(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＮｏｇｏＡポリペプチドのヒトＮｏｇｏＡ＿６２３−６４０（配列番号６）に結合可能なキメラもしくはヒト化モノクローナル抗体もしくはそのＦ(ａｂ')２断片、一本鎖抗体、または単一ドメイン抗体であって、少なくとも1種の抗原結合部位を含み、該抗原結合部位が
順に、超可変領域ＣＤＲ１−１１Ｃ７(配列番号８)、ＣＤＲ２−１１Ｃ７(配列番号９)およびＣＤＲ３−１１Ｃ７(配列番号１０)； ならびに
順に、超可変領域ＣＤＲ１'−１１Ｃ７(配列番号１１)、ＣＤＲ２'−１１Ｃ７(配列番号１２)およびＣＤＲ３'−１１Ｃ７(配列番号１３)
を含む、上記抗体または上記断片。
【請求項２】
さらに、ヒト重鎖の定常部分およびヒト軽鎖の定常部分を含む、請求項１に記載の抗体または断片。
【請求項３】
ヒト重鎖の定常部分がγ４タイプであり、ヒト軽鎖の定常部分がκタイプである、請求項２に記載の抗体または断片。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか１項に記載の抗体または断片をコードするポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項４に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項６】
請求項４に記載のポリヌクレオチドまたは請求項５に記載のベクターを含む発現系であって、該発現系が適合性宿主細胞中に存在するとき、請求項１から３のいずれか１項に記載のポリペプチドを産生できる、発現系。
【請求項７】
請求項６に記載の発現系を含む、単離宿主細胞。
【請求項８】
医薬としての、請求項１から３のいずれか１項に記載の抗体または断片の使用。
【請求項９】
神経修復の処置用医薬の製造のための請求項１から３のいずれか１項に記載の抗体または断片の使用。
【請求項１０】
請求項１から３のいずれか１項に記載の抗体または断片と、少なくとも１種の薬学的に許容される担体もしくは希釈剤を含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ＮｏｇｏＡ結合分子、例えばモノクローナル抗体またはそのＦａｂフラグメントに関する。
【０００２】
成人の中枢神経系(ＣＮＳ)の傷害後の神経再生は、軸索を髄鞘に入れる阻害性ミエリン環境の存在および瘢痕組織の形成のために限定されている。最近の数年間で、なぜＣＮＳが傷害後に自発的に自己を修復できないかを分子的に理解するための重要な観察が得られている。ミエリンにおける阻害性分子は、特に傷害直後の軸索再生の主な障害物である。今のところ、ＮｏｇｏＡ、ミエリン結合糖タンパク質(ＭＡＧ)およびミエリン−オリゴデンドロサイト糖タンパク質(ＯＭｇｐ)が神経突起伸長の強力な阻害剤として特徴付けられている。加えて、ミエリンはまたコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのような他の阻害性成分も含む。Ｎｏｇｏ−Ａはreticulonタンパク質ファミリーのメンバーであり、少なくとも２つの、生物学的に活性で、薬理学的に区別される、アミノ−ＮｏｇｏおよびＮｏｇｏ−６６と名付けられたドメインを有する。前者のレセプター部位は現在までまだ判っていないが、Ｎｏｇｏ−６６はインビトロおよびインビボで神経レセプターＮｇＲを介して神経成長を阻害する。Ｎｏｇｏ−６６に加えて、ＭＡＧおよびＯＭｇｐもＮｇＲに高い親和性で結合し、神経突起伸長を阻害する。
【０００３】
神経修復を高めるために現在遂行されている可能性を有する新しい研究アプローチは、コンドロイチナーゼＡＢＣを使用した瘢痕組織の消化、嗅神経有髄細胞(Olfactory ensheathing cell)および幹細胞を使用した架橋技術ならびに神経成長を促進するためのタンパク質生長因子を含む。Ｒｈｏ、膜結合グアノシントリスホスファターゼ(ＧＴＰａｓｅ)のような細胞内シグナル伝達物質による神経突起伸長阻害剤の遮断作用が、軸索生長の阻害において重要な手懸かり（link）のように見える。環状アデノシンモノホスフェート(ｃＡＭＰ)はインビトロでミエリンが関与する阻害に勝つことができ、インビボで再生を誘導する。ＮｇＲレセプターのペプチドインヒビター(ＮＥＰ１−４０)を使用して、ラットにおける脊髄傷害後の神経再生および機能回復を誘導する。
【０００４】
上記のアプローチの使用に加えて、中枢および末梢神経系の神経突起増殖阻害性分子を中和するための、特にＮｏｇｏＡの神経突起増殖阻害活性を中和するための、あるモノクローナル抗体の使用に注目が集まってきている。故に、モノクローナル抗体ＩＮ−１またはそのＩＮ−１Ｆａｂフラグメントは、インビトロで神経突起伸長を誘導し、インビボで神経発芽および再生を増強する(Schwab ME et al. (1996) Physiol. Rev. 76, 319-370)。神経突起増殖阻害活性に関するＮｏｇｏＡの異なるドメインの試験で、分子中の数個の阻害性ドメインが描出されている(Chen et al. (2000) Nature 403, 434-439; GrandPre eta l. (2000) Nature 403, 439-444; Prinjha et al. (2000) Nature 403, 383-384；実施例１の詳細な分析も参照)。
【０００５】
天然免疫グロブリンまたは抗体は、一般に、各上腕の末端に抗原−結合部位を有する、Ｙ字形多重体(multimeric)分子を含む。その構造の残りの部分、特にＹの軸部分は、免疫グロブリンと関連するエフェクター機能を仲介する。抗体は２つの重鎖および２つの軽鎖から成る。重鎖および軽鎖の両方とも、可変ドメインおよび定常部分から成る。抗原結合部位は、軽鎖の可変ドメインと一緒になった重鎖の可変ドメインから成る。重鎖および軽鎖の可変ドメインは、同じ一般的構造を有する。より特に、抗体の抗原結合特性は、重鎖および軽鎖の可変ドメイン中の、超可変領域または相補性決定領域(ＣＤＲ)と呼ばれる３つの特異的領域により本質的に決定する。これらの３つの超可変領域は４つのフレームワーク領域(ＦＲ)と交互であり、ＦＲの配列は相対的に保存され、結合に直接関与しない。ＣＤＲはループを形成し、β−シート構造を主に採用するフレームワーク領域に非常に近接して保持されている。重鎖のＣＤＲは、結合している軽鎖のＣＤＲと共に抗体分子の抗原結合部位を本質的に構成する。何がＦＲまたはＣＤＲ領域を構成するかの決定は、通常同じ種に発生する多くの抗体のアミノ酸配列の比較により成される。ＣＤＲおよびＦＲ領域を同定するための一般的な原則は、当業者には一般的な知識であり、例えば、ウェブサイト(http://www.bioinf.org.uk/abs/)に見ることができる。
【０００６】
本発明により、ラットＮｏｇｏＡ(配列番号１)のおよびＩｇＧ１タイプのポリペプチドフラグメントに対して産生した新規モノクローナルマウス抗体(以後“１１Ｃ７”と呼ぶ)が、とりわけホモ・サピエンスを含む異なる種のＮｏｇｏＡに対する結合親和性の点でおよび特定の抗体濃度でのその高いＮｏｇｏＡ神経突起伸長中和活性の点で、先行のＮｏｇｏＡ抗体よりも優れていることが驚くべきことに判明した。さらに、該抗体と同じ超可変領域を有する他のＮｏｇｏＡ結合分子を構築することが本発明により可能となった。
【０００７】
したがって、本発明は、ＮｏｇｏＡの特定の領域またはエピトープに対する結合分子を提供する(以後“本発明の結合分子”または単に“結合分子”と呼ぶ)。好ましくは、本発明の結合分子は、ヒトＮｏｇｏＡ＿６２３−６４０(オーソロガスフラグメントであり、それに対して１１Ｃ７を産生した；＝配列番号６)、ヒトＮｉｇ−Ｄ２０(神経突起伸長阻害活性を有するＮｏｇｏＡのオーソロガスから最小フラグメント、配列番号２４)、ヒトＮｏｇｏＡ(配列番号５)またはヒトＮｉＧ(ＮｏｇｏＡの最も強力な神経突起伸長阻害性フラグメントであり、ヒトＮｏｇｏＡのアミノ酸１８６番から開始し、アミノ酸１００４番で終わる、＝配列番号５)に、解離定数(Ｋｄ)＜１０００nMで、より好ましくはＫｄ＜１００nMで、最も好ましくはＫｄ＜１０nMで結合する。本結合反応は、例えば、実施例６に記載のＥＬＩＳＡ法および実施例７に記載のバイオセンサー親和性法を含む標準試験(定性アッセイ)により示され得る。加えて、ヒトＮｏｇｏＡへの結合およびより重要な有効性は、例えば下記のような神経突起伸長アッセイにおいて示され得る。
【０００８】
故に、さらに好ましい態様において、結合分子(１mg／ml、より好ましくは０.１mg／ml、さらにより好ましくは０.０１mg／ml培養培地の濃度で)は、ラット脊髄タンパク質抽出物の支持体上のラット小脳顆粒細胞の神経突起数を、ヒトＮｏｇｏＡ、ヒトＮｉＧ、ヒトＮｉｇ−Ｄ２０またはＮｏｇｏＡ＿６２３−６４０ポリペプチドと結合しない(すなわち解離定数＞１０００nMを有する)コントロール抗体で処理したラット小脳顆粒細胞の神経突起と比較して、少なくとも２０％、好ましくは５０％、最も好ましくは１００％増加する。
【０００９】
さらに好ましい態様において、本発明の結合分子は、少なくとも１つの抗原結合部位を含み、該抗原結合部位は順に、超可変領域ＣＤＲ１−１１Ｃ７、ＣＤＲ２−１１Ｃ７およびＣＤＲ３−１１Ｃ７(該ＣＤＲ１−１１Ｃ７は配列番号８のアミノ酸配列を有し、該ＣＤＲ２−１１Ｃ７は配列番号９のアミノ酸配列を有し、そして該ＣＤＲ３−１１Ｃ７は配列番号１０のアミノ酸配列を有する)およびそれらの直接等価物を含む。
【００１０】
本発明のさらなる局面において、本発明の結合分子は少なくとも１つの抗原結合部位を含み、該抗原結合部位は
ａ)順に超可変領域ＣＤＲ１−１１Ｃ７、ＣＤＲ２−１１Ｃ７およびＣＤＲ３−１１Ｃ７(該ＣＤＲ１−１１Ｃ７は配列番号８のアミノ酸配列を有し、該ＣＤＲ２−１１Ｃ７は配列番号９のアミノ酸配列を有し、そして該ＣＤＲ３−１１Ｃ７は配列番号１０のアミノ酸配列を有する)；または
ｂ)順に超可変領域ＣＤＲ１'−１１Ｃ７、ＣＤＲ２'−１１Ｃ７およびＣＤＲ３'−１１Ｃ７(該ＣＤＲ１'−１１Ｃ７は配列番号１１のアミノ酸配列を有し、該ＣＤＲ２'−１１Ｃ７は配列番号１２のアミノ酸配列を有し、そして該ＣＤＲ３'−１１Ｃ７は配列番号１３のアミノ酸配列を有する)；または
ｃ)それらの直接等価物
のいずれかを含む。
【００１１】
本発明のさらなる局面において、本発明の結合分子は少なくとも
ａ)順に超可変領域ＣＤＲ１−１１Ｃ７、ＣＤＲ２−１１Ｃ７およびＣＤＲ３−１１Ｃ７を含む第一ドメイン(該ＣＤＲ１−１１Ｃ７は配列番号８のアミノ酸配列を有し、該ＣＤＲ２−１１Ｃ７は配列番号９のアミノ酸配列を有し、そして該ＣＤＲ３−１１Ｃ７は配列番号１０のアミノ酸配列を有する)；および
ｂ)順に超可変領域ＣＤＲ１'−１１Ｃ７、ＣＤＲ２'−１１Ｃ７およびＣＤＲ３'−１１Ｃ７を含む第二ドメイン(該ＣＤＲ１'−１１Ｃ７は配列番号１１のアミノ酸配列を有し、該ＣＤＲ２'−１１Ｃ７は配列番号１２のアミノ酸配列を有し、そして該ＣＤＲ３'−１１Ｃ７は配列番号１３のアミノ酸配列を有する)；または
ｃ)それらの直接等価物
を含む。
【００１２】
さらに、本発明はまた下記の本発明の結合分子を提供し、それは
ａ)１１Ｃ７の重鎖の可変部分(配列番号２)；または
ｂ)１１Ｃ７の軽鎖の可変部分(配列番号３)、またはそれらの直接等価物
のいずれかを含む、少なくとも１つの抗原結合部位を含む。
【００１３】
本抗原結合部位がこの第一および第二ドメインの両方を含むとき、これらは同じポリペプチド分子上に位置するか、好ましくは、各ドメインは異なる鎖上にあり得、第一ドメインが免疫グロブリン重鎖またはそのフラグメントの一部であり、そして第二ドメインが免疫グロブリン軽鎖またはそのフラグメントの一部であり得る。
【００１４】
本発明の結合分子の例は、Ｂ細胞により産生される抗体またはハイブリドーマおよびキメラまたはヒト化抗体またはそれらの任意のフラグメント、例えばＦ(ａｂ')２；およびＦａｂフラグメント、ならびに一本鎖または単一ドメイン抗体を含む。
【００１５】
一本鎖抗体は、通常１０から３０アミノ酸、好ましくは１５から２５アミノ酸から成るペプチドリンカーにより共有結合される、抗体重鎖および軽鎖の可変ドメインから成る。したがって、このような構造は重鎖および軽鎖の定常部分を含まず、小ペプチドスペーサーは全定常部分よりも少ない抗原性であると考えられている。“キメラ抗体”は、重鎖もしくは軽鎖のまたは両方の定常領域がヒト起源であるが、重鎖および軽鎖の両方の可変ドメインは非ヒト(例えばマウス)起源である、抗体を意味する。“ヒト化抗体”は、超可変領域(ＣＤＲ)が非ヒト(例えばマウス)起源のものであるが、免疫グロブリンの他の部分の全てまたは実質的に全て、例えば定常領域および可変ドメインの非常に保存性の部分、すなわちフレームワーク領域がヒト起源である、抗体を意味する。ヒト化抗体は、しかしながら、超可変領域に隣接したフレームワーク領域の一部に数個のマウス配列のアミノ酸を保持し得る。
【００１６】
超可変領域は、好ましくはマウスまたはヒト起源の、任意の種類のフレームワーク領域と結合し得る。適当なフレームワーク領域は、“Sequences of proteins of immunological interest”, Kabat E.A. et al, US department of health and human services, Public health service, National Institute of Healthに記載されている。好ましくは、本結合分子のヒト重鎖の定常部分は、ＩｇＧ４タイプ(サブタイプを含む)であり得、好ましくはヒト軽鎖の定常部分はκまたはλタイプ、より好ましくはκタイプであり得る。
【００１７】
全てのヒトに自然に見られるタンパク質に対して産生したモノクローナル抗体は、非−ヒト系、例えばマウスにおいて発現し得る。この直接の結果として、ハイブリドーマとして産生した異種抗体は、ヒトに投与したとき、望ましくない免疫応答を誘発し、これは主に異種免疫グロブリンの定常部分により仲介される。これは、このような抗体の使用を、それらが長期間にわたり投与できないため、明らかに限定する。したがって、ヒトに投与したときに実質的にアロジェニック応答を誘発しそうにない一本鎖、単一ドメイン、キメラまたはヒト化抗体を使用することが特に好ましい。
【００１８】
前記の観点から、より好ましい本発明の結合分子はキメラ抗体から選択され、それは少なくとも
ａ)(ｉ)順に超可変領域ＣＤＲ１−１１Ｃ７、ＣＤＲ２−１１Ｃ７およびＣＤＲ３−１１Ｃ７を含む可変ドメインおよび(ii)ヒト重鎖の定常部分またはそのフラグメントを含む一つの免疫グロブリン重鎖またはそのフラグメント(該ＣＤＲ１−１１Ｃ７は配列番号８のアミノ酸配列を有し、該ＣＤＲ２−１１Ｃ７は配列番号９のアミノ酸配列を有し、そして該ＣＤＲ３−１１Ｃ７は配列番号１０のアミノ酸配列を有する)、および
ｂ)(ｉ)順に超可変領域ＣＤＲ１'−１１Ｃ７、ＣＤＲ２'−１１Ｃ７およびＣＤＲ３'−１１Ｃ７を含む可変ドメインおよび(ii)ヒト軽鎖の定常部分またはそのフラグメントを含む一つの免疫グロブリン軽鎖またはそのフラグメント(該ＣＤＲ１'−１１Ｃ７は配列番号１１のアミノ酸配列を有し、該ＣＤＲ２'−１１Ｃ７は配列番号１２のアミノ酸配列を有し、そして該ＣＤＲ３'−１１Ｃ７は配列番号１３のアミノ酸配列を有する)；または
それらの直接等価物
を含む。
【００１９】
あるいは、本発明の結合分子は一本鎖結合分子から選択され、それは
ａ)順に超可変ＣＤＲ１−１１Ｃ７、ＣＤＲ２−１１Ｃ７およびＣＤＲ３−１１Ｃ７を含む第一ドメイン(該ＣＤＲ１−１１Ｃ７は配列番号８のアミノ酸配列を有し、該ＣＤＲ２−１１Ｃ７は配列番号９のアミノ酸配列を有し、そして該ＣＤＲ３−１１Ｃ７は配列番号１０のアミノ酸配列を有する)；および
ｂ)順に超可変ＣＤＲ１'−１１Ｃ７、ＣＤＲ２'−１１Ｃ７およびＣＤＲ３'−１１Ｃ７を含む第二ドメイン(該ＣＤＲ１'−１１Ｃ７は配列番号１１のアミノ酸配列を有し、該ＣＤＲ２'−１１Ｃ７は配列番号１２のアミノ酸配列を有し、そして該ＣＤＲ３'−１１Ｃ７は配列番号１３のアミノ酸配列を有する)；および
ｃ)第一ドメインのＮ−末端と第二ドメインのＣ−末端、または、第一ドメインのＣ−末端と第二ドメインのＮ−末端のいずれかに結合するペプチドリンカー；
またはそれらの直接等価物
を含む、抗原結合部位を含む。
【００２０】
既知のように、１個または数個のアミノ酸の欠失、付加または置換のようなアミノ酸配列の小さな変化は、元のタンパク質の対立形質をもたらし得、それは実質的に同じ特性を有する。故に、“それらの直接等価物”なる用語は、
(ｉ)結合分子の超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の各々が、ＣＤＲ１−１１Ｃ７(配列番号８)、ＣＤＲ２−１１Ｃ７(配列番号９)およびＣＤＲ３−１１Ｃ７(配列番号１０)の等価超可変領域に少なくとも５０％または８０％相同、好ましくは少なくとも９０％相同、より好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同であり、ここで、ＣＤＲ１はＣＤＲ１−１１Ｃ７と等価であり、ＣＤＲ２はＣＤＲ２−１１Ｃ７と等価であり、ＣＤＲ３はＣＤＲ３−１１Ｃ７と等価である；および
(ii)ヒトＮｏｇｏＡ、ヒトＮｉＧ、ヒトＮｉＧ−Ｄ２０またはヒトＮｏｇｏＡ＿６２３−６４０と、好ましくは解離定数(Ｋｄ)＜１０００nMで、より好ましくはＫｄ＜１００nMで、最も好ましくはＫｄ＜１０nMで結合できる
本発明の任意の単一ドメイン結合分子(分子Ｘ)、または
(iii)超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＣＤＲ１'、ＣＤＲ２'およびＣＤＲ３'の各々が、ＣＤＲ１−１１Ｃ７(配列番号８)、ＣＤＲ２−１１Ｃ７(配列番号９)、ＣＤＲ３−１１Ｃ７(配列番号１０)、ＣＤＲ１'−１１Ｃ７(配列番号１１)、ＣＤＲ２'−１１Ｃ７(配列番号１２)およびＣＤＲ３'−１１Ｃ７(配列番号１３)の等価超可変領域と少なくとも５０％または８０％相同、好ましくは少なくとも９０％相同、より好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であり、ここで、ＣＤＲ１はＣＤＲ１−１１Ｃ７と等価であり、ＣＤＲ２はＣＤＲ２−１１Ｃ７と等価であり、ＣＤＲ３はＣＤＲ３−１１Ｃ７と等価であり、ＣＤＲ１'はＣＤＲ１'−１１Ｃ７と等価であり、ＣＤＲ２'はＣＤＲ２'−１１Ｃ７と等価であり、ＣＤＲ３'はＣＤＲ３'−１１Ｃ７と等価である；および
(iv)ヒトＮｏｇｏＡ、ヒトＮｉＧ、ヒトＮｉＧ−Ｄ２０またはヒトＮｏｇｏＡ＿６２３−６４０を、好ましくは解離定数(Ｋｄ)＜１０００nMで、より好ましくはＫｄ＜１００nMで、最も好ましくはＫｄ＜１０nMで結合できる、
結合部位あたり少なくとも２つのドメインを有する任意の本発明の結合分子(分子Ｘ')のいずれかを意味する。
【００２１】
故に本発明のさらなる態様は、例えばヒトＮｏｇｏＡ、ヒトＮｉＧ、ヒトＮｉＧ−Ｄ２０またはヒトＮｏｇｏＡ＿６２３−６４０に解離定数＜１０００nMで結合でき、かつ、少なくとも１つの抗原結合部位を含み、該抗原結合部位が
・順に超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３(その中で各超可変領域はそれらの等価超可変領域ＣＤＲ１−１１Ｃ７(配列番号８)、ＣＤＲ２−１１Ｃ７(配列番号９)およびＣＤＲ３−１１Ｃ７(配列番号１０)と少なくとも５０％、好ましくは８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同である)；または
・順に超可変領域ＣＤＲ１'、ＣＤＲ２'およびＣＤＲ３'(その中で各超可変領域はそれらの等価超可変領域ＣＤＲ１'−１１Ｃ７(配列番号１１)、ＣＤＲ２'−１１Ｃ７(配列番号１２)およびＣＤＲ３'−１１Ｃ７(配列番号１３)と少なくとも５０％、好ましくは８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同である)
のいずれかを含む、結合分子である。
【００２２】
さらに、ヒトＮｏｇｏＡ、ヒトＮｉＧ、ヒトＮｉＧ−Ｄ２０またはヒトＮｏｇｏＡ＿６２３−６４０と解離定数＜１０００nMで結合でき、かつ
・順に超可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む第一抗原結合部位(その中で各超可変領域はそれらの等価超可変領域ＣＤＲ１−１１Ｃ７(配列番号８)、ＣＤＲ２−１１Ｃ７(配列番号９)およびＣＤＲ３−１１Ｃ７(配列番号１０)と少なくとも５０％、好ましくは８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同である)；および
・順に超可変領域ＣＤＲ１'、ＣＤＲ２'およびＣＤＲ３'を含む第二抗原結合部位(その中で各超可変領域はそれらの等価超可変領域ＣＤＲ１'−１１Ｃ７(配列番号１１)、ＣＤＲ２'−１１Ｃ７(配列番号１２)およびＣＤＲ３'−１１Ｃ７(配列番号１３)と少なくとも５０％、好ましくは８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同である)
結合分子。
【００２３】
この解離定数は、例えば、実施例７に記載のバイオセンサー親和性法を含む、種々のアッセイで簡便には試験し得る。加えて、結合分子の結合および機能的効果を、例えば下記のようなバイオアッセイにおいて示し得る。
【００２４】
ヒト重鎖の定常部分は、γ１；γ２；γ３；γ４；α１；α２；δまたはεタイプ、好ましくはγタイプ、より好ましくはγ４；タイプであり得、一方ヒト軽鎖の定常部分はκまたはλタイプ(λ１；λ２；およびλ３サブタイプを含む)であり得るが、好ましくはκタイプである。これら全ての定常部分のアミノ酸配列は、Kabat et al(前掲)に記載されている。
【００２５】
本発明の結合分子の接合体、例えば酵素または毒素または放射性同位体接合体も本発明の範囲内に包含される。
【００２６】
“ポリペプチド”は、本明細書で他に明記していない限り、互いにペプチド結合により結合しているアミノ酸を含み、Ｎ−末端から始まり、Ｃ−末端で終わるアミノ酸配列を有する任意のペプチドまたはタンパク質を含む。好ましくは本発明のポリペプチドはモノクローナル抗体、より好ましくはキメラ(Ｖ−グラフテッドとも呼ぶ)またはヒト化(ＣＤＲ−グラフテッドとも呼ぶ)モノクローナル抗体である。ヒト化(ＣＤＲ−グラフテッド)モノクローナル抗体は、アクセプター抗体のフレームワーク(ＦＲ)配列中にさらなる変異を含み得、または含み得ない。
【００２７】
本明細書で使用するポリペプチドの機能的誘導体は、本発明のポリペプチドと共通した質的生物学的活性を有する、すなわちヒトＮｏｇｏＡ、ヒトＮｉＧ、ヒトＮｉＧ−Ｄ２０またはヒトＮｏｇｏＡ＿６２３−６４０と結合する能力を有する分子を含む。機能的誘導体は、本発明のポリペプチドのフラグメントおよびペプチドアナログを含む。フラグメントは、例えば特記した配列の本発明のポリペプチドの配列内の領域を含む。“誘導体”なる用語は、アミノ酸配列変異体、および、例えば特記した配列の、本発明のポリペプチドの、共有結合的修飾を定義するために使用する。例えば軽鎖および重鎖の超可変領域の、例えば特記した配列の、本発明のポリペプチドの機能的誘導体は、好ましくは、例えば特記した配列の、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも約６５％、より好ましくは少なくとも約７５％、さらにより好ましくは少なくとも約８５％、最も好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の全体的配列相同性を有し、かつ、ヒトＮｏｇｏＡ、ヒトＮｉＧ、ヒトＮｉＧ−Ｄ２０またはヒトＮｏｇｏＡ＿６２３−６４０に結合する能力を実質的に保持する。
【００２８】
“共有結合的修飾”なる用語は、例えば特記した配列の、本発明のポリペプチド；またはそのフラグメントの、有機タンパク質性または非タンパク質性誘導化剤での修飾、異種ポリペプチド配列への融合および翻訳後修飾を含む。例えば特記した配列の、共有結合的に修飾されたポリペプチドは、ヒトＮｏｇｏＡ、ヒトＮｉＧ、ヒトＮｉＧ−Ｄ２０またはヒトＮｏｇｏＡ＿６２３−６４０に架橋により結合する能力をまだ有する。共有結合的修飾は、標的アミノ酸残基と、選択した側または末端アミノ酸と反応できる有機誘導化剤を反応させることにより、または、選択した組み換え宿主細胞で機能する翻訳後修飾の機構を利用することにより、伝統的に挿入される。ある翻訳後修飾は、発現したポリペプチドに対する組み換え宿主細胞の作用の結果である。グルタミニルおよびアスパラギニル残基は、対応するグルタミルおよびアスパルチル残基に頻繁に翻訳後脱アミド化される。あるいは、これらの残基は、緩和な酸性条件下で脱アミド化される。他の翻訳後修飾は、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリル、チロシンまたはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニンおよびヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化を含み、例えばT. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86(1983)参照。共有結合的修飾は、例えば特記した配列の、本発明のポリペプチドおよびそのアミノ酸配列変異体を含む、例えば、イムノアドヘシンのような融合タンパク質、および異種シグナル配列へのＮ−末端融合を含む。
【００２９】
天然ポリペプチドおよびその機能的誘導体に関する“相同性”は、本明細書では、
最大相同性パーセントを達成するように、必要であれば、配列を整列し、ギャップを挿入した後の、対応する天然ポリペプチドの残基と同一である候補配列におけるアミノ酸残基の割合として定義し、配列同一性の一部としていかなる保存的置換も考慮しない。Ｎ−またはＣ−末端伸長も挿入も、同一性または相同性を減少させるものと解釈すべきではない。アラインメントのための方法およびコンピュータープログラムは既知である。
【００３０】
“アミノ酸”は、全ての自然に存在するＬ−α−アミノ酸を言及し、例えばＤ−アミノ酸を含む。アミノ酸は、既知の一文字表記または三文字表記により同定する。
【００３１】
“アミノ酸配列変異体”なる用語は、例えば特記した配列の、本発明のポリペプチドと比較して、アミノ酸配列が幾分変化している分子を言及する。例えば特記した配列の、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列変異体は、またヒトＮｏｇｏＡまたはヒトＮｉＧまたはより好ましくはＮｏｇｏＡ＿６２３−６４０と結合する能力をまだ有する。置換型変異体は、例えば特記した配列の、本発明のポリペプチドにおける同じ位置で、少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、異なるアミノ酸がその代わりに挿入されているものである。これらの置換は、分子中のただ一つのアミノ酸が置換されている一置換、または、同じ分子中の２つまたはそれ以上のアミノ酸が置換されている多置換であり得る。挿入型変異体は、一つまたはそれ以上のアミノ酸が、例えば特記した配列の、本発明のポリペプチドにおける特定の位置のアミノ酸に直ぐに隣接して挿入されているものである。「アミノ酸に直ぐに隣接している」は、アミノ酸のα−カルボキシまたはα−アミノ官能基のいずれかに接続していることを意味する。欠失型変異体は、例えば特記した配列の、本発明のポリペプチドにおける一つまたはそれ以上のアミノ酸が除去されているものである。普通は、欠失型変異体は、分子の特定領域に、一つまたは二つのアミノ酸欠失を有する。
【００３２】
本発明の結合分子は、組み換えＤＮＡ技術により製造し得る。この観点から、結合分子をコードする一つまたはそれ以上のＤＮＡ分子を構築し、適当な制御配列下に置き、発現のための適当な宿主生物に移さなければならない。
【００３３】
非常に一般的な方法において、したがって
(ｉ)本発明の単一ドメイン結合分子、本発明の一本鎖結合分子、本発明の結合分子の重鎖または軽鎖もしくはそれらのフラグメントをコードするＤＮＡ分子；および
(ii)組み換え手段により本発明の結合分子を製造するための本発明のＤＮＡ分子使用
が提供される。
【００３４】
現在の最先端は、技術者が本明細書に提供した情報、すなわち、超可変領域のアミノ酸配列およびそれらをコードするためのＤＮＡ配列を元に本発明のＤＮＡ分子を合成できるものである。可変ドメイン遺伝子を構築するための方法は、例えばＥＰ２３９４００に記載され、以下のように簡単に要約できる：どんな特異性のモノクローナル抗体の可変ドメインをコードする遺伝子でもクローン化する。フレームワークおよび超可変領域をコードするＤＮＡセグメントを決定し、超可変領域をコードするＤＮＡセグメントを除去して、フレームワーク領域をコードするＤＮＡセグメントを、接合点で適当な制限部位と融合させるようにする。制限部位は、標準法によるＤＮＡ分子の変異誘発により適当な位置に産生し得る。二本鎖合成ＣＤＲカセットを、上記のＣＤＲ１−１１Ｃ７、ＣＤＲ２−１１Ｃ７、ＣＤＲ３−１１Ｃ７、ＣＤＲ１'−１１Ｃ７、ＣＤＲ２'−１１Ｃ７およびＣＤＲ３'−１１Ｃ７配列にしたがったＤＮＡ合成により製造する。これらのカセットは粘着末端を備え、免疫グロブリン可変ドメインをコードするＤＮＡ分子を達成するための標準プロトコールにより、それらを接合点でフレームワークとライゲートできる。
【００３５】
さらに、本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡ構築物を得るために、産生ハイブリドーマ細胞系からのｍＲＮＡを入手する必要はない。故にＰＣＴ出願ＷＯ９０／０７８６１は、遺伝子のヌクレオチド配列に関する記載の情報のみに基づき、組み換えＤＮＡ技術によりモノクローナル抗体を産生するための完全な教示を提供する。
【００３６】
この方法は、所望のＤＮＡ配列を得るための多くのオリゴヌクレオチドの合成、それらのＰＣＲ法による増幅、およびそれらのスプライシングを含む。
【００３７】
適当なプロモーターまたは重鎖および軽鎖定常部分をコードする遺伝子を含む発現ベクターは、公に入手できる。故に、本発明のＤＮＡ分子をいったん製造すれば、それを適当な発現ベクターに簡便に導入し得る。
【００３８】
一本鎖抗体をコードするＤＮＡ分子も、標準法により、例えば、ＷＯ８８／１６４９に記載のように製造し得る。
【００３９】
本発明の特定の態様において、いくつかの本発明の結合分子を製造するための組み換え手段は、下記のような第一および第二ＤＮＡ構築物を含む：
本第一ＤＮＡ構築物は重鎖またはそのフラグメントをコードし、かつ、
ａ)フレームワークおよび超可変領域を交互に含み、該超可変領域が順にＤＮＡ−ＣＤＲ１−１１Ｃ７(配列番号１５)、ＤＮＡ−ＣＤＲ２−１１Ｃ７(配列番号１６)およびＤＮＡ−ＣＤＲ３−１１Ｃ７(配列番号１７)を含む可変ドメインをコードする第一部分；この第一部分は可変ドメインの最初のアミノ酸をコードするコドンで開始し、可変ドメインの最後のアミノ酸をコードするコドンで終わる、そして
ｂ)重鎖の定常部分の最初のアミノ酸をコードするコドンで開始し、定常部分またはそのフラグメントの最後のアミノ酸をコードするコドンで終わり、非センスコドンに続く重鎖定常部分またはそのフラグメントをコードする第二部分
を含む。
【００４０】
好ましくは、第二部分はヒト重鎖の定常部分、より好ましくはヒトγ４鎖の定常部分をコードする。この第二部分はゲノム起源のＤＮＡフラグメント(イントロンを含む)またはｃＤＮＡフラグメント(イントロン無し)であり得る。
【００４１】
本第二ＤＮＡ構築物は軽鎖またはそのフラグメントをコードし、かつ、
ａ)フレームワークおよび超可変領域を交互に含む可変ドメインをコードする第一部分；該超可変領域は順にＤＮＡ−ＣＤＲ１'−１１Ｃ７(配列番号１７)、ＤＮＡ−ＣＤＲ２'−１１Ｃ７(配列番号１８)およびＤＮＡ−ＣＤＲ３'−１１Ｃ７(配列番号１９)を含み、この第一部分は可変ドメインの最初のアミノ酸をコードするコドンで開始し、可変ドメインの最後のアミノ酸をコードするコドンで終わる、そして、
ｂ)軽鎖の定常部分の最初のアミノ酸をコードするコドンで開始し、定常部分またはそのフラグメントの最後のアミノ酸をコードするコドンで終わり、非センスコドンに続く軽鎖定常部分またはそのフラグメントをコードする第二部分
を含む。
【００４２】
好ましくは、第二部分はヒト軽鎖の定常部分、より好ましくはヒトκ鎖の定常部分をコードする。
【００４３】
この第一または第二ＤＮＡ構築物は、有利には第一部分の上流に位置し、リーダーペプチドの部分をコードする第三部分を含む；この第三部分は、リーダーペプチドの最初のアミノ酸をコードするコドンで開始し、最後のアミノ酸で終わる。このペプチドは、それを発現する宿主生物に鎖を分泌させ、続いて宿主生物から取り出すために必要である。好ましくは、第一ＤＮＡの第三部分は、配列番号２１に示すような重鎖リーダー配列のアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を有するリーダーペプチドをコードする(−１９位のアミノ酸で開始し、−１位のアミノ酸で終わる)。また好ましくは、第二ＤＮＡ構築物の第三部分は、配列番号２３に示すようなアミノ酸配列を有するリーダーペプチドをコードする(軽鎖、−１８位のアミノ酸で開始し、−１位のアミノ酸で終わる)。
【００４４】
このＤＮＡ構築物の各々を、適当な制御配列下、特に適当なプロモーターの制御下に置く。任意の種類のプロモーターを使用できるが、ただし、ＤＮＡ構築物が発現のために導入されるであろう宿主生物と適合していなければならない。しかしながら、発現が哺乳類細胞で行われるとき、特に免疫グロブリン遺伝子のプロモーターを使用することが好ましい。
【００４５】
所望の抗体は細胞培養またはトランスジェニック動物において製造し得る。適当なトランスジェニック動物は、卵に適当な制御配列下に置かれた第一および第二ＤＮＡ構築物をマイクロインジェクションし、このようにして製造した卵を適当な疑似妊娠雌に移植し、所望の抗体を発現する子孫を選択することを含む、標準法にしたがい得ることができる。
【００４６】
本抗体鎖を細胞培養で製造しなければならないとき、本ＤＮＡ構築物を一つの発現ベクターに、または併存し得る(compatible)２個の発現ベクターのいずれかに最初に挿入しなければならず、後者が好ましい可能性がある。
【００４７】
したがって、本発明はまた上記のＤＮＡ構築物の少なくとも１つを含む、原核または真核細胞系において複製可能な発現ベクターを提供する。
【００４８】
ＤＮＡ構築物を含む各発現ベクターを次いで適当な宿主生物に導入する。ＤＮＡ構築物を２つの発現ベクターに別々に挿入するとき、それらは別々に、すなわち細胞あたり一つのタイプのベクターに導入するか、または同時導入することができ、後者が好ましい可能性がある。適当な宿主生物は細菌、酵母または哺乳類細胞系が可能であり、この後者が好ましい。より好ましくは、本哺乳類細胞系はリンパ起源、例えば骨髄腫、ハイブリドーマまたは正常不死化Ｂ細胞であるが、任意の内因性抗体重鎖または軽鎖を発現しない。
【００４９】
宿主生物が細胞あたり多数のベクターのコピー数を含むことも好ましい。宿主生物が哺乳類細胞系であるならば、この所望の目的は標準法にしたがったコピー数の増幅により到達できる。増幅法は通常薬剤に対する増加した耐性の選択を含み、該耐性は発現ベクターによりコードされる。
【００５０】
本発明の他の局面において、(ｉ)本発明の第一および第二ＤＮＡ構築物を導入された生物を培養し、そして(ii)活性の本発明の結合分子を培養から回収することを含む、本発明の多鎖結合分子の製造法を提供する。
【００５１】
別法として、重鎖および軽鎖を別々に回収し、インビトロ再折りたたみの後、活性の結合分子に再構築することが可能である。再構築法は当分野で既知である；方法の例は、特にＥＰ１２０６７４またはＥＰ１２５０２３に提供されている。
【００５２】
したがって、方法はまた
(ｉ)本発明の第一ＤＮＡ構築物を導入された第一生物を培養し、その培養から該重鎖またはそのフラグメントを回収し、そして
(ii)本発明の第二ＤＮＡ構築物を導入された第二生物を培養し、その培養から軽鎖またはそのフラグメントを回収し、そして
(iii)(ｉ)で得た重鎖またはそのフラグメントと(ii)で得た軽鎖またはそのフラグメントから、インビトロで活性の本発明の結合分子を再構築する
ことを含み得る。
【００５３】
同様の様式で、
(ｉ)本発明の一本鎖または単一ドメイン結合分子を各々コードするＤＮＡ構築物を導入された生物を培養し、そして
(ii)該分子を培養から回収する
ことを含む、本発明の一本鎖または単一ドメイン結合分子の製造法も提供する。
【００５４】
本発明の結合分子は、例えば、顆粒細胞神経突起伸長モデルで示されるような非常に優れた神経修復活性を有する。
【００５５】
１. 顆粒細胞神経突起伸長アッセイ(インビトロ)
分離した小脳顆粒細胞からの神経突起伸長を記載のように測定する(Niederoest et al. (1999)J.Neurosci. 19: 8979-8989)。簡単に言えば、断頭した生後５−７日のラットから小脳を摘出し、トリプシン処理により分離する。繊維芽細胞混入を減らすために、この細胞を細菌皿で予備培養する。ウェルあたり７５,０００細胞を次いで４−ウェルGreiner組織培養(Huber & Co AG, Rheinach, Basel)皿(ウェル表面：１cm２)中の培地(B27 serum replacement添加Neurobasal、Invitrogen)中で培養する。培養皿をポリ−Ｌ−リジン(Sigma)でコートする。成熟ラットの全脊髄ホモジネートからのChaps抽出タンパク質(Spillmann et al. (1998)J. Biol. Chem. 273:19283-19293)で、０.５から８μg／ウェルまでのタンパク質濃度で一晩４℃でコートし、洗浄する。本発明の結合分子を次いで３０分試験基質上でプレインキュベートし、細胞を添加する前に除去する。小脳顆粒細胞を添加し、２４時間インキュベートする。実験を停止するために、２mlの４％緩衝化ホルムアルデヒドをゆっくり培養皿に添加する。次いで、培養物を、増殖関連タンパク質ＧＡＰ−４３については免疫蛍光法で、細胞核に関してはHoechstで染色する(顆粒細胞は、全ての細胞が神経突起を有するかどうかを見るためにHoechstで染色する(神経突起は抗−ＧＡＰ−４３で可視化する))。三枚の写真を、Zeiss Axiophot Fluorescence Microscopeの４０倍対物レンズを用いて、各ウェルの上部、底部および側面の端を定めた距離から無作為に撮る。視野中の全ての神経突起を、番号を振った無作為に配置した写真上で計数する。反応(顆粒細胞神経突起の伸長)は、約０.１−１０μg総タンパク質／ウェルの範囲で用量依存性である(一定濃度の調製物の特異活性はこの範囲内で変化する)。
【００５６】
本発明の結合分子とのプレインキュベーションによる、上記のように製造した脊髄抽出物の非許容環境中の小脳顆粒細胞の神経突起伸長を観察し得る。例えば、顆粒細胞神経突起伸長モデルにおけるマウス１１Ｃ７−ＩｇＧ１抗体の中和効果のための典型的プロフィールを下記に示す：
【表１】
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【００５７】
本発明の分子の中和活性をまた下記のようにインビボ脊髄損傷モデルで、再生する発芽および神経突起伸長の測定により評価し得る：
【００５８】
２. 脊髄損傷モデル(インビボ)
成熟Lewisラットを、顕微鏡手術で、第八胸椎の位置で、脊髄の両側の背面側半分を離断することにより傷害する。椎弓切除術、麻酔および手術はSchnell and Schwab 1993(Eur.J. Neurosci. 5:1156-1171)に記載されている。コントロールまたは本発明の結合分子を２つの異なる方法：１０６の新たに回収したハイブリドーマ細胞を大脳皮質の片側にインプラントすることにより(移植動物)、または、別法として皮下にインプラントした２ml  Alzet(Alza Corporation, Palo Alto)ポンプに接続したインプラントした脳室内カニューレ(ポンプ動物)のいずれかにより適用する。−ハイブリドーマ移植動物：ラットをシクロスポリンＡで７−１０日免疫抑制し、損傷１４日後に４％緩衝化ホルマリンの経心腔的潅流(transcardial perfusion)により殺す。−ポンプ動物：本発明の結合分子(例えばマウス１１Ｃ７に関して３.３mg／ml)を、２週間、側脳室に０.５μl／時間で輸送する２mlポンプに入れる。ポンプを脊髄損傷時にインプラントし、ラットを２週間後に殺す。
【００５９】
神経解剖学的追跡：運動および感覚皮質脊髄路(ＣＳＴ)を、順行性トレーサービオチンデキストランアミン(ＢＤＡ)を、皮質のポンプまたは移植片の逆側に注射することにより追跡する。ＢＤＡを、Broesamle et al., (2000 J.Neurosci. 20:8061-8068)が記載のように、１０−１４日以内に脊髄に輸送し、基質としてジアミノベンジジン(ＤＡＢ)を使用して可視化する。
【００６０】
解剖学的結果の評価：２つの評価法を使用する：半定量的方法と定量的方法である。発芽および再生の強度の半定量的評価：番号付けした無作為に混ぜた動物の完全な矢状切断シリーズを、以下の定義を使用して損傷の吻側の発芽の再生の存在および密度を評価する：再生する発芽は、離断ＣＳＴから出てくる繊維である；それらは長く、そのコースは異常であり、正常灰白質側枝よりも分枝が少なく、損傷の周りを腹側または横に向かって生長する。再生する発芽はしばしば小さく球根状であり得るか、大きく分枝し得る、成長円錐で終わる。発芽の密度は各動物あたり０−３のスケールで評価する。−長距離の再生：損傷部から尾部脊髄までを貫通できる繊維を、長距離を再生した繊維と見なす。それらの損傷部からの最大距離を測定できるが、小腹側索ＣＳＴからのいくつかの非損傷繊維がしばしば存在するため、最小の距離であることがしばしばである；それらの分枝は再生している軸索のものと混ざり、区別が困難である。
【００６１】
繊維計数(定量的アッセイ)：離断したＣＳＴの末端の−０.５mm吻側に位置する線を灰白質の別のセクション上に置き、ＣＳＴ繊維との全ての交差(正常側枝または発芽)を計数する。同様の線を損傷部中心から＋０.５、＋２および＋５mmの距離の尾側に引く。交差する繊維を計数し、３つのレベルを加算して、尾側脊髄におけるＣＳＴ繊維を反映させる。これらの尾側繊維を、ＣＳＴ末端に−０.５mm吻側の繊維の数で割り、比率を得る。
【００６２】
脊髄損傷２週間後、両方の主ＣＳＴを含む約４０％の脊髄Ｔ８部分を、主に背面側半分を破壊する：コントロール動物におけるＣＳＴ追跡は、この路中の中程度の反応性発芽を示す。この現象は、文献で既知の損傷に応答した自発的発芽である。本発明の結合分子で、または本発明の結合分子をポンプ輸送することにより処置した損傷ラットは、損傷部の増進された発芽および傷害された神経突起の傷害された神経突起伸長の再生を示し得る。
【００６３】
したがって、本発明はまた
(ｉ)哺乳類神経系、特にヒト神経系の神経修復における、本発明の結合分子の使用、
(ii)哺乳類神経系、特にヒト神経系を修復する方法であり、このような処置を必要とする患者に有効量の本発明の結合分子を投与することを含む方法、または
(iii)本発明の結合分子および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む、哺乳類神経系、特にヒト神経系の神経修復のための医薬組成物
を提供する。
【００６４】
特に、本発明の結合分子は、繊維損傷の軸索再生および発芽の改善に有用である。故に、本発明の分子は、特にヒト対象において広い有用性を有する。例えば、本発明の結合分子は末梢(ＰＮＳ)および中枢(ＣＮＳ)神経系の種々の疾患、すなわちより特にはアルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症(ＡＬＳ)、レヴィ様病理または他の一般的痴呆、頭、脳または脊髄外傷後の疾患、卒中または脱髄疾患のような神経変性疾患の処置に有用である。このような脱髄疾患は、多発性硬化症、一相性脱髄、脳脊髄炎、多病巣性白質脳障害、汎脳炎、Marchiafava-Bignami病、橋髄鞘崩壊(pontine myelmolysis)、副腎白質ジストロフィー、Pelizaeus-Merzbacher病、海綿状変性、アレキサンダー病、カナバン病、異染性白質委縮症およびクラッベ病を含むがこれらに限定されない疾患の処置に有用である。一つの例において、本発明の結合分子の投与を、ＮｏｇｏＡタンパク質に関連する脱髄疾患の処置に使用できる。他の例において、本発明の結合分子を発現する細胞を脊髄損傷部位に移植し、損傷部位の軸索生長を促進し得る。このような移植細胞は損傷または外傷後の脊髄機能回復の手段を提供するであろう。このような細胞は、胎児神経または組織移植片の異なる系統の嗅神経有髄細胞および幹細胞を含み得る。
【００６５】
加えて、本発明の結合分子は、変性眼疾患の処置に有用であり、この変性眼疾患は直接または間接的に網膜または角膜細胞の変性を含み、一般的な虚血性網膜症、前部虚血性視神経障害、視神経炎の全ての形、加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症、類嚢胞黄斑浮腫(ＣＭＥ)、網膜色素変性症、シュタルガルト病、ベスト卵黄様網膜変性(Best's vitelliform retinal degeneration)、レーバー先天性黒内障および他の遺伝的網膜変性、病的近視、未熟児網膜症、およびレーバーの遺伝的視神経障害、角膜移植または屈折性角膜手術の後遺症、およびヘルペス性角膜炎を含む。
【００６６】
さらに、ＮｏｇｏＡが精神医学的状態、特に統合失調症および鬱において役割を演じることが示された。このように、本発明の結合分子は精神医学的状態、特に統合失調症および鬱の処置に有用である。
【００６７】
本発明の結合分子は単独で、または他の薬剤と組み合わせてまたは連続的に組み合わせて提供できる。例えば、本発明の結合分子を卒中または脊髄損傷の後に、さらなる神経損傷の遮断と軸索再生の阻害の手段としてコルチコステロイドのようなしかしこれに限定されない抗炎症剤、ＮＧＦ、ＢＤＮＦのような神経栄養因子または他の神経変性疾患様薬剤、例えばExelonTMまたはLevodopaと組み合わせて投与できる。本明細書で使用するとき、２つの薬剤は、２つの薬剤を同時に投与するか、個々に、これらの薬剤が同時に作用するような形式で投与するとき、組み合わせて投与すると言う。
【００６８】
精神医学的状態、特に統合失調症または鬱の処置のために、本発明の結合分子は、単独でまたは特に(ａ)バルビツレートおよびそれらの誘導体、ベンゾジアゼピン、カルボキサミド、ヒダントイン、スクシンイミド、バルプロ酸および他の脂肪酸誘導体および他の抗癲癇剤からなる群から選択される抗癲癇剤、(ｂ)慣用の抗精神病剤、(ｃ)非定型抗精神病剤および(ｄ)抗鬱剤からなる群から選択される他の薬剤と組み合わせて提供できる。
【００６９】
本明細書で使用する“バルビツレートおよびその誘導体”なる用語は、フェノバルビタールおよびプリミドンを含むが、これらに限定されない。本明細書で使用する“ベンゾジアゼピン”なる用語は、クロナゼパム、ジアゼパムおよびロラゼパムを含むが、これらに限定されない。本明細書で使用する“カルボキサミド”なる用語は、カルバマゼピン、オキシカルバゼピンおよび１０−ヒドロキシ−１０,１１−ジヒドロカルバマゼピンを含むが、これらに限定されない。本明細書で使用する“ヒダントイン”なる用語は、フェニトインを含むが、これに限定されない。本明細書で使用する“スクシンイミド”なる用語は、エトスクシミドおよびメスクシミドを含むが、これらに限定されない。本明細書で使用する“バルプロ酸および他の脂肪酸誘導体”なる用語は、バルプロ酸ナトリウム塩、チアガビン塩酸塩一水和物およびビグラバトリンを含むが、これらに限定されない。本明細書で使用する“他の抗癲癇剤”なる用語は、レベチラセタム、ラモトリジン、ガバペンチンおよびフェルバメートを含むが、これらに限定されない。
【００７０】
本明細書で使用する“慣用の抗精神病剤”なる用語は、ハロペリドールおよびフルフェナジンを含むが、これらに限定されない。
本明細書で使用する“非定型抗精神病剤”なる用語は、クロザリル、リスペリドン、オランザピン、クエチアピン、ジプラシドンおよびアリピプラゾールを含むが、これらに限定されない。
【００７１】
本明細書で使用する“抗鬱剤”なる用語は、選択的セロトニン再取り込み阻害剤(ＳＳＲＩ)または選択的セロトニンおよびノルエピネフリン再取り込み阻害剤(ＳＮＲＩ)を含むがこれらに限定されない。本発明のために適当なＳＳＲＩは、フルオキセチン、フルボキサミン、セートラリン、パロキセチン、シタロプラムおよびエスシタロプラムから選択できる。
【００７２】
コード番号、一般名または商品名により特定した活性剤の構造は、標準概論“The Merck Index”またはコンピューターデータベース、例えばPatents International(例えばIMS World Publications)から得られ得る。それらの対応する内容は、出典明示により本明細書に包含させる。当業者は活性成分の特定が完全に可能であり、これらの引用文献に基づいて、同様に、製造でき、インビトロおよびインビボの両方の標準試験モデルにおいて薬学的適応および特性を試験できる。
【００７３】
上記の適応に関して、適当な投与量は、もちろん、例えば用いる特定の本発明の分子、投与形態および処置する状態の性質および重症度に依存して変化する。本発明の結合分子は、簡便には損傷部位での治療剤としてポンプ輸送または注射により投与し、例えばそれらは損傷部位にＣＮＳに直接頭蓋内にまたは脊骨髄腔内に投与できる。
【００７４】
本発明の医薬組成物は慣用法で製造し得る。例えば本発明の分子を含む本発明の組成物は、好ましくは凍結乾燥形で提供される。直ぐの投与のために、それを適当な水性担体、例えば注射用滅菌水または滅菌緩衝化生理食塩水に溶解する。
【００７５】
適当な組成物を製造するための助けとして、本発明の結合分子および所望により本発明の結合分子の効果を増強する第二の薬剤を、同じ容器内に別々に、混合または同時投与のための指示書と共に包装することができる。所望の第二の薬剤の候補物は上記である。
【００７６】
本発明の結合分子とＮＧＦのような成長因子の相乗効果が、インビボで上記の脊髄損傷モデルにより証明され得る。
【００７７】
図面の簡単な説明
図１：配列比較：１１Ｃ７ｍＡｂに対する免疫原性ペプチド配列を示す、異なる種由来のＮｉＧの配列比較である。
【００７８】
本発明は、以下の実施例を参照してより完全に理解されるであろう。しかしながら、それらは本発明を限定するものと見なしてはならない。
以下の実施例において、全ての温度は摂氏(℃)である。
【００７９】
実施例で注目しているモノクローナル抗体は、軽鎖の可変部分(配列番号３)および重鎖の可変部分(配列番号２)を含む、本発明の結合分子である。
【００８０】
以下の略語を使用する：
ＥＬＩＳＡ      酵素結合免疫吸着検定法
ＦＡＣＳ        蛍光標示式細胞分取器
ＦＩＴＣ        フルオレッセインイソチオシアネート
ＦＢＳ          ウシ胎児血清
ＨＣＭＶ        ヒトサイトメガロウイルスプロモーター
ＩｇＧ          免疫グロブリンイソタイプＧ
ＭＡｂ          モノクローナル抗体
ＰＢＳ          リン酸緩衝化食塩水
ＰＣＲ          ポリメラーゼ連鎖反応
【００８１】
実施例１：ＮｉＧ−Ｄ２０(配列番号２４)は、ＮｏｇｏＡの神経突起伸長阻害性フラグメントの一つである
方法：
ａ)ラットＮｏｇｏ−Ａ欠失ライブラリー：欠失構築物を内部制限部位を使用して、エキソヌクレアーゼIII／マング・ビーン・ヌクレアーゼ処理により、および、ラットＮｏｇｏ−：ラットＮｏｇｏ−Ａ(ａａ  １−１１６３；以後に示すＤＮＡは、ラットＮｏｇｏＡ(配列番号２６)のアミノ酸と関連付けて示し、例えばａａ  １−１１６３は、ｃＤＮＡ構築物がＮｏｇｏＡのラットポリペプチド配列のアミノ酸１位から開始し、アミノ酸１１６３位で終わるポリペプチドをコードすることを意味する)、ラットＮｏｇｏ−Ｂ(ａａ  １−１７２＋９７６−１１６３)、ラットＮｏｇｏ−Ｃ(Ｎｏｇｏ−Ｃ  Ｎ−末端１１  ａａ＋ａａ  ９７６−１１６３)、ラットＮｏｇｏ−６６(ａａ  １０１９−１０８３)、ラットＧＳＴ−Ｎｏｇｏ−６６(ａａ  １０２６−１０９１)、ラットＮｉＲ−Ｇ(ａａ  １−９７９)、ラットＮｉＲ(１−１７２)、ラットＮｉＲ−Ｄ１(ａａ  １−３１)、ラットＮｉＲ−Ｄ２(ａａ  ５９−１７２)、ラットＮｉＲ−Ｄ３(ａａ  １−３１＋５９−１７２)、ラットＥＳＴ−Ｎｏｇｏ１(ａａ  ７６２−１１６３)、ラットＮｉＧ(ａａ  １７４−９７９)、ラットＮｉＧ−Ｄ１(ａａ１７４−９０９)、ラットＮｉＧ−Ｄ２(ａａ  １７４−８６５)、ラットＮｉＧ−Ｄ３(ａａ  １７２−７２３)、ラットＮｉＧ−Ｄ４(ａａ  １７２−６４６)、ラットＮｉＧ−Ｄ５(ａａ  ２９３−６４７)、ラットＮｉＧ−Ｄ６(ａａ  ７６３−９７５)、ラットＮｉＧ−Ｄ７(ａａ  １７４−２３５＋２９４−９７９)、ラットＮｉＧ−Ｄ８(ａａ  ２１８−６５３)、ラットＮｉＧ−Ｄ９(ａａ  １７２−２５９＋６４６−９７４)、ラットＮｉＧ−Ｄ１０(ａａ  ２９３−９７９)、ラットＮｉＧ−Ｄ１１(ａａ  ２０９−２６８)、ラットＮｉＧ−Ｄ１２(ａａ  １９８−２３３)、ラットＮｉＧ−Ｄ１３(ａａ  １７４−２１６)、ラットＮｉＧ−Ｄ１４(ａａ  １７４−２６０)、ラットＮｉＧ−Ｄ１５(ａａ  １７４−１９０＋４９３−９７９)、ラットＮｉＧ−Ｄ１６(ａａ  １７４−１９０＋６２１−９７９)、ラットＮｉＧ−Ｄ１７(ａａ  １７４−１９０＋２５９−９７９)、ラットＮｉＧ−Ｄ１８(ａａ  １７４−１９０＋２６３−９７９)、ラットＮｉＧ−Ｄ１９(ａａ  ７６３−８６５)、ラットＮｉＧ−Ｄ２０(ａａ  ５４４−７２５)、ラットＮｉＧ−Ｄ２１(ａａ  ８１２−９１８)、ラットＮｉＧ−Ｄ２２(ａａ  ８６６−９７５)、ラットＮｉＧ−Ｄ２３(ａａ  ９１４−９７５)、ラットＮｉＧ−Ｄ２４(ａａ  ５４４−６８５)、ラットＮｉＧ−Ｄ２５(ａａ  ６１４−７２５)、ラットＮｉＧ−Ｄ２６(ａａ  ５４４−６１３)、ラットＮｉＧ−Ｄ２７(ａａ  ５８１−６４８)、ラットＮｉＧ−Ｄ２８(ａａ  ６１４−６８５)、ラットＮｉＧ−Ｄ２９(ａａ  ６４８−７２５)、ラットＮｉＧ−Ｄ３０(ａａ  ６８２−７２５)、ラットＮｉＧ−Ｄ３１(ａａ  ５４４−５８０)、ラットＮｉＧ−Ｄ３２(ａａ  ５８１−６１３)、ラットＮｉＧ−Ｄ３３(ａａ  ６１４−６４８)、ラットＮｉＧ−Ｄ３４(ａａ  ６４８−６８５)、ラットＮｉＧ−Ｄ３５(ａａ  ２６０−５５６)、ラットＮｉＧ−Ｄ３６(ａａ  ２６０−４１５)のラットＮｏｇｏ−Ａ−特異的プライマーでのＰＣＲにより製造する(方法はＷＯ００／３１２３５の通り)。ＮｉＲ−ＧおよびＮｉＲ−ａは、Ｎｏｇｏ−Ａ−ｐＥＴ２８から制限酵素消化により��じた。ＮｉＧは、ＮｉＲ−Ｇから制限消化およびマング・ビーン・ヌクレアーゼ処理により生じた。ＮｉＧ−Ｄ１、−Ｄ３、−Ｄ４、−Ｄ５、−Ｄ７、−Ｄ８、−Ｄ９、−Ｄ１０は、ＮｉＧ−ｐＥＴ２８から制限酵素消化により生じた。ＮｉＧ−Ｄ１５、−Ｄ１６、−Ｄ１７、−Ｄ１８はＮｉＧ−ｐＥＴ２８からエキソヌクレアーゼIII消化により生じた。ＮｉＲ−ｂ、ＮｉＲ−Ｄ１、−Ｄ２、−Ｄ３は、ＮｉＲ−ａ−ｐＥＴ２８を鋳型としたＰＣＲにより生じた。ＮｉＧ−Ｄ２、−Ｄ６、−Ｄ１１、−Ｄ１２、−Ｄ１３、−Ｄ１４、−Ｄ１９、−Ｄ２０、−Ｄ２１、−Ｄ２２、−Ｄ２３、−Ｄ２４、−Ｄ２５、−Ｄ２６、−Ｄ２７、−Ｄ２８、−Ｄ２９、−Ｄ３０、−Ｄ３１、−Ｄ３２、−Ｄ３３、−Ｄ３４、−Ｄ３５、−Ｄ３６は、ＮｉＧ−ｐＥＴ２８を鋳型として使用するＰＣＲにより生じた。全ての構築物をｐＥＴ２８にサブクローニングする。上記の全ての構築物にｐＥＴ２８を使用した。ＧＳＴ−Ｎｏｇｏ６６にｐＧＥＸ−６Ｐを、ラットＮｉＧの周辺質発現にｐＥＴ２６を使用した。ヒトＧＳＴ−Ｎｏｇｏ−６６(ヒトＮｏｇｏ−Ａのａａ  １０５５−１１２０)を、鋳型としてのヒトＮｏｇｏＡ  ＤＮＡ(配列番号４)上のＰＣＲによりクローン化する。欠失構築物を次いでｐＥＴ２８ベクター(Novagen)、ｐＧＥＸ−６Ｐ(Amersham Pharmacia Biotech)およびｐＥＴ２６ベクター(Novagen)にクローン化する。ヒトＧＳＴ−Ｎｏｇｏ−６６は、GrandPre et al. (前掲)により公表されたＧＳＴ−ｎｏｇｏタンパク質に対応する。合成ラットペプチド４  EELVQKYSNSALGHVNSTIKELRRL(配列番号２７)は、ヒトペプチド４(ヒトペプチド４は、Ｎｏｇｏ−６６ドメインの阻害性領域であることが示されている(GrandPre et al., 2000))に対応する。オーソロガスラットペプチドは一つのミスマッチＣ−＞Ｓを含む(GrandPre et al., 2000, 前掲のペプチド４配列参照)。合成Ｐｒｏ／Ｓｅｒに富むペプチドPSSPPPSSPPPSSPPPS(配列番号２８)ならびにラットペプチド４はPrimm SAにより製造され、ＨＰＬＣ−精製されている。ヒトＮｏｇｏＡ＿６２３−６４０(配列番号６)はResearch Genetics Incにより合成され、精製されている。
【００８２】
ｂ)ヒトＮｏｇｏ−Ａ発現構築物(ｐＲＫ７−ｈＮｏｇｏ−Ａ)の産生：ラムダｇｔ１０(Clontech)中に構築したヒトｃＤＮＡライブラリーを標準法を使用して、デュプリケートのフィルターセットでスクリーニングする。ヒトＮｏｇｏ−Ａのフラグメントを、標準プロトコールを使用してヒト全脳ｃＤＮＡ(Clontech)からＰＣＲにより増幅し、続いてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローン化し、消化し、単離するか、または直接スクリーニングプローブとして使用する。４００ｂｐ  ＸｈｏＩ／ＳｍａＩフラグメントを５'プローブとして使用し、３'プローブはプライマーＣＡ−ＮＡ−２Ｆ：5'-AAG CAC CAT TGA ATT CTG CAG TTC C-3'(配列番号２９)およびＣＡ−ＮＡ−３Ｒ：5'-AAC TGC AGT ACT GAG CTC CTC CAT CTG C-3'(配列番号３０)と共に増幅する。陽性のクローンを単離し、サブクローン化し、配列を確認する。完全長ヒトＮｏｇｏ−Ａ  ｃＤＮＡを得るために、重複クローンをヒトＮｏｇｏ−Ａ  配列中の独特のＥｃｏＲＩ制限部位を使用して集合させ、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターにサブクローン化し、Ｐｂｓｎｏｇｏａと名付けた。ｐＲＫ７−ｈＮｏｇｏ−Ａを得るために、完全長ｃＤＮＡを真核発現ベクターｐＲＫ−７に指向性(directional)クローニングにより挿入した。
【００８３】
ｃ)細菌性産生のためのヒトＮｉＧ(ｈＮｉＧ)発現プラスミド(ｐＥＴ２８ａ−ｈＮｉＧ)の産生：ｈＮｉＧをコードするＤＮＡフラグメントを、プライマーセット：前方5'-GTC GCG GAT CCA TGG AGA CCC TTT TTG CTC TTC-3'(配列番号３１)；逆性5'-GTT CTC GAG TTA TGA AGT TTT ACT CAG-3'(配列番号３２)を使用した、細菌性発現のためのＮ−末端Ｈｉｓ−およびＴ７−タグのフレーム内でのＰｂｓｎｏｇｏａからの各々のコード領域のＰＣＲ増幅後、ｐＥＴ２８ａ(Novagen)のＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩにサブクローン化する。最終プラスミドをｐＥＴ２８ａ−ｈＮｉＧと名付ける。ｈＮｉＧを次いで大腸菌(E. coli)ＢＬ２１ｐＲＰ中で、１mM  イソプロピル−ベータ−Ｄ−チオガラクトピラノシド(ＩＰＧＴ)での誘導により発現させた。
【００８４】
ｄ)マウスＮｉＧ−エクソン３(ｍＮｉＧ−エクソン３)発現プラスミドの産生：マウスエクソン３をコードする領域を、マウスゲノムＢＡＣ鋳型から、プライマー：前方5'-GTG CGG ATC CAT GGA TTT GAA GGA GCA GC-3'(配列番号３３)；逆性5'-GTT TCT CGA GTG AAG TTT TAT TCA GCT C-3'(配列番号３４)と共に増幅し、ｐＥＴ２８ａのＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩクローニング部位にサブクローン化する。最終プラスミド構築物をｐＥＴ２８ａ−ｍＮｉＧ−エクソン３と名付ける。
【００８５】
サルＮｉＧのクローニング：ポリＡ  ＲＮＡを凍結サル脳組織から単離し、ｃＤＮＡをオリゴｄＴプライマーを使用して合成する。ｃＤＮＡの５'および３'領域をカバーする２つの重複フラグメントを、ＰＣＲにより、配列−特異的プライマーおよびプルーフリーディング酵素を使用して増幅する。プライマーを、ヒトＮｉＧ  ｃＤＮＡの既知の配列を使用して消化する。５'フラグメントの増幅のために、プライマーは5'-TCCACCCCGGCCGCGCCCAA-3'(配列番号３５)および5'-AATGATGGGCAAAGCTGTGCTG-3'(配列番号３６)であり、３'−フラグメントのためには5'-GGTACAAAGATTGCTTATGAAACA-3'(配列番号３７)および5'-AGCAGGGCCAAGGCAATGTAGG-3'(配列番号３８)である。これら２つのフラグメントを次いでサブクローン化し、各フラグメントについて少なくとも４つの独立したクローンを配列決定した。完全長ｃＤＮＡを、重複ＰＣＲで、上記のプライマーを使用して集合させ、得られた生成物をクローン化し、再び配列決定する。
【００８６】
ｅ)上記で定義の組み換えＮｏｇｏＮｉＧタンパク質およびＮｏｇｏ−Ａ−欠失ライブラリーの製造：細菌性Ｎｏｇｏ−Ａ−欠失ライブラリーを大腸菌に発現させる。タンパク質を、超音波緩衝液(２０mM  Ｔｒｉｓ、５０mM  ＮａＨ２ＰＯ４、１００mM  ＮａＣｌ、ｐＨ８.０)中、０.７５mg／mlリソザイムとの繰り返し超音波処理により、Ｂ−ＰｅｒTM(Pierce)または８Ｍ  尿素での可溶化によるいずれかにより抽出する。ｐｅｌＢ−リーダーと共に発現するＮｉＧを、周辺質タンパク質精製に関するNovagenプロトコールにしたがい、周辺質空間から得る。ｐＥＴ２８−構築物の上清を、Ｃｏ２＋−ＴａｌｏｎTM金属親和性樹脂(Clontech)をバッチ法で使用して精製する。８Ｍ  尿素およびＢ−ＰｅｒTM可溶化融解物を、バッチ法中、緩衝液を超音波緩衝液に徐々に置き換えることにより、非変性条件に持っていく。タンパク質は、超音波緩衝液中の２５０mM  イミダゾールで、重力カラム(BioRad)上で溶出する。ＮｉＧタンパク質をSuperdex 200 HiLoad 16/60上のゲル濾過によりさらに精製する。ｐＧＥＸ−６Ｐ構築物の上清をＧ−セファロースカラムで、製造者(Amersham Pharmacia)の指示にしたがいバッチ法で精製する。ＧＳＴ−Ｎｏｇｏ−６６の開裂を、可溶化ＧＳＴ−Ｎｏｇｏ−６６とPreScissionプロテアーゼをインキュベートし、続いてＨＰＬＣ精製することにより行う。ゲル電気溶出をＩＭＡＣ−精製組み換えＮｏｇｏの分取ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびBioRad Electro-Eluterでの５０mM  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７.４、１００mM  ＮａＣｌ、０.２％(ｗ／ｖ)ＣＨＡＰＳへの１時間、２５０ｍＡでの溶出、続く３０秒の逆電極極性により行う。クロマトグラフィー−精製タンパク質のタンパク質濃度を、Pierce Coomassie Stainおよび標準タンパク質としてのＢＳＡを使用して決定する。ゲル溶出タンパク質のタンパク質濃度を、銀染色ゲルのバンド強度に基づき、標準としてのＢＳＡにより見積もる(Merril CR, Dunau ML, Goldman D(1981)A rapid sensitive silver stain for polypeptides in polyacrylamide gels. Analyt.Biochem. 110:201-207)。
【００８７】
ｆ)ＣＨＯ細胞中の組み換えＮｏｇｏＡフラグメントの製造：ラットＮｏｇｏ−Ａ  ｃＤＮＡの部分的ＨｉｎｃII消化により得られた３１１９ｂｐフラグメント、ＮｉＲ−Ｇを、ｐＳｅｃＴａｇ２発現ベクター(Invitrogen, Groningen, The Netherlands)にクローン化する。ｐＮｉＲ−ＧのＣＨＯ細胞へのトランスフェクションは、ＮｉＲ−Ｇの細胞質発現をもたらす。安定なＮｉＲ−Ｇ  ＣＨＯ細胞系を２５０μg／ml  ゼオシン(Invitrogen)で選択する。細胞融解物からの組み換えＮｉＲ−Ｇを、Ｎｉ２＋−ＮＴＡカラム(Qiagen AG, Basel, Switzerland)で精製する。ラットＮｉＧ−Ｄ２０およびＮｏｇｏ−６６を、ｐＡＰタグ５ベクターにＰＣＲによりクローン化する。ｐＮｉＧ−Ｄ２０−ＡＰのＣＨＯ細胞へのトランスフェクションはＮｉＧ−δ２０−ＡＰをもたらし、それは培養上清中に分泌された。安定なｐＮｉＧ−Ｄ２０−ＡＰおよびｐＮｏｇｏ−６６−ＡＰ細胞系を２５０μg／ml  ゼオシン(Invitrogen)で選択した。両方の細胞系を無血清培地(Gibco)条件に適合させ、細胞系チャンバー(Integra)中で増殖する。上清は使用前に１０倍濃縮し、融合タンパク質の濃度を他の場所(Flanagan JG, Leder P(1990)The kit ligand:a cell surface molecule altered in steel mutant fibroblasts. Cell 63:185-194)に記載のように評価する。
【００８８】
ｇ)３Ｔ３繊維芽細胞およびＣＨＯ延展アッセイ：本３Ｔ３延展アッセイは先に記載(Spillmann AA, Bandtlow CE, Lottspeich F, Keller F, Schwab ME(1998)Identificationおよびcharacterization of a bovine neurite growth inhibitor(bNI-220). J.Biol.Chem. 273:19283-19293)のように行う。ＣＨＯ延展アッセイは本質的に３Ｔ３繊維芽細胞に関するのと同じ方法で行う。簡単に言えば、ＣＨＯ細胞を１：２に分ける。２４時間後、それらをＰＢＳ−ＥＤＴＡ中で３０秒トリプシン処理し、〜８,０００ＣＨＯ細胞を、５、１、０.５および０.２μg／ウェルＮｉＧまたはＮｏｇｏ−６６で予めコートした培養皿に撒く。３０−４５分後、細胞を４％(ｗ／ｖ)ＰＦＡ、５％(ｗ／ｖ)スクロースで固定し、次いでSpillmann et al, (前掲)に記載のように分析する。〜１００細胞を、光学顕微鏡でウェルあたり計数する；延展細胞の基準：(ａ)皿への付着および(ｂ)膜状仮足の指標となる伸長した形態；光学顕微鏡下で延展していない、丸い細胞より暗く、大きく見える細胞である；非延展細胞は、(ａ)皿に付着していないかまたは(ｂ)皿に付着しているが、小さく、丸く、皿につきだした検出可能な膜状仮足がない細胞と考える。延展および非延展細胞の比率を、基層の非許容性の程度と定義する。
【００８９】
ｈ)ＰＣ１２神経突起伸長アッセイ：ＰＣ１２神経突起伸長アッセイを先に記載(Rubin BP, Spillmann AA, Bandtlow CE, Keller F, Schwab ME(1995)Inhibition of PC-12 cell attachment and neurite outgrowth by detergent solubilized CNS myelin proteins. Europ. J. Neurosci. 7:2524-2529)のように行う。ＰＣ１２細胞(ラミニンと無関係に増殖できるＰＣ１２クローンは、Moses Chao, New Yorkから得られる)を、２日間、５０−１００ng／ml  ＮＧＦ(Harlan Bioproducts, Indianapolis)で、ＤＭＥＭ、５％ウシ胎児血清、１０％ウマ血清、１００Ｕ／ml  ペニシリンおよび０.５mg／ml  ストレプトマイシン(Gibco-BRLのPen-Strep)で刺激する。ＰＣ１２細胞を機械的に離し、ＨＢＳＳ(Gibco)中の０.０５％トリプシン(Sigma)で５分トリプシン処理し、３,０００−５,０００細胞／cm２の密度で１００ng／ml  ＮＧＦ添加培養培地に撒く。アッセイを２４時間後に４％(ｗ／ｖ)ＰＦＡ、５％(ｗ／ｖ)スクロースのＰＢＳ溶液、ｐＨ８の添加により停止する。細胞培養皿を、３Ｔ３細胞に関するのと同様の方法でＰＣ１２細胞でコートした。
【００９０】
ｉ)網膜神経節細胞ストライプアッセイ：本網膜神経節細胞ストライプアッセイを、Vielmetter(Vielmetter J, Stolze B, Bonhoeffer F, Stuermer CA(1990) In vitro assay to test differential substrate affinities of growing axons and migratory cells. Exp. Brain Res. 81:283-287参照)にしたがい、改変して(Schmalfeldt M, Bandtlow CE, Dours-Zimmermann MT, Winterhalter KH, Zimmermann DR(2000)Brain derived versican V2 is a potent inhibitor of axonal growth. J. Cell Sci. 113:807-816参照)行う。外植片を、４％(ｗ／ｖ)ＰＦＡ、０.１％(ｖ／ｖ)グルタールアルデヒドのＰＢＳ溶液で１０分、ＲＴで固定後に評価する。免疫染色のために、固定した外植片を、１時間、ＲＴでＲＮＯ−遮断溶液(０.５％(ｗ／ｖ)ＢＳＡ、０.３％(ｗ／ｖ)ＴｏｐＢｌｏｃｋ(Juro Supply)、０.１％(ｗ／ｖ)ＮａＮ３のＰＢＳ溶液)で遮断し、１０分、０.０５％(ｖ／ｖ)Ｔｘ−１００のＲＮＯ−遮断溶液で透過性にし、１分、−２０℃で凍結し、一次抗体(ＮｉＲについてはAS Bianca、Ｎｏｇｏ−Ａ、ＮｉＲ−Ｇ、ＮｉＧ、ＮｉＧ−Ｄ３およびＮｉＧ−Ｄ２０についてはAS Laura、Ｎｏｇｏ−Ｃおよびベータ−Ｇａｌコントロールタンパク質についてはNovagen mAb抗−Ｔ７)とインキュベートする。ＰＢＳで洗浄後、ＦＩＴＣ−およびＴＲＩＴＣ(ＦＩＴＣ：フルオレッセインイソチオシアネート：ＴＲＩＴＣ：テトラメチルローダミンイソチオシアネート)−結合抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories)を外植片に添加する(１：１５０)。サンプルを５０％(ｖ／ｖ)グリセロール、２５mM  ＮａＨＣＯ３、４０mM  ＮａＣｌ、１％(ｗ／ｖ)ｐ−フェニレンジアミン(Sigma)中カバーガラスに載せる。
【００９１】
結果：
ａ)Ｎｏｇｏ−ＡのＮ−末端における２つの領域は、３Ｔ３繊維芽細胞の延展に関して阻害性である：３Ｔ３繊維芽細胞延展の阻害を担うＮｏｇｏ−Ａの領域を同定するために、５０個のＮｏｇｏ欠失構築物ライブラリーを作成し、組み換えタンパク質を細菌中で発現させる(方法１ａ参照)。３Ｔ３繊維芽細胞延展阻害に対する見かけのＥＣ５０は、４００−５００ng／０.１ml  Ｎｏｇｏ−Ａ一晩被覆／培養皿cm２(〜４pmol／cm２)であった。Ｎｏｇｏ−Ａまたはそのフラグメントの８Ｍ  尿素での処置は、阻害活性の著しい減少をもたらし、この構造が重要であることを示唆する。繊維芽細胞延展アッセイでのＮｏｇｏフラグメントの分析は、少なくとも２つのＮｏｇｏ−Ａタンパク質の範囲が新たに培養した繊維芽細胞の延展を阻害し、この２つはＮｉＲ−Ｄ２(ａａ  ５９−１７２)およびＮｉＧ−Ｄ２０(ａａ  ５４４−７２５)であることを明らかにする。ＮｉＧ−領域由来の全てのフラグメントが阻害活性(例えばＮｉＧ−Ｄ４およびＮｉＧ−Ｄ８)を示し、一部ＮｉＧ−Ｄ２０と重複する。高タンパク質濃度でのわずかな阻害活性が、ＮｉＧ−Ｄ６領域中のＮｉＧ−Ｄ１９で観察される。Ｎｏｇｏ−Ｃ、Ｎｏｇｏ−６６およびラットペプチド４(GrandPre et al., 2000により、Ｎｏｇｏ−６６の阻害性領域であるはずであると示されている)は繊維芽細胞延展に阻害性ではない。これらのデータは、３Ｔ３繊維芽細胞におけるＮｏｇｏ−Ａの抗−延展活性が、Ｎ−末端(ＮｉＲ−Ｄ２)に位置する２つの定義された範囲およびタンパク質のＮｏｇｏ−Ａ−特異的部分(ＮｉＧ−Ｄ２０)に帰することを示す。非特異的物理化学的特性(フラグメントの酸性度、プロリンおよびセリン残基による構造的効果)はこの効果の原因ではない。Ｃ−末端ＲＴＮドメインは、繊維芽細胞延展の阻害に関与しない。
【００９２】
ｂ)Ｎｏｇｏ−ＡのＮｉＧ−Ｄ２０領域は、神経突起伸長に関して阻害性である：細胞延展に非許容性であるＮｏｇｏ−Ａのどのフラグメントがまた神経突起伸長に関して阻害性であるかを決定するために、異なるニューロンアッセイにおける一連の細菌産生Ｎｏｇｏ−Ａフラグメントならびに真核細胞産生Ｎｏｇｏ−ＡＰキメラを試験する。ストライプアッセイ(方法１)において、神経突起はラミニン／Ｎｏｇｏ−Ａ被覆ストライプを避け、ラミニン−のみのストライプで伸長し、一方ラミニン／ベータ−ガラクトシダーゼで被覆されたストライプは回避されなかった。完全長Ｎｏｇｏ−Ａは、網膜神経節細胞(ＲＧＣ)神経突起伸長に関して強く非許容性であるが、一方Ｎ−末端部分(ＮｉＲ)は下限ぎりぎりの効果しか有しなかった。Ｎｏｇｏ−Ｃ活性はコントロールタンパク質ベータ−ガラクトシダーゼと区別できない。Ｎｏｇｏ−Ａ−特異的領域ＮｉＧ−Ｄ２０は、ＲＧＣ神経突起伸長上の非許容性活性を担う主領域を含むようである；成長円錐は、ＮｉＧ−Ｄ２０−被覆ストライプに遭遇したとき停止する。本非許容性効果は、濃度依存性である。低いＮｏｇｏ−Ａ濃度で、交差繊維数は増加した。鼻および側頭部ＲＧＣ神経突起は、それらのＮｏｇｏ−Ａ領域に対する反応性に関して明らかな差は観察されない。ＰＣ１２細胞のラミニン−非依存性、ＮＧＦ−反応性クローンを５０ng／ml  ＮＧＦで２４時間刺激し、次いで０.１−３μg／cm２の濃度のＮｏｇｏフラグメントで被覆された皿に撒く。神経突起伸長を一日後に採点する。Ｎｏｇｏ−Ａ−特異的領域(ＮｉＧ)およびそのフラグメントＮｉＧ−δ２０は、ＰＣ１２神経突起伸長を強く阻害する。対照的に、Ｎ−末端フラグメントＮｉＲはわずかな活性しかなく、高タンパク質濃度でのみ検出可能である。Ｎｏｇｏ−ＣおよびＮｏｇｏ−６６は不活性である。
【００９３】
実施例２：３Ｔ３繊維芽細胞およびラット脳皮質膜におけるＮｉＲ−ＧおよびＮｉＧ−Ｄ２０への結合部位(複数もある)の存在：
方法：
ａ)放射活性標識および結合実験：ＩＭＡＣ−精製ＮｉＧ−Ｄ２０を、ラクトペルオキシダーゼを使用したANAWA Trading SA(Wangen, Switzerland)(２,０３０Ci／mmol)のヨウ素化、逆相ＨＰＬＣにより精製する。ラット脳皮質からの膜を記載のように調製する(Olpe HR, Karlsson G, Pozza MF, Brugger F, Steinmann M, Van Riezen H, Fagg G, Hall RG, Froestl W, Bittiger H(1990)CGP 35348:a centrally active blocker of GABAB receptors. Eur.J.Pharmacol. 187:27-38)。非特異的結合を減少させるために２時間、１％(ｗ／ｖ)ウシ血清アルブミンとプレインキュベートした１.５ml試験管を使用して、１時間、ＲＴで本質的に記載のように結合させる(Kaupmann K, Huggel K, Heid J, Flor PJ, Bischoff S, Mickel SJ, McMaster G, Angst C, Bittiger H, Froestl W, Bettler B(1997)Expression cloning of GABA(B) receptors uncovers similarity to metabotropic glutamate receptors. Nature 386:239-246)。プロテアーゼ阻害剤(Roche Diagnostics, Mannheim, FRG)を含むＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７.４(１２５mM  ＮａＣｌ、５mM  ＫＣｌ、０.６mM  ＭｇＣｌ２、１.８mM  ＣａＣｌ２、２０mM  ＨＥＰＥＳ、６mM  デキストロース)中の膜ホモジネートを、１.３nMヨウ素化ＮｉＧ−Ｄ２０と、非標識ＮｉＧ−Ｄ２０の漸増濃度の非存在下または存在下インキュベートする。
【００９４】
ｂ)フローサイトメトリー：フローサイトメトリーおよび細胞選別は、Cytomation MoFlo高速細胞選別機(Fort Collins, Colorado)上で行う。フローサイトメーターに、１３０ｍＷの力で４８８nmに合わせられたアルゴン−イオン／ＵＶ  Enterprise IIレーザーを接続する。フルオレッセイン(ＦＩＴＣ)蛍光を、５３０／４０nm帯域通過フィルターを通して集める。分析のために３Ｔ３繊維芽細胞を細胞分離緩衝液(Gibco)で離す。ＮｉＲ−Ｇの３Ｔ３繊維芽細胞への結合を検出するために使用する予備形成複合体を、下記のように調製する：ＮｉＲ−Ｇおよび抗−Ｍｙｃ抗体(９Ｅ１０)を、１：１モル比で３０分、４℃でインキュベートする。次に、ＦＩＴＣ結合Ｆ(ａｂ)２ヤギ抗マウスＩｇＧを添加し、さらに３０分、４℃でインキュベートする。三量体の得られるモル比は１：１：０.５である。複合体を、最終容量０.１mlで１×１０６  ３Ｔ３繊維芽細胞に添加し、２時間、４℃でインキュベートし、洗浄し、フローサイトメトリーで分析する。
【００９５】
結果：
３Ｔ３繊維芽細胞およびラット脳皮質膜上のＮｏｇｏ−Ａ−特異的活性フラグメントに関する結合部位(複数もある)の存在：Ｎｏｇｏ−ＡのＮｉＲ−Ｄ２およびＮｉＧ−Ｄ２０領域が、Ｎｏｇｏ−６６が不在であり、かつＮｇＲと無関係であるにも関わらず、細胞延展および神経突起伸長に阻害性であるため、別の、Ｎｏｇｏ−Ａ−特異的レセプターの存在を仮定しなければならない。故に結合試験を、フローサイトメトリーにより分析された生存３Ｔ３繊維芽細胞に対して、多量体化、ｍｙｃ−タグ付けおよびＩＭＡＣ−精製したＮｉＲ−Ｇで行われる。Ａｂ複合体化ＮｉＲ−Ｇは、３Ｔ３細胞に、９０％を超える３Ｔ３細胞の蛍光シフトにより見られるように効率的に結合する。対照的に、３Ｔ３細胞は、ＦＩＴＣ−結合二次Ｆ(ａｂ)２ヤギ抗−マウスＩｇＧと結合した９Ｅ１０一次マウス抗−ｍｙｃ  ｍＡｂと、または二次Ａｂ単独とインキュベートした後、標識されない。ＮｉＧ−Ｄ２０のラット皮質膜に対する結合を試験するために、放射性リガンド結合アッセイにおける[１２５Ｉ]−標識ＮｉＧ−Ｄ２０を使用する。１.３nMの[１２５Ｉ]−ＮｉＧ−Ｄ２０の濃度で、非標識ＮｉＧ−Ｄ２０による放射リガンド結合の濃度依存的競合により示されるように、脳膜上の特異的ＮｉＧ−Ｄ２０結合部位の証拠を発見した。これらの結果は、Ｎｏｇｏ−Ａのアミノ末端フラグメントが、３Ｔ３細胞およびラット皮質膜に結合でき、膜−結合、Ｎｏｇｏ−Ａ−特異的結合部位またはレセプター(複数もある)の存在を証明する。
【００９６】
実施例３：マウス１１Ｃ７−ＩｇＧ１の産生
マウス(Ｃ３Ｈ−およびＣ５７ＢＩ６／Ｊ−種)を、ＮｉＧ−Ｄ２０における特定のエピトープに対応する合成ペプチドSYDSIKLEPENPPPYEEA(＝ラットＮｏｇｏＡ＿６２３−６４０；配列番号１)で免疫する。このエピトープはヒト、カニクイザルおよびマウスＮｉＧ−Ｄ２０  Ｎｏｇｏ−Ａ特異的領域で非常に保存的であり、ヒトＮｏｇｏＡアミノ酸配列(配列番号５)のアミノ酸６２３で開始し、アミノ酸６４０で終わる(配列アライメント：図１をまた参照)。
【００９７】
ｍＡｂ  １１Ｃ７は、ラットＮｏｇｏＡ＿６２３−６４０と担体タンパク質キーホールリンペットヘマグルチニン(ＫＬＨ)免疫マウスの融合物の中から得られる。モノクローナル抗体を、ラットＮｏｇｏＡ＿６２３−６４０−ＫＬＨ、ラットＮｏｇｏＡ＿６２３−６４０遊離ペプチドおよび非関連ペプチド−ＫＬＨ上のＥＬＩＳＡによりスクリーニングしている。さらなるスクリーニングのために、ｍＡｂｓを、両方ともｈｉｓ−タグ付けされたタンパク質として発現され、金属親和性クロマトグラフィーで精製したＮｉＲ−Ｇ対ｂ−ガラクトシダーゼ上のＥＬＩＳＡにより試験している。続いて、ｍＡｂｓをオリゴデンドロサイトおよび脳融解物(ラット起源)のウェスタン・ブロット上でＮｏｇｏ−Ａの認識について試験している。抗体は、ラットＮｏｇｏ−Ａ−導入ＣＨＯまたはＣＯＳ細胞およびラットオリゴデンドロサイト(透過性細胞)の内因性Ｎｏｇｏ−Ａの免疫細胞化学におけるタンパク質の認識について試験する。それらはまた生存ラットオリゴデンドロサイトに対する表面結合についても試験する。種交差反応性は、ラット、マウス、ヒトおよびウシ起源の組み換えＮｉＧについてＥＬＩＳＡにより、および内因性ラット、マウス、ヒトおよびサルＮｏｇｏ−Ａについて組織または細胞抽出物のウェスタン・ブロットにより試験する。
【００９８】
ウェスタン・ブロット分析：ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタン・ブロット分析を先に記載のように行い(Huber AB, Weinmann O, Brosamle C, Oertle T, Schwab ME(2002)Patterns of Nogo mRNA and protein expression indeveloping and adult rat and after CNS lesions. J. Neurosci. 22:3553-3567)、遮断は３％(ｗ／ｖ)Top Block(Juro Supply, Lucerne, Switzerland)で行う。抗体を下記のように希釈する：精製モノクローナル１１Ｃ７またはハイブリドーマ上清１：１５０。二次抗体はＨＲＰ−コンジュゲート抗−マウス((Pierce；１：５０００,)１：５０,０００)である。１１Ｃ７抗体とのハイブリダイゼーションは４℃で一晩行う。検出のためにAmersham PharmaciaのＥＣＬ検出試薬を使用する。
【００９９】
結果：
１１Ｃ７  ｍＡｂは、１９０kD  Ｎｏｇｏ−Ａ  バンドをオリゴデンドロサイト細胞培養ホモジネートのウェスタン・ブロットで同定する。１１Ｃ７はまたウェスタン・ブロットでヒトＮｉＧ、カニクイザルＮｉＧ細胞融解物およびラットＮｉＧ−Ｄ２０を同定する。１１Ｃ７  ｍＡｂは、ＩｇＧ１イソタイプ(IsoStrip Kit, Roche)として特徴付けられる。
【０１００】
実施例４：マウス１１Ｃ７  ｍＡｂの特徴付け
免疫細胞化学：視神経オリゴデンドロサイトを記載のように調製する(Schwab, Caroni, 1988, Neuron)。ポリ−Ｌ−リジン被覆カバーガラス上で増殖させた３日から５日目の培養を２回ＰＢＳで洗浄し、４％(ｗ／ｖ)パラホルムアルデヒド(ＰＦＡ)、５％(ｗ／ｖ)スクロースのＰＢＳ溶液で、１５分、室温(ＲＴ)で固定し、非特異的結合を１０％(ｖ／ｖ)ＦＣＳで遮断する。次いで、細胞をマウス１１Ｃ７(１：１００)とインキュベートした。二次抗体はヤギ−抗−マウスＴＲＩＴＣ(Jackson ImmunoResearch Laboratories)である。細胞表面染色のために、２日目のラット視神経培養物を、培地中のモノクローナル抗体と２５分、ＲＴでインキュベートする。二次アルカリホスファターゼ結合抗体(Milan Analytica, Lausanne)を、０.１Ｍ  マレイン酸中１：７,５００で、１％(ｗ／ｖ)遮断試薬(１時間)と共に使用する。培養物を２回マレイン酸緩衝液で、１回アルカリホスファターゼ緩衝液(０.１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ９.５、０.１Ｍ  ＮａＣｌ、５mM  ＭｇＣｌ２)で洗浄し、染色を３時間、室温で０.１７５mg／ml  ＢＣＩＰ(Sigma)および０.３３８mg／ml  ＮＢＴ(Sigma)のアルカリホスファターゼ緩衝液中の溶液で展開する。
【０１０１】
Ｎｏｇｏ−ＡのＮｏｇｏＡ＿６２３−６４０エピトープは培養オリゴデンドロサイトの細胞表面に存在する：マウス１１Ｃ７  ｍＡｂとインキュベートしたオリゴデンドロサイトの生存培養は、分化オリゴデンドロサイト細胞体およびそれらの放射状突起を染色する。コントロールマウスＩｇＧおよび細胞性タンパク質ＣＮＰａｓｅに対する抗体は生存細胞を染色しない。マウス１１Ｃ７と対応する免疫原性ペプチド(＝ラットＮｏｇｏＡ＿６２３−６４０配列番号１)とのプレインキュベーションは、背景レベルまで染色を減少させた(競合アッセイ)。細胞表面染色は全ての大きいおよび小突起および細胞体上に存在する。故に、マウス１１Ｃ７  ｍＡｂにより認識される分子のＮｏｇｏ−Ａ特異的部分は、オリゴデンドロサイトの原形質膜上の細胞外空間に暴露される。
【０１０２】
マウス１１Ｃ７  ｍＡｂの製造および精製：１０−Ｌガラスバイオリアクターを、マウス１１Ｃ７  ｍＡｂを産生するハイブリドーマクローンの連続形式培養のために使用する。バイオリアクターは穏やかな撹拌のために試験管の中心にマリン・インペラー、細胞保持のためのスピン・フィルターおよび無気泡通気のためのコイル状シリコン管を備える。ハイブリドーマ細胞を我々のＲＰＭＩベースの無血清培地で培養する。培地に細胞を３.７×１０５／mlで接種する。２８時間連続的培地貫流後、バイオリアクターを０.５発酵槽容量／日(５リットル／日)の速度で開始する。さらに２４時間後、流速を１発酵槽容量／日(１０リットル／日)のその最終レベルまで増加させる。１週間後、培養は１１×１０５細胞／mlで定常状態に到達し、この工程をさらに１週間続ける。マウス１１Ｃ７  ｍＡｂの力価を毎日ＨＰＬＣで測定する。合計１５０リットル培養上清をバイオリアクターから回収し、細胞および細胞残骸を除去するために滅菌濾過する。１５０Ｌ培養上清をPellikonタンゲスティナル・フロー・デバイス(Millipore；１０kDaカットオフ)を使用して約６Ｌに濃縮する。濃縮した上清を、タンパク質ＡセファロースＣｌ−４Ｂの２２０ml容積カラム(Pharmacia；１１cm床高)に３回かけて精製する。簡単に言えば、ｐＨを８.１に補正した後の培養上清を４ml／分でかけ、カラムを１００mM  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ８.１を使用して８ml／分でベースラインまで流す。結合物質は、最終的に５０mM  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ３.０、１４０mM  ＮａＣｌを使用して８ml／分で溶出し、直ぐに５Ｎ  ＮａＯＨで中和し(ｐＨ７.０)、滅菌濾過する。吸光度を２８０nmで追跡する。精製物質の一部を最終的に限外濾過および／またはＰＢＳに対する透析によりさらに濃縮する。精製に使用した全ての緩衝液は、可能性のあるエンドトキシン汚染を除くために、１０kDa  ULTRASETTEＴＭタンゲスティナル・フロー・デバイス(Filtron Technology Corporation)上で濾過する。いくつかの理由のために、タンパク質Ａ樹脂を２０％エタノールで徹底的に洗浄し、使用前に全ての管／ポンプを０.１Ｍ  ＮａＯＨで処理する。タンパク質濃度を、１mg／mlで１.３５の参考吸収を使用して、２８０nmで分光光度測定法により測定する。純度は、４−２０％Novex勾配ゲルを使用した還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより慣用的に評価する。エンドトキシン含量を、製造者(Endotell AG, Allschwil, Switzerland)の指示にしたがった伝統的リムルス変形細胞融解物(ＬＡＬ)反応により測定する。
【０１０３】
Ｆａｂフラグメントの産生：マウス１１Ｃ７  ｍＡｂの一部を、１００mM  Ｎａ−アセテート、ｐＨ５.５、２mM  ＥＤＴＡに対して徹底的に透析し、６mg／mlの濃度に調節する。Ｆａｂフラグメントを、０.２５mMシステイン存在下のパパイン消化(１：２００ｗ／ｗ比)により産生する。反応を１６時間、３７℃で進行させ、次いで特異的パパイン阻害剤Ｅ６４(Ｎ−［Ｎ−(Ｌ−３−ｔｒａｎｓ−カルボキシラン−２−カルボニル)−Ｌ−ロイシル］−アグマチン)を大過剰(１０μＭ)で添加することにより停止させる。消化した抗体を次いで、無傷の材料およびＦｃフラグメントを除去するためにタンパク質ＡセファロースFast Flowカラムを通す。ＦａｂフラクションをＰＢＳに対して徹底的に透析し、約３mg／mlに濃縮する。(パパインおよびＥ６４はRoche Molecular Biochemicalsからである)。
【０１０４】
ＶＬおよびＶＨ領域のＨＰＬＣ、質量分析法およびＮ−末端アミノ酸配列決定：
ａ)還元およびアルキル化：精製し、乾燥した１１Ｃ７抗体を４０μlの８Ｍ  尿素、０.４Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３、ｐＨ８.３に溶解する。タンパク質と同じ緩衝液１０μlに予め溶解した６０μg  ＤＴＴ(Calbiochem)を添加する。還元を、５０℃で３０分、アルゴン下に行う(タンパク質チオールよりも１００倍モル過剰のＤＴＴ)。還元後、サンプルを室温に冷却する。タンパク質と同じ緩衝液に溶解した３０４μgのヨードアセトアミド(Sigma Ultra、Ｉ−１１４９)を添加する。カルボキサミドメチル化を、室温で１５分、暗所で行う。１μl  β−メルカプトエタノールを反応を停止するために添加する。
【０１０５】
ｂ)重鎖および軽鎖の単離：抗体のカルボキサミドメチル化重鎖および軽鎖を、ＤＲ５ポンプ輸送系およびダイオードアレーＵＶ検出器を備えたHewlett Packard 1090M HPLC System上の逆相高速液体クロマトグラフィー(ＲＰ−ＨＰＬＣ)により単離する。クロマトグラフィーの条件は以下の通りである：Ｒ１／Ｈ材を詰めたPerSeptive Biosystems Poros  ２.１×１００mmカラム；流速は０.５ml／分；溶媒：(Ａ)０.１％ＴＦＡ水溶液および(Ｂ)０.０９％ＴＦＡ／アセトニトリル／水９：１；勾配２５−７０％Ｂ、８分、８０℃で；２１８／２８０nmで検出。
【０１０６】
ｃ)ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ：質量分析法を、Micromass  Ｚ−タイプ・エレクトロスプレーイオン化源(ＥＳＩ)を備えた、Ｑ−Ｔｏｆ(Micromass, Manchester, UK)四極子飛行時間型縦型質量分析器を使用して行う。獲得質量範囲は典型的にｍ／ｚ  ５００−２０００の範囲である。データを記録し、MassLynxソフトウェアを使用して処理する。５００−２５００ｍ／ｚスケールの較正は、ウマ心臓ミオグロビン(ＭＷ  １６９５１.５)の複数荷電したイオンピークを使用して達成する。
【０１０７】
ｄ)重鎖および軽鎖のＨＰＬＣ−ＭＳ：還元およびカルボキサミドメチル化重鎖および軽鎖の分離を、Perseptive Biosystems POROS R1/Hを充填した１mm×１５０mm  LC Packingsカラムを用いるＨＰ１１００  ＨＰＬＣ系(Hewlett Packard, Palo-Alto, CA, USA)で行う。カラムを６０℃に維持する。１０μl容量のサンプルをValcoモデルC6UW HPLCバルブ(Valco, Houston, TX, USA)および１０μlインジェクション・ループに適したＣＴＣ  ＰＡＬオートサンプラー(CTC, Zwingen, Switzerland)を使用してカラムに注入する。ＨＰＬＣをMassLynxソフトウェア(Micromass, Manchester, UK)により制御した。ＵＶ検出は２１４nmである。溶離剤Ａは０.０５％ＴＦＡ水溶液である。溶離剤Ｂは水：０.０４５％ＴＦＡ含有アセトニトリルの１：９混合物である。２０％Ｂから９０％Ｂの勾配を、２０分、８０℃で行う。流速は典型的に６０μl／分である。ＬＣ系からの全流出物をＵＶ検出セルに、次いで任意のスプリットなしのＥＳＩ供給源に入れる。ＨＰＬＣ系は制御され、ＵＶ検出器からのシグナルはMassLynxソフトウェア(Micromass, Manchester, UK)を使用して処理する。以下の５つのシグナルを検出する：
【表２】
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【０１０８】
ｄ)ＶＬおよびＶＨ領域のＮ−末端アミノ酸配列決定：ＨＰＬＣから回収したＨ＋Ｌ鎖ピークを配列分析に使用する。アミノ酸配列を、Hewlett Packard G1000A  Ｎ−末端タンパク質配列決定システム上で決定する。本システムは、ミニチュア吸着２相カラム上に保持されたタンパク質サンプル上の自動化エドマン化学反応を行う。最適化化学法(ダブル・カップル３.０)を使用して、化学反応効率を高め、遅延を最小にし、これにより配列分析が約５０残基まで伸びる。ＰＴＨ−アミノ酸の分析は、３成分ポンプ輸送系およびNarrowbore(２.１mm×２５cm)ＰＴＨカラムを備えた、オンラインHewlett Packard HP1090 HPLC系上で行う。
【０１０９】
結果：
室量分析から、マウス１１Ｃ７−ＩｇＧ１の同種重鎖および軽鎖を決定する。Ｈ−鎖は一つグリコシル化され、したがって、Ｃ−末端リジンが異なる２つの形が存在する。重鎖および軽鎖の総質量分析は、両方の鎖で一つの質量を示す。マウス１１Ｃ７−ＩｇＧ１のＨＰＬＣクロマトグラフィーは一つのピークを示す。ＨＰＬＣ精製、その後の還元およびアルキル化の後、純粋重鎖および軽鎖が利用可能である。Ｎ−末端配列変性を軽鎖および重鎖で行う。Ｌ−鎖およびＨ−鎖のＮ−末端配列からの４５から５５アミノ酸を、配列変性により同定する。
【０１１０】
【表３】
0004504200.tif 000004
【０１１１】
実施例５：マウス１１Ｃ７  ｍＡｂの重鎖および軽鎖遺伝子のクローニング
総ＲＮＡを、１０７ハイブリドーマ細胞(クローン１１Ｃ７)から、TriPure試薬(Roche diagnostics, Germany, Cat.# 1667157)を使用し、製造者の指示にしたがって調製する。ｃＤＮＡ合成のために、ｍＲＮＡを、上記のように製造した総ＲＮＡから、Oligotex樹脂(Qiagen, Germany, Cat. # 70022)を使用して単離する。
【０１１２】
ｃＤＮＡを、以下の条件を使用した逆転写により産生する：２μl  ｍＲＮＡ、２μl  １０×逆転写緩衝液、２μl(ｄＴ)２０プライマー(１０μＭ)、０.５μl  ＲＮａｓｉｎ(Promega、４０Ｕ／ml)、２μl  ｄＮＴＰ(各５mM)、１μl  OmniscriptＴＭ逆転写酵素(Qiagen, Cat # 205110)、１０.５μl  ｄｄＨ２Ｏ、反応：１時間、３７℃。ＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡのＰＣＲ増幅のために、プルーフリーディング酵素ProofStartＴＭＤＮＡポリメラーゼを使用する。
【０１１３】
軽鎖および重鎖のＰＣＲ：反応混合物：２μl  ｃＤＮＡ、５μl  １０×反応緩衝液、３μl  ｄＮＴＰ(各５mM)、２μl  ５'プライマー(１０μＭ)(表２参照)、２μl  ３'プライマー(１０μＭ)(表２参照)、１μl  ProofStart(Qiagen, Cat # 202203)、３６μl  ｄｄＨ２Ｏ。ＰＣＲ条件：９５℃／５分、(９５℃／４０秒、５３℃／１分、７２℃  １分)×３５、７２℃／１０分。得られたＰＣＲ生成物を直接ｐＣＲｂｌｕｎｔＴＯＰＯ(Invitrogen)にライゲートする。ライゲーション混合物をＴＯＰ  １０細胞(Invitrogen)に導入し、数個のクローンを選択する。１１Ｃ７  ｍＡｂ重鎖可変部分のヌクレオチド配列(Ｖ−Ｈ、配列番号４３)および１１Ｃ７  ｍＡｂ軽鎖可変部分のヌクレオチド配列(Ｖ−Ｌ、配列番号４４)ｃＤＮＡを、ＡＢＩシークエンサーで決定する。Ｖ−ＨおよびＶ−Ｌのその後のアミノ酸配列を配列番号２(Ｖ−Ｈ)および配列番号３(Ｖ−Ｌ)に示す。ＶＨおよびＶＬ  ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅に使用するプライマー；全プライマーは、MWG Biotech, Germanyによる合成である。
【表４】
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【０１１４】
実施例６：ＥＬＩＳＡを使用した、Ｎｏｇｏ−Ａドメインへの１１Ｃ７およびＦａｂの結合
Greiner  ９６ウェルＰＳプレート(#655161)を、０.４−２μg／ml  Ｎｏｇｏタンパク質フラグメントのＰＢＳ(１００μl／ウェル)で被覆し、カバーし、４時間、室温でインキュベーションする。プレートを軽く叩き、２００μl／ウェル遮断緩衝液(ＰＢＳ＋２％ＢＳＡ)を再び入れ、カバーし、インキュベーションする。１時間、ＲＴまたは一晩、４℃、次いで４回水およびＰＢＳで洗浄する。マウス１１Ｃ７  ｍＡｂまたは１１Ｃ７  Ｆａｂの異なる濃度をＰＢＳ＋２％ＢＳＡ(１００μl／ウェル)で希釈し、２時間、ＲＴまたは一晩、４℃でインキュベートする。洗浄段階を繰り返し、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)と結合したヤギ抗−マウスＩｇＧを、ＰＢＳ／０.１％ＢＳＡ／０.１％Nonidet 40(１００μl／ウェル)中の１：５０００(ICN #55550)の希釈で添加し、インキュベートする。２時間、ＲＴまたは一晩、４℃、そして洗浄段階を繰り返す。ＨＲＰ反応を、１００μl／ウェル  ＢＭブルーＰＯＤ(Roche #1484281)を添加により開始し、暗所でＲＴで１５分インキュベートする。Ｈ２ＳＯ４  ５０μl／ウェル  １Ｍを添加してＨＲＰ基質反応を停止し、光学密度を４５０nmに設定したマイクロプレートリーダー(Packard Spectra Count)を使用して測定する。
【０１１５】
このマウス１１Ｃ７  ｍＡｂは、ヒトＮｉＧ、ラットＮｉＧ、マウスＮｉＧ、ラットＮｉＧ−Ｄ２０およびペプチド４７２に、０.０２から２.５nMの非常に低い濃度で結合する。ヒトＮｉＧ、ラットＮｉＧ、マウスＮｉＧへの非常に低濃度での結合を、非常に高い親和性(Ｋｄ  ０.１−０.４４nM  Biosensor親和性測定)により確認し、これは２−３アミノ酸以外、４７２ペプチドが、ラットおよびマウス等価領域と比較してヒトで同一であるという事実と一致する。この結合の特異性は、マウス１１Ｃ７  ｍＡｂが、同じ濃度範囲でラットＮｉＧ−Ｄ６およびＮｏｇｏ−６６フラグメントにいかなる結合も示さないという事実により示唆される。Ｆａｂ一価フラグメントは、ヒトＮｉＧおよびラットＮｉＧ−Ｄ２０に０.０２５から２５nMの濃度で結合し、同じ濃度範囲でラットＮｉＧ−Ｄ６およびＮｏｇｏ−６６フラグメントに結合しない。Biosensorにより測定したＫｄは、ヒトＮｉＧで７.１４nMであった。
【０１１６】
実施例７：Ｎｏｇｏ−Ａドメインに対するマウス１１Ｃ７−ＩｇＧ１およびＦａｂのBiosensor親和性測定
マウス１１Ｃ７  ｍＡｂおよび１１Ｃ７  Ｆａｂの親和性を、ＢＩＡｃｏｒｅ  ２０００光学バイオセンサー(Biacore, Uppsala, Sweden)を使用し、製造者の指示にしたがって表面プラスモン共鳴(ＳＰＲ)により測定する(図２参照)。組み換えヒト、マウスおよびラットＮＩＧは、アミン−結合化学反応を使用してＣＭ５センサーチップの３つの別々のフローセルに共有結合させる。簡単に言えば；カルボキシメチル化デキストランマトリックスを、３５μlの０.０２５Ｍ  ＮＨＳおよび０.１Ｍ  ＥＤＣを含む溶液の注入により活性化する。センサーチップ上への固定化のために、組み換えマウス、ヒトおよびラットＮＩＧを３.５から４.５の範囲のｐＨの０.０１Ｍクエン酸緩衝液で希釈し、５μl／分の流速で注入して親和性測定を可能にする結合レベルを達成する。残りのＮＨＳ−エステル基の不活性化は、３５μlの１Ｍ  エタノールアミン塩酸塩(ｐＨ８.５)の注入により行う。センサーチップの表面を、５μl  ０.１Ｍ  ＨＣｌの注入により再生する。親和性の測定のために、本抗体を０.５０nMから１００nMの範囲の異なる濃度で、２００μl／分の流速で注入する。各注入後、センサーチップ表面を１０μl  ０.１Ｍ  ＨＣｌの注入により、表面上の結合活性の損失なしに再生する。速度定数ｋａおよびｋｄならびに親和性定数ＫＡおよびＫＤを、製造者により提供されたBIAevaluations 3.0ソフトウェアにより評価する。
【０１１７】
ＢＩＡｃｏｒｅでの親和性精製：組み換えＮｏｇｏＡに対するマウス１１Ｃ７  ｍＡｂおよび１１Ｃ７由来一価Ｆａｂフラグメントの速度および親和性結合定数を、リアルタイムで表面プラスモン共鳴(ＳＰＲ)法(Biacore)を使用して測定する。この分析のために、組み換えヒト、マウスおよびラットＮＩＧを、別々のセンサーチップ表面に結合させ、異なる濃度の抗体を注入する。結合相互作用の速度パラメーターは、非直線カーブフィッティングによるセンサーグラムに由来する。マウス１１Ｃ７−ＩｇＧ１の平衡での親和性定数は、ヒト、ラットおよびマウスＮＩＧに関して各々ＫＤ＝０.１nM、ＫＤ＝０.４nMおよびＫＤ＝０.１９nMである(表３)。１１Ｃ７由来Ｆａｂフラグメントに関して、ヒトＮＩＧに対する親和性定数はＫＤ＝７.１４nMである。Ｆａｂフラグメントの低い親和性は、速度定数、結合および解離(ｋａ、ｋｄ)の両方の減少に由来する。Ｆａｂフラグメントの完全抗体と比較して低い親和性は、おそらくモノマーＦａｂで欠いている親和力効果に関係するであろう。
【０１１８】
【表５】
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【図面の簡単な説明】
【０１１９】
【図１】配列比較：１１Ｃ７ｍＡｂに対する免疫原性ペプチド配列を示す、異なる種由来のＮｉＧの配列比較である。
【図１】
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【配列表】
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