(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
白金を基礎とする化学療法に対する患者の腫瘍の感受性を予測する方法において、
（ａ）固定され、パラフィン包埋された腫瘍試料から、ｍＲＮＡを単離する工程であって、前記単離が、
（ａ１）前記試料を、有効な濃度のカオトロピック剤を含む溶液中、７５から１００℃までの温度で、５分から１２０分までの時間に亘って加熱し、
（ａ２）前記カオトロピック剤の溶液から、前記ｍＲＮＡを回収する
ことにより行なわれる、工程；
（ｂ）ストリジェントな条件下で、ＥＲＣＣ１遺伝子に相補する領域にハイブリダイズする１対のオリゴヌクレオチド・プライマーを用いて、前記ｍＲＮＡを増幅し、増幅された試料を得る工程；
（ｃ）増幅された試料においてＥＲＣＣ１のｍＲＮＡ量を決定する工程；
（ｄ）工程（ｃ）で得られた増幅試料のＥＲＣＣ１のｍＲＮＡ量を、内部コントロール遺伝子から増幅されたｍＲＮＡ量と比較し、補正された相対ＥＲＣＣ１発現レベルを得る工程；及び
（ｅ）工程（ｄ）で得られた、補正された相対ＥＲＣＣ１発現レベルと、ＥＲＣＣ１遺伝子発現に対する所定の閾値とを比較し、補正された相対ＥＲＣＣ１発現レベルが所定の閾値よりも低い場合には、白金を基礎とする化学療法に対して患者の腫瘍が感受性であると判断することにより、白金を基礎とする化学療法に対する患者の腫瘍の感受性を予測する工程；
を含む方法。
【請求項２】
前記のオリゴヌクレオチド・プライマーの対が、配列番号１の配列又はそれに実質的に同一なオリゴヌクレオチド・プライマーと、配列番号２の配列又はそれに実質的に同一なオリゴヌクレオチド・プライマーとからなる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記腫瘍が、非小細胞の肺ガン（ＮＳＣＬＬＣ）の腫瘍である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記内部コントロール遺伝子が、β−アクチン遺伝子である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
ＥＲＣＣ１遺伝子発現レベルに対する前記閾値が、β−アクチン遺伝子発現レベルの６．７×１０−３倍である請求項４記載の方法。
【請求項６】
固定され、パラフィン包埋された組織試料におけるＥＲＣＣ１遺伝子の発現レベルを決定する方法において、
（ａ）組織試料の脱パラフィンを行い、脱パラフィンされた試料を得る工程；
（ｂ）脱パラフィン化された試料から、ｍＲＮＡを単離する工程であって、前記単離が、
（ｂ１）前記試料を、有効な濃度のカオトロピック剤を含む溶液中、７５から１００℃までの温度で、５分から１２０分までの時間に亘って加熱し、
（ｂ２）前記カオトロピック剤溶液から、前記ｍＲＮＡを回収する
ことにより行なわれる、工程；
（ｃ）ＥＲＣＣ１遺伝子に相補する領域にストリジェント条件下にてハイブリダイズする１対のオリゴヌクレオチド・プライマーを用いて、前記ｍＲＮＡを増幅処理し、増幅された試料を得る工程；
（ｄ）内部コントロール遺伝子から増幅されたｍＲＮＡ量に対する、工程（ｃ）で得られた増幅試料におけるＥＲＣＣ１遺伝子のｍＲＮＡの相対発現を決定する工程；
を含む方法。
【請求項７】
前記のオリゴヌクレオチド・プライマーの対が、配列番号１の配列又はそれに実質的に同一なオリゴヌクレオチド・プライマーと、配列番号２の配列又はそれに実質的に同一なオリゴヌクレオチド・プライマーとからなる、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記内部コントロール遺伝子がβ−アクチン遺伝子である、請求項６記載の方法。
【請求項９】
配列番号１の配列、及び／又は、それに実質的に同一な配列を有するオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
配列番号２の配列、及び／又は、それに実質的に同一な配列を有するオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
配列番号１の配列又はそれに実質的に同一なオリゴヌクレオチド・プライマーと、配列番号２の配列又はそれに実質的に同一なオリゴヌクレオチド・プライマーとからなる、オリゴヌクレオチドの対を含む、ＥＲＣＣ１の発現を検出するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、医療、特にガンの化学療法に有益である予後予測の方法に関する。より具体的に本発明は、患者の腫瘍細胞遺伝子の発現を評価(assessment)することに関する。DNAを標的とする化学療法としての薬剤、特に白金を基本とする方法にてDNAに損傷を与える薬剤により治療された患者の生存性が、ヒトのDNAの修復に関与する遺伝子から発現されるmRNAを検査することにより評価される。
【０００２】
発明の背景
正常な細胞細胞が原ガン細胞に転換され、そして悪性細胞となるとガンが生ずる。形質転換された(悪性の)細胞が、細胞の現象型を特定し、そして細胞の増殖を阻害するという正常な生理的制御から回避する。従って個体の生体内の転換された細胞が、増殖し腫瘍を形成する。腫瘍が見出された時臨床の目的は、治療を受けている個体における正常な細胞に生ずる何らかの損傷を緩和させながら、悪性細胞を選択的に破壊させることである。
【０００３】
化学療法は、ガン細胞に選択的な毒性(細胞毒性)のある薬剤を使用することに基づいている。一般的分類の幾つかの化学療法薬剤が、核酸の合成、タンパク質の合成、及び他の生体の代謝過程を妨害する薬剤を含めて、開発されてきた。これらは、一般的抗代謝薬剤として言及されている。他の分類の化学療法薬剤が、細胞DNAに損傷を与える。こうした分類の薬剤は、一般的に遺伝子毒素として言及されている。よく所望される化学療法薬剤又はその薬剤の組み合わせに対し個体の腫瘍形成の感受性が、試用治療期間の後にしか正確に評価することができない。成功しなかった試験期間に使われた経過時間にて、進行の急激な悪性腫瘍の臨床治療に重大な危険が提示される。
【０００４】
細胞DNAの損傷の修復が、細胞の酵素修復機構により行われる重要な生体的なプロセスである。細胞ゲノムの修復されない損傷部が、DNAの複製を阻害し、新たに合成されるDNAの複製の適合性を損傷させ、そして/又は細胞の生存に必要な遺伝子の発現を阻害する可能性がある。
【０００５】
従って一般的に遺伝子毒性薬剤は、不活性期の非分裂細胞よりDNA合成に働く活性な分裂細胞に有為的に強い毒性があると、考えられる。体内の多くの組織の正常な細胞が不活性期であり、そして細胞サイクルの再入及び分裂を頻繁に行うわけではない。細胞分裂周期間の時間が有意的に長くなれば、化学療法の遺伝子毒素にて行われた正常細胞DNAの損傷を、修復することができる。結果としてガン細胞を殺すための幾つかの選択が行われる。多くの治療処方では、これら一般分類に2以上属する化学療法薬剤を、共に投与することにより、ガン細胞に対する選択性の改良するための試行には、反映されている。
【０００６】
固形状の腫瘍における有効な化学療法は、薬剤を組み合わせることが必要なことから、単一のそれぞれの薬剤に対する抵抗性又は感受性の決定剤を、同定しそして定量することが、組み合わせ化学療法を個体に処方する重要なツールとなってきた。
【０００７】
細胞DNAの損傷に示され、広く用いられている2種の遺伝子毒性の抗ガン剤は、シスプラチン(DDP)及びカルボプラチンである。近年シスプラチン及び／又はカルボプラチンが、呼吸、胃腸及び生殖管の、中空神経系の、及び頭部や首における鱗状器官の、ガン腫及び肉腫を含む、上皮及び間葉細胞の選択された、多様な腫瘍新生物質の治療に用いられる。他の薬剤と組み合わせたシスプラチンが、精巣ガン腫瘍の治療に好まれ、そして多くの例において継続的に快癒方向になるか、消失状態を形成する(Loehrerらの1984,100 Ann.Int.Med.704)。シスプラチン(DDP)が、鎖内に付加物を形成しDNA構造を破壊する。DDPなどの白金系薬剤に対する抵抗性が、白金付加物に対する寛容性を高め、薬剤の蓄積を減少させ、あるいはDNAの修復を高めることに帰することになる。DDPへの抵抗性が多因性であるが、おそらくDNA修復機構の変化が重要な役割を果たしている。白金系薬剤により形成されるなどの塊状DNA付加物の切除(excision)による修復には、DNA損傷の認識、及び切除(excision)に関与する遺伝子が介在すると見られる。CleaverらのCarcinogenesis 11:875-882(1990);Hoeijmakers らのCancer Cell 2:311-320(1990);Shivji らのCell 69:367-374(1992)を参照。実際に酵素DNA修復機構の1又は複数の要素における遺伝子欠陥を誘導する細胞が，シスプラチンに極めて高い感受性を有す。Fravalらの(1978),51 Mutat.Res.121,Beck and Brubaker(1973),116J.Bacterol 1247を参照。
【０００８】
切除修復交差-相補((excision repair cross-complementing)(ERCC1))遺伝子が、DNA付加物の修復に必須である。ヒトERCC1遺伝子がクローンされてきた。Westerveldら、Nature(London)310:425-428(1984);Tanaka ら、Nature348:73-76(1990)を参照。
【０００９】
その幾つかを、この遺伝子に欠陥のあるヒト及びハムスターの変異化細胞株を用いることにより研究し、そしてびヒト腫瘍組織を研究することにより、ERCC1によりコードされる産生物が、白金-DNA付加物の切除による修復に関与していることが明示された。Dabholkarら、J.Natl.Cancer Inst.84:1512-1517(1992);Dijtら、Cancer Res.48:6058-6062(1988);Hanssonら、Nucleic Acids Res.18:35-40(1990)を参照。
【００１０】
DNA-修復欠陥CHO細胞にトランスフェクトされた時、ERCC1が、白金-DNA付加物を修復できると共にシスプラチンに細胞抵抗性を与える。Hanssonら、Nucleic Acids Res.18:35-40(1990)を参照。切除による修復の最近受け入れられたモデルが、損傷の認識/切除する工程が、切除修復過程における速度の限定を示唆している。
【００１１】
白金を基本とする治療を受けているガン患者から悪性細胞におけるERCC1などの切除修復遺伝子発現の相対的なレベルが、研究されてきた。Dabholkarら、J.Natl.Cancer Inst.84:1512-1517(1992)を参照。胃ガン患者のERCC1の過剰発現が、腫瘍応答にマイナスの刺激を有し、シスプラチン(DDP)/フルオロウラシルの化学療法としての処方により治療された場合、最終的に生存することが報告されている(Metzger,et al.,J.Clin Oncol 16:309,1998)。最近の実証として、ゲムシタビン(gemcitabine(GEM))が、ERCC1ヌクレオチド切除修復(NER)活性を調節することを明示している。従って腫瘍内部のERCC1の発現レベルが、DDPであるかどうかを決定する主要な予後予測因子となり、そしてGEMがガン患者の療法に有効となるであろう。
【００１２】
組織的な分析と、その後のアーキバル保存(archival storage)ができるよう、大部分の病理試料が、一定に固定され且つパラフィンに包埋(FRE)される。従って大部分の生検組織の試料は、遺伝子発現の分析に有益でない、それはこうした研究には、遺伝子発現が正確に測定できるよう、RNAの高い集合性(integrity)が必要である。最近の遺伝子発現レベルは、タンパク質発現レベルを監視するための免疫組織化学による染色処理を用いることにより、こうした固定した包埋試料を定性的にのみ監視することができる。
【００１３】
現在まで、ERCC1発現のものを含む定量的な遺伝子発現の研究が、新鮮な組織又は凍結組織からRNAの逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)増幅に限定されてきた。Reedらによる米国特許第5,705,336では、卵巣腫瘍組織からERCC1mRNAを定量し、そしてその組織が白金を基本とする化学療法に感受性であるかどうか決定する方法が、開示されている。Reedらは、凍結された卵巣腫瘍の生検からのERCC1のmRNAを定量化した。
【００１４】
Reedら記載のようにヘルス・ケアーの専門家による凍結組織を使用すると、実質的に不都合であることが提示されている。RNAによる定量性の遺伝子マーカ・アッセイを計画している場合に、組織及び後のmRNAの変性を避けるために生検を迅速に搬送することが、重要な関心事である。生検を行うヘルス・ケアーの専門家が、組織試料のレシートに基づいてRNA抽出手法を迅速に行うよう備えられた施設に前記組織試料を、迅速に搬送しなければならない。こうした施設が利用できない場合、療法する人が、mRNAの変性を防止するよう試料を迅速に凍結しなければならない。組織及びRNAが変性する前に、こうした診断施設に有効に抽出できるよう、診断施設に到着するまで、前記組織試料が、冷凍状態を維持されなければならない、しかしながら遠方になる場合がある。ある場合、液体窒素やドライアイスを備えた特別搬送装置(couriers)を用いて輸送中の凍結組織の挿入可能性(integrity)を維持することは、来るだけで極めて経費が高くなる。
【００１５】
定まった生検は、基質(ストローマ)及び腫瘍組織の異種混合物を含む。新鮮又は凍結組織とは異なるFPE生検組織試料は、容易に顕微解剖され、そしてストローマーと腫瘍組織に分離され、そのため新鮮又は凍結組織を使用するより有意的な利点を提供する。しかしながら、固定組織、特に固定され、パラフィン包埋の組織からRNAを単離すると、高いRNAの変性が生じ、それが遺伝子発現の研究に一般的に適応することができない。
【００１６】
生物による試料からRNAを精製するには、多くの技術が存在するが、FPE試料からRNAの単離には、全く信頼性がない。たとえば、Chomczynski(米国特許第5,346,994号)では、フェノール及びグアニジン・イソチオシアネートを用いて液相分離により組織から、RNAを精製する方法が記載されている。生物としての試料を、フェノール及びグアニジン・イソチオシアネート水溶液にて均質化し、その後均等化された溶液にクロロホルムを混合した。その後遠心分離により均質化された質物を、有機相、中間相、及び水溶液相に分離する。有機相にタンパク質を、中間相にDNAを、水溶液相にRNAが分けられる。RNAを水溶液相から沈殿させることができる。残念ながら、固定、及びパラフィン包埋の(FPE)組織試料に、この方法を適用することができない。
【００１７】
RNAを単離するための他の周知な技術では、典型的にグアニジン塩かフェノール抽出物のいずれかが利用され、それは、Sambrook,J.ら、(1989)at pp.7.3-7.24,and in Ausubel,F.M.ら、(1994) at pp.4.0.3-4.4.7における例として記載されている。再度周知の方法では、パラフィン包埋の組織試料からRNAの単離における再生可能な定量結果が、全く提供されなかった。
【００１８】
従ってパラフィン包埋の組織からRNAを単離する技術が、特に腫瘍組織の遺伝子発現の研究に必要とされ、その理由として特定のリセプター又は酵素の発現レベルを、特定治療の成功の可能性を決定するため使用できるからである。
【００１９】
提示された遺伝子毒性ガン治療の早期予後予測を提供するためのパラフィン包埋の組織からERCC1mRNAを定量化する方法が必要である。結果として、固定、及びパラフィン包埋(FPE)の組織におけるERCC1の定量化を得るための努力が、成功していないが技術的に集中して行われてきた。従って本発明の目的は、固定、及びパラフィン包埋(FPE)の組織におけるERCC1レベルの評価、及びDNA損傷剤による治療に患者の腫瘍の抵抗可能性を予後予測する方法を提供し、患者の腫瘍細胞におけるERCC1mRNA量の調査、DNA・白金処理剤により生成されるDNAに、ある種の損傷の創生、及びそれと所定の閾値発現レベルのと比較する工程を提供することである。
【００２０】
発明の要約
本発明の1つの観点において、固定、及びパラフィン包埋(FPE)の腫瘍細胞から得られるERCC1mRNA発現のレベルを評価するための方法を提供する。
【００２１】
本発明の別の観点において、固定され、そしてパラフィン包埋(FPF)された組織試料から内部コントロールに対するERCC1のmRNAの発現量を定量する方法を提供する。この方法は、前記試料から全mRNAを単離し、そして内部コントロール遺伝子のmRNAの量に対するERCC1のmRNA量を決定することを含む。
【００２２】
本発明のこの観点の例において、ERCC1-504F(配列ID番号1)又はERCC1-547R(配列ID番号2)の配列、及び実質的にそれに同一の配列を有するオリゴヌクレオチド・プライマーを提供する。さらに本発明は、配列ID番号1又は配列ID番号2、あるいはそれに相補する配列に、ストリジェント条件下にてハイブリダイズする配列を有するオリゴヌクレオチド・プライマーを提供する。
【００２３】
本発明のさらに別の観点において、固定、及びパラフィン包埋 (FPE)の腫瘍試料からRNAを単離する工程、試料中のERCC1の遺伝子発現レベルを決定する工程、試料中のERCC1遺伝子の発現レベルと、所定のERCC1遺伝子に対する閾値レベルとを比較する工程、そして所定の閾値レベルとERCC1遺伝子の発現レベルとの比較の結果に基づいて化学療法の構成を決定する工程を含む、患者に対する化学療法の処方を決定する方法を提供する。
【００２４】
さらに本発明は、pre-TaqManTM技術により分析された試料の内部コントロールに対する周知のERCC1発現レベルに対し、TaqManTM技術を用いて分析される組織試料における内部コントロール遺伝子に対するERCC1の補正されていない遺伝子発現(UGE)を、正規化する方法に関する。
【００２５】
発明の詳細な説明
本発明が、腫瘍におけるERCC1mRNの量が、DNAと白金による薬剤にて治療された患者の生存性と関係するということを、ある程度見出している。ERCC1mRNAを高レベルに発現する腫瘍を有する患者が、白金を基本とする化学療法に抵抗性があり、そのことが、生存可能性のレベルが有意的に低いと考えられる。逆にいえば、ERCC1mRNA発現量の低い腫瘍のある患者が、白金を基本とする化学療法に感受性があると考えられ、有意的に高レベルの生存可能性を有している。患者の腫瘍におけるERCC1mRNAの相対的発現が、それを所定の閾値発現レベルと比較することにより判定される。
【００２６】
本発明は、内部コントロールの遺伝子発現に対し、固定、及びパラフィン包埋(FPE)の組織におけるERCC1mRNAの発現量を定量化する方法に関する。本発明者が、固定、及び包埋の組織におけるERCC1の発現を正確にアセスメントできるオリゴヌクレオチド・プライマーを開発した。本発明によるオリゴヌクレオチド・プライマーであるERCC1-504F(配列ID番号第1)、ERCC1-574F(配列ID番号第2)、又は実質的にそれに等しいオリゴヌクレオチド・プライマーが、固定、及びパラフィン包埋(FPE)の腫瘍試料から抽出されたRNAと共に使用される。次にこのERCC1の遺伝子発現の測定が、白金を基本とする化学療法の予後予測のため使用することができる。
【００２７】
本発明のこうした例は、第1が、FPE試料からRNAの信頼性のある抽出を行う方法、及び第2が、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応を行うための、1対のオリゴヌクレオチド・プライマー、好ましくはオリゴヌクレオチド・プライマー対であるERCC1-504F(配列ID番号1)及びERCC1-574R(配列ID番号2)、又はそれに実質的に等しいオリゴヌクレオチドを使用することによる試料中のERCC1mRNA含量の決定、を含んでいる。RNAが、1999年12月20日に出願された米国特許出願番号09/469,338に記載され、そしてその全体を引例として本明細書取り入れられている、こうした試料からmRNAを単離するいずれかの方法にて、FPE細胞より抽出される。
【００２８】
本発明は、患者における任意の種類の組織に適用することができる。腫瘍組織の耐性を試験するためには、その腫瘍組織を試験することが好ましい。好ましい例において、腫瘍が得られる患者からの1部の正常な組織が、さらに試験される。正常な組織が白金を基礎とする化学治療としての化合物に耐性があると予測される、すなわちERCC1遺伝子の高レベルな発現を示すが、しかし腫瘍が、こうした化合物に対して感受性があると予測され、すなわちERCC1遺伝子の低レベルな発現を示している患者が、従って、この化学治療化合物を有意に多い量にて治療することができる。
【００２９】
閾値より低いERCC1遺伝子発現レベルを示す患者が、化学療法化合物の有意的に高い量にて治療することが可能であり、その理由が閾値より高いERCC1遺伝子発現レベルを発現する腫瘍を有する患者より有意的に高い生存可能性を有すると期待されるからである。
【００３０】
選択肢として、臨床者は、閾値レベルより高いERCC1遺伝子の発現レベルを発現する腫瘍を有する患者が、予測による低い生存性が与えられると、化学治療から何ら有意な利点がもたらされないことを、決定することができる。
【００３１】
本発明の方法は、広範囲な腫瘍の種類に適用することができる。これは、個人の「腫瘍発現の形状(profiles)」に備えることが出来、これによりERCC1の発現レベルが、個々の患者の試料にて決定され、そして種々の化学療法に対する応答が予測される。好ましくは、本発明の方法が、固形状の腫瘍に適用され、最も好ましくは、非小細胞肺ガン(NSCLC)腫瘍に適用されることである。特定種の腫瘍に本発明による幾つか適用例では、白金を基本とする化学療法に特定のERCC1発現と臨床的抵抗性との関連性を可能にするデータセットを翻訳することにより、生存可能性に対するERCC1遺伝子発現レベルの関係を確認することが好ましい。
【００３２】
本明細書に定義されているような「所定の閾値レベル」は、腫瘍が、白金を基本とする化学療法による処方に対し、抵抗性のある可能性が見出された補正した相対レベルのERCC1腫瘍発現である。この閾値レベルより低い腫瘍発現レベルが、白金を基本とする化学療法による処方に対する腫瘍の感受性に見出されるはずである。ERCC1の補正された相対発現の範囲が、ERCC1の率として表され、すなわち白金を基本とする化学療法による処方に応答する腫瘍中のβ-アクチンが、約6.7x10-3より少ない。白金を基本とする化学療法による処方に応答しない腫瘍が、ERCC1の相対発現、すなわち約6.7x10-3より多いβ-アクチン率を有している。実施例4を参照。
【００３３】
さらに「所定の閾値レベル」は、白金を基本とする化学療法による処方を受けた患者が、生存の可能性の低いと考えられる腫瘍の補正された相対的ERCC1発現レベルとして定義される。白金を基本とする化学療法による処方を受けている患者の閾値より低い腫瘍の補正された相対ERCC1発現レベルが、患者の高い生存可能性と関係している。閾値による補正相対ERCC1発現が、ERCC1：β-アクチンの比率として表され、約6.7x10-3、図1である。実例4を参照。しかしながら、本発明は、内部コントロール遺伝子としてβ-アクチンの使用に限定していない。
【００３４】
本発明のこの実例の方法を行うには、腫瘍細胞を患者から単離することが好ましい。固形又はリンパ様腫瘍又はその1部が、患者から外科的に切除されるか、又は定まった生検により得られる。凍結又は新鮮な試料から単離されたRNAが、典型的な先行技術としてのいずれかの方法により細胞から抽出される、たとえばSambrook,Fischer and Maniatis,Molecular Cloning,alaboratory manual,(2nd ed.),Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York,(1989)を参照。抽出過程中RNAの変性を避けるための配慮が行われることが、好ましい。
【００３５】
しかしながら、生検の後患者から得られた組織が、通常はホルマリン(ホルムアルデヒド)又はグルタルアルデヒド、あるいはアルコールの液浸により良く固定される。固定化された生物的な試料が、しばしば脱水、及び当業者に周知のパラフィン又は他の固形状支持体に包埋される。さらに非包埋の、固定組織を、本方法にて使用することができる。こうした固形支持体を、試料のため有機溶媒にて除去することができ、その後の保持されていた組織を再水和できることが想定される。
【００３６】
RNAが、1999年12月20に出願された米国特許出願第09/469,338号に記載され、その実体を引例としてここに取り入れられているいずれかの方法によりFPE細胞から抽出される。本明細書に記載されている、固定、及び包埋(FPE)の組織試料が、保存可能又は記録保持可能な組織試料を指している。RNAが、最初に脱パラフィン化した記録保持可能な病理試料又は生検試料より単離することができる。例示的な脱パラフィン法は、たとえばキシレンなどの有機溶媒によりパラフィン化された試料を洗浄する工程を含む。脱パラフィン化した試料を、低級アルコール水溶液により再水和することができる。適切な低級アルコールには、たとえばメタノール、エタノール、プロパノール、及びプタノールが含まれる。脱パラフィン化試料が、たとえば濃度を減少させて低級アルコールにて洗浄を続けて再水和することができる。別の選択肢として、その試料には、脱パラフィン化及び再水和が同時に行われる。その後RNAがその試料から抽出される。
【００３７】
RNAを抽出するための固定試料又は固定及び脱パラフィン化試料が、装置、音波又は均質化させる他の手段を用いて均質化(homogenized)することができる。
【００３８】
再水和された試料が、グアニジウム・チオシアネート(グアニジウム・イソチオシアネートとしても販売されている)などのカオトロピック剤を含む溶液にて均質化することができる。均質化された試料を、カオトロピック溶液中約50から100℃の温度範囲にて加熱し、そこには、グアニジウム化合物などのカオトロピック剤の有効量を含む。好ましいカオトロピック剤が、グアニジウム・チオシアネートである。
【００３９】
RNAが、カオトロピック剤のない状態にて単離されたものより約10倍以上の量を、パラフィン包埋の試料から精製されるように、「カオトロピック剤の有効濃度」が選択される。カオトロピック剤は、グアニジウム化合物、尿素、ホルムアミド、ヨウ化カリウム、ヨウ化ナトリウム、ポタジウム・チオシアネート、及び同様の化合物を含む。本発明による方法の好ましいカオトロピック剤は、グアニジウム・イソチオシアネート(グアニジウム・チオシアネートとしても販売されている)、及びグアニジウム・ハイドロクロライドなどのグアニジウム化合物である。多くのアニオンイオンの対イオン(counterions)が有益であり、当業者がこうした適切なアニオンによる多くのグアニジウム塩を調製することができる。本発明に用いられるグアニジウム溶液の有効な濃度が、約1から約5Mの範囲、好ましくは約4Mの値の濃度を有する。RNAがすでに溶液中にあるならば、試料における達成すべき最終濃度が、約1から約5Mの範囲であるよう有意的に高い濃度にすることができる。さらにグアニジウム溶液は、Tris-Clなど適切な生化学緩衝液により、好ましくは約3から約6のpH、より好ましくは約4のpHの緩衝液とされる。カオトロピック溶液が、ジチオトレイトール(DTT)、及びβ-メルカプトエタノール(BME)などの還元剤を含むことができる。さらにカオトロピック溶液が、RNAse阻害剤を含むことができる。
【００４０】
均質化された試料が、カオトロピック溶液中約50から約100℃の範囲の温度に加熱することができ、そこには、グアニジウム化合物などのカオトロピック剤の有効量を含む。好ましいカオトロピック剤が、グアニジウム・チオシアネートである。
【００４１】
次にRNAが、たとえばフェノール・クロロホルム抽出、イオン交換クロマトグラフィ、又はサイズ排除クロマトグラフィにより、溶液から回収される。次にRNAを、抽出、電気泳動、クロマトグラフィ、沈降法、又は他の適切な技術を用いて、さらに精製することができる。
【００４２】
新鮮、凍結又は固定されたものから精製された全mRNAより、ERCC1mRNAを定量化すること、たとえば技術的に共通する逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)法を用いて行うことが好ましい。ERCC1mRNAの定量化のもう1つの方法では、たとえば分子ビーコン、及び複数のPCRに有益な他の標識化されたプローブの使用が含まれる。さらに本発明は、InvaderTMAssay(Third Wave Technologies,Inc.)とよく似た、たとえば蛍光標識化プローブを用い、PCRのない系の使用によりERCC1mRNAの定量化が予測される。最も好ましくは、ERCC1cDNA及び内部コントロール又はハウスキーピング遺伝子(たとえばβ-アクチン)が、蛍光を基本とする実時間検出方法(ABI PRISM 7700又は7900配列検出系(Sequence Detection System[TaqManTM],Applied Biosystems,Foster City,CA.)又はHeidら記載の(Genome Res 1996;6:986-944)及びGibsonら記載の(Genome Res 1996;995-1001)の同様の系を用いて行われる。ABI7700(TaqManTM Instrument)の出力が、Ct’s、つまり「サイクル閾値(cycle thresholds)」に発現される。TaqManTM系の場合、試料中に非常に多くの標的分子を有する高い発現遺伝子が、有意的に少ない標的分子(高いCt)を伴う相対発現の低い遺伝子より、有意的に少ないPCRサイクル(低いCt)を伴うシグナルを生成する。
【００４３】
本明細書に用いられるように、「ハウスキーピング」遺伝子、又は「内部コントロール」は、構成的に又は全体的に発現されるいずれかの遺伝子を含むことを意味し、これらの存在が、ＥＲＣＣ１のｍＲＮＡのレベルを評価することを可能にする。こうした評価には、全体にわたる構成的な遺伝子転写レベルの決定と、ＲＮＡ回収の変化に対するコントロールの決定とが含まれる。「ハウスキーピング」遺伝子、又は「内部コントロール」が、シクロピレン遺伝子、βアクチン遺伝子、トランスフェラーゼ受容体遺伝子、ＧＡＰＤＨ遺伝子などを含むがそれに限定されない。最も好ましくは、EadsらのCancer Research 1999; 59: 2302-2306に記載のβアクチン遺伝子である。ＲＮＡ回収の変動に対するコントロールには、「調整（calibrator）ＲＮＡ」の使用が必要である。「調整（calibrator）ＲＮＡ」が、予め正確に定量されたコントロールＲＮＡの任意の利用可能な資源であると考えられる。好ましくは、Human Liver Total RNA（Stratagene、Cat.#735017）が用いられる。
【００４４】
本明細書に用いられる「非補正遺伝子発現(Uncorrected Gene Expression(UGE))」が、TaqManTM装置によって生成される内部コントロール遺伝子に対するERCC1発現の数値による出力を言及している。UGEを決定するために使用される式が、実施例3に示され、図2に試料の計算値を表している。
【００４５】
さらに本発明の観点は、非TaqManTM技術から誘導される「周知の相対遺伝子発現」により、TaqManTM 装置から要求される非補正遺伝子発現(UGE)を正規化する方法を提供する。好ましくは、周知の非TaqManTMから誘導される相対ERCC1、すなわちβアクチンの発現値が、組織試料からのTaqManTMから誘導されるERCC1 USG値により正規化される。
【００４６】
本明細書に用いられている「補正された相対ERCC1発現」は、正規化されたERCC1発現を指しており、これによりUGEを、ERCC1特定補正因子(KERCC1)と乗して、内部コントロール遺伝子に対するERCC1発現レベルの周知の範囲と比較することのできる値となっている。実施例3及び図2に、これらの計算の細部を示している。これらの数値は、特定試料の「補正された相対ERCC1発現」が、「所定の閾値」レベルより上になるか下になるかを、決定することができる。βアクチンのレベルに対する補正された相対ERCC1発現の所定の閾値レベルが、約6.7x10-3である。ERCC1に対して特異的なKERCC1である、内部コントロールβアクチン及び調整剤(calibrator)、Human Liver Total RNA(Stratagene,Cat.#735017)が、1.54x103である。
【００４７】
「周知の相対遺伝子発現」値が、前に分析された組織試料から誘導され、そして構造的に発現される内部コントロール遺伝子(たとえばβアクチン、GAPDHなど)に対する標的遺伝子のRT-PCRシグナル比に基づいている。
【００４８】
好ましくはこうした組織試料が、ホルマリンに固定、及びパラフィン包埋の試料であり、そしてRNAが、実施例1にて、及び1999年12月20に出願され、その全体を引例により本明細書に組み入れられた米国特許出願第09/469,336記載の手順に従って、ここから抽出される。内部コントロールに対する遺伝子発現を定量化する技術的に周知な標準定量RT-PCR技術が、用いられる。Pre- TaqManTM技術PCR反応が、サイクルの固定数(すなわち30)として行われ、そして終点における値がそれぞれの試料に対して記載されている。次にこれらの値が、βアクチンに対するERCC1発現の率として記載されている。Reedらによる米国特許番号第5,705,336に、記載されている。
【００４９】
KERCC1を、βアクチン以外の内部コントロール遺伝子及び／又はHuman Liver Total RNA(Stratagene,Cat.#735017)より異なる較正RNAに対し、決定することができる。それをするために、そうした特定の内部コントロール遺伝子にERCC1の発現が、すでに決定されている(すなわち「周知の相対遺伝子発現」)組織試料に、内部コントロール遺伝子と較正剤といてのRNAとを共に較正しなければならない。好ましくは、こうした組織試料は、ホルマリンによる固定、及びパラフィン包埋の(FPE)試料であり、そしてRNAが、実施例1において、及び1999年12月20日に出願され、その全体が引例により本明細書に取り入れられている、米国特許出願番号第09/469,338に記載されている方法にしたがって、これらから抽出される。そうした決定が、標準のpre-TaqManTM、技術的に周知の計量的なRT-PCR技術を用いて行うことができる。そうした決定下、こうした試料が、実施例3に記載された新規な内部コントロール、及び／又は較正剤(calibrator)RNAに対し特異的な新規なKERCC1の決定に有益なERCC1の「周知な相対遺伝子発現」レベルを有している。
【００５０】
本発明の方法は、広範囲な組織及び腫瘍類に適用でき、そうしたことが、患者の臨床治療の評価として、そして胸部、頭部及び首部、肺、食道、結腸、及びその他の部分を含むある種のガンに対する診断又は予後予測のツールとして使用することができる。好ましい例における本方法は、Non-Small Cell Lung Cancer(NSCLC)の予後予測に適用される。
【００５１】
前化学療法治療の腫瘍生検が、一般的に極めて少量の不均質組織だけを含む、固定され、パラフィン包埋(FPE)の組織としてのみ、通常利用することができる。ERCC1遺伝子発現が、ストロマ組織により感染されない腫瘍組織において決定できるように、そうしたFPE試料が、顕微解剖に容易に対処することができる。さらにそうした試料が両方の種類の組織をしばしば含むことから、生検組織試料内のストロマと腫瘍組織との間における比較を、行うことができる。
【００５２】
一般的にERCC1遺伝子領域を側面に位置する(flanks)任意のオリゴヌクレオチド対を、本発明の方法を行うために用いることができる。本発明に使用するためのERCC1遺伝子領域にストリンジェントな条件下にてハイブリダオズするプライマーが、20-1000の間の塩基対、好ましくは50-100の間の塩基対、最も好ましくは100以下の塩基の産生物を増幅する。
【００５３】
本発明は、特異的なオリゴヌクレオチド・プライマー、及びそれに実質的に同一のオリゴヌクレオチド・プライマーを提供し、それが、FPE組織におけるERCC1発現の特定の正確な評価を可能にする。好ましくは、オリゴヌクレオチド・プライマー、ERCC1-504F(配列ID番号第1)、及びERCC1(配列ID番号第2)、(さらにオリゴヌクレオチド・プライマー対ERCC1として本明細書に言及されている)、及びそれに実質的に等しいオリゴヌクレオチド・プライマーである。オリゴヌクレオチド・プライマー、ERCC1-504F(配列ID番号第1)、及びERCC1(配列ID番号第2)が、ストリンジェントな条件下にてERCC1遺伝子(配列ID番号第7)にハイブリダイズし、そしてmRNAを単離する何らかの方法によって、FPE細胞より抽出したRNAを使用すると、ERCC1mRNAレベルを測定するため特に有効であることが示され、たとえば実施例1及び1999年12月20日に出願され、その全体に対し引例により本明細書に取り入れられている、米国特許出願第09/469,338に記載されている。
【００５４】
本明細書に使用される核酸の内容における「実質的な同一」は、ストリジェントな条件下における標的にハイブリダイゼーションすることを意味し、さらにその核酸断片又はこれらの相補鎖が、比較される場合、適切なヌクレオチドの挿入、欠失を伴う適正に構成された場合と同一であり、その正しい構成が、少なくとも約60%のヌクレオチド、典型的に少なくとも約70%のヌクレオチド、より典型的に少なくとも約80%のヌクレオチド、一般的に少なくとも約90%、及びより一般的に少なくとも約95-98%のヌクレオチドである。ハイブリダイゼーションが、特異性の全体的な欠損よりも有意的に高い選択性である場合、選択的ハイブリダイゼーションが存在する。Kanehisa,Nucleic Acids Res.,12:203-213(1984)を参照。
【００５５】
本発明は、オリゴヌクレオチド・プライマー配列であるERCC1-504F(配列ID番号1)、その相補鎖、又はERCC1-574R(配列ID番号2)、又はその相補鎖の全て、又は1部に、ストリジェントな条件下(本明細書にて明示されたように)にてハイブリダイズする、実質的に同一のオリゴヌクレオチドを含む。
【００５６】
ストリジェントなハイブリダイゼーションの条件下、高い相補鎖、つまり実質的に同様の核酸配列のみハイブリダイズする。好ましくは、そうした条件が、20連続するヌクレオチドから4以上のミスマッチ、より好ましくは20連続するヌクレオチドから2以上のミスマッチ、最も好ましくは、20連続するヌクレオチドから1又は複数のミスマッチを有する核酸のハイブリダイゼーションを阻止する。
【００５７】
核酸のハイブリダイズする部分が、典型的には少なくとも10(たとえば15)の長さのヌクレオチドである。ハイブリダイズ核酸のハイブリダイズする部分が、オリゴヌクレオチド・プライマーERCC1-504F(配列ID番号1)、その相補鎖、又はERCC1-574R(配列ID番号2)、又はその相補鎖の1部又は全ての配列に、少なくとも約80%、好ましくは少なくとも95%、又は最も好ましくは98%の同一である。
【００５８】
ストリジェントな条件下、核酸試料にオリゴヌクレオチド・プライマーをハイブリダイゼーションすることが、以下に明示されている。核酸の二重化又はハイブリット化の安定性が、溶融温度(Tm)として表され、それは、プローブが標的DNAから解離する温度である。この溶融温度が必要なストリジェントな条件を明確にするために用いられる。プローブに実質的に同一である配列が同定されるなら、同定よりむしろ、相同ハイブリダイゼーションのみが、特定濃度の塩(たとえばSSC又はSSPE)によって生ずる最低温度を最初に確立することが、有益である。次に1%のミスマッチが生ずると、Tmの温度が1℃低くなると想定され、従ってハイブリダイゼーション反応における最後の洗浄温度が、低下する(たとえばプローブと95%以上相同である配列が求められる場合、最終の洗浄温度が5℃だけ低くなる)。実際にTmの変化が、1%のミスマッチ当り0.5℃と1.5℃の間となる得る。
【００５９】
ストリジェントな条件では、5xSSC/5xDenhart’s溶液/1.0%のSDS、68℃にてハイブリダイズすること、及び0.2xSSC/0.1%SDS、室温にて洗浄することが含まれる。中位のストリジェントな条件は、3xSSC、42℃にて洗浄することを含む。塩濃度及び温度のパラメータを、プライマーと標的核酸との間を同定する最適なレベルを実現するため変化させる。さらにこうした条件に関する指針として、先行技術、たとえばSambrook,Fischer and Maniatis,Molecular Cloning,a laboratory manual,(2nded),Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York,(1989) and F.M.Ausubelらeds.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons(1994)を容易に利用することができる。
【００６０】
本明細書に開示されるオリゴヌクレオチド・プライマーが、固定又は固定及びパラフィン包埋の組織、及び凍結又は新鮮な組織におけるERCC1遺伝子発現を正確に評価(assesment)することができる。このことは、FPE試料から誘導されるRNAが、新鮮又は凍結された組織のRNAに対し有意的に断片化されるという事実にかかわらずである。
【００６１】
従って、本発明の方法は、FPE組織におけるERCC1発現レベルの評価の使用に適切であり、今まで、固定された組織を用いるERCC1遺伝子発現を評価する方法がなかった。
【００６２】
腫瘍にて発現されるERCC1mRNAの量を測定することから、技術専門家が、特定の遺伝子毒に対する腫瘍の臨床における抵抗性、又は特定の遺伝子毒を受ける患者の生存可能性に関する予後予測を可能にする。白金を基本とする化学療法又は同様の種類のDNA損傷を含む化学療法が、好ましい遺伝子毒である。
【００６３】
白金を基本とする化学療法にてDNAが「塊状付加物」となり、ここで最初の影響として二重ラセンの3次元構造を変形させることである。こうした化合物が、単独又はゲムシタビン(gemcitabine(Gem))又は5-フルオロウラシル(5-Fluorouracil(5-FU))などの別の化学療法を伴い投与される手段である。白金を基本とする遺伝子毒性化学療法が、共有結合のDNA付加物を形成する重金属の配位化合物を含む。一般的にこれらの重金属がDNAと共有結合し、適切な部分にcis-イントラストランド-ジヌクレオチド・付加物を形成する。一般的にこれらの分類が、cis-ジアミンジクロロプラチニウム(II)(cisplatin)、及びcis-ジアミン-(1,1-シクロブタンジカルボキシレイト)プラチニウム(II)(carboplatin)、cis-ジアミノ-(1,2-シクロヘキシル)ジクロロプラチニウム(II)、及びcis-(1,2-エチレンジアミン)ジクロロプラチニウム(II)により表される。最初の白金の薬剤には、前記任意の代表的化合物に類似するか又は誘導される化合物が含まれる。
【００６４】
白金配位化合物により現段階で治療可能な腫瘍が、髄芽腫及び神経芽腫を伴う精巣、子宮内膜、頚部、胃、鱗状細胞、副腎皮質、及び小細胞悪性腫瘍を含む。そのDNA付加物を迅速に修復するため、Trans-ジアミンジクロロプラチニウム(II)(trans-DDP)が、臨床的に実用的でないと考えられる。本明細書の化学療法の薬剤としてTrans-DDPの使用では、選択されない細胞における毒性が低く、選択された細胞における毒性が相対的に高い化合物を提供できることになる。好ましい例における白金化合物は、シスプラチンである。
【００６５】
一般的に多くの化合物が、白金を基本とする化学療法の薬剤により与えられる。たとえば、BEP(ブレオマイシン、エトポシド、シスプラチン)が、睾丸ガンに使用され、MVAC(メトトレキシエイト(methitrexate)、ビンブラスチン(vinblastine)、ドキソルビシン(doxorubicin)、シスプラチン)が、膀胱ガンとして用いられ、MVP(ミトマイシンC、ビンブラスチン、シスプラチン)が、非小細胞肺ガンの治療に用いられる。多くの研究にて、白金含有薬剤の間の相互作用が記載されている。たとえば、治療薬剤の相乗作用では、白金を基本とする化学療法に含まれる多くの強力な薬剤が報告されている。これに対し最近の非常に簡潔な文章の文献一覧、すなわちOkamotoらの、Urology2001;57:188-192.;Tanakaらの、Anticancer Research2000;21:313-315;Slamonらの、Seminars in Oncology2001;28:13-19;Lidorらの、Journal of Clinical Investigation 1993;92:2440-2447;Leopoldらの、NC1 Moorsel らの、British Jornal of Csncer 1999;80:981-990を含む。
【００６６】
別の遺伝子毒性薬剤は、永続的な遺伝子損傷を形成する薬剤であり、ガンの臨床治療における化学療法薬剤として使用するには、好ましい。遺伝子毒素に誘発されるDNA損傷の細胞修復の割合、及び細胞分裂サイクルを介した細胞の増加率が、遺伝子毒素による治療の結果に影響を与える。
【００６７】
修復されない細胞ゲノムの損傷が、DNAの複製を阻害し、新たに合成されるDNAの複製適合性を損じ、細胞の生存に必要な遺伝子発現を妨げることになる。従って遺伝子毒性薬剤における細胞毒性の１つの決定因子(細胞の死に寄与する傾向性)が、細胞を修復に対し、そこから形成されるゲノム損傷の抵抗因子である。永続的なゲノムの損傷を形成する、たとえば少なくとも細胞が細胞サイクルを入るまでゲノムに残っている遺伝子毒性薬剤が、一般的に一過性にて、容易に修復される遺伝子損傷を形成する薬剤より有意的に効果的な細胞毒素である。
【００６８】
多くのガン治療に使用され、ERCC1発現レベルに有意に影響される一般的分類の遺伝子毒性化合物が、DNAアルキル化剤、及びDNA挿入剤である。ソラーレン(psoralens)は、遺伝子毒性化合物であり、乾癬、白斑、菌による感染、皮膚におけるTリンパ腫など皮膚疾患を光化学療法における治療に有益であると知られている。Harrison’s Principles of Internal Medicine,Part2 Cardinal Manifestations of Disese,Ch.60(12th ed.1991)を参照。DNAをアルキル化又はDNAに挿入可能なメンバーの他の一般分類の遺伝子毒性化合物が、合成及び天然に供給される抗生物質を含む。本明細書に特に関係のあるもののうち、抗腫瘍性の抗生物質があり、それが以下の化合物すなわち、アムサクリン(amsacrine)；アクチノマイシン(actinomycin)A、C、D(別にはジアクチノマイシン(dactinomycin)として知られている)又はF(別にはKS4)；アザセリン(azaserine)；ブレオマイシン；カルミノマイシン(カルビシン)、デアウノマイシン(daunomycin)（デアウノルビシン(daunorubicin)）又は14-ヒドロキシデアウノマイシン(アドリアマイシン又はドキソルビシン)；ミトマイシンA、B又はC；ミトキサントロン(mitoxantrone)；ポリカミシン(plicamycin)（ミトラミシン(mithramycin)）;などにより表される上記分類の化合物を含むが、それに限定されない。
【００６９】
共通的に用いられそしてDNAをアルキル化する更に別の分類の遺伝子毒性薬剤が、ハロエチルニトロソウレア、特にコロロエチルニトロソウレアを含む薬剤である。この広範囲な分類のうちの代表的なメンバーが、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ミムスチン、ラニムスチン及びストレプトゾトシンを含む。ハロエチルニトロソウレアの第1薬剤は、先の任意の代表的化合物に類似または誘導体でも良い。
【００７０】
DNAをアルキル化するメンバーである、さらに他の一般分類である遺伝子毒性薬剤には、硫黄及び窒素マスタードが含まれる。これらの化合物が、グアニンのN17原子に共有結合した付加物を形成することによりほぼDNAを損傷する。この広範囲な分類のうち代表的メンバーには、クロラムブシル(chlorambucil)、シクロホスフォアミド、イフォスフアミド(ifosfamide)、メルファラン(melphalan)、メチロロエタミン(mechloroethamine)、ノベムビシン(novembicin)、トロフォスフォアミド(trofosfamide)などが含まれる。ゲノム損傷の配位座として1又は複数の予め明示されたゲノム標的の選択が所望されると、選択された細胞ゲノムの特定配列と共有結合又は非共有結合して相互作用するオリゴヌクレオチド又はその類似物質が、遺伝子毒性薬剤としても用いることも可能である。
【００７１】
DNAをアルキル化するメンバーである、別の分類の薬剤は、エチレンイミン、及びメチルメラミンを含む。これらの分類では、たとえばアルトレトアミン((altretamine)ヘキサメチルメラミン)、トレエチレンフォスフォロアミド(TEPA)、トリエチレンチオフォスフォロアミド(ThioTEPA)、及びトリエチレンメラミンが含まれる。
【００７２】
さらに別の分類のDNAアルキル化薬剤には、ブスルファン(busulfan)として表されるアルキル・スルフォネート；ベンゾデパ（benzodepa）により表されるアジニジン(azinidines)；たとえばミトグアゾン(mitoguazone)、ミトクサントロン(mitoxantrone)、及びプロカルバジン(procabazine)により表される他の薬剤が含まれる。これら分類のそれぞれが、それぞれ表される化合物の類似物質及びその誘導物質を含む。
【００７３】
本発明が記載されているように、本発明の実施は、以下に提供される実験例によって表される。明示された例において用いられる材料及び方法が、種々の方法にて変更できるということが、当業者には理解できよう。こうした変更が、本発明の範囲内に入ると意図する。
【００７４】
実施例
実施例1
FPE組織よりRNAの単離
RNAga,以下の一般手順によりパラフィン包埋の組織から抽出される。
【００７５】
A.  切片の脱パラフィン化および水和処理：
(1)  約10μMの断片の1部を、1.5mLのプラスチックの遠心分離チューブに入れる。
【００７６】
(2)  600μLのキシレンを加え、そしてその混合物を室温(約20から25℃) にて、約10分間激しく振動させる。
【００７７】
(3)  その試料を、ベンチ・トップ遠心分離機の最大速度(約10-20,000xg)にて、室温で約7分間遠心分離にかける。
【００７８】
(4)  ほとんどのパラフィンが溶解されるまで工程2および3を、繰り返えす。元の試料部に含まれるパラフィン量により、通常は2回以上必要である。
【００７９】
(5)  キシレン溶液を、低級アルコール、好ましくは100%エタノール(約600μL)にて、3分間激しく振動させて除去する。
【００８０】
(6)  工程(3)と同様、チューブを約7分間遠心分離にかける。その上清液がデカント(decanted)され廃棄される。ペレットは白色となる。
【００８１】
(7)  工程5および6が、継続的に希釈をより多くするエタノール溶液、すなわち最初が約95%のエタノール、次に約80%、そして最後が約70%のエタノールにより繰り返される。
【００８２】
(8)  その試料を、工程(3)と同様に室温にて7分間、遠心分離にかける。その上清液を廃棄し、そしてペレットを室温にて、5分間乾燥する。
【００８３】
B.フェノールとクロロホルムによるRNAの単離
(1)  0.5%のサルコシンおよび8μLのジチオセレイトールを含む400μLのグアニジン・イソチオシアネート溶液を加える。
【００８４】
(2)  次にその試料を、組織ホモジェナイザー(Ultra-Turrax,IKA-Works,Inc.,Wilmington,NC)により、低速(速度1)から高速(速度5)の速度を、漸次増大させながら約2乃至3分間均質化する。
【００８５】
(3)  次にその試料を、約95℃にて約5-20分間加熱する。95℃に加熱する前に、試料を含むチューブ・キャップに細い測定針を刺し入れることが、好ましい。他の選択肢として、そのキャップが、プラスチックのクランプ又は実験用フイルムにて貼り付けることができる。
【００８６】
(4)  次にその試料を、pH4.0の酢酸ナトリウムの50μL 2Mとフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール(10:1.93:0.036)の600μLとにより抽出する、その比の液は、イソアミルアルコールとクロロホルムとの比が1:49の溶液3.6mLとフェノール18mLとを混合することによる新たに調製されたものである。その溶液を約10秒間激しく振動し、次に約15分間氷上にて冷却する。
【００８７】
(5)  その溶液を、最大速度にて約7分間遠心分離にかける。上部(水溶液)の相を新しいチューブに移し変える。
【００８８】
(6)  そのRNAを約10μLのグリコーゲン、及び400μLのイソプロパノールより、30分間、-20℃にて沈析させる。
【００８９】
(7)  そのRNAを、ベンチトップ(benchtop)遠心分離機に、最大速度にて約7分間遠心分離することによりペレット化し、その上清液がデカント(decanted)さら、廃棄される。そしてそのペレットを、約70から75%のエタノールを約500μLにて洗浄する。
【００９０】
(8)  その試料を、7分間細大速度にて遠心分離にかける。その上清液をデカント(decanted)し、そしてペレットを空気乾燥する。次にさらなる実験用として、そのペレットを適切な緩衝液に溶解する(たとえば50pI．5mMのトリス塩酸、pH8.0)。
【００９１】
実施例2
mRNA逆転写及びPCR
逆転写：RNAを、顕微解剖又は非顕微解剖にて、ホルマリンに固定し、パラフィン包埋(FPE)の組織から単離し、その組織を、実施例1に示し、そしてそれが、1999年12月20日に出願され、その全体が引例により本明細書に組み入れられている米国特許出願第09/469,338に上に記載されている。エタノールにより、次に遠心分離により沈降させた後、そのRNAペレットを、5mMのTris/Clを50μl、pHを8.0にて溶解した。M-MLV逆転写酵素が、デオキシヌクレオチドの存在下、1本鎖RNA又はDNA鋳型にハイブリットされるオリゴヌクレオチドを伸長させ、相補鎖を生成させる。生成されたRNAが、任意の6量体(hexamers)及びLife TechnologiesからのM-MLV逆転写酵素(Reverse Transcritase)により逆転写される。逆転写が、「逆転写ミックス(reverse transcription mix)」の25.5μlとRNA溶液25μlとを混合することにより行われた。その反応が、26℃、8分間(任意の6量体(hexamers)をRNAに結合させるため)、42℃、45分間(M-MLV逆転写酵素反応のため)、及び95℃、5分間(DNAseの熱による不活性化のため) 、サーモサイクラー(thermocycler)にて行われた。
【００９２】
「逆転写ミックス」は、10ul 5X緩衝液(250mM Tris-HCl、pH8.3、375mM KCl、15mM MgCl2)、任意の6量体(hexamers) 0.5ul(10mMのTris-HClを550ul、pH7.5にて溶解された50 O.D.)、5ul 10mM dNTPs(dATP、dGTP、dCTP及びdTTP)、5ul 0.1M DTT、1.25ul BSA(10mMのTris-HClにおける3mg/ml 、pH7.5)、1.25ul RNA Guard 24、800U/ml(RNAse阻害剤)(Porcine #27-0816、Amersham Pharmacia)及び2.5ul MMLV 200U/ul(Life Tech Cat #28025-02)から成る。
【００９３】
反応成分の最終濃度は、50mM Tris-HCl、pH8.3、75mM KCl、3mM MgCl2、1.0mM dNTP、1.0mM DTT、0.00375.mg/ml BSA、0.62U/ul RNA Guard and 10 U/ul MMLVである。
【００９４】
mRNA発現のPCRによる定量化
ERCC1 cDNA及び内部コントロール又はハウスキーピング遺伝子(たとえばβアクチン)cDNAが、蛍光を基本とする実時間検出方法(ABI PRISM7700又は7900 Sequence Detection System[TaqManTM],Applied Biosystems,Foster City,CA)を用いて行われ、その実時間検出方法が、Heidら(Genome Res 1996;6:986-994);Gibsonらの(Genome Res1996;6:995-1001)に記載されている。簡単に言うと、この方法では、順方及び逆方プライマー内を特異的にアニールする、2重に標識化された蛍光遺伝子TaqManTMオリゴヌクレオチド・プローブ、(ERCC1-530Tc(配列ID番号3)、Tm=70℃)が、使用される。反応混合物を含むキャプされたウエル内をレザー刺激すると、そのプローブが、PCR伸長中DNAポリメラーゼの5’から3’のヌクレアーゼ活性により切断され、そして3’レポータ染料(6FAM)の発光を引き起こすまで、3’消光剤染料(TAMRA)の発光が引き起こされる。したがって、アンプリコンの生成は、TaqManTMのCCD(電荷結合素子)検出カメラにより検出される蛍光シグナルの発光を引き起こし、そしてPCR反応の純粋な指数成長の期間内の閾値サイクル(threshold cycle)にて生成されるシグナル量が、関係する配列の開始する複製数を反映する。内部コントロール遺伝子の開始する複製数と関係配列の開始する複製数とを比較すると、相対遺伝子発現レベルが提供される。TaqManTMの分析は、2つの測定絶対値(absolute measurements)間の比(関係遺伝子/内部コントロール遺伝子)として発現される値を生成する。
【００９５】
PCR反応混合物が、調製されたcDNAを含む0.5μlの逆転写反応物から成り、その調製されたcDNAでは、600nM以上の各オリゴヌクレオチド・プライマー(ERCC1-504F(配列ID番号1)、Tm=59℃、及びERCC1-574R(配列ID番号2)、Tm=58℃)、200nMのTaqManTMプローブ(配列ID番号3)、5UのAmpliTaq Gold Polymerase,200μMの各dATP,dCTP,dGTP,400μMのdTTP,5.5mMのMgCl2,及び基準染料を含む1xTaqManTM緩衝液、最終的に25μl以下の容量(全ての薬剤がApplied Biosystems Foster City,CA)が記載されている。サイクリング条件は、95℃にて10分間、その後95℃にて15秒間を45サイクル、そして60℃にて1分間である。内部コントロール遺伝子β-アクチンの定量化に使用されるオリゴヌクレオチドが、β-アクチン TaqManTMプローブ(配列ID番号4)、β-アクチン-529F(配列ID番号5)、及びβ-アクチン-651R(配列ID番号6)であった。
【００９６】
オリゴヌクレオチド・プライマーERCC1-504F(配列ID番号1)，及びERCC1-574R(配列ID番号2)、が上記反応に用いられ、71bpの産生物を増幅することになる。
【００９７】
実施例3
ERCC1に対する非補正遺伝子発現の決定：
2対の並行した反応、すなわち「試験」としての反応、及び「較正」としての反応が行われた。ERCC1増幅反応及びβ-アクチン内部コントロール増幅反応が、試験反応である。個々のERCC1及びβ-アクチン増幅反応が、較正物質(calibrator)RNA鋳型にて行われ、そして較正反応として言及される。TaqManTM装置では、4種の異なるサイクル閾値(Ct)値、すなわち試験反応からCtERCC1及びCtβ-actin、及び較正反応からCtERCC1及びCtβ-actinが生成されことになる。2種の反応のCt値における相違が、以下の式により決定される。
【００９８】
ΔCttest= CtERCC1- Ctβ-actin    (「試験」反応から)
ΔCtcalibrator= CtERCC1- Ctβ-actin    (「較正」反応から)
次の工程が、以下の式により、負のΔCtに数値2を上揚することを含む。
【００９９】
2-ΔCttest      (「試験」反応から)
2-ΔCtcalibrator    (「較正」反応から)
次にTaqManTM装置からERCC1に対する非補正遺伝子発現を得るために、以下の式にて行なわれる、すなわち、
ERCC1に対する非補正遺伝子発現(UGE)= 2-ΔCttest/2-ΔCtcalibrator
周知の相対ERCC1発現レベルによるUGEの正規化：
正規化の計算は、ERCC1に特異的な補正因子(KERCC1)と特定のキャリブレータRNAとUGEとの乗算を伴う。さらに補正因子KERCC1が、任意の内部コントロール遺伝子、及び任意の予め正確に定量されたキャリブレータRNAに対し決定することができる。好ましくは、内部コントロール遺伝子β-アクチン、及び予め正確に定量されたキャリブレータRNA・Human Liver Total RNA(Stratagene,Cat.#735017)を使用することである。これらの薬剤が与えられた場合補正因子KERCC1が1.54x10-3となる。
【０１００】
正規化が、Applied Biosystes,the TaqManTMmanufacturer,in User Buiiein#2に記載され、且つ上記のΔCt法の変更(modification)を用いて行われる。この方法を行うようにUGEの6種の異なる試料を、上記TaqManTM方法を用いてERCC1発現に対して分析した。内部コントロール遺伝子β-アクチン、及びキャリブレータ・RNA・Human Liver Total RNA(Stratagene,Cat.#735017)を使用した。
【０１０１】
各試料、AG221,AG222,AG252,成人の肺、PC3,AdColの周知の相対ERCC1発現レベルを、その相当するTaqManTMに誘導されるUGEにて除することにより、非平均の補正因子Kが得られる。
【０１０２】
Kunaveraged=周知の値/UGE
次にK値全ては、キャリブレータRNA及びβ-アクチンからのERCC1、Human Liver Total RNA(Stratagene,Cat.#735017)に特異的な単一KERCC1補正因子を決定するために、平均が行われる。
【０１０３】
したがって、pre-TaqManTMERCC1発現研究から成るスケールに、未知の組織の試料における補正された相対ERCC1発現を決定するために、1つには、TaqManTM装置から誘導される非補正遺伝子発現データ(UGE)を、補正因子に特異的なKERCC1にて乗算して、同じ内部コントロール遺伝子及びキャリブレータRNAを使用することから得られる。
【０１０４】
補正された相対ERCC1発現=UGFｘKERCC1
KERCC1が、予め正確に定量化されたキャリブレータRNA又は内部コントロール遺伝子を使用して、決定することができる。さらに予め正確に定量化されたキャリブレータRNAの供給資源が、上記方法に記載の周知な相対ERCC1発現レベルにて、試料に対する較正を行うことができ、又は上記のHuman Liver Total RNA(Stratagene,Cat.#735017)などの予め較正されたキャリブレータRNAに対し、現段階で較正することができる。
【０１０５】
たとえば、次のKERCC1が、異なる内部コントロール遺伝子、及び／又は異なるキャリブレータRNAに決定される場合、そうした特定の内部コントロール遺伝子に対するERCC1発現レベルが、すでに決定されている組織試料に、内部コントロール遺伝子とキャリブレータRNAを共に較正しなければならない。
【０１０６】
こうした決定には、技術的に周知の定量化RT-PCR技術を、標準pre-TaqManTMを使用して行うことができる。これらの試料に対する周知の発現レベルを、相当するUGEレベルにて除し、その試料に対してのK値を決定する。次にK値を、周知の試料数によて平均値を計算し、異なる内部コントロール遺伝子、及び／又はキャリブレータRNAに対する新たな特異的KERCC1を決定する。
【０１０７】
実施例4
全ての患者は、予測されるマルチセンターの3部門(arm)の無作為試験のシスプラチン(Cisplatin)/ゲムシタビン(Gemcitabine)部(arm) (進行性NSCLCにおける、Cisplatin/Gemcitabine(CG)対Cisplatin/ Gemcitabine/Vinorelbune(CGV)対Gemcitabine/Vinorelbuneの後にIfosfamide/Vinorelbine(GV/IV)の直列に二重鎖(sequential of doublets)、とするSpanish Lung Cancer Group Phase III試験(trial)、GEPC/98-02) に登録された。全患者は、Gem 1250mg/m21日、8日に加え3週に1回CDDP 100mg/m21日を受けた。
【０１０８】
GEPC/98-02に対する適格性基準が、測定段階IV(無症候性の場合適切な脳転移)、又は段階IIIB(悪性胸膜、および／または心臓周囲の滲出、および／または鎖骨上の膜症)NSCLCであり、そしてEastern Cooperative Group(ECOG)性能得点0-2であった。全ての患者が、研究に入る前に胸部X線、および胸部、および腹部上部のコンピュータ断層撮影法(CT)走査法を行い、少なくとも6週間毎に評価を繰り返し行った。腫瘍応答を、完全な応答、1部応答、安定疾患、および進行性疾患としてWHO基準により評価した。腫瘍を、腫瘍測定の基準を確定するために使用される同じ画像表示方法による治療中に再評価した。
【０１０９】
全mRNAを顕微解剖されたFPE前処理腫瘍試料より単離し、そして補正された相対ERCC1発現を、試料2および3に記載のように定量RT-PCRを用いて測定した。こうした試料からmRNAの単離方法が、実施例1および1999年12月20日出願され、その全体を引例により本明細書に組み入れられている、米国特許出願番号09/469,338に記載されている。
【０１１０】
統計による分析
Mann-Whitney U試験を、補正される相対ERCC1発現の連続試験による変動可能性と、および二分肢による変動(dichotomous variables)(患者の性別、年齢のメジアンより上および下の年齢、体重欠損の存在、胸膜滲出の存在、腫瘍の段階)との間の有意的な関連性のために使用した。Kruskal-Wallis試験を、複数の群(ECOG性能状況、組織病理学)の中の補正される相対ERCC1発現の有意差を試験するために使用した。Fisherの抽出試験を、応答、および二分肢され、補正される相対ERCC1発現値を含む、臨床病理的値の範疇としての分析のため使用した。
【０１１１】
全ての患者が、最初の研究治療より、死、またはそれが中止されるまで追跡した。Kaplan-Meier生存曲線およびLog[範囲試験を、生存および疾患のない生存の単一変異分布を分析するために使用した。Miller、及びAiegmund(Biometrics、1982;38:1011-1016)、及びHalpern(Biometrics1982;38:1017-1023)の最大、chi-square法が、グループ化強度の測定に使用される統計的なLog範囲試験を伴い、発現値は、悪性と良性の予後予測のサブクループ(生存する可能性の点から)に患者を最も適切に分離するよう決定するために適用される。最大のchi-squareに基づく関連強度の測定として解釈することのできるP値を測定するために、1000ブート・ストラップ様シュミレーション(1000boot-strap-like simulations)が、非関連性の仮定に基づいて最大chi-aquare統計の分布を想定して使用された。(Biometrics1982;38:1017-1023)を参照。一変量分析に有意差のあったCox’の比例危険モデリング(Cox’s proportional hazards modeling)の因子は、その諸因子が、生存に有意的に影響を及ぼす可能性があることを同定するため行われた。SPSS版10.0.5ソフトウエア(SPSS InC.,Chicago III)を、全ての統計分析に使用した。全てのP値が両側であった。
【０１１２】
補正された相対ERCC1の発現レベル：
ERCC1mRNA発現が、分析される56試料にて検出できることである。内部コントロール・ハウスキーピング遺伝子、βアクチンの発現に対する、メジアンにより補正された相対ERCC1発現が、6.7x10-3(0.8x10-3-24.6x103の範囲)であった。
【０１１３】
補正される相対ERCC1発現レベルと任意の諸因子、年齢 (P=0.66)、性別(P=0.18)、無作為抜き取り6ヶ月前における体重欠損の存在(P=0.74)、腫瘍段階(IIIB対IV、P=0.39)、または胸膜の滲出の存在(P=25,全Mann-Whitney U試験)との関係付けに有意差がなかった。さらに異なる性能状態の等級(P=0.48、Kruskal-Wallis試験)または異なる腫瘍細胞種(4種の腫瘍全て、P=0.10、Kruskal-Wallis試験) による患者間の補正される相対ERCC1発現レベルに有意差がないが、補正される相対ERCC1発現レベルが、腺ガン(メジアン5.2x10-3,P=0.015, Mann-Whitney試験)と比較してSCC腫瘍(メジアン8.6x10-3)において有意的に高かった。
【０１１４】
化学療法に対する応答：
応答に評価できる47人の患者に対し良く生ずる腫瘍の応答を、図3に示している。全体にわたる応答率が、44.7%である。完全な応答、および部分的応答すなわち「応答する」腫瘍(メジアン4.3x10-3、範囲1.2x10-3-24.6x10-3)における補正される相対ERCC1発現レベルが、安定な疾患、および進行性の疾患すなわち「非応答性」腫瘍(メジアン7.85x10-3、範囲0.8x10-3-24.3x10-3、P=0.31 Mann-Whitney試験)におけるレベルと有意的に相違しなかった。任意にERCC1レベル(すべてFisher’の抽出試験)より高い、および低い補正される相対ERCC1発現レベルにより、応答する、および非応答腫瘍の比率の間に有意的な差がない。閾値より低い(「低」発現、52%の応答値) 補正される相対ERCC1発現レベルによる腫瘍における応答率が、閾値より高い(「高」発現、36.4%の応答値、Fisher’の抽出試験、P=0.38) 補正される相対ERCC1発現レベルによる腫瘍に対するより有意的に高い。
【０１１５】
患者全体における生存性と補正された相対ERCC1発現レベルとの関連付け：
メジアンとしての全体における生存期間が、36.6週間(範囲0-113.4週)であり、メジアンとしての進行性に対する期間が、24.4週間(範囲0-102.94週)であった。閾値補正された相対ERCC1発現レベルを同定するようLogランク試験(log rank test)および最大chi-square統計を用いて、患者を予後予測の悪いサブグループ、と良好なサブグループに分離し、その識別範囲がメジアンを含み、そのため生存分析のための閾値として使用されることを示している。したがって、閾値補正相対ERCC1発現値を、NSCLCに6.7x10-3であると決定した。図1は、閾値補正相対ERCC1発現レベルより上、下の腫瘍内の補正相対ERCC1発現レベルを伴う患者用のKaplan-Meierの生存曲線を示している。
【０１１６】
図4に示すように、閾値より低い補正相対ERCC1発現レベルを有する患者が、閾値より高い補正相対ERCC1発現レベルを有する患者の20.4週(95%C.I.6.9,33.9週)と比較して、メジアンとして有意的に長い生存期間、61.6週(95%C.I.42.4，80.7週)を有した。腫瘍段階として調整され、補正された相対ERCC1発現の高、低と全体の生存性との間を関係付けるLog rank統計値が3.97で、P値が0.046であった。調整されなかったLog rankの結果を表4に示す。
【０１１７】
別の補正相対ERCC1発現の閾値5.8x10-3を試験した。それはこの値が、胃ガンの患者に対する全体の生存性との関連性があると、これまでの研究において値が示されていた(MetzgerらのJ Clin Oncol 1998;16:309-316)からである。全体生存性は、この研究におけるNSCLC患者のクループに対して有意的に良好であり、この研究においては、有意的に高い6.7x10-3の補正相対発現閾値レベルが、より強力な識別値であるが、全体の生存率は、5.8x10-3(log rank統計値6.37、P=0.011)より低いERCC1レベルの値と比較して5.8x10-3より低い補正相対ERCC1発現レベルであった。
【０１１８】
Kaplan Meier生存曲線、及びlog rank試験を使用する一変量分析(univariable analysis)により全体の生存性と有意的に関連付けられる他の因子は、前処理に体重の欠損があること、及びECOGの性能状態(表2)である。患者の年齢(P=0.18)、性別(P=0.87)、腫瘍の段階(P=0.99)、腫瘍の細胞種(P=0.63)、及び胸膜の滲出の存在(P=0.71)が、全体の生存の有意的な予後予測因子でない。補正された相対ERCC1発現レベル、ECOGの性能状態、及び体重の欠損が、Cox比例危険回帰モデル多重変動分析(Cox proportional hazards regression model multivariable analysis)(図4)における生存の有意的な予後予測因子として存在する。腫瘍段階に層化されたCox回帰モデル(Cox regression model)に対するP値は、ERCC1に対し0.038、体重の欠損に対し0.017、及びECOGの性能状態に対し0.02(PS 0対1又は2)であった。
【０１１９】
本研究は、低いERCC1mRNA発現レベルとガン患者に白金を基本とする化学的療法による治療後の生存性の改良との間の関連を見出した。
【図面の簡単な説明】
【図１】図1は、NSCLCの補正された相対ERCC1の発現に対するシスプラチン/ゲム(Cisplatin/Gem)治療を受けた全体にわたる患者の生存を示すグラフである。
患者の補正された相対ERCC1の発現(Corrected Relative ERCC1 Expression)が、6.7x10-3の閾値より有意的に低いことが、非常に良好な生存性と関連していた。一方で患者の補正された相対ERCC1の発現(Corrected Relative ERCC1 Expression)が、6.7x10-3の閾値より有意的に高いことが、非常に悪い生存性(P=0.009ログランクテスト(Log rank test)と関連していた。
【図２】図2は、内部コントロール遺伝子に関する補正された相対ERCC1発現の計算の仕方を示すチャートである。このチャートは、2種の試験試料(未知の1及び2)により得られたデータを含む、そして補正されていない遺伝子発現データ(UGE)の決定の仕方を表している。さらにチャートが、pre-TaqManTM技術により決定された周知の相対ERCC1値と共にTaqManTM装置により生成されるUGEの正規化の仕方を示している。これは、補正因子KERCC1に対し、UGFを多重にすることにより行われる。図の内部コントロール遺伝子が、β-アクチンであり、そして較正物質としてのRNAは、Human Liver Total RNA(Stratagene Cat.#735017)である。
【図３】図3は、腫瘍段階及び細胞の種類、の研究における56人の患者の統計的詳細を示す表である。受け入れられる処理サイクルの介在数が、3(1-6の範囲)であった。14人の患者(25%)が、前に化学療法を受けていたが、そのほとんどが(9人の患者)タキサン(taxane)療法だけ、又はDDP又はカボプラチン(carboplatin)と組み合わせて受けていた。56人の患者の3人が、放射性治療を受け、そして5人の患者が1次腫瘍の外科的切除を受けていた。
【図４】図4は、閾値より低い補正相対ERCC1発現レベルの患者が、閾値より高い補正相対ERCC1発現レベルの患者に20.4週(95%C.I.6.9,33.9週)と比較して61.6週(95%C.I.42.2、80.7週)と有意的に長いメジアンの生存性を有したことを示している表である。腫瘍段階に対し調整されると、低い又は高いERCC1発現の高低、と全体生存性との間を関係付ける定常的ログ・ランク(log rank statistic)が3.97で、P値が0.046であった。調整されていないログ・ランク(log rank)の結果が、この図に示されている。さらに示されているものは、Kaplan Meier 生存曲線(survival curves)及びログ・ランク・テスト(log rank test)を用いる一変量分析による全体生存性と有意的に関連する因子である。これらは、前処理による体重の低減及びECOGの性能状態の存在であった。患者の年齢(P=0.18)、性別(P=0.87)、腫瘍段階(P=0.99)、腫瘍細胞の種類(P=0.63)、及び胸膜浸出の存在(P=0.71)は、全体的生存性の予後予測を示す有意な因子ではなかった。補正された相対ERCC1発見レベル(Corrected Relative ERCC1 Expression level)、ECOG性能状態、及び体重の低減が、Cox比例危険軽減モデルの多重分析における生存性の有意な予後予測を示す因子として存在する。腫瘍段階に層化されたCox軽減モデルのP値が、ERCC1に対し0.038、体重の低減に対し0.017、及びECOG性能状況(PS0対1又は2)に対し0.02であった。
【配列表】
0004503922.tif 000002
0004503922.tif 000003
【図１】
0004503922.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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