(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
β−、γ−又はδ−トコトリエノールを有効成分とする糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症、未熟児網膜症、加齢黄斑変性症、緑内症、又は強皮症治療剤
【請求項２】
γ−又はδ−トコトリエノールを有効成分とする糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症、未熟児網膜症、加齢黄斑変性症、緑内症、慢性関節リウマチ、又は強皮症治療剤
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、トコトリエノールを有効成分とする血管新生阻害剤、細胞増殖阻害剤、管腔形成阻害剤及び繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）阻害剤に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
血管新生とは、既存の血管から新しい血管が形成される現象であり、次のステップよりなる。(１)血管新生因子が内皮細胞に血管新生シグナルを伝達し、内皮細胞が近傍の基底膜と細胞外基質を消化する。(２)血管内皮細胞が遊走し、増殖する。(３)血管内皮細胞が管腔を形成（血管新生）し、毛細血管網を形成する。この血管新生は固形腫瘍や糖尿病性網膜症、慢性関節リウマチ、血管腫、歯周病、強皮症、緑内障、乾癬、加齢黄斑変性症などの病変において発症・進行するときに発生することが観察され、それぞれの病態の進展を助長すると考えられている。上記各種疾患の治療及び予防のため、様々な血管新生阻害剤が開発されているが、未だ、実用化されたものはなく、副作用のない安全な血管新生阻害作用を有する化合物の探索が望まれている。
【０００３】
ところで、トコフェロール又はその誘導体を有効成分として含有する分子量４７キロダルトンの熱ショックタンパク質の合成抑制剤が知られている（特開平９−４０５５６号公報）。上記誘導体にはトコトリエノール同族体、すなわち、α−，β−，γ−及びδ−トコトリエノールが含まれている。この発明は、肝硬変や強皮症などの細胞外マトリックス産生の病態を示す病気の治療を意図しており、これらの病気に伴う線維化がコラーゲンの合成の増加にあること、及び前記熱ショックタンパク質の発現の増大につれてコラーゲンの合成も増加することが示されている。更に、血管新生においても基底膜中のコラーゲン合成が重要な役割を果たすことを指摘し、この合成抑制剤が、血管新生の異常増殖に基づく疾患、すなわち、糖尿病性網膜症、緑内障、リューマチ性関節炎等にも有効であるとしている。しかしながら、この発明では、ビタミンＥであるα−トコフェロールが特に好ましいとしており、α−トコフェロールのみが実施例で示されている。トコトリエノールについては、単に列挙されているにとどまり、その具体的内容は全く示されていない。
【０００４】
一方、トコフェロール類には血管新生阻害作用がないと言われていたが、本発明者らも本明細書において後述する比較実験により確認している。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、安全性に問題がなく、α−トコフェロールよりはるかにすぐれた血管新生阻害作用、細胞増殖阻害作用、管腔形成阻害作用及びＦＧＦ阻害作用を発揮する阻害剤を提供し、もって、血管新生の異常増殖に基づく疾患の治療に寄与することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意検討の結果、トコトリエノールが、特にβ−，γ−及びδ−トコトリエノールがα−トコフェロールよりはるかにすぐれた血管新生阻害作用、細胞増殖阻害作用、管腔形成阻害作用及びＦＧＦ阻害作用を有することを見出し、この知見に基づいて本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、
β−、γ−又はδ−トコトリエノールを有効成分とする糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症、未熟児網膜症、加齢黄斑変性症、緑内症、又は強皮症治療剤
γ−又はδ−トコトリエノールを有効成分とする糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症、未熟児網膜症、加齢黄斑変性症、緑内症、慢性関節リウマチ、又は強皮症治療剤
を提供するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】
トコトリエノールには、α−トコトリエノール、β−トコトリエノール、γ−トコトリエノール及びδ−トコトリエノールの４つの同族体がある。これらはいずれも血管新生阻害作用、細胞増殖阻害作用、管腔形成阻害作用及びＦＧＦ阻害作用を発揮するが、α−トコトリエノールに比べてβ−トコトリエノール、γ−トコトリエノール及びδ−トコトリエノールが格段に大きな作用を発揮する。これらのトコトリエノールはいずれもＬ−体とＤ−体があるが、これらはいずれも使用することができ、更に上記４種の同族体の２以上の混合物であってもよい。この場合、α−トコトリエノールは、混合物中に有効成分であるβ−トコトリエノール、γ−トコトリエノール及び／又はδ−トコトリエノールの有効量が存在していれば、共存していても、存在していなくても良いものである。従って、天然由来の原料から抽出・分離した後にα−トコトリエノールが含まれていても相互作用により効果が相殺されることがないので特に制限する必要はない。むしろ、医薬としての効果、服用・摂取のし易さ、精製を繰り返すことによるコストの面から、混合物に含まれるα−トコトリエノールの使用量を選択すれば良い。
【０００９】
また、上記トコトリエノールは、生体内でトコトリエノールを遊離することができるエステルの形態であってもよい。このエステルは、好ましくは、飽和又は不飽和脂肪酸とのエステルである。
【００１０】
トコトリエノールは、天然物の圧搾、天然物からの抽出、合成などの方法で得られる。一般的には、ヤシ科植物の果皮及び／又は種子から抽出される。天然物の抽出物から得られるトコトリエノールは複数のトコトリエノール同族体の混合物である。
【００１１】
天然物からは公知の方法に従って製造することができる。例えば、抽出物に水を加えて分離し、油層分をカラムクロマトグラフィーで分離精製してトコフェロール類を全く含まないか、または痕跡程度に含むトコトリエノールを調製することができる。各トコトリエノール同族体の比率及び含量は、常法に従って、例えば、液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などにて測定することができる。
【００１２】
トコトリエノールの各同族体は、α−トコトリエノール、β−トコトリエノール、γ−トコトリエノール、δ−トコトリエノールとして市販されている。
【００１３】
又は、常法により、抽出濃縮したトコトリエノールを更にカラムクロマトグラフィーに付し、α−トコトリエノール、β−トコトリエノール、γ−トコトリエノール及びδ−トコトリエノールの各成分に単離精製することができる。
【００１４】
本発明の各阻害剤はトコトリエノールのみからなるものであってもよく、用途等に応じた他の成分を含むものであってもよい。この他の成分の例としては水やパーム油を挙げることができる。水やパーム油の使用量は剤形により異なり特に限定されるものではないが、成分中に有効成分であるβ−トコトリエノール、γ−トコトリエノール、δ−トコトリエノールの有効量が存在していれば任意の比率で含むことができる。例えば、液剤として用いる場合は、０．０１〜９９重量％、好ましくは０．０１〜９０重量％である。
【００１５】
本発明の各阻害剤はそれぞれの阻害作用が効果を発揮する疾患の治療剤及び予防剤として使用することができる。この対象となる疾患は、発症メカニズムにより異なるが、血管新生阻害剤は、固形腫瘍、糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症、未熟児網膜症、加齢黄斑変性症、血管新生緑内症、慢性関節リウマチ、血管腫、歯周病、強皮症、乾癬等であり、細胞増殖阻害剤は、固形腫瘍、糖尿病性網膜症、慢性関節リウマチ、血管腫、歯周病、強皮症、緑内障、乾癬、加齢黄班変性症等であり、管腔形成阻害剤は、固形腫瘍、糖尿病性網膜症、慢性関節リウマチ、血管腫、歯周病、強皮症、緑内障、乾癬、加齢黄班変性症等であり、ＦＧＦ阻害剤は、ＦＧＦによる皮膚細胞の増殖、血管新生、細胞増殖が過剰に活性化されることを防ぐので、固形腫瘍、糖尿病性網膜症、慢性関節リウマチ、血管腫、強皮症、緑内障、乾癬、加齢黄班変性症等に有効である。
【００１６】
これらの治療剤及び予防剤は、ヒト以外の動物、例えば、牛、馬、豚、羊等の家畜用哺乳類、鶏、ウズラ、ダチョウ等の家禽類、は虫類、鳥類或いは小型哺乳類等のペット類、養殖魚類等にも用いることができる。
【００１７】
本発明の製薬組成物は、常法により、例えば、錠剤、舌下錠、丸剤、坐剤、散剤、粉剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、マイクロカプセル剤、注射剤、乳剤、貼付剤などの形態に製剤化することができる。例えば、錠剤は薬理的に受容しうる担体と均一に混合して打錠することにより、また、散剤、粉剤、顆粒剤は薬剤と担体とを溶液又は懸濁液とし、常法により、例えば、噴霧乾燥法又は凍結乾燥法などにより乾燥することにより製造できる。
【００１８】
散剤、粉剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤はラクトース、グルコース、スクロース、マンニトールなどの賦形剤、でんぷん、アルギン酸ソーダなどの崩壊剤、マグネシウムステアレート、タルクなどの滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの表面活性剤、グリセリンなどの可塑剤などを用いて製造できる。
【００１９】
本発明の製剤組成物には必要ならばさらに他の抗酸化剤を添加してもよい。抗酸化剤は特に限定されるものでなく、抗酸化作用を有するものであれば適用可能である。例えば、レチノール、３，４−ジデヒドロレチノールなどのビタミンＡ類、ビタミンＢ、Ｄ−アスコルビン酸、Ｌ−アスコルビン酸などのビタミンＣ類、α−トコフェロール、β−トコフェロール、γ−トコフェロール、δ−トコフェロール、酢酸ビタミンＥ、コハク酸ビタミンＥなどのビタミンＥ類、リン酸ビタミンＥ類、コエンザイムＱ、フラボノイド、タンニン、エラグ酸、ポリフェノール類、ラジカル阻止剤、ヒドロペルオキシド分解剤、金属キレート剤、活性酸素除去剤、α−カロチン、β−カロチン、γ−カロチン、及びδ−カロチンを含むカロチン類、トコキノン、及びこれらの薬学的に許容できる塩、並びにそれらの混合物からなる群から１種または２種以上選択することができる。
【００２０】
注射剤は、有効成分を必要に応じてｐＨ調製剤、緩衝剤、溶解剤、懸濁剤等、張化剤、安定化剤、防腐剤などの存在下、常法により製剤化することができる。
【００２１】
また、必要に応じて、常法により凍結乾燥製剤とすることができる。
【００２２】
懸濁剤としては、例えば、ポリソルベート８０、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ナトリウムカルボキシルメチルセルロース、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、アラビアガム、粉末トラガントなどを挙げることができる。溶解剤としては、例えば、ポリソルベート８０、水添ポリオキシエチレンヒマシ油、ニコチン酸アミド、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、マクロゴール、ヒマシ油脂肪酸エチルエステルなどを挙げることができる。安定化剤としては、例えば亜硫酸ナトリウム、メタ亜硫酸ナトリウムなどを挙げることができる。防腐剤としては、例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エチル、ソルビン酸、フェノール、クレゾール、クロロクレゾールなどを挙げることができる。
【００２３】
本発明の各阻害剤におけるβ−，γ−又はδ−トコトリエノールの含有量（２種以上の場合は合計量）は０．０１〜９９重量％、好ましくは１〜９９重量％の量で含有させることができる。
【００２４】
本発明の各阻害剤の投与量は、病気の種類、患者の年齢、性別、体重、症状の程度、又は投与方法などにより異なり、特に制限はないが、通常成人１人当り３０〜３０００ｍｇ程度、好ましくは１００〜３０００ｍｇ程度を、１日１〜４回程度にわけて、経口的に又は非経口的に投与する。
【００２５】
本発明に用いられるトコトリエノールは、急性毒性はもちろん目立った慢性毒性も認められない安全なものであることが知られている（例えば、特開昭５８−９６０２１号公報）。
【００２６】
本発明の有効成分を食品に利用する場合、上記のトコトリエノールのβ−，γ−，δ−トコトリエノールの各異性体の有効量及びそれらの混合物のいずれかを適宜組み合わせて使用することができる。トコトリエノールは、そのままの形態、オイル等に希釈した形態、乳液状形態食、又は食品業界で一般的に使用される担体を添加した形態等のものを調製してもよい。
【００２７】
乳液状形態のものは、例えば、油相部にトコトリエノール又はその混合物を添加し、更にグリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、グリセロール、デキストリン、ナタネ油、大豆油、コーン油等の液状の脂肪を加え、水相部にＬ−アスコルビン酸或いはそのエステル又は塩、例えばローカストビーンガム、アラビアガム又はゼラチン等のガム質、例えばヘスペリジン、ルチン、ケルセチン、カテキン、チアニジン等のフラボノイド類又はポリフェノール類或いはその混合物等を添加し、乳化することによって調製できる。
【００２８】
飲料の形態は、非アルコール飲料又はアルコール飲料である。非アルコール飲料としては、例えば、炭酸系飲料、果汁飲料、ネクター飲料等の非炭酸系飲料、清涼飲料、スポーツ飲料、茶、コーヒー、ココア等、又、アルコール飲料の形態ではリキュール、薬用酒等の一般食品の形態を挙げることができる。
【００２９】
飲食物としては、具体的には以下のものを例示することができる。洋菓子類（プリン、ゼリー、グミキャンディー、キャンディー、ドロップ、キャラメル、チューインガム、チョコレート、ペストリー、バタークリーム、カスタードグリーム、シュークリーム、ホットケーキ、パン、ポテトチップス、フライドポテト、ポップコーン、ビスケット、クラッカー、パイ、スポンジケーキ、カステラ、ワッフル、ケーキ、ドーナツ、ビスケット、クッキー、せんべい、おかき、おこし、まんじゅう、あめ等）、乾燥麺製品（マカロニ、パスタ）、卵製品（マヨネーズ、生クリーム）、飲料（機能性飲料、乳酸飲料、乳酸菌飲料、濃厚乳性飲料、果汁飲料、無果汁飲料、果肉飲料、透明炭酸飲料、果汁入り炭酸飲料、果実着色炭酸飲料）、嗜好品（緑茶、紅茶、インスタントコーヒー、ココア、缶入りコーヒードリンク）、乳製品（アイスクリーム、ヨーグルト、コーヒー用ミルク、バター、バターソース、チーズ、発酵乳、加工乳）、ペースト類（マーマレード、ジャム、フラワーペースト、ピーナッツペースト、フルーツペースト、果実のシロップ漬け）、畜肉製品（ハム、ソーセージ、ベーコン、ドライソーセージ、ビーフジャーキー、ラード）、魚介類製品（魚肉ハム、魚肉ソーセージ、蒲鉾、ちくわ、ハンペン、魚の干物、鰹節、鯖節、煮干し、うに、いかの塩辛、スルメ、魚のみりん干し、貝の干物、鮭等の燻製品）、佃煮類（小魚、貝類、山菜、茸、昆布）、カレー類（即席カレー、レトルトカレー、缶詰カレー）、調味料剤（みそ、粉、末みそ、醤油、粉末醤油、もろみ、魚醤、ソース、ケチャップ、オイスターソース、固形ブイヨン、焼き肉のたれ、カレールー、シチューの素、スープの素、だしの素、ペースト、インスタントスープ、ふりかけ、ドレッシング、サラダ油）、揚げ製品（油揚げ、油揚げ菓子、即席ラーメン）、豆乳、マーガリン、ショートニング等を挙げることができる。
【００３０】
上記飲食物は、トコトリエノールを常法に従って、一般食品の原料と配合することにより、加工製造することができる。
【００３１】
上記飲食物へのトコトリエノールの配合量は食品の形態により異なり特に限定されるものではないが、通常は０．００１〜１０％が好ましい。トコトリエノールの使用量は、トコトリエノールとして血管新生の発症又は進行を抑制するのに１日当り、必要な量だけ含まれるように調製する。現在知られている限り成人１日摂取量当りトコトリエノールとして１０〜３，０００ｍｇ、好ましくは１００〜１，０００ｍｇであるが、その量は、食品の形態により使用者が適宜選択できる。
【００３２】
上記飲食物は、機能性食品、栄養補助食品或いは健康食品類としても用いることができる。その形態は、特に限定されるものではなく、例えば、食品の製造例としては、アミノ酸バランスのとれた栄養価の高い乳蛋白質、大豆蛋白質、卵アルブミン等の蛋白質、これらの分解物、卵白のオリゴペプチド、大豆加水分解物等の他、アミノ酸単体の混合物等を、常法に従って使用することができる。又、ソフトカプセル、タブレット等の形態で利用することもできる。
【００３３】
栄養補助食品或いは機能性食品の例としては、糖類、脂肪、微量元素、ビタミン類、乳化剤、香料等が配合された流動食、半消化態栄養食、成分栄養食、ドリンク剤、カプセル剤、経腸栄養剤等の加工形態を挙げることができる。上記各種食品には、例えば、スポーツドリンク、栄養ドリンク等の飲食物は、栄養バランス、風味を良くするために、更にアミノ酸、ビタミン類、ミネラル類等の栄養的添加物や甘味料、香辛料、香料、色素等を配合することもできる。
【００３４】
本発明の薬剤の有効成分であるトコトリエノールを安定化させるために抗酸化剤、例えば、トコフェロール、Ｌ−アスコルビン酸、ＢＨＡ、ローズマリー抽出物等を常法に従って併用することができる。
【００３５】
本発明の飲食物は、家畜、家禽、ペット類の飼料用に応用することができる。例えば、ドライドッグフード、ドライキャットフード、ウェットドッグフード、ウェットキャットフード、セミモイストドックフード、養鶏用飼料、牛、豚等の家畜用飼料に配合することができる。飼料自体は、常法に従って調製することができる。
【００３６】
【実施例】
先ず、実施例に用いた、使用細胞、培養条件、使用サンプル〔トコトリエノール、トコトリエノールの各同族体、α−トコフェロール及び繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）〕について、又、これらのサンプルの使用方法について説明する。
【００３７】
尚、ＭＴＴは２−４，３−(４，５−ジメチルチアゾール−２−イル)−２，５−ジフェニルテトラゾリウムプロミド、ＬＤＨはＬａｃｔａｔｅ Ｄｅｈｙ ｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ＭＥＭはミニマム エッセンシャル メディウムの略である。又、ＷＳＴは２−(４−Ｉｏｄｏｐｈｅｎｙｌ)−３−(４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ)−５−(２，４−ｄｉｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ)−２−Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔの略である。
【００３８】
(１)  使用細胞
正常ウシ大動脈由来内皮細胞（Ｎｏｒｍａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ａｏｒｔｉｃ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ：ＢＡＥＣ）は、セルシステムズ社製のものを大日本製薬株式会社より購入した。
【００３９】
(２)  培養条件
細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ血清（ＦＢＳ）とペニシリン−ストレプトマイシン（各２０ＩＵ／ｍｌ）を加えたＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ）（以下、ＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）を用いて１×１０5細胞／ｍｌとなるように調製し、Ｉ型コラーゲンでコートしてある６０ｍｍディッシュを用いて、５％ＣＯ2インキュベーター（３７℃）で培養し、２〜３日おきに継代した。
【００４０】
(３)  使用サンプル
(３−１)  トコトリエノール混合物：
トコトリエノールの成分が、α−トコトリエノール１８．９重量％、γ−トコトリエノール２２．６重量％、δ−トコトリエノール１．２重量％、α−トコフェロール０．０重量％、その他４５．３重量％（主に水又はパーム油）のものを用いた。
【００４１】
(３−２)  トコトリエノール同族体：
市販のα−トコトリエノール、β−トコトリエノール、γ−トコトリエノール、及びδ−トコトリエノール（商品名『Ｔｏｃｏｔｒｉｅｎｏｌ』，ＤＬ−体，ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製）をエタノールに溶解して用いた。
【００４２】
(３−３)  α−トコフェロール：
市販のα−トコフェロール（Ｗａｋｏ社製）をエタノールに溶解して用いた。
【００４３】
(３−４)  繊維芽細胞成長因子（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ：ＦＧＦ）：
市販品（Ｓｉｇｍａ社製）をＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ社製）に溶解して用いた。
【００４４】
上記の各サンプルは、２％（ｖ／ｖ）ウシ血清（ＦＢＳ）とペニシリン−ストレプトマイシン（各２０ＩＵ／ｍｌ）を加えたＭＥＭ（以下、ＭＥＭ＋２％ＦＢＳ）中に含ませて用いた。
【００４５】
実施例１〜５  トコトリエノールがＢＡＥＣ細胞増殖に及ぼす効果
ＭＴＴアッセイにより、ＢＡＥＣの細胞増殖への影響を見た。
コンフルエントに増殖したＢＡＥＣをトリプシン処理し、ＭＥＭ＋１０％ＦＢＳを用いて１×１０4細胞／ｍｌの浮遊液とした。９６穴マイクロプレート（４枚）に細胞を１００μｌ／ｗｅｌｌで播種した後、ＣＯ2インキュベーター内で一晩インキュベートした。各ｗｅｌｌ内の培養液を除去して、サンプルを含む培地（ＭＥＭ＋２％ＦＢＳ）１００μｌに交換し、インキュベートを続けた。９６時間後のものについては、４８時間後に一度、培地を交換した。サンプル入り培地を加えてから０、２４、４８、９６時間後に、それぞれのマイクロプレートを取り出し、ＭＴＴ溶液〔３ｍｇ／ｍｌ ＰＢＳ（−）〕を５０μｌ／ｗｅｌｌで添加した後、ＣＯ2インキュベーター内で３時間インキュベートした。ＰＢＳ（−）を各ｗｅｌｌいっぱいに加えた後、液を吸引した後、０．０４ｍｏｌ／ｌ塩酸を含むイソプロピルアルコールを２００μｌずつ加えた。暗所に一晩置いた後、マイクロプレートリーダーを用い、各ｗｅｌｌについて５９５ｎｍ及び６５５ｎｍ（ｄｕａｌ）の吸光度を測定した。
【００４６】
サンプルとしてトコトリエノール混合物、ＤＬ−α−トコトリエノール、ＤＬ−β−トコトリエノール、ＤＬ−γ−トコトリエノール、ＤＬ−δ−トコトリエノールを用いてＭＴＴアッセイを行った。サンプル無添加のものを対照群Ａとした。
【００４７】
比較例１
前記実施例１のＤＬ−α−トコトリエノールをα−トコフェロールに代えた以外は実施例１と同様にしてアッセイした。
【００４８】
上記実施例１〜５及び比較例１のサンプルの種類、使用量、アッセイ時間及びその結果を表１に示す。
尚、表中、ｎ＝８、ＭＴＴアッセイの結果はＭｅａｎ±ＳＥで示す。
【００４９】
【表１】
0004447198.tif 000002
【００５０】
ＤＬ−β−トコトリエノール、ＤＬ−γ−トコトリエノール、ＤＬ−δ−トコトリエノールは１０μＭ添加により阻害作用が見られる。
【００５１】
一方、ＤＬ−α−トコトリエノールは１０μＭ添加では、対照群に比べると同等であった。また、α−トコフェロールは１００μＭ添加でも改善が観察されなかった。
【００５２】
実施例６〜１１  トコトリエノールのＦＧＦ阻害試験
ＦＧＦ活性に及ぼすトコトリエノール混合物、ＤＬ−α−トコトリエノール、ＤＬ−β−トコトリエノール、ＤＬ−γ−トコトリエノール、ＤＬ−δ−トコトリエノールの効果を前記実施例１〜５と同様にしてＭＴＴアッセイにて試験した。サンプル無添加のものを対照群Ｂとした。
【００５３】
実施例６〜１１のサンプルの種類と使用量、インキュベート時間及びその結果を表２に示す。
【００５４】
比較例２
実施例７のＤＬ−α−トコトリエノールに代えてα−トコフェロールを用いて以下実施例７と同様にして試験した。
【００５５】
比較例２のサンプルの種類、使用量及びインキュベートした時間及びその結果は表２に示す。
尚、表中、ｎ＝８、ＭＴＴアッセイの結果はＭｅａｎ±ＳＥで示す。
【００５６】
【表２】
0004447198.tif 000003
【００５７】
実施例１２〜１４  血管新生のアッセイ
ＢＡＥＣを２層のＩ型コラーゲンゲル間で培養し、形成された管腔様網目構造を評価した。
【００５８】
コンフルエントに増殖したＢＡＥＣをトリプシン処理し、ＭＥＭ＋１０％ＦＢＳを用いて１×１０5細胞／１．５ｍｌの浮遊液とした。Ｉ型コラーゲンでコートしてある１２穴マイクロプレートに１．５ｍｌ／ｗｅｌｌで細胞を播種した後、ＣＯ2インキュベーター内で一晩インキュベートした。以下の試薬をチューブに入れ、氷冷下ですばやく混ぜた〔Ｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｌｌａｇｅｎ（ｃｏｌｌａｇｅｎ社）８ｖｏｌ，０．１Ｎ ＮａＯＨ  １ｖｏｌ，×１０ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）１ｖｏｌ〕。培養液を吸引除去し、上記で調製したコラーゲンを０．５ｍｌ／ｗｅｌｌで細胞上に分注した。これをＣＯ2インキュベーター内に約３０分置いてゲル化させた。サンプルを含むｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ＋２％ＦＢＳ）１．５ｍｌを加え、その後１日おきにｍｅｄｉｕｍ交換しながらインキュベートを続けた。
【００５９】
細胞の変化を顕微鏡で観察し、写真撮影し、管腔を形成している細胞の分岐数を数えることで、管腔形成について評価した。
【００６０】
実施例１２〜１４のサンプルの種類、使用量およびその結果（管腔形成細胞数／ｃｍ2）は表３に示す。サンプル無添加のものを対照群Ｃとした。
尚、表中、ｎ＝４、管腔形成細胞数／ｃｍ2の結果はＭｅａｎ±ＳＥで示す。
【００６１】
【表３】
0004447198.tif 000004
【００６２】
上記結果からトコトリエノールを２μＭ以上使用することにより、管腔形成細胞数が減少し、２５μＭの添加量では管腔形成細胞が全く見られないことが分かる。
【００６３】
実施例１５〜２０  管腔形成阻害試験
前記実施例１２〜１４のトコトリエノール混合物に代えて、ＤＬ−α−トコトリエノール、ＤＬ−β−トコトリエノール、ＤＬ−γ−トコトリエノール、ＤＬ−δ−トコトリエノールを用いて、以下前記実施例１２と同様にして管腔形成阻害試験を行った。
【００６４】
実施例１５〜２０のサンプルの種類、使用量及びその結果（管腔形成細胞数／ｃｍ2）は表４に示す。サンプル無添加のものを対照群Ｄとした。
尚、表中、ｎ＝４、管腔形成細胞数／ｃｍ2の結果はＭｅａｎ±ＳＥで示す。
【００６５】
比較例３
上記実施例１５のＤＬ−α−トコトリエノールに代えてα−トコフェロールを用いて、以下前記実施例１５と同様にして管腔形成阻害試験を行った。
【００６６】
比較例３のサンプルの種類、使用量及びその結果（管腔形成細胞数／ｃｍ2）は表４に示す。
【００６７】
【表４】
0004447198.tif 000005
【００６８】
上記表４の結果から、ＤＬ−δ−トコトリエノールは１０μＭの添加量で管腔形成を完全に阻害し、ＤＬ−γ−トコトリエノール、及びトコトリエノール混合物も管腔形成を充分に阻害した。ＤＬ−α−トコトリエノールは１０μＭの添加量では対照群に比べて同等であったが添加量を増加させると３０μＭ以上では管腔形成を阻害し、５０μＭでは完全に阻害した。一方、比較例として用いたα−トコフェロールは１００μＭの添加量でも管腔形成を阻害しなかった。
【００６９】
実施例２１〜２６  ＦＧＦにより誘発される管腔形成の阻害試験
ＦＧＦにより誘発される管腔形成をトコトリエノール混合物、ＤＬ−α−トコトリエノール、ＤＬ−β−トコトリエノール、ＤＬ−γ−トコトリエノール、ＤＬ−δ−トコトリエノールが阻害するか試験した。サンプル無添加のものを対照群Ｅとした。ＦＧＦはトコトリエノールと同時に加えた。
【００７０】
実施例２１〜２６のサンプルの種類、添加量、その結果（管腔形成細胞数／ｃｍ2）は表５に示す。
尚、表中、ｎ＝４、管腔形成細胞数／ｃｍ2の結果はＭｅａｎ±ＳＥで示す。
【００７１】
比較例４
実施例２２のＤＬ−α−トコトリエノールに代えてα−トコフェロールを用いた以外は実施例２２と同様にして試験した。
【００７２】
比較例４サンプルの種類、添加量、その結果（管腔形成細胞数／ｃｍ2）は表５に示す。
【００７３】
【表５】
0004447198.tif 000006
【００７４】
表５の結果から、ＤＬ−α−トコトリエノール、ＤＬ−β−トコトリエノール、ＤＬ−γ−トコトリエノール、ＤＬ−δ−トコトリエノールはＦＧＦに誘導される管腔形成を阻害することが分かる。特にＤＬ−β−トコトリエノール及びＤＬ−δ−トコトリエノールは１０μＭで管腔形成を完全に阻害した。
【００７５】
実施例２７〜２９  ＬＤＨ活性測定
サンプルによるＢＡＥＣに対する細胞障害率を評価するために、培地中の遊離ＬＤＨ活性をＬＤＨ−細胞毒性テスト（Ｗａｋｏ社製）のキットを用いて測定した。
【００７６】
コンフルエントに増殖したＢＡＥＣをトリプシン処理し、ＭＥＭ＋１０％ＦＢＳを用いて５×１０4細胞／ｍｌの浮遊液とした。９６穴マイクロプレートに、細胞を１００μｌ／ｗｅｌｌで播種した後、ＣＯ2インキュベーター内で一晩インキュベートした。各ｗｅｌｌ内の培養液を除去してサンプルを含む培地（ＭＥＭ＋２％ＦＢＳ）１００μｌに交換し、インキュベートを続けた。ネガティブコントロール（ＮＣ）としてＭＥＭ＋２％ＦＢＳを、ポジティブコントロール（ＰＣ）としてＭＥＭ＋２％ＦＢＳで溶解した０．２％Ｔｗｅｅｎ２０を使用した。４８時間後、ｗｅｌｌ内の培地を５０μｌずつ別の新しいｗｅｌｌに移し、キットの発色試薬を５０μｌずつ加えた後、室温で４５分間インキュベートした。０．５Ｎ ＨＣｌを１００μｌずつ加えて反応を停止し、５９５ｎｍの吸光度を測定し、以下に示す計算式により細胞障害率を求めた。
細胞障害率＝（Ｓ−Ｎ）／（Ｐ−Ｎ）×１００（％）
Ｓ＝サンプルでの吸光度
Ｎ＝ネガティブコントロールでの吸光度
Ｐ＝ポジティブコントロールでの吸光度
【００７７】
実施例２７〜２９のサンプルの種類、添加量、その結果〔細胞障害率（％ ｏｆ ｃｏｎｔｒｏｌ）〕を表７に示す。サンプル無添加のものを対照群Ｆとした。
尚、表中、ｎ＝４、細胞障害率は、Ｍｅａｎ±ＳＥで示す。
【００７８】
比較例５〜７
実施例２７のトコトリエノール混合物に代えてα−トコフェロールを使用した以外は、実施例２７と同様にして試験した。
【００７９】
比較例５〜７のサンプルの種類、添加量、その結果〔細胞障害率（％ ｏｆ ｃｏｎｔｒｏｌ）〕を表６に示す。
【００８０】
【表６】
0004447198.tif 000007
【００８１】
表６の結果から、トコトリエノールの細胞障害作用がトコフェロールより強いことが分かる。
【００８２】
実施例３０〜３４
前記実施例２７のトコトリエノール混合物に代えて、ＤＬ−α−トコトリエノール、ＤＬ−β−トコトリエノール、ＤＬ−γ−トコトリエノール、ＤＬ−δ−トコトリエノールの各同族体を用いた以外は実施例２７と同様にして細胞障害率（％ ｏｆ ｃｏｎｔｒｏｌ）を求めた。実施例３０〜３４のサンプルの種類、添加量、その結果〔細胞障害率（％ ｏｆ ｃｏｎｔｒｏｌ）〕を表８に示す。無添加のものを対照群Ｇとした。
尚、表中、ｎ＝５、細胞障害率（％ ｏｆ ｃｏｎｔｒｏｌ）はＭｅａｎ±ＳＥを示す。
【００８３】
比較例８
前記実施例３０のＤＬ−α−トコトリエノールに代えてα−トコフェロールを使用した以外は実施例３０と同様にして試験した。
【００８４】
【表７】
0004447198.tif 000008
【００８５】
表７の結果から、ＤＬ−α−トコトリエノール、ＤＬ−β−トコトリエノール、ＤＬ−γ−トコトリエノール、ＤＬ−δ−トコトリエノールは細胞を傷害することがわかる。
【００８６】
一方、α−トコフェロールは１００μＭ投与しても対照群と同等であり、細胞障害作用はなかった。
【００８７】
実施例３５〜４０
ＦＧＦに対するＤＬ−α−トコトリエノール、ＤＬ−β−トコトリエノール、ＤＬ−γ−トコトリエノール、ＤＬ−δ−トコトリエノール及びトコトリエノール混合物の細胞障害作用を試験した。試験方法は、ＦＧＦを加えたほかは実施例２７〜２９に準じた。
【００８８】
実施例３５〜４０のサンプルの種類及びその結果〔（細胞障害率（％ ｏｆ ｃｏｎｔｒｏｌ）〕を表８に示す。サンプル無添加物を対照群Ｈとした。
尚、表中、ｎ＝４、細胞障害率（％ ｏｆ ｃｏｎｔｒｏｌ）を示す。
【００８９】
比較例９
前記実施例３６のＤＬ−α−トコトリエノールに代えてα−トコフェロールを用いた以外は実施例３６と同様にして細胞障害率を求めた。
【００９０】
実施例３５〜４０及び比較例９のサンプルの種類及びその結果〔細胞障害率（％ ｏｆ ｃｏｎｔｒｏｌ）〕を表８に示す。
【００９１】
【表８】
0004447198.tif 000009
【００９２】
ＦＧＦの細胞増殖、管腔形成及び細胞毒性に及ぼすトコトリエノールの影響を下記表にまとめた。
【００９３】
【表９】
0004447198.tif 000010
【００９４】
表中、↑は促進、／は増加傾向、→は変化なし、↓は抑制、↓↓は強く抑制、−は毒性がない、＋毒性がややある、＋＋は毒性があることを示す。
【００９５】
表９の結果から、トコトリエノール混合物、ＤＬ−β−トコトリエノール、ＤＬ−γ−トコトリエノール、ＤＬ−δ−トコトリエノールは、各１０μＭで管腔形成阻害効果（β＝δ＞γ）を示した。ＤＬ−α−トコトリエノールは前記管腔形成阻害試験の結果から使用量を１０μＭ以上とすることにより管腔形成阻害効果が得られるものと考えられる。
【００９６】
一方、α−トコフェロールは１００μＭでも阻害効果が認められなかった。
【００９７】
実施例４１〜６０  トコトリエノールがＢＡＥＣ細胞増殖に及ぼす効果
ＢＡＥＣ細胞増殖に対するトコトリエノールの影響を種々の濃度で検討した。この目的のため、細胞増殖の測定法としては従来法であるＭＴＴの代わりに、高感度測定が可能なＷＳＴ−１を用いて細胞生存能力を定量した。
【００９８】
コンフルエントに増殖したＢＡＥＣをトリプシン処理し、ＭＥＭ＋１０％ＦＢＳを用いて、２×１０4細胞／ｍｌの細胞浮遊液とした。Ｉ型コラーゲンでコートしてある９６穴マイクロプレートに細胞を１００μｌ／ｗｅｌｌで播種した後、ＣＯ2インキュベーター内で２４時間インキュベートした。ブランクとして細胞を播種せずに培地のみをインキュベートした。各ｗｅｌｌ内の培養液を除去して、サンプルを含む培地（ＭＥＭ＋２％ＦＢＳ）１００μｌに交換し、インキュベートを続けた。サンプル培地を加えてから２４時間後に、マイクロプレートを取り出しＷＳＴ−１溶液を１０μｌ／ｗｅｌｌで添加した後、ＣＯ2インキュベーター内でインキュベートした。３時間後、マイクロプレートリーダーを用い、各ｗｅｌｌについて４５０ｎｍ及び６５５ｎｍ（ｄｕａｌ）の吸光度を測定した。
【００９９】
サンプルとしてＤＬ−α−トコトリエノール、ＤＬ−β−トコトリエノール、ＤＬ−γ−トコトリエノール、ＤＬ−δ−トコトリエノールを用いてＷＳＴ−１アッセイを行った。サンプル無添加のものを対照群Ｉとした。
【０１００】
上記実施例４１〜６０のサンプルの種類、使用量及びその結果［細胞生存率（％ ｏｆ ｃｏｎｔｒｏｌ）］を表１０に示す。
細胞生存率＝（Ｓ−Ｂ）／（Ｃ−Ｂ）×１００（％）
Ｓ＝サンプルの吸光度
Ｃ＝対照群の吸光度
Ｂ＝ブランクの吸光度
尚、表中、ｎ＝９、ＷＳＴ−１アッセイの結果はＭｅａｎ±ＳＤで示す。
又、ＴＣはトコトリエノールを示す。
【０１０１】
【表１０】
0004447198.tif 000011
【０１０２】
トコトリエノールは濃度依存な阻害作用を示した。さらに、ＤＬ−α−トコトリエノール＜ＤＬ−γ−トコトリエノール＜ＤＬ−β−トコトリエノール＜ＤＬ−δ−トコトリエノールの順に強い阻害作用が見られた。つまり、トコトリエノールの内皮細胞増殖抑制効果は構造異性により大きく異なる。
【０１０３】
表１０の結果を図示し、さらに、この図から５０％増殖阻害濃度（ＩＣ50）を求めた。図の縦軸は％ ｏｆ ｃｏｎｔｒｏｌ、横軸は濃度（μＭ）、−●−はＤＬ−α−トコトリエノール、−■−はＤＬ−β−トコトリエノール、−△−はＤＬ−γ−トコトリエノール、−×−はＤＬ−δ−トコトリエノールを示す。結果を表１１に示す。
【０１０４】
【表１１】
0004447198.tif 000012
【０１０５】
製剤例１  錠剤
以下の組成を有する経口用錠剤を、常法により製造した。
トコトリエノール混合物                    ５０ｍｇ
ラクトース                                ５０ｍｇ
コーンスターチ                            １４ｍｇ
ポリビニルピロリドン                        ５ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム                    １ｍｇ
【０１０６】
製剤例２  錠剤
以下の組成を有する経口用錠剤を、常法により製造した。
ＤＬ−β−トコトリエノール                ５０ｍｇ
ラクトース                                ５０ｍｇ
コーンスターチ                            １４ｍｇ
ポリビニルピロリドン                        ５ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム                    １ｍｇ
【０１０７】
製剤例３  筋肉用注射剤
ＤＬ−β−トコトリエノールの１００ｍｇを精製コーンオイル１ｍｌに溶解して、筋注用注射剤とした。
【０１０８】
製剤例４  筋肉用注射剤
ＤＬ−δ−トコトリエノールの１００ｍｇを精製コーンオイル１ｍｌに溶解して、筋注用注射剤とした。
【０１０９】
製剤例５  静注用注射剤
トコトリエノールの５０ｍｇをポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート５ｍｇを用いて１ｍｌの精製水に乳化分散させ、これにプロピルパラベン０．２ｍｇを添加して、静注用注射剤とした。
【０１１０】
【発明の効果】
本発明によりトコトリエノールを有効成分とする血管新生阻害剤、細胞増殖阻害剤、管腔形成阻害剤及びＦＧＦ阻害剤を提供することができた。
【図面の簡単な説明】
【図１】  表１の数値を図示した。図の縦軸は％ ｏｆ ｃｏｎｔｒｏｌ、横軸は濃度（μＭ）、−●−はＤＬ−α−トコトリエノール、−■−はＤＬ−β−トコトリエノール、−△−はＤＬ−γ−トコトリエノール、−×−はＤＬ−δ−トコトリエノールを示す。
【図１】
0004447198.tif 000013