(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその相補鎖、
（ｂ）配列番号：２で示される塩基配列を含むポリヌクレオチドまたはその相補鎖。
【請求項２】
請求項１に記載のポリヌクレオチドを含む遺伝子。
【請求項３】
請求項１に記載のポリヌクレオチド又は請求項２に記載の遺伝子を含む組み換え体発現ベクター。
【請求項４】
請求項３に記載の組み換え体発現ベクターを保有する宿主細胞。
【請求項５】
請求項３に記載の組み換え体発現ベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項６】
請求項５に記載の形質転換体を培養することにより得られる発現産物。
【請求項７】
配列番号：１で示されるアミノ酸配列を含む蛋白質。
【請求項８】
請求項６に記載の発現産物又は請求項７に記載の蛋白質の酵素活性を阻害する候補化合物をスクリーニングする方法であって、
請求項７に記載の蛋白質又は請求項６に記載の発現産物に基質のみを接触させた場合と、請求項７に記載の蛋白質又は請求項６に記載の発現産物に基質および候補化合物を接触させた場合とにおける、同蛋白質または同発現産物の酵素活性を測定、比較することを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項９】
以下の(i)〜(iii)を含む、請求項８に記載の候補化合物のスクリーニング方法に用いられるスクリーニング用キット：
(i)測定用緩衝液、
(ii)配列番号：１で示されるアミノ酸配列を含む蛋白質、および
(iii)基質としてのフルクトース−６−リン酸およびグルタミン。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、グルタミン：フルクトース−６−リン酸 アミドトランスフェラーゼ（Glutamine：fructose-6-phosphate amidotransferase、以下、ＧＦＡＴと略記する）の活性を有する新規な酵素の遺伝子、およびその遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を有する新規な蛋白質（酵素）に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＧＦＡＴは、生体内におけるヘキソサミン生合成経路において、律速段階であるフルクトース−６−リン酸からグルコサミン−６−リン酸への反応を触媒する重要な酵素である。近年、マクナイト(McＫnight)らは、６８１アミノ酸配列からなる該酵素のヒト遺伝子を報告した(McKnight, G. L. , et al., J. Biol. Chem., 267, 25208-25212 (1992)。その後、新たなヒトＧＦＡＴ遺伝子が、ニシらによって報告されている(米国特許第5,876,713号)。
【０００３】
このＧＦＡＴの活性を阻害する薬剤は、細胞内へのグルコースの取り込みを促進し、血糖値を低下させることができると考えられており、そのため糖尿病治療薬として期待されている。即ち、インスリンにより細胞内にグルコースの取り込みが促進され、取り込まれたグルコースは解糖系により代謝されエネルギー源としてのＡＴＰを蓄積するが、過剰に取り込まれた場合はグルコース代謝物であるフルクトース−６−リン酸がヘキソサミン生合成経路へ流れる。このヘキソサミン生合成経路へ流れたフルクトース−６−リン酸は、ＧＦＡＴによりグルコサミン−６−リン酸に変換される。
【０００４】
グルコサミン−６−リン酸代謝産物が糖輸送担体の膜移行を抑制し、それによって細胞内へのグルコースの取り込みが抑制されることが報告されている(FASEB J.，5, 3031-3036 (1991)）; Diabetologia, 38, 518-524 (1995);.J. Biol. Chem., 266, 10155-10161 (1991); J. Biol. Chem., 266, 4706-4712 (1991); Endocrinology, 136, 2809-2816 (1995)）。
【０００５】
糖代謝経路において、ヘキソサミン生合成経路は、グルコースの過剰取り込みに対するフィードバック機構として機能することが一つの役割として考えられており、ＧＦＡＴはその経路における律速酵素として重要であるとされている。更に、インスリンに依存しない２型糖尿病患者においては、このＧＦＡＴ活性が一般的に高いことが知られており、高血糖値を示す一つの原因であるとも報告されている(Diabetes, 45, 302-307 (1996))。
【０００６】
ＧＦＡＴは、ヒト由来(J. Biol. Chem., 267, 25208-25212 (1992):米国特許第5,876,713号）の他、マウス由来、酵母由来および大腸菌由来のものが報告されている。これらはいずれもヒトＧＦＡＴと高い相同性を示す。しかるに、現在、糖代謝において重要な臓器である骨格筋に特異的な新規なＧＦＡＴの存在については未だ知られていない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
ＧＦＡＴ活性を示す新たなＧＦＡＴの遺伝子の単離は、ヘキソサミン生合成経路におけるＧＦＡＴによる調節機能の解明に役立ち、また骨格筋などの臓器特異的に発現するＧＦＡＴ遺伝子の単離は、その臓器での糖代謝系機構の解明について更なる研究を可能とする。更に、これらの遺伝子によってコードされるアミノ酸配列の発現物としてのＧＦＡＴ蛋白質に対して阻害活性を有する特異的な候補化合物が見い出されれば、新たな作用機序を有する糖尿病疾患の予防や治療に役立つ血糖低下薬の開発が可能となる。
【０００８】
従って、本発明の課題は、かかる新たなＧＦＡＴの遺伝子、殊に骨格筋に特異的に発現するＧＦＡＴの遺伝子を単離する点にある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題より研究を重ねた結果、ヒト骨格筋ｍＲＮＡライブラリーから、ＧＦＡＴ活性を有する蛋白質をコードする新規な塩基配列のｃＤＮＡのクローニングに成功し、ここに、ヒト骨格筋および心臓に特異的に発現する所望の遺伝子に係わる本発明を完成するに至った。
【００１０】
即ち、本発明によれば、以下の要旨の発明が提供される。
(1)以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリヌクレオチドを含む遺伝子：
（ａ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはそれらの相補鎖、
（ｂ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して少なくとも９８％の相同性を持つポリヌクレオチドまたはそれらの相補鎖、
（ｃ）上記（ａ）のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり且つＧＦＡＴ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはそれらの相補鎖。
(2)以下の（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドからなる遺伝子：
（ａ）配列番号：２で示される塩基配列またはその相補鎖、
（ｂ）上記（ａ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドと高いストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
(3)配列番号：２で示される塩基配列である上記(2)に記載の遺伝子。
(4)上記(1)または(2)に記載の遺伝子を発現させて得られる遺伝子発現産物。
(5)上記(1)または(2)に記載の遺伝子を有する組換え体発現ベクター。
(6)上記(5)に記載の組換え体発現ベクターを保有する宿主細胞。
(7)上記(5)に記載の組換え体発現ベクターで形質転換された形質転換体。
(8)以下の（ａ）または（ｂ）の蛋白質：
（ａ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）上記（ａ）のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり且つＧＦＡＴ活性を有する蛋白質。
(9)上記(1)または(2)に記載の遺伝子または上記(4)に記載の遺伝子発現産物を有効成分として含有する低血糖症の治療または予防用組成物。
(10)上記(8)に記載の蛋白質を有効成分として含有する低血糖症の治療または予防用組成物。
(11)上記(4)に記載の遺伝子発現産物および上記(8)に記載の蛋白質およびこれらの断片から選ばれるいずれかに結合性を有する抗体、特にモノクローナル抗体。
(12)上記(1)に記載の遺伝子または上記(4)に記載の遺伝子発現産物および上記(8)に記載の蛋白質の酵素活性を阻害する候補化合物をスクリーニングする方法であって、上記(11)に記載の抗体と、候補化合物を含む被検液および標識化された請求項８に記載の蛋白質またはその部分ペプチドとを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化された蛋白質またはその部分ペプチドの割合を測定するか、(2)候補化合物を含む被検液と、担体上に不溶化した上記抗体および標識化された他の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定するか、或いは(3)上記(8)に記載の蛋白質またはその部分ペプチドに基質を接触させた場合と、同蛋白質またはその部分ペプチドに基質および候補化合物を接触させた場合とにおける、同蛋白質またはその部分ペプチドの酵素活性を測定、比較することを特徴とするスクリーニング方法。
(13)上記(12)に記載の候補化合物のスクリーニング方法に用いられるスクリーニング用キットであって、測定用緩衝液、上記(8)に記載の蛋白質またはその部分ペプチドおよび基質としてのフルクトース−６−リン酸およびグルタミンをキット成分として含有するキット。
【００１１】
また、本発明によれば、以下の要旨の発明も提供される。
(14)前記(4)に記載の遺伝子発現産物または(8)に記載の蛋白質(以下、これらを「ＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質」と総称する)或いはＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質の断片（部分ペプチド）に対する抗体と、被検液および標識化されたＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質またはその断片とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化されたＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質またはその断片の割合を測定することを特徴とする被検液中のＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質またはその断片の定量法。
(15)被検液と、担体上に不溶化した前記(14)に記載の抗体および標識化された別の異なるＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質に対する抗体とを、同時あるいは連続的に反応させた後、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中のＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質またはその断片の定量法。
(16)ＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質に対する抗体（好ましくは、ＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質の活性を中和する活性を有するＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質に対する抗体）を含有してなる医薬、特に糖尿病の治療および予防剤である医薬。
(17)ＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質またはその断片に基質を接触させた場合と、ＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質またはその断片に基質および試験化合物を接触させた場合とにおける、ＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質またはその断片の酵素活性を測定、比較することを特徴とする、ＧＦＡＴ酵素活性を阻害する化合物のスクリーニング方法。
【００１２】
更に本発明によれば、以下の要旨の発明も提供される。
(18)ＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子のＤＮＡに相補的または実質的に相補的な塩基配列を有し、該ＤＮＡの発現を抑制し得る作用を有するアンチセンスＤＮＡ。
(19)ＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子のＤＮＡに実質的に相補的な塩基配列が、該ＤＮＡに相補的な塩基配列の全塩基配列であるかあるいは部分塩基配列と約９８％以上（好ましくは約９９％以上）の相同性を有する塩基配列であるＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子のアンチセンスＤＮＡ。
(20)ＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子のアンチセンスＤＮＡを含有してなる医薬組成物、特に糖尿病の治療および予防剤である医薬組成物。
【００１３】
本明細書におけるアミノ酸、ペプチド、塩基配列、核酸等の略号による表示は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの規定〔IUPAC-IUB Communication on Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem., 138: 9 (1984)〕、「塩基配列またはアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（特許庁編）および当該分野における慣用記号に従うものとする。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明ＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子およびＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質につき、詳述する。
【００１５】
本発明蛋白質は、配列番号：１で示されるアミノ酸配列またはこれと実質的に同一のアミノ酸配列を含有することで特徴付けられる。本発明蛋白質は、例えば、ヒト細胞、特にヒト横紋筋細胞、あるいは例えばヒト組織、特に骨格筋、心臓に由来する蛋白質であることができ、また合成蛋白質であることもできる。
【００１６】
上記配列番号：１で示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号：１で示されるアミノ酸配列と約９８％以上、好ましくは約９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列が挙げられる。該配列番号：１で示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質には、前記した配列番号：１と実質的に同一のアミノ酸配列を有し且つ配列番号：１で示されるアミノ酸配列を含有する本発明蛋白質と実質的に同質のＧＦＡＴ活性を有する蛋白質が包含される。ここで実質的に同質とは、その活性が性質的に（例えば生理化学的または薬理学的に）同質であることを示す。従って、ＧＦＡＴ活性の程度や蛋白質の分子量などの量的要素は当然に異なることができる。
【００１７】
ＧＦＡＴ活性の測定は、それ自体公知の方法、例えばマーシャルらの方法(Marshall, et. al., J. Biol. Chem., 266(8), 4706-4712 (1991))に準じて行なうことができる。
【００１８】
また、本発明蛋白質には、配列番号：１で示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有し且つＧＦＡＴ活性を有するものも包含される。
【００１９】
また、本発明において「ＧＦＡＴ活性」とは、後記実施例に示されるように、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンがＧＦＡＴ活性を阻害することにおいて、フルクトース−６−リン酸を基質とした場合の、その阻害様式が、混合阻害様式で示されるＧＦＡＴ活性をいい、上記阻害様式が拮抗阻害様式であるものとは明確に区別される。以下、本明細書においては、かかる本発明に特有の混合阻害様式を示すＧＦＡＴ活性を単に「ＧＦＡＴ活性」と称するものとする。
【００２０】
上記アミノ酸配列の欠失、置換または付加の位置は、かかる改変されたアミノ酸配列を有する蛋白質がＧＦＡＴ活性を有する限り、任意であり、これら欠失、置換、付加の数も、同様にＧＦＡＴ活性を有する限り任意であることができる。
【００２１】
本発明遺伝子の一具体例としては、後述する実施例に示される「ＧＦＡＴ１Ｌ」と名付けられたＰＣＲ産物のＤＮＡ配列から演繹されるものを挙げることができる。その塩基配列は、配列番号：２に示されるとおりである。
【００２２】
該遺伝子は、配列番号：１で示される６９９アミノ酸配列の、骨格筋および心臓特異的蛋白質（ＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質）をコードするものであり、全長２０９７塩基からなっている。
【００２３】
本発明ＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子は、マクナイトらによってクローニングされたＧＦＡＴ遺伝子(McKnight, G.L., et. al., J. Biol. Chem., 267, 25208-25212 (1992))の６８４番目と６８５番目の塩基の間に、５４個の塩基が挿入された新規な配列を有することが確認された。
【００２４】
従って、本発明遺伝子によりコードされるＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質のアミノ酸配列は、上記マクナイトらの報告による遺伝子から演繹されるアミノ酸配列の２２８番目と２２９番目の間に、新たな１８個のアミノ酸配列が挿入されたものである。
【００２５】
本発明ＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質は、ＧＦＡＴ活性を有し、例えば低血糖の改善薬として有用である。また本発明遺伝子のアンチセンスＤＮＡや本発明遺伝子の発現産物に対する抗体は、糖尿病疾患の治療効果が予測され、更にこれらを利用した糖尿病治療剤としての候補化合物のスクリーニングへの利用も可能である。
【００２６】
本発明において遺伝子は、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡを包含する趣旨であり、またその長さに何ら制限されるものではない。従って、本発明遺伝子(DNA）には、特に言及しない限り、ヒトゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡおよびｃＤＮＡを含む１本鎖ＤＮＡ（センス鎖）並びに該センス鎖と相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（アンチセンス鎖）およびそれらの断片のいずれもが含まれる。
【００２７】
また本発明遺伝子(ＤＮＡ）は、リーダ配列、コード領域、エキソン、イントロン等を含むこができる。ポリヌクレオチドとしては、ＲＮＡ、ＤＮＡを例示できる。ＤＮＡは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡを含み、特定アミノ酸配列を有するポリペプチドは、その断片、同族体、誘導体、変異体を含み得る。
【００２８】
遺伝子における変異体は、天然に存在するアレル変異体、天然に存在しない変異体、欠失、置換、付加および挿入を有する変異体等であって、これらによりコードされるポリペプチドの機能を実質的に変更しないものを意味する。
【００２９】
ポリペプチドは、アレル体、ホモログ、天然の変異体で少なくとも９８％、好ましくは９９％相同なものを含む。
【００３０】
また、本発明遺伝子発現産物の生物活性、即ちＧＦＡＴ活性とは、フルクトース−６−リン酸からグルコサミン−６−リン酸への反応を触媒する作用として例示される。また、これはヒトまたは哺乳動物の血糖の上昇作用としても捉えることができる。なおＤＮＡおよびポリペプチドにおける相同性は、配列分析ソフトウェア、例えばＦＡＳＴＡプログラムを使用した測定（Clustal,V., Methods Mol.Biol., 25, 307-318 (1994))にて解析することがでる。
【００３１】
前記本発明遺伝子における変異体は、これによりコードされるアミノ酸置換についてサイレントまたは保存変異体を意味し、その塩基配列によってコードされるアミノ酸残基が変らない塩基配列の変異のことを表わす。
【００３２】
保存的なアミノ酸置換の数は以下に示されるとおりである：
元のアミノ酸残基          保存的な置換アミノ酸残基
Ala                               Ser
Arg                               Lys
Asn                               Gln, His
Asp                               Glu
Cys                               Ser
Gln                               Asn
Glu                               Asp
Gly                               Pro
His                               AsnまたはGln
Ile                               LeuまたはVal
Leu                               IleまたはVal
Lys                               Arg, Alnまたは Glu
Met                               LeuまたはIle
Phe                               Met, LeuまたはTyr
Ser                               Thr
Thr                               Ser
Trp                               Tyr
Tyr                               TrpまたはPhe
Val                               IleまたはLeu。
【００３３】
加えて、一般にシスティン残基をコードする１またはそれ以上のコドンは、特定のポリペプチドのジスフィド結合に影響を与えるのでシステイン残基の欠失の結果、置換することが可能である。
【００３４】
置換基を選択することによって作られる機能における実質的な変化は、上記アミノ酸のリストに記載されたものより少し保存性が劣っている：例えば、
a)置換基の領域におけるポリペプチドの構造背景、
b)標的部位のポリペプチドの電荷または疎水性、
c)アミノ酸側鎖の大きさ(容積)。
【００３５】
蛋白の特性に最も大きな変化を生み出すと一般的に期待される置換は、以下のものである：
a) 親水性残基、例えばセリルまたはスレオニンが疎水性残基例えば、ロイシル、イソロイシル、ファニルアラニル、ヴァリルまたはアラニイルに対して置換される、
b) システィンまたはプロリンは、いかなる他の残基に対して置換される、
c) 電気的陽性側鎖を有している残基、例えば、リジル、アルギニリル、ヒスタジルは電気的陰性残基、例えば、バルタアミルまたはアスパルチルによって置換されるが、
d) 非常に大きな側鎖を有している残基、例えば、フェニルアラニンはグリシンのような側鎖を有しないものと置換できる。
【００３６】
本発明ＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子およびその遺伝子産物の提供は、糖尿病の解明、把握、診断、予防および治療などに極めて有用な情報乃至手段を与える。また、本発明遺伝子は、上記の処置に利用される本発明遺伝子の発現を抑制または誘導する新規薬剤の開発の上でも好適に利用できる。更に、個体或は組織における本発明遺伝子の発現を抑制または誘導するその産物の発現の検出や、該遺伝子の変異（欠失や点変異）乃至発現異常の検出は、上記糖尿病病態の解明や診断において好適に利用できる。
【００３７】
前記改変されたアミノ酸配列をコードする本発明遺伝子は、その利用によって改変前のアミノ酸配列をコードする本発明遺伝子が検出できるものであってもよい。
【００３８】
本発明遺伝子の具体例としては、例えば配列番号：１で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする塩基配列を有するＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子を挙げることができるが、本発明遺伝子は特にこれに限定されることなく、当該ＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子の相同物をも包含する。
【００３９】
ここで「ＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子の相同物」とは、本発明ＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子（またはその遺伝子産物）と配列相同性を有し、上記構造的特徴並びに遺伝子発現パターンにおける共通性および上記したようなその生物学的機能の類似性（例えばＦＡＳＴＡプログラムを使用した相同性）より、ひとつの遺伝子ファミリーと認識される一連の関連遺伝子を意味する。
【００４０】
上記アミノ酸配列の改変（変異）などは、天然において、例えば突然変異や翻訳後の修飾などにより生じることもあるが、天然由来の遺伝子（例えば本発明ＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子）に基づいて人為的に改変することもできる。本発明は、このような改変・変異の原因および手段などを問わず、上記特性を有する全ての改変遺伝子を包含する。本発明の遺伝子には、配列番号：１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする遺伝子の対立遺伝子（アレル体）もまた包含される。
【００４１】
上記の人為的手段としては、例えばサイトスペシフィック・ミュータゲネシス〔Methods in Enzymology, 154, 350, 367-382 (1987)；同100, 468 (1983)；Nucleic Acids Res., 12, 9441 (1984)；続生化学実験講座１「遺伝子研究法II」、日本生化学会編, p105 (1986)〕などの遺伝子工学的手法、リン酸トリエステル法やリン酸アミダイト法などの化学合成手段〔J. Am. Chem. Soc., 89, 4801 (1967)；同91, 3350 (1969)；Science, 150, 178 (1968)；Tetrahedron Lett., 22, 1859 (1981)；同24, 245 (1983)〕およびそれらの組合せ方法などが例示できる。より具体的には、ＤＮＡの合成は、ホスホルアミダイト法またはトリエステル法による化学合成によることもでき、市販されている自動オリゴヌクレオチド合成装置上で行うこともできる。二本鎖断片は、相補鎖を合成し、適当な条件下で該鎖を共にアニーリングさせるか、または適当なプライマー配列と共にＤＮＡポリメラーゼを用い相補鎖を付加するかによって、化学合成した一本鎖生成物から得ることもできる。
【００４２】
本発明遺伝子の具体的態様としては、配列番号：２に示される塩基配列を有する遺伝子を例示できる。この塩基配列(コーディング領域)は、配列番号：１に示されるアミノ酸配列の各アミノ酸残基を示すコドンの一つの組合せ例を示している。本発明の遺伝子は、かかる特定の塩基配列を有する遺伝子に限らず、各アミノ酸残基に対して任意のコドンを組合せ、選択した塩基配列を有することも可能である。コドンの選択は、常法に従うことができ、例えば利用する宿主のコドン使用頻度などを考慮することができる〔Ncleic Acids Res., 9, 43 (1981)〕。
【００４３】
また、本発明遺伝子は、前記のとおり、配列番号：２に示される塩基配列と一定の相同性を有する塩基配列からなるものも包含する。
【００４４】
上記相同性を有する塩基配列からなるものとは、配列番号：２に示される塩基配列と少なくとも９８％の同一性、好ましくは少なくとも９９％の同一性を有するポリヌクレオチドおよびそれらの相補鎖ポリヌクレオチドをいう。
【００４５】
かかる遺伝子としては、例えば、０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中、６０℃または０．１％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ中、６０℃の高いストリンジェントな条件下で、配列番号：２に示される塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズする塩基配列を有する遺伝子を例示することができる。
【００４６】
本発明遺伝子は、本発明により開示された本発明遺伝子の具体例についての配列情報に基づいて、一般的遺伝子工学的手法により容易に製造・取得することができる〔Molecular Cloning 2d Ed, Cold Spring Harbor Lab. Press (1989)；続生化学実験講座「遺伝子研究法Ｉ、II、III」、日本生化学会編（1986）など参照〕。
【００４７】
具体的には、本発明遺伝子が発現される適当な起源より、常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを調製し、該ライブラリーから、本発明遺伝子に特有の適当なプローブや抗体を用いて所望クローンを選択す手法を挙げることができる〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 78, 6613 (1981)；Science, 222, 778 (1983)など〕。
【００４８】
上記において、ｃＤＮＡの起源としては、本発明の遺伝子を発現する各種の細胞、組織やこれらに由来する培養細胞などが例示される。また、これらからの全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡの取得とそのクローニングなどはいずれも常法に従って実施することができる。また、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーは市販されてもおり、本発明においてはそれらｍＲＮＡまたはｃＤＮＡライブラリー、例えばクローンテック社（Clontech Lab.Inc.）などより市販されている各種ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーなどを用いることもできる。
【００４９】
本発明の遺伝子をｃＤＮＡのライブラリーからスクリーニングする方法も、特に制限されず、通常の方法に従うことができる。具体的には、例えばｃＤＮＡによって産生される蛋白質に対して、該蛋白質の特異抗体を使用した免疫的スクリーニングにより対応するｃＤＮＡクローンを選択する方法、目的のＤＮＡ配列に選択的に結合するプローブを用いたプラークハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション、これらの組合せなどを例示できる。
【００５０】
ここで用いられるプローブとしては、本発明の遺伝子の塩基配列に関する情報をもとにして化学合成されたＤＮＡなどが一般的に使用できるが、既に取得された本発明遺伝子やその断片も良好に利用できる。また、本発明遺伝子の塩基配列情報に基づき設定したセンス・プライマー、アンチセンス・プライマーをスクリーニング用プローブとして用いることもできる。
【００５１】
前記プローブとして用いられるヌクレオチド配列は、配列番号：２に対応する部分ヌクレオチド配列であって、５４塩基の挿入配列部分の一部を少なくとも含む１５個以上の連続した塩基、好ましくは２０個の連続した塩基、より好ましくは３０個の連続した塩基、最も好ましくは５０個の連続した塩基を有するものである。或いは前記配列を有する陽性クローンそれ自体をプローブとして用いることもできる。
【００５２】
本発明の遺伝子の取得に際しては、ＰＣＲ法〔Science, 230, 1350 (1985)〕によるＤＮＡ／ＲＮＡ増幅法が好適に利用できる。殊に、ライブラリーから全長のｃＤＮＡが得られ難いような場合には、ＲＡＣＥ法〔Rapid amplification of cDNA ends；実験医学、12(6), 35 (1994)〕、特に５'-ＲＡＣＥ法〔M.A. Frohman, etal., Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 8, 8998 (1988)〕などの採用が好適である。
【００５３】
かかるＰＣＲ法の採用に際して使用されるプライマーは、本発明によって明らかにされた本発明遺伝子の配列情報に基づいて適宜設定でき、これは常法に従って合成できる。尚、増幅させたＤＮＡ／ＲＮＡ断片の単離精製は、前記の通り常法に従うことができ、例えばゲル電気泳動法などによればよい。
【００５４】
また、上記で得られる本発明遺伝子或いは各種ＤＮＡ断片は、常法、例えばジデオキシ法〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 74, 5463 (1977)〕やマキサム−ギルバート法〔Methods in Enzymology, 65, 499 (1980)〕などに従って、また簡便には市販のシークエンスキットなどを用いて、その塩基配列を決定することができる。
【００５５】
このようにして得られる本発明の遺伝子によれば、例えば該遺伝子の一部または全部の塩基配列を利用することにより、個体もしくは各種組織における本発明遺伝子の発現の有無を特異的に検出することができる。
【００５６】
かかる検出は常法に従って行うことができ、例えばＲＴ−ＰＣＲ〔Reverse transcribed-Polymerase chain reaction; E.S. Kawasaki, et al., Amplification of RNA. In PCR Protocol, A Guide to methods and applications, Academic Press,Inc.,SanDiego, 21-27 (1991)〕によるＲＮＡ増幅、ノーザンブロッティング解析〔Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Lab. (1989)〕、in situ ＲＴ−ＰＣＲ〔Nucl. Acids Res., 21, 3159-3166 (1993)〕、in situ ハイブリダイゼーションなどを利用した細胞レベルでの測定、ＮＡＳＢＡ法〔Nucleic acid sequence-based amplification, Nature, 350, 91-92 (1991)〕およびその他の各種方法を挙げることができる。好適には、ＲＴ−ＰＣＲによる検出法を挙げることができる。
【００５７】
尚、ここでＰＣＲ法を採用する場合に用いられるプライマーは、本発明遺伝子のみを特異的に増幅できる該遺伝子特有のものである限り、特に制限はなく、本発明遺伝子の配列情報に基いて適宜設定することができる。通常、１０〜３５ヌクレオチド程度、好ましくは１５〜３０ヌクレオチド程度の長さを有する本発明遺伝子の部分配列を有するものを挙げることができる。
【００５８】
このように、本発明の遺伝子には、本発明にかかるＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子を検出するための特異プライマーおよび／または特異プローブとして使用されるＤＮＡ断片もまた包含される。
【００５９】
当該ＤＮＡ断片は、配列番号：２に示される塩基配列からなるＤＮＡと高いストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを特徴とするＤＮＡとして規定することできる。ここで、高いストリンジェントな条件としては、プライマーまたはプローブとして用いられる通常の条件を挙げることができ、特に制限はされないが、例えば、前述するような０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中、６０℃の条件または０．１％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ中、６０℃の条件を例示することができる。
【００６０】
本発明のＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子によれば、通常の遺伝子工学的手法を用いることにより、該遺伝子産物（ＧＦＡＴ１Ｌ蛋白）またはこれを含む蛋白質を容易に大量に、安定して製造することができる。
【００６１】
従って本発明は、本発明遺伝子によってコードされるＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質などの蛋白質を始め、該蛋白質の製造のための、例えば本発明遺伝子を含有するベクター、該ベクターによって形質転換された宿主細胞、該宿主細胞を培養して上記本発明蛋白質を製造する方法などをも提供するものである。
【００６２】
本発明蛋白質の具体的態様としては、配列番号：１に示すアミノ酸配列を有するＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質を挙げることができるが、本発明蛋白質には、該ＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質のみならず、その相同物も包含される。該相同物としては、上記配列番号：１に示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有し且つ前記ＧＦＡＴ活性を有する蛋白質を挙げることができる。ここで前記ＧＦＡＴ活性とはフルクトース−６−リン酸からグルコサミン−６−リン酸への反応を触媒する作用または血糖上昇作用を例示でき且つフルクトース−６−リン酸を基質としてＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンがＧＦＡＴに対して、混合阻害の様式を示すものを包含するものとする。
具体的には、前記ＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子の相同物（アレル体を含むＧＦＡＴ１Ｌ同等遺伝子）の遺伝子産物を挙げることができる。
【００６３】
また、本発明ＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質の相同物には、配列番号：１に示されるアミノ酸配列のＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質と同一活性を有する、哺乳動物、例えばヒト、ウマ、ヒツジ、ウシ、イヌ、サル、ネコ、クマ、ラット、ウサギなどの哺乳動物の蛋白質も包含される。
【００６４】
本発明の蛋白質は、本発明により提供されるＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子の配列情報に基づいて、常法の遺伝子組換え技術〔例えば、Science, 224, 1431 (1984) ; Biochem. Biophys. Res. Comm., 130, 692 (1985)；Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 80, 5990 (1983)など参照〕に従って調製することができる。
【００６５】
該蛋白質の製造は、より詳細には、該所望の蛋白をコードする遺伝子が宿主細胞中で発現できる組換えＤＮＡ（発現ベクター）を作成し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転換体を培養し、次いで得られる培養物から回収することにより行なわれる。
【００６６】
上記宿主細胞としては、原核生物および真核生物のいずれも用いることができ、例えば原核生物の宿主としては、大腸菌や枯草菌といった一般的に用いられるものが広く挙げられ、好適には大腸菌、とりわけエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２株を例示できる。また、真核生物の宿主細胞には、脊椎動物、酵母等の細胞が含まれ、前者としては、例えばサルの細胞であるＣＯＳ細胞〔Cell, 23: 175 (1981)〕、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞およびそのジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 77: 4216 (1980)〕などが、後者としては、サッカロミセス属酵母細胞などが好適に用いられる。勿論、これらに限定される訳ではない。
【００６７】
原核生物細胞を宿主とする場合は、該宿主細胞中で複製可能なベクターを用いて、このベクター中に本発明遺伝子が発現できるように該遺伝子の上流にプロモーターおよびＳＤ（シャイン・アンド・ダルガーノ）塩基配列、更に蛋白合成開始に必要な開始コドン（例えばＡＴＧ）を付与した発現プラスミドを好適に利用できる。上記ベクターとしては、一般に大腸菌由来のプラスミド、例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３などがよく用いられるが、これらに限定されず既知の各種のベクターを利用することができる。大腸菌を利用した発現系に利用される上記ベクターの市販品としては、例えばｐＧＥＸ−４Ｔ（Amersham Pharmacia Biotech社）、ｐＭＡＬ−Ｃ２，ｐＭＡＬ−Ｐ２（New England Biolabs社）、ｐＥＴ２１，ｐＥＴ２１／ｌａｃｑ（Invitrogen社）、ｐＢＡＤ／Ｈｉｓ（Invitrogen社）等を例示できる。
【００６８】
脊椎動物細胞を宿主とする場合の発現ベクターとしては、通常、発現しようとする本発明遺伝子の上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位および転写終了配列を保有するものが挙げられ、これは更に必要により複製起点を有していてもよい。該発現ベクターの例としては、具体的には、例えばＳＶ４０の初期プロモーターを保有するｐＳＶ２dhfr〔Mol. Cell. Biol., 1: 854 (1981)〕等が例示できる。上記以外にも既知の各種の市販ベクターを用いることができる。動物細胞を利用した発現系に利用されるかかるベクターの市販品としては、例えばｐＥＧＦＰ−Ｎ，ｐＥＧＦＰ−Ｃ（Clontrech社）、ｐＩＮＤ（Invitrogen社）、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ（Invitrogen社）などの動物細胞用ベクターや、ｐＦａｓｔＢａｃ ＨＴ（ＧｉｂｃｉＢＲＬ社）、ｐＡｃＧＨＬＴ（PharMingen社）、ｐＡｃ５／Ｖ５−Ｈｉｓ，ｐＭＴ／Ｖ５−Ｈｉｓ，ｐＭＴ／Ｂｉｐ／Ｖ５−ｈｉｓ（以上Invitrogen社）などの昆虫細胞用ベクターなどが挙げられる。
【００６９】
また、酵母細胞を宿主とする場合の発現ベクターの具体例としては、例えば酸性ホスフアターゼ遺伝子に対するプロモーターを有するｐＡＭ８２〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 80: 1 (1983)〕などが例示できる。市販の酵母細胞用発現ベクターには、例えばｐＰＩＣＺ（Invitrogen社）、ｐＰＩＣＺα（Invitrogen社）なとが包含される。
【００７０】
プロモーターとしても特に限定なく、エッシェリヒア属菌を宿主とする場合は、例えばトリプトファン(trp)プロモーター、lppプロモーター、lacプロモーター、recAプロモーター、PL/PRプロモーターなどを好ましく利用できる。宿主がバチルス属菌である場合は、SP01プロモーター、SP02プロモーター、penPプロモーターなどが好ましい。酵母を宿主とする場合のプロモーターとしては、例えばpH05プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーターなどを好適に利用できる。また、動物細胞を宿主とする場合の好ましいプロモーターとしては、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ＳＲαプロモーターなどを例示できる。
【００７１】
尚、本発明遺伝子の発現ベクターとしては、通常の融合蛋白発現ベクターも好ましく利用できる。該ベクターの具体例としては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合蛋白として発現させるためのｐＧＥＸ（Promega 社）などを例示できる。
【００７２】
また、成熟ポリペプチドをコードする配列が宿主細胞からのポリペプチドの発現、分泌を助けるポリヌクレオチド配列としては、分泌配列、リーダ配列が例示でき、細菌宿主に対して融合成熟ポリペプチドの精製に使用されるマーカー配列(ヘキサヒスチジン・タグ)、哺乳動物細胞の場合はヘマグルチニン(HA)・タグを例示できる。
【００７３】
所望の組換えＤＮＡ（発現ベクター）の宿主細胞への導入法およびこれによる形質転換法としては、特に限定されず、一般的な各種方法を採用することができる。
【００７４】
また得られる形質転換体は、常法に従い培養でき、該培養により所望のように設計した遺伝子によりコードされる本発明の目的蛋白質が、形質転換体の細胞内、細胞外または細胞膜上に発現、生産（蓄積、分泌）される。
【００７５】
該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択利用でき、培養も宿主細胞の生育に適した条件下で実施できる。
【００７６】
かくして得られる本発明の組換え蛋白質は、所望により、その物理的性質、化学的性質などを利用した各種の分離操作〔「生化学データーブックII」、1175-1259 頁、第１版第１刷、1980年 6月23日株式会社東京化学同人発行；Biochemistry, 25(25), 8274 (1986); Eur. J. Biochem., 163, 313 (1987)など参照〕により分離、精製できる。
【００７７】
該方法としては、具体的には、通常の再構成処理、蛋白沈澱剤による処理（塩析法）、遠心分離、浸透圧ショック法、超音波破砕、限外濾過、分子篩クロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの各種液体クロマトグラフィー、透析法、これらの組合せが例示でき、特に好ましい方法としては、本発明蛋白質に対する特異的な抗体を結合させたカラムを利用したアフィニティクロマトグラフィーなどを例示することができる。
【００７８】
尚、本発明蛋白質をコードする所望の遺伝子の設計に際しては、配列番号：２に示されるＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子の塩基配列を良好に利用することができる。該遺伝子は、所望により、各アミノ酸残基を示すコドンを適宜選択変更して利用することも可能である。
【００７９】
本発明蛋白質は、また、配列番号：１に示すアミノ酸配列に従って、一般的な化学合成法により製造することができる。該方法には、通常の液相法および固相法によるペプチド合成法が包含される。
【００８０】
かかるペプチド合成法は、より詳しくは、アミノ酸配列情報に基づいて、各アミノ酸を１個ずつ逐次結合させて鎖を延長させていく所謂ステップワイズエロンゲーション法と、アミノ酸数個からなるフラグメントを予め合成し、次いで各フラグメントをカップリング反応させるフラグメント・コンデンセーション法とを包含し、本発明蛋白質の合成は、そのいずれによってもよい。
【００８１】
上記ペプチド合成に採用される縮合法も、常法に従うことができ、例えば、アジド法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法、酸化還元法、ＤＰＰＡ（ジフェニルホスホリルアジド）法、ＤＣＣ＋添加物（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシサクシンアミド、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミドなど）法、ウッドワード法などを例示できる。
【００８２】
これら各方法に利用できる溶媒も、この種ペプチド縮合反応に使用されることのよく知られている一般的なものから適宜選択することができる。その例としては、例えばジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ヘキサホスホロアミド、ジオキサン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、酢酸エチルなどおよびこれらの混合溶媒などを挙げることができる。
【００８３】
尚、上記ペプチド合成反応に際して、反応に関与しないアミノ酸乃至ペプチドにおけるカルボキシル基は、一般にはエステル化により、例えばメチルエステル、エチルエステル、第３級ブチルエステルなどの低級アルキルエステル、例えばベンジルエステル、ｐ−メトキシベンジルエステル、ｐ−ニトロベンジルエステルなどのアラルキルエステルなどとして保護することができる。
【００８４】
また、側鎖に官能基を有するアミノ酸、例えばチロシン残基の水酸基は、アセチル基、ベンジル基、ベンジルオキシカルボニル基、第３級ブチル基などで保護されてもよいが、必ずしもかかる保護を行う必要はない。更に、例えばアルギニン残基のグアニジノ基は、ニトロ基、トシル基、ｐ−メトキシベンゼンスルホニル基、メチレン−２−スルホニル基、ベンジルオキシカルボニル基、イソボルニルオキシカルボニル基、アダマンチルオキシカルボニル基などの適当な保護基により保護することができる。
【００８５】
上記保護基を有するアミノ酸、ペプチドおよび最終的に得られる本発明蛋白質におけるこれら保護基の脱保護反応もまた、慣用される方法、例えば接触還元法や、液体アンモニア／ナトリウム、フッ化水素、臭化水素、塩化水素、トリフルオロ酢酸、酢酸、蟻酸、メタンスルホン酸などを用いる方法などに従って実施することができる。
【００８６】
かくして得られる本発明蛋白質は、前記した各種の方法、例えばイオン交換樹脂、分配クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー、向流分配法などのペプチド化学の分野で汎用される方法に従って、適宜精製を行うことができる。
【００８７】
本発明ＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質は、その特異抗体を作成するための免疫抗原としても好適に利用でき、この抗原を利用することにより、所望の抗血清（ポリクローナル抗体）およびモノクローナル抗体を取得することができる。
【００８８】
該抗体の製造法自体は、当業者によく理解されているところであり、本発明においてもこれら常法に従うことができる〔例えば、続生化学実験講座「免疫生化学研究法」、日本生化学会編（1986）など参照〕。
【００８９】
かくして得られる抗体は、例えばＧＦＡＴ１Ｌ蛋白の精製およびその免疫学的手法による測定ないしは識別などに有利に利用することができる。より具体的には、本発明遺伝子の発現が骨格筋や心臓の組織において確認されていることから、該抗体を用いて、ＧＦＡＴのこれら組織中での濃度の測定に利用することができる。
【００９０】
上記で得られた本発明ＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質は、これを有効成分とする医薬品として医薬分野において有用である。従って、本発明は本発明ＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質を有効成分とする医薬組成物をも提供するものである。
【００９１】
本発明ＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質の医薬としての有用性は上記したようにその糖代謝において、重要とされる組織である骨格筋に特異的ポリペプチドが有するＧＦＡＴ活性の促進、または低血糖改善作用の促進にあり、これらの活性を確認する方法は、例えば後記実施例に記載されているMarshallらの方法(Marshall, J. Biol.Chem.,266(8), 4706-4712 (1991))に準じて実施できる。
【００９２】
該方法は、ＧＦＡＴにより生成されたグルタメート(Glutamate)をさらにグルタメート脱水素酵素(Glutamate deydrogenase:GDH）と反応させる際に、同時に補酵素であるAPADがAPADHに還元され、この還元反応に伴った吸光度の変化をＧＦＡＴ活性として測定する方法である。即ち、該方法では、96穴のマイクロプレートを用い、200μlの基質溶液(40 mM Sodium phosphate buffer、pH 7.5、50 mM KCl、1.25 mM EDTA、0.3 mM APAD、6 U/ml (GDH)、0-6 mM Glutamine、0-6 mM Fructose-6-P (F6P))に適宜希釈したＧＦＡＴ１Ｌの大腸菌溶解液の可溶性画分50μlを加え、37℃で60分間反応させ、この時の365nmの吸光度の変化をマイクロプレートリーダーを用いる分光光度計法にて測定する。
【００９３】
医薬組成物において有効成分とする蛋白質には、その医薬的に許容される塩もまた包含される。かかる塩には、当業界で周知の方法により調製される、例えばナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、バリウム、アンモニウムなどのアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩などが包含される。更に上記塩には、本発明蛋白質と適当な有機酸ないし無機酸との反応による酸付加塩も包含される。代表的酸付加塩としては、例えば塩酸塩、塩化水素酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、酢酸塩、蓚酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、ラウリン酸塩、硼酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩（トシレート）、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、スルホン酸塩、グリコール酸塩、マレイン酸塩、アスコルビン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ナプシレートなどが例示される。
【００９４】
上記医薬組成物は、本発明蛋白質を活性成分として、その薬学的有効量を、適当な医薬担体ないし希釈剤と共に含有するものが含まれる。
【００９５】
上記医薬組成物（医薬製剤）に利用できる医薬担体としては、製剤の使用形態に応じて通常使用される、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤などの希釈剤或は賦形剤などを例示でき、これらは得られる製剤の投与単位形態に応じて適宜選択使用される。
【００９６】
特に好ましい本発明医薬製剤は、通常の蛋白製剤などに使用され得る各種の成分、例えば安定化剤、殺菌剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤などを適宜使用して調製される。
【００９７】
上記安定化剤としては、例えばヒト血清アルブミン、通常のＬ−アミノ酸、糖類、セルロース誘導体などを例示でき、これらは単独でまたはそれぞれを組合せたり、更にこれらに界面活性剤などと組合せて使用できる。この組合せによれば、有効成分の安定性をより向上させ得る場合がある。
【００９８】
上記Ｌ−アミノ酸は、特に限定はなく例えばグリシン、システィン、グルタミン酸などのいずれでもよい。
【００９９】
上記糖としても特に限定はなく、例えばグルコース、マンノース、ガラクトース、果糖などの単糖類、マンニトール、イノシトール、キシリトールなどの糖アルコール、ショ糖、マルトース、乳糖などの二糖類、デキストラン、ヒドロキシプロピルスターチ、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸などの多糖類、それらの誘導体などを使用できる。
【０１００】
界面活性剤としても特に限定はなく、イオン性および非イオン性界面活性剤のいずれも使用できる。例えばポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル系、ポリオキシエチレンアルキルエ−テル系、ソルビタンモノアシルエステル系、脂肪酸グリセリド系などを使用できる。
【０１０１】
セルロース誘導体としても特に限定はなく、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどを使用できる。
【０１０２】
上記糖類の添加量は、有効成分1μg当り約0.0001mg程度以上、好ましくは約0.01〜10mg程度の範囲とするのが適当である。界面活性剤の添加量は、有効成分1μg当り約0.00001mg程度以上、好ましくは約0.0001〜0.01mg程度の範囲とするのが適当である。ヒト血清アルブミンの添加量は、有効成分1μg当り約0.0001mg程度以上、好ましくは約0.001〜0.1mg程度の範囲とするのが適当である。アミノ酸は、有効成分1μg当り約0.001〜10mg程度とするのが適当である。また、セルロース誘導体の添加量は、有効成分1μg当り約0.00001mg程度以上、好ましくは約0.001〜0.1mg程度の範囲とするのが適当である。
【０１０３】
本発明医薬製剤中に含まれる有効成分の量は、広範囲から適宜選択されるが、通常約0.00001〜70重量％、好ましくは約0.0001〜5重量％程度の範囲とするのが適当である。
【０１０４】
また本発明医薬製剤中には、各種添加剤、例えば緩衝剤、等張化剤、キレート剤などをも添加することができる。ここで緩衝剤としては、ホウ酸、リン酸、酢酸、クエン酸、ε−アミノカプロン酸、グルタミン酸および／またはそれらに対応する塩（例えばそれらのナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ金属塩やアルカリ土類金属塩）などを例示できる。等張化剤としては、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、糖類、グリセリンなどを例示できる。またキレート剤としては、例えばエデト酸ナトリウム、クエン酸などを例示できる。
【０１０５】
本発明医薬製剤は、溶液製剤として使用できる他に、これを凍結乾燥化し保存し得る状態にした後、用時水、生埋的食塩水などを含む緩衝液などで溶解して適当な濃度に調製した後に使用することも可能である。
【０１０６】
本発明の医薬製剤の投与単位形態としては、各種の形態が治療目的に応じて選択でき、その代表的なものとしては、錠剤、丸剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、カプセル剤などの固体投与形態、溶液、懸濁剤、乳剤、シロップ、エリキシルなどの液剤投与形態が含まれ、これらは更に投与経路に応じて経口剤、非経口剤、経鼻剤、経膣剤、坐剤、舌下剤、軟膏剤などに分類され、それぞれ通常の方法に従い、調合、成形乃至調製することができる。
【０１０７】
例えば、錠剤の形態に成形するに際しては、上記製剤担体として例えば乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸、リン酸カリウムなどの賦形剤、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどの結合剤、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウムなどの崩壊剤、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリドなどの界面活性剤、白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油などの崩壊抑制剤、第４級アンモニウム塩基、ラウリル硫酸ナトリウムなどの吸収促進剤、グリセリン、デンプンなどの保湿剤、デンプン、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸などの吸着剤、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ酸末、ポリエチレングリコールなどの滑沢剤などを使用できる。
【０１０８】
更に錠剤は必要に応じ通常の剤皮を施した錠剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーティング錠とすることができ、また二重錠ないしは多層錠とすることもできる。
【０１０９】
丸剤の形態に成形するに際しては、製剤担体として例えばブドウ糖、乳糖、デンプン、カカオ脂、硬化植物油、カオリン、タルクなどの賦形剤、アラビアゴム末、トラガント末、ゼラチン、エタノールなどの結合剤、ラミナラン、カンテンなどの崩壊剤などを使用できる。
【０１１０】
カプセル剤は、常法に従い通常本発明の有効成分を上記で例示した各種の製剤担体と混合して硬質ゼラチンカプセル、軟質カプセルなどに充填して調製される。
【０１１１】
経口投与用液体投与形態は、慣用される不活性希釈剤、例えば水、を含む医薬的に許容される溶液、エマルジョン、懸濁液、シロップ、エリキシルなどを包含し、更に湿潤剤、乳剤、懸濁剤などの助剤を含ませることができ、これらは常法に従い調製される。
【０１１２】
非経口投与用の液体投与投与形態、例えば滅菌水性乃至非水性溶液、エマルジョン、懸濁液などへの調製に際しては、希釈剤として例えば水、エチルアルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、オリーブ油などの植物油などを使用でき、また注入可能な有機エステル類、例えばオレイン酸エチルなどを配合できる。これらには更に通常の溶解補助剤、緩衝剤、湿潤剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤、分散剤などを添加することもできる。
【０１１３】
滅菌は、例えばバクテリア保留フィルターを通過させる濾過操作、殺菌剤の配合、照射処理および加熱処理などにより実施できる。また、これらは使用直前に滅菌水や適当な滅菌可能媒体に溶解することのできる滅菌固体組成物形態に調製することもできる。
【０１１４】
坐剤や膣投与用製剤の形態に成形するに際しては、製剤担体として、例えばポリエチレングリコール、カカオ脂、高級アルコール、高級アルコールのエステル類、ゼラチン、半合成グリセライドなどを使用できる。
【０１１５】
ペースト、クリーム、ゲルなどの軟膏剤の形態に成形するに際しては、希釈剤として、例えば白色ワセリン、パラフイン、グリセリン、セルロース誘導体、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、オリーブ油などの植物油などを使用できる。
【０１１６】
経鼻または舌下投与用組成物は、周知の標準賦形剤を用いて、常法に従い調製することができる。
【０１１７】
尚、本発明薬剤中には、必要に応じて着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤などや他の医薬品などを含有させることもできる。
【０１１８】
上記医薬製剤の投与方法は、特に制限がなく、各種製剤形態、患者の年齢、性別その他の条件、疾患の程度などに応じて決定される。例えば錠剤、丸剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤およびカプセル剤は経口投与され、注射剤は単独でまたはブドウ糖やアミノ酸などの通常の補液と混合して静脈内投与され、更に必要に応じ単独で筋肉内、皮内、皮下もしくは腹腔内投与され、坐剤は直腸内投与され、経膣剤は膣内投与され、経鼻剤は鼻腔内投与され、舌下剤は口腔内投与され、軟膏剤は経皮的に局所投与される。
【０１１９】
上記医薬製剤中に含有されるべき有効成分の量およびその投与量は、特に限定されず、所望の治療効果、投与法、治療期間、患者の年齢、性別その他の条件などに応じて広範囲より適宜選択される。一般的には、該投与量は、通常、1日当りヒト体重1kg当り、約0.01μg〜10mg程度、好ましくは約0.1μg〜1mg程度とするのがよく、該製剤は1日に1回または数回に分けて投与することができる。
【０１２０】
上記により得られる本発明骨格筋特異的ポリペプチド、即ちＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質は、ＧＦＡＴ活性を有しており、本発明ＧＦＡＴ１Ｌ蛋白の全ポリペプチドまたはその一部は、それら自身低血糖改善剤として有用である。
【０１２１】
また、後記実施例に示されるように本発明遺伝子は、骨格筋や心臓の組織においてその発現が認められていることから、本発明ＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子のアンチセンスＤＮＡの全部または一部を包含する任意の遺伝子発現ベクターを作成し、該発現ベクターをこれら骨格筋組織において細胞内のｍＲＮＡに対して相補的配列を有するＲＮＡを作り出し、翻訳を阻害することにより強制的にＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子の発現を抑制させることができ、かくして、骨格筋組織におけるヘキソサミン生合成経路においてＧＦＡＴの活性を阻害することができ、細胞内へのグルコースの取り込みを促進させ、血糖値を低下させることができ、結果として糖代謝を改善し、糖尿病の進展の抑制または改善することができる。本発明遺伝子は、かかる抗糖尿病作用を有する遺伝子治療用組成物として、或いは遺伝子治療剤として利用できると考えられる。
【０１２２】
また、本発明は、ＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子の全部または一部を含有する遺伝子治療用ベクターおよび該ベクターによりＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子を導入した細胞を有効成分とする医薬を提供しようとするものである。
【０１２３】
即ち、本発明によれば、配列番号：２で示される塩基配列のアンチセンスＤＮＡ配列の全部または一部を含むＧＦＡＴ１Ｌアンチセンス遺伝子を含有する遺伝子治療用導入用ベクターおよび該ベクターによりＧＦＡＴ１Ｌアンチセンス遺伝子を導入した細胞、並びに該遺伝子治療用導入用ベクターおよび該ベクターによりＧＦＡＴ１Ｌアンチセンス遺伝子を導入した細胞を有効成分とする遺伝子治療剤が提供される。
【０１２４】
また、本発明によれば、配列番号：２で示される塩基配列のアンチセンスＤＮＡ配の全部または一部を含むＧＦＡＴ１Ｌアンチセンス遺伝子を含有する遺伝子治療用導入用ベクターおよび該ベクターによりＧＦＡＴ１Ｌアンチセンス遺伝子を導入した細胞を糖尿病患者の骨格筋細胞または患者の筋肉組織部位に投与することによってこれら組織における糖代謝を改善し、糖尿病の進展の抑制または糖尿病患者の糖代謝の改善をすることを特徴とする糖尿病治療剤を提供することができる。
【０１２５】
更にまた、本発明によれば、上記ＧＦＡＴ１Ｌアンチセンス遺伝子を含有する遺伝子治療用導入用のウイルスベクターを有効成分として含有する医薬、特に、骨格筋における糖代謝を改善するための処置などに使用される当該医薬が提供される。
【０１２６】
以下、かかる遺伝子治療につき詳述する。尚、以下の遺伝子治療の実施においては、特記しないかぎり、化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、遺伝学および免疫学の慣用的な方法を用いることができる。これらは、例えばマニアティス(Maniatis,T., et al., Molecular cloning: A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982))、サムブルック(Sambrook,J., et al.,Molecular cloning: A laboratory manual, 2nd Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1981))、アウスベル(Ausbel,F.M., et al., Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons, New York, New York,(1992))、グローバー(Glover,D., DNA Cloning,I and II(Oxford Press)(1985))、アナンド(Anand,Techniques for the Analysis of Complex Genomes,(Academic Press(1992))、グスリー(Guthrie,G., et al., Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, (Academic Press)(1991))およびフィンク(Fink,et al., Hum. Gene Ther., 3, 11-19(1992)に記載されている。
【０１２７】
本発明は、本発明ＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子の発現する細胞において、細胞内のｍＲＮＡに対して相補的配列を持つＲＮＡを作り出し、翻訳を阻害し、ＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子の発現を抑制するためのアンチセンス医薬の提供によるＧＦＡＴ活性抑制または血糖の上昇を抑制する遺伝子治療法を提供する。
【０１２８】
該治療法は、例えばＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子を有するＧＦＡＴ発現細胞本来のｍＲＮＡと結合させるか、あるいはＤＮＡ二重螺旋の間に入り込み三重鎖を形成させることによって、転写或いは翻訳の過程を阻害することによって、標的とする遺伝子の発現を抑制する方法である。この方法は遺伝子のｍＲＮＡと相補的なアンチセンス・オリゴヌクレオチドを製造し、該アンチセンス・オリゴヌクレオチドを標的細胞に供給する方法としてとらえることができる。
【０１２９】
かかるＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子の発現機能を抑制する作用を供給すれば、受容細胞／標的細胞におけるＧＦＡＴ活性または血糖の上昇を抑制することができる。当該アンチセンス・オリゴヌクレオチドを含有するベクターまたはプラスミドを用いて染色体外に維持し、目的の細胞に導入することができる。
【０１３０】
上記アンチセンス・オリゴヌクレオチドを用いた糖尿病の遺伝子治療によれば、レトロウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶ由来のベクターに該アンチセンス・オリゴヌクレオチドを組み込み、これをＧＦＡＴ活性発現細胞に感染させてアンチセンス・オリゴヌクレオチドを過剰発現させることにより、所望の血糖降下効果を得ることができる。
【０１３１】
このようにＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子を有する細胞にアンチセンス・オリゴヌクレオチドを導入してＧＦＡＴ１Ｌ蛋白の発現を抑制させる場合、当該アンチセンス・オリゴヌクレオチドは対応するＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子の全長に対応するものである必要はなく、例えば該ＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子の発現機能を抑制する機能と実質的に同質な機能を保持する限りにおいて、前記した改変体であっても、また特定の機能を保持した一部配列からなる遺伝子を使用することもできる。
【０１３２】
かかる組換えおよび染色体外維持の双方のための所望遺伝子の導入のためのベクターは、当該分野において既に知られており、本発明ではかかる既知のベクターのいずれもが使用できる。例えば、発現制御エレメントに連結したＧＦＡＴ１Ｌ のアンチセンス・オリゴヌクレオチドのコピーを含み、かつ目的の細胞内で当該アンチセンス・オリゴヌクレオチド産物を発現できるウイルスベクターまたはプラスミドベクターを挙げることができる。かかるベクターとして、通常前述する発現用ベクターを利用することもできるが、好適には、例えば起源ベクターとして、米国特許第５２５２４７９号明細書およびＰＣＴ国際公開ＷＯ９３／０７２８２号明細書に開示されたベクター（ｐＷＰ−７Ａ、ｐｗＰ−１９、ｐＷＵ−１、ｐＷＰ−８Ａ、ｐＷＰ−２１および／またはｐＲＳＶＬなど）またはｐＲＣ／ＣＭＶ（Invitrogen社製）などを用いて、調製されたベクターを挙げることができる。より好ましくは、後述する各種ウイルス・ベクターである。
【０１３３】
なお、遺伝子導入治療において用いられるベクターに使用されるプロモーターとしては、各種疾患の治療対象となる患部組織に固有のものを好適に利用することができる。
【０１３４】
その具体例としては、例えば、骨格筋に対しては、骨格筋アクチン、ミオシン重鎖、クレアチンキナーゼなどを例示できる。心臓に対しては、心房性ナトリウム利尿ホルモン、Ventricle-specific myosine軽鎖、Atrial- and ventricular- specific α-myosine重鎖などを例示できる。また、肝臓に対しては、アルブミン、α−フェトプロティン、α１−アンチトリプシン、トランスフェリン、トランススチレンなどを例示できる。結腸に対しては、カルボン酸アンヒドラーゼＩ、カルシノエンブロゲンの抗原などを例示できる。子宮および胎盤に対しては、エストロゲン、アロマターゼサイトクロームＰ４５０、コレステロール側鎖切断Ｐ４５０、１７アルファーヒドロキシラーゼＰ４５０などを例示できる。
【０１３５】
前立腺に対しては、前立腺抗原、ｇｐ９１−フォックス遺伝子、前立腺特異的カリクレインなどを例示できる。乳房に対しては、ｅｒｂ−Ｂ２、ｅｒｂ−Ｂ３、β−カゼイン、β−ラクトグロビン、乳漿蛋白質などを例示できる。肺に対しては、活性剤蛋白質Ｃウログロブリンなどを例示できる。皮膚に対しては、Ｋ−１４−ケラチン、ヒトケラチン１または６、ロイクリンなどを例示できる。
【０１３６】
脳に対しては、神経膠繊維質酸性蛋白質、成熟アストロサイト特異蛋白質、ミエリン塩基性蛋白質、チロシンヒドロキシラーゼなどを例示できる。膵臓に対しては、ヴィリン、グルカゴン、ランゲルハンス島アミロイドポリペプチド、アミラーゼ、ＰＡＰ１などを例示できる。甲状腺に対しては、チログロブリン、カルシトニンなどを例示できる。骨に対しては、α１コラーゲン、オステオカルシン、骨シアログリコプロティンなどを例示できる。腎臓に対してはレニン、肝臓／骨／腎臓アルカリ性ホスフォターゼ、エリスロポエチンなどを例示できる。
【０１３７】
なおアンチセンス・オリゴヌクレオチド導入用ベクターの製造において、導入されるアンチセンス・オリゴヌクレオチド（ＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子配列に対応する相補配列全部または一部）は、本発明のＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子の塩基配列情報に基づいて、前記の如く、一般的遺伝子工学的手法により容易に製造・取得することができる。
【０１３８】
かかるアンチセンス・オリゴヌクレオチド導入用ベクターの細胞への導入は、例えばエレクトロポレーション、リン酸カルシウム共沈法、ウイルス形質導入などを始めとする、細胞にＤＮＡを導入する当該分野において既に知られている各種の方法に従って行うことができる。なお、ＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子のアンチセンス・オリゴヌクレオチドで形質転換された細胞は、それ自体単離状態でＧＦＡＴ活性または血糖の上昇を抑制するための医薬や、治療研究のためのモデル系として利用することも可能である。
【０１３９】
遺伝子治療においては、上記のアンチセンス・オリゴヌクレオチド導入用ベクターは、患者の対象とする組織部位に局所的にまたは全身的に注射投与することにより患者の標的細胞内に導入することができる。この際全身的投与によれば、他の部位にＧＦＡＴｍＲＮＡが発現し得るいずれの細胞にも到達させることができる。形質導入された遺伝子が各標的細胞の染色体内に恒久的に取り込まれない場合には、該投与を定期的に繰り返せばよい。
【０１４０】
本発明の遺伝子治療方法は、前述するアンチセンス・オリゴヌクレオチド導入用の材料（アンチセンス・オリゴヌクレオチド導入用ベクター）を直接体内に投与するインビボ（in vivo）法と、患者の体内より一旦標的とする細胞を取り出して体外で遺伝子を導入して、その後、該細胞を体内に戻すエクスビボ（ex vivo）法の両方の方法を包含する。
【０１４１】
またＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子のアンチセンス・オリゴヌクレオチドを直接細胞内に導入し、ＲＮＡ鎖を切断する活性分子であるリボザイムによる遺伝子治療も可能である。
【０１４２】
後述する、本発明ＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子に対応する配列のアンチセンス・オリゴヌクレオチド全部もしくはその断片を含有する遺伝子導入用ベクターおよび該ベクターによりヒトＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子のアンチセンス・オリゴヌクレオチドを導入された細胞を有効成分とする本発明の遺伝子治療剤は、特に糖尿病をその利用対象とするものであるが、上記の遺伝子治療（処置）は、糖尿病以外にも糖尿病性神経症、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症のような糖尿病合併症の治療、並びに遺伝子標識をも目的として行うことができる。
【０１４３】
また、アンチセンス・オリゴヌクレオチドを導入する標的細胞は、遺伝子治療（処置）の対象により適宜選択することができる。例えば、標的細胞として、ＧＦＡＴ発現が認められる細胞、特に骨格筋、心臓組織以外に、リンパ球、線維芽細胞、肝細胞、造血幹細胞などを挙げることができる。
【０１４４】
上記遺伝子治療におけるアンチセンス・オリゴヌクレオチド導入方法には、ウイルス的導入方法および非ウイルス的導入方法が含まれる。
【０１４５】
ウイルス的導入方法としては、例えば、ＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子のアンチセンス・オリゴヌクレオチドが正常細胞に発現する外来の物質であることに鑑みて、ベクターとしてレトロウイルスベクターを用いる方法を挙げることができる。その他のウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、ＨＩＶ（human immunodeficiency virus）ベクター、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ，adeno-associated virus）、ヘルペスウイルスベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクター、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ，Epstein-Barr virus）ベクターなどがあげられる。
【０１４６】
非ウイルス的な遺伝子導入方法としては、リン酸カルシウム共沈法；ＤＮＡを封入したリポソームと予め紫外線で遺伝子を破壊した不活性化センダイウイルスを融合させて膜融合リポソームを作成し、細胞膜と直接融合させてＤＮＡを細胞内に導入する膜融合リポソーム法〔Kato,K.,et al.,  J. Biol. Chem., 266, 22071-22074 (1991)〕；プラスミドＤＮＡを金でコートして高圧放電によって物理的に細胞内にＤＮＡを導入する方法〔Yang,N.S. et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,87, 9568-9572 (1990)〕；プラスミドＤＮＡを直接インビボで臓器や標的組織に注入するネイキッド（naked）ＤＮＡ法〔Wolff,J.A.,et al., Science, 247, 1465-1467 (1990)〕；多重膜正電荷リポソームに包埋した遺伝子を細胞に導入するカチオニック・リポソーム法〔八木国夫, 医学のあゆみ, Vol.175,No.9,635-637 (1995)〕；特定細胞のみに遺伝子を導入し、他の細胞に入らないようにするために、目的とする細胞に発現するレセプターに結合するリガンドをＤＮＡと結合させてそれを投与するリガンド−ＤＮＡ複合体法〔Frindeis,et al.,Trends Biotechnol., 11, 202 (1993); Miller, et al.,FASEB J.,9, 190 (1995)〕などを使用することができる。
【０１４７】
上記リガンド−ＤＮＡ複合体法には、例えば肝細胞が発現するアシアロ糖蛋白レセプターをターゲットとしてアシアロ糖蛋白をリガンドとして用いる方法〔Wu, et al.,J.Biol.Chem., 266, 14338 (1991); Ferkol, et al.,FASEB J., 7, 1081-1091 (1993)〕、標的細胞が強く発現しているトランスフェリン・レセプターを標的としてトランスフェリンをリガンドとして用いる方法〔Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 87, 3410 (1990)〕などが含まれる。
【０１４８】
また本発明で用いられる遺伝子導入法は、上記の如き各種の生物学的および物理学的な遺伝子導入法を適宜組合せたものであってもよい。該組合せによる方法としては、例えばあるサイズのプラスミドＤＮＡをアデノウイルス・ヘキソン蛋白質に特異的なポリリジン抱合抗体と組合わせる方法を例示できる。該方法によれば、得られる複合体がアデノウイルスベクターに結合し、かくして得られる三分子複合体を細胞に感染させることにより本発明アンチセンス・オリゴヌクレオチドの導入を行い得る。この方法では、アデノアイルスベクターにカップリングしたＤＮＡが損傷される前に、効率的な結合、内在化およびエンドソーム分解が可能となる。また、前記リポソーム／ＤＮＡ複合体は、直接インビボにて遺伝子導入を媒介できる。
【０１４９】
以下、具体的な本発明のアンチセンス・オリゴヌクレオチド導入用ウイルスベクターの作成法並びに標的細胞または標的組織へのアンチセンス・オリゴヌクレオチド導入法について述べる。
【０１５０】
レトロウイルスベクター・システムは、ウイルスベクターとヘルパー細胞（パッケージング細胞）からなっている。ここでヘルパー細胞は、レトロウイルスの構造蛋白質ｇａｇ（ウイルス粒子内の構造蛋白質）、ｐｏｌ（逆転写酵素）、ｅｎｖ（外被蛋白質）などの遺伝子を予め発現しているが、ウイルス粒子を生成していない細胞を言う。一方、ウイルスベクターは、パッケージングシグナルやＬＴＲ(long terminal repeats)を有しているが、ウイルス複製に必要なｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖなどの構造遺伝子を持っていない。パッケージング・シグナルはウイルス粒子のアセンブリーの際にタグとなる配列で、選択遺伝子（ｎｅｏ，ｈｙｇ）とクローニングサイトに組込まれた所望の導入アンチセンス・オリゴヌクレオチド（ＧＦＡＴ１Ｌ に対応する全アンチセンス・オリゴヌクレオチドまたはその断片）がウイルス遺伝子の代りに挿入される。ここで高力価のウイルス粒子を得るにはインサートを可能な限り短くし、パッケージングシグナルをｇａｇ遺伝子の一部を含め広くとることと、ｇａｇ遺伝子のＡＴＧを残さぬようにすることが重要である。
【０１５１】
所望のＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子のアンチセンス・オリゴヌクレオチドを組込んだベクターＤＮＡをヘルパー細胞に移入することによって、ヘルパー細胞が作っているウイルス構造蛋白質によりベクターゲノムＲＮＡがパッケージされてウイルス粒子が形成され、分泌される。組換えウイルスとしてのウイルス粒子は、標的細胞に感染した後、ウイルスゲノムＲＮＡから逆転写されたＤＮＡが細胞核に組み込まれ、ベクター内に挿入されたアンチセンス遺伝子が発現する。
【０１５２】
尚、遺伝子の導入効率を上げる方法として、フイブロネクチンの細胞接着ドメインとヘパリン結合部位と接合セグメントとを含む断片を用いる方法〔Hanenberg,H.,et al., Exp. Hemat., 23, 747 (1995)〕を採用することもできる。
【０１５３】
上記レトロウイルスベクター・システムにおいて用いられるベクターとしては、例えばマウスの白血病ウイルスを起源とするレトロウイルス〔McLachlin, J.R., et al., Proc. Natl. Acad. Res. Molec. Biol., 38, 91-135 (1990)〕を例示することができる。
【０１５４】
アデノウイルスベクターを利用する方法につき詳述すれば、該アデノウイルスベクターの作成は、バークネル〔Berkner,K.L.,Curr.Topics Microbiol.Immunol., 158, 39-66 (1992)〕、瀬戸口康弘ら〔Setoguchi,Y.,et al., Blood, 84, 2946-2953 (1994)〕、鐘カ江裕美ら〔実験医学, 12, 28-34 (1994)〕およびケナーら〔Ketner,G.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA., 91, 6186-6190 (1994)〕の方法に準じて行うことができる。
【０１５５】
例えば、非増殖性アデノウイルスベクターを作成するには、まずアデノウイルスの初期遺伝子のＥ１および／またはＥ３遺伝子領域を除去する。次に、目的とする所望の外来遺伝子発現単位（目的とする導入用アンチセンス・オリゴヌクレオチド、即ち本発明ＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子のアンチセンス・オリゴヌクレオチドそのアンチセンス・オリゴヌクレオチドを転写するためのプロモーター、転写された遺伝子の安定性を賦与するポリＡから構成）およびアデノウイルスゲノムＤＮＡの一部を含むプラスミドベクターと、アデノウイルスゲノムを含むプラスミドとを、例えば２９３細胞に同時にトランスフェクションする。この２者間で相同性組換えを起こさせて、遺伝子発現単位とＥ１とを置換することにより、所望のＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子のアンチセンス・オリゴヌクレオチドを包含するベクターである非増殖性アデノウイルスベクターを作成することができる。また、コスミドベクターにアデノウイルスゲノムＤＮＡを組み込んで、末端蛋白質を付加した３’側アデノウイルスベクターを作成することもできる。更に組換えアデノウイルスベクターの作成には、ＹＡＣベクターも利用可能である。
【０１５６】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの製造につき概略すると、ＡＡＶはアデノウイルスの培養系に混入してくる小型のウイルスとして発見された。これには、ウイルス複製にヘルパーウイルスを必要とせず宿主細胞内で自律的に増殖するパルボウイルス属と、ヘルパーウイルスを必要とするディペンドウイルス属の存在が確認されている。該ＡＡＶは宿主域が広く、種々の細胞に感染するありふれたウイルスであり、ウイルスゲノムは大きさが４６８０塩基の線状一本鎖ＤＮＡからなり、その両端の１４５塩基がＩＴＲ(inverted terminal repeat)と呼ばれる特徴的な配列を持って存在している。このＩＴＲの部分が複製開始点となり、プライマーの役割をなす。更にウイルス粒子へのパッケージングや宿主細胞の染色体ＤＮＡへの組込みにも、該ＩＴＲが必須となる。また、ウイルス蛋白質に関しては、ゲノムの左半分が非構造蛋白質、即ち複製や転写をつかさどる調節蛋白質のＲｅｐをコードしている。
【０１５７】
組換えＡＡＶの作成は、ＡＡＶが染色体ＤＮＡに組み込まれる性質を利用して行うことができ、かくして所望の遺伝子導入用ベクターが作成できる。この方法は、より詳しくは、まず野生型ＡＡＶの５'と３'の両端のＩＴＲを残し、その間に所望の導入用アンチセンス・オリゴヌクレオチド（ＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子のアンチセンス・オリゴヌクレオチド）を挿入したプラスミド（ＡＡＶベクタープラスミド）を作成する。一方、ウイルス複製やウイルス粒子の形成に必要とされるウイルス蛋白質は、別のヘルパープラスミドにより供給させる。この両者の間には共通の塩基配列が存在しないようにし、遺伝子組換えによる野生型ウイルスが出現しないようにする必要がある。その後、両者のプラスミドを例えば２９３細胞へのトランスフェクションにより導入し、さらにヘルパーウイルスとしてアデノウイルス（２９３細胞を用いる場合は非増殖型のものでもよい）を感染させると、非増殖性の所望の組換えＡＡＶが産生される。続いて、この組換えＡＡＶは核内に存在するので、細胞を凍結融解して回収し、混入するアデノウイルスを５６℃加熱により失活させる。更に必要に応じて塩化セシウムを用いる超遠心法により組換えＡＡＶを分離濃縮する。上記のようにして所望の遺伝子導入用の組換えＡＡＶを得ることができる。
【０１５８】
ＥＢＶベクターの製造は、例えば清水らの方法に準じて行うことができる〔清水則夫ら、細胞工学, 14(3), 280-287 (1995)〕。
【０１５９】
本発明のアンチセンス・オリゴヌクレオチド導入用ＥＢＶベクターの製造につき概略すると、ＥＢウイルス（Epstein-Barr virus: EBV）は、1964年にエプスタイン(Epstein)らによりバーキット（Burkitt）リンパ腫由来の培養細胞より分離されたヘルペス科に属するウイルスである〔Kieff, E. and Liebowitz, D.: Virology, 2nd ed. Raven Press, New York, 1990, pp.1889-1920〕。該ＥＢＶには細胞をトランスフォームする活性があるので、遺伝子導入用ベクターとするためには、このトランスフォーム活性を欠いたウイルスを調製しなければならない。これは次の如くして実施できる。
【０１６０】
即ち、まず、所望の外来遺伝子を組み込む標的ＤＮＡ近傍のＥＢＶゲノムをクローニングする。そこに外来遺伝子のＤＮＡ断片と薬剤耐性遺伝子を組込み、組換えウイルス作製用ベクターとする。次いで適当な制限酵素により切り出された組換えウイルス作製用ベクターをＥＢＶ陽性Ａｋａｔａ細胞にトランスフェクトする。相同組換えにより生じた組換えウイルスは抗表面免疫グロブリン処理によるウイルス産生刺激により野生型ＡｋａｔａＥＢＶとともに回収できる。これをＥＢＶ陰性Ａｋａｔａ細胞に感染し、薬剤存在下で耐性株を選択することにより、野生型ＥＢＶが共存しない所望の組換えウイルスのみが感染したＡｋａｔａ細胞を得ることができる。さらに組換えウイルス感染Ａｋａｔａ細胞にウイルス活性を誘導することにより、目的とする大量の組換えウイルスベクターを産生することができる。
【０１６１】
組換えウイルスベクターを用いることなく所望のアンチセンス・オリゴヌクレオチドを標的細胞に導入する、非ウイルスベクターの製造は、例えば膜融合リポソームによる遺伝子導入法により実施することができる。これは膜リポソーム（脂質二重膜からなる小胞）に細胞膜への融合活性をもたせることにより、リポソームの内容物を直接細胞内に導入する方法である。
【０１６２】
上記膜融合リポソームによるアンチセンス・オリゴヌクレオチドの導入は、例えば中西らの方法によって行うことができる〔Nakanishi,M.,et al.,Exp.Cell Res.,159, 399-499 (1985); Nakanishi,M.,et al.,Gene introduction into animal tissues.In Trends and Future Perspectives in Peptide and Protein Drug Delivery (ed. by Lee, V.H. et al.)., Harwood Academic Publishers Gmbh. Amsterdam, 1995, pp.337-349〕。
【０１６３】
以下、該膜融合リポソームによるアンチセンス・オリゴヌクレオチドの導入法につき概略する。即ち、紫外線で遺伝子を不活性化したセンダイウイルスと所望のアンチセンス・オリゴヌクレオチドや発現蛋白質などの高分子物質を封入したリポソームを３７℃で融合させる。この膜融合リポソームは、内側にリポソーム由来の空洞を、外側にウイルス・エンベロープと同じスパイクがある疑似またイルスともよばれる構造を有している。更にショ糖密度勾配遠心法で精製後、標的とする培養細胞または組織細胞に対して膜融合リポソームを４℃で吸着させる。次いで３７℃にするとリポソームの内容物が細胞に導入され、所望のアンチセンス・オリゴヌクレオチドを標的細胞に導入できる。ここでリポソームとして用いられる脂質としては、５０％(モル比）コレステロールとレシチンおよび陰電荷をもつ合成リン脂質で、直径３００ｎｍの１枚膜リポソームを作製して使用するのが好ましい。
【０１６４】
また、別のリポソームを用いてアンチセンス・オリゴヌクレオチドを標的細胞に導入する方法としては、カチオニック・リポソームによるアンチセンス・オリゴヌクレオチド導入法を挙げることができる。該方法は、八木らの方法に準じて実施できる〔Yagi,K.,et al.,B.B.R.C., 196, 1042-1048 (1993)〕。この方法は、プラスミドも細胞も負に荷電していることに着目して、リポソーム膜の内外両面に正の電荷を与え、静電気によりプラスミドの取り込みを増加させ、細胞との相互作用を高めようとするものである。ここで用いられるリポソームは正荷電を有する多重膜の大きなリポソーム（multilamellar large vesicles: ＭＬＶ）が有用であるが、大きな１枚膜リポソーム（large unilamellar vesicles: ＬＵＶ）や小さな１枚膜リポソーム（small unilamellar vesicles: ＳＵＶ）を使用してプラスミドとの複合体を作製し、所望のアンチセンス・オリゴヌクレオチドを導入することも可能である。
【０１６５】
プラスミト包埋カチオニックＭＬＶの調製法について概略すると、これはまず脂質ＴＭＡＧ（N-(α-trimethylammonioacetyl)-didodecyl-D-glutamate chloride）、ＤＬＰＣ（dilauroyl phosphatidylcholine）およびＤＯＰＥ（dioleoyl phosphatidylethanolamine）をモル比が１：２：２となる割合で含むクロロホルム溶液（脂質濃度として1mM）を調製する。次いで総量1μmolの脂質をスピッツ型試験管に入れ、ロータリーエバポレーターでクロロホルムを減圧除去して脂質薄膜を調製する。更に減圧下にクロロホルムを完全に除去し、乾燥させる。次いで20μgの遺伝子導入用プラスミドを含む0.5mlのダルベッコのリン酸緩衝生理食塩液−Ｍｇ，Ｃａ含有を添加し、窒素ガス置換後、２分間ボルテックスミキサーにより攪袢して、所望のアンチセンス・オリゴヌクレオチドを含有するプラスミド包埋カチオニックＭＬＶ懸濁液を得ることができる。
【０１６６】
上記で得られたプラスミド包埋カチオニックＭＬＶを遺伝子治療剤として使用する一例としては、例えば発現目的アンチセンス・オリゴヌクレオチドを組み込んだ発現プラスミドを上記カチオニックＭＬＶにＤＮＡ量として0.6μg、リポソーム脂質量として30nmolになるように包埋し、これを2μlのリン酸緩衝生理食塩液に懸濁させて患者より抽出した標的細胞または患者組織に対して隔日投与する方法が例示できる。
【０１６７】
ところで、遺伝子治療とは「疾病の治療を目的として、遺伝子または遺伝子を導入した細胞をヒトの体内に投与すること」と厚生省ガイドラインに定義されている。しかしながら、本発明における遺伝子治療とは、該ガイドラインの定義に加えて、前記した標的細胞にＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子の、ＧＦＡＴ発現抑制アンチセンスＤＮＡとして特徴付けられるアンチセンス・オリゴヌクレオチドを導入することによって糖尿病を始めとする糖尿病合併症の治療のみならず、更に標識となる遺伝子または標識となる遺伝子を導入した細胞をヒト体内に導入することも含むものとする。
【０１６８】
本発明の遺伝子治療において、所望遺伝子の標的細胞または標的組織への導入方法には、代表的には２種類の方法が含まれる。
【０１６９】
その第１法は、目的とするアンチセンス・オリゴヌクレオチド（ＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子のアンチセンス・オリゴヌクレオチド）を導入された、アデノウイルスベクター等のウイルスベクターを患者の標的細胞または標的組織に直接感染させる遺伝子導入法である。
【０１７０】
上記第１法の別法として、目的アンチセンス・オリゴヌクレオチド（ＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子のアンチセンス・オリゴヌクレオチド）を含有するウイルスベクターを感染、あるいはウイルスベクターを含有するウイルス産生細胞と共培養し、患者由来の細胞に目的アンチセンス・オリゴヌクレオチドを導入し、患者体内に移植するex vivo法も採用することができる。
【０１７１】
第２法は、目的とする適当な動物細胞発現ベクタープラスミドＤＮＡに組み込まれたアンチセンス・オリゴヌクレオチド（ＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子のアンチセンス・オリゴヌクレオチド）を直接患者の体内や、骨格筋などの標的部位に注入する遺伝子直接導入法（直接法）である。これは例えばＨＶＪリポソーム法、カチオニックリポソーム法、ＤＮＡ直接注射法、電気穿孔法、遺伝子銃法等により実施できる。
【０１７２】
上記実施においては、特に体外における予備試験によって、遺伝子導入法によって、実際に目的アンチセンス・オリゴヌクレオチド（ＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子のアンチセンス・オリゴヌクレオチド）が導入されるか否かを、予めベクター遺伝子ｃＤＮＡのＰＣＲ法による検索やin situＰＣＲ法によって確認するか、あるいは目的アンチセンス・オリゴヌクレオチド（ＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子のアンチセンス・オリゴヌクレオチド）の導入に基づく所望の治療効果である特異的活性の上昇または低下や、標的細胞への効果を確認することが望ましい。また、ウイルスベクターを用いる場合には、増殖性ウイルスの検索をＰＣＲ法で行うなどして、遺伝子治療に際し、これらのアンチセンス・オリゴヌクレオチド等の導入による安全性を確認することが重要であることはいうまでもない。
【０１７３】
本発明はまた、本発明のアンチセンス・オリゴヌクレオチド導入用ベクターまたは目的アンチセンス・オリゴヌクレオチド（ＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子のアンチセンス・オリゴヌクレオチドど）が導入された細胞を活性成分とし、それを薬学的有効量、適当な無毒性医薬担体ないしは希釈剤と共に含有する医薬組成物または医薬製剤（遺伝子治療剤）を提供する。
【０１７４】
本発明の医薬組成物（医薬製剤）に利用できる医薬担体としては、製剤の使用形態に応じて通常使用される、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤などの希釈剤ないし賦形剤などを例示でき、これらは得られる製剤の投与単位形態に応じて適宜選択使用できる。
【０１７５】
本発明医薬製剤の投与単位形態としては、前記したＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質抗体製剤の製剤例を同様に挙げることができ、治療目的に応じて各種の形態から適宜選択することができる。
【０１７６】
例えば、本発明のアンチセンス・オリゴヌクレオチド導入用ベクターを含む医薬製剤は、該ベクターをリポソームに包埋された形態あるいは所望のアンチセンス・オリゴヌクレオチドが包含されるウイルスベクターを含むウイルスによって感染された培養細胞の形態に調製される。
【０１７７】
これらは、リン酸緩衝生理食塩液（ｐＨ７．４）、リンゲル液、細胞内組成液用注射剤中に配合した形態などに調製することもでき、またプロタミンなどの遺伝子導入効率を高める物質と共に投与されるような形態に調製することもできる。
【０１７８】
上記医薬製剤の投与方法は、特に制限がなく、各種製剤形態、患者の年齢、性別その他の条件、疾患の程度などに応じて決定される。
【０１７９】
上記医薬製剤中に含有されるべき有効成分の量およびその投与量は、特に限定されず、所望の治療効果、投与法、治療期間、患者の年齢、性別その他の条件などに応じて広範囲より適宜選択される。
【０１８０】
該製剤は１日に１回または数回に分けて投与することもでき、１から数週間間隔で間欠的に投与することもできる。尚、好ましくは、プロタミンなど遺伝子導入効率を高める物質またはこれを含む製剤と併用投与することができる。
【０１８１】
本発明に従う遺伝子治療を糖尿病の治療に適用する場合は、前記した種々の遺伝子治療を適宜組合わせて行う（結合遺伝子治療）こともでき、前記した遺伝子治療に、従来のインスリン療法、食事療法、などを組合わせて行うこともできる。さらに本発明遺伝子治療は、その安全性を含めて、ＮＩＨのガイドラインを参考にして実施することができる〔Recombinant DNA Advisory Committee, Human Gene Therapy, 4, 365-389 (1993)〕。
【０１８２】
本発明によれば、細胞のＧＦＡＴ活性を促すＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子の存在を検出するために、血液または血清のごとき生物学的試料を調製し、所望により核酸を抽出し、ＧＦＡＴ１Ｌの感受性遺伝子が存在する否かについて分析することが可能である。また、本発明によれば細胞または組織におけるＧＦＡＴ活性レベル、ＧＦＡＴｍＲＮＡの発現レベル、ヘキソサミン生合成経路調節機能障害への進行、または予後指標としての存在を検出するためには、ヘキソサミン生合成経路調節障害を有する生物学的な試料を調製し、ＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子が存在するか否か、あるいはそのｍＲＮＡの量について分析できる。この方法を用いることにより細胞または組織におけるＧＦＡＴ活性のレベル、ＧＦＡＴｍＲＮＡの発現レベル、ヘキソサミン生合成経路の調節機能障害への進行、または予後指標としての存在を検出することが可能となり、これらの診断、例えば糖尿病の診断並びに糖尿病治療効果の判定並びに予後の予測が可能となる。
【０１８３】
該検出方法は、例えば、予めＧＦＡＴ活性を有する患者サンプルから得られたＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子に関する情報を基に、該ＤＮＡ断片を作成し、ＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子のスクリーニングおよび／またはその増幅に用いられるように設計される。より具体的には、例えばプラークハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション、サザンブロット法、ノーザンブロット法などにおけるプローブとしての性質を有するもの、核酸配列をポリメラーゼで増幅するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、増幅したＧＦＡＴ１Ｌの全部または一部のＤＮＡ断片を得ることができるためのプローブとしての性質を有するものを作成できる。そのためにはまずＧＦＡＴ１Ｌと同じ配列を持つプライマーを作成し、スクリーニング用プローブとして用い、生物学的試料（核酸試料）と反応させることにより、当該ＧＦＡＴ１Ｌ配列を有する遺伝子の存在を確認することができる。該核酸試料は、標的配列の検出を容易にする種々の方法、例えば変性、制限消化、電気泳動またはドットブロッティングで調製してもよい。
【０１８４】
前記スクリーニング方法としては、特にＰＣＲ法を用いるのが感度の点から好ましく、該方法は、ＧＦＡＴ１Ｌ断片をプライマーとして用いる方法であれば特に制限されず、従来公知の方法(Science, 230, 1350-1354(1985))や新たに開発された、或いは将来使用されるＰＣＲ変法(榊 佳之、ほか編、羊土社、実験医学、増刊, 8(9)(1990); 蛋白質・核酸・酵素、臨時増刊、共立出版(株), 35(17)(1990))のいずれも利用することが可能である。
【０１８５】
プライマーとして使用されるＤＮＡ断片は、化学合成したオリゴＤＮＡであり、これらオリゴＤＮＡの合成は自動ＤＮＡ合成装置など、例えばＤＮＡ合成装置(PharmaciaLKB Gene Assembler Plus: ファルマシア社製)を使用して合成することができる。合成されるプライマー(センスプライマーまたはアンチセンスプライマー)の長さは約１０〜５０ヌクレオチド程度が好ましく、より好ましくは１５〜３０ヌクレオチド程度が例示できる。前記において、特に合成されるプライマーは、公知の他のＧＦＡＴのＤＮＡ配列と区別される配列を使用することが好ましい。上記スクリーニングに用いられるプローブは、通常は標識したプローブを用いるが、非標識であってもよく、直接的または間接的に標識したリガンドとの特異的結合によって検出してもよい。適当な標識、並びにプローブおよびリガンドを標識する方法は、本発明の技術分野で知られており、ニック・トランスレーション、ランダム・プライミングムまたはキナーゼ処理のような、既知の方法によって取り込ませることができる放射性標識、ビオチン、蛍光性基、化学発光基、酵素、抗体などがこれらの技術に包含される。
【０１８６】
検出のために用いるＰＣＲ法としては、例えばＲＴ−ＰＣＲ法が例示されるが、当該分野で用いられる種々の変法を適応することができる。
【０１８７】
また、本発明の測定方法は、試料中のＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子の検出のための試薬キットを利用することによって、簡便に実施することができる。
【０１８８】
故に本発明は上記ＧＦＡＴ１Ｌ ＤＮＡ断片を含有することを特徴とするＧＦＡＴ１Ｌの検出用試薬キットが提供される。
【０１８９】
該試薬キットは、少なくとも配列番号：２に示される塩基配列もしくはその相補的塩基配列の一部または全てにハイブリダイズするＤＮＡ断片を必須構成成分として含んでいればよく、他の成分として、標識剤、ＰＣＲ法に必須な試薬（例えば、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオチド三リン酸、プライマーなど）が含まれていてもよい。
【０１９０】
標識剤としては、放射性同位元素または蛍光物質などの化学修飾物質などが挙げられ、ＤＮＡ断片自身が予め該標識剤でコンジュゲートされていてもよい。更に当該試薬キットには、測定の実施の便益のために適当な反応希釈液、標準抗体、緩衝液、洗浄剤、反応停止液などが含まれていてもよい。
【０１９１】
更に本発明は、前記測定方法を用いる糖代謝障害、特にヘキソサミン生合成障害の診断方法および該方法に用いる診断剤並びに診断用キットをも提供するものである。
【０１９２】
また、前記方法を用いることにより、被検試料中から得られたＧＦＡＴ１Ｌ配列を直接的若しくは間接的に配列決定することにより、野生型ＧＦＡＴ１Ｌと相同性の高い相同物である新たなＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子に関連する関連遺伝子を見出すことができる。
【０１９３】
従って、本発明はかかる測定と被検試料中のＧＦＡＴ１Ｌ ＤＮＡの配列決定により、被検試料中のヒトＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子に関連する関連遺伝子のスクリーニング方法をも提供するものである。
【０１９４】
また、本発明の配列番号：１で示されるヒトＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子でコードされるポリペプチド、または該配列番号：１において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列、またはこれらの断片からポリペプチドを合成し、もしくは該ポリペプチドに対する抗体を合成することによって、野生型ＧＦＡＴ１Ｌおよび／または変異ＧＦＡＴ１Ｌの測定が可能となる。
【０１９５】
従って、本発明は、野生型ＧＦＡＴ１Ｌおよび／または変異ＧＦＡＴ１Ｌの抗体測定法、抗原測定法を提供するものである。該測定法によってＧＦＡＴ活性の程度、血糖調節障害の程度、ヘキソサミン生合成経路の機能障害の程度あるいは糖尿病の重症度、糖尿病性神経症、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症などの糖尿病合併症の程度を野生性型ＧＦＡＴ１Ｌポリペプチドの変化に基づいて検出することも可能である。かかる変化は、この分野における前記慣用技術によるＧＦＡＴ１Ｌ配列分析によっても決定できるが、更に好ましくは、抗体(ポリクローナルまたはモノクローナル抗体)を用いて、ＧＦＡＴ１Ｌポリペプチド中の相違、またはＧＦＡＴ１Ｌポリペプチドの有無を検出することができる。本発明の測定法の具体的な例示としては、ＧＦＡＴ１Ｌ抗体は、血液・血清などのヒトより採取した生体材料試料含有溶液からＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質を免疫沈降し、かつポリアクリルアミドゲルのウェスタン・ブロットまたはイムノブロット上でＧＦＡＴ１Ｌポリペプチドと反応することができる。また、ＧＦＡＴ１Ｌ抗体は免疫組織化学的技術を用いてパラフィンまたは凍結組織切片中のＧＦＡＴ１Ｌポリペプチドを検出することができる。抗体産生技術および精製する技術は当該分野においてよく知られているので、これらの技術を適宜選択することができる。
【０１９６】
野生型ＧＦＡＴ１Ｌまたはその突然変異体を検出する方法に関連するより好ましい具体例には、モノクローナル抗体および／または、ポリクローナル抗体を用いるサンドイッチ法を含む、酵素結合イムノソルベントアッセイ(ＥＬＩＳＡ)、放射線免疫検定法(ＲＩＡ)、免疫放射線検定法(ＩＲＭＡ)、および免疫酵素法(ＩＥＭＡ)が含まれる。
【０１９７】
また、本発明のＧＦＡＴ活性を阻害する薬剤の候補化合物をスクリーニングする方法において、例えば、ＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子発現産物またはＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質(以下、ＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質と併せて称する)またはそれらの断片に対する抗体と、候補化合物を含む被検液および標識化されたＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質またはＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質の部分ペプチドとを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化されたＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質またはＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質の部分ペプチドの割合を測定することを特徴とする被検液中のＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質またはＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質の部分ペプチドを定量するスクリーニング方法も可能である。
【０１９８】
また候補化合物を含む被検液と担体上に不溶化した前記抗体および標識化された別の異なるＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質に対する抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中のＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質またはＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質の部分ペプチドの定量法も可能である。
【０１９９】
さらに、ＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質またはＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質の部分ペプチドに基質を接触させた場合とＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質またはＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質の部分ペプチドに基質および試験化合物を接触させた場合における、ＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質またはＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質の部分ペプチドの酵素活性を測定して、比較することによってＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質の酵素活性（例、ＧＦＡＴ活性）を阻害する化合物をスクリーニングすることも可能である。
【０２００】
上記において、基質としては、本発明ＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質またはＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質の部分ペプチドの基質となり得るものであれば何れのものでもよく、通常、フルクトース−６−リン酸およびグルタミンが用いられる。フルクトース−６−リン酸としては、放射線標識（例、14Ｃ、3Ｈなど）したフルクトース−６−リン酸などを用いるのが好適である。試験化合物としては、例えば、ペプチド、蛋白、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
【０２０１】
上記のスクリーニング方法を実施するには、本発明ＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質またはＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質の部分ペプチドを、スクリーニングに適した緩衝液に懸濁させてこれらの標品を調製する。緩衝液は、ｐＨ約４〜１０（望ましくはｐＨ約６〜８）のリン酸バッファー、トリス−塩酸バッファーなどの、本発明ＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質またはＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質の部分ペプチドと基質との結合を阻害しないものであればいずれでもよい。
【０２０２】
本発明ＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質またはＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質の部分ペプチドのＧＦＡＴ活性は、公知の方法、例えばマーシャルらの方法(Journal of Biological Chemistry, vol. 266, No. 8, 4706-4712, (1991))に準じて測定することができる。
【０２０３】
該方法は、例えば９６穴のマイクロプレート上に２００μｌの基質溶液(400 mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH 7.5)、50 mM塩化カリウム、1.25 mM EDTA、0.3 mM APAD、6 U/ml (GDH)、0-6 mMグルタミン、0-6 mMフルクトース−６−リン酸 (F-6-P))に適宜希釈したＧＦＡＴ１Ｌの大腸菌溶解質５０μlを加え、３７℃で６０分間反応させ、この時の３６５ｎｍの吸光度の変化をマイクロプレートリーダーにより測定することにより実施することができる。上記ＧＦＡＴ活性の測定は、ＧＦＡＴにより生成されたグルタメート(Glutamate)をさらにグルタメート脱水素酵素(Glutamate deydrogenase:GDH）と反応させ、その際同時に惹起される補酵素であるＡＰＡＤがＡＰＡＤＨ に還元される反応に伴われる吸光度の変化をＧＦＡＴ活性として表わす方法である。
【０２０４】
また、別方法としては、例えばスミスらの方法〔アナリティカル・バイオケミストリー（Analytical Biochemistry）, 98, 478-480 (1979)〕を挙げることができる。該方法は例えば次の如くして実施される。即ち、まず１２μＭ フルクトース−６−リン酸、５μＭ グルタミンおよび０.２Ｍ リン酸バッファー（ｐＨ８.０）からなる混合液に本発明ＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質またはＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質の部分ペプチドを添加し、得られる溶液を２５℃で３０分間保温する。同溶液に０.５Ｍ塩酸を加え、９８℃で２時間反応させた後、２.５％ ＮａＮＯ2と１２.５％ ＮＨ4Ｏ3ＳＮＨ2を添加し、さらに０.２５％ ２−メチル−２−ベンゾチアゾロンを添加する。次に、０.５％ ＦｅＣｌ3を加えて、その溶液を６５０ｎｍで吸光度を測定し、生成されるグルコサミン−６−リン酸を定量する。
【０２０５】
上記各方法において、医薬候補化合物の選択方法は、例えば各試験において上記試験化合物が添加されていない場合におけるＧＦＡＴ活性が上記試験化合物が添加されている場合に比べて、約２０％以上、好ましくは約３０％以上、より好ましくは約５０％以上阻害されている場合、該試験化合物を本発明ＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質またはＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質の部分ペプチドのＧＦＡＴ活性を阻害する化合物として選択することができる。
【０２０６】
また本発明によれば、上記ＧＦＡＴ活性を阻害する薬剤の候補化合物をスクリーニングするためのスクリーニング用キットが提供できる。
【０２０７】
本発明のスクリーニング用キットは、構成要素の一つとして、本発明のＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質またはＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質の部分ペプチドを含有するものである。
本発明のスクリーニング用キットの具体例を以下に例示する。
１．スクリーニング用キットＩ
〔スクリーニング用試薬〕
１）ＧＦＡＴ１Ｌ標品：５０μl本発明のＧＦＡＴ１Ｌ大腸菌溶解質(ＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質の部分ペプチド)
２）補酵素入測定用緩衝液：４００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)、５０ｍＭ塩化カリウム、１．２５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．３ｍＭ ＡＰＡＤ、６Ｕ／ｍｌ(ＧＤＨ)
３）基質:０−６ｍＭフルクトース−６−リン酸、０−６ｍＭグルタミン
検出は、３６５ｎｍでの吸光度を測定する。
〔測定法〕９６穴のマイクロプレート上に２００μｌの基質溶液(400 mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH 7.5)、50 mM塩化カリウム、1.25 mM EDTA、0.3 mM APAD、6 U/ml (GDH)、０−６ｍＭグルタミン、０−６ｍＭフルクトース−６−リン酸 (F-6-P))に適宜希釈したＧＦＡＴ１Ｌの大腸菌溶解質５０μｌを加え、３７℃で６０分間反応させる。この時の３６５ｎｍの吸光度の変化をマイクロプレートリーダーにより測定する。
２．スクリーニング用キットＩＩ
〔スクリーニング用試薬〕
１）蛋白質標品：本発明のＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質(ＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質の部分ペプチド)またはその塩
２）測定用緩衝液：０.２Ｍ リン酸バッファー（ｐＨ８.０）
３）基質:１２μＭ フルクトース−６−リン酸、５μＭ グルタミン
検出は、６５０ｎｍでの吸光度を測定する。
〔測定法〕１２μＭ フルクトース−６−リン酸、５μＭ グルタミン、本発明のタンパク質またはその塩および０.２Ｍ リン酸バッファー（ｐＨ８．０）からなる反応液に試験化合物を添加した後、２５℃で３０分間保温する。これに０.５Ｍ塩酸を加え、９８℃で２時間加水分解する。２.５％ＮａＮＯ2と１２.５％ＮＨ4Ｏ3ＳＮＨ2を添加し、次いで０.２５％ ２−メチル−２−ベンゾチアゾロンを添加する。次に、０.５％ ＦｅＣｌ3を添加した後、６５０ｎｍで吸光度を測定する。
【０２０８】
また本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物（例えば、ペプチド、蛋白、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液など）から選ばれた化合物であり、本発明のＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質(ＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質の部分ペプチド）の酵素活性（例、ＧＦＡＴ活性）を阻害する化合物である。該化合物は、新規化合物であってもよいし、公知化合物であってもよい。また、低血糖改善用候補化合物としては、本発明のＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質(ＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質の部分ペプチドの酵素活性（例、ＧＦＡＴ活性）を促進する化合物である。
【０２０９】
該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属）などとの塩が例示でき、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが挙げられる。
【０２１０】
本発明のＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質(ＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質の部分ペプチドを含む、以下同じ）の酵素活性を阻害する化合物またはその塩は、例えば、糖尿病および糖尿病合併症などの疾患に対する治療剤または予防剤としての医薬として有用である。
【０２１１】
本発明のＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質の酵素活性を促進する化合物またはその塩は、例えば、低血糖症及び低血糖による合併症などの疾患に対する治療剤または予防剤としての医薬として有用である。
【０２１２】
また本発明によれば、より活性または安定した形態のＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質の誘導体または例えば、イン・ビボ(in vivo)でＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質の機能を高めるか、もしくは妨害する薬剤を開発するために、それらが相互作用する目的の生物学的に活性なポリペプチドまたは構造アナログ、例えばＧＦＡＴ１Ｌアゴニスト、ＧＦＡＴ１Ｌアンタゴニスト、ＧＦＡＴ１Ｌインヒビターなどを作製することが可能である。前記構造アナログは、例えばＧＦＡＴ１Ｌと他の蛋白質の複合体の三次元構造をＸ線結晶学、コンピューター・モデリングまたはこれらの組み合わせた方法によって決定することができる。また、構造アナログの構造に関する情報は、相同性蛋白質の構造に基づく蛋白質のモデリングによって得ることも可能である。
【０２１３】
また上記より活性または安定した形態のＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質の誘導体を得る方法としては、例えばアラニン・スキャンによる分析方法が挙げられる。該方法はあるアミノ酸残基をAlaで置換し、ペプチドの活性に対するその影響を測定する方法でペプチドの各アミノ酸残基をこのように分析し、当該ペプチドの活性や安定性に重要な領域を決定する方法である。該方法によって、より活性な、または安定なＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質の誘導体を設計することができる。
【０２１４】
また機能性アッセイによって選択した標的−特異的抗体を単離し、次いでその結晶構造を解析することも可能である。原則として、このアプローチにより、続く薬剤の設計の基本となるファーマコア(pharmacore)を得る。機能性の薬理学的に活性な抗体に対する抗−イディオタイプ抗体を生成させることによって、化学的または生物学的に生成したペプチドのバンクよりペプチドを同定したり単離したりすることが可能である。故に選択されたペプチドもファーマコアとして作用すると予測される。
【０２１５】
かくして、改善されたＧＦＡＴ１Ｌ活性もしくは安定性またはＧＦＡＴ１Ｌ活性のインヒビター、アゴニスト、アンタゴニストなどとしての作用を有する薬剤を設計・開発することができる。
【０２１６】
クローン化ＧＦＡＴ１Ｌ配列によって、十分な量のＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質を入手して、Ｘ線結晶学のような分析研究をも行うことができる。さらに、本発明の配列番号：１に示されるアミノ酸配列よりなるＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質の提供により、Ｘ線結晶学に代えるかまたはこれに加えて、コンピューターモデリング技術に適応可能である。
【０２１７】
また本発明によれば、ＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子のノックアウト・マウスやノックイン・マウス(変異マウス)を作成することによってＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子配列のどの部位が生体内で上記したような多様なＧＦＡＴ１Ｌ活性に影響を与えるかどうか、即ちＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子産物、並びに改変ＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子産物が生体内でどのような機能を有するかを確認することができる。
【０２１８】
該方法は、遺伝子の相同組換えを利用して、生物の遺伝情報を意図的に修飾する技術であり、マウスの胚性幹細胞(ＥＳ細胞)を用いた方法を例示できる（Capeccchi, M. R., Science, 244, 1288-1292 (1989))。
【０２１９】
尚、上記変異マウスの作製方法はこの分野の当業者にとって既に通常の技術であり、この改変技術(野田哲生編、実験医学,増刊, 14 (20) (1996)、羊土社)に、ヒト野性型ＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子および変異ＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子を適応して容易に変異マウスを作製し得る。従って前記技術の適応により、改善されたＧＦＡＴ１Ｌ活性もしくは安定性またはＧＦＡＴ１Ｌ活性のインヒビター、アゴニスト、アンタゴニストなどとしての作用を有する薬剤を設計・開発することができる。
【０２２０】
【発明の効果】
本発明によれば、ヒトＧＦＡＴと相同性を有する新規なヒト蛋白相同物をコードする遺伝子が提供される。
【０２２１】
本発明の遺伝子は糖代謝に重要な組織である骨格筋および心臓においてその発現が高く、これら組織およびその周辺組織におけるＧＦＡＴ活性または解糖系におけるヘキソサミン生合成経路を促進し、糖輸送担体の細胞膜への移行性を抑制すると考えられる。従って糖代謝における血糖調節に対して上昇的に作用することが考えられることから、本発明ＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子の発現量やＧＦＡＴ活性などの解析により、関連遺伝子の機能と糖代謝関連疾患との係わりについての研究に利用でき、特に低血糖または糖尿病患者への遺伝子診断並びに該遺伝子の発現産物に対する抗体やアンチセンスによる医薬用途への応用研究に用いることが可能である。
【０２２２】
また、本発明遺伝子の利用によれば、各種組織での該遺伝子の発現状況が調べられ、生体内におけるその機能を解析することが可能となる。
【０２２３】
また、該遺伝子によれば、該遺伝子がコードするＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質を遺伝子工学的に大量に製造することができ、該蛋白質の提供によれば、ＧＦＡＴ１Ｌ活性やＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質の結合活性などの機能を調べることもできる。
【０２２４】
またＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質は、ＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子およびその産物が関与する疾患（例えば、ＧＦＡＴ活性または解糖系におけるヘキソサミン生合成経路の調節に関連する疾患または低血糖、血糖調節に関連する疾患など、特に低血糖症の治療、または糖尿病や糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経症などの糖尿病性合併症）の病態解明や診断、治療などに有用である。
【０２２５】
本発明によれば、更にＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子のアンチセンス・オリゴヌクレオチドを含有する遺伝子治療に有用な遺伝子導入用ベクター、該ＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子のアンチセンス・オリゴヌクレオチドが導入された細胞および該ベクターまたは細胞を有効成分とする遺伝子治療剤、並びにその利用による遺伝子治療法などが提供される。
【０２２６】
本発明によれば、更に骨格筋、特に骨格筋の平滑細胞におけるＧＦＡＴｍＲＮＡの発現の抑制作用を有し、該作用による糖尿病および糖尿病合併症などの疾患および病態の処置などに使用されるＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子のアンチセンス・オリゴヌクレオチドまたはＧＦＡＴ１Ｌに結合性を有する抗体またはその断片を有効成分とする医薬も提供することができる。
【０２２７】
また、本発明によれば、ＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質、ＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子発現産物の酵素活性を阻害する、糖尿病の治療のための候補化合物のスクリーニング方法およびスクリーニング用キットをも提供することができる。
【０２２８】
【実施例】
以下、本発明を更に詳しく説明するため、実施例を挙げる。
【０２２９】
【実施例１】
ＧＦＡＴ１Ｌのクローニングと発現ベクターの構築
まず、マクナイトらの公知のヒトＧＦＡＴ(G.L.McKnight et.al.  J.Biol.Chem., 267, 25208-25212 (1992))の発現ベクターの構築のために、ヒトＧＦＡＴのｃＤＮＡ配列をもとに４つのプライマーＰ１〜Ｐ４を合成した。之等の塩基配列は、それぞれ配列番号：３〜６に示すとおりである。
【０２３０】
Ｐ１は、配列番号：２の３４−６６番目のヌクレオチド配列に相当する。Ｐ２は、同配列番号：２の１６−４８番目のヌクレオチド配列に相当する。Ｐ３は、同配列番号：２の１−３０番目のヌクレオチド配列に相当する。またＰ４は、同配列番号：２の２０７７−２０９７番目のヌクレオチド配列に相当する。Ｐ１〜Ｐ３は、それぞれフォワード・プライマーであり、大腸菌において発現効率をあげるために大腸菌のコドン利用度を考えて以下の部分に変異を与えたものである。
Ｐ１：配列番号：３の６，９，１２，１３，１５，１８番目のヌクレオチド
Ｐ２：配列番号：４の７，９，１８，２４，２７，３０，３１，３３番目のヌクレオチド
Ｐ３：配列番号：５の２２，３２，３４番目のヌクレオチド
Ｐ３における配列番号：５の１〜１０番目のヌクレオチド配列は、ｐＥＴベクターに挿入する際に必要になるＮｄｅＩサイト（CATATG）を導入するために付加した配列である。
【０２３１】
また、Ｐ４はリバース・プライマーであり、Ｃ末アミノ酸の後にＸｈｏＩサイト(CTCGAG，配列番号：６の１〜１１番目のヌクレオチド配列参照)を含む配列である。該ＸｈｏＩサイトの直前には終止コドン(TAA)が挿入されるように設計された。
【０２３２】
以下の方法で上記４つのプライマーを使って、Ｎ末アミノ酸が大腸菌で合成しやすいコドンに置き換わったベクターが構築され得る。
【０２３３】
ついで、クロンテック社から購入したヒト骨格筋ｍＲＮＡをもとに、プライマーＰ４で逆転写酵素を用いて逆転写反応をおこなった。ヒト骨格筋ｍＲＮＡ２μｇ／μｌを１００℃で５分間で変性させた後、氷中にて急冷させた。最終的に５０ｍＭトリス塩酸(pH8.3)、４０ｍＭ 塩化カリウム、６ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭ ＤＴＴ、０．１ｍＭのプライマー４、０．１ｍｇＢＳＡおよび４００単位／２μｌのＭＭＬＶ逆転写酵素（ギブコBRL社製）と脱イオン水(ＤＤＷ)を加えて５０μｌとし、３７℃で１０分間反応させた。
【０２３４】
前記反応物５μｌを１００℃で５分間で変性させた後、プライマーＰ１およびＰ４にてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は５μｌの逆転写反応物と５μｌの１０×緩衝液(１．２ｍＭトリス塩酸(pH8.0)、１００ｍＭ塩化カリウム 、６０ｍＭ硫酸アンモニウム、１％トリトンＸ−１００、 ０．１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ) 、５μｌの２ｍＭ ｄＮＴＰｓ混合物、０．４μＭの各プライマー、１ｍＭの塩化マグネシウム、２．５単位のＫＯＤダッシュ(dash) およびＤＤＷを加えて、総量５０μｌとし、９５℃、３０秒、６５℃、２秒、７４℃、６０秒を３０サイクル行い、さらに、７４℃、５分間反応させた。
【０２３５】
前記で得られた５μｌの反応産物について同様のＰＣＲ条件でプライマーをＰ２およびＰ４に変えてＰＣＲ反応を行なった。
【０２３６】
さらに、その反応産物の５μｌについて同様のＰＣＲ条件でプライマーＰ３およびＰ４にてＰＣＲ反応を行った。
【０２３７】
最終反応物は、ｐＥＴ２３ｂベクター（ノバゲン：Novagen社製）にクローニングし、ＡＢＩ３７７ＤＮＡシークエンサー（PE-ABI社製）にてＤＮＡ配列を確認した。
【０２３８】
次いで最終反応物はフェノール／クロロホルム処理し、エタノール沈殿をおこない、ＴＥ緩衝液に溶かした後、制限酵素ＮｄｅＩとＸｈｏＩにてＤＮＡの両端を切断した。
【０２３９】
該ＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩとＸｈｏＩで切断したｐＥＴ２３ｂベクターにライゲーションにより挿入した。
【０２４０】
かくして、塩基配列決定によって新規な配列の遺伝子を得、これを「ＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子」と命名した。
【０２４１】
得られた遺伝子は、そのコード領域の全長が配列番号：２で示される２０９７塩基からなり、該塩基配列によってコードされるアミノ酸配列は、配列番号：１に示される６９９アミノ酸配列からなっていた。これは該アミノ酸配列をコードするヒトｃＤＮＡ（全長２０９７塩基）であった。
【０２４２】
本発明遺伝子ＧＦＡＴ１ＬがコードするＧＦＡＴ１Ｌ蛋白質は、マクナイトらによってクローニングされたヒトＧＦＡＴ遺伝子(McKnight, G.L., et. al., J. Biol. Chem., 267, 25208-25212 (1992)) の６８４番目と６８５番目の塩基の間に、５４個の塩基が挿入された新規な遺伝子であることが確認された。従って、遺伝子配列でコードされる蛋白質のアミノ酸配列は、２２８番目と２２９番目の間に１８個のアミノ酸配列が挿入された構造物であることが判明した。
【０２４３】
以下に続く試験においては、本発明者らが単離した新規遺伝子を「ＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子」と呼び、マクナイトらのヒトＧＦＡＴ遺伝子を「ＧＦＡＴ１Ｓ遺伝子」と呼ぶ。
【０２４４】
【実施例２】
ＲＴ−ＰＣＲ法により、各臓器でのＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子の発現パターンを、ＧＦＡＴ１Ｓ遺伝子のそれと対比して、検索した。
【０２４５】
サンプルとしては、クローンテック社のクイッククローンｃＤＮＡ（QUICK-Clone cDNA, 心臓、脳、肝臓、骨格筋、小腸、腎臓、膵臓、脂肪）を用いた。
【０２４６】
プライマーとしては、配列番号：７および８に示す塩基配列を合成して使用し、更にExTaq（宝酒造社）を使用した。
【０２４７】
ＰＣＲ反応は、９５℃１分の後、９５℃、３０秒、５５℃、３０秒および７２℃、４５秒を１サイクルとして、４０サイクル繰り返した。遺伝子発現パターンの検索は、反応産物の一部を４％アガロースゲル電気泳動に供してもとめた。
【０２４８】
結果を図１に示す。
【０２４９】
図における各レーンは次の通りである。
【０２５０】
Marker（マーカー）、Heart（心臓）、Brain（脳）、Liver（肝臓）、Skeltal Muscle（骨格筋）、Kidney（腎臓）、Pancreas（膵臓）、Small Intestine（小腸）およびFat（脂肪）
図１より、ＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子は、心臓および骨格筋に強い発現が認められ、脳でも非常に弱い発現が認められた。試験した他の臓器においては、ＧＦＡＴ１Ｓ遺伝子のみの発現が認められた。
【０２５１】
このことから、本発明のＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子の発現は、臓器特異的に制御されていることが判明した。
【０２５２】
【実施例３】
ＧＦＡＴ１Ｌ組換え蛋白質の調製
ヒトＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子（対比のためＧＦＡＴ１Ｓ遺伝子）のそれぞれをｐＥＴ２３ｂベクター（ノバゲン社製：Novagen）に組み込み、該ベクターを用いてＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ(ＤＥ３)ＲＩＬ(ストラタジーン社製：Stratagene）を形質転換し、得られた形質転換体をアンピシリンを含むＬＢ培地で３７℃、一晩培養した。翌日、５０ｍｌの培養液を１Ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地に加え、さらに３７℃で培養した。９０分後、２ｍｌの１Ｍイソプロピルβ−Ｄ−(−)−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ：和光純薬社製）を加え、２０℃で一晩培養して組換え蛋白質の発現を誘導した。
【０２５３】
培養液を７０００ｒｐｍで５分間遠心して大腸菌を回収し、５０ｍｌの０℃に冷やしたダルベッコのＰＢＳ(-)：日水製薬社製）で１回洗浄した。次に５ｍＭジチオスレイトール（DTT）、２０％グリセリンを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（pH8.0）を、全量が４０ｍｌになるように加えて懸濁した後、超音波処理して菌体を破砕した。この破砕液を超遠心（30,000rpm、30分、4℃）して不溶性成分を除いた。
【０２５４】
かくして、所望の組換え蛋白質を含む上清を得た。得られた上清は１ｍｌづつ分注して、液体窒素で急速凍結後に−８０℃に使用時まで保存した。
【０２５５】
【実施例４】
ＧＦＡＴ１ＬとＧＦＡＴ１Ｓの特徴的な差異の検討
１．ＧＦＡＴ活性測定方法
ＧＦＡＴ活性の測定は、マーシャル(Marshall)らに準じ、９６穴のマイクロプレートを用いた分光光度計法にて行なった(Journal of Biological Chemistry, vol. 266, No. 8, 4706-4712, (1991))。この測定方法では、ＧＦＡＴにより生成されたグルタメート(Glutamate)をさらにグルタメート脱水素酵素(Glutamate deydrogenase:GDH）と反応させ、その際同時に起こる補酵素であるＡＰＡＤがＡＰＡＤＨに還元される反応に伴われる吸光度の変化をＧＦＡＴ活性として表わした。
【０２５６】
即ち、２００μlの基質溶液(40 mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH 7.5)、50 mM塩化カリウム、1.25 mM EDTA、0.3 mM APAD、6 U/ml (GDH)、0-6 mMグルタミン、0-6 mMフルクトース−６−リン酸 (F-6-P))に適宜希釈したＧＦＡＴ１ＬあるいはＧＦＡＴ１Ｓの大腸菌溶解質５０μlを加え、３７℃で６０分間反応させた。この時の３６５ｎｍの吸光度の変化をマイクロプレートリーダーにより測定した。
２．ＧＦＡＴ１ＬとＧＦＡＴ１Ｓの酵素学的相違
ＧＦＡＴ１ＬとＧＦＡＴ１Ｓの間の酵素学的な相違を検討するため、基質としてグルタミンおよびＦ−６−Ｐのそれぞれを用いて、Ｋｍ値を求めた。Ｋｍ値は、酵素の基質濃度（S）および酵素活性（反応速度（v））の値を基に作成したＳ／ｖ〜Ｓおよびｖ〜ｖ／ｓプロットから算出した。またその算出は、Ｓ／ｖ〜ＳのプロットではグラフのＸ軸とプロットして得られた直線の交点（交点＝−Ｋｍ値）から、ｖ〜ｖ／ｓプロットでは直線の傾き（傾き＝−Ｋｍ値）から求めた。
【０２５７】
さらにＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン (UDP-GlcNAc)がＧＦＡＴ活性を阻害することが報告されていることから（Journal of Biological Chemistry vol. 241, 1705-1712( 1966)）、この阻害様式についても検討した。この阻害様式は、同様のプロッティングを行ない、得られた直線の形式から求めた。
【０２５８】
その結果を図２、図３および表１に示す。
【０２５９】
図２は、Ｆ−６−Ｐを基質とした場合のＧＦＡＴ１ＳおよびＧＦＡＴ１ＬにおけるＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃのＧＦＡＴ活性阻害様式を示すグラフであり、縦軸は酵素の反応速度（ｖ）を、横軸は反応速度（ｖ）／酵素の基質濃度（ｓ）を示す。
【０２６０】
図２の左のグラフがＧＦＡＴ１Ｓの結果であり、右のグラフがＧＦＡＴ１Ｌの結果を示している。各図において、(1)はＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃなしの場合を、(2)はＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ３０μＭ添加の場合を、(3)はＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ１００μＭ添加の場合をそれぞれ示す。
【０２６１】
該図より求められたＫｍ値は、ＧＦＡＴ１ＳおよびＧＦＡＴ１Ｌにおいて、それぞれ９０μＭおよび４７８μＭであり、またＧＦＡＴ活性阻害様式は、それぞれ「拮抗阻害」および「混合阻害」を示すことが明らかとなった。
【０２６２】
図３は、グルタミンを基質とした場合のＧＦＡＴ１ＳおよびＧＦＡＴ１ＬにおけるＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃのＧＦＡＴ活性阻害様式を示すグラフであり、縦軸は酵素の反応速度（ｖ）を、横軸は反応速度（ｖ）／酵素の基質濃度（ｓ）を示す。
【０２６３】
図３の左のグラフがＧＦＡＴ１Ｓの結果であり、右のグラフがＧＦＡＴ１Ｌの結果を示している。各図において、(1)はＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃなしの場合を、(2)はＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ１０μＭ添加の場合を、(3)はＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ３０μＭ添加の場合を、また(4)はＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ１００μＭ添加の場合をそれぞれ示す。
【０２６４】
該図より求められたＫｍ値は、ＧＦＡＴ１ＳおよびＧＦＡＴ１Ｌにおいて、それぞれ８２２μＭおよび８０４μＭであり、またＧＦＡＴ活性阻害様式は、それぞれ「不拮抗阻害」および「混合阻害」を示すことが明らかとなった。
【０２６５】
【表１】
0004601143.tif 000002
【０２６６】
図２、図３および表１より、ＧＦＡＴ１ＬおよびＧＦＡＴ１ＳのＫｍ値については、Ｆ−６−Ｐに対してはＧＦＡＴ１Ｓが１００μＭ、ＧＦＡＴ１Ｌが５００μＭ程度と両者で大きな差が認められた。一方、グルタミンに対してはＧＦＡＴ１ＳとＧＦＡＴ１Ｌともに８００μＭ前後であり両者に差は認められなかった。
【０２６７】
UDP-GlcNAcの阻害様式ついては、Ｆ−６−Ｐを基質とした場合、ＧＦＡＴ１Ｓでは拮抗阻害、ＧＦＡＴ１Ｌでは非拮抗および拮抗阻害が混在した混合阻害様式を示した。また、グルタミンを基質とした場合、ＧＦＡＴ１Ｓでは不拮抗阻害、ＧＦＡＴ１Ｌにおいては不拮抗およびその他の阻害様式を含んだ混合阻害様式を示した。
【０２６８】
上記の結果から、本発明のＧＦＡＴ１ＬとヒトＧＦＡＴの酵素学的な違いとして、(1)Ｆ−６−Ｐに対するＫｍ値は本発明のＧＦＡＴ１ＬがヒトＧＦＡＴより５倍程高い、および(2)UDP-GlcNAcの阻害様式が異なる、の２点が認められた。３．インスリン抵抗性におけるＧＦＡＴ１Ｌの関わりについての検討
ＧＦＡＴがインスリン抵抗性に関与していることはイン・ビトロおよびイン・ビボ試験の両者において報告されている。しかしながら、本発明者らにより発見された新規遺伝子により、ＧＦＡＴには２つのサブタイプが存在することが明らかとなったことから、ＧＦＡＴ１ＬとヒトＧＦＡＴ(ＧＦＡＴ１Ｓ)のどちらがよりインスリン抵抗性に関与しているのかについて、以下の通り考察した。
【０２６９】
正常人では通常、インスリン刺激時には血中グルコースの約７０％が骨格筋で代謝されるのに対し、２型糖尿病患者においては、特に骨格筋でグルコースの利用率が３０％まで減弱しており他の臓器ではその利用率が正常人と変わらないことが報告されている(Journal of  Clinical Investigation, 76 (1), 149-155(1985))。このことから、インスリン抵抗性の主要な臓器は骨格筋であると考えられる。この骨格筋ではＧＦＡＴ１Ｓは発現しておらず、本発明のＧＦＡＴ１Ｌのみが発現していることが明らかとなったことから、インスリン抵抗性には主に本発明のＧＦＡＴ１Ｌが関与していると考えられる。
【０２７０】
また、ＧＦＡＴ１ＳおよびＧＦＡＴ１Ｌの酵素学的検討の結果より、
(1)Ｆ−６−Ｐに対する本発明ＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子のＫｍ値は、ＧＦＡＴ１Ｓ遺伝子のそれよりも５倍程高い、
(2)細胞内のグルタミン濃度は４〜５ｍＭ存在するため、ＧＦＡＴ活性は細胞内のＦ−６−Ｐ濃度に規定される、
(3)基礎レベルにおける２型糖尿病患者の赤血球中のＦ−６−Ｐ濃度は数十μＭであると報告されている（Horm. Metabol. Res., 14, 233-236 (1982)）、ことなどを考え合わせ、以下のようなことが推測された。
【０２７１】
即ち、この濃度のＦ−６−ＰからＧＦＡＴの活性状態を推測すると、ＧＦＡＴ１ＳではＫｍ値付近であり定常的に働いているが、ＧＦＡＴ１Ｌではほとんど活性化されていないと考えられる。このことは図４より明らかである。
【０２７２】
図４は、上記結果より、ＧＦＡＴ１ＳおよびＧＦＡＴ１Ｌの酵素反応曲線（ＧＦＡＴの活性化の状態）をグラフ化したものであり、縦軸は酵素の反応速度（ｖ）を、横軸は細胞内のＦ−６−Ｐの濃度（μＭ）を示しており、この濃度が高いほど細胞内への糖の流入量が大きいことを表わす。また、図中、太線は文献に報告されている非インスリン依存型糖尿病患者の赤血球中のＦ−６−Ｐ濃度を示しており、太矢印はインスリン抵抗性に関与することを示している。
【０２７３】
更に、インスリン刺激時には細胞内へのグルコースの取り込みは数倍増加するが、この場合、ＧＦＡＴ１Ｓでは酵素反応がＶｍａｘに達しているため、さらにグルコースが細胞内に流入してもそれ以上のＧＦＡＴの活性化は起こらないのに対し、本発明のＧＦＡＴ１Ｌではグルコースの流入量が増加すればするほどＧＦＡＴが活性化され代謝物も増加し、糖輸送担体の細胞膜への移行が抑制され、血糖が上昇するものと考えられる（ただし、ＧＦＡＴ１ＬおよびＧＦＡＴ１ＳともにＶｍａｘは同程度と仮定している）。
【０２７４】
従ってＧＦＡＴ１Ｓに比べ本発明のＧＦＡＴ１Ｌがよりインスリン抵抗性に関与していると考えられる。以上のことからインスリン抵抗性に本発明のＧＦＡＴ１Ｌの関与が大きいと結論づけられる。
【０２７５】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】実施例２に従い、ＲＴ−ＰＣＲ法により各臓器での本発明ＧＦＡＴ１Ｌ遺伝子の発現パターンを求めたアガロースゲル電気泳動結果を示す図面代用写真である。
【図２】実施例４に従い、本発明ＧＦＡＴ１Ｌの酵素学的性質としての、Ｆ−６−Ｐを基質としたときのＫｍ値およびＧＦＡＴ活性阻害様式を求めるためのグラフである。
【図３】実施例４に従い、本発明ＧＦＡＴ１Ｌの酵素学的性質としての、グルタミンを基質としたときのＫｍ値およびＧＦＡＴ活性阻害様式を求めるためのグラフである。
【図４】実施例４に従い、本発明ＧＦＡＴ１Ｌの酵素反応曲線（ＧＦＡＴの活性化の状態）を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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