(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
多成分試料を、試料の成分に対して親和力を有する固定相物質を含むクロマトグラフィーベッドの一端に適用し、試料の成分を、前記ベッドの上を非溶出移動溶媒相を通過させることによりクロマトグラフィーベッドに沿って分配させ、クロマトグラフィーベッドの少なくとも一部から試料の所望成分を回収する試料置換クロマトグラフィー分離法であって、固定相物質に対して相対的に低い親和力を有する少なくとも一つの成分の濃度が、試料適用の早い段階で高くなるように、および／または固定相物質に対して相対的に高い親和力を有する少なくとも一つの成分の濃度が、試料適用の遅い段階で高くなるように、試料成分を、非均質的な方法でクロマトグラフィーベッドに適用し、
前記試料置換クロマトグラフィー分離が、逆相クロマトグラフィーを含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記非均質的な方法での適用が、固体試料を前記クロマトグラフィーベッド上に載せ、前記固体試料の成分を異なる割合で溶解する担体溶媒を用いて溶出させることにより実現される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記多成分試料が、前のクロマトグラフ分離から誘導されている請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記前のクロマトグラフ分離が、可分試料置換クロマトグラフィーカラムの使用を含む請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記可分試料置換クロマトグラフィーカラムが、逆相クロマトグラフィーカラム、イオン交換カラム、または疎水相互作用カラムである請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記前のクロマトグラフ分離が、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、または逆相クロマトグラフィーを含む請求項３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、クロマトグラフ分離に関し、さらに詳しくは、試料置換クロマトグラフィーの新しくかつ改良された方法およびその応用、ならびにこの方法に有用な機器に関する。
【０００２】
過去１０〜１５年の間、置換クロマトグラフィーは、溶出技術を用いる液体クロマトグラフィーの代替として提案されている。溶出クロマトグラフィーでは、試料の成分は、固定相物質を含むクロマトグラフィーベッドに沿って、たとえばカラムの中で、移動溶媒相によって運ばれていく。各種成分は、異なるレベルで固定相物質と互いに作用し合うため、バンドに分離されている。置換クロマトグラフィーは、逆に、試料成分よりも固定相物質に対する親和力の高いディスプレイサー溶液を移動相として利用している。カラムクロマトグラフィーの場合、試料成分は、これにより位置を移し、ディスプレイサー正面よりも先にカラムの下に押されることになり、競って吸着位置を求め、進むうちに、個別の成分バンドに分けられていく。
【０００３】
溶出クロマトグラフィーでは、通常、試料物質を実質的に希釈する結果となるのに対して、置換クロマトグラフィーでは、著しく高い濃度での試料成分の回収が可能であり、一般に、固定相物質をより効率的に利用している。しかし、置換クロマトグラフィーでは、最適結果を達成するために、ディスプレイサー溶液の組成、濃度および流量などの作動条件を、個々の試料タイプに具体的に合わせなければならないという問題は確かにある。
【０００４】
試料置換クロマトグラフィーは、ホッジズ（Hodges）等（J. Chromatogr. 444 (1988), pp. 349-362）が最初に提案した逆相ＨＰＬＣによるペプチドの分取精製用の自己置換技術であり、しかも余分なディスプレイサー溶液を必要としていない。ペチブド成分は、カラムインプットに適用され、適切な溶媒によってカラムまたは連結したカラムの中を運ばれていくうちに、固定相上で結合部位を求めて競い合う。結合力のより強い成分は、最初に結合し、さらに（複数の）カラムに沿って、結合力のより弱い成分に置き換わる。成分はよって、その異なる度合いの疎水性／親水性に応じて、したがって固定相物質に対するその親和力に応じて分離される。代表的な例では、所望の試料成分よりも疎水性の高い不純物を閉じ込めるために短いプレ・カラムを使用しているが、試料成分がメイン・カラム内に保持されて飽和させるのに対して、より親水性の高い不純物はさらに置換され、そうしてメイン・カラムの外へと洗い出される。プレ・カラムの大きさが、ある特定の試料内に存在する疎水不純物の量に合うように調整してもよいのに対して、メイン・カラムの大きさは、最大限の生成物の保持率および親水不純物の流出を確保するように調整してもよい、と提案されている。
【０００５】
奇妙なことに、ホッジズ等は、メイン・カラムから所望の生成物を回収するために、続いて勾配溶出を使用しているため、相対的に高い濃度の生成溶液を産出するという置換クロマトグラフィーの有利な潜在性は失われてしまう。これは、初期の成分分離が不完全であったことを示唆することになろう。
【０００６】
ヴェーララガヴァン（Veeraragavan）等（J. Chromatogr. 541 (1991), pp. 207-220）は、ホッジズの技術を、高性能陰イオン交換クロマトグラフィーカラムを用いたタンパク質の精製に応用した報告をしている。使用された機器は、低圧高速タンパク質液体クロマトグラフシステムであり、ここでも勾配溶出が使用された。これはおそらく、一次分離手順でのピーク重なりが問題であったという観測を考慮して、必要であると感じられたのであろう。１および２カラムシステムが具体的に記載されていて、前者は、所望の生成物が最も強い、または最も弱い結合成分のいずれかであるといういわゆる稀な場合に適用可能である。「理論上、タンパク質試料のどの成分でも、適切な寸法のカラムに固定することが可能な」マルチカラムシステムを用いる可能性が記載されている。
【０００７】
試料置換クロマトグラフィーのためのマルチカラムＨＰＬＣシステムについては、実際にホッジズにより、カナダ特許明細書２０５９１１４（CA-A-2059114）のインターアリア（inter alia）に記載されている。一つの代表的な実例では、ペプチド試料の精製のために、１０個の逆相ＨＰＬＣカラムまたは連結したカラムセグメントの使用が示されている。試料物質が投入されて一連のカラムの上で分配／分離された後、勾配溶出によらずとも、個々のカラムまたはセグメントを別々に溶出してもよく、所望の生成成分は、少なくとも一つのこのようなカラムまたはセグメントから実質的に純粋な形で回収される。このプロセスの利点として言われているのは、（i）これは、比較可能な勾配溶出分離よりも１０倍多い投入が可能である、（ii）これは、高価なＨＰＬＣ溶媒の最小限の使用を伴う、（iii）これは、分画分析の最小限の使用を必要とする、（iv）これは、実際の分離中にディスプレイサー溶液を使う必要を回避する、および（v）溶媒、カラム包装および機械の使用にかかる操業費は、典型的な勾配溶出よりもずっと低い、ことである
。
【０００８】
ホッジズのマルチカラム手順は、広く採用されているようには思われず、実施に際し、近縁の不純物からの生成物の不十分な分解の結果として、生成物の純度が不十分になることが分かった。さらに、ＨＰＬＣ手順を、一般的に８０〜２００バールの高圧で作動する必要があるため、必要な機器は、必然的に複雑かつ高価となる。
【０００９】
ＷＯ９８／４６６２３には、 参照によりその内容をこの中に組み込んでいるが、一般的に低い操業圧力を用いて、非勾配的な方法で所望の生成物を回収する試料置換クロマトグラフィー手順が記載されている。このような低い操業圧力の使用により、機器の必要条件は簡単になり、ＨＰＬＣシステムで必要とされているよりも、より単純かつ安価なポンプ、タップ、コネクターなどの使用が可能になる。間接的な低移動相流量もまた、試料成分の良好な分離を生じさせる。分離手順は、勾配溶出の使用を回避することで、溶媒の必要条件も減らし、有利な高い濃度での所望生成物の回収を促すかもしれない。
【００１０】
現存の試料置換クロマトグラフィー分離では、試料成分は均質な試料溶液の形で導入されるため、個々の成分は、試料の適用段階を通じて、一定の濃度でそれぞれ運ばれていく。分離の推進力は、弱い結合剤が、固定相物質上の限られた数の結合部位から、生成物のより強力に結合するバルクに置き換えられることである。これは、生成物および他のより強い結合剤の速度が、クロマトグラフィーベッドのより早い部分で完全に遅くなるまで連続的に進み、したがってより弱く結合する不純物が、さらにクロマトグラフィーベッドに沿って固定相物質と結合し続けるのを可能にする。一旦全ての試料分子が固定相と結合したら、これらの分子のさらなる動きは観測されない。
【００１１】
このような均質な試料溶液のせいで起こるかもしれない問題は、しかしながら、試料適用の早い部分で導入された強く結合する成分の分子が、試料適用のさらに後の段階で導入されたより弱い結合剤によって、不用意にも置き換えられてしまうかもしれないことである。試料分子は、担体の流れに逆らって移動することはできないので、このように置き換えられた強い結合剤は、クロマトグラフィーベッドの所望生成部分の中で、最終的に不純物になってしまうかもしれない。さらに、適用の後の段階でクロマトグラフィーベッドに入ってくる弱い結合成分は、ベッドの早い位置で部位を求めて競合するかもしれないが、試料全体の小さな割合しか残っていないため、ベッド上でのこのような早い位置からの置換の見込みは、少なくなる。したがって、この不純物は、分離後、予想外に早い位置に残ってしまうかもしれず、そうすることで所望の生成物を汚染するかもしれない。複数の成分が所望生成物に非常に類似している難しい分離では、この影響は重大であろう。
【００１２】
本発明は、この今まで認識されなかった問題に起因する試料置換クロマトグラフィー分離での分離度の損失を、もしも試料成分がクロマトグラフィーベッドに対して非均質な形で適用されるなら、大幅に減少されるかもしれないという発見に基づいている。このように、より弱い結合の不純物のさらに高い濃度を試料適用の早い部分で導入すると、より強い結合の不純物の早い導入を減らせるかもしれず、よってこのような不純物に伴う不必要な競合を実質的に減らし、その結果として生成物の分離度が向上するかもしれない。
【００１３】
したがって、本発明の一つの側面によれば、多成分試料を、試料の成分に対して親和力を有する固定相物質を含むクロマトグラフィーベッドの一端に適用し、試料の成分を、ベッドの上を非溶出移動溶媒相を通過させることによりクロマトグラフィーベッドに沿って分配させ、クロマトグラフィーベッドの少なくとも一部から試料の所望成分を回収する試料置換クロマトグラフィー分離法であって、固定相物質に対して相対的に低い親和力を有する少なくとも一つの成分の濃度が、試料適用の早い段階で高くなるように、および／または固定相物質に対して相対的に高い親和力を有する少なくとも一つの成分の濃度が、試料適用の遅い段階で高くなるように、試料成分を、非均質的な方法でクロマトグラフィーベッドに入れることを特徴とする方法を提供する。
【００１４】
望ましい試料成分の非均質的な適用は、たとえば以下に記載するように、様々な方法で実現されるであろうし、本明細書の開示内容を知っている当該技術を有する者が、他の方法を考案するかもしれない。多くの場合、非均質性は、試料置換もしくは溶出クロマトグラフィーのいずれかを用いて、一次クロマトグラフ分離を用いて実現される。強調しておくべきなのは、マルチクロマトグラフ分離が当該技術でよく知られているのに対して、現存の手順は、前の分離により部分的に精製された分画の連続的な精製を伴うことである。これは、本発明の手順とは全く異なり、本発明では、多成分試料の全体またはその成分の相当数のいずれかを、試料組成内での適切な不均質性を誘発するあるプロセス形態と結合させて、試料置換クロマトグラフィーの対象としている。
【００１５】
溶出モードまたは試料置換クロマトグラフィーを伴う現存のクロマトグラフ精製では、後の方の段階で取り除くのが困難な汚染不純物が存在しているために、半純粋生成物を含んでいる分画を破棄するのが常である。本発明のプロセスでは、逆に、一回目の分離工程からの生成物を含んでいるこのような分画を、次の試料置換クロマトグラフィーに利用できるかもしれない。なぜなら、不純物は、分画の一部にしか存在していないからである。したがって、早く適用した分画内に存在するなら置換し、遅く適用した分画内に存在するなら保持するのが、より効率的であろう。半純粋生成物分画のこのような利用が、全体の歩留まりを上げると共に、置換効果を強化するので望ましい。
【００１６】
本発明にかかる分離プロセスでの所望の不均質性は、たとえば、固体試料と、試料成分を異なる割合で溶解し、それによりクロマトグラフィーベッドに濃度勾配を与える担体溶媒とを用いて実現されてもよい。順相および逆相の両方のクロマトグラフィーで用いられる担体溶媒内の試料成分の溶解性は、固定相物質に対する成分の結合親和力が増すのにつれて、減少する傾向にあるため、本発明により、結果の溶解性に誘発された濃度勾配は、試料置換分離の効率を上げることになる。
【００１７】
代わりに、前の分離の結果として試料成分がもうすでに固定相と結合している場合、主成分が相対的に遅く抽出されるように、したがって試料置換クロマトグラフィーベッドに相対的に遅く適用されるように、抽出条件を選択すればよい。このように、より早く抽出された成分は、より後で適用された主成分により、さらに効率的に置換される。
【００１８】
さらなる実施例においては、可分試料置換クロマトグラフィーカラムシステムを用いて、試料を少なくとも部分的に分離してもよく、たとえば前記のWO９８／４６６２３に記載されているように、多数の連続した分画が、固定相物質の連続部分から抽出により集められることになる。ここで使用してもよい代表的なシステムに含まれるのは、水性アセトニトリルもしくは酢酸などの有機溶媒システムにより抽出を行う逆相クロマトグラフィー、塩溶液により抽出を行うイオン交換クロマトグラフィー、または塩濃度の減少により抽出を行う疎水相互作用クロマトグラフィーである。必要に応じて抽出物質の除去をした後、たとえば有機溶媒もしくは炭酸アンモニウムの除去、または脱塩工程の実施により、分画は、それから結合親和力の増した同様または類似のクロマトグラフィーシステムに順番に適用される。すなわち、溶出した分画および初期に使用したクロマトグラフィーベッドの出口端からの分画を最初に適用し、初期に使用したクロマトグラフィーベッドの入口端からの分画を後で適用するのである。このようにより強いディスプレイサーを遅らせて導入することは、二回目の分離の効率を顕著に上げる。
【００１９】
さらに別の実施例を、テーリング効果のせいでほんのわずかだけ弱い結合不純物を所望の生成物から取り除くのがしばしば困難であるという問題に対処するために用いてもよい。これは、このような不純物が、試料の相対的に大きな割合を占めているときには特にそうであり、この不純物の相当量が、分離プロセスの遅い段階でクロマトグラフィーベッドに適用されることにより起こる。このように分離を連続して実施する場合、所望の不均質性は、現在の試料のクロマトグラフィーベッドへの適用後、前の分離または複数の分離からの一つ以上の分画を適用することで実現されるであろう。もしも、次に適用した分画または複数の分画が、所望の生成物の中で相対的に濃縮されているなら、これはテーリング不純物に付加的な分離力を与えることになり、その結果、所望の生成物の純度が上がる。次に加えられる分画そのものがさらなる精製を必要としている場合、これは、上記のテーリング不純物の置換と同時に起こることになり、これにより生成物の生産量を効果的に上げることになり望ましい。
【００２０】
さらに別の実施例においては、所望の不均質性を、溶出モード分離によって生じさせてもよい。したがって、たとえば、最初の部分分離をもたらすために、ゲルパーミエーションクロマトグラフィーを用いてもよい。溶出液を、それから適切に、直接または逆の順番で試料置換クロマトグラフィーベッドに適用してもよい。代わりに、試料置換イオン交換クロマトグラフィーに引き続き、定組成溶離を用いた不完全に分解する逆相クロマトグラフィー分離を行ってもよい。最初の分離で使用された有機溶媒の比率を、所望の生成物が相対的に早くかつ濃縮した分画内で主に溶出され、しかもある程度不純物から分離されるように、有利に選択してもよく、たとえば、逆相クロマトグラフィーベッド上でさらに多くの疎水不純物が保持されることになる。希望により、初期分離を、ある種の不要な試料成分を取り除くためにも使用してもよい。したがって、たとえば、逆相クロマトグラフィーに引き続き、塩不純物または部分的に保護された合成生成物を分離および破棄してもよいし、後者の場合、保護グループが、生成物の疎水性に寄与するからである。所望の生成物を含んでいる分画を、たとえばイオン交換固定相物質を用いて、その後、試料置換クロマトグラフィーの対象にしてもよい。
【００２１】
本発明にかかる分離手順を用いてもよい代表的な分野には、以下が含まれる。
【００２２】
現代ドラッグデザインでは多くの場合、莫大な数の化合物が合成されているが、適切な精製または特性解析のための時間や資源のないことが多い。試料置換クロマトグラフィーに基づく確実かつ望ましくは自動化された精製システムは、いくつかの未精製生成物を個別および同時に処理するのに用いてもよく、しばしば他の隔離工程を回避する利点がある。
【００２３】
もしも、固体相合成物から誘導された未精製ペプチドが、陽イオン交換または逆相クロマトグラフィーによって精製されるなら、高い純度が得られることになる。一貫して高い純度の生成物を確保するために、本発明のプロセスにより、二つの工程を組み合わせてもよい。生成物内の不良シーケンスの内容は、遊離アミノ官能基をN端子に有する目標のペプチドの混合物を適用することで減らせるかもしれないし、試料置換クロマトグラフィーを目的としたシステムにおいては、ペプチド合成物での通常の手順であるが、アセチル化によりエンドキャップされたより短い不良シーケンスとなる。正しいシーケンスは、水性酢酸を担体に用いて陽イオン交換クロマトグラフィーベッドに適用されたとき、ｐＨ２〜３で余分な陽電荷を含むことになる。ベッドの容量は、試料の最適ローディングを決定することになるため、生成物のほとんどはベッドに結合されたままであり、低めの荷電不純物は、ベッドから置換される。
【００２４】
この最初のイオン交換クロマトグラフィー精製に続き、逆相クロマトグラフィー精製を行ってもよい。担体への塩の添加は電荷を増やすため、イオン交換クロマトグラフィーベッドからペプチドを抽出することになる。したがって、残留不純物は、相対的に遅くベッドに入ることになる所望の生成物よりも前に、逆相クロマトグラフィーベッド上へと運ばれていくことになり、そうして、試料が均質的に適用されたときよりもさらに効率的に、通常は疎水性の少ない不純物に置換されることになる。
【００２５】
このような分離からの生成物は、逆相クロマトグラフィーベッドからの抽出により集めてもよいし、その後、ＨＰＬＣまたは細管電気泳動などの高生産、高分解分析システムを用いて、十分に純粋な生成分画の組み合わせを可能にするために、純度検査を行ってもよい。
【００２６】
現存の分離／精製手順は、不十分な選択度によってしばしば制限され、面倒な溶出モード分析を使用しなければならない結果となる。代表的な例は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィーにおいて見掛けの大きさにわずかな差があるとき、または定組成溶離によるイオン交換および逆相クロマトグラフィーシステムのそれぞれにおいて、電荷もしくは疎水性のわずかな差があるときである。試料置換クロマトグラフィーは、与えられた試料内での所望生成物の濃度、よって置換作用が低い場合にもまた非効率である。
【００２７】
この最後の場合の例を挙げているのは、ヴェーララガヴァン（前掲書）であり、彼は、試料置換陰イオン交換クロマトグラフィーによって大豆トリプシン抑制物の精製を試みた。発表された結果から、効率的な試料置換クロマトグラフィー分離のためには、成分の選択度が不十分であったのが明らかであり、そのため分離の主力として溶出モード勾配分離を用いた。それでも、生成物の化学純度は特に高くはなく、効率的な精製のためには、回収は不十分であった。
【００２８】
ヴェーララガヴァンのゲル電気泳動法の結果から分かるのは、最も強力に結合する、すなわち遅く溶出する成分（生成物ピーク６および不純物ピーク８）が、最も低い分子量、よって最も小さい大きさを有するように思われたことである。分離全体の向上を図るため、したがって、初期ゲルパーミエーションクロマトグラフィー分離を行い、溶出液を直接陰イオン交換クロマトグラフィーベッド上に供給してもよい。二回目の分離工程で、「選別された大きさの」強力な結合成分を結果として遅く適用することは、この試料置換クロマトグラフィー工程の効率を大幅に上げることになる。
【００２９】
ゲルパーミエーションクロマトグラフィーを、次の試料置換工程と結合させて、広い範囲の合成オリゴマーまたはポリマーの精製に利用してもよく、この場合、モノマー残留物の不足または過多により、主不純物は所望の生成物とは大きさで異なることになり、しかも、たとえば疎水性／親水性の違い、全体の電荷、電荷密度等の結果として、部位特定の固定相物質に対する結合親和力においても異なることになる。ゲルパーミエーションクロマトグラフィーからの溶出成分の適用の順序は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー分離からの遅く溶出する（すなわち、より小さい）成分分画が、試料置換クロマトグラフィー分離において、早く溶出する（すなわち、より大きい）成分分画よりも、より低い固定相物質への結合親和力を示す場合には、逆にするのが望ましい。
【００３０】
上記の原則は、未精製のオリゴヌクレオチドの精製に用いてもよく、この場合、全長シーケンスは、短いシーケンスよりも高い電荷を有し、それによって陰イオン交換クロマトグラフィーでさらに強力に結合するが、試料置換クロマトグラフィーだけでは、所望の生成物と、たとえば「ｎ−１」不純物の不良シーケンスとの間で、不十分な分解しか起こらないかもしれない。同様に、逆相試料置換クロマトグラフィーによる未精製ペプチド試料の精製では、初期ゲルパーミエーションクロマトグラフィーおよびそれによる溶出液の流れ逆転の結果、より小さくて疎水性の低い欠失シーケンスが、所望の生成物よりもいくらか前に逆相クロマトグラフィーシステムに入ってくることになるかもしれない。このような不純物は、したがって、次に適用する分画内での生成物の割合を上げることにより、試料置換クロマトグラフィーの間、さらに効率的に置換されることになる。このような手順において、ゲルパーミエーションクロマトグラフィーの工程で用いられる溶媒を、それが次の試料置換クロマトグラフィー分離で担体に機能するように選択するのが望ましい。
【００３１】
合成オリゴヌクレオチドの精製のための代用の手順では、所望の不均質性を誘発するために、逆相クロマトグラフィーが用いられる。逆相クロマトグラフィーベッド上の試料成分の保持時間は、有機溶媒またはトリエチルアミン緩衝液などのイオンペアリング剤の添加により調整してもよい。一旦所望の生成物が塩基性のｐＨで溶出を始めたら、溶出液の流れを、適切な担体を用いて均衡化した陰イオン交換クロマトグラフィーベッド上へと直接適用してもよい。この試料置換分離に続き、この生成物を、塩溶液の添加により抽出し、それから脱塩カラムを通過させてもよい。脱塩工程は、一般にゲル濾過を基礎に置き、所望生成物の単純な水溶液を提供するために、前の分離から低分子量塩と担体溶液の両方を取り除くような構成にしてもよい。
【００３２】
本発明の方法を用いて、ホモポリマーの精製を実施してもよい。代表的なホモポリマーには、メトキシポリエチレングリコール（メトキシＰＥＧ）化合物が含まれ、この粒度分布は、逆相クロマトグラフィー試料置換分離と組み合わせたゲルパーミエーションクロマトグラフィーにより修正してもよい。大きさによる分離に基づくこのような手順の次の大きさ／疎水性選択は、生成物の分子量範囲を狭くする。同時に、次の適用でタンパク質の変形などの交差反応を起すかもしれない二官能不純物もまた、取り除いてもよい。
【００３３】
代わりに、連続的な逆相クロマトグラフィー試料置換分離によって、ＰＥＧ化合物を精製してもよい。単一の逆相クロマトグラフィー試料置換工程は、ある程度まで化合物を分離するが、高純度の単一オリゴマーを得るためには、選択度が不十分かもしれない。しかし、本発明の手順を用いれば、試料は事実上、単分散分画に分離されるかもしれない。したがって、最初の分離後、粒度分布の狭くなった元の試料の分画を、クロマトグラフィーベッドの様々な部分から集めてもよい。一旦移行の順に再適用されたら（最小分子を含む分画を最初に）、不要な競争のリスクが少なくて、置換効果はさらに顕著となる。反復プロセスでのそれぞれの連続した分離において、より高い生成物の純度がこれにより得られる。試料全体を再適用してもよいし、または、たとえば不要な物質もしくは不純物を多く含んでいる分画の部分を取り除いてもよい。効率を上げるために、たとえば前に述べたように、他の分別からの物質も添加してもよい。
【００３４】
これらの方法は、高純度ポリマーの経済的な調合を可能にするために、工業規模のプロセスで応用されてもよい。試料と溶媒の両方が、各分離周期の後で回収されて、これにより操業費の削減を図るのが望ましい。
【００３５】
小規模ゲルパーミエーションクロマトグラフィーの適用では、第二分離工程前のいかなる必要な流れ逆転は、適切な管類とスイッチングバルブからなる集合ループを用いて簡単に実現されてもよい。ループ内に溶出液を収集した後、バルブを切り換え、集められた試料は、逆の順番で第二のクロマトグラフィーベッド上へと向けられる。再処理される実際の量は、あらかじめ最適化されていてもよいし、または最初のクロマトグラフィーベッドの後で検出系を用いて決定してもよい。もしも、さらに大きな容量の処理が行われるのであれば、適切な集合装置は、収集と逆の順番に再適用を実施できるように、バルブに接続された分画集合フラスコを含む。
【００３６】
大規模プロセスは、一個や二個の長いカラムを用いるよりも、複数の相対的に短いカラムを用いて有利に実施してもよい。したがって、たとえば、表面積１×２ｍ、ベッドの高さ５〜１５ｃｍの長方形カラムを連ねて使うと便利であろう。いくつかのこのようなカラム、たとえばベッドの高さ１０ｃｍのカラム１０個を互いに上に重ね、バルブと接続してもよく、そうすれば、試料適用中連続して、または生成物の抽出中に個々に動作可能になる。
【００３７】
このように大きな断面積を有するカラム内での均一な溶媒分散を確保するため、カラムの上部の一方に入口を、カラムの底部の裏面に出口を配置するのが望ましく、入口と出口はそれぞれ、クロマトグラフィーベッドの表面の上で試料溶液の均一な分散を促進させる溝の配列と接続している。全ての試料成分はそれから、固定相物質の表面の上をどこでも等しい割合で運ばれることになり、さらに最短垂直ルートによってベッドを通過することになる。このように大きなクロマトグラフィーベッドは上部から充填してもよく、対向するカラム壁の間に置かれ、かつカラムベッドの高さと同じ高さのスペーサーバーを合体させるのが望ましい。これらのバーは、カラム内で固定相物質が横へ動くのを防ぐと同時に、上部と底部のフリットを安定させる。代わりに、より小規模の分離には、および／またはクロマトグラフィーベッドの安定性があまり問題にならない場合には、たとえば米国特許明細書５６６７６７６に記載されているように、側面充填出入口を備えたクロマトグラフィーカラムを用いてもよい。
【００３８】
次の工程とのインタフェイシングを促進するために、様々な装置を作ってもよい。したがって、たとえば、シリンダーに穴をあけた数個のカラムからなるクロマトグラフィーカラム装置を、適当な溝を有する上下密封プレートの回転により、試料溶液が入口から第一カラムの上部へ、そのカラムの底部から細い孔径の管類を通って次のカラムの上部へと通過するように、また同様に全てのカラムを通過するように、連続または平行のいずれかで作動してもよい。試料抽出およびカラム再均衡化の間、プレートを、共通の入口と個々の出口をそれぞれのカラムと一列に並べるために回転する。
【００３９】
このようなカラム配置から得られた生成物は、それらのさらなる処理を促進する装置の中に集めてもよい。このような装置は、分画収集の間、それぞれのカラムに対して一つの位置で、カラムの下に置いてもよい。分画が抽出および分析された後、これらは、たとえば適切な順番で新しいカラムに直接適用することにより、さらに処理してもよい。代わりに、分画を、たとえば、スピーディ−ヴァック濃縮器の上で濃縮したり、不要な溶媒を取り除くために凍結乾燥してもよい。
【００４０】
物質の取り扱いを簡単にするため、集合装置には、各試料分画の順次回収を可能にするため、各区画の底部に孔が設けられていてもよい。孔は、前の処理中に分画が漏出するのを防止するプレートによって、閉じられていてもよい。このプレートを回転可能にして、一区画ごとに底部の出口に接続されるように、たとえば適切な接続管類にぴったりとはめ込むようにしてもよい。装置の上部に圧力を加えると、試料の流れが、接続された区画から、たとえば先のクロマトグラフィーベッドの方へと生じるのを助けることになる。このようなシステムは、簡単なバルブ切換を用いて自動化してもよいし、またセンサーを組み込んで、エアー・リキッドインターフェイスの検出を行い、このようなインターフェイスが一旦検出されたとき、プレートの向きを次の区画へと一段変えてもよい。
【００４１】
カラム装置は、９６ウェルのマイクロタイタープレートフォーマットを基礎に置いてもよく、このフォーマットで多数の分画を得ることが可能であり、本発明のプロセスの応用で有利である。もしもシステムが自動化されれば、生成物の分画を、ロボットシステムにより適切な順番で自動的に再注入してもよい。この装置は、WO９８／４６６２３に記載されているように、またはカラムの本体が異なった定位置間で運搬されてもいいような形に作られていてもよく、その定位置で、本体の上部と底部に異なるプレートを接触させることで均衡化、分離あるいは抽出を行ってもよい。
【００４２】
上記のカラムおよび集合装置は、WO９８／４６６２３および米国特許明細書５６６７６７６に記載されているものを除き、本発明のさらなる特徴を構成している。
【００４３】
一般に、本発明にかかる分離手順の試料置換クロマトグラフィー工程において、様々な固定相物質を用いてもよい。物質が試料の成分に対して親和力を有するという必要条件は、物質が、試料の成分と可逆性の相互作用が可能な特定の部位を有する必要があると解釈するべきである。ゲル濾過媒体は、試料が実際の部位よりもむしろ網状組織と相互に作用するし、よって不適切であるが、利用してもよいシステムには、順および逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィーおよび親和性クロマトグラフィーが含まれる。
【００４４】
本発明にかかる分離プロセスで用いられる固定相物質は、どのような便利な形でもよく、たとえば皮膜、ゲルまたはミクロスフェア、特に単分散ミクロスフェアとして、たとえば前述したように、通常一つ以上のカラムに充填されることになる。
【００４５】
本発明による試料置換分離プロセスで用いられる移動溶媒相が非溶離性であるという必要条件は、溶媒が、遅れの少ない試料成分を次に利用可能な結合部位へと運ぶことはできるが、溶解している試料成分と固定相物質との間の相互作用に割り込む能力がほとんどない、または全くないことを示していると解釈するべきである。広い範囲の溶媒系を、この必要条件の対象に用いてもよい。たとえば、逆相およびイオン交換クロマトグラフィーで有用な水性系には、水、緩衝液、苛性ソーダ、重炭酸アンモニウムもしくは水酸化アンモニウムなど基剤の溶液、および酢酸もしくはトリフルオロ酢酸などの溶液が含まれる。
【００４６】
本発明にかかる試料置換分離工程を、たとえばWO９８／４６６２３に記載されているように、低圧力で作動すると便利であろう。したがって、移動溶媒相は
、３０バールを越えない圧力、つまり１５バール未満、好ましくは１０バール未満で適用すると有利である。商業用の分離には、約３バールの動作圧を使用するの有利であろう。わずか０．５バールの過圧で、良好に分離することが分かっている。クロマトグラフィーベッドの性質によっては、さらに低い過圧または全く過圧を用いないのが適切であろう。したがって、たとえば、ベッドが相対的に粗い物質、たとえば粗いポリマーゲルで構成されている場合、移動溶媒相は、重力および／またはベッド物質との相互作用の結果として、移動可能であろう。このような実施例では、移動溶媒相の流れを動かすというよりはむしろ制御のために、０．１バール等の非常に低い過圧を加えるのが適切であろう。
【００４７】
移動溶媒相を動かす圧力源は、窒素等の加圧ガスが有利であり、機械ポンプの必要性を回避して、その結果、プロセスの操業費を削減することになるだろう。
【００４８】
試料置換分離に続く所望生成物の回収は、どのような適切な方法で行ってもよく、たとえば、水性溶媒系もしくは非水系溶媒系への抽出により（たとえば、有機溶媒または超臨界二酸化炭素）、固定相物質に対して試料よりも高い親和力を有するディスプレイサー溶液の使用により（たとえば、逆相クロマトグラフィーの場合は水性アセトニトリルもしくは酢酸、またはイオン交換クロマトグラフィーの場合は塩溶液）、塩濃度の減少により（たとえば、疎水相互作用クロマトグラフィーの場合）、またはｐＨ変化により行われる。定常状態（すなわち、非勾配）条件の使用が好まれるのは、これが本質的に、生成物を、勾配溶出を用いて可能なことよりも、さらに濃縮した形で得ることを可能にするからである。さらに、回収手順は分離手順とは完全に独立しているため、回収の条件は、分離の効率で全く妥協することなく、生成物の放出の最大効率および溶媒、ディスプレイサー溶液等の使用の最大効率を確保するために最適化してもよい。したがって、勾配または定組成溶離で得られるかもしれないよりも、１０〜１００倍高い濃度の生成物を回収できる。
【００４９】
生成物を、好みの溶媒に抽出する能力もまた、次の処理工程での使用における安定した形または最適な形での生成物の回収を可能にするので、有利である。したがって、たとえば、タンパク質は、タンパク質の安定性を最大にするのに適したｐＨの緩衝液を用いて抽出してもよい。
【００５０】
【実施例】
以下の非制限的な実施例は、本発明を表わすのに役に立つ。別の記載がない限り、カラムは、ＳＰセファロースＦＦ（陽イオン交換）またはリクロスフィア Ｃ−１８ ２５−４０μ（逆相クロマトグラフィー）の充填された空の分離カートリッジを使用した。多数のカラムが用いられたとき、それらは、標準アダプタ（Supelco 5-7020）により接続された.
【００５１】
実施例１
メトキシＰＥＧ1000の均質性の向上
商業用のメトキシＰＥＧ生成物は、マススペクトロメトリ（Maldi-MS, Finnegan Lasermat 2000）により、主に酸化エチレン単位が９〜２７のオリゴマーの混合物からなることが分かった。主成分は、７６０ダルトンの分子量（Mw）を有することが分かり、これは、１６量体のナトリウム付加物と相互に関係することが予想された。
【００５２】
ａ）単一逆相試料置換クロマトグラフィー工程による分離（比較）
６個のカラムのそれぞれに、１ｍｌのリクロスフィア（Lichrosphere）２５−４０μmＲＰＣ  Ｃ１８粒子を充填し、メタノールで洗浄し、水と平衡にさせてから連結した。４ｍｌの水に４００ｍｇのメトキシＰＥＧを溶かした試料を、カラム上で分離させ、その後、カラムを切り離し、ポリマーを個々のカラムからメタノールで抽出した。溶媒を除去した後、水へ再溶解し、分画を再度Ｍａｌｄｉ−ＭＳで分析した。分画の組成は、逆相クロマトグラフィー分離が、ポリマーの大きさを基に区別したことを示し、より小さくかつ疎水性の低い成分が、システム内の遅いカラムまたはカラムの外へと置換された。
【００５３】
ｂ）逆相試料置換クロマトグラフィー工程の連続による分離
上記（ａ）からの両者間の試料は、本質的に元の試料の全ての成分を含んでいたが、疎水性およびその大きさを基に、ある程度組織化されていた。これらを同じカラムシステムに再適用したが、今回は、より小さいポリマーが豊富な分画を最初にシステムに入れ、続いてより大きいポリマーを主として含む後の分画を入れた。上記抽出手順を繰り返した後、個々の分画が著しく向上した均質性を呈することが分かった。
【００５４】
分画にさらにより高い均質性を与えるために、同じ手順を三回繰り返した。図１は、それぞれの分離でカラム５から抽出した分画のＭａｌｄｉ−ＭＳパターンを示している。図２は、６個のカラムから集めた分画内で観察された質量信号の上限と下限（最大信号のほぼ２〜５％）を示し、また溶出した分画内の物質に対しても（試料７以降）、三回連続分離の結果を、それぞれ符号ＭＰ２、ＭＰ３、ＭＰ４で識別した。これらの結果は、元の複合物質に対して、分画の均質性が著しく向上していることを示している。
【００５５】
実施例２
試料置換クロマトグラフィーによるオリゴヌクレオチドの精製
純度約６０％の未精製２０量体オリゴヌクレオチド（ＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧ）１．５ｇを、Ｑセファロース（Sepharose）ＦＦ（Pharmacia）を充填した三つの陰イオン交換カラム（５３ｍｍ×１０ｍｍ）上で、ｐＨ９．８の５０ｍＭホウ酸緩衝液を担体に用いて精製した。同じ分離を、ソース（Source）３０ＲＰＣ（Pharmacia）を充填したプレ・カラム（内径３０ｃｍ×１０ｍｍ）を用いた場合と用いなかった場合で行った。試料を適用している間に、成分は、疎水性によりＲＰＣカラムの上に分配されたが、実際のイオン交換ＳＤＣ分離は、試料をプレ・カラムから分離カラムへと溶出させるために、メタノールを２０％含有する担体の中で行われた。
【００５６】
ＨＰＬＣ陰イオン交換分析（Dionex Nucleopac PA100、１０mM NaOH中の
NaClO4の勾配）により、プレカラムが流路中に挿入されたとき、カラムの純度プロフィールがかなり向上するのが明らかになった。
【００５７】
実施例３
ゲルパーミエーションクロマトグラフィーおよび逆相試料置換クロマトグラフィーを用いたペプチド精製
試料置換クロマトグラフィーだけによる純度６５％の未精製ペプチド（YADKETEDLK）の精製は、所望の生成物に著しく高い純度を与える。しかし、アラニンとトレオニンのそれぞれを欠く二つの削除順番を除去するのが難しいため、生成物全体の純度は、９２〜９３％である。
【００５８】
本発明による分離において、酢酸０．１％に未精製ペプチド２００ｍｇを溶かした溶液を、０．１％酢酸中のセファデックスＧ１５（Sephadex G15）を充填した３０ｍｌ（内径５０ｃｍ×９ｍｍ）のゲルパーミエーションクロマトグラフィーカラムに、重力流動により適用する。溶出液は、バルブを介してカラム出口に接続されている管類の中に、連続して集められる。適切な容量の溶出液が通過した後、流れを止め、バルブを切り換えて溶出液を実施例１で記載した逆相カラムシステム上へ逆の順番で適用する。カラムをそれから切り離し、それぞれをメタノールで抽出する。最終的な分画のＨＰＬＣ分析を、試料置換分離だけから得られた分画と比較する。
【００５９】
実施例４
バシトラシンの精製
バシトラシン（bacitracin）（Sigma B-0125）１ｇを、０．１％酢酸を担体に用いて１０ｍｌの陰イオン交換カラム上で精製した。分離後、生成物を０．１Ｍの酢酸アンモニウムを用いてカラムから抽出し、抽出物を分画に集めた。分析は、バシトラシンＡの純度が分画の数と共に上がり、よって純度勾配を作っていることを示した。バシトラシンＡを主成分として含んでいる分画を、二つの部分に分けた。第一の部分をプールに集め、第二の部分は別に保管した。
【００６０】
プールした物質を、実施例１に記載した逆相カラムシステムに、０．１％酢酸を担体として用いて適用し、その後、カラムを切り離し、それぞれをメタノールで抽出してから再均衡化した。それらは、その後再連結されて、プールされなかった物質の分離に用いられ、分画を、陰イオン交換カラムからのそれらの溶出順に適用した。カラムを再び切り離し、それぞれをメタノールで抽出した。
【００６１】
抽出物質の逆相ＨＰＬＣ分析は、二回目の分離から集められた生成物が、第一の分離からの分画よりもずっと高純度のバシトラシンＡを含んでいることを示した。両方の実験で、２番のカラムが最も高い純度の物質を含んでいた。しかし、陰イオン交換分画を連続して適用したとき、生成物の純度は９０％を越えたのに対して、プールした分画を適用した後には、７７％の純度しか得られなかった。これらの結果は、図３に示されている。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、実施例１の手順により同じカラムの位置で得られた連続メトキシＰＥＧ分画のマススペクトロメトリ分析を表わしている。
【図２】  図２は、実施例１の手順により得られたメトキシPEG分画で観測された質量信号の上限と下限を表わしている。
【図３】  図３は、実施例４に記載されている種々の分離技術を用いて実現したそれぞれのバシトラシン純度を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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