(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の遺伝子領域：
ＲＳＶの融合糖蛋白遺伝子のＦ１サブユニット
ＰＩＶ−１の赤血球凝集素ノイラミニダーゼ遺伝子
ＰＩＶ−３融合蛋白遺伝子の５’非コーディング領域
M. pneumoniaeの１６Ｓ ｒＲＮＡ配列
C. pneumoniaeの１６Ｓ領域
エンテロウイルス
インフルエンザＡ由来の非構造蛋白遺伝子
インフルエンザＢ由来の非構造蛋白遺伝子、および
アデノウイルスのヘキソン遺伝子
のそれぞれに由来するプライマーセットを少なくとも１つずつ含むプライマー混合物を用いることにより生物学的試料中に存在するいくつかの標的ヌクレオチド配列を同時増幅することを含む、急性気道感染の検出方法であって、該プライマーセットは、それぞれ配列番号：５１および５２、配列番号：４７および４８、配列番号：４９および５０、配列番号：３７および３８、配列番号：４５および４６、配列番号：３５および３６、配列番号：３９および４０、配列番号：４１および４２、または配列番号：４３および４４で示される配列を有する、検出方法。
【請求項２】
M. pneumoniaeの１６Ｓ ｒＲＮＡ配列由来のプライマーセットが、M. pneumoniaeの１６Ｓ ｒＲＮＡ配列と２３Ｓ ｒＲＮＡ配列との間のスペーサー領域に由来する配列番号：１７および１９または配列番号：１８および１９で示される配列を有するプライマーセットに置き換えられ、かつ、C. pneumoniaeの１６Ｓ領域由来のプライマーセットが、C. pneumoniaeの１６Ｓ ｒＲＮＡ配列と２３Ｓ ｒＲＮＡ配列との間のスペーサー領域に由来する配列番号：２０および２１で示される配列を有するプライマーセットに置き換えられている請求項１記載の方法。
【請求項３】
さらにB. pertussisおよびB. parapertussisを特異的に検出するための少なくとも１つのプライマーセットが使用され、該プライマーセットは、配列番号：２２および２３で示される配列を有する請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
引き続いて、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３および配列番号：３４から選択されるプローブを用いて該増幅生成物が検出される請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
請求項１記載の遺伝子領域のそれぞれに由来するプライマーセットを少なくとも１つずつ含むプライマー混合物であって、配列番号：３５および３６、配列番号：３７および３８、配列番号：３９および４０、配列番号：４１および４２、配列番号：４３および４４、配列番号：４５および４６、配列番号：４７および４８、配列番号：４９および５０、配列番号：５１および５２、配列番号：１７および１９、配列番号：１８および１９、配列番号：２０および２１、ならびに配列番号：２２および２３からなる群から選択される少なくとも９つのプライマーセットを含むプライマー混合物。
【請求項６】
請求項１記載の遺伝子領域のそれぞれについて特異的なプローブを少なくとも１つずつ含む、呼吸器病原体を同時検出するためのプローブ混合物であって、配列番号：５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３および３４、それらの相補形態、ならびにＴがＵに置換されたそれらのＲＮＡ形態から選択される少なくとも９つのプローブを含むプローブ混合物。
【請求項７】
請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法を行うための急性気道感染を検出するためのキットであって、請求項５記載のプライマー混合物を含むキット。
【請求項８】
請求項４記載の方法を行うための急性気道感染を検出するためのキットであって、請求項６記載のプローブ混合物を含むキット。
【請求項９】
固体支持体上の並行線として該プローブが適用される請求項８記載のキット。
【請求項１０】
固体支持体がナイロン膜である請求項９記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は微生物の検出、より詳細には急性気道感染の検出の分野に関する。
【０００２】
急性気道感染（ＡＲＩ）は世界の小児の罹病および死亡の最もありふれた原因であり、発展途上国の小児の死亡の約３０％はこれによる（Hinman et al., 1998）。先進国においてはまれにしか死亡を引き起こさないが、ＡＲＩに対しては莫大な直接的および間接的健康ケア費用が必要となる（Garenne et al., 1992; UNICEF, 1993; Dixon, 1985）。ＡＲＩの原因は広範な微生物を包含する。Streptococcus pneumoniae、Haemophilus influenzaeおよびMoraxella caterrhalis（Barlett and Mundy, 1995）は最も頻繁に見出される細菌である。通常には上部気道の共生生物は痰試料、鼻咽頭吸引物またはスワブに混入しているが、侵襲的手法（肺せん刺）を使用しなければ、上部気道サンプリングによってＡＲＩにおけるそれらの病因学的役割を証明することは困難である（Trolfors and Claesson, 1997; Nohynek et al., 1995）。
【０００３】
これらの細菌とは対照的に、呼吸器の症候を有する小児におけるMycoplasma pneumoniae、Chlamydia pneumoniaeの検出、ならびにウイルスの検出は、通常には急性感染の証拠と考えられている。これらの病原体を同定するための現在の方法は、細胞培養、迅速抗原検出アッセイ、血清学的方法（間接的）、ならびに最近ではＰＣＲを包含する（Trolfors and Claesson, 1997; Saikku, 1997）。細胞培養法は特別な研究室を必要とし、費用、時間がかかり、きつい仕事である。迅速抗原アッセイは２〜３の微生物（大部分の国においてインフルエンザＡおよびＲＳＶ）にしか使用できない。通常には、血清学的方法は急性期から回復期に至る血液試料における抗体濃度上昇を調べる必要があり、よって、試験結果が得られるのが遅すぎて急性疾患の治療には適さない。現在、通常使用されるＡＲＩの微生物診断のための迅速な方法は利用不可能であるが、かかる試験の利用可能性は、程度の差こそあれ正確に適合した抗生物質での治療を可能にし、費用、副作用ならびに耐性の出現を抑制するであろう（Woo et al., 1997）。
ＰＣＲ（Saiki et al., 1988）およびＴＲ−ＰＣＲのごとき現在利用可能な核酸増幅法は臨床標本中のウイルスおよび細菌に由来する核酸を検出するための非常に感度の高い方法である。これらの増幅方法は呼吸器合胞体ウイルス（Panton et al., 1992）またはM. pneumoniae（Van Kuppeveld et al., 1992）のごとき取り扱いの難しいあるいは「培養困難」な生物の検出に特に有利である。
ＡＲＩを診断するためのＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲを用いた以前の研究は単一のウイルスまたは細菌の検出に重点を置いていた。しかしながら、結果が陰性である場合はいつも特別な病因論が確立できないことにより、および１種よりも多い生物が関与する同時感染を調べることができないことにより、単一の感染病原体に関する核酸増幅法の診断における有用性が限定されている。
病原体同時検出のための公表された多重ＰＣＲアッセイ（Hassan-King et al., 1996, 1998; Messmer et al., 1997）およびGilbert et al., (1996)により記載された呼吸器標本に対する多重ＲＴ−ＰＣＲパネルはそれぞれ欠点を有しており、検出された各微生物のアッセイ条件には時間がかかり、１の試料について数本の試験管を使用するものであり、よって、クロスコンタミネーションの危険性が増大する。
【０００４】
これらの制限を克服するための我々の戦略は、通常には小児の上部気道にコロニーを形成しないＲＮＡウイルス（エンテロウイルス、インフルエンザＡおよびＢウイルス、パラインフルエンザウイルスタイプ１および３、呼吸器合胞体ウイルス）、ＤＮＡウイルス（アデノウイルス）および細菌（C. pneumoniae、M. pneumoniae）を包含する呼吸器病原体の同時検出を１日で可能にする多重ＴＲ−ＰＣＲ（multiplex PCR）プロトコルを使用することである。
【０００５】
急性気道感染を検出するための方法およびキットを提供することが本発明の目的である。
より詳細には、急性気道感染を検出するための多重ＰＣＲ法およびキットを提供することが本発明の目的である。
急性気道感染の検出に有用なプライマーおよびプローブを提供することも本発明の目的である。
より詳細には、本発明は、下記の遺伝子領域：
ＲＳＶの融合糖蛋白遺伝子のＦ１サブユニット
ＰＩＶ−１の赤血球凝集素ノイラミニダーゼ遺伝子
ＰＩＶ−３融合蛋白遺伝子の５’非コーディング領域
M. pneumoniaeの１６Ｓ ｒＲＮＡ配列
C. pneumoniaeの１６Ｓ ｒＲＮＡ配列
エンテロウイルスの５’非コーディング領域
インフルエンザＡ由来の非構造蛋白遺伝子
インフルエンザＢ由来の非構造蛋白遺伝子、および
アデノウイルスのヘキソン遺伝子
のそれぞれに由来する少なくとも１つのプライマーセットを含むプライマー混合物を用いることにより生物学的試料中に存在するいくつかの標的ヌクレオチド配列を同時増幅することを含む、急性気道感染の検出方法に関する。
【０００６】
この多重ＲＴ−ＰＣＲ法は、主に小児の気道に感染する下記微生物の存在の決定を１の増幅工程で可能にするので、この多重ＲＴ−ＰＣＲ法が特に好ましい：ＲＳＶ、パラインフルエンザウイルス、M. pneumoniae、C. pneumoniae、エンテロウイルス、インフルエザＡおよびＢならびにアデノウイルス。
別の具体例によれば、本発明は、上記領域に由来するプライマーペアーを用いる多重ＲＴ−ＰＣＲを用いることによりヒトパラインフルエンザウイルス、インフルエンザＡおよびＢ、ＲＳＶならびに少なくとも１つの下記微生物が検出される上記方法にも関する：M. pneumoniae、C. pneumoniae、エンテロウイルスまたはアデノウイルス。
別の具体例によれば、本発明は、上記領域に由来するプライマーペアーを用いるＲＴ−ＰＣＲを用いることによりヒトパラインフルエンザウイルス、インフルエンザＡおよびＢ、ＲＳＶならびに少なくとも１つの下記微生物が検出される上記方法にも関する：M. pneumoniae、C. pneumoniae、エンテロウイルスまたはアデノウイルス。
好ましい具体例によれば、本発明は、１６Ｓ ｒＲＮＡおよび２３Ｓ ｒＲＮＡ配列の間のスペーサー領域に由来するプライマーにより該１６Ｓ ｒＲＮＡプライマーが置き換えられた上記方法に関する。
別の具体例によれば、本発明は、B. pertussisおよびB. parapertussisを特異的に検出するためのさらに少なくとも１つのプライマーペアーが使用される上記方法に関し、好ましくは該プライマーは１６Ｓ ｒＲＮＡおよび２３Ｓ ｒＲＮＡ配列の間のスペーサー領域に由来するものである。
もう１つの具体例によれば、本発明は、上記プライマーが表２または表４から選択されるものである上記方法に関する。
もう１つの具体例によれば、本発明は、引き続いて該増幅生成物がプローブを用いて検出され、該プローブが好ましくは表３、表４または表５から選択されるものである上記方法に関する。
もう１つの具体例によれば、本発明は表２または表４から選択されるプライマーに関する。また本発明は上記方法におけるかかるプライマーの使用にも関する。また本発明は本発明のプライマーの製造方法にも関する。
もう１つの具体例によれば、本発明は表３、表４または表５から選択されるプローブに関する。また本発明は上記方法におけるかかるプローブの使用にも関する。また本発明は、本発明のプローブの製造方法にも関する。本発明のプライマーおよびプローブを後で詳述するように変化させることができる。
【０００７】
もう１つの具体例によれば、本発明は、上記方法を行うための上記プライマーのセットを含む、急性気道感染を検出するためのキットに関する。上記プライマーのほかに、かかるキットはプローブならびに増幅および所望によりハイブリダイゼーション反応を行うに必要なバッファーならびにキット説明書を含んでいてもよい。また本発明は、少なくとも１つの上記プローブを含む上記キットにも関する。
もう１つの具体例において、本発明は、上記方法を行うためのプローブのセットを含む、急性気道感染を検出するためのキットに関する。上記プローブのほかに、かかるキットはプライマーならびにハイブリダイゼーションおよび所望により増幅反応を行うに必要なバッファーならびにキット説明書を含んでいてもよい。また本発明は、少なくとも１つの上記のプライマーを含む上記キットにも関する。
もう１つの具体例によれば、本発明は、上記プローブが固体支持体上に、好ましくはナイロン膜上に並行線状に適用される上記キット、好ましくはＬｉＰＡキットに関する（後で示す実施例参照）。
【０００８】
異なる手法を用いて本発明の方法を行うことができる。これらの手法は、増幅後に固体支持体に標的核酸を固定化すること、次いで標識オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションを行うことを含んでいてもよい。別法として、プローブを固体支持体上に固定化してもよく、所望により増幅後に標識標的ポリ核酸を用いてハイブリダイゼーションを行ってもよい。この手法は逆ハイブリダイゼーションと呼ばれる。便利な逆ハイブリダイゼーション手法はラインプローブアッセイ（LiPA, Innogenetics, Belgium）である。このアッセイは、固体支持体片上に並行線として固定化されたオリゴヌクレオチドプローブを用いる。別法として、プローブが隊列または微小隊列形式となって存在していてもよい。プローブをこの隊列上にスポットすることができ、あるいは隊列上の別個の場所でin situ合成することができる（Lockhart et al., 1996）。上記の同時増幅される標的配列を検出するための他のいずれの手法も本発明によりカバーされることが理解されるはずである。かかる手法は当該分野で知られた配列決定法または他のアレイ法を包含しうる。
【０００９】
以下の定義および説明は本発明をよりよく理解することを可能するであろう。
分析すべき試料中の標的材料はＤＮＡまたはＲＮＡであってよく、例えば、ゲノムＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡまたはれらの増幅されたバージョンであってよい。本明細書においてこれらの分子を「ポリ核酸」ともいう。
試料からのＲＮＡまたはＤＮＡの単離によく知られた抽出および精製方法を陥ることができる（例えば、Sambrook et al., 1989中に示されている）。
本明細書の用語「プローブ」は、標的ポリ核酸に特異的にハイブリダイゼーションするように設計された１本鎖オリゴヌクレオチドをいう。好ましくは、本発明のプローブは約５ないし５０ヌクレオチドの長さであり、より好ましくは約１０ないし２５ヌクレオチドの長さである。特に好ましいプローブの長さは１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチドである。本発明に使用されるヌクレオチドはリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドおよびイノシンまたは本質的にハイブリダイゼーション特性を変化させない修飾基を含むヌクレオチドのごとき修飾ヌクレオチドであってもよい。
【００１０】
用語「プライマー」は、コピーされる核酸鎖に相補的なプライマー伸長生成物の合成の開始点として作用しうる１本鎖オリゴヌクレオチド配列をいう。プライマーの長さおよび配列は、伸長生成物の合成を開始させうるものでなくてはならない。好ましくは、プライマーは約５〜５０ヌクレオチドの長さである。個々の長さおよび配列は必要なＤＮＡまたはＲＮＡ標的の複雑さならびに温度およびイオン強度のごときプライマーの使用条件によるであろう。実験条件が適合したものであるかぎり、本発明のプライマーをプローブとして用いてもよく、あるいはその逆であってもよいことが理解されるはずである。
本明細書の表現「適当なプライマーペアー」は、特定のポリ核酸フラグメントの特異的増幅を可能にするプライマーのペアーをいう。
本明細書プローブまたはプライマーの「標的領域」は、プローブまたはプライマーが完全に相補的であるかあるいは部分的に相補的である（すなわち、ある程度のミスマッチがある）検出すべきポリ核酸中の配列である。ある場合には該標的配列の相補物も適当な標的配列であることが理解されるはずである。
ポリ核酸の標的領域に対するプローブの「特異的ハイブリダイゼーション」は、使用実験条件下において該プローブがこの標的領域の一部分または全領域と２本鎖を形成し、それらの条件下において分析すべき試料中に存在するポリヌクレオチドの他の領域とは該プローブが２本鎖を形成しないことを意味する。
ポリ核酸の標的領域に対するプライマーの「特異的ハイブリダイゼーション」は、増幅工程中に、使用実験条件下において該プライマーがこの標的領域の一部分または全領域と２本鎖を形成し、それらの条件下において分析すべき試料中に存在するポリヌクレオチドの他の領域とは該プライマーが２本鎖を形成しないことを意味する。
【００１１】
正しい増幅を保証するために増幅プライマーが鋳型中の対応標的配列と正確に合致する必要はないという事実は文献において十分に示されている（Kwok et al., 1990）。しかしながら、プライマーがそれらの標的配列に対して完全には相補的でない場合、増幅されたフラグメントはプライマーの配列を有し、標的配列の配列を有しないであろうということを考慮すべきである。プライマーを選択された標識（例えば、ビオチン）で標識してもよい。使用する増幅方法はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ；Saiki et al., 1988）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ；Landgren et al., 1988; Wu & Wallace, 1989; Barany, 1991）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ；Guatelli et al., 1990; Compton, 1991）、鎖置換増幅（ＳＤＡ；Duck, 1990）またはＱβレプリカーゼを用いる増幅（Lomeli et al., 1989）により、あるいは核酸増幅が可能な当該分野で知られた他の適当な方法のいずれであってもよい。
本明細書においてプローブおよびプライマー配列を１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドとして５’から３’方向へと示す。以下に示すプローブをそのまま、あるいはそれらの相補形態として、あるいはそれらのＲＮＡ形態として（ＴがＵに置き換わっている）使用できることは当業者に明らかである。
【００１２】
必要ならば十分なヌクレアーゼを用いて対応ヌクレオチド配列をクローン化プラスミドから切り出し、次いで、例えば、分子量により分画することにより、対応ヌクレオチド配列を含むインサートを含有する組み換えプラスミドをクローン化することにより本発明のプローブを調製することができる。例えば、慣用的なホスホ−トリエステル法により本発明のプローブを化学合成することもできる。
プライマー、またはプローブとして使用されるオリゴヌクレオチドはホスホロチエート（Matsukura et al., 1987）、アルキルホスホロチエート（Miller et al., 1979）またはペプチド核酸（Nielsen et al., 1991; Nielsen et al., 1993）のごときヌクレオチドアナログを含有していてもよく、あるいはそれよりなっていてもよく、あるいは挿入剤（Asseline et al., 1984）を含んでいてもよい。これらの修飾の導入は、ハイブリダイゼーション反応特性、ハイブリッド形成の可逆性、オリゴヌクレオチド分子の生物学的安定性等のように特徴に正の影響を与えるには有利であるかもしれない。
【００１３】
用語「固体支持体」は、オリゴヌクレオチドプローブをカップリングさせることのできる基材をいうが、オリゴヌクレオチドプローブがそのハイブリダイゼーション特性を保持し、ハイブリダイゼーションのバックグラウンドレベルが低いままであることが条件となる。通常には、固体基材はマイクロタイタープレート（例えばDEIA法において使用）、膜（例えば、ナイロンまたはニトロセルロース）または微小球（ビーズ）またはチップである。膜への適用または固定化の前に、核酸を修飾して固定化を容易にし、あるいはハイブリダイゼーション効率を増加させることが便利であるかもしれない。かかる修飾はホモポリマーテイリング、脂肪族基、ＮＨ２基、ＳＨ基、カルボキシル基のごとき異なる反応性の基とのカップリング、あるいはビオチン、ハプテンまたは蛋白とのカップリングを包含する。
【００１４】
用語「標識」は標識核酸の使用を意味する。Saiki et al., (1988)またはBej et al., (1990)により説明されたように増幅のポリメラーゼ工程において標識ヌクレオチドを取り込ませるこにより、あるいは標識プライマーを用いることにより、あるいは当業者に知られた他のいずれかの方法により標識を行ってもよい。標識の性質はアイソトープ性（３２Ｐ、３５Ｓ等）であっても非アイソトープ性（ビオチン、ジゴキシゲニン等）であってもよい。
用語「生物学的試料」または「試料」は、例えば、ＤＮＡもしくはＲＮＡを含む鼻咽頭吸引物、喉または鼻咽頭スワブ、鼻咽頭洗浄物または気管吸引物または他の気道試料をいう。
【００１５】
所望特性を有するプローブを設計するために、当業者に知られた以下の有用な指針を適用することができる。
本明細書にて説明するようにハイブリダイゼーション反応の程度および特異性が多くの因子により影響されるので、標的に対して完全に相補的であろうとなかろうと、それらの因子の１つまたはそれ以上を操作することは個々のプローブの正確な感度および特異性を決定することになるであろう。種々のアッセイ条件の重要性および影響を本明細書においてさらに説明する。
［プローブ：標的］核酸ハイブリッドの安定性をアッセイ条件に適合するように選択すべきである。長いＡＴ豊富配列を避け、Ｃ：Ｇ塩基対でハイブリッドを終了させ、適応なＴｍを有するようにプローブを設計することによりこれを行うことができる。長さおよびＧＣ含量により最終アッセイが行われる温度よりもＴｍが約２〜１０℃高くなるようにプローブの始点および終点を選択する。プローブの塩基組成は重要である。なぜなら、Ｇ−Ｃ塩基対は水素結合によりＡ−Ｔ塩基対よりも熱安定性が高いからである。よって、高いＧ−Ｃ含量の相補的な核酸が関与するハイブリダイゼーションは熱安定性がより高い。
プローブ設計の際に、プローブが使用されるイオン強度およびインキュベーション温度のごとき条件も考慮すべきである。ハイブリダイゼーションの程度は反応混合物のイオン強度が増加するにつれて増加すること、ならびにハイブリッドの熱安定性はイオン強度の増加に伴って増加することが知られている。一方、水素結合を破壊するホルムアミド、尿素およびアルコール類のごとき化学試薬はハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを増加させるであろう。かかる試薬による水素結合の脱安定化はＴｍを大幅に低下させる可能性がある。一般的には、約１０〜５０塩基の長さの合成オリゴヌクレオチドプローブの最適ハイブリダイゼーションは２本鎖の融解温度よりも約５℃低い場合に起こる。最適温度未満でのインキュベーションはミスマッチ塩基配列のハイブリダイゼーションを可能にし、それゆえ特異性が低下する。
高いストリンジェンシーの条件下においてのみハイブリダイゼーションするプローブが望ましい。高いストリンジェンシー条件下において、非常の相補的な核酸ハイブリッドのみが形成されるであろう。十分に相補性のないハイブリッドは形成されないであろう。したがって、アッセイ条件のストリンジェンシーは、ハイブリッドを形成する２つの核酸鎖の間に必要な相補性の量を決定する。標的核酸と形成されたハイブリッドと非標的核酸と形成されたハイブリッドとの間の安定性の差を最大にするようにストリンジェンシーの程度が選択される。
【００１６】
ハイブリダイゼーションを妨害する強力な内部構造を形成することが知られている標的ＤＮＡまたはＲＮＡ中の領域はあまり好ましくない。同様に、非常に自己相補性があるプローブも避けるべきである。上で説明したように、ハイブリダイゼーションは２つの１本鎖の相補的核酸の会合であり、水素結合した２本鎖を形成するものである。２つの鎖の一方がハイブリッド中に完全にまたは不完全に含まれる場合、それは新たなハイブリッドの形成にあまり関与できないであろうということは含蓄的である。十分な自己相補性がある場合には、あるタイプのプローブ分子中に形成された分子内および分子間ハイブリッドが存在する可能性がある。注意深くプローブを設計することによりかかる構造を回避することができる。目的配列の実質的な部分が１本鎖であるようにプローブを設計することにより、ハイブリダイゼーションの速度および程度を大幅に増大させることができる。コンピュータープログラムを用いてこのタイプの相互作用を検索することができる。しかしながら、ある種の例においては、このタイプの相互作用を回避することができないかもしれない。
標準的なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は実施例の材料および方法のセクションに開示してある。他の条件は、例えば、５０℃において３Ｘ ＳＳＣ（クエン酸ナトリウムセイライン）、２０％脱イオン化ＦＡ（ホルムアミド）である。プローブの特異性および感度が維持される場合には、他の溶液（ＳＳＰＥ（リン酸ナトリウムセイラインＥＤＴＡ）、ＴＭＡＣ（塩化テトラメチルアンモニウム）等）および温度を用いることもできる。必要な場合には、プローブの長さまたは配列をわずかに改変して、与えられた条件下で必要とされる特異性および感度を維持する必要がある。
【００１７】
用語「ハイブリダイゼーションバッファー」は、適当なストリンジェンシー条件下において、プローブと試料中に存在するポリ核酸との間、あるいはプローブと増幅生成物との間のハイブリダイゼーション反応を可能にするバッファーを意味する。
用語「洗浄溶液」は、適当なストリンジェンシー条件において形成されたハイブリッドの洗浄を可能にする溶液を意味する。
【００１８】
本発明を一般的に説明したが、下記実施例および図面を参照することにより本発明はさらに容易に理解されるであろう。実施例および図面は本発明の多雨ようおよび具体例を説明するためだけのものであり、本発明を限定するものと解釈してはならない。本明細書中で挙げたすべての文献を出典明示により本明細書に一体化させる。
【００１９】
表の説明
表１は、ｍ−ＲＴ−ＰＣＲ−ＥＬＩＳＡおよび市販ＥＩＡ間の比較研究から得られた結果を示す。
表２は実施例１に使用したプライマー配列を示す。
表３は、すでに記載されている同定された生物に対する異なるプローブならびにＬｉＰＡ用途に適合したバージョンをまとめたものである。
表４は、細菌病原体用のの１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡスペーサー領域に由来するプライマーおよびプローブの配列をまとめたものである。
表５は実施例３に使用したＲＳＶ用のプローブの配列を示す。
表６は、実施例３にて行われた一連の３６個のブラインドされた（blinded）試料に関する培養およびＬｉＰＡの結果の比較を示す。
表７は、実施例３にて行われた多重ＲＴ−ＰＣＲおよびＬｉＰＡを用いた、Mycoplasma pneumoniaeの培養物に関する一連の３０個のブラインドされた標本についての培養およびＬｉＰＡの結果の比較を示す。
【００２０】
実施例
実施例１
略号
急性気道感染（ＡＲＩ）；ＰＣＲと組み合わせた逆転写（ＲＴ−ＰＣＲ）；多重ＲＴ−ＰＣＲ（ｍ−ＲＴ−ＰＣＲ）；マイクロウェルハイブリダイゼーションアッセイと組み合わせたｍ−ＲＴ−ＰＣＲ（ｍ−ＲＴ−ＰＣＲ−ＥＬＩＳＡ）；インフルエンザウイルスタイプＡ（インフルエンザＡまたはＩｎｆＡ）；インフルエンザウイルスタイプＢ（インフルエンザＢまたはＩｎｆＢ）；パラインフルエンザウイルスタイプ１（ＰＩＶ−１）；パラインフルエンザウイルスタイプ３（ＰＩＶ−３）；呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）
【００２１】
材料および方法
１．患者の試料
１９９５年１１月から１９９８年４月までの間に我々の施設に入院していたＡＲＩを有する小児から鼻咽頭吸引物を得た。診断は、肺炎、ぜん鳴気管支炎、気管支炎、喉頭気管炎（これは喉頭炎、喉頭−気管−気管支炎および（偽）クループを包含する）、咽頭炎、扁桃炎、鼻炎、結膜炎、中耳炎を包含し、病因のコンピューターによるディスチャージ診断データベースによった。標本の収集は最初の冬季（１９９５年１１月から１９９６年４月まで）において完全でなかったが、１９９６年１０月１日には９５％以上完全であった。入院初日に標本を集め、研究室に直接運び、まず４℃に保存し、試験用に調製し、さらに後に使用するか長期保存するものは−７０℃で保存した。適度の注意を払って試料を分配してコンタミネーションを回避し、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）（Becton Dickinson, Heidelberg, Germany）を用いるＲＳＶおよびインフルエンザＡ抗原の検出にその一部分を直接使用した。次の部分をｍ−ＲＴ−ＰＣＲ、次いで、アガロースゲル電気泳動に使用し、マイクロウェルハイブリダイゼーションアッセイにて詳細を調べた。
【００２２】
２．核酸の抽出
１９９５年１１月から１９９７年７月までに受け取った試料を下記のごとく調製した。１００μｌの呼吸器標本を１００μｌの０．９％ ＮａＣｌ溶液で希釈したものから全核酸を得た。ドデシル硫酸ナトリウムを添加して最終濃度０．１％とした。１体積の１：１フェノール−クロロホルム混合物で１回、次いで、１体積のクロロホルムで１回核酸を抽出し、０．３Ｍ酢酸アンモニウムおよびエタノールで沈殿させた。核酸ペレットを乾燥させ、１５μｌのジエチルピロカルボン酸処理された２回蒸留水中に再懸濁した。１９９７年８月から１９９８年４月までに受け取った標本を、説明書に従ってBoehringerの"High Pure Viral Nucleic Acid Kit"（Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany）を用いて調製した。
調製手順のコントロールは以下のごとし：１の陰性試料（健康な人の痰）を５〜１０個の試料の各シリーズに付し、クロスコンタミネーションの可能性をモニターした。陰性対照において偽陽性である場合、臨床標本の別の部分を用いて当該シリーズ中のすべての陽性臨床試料についてｍ−ＲＴ−ＰＣＲを繰り返した。培養から得た陽性対照（それぞれインフルエンザＡ、インフルエンザＢ、ＰＩＶ−１、ＰＩＶ−３またはＲＳＶ）を各試験に使用して調製手順の有効性を調べた。調製した試料を即座にｍ−ＲＴ−ＰＣＲに使用し、残りを−７０℃で保存した。
【００２３】
３．多重ＲＴ−ＰＣＲ
標的配列は下記のそれぞれのもののコーディング／非コーディング領域であった：ＲＳＶの融合糖蛋白遺伝子のＦ１サブユニット、ＰＩＶ−１の赤血球凝集素ノイラミニダーゼ遺伝子、ＰＩＶ−３融合蛋白遺伝子の５’−非コーディング領域、M. pneumoniaeの１６ＳリボソームＲＮＡのヌクレオチド配列、C. pneumoniaeの１６ＳリボソームＲＮＡのヌクレオチド配列、エンテロウイルスの非常に保存された５’非コーディング領域、インフルエンザＡおよびＢ由来の非構造蛋白遺伝子ならびにアデノウイルスのヘキシン遺伝子の配列。以前記載された手順により配列を選択した（Paton et al., 1992; Karron et al., 1992; Fan and Henrickson, 1996; Rotbart, 1990; Gaydos et al., 1992; Van Kuppeveld et al., 1992; Claas et al, 1992; Hierholzer et al 1993）。アデノウイルスに関しては、プローブＡの配列を、プライマー２のかわりに第２増幅プライマーとして使用した（Hierholzer, 1993）。
臨床標本からの５ないし６μｌの核酸調合物を、最終体積２０μｌ中で逆転写（ＲＴ）反応に供した。下記バッファー組成を用いて３７℃で６０分間ＲＴを行った：50 mM Tris-HCI (pH 8.3), 75mM MgCl2, 10 mM (各) デオキシヌクレオシド三リン酸 (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden), 0.2 μg/μl ヘキサヌクレオチドミックス (Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany), 20 U RNAsin (Promega, Madison, Wisconsin USA) および 10 U の Moloney murine 白血病ウイルス逆転写酵素 (Eurogentec, Seraing, Belgium)。
９０℃で５分間逆転写酵素を熱不活性化させた後、全部で２０μｌのＲＴ反応混合物を、全体積８０μｌ中での多重ＰＣＲに使用した。バッファー組成（ＲＴバッファーを考慮せず）は10 mM Tris-HCI (pH 8.3), 50 mM KCI, 1,5 mM MgCl2, 0.001 % gelatin, 0.2 mM dATP, dCTP, dGTP, 0.2 mM dTTP, 0.01 mM ジゴキシゲニン-11-dUTP (Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany), 1 μM (各) プライマー (Eurogentec, Seraing, Belgium), および 5 U の AmpliTaq-Gold ポリメラーゼ (Perkin-Elmer, Branchburg, NJ, USA)であった。下記のごとくPE9600 Thermocycler（Perkin, Elmer, Branchburg, NJ, USA）にてＰＣＲを行った：９４℃で３０秒変性（サイクル１においては１０分）、５０℃で３０秒アニーリング、７２℃で３０秒伸長（サイクル４０においては７分）を４０サイクル。
陰性対照として、Ｈ２Ｏを含有するブランク試薬を核酸のかわりに使用した。陽性ｍ−ＲＴ−ＰＣＲ対照として、ウイルスおよび／または細菌ストックから調製した全細胞核酸を使用した。
【００２４】
４．持ち越しコンタミネーションの防止
研究室内でのキャリーオーバーコンタミネーションを防止するために、下記の注意を払った：購入したすべての試薬を小分けした。ＰＣＲ試薬の調製、臨床試料からの核酸抽出および増幅工程を３つの別個の部屋で行った。シーリングフィルターを装備したチップ（BIOzym, Hess, Oldendorf, Germanyのsafeseal-tip）を、ＰＣＲに導入する試薬のピペッティングに使用し、ピペッティングの前後にすべてのエリアおよび装置を次亜塩素酸ナトリウムおよびBacillol（Bode Chemie, Hamburg, Germanyのアルコール性感染防止剤）で脱コンタミネーションした。
【００２５】
５．アガロースゲル電気泳動
Sambrookら（Sambrook et al., 1989）により記載されたようにして、０．５ＸＴＢＥバッファー（０．０４５Ｍ Ｔｒｉｓ−硼酸、０．００１Ｍ ＥＤＴＡ）中、２％アガロースゲルにて、１３０ボルト、１６０ｍＡで、ＰＣＴ生成物（１０μｌ）の電気泳動による分離を行い、臭化エチジウムで染色し、ＵＶ照射によりＰＣＲ生成物を可視化した。フラグメント長対照としては、０．６〜０．８μｇのＭｓｐＩ消化ｐＵＣ１９ ＤＮＡをマーカーとして使用した。
【００２６】
６．マイクロウェルハイブリダイゼーション分析
Boehringer Mannheim（Mannheim, Germany）のＰＣＲ−ＥＬＩＳＡ系を用いてこのアッセイを行った。ストレプトアビジンで被覆したマイクロタイタープレートの９個のウェルそれぞれに５μｌのＰＣＲ生成物を入れ、２５μｌの０．２Ｎ ＮａＯＨを各ウェルに添加することにより変性させた。５分後、２ｐｍｏｌのビオチン化された各捕捉プローブを含有する２００μｌのハイブリダイゼーションバッファーを添加した。使用した捕捉プローブは増幅された標的配列に特異的であり（上記参照）、エンテロウイルス、インフルエンザＡ、インフルエンザＢ、ＰＩＶ−１、アデノウイルス（プローブＢ）およびM. pneumoniae（Ｇｐｏ１）に対するプローブは以前に報告されたものと同じであった（Rotbart, 1990; Claas et al., 1992; Van Kuppenveld et al., 1992; Hierholzer et al., 1993; Fan and Hendricksom, 1996）。他のものに対して使用したプローブの配列は、ＲＳＶに対して5'-CCT GCA TTA ACA CTA AAT TC-3'（配列番号：１）；C. pneumoniaに対して5'-TCT TGC TAC CTT CTG TAC TAA-3'（配列番号：２）；およびＰＩＶ−３に対して5'-AAA ATT CCA AAA GAG ACC GGC-3'（配列番号：３）であった。すべての捕捉プローブは３’−ビオチン化されており、それらをEurogentec（Seraing, Belgium）から購入した。３７℃で１時間捕捉を行い、その後、室温にてウェルを２００μｌの洗浄溶液（Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany）で４回洗浄した。100 mM Tris-HCI, 150 mM NaCl (pH 7.5)を含有するバッファーで１／１０００に希釈した２００μｌの抗−ＤＩＧ−ペルオキシダーゼ（10 mU/ml, Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany）を各ウェルに添加した。プレートを３７℃で３０分インキュベーションし、ウェルを洗浄溶液で４回洗浄した。２００μｌのＡＢＴＳＲ基質溶液（Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany）を添加し、ウェルを３７℃で３０分インキュベーションした。４０５ｎｍの光学密度（ＯＤ）をＤＩＡＳリーダー（Dynatech Laboratories, Guernsey, Channel Islands）にて読んだ（リファレンスフィルター４９２ｎｍ）。すべての陰性対照値が０．２ＯＤ単位未満であり、陽性対照が１．０ＯＤ単位よりも高い場合に、操作は有効と考えられた。カットオフＯＤ値０．５としてＰＣＲ陽性または陰性を判別し、さらにゲル電気泳動の結果と比較することにより試料を分類した。０．２ないし０．５の間の最初の読みを有する試料をボーダーラインと考え、特異的な単一のプライマーセットを用いる再試験後にのみ陽性または陰性であると分類した。陽性ハイブリダイゼーション対照を各マイクロウェルハイブリダイゼーションアッセイに含めた。それらはｍ−ＲＴ−ＰＣＲに含まれる陽性対照に由来するＰＣＲ生成物からなっていた。
【００２７】
７．データの管理
得られたすべてのデータをMicrosoft Accessデータベース中で管理した。このデータベースは患者に関する利用可能なすべての情報ならびにすべての診断結果およびｍ−ＲＴ−ＰＣＲ−ＥＬＩＳＡから得た結果、そしてインフルエンザＡおよびＲＳＶの場合にはＥＩＡのデータを含んでいた。
【００２８】
８．細菌およびウイルスのストック
陽性対照として使用した細菌およびウイルスのストックは下記の人から親切にも提供された：エンテロウイルス、インフルエンザＡおよびインフルエンザＢはB. Schweiger and E. Schreier, (Robert-Koch-Institute, Berlin)；ＲＳＶ、ＰＩＶ−１、ＰＩＶ−３はK.M. Edwards (Vanderbilt University, Tennessee, USA)；ＲＳＶ−ｌｏｎｇ、ＰＩＶ−３はA. Strecker (Institute for Virology, Bochum)；M. pneumoniae、C. pneumoniae、およびアデノウイルスはR. Krausse and P. Rautenberg (Institute for Medical Microbiology, Kiel)。
これらの試料中のウイルスまたは細菌の正確な数は不明であったが、B. SchweigerおよびP. Rautenbergの私信によれば多くとも１０８個／ｍｌと考えられた。これらの培養物から調製した核酸のｍ−ＲＴ−ＰＣＲ系列希釈物（１０倍ずつ）を、ｍ−ＲＴ−ＰＣＲおよび単一プラマーセットを用いる増幅の鋳型として使用して、感度の予備試験を行った。
ウイルスおよび細菌の正確な数についての情報が得られないので、増幅生成物を生じさせるに十分な推定核酸量を推定粒子数（１０８個／ｍｌ未希釈試料）から計算した。生物間の可能な交差反応性を検出するために、各生物からの１μｌの未希釈核酸をｍ−ＲＴ−ＰＣＲに使用した。
【００２９】
結果
１．細菌およびウイルス核酸に関する多重ＲＴ−ＰＣＲ
材料および方法に記載したストック溶液から調製した核酸を用いるｍ−ＲＴ−ＰＣＲ−ＥＬＩＳＡ法について試験した。図１からわかるように、各レーンにおいて１の特別な増幅生成物のみが観察された。その増幅生成物の推定サイズ（C. pneumoniae, 463 bp; M. pneumoniae, 277 bp; インフルエンザ B, 249 bp; RSV, 239 bp; PIV-3, 205 bp; インフルエンザ A, 190 bp; PIV-1, 179 bp; エンテロウイルス, 154 bp; アデノウイルス, 134 bp）はアガロースゲルから計算したフラグメントサイズとよく一致した（図１）。このことは、ｍ−ＲＴ−ＰＣＲが特異的な生成物を生じたことを示唆する。しかしながら、ゲル電気泳動のみによってはインフルエンザＡおよびＰＩＶ−３のサイズ識別は困難であるが、ＰＣＲ−ＥＬＩＳＡ試験により得られた吸光度値によりこの特異性が確認された。利用されなかったプライマーはゲル下部に見られる。
ｍ−ＲＴ−ＰＣＲの感度を評価するために、濃縮ウイルスストック溶液を１０倍ずつ系列希釈し、特異的プライマーペアーを用いて試験してアガロースゲル上で視認しうる増幅生成物を得て、これらをＰＣＲ−ＥＬＩＳＡにて調べた。元のストック溶液１ｍｌ中に存在する個々の生物の最大数を１０８個と仮定すると、当該方法は類似のｍ−ＲＴ−ＰＣＲ反応においてM. neumoniaeの１個の標的配列およびC. pneumoniaeの１個の標的配列、１０コピーのアデノウイルスＤＮＡおよびエンテロウイルスＲＮＡ、１００コピーのＰＩＶ−１、ＰＩＶ−３、インフルエンザＡ、インフルエンザＢおよびＲＳＶ−ＲＮＡを検出することができた。
【００３０】
２．酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）とｍ−ＲＴ−ＰＣＲ−ＥＬＩＳＡとの比較
ｍ−ＲＴ−ＰＣＲ−ＥＬＩＳＡの品質に関する情報を得るために、我々は、市販ＥＩＡから得られた結果と比較した。このＥＩＡを用いて、９４０個の臨床標本をインフルエンザＡの存在に関して試験し、１０３１個の臨床標本をＲＳＶの存在に関して試験した。結果を表１にまとめる。ＲＳＶに関してＥＩＡにより得られた結果に対するＰＣＲにより得られた結果の正味の一致は９５％であった（ＥＩＡにおける１４０個の陽性標本＋８９１個の陰性標本＝１００％）。ＰＣＲ−ＥＬＩＳＡのみにより２５個の標本がＲＳＶ陽性と同定され、ＥＩＡのみにより２４個の標本がＲＳＶ陽性と同定された。インフルエンザＡの場合、ＥＩＡに対するＰＣＲの正味の一致は９８％であり（ＥＩＡにおける５３個の陽性＋８８７個の陰性＝１００％）、ＥＩＡのみにより１個の標本が陽性であり、ＰＣＲ ＥＬＩＳＡのみにより１４個の標本が陽性であった。
【００３１】
３．臨床標本を用いたｍ−ＲＴ−ＰＣＲ−ＥＬＩＳＡの結果
全部で１１１８個の標本をｍ−ＲＴ−ＰＣＲ−ＥＬＩＳＡにより試験した。期間中の試験した標本数および陽性ＰＣＲ結果の割合が図２からわかる。すべての寒い期間中（１１月から４月まで）に標本数が定期的に増加し、これは陽性ＰＣＲ数の増加と相関関係があった。１９９６／１９９７年冬季において、最大数の患者（ｎ＝１０６）が２月に受診し、その４８％においてｍ−ＲＴ−ＰＣＲにより少なくとも１種の微生物が検出された。１９９５／１９９６年冬季における標本数の減少は我々の試験の初期における不完全な試料収集によるものであった。異なる微生物に関する結果を図３に詳細に示す。試験に供した試料のうち合計７２３個（６５％）の標本は陰性であり、３９５個（３５％）の標本は少なくとも１種の生物に関して陽性であった。単離体のうち３７．５％がＲＳＶであり、２０．０％がインフルエンザＡであり、１２．９％がアデノウイルスであり、１０．６％がエンテロウイルスであり、８．１％がM. pneumonoaeであり、４．３％がＰＩＶ−３であり、３．５％がＰＩＶ−１であり、２．８％がインフルエンザＢであり、０．２％がC. pneumoniaeであった（陽性ｍ−ＲＴ−ＰＣＲ−ＥＬＩＳＡ全数に対して）。１２月から５月までの間は主にＲＳＶおよびインフルエンザＡが検出された。インフルエンザＢ（１９９７年２月から４月まで）およびＰＩＶ−１（１９９７年９月から１２月まで）に関してはただ１つのピークが観察された。アデノウイルスおよびエンテロウイルス、ＰＩＶ−３およびM. pneumoniaeでの感染は数の多少はあるものの期間を通して一貫して検出された。C. pneumoniaeは１９９７年１月において１回だけ検出された。
【００３２】
４．２種の生物の同時検出
２０の症例において２種の生物による同時感染がｍ−ＲＴ−ＰＣＲにより明らかとなった（全体の１．８％あるいは陽性標本の５％）。アデノウイルス核酸配列と、C. pneumoniae（１例）、エンテロウイルス（１例）、インフルエンザＡ（１例）およびＲＳＶ（５例）との同時増幅が生じた。エンテロウイルスが関与していた二重感染がアデノウイルス（１例）、インフルエンザＡ（３例）、インフルエンザＢ（１例）、ＰＩＶ−３（３例）、M. pneumoniae（１例）およびＲＳＶ（３例）とともに検出された。
さらにそのうえ、各１個の標本において、インフルエンザＢ核酸がＲＳＶとともに同時増幅され、M. pneumoniae核酸がＰＩＶ−１核酸とともに同時増幅された。
【００３３】
５．臨床データ
１９９５年２月に１０６１個の試料−患者ペアーのうち８６１個から臨床データが利用可能であったが、１人の患者が同じ病院に入院した場合、次の試料またはその後の試料は除外した。これらの８６１人の患者のうち、５５０人は０ないし２歳であり、１５３人は２ないし５歳であり、１５８人は５歳よりも大きかった。それらの標本の６２％において、細菌またはウイルスの核酸はｍ−ＲＴ−ＰＣＲにより検出されなかった。この病院による研究において最も多い診断は肺炎であった（３０９例または３６％）。最も通常には、肺炎はＲＳＶ（ｎ＝５９）、インフルエンザＡ（ｎ＝１７）、M. pneumoniae（ｎ＝１６）およびアデノウイルス（ｎ＝１５）により引き起こされたものであった。エンテロウイルス、ＰＩＶ−３、ＰＩＶ−１およびインフルエンザＢはそれぞれ１０例未満の肺炎に関連していた。ぜん鳴気管支炎の１６７人の患者（８６１個の標本の１９％）のうち、４５の症例においてＲＳＶが検出され、１６の症例においてアデノウイルスが検出され、エンテロウイルス、インフルエンザＡ、インフルエンザＢ、ＰＩＶ−１、ＰＩＶ−３およびM. pneumoniaeがそれぞれ１０未満の症例において検出された。全部で９５人の患者（８６１個の標本の１１％）において気管支炎が観察され、検出された生物はＲＳＶ（１３例）、エンテロウイルスおよびインフルエンザＡ（各４例）、アデノウイルス（３例）であった。ｍ−ＲＴ−ＰＣＲによる微生物の検出に関して試験した８６１個の標本のうち７．１％が鼻炎と診断され、６．２％が喉頭気管炎と診断され、５％未満がそれぞれ咽頭炎、中耳炎、扁桃炎および結膜炎と診断された。患者の９．１％が他の疾患と診断された。
１の疾病についてＰＣＲで得られた９種の生物の検出頻度を図４に示す。ＲＳＶは肺炎、ぜん鳴気管支炎、気管支炎、中耳炎または咽頭炎に最も通常に関連していた。インフルエンザＡは中耳炎、扁桃炎、咽頭炎、喉頭気管炎、肺炎の症例の５％よりも多くに関連していた。エンテロウイルスは扁桃炎、咽頭炎の症例の５％よりも多くに関連いていた。アデノウイルスは咽頭炎、ぜん鳴気管支炎、結膜炎および扁桃炎に関連していた。M. pneumoniaeは肺炎に最も通常に関連していたが、ＰＩＶ−１は主に喉頭気管炎に関連しており、ＰＩＶ−３は喉頭気管炎および結膜炎に関連していた。C. pneumoniaeはたった１人の気管支炎患者においてのみ検出された。
【００３４】
実施例２：急性気道感染へのＬＩＰＡの適用
１．ＬｉＰＡに適用するためのオリゴヌクレオチドプローブの設計
実施例に使用したオリゴヌクレオチドのいくつかを適用して、ＬｉＰＡアッセイ（ラインプローブアッセイ、ＷＯ９４／１２６７０）に使用した場合に異なる生物に対して良好な特異性および感度を得た。表３は、すでに記載されている同定された生物に対する異なるプローブならびにＬｉＰＡ用途に適合したバージョンをまとめたものである。
デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（Pharmacia）を標準反応バッファー中で使用して、最適化されたプローブにポリ−Ｔテイルを酵素的に付加した。１時間インキュベーション後、反応を停止させ、テイルを付したプローブを沈殿させ、氷冷エタノールで洗浄した。プローブを６Ｘ ＳＳＣ中に個々の濃度で溶解させ、膜片上に横線として適用した。陽性対照としてビオチン化ＤＮＡを一緒に並べて適用した。８０℃で１２時間ベーキングすることによりオリゴヌクレオチドを膜に固定した。次いで、膜を４ｍｍの片にスライスした。
【００３５】
２．核酸の調製およびＰＣＲ増幅
細菌およびウイルスの培養ストックをリファレンス材料として使用した。上記の標準的方法にしより核酸を抽出した。
サイクル数を３５とし、ジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰを取り込ませるかわりにビオチン化プライマーを用いることによりアンプリコンの標識を行ったこと以外は、すでに説明したようにして、１ないし５μｌの核酸調合物を多重ＲＴ−ＰＣＲに使用した。
【００３６】
３．ＬｉＰＡ試験の品質
同体積（５ないし１０μｌ）のビオチン化ＰＣＲフラグメントおよび変性溶液（４００ｍＭ ＮａＯＨ／１０ｍＭ ＥＤＴＡ）を試験槽中で混合し、室温で５分インキュベーションした。次いで、５０℃に温めておいたハイブリダイゼーション溶液（２ｘＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ）２ｍｌを添加し、次いで、１個の試験槽につき１個の片を入れた。密閉振盪水浴中で５０℃において１時間ハイブリダイゼーションさせた。室温において２ｍｌのストリンジェントな洗浄溶液（２ｘＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ）で片を２０秒間、２回洗浄し、次いで、５０℃で１５分洗浄した。このストリンジェントな洗浄後、Innogenetics標準リンス溶液（ＲＳ）２ｍｌで片を２回すすいだ。アルカリ性ホスファターゼ標識ストレプトアビジン抱合体とともに片を回転プラットフォーム上でインキュベーションし、室温において３分間、標準コンジュゲート溶液で希釈した。次いで、片を２ｍｌのＲＳで２回洗浄し、基質バッファー（ＳＢ）で１回洗浄し、次いで、ＢＣＩＰおよびＮＢＴをＳＢに添加することにより発色反応を開始させた。室温で３０分後、発色化合物を蒸留水に交換することにより発色反応を停止させた。乾燥させてすぐに片を調べた。上記の完全な手順を標準Inno-LiPAオートメーションデバイス（Auto-LiPA, Innogenetics, Zwijnaarde, Belgium）に置き換えることもできた。
図５からわかるように、リファレンス材料に関して行った多重ＲＴ−ＰＣＲ後に得られたアンプリコンの２％アガロースゲル上での分離により、すべての試験生物に関して予想されたサイズの別々のバンドが示された。
図６は、ＬｉＰＡ片によるこれらのアンプリコンの結果ならびに陰性対照の結果を示す。これらの結果は、片上のすべてのプローブがその対応アンプリコンと特異的に反応し、試験した異なる生物間において交差ハイブリダイゼーションが見られないことを明確に示す。
【００３７】
４．C. pneumonia、M pneumoniae、B. pertussisおよびB. parapertussis用の新たなプローブの開発
多重ＲＴ−ＰＣＲに使用したプイライマーおよびプローブをM pneumoniaeおよびC. pneumoniaの検出用のものに置き換えるために、これらの生物用に１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡスペーサー領域に由来する新たなプライマーおよびプローブのセットを開発した。B. pertussisおよびB. parapertussisまたはB. bronchisepticaの特異的検出のためのプライマーおよびプローブも開発して多重ＲＴ−ＰＣＲに加えた。
これらの細菌病原体用の、１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡスペーサー領域由来のプライマーおよびプローブの配列を表４にまとめる。
ＰＣＲ実験は、選択されたすべてのプライマーセットが対応生物配列を特異的に増幅し、系統発生的に関連した生物または多重ＲＴ−ＰＣＲにおいて検出された他の感染性病原体に由来する核酸を用いた場合にはアンプリコンが得られないことを示した。
１６Ｓ ｒＲＮＡの３’末端および２３Ｓ ｒＲＮＡの５’部分に由来するビオチン化汎用プライマーを用いて目的細菌およびそれらに最も近縁種の１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡスペーサー領域を増幅した。
２ｘＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ中、５０℃でのＬｉＰＡ片上のハイブリダイゼーションは、選択したすべてのプローブが目的微生物と特異的に反応し、上記多重ＲＴ−ＰＣＲから得られたアンプリコンとの交差反応が見られないことを示した。
最初の実験は、プライマーおよびプローブ（リボソームスペーサー由来）を多重ＲＴ−ＰＣＲに用いて、現在使用しているプライマーおよびプローブをM. pneumoniaeおよびC. pneumoniae用のものに置き換えることができること、ならびに気道感染に関与するBordetella sp.用のプライマーおよびプローブを加えることによりアッセイを拡張することができることを示した。
これらの結果から、さらにこのセットをLegionella pneumoniaeのごとき他の関連病原体用のプローブ（より詳細には１６Ｓ−２３Ｓ ｒＲＮＡスペーサー領域由来のプローブ）を含めたものに拡張できると予期される。
【００３８】
実施例３：培養上清によるｍ−ＲＴ-およびＬｉＰＡハイブリダイゼーション
多重ＲＴ−ＰＣＲおよびＬｉＰＡハイブリダイゼーションの正確さおよび特異性をチェックするために、ＬｉＰＡアッセイを用いて多くのブラインドされた培養（blinded cultures）を分析した。
１．製造者の説明に従ってBoehringer-Mannheim "High Pure Viral Nucleic Acid Kit"を用いて培養上清の核酸の調製を行った。ｍ−ＲＴ−ＰＣＲは、ＲＮＡ生物（ＲＳＶ、ＰＩＶ１、ＰＩＶ３、ＩｎｆＡ、ＩｎｆＢ、エンテロウイルス）由来のＲＮＡを逆転写すること、次いで、上記実施例と同様にして対応ＤＮＡならびにアデノウイルス、M. pneumoniae、C. pneumoniae、B. pertussisおよびB. parapertussisのＤＮＡをＰＣＲ増幅することを含んでいた。
すでに公表されている非常に保存された標的配列からプライマーを選択した。ただし、細菌種の増幅に使用したプライマーは下記のものである：
M. pneumoniaeについては配列番号：１７および配列番号：１９；C. pneumoniaeについては配列番号：２０および配列番号：２１、両方のBordetella種については配列番号：２２および配列番号：２３。
【００３９】
２．ＬｉＰＡハイブリダイゼーション
表３に示すエンテロウイルス、インフルエンザＡおよびＢ、アデノウイルスおよびパラインフルエンザウイルス、ならびに表４に示す細菌種のごとき異なる生物用の特異的プローブを含有するＬｉＰＡ片に５ないし１０μｌのＰＣＲ生成物をハイブリダイゼーションさせた。ＲＳＶに使用したプローブを表５に示す。
実施例２記載のごとくハイブリダイゼーションを行った。
３．結果
第１シリーズの３６個のブラインドされた試料に関する培養およびＬｉＰＡの結果を比較して表６にまとめる。
大部分の場合においてＬｉＰＡの結果は培養の結果と一致した。２つの場合において、多重試験により二重感染の存在が明らかとなったが、培養の結果によれば存在する２種の生物のうち１つだけが検出された。
古い培養上清を用いた場合、得られたＬｉＰＡの結果は陰性であり、おそらく核酸の分解によるものであろう。
第２の実験において、多重ＲＴ−ＰＣＲおよびその後のＬｉＰＡハイブリダイゼーションを用いてMycoplasma pneumoniaeの培養に関するブラインドされた試料を評価した。３０個のブラインドされた試料についての結果を表７にまとめる。
ＬｉＰＡ試験における結果は培養において得られた結果と１００％一致した。
【００４０】
表１: ＥＩＡとｍ−ＲＴ−ＰＣＲ−ＥＬＩＳＡとの比較
【表１】
0004503844.tif 000002
【００４１】
表２．実施例１に使用したプライマーの配列
エンテロ−  ＦＰ１：ａｔｔ  ｇｔｃ  ａｃｃ  ａｔａ  ａｇｃ  ａｇｃ  ｃａ−３’（配列番号：３５）
エンテロ−  ＲＰ１：ｔｃｃ  ｔｃｃ  ｇｇｃ  ｃｃｃ  ｔｇａ  ａｔｇ  ｃｇ−３’（配列番号：３６）
ＭＰＮ−ＦＰ１：ａａｇ  ｇａｃ  ｃｔｇ  ｃａａ  ｇｇｇ  ｔｔｃ  ｇｔ−３’（配列番号：３７）
ＭＰＮ−ＲＰ１：ｃｔｃ  ｔａｇ  ｃｃａ  ｔｔａ  ｃｃｔ  ｇｃｔ  ａａ−３’（配列番号：３８）
インフルエンザＡ−ＦＰ１：ａａｇ  ｇｇｃ  ｔｔｔ  ｃａｃ  ｃｇａ  ａｇａ  ｇｇ−３’（配列番号：３９）
インフルエンザＡ−ＲＰ１：ｃｃｃ  ａｔｔ  ｃｔｃ  ａｔｔ  ａｃｔ  ｇｃｔ  ｔｃ−３’（配列番号：４０）
インフルエンザＢ−ＦＰ１：ａｔｇ  ｇｃｃ  ａｔｃ  ｇｇａ  ｔｃｃ  ｔｃａ  ａｃ−３’（配列番号：４１）
インフルエンザＢ−ＲＰ１：ｔｇｔ  ｃａｇ  ｃｔａ  ｔｔａ  ｔｇｇ  ａｇｃ  ｔｇ−３’（配列番号：４２）
アデノ−ＦＰ１：ｇｃｃ  ｇａｇ  ａａｇ  ｇｇｃ  ｇｔｇ  ｃｇｃ  ａｇｇ  ｔａ−３’（配列番号：４３）
アデノ−ＲＰ１：ａｔｇ  ａｃｔ  ｔｔｔ  ｇａｇ  ｇｔｇ  ｇａｔ  ｃｃｃ  ａｔｇ  ｇａ−３’（配列番号：４４）
ＣＰＮ−ＦＰ１：ｔｇａ  ｃａａ  ｃｔｇ  ｔａｇ  ａａａ  ｔａｃ  ａｇｃ−３’（配列番号：４５）
ＣＰＮ−ＲＰ１：ｃｇｃ  ｃｔｃ  ｔｃｔ  ｃｃｔ  ａｔａ  ａａｔ−３’（配列番号：４６）
ＰＩＶ１−ＦＰ１：ｃａｃ  ａｔｃ  ｃｔｔ  ｇａｇ  ｔｇａ  ｔｔａ  ａｇｔ  ｔｔｇ  ａｔｇ  ａ−３’（配列番号：４７）
ＰＩＶ１−ＲＰ１：ａｔｔ  ｔｃｔ  ｇｇａ  ｇａｔ  ｇｔｃ  ｃｃｇ  ｔａｇ  ｇａｇ  ａａｃ−３’（配列番号：４８）
ＰＩＶ３−ＦＰ１：ｔａｇ  ｃａｇ  ｔａｔ  ｔｇａ  ａｇｔ  ｔｇｇ  ｃａ−３’（配列番号：４９）
ＰＩＶ３−ＲＰ１：ａｇａ  ｇｇｔ  ｃａａ  ｔａｃ  ｃａａ  ｃａａ  ｃｔａ−３’（配列番号：５０）
ＲＳＶ−ＦＰ１：ｔｇｔ  ｔａｔ  ａｇｇ  ｃａｔ  ａｔｃ  ａｔｔ  ｇａ−３’（配列番号：５１）
ＲＳＶ−ＲＰ１：ｔｔａ  ａｃｃ  ａｇｃ  ａａａ  ｇｔｇ  ｔｔａ  ｇａ−３’（配列番号：５２）
【００４２】
【表２】
0004503844.tif 000003
【００４３】
【表３】
0004503844.tif 000004
【００４４】
表５. 実施例３に使用したＲＳＶ用プローブの配列
【表４】
0004503844.tif 000005
* r = a または g, m = a または c
【００４５】
【表５】
表６.  一連の３６個のブラインドされた試料に関する培養およびＬｉＰＡの結果
0004503844.tif 000006
【００４６】
表７.  Mycoplasma pneumoniaeの培養物に関する３０個のブラインドされた標本の結果
【表６】
0004503844.tif 000007
【００４７】
文献
Adcock, P.M., G.G. Stout, M. A. Hauck, and G.S. Marshall (1997). Effect of rapid viral diagnosis on the management of children hospitalized with lower respiratory tract infection. J. Pediatric. Infect. Dis. 16: 842-846.
Asseline U., Delarue M., Lancelot G., Toulme F. and Thuong N. (1984) Nucleic acid-binding molecules with high affinity and base sequence specificity : intercalating agents covalently linked to oligodeoxynucleotides. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81(11):3297-301.
Bartlett, J.G., and L.M. Mundy (1995). Community-acquired pneumonia, NEJM, 333: 1618 - 1624.
Bej A., Mahbubani M., Miller R., Di Cesare J., Haff L., Atlas R. (1990) Multiplex PCR amplification and immobilized capture probes for detection of bacterial pathogens and indicators in water. Mol Cell Probes 4:353-365.
Claas, E.C.J., M.J.W. Sprenger, G.E.M. Kleter, R. van Beek, W.G.V. Quint, and N. Masurel (1992). Type-specific identification of influenza viruses A, B and C by the polymerase chain reaction. J. Virol. Meth. 39: 1 - 13.
Compton J. (1991) Nucleic acid sequence-based amplification. Nature 350: 91-92.
Dixon, R.E. (1985). Economic costs of respiratory infections in the United States. Am. J. Med. 78 (Suppl. 6B) : 45 - 51.
Drews, A. L., R. L. Atmar, W.P. Glezen, B.D. Baxter, P.A. Piedra, S.B. Greenberg (1997). Dual respiratory virus infections. Clin. Infect. Dis. 25: 1421 - 1429.
Duck P. (1990) Probe amplifier system based on chimeric cycling oligonucleotides. Biotechniques 9: 142-147.
Echeviarra, J.E., D.D. Erdman, E.M. Swierkosz, B.P. Holloway, L.J. Anderson (1998). Simultaneous detection and identification of human parainfluenza viruses 1, 2, and 3 from clinical samples by multiplex PCR. J. Clin. Microbiol. 36: 1388 - 1391.
Ellis, J.S., D.M. Fleming and M.C. Zambon (1997). Multiplex reverse transcription-PCR for surveillance of influenza A and B viruses in England and Wales in 1995 and 1996. J. Clin. Microbiol. 35: 2076 - 2082.
Falck G., J.  Gnarpe, and H. Gnarpe (1997). Prevalence of Chlamydia pneumoniae in healthy children and in children with respiratory tract infections. Pediatr. Infect. Dis. J. 16: 549 - 554.
Fan, J. And K. Henrickson (1996). Rapid diagnosis of human parainfluenza virus type 1 infection by quantitative reverse transcription-CPR-enzyme hybridization assay. J. Clin. Microbiol. 34 : 1914 - 1917.
Garenne, M., C. Ronsmans, H. Campbell (1992). The magnitude of mortality from acute respiratory infections in children under 5 years in developing countries. World Health Stat. Q. 45: 180 - 191.
Gaydos, C.A., T.C. Quinn, and J.J. Eiden (1992). Identification of Chlemydia pneumoniae by DNA amplification of the 16S rRNA gene. J. Clin. Microbiol. 30: 796 - 800.
Gendrel, D., J. Raymond, F. Moulin, J.L. Iniguez, S. Ravilly, F. Habib, P. Lebon, and G. Kalifa (1997). Etiology and response to antibiotic therapy of community-acquired pneumonia in French children. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 16: 388 - 391.
Gilbert, L.L., A. Dakhama, B.M. Bone, E.E. Thomas, and R.G. Hegele (1996). Diagnosis of viral respiratory tract infections in children by using a reverse transcription-PCR panel, J. Clin. Microbiol. 34: 140 - 143.
Goo, Y.A.M.K. Hori, J.H. Jr. Voorhies, C.C. Kuo, S.P. Wang, L.A. Campbell (1995). Failure to detect Chlamydia pneumoniae in ear fluids from children with otitis media. Pedriatr. Infect. Dis. J. 14: 1000 - 1001.
Guatelli J., Whitfield K., Kwoh D., Barringer K., Richman D.  and Gengeras T. (1990) Isothermal, in vitro amplification of nucleic acids by a multienzyme reaction modeled after retroviral replication. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874-1878.
Hassan-King, M., I. Baldeh, R. Adegbola, C. Omosigho, S.O. Usen, A. Oparaugo, B.M. Greenwood (1996). Detection of Haemophilus influenzae and Streptococcus pneumoniae DNA in blood culture by a single PCR assay. J. Clin. Microbiol. 34: 2030 - 2032.
Hassan-King, M., R. Adegbola, I. Baldeh, K. Mulholland, C. Omosigho, A. Oparaugo, S. Usen, A. Palmer, G. Schneider, O. Secka, M. Weber, B. Greenwood (1998). A polymerase chain reaction for the diagnosis of Heamoplihus influenzae type b disease in children and its evaluation during a vaccine trail. Pediatr. Infect. Dis. J. 17: 309 - 312.
Hemming, V. G. (1994). Viral respiratory diseases in children : classification etiology, epidemiology and risk factors. J. Pediatr. 124: S 13 - 16.
Hierholzer, J.C., P.E. Halonen, P.O. Dahlen, P. G Bingham, M.M. McDonough (1993). Detection of adenovirus in clinical specimens by polymerase chain reaction and liquid-phase hybridization quantitated by time-resolved fluoremetry, J. Clin. Microbiol. 31: 1886 - 1891.
Hinman, A.R. (1998). Global progress in infectious disaeses control. Vaccine 16: 1116 - 1121.
Karron, R.A., K.L. O'Brien, J.L. Froehlich, and V.A. Brown (1992). Molecular epidemiology of a parainfluenza type 3 virus outbreak on a pediatric ward. J. Inf. Dis. 167: 1441 - 1445.
Kawasaki, E.S. (1990). Amplification of RNA. P 21-27 In M.A. Innis, D.H. Gelfand, J.J. Sninsky and T.J. White (ed.), PCR protocols : A guide to methods and applications. Academic Press.
Kwoh D., Davis G., Whitfield K., Chappelle H., Dimichele L. and Gingeras T. (1989). Transcription-based amplification system and detection of amplified human immunodeficiency virus type 1 with a bead-based sandwich hybridization format. Proc Natl Acad Sci USA 86: 1173-1177.
Kwok S., Kellogg D., McKinney N., Spasic D., Goda L., Levenson C. and Sinisky J. (1990) Effects of primer-template mismatches on the polymerase chain reaction: Human immunodeficiency virus type 1 model studies. Nucl. Acids Res. 18: 999.
Landgren U., Kaiser R., Sanders J. and Hood L. (1988) A ligase-mediated gene detection technique. Science 241:1077-1080.
Lockhart, D.J., Dong, H., Byrne, M.C., Follettie, M., Gallo, M.V., Chee, M.S., Mitteman, M., Wang, C., Kobayashi, M., Horton, H. and Bown, E.L. (1996). Expression monitoring by hybridisation to high density oligonucleotide arrays. Nature Biotechnology 14: 1675-1680.
Lomeli H., Tyagi S., Pritchard C., Lisardi P. and Kramer F. (1989) Quantitative assays based on the use of replicatable hybridization probes. Clin Chem 35: 1826-1831.
Marx, A., T.J. Torok, R.C. Holman, M.J. Clarke, and L.J. Anderson (1997). Pediatric Hospitalizations for croup (laryngotracheobronchitis): biennial increases associated with human parainfluenzavirus 1 epidemics. J. Infect. Dis. 176 : 1423 - 1427.
Matsukura M., Shinozuka K., Zon G., Mitsuya H., Reitz M., Cohen J. and Broder S (1987). Phosphorothioate analogs of oligodeoxynucleotides : inhibitors of replication and cytopathic effects of human immunodeficiency virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (21):7706-10.
Messmer, T.O., K. Skelton, J. F. Moroney, H. Daugharty, and B.S. Fields (1997). Application of a nested, multiplex PCR to psittacosis outbreaks. J. Clin. Microbiol. 35: 2043 - 2046.
Miller P, Yano J, Yano E, Carroll C, Jayaram K, Ts'o P (1979) Nonionic nucleic acid analogues. Synthesis and characterization of dideoxyribonucleoside methylphosphonates. Biochemistry 18 (23): 5134-43.
Mullis K., Faloona F., Scharf S. et al. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction (1986). Gold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 1: 263-273.
Mullis K.B. and Faloona F.A. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction (1987). Methods Enzymol. 155: 335-350.
Nielsen P., Egholm M., Berg R. and Buchardt O. (1991) Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide. Science 254 (5037): 1497-500.
Nielsen P., Egholm M., Berg R. and Buchardt O. (1993) Sequence specific inhibition of DNA restriction enzyme cleavage by PNA. Nucl. Acids Res. 21(2): 197-200.
Nohynek, H., J. Eskola, M. Kleemola, E. Jalonen, P. Saikku, M. Leinonen (1995). Bacterial antibody assays in the diagnosis of acute lower respiratory tract infection in children. Pediatr. Infect. Dis. J. 14: 478 - 484.
Paton, A.W., J.C. Paton, A.J. Lawrence, P.N. Goldwater, and R.J. Harris (1992). Rapid detection of respiratory syncytial virus in nasopharyngeal aspirates by reverse transcription and polymerase chain reaction amplification. J. Clin. Microbiol. 30: 901 - 904.
Reznikov, M., T.K. Blackmore, J.J. Finlay-Jones and D.L. Gordon (1995). Comparison of nasopharyngeal and throat swab specimens in a polymerase chain reaction-based test for Mycoplasma pneumoniae. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 14: 58 - 61.
Rotbart, H.A. (1990). Enzymatic RNA amplification of the enteroviruses. J. Clin. Microbiol. 28 : 438 - 442.
Rotbart, H.A., M.H. Sawyer, S. Fast, C. Lewinski, N. Murphy, E.F. Keyser, J. Spadoro, S.Y. Kao, M. Loeffelholz (1994). Diagnosis of enteroviral meningitis by using PCR with a colorimetric microwell detection assay. J. Clin. Microbiol. 32: 2590 - 2592.
Saiki R.K., Bugawan T.L., Horn G.T. et al. Analysis of enzymatically amplified beta-globin and HLA-DQ alpha DNA with allele-specific oligonucleotide probes (1986). Nature 324: 163-166.
Saiki, R.K., D.H. Gelfand, S. Stoffel, S.J. Scharf, R. Higuchi, G.T. Horn, K.B. Mullis, H.A. Erlich (1988). Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 239: 487 - 491.
Saiki R.K., Walsh P.S., Levenson, C.H. and Erlich H.A. Genetic analysis of amplified DNA with immobilizes sequence-specific oligonucleotide probes (1989). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6230-6234.
Saiki, R.K. (1990). Amplification of genomic DNA, p 13-20. In M.A. Innis, D.H. Gelfand, J.J. Sninsky and T.J. White (ed.) PCR protocols : A guide to methods and applications. Academic Press.
Saikku, P. (1997). Atypical respiratory pathogens. Clin. Microbiol. Inf. 3: 599 - 604.
Sambrook, J., E.F. Fritsch, And T. Maniatis (1989). Molecular cloning : A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, NY.
Stauffer, F., H. Haber, A. Rieger, R. Mutschlechner, P. Hasenberger, V.J. Tevere, K.K. Young (1998). Genus level identification of mycobacteria from clinical specimens by using an easy-to-handle Mycobacterium-specific PCR Assay. J. Clin. Microbiol. 36: 614 - 617.
Stuyver L., Rossau R., Wyseur A .et al (1993) Typing of hepatitis C virus isolates and characterization of new subtypes using a line probe assay. J. Gen. Virol. 74: 1093-1102
Trolfors, B.  And B.A. Claesson (1997). Childhood pneumonia : possibilities for aetiological diagnosis. Bailliere's Clinical Paediatrics. 5: 71 - 84.
UNICEF. (1993). Pneumonia, 3.5 millions deaths, The State of the World's Children.
Valassina, M. A.M. Cuppone, M.G. Cusi, P.E. Valensin (1997). Rapid detection of different RNA respiratory virus species by multiplex RT-PCR: application to clinical specimens. Clin. Diagn. Virol. 8: 227 - 232.
Van Kuppeveld, F.J.M. van der Logt, A.F. Angulo, M.J. Van Zoest, W.G.V. Quint, H.G.M. Niesters, J.M.D. Galama, and W.J.G. Melchers (1992). Genus- and species-specific identification of mycoplasmas by 16S rRNA amplification. Appl. Env. Microbiol. 58: 2606 - 2615.
Woo, P.C., S.S. Chlu, W. H. Seto, M. Pelris (1997). Cost-effectiveness of rapid diagnosis of viral respiratory tract infections in pediatric patients. J. Clin. Microbiol. 35: 1579 - 1581.
Wu D. and Wallace B. (1989) The ligation amplification reaction (LAR) - amplification of specific DNA sequences using sequential rounds of template-dependent ligation. Genomics 4:560-569.
Yang S.Y. A standardised method for detection of HLA-A and HLA-B alleles by one-dimensional isoelectric focusing (IEF) gel electrophoresis. Immunobiology of HLA. Histocompatibility testing 1987 (ed. B. Dupont). Springer-Verlag, New York, pp. 332-335.
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１はｍ−ＲＴ−ＰＣＲ生成物のアガロースゲル上での分離を示す。１０μｌのｍ−ＲＴ−ＰＣＲ生成物を２％アガロースゲル上で分離した。材料および方法に記載したように、１μｌのウイルスまたは細菌の核酸を鋳型としてｍ−ＲＴ−ＰＣＲを行った。予想される生成物の長さは本文中に記載する。マーカーのＤＮＡフラグメント（Ｍｓｐｌで消化した０．７μｇのｐＵＣ１９）のサイズ（塩基対（ｂｐ））は以下のとおり：  １：５０１ｂｐ；２：４０４ｂｐ；３：３３１ｂｐ；４：２４２ｂｐ；５：１９０ｂｐ；６：１４７ｂｐ；７：１１０ｂｐ。
【図２】  図２は陽性のｍ−ＲＴ−ＰＣＲ結果の割合を示す。陽性のｍ−ＲＴ−ＰＣＲ結果数および全試料数をｙ軸に示す。ｘ軸上の時間目盛は１９９５年１１月から１９９８年４月までである。
【図３】  図３は臨床標本における陽性のｍ−ＲＴ−ＰＣＲ結果の頻度を示す。９種の生物それぞれに関する陽性のｍ−ＲＴ−ＰＣＲ結果数をｙ軸上に示す。ｘ軸上の時間目盛は１９９５年１１月から１９９８年４月までである。
【図４】  図４は感染を引き起こす生物のパーセンテージを示す。呼吸器疾患を引き起こす生物の量を、疾病を引き起こす全生物に対するパーセントで示す。試験に使用されなかった生物は図に示していない。
【図５】  図５はリファレンス物質に関して行った多重−ＲＴ−ＰＣＲ後に得られたアンプリコンの２％アガロースゲル上での分離を示す。試験したすべての生物について予想されるサイズのバンドが個々に示される。
【図６】  図６はこれらのアンプリコンとＬｉＰＡ片とのハイブリダイゼーションならびに陰性対照を示す。これらの結果は、片上のすべてのプローブがそれらに対応するアンプリコンと特異的に反応することを明確に示す。試験した異なる生物間において交差ハイブリダイゼーションは見られない。
【図１】
0004503844.tif 000008
【図２】
0004503844.tif 000009
【図３】
0004503844.tif 000010
【図４】
0004503844.tif 000011
【図５】
0004503844.tif 000012
【図６】
0004503844.tif 000013