(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液凝固促進剤が収納された血液検査用容器において、
該血液凝固促進剤は、ペプチド鎖においてアルギニンと任意のアミノ酸残基との結合及び／又はリジンと任意のアミノ酸残基との結合を加水分解し得る酵素と、アラニンとが溶解されたｐＨが６以上７未満の水溶液を乾燥して調製されたものであることを特徴とする血液検査用容器。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、血清生化学検査等の臨床検査において用いられる血液検査用容器、特に血液検体の凝固を促進する物質が収納された血液検査用容器に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、血清生化学検査、血清免疫学検査、血球検査といった血清検査のための血液を採取するために、血液の凝固時間を短縮させ、血清を迅速に得ることを可能とした血液検査用容器が盛んに用いられるようになっている。
このような血液検査用容器においては血液凝固促進剤として、シリカに代表される無機系の血液凝固促進剤や、トロンビンに代表される酵素系の血液凝固促進剤が予め収納されており、これらの薬剤の作用によって血液凝固が促進される。
【０００３】
このうちトロンビンに代表される酵素系の血液凝固促進剤は、無機系の血液凝固促進剤と比較して血液凝固活性が数段高く、極めて優れた血液凝固活性を発揮する。
しかしながら酵素系の血液凝固促進剤は、極めて不安定であり経時的に血液凝固活性が低下してしまうという問題があった。
【０００４】
この問題を解決するために、トロンビンといった酵素系の血液凝固促進剤を凍結乾燥させることによって安定化させる技術も知られている。
しかしながら、凍結乾燥させるのみでは長期間にわたる安定性は必ずしも高いものではなかった。
【０００５】
一方、トロンビン等を水溶液中で安定化させる技術としては、特開昭６４−４０４３３号公報に記載があるように水溶液中に安定化剤を添加する技術や、特開昭６２−１０６０２８号公報に記載があるように水溶液のｐＨを調節する技術が知られている。
しかしながら、こういった技術であっても特に長期間の保存安定性が要求される血液検査用容器に適用することのできるものではなかった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、高い血液凝固性能を長期間にわたり安定して発揮することのできる血液検査用容器を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
請求項１記載の発明は、血液凝固促進剤が収納された血液検査用容器において、該血液凝固促進剤は、ペプチド鎖においてアルギニンと任意のアミノ酸残基との結合及び／又はリジンと任意のアミノ酸残基との結合を加水分解し得る酵素と、アミノカルボン酸とが溶解されたｐＨ７未満の水溶液を乾燥して調製されたものであることを特徴とする血液検査用容器である。
【０００９】
上記アミノカルボン酸はアラニンである。
【００１０】
上記水溶液のｐＨは６以上７未満となされている。
【００１１】
以下に、本発明について詳説する。
【００１２】
本発明の血液検査用容器には、血液凝固促進剤が収納されている。
また上記血液凝固促進剤は、ペプチド鎖においてアルギニンと任意のアミノ酸残基との結合及び／又はリジンと任意のアミノ酸残基との結合を加水分解し得る酵素と、アミノカルボン酸とが溶解されたｐＨ７未満の水溶液を乾燥して調製されたものである。
【００１３】
ペプチド鎖においてアルギニンと任意のアミノ酸残基との結合及び／又はリジンと任意のアミノ酸残基との結合を加水分解し得る酵素は、一般に単独で血液凝固促進作用を有する物質である。
【００１４】
上記加水分解酵素としては、例えば、トリプシン、トロンビン、蛇毒トロンビン様酵素等のセリンプロテアーゼ；カテプシンＢ、フィシン等のチオールプロテアーゼ；キニナーゼＩ等の金属プロテアーゼなどが挙げられ、特にセリンプロテアーゼ、中でもトロンビンが好適に用いられる。
【００１５】
トロンビンの調製方法としては特に限定されず、例えば動物（ヒト、ウシ等）の血漿から精製して得たものを用いることができる。
【００１６】
上記アミノカルボン酸は、ペプチド鎖においてアルギニンと任意のアミノ酸残基との結合及び／又はリジンと任意のアミノ酸残基との結合を加水分解し得る酵素、特にトロンビンを安定化させる作用を有する。
【００１７】
アミノカルボン酸は一分子中にアミノ基とカルボキシル基を有する物質であり、本発明においては上記加水分解酵素を安定化させる作用を有する物質である。
【００１９】
上記アミノカルボン酸としては、アラニンを用いる。
【００２１】
本発明における血液凝固促進剤の調製にあたっては、まず上記ペプチド鎖においてアルギニンと任意のアミノ酸残基との結合及び／又はリジンと任意のアミノ酸残基との結合を加水分解し得る酵素と、上記アミノカルボン酸とを溶解させた水溶液が調製される。
【００２２】
上記水溶液は、上記加水分解酵素と上記アミノカルボン酸とが溶解された状態で、ｐＨ７未満（液温２０℃）となるように調製される。これは水溶液のｐＨが７以上（特にｐＨ７）であると、加水分解酵素が自己消化を起こしてしまうため、ｐＨを７未満とすることにより加水分解酵素の自己消化を防止するためである。
【００２３】
水溶液のｐＨは、６以上７未満である。これは、水溶液のｐＨが５未満であると、加水分解酵素が酸により失活してしまうためである。また水溶液のｐＨの最も好ましい範囲は、６．０〜６．７である。
【００２４】
ｐＨ７未満の水溶液を調製する場合、特に限定されるものではないが、あらかじめｐＨを７未満に調製した緩衝液に、上記加水分解酵素とアミノカルボン酸を溶解させて調製するのが簡便である。
【００２５】
上記緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、クエン酸−リン酸二ナトリウム緩衝液、クエン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液、マレイン酸ナトリウム−水酸化ナトリウム緩衝液等が挙げられる。
【００２６】
上記水溶液中の、ペプチド鎖においてアルギニンと任意のアミノ酸残基との結合及び／又はリジンと任意のアミノ酸残基との結合を加水分解し得る酵素の濃度は、５〜１００００ＩＵ／ｍＬが好ましく、１０〜５０００ＩＵ／ｍＬがより好ましい。
【００２７】
また、上記溶液中のアミノカルボン酸の濃度は、併用される加水分解酵素の種類及び濃度によって異なるが、０．００１〜３０％（ｗ／ｖ）とされるのが好ましく、０．０１〜１５％（ｗ／ｖ）とされるのがより好ましい。
【００２９】
本発明における血液凝固促進剤は、上述の加水分解酵素とアミノカルボン酸とが溶解された水溶液を調製後、この水溶液を乾燥して調製されるものである。この様に乾燥させる必要があるのは、加水分解酵素が水中において経時的に失活してゆく性質を有するためである。
【００３０】
上記乾燥の方法は特に限定されるものではなく、自然乾燥させても、熱風乾燥機や除湿乾燥機を利用して乾燥させてもよい。但し、乾燥時に加温する場合において、高温下で乾燥させると加水分解酵素が失活してしまう恐れがあるため、５０℃以下で乾燥させるのが好ましく、３５℃以下で乾燥させるのがより好ましい。
【００３１】
本発明の血液検査用容器の製造において、上記水溶液を乾燥させる段階は特に限定されるものではなく、水溶液を容器本体に収納した後に乾燥させてもよいし、予め容器外で水溶液を乾燥させて血液凝固促進剤を調製した後、この血液凝固促進剤を容器内に収納してもよい。
【００３２】
水溶液を容器本体に収納した後に乾燥させる場合、水溶液の収納方法及び収納形態は特に限定されるものではない。収納方法としては、水溶液を容器内壁面にスプレー塗布する方法や、容器底面に滴下する方法等が挙げられる。
【００３３】
また、収納形態としては、容器内壁面の全体に保持されていてもよいし、容器内に局所的に保持されていてもよい。
【００３４】
水溶液を乾燥させて得られた血液凝固促進剤を容器に収納する場合においても、その収納方法及び収納形態は特に限定されるものではない。
【００３５】
収納方法としては上記血液凝固促進剤を、錠剤化して容器内に収納してもよいし、粉末状にして収納してもよい。また、血液凝固促進剤を直接容器内に収納してもよいし、担体を介して容器内に収納してもよいし、また容器壁面に保持されるように収納してもよい。
【００３６】
本発明の血液検査用容器を構成する容器本体の形状としては、血液を収納し薬剤と反応させることのできる形状であれば特に限定させるものではないが、好ましくは一般的な採血管を構成する有底管体状の容器を挙げることができる。
【００３７】
上記容器本体の内容量は特に限定されるものではなく、１〜２０ｍＬ程度、より好ましくは２〜１０ｍＬ程度の内容量を持つ容器本体を用いることができる。
【００３８】
容器本体に収納される上記加水分解酵素の量は、採取される血液量に応じて調整されるが、少な過ぎると血液凝固の時間が長くなったり凝固が不完全になることがあり、多過ぎると検査値に悪影響を及ぼす恐れがあるので、採取する血液１ｍｌあたり１〜２０ＩＵが好ましく、３〜１５ＩＵがより好ましい。
【００３９】
容器本体の素材としては、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリメチルメタクリレート、ポリアクリロニトリル等の熱可塑性樹脂；不飽和ポリエステル樹脂、エポキシ樹脂、エポキシ−アクリレート樹脂等の熱硬化性樹脂；酢酸セルロース、プロピオン酸セルロース、エチルセルロース、エチルキチン等の変性天然樹脂；ソーダ石灰ガラス、リンケイ酸ガラス、ホウケイ酸ガラス等のケイ酸塩ガラス；石英ガラスなどのガラス、及びこれらを主成分とするもの等が挙げられる。
【００４０】
上記容器本体の開口部は、封止部材で封止してもよい。また、本発明の血液検査用容器においては、その開口部を密封すると共に容器内部を減圧とすることによって、いわゆる真空採血管として利用することもできる。真空採血管とすることにより、採血が簡便となると同時に、血液凝固促進剤の安定性がさらに高まるという利点がある。
【００４１】
上記容器本体の開口部を封止する部材としては、開口部に嵌合する形状となされたゴム製栓体のほか、シート状のシール部材であってもよい。栓体を構成する材料としては、ブチルゴム、塩素化ブチルゴム、臭素化ブチルゴムやエラストマー等の密封性に優れた素材が挙げられ、シール部材を構成する材料としては、アルミニウム等の金属箔が挙げられる。
【００４２】
本発明の血液検査用容器では、その底部に血清分離剤が収納されてもよい。血清分離剤は、採血後の遠心分離により血餅と血清の間に移動し、隔壁を形成することにより血清を分離する。
【００４３】
上記血清分離剤はチクソトロピー性を有するゲル状物であり、例えば、常温で流動性を有する合成樹脂などに、チクソトロピー性付与剤、比重調整剤、及び粘度調整剤などの添加剤を添加し混合することにより得られる。
【００４４】
上記合成樹脂としては、例えば、ジシクロペンタジエンのオリゴマー等、上記チクソトロピー性付与剤としては、例えば、ソルビトールと芳香族アルデヒドとの縮合物、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンブロック共重合体等、上記比重調整剤としては、例えば、シリカ等、及び上記粘度調整剤としては、例えば、フタル酸エステル等が、それぞれ挙げられる。
【００４５】
本発明の血液検査用容器には、さらに血餅付着防止成分が収容されてもよい。これにより血液が凝固した後の血餅成分が容器内表面に付着することを防止でき、遠心分離時に血餅の移動が制限されることがなく、血餅と血清を良好に分離できる。
【００４６】
上記血餅付着防止成分としては、水に対して難溶又は不溶の親水性物質を用いることができ、例えば、脂肪族変性シリコーンオイル（例えばジメチルポリシロキサン等）、芳香族変性シリコーンオイル（例えばメチルフェニルポリシロキサン等）、部分ケン化ポリビニルアルコール、ビニルピロリドン−酢酸ビニル共重合体などが挙げられる。このうち変性シリコーンオイルを用いる場合は、これらが血液凝固促進剤の表面を覆うことによる血液凝固促進性能の低下を防ぐために、さらに水溶性物質を添加することが好ましい。上記水溶性物質としては、例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。
【００４７】
上記血餅付着防止成分は、上記の加水分解酵素とアミノカルボン酸とが溶解された水溶液に添加しておくことにより、血液凝固促進剤と同時に容器内壁面に保持させることもできる。
【００４８】
［作用］
本発明の血液検査用容器においては、血液凝固促進剤にペプチド鎖においてアルギニンと任意のアミノ酸残基との結合及び／又はリジンと任意のアミノ酸残基との結合を加水分解し得る酵素の安定化剤としてアミノカルボン酸が配合されている。さらにその血液凝固促進剤は、酵素の自己消化を抑制するためにｐＨが所定の範囲にされた水溶液を乾燥して調製される。従って本発明の血液検査用容器は、長期間にわたり安定した血液凝固性能を発揮することができる。
【００４９】
【実施例】
次に、本発明の実施例について説明する。但し、本発明は、これらの実施例のみに限定されるのもではない。
【００５０】
実施例及び比較例において、試薬及び容器等として以下のものを用いた。
・トロンビン（商品名：トロンビン持田、持田製薬社製）
・β−アラニン（和光純薬工業社製、試薬特級）
・検査用容器 ポリエチレンテレフタレート製 内容積１０ｍｌ（１２φ×１００mm） （積水化学工業社製）
・封止部材 ブチルゴム製栓体
・精製水（注射用水（日本薬局方））
【００５２】
［実施例］
トロンビン２５００００ＩＵとアラニン１．５ｇを２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５、２０℃）１００ｍＬに溶解させた。この水溶液（ｐＨ６．５、２０℃）１０μＬを、内容量１０ｍＬのポリエチレンテレフタレート管内表面にスプレー塗布し、除湿乾燥機を用いて２３℃で２４時間乾燥させた。このエチレンテレフタレート管の開口部をブチルゴム製の栓体で密封して、本発明の血液検査用容器とした。
【００５３】
［比較例１］
トロンビン２５００００ＩＵを精製水１００ｍＬに溶解させた。この水溶液１０μＬを内容量１０ｍＬのポリエチレンテレフタレート管内表面にスプレー塗布し、除湿乾燥機を用いて２３℃で２４時間乾燥させた。このエチレンテレフタレート管の開口部をブチルゴム製の栓体で密封して、比較例の血液検査用容器とした。
【００５４】
［安定性評価］
上記実施例及び比較例の血液検査用容器について、保存前と、３５℃・７５％ＲＨで１週間保存後のトロンビン量を第１３改正日本薬局方トロンビン定量法に準拠して測定し、トロンビン残存率を求めた。この結果を表１に示した。
【００５５】
【表１】
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【００５６】
表１から明らかなように、本発明の実施例は比較例に比べ、トロンビンの残存率が２倍程度高く、血液凝固活性の経時的安定性に優れていることが分かる。
【００５７】
【発明の効果】
本発明の血液検査用容器は上述の通りであり、容器中の血液凝固促進剤にアミノカルボン酸が配合されており、かつ凝固促進剤の乾燥前における水溶液のｐＨが７未満となされているので、長期間にわたり安定した血液凝固性能を発揮することができる。