(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療的に有効量の凝固因子VIII（ＦVIII）及び中性のコロイド状粒子を含有する非経口投与用薬学的組成物であって、前記粒子が生物適合性親水性ポリマーにより誘導された両親媒性リピドを１〜２０モルパーセント含有し、前記ポリマーが正味電荷を帯びていないものである組成物において、
前記ＦVIIIが前記コロイド状粒子内に被包されていない薬学的組成物。
【請求項２】
前記コロイド状粒子が、平均粒子直径０．０５ないし０．４ミクロンを有する請求項１の薬学的組成物。
【請求項３】
前記コロイド状粒子が平均粒子直径０．１ミクロンを有する請求項２の薬学的組成物。
【請求項４】
前記両親媒性リピドが、天然又は合成源由来のリン脂質である請求項１の薬学的組成物。
【請求項５】
前記両親媒性リピドが、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）である請求項４の薬学的組成物。
【請求項６】
前記生物適合性親水性ポリマーが、ポリアルキルエーテル、ポリ乳酸及びポリグリコール酸ファミリーからなる群から選択される請求項１の薬学的組成物。
【請求項７】
前記生物適合性親性ポリマーが、ポリエチレングリコールである請求項６の薬学的組成物。
【請求項８】
前記ポリエチレングリコールが、１０００ないし５０００ダルトンの分子量を有する請求項７の薬学的組成物。
【請求項９】
前記ポリエチレングリコールが、２０００ダルトンの分子量を有する請求項８の薬学的組成物。
【請求項１０】
前記ＦVIIIが、天然源由来のものである請求項１の薬学的組成物。
【請求項１１】
前記ＦVIIIが、組替えにより調製されたものである請求項１の薬学的組成物。
【請求項１２】
前記粒子対ＦVIII比（ｗ／ユニットＦVIII）が、０．１ｍｇ／ユニットないし１０ｍｇ／ユニットである請求項１の薬学的組成物。
【請求項１３】
前記粒子対ＦVIII比（ｗ／ユニットＦVIII）が、１ｍｇ／ユニットである請求項１２の薬学的組成物。
【請求項１４】
血友病に罹っている患者の治療のための非経口投与用薬学的組成物の調製におけるコロイド状粒子の使用であって、前記薬学的組成物が治療的に有効量の凝固第VIII因子（ＦVIII）及び中性のコロイド状粒子を含み、前記粒子が生物適合性親水性ポリマーにより誘導された両親媒性リピド１〜２０モルパーセントを含有し、前記ポリマーが正味電荷を帯びていないものである使用において、
前記ＦVIIIが前記コロイド状粒子内に被包されていないものである使用。
【請求項１５】
前記患者が、ＦVIII阻害抗体を発現している請求項１４の使用。
【請求項１６】
前記コロイド状粒子が、さらに天然又は合成源から得られた第２の両親媒性リピドを含む請求項１の薬学的組成物。
【請求項１７】
前記第２の両親媒性リピドが、ホスファチジルコリンである請求項１６の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、血液凝固疾患の治療のための凝固促進物質を除放するための安定な薬学的製剤(pharmaceutical formulation)に関する。
【０００２】
【従来の技術】
血友病Ａは、最も度々発生する遺伝性凝固疾患の１つである。血友病Ａの患者は、凝固系の１又はそれ以上が誤機能する結果、頻繁な出血の傾向がある。血友病の原因の１つは、血液中の第VIII因子（ＦVIII）の欠乏である。この問題は、第VIII因子濃縮物により治療し得る。しかしながら、患者の約１５％において、第VIII因子中和抗体（いわゆる、阻害剤）が発生し、これにより、第VIII因子濃縮物(concentrate)を用いる治療は、ほとんど不可能である。
【０００３】
文献には、ＦVIIIを阻害剤による不活化から保護するための２つの基本的なアプローチが記載されている。
【０００４】
ヘムカー(Hemker)のＷＯ／８０／０１４５６には、リン脂質から形成される０．５〜１．０ミクロンのリポソーム内に取り込まれたＦVIIIを含む経口投与に好適な薬学的組成物が開示されている。リン脂質は、正味電荷を有し、ＦVIIIは、リポソームの層間に取り込まれる。血漿中のＦVIIIレベルは、５０時間の間、正常値の約５％に維持されることが特許請求されている。
【０００５】
ホリコシのＵＳ  ４，３４８，３８４には、ヘムカーに記載される組成物を調製したが、満足な結果は得られなかったことが述べられている。そこで、ホリコシは、ＦVIIIを蛋白分解から保護するために、リポソーム内にＦVIIIとともにプロテアーゼ阻害剤を取り込んでいる。ＦVIIIの正常血中レベルの３％が６時間にわたり得られている。
【０００６】
ウードル(Woodle)のＵＳ  ５，０１３，５５６には、血流を通して各種の薬剤を配達するために用いるリポソーム組成物が開示されている。このリポソームには、ポリアルキルエーテルにより誘導された両親媒性リピド１〜２０モルパーセントが含有されている。ここでも、薬剤化合物は、リポソーム内に取り込まれている。これらのリポソーム組成物は、ステアルス小胞(Stealth(登録商標)  vesicle)の名称で（ＳＵＶ’ｓ、リン脂質及びリン脂質に共有結合したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含有する小さい単房小胞）、商業的に入手可能である。
【０００７】
このアプローチに伴う更なる問題は、大きい直径を有するリポソームが短い半減期を有することにある。従って、リポソームは、高圧下にサイズダウンしなければならず、凝固因子Ｖ及びVIII内おけるような蛋白活性に影響を及ぼし得る。
【０００８】
第２のアプローチにおいて、バロウクリフ(Barrowcliffe)，Ｔ．Ｗ．，ら（１９８３）、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１０１：３４〜４３には、ＦVIIIをヒト及び／又は動物の脳から抽出したリン脂質と混合することにより、イン・ビトロでＦVIIIへの有意な保護が付与されることが教示されている。このアプローチでは、リン脂質は、それを被胞するというよりは、むしろ、ＦVIIIに結合している。ケンボル−クック(Kemball-Cook)，Ｇ．及びバロウクリフ，Ｔ．Ｗ．（１９９２）、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．６７：５７〜７１には、負電荷を帯びたリン脂質表面が、ＦVIII結合に必要であることが教示されている。負電荷を帯びたホスファチジルセリン及びホスファチジン酸がＦVIIIに対する結合が高活性である一方で、ホスファチジルコリンは、不活性であることが見出された。しかしながら、負に電荷したリン脂質は、毒性があり、脳組織由来のリン脂質は、細胞変性剤を同伴し得る。
【０００９】
ＥＰ  ６８９，４２８には、親水性ポリマー鎖の外表面層を有するリポソームを含有するリポソーム組成物が開示されている。ポリペプチド又は多糖類エフェクター分子が、エフェクター結合に先立つリピドアンカーの活性化によりポリマー鎖の遠心端に共有結合している。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、治療的処置のための蛋白又はポリペプチドを含有する薬学的組成物を提供することである。具体的には、本発明の目的は、血液凝固疾患の治療のためのＦVIIIを含有する薬学的組成物を提供することである。
【００１１】
本発明の更なる目的は、血流中で延長された半減期を有する形態にあるＦVIIIを提供することである。
【００１２】
本発明の更なる目的は、血液凝固疾患に罹った患者、具体的には、血友病、最も具体的には、ＦVIII阻害剤を有する患者を治療する方法を提供することである。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明の一つの側面において、非経口投与のための薬学的組成物であって、治療的に有効量の凝固因子ＶIII（ＦVIII）及び実質的に中性のコロイド状粒子を含み、前記粒子が生物適合性親水性ポリマーにより誘導された両親媒性リピドを１〜２０モルパーセント含み、前記ポリマーが実質的に正味電荷を有さないものである組成物において、前記ＦVIIIがコロイド状粒子内に被包されていないものである組成物、が提供される。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明は、生物適合性親水性ポリマー(biocompatible hydrophilic polymer)により誘導された中性リン脂質が、ＦVIIIと結合させるために用い得、ＦVIIIを血流中の阻害剤から保護し得るという驚くべきかつ予測外の発見に基づいている。これにより、従来の組成物よりも有意な利点が提供される。なぜならば、用いられるリン脂質は、合成品であり、非毒性であり、従って、治療的処置のためにイン・ビボで用い得るからである。さらに、リポソームは、ＦVIIIを被包しないので、イン・ビボにおいてより長い半減期を有するより小サイズのリポソームを用いることができる。これは、細網内皮系により除去されないからである。以下に、より詳細に記載するように、ＦVIIIは、リポソームの外表面上のポリマー鎖と非共有的に相互作用し、ＥＰ  ６８９，４２８に開示される組成物とは異なり、ポリマー鎖を活性化するための化学反応は行われない。
【００１５】
本明細書において、「実質的に中性」及び「実質的に正味電荷がない」との用語は、正にも負にも電荷されていないことを意味する。しかしながら、実験誤差ゼロの範囲内の非常に低い測定電荷は、上記用語の意味に含まれる。
【００１６】
「治療的に有効量」との用語は、所望の治療効果を有するＦVIIIの血流中レベルをもたらすＦVIIIの量をいう。そのような量は、異なる量のＦVIIIを含む組成物を投与し、投与後の様々な時間に血液中のレベルを測定することにより実験的に測定することができる。
【００１７】
コロイド状粒子を調製するために用いる両親媒性リピドは、好ましくは、リン脂質であり、天然源又は合成源のいずれからでも入手し得る。最も好ましいリン脂質は、ホスファチジルコリンであり、最も好ましくは、卵−ホスファチジルコリンである。
【００１８】
生物適合性親水性ポリマーには、ポリアルキルエーテル、ポリ乳酸又はポリグリコール酸ファミリー由来のポリマーが含まれる。好ましくは、生物適合性親水性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。このポリマーの目的は、立体的にＳＵＶsを安定化し、それによりイン・ビボでの小胞の融合を防止し、イン・ビボにおいて小胞がＲＥＳにより吸着することを回避することを可能にする。生物適合性親水性ポリマーは、好ましくは約１０００ないし約５０００ダルトン、最も好ましくは、約２０００ダルトンの分子量を有するであろう。
【００１９】
コロイド状粒子は、好ましくは、平均粒子直径約０．０５ないし約０．４ミクロン、最も好ましくは、約０．１ミクロンを有する。これは、コロイド状粒子のイン・ビボにおける循環時間を増加させ、ＲＥＳによりそれらが吸着されることを防止するためである。両親媒性リピドは、粒子の約１ないし約２０モル％、好ましくは、約１〜５％、最も好ましくは、５％を構成する。
【００２０】
親水性ポリマーにより誘導される小胞形成リピドを調製するために、多様な既知の結合反応を用いることができる。例えば、ポリマー（ＰＥＧのような）を、塩化シアヌル基を通してホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）のようなリピドに誘導し得る。その代りに、キャップしたＰＥＧをカルボニルジイミダゾールカップリング剤により活性化し、活性化イミダゾール化合物を形成することができる。他の反応は周知であり、例えば、前述のＵ．Ｓ．  ５，０１３，５５６（この内容は、引用により本明細書に取り込む）に列記されている。
【００２１】
本発明の組成物において用いられるＦVIIIは、商業的に入手可能である。天然のヒト起源由来であってもよいし、または、好ましくは、組換えにより調製することもできる。組換えＦVIIIは、商業的に入手可能であり、例えば、抗血友病因子（レコンビナント(Recombinant)）、ｒＦVIII−ＳＱ（ファルマシア(Pharmacia)）、及びとりわけ、コゲネート(Kogenate)、マイルス社(Miles Inc.,)、薬学部門、エルクハート(Elkhart)、インデティアナ州、アメリカ合衆国が挙げられる。
【００２２】
本発明の組成物は、非経口的に投与され、好ましくは、静脈内投与される。従来の組成物は、リポソーム組成物による注射中に引き起こされる副作用故に、経口使用のみであった。これに対して、本発明の組成物は、その他の理由のなかでも、おそらくは荷電を欠如しているが故に、注射により非毒性である。本発明のコロイド状粒子は、検知し得る毒性症状を伴わず、０．５ｇｍ／体重Ｋｇまでの量注射されてきた。投与量は、およそ２５〜７５ｉ．ｕ．／体重Ｋｇの範囲であることが期待される。粒子対ＦVIII比（Ｗ／ユニットＦVIII）は、好ましくは、約０．１ｍｇ／ユニット及び約１０ｍｇ／ユニットの間、最も好ましくは、約１ｍｇ／ユニットであろう。遊離の形態のＦVIII：Ｃの半減期は、マウスにおいて２時間未満であるが（凝固活性により測定されるＦVIII）、本発明の組成物中において投与されるＦVIIIは、少なくとも２４時間有効であることが期待される。この半減期は、前記凝固促進化合物の有効活性の期間である。本発明の組成物は、「オン・デマンド」であり、かつ血友病患者の予防的治療、特に、ＦVIII阻害抗体を発現した患者に有効であることが期待される。
【００２３】
本発明の組成物に含有されるＦVIIIの有効性は、次の２つの連続工程：（１）精製された成分を含有する凝固因子試薬におけるＸ因子のＸａ因子へのＦVIII依存的転換工程、及び（２）色素因子Ｘａ基質の酵素的解裂により、分光測光により定量化し得る色素を得る工程、によりＦVIII活性を測定する色素アッセイにより測定することができる。適切なアッセイ条件下において、Ｘａ因子形成速度とＦVIII濃度との間には直線関係がある。更に、ＦVIII活性は、一段階凝固アッセイにより測定し得る。このアッセイは、プロスロンビンからスロンビンへの転換（スロンビンは、引き続いて、フィブリノーゲンを解裂し、フィブリンを含む血塊を形成する）によりＦVIII活性を測定する。血友病マウスにおけるＦVIII活性は、尾切断後のマウスの生存数を測定することによっても決定し得る。
【００２４】
本発明のさらなる側面において、非経口投与のための薬学的組成物であって、薬学的に有効量の蛋白又はポリペプチド及び実質的に中性のコロイド状粒子を含有し、前記粒子が、生物適合性親水性ポリマーにより誘導される両親媒性親水性ポリマーを約１〜２０モルパーセント含有し、前記ポリマーが実質的に正味電荷を有しない組成物において、前記蛋白又はポリペプチドが、（ａ）前記コロイド状粒子に外部から結合し得る蛋白又はポリペプチド、及び（ｂ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に結合し得る蛋白又はポリペプチドからなる群から選択され、前記蛋白又はポリペプチドが、前記コロイド状粒子内に被包されていないものである薬学的組成物、が提供される。
【００２５】
「前記コロイド状粒子に外部から結合し得る蛋白又はポリペプチド」との用語には、蛋白及びポリペプチドであって、ＦVIIIと同様に、ホスファチジルコリン：ホスファチジルセリン（ＰＣ：ＰＳ）を含む膜に結合するものが含まれる（恒常性及び血栓症(Haemostasis and Thrombosis)、アルサー(Arthur)  Ｌ．、ブルーム及びダンカン(Bloom and Duncan)、Ｐ．トーマス(Thomas)（編）（１９８７）、チャーチル  リビングストン(Churchill Livingstone)、１７９〜１８０頁を参照）。そのような蛋白の例は、プロスロンビン、Ｘ因子及びＶ因子のような凝固因子であるが、これらに限られるものではない。
【００２６】
「ポリエチレングリコールに結合し得る蛋白又はポリペプチド」との用語には、蛋白及びポリペプチドであって、イオン相互作用、疎水性相互作用、水素結合及びファンデルワールス力のような、非共有性メカニズムによりＰＥＧ又はＰＥＧの誘導体に結合するものが含まれる（アラカワ、Ｔ．及びチマシェフ(Timasheff)、Ｓ．Ｎ．（１９８５）、バイオケミストリー  ２４：６７５６〜６７６２；リー(Lee)，Ｊ．Ｃ．及びリー、Ｌ．Ｌ．Ｙ．（１９８１）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２２６：６２５〜６３１）。
【００２７】
［好ましい態様の詳細な説明］
例１〜３
方法及び材料
１．卵ホスファチジルコリン（Ｅ−ＰＣ）リポソーム
卵ホスファチジルコリン（Ｅ−ＰＣ）のｔｅｒｔ−ブタノール溶液を、１８ｍｌのｔｅｒｔ−ブタノール中に２．０ｇのＥ−ＰＣ、１．９ｍｇのα−トコフェロール及び蛍光標識されたホスファチジルエタノールアミン（１：１０００リピドモル比）を溶解することにより調製した。
【００２８】
凍結乾燥によりリピド混合物から有機溶媒を除去し、リピドを水に再溶解し、１０％（ｗ／ｖ）にした。得られたリポソームを、Ｌｉｐｏｓｏｆａｓｔ−Ｂａｓｉｃ又はＬｉｐｏｓｏｆａｓｔ−５０押出し機（Ａｖｅｓｔｉｎ）を用いてポリカーボネート（ＰＣ）フィルター（０．４μｍ、０．２μｍ、０．１μｍ及び０．０５μｍ）を連続的に通して押出すことにより、リポソームのサイズを低減させ、平均サイズ０．１μｍのリポソームを得た。
【００２９】
２．卵ホスファチジルコリン／ポリエチレングリコール−ホスファチジルエタノールアミン（Ｅ−ＰＣ／ＰＥＧ−ＰＥ）リポソーム
卵ホスファチジルコリン（Ｅ−ＰＣ）及びポリエチレングリコール−ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）のｔｅｒｔ−ブタノール溶液を、１８ｍｌのｔｅｒｔ−ブタノール中に０．７３ｇのＥ−ＰＣ、０．１８５ｇのＰＥＧ−ＰＥ、０．８６ｍｇのα−トコフェロール及び蛍光標識されたホスファチジルエタノールアミン（１：１０００リピドモル比）を混合することにより調製した。
【００３０】
凍結乾燥によりリピド混合物から有機溶媒を除去し、次いで、リピドを水に再溶解し、１０％（ｗ／ｖ）にした。上記１に記載したようにして、得られたリポソームのサイズを低減させ、平均サイズ０．１μｍのリポソームを得た。
【００３１】
３．卵ホスファチジルコリン−ホスファチジルグリセロール（Ｅ−ＰＣ／ＰＧ）リポソーム
卵ホスファチジルコリン（Ｅ−ＰＣ）及びホスファチジルグリセロール（ＰＧ）のｔｅｒｔ−ブタノール溶液を、１８ｍｌのｔｅｒｔ−ブタノール中に０．８２２ｇのＥ−ＰＣ、０．０９２４ｇのＰＧ、０．８６ｍｇのα−トコフェロール及び蛍光標識されたホスファチジルエタノールアミン（１：１０００リピドモル比）を混合することにより調製した。
【００３２】
凍結乾燥によりリピド混合物から有機溶媒を除去し、次いで、リピドを水に再溶解し、１０％（ｗ／ｖ）にした。上記１に記載したようにして、得られたリポソームのサイズを低減させ、平均サイズ０．１μｍのリポソームを得た。
【００３３】
４．ヒト組替え第VIII因子の再溶解
コゲネート(Kogenate)（ヒトアルブミンと共に製剤されたｒＦVIII、バイエル(Bayer)）のロット７０Ｋ０２６及び７０Ｋ０２７を以下の例で用いた。約５００ＩＵのＦVIII活性を含有する１つのバイアルを水２ｍｌに再溶解し、安定化させた。２００μｌのアリクオットを使用するまで−２０℃に凍結した。
【００３４】
アルブミン枯渇コゲネートの調製のために、ロット＃７０Ｋ０２７を用いた。コゲネート１０バイアルを２０ｍｌの水に再溶解し、親水性シリカゲル（３〜１０μｍビーズ）でクロマトグラフに供した。１０ｍｌのフラクションを回収し、蛋白及びＦVIII：Ａｇ活性をモニターした。フラクション４〜６の１つのピーク及びフラクション８〜１４の別のピークにおいて、ＦVIII：Ａｇ活性の回収率５０％を認めた。蛋白アッセイによりフラクション９〜１２にピークが得られたので、フラクション４〜６をプールし、アリクオットにして凍結乾燥し、更なる使用に供した。
【００３５】
５．ビ(Bi)．Ｌ．，ら（１９９５）のネイーチャー・ジェネティクス、１０：１１９〜１２１に記載されるようにして調製した血友病マウスを用いた。
【００３６】
６．スイス、ＤｕｄｉｎｇｅｎのＤａｄｅ  ＡＧから商業的に入手可能なＦVIII色素アッセイを用いて、ＦVIII：Ａｇ活性を測定した。
【００３７】
７．組成物の調製及び血友病マウスへの注射
リポソームアリクオットを所定の体積のＦVIIIと混合し、５〜１０ＩＵ／ｍｌのＦVIII：Ａｇ活性を得、室温で回転させ、均質にした。
【００３８】
８．５〜１０匹の血友病マウスの群に、２００又は４００μｌの混合物と共にIVボーラス(IV bolus)を尾静脈を通して注射した。規則的な時間間隔（１時間、４時間、８時間、２４時間、３２時間及び４８時間）でマウスの目から採血し、血漿中のＦVIII：Ａｇ活性を追跡した。
【００３９】
９．ＲＳＴＲＩＰコンピュータソフトウエアーを用いて得られた結果から、ＦVIIIの薬学速度論を測定し、マウス血液循環における初ＦVIII：Ｃ活性（Ａ0）及びVIII因子の半減期（Ｔ1/2）を得た。
【００４０】
結果
１．第VIII因子の半減期へのリピド組成物の影響
Ｅ−ＰＣ、Ｅ−ＰＣ／ＰＥＧ−ＰＥ及びＥ−ＰＣ／ＰＧを含む０．０５μｍのリポソームを調製し、コゲネートと７２：１のリピド対蛋白（Ｗ／Ｗ）比率に混合し、血友病マウスに注射した。対照として、コゲネートを生理食塩水に希釈し、リポソーム混合物と同様にしてマウスに注射した。薬学速度論パラメータを上述のようにして求めた。結果を以下の表に要約する。
【００４１】
【表１】
0004545928.tif 000002
【００４２】
上記表から、Ｅ−ＰＣ／ＰＥＧ−ＰＥを含有するリポソームの初ＦVIII活性及び半減期は、リポソームがＥ−ＰＣ／ＰＧ又はＥ−ＰＣのみから構成されるコゲネート又はコゲネート−リポソーム混合物よりも高いので、Ｅ−ＰＣ／ＰＥＧ−ＰＥを含有するリポソームが最も有効であったことが明らかである。
【００４３】
さらに、遊離のＦVIIIを注射されたマウスの４０％及びＦVIII／ＰＣ複合体を注射されたマウスの１００％は、ＦVIII色素活性の回復を見せなかった一方で、ＦVIII／ＰＣ＋ＰＥＧを注射されたマウスの１０％は、注射後６０分で同じ現象を見せた。
【００４４】
２．第VIII因子の半減期へのリピド／蛋白比の影響
Ｅ−ＰＣ／ＰＥＧ−ＰＥを含有する０．０５μｍのリポソームの様々なアリクオットをコゲネートと混合することにより、リポソーム組成物における様々なリピド対蛋白比を得た。これらを血友病マウスに注射した。対照として、コゲネートを生理食塩水で希釈し、リポソーム混合物と同じ方法でマウスに注射した。薬学速度論を上述のようにして求めた。結果を以下の表に要約する。
【００４５】
【表２】
0004545928.tif 000003
【００４６】
表２から、リピド／蛋白比を増加することにより、血友病マウスの血流中のＦVIIIの半減期が増加することが分かる。初ＦVIII：Ｃ活性における差違は、リピド／蛋白比に無関係なようである。
【００４７】
３．異なる第VIII因子源の影響
Ｅ−ＰＣ及びＰＥＧ−ＰＥ（９４：６モル％）を含有する０．０５μｍのＳＵＶｓを調製し、様々な源由来（コゲネート、バクスター(Baxter)及びオムリキシエート(Omrixate)）のＦVIII濃縮物と７２：１のリピド対蛋白比に混合し、血友病マウスに注射した。対照として、様々な源由来のＦVIIIの濃縮物の各々を生理食塩水に希釈し、リポソーム混合物と同じ方法でマウスに注射した。薬学速度論を上述のようにして求めた。結果を以下の表に要約する。
【００４８】
【表３】
0004545928.tif 000004
【００４９】
上記表から明らかなように、遊離の因子の薬学速度論と比較して、リポソーム及びバクスター又はオムリキシエート由来のＦVIIIを含有する混合物は、この因子の半減期を２０％増加させた。コゲネート由来のＦVIII因子の半減期は、Ｅ−ＰＣ／ＰＥＧ−ＰＥリポソームと混合された場合、遊離形態の因子と比較して２倍長かった。
【００５０】
例４
方法及び材料
１．リポソーム調製：
リポソームを次のようにして調製した：卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）及びジステアロイルホスファチジル−エタノールアミンメチルポリエチレングリコール２０００（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ  ２０００）を８０：２０ｗ／ｗの割合（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ  ２０００の５％モル比）にそれぞれ秤量し、ｔｅｒｔ−ブタノール（Ｒｅｉｄｅｌ−ｄｅ  Ｈａｅｎ）中に１０％ｗ／ｖに溶解し、溶液を凍結乾燥した。得られた乾燥リピド粉末を、１３０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのクエン酸ナトリウム、１ｍＭのＣａＣｌ2を含有する緩衝液（ｐＨ７．０）に１０％ｗ／ｖに再懸濁させ、リポソームを形成した。１．２μｍ、０．２μｍ及び０．１μｍサイズのポリカーボネートフィルターを通して押出し機（Ａｖｅｓｔｉｎ）でろ過し、１２０〜１４０ｎｍサイズのリポソームを形成した。
【００５１】
２．リポソーム品質管理
リポソームの品質管理には、
１）サブミクロン粒子分析器（Ｎ４プラス、Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ）により測定したサイズ分布
２）リン脂質測定（リンによる）
３）ＴＬＣによるリピドの化学的安定性
が含まれる。
【００５２】
試験は、バレンホルツ(Barenholz)，Ｙ．及びアムセレム(Amselem)，Ｓ．（１９９３）のリポソームテクノロジー、第２版、Ｉ巻（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｇ．，編）、フロリダ州、ボカレイトン(Boca Rayton)のＣＲＣプレス、５２７〜６１６頁に記載されるようにして行った。
【００５３】
３．ＦVIII及びリポソームの製剤
コゲネート（ロット番号７０Ｋ０２７、６２０ＩＵ）又はニューコゲネート(New Kogenate)（５００ＩＵ）を１ｍｌ又は２ｍｌのＨ2Ｏに溶解した。ｒＦVIII−ＳＱ濃縮物をリポソーム溶液に溶解した。第VIII因子濃縮物をリポソームと室温で約１時間混合することにより、第VIII因子をリポソームと製剤した。リピド対ＦVIIIユニットの比は、約１ｍｇリピド／１ユニットＦVIIIであった。
【００５４】
４．血友病マウスへの注射及び採血手順
第VIII因子及びリポソームと製剤されたＦVIIIを血友病マウスの尾静脈に注射した。注射投与量は、コゲネート（２つの別の実験）及びニューコゲネートについては３ユニット／マウス、並びにｒＦVIII−ＳＱについては４ユニット／マウスであった。注射後１０分において、並びに注射後約４、１９及び２７時間において、クエン酸塩試験管にマウスから採血した。
【００５５】
５．マウス血漿におけるＦVIII濃縮物の測定
色素アッセイ（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ）を用いて製造者の指示に従い、及び１段階凝固アッセイ（Ｓｔａｇｏ  ｒｅａｇｅｎｔｓ及びＳＴ４凝固機を用いた）により製造者の指示に従い、マウス血漿中のヒトＦVIII濃縮物を測定した。
【００５６】
６．薬学速度論分析
薬学速度論パラメータは、コンピュータプログラム（ＲＳＴＲＩＰ、ＭｉｃｒｏＭａｔｈ社）を用いて分析した。
【００５７】
７．尾切断後の血友病マウスの生存数
ｒＦVIII−ＳＱ又はリポソームと製剤されたｒＦVIII−ＳＱをマウスに注射した（４ユニット／マウス、各々の群１１匹のマウス）。注射後２０時間において、尾を２ｃｍ切断した。投与後２８、４４、５２、６９、８８及び１４０時間において、生存しているマウスの尾を再び切断した（各々の回、２ｍｍ）。
【００５８】
結果
４つの異なる実験の、各々の注射後の時点におけるＦVIII活性及び薬学速度論パラメータ｛ＦVIII半減期（ＨＬ）及び曲線下エリア（ＡＵＣ）｝の結果を表４〜７Ｂに要約する。表４及び５において、３ユニットのコゲネート／マウスが注射された。表６において、３ユニットのニューコゲネート／マウスが注射された。また、表７Ａ、７Ｂ及び図１において、４ユニットのｒＦVIII−ＳＱ／マウスが注射された。
【００５９】
【表４】
0004545928.tif 000005
【００６０】
【表５】
0004545928.tif 000006
【００６１】
【表６】
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【００６２】
【表７】
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【００６３】
【表８】
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【００６４】
さらに、各々のマウスにおけるヒトＦVIIIの半減期を計算し、全ての実験群におけるＦVIII半減期をスチューデント試験により統計的に互いに比較した。
【００６５】
４つの実験すべてにおいて、リポソームと製剤されたＦVIIIを受けた群におけるヒトＦVIII半減期は、遊離のＦVIIIを受けた群におけるヒトＦVIIIよりも高くかつ有意に異なる（ｐ＜０．０５５）：
コゲネートのＨＬ対コゲネート＋リポソームのＨＬ（表４）ｐ＝０．０５４；
コゲネートのＨＬ対コゲネート＋リポソームのＡＵＣ（表５）ｐ＝０．０３１；
ニューコゲネートのＨＬ対ニューコゲネート＋リポソームのＨＬ（表６）ｐ＝０．００８５
ｒＦVIII−ＳＱのＨＬ対ｒＦVIII−ＳＱ＋リポソームのＨＬ（表７Ａ）ｐ＝０．００４５；
ｒＦVIII−ＳＱのＨＬ対ｒＦVIII−ＳＱ＋リポソームのＨＬ（表７Ｂ）ｐ＝０．０２２）。
【００６６】
これらの結果は、コゲネート、ニューコゲネート又はｒＦVIII−ＳＱのリポソームとの製剤は、第VIII因子の半減期（ＨＬ）及び血友病マウス（ＨＬ及びＡＵＣについて１．６〜２．０の因子）におけるＦVIIIの曲線下エリア(area under the curve)（ＡＵＣ）を有意に増加させることを示している。
【００６７】
マウスの生存数を図１に示す。尾切断実験の結果は、リポソームと製剤されたＦVIIIは、遊離のＦVIIIよりも生物学的に活性であり、従って、血友病患者をより長い期間保護し得ることを示している。
【００６８】
例５
阻害剤を有する患者におけるＦVIII組成物の影響
ＦVIII（コゲネート）１５ユニットを、ＥＰＣ：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（９５：５モル％）を含有する１２０ｎｍリポソーム（１５ｍｇリピド）と室温で１時間インキュベートした。次いで、阻害剤（抗ＦVIII抗体）を発現した血友病患者からの血漿の様々な希釈物とともに、１ユニットの遊離のＦVIII（コゲネート）又は１ユニットのリポソームと製剤されたＦVIIIを３７℃で２時間インキュベートした。インキュベーションの後、第VIII因子の活性を色素アッセイにより測定した。
【００６９】
表８に結果を要約する：
【表９】
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【００７０】
この実験から、コロイド状粒子と一緒にＦVIIIを投与することは、ＦVIIIを血漿阻害剤から保護することに有効であることが明らかに分かる。
【図面の簡単な説明】
本発明を理解し、及び本発明がどのようにして実施し得るかが分かるために、制限を課することのない例のみにより好ましい態様を添付の図面を言及して説明する。
【図１】  図１には、ＦVIIIを注射され、引き続いて注射後の様々な時間において尾を切断された血友病マウスの生存数を示している。
【図１】
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