(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定の標的に結合することができるポリペプチドの同定及び単離のための方法であって、
１）核酸のライブラリを提供することであって、該ライブラリは、Ｃ型レクチン様ドメイン（ＣＴＬＤ）の骨格構造を含むポリペプチドの集合体をコードし、該ＣＴＬＤは、以下の主要な２次構造要素：
ａ）β１、α１、α２、β２、β３、β４及びβ５の順番で連続して出現する５本のβ鎖及び２本のαへリックスであって、該β鎖は２つの逆平行βシートに配置されており、１つはβ１及びβ５から成り、もう１つはβ２、β３及びβ４から成る、
ｂ）少なくとも２個のジスルフィド結合であって、１個はα１とβ５とを連結し、もう１個はβ３と、β４とβ５とを連結するポリペプチドセグメントとを連結する、
ｃ）β２とβ３とを連結するループセグメントＡ（ＬＳＡ）、及びβ３とβ４とを連結するループセグメントＢ（ＬＳＢ）である２個のポリペプチドセグメントから成るループ領域、
によって特徴付けられ、そして
該ループ領域の一部又は全てをコードする核酸断片は、多数の核酸断片から成る集合体の無作為に選択された構成成分に置換されており、
２）ディスプレイ系で核酸ライブラリを発現して、ポリペプチドの集合体を得ることであって、そのアミノ酸残基は１以上の配列位置で該ポリペプチドの集合体の種々の構成成分との間で異なっており、
３）該ポリペプチドの集合体を該標的に接触させ、そして
４）該標的に結合することができるポリペプチドを単離する、
工程を含む、方法。
【請求項２】
ループセグメントＡの一部又は全てをコードする核酸断片が、多数の核酸断片から成る集合体の無作為に選択された構成成分に置換されている、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ループセグメントＢの一部又は全てをコードする核酸断片が、多数の核酸断片から成る集合体の無作為に選択された構成成分に置換されている、請求項１記載の方法。
【請求項４】
そのアミノ酸残基は、少なくとも２個の配列位置でポリペプチドの集合体の種々の構成成分との間で異なっている、請求項１記載の方法。
【請求項５】
そのアミノ酸残基は、少なくとも３個の配列位置でポリペプチドの集合体の種々の構成成分との間で異なっている、請求項１記載の方法。
【請求項６】
そのアミノ酸残基は、少なくとも４個の配列位置でポリペプチドの集合体の種々の構成成分との間で異なっている、請求項１記載の方法。
【請求項７】
そのアミノ酸残基は、少なくとも５個の配列位置でポリペプチドの集合体の種々の構成成分との間で異なっている、請求項１記載の方法。
【請求項８】
そのアミノ酸残基は、少なくとも６個の配列位置でポリペプチドの集合体の種々の構成成分との間で異なっている、請求項１記載の方法。
【請求項９】
そのアミノ酸残基は、少なくとも７個の配列位置でポリペプチドの集合体の種々の構成成分との間で異なっている、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
そのアミノ酸残基は、少なくとも８個の配列位置でポリペプチドの集合体の種々の構成成分との間で異なっている、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
そのアミノ酸残基は、少なくとも９個の配列位置でポリペプチドの集合体の種々の構成成分との間で異なっている、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
そのアミノ酸残基は、少なくとも１０個の配列位置でポリペプチドの集合体の種々の構成成分との間で異なっている、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
そのアミノ酸残基は、少なくとも１１個の配列位置でポリペプチドの集合体の種々の構成成分との間で異なっている、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
そのアミノ酸残基は、少なくとも１２個の配列位置でポリペプチドの集合体の種々の構成成分との間で異なっている、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
そのアミノ酸残基は、少なくとも１３個の配列位置でポリペプチドの集合体の種々の構成成分との間で異なっている、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
ループセグメントＡが１５〜７０個のアミノ酸残基を含む請求項１記載の方法。
【請求項１７】
ループセグメントＡが５〜１４個のアミノ酸残基を含む請求項１記載の方法。
【請求項１８】
ループセグメントＢが５〜１２個のアミノ酸残基を含む請求項１記載の方法。
【請求項１９】
ループセグメントＢが２〜４個のアミノ酸残基を含む請求項１記載の方法。
【請求項２０】
該αへリックス及び／又はβ鎖及び／又は連結セグメントのいくつか又は全てをコードする核酸断片が、多数の核酸断片から成る集合体の無作為に選択された構成成分に置換され、該置換は、１０個までのアミノ酸残基が、各々の該ポリペプチド中の該αへリックス及び／又はβ鎖及び／又は連結セグメントにおいて改変されることになる、請求項１記載の方法。
【請求項２１】
Ｃ型レクチン様ドメイン（ＣＴＬＤ）の骨格構造を含むポリペプチドの集合体がテトラネクチンに由来する請求項１記載の方法。
【請求項２２】
Ｃ型レクチン様ドメイン（ＣＴＬＤ）の骨格構造を含むポリペプチドの集合体がヒトテトラネクチン（ｈＴＮ）に由来する請求項１記載の方法。
【請求項２３】
ポリペプチドの集合体が、配列番号１３の５位Ｇｌｕから１８５位Ｖａｌのアミノ酸配列を含むペプチドヒトテトラネクチンレクチンに由来する、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
ポリペプチドの集合体が、配列番号１５の５位Ａｌａから１４１位Ｖａｌのアミノ酸配列を含むペプチドヒトテトラネクチンＣ型レクチン様ドメインに由来する、請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
ポリペプチドの集合体が、配列番号９の５位Ｇｌｕから１８５位Ｖａｌのアミノ酸配列を含むペプチドヒトテトラネクチンに由来する、請求項２２記載の方法。
【請求項２６】
ポリペプチドの集合体が、配列番号１１の５位Ａｌａから１４１位Ｖａｌのアミノ酸配列を含むペプチドヒトテトラネクチン３に由来する、請求項２２記載の方法。
【請求項２７】
図２の１１６位Ｄ（Ａｓｐ）から１２３位Ｗ（Ｔｒｐ）（ループ１）のアミノ酸配列の一部又は全てをコードする核酸断片が、多数の核酸断片から成る集合体の無作為に選択された構成成分に置換されている、請求項２２記載の方法。
【請求項２８】
図２の１２５位Ｄ（Ａｓｐ）から１２９位Ａ（Ａｌａ）（ループ２）のアミノ酸配列の一部又は全てをコードする核酸断片が、多数の核酸断片から成る集合体の無作為に選択された構成成分に置換されている、請求項２２記載の方法。
【請求項２９】
図２の１３５位Ｎ（Ａｓｎ）から１４３位Ｑ（Ｇｌｎ）（ループ３）のアミノ酸配列の一部又は全てをコードする核酸断片が、多数の核酸断片から成る集合体の無作為に選択された構成成分に置換されている、請求項２２記載の方法。
【請求項３０】
図２の１４５位Ｄ（Ａｓｐ）から１５１位Ｎ（Ａｓｎ）（ループ４）のアミノ酸配列の一部又は全てをコードする核酸断片が、多数の核酸断片から成る集合体の無作為に選択された構成成分に置換されている、請求項２２記載の方法。
【請求項３１】
図２の１５８位Ａ（Ａｌａ）から１６１位Ｇ（Ｇｌｙ）（ループ５）のアミノ酸配列の一部又は全てをコードする核酸断片が、多数の核酸断片から成る集合体の無作為に選択された構成成分に置換されている、請求項２２記載の方法。
【請求項３２】
配列番号１５の７７位Ｍｅｔから８２位Ｔｈｒのアミノ酸配列の一部又は全てをコードする核酸断片が、多数の核酸断片から成る集合体の無作為に選択された構成成分に置換されている、請求項２４記載の方法。
【請求項３３】
配列番号１５の９７位Ｇｌｕから１０２位Ａｌａのアミノ酸配列の一部又は全てをコードする核酸断片が、多数の核酸断片から成る集合体の無作為に選択された構成成分に置換されている、請求項２４記載の方法。
【請求項３４】
配列番号１５の１０８位Ｌｙｓから１０９位Ｔｈｒのアミノ酸配列の一部又は全てをコードする核酸断片が、多数の核酸断片から成る集合体の無作為に選択された構成成分に置換されている、請求項２４記載の方法。
【請求項３５】
配列番号１５の１１６位Ｓｅｒから１２２位Ｌｙｓのアミノ酸配列の一部又は全てをコードする核酸断片が、多数の核酸断片から成る集合体の無作為に選択された構成成分に置換されている、請求項２４記載の方法。
【請求項３６】
配列番号１２の１２１位Ｍｅｔから１２３位Ａｌａのアミノ酸配列の一部又は全てをコードする核酸断片が、多数の核酸断片から成る集合体の無作為に選択された構成成分に置換されている、請求項２２記載の方法。
【請求項３７】
配列番号１２の１２５位Ｇｌｙから１２６位Ｔｈｒのアミノ酸配列の一部又は全てをコードする核酸断片が、多数の核酸断片から成る集合体の無作為に選択された構成成分に置換されている、請求項２２記載の方法。
【請求項３８】
配列番号１２の１４１位Ｇｌｕから１４６位Ａｌａのアミノ酸配列の一部又は全てをコードする核酸断片が、多数の核酸断片から成る集合体の無作為に選択された構成成分に置換されている、請求項２２記載の方法。
【請求項３９】
配列番号１２の１５０位Ｇｌｙから１５３位Ｔｈｒのアミノ酸配列の一部又は全てをコードする核酸断片が、多数の核酸断片から成る集合体の無作為に選択された構成成分に置換されている、請求項２２記載の方法。
【請求項４０】
配列番号１２の１６８位Ｐｈｅ（β４において）のアミノ酸配列をコードする核酸断片が、多数の核酸断片から成る集合体の無作為に選択された構成成分に置換されている、請求項２２記載の方法。
【請求項４１】
Ｃ型レクチン様ドメイン（ＣＴＬＤ）の骨格構造を含むポリペプチドの集合体がマウステトラネクチンに由来する請求項１記載の方法。
【請求項４２】
ポリペプチドの集合体が、配列番号３６の５位Ｇｌｕから１８５位Ｖａｌのアミノ酸配列を含むペプチドマウステトラネクチンレクチンに由来する請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
ポリペプチドの集合体が、配列番号３８の５位Ａｌａから１４１位Ｖａｌのアミノ酸配列を含むペプチドマウステトラネクチンＣ型レクチン様ドメインに由来する請求項４１記載の方法。
【請求項４４】
Ｃ型レクチン様ドメイン（ＣＴＬＤ）の骨格構造を含むポリペプチドの集合体がマンノース結合蛋白質（ＭＢＰ）に由来する請求項１記載の方法。
【請求項４５】
配列番号５９の７０位Ａｓｐから７６位Ｇｌｎのアミノ酸配列の一部又は全てをコードする核酸断片が、多数の核酸断片から成る集合体の無作為に選択された構成成分に置換されている、請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
配列番号５９の９７位Ａｓｐから１０１位Ｇｌｙのアミノ酸配列の一部又は全てをコードする核酸断片が、多数の核酸断片から成る集合体の無作為に選択された構成成分に置換されている、請求項４４記載の方法。
【請求項４７】
Ｃ型レクチン様ドメイン（ＣＴＬＤ）の骨格構造を含むポリペプチドの集合体がサーファクタント蛋白質Ｄ（ＳＰ−Ｄ）に由来する請求項１記載の方法。
【請求項４８】
Ｃ型レクチン様ドメイン（ＣＴＬＤ）の骨格構造を含むポリペプチドの集合体がヒト肺サーファクタント蛋白質Ｄ（ＳＰ−Ｄ）に由来する請求項１記載の方法。
【請求項４９】
配列番号６１の７３位Ａｓｐから７９位Ｌｙｓのアミノ酸配列の一部又は全てをコードする核酸断片が、多数の核酸断片から成る集合体の無作為に選択された構成成分に置換されている、請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
配列番号６１の１００位Ａｓｐから１０４位Ｓｅｒのアミノ酸配列の一部又は全てをコードする核酸断片が、多数の核酸断片から成る集合体の無作為に選択された構成成分に置換されている、請求項４８記載の方法。
【請求項５１】
Ｃ型レクチン様ドメイン（ＣＴＬＤ）の骨格構造を含むポリペプチドの集合体がＮＫ受容体（ＬＹ４９Ａ）に由来する請求項１記載の方法。
【請求項５２】
Ｃ型レクチン様ドメイン（ＣＴＬＤ）の骨格構造を含むポリペプチドの集合体がアシアロ糖蛋白質受容体のＨ１サブユニット（Ｈ１−ＡＳＲ）に由来する請求項１記載の方法。
【請求項５３】
Ｃ型レクチン様ドメイン（ＣＴＬＤ）の骨格構造を含むポリペプチドの集合体がマクロファージマンノース受容体ドメイン４（ＭＭＲ−４）に由来する請求項１記載の方法。
【請求項５４】
Ｃ型レクチン様ドメイン（ＣＴＬＤ）の骨格構造を含むポリペプチドの集合体が凝固因子ＩＸ／Ｘ−結合蛋白質に由来する請求項１記載の方法。
【請求項５５】
Ｃ型レクチン様ドメイン（ＣＴＬＤ）の骨格構造を含むポリペプチドの集合体がリソスタチン（ｌｉｔｈｏｓｔａｔｉｎｅ：Ｌｉｔ）に由来する請求項１記載の方法。
【請求項５６】
Ｃ型レクチン様ドメイン（ＣＴＬＤ）の骨格構造を含むポリペプチドの集合体が尾索類Ｃ型レクチン（ＴＵ１４）に由来する請求項１記載の方法。
【請求項５７】
ディスプレイ系が、
（Ｉ）ファージディスプレイ系、又は
（ＩＩ）核酸のライブラリが真核ウイルスのウイルス核酸に挿入されたウイルスディスプレイ系、又は
（ＩＩＩ）細胞内に維持され、それ自体発現することが可能で、
（ａ）細菌細胞、
（ｂ）酵母細胞、又は
（ｃ）ほ乳類細胞の表面上で細胞表面ディスプレイするために適した宿主ゲノム又は染色体外因子に組み込まれることが可能な核酸担体に、核酸のライブラリが挿入された、又は隣接した細胞をベースとしたディスプレイ系、又は
（ＩＶ）核酸のライブラリを挿入するリボゾーム結合ディスプレイ系、又は
（Ｖ）核酸のライブラリを挿入するプラスミド結合ディスプレイ系、
から選択された、請求項１記載の方法。
【請求項５８】
該標的が、真核細胞、ウイルス、細菌、蛋白質、多糖類、重合体及び有機化合物から成る群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項５９】
該αへリックス及び／又はβ鎖及び／又は連結セグメントのいくつか又は全てをコードする核酸断片が、多数の核酸断片から成る集合体の無作為に選択された構成成分に置換され、該置換は、４個までのアミノ酸残基が、各々の該ポリペプチド中の該αへリックス及び／又はβ鎖及び／又は連結セグメントにおいて改変されることになる、請求項１記載の方法。
【請求項６０】
該αへリックス及び／又はβ鎖及び／又は連結セグメントのいくつか又は全てをコードする核酸断片が、多数の核酸断片から成る集合体の無作為に選択された構成成分に置換され、該置換は、１又は２個のアミノ酸残基が、各々の該ポリペプチド中の該αへリックス及び／又はβ鎖及び／又は連結セグメントにおいて改変されることになる、請求項１記載の方法。
【請求項６１】
該ファージディスプレイ系は、核酸のライブラリが、（ａ）ファージミドベクター、（ｂ）ファージのウイルスゲノム、又は（ｃ）精製された１本鎖又は２本鎖型の精製ウイルス核酸に挿入された繊維状ファージである、請求項５７記載の方法。
【請求項６２】
該ファージディスプレイ系は、核酸のライブラリが、（ａ）精製ラムダファージＤＮＡ、又は（ｂ）ラムダファージ粒子の核酸に挿入されたラムダファージである、請求項５７記載の方法。
【請求項６３】
該真核ウイルスがバキュロウイルスである、請求項５７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明では、いわゆるＣ型レクチン様ドメイン（ＣＴＬＤ）を含有する蛋白質から得られたリガンド結合蛋白質単位のランダムライブラリの作製に関する系について説明するが、Ｃ型レクチンの糖認識ドメイン（ＣＲＤ）がこのような蛋白質ドメインファミリーの一例である。
【０００２】
（発明の背景）
Ｃ型レクチン様ドメイン（ＣＴＬＤ）とは、多くの動物種から単離されたいくつかの蛋白質で確認された蛋白質ドメインファミリーである（Ｄｒｉｃｋａｍｅｒ及びＴａｙｌｏｒ（１９９３）及びＤｒｉｃｋｍｅｒ（１９９９）で論じられている）。最初に、ＣＴＬＤドメインはいわゆるＣ型レクチン（カルシウム依存性糖結合蛋白質）に共通なドメインとして同定され、「糖認識ドメイン」（「ＣＲＤ」）と命名された。さらに最近、このドメインは多くの真核細胞蛋白質に分布していることが明らかになってきており、そのうちのいくつかは糖部分に結合しないので、基準となるドメインはＣＴＬＤと命名された。
【０００３】
ＣＴＬＤは、糖質、脂質、蛋白質、及び氷でさえも含めた非常に様々な化合物に結合することが報告されている（Ａｓｐｂｅｒｇ他（１９９７）、Ｂｅｔｔｌｅｒ他（１９９２）、Ｅｗａｒｔ他（１９９８）、Ｇｒａｖｅｒｓｅｎ他（１９９８）、Ｍｉｚｕｍｏ他（１９９７）、Ｓａｎｏ他（１９９８）、及びＴｏｒｍｏ他（１９９９））。蛋白質の中には、ＣＴＬＤが１コピーのみ存在するものがあれば、このドメインを２個から多数コピーを含有する蛋白質もある。生理学的機能単位において、ＣＴＬＤ数の多様性は、単一コピー蛋白質プロモータがより大きな構造に組み込まれることによって実現することが多い。
【０００４】
ＣＴＬＤは約１２０個のアミノ酸残基から成り、２個又は３個の鎖内ジスルフィド結合を含有することが特徴である。ＣＴＬＤと異なる蛋白質との間のアミノ酸配列レベルでの同一性は比較的低いが、いくつかのＣＴＬＤの３Ｄ構造は非常に保存されおり、構造的な変化は、５個までのループによって限定されることが多いいわゆるループ領域に本質的に限られている。いくつかのＣＴＬＤは、１個又は２個のカルシウム結合部位を含有し、カルシウムと相互作用する側鎖のほとんどはループ領域に位置している。
【０００５】
３Ｄ構造の情報が入手可能なＣＴＬＤに基づいて、基準となるＣＴＬＤの構造的な特徴は７個の主要な２次構造要素（すなわち、５個のβ鎖及び２個のαへリックス）が特徴で、β１、α１、α２、β２、β３、β４及びβ５の順番で出現することが推測された（図１及びその中に挙げた文献）。３Ｄ構造が決定されたＣＴＬＤはいずれも、β鎖は２本の逆平行βシート状に配置されており、１本はβ１及びβ５から成り、もう１本はβ２、β３及びβ４から成る。他のβ鎖、β０は配列中β１より前にあることが多く、存在する場合はβ１、β５シートを組み込んで別の鎖を形成する。さらに、２個のジスルフィド結合のうち、１個はα１とβ５（ＣI〜ＣIV、図１）とを連結し、もう１個はβ３とβ４及びβ５とを連結するポリペプチドセグメント（ＣII〜ＣIII、図１）を連結しており、今までのところ特徴付けられた全てのＣＴＬＤに一様に発見されている。ＣＴＬＤの３Ｄ構造では、これら保存された２次的構造要素は、ここでは集合的に「ループ領域」と呼ぶ、核から突出したいくつかのループのためのコンパクトな骨格を形成する。これらのループは、２セグメント、ループセグメントＡ、ＬＳＡ、及びループセグメントＢ、ＬＳＢから構成されたＣＴＬＤの一次構造に存在する。ＬＳＡは、β２とβ３とを連結した長いポリペプチドセグメントで表され、規則的な二次構造を欠いていることが多く、ループを４個まで含んでいる。ＬＳＢはβ鎖β３及びβ４を連結したポリペプチドセグメントで表される。ＬＳＡの残基は、β４の単一残基と共に、テトラネクチンを含めたいくつかのＣＴＬＤのＣａ2+及びリガンド結合部位に特異性を示した。たとえば、１個又は数個の残基を置換する突然変異誘発研究によって、結合特異性、Ｃａ2+感受性及び／又は親和性の変化はＣＴＬＤドメインによって調節できることが示された［Ｗｅｉｓ及びＤｒｉｃｋａｍｅｒ（１９９６）、Ｃｈｉｂａ他、（１９９９）、Ｇｒａｖｅｒｓｅｎ他、（２０００）］。
【０００６】
前述のように、たとえば、配列比較方法及び蛋白質化学の分野で通常使用される分析手段を使用して、図１に示した構造が特徴づけられたＣＴＬＤ群と予想ＣＴＬＤ配列との配列比較によって評価したとき、ＣＴＬＤ全体にわたる配列同一性は限定されることが多い。このような配列比較では、一般的に予想ＣＴＬＤの残基の２２〜３０％は、少なくとも１個の構造が特徴づけられたＣＴＬＤの対応する残基と同一であろう。図１で示した配列比較は、実際の３Ｄ構造データから厳密に解明され、フレームワークの対応する構造要素のポリペプチドセグメントはまた高い配列同一性を示すという事実によって、配列比較から容易に推定できる一連の直接的な配列構造記号が得られる。
【０００７】
ＣＴＬＤはまた、正確な３Ｄ構造の情報が未だ得られていなくても新型のＣＴＬＤライブラリの構造のフレームワークとして使用できることがわかる。正確な３Ｄ構造が得られていないＣＴＬＤをベースとして、このような新型のＣＴＬＤライブラリを構築するための開始物質を調製するために関連する他の特定の段階は以下の通りで、（１）新規ＣＴＬＤと図１で示した配列との配列比較、及び（２）配列比較によって導かれたフレームワーク構造要素に隣接した位置の指定、２個の保存されたジスルフィド結合（図１のＣI−ＣIV及びＣII−ＣIII）の形成に関連する４個の基準システイン残基を正確に位置決定するために配列比較の微調整の必要性が認められる。これらの段階の主な目的は、β２鎖、β３鎖及びβ４鎖に対応するセグメントが配列に隣接するように、新規ＣＴＬＤのループ領域の配列位置を明らかにすることであろう。このためにさらに参考となるように、２９個の真性ＣＴＬＤの配列を分析して、典型的なテトラペプチド配列の形態、ＣＴＬＤβ２鎖及びβ３鎖の一部として発見されたそれらのコンセンサス配列、及び説明したような位置及び配列特性によるβ４鎖の正確な配置を以下の表１に挙げる。
【０００８】
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【０００９】
２９本のβ２鎖のうち、
１４本はコンセンサス配列ＷＩＧＸと一致することがわかった（そのうち１２本はＷＩＧＬ配列で、１本はＷＩＧＩ配列で、１本はＷＩＧＶ配列であった）；
３本はコンセンサス配列ＷＬＧＸと一致することがわかった（そのうち１本はＷＬＧＬ配列で、１本はＷＬＧＶ配列で、１本はＷＬＧＡ配列であった）；
３本はＷＭＧＬ配列であることがわかった；
３本はコンセンサス配列ＹＬＸＭと一致することがわかった（そのうち２本はＹＬＳＭ配列で、１本はＹＬＧＭ配列であった）；
２本はＷＶＧＸ配列であることがわかった（そのうち１本はＷＶＧＬ配列で、１本はＷＶＧＡ配列であった）；及び
収集したうちの残り４本のβ２鎖の配列はそれぞれ、ＦＬＧＩ、ＦＶＧＬ、ＦＩＧＶ及びＦＬＳＭ配列であった。
【００１０】
したがって、４本の残りのβ２コンセンサス配列（「β２ｃｓｅｑ」）は以下のように定められるものと考えられる。
残基１：芳香族残基、最も好ましくはＴｒｐ、より好ましくはＰｈｅで、やや好ましくはＴｙｒである。
残基２：脂肪族又は非極性残基、最も好ましくはＩｌｅ、より好ましくはＬｅｕ又はＭｅｔで、やや好ましくはＶａｌである。
残基３：脂肪族又は親水性残基、最も好ましくはＧｌｙで、やや好ましくはＳｅｒである。
残基４：脂肪族又は非極性残基、最も好ましくはＬｅｕで、より好ましくはＭｅｔ、Ｖａｌ、又はＩｌｅである。
【００１１】
したがって、β２コンセンサス配列は以下のように要約することができる。
β２ｃｓｅｑ：（Ｗ，Ｙ，Ｆ）−（Ｉ，Ｌ，Ｖ，Ｍ）−（Ｇ，Ｓ）−（Ｌ，Ｍ，Ｖ，Ｉ）
式中、下線を引いた残基はこの配列位置で最も一般的に見られる残基を示す。
【００１２】
分析した２９本のβ３鎖全ては、公知のＣＴＬＤ配列全ての標準となるＣｙｓII残基で始まっており、２９本のβ３鎖のうち、
５本はコンセンサス配列ＣＶＸＩと一致することがわかった（そのうち３本はＣＶＥＩ配列で、１本はＣＶＴＩ配列で、１本はＣＶＱＩ配列であった）；
４本はコンセンサス配列ＣＶＸＭと一致することがわかった（そのうち２本はＣＶＥＭ配列で、１本はＣＶＶＭ配列で、１本はＣＶＭＭ配列であった）；
６本はコンセンサス配列ＣＶＸＬと一致することがわかった（そのうち２本はＣＶＶＬ配列で、２本はＣＶＳＬ配列で、１本はＣＶＨＬ配列で、１本はＣＶＡＬ配列であった）；
３本はコンセンサス配列ＣＡＸＬと一致することがわかった（そのうち２本はＣＡＶＬ配列で、１本はＣＡＳＬ配列であった）；
２本はコンセンサス配列ＣＡＸＦと一致することがわかった（そのうち１本はＣＡＨＦ配列で、１本はＣＡＥＦ配列であった）；
２本はコンセンサス配列ＣＬＸＬと一致することがわかった（そのうち１本はＣＬＥＬ配列で、１本はＣＬＧＬ配列であった）；及び
収集したうちの残りの７本のβ３鎖の配列はそれぞれ、ＣＶＹＦ、ＣＶＡＱ、ＣＡＨＶ、ＣＡＨＩ、ＣＬＥＩ、ＣＩＡＹ、及びＣＭＬＬ配列であった。
【００１３】
したがって、４本の残りのβ３コンセンサス配列（「β３ｃｓｅｑ」）は以下のように定められるものと考えられる。
残基１：Ｃｙｓ、ＣＴＬＤの標準的ＣｙｓII残基である。
残基２：脂肪族又は非極性残基、最も好ましくはＶａｌ、より好ましくはＡｌａ又はＬｅｕで、やや好ましくはＩｌｅ又はＭｅｔである。
残基３：最も一般的には脂肪族又は荷電残基で、最も好ましくはＧｌｕである。
残基４：最も一般的には脂肪族、非極性、又は芳香族残基で、最も好ましくはＬｅｕ又はＩｌｅで、より好ましくはＭｅｔ又はＰｈｅでやや好ましくはＴｒｙ又はＶａｌである。
【００１４】
したがって、β３コンセンサス配列は以下のように要約することができる。
β３ｃｓｅｑ：（Ｃ）−（Ｖ，Ａ，Ｌ，Ｉ，Ｍ）−（Ｅ，Ｘ）−（Ｌ，Ｉ，Ｍ，Ｆ，Ｙ，Ｖ）
式中、下線を引いた残基はこの配列位置で最も一般的に見られる残基を示す。
【００１５】
ＣＴＬＤの公知の３Ｄ構造（図１）をよく見ると、β４鎖は一次構造において公知の全ＣＴＬＤの標準的ＣｙｓIII残基に対して−６位から−２位に位置する５個の残基に含まれることが最も多く、それほど多くはないが公知の全ＣＴＬＤの標準的ＣｙｓIII残基に対して−５位から−２位に位置する４個の残基に含まれる。ＣｙｓIIIに対して−３位に位置する残基は、この部位を含むＣＴＬＤのこの部分での２個のカルシウムイオンの配位に関与しており、この考えは表１で分析した２９個のＣＴＬＤ配列のうち、２７個はこの位置にＡｓｐ残基又はＡｓｎ残基を有するが、２個のＣＴＬＤはこの位置にＳｅｒを有するという知見に反映されている。公知のＣＴＬＤの３Ｄ構造から、ＣｙｓIII残基に対して−５位に位置する残基がＣＴＬＤ骨格の疎水性核の形成に関与していることもまた理解されよう。この考えは、分析した２９個のＣＴＬＤ配列のうち、２５個はこの位置にＴｒｐ残基を有し、３個はＬｅｕ残基を有し、１個はＡｌａ残基を有するという知見に反映されている。分析した２９個のＣＴＬＤ配列のうち、１８個は−４位にＡｓｎ残基を有する。さらに、２９本のβ４鎖セグメントのうち１９本はＧｌｙ残基が前にある。
【００１６】
β４鎖の標準ＣｙｓIII残基に対して−５、−４及び−３位に位置する２９個の中心的な３残基モチーフのうち、
２２個は配列ＷＸＤであり（１８個はＷＮＤ、２個はＷＫＤ、１個はＷＦＤで、１個はＷＷＤであった）、
２個はＷＸＮ配列であり（１個はＷＶＮで、１個はＷＳＮであった）、
残りの５個のモチーフ（ＷＲＳ、ＬＤＤ、ＬＤＮ、ＬＫＳ及びＡＬＤ）はそれぞれ分析中１回だけ現れた。
【００１７】
現在では、ＣＴＬＤドメインファミリーのそれぞれの要素ドメインは、新規蛋白質ライブラリを構築するための魅力的な標的であり、それによって新しいリガンド標的に親和性のある要素ドメインがスクリーニング及び選択方法を使用して同定及び単離できることがわかってきた。このようなライブラリは、ＣＴＬＤのループ領域が部分的又は完全に１個又は複数のランダムポリペプチドセグメントで置換されたＣＴＬＤフレームワーク構造を結合することによって構築することができる。
【００１８】
骨格として使用した蛋白質がテトラネクチン又はテトラネクチンのＣＴＬＤドメインであるような１系が特に興味深い系として認識されているのは、テトラネクチンプロモータの３量体複合体の安定性が非常に優れているために他ならない（国際特許出願公開番号ＷＯ９８／５６９０６  Ａ２）。
【００１９】
テトラネクチンは３量体の糖蛋白質で（Ｈｏｌｔｅｔ他（１９９７）、Ｎｉｅｌｓｅｎ他（１９９７））、ヒト血漿から単離され、ある組織の細胞外マトリックスに存在することが発見された。テトラネクチンは、カルシウム、多糖類複合体、プラスミノーゲン、フィブリノーゲン／フィブリン、及びアポリポ蛋白質（ａ）に結合することが知られている。プラスミノーゲンとアポリポ蛋白質（ａ）との相互作用は、その中のいわゆるクリングル４蛋白質ドメインが媒介している。この相互作用はカルシウム及びアミノ酸リジンの誘導体に対して感受性であることが知られている（Ｇｒａｖｅｒｓｅｎ他（１９９８））。
【００２０】
ヒトテトラネクチンは特徴づけられており、ヒト及びマウス両方のテトラネクチンｃＤＮＡクローンが単離された。ヒト及びマウス両方の成熟蛋白質は１８１個のアミノ酸残基を含む（図２）。完全長組換えヒトテトラネクチン及び単離されたテトラネクチンＣＴＬＤの３Ｄ構造は、２つの別々の研究で決定された（Ｎｉｅｌｓｅｎ他（１９９７）及びＫａｓｔｒｕｐ他（１９９８））。テトラネクチンは２個又は場合によっては３個のドメインを有する蛋白質で、すなわちポリペプチド鎖の主な部分がＣＴＬＤを含み（アミノ酸残基Ｇｌｙ５３からＶａｌ１８１）、一方Ｌｅｕ２６からＬｙｓ５２の領域はアルファへリックスをコードし、平行コイルドコイルホモ３量体の形成による蛋白質の３量体形成を制御する。Ｇｌｕ１からＧｌｕ２５のポリペプチドセグメントは、多糖類複合体が結合する部位（Ｌｙｓ６からＬｙｓ１５）を含み（Ｌｏｒｅｎｔｓｅｎ他（２０００））、３量体構造の安定性に寄与しているようである（Ｈｏｌｔｅｔ他（１９９７））。２種類のアミノ酸残基Ｌｙｓ１４８及びＧｌｕ１５０はループ４に位置し、（β４に位置する）Ａｓｐ１６５はプラスミノーゲンクリングル４結合に極めて重要で、一方（ループ３の）残基Ｉｌｅ１４０及び（β４の）Ｌｙｓ１６６及びＡｒｇ１６７は、いくらか重要であることが示された（Ｇｒａｖｅｒｓｅｎ他（１９９８））。芳香族残基による（ループ４の）Ｔｈｒ１４９の置換は、テトラネクチンのクリングル４に対する親和性を著しく増大させ、プラスミノーゲンクリングル２に対する親和性を野生型テトラネクチンのクリングル４に対する親和性に匹敵する程度まで増大させることが示された（Ｇｒａｖｅｒｓｅｎ他（２０００））。
【００２１】
（発明の目的）
本発明の目的は、関心のある物質に高い親和性及び特異性で結合することが可能な結合部位を付与された有用な蛋白質産物を創出する新しい実用的方法を提供することである。
【００２２】
本発明では、組換え抗体分野で通常使用される標準的なコンビナトリアル蛋白質化学方法を適用することによって、このような新規の有用な蛋白質産物を有利に得て、各要素ドメインがＣＴＬＤと類似した本質的に共通な核構造を含有する蛋白質基本単位のランダムコンビナトリアルライブラリを作製することができる１方法を説明する。
【００２３】
天然に生じるＣＴＬＤの結合部位の立体配置が様々であることによって、共通の核構造は本質的に立体配置が異なる多くのリガンド結合部位を含み得ることが示唆される。したがって、ＣＴＬＤは特によく研究されており、このような所望する結合特性を備えた有用な新規蛋白質産物を構築する基礎として役立っている。
【００２４】
実用面では、現在抗体生成物を生化学的技術アッセイ系又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏにおける診断アッセイ系の重要な試薬として、又は治療組成物の活性成分として使用している適用において、新規の人工的ＣＴＬＤ蛋白質生成物を使用することができる。
【００２５】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ系の成分として使用する場合、この人工ＣＴＬＤ蛋白質産物は、新規蛋白質産物の結合部位がそれぞれ、単一の構造的に自立した蛋白質ドメインに含まれるような抗体誘導体であることが好ましい。ＣＴＬＤドメインは、蛋白質分解に耐性で、ＣＴＬＤのＮ末端又はＣ末端に他の蛋白質ドメインが接着してもリガンド結合部位の安定性も接近しやすさも損なわれない。したがって、基本分子を組み立てて構築するために、たとえば、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ又は任意のその他のシグナル媒介部分のような適切なレポータ基本単位に加えて特異性が同一又は同一ではない複数のＣＬＴＤを含めるために、ＣＴＬＤ結合基本単位を構造単位として容易に利用することができる。
【００２６】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける診断又は治療目的のために使用する組成物の本質的な成分としてｉｎ  ｖｉｖｏで使用する場合、ヒトＣＴＬＤに基づいて構築された人工的ＣＴＬＤ蛋白質産物は、体内に既に存在する対応する天然のＣＴＬＤ蛋白質とほぼ同一であり、したがって患者で惹起される免疫応答は最小限であるものと予期される。単一ＣＴＬＤの大きさは、機能を備えた最小抗体誘導体、１本鎖Ｆｖ誘導体の約半分で、大きさが小さいことによって、組織によりよく浸透及び分布することができ、並びに循環中の半減期が短いので適用によっては有利であることができる。たとえば完全なテトラネクチン３量体又はさらに多量体化したコレクチンに対応するＣＴＬＤ蛋白質の多価形態、たとえば、マンノース結合蛋白質によって、結合容量及び結合力は増大し、循環半減期は長くなる。
【００２７】
本発明の好ましい実施形態の一つの特に有利な点は、マウス及びヒトのテトラネクチンによって例示されるように、ほ乳類テトラネクチンが本質的に同一の構造であるという事実から生じる。種間でこのように保存されていることによって、たとえば、マウスとヒトのテトラネクチン誘導体の間でリガンド結合特異性を定めるポリペプチドセグメントを簡単に交換することが可能となるので、実用面で非常に重要である。任意選択でテトラネクチン誘導体の間で種の遺伝的背景が容易に交換できることは、マウス抗体誘導体の「ヒト化」を実施する際によく知られている複雑さとは全く対照的である。
【００２８】
本発明の他の利点は、
さらに再構成することなく小規模で、及び大規模で細菌（たとえば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）で産生できる最終的な蛋白質産物に最初に選択された蛋白質誘導体を確実に変換する一般的かつ簡単な方法が利用できること（国際特許出願公開番号ＷＯ９４／１８２２７  Ａ２）、
簡単かつ一般的な手段によって同様の機能を有する蛋白質単位に任意にいくつかの同一又は同一ではない結合部位を含め、それによって相互作用の結合能力によって、又は２機能性、又は異なる機能性を備えた分子集合体の構築によって親和性が弱くても活用できるようになること（国際特許出願公開番号ＷＯ９８／５６９０６  Ａ２）、
ＣＴＬＤの１個又は複数の保存された金属結合部位（類）を備えたコンビナトリアルライブラリに２価の金属イオン（たとえば、カルシウムイオン）を添加又は除去することによって結合が調節可能であることである。
【００２９】
（発明の概要）
本発明は、それぞれがＣ型レクチン様ドメイン（ＣＴＬＤ）の骨格構造を有する蛋白質である非常に多くの有用な新規蛋白質を提供するものであり、前記蛋白質はＣＴＬＤの骨格構造が実質的に維持されるような程度までαへリックス及びβ鎖及び連結セグメントが保存されており、一方ループ領域はアミノ酸置換、欠損、挿入又はそれらの任意の組合せによって変更されたモデルＣＴＬＤの変種を含むが、但し、前記蛋白質は以下の表２に挙げたＣ型レクチン様蛋白質又はＣ型レクチンの公知のＣＴＬＤループ誘導体のいずれでもない。
【００３０】
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0004493271.tif 000004
0004493271.tif 000005
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【００３１】
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【００３２】
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【００３３】
通常モデルＣＴＬＤは、以下の主要な第２構造要素を特徴とする図１に示した第２構造配置に適合する３Ｄ構造を有することによって定義される。
β１、α１、α２、β２、β３、β４、及びβ５の順番に並んだ５個のβ鎖及び２個のβへリックスがあり、β鎖は２本の逆平行βシート状に配置されており、１本はβ１及びβ５から成り、もう１本はβ２、β３及びβ４から成ること、
少なくとも２個のジスルフィド結合があり、１個はα１とβ５を連結し、もう１個はβ３とβ４及びβ５を連結するポリペプチドセグメントとを連結すること、
２個のポリペプチドセグメント、β２とβ３とを連結し、一般的に１５〜７０個、又はやや一般的に５〜１４個のアミノ酸残基を含むループセグメントＡ（ＬＳＡ）、β３とβ４とを連結し、一般的に５〜１２個、又はやや一般的に２〜４個のアミノ酸残基を含むループセグメントＢ（ＬＳＢ）から成るループ領域があること。
【００３４】
しかし、正確な３Ｄ構造が入手できないＣＴＬＤもまた、モデルＣＴＬＤとして使用することができる。このようなＣＴＬＤは、アミノ酸配列同一性で表示したとき少なくとも２２％、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも３０％の、ＣＴＬＤファミリーの確認済み要素ドメインとの配列類似性を示し、保存された２個のジスルフィド結合形態を確立するために必要なシステイン残基（すなわち、ＣｙｓI、ＣｙｓII、ＣｙｓIII及びＣｙｓIV）を含有することによって定義される。次に、ループセグメントＬＳＡ及びＬＳＢから成るループ領域、及び隣接したβ鎖構造要素は、図１に示したＣＴＬＤ収集物と配列比較点検することによって確認することができ、β２鎖及びβ３鎖の配列位置は、これらの配列を４残基のコンセンサス配列、β２ｃｓｅｑ及びβ３ｃｓｅｑ、及び保存されたＣｙｓIII残基に対して一般的に−６位から−２位、やや一般的には−５位から−２位に位置するβ４鎖セグメントとを比較し、表１で説明した、前記の発明の背景にある物を除外した−５位及び−３位の特徴的な残基とを比較することによってさらに証明されて明らかとなる。
【００３５】
モデルＣＴＬＤにおいて、ＣＴＬＤの骨格構造が実質的に維持されるような程度までαへリックス及びβ鎖及び連結セグメントが保存されるかどうか決定するために、同様の考察を行う。
【００３６】
モデルＣＴＬＤのαへリックス及び／又はβ鎖及び／又は連結セグメントには１０個まで、好ましくは４個まで、より好ましくは１個又は２個のアミノ酸残基が置換、欠失又は挿入されていることが望ましい可能性がある。特に、ＣＴＬＤの骨格構造を実質的に維持しながら、容易にループ領域の一部又は全部を切除し、変更したアミノ酸配列を挿入するために、ＣＴＬＤをコードするヌクレオチド配列中に１個又は複数個の制限エンドヌクレアーゼ認識部位を導入する結果として、モデルＣＴＬＤのβ鎖中に４残基までを変化させることができる。
【００３７】
特に関心が持たれるのは、モデルＣＴＬＤがテトラネクチンの場合である。周知のテトラネクチン、モデルＣＴＬＤとして使用できるＣＴＬＤは、ヒトテトラネクチン及びマウステトラネクチンである。したがって、本発明による蛋白質にはこのようなモデルＣＴＬＤの変種が含まれる。
【００３８】
本発明による蛋白質には、ＣＴＬＤ変種のＮ末端及び／又はＣ末端の伸長部を含めることができ、このような伸長部には、たとえばエフェクター、酵素、他の結合及び／又は多量体化用官能基が含んでもよい。特に、前記伸長部は、天然のＣ型レクチン様蛋白質又はＣ型レクチン又は機能性膜貫通ドメインを欠損したそれらの「可溶性」変種の非ＣＴＬＤ部分であってもよい。
【００３９】
本発明による蛋白質はまた、ＣＴＬＤ変種を含む部分の多量体、たとえば天然のテトラネクチン３量体の誘導体であってもよい。
【００４０】
好ましい態様では、本発明はＣ型レクチン用ドメイン（ＣＴＬＤ）の骨格構造を有する蛋白質のコンビナトリアルライブラリを提供し、前記蛋白質には、ＣＴＬＤの骨格構造を実質的に維持する様な程度までαへリックス及びβ鎖が保存されており、一方ＣＴＬＤのループ領域又はループ領域の一部は、アミノ酸配列及び／又はアミノ酸残基の数について無作為化されているモデルＣＴＬＤの変種が含まれる。
【００４１】
このようなライブラリを構成する蛋白質には、本発明の前記蛋白質で定義されたモデルＣＴＬＤの変種が含まれ、該変種にはこのような蛋白質について記載された変更を含めることができる。
【００４２】
特に、本発明のコンビナトリアルライブラリは、モデルＣＴＬＤがテトラネクチンのモデルＣＴＬＤ、たとえばヒトテトラネクチン又はマウステトラネクチンのモデルである蛋白質から成ることができる。
【００４３】
本発明のコンビナトリアルライブラリは、ＣＴＬＤ変種のＮ末端及び／又はＣ末端伸長部を含む蛋白質から成ることが可能で、このような伸長部には、たとえばエフェクター、酵素、他の結合及び／又は多量体化用官能基を含めることができる。特に、前記伸長部は、天然のＣ型レクチン用蛋白質又はＣ型レクチン又は機能性膜貫通ドメインを欠損したそれらの「可溶性」変種の非ＣＴＬＤ部分であることが可能である。
【００４４】
本発明によるコンビナトリアルライブラリはまた、ＣＴＬＤ変種を含む部分の多量体である蛋白質、たとえば天然のテトラネクチン３量体の誘導体から構成されてもよい。
【００４５】
本発明はまた、天然テトラネクチンの誘導体であって、そのＣＴＬＤのαへリックス及び／又はβ鎖及び／又は連結セグメントに１０個まで、好ましくは４個まで、より好ましくは１個又は２個のアミノ酸残基が置換、欠失又は挿入されている誘導体並びにこのような誘導体をコードする核酸を提供する。特定の誘導体は、配列番号２、４、９、１１、１３、１５、２９、３１、３６及び３８で表され、特定のテトラネクチン誘導体をコードするヌクレオチド挿入部分を含む核酸は、配列番号１２、１４、３５及び３７で表される。
【００４６】
本発明には、β２、β３又はβ４をコードする核酸セグメント、又はβ２、β３又はβ４をコードする核酸セグメントに属する任意のヌクレオチドから得られた配列の３０ヌクレオチド上流又は下流にエンドヌクレアーゼ制限部位を生じるようにテトラネクチン誘導体をコードする核酸が変更された、本発明によるコンビナトリアルライブラリの調製に適合したテトラネクチン誘導体の構築方法が含まれる。
【００４７】
本発明にはまた、そのＣＴＬＤのループ領域をコードする核酸配列の一部又は全部を無作為化することによって関連する蛋白質をコードするヌクレオチド配列のライブラリを調製するために、テトラネクチンをコードするヌクレオチド配列、又はそのＣＴＬＤの骨格構造が実質的に維持されたそれらの誘導体を使用することが含まれる。
【００４８】
さらに、本発明は、本発明による蛋白質をコードする任意のヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。
【００４９】
特に、本発明は集合して核酸の前記ライブラリを構成する核酸集合体の要素核酸がディスプレイ系で発現することが可能な本発明によるコンビナトリアルライブラリの蛋白質をコードする核酸のライブラリを提供し、ディスプレイされた発現産物の特性を表す表現型をディスプレイする単位と対応する遺伝子型との間の論理的、物理的又は化学的つながりを提供する。
【００５０】
このようなライブラリでは、ディスプレイ系は、
（Ｉ）ファージディスプレイ系、たとえば、
（１）核酸ライブラリが、
（ａ）ファージミドベクター、
（ｂ）ファージのウイルスゲノム、
（ｃ）精製した１本鎖又は２本鎖型の精製ウイルス核酸に挿入された繊維状ファージｆｄ、又は
（２）該ライブラリが、
（ａ）精製ラムダファージＤＮＡ、又は
（ｂ）ラムダファージ粒子の核酸に挿入されたラムダファージ、又は
（ＩＩ）核酸ライブラリがバキュロウイルスなどの真核ウイルスのウイルス核酸に挿入されたウイルスディスプレイ系、又は
（ＩＩＩ）宿主ゲノム又は染色体外因子に組み込まれることが可能で、細胞内でそれ自身が維持され発現し、
（ａ）細菌細胞、
（ｂ）酵母細胞、又は
（ｃ）ほ乳類細胞の表面上での細胞表面ディスプレイに適した核酸担体に核酸ライブラリが挿入されるか、又は隣接している細胞をベースとしたディスプレイ系、又は
（ＩＶ）核酸ライブラリが挿入されたリボソーム結合ディスプレイに適した核酸単位、又は
（Ｖ）核酸ライブラリが挿入されたプラスミド結合ディスプレイに適したプラスミドから選択することができる。
【００５１】
周知の有用なディスプレイ系は、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈによって供給されているファージミドベクター「ｐＣＡＮＴＡＢ  ５Ｅ」を備えた「組換えファージ抗体システム」（コード番号２７−９４０１−０１）である。
【００５２】
さらに、本発明は、本発明による蛋白質であって、スクリーニング又は選択によって１個又は複数のＣＴＬＤライブラリから単離された新規ループ領域配列を有する少なくとも１個又は複数の同一又は異なったＣＴＬＤドメインを含む蛋白質の調製方法を提供する。少なくとも１個のこのようなＣＴＬＤドメインは突然変異によってさらに変更されてもよく、少なくとも１個のＣＴＬＤドメインを含有する蛋白質は化学的、又は酵素的結合又は架橋結合によって２個以上の成分から組み立てられてもよい。
【００５３】
また、本発明は以下の段階、
１）適切なベクターにモデルＣＴＬＤを含む蛋白質をコードする核酸を挿入する段階、
２）必要ならば、部位特異的突然変異によって制限エンドヌクレアーゼ認識部位を導入する段階であって、前記認識部位がＣＴＬＤのループ領域又はその一部をコードする配列の末端又は末端近くの配列に適当に位置している段階、
３）適切な制限エンドヌクレアーゼを使用することによってループ領域又はループ領域の一部をコードするＤＮＡ断片を切除する段階、
４）ＤＮＡ断片混合物を制限ベクターに連結する段階、及び
５）ＣＴＬＤの骨格構造を有する無作為化蛋白質を適切な溶媒中で発現するベクターを導入する段階を含む本発明によるコンビナトリアルライブラリの調製方法を提供する。
【００５４】
他の態様では、本発明は、以下の段階、
１）ディスプレイ系で蛋白質ライブラリをディスプレイするために、請求項５９から請求項６１までのいずれか一項に記載の核酸ライブラリを発現する段階、
２）ディスプレイされた単位収集物を適切なタグ付き標的物質と接触させる段階であって、そのために前記標的物質に親和性を示すＣＴＬＤ由来物の単離が望まれる段階、
３）アフィニティ精製の媒体又は手段として前記標的物質を結合させるか、又は物理的に付着させるか、接着させたタグ、この分野では通常「アフィニティパニング（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｐａｎｎｉｎｇ）」と呼ばれる方法、その後サブライブラリの再増幅を利用して、親和性を基にした選択的抽出によって前記標的物質に親和性を示すディスプレイされた単位の部分集団を収集する段階、
４）適切な少数の優れた結合物候補が得られるまで、パニング及び再増幅を繰り返すことによって着実により優れた結合物を単離する段階、及び
５）所望するならば、個々のクローンのように優れた候補それぞれを単離し、１個又は複数の好ましい産物クローンを最終的に選択するために調製物の通常機能及び構造の特徴付けを行う段階を含む特定の標的を結合するための本発明によるコンビナトリアルライブラリのスクリーニング方法を提供する。
【００５５】
さらに他の態様では、本発明は、本発明によるか、又は本発明によるコンビナトリアルライブラリから選択した蛋白質を再構成し、及びループ領域をコードする核酸断片を切除することによって所望する他の種適合フレームワークに所望する結合特性を示すＣＴＬＤ変種を含める方法、すなわち、ポリペプチドの置換及びＰＣＲ技術を使用した前記蛋白質をコードする核酸の任意の必要な単一フレームワーク変異、部位特異的突然変異又は制限酵素消化及び所望する他のＣＴＬＤフレームワークをコードする核酸配列を含むディスプレイベクター又は蛋白質発現ベクターの適切な位置への前記核酸断片の挿入を提供する。
【００５６】
（発明の詳細な説明）
Ｉ．定義
「Ｃ型レクチン様蛋白質」及び「Ｃ型レクチン」という用語は、任意の真核種に存在する蛋白質、又はゲノムにコードされている蛋白質であって、糖リガンドに結合する１個又は複数のＣＴＬＤ又はＣＴＬＤの亜群、ＣＲＤに属する１個又は複数のドメインを含有する蛋白質を意味するために使用する。この定義には具体的に、膜に接着したＣ型レクチン様蛋白質及びＣ型レクチン、機能性膜貫通ドメインを欠損した「可溶性」Ｃ型レクチン様蛋白質及びＣ型レクチン、及び糖鎖形成又はその他の任意の合成後の変更によって１個又は複数のアミノ酸残基がｉｎ  ｖｉｖｏで変更されたＣ型レクチン様蛋白質及びＣ型レクチンの変種、並びにＣ型レクチン様蛋白質及びＣ型レクチンの化学的変更によって得られた任意の産物が含まれる。
【００５７】
請求の範囲及び明細書を通じて、ＣＴＬＤドメイン又はＣＴＬＤ含有蛋白質のアミノ酸残基番号に関して、ある種の変更を定めることができる。このアミノ酸の番号付けは、ＣＴＬＤあるいは天然又は人工のＣＴＬＤ含有蛋白質産物の最初のＮ末端アミノ酸から開始し、場合によっては、明白な外部文献又は本明細書の本文中に含まれる図の内部文献にそれぞれの場合が示されている。
【００５８】
「アミノ酸」、「アミノ酸類」及び「アミノ酸残基」という用語は、天然に生じるＬ−α−アミノ酸全てを意味する。この定義には、ノルロイシン、オルニチン、及びホモシステインが含まれることになっている。アミノ酸は、１文字又は３文字の名称のいずれかによって識別する。
Ａｓｐ  Ｄ  アスパラギン酸      Ｉｌｅ  Ｉ  イソロイシン
Ｔｈｒ  Ｔ  トレオニン          Ｌｅｕ  Ｌ  ロイシン
Ｓｅｒ  Ｓ  セリン              Ｔｙｒ  Ｙ  チロシン
Ｇｌｕ  Ｅ  グルタミン酸        Ｐｈｅ  Ｆ  フェニルアラニン
Ｐｒｏ  Ｐ  プロリン            Ｈｉｓ  Ｈ  ヒスチジン
Ｇｌｙ  Ｇ  グリシン            Ｌｙｓ  Ｋ  リジン
Ａｌａ  Ａ  アラニン            Ａｒｇ  Ｒ  アルギニン
Ｃｙｓ  Ｃ  システイン          Ｔｒｐ  Ｗ  トリプトファン
Ｖａｌ  Ｖ  バリン              Ｇｌｎ  Ｑ  グルタミン
Ｍｅｔ  Ｍ  メチオニン          Ａｓｎ  Ｎ  アスパラギン
Ｎｌｅ  Ｊ  ノルロイシン        Ｏｒｎ  Ｏ  オルニチン
Ｈｃｙ  Ｕ  ホモシステイン      Ｘｘｘ  Ｘ  任意のＬ−α−アミノ酸
【００５９】
天然に生じるＬ−α−アミノ酸は、化学的組成及び側鎖の特性によって分類することができる。荷電及び非荷電の２つに大きく分類することができる。どちらの群も、アミノ酸をより正確に分類するために亜群に分けられる。
Ａ．荷電アミノ酸
酸性残基：  Ａｓｐ、Ｇｌｕ
塩基性残基：Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｏｒｎ
Ｂ．非荷電アミノ酸
親水性残基：Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ
脂肪族残基：Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｎｌｅ
非極性残基：Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｈｃｙ
芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ
【００６０】
「アミノ酸変更」及び「変更」という用語は、ＣＴＬＤアミノ酸配列のアミノ酸置換、欠失又は挿入又はそれらの組合せを意味する。本発明のＣＴＬＤ変種では、このような変更はＣＴＬＤアミノ酸配列の部位又は部位類に生じる。本明細書での置換による変種は、天然ＣＴＬＤ配列の少なくとも１個のアミノ酸残基が除去され、その場所の同じ位置に異なるアミノ酸が挿入されたものである。置換は１個、すなわち分子中１個のアミノ酸のみが置換されることが可能で、又は複数、すなわち２個以上のアミノ酸が同分子内で置換されることも可能である。
【００６１】
本明細書の置換変種の名称は、１文字、数字、１文字の順に構成される。最初の（最も左の）文字は、天然（未変更）ＣＴＬＤ又はＣＴＬＤ含有蛋白質のアミノ酸を示す。数字は、アミノ酸置換が生じたアミノ酸位置を意味し、第２の（右の）文字は天然アミノ酸と置換するために使用されたアミノ酸を示す。前述のように、場合によっては、番号付けはＣＴＬＤ又はＣＴＬＤ含有蛋白質のＮ末端アミノ酸配列を示す「１」として開始する。変更物が複数ある場合は、読みやすいようにカンマによって分けて表す。
【００６２】
「コードする核酸分子」、「コードするＤＮＡ配列」及び「コードするＤＮＡ」という用語は、デオキシリボ核酸の鎖に沿ったデオキシリボヌクレオチドの順番又は配列を意味する。これらのデオキシリボヌクレオチドの順番は、ポリペプチド鎖に沿ったアミノ酸の順番を決定する。したがって、このようなＤＮＡ配列はアミノ酸配列をコードする。
【００６３】
「変異によって無作為化した配列」、「無作為化したポリペプチドセグメント」、「無作為化したアミノ酸配列」、「無作為化したオリゴヌクレオチド」及び「変異によって無作為化した配列」、並びに無作為化した配列、ポリペプチド又は核酸配列又はセグメントを称するために任意の状況で使用した同様の用語は、ポリペプチド又は核酸の集合体の異なる要素物質の間で、１個又は複数の配列位置のアミノ酸残基又はヌクレオチドが異なってよいポリヌクレオチド又は核酸配列又は部分を意味し、したがって、このような配列位置それぞれに生じるアミノ酸残基又はヌクレオチドは、全ての可能なアミノ酸残基又はヌクレオチド又は限定されたそれらの亜集団を含むことができる一連のアミノ酸残基又はヌクレオチドに属することができる。前記用語は、アミノ酸残基又はヌクレオチドの数が集合体のそれぞれの要素物質で同じである集合体を意味するために使用されることが多いが、また、集合体のそれぞれの要素物質のアミノ酸残基又はヌクレオチドの数が適切な範囲の整数内の任意の整数であることが可能な集合体を意味するために使用することができる。
【００６４】
ＩＩ．コンビナトリアルＣＴＬＤライブラリの構築及び利用
表現型を表すいくつかの系を、推定リガンド結合基本単位又は推定酵素活性を備えた基本単位に関して説明した。これらには、ファージディスプレイ（たとえば、繊維状ファージｆｄ（Ｄｕｎｎ（１９９６）、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ及びＤｕｎｃａｎ（１９９８）、Ｍａｒｋｓ他（１９９２））、ラムダファージ（Ｍｉｋａｗａ他（１９９６））、真核ウイルスにおけるディスプレイ（たとえば、バキュロウイルス（Ｅｒｎｓｔ他（２０００）））、細胞ディスプレイ（たとえば、細菌細胞におけるディスプレイ（Ｂｅｎｈａｒ他（２０００））、酵母細胞（Ｂｏｄｅｒ及びＷｉｔｔｒｕｐ（１９９７））、及びほ乳類細胞（Ｗｈｉｔｅｈｏｒｎ他（１９９５））、リボソーム結合ディスプレイ（Ｓｃｈａｆｆｉｔｚｅｌ他（１９９９））、及びプラスミド結合ディスプレイ（Ｇａｔｅｓ他（１９９６））が含まれる。
【００６５】
表現型ディスプレイ及び遺伝子型に表現型を結合するために最もよく使用される方法はファージディスプレイである。これは、骨格蛋白質又は関心のある蛋白質をコードするリーディングフレームを、ファージ蛋白質を暴露した表面のドメイン内セグメントに挿入することによって実現する。この目的のために、繊維状ファージｆｄ（たとえば、Ｍ１３）が最も有用であることが判明した。ポリペプチド、蛋白質ドメイン、又は蛋白質は、「搬出」シグナルとｆｄ遺伝子ＩＩＩ蛋白質のドメイン１との間、又はｆｄ−ファージ遺伝子ＩＩＩ蛋白質のドメイン２とドメイン３との間のいわゆるヒンジ領域のいずれかに挿入されることが最も多い。新規結合単位を単離するためには、ヒト抗体が最もよく使用される蛋白質であるが、他の蛋白質及びドメインもまた使用されてきた（たとえば、ヒト成長ホルモン（Ｂａｓｓ他（１９９０））、アルカリホスファターゼ（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ他（１９９１））、β−ラクタマーゼ阻害蛋白質（Ｈｕａｎｇ他（２０００））、及び細胞毒性Ｔリンパ球関連抗原４（Ｈｕｆｔｏｎ他（２０００））。抗体は、ｓｃＦｖ又はＦａｂ融合蛋白質として発現し存在することが多い。３種類の方法が使用されている。抗原結合溝内を変異によって無作為化した配列のライブラリを作製するための骨格として特異的な抗体を使用するか（たとえば、Ｆｕｊｉ他（１９９８））、又は非免疫宿主（たとえば、Ｎｉｓｓｉｍ他（１９９４））又は免疫宿主（たとえば、Ｃｙｒ及びＨｕｄｓｐｅｔｈ（２０００））の遺伝子をコードするヒト抗体の大集合体を表すライブラリをｆｄファージベクターにクローニングする。
【００６６】
ＣＴＬＤライブラリを作製するためのディスプレイ系の作製の一般的な実施方法には本質的に、
（１）情報が入手可能であれば、選択したＣＴＬＤの３Ｄ構造を参照することによってループ領域の位置を確認し、又は入手可能でなければ、図１に示した配列と配列比較し、補助としてβ２及びβ３コンセンサス配列要素に対応する配列要素及びβ４鎖特性を確認することによってさらに確かに、β２、β３及びβ４鎖の配列位置を確認すること、
（２）β２、β３及びβ４をコードする配列の近くのエンドヌクレアーゼ制限部位を前もって挿入して、又は挿入しないで、蛋白質ディスプレイベクター系に選択したＣＴＬＤをコードする核酸断片をサブクローニングすること、及び
（３）選択したＣＴＬＤのループ領域のいくつか又は全てをコードする核酸断片と、多数の核酸断片から成る集合体から無作為に選択された要素核酸断片とを置換することであって、受容フレームワークをコードする核酸配列に挿入すると、元のループ領域ポリペプチド断片をコードする核酸断片と無作為に選択した核酸断片とが置換されることが含まれる。元のループセグメント又は完全なループ領域の代わりに新ポリペプチドをコードするクローニングされた核酸断片それぞれは、新しい配列内で決定されたリーディングフレーム中で翻訳される。
【００６７】
核酸断片は、任意の通常の核酸分子クローニング方法によって、たとえば化学的に合成された核酸を受容核酸中に格納する、挿入のためにエンドヌクレアーゼ制限部位が必要ない適切に考案されたＰＣＲ操作によって、受容核酸の特定の位置に挿入することができる。あるいは、エンドヌクレアーゼ制限部位の適切な組合せを、適切に設計されたオリゴヌクレオチド断片を核酸の標準的分子クローニング方法を使用して挿入できる標的の核酸に操作することによって、核酸断片の挿入／切除を容易にすることができる。
【００６８】
制限エンドヌクレアーゼ部位が便宜上挿入されたＣＴＬＤライブラリから単離された興味あるＣＴＬＤ変種は、元のＣＴＬＤに存在する残基に一致することもなく、ＣＴＬＤ変種の興味ある新規親和性の維持に重要でもない変異又は追加アミノ酸残基を含み得ることが明らかであろう。所望するならば、たとえば可能な限り産物に免疫原性を付与しないようにする場合、このような残基は適切ならば、特定のクローンの復帰突然変異又は欠損によって変更又は除去することができる。
【００６９】
多数の核酸断片から成る集合体は、核酸断片の化学合成の各段階において予め限定された純粋なヌクレオチドモノマーの組合せ、又はヌクレオチドモノマーの任意の組合せ混合物を添加するために段階合成を行って、通常の核酸化学的合成法によって得ることができる。この方法では、１個の固有の核酸配列から最も複雑な混合物まで、あらゆる程度の配列縮重が生じる可能性があり、固有の配列の最大数４N（Ｎが配列のヌクレオチドの数である）で完全に又は不完全に表される。
【００７０】
あるいは、多数の核酸断片から成る複合体集合体は、たとえば、任意の生物から抽出されたゲノム核酸のような高分子量核酸組成物の化学的、物理的又は酵素的断片化によって核酸断片混合物を生じさせることによって調製することができる。このような核酸断片混合物を分子集合体作製に役立つようにするために、本明細書で説明したように、最初の切断段階で得られた断片の粗混合物を一般的に大きさによって分画して、後で一般的に、大きさによって制限されたオリゴヌクレオチド断片のリンカー包埋混合物が容易に受容核酸ベクターに挿入するように設計された適切な組合せのリンカー核酸に隣接させる適切な分子量範囲の断片を得る。
【００７１】
本発明の好ましい実施形態のモデルＣＴＬＤ、テトラネクチンのコンビナトリアルＣＴＬＤライブラリの構築を容易にするために、ヒト及びマウス両方のテトラネクチンのβ２、β３及びβ４をコードする核酸配列の近隣に位置する適切な制限部位は、変更された配列によってコードされたポリペプチド配列の混乱が最小限になるように設計された。以下に詳述したように、考案した方法を確立することが可能で、それによって同一のエンドヌクレアーゼ制限部位を２個の配列の対応する位置に導入することができ、興味のあるループ領域変種を容易に組換えマウスＣＴＬＤから切除し、正確にヒトテトラネクチンのＣＴＬＤフレームワークに挿入することが可能で、その逆も可能であることがわかった。
【００７２】
ヒトテトラネクチンの成熟型をコードするヌクレオチド配列を分析すると（図２）、制限エンドヌクレアーゼＢｇｌＩＩの認識部位は位置３２６から３３１に見られ（ＡＧＡＴＣＴ）、β２のコード残基Ｇｌｕ１０９、Ｉｌｅ１１０、及びＴｒｐ１１１に関与し、制限エンドヌクレアーゼＫａｓＩの認識部位は位置３８２から３８７に見られ（ＧＧＣＧＣＣ）、コードアミノ酸残基Ｇｌｙ１２８及びＡｌａ１２９（ループ２のＣ末端に位置する）に関与することが明らかとなる。
【００７３】
部位特異的突然変異によるヒトテトラネクチンをコードするヌクレオチドのＧ５１３からＡ及びＣ５１４からＴへの変異によって、位置５１１から５１６の位置にＭｕｎＩ制限エンドヌクレアーゼ認識部位が導入され、マウステトラネクチンをコードするヌクレオチド配列のＧ５１３からＡへの変異によって、コードされたプロモータのいずれのアミノ酸配列にも影響を及ぼすことなく、ＭｕｎＩ制限エンドヌクレアーゼ部位がヒトテトラネクチンのＭｕｎＩ部位に対応する位置に導入される。マウステトラネクチンをコードするヌクレオチド配列のＣ３２７からＧ及びＧ３８６からＣへの部位特異的突然変異による変異によって、それぞれそこにＢｇｌＩＩ及びＫａｓＩ制限エンドヌクレアーゼ認識部位が導入される。さらに、マウステトラネクチンをコードするヌクレオチド配列のＡ３２５は、Ｇに突然変異させる。これらの３個の変異によって、Ａｓｎ１０９はＧｌｕに、及びＧｌｙ１２９はＡｌａにそれぞれ置換され、コードされたアミノ酸配列に影響を及ぼす。現在、制限エンドヌクレアーゼＫａｓＩは、著しい部位指向性を示し、テトラネクチンコーディング領域のみをゆっくり切断することが知られている。したがって、ＫａｓＩ部位の代わりに他の制限エンドヌクレアーゼの認識部位が好ましい（たとえば、制限エンドヌクレアーゼＫｐｎＩの認識部位、認識配列ＧＧＴＡＣＣ）。得られたテトラネクチン誘導体、ヒトテトラネクチンレクチン（ｈｔｌｅｃ）及びマウステトラネクチンレクチン（ｍｔｌｅｃ）のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を図３に示す。ｈｔｌｅｃ及びｍｔｌｅｃプロモータをコードするヌクレオチド配列は、結合したヌクレオチド配列の蛋白質ディスプレイを可能にする手段（たとえば、ファージミドベクター）及び蛋白質の異種発現用に考案されたプラスミド（たとえば、ｐＴ７Ｈ６、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ他（１９９１））に容易にサブクローンすることができる。ｈｔｌｅｃ又はｍｔｌｅｃのいずれかの変異ＣＴＬＤのみをコードするその他の誘導体もまた構築してファージミドベクター及び発現プラスミドにサブクローニングし、これらのＣＴＬＤ誘導体のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を図４に示す。
【００７４】
テトラネクチン及びＣＴＬＤ誘導体の集合体に制限エンドヌクレアーゼＢｇｌＩＩ、ＫａｓＩ又はＫｐｎＩの通常の認識部位の組合せが存在することによって、無作為化したオリゴヌクレオチドをｈｔｌｅｃ、ｍｔｌｅｃ、ｈｔＣＴＬＤ、又はｍｔＣＴＬＤ誘導体をコードする適切な制限ファージミドベクターに連結することによって、１個又は複数のループ及びレクチンリガンド結合領域を含むβ４の単一の残基位置に無作為化アミノ酸配列を有する蛋白質ライブラリの作製が可能となる。
【００７５】
特定の標的（たとえば、真核細胞、ウイルス、細菌、特定の蛋白質、多糖類、そのほかの重合体、有機化合物など）の選択を何回か行った後、特定のファージからＤＮＡを単離し、決定したリガンド結合領域をコードするセグメントのヌクレオチド配列をファージミドＤＮＡから切り出し、所望する産物の異種産生用の適切な誘導体発現ベクターに移すことができる。原核生物における異種産生は、テトラネクチン及び誘導体の単離及び再生の効果的な方法が報告されているので（国際特許出願公開番号ＷＯ９４／１８２２７Ａ２）、好ましい可能性がある。
【００７６】
骨格構造としてテトラネクチンを使用して本発明の技術を実施することによって得られる特別な利点は、マウス及びヒトのテトラネクチン骨格構造がほとんど同一で、機能性を保持しながらループ領域をマウスとヒトのテトラネクチンとの間で自由に交換できることである。ループ領域のマウスとヒトフレームワークの間での交換は、テトラネクチン誘導体ベクターで説明した系の中で容易に実施され、遺伝子レベルであっても、ヒトとマウスの配列の間には高い相同性があることを考慮すると、関連する他の種（たとえば、ラット、旧世界ザル及び新世界ザル、イヌ、ウシ、ヒツジ、ヤギなど）を含めるためにこの系を適用することができることが予測される。このような種からテトラネクチンを最終的にクローニング及び／又は配列決定するとき、この戦略をより多くの種を含めるために適用することが可能である。
【００７７】
Ｃ型レクチンリガンド結合領域は抗体の抗原結合溝と比較して異なる形態単位を表すので、選択された結合特異性は抗体と比較して異なる性質であることが予想される。さらに、テトラネクチン誘導体は、糖部分又は多糖類に結合する特異性に関しては抗体と比較して有利な可能性がある。テトラネクチン誘導体はまた、ある種の天然又は合成有機化合物に対して結合特異性を選択する場合に有利である。
【００７８】
いくつかのＣＴＬＤは、カルシウムイオンを結合することが知られており、他のリガンドの結合はカルシウム（たとえば、部位２に結合したカルシウムイオンが直接糖リガンドの結合に関与するＣ型レクチンのコレクチンファミリー（Ｗｅｉｓ及びＤｒｉｃｋａｍｅｒ（１９９６））又はカルシウム感受性（たとえば、カルシウム結合がその他にプラスミノーゲンクリングル４結合に関与することが知られている側鎖の多くに関与するテトラネクチン（Ｇｒａｖｅｒｓｅｎ他（１９９８））のいずれかに左右されることが多い。Ｃ型レクチン様蛋白質ファミリーに特徴的なカルシウム結合部位は、ループ１、ループ４及びβ鎖４に位置する残基に含まれ、結合に際してｃｉｓ構造中に変わることなく見いだされる（構造のループ３とループ４の間にあることが多い）プロリン残基の存在によって左右される。さらに、カルシウムの結合は、ＣＴＬＤループ領域における構造変化を実施することが知られている（Ｎｇ他（１９９８ａ、ｂ））。したがって、ＣＴＬＤ金属結合部位を保持しながらコンビナトリアルライブラリの要素ドメインが特定の標的に結合することが、２価金属イオン（たとえば、カルシウムイオン）を添加又は除去することによって調節できるのは、金属イオンが直接結合に関与するためか、金属イオンが競合リガンドであるためか、又は金属イオンの結合が推定結合部以内の構造再構成を実施するためであると考えられる。
【００７９】
テトラネクチンを含めたＣ型レクチン及びＣ型レクチン様蛋白質ファミリーのいくつかの要素ドメインの３量体の性質、及び付随する結合活性はまた、非常に結合親和性が高い結合単位の創出に活用することができる。
【００８０】
前記の開示から理解できるように、本発明の範囲は広範で、多岐にわたる応用を含む。したがって、以下の実施例ではそれらの様々な実施形態を説明しているが、例示のためだけのものであって、限定するものではない。
【００８１】
実施例１
テトラネクチン由来のＥ．ｃｏｌｉ発現プラスミド及びファージミドの構築
完全長Ｈ６ＦＸ−ｈｔｌｅｃ機能蛋白質のＦＸ−ｈｔｌｅｃ（配列番号１）部分をコードする発現プラスミドｐＴ７Ｈ６ＦＸ−ｈｔｌｅｃは、発現プラスミドｐＴ７Ｈ６−ｒＴＮ１２３（Ｈｏｌｔｅｔ他（１９９７））からＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（商標）部位特異的突然変異キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を使用して製造者が説明したように一連の連続した４種類の部位特異的突然変異実験を実施して構築した。所望する変異を導入する不適正プライマー対は、ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ａａｒｈｕｓ、デンマーク）から入手した。得られたｐＴ７Ｈ６ＦＸ−ｈｔｌｅｃ発現プラスミドの概略を図５に示し、挿入部分をコードするＦＸ−ｈｔｌｅｃのヌクレオチド配列を配列番号１とする。Ｈ６ＦＸ−ｈｔｌｅｃ融合蛋白質のＦＸ−ｈｔｌｅｃ部分のアミノ酸配列を図６に示し、配列番号２とする。
【００８２】
Ｈ６ＦＸ−ｈｔＣＴＬＤ融合蛋白質のＦＸ−ｈｔＣＴＬＤ（配列番号３）部分をコードする発現プラスミドｐＴ７Ｈ６ＦＸ−ｈｔＣＴＬＤは、増幅及びプラスミドｐＴ７Ｈ６へのサブクローニング（すなわち、鋳型として発現プラスミドｐＴ７Ｈ６−ｈｔｌｅｃ、及び別の場合ではプライマー、条件、及び発現プラスミドｐＴ７Ｈ６ＴＮ３の構築で説明したサブクローニング方法（Ｈｏｌｔｅｔ他（１９９７））を使用したポリメラーゼ鎖反応における増幅）によって構築した。得られたｐＴ７Ｈ６ＦＸ−ｈｔＣＴＬＤ発現プラスミドの概略を図７に示し、挿入部分をコードするＦＸ−ｈｔＣＴＬＤのヌクレオチド配列を配列番号３とする。Ｈ６ＦＸ−ｈｔＣＴＬＤ融合蛋白質のＦＸ−ｈｔＣＴＬＤ部分を図８に示し、配列番号４とする。
【００８３】
ファージミド、ｐＰｈＴＮ及びｐＰｈＴＮ３は、発現プラスミドｐＴ７Ｈ６−ｒＴＮ１２３（オリゴヌクレオチドプライマー５−ＣＧＧＣＴＧＡＧＣＧＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＧＣＣＡＣＣＡＡＣＣＣＡＧＡＡＧＣ−３’（配列番号５）及び５’−ＣＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＣＧＡＴＣＣＣＧＡＡＣＴＧＧ−３’（配列番号６）を使用）及びｐＴ７Ｈ６ＦＸ−ｈｔＣＴＬＤ（オリゴヌクレオチドプライマー５’−ＣＧＧＣＴＧＡＧＣＧＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＣＧＣＣＣＴＧＣＡＧＡＣＧＧＴＣ−３’（配列番号７）及び５’−ＣＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＣＧＡＴＣＣＣＧＡＡＣＴＧＧ−３’（配列番号６）を使用）それぞれから増幅したＳｆｉＩ及びＮｏｔＩ制限ＤＮＡ断片をＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈから入手したＳｆｉＩ及びＮｏｔＩで予め切断したベクターｐＣＡＮＴＡＢ  ５Ｅ（コード番号２７−９４０１−０１）に標準的手順を使用して連結することによって構築した。得られたｐＰｈＴＮ及びｐＰｈＴＮ３ファージミドの概略をそれぞれ図９及び図１１に示し、ｐｈＴＮ及びＰｈＴＮ３挿入部分のヌクレオチド配列をそれぞれ配列番号８及び配列番号１０とする。ＰｈＴＮ及びＰｈＴＮ３挿入部分によってコードされるアミノ酸配列をそれぞれ、図１０（配列番号９）及び図１２（配列番号１１）に示す。
【００８４】
ファージミド、ｐＰｈｔｌｅｃ及びｐＰｈｔＣＴＬＤは、発現プラスミドｐＴ７Ｈ６ＦＸ−ｈｔｌｅｃ（オリゴヌクレオチドプライマー５−ＣＧＧＣＴＧＡＧＣＧＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＧＣＣＡＣＣＡＡＣＣＣＡＧＡＡＧＣ−３’（配列番号５）及び５’−ＣＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＣＧＡＴＣＣＣＧＡＡＣＴＧＧ−３’（配列番号６）を使用）及びｐＴ７Ｈ６ＦＸ−ｈｔＣＴＬＤ（オリゴヌクレオチドプライマー５’−ＣＧＧＣＴＧＡＧＣＧＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＣＧＣＣＣＴＧＣＡＧＡＣＧＧＴＣ−３’（配列番号７）及び５’−ＣＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＣＧＡＴＣＣＣＧＡＡＣＴＧＧ−３’（配列番号６）を使用）それぞれから増幅したＳｆｉＩ及びＮｏｔＩ制限ＤＮＡ断片をＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈから入手したベクターｐＣＡＮＴＡＢ  ５Ｅ（コード番号２７−９４０１−０１）をＳｆｉＩ及びＮｏｔＩで予め切断したものに標準的手順を使用して連結することによって構築した。得られたｐＰｈｔｌｅｃ及びｐＰｈｔＣＴＬＤファージミドの概略をそれぞれ図１３及び図１５に示し、Ｐｈｔｌｅｃ及びＰｈｔＣＴＬＤ挿入部分のヌクレオチド配列をそれぞれ配列番号１２及び配列番号１４とする。Ｐｈｔｌｅｃ及びＰｈｔＣＴＬＤ挿入部分によってコードされるアミノ酸配列をそれぞれ、図１４（配列番号１３）及び図１６（配列番号１５）に示す。
【００８５】
マウステトラネクチン誘導体に対応するヌクレオチド配列ｍｔｌｅｃ（図３及び配列番号１６）を含有するプラスミドクローン、ｐＵＣ−ｍｔｌｅｃは、以下の方法でＤＮＡ細断片の４種類の連続サブクローニングによって構築した。第１に、２種類のオリゴヌクレオチド５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＧＡＧＴＣＡＣＣＣＡＣＴＣＣＣＡＡＧＧＣＣＡＡＧＡＡＧＧＣＴＧＣＡＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＡＡＧＡＴＴＴＧＧＴＧＡＧＣＴＣＡＡＡＧＡＴＧＴＴＣ−３’（配列番号１７）と５’−ＧＣＧＧＡＴＣＣＡＧＧＣＣＴＧＣＴＴＣＴＣＣＴＴＣＡＧＣＡＧＧＧＣＣＡＣＣＴＣＣＴＧＧＧＣＣＡＧＧＡＣＡＴＣＣＡＴＣＣＴＧＴＴＣＴＴＧＡＧＣＴＣＣＴＣＧＡＡＣＡＴＣＴＴＴＧＡＧＣＴＣＡＣＣ−３’（配列番号１８）をアニールし、制限切断部分を制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ（ＧＡＡＴＴＣ）及びＢａｍＨＩ（ＧＧＡＴＣＣ）で充填して、ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで予め切断したｐＵＣ１８プラスミドＤＮＡに連結した。第２に、オリゴヌクレオチド対５’−ＧＣＡＧＧＣＣＴＴＡＣＡＧＡＣＴＧＴＧＴＧＣＣＴＧＡＡＧＧＧＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＡＡＣＴＴＧＡＡＧＴＧＣＣＴＣＣＴＧＧＣＣＴＴＣＡＣＣＣＡＡＣＣＧＡＡＧＡＣＣＴＴＣＣＡＴＧＡＧＧＣＧＡＧＣＧＡＧ−３’（配列番号１９）と５’−ＣＣＧＣＡＴＧＣＴＴＣＧＡＡＣＡＧＣＧＣＣＴＣＧＴＴＣＴＣＴＡＧＣＴＣＴＧＡＣＴＧＣＧＧＧＧＴＧＣＣＣＡＧＣＧＴＧＣＣＣＣＣＴＴＧＣＧＡＧＡＴＧＣＡＧＴＣＣＴＣＧＣＴＣＧＣＣＴＣＡＴＧＧ−３’（配列番号２０）とをアニールして、制限切断部分を制限エンドヌクレアーゼＳｔｕＩ（ＡＧＧＣＣＴ）及びＳｐｈＩ（ＧＣＡＴＧＣ）で充填して、ＳｔｕＩ及びＳｐｈＩで予め切断した最初の連結によって得られたプラスミドに連結した。第３に、オリゴヌクレオチド対５’−ＧＧＴＴＣＧＡＡＴＡＣＧＣＧＣＧＣＣＡＣＡＧＣＧＴＧＧＧＣＡＡＣＧＡＴＧＣＧＧＡＧＡＴＣＴＡＡＡＴＧＣＴＣＣＣＡＡＴＴＧＣ−３’（配列番号２１）と５’−ＣＣＡＡＧＣＴＴＣＡＣＡＡＴＧＧＣＡＡＡＣＴＧＧＣＡＧＡＴＧＴＡＧＧＧＣＡＡＴＴＧＧＧＡＧＣＡＴＴＴＡＧＡＴＣ−３’（配列番号２２）とをアニールして、反応切断部分を制限エンドヌクレアーゼＢｓｔＢＩ（ＴＴＣＧＡＡ）及びＨｉｎｄＩＩＩ（ＡＡＧＣＴＴ）で充填した後、ＢｓｔＢＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで予め切断した第２の連結で得られたプラスミドに連結した。第４に、オリゴヌクレオチド対５’−ＣＧＧＡＧＡＴＣＴＧＧＣＴＧＧＧＣＣＴＣＡＡＣＧＡＣＡＴＧＧＣＣＧＣＧＧＡＡＧＧＣＧＣＣＴＧＧＧＴＧＧＡＣＡＴＧＡＣＣＧＧＴＡＣＣＣＴＣＣＴＧＧＣＣＴＡＣＡＡＧＡＡＣＴＧＧ−３’（配列番号２３）と５’−ＧＧＧＣＡＡＴＴＧＡＴＣＧＣＧＧＣＡＴＣＧＣＴＴＧＴＣＧＡＡＣＣＴＣＴＴＧＣＣＧＴＴＧＧＣＴＧＣＧＣＣＡＧＡＣＡＧＧＧＣＧＧＣＧＣＡＧＴＴＣＴＣＧＧＣＴＴＴＧＣＣＧＣＣＧＴＣＧＧＧＴＴＧＣＧＴＣＧＴＧＡＴＣＴＣＣＧＴＣＴＣＣＣＡＧＴＴＣＴＴＧＴＡＧＧＣＣＡＧＧ−３’（配列番号２４）とをアニールして、反応切断部分を制限エンドヌクレアーゼＢｇｌＩＩ（ＡＧＡＴＣＴ）及びＭｕｎＩ（ＣＡＡＴＴＧ）で充填した後、ＢｇｌＩＩ及びＭｕｎＩで予め切断した第３の連結で得られたプラスミドに連結した。ｐＵＣ−ｍｔｌｅｃプラスミドの概略を図１７に示し、ＥｃｏＲＩからＨｉｎｄＩＩＩまでの挿入部分の得られたヌクレオチド配列を配列番号１６とする。
【００８６】
発現プラスミドｐＴ７Ｈ６ＦＸ−ｍｔｌｅｃ及びｐＴ７Ｈ６ＦＸ−ｍｔＣＴＬＤはそれぞれ、ｐＵＣ−ｍｔｌｅｃプラスミドをオリゴヌクレオチドプライマー対５−ＣＴＧＧＧＡＴＣＣＡＴＣＣＡＧＧＧＴＣＧＣＧＡＧＴＣＡＣＣＣＡＣＴＣＣＣＡＡＧＧ−３’（配列番号２５）及び５’−ＣＣＧＡＡＧＣＴＴＡＣＡＣＡＡＴＧＧＣＡＡＡＣＴＧＧＣ−３’（配列番号２６）、及びオリゴヌクレオチドプライマー対５’−ＣＴＧＧＧＡＴＣＣＡＴＣＣＡＧＧＧＴＣＧＣＧＣＣＴＴＡＣＡＧＡＣＴＧＴＧＧＴＣ−３’（配列番号２７）及び５’−ＣＣＧＡＡＧＣＴＴＡＣＡＣＡＡＴＧＧＣＡＡＡＣＴＧＧＣ−３’（配列番号２６）を使用して増幅したＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限ＤＮＡ断片を、標準的手順を使用してＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで予め切断したｐＴ７Ｈ６ベクターに連結することによって構築した。発現プラスミドｐＴ７Ｈ６ＦＸ−ｍｔｌｅｃ及びｐＴ７Ｈ６ＦＸ−ｍｔＣＴＬＤの概略をそれぞれ図１８及び図２０に示し、ＦＸ−ｍｔｌｅｃ及びＦＸ−ｍｔＣＴＬＤ挿入部分のヌクレオチド配列をそれぞれ配列番号２８及び配列番号３０とする。融合蛋白質Ｈ６ＦＸ−ｍｔｌｅｃ及びＨ６ＦＸ−ｍｔＣＴＬＤのＦＸ−ｍｔｌｅｃ及びＦＸ−ｍｔＣＴＬＤ部分のアミノ酸配列をそれぞれ、図１９（配列番号２９）及び図２１（配列番号３１）に示す。
【００８７】
ファージミドｐＰｍｔｌｅｃ及びｐＰｍｔＣＴＬＤは、ＳｆｉＩ及びＮｏｔＩ制限ＤＮＡ断片（ｐＵＣ−ｍｔｌｅｃプラスミドをそれぞれオリゴヌクレオチドプライマー対５−ＣＧＧＣＴＧＡＧＣＧＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＧＴＣＡＣＣＣＡＣＴＣＣＣＡＡＧＧ−３’（配列番号３２）及び５’−ＣＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＣＧＡＴＣＣＣＧＡＡＣＴＧＧ−３’（配列番号３３）、及びオリゴヌクレオチドプライマー５’−ＣＧＧＣＴＧＡＧＣＧＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＣＧＣＣＴＴＡＣＡＧＡＣＴＧＴＧＧＴＣ−３’（配列番号３４）及び５’−ＣＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＣＧＡＴＣＣＣＧＡＡＣＴＧＧ−３’（配列番号３３）を使用して増幅）をＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈから入手したＳｆｉＩ及びＮｏｔＩで予め切断したベクターｐＣＡＮＴＡＢ  ５Ｅ（コード番号２７−９４０１−０１）に標準的手順を使用して連結することによって構築した。ｐＰｍｔｌｅｃ及びｐＰｍｔＣＴＬＤプラスミドの概略をそれぞれ図２２及び図２４に示し、得られたＰｍｔｌｅｃ及びＰｍｔＣＴＬＤ挿入部分のヌクレオチド配列をそれぞれ配列番号３５及び配列番号３７とする。Ｐｍｔｌｅｃ及びＰｍｔＣＴＬＤ挿入部分によってコードされるアミノ酸配列をそれぞれ、図２３（配列番号３６）及び図２５（配列番号３８）に示す。
【００８８】
実施例２
ファージ上で成功したＰｈｔｌｅｃ及びＰｈＴＮ３のディスプレイの説明
Ｐｈｔｌｅｃ及びＰｈＴＮ３遺伝子ＩＩＩ融合蛋白質が実際に組換えファージ粒子によってディスプレイできることを確認するために、（実施例１で説明した）ファージミドｐＰｈｔｌｅｃ及びｐＰｈＴＮ３をＥ．ｃｏｌｉＴＧ１細胞に形質転換し、ヘルパーファージＭ１３Ｋ０７と共に感染させると組換えファージが産生した。組換えファージをポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ８０００）で沈殿させて単離し、Ｐｈｔｌｅｃ及びＰｈＴＮ３ファージ調製物の試料並びにヘルパーファージの試料について、Ｍａｘｉｓｏｒｂ（Ｎｕｎｃ）マルチウェルプレートをまず抗ヒトテトラネクチン又はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と共にインキュベートし、スキムミルク又はスキムミルク／ＥＤＴＡでブロックするＥＬＩＳＡ型サンドイッチアッセイを行った。簡単に説明すると、ｐＰｈｔｌｅｃ及びｐＰｈＴＮ３ファージミドで形質転換したＴＧ１細胞の培養物を、Ａ600が０．５に達するまで２％グルコース及びアンピシリン１００ｍｇ／Ｌを補給した２×ＴＹ培地で３７℃で増殖させた。そのときまでにヘルパーファージ、Ｍ１３ＫＯ７を５×１０9ｐｆｕ／ｍｌの濃度で添加した。この培養物をさらに３０分間３７℃でインキュベートし、その後細胞を遠心によって収集し、カナマイシン５０ｍｇ／Ｌ及びアンピシリン１００ｍｇ／Ｌを補給した同培養量の２×ＴＹ培地に懸濁し、新しいフラスコ類に移し、２５℃で１６時間培養した。細胞を遠心によって除去し、氷冷した６ｍＬの２０％ＰＥＧ８０００、２．５Ｍ  ＮａＣｌを添加することによって培養上清２０ｍＬからファージを沈殿させた。混合した後、この溶液を氷上で１時間静置し、４℃で遠心して沈殿したファージを単離した。ファージのペレットそれぞれを１ｍｌの１０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ＴＥ）に再懸濁し、遠心前に３０分間インキュベートした。ファージを含む上清を新しい試験管に移した。ファージ試料の調製と共に、Ｍａｘｉｓｏｒｂプレートのウェルを１：２０００に希釈したウサギ抗ヒトテトラネクチン（ＤＡＫＯ  Ａ／Ｓ製のポリクローナル抗体、コード番号Ａ０３７１）（７０μＬ）及びＢＳＡ（１０ｍｇ／ｍＬ）（７０μＬ）で一晩コーティングした。コーティングに際して、ウェルをＰＢＳ（２．６８ｍＭ  ＫＣｌ、１．４７ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、８．１０ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4、ｐＨ７．４）で３回洗浄し、ＰＢＳに溶かした３％スキムミルク、又はＰＢＳに溶かした３％スキムミルク、５ｍＭ  ＥＤＴＡ２８０μＬで３７℃で１時間ブロックする。次に、抗テトラネクチンでコートしたウェル及びＢＳＡでコートしたウェルをヒトＰｈｔｌｅｃ−、ＰｈＴＮ３−、又はヘルパーファージ試料と１時間インキュベートし、次に適切なブロック剤を補給したＰＢＳ緩衝液で３回洗浄した。ウェル中のファージはＨＲＰ結合抗ファージ複合体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ、コード番号２７−９４２１−０１）とインキュベートし、さらに洗浄した後検出した。次に、ＨＲＰ活性を９６ウェルＥＬＩＳＡリーダーで標準的ＨＲＰ色素産生基質アッセイを使用して測定した。
【００８９】
Ｐｈｔｌｅｃ及びＰｈＴＮ３ファージは、ブロック剤のＥＤＴＡの有無に関わりなくアッセイで強い応答を生じたが（バックグラウンドの１４倍）、一方ヘルパーファージではいずれのブロック剤でもバックグランド値を上回る応答が生じなかった。ＢＳＡでは弱い結合のみが認められた（図２６）。
【００９０】
したがって、ヒトＰｈｔｌｅｃ及びＰｈＴＮ３ファージはいずれも抗ヒトテトラネクチン抗体によって特異的に認識されるエピトープをディスプレイすることができる。
【００９１】
実施例３
ファージにディスプレイされたＰｈｔｌｅｃ及びＰｈＴＮ３の基準リガンド結合特性の説明
ヒトテトラネクチンのＣＴＬＤドメインのアポ型は、リジン感受性でヒトプラスミノーゲンのクリングル４ドメインに特異的に結合する（Ｇｒａｖｅｒｓｅｎ他（１９９８））。テトラネクチンのプラスミノーゲンに対する結合は、ＣＴＬＤドメインのリガンド結合部位の２部位に結合するカルシウムによって、又は１個はクリングル１に位置し、もう１個はクリングル４（Ｋｄ約１５マイクロモル）に位置するプラスミノーゲン中の２個の強力なリジン結合部位に特異的に結合したＡＭＣＨＡのようなリジン類縁体（６−アミノシクロヘキサン酸）によって阻害されることができる。
【００９２】
ヒトＰｈｔｌｅｃ及びＰｈＴＮ３ファージがＡＭＣＨＡ感受性でヒトプラスミノーゲンに特異的に結合することを示すために、ファージ粒子上にディスプレイしたＰｈｌｅｃ及びＰｈＣＴＬＤＧＩＩＩの融合蛋白質の存在（たとえば、実施例２）を示すために使用したものとほぼ同様なＥＬＩＳＡアッセイを考案した。
【００９３】
ウェルは、５ｍＭ  ＡＭＣＨＡを添加して、又は添加しないで、ヒトプラスミノーゲン溶液（１０μｇ／ｍＬ）でコーティングした。対照ウェルはＢＳＡでコーティングした。２枚の同一のアレイを作製し、１枚は過剰な結合能力を３％スキムミルクでブロックし、もう１枚は５ｍＭ  ＥＤＴＡを補給した３％スキムミルクを使用してブロックした。適切ならば、ブロック、洗浄及びファージ保存溶液には５ｍＭ  ＡＭＣＨＡを補給した。２枚のウェルのアレイをＰｈｔｌｅｃ、又はＰｈＴＮ３又はヘルパーファージ試料と共にインキュベートし、洗浄した後、各ウェルに結合したファージ量を前述のようにＨＲＰ複合抗ファージ抗体を使用して測定した。結果を図２７、パネルＡ及びＢに示し、以下のようにまとめて示すことができる。
（ａ）ＡＭＣＨＡがない場合、プラスミノーゲンをコートしたウェルに対するヒトＰｈｔｌｅｃファージの結合は、いずれかのブロッキング剤調合剤を使用したバックグラウンドレベルの応答の８〜１０倍を発生し、一方ヒトＰｈＴＮ３ファージはバックグラウンド応答レベルの４倍（ＥＤＴＡがない場合）又は７倍（ＥＤＴＡがある場合）の応答を発生した。
（ｂ）５ｍＭ  ＡＭＣＨＡがある場合、プラスミノーゲンに対するヒトＰｈｔｌｅｃ及びＰｈＴＮ３ファージの結合は、完全に消失することがわかった。
（ｃ）Ｐｈｔｌｅｃ及びＰｈＴＮ３ファージはＢＳＡに結合を示さず、対照ヘルパーファージは固定物質のいずれにも結合を示さなかった。
（ｄ）特異的リガンドに対する適度な結合力でのヒトＰｈｔｌｅｃ及びＰｈＴＮ３ファージの特異的結合（約２０マイクロモル濃度）は、非特異的結合の減少を実現する好ましい薬剤としてコンビナトリアルファージ技術で周知のスキムミルクブロック剤を使用して、バックグランドがほぼない状態で、高い効率で検出することができる。
【００９４】
最後に、これらの結果は、ファージ粒子上にディスプレイされたＰｈｔｌｅｃ及びＰｈＴＮ３遺伝子ＩＩＩ融合蛋白質は基準テトラネクチンに対応するプラスミノーゲン結合特性を示し、Ｐｈｔｌｅｃ及びＰｈＴＮ３ファージの物理的及び生化学的特性は、新しい結合特性を有するＣＴＬＤ由来の単位を選択することができるコンビナトリアルライブラリを作製するための手段として使用するという目的に適合していることを示している。
【００９５】
実施例４
ファージライブラリＰｈｔｌｅｃ−１ｂ００１及びＰｈｔｌｅｃ−ｌｂ００２の構築
この実施例で使用したオリゴヌクレオチドは全てＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ａａｒｈｕｓ、デンマーク）から入手した。
【００９６】
Ｐｈｔｌｅｃ（配列番号１２）位置１４１〜１４６（ループ３）、１５０〜１５３（ループ４の一部）、及び残基１６８（β４のＰｈｅ）に対応するランダムアミノ酸残基を含有するファージライブラリＰｈｔｌｅｃ−ｌｂ００１は、ＫｐｎＩ及びＭｕｎＩ制限ｐＰｈｔｌｅｃファージミドＤＮＡ（たとえば、実施例１）２０μｇを、適切に無作為化されたヌクレオチド配列をコードするオリゴヌクレオチドｈｔｌｅｃ−ｌｉｂ１−ｔｐ（配列番号３９）及びプライマーとしてオリゴヌクレオチドｈｔｌｅｃ−ｌｉｂ１−ｒｅｖ（配列番号４０）及びｈｔｌｅｃ−ｌｉｂ１／２−ｆｏ（配列番号４１）から標準的条件を使用して増幅したＫｐｎＩ及びＭｕｎＩ制限ＤＮＡ断片１０μｇと連結すること（式中、ＮはそれぞれヌクレオチドＴ、Ｃ、Ｇ、及びＡそれぞれ２５％の混合物を表し、ＳはＣ及びＧ５０％の混合物を表す）によって構築した。連結した混合物を使用して、標準的方法でいわゆるエレクトロコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ  ＴＧ−１細胞をエレクトロポレーションによって形質転換した。形質転換した後、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＴＧ−１細胞をアンピシリン０．２ｍｇ／ｍＬ及び２％グルコースを含有する２×ＴＹ−寒天プレートに入れ、３０℃で一晩インキュベートした。
【００９７】
Ｐｈｔｌｅｃ（配列番号１２）位置１２１〜１２３、１２５及び１２６（ループ１のほとんど）、及び残基１５０〜１５３（ループ４の一部）に対応するランダムアミノ酸残基を含有するファージライブラリＰｈｔｌｅｃ−ｌｂ００２は、ＢｇｌＩＩ及びＭｕｎＩ制限ｐＰｈｔｌｅｃファージミドＤＮＡ（たとえば、実施例１）２０μｇを、適切に無作為化されたヌクレオチド配列をコードするオリゴヌクレオチドｈｔｌｅｃ−ｌｉｂ２−ｔｐｒｅｖ（配列番号４２）及びｈｔｌｅｃ−ｌｉｂ２−ｔｐｆｏ（配列番号４３）の対及びプライマーとしてオリゴヌクレオチドｈｔｌｅｃ−ｌｉｂ２−ｒｅｖ（配列番号４４）及びｈｔｌｅｃ−Ｌｉｂ１／２−ｆｏ（配列番号４１）から標準的条件を使用して増幅したＢｇｌＩＩ及びＭｕｎＩ制限ＤＮＡ断片１５μｇと連結すること（式中、ＮはそれぞれヌクレオチドＴ、Ｃ、Ｇ、及びＡそれぞれ２５％の混合物を表し、ＳはＣ及びＧ５０％の混合物を表す）によって構築した。連結した混合物を使用して、いわゆるエレクトロコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ  ＴＧ−１細胞を形質転換した。形質転換した後、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＴＧ−１細胞をアンピシリン０．２ｍｇ／ｍＬ及び２％グルコースを含有する２×ＴＹ−寒天プレートに入れ、３０℃で一晩インキュベートした。
【００９８】
ライブラリＰｈｔｌｅｃ−ｌｂ００１及び−ｌｂ００２の力価を測定すると、それぞれ１．４×１０9及び３．２×１０9クローンであった。各ライブラリから６個のクローンを増殖させ、標準的ミニプレップ方法を使用してファージミドＤＮＡを単離し、ループ領域のヌクレオチド配列を決定した（ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ａａｒｈｕｓ、デンマーク）。技術的な理由で各ライブラリの１クローンからは確実なヌクレオチド配列を得ることができず、ｐｈｔｌｅｃ−ｌｉｂ００１の１個のクローンには明らかに大欠失が含まれていた。その他の９種のクローン（ｌｂ００１−１、ｌｂ００１−２、ｌｂ００１−３、ｌｂ００１−４、ｌｂ００２−１、ｌｂ００２−２、ｌｂ００２−３、ｌｂ００２−４及びｌｂ００２−５）のループ領域のＰｈｔｌｅｃ（配列番号１２）と比較したヌクレオチド配列の変動を表３に示す。
【００９９】
0004493271.tif 000009
【０１００】
実施例５
ファージライブラリＰｈｔＣＴＬＤ−ｌｂ０００３の構築
この実施例で使用したオリゴヌクレオチドは全て、ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ａａｒｈｕｓ、デンマーク）から入手した。
【０１０１】
ＰｈｔＣＴＬＤ（配列番号１５）位置７７から７９及び８１から８２（ループ１）及び１０８から１０９（ループ４）に対応するランダムアミノ酸残基を含有するファージライブラリＰｈｔＣＴＬＤ−ｌｂ０００３は、ＢｇｌＩＩ及びＭｕｎＩ制限ｐＰｈｔＣＴＬＤファージミドＤＮＡ２０μｇ（実施例１を参照のこと）を、ループ１に２個及び３個のランダム残基が挿入されているか又は挿入されておらず、ループ４に３個及び４個のランダム残基が挿入された適切に無作為化したループ１及び４領域をコードするＢｇｌＩＩ及びＭｕｎＩ制限ＤＮＡ断片集合体１０μｇとを連結することによって構築した。このＤＮＡ断片集合体は、３個のループ１ＤＮＡ断片それぞれと２個のループ４ＤＮＡ断片それぞれを結合させた６個のいわゆる組合せ反応物を鋳型として、オリゴヌクレオチドＴＮ−ｌｉｂ３−ｒｅｖ（配列番号４５）及びループ３−４−５ｔａｇｆｏ（配列番号４６）をプライマーとして、標準的方法を使用して増幅した。３個のループ１断片それぞれは、オリゴヌクレオチドｌｏｏｐ１ｂ（配列番号４７）、ｌｏｏｐ１ｃ（配列番号４８）、又はｌｏｏｐ１ｄ（配列番号４９）のいずれかを鋳型としてオリゴヌクレオチドＴＮ−ｌｉｂ３−ｒｅｖ（配列番号４５）及びＴＮ−ＫｐｎＩ−ｆｏ（配列番号５０）をプライマーとした反応で増幅して、２個のＤＮＡループ４断片それぞれは、オリゴヌクレオチドｌｏｏｐ４ｂ（配列番号５１）又はｌｏｏｐ４ｃ（配列番号５２）を鋳型として、オリゴヌクレオチドｌｏｏｐ３−４ｒｅｖ（配列番号５３）及びｌｏｏｐ３−４ｆｏ（配列番号５４）をプライマーとして標準的方法を使用した反応で増幅した。オリゴヌクレオチド配列では、ＮはヌクレオチドＴ、Ｃ、Ｇ、及びＡそれぞれ２５％の混合物を表し、ＳはＣ及びＧ５０％の混合物を表し、適切に無作為化されたヌクレオチド配列をコードする。連結した混合物を使用して、いわゆるエレクトロコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ  ＴＧ−１細胞をエレクトロポレーションによって標準的な方法を使用して形質転換した。形質転換した後、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＴＧ−１細胞をアンピシリン０．２ｍｇ／ｍＬ及び２％グルコースを含有する２×ＴＹ−寒天プレートに入れ、３０℃で一晩インキュベートした。
【０１０２】
得られたライブラリ、ＰｈｔＣＴＬＤ−ｌｂ００３の大きさを測定すると、１．４×１０10クローンであった。ライブラリから得られた２４個のクローンを増殖させ、ファージ及びファージミドＤＮＡを単離した。ループ領域のヌクレオチド配列を決定し（ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ａａｒｈｕｓ、デンマーク）、テトラネクチンに対するポリクローナル抗体、抗ＴＮ（ＤＡＫＯ  Ａ／Ｓ、デンマーク）に対する結合を第２抗体としてＨＲＰ複合抗遺伝子ＶＩＩＩ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用したＥＬＩＳＡ型アッセイで、標準的方法を使用して分析した。１８個のクローンが正確なループ挿入部を含有することがわかり、１個のクローンが野生型ループ領域配列を含有し、１個には重大な欠失が生じており、２個は２個以上の配列を含有しており、２個のクローンは領域内にフレームシフト変異を含有していた。正確なループ挿入部を有する１８個のクローンのうち１３個、野生型クローン、及び混合単離物のうち１個はポリクローナル抗ＴＮ抗体に強く反応した。１８個の正確なクローンのうち３個はこの抗体に弱く反応し、一方正確なクローンのうち欠失変異体である２個、混合物のうちの１個、２個のフレームシフト変異体はバックグラウンドを上回るシグナルを生じなかった。
【０１０３】
実施例６
抗ＴＮ抗体のバイオパニング（ｂｉｏｐａｎｎｉｎｇ）によるファージ選択
ＰｈｔＣＴＬＤ−ｌｂ００３ライブラリから約１０11個のファージを使用して、Ｍａｘｉｓｏｒｂイムノチューブ（ＮＵＮＣ、デンマーク）でポリクローナル抗ＴＮ抗体によって標準的方法を使用して２回パニングして選択した。２回目の選択の後、プレートに入れた７×１０7個から１５個のクローンを増殖させ、ファージミドＤＮＡを単離し、ヌクレオチド配列を決定した。１５個のクローン全てが正確で異なるループ配列をコードすることがわかった。
【０１０４】
実施例７
プラスミノーゲンによるＣＴＬＤファージのモデル選択。
Ｉ：パニング後のトリプシン消化による溶出。
テトラネクチン誘導ＣＴＬＤ保持ファージをファージ集団から選択できることを明示するために、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージを感染した後ファージミドｐＰｈｔＣＴＬＤで形質転換したＥ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１培養物（実施例１を参照のこと）から単離したＰｈｔＣＴＬＤファージと、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージで感染した後ファージミドｐＰｈｔＣＰＢで形質転換した培養物から単離したファージとの１：１０及び１：１０5の比の混合物それぞれを、９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｂマイクロタイタープレート（ＮＵＮＣ、デンマーク）及び抗原としてヒトプラスミノーゲンを用いたパニングを使用した選択実験で使用した。ｐＰｈｔＣＰＢファージミドは、２本鎖オリゴヌクレオチド（配列番号５５）と適切な制限酵素突出配列とをＫｐｎＩ及びＭｕｎＩ制限ｐＰｈｔＣＴＬＤファージミドＤＮＡに連結することによって構築した。ヘルパーファージを感染させることによって得られたｐＰｈｔＣＢＰファージは、翻訳終止コドンを得られたｐＰｈｔＣＰＢファージミドのＣＴＬＤコーディング領域（配列番号５６）に導入したので、野生型Ｍ１３遺伝子ＩＩＩ蛋白質のみをディスプレイする。
【０１０５】
選択実験は、標準的方法を使用して９６ウェルマイクロタイタープレートで実施した。簡単に説明すると、ＰＢＳ（ＰＢＳ、ＫＣｌ０．２ｇ、ＫＨ2ＰＯ4０．２ｇ、ＮａＣｌ８ｇ、Ｎａ2ＨＰＯ4１．４４ｇ、２Ｈ2Ｏ、水で１Ｌとし、ＮａＯＨでｐＨ７．４に調節する）１００μＬに溶かしたヒトプラスミノーゲン３μｇ又はＰＢＳ１００μＬ（非特異的結合分析用）を入れた各ウェルを４℃で一晩及び３７℃で１時間コーティングした。ＰＢＳで１回洗浄した後、ウェルをＰＢＳ及び３％脱脂粉乳４００μＬで３７℃で１時間ブロックした。ブロッキング後、ウェルをＰＢＳ及び０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で１回、及びＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳ、３％脱脂粉乳１００μＬに懸濁したファージを添加した。ファージを３７℃で１時間結合させ、ＰＢＳ、Ｔｗｅｅｎ２０で１回、及びＰＢＳで３回洗浄した。結合したファージは、１００μＬ中で３０分間室温でトリプシン消化して（トリプシンをＰＢＳに１ｍｇ／ｍＬで溶かす）各ウェルから溶出し、対数増殖しているＥ．ｃｏｌｉＴＧ１細胞の感染に使用して、アンピシリン０．１ｍｇ／ｍＬ及び２％グルコースを含有する２×ＴＹ−寒天プレートにプレーティングして力価測定した。
【０１０６】
最初に（１回目）、１０12ＰｈｔＣＴＬＤファージ（Ａ系列）、１０10ＰｈｔＣＴＬＤファージ及び１０11ＰｈｔＣＰＢファージの混合物（Ｂ系列）、又は１０6ＰｈｔＣＴＬＤ及び１０11ＰｈｔＣＰＢファージの混合物（Ｃ系列）を使用した。次の回で（２回目）、各系列から得られた１０11個のファージを使用した。２回の選択によって得られた結果を表４にまとめて示す。
【０１０７】
0004493271.tif 000010
【０１０８】
１回目のファージ混合物をプレーティングして得た５個のコロニーと２回目のプレーティングから得られた１２個のコロニーからファージミドＤＮＡを単離して、ＣＴＬＤ領域のヌクレオチド配列を決定した。最初のＰｈｔＣＴＬＤ／ＰｈｔＣＰＢの１／１０混合物（Ｂ系列）では、５個のうち１個がＣＴＬＤ配列として同定された。最初の１／１０5混合物（Ｃ系列）では、５個の配列全てがｐＰｈｔＣＰＢファージミドから得られた。２回目の後、Ｂ系列で分析した１２個の配列のうち９個及びＣ系列の１２個の配列全てがｐＰｈｔＣＴＬＤファージミドから得られた。
【０１０９】
実施例８
プラスミノーゲンによるＣＴＬＤ−ファージのモデル選択。
ＩＩ：パニング後０．１Ｍトリエチルアミンによる溶出。
テトラネクチンから得られたＣＴＬＤを有するファージをファージ集団から選択することができることを示すために、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージを感染した後ファージミドｐＰｈｔＣＴＬＤで形質転換したＥ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１培養物（実施例１を参照のこと）から単離したＰｈｔＣＴＬＤファージと、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージで感染した後ファージミドｐＰｈｔＣＰＢで形質転換した培養物（実施例６を参照のこと）から単離したファージとの１：１０2及び１：１０6の比の混合物それぞれを、９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｂマイクロタイタープレート（ＮＵＮＣ、デンマーク）及び抗原としてヒトプラスミノーゲンを用いたパニングを使用し、標準的方法を使用した選択実験で使用した。
【０１１０】
簡単に説明すると、ＰＢＳ（ＰＢＳ、ＫＣｌ０．２ｇ、ＫＨ2ＰＯ4０．２ｇ、ＮａＣｌ８ｇ、Ｎａ2ＨＰＯ4１．４４ｇ、２Ｈ2Ｏ、水で１Ｌとし、ＮａＯＨでｐＨ７．４に調節する）１００μＬに溶かしたヒトプラスミノーゲン３μｇ又はＰＢＳ１００μＬ（非特異的結合分析用）を入れた各ウェルを４℃で一晩及び３７℃で１時間コーティングした。ＰＢＳで１回洗浄した後、ウェルをＰＢＳ及び３％脱脂粉乳４００μＬで３７℃で１時間ブロックした。ブロッキング後、ウェルをＰＢＳ及び０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で１回、及びＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳ、３％脱脂粉乳１００μＬに懸濁したファージを添加した。ファージを３７℃で１時間結合させ、ＰＢＳ、Ｔｗｅｅｎ２０で１５回、及びＰＢＳで１５回洗浄した。結合したファージは、０．１Ｍトリエチルアミン１００μＬによって室温で１０分間各ウェルから溶出し、０．５体積の１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４で中和して、対数増殖しているＥ．ｃｏｌｉＴＧ１細胞の感染に使用して、アンピシリン０．１ｍｇ／ｍＬ及び２％グルコースを含有する２×ＴＹ−寒天プレートにプレーティングして力価測定した。
【０１１１】
最初に（１回目）、１０12ＰｈｔＣＴＬＤファージ（Ａ系列）、１０10ＰｈｔＣＴＬＤファージ及び１０11ＰｈｔＣＰＢファージの混合物（Ｂ系列）、又は１０5ＰｈｔＣＴＬＤ及び１０11ＰｈｔＣＰＢファージの混合物（Ｃ系列）を使用した。次の回で（２回目）、各系列から得られた１０11個のファージを使用した。２回の選択によって得られた結果を表５にまとめて示す。
【０１１２】
0004493271.tif 000011
【０１１３】
標準的方法を使用して２回目の選択によって得られたＡ及びＢ系列のファージ混合物を増殖させ、ＥＬＩＳＡ型アッセイでプラスミノーゲンに対する結合を分析した。簡単に説明すると、ＰＢＳ（ＰＢＳ、ＫＣｌ０．２ｇ、ＫＨ2ＰＯ4０．２ｇ、ＮａＣｌ８ｇ、Ｎａ2ＨＰＯ4１．４４ｇ、２Ｈ2Ｏ、水で１Ｌとし、ＮａＯＨでｐＨ７．４に調節する）１００μＬに溶かしたヒトプラスミノーゲン３μｇ又はＰＢＳ１００μＬ（非特異的結合分析用）を入れた各ウェルを４℃で一晩及び３７℃で１時間コーティングした。ＰＢＳで１回洗浄した後、ウェルをＰＢＳ及び３％脱脂粉乳４００μＬで３７℃で１時間ブロックした。ブロッキング後、ウェルをＰＢＳ及び０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で１回、及びＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳ、３％脱脂粉乳１００μＬに懸濁したファージを添加した。ファージ混合物を３７℃で１時間結合させ、ＰＢＳ、Ｔｗｅｅｎ２０で３回、及びＰＢＳで３回洗浄した。洗浄後、ＰＢＳ、３％脱脂粉乳に溶かしたＨＲＰ−結合抗遺伝子ＶＩＩＩ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）の１：５０００希釈物５０μｌを各ウェルに添加して、３７℃で１時間インキュベートした。「第２」抗体結合後、ウェルをＰＢＳ、Ｔｗｅｅｎ２０で３回、ＰＢＳで３回洗浄し、ＴＭＢ基質（ＤＡＫＯ−ＴＭＢ１段階基質系、コード：Ｓ１６００、ＤＡＫＯ、デンマーク）５０μＬを添加した。反応は２０分間行い、０．５体積の０．５Ｍ  Ｈ2ＳＯ4で反応停止し、分析した。ＥＬＩＳＡ分析の結果から、いずれの系列でもファージはプラスミノーゲンに特異的に結合することが確認された（図２８）。
【０１１４】
実施例９
ライブラリＰｈｔｌｅｃ−ｌｂ００２から雌鶏卵白リゾチームに結合するファージの選択
Ｐｈｔｌｅｃ−ｌｂ００２ライブラリ（実施例４を参照のこと）から得られた元のライブラリの約２５０倍の大きさの１．２×１０12ファージを、標準的な方法で連続パニングすることが必要な、雌鶏卵白リゾチーム結合ファージを選択するための実験方法に使用した。
【０１１５】
簡単に説明すると、ＰＢＳ（ＰＢＳ、ＫＣｌ０．２ｇ、ＫＨ2ＰＯ4０．２ｇ、ＮａＣｌ８ｇ、Ｎａ2ＨＰＯ4１．４４ｇ、２Ｈ2Ｏ、水で１Ｌとし、ＮａＯＨでｐＨ７．４に調節する）１ｍＬに溶かした雌鶏卵白リゾチーム３０μｇ又はＰＢＳ１ｍＬ（非特異的結合分析用）を使用して、Ｍａｘｉｓｏｒｂイムノチューブ（ＮＵＮＣ、デンマーク）を４℃で一晩及び３７℃で１時間コーティングした。ＰＢＳで１回洗浄した後、チューブをＰＢＳ及び３％脱脂粉乳で満たし、３７℃で１時間ブロックした。ブロッキング後、チューブをＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で１回洗浄し、及びＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳ、３％脱脂粉乳１ｍＬに懸濁したファージを添加した。ファージを３７℃で１時間結合させ、ＰＢＳ、Ｔｗｅｅｎ２０で６回、及びＰＢＳで６回洗浄した。結合したファージは、０．１Ｍトリエチルアミン１ｍＬによって室温で１０分間各ウェルから溶出し、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４で中和して、対数増殖しているＥ．ｃｏｌｉＴＧ１細胞の感染に使用して、２％グルコース及びアンピシリン０．１ｍｇ／ｍＬを含有する２×ＴＹ−寒天プレートにプレーティングして力価測定した。その後の選択で、リゾチームをコーティングしたチューブから溶出したファージで感染させた後、プレーティングしたコロニーの培養増殖物から得られた約１０12個のファージをパニング方法に使用した。しかし、結合の厳密さは、ファージパニング後の洗浄段階数を６回から１０回に増加させることによって高まった。
【０１１６】
選択方法によって得られた結果を表７に示す。
【０１１７】
0004493271.tif 000012
【０１１８】
標準的方法を使用して結合の特異性を分析するために、３回選択して単離した１２個のクローンからファージを増殖させ、ＥＬＩＳＡ型アッセイで雌鶏卵白リゾチーム及びヒトβ2ミクログロブリンに対する結合を分析した。簡単に説明すると、各ウェルをＰＢＳ（ＰＢＳ、ＫＣｌ０．２ｇ、ＫＨ2ＰＯ4０．２ｇ、ＮａＣｌ８ｇ、Ｎａ2ＨＰＯ4１．４４ｇ、２Ｈ2Ｏ、水で１Ｌとし、ＮａＯＨでｐＨ７．４に調節する）１００μＬに溶かした雌鶏卵白リゾチーム３μｇ、又はヒトβ2ミクログロブリン３μｇ、又はＰＢＳ１００μＬ（非特異的結合分析用）を使用して４℃で一晩及び３７℃で１時間コーティングした。ＰＢＳで１回洗浄した後、ウェルをＰＢＳ及び３％脱脂粉乳４００μＬで３７℃で１時間ブロックした。ブロッキング後、ウェルをＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で１回洗浄し、及びＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳ、３％脱脂粉乳１００μＬに懸濁したファージを添加した。ファージを３７℃で１時間結合させ、ＰＢＳ、Ｔｗｅｅｎ２０で３回、及びＰＢＳで３回洗浄した。洗浄後、ＰＢＳ、３％脱脂粉乳に溶かしたＨＲＰ−結合抗遺伝子ＶＩＩＩ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）の１：５０００希釈物５０μｌを各ウェルに添加して、３７℃で１時間インキュベートした。「第２」抗体結合後、ウェルをＰＢＳ、Ｔｗｅｅｎ２０で３回、ＰＢＳで３回洗浄し、ＴＭＢ基質（ＤＡＫＯ−ＴＭＢ１段階基質系、コード：Ｓ１６００、ＤＡＫＯ、デンマーク）５０μＬを添加した。反応は２０分間行い、０．５Ｍ  Ｈ2ＳＯ4で反応停止した。
【０１１９】
比較的弱いが、リゾチームに対して特異的な結合を示す結果を図２９にまとめて示す。
【０１２０】
実施例１０
ファージミド（ｐＰｒＭＢＰ）から得られたラットマンノース結合蛋白質ＣＴＬＤ（ｒ−ＭＢＰ）及びファージミド（ｐＰｈＳＰ−Ｄ）から得られたヒト肺サーファクタント蛋白質Ｄ  ＣＴＬＤ（ｈ−ＳＰ−Ｄ）の構築
ファージミド、ｐＰｒＭＢＰは、（オリゴヌクレオチドプライマーＳｆｉＭＢＰ５’−ＣＧＧＣＴＧＡＧＣＧＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＧＣＣＡＡＡＣＡＡＧＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＴＣＴＣＣ−３’（配列番号６２）及びＮｏｔＭＢＰ５’−ＧＣＡＣＴＣＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＣＴＧＧＧＡＡＣＴＣＧＣＡＧＡＣ−３’（配列番号６３）を使用して）ラット肝から単離したｃＤＮＡから増幅したＳｆｉＩ及びＮｏｔＩ制限ＤＮＡ断片（Ｄｒｉｃｋａｍｅｒ、Ｋ．他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８７、２６２（６）、２５８２〜２５８９）を標準的方法を使用してＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（コード番号２７−９４０１−０１）から入手したＳｆｉＩ及びＮｏｔＩで予め切断したｐＣＡＮＴＡＢ  ５Ｅに連結することによって構築した。得られたｐＰｒＭＢＰの概略を図３１に示し、ＰｒＭＢＰのヌクレオチド配列を（配列番号５８）とする。ＰｒＭＢＰ挿入によってコードされるアミノ酸配列を図３０に示す（配列番号５９）。
【０１２１】
ファージミド、ｐＰｈＳＰ−Ｄは、（オリゴヌクレオチドプライマーＳｆｉＳＰ−Ｄ５’−ＣＧＧＣＴＧＡＧＣＧＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＧＣＣＡＡＡＧＡＡＡＧＴＴＧＡＧＣＴＣＴＴＣＣＣ−３’（配列番号６４）及びＮｏｔＳＰ−Ｄ５’−ＧＣＡＣＴＣＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＡＣＴＣＧＣＡＧＡＣＣＡＣＡＡＧＡＣ−３’（配列番号６５）を使用して）ヒト肺から単離したｃＤＮＡから増幅したＳｆｉＩ及びＮｏｔＩ制限ＤＮＡ断片（Ｌｕ、Ｊ．他、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．１９９２  ｊｕｎ  １５、２８４、７９５〜８０２）を標準的方法を使用してＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（コード番号２７−９４０１−０１）から入手したＳｆｉＩ及びＮｏｔＩで予め切断したｐＣＡＮＴＡＢ  ５Ｅに連結することによって構築した。得られたｐＰｈＳＰ−Ｄの概略を図３３に示し、ＰｈＳＰ−Ｄのヌクレオチド配列を（配列番号６０）とする。ＰｈＳＰ−Ｄ挿入によってコードされるアミノ酸配列を図３２に示す（配列番号６１）。
【０１２２】
実施例１１
ファージライブラリＰｒＭＢＰ−ｌｂ００１の構築
ＰｒＭＢＰ  ＣＴＬＤ（配列番号５９）位置７１から７３又は７０から７６（ループ１）及び９７から１０１又は１００から１０１（ループ４）に対応するランダムアミノ酸残基を含有するファージライブラリＰｒＭＢＰ−ｌｂ００１は、ＳｆｉＩ及びＮｏｔＩ制限ｐＰｒＭＢＰファージミドＤＮＡ（実施例１０を参照のこと）２０μｇを適切に無作為化したループ１及び４領域をコードするＳｆｉＩ及びＮｏｔＩ制限ＤＮＡ断片集合体１０μｇと連結することによって構築する。ＤＮＡ断片集合体は、３個のループ１ＤＮＡ断片それぞれと３個のループ４ＤＮＡ断片それぞれを結合させた９個の組合せ反応物を鋳型として、オリゴヌクレオチドＳｆｉ−ｔａｇ５’−ＣＧＧＣＴＧＡＧＣＧＧＣＣＣＡＧＣ−３’（配列番号７４）及びＮｏｔ−ｔａｇ５’−ＧＣＡＣＴＣＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧ−３’（配列番号７５）をプライマーとして標準的方法を使用して増幅させる。３個のループ１断片のそれぞれは、ｐＰｒＭＢＰファージミドＤＮＡ（実施例１０を参照のこと）を鋳型として、オリゴヌクレオチドＭＢＰｌｏｏｐ１ａ  ｆｏ（配列番号６６）、ＭＢＰｌｏｏｐ１ｂ  ｆｏ（配列番号６７）又はＭＢＰｌｏｏｐ１ｃ（配列番号６８）及びＳｆｉＭＢＰ（配列番号６２）をプライマーとして、１次ＰＣＲ反応で増幅し、さらにＳｆｉ−ｔａｇ（配列番号７４）及びＭＢＰｌｏｏｐ１−ｔａｇ  ｆｏ（配列番号６９）を使用した２次ＰＣＲ反応で増幅する。３個のＤＮＡループ４断片は、ｐＰｒＭＢＰファージミドＤＮＡ（実施例１０を参照のこと）を鋳型として、オリゴヌクレオチドＭＢＰｌｏｏｐ４ａ  ｒｅｖ（配列番号７１）、ＭＢＰｌｏｏｐ４ｂ  ｒｅｖ（配列番号７２）又はＭＢＰｌｏｏｐ４ｃ  ｒｅｖ（配列番号７３）及びＮｏｔＭＢＰ（配列番号６３）をプライマーとして標準的方法を使用して１次ＰＣＲ反応で増幅し、さらにＭＢＰｌｏｏｐ４−ｔａｇ  ｒｅｖ（配列番号７０）及びＮｏｔ−ｔａｇ（配列番号６３）を使用した２次ＰＣＲ反応で増幅する。このオリゴヌクレオチド配列では、ＮはそれぞれヌクレオチドＴ、Ｃ、Ｇ、及びＡそれぞれ２５％の混合物を表し、ＳはＣ及びＧ５０％の混合物を表し、適切に無作為化されたヌクレオチド配列をコードする。連結した混合物を使用していわゆるエレクトロコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ  ＴＧ−１細胞を標準的な手順を用いたエレクトロポレーションによって形質転換した。形質転換した後、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＴＧ−１細胞をアンピシリン０．２ｍｇ／ｍＬ及び２％グルコースを含有する２×ＴＹ−寒天プレートに入れ、３０℃で一晩インキュベートした。
【０１２３】
実施例１２
ファージライブラリＰｈＳＰ−Ｄ−ｌｂ００１の構築
ＰｈＳＰ−Ｄ  ＣＴＬＤ挿入部分（配列番号６１）位置７４から７６又は７３から７９（ループ１）及び１００から１０４又は１０３から１０４（ループ４）に対応するランダムアミノ酸残基を含有するファージライブラリＰｈＳＰ−Ｄ−ｌｂ００１は、ＳｆｉＩ及びＮｏｔＩ制限ｐＰｈＳＰ−ＤファージミドＤＮＡ（実施例１０を参照のこと）２０μｇを適切に無作為化したループ１及び４領域をコードするＳｆｉＩ及びＮｏｔＩ制限ＤＮＡ断片集合体１０μｇと連結することによって構築する。ＤＮＡ断片集合体は、３個のループ１ＤＮＡ断片それぞれと３個のループ４ＤＮＡ断片それぞれを結合させた９個の組合せ反応物を鋳型として、オリゴヌクレオチドＳｆｉ−ｔａｇ５’−ＣＧＧＣＴＧＡＧＣＧＧＣＣＣＡＧＣ−３’（配列番号７４）及びＮｏｔ−ｔａｇ５’−ＧＣＡＣＴＣＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧ−３’（配列番号７５）をプライマーとして標準的方法を使用して増幅する。３個のループ１断片のそれぞれは、ｐＰｈＳＰ−ＤファージミドＤＮＡ（実施例１０を参照のこと）を鋳型として、オリゴヌクレオチドＳｐ−ｄｌｏｏｐ１ａ  ｆｏ（配列番号７６）、Ｓｐ−ｄｌｏｏｐ１ｂ  ｆｏ（配列番号７７）又はＳｐ−ｄｌｏｏｐ１ｃ  ｆｏ（配列番号７８）及びＳｆｉＳＰ−Ｄ（配列番号６４）をプライマーとして１次ＰＣＲ反応で増幅して、さらにＳｆｉ−ｔａｇ（配列番号７４）及びＳｐ−ｄｌｏｏｐ１−ｔａｇ  ｆｏ（配列番号７９）をプライマーとして使用したＰＣＲ反応で増幅する。３個のＤＮＡループ４断片は、ｐＰｈＳＰ−ＤファージミドＤＮＡ（実施例１０を参照のこと）を鋳型として、オリゴヌクレオチドＳｐ−ｄｌｏｏｐ４ａ  ｒｅｖ（配列番号８１）、Ｓｐ−ｄｌｏｏｐ４ｂ  ｒｅｖ（配列番号８２）又はＳｐ−ｄｌｏｏｐ４ｃ  ｒｅｖ（配列番号８３）及びＮｏｔＳＰ−Ｄ（配列番号６５）をプライマーとして標準的方法を使用して１次ＰＣＲ反応で増幅し、さらにＳｐ−ｄｌｏｏｐ４−ｔａｇ  ｒｅｖ（配列番号８０）及びＮｏｔ−ｔａｇ（配列番号７５）をプライマーとして使用したＰＣＲ反応で増幅する。このオリゴヌクレオチド配列では、ＮはそれぞれヌクレオチドＴ、Ｃ、Ｇ、及びＡそれぞれ２５％の混合物を表し、ＳはＣ及びＧ５０％の混合物を表し、適切に無作為化されたヌクレオチド配列をコードする。連結した混合物を使用していわゆるエレクトロコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ  ＴＧ−１細胞を標準的な方法を使用してエレクトロポレーションによって形質転換した。形質転換した後、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＴＧ−１細胞をアンピシリン０．２ｍｇ／ｍＬ及び２％グルコースを含有する２×ＴＹ−寒天プレートに入れ、３０℃で一晩インキュベートした。
【０１２４】
実施例１３
ファージライブラリＰｈｔＣＴＬＤ−ｌｂ００４の構築
この実施例で使用したオリゴヌクレオチドは全てＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ａａｒｈｕｓ、デンマーク）から入手した。
【０１２５】
ＰｈｔＣＴＬＤ（配列番号１５）位置９７から１０２又は９８から１０１（ループ３）及び位置１１６から１２２又は１１８から１２０（ループ５）に対応するランダムアミノ酸残基を含有するファージライブラリＰｈｔＣＴＬＤ−ｌｂ００４は、ＫｐｎＩ及びＭｕｎＩ制限ｐＰｈｔＣＴＬＤファージミドＤＮＡ（実施例１を参照のこと）２０μｇを無作為化したループ３及び５領域をコードするＫｐｎＩ及びＭｕｎＩ制限ＤＮＡ断片集合体１０μｇと連結することによって構築した。ＤＮＡ断片集合体は、３個のループ３ＤＮＡ断片それぞれと３個のループ５ＤＮＡ断片それぞれを結合させた９個の１次ＰＣＲ反応によって増幅した。断片は、鋳型としてオリゴヌクレオチドｌｏｏｐ３ａ（配列番号８４）、ｌｏｏｐ３ｂ（配列番号８５）又はｌｏｏｐ３ｃ（配列番号８６）のいずれかとプライマーとしてｌｏｏｐ５ａ（配列番号８７）、ｌｏｏｐ５ｂ（配列番号８８）又はｌｏｏｐ５ｃ（配列番号８９）及びｌｏｏｐ３−４ｒｅｖ（配列番号９１）とで増幅した。このＤＮＡ断片はさらに、１次ＰＣＲ産物を鋳型として、ｌｏｏｐ３−４ｒｅｖ（配列番号９１）及びｌｏｏｐ３−４−５ｔａｇ  ｆｏ（配列番号９０）をプライマーとして使用したＰＣＲ反応で増幅した。ＰＣＲ反応は全て、標準的方法を使用して実施した。
【０１２６】
このオリゴヌクレオチド配列では、ＮはそれぞれヌクレオチドＴ、Ｃ、Ｇ、及びＡそれぞれ２５％の混合物を表し、ＳはＣ及びＧ５０％の混合物を表し、適切に無作為化されたヌクレオチド配列をコードする。連結した混合物を使用していわゆるエレクトロコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ  ＴＧ−１細胞を標準的な方法を使用してエレクトロポレーションによって形質転換した。形質転換した後、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＴＧ−１細胞をアンピシリン０．２ｍｇ／ｍＬ及び２％グルコースを含有する２×ＴＹ−寒天プレートに入れ、３０℃で一晩インキュベートした。
【０１２７】
得られたライブラリ、ＰｈｔＣＴＬＤ−ｌｂ００４の大きさを測定すると、７×１０9クローンであった。ライブラリから１６個のクローンを採取し、ファージミドＤＮＡを単離した。ループ領域のヌクレオチド配列を決定した（ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ａａｒｈｕｓ、デンマーク）。１３個のクローンが正確なループ挿入部分を含有し、３個のクローンが領域中にフレームシフト変異を含有していることがわかった。
【０１２８】
実施例１４
ヒト血清アルブミンに固定した血液型Ａの糖部分に結合するＰｈｔｌｅｃファージ及びＰｈｔＣＴＬＤファージの選択
標準的方法を使用して、グリセロール保存したライブラリＰｈｔｌｅｃ−ｌｂ００１及びＰｈｔｌｅｃ−ｌｂ００２（実施例４を参照のこと）から増殖させたファージ及びグリセロール保存したライブラリＰｈｔＣＴＬＤ−ｌｂ００３（実施例５を参照のこと）から増殖させたファージを、９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｂマイクロタイタープレート（ＮＵＮＣ、デンマーク）で標準的方法を使用してパニングすることによってヒト血清アルブミンに固定した血液型Ａ糖部分Ａ−ＨＡに特異的親和性を有するＰｈｔｌｅｃ及びＰｈｔＣＴＬＤ由来のファージを選択するために考案された実験で使用した。
【０１２９】
最初に、ファージ上清を０．３体積の２０％ポリエチレングリコール６０００（ＰＥＧ）及び２．５Ｍ  ＮａＣｌ溶液で沈殿させ、ペレットをＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に再懸濁した。Ｅ．ｃｏｌｉＴＧ−１細胞で力価測定後、Ｐｈｔｌｅｃ−ｌｂ００１及びｌｂ００２由来のファージを１：１の比で混合し（＃１）、２×ＴＹ培地で５×１０12ｐｆｕ／ｍＬに調節し、ＰｈｔＣＴＬＤ−ｌｂ００３から増殖させたファージ（＃４）を２×ＴＹ培地で２．５×１０12ｐｆｕ／ｍＬに調節した。
【０１３０】
１回目のパニングの前に、「抗原」であるヒト血清アルブミンに固定したヒト血液型Ａ３糖類、Ａ−ＨＡ（Ｇｌｙｃｏｒｅｘ  ＡＢ、Ｌｕｎｄ、スウェーデン）１ミリグラムをＰＢＳ（ＰＢＳ、ＫＣｌ０．２ｇ、ＫＨ2ＰＯ4０．２ｇ、ＮａＣｌ８ｇ、Ｎａ2ＨＰＯ4１．４４ｇ、２Ｈ2Ｏ、水で１Ｌとし、ＮａＯＨでｐＨ７．４に調節する）１００μＬに溶かし、３個のウェルそれぞれに入れて、４℃で一晩及び室温で１時間コーティングした。ＰＢＳで１回洗浄した後、ウェルをＰＢＳ及び３％脱脂粉乳３００μＬで室温で１時間ブロックした。ブロックしたウェルをＰＢＳ及び０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で１回、ＰＢＳで３回洗浄した後、ファージ懸濁駅５０μｌ及びＰＢＳ、６％脱脂粉乳５０μＬの混合物を添加した。ファージを室温で２時間結合させてから、ＰＢＳ、Ｔｗｅｅｎ２０で８回、ＰＢＳで８回洗浄した。結合したファージを１００μＬのトリプシンで室温で３０分消化（ＰＢＳにトリプシンを１ｍｇ／ｍＬで溶かす）することによって各ウェルから室温で３０分間溶出し、対数増殖しているＥ．ｃｏｌｉＴＧ１細胞の感染に使用して、アンピシリン０．１ｍｇ／ｍＬ及び２％グルコースを含有する２×ＴＹ−寒天プレートにプレーティングして力価測定した。
【０１３１】
２回目の選択では、１回目から得られたコロニーから増殖した粗ファージ上清１５０μＬをＰＢＳ、６％脱脂粉乳１５０μＬと混合し、前述のようにＡ−ＨＡでコーティングしたウェルそれぞれに混合物を１００μＬ分配してパニングに使用した。結合の厳密さは、洗浄段階数を１６から３２に増加させることによって高まった。ファージ混合物３００μＬはまた、対照として抗原を入れていない３個のウェルでのパニングに使用した。
【０１３２】
３回目の選択では、２回目から得られたコロニーから増殖した粗ファージ上清１５０μＬをＰＢＳ、６％脱脂粉乳１５０μＬと混合し、前述のようにＡ−ＨＡでコーティングしたウェルそれぞれに混合物を１００μＬ分配してパニングに使用した。結合の厳密さは洗浄段階数を１６から３２に増加させることによって高まった。ファージ混合物３００μＬはまた、対照として抗原を入れていない３個のウェルでのパニングに使用した。
【０１３３】
選択方法から得られた結果を表８にまとめて示す。
【０１３４】
0004493271.tif 000013
【０１３５】
＃１及び＃４シリーズのそれぞれから４８個のクローンを採取し、９６ウェルマイクロタイタートレイで増殖させ、標準的方法を使用してＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージで感染させることによってファージを産生させた。９６個のファージ上清から得られたファージのＡ−ＨＡ抗原に対する結合及び雌鶏卵白リゾチームに対する非特異的結合をＥＬＩＳＡ型アッセイを使用して分析した。簡単に説明すると、ＰＢＳ（ＰＢＳ、ＫＣｌ０．２ｇ、ＫＨ2ＰＯ4０．２ｇ、ＮａＣｌ８ｇ、Ｎａ2ＨＰＯ4１．４４ｇ、２Ｈ2Ｏ、水で１Ｌとし、ＮａＯＨでｐＨ７．４に調節する）１００μＬに溶かしたＡ−ＨＡ１μｇ又はＰＢＳ１００μＬに溶かした雌鶏卵白リゾチーム１μｇ（非特異的結合分析用）を使用して、各ウェルを４℃で一晩及び３７℃で１時間コーティングした。ＰＢＳで１回洗浄した後、ウェルをＰＢＳ及び３％脱脂粉乳３００μＬで室温で１時間ブロックした。ブロッキング後、ウェルをＰＢＳ及び０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で１回洗浄し、ＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳ、６％脱脂粉乳５０μＬに溶かしたファージ上清５０μＬを添加した。ファージ混合物を室温で２時間結合させ、ＰＢＳ、Ｔｗｅｅｎ２０で３回、ＰＢＳで３回洗浄した。洗浄後、ＰＢＳ、３％脱脂粉乳に溶かしたＨＲＰ−結合抗遺伝子ＶＩＩＩ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）の１：５０００希釈物５０μＬを各ウェルに添加して、室温で１時間インキュベートした。「第２」抗体結合後、ウェルをＰＢＳ、Ｔｗｅｅｎ２０で３回、ＰＢＳで３回洗浄し、ＴＭＢ基質（ＤＡＫＯ−ＴＭＢ１段階基質系、ＤＡＫＯ、デンマーク）５０μＬを添加した。反応は２０分間行い、０．５Ｍ  Ｈ2ＳＯ4で反応停止し、分析した。ＥＬＩＳＡ分析の結果から、リゾチームに対するシグナルとＡ−ＨＡに対するシグナルのシグナル比が１．５以上であることから判断すると、いずれの系列ともバックグランドのシグナルを上回っており（図３４及び３５）、ファージのＡ−ＨＡに対する特異的結合に関しては「成功（ｈｉｔｓ）」していることが示された。
【０１３６】
＃１系列からは１３個の成功が確認され、＃４シリーズからは２８個の成功が確認された。
【０１３７】
（参考文献）
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【図面の簡単な説明】
【図１】  ３Ｄ構造が公知の１０個のＣＴＬＤのアミノ酸配列の比較を示す。主要な２次構造要素の配列位置は、各配列の上に示してあり、αへリックス数Ｎを示す「αＮ」、及びβ鎖数Ｍを示す「βＭ」として連続した数字の順番で識別してある。
ＣＴＬＤの保存された２個のジスルフィド結合の形成に関与する４個のシステイン残基は、図中にそれぞれ「ＣI」、「ＣII」、「ＣIII」及び「ＣIV」として列挙して示してある。２個の保存されたジスルフィド結合は、それぞれＣI−ＣIV及びＣII−ＣIIIである。
１０個のＣ型レクチンは、
ｈＴＮ：ヒトテトラネクチン（Ｎｉｅｌｓｅｎ他（１９９７））、
ＭＢＰ：マンノース結合蛋白質（Ｗｅｉｓ他（１９９１）、Ｓｈｅｒｉｆｆ他（１９９４））、
ＳＰ−Ｄ：サーファクタント蛋白質Ｄ（Ｈａｋａｎｓｓｏｎ他（１９９１））、
ＬＹ４９Ａ：ＮＫ受容体ＬＹ４９Ａ（Ｔｏｒｍｏ他（１９９９））、
Ｈ１−ＡＳＲ：アシアロ糖蛋白質受容体のＨ１サブユニット（Ｍｅｉｅｒ他（２０００））、
ＭＭＲ−４：マクロファージマンノース受容体ドメイン４（Ｆｅｉｎｂｅｒｇ他（２０００））、
ＩＸ−Ａ及びＩＸ−Ｂ：それぞれ、凝固因子ＩＸ／Ｘ−結合蛋白質ドメインＡ及びＢ（ＭＩｚｕｎｏ他（１９９７））、
Ｌｉｔ：Ｌｉｔｈｏｓｔａｔｉｎｅ（Ｂｅｒｔｒａｎｄ他（１９９６））、
ＴＵ１４：尾索類Ｃ型レクチン（Ｐｏｇｅｔ他（１９９９））。
【図２】  ２次構造要素が公知であることが示されている成熟型ヒト及びマウスのテトラネクチンのコーディング領域のヌクレオチド配列とアミノ酸配列の配列比較を示す。
ｈＴＮ：ヒトテトラネクチン、Ｂｅｒｇｌｕｎｄ及びＰｅｔｅｒｓｅｎ（１９９２）のヌクレオチド配列。
ｍＴＮ：マウステトラネクチン、Ｓｏｒｅｎｓｅｎ他（１９９５）のヌクレオチド配列。
Ｎｅｉｌｓｅｎ他（１９９７）の２次構造要素。「α」はαへリックスを示し、「β」はβ鎖を示し、「Ｌ」はループを示す。
【図３】  ヒト及びマウスのｔｌｅｃコーディング領域のヌクレオチド配列とアミノ酸配列の配列比較を示す。ｈｔｌｅｃ：ｈＴＮ由来の配列。ｍｌｅｃ：ｍＴＮ由来の配列。ＢｇｌＩＩ、ＫｐｎＩ、及びＭｕｎＩの制限エンドヌクレアーゼ部位の位置を示す。
【図４】  ヒト及びマウスのｔＣＴＬＤコーディング領域のヌクレオチド配列とアミノ酸配列の配列比較を示す。ｈｔＣＴＬＤ：ｈＴＮ由来の配列。ｍｔＣＴＬＤ：ｍＴＮ由来の配列。ＢｇｌＩＩ、ＫｐｎＩ、及びＭｕｎＩの制限エンドヌクレアーゼ部位の位置を示す。
【図５】  ｐＴ７Ｈ６ＦＸ−ｈｔｌｅｃ発現プラスミドの概略を示す。Ｆｘ−ｈｔｌｅｃ断片をｐＴ７Ｈ６（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ他（１９９１））のＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位の間に挿入した。
【図６】  ｐＴ７Ｈ６ＦＸ−ｈｔｌｅｃによって産生したＨ６ＦＸ−ｈｔｌｅｃ融合蛋白質のＦｘ−ｈｔｌｅｃ部分のアミノ酸配列（１文字コード）を示す。
【図７】  ｐＴ７Ｈ６ＦＸ−ｈｔＣＴＬＤ発現プラスミドの概略を示す。ＦＸ−ｈｔＣＴＬＤ断片をｐＴ７Ｈ６（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ他（１９９１））のＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位の間に挿入する。
【図８】  ｐＴ７Ｈ６ＦＸ−ｈｔＣＴＬＤによって産生したＨ６ＦＸ−ｈｔＣＴＬＤ融合蛋白質のＦｘ−ｈｔＣＴＬＤ部分のアミノ酸配列（１文字コード）を示す。
【図９】  ｐＰｈＴＮファージミドの概略を示す。ＰｈＴＮ断片をファージミドｐＣＡＮＴＡＢ  ５Ｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、コード番号２７−９４０１−０１）のＳｆｉＩとＮｏｔＩ制限部位の間に挿入した。
【図１０】  ｐＰｈＴＮによって産生されるＰｈＴＮ−遺伝子ＩＩＩ融合蛋白質のＰｈＴＮ部分のアミノ酸配列（１文字コード）を示す。
【図１１】  ｐＰｈＴＮ３ファージミドの概略を示す。ＰｈＴＮ３断片をファージミドｐＣＡＮＴＡＢ  ５Ｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、コード番号２７−９４０１−０１）のＳｆｉＩとＮｏｔＩ制限部位の間に挿入した。
【図１２】  ｐＰｈＴＮ３によって産生されるＰｈＴＮ３−遺伝子ＩＩＩ融合蛋白質のＰｈＴＮ３部分のアミノ酸配列（１文字コード）を示す。
【図１３】  ｐＰｈｔｌｅｃファージミドの概略を示す。Ｐｈｔｌｅｃ断片をファージミドｐＣＡＮＴＡＢ  ５Ｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、コード番号２７−９４０１−０１）のＳｆｉＩとＮｏｔＩ制限部位の間に挿入した。
【図１４】  ｐＰｈｔｌｅｃによって産生されるＰｈｔｌｅｃ−遺伝子ＩＩＩ融合蛋白質のＰｈｔｌｅｃ部分のアミノ酸配列（１文字コード）を示す。
【図１５】  ｐＰｈｔＣＴＬＤファージミドの概略を示す。ＰｈｔＣＴＬＤ断片をファージミドｐＣＡＮＴＡＢ  ５Ｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、コード番号２７−９４０１−０１）のＳｆｉＩとＮｏｔＩ制限部位の間に挿入した。
【図１６】  ｐＰｈｔＣＴＬＤによって産生されるＰｈｔＣＴＬＤ−遺伝子ＩＩＩ融合蛋白質のＰｈｔＣＴＬＤ部分のアミノ酸配列（１文字コード）を示す。
【図１７】  ｐＵＣ−ｍｔｌｅｃの概略を示す。
【図１８】  ｐＴ７Ｈ６ＦＸ−ｍｔｌｅｃ発現プラスミドの概略を示す。ＦＸ−ｍｔｌｅｃ断片をｐＴ７Ｈ６（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ他（１９９１））のＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位の間に挿入した。
【図１９】  ｐＴ７Ｈ６ＦＸ−ｍｔｌｅｃによって産生されるＨ６ＦＸ−ｍｔｌｅｃ融合蛋白質のＦＸ−ｍｔｌｅｃ部分のアミノ酸配列（１文字コード）を示す。
【図２０】  ｐＴ７Ｈ６ＦＸ−ｍｔＣＴＬＤ発現プラスミドの概略を示す。ＦＸ−ｍｔＣＴＬＤ断片をｐＴ７Ｈ６（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ他（１９９１））のＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位の間に挿入した。
【図２１】  ｐＴ７Ｈ６ＦＸ−ｍｔＣＴＬＤによって産生されるＨ６ＦＸ−ｍｔＣＴＬＤ融合蛋白質のＦＸ−ｍｔＣＴＬＤ部分のアミノ酸配列（１文字コード）を示す。
【図２２】  ｐＰｍｔｌｅｃファージミドの概略を示す。Ｐｍｔｌｅｃ断片をファージミドｐＣＡＮＴＡＢ  ５Ｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、コード番号２７−９４０１−０１）のＳｆｉＩとＮｏｔＩ制限部位の間に挿入した。
【図２３】  ｐＰｍｔｌｅｃによって産生されるＰｍｔｌｅｃ−遺伝子ＩＩＩ融合蛋白質のＰｍｔｌｅｃ部分のアミノ酸配列（１文字コード）を示す。
【図２４】  ｐＰｍｔＣＴＬＤファージミドの概略を示す。ＰｍｔＣＴＬＤ断片をファージミドｐＣＡＮＴＡＢ  ５Ｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、コード番号２７−９４０１−０１）のＳｆｉＩとＮｏｔＩ制限部位の間に挿入した。
【図２５】  ｐＰｍｔＣＴＬＤによって産生されるＰｍｔＣＴＬＤ−遺伝子ＩＩＩ融合蛋白質のＰｍｔＣＴＬＤ部分のアミノ酸配列（１文字コード）を示す。
【図２６】  抗テトラネクチン又はＢＳＡに結合するＰｈｔｌｅｃ−、ＰｈＴＮ３−、及びＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージのＥＬＩＳＡ型分析を示す。パネルＡ：ブロック試薬として３％スキムミルク／５ｍＭ  ＥＤＴＡを使用した分析。パネルＢ：ブロック試薬として３％スキムミルクを使用した分析。
【図２７】  プラスミノーゲン（Ｐｌｇ）及びＢＳＡに結合するＰｈｔｌｅｃ−、ＰｈＴＮ３−、及びＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージのＥＬＩＳＡ型分析を示す。パネルＡ：ブロック試薬として３％スキムミルク／５ｍＭ  ＥＤＴＡを使用した分析。パネルＢ：ブロック試薬として３％スキムミルクを使用した分析。
【図２８】  選択２回目からプラスミノーゲン（Ｐｌｇ）に結合するＢ系列及びＣ系列のポリクローナル集団のＥＬＩＳＡ型分析をバックグラウンドと比較して示す。
【図２９】  ＥＬＩＳＡ型アッセイにおいて雌鶏卵白リゾチーム、ヒトβ2−ミクログロブリン及びバックグラウンドに対する結合について分析を行った３回目の選択から単離した１２個のクローンからのファージ。
【図３０】  ｐＰｒＭＢＰによって産生したＰｒＭＢＰ遺伝子ＩＩＩ融合蛋白質のＰｒＭＢＰ部分のアミノ酸配列（１文字コード）を示す。
【図３１】  ｐＰｒＭＢＰファージミドの概略を示す。ＰｒＭＢＰ断片をファージミドｐＣＡＮＴＡＢ  ５Ｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、コード番号２７−９４０１−０１）のＳｆｉＩとＮｏｔＩ制限部位の間に挿入した。
【図３２】  ｐＰｈＳＰ−Ｄによって産生されるＰｈＳＰ−Ｄ−遺伝子ＩＩＩ融合蛋白質のＰｈＳＰ−Ｄ部分のアミノ酸配列（１文字コード）を示す。
【図３３】  ｐＰｈＳＰ−Ｄファージミドの概略を示す。ＰｈＳＰ−Ｄ断片をファージミドｐＣＡＮＴＡＢ  ５Ｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、コード番号２７−９４０１−０１）のＳｆｉＩとＮｏｔＩ制限部位の間に挿入した。
【図３４】  ＥＬＩＳＡ型アッセイで雌鶏卵白リゾチーム及びＡ−ＨＡに対する結合を分析した１番系列における３回目の選択から単離した４８個のクローンからのファージ。
【図３５】  ＥＬＩＳＡ型アッセイで雌鶏卵白リゾチーム及びＡ−ＨＡに対する結合を分析した４番系列における３回目の選択から単離した４８個のクローンからのファージ。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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