(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
濾胞性結膜炎患者の結膜から分離され、アデノウイルス８型プロトタイプ又は９型プロトタイプに対する抗血清により弱く中和されるがアデノウイルス１〜７型プロトタイプ、１０型プロトタイプ、１１型プロトタイプ、１４型プロトタイプ、１９型プロトタイプ、２２型プロトタイプ、３４型プロトタイプ、３５型プロトタイプ、３７型プロトタイプ、４０型プロトタイプ又は４１型プロトタイプに対する抗血清によっては中和されず、ヒトにおいて結膜充血と濾胞性結膜炎を引き起こし、そのヘキソンの高度変異領域のアミノ酸配列が、配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、前記抗原性及び前記病原性を有するアデノウイルスを含む被検試料中の該アデノウイルスのヘキソン遺伝子の高度変異領域の塩基配列に基づき該アデノウイルスを特異的に測定する方法。
【請求項２】
前記高度変異領域が、配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記アミノ酸配列をコードする遺伝子が配列表の配列番号２で示される塩基配列からなる請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記アデノウイルスのファイバー領域のアミノ酸配列が、配列表の配列番号３で示されるアミノ酸配列を含む請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記アミノ酸配列をコードする遺伝子が配列表の配列番号４で示される塩基配列からなる請求項４記載の方法。
【請求項６】
ヘキソン遺伝子中の高度変異領域又はその一部の塩基配列を決定し、配列表の配列番号２に記載された塩基配列と比較することから成る、請求項１記載の方法。
【請求項７】
配列表の配列番号２で示される塩基配列からなる核酸又はその一部を核酸増幅法により特異的に増幅させ、増幅された断片を検出することから成る請求項１記載の方法。
【請求項８】
被検試料中のアデノウイルスのファイバー領域の塩基配列に基づきアデノウイルスを特異的に測定する方法であって、該アデノウイルスは、濾胞性結膜炎患者の結膜から分離され、アデノウイルス８型プロトタイプ又は９型プロトタイプに対する抗血清により弱く中和されるがアデノウイルス１〜７型プロトタイプ、１０型プロトタイプ、１１型プロトタイプ、１４型プロトタイプ、１９型プロトタイプ、２２型プロトタイプ、３４型プロトタイプ、３５型プロトタイプ、３７型プロトタイプ、４０型プロトタイプ又は４１型プロトタイプに対する抗血清によっては中和されず、ヒトにおいて結膜充血と濾胞性結膜炎を引き起こし、そのヘキソンの高度変異領域のアミノ酸配列が、配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、前記抗原性及び前記病原性を有し、そのファイバー領域のアミノ酸配列が、配列表の配列番号３で示されるアミノ酸配列を含む、アデノウイルスの測定方法。
【請求項９】
前記ファイバー領域の前記アミノ酸配列をコードする遺伝子が配列表の配列番号４で示される塩基配列からなる請求項８記載の方法。
【請求項１０】
ファイバー領域又はその一部の塩基配列を決定し、配列表の配列番号４に記載された塩基配列と比較することから成る、請求項８又は９記載の方法。
【請求項１１】
配列番号４で示される塩基配列からなる核酸又はその一部を遺伝子増幅法により特異的に増幅させ、増幅された断片を検出することから成る請求項８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒトにおいて結膜充血と濾胞性結膜炎を引き起こす新規アデノウイルスの測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトに感染するアデノウイルスの血清型は、ウイルスの増殖を特異的に阻害する抗血清により決定される。現在、４９の血清型が知られており、これらはさらに、ＤＮＡ相同性並びにウイルスの物理的、生化学的及び生物学的性質によりＡ〜Ｆの６つの亜属に分類される（Toogood,C.I.A. et al., J. Gen. Virol. 70:3203-3214, 1989）。
【０００３】
アデノウイルスは、１９５３年にRoweらにより初めてヒト組織から単離された(Rowe, W.R. et al., Proc. Soc. Exp. Biol. 84:570-573, 1953)。それ以来、アデノウイルス群のメンバーは、上部及び下部気管感染、角結膜炎及び出血性膀胱炎を引き起こすことが示された(Jackson, G.G. et al., J. Infect. Dis. 128:811-866, 1973)。角結膜炎患者の目からアデノウイルス２、３、４、５、７、８、１１、１３、１４、１５、１９、２１及び３７型が単離されている(Horwitz, M.S., Adenoviruses, p.2149-2171, 1996, In B.N. Fields et al. ed. Fields Virology, 3rd ed. Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, New York; Kinchington, P.R.et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 35:4126-4134, 1994; O'Donnell, B. et al., Eye 7:8-14, 1993; Schmitz, H., et al., Am. J. Epidemiol. 117:455-466, 1983)。アデノウイルス３型及び４型が、散発性角結膜炎及び咽頭結膜熱(PCF)の最も一般的な病因であり、アデノウイルス８型、１９型及び３７型は、散発性の症例のみならず、いくつかの国、特に東アジア及び東南アジアにおける角結膜炎の大発生の原因でもある(Aoki, K. et al., Br. J. Ophthalmol. 66:776-780, 1982; Aoki, K. et al., Jpn. J. Ophthalmol. 30:158-164, 1982; Guo, D.F., Microbiol. Immunol. 32:1107-1118, 1988; Hierholzer, J.C. et al., N. Engl. J. Med. 290:1436, 1974; Ishii, K. et al., Int. J. Epidemiol. 16:98-103, 1987)。アデノウイルス８、１９及び３７型は、院内感染の疫学的原因としてよく知られている(Jernigan, J.A., et al., J. Infect. Dis. 167:1307-1313, 1993; Nauheim, R. C., Ophthalmonogy 97:1450^1453, 1990; Warren, D. et al., J. Infect. Dis. 160:938-943)。最近、アデノウイルスにより引き起こされる院内感染が公衆衛生における重要な社会問題となっており、病院における経済的及び倫理的問題となっている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
病原性を有するアデノウイルスを迅速かつ正確に検出することは、その感染を防止するためにも重要である。本願発明者らは、院内感染の原因となったアデノウイルスを濾胞性結膜炎患者の目から分離した。このアデノウイルスは、抗血清との反応性やヘキソンのアミノ酸配列等から、従来報告されているアデノウイルスのいずれでもなく、新規なアデノウイルスであると考えられ、従って、当然ながら迅速かつ正確に該ウイルスを検出又は定量する手段もない。
【０００５】
本発明の目的は、濾胞性結膜炎患者の目から分離された、病原性を有する新規アデノウイルスを測定するための手段を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本願発明者らは、濾胞性結膜炎患者の結膜擦過材料８検体から、公知のアデノウイルスとは異なる抗原性及びヘキソンのアミノ酸配列を有し、病原性を有する新規なアデノウイルスを分離することに成功し、その抗原性を調べ、ヘキソン遺伝子中の高度変異領域及びファイバー領域中の塩基配列を決定することに成功し、本願発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、濾胞性結膜炎患者の結膜から分離され、アデノウイルス８型プロトタイプ又は９型プロトタイプに対する抗血清により弱く中和されるがアデノウイルス１〜７型プロトタイプ、１０型プロトタイプ、１１型プロトタイプ、１４型プロトタイプ、１９型プロトタイプ、２２型プロトタイプ、３４型プロトタイプ、３５型プロトタイプ、３７型プロトタイプ、４０型プロトタイプ又は４１型プロトタイプに対する抗血清によっては中和されず、ヒトにおいて結膜充血と濾胞性結膜炎を引き起こし、そのヘキソンの高度変異領域のアミノ酸配列が、配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、前記抗原性及び前記病原性を有するアデノウイルスを含む被検試料中の該アデノウイルスのヘキソン遺伝子の高度変異領域の塩基配列に基づき該アデノウイルスを特異的に測定する方法を提供する。また、本発明は、被検試料中のアデノウイルスのファイバー領域の塩基配列に基づきアデノウイルスを特異的に測定する方法であって、該アデノウイルスは、濾胞性結膜炎患者の結膜から分離され、アデノウイルス８型プロトタイプ又は９型プロトタイプに対する抗血清により弱く中和されるがアデノウイルス１〜７型プロトタイプ、１０型プロトタイプ、１１型プロトタイプ、１４型プロトタイプ、１９型プロトタイプ、２２型プロトタイプ、３４型プロトタイプ、３５型プロトタイプ、３７型プロトタイプ、４０型プロトタイプ又は４１型プロトタイプに対する抗血清によっては中和されず、ヒトにおいて結膜充血と濾胞性結膜炎を引き起こし、そのヘキソンの高度変異領域のアミノ酸配列が、配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、前記抗原性及び前記病原性を有し、そのファイバー領域のアミノ酸配列が、配列表の配列番号３で示されるアミノ酸配列を含む、アデノウイルスの測定方法を提供する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明のアデノウイルス（以下、アデノウイルスを「Ad」と言うことがある）は、下記実施例において詳述するように、院内感染した角結膜患者の結膜擦過材料から単離されたものである。本発明のAdは、ヒトにおいて結膜充血と濾胞性結膜炎を引き起こす。
【０００９】
本発明のAdは、アデノウイルス８型プロトタイプ又は９型プロトタイプに対する抗血清により弱く中和されるがアデノウイルス１〜７型プロトタイプ、１０型プロトタイプ、１１型プロトタイプ、１４型プロトタイプ、１９型プロトタイプ、２２型プロトタイプ、３４型プロトタイプ、３５型プロトタイプ、３７型プロトタイプ、４０型プロトタイプ又は４１型プロトタイプに対する抗血清によっては中和されない。なお、ここで「弱く中和される」とは、２倍段階希釈した抗血清を用いて中和試験を行った場合、本発明のAdの中和に必要な抗Ad8プロトタイプ又は抗Ad9プロトタイプ抗血清の希釈率が、Ad8プロトタイプが抗Ad8プロトタイプ抗血清により中和される希釈率及びAd9プロトタイプが抗Ad9プロトタイプ抗血清により中和される希釈率のそれぞれ１／４以下であることを意味する。なお、上記の各Adプロトタイプは、ATCCから購入可能である。
【００１０】
下記実施例において単離された本発明のAdのヘキソン遺伝子中の高度変異領域(hypervariable region, HVR)は、配列表の配列番号２で示される塩基配列を有し、それによりコードされる推定アミノ酸配列を取り出したものを配列番号１に示す。また、該アミノ酸配列を他の公知の各種Adプロトタイプの同領域の推定アミノ酸配列と整列させ、比較した図を図１及び図２に示す。同様に、同領域の塩基配列を配列させ、比較した図を図３ないし図５に示す。なお、図１〜図５から明らかなように、ヘキソンにはHVR1〜HVR7までの７個のHVRが存在するが、配列番号１及び２で示される配列は、これらの各HVR間の配列並びにHVR1の５’側（Ｎ末端側）及びHVR7の３’側（Ｃ末端側）をも含んでおり、これらHVR以外の配列部分をも含んだものを本明細書では、「ヘキソン遺伝子中の高度変異領域」と呼ぶ。下記実施例において詳述するように、ヘキソンのHVR全体のアミノ酸配列を比較した場合に、本発明のAdと最も相同性が高いのはAd9プロトタイプであり、その相同性は75.0%であった。ヘキソンは、抗原性に大きな影響を与えるタンパク質であるから、本発明のAdのヘキソンHVRが、Ad9のヘキソンHVRと最も高い相同性を有することは、本発明のAdが上記のようにAd9と交差反応性を有することと符合する。また、その相同性が75.0%と比較的低いことは、該交差反応性が弱いことと符合する。ともあれ、本発明のAdのヘキソン領域のHVRのアミノ酸配列及び塩基配列は、公知の各種Adのそれらとかなり大きく異なっており、本発明のAdを特徴付ける重要な特徴である。
【００１１】
なお、一般に、ウイルスの遺伝子の塩基配列はしばしば変異を起こすことは当業者にとって周知であり、また、僅かな変異が起きてもその抗原性や病原性には実質的に影響を与えない場合も少なくないことも当業者にとって周知である。従って、ヘキソンのHVRによりコードされるアミノ酸配列が、配列表の配列番号１で記載されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列中の１若しくは複数のアミノ酸残基が置換し、欠失し若しくは該アミノ酸配列に１若しくは複数のアミノ酸残基が挿入され付加されたアミノ酸配列を有する（配列からなる、以下同じ）Adであっても、前記抗原性（すなわち、抗Ad8プロトタイプ抗血清及び抗Ad9プロトタイプ抗血清によって弱く中和されるが、上記した他のAdプロトタイプに対する抗血清によっては中和されない）及び前記病原性を有するAdは、本発明の範囲に含まれる。この場合、該アミノ酸配列と配列番号１に示されるアミノ酸配列の相同性（同一性、以下同じ）は９０％以上である。
【００１２】
また、下記実施例で単離された本発明のAdのファイバー領域は、配列表の配列番号４に示される塩基配列を有しており、それによってコードされるアミノ酸配列を配列番号３に示す。また、該アミノ酸配列を他の公知の各種Adプロトタイプの同領域のアミノ酸配列と整列させて比較した図を図６に示す。さらに、ファイバー領域の塩基配列を他の公知の各種Adプロトタイプの同領域の塩基配列と整列させて比較した図を図７〜９に示す。なお、ファイバー領域は抗原性には影響しないので、ファイバー領域によりコードされるアミノ酸配列が配列番号３に示されるアミノ酸配列とは異なるものであっても上記の病原性及び抗原性を有するものは、本発明の範囲に含まれる。
【００１３】
本発明のAdは、上記のような新規な抗原性を有しており、そのヘキソンHVRによりコードされるアミノ酸配列と公知のAdの同領域のアミノ酸配列との相同性も上記の通り比較的低いので、本発明のAdに特異的な抗体を調製することが可能である。ここで、「特異的な」とは、本発明のAdとは抗原抗体反応するが、他の型のAdとは抗原抗体反応しないことを意味する。これは、例えば、本発明のAdを免疫原として常法により哺乳動物を免疫し、脾細胞又はリンパ球のような抗体産生細胞を回収し、これとミエローマ細胞を融合させ、ハイブリドーマを選択培養し、本発明のAdとは反応するが、他の型のAdとは反応しないモノクローナル抗体を産生しているハイブリドーマをスクリーニングし、該ハイブリドーマを培養してモノクローナル抗体を回収することにより容易に行うことができる。
【００１４】
本発明のAdは、このような特異的な抗体を用いた免疫測定法により測定することができる。なお、本明細書において「測定」とは検出と定量の両者を包含する。また、逆に、被検試料中の、本発明のAdに特異的な抗体を、本発明のAdを用いた免疫測定法により測定することができる。被検試料の例としては、血清や髄液等の体液及びそれらの希釈物を挙げることができる。免疫測定法自体はこの分野において周知であり、周知のいずれの免疫測定法をも用いることができる。周知の免疫測定法には、反応形式で分類すれば、サンドイッチ法、競合法、凝集法等が含まれ、用いる標識により分類すれば、酵素抗体法、蛍光抗体法、放射抗体法、ビオチン抗体法等が含まれるが、これらのいずれの方法をも採用できる。
【００１５】
さらに、例えば下記実施例２に記載するように、ヒト肺癌株細胞であるA549細胞などの培養細胞に対する細胞変性効果を利用した中和試験により本発明のAd又はこれに対する抗体を測定することも可能である。すなわち、本発明のAdに対する被検試料中の抗Ad抗体を測定する場合には、被検試料と、本発明のAdを接触させ、その結果物を本発明のAdによる細胞変性作用を受けるA549細胞などの細胞に投与し、その細胞変性効果を観察する。もし、細胞変性効果が測定されなければ、被検試料中には本発明のAdを中和するのに十分な量の抗Ad抗体が含まれていたことになる。従って、この方法により被検試料中に本発明のAdに対する抗体が含まれているか否かを知ることができる。さらに、例えば被検試料の各段階希釈物と、本発明のAdとを混合し、得られた混合物を上記細胞に投与し、細胞変性効果が観察されない最大の希釈倍率を調べることにより、被検試料中の抗Ad抗体を測定することができる。同様な原理により、本発明のAdに対する抗体を用いて、被検試料中の本発明のAdを測定することもできる。
【００１６】
本発明のAdは、上記の通り特徴的なヘキソンHVRを有しているので、HVRの塩基配列に基づいて本発明のAdを測定することができる。例えば、HVR又はその一部をＰＣＲのような核酸増幅法により増幅し、その塩基配列を決定し、決定された塩基配列を配列番号２に示される塩基配列と比較することにより本発明のAdを検出することができる。また、配列番号２で示される塩基配列を有する核酸又はその一部を核酸増幅法により特異的に増幅させ、増幅された断片を検出することによっても本発明のAdを測定することができる。ここで、「特異的に増幅させ」とは、本発明のAdのヘキソンHVR又はその一部は増幅されるが、他の型のAdのヘキソンHVR又はその一部は増幅されないことを意味する。このような特異的な増幅に用いられるオリゴヌクレオチドプライマーは、本発明のAd及び他の型のAdのヘキソンHVRの塩基配列の比較が図３ないし図５に示されているので、容易に設計することができる。すなわち、本発明のAdのみが他の型のAdとは異なる塩基を有する部位を含むようにオリゴヌクレオチドプライマーを設定する。この際、非特異的な増幅を確実に妨げることができるように、その異なる塩基が、プライマーの３’末端に来るように設定することが好ましい。本発明のAdのみが他の型のAdとは異なる塩基を有する部位としては、図３〜図５から明らかなように、第８３塩基（以下、「83nt」のように記載）、108nt, 124nt, 207nt, 241nt, 352nt, 367nt, 386nt, 387nt, 434nt, 441nt, 444nt, 450nt, 541nt及び 545nt等を挙げることができる。なお、これらの部位は図３から図５に示されるナンバリングによるものである。これらのいずれかの部位を含み、配列番号２で示される塩基配列の連続する１５塩基以上、好ましくは２０〜５０塩基程度から成るオリゴヌクレオチド、特に好ましくは、これらのいずれかの部位をその３’末端とするオリゴヌクレオチドを一方のプライマーとして用いてＰＣＲ等の核酸増幅法を行うことにより、本発明のAdのヘキソンHVRのみを特異的に増幅させることができる。なお、用いるプライマーの塩基配列は、配列番号２に示される塩基配列中の連続する部分と完全に同一の配列を有していることが好ましいが、特異的なハイブリダイゼーションが起きるならば１若しくは複数の塩基が置換し、欠失し又は１若しくは複数の塩基が挿入され若しくは付加されたものであってもよい。なお、ＰＣＲのような核酸増幅法自体はこの分野において周知であり、そのためのキット及び装置も市販されているので、当業者が容易に行うことができる。さらに、上記のような特異的なオリゴヌクレオチドに標識を付して、本発明のAdを測定するためのプローブとすることもできる。標識としては、酵素、蛍光、放射性物質、ビオチン等の周知のものを用いることができる。さらに、上記のように、本発明のAdのヘキソンHVRに特異的な部位が明らかになったので、これらの特異的な部位でのみ切断が起きる又は起きない制限酵素を用いて増幅された核酸を消化し、その切断パターンを調べる、いわゆるPCR-RFLPの手法によっても本発明のAdを測定することが可能である。
【００１７】
上記のように、下記実施例で単離された本発明のAdのファイバー領域は、配列番号４に示す塩基配列を有する。従って、配列番号２に示されるHVRの塩基配列の場合と同様に、配列番号４に示される塩基配列に基づき本発明の実施例のAdを測定することができる。核酸増幅法による特異的な増幅のために用いられるオリゴヌクレオチドプライマーとしては、図７から図９からわかるように、36nt, 83nt, 135nt, 154nt, 285nt, 447nt, 488nt及び 793nt のいずれかの部位を含むものが用いられる。他の説明は、先の段落に記載した配列番号２に示されるHVRの塩基配列の場合と同様である。
【００１８】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００１９】
実施例１
１．材料及び方法
(1)  臨床材料
１９９６年秋、横浜市立大学付属病院の眼科で院内感染が発生した。この時に発症７日以内の８人の急性濾胞性結膜炎患者の結膜から結膜擦過材料を採取した。すなわち、下側の眼瞼結膜を綿棒で擦り、この綿棒を直ちに1.5 mlのイーグル最小必須培地(MEM)中に浸漬することによりウイルスを抽出した。
【００２０】
(2)  ウイルスの単離及び同定
(1)で得られたウイルス抽出液をHep-2細胞（ヒト喉頭癌細胞、Cancer Res. 15:598, 1955, 東京都武蔵村山市の国立感染症研究所より入手）及びA549細胞（ヒト肺癌細胞、J. Nat. Cancer Inst. 51:1417-1423, 1973,大日本製薬株式会社（大阪府吹田市）より市販）に接種し、ウイルスがこれらの細胞に対する細胞変性作用(CPE)を有するか否かを接種２８日後まで調べた。感染細胞は、抗Adモノクローナル抗体（米国カリフォルニア州TemeculaのChemicon International Inc.より市販）、抗HSV-1モノクローナル抗体及び抗HSV-2モノクローナル抗体（商品名Micro Trak、米国カリフォルニア州Palo AltoのSyva, Co.より市販）並びに抗クラミジアモノクローナル抗体（商品名Micro Trak、Syva, Co.より市販）を用いて同定した。
【００２１】
(3)  中和試験
Hep-2細胞及びA549細胞を用いたマイクロタイター法により中和試験を行い、CPE指数を測定した。この試験に用いた抗血清は、ATCCからAd１〜１１、１４、１９、２２、３４、３５、３７、４０及び４１型プロトタイプを取り寄せ、これらを免疫原として常法によりウサギに免疫することにより調製した。その他は下記実施例２と同様に行った。
【００２２】
(4)  Adプロトタイプ及び臨床材料からのＤＮＡの調製
各Adプロトタイプにより感染された細胞懸濁液又は(1)で調製したウイルス抽出液の各５００μｌをそれぞれ1.5 mlのマイクロチューブに入れ、４℃で12000 x gで１５分間遠心した。ＤＮＡをペレットからSepaGene（商品名、三光純薬株式会社製）を用いて抽出した。５０μｌのTrisバッファー、５０μｌのグアニジンチオシアネート、３５０μｌの蛋白吸着剤含有クロロホルム及び２００μｌの酢酸ナトリウムを撹拌下にペレットに加え、次いで該混合物を１５℃で12000 x gで１０分間遠心した。次いで２４０μｌの上清を回収し、これに２４μｌの酢酸バッファーと６００μｌの１００％エタノールを加え、次いでこの溶液を４℃で12000 x gで１０分間遠心した。上清を捨て、３８０μｌの７０％エタノールをペレットに加え、４℃で12000 x gで１分間遠心し、上清を捨てた。ＤＮＡペレットを乾燥させた後、２５μｌの滅菌水に溶解した。
【００２３】
(5)  PCR-RFLP分析によるＤＮＡの型分類
本願発明者らは、結膜炎の主な原因であるAdを検出し、その血清型を同定するPCR-RFLP法を報告した(Saitoh-Inagawa, W. et al., J. Clin. Microbiol. 34:2113-2116, 1996) 。すなわち、ヘキソン遺伝子の保存領域1004 bpを第一段階ＰＣＲにより増幅し、続く第２段階ＰＣＲにおいて、増幅産物中の956 bpを増幅するnestedＰＣＲを行い、増幅産物を制限酵素EcoT14 I, Hae III及びHinf Iで消化し、ゲル電気泳動によりその切断パターンを調べた。(1)で採取したAdをこの方法により分析し、２６種類のAdプロトタイプの切断パターンと比較することにより５つの亜属に分類した。
【００２４】
(6)  PCR-塩基配列決定による血清型分類
Adのヘキソンの表面上に、Adの型特異的中和に関与する複数のHVRが存在することが報告されている。ヘキソンHVRsを増幅するプライマーの塩基配列を設計するために、ヘキソン遺伝子の塩基配列を比較し、各型間で最高の相同性を有する部位を選択した。HVR1〜7を増幅するための第一段階ＰＣＲでは、プライマーとしてHX5-1（フォワード側プライマー）: 5'-aagatggccaccccctcgatgatgccgcagt-3'及びHX3-1（リバース側プライマー）: 5'-cacttatgtggtggcgttgccggccgagaacgg-3'を用いた。このプライマーセットは、Ad３型のヘキソン遺伝子の1nt〜2829ntに相当する2829bpの断片を増幅すべく設計された。第２段階のＰＣＲのためのプライマーは、増幅産物の40nt〜1887ntに相当する1848bpの断片を増幅すべく設計されたものであり、７個の全てのHVRsはこの断片中に含まれる。第２段階ＰＣＲに用いたプライマーは、HX5-3（フォワード側プライマー）: 5'-cacatcgccggacaggatgcttcggagta-3'及びHX3-5（リバース側プライマー）: 5'-gtgttgtgagccatggggaagaaggtggc-3'であった。ＰＣＲは、2 mM Tris-HCl[pH8.0], 10 mM KCl, 2.5 mM MgCl2, 400μＭの各デオキシヌクレオチド(dATP, dGTP, dCTP, dTTP)、0.2μＭの各プライマー及び1 UのLA Taq DNAポリメラーゼ(宝酒造バイオメディカル社製)を含む２０μｌの反応溶液を用いて行った。第１段階のＰＣＲは、Cetus 9600（商品名、Perkin-Elmer社製）中で、９４℃１０秒間の変性工程、６５℃６分間のアニーリング及び伸長工程を４０サイクル繰り返すことにより行った。第２段階のＰＣＲは、９４℃１分間の変性工程、４０℃１分間のアニーリング工程及び７２℃２分間の伸長工程を４０サイクル繰り返すことにより行った。バッファー交換及び濃縮はMICROCON-100（商品名、Amicon, Inc.製）を用いて行った。精製されたＤＮＡを３０μｌの滅菌水に溶解した。塩基配列決定のために次の６種類のプライマーを用いた。すなわち、センス側プライマーとして、S-28: 5'-acccacgatgtgaccac-3'(Ad３型ヘキソンの152nt〜172nt)、S-29: 5'-gccagcacrtwctttgacat-3'(同289nt〜308nt)及びS-51: 5'-cccaacagacccaaytacat-3'（同937nt〜956nt）を用い、アンチセンス側プライマーとしてS-52: 5'-cccatgttgccagtgctgttgtartaca-3'（同986nt〜1013nt）、S-53: 5'-aaggggttgacgttgtccat-3'（同1555nt〜1574nt）及びS-54: 5'-ccagcattgcggtggtgrtt-3'（同1576nt〜1595nt）を用いた（なお、塩基の位置は図３〜図５に記載のもの）。8.0μｌのTerminator Ready Reaction Mix with Ampli Taq(商品名、Perkin Elmer社製)、1.0μｌ(3.2 pmol)の各プライマー及び1.0μｌのＰＣＲ産物を用いてサイクルシーケンシングを行った。塩基配列決定のためのＰＣＲは、９６℃１０秒間の変性工程、５０℃５秒間のアニーリング工程及び６０℃４秒間の伸長工程を２５サイクル繰り返すことにより行った。サンプルは、オートシーケンサーABI PRISM 310 Genetic Analyzer（商品名、Perkin-Elmer社製）により分析した。塩基配列は、DNASIS(商品名、日立ソフトウェアエンジニアリング社製)により整列させ、相同性を算出した。臨床材料から分離されたウイルスと、ATCCから得た２６のプロトタイプとの各HVRの相同性を計算した。
【００２５】
(7)  ファイバー領域の塩基配列決定
臨床サンプルからのAd並びにAd8, Ad9, Ad17, Ad19及びAd37プロトタイプのファイバー領域の塩基配列を決定し、それがコードするアミノ酸配列を推定した。これは具体的には次のように行った。Adのファイバー領域は約1200bpの長さである。ファイバー全領域を増幅するためのＰＣＲでは、プライマーとしてS-59（フォワード側プライマー）: 5'-aagggatgtcaaattcctgg-3'及びS-63（リバース側プライマー）: 5'-agactgactacccgtgctgg-3'を用いた。このプライマーセットは、Ad8型ファイバー遺伝子(X74660)前の49ntからファイバー遺伝子後ろの78ntを含むファイバー遺伝子領域1217ntを増幅すべく設計された。ＰＣＲは、2 mM Tris-HCl[pH8.0], 10 mM KCl, 2.5 mM MgCl2, 400μＭの各デオキシヌクレオチド(dATP, dGTP, dCTP, dTTP)、0.2μＭの各プライマー及び1 UのTaq DNAポリメラーゼ(宝酒造バイオメディカル社製)を含む２０μｌの反応溶液を用いて行った。ＰＣＲは、Thermal Sequencer TSR-300（商品名、Iwaki Glass社製）中で、94℃60秒間の変性工程、60℃60秒間のアニーリング及び72℃120秒間の伸長工程を計４０サイクル繰り返すことにより行った。バッファー交換及び濃縮はMICROCON-100（商品名、Amicon, Inc.製）を用いて行った。精製されたＤＮＡを３０μｌの滅菌水に溶解した。塩基配列決定のために次の5種類のプライマーを用いた。すなわち、センス側プライマーとして、S-60: 5'-cctggtccacaattttcattgt-3'(Ad8型ファイバーの-35nt?-14nt)、S-69: 5'-cgcaccttatggacaac-3'(同538nt?554nt)及びS-70: 5'-cgcacactttggacaac-3'（同538nt?554nt）を用い、アンチセンス側プライマーとしてS-71: 5'-atctgacttccacactttgt-3'（同619nt?638nt）及びS-64: 5'-tacccgtgctggtgtaaaaatc-3'（同1217+49nt?+70nt）を用いた。8.0μｌのTerminator Ready Reaction Mix with Ampli Taq(商品名、Perkin Elmer社製)、1.0μｌ(3.2 pmol)の各プライマー及び1.0μｌのＰＣＲ産物を用いてサイクルシーケンシングを行った。塩基配列決定のためのＰＣＲは、９６℃１０秒間の変性工程、５０℃５秒間のアニーリング工程及び６０℃４分間の伸長工程を計２５サイクル繰り返すことにより行った。サンプルは、オートシーケンサーABI PRISM 310 Genetic Analyzer（商品名、Perkin-Elmer社製）により分析した。塩基配列は、DNASIS(商品名、日立ソフトウェアエンジニアリング社製)により整列させた。臨床材料から分離されたウイルスと、ATCCから得たD亜属のプロトタイプとの相同性を計算した。
【００２６】
２．  結果
(1)  臨床症例からのウイルスの単離
ウイルスは、８人の患者の臨床サンプルのうちの３つから単離された（表１）。数代継代培養し、培養細胞中でCPEが４＋になるのに３週間超の時間がかかった。全てのタイプの細胞において、細胞の球状化及び屈折性の核内封入体という細胞変性効果を示した。４＋のCPEを示した２日後に、Hep-2及びA549細胞培養物を回収し、Adの感染について種々の試験を行った。直接的な蛍光抗体試験では、希釈した抗Adヘキソンマウスモノクローナル抗体に対して培養細胞は、３＋及び４＋特異的な染色を示した。一方、抗HSV-1モノクローナル抗体及び抗HSV-2モノクローナル抗体並びに抗クラミジアモノクローナル抗体とは反応しなかった。これにより、臨床サンプルから単離されたウイルスがアデノウイルスであることが同定された。
【００２７】
【表１】
表１  結膜炎患者からの単離物
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VKH: フォークト−小柳−原田病、POAG: 原発性開放角緑内障、Sarcoidosis: サルコイドーシス
【００２８】
(2)  臨床特徴
８人の患者の臨床所見を表２にまとめた。疾病の徴候は、発赤、まぶしがり症、異物感及び片眼又は両眼からの分泌であった。８人のうちの６人（75.0%）が両眼とも発症していた。全ての患者において、結膜充血及び結膜濾胞が観察され、結膜炎の程度は中度ないし高度であった。過半数の患者では点状表層角膜炎が起きていた。一方、結膜下出血は１例だけであり、偽膜は観察されなかった。
【００２９】
【表２】
表２  ８人の患者の臨床特徴
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【００３０】
(3)  ヘキソンの中和試験による臨床サンプルの同定
中和試験によると、臨床単離物は、これまでに報告されていない抗原構造を有していた。臨床単離物とAd８型又は９型の間に弱い交差反応が観察された（表３）。これらの単離物の血清型を仮にAdX型（又はAd8/9型）と命名した。Ad8プロトタイプに対する抗血清は、Ad8プロトタイプに対するよりも弱くAdXと反応した。同様に、Ad9プロトタイプに対する抗血清は、Ad9プロトタイプに対するよりも弱くAdXと反応した。AdXは、ATCCから入手可能な、上記した他のいずれのAdプロトタイプに対する抗血清によっても中和されなかった。
【００３１】
【表３】
表３    交差中和試験によるAdXの同定
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【００３２】
(4)  PCR-RFLP分析によるＤＮＡ開裂パターン
全ての臨床サンプルからの単離物のPCR-RFLP開裂パターンは同一であり、これはAd8プロトタイプの開裂パターンと同一であった。臨床サンプルの制限酵素開裂パターンは、Ad9プロトタイプの開裂パターンとEcoT14 I及びHaeIIIで異なっていた。
【００３３】
(5)  推定アミノ酸配列の比較
２６種類のAdプロトタイプの塩基配列から推定されるアミノ酸配列を比較した。新たに設定されたHVRsはHVR1(132-189), HVR2(195-211), HVR3(219-230), HVR4(254-272), HVR5(279-300), HVR6(317-328)及び HVR7(430-474)である。なお、括弧内の数字は、Crawford-Miksza, L. et al., J. Virol. 70:1836-1844, 1996に記載されたアミノ酸配列におけるアミノ酸のナンバリングに従ったアミノ酸番号である（図１及び図２参照）。
【００３４】
全ての臨床サンプルから得られたAd(AdX)のヘキソンのHVRの推定アミノ酸配列は同一であった。これと、Ad8, 9, 10, 17, 19, 22 及び37プロトタイプの同領域の推定アミノ酸配列を整列させて図１及び図２に示す。また、同領域の塩基配列を整列させて図３〜図５に示す。さらに、AdXの同領域のアミノ酸配列を配列番号１に、塩基配列を配列番号２に示す。さらに、Ad8, 9, 10, 17, 19, 22 及び37プロトタイプの同領域の塩基配列及び推定アミノ酸配列を配列表の配列番号５〜１１に示す。さらに、臨床サンプル由来の配列と２６種類のAdプロトタイプの同配列の相同性を表４及び表５に示す。７個のHVRのうち５個において臨床サンプルと最も相同性が高かったのはAd9であった。また、各HVRにおける相同性の平均値でも、臨床サンプルと最も相同性が高かったのはAd9であり、その相同性は75.0%であった。このことは、AdXが抗Ad9抗血清によって弱く中和されることと符合している。
【００３５】
【表４】
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【００３６】
【表５】
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【００３７】
(6)  ファイバー領域の配列
臨床サンプルからのAd(AdX)のファイバー領域の推定アミノ酸配列を配列番号３に、塩基配列を配列番号４に示す。また、Ad8, Ad9, Ad17, Ad19及びAd37プロトタイプのファイバー領域の塩基配列及びそれがコードするアミノ酸配列を配列表の配列番号１２〜１６にそれぞれ示す。さらに、該領域のアミノ酸配列を整列させて比較した図を図６に、同領域の塩基配列を整列させて比較した図を図７〜９に示す。
【００３８】
実施例２  AdX型中和抗体検査
(1)  使用培養細胞及び培養液
培養細胞は、A549を使用した。維持培養液は、5%FBS加Eagle-MEM培養液を使用した。
【００３９】
(2)  対象サンプル
アデノウイルス結膜炎患者血清７件及びAd8, 9及び22プロトタイプに対する抗血清３件を用いた。
【００４０】
(3)  検査法
各患者血清又はAd中和抗血清を、あらかじめEagle-MEM培養液25μl滴下しておいたトランスファープレートに25μl分注し、２倍段階希釈した。次に30TCID50/25μlに調整したアデノウイルスX型のウイルス液を25μlを混合し、室温で30分間反応させた後、96ウェルマイクロプレート内のA549細胞浮遊液に反応液を接種した。37℃、5%CO2インキュベーターで５日間培養し、CPEの有無を顕微鏡下で観察した。中和抗体価は、常法に従いウイルスを中和した血清の最高希釈倍数で表した。
【００４１】
(4)  結果
結果を下記表６に示す。なお、抗体価「４倍未満」は実質的に中和が起きなかったことを示す。
【００４２】
【表６】
表６
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【００４３】
【発明の効果】
本発明により、病原性を有する新規なアデノウイルス及びその迅速かつ正確な測定方法が提供された。本発明のアデノウイルスは強力な感染力と病原性を有しており、その迅速かつ正確な測定が感染防止や治療のために重要であるが、本発明によりこれが可能となった。
【００４４】
【配列表】
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【００４５】
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【００４６】
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【００４７】
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【００４８】
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【００４９】
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【００５０】
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【００５３】
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【００６０】
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【００６１】
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【００６２】
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【００６３】
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【００６４】
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【００６５】
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【００６６】
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【００６７】
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【００６８】
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【００６９】
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【００７０】
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【００７１】
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【００７２】
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【００７３】
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【００７４】
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【００７５】
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【００７６】
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【００７７】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のアデノウイルス及び公知の各種アデノウイルスプロタイプのヘキソン遺伝子中の高度変異領域によりコードされる推定アミノ酸配列を整列させ、比較して示す図である。
【図２】図１の続きである。
【図３】本発明のアデノウイルス及び公知の各種アデノウイルスプロタイプのヘキソン遺伝子中の高度変異領域の塩基配列を整列させ、比較して示す図である。
【図４】図３の続きである。
【図５】図４の続きである。
【図６】本発明のアデノウイルス及び公知の各種アデノウイルスプロタイプのファイバー領域によりコードされる推定アミノ酸配列を整列させ、比較して示す図である。
【図７】本発明のアデノウイルス及び公知の各種アデノウイルスプロタイプのファイバー領域の塩基配列を整列させ、比較して示す図である。
【図８】図７の続きである。
【図９】図８の続きである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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