(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１に示す塩基配列のうち−１〜−１１７３の領域からなる、麹菌を用いた有用タンパク質高生産用プロモーターＤＮＡ。
【請求項２】
請求項１に記載のプロモーターＤＮＡと有用タンパク質遺伝子のコーディング領域を結合してなる、麹菌を用いた有用タンパク質高生産用融合ＤＮＡ。
【請求項３】
配列表の配列番号１に示す塩基配列からなる、麹菌を用いたグルコアミラーゼ高生産用融合ＤＮＡ。
【請求項４】
請求項２又は３に記載のＤＮＡを導入連結してなる組換えプラスミド。
【請求項５】
請求項３に記載のＤＮＡをＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅのｎｉａＤ遺伝子を含むベクターに導入連結してなる組換えプラスミド。
【請求項６】
請求項４又は５に記載のプラスミドを麹菌に導入してなる形質転換体。
【請求項７】
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  Ｍｅｌ−ＧＬＢ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７００７）。
【請求項８】
請求項６に記載の麹菌形質転換体をグルコースを炭素源とする培地で液体培養し、定常期以降の菌体に対して培地を徐々に添加することにより有用タンパク質遺伝子を高発現せしめること、を特徴とする有用タンパク質の高生産方法。
【請求項９】
請求項７に記載の麹菌形質転換体をグルコースを炭素源とする培地で液体培養し、定常期以降の菌体に対して培地を徐々に添加することによりグルコアミラーゼ遺伝子Ｂを高発現せしめること、を特徴とするグルコアミラーゼの高生産方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、麹菌のチロシナーゼ遺伝子（ｍｅｌＯ）のプロモーター領域の少なくとも一部をプロモーターとして利用する同種又は異種遺伝子発現システムに関する。さらに詳細には、本発明では、麹菌のチロシナーゼ遺伝子の発現機構を検討した結果、長期間液体培養することにより本遺伝子が大量に発現することを見いだし、この性質を用いて同種又は異種遺伝子を麹菌で大量に発現させるシステムの構築に関するもので、有用タンパク質の高生産を可能にするものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年の遺伝子組換え技術の発展とともに、ヒトの有用タンパク質が大腸菌や酵母を用いて生産することが可能となってきた。しかし大腸菌を宿主としてヒトなどの真核生物由来の遺伝子を発現させた場合、正常なプロセッシングが行われない、糖鎖が付着しないなどの問題点が指摘されている。また酵母によって異種タンパクの分泌生産を行う場合は、糖鎖結合はされるものの、その分泌量が非常に少ないという欠点を有する。そこで高いタンパク分泌能を持つ糸状菌が、真核生物のタンパク発現の宿主として注目されてきた。なかでも黄麹菌Aspergillus oryzaeは、清酒や味噌など醸造産業上で長く使用された実績から、異種遺伝子発現への応用に積極的に利用されている。既にMucor mieheiの酸性プロテアーゼなどがA. oryzaeを宿主として、工業生産されている。
【０００３】
麹菌はαアミラーゼやグルコアミラーゼなどのアミラーゼ蛋白生産量が高いことから、これらの異種タンパク生産には、これらアミラーゼ系の遺伝子プロモーターが利用されている。プロテアーゼや３フォスフォグリセレートキナーゼなど遺伝子プロモーターの利用も検討されているが、通常の液体培養では上記アミラーゼ系、特にαアミラーゼ遺伝子プロモーターの発現量にははるかに及ばない。したがって麹菌において異種タンパク遺伝子を高発現をさせるためには、アミラーゼ系遺伝子プロモーターを使用する以外方法がないのが現状である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
アミラーゼ系遺伝子、特にαアミラーゼの遺伝子プロモーターは、液体培養でも非常に高発現を示し、異種タンパク生産での有用性が認められているが（特開平７−５１０６７）、培地中にデンプンあるいはオリゴ糖などの誘導物質を添加する必要がある。また異種タンパクとしてグルコアミラーゼ、グルコシダーゼなどのようなグルコースを生産する蛋白を発現させる場合、発現した蛋白によりグルコースが大量に生成するため、グルコースレプレッションにより生産量が低下する現象が見られる。したがって麹菌を用いた組換えタンパク質の生産の可能性を広げるためには、アミラーゼ遺伝子の制御系以外で、高い発現能を有するプロモーターの検索が必要である。
【０００５】
麹菌が固体培養で生産するグルコアミラーゼは、糖含量が高く、酵素産業上で重要な酵素であるが、その遺伝子であるｇｌａＢ遺伝子（特開平１０−８４９６８）は液体培養でほとんど発現しないため、液体培養での大量生産ができない。また高発現プロモーターを用いて組換え蛋白を生産させた場合、生産される蛋白によって大量のグルコースが生産されるために、上記アミラーゼ系遺伝子のプロモータでは高生産されない。アミラーゼ系以外の制御系の遺伝子で高い発現能を有するプロモーターを発見することにより、従来液体培養では生産することが困難であった、ｇｌａＢタイプのグルコアミラーゼ生産も可能となる。
【０００６】
本発明は、上記した現状に鑑み、麹菌の液体培養で高発現する遺伝子を検索し、そのプロモーターを用いてグルコアミラーゼなど有用なタンパク質を液体培養にて高生産させることを目的としてなされたものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するため、先ず本発明者らは、プロモーター解析システムを用いて、麹菌の様々な遺伝子の発現能について検討することとし、プロモーター解析を行うについては、検討しようとするプロモーターの下流域にレポーター遺伝子を連結し、そのレポーター遺伝子産物の活性をプロモーター発現の指標とする方法を採用した。そして各種遺伝子のプロモーターについて検討した結果、好適なプロモーターを発見し、更に研究の結果、遺伝子の高発現システムの創製に成功し、本発明の完成に至ったものである。
以下、本発明について詳述する。
【０００８】
本発明に係る高発現システムを開発するためのプロモーター解析システムとして、具体的には図１に示すような、プロモーター解析プラスミドｐＮＧＵＳを用いた。このプラスミドは、形質転換用マーカーであるA. oryzaeのｎｉａＤ遺伝子（S.Unklesら、Mol. Gen. Genet., 218, p.99-104, 1989）と、レポーター遺伝子である大腸菌のβグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードするｕｉｄＡ遺伝子（R. A. Jeffersonら、Proc. Natl. Acad. Sci., p.8447-8451, 1986）を含む。このプラスミドのｕｉｄＡ遺伝子の上流域（例えばＳａ１Ｉ、ＰｓｔＩサイト）に、検討しようとする種々の遺伝子プロモーターあるいはその一部分を挿入し、構築されたプロモーター解析用プラスミドをA. oryzae(Aspergillus oryzae Ｏ−１０１３：本菌株は、工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ  Ｐ−１６５２８として既に寄託されている）のｎｉａＤ変異株（硝酸資化能欠損株、Nitrate Reductase欠損）に導入し、導入プラスミドが宿主染色体のｎｉａＤ  ｌｏｃｉで１コピーだけ導入された形質転換体を選択した。そしてこれらの形質転換体のＧＵＳ活性を測定することにより、プロモーター活性の指標とした。
【０００９】
様々な遺伝子のプロモーターを検索した結果、麹菌のチロシナーゼ遺伝子、ｍｅｌＯ遺伝子（Biochim. Biophys. Acta., 1261(1), p.151-4 1995）に、液体培養における強い発現能が認められた。この遺伝子は麹菌の固体培養である麹培養での褐変現象に関与する遺伝子として単離されたもので、液体培養で強く発現していることは報告されていない。この遺伝子プロモーター下流にＧＵＳ遺伝子を連結した場合、液体培養での発現能は、αアミラーゼ遺伝子ａｍｙＢやグルコアミラーゼ遺伝子ｇｌａＡのプロモーターとほぼ同程度であった。またこの遺伝子プロモーターでの組換えタンパク生産は、グルコース培地でもデンプン培地でも同程度の生産量を示し、タンパク生産性は培地中の炭素源の影響を受けないことが明らかとなった。また本遺伝子は、培養期間を長くすることにより、発現能の増加が認められ、培養期間を調節することによりさらに高発現させることが可能であることも確認した。
【００１０】
そこで、本発明者らは、ｍｅｌＯ遺伝子のプロモーター（その塩基配列を図２に示す）に着目し、遺伝子工学において常用される遺伝子操作技術によって、ｍｅｌＯ遺伝子プロモーターの下流に麹菌のｇｌａＢ遺伝子のコーディング領域を結合せしめ、融合遺伝子を新規に構築した。得られた新規融合遺伝子の塩基配列を配列番号１（及び図３、図４）に示す。図面の塩基配列で示される１の位置から始まり１１７３の位置で終了する領域がｍｅｌＯプロモーター領域であり、１１７４の位置から始まり３０９３の位置で終了する領域がｇｌａＢ翻訳領域である。
【００１１】
上記によりｍｅｌＯ遺伝子プロモーターとｇｌａＢ遺伝子のコーディング領域とを遺伝子組換え技術の常法にしたがって結合して調製した新規組換えプラスミド（配列番号１の配列を含む）を麹菌に導入し、液体培養によるグルコアミラーゼ生産を試みた。この形質転換体をグルコースを炭素源とするツァペックドックス培地において１０日間液体培養することにより、５００Ｕ／ｍｌ以上のｇｌａＢタイプのグルコアミラーゼが生産された。これは固体培養である麹培養に比べても２倍以上の生産性を示し、本培養法により固体培養よりもさらに高いグルコアミラーゼ生産が達成された。またこの培養では、培地中には組換えタンパクであるグルコアミラーゼ以外のタンパクはほとんど生産されておらず、非常に純度の高い組換えタンパクを容易に得られることもはじめて確認し、ｍｅｌＯ遺伝子プロモーターを用いることにより、目的とするタンパク質を高純度でしかも高収率で得ることができるとの有用な新知見が得られ、本発明の完成に至ったものである。
【００１２】
換言すれば、ｍｅｌＯ遺伝子の５′側上流１１７３塩基対の少なくとも一部をプロモーターとして利用することにより、同種又は異種の遺伝子を高発現できることがはじめて明らかにされたのである。本発明に係る新規高発現システムによれば、該プロモーターに各種タンパク質をコードする構造遺伝子を遺伝子組換え技術における常法にしたがって結合し、得られた融合遺伝子を含有してなる発現プラスミドを麹菌に導入し、得られた形質転換体を培養することにより、目的とする各種タンパク質をそれぞれ自由に得ることができる。
【００１３】
このようにｍｅｌＯ遺伝子プロモーターを用いたタンパク発現システムは、グルコアミラーゼなどのアミラーゼ系の組換えタンパク生産に有用であるばかりか、広く外来遺伝子の発現に活用されるものである。しかも本タンパク発現システムによれば、各種遺伝子が効率的に発現されるほか、例えばｇｌａＢ遺伝子の場合は、本来固体培養で高発現し液体培養では低い生産性しか示さないにもかかわらず、本システムによれば液体培養でもｇｌａＢ遺伝子を強力に発現することがはじめて可能となったり、また、他のタンパク質を副生産することがない、目的タンパク質を高生産するといった著効も奏される。
以下、本発明の実施例について述べる。
【００１４】
【実施例１：ｍｅｌＯ遺伝子の発現能の検討】
プロモーター解析プラスミドｐＮＧＵＳのＧＵＳ遺伝子上流に、ｍｅｌＯ遺伝子プロモーターあるいはｇｌａＢ遺伝子プロモーターを挿入し、それぞれ麹菌に導入した。得られた形質転換体のなかから、プラスミドが１コピー導入された菌株を選択し、それぞれ液体培養と固体培養でのＧＵＳ生産性を比較した。得られた結果を下記表１に示す。
【００１５】
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【００１６】
上記表１（液体培養と固体培養におけるＧＵＳ活性）の結果から明らかなように、固体培養で強力に発現することが知られているｇｌａＢ遺伝子は、固体培養で８，０００Ｕ／ｍｇ-proteinを越える高いＧＵＳ生産性を示した。一方ｍｅｌＯプロモーター導入株では、固体培養ではほとんどＧＵＳ活性は認められないが、液体培養では高い生産性を示した。以上の結果より、ｍｅｌＯ遺伝子は液体培養で強く発現する遺伝子であることが明らかとなった。したがってｍｅｌＯプロモーターを利用すれば、液体培養での異種タンパクの高生産が可能となるものと認められた。
【００１７】
【実施例２：ｇｌａＢグルコアミラーゼ生産】
１．６Ｋｂ  ｍｅｌＯプロモーターの下流に１．９Ｋｂ  ｇｌａＢ遺伝子のコーディング領域をヒグチらのcombinationＰＣＲ法によって結合し、ｍｅｌＯプロモーターの直後にｇｌａＢ遺伝子の開始コドンが連結した融合遺伝子を調製した。その塩基配列を配列番号１に示す。得られた融合遺伝子をベクターｐＮＩＡ２に導入連結して、麹菌発現プラスミドｐＧＬＡＧＸ（図８）を作成し、これを麹菌に導入した。得られた形質転換体を、Aspergillus oryzae Mel−GLB と命名し、工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ  ＢＰ−７００７ として寄託した。
【００１８】
このようにして得られた形質転換体を、ツァペックドックス合成培地（Ｃｚ培地）およびデキストリン−ペプトン−酵母エキス培地（ＤＰＹ培地）で３０℃の液体培養を行い、培養液中のグルコアミラーゼ活性を測定した（図５）。培養３日から培養液にグルコアミラーゼが生産されるようになり、培養１０日目で５００Ｕを越える高いグルコアミラーゼ活性が得られた。ＤＰＹ培地のような栄養が豊富な培地では７５６Ｕ／ｍｌと、タンパク量換算で１．４ｍｇ／ｍｌと非常に高いグルコアミラーゼが生産され、またＣｚ培地のような完全合成培地でも５００Ｕ／ｍｌまで生産することができた。これは通常のA. oryzae野生株の液体培地での生産性に比べて約１００倍以上の高い活性であり、固体培養（麹培養）に比べても２倍以上の高い生産性を示すものであった。
【００１９】
【実施例３：組換えタンパクの純度】
実施例２に示した遺伝子導入株の培養液を、電気泳動にてそのタンパク組成を解析した（図６）。ＤＰＹ培地では組換えグルコアミラーゼ以外にも、αアミラーゼなどのタンパクのシグナルも認められるが、Ｃｚ合成培地ではグルコアミラーゼ以外のタンパクはほとんど検出できなかった。このようにｍｅｌＯプロモーターを用いた異種タンパク生産は、その生産量が高いだけではなく、生産されるタンパクの純度が非常に高いことが示された。
【００２０】
【実施例４：グルコアミラーゼの高生産】
実施例２などから、ｍｅｌＯ遺伝子は菌体の増殖が定常期に達した以降に発現することが明らかとなった。そこで定常期以降の菌体に対して、培地を徐々に添加し、グルコアミラーゼの生産性をさらに上昇させることを試みた（図７）。培養１０日目の菌体に対して培地を１５％ずつ添加する流加培養にて、最終的に１２００Ｕ／ｍｌのグルコアミラーゼの生産が可能となった。その結果グルコアミラーゼの生産性は、バッチ培養に比べてさらに３．５倍上昇した。このように培養末期に発現するｍｅｌＯ遺伝子の性質をうまく利用すれば、さらに高い異種タンパク生産性を達成することができることが確認された。
【００２１】
【発明の効果】
本発明によれば、ｍｅｌＯ遺伝子のプロモーター領域を利用することにより、各種遺伝子を効率的に発現することがはじめて可能となり、目的とするタンパク質を高純度、高収率で、しかも液体培養によって得ることができる。
【００２２】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】プロモーター解析用プラスミドを示す。
【図２】ｍｅｌＯ遺伝子プロモーターの塩基配列を示す。
【図３】ｍｅｌＯ遺伝子プロモーターとｇｌａＢ翻訳領域との融合遺伝子の塩基配列１を示す。
【図４】同２を示す。
【図５】グルコアミラーゼ生産の経時的変化を示す。
【図６】組換えグルコアミラーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンを示す。
【図７】培養末期におけるグルコアミラーゼ高生産を示す。
【図８】麹菌発現プラスミドｐＧＬＡＧＸを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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