でも）製品に関連した目的は、１以上の活性成分ＡＰを保持するために特に使用することができるサブミクロン構造化粒子の安定コロイド懸濁液にまず第一に関係する本発明によって達成され、これらの粒子は、
・ペプチド結合を有し、各タイプのアミノ酸が互いに同一又は異なる少なくとも２つの異なるタイプの親水性繰り返しアミノ酸ＡＡＩ、及び疎水性繰り返しアミノ酸ＡＡＯを含む、線状両親媒性（ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ）ポリアミノ酸（ＰＡＡ）を基礎とし；
・未溶解状態においてコロイド懸濁液中の少なくとも１つのＡＰを会合する（ａｓｓｏｃｉａｔｅ）ことができ、且つ、特にインビボで、持続及び／又は遅延した様式でそれを放出することができ；
・ｐＨ４〜１３の水相中で、界面活性剤の非存在下で安定な、
個別化された（分離した）超分子配列であって、
・親水性繰り返しアミノ酸ＡＡＩが、アスパラギン以外の親水性中性アミノ酸ＡＡＮＩであり；
・疎水性繰り返しアミノ酸ＡＡＯが、疎水性中性アミノ酸ＡＡＮＯであり；
・ＡＡＮＩ及びＡＡＮＯ各タイプの繰り返しアミノ酸が互いに同一又は異なる、ことを特徴とする。
【００４２】
発明の詳細な開示
【課題を解決するための手段】
安定な水性コロイド懸濁液又は粉末状固体の形のこれら新規キャリア粒子ＣＰの発明の主要な側面の一つは、界面活性剤又は溶媒の非存在下で安定な水性コロイド懸濁液を形成するサブミクロンサイズの粒子を得るための、１群のポリマーの新規な選択及び新規な方法論に関する。
【００４３】
安定な水性コロイド懸濁液又は粉末状固体の形のこれら新規キャリア粒子ＣＰの発明の別の主要な側面は、親水性繰り返しモノマーＡＡＮＩ及び疎水性繰り返しモノマーＡＡＮＯとして、２つの中性アミノ酸を新規に選択することに関する。
【００４４】
今回、当業者の懸念に反し、国際出願第９６／２９９９１号による粒子のように、イオン性親水性アミノ酸ＡＡＩＩ、すなわち負電荷を持たないことが、安定性を損なうことはない。実際、すべての予想に反して、本発明によるコロイド懸濁液は凝集しない。ポリ（ＡＡＮＩ／ＡＡＮＯ）を基礎とした粒子は、自己凝集しない。さらに、これらのポリ（ＡＡＭ／ＡＡＮＯ）粒子が活性成分ＡＰと自発的に会合し、これらのＡＰを治療上の作用部位で放出できるかどうかは、演繹的に全く明白ではない。
【００４５】
ＰＡＡポリマーの構造及び中性アミノ酸の性質は、
・ポリマー鎖が自発的に自己を小粒子（ＣＰ）に作り上げ；
・この粒子が安定コロイド懸濁液を水中及び生理的媒体中で形成し；
・このＣＰがタンパク質又は他のＡＰと、タンパク質を変性させない自発的メカニズムによって、水性媒体中で会合し；且つ
・このＣＰが生理的媒体中、より正確にはインビボでＡＰを放出し；放出の動力学がＣＰの前駆体であるＰＡＡポリマーの性質に依存するように選択される。
【００４６】
したがって、ＰＡＡの特異構造を変化させることによって、ＡＰの会合及び放出現象を、動力学的及び定量的観点から制御することが可能である。
【００４７】
ＣＰの構成材料として、両親媒性で、したがってＰＡＡでできたＣＰの諸性質、すなわち
・目的とする治療用途において遭遇する生理的媒体のｐＨに適合するＣＰのコロイド懸濁液を自発的に形成する潜在能力；
・水（溶媒として作用し、タンパク質の場合には非変性である）以外のあらゆる薬剤の非存在下でのＡＰとＣＰの自発的会合；
・治療分野（ＡＰ輸送）において貴重な利用が期待される薬物動態学的及び薬力学的プロフィールに従い、生理的条件下でＡＰ−ＣＰ会合複合体からＡＰを放出する潜在能力；
・滅菌目的の０．２μｍ以下のカットオフ閾値を有する濾過性；
・改善された生分解性；及び
・最適化された注射適性
を有する中性ポリアミノ酸の特定の組成を選択したことは、本出願者の功績である。
【００４８】
これらのＰＡＡは、交互配列（ブロック）を有する秩序型又はランダム配列を有する無秩序型とすることができる。
【００４９】
すなわち、本発明によるＣＰの第１の実施態様において、成分ＰＡＡは、「ブロック」型であり、
・ＡＡＮＯ／（ＡＡＮＩ＋ＡＡＮＯ）≧６％、
・１０％≦ＡＡＮＯ／（ＡＡＮＯ＋ＡＡＮＩ）≦７０％、
・好ましくは、２０％≦ＡＡＮＯ／（ＡＡＮＩ＋ＡＡＮＯ）≦６０％、
・特に好ましくは、３５％≦ＡＡＮＯ／（ＡＡＮＩ＋ＡＡＮＯ）≦５０％
であるモル比ＡＡＮＯ／（ＡＡＮＩ＋ＡＡＮＯ）によって特徴付けられる。
【００５０】
ＡＡＮＯの各ブロックの絶対長さは、ＡＡＮＯの数で表され、
・ＡＡＮＯ≧５、
・好ましくは、ＡＡＮＯ≧１０、
・特に好ましくは、ＡＡＮＯ≧２０
であることが有利である。
【００５１】
本発明によるＣＰの第２の実施態様において、成分ＰＡＡは「ランダム」型であり、すなわちＡＡＮＩとＡＡＮＯモノマーの同時共重合によって調製され、モル比ＡＡＮＯ／（ＡＡＮＯ＋ＡＡＮＩ）は、
・ＡＡＮＯ／（ＡＡＮＯ＋ＡＡＮＩ）≧１０％、
・好ましくは、ＡＡＮＯ／（ＡＡＮＯ＋ＡＡＮＩ）≧２０％、
・特に好ましくは、３０％≦ＡＡＮＯ／（ＡＡＮＩ＋ＡＡＮＯ）≦７０％
である。
【００５２】
これらのランダムＰＡＡの分子量Ｍｗは、
・Ｍｗ≧２０００ｇ／ｍｏｌ、
・好ましくは、Ｍｗ≧５５００ｇ／ｍｏｌ、
・特に好ましくは、５５００ｇ／ｍｏｌ≦Ｍｗ≦２００，０００ｇ／ｍｏｌ
であることが有利である。
【００５３】
本発明の好ましい特性によれば、粒子を構成するブロック又はランダムＰＡＡは、重合度ＤＰが３０〜６００、好ましくは５０〜２００、特に好ましくは６０〜１５０である。
【００５４】
粒子ＣＰを構成するＰＡＡは、「ジブロック」ＰＡＡであることが有利である。
【００５５】
親水性ＡＡＮＩは、
・天然中性アミノ酸、好ましくは、セリン、スレオニン、ヒドロキシプロリン、及びグルタミンを含む群から選択される天然中性アミノ酸；
・希少又は合成中性アミノ酸、好ましくは、メチオニンＳ−オキシド及びＯ−グリコシジルセリンを含む群から選択される希少又は合成中性アミノ酸；及び
・中性アミノ酸誘導体、好ましくは、Ｎ−ヒドロキシエチルグルタミン、Ｎ−ヒドロキシプロピルアスパラギン、Ｎ−ヒドロキシエチルアスパラギン、及びＮ−ヒドロキシプロピルグルタミンを含む群から選択される中性アミノ酸の誘導体
を含む群から選択するのが好ましい。
【００５６】
疎水性ＡＡＮＯは、
・天然中性アミノ酸、好ましくは、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、及びＰｈｅを含む群から選択される天然中性アミノ酸；
・希少又は合成中性アミノ酸、好ましくは、ノルロイシン及びノルバリンを含む群から選択される希少又は合成中性アミノ酸；及び
・極性アミノ酸誘導体、好ましくは、グルタミン酸メチル、グルタミン酸エチル、アスパラギン酸ベンジル、及びＮ−アセチルリジンを含む群から選択される極性アミノ酸誘導体
を含む群から選択することが有利である。
【００５７】
有利な特性によれば、懸濁液のキャリア粒子（ＣＰ）は、平均サイズが０．０１〜０．５μｍ、好ましくは０．０１〜０．２μｍである。
【００５８】
懸濁液の別の好ましい特性は、それが水性であり安定であることである。
【００５９】
本発明は、先に定義した裸の粒子の懸濁液だけでなく、少なくとも１つの活性成分ＡＰを含む粒子の懸濁液にも関する。本発明による懸濁液は、水性であり安定であることが好ましい。これらの粒子は、ＡＰを載荷していてもあるいはしていなくても、液体（懸濁液）、好ましくは水性液体中に分散した形態が有利であるが、先に定義したＣＰの懸濁液から得られる粉末状固体の形態でもよい。
【００６０】
このことから、本発明は、ＣＰの（好ましくは、水性）コロイド懸濁液だけでなく、本発明による懸濁液から得られるＣＰを含む粉末状固体にも関係することになる。
【００６１】
本発明の別の本質的な対象は、
・上述の選択された粒子；
・及び構造化された、サブミクロンの、１以上の活性成分ＡＰを保持するために特に使用できる別の選択された粒子、
の調製に関し、これらの粒子は、
・ペプチド結合を有し、各タイプのアミノ酸が互いに同一又は異なる少なくとも２つの異なるタイプの親水性繰り返しアミノ酸ＡＡＩ、及び疎水性繰り返しアミノ酸ＡＡＯを含む、線状両親媒性ポリアミノ酸（ＰＡＡ）を基礎とし；
・未溶解状態においてコロイド懸濁液中の少なくとも１つのＡＰを会合することができ、且つ、特にインビボで、持続及び／又は遅延した様式でそれを放出することができ；
・ｐＨ４〜１３の水相中で、界面活性剤の非存在下で安定な、
個別化された（分離した）超分子配列であって、
・親水性繰り返しアミノ酸ＡＡＩが、少なくとも部分的にアスパラギンからなり；
・疎水性繰り返しアミノ酸ＡＡＯが、疎水性中性アミノ酸ＡＡＮＯであり、これらが互いに同一又は異なり、
これらの粒子は、コロイド懸濁液の形、又は粒子の安定コロイド懸濁液から得られる粉末状固体の形のいずれかであり得る。
【００６２】
当該調製方法は、前駆体ＰＡＡを合成し、それらを構造化された粒子に転換することから本質的になる。
【００６３】
より正確には、本調製方法は、まず第一に、１以上の活性成分を保持するために特に使用することができるサブミクロン構造化粒子の調製方法であって、これらの粒子は、
・ペプチド結合を有し、各タイプのアミノ酸が互いに同一又は異なる少なくとも２つの異なるタイプの親水性繰り返しアミノ酸ＡＡＩ、及び疎水性繰り返しアミノ酸ＡＡＯを含む、線状両親媒性ポリアミノ酸（ＰＡＡ）を基礎とし；
・未溶解状態においてコロイド懸濁液中の少なくとも１つのＡＰを会合することができ、且つ、特にインビボで、持続及び／又は遅延した様式でそれを放出することができ；
・ｐＨ４〜１３の水相中で、界面活性剤の非存在下で安定な、
分離した超分子配列である。
【００６４】
この方法は、
次の少なくとも２つの異なるタイプのアミノ酸Ｎ−カルボキシ無水物（ＮＣＡ）から形成されるモノマー間で共重合を行う；
・一方は、ＮＣＡ−Ｇｌｕ−ＯＲ及び／又はＮＣＡ−Ａｓｐ−ＯＲ及び／又はＮＣＡ−ＡＡＮＩを含む開始ＮＣＡモノマー、及び
・他方は、
−  Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、及びピロリドンを含む群から好ましくは選択され、ＮＭＰがより特に好ましい、少なくとも１つの非芳香族極性溶媒；及び
−  必要に応じて、非プロトン性溶媒（好ましくは１，４−ジオキサン）及び／又はプロトン性溶媒（好ましくはピロリドン）及び／又は水及び／又はアルコールから選択され、メタノールが特に好ましい、少なくとも１つの共溶媒；
の存在下にあるＮＣＡ−ＡＡＮＯ、
２）開始ＮＣＡモノマーがＮＣＡ−Ｇｌｕ−ＯＲ及び／又はＮＣＡ−Ａｓｐ−ＯＲ（Ｒ＝アルキル）の場合には、ステップ１で得られたコポリマーを、少なくとも１つのアミンを含む水相と接触させることからなり、且つＧｌｕ−ＯＲをＧｌｎに、及びＡｓｐ−ＯＲをＡｓｎに転換させることを可能にするアミノ分解を行う；
３）反応媒体を必要に応じて透析して構造体粒子の水性懸濁液を精製する；
４）必要に応じて、ステップ３の懸濁液を濃縮する；
５）粒子を含む粉末状固体を収集できるように液体媒体を除去する
ことを特徴とする。
【００６５】
本方法の第１ステップは、α−アミノ酸Ｎ−カルボキシ無水物（ＮＣＡ）を重合する既知の技術に基づいており、この技術は、例えば、論文「Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、１５、１８６９（１９７６）」、及び「α−Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  Ｎ−ｃａｒｂｏｘｙ  ａｎｈｙｄｒｉｄｅ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｅｓ」、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ（１９８７）と題するＨ．Ｒ．ＫＲＩＣＨＥＬＤＯＲＦの著書に記載されている。
【００６６】
いかなる沈殿の発生も防止する極性、非芳香族の非プロトン性共重合溶媒を注意深く選んで用い、且つ水及び非芳香族極性有機溶剤の存在下で酸加水分解すると、水性媒体中で安定なコロイド懸濁液を形成する、高いＡＰ載荷能力を有するサブミクロンの分離した構造化粒子が得られる。これらの粒子は、以前の提案（ｄ）に関して上述した種類の巨視的凝集沈殿物とは全く別物である。
【００６７】
一変形においては、ステップ１の後に、得られたポリ（ＡＡＮＯ／ＡＡＮＩ）コポリマーを、好ましくは水中で、沈殿させ、この沈殿物を収集する。この変形は、バッチ形式の粒子調製に相当し、ポリ（ＡＡＮＯ／ＡＡＮＩ）コポリマーは、安定な中間体を構成する沈殿物の形態で単離される。この沈殿物を、例えば、濾過分離し、洗浄し、乾燥することができる。
【００６８】
特に好ましくは、ＮＣＡ−ｐＡＡＩは、Ｏ−アルキル化グルタミン酸又はアスパラギン酸のＮＣＡ、例えばＮＣＡ−Ｇｌｕ−Ｏ−Ｍｅ、ＮＣＡ−Ｇｌｕ−ＯＥｔ又はＮＣＡ−Ｇｌｕ−Ｏ−Ｂｚ（Ｍｅ＝メチル、Ｅｔ＝エチル、Ｂｚ＝ベンジル）である。
【００６９】
既知の方法では、共重合は、温度２０〜１２０℃、大気圧で、アミン開始剤、例えばＮＨ３の存在下で起こる。
【００７０】
非芳香族極性溶媒（好ましくはＮＭＰ）中のＮＣＡ及び／又はポリマーの濃度及び／又はプロトン性共溶媒の濃度又は性質などの他の実験パラメータは、合成中に、当業者に既知の所望の効果に従って調節する。
【００７１】
酸加水分解（ステップ２）は、水、及びリン酸又は塩酸などの少なくとも１つの鉱酸（塩酸が好ましい）、及び／又はトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、酢酸、ジクロロ酢酸又は有機スルホン酸などの少なくとも１つの有機酸を用いて行われる。
【００７２】
重量部で表される水／酸の比率は、酸性水性加水分解相中で、
・６０／１〜２／１、
・好ましくは、４０／１〜２／１、
・特に好ましくは２０／１〜２／１
であることが有利である。
【００７３】
重量部で表される酸性水性加水分解相／ＮＭＰの比率は、
・５／１００〜２００／１００、
・好ましくは１０／１００〜１００／１００、
・特に好ましくは２０／１００〜８０／１００
であることが有利である。
【００７４】
ポリマー濃度、反応混合物の温度、酸性水性加水分解相の添加方式、減圧の使用、反応時間などの他のパラメータは、当業者の周知の所望の効果に従って調節する。
【００７５】
実際には、中和（ステップ３）は、例えば水酸化ナトリウムを用いて行われる。中和の最後に形成される塩、及び溶媒は、任意の適切な物理的分離処置、例えばダイアフィルトレーション（透析）（ステップ４）、濾過、ｐＨ変更、クロマトグラフィなどによってその後除去される。
【００７６】
これにより、例えば蒸留、或いは限外濾過、遠心分離などの他のあらゆる適切な物理的手段によって濃縮できる構造化粒子の水性懸濁液が得られる。
【００７７】
ステップ６においては、粒子をその液体懸濁液媒体から分離するために、例えば乾燥（例えば、乾燥器中で）、凍結乾燥、或いは限外濾過又は遠心分離などの他のあらゆる適切な物理的手段により、必要に応じて水相を除去する。白色粉末状固体をこのステップ６の最後に回収する。
【００７８】
一変形において、グルタミン酸モノマーの親水性部分を酸に転換して、それらを水に不溶にするｐＨ低下などの化学的処理手段によって濃縮ステップを実施することができる。これらの酸性ＰＡＡ中間体を、濾過分離し、洗浄し、乾燥することができる。この酸性中間体は、後続のステップにおいて化学塩基で中和して、粒子の懸濁液を生成することができる。
【００７９】
上記方法のステップ１、２、３、４及び必要に応じて５を実行することが、高いＡＰ載荷ファクターを有するサブミクロン粒子のコロイド懸濁液を調製することに相当することに注目されたい。
【００８０】
このコロイド性懸濁液の調製においては、ステップ２の両親媒性ＰＡＡ、ポリ（ＡＡＮＯ／ＡＡＮＩ）が、ＡＡＮＩの少なくとも一部が可溶性であり、且つＡＡＮＯの少なくとも一部が不溶性である水性媒体中に置かれている。ＰＡＡは、この水性媒体中にナノ粒子の形で存在する。
【００８１】
本発明によるＣＰ懸濁液の別な調製法は、生成物として及びその調製方法によって上述した粉末状固体を、ＡＡＮＯの非溶媒である水性媒体と接触させることからなる。
【００８２】
１以上のＡＰを、本発明による幾つかの方法を用いて粒子と会合することができる。これらの方法の非限定的な例を、以下に列挙する。
【００８３】
第１の方法によれば、ＡＰを含有する液相（水性又は非水系）を、ＡＡＮＩとしてＡｓｐを含んでも含まなくてもよい粒子のコロイド懸濁液と接触させることによって、ＡＰを粒子と会合させる。
【００８４】
第２の方法によれば、固体状態のＡＰを、ＡＡＮＩとしてＡｓｐを含んでも含まなくてもよい粒子のコロイド懸濁液と接触させることにより、ＡＰを粒子と会合させる。この固体ＡＰは、例えば、凍結乾燥体、沈殿物、粉末、又は他の形とすることができる。
【００８５】
第３の方法によれば、生成物として及びその調製上の特性によって上述した粉末状固体（ＡＡＮＩとしてＡｓｐを含んでも含まなくてもよいＰＡＡ）を、ＡＰを含有する液相（水性又は非水系）と接触させる。
【００８６】
第４の方法によれば、生成物として及びその調製上の特性によって上述した粉末状固体（ＡＡＮＩとしてＡｓｐを含んでも含まなくてもよいＰＡＡ）を、固形のＡＰと接触させる。次いで、この固体の混合物を、液相、好ましくは水溶液中に分散させる。
【００８７】
これらすべての方法において、使用するＡＰは、純粋な形態又は予備処方された形態とすることができる。
【００８８】
粒子はナノメーターの大きさであるので、懸濁液を滅菌フィルターで濾過することができ、それによって無菌の注射用薬用液体を容易に且つ低コストで得ることが可能になる。本発明によって付与される、粒径を制御し、２５〜１００ｎｍのＤｈ値に達する能力は、重要な利点である。
【００８９】
本発明は、上述の方法の新規な中間体にもさらに関係し、それらは粒子前駆体のＰＡＡコポリマー（ＡＡＮＩとしてＡｓｐを含んでも含まなくてもよい）からなることを特徴とする。
【００９０】
産業上の利用分野
その別な特徴によれば、本発明は、先に定義した及び／又は上述の方法によって得られる、懸濁液及び／又は粉末状固体（ＡＡＮＩとしてＡｓｐを含んでも含まなくてもよいＰＡＡ）に関し、この懸濁液及びこの固体は、
・ワクチン；
・タンパク質及び／又はペプチド（中でも次のものがより好ましく選択される：ヘモグロビン、チトクロム、アルブミン、インターフェロン、抗原、抗体、エリスロポエチン、インシュリン、成長ホルモン、第ＶIII因子及び第ＩＸ因子、インターロイキン又はこれらの混合物、及び造血刺激因子）；
・多糖体（特にヘパリンが選択される）；
・核酸、好ましくはＲＮＡ及び／又はＤＮＡオリゴヌクレオチド；
・様々な抗癌化学療法の範疇に属する非ペプチドタンパク質分子、特にアントラサイクリン及びタキソイド（ｔａｘｏｉｄｓ）；
・及びこれらの混合物
から好ましくは選択される少なくとも１つの有効成分を含有する。
【００９１】
さらに、本発明は、栄養、植物の健康又は化粧用ＡＰを載荷した懸濁液及び／又は粉末状固体（ＡＡＮＩとしてＡｓｐを含んでも含まなくてもよいＰＡＡ）に関する。
【００９２】
最後に、本発明は、ＡＰを載荷し、先に定義した懸濁液及び／又は粉末状固体を含有することを特徴とする、医薬品、栄養、植物の健康又は化粧用特許製品に関する。
【００９３】
本発明の別の対象によれば、本発明は、さらに、ＡＰの制御放出用システムからなるタイプの薬物を製造するための、ＡＰを載荷するこれらのＣＰ（懸濁液又は固体状の：ＡＡＮＩとしてＡｓｐを含んでも含まなくてもよいＰＡＡ）の使用に関する。
【００９４】
特に、本発明は、少なくとも１つの活性成分ＡＰを載荷し、先に定義した水性懸濁液又は粉末状固体を製造するための、１以上の活性成分ＡＰを載荷するサブミクロン構造化粒子の安定コロイド懸濁液の使用に関し、これらの粒子は、
・ペプチド結合を有し、各タイプのアミノ酸が互いに同一又は異なる少なくとも２つの異なるタイプの親水性繰り返しアミノ酸ＡＡＩ、及び疎水性繰り返しアミノ酸ＡＡＯを含む、線状両親媒性ポリアミノ酸（ＰＡＡ）を基礎とし；
・未溶解状態においてコロイド懸濁液中の少なくとも１つのＡＰを会合することができ、
・且つ、特にインビボで、持続及び／又は遅延した様式でそれを放出することができ；
・ｐＨ４〜１３の水相中で、界面活性剤の非存在下で安定な、
個別化された（分離した）超分子配列であって、
・親水性繰り返しアミノ酸ＡＡＩが、アスパラギン以外の親水性中性アミノ酸ＡＡＮＩであり；
・疎水性繰り返しアミノ酸ＡＡＯが、疎水性中性アミノ酸ＡＡＮＯであり；
・ＡＡＮＩ及びＡＡＮＯ各タイプの繰り返しアミノ酸が互いに同一又は異なる。
【００９５】
薬物の例は、経口、経鼻、経膣、経眼、皮下、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、脳内、又は非経口経路によって好ましくは投与することができるものである。
【００９６】
考えられる化粧用途の例は、本発明に従ってＣＰに会合されたＡＰを含み、且つ経皮的に投与される組成物である。
【００９７】
植物の健康製品候補の例は、除草剤、農薬、殺虫剤、殺菌剤などである。
【００９８】
以下の実施例により、本発明が、その様々な製品／方法／用途の特徴に従って、よりよく理解されるであろう。これらの実施例は、活性成分を担持していてもいなくともよいポリアミノ酸粒子の調製法を説明するものであり、構造上の特性及びこれらの粒子の性質も提示するものである。
【００９９】
【実施例】
例１  ポリ（ロイシン／グルタミン酸メチル）ブロックコポリマーの調製
ＮＣＡをブロック又はランダムな構造のポリマーに重合するのに使用される技術は、当業者には周知であり、「α−Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  Ｎ−ｃａｒｂｏｘｙ  ａｎｈｙｄｒｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｅｓ」、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ（１９８７）と題するＨ．Ｒ．ＫＲＩＣＨＥＬＤＯＲＦの著書に詳述されている。そのような１つのポリマーの合成を以下に具体的に示す。
【０１００】
ポリ（Ｌｅｕ）40−ポリ（ＧｌｕＯＭｅ）80の合成：１０ｇのＮＣＡ−ＧｌｕＯＭｅを、１５０ｍｌのＮＭＰに、６０℃で溶解させる。ＮＭＰ５０ｍｌ中ベンジルアミン０．９１ｇの溶液５ｍｌを、全量一度にモノマーに添加する。１時間後、予め２０ｍｌのＮＭＰに溶解した１４．１ｇのＮＣＡ−Ｌｅｕを添加する。さらに３〜４時間重合を続ける。
【０１０１】
反応媒体をサンプリングして、次の特性が得られる：収率：９０％。1ＨＮＭＲ（ＴＦＡ−ｄ）による組成：ＧｌｕＯＭｅ６６ｍｏｌ％。還元粘度（ＴＦＡ中０．５％、２５℃）：０．４ｄｌ／ｇ。ＧＰＣ分子量：２０，０００ｇ／ｍｏｌ。
【０１０２】
例２  ポリ（ロイシン／グルタミン酸メチル）ブロックコポリマーのヒドロキシエチルアミンによるアミノ分解
例１に従って調製したポリマーのＮＭＰ溶液に、１０ｇのヒドロキシエチルアミンの全量を一度に添加する。反応媒体を８０℃に加熱し、この温度に２日間維持する。次いで、１５０ｍｌの水をポリマー溶液に添加し、次いで、透析ステップで精製して過剰のアミン及びＮＭＰを確実に除去する。最後に、粒子を凍結乾燥により単離する。
収率：定量。1ＨＮＭＲ（ＴＦＡ−ｄ）：残留メトキシ８％（３．５ｐｐｍ）；ヒドロキシエチルグルタミン９２％。１ＨＮＭＲ（ＴＦＡ−ｄ）による組成：Ｌｅｕ３４％。粒径（光散乱、ＱＬＳモード）：１００ｎｍ。
【０１０３】
例３  光散乱（ＬＳ）及び透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）によるナノ粒子の証明  ポリマー１の粒子１０ｍｇを、１０ｍｌの水又は塩の水溶液に懸濁させる。次いで、Ｃｏｕｌｔｅｒ粒度分析計（又はレーザー回折計）にこの溶液を導入する。試験した様々な生成物の粒径分析の結果を下記表１に示す。
【０１０４】
【表１】
0004499352.tif 000002
【０１０５】
例４  ナノ粒子とタンパク質（インシュリン）との会合試験
ｐＨ７．４の等張性リン酸緩衝液を用いて、ヒトインシュリンを１．４ｍｇ／ｍｌ（４０ＩＵ／ｍｌ相当）含む溶液を調製する。例１で調製したＣＰ１０ｍｇを、このインシュリン溶液１ｍｌ中に分散する。室温で１５時間インキュベーションした後、ＣＰと会合したインシュリンと遊離のインシュリンとを遠心分離（６０，０００ｇ、１時間）及び限外濾過（濾過カットオフ：３００，０００Ｄ）により分離する。濾液から回収した遊離のインシュリンをＨＰＬＣ又はＥＬＩＳＡでアッセイし、会合しているインシュリンを差から推算する。ＣＰと会合しているインシュリンの量は０．７７ｍｇを超え、用いた全インシュリンの５５％を超える。
【０１０６】
下記の表は、異なるＣＰについて実施した会合度の測定結果をまとめたものである。会合度は、１．４ｍｇ／ｍｌのインシュリンと１０ｍｇ／ｍｌのＣＰを含有する調製物中に使用されたインシュリンに対する会合したインシュリンの百分率で表される。この値を、タンパク質が１００％結合した状態の処方を表す載荷ファクター（ＣＰ１００ｍｇ当たりのインシュリンのｍｇ）に変換する。
【０１０７】
【表２】
0004499352.tif 000003
【０１０８】
例５  絶食した健康なイヌにおけるインシュリン載荷ＣＰの薬物動態学及び薬力学
例４の粒子＋インシュリン調製物を、膵全摘術により糖尿病性を付与し、前夜から絶食中のイヌに注射した。午前１１時に、動物の生体重ｋｇ当たりインシュリン０．５ＩＵの用量で、この調製物を胸郭中に皮下投与した。投与容積は、０．１８〜０．２４ｍｌである。−４、−２、０、１、２、４、６、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、４０、４４及び４８時に、減圧下、頚静脈穿刺によりヘパリンナトリウム管中に１ｍｌの血液を採取する。３０μｌの全血を即時に使用して血糖を測定する。次いで、この管を遠心し、上清をデカントし、インシュリンをアッセイするために血漿を−２０℃で貯蔵する。以下の図１の結果から、インシュリンが注射後１２時間まで放出され（実線）、実質的な血糖降下効果が注射後２０時間まで持続する（破線）ことが分かる。
【０１０９】
【表３】
0004499352.tif 000004
【０１１０】
この例から、本発明によるＣＰの存在下で、インシュリンが変性されないことが示される。
【０１１１】
また、例２により、処方されていないインシュリンと比較して、インシュリンの作用持続時間が増加し、したがって、インシュリンの制御放出用遅延システムとしてのＣＰの有用性を実証することができる。疎水基を適切に選択することによって作用持続時間をいかに制御できるかも示される。
【０１１２】
例６  ポリ（フェニルアラニン／グルタミン酸メチル）ブロックコポリマーのヒドロキシエチルアミンによるアミノ分解
ＮＣＡ−ＧｌｕＯＭｅ及びＮＣＡ−フェニルアラニンモノマーを用いて、例１に従って調製されたポリマーのＮＭＰ溶液に、１０ｇのヒドロキシエチルアミンの全量を一度に添加する。この反応媒体を８０℃に加熱し、この温度に２日間維持する。次いで、１５０ｍｌの水をポリマー溶液に添加し、次いで、透析ステップにより精製して、過剰のアミン及びＮＭＰを確実に除去する。最後に、粒子を凍結乾燥して単離する。
収率：定量。1ＨＮＭＲ（ＴＦＡ−ｄ）：残留メトキシ６％（３．５ｐｐｍ）；ヒドロキシエチルグルタミン９４％。1ＨＮＭＲ（ＴＦＡ−ｄ）による組成：Ｌｅｕ３４％。粒径（光散乱、ＱＬＳモード）：１００ｎｍ。
【０１１３】
例７  ポリ（ロイシン／グルタミン酸ベンジル）ブロックコポリマーの３−アミノプロピレン−１，２−グリコールによるアミノ分解
ＮＣＡ−ＧｌｕＯＢｚｌ及びＮＣＡ−Ｌｅｕモノマーを用いて、例１に従って調製されたポリマーのＮＭＰ溶液に、１０ｇの３−アミノプロピレン−１，２−グリコールの全量を一度に添加する。この反応媒体を８０℃で２日間加熱する。次いで、１５０ｍｌの水をポリマー溶液に添加し、次いで、これを透析ステップにより精製して、過剰のアミン及び溶媒を確実に除去する。最後に、粒子を凍結乾燥して単離する。
収率：定量。粒径（ＱＬＳ、例３に従う）：１００ｎｍ。
【０１１４】
例８  ナノ粒子とタンパク質（インシュリン）との会合試験
例４に従い、例６の単離粒子とヒトインシュリンを用いて、ＣＰ１００ｍｇ当たりのインシュリンのｍｇで表される載荷ファクターを求める。
【０１１５】
【表４】
0004499352.tif 000005
【０１１６】
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、インシュリンが注射後１２時間まで放出され（実線）、実質的な血糖降下効果が注射後２０時間まで持続する（破線）ことを示すグラフ。
【図１】
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