(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトHIF-1をコードする核酸分子を標的とする、配列番号：２、5'aatgagccaccagtgtccaa 3'の配列を有し、ヒトHIF-1の発現を抑制するオリゴヌクレオチド化合物、RX-0047。
【請求項２】
アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１記載の化合物。
【請求項３】
少なくとも1の被修飾ヌクレオシド間結合であるホスホロチオエート結合を有する、請求項２記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物。
【請求項４】
請求項１記載の化合物をヒトの細胞または組織と接触させ、前記細胞または組織におけるHIF-1発現を抑制するための、請求項１記載の化合物を含む医薬組成物。
【請求項５】
ヒトHIF-1配列にハイブリダイズする、配列番号：２、5' aatgagccaccagtgtccaa 3'の配列を有するオリゴヌクレオチド化合物RX-0047を癌細胞内に導入し、該細胞において細胞障害性を誘導するための、該オリゴヌクレオチド化合物を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、ヒトタンパク質HIF-1の発現を抑制し、且ついくつかの癌細胞株において細胞障害性を誘導する新規なアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物、RX-0047およびRX-0149に関する。
【発明の背景】
【０００２】
腫瘍は、癌細胞に酸素と栄養素を供給する血管なくしては成長できない(Blagosklonny, International J. Oncol., 2001 19: 257-262)。哺乳類細胞における低酸素応答を転写因子、HIF-1によって制御することは、癌細胞の成長に対する主要な調節因子のひとつである。HIFは、低酸素状態で細胞を生残らせ、内皮成長の刺激を促すもので、広範な癌で上方制御される(Zhong et al., Cancer Res. 1999 59: 5830-5835)。HIFの血管新生および腫瘍進行における役割の最も顕著な例のひとつは、腫瘍抑制因子遺伝子VHLのタンパク質機能を消失させることであり、VHLはほとんどの散発性明細胞腎臓癌およびVHL疾患で突然変異している。それゆえ、HIF-1経路を破壊すると腫瘍成長は抑制され、このことは、HIF-1が潜在的な抗癌標的であることを示唆している。HIFが媒介する作用が腫瘍の血管新生を制御するので、HIF-1の抑制は作用機序に基づいた抗血管新生方法である。2001年4月24日発効の米国特許第6,222,018号(Semenza)は、HIF-1をコードするヌクレオチド配列に関する。本発明に開示し、請求する特定オリゴヌクレオチドは前記特許には開示されていない。
【発明の開示】
【０００３】
［発明の概要］
本発明はHIF-1をコードする核酸を標的とし、HIF-1(低酸素誘導性因子1(hypoxia-inducible factor 1))の発現を調節するアンチセンスオリゴヌクレオチドを対象とする。また、細胞におけるHIF-1の発現を抑制する方法であって、細胞を本発明のオリゴヌクレオチド化合物および組成物と接触させることを含む方法を提供する。前記のオリゴヌクレオチドの利点は、HIF-1の発現を抑制することに加え、いくつかの異なる癌細胞株に対して細胞障害効果を持つことである。本発明の効果は、HIF-1遺伝子(Genebank番号NM001530)の2,772位の以下の配列：5' ttggacactggtggctcatt 3'(配列番号：1)を有する部位に特異的にハイブリダイズ可能なアンチセンス化合物を、様々な癌細胞株の細胞と接触させることによって得られる。特に好ましいのは、5' aatgagccaccagtgtccaa 3'(配列番号：2)を含むRX-0047である。HIF-1遺伝子(Genebank番号NM001530)の1,936位の配列5' gacttggagatgttagctcc 3'(配列番号：3)に対してアンチセンスである化合物でも、同様の効果を得ることが出来る。特に好ましいのは、5' ggagctaacatctccaagtc 3'(配列番号：4)を含むRX-0149である。この接触は、該オリゴヌクレオチドとHIF-1をコードする遺伝子とのハイブリダイズが可能な状況下で起こる。ハイブリダイゼーション後、細胞のHIF-1生成能が抑制され、癌細胞の生存度は減少する。
【０００４】
HIF(低酸素誘導性因子)はヘテロ二量体の主要転写因子であり、低酸素下で活性化する。HIFは、哺乳類において低酸素状態に対する赤血球新生、血管新生および解糖などの恒常性反応を媒介するだけでなく、腫瘍の新血管新生および成長をも促進する。HIFは2つのサブユニット、HIF-1αおよびHIF-1βから構成されており、ARNT(アリル受容体核輸送体(Aryl Receptor Nuclear Translocator))としても知られている。この2つのサブユニットは、bHLH(ベーシック-へリックス-ループ-へリックス(basic helix-loop-helix))およびPAS(Per, ARNT, Sim)ファミリーに属している。これらの因子のbHLHドメインの2つのへリックスは二量体形成に、ベーシック領域はDNA結合に関与する。HIF-1αおよびHIF-2α内のこれら2つのドメインは、低酸素シグナル経路に応答する。前者は酸素依存性分解(ODD)ドメインで、正常酸素圧下で酸素依存性プロリル水酸化酵素による翻訳後修飾を受ける(Jaakkola et al., Science, 2001, 292: 468-472)。水酸化したプロリンは、HIFとVHL(von Hippel-Lindau)ユビキチンリガーゼ複合体との相互作用を促進し、素早いユビキチン化の後、プロテアソームによりHIFタンパク質が破壊される。HIFのCOOH末端トランス活性化ドメイン(CAD)のアスパラギンの水酸化も、プロテアソーム媒介性HIF破壊に重要な役割を担っており、該水酸化によりp300/CBPコアクチベーターとの相互作用が抑制され、正常酸素圧下でHIF-1転写活性が減少することが、最近の研究で示されている(Lando et al., Science, 2002, 295: 858-861)。このように、アスパラギン水酸化酵素はプロリル水酸化酵素とともに、細胞内のO2レベルで調節される低酸素スイッチとして作用する。低酸素状態では、p42/p44 MAPK活性がHIF-1の翻訳後リン酸化を誘導し、HIF-1の転写活性を促進する。最近の研究で、水酸化と同様に、ユビキチン化およびリン酸化、アセチル化がHIF-1の安定性の調節に重要な役割を持っていることが示された(Jeong et al., Cell, 2002, 111: 709-720)。
【０００５】
低酸素状態では、活性化に酸素分子を要する水酸化酵素が非活性になり、HIF-1αは水酸化されず、従って、HIF-1αはpVHLに認識されず細胞内に蓄積する。その後、HIF-1αは核に移動し、恒常的に存在するHIF-1βサブユニットと二量体を形成する(Semenza, Genes & Development, 1985, 14: 1983-1991)。その後、二量体は標的遺伝子内の低酸素応答要素(hypoxia responsive element)(HRE)と結合し、エリスロポエチン、VEGF(Forsythe et al., Mol. Cell. Biol., 1996, 16: 4604-4613)、血小板由来成長因子β(PDGF-β)、グルコース輸送体(GLUT1)および亜酸化窒素合成酵素(Neckers, J. Natl. Cancer Ins., 1999, 91: 106-107)のような遺伝子がトランス活性化する。特定のホルモンおよび成長因子もまた、HIF-1α濃度を増加させ、そして、特定の発癌遺伝子および腫瘍抑制遺伝子、例えばVHLの突然変異頻度も上昇させるので、結果としてHIF-1αレベルが増加する(Ivan and Kaelin, Current Opinion in Genetics & Development, 2001,  11: 27-34)。水酸化またはそれに代わる機構が、この低酸素非依存性HIF活性化に関与しているかどうかは興味深い問題である。
【０００６】
低酸素状態の微小環境および低酸素応答を利用した、いくつかの最新の癌の治療方法は以下の通りである：1)低酸素依存性薬物または遺伝子治療ベクター、2)HIFの安定性の抑制、3)HIFによるトランス活性化の抑制、4)VEGF抑制剤。
【０００７】
癌の進行におけるHIF転写因子の中心的な役割を考えると、腫瘍形成時にその働きを抑制することが望ましいと思われる。しかし、該ファミリーの細胞代謝における他の面での役割をできるだけ妨害しないようにすることも望ましいと思われる。低酸素状態で多く発現する有望な転写因子をコードする遺伝子を同定し、その遺伝子活性の正しい意味での抑制に利用できるアンチセンスオリゴヌクレオチドを発明することは、一つの方法であると考えられる。本発明者らは、2つのアンチセンスオリゴヌクレオチドがいずれも、HIF-1遺伝子のタンパク質産生を抑制する能力が高く、さらに様々な癌細胞株において細胞障害性を誘導することを発見した。
【０００８】
アンチセンス化合物は、生細胞に存在する核酸を修飾するのに用いることができる。「アンチセンス」なる用語は、核酸がタンパク質を「コードする」という概念を意味する。つまり、核酸のヌクレオチド配列は、何よりも、どのタンパク質が生産されるかを決定する。完全長遺伝子の「センス」配列は、与えられた刺激に応答して、正常なタンパク質を正常な量だけ生産する。「センス」オリゴヌクレオチドは、正常な遺伝子配列にハイブリダイズし、タンパク質の量や特性に影響を与えない。「ナンセンス」配列は産物を生産しないか、または非機能性の産物を生産する可能性がある。例えば、「ナンセンス」コドンまたはオリゴマーが遺伝子に挿入されると、生産されたタンパク質は、切断され、非機能性である可能性がある。「アンチセンス」オリゴヌクレオチドは正常遺伝子にハイブリダイズするが、生産されたタンパク質は構造または量が変化している。アンチセンスオリゴマー、すなわち比較的短いアンチセンス化合物は、細胞に容易に挿入でき、遺伝子の機能を改変することが分かっている。
【０００９】
アンチセンス化合物は、優れた特異性で遺伝子発現を改変できるので、遺伝子の機能を調べる研究用試薬として一般に用いられており、特定遺伝子の機能の解明に用いることができる。アンチセンス化合物は、例えば生物学的経路の様々なメンバーの機能の区別に用いることができる。
【００１０】
アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、疾患を引き起こす遺伝子を選択的にブロックすることができ、それにより疾患関連タンパク質の生産が抑制される。いくつかのアンチセンスオリゴヌクレオチドが安全に且つ効果的にヒトに投与されており、数多くの臨床試験が目下進行中である。このように、細胞、組織および動物、特にヒトの処置にオリゴヌクレオチドを用いることが可能である。本発明を説明するにあたり、「オリゴヌクレオチド」なる用語は、リボ核酸(RNA)またはデオキシリボ核酸(DNA)のオリゴマーまたはポリマーまたはそれらの擬態物を意味する。この用語には、天然に存在する核酸塩基、糖および共有結合性ヌクレオシド間(基本骨格)結合から構成されるオリゴヌクレオチドだけでなく、同様に機能し、天然に存在しない部分を持つオリゴヌクレオチドも含まれる。そのような修飾または置換されたオリゴヌクレオチドは、例えば、細胞への取り込み、標的核酸への親和性および核酸塩基存在下での安定性がより高いなどといった望ましい特性を持つので、しばしば天然型よりも好まれる。本発明は、HIF-1をコードする核酸の一部分を標的とし、HIF-1発現を変化させるオリゴマーヌクレオチド化合物、特にアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いる。オリゴヌクレオチド化合物はHIF-1をコードする1またはそれ以上の核酸に特異的にハイブリダイズするよう設計する。オリゴヌクレオチド、RX-0047は、HIF-1遺伝子(Genebank番号NM001530)の2,772位の以下の配列：5' ttggacactggtggctcatt 3'(配列番号：1)を有する部位を標的とする。RX-0047の基本骨格の該配列は、この部位と相補的である。オリゴヌクレオチド、RX-0149は、HIF-1遺伝子(Genebank番号NM001530)の1,936位のコード領域中の以下の配列：5' gacttggagatgttagctcc 3'(配列番号：3)を有する部位を標的とする。RX-0149の基本骨格の配列はこの部位と相補的である。本発明者らは、20merのRX-0047およびRX-0149が由来する配列の上流および下流に5または10ヌクレオチドを含むオリゴマーが、HIF-1 mRNA発現を測定可能程度に抑制することを発見した。しかし、本発明者らは、このオリゴヌクレオチドは変異に対してより敏感であること、また、18merのRX-0149はHIF-1 mRNA発現をいくらか抑制するが、どちらかの末端をさらに切断すると、HIF-1 mRNA発現の抑制がかなり失われることを発見した。20merのRX-0047およびRX-0149が由来する配列の上流および下流に5または10ヌクレオチドを含むオリゴマーは、癌細胞増殖の抑制を示した。HIF-1 mRNA発現をいくらか抑制する、切断型のRX-0047およびRX-0149もまた、癌細胞増殖の抑制を示した。
【００１１】
アンチセンス化合物を特定の遺伝子に標的化することは、目的の核酸配列を同定し、核酸配列内の修飾する1またはそれ以上の部位を選択することを意味する。標的部位を同定すれば、その部位に特異的にハイブリダイズする、つまり、十分強く且つ十分な特異性を持ってハイブリダイズして所望の効果が得られる、標的部位に十分相補的なオリゴヌクレオチドが選択できる。
【００１２】
本明細書で用いられる「HIF-1をコードする核酸」なる語句は、HIF-1をコードするDNA、そのようなDNAから転写されるRNA(プレmRNAを含む)およびそのようなRNAに由来するcDNAも包含する。アンチセンスオリゴマー化合物がその標的核酸へ特異的にハイブリダイズすると、その核酸の正常な機能が妨害される。妨害されるDNAの機能には、複製および転写が含まれる。妨害されるRNAの機能には、例えば、タンパク質翻訳部位へのRNAの転位、RNAのタンパク質への翻訳、1またはそれ以上のmRNA種を産生するためのRNAのスプライシング、およびRNAが関与するまたはRNAによって促進される酵素活性などの、あらゆる生体機能が含まれる。標的核酸の機能をそのように妨害して得られる総合的な効果は、タンパク質の発現または生産が調節されることである。本発明の文中において、「調節」は遺伝子発現の増加(刺激)または減少(抑制)を意味する。本発明の目的のために、HIF-1をコードする遺伝子は、HIF-1発現が抑制されるように調節される。
【００１３】
本発明の文中において、「ハイブリダイズ」は、水素結合を意味し、それはワトソン−クリックの、相補的ヌクレオシドまたはヌクレオチド塩基間の、フーグスティーン(Hoogsteen)または逆フーグスティーン水素結合であってもよい。例えば、アデニンとチミンは水素結合の形成で対になる祖補的核酸塩基である。本明細書で用いられる「相補的」は、2つのヌクレオチド間に正確な対を形成する能力を意味する。例えば、オリゴヌクレオチドのある位置のヌクレオチドが、DNAまたはRNA分子の同じ位置のヌクレオチドと水素結合することができる場合、そのオリゴヌクレオチドとDNAまたはRNAはその位置において互いに相補的であるとみなされる。それぞれの分子における十分数の対応位置が互いに水素結合可能なヌクレオチドによって占められている時、該オリゴヌクレオチドと該DNAまたはRNAは、互いに相補的である。このように、「特異的にハイブリダイズ可能な」および「相補的」は、オリゴヌクレオチドとDNAまたはRNA標的間に安定で特異的な結合が起こるような、十分な程度の相補性または正確な対形成を示す用語である。当分野には、アンチセンス化合物の配列は、その標的核酸の配列に特異的にハイブリダイズするために100％相補的である必要はないという共通認識がある。アンチセンス化合物が標的DNAまたはRNA分子に結合することにより、該標的DNAまたはRNAの正常な機能が妨害されて有用性が失われ、且つ、特異的な結合が望まれる条件、つまり、インビボ分析または治療上の処置の場合の生理的条件、およびインビトロ分析の場合のその分析が遂行される条件下で、十分な程度の相補性があり、該アンチセンス化合物と非標的配列との非特異的な結合が回避されるならば、該アンチセンス化合物は特異的にハイブリダイズ可能である。
【００１４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドはアンチセンス化合物の好ましい形態であるが、本発明は他のオリゴマーアンチセンス化合物も包含し、それは下記のようなオリゴヌクレオチド擬態物を含むがそれらに限定されない。本発明によるアンチセンス化合物は、核酸塩基を約10から約30個まで含むのが好ましい。特に好ましいのは、約20個の核酸塩基(つまり約20個の結合ヌクレオシド)を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである。当分野で周知の通り、ヌクレオシドは塩基-糖結合体である。ヌクレオシドの塩基部分は通常複素環塩基である。そのような複素環塩基の2つのもっとも一般的な種類は、プリンおよびピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分にリン酸基がさらに共有結合したヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むそれらのヌクレオシドに対して、リン酸基は糖の2'、3'または5'のいずれかのヒドロキシル部分に結合できる。オリゴヌクレオチドを形成する際、リン酸基は互いに隣接するヌクレオシドと共有結合し、直鎖状のポリマー化合物を形成する。この直鎖状のポリマー構造の各末端は、さらに次々に連結して環状構造を形成することも可能であるが、一般的には開直鎖状構造が好ましい。オリゴヌクレオチド構造内では、リン酸基は一般に、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間基本骨格を形成していると称される。RNAおよびDNAの正常な結合または基本骨格は、3'から5'へのリン酸ジエステル結合である。
【００１５】
本発明において有用な好ましいアンチセンス化合物の具体例には、被修飾基本骨格または非天然ヌクレオシド間結合を含有するオリゴヌクレオチドがある。本明細書で定義した通り、被修飾基本骨格を有するオリゴヌクレオチドは、基本骨格にリン原子を維持するもの、および基本骨格にリン原子を持たないものを含む。本明細書の目的のために、および当分野で時折言及されるように、ヌクレオシド間の基本骨格中にリン原子を持たない被修飾オリゴヌクレオチドもまた、オリゴヌクレオシドであると考えることができる。
【００１６】
好ましい被修飾オリゴヌクレオチドの基本骨格には、例えば、ホスホロチオエート、キラルなホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、3'-アルキレンホスホン酸およびキラルなホスホン酸などのメチルおよび他のアルキルホスホン酸、ホスフィン酸、3'-アミノホスホラミデートおよびアミノアルキルホスホラミデートなどのホスホラミデート、チオノホスホラミデート、チオノアルキルホスホン酸、チオノアルキルホスホトリエステル、および正常な3'-5'結合、これらの2'-5'結合アナログおよびヌクレオシド単位の隣接する対が3'-5'から5'-3'へ、または2'-5'から5'-2'へ結合している逆方向性の結合を有するボラノホスフェートが含まれる。様々な塩、混合塩および遊離酸型もまた含まれる。
【００１７】
リン原子を含まない好ましい被修飾オリゴヌクレオチドの基本骨格は、短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または1またはそれ以上の短鎖ヘテロ原子または複素環式ヌクレオシド間結合によって形成される基本骨格を持つ。これらは、モルホリノ結合(morpholino linkages)(ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成される)を持つ基本骨格、シロキサン基本骨格、硫化物、スルホキシドおよびスルホン基本骨格、ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル基本骨格、メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル基本骨格、アルケン含有基本骨格(alkene containing backbones)、スルファミン酸基本骨格、メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ基本骨格、スルホン酸塩およびスルホンアミド基本骨格、アミド基本骨格、およびN、O、SおよびCH2混合構成成分を有する他の基本骨格を含む。
【００１８】
他の好ましいオリゴヌクレオチド擬態物では、ヌクレオチド単位の糖およびヌクレオシド間結合つまり基本骨格の両方が、新規な基で置換されている。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とハイブリダイゼーションするために維持されている。そのようなオリゴマー化合物の１つである、優れたハイブリダイゼーション特性を持つことが示されているオリゴヌクレオチド擬態物は、ペプチド核酸(PNA)と呼ばれている。PNA化合物において、オリゴヌクレオチドの糖-基本骨格は、基本骨格、特にアミノエチルグリシン基本骨格を含有するアミドによって置換されている。核酸塩基は維持され、基本骨格のアミド部分の炭素の代わりの窒素原子に直接または間接的に結合している。
【００１９】
もっとも好ましい本発明の態様は、ホスホロチオエート基本骨格を持つオリゴヌクレオチド、およびヘテロ原子基本骨格、特に-CH2-NH-O-CH2-、-CH2-N(CH3)-O-CH2-(メチレン(メチルイミノ)またはMMI基本骨格として知られている)、-CH2-O-N(CH3)-CH2-、-CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2-および-O-N(CH3)-CH2-CH2-（ちなみに天然リン酸ジエステル基本骨格は-O-P-O-CH2-と表される)を持つオリゴヌクレオシドである。モルホリノ基本骨格構造を持つオリゴヌクレオチドもまた好ましい。
【００２０】
被修飾オリゴヌクレオチドはまた、1またはそれ以上の糖部分が置換されていてもよい。好ましいオリゴヌクレオチドは2'位に以下のうち１つを含む：OH、F、O-アルキル、S-アルキルまたはN-アルキル、O-アルケニル、S-アルケニルまたはN-アルケニル、O-アルキニル、S-アルキニルまたはN-アルキニル、またはO-アルキル-O-アルキル、(ここで、該アルキル、アルケニルおよびアルキニルは置換または非置換C1-C10アルキルまたはC2-C10アルケニルおよびアルキニルであり得る)。特に好ましいのは、O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2およびO(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2(ここでnおよびmは1から約10)である。他の好ましいオリゴヌクレオチドは2'位に以下のうち１つを含む：C1-C10低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、O-アルカリルまたはO-アラルキル、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、RNA切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改善するための基またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善するための基、および同様の特性を持つ他の置換基。好ましい修飾には、2'-メトキシエトキシ(2'-O-CH2CH2OCH3、また2'-O-(2-メトキシエチル)または2'-MOEとしても知られる)(Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504)つまり、アルコキシアルコキシ基が含まれる。さらに好ましい修飾には、2'-ジメチルアミノオキシエトキシ、つまり、後文の実施例に記載する通り2'-DMAOEとしても知られるO(CH2)2ON(CH3)2基が含まれる。他の好ましい修飾には、2'-メトキシ(2'-O-CH3)、2'-アミノプロポキシ(2'-OCH2CH2CH2NH2)および2'-フルオロ(2'-F)が含まれる。同様の修飾はまた、オリゴヌクレオチド上の他の位置、特に3'末端ヌクレオチド上または2'-5'結合オリゴヌクレオチド内の糖の3'位、および5'末端ヌクレオチドの5'位になされてもよい。オリゴヌクレオチドはまた、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分のような糖擬態物を含んでいてもよい。オリゴヌクレオチドはまた、核酸塩基(当分野ではしばしば単に「塩基」と呼ばれる)の修飾または置換を含んでいてもよい。本明細書で用いられる「非修飾」または「天然」核酸塩基には、プリン塩基であるアデニン(A)およびグアニン(G)、およびピリミジン塩基であるチミン(T)、シトシン(C)およびウラシル(U)が含まれる。被修飾核酸塩基には、5-メチルシトシン(5-Me-C)、5-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの6-メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの2-プロピルおよび他のアルキル誘導体、2-チオウラシル、2-チオチミンおよび2-チオシトシン、5-ハロウラシルおよびシトシン、5-プロピニルウラシルおよびシトシン、6-アゾウラシル、シトシンおよびチミン、5-ウラシル(偽ウラシル)、4-チオウラシル、8-ハロ、8-アミノ、8-チオール、8-チオアルキル、8-ヒドロキシルおよび他の8-置換アデニンおよびグアニン、5-ハロ特に5-ブロモ、5-トリフルオロメチルおよび他の5-置換ウラシルおよびシトシン、7-メチルグアニンおよび7-メチルアデニン、8-アザグアニンおよび8-アザアデニン、7-デアザグアニンおよび7-デアザアデニンおよび3-デアザグアニンおよび3-デアザアデニンなどの、他の合成および天然核酸塩基が含まれる。ある核酸塩基は本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を増加させるのに特に有用である。これらには、2-アミノプロピルアデニン、5-プロピニルウラシルおよび5-プロピニルシトシンなどの、5-置換ピリミジン、6-アザピリミジン、およびN-2、N-6およびO-6置換プリンが含まれる。5-メチルシトシン置換は0.6-1.2℃において核酸二本鎖の安定性を増加させることが示されており、特に2'-O-メトキシエチル糖修飾と組み合わされる場合にはなお一層、目下好ましい塩基置換である。
【００２１】
本発明の別のオリゴヌクレオチド修飾には、オリゴヌクレオチドへの1またはそれ以上の部分の化学的結合、またはその活性、細胞分化または細胞によるオリゴヌクレオチド取得を促進するコンジュゲートが含まれる。そのような部分には、コレステロール部分、コール酸、例えばヘキシル-S-トリチルチオール、チオコレステロールなどのチオエーテル、例えばドデカンジオールまたはウンデシル残基などの脂肪族鎖、例えばジ-ヘキサデシル-rac-グリセロールまたはトリエチル-アンモニウム 1,2-ジ-O-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-H-ホスホン酸などのリン脂質、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖、またはアダマンタン酢酸、パルミチル部分、またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ-カルボニル-オキシコレステロール部分のような、脂質部分が含まれるがこれらに限定されない。
【００２２】
ある化合物内の全ての位置が一様に修飾されている必要はなく、実際には、一化合物内に、または極端にはオリゴヌクレオチド内の一ヌクレオシドに上記修飾のうち１つより多くが包含されていればよい。本発明はまたキメラな化合物であるアンチセンス化合物も含む。本発明の文中における「キメラ(chimeric)」アンチセンス化合物または「キメラ(chimeras)」は、それぞれが少なくとも1つのモノマー単位、つまり、オリゴヌクレオチド化合物の場合のヌクレオチドから構成される、2またはそれ以上の化学的に異なる領域を含有するアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは通常、そのオリゴヌクレオチドの、核酸分解酵素による分解に対する耐性が向上し、細胞による取得が増加し、および/または標的核酸に対する結合親和性が向上するように、少なくとも1つの領域が修飾されている。該オリゴヌクレオチドのさらなる領域は、RNA:DNAまたはRNA:RNAハイブリッドを切断する酵素の基質となり得る。一例として、RNase HはRNA:DNA二本鎖のRNA鎖を切断する細胞性エンドヌクレアーゼである。従って、RNase Hが活性であると標的RNAが切断され、それによりオリゴヌクレオチドの遺伝子発現抑制効果が大いに促進される。結果的に、同じ標的領域にハイブリダイズするホスホロチオエート化デオキシオリゴヌクレオチドと比較して、キメラオリゴヌクレオチドを用いる場合の方が、より短いオリゴヌクレオチドで同様の効果がしばしば得られる。標的RNAが切断されているかは、ゲル電気泳動および要すれば当分野で既知の関連核酸ハイブリダイゼーション技術によって、日常的に確認することができる。
【００２３】
本発明のキメラアンチセンス化合物は、上記のように、2またはそれ以上のオリゴヌクレオチド、被修飾オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドおよび/またはオリゴヌクレオチド擬態物の複合構造をとるように形成してもよい。そのような化合物は当分野でハイブリッドまたはギャップマー(gapmers)とも呼ばれている。
【００２４】
本発明で用いられるアンチセンス化合物は、周知の固相合成技術によって便利よく且つ日常的に生成することができる。そのような合成をするための装置は、例えばApplied Biosystems(フォスターシティー、CA)などのいくつかの業者が販売している。そのような合成をするための当分野で既知の他のどんな方法も付加的にまたは代わりに用いてもよい。同様の技術を用いてホスホロチオエート化およびアルキル化誘導体などのオリゴヌクレオチドを調製できることはよく知られている。
【００２５】
本発明のアンチセンス化合物はインビトロで合成されるものであり、生物学的起源のアンチセンス組成物、またはアンチセンス分子のインビボ合成を導くように設計された遺伝的ベクターコンストラクトは含まない。本発明の化合物は、混合、カプセル封入、コンジュゲート、または他の態様にて、例えばリポソーム、レセプターを標的にする分子、経口、直腸、局所的製剤形態、または摂取、分配および/または吸収を補助する他の製剤形態などの、他の分子、分子構造、または化合物の混合物と共に処方される。
【００２６】
本発明のアンチセンス化合物は、あらゆる製薬的に許容される塩、エステル、またはそのようなエステルの塩、または、ヒトを含めた動物に投与すると、生物学的に活性な代謝産物またはそれらの残留物を(直接または間接的に)提供することができるあらゆる他の化合物を包含する。従って、例えば、本発明は本発明の化合物のプロドラッグおよび製薬的に許容される塩、該プロドラッグの製薬的に許容される塩、および他の生物学的等価物にも及ぶ。
【００２７】
「プロドラッグ」なる用語は、非活性型に調製され、体内またはその細胞内で、内在性の酵素または他の化学物質および/または状態の作用によって活性型(つまり薬物)に変換される治療薬を示す。特に、本発明のオリゴヌクレオチドのプロドラッグ型は、SATE[(S-アセチル-2-チオエチル)リン酸]誘導体として調製される。
【００２８】
「製薬的に許容される塩」なる用語は、本発明の化合物の生理学的且つ製薬的に許容される塩、つまり、親化合物の所望の生物学的活性を保持し、親化合物に対し好ましくない毒物学的影響を与えない塩を意味する。
【００２９】
オリゴヌクレオチドの製薬的に許容される塩の好ましい例には、以下の塩が含まれるがそれらに限定されない：(a)ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウム、スペルミンおよびスペルミジンのようなポリアミンなどのカチオンで形成される塩、(b)例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸などの非有機酸で形成される酸付加塩、(c)例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パルミチン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、メタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸、などの有機酸で形成される塩、および(d)塩素、臭素およびヨウ素などの基本的なアニオンから形成される塩。
【００３０】
本発明の化合物は、アンチセンス化合物の有効量を製薬的に許容される適切な希釈液または担体に加えることにより、医薬組成物として利用可能になる。本発明のアンチセンス化合物の使用および方法は、例えば、感染、炎症または腫瘍形成などの防止または遅延にも、予防的に有用であり得る。
【００３１】
本発明のアンチセンス化合物は、HIF-1をコードする核酸にハイブリダイズすることから、このことを利用してサンドイッチや他の分析を簡単に構築することができるので、研究および診断に有用である。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドとHIF-1をコードする核酸とのハイブリダイゼーションは、当分野で既知の方法で検出できる。そのような方法には、酵素のオリゴヌクレオチドへの結合、オリゴヌクレオチドの放射性同位体によるラベル付け、またはあらゆる他の適切な検出方法が含まれ得る。そのような検出方法を用いてサンプル中のHIF-1濃度を検出するキットも入手可能である。
【００３２】
本発明はまた、本発明のアンチセンス化合物を含む医薬組成物および製剤も含む。本発明の医薬組成物は、局所的処置か全身的処置のどちらが望ましいかや、処置する部位に依拠する多くの方法で投与できる。投与は、局所的(眼内投与および膣や直腸輸送などの粘膜への投与、噴霧器を使用するなど粉末またはエアロゾルの吸入またはガス注入による、経気管、経鼻腔、表皮および経皮を含む肺への投与)であっても、経口または非経口であってもよい。非経口投与には、静脈、動脈、皮下、腹腔内または筋肉内注射または注入、または、頭蓋内、例えばくも膜下腔内または脳室内投与が含まれる。少なくとも1の2'-O-メトキシエチル修飾を持つオリゴヌクレオチドは、経口投与に特に有用であるとされている。
【００３３】
局所的投与のための医薬組成物および製剤には、経皮貼付、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、坐薬、スプレー、液体および粉末などがあり得る。従来の医薬担体、水溶性、粉末性または油性基剤、増粘剤などが必要または望ましい場合がある。
【００３４】
経口投与のための組成物および製剤には、粉末または顆粒、水または非水溶媒中の懸濁液または溶液、カプセル、サシエ（小袋）または錠剤が含まれる。増粘剤、着香料、希釈液、乳化剤、分散補助剤または結合剤が望ましい場合がある。
【００３５】
非経口、くも膜下腔内または脳室内投与のための組成物および製剤には、緩衝液、希釈液、および、浸透促進剤、担体化合物および他の製薬的に許容される担体または賦形剤などがあるがこれらに限定されない他の適切な添加剤を含有し得る滅菌水溶液が含まれていてもよい。
【００３６】
本発明の医薬組成物は、溶液、乳濁液およびリポソーム含有製剤を含むが、これらに限定されない。これらの組成物は、予製液、自己乳化固体および自己乳化半固体などであるがこれらに限定されない様々な成分から調製できる。
【００３７】
［実施例］
下記の実施例は、本発明の様々な面の実施の説明である。これらは本発明または添付の特許請求の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００３８】
癌細胞株の培養
オリゴヌクレオチド化合物の効果の測定に用いる癌細胞は以下の株から得た：American Type Culture Collection(ATCC)(マナッサス、VA)のヒトOVCAR-3(卵巣)、MCF-7(胸、ホルモン依存性)、HeLa(頚部)、PC3(前立腺)、HepG2(肝臓)、A549(肺)、HT-29(大腸)、PANC-1(膵臓)およびCaki-1(腎臓)、Riken Cell Bank(日本)のU251(脳)、German Collection of Microorganisms and Cell Cultures(DSMZ)(ドイツ)のMKN-45(胃)、United States National Cancer Institute(ベテスダ、MD)のUMRC2(肝臓)およびLox IMVI(黒色腫)。UMRC2、Caki-1およびPANC-1を除く全ての細胞株は、10％ウシ胎児血清(「FBS」)、1mMピルビン酸ナトリウム、10mM HEPESおよび100U/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシン(「P/S」)を補ったRPMI1640培地(Invitrogen、カールズバッド、CA)で培養した。UMRC2、Caki-1およびPANC-1細胞は、10％FBS、P/S、10mM HEPESおよび2mM L-グルタミンを補ったダルベッコ変法イーグル培地(「DMEM」、Invitrogen)で維持した。全ての細胞は、加湿した5％CO2下37℃で培養した。
【実施例２】
【００３９】
オリゴヌクレオチドの合成
ヒトHIF-1遺伝子の、オープンリーディングフレーム(「ORF」)として知られるコード領域および3'非翻訳領域(「3' UTR」)に見られる種々のヌクレオチド配列を標的として選択し、対応する相補的オリゴヌクレオチドを合成した。アンチセンスオリゴヌクレオチドを作製するため、3'および5'末端を除くヌクレオチド間に、ホスホロチオエート結合を導入する合成過程で、それぞれのオリゴヌクレオチドの基本骨格を修飾した。
【００４０】
HIF-1コード領域に位置するオリゴヌクレオチドを、Applied Biosystems、フォスターシティー、CA(「ABI」)の8909 Expedite DNA synthesizerを用いて合成した。ホスホロチオエートの合成は、亜リン酸結合を段階的にチエーション(thiation)するために、標準酸化瓶(standard oxidation bottle)を0.2M 3H-1,2-ベンゾジチオール-3-オン1,1-ジオキシドのアセトニトリル溶液で置換する以外は、対応するリン酸ジエステルオリゴヌクレオチドの合成と同じ方法で行った。オリゴヌクレオチド化合物を多孔質ガラスビーズ(controlled pore glass)カラムから切断し、濃縮水酸化アンモニウム中で非ブロック化した後、水酸化アンモニウム存在下55℃で一晩加熱した。上清を新しいチューブに移し、Speedvac plusおよびUVS400 Universal Vacuum System(Thermo Savant、ホールブルック、NY)で水酸化アンモニウムを蒸発させた。pH7.2の75mM NaOAcおよび2.5体積のエチルアルコールでオリゴヌクレオチドを沈殿させ、エチルアルコールで１回洗浄した。オリゴヌクレオチドを水に溶解し、UV分光光度計でオリゴヌクレオチド濃度を測定した。
【実施例３】
【００４１】
移入
移入の前日、細胞をトリプシン処理し、カウントし、プレートに蒔いた。移入当日に密集度が50-90％に達するように、6穴プレートの各穴にUMRC2細胞を2.5x105個蒔いた。移入実験に用いる全ての試薬および培養液は、Invitrogen(カールズバッド、CA)から入手した。以下の溶液を滅菌チューブに調製した。溶液A：各移入において、2μl(0.5μg)のDNA、100μlの無血清培養液(「Opti-MEM」)および3μlのPLUS試薬の混合物を室温で15分間インキュベートした。溶液B：各移入において、2.5μlのリポフェクトアミン試薬および100μlの無血清培養液(Opti-MEM)の混合物。溶液AおよびBを混合し、室温で15分間インキュベートした。移入において、2mlの無血清培養液またはPBSで細胞を1回洗浄し、800μlの無血清培養液(Opti-MEM)を各穴に加えた。混合した溶液AおよびBを各穴に加え、穏やかに混ぜ合わせた。引き続いて、細胞を37℃で3時間インキュベートし、培養液を標準培養液に置き換え、指示時間インキュベートした。RT-PCRおよび細胞障害性実験には標準リポフェクトアミン2000を用い、細胞を移入の前日に96穴プレートの100μlの成長培地に蒔いた。各穴用に、オリゴヌクレオチドサンプルをOPTI-MEM血清使用量低減培地(reduced serum medium)25μlに希釈した。別個に、リポフェクトアミン2000試薬を25μlのOPTI-MEMに1:50の割合で希釈し、室温に5分間置いた。オリゴヌクレオチドと試薬を混合し、室温で20分間インキュベートして複合体を形成させ、その後、該複合体を成長培地内の細胞に直接加え、穏やかに混ぜ合わせた。次いで、細胞を37℃で4時間インキュベートし、その後成長培地を標準培地に置換し、指示時間インキュベートした。
【実施例４】
【００４２】
アンチセンスオリゴヌクレオチドによるHIF-1α mRNA発現の抑制
得られたアンチセンスオリゴヌクレオチドの、HIF-1αをコードするmRNAの発現を下方制御する、または抑制する能力を試験した。アンチセンスオリゴヌクレオチドを移入した細胞におけるHIF-1α mRNA発現レベルをRT-PCR解析で測定した。移入(培地の置換)から2時間後にサンプルを採取し、RNAを単離してRT-PCR解析にかけた。
【００４３】
6穴プレート上のUMRC2細胞(穴あたり細胞2.5x105個)に被験オリゴヌクレオチドを移入し、得られた移入細胞からトータルRNAを単離した。RNA-STAT kit(TEL-TEST, Inc.、フレンズウッド、TX)を用いて説明書に沿ってトータルRNAを単離した(Chomczynski, P. and Sacchi, N in Anal. Biochem. 162: 156-159 (1987)もまた参照のこと)。簡潔に述べると、2つの6穴プレートから培地を除去し、総量0.5mlのRNA-STAT溶液を加え、数回ピペッティングして混合し、エッペンドルフチューブへ移した。0.1mlのクロロホルムをチューブに加え、チューブを15秒間激しく振盪し、その後室温で3分間インキュベートしてから14,000rpm、4℃で15分間遠心分離した。最上層を新しいチューブに移し、0.3mlのイソプロパノールを加え、10分間室温でインキュベートした。次いで、RNAの沈殿を14,000rpmで10分間遠心分離した。生じたペレットを70％エタノールで洗浄し、短時間乾燥させ、20μlの水に戻した。RNA濃度を分光光度計で測定した。M-MLV enzyme kit(Invitrogen)を用いてRT反応を行った。5μgのトータルRNAを用いて20μlのRT反応液中でcDNAを合成した。トータルRNA、oligo dT(0.5mg)およびdNTP(0.5mM)の混合物を65℃で5分間インキュベートし、氷上で急冷して第一鎖cDNAを合成した。第一鎖緩衝液、7.4mM DTTおよび1μL M-MLV逆転写酵素(200単位)を上記の反応混合物に加え、37℃で50分間インキュベートし、次いで70℃で15分間インキュベートして酵素を失活させた。RT反応で合成したHIF-1 cDNAを、Sapphire RCR mix(SuperBio Inc.、ソウル、韓国)と適切なプライマーを用いてPCR測定した。HIF-1α mRNA測定のためのプライマーは、5' GCACAGGCCACATTCACG 3'(配列番号：5)および5' TGAAGATTCAACCGGTTTAAGGA 3'(配列番号：6)であった。PCR内部標準としてベータアクチンを用いた。ベータアクチン用のプライマーは、5' CCCATGCCATCCTGCGTCTG 3'(配列番号：7)および5' ACGGAGTACTTGCGCTCAG 3'(配列番号：8)であった。PCR産物を1.5％アガロースゲルの電気泳動で解析した。
【００４４】
最初にスクリーニングした合計124のオリゴヌクレオチドのうち、好ましい4のオリゴヌクレオチドの結果を以下の表1に示す。それぞれのオリゴヌクレオチドはmRNA発現の下方制御レベルを確認するために再解析した。それぞれの反応は2回行った。
【表１】
0004546454.tif 000002
【００４５】
RX-0047、RX-0073、RX-0149およびRX-0158は、本発明者が設計した新規な配列である。これらは、文献中の2領域、HIF-1α遺伝子の3'UTRおよびORF領域から代表として選択されたもので、引例中で用いられた試験によれば、この2領域は両者とも最も高い抑制率(％)を示していた。他の全てのオリゴヌクレオチドは本発明者によって設計された新規な配列を持つ。新規な配列は全て、本明細書記載の試験において引例の配列よりも高い抑制率(％)を示した。しかし、実施例6に記載のように、抑制率(％)は細胞障害性とは相関していないことが分かった。続いて、UMRC2細胞において高いHIF-1 mRNA発現抑制率(％)および細胞障害性を示した2オリゴヌクレオチドを、他の12癌細胞株で試験するために選択した。試験したヌクレオチドの一覧表を以下の表2に示す。
【００４６】
【表２】
0004546454.tif 000003
【表３】
0004546454.tif 000004
【表４】
0004546454.tif 000005
【００４７】
図1は、0.3μMのRX-0047およびRX-0149を移入した後の13癌細胞株(UMRC2、OVCAR-3、MKN-45、A549、PC3、U251、Lox IMVI、HeLa、HepG2、HT-29、Caki-1、PANC-1およびMCF-7)におけるHIF-1 mRNAレベルの下方制御を示す。UMRC2、PANC-1、OVCAR-3、MCF-7、Lox IMVI、A549およびPC3細胞株では高レベルのHIF-1下方制御が観察され、HT-29およびCaki-1細胞では中程度の下方制御が観察され、HeLa、HepG2、MKN-45およびU251では低レベルの下方制御が観察された。図1に示すように、RX-0047およびRX-0149のHIF-1 mRNA発現の下方制御レベルは、いくつかの細胞株でRX-0047処理細胞がRX-0149処理細胞よりも少しだけ高い下方制御レベルを示した他は、同じ程度であった。
【実施例５】
【００４８】
HIF-1タンパク質濃度のウエスタンブロット解析
上記の実施例3に記載した通りに、0.3μMの濃度の、好ましいRX-0047およびRX-0149オリゴヌクレオチドを様々な癌細胞株に移入した。移入後24時間になる前の6時間、鉄キレート剤である、最終濃度100μMのデフェルオキシアミン(deferroxiamine)で細胞を処理した。核抽出物の調製には、以下の方法を用いた。10cmのシャーレ上で、0.1mM NaVO4を含有する氷冷PBSで細胞を穏やかに洗浄し(2×6ml)、0.1mM NaVO4を含有する氷冷PBS 1mlに再懸濁し、2000rpmで5分間遠心分離した。0.5％NP40を含むpH7.6のCE緩衝液(10mM HEPES、60mM KCl、1mM EDTA、1mM DTT、1mM PMSF、1×プロテアーゼ阻害剤カクテル(protease inhibitor cocktail)および0.1mM NaVO4)0.3-0.5mlに、ペレットを再懸濁し、氷上で5分間細胞を膨張させた。該調製物を2000rpmで5分間遠心分離した。細胞質抽出物をペレットから取り出し、新しいチューブに移した。NP40を含まないCE緩衝液0.5mlで核を穏やかに洗浄した。核を上記のように2,000rpmで5分間遠心分離した。pH8.0のNE緩衝液(20mM Tris-HCl、420mM NaCl、1.5mM MgCl2、0.2mM EDTA、1mM PMSF、25％グリセロール、0.1mM NaVO4および1×プロテアーゼ阻害剤カクテル)50μlを核ペレットに加え、ボルテックスして再懸濁した。該抽出物を断続的にボルテックスしながら氷上で40分間インキュベートし、全ての核をペレット化するために、CEおよびNE画分を最大速度で15分間遠心分離した。上清を新しいチューブに移し(溶解性核画分)、−70℃で保存した。BCAタンパク質定量試薬(Pierce Biotechnology、ロックフォード、IL)を用いてタンパク質濃度を測定した。粗製の細胞抽出物のHIF-1タンパク質発現を、SDS-PAGEに続いて抗HIF1抗体(Transduction Labs、レキシントン、KY)を用いたウエスタン解析により測定した。内部標準として抗ベータアクチン抗体(Santa Cruz Biotechnology)を用いた。結果を図2に示す。RX-0047とRX-0149の両方は、程度の差はあるが、全ての細胞株においてHIF-1タンパク質発現の抑制を示した。
【実施例６】
【００４９】
細胞障害活性試験
ヒト癌細胞株を用いて被験オリゴヌクレオチドの細胞障害活性を試験した。スルホローダミンB(「SRB」)法(Skehan et al., J. National Cancer Institute, 82: 1107-1112 (1990))を用いてRX-オリゴヌクレオチド移入後の細胞生存を評価した。
【００５０】
細胞を96穴プレート上に蒔き、翌日にオリゴヌクレオチドを移入した。72時間のインキュベーションの後、生存細胞をスルホローダミンBで染色し、マイクロプレートリーダーで計測した。簡潔に述べると、96穴プレートの各穴に1,000から10,000の細胞を蒔き、リポフェクトアミン2000試薬(Invitrogen)を用いて被験オリゴマーを移入した。4時間のインキュベーションの後、移入用試薬を除去し、新たに調製した培養液を各穴に加えた。72時間のインキュベーションの後、培養液を除去した。細胞を10％トリクロロ酢酸(「TCA」)で固定し、4℃で1時間インキュベートし、水道水で4回洗浄した。次いで、細胞を0.4％スルホローダミンB／1％酢酸で30分間染色し、1％酢酸で4回洗浄し、さらに空気乾燥した。10mM Tris溶液中に5分間攪拌した後、Benchmark Plusマイクロプレートリーダー(Bio-Rad Laboratories、ハーキュリーズ、CA)を用いて530nmでサンプルの光学密度を測定した。
【００５１】
HIF-1 mRNAの下方制御を示した被験化合物の、UMRC2細胞生存度に対する効果を試験した。以下のオリゴ化合物、RX-0047、RX-0073、RX-0149およびRX-0158を細胞障害性実験に用いた。RX-0047およびRX-0149は試験した他のオリゴヌクレオチドと比較して最も強力な細胞障害活性効果を示した。興味深いことに、新規なオリゴヌクレオチド、RX-0118およびRX-0121のmRNA抑制率(％)はそれぞれ74および45であったが、RX-0047およびRX-0149ほどの細胞障害性を示さなかった。従って、mRNA抑制試験は細胞障害性と相関しなかった。
【００５２】
mRNA抑制研究の最有力候補の2つRX-0047およびRX-0149を、様々な癌細胞株に対する細胞障害性でスクリーニングした。RX-0047によって以下のヒト癌細胞株の細胞生存度が減少した：PC3(前立腺)、U251(脳)、HeLa(頚部)、OVCAR-3(卵巣)、Lox IMVI(黒色腫)、HepG2(肝臓)、MCF-7(胸)、UMRC2(腎臓)、MKN-45(胃)、PANC-1(膵臓)、HT-29(大腸)、Caki-1(腎臓)およびA549(肺)。試験したそれぞれの細胞株において、RX-0047の細胞障害活性は、RX-0047濃度とともに増大した。0.1μMのRX-0047では、試験した13細胞株すべてにおいて、50％より多くの細胞に細胞死が起こった。RX-0149でも同様の結果が得られた。やはり、RX-0149も全細胞株において細胞障害性を示し、その障害性はそれぞれの細胞株において濃度とともに様々な程度で増大した。0.1μMのRX-0149では、PC3、U251、HeLa、OVCAR-3、Lox IMVI、MCF-7、MKN-45、A549、Caki-1およびUMRC2において50％より多くの細胞に細胞死が起こった。しかし、PANC-1、HT-29およびHepG2においては、0.1μMでは、50％より多くの細胞が生き残った。
【実施例７】
【００５３】
RX-0047およびRX-0149オリゴヌクレオチドの細胞障害活性を表すIC50の測定
被験オリゴヌクレオチドを相対有効量でスクリーニングした。13の異なる癌細胞株に、0.01μMから1μMの濃度範囲のRX-0047またはRX-0149を移入し、移入から72時間後、細胞をスルホローダミンBで染色し、Bio-Radマイクロプレートリーダー(Bio-Rad Laboratories)で生存細胞数をカウントした。IC50値または細胞の半数を殺すのに必要な薬物濃度を、KaleidaGraphソフトウェア(Synergy Software、レディング、PA)プログラムで計算した。結果を下の表3に示す。
【表５】
0004546454.tif 000006
【００５４】
比較のために、UMRC2のIC50は、RX-0047で8nM、RX-0149で17nMであることを特記しておく。細胞株U251、OVCAR-3およびA549においても、同程度の細胞障害効果が観察された。
【実施例８】
【００５５】
配列の可変性
HIF-1 mRNA発現を下方制御するのに、RX-0047およびRX-0149は完全な20merの基本骨格である必要があるどうかを決定するために、18-、16-、14-および10merのオリゴヌクレオチドを合成し、mRNA発現および細胞障害性への効果を分析した。RT-PCR解析データでは、18mer型のRX-0047は、ある程度のHIF-1 mRNA発現抑制を示した。一方、16、14および10mer型は、より弱いHIF-1 mRNA発現抑制を示した。このことは、RX-0047の配列を16、14および10merに切断しても、ある程度のHIF-1 mRNA発現抑制効果があることを示唆している。RX-0149に関しては、18および16mer型のRX-0149は、20mer型のRX-0149と同様のHIF-1 mRNA発現抑制を示した。しかし、14および10mer型RX-0149になるまで配列を切断した場合、抑制はわずかなものとなった。このことは、RX-0047に関しては、18および16mer型も20mer型と同程度の効率で作用したことを示している。RX-0149に関しては、最大のHIF-1 mRNA発現抑制を達成するには、20merの完全長配列が必要である。
【００５６】
上記のデータと併せて、20merのRX-0047が由来する配列の上流および下流の両方に5または10のヌクレオチドを含むオリゴマーは、測定可能なHIF-1 mRNA発現抑制を示すことを確認した。
【００５７】
20merのRX-0047が由来する配列の上流および下流に5または10のヌクレオチドを含む同じオリゴマーを用いて、UMRC2細胞株における細胞障害性を試験した。RT-PCRデータと一貫して、全4つの被修飾オリゴマーが、20merのRX-0047に匹敵する細胞障害効果を示した。上記のRX-0047およびRX-0149の切断型もまた、RT-PCR解析で観察したように、癌細胞増殖に同様の抑制パターンを示した。
【実施例９】
【００５８】
エキソビボ異種移植研究
動物モデルにおいて、本発明の化合物のひとつ、RX-0047による腫瘍成長の抑制を観察するために、ヌードマウスのエキソビボ異種移植研究を行った。ダルベッコ変法イーグル培地と199培地(medium 199)の4：1混合物に10％子牛血清(cosmic calf serum)(HyClone、ローガン、UT)を補った培地で、ヒト肺癌細胞株A549を培養した。5％CO2下37℃で細胞を維持した。
【００５９】
マーカー遺伝子、ルシフェラーゼを腫瘍細胞に導入した。以下の方法を用いた。ルシフェラーゼ遺伝子およびG418/neo選択マーカーを含有するレンチウイルスベクターを用いて、細胞をルシフェラーゼに感染させた。ウイルスの上清の存在下で、細胞を24時間インキュベートした。感染の後に培地を変え、感染後3から4日でG418選択を開始した。ルシフェラーゼ陽性細胞を照度計で確認した。
【００６０】
免疫不全マウス(Nu/Nu、Harlan Sprague Dawley, Inc.、インディアナポリス、IN)をテキサス大学南西医療センター(University of Texas Southwestern Medical Center)の動物管理部(animal resources center)(ARC)内で無菌状態で維持し、ARCおよびIACUC指針に従って処置した。
【００６１】
A549肺癌異種移植モデルとして、A549の細胞(4×106細胞)を各マウスの両脇腹に皮下注射した。試験物質をアルゼットポンプシステム(Alzet pump system)で14日かけて投与した。アルゼット微小浸透圧ポンプ(Alzet micro-osmotic pumps)(Alza、パロアルト、CA)を、10gのマウスには皮下移植(sc)し、20gのマウスには腹腔内移植(IP)した。ポンプ速度を0.25μl/時(±0.05μl/時)に維持し、14日間注入し続けた。ポンプの充填時や取り扱い時、および外科移植の間は、無菌技術を用いた。
【００６２】
A549肺癌転移モデルとして、マウスにγ線を照射し、1×106細胞を尾静脈に静脈投与した。ルシフェラーゼによる生物発光画像化(luciferase-based bioluminescence imaging)により週毎に動物を画像化観察した。(3から4ヶ月後に)否定的な結果の場合はマウスの処理を終了し、そうでなければARC/IACUC指針に従い、癌重量が宿主マウスの標準体重の10％(成体マウスで直径1から2cm)を超えるまで、週毎に画像化観察した。
【００６３】
対照およびA549ヒト肺癌異種移植片をsc移植したRX-0047処置胸腺欠損ヌードマウスにおける、ルシフェラーゼによる生物発光の測定結果を、腫瘍成長の指標として表4に示す。RX-0047処置後1週間で、対照動物と比較して、腫瘍サイズが1/3に減少した。RX-0047処置後2週間で、腫瘍サイズが1/2に減少した。これは、腫瘍異種移植モデルにおいて、RX-0047が強力な抗腫瘍物質であることを示唆している。
【表６】
0004546454.tif 000007
【００６４】
A549転移モデルでは、毎日動物にRX-0047をIP投与(60mg/kg/日を9日間、次いで30mg/kg/日をさらに5日間)した。RX-0047を14日間IP投与してから2および3週間目に、転移腫瘍を画像化した。表5に示すように、RX-0047処置後2週間では、肺転移は検出されなかったが、対照群では肺転移が観察された。RX-0047処置後3週間では、肺転移は対照群と比べ1/60に減少した。これは、RX-0047が潜在的に強力な肺転移抑制物質であることを示唆している。
【表７】
0004546454.tif 000008
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】RX-0047およびRX-0149は、様々な癌細胞においてHIF-1 mRNA発現を抑制する。
【図２】RX-0047およびRX-0149によるHIF-1タンパク質発現抑制のウエスタンブロット解析。
【図１】
0004546454.tif 000009
【図２】
0004546454.tif 000010
【配列表】
0004546454000001.app