(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物及びヒトの内在性シアリダーゼによる加水分解に抵抗性を有するＮ−アセチルノイラミン酸化合物の１−４又は１−２ラクトン体を、有効成分として少なくとも０．０１重量％の割合で含有することを特徴とする抗ウイルス剤。
【請求項２】
Ｎ−アセチルノイラミン酸化合物の１−４又は１−２ラクトン体が、３’−Ｎ−アセチルノイラミニルラクトース１−４ラクトン、３’−Ｎ−アセチルノイラミニルラクトース１−２ラクトン、又はカゼイン若しくはカゼイン加水分解物より得られるＮ−アセチルノイラミン酸化合物の１−４若しくは１−２ラクトン体である請求項１に記載の抗ウイルス剤。
【請求項３】
動物及びヒトの内在性シアリダーゼによる加水分解に抵抗性を有するＮ−アセチルノイラミン酸化合物の１−４又は１−２ラクトン体を、有効成分として少なくとも０．０１重量％の割合で含有することを特徴とする大腸菌付着阻止剤。
【請求項４】
Ｎ−アセチルノイラミン酸化合物の１−４又は１−２ラクトン体が、３’−Ｎ−アセチルノイラミニルラクトース１−４ラクトン、３’−Ｎ−アセチルノイラミニルラクトース１−２ラクトン、又はカゼイン若しくはカゼイン加水分解物より得られるＮ−アセチルノイラミン酸化合物の１−４若しくは１−２ラクトン体である請求項３に記載の大腸菌付着阻止剤。
【請求項５】
動物及びヒトの内在性シアリダーゼによる加水分解に抵抗性を有するＮ−アセチルノイラミン酸化合物の１−４又は１−２ラクトン体を、有効成分として少なくとも０．０１重量％の割合で含有することを特徴とする細菌感染予防剤。
【請求項６】
Ｎ−アセチルノイラミン酸化合物の１−４又は１−２ラクトン体が、３’−Ｎ−アセチルノイラミニルラクトース１−４ラクトン、３’−Ｎ−アセチルノイラミニルラクトース１−２ラクトン、又はカゼイン若しくはカゼイン加水分解物より得られるＮ−アセチルノイラミン酸化合物の１−４若しくは１−２ラクトン体である請求項１に記載の細菌感染予防剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、内在性シアリダーゼ耐性ラクトン体含有組成物に関するものである。更に詳しくは、この出願の発明は、内在性シアリダーゼによる加水分解に抵抗性を有するＮ−アセチルノイラミン酸化合物のラクトン体を有効成分として含有する内在性シアリダーゼ耐性ラクトン体含有組成物に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来、シアル酸は細胞表面糖鎖、糖タンパク質糖鎖、又は糖脂質糖鎖の末端に位置し、細胞間識別等の種々な生理機能を有することが知られている（山内邦男他編、「ミルク総合辞典」、第１版、第５１９頁、朝倉書店、１９９２年）。
【０００３】
シアル酸はノイラミン酸のアシル誘導体の慣用名であり、例えばＮ−アセチル又はＮ−グリコリルノイラミン酸、及びＯ−アセチル又はＯ−グリコリルノイラミン酸等の化学物質を意味している。
【０００４】
シアル酸は乳中ではオリゴ糖、ガングルオシド、糖タンパク質等の構成分子として存在しており、感染防御活性があること、ビフィズス因子として作用すること（山内邦男他編、「ミルク総合辞典」、第５１９頁、朝倉書店、１９９２年）及び乳児の初期免疫を制御すること（酪農科学の研究、第１７巻、第Ａ−５５頁、１９６８年）等の生理機能が知られており、シアル酸化合物を食品、医薬品等に利用した例として、シアル酸含有粉乳（特開昭６１−１５２２３３号公報）、細菌毒素中和能を付与した育児用粉乳（特開平３−４９６４８号公報）、細菌毒素中和剤（特許第２８０５４９０号）、感染防御剤（特許第２６３１４７０号）、抗炎症剤（特許２６８４１７９号）、感染防御能を付与した育児用粉乳（特許第２５１４３７５号）等のとおり、シアル酸化合物を母乳代替品、機能性食品、及び医薬品素材として利用する試みが行われている。
【０００５】
しかしながら、前記従来技術のいずれにおいても、投与されたシアル酸化合物は細菌及びウイルスのシアリダーゼばかりではなく、動物及びヒトのシアリダーゼにより分解され、その生理機能を喪失することが知られている（丸尾文治、田宮信雄監修、「酵素ハンドブック」、初版、第４９９頁、朝倉書店、１９８６年）。
【０００６】
一般にシアリダーゼは、シアル酸化合物からα−ケトシド結合したシアル酸を遊離させる酵素であり、ウイルス、細菌、鳥類、哺乳動物等の種々の組織に広く分布している（丸尾文治、田宮信雄監修、「酵素ハンドブック」、初版、第４９９頁、朝倉書店、１９８６年）。
【０００７】
このような生理活性物質の酵素による分解及び不活性化を防止する方法として、例えば酵素の阻害剤を添加する方法〔バイオケミカル・ファーマコロジー(Biochemical Pharmacology)、第３６巻、第１０３５〜１０３９頁、１９８７年〕、又は閉鎖構造を有するリポソーム内等に生理活性物質を封じ込める方法（バイオサイエンスとバイオインダストリー、第５３巻、第１３０〜１３３頁、１９９５年）が一般的に知られているが、前記いずれの従来技術においても、このようなシアリダーゼに対する抵抗性を考慮した方法は採用されていない。
【０００８】
また、シアル酸化合物は、単一な物質ではなく、アセチルノイラミン酸又はグリコリルノイラミン酸を分子内に結合した糖脂質、オリゴ糖、糖タンパク質等の化合物の総称であるが、この中で特定の化合物がシアリダーゼの分解に対して抵抗性を有するか否かについては、前記いずれの従来技術においても記載されていない。
【０００９】
一方、シアル酸化合物の誘導体として、分子内に１−３ラクトン構造をもつ化合物（特開昭６１−１２６９５号公報）、又は１−７ラクトン構造をもつ化合物（特開昭６３−１３９１３号公報）が化学合成されている。また、分子内にラクトン構造を有するガングリオシドのラクトン体が脳内に存在すること〔ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(The journal of Biological Chemistry) 、第２６１巻、第８５１４頁、１９８６年〕、及びＮ−グリコリルノイラミン酸化合物の１−４又は１−２ラクトン体が羊乳中に存在すること〔ビオキミカ・エト・ビオフィジカ・アクタ(Biochimica et Biophysica Acta) 、第１３８１巻、第２８６頁、１９９８年〕が報告されている。
【００１０】
一般に、これらシアル酸化合物のラクトン体には、シアル酸化合物の有する遊離のカルボキシル基が存在せず、カルボキシル基がラクトン環の一部を形成しており、その分子構造においてシアル酸化合物とは全く異なる物質である。当然のことながら、シアル酸化合物は酸性の物質であり、中性のシアル酸化合物のラクトン体とは物理化学的性質においても全く異なっている。
【００１１】
また、シアル酸結合化合物のラクトン体は、従来知られている一般的なシアル酸化合物の分離法では、電気的性質が異なることから、全く又は極く微量しか分離できないという点においても、シアル酸化合物とは明らかに性質に異にする物質である（化学と生物、第３７巻、第４０１頁、１９９９年）。
【００１２】
これらのシアル酸化合物のラクトン体は後記のとおりシアリダーゼの分解に抵抗性を示す可能性が考えられる。しかしながら、シアル酸化合物の１−３又は１−７ラクトン体に関しては、シアリダーゼによる分解に対する抵抗性は全く知られていない。また、シアル酸化合物の１−３又は１−７ラクトン体は天然にはほとんど存在しない物質であり、安全性を含めてヒト及び動物に大量投与できないという問題点がある。
【００１３】
一方、ガングリオシドの１−４又は１−２ラクトン体がウイルス由来のシアリダーゼに分解抵抗性を示すことが示唆されている〔グリココンジュゲート・ジャーナル(Glycoconjugate Journal)、第１６巻、第２２３頁、１９９９年。以下従来技術１と記載する〕。また、Ｎ−グリコリルノイラミン酸化合物の１−４又は１−２ラクトン体が細菌由来のシアリダーゼに対しても分解抵抗性があるのではないかと推測されている〔ビオキミカ・エト・ビオフィジカ・アクタ(Biochimica et Biophysica Acta) 、第１３８１巻、第２８６頁、１９９８年。以下従来技術２と記載する〕。これらの従来技術１及び２には、シアリダーゼに対する抵抗性に関しても次に記載するとおり不明な点が多々あり、現状では産業上種々の利用を行うにはほど遠い状態にある。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
仮に、従来技術１及び２のラクトン体がウイルス及び細菌のシアリダーゼに対して抵抗性があったとしても、ヒト及び動物に投与した場合には、消化管及び粘膜等に存在するシアリダーゼ、即ち内在性のシアリダーゼにより容易に分解され、シアル酸化合物としての生理活性も失活することが考えられる。しかしながら、現時点でこれらのラクトン体に関しては、ウイルス及び細菌由来シアリダーゼによる分解に対する明確な抵抗性はもとより、ヒト及び動物のシアリダーゼに対する抵抗性も全く知られていない。
【００１５】
前記従来技術１及び２はラクトン体のウイルス及び細菌由来シアリダーゼに対する抵抗性を記載しているが、ヒト及び動物が本来有するシアリダーゼに対する抵抗性については記載していない。ヒト及び動物の種々の組織、特に消化管内（組織及び粘膜）には多量の内在性シアリダーゼが存在する。このような動物の組織及び消化管に存在する内在性シアリダーゼは動物種により異なり、更に細菌及びウイルスのシアリダーゼとも特徴が異なっている（代謝、第１６巻、第３７頁、１９７９年）。
【００１６】
例えば、シアル酸化合物の一種であるガンリオシドＧＭ２は従来シアリダーゼに抵抗性があると考えられてきたが、動物シアリダーゼはこのシアル酸化合物を分解する（代謝、第１６巻、第３７頁、１９７９年）。従って、経口的に摂取されたシアル酸化合物の場合、ラクトン体の安定性及び有効性（感染防御又は感染予防をいう）に関しては、第一にヒト及び動物の消化管内のシアリダーゼに対する抵抗性を考慮しなければならず、その次に細菌及びウイルスのシアリダーゼに対する抵抗性をも考慮しなければならないのである。
【００１７】
また、従来技術１はガングリオシドのラクトン体についてのみウイルスシアリダーゼによる分解に対する抵抗性を記載している。しかしながら、ガングリオシドのラクトン体は、天然由来の物質であるがミンククジラ等の脳に微量に発見されている物質であり〔カーボハイドレート・リサーチ(Carbohydrate Research) 、第３０７巻、第２８１頁、１９９８年〕、食品及び医薬品に応用することは質的にも量的にも不可能である。
【００１８】
また、従来技術２のＮ−グリコリルノイラミン酸化合物の１−４又は１−２ラクトン体は羊乳中に存在する化合物であるが、ヒトを含む何種類かの動物にはＮ−グリコリルノイラミン酸化合物は全く存在せず、投与した場合の消化性及び安全性は未知である（今堀和友他監修、「生化学辞典」、第１版、第５４１頁、東京化学同人、１９８４年）。
【００１９】
更に、Ｎ−グリコリルノイラミン酸のラクトン体について、抗ウイルス薬としての応用及び感染予防剤を添加した育児用粉乳への応用の可能性が示唆されているが（化学と生物、第３７巻、第４０１頁、１９９９年）、同様にヒト及びある種の動物に投与した場合の安全性、ヒト及び動物の体内に存在するシアリダーゼに対する抵抗性が不明であり、Ｎ−グリコリルノイラミン酸のラクトン体の食品及び医薬品への応用は不可能な状況にあった。
【００２０】
そこで、この出願の発明者らは、前記従来技術に鑑みて、鋭意研究を行い、後記試験例から明らかなとおり、種々のシアル酸化合物のラクトン体の中で、牛乳から分離されたＮ−アセチルノイラミン酸化合物の１−４又は１−２ラクトン体が動物及びヒトの内在性シアリダーゼによる分解に対して顕著な抵抗性を有することを見出した。
【００２１】
この出願の発明は、以上のとおり、知見に基づいてなされたものであって、生体内で安定なＮ−アセチルノイラミン酸化合物の１−４又  は１−２ラクトン体を含有する栄養組成物又は抗ウイルス剤を提供することを課題としている。
【００２２】
前記課題を解決するこの出願の発明は、第１には、動物及びヒトの内在性シアリダーゼによる加水分解に抵抗性を有するＮ−アセチルノイラミン酸化合物の１−４又は１−２ラクトン体を、有効成分として少なくとも０．０１重量％の割合で含有することを特徴とする抗ウイルス剤を提供する。
前記課題を解決するこの出願の発明は、第２には、動物及びヒトの内在性シアリダーゼによる加水分解に抵抗性を有するＮ−アセチルノイラミン酸化合物の１−４又は１−２ラクトン体を、有効成分として少なくとも０．０１重量％の割合で含有することを特徴とする大腸菌付着阻止剤を提供する。
前記課題を解決するこの出願の発明は、第３には、動物及びヒトの内在性シアリダーゼによる加水分解に抵抗性を有するＮ−アセチルノイラミン酸化合物の１−４又は１−２ラクトン体を、有効成分として少なくとも０．０１重量％の割合で含有することを特徴とする細菌感染予防剤を提供する。
本発明のＮ−アセチルノイラミン酸化合物の１−４又は１−２ラクトン体は、３’−Ｎアセチルノイラミニルラクトース１−４ラクトン、３’−Ｎアセチルノイラミニルラクトース１−２ラクトン、又はカゼイン若しくはカゼイン加水分解物より得られるＮ−アセチルノイラミン酸化合物の１−４若しくは１−２ラクトン体であることが好ましい。
【００２３】
【発明の実施の形態】
以下、この出願の発明の実施の形態について詳細に説明する。なお、以下の記載において、百分率は付着率を除き、特に断りの無い限り重量による値である。
【００２４】
まず、この出願の発明に使用するＮ−アセチルノイラミン酸化合物の１−４又は１−２ラクトン体は、出願人が既に特許出願した発明（平成１１年特許願第３３１２９５号）により、次のとおり製造することができる。
【００２５】
即ち、Ｎ−アセチルノイラミン酸化合物を含有する牛乳、ホエイ等の原料中のラクトン体を予め開環処理し、該原料中のＮ−アセチルノイラミン酸化合物を分離し、ラクトン化し、陰イオン交換体に接触し、非吸着画分を取得する。この方法により得られた内在性シアリダーゼ耐性Ｎ−アセチルノイラミン酸化合物の１−４又は１−２ラクトン体（以下、単にラクトン体と記載することがある）は、そのまま液状で、育児用粉乳、離乳食、又は経腸栄養剤の原料として使用することができる。尚、より具体的には参考例１及び参考例２を参照することができる。
【００２６】
食品、抗ウイルス剤等にラクトン体を含有させる具体的な方法は、液状で混合することも可能であり、粉末状で混合することもできる。しかしながら、ラクトン体は液状では、徐々にではあるが分解される場合があるので、長期の保存を前提とした食品、抗ウイルス剤等では粉末状で混合されたものをそのまま用いるか、又は使用時に溶解して使用するか、いずれかが望ましい。
【００２７】
ラクトン体を粉末で製造して原料とする場合、液状で得られたラクトン体の画分を、脱塩し、急速に冷凍し、凍結乾燥することにより、ラクトン体の保存安定性を向上させた粉末状態とすることができる。
【００２８】
この出願の発明の育児用粉乳、離乳食、又は経腸栄養剤において、脂肪を含有する粉末を製造する場合には、例えば、水相と油相を別個に調製し、乳化剤、安定剤を添加し、均一に混合し、均質機により均質化し、濃縮し、乾燥し、粉末状の中間製品を製造し、この中間製品に、ラクトン体、必要に応じて難消化性糖類、微量の金属、鉄剤、その他の製品原料を添加し、均一に混合し、最終製品を製造することも可能である。
【００２９】
この出願の発明の抗ウイルス剤を製造する場合は、薬学的に許容されている賦形剤、増量剤、希釈剤、溶解補助剤等と適宜混合し、錠剤、丸剤、カプセル剤、酸剤、坐剤等の形態に製造することができる。
【００３０】
この発明の最終製品である育児用ミルク、離乳食、経腸栄養剤又は抗ウイルス剤におけるシアル酸化合物のラクトン体の含量は、少なくとも０．０１％であり、より望ましくは０．１〜３０％である。また、育児用ミルク、離乳食又は経腸栄養剤においては、通常ラクトン体を１ｍｇ／ｋｇ／日以上投与されるのが望ましい。更に、この発明の抗ウイルス剤は、症状、年齢等により異なるが、後記する試験例から明らかなとおり、ラクトン体を１０ｍｇ／ｋｇ／日以上投与されるのが望ましい。
【００３１】
次に、試験例を示してこの出願の発明を詳細に説明する。
試験例１
この試験は、この出願の発明のラクトン体の内在性シアリダーゼに対する抵抗性を調べるために行なった。
（１）試料の調製
１）内在性シアリダーゼの調製
−８０℃で保存したヒトの大腸に、氷冷した０．１ｍＭフェニルメチルスルフォニルフルオライド（ロッシュダイアグノシス社製）を含むＰＢＳ緩衝液（シグマ社製）９容量を添加し、テフロン・グラスホモジナイザー（東京理化器械社製）により均質化し、１０００ｘｇで１０分間遠心分離し、上清を分取し、３．４ｍｇ／ｍｌの蛋白濃度にリン酸緩衝液で希釈し、粗抽出した内在性シアリダーゼ液を得た。
２）各試料の調製
３′−Ｎ−アセチルノイラミニルラクトース（シグマ社製）又は後記する参考例１と同一の方法により調製した３′−Ｎ−アセチルノイラミニルラクトースラクトンを、０．１ｍｇ／ｍｌの濃度で１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．６）０．１ｍｌに溶解した。
【００３２】
各溶液を前記内在性シアリダーゼ液０．１ｍｌと混合し、３７℃で反応させ、試料を調製した。また、対照として、酢酸ナトリウム緩衝液０．１ｍｌを前記内在性シアリダーゼ液０．１ｍｌと混合し、同様に保持した。
（２）試験方法
遊離したシアル酸を過ヨウ素酸−チオバルビツール酸法（代謝、第１６巻、第７６１頁、１９７９年）により定量した。この方法は次に具体的に示すとおり、シアル酸から過ヨウ素酸酸化によりβ−ホルミルピルビン酸を生成させ、これをチオバルビツール酸により発色させて定量する方法である。
【００３３】
この方法に使用した試薬は次のとおりである。
▲１▼過ヨウ素酸液
過ヨウ素酸（和光純薬工業社製）を２５ｍＭの最終濃度で０．１２５Ｎ硫酸に溶解した。
【００３４】
▲２▼亜砒酸ナトリウム液
亜砒酸ナトリウム（和光純薬工業社製）を２％の最終濃度で０．５Ｎ塩酸に溶解した。
【００３５】
▲３▼チオバルビツール酸液
２−チオバルビツール酸（ナカライテスク社製）を０．１Ｍの最終濃度で水に溶解し、水酸化ナトリウムによりｐＨを９．０に調整した。
【００３６】
▲４▼酸性ブタノール
ｎ−ブタノール（ナカライテスク社製）９５ｍｌと１２Ｎ塩酸５ｍｌとを混合した。
【００３７】
各試料及び対照溶液に内在性シアリダーゼ液を混合し、２、４及び６時間後に陽イオン交換カラムＡＧ１Ｘ２（バイオラッド社製）に通液し、透過液を適宜希釈し、その０．５ｍｌに過ヨウ素酸液０．２５ｍｌを添加し、３７℃で３０分間保持した。のち、亜砒酸ナトリウム液０．２ｍｌを添加して過ヨウ素酸を分解し、チオバルビツール酸液２ｍｌを添加し、キャップをして沸騰湯浴中に７．５分間保持して発色させた。
【００３８】
発色後、氷水中に浸漬して冷却し、酸性ブタノール５．０ｍｌを添加し、十分混合し、色素をブタノール層に転溶し、５４９ｎｍにおける吸光度を測定した。同時に既知濃度のシアル酸（シグマ社製）を同様に測定し、標準曲線を作成し、試料中のシアル酸濃度を定量した。
【００３９】
尚、３′−Ｎ−アセチルノイラミニルラクトース又は３′−Ｎ−アセチルノイラミニルラクトースラクトンから遊離したシアル酸の量は、対照の緩衝液のみを粗酵素と混合して得られたシアル酸量、即ちバックグランドをそれぞれ差し引いて求めた。
【００４０】
また、３′−Ｎ−アセチルノイラミニルラクトースから遊離したシアル酸生成量（Ａ）、及び３′−Ｎ−アセチルノイラミニルラクトースラクトンから遊離したシアル酸生成量（Ｂ）から次式により、３′−Ｎ−アセチルノイラミニルラクトースラクトンの分解抵抗性倍率を算出した。
【００４１】
分解抵抗性倍率＝Ａ／Ｂ
（３）試験結果
この試験の結果は、図１に示すとおりである。図中△及び○は、それぞれ３′−Ｎ−アセチルノイラミニルラクトース及び３′−Ｎ−アセチルノイラミニルラクトースラクトンの結果を示す。
【００４２】
図１から明らかなとおり、３′−Ｎ−アセチルノイラミニルラクトースは管上度細胞に存在するシアリダーゼにより分解されるのに対して、３′−Ｎ−アセチルノイラミニルラクトースラクトンは全く分解されないか、又は極く僅か分解されるのみであり、内在性のシアリダーゼによる消化に対して強い抵抗性を有することが判明した。
【００４３】
また、例えば内在性シアリダーゼ液と各試料を４時間反応させた後の分解抵抗性倍率は４を超えており、３′−Ｎ−アセチルノイラミニルラクトースと比較してそのラクトン体は４倍以上もの分解抵抗性を示すことが認められた。
【００４４】
この試験結果からこの出願の発明のラクトン体が内在性シアリダーゼに耐性を有することが判明した。
尚、内在性シアリダーゼの種類、Ｎ−アセチルノイラミン酸化合物及びラクトン体の種類を適宜変更して試験したが、いずれの場合も、ラクトン体の分解抵抗性倍率は４以上であり、ラクトン体はヒト及び動物の内在性のシアリダーゼに対して高い分解抵抗性を示すことが確認された。
試験例２
この試験は試験管内におけるこの出願の発明の育児用粉乳の大腸菌付着阻止効果を調べるために行った。
（１）試料の調製
育児用粉乳は、参考例１と同一の方法により調製した３′−Ｎ−アセチルノイラミニルラクトースラクトンを０％（対照）、０．００１％、０．０１％、０．１％及び１．０％添加したことを除く、後記実施例１と同一の方法により５種類の試料を調製した。
（２）試験方法
ハートインフュージョン培地（日水製薬社製）により培養した大腸菌ｏ１１ａ（ＡＴＣＣ２９５５２）を１０8 個／ｍｌの割合でイーグル培地（ギブコＢＲＬ社製）に懸濁した。この懸濁液０．１ｍｌに、３′−Ｎ−アセチルノイラミニルラクトースラクトンを含む前記育児用粉乳試料又は対照試料をそれぞれ１３％の濃度に溶解した溶液０．１ｍｌを添加し、更にイーグル培地中で継代培養しているヒト小腸由来４０７株（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６）０．８ｍｌを添加し、３０℃の温度で１時間それぞれ培養した。
【００４５】
培養後、各試料を顕微鏡下で細胞に付着している菌数を観測し、細胞５０個当たりの付着菌数を計測し、対照試料における菌数（Ｃ）及び各試料における菌数（Ｂ）から、付着率（Ａ）を次式により算出して試験した。
【００４６】
Ａ（％）＝（Ｂ／Ｃ）×１００
（３）試験結果
この試験の結果は表１に示すとおりである。表１から明らかなとおり、３′−Ｎ−アセチルノイラミニルラクトースラクトン０．０１％以上の濃度において、付着率が顕著に低下し、０．１％及び１．０％の濃度において、付着がほぼ認められず、０．０１％以上の濃度において大腸菌の細胞への付着防止効果が認められた。
【００４７】
この試験結果からラクトン体を少なくとも０．０１％含有することが、有効であることが判明した。
尚、ラクトン体の種類を変更して試験したが、ほぼ同様の結果が得られた。
【００４８】
【表１】
0004601107.tif 000002
【００４９】
試験例３
この試験は生体内における３′−Ｎ−アセチルノイラミニルラクトースラクトンの細菌感染予防効果を調べるために行った。
（１）試験動物及び試料の調製
１）試験動物
試験に使用した動物は次のとおりである。体重約２００ｇのウイスター系ラット（日本チャールスリバー社より購入）２５匹を無作為に５匹ずつ５群に分け、１群を対照群、残りの４群を試験群とした。
２）試料の調製
育児用粉乳は３′−Ｎ−アセチルノイラミニルラクトースラクトンを０％（対照）、０．００１％、０．０１％、０．１％、及び１．０％を添加したことを除き、後記実施例１と同一の方法により４種類の試料を調製した。
（２）試験方法
大腸菌ｏ５５（ＡＴＣＣ１２０１４）を１０8 個／ｍｌ含む懸濁液０．５ｍｌに、前記各試料を１３％の濃度で溶解した溶液９．５ｍｌを添加し、直ちに一匹当り２ｍｌを各群のラットに経口投与し、ＭＦ固形試料（オリエンタル酵母工業社製）及び新鮮な水道水を自由に摂取させて３日間飼育し、のち下痢の発症状態を観察して試験した。
（３）試験結果
この試験の結果は表２に示すとおりである。表２から明らかなとおり、３′−Ｎ−アセチルノイラミニルラクトースラクトンを０．０１％以上添加した育児用粉乳を投与した群では、顕著に下痢の発症が低下し、感染予防効果が認められた。
【００５０】
この試験結果から、ラクトン体を少なくとも１ｍｇ／ｋｇ／日の割合で投与することが、大腸菌による下痢の予防に有効であることが判明した。
尚、ラクトン体の種類を変更して試験したが、ほぼ同様の結果が得られた。
【００５１】
【表２】
0004601107.tif 000003
【００５２】
試験例４
この試験は生体内における本発明の３′−Ｎ−アセチルノイラミニルラクトースラクトンのウイルス感染予防効果を調べるために行った。
（１）試験動物及び試料の調製
１）試験動物
試験動物としてＢＡＬＢ／Ｃ系５日齢マウス２７匹（体重約３〜４ｇ）を無作為に１群９匹の３群に分けた。
２）試料の調製
参考例１と同一の方法により３′−Ｎ−アセチルノイラミニルラクトースラクトンを調製した。
（２）試験方法
前記３′−Ｎ−アセチルノイラミニルラクトースラクトンを、１ｍｇ又は２ｍｇを蒸留水１ｍｌに溶解した液及びヒトロタウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＰ−２１０４）を１０6 ＦＣＦＦＵ(Fluorescent Cell Focus Forming Unit) ／ｍｌの割合で混合し、３７℃、３０分間培養した培養液を体重１ｇ当たり０．０１ｍｌの割合で前記試験動物の２群に経口投与し、のち試験例３と同様に飼育された同種の母マウスから授乳させ、３日後の下痢症状の程度を観察して試験した。尚、３′−Ｎ−アセチルノイラミニルラクトースラクトンを添加しない混合液を対照群に投与した。
（３）試験結果
この試験の結果は表３に示すとおりである。表３から明らかなとおり、対照群では、ほとんどのマウスに下痢が認められたのに対して、ラクトン体を投与した両試験群では下痢が顕著に抑制されていることが認められた。
【００５３】
この試験結果から、この発明のラクトン体は、ウイルスに対しても有効であることが判明した。
尚、ラクトン体の種類を変更して試験したが、ほぼ同様の結果が得られた。
【００５４】
【表３】
0004601107.tif 000004
【００５５】
参考例１
ウシ初乳１５ｋｇを１２，０００ｇで２０分間遠心して脱脂し、脱脂乳約１０ｋｇを得た。水２０ｋｇを添加し、４倍容量のクロロホルム及びエタノール（いずれも和光純薬工業社製）２：１混合液により抽出し、除蛋白し、得られた水相を４０℃以下に保持してロータリーエバポレーターで約１０００ｍｌ（固形分換算で４．０％）に濃縮した。
【００５６】
得られた濃縮液を−１０℃のフリーザー（日立製作所製）で徐々に冷却し、凍結させ、のち室温に放置して融解し、Ｎ−アセチルノイラミン酸化合物のラクトン体を開環処理した。融解した溶液をワコーゲルＬＰ−４０Ｃ１８カラム（和光純薬工業社製）に通液し、残存するペプチドを除去した透過液を得た。
【００５７】
次いで、得られた透過液（固形分換算で３．５％）を４℃で、陰イオン交換体ＡＧ１Ｘ４（バイオラッド社製。イオン型Ｃｌ- 、イオン強度１３．５ｍＳ／ｃｍ）を充填したカラムに通液し、カラムに吸着したＮ−アセチルノイラミン酸化合物を０．５Ｍ塩化ナトリウム溶液により溶出し、溶出液をマイクロアシライザーＧ１（旭化成工業社製）を使用して脱塩し、凍結乾燥し、３′−Ｎ−アセチルノイラミニルラクトースラクトンを含有する粉末約７．９ｇを得た。
【００５８】
この凍結乾燥粉末を氷酢酸（和光純薬工業社製）に固形分換算で２％の濃度で溶解し、３７℃で７日間反応させラクトン化した。
得られたＮ−アセチルノイラミン酸化合物のラクトン体を含有する溶液を水で１０倍に希釈し、マイクロアシライザーＧ１（旭化成工業社製）により酢酸を除去し、固形分換算で０．１％の濃度に調整し、この溶液を４℃で、ＡＧ１Ｘ４（バイオラッド社製。イオン型Ｃｌ- 、イオン強度１３．５ｍＳ／ｃｍ）を充填したカラムに通液し、非吸着画分を分離し、透過液を採取した。
【００５９】
次いで、得られた透過液をマイクロアシライザーＧ１（旭化成工業社製）を使用して脱塩し、−８０℃のドライアイスアセトンバスにより急冷して凍結し、凍結乾燥し、純度約９７％の３′−Ｎ−アセチルノイラミニルラクトースラクトンを含有する粉末約５．９ｇを得た。
参考例２
レンネットホエー由来のＮ−アセチルノイラミン酸化合物のラクトン体の製造例
レンネットホエー（森永乳業社製）２００ｋｇを水酸化ナトリウム（三栄源エフ・エフ・アイ社製）によりｐＨ７．０に調整し、クラリファイヤー（エーピーブイ社製）により微細な沈殿物を除去し、濃縮機（旭化成工業社製）で濃縮し、電気透析装置（旭化成工業社製）により脱塩した。
【００６０】
得られた濃縮液を−１０℃のフリーザー（日立製作所製）により徐々に冷却して凍結させ、のち室温に放置して融解し、Ｎ−アセチルノイラミン酸化合物のラクトン体を開環処理した。
【００６１】
次いで、融解した溶液（固形分換算で１９％）を４℃で、陰イオン交換体ＤＥＡＥ−セファデックス（アマシャムファルマシアバイオテック社製。イオン型Ｃｌ- 、イオン強度３ｍＳ／ｃｍ）とバッチ法により接触させ、陰イオン交換体ゲルを水洗し、吸着したシアル酸化合物を０．８Ｍ塩化ナトリウム溶液で溶出し、溶出液を電気透析装置（旭化成工業社製）により脱塩し、凍結乾燥し、Ｎ−アセチルノイラミン酸化合物を含有する粉末約９００ｇを得た。
【００６２】
得られた凍結乾燥粉末を氷酢酸（三栄源エフ・エフ・アイ社製）に固形分換算で２％の濃度で溶解し、３７℃で７日間反応させラクトン化し、のち得られたシアル酸化合物のラクトン体を含有する溶液を水で１０倍に希釈し、電気透析装置（旭化成工業社製）により酢酸を除去し、固形分換算で０．１％の濃度に調整し、この溶液を４℃で、ＤＥＡＥ−セファデックス（アマシャムファルマシアバイオテック社製。イオン型Ｃｌ- 、イオン強度３ｍＳ／ｃｍ）とバッチ法により接触させ、非吸着画分の溶液を採取した。
【００６３】
次いで得られた、非吸着画分溶液を−４０℃のフリージングバスにより急冷して凍結し、凍結乾燥し、レンネットホエー由来のＮ−アセチルノイラミン酸化合物のラクトン体を含有する凍結乾燥粉末約２３０ｇを得た。
【００６４】
次に実施例を示して更に詳細に説明するが、この出願の発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００６５】
【実施例】
参考例３
乳糖（ドイツのミライ社製）７．５ｋｇ、及び脱脂粉乳（森永乳業社製）２．５ｋｇを水５０ｋｇに溶解し、水相をタンク内に調製した。一方、植物油１．９６ｋｇ（太陽油脂社製）及びレシチン（味の素社製）０．０４ｋｇを溶融混合し、油相を調製した。タンク内の水相に油相を添加し、攪拌して混合し、７０℃に加温し、均質機（三和機械社製）により１．４７×１０７Ｐａの圧力で均一化し、９０℃で１０分間殺菌し、濃縮し、噴霧乾燥し、粉末状の中間製品約１０ｋｇを得た。
【００６６】
この粉末状の中間製品７．２８ｋｇに、脱塩ホエー（オランダのドモ社製）０．５ｋｇ、ウシラクトフェリン（森永乳業社製）０．２ｋｇ、炭酸カルシウム（和光純薬工業社製）０．０２ｋｇ、及び前記参考例１と同一の方法により製造した３’−Ｎ−アセチルノイラミニルラクトースラクトン７ｇを添加し、ミキサーで均一に混合し、最終製品である育児用粉乳約８ｋｇを得た。
参考例４
乳糖（ドイツのミライ社製）１．５ｋｇ及び脱脂粉乳（森永乳業社製）０．５ｋｇを水１０ｋｇに溶解し、得られた水相をタンク内に貯蔵した。一方、植物油０．３９２ｋｇ（太陽油脂社製）及びレシチン（味の素社製）８ｇを溶融混合し、油相を調製した。タンク内の水相に油相を添加し、攪拌して混合し、７０℃に加温し、均質機（三和機械社製）により１．４７×１０７ Ｐａの圧力で均質化し、９０℃で１０分間殺菌し、濃縮し、噴霧乾燥し、粉末状の中間製品約２ｋｇを得た。
【００６７】
この粉末状の中間製品０．５ｋｇに、脱塩ホエー（オランダのドモ社製）０．０３４ｋｇ、ウシラクトフェリン（森永乳業社製）０．０１３ｋｇ、炭酸カルシウム（和光純薬工業社製）１．３ｇ及び参考例１と同一の方法により製造した３′−Ｎ−アセチルノイラミニルラクトースラクトン５ｇを添加し、ミキサーで均一に混合し、最終製品である育児用粉乳約０．５５ｋｇを得た。
実施例３
ホエー蛋白酵素分解物（森永乳業社製）１ｋｇ、デキストリン（昭和産業社製）３．３ｋｇ、及び少量の水溶性ビタミンとミネラルを水１８．５ｋｇに溶解し、水相をタンク内に貯蔵した。一方、大豆サラダ油（太陽油脂社製）０．２７ｋｇ、パーム油（太陽油脂社製）０．７８ｋｇ、サフラワー油（太陽油脂社製）０．２３ｋｇ、レシチン（味の素社製）１９ｇ、脂肪酸モノグリセリド（花王社製）１９ｇ及び少量の脂溶性ビタミンを溶融混合し、油相を調製した。タンク内の水相に油相を添加し、攪拌して混合し、７０℃に加温し、均質機（三和機械社製）により１．４７×１０7 Ｐａの圧力で均質化し、９０℃で１０分間殺菌し、濃縮し、噴霧乾燥し、粉末状の中間製品約５．５ｋｇを得た。
【００６８】
この粉末状の中間製品に蔗糖（ホクレン社製）０．７６ｋｇ、参考例１と同一の方法により製造した３′−Ｎ−アセチルノイラミニルラクトースラクトン５ｇ、アミノ酸混合粉末（味の素社製）０．０１８５ｋｇ、ウシラクトフェリン（森永乳業社製）０．６９４ｋｇ及びクエン酸第１鉄ナトリウム（エーザイ社製）９．３ｇを均一に混合し、粉末状の経腸栄養剤約６．９ｋｇを得た。
実施例４
１錠当たり次の割合で各成分を均一に混合し、常法により造粒し、乾燥し、打錠し、錠剤（抗ウイルス剤）を得た。尚、参考例１と同一の方法により製造した３′−アセチルノイラミニルラクトースラクトン以外の原料はいずれも市販品を使用した。
【００６９】
３′−Ｎ−アセチルノイラミニルラクトースラクトン      ５（ｍｇ）
結晶セルロース                                  １７０
コーンスターチ                                    ６６
タルク                                            １１
ステアリン酸マグネシウム                            ３
実施例５
１錠当たり次の割合で各成分を均一に混合し、常法により造粒し、乾燥し、打錠し、抗ウイルス剤の錠剤を得た。尚、参考例１と同一の方法により製造した３′−アセチルノイラミニルラクトースラクトン以外の原料はいずれも市販品を使用した。
【００７０】
３’−Ｎ−アセチルノイラミニルラクトースラクトン    ５０（ｍｇ）
乳糖                                             １７０
結晶セルロース                                       ８．５
カルボキシメチルセルロース                           ２
タルク                                               ３
参考例５
乳糖（ドイツのミライ社製）７．５ｋｇ、及び脱脂粉乳（森永乳業社製）２．５ｋｇを水５０ｋｇに溶解し、水相をタンク内に貯蔵した。一方、植物油１．９６ｋｇ（太陽油脂社製）及びレシチン（味の素社製）０．０４ｋｇを溶融混合し、油相を調製した。タンク内の水相に油相を添加し、攪拌して混合し、７０℃に加温し、均質機（三和機械社製）により１．４７×１０７ Ｐａの圧力で均質化し、９０℃で１０分間殺菌し、濃縮し、噴霧乾燥し、粉末状の中間製品約１０ｋｇを得た。
【００７１】
得られた中間製品７．２８ｋｇに、脱塩ホエー（オランダのドモ社製）０．５ｋｇ、ウシラクトフェリン（森永乳業社製）０．２ｋｇ、炭酸カルシウム０．０２ｋｇ、及び前記参考例２と同一の方法により製造したレンネットホエー由来の３’−Ｎ−アセチルノイラミン酸化合物のラクトン体７ｇを添加し、ミキサーで均一に混合し、最終製品である育児用粉乳約８ｋｇを得た。
参考例６
乳糖（ドイツのミライ社製）１．５ｋｇ、及び脱脂粉乳（森永乳業社製）０．５ｋｇを水１０ｋｇに溶解し、水相をタンク内に貯蔵した。一方、植物油０．３９２ｋｇ（太陽油脂社製）及びレシチン（味の素社製）８ｇを溶融混合し、油相を調製した。タンク内の水相に油相を添加し、攪拌して混合し、７０℃に加温し、均質機（三和機械社製）により１．４７×１０７ Ｐａの圧力で均質化し、９０℃で１０分間殺菌し、濃縮し、噴霧乾燥し、粉末状の中間製品約２ｋｇを得た。
【００７２】
得られた中間製品０．５ｋｇに、脱塩ホエー（オランダのドモ社製）０．０３４ｋｇ、ウシラクトフェリン（森永乳業社製）０．０１３ｋｇ、炭酸カルシウム１．３ｇ及び前記参考例２と同一の方法により製造したレンネットホエー由来の３’−Ｎ−アセチルノイラミン酸化合物のラクトン体５ｇを添加し、ミキサーで均一に混合し、最終製品である育児用粉乳約０．５５ｋｇを得た。
参考例７
ホエー蛋白酵素分解物（森永乳業社製）１ｋｇ、デキストリン（昭和産業社製）３．３ｋｇ、少量の水溶性ビタミン及びミネラルを水１８．５ｋｇに溶解し、水相をタンク内に貯蔵した。一方、大豆サラダ油（太陽油脂社製）０．２７ｋｇ、パーム油（太陽油脂社製）０．７８ｋｇ、及びサフラワー油（太陽油脂社製）０．２３ｋｇ、レシチン（味の素社製）１９ｇ、脂肪酸モノグリセリド（花王社製）１９ｇ及び少量の脂溶性ビタミンを溶融混合し、油相を調製した。タンク内の水相に油相を添加し、攪拌して混合し、７０℃に加温し、均質機（三和機械社製）により１．４７×１０７ Ｐａの圧力で均質化し、９０℃で１０分間殺菌し、濃縮し、噴霧乾燥し、粉末状の中間製品約５．５ｋｇを得た。
【００７３】
得られた中間製品に蔗糖（ホクレン社製）０．７６ｋｇ、前記参考例２と同一の方法により製造したレンネットホエー由来の３′−Ｎ−アセチルノイラミン酸化合物のラクトン体５ｇ、アミノ酸混合粉末（味の素社製）０．０１８５ｋｇ、ウシラクトフェリン（森永乳業社製）０．６９４ｋｇ及びクエン酸第１鉄ナトリウム（エーザイ社製）９．３ｇを均一に混合し、経腸栄養剤約６．９ｋｇを得た。
実施例９
１錠当たり次の割合で各成分を均一に混合し、常法により造粒し、乾燥し、打錠し、錠剤（抗ウイルス剤）を得た。尚、前記参考例２と同一の方法により製造したレンネットホエー由来の３′−Ｎ−アセチルノイラミン酸化合物のラクトン体以外の原料はいずれも市販品を使用した。
【００７４】
レンネットホエー由来３′−Ｎ−アセチル
ノイラミン酸化合物のラクトン体                      ５（ｍｇ）
結晶セルロース                                  １７０
コーンスターチ                                    ６６
タルク                                            １１
ステアリン酸マグネシウム                            ３
実施例１０
１錠当たり次の割合で各成分を均一に混合し、常法により造粒し、乾燥し、打錠し、抗ウイルス剤の錠剤を得た。尚、前記参考例２と同一の方法により製造したレンネットホエー由来の３′−Ｎ−アセチルノイラミン酸化合物のラクトン体以外の原料はいずれも市販品を使用した。
【００７５】
レンネットホエー由来３′−Ｎ−アセチル
ノイラミン酸化合物のラクトン体                      ５（ｍｇ）
乳糖                                            １７０
結晶セルロース                                      ８．５
カルボキシメチルセルロース                          ２
タルク                                              ３
【００７６】
【発明の効果】
以上詳記したとおり、この出願の発明は、内在性シアリダーゼによる加水分解に抵抗性を有するＮ−アセチルノイラミン酸化合物のラクトン体を、有効成分として少なくとも０．０１重量％の割合で含有することを特徴とするラクトン体含有組成物に関するものであり、この出願の発明により奏される効果は次のとおりである。
１）Ｎ−アセチルノイラミン酸化合物の１−４又は１−２ラクトン体は天然に存在する物質であり、ヒト及び動物に投与した場合、従来の１−３又は１−７ラクトン体に比較して安全性が高い。
２）Ｎ−アセチルノイラミン酸化合物の１−４又は１−２ラクトン体は内在性シアリダーゼによりほとんど分解されず、しかもシアル酸のいくつかの生理機能を保持している。
３）Ｎ−アセチルノイラミン酸化合物の１−４又は１−２ラクトン体を含有するこの出願の発明の組成物は、従来のシアル酸を含有した栄養組成物又は抗ウイルス剤と比較してより優れた生理機能を有する製品を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、反応時間と遊離シアル酸量との関係を示す。
【図１】
0004601107.tif 000005