(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析物を含有しているかまたは含有している疑いがある水性サンプル中の少なくとも２つの分析物を定性的、半定量的または定量的に測定する方法であって、
（ｉ）第一次元に伸びるクロマトグラフィーによる分離ゾーンと、前記分離ゾーンから離間した平行な関係で前記第一次元に伸びておりかつ前記分離ゾーンに沿った検出ゾーンとを含む、フローマトリックスを準備し、前記検出ゾーンに前記分析物との生体特異的相互作用を介して前記少なくとも２つの分析物を捕獲し得る固定化試薬を含ませる段階と、
（ｉｉ）前記サンプルを分離ゾーンでまたは分離ゾーンの上流でフローマトリックスに加える段階と、
（ｉｉｉ）分離ゾーンで互いにクロマトグラフィーにより分離すべき前記少なくとも２つの分析物を分離ゾーンに搬送するために、フローマトリックス中で本質的に水性の第一流体流を前記第一次元の分離ゾーンに沿って生じさせる段階と、
（ｉｖ）前記分離された分析物を検出ゾーンに搬送し分析物を検出ゾーンで前記固定化試薬によって捕獲するために、前記第一流体流を中断し、前記第一次元に実質的に交差するフローマトリックスの第二次元で本質的に水性の第二流体流を検出ゾーンに向かって生じさせる段階と、
（ｖ）検出ゾーンで分析物を測定する段階と、
から成る方法。
【請求項２】
前記マトリックス中の前記流体流が毛管力によって促進されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
フローマトリックスが少なくとも実質的に偏平であることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
分離ゾーンと検出ゾーンとが同一平面内に配置されており、前記第一及び第二の流体流が水平流であることを特徴とする請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項５】
分離ゾーンと検出ゾーンとが互いに上下に重なって配置されており、前記第一流体流が水平流であり前記第二流体流がフローマトリックスの深層流であることを特徴とする請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項６】
フローマトリックス中の流体搬送が少なくとも部分的にマトリックス自体の毛管力によって生じることを特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
フローマトリックス中の流体搬送が、フローマトリックスから独立したまたはフローマトリックスに一体的な吸収エレメントによって少なくとも促進されることを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
アッセイを開始する前にフローマトリックスを本質的に水性の流体によって湿らせることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項１に記載の検出段階（ｖ）が前記捕獲分析物を検出可能な試薬と反応させることから成る請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
検出可能な試薬が免疫化学的試薬であることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の検出段階（ｖ）がマトリックス中の未反応の固定化試薬を検出可能な分析物または検出可能な分析物類似体と反応させることから成る請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記検出可能な試薬、分析物または分析物類似体が検出可能なラベルを含むことを特徴とする請求項９、１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記検出可能な試薬、分析物または分析物類似体が第三の流体流によって導入されることを特徴とする請求項９から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記第三の流体流が前記フローマトリックスの１つの側縁から加えられる水平流であることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記クロマトグラフィーが、イオン交換クロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー及び疎水性相互作用クロマトグラフィーから選択されることを特徴とする請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記分離ゾーンが前記第一方向に分離能力に関する勾配を有することを特徴とする請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記分析物が生体分子のヘテロ形態であることを特徴とする請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ヘテロ形態が異なる電荷を有していることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記分析物が糖タンパク質であることを特徴とする請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記フローマトリックスが膜から成ることを特徴とする請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記マトリックスが内部に付着した粒子を含む膜から成ることを特徴とする請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記検出ゾーンが、固定化試薬を含有する少なくとも２つの平行な検出線またはバンドを含むことを特徴とする請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
検出ゾーンにおける分析物の結合が免疫化学的相互作用によることを特徴とする請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
サンプル中の少なくとも２つの分析物を測定する装置であって、
（ｉ）フローマトリックスの第一次元に離間した平行な関係で伸びるクロマトグラフィーによる分離ゾーンと前記分離ゾーンに沿った検出ゾーンとを有し、検出ゾーンが分析物との生体特異的相互作用によって前記少なくとも２つの分析物と結合し得る固定化試薬を含んでいるフローマトリックスと、
（ｉｉ）フローマトリックス中で本質的に水性の第一流体流をフローマトリックスの前記第一次元の分離ゾーンに沿って生じさせる手段と、
（ｉｉｉ）前記第一次元に実質的に交差する前記フローマトリックスの第二次元で本質的に水性の第二流体流を検出ゾーンに向かって生じさせる手段と、
から成り、
分析物含有サンプルが分離ゾーンに導入されると、前記少なくとも２つの分析物は分離ゾーンを通る前記第一流体流によって分離ゾーンで互いにクロマトグラフィーにより分離され、前記第二流体流によって検出ゾーンに搬送され、前記検出ゾーンで分析物が測定用の固定化試薬に結合することを特徴とする装置。
【請求項２５】
フローマトリックスが毛管力に促進されて流体流を通過させ得ることを特徴とする請求項２４に記載の装置。
【請求項２６】
フローマトリックスが少なくとも実質的に偏平であることを特徴とする請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
分離ゾーンと検出ゾーンとが同一平面内に配置されており、前記第一及び第二の流体流が水平流であることを特徴とする請求項２４、２５または２６に記載の装置。
【請求項２８】
分離ゾーンと検出ゾーンとが互いに上下に重なって配置されており、前記第一流体流が水平流であり、前記第二流体流がフローマトリックスの深層流であることを特徴とする請求項２４、２５または２６に記載の装置。
【請求項２９】
分離ゾーンが請求項１５から１６のいずれか一項に規定のゾーンであることを特徴とする請求項２４から２８のいずれか一項に記載の装置。
【請求項３０】
フローマトリックスが請求項２０または２１に規定のフローマトリックスであることを特徴とする請求項２４から２９のいずれか一項に記載の装置。
【請求項３１】
検出ゾーンが、固定化試薬を含有する少なくとも２つの平行な検出線またはバンドを含むことを特徴とする請求項２４から３０のいずれか一項に記載の装置。
【請求項３２】
装置がフローマトリックス中に液体吸引を生じさせる手段を含むことを特徴とする請求項２４から３１のいずれか一項に記載の装置。
【請求項３３】
液体吸引を生じさせる前記手段がフローマトリックスの下流末端の吸収性部材から成ることを特徴とする請求項３２に記載の装置。
【請求項３４】
装置がフローマトリックスに流動液体を供給する手段を含むことを特徴とする請求項２４から３３のいずれか一項に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明はサンプル中の分析物の測定方法及び装置、より特定的には分析物が検出に先立って分離されるような分析物の測定方法及び装置に関する。
【０００２】
（発明の背景）
生体分子はアイソフォームのような複数のヘテロ形態で存在し、ヘテロ形態中の分子構造の小さい変化が分子の作用の大きい変化の原因になり得る。しかしながら、特異的抗体に対する結合に関しては通常は化合物間の競合が生じるので、イムノアッセイのような高い特異性を有する方法を用いたとしてもこのような小さい構造変化を特定的に測定することは難しい。我々の同時係属中の国際出願（ＰＣＴ）ＷＯ９９／６０４０２には、このような構造変化が検討され、幾つかのヘテロ形態、例えば最大の正電荷または負電荷を有するヘテロ形態を測定する方法が開示されている。該方法は、サンプル付加ゾーンとその下流の検出ゾーンとを有しているフローマトリックスを使用し、分析物と結合する試薬を検出ゾーンに固定化し、結合した分析物を検出ゾーンで検出する。サンプル付加ゾーンと検出ゾーンとの間に分離ゾーンが設けられている。分離ゾーンで夾雑成分または測定対象でない成分を結合させるかまたは遅滞させ、このような成分が分析物と共に検出ゾーンに到達することを防ぐ。例えば分析物が２つのヘテロ形態の一方である場合、分析物の選択的検出を可能にするために、結合ゾーンで分析物と競合的に結合する測定対象でない他方のヘテロ形態を分離ゾーンに遅滞させる。しかしながら、３つ以上のヘテロ形態が存在する場合も少なくはない。例えば、トランスフェリンは少なくとも９個の異なるアイソフォームとして存在し、アルコール濫用を試験するためには、幾つかのアイソフォーム、主としてジシアロトランスフェリン及びアシアロトランスフェリンを測定することが重要である。複合混合物中の全部のアイソフォームを測定できるようにするために、これまではカラムクロマトグラフィーによってアイソフォームを分離し、次いで測定すべき分析物の濃度に応じて分光光度法またはイムノアッセイ法で検出することによって各画分のアイソフォームの存在を分析することが必要であった。
【０００３】
ＷＯ９９／３０１４５は、サンプル中の核酸、タンパク質、糖質または脂質を定性的に測定するための２次元ゲル電気泳動を開示している。このゲルは分離ゲルと検出ゲルとを含んでおり、分離ゲルの内部スロットにサンプル充填ゾーンが設けられており、１つまたは複数のターゲット分子のプローブが検出ゲルに固定化されている。分離ゲル中で第一次元に電気泳動させて分離した後、ゲルを９０度回転させ、ターゲット分子を検出ゾーンに搬送するために第二次元に電気泳動させ、検出ゾーンで固定化プローブに結合したターゲット分子を検出する。ＷＯ９９／３０１４５は、ヘテロ形態が測定できることを全く示唆していない。また電気泳動システムは一般に、電気泳動システムに追加の検出段階を組込む必要があるときは特に、操作が難しくコストも高い。
【０００４】
米国特許ＵＳ−Ａ−４，４６９，６０１は、薄層クロマトグラフィープレートでサンプルを成分列に分離する多次元クロマトグラフィーの方法及びシステムを開示している。これらの成分を次に、成分列に交差する方向で流体をプレートにポンピングすることによって第二の列、即ち、サブ成分列に分離し、サブ成分がこの第二方向で所定の位置を通過するときにサブ成分を検出する。しかしながら、薄層クロマトグラフィーは小分子（即ち、低分子量分子）の分離に限定されており、例えばタンパク質のような生体分子を分離することはできない。
【０００５】
Ｐｒｉｓｔｏｕｐｉｌ，Ｔ．Ｉ．，Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．Ｒｅｖ．，１２（１９７０）１０９−１２５は、クロマトグラフィー及び電気泳動におけるニトロセルロースフィルターの使用を記載している。プレキシガラス室内の水平状態のニトロセルロース膜を用いて水溶液中でクロマトグラフィー処理した。染色用溶液に膜を浸漬させることによってタンパク質を検出し、常用のスプレーまたはサンドイッチ法によって他の物質を検出した。無加工の（ｉｎｔａｃｔ）膜の上では、１０５以上のオーダの分子量をもつタンパク質は膜に強固に吸着されるが、ペプチド、アミノ酸及びその他の親水性の低分子量物質は展開溶液の前縁と共に泳動した。電気泳動の場合、タンパク質の高度な吸着を防止するために膜に中性洗剤を含浸させることが必要であった。また、ウシ血清を吸着させた膜を用いるウサギ抗ウシ血清及び免疫化学的に不活性の正常ウサギ血清のイムノクロマトグラフィーも記載されている。抗原−抗体複合体は最初から顕著なスポットを示したが、免疫化学的に不活性のタンパク質は顕著な吸着を生じることなく泳動した。従って、成分の“適正な”クロマトグラフィーは、無加工の（即ち手を加えていない）膜を用いたかまたは抗体がコートされた膜を用いたかではなく、強固な結合が生じたかまたは結合が全く生じなかったかによって得られたと考えられる。
【０００６】
従って、生体分子のヘテロ形態を測定することができ、しかも、従来技術の方法及び装置よりも迅速かつ容易にアッセイを実施できるような分析方法及び装置が要望されている。
【０００７】
（発明の概要）
従って、本発明の１つの目的は、従来技術の方法の欠点を克服し、複合サンプル中でもアイソフォームのような生体分子のすべてのヘテロ形態を迅速かつ確実に測定することが容易な測定方法を提供することである。本発明の別の目的は、単一のプレート、シートまたはチップ上で実施し得る測定方法を提供することである。本発明の更に別の目的は、本発明方法を実施するための簡単で使用し易いプレート、シートまたはチップ型の装置を提供することである。
【０００８】
本発明によれば、上記及びその他の目的及び利点は、水性サンプル中の（アイソフォームのような）分析物を、毛管力で促進される流体流を通し得るフローマトリックス、特にクロマトグラフィー膜（例えばイオン交換膜）のような偏平フローマトリックス中で分離する方法によって得られる。本発明の特徴によれば、分離した分析物を測定するために、分離した分析物をフローマトリックスの分離エリアから分離方向に実質的に交差する方向に溶出させ、通常は線またはバンドの形態に反応体が固定化された（例えば、全部の分析物に共通の単一抗体が固定化された）捕獲ゾーンに泳動させ、溶出した分析物を該ゾーンで捕獲する。捕獲ゾーンでは、捕獲した分析物に結合し得る検出試薬を添加することによって分析物を検出及び測定し得る。検出試薬は例えば、黒色粒子によって標識された抗体のような適宜標識された抗アイソフォーム抗体でもよい。黒色粒子によって標識された抗体の場合、例えば、検出線またはバンドに沿った色の濃淡をスキャナーによって容易に検出し定量し得る。
【０００９】
分離段階及び溶出段階で本質的に水性の系を使用する。本文中に使用した“本質的に水性の”という表現は、系が完全に水性であるかまたは１種以上の別の溶媒を約３％以下の少量で含有し得ることを意味する。
【００１０】
本質的に水性の系の好ましくは約９９％、より好ましくは約９９．５％、通常は少なくとも約９９．９％が水である。
【００１１】
従って、本発明の第一の目的は、分析物を含有しているかまたは含有している疑いがある水性サンプル中の少なくとも２つの分析物を定性的、半定量的または定量的に測定する方法であって、
（ｉ）第一次元に伸びる分離ゾーンと分離ゾーンから離間した平行な関係で該第一次元に伸びる検出ゾーンとを含むフローマトリックスを準備し、該検出ゾーンに該分析物との生体特異的相互作用を介して該分析物を捕獲し得る固定化試薬を含ませる段階と、
（ｉｉ）該サンプルを分離ゾーンでまたは分離ゾーンの上流でフローマトリックスに加える段階と、
（ｉｉｉ）分離ゾーンで分離すべき分析物を分離ゾーンに搬送するために、フローマトリックス中で本質的に水性の第一流体流を該第一次元の分離ゾーンに沿って生じさせる段階と、
（ｉｖ）該分離された分析物を検出ゾーンに搬送し分析物を検出ゾーンで該固定化試薬によって捕獲するために、該第一流体流を中断し、該第一次元に実質的に交差するフローマトリックスの第二次元で本質的に水性の第二流体流を検出ゾーンに向かって生じさせる段階と、
（ｖ）検出ゾーンで分析物を測定する段階と、
から成る方法を提供することである。
【００１２】
本発明の別の目的は、サンプル中の分析物を測定する装置であって、
（ｉ）フローマトリックスの第一次元に離間した平行な関係で伸びる分離ゾーンと検出ゾーンとを有し、検出ゾーンが分析物との特異的相互作用によって分析物と結合し得る固定化試薬を含んでいるフローマトリックスと、
（ｉｉ）フローマトリックス中で本質的に水性の第一流体流をフローマトリックスの該第一次元の分離ゾーンに沿って生じさせる手段と、
（ｉｉｉ）該第一次元に実質的に交差する該フローマトリックスの第二次元で本質的に水性の第二流体流を検出ゾーンに向かって生じさせる手段と、
から成り、
分析物含有サンプルが分離ゾーンに導入されると、分析物は分離ゾーンを通る該第一流体流によって分離ゾーンで分離され、該第二流体流によって検出ゾーンに搬送され、該検出ゾーンで分析物が測定用の固定化試薬に結合することを特徴とする装置を提供することである。
【００１３】
好ましくは、フローマトリックスが少なくとも実質的に偏平である。
【００１４】
分離ゾーン及び検出ゾーン（互いに一体的でもよくまたは独立の２つの部を互いに接合してもよい）はフローマトリックスの同一平面内に配列されてもよく、または互いに上下に重ねて配置されてもよい。後者の場合、本発明方法の分離段階の実行中に例えば着脱自在な隔壁エレメントによって２つのゾーンが互いに接触することを防止しなければならない。このような隔離エレメントはフィルムなどでよく、上記の処理段階（ｉｖ）及び（ｖ）に先立って除去される。
【００１５】
（図面の簡単な説明）
図１は、本発明装置の１つの実施態様の概略平面図である。
図２Ａ、２Ｂ及び２Ｃは、各々が本発明方法の異なる段階を示す図１の装置の概略平面図である。
図３は、本発明方法によって分析されたトランスフェリンアイソフォームの検出された濃度曲線を示すグラフである。
図４は、本発明方法による別々の分析によって検出されたトランスフェリンアイソフォームの４つの濃度曲線を合わせて示すグラフである。
【００１６】
（発明の詳細な説明）
上述のように、本発明方法は、抗体のような特異的リガンドまたは受容体によって識別できない生体分子のヘテロ形態、即ち、密接に近縁の生体分子分析物を測定するために特に有効である。代表的なヘテロ形態は、タンパク質のアイソフォーム、例えば、異なるグリコシル化形態のタンパク質（糖タンパク質）であり、これらの糖タンパク質では、糖質構造の小さい差異によって異なる等電点、アイソザイムなどをもつアイソフォームが生じる。ヘテロ形態なる用語はまた、特に生体親和性（ｂｉｏａｆｆｉｎｅ）複合体の種々の形態を包含する。複合体の一方の要素がアイソフォームタンパク質、例えば遊離分子及び抗体結合分子である。２つの化合物が互いにヘテロ形態であるか否かを判定するためにいわゆる阻害試験を使用し得る。被疑アイソフォームの一方または双方とリガンドとを反応させ結果を比較することによって、分子がアイソフォームであるか否かを判定することが可能である。
【００１７】
トランスフェリン、ＦＳＨ、ＬＨ及びＴＳＨのような糖タンパク質は多様なアイソフォームが存在する分析物の例であり、アイソフォームの相対的発生率は臨床的に重要であるが、アイソフォームが免疫化学的見地では極めて類似しているので通常はイムノアッセイによって識別することができない。本発明の別の例は、いわゆる心臓マーカー（例えばクレアチニンキナーゼ）であり、これは細胞外媒体中でプロトリシス的分解の結果として異なる電荷をもつ種々のアイソフォームが存在する。
【００１８】
トランスフェリン及びそれらの有益なアイソフォームは血液中にかなり高い濃度で存在し、十分な量のサンプルがカラムに加えられるならば、カラム分離後直接に分光光度法によるオンライン検出によって分析できる（Ｊｅｐｐｓｓｏｎ，Ｊ．−Ｏ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３９／１０，２１１５−２１２０（１９９３））。ホルモンＦＳＨ、ＬＨ及びＴＳＨのような別の分子は低濃度で存在するので、イムノアッセイ検出が必要である（Ｗｉｄｅ，Ｌ．，Ａｃｔａ  Ｅｎｄｏｃｒｏｎｏｌｏｇｉｃａ  １９８５，１０９：１８１−１８９）。
【００１９】
本発明方法では、アイソフォームのような分析物の分離を行うために、アイソフォーム含有サンプルを特に膜のような偏平なフローマトリックスに付加し、第一液体流によってフローマトリックスの分離エリアでアイソフォームを分離し、次いで、分離したアイソフォームを第一液体流に交差する第二液体流で溶出させる。その結果として、アイソフォームが分離エリアから除去されて、通常は線またはバンドとして固定化された捕獲用試薬を含む検出エリアに到達し、該試薬によって捕獲される。次いで捕獲されたアイソフォームに検出試薬、例えばアイソフォームに対する標識抗体を加えることによって検出し得る。検出試薬は、上記第二流の方向と同方向、対向方向または交差方向の第三流体流を介して添加し得る。
【００２０】
１つの実施態様では（現在ではより好ましい実施態様もある）、分離ゾーン及び検出ゾーンが、互いに上下に重なって配置された独立の２つのフローマトリックス部材に設けられてもよく、これらの部材は、分離された分析物を溶出させて検出ゾーンに搬送する前に除去される着脱自在なフィルムなどによって隔離されていてもよい。
【００２１】
このような分析用に設計された膜のような偏平なフローマトリックスは、分離ゾーンと、該分離ゾーンから離間した平行な検出ゾーンとを含み、検出ゾーンは、検出ゾーンに沿って伸びる１つまたは複数の線またはバンドの形態で固定化された捕獲試薬を含んでいる。
【００２２】
上記から容易に理解されかつ以後の記載からより十分に理解されるであろうが、本発明はこれまでに達成することができなかったようなタンパク質のアイソフォーム及びその他のヘテロ形態を迅速に分析する方法及び装置を提供する。
【００２３】
フローマトリックス
フローマトリックス（分離ゾーンと検出ゾーンとを含む）の材料は、いわゆるイムノクロマトグラフィー定量法で従来から使用されている材料と同種の材料でよく、サンプル成分（分析物を含む）と反応体との搬送スペースを形成しているが、勿論、材料が種々の方向の流れを許容するという条件を伴う。マトリックスの内面、即ち、マトリックス中のフローチャネルの表面は、バッファ、血清、血漿、血液、唾液などのような水性媒体がマトリックス中で搬送され得るように十分に親水性でなければならない。この搬送は、毛管力によって、例えばマトリックス自体またはマトリックスに接触した吸収エレメント（例えば、セルロースの吸取パッドなど）のような補助手段に生じる毛管力によって遂行または促進される。任意に、ポンプデバイスで圧力または吸引を作用させることによって毛管流を更に促進してもよい。最小の内側寸法（円形チャネルでは直径として測定される）は、分析物と添加された反応体とがマトリックス中で搬送され得る十分な大きさでなければならない。マトリックスが連通するフローチャネル系を有しているとき、適当なマトリックスは、フローチャネルの最小内側寸法が典型的には０．０１−１，０００μｍ、好ましくは０．４−１００μｍの範囲の値を有しているマトリックスから選択される。（１，０００μｍまでという）広い範囲の高い値域に最小寸法を有しているようなフローチャネルは、外的に加えられる圧力／吸引によって流れが駆動される場合に主として使用され得る。
【００２４】
現在では、フローマトリックスが通常は約５００μｍ未満、例えば約２５μｍ−約５００μｍの範囲の膜厚、好ましくは約１５０μｍ未満、例えば約７５μｍ−約１５０μｍの膜厚をもつ膜の形態であるのが好ましい。しかしながら当業界で公知のように、ゲル、または、相互接続チャネルが食刻されたシリコン（またはガラス）のプレートもしくはチップのような別の形態のマトリックスを考察することも可能である。
【００２５】
適当なマトリックスはしばしば、ポリマー、例えば、ニトロセルロース、ポリエステル、ポリエーテルスルホン、ナイロン、硝酸／酢酸セルロース、セルロース、再生セルロースから構成される。このような材料から成る膜は緻密な裏面を備える、例えばポリエステルで裏打ちされているのが有利である。
【００２６】
フローマトリックス材料の均質性はそのクロマトグラフィー品質に影響を与えるので、これを理論的プレート高さによって表す。理論的プレート高さが低いほど優れた材料である。例えば、本発明に使用する膜は、好ましくは約５００μｍ未満、特に約１００μｍ未満の理論的プレート高さ（ＨＥＴＰ）を有していなければならない。
【００２７】
分離ゾーン
分離ゾーンと検出ゾーンとは同一フローマトリックスの一体部分でもよくまたは独立部品の集成でもよい。任意に２つ以上のサブゾーンから成り得る分離ゾーンの基本原理は、イオン交換クロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ゲル濾過（サイズ分離）（例えば、ゲルまたは緻密な膜を使用する）クロマトグラフィー、ＩＭＡＣ（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｍｅｔａｌ  ｃｈｅｌａｔｅ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）のようなアフィニティ（好ましくは、１０６未満、特に１０３−１０６という中等度の結合定数）クロマトグラフィー、及び、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）のような本質的に水性の系を使用できるということである。
【００２８】
分離ゾーンは所望のサンプル成分（分析物及び近縁のヘテロ形態）に対してある程度の結合能力を有しているリガンド／構造を示す。特に特異性、結合強度（アフィニティ）及び動力学（ｋｉｎｅｔｉｃｓ）に関して本発明の目的に適うリガンドまたは構造の選択は当業者に直ちに明らかであろう。従って分離ゾーンで分離することが可能なリガンドは、電荷を有するリガンド（アニオン性、カチオン性、両性＝イオン交換性リガンド）、または、両性／両親媒性、生体親和性、キレート性、イオウ含有性（いわゆるチオ親和性アフィニティに対しては主としてチオエーテル）のリガンド、または、π−π相互作用に基づくリガンド、疎水性リガンド、などである。生体特異的アフィニティリガンドのうちでは、主として所謂イムノリガンド、即ち抗体及びその抗原結合性フラグメントが注目される。
【００２９】
問題のリガンド／構造は製造プロセスでマトリックスに物理的に導入される構造でもよく、または、マトリックスへの共有結合によってもしくは物理的吸着を介して分離ゾーンに固定されてもよい。マトリックスに対するリガンド／構造の固定は、分離に使用されるリガンドと共有結合したか、物理的吸着したかまたは生体特異的結合したポリマーまたは別の置換基を介して行われてもよい。あるいは、所望のタイプのリガンドを提供するポリマー粒子の付着を用いることも可能である。粒子は親水性でも疎水性でもよく、粒子に吸着されるかまたは共有結合した化合物によってリガンド構造が提供される。分離用リガンドをマトリックスに結合させる技術に関しては、例えば、我々の先行国際特許出願（ＰＣＴ）ＷＯ９９／３６７８０、ＷＯ９９／３６７７６及びＷＯ９９／３６７７７（これらの特許の記載内容は参照によって本発明に含まれるものとする）を参照し得る。これに関連して、共有結合したリガンドを有する市販の膜、例えば、ＤＥＡＥセルロースペーパー（ジエチルアミノエチル）（ＤＥ８１、Ｗｈａｔｍａｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｔｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）が存在することを記載しておく。
【００３０】
リガンド密度（置換度）は、所望のアイソクラチック分離が得られるように選択する。任意に、分離ゾーンが種々のリガンド密度を有していてもよく、または、分離方向に沿ったリガンド密度の勾配を有していてもよい。
【００３１】
イオン交換官能基の例は、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、トリメチルヒドロキシプロピル（ＱＡ）、第四級アミノエチル（ＱＡＥ）、第四級アミノメチル（Ｑ）、ジエチル−（２−ヒドロキシプロピル）−アミノエチル、トリエチルアミノメチル（ＴＥＡＥ）、トリエチルアミノプロピル（ＴＥＡＰ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）のようなアニオン交換体、及び、メタクリレート、カルボキシメチル（ＣＭ）、オルトホスフェート（Ｐ）、スルホネート（Ｓ）、スルホエチル（ＳＥ）、スルホプロピル（ＳＰ）のようなカチオン交換体である。
【００３２】
リガンドのコーティング後、通常は膜マトリックスの望ましくないバックグラウンドもしくは非特異的吸着作用を実質的に減少させるかまたは除去する洗剤または当業界でそれ自体公知のその他の適当な物質で膜を処理する。
【００３３】
分析物含有サンプルはフローマトリック表面に直接添加してもよいが、通常は独立のサンプル塗布膜または該膜に液体接触するパッドに添加される。パッドは縁−縁接触によって膜に接触してもよいが、好ましくはフローマトリックスの頂部に取り付けられる。
【００３４】
分離ゾーンにおける分析物の分離条件は使用される分離原理に応じて選択されるが、一般には段階的または連続的に変化するイオン強度のアイソクラチック条件が使用される。また、分離ゾーンからの分析物の交差方向溶出は通常はアイソクラチック条件で行われる。従って、例えばゲル濾過の場合には分離バッファと溶出バッファとが同じでもよいが、イオン交換クロマトグラフィーの場合には分離した分析物を効率的に溶出するために通常は高いイオン強度の溶出バッファを使用する必要がある。
【００３５】
検出ゾーン
検出ゾーンにおける分析物捕獲は、生体特異的捕獲、好ましくは免疫化学的捕獲または基特異的捕獲、例えば疎水性基の存在に基づくタンパク質の結合のような種々の原理に基づく。現在では、生体特異的捕獲が好ましく、この場合の結合定数Ｋは１０８よりも大きい値であるのが望ましい。
【００３６】
捕獲試薬は、当業界で公知のように、例えば分離ゾーンのリガンドに関して上述した方法でフローマトリックスの検出部に結合または固定化され得る。
【００３７】
上述のように、検出ゾーンは好ましくは連続線またはバンドの形態の捕獲試薬を含む。１つまたは複数の分析物が高濃度で存在する場合、２つまたは場合によってはそれ以上の検出線またバンドを使用することが必要であろう。同様に、検出ゾーンのリガンド密度は種々の分析物の互いの濃度次第で変更し得る。
【００３８】
検出ゾーンは勿論、分離が完了する前に分析物が検出ゾーンに拡散しないように分離ゾーンから十分に離間していなければならない。
【００３９】
分離ゾーンからの分析物の解放及び検出ゾーンへの搬送が実質的に完全であることが望ましいが、全部の分析物が検出ゾーンで同じ程度に結合するならば検出ゾーンでの結合に関しては必ずしも完全である必要はない。
【００４０】
使用されるフローマトリックスのタイプ次第では、分離ゾーンからの溶出流を、適当なデリミッター、例えばワックスデリミッター、レーザー刻設溝、などによって検出ゾーンに案内し得る。
【００４１】
分離ゾーンと検出ゾーンとは、異なる材料から成る独立部品であり、組合せフローマトリックスを形成するように接合されてもよい。しかしながら２つのゾーンはまた、当業界でそれ自体公知のように膜またはチップのような一体マトリックスの上に適当な化学的／物理的改質によって設けられてもよい。
【００４２】
検出方法及び試薬
検出ゾーンで捕獲された分析物の検出及び定量は種々の方法で行うことができる。捕獲された分析物が酵素的に活性である場合、分析物は適当な基質に対する作用、例えば色の変化によって検出され得る。しかしながら通常は検出可能な試薬を添加する。このような基質または試薬は、（ｉ）フローマトリックスの分離方向に交差する側縁の１つ（通常は長辺）から好ましくは溶出流の対向方向で、または、（ｉｉ）フローマトリックスの分離方向に伸びる側縁の１つ（通常は短辺）から、または、（ｉｉｉ）パッドもしくはマトリックスの折り畳み可能部分を介して通常は検出ゾーンの近傍でマトリックスの頂部から、マトリックス内の流体流に添加され、基質または試薬が流体流によって検出ゾーンに搬送される。後者の場合、拡散性の検出用試薬を任意にパッドまたは折り畳み可能部分に予め付着させておいてもよい。このような予めの付着及び折り畳み構造は当業界でそれ自体公知である。余剰の基質または試薬はバッファ流によって除去されるであろう。
【００４３】
検出可能な試薬は通常は、酵素活性基（例えば基質に作用して発色する）、蛍光発生基、色素原性基、ハプテン、ビオチン、放射性ラベル（オートラジオグラフィー）、粒子などのような分析的に検出可能な基で標識された生体特異的親和性をもつ反応体である。分析的に標識された反応体の常用の形態は標識抗体である。
【００４４】
標識抗体は、（ｉ）捕獲剤が標識抗体と同じ抗原（＝分析物）または抗原／ハプテンに対する抗体から成るサンドイッチ法のような非競合法、または、（ｉｉ）限定量の抗分析物抗体に対して分析物と固相結合分析物類似体との競合が生じるような競合法に使用され得る。
【００４５】
特に有効な標識基は、粒子、例えば、従来型スキャナーによって直接測定し得る黒色カーボン粒子である。任意に、粒子が蛍光発生基または色素原性基（それぞれ蛍光粒子または有色粒子）のような上述の検出可能基の１つを含む。有用な粒子はしばしば、０．００１−５μｍの範囲、好ましくは０．０５−５μｍの範囲の粒度を有している。粒子がコロイド寸法を有しており、いわゆるゾル（即ち、通常は０．００１−１μｍの範囲の粒度を有する球形粒子の単分散系）でもよい。特に挙げられるのは、金属粒子（例えば金ゾル）、非金属粒子（例えばＳｉＯ２、カーボン、ラテックス及び死亡赤血球と細菌）である。また、非コロイド寸法の粒子も使用されている。これらは多少とも不規則で、多少とも多分散性である（例えば１μｍ未満のカーボン粒子；例えば我々のＷＯ９６／２２５３２参照）。
【００４６】
粒子が標識基のとき、検出ゾーンで形成される複合体はしばしば、肉眼でまたは光学測定装置（例えば、イメージ解析専用ソフトウェアを含むコンピューターに結合されたＣＣＤカメラまたはレーザースキャナー）によって検出できる。
【００４７】
標識基となる粒子に関しては更に、ＷＯ８８／０８５３４（Ｕｎｉｌｅｖｅｒ）；米国特許ＵＳ−Ａ−５，１２０，６４３（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｓ．）；欧州特許ＥＰ−Ａ−２８４，２３２（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を参照するとよい。
【００４８】
本発明は主として、生物サンプル、例えば、血液（血清、血漿、全血）、唾液、涙液、尿、脳脊髄液、汗などに使用される。本発明はまた、発酵溶液、反応混合物、などのような別のサンプルにも使用し得る。
【００４９】
代表的実施形態
本発明の理解を容易にするために、本発明の１つの実施形態を添付の図１及び図２Ａ−２Ｃに基づいて単なる代表例として以下に詳細に説明する。
【００５０】
図１は、本発明方法に従ってタンパク質のアイソフォームまたは別のヘテロ形態を分析するために使用し得る膜の概略図である。図示の場合の膜は異なる材料から成る２つの部、即ち、分離部１と検出部２との組合せから成り、双方の部が（図示しない）接着テープ片によって組合せ膜の裏面に接合され、オーバーラップとなる薄膜バンド３によって互いに液体受容的に接触している。この膜バンド３は接着テープ片４によって分離／検出膜に固定されている。分離部は組合せ膜の分離ゾーンを規定している。検出部２は分析物捕獲試薬が線５の形態に固定化された検出ゾーンを有しており、線５の幅は例えば約１ｍｍである。参照符号６は測定範囲を拡大するために追加した任意の検出線を表す。膜の短辺は図１にａ及びｃ、長辺はｂ及びｄでそれぞれ示す。
【００５１】
膜は図２Ａ−図２Ｃに基づいて以下に説明するように使用され得る。膜を湿らせた後、分析すべき２つの分析物（以下の記載では分析物１及び分析物２と呼ぶ）を含有するサンプルを７で分離ゾーン１に加える（図２Ａ）。分離バッファを含浸しているパッド８を膜の短辺ａに付加し、吸取パッド９を対向する短辺ｃに付加する。これによって図２Ａの矢印方向にバッファ流が生じ、２つの分析物は図２Ａに点１０（分析物１）及び１１（分析物２）で示すように分離される。
【００５２】
次に図２Ｂに示すように、パッド８と９とを取り外し、溶出剤含有パッド１２を長辺ｄに取り付け、吸取パッド１３を長辺ｂに取り付ける。これによって図２Ｂの矢印方向で溶出剤流が生じ、分離された分析物１及び分析物２が検出ゾーンに搬送され、検出ゾーンでそれぞれ固定化試薬線に沿った位置１４及び１５で固定化試薬に捕獲される。
【００５３】
次に図２Ｃに示すように、パッド１２と１３とを取り外し、長辺ｄは吸取パッド１６及び長辺ｂは標識反応体の溶液または懸濁液を入れた容器１７に交換する。これによって標識反応体は矢印の方向に泳動し、図２Ｃの１８及び１９で捕獲分析物１及び２に結合する。標識複合体、従って対応する分析物１及び２を次に、検出線に沿ったラベルからのシグナルの強度を読み取り、それぞれの量を算出することによって検出し定量し得る。ラベルがカーボン粒子の場合、測定をスキャナーによって行うのが有利であろう。
【００５４】
上述のように流れを手動操作で開始させかつ停止させる方法は勿論単なる代表例として示しただけであり、例えばいわゆるインプリント液体回路（例えばＷＯ９３／１０４５７参照）などのようなより複雑な手段は当業者に容易に明らかであろう。
【００５５】
トランスフェリンのアイソフォームの分析に使用される本発明方法の特定実施例を以下に記載する。
【００５６】
実施例１：トランスフェリンのアイソフォームの定量
（ｉ）アニオン交換特性をもつ分離膜の製造
ニトロセルロース膜のシート（３μｍ、ポリエステル裏打ち上のニトロセルロース、Ｗｈａｔｍａｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｔｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を０．０３％のポリエチレンイミン（ＰＥＩ，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）の溶液に入れた。混合物を３時間振盪し、次いで膜を０．１％トゥイーン２０中に３０分間維持し、風乾し、次いでプラスチックバッグに入れて＋４℃で保管した。
【００５７】
（ｉｉ）検出膜の製造
３ｍｇ／ｍｌの抗トランスフェリンモノクローナル抗体をニトロセルロース膜（５μｍ、ポリエステル裏打ち上、Ｗｈａｔｍａｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｉｏｎａｌ  Ｌｔｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）のストリップ（２９ｃｍ×４ｃｍ）の中央に、２ｍｍ間隔を隔てるストリップの長辺に平行な１ｍｍ幅の線の形態にスプレーした。スプレー装置（ＩＶＥＫ  Ｌｉｎｅａｒ  Ｓｔｒｉｐｅｒ  ＩＶＥＫ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｖｅｒｍｏｎｔ，ＵＳＡ）は１μｌ／ｃｍの吐出速度で使用した。膜を室温で乾燥しプラスチックバッグに入れて＋４℃で保管した。
【００５８】
（ｉｉｉ）組合せ膜の製造
分離膜を１．５×５ｃｍに裁断し、検出膜を２つの抗体線が長辺に平行に膜の中央に位置するようにして２×５ｃｍに裁断した。２つの膜を長辺に沿って突き合わせ状態にぴったりと並べ、下面を接着テープで接合した。ニトロセルロース膜片（０．２ｃｍ×５ｃｍ、８μｍ、Ａ９９、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｈｕｅｌｌ，Ｄａｓｓｅｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を２つの膜の上面にオーバーラップとして配置した。形成された組合せ分離／検出膜の短辺に０．５ｃｍの未被覆部分が残るようにしてこの膜を１×４ｃｍの自己接着性ポリエステルフィルム（Ｇｅｌｍａｎ接着ポリエステルフィルム、３ｍｉｌ）によって固着した。以後の記載では、組合せ膜の２つの短辺をそれぞれａ及びｃと呼び、長辺をそれぞれｂ及びｄと呼ぶ（図１参照）。
【００５９】
（ｉｖ）カーボン粒子コンジュゲート
カーボン粒子懸濁液（予製液）：３ｇのカーボン粒子（ｓｐ  ４、Ｄｅｇｕｓｓａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を２５０ｍｌの５ｍＭのホウ酸塩バッファ，ｐＨ８．４に懸濁させ、氷浴に入れて１００％振幅及び５＋５秒のパルスで４×５分間音波処理した（ＶｉｂｒａＣｅｌｌ  ６００Ｗ、１．５ｃｍプローブ）。
【００６０】
カーボン粒子コンジュゲート：７５μｇ／ｍｌの抗トランスフェリンモノクローナル抗体とカーボン懸濁液（２５０μｇ／ｍｌ）とを３時間混合した。１％最終濃度に相当するウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を添加し、粒子を更に３０分間混合し、次いで遠心分離によって洗浄し、０．１Ｍのホウ酸塩バッファ，ｐＨ８．５（１％ＢＳＡと０．０５％ＮａＮ３とを含有する）に傾瀉し、洗浄用バッファで３．７ｍｇカーボン／ｍｌに希釈した。できあがったカーボン粒子コンジュゲートを洗浄用バッファに入れて＋４℃で保管した。
【００６１】
（ｖ）サンプル材料
テトラシアロトランスフェリン、トリシアロトランスフェリン及びジシアロトランスフェリン：Ｍｏｎｏ  Ｑ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）上のイオン交換クロマトグラフィーによってトランスフェリンの鉄飽和調製物（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）からこれらのイソトランスフェリンを単離した。
【００６２】
アシアロトランスフェリン：トランスフェリンの鉄飽和調製物（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）をノイラミニダーゼ（Ｂｅｈｒｉｎｇ  ＯＲＫＤ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって処理し、次いでＭｏｎｏ  Ｑ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）上のイオン交換クロマトグラフィーによってアシアロトランスフェリンを単離した。
【００６３】
種々のアイソフォームを０．２％のＢＳＡ、０．１％のウシガンマグロブリン、０．１％のトゥイーン２０、０．１ｍＭのＦｅ３＋−シトレート、１ｍＭのＮａＨＣＯ３及び０．０５％のＮａＮ３で２−６．５μｇトランスフェリン／ｍｌの濃度に希釈した。
【００６４】
等電点（ｐＩ）：Ｐｈａｓｔ  Ｓｙｓｔｅｒｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）中で等電点電化泳動を繰り返すことによってそれぞれのアイソフォーム調製物のｐＩを測定した。アシアロトランスフェリンのｐＩ＝５．６６；ジシアロトランスフェリンのｐＩ＝５．５６；トリシアロトランスフェリンのｐＩ＝５．４６；テトラシアロトランスフェリンのｐＩ＝５．３２及びペンタシアロトランスフェリンのｐＩ＝５．２１であった。Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，１７−０４７２−０１，２．５−６．５を校正に使用した。
【００６５】
トランスフェリン標準：上述のように調製したアシアロトランスフェリンを、０．２％のＢＳＡ、０．１％のトゥイーン２０、０．１ｍＭのＦｅ３＋シトレート、１ｍＭのＮａＨＣＯ３及び０．０５％のＮａＮ３を含有している２０ｍＭのＢｉｓ−Ｔｒｉｓ，ｐＨ６．３７に０．０７−１６．６μｇトランスフェリン／ｍｌの濃度まで希釈し、標準として使用した。
【００６６】
（ｖｉ）組合せ分離及び免疫化学的定量の標準プロトコル
段階１．短辺ａから短辺ｃまでの膜の湿潤
溶出バッファを１×３．５×０．５ｃｍのＰＶＡスポンジ（ＰＶＡ  Ｄ、６０μｍ、Ｋａｎｅｂｏ  Ｌｔｄ，Ｊａｐａｎ）に添加し、次いでスポンジをパッドの短辺ａに沿って配置することによって組合せ膜を湿潤させる。膜の対向短辺ｃに２×３．５ｃｍのセルロース製吸取パッド（ＧＢ  ００４，Ｓｃｈｌｅｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ）を取り付ける。溶出バッファの前縁がセルロースパッドに到達すると、ＰＶＡスポンジを取り外す。以下の分析（ａ）では溶出バッファは２０ｍＭのＢｉｓ−Ｔｒｉｓ、０．１％のトゥイーン２０、５ｍＭのＮａＣｌ，ｐＨ６．１２であり、以下の分析（ｂ）では溶出バッファは２０ｍＭのＢｉｓ−Ｔｒｉｓ、０．１％のトゥイーン２０、１５ｍＭのＮａＣｌ，ｐＨ６．３２であった。
【００６７】
段階２．サンプル塗布及び短辺ａから短辺ｃまでの溶出
０．５μｌのサンプル（２−６．５μｇ／ｍｌ）を短辺ａから０．５ｃｍ離して分離膜の中央におく。溶出バッファを含浸させたＰＶＡスポンジを付加し、溶出を４分間継続させる。次に、ＰＶＡスポンジと吸取パッドとを取り外す。
【００６８】
段階３．長辺ｄ（分離膜）から長辺ｂ（検出膜）への溶出
２×５ｃｍのセルロースパッド（ＧＢ  ００４、Ｓｃｈｌｅｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ）を長辺ｂ（検出膜）に沿って取り付け、溶出バッファ（２０ｍＭのＢｉｓ−Ｔｒｉｓ，２００ｍＭのＮａＣｌ，０．１％のトゥイーン２０，ｐＨ６．２９）を湿潤させた１×５×０．５ｃｍのＰＶＡスポンジ（ＰＶＡ  Ｄ、６０μｍ、Ｋａｎｅｂｏ  Ｌｔｄ，Ｊａｐａｎ）を長辺ｄに沿って取り付ける。溶出を４分間継続させ、ＰＶＡスポンジと吸取パッドとを取り外すことによって流れを停止させる。
【００６９】
段階４．カーボン−抗トランスフェリンの反応
２×５ｃｍのセルロース吸取パッド（ＧＢ  ００４、Ｓｃｈｌｅｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ）を長辺ｄ（分離膜部）に沿って取り付け、次いで長辺ｂを、カーボン−抗トランスフェリン、４０％のトレハロース中に０．２５ｍｇ／ｍｌのカーボン、１％のトゥイーン２０、１％のウシアルブミン、０．１Ｍのホウ酸塩バッファ，ｐＨ８．５、０．０５％のＮａＮ３と共に容器に入れる。カーボン粒子コンジュゲートを検出線に２分間通し、組合せ膜を容器から取り出し、吸取パッドを除去して組合せ膜を乾燥させる。
【００７０】
段階５．黒化の検出及びトランスフェリン濃度の計算
検出線に沿ってグレースケールを測定するために膜をスキャナー（Ａｇｆａ  Ａｃｕｓ  ＩＩ  Ｓｃａｎｎｅｒ）に入れる。グレースケールを１２ビットのグレースケール分解能（４０９６レベル）及び６００ポイントパーインチ（ｐｐｉ）の光学分解能で読み取る。得られたイメージをディジタル化し、強度値をＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌで処理する。検出線の短辺に沿った強度の平均値（１ｍｍ＝２３グレースケール値）を計算し、検出線に沿って４ｃｍのクロマトグラムをグラフ化する。
【００７１】
トランスフェリンの濃度を計算するために、アシアロトランスフェリンの希釈系列を使用し、０．５μｌのサンプルを分離膜に供給し、次いで直接に溶離する（段階３−５）。それぞれの標準点の最高強度を測定し、カーブフィッティング（曲線適合）プログラム（ＧｒａｐｈＰａｄ  ＰｒｉｓｍＲＴＭ  非線形適合）を用いて標準曲線を作成し、クロマトグラムに対するトランスフェリン濃度を計算し得る。
【００７２】
（ｖｉ）分析
（ａ）アシアロトランスフェリン、ジシアロトランスフェリン、トリシアロトランスフェリン及びテトラシアロトランスフェリンを含有する調製サンプルを上記の標準プロトコルで分析し、得られたシグナル強度曲線を図３に示す。図中、参照符号１は、テトラシアロトランスフェリンのピーク、２はトリシアロトランスフェリン、３はジシアロトランスフェリン、４はアシアロトランスフェリンを表す。
【００７３】
（ｂ）（ｉ）アシアロトランスフェリン、（ｉｉ）ジシアロ＋トリシアロトランスフェリン、（ｉｉｉ）トリシアロ＋テトラシアロトランスフェリン、（ｉｖ）テトラシアロ＋ペンタシアロトランスフェリンをそれぞれ含有する調製サンプルを上記の標準プロトコルに従って分析し、結果を図４に示す。種々のピークは図の右上隅に特定された成分を示す。図４はまた、ピークの等電点の値を示す。
【００７４】
図３及び図４に示すように、本発明方法によれば、サンプル中のアイソフォームの優れた分離及び定量が可能である。例えば図４に示すように０．１ｐＩ単位の分解能が容易に達成される。
【００７５】
本発明をその使用実施例に関して記載及び説明したが、本発明の要旨を逸脱することなく種々の変更、修正、置換及び削除が可能であることは当業者に理解されよう。従って本発明は特許請求の範囲に等価の概念を包含すると考えてよい。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明装置の１つの実施態様の概略平面図である。
【図２Ａ】  本発明方法の異なる段階を示す図１の装置の概略平面図である。
【図２Ｂ】  本発明方法の異なる段階を示す図１の装置の概略平面図である。
【図２Ｃ】  本発明方法の異なる段階を示す図１の装置の概略平面図である。
【図３】  本発明方法によって分析されたトランスフェリンアイソフォームの検出された濃度曲線を示すグラフである。
【図４】  本発明方法による別々の分析によって検出されたトランスフェリンアイソフォームの４つの濃度曲線を合わせて示すグラフである。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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