(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つまたはそれ以上の生物特異的親和性反応物を輸送フローに用いることにより、フローマトリックスにおけるサンプル中の試験対象物を決定する方法であって、その反応物のうち少なくとも１つが分析学的に検出可能であり(反応物*)、１つが確実にマトリックス中に固定され(反応物Ｉ)、そして、フローマトリックスは、
Ａ)緩衝液およびサンプルを含む、液体の適用ゾーン(ＬＺ)、および
Ｂ)確実に固定した反応物(反応物Ｉ)を有するＬＺの下流に位置する検出ゾーン(ＤＺ)
を含み、
ここで、(ｉ)検出ゾーンへの流れは、検出ゾーンへの試験対象物および反応物の輸送用の適用ゾーンＬＺＳにおいてサンプルと共に液体を加えることにより、開始され、そして、(ii)ＤＺに結合する反応物*の量を検出し、その検出される量はサンプル中の試験対象物の量に関係し、
Ｉ．フローマトリックスが、相互に実質的に隣接して配置される少なくとも２つの液体の適用ゾーン：
ＬＺｍ  ．  ．  ．ＬＺｎ  ．  ．  ．ＬＺｌ          ＤＺ
--------------------------------------------------------＞
を含み、ここで、
ａ)ＬＺｎは液体の適用ゾーンであり、ｎは適用ゾーンＬＺｎの位置であり、
ｂ)ｍは、流れが開始する適用ゾーンの総数であり(ｍ≧２)。
ｃ)１つのＬＺｎはサンプル用の適用ゾーン(ＬＺｎ’Ｓ)用であり、１つのＬＺｎは反応物*(ＬＺｎ''Ｒ*)用であり、ｎ''≧ｎ'であり、
ｄ)-------------＞は流れの方向であり、そして、
ｅ)ＤＺは検出ゾーンであり、そして、
II．適用ゾーンＬＺｎ＋１に加えた液体ｎ＋１が、実質的に液体ｎと同時にフローマトリックスに接触し、そして直近の下流適用ゾーンＬＺｎに加えた液体ｎの直後のマトリックスを介して輸送されるような方法で、液体を各ゾーンＬＺｍ  ．  ．ＬＺｎ  ．  ．ＬＺｌ（ｍ≠ｎ）に加えることにより、流れが開始される
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
液体の適用ゾーン(ＬＺ)がさらに１つまたはそれ以上の反応物を含むが、反応物Ｉは含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
フローマトリックスが任意の反応物が事前に保持されている１つまたはそれ以上のゾーンをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ｎ''＞ｎ'(試験対象物および反応物*について連続的変形型)であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ｎ''＝ｎ'(試験対象物および反応物*について同時変形型)であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
反応物*が適用ゾーン(ＬＺｎ''Ｒ*)において事前に保持されていることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかの何れかに記載の方法。
【請求項７】
ＬＺｎが開始するところでＬＺｎ＋１が終了することを特徴とする（ｍ≠ｎ）、請求項１〜６の何れかに記載の方法。
【請求項８】
液体の適用を、すべてのＬＺｍ  ．  ．ＬＺｎ  ．  ．ＬＺｌにおいて実質的に同時に行うことを特徴とする、請求項１〜７の何れかに記載の方法。
【請求項９】
ｍ＜６；ｎ'は１、２または３である；ｎ''＞ｎ'；ＬＺｎ'＋１、ＬＺｎ'＋２、ＬＺｎ'＋３、ＬＺｎ'-１およびＬＺｎ'-２は、反応物*または他の反応物または反応物のない緩衝液の輸送を目的とする液体の適用ゾーンであることを特徴とする、請求項１〜８の何れかに記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも１つのゾーンＬＺｍ  ．  ．ＬＺｎ  ．  ．ＬＺｌが、フローマトリックスに適用するパッドまたは物質層を含むことを特徴とする、請求項１〜９の何れかに記載の方法。
【請求項１１】
ゾーンＬＺｍ  ．  ．ＬＺｎ  ．  ．ＬＺｌが相互間でゾーンスペーサーを有することを特徴とする、請求項１〜９の何れかに記載の方法。
【請求項１２】
適用ゾーンＬＺｎからの輸送された成分の組成が、流れが開始する直近の隣接適用ゾーンＬＺ(ゾーンがそれぞれＬＺｎ＋１およびＬＺｎ-１を欠くｎ＝ｍおよびｎ＝１を除く、ＬＺｎ＋１およびＬＺｎ-１)とは同じにはならないことを特徴とする、請求項１〜１１の何れかに記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも１つの反応物、反応物*以外の反応物が、反応物の輸送を目的とした液体の適用ゾーンＬＺｎ'''Ｒにおいて事前に保持することを特徴とする、請求項１〜１２の何れかに記載の方法。
【請求項１４】
ｍ＜６であり、サンプルの適用ゾーン(ＬＺｎ'Ｓ)のｎ'が１、２または３であることを特徴とする、請求項１〜１３の何れかに記載の方法。
【請求項１５】
反応物*が試験対象物に生物特異的親和性を有し、そのため、反応物*は、サンプル中の試験対象体の量に関係する量の検出ゾーンにおける複合体反応物'---試験対象物---反応物*に組込まれ、その複合体反応物'が、試験対象物に生物特異的親和性を有し、かつ
(ａ)反応物Ｉ、または
(ｂ)反応物Ｉが生物特異的親和性を示し、ＬＺｎ'ＳからまたはＬＺｎ'Ｓの適用ゾーンの下流から輸送される、反応物
であることを特徴とする、請求項１〜１４の何れかに記載の方法。
【請求項１６】
マトリックスは少なくとも１つのキャリブレーターゾーン(ＣＺ)を有し、そのキャリブレーターはマトリックスに結合するか、または事前にマトリックスに結合していることを特徴とする、請求項１〜１５の何れかに記載の方法。
【請求項１７】
キャリブレーターゾーンまたはゾーン群(ＣＺ)はマトリックスに確実に固定化されているキャリブレーター用の結合剤を有することを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ａ．試験対象物を一般的な抗原から選択し、そして
ｂ．その方法は、アレルギーまたは自己免疫疾患の関連物質をインビトロで測定する
ことを特徴とする、請求項１〜１７の何れかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、サンプル中の試験対象物(analyte)を、生物特異的親和性反応物(反応物１、反応物２など)を使用することにより、決定する方法に関係し、その反応物の１つは分析学的に検出可能(反応物*)であり、１つは輸送フローマトリックス中の検出ゾーン中に確実に固定する(反応物Ｉ)。サンプル(試験対象物)を、試験対象物(サンプル)および／または緩衝液を含む液体の適用ゾーン(ＬＺＳ)から、反応物Ｉを確実に固定化する検出ゾーン(ＤＺ)へ、マトリックス中の流れによって輸送する。サンプルをマトリックス中において輸送すると同時に、反応物*を含む可溶性反応物をもまた輸送する。検出ゾーンにおいて、サンプル中に存在する試験対象物の量と相関する量の反応物*を捕捉する。これを達成するため、反応物*が、反応物Ｉに直接か、または１つまたはそれ以上の添加された生物特異的親和性反応物(試験対象物を含む)を介して間接的に、生物特異的に結合するように、反応物*を選択する。次いで、試験対象物の量を、検出ゾーンにおいて結合する反応物*の量より決定する。輸送フローは、様々な生物特異的親和性反応物(例えば、反応物*、しかし試験対象物ではない)を溶解しそして検出ゾーンに向うフローと共に輸送するために事前に適用(事前に保持(predeposit))する、ゾーンを含む。
【０００２】
生物特異的親和性(生物親和性反応物)を示す反応物(試験対象物を含む)は、抗原／ハプテン-抗体；ビオチン-アビジン／ストレプトアビジン；２つの相補的一本鎖核酸などの反応対における個々の成分を意味する。抗体として、Ｆａｂ、Ｆ(ａｂ)2'、一本鎖Ｆｖ抗体(ｓｃＦｖ)などのような抗原結合抗体断片が考えられる。関連する反応物は天然には生じないものであるが、分子／結合剤を合成的に製造し得る。
【０００３】
当該試験方法のタイプは、従来、生物特異的親和性反応物に主として用いられ、特に、いわゆる免疫化学的決定方法と関連して、少なくとも使用反応物対の一方はタンパク質構造を有していた。
【０００４】
生物特異的親和性反応は、水性溶媒(例えば、水)において主として行われる。
【０００５】
当該技術は既知であり、しばしばいわゆる試験ストリップ(test strip)に適用されている。そのストリップはフローマトリックスとして機能する。フローは、サンプルを加えるゾーン(ＬＺＳ)において始まる。フローはしばしば横向きであり、すなわち、マトリックスの表面に平行であるか、または他のタイプ、例えばマトリックスの深部に行く。
【０００６】
試験プロトコールは、いわゆる阻害型(競合的)であるか、または非阻害型(非競合的、サンドイッチ)である。例えば、Behringwerke US 4,861,711; Unilever WO 88/08534; Abbot US 5,120,643; Becton Dickinson EP 284,232およびUS 4,855,240; Abbot/Syntex US 4,740,468; Pharmacia AB, WO 96/22532など参照。
【０００７】
この文書では、ある反応物(特に試験対象物および反応物*)に関する同時および連続方法(プロトコール)についてしばしば記載する。同時変形型では、試験対象物(サンプル)および関連反応物、例えば反応物*を同時に検出ゾーンに輸送する。サンプルを反応物*とプレインキュベーション／混合するならば、または反応物*をサンプル適用ゾーンかサンプル適用ゾーンのゾーン下流(しかし、検出ゾーンの前)に事前に保持するならば、同時変形型が得られる。連続変形型では、試験対象物(サンプル)を、反応物、例えば反応物*の前に、検出ゾーン中に輸送する。サンプル(試験対象物)をゾーンの外に輸送した後、関連する反応物、例えば反応物*をサンプルと同様の適用ゾーンに加えるならば、連続変形型が得られる。連続的方法の変形型についてはUS 4,855,240(Becton & Dickinson)において考察されている。同じ輸送フロー中の“トレイサー”(＝反応物*)の前に輸送されるサンプル(試験対象物)の代わりとして、US 4,855,240では、分離した輸送フローについて記載されており、サンプル(試験対象物)が“トレイサー”(反応物*)の前に検出ゾーンに到達するように輸送の時間を調節する。
【０００８】
同時試験という語は、そのサンプルおよび反応物*が、フローマトリックスに加えられる前に事前にインキュベーション／混合されるかまたはサンプルがフローマトリックスに加えられ、その反応物*はサンプル適用ゾーンまたはその上流において事前に保持する、すべての変形型をしばしば含む。連続試験という語は、サンプルが適用ゾーンの外に移動した後反応物*をサンプル適用ゾーンに加える、すべての変形型を同様に含む。そのため、試験対象物および反応物*の順序が検出ゾーンに輸送される間に変わるかどうかは考慮されていない。特記しなければ、この名称を本発明にも用い、幾つかの液体の適用ゾーンが存在する場合に適用する。この観点から、主として開始順序は試験対象物および反応物*の両方が可溶型であるときを考慮しているが、試験対象物および反応物*を検出ゾーンに輸送する順序ではない。
【０００９】
従来技術および本発明の目的に付随する不利な点
従来技術は、自動化において実施上の問題をしばしば含む。主として、サンプルおよび反応物の事前のインキュベーションまたは連続の添加が、用いる試験プロトコールにより決めたある事前決定の順序において、しばしば必要となるからである。本発明の目的は、(ａ)自動化を促進すること、(ｂ)サンプルおよび分析学的に検出可能な反応物(反応物*)の連続的添加を避けること、そして(ｃ)試験対象物および反応物*に関係する連続的方法を用いる際に反応物*を事前に保持し得ることである。更に通常の目的は、高品質の試験結果、好ましくは改善された感度および従来の変形型から得られる場合よりも正確である結果に到達することである。
【００１０】
本発明
フローマトリックス中の２つの隣接ゾーンに液体を殆ど同時に加えることにより流れが開始するならば、下流ゾーン中に加えた液体が上流ゾーンに加えた液体より前に検出ゾーンの方向に向けて移動することを、我々は驚くべきことにこの度発見した。直近の下流ゾーン中への液体の添加後上流ゾーン中の液体の添加が実施されるならば、液体のゾーン毎移動(zonewise migration)が得られることをも我々の発見に含まれる。関連型の分析方法におけるこの発見の適用により、改良が上記の目的に関し得られ得る。
【００１１】
本発明の最初の態様は、最初に記載した分析方法に関係し、
Ａ．フローマトリックスは、相互に実質的に隣接して配置される少なくとも２つの液体の適用ゾーンを有し：
ＬＺｍ  ．  ．  ．ＬＺｎ  ．  ．  ．ＬＺｌ          ＤＺ
--------------------------------------------------------＞
[式中、
ａ)ＬＺｎは液体の適用ゾーンである{式中、ｎは適用ゾーンＬＺｎの位置である(ｎは２＜ｎ＜ｍの整数である)}。
ｂ)ｍは、流れが開始する適用ゾーンの総数である。
ｃ)１つのＬＺｎはサンプル用の適用ゾーンであり(ＬＺｎ’Ｓ)、１つのＬＺｎは反応物*用の適用ゾーンであり(ＬＺｎ''Ｒ*)、ｎ''＞ｎ'である。
ｄ)-------------＞は流れの方向である。そして、
ｅ)ＤＺは検出ゾーンである。]
Ｂ．適用ゾーンＬＺｎ＋１に加えた液体ｎ＋１が、直近の下流の適用ゾーンＬＺｎに加えた液体ｎの後のマトリックスを介して輸送されるような方法で、液体を各ゾーンＬＺｍ  ．  ．ＬＺｎ  ．  ．ＬＺｌに加えることにより、流れが開始される
ことを特徴とする。
【００１２】
液体の適用のための相当するゾーンが相互に隣接するか、または加えた液体体積がこの目的に適合するならば、液体n+1は液体n直後に容易に移動する。
【００１３】
最も通常の場合、上記には、液体ｎをＬＺｎに加える前または主として同時に、液体ｎ＋１をＬＺｎ＋１に加えることが含まれる。ｎ＝ｍの場合、ＬＺｎ＋１を欠き、そのため、当該ゾーンでは任意の液体をＬＺｍ＋１に加えることができない。添加がすべてのＬＺｍ  ．  ．ＬＺｎ  ．  ．ＬＺｌに主として同時に実施されるならば、実施での利点に到達する。
【００１４】
液体の適用ゾーン(ＬＺm  ．  ．ＬＺn  ．  ．ＬＺl)の数(ｍ)は、原理的には、１を除く任意の数である(ｍ≠１)。実施上の理由により、将来的には、ｍ＝２または３または４または５のような、２＜ｍ＜１０、好ましくは２＜ｍ＜６となる得る。
【００１５】
加えた液体(液体1 ．  ．  ．液体m)は、緩衝溶液のみか、または緩衝液に反応物(反応物１、反応物２など)を加えた溶液からなり得、反応物*は、サンプル中の測定対象物量に関連する量で検出ゾーン中で捕捉され得る必要がある。また、反応物*は液体n中に含まれる。概して、適用ゾーンから輸送された成分の組成物は、流れが開始する直近の隣接適用ゾーン(ゾーンＬＺn+1およびＬＺn-1、それぞれを欠く場合であるｎ＝ｍおよびｎ＝１を除くＬＺn+1およびＬＺn-1)とは同じにはならない。
【００１６】
“実質的に相互に隣接する”という表現は、液体の適用ゾーンが相互に直接隣接するか、マトリックスの中間体領域が好ましくは約２ｍｍ未満、および特に約１ｍｍ未満であることを意味する。
【００１７】
適用ゾーンに加えた液体は、マトリックスの上部においてゾーンの外側に位置するマトリックス部分に広がる性質がある。隣接ゾーンの場合、これは、液体が望ましくない方法で相互に混合されることを意味する。これを避けるため、２つの隣接適用ゾーンの境界を決める物理的バリア(ゾーンスペーサー)を置く。このバリアは、マトリックスの上部に主として置かれるが、流れを完全には止めないでマトリックス中下方に延びている。境界決定は、液体の適用のための隣接ゾーンに対して主として行われるが、もちろん、液体の適用ゾーン全体周辺に広がり得る。液体を、マトリックス上で適用されるパッドまたは物質層を介し、そしてマトリックス物質と同じもしくは異なる物質から導入される。その場合、ゾーンスペーサーの存在の必要はない。
【００１８】
関連した反応物は、液体の適用ゾーン中か、またはそのような２つのゾーンの間に事前に保持する。緩衝性成分および／または生物特異的親和性反応に関係しない他の成分(すなわち、任意の反応反応物または測定対象物を含まず、または輸送の目的としない、液体)を移動することのみを目的とする液体の適用ゾーンを以下ではＬＺnＢと呼ぶ。液体が反応物を含むか、または反応物、例えば、反応物*、反応物１、反応物２などの輸送を目的とする、液体の適用ゾーン(ＬＺn)をＬＺn''Ｒ*、ＬＺn'''Ｒ１、ＬＺn''''Ｒ２などと呼ぶ。液体nが、成分の組合せ、例えば反応体*および測定対象物(サンプル)を輸送するならば、適用ゾーンは通常の成分となり、そしてＬＺn'''Ｒ２／Ｒ１などと呼ぶ。組合せサンプルおよび反応物*の場合、適用ゾーンはＬＺn'Ｒ*／Ｓ(ｎ'＝ｎ'')である。当該液体nを、ある反応物の輸送の目的とし、当該反応物またゾーンＬＺn中に事前に保持し得ることを含む。後者は、反応物は、直近の下流に位置するＬＺ(ＬＺn-1)の上流以外の、関連液体用の適用ゾーンの下流領域(area dwonstream)中に事前に保持することを含むか、またはｎ＝１ならば、検出ゾーンは上流のみである(そのため、ＬＺn-1を欠く)ことを含む。
【００１９】
事前に保持するとは、反応物を前以ってマトリックスに加え、そして、流れを開始するために適用された液体が到着するまでマトリックス中に広がらないようにすることを意味する。反応物の事前の保持は本質的に知られている方法で実施される(例えばBehringwerke US 4,861, 711; Unilever WO 88/08534; Abbot US 5,120,643; Becton Dickinson EP 284,232)。事前に保持した反応物を含む領域を液体が通過するとき、当該反応物が急速に溶解するように配置を作成することが重要である。急速な溶解を実現するために、その急速に溶解する物質中に反応物を通常組込む。この型の物質は、しばしば、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、スルホネートなどのような極性および／または帯電基を有し親水的である。特に親水性の急速に可溶するポリマーについて言及し、例えば、炭水化物構造、モノ-、ジ-およびオリゴサッカライドを含む単糖、ならびに相当する糖アルコール(マンニトール、ソルビトールなど)を有するポリマーである。通常の実施では、最初に当該適用ゾーンを急速に可溶する物質の層で被覆し、次いで、反応物を適用し、その後、所望により、急速に可溶する物質の１つの更なる層を適用する。他の方法は、急速に可溶する物質の粒子中の反応物を組込み、次いでマトリックスの関連ゾーンに保持することによる。
【００２０】
液体の適用ゾーンに関する最も重要な実施態様の幾つかは、２＜ｍ＜６；ｎ'は１、２または３である；ｎ''＞ｎ'またはｎ''＝ｎ'；ＬＺn'Ｓはサンプルまたは所望により反応物*または他の反応物の適用ゾーンである；ＬＺn'+1、ＬＺn'+2、ＬＺn'+3、ＬＺn'-1およびＬＺn'-2は、反応物*または他の反応物またはｍ、ｎ''およびｎ'が許す限り反応物のない緩衝液の輸送を目的とする液体の適用ゾーンであると要約される。
【００２１】
特定の型のマトリックスを通る輸送フロー(transport flow)は、毛管力の作用により、例えば、実質的に乾燥マトリックスで開始されることにより達成される。吸収体(sucking body)を促進のために流れの端に置く。マトリックスを交差して電界(electrical field)を適用するならば、主として溶解した成分のみの輸送を意味する流れとなる。
【００２２】
試験プロトコール
本発明を使用することにより、反応物および試験対象物を作成し、個々の成分として、または検出ゾーンに向う様々な組合せにおいて共にゾーン毎に移動し得る。適用ゾーンの抽出配列は、利用される試験プロトコールにより決定される。
【００２３】
本発明は、任意の反応物について同時にまたは連続的であるならば、それにかかわらず、競合(阻害)および非競合(非阻害)試験変形型として適用される。示したシステムを形成された複合体型で以下に図示する。“-”はマトリックスの固定形成に関係し、“---”は生物特異的親和性を介する結合に関係する。単純化のため、使用する反応物を、使用する結合部位については一価であると仮定する。
【００２４】
Ａ．サンドイッチプロトコール(非阻害)
反応物Ｉおよび反応物*は両方とも、試験対象物に対し生物特異的親和性を有する。ｘ＝マトリックス上の反応物Ｉのモル数およびｙ＝反応物Ｉに結合する試験対象物のモル数(＝反応物*のモル数)。
【００２５】
検出ゾーン中の複合体：
マトリックス(-反応物Ｉ)x-y(-反応物Ｉ---試験対象物---反応物*)y
【００２６】
同時変形型：
ｍ＝２：ＬＺ2Ｒ*／Ｓ  ＬＺ1Ｂ  ＤＺ
【００２７】
連続変形型：
ｍ＝２：ＬＺ2Ｒ*  ＬＺ1Ｓ  ＤＺ
ｍ＝３：ＬＺ3Ｒ*  ＬＺ2Ｂ  ＬＺ1Ｓ  ＤＺおよび緩衝ゾーンが位置１または３である他のもの
ｍ＝４：ＬＺ4Ｂ  ＬＺ3Ｒ*  ＬＺ2Ｂ  ＬＺ1Ｂ  ＤＺおよび任意の緩衝ゾーンが位置１に置かれているもの
ｍ＝５：抽出緩衝ゾーンが位置１であること以外、ｍ＝４と同じ配列
【００２８】
Ｂ．サンドイッチプロトコール(非阻害)
反応物Ｉは反応物IIに対し生物特異的親和性を示す。反応物IIおよび反応物*の両方は試験対象物に対して生物特異的親和性を有する。ｘ＝マトリックス上の反応物Ｉのモル数およびＹ＝試験物IIを介して試験物Ｉに結合する試験対象物のモル数(反応物*のモル数)。ｙ＋ｚは反応物Ｉに結合する反応物IIのモル数である。
【００２９】
検出ゾーン中の複合体：
マトリックス(-反応体Ｉ)x-z-y(-反応体Ｉ---反応体II)z(-反応体Ｉ---反応体II---試験対象物---反応体*)y
【００３０】
同時変形型：
ｍ＝２：ＬＺ2Ｒ*／ＳがＬＺ2Ｒ*／Ｓ／ＲIIでありまたはＬＺ1ＢがＬＺ1ＲIIであること以外、プロトコールＡと同様
ｍ＝３：ＬＺ3Ｒ*／Ｓ  ＬＺ2Ｂ  ＬＺ1ＲII  ＤＺまたはＬＺ3Ｒ*／Ｓ  ＬＺ2ＲII  ＬＺ1Ｂ  ＤＺ
【００３１】
連続変形型：
ｍ＝２：ＬＺ1ＳがＬＺ1Ｓ／ＲIIにより置換されること以外プロトコールＡと同様
ｍ＝３：ＬＺ3Ｒ*  ＬＺ2Ｂ  ＬＺ1Ｓ／ＲII  ＤＺまたは
ＬＺ3Ｒ*  ＬＺ2Ｓ  ＬＺ1ＲII  ＤＺまたは
ＬＺ3Ｒ*  ＬＺ2Ｓ／ＲII  ＬＺ1Ｂ  ＤＺ
ｍ＝４、５、６：プロトコールＡとの類似において、６までの液体の適用ゾーンを有する配列が考えられる。
【００３２】
Ｃ．阻害プロトコール：
反応物Ｉは試験対象物類似体であり、確実にマトリックスに固定され、反応物IIIは試験対象物に対し生物特異的親和性を示し、そして反応物*は反応物IIIに対し生物特異的親和性を有する。ｘ＝マトリックス上の反応物Ｉのモル数。ｙ＝反応物Ｉを介してマトリックスに結合する反応物IIIのモル数(反応物*のモル数)。ｙが、サンプル中の試験対象物量の尺度となるように条件を選択する。
【００３３】
検出ゾーンの複合体：
マトリックス(-反応物Ｉ)x-y(-反応物Ｉ---反応物III---反応物*)y
【００３４】
同時変形型：
ｍ＝２：ＬＺ2Ｒ*／ＲIII／Ｓ  ＬＺ1Ｂ  ＤＺ
【００３５】
連続変形型：
ｍ＝２：ＬＺ２Ｒ*  ＬＺ１／ＲIII／Ｓ  ＤＺ
ｍ＝３、４および５：プロトコールＡの類似として製造される。
【００３６】
Ｄ．阻害プロトコール
反応物Ｉは、試験対象物および反応物*の両方に対し生物特異的親和性を示す。反応物*は可溶性試験対象物類似体である。ｘ＋ｙは、マトリックス上の反応物Ｉのモル数であり、ｘおよびｙは、それぞれマトリックスに結合する反応物*および試験対象物のモル数である。
【００３７】
検出ゾーンの複合体：
マトリックス(-反応物Ｉ---反応物*)x(-反応物Ｉ---試験対象物)y：
同時変形型：
ｍ＝２：ＬＺ2Ｒ*／Ｓ  ＬＺ1Ｂ  ＤＺ
連続変形型：
ｍ＝２：ＬＺ2Ｒ*  ＬＺ1Ｓ  ＤＺ
ｍ＝３、４および５はプロトコールＡの類似型に製造される。
【００３８】
マトリックス
マトリックスは、流れが輸送される空間を規定する。マトリックスは、単一のフローチャンネル(simple flow channel)(例えば、キャピラリー)の内部表面であり、多孔性マトリックスの内部表面はフローチャンネルなどのシステム(多孔性マトリックス)を有し、広がっている。単純化の目的のため、本発明の変形型において有用のマトリックスをフローマトリックス群と呼ぶ。多孔性マトリックス群は、モノリス、シート、カラム、膜、キャピラリー大の単一のフローチャンネル、またはそのフローチャンネルを集合したシステムの形で存在する。それらはまた、カラムケーシングにパックした粒子、繊維形に加圧した形で存在する。マトリックスの内部表面、すなわち、フローチャンネルの表面は、水性媒体(通常、水)がマトリックスを介して吸収または輸送されるように、親水性とすべきである。フローチャンネルの最も小さい内のり寸法は、用いる反応物のマトリックスを通して輸送できるような十分な大きさにすべきである。その目安は、マトリックスがフローチャンネルを相互に通じるシステムを示すならば、範囲０.４-１０００μｍ、好ましくは０．４-１００μｍである最も小さい内のり寸法(しばしば、丸チャンネルの直径とする)を有するフローチャンネルを有するもののなかから適当なマトリックス群を選択する。範囲０．４-１０００μｍの上側部分の最も小さな内のり寸法を有するフローチャンネルは、単一のアンブランチ・チャンネルに適し、その流れは外からの加圧または吸引により実施する。
【００３９】
関連するマトリックス群を、ポリマー、例えばニトロセルロース、ナイロンなどからしばしば製造する。マトリックスの物質ならびにフローチャンネルの物理的および幾何学的設計は、マトリックスのある部分の使用に応ずる流れによって変化する(Pharmacia AB WO 96/22532; Medix WO 94/15215)。
【００４０】
検出ゾーン
検出ゾーンでは、試験条件下で反応物Ｉが不意に輸送されないような結合で反応物Ｉを確実にマトリックスに固定する。反応物Ｉによるマトリックスへの結合は共有結合であり、物理的吸着、生物特異的親和性などを介する。当分野の従来の技術のように、本発明を結合型の組合せ、例えば、反応物Ｉに向ける生物特異的親和性反応物のマトリックスへの共有結合を用いる。特に、特異的結合対(反応物対)の物理的、吸着的、または共有結合的な結合成分を、特異的結合対の他の成分に結合または連結する反応物Ｉと組合せて、示すマトリックス、または反応物Ｉに向ける同様の結合抗体を示すマトリックスについて記載される。特異的結合対の例として、抗原-抗体およびハプテン抗体のような免疫学的結合対、ビオチン-アビジンまたは-ストレプトアビジン、レクチン-糖、ホルモン-ホルモンレセプター、核酸二重鎖を記載する。上記の通りに反応物Ｉをマトリックスに他の反応物を介して結合するならば、反応物Ｉは、マトリックスに固定化される必要はないが、検出ゾーンとは離れた領域またはゾーンのマトリックスに可動的(拡散的)に事前に保持するか、またはサンプルと共にまたは別々に添加され得る。反応物Ｉによるマトリックスへの固定化は、マトリックス内／上に保持する粒子を介して行われ、その場合、反応物Ｉは共有結合的に、物理的吸着的に、または生物特異的などの結合である。その粒子をマトリックスに結合する。マトリックスまたは物理的吸着を通して輸送できないような大きさを選択するのためである。Abbott/Syntex US 4,740,468; Abbott EP 472,376; Hybritech EP 437,287およびEP 200,381; Grace & Co. EP 420,053; Fuji Photo Film US 4,657, 739; Boehringer Mannheim WO 94/06012参照。本発明の場合、マトリックスに物理的に吸着するより小さな粒子を有する後者の変形型が良好であった。
【００４１】
ある輸送の流れおよび同じ輸送の流れにおいて、幾つかの検出ゾーンがある(ＤＺ１、ＤＺ２など)。１つまたはそれ以上の検出ゾーンが同じまたは異なる試験対象物に関係する。測定対象物が異なるならば、反応物Ｉは、通常、各ＤＺとは異なる。
【００４２】
分析学的に検出可能な反応物(反応物*)
本発明では、反応物*は試験対象物とはなり得ない。通常の分析的検出性は、天然の反応物、例えば抗体または抗原またはハプテンが分析学的に検出可能な基を備えているため、得られる。熟知され、しばしば用いられる基の例は、酵素学的に活性な基(酵素、補因子、補酵素、酵素基質など)、蛍光発生性、発色性、化学ルミネセンス性、放射活性基などである。生物特異的親和性反応物の方法より検出される基は、通常、このカテゴリー、例えば、ビオチン、ハプテン、免疫グロブリン中のクラス-、サブクラス-および種-特異的決定基などについても言及される。
【００４３】
好ましい標識基は、蛍光発生性基または発色性基(色をつけた粒子)のような上記の任意の検出可能基を所望により含む基である。有用な粒子は、しばしば、範囲０．００１-５μｍの大きさである。粒子は、いわゆるゾルと呼ばれるコロイドの大きさを有する(通常、範囲０．００１-１μｍの大きさを有する球状および単分散である)。特に金属粒子(例えば、金ゾル)、非金属粒子(例えば、ＳｉＯ２、炭素、ラテックスおよび死滅した赤血球および細菌)について記載する。非コロイドの大きさで、非保持能に焦点をおいた粒子が用いられる。これらは多かれ少なかれ不規則であり、多かれ少なかれ多分散である(炭素粒子＜１μｍ；Pharmacia AB, WO 96/22532)。
【００４４】
標識基としての粒子の場合、参考文献は次の通りである；Unilever WO 88/08534; Abbott US 5,120,643; Becton Dickinson EP 284,232など。
【００４５】
本発明を導く開発と関連して、
(ａ)検出可能基として上記の通り標識粒子を有する反応物*、および
(ｂ)反応物Ｉが、マトリックスを通すように粒子を輸送し得るディメンジョンを実質的に有する粒子を介してマトリックスに固定される、検出ゾーン
を同時に用いるならば、良好な結果が得られることが驚くべきことに発見された。
【００４６】
我々は、標識粒子および固定化粒子が実質的に同じディメンジョンを有する機能性システムに到達した。これは、マトリックスにより決まるフローチャンネルより小さい限り、標識粒子が固定化粒子よりも大きく、およびその逆となる可能性が高いことを意味する。そのシステムは、目的の適用ゾーン中の反応物*の事前保持と共にまたはそれなしで機能する。この実施態様は、本発明の一部であり、我々の同時係属のＰＣＴ出願：“粒子を使用した分析法および本方法を行うための試験キット”(SE 9704935-7に基く)に記載している。この別の特許出願は引用によりこの文書に加える。
【００４７】
測定対象物
本発明は、最初に記載した型の生物特異的親和性反応物の決定に主として適用する。反応物は、細胞またはウイルスまたはその一部である。特に免疫グロブリンまたは抗体のような抗原について記載する。免疫グロブリンの場合、決定は、あるＩｇおよび／またはあるＩｇサブクラスに関係する。抗体の場合、決定は、ある特異性、所望により、抗体のＩｇクラスまたはＩｇサブクラスに関係する。関連するＩｇクラスは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭである。関連するＩｇサブクラスはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４である。
【００４８】
サンドイッチ変形型(上記プロトコールＡおよびＢの通り)では、試験対象物は、アレルゲン／抗原／ハプテンに向けられた抗体であり、ある種、あるＩｇクラスまたはあるＩｇサブクラスから誘導される。この場合、反応物*は、種、ＩｇクラスまたはＩｇサブクラスに特異的なエピトープに向けられた分析学的に検出可能な抗体であり、アレルゲン／抗原／ハプテンのような反応物Ｉ(プロトコールＡ)または反応物II(プロトコールＢ)を有する。他に、逆が選択される。すなわち、反応物*がアレルゲン／抗原／ハプテンであり、反応物Ｉおよび反応物IIはそれぞれ試験対象物に向けられた抗体である。試験対象物が通常の抗原であるとき、反応物Ｉおよび反応物*は両方ともプロトコールＡで抗原に向けられる抗体である。プロトコールＢの場合、それは、抗原に向けられる抗体である反応物IIおよび反応物*である。
【００４９】
競合的変形型の場合、低分子試験対象物に最も興味が惹かれる。示す例は、抗原およびハプテンである。プロトコールＣの場合、反応物Ｉは、マトリックスに確実に固定された抗原またはハプテンであり、反応物IIIは抗原に向けられた抗体であり、そして反応物*は反応物IIIに向けられた抗体である。プロトコールＤの場合、反応物Ｉは、試験対象物に向けられた抗体であり、反応物*は分析学的に検出可能な基で標識された試験対象物である。
【００５０】
本発明の方法は、アレルギーまたは自己免疫疾患の診断の一部として実施される。
【００５１】
本発明の場合、ＩｇＥまたはＩｇＧクラスの抗-アレルゲン抗体の測定に特に興味が惹かれ、任意の記載したサブクラスに好ましくは焦点がおかれる後者の場合である。アレルゲン-特異的抗体の測定は、ＩｇＥを仲介するアレルギーを診断するときに利用される。
【００５２】
サンプル
関連するサンプルは、生物的起源であり、例えば、様々な体液(血液全体、血清、血漿、尿、唾液、涙、髄液など)、バイオテクノロジーの手法で加工した細胞培養培地、組織抽出物、食品、環境(環境分析サンプル)などによる。サンプルは、例えば、マトリックス、含まれる試験プロトコールなどに適するように事前に処理される。
【００５３】
キャリブレーター
本発明が関係する型の決定方法には、分析学的に検出可能な反応物(反応物*)からの検出可能なシグナルを測定し、測定されたシグナル(サンプル値)をサンプル中に存在の試験対象物の量の測定とすることを含む。測定シグナルを実際の試験対象物に移行するため、シグナルを、試験対象物(キャリブレーター)の既知標準量の相当するシグナル(キャリブレーター値)と通常比較する。本発明と関連して、新規キャリブレーターシステムを開発し、本発明に適用し最善の実施態様を構成する。
【００５４】
この別の発明は、使用するキャリブレーターを前以ってマトリックス(マトリックスキャリブレーター)に固定し、好ましくは、サンプルのラン(run)に利用するものと同じ型であることを意味する。キャリブレーター値を測定する際、マトリックスキャリブレーターを反応物*に結合し得、次いで、反応物*の測定シグナルを本質的に知られる方法で測定する。マトリックスキャリブレーターの様々な量を利用することにより、一群のキャリブレーター値が、サンプル中の、事前に決定した様々な試験対象物量に相当して得られる(標準量、用量-応答曲線、キャリブレーション曲線)。
【００５５】
他に、代わりに、キャリブレーターの結合剤をマトリックスに固定し、キャリブレーターをキャリブレーター値の決定時に加え、所望により、決定にあたりサンプル溶液または緩衝液により溶解するようにキャリブレーターゾーンの上流マトリックスに事前に保持する。キャリブレーター結合剤がマトリックスに結合する際、キャリブレーターは、検出ゾーンとは離れたゾーン中のマトリックスに可動的(拡散的)に事前に保持するか、またはサンプルと共に、または別けて加えられる。キャリブレーター結合剤は、通常、特異的結合対(反応物対)の１つの成分であり、他の成分の結合対はキャリブレーター物質に結合または連結する。その特異的結合対の例として、抗原-抗体およびハプテン-抗体のような免疫学的結合対、ビオチン-アビジンまたは-ストレプトアビジン、レクチン-糖、ホルモン-ホルモンレセプター、核酸二重鎖を記載する。
【００５６】
本発明を適用すると、輸送フローが、各キャリブレーターゾーン(ＣＺ)中のマトリックスに確実に固定されたキャリブレーターを有する１つまたはそれ以上のゾーンを通過することが、我々の新規キャリブレーターシステムに主として含まれる。
【００５７】
キャリブレーターゾーン中のマトリックスへのキャリブレーターの固定化は、検出ゾーンへの反応物Ｉの固定化と同様の原理により実施する。
【００５８】
キャリブレーターゾーンは、液体の適用ゾーンの下流に位置し、反応物*の輸送を目的とする。検出ゾーン(ＤＺ)の関係において、キャリブレーターゾーンは好ましくは上流に位置する。
【００５９】
キャリブレーターに関係する本発明は、標題“新規キャリブレーターの使用方法および本キャリブレーターを含む装置および試験キット”(SE 9704933-2に基く)の我々の同時係属のＰＣＴ出願に詳細を記載している。この出願は、引用によりこの文書に加える。
【００６０】
本発明の２番目の主な態様
２つまたはそれ以上の液体の適用ゾーンを含む上記のフローマトリックス、所望により、分析学的に示し得る反応物と共にフローマトリックスが含まれる型のキットは、本発明の２番目の主な態様を構成する。
【００６１】
本発明を、下記の非制限的実験部分において解説する。
【００６２】
実施例１：ゾーン配列を有する連続法：ＬＺ4Ｂ、ＬＺ3Ｒ*、ＬＺ2Ｂ、ＬＺ1Ｓ、ＤＺ  炭素粒子結合を伴う試験変形型におけるｈＩｇＥの検出
方法および物質
フェニルデキストランによるポリスチレン粒子への吸着：
フェニルデキストラン(置換度：それぞれ１／５モノサッカライド単位＝２０％につき１フェニル基、Ｍｗデキストラン４０，０００、Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden)を、脱イオン水に１)５ｍｇ／ｍｌ、１０％粒子懸濁、ＲＴ、３０−６０分間；２)５ｍｇ／ｍｌ、５％粒子懸濁、ＲＴ、１ｈ；３)２０ｍｇ／ｍｌ、１-２％粒子懸濁、ＲＴ、３時間または一夜で溶解したフェニルデキストランで攪拌しながらインキュベーションすることによりポリスチレン粒子(0.49μm Bangs Laboratories, USA)に吸着させる。粒子を実質的に２回脱イオン水で洗浄した。粒子懸濁液を、それぞれインキュベーションと洗浄の間で遠心分離した(12,100ｘｇ、25min、Beckman, J-21, JA-20, 10,000rpm)。粒子懸濁液に最終的に超音波をかけた(Ultrasonic bath, Branson 5210, ５分)。
【００６３】
抗-ヒトＩｇＥ抗体(抗-ｈＩｇＥ)によるポリスチレン粒子への結合：
抗-ｈＩｇＥを、ＣＤＡＰ(１-シアノ-４-ジメチルアミノ-ピリジニウムブロミド(Kohn J and Wilchek M, FEBS Letters 154 (1) (1983) 209-210)でポリスチレン粒子を被覆したフェニルデキストランに連結する。
【００６４】
抗-ｈＩｇＥの脱塩および緩衝液置換を、ＮａＨＣＯ3、０．１Ｍ、ｐＨ８．５中のゲル濾過(PD-10, Pharmacia Biotech AB)により行った。３０％(体積)アセトン中の２％溶液中のポリスチレン粒子２．３ｇ(上記フェニルデキストランで被覆)を１７ｍｌＣＤＡＰ(０．４４Ｍ)および１４ｍｌ ＴＥＡ(0.2M トリエチルアミン、Riedel-deHaen, Germany)で活性化した。ＣＤＡＰを１５０秒間攪拌しながら加え、ＴＥＡを１５０秒間攪拌しながら加えた。粒子を、３０％(体積)アセトンで洗浄し、１２，１００ｘｇ(２５分間、Beckman, J-21, JA-20, 10,000rpm)で遠心分離した。１７の抗-ｈＩｇＥを、＋４℃で一夜攪拌しながらインキュベーションする活性化粒子(２％、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ3ｐＨ８．５中０．１５ｇ)に結合した。＋４℃で一夜攪拌しながらインキュベーションするとき、０．１Ｍ ＮａＣＨＯ3ｐＨ８．５中のグルタミン酸０．０５Ｍおよびアスパラギン酸０．０５Ｍで不活性化する前に粒子を遠心分離し、デカントした。結合した粒子を、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ3、０．３Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．５で一度洗浄し、０．１Ｍ ＨＡｃ、０．３Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ５で一度洗浄し、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ3、ｐＨ８．５で一度洗浄し、そして２０ｍＭ ホウ酸緩衝液ｐＨ８．５で一度洗浄する。
【００６５】
粒子の濃度を、参照として非処理粒子を用いてＡ600ｎｍで、スペクトロメトリーで測定した。結合したタンパク質の濃度を、結合およびｃｐｍ測定の間に抗-ｈＩｇＥを存在させることにより測定する。
【００６６】
炭素粒子連結物(反応物*)：
これを、WO96/22532(Pharmacia AB)により炭素粒子(sp100、＜１μｍ、Degussa、Germany)に吸着する抗-ｈＩｇＥにより調製した。最終溶液をｍｌあたり炭素粒子４００μｇを含むフローマトリックスに使用した。
【００６７】
膜への抗-ｈＩｇＥ結合粒子の保持：
ニトロセルロースシート(Whatman, ８μｍ、長さ５ｃｍおよび幅２５ｃｍのポリエステルバッキングにおいて、抗-ｈＩｇＥ粒子(上記の通り調製した)を、Linear Striper(IVEK Corporation)を有するシート(将来的には検出ゾーン)の幅を超えるゾーンに保持した。フローは１μｌ／ｓｅｃおよび１μｌ／ｃｍであった。粒子をホウ酸緩衝液(２０ｍＭ、ｐＨ８．５、デキストラン Ｔ５０００ ４．２％ ｗ／ｗ、ソルビトール ５．８％ ｗ／ｗ)に希釈した。保持した抗-ＩｇＥ抗体の量は約１０００ｎｇ／ｃｍであった。そのシートを１時間３０℃で乾燥させた。
【００６８】
緩衝液、サンプルおよび炭素粒子連結物の適用用ゾーン：
ゾーンから離れたウェルは保持した物質を含み、幅１ｍｍの４つのInplastor strip(一端に接着剤のついているMylar, Gelman)をゾーンに平行に、そして相互に平行にし、相互から５ｍｍ離した(ゾーンスペーサー)。そのため、Inplastor stripは５ｍｍの幅の４つのゾーンを決定した。シートを、保持物質を含むゾーンに対し垂直に切断し、幅０．５ｃｍ(ストリップの長さは５ｃｍとなった)で剥がした(Singulator: Matrix 1201 membrane cutter, Kinematic automation)。最終ストリップにより、ゾーンスペーサーとしてInplastor stripにより別けられた(適用ゾーン)４つの平行ゾーンが見られ、そして、保持した抗-ｈＩｇＥ抗体(検出ゾーン)により分離ゾーンが見られた。比較として、ゾーンスペーサーがなく、すなわち、分離した適用ゾーンのないストリップを製造した。
【００６９】
試験方法：
分離した適用ゾーンを有するストリップを平面ホルダー上にマウントした。ストリップの上(０.５ｃｍ)において(直近ゾーンのように検出ゾーンと共に)、吸収膜を置いた(Whatman, 17 Chr, 幅３ｃｍ)。４つのサブゾーンへの試薬の同時適用の場合、４チャンネルMultipipette(Labsystems)を用いた。マルチピペットを使用して、血清サンプル(３０μｌ)を、それぞれの上流適用ゾーンに緩衝液(３０μｌ)、炭素粒子連結物(３０μｌ)および緩衝液(３０＋３０μｌ)の順序で検出ゾーンに直近の適用ゾーン中に適用した。ゾーンスペーサーを使用しないストリップに対する連続適用の場合、サンプル３０μｌを、ストリップの下端に最初に適用した。サンプル体積の吸収の後、緩衝液(３０μｌ)、炭素粒子連結(３０μｌ)および緩衝液(３０＋３０μｌ)を吸収後連続的に加えた。炭素粒子連結を上記の通り調製し、緩衝液中に懸濁した。緩衝液はＮａＰＯ４０．１Ｍ、ＢＳＡ３％、ＮａＮ３０．０５％、シュクロース３％、塩化ナトリウム０．２％、フェニルデキストラン０．０５％、ウシガンマグロブリン０．０５％、ｐＨ７．５であった。炭素粒子連結による検出ゾーンへの連結を、吸収の測定により定量した(Ultroscan XL, Enhanced Laser Densitometer, LKB)。血漿環境中において標準濃度を有するＩｇＥ(０；０．５；２；１０；５０および２００ＫＵ／Ｌ)をサンプルとして用いた。
【００７０】
結果
４つの液体の適用ゾーン用い、同時添加すると、液体は、適用ゾーンの順序で移動した。すなわち、検出ゾーンに直近のゾーン中のサンプルが、その後の適用ゾーンの洗浄溶液と混合することなく最初に移動した。次いで、サンプルがサンプルの適用ゾーンの外に輸送されるとき、その溶液が移動し始めた。相応じて、残りのゾーンの液体が混合することなく連続して移動した。
【００７１】
表１：あるゾーン中における連続的添加のランおよび４つのサブゾーンにおける同時添加の分析結果(緩衝液、分析学的に検出可能な反応物、緩衝液、サンプル)
【表１】
0004424848.tif 000002
【００７２】
表１中において示されるのは、あるゾーンおよび同じゾーンにおいて添加を実施するときと比べて、分離した適用ゾーンを有するストリップについて吸収がわずかに減少することである。しかし、その減少は端である。そのため、実験により示されるのは、まるでサンプル、反応物*および緩衝液が通常の適用ゾーンに連続して添加されるかのように、同時添加がゾーン配列ＬＺ4Ｂ、ＬＺ3Ｒ＊、ＬＺ2Ｂ、ＬＺ1Ｓに行われるならば、通常同じ結果となることである。
【００７３】
確実に固定した抗-ＩｇＥ抗体(反応物Ｉ)をアレルゲンで置換するならば、アレルゲンに向けるＩｇＥ抗体の決定方法が得られる。同様に、他のクラス／サブクラスの抗体であって、他の特異性を有する抗体に関係する試験システムを決定する。緩衝液のみの適用ゾーンを除く。付加的な他の試験プロトコールおよび試験対象物の場合、上記の標題“試験プロトコール”および“試験対象物”を参照のこと。
【００７４】
実施例２：ゾーン配列ＬＺ4Ｂ、ＬＺ3Ｒ＊、ＬＺ2Ｂ、ＬＺ1Ｓ、ＤＺを有する連続方法。蛍光検出連結を有する試験変形型におけるｈＩｇＥの検出。
方法および物質
抗-ヒトＩｇＥ抗体(抗-ｈＩｇＥ)によるポリスチレン粒子への連結：
抗-ｈＩｇＥを、ＣＤＡＰ(１-シアノ-４-ジメチルアミノピリジニウムブロミド)と共にフェニルデキストランで被覆したポリスチレン粒子(実施例１の通り調製した)に連結した(Kohn J and Wilchek M, FEBS Letters 154(1) (1983) 209-210)。抗-ｈＩｇＥの脱塩および緩衝液置換を、ＮａＨＣＯ3、０．１Ｍ、ｐＨ８．５中のゲル濾過(ＰＤ-１０、Amersham Pharmacia Biotech AB)により行った。
【００７５】
ポリスチレン粒子(２％溶液)０．３５ｇを、ＣＤＡＰ５．２ｍｌ(０．４４Ｍ)およびＴＥＡ(０．２Ｍトリエチルアミン、Riedel-deHaen, Germany)４．２ｍｌで活性化した。ＣＤＡＰを６０秒間攪拌しながら加え、ＴＥＡを１２０秒間攪拌しながら加えた。５倍過剰の氷冷脱イオン水を加えた。粒子を１２，１００×ｇ(２５分、Bechman, J-21, JA-20, 10,1000rpm)で遠心分離した。作成したペレットを氷冷脱イオン水に溶解し、氷冷脱イオン水で一度洗浄し、次いで、１２，０００×ｇで遠心分離した。抗-ｈＩｇＥ５０ｍｇを活性化粒子に連結した(２％、ＮａＨＣＯ3中０．３５ｇ、ｐＨ８．５)。攪拌しながらのインキュベーションを１時間＋４℃で行った。遠心分離後、粒子を、０．１ＭＮａＨＣＯ3、ｐＨ８．５中のグルタミン酸０．０５Ｍおよびアスパラギン酸０．０５Ｍで不活性化した。次いで、インキュベーションおよび攪拌を＋４℃で一夜行った。結合した粒子を２０ｍＭホウ酸緩衝液ｐＨ８．５で２度洗浄した。そして粒子濃度を、参照として非処理粒子を用いＡ600ｎｍのスペクトロメトリーで測定した。結合したタンパク質濃度を、結合において放射活性抗-ｈＩｇＥを存在させることにより測定した。
【００７６】
抗-ｈＩｇＥ抗体による検出粒子への結合：
ペプシンにより、ｆａｂ'２断片に切断したｈＩｇＥに対する抗体を、表面上にアルデヒド基を有する蛍光ポリスチレン粒子に結合した(Molecular Probes C-17177 TransFluoSphere, aldehyde-sulphate microspheres, ０．１μｍ、６３３／７２０、２％固体)。次いで、抗体２３ｍｇを、５０ｍＭＮａＰＯ4、ｐＨ６．５中の粒子６６ｍｇに、室温で一夜かけて結合させた。そして、ＮａＣＮＢＨ4(５Ｍ)を加え、室温で３時間かけて結合を減少させた。遠心分離を５０分間２０，８００×ｇ(Eppendorf 5417R, 14,000rpmで５０分間)行い、次いで、脱イオン水、ｐＨ６．５中のグルタミン酸０．０５Ｍおよびアスパラギン酸０．０５Ｍにおいて不活性化を、室温で一夜攪拌しながら行った。２０，８００×ｇの遠心分離後、ブロッキングを０．０５％ＮａＮ3を伴う５０ｍＭＮａＰＯ4、ｐＨ７．４中の０．２％ＢＳＡで行い、インキュベーションを＋４℃で一夜行った。次いで、遠心分離を２０，８００×ｇで行い、洗浄を、保存用としても使用し得るブロッキング緩衝液を用い２回行った。粒子濃度を、オリジナル粒子で作成する標準曲線を用い、蛍光計(Perkin-Elmer LS50B)で測定した。結合タンパク質濃度を、結合において放射活性ｈＩｇＥを存在させることにより測定した。
【００７７】
膜および適用ゾーンにおける抗-ｈＩｇＥ結合粒子の保持：
実施例１の通り行った。ただし、Inplastor stripの代わりに粘着テープを用いた(片面に接着剤のついている透明なポリエステルArcare ２ミル)。
【００７８】
試験方法：
スペースのある適用ゾーンを伴うストリップを約１６°傾斜してホルダー中にマウントした。ストリップの上(０．５ｃｍ)において(および直近ゾーンとして検出ゾーンを有する)、２つの吸収膜(Whatman, 17Chr, 幅３．４ｃｍ)を相互の上に置く。また、ホルダーにより、吸収膜上に一定圧をかける。試薬による４つのサブゾーンへの同時適用の場合、マルチチャンネルＦｉｎｎピペット(Labsystems)を用いた。マルチピペットを帯電させ、血清サンプル(３０μｌ)を、上流に位置する各適用ゾーン中の緩衝液(１５μｌ)、蛍光粒子連結(３０μｌ)および緩衝液(３０+３０μｌ)の順序で検出ゾーンに直近の適用ゾーンに適用した。ゾーンスペーサーのないストリップへの連続適用の場合、サンプル３０μｌを、より低い端のストリップに最初に適用した。サンプル体積の吸収後、緩衝液(１５μｌ)、検出粒子連結(３０μｌ)および緩衝液(３０＋３０μｌ)を吸収後に連続的に加えた。粒子連結を、ＮａＰＯ4０．１Ｍ、ＢＳＡ３％、ＮａＮ3０．０５％、シュクロース１０％、ＮａＣｌ、０．１５Ｍ、ウシガンマグロブリン０．０５％、ｐＨ７．５からなるアッセイ緩衝液中に懸濁した。時間の測定は、サンプルの適用で開始し、最後の緩衝液が膜に吸収されるまでの時間である。蛍光粒子連結による検出ゾーンへの結合を、赤色のダイオードレーザー(６３５±５ｎｍ)でスキャンニングすることにより定量した。サンプルとして、血漿環境中のＩｇＥ標準濃度を用いた(０．０．５、２、１０、５０および２００ＫＵ／Ｌ)。
【００７９】
結果：
実施例１のように正確に、液体は、存在する順序で適用ゾーンの外に移動した。同時適用を伴う試験全体の時間は約２０分間であり、連続適用の試験の時間は約２５分間であった。
【００８０】
表２：あるゾーン中における連続的適用のランおよび４つのサブゾーンにおける同時適用の分析結果(緩衝液、分析学的に検出可能な反応物、緩衝液、サンプル)
【表２】
0004424848.tif 000003
*＝スキャンニングシグナル(Ｖｍｍ)
【００８１】
表２が示すのは、吸収が、単一のゾーンへの添加と比べて、分離した適用ゾーンを有するストリップに匹敵することである。そのため、実験により示されるのは、まるでサンプル、反応物*および緩衝液が通常の適用ゾーンに連続して添加されるかのように、添加がゾーン配列ＬＺ4Ｂ、ＬＺ3Ｒ＊、ＬＺ2Ｂ、ＬＺ1Ｓに行われるならば、同じ結果となることである。
【００８２】
実施例３：ゾーン配列ＬＺ5Ｂ、ＬＺ4Ｒ＊、ＬＺ3Ｂ、ＬＺ2Ｓ、ＬＺ1Ｂ、ＤＺを有する連続方法。蛍光検出連結を有する試験変形型におけるシラカンバ特異的ｈＩｇＥの検出。
方法および物質
シラカンバ花粉アレルゲンｔ３、Betula verucosaの抽出；
シラカンバ花粉(Allergon, Sweden)の１重量部を、１０体積部の０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．４で抽出した。抽出は２時間、シェーカーテーブル上、＋４℃で続けた。抽出物を４０００ｒｐｍで１．７５時間遠心分離した。濾過後、溶液をＰＤ-１０カラム(Pharmacia Biotech AB)に適用し、０．１ＭＮａＨＣＯ3、ｐＨ８．５で溶出した。ｔ３溶出液(ｔ３抽出物１／１４と名付けた)を、全タンパク質内容物を決定するアミノ酸分析にかけた。
【００８３】
シラカンバ花粉アレルゲンによるポリスチレン粒子への結合：
ｔ３抽出物を、ＣＤＡＰでポリスチレン粒子(実施例１の通りに作成)を被覆したフェニルデキストランに結合させた。結合は、ｈＩｇＥの結合に類似する効果があった。
【００８４】
３０％(体積)アセトン、２％粒子懸濁液中のフェニルデキストランで被覆したポリスチレン粒子(２１２８ｍｇ)を、ＣＤＡＰ９５４ｍｇ(３０％アセトン中１００ｍｇ／ｍｌ)および０．２Ｍトリエチルアミン(ＴＥＡ、Riedel-de Haen, Germany)７．６３ｍｌで活性化した。ＣＤＡＰを攪拌しながら添加し、ＴＥＡを９０秒間滴下し、合計１２０秒間攪拌しながら滴下した。反応は、３０％アセトン(４倍体積)を添加することにより停止し、遠心分離は１２，４００ｇで３５分間行った。粒子を脱イオン水で１度洗浄した。
【００８５】
０．１ＭＮａＨＣＯ3、ｐＨ８．５中のｔ３抽出物１／１４ ６４０ｍｌを活性化粒子に添加し、結合はシェーカーテーブル上で１時間続けた。遠心分離後、粒子を、０．１ＭＮａＨＣＯ3、ｐＨ８．５中の０．０５Ｍアスパラギン酸および０．０５Ｍグルタミン酸で不活性化した。次いで、インキュベーションはシェーカーテーブル上で一夜、＋４℃で行った。次いで、粒子を５０ｍＭ ＮａＰＯ4、０．０５％ＮａＮ3、ｐＨ７．４で２回洗浄した。粒子濃度を、参照として被覆していないポリスチレン粒子を用い６００ｎｍのスペクトロメトリーで測定した。ｔ３-結合ポリスチレン粒子を、全タンパク質内容物の測定用のアミノ酸分析にかける。
【００８６】
膜へのｔ３-結合ポリスチレン粒子の保持：
ポリエステルバッキングを有するニトロセルロースシート(Whatman, ８μｍ、幅５ｃｍ)に、５０ｍＭＮａＰＯ4、１０％シュクロース、０．０５ＮａＮ3、ｐＨ７．４の４％粒子内容物に希釈したｔ３-結合粒子をゾーンに適用した。保持物を１時間３０℃で乾燥した。
【００８７】
緩衝液、サンプルおよび検出粒子連結の適用のためのゾーン：
５つの１ｍｍ幅の粘着テープ(片面に接着剤のついている透明なポリエステルArcare ２ミル)を、保持物質を含むゾーンから離れたウェルに、相互に５ｍｍ離れたゾーンに平行に置く。それによって、テープストリップは５種の５ｍｍ幅のゾーンを決めた。シートを、幅０．５ｃｍのストリップに保持物質を含むゾーンに垂直に切断した(ストリップの長さは５ｃｍとなった)(Singulator: Matrix 1201 membrane cutter, Kinematic automation)。最終ステップは、ゾーンスペーサーとしてテープストリップにより分離した５つのゾーン(適用ゾーン)および保持したシラカンバ花粉を伴う分離ゾーン(検出ゾーン)を示す。ゾーンスペーサーのない、すなわち、分離した適用ゾーンのないストリップを比較として調製した。
【００８８】
試験方法：
分離した適用ゾーンを有するストリップをマウントし、試薬を実施例２のように適用した。緩衝液(２０μｌ)を適用ゾーンに最も近いゾーンに適用し、次いで、各適用ゾーン中の血清サンプル(３０μｌ)、緩衝液(２０μｌ)、検出粒子連結(２０μｌ)および緩衝液(３０＋３０μｌ)が上流に位置した。ゾーンスペーサーのないストリップに連続適用する場合、緩衝液２０μｌを、より低い端のストリップに最初に適用し、その吸収後、サンプル３０μｌを同じ位置に適用し、次いで、緩衝液(２０μｌ)、蛍光粒子連結(２０μｌ)および緩衝液(３０+３０μｌ)を適用した。すべての適用の前に、前述の適用をストリップ中により吸収させた。検出粒子連結および緩衝液は実施例２の通りである。
【００８９】
結果：
５つのサブゾーンからなる適用ゾーンにより、そしてその同時添加により、上記実施例のように正確に液体が存在する順序で適用ゾーンの外に移動した。同時添加を伴うすべての試験に必要な時間は約２１分間であり、連続的添加を伴うすべての試験に必要な時間は約２７分間であった。
【００９０】
表３：あるゾーン中における連続的添加のランおよび４つのサブゾーンにおける同時添加の分析結果(緩衝液、分析学的に検出可能な反応物、緩衝液、サンプル)
【表３】
0004424848.tif 000004
*＝スキャニングシグナル(Ｖｍｍ)
【００９１】
表３が示すのは、吸収が、単一のゾーンへの添加と比べて、分離した適用ゾーンを有する、ある範囲のストリップに減少することである。しかし、減少は端であり、同時適用の流速が幾らか遅れるという事実に恐らく起因する。そのため、実験により示されるのは、まるでサンプル、反応物*および緩衝液が通常の適用ゾーンに連続して添加されるかのように、本質的に同じ結果によりゾーン配列ＬＺ5Ｂ、ＬＺ4Ｒ＊、ＬＺ3Ｂ、ＬＺ2Ｓ、ＬＺ1Ｂへの同時適用が達成され得ることである。