(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
単一全血試料から自家移植生体接着性シーラントを製造する方法であって、
前記全血試料から不活性な血小板の豊富な血漿を形成すること、
前記不活性な血小板の豊富な血漿を第１および第２の部分に分けること、
前記不活性な血小板の豊富な血漿の前記第１の部分を再活性化させて血塊を形成すること、
前記血塊を粉砕して自家移植トロンビンを含む血清を得ること、および
前記血清を前記不活性な血小板の豊富な血漿の前記第２部分と混合することを含む方法。
【請求項２】
前記血小板の豊富な血漿がクエン酸ナトリウムを含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記不活性な血小板の豊富な血漿がヘパリンを含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記再活性化がカルシウムイオンの添加によって起こる請求項２に記載の方法。
【請求項５】
再活性化がヘパリナーゼの添加によって起こる請求項３に記載の方法。
【請求項６】
全血の、３．８％クエン酸ナトリウム溶液に対する比９：１で前記全血を採血して、クエン酸処理した血液混合液を形成すること、および
前記クエン酸処理した血液混合液を遠心処理してクエン酸ナトリウムを含む血小板の豊富な血漿を形成すること
によって、クエン酸ナトリウムを含む前記血小板の豊富な血漿を形成させる請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記血小板の豊富な血漿を、前記自家移植生体接着性シーラントを適用することになる個人より入手する請求項１に記載の方法。
【請求項８】
メッシュを通して前記血塊を絞ることにより前記血清から前記血塊を分離することが前記粉砕に含まれる請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記粉砕が前記血清から前記血塊を分離するための高速遠心処理を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
さらに前記血清と前記血小板の豊富な血漿の前記第２部分の前記混合の間にカルシウムイオンを加えることを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記血清および前記血小板の豊富な血漿の前記第２部分を、血清の血小板の豊富な血漿に対する比１：４で混合する請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記血清および前記血小板の豊富な血漿の前記第２部分を、血清の血小板の豊富な血漿に対する比１：２で混合する請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記血清および前記血小板の豊富な血漿の前記第２部分を、血清の血小板の豊富な血漿に対する比３：４で混合する請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
単一全血試料から自家移植生体接着性シーラントを製造する方法であって、
前記全血試料から不活性な血小板の豊富な血漿および不活性な血小板の乏しい血漿を形成すること、
前記不活性な血小板の豊富な血漿を再活性化させて血塊を形成すること、
前記血塊を粉砕して自家移植トロンビンを含む血清を得ること、および
前記血清を前記血小板の乏しい血漿と混合すること
を含む方法。
【請求項１５】
前記血小板の豊富な血漿および前記血小板の乏しい血漿がそれぞれクエン酸ナトリウムを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記再活性化がカルシウムイオンの添加で起こる請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記血小板の豊富な血漿および前記血小板の乏しい血漿がそれぞれヘパリンを含む請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記再活性化がヘパリナーゼの添加で起こる請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
クエン酸ナトリウムを含む前記血小板の豊富な血漿および前記血小板の乏しい血漿を、
全血の、３．８％クエン酸ナトリウム溶液に対する比９：１で前記全血を採血して、クエン酸処理血液混合液を形成すること、および
クエン酸処理血液混合液を遠心処理して、それぞれクエン酸ナトリウムを含む血小板の豊富な血漿および血小板の乏しい血漿を形成すること
によって形成する請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記全血を、前記自家移植生体接着性シーラントを適用することになる個人から入手する請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
メッシュを通して前記血塊を絞ることにより前記血清から前記血塊を分離することが前記粉砕に含まれる請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
前記粉砕が、高速遠心処理によって前記血清から前記血塊を分離することを含む請求項１４に記載の方法。
【請求項２３】
前記血清および前記血小板の乏しい血漿を、血清の血小板の乏しい血漿に対する比１：４で混合する請求項１４に記載の方法。
【請求項２４】
前記血清および前記血小板の乏しい血漿を、血清の血小板の乏しい血漿に対する比１：２で混合する請求項１４に記載の方法。
【請求項２５】
前記血清および前記血小板の乏しい血漿を、血清の血小板の乏しい血漿に対する比３：４で混合する請求項１４に記載の方法。
【請求項２６】
単一全血試料から自家移植生体接着性シーラントを製造する方法であって、
前記全血試料から不活性な血小板の乏しい血漿を形成すること、
前記不活性な血小板乏しい血漿を第１および第２部分に分けること、
前記不活性な血小板の乏しい血漿の前記第１部分を再活性化させて血塊を形成すること、
前記血塊を粉砕して自家移植トロンビンを含む血清を得ること、および
前記血清を前記不活性な血小板の乏しい血漿の前記第２部分と混合することを含む方法。
【請求項２７】
前記血小板の乏しい血漿がクエン酸ナトリウムを含む請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
前記再活性化がカルシウムイオンの添加で起こる請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記血小板の乏しい血漿がヘパリンを含む請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記再活性化がヘパリナーゼの添加で起こる請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
クエン酸ナトリウムを含む前記血小板の乏しい血漿を、全血の、３．８％クエン酸ナトリウム溶液に対する比９：１で前記全血を採血して、クエン酸処理血液混合液を形成すること、および
クエン酸処理血液混合液を遠心処理してクエン酸ナトリウムを含む血小板の乏しい血漿を形成すること
によって形成する請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記全血試料を、前記自家移植生体接着性シーラントを適用することになる個人から入手する請求項２６に記載の方法。
【請求項３３】
メッシュを通して前記血塊を絞ることにより前記血清から前記血塊を分離することが前記粉砕に含まれる請求項２６に記載の方法。
【請求項３４】
前記粉砕が、高速遠心処理によって前記血清から前記血塊を分離することを含む請求項２６に記載の方法。
【請求項３５】
前記血清および前記血小板の乏しい血漿の前記第２部分を、血清の血小板の乏しい血漿に対する比１：４で混合する請求項２６に記載の方法。
【請求項３６】
前記血清および前記血小板の乏しい血漿の前記第２部分を、血清の血小板の乏しい血漿に対する比１：２で混合する請求項２６に記載の方法。
【請求項３７】
前記血清および前記血小板の乏しい血漿の前記第２部分を、血清の血小板の乏しい血漿に対する比３：４で混合する請求項２６に記載の方法。
【請求項３８】
単一全血試料から自家移植生体接着性シーラントを製造する方法であって、
前記全血試料から不活性な血小板の豊富な血漿および不活性な血小板の乏しい血漿を形成すること、
前記不活性な血小板の乏しい血漿を再活性化させて血塊を形成すること、
前記血塊を粉砕して自家移植トロンビンを含む血清を得ること、および
前記血清を前記血小板の豊富な血漿と混合すること
を含む方法。
【請求項３９】
前記血小板の豊富な血漿および前記血小板の乏しい血漿がそれぞれクエン酸ナトリウムを含む請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記再活性化がカルシウムイオンの添加で起こる請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記血小板の豊富な血漿および前記血小板の乏しい血漿がそれぞれヘパリンを含む請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記再活性化がヘパリナーゼの添加で起こる請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
クエン酸ナトリウムを含む前記血小板の豊富な血漿および前記血小板の乏しい血漿を、
全血の、３．８％クエン酸ナトリウム溶液に対する比９：１で前記全血を採血してクエン酸処理血液混合液を形成すること、および
クエン酸処理血液混合液を遠心処理して、それぞれクエン酸ナトリウムを含む血小板の豊富な血漿および血小板の乏しい血漿を形成すること
によって形成する請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
前記全血を、前記自家移植生体接着性シーラントを適用することになる個人から入手する請求項３８に記載の方法。
【請求項４５】
メッシュを通して前記血塊を絞ることによって前記血清から前記血塊を分離することが前記粉砕に含まれる請求項３８に記載の方法。
【請求項４６】
前記粉砕が、高速遠心処理によって前記血清から前記血塊を分離することを含む請求項３８に記載の方法。
【請求項４７】
前記血清および前記血小板の豊富な血漿を、血清の血小板の豊富な血漿に対する比１：４で混合する請求項３８に記載の方法。
【請求項４８】
前記血清および前記血小板の豊富な血漿を、血清の血小板の豊富な血漿に対する比１：２で混合する請求項３８に記載の方法。
【請求項４９】
前記血清および前記血小板の豊富な血漿を、血清の血小板の豊富な血漿に対する比３：４で混合する請求項３８に記載の方法。
【請求項５０】
単一全血試料から自家移植生体接着性シーラントを製造する方法であって、
前記全血試料から不活性な血小板の豊富な血漿を形成すること、
前記不活性な血小板の豊富な血漿を第１および第２部分に分けること、
前記第１の血小板の豊富な血漿部分にヒト組換え体トロンボプラスチンを加えてトロンビンを製造すること、および
前記トロンビンを前記第２の不活性な血小板の豊富な血漿部分と混合することを含む方法。
【請求項５１】
前記全血試料を、前記自家移植生体接着性シーラントを適用することになる個人から入手する請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
自家移植トロンビン組成物の調整方法であって、
単一のドナーから不活性な血漿を入手すること、
前記不活性な血漿を再活性化させ、それによって血塊を形成して、トロンビンを含む血清を生成すること、および
前記血清から前記血塊を分離して、前記自家移植トロンビンを入手することを含む方法。
【請求項５３】
前記不活性な血漿が血小板の豊富な血漿である請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記不活性な血漿が血小板の乏しい血漿である請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記不活性な血漿がクエン酸ナトリウムを含む請求項５２に記載の方法。
【請求項５６】
前記再活性化がカルシウムイオンの添加によって起こる請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記不活性な血漿がヘパリンを含む請求項５２に記載の方法。
【請求項５８】
前記再活性化がヘパリナーゼの添加によって起こる請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記生体接着性シーラントが、前記血清を前記不活性な血小板の豊富な血漿と２分間以内で混合することにより製造されてなる請求項１に記載の方法。
【請求項６０】
前記生体接着性シーラントが、前記血清を前記不活性な血小板の乏しい血漿と２分間以内で混合することにより製造されてなる請求項１４に記載の方法。
【請求項６１】
前記生体接着性シーラントが、前記血清を前記不活性な血小板の乏しい血漿と２分間以内で混合することにより製造されてなる請求項２６に記載の方法。
【請求項６２】
前記生体接着性シーラントが、前記血清を前記不活性な血小板の豊富な血漿と２分間以内で混合することにより製造されてなる請求項３８に記載の方法。
【請求項６３】
単一全血試料から自家移植生体接着性シーラントを形成する方法であって、
前記全血試料から不活性な血小板の豊富な血漿を形成すること、
前記不活性な血小板の豊富な血漿を第１および第２の部分に分けること、
前記不活性な血小板の豊富な血漿の前記第１の部分を再活性化させて血塊を形成すること、
前記血塊を粉砕して自家移植トロンビンを含む血清を得ること、および
前記血清を前記不活性な血小板の豊富な血漿の前記第２の部分と、血清の血小板の豊富な血漿に対する比３：４で混合して、前記生体接着性シーラントを３０秒で形成させること
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連特許出願の他所参照）
本願は、１９９６年４月３０日に申請した、名称、自家移植フィブリンシーラントの作成方法である米国特許第０８／６４０，２７８号の一部継続出願である。
【０００２】
（技術分野）
本発明は自家移植生体接着性シーラント組成物に関し、さらにとりわけ、特に生体接着性シーラントを適用することになる患者由来の血液成分から生体接着性シーラントを調製するための簡便で実用的な２相の方法に関する。
【０００３】
（背景技術）
血管の内層が損傷したとき、複合的な連続した事象が起こり、血液の損失を防ぎ、最終的に血管を元の状態に戻す。短期間の血管収縮および血管壁上の噴出した血液の圧力などの身体因子が止血に何らかの役割を果たしている可能性があるが、止血機構の主要な因子は血小板および血液凝固系である。
【０００４】
血液凝固は、図１に示されるようにカスケードを通したいくつかの血液凝固因子タンパク質の複合相互作用の結果である。一般的に、血管内皮に対する損傷は、血小板を引き寄せ、それらを可逆的に集合するよう誘導する内皮下構造を露出する。凝固経路が活性化されている間に形成されるタンパク質トロンビンは、タンパク質フィブリンの不溶性の交差結合フィブリルを生成し、血小板の可逆的な集合を引き起こす。結果として得られた血小板−フィブリン血塊（clot）は血管系からの血液の損失に対する効果的な保護であり、また続く血管の内層の修復に対する足場として役に立つ。
【０００５】
生体接着性シーラントまたはフィブリン接着剤は、血液凝固の最終段階の生物学的工程を繰り返す比較的新しい技術進歩である。臨床的な報告は、例えば心臓血管、及び胸部移植、頭頸部、口、消化管、整形、神経および形成の各手術などのさまざまな外科分野でのフィブリン接着剤の有用性を証明している。手術の時に、フィブリン接着剤を含む２つの最初の成分である、フィブリノーゲンとトロンビンとを混合して血塊を形成する。血塊は数秒以内に必要な組織、骨、または神経に接着するが、フィブリン溶解によっておよそ１０日間でゆっくりと体に再吸収される。フィブリン接着剤の重要な特徴は、（１）特に縫合でのアプローチが難しい領域、または縫合する場所が過度の危険を負うような領域において血管吻合連結での止血を達成する能力、（２）縫合術のみでは抑止できない針穴または動脈の裂け目からの出血を抑止する能力、および（３）ヘパリン添加処置した患者または凝血障害を持つ患者の止血を達成する能力、である。Borst，H.G., et al., J. Thorac. Cardiovasc. Surg., 84:548-553 (1982); Walterbusch, G.J., et al., Thorac. Cardiovasc. Surg., 30:234-235 (1982); Wolner, F.J., et al., Thorac. Cardiovasc. Surg., 30:236-237 (1982) を参照されたい。
【０００６】
欧州の医療従事者によるフィブリン接着剤の効果と成功した使用実績にも関わらず、フィブリン接着剤も、その本質的な成分のフィブリノーゲンおよびトロンビンも、米国では広く使用されてはいない。これは貯蓄されたドナーからつくられた商業的に調製されたフィブリノーゲン濃縮物の販売に対する１９７８年の米国食品医薬品局の禁止令によるもので、大部分において、ウイルス感染、とりわけＨＢＶとＨＣＶ（非Ａ型、非Ｂ型肝炎ウイルスとしても知られている）のような肝炎を引き起こすウイルス感染の伝染の危険性を理由としている。加えて、さらに最近の、ＡＩＤＳに関連したＨＩＶ、さらにサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン−バーウイルスおよびフィブリノーゲン調製における単純疱疹ウイルスのような他の脂質包皮ウイルスの出現によって、当面はこの方針での変更はあり得ないこととなった。同様の理由で、ヒトトロンビンもまた米国でのヒトの使用に対して目下許可されていない。米国でヒトの使用に許可されているウシトロンビンは、ウシ海綿状脳障害などの他のウシ病原体は存在するかも知れないが、ＨＩＶおよび肝炎に対してそれほど大きな危険を持たないと思われるウシ供給源より入手する。
【０００７】
フィブリン接着剤の調製のためにさまざまな方法が開発されてきた。例えば、Rose等は、(ａ)例えば、梅毒、肝炎または後天性免疫疾患症候群の１つ以上の血液伝染病について、約８０℃で、少なくとも約６時間、好ましくは少なくとも約１２時間選別した、ヒトまたは例えば雌ウシ、ヒツジまたはブタのような他の動物などの単一ドナーからの新鮮な血漿を凍結すること、(ｂ)凍結血漿の温度を例えば約０℃と室温の間まで上昇させてフィブリノーゲンおよび第ＸIII因子を含む上清および寒冷沈殿物懸濁液を形成すること、(ｃ)寒冷沈殿物懸濁液を採血すること、を含むフィブリン接着剤の調製において前駆体として有用な、フィブリノーゲンおよび第ＸIII因子を含む寒冷沈殿物懸濁液を調製する方法を開示している。そしてフィブリン接着剤を、懸濁液内のフィブリノーゲンをそこでゲルの形で凝固するフィブリン接着剤に変換させることとなるような場所に、上述の決まった容量の寒冷沈殿物懸濁液を適用し、また例えばヒト、ウシ、ヒツジまたはブタのトロンビンのようなトロンビンを十分な量で含む組成物を適用することによって調製する。米国特許第４，６２７，８７９号を参照のこと。
【０００８】
フィブリン接着剤を調製するための第２の技術が、Marxによって彼の米国特許第５，６０７，６９４号に開示されている。本質的には、すでに記述したような寒冷沈殿物がフィブリノーゲン成分の供給源となり、そこにMarxはトロンビンとリポソームを加えている。表題「心臓血管手術時にフィブリン接着剤とともに使用するウシトロンビンによる免疫」(J. Thorac. Cardiovasc. Surg., 105(5):892-897 (1992))でBerruyer, M.等によって論議された第３の方法は、ウシトロンビンを、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、第ＸＩＩＩ因子およびプラスミノーゲンなどのヒト凝固タンパク質とだけではなく、ウシアプロチニンおよび塩化カルシウムとも混合することによって調製したフィブリン接着剤を開示している。
【０００９】
上述のRose等およびMarxによる特許および Berruyer等による技術論文は、それぞれフィブリンシーラントの調製についての方法を明らかにしているが、しかしこれらの方法のいずれもが活性化剤としてウシトロンビンを使用していることに関する不都合を受けている。ウシトロンビンを含むフィブリン接着剤の使用に関連する深刻なまた生命を脅かすような結果としては、患者が局所のウシトロンビンを受けた後、出血性体質となることが報告されたことである。この合併症は患者が比較的不純なウシトロンビン調製でのウシ第Ｖ因子に対する抗体を発生させたときにおこる。これらの抗体はヒト第Ｖ因子と交差反応し、それによって、出血および死さえももたらすほど十分深刻である第Ｖ因子欠損を引き起こす。Rapaport, S.I., et al., Am. J. Clin. Pathol, 97:84-91 (1992); Berruyer, M., et al., J. Thorac. Cardiovasc. Surg., 105:892-897 (1993); Zehnder, J., et al., Blood, 76(10): 2011-2016 (1990); Muntean, W., et al., Acta Paediatr., 83:84-7 (1994); Christine, R.J., et al., Surgery, 127:708-710 (1997)を参照のこと。
【００１０】
Marx およびRose等によって開示された方法に関連するさらなる不都合としては、寒冷沈殿調製には調製するための多くの時間と財政上の掛かわりが必要であることである。さらに、いかなるウイルスの汚染もないことを保証するために多くの注意を払わなければならない。
【００１１】
すでに開示された方法に関連する最後の不都合としては、ヒトトロンビンを活性剤として使用することがもくろまれる一方、ヒトトロンビンは臨床使用としては使用可能ではなく、患者がヒトトロンビンに対する抗原性応答を持たないという証拠はないことである。類推によって、ヒト組換え体第ＶIII因子が血友病患者で抗原性応答を起こすことが示された。Biasi, R. de., Thrombosis and Hoemostasis, 71(5):544-547 (1994)を参照のこと。従って、ヒト組換え体トロンビンの効果についてさらなる臨床的な研究が行われるまで、組換え体ヒトトロンビンの使用がウシトロンビンに関連した抗原性の問題を未然に防ぐであろう、と単に推定することは出来ない。トロンビンについての第２の難点は、自己触媒反応性であること、すなわち自己破壊して取り扱いや長期の保存が問題となりやすいことである。
【００１２】
従って、結果として得られる生体接着性シーラントによる疾病伝染の危険性が皆無、および有害な生理学的反応を引き起こす危険性も皆無となるような、生体接着性シーラント組成物の調製のための簡便な実質的な方法に対する必要性が依然として存在する。
【００１３】
（発明の開示）
従って、本発明の目的は、完全な自家移植生体接着性シーラント組成物を提供することである。
【００１４】
本発明の他の目的は、ウシおよび組換え体ヒトトロンビンの使用に関連する危険が除去された自家移植生体接着性シーラント組成物を提供することである。
【００１５】
本発明のさらなる目的、利点および新規特徴は、一部は以下に続く記述に示され、また、一部は以下の明細の試験で当業者に明らかになるか、あるいは、本発明の実施によって確認されるであろう。本発明の目的および利点は、特に付帯する請求項で示した手段、組み合わせ、組成物、および方法によって十分に理解され、成し遂げられるであろう。
【００１６】
本発明の意図に従って、前述のおよび他の目的を成し遂げるために、本明細書で具体化し、広く記述したように、本発明の方法は、抗凝血剤を含む血小板の豊富な血漿または血小板の乏しい血漿を形成する工程を含む自家移植生体接着性シーラントの形成を含む。そして血小板の豊富な血漿または血小板の乏しい血漿を２つの部分に分け、第１の部分を回復させ凝血させることによって血塊を形成させる。そして血塊を粉砕し、結果として得られる血清を集める。そして生体接着性シーラント組成物を、そこでゲルの形で固まるフィブリンに変換するための血小板の豊富な血漿または血小板の乏しい血漿の第２の部分でフィブリノーゲンとなるのに十分な容量の血清を、血小板の豊富な血漿または血小板の乏しい血漿の決まった量の第２の部分と混合することで調製する。
【００１７】
（発明を実施するための最良な形態）
一般的に、本発明は、生体接着性シーラントのためのすべての血液成分が、生体接着性シーラントを適用しようとしている患者由来であるような、自家移植生体接着性シーラント組成物またはフィブリン接着剤の形成のための、図２、３および４に示した２相方法に関する。まず、患者から予め採血した多量の抗凝血処理した全血を遠心処理することで、血小板の豊富な血漿および血小板の乏しい血漿を形成する。そして血小板の豊富な血漿および血小板の乏しい血漿を２つの部分に分ける。第１相で使用する最初の部分に、抗凝血剤の効果を逆転する化合物を加え、血塊を形成させる。そして血塊を粉砕し、結果として得られる自家移植トロンビンを含む血清を回収する。そして第１相から入手した血清を、第２相で使用した血小板の豊富な血漿または血小板の乏しい血漿の第２の部分と混合して、本発明の生体接着性シーラントを形成する。
【００１８】
さらに以下で詳細に記載されている、自家移植生体接着性シーラント組成物の調製のための本発明の方法は、図２、３および４に示された流れ図で表される。本発明の方法は、クエン酸ナトリウム（クエン酸塩）またはヘパリンなどの抗凝血剤を含む培養液中に患者の全血８０を採血することで行う抗凝血処理全血９０の作成で始まる。採血の行為は凝血反応を開始させ、何らかで工程を停止しない限り、血塊が形成されるであろう。血塊の形成は多段階工程であり、このような段階のいくつかはカルシウムイオンの存在が必要である。血液をクエン酸塩中に採血した時の効果のように、全血に存在するカルシウムイオンを取り除くことによって血液を凝固から防ぐことが出来る。血塊形成工程を再び開始させるために、カルシウムを全血内に加えなおす（再カルシウム化）。カルシウムキレート剤はカルシウムと反応する化学物資であり、カルシウムがもはや血液凝固で機能できないような様式で血液に存在する。凝固系の組成物上でもっとも副作用が少ないので、最も一般的なキレート剤はクエン酸の塩（クエン酸塩）である。クエン酸塩のようなカルシウムキレート剤を含む培養液中に血液を採血することで、試料採取およびさらなるクエン酸試料の調製が数時間までの時間を超えて行うことが出来る。
【００１９】
好ましくは、全血８０を採血し、クエン酸ナトリウムの３．８％溶液（本明細書では「クエン酸採血培養液(citrate collection medium)」と呼ぶ）と、とりわけ血液のクエン酸採血培養液に対する比９：１で混合する。３．８％クエン酸ナトリウム溶液は、１００ｍｌの水あたり３．８グラムのクエン酸ナトリウムを加えることで調製する。３．８％クエン酸ナトリウム採血培養液が血液を採血し保存するのによく使われるものである一方、当業者は全血に対するクエン酸ナトリウムの比が最終濃度で約１０．９〜１２．９％ｍＭ／Ｌの範囲であってよいことを認識するであろう。
【００２０】
抗凝血処理した全血９０を、次に１０〜４０分間、およそ２０〜５０r.c.f.（相対遠心力）の速度で遠心処理し、好ましくは２０分間、２５r.c.f.で冷却遠心処理し、その結果２つの液体相が形成する。上相は血小板の豊富な血漿(ＰＲＰ)１００であり、下層は抗凝血処理した全血から血小板の豊富な血漿を引いたもの１９０である。その後、血小板の豊富な血漿(ＰＲＰ)１００を静かに抜きとり、容器内に保存する。
【００２１】
残った血小板の豊富な血漿を除いた抗凝血処理全血１９０をさらに１５〜３０分間、およそ３０００〜４５００r.c.f.の速度で遠心処理、好ましくは２０分間、３８５０r.c.f.で冷却遠心処理する。このより速い速度での遠心処理は結果として、血小板の豊富な血漿相を除いた抗凝血処理した全血１９０から赤血球、白血球および血小板を除去し、それによって、後で除くことになる細胞構成物を含む沈殿物（図示せず）を形成する。そして結果として得られた血小板の乏しい血漿(ＰＰＰ)２００を沈殿物よりデカントし、容器に保存した。血小板の豊富な血漿１００および血小板の乏しい血漿２００を保存する容器(図示せず)は、(シリカ、透熱性土壌、カオリンなどのような)湿潤性表面または（プラスチック、シリコン処理ガラスなどのような）非湿潤性表面のどちらを有するものであってもよい。表面が血液凝固を活性化する役割を有しているので、血小板の豊富な血漿１００または血小板の乏しい血漿２００のいずれかを保存するための表面を有する容器のどちらを選択するかは、血塊を速く形成させることを望むか、遅く形成させることを望むかに依るものである。カオリンのような化学的活性剤も凝血時間を早めるのに使用できるが、それらを後で取り除くことも必要となる。好ましい実施様態において、ガラス製の試験管が血小板の豊富な血漿１００および血小板の乏しい血漿２００を採血するのに使用する好ましい容器である。
【００２２】
経路１０１による好ましい実施様態において、血小板の豊富な血漿１００を２つの部分に分ける。最初の部分は血小板の豊富な血漿１００の全量のおよそ１／４から１／２であり、トロンビンを調製するために第１相に使用し、一方、血小板の豊富な血漿１００の第２の部分は第２相に使用する。いったん血小板の豊富な血漿１００および血小板の乏しい血漿２００を入手したならば、迅速にすなわち２分以内に生体接着性シーラント組成物を入手するための好ましい方法が、それぞれ図３および４に示され、以下で詳細に議論するような経路１０１または２０１で概略的に詳述される。しかしながらより長い、すなわち２分間から８分間の範囲内での長い凝血時間が望まれる場合、本発明の生体接着性シーラント組成物の入手方法は、それぞれ図３および４に流れ図で詳細に示され、以下で詳細に論議する、経路１０５および２０５に沿って進められる。
【００２３】
好ましい実施様態による第１相は血塊形成作用を回復させることで始まる。このことを成し遂げるために、抗凝血剤の効果を逆転することのできる試薬（回復剤）を血小板の豊富な血漿１００の最初の部分に加えなおす。本発明の目下の好ましい実施様態では、抗凝血剤の効果の逆転が塩化カルシウムを使用することで行われる。しかしながら、クエン酸処理血液の凝血作用を回復させるにあたり、グルコン酸カルシウムなどの、塩化カルシウムと機能的に同等であることが既知であるか、確認されている任意の物質を、本発明の実施において使用することができる。この様に、塩化カルシウムが本発明での使用で目下好ましいカルシウム塩であるが、塩化カルシウムと同様な様式で機能を持つ任意のカルシウム塩を本発明で使用することができる。同様に、多くの血液凝固反応が現在補助因子としてカルシウムイオンが必要と信じられているが、これらの凝固反応を促進することでカルシウムと機能的に同等であることが既知であるか、または後に確認されている任意の物質を、本発明の実施において、個別にまたはカルシウムとの組み合わせで使用することができる。使用した抗凝血剤がヘパリンの場合、抗凝血剤の効果を逆転するためにヘパリナーゼが使用される。抗凝血反応を逆転するために使用する回復剤の濃度は、ある程度、血小板の豊富な血漿１００中の抗凝血剤の濃度とキレート化および凝血反応の化学量論とに依存するであろう。しかしながら、抗凝血反応を逆転するために使用する回復剤の濃度は、血塊形成を成し遂げるのに十分でなければならない。
【００２４】
図３で示したような血小板の豊富な血漿１００の回復において、血塊１１０が自然に形成する。そして結果として得られた血塊１１０を高速遠心処理で粉砕、またはメッシュを通して押しつぶし、それによってトロンビンを含む血清１２０を放出する。好ましい実施様態において、ここで血清１２０を、血小板の豊富な血漿(ＰＲＰ)１００の第２の部分と混合して、２分以内で、臨床利用に十分な量で本発明の生体接着性シーラント組成物１３０を形成する。
【００２５】
もう一つの実施様態において、血清１２０を第２相の血小板の乏しい血漿２００と混合し、それによって本発明の自家移植生体接着性シーラント組成物１４０を２分以内に形成する。
【００２６】
本発明の第３の実施例である、図３で示した経路１０５は、抗凝血処理した全血９０から得られた初期量の血小板の豊富な血漿（ＰＲＰ）１００を、ガラスのような湿潤性表面を持っている容器内に集めることを意図するものである。そして血小板の豊富な血漿１００を再カルシウム化し、生体接着性シーラント組成物１５０を形成する。この所望の生体接着性シーラント組成物１５０は、好ましい実施様態で記述されたような２分間以内の形成に対して、形成するのにおよそ２分から８分を必要とする。
【００２７】
図４の経路２０１により流れ図で示した第４の実施様態において、すでに好ましい実施様態で議論したように、血小板の豊富な血漿１００ではなくむしろ血小板の乏しい血漿２００をふたつの部分に分ける。およそ本来の量の１／４から１／２である第１相に使用する第１の部分を湿潤性表面を持つ容器に保存し、そして回復剤、好ましくは塩化カルシウムを、直接血小板の乏しい血漿２００に加える。保存した血小板の乏しい血漿２００の表面活性化が、容器の表面の結果として起こり血塊が形成する。結果として得られた血塊を、すでに記述したように粉砕し、血清２２０を回収した。そして血清２２０を第２相の血小板の豊富な血漿１００と混合することによって自家移植生体接着性シーラント組成物２３０を形成する。
【００２８】
第５の実施例では、血清２２０を第２相の血小板の乏しい血漿２００と混合することによって、２分以内に生体接着性シーラント組成物２４０を形成する。
【００２９】
第６の実施例は図４で示した経路２０５により、血小板の豊富な血漿を除いた抗凝血処理した全血１９０から得られた血小板の乏しい血漿２００の初期量を、ガラスのような湿潤性表面をもつ容器に回収する。そして血小板の乏しい血漿２００を再カルシウム化し、生体接着性シーラント組成物２５０が形成する。
【００３０】
第７の実施例は、ヒト組換え体トロンボプラスチンを直接血小板の豊富な血漿と混合して、生体接着性シーラント組成物（図示せず）を形成することを意図するものである。あるいは、ヒト組換え体トロンボプラスチンを少量の血漿でトロンビンを生成するのに使用し、そして結果として得られたトロンビンを、血小板の豊富な血漿と結合させて、生体接着性シーラントを形成する。トロンボプラスチンは、後で遠心処理によって取り除くことができる。
【００３１】
本発明の生体接着性シーラント組成物の伸長強度はカルシウムイオンの添加によって影響を受けうる。従って、それぞれ図３および４での経路１０１および１０２で上述し、開示した方法を用いて、もしより強い生体接着性シーラント組成物が望ましい場合、より多くのカルシウムイオンを、血清を血小板の豊富な血漿１００または血小板の乏しい血漿２００内に導入する時に加えてよい。あるいはもし生体接着性シーラント組成物の調製の方法がそれぞれ図３および４に描写されている経路１０５および２０５に従う場合、カルシウムイオンを直接血小板の豊富な血漿１００または血小板の乏しい血漿２００へ導入してよく、それぞれ生体接着性シーラント組成物１５０および２５０が形成する。
【００３２】
さらに以下で詳細に記述するように、本発明の生体接着性シーラント組成物の形成に必要な時間間隔は、加えた血清の量に依存する。血清の、血小板の豊富な血漿または血小板の乏しい血漿に対する比が１：４、１：２および３：４の場合、結果としてそれぞれおよそ９０秒、５５秒及び３０秒間で生体接着性ゲル組成物が形成される。更に、トロンビンが自己触媒反応性であるという事実から、血清は調製から５時間以内、好ましくは２時間以内、理想的には直ちに使用することが重要である。その代わり、血清は無期限に冷蔵または凍結しておくことができる。
【００３３】
本発明の生体接着性シーラント組成物を、いったんゲルになったならば、適切な量の血小板の豊富な血漿または血小板の乏しい血漿を傷に適用することで外科的な傷を封印するのに使用してよい。さらに、本発明の生体接着性シーラント組成物を単に生体接着性シーラントを受ける予定の患者由来の血液成分から調製したという事実により、患者に新しい血液伝染疾病を持ち込む確率はゼロである。本発明の方法は、形成した生体接着性シーラント組成物を、止血剤としてのみでなく、傷治癒への添加物として、および薬剤および他の生物学的な活性を持つタンパク質の受け渡しのためのマトリックスとして機能するようにさらに修飾してよい。例えば、フィブリン接着剤が形成手術でのような骨再構築で、または大きな骨折の回復で有用である骨断片への結合に高い親和性を持つことがよく知られている。従って、本発明の生体接着性シーラント組成物の自家移植性質を保ち続けることで、患者からの自家移植骨はすりつぶして粉末またはそれに類似のものにすることができ、本発明の方法の第２相で入手した血小板の豊富な血漿内に混ぜることが出来る。そしてトロンビンを含む血清を、結果として得られるゲルをそれが凍る望ましい場所へ適用することが出来るのに十分な量で、血小板の豊富な血漿と骨断片に混合する。
【００３４】
本発明の望ましい生体接着性シーラント組成物がさらに薬剤および他の生物学的活性を持つタンパク質の受け渡し役として機能する事例において、本発明の方法を以下のように修飾してよい。第１相で入手したトロンビンを含む血清を第２相の血小板の豊富な血漿に加える前に、広い種類の薬剤および他の生物学的活性を持つタンパク質を第２相の血小板の豊富な血漿へ加えてよい。血清の添加の前に血小板の豊富な血漿に加える薬剤の例には、鎮痛薬化合物、殺菌性および静菌性化合物を含む抗菌性化合物、抗生物質（例えばアドリアマイシン、エリスロマイシン、ゲンタマイシン、ペニシリン、トブラマイシンなど）、抗真菌化合物、抗炎症剤、駆虫薬化合物、抗ウイルス性化合物、酵素、酵素阻害剤、糖タンパク質、成長因子（例えば、リンホカイン類、サイトカイン類など）、ホルモン、ステロイド、糖質コルチコステロイド、免疫調節剤、免疫グロブリン、ミネラル、神経弛緩薬、タンパク質、ペプチド、リポタンパク質、殺腫瘍性化合物、腫瘍静止化合物、毒素およびビタミン（例えばビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＢ、ビタミンＣ、ビタミンＤまたはこれらの誘導物など）が限定はしないが含まれる。上記のいくつかまたはすべての選別した断片、部分、誘導物または類似物も使用してよいことが想像される。
【００３５】
いくつかの異なった医学的な装置および試験方法が、血液の凝固と凝固関連活性を測定し、決定するために存在する。これらの装置および方法は、本発明の生体接着性シーラント組成物を形成するのに必要な活性体、すなわちトロンビン、カルシウムおよび血漿の最善の処方を決定する補助をするのに使用できる。血液塊化および凝固を評価するより好結果の技術のいくつかは、そのすべてが参照文献として本明細書に組み込まれ、すべてが本発明の指定代理人に委ねられた、Cooper等に付与された米国特許第４，５９９，２１９号、 Jackson等に付与された米国特許第４，７５２，４４９号および Smithに付与された米国特許第５，１７４，９６１号によって例示されたプランジャー技術である。
【００３６】
凝固および凝固関連活性を測定し検出するためのプランジャー技術を用いている自動化装置は、一般的にプランジャーセンサカートリッジまたはカートリッジ類およびその中にカートリッジが挿入されているマイクロプロセッサー制御装置を含む。この装置はカートリッジ上で働き、血液試料を、凝固関連事象を誘導し検出するためにそこに配置する。カートリッジは多数の試験細胞を含み、そのそれぞれがプランジャー集合が位置し、解析試験を実施する上部反応チャンバー、試薬または試薬類を含む試薬チャンバーをもつチューブ様のメンバーによって決定される。例えば、活性化凝固時間（ＡＴＣ）試験のために、試薬には血液の凝固を活性化する活性剤が含まれる。プラグメンバーが試薬チャンバーの底を封印する。試験が始まると、試薬チャンバーの内容物が流体の試料、通常はヒトの血液またはその成分と混合するように反応チャンバー内に押し出される。装置の一部分である作動装置がプランジャー集合を持ち上げ、それを下げることによってプランジャー集合を反応チャンバー内の流体のプールを通して交換する。プランジャー集合は重力によって下がり、粘着性などの反応チャンバー内の流体の性質によって抵抗する。試料の性質が凝固関連活性の開始または発生の結果として所定の様式で変化すると、その結果プランジャー集合の降下速度が変化する。降下速度の十分な変化によって、凝固関連活性が装置により検出され、示される。
【００３７】
上で論じた方法を用いて、カートリッジを、試薬チャンバー内で血小板の豊富な血漿または血小板の乏しい血漿のいずれかから入手した血清およびＣａＣｌ2で集めた。凝固時間試験を、カートリッジの反応チャンバー内に分散させた血小板の豊富な血漿（ＰＲＰ）または血小板の乏しい血漿（ＰＰＰ）のいずれかを用いて自動化処理によって行った。図５に結果を示した最初の実験で、血清の量、血清の元となる血漿の型、および血清を混合した血漿の型を、もっとも短い凝固時間を決定するために調べた。血清の、調べた血小板の豊富な血漿または血小板の乏しい血漿に対する比には１：４、１：２および３：４が含まれる。図６および７に結果を示した第２の組の実験では、本発明の生体接着性シーラント組成物に関する実際のゲル化時間の関係を、血清の生成から血清を加えるまでの遅延時間を、０分、３０分または６０分間とし、カートリッジ内の凝固時間と比較した。図８および９に結果を示した第３の実験では、実際のゲル時間対カートリッジでの凝固時間におけるカルシウム添加の効果を調べた。図１０に結果を表した最後の実験では、凝固時間におけるカルシウムの添加の効果を調べた。
【００３８】
ドナー間で凝固時間は変動するけれども、個々のドナーについての凝固時間の比較によって、血清の血漿に対する比とカルシウム濃度の明白な効果が示されている。すべてのドナーに関して、最も短い凝固時間が３：４の比の時に起こり、１：４の比の凝血時間よりも４７％短い。３：４比と１：２比に対する凝固時間の違いは統計学的に有意ではないが、すべてのドナーに対して３：４の比を使用した凝固時間が一貫して短かった。これらの結果は、凝固時間が、血清の血小板の豊富な血漿に対する比を増加させることにより短くなる可能性を示している。同様に、凝固時間は加えたカルシウム量に明らかに影響され、最も短い凝固時間がカルシウムを加えなかった時に得られ、これは血清がクエン酸処理済の血小板の豊富な血漿を再カルシウム化するのに十分なレベルのカルシウムを含むことを示唆している。規模拡大実験からの予備的な結果は、カートリッジでの実験的凝固時間が実際のゲル化時間と相関することを示唆するものである。
【００３９】
本発明を、更に以下の非限定的な実施例によって例示する。すべての科学的および技術的用語は当業者によって理解されるような意味を持つ。以下に続く特定の実施例は、本発明の生体接着性シーラント組成物が臨床的な設定で調製されてなる方法を例示しており、範囲または領域において本発明を制限するものと解釈すべきものではない。本発明の方法は、本発明に含まれた組成物を製造するために変更を加えてよいが、とくに開示はしない。更に、ある程度の異なる様式で同様の組成物を製造する方法に改変できることは、当業者にとって明らかであろう。
【００４０】
（実施例）
本明細書の実施例は本発明を実施するさまざまな局面を例示するためのものであり、決して本発明を限定することを意図するものではない。
【００４１】
（実施例１）
血小板の豊富な血漿および血清を用いた生体接着性シーラント組成物の調製
１０ｃｃの血小板の豊富な血漿を、３３ｃｃの１０％塩化カルシウムを含む滅菌したガラス製の試験管に加える。試験管に栓をして、内容物をゆっくりと混合し、試験管をわきに置いた。内容物のゲル化が２分から８分で起こる。４〜６ｃｃの血清を生成し搾り出すための乾燥滅菌カップに、ゲルを通し、１ｃｃの空気を、血清１ｃｃと一緒に４ｃｃの血小板の豊富な血漿を含むシリンジ内に引く。生体接着性シーラント組成物がおよそ２分以内にシリンジの内部でゲル化する。血小板の豊富な血漿へ加えた血清の量を増加させることによって、ゲル時間を減少することができる。
【００４２】
（実施例２）
１０ｃｃの全血を患者より採血し、滅菌したガラス製の試験管に入れ、自然に凝血させる。続いて凝血を絞るかまたは遠心処理して、およそ４〜６ｃｃの血清を放出することができる。
【００４３】
次に、等体積の１０％塩化カルシウムを血清に混合する。そして、１ｃｃのこのカルシウム化血清を、７〜８ｃｃの血小板の豊富な血漿および２ｃｃの空気と混合した。結果として得られた生体接着性シーラントはおよそ１〜２分間でゲル化する。
【００４４】
（実施例３）
３３ｃｃの１０％塩化カルシウムの入った滅菌ガラスシリンジへ、１０ｃｃの血小板の豊富な血漿を加える。混合液を２分から８分間静置させる。いったんゲルが適切に粘着性を表したらば、望んだ場所に適用することができる。
【００４５】
実施例１および２で説明した技術を、（ａ）血清の追加的な供給源のため、および（ｂ）好結果の凝固を確立するために同時に調製してよい。
【００４６】
前述の記載は本発明の原理のみを例示するものとして考慮される。さらに、多くの修正例と変更例が当業者にとって容易に考え付くものであろうから、本発明を、上述の如く示された構成および処理そのものへ限定するのは望ましくない。従って、すべての適切な修正例および同等例は付随する請求項によって限定された本発明の範囲内に含まれるべく帰属する可能性がある。
【図面の簡単な説明】
本願に組み込まれ、明細書の一部をなす付随の図面は、本発明の好ましい実施様態を図解するものであり、本記述と共に、本発明の原理を説明するものである。
【図１】  血液凝固カスケードの模式的表示である。
【図２】  血小板の豊富な血漿および血小板の乏しい血漿を入手するのに使用した本発明の方法の最初の部分を示している流れ図である。
【図３】  出発物質として血小板の豊富な血漿を使用した本発明の生体接着性シーラント組成物を調製するための方法の最後の部分を示している流れ図である。
【図４】  出発物質として血小板の乏しい血漿を使用した本発明の生体接着性シーラント組成物を調製するための方法の最後の部分を示している流れ図である。
【図５】  凝血時間における血清−血漿比の効果の図表である。
【図６】  ドナーから採血した血液を用いた凝固時間と実際のゲル化時間との関係を表す図表である。
【図７】  ドナーから採血した血液を用いた凝固時間と実際のゲル化時間との関係を表す図表である。
【図８】  ドナーから採血した血液を用いた凝固時間とゲル化時間におけるカルシウム添加の効果を表す図表である。
【図９】  ドナーから採血した血液を用いた凝固時間とゲル化時間におけるカルシウム添加の効果を表す図表である。
【図１０】  血小板の豊富な血漿および血小板の乏しい血漿の凝固時間におけるカルシウム添加の効果を表す図表である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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