(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
髄質嚢胞腎疾患２（ＭＣＫＤ２）あるいは髄質嚢胞腎疾患２にかかる素因の有無を検査する方法であって、該方法は、少なくとも１コピーのウロモジュリン（ＵＭＯＤ）遺伝子配列における変異を検出するために、予め被験者から得られた遺伝物質を分析することを含み、ここで、ＵＭＯＤ変異の存在は、患者における髄質嚢胞腎疾患２あるいは髄質嚢胞腎疾患２にかかる素因を示唆し、該変異が、ＵＭＯＤ遺伝子配列のエクソン４の内である、検査方法。
【請求項２】
家族性若年性痛風性腎症（ＦＪＧＮ）あるいは家族性若年性痛風性腎症にかかる素因の有無を検査する方法であって、該方法は、少なくとも１コピーのウロモジュリン（ＵＭＯＤ）遺伝子配列における変異を検出するために、予め被験者から得られた遺伝物質を分析することを含み、ここで、ＵＭＯＤ変異の存在は、患者における家族性若年性痛風性腎症あるいは家族性若年性痛風性腎症にかかる素因を示唆し、該変異が、ＵＭＯＤ遺伝子配列のエクソン４の内である、検査方法。
【請求項３】
疾患あるいは疾患にかかる素因の有無を検査する方法であって、該方法は、少なくとも１コピーのウロモジュリン（ＵＭＯＤ）遺伝子配列における変異を検出するために、予め被験者から得られた遺伝物質を分析することを含み、ここで、ＵＭＯＤ変異の存在は、患者における疾患あるいは疾患にかかる素因を示唆し、該疾患は、腎症、腎不全、高尿酸血症、痛風関節炎および夜尿症からなる群より選択され、該変異が、ＵＭＯＤ遺伝子配列のエクソン４の内である、検査方法。
【請求項４】
予め被験者から得られた遺伝物質がゲノムＤＮＡである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
予め被験者から得られた遺伝物質がＲＮＡである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
予め被験者から得られた遺伝物質が、被験者のＤＮＡまたはＲＮＡの合成コピーである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
分析することが、予め被験者から得られた遺伝物質の少なくとも１部の配列を得ることを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
分析することが、実質的にすべての予め被験者から得られた遺伝物質の配列を得ることを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
さらに、予め被験者から得られた遺伝物質の配列を野生型ＵＭＯＤ遺伝子の配列と比較すること、および予め被験者から得られた遺伝物質と野生型ＵＭＯＤ遺伝子の配列間の差異を同定することを含む、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
分析することが、予め被験者から得られた遺伝物質を、所定のＵＭＯＤ変異に実質的に特異的なハイブリダイゼーションプローブにさらすこと、および予め被験者から得られた遺伝物質に対する該プローブのハイブリダイゼーションが存在するかしないかを検出することを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
髄質嚢胞腎疾患２（ＭＣＫＤ２）あるいは髄質嚢胞腎疾患２にかかる素因の有無を検査する方法であって、該方法は、変異ＵＭＯＤタンパク質を検出するために、予め被験者から得られたＵＭＯＤタンパク質を分析することを含み、ここで、変異ＵＭＯＤタンパク質の存在は、患者における髄質嚢胞腎疾患２あるいは髄質嚢胞腎疾患２にかかる素因を示唆し、該変異が、［ｐ．Ｇ１０３Ｃ］を含む、検査方法。
【請求項１２】
家族性若年性痛風性腎症（ＦＪＧＮ）あるいは家族性若年性痛風性腎症にかかる素因の有無を検査する方法であって、該方法は、変異ＵＭＯＤタンパク質を検出するために、予め被験者から得られたＵＭＯＤタンパク質を分析することを含み、ここで、変異ＵＭＯＤタンパク質の存在は、患者における家族性若年性痛風性腎症あるいは家族性若年性痛風性腎症にかかる素因を示唆し、該変異が、Ａ．［ｐ．Ｈ１７７＿Ｒ１８５del］、Ｂ．［ｐ．Ｃ１４８Ｙ］、Ｃ．［ｐ．Ｃ２１７Ｒ］、Ｄ．［ｐ．Ｃ２２３Ｙ］、およびＥ．その２以上のいずれかの組み合わせからなる群から選択される変異を含む、検査方法。
【請求項１３】
疾患あるいは疾患にかかる素因の有無を検査する方法であって、該方法は、変異ＵＭＯＤタンパク質を検出するために、予め被験者から得られたＵＭＯＤタンパク質を分析することを含み、ここで、変異ＵＭＯＤタンパク質の存在は、患者における疾患あるいは疾患にかかる素因を示唆し、該疾患は、腎症、腎不全、高尿酸血症、痛風関節炎および夜尿症からなる群より選択され、該変異が、Ａ．［ｐ．Ｈ１７７＿Ｒ１８５del］、Ｂ．［ｐ．Ｃ１４８Ｙ］、Ｃ．［ｐ．Ｇ１０３Ｃ］、Ｄ．［ｐ．Ｃ２１７Ｒ］、Ｅ．［ｐ．Ｃ２２３Ｙ］、およびＦ．その２以上のいずれかの組み合わせからなる群から選択される変異を含む、検査方法。
【請求項１４】
分析することが、予め被験者から得られたＵＭＯＤタンパク質を、変異ＵＭＯＤタンパク質に選択的な抗体にさらすことを含む、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
分析することが、予め被験者から得られたＵＭＯＤタンパク質を、正常ＵＭＯＤタンパク質に選択的な抗体にさらすことを含む、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
該変異が、Ａ．［ｇ．１９６６＿１９９２del；ｃ５２９＿５５５del］、Ｂ．［ｇ．１８８０Ｇ＞Ａ；ｃ．４４３Ｇ＞Ａ］、Ｃ．［ｇ．１７４４Ｇ＞Ｔ；ｃ．３０７Ｇ＞Ｔ］、Ｄ．［ｇ．２０８６Ｔ＞Ｃ；ｃ．６４９Ｔ＞Ｃ］、Ｅ．［ｇ．２１０５Ｇ＞Ａ；ｃ．６６８Ｇ＞Ａ］、およびＦ．その２以上のいずれかの組み合わせからなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項１７】
該変異が、［ｇ．１７４４Ｇ＞Ｔ；ｃ．３０７Ｇ＞Ｔ］である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
該変異が、Ａ．［ｇ．１９６６＿１９９２del；ｃ５２９＿５５５del］、Ｂ．［ｇ．１８８０Ｇ＞Ａ；ｃ．４４３Ｇ＞Ａ］、Ｃ．［ｇ．２０８６Ｔ＞Ｃ；ｃ．６４９Ｔ＞Ｃ］、Ｄ．［ｇ．２１０５Ｇ＞Ａ；ｃ．６６８Ｇ＞Ａ］、およびＥ．その２以上のいずれかの組み合わせからなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦によって後援された研究と開発に関する声明
本発明は、ナショナル・インスティテュート・オブ・ダイアベティス・アンド・ダイジェスティブ・アンド・キドニー・ディジージズ(National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases)によって授けられた助成金番号ＤＫ６２２５２に基づき、部分的に政府の援助によってなされたものである。合衆国政府は本発明において一定の権利を有することがある。
【０００２】
発明の分野
本発明は疾患または疾患を発症する素因を診断するための方法および試薬に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
髄質嚢胞腎疾患２（すなわち、「ＭＣＫＤ２」、Online Mendelian Inheritance in Man Ref. OMIN603860 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?id=603860)）および家族性若年性痛風性腎症（すなわち、「ＦＪＧＮ」Online Mendelian Inheritance in Man Ref. OMIM162000 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?id=162000)）は、高尿酸血症、痛風、夜尿症および進行性腎不全の若年性発症を特徴とする、常染色体優性腎疾患である。どちらの病気も、腎移植を行わない限り、通常は死に至る。
【０００４】
ＭＣＫＤ２およびＦＪＧＮ両方の臨床的徴候は存在および重篤度によって異なるため、顕著な病状が出る前は、どちらの病気もはっきりとした診断が難しい。そのため、現在、どちらの病気も一般的に早期に治療できず、また通常これらの病気において予防は不可能である。したがって、ＭＣＤＫ２およびＦＪＧＮのような疾患、あるいはかかる疾患を発症する素因を診断するための、より感度のよい方法および試薬が必要とされている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の要旨
本発明は、被験者または患者におけるウロモジュリン（ＵＭＯＤ、タム−ホースフォールグリコプロテイン（Tamm-Horsfallglycoprotein）としても知られている（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?id=191845参照)）の変異を分析することによって、疾患あるいは疾患にかかる素因を診断する方法を提供する。ＵＭＯＤにおける変異の存在は、患者の疾患あるいは疾患にかかる素因の診断を補助する。
【０００６】
本発明の方法は、現行の方法よりも早期に疾患（例えば、ＭＣＫＤ２、ＦＪＧＮ、腎症、腎不全、高尿酸血症、痛風関節症、夜尿症など）を診断することを可能にし、それにより顕著な病状が発現する前の、上記疾患の診療及び治療を容易にすることができる。使用目的によっては、本発明の方法はかかる疾患を発症する素因を、症状を示していない患者においてさえも同定することができる。さらに該方法は、潜在的な組織提供者あるいは提供された組織または器官（例えば、腎臓若しくは腎組織）を調べ、提供された組織を受け取る移植受容者が上記疾患を発症する危険性を最小限に抑えるために使用されうる。本発明のこれらの利点およびその他の利点、そしてさらなる発明の特徴は、以下に提供される発明の詳細から明らかとなるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
発明の詳細な説明
本発明は、被験者におけるＵＭＯＤの変異を分析することによって、疾患あるいは疾患にかかる素因を診断する方法を提供する。本発明の方法によれば、あらゆる個体を試験することができる。しかしながら、通常、被験者（または患者）は、例えば、ＭＣＫＤ２、ＦＪＧＮ、腎症、腎不全、高尿酸血症、痛風関節症および夜尿症などの病歴を有する家系に属している。かかる家系出身の無症候個体を試験して、彼らが上記疾患にかかる素因を有しているかどうか、あるいは彼らが彼らの子孫において疾患を起こしうる対立遺伝子のキャリアであるかどうかを調べることができる。その上、この方法を出生前に用いて、胎児が生後、ＭＣＫＤ２、ＦＪＧＮ、腎症、腎不全、高尿酸血症、痛風関節症および夜尿症を発症する傾向を調べることができる。あるいは、本発明の方法を用いて、症状を示す患者、通常、高尿酸血症、腎不全および／または夜尿症を示すような患者を診断することができる。かかる患者のために、本発明の方法はより早期に、および／またはより明瞭な診断を提供することができ、したがってより早期の診療および治療を容易にすることができる。さらに、移植の必要がある人々は提供腎臓やその他の腎組織を家族員の近親者から受け取ることが多いので、本発明の方法を用いて提供者や提供された組織を調べ、移植受容者が異常ＵＭＯＤタンパク質を生成する腎組織を受け取らないことを確実にすることができる。
【０００８】
１つの実施態様では、本発明の方法は、被験者から得た遺伝物質を分析することを含む。遺伝物質は、例えば、被験者から直接得たＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、あるいは遺伝物質を被験者の細胞内で遺伝物質から（例えば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、若しくはその他の適切な技術を介して）複製または増幅してもよい。例えば、細胞を尿サンプルから集めて遺伝物質を得てもよい。十分な量の遺伝物質が試験に利用できるようにするため、通常、被験者から得た細胞から増幅した遺伝物質を本発明の方法によって分析する。望ましくは、患者由来のＵＭＯＤ遺伝子を分析のために増幅するため、この配列の全てまたは一部に隣接するプライマーを用いてＰＣＲあるいはＲＴ−ＰＣＲストラテジーを使用する。ＭＣＫＤ２および／またはＦＪＧＮは常染色体優性疾患であるので、本発明の方法に応じて両方を分析するため、被験者由来のＵＭＯＤ遺伝子の両方のコピーを増幅／複製するのが最も好ましい。
【０００９】
どのようにして得たかに関わらず、遺伝物質を分析して、ＵＭＯＤ遺伝子における変異（例えば、２つのＵＭＯＤ対立遺伝子の少なくとも１つにおける変異）を検出する。この目的のために、遺伝物質（例えば、ｇＤＮＡ，ｃＤＮＡ，ＲＮＡなど）の種類に適切な変異を検出することができる任意の試験を用いてもよい。例えば、一部の遺伝物質または実質的に全ての遺伝物質を配列決定してもよく、また配列を野生型ＵＭＯＤ配列（例えば、GenBank登録番号：ＡＹ１６２９６３、ＡＹ１６２９６４、ＡＹ１６２９６５、ＡＹ１６２９６７、ＡＹ１６２９６８、ＡＹ１６２９６９およびＡＹ１６２９７０参照）と比較して変異を検出してもよい（例えば、図５参照）。あるいは、遺伝物質を所定のＵＭＯＤ変異に実質的に特異であるハイブリダイゼーションプローブで（例えば、ノザンまたはサザンハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、あるいは当業者によく知られている周知であるようなその他の適当な方法によって）プローブすることができる。例えば、ＭＣＫＤ２および／またはＦＪＧＮに関連した公知のＵＭＯＤ変異の１つは、ＵＭＯＤ遺伝子のエクソン４から２７ベースペアの欠失（図６参照）であり、この欠失をまたぐように設計されたプローブを使用して、この変異を（例えば、ＥＬＩＳＡによって）素早く分析することができる。
【００１０】
別の実施態様では、本発明の方法は、被験者から得たＵＭＯＤタンパク質を分析することを含む。ＵＭＯＤタンパク質は尿サンプルまたはそこから単離された細胞中などから任意の適切な方法によって得られうる。その後、被験者から得たＵＭＯＤタンパク質を分析し、変異を検出する。例えば、ＵＭＯＤタンパク質を精製し（部分的にもしくは実質的に、（例えば、Tamm and Horsfall, J. Exp. Med., 95, 71-97 (1952)参照）、そして、野生型ＵＭＯＤタンパク質ではなく、公知の変異ＵＭＯＤタンパク質を認識する抗体を１つ以上用いて、免疫組織学的（immunohistorlogical）技術（例えば、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ，免疫沈降など）によって分析できる。もう１つの方法として、あるいは上記の方法と併せて、被験者由来のＵＭＯＤタンパク質サンプルを、公知の変異ＵＭＯＤタンパク質ではなく、野生型ＵＭＯＤタンパク質を認識する抗体を１つ以上用いて分析することができる。したがって、使用目的によっては、所定の被験者の免疫学的ＵＭＯＤプロファイルを作成したり、またさらには、存在する変異および野生型ＵＭＯＤタンパク質の量および／または種類を定量的に決定したりすることさえも可能である。
【００１１】
免疫学的特性評価の代わりとして、被験者由来のタンパク質を形態学的に分析することができる。この場合、ＵＭＯＤは、約８５ｋＤの単量体サブユニットから構成され、分子量の３０％の炭水化物と残りの７０％のポリペプチド鎖を有する、その天然形態における重合体であることが知られている（Fletcher et al., Biochem. J., 120, 425-32 (1970)）。電子顕微鏡観察により、高分子量の会合体がジグザグまたはらせん構造を有する薄くて絡み合った繊維で構成されていることが明らかになっている。最近の分析は、お互いに巻きついた２つのプロトフィラメントからなるフィラメントが、右巻きの螺旋を形成していることを示している（Jovine et al., Nat. Cell. Biol., 4, 457-61 (2002)）。ＵＭＯＤは透明帯（zona pelucida）（ＺＰ）ドメインを含有しており、これはＺＰ−含有タンパク質をフィラメントへの重合を担うことが示されてきた（Jovine et al.）。また、ＵＭＯＤは多数のシステイン残基を含有しており（モノマーにつき４８個）、２４個の分子内ジスルフィド結合の潜在的形成を可能にする。これらのシステイン残基は生物種間で高く保全される(図６)。ＵＭＯＤタンパク質の変異はその一次および二次構造、並びに結合力を改変し、またその特徴的な三次構造を形成することができる。よって、使用目的によっては、変異ＵＭＯＤタンパク質の形態学的分析として、被験者からのＵＭＯＤの構造を野生型タンパク質のそれと比較することが可能である。
【００１２】
当然に、遺伝子およびタンパク質分析の両方を互いに組み合わせて使用し、被験者における変異ＵＭＯＤを検出することも可能である。しかしながら、もし上記疾患と一致するその他の症状を伴う場合、分析の方法に関わらず、被験者由来の変異もしくは異常ＵＭＯＤ遺伝物質および／またはタンパク質の存在を裏付ける試験結果は、被験者におけるＭＣＤＫ２、ＦＪＧＮ、腎症、腎不全、高尿酸血症、痛風関節症または夜尿症の診断を補助する。無症候被験者のＵＭＯＤ陽性の結果は、上記疾患を発症する素因の診断を補助する。
【００１３】
以下の実施例により本発明をさらに例示するが、当然に、これらはいかなる形にしろ本発明の範囲を制限するように解釈されるべきではない。
【実施例】
【００１４】
実施例１
本実施例は、ＦＪＧＮを有する３つのファミリーおよびＭＣＫＤ２を有する１つのファミリーにおいて、疾患表現型により分離した４つのＵＭＯＤ遺伝子変異の存在を示している。これらの知見は、ＭＣＫＤ２およびＦＪＧＮはＵＭＯＤ遺伝子の変異に起因し、対立遺伝子の疾患であることの直接の証拠を提供する。したがって、ＵＭＯＤ変異を分析してＦＪＨＮおよび／またはＭＣＫＤ２を発症する傾向を同定することが可能である。
【００１５】
患者および方法
家系図および診断法
調査参加者を４つのファミリーから得た。ファミリー１は数世代にわたる大きなファミリーであり、このファミリーにおいて７世代遡って疾患をたどった。この家系は３００人以上を超える家族員を含み、家系図全体を表すには大きすぎた。図１は、サンプルの大部分をそこから得たこのファミリーの選択した部分の家系図を示す。このファミリーは、常染色体優性様式で遺伝した、高尿酸血症、尿酸の分画排出の低減、および腎不全の長い病歴有しており、それらはＦＪＨＮと一致する臨床所見を伴っていた。ファミリー２は、同じくＦＪＨＮを高浸透常染色体優性形質として分離した数世代にわたる大きなファミリーであった。ファミリー３はこれまで、常染色体優性様式で遺伝した髄質嚢胞疾患、高尿酸血症および痛風（Thompson et al., Arch. Intern. Med., 138, 1614-17 (1978)）を患っていると報告されてきた（図１参照）。サンプルをファミリー４の罹患家族員の１人から得た。ファミリー４はこれまで文献において家族性高尿酸血症および腎臓病を患っているが髄質嚢胞は患っていないと広く述べられてきており、所見はＦＪＨＮの診断と一致する（Massari et al., Arch. Intern. Med., 140, 680-84 (1980)）。ファミリー５は、家族員がＦＪＧＮの診断と一致する症状を示していたので調べた。
【００１６】
血中尿酸および血中クレアチニン測定を行い、尿酸およびクレアチニンの２４時間蓄尿を得た。クレアチニン測定はジャッフェ(Jaffe)アルカリ性ピクリン酸塩反応速度法によって行った（Tietz NW. Clinical Guide to Laboratory Tests, 3d edition. WB Saunders Company, Philadelphia, PA; 186-87 (1995)）。尿酸測定はＡＤＶＩＡ１６５０ケミストリーシステムで行った。尿酸定量法は、トリンダー（Trinder）様エンドポイントを有するウリカーゼを用いたフォサッティ(Fossati）酵素反応の基づくものである（Fossati, Clin. Chem., 26, 227-231(1980)）。コックロフト−ゴールト(Cockroft-Gault)式によって判定されるように（Cockroft et al., Nephron, 16, 31-41 (1976)）、クレアチニンクリアランスの評価を、患者の体重または標準体重のうちどちらか少ない方を用いて行った。腎不全を概算クレアチニンクリアランスが８０ｍｌ／分未満のものとして定義した。夜尿症は４歳以降の持続的な夜尿と定義した。
【００１７】
もし以下の基準を満たすならば、患者が確実に罹患しているとみなした：（１）高尿酸血症（集団の年齢および性別を調節した平均よりも２標準偏差（ｓ．ｄ．）高いレベルの血中尿酸レベルとして定義する（Wilcox, J. Pediatr., 128:731-41(1996);Mikkelsen et al., Am. J. Med., 39, 242-51 (1965)））または痛風の病歴およびアロプリノールの現行治療、および（２）尿酸の分画排出の低減（男性で＜５％、女性で＜６％）または８０ｍｌ／分未満の低下したクレアチニンクリアランス。（一般的に、クレアチニンクリアランスが８０ｍｌ／分未満の個体は、尿酸の分画排出の上昇が現れ始める（Rieselbach et al., Nephron, 14, 81-87 (1975)）、そのため、腎不全を有する家族員では尿酸の分画排出をＦＪＨＮの決定因子として用いることができない。）血中尿酸レベルが集団の年齢および性別により調節した平均の１標準偏差以内であれば、家族員を臨床的に罹患していないと定義する(Wilcox; Mikkelsen et al.)。
【００１８】
ＤＮＡ−マーカー解析
ゲノムＤＮＡを末梢血液からＱＩＡａｍｐ血液キット（Qiagen）を用いた標準方法によって抽出した。遺伝子の連鎖の調査を、ＦＪＨＮと診断された２つの数世代にわたる大ファミリー出身の９０個体において行った（図１、ファミリー１およびファミリー２）。有効な家族員を、候補インターバル（candidate interval）にまたがるＳＴＲＰ−タイプ（Short Tandem Repeat Polymorphisim）遺伝子マーカーについて遺伝子型を調べた。以前に報告された９つのＳＴＲＰ遺伝子座に加え、９つの新規なＳＴＲＰ遺伝子座を５．６Ｍｂのインターバルの物理的地図から作成した（図２、図３）。これらのマーカー遺伝子座を、蛍光ラベルしたプライマーを用いてＰＣＲ増幅し、従来法での遺伝子型決定を可能にした（Hart et al., Am. J. Hum. Genet., 70, 943-54 (2002)）。ＰＣＲ生成物をＡＢＩ３７７蛍光シーケンサーで検出し、ＧＥＮＥＳＣＡＮ２．１（Applied Biosystems）で分析した。
【００１９】
パラメトリック連鎖計算：ＬＯＤスコアおよびハロタイプ解析
候補インターバルのサブローカライゼーションを遺伝連鎖調査およびファミリー１とファミリー２におけるＦＪＨＮ形質により分離したハロタイプの最小重複部位の評価の方法によって得た。標準の二点および多重連鎖解析を、ＶＩＴＥＳＳＥプログラムを用いて行った（O’Connele et al., Nat. Genet., 11, 402-08 (1995)）。連鎖解析の条件は、常染色体優性トランスミッション、９５〜１００％の浸透率、０．０００１の疾患対立遺伝子頻度および１％の表現型模写率を含むものであった。ハロタイプの同定を可能にするため、ＦＪＨＮ候補遺伝子領域の物理的地図を作成した。この地図により、この領域内の公知のＳＴＲＰマーカーの正確なローカライゼーションが可能となり、またインターバルにまたがる所望のロケーションの新規なＳＴＲＰマーカーを同定することができた。
【００２０】
候補ＦＪＧＮ候補インターバルの物理的地図の作成；ＳＴＲＰおよび遺伝子同定
候補インターバルにまたがる新規なＳＴＲＰタイプマーカーを同定し、インターバル内の全ての公知および推定遺伝子を同定できるようにするため、詳細な物理的／遺伝的地図の作成が始められた（Zhang et al., Cyto. Genet. Cell. Genet., 95, 146-52 (2001)）。最終アラインメントは５．６百万ベース領域にまたがる６７ＢＡＣＳを含有していた。この領域はＢＡＣ配列が整列できない２つのギャップを含む。このコンティグ（contig）をすべての公知の遺伝子で調べ、ＳＴＲＰ遺伝子座をＮＣＢＩヒトゲノム配列サイトおよびＧＥＮＥＭＡＰ９９(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/およびhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/genemap/)を通じて同定し、またＢＡＣコンティグで確認された遺伝子およびＳＴＲＰ遺伝子座を新しい地図上で位置づけた。新規なＳＴＲＰマーカーをタンデムリピーツファインダー（Tandem Repeats Finder）（Benson, Nucl. Acids. Res.. 27, 573-80 (1999); http://c3.biomath.mssm.edu/trf.advanced.submit.html）を用いて同定した。次いで候補ＳＴＲＰサイトを選び、プライマーをＯｌｉｇｏ４．０ソフトウェアを用いて設計した。
【００２１】
候補領域における遺伝子を同定するためにいくつかの情報源を用いた：ＵＣＳＣのHuman Genome Project Working Draft (http://genome.ucsc.edu/)、Sanger Center’s ENSENBLE detabase (http://ensembl.org/)およびLocus Link (Benson)。また、ＢＬＡＳＴ非重複（non-redundant）データベースおよびｄｂＥＳＴデータベースを調べたBACコンティグ配列に、ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)およびｅＰＣＲを用いた。その時点で利用可能な全ての情報を用いて、ｃＤＮＡコンティグを個々の候補遺伝子のために作成した。遺伝子のより正確な表現のため、すべてのＥＳＴデータを含めた。イントロン／エクソンの境界は、ＧＥＮＩＯ／ｓｐｌｉｃｅ（http://genio.informatik.uni-stuttgart.de/GENIO/splice/）で示されたコンセンサススプライス配列を用いてマニュアルで決定した。利用可能なＮＣＢＩデータ（電子リファレンスにおける登録番号；NCBI Locus Link, NCBI Entrez）[図２で示した遺伝子に関するNCBI Locus Link (http://www.ncbi.nlm.nih.giv/LocusLink/)−Locus ID番号は：XT1-64131, COQ7-10229, B/K-51760, G104-162074, GPRC5B-51704, GP2-2813, UMOD-7369, BUCS1-116285; (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/)で提供されるNCBI Entrez  遺伝子登録番号：XT1-XM_485032, COQ7-NM_016138, B/K-NM_016524, G104-XM_091332 GPRC5B-NM_016235, GP2-NM_001502, UMOD-NM_003361, BUCS1-NM_052956）]からのデータと同様にプライマリーコンティグから得たデータを用いて、ゲノムＤＮＡからの候補遺伝子を増幅するためのプライマーを設計した。連鎖およびハプロタイプ解析により、ＦＪＨＮ候補領域を約１．７Ｍｂインターバルに細分化した。５つの公知の遺伝子をこのインターバルで位置特定した。加えて、インテグレイテッドバイオインフォマティックスおよびベンチラボアプローチを用いて、今まで特徴付けられていなかった遺伝子座をインターバル中で位置特定した。これら遺伝子のうち４つすべてのエクソンおよびイントロン−エクソン境界を、ファミリー１およびファミリー２の罹患および非罹患家族員から得たゲノムＤＮＡの配列解析によって解析した。
【００２２】
ＵＭＯＤエクソン配列決定
ＵＭＯＤ遺伝子のゲノム構造をバイオインフォマティックスに決め、配列解析で確認した。イントロン−エクソン境界（表２）を含む、１２エクソン中１１を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーを、Ｏｌｉｇｏ４．０２（National Biosciences）を用いて設計した。ＵＭＯＤ遺伝子のＯＣＲ増幅を、表２に示したようにして行った。増幅したＤＮＡをQIAquick PCR精製キット（Qiagen）で精製し、ピッツバーグ大学のゲノミクス・アンド・プロテオミクス・コア（Genomics and Proteomics Core）研究所によるＡＢＩ３７００ＤＮＡアナライザー(Applied Biosystems)のビックダイ・ターミネータ・サイクル（BigDye Terminator Cycle）配列決定キットを用いて配列決定した。配列解析をSequencher４．１ソフトウェア(GeneCodes)で行った。
【００２３】
結果
臨床所見
５年間にわたり、ファミリー１の７２人に対し臨床試験を行った。３１人が罹患したとみなされる厳密な基準を満たし（尿酸の分画排出の低減を伴った高尿酸血症または腎不全）、２２人が正常だと診断され、そして非罹患配偶者が１０人いた。９人の家族員には規定の診断をすることができなかった。３４人の個体が高尿酸血症を患い、２８人が腎不全を患っていた。ファミリー２および３の家系図により、高尿酸血症または腎不全を患った全ての個体を同定する。
【００２４】
腎生検
ファミリー１の３人の家族員における腎生検によって病理学的サンプルを得た。３つすべての生検により、尿細管萎縮および間質性繊維症の組織学的変化が明らかになった。糸球体硬化症は全体的に存在し、糸球体腎炎の徴候はなかった。ファミリー２における３９歳の罹患女性の生検標本によって、広範囲に及ぶ尿細管萎縮が明らかになった。ファミリー３において、いくつかの生検標本を得た。最初のものは３４歳男性のものであり、報告により、濃密な無細胞性硝子状物質によって細管が覆われていることが明らかになた（Thompson et al., Arch Intern Med, 138, 1614-17(1978)）。髄質嚢胞が存在した。別の家族員において、生検調査により、繊維組織によって細管が覆われていることも明らかになった。３つ目の場合、細管は濃密な無細胞性硝子状物質によって覆われていた(Thompson et al.)。ファミリー４において、生検サンプルによって、間質性繊維症をともなった局所性尿細管萎縮およびリンパ球浸潤が明らかになった。つまり、全ての生検標本により間質性繊維症をともなった局所性尿細管萎縮が示された。解剖報告により、濃密な無細胞性硝子状物質によって覆われた細管が明らかになった。ＰＡＳ陽性物質の間質沈積もまた、髄質嚢胞腎疾患において確認されている(Zagar et al., Lab. Invest., 38, 52-57 (1978); Resnick et al., Lab., Invest. ,38, 550-55 (1978))。これらの沈積物の免疫染色は、タム−ホースフォールタンパク質に対する抗体に著しく陽性であることがわかった。
【００２５】
候補インターバルの物理的地図
ＦＪＨＮ／ＭＣＫＤ２候補インターバルの既存の遺伝的および物理的地図は一般に統合性に乏しく、インターバルをまたぐ比較的少数の多型性遺伝子マーカー（ＳＴＲＰｓ）を同定した。これは、キーマーカー（Ｄ１６Ｓ３０５６）が調査したファミリーにおいて情報価値がなかったため、問題であった。ＦＪＨＮ／ＭＣＫＤ２候補インターバルの統合された物理的および遺伝的地図の作成（図２にまとめた）によって、これまでの連鎖調査の結果を正確に方向付けることが可能になり、公知の遺伝子を正確に候補インターバルに局在させ、また新規なＳＴＲＰ遺伝子座を作成することができた。新規なＳＴＲＰ遺伝子座マーカーのアベイラビリティにより、ハプロタイプ解析によって候補インターバルを細分化ができた。８つの公知のＳＴＲＰおよび８つの新規のＳＴＲＰの位置を図２に示す。これらのＳＴＲＰを増幅するために用いたオリゴヌクレオチドプライマーおよび条件を表１に示す。現在の連鎖データを含む、ほとんどの報告におけるコンセンサス候補インターバルは、１６ｐ１３．１１（Ｄ１６Ｓ４９９）から１６ｐ１２．２（Ｄ１６Ｓ４０３）に位置する候補インターバルを裏付けている。ＦＪＨＮおよびＭＣＫＤ２として報告されたすべての連鎖インターバルが染色体１６ｐにマッピングされる一方で、すべてが重複するわけではないことは図２から明らかである。
【００２６】
連鎖解析
遺伝連鎖解析の結果により、２つのファミリー（ファミリー１およびファミリー２）におけるＦＪＨＮの遺伝子を約１．７−Ｍｂの重複インターバルに位置づけた（図２）。ファミリー１では、その遺伝子を２３４９Ｂ８（１６）からＤ１６Ｓ４０３（ＺＭＡＸ＝１２．５＠Ｄ１６Ｓ３０４１、q＝０．０１）に線引きされた約３．８−Ｍｂのインターバルに位置づけ、またファミリー２では、連鎖インターバルはＤ１６Ｓ４０４およびＤ１６Ｓ３０４６（ＺＭＡＸ＝３．２＠Ｄ１６Ｓ３０４１、q＝０．００）間の〜１７−Ｍｂであった。Ｄ１６Ｓ４０４はテロマー的に約１４−Ｍｂ、Ｄ１６Ｓ４９９へ伸びている。これらの知見は、ＦＪＨＮの染色体１６ｐへの連鎖に関するこれまでの５つの報告のうち４つ（Dahan et al., J. Am. Soc Nephrol., 12, 2348-57 (2001); Hateboer et al., Kidney Int., 60, 1233-39 (2001); Scolari et al., Am. J. Hum. Genet., 64, 1655-60 (1999); Stiburkova et al., Am. J. Hum. Gen., 66, 1989-94 (2000)）と一致した。本発明の候補インターバルは５つめの調査（Kamatani et al., Arthritis Rheum., 43, 925-29 (2000)）のインターバルとは重複しなかったが、これはおそらく遺伝的異質性を反映している（彼らは日本のＦＪＨＮファミリーを調査している唯一のグループである）。
【００２７】
候補遺伝子評価；変異解析
ＦＪＨＮに関する公知の連鎖報告の全てと本発明の連鎖データを統合することにより、本発明の連鎖結果における２３４９Ｂ８（１６）からＤ１６Ｓ３０３６の最小重複（＜０．３−Ｍｂ）のインターバルとDahanおよびその同僚らのそれ[Dahan et al.,前述]とが一致した（図２参照）。この遺伝子同定アプローチにより、公知の遺伝子の１つ（Ｂ／Ｋタンパク質；ＮＭ＿０１６５２４）および仮想遺伝子の１つ（Ｇ１０４；ＸＭ＿０９１３３２）をこの共通のインターバル中で同定した。Ｂ／Ｋ遺伝子および仮想遺伝子Ｇ１０４のコード領域（イントロン−エクソン接合部を含む）に関して、ファミリー１およびファミリー２の罹患および非罹患家族員から得たゲノムＤＮＡの直接配列解析では、どちらのファミリーにおいてもＦＪＨＮ形質の原因となるＤＮＡの変異は何も同定されなかった。
【００２８】
ＦＪＨＮの明確な診断は問題が多く（特に、軽度の場合や若い個体の場合）、また家族員の間違った診断は候補遺伝子部位の境界に直接影響するかもしれないため、本解析をファミリー１およびファミリー２から得た連鎖および遺伝子型データのみを用いて進めた。したがって、上記の診断基準に基づいて罹患していると診断されなかった個体を本解析から除いた。同様に、正常な腎機能（計算したクレアチニンクリアランスが１００ｍｌ／分を超える）かつ血中尿酸レベルが年齢と性別で調整した平均の１標準偏差以内である個体（Wilcox; Mikkelsen et al.）を本解析から除き、候補インターバルを細分化した。
【００２９】
ハプロタイプ解析によって、ファミリー１およびファミリー２におけるＦＪＨＮ形質により分離した最も小さい共通のハプロタイプが同定された（図３）。本配列解析により、公知の遺伝子（Ｂ／Ｋタンパク質）および仮想の遺伝子（Ｇ１０４）がインターバル２３４９Ｂ８（１６）〜Ｄ１６Ｓ３０３６から除かれ、候補インターバルを、Ｄ１６Ｓ３０３６〜Ｄ１６Ｓ３０４６から約１．２−Ｍｂに細分化できた。これで、４つの遺伝子：ブチリル（Butyrl）コエンザイムＡシンセターゼ１（ＢＵＣＳ１）；グリコプロテイン２（ＧＰ２）；Ｇプロテイン共役型受容体、ファミリーＣグループ５、メンバーＢ（ＧＰＲＣ５Ｂ）およびＵＭＯＤを含む候補インターバルが修正された。ＧＰＲＣ５ＢおよびＵＭＯＤの配列解析を、罹患および非罹患家族員から得たゲノムＤＮＡで行った。ＧＰＲＣ５Ｂ配列データにおいて、コード領域多型は検出されなかった。ＵＭＯＤ遺伝子全体のゲノム構成を決定するため、利用可能なすべてのＵＭＯＤｍＲＮＡおよびＥＳＴデータを整列して、考えられるあらゆるスプライス改変体を同定した。バイオインフォマティックスアプローチを用いて、ＵＭＯＤ遺伝子のゲノム構造を決定した（図４参照）。このアプローチにより、１２個のＵＭＯＤエクソンが同定がされ、これはこれまで報告されたエクソンより１つ多い（Pennica et al., Science, 236, 83-88 (1987)）。本アプローチによって同定され、ＥＳＴデータによって支持される、新規のエクソンはエクソン２である。エクソン１および２はエクソン３のＡＴＧ開始部位とコードしない。ＥＳＴデータに基づくと、エクソン１から転写が始まりエクソン３へ進行するか、エクソン２において転写が始まりエクソン３へ進行するかのいずれかであるために、代わりの５’転写開始部位があるようである。どちらの場合も、得られたタンパク質は同一である。
【００３０】
ＵＭＯＤ配列解析をファミリー１およびファミリー２で行った。配列解析の結果により、ファミリー１および２の、ＵＭＯＤのエクソン４における２つの異なる変異が明らかになった（図５Ａ、５Ｂ）。変異は命名法ガイドラインにそって記載した（Antonarakis, Hum. Mutat., 11, 1-3 (1998); Den Dunnen et al., Hum. Mutat., 15, 7-12 (2000)）。それぞれのファミリーにおいて（ファミリー１におけるg.1966_1992delおよびファミリー２におけるg.1880G＞A）、ＵＭＯＤエクソン４遺伝子変異は疾患表現型と完全に分離していた。ＭＣＫＤ２におけるＵＭＯＤ変異の関与の可能性を評価するため、ＭＣＫＤ２を分離する、より小さいファミリーの３人の罹患家族員および５人の非罹患家族員（ファミリー３、図１）の配列解析を行った。このファミリーの解析により、ＵＭＯＤにおいて、またエクソン４においても、３つ目の新規な変異（g.1744G＞T）を同定した（図５Ｃ）。ＦＪＨＮにおけるＵＭＯＤ変異の普遍性を評価するため、我々はこれまでに報告された大親族の罹患家族員に対し変異解析を行った(Massari et al., Arch. Intern. Med., 140, 680-84 (1980))。この解析により、ＵＭＯＤのエクソン４における４つ目の新規な変異（g.2086T＞C）が明らかになった（図５Ｄ）。ファミリー５における罹患個体は別の変異を含有していた（g.2105G＞A、c.668G＞A、p.C223Y）。
【００３１】
ファミリー１、ファミリー２およびファミリー３における特定のＵＭＯＤ遺伝子変異は、罹患した家族員（ファミリー１およびファミリー２におけるＦＪＨＮ；並びにファミリー３におけるＭＣＤＫ２）においてそれぞれ分離していた。これらの変異の中で試験された１００の対照染色体において同定されたものはなかった。５０人の白人対照（１００染色体）におけるＵＭＯＤ遺伝子の配列解析では、ＵＭＯＤエクソン内の２つのサイレント多型の存在が明らかになった。以前に報告された、Ｃ１７４に位置する同義的ＳＮＰ（Pirulli et al., J. Nephrol., 14, 392-96 (2001)）は、我々のサンプルで、８２％のＴ対立遺伝子頻度および１８％のＣ対立遺伝子頻度を有している。Ｖ２８７に位置している新規な同義的ＳＮＰは８７％のＧ対立遺伝子頻度および１３％のＡ対立遺伝子頻度を有している。ＵＭＯＤ翻訳に影響を与える多型は、調べた１００の対照染色体いずれにおいても検出されなかった。
【００３２】
遺伝子型−表現型相互関係
ファミリー１では、３６人の家族員が変異を持ち、２６人の家族員が持っていなかった。遺伝的に罹患している３６人中３２人（８９％）の個体が高尿酸血症を患っていた（前述の方法にて定義）。遺伝的に罹患している３２人中２８人（８８％）の家族員が、１８歳以降で測定したとき、９０ｍｌ／分未満の概算クレアチニンクリアランスを有していた。ＵＭＯＤ変異を持っている３６人中１０人（２８％）の個体が夜尿症を患っていた。尿酸の分画排出は、遺伝的に罹患しているすべての男性において６％未満、そして概算クレアチニンクリアランスが７０ｍｌ／分より高い遺伝的に罹患しているすべての女性においては５％未満であった。（患者の尿酸の分画排出は腎機能が低下するにつれて増加する（Rieselbach et al., Nephron, 14, 81-87 (1975)）。ＵＭＯＤ変異を持っている３６人中３２人の個体は、罹患されていると診断されるのに必要である厳密な臨床基準を満たしていた。残りの４人は、尿酸の分画排出が低かったにも関らず正常な血中尿酸レベルを有していた女性であった。これらの女性のうち２人は軽度の腎不全を有していた。これらの女性のうち３人を数年間にわたって試験したところ、血中尿酸レベルは正常かボーダーライン上のままであった。ＵＭＯＤ変異を持たない５人の家族員では、血中尿酸レベルが上昇はしたが平均の２標準偏差より高くはならなかった。
【００３３】
ファミリー２においては、変異を有する９人中９人の患者が高尿酸血症を患い、また９人中９人の患者が腎不全を患っていた。ファミリー３においては、変異を持っている３人の家族員中２人が高尿酸血症を患っており、また罹患家族員の３人全員が腎不全を患っていた。
【００３４】
最近、研究の１つが、ＭＣＫＤ２を分離する大きなイタリア人ファミリーの候補遺伝子としてＵＭＯＤを除外してきたこと（Pirulli et al.,前述）を考えると、これらのデータは驚くべきものである。この研究はＵＭＯＤコード領域全体が配列決定されていることを報告したが、これは本研究で用いたプライマーセットと異なるもので行われた。エクソン４の配列における方法論的な差異によりこの異なる結果の説明がつくと考えられる。しかしながら、その他の可能性も考慮しなければならない。エクソン全体の欠失が野生型対立遺伝子のみのＰＣＲ増幅をもたらし、変異の存在を隠しているのかもしれない。Pirulliらは非コーディングエクソン１および２も、ＵＭＯＤの５’調節領域も解析していない。エクソン１、エクソン２または調節領域の変異がＵＭＯＤ生成の損失をもたらしている可能性がある（Salowsky et al., Gene, 293, 9-19 (2002); Flagiello, Mutations in brief no. 195. Online. Hum. Mutat., 12, 361 (1998)）。あるいは、遺伝的異質性が候補インターバルに位置する別の腎特異的遺伝子とともに存在しているのかもしれない。
【００３５】
本明細書中で引用された刊行物、特許出願、及び特許を含む全ての参考文献は、それぞれの参考文献が参照により、一つ一つ具体的に援用されることが示され、本明細書にその参考文献の全体が記述されているのと同程度まで、参照によって本明細書中に援用されるものとする。
【００３６】
本明細書に他に記述がないか又は文脈に明らかに矛盾していない限り、本発明を表す文脈における用語「a」、「an」、「the」および類似表現の使用は（特に請求の範囲中の文脈において）、単数および複数の両方を包含していると解釈されるものとする。他に注釈がなければ、用語「含有する（comprising）」、「有する（having）」、「含む（including）」、及び「含有する(containing)」は制限のない用語（つまり、「含むがそれに制限されない」という意味）として解釈されるものとする。本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書に他に記述がない限り、範囲内に含まれるそれぞれ個々の値を個別に言及する簡略な方法として働くことを単に意図されたもので、それぞれ個々の値は個別に本明細書中に記述されたものの如く本明細書中に包含される。本明細書中他に記述がないか、又は文脈に明らかに矛盾していない限り、本明細書中に記載した全ての方法は任意の適当な順序でも行われうる。本明細書中に提供された任意のまたは全ての実施例、又は例示的な言葉（例えば「〜のような（such as）」）の使用は、単に発明をより明快にするよう意図したものであり、他に主張がない限り、本発明の範囲に制限をもたらすようなものではない。明細書中のどの言葉も、未請求の要素を本発明の実施に必須であると示唆していると解釈されるべきではない。
【００３７】
本発明の好ましい実施態様を本明細書に記載し、それには本発明者らが知る本発明を実施するための最良の態様が含まれている。それらの好ましい実施態様の改変は、前述の説明を読むことによって当業者に明らかになるだろう。本発明者らは当業者がそのような改変を適切に使用することを予期し、さらに本発明がここに具体的に記載した以外の方法で実施されることを意図している。したがって本発明は、適用法で許可されている通り、ここに添付する特許請求の範囲において言及した主題の全ての改変物や等価物を含む。さらには、本明細書中に他に記述がないか、又は文脈に明らかに矛盾していない限り、上述の要素のいかなる組み合わせも、それらの全ての可能な改変において、本発明によって包含されている。  
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１−１】図１−１は調査したファミリーの家系図を表す。ファミリー１：３００人を超える個体が系統的に７世代にわたって同定された。この親族は全部含めるには多すぎるので、調査した核ファミリーをこのレポートでは示した。これらのファミリーは拡大した親族の異なる部分からのものであり、サブファミリーＡ、Ｂ、ＣおよびＤとして示す。さらに８人の独身者を調査した。罹患家族員における臨床所見はファミリー１におけるＦＪＨＮの臨床診断と一致する。ファミリー２：このファミリーにおける臨床所見はＦＪＨＮの臨床診断と一致する。ファミリー３：臨床所見および腎生検／解剖の報告はＭＣＫＤ２の臨床診断と一致した（Thompson et al., Arch. Intern. Med., 138, 1614-17 (1978)）。
【図１−２】図１−１の続き。
【図２】図２は染色体１６ｐ上のＦＪＨＮ／ＭＣＫＤ２候補部位の、物理的および遺伝的な統合マップを表す。遺伝子のＳＴＲＰマーカーおよびそれらの相対的位置を左に示す。顕著な連鎖結果を示した位置（ＬＯＤスコア＞３．０）が今回のレポートにおける２つのファミリー（ファミリー１およびファミリー２）において、並びに別の５つの調査（参考文献１〜５）において示された。９つの公知のＳＴＲＰおよび９つの新規なＳＴＲＰが同定され、位置特定され、また遺伝子型が特定された。２つの新規ＳＴＲＰの遺伝子座がＢＡＣ２３４９Ｂ８において同定された。これらの遺伝子座の位置（２３４９Ｂ８（１６）−２および２３４９Ｂ８（１６）−１）は図２に示すように５４，０００ｂｐ離れている。これらの順列を図３に示す。この領域で同定された遺伝子座を図の右側に示す。
【図３】図３は、ファミリー１およびファミリー２における、ＦＪＨＮ表現型により分離した染色体１６上の最小遺伝インターバルを示すハプロタイプの結果を表す。ＦＪＨＮ罹患個体を影付きの記号で示し、白丸および四角は非罹患家族員を示し、斜線は死亡した人を示す。遺伝子型が特定された遺伝子ＳＴＲＰ座を、それぞれのファミリーにつき左欄に位置的順列でリストする。疾患遺伝子座により分離したハプロタイプには影を付けている。ファミリー２の個体ＩＩ−５は非罹患であるが、インターバルＤ１６Ｓ４１２−Ｄ１６Ｓ３０４６のハプロタイプに関連した疾患を遺伝で受け継いでいる。これはこの領域がＦＪＨＮ疾患遺伝子座を含んでいないことを示している。四角で囲った部位は両方のファミリーにおけるＦＪＨＮにより分離した最小ハプロタイプ部位を示しており、これはＦＪＨＮ遺伝子が２３４９Ｂ８（１６）−２およびＤ１６Ｓ３０４６に隣接するインターバル中にあることを示している。
【図４】図４はヒトＵＭＯＤ遺伝子の構造を表す。Ａ．ＵＭＯＤ遺伝子のゲノム構成。エクソンとイントロンはそれぞれ縦四角および横線で示す。それぞれのイントロンのサイズはｂｐで示している。Ｂ．ＵＭＯＤ遺伝子のｃＤＮＡ構造。翻訳開始および終了のコドンはそれぞれＡＴＧおよびＴＧＡでラベルしている。５’および３’の未翻訳領域はグレーで影をつける。矢印は本調査で同定したミスセンス変異を示す。横棒は本調査で同定した欠失を示す。Ｃ．野生型ＵＭＯＤタンパク質の構造。開始Ｍｅｔ(initiation met)がアミノ酸１である。シグナルペプチドは黒い四角で示す。ＥＧＦ様ドメインは点線で示す。ＺＰドメインはグレーの四角で示す。８つの潜在グリコシル化部位はＹで示す。本調査で同定したミスセンス変異は矢印で示し、対応するアミノ酸をその下にリストする。９つのアミノ酸欠失は横棒で示す。追加の最近の予備データはさらなるエクソン（図４に表したもの以外のもの）が存在することを示唆している。
【図５】図５はＵＭＯＤ配列における変異のダイアグラムである。それぞれのパネルの上の配列は野生型配列を示している。下の配列は罹患個体からのものである。それぞれの変異の説明は、命名法ガイドラインにそって［ゲノム、ｃＤＮＡ、タンパク質］で表した。Ａ．ファミリー１における罹患個体は、アミノ酸１７７〜１８５のインフレーム欠失をもたらす２７ｂｐ欠失が異型接合であった。［g.1966_1992del; c529_555del; p.H177_R185del.］。Ｂ．ファミリー２における罹患個体は、保存的cysをtyrに変えるミスセンス変異が異型接合であった。［g.1880G＞A; c.443G＞A; p.C148Y］。ファミリー３における罹患個体は、glyをcysに変えるミスセンス変異が異型接合であった。［g.1744G＞T; c.307G＞T; p.G103C］。Ｄ．ファミリー４における罹患個体は、保存的cysをargに変えるミスセンス変異が異型接合であった。［g.2086T＞C; c.649T＞C; p.C217R］。
【図６】図６．ヒトＵＭＯＤ（GenBank登録番号：Ｍ17778）、ウシＵＭＯＤ（GenBank登録番号：Ｓ75958）、マウスＵＭＯＤ（GenBank登録番号：ＮＭ＿009470）、ラットＵＭＯＤ（GenBank登録番号：Ｍ63510）のアミノ酸配列のアラインメント。４８個のＣ残基全てが保存され、星印をつけて太文字で示されいる。矢印は本調査で同定したミスセンス変異の位置を示している。ファミリー１において欠失した９つのアミノ酸は太文字と下線で示している。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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