(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式I：
【化１】
0004521582.tif 000040
ここで：
Pは、下記式に示されているような、ポリフェニレン、ポリフェニレンビニレン、ポリフェニレンエチニレン、及びポリビニレンを含む群から選択されるポリマーである：
【化２】
0004521582.tif 000041
*GpFへの結合
ここで：
Aは水素原子又は次の基の1つである：アルキル、OH、O-アルキル、NH2、NH-アルキル、CO2H、CO2-アルキル、CONH2、CONH-アルキル；
GpF(官能基)は基B-Rであり、ここで：
−  B(結合アーム）は必要に応じてアルキル基で置換され、不飽和の単位又はポリオキシエチレン単位を有する又は有しない、及び、鎖の中心にフォスフェート基を有する又は有しないC1-C10炭化水素基から選択され、下記のようなものである：
【化３】
0004521582.tif 000042
ここで：
mは1から10の整数であり、及び
XはO、NHCO、OCO、COO、CONH、S、CH2又はNHであり、前記炭化水素基の末端で、エステル、アミド、エーテル又はチオエーテルタイプの有機カップリング基を構成する；及び
−  Rは配位子又はビオチン、ノボビオシン、レチノイン酸及びステロイドから選ばれる生物学的マクロ分子の類似体；又はアミノ酸若しくは核酸と相互作用する有機金属錯体、その配位子は必要に応じて、Eに結合するためにアルキル基により官能基化されている、から選択される親水性基である；
nは5〜1000の整数；
pは0〜10の整数；及び
E(スペーサーセグメント)は、Pによって形成された骨格の硬い構造を妨げない性質の化学単位であり、フェニレン、エチニレン又はビニレン単位、又は下記式に示されているような、これら単位の組み合わせである：
【化４】
0004521582.tif 000043
ここでAは水素原子又は次の基の1つである：アルキル、OH、O-アルキル、NH2、NH-アルキル、CO2H、CO2-アルキル、CONH2、CONH-アルキル、
により表される構造を有することを特徴とする分子ロッド。
【請求項２】
下記一般式IIを有することを特徴とする、請求項1に記載の分子ロッド：
【化５】
0004521582.tif 000044
ここで：
p=0：Ｅなし；
Pは上記で定義されたような基bである；
GpFは、m=3、基Xの1つがNHCOであり、もう1つがCH2である上記で定義されたような基fにより表される基B、及び、ニッケルベースの有機金属錯体(Ni-NTA錯体)により表される基Rを含む；及び
nは5〜1000の整数である。
【請求項３】
下記一般式IIIを有することを特徴とする請求項1に記載の分子ロッド：
【化６】
0004521582.tif 000045
ここで：
mは1〜10の整数である；
pは0〜10の整数である；
Pは上記で定義されたような基bである；
GpFは2つの基Xが同一であり、NHCOである、上記で定義されたような基ｇにより表される基B、及び、配位子NTAがC4アルキル基により官能基化されているニッケルベースの有機金属錯体(Ni-NTA錯体)により表される基Rを含む；及び
nは5〜1000の整数である。
【請求項４】
請求項1〜3のいずれかに記載の分子ロッドと、溶液中の生物学的マクロ分子を、室温で15分〜48時間、及びpHが5.5〜8.5の条件下でインキュベートすることを含むことを特徴とする、生物学的マクロ分子の結合及び/又は自動組織化の方法。
【請求項５】
前記生物学的マクロ分子は、可溶な膜若しくは貫膜タンパク質、酵素、抗体、抗体フラグメント又は核酸であることを特徴とする、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
前記溶液は、前記生物学的マクロ分子を溶かすための水性又は水性-アルコール性溶媒からなり、必要に応じて少なくとも1つの洗剤(detergent)を含むことを特徴とする、請求項4又は請求項5に記載の方法。
【請求項７】
生物学的マクロ分子が非共有様式で結合している、請求項1〜3のいずれかに記載の分子ロッドからなることを特徴とする超分子物体。
【請求項８】
表面で、生物学的マクロ分子が結晶形で自動組織化している、請求項1〜3のいずれかに記載の分子ロッドからなることを特徴とする超分子物体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は分子ロッド、マクロ分子の結合及び/又は結晶化の方法におけるそれらの使用、結果として生じる生成物、及び材料及び構造生物学の分野における、特にバイオセンサー又は生体材料としての前記生成物の応用に関する。
【０００２】
タンパク質構造及び特にその活性部位の知識は、その作用メカニズムを理解するのに必須である。いくつかの方法がその様な研究を行うために利用される：X線、NMR及び電気結晶学(electrocrystallography)(2D結晶化)。
【０００３】
実際の結晶化を行うために、脂質単層又はフィルム上、空気/水界面での2次元結晶化技術(E. E. Ugzirisら、Nature, 1983, 301, 125-129)により、生物学的マクロ分子（結晶）の自動組織化システムを形成すること、及びこれら分子の構造を得られた結晶の電子顕微鏡分析により決定することが可能となる。
【０００４】
この方法は、空気/液体界面で脂質単層を作ること、脂質は液相に存在するタンパク質と相互作用するように選択されること、そのタンパク質は脂質に結合し、それから組織化されたネットワークを形成することにある。
【０００５】
たんぱく質の単層脂質への結合は、脂質の極性頭部での化学相互作用を包含する。これらの相互作用は特異的でない−この場合脂質は、イオン性相互作用により結晶化を起こす、電荷を帯びた極性末端を有する−又は特異的のいずれかである。後者の場合、脂質の極性頭部は結合するたんぱく質と強い親和性を示す配位子を有している。
【０００６】
特に、電荷を帯びた脂質フィルム、つまり研究されたタンパク質の配位子により官能基化された脂質フィルム上で、可溶タンパク質は2次元的に結晶化することができることを示すことが可能になっている(B. J. Japら、Ultramicroscopy, 1992, 46, 45-84)。
【０００７】
より最近、ニッケル錯体のような金属錯体により官能基化された脂質(E. W. Kubalekら、J. Struct. Biol., 1994, 113, 117-123)により、いわゆるヒスチジン標識融合タンパク質を結晶化させることが可能となった。これらのタンパク質は実際、そのN-末端又はC-末端に、いくつかのヒスチジンからなる配列を有している。その様なタンパク質のニッケル官能基化脂質への結合は、ニッケル錯体及びポリヒスチジン配列間の強い相互作用によるものであることを示すことが可能になっている(C. Venien-Brianら、J. Mol. Biol., 1997, 274, 687-692)。特に、適当な配位子が入手できなかった場合に、その様な官能基化された脂質により、結晶化を達成することが可能になった。
【０００８】
しかしながら、たんぱく質の脂質フィルム上での結晶化には、比較的ランダム、及び容易に同時にコントロールされることができない多くの要因に依存するといった欠点があり、その要因とは：
−  脂質により保持される配位子は、タンパク質と相互作用するために十分接近できるものでないといけない。この接近しやすさは脂質と配位子間のスペーサーアームの長さに依存する：短すぎると、タンパク質の脂質層内への貫入が起こり；長すぎると、結合タンパク質上に非常に高い自由度を与え、結晶中の欠陥発生率を増加させる。
−  脂質単層は結合タンパク質に十分な横方向及び回転の可動性を与えるために、十分に流動的でないといけなくて、その様にして、タンパク質が互いに関して自己組織化すること、及び分子間接触を発達させることができ、その結果、結晶を生成する。
−  脂質単層上での結晶化に固有のもう１つ困難なことは、単層の安定性に関する；実際、空気/液体界面の安定性はコントロールしにくい。さらに、たんぱく質の空間的組織化を可能にするために、脂質単層はタンパク質の結合前だけでなく、結合後も安定のままでないといけない。
−  結晶化ステップの次にくる顕微鏡研究には、得られる構造の平面性質のため、多数の面を作り出すことが必要である。
【０００９】
結果として本発明者らは、溶液中の生物学的マクロ分子を結合及び結晶化するのに適した構造物、以後は分子ロッドと呼ぶ、並びに溶液中前記生物学的マクロ分子を結合させ、必要に応じてその自動組織化を誘発する方法を提供することを計画し、前記方法は従来技術で使用される2D結晶化方法より優れた実用的必要性を満たしている。
【００１０】
本発明は、下記の一般式Iで表される構造を有することを特徴とする分子ロッドに関する：
【００１１】
【化７】
0004521582.tif 000002
【００１２】
ここで：
Pは、下記式で明示されているような、ポリフェニレン、ポリフェニレンビニレン、ポリフェニレンエチニレン及びポリビニレンを含む群から選択されるポリマーである：
【００１３】
【化８】
0004521582.tif 000003
【００１４】
*GpFへの結合
ここで：
Aは水素原子又は次の基のいずれか１つである：アルキル、OH、O-アルキル、NH2、NH-アルキル、CO2H、CO2-アルキル、CONH2、CONH-アルキル；
GpF（官能基）は基B-Rであり、ここで：
−  B(結合アーム）は、必要に応じてアルキル基で置換され、不飽和の単位又はポリオキシエチレン単位を有する又は有しない、及び、鎖の中心にフォスフェート基を有する又は有しないC1-C10炭化水素基から選択され、下記のようなものである：
【００１５】
【化９】
0004521582.tif 000004
【００１６】
ここで：
mは1から10の整数、及び
XはO、NHCO、OCO、COO、CONH、S、CH2又はNHであり、前記炭化水素基の末端で、エステル、アミド、エーテル又はチオエーテルタイプの有機カップリング基を構成する；及び
−  Rは正又は負に電荷をおびた基から選択される親水性基である；配位子又は、制限を示唆せず、ビオチン、ノボビオシン、レチノイン酸、ステロイド又は抗原のような生物学的マクロ分子の類似体；又は、IDA、NTA、EDTA、ビピリジン、又はテルピリジンのような配位子を有する、銅、亜鉛、ニッケル、コバルト、クロミウム、プラチナ、パラジウム、鉄、ルテニウム又はオスミウムの錯体のような、アミノ酸又は核酸と相互作用する有機金属錯体、前記配位子は必要に応じて、（Xで）Eに結合するためにアルキル基で官能基化される；制限を示唆せず、正又は負の電荷を帯びた基は、アンモニウム、カルボキシレート、フォスフェート又はスルフォネート基を意味すると理解される；次に挙げる基が例として言及され得る：-N(CH3)3+又は-CO2-；
nは5〜1000の整数；
pは0〜10の整数；及び
E(スペーサーセグメント)はPによって形成された骨格の硬い構造を妨げない性質の化学単位であり、フェニレン、エチニレン又はビニレン単位、又は下記式に明示されているようなフェニレンエチニレンのような、これら単位の組み合わせである：
【００１７】
【化１０】
0004521582.tif 000005
【００１８】
ここでAは水素原子又は次の基の1つである：アルキル、OH、O-アルキル、NH2、NH-アルキル、CO2H、CO2-アルキル、CONH2、CONH-アルキル。
【００１９】
GpF及びEと一緒に、上記で定義されたような異なるポリマーPは次式を与える：
【００２０】
【化１１】
0004521582.tif 000006
【００２１】
本発明に関して、アルキルは、直鎖又は分枝又は必要に応じて置換されたC1-C6アルキル基を意味すると理解される。
【００２２】
C1-C10炭化水素基Bの置換基は、特にC1-C6アルキルから選択される。
【００２３】
骨格が多数の共役単位（ポリフェニレン、ポリフェニレンビニレン、ポリフェニレンエチニレン）を有するポリマーはすでに述べられており(Angew. Chem. Int. Ed., 1998, vol. 37, pp. 402-428)、非線形光学における、その電子及び蛍光特性のために使用される(Macromolecules, 1994, 27, 562-571、及びJ. Phys. Chem., 1995, 99, 4886-4893)。
【００２４】
本発明に記載のポリマーは、部分Eとの結合において、本発明に記載の分子ロッドに特有の性質を与える基GpFにより官能基化される：
−  それは直鎖で、硬く、及び水性媒体中に可溶である；
−  それは、生物学的マクロ分子に対し非常に強い親和性を有する基により、規則的に官能基化される；及び
−  それは、生物学的マクロ分子と溶かされた時、分子認識による前記ロッドへ/上の前記マクロ分子の結合及び/又は自動組織化に特に適している。
【００２５】
本発明に記載の分子ロッドの構造は図1に説明されている：
Pはポリマー骨格を構成し、それは分子ロッドの性質を有するように全体的に硬く、直線形でないといけない；及び
図2に説明されているように、Eによって、官能基GpF間の距離L2をコントロールすることが可能になり、一方、GpFの結合アームBによって、基R及びポリマーの軸間の距離L1をコントロールすることが可能になる。
【００２６】
前記分子ロッドの１つの有用な実施態様において、それらは下記一般式IIを有する：
【００２７】
【化１２】
0004521582.tif 000007
【００２８】
ここで：
p=0：Ｅなし；
Pは上記で定義されたような基bである；
GpFは、m=3、基Xの1つがNHCOであり、もう1つがCH2である上記で定義されたような基fにより表される基B及び、ニッケルベースの有機金属錯体(Ni-NTA錯体)により表される基Rを含む；及び
nは5〜1000の整数である。
【００２９】
前記分子ロッドのもう1つの有用な実施態様において、それらは下記一般式IIIを有する：
【００３０】
【化１３】
0004521582.tif 000008
【００３１】
ここで：
mは1〜10の整数である；
pは0〜10の整数である；
Pは上記で定義されたような基bである；
GpFは、2つの基Xが同一であり、NHCOである、上記で定義されたような基hにより表される基Bを含み、その基Bは、配位子NTAがC4アルキル基=(CH2)4により官能基化されているニッケルベースの有機金属錯体(Ni-NTA錯体)により表される基Rと結合している；及び
nは5〜1000の整数である。
【００３２】
本発明はさらに、本質的に溶液中の生物学的マクロ分子を、上記で定義されたような分子ロッドと、少なくとも15分間、好適の温度及びpH条件下でインキュベートすることを含むことを特徴とする、生物学的マクロ分子の結合及び/又は自動組織化の方法に関する。
【００３３】
マクロ分子の結合及び/又は自動組織化の後、超分子物体が得られる。
【００３４】
本発明に記載の自動組織化プロセスにおいて、得られる超分子物体は必要に応じて、分子ロッド周りで生物学的マクロ分子のらせん状結晶に発達することができるだろう。
【００３５】
前記方法は特に、前記分子ロッド周りの生物学的マクロ分子のらせん状結晶化をコントロールするのに適している。
【００３６】
驚くべきことに、溶液中の生物学的マクロ分子を結合すること及び必要に応じてその自動組織化を誘起することを可能にする本発明に記載の分子ロッドは、ナノ材料又は構造生物学の分野において重要な応用性：
−  結合の配向のコントロールと共に又はそれなしで、分子ロッドへの生物学的マクロ分子の結合；
−  分子ロッド周りでの、生物学的マクロ分子のらせん状結晶化のコントロール；及び
−  得られるらせん状結晶の電子顕微鏡分析による、生物学的マクロ分子の構造研究、
を提供する。
【００３７】
前記方法実施の1つの有用な態様において、前記生物学的マクロ分子は特に、可溶な膜若しくは貫膜タンパク質、酵素、抗体、抗体フラグメント又は核酸である。
【００３８】
前記方法の実施のもう1つの態様において、前記溶液は、前記生物学的マクロ分子を溶かすために、水性又は水性-アルコール性溶媒からなり、結晶化される生物学的マクロ分子により、必要に応じて少なくとも1つの洗剤(detergent)を含む。
【００３９】
前記方法を実施するもう1つの有用な態様において、インキュベーション条件は好ましくは以下の通りである：室温、15分〜48時間、pH 5.5〜8.5でのインキュベーション。
【００４０】
本発明に記載の方法は特に、可溶なタンパク質の3次元構造の決定に応用できる。
【００４１】
タンパク質のような生物学的マクロ分子の、分子ロッド上でのらせん状結晶の形成は、マクロ分子の大きさ（直径）及びロッドのパラメーター（距離L1及びL2、並びに分子ロッドの長さ）間の完全な一致の結果である。距離L1は基R及びポリマーの軸間の距離を表す。距離L2は二つの基R間の距離を表す。分子ロッドの長さはポリマーのポリマー化の程度に等しい(図2参照)。
【００４２】
驚くべきことに、前記方法により、生物学的マクロ分子の配列を得ることができ、その配列により、電子顕微鏡による構造研究が可能となり、又は物理学的、電気的、生物学的特性について有用である新しいナノ材料を調製することが可能となる。
【００４３】
結果的に本発明は、距離L1及びL2が可変である分子ロッドのライブラリーの調製を含む。
【００４４】
本発明は更に、上記で定義されたような分子ロッドからなるという特徴を持つ超分子物体に関し、その分子ロッドに生物学的マクロ分子が非共有様式で結合し、又はその分子ロッド上で結晶形で組織化している。
【００４５】
本発明は更に、生物学的試薬として、及び特に免疫学的試薬として、及びバイオセンサー又はバイオ伝導体としての、前記超分子物体の応用、及びそれが結合しているマクロ分子の構造研究に関する。
【００４６】
前記の条件は別として、本発明はまた、本発明の主題を形成する方法をどのように実施するかの実施例、及び添付の図面について言及する以下の記述から明かとなるであろう他の条件も含む。
【００４７】
しかしながら、これらの実施例が、いかなる方法でも制限を示唆することなく本発明の主題を説明するためにだけ提供されていることは、はっきりと理解されねばならない。
【００４８】
実施例１：
ストレプトアビジンの結合のためのビオチニル化された分子ロッドの製造
ビオチンによって官能基化されたポリフェニレンエチニレンポリマーをストレプトアビジン又は融合ストレプトアビジンの結合及び結晶化を目的として製造した。
【００４９】
【化１４】
0004521582.tif 000009
【００５０】
条件：
a. TMSA, PdCl2(PPh3)2, CuI, THF/TEA; b. KOH, MeOH; c. NHS, DCC, THF; d. H2N-(CH2)3-NHBoc, CH2Cl2, TEA; e. PdCl2(PPh3)2, CuI, THF/TEA; f. TFA, CH2Cl2; g. ビオチン-NHS, DMF, TEA
実験プロトコル
t-ブチル(3-アミノプロピル)カルバメート：
【００５１】
【化１５】
0004521582.tif 000010
【００５２】
方法
2.6gのt-ブチルジカーボネート（11.9mmol, 0.1eq）を含む10mlのMeOHの溶液を0℃で、10mlのプロパンジアミン（120mmol, 1eq）を含む40mlのMeOHの溶液に滴下にて加える。室温で撹拌を15時間持続し、次いで反応液を蒸発させる。残渣を20mlの水及び50mlのCH2Cl2に溶解し、有機相をMgSO4で乾燥し、ろ過し、次いで蒸発させて、1.8gの無色のオイルを得（収率：87％/Boc2O）、これをさらに精製することなく次の工程に使用する。
実験式：C8H18O2N2        MW：174g/mol
TLC：Rf(CH2Cl2/MeOH/TEA：69/30/1)：0.26；
1H NMR(300MHz, CDCl3)：δ4.92(bs, 1H, H2); 3.16(tt, J3-4=6.6Hz, J3-2=7.2Hz, 2H, H3); 2.73(t, J5-4=6.6Hz, 2H, H5); 1.57(tt, J4-3及ビ4-5=6.6Hz, 2H, H4); 1.41(s, 9H, H8); 1.17(bs, 2H, H6);
13C NMR(75.47MHz, CDCl3)：δ155.88(1C, C1); 78.73(1C, C7); 39.42(1C, C5); 38.15(1C, C3); 33.16(1C, C4); 28.15(3C, C8);
MS(70eV/DCI/NH3/強度 ％)：m/e：175(100, [M+1]+); 192(10, [M+18+]);
t-ブチル[3-(5-エチニル-2-ヨードベンゾイルアミノ)プロピル]カルバメート：
【００５３】
【化１６】
0004521582.tif 000011
【００５４】
方法
174mgのt-ブチル(3-アミノプロピル)カルバメート（1mmol, 1eq）を含む7mlのCH2Cl2及び0.5mlのトリメチルアミンの溶液を、369mgの2,5-ジオキソピロリジン-1-イル 2-ヨード-5-エチニルベンゾエート（1mmol, 1eq）を含む7mlのCH2Cl2の溶液に添加する。反応液を室温で48時間撹拌し、次いで蒸発させる。得られた残渣をシリカゲル60H（ヘキサン/EtOAc：1/1）上のクロマトグラフィーで精製し、97％の収率で、416mgの白色固体を得る。
実験式：C17H21O3N2        MW：428g/mol
TLC：Rf(ヘキサン/EtOAcH：1/1)：0.40；
1H NMR(300MHz, CDCl3)：δ7.80(d, J12-13=8.2Hz, 1H, H12); 7.46(d, J15-13=2.0Hz, 1H, H15); 7.17(dd, J13-12=8.2Hz, J13-15=2.0Hz, 1H, H13); 6.55(bs, 1H, H2); 4.92(bs, 1H, H6); 3.48(tt, J3-4=6.2Hz, J3-2=6.0Hz, 2H, H3); 3.27(tt, J5-4=5.7Hz, J5-6=6.4Hz, 2H, H5); 1.70-1.78(m, 2H, H4); 1.41(s, 9H, H8);
13C NMR(75.47MHz, CDCl3)：δ166.70(1C, C1); 156.44(1C, C7); 142.38(1C, C10); 139.63, 133.74(2C, C12, C13); 131.05(1C, C15); 122.22(1C, C14); 92.81(1C, C11); 81.62(1C, C16); 79.26, 79.17(2C, C17, C7); 37.07, 36.42(2C, C5, C3); 29.83(1C, C4); 28.14(3C, C8);
MS(70eV/DCI/NH3/強度 ％)：m/e：429(26, [M+1]+); 446(100, [M+18+]);
t-ブチル[3-(5-エチニル-2-ヨードベンゾイルアミノ)プロピル]カルバメートの重合：
【００５５】
【化１７】
0004521582.tif 000012
【００５６】
方法
350mgのt-ブチル[3-(5-エチニル-2-ヨードベンゾイルアミノ)プロピル]カルバメート（0.81mmol, 1eq）を24.5mlのTHF及び24.5mlのトリエチルアミンからなる混合物中に置き、次いで57mgのビスジクロロビストリフェニルホスフィンパラジウム（0.081mmol, 0.1eq）及び57mgのヨウ化銅（0.28mmol, 0.3eq）を添加する。反応液を50℃で15時間加熱する。室温に戻した後に、反応液を900mlのアセトンに注ぎ入れる。アセトンの遠心分離によって、黄色固体の形態で160mgのポリマーを回収する。
ポリマーの加水分解
【００５７】
【化１８】
0004521582.tif 000013
【００５８】
方法
50mgのポリマーを1mlのCH2Cl2に懸濁し、続いて0.5mlのトリフルオロ酢酸を0℃で滴下にて加え、次いで反応液を溶解する。2時間の撹拌の後、反応液を蒸発させ、次いで1mlのCH2Cl2及び1mlのトリエチルアミンからなる混合物中に再懸濁する。沈殿を遠心分離によって回収し、水で数回洗浄し、次いで凍結乾燥する。UV（0.1N HCl, 0.208mg/ml）：348(5856); 321(5317); 301(3990); 283(3317); 201(8519);
ビオチンの結合
【００５９】
【化１９】
0004521582.tif 000014
【００６０】
方法
15mgのポリマー及び15mgのビオチン-N-ヒドロキシスクシンイミドを10mlのDMF中で懸濁する。48時間撹拌後、反応液をろ過し、蒸発させ、次いでCH2Cl2中で再懸濁する。沈殿を遠心分離にて回収し、酢酸エチルで数回洗浄し、次いで凍結乾燥する。
【００６１】
実施例２：Ni-NTA錯体によって官能基化された分子ロッドの製造
ニッケル-NTA錯体によって官能基化されたポリフェニレンエチニレンタイプのポリマーを、ポリヒスチジン標識を保有する生物学的なマクロ分子を結合及び結晶化する目的で、製造した。NTA*、NTAのアナログを製造する方法は、C. Venien-Brian ら（J. Mol. Biol., 1997, vol. 274, pp. 687-692）の記載と同じである。
【００６２】
合成スキーム：ポリマーP0の製造
【００６３】
【化２０】
0004521582.tif 000015
【００６４】
条件：
a. TMSA, PdCl2(PPh3)2, CuI, THF/TEA; b. KOH, MeOH; c. NHS, DCC, THF; d. NTA*, CH2Cl2, TEA; e. PdCl2(PPh3)2, CuI, THF/TEA; f. KOH, MeOH; g. NiCl2・6H2O, トリス（10mM, pH8）
実験プロトコル
2-ヨード-5-トリメチルシラニルエチニル安息香酸：
【００６５】
【化２１】
0004521582.tif 000016
【００６６】
方法
1.12gの2,5-ジヨード安息香酸（3mmol, 1eq）, 210mgのジクロロビストリフェニルホスフィンパラジウム(II)（0.3, 0.1eq）及び200mgのヨウ化銅(I)（1mmol, 0.34eq）を60mlのTHF/TEA混合物（3/1）中で溶解する。425μlのトリメチルシリルアセチレン（3mmol, 1eq）を加えた後、暗室中で室温にて16時間撹拌を続ける。次いで反応液を蒸発乾固し、得られた残渣をシリカ60H上のフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン/EtOAc/AcOH：70/30/1％）により精製し、真空下で乾燥した後、微細な黄色針状晶の形態で754mgの2-ヨード-5-トリメチルシリラニルエチニル安息香酸を得る（収率；73％）。
実験式：C12H13IO2Si              MW：344.221g/mol
TLC：Rf(ヘキサン/EtOAc/AcOH：50/50/1％)：0.55;
1H NMR(300MHz, アセトン-d6)：δ10.93(ブロード s, 1H, H1), 8.02(d, J4-5=8.2Hz, 1H, H4); 7.92(d, J5-7=1.8Hz, 1H, H7); 7.27(dd, J4-5=8.2Hz, J5-7=1.8Hz, 1H, H5); 0.25(s, 9H, H10);
13C NMR(75.47MHz, アセトン-d6)：δ166.99(1C, C1); 142.24(1C, C4); 136.85(1C, C2), 135.57(1C, C5); 134.16(1C, C7); 123.75(1C, C6); 103.59(1C, C3); 97.12(1C, C8); 94.52(1C, C9); -0.28(3C, C10);
MS(70eV/DCI/NH3/強度 ％)：m/e：362(100, [M+18]+);
2-ヨード-5-エチニル安息香酸：
【００６７】
【化２２】
0004521582.tif 000017
【００６８】
方法
4.5mlの水酸化カリウム水溶液（1N）を、0℃で、500mgの2-ヨード-5-トリメチルシリラニルエチニル安息香酸（1.45mmol, 1eq）を含む30mlのメタノール溶液に添加する。室温で2時間撹拌した後、反応液を2×50mlのCH2Cl2で洗浄し、次いで水相を塩酸モル溶液の添加によってpH2に再酸性化する。2×50mlのCH2Cl2で抽出した後、有機相を集め、乾燥し、蒸発させ、黄色固体の形態で383mgの2-ヨード-5-エチニル安息香酸を得る（収率：97％）。
実験式：C9H5IO2              MW：272.039g/mol
TLC：Rf(ヘキサン/EtOAc/AcOH：50/50/1％)：0.4;
1H NMR(300MHz, アセトン-d6)：δ8.08(d, J4-5=8.1Hz, 1H, H4); 7.93(d, J5-7=1.9Hz, 1H, H7); 7.36(dd, J4-5=8.1Hz, J5-7=1.9Hz, 1H, H5); 3.87(s, 1H, H9);
13C NMR(75.47MHz, アセトン-d6)：δ167.01(1C, C1); 142.22(1C, C4); 137.32(1C, C2), 135.72(1C, C5); 134.12(1C, C7); 123.00(1C, C6); 94.51(1C, C3); 82.08(1C, C8); 81.22(1C, C9);
MS(70eV/DCI/NH3/強度 ％)：m/e：290(100, [M+18]+); 307(66, [M+35]+); 562(8, [2M+18]+);
2,5-ジオキソピロリジン-1-イル 2-ヨード-5-エチニルベンゾエート：
【００６９】
【化２３】
0004521582.tif 000018
【００７０】
方法
495mg（2.4mmol, 1.2eq）のDCCを含む20mlのTHF溶液を、0℃で、544mg（2mmol, 1eq）の2-ヨード-5-エチニル安息香酸及び276mg（2.4mmol, 1.2eq）のNHSを含む30mlのTHF溶液に添加する。混合物を室温で一晩撹拌する。次に、反応液をろ過し、続いて蒸発させ、得られた残渣をシリカ60H上のフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン/EtOAc：70/30）で精製し、真空下で乾燥後、黄色固体の形態で568mgの2,5-ジオキソピロリジン-1-イル 2-ヨード-5-エチニルベンゾエートを得る（収率：77％）。
実験式：C13H8INO4              MW：369.114g/mol
TLC：Rf(ヘキサン/EtOAc：50/50)：0.46;
1H NMR(300MHz, CDCl3)：δ8.18(d, J5-7=2.4Hz, 1H, H7); 8.3(d, J4-5=8.5Hz, 1H, H4); 7.34(dd, J4-5=8.5Hz, J5-7=2.4Hz, 1H, H5); 3.22(s, 1H, H9); 2.91(s, 4H, H11);
13C NMR(75.47MHz, CDCl3)：δ168.53(2C, C11); 160.49(1C, C1); 141.92(1C, C4); 136.97(1C, C5), 135.09(1C, C7); 129.67(1C, C2); 122.60(1C, C6); 95.60(1C, C3); 80.81(1C, C8); 80.20(1C, C9); 25.46(2C, C12);
MS(70eV/DCI/NH3/強度 ％)：m/e：387(100, [M+18]+); 404(27, [M+35]+);
メチル 2-(ビスメトキシカルボニルメチルアミノ)-6-(2-ヨード-5-エチニルベンゾイルアミノ)ヘキサノエート：
【００７１】
【化２４】
0004521582.tif 000019
【００７２】
方法
1mlのTEA及び370mg（1mmol, 1eq）の2,5-ジオキソピロリジン-1-イル 2-ヨード-5-エチニルベンゾエートを含む20mlのCH2Cl2溶液を、320mg（1.05mmol, 1.05eq）のNTA*を含む20mlのCH2Cl2溶液に添加する。混合物を室温で16時間撹拌する。次いで反応液を蒸発させ、シリカ上のクロマトグラフィー（CH2Cl2/MeOH/TEA：90/10/1）にかけて、橙色オイルの形態で380mgのメチル 2-(ビスメトキシカルボニルメチルアミノ)-6-(2-ヨード-5-エチニルベンゾイルアミノ)ヘキサノエートを得る（収率：68％）。
実験式：C22H27IN2O7              MW：558.372g/mol
TLC：Rf(ヘキサン/EtOAc：50/50)：;
1H NMR(300MHz, CDCl3)：δ7.74(d, J15-16=8.2Hz, 1H, H15); 7.41(d, J16-18=2.1Hz, 1H, H18); 7.09(dd, J15-16=8.2Hz, J16-18=2.1Hz, 1H, H16); 6.46(t, J6-9=5.1Hz, 1H, H9); 3.62及び3.56(s, 13H, H10, H11, H7); 3.38(t, J2-3=7.3Hz, 1H, H2); 3.36(t, J5-6=6.6Hz, J6-9=5.1Hz, 2H, H6); 1.40-1.80(m, 6H, H3, H4, H5);
13C NMR(75.47MHz, CDCl3)：δ172.82(1C, C1); 171.54(2C, C8); 168.42(1C, C12); 142.57(1C, C13); 139.49(1C, C15); 133.54(1C, C16), 131.17(1C, C18); 122.00(1C, C17); 93.04(1C, C14); 81.69(1C, C19); 79.19(1C, C20); 63.95(1C, C2); 52.25(2C, C7); 51.41及び51.22(3C, C10, C11); 39.53(1C, C6); 29.37(1C, C3); 28.08(1C, C5); 22.71(1C, C4);
MS(70eV/DCI/NH3/強度 ％)：m/e：631(9, [M+1]+); 648(100, [M+18]+);
C22H27IN2O7の微量分析：
計算値：C, 47.32; H, 4.87; N, 5.02; O, 20.06; I, 22.73
実測値：C, 47.01; H, 4.95; N, 4.87
メチル 2-(ビスメトキシカルボニルメチルアミノ)-6-(2-ヨード-5-エチニルベンゾイルアミノ)ヘキサノエートの重合：
【００７３】
【化２５】
0004521582.tif 000020
【００７４】
方法
84mgのメチル 2-(ビスメトキシカルボニルメチルアミノ)-6-(2-ヨード-5-エチニルベンゾイルアミノ)ヘキサノエート（0.15mmol, 1eq）を、6mlのTHF及び2mlのトリエチルアミンからなる混合物中に置き、次いで11mgのビスジクロロビストリフェニルホスフィンパラジウム（17μmol, 0.1eq）及び15mgのヨウ化銅（79μmol, 0.5eq）を添加する。反応液を50℃で15時間加熱する。室温に戻した後、反応液を200mlのアセトンに注ぎ入れる。アセトンの遠心分離により55mgのポリマーを黄色固体の形態で回収する。
ポリマーの加水分解
【００７５】
【化２６】
0004521582.tif 000021
【００７６】
方法
50mgのポリマーを5mlのMeOH中に懸濁し、次いで5mlの水酸化カリウムモル溶液を0℃で滴下にて加える。96時間撹拌した後、反応液をろ過し、蒸発させ、次いで最小量の水に溶解する。次いで得られた溶液を、0.1Mの塩酸溶液をゆっくり添加することにより再酸性化する。生成した沈殿を遠心分離で回収し、水で数回洗浄し、次いで凍結乾燥する。
ニッケルイオンの錯形成反応：
【００７７】
【化２７】
0004521582.tif 000022
【００７８】
方法
1mgのポリマーを5.15mlのトリスバッファー（10mM, pH8）中に溶解する。次いで20μlのNiCl2・6H2O（500mM）を含むトリス（10mM, pH8）溶液を1mlのポリマー溶液に加える。透析後、さらに精製することなく、溶液中で該化合物を使用する。
【００７９】
実施例３：ヒスチジン標識化プロテインの結合のためにニッケル-NTA錯体（ポリマー Ppm）によって官能基化された分子ロッドのライブラリーの設計
間隔L1の制御のための合成的アプローチ
【００８０】
【化２８】
0004521582.tif 000023
【００８１】
条件：
i. TsCl, TEA, THF; ii. NaN3, CH3CN; iii. NaH, BrCH2CO2tBu, THF; iv. TFA, CH2Cl2; v. SOCl2/TEA, CH2Cl2; vi. H2, Pd/C, MeOH
間隔L2の制御のための合成的アプローチ
【００８２】
【化２９】
0004521582.tif 000024
【００８３】
条件：
a. TMSA, PdCl2(PPh3)2, CuI, THF/TEA; b. KOH, MeOH; c. NHS, DCC, THF; d. MeOH, EDC, HOBT, THF; e. HCl, NaNO2/K2CO3, HNPri2; f. LDA, CIPO(OEt)2; g. LDA(2eq), Me3SiCl; h. K2CO3, MeOH; i. PdCl2(PPh3)2, CuI, THF/TEA; j. MeI
実験プロトコル
重合及び加水分解のための実験プロトコルは、ロッドP0に関する記載と同様である。
【００８４】
ロッドP10のためのモノマーの製造
2-(2-ヒドロキシエトキシ)エチルトルエン-4-スルホネート：
【００８５】
【化３０】
0004521582.tif 000025
【００８６】
方法
50mlのジエチレングリコール（0.5mol, 10eq）及び10gのトシルクロリド（0.05mol, 1eq）を200mlのジクロロメタン中に溶解する。7.3mlのトリエチルアミン（0.05mol, 1eq）を滴下にて加えた後、反応液を室温で16時間撹拌する。100mlの水で加水分解した後、反応液を100mlのジクロロメタンで２回抽出し、有機相を硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、次いで蒸発させ、残渣を得、これをシリカ60Hのフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン/EtOAc：40/60）で精製する。これにより無色の軽いオイルの形態で13.4gのO-トシルジエチレングリコールを得る（収率：99％/TsCl）。
実験式：C11H16O5S              MW：260.2g/mol
TLC：Rf(ヘキサン/EtOAc：7/3)：0.32;
1H NMR(300MHz, CDCl3)：δ7.78(d, J6-7=8.1Hz, 2H, H6); 7.33(d, J7-6=8.1Hz, 2H, H7); 4.18(t, J4-3=3.2Hz, 2H, H4); 3.69-3.63(m, 4H, H2-3); 3.51(t, J1-2=3.2Hz, 2H, H1); 2.43(s, 3H, H9); 1.98(bs, 1H, H10);
13C NMR(75.47MHz, CDCl3)：δ144.70(1C, C8); 132.82(1C, C5); 129.60(2C, C6), 127.69(2C, C7); 72.24(1C, C2); 68.91(1C, C3); 68.35(1C, C4); 61.40(1C, C1); 21.33(1C, C9);
MS(70eV/DCI/NH3/強度 ％)：m/e：278(100, [M+18]+);
2-(2-アジドエトキシ)エタノール 16a：
【００８７】
【化３１】
0004521582.tif 000026
【００８８】
方法
12.27gの2-(2-ヒドロキシエトキシ)エチルトルエン-4-スルホネート（0.047mol, 1eq）を200mlのアセトニトリル中に溶解し、次いで3.67gの窒化ナトリウム（0.056mol, 1.2eq）を加える。反応液を80℃で16時間加熱する。100mlの水で加水分解した後、反応液を100mlの酢酸エチルで２回抽出する。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、次いで蒸発させ、3.9gの無色の軽いオイルを得る（収率：63％）。
実験式：C4H9O2N3            MW：131g/mol
TLC：Rf(ヘキサン/EtOAc：1/1)：0.28;
1H NMR(300MHz, CDCl3)：δ3.72(t, J2-1=4.7Hz, 2H, H2); 3.66(t, J3-4=4.8Hz, 2H, H3); 3.58(t, J1-2=4.7Hz, 2H, H1); 3.38(t, J4-3=4.8Hz, 2H, H4); 2.32(bs, 1H, H5);
13C NMR(75.47MHz, CDCl3)：δ72.19(1C, C2); 69.82(1C, C3); 61.53(1C, C1)†; 50.49(1C, C4);
MS(70eV/DCI/NH3/強度 ％)：m/e：149(100, [M+18]+);
t-ブチル[2-(2-アジドエトキシ)エトキシ]アセテート 19a：
【００８９】
【化３２】
0004521582.tif 000027
【００９０】
方法
1.42gの水素化ナトリウム（0.035mol, 1.2eq）を30mlのテトラヒドロフラン中に懸濁し、次いで3.89gの16a（0.029mol, 1eq）を含む10mlのテトラヒドロフラン溶液を0℃で滴下にて加える。8.71mlのt-ブチルブロモアセテート（0.059mol, 2eq）を緩やかに加える前に、該温度で半時間撹拌を持続する。温度は緩やかに上昇し、一晩撹拌を持続する。反応液を50mlの水で加水分解し、次いで濃縮して残渣を得、これをシリカ60H上のフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン/EtOAc：70/30）で精製する。黄色がかったオイルの形態の3.95gの生成物を収率55％で回収する。
実験式：C10H19O4N3              MW：245g/mol
TLC：Rf(ヘキサン/EtOAc：7/3)：0.47;
1H NMR(300MHz, CDCl3)：δ4.02(s, 2H, H2); 3.70-3.66(m, 6H, H3,4,5); 3.39(t, J6-5=5.0Hz, 2H, H6); 1.46(s, 9H, H8);
13C NMR(75.47MHz, CDCl3)：δ169.37(1C, C1); 81.33(1C, C7), 70.55-70.49(2C, C3及び4); 69.81(1C, C5); 68.90(1C, C2); 50.46(1C, C6); 27.86(3C, C8);MS(70eV/DCI/NH3/強度 ％)：m/e：207(15, [M+1]+); 263(100, [M+18]+);
メチル 6-(2-[2-(2-アジドエトキシ]アセチルアミノ)-2-(ビスメトキシカルボニルメチルアミノ)ヘキサノエート 20a：
【００９１】
【化３３】
0004521582.tif 000028
【００９２】
方法
3.95gの19a（0.016mol, 1eq）を20mlのジクロロメタン中に溶解し、次いで10mlのトリフルオロ酢酸を滴下にて加える。60℃で2時間の撹拌の後、反応液を蒸発乾固させる。次いで得られた残渣を4mlのチオニルクロリドに溶解し、室温で1時間撹拌する。液を再び蒸発乾固させ、4mlのジクロロメタンで２回溶解し、次いで再蒸発させる。生成した該酸塩化物を10mlのジクロロメタンに溶解し、次いで6.43gの極性ヘッドNTA*（0.016mol, 1eq）を含む10mlのジクロロメタン及び4.46mlのトリエチルアミン（0.032mol, 2eq）の溶液を加える。反応液を室温で一晩撹拌し、次いで蒸発乾固させて残渣を得、これをシリカ60H上のフラッシュクロマトグラフィー（MeOH/CH2Cl2：3/97）で精製する。これにより黄色オイルの形態の1.84gの生成物を収率25％で得る。
実験式：C19H33O9N5              MW：475g/mol
TLC：Rf(純粋なEtOAc)：0.34;
1H NMR(300MHz, CDCl3)：δ6.79(bt, J9-6=5.3Hz, 1H, H9); 3.88(s, 2H, H13); 3.59-3.62(m, 15H, H10, H11, H15, H15, H16); 3.54(s, 4H, H7); 3.29-3.34(m, 3H, H2, H17); 3.18(dt, J6-5=6.5Hz, J6-9=5.3Hz, 2H, H6);1.27-1.65(m, 6H, H3, H4, H5);
13C NMR(75.47MHz, CDCl3)：δ172.68(1C, C1); 171.42(2C, C8); 169.29(1C, C12);  70.52(1C, C15); 70.20(1C, C13); 69.91(1C, C14); 69.75(1C, C16); 64.35(1C, C2); 52.10(2C, C7); 51.27及び50.30(2C, C10, C11); 51.06(1C, C17); 38.30(1C, C6); 29.74(1C, C3); 28.94(1C, C5); 22.93(1C, C4);
MS(70eV/DCI/NH3/強度 ％)：m/e：476(100, [M+1]+);
メチル 6-(2-[2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)-2-(ビスメトキシカルボニルメチルアミノ)ヘキサノエート 21a：
【００９３】
【化３４】
0004521582.tif 000029
【００９４】
方法
1.84gの20a（3.88mmol, 1eq）を30mlのメタノール中に溶解し、次いで184mgのパラジウム担持チャコール（10重量％）を加える。反応液を水素で３回パージし、次いで水素雰囲気下で室温にて一晩静置する。パラジウムをセライトでろ別した後、ろ液を蒸発させ、1.70gの黄色オイルを得（収率：97％）、これをさらに精製することなく次の工程に使用する。
実験式：C19H35O9N3              MW：449g/mol
TLC：Rf(MeOH/CH2Cl2：1/9)：0.17;
1H NMR(300MHz, CDCl3)：δ6.92(bs, 1H, H9); 3.85(s, 2H, H13); 3.55-3.13(m, 26H, H2, H6, H7, H10, H11 H13, H14, H15, H16, H17); 1.24-1.62(m, 6H, H3, H4, H5);
MS(70eV/DCI/NH3/強度 ％)：m/e：450(100, [M+1]+);
メチル 2-(ビスメトキシカルボニルメチルアミノ)-6-(2-[2-(2-(5-エチニル-2-ヨードベンゾイルアミノ)エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)ヘキサノエート 22a：
【００９５】
【化３５】
0004521582.tif 000030
【００９６】
方法
150mgの2,5-ジオキソピロリジン-1-イル 2-ヨード-5-エチニルベンゾエート（0.33mmol, 1eq）を含む5mlのCH2Cl2及び0.2mlのトリエチルアミンの溶液を123mgの21a（0.33mmol, 1eq）を含む2mlのCH2Cl2の溶液中に加える。反応液を室温で24時間撹拌し、次いで蒸発させる。残渣をシリカゲル60H（MeOH/CH2Cl2：3/97）上のクロマトグラフィーにかけて145mgの黄色がかったオイルを収率62％で得る。
実験式：C28H38O10N3I              MW：703g/mol
TLC：Rf(MeOH/CH2Cl2：1/9)：0.50;
1H NMR(300MHz, CDCl3)：δ7.79(d, J23-25=8.1Hz, 1H, H23); 7.45(d, J25-23=1.5Hz, 1H, H25); 7.15(dd, J23-25=1.5Hz及びJ23-22=8.1Hz, 1H, H23); 6.76(bt, 1H, H9); 6.50(bt, 1H, H18); 4.11(s, 2H, H13); 3.58-3.96(m, 17H, H10, H11, H14, H15, H16); 3.51(s, 4H, H7); 3.20-3.41(m, 5H, H2, H6, H17); 3.17(s, 1H, H28);1.44-1.71(m, 6H, H3, H4, H5);
13C NMR(75.47MHz, CDCl3)：δ172.75(1C, C19); 171.64(1C, C1); 171.49(1C, C8); 169.38(1C, C12);  142.14(1C, C20); 139.69(1C, C25); 133.86(1C, C22); 131.21(1C, C23); 122.25(1C, C24); 115.97(1C, C21); 92.71(1C, C26); 79.45(1C, C27); 70.65(1C, C15); 70.36(1C, C13); 69.87(1C, C14); 69.41(1C, C16); 64.36(1C, C2); 52.39; 51.16(2C, C7); 52.16; 51.37(3C, C10, C11); 39.46(1C, C17); 39.37(1C, C6); 29.77(1C, C3); 28.95(1C, C5); 22.98(1C, C4);
MS(70eV/DCI/NH3/強度 ％)：m/e：704(100, [M+1]+); 721(36, [M+18]+);
C28H38N3O10Iの微量分析：
計算値：C, 47.80; H, 5.44; N, 5.97; O, 22.74; I, 18.03
実測値：C, 47.75; H, 5.71; N, 5.72
ロッドP21のためのモノマーの製造
メチル 6-(2-(2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]エトキシ)アセチルアミノ)-2-(メトキシカルボニルメチルアミノ)ヘキサノエート 21b：
【００９７】
【化３６】
0004521582.tif 000031
【００９８】
方法
プロトコルは、生成物21aの製造に使用されたものと同じであり、合成はトリエチレングリコールから出発する。
実験式：C21H39O10N3              MW：493g/mol
TLC：Rf(MeOH/CH2Cl2/TEA：1/9/0.1)：0.27;
1H NMR(300MHz, CD3OD)：δ4.59(bs, 3H, H9, H20); 3.94(s, 2H, H13); 3.10-3.61(m, 28H, H2, H6, H7, H10, H11, H14, H15, H16, H17, H18, H19); 1.19-1.62(m, 6H, H3, H4, H5);
MS(70eV/DCI/NH3/強度 ％)：m/e：494(100, [M+1]+);
4-(ジイソプロピルトリアゼニル)アセトフェノン 25：
【００９９】
【化３７】
0004521582.tif 000032
【０１００】
方法
1g（7.4mmol）の4-アミノアセトフェノンを30mlの水及び5mlの濃塩酸からなる混合物中に溶解する。反応液を0℃に冷却し、次いで520mg（7.54mmol, 1.02eq）の亜硝酸ナトリウムを含む1mlの水を加える。30分の撹拌の後、反応液を、0℃で、8gの炭酸カリウム及び8.17ml（5.82mmol, 7.8eq）のジイソプロピルアミンを含む50mlの水で構成される溶液に慎重に加える。該温度で30分間撹拌を持続し、次いで反応液を50mlの水で加水分解し、水相を50mlのエチルエーテルで４回抽出する。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、次いで蒸発させて残渣を得、これをシリカゲル60H上のクロマトグラフィー（AcOEt/ヘキサン：2/8）にかけて1.18gの黄色粉末を収率64％で得る。
実験式：C14H21N3O2              MW：247.33g/mol
TLC：Rf(ヘキサン/EtOAc：9/1)：0.40;
1H NMR(300MHz, CDCl3)：δ7.92(d, J3-4=8.6Hz, 2H, H3); 7.44(d, J4-3=8.6Hz, 2H, H4); 5.33(bs, 1H, H6); 4.03(bs, 1H, H6); 2.57(s, 3H, H3); 1.37(bd, 6H, H7); 1.24(bd, 6H, H7);
13C NMR(75.47MHz, CDCl3)：δ197.17(1C, C1); 155.32(1C, C5); 133.11(1C, C2); 129.30(2C, C3); 119.82(2C, C4); 49.17(1C, C6); 46.17(1C, C6); 26.23(1C, C8); 23.63, 19.11(4C, C7);
MS(70eV/DCI/NH3/強度 ％)：m/e：248(100, [M+1]+);
1-(ジイソプロピルトリアゼニル)-4-((トリメチルシリル)エチニル)ベンゼン 26：
【０１０１】
【化３８】
0004521582.tif 000033
【０１０２】
方法
8.62g（34.9mmol, 1eq）の4-(ジイソプロピルトリアゼニル)アセトフェノンを含む30mlのTHFの溶液を、-78℃で、1.03eqのLDAに滴下にて加える。後者は、5.17mlのジイソプロピルアミン（36.9mmol, 1.06eq）及び22.4mlのヘキサン中1.6M BuLi（35.9mmol, 1.03eq）を含む38.5mlのTHFから0℃で生成する。反応液を-78℃で1時間撹拌し、次いで5.04mlのジエチルクロロホスフェート（34.9mmol, 1eq）を滴下にて加え、混合物を室温に加熱する。3時間の撹拌の後、該液を2.25eqのLDAに加える。後者は11mlのジイソプロピルアミン（78.5mmol, 2.25eq）及び49mlのヘキサン中1.6M BuLi（78.5mmol, 2.25eq）を含む80mlのTHFから0℃で生成する。反応液を一晩静置し、その間温度は緩やかに上昇する。丸底フラスコを0℃に冷却し、4.86mlのトリメチルシリルクロリド（38.3mmol, 1.1eq）を加え、15分間撹拌を持続し、次いで混合物を100mlの水で加水分解する。水相を100mlのエチルエーテルで3回抽出し、該有機相を硫酸マグネシウムで乾燥した後、ろ過し、次いで蒸発させる。得られた残渣をシリカゲル60H上のフラッシュクロマトグラフィー（純粋なヘキサン）で精製し、58％の収率で6.08gの1-(ジイソプロピルトリアゼニル)-4-((トリメチルシリル)エチニル)ベンゼンを得る。
実験式：C17H27N3Si              MW：301g/mol
TLC：Rf(ヘキサン)：0.30;
1H NMR(300MHz, CDCl3)：δ7.40(d, J2-3=8.5Hz, 2H, H2); 7.32(d, J3-2=8.5Hz, 2H, H3); 5.33(bs, 1H, H8); 4.03(bs, 1H, H8); 1.29(bs, 12H, H9); 0.24(s, 9H, H7);
13C NMR(75.47MHz, CDCl3)：δ151.45(1C, C1); 132.42(2C, C2); 119.82(2C, C3); 118.66(1C, C4); 105.72(1C, C6); 93.05(1C, C5); 48.13, 46.17(2C, C8); 23.80, 19.11(4C, C9); -0.15(3C, C7);
MS(70eV/DCI/NH3/強度 ％)：m/e：302(100, [M+1]+);
1-(ジイソプロピルトリアゼニル)-4-エチニルベンゼン 27：
【０１０３】
【化３９】
0004521582.tif 000034
【０１０４】
方法
6gの1-(ジイソプロピルトリアゼニル)-4-((トリメチルシリル)エチニル)ベンゼン（19.9mmol, 1eq）を100mlのMeOHに溶解し、13.7gのK2CO3（99.5mmol, 5eq）を少量ずつ加える。反応液を室温で15時間撹拌し、次いで蒸発乾固させ、100mlの水及び100mlのEtOAcに溶解する。水相を50mlのEtOAcで4回抽出し、その後有機相を硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、次いで蒸発させ、96％の収率で4.38gの1-(ジイソプロピルトリアゼニル)-4-エチニルベンゼンを得る。
実験式：C14H19N3              MW：229g/mol
TLC：Rf(純粋なヘキサン)：0.30;
1H NMR(300MHz, CDCl3)：δ7.46(d, J2-3=8.6Hz, 2H, H2); 7.37(d, J3-2=8.6Hz, 2H, H3); 5.33(bs, 1H, H8); 4.03(bs, 1H, H8); 3.06(s, 1H, H7); 1.29(bs, 12H, H9);
13C NMR(75.47MHz, CDCl3)：δ151.75(1C, C1); 132.57(2C, C2); 119.95(2C, C3); 117.56(1C, C4); 84.14(1C, C5); 76.28(1C, C6); 48.68, 45.75(2C, C8); 23.61, 19.28(4C, C9);
MS(70eV/DCI/NH3/強度 ％)：m/e：230(100, [M+1]+);
メチル 2-ヨード-4-トリメチルシリルエチニルベンゾエート 28：
【０１０５】
【化４０】
0004521582.tif 000035
【０１０６】
方法
2.6gの2-ヨード-5-((トリメチルシリル)エチニル)安息香酸（7.56mmol, 1eq）を50mlのTHFに溶解し、次いで2.17gのN-エチル-N'-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド（EDC）（11.3mmol, 1.5eq）及び1.52gのヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBT）（11.3mmol, 1.5eq）を加え、最後に18mlのMeOHを滴下にて加える。反応液を室温で4時間撹拌し、次いで蒸発乾固させ、50mlの水及び50mlのEtOAcに溶解する。有機相を25mlの5％KHSO4水溶液、25mlの5％NaHCO3水溶液及び25mlの飽和NaCl水溶液で洗浄する。続いて有機相を硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、次いで蒸発させ、2.93gの黄色オイルを得る（収率：定量的）。これをさらに精製することなく次の工程に使用する。
実験式：C13H15O2ISi              MW：357.9g/mol
TLC：Rf(ヘキサン/EtOAc：9/1)：0.46;
1H NMR(300MHz, CDCl3)：δ7.91(d, J4-6=8.0Hz, 1H, H4); 7.87(d, J7-6=2.1Hz, 1H, H7); 7.18(dd, J6-7=2.1Hz, J6-4=8.0Hz, 1H, H6); 3.91(s, 3H, H11); 0.23(s, 9H, H10);
13C NMR(75.47MHz, CDCl3)：δ165.86(1C, C1); 141.05(1C, C4); 134.99; 133.90(2C, C6, C7); 134.78(1C, C2); 123.10(1C, C5); 102.61(1C, C3); 96.60(1C, C9); 93.83(1C, C8); 52.31(1C, C11); -0.44(3C, C10);
MS(70eV/DCI/NH3/強度 ％)：m/e：376(100, [M+18]+);
メチル 2-(4-トルイソプロピルトリアゼニルフェニルエチニル)-5-トリメチルシリルエチニルベンゾエート 29：
【０１０７】
【化４１】
0004521582.tif 000036
【０１０８】
方法
676mgの27（1.88mmol, 1eq）を7mlのTHFに溶解し、次いで132mgのPd（0.18mmol, 0.01eq）及び132mgのヨウ化銅（3.76mmol, 0.02eq）を加える。反応液を15分間撹拌し、次いで430mgの28（1.88mmol, 1eq）を含む7mlのTHFを滴下にて加える。室温で15時間撹拌を持続する。蒸発乾固後、残渣をシリカゲル60H上（ヘキサン/EtOAc：97/3）で精製し、79％の収率で683mgのレモンイエロー粉末を得る。実験式：C27H33N3O2Si              MW：459g/mol
TLC：Rf(ヘキサン/EtOAc：9/1)：0.28;
1H NMR(300MHz, CDCl3)：δ8.06(s, 1H, H3); 7.34-7.57(m, 6H, H5, H6, H11, H12); 5.27(bs, 1H, H14); 3.96(s, 4H, H14, H19); 1.31(bs, 12H, H15); 0.25(s, 9H, H18);
13C NMR(75.47MHz, CDCl3)：δ165.84(1C, C1); 151.78(1C, C13); 134.28; 133.85; 133.45; 132.99(4C, C3, C5, C6); 132.99(2C, C11); 131.36(1C, C2); 123.80; 122.16(2C, C7, C10); 102.08(2C, C12); 118.54(1C, C4); 103.47(1C, C17); 97.21; 96.83(2C, C8, C9); 87.69(1C, C16); 52.02(1C, C19); 48.88, 45.97(2C, C14); 23.72; 19.16(4C, C15); -0.36(3C, C18);
MS(70eV/DCI/NH3/強度 ％)：m/e：460(100, [M+1]+);
メチル 2-(4-ヨードフェニルエチニル)-5-トリメチルシリルエチニルベンゾエート：
【０１０９】
【化４２】
0004521582.tif 000037
【０１１０】
方法
2.3gの29（5mmol, 1eq）を含む5mlのヨウ化メチル（90mmol, 18eq）を封管に入れる。反応液を120℃で72時間加熱し、次いで蒸発乾固させる。残渣を20mlのエチルエーテルに溶解し、ろ過し、蒸発させて収率96％で2.2gの黄色オイルを得る。
実験式：C21H19O2SiI              MW：458g/mol
TLC：Rf(ヘキサン/EtOAc：9/1)：0.38;
1H NMR(300MHz, CDCl3)：δ8.06(s, 1H, H3); 7.68(d, J11-12=8.0Hz, 2H, H12); 7.54(s, 2H, H3, H5); 7.26(d, J11-12=8.0Hz, 2H, H11); 3.93(s, 3H, H17); 0.25(s, 9H, H16);
13C NMR(75.47MHz, CDCl3)：δ165.51(1C, C1); 137.36(2C, C12); 134.40; 133.87; 133.59(3C, C3, C5, C6); 132.97(2C, C11); 131.54(1C, C2); 122.95(2C, C7, C10); 122.38(1C, C4); 103.21(1C, C15); 97.35; 94.96(2C, C8, C9); 89.19(13C, C14); 94.54(1C, C13); 52.08(1C, C17); -0.40(3C, C16);
MS(70eV/DCI/NH3/強度 ％)：m/e：459(59, [M+1]+); 476(100, [M+18]+);
2,5-ジオキソピロリジン-1-イル 5-エチニル-2-(4-ヨードフェニルエチニル)ベンゾエート 30：
【０１１１】
【化４３】
0004521582.tif 000038
【０１１２】
方法
500mgのメチル 2-(4-ヨードフェニルエチニル)-5-トリメチルシリルエチニルベンゾエートを塩基を含むメタノールで処理する；68mgの5-エチニル-2-(4-ヨードフェニルエチニル)安息香酸（0.18mmol, 1eq）を3mlのTHFに溶解し、次いで25mgのN-ヒドロキシスクシンイミド（0.22mmol, 1.2eq）及び13mgのジメチルアミノピリジン（0.10mmol, 0.55eq）を加える。反応液を0℃に冷却し、次いで45mgのジシクロヘキシルカルボジイミド（0.22mmol, 1.2eq）を含む1mlのCH2Cl2の溶液を滴下にて加える。15の間撹拌を持続しながら、温度を緩やかに上昇させる。続いて反応液をろ過し、次いで蒸発させて残渣を得、これをシリカゲル上のクロマトグラフィーで精製する。生成物をEtOAcで1回洗浄し、60％の収率で50mgの淡黄色固体を得る。
実験式：C21H12O4NI              MW：469g/mol
TLC：Rf(ヘキサン/EtOAc：60/40)：0.5;
1H NMR(300MHz, CD3OD)：δ8.03(s, 1H, H3); 7.44-7.50(m, 4H, H5, H6, H12); 7.06(d, J11-12=8.2Hz, 2H, H11); 3.22(s, 1H, H16); 2.74(s, 4H, H18);
MS(70eV/DCI/NH3/強度 ％)：m/e：470(9.8, [M+1]+); 477(100, [M+18]+);
メチル 2-(ビスメトキシカルボニルメチルアミノ)-6-(2-[2-(2-(2-[5-エチニル-2-(4-ヨードフェニルエチニル)ベンゾイルアミノ]エトキシ)エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)ヘキサノエート 31b：
【０１１３】
【化４４】
0004521582.tif 000039
【０１１４】
方法
92mgの30（0.18mmol, 1eq）を含む3mlのCH2Cl2及び0.25mlのトリエチルアミン（1.8mmol, 10eq）の溶液を88mgの21b（0.18mmol, 1eq）を含む2mlのCH2Cl2溶液に滴下にて加える。反応液を室温にて4時間撹拌し、次いで蒸発乾固させる。得られた残渣をシリカゲル60H（CH2Cl2/MeOH：97/3）上のクロマトグラフィーにかけて40％の収率で60mgの黄色がかったオイルを得る。
実験式：C38H46O11N3I              MW：847g/mol
TLC：Rf(MeOH/CH2Cl2：1/9)：0.47;
1H NMR(300MHz, CDCl3)：δ8.00(s, 1H, H27); 7.70(d, J32-31=8.2Hz, 2H, H32); 7.50(bs, 3H, H24, H25, H20); 7.26(d, J31-32=8.2Hz, 2H, H31); 6.61(bt, 1H, H9); 3.88(s, 2H, H13); 3.16-3.70(m, 25H, H7, H10, H11, H14, H15, H16, H17, H18, H19); 3.16-3.25(m, 4H, H2, H6, H35); 1.41-1.69(m, 6H, H3, H4, H5);
MS(70eV/DCI/NH3/強度 ％)：m/e：848(7, [M+1]+);
C30H42N3O11Iの微量分析：
計算値：C, 53.84; H, 5.46; N, 4.95; O, 20.76; I, 14.97
実測値：C, 52.62; H, 5.84; N, 4.98
実施例４：Ni-NTA錯体によって官能基化された分子ロッドへのHis標識タンパクの結合
酵母RNAポリマラーゼのABC23-(His)6サブユニットの、ニッケル-NTA錯体によって官能基化されたポリマーP0への結合を研究した。浸透クロマトグラフィー（chromatographie de permeation）による研究は、“ヒスチジン-標識化”タンパクの該ポリマーへの特異的な結合を実証することを可能にした。実際に、タンパクの溶離はポリマーの存在下で促進される。いくつかのタンパクは、それ自身がポリマーに結合してより大きな分子タンパク複合体を形成する。さらに、非標識ABC23タンパクはポリマーP0への結合がほとんど又は全く見られないようであることから、該結合はニッケルとポリヒスチジン標識との間の相互作用によって誘発される。
【０１１５】
プロトコル：
トリスバッファー（10mM, pH8）中500μMの分子ロッドP0溶液の5μlを、ABC23-His6タンパクの溶液（10mMトリスバッファー、150mM NaCl中3.2mg/ml）の5μl、ABC23タンパクの溶液（10mMトリスバッファー、150mM NaCl中2.3mg/ml）の7μl又はトリスバッファー（10mM、pH8）の5μlのいずれかに加える。撹拌せずに18時間後、溶液の体積をトリスバッファー（10mM、pH8）の添加によって50μlに調整し、全混合物をSmart（登録商標）システムの50μlインジェクションループに注入する。
【０１１６】
条件：
Smart（登録商標）システム（スーパローズ（Superose） 6 カラム；トリス（10mM、pH8；150mM NaCl）を用いた溶離）を使用した浸透クロマトグラフィー（chromatographie de permeation）による、酵母RNAポリメラーゼのABC23-(His)6のポリマーP0への結合の研究。
【０１１７】
実施例５：Ni-NTA錯体によって官能基化された分子ロッド上のHis-標識タンパクの電子顕微鏡観察
ニッケル-NTA錯体によって官能基化されたポリマーP0へのホスファターゼ-(His)6の結合を浸透クロマトグラフィー（chromatographie de permeation）で研究した。形成された超分子物体の構造を電子顕微鏡で観察する。タンパクの線状凝集体の形成がみとめられた。
【０１１８】
実験条件：
Smart（登録商標）システム（スーパローズ（Superose） 6 カラム；トリス（10mM、pH8；150mM NaCl）を用いた溶離）上での浸透クロマトグラフィー（chromatographie de permeation）による精製の後、5μlの溶液を、真空下にて20mAの電流で前もって放電され、炭素フィルムでコートされた電子顕微鏡のグリッド上に置く。次いで該グリッドを酢酸ウラニル溶液で陰性染色し、電子顕微鏡で観察する。
【０１１９】
最小電子線条件（＜10エレクトロン/Å2）下にて100kVで操作するPhilips CM120 透過型電子顕微鏡で45,000倍に拡大し、写真をKODAK SO163に記録する。
【０１２０】
先の記述から明らかであるように、本発明は、今回、より明白に記載された実行の形態、具体例及び応用の形態に何ら制限されず、一方で、本発明は、本発明の枠組み又は範囲から逸脱することなく、当業者の想像するこれらの全ての変化形を包含する。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に記載の分子ロッドの要素の記述図である。
【図２】本発明に記載の分子ロッドを説明する図である。
【図３】分子ロッド上での、生物学的マクロ分子のらせん状結晶の形成を示した記述図である。
【図４】トリス緩衝液(10 mM, pH 8; 150 mM NaCl)を溶離液(Smart(登録商標)システム)として使用する、Superose(登録商標)6カラム上の浸透クロマトグラフィーによる、イーストRNAポリメラーゼのABC23-(His)6を本発明に記載の分子ロッドへ結合させる研究を説明する図である。
【図５】本発明に記載の分子ロッドの写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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