(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＮＦαの有毒な作用を改善することが必要な疾患の治療のための医薬組成物であって、ポリ乳酸ミクロスフェア中に可溶性ＴＮＦαレセプターが組み込まれている、可溶性ＴＮＦαレセプターの制御放出医薬組成物。
【請求項２】
該可溶性ＴＮＦαレセプターが可溶性ｐ５５  ＴＮＦαレセプター（ｐ５５  ｓＴＮＦ−Ｒ）である請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
該可溶性ＴＮＦαレセプターが可溶性ｐ７５  ＴＮＦαレセプター（ｐ７５  ｓＴＮＦ−Ｒ）である請求項１記載の医薬組成物。
【請求項４】
敗血症性ショックの治療のための請求項１記載の医薬組成物。
【請求項５】
癌に関連したカヘキシーの治療のための請求項１記載の医薬組成物。
【請求項６】
自己免疫疾患の治療のための請求項１記載の医薬組成物。
【請求項７】
慢性関節リウマチの治療のための請求項６記載の医薬組成物。
【請求項８】
さらに抗炎症剤を含む請求項７記載の医薬組成物。
【請求項９】
多発性硬化症の治療のための請求項６記載の医薬組成物。
【請求項１０】
多発性硬化症の治療のためのさらなる薬剤を含む請求項９記載の医薬組成物。
【請求項１１】
全身性紅斑性狼瘡の治療のための請求項６記載の医薬組成物。
【請求項１２】
移植片宿主反応の治療のための請求項１記載の医薬組成物。
【請求項１３】
皮膚遅延型過敏性障害の治療のための請求項１記載の医薬組成物。
【請求項１４】
インプラントの形態の請求項１記載の医薬組成物。
【請求項１５】
注射剤の形態の請求項１記載の医薬組成物。
【請求項１６】
慢性関節リウマチにおける関節の炎症を治療するために滑液に局所注射するための請求項１４または１５記載の医薬組成物。
【請求項１７】
多発性硬化症を治療するために脳脊髄液に鞘内注射するための請求項１４または１５記載の医薬組成物。
【請求項１８】
局所適用のための請求項１３記載の医薬組成物。
【請求項１９】
さらなる薬剤がβ−インターフェロンまたはコポリマー−１である請求項１０記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリマーマトリックスからの可溶性形態のレセプターの制御された送達のための医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
制御された放出システムは、数日から数年にわたりうる決められた期間、所定の速度で薬物を送達する。これらのシステムは従来の薬物療法より有利である。たとえば、標準的な剤形を摂取または注射すれば、その薬物の血中濃度はそののち上昇し、最高値に達し、ついで下降する。薬物はそれぞれ治療範囲を持ち、その範囲をこえると毒性を示し、その範囲を下回れば効力を示さない。したがって、薬物濃度が変動すると、無効な期間と毒性を示す期間が交互にやってくることにもなりうる。これに対し、放出制御製剤（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）は、１回の投与でその薬物の濃度を所望の治療範囲に維持する。そのほかの制御された放出システムの可能性のある利点としては、（ｉ）特定の身体区画に局部的に薬物を送達し、それによって全身の薬物濃度を下げること、（ii）体内で急速に破壊される薬物の保護（これは、たとえば蛋白質などの生物学的に不安定な分子にとってはとくに重要である）、（iii）継続管理の必要性の減少、（iv）苦痛の軽減および（ｖ）コンプライアンスの改善が挙げられる。
【０００３】
薬物放出の最適な制御は、その薬物をポリマー材料に入れることによって達成できる。ポリマー材料は一般に、拡散、化学反応または溶媒活性化によって薬物を放出する。
【０００４】
最も一般的な放出機構は拡散であり、これによって薬物はポリマーシステムの最初の位置からポリマーの外側表面へ、そして身体へと移動する。拡散は、薬物の核がポリマーフィルムに包まれているリザーバー（ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）を通しても起こりうるし、薬物がポリマーシステム中に均一に分布しているマトリックス内でも起こりうる。また、薬物は、たとえばポリマーの分解（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）やポリマー骨格からの薬物の切断などの化学反応によっても放出されうる。
【０００５】
前記の機構の組み合わせも可能である。ポリマーシステムからの放出速度（ｒｅｌｅａｓｅ  ｒａｔｅ）は、ポリマー材料の性質（たとえば、拡散制御システムについては多孔構造や結晶化度、化学的に制御されるシステムについてはモノマーの疎水性や結合の加水分解に対する不安定性など）とシステムの設計（たとえば、厚さおよび形状）によって制御することができる。異なる放出機構を持つシステムが存在することの利点は、それぞれが異なる目的を達成できるということである。
【０００６】
長年の間、制御された放出システムは低分子量（＜６００）の薬物をゆっくりと放出することしかできなかった。蛋白質などの大きい分子は適当な候補とは見なされなかった。なぜなら、ポリペプチド類は大きすぎるので、ポリマーの膨潤後でさえ、ほとんどのポリマー材料中をゆっくりと拡散することができないと考えられたからである。粉末化した巨大分子を含有する固体疎水性ポリマーのマトリックスを使用すれば、ほとんどあらゆる大きさの分子を１００日以上にわたって放出させうるという発見によって、種々の蛋白質、多糖類およびポリヌクレオチド類の制御された送達が可能になった。Ｌａｎｇｅｒ、１９９０年を参照。
【０００７】
現在までに制御された放出のためにポリマー材料に組み込まれた蛋白質およびポリペプチド類は、主としてインスリンなどのエフェクター分子であって、人体内で生産されるエフェクター分子と結合し、中和するであろう分子の制御された放出のための組成物ではない。
【０００８】
腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα）は、スペクトルの広い生物学的応答を引き起こす強力なサイトカインである。ＴＮＦαは多くの腫瘍細胞にとって細胞傷害性であり、癌の治療に使用できる。ＴＮＦαは繊維芽細胞の成長を増進し、組織再形成因子（ｔｉｓｓｕｅ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）として作用するので、創傷治癒に適している。さらに、ＴＮＦαは、マウスに移植した腫瘍の出血性壊死を誘発し、多形核好中球の細胞傷害性と食作用を増進し、リポ蛋白質リパーゼ、主要組織適合遺伝子複合体のクラスＩ抗原およびインターロイキン−１やインターロイキン−６などのサイトカイン類を含む多くの蛋白質の発現を調節する。ＴＮＦαは、ウイルス、細菌および多細胞（ｍｕｌｔｉｃｅｌｌｕｌａｒ）（とくに細胞内）寄生虫に対して効果を示すことがわかっている。ＴＮＦαは正常な免疫応答に必要であると思われるが、大量になると劇的な病原性作用を生じる。ＴＮＦαは新生物疾患と寄生虫血症に関連する消耗性症候群（カヘキシー）を招く主要因子であるので、「カケクチン」と名づけられた。また、ＴＮＦαに対する抗体は感染動物を保護できるので、ＴＮＦαはグラム陰性敗血症における毒性の主因でもある。
【０００９】
ＴＮＦαは、成人呼吸障害症候群、肺繊維症、マラリア、感染性肝炎、結核、炎症性腸疾患、敗血症性ショック、ＡＩＤＳ、移植片宿主反応、自己免疫疾患（慢性関節リウマチ、多発性硬化症、若年型糖尿病など）および皮膚遅延型過敏性障害などの、いくつかの疾患に関与していることが示されている。
【００１０】
ＴＮＦαの作用のいくつかがその宿主にとって有害でありうるという証拠から、ＴＮＦα機能を調節する機構が注目されてきている。ＴＮＦαに対する応答に関する細胞内シグナルは、ＴＮＦαが高い親和性で結合する２つの異なる分子種である細胞表面レセプター（以下、ＴＮＦ−Ｒという）によって供給される。
【００１１】
これらの細胞表面ＴＮＦ−Ｒは、身体のほとんどすべての細胞で発現する。ＴＮＦαの種々の作用（細胞傷害作用、成長促進作用およびその他）はすべて、ＴＮＦレセプターにＴＮＦαが結合したときに、そのレセプターによってシグナル化される。分子サイズが異なるこれら２種類のレセプター（５５キロダルトンと７５キロダルトン）は既に記載されており、本明細書ではこれらを、それぞれｐ５５  ＴＮＦ−Ｒおよびｐ７５  ＴＮＦ−Ｒと呼ぶ。ただし、これらの受容体を、ｐ６０  ＴＮＦ−Ｒおよびｐ８０  ＴＮＦ−Ｒと呼ぶ刊行物もあることに注意されたい。
【００１２】
ＴＮＦαのこれらレセプターは共に、細胞に結合して存在するばかりでなく、細胞表面形態から蛋白分解によって誘導された、無傷（ｉｎｔａｃｔ）なレセプターの切断された細胞外ドメインからなる可溶性形態でも存在する。これらの可溶性ＴＮＦαレセプター（ｓＴＮＦ−Ｒ）はＴＮＦαと結合する能力を維持できるので、ＴＮＦαについて細胞表面レセプターと競合し、ＴＮＦα活性を遮断することができる。したがってｓＴＮＦ−Ｒは、ＴＮＦα活性の生理学的減弱因子（ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｔｔｅｎｕａｔｏｒ）として機能し、その潜在的な有害作用から保護する機能を持つ。しかしながら、ｓＴＮＦ−Ｒは、ＴＮＦαの活性を安定化することによって（おそらくはその生物学的に活性な三量体構造が不活性な単量体に解離するのを防ぐことによって）、ＴＮＦαの機能に影響を及ぼすという報告もある（Ａｄｅｒｋａら、１９９２年）。したがって、ｓＴＮＦ−Ｒは２つの異なる方法でＴＮＦα活性に影響を及ぼしうる。すなわち、ｓＴＮＦ−Ｒは、ＴＮＦαに関して細胞表面レセプターと競合して、ＴＮＦαの有害な作用を遮断するか、もしくは緩衝剤として作用して、ＴＮＦα活性を安定化する。
【００１３】
これら２種類のｓＴＮＦ−Ｒ（以下、ｐ５５  ｓＴＮＦ−Ｒおよびｐ７５  ｓＴＮＦ−Ｒという）は、以前はそれぞれＴＮＦ結合蛋白質ＩおよびII、またはＴＢＰＩおよびＴＢＰIIと呼ばれていた（たとえばＥＰ３９８３２７、ＥＰ４１２４８６およびＥＰ４３３９００参照）。本願では、両方の名称を使用することにする。すなわち、ｐ５５  ｓＴＮＦ−ＲとＴＢＰＩ、およびｐ７５  ｓＴＮＦ−ＲとＴＢＰIIは、それぞれどちらの名称でも同じ蛋白質を表す。
【００１４】
ｓＴＮＦ−Ｒは血清中に本質的に存在し、その濃度は炎症性疾患状態と非炎症性疾患状態のどちらでも有意に上昇する。しかしながら、これらの蛋白質の作用は、ＴＮＦαが作用する部位におけるｓＴＮＦ−Ｒの濃度、ＴＮＦαの局所濃度に対するｓＴＮＦ−Ｒの濃度の関係、およびｓＴＮＦ−ＲとＴＮＦαがＴＮＦαが作用する部位から除かれる速度とＴＮＦα活性の減衰速度との関係により異なりうる。これらのパラメーターに依存して、ｓＴＮＦ−Ｒは異なる状況下で極めて異なる方法により、すなわちＴＮＦαの作用を阻害することによって、またはＴＮＦαの担体として機能することによって、もしくはその機能を長続きさせてＴＮＦαの作用を増強までもすることによって、ＴＮＦαの機能に作用しうる（Ａｄｅｒｋａら、１９９２年）。
【００１５】
抗ＴＮＦα剤としてのｓＴＮＦ−Ｒの有効性は、多数の異なる因子（細胞表面レセプターとの親和性と比較した、ｓＴＮＦ−ＲとＴＮＦαとが結合する際の親和性、ＴＮＦαが作用する部位への可溶性レセプターの近づきやすさ、ならびにＴＮＦα形成部位からのＴＮＦαをともなって形成される複合体の除去速度（ｒａｔｅ  ｏｆ  ｃｌｅａｒａｎｃｅ）と可溶性レセプターの除去速度）により影響を受けうる。天然型のｓＴＮＦ−Ｒは、生理学的に最も適当な様式で作用すると思われる。しかしながら、それらを使用する際の主たる制限は、それらがかなり速く血液から除かれるということである。これらの分子を改良しようとする試みはいくつかなされている。たとえば、ｓＴＮＦ−Ｒを免疫グロブリン分子のＦｃ部分に結合した、いわゆる「イムノアドヘジン（ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｓｉｎ）類」（ホフマン  ラ  ロッシュ（Ｈｏｆｆｍａｎ  Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ）とイムネックス（Ｉｍｍｕｎｅｘ）が開発）や、ｓＴＮＦ−ＲをＰＥＧ分子で架橋した「ＰＥＧ化（ＰＥＧｕｌａｔｅｄ）」ｓＴＮＦ−Ｒ（シナージェン（Ｓｙｎｅｒｇｅｎ）が開発）などである。どちらの方法も、より長い除去時間（ｃｌｅａｒａｎｃｅ  ｔｉｍｅ）を持ち、かつ、より効果的に三価のＴＮＦα分子と結合できる二価ｓＴＮＦ−Ｒ分子の形成をもたらす。しかしながら、これらは天然の可溶性レセプターよりも強い免疫原性を持つ可能性が極めて高く、またＴＮＦαとの複合体の循環システムからの除去は、充分な効率では起こらないであろう。
【００１６】
ＴＮＦαの多くの有害な作用は、体内のある特定の場所でこのサイトカインが慢性的に形成されることによってもたらされる。そのような病的状態（ｄｉｓｏｒｄｅｒ）に対する防御として可溶性形態のＴＮＦレセプターを使用する際に予想される主な制限は、必要な部位で可溶性レセプターの治療有効濃度を長期間維持することの困難性である。
【発明の概要】
【００１７】
本発明の目的は、可溶性形態のレセプターのリガンドの機能に影響を及ぼすための（たとえば、それらのリガンドの有害な作用から保護するための）可溶性形態のレセプターの治療への適用に関する新規な方法を開発すること、とくには、一定速度で長期間にわたり体内での可溶性レセプターの局所放出を可能にするシステムを開発することである。これらの方法は、所望の身体区画に移植または注射される生体適合性（ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）ポリマー材料に、可溶性レセプターを組み込むことにもとづく。可溶性レセプターを含有するポリマーのマトリックスは、天然型の可溶性レセプターの局所的かつ制御された放出を可能にする。
【００１８】
そのリガンドに結合し、その機能に影響を及ぼして、そのリガンドの有害な作用を中和し、かつ／または、その活性を安定化または増強することのできる可溶性レセプターは、すべて本発明に包含される。そのような可溶性レセプターの具体例は、ホルモン類やサイトカイン類の可溶性レセプターであり、好ましい実施態様では、その可溶性レセプターが可溶性ＴＮＦαレセプターである。
【００１９】
したがって、本発明の別の目的は、ＴＮＦαの作用に影響を及ぼすための（たとえばＴＮＦ作用から保護するための）可溶性ＴＮＦαレセプターの治療への適用に関する、放出制御システムをもちいる新規な方法を提供することである。
【００２０】
したがって、本発明は可溶性レセプターが生体適合性ポリマー材料の中に組み込まれている、該可溶性レセプターの制御された放出のための医薬組成物を提供する。
【００２１】
本発明の組成物に用いることができる生体適合性ポリマー材料の具体例としては、これらに限定されないが、エチレン−酢酸ビニルコポリマー類（ＥＶＡｃ）、シリコーンゴム類、たとえばセルロースなどの多糖類、ポリアミド類、ポリアクリレート類、ポリエチレン類、ポリウレタン類、ポリイソブチレンおよびポリホスファゼン類からなる群より選択される生体適合性の分解しにくい（ｎｏｎｄｅｇｒａｄａｂｌｅ）ポリマー、ならびにポリエステル類、ポリ無水物類、ポリオルトエステル類、ポリカプロラクトン、偽ポリアミノ酸類（ｐｓｅｕｄｏｐｏｌｙａｍｉｎｏａｃｉｄｓ）、ポリペプチド類、ゼラチン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸およびポリ（乳酸−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）コポリマー類からなる群より選択される生体内分解性（ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ）ポリマーがあげられる。
【００２２】
１つの好ましい実施態様において、可溶性ＴＮＦαレセプター（ｓＴＮＦ−Ｒ）は、たとえばポリエチレン−酢酸ビニルのマトリックスなどの適当なポリマー材料に、またはポリ（乳酸−グリコール酸）ミクロスフェア中に組み込まれている。
【００２３】
本発明の医薬組成物はｐ５５  ｓＴＮＦ−Ｒまたはｐ７５  ｓＴＮＦ−Ｒを含有しうる。好ましい実施態様において、前記組成物はｐ５５  ｓＴＮＦ−Ｒ（ＴＢＰＩ）を含有する。
【００２４】
１つの実施態様において、本発明の医薬組成物はリガンド、たとえばＴＮＦαの有毒な作用から保護することが望まれる病的状態の治療に用いられる。ｓＴＮＦ−Ｒを含有するポリマーマトリックスは所望の身体区画に置かれ、体内でｓＴＮＦ−Ｒを一定に長期間維持することができる。
【００２５】
別の実施態様において、本発明の医薬組成物は、ＴＮＦα活性を安定化するためまたは増強するためにリガンド、たとえばＴＮＦαとともに用いられ、ＴＮＦαの有益な作用が望まれるいかなる状況においても用いられる。この実施態様の１つの様相において、前記組成物はＴＮＦα／ｓＴＮＦ−Ｒ複合体からなり、腫瘍部位に投与することにより、効果的な局所抗腫瘍機能を可能とし、ＴＮＦαの全身性の望まれない作用を少なくすることができる。この実施態様のほかの様相において、ＴＮＦα／ｓＴＮＦ−Ｒ複合体を含有する組成物はウイルス感染、細菌感染および寄生虫（ｐａｒａｓｉｔｉｃｉｄａｌ）感染、とくに細胞内多細胞寄生虫感染に有用であり、創傷治癒に有用である。
【００２６】
別の実施態様において、本発明はリガンド、たとえばＴＮＦαの有害な作用から患者を保護するために前記患者を治療することからなり、前記患者に制御された形態の有効量の適当な可溶性レセプター、たとえばｓＴＮＦ−Ｒからなる本発明の医薬組成物を投与することからなる。
【００２７】
さらなる実施態様において、本発明は癌の治療に関するものであり、そのような治療を要する患者の腫瘍部位に放出が制御された形態のＴＮＦα／ｓＴＮＦ−Ｒ複合体からなる本発明の医薬組成物を投与することからなる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、累積したＴＢＰＩ放出に対する粒子サイズの効果を示す。３種類のサイズ範囲のＴＢＰＩ＋ＢＳＡ粉末粒子を３０％の充填率（ｌｏａｄｉｎｇ）でエチレン−酢酸ビニルコポリマー（ＥＶＡｃ）マトリックスに組み込んだ：（ｉ）＜７５μｍ（◆）、（ii）７５〜２５０μｍ（□）および（iii）２５０〜４２５μｍ（●）。
【図２】図２は、累積したＴＢＰＩ放出に対する充填率の効果を示す。７５〜２５０μｍの粒子サイズ範囲を用いて、ＴＢＰＩ＋ＢＳＡの充填物を含有するＥＶＡｃマトリックスを調製した：（ｉ）１０％充填率（◆）、（ii）３０％充填率（□）および（iii）５０％充填率（●）。
【図３】図３は、可溶性ＴＮＦαレセプターＩ（ＴＢＰＩ）のみ、またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と共に組み込んだＴＢＰＩの、（ｉ）ポリ乳酸−グリコール酸（ＰＬＧＡ）７５：２５（それぞれ○および●）、（ii）ＰＬＧＡ５０：５０（それぞれ□および黒塗り四角）、および（iii）ポリ−Ｌ−乳酸（ＰＬＬＡ）（それぞれ△および黒塗り三角）のミクロスフェアからの累積放出率（％）を示す。
【図４ａ】図４ａ〜ｃは、ＴＮＦ産生チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（ＣＨＯ／ＴＮＦ）を接種し、ＴＢＰＩまたはマウス抗ＴＮＦモノクローナル抗体ＴＮＦ−１（Ａｂ）で処置したＢａｌｂヌードマウスのインビボの結果を示す。図４ａは、（ｉ）皮下に移植したＥＶＡｃマトリックス中のＴＢＰＩ（●）、（ii）ＰＬＧＡ７５：２５インプラント中のＴＢＰＩ（○）、（iii）ＣＨＯ／ＴＮＦ細胞をマウスに接種した５日後に１回注射した抗ＴＮＦ抗体（Ａｂ−１回）（黒塗り四角）、または（iv）ＣＨＯ／ＴＮＦ細胞をマウスに接種した５日後とその１週間後に２回注射した抗ＴＮＦ抗体（Ａｂ−２回）（□）で処置したＢａｌｂヌードマウスと、（ｖ）無処置の対照（黒塗り三角）の、群平均体重（ｇ）を示すグラフである。
【図４ｂ】図４ａ〜ｃは、ＴＮＦ産生チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（ＣＨＯ／ＴＮＦ）を接種し、ＴＢＰＩまたはマウス抗ＴＮＦモノクローナル抗体ＴＮＦ−１（Ａｂ）で処置したＢａｌｂヌードマウスのインビボの結果を示す。図４ｂは、マウス血清中の生物活性のあるＴＮＦα濃度をインビトロで評価した結果を表す。ＴＮＦα産生チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を担持するマウスから、ＥＶＡｃ中のＴＢＰＩ（●）またはＰＬＧＡ７５：２５中のＴＢＰＩ（○）の移植後、または１回（黒塗り四角）もしくは２回（□）の抗ＴＮＦα抗体の注射後、あるいは無処置のマウスから（黒塗り三角）、図４ｂに示した日数間隔で血清を集め、その血清を１：１００の希釈率で、シクロヘキシミド（２５μｇ／ｍｌ）の存在下、培養ＭＨＡ２細胞（ＨｅＬａ細胞に由来する細胞、９ｍＭマイクロウェルあたり３×１０４細胞で接種した２４時間後）に１０時間適用したのち、ニュートラルレッド取り込み法（Ｗａｌｌａｃｈら、１９８４年）で細胞の生存能力を評価することによって、血清中のＴＮＦαの生物活性を決定した。
【図４ｃ】図４ａ〜ｃは、ＴＮＦ産生チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（ＣＨＯ／ＴＮＦ）を接種し、ＴＢＰＩまたはマウス抗ＴＮＦモノクローナル抗体ＴＮＦ−１（Ａｂ）で処置したＢａｌｂヌードマウスのインビボの結果を示す。図４ｃは、（ｉ）ＥＶＡｃインプラント中のＴＢＰＩ（□）、（ii）ＰＬＧＡ７５：２５インプラント中のＴＢＰＩ（●）、（iii）抗ＴＮＦ抗体１回（△）、または（iv）抗ＴＮＦ抗体２回（黒塗り三角）で処置したマウス、および（ｖ）無処置の対照（○）に関する生存率のグラフを表す。
【図５】図５は、ＴＢＰＩを含有するＥＶＡｃマトリックスをマウスの身体の異なる部位に移植したばあいの、ＴＢＰＩ濃度放出に対する効果を示す：首（●）、背中（○）および腹部（黒塗り四角）。
【図６】図６は、ＴＢＰＩを含むＥＶＡｃ（黒のカラム）もしくはＥＶＡｃのみ（灰色のカラム）のインプラントで処置した遺伝子導入Ｔｇ１９７関節炎マウス子孫、また無処置の前記マウス（対照）（白いカラム）の、異なる発育段階における関節炎の進行を示す、果関節（ａｎｋｌｅ  ｊｏｉｎｔ）の腫脹（ｍｍ）を表すグラフである。
【図７】図７は、実験期間（６５日間）中毎週１回（黒のカラム）または２週間にわたって週１回（灰色のカラム）、抗ＴＮＦα抗体で処置した遺伝子導入Ｔｇ１９７関節炎マウス子孫、および無処置の前記マウス（対照）（白のカラム）の、異なる発育段階における関節炎の進行を示す、果関節の腫脹（ｍｍ）を表すグラフである。
【図８】図８は、ＴＢＰＩを含むＥＶＡｃ（●）もしくはＥＶＡｃのみ（○）のインプラントで処置した、または無処置（対照）（黒塗り四角）の、Ｔ細胞においてヒトＴＮＦαのｍＲＮＡを発現する遺伝子導入Ｔｇ２１１マウスの群平均体重（ｇ）を表すグラフである。
【図９】図９は、実験期間（５０日間）中毎週１回（黒塗り三角）もしくは２週間にわたって週１回（△）、抗ＴＮＦα抗体で処置した、または無処置（対照）（黒塗り四角）の、遺伝子導入Ｔｇ２１１マウスの群平均体重（ｇ）を表すグラフである。
【図１０】図１０は、ＴＢＰＩを含むＥＶＡｃ（●）もしくはＥＶＡｃのみ（○）のインプラントで処置した、または無処置（対照）（黒塗り四角）の、遺伝子導入Ｔｇ２１１マウスに関する生存率のグラフを表す。
【図１１】図１１は、６５日間にわたって毎週１回（●）もしくは２週間にわたって週１回（○）抗ＴＮＦα抗体で処置した、または無処置（対照）（黒塗り四角）の、遺伝子導入Ｔｇ２１１マウスに関する生存率のグラフを表す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明は、そのリガンドに結合して、たとえば、有害な作用を持つリガンドを中和し、またはリガンドの活性を安定化／増強するなどの、リガンドの活性に影響を及ぼすことのできる任意の可溶性レセプターの制御された放出に関する。そのような可溶性レセプターの具体例としては、たとえばＴＮＦα、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−６などのサイトカイン類の可溶性レセプターがあげられる。
【００３０】
好ましい実施態様において、本発明の組成物は、天然の供給源［たとえばヒトの尿（Ｅｎｇｅｌｍａｎｎら、１９８９年；Ｅｎｇｅｌｍａｎｎら、１９９０年；Ｏｌｓｏｎら、１９８９年；Ｓｅｃｋｉｎｇｅｒら、１９８９年）］から、または組換え技術（ＥＰ４３３９００；Ｎｏｐｈａｒら、１９９０年；Ｓｃｈａｌｌら、１９９０年およびＬｏｅｔｓｃｈｅｒら、１９９０年）によってえることができ、ついで、たとえばＥＰ３０８３７８やＥＰ３９８３２７に記載されたようにさらに精製できるｓＴＮＦ−Ｒからなる。
【００３１】
本明細書において「ｓＴＮＦ−Ｒ」、「ｐ５５  ｓＴＮＦ−Ｒ」「ｐ７５  ｓＴＮＦ−Ｒ」という用語は、天然の供給源に由来する全てのｓＴＮＦまたは組換えＤＮＡ技術によってえられる全てのｓＴＮＦを意味し、たとえばＥＰ３０８３７８やＥＰ３９８３２７に記載のＴＮＦ結合蛋白質ＩおよびIIを含むが、これらに限定されるものではない。
【００３２】
本発明で使用できるポリマーとしては、エチレン−酢酸ビニルコポリマー類、シリコーンゴム類、たとえばセルロースなどの多糖類、ポリアミド類、ポリアクリレート類、ポリエチレン類、ポリイソブチレン、ポリウレタン類およびポリホスファゼン類から選択される生体適合性の分解しにくいポリマー、ならびにポリエステル類、ポリオルトエステル類、ポリカプロラクトン、ポリペプチド類、偽ポリ（アミノ酸）、ゼラチン、ポリ無水物類、ポリ−Ｌ−乳酸、ポリ−Ｄ−乳酸、ポリ−Ｄ，Ｌ−乳酸、ポリグリコール酸から選択される生体内分解性ポリマー、さらにポリ−Ｌ−乳酸-グリコール酸、ポリ−Ｄ−乳酸−グリコール酸、ポリ−Ｄ，Ｌ−乳酸-グリコール酸、ポリ−Ｌ−乳酸−Ｄ−乳酸およびポリ−Ｌ−乳酸−Ｄ，Ｌ−乳酸から選択されるコポリマーが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
【００３３】
本発明で好ましく使用されるポリマーは、エチレン−酢酸ビニルコポリマー類（ＥＶＡｃ）、ポリ乳酸−グリコール酸コポリマー（ＰＬＧＡ）およびポリ−Ｌ−乳酸（ＰＬＬＡ）である。
【００３４】
ＥＶＡｃマトリックスに組み込まれたｓＴＮＦ−Ｒからなる医薬組成物は、要すれば、たとえばＲｈｉｎｅら、１９８０年に記載の溶媒キャスティングなどによって、精製後、市販のＥＶＡｃから調製できる。これらのマトリックスは、均一な蛋白質分布、再現性のある動態（ｋｉｎｅｔｉｃｓ）、および数週間から数ヶ月間にもわたる生物学的に活性なｓＴＮＦ−Ｒの長期間の放出を可能にする拡散制御システムを構成する。ＥＶＡｃは生体適合性であるが分解しにくいポリマーなので、ＥＶＡｃマトリックスは、長期間にわたる薬物送達が必要または望ましい適用での使用に適している。
【００３５】
活性成分はたとえばＥＶＡｃなどの分解しにくいポリマー材料からマトリックス中の通路（ｃｈａｎｎｅｌ）を通って拡散によって放出されるので、蛋白質充填率が高いほど拡散が促進される。したがって、好ましい実施態様では、総蛋白質負荷量（ｔｏｔａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｏａｄ）を増大させるために、活性蛋白質を、活性蛋白質に対する生物学的応答に影響を及ぼさない中性蛋白質と組み合せる。そのような中性蛋白質の具体例としては、ウシ血清アルブミン（ただしこれはヒトへの使用には好ましくない）、ヒトアルブミン、ミオグロビン、ヘモグロビンなどがあげられる。
【００３６】
ポリ−Ｌ−乳酸、ポリグリコール酸およびそれらのコポリマーから選択される生体内分解性ポリマーに組み込まれたｓＴＮＦ−Ｒからなる本発明の医薬組成物では、乳酸および／またはグリコール酸の市販のホモポリマーまたはコポリマーを、インプラントとしての適用にも、注射剤としての適用にも好適なミクロスフェアの形態に調製する。ミクロスフェアは、たとえば、Ｃｏｈｅｎら、１９９１年に記載の二重エマルジョンを用いる改良型溶媒蒸発法などによって調製できる。これらのポリマーは生体内分解性であるので、そのインプラントは容易に注射でき、外科手術を使用する必要も、薬物が枯渇したのちにそのデバイスを摘出する必要もない。活性因子は、制御可能で予測できる放出動態（ｒｅｌｅａｓｅ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ）で放出される。このシステムは、活性因子の数週間から数ヶ月間にもわたる長期間の放出を可能にする。
【００３７】
ｓＴＮＦ−Ｒからなる本発明の医薬組成物は、たとえば敗血症性ショック、移植片宿主病（ＧＶＨＤ）、マラリア、感染性肝炎および結核などの急性疾患、またはたとえば癌に関連したカヘキシーおよび慢性ＧＶＨＤなどの慢性疾患、またはたとえば慢性関節リウマチ、若年型糖尿病、全身性紅斑性狼瘡および多発性硬化症などの自己免疫疾患、または皮膚遅延型過敏性障害（ｓｋｉｎ  ｄｅｌａｙｅｄ−ｔｙｐｅ  ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）におけるＴＮＦαの有害な作用を中和するために使用することができる。
【００３８】
本発明の医薬組成物は、インプラントとして、または局所注射剤として、ｓＴＮＦ−Ｒの制御された送達に適した任意の方法で投与できる。たとえば、慢性関節リウマチの治療には関節窩の滑液中に関節内注射剤として、多発性硬化症の治療では脳脊髄液中にくも膜下注射剤として、また、皮膚障害の治療には局所製剤（たとえばローション）として投与できる。慢性関節リウマチ治療用の組成物は、ほかの抗炎症剤を含んでもよく、多発性硬化症治療用の組成物は多発性硬化症に対するほかの薬剤（たとえばβ−インターフェロンやコポリマー−１（Ｃｏｐ−１）を含んでもよい。
【００３９】
ｓＴＮＦ−Ｒからなる本発明の組成物は、ＴＮＦα作用を遮断するに足る量のｓＴＮＦ−Ｒを体内に送達するように設計される。自己免疫疾患のばあい、本組成物は、自己免疫疾患の経過と重篤度に影響を及ぼし、患者の状態を改善して、その疾患の軽減または緩解を導きうる量のｓＴＮＦ−Ｒを送達するよう設計される。有効量は、投与経路、治療すべき疾患および患者の状態に依存する。患者の血清またはそのほかの適当な体液中のｐ５５  ｓＴＮＦ−Ｒまたはｐ７５  ｓＴＮＦ−Ｒの濃度を公知の方法（ＥＬＩＳＡについてはＡｄｅｒｋａら、１９９１年を参照）で決定すれば、外から投与したｓＴＮＦ−Ｒが生体内で生成したｓＴＮＦ−Ｒを補ってＴＮＦαの有害な活性を中和しうるということを考慮して、その患者に適した投与量を確定するのに役立つであろう。
【００４０】
ＴＮＦα活性の安定化が望まれるばあい、本組成物は、腫瘍部位に投与するためのＴＮＦαとｓＴＮＦ−Ｒの複合体（たとえば１：１複合体）を含む。
【００４１】
以下、実施例と添付の図面によって本発明を例示するが、これらは本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００４２】
材料と方法
材料：固有粘度（ｉ．ｖ．）０．５１ｄｌ／ｇのＰＬＧＡ（５０：５０）、固有粘度０．４８ｄｌ／ｇのＰＬＧＡ（７５：２５）、および固有粘度０．６４ｄｌ／ｇのＰＬＬＡ（ポリ−Ｌ−乳酸）（いずれもピーユーアールエーシー  バイオケム  ビーブィ（ＰＵＲＡＣ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ＢＶ）（オランダ王国）製）を使用した。エチレン−酢酸ビニルコポリマー（ＥＶＡｃ）（４０％酢酸ビニル）（デュポン（Ｄｕｐｏｎｔ）製）；ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（シグマ  ケミカル  カンパニー（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）（アメリカ合衆国）製）；平均分子量７７０００〜７９０００のポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、８８％加水分解型（アルドリッチ  ケミカル  カンパニー（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）製）、およびＴＢＰＩ（ｐ５５  ｓＴＮＦ−Ｒ）（インターファーム  ラボラトリーズ  リミテッド（ＩｎｔｅｒＰｈａｒｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｌｔｄ．）（イスラエル国）製）は、そのまま使用した。ＴＮＦ−１と命名された抗ＴＮＦα抗体は、本発明者らの研究室の１つ（Ｄ．  Ｗａｌｌａｃｈ）でヒト組換えＴＮＦαに対して生じさせたマウスモノクローナル抗体である。
【００４３】
方法：インビトロの放出プロフィールは、バイアルに入れて振とう槽で攪拌したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）に、薬物送達マトリックスを入れることによってえた。試料を定期的に採取し、Ａｄｅｒｋａら（１９９１年）に記載のＴＢＰＩ用酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）で、ＴＢＰＩについて分析した。
【００４４】
ポリマーシステムのインビボの効力は３種類のモデルで調べた：（ｉ）Ｏｌｉｆｆら（１９８７年）に記載のＴＮＦα産生腫瘍細胞（ＣＨＯ／ＴＮＦ）を移植したマウス（これらは死に至る重度のカヘキシーを示す）、（ii）Ｋｅｆｆｅｒら（１９９１年）に記載の遺伝子導入Ｔｇ１９７マウス（これらは関節炎を予測通り発症する）および（iii）Ｐｒｏｂｅｒｔら（１９９３年）に記載の遺伝子導入Ｔｇ２１１マウス（これらはＴ細胞においてヒトＴＮＦαのｍＲＮＡを発現し、著しい組織学的変化と致死的消耗性症候群を発症する）。
【００４５】
実施例１：ＥＶＡｃマトリックスからのｐ５５  ｓＴＮＦ−Ｒ／ＴＢＰＩの制御された放出
エチレン−酢酸ビニルコポリマー（４０重量％酢酸ビニル）を塩化メチレンに溶解して１０％（ｗ／ｖ）溶液をえた。二重蒸留水に溶解したウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）粉末にＴＢＰＩ溶液を加えた。その混合物を凍結乾燥して（−７０℃、５μＨｇで２４時間、ラブ  コンコ（Ｌａｂ  Ｃｏｎｃｏ）製、フリーズ  ドライヤー（Ｆｒｅｅｚｅ  Ｄｒｙｅｒ））粉末にした。ＴＢＰＩ＋ＢＳＡ粉末をふるい分けし、＜７５μｍ、７５〜２５０μｍまたは２５０〜４２５μｍの粒子をえた。１つのサイズ範囲から粉末を計りとって、ガラス製バイアル中のポリマー溶液１５ｍｌに加え、その混合物を、予めドライアイス上で５分間冷却しておいたディスク（直径１ｃｍ、厚さ０．５ｃｍ）の水平なテフロン製の金型の中心にすばやく注いだ。予備冷却中は、過度の霜着きを防ぐために、金型をガラス板で覆った。混合物を注いだのち、金型をドライアイス上に１０分間維持し、その混合物を凍らせた（この段階の最後の７分間は、金型を再び覆った）。凍結した平板（ｓｌａｂ）は冷たいスパチュラで容易に取り出すことができ、それを金網の上に移して、−２０℃で２日間保存した。ついでそのディスクを、温和なハウスライン（ｈｏｕｓｅｌｉｎｅ）真空下（６００ｍｔｏｒｒ）、デシケーター中、室温でさらに２日間乾燥した。ディスクは乾燥によって、直径約０．５ｃｍ、厚さ０．１〜０．２ｃｍに縮んだ。
【００４６】
このポリマー送達システムをＰＢＳ培地に浸した。インビボ実験用には、各ディスクにつき２２．３５μｇのＴＢＰＩを含有する直径０．５ｃｍ、厚さ１〜２ｍｍのディスクとして、ＥＶＡｃマトリックスを調製した。インビトロ実験用のディスクは、４．４７、１３．４１または２２．３５μｇのＴＢＰＩを含有した（充填率１０％、３０％および５０％）。ＴＢＰＩの放出を、ＴＢＰＩ用のＥＬＩＳＡで、時間の関数として検出した（Ａｄｅｒｋａら、１９９１年）。
【００４７】
図１と図２は、ＥＶＡｃマトリックスからの放出動態に対する、薬物粒子サイズと充填率の効果を示す。粒子サイズは薬物放出速度に有意に影響を及ぼした。粒子サイズが大きくなると、放出速度も早くなった（図１）。薬物充填率が大きくなると、薬物放出速度は一様に早くなった（図２）。放出された薬物の総量が増加したばかりでなく、放出速度も早くなった。
【００４８】
薬物の粒子サイズと充填率は、巨大分子ポリマー送達システムの放出動態に著しい影響を及ぼした。巨大分子はポリマーフィルムを通って拡散するには大きすぎるので、マトリックス中のチャンネルを通る拡散によって持続的放出が起こりうる。金型で成形中に巨大分子を組み込むとこのようなチャンネルが形成され、それを通って、溶解した薬物が拡散できる。粒子サイズが大きくなることによって生じる放出速度の増大は、ポリマーマトリックス中に、より大きいチャンネル孔が形成したからであろう。また、充填率を大きくすると、拡散用の通路がより単純になり（通路の曲がりが少なくなり）、多孔性が増す（これらは共に、水またはＰＢＳのマトリックスへの流入と蛋白質のマトリックスからの流出とを容易にする）。
【００４９】
実施例２：ＰＬＧＡおよびＰＬＬＡミクロスフェアからのｐ５５  ｓＴＮＦ−Ｒの制御された放出
Ｃｏｈｅｎら（１９９１年）に記載の二重エマルジョンを用いる改良型溶媒蒸発法によって、ポリ（乳酸−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）ミクロスフェアまたはポリ−Ｌ−乳酸（ＰＬＬＡ）ミクロスフェアを調製した。簡単に述べると、ＴＢＰＩ溶液またはＴＢＰＩとＢＳＡの粉末（前記実施例１に記載したように調製したもの）を二重蒸留水に溶解し、それを塩化メチレンに溶解したＰＬＧＡまたはＰＬＬＡに注いだ。その混合物をプローブ型超音波処理装置（ソニック  アンド  マテリアルズ  インコーポレーティッド（Ｓｏｎｉｃ  ＆  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｉｎｃ．）製、モデル  ブィシー（ＶＣ）−２５０）で３０秒間超音波処理して、第１の内部エマルジョン（Ｗ１／０）を形成した。そのエマルジョンを、磁気攪拌子で激しく混合しながら、塩化メチレンで飽和した１％ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）水溶液２ｍｌに注いで、第２のエマルジョン（（Ｗ１／０）Ｗ２）を形成した。えられた二重エマルジョンを２００ｍｌの０．１％ＰＶＡに注ぎ、塩化メチレンがほとんど蒸発するまで、室温で３時間攪拌し続けたところ、固形のミクロスフェアが残った。遠心分離（１０００ｇで１０分間）によってそのミクロスフェアを集め、口径１００μｍのふるいを用いてサイズを整え、凍結乾燥して（１６時間、ラブ  コンコ製、フリーズ  ドライヤー）粉末をえた。とくに指定しないかぎり、比率７５：２５および５０：５０（Ｌ／Ｇ）のＰＬＧＡ、ならびにＰＬＬＡで研究を行なった。
【００５０】
前記のポリマー送達システムをＰＢＳに浸した。１８．２μｇのＴＢＰＩを含有する０．０４ｇのＰＬＧＡまたはＰＬＬＡミクロスフェアを各実験で評価し、ＴＢＰＩの放出を時間の関数としてＥＬＩＳＡで検出した。
【００５１】
図３は、異なるＰＬＧＡコポリマー（５０：５０ないし７５：２５）またはＰＬＬＡミクロスフェアからのＴＢＰＩの累積放出率（％）を示す。２２００時間後でも、ミクロスフェアに組み込まれたＴＢＰＩの１０％しか放出されていないことがわかる。またこのグラフから、ＴＢＰＩをＢＳＡと共に加えたポリマー（ＴＢＰ＋ＢＳＡ）（●、黒塗り四角および黒塗り三角）からのＴＢＰＩの累積放出率の方が、ＢＳＡを加えずＴＢＰＩのみを加えた試料（○、□および△）からの累積放出率よりも高いことがわかる。
【００５２】
実施例３：ポリマーマトリックスから放出されたＴＢＰＩは、ＣＨＯ／ＴＮＦα細胞を接種したマウスにおいて、そのインビボの生物学的活性を保持する
本実施例では、ＴＮＦαの慢性的な有害作用を追跡する方法として、ＴＮＦαのカヘキシー作用に関する周知の動物モデル（すなわちＯｌｉｆｆら（１９８７年）に記載されているようなＴＮＦα産生腫瘍（ＣＨＯ／ＴＮＦα）細胞を移植したｂａｌｂヌードマウス）を使用した。
【００５３】
カヘキシーを達成するため、ｂａｌｂヌードマウスの皮下にＣＨＯ／ＴＮＦα細胞（Ｋｏｒｎら、１９８８年）を接種した。接種は濃度１×１０7細胞／ｍｌの新たにトリプシン処理した細胞系列の懸濁液（１ｍｌ／マウス）を用いて行なった。注射はプラスチック製３ｃｃ注射器に付けた２３ゲージ針を通して行なった。前記細胞を背中、首または腹部の皮下に注射した。毎週数回、尾部の出血によって血清試料を採取した。マウスにＣＨＯ／ＴＮＦαを接種した５日後に移植したポリマーシステムの性能を、血中のＴＢＰＩおよびＴＮＦα濃度、体重の減少および死亡率を追跡することによって評価した。
【００５４】
カヘキシーを達成するためにＴＮＦα産生ＣＨＯ細胞をマウスの皮下に接種した５日後に、前記実施例１および２のポリマーマトリックスをｂａｌｂヌードマウスに移植するか注射し、血中のＴＢＰＩおよびＴＮＦα濃度を追跡（ＥＬＩＳＡ）することによって、それらの性能を評価した。調べたパラメーターは以下の通りである：（１）時間の関数としてのＴＢＰＩの生物学的活性、（２）ＴＢＰＩによる処置と、ヒトＴＮＦαに対するマウス抗体（本発明者らの研究室で作製し、ＴＮＦ−１と命名したもの）の１回注射（ＣＨＯ／ＴＮＦα細胞をマウスに接種してから５日後、「Ａｂ−１回」と表記）または１週間の間隔を置いて２回注射（ＣＨＯ／ＴＮＦα細胞をマウスに接種してから５日後とその１週間後、「Ａｂ−２回」と表記）による処置との比較、（３）マウスの群平均体重とマウスの死亡率の点から見たカヘキシーの進行および（４）移植の部位（首、背中または腹部の皮下）。
【００５５】
ＴＮＦαはカヘキシーの誘因となる可能性があり、腫瘍担持動物に進行性の体重減少を誘発することができる。ＴＮＦα生産腫瘍細胞を移植したマウスで、マトリックスのインビボの効力を調べた。高レベルのＴＮＦαを本質的に産生する１×１０7個のＣＨＯ／ＴＮＦα細胞を注射したマウスは、重度のカヘキシーと体重減少を示して死に至った。ＴＢＰＩを含有するポリマーマトリックスをさらに移植したマウスは、死ぬことなく体重を増やし、マトリックスから放出されたＴＢＰＩが、ＴＮＦαに対する長期間持続する保護を提供することを示した。
【００５６】
腫瘍担持マウスにおけるＴＢＰＩの生物学的活性を評価するために、種々の時点で血清試料を集め、それらに含まれるＴＮＦαの生物活性を、ＭＨＡ２細胞（ＴＮＦα感受性のＨｅＬａ細胞に由来する細胞）に対するそれらの細胞傷害性を決定することによって評価した。図４ｂに示すように、ＴＢＰＩ含有マトリックスの接種は、血清ＴＮＦα生物活性の長期間にわたる有意な減小をもたらし、マトリックスから放出されたＴＢＰＩがＭＨＡ２細胞の細胞表面ＴＮＦαレセプターとのＴＮＦαの結合を強く阻害することを示した。
【００５７】
比較のため、ＴＮＦαに対する抗体をマウスに１回（ＣＨＯ／ＴＮＦα細胞を接種してから５日後、Ａｂ−１回と表記）または２回（ＣＨＯ／ＴＮＦα細胞をマウスに接種してから５日後とその１週間後、Ａｂ−２回と表記）注射した。図４ａに示すように、抗体はマウスの体重に注射時から数日間だけは影響を及ぼした（マウスは体重を維持した）が、そののちは進行性の消耗を発症（ｄｅｖｅｌｏｐ）した。これに対し、ポリマーに組み込んだＴＢＰＩは体内に長時間存在した。
【００５８】
注射した抗ＴＮＦα抗体（ＴＮＦ−１）の作用の持続時間が短いことは、抗体を注射したマウスの血清中のＴＮＦαの生物活性のパターン（図４ｂ）にも現れている。
【００５９】
図４ｃでは、ＴＮＦ−１抗体で処置したマウスが、抗体の注射を止めるとカヘキシーを発症し生き延びられなかったのに対して、制御され局部に集中したＴＢＰＩの放出を可能にするポリマーシステムで処置されたマウスは、５０日以上生存したことがわかる。
【００６０】
これらの結果は、ＴＢＰＩのポリマーをもちいる制御された送達にもとづく治療が消耗性症候群の発症を防止すること、そして、それは毎週注射する必要がなく、ＴＮＦαに対する長期間持続する保護を提供するので、ＴＮＦαに対する抗体の注射よりも好ましいであろうことを示している。そのうえ、天然分子であるから、可溶性ＴＮＦαレセプターは長期間の使用にさらに適している。抗ＴＮＦα抗体は、遅かれ早かれそれらに対する抗体を生じさせることになり、それが抗ＴＮＦα抗体の作用を妨害するであろうから、長期間の使用には適さない。ヒトの抗体または擬ヒト化抗体のばあいも、それらの機能を遮断する抗イディオタイプ抗体が生じるので、同様である。
【００６１】
マトリックスの移植部位の関数としての、マウスの首、背中または腹部に移植したＥＶＡｃのマトリックスからのＴＢＰＩ放出動態には有意な相違はない（図５）。ＴＢＰＩの放出動態は、その放出持続期間すべてにわたって一定である。
【００６２】
実施例４：ポリマーマトリックスから放出されたＴＢＰＩは、遺伝子導入関節炎Ｔｇ１９７マウスにおいて、そのインビボの生物学的活性を保持する
実施例１にしたがって調製したＥＶＡｃマトリックス（出生から１４日後に小手術によって皮下に移植したもの）の遺伝子導入Ｔｇ１９７マウスにおける性能を、果関節の腫脹レベルを追跡することによって評価した。疾患は約４〜６週齢ではっきりわかり、果関節の腫脹を伴った。果関節のさらなる腫脹と肢運動の障害は、約９〜１０週齢で後肢の動きが完全になくなるまで進行した。さらに、進行性の体重減少はこれらのマウスに共通する特徴であった。しかしながら、これらの関節炎マウスを、ＴＢＰＩを含有するＥＶＡｃマトリックスで処置すると、果関節の腫脹が完全に抑えられた（図６）。さらに、処置した動物は正常に発育し、１０週齢を過ぎても関節炎の兆候や体重減少を示さなかった。
【００６３】
比較のため、出生から１４日後に、全処置期間（６５日間）にわたって毎週１回または２週間にわたって週１回、ＴＮＦ−１抗体をマウスに注射した。図７に示すように、全実験期間にわたって毎週１回与えられたばあい（黒のカラム）にのみ、抗体は腫脹に影響を及ぼした。毎週注射されたマウスは正常に発育し、運動障害がこれらのマウスに共通する巨視的特徴となる１０週齢を過ぎても、関節炎の兆候や体重減少を示さなかった。しかしながら、２週間にわたって週に１回注射したマウスは、果関節の腫脹が大きくなり、進行性の体重減少と共に、肢運動の障害が約９〜１０週齢で後肢の運動が完全になくなるまで進行した。
【００６４】
これらの結果は、ＴＢＰＩのポリマーを用いる制御された送達にもとづく治療が、マウスの関節炎の発症を完全に防止すること、そして、それは毎週注射する必要がなく、ＴＮＦαに対する長期間持続する保護を提供するので、ｈＴＮＦαに対する抗体の注射よりも好ましいであろうことを示している。
【００６５】
実施例５：ポリマーマトリックスから放出されたＴＢＰＩは、遺伝子導入Ｔｇ２１１マウスにおいて、そのインビボの生物学的活性を保持する
Ｔ細胞中でヒトＴＮＦのｍＲＮＡを発現する遺伝子導入Ｔｇ２１１マウスは、著しい組織学的変化と致死的な消耗性症候群を発症した。出生から１４日後に移植したＴＢＰＩを含有するポリマーシステムの性能を、体重の減少と死亡率を追跡することによって評価した。個々の動物について毎週数回体重を測定した。ＥＶＡｃマトリックスは小手術で皮下に移植した。
【００６６】
図８および１０に示すように、無処置のマウス（対照群；黒塗り四角）は、重度の進行性体重減少を発症し死に至ったが、ＴＢＰＩを含有するＥＶＡｃマトリックスを移植したマウス（●）は、体重が増加し、全実験期間中生存していた。
【００６７】
比較のため、出生から１４日後に、全実験期間にわたって毎週１回、または２週間にわたって週に１回、ＴＮＦ−１抗体をマウスに注射した。図９に示すように、抗ＴＮＦα抗体の投与は、出生から毎週投与すると消耗性症候群の発症を完全に防止した。しかしながら、２週間にわたって週１回だけ与えたばあいは有効ではなく、図１１に示すように、マウスは死に至る消耗性症候群を発症した。
【００６８】
これらの結果は、ＴＢＰＩのポリマーを用いる制御された送達にもとづく治療が、マウスにおける消耗性症候群の発症を完全に防止すること、そして、それはｈＴＮＦαに対する抗体の注射よりも好ましいであろうことを示している。
【００６９】
これらのインビボの結果は、放出されたＴＢＰＩが、群平均体重変化（図４ａ）とＴＮＦα感受性のＭＨＡ２細胞の高い生存率（図４ｂ）によって示されるように、その生物学的活性を保持することを示している。
【００７０】
本明細書に引用した全ての文献は、雑誌の記事や要約、公開されたもしくは対応する米国または他国の特許出願、発行された米国または他国の特許、またはそのほかのあらゆる文献を含めて、引用文献に記載の全てのデータ、表、図面および本文を含むそのすべてが、参考文献として本明細書の一部を構成するものである。さらに、本明細書に引用した文献で引用されている文献の全内容もすべて、参考文献として本明細書の一部を構成するものである。
【００７１】
公知方法の工程、従来法の工程、公知方法または従来法への言及は、決して本発明の何らかの様相、説明または実施態様が関連技術に開示、教示または示唆されているとの承認ではない。
【００７２】
特定の実施態様に関する前記の説明によって、本発明の一般的性質が完全に明らかになるので、ほかの当業者は、当該技術分野の技術に含まれる知識（本明細書に引用した参考文献の内容を含む）を適用することによって、過度の実験を行なうことなく、また本発明の一般的概念から逸脱することなく、前記の特定の実施態様を容易に変更し、かつ／または種々の応用に適合させることができる。したがって、そのような適合や変更は、本明細書に認められる教示と指導にもとづいて、開示した実施態様と等価な意義と範囲に属すると解される。本明細書における表現と用語は、説明のためになされたものであって、制限を目的とするものではない。したがって本明細書における表現と用語は、一当業者の知識と共に本明細書に認められる教示と指導を考慮して、当業者によって解釈されるべきであると理解すべきである。
【００７３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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