(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リン脂質、組織因子および水溶性のニッケル化合物を含有することを特徴とするプロトロンビン時間測定試薬。
【請求項２】
水溶性のニッケル化合物が塩化ニッケル、硝酸ニッケル又は酢酸ニッケルから選ばれる少なくとも１又は２以上の化合物を含有することを特徴とする請求項１に記載のプロトロンビン時間測定試薬。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の化合物の濃度が０．１〜５．０ｍｍｏｌ／Ｌであることを特徴とするプロトロンビン時間測定試薬。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のプロトロンビン時間測定試薬を用いることを特徴とするプロトロンビン時間測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は臨床検査に用いられるプロトロンビン時間測定試薬及びプロトロンビン時間測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
血液凝固能検査の中でプロトロンビン時間測定（ＰＴ）は、血液凝固因子であるＩＩ、Ｖ、ＶＩＩ、Ｘ因子の活性を総合的に検査するものであり、凝固能検査のスクリーニング検査及び経口抗凝固薬の効果判定検査として広く実施されている。ＰＴの測定は、組織因子又は組織因子を含むヒト又は動物由来の組織トロンボプラスチンと適当な濃度のカルシウムイオンが主成分である測定試薬に、被検血漿を加え、血液凝固時間を測定することにより行われる。試薬成分であるヒト又は動物由来の組織トロンボプラスチンは通常脳あるいは胎盤といった臓器から抽出される。抽出源となる臓器には血液凝固因子を含む血液成分が含まれている。このため、血液凝固因子を混在させないで組織トロンボプラスチンを抽出することは困難であり、血液凝固因子の活性を感度よく反映する試薬を調製することは困難であった。とりわけＶＩＩ因子と組織トロンボプラスチンは複合体を形成するため、ＶＩＩ因子活性を感度よく反映する組織トロンボプラスチンを調製することが極めて困難であった。
【０００３】
感度の良い組織因子又は組織トロンボプラスチンを含有する試薬を調製することはこの分野に携わる研究者の最大の課題であり、組織トロンボプラスチンを抽出、調製する方法が今までにも示されていたが（特許公告平３−３９２６７、公表特許公告平３−５０３５３４、公開特許公告平成１０−３３０４００、米国特許３，９８３、００４）、何れも実用的に満足の行くものではなかった。
【０００４】
【解決しようとする課題】
本発明の課題は、血液凝固因子活性を感度良く測定できるプロトロンビン時間測定試薬を提供することである。
【０００５】
【解決する手段】
本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、組織因子又は動物器官より抽出した組織トロンボプラスチンとニッケル化合物を混合させることにより、飛躍的に感度の良い試薬すなわち、ＷＨＯ参照品と同等の感度を示すＩＳＩ値が１．５以下であり、さらに、外因系凝固因子に対する感受性が高い試薬を調製できることを見出し本発明を完成させるに至った。また目標とするＩＳＩ値は１．５以下に限定されるもので無く当業者が適宜目的に応じ設定可能である。その他条件についても同様に当業者が適宜目的に応じ設定可能である。
【０００６】
本発明は、リン脂質、組織因子および水溶性のニッケル化合物を含有させることを特徴とするプロトロンビン時間測定試薬に関するものである。上記ニッケル化合物が塩化ニッケル、硝酸ニッケル又は酢酸ニッケルから選ばれる少なくとも１又は２以上の化合物を含有することを特徴とするプロトロンビン時間測定試薬に関するものである。上記化合物の濃度が０．１〜５．０ｍｍｏｌ／Ｌであることを特徴とするプロトロンビン時間測定試薬に関するものである。上記プロトロンビン時間測定試薬を用いることを特徴とするプロトロンビン時間測定方法に関するものである。
【０００７】
組織因子は、ヒト又は動物由来の組織トロンボプラスチンに含まれており、さらに遺伝子組換えにより作成することもできる。組織因子の遺伝子組換えによる作成は、遺伝子組換えにより得られた組織因子タンパク質にリン脂質を加えることにより組織因子としての活性が発現される。また、組織トロンボプラスチンは一般にヒト胎盤又はウサギ或いは牛脳から抽出される。ウサギ脳を用いる場合には、ウサギ脳をアセトンで脱水したアセトン粉末を、適当な緩衝液で抽出される。牛脳もアセトン粉末から抽出したり、新鮮脳をミンチにして直接抽出することも有る。抽出した組織トロンボプラスチンは適当な濃度に調整されて、カルシウムイオン及び安定化、賦型剤等を添加して凍結乾燥されるのが一般的である。場合によっては、液状で保存されることもある。
【０００８】
ニッケル化合物を添加する工程は特に限定されないが、上記の最終調製物また抽出液に含ませておくこともできる。添加する濃度は０．１〜５．０ｍｍｏｌ／Ｌであり、とりわけ０．５〜３．０ｍｍｏｌ／Ｌが好適である。添加するニッケル化合物の種類は特に限定されないが、塩化ニッケル、硝酸ニッケル等の無機化合物及び酢酸ニッケル等の有機ニッケル化合物等の中から選ばれる。
【０００９】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明を更に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００１０】
【実施例１】
ウサギ脳をアセトンで脱水したウサギ脳アセトン粉末３ｇを生理食塩水１００ｍＬに懸濁し、４５℃で３０分間撹拌した後、５，０００回転で１０分間遠心分離してその上清をトロンボプラスチン抽出原液とした。抽出原液４容と０．１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、１２０ｍｍｏｌ／Ｌ  乳酸カルシウムを含む５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．３５）１容を混合してＰＴ測定試薬とした。調製試薬に１ｍｍｏｌ／Ｌの種々の金属化合物を添加し、コントロール血漿のＰＴを測定し、国際感度指数（ＩＳＩ）及びＶＩＩ因子欠乏血漿のＰＴ比を求めた。その結果を表１に示した。
【００１１】
【表１】
0004526152.tif 000002
【００１２】
以上の結果、塩化ニッケルが特異的にＩＳＩ値を小さくしＶＩＩ因子欠乏血漿に対するＰＴ比を大きくする効果があり、ＰＴ試薬の感度の改善に有効であることが判った。
【００１３】
【実施例２】
実施例１で用いた無添加のＰＴ試薬に、塩化ニッケル、酢酸ニッケル、硝酸ニッケルを各１ｍｍｏｌ／Ｌ添加してＩＳＩ値及びＶＩＩ因子欠乏血漿のＰＴ比の改善効果を実施例１と同様にコントロール血漿のＰＴを測定して調べた。その結果を表２に示した。
【００１４】
【表２】
0004526152.tif 000003
【００１５】
以上の結果いずれのニッケル化合物でもＩＳＩ値及びＶＩＩ因子欠乏血漿のＰＴ比の改善効果が認められ、ニッケルイオンがＰＴ試薬の感度の改善に有効であることが判った。
【００１６】
【実施例３】
塩化ニッケルの濃度を変化させて、実施例１と同様に操作して、ニッケルイオンの濃度効果を調べた。その結果を表３に示した。
【００１７】
【表３】
0004526152.tif 000004
【００１８】
以上の結果、塩化ニッケル濃度の増加と共にＩＳＩ値の低下及びＶＩＩ因子に対する感度、すなわち高感度化効果が観測されたが、５ｍＭを超える濃度では、正常血漿のＰＴが大幅に延長するため適当な濃度として塩化ニッケル０．１〜５．０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲で効果的であり、とりわけ０．５〜３．０ｍｍｏｌ／Ｌが好適であることが判った。
【００１９】
【発明の効果】
組織因子又は組織トロンボプラスチンとニッケルイオンを含有させることにより血液凝固活性を感度よく測定可能となった。