(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１および第２の結合相手間の親和力を測定するための方法において、
（ｉ）前記第１の結合相手が表面上で不動にされ、前記第１および第２の結合相手が相互に結合するように、前記第１および第２の結合相手を接触させる工程と、
（ｉｉ）振動の振幅が前記第１および第２の結合相手が分離する値まで増大するように前記表面を振動させる工程と、
（ｉｉｉ）前記第１および第２の結合相手の親和力が分離状態から測定されるように、前記第１および第２の結合相手の分離を検出する工程と、を備えてなることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記第２の結合相手が粒子であるか、または粒子上で不動にされることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１または第２の結合相手がたんぱく質、抗体、抗原、酵素、酵素抑制剤またはポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第１または第２の結合相手が細胞、バクテリア、ウイルス、プリオンまたはファージであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
異なる結合相手が前記表面上の異なる位置において不動にされることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記分離状態が音響放出によって検出されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記表面が圧電変換器または音響変換器であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記変換器が水晶結晶板マイクロバランスまたは表面音響波装置であることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
液体中で実施されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１および第２の結合相手が、独立して、たんぱく質、抗体、抗原、酵素、酵素抑制剤またはポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１および第２の結合相手が、独立して、細胞、バクテリア、ウイルス、プリオンまたはファージであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記増大する振幅が単調に増大することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
（ｉｖ）前記分離状態が発生する電圧を測定する工程をさらに備えてなることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
結合の分離を検出するための装置において、
（ｉ）結合が形成され得る表面と、
（ｉｉ）前記表面を単調に増大している振幅で前記表面の平面で振動させるための手段と、
（ｉｉｉ）分離状態を検出するための手段と、を備えてなることを特徴とする装置。
【請求項１５】
１以上のリガンドが前記表面上で不動にされることを特徴とする請求項１４に記載の装置。
【請求項１６】
前記１以上の不動にされるリガンドが細胞、バクテリア、ウイルス、プリオンおよびファージからなるグループから選択されることを特徴とする請求項１５に記載の装置。
【請求項１７】
異なるリガンドが前記表面上の異なる位置で不動にされることを特徴とする請求項１５に記載の装置。
【請求項１８】
前記１以上の不動にされるリガンドがたんぱく質、抗体、抗原、酵素、酵素抑制剤およびポリヌクレオチドからなるグループから選択されることを特徴とする請求項１４に記載の装置。
【請求項１９】
前記検出手段が音響放出を検出することを特徴とする請求項１４に記載の装置。
【請求項２０】
前記振動手段および前記検出手段が圧電または音響変換器を備えていることを特徴とする請求項１４に記載の装置。
【請求項２１】
前記変換器が表面音響波装置であることを特徴とする請求項２０に記載の装置。
【請求項２２】
前記変換器が水晶結晶板マイクロバランスであることを特徴とする請求項２０に記載の装置。
【請求項２３】
前記振動手段が前記水晶結晶板マイクロバランスをその共振周波数で駆動し、前記検出手段がその駆動周波数の第３高調波で前記音響放出に敏感であることを特徴とする請求項２２に記載の装置。
【請求項２４】
前記振動手段がある共振周波数で前記表面の振動を発生させ、前記検出手段が他の周波数で分離を検出することを特徴とする請求項２３に記載の装置。
【請求項２５】
前記他の周波数が他の共振周波数であることを特徴とする請求項２４に記載の装置。
【請求項２６】
前記振動周波数が基本共振周波数であることを特徴とする請求項２４に記載の装置。
【請求項２７】
前記他の周波数が３倍音共振周波数であることを特徴とする請求項２６に記載の装置。
【請求項２８】
前記振動手段が前記水晶結晶板マイクロバランスをその共振周波数で駆動し、前記検出手段がその駆動周波数の第３高調波で前記音響放出に敏感であることを特徴とする請求項２４に記載の装置。
【請求項２９】
前記振動手段がある共振周波数で前記表面の振動を発生させ、前記検出手段が他の周波数で分離を検出することを特徴とする請求項１４に記載の装置。
【請求項３０】
前記他の周波数が他の共振周波数であることを特徴とする請求項２９に記載の装置。
【請求項３１】
前記振動周波数が基本共振周波数であることを特徴とする請求項２９に記載の装置。
【請求項３２】
前記他の周波数が３倍音共振周波数であることを特徴とする請求項３１に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、分子の相互作用を測定しかつ粒子を分離し、選別しかつ大きさに合わせて分類する方法に関する。とくに、本発明は、種々の結合相手間の、例えば抗体−抗原相互作用における親和力の測定に関する。
【０００２】
（背景技術）
特別な分子の認知は基本的な過程であり、酵素−リガンド相互作用、抗体−抗原相互作用およびレセプターへの分子の結合の基礎となっている。分子の認知は静電相互作用（水素結合）および疎水性相互作用のごとき非共有相互作用によって達成される。結合定数および自由エネルギ、エンタルピーおよびエントロピー変化の熱力学的測定は、とくにＸ線回析、かつ可能ならば、サイトに向けられた突然変異生成からの情報と結合されるとき、分子認知の基礎に見通しを付与する。
【０００３】
相互作用力の直接の測定は原子力顕微鏡（ＡＦＭ）ならびに表面力装置によってなされた。ＡＦＭが結合破壊力を測定することができる一方、その技術は１つの測定のみが一度になされ得るという欠点を有している。今日まで、ＡＦＭは、アビジン−ビオチン相互作用（フローリン他、サイエンス、１９９５；２６４：４１５）、ＤＮＡ交配（ボーランド他、ＰＮＡＳ、１９９５；９２：５２９１）、抗体−抗原相互作用（ダマー他、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，１９９６；７０：２４３７）および付着糖たんぱく質（ダマー他、サイエンス、１９９５；２６７：１１７３）に使用された。
【０００４】
リガンド用のそれらの関連の親和力に基づいて生物学上の分子を分離することは十分に認められた技術である。例えば、親和力クロマトグラフィにおいて、分離されるべき成分は特別なリガンドを収容しているコラムの下に通される。関心の有る成分は優先的にかつ強力にコラムに結合し、かつ他の成分が除去されながらコラム上に保持される。結合された材料は後の段階においてコラムから溶出され得る。
【０００５】
分離技術は多くの研究実験の重要な部分である。これらの技術の感度または選択性を増加するのが望ましい。
【０００６】
コロメンスキ他、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．，１９９８；８４（４）：２４０４−１０は、レーザ発生の表面音響パルスを使用して行われた表面洗浄および付着の研究を開示している。パルスは低い反復率（２０Ｈｚ）および一定のエネルギであった。手順は真空中で行われ、かつそれゆえ、商業的な開発には適さない。光学的顕微鏡が粒子の除去を検出するのに使用され、そしてそれは種々の大きさの粒子間で識別することができなかった。
【０００７】
ＷＯ−Ａ−９８／４５６９２は、クラスレート水和物の形成／分離を測定するための圧電結晶センサの使用を開示している。クロサワ他、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ，１９９０；３８（５）：１１１７−２０は、抗体支持ラテックスの粘着作用の検出のためにかかるセンサを使用することを報告している。ＷＯ−Ａ−９８／４０７３９は、また、媒体中の細胞の存在を指示するのに使用するために、特別な結合物がそれに不動にされるようなプレートを含んでいる、かかるセンサを開示している。これらのセンサは一定の電圧において共振周波数の変化を測定することによって使用される。
【０００８】
現在、可能ならば、ほとんどのウイルスは、この方法が時間はかかるけれども高感度であるので、細胞中での標本の培養によって検出される。臨床サンプル中のウイルスＤＮＡまたはＲＮＡの直接検出は、ＰＣＲおよび関心のあるウイルスに合わせられた特別なプライマを使用して達成され得る。ＰＣＲが増幅段階を伴うので、相互汚染が主要な問題でありかつ信頼し得る定量的な方法を確立するのは難しい。他の直接的な方法は電子顕微鏡、免疫電子顕微鏡、および酵素−結合抗体による抗原検出を基礎にした方法を含んでいる。これらの方法はしばしば比較的無感応であり、かつそれゆえ比較的大量のウイルス粒子を要求している。
【０００９】
本発明は、目標分子、または粒子に付着された目標分子と表面との間の結合が増大している振幅において表面を機械的に振動することによって破壊されることが可能で、表面から目標分子または粒子を分離させるという現実に基礎を置いている。必要とされる加速、かつそれゆえ、力は、分子または粒子の質量、表面への結合の性質および目標分子または粒子の幾何学的形状または大きさを含んでいる、種々の要因に依存している。本発明は、それゆえ、種々の目標分子を分離し、またはこれらを大きさにしたがって分類するのに、またはそれらの存在を検出するのに使用され得る。
【００１０】
（発明の開示）
本発明の第１の態様によれば、組成物から目標分析物を分離するための方法は、
（ｉ）前記組成物を表面上で不動にされる分析物用の結合相手と接触させる工程と、
（ｉｉ）前記表面上から、前記分析物、または前記組成物の他の構成成分を選択的に除去するように、増大する振幅で前記表面を振動させる工程と、を備えてなっている。
【００１１】
加えて、本発明は、粒子の存在または大きさ、または結合相手間の親和力を測定するための方法に使用されることが可能である。本発明の第２の態様によれば、かかる方法は、
（ｉ）一方が表面上で不動にされる前記結合相手を接触させる工程と、
（ｉｉ）増大する振幅で前記表面を振動させる工程と、
（ｉｉｉ）分離状態を検出する工程と、を備えてなっている。
【００１２】
この第２の態様において、本発明は、水素結合のごとき比較的弱い相互作用から共有結合への範囲にある、種々の物理的および化学的結合に適用されることが可能である。
【００１３】
本発明における使用に適する装置は、その上で不動にされた一方の結合相手を有している表面と、前記表面を増大している振幅で振動させるための手段と、分離状態を検出するための手段と、を備えてなっている。
【００１４】
とくに、本装置は音響変換器装置（ＡＴＤ）、例えば水晶結晶板マイクロバランス（ＱＣＭ）または表面音響波装置、または、例えば、交流電圧または磁界を印加することによって振動するように作られ得る圧電材料を備えてなることができる。これらはＡＦＭに比べて安価な装置であり、かつマルチプレックスにされることができる。かかる装置を使用することの他の利点は、結合の大部分が同時に破壊され、特別な加速（ＡＴＤに印加された電圧）において検出可能な音響および鋭い雑音ピークを生起するということである。他の利点は、ＡＴＤが、分離状態が発生するとき、音響放出を検出するように、高感度マイクロホンとして使用され得るということである。
【００１５】
ＡＴＤを使用するほとんどの従来技術の実験では、共振周波数または位相の変化が、ＡＴＤが一定の電圧で駆動されるとき測定された。これに対して、本発明は駆動電圧かつそれゆえＡＴＤの振動の振幅を増大することを伴っている。
【００１６】
本発明は分離、選別および大きさにしたがって分類するための広範な用途を有している。これらの例は、空気中において、ストレプトアビジンと呼ばれる球体がビオチニレートされた表面を有しかつ０．１Ｖ以上であるが６Ｖ以下の駆動電圧を有するＱＣＭを使用して通常のラテックス球体から分離され得ることを示している。通常のラテックス球体は表面から除去されて、表面に付着されたストレプトアビジンと呼ばれる球体のみを残している（より強力なストレプトアビジン−ビオチン結合によって）。これは、例えば、粒子の大きさによる分類および選別、細胞選別、ファージの選別ならびに新たなバイオセンサの設計における用途により、一定の時間長さに印加される可変の力に基づいて分離科学の新たな形態を開いている。かかる分離方法は低コストであり、かつ容易にマルチプレックスされかつ自動化され得る。例えば、同一のマイクロバランス上の種々の位置に種々の目標を堆積しかつ多数の目標に対してリガンドのライブラリーを同時に選別することができる。一定の大きさからなるウイルスの粒子の検出および分析は他の応用範囲である。同様に重要なことは、本発明は、分子認知に伴われる力をプローブするための、新たな、高感度のかつ潜在的に定量的な工具を提供するということである。
【００１７】
（発明を実施するための最良の形態）
本発明は振動させられ得るセンサ装置を使用する。センサは多数の方法において、例えば、表面音響波装置、共振水晶結晶板装置、音響板モードおよび薄膜柔軟プレート装置によって、振動するように作られ得る。
【００１８】
本発明における使用に適する、多くの種々のセンサは市場の供給源から入手可能である。本発明に使用され得るセンサの説明は、音響波センサ、バランタイン他、（１９９７）アカデミック・プレスに収録されている。センサは、好ましくは、表面音響波装置、または、より好ましくは、水晶結晶板マイクロバランス（ＱＣＭ）である。
【００１９】
ＱＣＭは、典型的には頂部および下方面上に金（ゴールド）電極を備えた水晶結晶からなる円板である。交流電圧が電極に印加されるとき、逆の圧電効果により、剪断振動を受ける。電圧を増加することはＱＣＭの振動の振幅を増大することである。
【００２０】
水晶結晶板は、また、高感度のマイクロホンであり、かつ破壊状態による音響放出を検出するのに使用され得る。１つの主要な共振周波数に対応し、かつ他のモード近傍で音響放出を検出する周波数で振動を励起するのは技術的により容易である。一例として、ＱＣＭはその共振周波数で駆動され、そして音響放出はその第３高調波において検出される。
【００２１】
図示のために、用語「分析物」は表面固定の結合相手と接触される結合相手または成分を説明するのに使用され得る。接触に続いて、分析物は分子の相互作用によりセンサに結合され加速を受け、かつそれゆえ力が分析物に働かされる。振動の振幅が増大するとき、かつ特定のしきい値力において、結合破壊が発生する。先に結合された分析物粒子はかくして表面上で自由に転動する。
【００２２】
分析物は分子の相互作用によりセンサ上に維持されることができる微視的なものであってもよい。分析物はたんぱく質、抗体、抗原、酵素、酵素抑制剤またはポリヌクレオチドであってもよい。分析物は、また、バクテリア、細胞、ウイルス、プリオンまたはファージのごとき、大きな粒子であってもよい。本発明における使用にとくに適するさらに他の粒子の例は、あらゆる材料、例えば、シリカ、金またはラテックス、またはプラスミドのごとき大きな高分子の微小球体を包含している。表面固定の結合相手は同一の型のものであることができ、したがって、適切な物理的または化学的結合に依存して選択され得る。
【００２３】
より小さな分析物の分離は、好ましくは音響放出によって検出される。より大きな粒子は、また、光学的手段、例えば、顕微鏡によって検出され得る。
【００２４】
本発明の第１の態様において、分離は結合相手との相互作用によりセンサ表面に目標分子を不動にすることによって実施される。表面は、次いで、センサの表面上の分子を分離するように振動させられ得る。振動は振幅を安定して増大することにより実施され、そして表面から目標分子を除去するか、または表面から組成物の他の成分を除去するように選択されることができ、表面に結合された目標分子を残している。好適な実施例において、センサ表面は圧電音響波装置、例えば、ＱＣＭを使用することによって振動させられる。同様の圧電装置が破壊状態によって発生される音響雑音を検出するためのマイクロホンとして使用されることが可能である。
【００２５】
分離技術は特別な結合相手と強く相互作用する分子のための選択に適用され得る。例えば、その技術は細胞表面に現れる特別なレセプター分子で細胞を選択するのに、または特別なリガンドに対する強い親和力で抗体のための選択に適用され得る。
【００２６】
種々のリガンドが、例えば、接触印刷またはマスクまたはリソグラフィの使用により表面上の種々の位置において局部化され得る。その場合に、幾つかの異なるリガンドを有する幾つかの強力に結合する相手用の混合物を同時にふるい分けすることができる。とくに、本発明は、その上に不動にされたレセプターのごとき種々の材料を有するチップとともに使用され得る。より一般的には、チップは、例えば、人間および動物臨床試験における種々の感染体、病原菌、プリオン、食物アレルゲン、ウイルス、バクテリア等の、および食物および水の衛生状態の試験を許容する材料を表示することができる。さらに、本発明はライブラリースクリーニング、ファージ表示等に使用され得る。
【００２７】
本発明の第２の態様は、粒子の存在または大きさ、または分子間の親和力レベルを測定する方法である。好ましくは、一方の分子がセンサ表面に対して不動にされ、かつ他方の分子が粒子に、例えば、微小球体に対して不動にされる。粒子は次いで関心のある分子の相互作用によりセンサに取着される。機能的なものにされた粒子は次いでセンサに電圧を印加することによって振動させられる。振動の振幅が増大するので、力は結合破壊が生じる臨界値に達する。この時点において、特徴的な雑音は高感度増幅器を使用することによって検出されることができ、かつ粒子の動きは、例えば、光学的顕微鏡により観察されることができる。信号の大きさはセンサ表面に結合された粒子の数に依存している。代表的には、ＱＣＭが、例１において、以下で説明されるように、物理的吸収の微小球体とともに使用されるならば、雑音は微小球体の大きさに依存して、０．１〜１Ｖで検出され、発生は、微小球体が、顕微鏡により、摺動しかつ逃げ去るように観察されるとき生じる。プロットは、破壊力スペクトルとして言及される、発生された雑音対振幅（または印加された電圧）からなされ得る。結合破壊がプロットから明らかとなる点が、そこで、雑音ピークとなる。それゆえ、結合破壊が生じる臨界電圧が決定される。公知の結合密度および強度を有する粒子を使用する、適宜な較正実験は、この方法を定量的にさせる。さらに、音響放出ピークの高さは結合された粒子の数の尺度である。
【００２８】
本発明は、分子の相互作用を研究するのに使用されることができるが、とくに、酵素／リガンド相互作用、抗体／抗原相互作用およびレセプター／リガンド相互作用または大きな高分子とその天然の結合相手との間の相互作用の研究に適している。本方法は、また、ポリヌクレオチド間の交配（ハイブリダイゼーション）の状態の研究に応用され得る。かくして、本発明の第１の態様において、リガンドは、例えば、たんぱく質、抗体または抗原、酵素、酵素抑制剤、ポリヌクレチオドまたは大きなプラスミドまたはウイルスのごとき大きな高分子であってもよい。いずれかの材料が、本発明の第２の態様において、表面または粒子に結合され得る。
【００２９】
以下の例は本発明を示している。
【００３０】
それぞれの例において、破壊力分光が表面と小さい粒子との間の付着力を測定するのに使用される。この作用は、単調に増大する振幅かつそれゆえ増大する加速において、表面上の巨大粒子により、表面を振動させることに基礎を置いている。これは圧電音響波装置、この場合には、水晶結晶板マイクロバランス（ＱＣＭ）により表面を駆動することによって達成される。振幅が増大すると、加速かつそれゆえ粒子上に作用する力も増大する。表面に粒子を付着させるすべての結合の破壊は音響雑音を結果として生じ、かつ同様の圧電装置が、破壊状態によって発生される、この雑音を検出するための高感度マイクロホンとして使用される。例１〜５に使用される装置の概略図が図１に示され、好適な装置のより一般的な概略図が図８に示されている。
【００３１】
より詳しくは、図１は圧電変換器１０、純粋な正弦波ｆ発生器１１、３ｆ＋Δｆ発生器１２、３ｆ＋Δｆフィルタ１３、ロックイン増幅器およびアナログ−デジタル変換器１４、および矢印によって示されるデータ入力および制御出力を有しているコンピュータ１５を備えている回路を示している。例１〜５において、ｆ＝１４．２ＭＨｚ、およびΔｆ＝８２ｋＨｚである。粒子１６は基板の表面上に配置されている。
【００３２】
図８は圧電変換器２１（ＱＣＭ，ＳＡＷ装置等のごとき）、および信号２５の制御下で滑らかに上昇している出力振幅を供給することができる入力２３および出力２４を備えた可変利得増幅器２２を示している。回路は、また、帯域受信機２６（例えばＳＳＢ無線受信機と同様な）、およびリンク２８によりデータを供給する１または複数のアナログ−デジタル変換器２７を備えている。さらに、回路はコントローラ、記録およびデータ信号処理装置２９（例えばコンピュータまたは特殊化されたＤＳＰプロセッサ）を備えている。破線３０によって指示された接触はより最適な濾過および結合手段によって置き換えられることができ、例えば、それは受動のＬ，Ｃ，Ｒネットワークであってもよい。
【００３３】
図８に示された回路の使用において、任意の濾過／結合手段３０とともに、変換器２１を備えた増幅器２２は、変換器が有効である周波数で好ましくは振動する、簡単な発振器ネットワークを提供し、ＱＣＭに関してそれは基本的な直列共振周波数であってもよい。この発振周波数（Ｆ）は、例えば、１４ＭＨｚである。出力２４において駆動電圧の振幅は制御リンク２５によってコントローラ２９の制御下で滑らかに上昇する。点３０において音響放出の出現信号は任意のフィルタ／カプラによって純化され、かつ次いで帯域受信機２６の入力に供給されてもよい。作動している受信機の周波数帯は最大の信号対雑音規準、例えば、第３高調波（３*Ｆ＋ΔＦ）、例えば、４２．０８２ＭＨｚの近傍に置かれた共振モードによって選択され得る。
【００３４】
単一のまたは直角位相の出力信号は高いダイナミックレンジの１または複数のアナログ−デジタル変換器２７によって変換される。データは、次いで、有用な信号を引き出すために、２９でさらにデジタル的に処理され、かつ次いで記録されおよび／または観察者に示される。増幅器２２は、加えて、信号対雑音比を改善し、かつまた、発振器が変換器を横切る電流対電圧の正しい周波数および移相下で作動することを保証する、受動的出力および／または入力フィルルタを備えることもできる。
【００３５】
図９は本発明における使用に好適なＳＡＷを基礎にしたセンサを示している。このセンサは変換器電極３３を駆動する増大している振幅を有する出力３２でＲＦ電圧を発生するための手段３１を備えている。電極３３は圧電基板３４において高振幅ＳＡＷの発生のために最適化されている。電極構成３７は音響放出の電気信号への最良の変換のために最適化されている。パターンは複雑かもしれず、１またはそれ以上の電極対を備えている。装置は、さらに、リンク３６によって発生器３１を制御するための、かつ発生された信号を１またはそれ以上の入力３８において受信しかつデータ信号処理、例えば、相関分析を実施するための制御ユニット３５を備えている。
【００３６】
ＳＡＷを基礎にしたセンサの使用において、発生器３１は出力３２において有効な変換周波数を供給するのに適するＲＦ電圧を発生し、かつこれは圧電基板３４（鎖線）上に置かれた発生している変換器電極３３に供給される。ＲＦ電圧の振幅は制御リンク３６によってコントローラ３５の制御下で時間とともに上昇する。受信電極３７は能動領域から現れる音響放出を受信機／コントローラ３５および入力３８に供給される電気信号へ変換する。アナログ−デジタル変換後に得られたデータは次いで有用な信号を引き出すために信号処理を受ける。結果はその場合に最終的に記録されおよび／またはオペレータに示される。
【００３７】
例からの幾つかの結果が図２ないし図７および図１０に示されている。図２Ａ，図２Ｂ，図３Ａ，図３Ｂ，図４Ａ，図４Ｂ，図４Ｃ，図４Ｄ，図６Ｂ，図７および図１０は信号雑音（Ｓ；任意の単位）対振幅（Ａ；ボルト）のプロットである。図５Ａ，図５Ｂ，図６Ａおよび図６Ｃは信号雑音（Ｓ；任意の単位）対粒子の数（Ｎ）のプロットである。
【００３８】
以下の略号が使用される。すなわち、
ＢＳＡ：牛血清アルブミン
ＬＢ：ルリア培養液
ＤＩＣ：塩化ジメチルアミノイソプロピル
ＤＭＡＰ：ジメチルアミノピリジン
ＥＤＣ：１，３−ジメチルアミノプロピル−３−エチルカルボジイミド
ＮＨＳ：Ｎ−ヒドロキシサクシニイミド
ＰＢＳ：燐酸塩−緩衝塩水
【００３９】
例１
直径５μｍのラテックス球体が多数の関心のある結合によりＱＣＭセンサ表面に付着された。使用された球体の被覆はＱＣＭの表面積の１％であった。球体はそれらの直径において１％のみの変化を有した。
【００４０】
ＱＣＭセンサは３５°Ｃで音響通遮断されかつ直径８．２５ｍｍの研磨された水晶結晶板を備えていた。クロム（厚さ２０〜３０ｎｍ）かつ次いで金（ゴールド）（厚さ１００〜１２０ｎｍ）の層が堆積された。
【００４１】
３つの異なる結合が、空気中で行われた実験において研究された。すなわち、それらは物理的結合（ラテックス−金）、ストレプトアビジン−ビオチン結合および共有結合（アミド連鎖）である。物理的結合はセンサ表面上に直接ラテックス球体を配置し、そして窒素中で乾燥することによってなされた。ストレプトアビジン−ビオチン結合はビオチニレーテッドＢＳＡを表面上に塗布し、そして窒素中で乾燥することによってなされた。化学的結合はエタノール中に溶解されたアシド−終止のチオール（１２−メルカプトドデカン酸）を使用してチオール分子膜を形成することによってなされた。これは、次いで、ＥＤＣ−ＮＨＳを使用して活性化され、そしてアミン−終止の球体がアミノ結合を形成するように付加された。
【００４２】
実験は２つの光学窓、すなわち、サンプルのレーザ照射を供給するための光学窓、および光学顕微鏡による散乱レーザ光の観察を許容するための光学窓を備えたチャンバ内で実施された。ＱＣＭはチャンバ内に配置された。信号発生器、モデルＤＳ３４５（スタンフォード・リサーチ・システムズ）がＱＣＭを駆動するのに使用された。粒子の運動および分離はＣＣＤパナソニックＷＬ−ＳＬ３００ビデオカメラを備えたオリンパスＢＨ−２光学顕微鏡を使用して観察された。主要な測定装置はロックイン増幅器、ＳＲ８４４（スタンフォード・リサーチ・システムズ）であった。基準信号は第１の発生器に同期された第２の発生器を使用してロックインに供給された。すべての装置は実験の制御およびデータの収集のためにコンピュータにインターフェイスされた。
【００４３】
図２Ａはストレプトアビジン−ビオチン（１）および化学的結合（２）用の破壊力スペクトルを示し、図２Ｂは物理的結合用のスペクトルである。
【００４４】
破壊力スペクトルを記録することにより、結合を破壊するための力または電圧を実験的に測定することができる。これは分離に使用され得る。図２Ａに示されるように、幾つかが表面上にストレプトアビジンを有しかつ幾つかがそうでない５μｍの球体の混合物があるならば、０．１Ｖ以上であるが６Ｖ以下の、およそ、１Ｖの電圧を表面上にビオチンを有するＱＣＭに印加することにより、２つの球体のセットを分離して表面上にストレプトアビジンと呼ばれる球体のみを設けることができる。この技術は、また、これらの球体が１Ｖで振動される場合に表面上に結合するのみであるから、ストレプトアビジンと呼ばれる球体を検出するのに使用され得る。
【００４５】
測定を定量的にするため、ＱＣＭの振動の振幅が、微小球体上の力の評価を許容している、実験データに基づいて、種々の電圧で計算された。この評価はＱＣＭの電力消費およびそのＱ因数（またはメリット因数−往復の相対的な共振帯域幅＝ｆ／Δｆresonance）を測定することによって行われた。振幅Ａは、
Ａ＝〔ＱＰ／２π3ｆ3Ｍ〕1/2
によって付与され、ここで、ＱはＱまたはメリット因数、ＰはＱＣＭによって消費される電力、ｆは水晶結晶板の共振周波数およびＭは運動に伴われるＱＣＭ水晶結晶板の有効質量である。Ｑ因数は６Ｖでおよそ１５０００であるように測定され、それは６０ｎｍのＱＣＭの振動振幅の評価を付与する。球体上の力はそれゆえ９μＮである。これは１６０ｐＮ2の単一のストレプトアビジン−ビオチン結合を破壊するのに必要とされる力と比較されるべきであり、かつほぼ６０，０００結合が同時に破壊されることを示している。評価は、これが球体と表面との間の最初のストレプトアビジン−ビオチン結合の５０％またはそれ以上に対応していることを示している。これは、球体を表面に付着する結合の大部分が同時に破壊されることを意味している。これは破壊力スペクトルおよび結合破壊についての検出可能な雑音に観察される鋭いピークを生じる。
【００４６】
例２
この例は、本発明の方法が、また、溶液中で実施され得ることを示している。ＱＣＭのＱ因数は液体負荷により減少し、かくして空気と比較されるとき特定の電圧において振動の振幅を減少する。微小球体に作用している粘着力がありそしてその有効な質量は、球体上の力を増加する、関連の水の層により、増加する。
【００４７】
図３はストレプトアビジン−ビオチン（図３Ａ）および化学的結合（図３Ｂ）により表面に付着された５μｍのラテックス球体に関する破壊力スペクトルを示している。破壊はそれぞれ１Ｖおよび１０Ｖにおいて発生する。
【００４８】
空気から水へ達するとき６Ｖから１Ｖへ、６の因数により、ストレプトアビジン−ビオチン結合、および水中での化学的結合の破壊に関する臨界電圧の減少が、後者の作用が特徴的であることを示している。したがって、この例は、結合破壊、かつそれゆえ分離およびバイオ感知が水液体または他において可能であることを明瞭に示している。
【００４９】
物理的、ストレプトアビジン−ビオチンおよび化学的な結合の結合密度が同一であると仮定し、かつ同一の大きさの微小球体がこれらの実験において使用されたので、破壊力の相対的なスケールが得られることができる。これは物理的：ストレプトアビジン−ビオチン：化学結合に関して１：６０：６００である。このスケーリングは合理的であると思われ、かつこの方法のダイナミックレンジを示している。公知の結合密度を用いて適宜な較正実験を行うことにより、これらの測定を定量的にすることが可能である。
【００５０】
例３
例は、ファージおよびマルトース−結合相互作用の両方が良好に特徴付けられかつ容易に利用可能であるので、ウイルス、かつとくに、ファージｐＩＩＩコートたんぱく質に溶解されたマルトース結合たんぱく質を表示する遺伝子で変性されたバクテリオファージの検出を示している。ファージは長さ１μｍそして直径６ｎｍの柔軟なロッドからなる長く、細い線維状ウイルスである。遺伝子で変性されたファージはファージｐＩＩＩコートたんぱく質への溶出としてウイルスの一端において５マルトース−結合たんぱく質まで追加的に表示する；マクカファーティ他、ネイチャー、１９９０，３４８：５５２参照。これらのファージはアミロース樹脂上でとくに純化され得る。
【００５１】
インドールグリセロールフォスフェートシンターゼのアミノ末端へのマルトース−結合たんぱく質融合が遺伝子ＩＩＩ−記号化されたコートたんぱく質のアミノ末端への融合としてｆｄファージの表面上に表示された。このために、ｆｄファージベクトル、ｐＪＢ１１３が構成された；それはＭａＩＥ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｔｒｐＣ（Ｅ．ｃｏｌｉ）と遺伝子ＩＩＩとの間の遺伝子融合を記号化した。このファージベクトルはテトラサイクリン−抵抗マーカーを運んだ。変性されないコンペティターファージはカナマイシン−抵抗マーカーを支持しているＶＣＳＭ１１３Ｋ０７ヘルパーファージ（ストラトジェーン）であった。
【００５２】
１×１０12ｃｆｕ／ｍＬのバクテリオファージ濃縮物が１０μＬのファージストックを有するエシェニチア・コリ・菌株ＴＧ１の３ｍＬのミッドログファーゼＬＢ培養を感染させることにより得られた。３７°Ｃで攪拌（２５０ｒｐｍ）の２時間後、培養の１ｍＬが１００ｍｌＬＢに接種されかつ１時間、３７°Ｃで、３５０ｒｐｍにおいて攪拌された。テトラサイクリン（１０μｇ／ｍＬ）またはカナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）が、３０°Ｃ、２５０ｒｐｍで一晩中成長された、それぞれ、ｐＪＢ１１３またはＶＣＳ培養に付加された。バクテリアは小球形にされ（１５分、４．１ｋｒｐｍ）そしてファージはそれぞれ０．５Ｍおよび４％（ｖ／ｖ）の最終濃度にＮａＣｌおよびＰＥＧ６０００の添加により浮遊物から沈殿した。氷上に１時間置いた後、ファージは遠心力（３０分、４．１ｋｒｐｍ）によって回収され、かつファージペレットが１ｍｌＨ2Ｏ中に再び懸濁されかつ４°Ｃで貯蔵された。
【００５３】
溶融可能な澱粉（５００ｍｇ，０．０１ｍｍｏｌ，１ｅｑ．）がＤＭＦ（１０ｍｌ）中に溶解されかつ５分間攪拌された（部分的に溶融可能）。ＤＭＦ（０．５ｍｌ）中の１１−メルカプトドデカン酸（１１．５ｍｇ，０．０５ｍｍｏｌ，５ｅｑ．）にＤＩＣ（７．８μｌ，６．３ｍｇ，０．０５ｍｍｏｌ，５ｅｑ．）およびＤＭＡＰ（ｃａｔ．）が添加され、そしてこの溶液が澱粉溶液に添加された。反応は室温で一晩攪拌して置かれた。反応は、次いで、ｍｉｌｌｉＱ水（６倍５０ｍＬ）を有する溶液で濯ぎかつ濃縮によって、遮断された１００００ＭＷ薄膜を備えた攪拌されたセルをを使用して純化され、これに減圧凍結乾燥が追随した。
【００５４】
表面は、チオールグループが表面に化学的に結合されるようにチオールグループを含有している変性された澱粉を使用して設けられた。ＱＣＭ（例１におけると同様に設けられた）は１２時間メタノール（１μｇ／ｍＬ）中で澱粉の溶液中に置かれた。サンプルは次いで水洗いされ、かつ窒素の蒸気下で乾燥された。ウイルスは溶液から表面上に堆積され、かつ空気中での実験のために室温で乾燥された。種々のウイルス濃度が希釈によって作られた。マルトース−結合たんぱく質を遮断するマルトースにより実験を行うために、１００ｎＭマルトースがファージの溶液に添加された。
【００５５】
ＱＣＭの表面は、かくして、硫黄−金結合により金表面に化学的に取着された、溶融可能なポテト澱粉（マルトースの分岐されたポリマを含有している）からなる層で被覆された。実験は空気中および水中の両方において実施された。
【００５６】
図４Ａはマルトース−結合ファージ（−）および変性されないファージ（．．．）の混合物に関して水中で得られた破壊力スペクトルを示しており、走査は５００秒にわたって獲得された。金電極の表面上に各型のファージのおよそ５００ミリオンが存在している。変性されない、かつそれゆえとくに結合されないファージに関して、破壊ピークは１．２Ｖで検出された。マルトース−結合ファージの対応する破壊ピークはほぼ９Ｖで、かつ結合破壊時に実施されるより大きなエネルギによりとくに結合されないファージより強力である。空気中において、とくに結合されたマルトース−結合ファージからのピークは１０Ｖまで観察されなかった；図４Ｂはとくに結合されないファージに関する空気中のデータを示している。ピークは７．５Ｖで、水中で認められたピークにわたってほぼ６の増加を発生する。第２の走査（．．．）はほとんどピークがなく、ファージが表面から除去されたことを示している。このことは、追加の粘性摩擦力および粒子の有効質量の増加が空気中より水中においてファージ粒子と表面との間の結合を破壊し易くさせるということを立証している。
【００５７】
破壊力スペクトルのピークの鋭さは、結合破壊がしきい値電圧で発生することの観察に明らかに関連させられており；これは短い時間周期で発生している音響雑音を結果として生じ、かつそれゆえ方法を非常に高感度にさせる。加えて、特別な結合ファージからの信号は特別な結合がないファージからかつより高い振幅において良好に分離され、それは特別でない吸着が特別な吸着の測定に影響を及ぼさないことを意味している。非常に大きい力が、変性されないファージと表面との間の特別でない相互作用を破壊するのに必要とされる力に比べて、ファージに表示されるマルトース−結合たんぱく質と澱粉被覆表面との間の特別な相互作用を破壊するのに必要とされる。
【００５８】
図４Ｃは、その結合場所がマルトースにより遮断され、かつ次いでファージが中心（頂部のプロット）でまたは表面全体（底部のプロット）にわたってＱＣＭ上に堆積されるとき、マルトース−結合ファージにより空気中で実施された制御実験の結果を示しており；これは変性されないファージと同様な作動を示し、差異がこれらの特別な相互作用によることを立証している。図４Ｄは表面上に１０００個のファージのみによる水中の破壊力スペクトルを示し、そして破壊の状態が検出可能であることを示している。負荷の変化の結果として、ＱまたはＱＣＭの品質因数のより小さい変化によるピーク位置の小さな移動が存在する。
【００５９】
データは、また、特別に結合されないファージへの結合を破壊するための電圧以上であるがマルトース−結合ファージに関する電圧以下である電圧においてＱＣＭを駆動することによりマルトース−結合ファージから特別に結合されないファージを分離可能にすべきであることを示唆している。このことは、結合のためにファージライブラリーをふるい分けするような代替の方法を示唆し、そのさい表面上に残されたファージの結合親和力は、ファージが実用可能であるならば、印加された電圧の大きさおよび印加される時間を制御することによって制御される。
【００６０】
本方法の感度を測定するために、希釈実験が、水中でのマルトース−結合ファージにより、実施された。図５Ａは、信号のパワーが少なくとも大きさの５個のオーダーにわたってファージの数と直線であり、かつＱＣＭ上のほぼ２００個のファージの存在が９９％の確立で検出され得ることを示している（９Ｖに近い最大強度の雑音ピークに関して）。図５Ｂは、９９％の確立による１００個のファージの検出感度を示している、空気中での特別な結合のないファージについての同様な曲線を示している。低い希釈において表面上のマルトース−結合ファージの数はＡＦＭを使用する直接作像によって確認された。
【００６１】
この例は、ＱＣＭ表面上のファージの数が検出され得ることを示している。それに対して、ＰＣＲを使用すると、ウイルスのＤＮＡのコピーの数が溶液中に検出される。強力なウイルス表面相互作用が存在するかまたは溶液が表面上にウイルスを残して蒸発させられる場合に発生する、溶液サンプル中のすべてのウイルス粒子が表面に結合すると仮定されるならば、その場合に、感度の直接比較が可能である。ＰＣＲの感度は、この例（最適化されていない）により、ファージの検出感度に比較し得るウイルスＤＮＡ／ｍＬの約１００コピーである。エレクトロニクスは改善可能であり、かつ多分、少なくとも大きさのオーダーにより、感度をさらに改善するような余地がある。例えば、これらの実験において、ファージはＱＣＭの表面上に均一に堆積された。しかしながら、ＱＣＭの振幅および感度の両方が、支配的な信号がＱＣＭの中心から到来することを意味している空間的な依存を有している（図４Ｃに示されるように）。これは、より強力なピークがファージがＱＣＭの中心にのみ堆積された場合に記録され得ることを意味し、結果として感度の向上を生じる。
【００６２】
この方法は、ＱＣＭの表面に付着されたウイルスへの特別な抗体の使用によって人間のウイルスの検出に簡単に拡張され得る。これらの抗体はＱＣＭの表面に付着されたウイルス間の特別な相互作用を形成する。これらの抗体はウイルスと特定の表面加速で破壊され得る表面との間の特別な相互作用を形成する。サンプル中に存在する同様な大きさのまたはより大きい粒子による不特定の吸着は、今示されたように、低い電圧においてピークを結果として生じ、そしてこれは表面上の巨大分子による吸着がウイルスに結合するのに利用し得る抗体の数を減少するかもしれないけれども分析に影響を及ぼすものでない。多くの一般的なウイルスは、表面との特別な相互作用の数および強度が異なるけれども、この例において使用されたファージより大きい有効質量を有している。これは、必要とされる電圧が同様な大きさまたはより小さいものであることを意味している。
【００６３】
この例は、破壊力分光が増幅過程を必要とせず、定量的であり、そして直接かつ低コストであるような潜在能力を有していることを示している。これは、臨床環境における患者または農業における植物および動物を包含している多くの状況においてウイルスの感染の迅速な診断を導くことができる。
【００６４】
例４
この例はウイルス結合分析を示している。この分析のために、水晶結晶板マイクロバランスチップが３５°の角度でＡＴカットの、研磨された水晶結晶板（ＨｙＱ，ケンブリッジ、英国）から作られ、そして３０ｎｍの厚さのクロムの付着層、次いで較正された電気的コンダクタンスによって決定されるような２００ｎｍの金層でエドワーズ蒸気堆積器中において覆われた。これらのチップは、次いで、１８時間分光等級のエタノール中でメルカプトドデカン酸の１ｍＭ溶液中に浸漬され、エタノールでかつ次いで水で完全に濯がれ、かつ次いで窒素の蒸気により吹き付け乾燥された。これらのチップは、次いで、２０分間ＮＨＳ（１００ｍＭ）およびＥＤＣ（４００ｍＭ）の混合物中に浸漬された。それらは水で完全に濯がれ、次いでｐＨ７．０で１０ｍＭＰＢＳにおいてＨＳＶＩグリコプロテインＤに対して上昇されたマウスの単クーロン性のＩｇＧ抗体の５０μｇ／ｍｌ溶液に１時間浸漬された。それらは次いで水で濯がれ、かつｐＨ８．５でエタノールアミンの１Ｍ溶液に１０分間浸漬された。それらは次いで水で完全に濯がれ、そしてＰＢＳの１ｍｌ中に４°Ｃで貯蔵された。
【００６５】
フィコル（Ｆｉｃｏｌｌ）の純化されたウイルスストック溶液中のウイルス粒子／ｍｌの数がラテックス球体の内部標準により電子顕微鏡を使用して測定された。５×１０10ウイルス粒子／ｍｌの濃度においてＨＳＶｇＤ+ストック溶液のシリアルの１０倍希釈がＢＳＡ（０．１ｍｇ／ｍｌ）を含有しているＰＢＳ（１０ｍＭＮａ2ＨＰＯ4／ＮａＨ2ＰＯ4，２．７ｍＭＫＣｌ，１２０ｍＭＮａＣｌ，ｐＨ７．４）において行われ、かつ４°Ｃで貯蔵された。ＱＣＭチップは次いで器具内に半田付けなしの接触により取り付けられ、そしてこれらの希釈の各々の１μｌまたは４０μｌがアンチ−ｇＤｌｇＧ抗体で覆われたチップ表面上に配置された。４０分後、表面は水で全体的に洗浄され、次いで４０μｌのＰＢＳで被覆され、そしてＱＣＭが０〜１０Ｖで走査した。
【００６６】
結果が図６に示されている。図６Ａは１μｌ（○）および４０μｌ（□）のサンプルに関する信号（７．５Ｖ近傍での雑音ピーク）対ｇＤ+ヘルペスシンプレックスウイルス粒子の数のプロットである。図６ＢはｇＤ+およびｇＤ-ウイルスに関する雑音対振幅のプロットである。表面上で抗体と特別な相互作用を持たないｇＤ-ウイルスはピークを示しておらず；これに対してｇＤ+ウイルスは７．５Ｖ近傍で鋭いピークを示している。
【００６７】
例５
このバクテリア結合分析に関して、ＱＣＭチップが例４におけると同様に設けられた。Ｅ．ｃｏｌｉおよびＳ．ａｕｒｅｕｓ（実験室菌株）がブレインハート／０．５％イースト抽出培養液中で培養されかつ３７°Ｃで一晩培養された。各培養の１ｍｌサンプルが光学的密度によって測定されるような１０10ｃｆｕ／ｍｌの濃度に調整され、そして２分間１２，０００ｇで遠心分離され；ペレットが無菌のＰＢＳに再び懸濁された。１０μｌのバクテリア懸濁液が、アンチＨＳＶ抗体に関して例４において記載された方法と同様な方法において、アンチＥ．ｃｏｌｉＩｇＧ抗体で被覆されたれＱＣＭチップ上に配置された。４０分後、表面は水で全体的に洗浄され、４０μｌのＰＢＳで被覆され、そしてＱＣＭが０〜１０Ｖで走査した。
【００６８】
結果が図７に示されている。雑音／振幅プロットはＥ．ｃｏｌｉに関して約６Ｖで鋭い信号を示し、そしてＳ．ａｕｒｅｕｓに関しては何もない。
【００６９】
例６
この例において、図９に示されるような、ＳＡＷ装置が使用された。この場合に、単一の器具中に増幅器１および受信機およびコントローラ５を結合している、単一の器具（ＨＰ８５１２ａ、ヒューレット・パッカード）が使用された。器具は連続波およびパワースイープモードに設定されている。ＳＡＷ装置はＲＦモノリティックス社から市場で入手可能なＲＦ１１７１であった。直径１μｍの、約１００，００個のラテックス球体がＳＡＷの表面上に堆積された。結果として生じているスペクトルは図１０に示されている。多数のピークがクリーンな表面上に存在しないことが観察される。これは、ＳＡＷ装置が破壊の状態を検出するのに使用され得ることを示している。種々のピークは、多分、種々の大きさの表面上の球体のクラスタに対応し、かつそれゆえピークは種々の位置において観察される。
【図１】
0004493892.tif 000002
【図２Ａ】
0004493892.tif 000003
【図２Ｂ】
0004493892.tif 000004
【図３Ａ】
0004493892.tif 000005
【図３Ｂ】
0004493892.tif 000006
【図４Ａ】
0004493892.tif 000007
【図４Ｂ】
0004493892.tif 000008
【図４Ｃ】
0004493892.tif 000009
【図４Ｄ】
0004493892.tif 000010
【図５Ａ】
0004493892.tif 000011
【図５Ｂ】
0004493892.tif 000012
【図６Ａ】
0004493892.tif 000013
【図６Ｂ】
0004493892.tif 000014
【図７】
0004493892.tif 000015
【図８】
0004493892.tif 000016
【図９】
0004493892.tif 000017
【図１０】
0004493892.tif 000018