(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ドメインＣを含有するヒトＴＮ−Ｃアイソフォームを同定することのできるリガンド。
【請求項２】
抗体及びそれらの断片及び同族の結合体；又は他のあらゆる分子であって、ドメインＣを含有するヒトＴＮ−Ｃアイソフォームを同定することができ、それ自体が、ドメインＣを含有するヒトＴＮ−Ｃアイソフォームと結合することのできる該分子；である、請求項１記載のリガンド。
【請求項３】
ｓｃＦｖ又はそれの断片及び同族の結合体である、請求項２記載のリガンド。
【請求項４】
（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ．１とも呼ぶ）配列：
0004577665.tif 000013
0004577665.tif 000014
0004577665.tif 000015
を有する組換えヒト抗体の断片である、請求項３記載のリガンド。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のリガンドと；放射性同位元素、蛍光物質、サイトカイン、毒素、光線感作物質、凝塊形成剤等から成る群から選ばれる１種の分子と；から成る結合体であって、診断及び／又は治療の目的で使用することのできる上記結合体。
【請求項６】
組織及び生物流体の中のＴＮ−ＣのｃＴＮ−Ｃアイソフォームを決定するための診断試薬を調製するために、請求項１〜４のいずれか１項に記載のリガンドを使用する方法。
【請求項７】
組織及び生物流体の中のＴＮ−ＣのｃＴＮ−Ｃアイソフォームを決定するための診断試薬を調製するために、請求項５に記載の結合体を使用する方法。
【請求項８】
ヒト病理を治療するための製剤を調製するために、請求項１〜４のいずれか１項に記載のリガンドを使用する方法。
【請求項９】
ヒト病理を治療するための製剤を調製するために、請求項５に記載の結合体を使用する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、組換えヒト抗体の断片(fragments)を用いてヒト腫瘍(neoplasias, 新生物)形成を非常に特異的に同定することのできる診断方法と、それら断片と、それら断片の結合体(conjugates)とに関する。本発明はまた、治療的に有用な製剤を調製するときに、それらの断片及び結合体を使用することにも関する。
【０００２】
（当該技術の状況）
腫瘍が成長する間、正常組織の細胞外マトリックス（以下「ＥＣＭ」という）（腫瘍はＥＣＭにおいて成長する）は、新たな成分の合成及びタンパク質減成(proteolytic degradation)の諸過程によって再構築される(remodelled, 改造される)。
腫瘍のＥＣＭ成分は、量的且つ質的な面で正常組織のＥＣＭ成分と相違する。そして、このＥＣＭ成分は、腫瘍の発育・分化における主要な役割を果たす脈管形成の間、腫瘍の成長と発育・分化を助ける条件を創り出す一因となる。
【０００３】
テネイシン−Ｃ（以下「ＴＮ−Ｃ」という）は、ジスルフィド結合によって連結された６個の類似サブユニットから成る糖タンパク質である。それは、単一遺伝子によってコードされ(coded)、単一のプロモーター（促進因子）によって調節される。
「III型フィブロネクチンドメイン」（以下「ＦＮIII」と呼ぶ）と相同の９個のタンパク質ドメイン(domains)は、選択的スプライシング(alternative splicing)として知られている機構によって、ヒトＴＮ−ＣのｍＲＮＡの中に含ませるか、又はその中から取り除くことが可能であり、これらタンパク質ドメインは、種々のタンパク質アイソフォーム(isoform, イソ型)を生じさせる。
【０００４】
ＴＮ−Ｃアイソフォームは成人の正常組織の中に豊富に存在すること、及び上記の９個のドメインのほとんど又は全てを含有するＴＮ−Ｃアイソフォームは腫瘍組織中に非常に広く発現される(expressed)ことも知られている。
現在入手可能な、ＴＮ−Ｃアイソフォームを同定するのに適した試薬は、それだけではヒトに使用するのが適切でないマウスのモノクローナル抗体（例えば、免疫シンチグラフィー）であり；更に、それら試薬は、腫瘍組織及び健全な組織の中に存在するアイソフォームと無差別的に反応する。
【０００５】
従って、腫瘍組織中に単独で存在するアイソフォームの同定を可能にする方法と試薬とを開発することは、非常に重要であることは明らかである。それらを開発することによって、実際、非常に正確で特異性のある診断が可能となり、同時に、薬剤又はもう１つの作用因子(effector)が、治療目的で腫瘍のみに到達することが可能となる。
【０００６】
ドメインＣを含有するヒトＴＮ−Ｃアイソフォーム（以下「ｃＴＮ−Ｃ」という）は、脈管構造において、高い段階のアストロサイトーマ増殖性細胞(astrocytoma proliferating cells)（第III期）及びグリオブラストーマ(glioblastoma, 多形性神経膠芽腫)の近辺に大きく発現される。当該アイソフォームはまた、ヒトの肺腫瘍の脈管構造中に広く発現されるが、それらアイソフォームは、通常の成人組織のいかなる組織にも検出されない。
【０００７】
従って本発明は、ＴＮ−ＣのｃＴＮ−Ｃアイソフォームの存在を決定することに基づいて、生体内(in vivo)及び生体外(in vitro)における腫瘍組織を同定する方法に関する。
本発明はまた、ｃＴＮ−Ｃ及びそれの結合体を認識することのできるリガンドにも関する。
本明細書において、用語「リガンド(ligands)」は、抗体；又はそれらの断片(fragments, フラグメント)；又は他のあらゆる分子であってｃＴＮ−Ｃを認識することができ、それ自体がｃＴＮ−Ｃと結合することのできる分子；を意味するものとして使用する。
【０００８】
特に、本発明による「リガンド」は、組換えヒト抗体の断片であり、一層詳しくは、ｓｃＦｖ断片である。実際、ｓｃＦｖ断片としての、ヒト抗体の小さい断片は、従来の免疫グロブリンと比較して、肝臓には蓄積されず、免疫性ではなく、組織内への一層優れた浸透を示す。
【０００９】
本発明による有用な結合体は、既知技術により、一定の診断目的及び／又は治療目的に適した分子に、ｃＴＮ−Ｃのためのリガンドを生化学的又は遺伝的に結合させることによって得ることができる。リガンドとの結合に適した分子は、例えば、放射性同位元素、蛍光物質、サイトカイン、毒素、光線感作物質、凝塊形成剤等である。
【００１０】
本発明による結合体を造るためには、上述のリガンド及びペプチド、又は他の非タンパク性分子を使用することができる。
本発明による、組換えヒト抗体ｓｃＦｖによって表わされるリガンドであって、その配列が表１（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ．１）に記される該リガンド（以下「ＴＮ１１」という）は、とりわけ興味深い。
【００１１】
0004577665.tif 000002
0004577665.tif 000003
0004577665.tif 000004
【００１２】
（実験の部）
「長い」ＴＮ−Ｃアイソフォームに対する抗体断片の分離
ヒトｓｃＦｖのファージ表示(phage display)ライブラリーは、抗原として、選択的スプライシング(alternative splicing, 択一的スプライシング)にかけられたＦＮIIIドメインを含有する「長い(long)」ＴＮ−Ｃ変異体を用いて選定した。前記の選定によって得られた細菌コロニーの培養基は、抗原として、選択的スプライシングにかけられた「短い(short)」ＦＮIIIドメインを全く持たないか又は「長い」ＦＮIIIドメインを全て含有するＴＮ−Ｃ変異体を使用するＥＬＩＳＡ技術によって分析した。
この研究によって、ＴＮ−Ｃの「長い」形態のための特異性抗体を生成するクローンを同定することが可能となった。前記クローンの細菌培養の上澄み液からの、ＴＮ１１と称するｓｃＦｖは、（選択的スプライシングにかけられたＦＮIIIドメインの全てを含有する）組換え断片Ａ〜Ｄとセファロース(Sepharose)でのカラム免疫クロマトグラフィー(immunochromatography)によって精製した。
【００１３】
ＴＮ１１は、免疫ブロッティング(immunoblotting)技術によって更に特徴付けられる。この技術によると、「長い」ＴＮ−Ｃ及び「短い」ＴＮ−Ｃと、ヒトＴＮ−Ｃの種々のドメインを含有する、種々の組換えタンパク質及び融合タンパク質(recombinant and fusion proteins)（ＴＮ  Ａ−Ｄ、ＴＮ  Ｂ−Ｄ、ＴＮ  Ｃ、ＴＮ  Ｂ、λＴＮ２７及びλＴＮＢＣ）との特異反応の評価が可能となる（図１Ａ）。ＴＮ１１は、［選択相(selection phases)の間のＥＬＩＳＡ技術によって既に見出されている］「長い」形態のＴＮ−Ｃを認識するだけでなく；ドメインを含有する全てのタンパク質断片と特異反応を生じる；ということが、前記技術によって証明される（図１Ｂ、Ｃ）。これは、ＴＮ１１によって認識されたエピトープがＴＮ−ＣのドメインＣの内部に位置しているという証拠であった。類似の諸研究によって、ＴＮ１１は正常ヒト繊維芽細胞の培養基から精製されたＴＮ−Ｃとは反応しないことが証明された。なぜなら、前記の細胞によって生成されるＴＮ−ＣはドメインＣを含有しないからである。
【００１４】
正常ヒト繊維芽細胞の培養基（ＧＭ−６１１４、ＡＴＣＣ、ロックビル(Rockville)，ＭＤ，米国）；黒色腫由来の細胞（ＳＫＭＥＬ−２８、ＡＴＣＣ、ロックビル，ＭＤ，米国）；並びに、ヒト・グリオブラストーマ及びヒト髄膜腫の組織試料；から抽出された全ＲＮＡについて、次の諸プライマー(primers)を使用して、ＲＴ−ＰＣＲ実験を行った：
（ヒトＴＮ−Ｃ配列の塩基４５４２〜４５７１）５'ＧＣＴＡＣＣＣＣＣＴＡＧＴＡＣＴＧＡＴＴＴＴＡＴＴＧＴＣＴＡ（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ．３）；
（相補的配列、塩基５０２８〜５０４７）５'ＴＴＴＣＣＡＧＴＧＧＣＴＣＡＧＡＣＴＧＣ（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ．４）；
（相補的配列、塩基５３２２〜５３４５）５'ＣＴＧＧＴＣＴＧＡＧＴＣＴＴＧＧＴＴＣＣＧＴＣＣ（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ．５）。
【００１５】
ＴＮ−ＣのドメインＣは、細胞ＧＭ−６１１４及びＳＫＭＥＬ−２８の中にも黒色腫の中にも存在しないが、ヒト・グリオブラストーマ断片から精製した、ＴＮ−ＣのｍＲＮＡの中に存在することが、ＲＴ−ＰＣＲ実験により証明された。
【００１６】
成人及び胎児の正常ヒト組織由来のｍＲＮＡと、ヒトＴＮ−Ｃ配列の２７０の塩基（４６３０〜４８９９）を含有するｃＤＮＡプローブとを用いて、ノーザンブロット分析(Northern blotting analyses)を行い、それによって、このドメインのｍＲＮＡは胎児組織（脳、肝臓、腎臓）においてのみ発現し、成人組織のｍＲＮＡ中には存在しないことが証明された（図２）。
精製済み抗体ＴＮ１１の「長い」ＴＮに対する結合親和性(binding bond affinity)は、ビアコア(BIAcore)を用いた相互作用分析によって決定した。解離定数は１．３×１０-10であることが分かった。
【００１７】
ＴＮ−ＣのドメインＣに対して特異的であるＴＮ１１を用いて、免疫組織化学分析を行った。この分析によって、ドメインＣは正常成人組織(normal adult tissues)中に見出だせないことが確認された。逆に言えば、全ＴＮ−Ｃの大きな存在がある。これは、全てのヒトＴＮ−Ｃアイソフォームに対して特異的なモノクローナル抗体ＢＣ−４との反応によって立証される。なぜなら、このモノクローナル抗体ＢＣ−４は、ヒトＴＮ−Ｃ分子の一定領域のエピトープを認識するからである。
更に、調べたグリオブラストーマのほとんど全てのもの（高度に陽性な腫瘍の１５症例のうち１４症例）は非常に高いレベルのドメインＣを発現することも分かった（表２及び図３）。特に、このＴＮ−Ｃアイソフォームの存在は主として、腫瘍細胞巣のストロマ（図３Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｅ及びＧ）；並びに増殖細胞（図３Ｆ）；の中の細胞増殖活性の高い領域の脈管構造の近辺において同定された。逆に言えば、骨髄腫２３症例のうち２症例は脈管構造の近辺においてのみわずかに陽性であった（表２及び図４）ことを除けば、脳の他の腫瘍では陽性反応は全く生じなかった。
また、肺腫瘍切片中のｃＴＮ−Ｃの大きな存在も、とりわけ、脈管構造の近辺において、観察された。
【００１８】
グリオブラストーマのクリオスタット切片の現場雑種形成(in situ hybridisations) （図６Ａ及びＢ）は、ｃＴＮ−Ｃに対して特異的なＤＩＧ標識ｃＲＮＡプローブを用いて行った（図５）。得られた結果によって、ｃＴＮ−Ｃアイソフォームは腫瘍細胞によって産生されるが、全ての腫瘍細胞によって産生される訳ではないことが分かる。
【００１９】
また、脈管構造中におけるｃＴＮ−Ｃの発現も、（ＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞を使用した）ヌード・マウスでの、ヒト黒色腫の実験モデルで証明された。ヒト黒色腫キャリヤのヌード・マウスに放射能標識ｓｃＦｖ  ＴＮ１１を注入した。それによって、腫瘍の脈管構造中においてのみ抗体特異蓄積が証明された。
結論として、ＴＮ−ＣのｃＴＮ−Ｃアイソフォームが存在することの決定は、種々のタイプの腫瘍を診断するための効果的な方法である。更に、腫瘍組織中における前記アイソフォームの存在もまた、治療目的に有用である場合がある。
【００２０】
【表１】
0004577665.tif 000005
【００２１】
全ての腫瘍は、ｓｃＦｖ  ＴＮ１２に対し高度に陽性であった。ｓｃＦｖ  ＴＮ１２は、全てのＴＮ−Ｃアイソフォームを同定する。ＴＮ１１は、ドメインＣを含有するＴＮ−Ｃアイソフォームのみを同定する。
(1) この陽性症例は、幾つかの脈管構造においてのみ陽性を呈した。
(2) この陽性症例は、変異(transition)髄膜種であり、幾つかの脈管構造においてのみ陽性を呈した。
(3) ７つの陽性症例のうち３症例は、結合組織において、幾つかの脈管構造において陽性を呈し、更に３症例は、幾つかの脈管構造においてのみ陽性を呈した。
(4) ３つの陽性症例では、染色がわずかに認められた。
【００２２】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  図１ＡはヒトＴＮ−Ｃのサブユニットの（ドメインの）構造モデルである。楕円及び正方形の記号はそれぞれ、ＥＧＦ様及びＦＮ様の繰返し(repeats, 反復)を表わす。また、アミノ終末ボタン及びフィブリノーゲン様終末ＣＯＯＨボタンも示す。Ａ１からＤまでのＦＮ様繰返しには影を付けてある。この繰返しの発現は、プレ−ｍＲＮＡの選択的スプライシングによって調節される。また、図の上部には、使用した、ＴＮ−Ｃ−β−ガラクトシダーゼの融合タンパク質又は組換えタンパク質を示す。矢印は、各々組換え抗体又はモノクローナル抗体のエピトープの位置を示す。Λは連続性を示す。
図１Ｂはクーマシーブルーを用いて着色した（ドメインＡ１〜Ｄを含有する）「長い」組換えタンパク質ＴＮ−Ｃ及び（ドメインＡ１〜Ｄを含有しない）「短い」組換えタンパク質ＴＮ−Ｃの、ドデシル硫酸ナトリウム(Sodium Dodecyl Sulphate)（４〜１８％  ＳＤＳ  ＰＡＧＥ）中での電気泳動；並びに、ｓｃＦｖ  ＴＮ１１及びＴＮ１２を用いて着色した免疫ブロット(immunoblots, イムノブロット)である。
図１ＣはｓｃＦｖ  ＴＮ１１及びＴＮ１２で着色した、種々の融合タンパク質及び組換えタンパク質（Ａ）の免疫ブロットである。左側に記す数値は、（キロドルトン単位の）基準分子質量を示す。
【図２】  （１）心臓、（２）脳、（３）胎盤、（４）肺、（５）肝臓、（６）骨格筋、（７）腎臓及び（８）膵臓の成人ヒト組織；（１）脳、（２）肺、（３）肝臓及び（４）胎盤の胎児ヒト組織；から得られたポリ（Ａ）に富むＲＮＡのノーザンブロット(Northern blots)である。このノーザンブロットは、本明細書中に記述される、ｃＴＮ−Ｃアイソフォームに対して特異的であるｃＤＮＡプローブ；全てのＴＮ−Ｃアイソフォームを認識するＨＴ１１プローブ；及びブロット規格化のためのヒトＧ３ＰＤＨのｃＤＮＡ；を用いて得られる。左側の数値は、（ｋｂ単位の）基準測定値を示す。
【図３】  グリオブラストーマの切片の免疫組織化学分析であり、Ａ及びＢはｓｃＦｖ  ＴＮ１１を用いたもの；Ｃ、Ｅ、Ｆ及びＧはｓｃＦｖ  ＴＮ１１（赤色）及びｍＡｂ ＫＩ６７（褐色）を用いて得られる二重染色法によるもの；ＤはｓｃＦｖ  ＴＮ１１で染色された肺ガンの大脳転移の切片である。バー(bar)＝１０μ。
【図４】  乳房の浸潤性導管ガン(invasive ductal carcinoma)の連続切片の免疫組織化学分析であり、Ａ及びＣはｓｃＦｖ  ＴＮ１２を用いたもの；Ｂ及びＤはｓｃＦｖ  ＴＮ１１を用いたもの；並びに、ＥはｓｃＦｖ  ＴＮ１２を用い、ＦはｓｃＦｖ  ＴＮ１１を用いて染色した髄膜種の連続切片もの；である。バー＝１０μ。
【図５】  現場(in situ)雑種形成試験に使用したｃＲＮＡプローブの特異性のサザンブロット(Southern blot)によるデモンストレーションである。底部：臭化エチジウムを用いたアガロース・ゲルの染色；  １：ＴＮＦＮＡＬＬ（これは、ドメイン２（III型）から、スプライシングにかけたドメインを含有するドメイン７（III型）までのヒトＴＮ−ＣのＤＮＡから成る）；  ２：ＴＮＦＮ１−８（ＴＮＦＮＡＬＬの配列と同一であるが、スプライシングにかけたドメインを含有しない）；  ３：全ＴＮＥＧＦ様ドメイン；  ４：ドメインＤ（III型）；  ５：ドメインＣ（III型）；  ６：ドメイン１（III型）；  ７：全ＴＮＥＧＦ様ドメイン８〜１０；  ８：基準。頂部：上述のものと同一の断片のサザンブロットであって、ＤＩＧ標識プローブを用いて交雑された(hybridised, 雑種形成された)ものである。右側の数字は測定値（ｋｂ単位）である。
【図６】  ドメインＣのＤＩＧ標識プローブを用いた、ヒト・グリオブラストーマのクリオスタット切片(cryostat sections)に関する現場雑種形成試験の２倍拡大図である。陽性信号は、大核(large nucleus)を持つ幾つかの腫瘍細胞においてのみ目に見える。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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