(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＮＦ受容体のシグナリングを妨害するかまたは阻害するＴＮＦ−ＲＩ並びに薬学上受容可能な担体を含む、子宮内膜症の治療および／または予防における使用のための薬剤組成物。
【請求項２】
ＴＮＦ受容体のシグナリングを妨害するかまたは阻害するＴＮＦ−ＲＩ並びに薬学上受容可能な担体を含む、子宮内膜損傷を減じることによる移植及び妊娠率の改善における使用のための薬剤組成物。
【請求項３】
ＴＮＦ−ＲＩがＴＮＦ−ＲＩの細胞外ドメインである、請求項１または２記載の薬剤組成物。
【請求項４】
ＴＮＦ−ＲＩがヒト可溶性組換えＴＮＦ−ＲＩである、請求項１または２記載の薬剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の属する分野
腫瘍ネクローシス因子アンタゴニスト類を治療上有効な用量にて投与することにより子宮内膜症を治療および／または予防する。この発明のアンタゴニストは、典型的にはさまざまなクラスの分子から選択されるが、好ましくは可溶性ＴＮＦ受容体である。上記アンタゴニスト類は子宮内膜症性の（endometriotic）損傷の回復に有用であり、他の活性成分と組み合わせれば、不妊のような関連する疾患の改善に有用である。
発明の背景
子宮内膜症は、子宮内膜腺および子宮内膜の腔並びに子宮筋肉組織の外部の間質の存在により特徴付けられる女性生殖器の疾患である。もっともしばしば襲われる解剖学上の部位は、卵巣、子宮仙骨の索、骨盤腹膜、直腸膣隔壁、子宮頸、膣、輸卵管および外陰である。一般に、子宮内膜症は、下にある組織中の直腸膣から深く浸潤するらしく、そして表面上は認識できない。場合により、子宮内膜症の中心は、肺、膀胱、皮膚、胸膜およびリンパ球のような卵巣外部の部位において遭遇しうる。子宮内膜症の損傷類は進行性である：それらは最初に透明な小水泡として観察され、それは次に赤くなり、そしてわずか数年の期間をかけて黒い線維性の損傷に進行する（MacSween，1993）。
【０００２】
子宮内膜症は良性の疾患と考えられているが、子宮内膜症性の損傷は場合により悪性になる。他の種類の悪性疾患におけるように、子宮内膜症由来の新形成の発生は、成長因子の変化およびまたはオンコジーン制御の変化を含む併発事象による（Cheung，1996）。
【０００３】
子宮内膜症はもっとも共通の婦人科学性疾患に属し、生殖年齢の女性の間で流行する：この疾患は生殖年齢の約５−１０％において発見される（Barbieri，1988）。子宮内膜症組織は、続く成長のためおよび異所性の局在においてもエストロゲンに完全に依存する。結果として、子宮内膜症は、女性がエストロゲンを欠損している初潮前および閉経後には稀である。子宮内膜症のホルモン感受性は、より共通の兆候のいくつかの基礎をなし、それは骨盤の痛みおよび月経困難症である。
【０００４】
子宮内膜症は、子宮から、生存可能な細胞が着床して生育可能な他の場所に撒き散らされた子宮内膜細胞を起源とする。２つの可能な機構が最初の細胞の拡散（spreading）を説明するために提案された。サイクリングする女性の間に共通する逆行性月経は、子宮内膜を離れた断片が月経逆流液を通して生殖器の構造物の近くに到達することを可能にする。あるいは、生殖器構造物以外の部位における子宮内膜症の発生を説明するためには、子宮内膜細胞が子宮静脈を通して広がり、リンパ系を通して広がるのかもしれない（造血性またはリンパ性の転移）。また、婦人科学的外科手術もこの転移に寄与しうる（MacSween，1993）。
【０００５】
子宮内膜細胞の転移とは別に、他の因子、例えば生殖器の素因（Malinak et al.，1980）、並びに免疫上の変化（Ho et al.，1997）が女性の子宮内膜症に対する感受性を決定するかもしれない。子宮内膜細胞はしばしば月経時のすべての女性の腹膜液中に観察されるから、哺乳類は、子宮内膜症を回避するためにもっとも恐らくは免疫系に関連した機構を有するべきである。通常、子宮内膜細胞は大きくて肉眼で見える損傷を形成するように増殖する。子宮内膜症は、よって、新たな損傷が連続して形成されつつある機能的プロセスであるが、存在する損傷は宿主の免疫応答により成長するかまたは破壊されると考えられる。
【０００６】
炎症性の反応が通常は子宮内膜症に付随し、腹膜の環境を変化させるが、なぜなら、腹膜液の体積が増加し、そして腹膜のマクロファージが数および活性の両面において増加するからである。よって、単球／マクロファージ系が子宮内膜症の発生において鍵となる役割を有すると提案された。ＲＡＮＴＥＳ（Hornung et al.，1997）、インターロイキン−６（Harada et al.，1997）、インターロイキン−８（Arici et al.，1996a）、腫瘍ネクローシス因子アルファ（Overton et al.，1996）、単球ケモタクティック蛋白質−１（Arici et al.，1997）を含むマクロファージの分泌産物が、この疾患を罹患した女性の腹膜液中に高濃度で見いだされた。免疫の変化は子宮内膜症の女性において証明されたが、これらの事象が子宮内膜症に必須であるかあるいは子宮内膜症により引き起こされた炎症の結果であるか否かは証明されていない（Rana et al.，1996）。
【０００７】
子宮内膜症の知見、およびその他の疾患との関連性は、診断レベルにおいてさえも今はまだ限定られている。子宮内膜症は不妊の主要な原因と考えられるが、この疾患の病理生理学の研究は否定的であり決定的ではない。痛みあるいは不妊の程度と疾患の重度の間には関連性が乏しいが、なぜなら初期の損傷が代謝上はより活性だからである。不妊の率は通常の集団よりも高く、そしてウサギの研究は、子宮内膜症の外科手術による導入が７５％から２５％への不妊の低下を導くことを示した（Hahn et al.，1986）。骨盤の痛みを伴う患者はその時子宮内膜症７１％を有することがわかり、一方骨盤の痛みと不妊の患者の８４％が子宮内膜症と診断された（Koninckx et al.，1991）。通常、不妊は、正常な膣の構造を破壊するほどに子宮内膜症が広がった場合に観察でき、一方、子宮内膜症が最小な場合は妊娠率は正常である。
【０００８】
子宮内膜症は別の様式においても不妊に影響しうる。インターロイキン−６、インターフェロンおよび腫瘍ネクローシス因子のような白血球細胞メッセンジャーはすべて増加し、逆に卵母細胞−精子の相互作用に影響する。子宮内膜症の女性から得た血清サンプルは、マウス胚モデルにおいて胚障害性であること、およびインビトロにおいて精子の運動性を阻害することがわかり（Halme，1991）、組換え腫瘍ネクローシス因子アルファを加えた場合に影響が増大した（Eisermann，1989）。それらの組織は、しかしながら、如何にしてサイトカインが子宮内膜症の進行に影響するかについての問題に接近しなかったが、そのような分子の細菌細胞および胚細胞の生存性に対する影響だけは示した。
【０００９】
ホルモン治療および外科手術は、子宮内膜症を治療するために現在使用される２つの治療上の様式である。子宮内膜症のための現在の薬学上の治療はエストロゲンの生産のホルモンによる抑圧を必要とし、その結果、プアーなホルモン環境が異所性の組織の成長をブロックする。子宮内膜症に関連する不妊の治療に関して、最小の疾患を伴う患者におけるホルモン治療は証明されない恩恵であり、一方他の研究は妊娠率の増加を示した（Arici et al.，1996b）。
【００１０】
ホルモン治療は、高い用量のプロゲステロン、エストロゲンとプロゲステロンの組み合わせ（「偽妊娠」養生法において高い用量の経口避妊ピルまたはＯＣＰｓを使用して）、ダンゾール（エチステロンのアンドロジェン誘導体）およびより最近はＧｎＲＨアンタゴニストを含んだ。これらのホルモン治療は骨盤の痛みに有効であり、且つ損傷の他覚的回復を誘導するが、いくつかの警告を有する。エストロゲンは子宮内膜組織の増殖を刺激して且つ原因となるかもしれないが、なぜなら、ＯＣＰｓが限定された数の患者に部分的な軽減を表すかもしれないような高い用量においてさえ、プロゲステロンに応答することを不可能にするかもしれないからである（Dawood，1993）。プロゲステロンの薬剤は、機能低下、体重増加および液体停留と共に不規則な出血を誘発しうる（５０％）。ダナゾールは子宮内膜症喚起性の様々な応答、血清中の可溶性腫瘍ネクローシス因子アルファ、インターロイキン−６ベータおよびＣＤ８レベルの低下（Matalliotakis，1997；Mori，1990）、デノボのステロイド生成の阻害およびその受容体からのエストラジオールの排除（displacement）を含む応答を抑圧する。ダナゾールは痛みを被る患者約６６−１００％において兆候を改善しうるが、４年以内のちの初期再発率は約４０−５０％である。ダナゾール治療の他の欠点は体重増加とアンドロジェンの副作用であり、８０％までの患者にこの治療を断念させうる（Barbieri，1988）。ＧｎＲＨ類似体はより有力であり、そしてＧｎＲＨよりも長期間作用し、すべてのエストロゲン感受性組織の成長のためのエストロゲン性刺激を除去することにより働く。ＧｎＲＨ類似体の副作用は、低下した骨密度のように、根深い低エストロゲン症（hypoestrogenemia）に対して主に二次的であり、そして再発率は５年後５０％までである（Waller and Shaw，1993）。
【００１１】
疾患の程度に依存して、もしも不妊を望むならば、外科手術による干渉は保守的であり得、あるいは重度の疾患の場合に子宮、輸卵管及び卵巣の除去を導き得る。何れにせよ、限定された外科手術処置でさえ不妊の顕著な低下を導く。外科手術後の妊娠率は３５％と６５％の間であり、患者は正常な生殖能力を達成するために排卵誘発および子宮内受精を要求する（Koninckx and Martin，1994）。臨床報告は、子宮内膜症の開腹および切除後に、４０％までの患者が５年以内の再手術を必要としたことを示す。攻撃性外科手術の干渉の後でさえ、子宮内膜症からの痛みの再発は顕著な問題として続く。外科治療の失敗の理由のいくつかは完全に認識されなかったかまたは見落とされた損傷の不完全な切除を含むかもしれない。多くの損傷は顕微鏡によらなければ見えず、腹腔鏡により供給された拡大にも拘わらず可視化できなかった。よって、外科手術のみではこの疾患を直すことが期待できない（Revelli et al.，1995）。
【００１２】
子宮内膜症を有するこのように多くの患者が、伝統的な治療の欠点を被る（ホルモン不均衡の帰結、高い再発率および不妊を含む）。よって、子宮内膜症の別の治療法を提供することに興味がある。可能な治療のアプローチは、子宮内膜損傷および免疫上の状況の両方を改善することが可能な免疫変調分子の使用により象徴されるかもしれない。そのようなアプローチは、一般的な兆候の処置には適していると考えられるが（Rana et al.，1996）、子宮内膜症後の変更された発現レベルを有する患者の間でサイトカインが、治療上の干渉のための好ましい薬剤となりうることを指摘する実験上の証拠がない。
【００１３】
上記のとおり、子宮内膜症性炎症反応に関与するいくつかのマクロファージの分泌産物の一つは、腫瘍ネクローシス因子（今からＴＮＦと略記される）である。ＴＮＦは、カケクチンとも定義され、活性化されたＴＮＦ細胞およびマクロファージにより放出される多向性サイトカインである。ＴＮＦはインターフェロン、インターロイキンおよびコロニー刺激因子サイトカインネットワークのメンバーであり、他のサイトカインおよび接着分子の生産を含む多数の前炎症性変化を誘導することにより、多くの感染性および炎症性疾患の病理に関するシグナリング系において鍵となる役割を有する（Fiers，1991）。
【００１４】
便宜上、用語ＴＮＦは、本出願の全テキスト中においては、動物またはヒト由来の腫瘍ネクローシス因子アルファまたはベータの両方、並びにその天然対立遺伝子ＴＮＦアルファを意味するべきである（Pennica et al.，1984）。ＴＮＦベータはリンホトキシンとも呼ばれ、同じ活性を有するが、抗原性または有糸分裂性刺激に応答して異なる細胞種（リンパ球およびナチュラルキラー細胞）により生産される（Gray et al.，1984）。
【００１５】
ＴＮＦはトリマーとして活性な成熟した１７ｋＤａの蛋白質として発現される。この複合体は、それらの細胞表面受容体を凝集させることによりその生物学上の活性を及ぼし、異なる器官および組織において特定の作用を媒介する。子宮内膜においては、ＴＮＦ発現は部位依存性且つ月経サイクル依存性であり（Hunt et al.，1992）、そして実験動物の子宮内膜においてアポトーシスを誘導する（Shalaby et al.，1989）。子宮内膜ストロマ細胞の中皮細胞への接着はＴＮＦを用いた中皮細胞の前処理により顕著に増加した（Zhang et al.，1993）ことから、ＴＮＦが子宮内膜症の開始および／または発生に寄与するかもしれないことを支持する。
【００１６】
ＴＮＦはその活性に影響を及ぼし、文献にてＴＮＦ−ＲＩとも定義されるｐ５５  ＴＮＦ受容体および文献にてＴＮＦ−ＲＩＩとも定義されるｐ７５  ＴＮＦ受容体を含む膜結合受容体分子のファミリーを結合することにより、免疫系の正常な発生および機能のために要求される（Bazzoni and Beutler，1996）。ＴＮＦシグナルをトランスデュースすることにおけるＴＮＦ−ＲＩの優位性は、この受容体に特異的なアゴニスト抗体がＴＮＦ誘導性応答の大多数を模倣する能力により示唆される（Shalaby et al.，1990）。その膜結合性受容体への結合により、ＴＮＦは、ＴＲＡＤＤおよびＴＲＡＰ−１（ＴＮＦ−ＲＩに関して）またはＴＲＡＦ−１およびＴＲＡＦ−２（ＴＮＦ−ＲＩＩに関して）のように、細胞質媒介物質を通してシグナリング経路を誘発することから、Ｔ細胞増殖、インビトロ腫瘍細胞溶解、皮膚ネクローシス、インスリン耐性、アポトーシスのような異なる細胞応答を導く。両ＴＮＦ受容体の細胞外部分は離脱することができ、これらの可溶性受容体はＴＮＦに結合する能力を保持し、親和性複合体形成によりＴＮＦ活性を不活性化し、それによりＴＮＦの標的細胞膜受容体への結合を低下させる（Nophar et al.，1990）。
【００１７】
子宮内膜においては、膜結合ＴＮＦ受容体のレベルはエストラジオールおよび／またはプロゲステロンの投与により影響され、マウスにおいてはＴＮＦ−ＲＩの一時的且つ細胞種特異的な発現をもたらす（Roby et al.，1996）。しかしながら、この研究は、子宮内膜症に関連する様々なモデルにおいて実施された他の多くの研究のように、子宮内膜中心の発生において膜結合性または可溶性の何れかのＴＮＦおよびＴＮＦ−ＲＩのインビボの実際の効果に対する何のヒントも与えなかったが、子宮内膜症付随性の免疫異常の記載のみを与えた。
発明の概要
本特許出願は、循環するＴＮＦを可溶状態にとどめておく（sequestering）ことにより、ＴＮＦアンタゴニストが子宮内膜の損傷の進行をブロックすることができるとの仮説に基づく。この仮説は実施例において報告された発見により確証され、ＴＮＦアンタゴニストがラット実験モデルにおいて子宮内膜症様中心のサイズを顕著に減少させることを示す。出願人の発見の結果、治療上有効な量のＴＮＦアンタゴニストの投与を含む、個体の子宮内膜症の治療および／または予防方法が提供される。
【００１８】
第２の態様において、本発明は、他の薬剤と組み合わせた治療上有効な量のＴＮＦアンタゴニストの投与を含む、個体の不妊の子宮内膜症関連の症状を治療および／または予防する方法に関する。
【００１９】
本発明のさらに別の目的は、子宮内膜症の治療のための薬剤組成物の製造におけるＴＮＦアンタゴニストと薬学上受容可能な担体の使用である。
本発明において、ＴＮＦアンタゴニストの投与は非経口または他の有効な製剤でありうる。非経口投与のあらゆる様式も適しており、静脈内、筋肉内および皮下を含む。薬学上受容可能な担体に加えて、本発明の組成物はマイナーな量の付加物、例えば安定剤、賦形剤、バッファーおよび保存剤を含むこともできる。
【００２０】
本発明の方法において有用なＴＮＦアンタゴニスト類は、可溶性ＴＮＦ受容体分子、抗−ＴＮＦ抗体およびＴＮＦ受容体シグナリングを妨害および／または阻害する化合物を含む。ＴＮＦアンタゴニストは単独あるいは他のＴＮＦアンタゴニストと組み合わせて使用することができる。一つまたは複数の薬学上活性な生成物との組み合わせも可能であり、特に、子宮内膜症に関連する不妊を罹患した患者の症状を改善する。
発明の説明
本明細書に記載された発明は、ＴＮＦ（その発現レベルが子宮内膜症後の腹腔内液体中で増加するいくつかのサイトカインのほんの一つである）をＴＮＦアンタゴニストにより可溶状態にとどめておく（sequestering）ことが、ラット実験モデルにおいて子宮内膜症様中心を減少させるという予測されなかった結果を示す。このモデルは、そのような作用がホルモン平衡およびナチュラルキラー細胞活性に顕著に影響することなしに得られることも証明する。ＴＮＦアンタゴニストを用いた子宮内膜症損傷の減少は不妊の率も改善することができるが、なぜならば、生殖器の構造の標準化が着床率に正の効果を有するからである。
【００２１】
よって、本発明の主要な目的は、治療上有効な量のＴＮＦアンタゴニストを投与することからなる、個体において子宮内膜症を治療および／または予防するための方法を提供することである。
【００２２】
第２の態様において、本発明は、他の薬剤と組み合わせた治療上有効な量のＴＮＦアンタゴニストの投与を含む、個体の不妊の子宮内膜症関連の症状を治療および／または予防する方法に関する。
【００２３】
本発明のさらに別の目的は、子宮内膜症の治療のための薬剤組成物の製造におけるＴＮＦアンタゴニストと薬学上受容可能な担体の使用である。この様式において製造された薬学組成物も本発明のさらなる目的である。
【００２４】
本明細書の特許請求の範囲に記載された活性成分はＴＮＦアンタゴニストである。請求されたＴＮＦアンタゴニストは２つの様式の一つに影響を及ぼす。第１に、アンタゴニストは十分な親和性および特異性をもってＴＮＦ分子自身に結合するかまたは可溶状態にとどめることにより、ＴＮＦ受容体結合に必須のＴＮＦエピトープを実質上中和することができる（以後、「可溶状態にとどめるアンタゴニスト」と呼ぶ）。あるいは、ＴＮＦアンタゴニストは、ＴＮＦ結合後に細胞表面受容体により活性化されるＴＮＦシグナリング経路を阻害する（以後、「シグナリングアンタゴニスト」と呼ぶ）。両グループのアンタゴニストは単独でも組み合わせても、本発明に従う子宮内膜症の治療において有用である。
【００２５】
ＴＮＦアンタゴニストは、ＴＮＦが増殖およびＩｇ分泌を引き起こすような、インビトロにて影響されやすい細胞系、例えばヒトＢ細胞上の天然ＴＮＦの活性に対するそれらの効果の候補を日常的にスクリーニングすることにより、容易に同定および評価される。上記アッセイは、候補アンタゴニストの希釈を変えて、例えばこのアッセイにおいて使用するＴＮＦのモル量の０．１倍から１００倍のＴＮＦ製剤、およびＴＮＦなしかまたはアンタゴニストのみの対照を含む（Tucci et al.，1992）。
【００２６】
可溶状態にとどめておくアンタゴニストは、本発明に従う好ましいＴＮＦアンタゴニストである。可溶状態にとどめておくアンタゴニストのうち、高い親和性にてＴＮＦに結合して低い免疫原性を有するポリペプチドが好ましい。可溶性ＴＮＦ受容体分子およびＴＮＦに対する中和抗体は特に好ましい。例えば、ＴＮＦ−ＲＩおよびＴＮＦ−ＲＩＩは本発明ににおいて有用である。受容体またはその機能部分の細胞外ドメインを含むこれらの受容体の末端削除形態は、本発明によれば、さらに好ましいアンタゴニストである。末端削除形態のＴＮＦ受容体は可溶性であり、そして尿および血清において３０ｋＤａおよび４０ｋＤａのＴＮＦ阻害性結合蛋白質として検出されており、最初はＴＢＰＩおよびＴＢＰＩＩと呼ばれた（Engelmann et al.，1990）。該受容体分子の誘導体、断片、領域および生物学上活性な部分は、本発明において使用できる受容体分子と機能上似ている。そのような生物学上活性な上記受容体分子の均等物または誘導体は、上記ポリペプチドの一部、または上記受容体分子をコードする配列の一部と称され、十分なサイズであって、且つ膜結合性ＴＮＦ受容体との相互作用が阻害されるかまたはブロックされるような親和性でＴＮＦに結合することができる。好ましい態様において、ヒト可溶性ＴＮＦ−ＲＩは患者に投与されるＴＮＦアンタゴニストである。天然および組換え体の可溶性ＴＮＦ−ＲＩ受容体分子およびそれらの生産方法は、欧州特許出願EP 308,378，EP 398,327およびEP 433,900に記載された。
【００２７】
ＴＮＦ受容体マルチマー分子およびＴＮＦ免疫受容体融合分子、およびそれらの誘導体または一部は、本発明の方法に有用な受容体分子の追加例である。本発明に有用なＴＮＦ受容体マルチマー分子は、一つまたは複数のポリペプチド鎖を通して結合した２つまたは複数のＴＮＦ受容体の細胞外ドメインのすべてまたは機能性部分を含む。上記マルチマー分子は、さらに、マルチマー分子の発現を指示するために分泌された蛋白質のシグナルペプチドを含むことができる。これらのマルチマー分子およびそれらの生産方法は、欧州特許出願EP 526,905に記載された。
【００２８】
本発明の方法において有用なＴＮＦ免疫受容体融合分子は、少なくとも、一つまたは複数の免疫グロブリン分子の一部分および一つまたは複数のＴＮＦ受容体のすべてまたは機能性部分を含む。上記免疫上記融合分子は、モノマー、またはヘテロマルチマーまたはホモマルチマーとして集合することができる。ＴＮＦ免疫受容体融合分子およびそれらの生産方法は、欧州特許出願EP 620,739に記載されており、PCT特許出願WO 94/06476に対応する。
【００２９】
本発明の方法において有用な可溶状態にとどめておくアンタゴニストは、抗ＴＮＦ抗体に代表され、モノクローナル、キメラヒト化、および組換え抗体並びにそれらの断片を含み、インビボにおけるＴＮＦへの高い結合性および低い毒性により特徴付けられる。本発明において使用可能な抗体は、子宮内膜の損傷の優れた回復および兆候の軽減および低い毒性に効力を有するのに十分に期間患者を治療するそれらの能力により特徴付けされる。中和抗体は、ＴＮＦを用いた免疫により動物、例えばウサギまたはマウスにおいて容易に生じさせられる。免疫されたマウスは、ハイブリドーマの製造のためのＢ細胞の供給源として特に有用であり、培養されることにより、大量の抗ＴＮＦモノクローナル抗体を生産する。キメラ抗体は、異なる動物種に由来する２つまたは複数のセグメントまたは部分により特徴付けされる免疫グロブリン分子である。一般に、キメラ抗体の可変領域は非ヒト哺乳類抗体由来であり、例えばマウスモノクローナル抗体であり、そして免疫グロブリンの定常領域はヒト免疫グロブリン分子に由来する。好ましくは、両領域および上記組み合わせは、日常的に測定されるとおり低い免疫原性を有する（Elliott et al.，1994）。ヒト化抗体は、マウス定常領域をヒト対照物で置換してマウス抗原結合領域は保持するように、遺伝子工学の技術により創製された免疫グロブリン分子である。その結果のマウス−ヒトキメラ抗体は、ヒトにおいて低下した免疫原性および改良された薬物動力学を有するべきである（Knight et al.，1993）。本発明の方法において有用な、高い親和性のモノクローナル抗体およびそれらのキメラ誘導体の好ましい例は、欧州特許出願EP 186,833およびPCTWO 92/16553に記載されている。
【００３０】
ＴＮＦアンタゴニストは、様々な様式において個体に投与することができる、投与経路は、皮内、経皮（例えば製剤のスローリリース）、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、経口、硬膜外、局所、および鼻内経路を含む。他の治療上有効ないかなる投与経路も使用することができ、例えば、上皮または内皮の組織を通した吸着あるいはＴＮＦアンタゴニストをコードするＤＮＡ分子を患者に投与してインビボにおいてＴＮＦを発現させて分泌する遺伝子治療による。さらに、ＴＮＦアンタゴニストは生物学上活性な薬剤、例えば薬学上受容可能な界面活性剤、賦形剤、希釈剤または他のあらゆる担体と共に投与することができる。
【００３１】
「薬学上受容可能な」という定義は、活性成分の生物活性の効果を干渉しないで、且つ投与される宿主に対して毒性がない、あらゆる担体を包含することを意味する。例えば、非経口投与に関しては、ＴＮＦアンタゴニストは、媒体、例えば塩溶液、デキストロース溶液、血清アルブミンおよびリンゲル液中に注射のためのユニット用量にて製剤化してよい。
【００３２】
非経口（例えば、静脈内、皮下、筋肉内）の投与のためには、ＴＮＦアンタゴニストを、溶液、懸濁液、乳濁液または凍結乾燥した粉末として、薬学上受容可能な非経口媒体（例えば、水、塩溶液、デキストロース溶液）および等張性を保持する添加物（例えば、マニトール）または化学安定剤（例えば、保存剤およびバッファー）と共に製剤化することができる。製剤は共通に使用される技術を用いて滅菌される。
【００３３】
ＴＮＦアンタゴニストの生物学上の利用可能性も、例えばPCT特許出願WO 92/13095に記載されたように分子をポリエチレングリコールに連結してヒト体内における半減期を増加させるコンジュゲーション手法を用いることにより改善することができる。
【００３４】
治療上有効な量のＴＮＦアンタゴニストは多くの変更物の函数になり、アンタゴニストの種類、ＴＮＦに対するアンタゴニストの親和性、該アンタゴニストにより呈される残存するあらゆる細胞毒性活性、投与の経路、患者の臨床上の症状（内因性ＴＮＦ活性の非毒性レベルを保持する望ましさを含む）、可溶状態にとどめておく薬剤、例えば抗体中の複数のＴＮＦ結合部位の存在を含む。
【００３５】
「治療上有効な量」は、投与されたときに、ＴＮＦアンタゴニストがＴＮＦの生物活性の阻害をもたらすような量である。単一または複数の用量として、個体に投与される用量は様々な因子に依存して変更されることになり、ＴＮＦアンタゴニストの薬物動力学特性、投与の経路、患者の症状および特徴（性別、年齢、体重、健康状態、体格）、兆候の範囲、同時の治療、治療の頻度および望まれる効果を含む。確立された用量範囲の調節および操作は、当業者の能力並びに個体におけるＴＮＦの阻害のインビトロおよびインビボにおける測定方法の範囲内である。
【００３６】
ヒトの臨床試行におけるＴＮＦの最大の寛容化用量は約２５マイクログラム／ｍ2体表面／２４時間間での範囲であるから、投与されるアンタゴニストの量は、ＴＮＦのこの量を中和するように計算された用量を越えないことが必要である。したがって、ＴＮＦアンタゴニストのモル用量はＴＮＦの最大寛容化モル用量の約０．００１から１０倍に変更されることになるが、上記のとおり、これは多くの治療上の判断力を必要とすることになる。
【００３７】
さらに、子宮内膜症の女性の腹膜液中のＴＮＦ濃度の増加を様々なプロトコルを用いて証明した臨床研究により得られたデータも（Eisermann et al.，1988；Halme，1991；Overton et al.，1996）、投与されるＴＮＦアンタゴニストの有効量の測定において有用でありうる。
【００３８】
通常、活性成分の一日の用量は体重キログラムあたり約０．０１から１００ミリグラムでありうる。普通は、一日にキログラムあたり１から４０ミリグラムを分割用量にてあるいは持続放出形態にて投与することが所望の結果を得るためには効果的である。第２の投与または続く投与は、個体に対して最初または以前に投与された用量と同じかまたはより低いかまたはより高い用量において実施することができる。第２のまたは続く投与は、子宮内膜症または関連する兆候の再発の間かまたは前に投与することができる。用語「再発」または「再出現」は、子宮内膜症の一つまたは複数の兆候の出現を包含するように定義される。
【００３９】
ＴＮＦアンタゴニストは、特に不妊の治療においては、治療上有効な量にて他の治療療法または薬剤（例えば、複数薬剤療法）の前か、同時かまたは連続して個体に対して予防上または治療上投与することができる。他の治療剤と同時に投与されるＴＮＦアンタゴニストは、同じかまたは異なる組成物中で投与することができる。特に、不妊が治癒されることを意図する子宮内膜症に付随する不全である場合、生物学上活性なヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）または卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の何れかを高度に精製された天然物または組換え形態のいずれかにて投与することができる。そのような分子およびそれらの生産方法は欧州特許出願EP 160,699，EP 211,894およびEP 322,438に記載されている。
【００４０】
本発明は実施例により今例示されることになるが、あらゆる意味において限定ではなく、そして以下の図面を参照する。
実施例
材料と方法
動物。スプラーグ−ダウリーラット（２５０−２７５ｇ）をチャールズリバーイタリア（Calco，Lecco，イタリア）から購入した。上記動物は、以下の環境条件下で飼った：温度２２±２℃、相対湿度５５±１０％、通気１時間あたり１５±３空気交換、ＨＥＰＡ９９．９９７％フィルターで濾過、および明期１２時間（７：００−１９：００）の日周リズムで人工的に照明。実験前に、少なくとも１週間の間これらの条件に動物を順化させた。標準ペレットダイエットにより動物を任意に給餌した。
【００４１】
研究試薬。アンチドはBachem（カリフォルニア、米国）により製造して供給した。この実施例において使用したヒト組換え可溶性ＴＮＦ−ＲＩ分子は、ヒトＴＮＦ−ＲＩのセグメント２０−１８０に相当する配列を有し（Nophar et al.，1990）、そしてＣＨＯ細胞中で製造して、ｒ−ｈＴＢＰ−１の名前で、インターファームラボラトリーズ社（イスラエル）により供給された。
【００４２】
材料。一般的な細胞培養の材料は、ギブコＢＲＬ，ライフテクノロジーズ（ペイズリー、英国）から購入した。エストラジオール−１７βのＲＩＡキットはＤＰＣ（ロスアンジェルス、ＣＡ，米国）から購入した。イノケタムはＶｉｒｂａｃ（Ｃａｒｒｏｓ，フランス）から購入した。［51Ｃｒ］−クロム酸ナトリウムはＮＥＮデュポン（ボストン、ＭＡ，米国）から購入した。ロムパンはベイヤーＡＧ（レバークーゼン、ドイツ）から購入した。絹の縫糸７．０はＥｔｈｉｃｏｎ（Ｐｏｍｅｚｉａ，イタリア）から購入した。
【００４３】
ラットにおける子宮内膜症の実験モデル。組換え可溶性ＴＮＦ−ＲＩの子宮内膜症における効果を探索するため、以前に記載された実験モデル（Jones，1987）をマイナーな修飾を用いて使用した。イノケタム／ロムパン麻酔下にて、子宮内膜組織の自家移植組織断片（１ｃｍの長さ）を右の子宮角から一部切除して、ＰＢＳ中にて３７℃においた。子宮のセグメントは縦の切断により開き、そして子宮筋層は除去せずに４つの角において非吸収性絹製縫糸を用いて５ｘ５ｃｍの切片を腹部壁の内部表面に移植した。
【００４４】
子宮内膜症の実験モデルにおける研究された薬剤の効果の探索。実験性子宮内膜症は、上記報告のとおりに麻酔されたラットへ外科手術により導入した。さらに、別のグループのラットが同様に一つの子宮角の断片を有するが、５ｘ５ｃｍ四角の子宮周囲の脂肪を移植した（シャム手術したグループ）。さらなるグループのラットは何ら外科手術を受けさせず、正常な対照グループとして保持した。子宮内膜症の導入の３週間後に動物に２回目の開腹を行うことにより（前処理開腹）、異所性子宮内膜組織のサイズと生存性を評価した。表面面積（長さｘ深さ）をカリバスを用いて測定して記録した。生存可能なグラフトを示す動物は表Ｉに報告するとおり指定された治療グループとされ、その結果、実験終了時に、第１の犠牲時間点に関してグループあたり６匹の動物、そして第２の時間点に関してグループあたり５匹の動物を得た。治療は１週間の回復期間後に開始した。対照グループは塩溶液のみを注射し、別のグループは３日ごとに２ｍｇ／ｋｇのアンチドの３回の皮下注射を、卵巣および視床下部を抑圧することが以前に示された療法により入れた（Sharpe et al.，1990）。さらなるグループは１０ｍｇ／ｋｇの組換え可溶性ＴＮＦ−ＲＩを、２回の１日用量に分けて１週間にわたり注射した。
【００４５】
【表１】
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【００４６】
指定された犠牲時間点（最後の処置から２日後および９日後、即ち外科手術によるグラフトの３６日および４３日後）に、動物を麻酔して；血液サンプルを腹部大動脈から採集して、血清を分離して、エストラジオール−１７βレベルの測定のための分析まで−２０℃に保存した。脾臓をナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性の測定のために切除した。子宮内膜症様の点の表面エリアを各犠牲時間点において測定することによりデータを平均化し、パーセント変動対前処理開腹値を式：
【００４７】
【数１】
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【００４８】
により計算したが、式中、Ｘ0は前処理開腹の時間におけるサイズであり、そしてＸは犠牲にするときのサイズである。各グループのパーセント変動の平均値を次にコンピューターで計算した。
【００４９】
ＮＫ活性の測定。ＮＫ活性の程度は、51Ｃｒ放出アッセイを用いて測定した。マウスリンパ腫ＹＡＣ−１細胞を対数増殖期に回収して、培地（ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミンおよび１０％熱失活胎児ウシ血清を含むＲＰＭＩ １６４０）で１回洗浄した。細胞沈殿物を１００μＣｉの［51Ｃｒ］−クロム酸ナトリウムで３７℃、５％ＣＯ2において２時間インキュベートした。次に、細胞を３回１０ｍｌのアッセイ培地で洗浄して、所望の濃度にて懸濁して、ラット脾臓細胞存在下でアッセイプレートに加えた。細胞をアンチド培地中で所望の濃度（２ｘ１０6／ｍｌ）にて懸濁して、51Ｃｒ標識された標的細胞への添加前に、アッセイ培地中でＵ底９６ウエルプレートの３通りのウエル中で連続希釈実施した。51Ｃｒ標識された標的細胞（５ｘ１０3）をアッセイプレートの各ウエルに加え、そして３通りのエフェクター対標的比（２００：１、１００：１および５０：１）を各サンプルに関してアッセイした。エフェクター対標的細胞混合物を含むプレートを２００ｘｇにて４分間遠心分離して、次に３７℃、５％ＣＯ2において４時間インキュベートした。２００ｘｇにおける４分間の追加の遠心分離後に、各ウエルからの２０μｌの上清をガラス製の繊維フィルターに移して、結合する放射活性をβカウンターにより測定した。
溶解のパーセンテージは以下のとおりに計算した：
【００５０】
【数２】
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【００５１】
式中、
ｃｐｍsample＝エフェクター細胞存在下の平均51Ｃｒ放出、
ｃｐｍspont＝培養培地細胞存在下の標的細胞の平均51Ｃｒ放出、
ｃｐｍtotal＝１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００存在下の標的細胞の平均51Ｃｒ放出。
【００５２】
エストラジオール−１７β測定。血清のエストラジオール−１７β濃度を市販のキットを用いて測定することにより、抽出工程なしで血清中のエストラジオールを定量した（DPC，ロスアンジェルス、ＣＡ，米国）。簡単に言えば、125Ｉ−標識したエストラジオールは抗体部位に関して血清サンプル中のエストラジオールと競合する。インキュベート後に、遊離のエストラジオールからの結合したエストラジオールの分離をデカントにより実施した。次に、チューブをガンマカウンター（ＬＫＢ−ファルマシアウオーラック）により計数したところ、カウントは血清サンプル中に存在したエストラジオールの量に逆比例した。サンプル中のエストラジオールの量は、カウントを校正曲線に比較することにより測定した。抗血清はエストラジオールに対する特異性が高く、他の天然のステロイドに対して相対的に低い反応性を有する。同じ実験セッションからのサンプルを単一の免疫アッセイにおいて分析した。
【００５３】
統計分析。治療グループ間で観察された差異の統計上の有意性は、Ｓｔａｔｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｐｌｕｓ（登録商標）ソフトウエア（バージョン１．４）に存在するＡＮＯＶＡを用いて評価した。ターキー複数範囲試験（Ｐ＜０．０５）を実施した。
結果
実験性子宮内膜症における組換え可溶性ＴＮＦ−ＲＩ効果の探索。
【００５４】
ラットにおける外科手術移植による子宮内膜組織の首尾よい成長および発生は、ヒトにおいて十分に調査されることができない子宮内膜症の側面にいくつかを研究するために使用されてきた研究モデルを提案した（Dudley et al.，1992）。ラット実験子宮内膜症の以前の研究は、陽性対照としてアンチドが正確に作用することを示す（Sharpe et al.，1990）。本実施例において、アンチドの効果を、処置前と後のグラフトのサイズの面積に関して、組換え可溶性ＴＮＦ−ＲＩを用いて得られた効果と比較し、表ＩＩに要約する。
【００５５】
【表２】
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【００５６】
グラフト化された子宮内膜断片の平均パーセント阻害として、結果を図１に示す（上記のとおりに計算された）。
アンチドは、子宮内膜様の点のサイズを減少させることにおいて効果があり（図１）、治療の停止後の療法の観察時間点において、ほとんど完璧な（最初の寸法に比較してそれぞれ９４％および９８％）そして統計上有意な（ｐ＜０．０５，ＡＮＯＶＡおよびターキー試験）緩解を誘導した。ヒト組換え可溶性ＴＮＦ−ＲＩ（１０ｍｇ／ｋｇ，２回の１日用量）による１週間の治療は、両観察時間点における子宮内膜様の点の有意なサイズの減少（最初の寸法に比較してそれぞれ３３％および６４％）をもたらしたが、統計上有意なのは（ｐ＜０．０５，ＡＮＯＶＡおよびターキー試験）９日目のみであった。グラフトは、いかなるときもシャム手術された動物において観察されなかった。
ＮＫ細胞活性の評価
ＹＡＣ細胞に対して脾臓細胞を用いたインビトロ試験によりＮＫ細胞活性を評価したところ、グループ間での変化は示さなく（図２）、ヒヒにおいて観察されたのと同様であり、子宮内膜症を有するか有さないかによらず、抗内胚葉細胞障害性およびＮＫ細胞活性における差異は動物において観察されなかった（D'Hooghe et al.，1995）。この発見は、子宮内膜症の患者における抑制されたＮＫ活性が、低下した腹膜ＮＫ活性と子宮内膜症の重度の間に顕著な相関と共に報告されたヒトのデータと対照的である（Oosterlynck et al.，1992）。
血清エストラジオール−１７βの評価
血清エストラジオール−１７βの濃度を両観察時間点において放射線免疫アッセイにより測定した。第２の観察時間点において対照グループと比較してアンチド処置グループにおいて、顕著な差異が観察された。統計上有意な差異は、対照と比較した場合に組換え可溶性ＴＮＦ−ＲＩに関しては観察されなかった（図３；ｐ＜０．０５，ＡＮＯＶＡおよびターキー試験）。
結論
子宮内膜症のラット実験モデルにおいて、ＴＮＦアンタゴニストである可溶性形態のＴＮＦ−ＲＩの投与は、最初、この病理症状のサイトカインに基づいた非ホルモン関連処置の潜在的効果の明らかな証拠を提供する。即ち、ＴＮＦアンタゴニストは、低下した副作用に関して存在する医療処置に対する代替物を意味する。
【００５７】
当業者は、日常の実験以上のものを用いずに、本明細書に記載された発明の特定の態様の多くの均等物を知るかまたは確かめることになる。これらおよび他の全ての均等物は以下の請求の範囲により包含されることを意図する。
【００５８】
【表３】
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【００５９】
【表４】
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【００６０】
【表５】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、アンチド（２ｍｇ／ｋｇ，皮下で３日毎に投与）、組換え可溶性ＴＮＦ−ＲＩ（１０ｍｇ／ｋｇ，１週にわたり毎日の用量を２回皮下投与）の、最後の処置から２日目および９日目の実験性子宮内膜症のラットにおけるグラフトの大きさに対する効果を示す。これらのデータは、第１の犠牲時間点に関してグループあたり６匹の動物、および第２の時間点に関してグループあたり５匹の動物を用いて得られたものであり、阻害の平均パーセンテージ±標準偏差を表す。
【図２】  図２は、組換え可溶性ＴＮＦ−ＲＩ（１０ｍｇ／ｋｇ，１週にわたり毎日の用量を２回皮下投与）およびアンチド（２ｍｇ／ｋｇ，皮下で３日毎に投与）の、最後の処置から２日目（パネルＡ）および９日目（パネルＢ）のＹＡＣ細胞に対する効果を示す。データは、溶解の平均パーセンテージ±標準偏差を表す。
【図３】  図３は、対照およびアンチド（２ｍｇ／ｋｇ，皮下で３日毎に投与）との比較における、組換え可溶性ＴＮＦ−ＲＩ（１０ｍｇ／ｋｇ，１週にわたり毎日の用量を２回皮下投与）の、ラットの実験性子宮内膜症におけるエストラジオール−１７β血清レベルに対する効果を示す。データは、エストラジオール−１７β濃度の平均±標準偏差を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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