(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サイクリンＤ１、Ｄ２又はＤ３であるサイクリンの遺伝子及びサイクリン依存性キナーゼ４又は６の遺伝子の少なくとも一方に核移行シグナルをコードする塩基配列を付加し、前記各遺伝子を試験管内で心筋細胞に導入し次いでその細胞を培養することを特徴とする心筋細胞の増殖方法。
【請求項２】
前記心筋細胞への遺伝子の導入がアデノウイルスベクターを用いた遺伝子導入である請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項３】
サイクリンＤ１、Ｄ２又はＤ３であるサイクリンの遺伝子とサイクリン依存性キナーゼ４又は６の遺伝子とを含む組換えベクターであって、これらの遺伝子のうち少なくとも一方に核移行シグナルをコードする塩基配列を付加したことを特徴とする組換えベクター。
【請求項４】
前記組換えベクターがアデノウイルスベクターである請求の範囲第３項記載の組換えベクター。
【請求項５】
請求の範囲第３項又は第４項記載の組換えベクターを有効成分とすることを特徴とする心筋細胞を増殖させるための薬剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は終末分化細胞の増殖方法及びこれに用いる組換えベクターに関し、詳しくはサイクリン及びサイクリン依存性キナーゼを用いて終末分化細胞を増殖させる方法等に関する。
背景技術
真核細胞の細胞周期はサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）によって制御される。これらは単独では活性をもたずサイクリンと呼ばれるサブユニットが結合してはじめて活性型となるリン酸化酵素群である。細胞周期における異なるプロセス（複製や有糸分裂への導入など）は、異なるＣＤＫによって制御されるが、一般にＣＤＫの発現量は細胞周期を通じて一定で、その活性はサイクリンの発現量に依存する。サイクリンは細胞周期の必要な時期に一過性に発現してＣＤＫを活性化する。
更に、ＣＤＫの活性はＣＤＫインヒビターと呼ばれる一連の阻害因子群によっても調節されている。その一次構造上の特徴と、阻害するＣＤＫの特異性からＩＮＫ４（Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ＣＤＫ４）ファミリーと、ＣＩＰ／ＫＩＰ（ＣＤＫ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ）ファミリーの２群に大別されている。細胞周期の進行を車の運転にたとえるとＣＤＫはアクセル、ＣＤＫインヒビターはブレーキの役割を果たす因子で、アクセルとブレーキが協調的に調節しあうことで、細胞周期の進行が決定されている。
静止期の細胞が細胞周期に入る際、Ｄ型サイクリンは増殖刺激に反応してＧ１中期から後期にかけて発現する。Ｒａｓ／Ｒａｆ−１／ＭＡＰＫによりその転写が促進され、Ｐ１３Ｋ（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ  ３−ｋｉｎａｓｅ）／Ａｋｔ（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ｂ）により分解が抑制されている。ＣＤＫ４，６はＤ型サイクリンと結合し、核内に移行しＣＡＫ（ＣＤＫ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｋｉｎａｓｅ）によるリン酸化を受け活性型となる。Ｄ型サイクリンは増殖シグナルのいわば細胞内センサーで、増殖シグナルに応じてその発現が誘導され、シグナルを実際に細胞周期を進行させるＣＤＫ２、ＣＤＣ２に伝える働きをするものと考えられている。Ｄ型サイクリン／ＣＤＫ４，６の細胞周期進行における役割は２つあると考えられている。１つはＲＢ（網膜芽細胞腫遺伝子蛋白）をリン酸化し、その増殖抑制効果を解除する。もう１つはＣＩＰ／ＫＩＰをトラップする働きである。細胞内に単独でＣＩＰ／ＫＩＰが存在するとＧ１後期に出現するＣＤＫ２活性は阻害されてしまう。Ｄ型サイクリン／ＣＤＫはＣＩＰ／ＫＩＰと結合することで細胞内のこれらのインヒビターによるＣＤＫ２阻害活性を低下させると考えられている。
細胞周期のＧ１期においてＣＤＫの標的となる基質はＲＢである。ＲＢは多くのタンパク質と相互作用することが知られているが、その中で鍵となるのが転写因子Ｅ２Ｆである。Ｅ２Ｆは細胞周期の進行やＤＮＡ複製に必要な遺伝子の転写を制御し、例えばサイクリンＥの転写を活性化し、サイクリンＥ／ＣＤＫ２の作用を介してＳ期の開始に重要な働きをしている。ＲＢは非リン酸化状態では、Ｅ２Ｆと強く結合し、Ｅ２ＦがＤＮＡ複製を促進しないように抑えている。ＲＢは細胞周期を進行させるＣＤＫによってリン酸化され、リン酸化されたＲＢはＥ２Ｆを抑制する作用を失い、不活性化される。近年、ＲＢとＥ２Ｆにはそれぞれ類似したタンパク質が存在することが示され、ＲＢファミリー、Ｅ２Ｆファミリータンパク質と呼ばれるようになった。その結果、細胞周期のＧ１からＳ期への進行は、ＲＢとＥ２Ｆファミリータンパク質によって高度に制御されているプロセスであることが明らかになってきた。更に、このＲＢ−Ｅ２Ｆ経路は、細胞の分化、癌化、アポトーシスなどの多くの生命現象に関与していることが明らかになってきた。例えば、上記ＲＢ等の不活化が細胞周期調節の異常によって細胞の癌化へつながることが明らかとなり、このような細胞周期調節遺伝子の多くが癌抑制遺伝子として報告されている。
一方、心筋細胞、神経細胞等の終末分化細胞は、このような細胞周期から逸脱して静止期（Ｇ０期）と呼ばれる特別な状態にあることが知られている。これら終末分化細胞の一つである心筋細胞は生直後に増殖能を失う。そのため、心筋梗塞や拡張型心筋症によって心筋細胞の壊死、喪失が起こった場合、心筋細胞は再生されない。従ってその後、心不全に陥ってさらには死亡する症例が多く、これらの心疾患の死亡率が非常に高い原因となっている。これまで心筋細胞はＧ０期で停止しており、細胞周期は進行しないものと考えられていたが、近年の研究によって心筋細胞にも細胞周期の調節機構が存在することが示唆され始めた。
例えば、アデノウイルスの発癌遺伝子であるＥ１Ａは上記ＲＢに結合することにより、Ｅ２Ｆ依存性の遺伝子の転写を促し、細胞のＤＮＡ合成を誘導する。ラット新生仔培養心筋細胞を用いて、Ｅ１Ａが心筋細胞においてＥ２Ｆを遊離し、ＤＮＡ合成及び脱分化を起こすかどうかを確かめたところ、Ｅ１ＡのみではＤＮＡ合成の誘導は明らかでなくアポトーシスが起こる。Ｅ１Ｂの共存下でＥ１ＡがＤＮＡ合成を誘導することが報告されている（Ｋｉｒｓｈｅｎｂａｕｍ，Ｌ．Ａ  ら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７０巻、７７９１−７７９４頁、１９９５年参照）。
次にＥ２Ｆアデノウイルスを使用した結果、Ｅ２Ｆは心筋細胞において心筋特異的な遺伝子の発現を抑制し、ＤＮＡ合成を誘導することが報告されている（Ｋｉｒｓｈｅｎｂａｕｍ，Ｌ．Ａ．ら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １７９巻、４０２−４１１頁、１９９６年参照）。
一方、核移行シグナルをもたない野生型のサイクリンＤ１を過剰発現するトランスジェニックマウスでは、心筋細胞においてＣＤＫ４の発現レベルの上昇と共にＤＮＡ合成も認められるが、異常な多核細胞が増加することが報告されている（Ｓｏｏｎｐａａ，Ｍ．Ｈら、Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９９巻、２６４４−２６５４頁、１９９７年参照）。
このような一連の研究から、心筋細胞においてもＤＮＡ合成は認められ細胞周期が進行する可能性が示唆されるが、これに続く細胞の分裂や細胞数が増加したという報告は無く、アポトーシスへ誘導されることなく心筋細胞を増殖させる方法は実質的に知られていない。
近年、臓器移植や白血病等の治療を目的として、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）と呼ばれる、いろいろな細胞に分化する能力を秘めた万能細胞を用いて所望の種類の細胞を作り出す再生医療技術が研究されている。しかし、ＥＳ細胞は胎児になる可能性がある胚を壊してつくるため、研究には倫理面からの抵抗が強い。
発明の課題
本発明は、上記問題点に鑑みなされたものであって、心筋細胞等の終末分化した細胞の再生を可能にして、心疾患等の治療に応用できるような終末分化細胞の増殖方法を提供することを目的とする。
また、このような方法に用いる組換えベクター又はこれを含有する薬剤を提供することを目的とする。
発明の開示
上記課題を解決するために、本発明者等は終末分化した細胞における細胞周期調節機構、特に心筋細胞において、血清などの増殖刺激を加えた場合におけるサイクリン／ＣＤＫの役割について研究を行なった結果、増殖刺激によって誘導されたＤ型サイクリン／ＣＤＫ４は細胞質に限局し核内へ移行しないこと、そのターゲットであるＲＢのリン酸化及びサイクリンＥ／ＣＤＫ２の活性化が起こらないことを見出した。そこで、サイクリンＤ１に核移行シグナル（ＮＬＳ）を付加した遺伝子とＣＤＫ４をコードする遺伝子を組み込んだアデノウイルスベクターを作成し、培養心筋細胞に感染させたところ、サイクリンＤ１／ＣＤＫ４が核内に発現し、ＲＢのリン酸化を介して心筋細胞の増殖、分裂を起こすことを見出し、本発明を完成するに到った。
すなわち、本発明の第一の視点において、サイクリン及びサイクリン依存性キナーゼを終末分化細胞の核内に導入し、次いでその細胞を培養又はその組織を保持することを特徴とする。
上記核内へ導入するための好ましい態様において、サイクリン遺伝子及びサイクリン依存性キナーゼ遺伝子の少なくとも一方に核移行シグナルをコードする塩基配列を付加し、前記各遺伝子を終末分化細胞に導入し次いでその細胞を培養するか、又は前記各遺伝子を生体内の終末分化細胞に直接導入することを特徴とする。
更に本発明の好ましい態様において、上記サイクリンはＣＤＫ４又はＣＤＫ６を活性化することができるサイクリンであり、例えば哺乳類のサイクリンＤ１、Ｄ２及びＤ３等が好適である。また、上記サイクリン依存性キナーゼはＤ型サイクリンにより活性化されるものであり、例えば哺乳類のＣＤＫ４及びＣＤＫ６が好適である。
本発明の別の好ましい態様において、前記終末分化細胞は心筋細胞、神経細胞、腎臓細胞又は膵臓細胞であることを特徴とする。
更に別の好ましい態様において、前記終末分化細胞への導入はアデノウイルスベクターを用いた遺伝子導入であることを特徴とする。
本発明の第二の視点において、上記目的を達成するために用いられる組換えベクターは、核移行シグナル（タンパク質を核内に移行させる機能があるシグナルペプチド）をコードする塩基配列を付加したサイクリン遺伝子、又は核移行シグナルをコードする塩基配列を付加したサイクリン依存性キナーゼ遺伝子を含むことを特徴とする。上記組換えベクターは、少なくとも一方に核移行シグナルをコードする塩基配列が付加されていれば、サイクリン遺伝子とサイクリン依存性キナーゼ遺伝子の両方を含んでいてもよい。
好ましい態様において、上記サイクリン遺伝子は哺乳類のＣＤＫ４又はＣＤＫ６を活性化し得るサイクリン遺伝子であり、上記サイクリン依存性キナーゼ遺伝子は哺乳類のサイクリンＤ１、Ｄ２又はＤ３によって活性化されるサイクリン依存性キナーゼ遺伝子であることを特徴とする。
更に好ましい態様において、前記組換えベクターはアデノウイルスベクターであり、前記核移行シグナルをコードする塩基配列はＳＶ４０のｌａｒｇｅ  Ｔ抗原由来の核移行シグナルの塩基配列であることを特徴とする。特にＳＶ４０のｌａｒｇｅ  Ｔ抗原由来の核移行シグナルを３回コードするものが推奨される。
本発明の第三の視点において、上記第一の視点における何れかの方法により増殖させたことを特徴とする動物細胞又は組織に関する。
更に、本発明の第四の視点において、上記第二の視点におけるいずれかの組換えベクターを有効成分とすることを特徴とする終末分化した細胞及び／又は組織を増殖させるための薬剤に関する。
本視点における薬剤を使用する好ましい態様としては、心臓疾患を有する患者の治療方法であって、少なくとも一方に核移行シグナルをコードする塩基配列が付加されたサイクリン遺伝子及びサイクリン依存性キナーゼ遺伝子を発現させるウイルスベクターを直接患者の心臓（心筋）に投与し、患者の心筋（心筋細胞）を増殖させることを特徴とする。
発明の実施の形態
（サイクリン及び該サイクリン依存性キナーゼ）
哺乳類のＤ型サイクリンは３種類（Ｄ１，Ｄ２，Ｄ３）のサブタイプを有し、細胞周期のＧ１中期から後期にかけて発現し、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６と結合して活性化する。おもにＲＢタンパク質をリン酸化してＧ１／Ｓ期移行を促進する。サイクリンＤ１はＧ１期には核内に局在するが、Ｓ期に入るとＧＳＫ−３β（ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ−３β）と呼ばれるタンパク質キナーゼによってＴｈｒ２８６をリン酸化されて細胞質へ移行しそのままプロテアソームによって分解される。サイクリンＤ１／ＣＤＫ４は細胞周期以外にも転写制御因子ＭｙｏＤの阻害を通じて筋分化を制御したり、乳腺上皮細胞においてＥＲ（ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）と結合して活性化するなどの多彩な機能が報告されている。
本発明は、このようなサイクリン及びサイクリン依存性キナーゼを終末分化細胞の核内に導入することにより、細胞周期を進行させて終末分化細胞を増殖させる方法である。これらのタンパク質を核内に導入する方法としては、マイクロインジェクションにより物理的に注入する方法もあるが、導入効率の観点から遺伝子導入法が好ましい。導入されるサイクリンとしてはＣＤＫ４又はＣＤＫ６を活性化できるものであれば良く、例えば上記３種類のサブタイプ（サイクリンＤ１，Ｄ２，Ｄ３）が挙げられる。また、サイクリン依存性キナーゼとしてはＤ型サイクリンによって活性化されるものであれば良く、ＣＤＫ４又はＣＤＫ６等が挙げられる。
（終末分化細胞の調製）
本発明の方法に使用される終末分化細胞は、生体から種々の方法により分離し、培養することができる。終末分化細胞とは、心筋細胞、神経細胞、腎臓細胞及び膵臓細胞等のように、生まれてから個体が死ぬまで一度も分裂しないで細胞周期のＧ０期にある細胞のことを言い、例えば、生後１〜２日の新生仔ラットの培養心筋細胞は、フローサイトメトリー等の細胞周期アッセイを行うと、培養後２４時間以内には９０％以上の細胞がＧ０／Ｇ１期にあることが確認される。更に、血清などの増殖刺激を加えた際にもＳ期への移行は認められない。（Ｃｌａｙｃｏｍｂ，Ｗ．Ｃ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２巻、２３１−２３６頁、１９９２年参照）。
同様に神経細胞、特に脳等の中枢神経細胞は胎児期において細胞分裂が完了するため、生後脳に障害を受けた場合は回復が困難である。腎臓細胞が障害を受けると再生することができず人工透析等の治療が必要となる。膵臓細胞は種々の消化酵素又は消化管ホルモンを産生するが、β細胞に障害を受けると再生が困難なためインシュリンの分泌に支障をきたし糖尿病の原因になることが知られている。本発明においては、これらの終末分化細胞を生体外に取り出して、又は生体内のそのままの状態で本発明の方法を適用し、培養又は保持することによって増殖させることができる。
（組換えベクターの構築）
Ｄ型サイクリン遺伝子及びサイクリン依存性キナーゼ遺伝子は、既にヒトを初め種々の生物からクローン化され、その塩基配列が報告されている。例えば、マウスサイクリンＤ１遺伝子の塩基配列は、Ｍａｔｓｕｓｈｉｍｅ，Ｈ．ら、Ｃｅｌｌ、６５巻、７０１−７１３頁、１９９１年等に報告され、ＧｅｎＢａｎｋに登録されている（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｍ６４４０３）。また、ヒトサイクリンＤ１遺伝子もＬｅｅ，Ｄ．ら、Ｃｅｌｌ、６６巻、１１９７−１２０６頁、１９９１年等に報告されている。ヒトＣＤＫ４は３０３個のアミノ酸からなるタンパク質であって、これをコードするｃＤＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋに登録されている（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｍ１４５０５）。さらに、哺乳類のゲノムＤＮＡを鋳型として、所望の遺伝子に特異的なプライマーＤＮＡを用いたＰＣＲにより取得することもできる。
これらの遺伝子にコードされるタンパク質を終末分化細胞の核内に導入するためには、細胞質内で合成されたタンパク質を核内に移行させることが必要となる。このためには、上記各遺伝子の少なくとも一方、好ましくはサイクリン遺伝子に核移行シグナルをコードする塩基配列を付加する。現在、核移行シグナルと考えられるものには３種類が知られている。これらはいずれもモチーフと呼ばれる共通の配列をもつとされている。
第一は、リジンやアルギニン等の塩基性のアミノ酸をほとんどもたないタイプである。このモチーフの例は非常に少ないが、例えばインフルエンザウイルスのｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎの核移行シグナル（ＡＡＦＥＤＬＲＶＬＳ：配列番号１）がある（Ｄａｖｙ，Ｊ．ら、Ｃｅｌｌ  ４０巻、６６７−６７５頁、１９８５年参照）。第二は、塩基性アミノ酸を多く含むタイプである。このモチーフの例は非常に多く、例えばＳＶ４０  ｌａｒｇｅ  Ｔ抗原の核移行シグナル（ＰＰＫＫＫＲＫＶ：配列番号２）がある（Ｋａｌｄｅｒｏｎ，Ｄ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１１巻、３３−３８頁、１９８４年参照）。第三は、塩基性アミノ酸が約１０アミノ酸を隔ててクラスターを作っているタイプで、Ｂｉｐａｒｔｉｔｅタイプの核移行シグナルと呼ぶ。このモチーフの例も非常に多く、例えばアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）のｎｕｃｌｅｏｐｌａｓｍｉｎの核移行シグナル（ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ：配列番号３）がある（Ｒｏｂｂｉｎｓ，Ｊ．ら、Ｃｅｌｌ  ６４巻、６１５−６２３頁、１９９１年参照）。
核移行シグナルをコードする塩基配列は、Ｄ型サイクリン遺伝子及び該サイクリンにより活性化されるサイクリン依存性キナーゼ遺伝子の少なくとも一方に付加する。これらの遺伝子によって発現された２つのタンパク質は細胞質内で複合体を形成するから、何れか一方、好ましくはサイクリン遺伝子に核移行シグナルを有すれば該複合体が核膜を通過することができる。なお、これらの核移行シグナルをコードする塩基配列を有し、クローン化したＤＮＡの発現タンパク質を核内に移行させるための組換えベクターは容易に入手することができ、例えば、ＳＶ４０  ｌａｒｇｅ  Ｔ抗原の核移行シグナルを有する発現プラスミドｐＥＦ／ｍｙｃ／ｎｕｃは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から市販されている。
ベクターとしては、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、ニワトリポックスウイルス、ＳＶ４０のごときパポバウイルス等のウイルス由来のベクターが例示される。
本発明の好ましい形態において用いられるアデノウイルスベクターは、ヒト胎児腎臓２９３細胞又は大腸菌を使用し、相同組換えによる方法（Ｍｉｙａｋｅ，Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３巻、１３２０頁、１９９６年参照）や簡単なｉｎ  ｖｉｔｒｏライゲーションによる方法（Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉ，Ｈ．ら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，９巻、２５７７−２５８３頁、１９９８年参照）により調製することができる。アデノウイルスは線状の二本鎖ＤＮＡゲノムを有するＤＮＡウイルスの一つであり、最も良く研究されているのは、ヒトアデノウイルス抗原型５（ＡＤ５）と抗原型２（ＡＤ２）である。これらの野生型アデノウイルスの初期遺伝子１（Ｅ１）及び３（Ｅ３）の大部分を欠失することにより、複製能のないアデノウイルスベクターを作製することができ、ウイルス粒子形成に有害な作用を及ぼすことなく、数ｋｂの外来ＤＮＡを挿入することが可能となる。この組換えアデノウイルスは、転写調節因子であるＥ１遺伝子を欠いているが、挿入した遺伝子特異的な転写ユニットによって、標的細胞の増殖や、その他のウイルス遺伝子の有無に依存せずに、挿入した目的遺伝子のみを発現させることができる。このような発現系を構築するために、たとえば宝酒造株式会社からＡｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｋｉｔが市販されており本願発明に利用可能である。
（遺伝子導入と細胞の培養）
遺伝子導入方法としては、従来より公知の方法が使用可能であり、例えばリン酸カルシウムやリポソームを使用した組換えＤＮＡによるトランスフェクション法やレトロウイルス等の種々のウイルスを用いた遺伝子導入法がある。レトロウイルスによる遺伝子導入は、通常特定の細胞に感染して遺伝情報を細胞自体のＤＮＡに組込むが、２種以上の細胞に感染できる場合もある。導入された遺伝子の発現は一過性発現であっても良く、また、受容細胞の染色体ＤＮＡに組込まれて構成的に発現しても良い。好ましくは、組換えアデノウイルスベクターを使用することによって、効率的な遺伝子導入と導入した遺伝子の高レベル発現を行うことができる。アデノウイルスによる遺伝子の導入は、哺乳動物の細胞に遺伝子を導入する最も強力な方法の一つであり、事実上すべての種類のヒト細胞及び多くの非ヒト細胞に導入するために使用できる。また、アデノウイルスによる感染は細胞周期に依存しないため、様々な初代培養細胞系および形質転換細胞系で遺伝子を発現させることができる。特に終末分化細胞のようにＤＮＡ合成や細胞分裂を起こさない細胞でも効率良く遺伝子導入ができる。感染後に多くの細胞が組換えＤＮＡのコピーを複数受け取ることから、導入された遺伝子は一時的に高レベルに発現する。更に、通常アデノウイルスＤＮＡは細胞ゲノムに組込まれず、エピゾームとしてとどまる。その結果、アデノウイルスを使用した場合には、外来ＤＮＡが宿主細胞ゲノムに組込まれた時にランダムに発生する突然変異誘発性のエラーは殆ど生じないという利点もある。
本発明においては、Ｄ型サイクリン遺伝子と該サイクリンによって活性化されるサイクリン依存性キナーゼ遺伝子の両方を発現させるために、これらを同一の組換えウイルスによって感染させることも、又は別々の組換えウイルスによって感染させることもできる。２種類の組換えウイルスによって共感染させる場合は、これらを同時に感染させても良いし、一定時間をおいて別々に感染させても良い。本発明においては、感染させるウイルス量は例えば１０９〜１０１１／ｍｌのウイルス保存液を用い、細胞当たり好ましくは１００個程度（ＭＯＩ＝１００）に調整することにより感染させる。タイプの異なる２種の組換えアデノウイルスの共感染によっても、遺伝子導入の効果が高く、また、細胞の生存率が高い状態を得ることができる。なお、ウイルス量の測定（力価測定）は、プラークアッセイにより容易に行うことができる。
Ｄ型サイクリンと、該サイクリンにより活性化されるサイクリン依存性キナーゼとを核内において発現する終末分化細胞は、従来より公知の方法に従って培養することにより増殖させる。該細胞の培養方法は細胞の種類によってそれぞれ好適な方法を選択することができ、マイクロタイタープレート、ペトリ皿又はフラスコ中での静置培養や培養びんを用いた回転培養、さらに微小担体培養等の方法がある。例えば心筋細胞の場合は、イーグルの最小必須培地（ＭＥＭ）等を用い、５〜２０％の牛胎児血清等の増殖因子を添加し、５％炭酸ガス存在下、３７℃で培養することができる。神経細胞、腎臓細胞及び膵臓細胞等も同様の方法により培養できる。各種細胞をそれぞれ最適の条件で増殖させるために種々の培地が開発、市販されている。例えば、ＲＰＭＩ１６４０培地やＣＭＲＬ１０６６培地等がある。このような多くの培地はＦｌｏｗ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社や、Ｇｉｂｃｏ社等の市販業者から入手できる。
また、本発明においては、上述した種々の方法によって生体内、例えば哺乳動物の終末分化細胞又は組織に直接遺伝子を導入し、該細胞又は組織を生体内で保持することによっても増殖させることができる。ここで、「保持する」とは、体温や血流等の生理的な環境において、該細胞や組織の生理的な機能を損なうことなく維持し、細胞を増殖させることをいう。
（増殖した細胞又は組織）
本発明はまた、本発明の方法により増殖させたことを特徴とする細胞又は組織に関する。例えば患者から摘出された終末分化細胞に核移行シグナルを付加したＤ型サイクリン遺伝子と該サイクリンによって活性化されるサイクリン依存性キナーゼ遺伝子を上述した方法で導入し、培養することによって増殖させる。これらの増殖した細胞又は組織は、当該細胞又は組織の壊死した患者に投与してその再生を図るために用いることができる。具体的には、本発明の方法により増殖させた心筋細胞、神経細胞、腎臓細胞又は膵臓細胞などを患者に移植することができる。
（終末分化した細胞及び／又は組織を再生させるための薬剤）
本発明の組換えベクターは、疾病の予防又は治療に使用することができ、特定の細胞や組織が障害を受けた場合に、そのような細胞又は組織に本発明に係る組換えベクターを有効成分とする薬剤を投与することによって、終末分化した細胞を増殖させて壊死した組織又は臓器の修復、補充をさせることができる。例えば、心筋梗塞や拡張型心筋症の治療に用いることができ、この場合には患者の心臓に直接、上記組換えベクターを含む薬剤を投与することによって患者の心筋（心筋細胞）を増殖させることができる。
実施例
以下、終末分化細胞の一つである心筋細胞を用いた実施例により本発明をさらに具体的に説明する。この実施例においては、ラット心筋細胞を試験管内で増殖させる一実施形態を示す。ただし、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
［実施例１］組換えアデノウイルスの調製
１）Ａｄ−ＣＤＫ４の調製
ＣＤＫ４を含むアデノウイルスベクターＡｄ−ＣＤＫ４は、プラスミドｐＣＭＶ−ＣＤＫ４（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  ＣｅｎｔｅｒのＳａｎｄｅｒ  ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｅｕｖｅｌ博士より入手、ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｅｕｖｅｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６２巻、２０５０−２０５４頁、１９９３年参照）から切り出したマウスＣＤＫ４遺伝子とアデノウイルス構築キット（宝酒造社製Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｋｉｔ  Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．６１５０）を用いて調製した。すなわち、ｐＣＭＶ−ＣＤＫ４をＢａｍＨＩで切断し、約９２０塩基対のＤＮＡ断片を調製した。この断片の末端をＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ宝酒造社製Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．６０２５を用いて平滑（Ｂｌｕｎｔ  ｅｎｄ）化した後、コスミドｐＡｘｃｗのＳｗａＩ部位に挿入してコスミドｐＡｄ−ＣＤＫ４を作製し、さらに斎藤らの方法（Ｍｉｙａｋｅ，Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３巻、１３２０頁、１９９６年参照）に従ってこのコスミドとヒトアデノウイルス５型のＤＮＡ−ＴＰＣ（ターミナルペプチドコンプレックス）とをヒト胎児腎臓由来の２９３細胞（以下「２９３細胞」という。）へトランスフェクションさせることにより、組換えアデノウイルス（Ａｄ−ＣＤＫ４）を作製した。
２）Ａｄ−Ｄ１ＮＬＳの調製
核移行シグナル（ＮＬＳ）をコードする塩基配列を付加したサイクリンＤ１遺伝子を含むプラスミドは、ｐＲＳＶ−ｃｙｃｌｉｎＤ１由来のマウスサイクリンＤ１遺伝子断片（Ｍａｔｓｕｓｈｉｍｅ，Ｈ．ら前掲参照）とｐＥＦ／ｍｙｃ／ｎｕｃプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）由来のＮＬＳを連結して構築した。すなわち、プラスミドｐＥＦ／ｍｙｃ／ｎｕｃを制限酵素ＮｃｏＩ及びＸｈｏＩで切断し、１．０％アガロースゲル電気泳動とＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製、Ｃａｔ．２８７０４）を用いて約５．５ｋｂの第一のＤＮＡ断片を調製した。次にプラスミドｐＲＳＶ−ｃｙｃｌｉｎＤ１を制限酵素ＮｃｏＩで切断し上記と同様の方法で６０３ｂｐの第二のＤＮＡ断片を調製した。更に、プラスミドｐＲＳＶ−ｃｙｃｌｉｎＤ１を鋳型として以下の２種類のプライマーを用いてＰＣＲを行い、マウスサイクリンＤ１遺伝子のＣ末端側をコードする第三のＤＮＡ断片を調製した。
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これらの３種類のＤＮＡ断片をＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ宝酒造社製Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．６０２２を用いて連結することによってマウスサイクリンＤ１遺伝子のＣ末端側にＳＶ４０  Ｌａｒｇｅ  Ｔ抗原由来の核移行シグナル（ＮＬＳ）を重複して３回コードする塩基配列を有するプラスミドを構築した。このプラスミドから制限酵素ＰｍａＣＩ及びＳｍａＩで切り出したＤＮＡ断片を上記と同様の方法によりコスミドｐＡｘｃｗのＳｗａＩ部位に挿入し、アデノウイルス構築キット（宝酒造社製Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｋｉｔ  Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．６１５０）を用いて組換えアデノウイルス（Ａｄ−Ｄ１ＮＬＳ）を作製した。この組換えアデノウイルスＡｄ−Ｄ１ＮＬＳは、Ｅ１およびＥ３遺伝子を欠失したアデノウイルスのＤＮＡ配列の中に、ＣＡＧプロモーター（トリβ−アクチンプロモーター＋サイトメガロウイルスエンハンサー）と、ウサギβ−グロビン遺伝子のポリＡ付加シグナル配列の間に上記核移行シグナルをコードする塩基配列を付加したマウスサイクリンＤ１遺伝子を有する。
３）ウイルス保存液の調製
２９３細胞をコラーゲンコートした６ｃｍシャーレにそれぞれ１枚ずつ培養しておく。上記１）及び２）で調製したコスミドＡｄ−ＣＤＫ４とＡｄ−Ｄ１ＮＬＳの４μｇを、それぞれ制限酵素処理済みＤＮＡ−ＴＰＣ（宝酒造社製Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｋｉｔ内）２．５μｌと混合し、それぞれ６ｃｍシャーレで培養した細胞にリポフェクション法でトランスフェクションを行った（ＦｕＧＥＮＥＴＭ６  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ，Ｒｏｃｈｅ社製、ｃａｔ＃１  ８１４  ４４３を使用）。翌日、細胞を剥がし、回収した細胞懸濁液を、それぞれコラーゲンコート９６ウエルプレートに播き直した。ウイルスが増殖し細胞が死滅したウエルが７〜１５日の間に現れたので、細胞が完全に死滅したウエル毎に培養液を無菌的に滅菌チューブに移して、凍結融解を６回繰り返し、５０００ｒｐｍ，５分間遠心分離した上清を１次ウイルス液として−８０℃で保存した。この１次ウイルス液１０μｌをコラーゲンコートした２４ウエルプレートに培養した２９３細胞に感染させ、３〜４日後に死滅した細胞／培養液を無菌的に滅菌チューブに移して、凍結融解を６回繰り返し、５０００ｒｐｍ，５分間遠心分離した上清を２次ウイルス液として−８０℃で保存した。この２次ウイルス液１５μｌを、コラーゲンコートした２５ｃｍ２ボトルに培養した２９３細胞に感染させ、３〜４日後に死滅した細胞／培養液を無菌的に滅菌チューブに移して、凍結融解または密封型ソニケーターで破砕してウイルスを遊離させた。３０００ｒｐｍ，１０分間、４℃で遠心分離した上清を３次ウイルス液として−８０℃で保存した。この３次ウイルス液５０μｌを、コラーゲンコートした７５ｃｍ２ボトルに培養した２９３細胞に感染させ、３〜４日後に死滅した細胞／培養液を無菌的に滅菌チューブに移して、凍結融解または密封型ソニケーターで破砕してウイルスを遊離させた。３０００ｒｐｍ，１０分間、４℃で遠心分離した上清を４次ウイルス液として−８０℃で保存した。この４次ウイルス液の力価は２９３細胞を用いてプラークアッセイにより決定したところ、いずれも常に１０９〜１０１１ｐｆｕ／ｍｌの範囲内であった。
［実施例２］心筋細胞の調製と組換えアデノウイルスの感染
生後１〜２日後のラット（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ｒａｔｓ）から心筋細胞を分離し、パーコール濃度勾配遠心分離によって心筋細胞の層（画分）を回収し、５％牛血清（ＣＳ）を含むＭＥＭ（ｍｉｎｉｍｕｍ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ；Ｓｉｇｍａ社製、Ｃａｔ．Ｍ−４６５５）に分散した（Ｔａｍａｍｏｒｉ，Ｍ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７５巻（Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．４４巻）、Ｈ２０３６−Ｈ２０４０頁、１９８８年参照）。このようにして得られた細胞の９５％以上は、マウスモノクローナル抗アクチン抗体（Ｄａｋｏｐａｔｔｓ社製、デンマーク）を用いた免疫染色によって心筋細胞であることを確認した。この新生仔ラット心筋細胞は、５％牛胎児血清（ＦＣＳ，Ｆｌｏｗ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を添加したイーグル最小培地（ＭＥＭ，Ｆｌｏｗ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）中で培養皿に播種し、炭酸ガスインキュベータ中、３７℃で２４時間培養した。次の日、培養液を無血清イーグル最小培地（ＭＥＭ）に交換し、更に２４時間培養した後、実施例１で調製した各々のウイルスを単独で又は２種以上を組み合わせて感染させた。ウイルス感染は、細胞当り１００ｐｆｕ（ｐｌａｑｕｅ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ）の組換えアデノウイルスを加え一定期間培養した。対照として、ラット心筋細胞の代わりに繊維芽細胞の一種であるＲＥＦ５２細胞を用いて同様の実験を行った。
［実施例３］ウエスタンブロット解析、リン酸化反応解析及び免疫蛍光染色による心筋細胞における遺伝子発現の解析
種々の増殖因子及び／又は実施例１で調製した各種の組換えアデノウイルスを、実施例２で示した方法で調製したラット心筋細胞に感染させた。これらのウイルス感染細胞を培養後、所定時間後の培地から、細胞全体、細胞質分画及び核分画をそれぞれ次のような方法で抽出した。培養皿上の細胞を氷冷した（４℃）ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）にて洗浄した後、セルスクレイパーにてかき取り、遠心分離して上清を捨てた。得られた沈殿を少量のＰＢＳでもう一度洗浄した後、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移し、沈殿の１０倍容量の氷冷した（４℃）Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．９），１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ，０．１％  ＮＯＮＩＤＥＴ  Ｐ−４０，０．４ｍＭ  ＮａＦ，０．４ｍＭ  Ｎａ２ＶＯ４，１０％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ）を加え、氷上にてピペッティングし、１５秒間ｖｏｒｔｅｘ  ｍｉｘｅｒで撹拌した後３０分間氷上にて静置した。その後、４℃、１５，０００回転にて１０分間遠心分離し、その上清を細胞全体の抽出物として保存した（液体窒素にて急速冷凍し、−８０℃にて保存した）。
細胞質タンパク質と核タンパク質は次のように分画した。上記と同様に、培養皿上の細胞を氷冷したＰＢＳにて洗浄した後、セルスクレイパーにてかき取り、遠心分離して上清を捨てた。得られた沈殿を少量のＰＢＳでもう一度洗浄した後、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移し、沈殿の５倍容量の氷冷したＢｕｆｆｅｒ  Ａ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．９），１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１０ｍＭ  ＫＣｌ，０．５ｍＭ  ＤＴＴ）にてピペッティングし、１５秒間ｖｏｒｔｅｘ  ｍｉｘｅｒで撹拌した後氷上にて１０分間静置した。ＮＯＮＩＤＥＴ  Ｐ−４０を最終濃度０．２％になるように加えｖｏｒｔｅｘ  ｍｉｘｅｒで撹拌した後５分間氷上にて静置した。最後に５，０００回転にて５分間遠心分離した上清を細胞質分画として保存した（液体窒素にて急速冷凍し、−８０℃にて保存した）。沈殿は等容量のＢｕｆｆｅｒ  Ｃ（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．９），２５％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ，０．４２Ｍ  ＮａＣｌ，１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ）にてピペッティングし、１５秒間ｖｏｒｔｅｘ  ｍｉｘｅｒで撹拌した後３０分間氷上にて静置した。最後に１５，０００回転にて１０分間遠心分離した上清を核分画として保存した（液体窒素にて急速冷凍し、−８０℃にて保存した）。なお、上記Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ，Ｂｕｆｆｅｒ  Ａ及びＢｕｆｆｅｒ  Ｃにはいずれも使用直前に、１ｍＭ  ＤＴＴ，１ｍＭ  ＰＭＳＦ，１μｇ／ｍｌ  ａｐｒｏｔｉｎｉｎ，１μｇ／ｍｌ  ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ，１μｇ／ｍｌ  ｐｅｐｓｔａｔｉｎ（いずれもＳｉｇｍａ社にて購入）を追加した。
上記の方法で抽出したタンパク質は、各サンプルごとに同じ数の細胞から抽出されたように補正した。すなわち、一サンプル当たり１ｘ１０６個から抽出したタンパク質を６％又は１１％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ＧＥＬにて電気泳動した後、ニトロセルロース膜にトランスファーし、５％  スキンミルク、０．２％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳに浸して１時間振とうした（ブロッキング）。この溶液に、マウスモノクローナル抗サイクリンＤ１抗体（Ａｂ−３；Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｓｃｉｅｎｃｅ社製）、マウスモノクローナル抗ＲＢ抗体（１４００１Ａ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）、ウサギポリクローナル抗サイクリンＡ抗体（ＳＣ−７５１；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、ウサギポリクローナル抗サイクリンＥ抗体（ＳＣ−４８１；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、及び／又はウサギポリクローナル抗ＣＤＫ４抗体（ＳＣ−２６０；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を加えてさらに１時間振とうし、５％  スキンミルク、０．２％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳにてこれらの抗体を洗浄した後、２次抗体としてヒツジ抗マウスＩｇ，ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｗｈｏｌｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ；ＮＡ９３１）又はヒツジ抗ウサギＩｇ，ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｗｈｏｌｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ；ＮＡ９３４）と反応させ、５％  スキンミルク、０．２％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳにて洗浄後、ＥＣＬキット（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔｓ；Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ；ＲＰＮ  ２１０９）を用いて免疫蛍光染色し、ウエスタンブロット解析を行った。
まず最初に増殖因子としての血清と、αアドレナリン作用性受容体アゴニストであるＰＥ（Ｐｈｅｎｙｌｅｐｈｒｉｎｅ）と、心肥大因子として働く活性型Ｒａｓタンパク質を発現する組換えアデノウイルスＡｄ−Ｒａｓ６１Ｌ（Ｄｕｋｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＣｅｎｔｅｒのＮｅｖｉｎｓ，Ｊ．Ｒ．博士から入手した。Ｌｅｏｎｅ，Ｇ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、３８７巻、４２２−４２６頁、１９９７年参照）を用いて心筋細胞を刺激した時のサイクリンＤ１の発現とＲＢのリン酸化の有無をウエスタンブロット解析により調べた。図１は、心筋細胞にＡｄ−Ｒａｓ６１Ｌ又は対照としてＲａｓ遺伝子を含まないアデノウイルスＡｄ−Ｃｏｎを感染させ、１８時間後に培養液を用％血清、１０−６ＭのＰＥ（Ｐｈｅｎｙｌｅｐｈｒｉｎｅ）を含む培地又は無血清培地に置換してさらに１８時間培養した後、細胞抽出物を電気泳動し、各抗体により染色した結果を示した。図１に示したように、これらの刺激によって心筋細胞でサイクリンＤ１とＣＤＫ４（データ示さず）の発現が誘導されることが分かる。サイクリンＤ１とＣＤＫ４の蓄積にもかかわらず、心筋細胞ではサイクリンＤ１に関連したキナーゼは活性化されず（データ示さず）、ＲＢタンパク質もリン酸化されなかった。これに対し、対照として用いたＲＥＦ５２細胞では、リン酸化により高分子量側にシフトしたバンド（ｐｐＲＢ）が検出されたことから、ＲＢが高度にリン酸化されていることが分かる。増殖している細胞においては、Ｄ型サイクリンの発現に伴ってＲＢタンパク質がリン酸化されるが、心筋細胞ではこれに反してＲＢはリン酸化されなかった。これらの結果は、増殖刺激に対する心筋細胞の反応はＲＢタンパク質のリン酸化が起らない点において増殖している細胞とは異なることが理解される。
サイクリンＤ１が細胞内に蓄積しているにもかかわらず、どうしてＲＢのリン酸化が起こらないのかを調べるために、Ｄ型サイクリン及びＣＤＫ４の細胞内における局在性を検討した。図２は、心筋細胞及びＲＥＦ５２細胞から抽出した細胞質分画と核分画をウエスタンブロット解析により調べた結果である。各種の増殖刺激を受けた心筋細胞において、Ｄ型サイクリン及びＣＤＫ４はいずれも核内には存在せず、細胞質でのみ発現していた。一方、増殖刺激を受けたＲＥＦ５２細胞においては、サイクリンＤ１、Ｄ３及びＣＤＫ４が核内に移行していた。ＲＢタンパク質は心筋細胞およびＲＥＦ５２共に核内に存在した。
図３は、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）又は組換えアデノウイルスＡｄ−ＲＡＳ６１Ｌで増殖刺激した心筋細胞を、マウス抗ｓａｒｃｏｍｅｒｉｃアクチンモノクローナル抗体を用いて免疫蛍光染色した顕微鏡写真である。いずれの場合もサイクリンＤ１が細胞質に蓄積していることが分かる。
更に、図４は、アデノウイルスＡｄ−Ｄ１とＡｄ−ＣＤＫ４によって野生型サイクリンＤ１とＣＤＫ４を過剰発現させてもサイクリンＤ１は核内に蓄積しないことを示す。従って、核移行シグナル（ＮＬＳ）の付加されたサイクリンＤ１遺伝子を含む組換えアデノウイルスＡｄ−Ｄ１ＮＬＳを構築した。図４及び図５に示したように、このＡｄ−Ｄ１ＮＬＳとＡｄ−ＣＤＫ４を共感染させると、心筋細胞の核内でサイクリンＤ１とＣＤＫ４が強く発現していることが分かった。なお、ヒトサイクリンＤ１を発現させるアデノウイルスＡｄ−Ｄ１は、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＦｏｕｎｄａｔｉｏｎのＡｌｂｒｅｃｈｔ，Ｊ．博士より入手した（Ａｌｂｒｅｃｈｔ，Ｊ．Ｈ．ら、Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  ＆  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ、１０巻、３９７−４０４頁、１９９９年参照）。
細胞周期をＧ１期からＳ期に移行させるためにはＤ型サイクリンとＣＤＫ４との複合体が核内に入りそこでＣＤＫ４がＣＤＫ活性化キナーゼ（ＣＡＫ）によるリン酸化を受けなければならない（Ｓｈｅｒｒ，Ｃ．Ｊ．ら、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖ．１９９９年参照）。従って、次に、このように核内で発現したサイクリンＤ１およびＣＤＫ４がＲＢをリン酸化して細胞周期を進行させるかどうかについて調べた。図６はＡｄ−Ｄ１ＮＬＳとＡｄ−ＣＤＫ４の共感染によって心筋細胞の核内でＲＢがリン酸化されていることを示す。図６において、ＣＤＫインヒビターであるｐ１６やｐ２１タンパク質を発現するアデノウイルスベクター（Ａｄ−ｐ１６及びＡｄ−ｐ２１）を上記Ａｄ−Ｄ１ＮＬＳ／Ａｄ−ＣＤＫ４と共感染させるとＲＢのリン酸化が阻害されることから、Ａｄ−Ｄ１ＮＬＳ／Ａｄ−ＣＤＫ４の感染によるＲＢのリン酸化は、サイクリン依存性キナーゼの活性に依存していることが確認される。また、図７はＲＢ／Ｅ２ＦのターゲットであるサイクリンＡやサイクリンＥが心筋細胞の核内で発現していることを示す。これらの結果は、核内におけるサイクリンＤ１／ＣＤＫ４の活性がＲＢをリン酸化し、細胞周期を進行させる可能性を示唆する。
［実施例４］細胞周期の解析
次に細胞周期の解析を行うため、実施例１で調製した組換えアデノウイルスを、実施例２で調製したラット心筋細胞に感染させ、種々の時間経過後に、直径２５ｍｍカバースリップガラス上で７０％エタノールにより固定し、ＤＮＡ含量を測定するためにヨウ化プロピジウム（ＰＩ；ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ）で染色した。即ち、エタノールで固定した細胞をフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）にて標識した抗ｓａｒｃｏｍｅｒｉｃ  ａｃｔｉｎ抗体（１：１０００）を加え、ＰＢＳにて洗った後、ＰＩ  ５０μｇ／ｍｌ，ＲＮａｓｅ  Ａ  ５００μｇ／ｍｌを加え、３７℃、１５分間、更に室温で１５分間静置した後、各細胞の細胞周期における位置をレーザースキャニングサイトメーター（ＬＳＣ、オリンパス社製）により検出した。心筋細胞は、上記抗ｓａｒｃｏｍｅｒｉｃ  ａｃｔｉｎ抗体による二重染色によって確認した。
図８は、ＬＳＣによる細胞周期の解析結果を示した。図８ａは種々のウイルス感染又は増殖因子によって刺激された心筋細胞を一定時間経過後の細胞の分布状態（ＤＮＡ含量と細胞数の関係）を示したものである。無血清培地でＡｄ−Ｄ１ＮＬＳ／Ａｄ−ＣＤＫ４を共感染させた心筋細胞（Ｄ１ＮＬＳ／ＣＤＫ４）は、時間経過と共にＳ期及びＧ２期に移行していることがＤＮＡ含量の変化から推測される。更に５％の牛血清を添加した細胞（５％ＣＳ＋Ｄ１ＮＬＳ／ＣＤＫ４）では、無血清の条件に比べてこの細胞周期の進行は加速される。これに対し、血清刺激（１０％ＦＣＳ）又は核移行シグナルのないサイクリンＤ１を含むＡｄ−Ｄ１／Ａｄ−ＣＤＫ４に感染した心筋細胞（Ｄ１／ＣＤＫ４）は、ほとんど細胞周期が進行していないことが分かる。５％牛血清のみ（５％ＣＳ）ではＧ１期にとどまったままである。これらの結果は、Ａｄ−Ｄ１ＮＬＳ／Ａｄ−ＣＤＫ４の共感染によって心筋細胞の細胞周期が進行していることを示している。
更に、細胞周期の進行を起こした細胞の割合を確認するため、細胞周期をＧ２期で停止させる抗生物質であるノコダゾール（シグマ社製）を添加してＬＳＣによる解析結果を図８ｂに示した。この結果から、ノコダゾール（５０ｎｇ／ｍｌ）を添加して培養したＡｄ−Ｄ１ＮＬＳ／Ａｄ−ＣＤＫ４の共感染心筋細胞（Ｄ１ＮＬＳ／ＣＤＫ４＋Ｎｏｃｏｄａｚｏｌｅ）はほとんどの細胞がＳ期及びＧ２／Ｍ期にあることが分かる。従って、Ａｄ−Ｄ１ＮＬＳ／Ａｄ−ＣＤＫ４によって共感染させた心筋細胞のほとんどが細胞周期の進行を起こしたことが示唆される。Ｇ２／Ｍ期に同調培養された心筋細胞からノコダゾールを除去するとこれらの細胞は再びＧ１期に入ることが分かる（ｐｏｓｔ  Ｎｏｃｏｄａｚｏｌｅ  ｗａｓｈ  ｏｕｔ）。これらの結果は、核内において発現したサイクリンＤ１／ＣＤＫ４がＳ期誘導だけでなく、細胞分裂も誘導し、心筋細胞の完全な細胞周期の進行を起こすことを示している。
図９は、共焦点レーザー顕微鏡（ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｌａｓｅｒ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）を備えたレーザースキャンサイトメーター（ＬＳＣ；オリンパス社製、日本）により、Ａｄ−Ｄ１ＮＬＳ／Ａｄ−ＣＤＫ４を共感染させ４８時間後の心筋細胞を撮影したものである。図９ａには、有糸分裂中の又は、有糸分裂直後の細胞が確認される。各細胞の細胞周期位置はＰＩ染色により計測したＤＮＡ含量（ＰＩの蛍光量）とＰＩ蛍光強度のピーク（最大値）で決定した。ＤＮＡ複製を起こした細胞は、そのＤＮＡ含量（ＰＩの蛍光量）が増加し、一方、分裂直前、直後の細胞はＤＮＡが凝集するためＰＩ蛍光強度が高くなる（明るくなる）ことを指標として、顕微鏡写真の中の個々の細胞（１〜２７の番号を付した）を、その細胞周期位置（Ｇ１〜Ｍ期）によってａ〜ｆに分類した（図９ｂ）。その結果、Ｇ１〜Ｍ期の各位置の細胞が混在し、細胞分裂中及び分裂した細胞が多数観察された。
図１０は、これらの細胞数をコールターカウンター（細胞数計測器）で計測した結果を相対的に示したものである。Ａｄ−Ｄ１ＮＬＳ／Ａｄ−ＣＤＫ４を共感染させ培養した心筋細胞の細胞数は、５日後には約３倍に増加していることが分かる。これに対し、対照としてベクターのみのアデノウイルスを感染させた心筋細胞はほとんど細胞数の増加は認められなかった。
［実施例５］生体内における心筋細胞の増殖可能性の検討
サイクリンＤ１とＣＤＫ４の核内への移行が、生体内における心筋細胞の増殖を起こすかどうかを確認するため、実施例１及び２で作製したＡｄ−Ｄ１ＮＬＳとＡｄ−ＣＤＫ４の２種類のアデノウイルスを、ウイスター系ラット（２５０〜３００ｇ）を開胸して目視にて心尖部（ａｐｉｃａｌ  ｒｅｇｉｏｎ）に注入した。対照としてｌａｃＺ遺伝子を含むアデノウイルスも同様に行った。注入後４日間経過後、４％パラホルムアルデヒドを灌流して心臓細胞を固定化し、心臓組織の切片をウサギ抗Ｋｉ−６７抗体及びマウス抗ｓａｒｃｏｍｅｒｉｃ  ａｃｔｉｎ抗体で標識した。標識された抗体は抗ウサギＡｌｅｘａ４８８抗体又は抗マウスＡｌｅｘａ５６８抗体（何れもＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）を用いてそれぞれ緑色及び赤色に染色視覚化した。視覚化された画像は、レーザースキャニング共焦点イメージシステム（ＺＥＩＳＳ社ＬＳＭ５１０）を用いて観察し、その結果を図１１に示した。図１１において、赤色はｓａｒｃｏｍｅｒｉｃ  ａｃｔｉｎを示し、緑色はＫｉ−６７を示す。
Ｋｉ−６７核タンパク質は細胞周期のすべてのサイクルにおいて増殖している細胞で発現することから（Ｓｃｈｏｌｚｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１８２巻、３１１−３２２頁、２０００年参照）、細胞周期が進行している細胞を検出するために用いた。Ａｄ−Ｄ１ＮＬＳとＡｄ−ＣＤＫ４の２種類のアデノウイルスを共感染させた心臓切片の画像（図１１ａ及びｂ）では、多くの心筋細胞及び非心筋細胞において、Ｋｉ−６７核タンパク質が発現していることが分かった。一方、ｌａｃＺ遺伝子を含むアデノウイルスを注射した心筋細胞ではＫｉ−６７核タンパク質の発現は認められなかった（図１１ｃ）。これらの結果より、生体内においても、サイクリンＤ１とＣＤＫ４の核内への移行が心筋細胞の細胞周期を進行させることが示唆された。
以上の結果より、サイクリンＤ１／ＣＤＫ４活性を核内で発現させた心筋細胞は明らかに増殖能を獲得したことが理解される。
産業上の利用可能性
本発明の方法によれば、終末分化した細胞の細胞分裂を誘導し、細胞を増殖させて移植用の細胞や組織をつくることができる。特に心筋細胞、神経細胞、腎臓細胞及び膵臓細胞等の終末分化した細胞自身を増殖させることによって、ＥＳ細胞等の未分化細胞を分化誘導させる場合と比べてより安全かつ確実な再生医療への利用が期待される。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、種々の増殖刺激による心筋細胞のサイクリンＤ１の発現とＲＢのリン酸化をウエスタンブロット解析した図である。略称は次の通りである。ｐｐＲＢ：リン酸化されたＲＢ蛋白質、ｐＲＢ：ＲＢ蛋白質、
図２は、種々の増殖刺激による心筋細胞のＤ型サイクリンとＣＤＫ４の発現を細胞質と核のそれぞれの抽出物に分けてウエスタンブロット解析した図である。略称は次の通りである。ＲＢ：ＲＢ蛋白質、
図３は、種々の増殖刺激によって誘導された心筋細胞におけるサイクリンＤ１の細胞内の局在性をマウス抗ｓａｒｃｏｍｅｒｉｃアクチンモノクローナル抗体を用いて免疫蛍光染色した顕微鏡写真である。
図４は、サイクリンＤ１への核移行シグナルの付加によって、心筋細胞の核内へのサイクリンＤ１の移行をウエスタンブロット解析した図である。
図５は、種々の組換えアデノウイルスにより発現させたサイクリンＤ１及びＣＤＫ４の心筋細胞内での局在性をウエスタンブロット解析した図である。
図６は、種々の組換えアデノウイルスを感染させた心筋細胞内のＲＢのリン酸化をウエスタンブロット解析した図である。略称は次の通りである。ｐｐＲＢ：リン酸化されたＲＢ蛋白質、ｐＲＢ：ＲＢ蛋白質、
図７は、組換えアデノウイルスを感染させた心筋細胞核内でのサイクリンＡ及びサイクリンＥの発現をウエスタンブロット解析した図である。
図８は、レーザースキャンサイトメーター（ＬＳＣ）により種々の増殖刺激を受けた心筋細胞の細胞周期を解析した結果を経時的に示した図である。
図９は、細胞分裂中の心筋細胞を共焦点レーザー顕微鏡（ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｌａｓｅｒ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）を備えたＬＳＣにより解析した結果を示した写真及び図である。
図１０は、ウイルス感染後の心筋細胞の細胞数を経時的に計測した結果を示した図である。
図１１は、Ｄ１ＮＬＳ／ＣＤＫ４（ａ及びｂ）又はｌａｃＺ遺伝子（ｃ）を含む組換えアデノウイルスを生体内においてラット心臓に感染させ、その心臓組織切片を免疫蛍光染色して発現タンパク質を視覚化した図である。図中、赤色はｓａｒｃｏｍｅｒｉｃ  ａｃｔｉｎを、緑色はＫｉ−６７タンパク質を、バーの長さは２０μｍを表す。
なお、上記各図面において用いられる符合は以下の内容を意味する。
＋：各種の増殖因子を添加し、又は各種の組換えアデノウイルスを感染させたことを示す。
−：各種の増殖因子を添加せず、又は各種の組換えアデノウイルスを感染させなかったことを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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