(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列が配列番号８に示され、ヒト酸感受性イオンチャンネル３（ｈＡＳＩＣ３）と称される、単離および精製されたヒト陽イオン輸送タンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載のヒト陽イオン輸送タンパク質をコードする、単離および精製された核酸分子。
【請求項３】
染色体７ｑ３５に位置する請求項２に記載の核酸分子。
【請求項４】
プロトン依存性陽イオンチャンネルを形成する、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項５】
輸送チャンネル活性が静止ｐＨ依存性である、請求項４に記載のタンパク質。
【請求項６】
２相性脱感作キネティクスも示す、請求項４に記載のタンパク質。
【請求項７】
アミロライド感受性である、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項８】
請求項１に記載のｈＡＳＩＣ３の少なくとも１つの分子と第２のプロトン依存性陽イオンチャンネルの少なくとも１つの分子を含む、ヒト陽イオン輸送チャンネル。
【請求項９】
前記第２の陽イオン輸送タンパク質は、配列番号３に示されるｈＡＳＩＣ２Ａ、配列番号６に示されるｒＡＳＩＣ２Ｂ、配列番号２に示されるｈＡＳＩＣ１Ａ、および配列番号４に示されるｒＡＳＩＣ１Ｂからなる群から選択される、請求項８に記載の陽イオン輸送チャンネル。
【請求項１０】
請求項２に記載の核酸分子を含むクローニングビヒクル。
【請求項１１】
配列番号３に示されるｈＡＳＩＣ２Ａ、配列番号６に示されるｒＡＳＩＣ２Ｂ、配列番号２に示されるｈＡＳＩＣ１Ａ、および配列番号４に示されるｒＡＳＩＣ１Ｂからなる群から選択される選択される第２の陽イオン輸送タンパク質をコードする配列もまた含む、請求項１０に記載のクローニングビヒクル。
【請求項１２】
請求項１０に記載のクローニングビヒクルを含む形質転換細胞。
【請求項１３】
ｈＡＳＩＣ３を発現する請求項１２に記載の形質転換細胞。
【請求項１４】
請求項１１に記載のクローニングビヒクルを含む形質転換細胞。
【請求項１５】
請求項１に記載のｈＡＳＩＣ３の少なくとも１つの分子と、配列番号３に示されるｈＡＳＩＣ２Ａ、配列番号６に示されるｒＡＳＩＣ２Ｂ、配列番号２に示されるｈＡＳＩＣ１Ａ、および配列番号４に示されるｒＡＳＩＣ１Ｂからなる群から選択される群から選択される第２の陽イオン輸送タンパク質の少なくとも１つの分子を含むヒト陽イオン輸送チャンネルを発現する、請求項１４に記載の形質転換細胞。
【請求項１６】
請求項１に記載のｈＡＳＩＣ３からなる陽イオン輸送チャンネルの活性を調節することができる物質をスクリーニングする方法であって、試験しようとする予め選択した量の前記物質と、前記陽イオン輸送チャンネルを発現する細胞とを接触させることと、前記陽イオンチャンネルの輸送機能に対する前記物質の効果を測定することと、カリウムチャンネル活性に対して正または負の効果がある前記物質を同定することを含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】
関連特許出願の相互参照
本特許出願は、１９９８年８月５日に出願した仮特許出願番号６０／０９５，４０８、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  Ｌｏｃａｌｉｓａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  Ｈｕｍａｎ−Ｐｒｏｔｏｎ−Ｇａｔｅｄ  Ｃａｔｉｏｎ  Ｃｈａｎｎｅｌおよび１９９８年８月５日に出願した同出願番号０９／１２９，７５８，Ｍａｍｍａｌ  Ｎｅｕｒｏｎａｌ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｎｓｉｎｇ  Ｃａｔｉｏｎｉｃ  Ｃｈａｎｎｅｌ，Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｔｈｅｒｅｏｆの利益を得、その利益を請求する。前記米国出願は、それらの全体が本明細書に参考として援用される。
【０００２】
【発明の分野】
本発明は、哺乳動物（特に、ヒトおよびラット）酸感受性イオンチャンネルの新たなファミリーに関する。さらに詳細には、本発明は、プロトン活性化陽イオンチャンネルの新たなファミリーを、ヒトおよびラットにおいて同定し、分子的に特徴付けしたことに関する。この新たなファミリーは、以下総称してＡＳＩＣ（Ａｃｉｄ    Ｓｅｎｓｉｎｇ  Ｉｏｎｉｃ  Ｃｈａｎｎｅｌ：酸感受性イオンチャンネル）ポリペプチドと呼ぶ。
【０００３】
ＡＳＩＣチャンネルは、アミロライド感受性デジェネリン（ｄｅｇｅｎｅｒｉｎｅ）ナトリウムチャンネル［６，１１〜１４］ファミリーに属する陽イオンチャンネルグループの最も重要なメンバーであり、細胞外酸性化により一過的に活性化される。
【０００４】
酸感受性は、痛覚［１］と味覚伝達［２］の両方に関連している。酸の強度が非常に多くの疼痛性炎症および虚血状態に関係するので、酸による感覚ニューロンの刺激は非常に重要である。酸により引き起こされる疼痛は、感覚ニューロンに存在し、プロトンにより活性化される陽イオンチャンネルにより媒介されると考えられる［３〜５］。本発明のＡＳＩＣチャンネルの生物物理学的および薬理学的な性質は、感覚ニューロンにあると記載されたプロトン活性化陽イオンチャンネルの性質と類似する［３，１５，１６］。しかしながら、以下の説明で示されるように、今までのところ、ＡＳＩＣチャンネルより単純なリガンド活性化イオンチャンネルは報告されていない。
【０００５】
【発明の概要】
本発明はまた、本発明によるプロトン活性化イオンチャンネルを含む第１のタンパク質と第２のプロトン活性化イオンチャンネルとの組み合わせにより構成されたハイブリッド陽イオンチャンネルに関する。
【０００６】
本発明の目的は、アミロライド感受性であり、かつプロトンにより活性化されるニューロン陽イオンチャンネルを構成するタンパク質をコードする核酸分子である。
【０００７】
本発明はまた、都合よく適切な制御配列と組み合わされた、前述の核酸分子の少なくとも１つを含むベクター、ならびに本発明によるイオンチャンネルを構成するタンパク質を細胞宿主において産生または発現するための手順に関する。
【０００８】
本発明はまた、前述の方法により得られた、ＡＳＩＣ陽イオンチャンネルおよび／またはその誘導体を発現する形質転換細胞に関する。
【０００９】
本発明はまた、ニューロン変性を引き起こし得る病理学的変化を研究するために、ＡＳＩＣチャンネルを使用することに関する。本発明はまた、活性成分として本発明のこれらのタンパク質の少なくとも１つを含む薬学的調製物に関する。
【００１０】
本発明の他の特徴および利点は、ＡＳＩＣチャンネルの証明および特徴付けにつながった研究活動に関する以下の説明で示されよう。
【００１１】
以下および実施例で論じられる図面を参照すれば、本発明をさらに理解することができる。
【００１２】
アミノ酸配列およびＤＮＡ配列の同定
配列番号１は、ラットのｃＤＮＡ配列から推定された、ｒＡＳＩＣ１Ａチャンネルタンパク質の５２６アミノ酸の配列を示す。
【００１３】
配列番号２は、ヒトｃＤＮＡの部分配列から推定された、ｈＡＳＩＣ１Ａチャンネルタンパク質の５１４アミノ酸の部分配列を示す。
【００１４】
配列番号３は、ヒトｃＤＮＡ配列から推定された、ｈＡＳＩＣ２Ａチャンネルタンパク質の５１２アミノ酸の配列を示す。
【００１５】
配列番号４は、ｒＡＳＩＣ１Ｂチャンネルタンパク質の５５９アミノ酸の配列、ならびにこのタンパク質をコードする配列を含むＤＮＡ分子の配列を示す。
【００１６】
配列番号５は、ｒＡＳＩＣ３チャンネルタンパク質の５５３アミノ酸の配列、およびこのタンパク質をコードするＤＮＡ配列を示す。
【００１７】
配列番号６は、ｒＡＳＩＣ２Ｂチャンネルタンパク質の５６３アミノ酸の配列、ならびにこのタンパク質をコードする配列を含むＤＮＡ分子の配列を示す。
【００１８】
配列番号７は、ｈＡＳＩＣ３チャンネルタンパク質の５５３アミノ酸の配列、ならびにこのタンパク質をコードする配列を含むＤＮＡ分子の配列を示す。
【００１９】
【詳細説明】
本発明の目的は、アミロライド感受性であり、かつプロトンにより活性化されるニューロン陽イオンチャンネルを構成するラットタンパク質である。本発明は、陽イオンチャンネルＡＳＩＣファミリーを構成するタンパク質、またはこれらのタンパク質の機能的に等価な誘導体に関する。
【００２０】
このような誘導体は、配列中の１または複数のアミノ酸残基が修飾および／または抑制および／または付加されたポリペプチドである。但し、このような修飾、抑制、および／または付加は、ＡＳＩＣチャンネルの機能的性質および構造的性質（主に、プロトンによる活性化）を変えない。実際に、ラットとヒトの両方にある３つの異なるＡＳＩＣポリペプチドＡＳＩＣ１、ＡＳＩＣ２、およびＡＳＩＣ３が本明細書に記載される。さらに、ＡＳＩＣ１およびＡＳＩＣ２をコードする転写物はオルタナティブスプライシングされ、ＡＳＩＣ１およびＡＳＩＣ２タンパク質のさらなる機能的な誘導体（それぞれ、ＡＳＩＣ１Ａおよび１ＢならびにＡＳＩＣ２ＡおよびＡＳＩＣ２Ｂ）が生成される。ＡＳＩＣタンパク質の他の機能的な誘導体、および／またはＡＳＩＣ  ｍＲＮＡ転写物のオルタナティブスプライシングにより生成されるＡＳＩＣポリペプチドの他の形態は、本発明の範囲内にあるとみなされる。当業者は、本明細書に含まれる実施例に記載の技術を用いて、このようなタンパク質およびその機能的誘導体を分析することができる。このため、ＡＳＩＣチャンネルの生物物理学的および薬理学的な性質を証明することができる。
【００２１】
ＡＳＩＣチャンネルの機能的誘導体のさらなる例は以下の通りである。ヒトおよびラットのＡＳＩＣ１Ａタンパク質（それぞれ、ｈＡＳＩＣ１ＡおよびｒＡＳＩＣ１Ａ、配列番号１および２）は機能的に等価であるとみなされる。これらの２つのタンパク質のアミノ酸配列は非常に相同であるが、同一ではない。このように、基本的な機能特徴に影響を及ぼすことなく、ＡＳＩＣタンパク質の一次配列内に置換を容易に導入することができる。
【００２２】
このような機能的に等価な誘導体の別の例は、ＭＤＥＧ［１４］またはＢＮａＣ１［２０］と以前に命名され、本明細書ではｒＡＳＩＣ２Ａと呼ぶ陽イオンチャンネルを構成するタンパク質である。ｒＡＳＩＣ２Ａのアミノ酸配列を、添付の配列表に配列番号３で示す。ｒＡＳＩＣ２Ａは、アミロライド感受性であり、かつＣ．ｅｌｅｇａｎｓにおいて神経変性をもたらす変異により活性化される哺乳動物陽イオンチャンネルとして記載されている。ｒＡＳＩＣ２ＡチャンネルはＡＳＩＣ１Ａチャンネルと構造的に類似し、アミノ酸配列では約６７％の相同性を示す。両方のポリペプチドによる陽イオン輸送はアミロライド感受性であり、かつ酸により調節される。しかしながら、これらの２つのチャンネルの電気生理学的性質は、同じｐＨ変化により活性化されないために異なる。このように、ｒＡＳＩＣ２Ａの感受性範囲（ＥＣ５０＝４．０５）は、ＡＳＩＣ１Ａのもの（ＥＣ５０＝６．２）とは異なる。異なる電気生理学的性質を示し得る他の機能的に等価なタンパク質もまた本発明の範囲内にあるとみなされる。
【００２３】
ｒＡＳＩＣ２Ａチャンネルは、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓでニューロン変性を引き起こす変異と同じ変異により活性化されることが示されている。従って、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの活性過多変異と同様に、ｒＡＳＩＣ２Ａの活性変異体は細胞死の原因となる。このことから、このニューロンイオンチャンネルによる機能獲得は、哺乳動物（特に、齧歯動物およびヒト）における様々な形のニューロン変性と関連する可能性があることがわかる。しかしながら、本発明の陽イオンチャンネルがプロトンにより活性化されることが証明されるまで、ｒＡＳＩＣ２Ａの正常な生理学的機能はわからなかった。
【００２４】
アミロライド感受性であり、かつプロトンにより活性化される、本発明によるニューロン陽イオンチャンネルを構成するタンパク質の他の例を以下に示す。
−ＡＳＩＣ１Ｂと命名したチャンネル。５５９アミノ酸からなるその配列を、添付の配列表に配列番号４で示す。ＡＳＩＣ１Ｂは、縮重ＰＣＲによりラット脳からクローニングされたＡＳＩＣ１Ａチャンネルのスプライシングバリアントである。最初の１８５アミノ酸は、配列番号４に下線を引いた２１８アミノ酸の新たな配列で置換されている。
−ｒＡＳＩＣ２Ｂと命名したチャンネル。ｒＡＳＩＣ２ＢはｒＡＳＩＣ２Ａのスプライシングバリアントであり、配列番号６に示される。
−ｒＡＳＩＣ３と命名したチャンネル。５３３アミノ酸からなるその配列を、配列表に配列番号５で示す。ｒＡＳＩＣ３を、データバンクからの部分配列（アクセッション番号Ｗ６２６９４の発現配列タグ）を用いてラットの感覚ニューロンからクローニングした。ｒＡＳＩＣ３の性質は以下の通りである。
−ａ）ｒＡＳＩＣ３は感覚ニューロンで発現するが、脳では発現しない。
−ｂ）ｒＡＳＩＣ３がＸｅｎｏｐｕｓ卵母細胞または哺乳動物細胞で発現すると、２つの成分（１つの成分は、それ自体を急速に活性化および不活性化し、１つの成分は、それ自体をゆっくり活性化し、それ自体を不活性化しない）を示すプロトン活性化ナトリウム電流を記録することができる。この２つの成分はＮａ＋選択性である。それ自体を不活性化しないプロトン活性化陽イオンチャンネルは、アシドーシスにより引き起こされる長期の痛覚に関与している。
−配列番号７に示す、ｈＡＳＩＣ３と命名したチャンネル。このタンパク質は、急速に不活性化するＮａ＋選択性成分と持続性成分とを伴う２相性脱感作キネティクスを有する、新規のヒトプロトン依存性陽イオンチャンネルサブユニットである。このタンパク質と、ラット感覚ニューロンに由来するプロトン依存性陽イオンチャンネルｒＡＳＩＣ３との配列同一性は８４％である。
【００２５】
本発明はまた、ハイブリッド陽イオンチャンネル、すなわち本発明によるプロトン活性化イオンチャンネルを含む第１のタンパク質とプロトン活性化イオンチャンネルを含む第２のタンパク質との組み合わせにより構成されたチャンネルに関する。前記第２のタンパク質はまた、本発明によるプロトン活性化イオンチャンネルを含むタンパク質が有利である。このような組み合わせの例は、ＡＳＩＣ１Ａ、ＡＳＩＣ２Ａ、またはＡＳＩＣ３チャンネルとＡＳＩＣ２Ａチャンネルとの組み合わせにより例示される。このようなハイブリッドチャンネルは、第３のｐＨ感受性範囲を示す（例えば、ＡＳＩＣの場合、ＥＣ５０＝４．８）。このようなハイブリッドチャンネルの別の例は、ＡＳＩＣ１Ａ、ＡＳＩＣ１Ｂ、ＡＳＩＣ２Ａ、またはＡＳＩＣ３チャンネルとＡＳＩＣ２Ｂチャンネルとの組み合わせである。
【００２６】
ＡＳＩＣ２Ｂは、データバンクにおいて利用可能な部分マウス配列（アクセッション番号Ｗ５０５２８の発現配列タグ）を用いてラット脳からクローニングされたチャンネルであり、５６３アミノ酸からなるその配列を添付の配列表に配列番号６で示す。ＡＳＩＣ２Ｂは、ＡＳＩＣ２Ａのスプライシングバリアントである。最初の１８５アミノ酸は、配列番号６に下線を引いた２３６アミノ酸の新たな配列で置換されている。ＡＳＩＣ２Ｂは、脳および後根神経節感覚ニューロンで発現される。
【００２７】
Ｘｅｎｏｐｕｓ卵母細胞または哺乳動物細胞において単独で発現されたＡＳＩＣ２Ｂはプロトン活性化陽イオンチャンネルを形成しない。しかしながら、ＡＳＩＣ２ＢはＡＳＩＣ２ＡまたはＡＳＩＣ３と組み合わさって、性質が変化したプロトン活性化ヘテロ多量体チャンネルを形成することができる。ＡＳＩＣ２ＡおよびＡＳＩＣ２Ｂの共発現後に形成されたチャンネルの活性化ｐＨは、ＡＳＩＣ２Ａのみだけで形成されたチャンネルとは異なる。ＡＳＩＣ２ＡおよびＡＳＩＣ２ＢをＣＯＳ細胞において発現させた後、電流はｐＨ３でその最大値に達しなかったが、ＡＳＩＣ２Ａのみで誘導される電流は４．５〜４．０のｐＨで飽和する。さらに、ＡＳＩＣ２ＡおよびＡＳＩＣ２Ｂの共発現後に形成されたチャンネルの不活性化キネティクスおよびイオン選択性は、ＡＳＩＣ２Ａ単独のものとは明らかに異なる。それ自体をゆっくりと不活性化し、わずかにＮａ＋およびＫ＋選択性である電流が現れる。
【００２８】
別の例では、ＡＳＩＣ３発現後に得られるナトリウム電流は、ＡＳＩＣ２ＢをＡＳＩＣ３と共発現させた場合、非選択性になる（ナトリウムとカリウムとを区別しない）。この新たな性質は、アシドーシスにより引き起こされる長期の痛覚に関与するプロトン活性化陽イオンチャンネルの性質と似ている。ＡＳＩＣ３およびＡＳＩＣ２Ｂはこのチャンネルの一部である可能性が高い。
【００２９】
本発明による列挙されたＡＳＩＣ１Ａ、ＡＳＩＣ１Ｂチャンネルを構成するタンパク質のアミノ酸配列相同性を以下の表１に示す。
【００３０】
【表１】
0004489952.tif 000002
【００３１】
本発明のイオンチャンネルを構成する少なくとも１つのタンパク質および／または上記のハイブリッドチャンネルに対するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を、文献に記載される古典的な方法により調製することができる。上記抗体は、本発明のイオンチャンネルが様々なヒトおよび動物の組織に存在するか調べるのに有用であり、ＡＳＩＣチャンネルおよび／またはその誘導体をｉｎ  ｖｉｖｏで阻害または活性化するためにも使用することができる。このような適用は、不完全なＡＳＩＣ陽イオン輸送に起因する疾患を治療するのに有用であり得る。
【００３２】
本発明の目的はまた、アミロライド感受性であり、かつプロトンにより活性化されるニューロン陽イオンチャンネルを構成するタンパク質をコードする核酸分子である。より詳細には、本発明は、ヒトまたはラットに由来するＡＳＩＣ１Ａ、ＡＳＩＣ１Ｂ、ＡＳＩＣ２Ａ、ＡＳＩＣ２Ｂ、またはＡＳＩＣ３陽イオンチャンネルを構成するタンパク質をコードする少なくとも１つの配列を含む核酸分子に関する。
【００３３】
本発明はまた、都合よく適切な制御配列と組み合わされた前述の核酸分子の少なくとも１つを含むベクター、ならびに本発明によるイオンチャンネルを構成するタンパク質を細胞宿主において産生または発現するための手順に関する。これらのベクターの調製、ならびにコンピテント宿主細胞における本発明のチャンネルの産生または発現は、当業者に既知の確立した方法により達成することができる。
【００３４】
例えば、本発明による陽イオンチャンネルを構成するタンパク質の発現および産生は、以下：
−本発明の核酸分子または前記分子を含むベクターをコンピテント宿主細胞に移し、
−前記宿主細胞を、本発明のイオンチャンネルの発現を可能にする条件下で培養すし、
−本発明のイオンチャンネルを構成するタンパク質を単離することにより達成することができる。
【００３５】
前述の方法で使用する宿主細胞は、原核生物または真核生物、特に、細菌、酵母、または哺乳動物細胞、植物細胞、もしくは昆虫細胞から選択することができる。
【００３６】
使用するベクターは、ベクターが移される宿主との関連を含めて選択される。プラスミドなどの任意のベクターを使用することができる。
【００３７】
本発明はまた、前述の方法により得られた、ＡＳＩＣ陽イオンチャンネルおよび／またはその誘導体を発現する形質転換細胞に関する。これらの細胞は、これらのポリペプチドによる陽イオン輸送を調節することができる物質、従って、痛覚と味覚伝達の両方に関連する酸性認識を調節することができる物質を同定するためのスクリーニングに有用である。このスクリーニングは、試験しようとする様々な量の物質をＡＳＩＣチャンネル発現細胞と接触させ、前記陽イオンチャンネルの電流に対する前記物質の効果を測定することにより実施される。このようなスクリーニングを行うと、疼痛の治療または予防に有用な新薬を同定することができる。また、このようなスクリーニングを行うと、酸味を調節する薬剤を同定および研究することができる。さらに、これらの方法は、これらのチャンネルの過剰発現により誘導される神経変性をブロックするか、または阻害することができる物質を同定するのに有用である。上記の方法により単離および検出される物質もまた本発明の一部である。ＡＳＩＣチャンネルには、イオン選択性（特に、ナトリウム、カリウム、およびカルシウムによる選択的浸透性）がはっきりとある。この選択的浸透性のために、ＡＳＩＣチャンネルは過剰に刺激されると興奮毒性を示す。
【００３８】
ＡＳＩＣニューロンイオンチャンネルを構成するタンパク質はまた、炎症性疾患、虚血、およびいくつかの腫瘍で起こる、疼痛性酸性認識を伴う病理を治療または予防することを目的とした薬物を開発するのに有用であり得る。従って、本発明はまた、活性成分として、本発明によるイオンチャンネルを構成する少なくとも１つのタンパク質を含む薬学的組成物に関する。
【００３９】
ＡＳＩＣチャンネルまたはその誘導体を構成するタンパク質をコードする核酸分子、あるいはこの核酸分子を含むベクターまたはＡＳＩＣチャンネルを発現する細胞はまた、トランスジェニック動物の作製に有用である。これらは、前記チャンネルを過剰発現する動物でもよいが、「ノックアウト」動物（すなわち、これらのチャンネルの発現またはＡＳＩＣチャンネルの陽イオン輸送活性に欠損のある動物）でもよい。これらのトランスジェニック動物は、当業者に周知の方法により作製され、ＡＳＩＣチャンネルに関する動物病理を研究するための生きたモデルを開発することができる。
【００４０】
従って、本発明の核酸分子または前記分子により形質転換された細胞は、患者の１または複数の組織のレベルでＡＳＩＣチャンネル欠損を補う遺伝子治療に使用することができる。従って、本発明はまた、ＡＳＩＣチャンネルまたはその誘導体に関与する病理を治療するための、本発明の核酸分子を含む薬物または前記分子により形質転換された細胞に関する。
【００４１】
プロトンにより活性化される性質、および酸性認識に関連した、結果として得られる上記の適用に加えて、ＡＳＩＣチャンネル、特に、遺伝子変異を有するＡＳＩＣチャンネルは、いくつかの神経変性プロセスに関与している可能性がある。あるニューロンの死は、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、および小脳性運動失調など、多種のニューロン変性疾患の特性を示している。このような神経変性プロセスの研究から、これらの疾患の原因となる可能性があるか、または疾患と関連する可能性がある、ほんのわずかな欠損遺伝子が同定された。より重要な多数の遺伝子がまだ同定されないでいる可能性がある。線虫Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの原始的なニューロンネットワークは、ニューロンの発達および死の優れたモデルである。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおける遺伝的変性は、遺伝子ｄｅｇ−１、ｍｅｃ−４、およびｍｅｃ−１０の変異が原因である可能性がある。これらの遺伝子は、アミロライド感受性ナトリウムチャンネルサブユニットと相同性を示す。さらに、上皮ナトリウムチャンネルのｍｅｃ−４キメラの機能的発現から、これらの遺伝子は、その機能を獲得するとニューロン変性を引き起こすイオンチャンネルであることが示唆される。
【００４２】
従って、本発明はまた、ニューロン変性を引き起こし得るこれらの病理学的変化を研究するためにＡＳＩＣチャンネルを適用することに関する。これらの適用（例えば、薬物スクリーニング）に使用される技術は、味覚調節薬および鎮痛薬の研究に使用される上記のものと同様である。
【００４３】
さらに、ＡＳＩＣニューロンイオンチャンネルを構成するタンパク質、前記タンパク質のアゴニストまたはアンタゴニストもまた、脳ニューロン変性に関与する病理の治療または予防を目的とした薬物を製造するために使用することができる。従って、本発明はまた、活性成分として本発明のこれらのタンパク質の少なくとも１つを含む薬学的調製物に関し、生理学的に受容可能なビヒクルと組み合わせてもよい。
【００４４】
より詳細には、本発明は、ヒトまたは動物被検体において痛覚ならびに味覚伝達に関連した酸性認識を調節することができる薬物を調製するための、本発明によるイオンチャンネルおよび／またはハイブリッドチャンネルの電流を変えることができる化学物質または生物学的物質に関する。
【００４５】
本発明の他の特徴および利点は、ＡＳＩＣチャンネルの証明および特徴付けにつながった研究活動に関する以下の説明で示されよう。以下、添付の配列および図面について言及する。
【００４６】
【図面の詳細説明】
図１は、配列番号１および配列番号２の配列である、ラットＡＳＩＣタンパク質（上段）配列とヒトＡＳＩＣタンパク質（下段）配列のアラインメントを示す。これらの配列の比較から、ラットと比較してヒトコーディングフェーズの始まりに１４個のアミノ酸がないことがわかる。
【００４７】
図２は、ｒＡＳＩＣ１Ａチャンネルタンパク質配列と他のイオンチャンネル配列との比較を示す。
−ＡＳＩＣ２Ａ（ＭＤＥＧ）［１４］、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓデジェネリンを用いた神経変性の原因である変異により活性化される哺乳動物陽イオンチャンネル。−ＦａＮａＣｈ［１０］、ＦＭＲＦアミドにより活性化されるＨｅｌｉｘ  ａｓｐｅｒｓａのナトリウムチャンネルペプチド。
−Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓデジェネリンＭＥＣ−４［１２］。
この図では、ＡＳＩＣの残基と同一または類似の残基を、それぞれ、黒地に白および灰色地に黒で印刷した。ｒＡＳＩＣ１Ａの推定膜貫通領域（ＭＩ、ＭＩＩ）を黒色の棒で印をつけた。
【００４８】
図３は、アミロライド感受性ナトリウムチャンネルであるサブユニットαＮａＣｈ、βＮａＣｈ、γＮａＣｈ、δＮａＣｈタンパク質と、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのデジェネリンＭＥＣ−４、ＭＥＣ−１０、およびＤＥＧ−１タンパク質の系統樹を示す。
【００４９】
図４は、イオンチャンネルのこの後者のファミリーについて提案されたトポロジーを示す［３０］。
【００５０】
図５は、プロトン活性化ｒＡＳＩＣ１Ａチャンネルの生物物理学的性質を示す。
ａ）ｐＨ７．４〜ｐＨ６の急速なｐＨ変化後に−７０ｍＶで記録した巨視的流入電流（ｉｎｆｌｏｗｉｎｇ  ｃｕｒｒｅｎｔ）。
ｂ）細胞外ｐＨの用量反応曲線。最初のｐＨは７．４であり、点は、６回の試験の平均値を示す。この図中の挿入物は−７０ｍＶでの典型的な反応を示す。
ｃ）１４０ｍＭのＮａ＋（■）またはＬｉ＋（●）を溶かしたバス液を用いたアウトサイドアウトパッチのＱ−Ｖ関係。Ｑは、酸性ｐＨ変化の間に運ばれる電荷である。この図中の挿入物は、Ｎａ＋含有培地中の代表的な反応を示す。
ｄ）Ｎａ＋含有培地中のアウトサイドアウトパッチにおいて様々な電位で記録されたＨ＋プロトン活性化電流。
ｅ）主要な浸透イオンとして１４０ｍＭのＮａ＋（■）、１４０ｍＭのＬｉ＋（●）、または１．８ｍＭのＣａ２＋（▲）を溶かした外部溶液を用いて、アウトサイドアウトパッチから測定された平均ｉ−Ｖ関係。逆転電位は、それぞれ、６５ｍＶ、５８ｍＶ、および−３４ｍＶであった。
ｆ）ｒＡＳＩＣ１Ａチャンネルを通るプロトン電流。電流ピークと電圧との関係を、ｐＨ４（●）およびｐＨ３（■）の遊離Ｋ＋溶液を含有するピペットを用いて、遊離Ｎａ＋、遊離Ｃａ２＋溶液中のアウトサイドアウトパッチから測定した。（▲）は、（■）と同じ条件下であるが、ピペット中にＫＣｌを用いて得られた結果を示す。この図中の挿入物は、（▲）条件下での典型的な反応を示す。
【００５１】
図６は、ｒＡＳＩＣ１Ａ電流に対するＣａ２＋およびアミロライドの効果を示す。
ａ）１．８ｍＭのＣａ２＋を溶かした遊離Ｎａ＋溶液を用いて、アウトサイドアウトパッチから様々な膜電位で記録したＨ＋プロトン活性化電流。電流は−３５ｍＶで逆転された。
ｂ）１．８ｍＭのＣａ２＋（○、逆転電位−３４ｍＶ）または０．１ｍＭのＣａ２＋（●、逆転電位−８０ｍＶ）を含む遊離Ｎａ＋溶液中で記録したアウトサイドアウトパッチからの平均Ｑ−Ｖ関係。
ｃ）−７０ｍＶで記録し、ｐＨ７．４からｐＨ６への急速なｐＨ変化により活性化された、巨視的流入電流ピークに対する外部Ｃａ２＋の効果。この図中の挿入物は典型的な反応を示す。点は、５個の卵母細胞の平均値±ｓｅを示す。
ｄ）アウトサイドアウトパッチから０ｍＶで記録したＨ＋プロトン活性化電流に対するアミロライドの効果。
ｅ）アミロライドおよび誘導体による−７０ｍＶでの、（ｐＨ７．４からｐＨ６へのｐＨ変化により誘導される）巨視的電流の阻害。点は、５個の卵母細胞の平均値±ｓｅを示す。
【００５２】
図７は、ＡＳＩＣ１ＡチャンネルｍＲＮＡの組織分布を示す。
ａ）ヒト組織におけるｈＡＳＩＣ１ＡチャンネルｍＲＮＡ発現のノザンブロット分析。
ｂ）ｂ：ラット脳および後根神経節（ＤＲＧ）におけるｒＡＳＩＣ１ＡチャンネルｍＲＮＡ発現のＲＴ−ＰＣＲ分析。（＋）、（−）は、それぞれ、逆転写酵素を用いた試料または逆転写酵素を用いなかった試料を示す。アガロースゲル切片を１％臭化エチジウム中で現像した。矢印は、減少した大きさ（６５７ｐｂ）のＰＣＲ生成物を示す。
【００５３】
図８はｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを示す。
ａ，ｂ）ジゴキシゲニン標識Ｅプローブを用いた、３年齢ラット後根神経節の６μｍ切片のハイブリダイゼーション。ａ：低照明顕微鏡写真（拡大×３０）。ｂ：「ａ」の高解像度画像（拡大８０×）。小さな直径のニューロンの強調表示（矢印）を見ることができる。同様の結果もまた、プローブＡ、Ｃ、およびＤを用いて得た。
ｃ）アンチセンスオリゴヌクレオチドＣを用いたｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより分析された、成獣ラット脳におけるｒＡＳＩＣ１ＡチャンネルｍＲＮＡ分布。同一の結果をオリゴヌクレオチドＢで得た。色は発現量を示す（赤：高発現；青：検出なし）。図に用いられた略語は以下の通りである：Ｃｅｒ＝小脳；Ｈｉｐ＝海馬；ＯＢ＝嗅球；Ｃｘ＝皮質。
【００５４】
図９は、ｈＡＳＩＣ３およびｒＡＳＩＣ３の推定タンパク質配列のアラインメントを示す。両配列において同一または類似のアミノ酸を、それぞれ、黒地に白および灰色地に黒で印刷した。２つの推定疎水性膜貫通ドメインを四角形で示した。配列を、パイルアッププログラム（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を用いてアラインメントした。
【００５５】
図１０は、ｈＡＳＩＣ３のｐＨ依存性および薬理学的性質を示す。プロトン誘導性膜電流を、ホールセル吸引ピペット技術を用いて、ｈＡＳＩＣ３でトランスフェクトされたＣＯＳ細胞から記録した。
ａ）ｈＡＳＩＣ３電流のｐＨ依存性。Ｈ＋依存性電流を、細胞外ｐＨをｐＨ７．３から示されたｐＨ値に急速に減少させることにより誘導した。最大活性化の半分に必要なｐＨは、一過性電流ではｐＨ６．２であり、持続性電流ではｐＨ４．３であった。
ｂ）Ｈ＋誘導性ｈＡＳＩＣ３電流は静止ｐＨに依存する。細胞外ｐＨを、示された静止ｐＨからｐＨ４に急速に減少させた。ＡおよびＢにおける電流を、ボルツマンフィットした飽和レベルの分数として示す。ｃ）利尿薬アミロライドおよびトリアムテレンによるｈＡＳＩＣ３阻害。アミロライド（Ｋ０．５＝１５．９μＭ）の用量反応曲線では、電流を、薬物非存在下での平均電流の分数として表す。データ点（○、一過性電流；Ｉ、持続性電流）は、少なくとも５回の実験の平均±ＳＥＭを示す。巨視的電流を、ホールセル吸引ピペット技術を用いて−６０ｍＶでクランプした細胞から記録した。
【００５６】
図１１は、ｈＡＳＩＣ３の選択性および単一チャンネル性質を示す。
ａ）一過性および持続性ホールセル電流の電圧依存性。一過性電流は３７．６ｍＶで逆転し、持続性電流は１０．１ｍＶで逆転する。
ｂ）ｐＨ７．３で自発的に活性なチャンネルの、またはｐＨ４に近づけることで活性化されるチャンネルの単位電流（ｕｎｉｔａｒｙ  ｃｕｒｒｅｎｔ）の電圧依存性。両条件での−１０ｍＶと＋４０ｍＶとの間のスロープコンダクタンスは１５．０＋／−０．６ｐＳである。Ｖｒｅｖ＝３０．２ｍＶ。Ｎａ＋平衡電位は４０．１ｍＶである。７．３の静止ｐＨでの自発的チャンネル活性（ｃ）またはｐＨ４に低下することにより誘発された活性（ｄ）の例。ｐＨ７．３で記録したチャンネル活性は１００μＭアミロライドにより阻害された（ｃ）。単一チャンネル電流を、ｈＡＳＩＣでトランスフェクトされたＣＯＳ細胞から切り出されたアウトサイドアウト膜パッチから−６０ｍＶで記録した。
【００５７】
図１２は、ｈＡＳＩＣ３遺伝子のヒト染色体局在を示す。ヒトＡＳＩＣ３遺伝子は、７番染色体上のフレームワークマーカーＡＦＭＡ０８２ＸＣ９から６．４ｃＲａｄテロメア側に位置する（ロッドスコア＞２１）。いくつかのマイクロサテライトと比較したｈＡＳＩＣ３の位置を、この図の右に示す。マーカーの相対位置およびそれらの距離（ｃＲａｄ）はＲＨＭＡＰＰＥＲプログラムのアウトプットである。マイクロサテライトＤ７Ｓ６７６およびＤ７Ｓ６４２は、７番染色体のバンドｑ３５に位置する（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖからのデータ）。これらの２つのマーカーの細胞発生的局在を点線で示す。
【００５８】
【ＡＳＩＣチャンネルのクローニング】
ＡＳＩＣイオンチャンネルファミリーの保存配列を用いて、以下のＰＣＲプライマー配列：ＴＴＹＣＣＩＧＣＩＲＴＩＡＣＩＩＴＮＴＧＹＡＡＹおよびＣＡＩＡＲＩＣＣＩＡＩＩＴＧＮＣＣＮＣＣＤＡＷＲＴＣを調製した。
【００５９】
ラット脳ｃＤＮＡバンク（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ＃９３６５１５）を、ラット脳の１ｋＢ  ＰＣＲ生成物とハイブリダイズさせ、部分的クローンを単離した。２本鎖ｃＤＮＡに合わせた連結の後、このｃＤＮＡの５番目の末端（２０２ｂｐ）をＰＣＲにより単離した。
【００６０】
【電気生理学】
０．２５ｎｇのｃＲＮＡをＸｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ卵母細胞に注射し、注射の２日後に、加電圧およびパッチクランプ用の記録微小電極を取り付けた。アウトサイドアウトパッチ記録用のバス液ならびにアウトサイドアウトパッチ記録および細胞全体記録用のピペットは、１４０ｍＭ  ＫＣｌ（またはＮＭＤＧ）、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＥＧＴＡ、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４（ＫＯＨを用いた）を含んでいた。アウトサイドアウトパッチ記録用のピペットならびにアウトサイドアウトパッチ記録および細胞全体記録用のバス液は、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ（あるいはＬｉＣｌまたはＮＭＤＧＣｌ）、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．８ｍＭ  ＣａＣｌ２、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４（ＨＣｌ、ＮａＯＨ、ＬｉＯＨ、またはＴＭＡＯＨで調節）を含んでいた。図中に示されたｐＨに調節したバス液で灌流することにより、初期ｐＨから急速にｐＨを変化させた。ｐＨ２の内部溶液５０ｍｌを注射することにより、または２０ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌを含む浴培地を灌流および回収することにより、卵母細胞の細胞内酸性化を行った。どの記録した電流にも、Ｘｅｎｏｐｕｓ卵母細胞のＣｌ−感受性Ｃａ２＋電流は混じっていなかった。データを２ｋＨｚでサンプリングし、分析のために５００Ｈｚでフィルタにかけた（Ｌｏｇｉｃｉｅｌ  Ｂｉｏｐａｔｃｈ）。
【００６１】
（ノザンブロット分析、ＲＴ−ＰＣＲ、およびｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）
ノザンブロットキットをＣｌｏｎｔｅｃｈ  Ｃｏ．（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）から入手した。これには、製品あたり約２μｇのポリ（Ａ＋）ＲＮＡが含まれていた。このブロットを、６×ＳＳＣ中、６５ｉＣで、３２Ｐで標識した部分的ヒトクローンフラグメント（ラットクローンの塩基２７０〜７６４に対応する）とハイブリダイズさせた。ＲＴ−ＰＣＲ分析のために、５μｇのラット脳総ＲＮＡおよび３μｇの後根神経節を逆転写し、この試料の１／３０を、以下の配列プライマー：ＡＴＴＧＣＴＣＴＴＣＣＣＡＴＣＴＣＴＡＴおよびＴＴＣＡＡＧＧＣＣＣＡＴＡＣＣＴＡＡＧＴを用いた３０回のＰＣＲサイクルにより増幅した。
【００６２】
負の対照を、逆転写酵素を添加しなかったことを除けば同一の方法で処理した。塩基７０〜１１４（Ａ）、２１５〜２４８（Ｂ）、１８２１〜１８５９（Ｃ）、１８９６〜１９４０（Ｄ）に対応するアンチセンスオリゴヌクレオチド、および塩基１６８５〜２６７２に対応する２本鎖ＤＮＡをｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに使用した。成獣ラット脳切片を、５０％ホルミアミド、２×ＳＳＣ中で、末端を３２Ｐで標識したオリゴヌクレオチドＢまたはＣと、３７ｉＣで一晩ハイブリダイズさせ、次いで、１×ＳＳＣ中、室温で洗浄した。シグナルを、５００倍過剰の非標識オリゴヌクレオチドで除去した。後根神経節切片を、ジゴキシゲニン（ＤＴＰ）−ｄＵＴＰで標識されたオリゴヌクレオチドＡ、Ｃ、またはＤおよびＰＣＲによりＤＩＧ−ｄＵＴＰで標識されたプローブＥとハイブリダイズさせた。プローブ標識、試料調製、ハイブリダイゼーション、およびアルカリホスファターゼ結合抗ＤＩＧ抗体によるＤＩＧ核酸視覚化を、製造業者のプロトコール（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）に従って行った。
【００６３】
【コンピューター解析】
配列アラインメントおよび系統樹（Ｋｉｍｕｒａ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ、ＵＰＧＭＡ  ｏｐｔｉｏｎ）を、ＧＣＧプログラム（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて行った。
【００６４】
【ｈＡＳＩＣ３の同定】
ラットＤＲＡＳＩＣタンパク質配列と発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースとの比較から、ヒト全胎児に由来する２つの部分ｃＤＮＡ配列が同定された（ＧｅｎｂａｎｋアクセッションＡＡ４４９５７９およびＡＡ４４９３２２）。両配列は、本発明者らがＵＫ  ＨＧＭＰ  ＲＥＳＯＵＲＣＥ  ＣＥＮＴＲＥから入手した同じクローン（ＩＭＡＧＥ  ＩＤ  ７８５７００）に由来する。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ自動シーケンサーを用いた両鎖の配列決定から、このクローンは全コード配列を含むことがわかった。
【００６５】
【染色体局在】
ヒトＡＳＩＣ３遺伝子を、６５℃のアニーリング温度での、プライマーＣＧＡＴＴＧＣＡＧＴＴＣＡＧＣＡＴＣＴＣＴ（センス）およびＡＣＣＡＴＴＣＧＧＣＡＧＣＣＧＣＡＣＴＴ（アンチセンス）を用いたＧｅｎｅｂｒｉｄｇｅ４  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｈｙｂｒｉｄ  ＤＮＡパネル上でのＰＣＲにより、位置付けした。ＰＣＲ生成物を２％アガロースゲルにより分析した。１５９ｂｐフラグメントの強い増幅が検出されれば、試料は陽性であるとみなし（コード１）、このフラグメントのかすかな増幅が検出されれば不明瞭であるとみなし（コード２）、１６０ｂｐ付近の増幅が見えなければ陰性であるとみなした（コード０）。陽性対照（ヒトゲノムＤＮＡ）は陽性であり、陰性対照（ハムスターゲノムＤＮＡ）は陰性であった。８３個の放射能ハイブリッドに対して以下のコード配列を得、２１のロッドスコアカットオフと共に、Ｗｈｉｔｈｅａｄ研究所（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ）のＰＨＭＡＰＰＥＲプログラムに入力した：０００００  ００１００  ００００１  ０００２１  ００１００  １２０１０  ０００００  １２１１２  ２１０００  ００００１  １０１２０  ０００１０  ００１０２  １１０１０  ０００１０  ００２１２  １１０１１  ００００１  １００。
【００６６】
【ＣＯＳ細胞における発現】
ｈＡＳＩＣ３コード配列を含むベクターをＮｏｔＩで線状化し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで平滑化した。Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ不活性化の後、ｈＡＳＩＣ３コード配列をＥｃｏＲＩで切断し、続いて、ＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ（平滑）で消化したＰＣＩ発現ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にサブクローニングした。３５ｍｍ直径ペトリ皿あたり２０，０００個細胞の密度のＣＯＳ細胞を、ＤＥＡＥ−デキストラン法を用いて、ＣＤ８およびｈＡＳＩＣ３−ＰＣＩの混合物（１：５）でトランスフェクトした。細胞を、トランスフェクションの１〜３日後に、電気生理学的測定のために使用した。首尾良くトランスフェクトされた細胞は、ＣＤ８抗体コートビーズ［１３］を固定する能力により認められた。
【００６７】
【電気生理学】
イオン電流を、ホールセルまたはアウトサイドアウトパッチクランプ技術のいずれかを用いて記録した。ピペット溶液は、ＫＣｌ  １２０ｍＭ、ＮａＣｌ  ３０ｍＭ，ＭｇＣｌ２  ２ｍＭ，ＥＧＴＡ  ５ｍＭ、ＨＥＰＥＳ  １０ｍＭ（ｐＨ７．２）を含んでいた。バス液は、ＫＣｌ  １４０ｍＭ、ＫＣｌ  ５ｍＭ、ＭｇＣｌ２  ２ｍＭ、ＣａＣｌ２  ２ｍＭ、ＨＥＰＥＳ  １０ｍＭ（ｐＨ７．３）を含んでいた。細胞外ｐＨの変化を、細胞またはパッチの前にある微小灌流システムの６個の出口のうちの１個を開くことにより誘導した。ｐＨ６未満の試験溶液を、ＨＥＰＥＳではなく１０ｍＭ  ＭＥＳを用いて緩衝化したが、その他全ての点では対照溶液と同一であった。実験を室温（２０〜２４℃）で行った。
【００６８】
【結果】
ラット脳から単離した３５ｋｂ  ｃＤＮＡは５２６アミノ酸をコードし、図２に示すように、アミロライド感受性デジェネリンナトリウムチャンネルファミリーのクローニングされた全メンバーと相同性を示す。
【００６９】
図５に示すように、Ｘｅｎｏｐｕｓ卵母細胞におけるｃＲＮＡ発現は、Ｈ＋プロトンにより活性化された流入電流を誘導した。ｒＡＳＩＣ１Ａチャンネルの生物物理学的および薬理学的な性質は、感覚ニューロンのプロトン活性化陽イオンチャンネルについて記載された性質［３，１５，１６］に近い。ｐＨ６．９以下に細胞外ｐＨを低下させると、急速に上昇し脱感作される流入電流が活性化される（図５ａおよびｂ）。このチャンネルは細胞外プロトンにより活性化される。なぜなら、図５（ｃおよびｄ）に示すように、アウトサイドアウトパッチの細胞外表面に酸が作用すると、このチャンネルは活性化されるからである。卵母細胞の細胞内酸性化およびアウトサイドアウトパッチの細胞内表面の酸性化は、ｒＡＳＩＣ１Ａチャンネルを活性化せず、また細胞外プロトンにより誘導されるｒＡＳＩＣ１Ａ電流を変化させない。
【００７０】
異なる細胞外陽イオンを用いて記録し図５（ｃおよびｅ）のＩ−Ｖ曲線の分析から、Ｎａ＋は主要な浸透イオンであることがわかる（単一コンダクタンスチャンネル１４．３ｐＳ）。感覚ニューロンのプロトン感受性イオンチャンネル［１５，１６］と同様に、ＡＳＩＣチャンネルは陽イオンをあまり区別しない（図５ｃ，ｅ，ｆ）。実際に、このチャンネルはまたＬｉ＋、Ｋ＋、Ｃａ２＋、およびＨ＋透過性であり、比ｐＮａ＋／ｐＬｉ＋＝１．３（図５ｃ，ｅ）、ｐＮａ＋／ｐＫ＋＝１３（図５ｃ，ｅ）、ｐＮａ＋／ＣＡ２＋＝２．５（図５ｅ）、およびｐＮａ＋／Ｈ＋＝０．９（図５ｆ）である。ＡＳＩＣのＣａ２＋透過性は、Ｃａ２＋の細胞への電圧依存性侵入経路である。ＡＳＩＣチャンネルを介した細胞へのＣａ２＋流入電流は、細胞外Ｎａ＋の非存在下で検出することができる（図６ａ，ｂ）。図５（ｅ）に示されるように、Ｃａ２＋に対する単位コンダクタンスは５．２ｐＳであった。１４０ｍＭの細胞外Ｎａ＋の存在下で、外部Ｃａ２＋濃度が増加すると、プロトン活性化電流の振幅は減少する（図６ｃ）。このことから、Ｃａ２＋は、Ｎａ＋浸透性を阻害することが証明される。外部Ｃａ２＋による妨害は、感覚ニューロンのＩ（Ｈ＋）の特性を示す［１７］。感覚ニューロンにおけるＨ＋活性化流入電流は、アミロライド［１８］およびエチルイソプロピルアミロライド（ＥＩＰＡ）［１９］により阻害される。図６（ｄ，ｅ）に示すように、ｒＡＳＩＣ１Ａチャンネルは同じ薬理学的性質を示し、アミロライドならびにその誘導体であるベンザミル（ｂｅｎｚａｍｉｌ）およびＥＩＰＡにより可逆的にブロックされる（Ｋｄ＝１０μＭ）。
【００７１】
さらに、ｒＡＳＩＣ１Ａチャンネルタンパク質と、ＭＤＥＧ［１４］またはＢＮａＣ１［２０］と呼ばれる（本明細書ではｒＡＳＩＣ２と命名した）デジェネリンイオンチャンネルとの配列相同性は約６７％である。しかしながら、Ｘｅｎｏｐｕｓ卵母細胞において発現したこれら２つのクローンの電気生理学的性質は明らかに異なる。
−図５（ａ）で示されるように、ｒＡＳＩＣ２チャンネルは、ｒＡＳＩＣ１Ａチャンネルと同じｐＨ変化により活性化されない。
−デジェネリンＭＥＣ−４の７０４位のアラニン変異がＣ．ｅｌｅｇａｎｓにおいて神経変性を引き起こすように［１２］、ｒＡＳＩＣ２の４３０位のグリシン残基がバリンまたはフェニルアラニンなどの酸阻害アミノ酸で置換されると、このチャンネルは活性化される［１４］。ｒＡＳＩＣ１Ａの同一の変異（４３１位のグリシンがバリンまたはフェニルアラニンで置換される）は活性を引き起こさず、この変異体はプロトンにより活性化することができない。
【００７２】
プロトン活性化陽イオンチャンネルは、感覚ニューロンだけでなく、中枢神経系ニューロン［２１］にあることも記載されている。ｒＡＳＩＣ１ＡチャンネルｍＲＮＡ発現の組織分布はこの観察と一致している。図７ａに示すように、４．３ｋｂ転写物がノザンブロット分析により脳で検出され、図７ｂに示されるＰＴ−ＰＣＲの結果から、後根神経節はｒＡＳＩＣ１Ａ  ｍＲＮＡを発現することがわかる。図８（ａ，ｂ）は、後根神経節の小さなニューロンがｒＡＳＩＣ１Ａ  ｍＲＮＡをかなり発現していることを示す。このことから、ＡＳＩＣは、侵害受容感覚ニューロンにあることが記載された急速に脱感作するプロトン活性化陽イオンチャンネルであることが支持される。プロトン活性化陽イオンチャンネルが後根神経節に存在することは、痛覚におけるこのチャンネルの酸性検出機能と一致するが、脳での役割はまだ証明されていない。図８ｃにおけるｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの結果から、ｒＡＳＩＣ１ＡチャンネルｍＲＮＡが広範かつ不均一に発現することがわかる。最高レベルの発現は、主嗅球、大脳皮質、海馬、手綱、基底外側扁桃核、および小脳で観察された。シナプス活性は細胞外ｐＨ変化と共に起こり［２２，２３］、シナプス間隙またはその付近の急速な局所的ｐＨ変化は、報告された巨視的ｐＨ変化よりかなり飽和状態になり、かつ顕著である。
【００７３】
プロトン活性化陽イオンチャンネルは、ｐＨ変化により直接活性化される唯一知られているイオンチャンネルである。細胞外ｐＨ変化は、神経調節的な役割を果たしていると考えられた［２３］。さらに、脳での陽イオンチャンネルの発現から、このｐＨ変化は、生成物によるニューロン活性化だけでなく、中枢神経系における伝達経路でもあるという仮説が支持される。
【００７４】
急速に不活性化されるプロトン活性化陽イオンチャンネルに加えて、より遅いキネティクスを示すプロトン活性化陽イオンチャンネルが感覚ニューロンに存在することが報告されている［４，２４］。リガンドにより活性化される他の陽イオンチャンネル［２５，２６］と同様に、おそらく、このプロトン活性化陽イオンチャンネルは陽イオンチャンネルファミリーを形成する。このファミリーでは、異なるサブユニットまたはサブユニットの組み合わせが、多様な薬理学的性質および生物物理学的性質を有するチャンネルを構成する。
【００７５】
酸性の知覚は痛覚のみに関与しているのではなく、味覚の伝達にも関連している［２］。酸刺激は、味覚細胞のプロトン活性化陽イオンチャンネルを活性化し［２，２７］、アミロライドは酸味の認識を阻害する［２］。また、生理学的ならびに薬理学的なデータから、ｒＡＳＩＣ１Ａおよびこのファミリーの他のメンバーは味覚伝達に関与していることがわかる。実際に、同じクラスのイオンチャンネルが感覚認識の異なる面と関連していることは特に驚くべきことである。
−アミロライド感受性ナトリウムチャンネルは塩味の伝達と関連している［２］。
−Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓデジェネリンは機械伝達に関与し、機械感覚性イオンチャンネルを形成すると提案されている［２８，２９］。
−ＡＳＩＣファミリーのチャンネルは痛覚および酸味伝達に関与している。
【００７６】
ｒＡＳＩＣ３配列と発現配列タグデータベースとの比較から、このイオンチャンネルファミリーの新規のヒトメンバーが同定された。総ヒト胚ライブラリーに由来するこの新規のクローンは５５３アミノ酸をコードし、ｒＡＳＩＣ３との相同性が最も近い（８４％同一性、８７％相同性）（図９）。最近、ヒト精巣に由来するほぼ同一のｃＤＮＡ（ｈＴＮａＣ１）のクローニングが報告されたが［１４］、このｃＤＮＡは機能的に発現しない。
【００７７】
新規のｈＡＳＩＣ３クローンをＣＯＳ細胞において発現すると、ｒＡＳＩＣ３と非常に似たキネティクスを有するＨ＋依存性陽イオン電流が誘導された。ｐＨがｐＨ７．３からｐＨ５に急速に減少すると、２相性電流が観察される。急速に不活性化する成分に続いて、持続性電流が現れる（図１０Ａ）。ｒＡＳＩＣ３［９］チャンネルでも見出されるこれらの非常に独特なキネティクスと、ｒＡＳＩＣ３との配列相同性（８４％アミノ酸同一性、８２％核酸同一性）から、この新規のクローンはヒトＡＳＩＣ３であることが示唆される。従って、本発明者らは、このクローンをｈＡＳＩＣ３（ｈｕｍａｎ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｎｓｉｎｇ  Ｉｏｎ  Ｃｈａｎｎｅｌ３：ヒト酸感受性イオンチャンネル３）と呼ぶ。
【００７８】
一過性ｈＡＳＩＣ３電流のｐＨ依存性（ｐＨ０．５＝６．２、図１０Ａ）は、ｒＡＳＩＣ３について報告されたもの（ｐＨ０．５＝６．５）［９］とほぼ同一である。しかしながら、持続性ｒＡＳＩＣ３電流および持続性ｈＡＳＩＣ３電流のｐＨ依存性は明らかに異なる。ｒＡＳＩＣ３は、持続性電流活性化のために非常に酸性のｐＨ値（＜ｐＨ４．５）［９］を必要とするが、その一方、持続性ｈＡＳＩＣ３電流は、細胞外ｐＨがｐＨ６以下に減少すると活性化し始め、ｐＨ４．３で最大活性の半分に達する（図１０Ａ）。ｒＡＳＩＣ３チャンネルと同様に、ｈＡＳＩＣ３のチャンネル活性は静止ｐＨに依存する（図１０Ｂ）。一過性ｈＡＳＩＣ３電流の最大活性は、静止ｐＨをｐＨ８より上にした場合に観察された。このことは、一過的に活性化するＨ＋依存性陽イオンチャンネルの画分が生理学的ｐＨで不活性化されることを示している。一過性電流の最大活性化の半分は、ｒＡＳＩＣ３クローンについて報告されたｐＨ（ｐＨ６．５）［９］よりわずかにアルカリ性である、ｐＨ７．５で観察された。静止ｐＨがｐＨ７以下の場合、浴培地を酸性にした後、持続性電流の活性化しか観察することができなかった（図１０Ｂ）。持続性ｒＡＳＩＣ３電流と同様に、持続性ｈＡＳＩＣ３電流は、初期ｐＨがかなり酸性（ｐＨ５）の場合でも活性化することができる（図１０Ｂ）。
【００７９】
現在までクローニングされたＡＳＩＣファミリーの全メンバーは、利尿薬アミロライド感受性である。ｈＡＳＩＣ３チャンネルも例外でない。ｈＡＳＩＣ３電流に対するアミロライドの効果は、ｒＡＳＩＣ３について報告されたもの［９］と似ている。一過性電流は、アミロライド（ＫＤ＝１５．９μＭ；図２ｃ）ならびにトリアムテレン（図１０Ｃ）により阻害されるが、その一方、持続性ｈＡＳＩＣ３電流は、これらの利尿薬によりほとんど影響されない。
【００８０】
一過性ｈＡＳＩＣ３電流は、Ｎａ＋逆転電位に近い３７．６ｍＶで逆転する。このことはＮａ＋対Ｋ＋の選択性が高いことを示している（図１１Ａ）。逆に、持続性電流は１０．１ｍＶで逆転するので（図１１Ａ）、Ｎａ＋とＫ＋とをあまり区別しない（選択比ｇＮａ＋／ｇＫ＋＝１．６２）。持続性ｈＡＳＩＣ３電流の低いＮａ＋対Ｋ＋選択性は、ｈＡＳＩＣ３チャンネルと、Ｎａ＋選択性が高いｒＡＳＩＣ３チャンネル［９］とを区別する。
【００８１】
プロトン誘導性単位電流を、エクサイズド・アウトサイドアウトパッチから記録した（図１１Ｂ〜Ｄ）。ｐＨ７．３付近の狭いｐＨ領域において、自発的チャンネル活性を観察することができる（図１１Ｃ）。この活性は、ｐＨが８．０に増加した際か、ｐＨが６．０に減少した際か（示さず）、または１００μＭのアミロライドが存在する場合（図１１Ｃ）に消失する。この基底電流は３０．２ｍＶで逆転するので（図１１Ｂ）、主にＮａ＋により運ばれる。アウトサイドアウトパッチの細胞外表面におけるｐＨがｐＨ７．３からｐＨ４に減少すると、単位電流が誘導され（図１１Ｄ）、自発的に活性なチャンネルと同じ膜電位で逆転する（図１１Ｂ）。Ｎａ＋に対するｈＡＳＩＣ３チャンネルの単位コンダクタンスは、ラットＡＳＩＣ３について報告されたもの（１２．６ｐＳ）［９］に近い、１５±０．６ｐＳである。持続性非選択性Ｈ＋活性化ｈＡＳＩＣ３電流は、ホールセル記録で容易に検出することができたが、その一方、持続性電流または非選択性電流はアウトサイドアウトパッチで記録することができなかった。パッチを切り離す間に失われる可溶性因子が必要とされることが、考えられる解釈である。
【００８２】
ｈＡＳＩＣ３遺伝子のヒト染色体局在を、ヒト−ハムスター放射能ハイブリッドＤＮＡパネル上でのＰＣＲにより決定した。ｈＡＳＩＣ３遺伝子の位置は、マイクロサテライトＡＦＭＡ０８２ＸＣ９から６．４ｃＲａｄテロメア側にあるヒト染色体７ｑ３５にある（ロッドスコア＞２１）。本発明者らが知っている限りでは、Ｈ＋依存性陽イオンチャンネルの機能変化と一致する症状を伴う遺伝病は、このヒトゲノム領域にマップされていなかった。
【００８３】
ｈＡＳＩＣ３チャンネルサブユニットは、ｒＡＳＩＣ３チャンネルについて報告された性質と同様の性質を有する持続性Ｈ＋依存性陽イオンチャンネルを形成する。しかしながら、非常に重要な違いが存在する。最も重要なことは、持続性ｈＡＳＩＣ３電流は、活性化のためにｒＡＳＩＣ３より酸性でないｐＨを必要とする［９］。この点で、ｈＡＳＩＣ３チャンネルの性質は、感覚ニューロンからの生理学的および電気生理学的なデータと、ｒＡＳＩＣ３の性質より良く一致している。ヒトボランティアの皮下を酸性緩衝液で灌流すると疼痛が生じる。ｐＨ５．２での疼痛は、０〜１００％（我慢できない疼痛）の段階で２０％と評価された［２］。さらに、ラット神経皮膚標本におけるポリモーダルＣ線維の亜集団は、酸性ｐＨで興奮することができる［４］。活性化の閾値はｐＨ６．９〜ｐＨ６．１にあり、最大刺激はｐＨ５．２で達成される。ラット感覚ニューロンで記録される内因性Ｈ＋依存性陽イオンチャンネルは、ｐＨ６．６以下で活性化し始める［５］。持続性ｈＡＳＩＣ３電流のｐＨ依存性はこれらの生理学的データと密接に一致するが、一方、ｒＡＳＩＣ３には、２つのｐＨ単位がより酸性のｐＨ値にシフトするｐＨ依存性がある［９］。持続性ＡＳＩＣチャンネル（特に、ｒＡＳＩＣ３）の生理学的データとｐＨ依存性との間の差の解釈として、ネイティブなチャンネルの形成の際に、まだ知られていないサブユニットが関与することが考えられ得る。ヘテロ多量体の集合が、ｒＡＳＩＣ３チャンネルについて以前に証明された［９］。ｒＡＳＩＣ３はｒＡＳＩＣ２ｂと会合することができ、このためにチャンネルの選択性が変化する。ｒＡＳＩＣ３は完全にＮａ＋選択性であるが、一方、ヘテロ多量体であるｒＡＳＩＣ３／ｒＡＳＩＣ２ｂチャンネルの持続性電流はＮａ＋とＫ＋とを区別しない。ラット感覚ニューロンにおいて記録されたＨ＋依存性陽イオンチャンネルもまたＮａ＋とＫ＋とを区別しない［５］。このことから、ｒＡＳＩＣ３とｒＡＳＩＣ２ｂとの両方が、ラット感覚ニューロンにおいて、このイオンチャンネルの形成に関与することが示唆される。ｒＡＳＩＣ３チャンネルとは対照に、ｈＡＳＩＣ３は、非選択的持続性電流を生じるために他のサブユニットの共発現を必要としない。持続性ヒトＨ＋依存性陽イオンチャンネルのイオン選択性はまだ知られていない。ネイティブなチャンネルの性質とｈＡＳＩＣ３チャンネルの性質との比較を可能にするために、ヒト持続性Ｈ＋依存性陽イオンチャンネルの、さらに詳細な電気生理学的特徴付けが必要であろう。
【００８４】
【表２】
配列番号１に関する情報
ｉ）配列の特徴：
Ａ）配列の長さ：３５６２塩基対
Ｂ）配列の型：核酸
Ｃ）鎖の数：二本鎖
Ｄ）配置：直線状
ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ
ｖｉ）起源：ラット
ｉｘ）特徴
Ａ）配列の特徴を表す記号：ＡＳＩＣ
Ｂ）位置；１２３．．１７００
ｘｉ）配列の説明：配列番号１
【００８５】
【表３】
配列番号２に関する情報
ｉ）配列の特徴：
Ａ）配列の長さ：１６２０塩基対
Ｂ）配列の型：核酸
Ｃ）鎖の数：二本鎖
Ｄ）配置：直線状
ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ
ｖｉ）起源：ヒト
ｉｘ）特徴
Ａ）配列の特徴を表す記号：ＡＳＩＣ
Ｂ）位置；１．．１５４２
ｘｉ）配列の説明：配列番号２
【００８６】
【表４】
配列番号３に関する情報
ｉ）配列の特徴：
Ａ）配列の長さ：１６６６塩基対
Ｂ）配列の型：核酸
Ｃ）鎖の数：二本鎖
Ｄ）配置：直線状
ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ
ｖｉ）起源：ヒト
ｉｘ）特徴
Ａ）配列の特徴を表す記号：ＭＤＥＧ
Ｂ）位置；１２３．．１６６３
ｘｉ）配列の説明：配列番号３
【００８７】
【表５】
配列番号４に関する情報
ｉ）配列の特徴：
Ａ）配列の長さ：３６４７塩基対
Ｂ）配列の型：核酸
Ｃ）鎖の数：二本鎖
Ｄ）配置：直線状
ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ
ｖｉ）起源：ラット
ｉｘ）特徴
Ａ）配列の特徴を表す記号：ＡＳＩＣ１Ｂ
Ｂ）位置；１０９．．１７８５
ｘｉ）配列の説明：配列番号４
【００８８】
【表６】
配列番号５に関する情報
ｉ）配列の特徴：
Ａ）配列の長さ：１６０２塩基対
Ｂ）配列の型：核酸
Ｃ）鎖の数：二本鎖
Ｄ）配置：直線状
ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ
ｖｉ）起源：ラット
ｉｘ）特徴
Ａ）配列の特徴を表す記号：ＡＳＩＣ３
Ｂ）位置；１．．１６０２
ｘｉ）配列の説明：配列番号５
【００８９】
【表７】
配列番号６に関する情報
ｉ）配列の特徴：
Ａ）配列の長さ：１９４８塩基対
Ｂ）配列の型：核酸
Ｃ）鎖の数：二本鎖
Ｄ）配置：直線状
ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ
ｖｉ）起源：ラット
ｉｘ）特徴
Ａ）配列の特徴を表す記号：ＡＳＩＣ２Ｂ
Ｂ）位置；１６．．１７０７
ｘｉ）配列の説明：配列番号６
【００９０】
【表８】
配列番号７に関する情報
ｉ）配列の特徴：
Ａ）配列の長さ：１７３６塩基対
Ｂ）配列の型：核酸
Ｃ）鎖の数：二本鎖
Ｄ）配置：直線状
ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ
ｖｉ）起源：ヒト
ｉｘ）特徴
Ａ）配列の特徴を表す記号：ＡＳＩＣ３
Ｂ）位置；１８．．１６１１
ｘｉ）配列の説明：配列番号７
【００９１】
【表９】
配列番号８に関する情報
ｉ）配列の特徴：
Ａ）配列の長さ：５３１
Ｂ）配列の型：タンパク質
Ｃ）鎖の数：一本鎖
Ｄ）配置：直線状
ｉｉ）分子の型：タンパク質
ｖｉ）起源：ヒト
ｉｘ）特徴
Ａ）配列の特徴を表す記号：ｈＡＳＩＣ３
Ｂ）位置；１−５３１
【００９２】
【参考文献】
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１０．Ｌｉｎｇｕｅｇｌｉａ，Ｅ．，Ｃｈａｍｐｉｇｎｙ，Ｇ．，Ｌａｚｄｕｎｓｋｉ，Ｍ．およびＢａｒｂｒｙ，Ｐ．Ｎａｔｕｒｅ  ３７８，７３０−７３３（１９９５）。
１１．Ｗａｌｄｍａｎｎ，Ｒ．，Ｃｈａｍｐｉｇｎｙ，Ｇ．，Ｂａｓｓｉｌａｎａ，Ｆ．，Ｖｏｉｌｌｅｙ，Ｎ．およびＬａｚｄｕｎｓｋｉ，Ｍ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，２７４４１１−２７４１４（１９９５）。
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１５．Ｋｏｖａｌｃｈｕｋ，Ｙｕ，Ｎ．，Ｋｒｉｓｈｔａｌ，Ｏ．Ａ．およびＮｏｗｙｃｋｙ，Ｍ．Ｃ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．１１５−２３７−２４２（１９９０）。
１６．Ｋｏｎｎｅｒｔｈ，Ａ．，Ｌｕｘ，Ｈ．Ｄ．およびＭｏｒａｄ，Ｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．３８６，６０３−６３３（１９８７）。
１７．Ｄａｖｉｅｓ，Ｎ．Ｗ．，Ｌｕｘ，Ｈ．Ｄ．およびＭｏｒａｄ，Ｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．４００，１５９−１８７（１９８８）。
１８．Ｋｏｒｋｕｓｈｋｏ，Ａ．Ｏ．およびＫｒｉｓｈｔａｌ，Ｏ．Ａ．Ｎｅｉｒｏｆｉｚｉｏｌｏｇｉｉａ  １６，５５７−５６１（１９８４）。
１９．Ｇｒａｎｔｙｎ，Ｒ．，Ｐｅｒｏｕａｎｓｋｙ，Ｍ．，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｔｅｂａｒ，Ａ．およびＬｕｘ，Ｈ．Ｄ．Ｄｅｖ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．４９，１５０−１５５（１９８９）。
２０．Ｐｒｉｃｅ，Ｍ．Ｐ．，Ｓｎｙｄｅｒ，Ｐ．Ｍ．およびＷｅｌｓｈ，Ｍ．Ｊ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，７８７９−７８８２（１９９６）。
２１．Ａｋａｉｋｅ，Ｎ．およびＵｅｎｏ，Ｓ．Ｐｒｏｇ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．４３，７３−８３（１９９４）。
２２．Ｋｒｉｓｈｔａｌ，Ｏ．Ａ．，Ｏｓｉｐｃｈｕｋ，Ｙ．Ｖ．Ｓｈｅｌｅｓｔ，Ｔ．Ｎ．およびＳｍｉｍｏｆｆ，Ｓ．Ｖ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．４３６，３５２−３５６（１９８７）。
２３．Ｃｈｅｓｌｅｒ，Ｍ．およびＫａｉｌａ，Ｋ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１５，３９６−４０２（１９９２）。
２４．Ｂｅｖａｎ，Ｓ．およびＹｅａｔｓ，Ｊ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．４３３，１４５−１６１（１９９１）。
２５．Ｌｅｗｉｓ，Ｃ．，Ｎｅｉｄｈａｒｔ，Ｓ．，Ｈｏｌｙ，Ｃ．，Ｎｏｒｔｈ，Ｒ．Ａ．，Ｂｕｅｌｌ，Ｇ．およびＳｕｒｐｒｅｎａｎｔ，Ａ．Ｎａｔｕｒｅ  ３７７，４３２−４３５（１９９５）。
２６．Ｂａｒｎａｒｄ，Ｅ．Ａ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．１７，３０５−３０９（１９９６）。
２７．Ｏｋａｄａ，Ｙ．，Ｍｉｙａｍｏｔｏ，Ｔ．およびＳａｔｏ，Ｔ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．１８７，１９−３２（１９９４）。
２８．Ｌｉｕ，Ｊ．Ｓｃｈｒａｎｋ，Ｂ．およびＷａｔｅｒｓｏｎ，Ｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７３，３６１（１９９６）。
２９．Ｗａｌｄｍａｎｎ，Ｒ．，Ｃｈａｍｐｉｇｎｙ，Ｇ．およびＬａｚｄｕｎｓｋｉ，Ｍ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，１１７３５−１１７３７（１９９５）。
３０．Ｒｅｎａｒｄ，Ｓ．，Ｌｉｎｇｕｅｇｌｉａ，Ｅ．，Ｖｏｉｌｌｅｙ，Ｎ．，Ｌａｚｄｕｎｓｋｉ，Ｍ．および
Ｂａｒｂｙ，Ｐ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，１２９８１−１２９８６（１９９４）。
３１．Ｒｅｅｈ，Ｐ．Ｗ．およびＳｔｅｅｎ，Ｋ．Ｈ．Ｐｒｏｇ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  １１３，１４３−１５１（１９９６）。
３２．Ｓｔｅｅｎ，Ｋ．Ｈ．，Ｓｔｅｅｎ，Ａ．Ｅ．，Ｋｒｅｙｓｅｌ，Ｈ．Ｗ．およびＲｅｅｈ，Ｐ．Ｗ．Ｐａｉｎ  ６６，１６３−１７０（１９９６）。
３３．Ｓｔｅｅｎ，Ｋ．Ｈ．，Ｉｓｓｂｅｍｅｒ，Ｕ．およびＲｅｅｈ，Ｐ．Ｗ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｌｅｔｔ  １９９，２９−３２（１９９５）。
３４．Ｓｔｅｅｎ，Ｋ．Ｈ．，Ｒｅｅｈ，Ｐ．Ｗ．，Ａｎｔｏｎ，Ｆ．およびＨａｎｄｗｅｒｋｅｒ，Ｈ．Ｏ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １２，８６−９５（１９９２）。
３５．Ｗａｌｄｍａｎｎ，Ｒ．，Ｃｈａｍｐｉｇｎｙ，Ｇ．，Ｂａｓｓｉｌａｎａ，Ｆ．，Ｈｅｕｒｔｅａｕｘ，Ｃ．およびＬａｚｄｕｎｓｋｉ，Ｍ．Ｎａｔｕｒｅ  ３８６，１７３−１７７（１９９７）。
３６．Ｂａｓｓｉｌａｎａ，Ｆ．，Ｃｈａｍｐｉｇｎｙ，Ｇ．，Ｗａｌｄｍａｎｎ，Ｒ．，ｄｅ  Ｗｅｉｌｌｅ，Ｊ．Ｒ．，Ｈｅｕｔｅａｕｘ，Ｃ．およびＬａｚｄｕｎｓｋｉ，Ｍ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，２８８１９−２８８２２（１９９７）。
３７．Ｗａｌｄｍａｎｎ，Ｒ．，Ｂａｓｓｉｌａｎａ，Ｆ．，ｄｅ  Ｗｅｉｌｌｅ，Ｊ．，Ｃｈａｍｐｉｇｎｙ，Ｇ．，Ｈｅｕｔｅａｕｘ，Ｃ．およびＬａｚｄｕｎｓｋｉ，Ｍ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，２０９７５−２０９７８（１９９７）。
３８．Ｌｉｎｇｕｅｇｌｉａ，Ｅ．，ｄｅ  Ｗｅｉｌｌｅ，Ｊ．Ｒ．，Ｂａｓｓｉｌａｎａ，Ｆ．，Ｈｅｕｔｅａｕｘ，Ｃ．，Ｓａｋａｉ，Ｈ．，Ｗａｌｄｍａｎｎ，Ｒ．およびＬａｚｄｕｎｓｋｉ，Ｍ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，２９７７８−２９７８３（１９９７）。
３９．Ｗａｌｄｍａｎｎ，Ｒ．およびＬａｚｄｕｎｓｋｉ，Ｍ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．８，４１８−４２４（１９９８）。
４０．Ｂａｕｍａｎｎ，Ｔ．Ｋ．，Ｂｕｒｃｈｉｅｌ，Ｋ．Ｊ．，Ｉｎｇｒａｍ，Ｓ．Ｌ．およびＭａｒｔｅｎｓｏｎ，Ｍ．Ｅ．Ｐａｉｎ  ６５，３１−３８（１９９６）。
４１．Ｊｕｒｍａｎ，Ｍ．Ｅ．，Ｂｏｌａｎｄ，Ｌ．Ｍ．，Ｌｉｕ，Ｙ．およびＹｅｌｌｅｎ，Ｇ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １７，８７６−８８１（１９９４）。
４２．Ｉｓｈｉｂａｓｈｉ，Ｋ．およびＭａｒｕｍｏ，Ｆ．Ｂｉｏｃｈｅｍ。Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍ  ２４５，５８９−５９３（１９９８）。
【図面の簡単な説明】
【図１】  配列番号１および配列番号２の配列である、ラットＡＳＩＣタンパク質（上段）配列とヒトＡＳＩＣタンパク質（下段）配列のアラインメントを示す図である。
【図２】  ｒＡＳＩＣ１Ａチャンネルタンパク質配列と他のイオンチャンネル配列との比較を示す図である。
【図３】  アミロライド感受性ナトリウムチャンネルであるサブユニットαＮａＣｈ、βＮａＣｈ、γＮａＣｈ、δＮａＣｈからなるタンパク質と、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのデジェネリンＭＥＣ−４、ＭＥＣ−１０、およびＤＥＧ−１の系統樹を示す図である。
【図４】  イオンチャンネルのこの後者のファミリーについて提案されたトポロジーを示す図である［３０］。
【図５ａ】  プロトン活性化ｒＡＳＩＣ１Ａチャンネルの生物物理学的性質を示す図である。
【図５ｂ】  プロトン活性化ｒＡＳＩＣ１Ａチャンネルの生物物理学的性質を示す図である。
【図５ｃ】  プロトン活性化ｒＡＳＩＣ１Ａチャンネルの生物物理学的性質を示す図である。
【図５ｄ】  プロトン活性化ｒＡＳＩＣ１Ａチャンネルの生物物理学的性質を示す図である。
【図５ｅ】  プロトン活性化ｒＡＳＩＣ１Ａチャンネルの生物物理学的性質を示す図である。
【図５ｆ】  プロトン活性化ｒＡＳＩＣ１Ａチャンネルの生物物理学的性質を示す図である。
【図６ａ】  ｒＡＳＩＣ１Ａ電流に対するＣａ２＋およびアミロライドの効果を示す図である。
【図６ｂ】  ｒＡＳＩＣ１Ａ電流に対するＣａ２＋およびアミロライドの効果を示す図である。
【図６ｃ】  ｒＡＳＩＣ１Ａ電流に対するＣａ２＋およびアミロライドの効果を示す図である。
【図６ｄ】  ｒＡＳＩＣ１Ａ電流に対するＣａ２＋およびアミロライドの効果を示す図である。
【図６ｅ】  ｒＡＳＩＣ１Ａ電流に対するＣａ２＋およびアミロライドの効果を示す図である。
【図７ａ】  ＡＳＩＣ１ＡチャンネルｍＲＮＡの組織分布を示す図である。
【図７ｂ】  ＡＳＩＣ１ＡチャンネルｍＲＮＡの組織分布を示す図である。
【図８ａ】  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを示す図である。
【図８ｂ】  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを示す図である。
【図８ｃ】  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを示す図である。
【図９】  ｈＡＳＩＣ３およびｒＡＳＩＣ３の推定タンパク質配列のアラインメントを示す図である。
【図１０ａ】  ｈＡＳＩＣ３のｐＨ依存性および薬理学的性質を示す図である。
【図１０ｂ】  ｈＡＳＩＣ３のｐＨ依存性および薬理学的性質を示す図である。
【図１０ｃ】  ｈＡＳＩＣ３のｐＨ依存性および薬理学的性質を示す図である。
【図１１ａ】  ｈＡＳＩＣ３の選択性および単一チャンネル性質を示す図である。
【図１１ｂ】  ｈＡＳＩＣ３の選択性および単一チャンネル性質を示す図である。
【図１１ｃ】  ｈＡＳＩＣ３の選択性および単一チャンネル性質を示す図である。
【図１１ｄ】  ｈＡＳＩＣ３の選択性および単一チャンネル性質を示す図である。
【図１２】  ｈＡＳＩＣ３遺伝子のヒト染色体局在を示す図である。
【配列表】
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0004489952.tif 000005
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0004489952.tif 000023
0004489952.tif 000024
【図１】
0004489952.tif 000025
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【図２】
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【図３】
0004489952.tif 000029
【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図５ｄ】
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【図５ｅ】
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【図５ｆ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図６ｄ】
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【図６ｅ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図８ｃ】
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【図９】
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0004489952.tif 000049
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１０ｃ】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１１ｃ】
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【図１１ｄ】
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【図１２】
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