(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
毛髪試料を水溶液中においてタンパク質分解反応させ、得られる液体試料の濁りに基づいて、濁り度測定で、毛髪の状態を検査、評価および診断するものであり、上記水溶液のｐＨが５．０ないし９．０であることを特徴とする、構造上の損傷を被った毛髪の状態の検査、測定方法。
【請求項２】
タンパク質分解反応を、プロテアーゼおよびプロテイナーゼの群に属し、ケラチン含有素材の分解に対して触媒作用を有する酵素を一個以上、単独で、あるいは混合して、用いて行うことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
プロテアーゼおよびプロテイナーゼがパパイン、プロナーゼＥ、プロテイナーゼＫ、サブチリシン、トリプシンあるいはケラチナーゼの中から選択されることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
タンパク質分解反応を、ケラチンの分解性および／あるいは還元性有機および／あるいは無機試薬を一個以上用いて行うことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
有機および／あるいは無機試薬が尿素、水酸化ナトリウム、トリブチルフォスフィン、ヨウ化ナトリウム、過蟻酸、アンモニア、チオグリコール酸、酢酸、システイン、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、ジチオトレイトールあるいはジチオエリトロールの少なくとも一個を含有することを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
タンパク質分解反応を、一個以上の酵素と一個以上のケラチン分解性および／あるいは還元性有機および／あるいは無機試薬の組み合せ下に、行うことを特徴とする、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
タンパク質分解反応によって分解されない毛髪成分を液体試料検査の前に除去すること、あるいは液体試料検査中隔離しておくこと、および液体試料の濁り度測定を不分解毛髪成分がない状態で実施することを特徴とする、請求項１ないし６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
タンパク質分解処理の間、毛髪試料を補助的に機械的作用下に置くことを特徴とする、請求項１ないし７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
液体試料の濁り度測定を毛髪試料のタンパク質分解反応の間および／あるいは後に行うことを特徴とする、請求項１ないし８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
液体試料の濁り度測定を断続して間接的に、あるいは継続して直接的に行うことを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明はケラチン含有素材である毛髪の状態を、特に環境、気候、加齢による老化、物理的あるいは化学的有害物、あるいは美容処理などの外的作用によって構造上に損傷を被った毛髪の状態を、検査および測定するための方法に関する。
【０００２】
皮膚や、たとえば毛髪、爪、羊毛、羽毛、蹄のような皮膚付属器官に含まれているケラチン含有素材は、自然的に、あるいは非自然的にいろんな物理的および化学的作用を受けやすい。作用として、たとえば高エネルギー射光（たとえば紫外線）、気象ないしは風化作用（たとえば気温、大気湿度、大気成分の影響）、美容処理（たとえば毛髪の脱色、パーマネントウエーブ処理、染色、樹脂処理）が挙げられる。このような作用によってこれらの素材は明らかに構造上にさまざまな変質をきたし、それによってこれらの素材の物理的および化学的性質が変化する。たとえば毛髪の場合、このような作用によって一般的に艶、しなやかさ、張り、あるいはブラッシング性が失われる。その上毛髪は脆くなり、毛羽立つ。損傷の度合いは作用要素の作用頻度が高くなるにつれて、また作用期間が長くなるにつれて大きくなる。
【０００３】
保護剤、コンディショニング剤あるいは構造再生剤を毛髪に効果的に適用するに当たっては、毛髪のその時の状態を正確に知る必要はない。しかし、特に毛髪のその時の構造状態に合わせてパーマネントウエーブ処理剤、染色剤あるいは脱色剤を選択するためには、毛髪の損傷度をできるだけ正確に調べる必要がある。毛髪の状態は、一方では毛髪の艶、脆さ、ざらつきあるいは毛羽立ちに基づいて視覚あるいは触覚によって感覚的に把握することができるが、他方では客観的測定法によって把握することができる。
【０００４】
毛髪の状態ないしは毛髪の損傷の度合いを判断する場合に、感覚による方法は簡単で速やかである。しかし毛髪の状態ないしは損傷の評価に対する知識、経験が不充分であるために、また毛髪保護剤によって損傷が覆い隠されることがあるために、初期段階および進行段階における毛髪の構造変化（毛髪の損傷）を感覚的パラメータによって評価した場合、その評価結果は誤差が大きく、このような結果は実際には用いることができない。
【０００５】
ケラチン含有素材において生じていると思われる損傷を確認するための客観的検査方法は若干公知である。たとえば高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によるシステイン酸含有量の測定。この方法は、広範な実験室検査を必要とし、このために時間および経費がかかるという欠点を持っている。従ってこのような方法は、特に理容師あるいは美容師において、実際に日常的に利用することはできない。これとは別に、アニオン性染料を用いて毛髪の損傷を測定するという方法も公知である（たとえばＥＰ−Ａ ０７０２２３２）。しかしこの方法は毛髪の構造状態に関しては不充分な情報しか提供しない。また当該毛髪の伸張率を測定するという方法、あるいは損傷毛髪の銅吸収度を測定するという方法も公知である。これらの方法は、たとえば米国特許５，４６１，９２５および４，６６５，７４１に記載されている。これらの方法はあまりにも非特異的であり、偽の正結果あるいは偽の負結果を与える恐れがある。またこれらの方法は手間がかかる上に、装置にも費用がかかる。
【０００６】
一方において確実で効果的な美容処理を行うためにケラチン含有素材の損傷を正確に検査し、評価したいという性急な要求があるにもかかわらず、他方においてはこの要求を適えることのできる迅速な試験法、これを実施するための適当な装置あるいは薬剤がないのが実状である。このために迅速試験法並びにそれ用の適当な装置および薬剤が強く要望されている。
【０００７】
そこで本発明は、先行技術の欠点を除去し、ケラチン含有素材の、特に毛髪の、損傷状態を正確に検査および評価するための方法を提供することを課題として出発した。
【０００８】
この課題は本特許請求の範囲の記載項目に従って解決され得る。
すなわち驚くべきことに、損傷度の異なる、たとえば毛髪のような、ケラチン含有素材は、水溶液中における酵素処理および／あるいは化学処理において異なった反応を示すこと、およびこの液体試料はケラチン含有素材の損傷度に応じて非常に異なった濁りを示すことが確認された。
【０００９】
従って本発明は、ケラチン含有素材である毛髪の状態の検査および測定方法において、毛髪試料を水溶液中において酵素処理および／あるいは化学処理し、次いで得られる水溶液の濁りに基づいて毛髪の状態を検査、評価および診断することを特徴とするものである。毛髪の状態は比較値（零値あるいは標準値）を用いることによって簡単に測定することができる。比較値は、上記の毛髪試料の場合と同じ条件下に、同量の健全な毛髪を酵素処理および／あるいは化学処理し、得られる液体試料の濁りを検査することによって得ることができる。
【００１０】
ここで「毛髪の状態の測定」とは、特に、該当の素材において潜在し得る、あるいは予想され得る損傷の状態を測定することを意味する。毛髪試料の酵素処理および／あるいは化学処理後に得られる水溶液については、以後これを「液体試料」と表示する。
【００１１】
本発明による方法は多数の利点を併せ持っている。すなわち本発明の方法においては、毛髪の状態の測定に対して高速試験が可能であり、これに基づいて毛髪のその時点の状態を正確に表出して、診断することができる。また再現可能な結果を提供することができ、利用者は客観的尺度に基づいて長期間にわたって毛髪の状態変化を追跡することができ、この集積データを利用することができる。
【００１２】
本発明による方法は毛髪保護ないしは毛髪美容の分野に非常に有効に利用することができる。これによって利用者、特に理容師においては個々の事例に応じて毛髪を保護しながら柔軟に美容処理を行うことができる。本方法においては液体試料の検査を光学的あるいは視覚的に実施することが可能であり、これによって本方法は簡単に実施することができる。これに必要な薬剤および装置は取り扱いが容易である。操作が簡単であると共に、毛髪の状態ないしは損傷度の識別検査が可能であること、および高い再現性有することによって、本発明の方法およびこれに適する本発明の装置および薬剤は、特に毛髪の品質の高速診断に対して、理想的である。
【００１３】
本発明の方法においては、毛髪においてタンパク質分解を生じさせ得る酵素処理および／あるいは化学処理をすべて利用することができる。従って本発明による方法は、タンパク質分解反応に基づく、毛髪試料の酵素処理および／あるいは化学処理をすべて含む。この場合被検査素材に対して、酵素処理単独、化学処理単独あるいは酵素／化学処理の組み合せ、いずれも有用である。
【００１４】
酵素処理法に関しては、プロテアーゼおよびプロテイナーゼ（エクソ−およびエンド−ペプチダーゼないしはエクソ−およびエンド−プロテアーゼ、およびこれらの混合物）の群に属し、ケラチン含有素材の分解に対して触媒作用を発揮し得る、あるいはケラチナーゼ活性を示し得る公知の酵素および本処理に有用な酵素すべてを考慮することができる。この場合に酵素処理（あるいは酵素／化学処理）に対して当該水溶液中には少なくとも一個の酵素が含有される。酵素は単一物あるいは混合物のいずれも用いることができる。これに対して、たとえばパパイン、プロナーゼＥ、プロテイナーゼＫ、サブチリシンあるいはトリプシン、並びに、たとえばＦｅｖｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｅｎｎａｖｏｒａｎｓ（ＦＲＩＤＲＩＣＨ，Ａ．Ｂ．＆ＡＮＴＲＡＮＩＫＩＡＮ，Ｇ．、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６２：２８７５、１９９６）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐａｃｔｕｍ，ＤＳＭ ４０５３０（ＢＯＥＣＫＬＥ，Ｂ．他、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６１：３７０５、１９９５）、Ｃａｎｄｉｄａ ｐｕｌｃｈｅｒｉｍａ ＫＳＹ １８８−５（ＧＯＴＯＣＨ，Ｔ．他、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９：３６７、１９９５）あるいはＢａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ＰＷＤ−１（ＬＩＮ，Ｘ．、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６１（４）：１４６９−１４７４、１９９５、ＣＨＥＮＧ，Ｓ．Ｗ．、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９（１２）：２２３９−２２４３、１９９５）から得られるケラチナーゼが挙げられる。特定のケラチナーゼはケラチン含有素材のタンパク質の分解を促進することができるので、これを使用することが有利である。たとえばＦｅｖｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｅｎｎａｖｏｒａｎｓに基づくケラチナーゼは、鶏の羽根を直ちに溶解し得ることが知られている（ＦＲＩＥＤＲＩＣＨ，Ａ．Ｂ．＆ＡＮＴＲＡＮＩＫＩＡＮ，Ｇ．、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６２：２８７５、１９９６）。本発明の方法に対して有用な酵素は市販されており、たとえば（Ｃａｒｉｃａ ｐａｐａｙａから分離可能な）パパインはボエーリンガー・マンハイム社から、（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓから分離可能な）プロナーゼＥはシグマ社（ダイゼンホーヘン）から、さらに（Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ ａｌｂｕｍから分離可能な）プロテイナーゼＫはメルク社（ダルムシュタット）から入手可能である。
【００１５】
毛髪に対する化学的分解処理に関しては、優先的にケラチンを加水分解することができ、それに基づいてケラチンを分解可能および／あるいは還元作用を有する、有機および／あるいは無機試薬あるいは溶液が考慮される。この場合有用な有機あるいは無機試薬の中に、塩基性条件下においても酸性条件下においても使用することのできる還元剤も含まれる。これらの有機および無機試薬は相応の水溶液中に単独で、あるいは混合物の形態で含有され得る。これに対して、ＩＷＴＯ−仕様書（ＩＷＴＯ １１−６２（Ｄ）、新版１９６６）に記載の、たとえば尿素／重亜硫酸塩−溶液（たとえば尿素およびメタ重亜硫酸ナトリウム含有溶液）による部分水性還元性加水分解、ＩＷＴＯ−仕様書（ＩＷＴＯ４−６０、新版１９９６）に記載の、たとえば水酸化ナトリウム溶液のようなアルカリ性溶液による部分アルカリ性水性加水分解、ＫＩＬＰＡＴＲＩＫ，Ｄ．Ｊ．他、Ｔｅｘｔ．Ｒｅｓ．Ｊ．４０：２５、１９７０に記載のトリブチルフォスフィン／ヨウ化ナトリウム−溶液による部分アルコール性還元性加水分解、過蟻酸／アンモニア−溶液による部分酸性−塩基性加水分解、チオグチコール酸／尿素−溶液による部分塩基性−還元性加水分解、あるいはチオグリコール酸あるいはシステイン／氷酢酸−溶液による部分酸性−還元性加水分解、並びにシステイン、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリトロール（ＤＴＥ）による部分酸性還元性加水分解が考慮される。従って、毛髪試料を水溶液中において化学的に処理すること、およびこの処理に基づくタンパク質分解反応を、ケラチン分解性および／あるいは還元性有機および／あるいは無機試薬を一個以上用いて行うことを特徴とする方法も、本発明に含まれる。
【００１６】
毛髪の酵素／化学−複合処理とは、酵素および純化学物質の双方の関与の下に毛髪に対して所望の加水分解ないしはタンパク質分解を行うことを意味する。この場合液体試料（この中で毛髪試料に対して酵素／化学−処理が行われる）は、上に挙げた酵素を一個以上含有すると同時に、ケラチン分解性および／あるいは還元性有機および／あるいは無機試薬を一個以上含有する。これに対しては、特にアミノ酸あるいは亜硫酸塩〔たとえばシステイン、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリトロール（ＤＴＥ）〕が有用である。この酵素／化学−複合処理は本発明の望ましい事例である。すなわち本発明による方法においては、毛髪試料を水溶液中において酵素および化学−処理すること、およびこの処理に基づくタンパク質分解反応あるいは加水分解反応を上に挙げたような酵素一個以上と上に挙げたようなケラチン分解性および／あるいは還元性有機および／あるいは無機試薬一個以上の双方を用いて行うことを特徴とする方法が好ましい。この場合、反応水溶液にまず酵素を入れ、次いで有機および／あるいは無機試薬を加える方法、あるいは酵素および試薬を同時に使用する方法、あるいは反応溶液にまず有機および／あるいは無機試薬を入れ、次いで酵素を加える方法のいずれの方法も可能である。しかし反応水溶液にまず有機および／あるいは無機試薬を入れ、次いで酵素を加えるという方法が合目的的である。
【００１７】
本発明においては、液体試料の検査および評価を酵素および／あるいは化学処理の間および／あるいは後のいずれにおいても行うことができる。従って本発明による方法は、液体試料の検査および評価を酵素および／あるいは化学処理の間および／あるいは後に行うことも含んでいる。
【００１８】
本発明において使用する酵素および有機／無機試薬の量は、酵素、試薬、毛髪試料の量および種類、および試料に対する酵素処理および／あるいは化学処理の条件（特に温度およびｐＨ−値）によって当然左右される。またこの場合に自明のことであるが、酵素が異なった温度最適度を示す場合があること、およびｐＨ−値が酵素の活性化に影響を及ぼすことを考慮する必要がある。プロテアーゼ、プロテイナーゼあるいはペプチダーゼがタンパク質の分解に対して最高の活性度を発揮する最適条件は、専門化においては周知のことである。これは多くの文献あるいは酵素提供者を通じて知ることもできる。また使用すべき酵素および化学試薬の種類並びにそれらの使用量は、被検査液体試料において所望の濁りを得るためにはケラチン含有素材を何時間以内にタンパク質分解させなければならないかによっても、左右される。所定量の毛髪試料を用いて、所定の条件（温度およびｐＨ−値）下に、所定量の酵素および／あるいは化学試薬を用いて所望の濁りを得るための条件は、自明のことであるが、比較試験から専門家によって簡単に求めることができる。そしてこれに基づいてそれぞれの要求に応じることができる。
【００１９】
本発明においては、通常、酵素は１．０ないし５００Ｕ／ｍｌ、特に５．０ないし２５０Ｕ／ｍｌ、中でも特に５．０ないし３５．０Ｕ／ｍｌの量（比活性度）において用いられる。酵素の比活性度は、特に加水分解性、ケラチン分解性および／あるいは還元性化学試薬との組み合せにおいて、５．０ないし３５．０Ｕ／ｍｌの範囲で充分であること、この範囲内において５ないし３０分以内に濁りが得られること、そしてこの濁りから毛髪の状態ないしは損傷度、特に毛髪の損傷状態を正確に、再現可能に把握することができることが確認されている。
【００２０】
本発明において使用するケラチン分解性および／あるいは還元性化学試薬の量に関しては、考慮される試薬が多種多様であるために固定の数値を挙げることはできない。しかし毛髪試料のタンパク質分解あるいは加水分解対して望ましい量、そしてその素材の状態あるいは損傷度の測定に対して有効な濁りを得るのに必要な量は、簡単な試験によって、簡単に求めることができる。しかしこの場合無機化学試薬は、望ましくは相応の酵素と組み合せの下に、０．５ないし５０．０ｍｇ／ｍｌ、特に１．０ないし２５．０ｍｇ／ｍｌ、中でも特に２．０ないし１５．０ｍｇ／ｍｌの範囲の量においてい使用することが合目的的であることが確認されている。他方、たとえばシステイン（特にＬ−システイン）のような有機化学試薬に対しては、０．１ないし５０ｍｇ／ｍｌ、特に０．２ないし３０ｍｇ／ｍｌ、中でも特に０．５ないし２５ｍｇ／ｍｌの範囲の量が考慮される。システインが単独化学試薬である場合は、有用な酵素と組み合せることが望ましく、特に水溶液中におけるシステイン濃度を高くすることが望ましい。システインと一緒に他の無機のケラチン分解性および／あるいは還元性試薬が一個以上、たとえば亜硫酸塩が一個あるいは複数個含有される場合は、望ましくは本発明において有用な酵素と組み合せの下に、システインの量を少なくすることが好ましい。
【００２１】
毛髪試料に対して最適なタンパク質分解を行う上で、特に有用な酵素との組み合せ下においては、有機化学試薬（たとえばシステイン）と一緒に無機化学試薬を一個以上（たとえば亜硫酸塩を一個あるいは複数個）併用することは、絶対的必要条件ではない。しかしシステインの濃度が０．１ないし２．０ｍｇ／ｍｌの範囲の低い濃度である場合には、無機化学試薬、たとえば亜硫酸塩を一個以上（たとえばメタ重亜硫酸ナトリウム（７．０ｍｇ／ｍｌ）および亜硫酸ナトリウム（３．０ｍｇ）を合計１０ｍｇ）含有させることによって、反応速度が高められ、液体試料における濁りが加速されることが判明している。反応速度およびそれに伴なって濁りの度合いはシステイン濃度が高くなるにつれて高くなる。すなわち使用する有機および無機試薬を変えることによって速度および所望の濁り強度を簡単に制御することができるということは大きな利点である。
【００２２】
本発明による方法において用いられる水溶液（この中で毛髪試料が酵素処理および／あるいは化学処理される）は、酵素処理および／あるいは化学処理に対して選択される反応体（酵素および／あるいは有機および／あるいは無機試薬）に応じて、５．０ないし９．０、特に望ましくは５．５ないし７．５の範囲のｐＨ−値を有する。個々には、たとえばプロテイナーゼＫ使用の場合は５．５ないし７．５のｐＨ−範囲が望ましく、プロナーゼＥ使用の場合は６．０ないし７．５のｐＨ−範囲が、さらにパパインの場合は６．０ないし７．５のｐＨ−範囲が望ましい。通常５．５ないし７．５の範囲のｐＨ−値が有効である。この範囲においてケラチン含有素材試料に対して効果的にタンパク質分解あるいは加水分解が行われ、それに基づいて望ましい濁りが生じ得る。上に挙げられている酵素に対しては６．５のｐＨ−値が標準値として挙げられる。他の酵素を使用する場合、自明のことであるが、それに適するｐＨ−値を選択しなければならない。
【００２３】
毛髪試料に対して酵素処理および／あるいは加水分解処理が行われるところの反応物ないしは液体試料は、水性液の形態で提供されているが、これは緩衝液、たとえば燐酸塩緩衝液を含有することが望ましい。この目的に対して、たとえば６．５のｐＨ−値を有する燐酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ）が有用である。
【００２４】
水溶液中における毛髪試料の酵素処理および／あるいは化学処理の温度は、同様に毛髪試料の酵素処理および／あるいは加水分解処理において選択される反応体に合わせて決定される。この場合に温度は、２０℃ないし１００℃、望ましくは３０℃ないし６０℃、特に望ましくは４０℃ないし５０℃の範囲で選択することができる。毛髪に対する分解速度および分解力は温度の上昇に伴なって高まること、そしてそれに応じて相応の濁りが生じることが確認されている。５０℃の温度において、たとえば燐酸塩緩衝液（５０ｍＭ）中タンパク質分解酵素（たとえばパパイン）および還元剤（たとえばシステイン）を含む反応混合物において、毛髪試料は直ちに分解される。反応体の選択（たとえばシステインおよび亜硫酸塩の量の選択）の場合と同様に、この場合も反応温度を選択することによって濁り度を効果的に制御することができる。
【００２５】
毛髪試料の量および長さは、規定量（ｍｇ）および／あるいは規定長さ（ｃｍ）を有する、たとえば健全素材に対する標準値に対応し得るように、選択することが望ましい。また試料の量および長さは、本発明に基づく酵素処理および／あるいは化学処理を行う反応容器の容量に応じて、変えられる。毛髪試料の量は０．０１ｍｇないし１００ｍｇであることが合目的的であるが、望ましくは０．５ｍｇないし５０ｍｇ、特に望ましくは１．０ｍｇないし１０ｍｇである。毛髪試料の長さは０．０５ｃｍないし５．０ｃｍ、望ましくは０．１ｃｍないし１．０ｃｍ、特に望ましくは０．１ｃｍないし０．５ｃｍの範囲内で選択される。小さい容器の中で（たとえば光度測定用の小容器あるいは小試験管の中で）濁り測定を行わなければならない場合は、試料に対して少ない量（０．１ないし１０ｍｇ）および短い長さ（０．１ないし０．５ｃｍ）を選択することが望ましい。ここに例示した量は、上に挙げた酵素処理および／あるいは化学処理において採用される反応体に対する量と相関関係にある。自明のことであるが、毛髪試料の量および長さは、採用条件および処理方法に応じて、大きくすることも、小さくすることもできる。一般に毛髪の長さが短いほど毛髪のタンパク質分解および／あるいは加水分解を加速することができ、それに伴なって短時間の内に（１０分以内に）本発明において使用可能な濁りを得ることができるので、原則として毛髪の長さは１．０ｃｍ以下であることが望ましい。
【００２６】
毛髪の状態の測定に適した濁りの生成時間は、上に挙げたパラメータ（反応パートナー、ｐＨ−値、温度、ケラチン含有素材試料の量および長さ）によって変化する。毛髪試料の酵素処理および／あるいは化学処理の時間は１ないし３０分間、望ましくは５ないし２０分間である。多くの検査から、たとえば毛髪の状態を正確に評価、診断するのに十分な濁りは本発明の方法によれば１０分以内に得られることが確認されている。
【００２７】
本発明の実施実験は主に毛髪について行ったので、以下においては毛髪を例にとって本発明を詳しく説明する。しかし本発明の対象はこれに限定されない。以下に記載する処置および表示の値および量は他のケラチン含有素材に対してもそのまま適用することができる。
【００２８】
一般的に酵素の存在下に有機あるいは無機化学試薬、ｐＨ−値および温度を適当に選択することによって毛髪試料のタンパク質分解度を広い範囲で変化させ得ることが、確認されている。この場合に反応速度が高くなると、ｍａｘｉｍａｌｅｒｒｅｉｃｈｂａｒｅｎ Ｔｒｕｂｕｎｇ（最高有効濁り）が減少することが認められた。緩慢な反応の場合は（たとえばパパインおよびシステイン２０ｍｇ／ｍｌ使用、ｐＨ５．５、５０℃において、あるいはパパインおよびＤＴＥ１０ｍｇ／ｍｌ使用、ｐＨ６．０、４５℃において）酵素添加後１０ないし１５分の以内に、経過は直線的に上昇する。これによって評価が容易になる。従って最高有効濁りに達するまでの反応時間が５ないし２０分、特に７ないし１５分である場合が、特に望ましい。被検査毛髪試料に大きな損傷が予想される場合には、このような反応経過が望ましいことが判明している。この場合に毛髪試料の酵素／化学処理に対して特に好ましい条件として、長さ約０．１ｃｍの毛髪５．０ｍｇ、パパイン（２１．２Ｕ）＋システイン（２０ｍｇ／ｍｌ）、ｐＨ６．５、５０℃、あるいはパパイン（２１．２Ｕ）＋ＤＴＥ（１０ｍｇ／ｍｌ）、ｐＨ６．２、５０℃の条件が挙げられる。
【００２９】
本発明に基づいて得られる液体試料における濁りを検査および評価するに当たって、毛髪の酵素処理および／あるいは化学処理後、液体試料中に分解していない毛髪成分が存在すると、不都合が生じることがある。たとえば物理的測定法を利用の場合、特に光度計による濁り測定の場合、不分解毛髪成分のために乱れが生じて、偽りの結果導き出されることがある。従って酵素処理および／あるいは化学処理によって分解しなかった毛髪成分は液体試料の検査前に除去することが、あるいは液体試料の検査中に継続的に除去することが、そして不分解毛髪成分が存在しない状態で液体試料の検査および評価を行うことが望ましい。多くの場合、特に測定（たとえば光度計による濁度測定あるいは吸光度測定）時に液体試料から、特に濁り測定に対して照射を行う範囲から、不分解毛髪成分を取り除くことで十分である。この場合不分解毛髪成分の沈殿物は問題ではない。不分解毛髪成分は物理的な分離方法によって、たとえば濾過、遠心分離あるいはあ沈降によって、あるいは適当な機械的分離手段、たとえばふるい、網、細かい格子あるいはフィルターなどを使用することによって、液体試料の検査前に取り除くことができる。このような分離方法は小試験管、測定セルあるいは測定容器と一緒に簡単に利用することができる。また相応の機械的分離手段を小試験管、測定セルあるいは測定容器に永続的にあるいは取り外し可能に取り付けることもできる。たとえば測定セル内に機械的分離手段を装置し、これによって酵素処理および／あるいは加水分解処理が行われる液体試料の領域と濁り測定に利用される液体試料の領域を分離することができる。この場合に測定セルに差し込まれている、あるいは集積されている混合装置とによって、濁りを生じさせる毛髪成分を均一に分布させることが合目的的である。
【００３０】
従って本発明による望ましい方法は、酵素処理および／あるいは化学処理によって分解されない毛髪成分を液体試料の検査前に除去すること、あるいは液体試料の検査中に隔離保持すること、および不分解毛髪成分が存在しない状態において液体試料の検査および評価を行うことを特徴とする。液体試料の測定および評価に対して使用する光透過容器（小試験管、測定セル、測定容器）はガラス製あるいは合成樹脂製であること、これに対して液体試料の温度を一定に保つための装置が補助的に装備されていることが望ましい。このような装置は、たとえば加熱薄片あるいは加熱水浴によって構成することができる。
【００３１】
毛髪の酵素処理および／あるいは化学処理後に得られる液体試料は光学的あるいは視覚的に検査され得る。検査は、たとえば肉眼によって、あるいは適当な物理的測定方法に基づいて適当な装置および薬剤を用いて実施することができる。
【００３２】
肉眼による検査は、たとえば毛髪試料を相応に処理することによって得られる液体試料を、損傷のない毛髪から得られる液体試料（比較値あるいは零値）と、望ましくは透過光において、比較することによって行うことができる。この方法は、特に、たとえば毛髪の損傷状態をとりあえず大まかに事前評価したい場合に、利用され得る。
【００３３】
物理的測定法による検査は、毛髪の損傷状態を正確に評価、測定することができるので、本発明においては望ましい。特に液体の検査および評価を濁り測定に基づいて行う方法が望ましい。この場合専門家において周知の、不溶懸濁成分を含む液体の測定に対して許容される光学的方法をすべて利用することができる。このような方法として、たとえば散乱光の測定、比濁分析（チンダル検査）、蛍光分析、透過光測定ないしは吸光度測定、混濁度測定（濁り測定）に基づく方法が挙げられる。本発明においては、得られる液体試料に対する濁り測定（混濁度測定）が好ましい。
【００３４】
物理的測定法に基づいて本発明を実施する場合に、専門家において周知の、市場において入手可能な装置および薬剤をすべて利用することができる。この場合特に光度計が考慮される。濁り測定は光度計ないしは濁度計を用いて行うことが好ましい。従って好ましい方法は、光度計を用いて問題の液体試料を濁りに関して検査および評価することを特徴とする方法である。毛髪の損傷状態は（合目的的に非損傷毛髪に基づく）比較値あるいは零値との比較において簡単に測定され得る。
【００３５】
本発明においては、毛髪の状態の検査および測定に対して濁度計を使用することも本発明の方法に含まれる。
【００３６】
毛髪の状態を濁り測定によって検査、評価および診断する場合、一般に通用する濁度単位を基本とする。濁度単位として、液体試料を透過する光線の減衰度の測定によってら求められる大きさ（ＦＡＵ、「ＦｏｒｍａｚｉｎｅＡｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ Ｕｎｉｔ」）、あるいは散乱光の強度測定によって求められる大きさ（ＦＮＵ、「Ｆｏｒｍａｚｉｎｅ ＮｅｐｅｌｏｍｅｔｒｉｃＵｎｉｔ」）のいずれかを用いることができる。ＦＮＵに基づいて求められる大きさがドイツの濁度単位「（ＴＥ／Ｆ）」に相当する。
【００３７】
液体試料の検査および評価は、本発明による方法に基づいて、毛髪試料の酵素処理および／あるいは化学処理の間および／あるいは後に行われる。酵素処理および／あるいは化学処理の間および／あるいは後の液体試料の検査および評価は、断続して間接的に、あるいは継続して直接的に（オンラインにおいて）行われる。断続的方法の場合は一定の時間間隔で液体試料の濁りが単独値において測定される。
【００３８】
液体試料における濁りないしは濁りの変化を継続して直接的に（オンラインで）追跡することができる連続的方法は、たとえばピペットによる採取作業を省くことができるので、時間を軽減できるという利点がある。さらに得られるデータを速動的に評価することも可能である。これによって本発明による方法はさらに時間短縮することができ、従って毛髪の状態の評価および診断を１０分以内に行うことが可能となる。本発明においてはこの連続的方法が好ましい。この方法はこれに適する装置を用いて実施することができる。装置は、濁り測定に用いられる光透過性反応容器（測定セル、小試験管、キュヴェット）を加熱するための加熱器、反応容器内に突き出た状態のあるいは反応容器に集積された状態の混合装置、この混合装置を駆動するための制御可能な駆動装置（望ましくは電気モータ）、並びに光度計によって構成することができる。
【００３９】
加熱は規則的熱制御装置（熱電対）を通して行うことが望ましく、加熱器は、たとえば加熱薄片によって構成することができる。この場合加熱薄片は反応容器と接合される。混合装置は光度計と立体的に連結される電気モータよって調整可能に駆動されることが望ましい。混合装置として攪拌器、あるいは射出器ないしは使い捨て射出器を用いることができる。これらの混合装置は測定セル内に、あるいは測定セル内に含まれている反応液の中に突き出している。攪拌器は相応の攪拌羽根を備えた回転子によって、あるいは刻み目を有する金属、ガラスあるいはプラスチック製の角棒あるいは丸棒、たとえばボーラーによって構成することができる。攪拌装置として磁気攪拌器を用いることもできる。この場合攪拌は反応液中に配置された攪拌体によって行われる。射出器の場合下端に格子、ふるいあるいは網を備えていることが望ましい。射出器の活栓子（Ｓｔｅｍｐｅｌ）あるいはピストンは往復運動によって毛髪試料ないしは液体試料を間断なく動かすことできる。これによって毛髪試料は反応液中において間断なく動かされ、毛髪試料の酵素処理および／あるいは化学処理が最適条件下に進行し得る。この場合射出器の間腔は毛髪試料の酵素処理および／あるいは化学処理の行われる反応反応空間である。活栓子の往復運動は制御電気モータによって行うことができる。図１ａ、図１ｂおよび図２は有用な装置を模式的に描かいたものである。
【００４０】
タンパク質分解反応が、反応液の混合強度によって左右され得ること、また攪拌器の速度ないしは混合装置の運動度によって左右され得ることは、専門家においては周知のことである。一般に本発明に基づく毛髪試料のタンパク質分解の速度および強度は混合装置の回転速度ないしは運転速度と共に上昇するということが前提とされる。何時間以内に一定の濁りを得るべきかによってこのパラメータは変えられる。攪拌羽根あるいは刻みを有する棒状攪拌器あるいは磁気攪拌の回転は、１００ないし１００００回転／分（ＵｐＭ）、望ましくは５００ないし５０００ＵｐＭ、特に望ましくは５００ないし２０００ＵｐＭの範囲にあることが合目的的であることが判っている。射出器形態の混合装置における活栓子あるいはピストンの往復運動は１０ないし５００、特に５０ないし２００である。
【００４１】
これに基づいて本発明の好ましい方法は、酵素処理および／あるいは化学処理の間、毛髪試料を補助的に機械的負荷下に置くことを特徴とする。
本発明による方法および、それに連結している装置で毛髪の状態の検査、評価および診断を完全に自動的に行う場合、液体試料の検査および評価を電子的手段を利用して実施することができる。従って本発明による方法は、液体試料の検査および／あるいは評価をコンピュータを用いてコンピュータ制御しながら実施する方法も対象とする。この目的に対して上記の光度計−装置は計算機、内部処理装置あるいは「パーソナル／コンピュータ」と連結することが望ましい。これによって濁り測定によって得られるデータを蓄積して、いつでも利用することができるようになる。
【００４２】
望ましい方法においては、濁り経過を図表に表示することができるように、あるいは数値を印刷することができるように、光度計に補助的に記録機あるいは印刷機を連結することができる。同様に、図表あるいは数値を得るために、直接読み取りが可能な画像機あるいは「ディスプレー」を光度計に連結することもできる。このようなデータは接続の計算機（コンピュータ）に蓄積され、たとえば比較値に対していつでも呼び出すことができ、これに接続されている印刷機を用いて随意印刷することができる。これに対しては、一般に用いられているコンピュータ、特に一般的なパーソナル／コンピュータ（ＰＣ）をすべて利用することができる。
【００４３】
従って液体試料の検査および評価をコンピュータおよび／あるいは記録機および／あるいは画像機（ディスプレー）および／あるいは印刷機を用いて行うことを特徴とする方法も本発明の対象である。
【００４４】
また、本発明による方法を実施するに当たっては、毛髪の状態の検査、評価および診断に対して、反応容器（たとえば測定セル、キュヴェットあるいは小試験管）を備えた光度計、光度計の反応容器を加熱するための加熱装置、反応容器内に突き出ているあるいは反応容器に集積されている混合装置、および混合装置駆動用の制御可能な駆動装置によって構成される装置を用意することが望ましい。
【００４５】
これに基づいて、反応容器およびアダプターあるいは支持装置を備えた光度計、反応容器加熱用加熱装置、反応容器内において液体試料を混合するための混合装置、および混合装置駆動用駆動装置によって構成される、ケラチン含有素材の状態を検査、評価および診断するための装置も本発明の対象である。反応容器内の温度を一定に保つために、加熱装置を熱電対と連結することができる。この場合加熱装置は加熱薄片の形態で提供することができる。この加熱薄片は、通常光度計の側に配置される反応容器用の、特にキュヴェットあるいは小試験管用のアダプターあるいは支持装置と一体化される。混合装置は活栓子あるいはピストンを備えた射出器、あるいは機械的、電気的あるいは磁気的駆動装置によって駆動および運転される攪拌器によって構成することができる。これとは別に混合装置は超音波発生装置によって構成することもできる。この場合混合は超音波によって行われる。
【００４６】
この装置は記録機、印刷機、画像機（ディスプレー）、計算機（コンピュータ）、内部処理装置、あるいはパーソナル・コンピュータ（ＰＣ）と機能的に連結されていることが望ましい。
【００４７】
実際に操作するに当たって、本発明による装置は移動可能なコンパクトな構造体として提供することが好ましい。特に計算機は携帯型であることが望ましい。これによって計算機は固定された光度計単位から離して、望ましくは記録機、印刷機あるいは画像表示機と接続した状態で、移動させながら利用することができる。
【００４８】
本発明の目的に対しては上記のような装置を使用することが望ましい。従って本発明は、本発明による方法において毛髪の状態を確認および診断するために上記の装置を使用することも対象とする。
【００４９】
本発明による方法を実施するに当たっては、これに適する装置とこれに必要な試薬を組み合せてひとつの単位として、あるいはひとつのキットとして提供することが合目的的である。このキットは、上記のような装置と、緩衝液、一個以上の酵素、および一個以上のタンパク質分解性あるいは加水分解性およびケラチン分解性および／あるいは還元性化学試薬の組み合わせによって構成することが望ましい。この組み合せ（キット）によれば、個々の要素すべてを統合できるという、また利用者が本方法を日常的に簡単に実施できるという、さらに再現可能な、比較可能な結果を得ることができるという利点がある。
【００５０】
従って緩衝液、一個以上の酵素、および／あるいは一個以上のタンパク質分解性あるいは加水分解性およびケラチン分解性および／あるいは還元性化学試薬を含む、毛髪の状態を検査、評価および診断するためのキットも、本発明の対象である。このキットには、比較値、空値あるいは零値として毛髪試料、たとえば美容処理の行われていない毛髪から成る毛髪試料、および／あるいは液体試料を補助的に加えることが合目的的である。また上に挙げられた要素の他に本発明に基づく装置もこのようなキットに含ませることができる。本発明による方法において毛髪の状態の確認および診断に対して上記のキットを使用することは望ましいことであり、従ってこれも本発明の対象である。
【００５１】
次ぎに実施例に基づいて本発明をさらに詳しく説明する。
実施例１：毛髪試料の酸化処理
酸化損傷度の異なる毛髪を製出するために、中央ヨーロッパ婦人の毛髪を色および密度に従って分類し、ひき揃えて、毛根部分および毛先部分のない毛束（それぞれ長さ１５．０ｃｍの毛髪３ｇ）を用意した。毛髪の酸化度およびそれぞれに対する化学処理を表１に示す。
【００５２】
【表１】
0004416101.tif 000002
【００５３】
この場合に、過酸化水素は漂白粉〔過硫酸アンモニウム５０．０％、ＮａＨＣＯ３２３．０％、珪酸ナトリウム２５．５％、ＳｉＯ２ （Ａｅｒｏｓｉｌ ３００、デグッサ）０．５％、ＥＤＴＡ １．０％〕と３：１で混合されている。
【００５４】
実施例２：毛髪試料のパーマネントウエーヴ処理
パーマネントウエーヴ処理による損傷度の異なる毛髪を製出するために、実施例１に記載されているのと同じ出所および同じ種類の毛髪束に対して、パーマネントウエーブ処理を一回、三回および六回実施した。毛髪束を十分湿らせ、吸収性あるナプキンで軽くたたいて拭き取り、９５ないし１００％の相対湿度下に一晩置いた。
この毛髪に、チオグリコール酸を８％（ｗ／ｖ）含有するパーマネントウエーブ処理液を、毛髪束の乾燥重量に対して１：１．２の割合で、均一に塗布した。この毛髪束をフォイル袋に入れ、乾燥器中４５℃において１５分間保持した。作用時間経過後、この毛髪束を３７℃の流温水下において５分間洗浄し、次いで固定液（３％のＨ２ Ｏ２ 溶液）に３分間浸した。次いで毛髪束を固定浴から取り出し、７分間置いた。最後に３７℃の温水で５分洗浄した後、４５℃において３０分間乾燥させた。三回および六回のパーマネントウエーブ処理に対しては、個々の処理の間に２４時間の間隔を置いて、上記の行程を繰り返し行った。
【００５５】
実施例３：非処理、風化毛髪試料
出発素材として、中央ヨーロッパ婦人の、通常の風化作用を受けた、未処理の褐色毛髪およびブロンド色毛髪を用いた。正確な評価を得るために、２０ｃｍ以上の長さを有する毛髪を使用した。毛髪は相応のタンパク質分解処理あるいは加水分解処理を行う直前に頭部から切り取った。毛根部分（未風化部分）と風化作用を受けた毛先部分の比較を行った。
【００５６】
実施例４：濁り度の測定
濁り度の測定に対して、反応液（液体試料）からたんぱく質分解処理毛髪を含む混合物を１．０ｍｌ採取し、Ｎｅｐｈｌａ ＬＰＧ ２３型濁度計（ドクター・ブルーノ・ランゲ有限会社、ベルリン）においてキュヴェットアダプターおよびガラスキュヴェット（１１ｍｍ）を用いて測定した。この場合にガラスキュヴェットは耐久性目盛り検定に合格しており、その精密度は基準点１０ＦＮＵ（ＴＥ／Ｆ）において＜２％である。次いで検査済み試料を次ぎの測定のために直ちに反応液（ガラスキュヴェット、測定セル）中に戻した。空値として、還元剤（Ｌ−システイン、ＤＴＴあるいはＤＴＥ）および酵素（パパイン、プロナーゼＥあるいはプロテイナーゼＫ）を含有する緩衝液（５０ｍＭの燐酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．５）１．０ｍｌを、毛髪を含有しない状態で、測定した。キュヴェット（測定セル）を備えた濁度計を用いて温度が＜６０℃（反応液の温度）になるまで濁り度の測定を行った。濁り度はドイツ工業規格に基づいて、選択的にＦＮＵ、ＴＥ／Ｆあるいはｍｇ／ｌ ＳｉＯ２ において、表示した。これは実施例５に記載の装置に対しても適用される。
【００５７】
実施例５：濁り度の直接的連続測定用装置
毛髪試料のタンパク質分解分析を継続して直接的に（オンライン）行うために、実施例４に記載の濁度計を改造して、熱制御装置を備えた加熱薄片および攪拌ユニットを取り付けた。このために１１ｍｍの円形キュヴェットに対するキュヴェットアダプターの壁に加熱薄片（テレメータ・エレクトロニック有限会社のＨＲ ５３７７Ｒ１７．５Ｌ １２Ａ）および熱電対（ＲＳコンポーネンツ有限会社のＲＳ ２１９−４７１９）を取り付け、これを制御器（ＣＡＬコントロールス社のＣＡＬ ３２００）によって制御した。攪拌ユニットはキュヴェット内に突き出る攪拌器（直径１．５ｍｍの木製ボーラー）およびこの攪拌器を駆動するための電気モータ（ＳＰ．Ｊ．シュベルター有限会社のＳＰ ２００ ＥＣ ３−５Ｖ ＤＣ）によって構成した。制御器および電気モータは低電圧用に設計されており、変圧器によって管理した。図１ａおよび１ｂはこのような装置を模式的に表したものであり、図２は別の装置の例である。
【００５８】
実施例６：毛髪試料の標準化
タンパク質分解検査において検査すべき毛髪試料に対する基準初期条件を作るために、実質的酵素処理の前に毛髪を１％のＳＤＳを用いて２時間普通に洗浄し、次いで蒸留水を用いて丁寧に洗浄し、乾燥器中３７℃において１２時間乾燥させた。
【００５９】
実施例７：一回および三回酸化毛髪試料のパパインによるタンパク質分解
パパインはエステラーゼ活性およびトランスアミナーゼ活性を有するＣａｒｉｃａ ｐａｐａｙａから得られる非特異性エンドペプチダーゼ（チオールプロテアーゼ）である。最適温度は５０℃、最適ｐＨは６．０ないし７．０（ＥＣ３．４．２２．２）である。この酵素はボエーリンガー・マンハイム社（製造番号１６９３３３７９）から懸濁液（１０ｍｇ／ｍｌ）の形態で提供されている。
長さ１．０ｃｍの、（実施例１に記載の）非酸化毛髪、一回酸化毛髪および三回酸化毛髪それぞれ５０．０ｍｇを、パパインを用いて処理する前に、密閉可能なガラス試験管内において、燐酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ６．５）５．０ｍｌ中、４５℃において１時間懸濁ないしは予備膨潤させた。毛髪のジスルヒッド架橋の還元およびプロテアーゼの活性化のために、Ｌ−システイン（０．７４ｍｇ／ｍｌ）、メタ重亜硫酸ナトリウム（Ｎａ２ Ｓ２ Ｏ５ 、７．０ｍｇ／ｍｌ）および亜硫酸ナトリウム( Ｎａ２ ＳＯ３ 、３．０ｍｇ／ｍｌ) を添加した。パパイン１００μｌ（２１．６Ｕ）を懸濁液（１０ｍｇ／ｍｌ）に添加した後、Ｎｅｐｈｌａ ＬＰＧ ２３型濁度計（実施例４）を用いて濁りを測定した。反応は４５℃において攪拌しながら（磁気攪拌器、６００ＵｐＭ）実施した。空値に対して、パパイン以外の還元剤を含有する緩衝液中において毛髪試料を処理した。その都度一回測定を行った。
この実施例および他の実施例において使用した試薬のＬ−システイン、メタ重亜硫酸ナトリウムおよび亜硫酸ナトリウムはシグマ社（ダイゼンホーヘン）製である。
図３はこれによって得られた結果を表している。二つの酸化度の間で濁りの増大度に差があることが明白である。４０分後にはすべての酸化度において相互の間に濁り挙動に差異が認められた。非酸化毛髪の濁りは非常にわずかしか増大しない。他方２０分後には三回酸化の毛髪の濁りが、一回酸化の毛髪の場合に比べて、大きく増大することが認められる。空値に関しては濁りの増大がまったく認められない。従って濁り作用が毛髪の状態ないしは毛髪の損傷度に依存し、それらが相関関係にあることが判る。
【００６０】
実施例８：七回までの酸化毛髪試料のパパインによるタンパク質分解
実施例１に示されている、七つの異なった酸化度を有する毛髪試料の濁りを実施例７と同様に検査した。ただしこの場合は反応速度を高めるために、実施例７よりも短い、長さ０．５ｃｍの毛髪試料をそれぞれ５０ｍｇ用いた。
図４はこの検査によって得られた結果を表している。酸化度の異なる毛髪試料は２０分後差異を現し、酸化度に応じて濁り度の上昇が認められた。濁り挙動が毛髪の状態ないしは毛髪の損傷度に依存すること、すなわちそれらが互いに相関していることが判る。
【００６１】
実施例９：一回、二回および三回酸化毛髪試料のプロナーゼＥによるタンパク質分解
プロナーゼＥはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓから得られるエンドプロテアーゼおよびエキソプロテアーゼから成る非特異性酵素混合物である。最適温度は３５ないし４０℃、最適ｐＨは６．０ないし７．５（ＥＣ ３．４２４．４ｋ）であった。使用したシグマ社（ダイゼンホーヘン）の製品は５．３Ｕ／ｍｇの比活性度を示した。
実施例７および８と同様に、長さ１．０ｃｍの、（実施例１に示されている）非酸化、一回酸化、二回酸化および三回酸化毛髪試料それぞれ５０．０ｍg を、プロナーゼＥで処理する前に、密閉可能なガラス試験管内において燐酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．５）あるいは選択的にトリス／ＨＣｌ−緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．５）全量５．０ｍｌ中、３７℃において１時間懸濁ないしは予備膨潤させた。プロナーゼＥ（１０．６ないしは２１．２Ｕ）を２．０ｍｇ（あるいは４．０ｍg ）添加した後、攪拌しながら（磁気攪拌器、６００ＵｐＭ）ガラス試験管を水浴中において３７℃に保温し、Ｎｅｐｈｌａ ＬＰＧ ２３型濁度計（実施例４）にを用いて、実施例７および８と同様に、濁りを測定した。この場合も毛髪の状態（毛髪の損傷度）の差によって濁りに差異が生じることがはっきり認められた。
高濃度のプロナーゼＥ（４．０ｍｇ、２１．２Ｕに相当）を使用した場合、毛髪試料の分解が加速された。
【００６２】
実施例１０：一回、二回および三回酸化毛髪試料のプロテイナーゼＫによるタンパク質分解
プロテイナーゼＫはＴｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ ａｌｂｕｍから得られるセリン・エンドペプチダーゼである。これはペプチド結合を、特にＮ−置換基を有する疎水性の脂肪族および芳香族アミノ酸のカルボキシル基に関して、加水分解する。使用のプロテイナーゼＫ（メルク社、ダルムシュッタト）の最適温度範囲は２５ないし３５℃であり、最適ｐＨ−値は６．５ないし７．５（ＥＣ ３．４．２１．１４ｄ）であった。懸濁プロテイナーゼＫに対する酵素活性度は６００Ｕ／ｍｌであった。このプロテアーゼを活性化するために、補助的にＣａ２＋を添加する必要があった（ＢＡＪＯＲＡＴＨ、Ｊ．等、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７６：４４１、１９８８）。
前記の実施例と同様に、長さ０．５ｃｍの、（実施例１に示されている）非酸化、一回酸化、二回酸化および三回酸化毛髪試料それぞれ５０．０ｍｇを、プロテイナーゼＫで処理する前に、密閉可能はガラス試験管内において、２ＭのＣａ２＋を含有する５０ｍＭのトリス／ＨＣｌ５．０ｍｌ中、２５℃において１時間懸濁ないしは予備膨潤させた。プロテイナーゼＫ（４２．２Ｕ）を７１μｌ添加した後、攪拌しながら（磁気攪拌器、６００ＵｐＭ）ガラス試験管を水浴中において２５℃に保温し、Ｎｅｐｈｌａ ＬＰＧ ２３型濁度計（実施例４）にを用いて、前記の実施例と同様に、濁りを測定した。この場合も毛髪の状態（毛髪の損傷度）の差によって濁りに差異が生じることがはっきり認められた。
【００６３】
実施例１１：一回、三回および六回パーマネントウエーブ処理した毛髪試料のパパインによるタンパク質分解
実施例２に示されている、パーマネントウエーブ処理度の異なる毛髪に対して、実施例７ないし１０と同様に、パパインを用いてタンパク質分解処理を行い、毛髪の状態ないしは毛髪の損傷度を診断するために濁りの増大度を求めた。この場合は長さ０．５ｃｍの毛髪を５０ｍｇ使用した。
図５はその都度一回測定を行って得た結果をグラフに表したものである。毛髪のパーマネントウエーブ処理度の相違に対応して濁りに差が生じることが、すなわち濁りと毛髪の状態（毛髪の損傷度）が相関していることがはっきりと確認される。またパーマネントウエーブ処理によって生じる損傷は、酸化処理によって生じる損傷よりも小さいことが判る。
【００６４】
実施例１２：暗褐色およびブロンド色の、未処理の、風化および未風化毛髪試料に対するタンパク質分解の比較
風化による損傷度を検査するために、毛根部分および毛先部分の毛髪試料について濁りの度合いを比較した。さらに毛髪の色ないしは酵素分解によって生じる色素、暗褐色の毛髪の場合はオイメラニン、ブロンド色の毛髪の場合はフェオメラニンが濁りに与える影響を調べるために、暗褐色の毛髪およびブロンド色の毛髪を使用した。検査は、両方の毛髪の種類に対してそれぞれ毛根部分および毛先部分から採取した長さ０．５ｃｍの毛髪試料５０．０ｍｇを使用して、実施例７と同様に、行った。その都度一回測定を行った。図８の（８ａ）−暗褐色の毛髪−および（８ｂ）−ブロンド色の毛髪−はこれによって得られた結果を図示したものである。 曲線の経過から、未風化の毛髪（毛根部分）に比べて、風化毛髪（毛先部分）は容易にタンパク質分解すること、従ってより強い濁りが生じることが確認され得る。両方の毛髪の種類において１０分後にすでに相違が認められる。また毛髪の色および毛髪の太さは濁り測定には影響しないことが判る。
美容処理毛髪（酸化処理毛髪およびパーマネントウエーブ処理毛髪）による検査との比較から、風化毛髪のタンパク質分解は美容処理毛髪の場合よりも緩慢に進行することが、確認された。このことから、風化による損傷は主に小皮に限られるのに対して、美容処理の場合皮質にも構造変化が生じると、推論される（ＲＯＢＢＩＮＳ、Ｃ．Ｒ．＆ＢＡＨＬ、Ｍ．Ｊ．、Ｊ．Ｓｏｃ．Ｃｏｓｍｅｔ．Ｃｈｅｍ．３５：３７９、１９８４）。
【００６５】
実施例１３：異なる毛髪試料における検査結果の比較
未処理（自然風化）, 酸化処理およびパーマネントウエーブ処理毛髪、並びに暗褐色およびブロンド色毛髪から成る毛髪試料に対して検査を行い、それに基づいて得られる濁りの値を比較した。濁りの値はすべて、毛髪５０ｍｇを、パパイン（２１．２Ｕ）１００μｌ；５０ｍＭの燐酸ナトリウム緩衝液５．０ｍｌ（ｐＨ６．５）、Ｌ−システイン０．７４ｍｇ／ｍｌ、Ｎａ２ Ｓ２ Ｏ５ ７．０ｍｇ／ｍｌ、Ｎａ２ ＳＯ３ ３．０ｍｇ／ｍｌ、４５℃、攪拌速度（磁気攪拌器）６００ＵｐＭにおいて３０分間保持した後に測定したものである。毛髪試料の長さはＮｏ．６以外すべて０．５ｃｍである。Ｎｏ．６の毛髪試料の長さは１．０ｃｍである。試験条件および反応条件はすべて実施例７と同じである。表２は種類の異なる毛髪試料それぞれに対して得られた濁りの値を表したものである。毛先部分あるいは毛根部分から切り取った毛髪を風化あるいは未風化毛髪として用いた。パーセント表示は実施例１に記載の酸化処理において使用したＨ２ Ｏ２ の濃度を表している。
【００６６】
【表２】
0004416101.tif 000003
【００６７】
毛根部分の毛髪試料は損傷度が最も小さいことを示している。暗褐色およびブロンド色の風化を受けた毛先部分（ＴＥ／Ｆ＝６０）は、被処理毛髪に対する比較対象として挙げられているＮｏ．３の暗褐色の毛髪束（ＴＥ／Ｆ＝５０）に比べて、わずかであるが損傷度が大きい。パーマネントウエーブ処理毛髪は、酸化処理毛髪に比べて、損傷度が小さいことが判る。すなわち損傷度において、３回パーマネントウエーブ処理した毛髪（Ｎｏ．９）と２回酸化処理した毛髪（Ｎｏ．１０）が同等である。また３回の強漂白処理（９％Ｈ２ Ｏ２ ）毛髪と３回の弱漂白処理（６％Ｈ２ Ｏ２）毛髪の間に違いがあることが（ＴＥ／Ｆ＝４３０ないし２４０）明白である。
【００６８】
実施例１４：最適タンパク質分解
前記実施例との対比において、毛髪試料は長さ０．３ｃｍに切断し、処理はパパイン５００μｌ（１０８Ｕ）を用いて行った。毛髪試料として非酸化、１回酸化および３回酸化毛髪試料を使用した。酸化は実施例１に従って行った。試験条件および反応条件は実施例７と同じである。図６はこれによって得られた結果を図示したものである。パパインの含有量が１０８Ｕに高められたこと、および毛髪の長さが１．０ないし０．５ｃｍから０．３ｃｍに縮小されたことによって、タンパク質分解がさらに加速され、１０分後には毛髪の損傷度の違いを識別することができた。
【００６９】
実施例１５：酸化毛髪試料のタンパク質分解に対する直接的、連続的濁り測定
長さ０．１ｃｍの、非酸化、１回−酸化および３回酸化毛髪５．０ｍｇをそれぞれ１０ｍｍのガラスキュヴェット内において５０ｍＭの燐酸ナトリウム緩衝液３．０ｍｌ（ｐＨ６．２）に懸濁させた。毛髪のジスルヒド架橋の還元およびプロテアーゼの活性化のために、ＤＴＥ（シグマ社、ダイゼンホーヘン）１０．０ｍｇ／ｍｌを加えた。反応温度が５０℃に達した時点で懸濁液（１０ｍｇ／ｍｌ）にパパイン１００μｌ（２１．２Ｕ）を添加し、実施例５ に記載の改造光度計を用いて濁りを継続して直接測定した。反応および測定は攪拌下に（１ｍｍのボーラー、１０００ＵｐＭ）行った。図７は検査毛髪に対して得られた経過曲線である。１０分以内にすでに毛髪試料間にはっきりと差異を認めることができる。
【００７０】
実施例１６：濁り測定の再現性
濁り測定の再現性を、二つの非酸化毛髪試料および二つの３回酸化毛髪試料（実施例１）を用いて同一条件下において調べた。検査および測定は実施例７に従って行った。そしてそれぞれ二回測定の平均値を求めた。この結果、二回測定における誤差は５％以下であることが確認された。
【００７１】
実施例１７：毛髪試料のタンパク質分解における濁り作用に対する還元剤の影響
プロテアーゼであるパパインの活性化に対して還元剤、たとえば亜硫酸塩あるいはＬ−システインが使用されている。この場合亜流酸塩およびＬ−システインは毛髪内に浸透、拡散し、ジスルヒド架橋を還元する。Ｌ−システインおよび亜硫酸が存在することによって、いわゆる「Ｂｕｎｔｅ Ｓａｌｚ」（雑色塩）が形成される（ＣＬＡＲＫ、Ｈ．Ｔ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、９７：２３５、１９３２）。三次元構造におけるこの変化が毛髪のタンパク質分解にどのような影響を及ぼすか、あるいはタンパク質分解を加速するかどうか、調べた。このために非酸化および３回酸化毛髪試料（それぞれ長さ０．５ｃｍ、５０．０ｍｇ）に対してそれぞれＬ−システイン（０．７４ｍｇ／ｍｌ）と一緒に亜流酸塩を実施例において使用の量（メタ重亜硫酸ナトリウム（Ｎａ２ Ｓ２ Ｏ５ ）７．０ｍｇ／ｍｌ、亜硫酸ナトリウム（Ｎａ２ ＳＯ３ ）３．０ｍｇ／ｍｌ）添加した（溶液Ａ）。他方においてはＬ−システインだけを添加した（濃度１０．６８ｍｇ／ｍｌ）（溶液Ｂ）。反応空間（浸液）、パパインおよび燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）の量、温度および攪拌速度は実施例７と同じである。溶液Ａと亜硫酸を含まない溶液Ｂの間には実質的な違いは認められない。
【００７２】
実施例１８ないし７７：毛髪試料に対するパパインによる種々の酵素処理／化学処理
以下の実施例において毛髪試料のタンパク質分解を全容量（浸液）３．０ｍｌにおいて行った。毛髪処理（酸化処理、パーマネントウエーブ処理、風化処理）は実施例１、２および３に従って実施した。分解は実施例６および７に記載の方法に従って行った。
【００７３】
【表３】
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【００７４】
【表４】
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【００７５】
【表５】
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【００７６】
【表６】
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【００７７】
【表７】
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【図面の簡単な説明】
【図１ａ】 図１ａは、光度計と組み合わされた、毛髪試料の濁りを直接的に測定するための（オンライン）装置を表している。
【図１ｂ】 図１ｂは、光度計と組み合わされた、毛髪試料の濁りを直接的に測定するための（オンライン）装置を表している。図１ａおよび１ｂにおいて、ａ＝電気モータ、ｂ＝ガラスキュヴェット用アダプター、ｃ＝ガラスキュヴェット、ｄ＝アルミニウムブロック、ｅ＝差し込み接合子、ｆ＝差し込み接続、ｇ＝攪拌器、ｈ＝加熱薄片である。
【図２】 図２は、光度計と組み合わされた、毛髪試料の濁りを直接的に測定するための別の（オンライン）装置を表している。この場合、ａ＝電気モータ、ｂ＝使い捨て射出器、ｃ＝活栓子、ｄ＝ガラスキュヴェット用アダプター、ｅ＝ガラスキュヴェット、ｆ＝アルミニウムブロック、ｇ＝差し込み接合子、ｈ＝差し込み接続、ｉ＝反応室、ｋ＝格子、ｍ＝加熱薄片である。
【図３】 図３は、酸化度の異なる二個の毛髪試料のタンパク質分解に対する、光度計による濁り測定の結果を表している。１＝空値、非酸化毛髪、２＝非酸化毛髪、３＝１回−酸化毛髪、４＝３回−酸化毛髪。試験条件：毛髪（長さ１．０ｃｍ）５０ｍｇ、パパイン（２１．２Ｕ）１００μｌ、５０ｍＭの燐酸ナトリウム緩衝液５．０ｍｌ、ｐＨ６．５（反応空間、浸液）、Ｌ−システイン０．７４ｍｇ／ｍｌ、Ｎａ２ Ｓ２ Ｏ５ ７．０ｍｇ／ｍｌ、Ｎａ２ ＳＯ３ ３．０ｍｇ／ｍｌ、４５℃、攪拌速度６００ＵｐＭ（磁気攪拌器）。それぞれ１回測定の結果が描かれている。
【図４】 図４は、酸化度の異なる七個の毛髪試料のタンパク質分解に対する、光度計による濁り測定の結果を表している。１＝１回−、２＝２回−、３＝３回−、４＝４回−、５＝５回−、６＝６回−、および７＝７回−酸化毛髪。試験条件は、毛髪の長さが０．５ｃｍである以外、図３の場合と同じである。それぞれ１回測定の結果が描かれている。
【図５】 図５は、パーマネントウエーヴ処理回数の異なる毛髪試料のタンパク質分解に対する、光度計による濁り測定の結果を表している。１＝１回−、２＝３回−、および３＝６回−パーマネントウエーヴ処理した毛髪。試験条件は、毛髪の長さが０．５ｃｍである以外、図３の場合と同じである。それぞれ１回測定の結果が描かれている。
【図６】 図６は、酸化度の異なる毛髪試料に対する最適のタンパク質分解を表したものである。１＝非酸化毛髪、２＝１回−酸化毛髪、３＝３回−酸化毛髪。試験条件は、毛髪の長さが０．３ｃｍであり、パパイン（１０８Ｕ）を５００μｌ使用する以外、図３の場合と同じである。それぞれ１回測定の結果が描かれている。
【図７】 図７は、酸化毛髪試料のタンパク質分解における濁りを継続して直接的に（オンライン）測定した結果を表している。１＝非酸化毛髪、２＝１回−酸化毛髪、３＝２回−酸化毛髪、４＝３回−酸化毛髪。試験条件：毛髪（長さ０．１ｃｍ）５．０ｍｇ、パパイン（２１．２Ｕ）１００μｌ、５０ｍＭの燐酸ナトリウム緩衝液３．０ｍｌ、ｐＨ６．２（反応空間、浸液）、ＤＴＥ１０ｍｇ／ｍｌ、５０℃、攪拌器の回転数１０００ＵｐＭ（磁気攪拌器）。
【図８】 図８は、暗褐色の毛髪およびブロンド色の毛髪から成る、風化および未風化毛髪試料のタンパク質分解度を比較したものである。（８ａ）が暗褐色の毛髪であり、１＝毛根部分、２＝毛先部分、（８ｂ）がブロンド色の毛髪であり、１＝毛根部分、２＝毛先部分。（８ａ）および（８ｂ）に対する試験条件：毛髪（長さ０．５ｃｍ）５０．０ｍｇ、パパイン（２１．２Ｕ）１００μｌ、５０ｍＭの燐酸ナトリウム緩衝液５．０ｍｌ、ｐＨ６．５（反応空間、浸液）、Ｌ−システイン０．７４ｍｇ／ｍｌ、Ｎａ２ Ｓ２ Ｏ５ ７．０ｍｇ／ｍｌ、Ｎａ２ ＳＯ３ ３．０ｍｇ／ｍｌ、４５℃、攪拌速度６００ＵｐＭ（磁気攪拌器）。それぞれ１回測定の結果が描かれている。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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