(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光標識免疫賦活多糖を含有する検出試薬、及び前記蛍光標識免疫賦活多糖とは異なる多糖の蛍光標識体又は前記蛍光標識免疫賦活多糖と同じ多糖であって、蛍光標識されていない免疫賦活多糖を含有する標準試薬とを含むことを特徴とする末梢血単核球の多糖結合能測定キット。
【請求項２】
免疫賦活多糖がβ−グルカンである請求項１記載のキット。
【請求項３】
免疫賦活多糖がレンチナンである請求項１記載のキット。
【請求項４】
検出試薬と標準試薬がそれぞれ液状で、別々の容器に収容されてなる請求項１〜３のいずれか１項記載のキット。
【請求項５】
溶血・固定液と組み合わせてなる請求項４記載のキット。
【請求項６】
洗浄・分析液と組み合わせてなる請求項５記載のキット。
【請求項７】
標準試薬が、検出試薬の蛍光標識免疫賦活多糖とは異なる多糖の蛍光標識体を含有する請求項１〜６のいずれか１項記載のキット。
【請求項８】
標準試薬が、検出試薬で用いる蛍光標識免疫賦活多糖と同じ多糖であって、蛍光標識されていない免疫賦活多糖を含有する請求項１〜６のいずれか１項記載のキット。
【請求項９】
標準試薬が、検出試薬の蛍光標識免疫賦活多糖とは異なる多糖の蛍光標識体を含有する第１の標準試薬及び検出試薬で用いる蛍光標識免疫賦活多糖と同じ多糖であって、蛍光標識されていない免疫賦活多糖を含有する第２の標準試薬との組み合わせである請求項１〜６のいずれか１項記載のキット。
【請求項１０】
さらに採血管を含んでなる請求項１〜９のいずれか１項記載のキット。
【請求項１１】
試験血液を、蛍光標識免疫賦活多糖を含有する検出試薬に接触させ、血液中の目的末梢血単核球画分を得、その蛍光強度を測定して蛍光標識免疫賦活多糖と目的末梢血単核球との結合量（B）を求める工程、
試験血液を、検出試薬で用いるのとは異なる多糖の蛍光標識体を含有する標準試薬に接触させ、血液中の目的末梢血単核球画分を得、その蛍光強度を測定して蛍光標識体と目的末梢血単核球との結合量（A）を求める工程、
両者の結合量の差B−Aから、使用した免疫賦活多糖が試験血液を提供した哺乳動物の免疫賦活に有効であるか否かを判定する工程、
を含むことを特徴とする免疫賦活多糖の免疫賦活剤としての有効性を判定する方法。
【請求項１２】
試験血液を、蛍光標識免疫賦活多糖を含有する検出試薬に接触させ、血液中の目的末梢血単核球画分を得、その蛍光強度を測定して蛍光標識免疫賦活多糖と目的末梢血単核球との結合量（B）を求める工程、
試験血液を、検出試薬で用いる蛍光標識免疫賦活多糖と同じ多糖であって蛍光標識されていない免疫賦活多糖を含有する標準試薬、及び蛍光標識免疫賦活多糖を含有する検出試薬に接触させ、血液中の目的末梢血単核球画分を得、その蛍光強度を測定して蛍光標識免疫賦活多糖と目的末梢血単核球との結合量（A）を求める工程、
測定値Ａ及び両者の結合量の差B−Aから、使用した免疫賦活多糖が試験血液を提供した哺乳動物の免疫賦活に有効であるか否かを判定する工程、
を含むことを特徴とする免疫賦活多糖の免疫賦活剤としての有効性を判定する方法。
【請求項１３】
試験血液を、検出試薬に接触させるときの温度が、0〜50℃である請求項１１又は１２記載の方法。
【請求項１４】
免疫賦活多糖がβ−グルカンである請求項１１〜１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
免疫賦活多糖がレンチナンである請求項１１〜１３のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、どの免疫賦活多糖がどの個体に対して免疫賦活剤として有効であるか否かを簡易に測定するのに有効な多糖結合能測定キット、及び免疫賦活剤としての有効性測定方法に関するものである。【０００２】
（発明の背景技術）
レンチナンといったβ−グルカンなどの免疫賦活多糖は、免疫賦活剤や抗悪性腫瘍剤として効果があることが知られているが、効果の発現には個体差が大きいことも知られている（非特許文献１）。
一方、ヒトやマウスなどの哺乳類の末梢血単核球、例えば、単球、顆粒球やリンパ球の表面に免疫賦活多糖が結合することが知られている（非特許文献２及び３）。そして、末梢血単核球への免疫賦活多糖の結合能には個体差やマウス系統差があることが示されており、免疫賦活多糖の効果発現と結合能は相関する可能性が大きい。
免疫賦活多糖の末梢血単核球への結合能は、抗レンチナン抗体などの免疫賦活多糖の抗体を用いる方法が知られているが、この方法では、抗レンチナン抗体はIgMなので使用しにくく、又抗レンチナン抗体は自家生産であり、力価が一定のものを恒常的に供給するのは困難であるとの問題がある。さらに、血液から白血球画分を分離し、血清存在下で反応にかけるため、操作が煩雑であるとの問題がある。【０００３】
これに対して、蛍光標識免疫賦活多糖を末梢血単核球（全血）に添加培養し、その蛍光強度を測定することが行われている（非特許文献４及び５）。
この方法は、抗レンチナン抗体などを用いる方法に比べて、遥かに効率的かつ高精度で標識免疫賦活多糖の末梢血単核球への結合能を測定できる方法である。しかしながら、本発明者らが調べたところ、この方法では、免疫賦活多糖に特異的な結合以外に、非特異的な結合を含んで測定しているため、たとえポジティブな結果がでたとしても、試験した個体の免疫賦活多糖に対する特異的な結合能のみを測定していることにはならず、必ずしも試験した個体の結合能と効果が相関しない可能性があることがわかった。【０００４】
【非特許文献１】Cancer Res. 44: 5132 (1984)
【非特許文献２】50th Annual Mtg. Proc. Jpn. Cancer Assoc. p259 (1991)
【非特許文献３】Int. J. Immunopharmac. 18: 211 (1996)
【非特許文献４】J. Clin. Invest. Vol. 98, No. 1, July 1996, pp50-61
【非特許文献５】J. Exp. Med. Vol. 196, No.3, August 5, 2002, pp407-412
【発明の開示】
【０００５】
本発明は、より予測精度の高い判定が可能な末梢血単核球の多糖結合能測定キットを提供することを目的とする。
本発明は、又、免疫賦活多糖の免疫賦活剤としての有効性を判定する、より予測精度の高い方法を提供することを目的とする。
【０００６】
本発明は、蛍光標識免疫賦活多糖を含有する検出試薬を用いることに加えて、蛍光標識免疫賦活多糖とは異なる多糖の蛍光標識体を含有する標準試薬、又は蛍光標識免疫賦活多糖と同じ多糖であって、蛍光標識されていない免疫賦活多糖を含有する標準試薬を用いると、より精度が高く免疫賦活多糖の免疫賦活剤としての有効性を予測でき、これによれば効果的に上記課題を解決できるとの知見に基づいてなされたものである。
すなわち、本発明は、蛍光標識免疫賦活多糖を含有する検出試薬、及び前記蛍光標識免疫賦活多糖とは異なる多糖の蛍光標識体又は前記蛍光標識免疫賦活多糖と同じ多糖であって、蛍光標識されていない免疫賦活多糖を含有する標準試薬とを含むことを特徴とする末梢血単核球の多糖結合能測定キットを提供する。
【０００７】
本発明は、又、試験血液を、蛍光標識免疫賦活多糖を含有する検出試薬に接触させ、血液中の目的末梢血単核球画分を得、その蛍光強度を測定して蛍光標識免疫賦活多糖と目的末梢血単核球との結合量（B）を求める工程、
試験血液を、検出試薬で用いる蛍光標識免疫賦活多糖とは異なる多糖の蛍光標識体を含有する標準試薬に接触させ、血液中の目的末梢血単核球画分を得、その蛍光強度を測定して異なる多糖の蛍光標識体と目的末梢血単核球との結合量（A）を求める工程、但し、検出試薬に標準試薬に含有する多糖の非標識体もしくは別の蛍光色素での標識体を共存させて接触させる場合は、この工程を省略することができる。
両者の結合量の差B−Aから、使用した免疫賦活多糖が試験血液を提供した哺乳動物の免疫賦活に有効であるか否かを判定する工程、
を含むことを特徴とする免疫賦活多糖の免疫賦活剤としての有効性を判定する方法を提供する。
【０００８】
本発明は、又、試験血液を、蛍光標識免疫賦活多糖を含有する検出試薬に接触させ、血液中の目的末梢血単核球画分を得、その蛍光強度を測定して蛍光標識免疫賦活多糖と目的末梢血単核球との結合量（B）を求める工程、
試験血液を、検出試薬で用いる蛍光標識免疫賦活多糖と同じ多糖であって蛍光標識されていない免疫賦活多糖を含有する標準試薬、及び蛍光標識免疫賦活多糖を含有する検出試薬に接触させ、血液中の目的末梢血単核球画分を得、その蛍光強度を測定して蛍光標識免疫賦活多糖と目的末梢血単核球との結合量（A）を求める工程、
測定値Ａ及び両者の結合量の差B−Aから、使用した免疫賦活多糖が試験血液を提供した哺乳動物の免疫賦活に有効であるか否かを判定する工程、
を含むことを特徴とする免疫賦活多糖の免疫賦活剤としての有効性を判定する方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明で用いる蛍光標識免疫賦活多糖としては、多糖類のグルコース残基に−CHO、−COOH、−NH2、−NHS、−CN、エポキシ基等の反応基を導入することができる多糖類であれば何でも使用することができる。例えば、β−グルカン，α−グルカン、ヘテロ多糖（好ましくはヘテログルカン）、蛋白結合グルカン等があげられ、好ましくはβ−グルカンであり、より好ましくはレンチナン、ザイモザン、パヒマラン、シゾフィラン、プスチュラン、スクレログルカン及びリヘナンである。これらの多糖類について、分子量は特に限定されない。
上記多糖類に蛍光標識を導入する蛍光物質としては、分子内にNH2−、COOH−やイミド等の反応基を有している蛍光物質（ビオチン等の蛍光標識アビジン等の二次蛍光物質で蛍光検出できる物質も含まれる）を用いることができる（例えば、新生化学実験講座３  糖質Ｉ（上）p19〜，p95〜（1990）東京化学同人、東京、同  糖質Ｉ（下）p605〜，p743〜及び同  糖質II  p283〜参照）。好ましくは、−ＮＨ２（イミド含む）を持つ蛍光物質やビオチン化合物があげられる。色の規定は特に限定されないが、FACS等のflowcytometry解析で検出可能な波長であることが望ましい。好ましくは、フルオレセイン（fluorescein）系の化合物である。具体的には、Fluorescein 5-thiosemicarbazide、FITC（Fluorescein isothiocyanate）などがあげられる。【００１０】
標準試薬として用いる、検出試薬で用いる蛍光標識免疫賦活多糖とは異なる多糖の蛍光標識多糖としては、検出試薬で用いる蛍光標識免疫賦活多糖とは末梢血単核球への結合様式の異なる多糖体で同一蛍光色素で蛍光標識したものであれば何でもよい。例えばβ-1,3-グルカンの結合能測定の場合の標準試薬は、同一蛍光物質で蛍光標識されたα−グルカン、ヘテロ多糖（好ましくはヘテログルカン）等である。分子量は、特に規定はなく単糖や二糖でもよいが、測定したい多糖体の0.01倍〜100倍（好ましくは0.1〜10倍、より好ましくは同程度）であるのがよい。蛍光強度は測定したい蛍光標識多糖（検出試薬）と比較してグルコース当り換算強度で0.01倍〜100倍（好ましくは0.1〜10倍、より好ましくは同程度）であるのがよい。
又、本発明では、標準試薬として、検出試薬で用いる蛍光標識免疫賦活多糖と同じ多糖であって、蛍光標識されていない免疫賦活多糖を用いることができる。
本発明では、検出試薬及び標準試薬とも、それぞれ液状で、別々の容器に収容されているのが好ましい。この場合、水溶液に、検出試薬又は標準試薬を1〜10,000μg/mLの量（好ましくは、10〜1,000μg/mL、より好ましくは100〜500μg/mL）で、かつ適当な防腐剤（アジ化ナトリウム等）や細胞膜の流動性を抑えるための試薬（アジ化ナトリウムやサイトカラシンB等）を添加しておいてもよい。【００１１】
本発明のキットには、さらに、溶血・固定液、洗浄・分析液、採血管を組み合わせるのが好ましい。
採血管としては、材質は特に限定されないが、ガラス、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン製等のものであって、ヘパリン、クエン酸、EDTA等で抗凝固処理したものが好ましい。採血用量は、0.01〜10mLであるのが好ましく、特に好ましくは１〜5mLである。
本発明では、採血管に採血した後、採血管に、標準試薬液（A液）（検出試薬に蛍光標識免疫賦活多糖とは異なる多糖の非標識体もしくは別の蛍光色素による標識体を共存させる場合は省略することができる）もしくは検出試薬液（B液）を容量比で1/100〜1/2量（好ましくは1/10〜1/20）（多糖体の最終濃度としては、0.1μg〜1,000μg/mL，好ましくは1〜100μg/mL，より好ましくは、10〜50μg/mL）を混和して5〜180分（好ましくは15〜90分、より好ましくは30〜60分）放置する。放置する温度は、0〜50℃が好ましい。【００１２】
さらに、この操作は、後述の溶血・固定液処理の後に行うこともできる。
溶血・固定液としては、赤血球を溶血させることができる水のような低張溶液であればよい。例えば塩化アンモニウム系の溶血溶液や市販溶液（FACS Lysing Solution(BD社製)等）などを用いることができる。添加量は、処理する血液溶液の１〜100倍量（好ましくは2〜50倍、より好ましくは10〜40倍）であり、血液と混和し、0℃〜40℃（好ましくは室温）で、１〜60分（好ましくは5〜30分、より好ましくは10〜15分）放置して赤血球を溶血させ、遠心分離し上澄みを除去する。また、測定までに24時間以上を要する場合は、細胞を固定することが望ましい。その際には、例えばホルマリン系の固定剤（ホルムアルデヒド等）を添加した溶液（FIX＆PERM Reagent A（Caltag社製）等）を用い上記と同様に赤血球を溶血させ遠心分離し上澄みを除去し、必要に応じて洗浄・分析液で洗浄した後、0℃〜室温（好ましくは冷蔵保存）で放置し72時間以内（好ましくは48時間以内）に測定する。【００１３】
洗浄・分析液は、生理食塩水のような等張溶液であればよく、例えば市販のPBS（phosphate buffered saline）系の試薬等を用いることができる。必要によりBSA（bovine serum albumin）やアジ化ナトリウム、エチレングリコール等を含有しているものを用いてもよい（例えば、洗浄用緩衝液 (PBS(-)+0.1%BSA+0.1%アジ化ナトリウム)等）。添加量は処理血液量の0.5〜10倍量（好ましくは1〜4倍量）加え混和後、遠心分離して上澄みを除去するのがよい。この操作を1〜数回行い、さらに処理血液量の0.5〜10倍量（好ましくは1〜4倍量）加え、混和しflowcytometryにて解析する。測定までに24時間以上を要する場合は、防腐剤や細胞膜流動性防止剤（例えばアジ化ナトリウムやサイトカラシンB等）を含有させたものを用いるのが望ましい。
本発明のキットに使用する血液は、採取直後、採取後氷中・冷蔵庫等で短時間保管しておいたもの、-30℃以下で凍結保存しておいたもの、の何れでもよく、凍結保存しておいた血液は、使用時に通常の方法で融解して使用すればよい。【００１４】
本発明のキットは、血液単核球のみならずその他の細胞浮遊液の染色にも応用できる。種々の細胞株（癌細胞株や白血球細胞株等）の浮遊液、癌組織や種々の臓器（リンパ節（実施例）、脾臓、肺、肝臓、腸管、皮膚等）の細胞浮遊液（EDTA処理や酵素（トリプシンやコラゲナーゼ等）処理し単細胞浮遊液にしたものでもよい）の染色にも応用できる。操作は、１×103〜108個／ｍL（好ましくは1×104〜107個／mL、より好ましくは1×105〜106個／ｍL）に調製した単細胞浮遊液であれば、上記と同様な操作で測定することができる。【００１５】
さらに、本発明のキットは、single color解析のみならずmulti-color解析にも応用できる。すなわち、ある細胞内外の特定の物質（例えば、表面抗原等）、細胞内物質（サイトカイン等）等に対する抗体を用いるflowcytometryと組み合わせて解析することができる。この際には、例えば細胞表面の物質の解析では、採血管に標準試薬液又は検出試薬液を加えて行う操作の際に、細胞表面物質に対する抗体を共存させれば簡便に測定することができる。A液／B液に用いている蛍光標識物質とは別の蛍光標識物質で標識された抗体を用いるのがより簡便である。またビオチン等で標識した抗体を用い、洗浄後に別の蛍光標識物質で標識されたアビジン等で処理してもよい。さらには標識されていない抗体を用いる場合は、洗浄後に、その抗体に対する二次抗体（A液／B液に用いている蛍光標識物質とは別の蛍光標識物質で標識された抗体やビオチン等で標識した抗体を用い、洗浄後に別の蛍光標識物質で標識されたアビジン等で処理）で測定することも可能である。採血管に標準試薬液又は検出試薬液を加えて行う操作の際に抗体を共存させなくても、溶血操作の後に、抗体を用いて処理して測定することも可能である。
又、細胞内の物質を測定する場合は、溶血・固定操作を行った後、細胞膜透過用緩衝液（例えばFIX＆PERM Reagent B（Caltag社製））でPermealizing処理後に抗体を用いて処理して測定することができる。【００１６】
本発明では、上述したように、試験血液を、蛍光標識免疫賦活多糖を含有する検出試薬に接触させ、血液中の目的末梢血単核球画分を得、その蛍光強度を測定して蛍光標識免疫賦活多糖と目的末梢血単核球の結合体の量（B）を求め、
試験血液を、検出試薬で用いる蛍光標識免疫賦活多糖とは異なる多糖の蛍光標識体を含有する標準試薬に接触させ、血液中の目的末梢血単核球画分を得、その蛍光強度を測定して蛍光標識体と目的末梢血単核球との結合量（A）を求め（検出試薬に蛍光標識免疫賦活多糖とは異なる多糖の非標識体もしくは別の蛍光色素による標識体を共存させる場合は省略することができる）、
両者の結合量の差B−Aから、使用した免疫賦活多糖が試験血液を提供した哺乳動物の免疫賦活に有効であるか否かを判定することができる。ここで、結合体の量や結合量としては、結合する細胞の数（割合）とすることができる（以下同じ）。【００１７】
又、検出試薬で用いる蛍光標識免疫賦活多糖と同じ多糖であって蛍光標識されていない免疫賦活多糖を含有する標準試薬を用いる場合には、
試験血液を、蛍光標識免疫賦活多糖を含有する検出試薬に接触させ、血液中の目的末梢血単核球画分を得、その蛍光強度を測定して蛍光標識免疫賦活多糖と目的末梢血単核球との結合量（B）を求め、
試験血液を、検出試薬で用いるのと同じ多糖であって蛍光標識されていない免疫賦活多糖を含有する標準試薬、及び蛍光標識免疫賦活多糖を含有する検出試薬に接触させ、血液中の目的末梢血単核球画分を得、その蛍光強度を測定して蛍光標識免疫賦活多糖と目的末梢血単核球との結合量（A）を求め、
測定値Ａ及び両者の結合量の差B−Aから、使用した免疫賦活多糖が試験血液を提供した哺乳動物の免疫賦活に有効であるか否かを判定することができる。
本発明では、非特異的な多糖の結合量を除去でき、測定したい免疫賦活多糖の特異的な結合を測定することができる。さらに、上記２つの判定方法を併用することにより、非特異的な抗腫瘍多糖の結合量を除去でき、免疫賦活多糖の蛍光標識化により、細胞への結合様式が変化していないことを確認でき、使用した免疫賦活多糖の特異的な結合のみを測定でき、免疫賦活多糖の免疫賦活剤としての有効性を精度が高く予測できる。【００１８】
本発明により、蛍光標識免疫賦活多糖を含有する検出試薬を用いることに加えて、蛍光標識免疫賦活多糖とは異なる多糖の蛍光標識体を含有する標準試薬を用いる（非特異的な異なる多糖の結合量を測定できる）もしくは検出試薬に異なる多糖の非標識体あるいは別の蛍光色素による標識体を共存させると、前者の測定結果から非特異的な異なる多糖の結合量を除去でき、測定したい免疫賦活多糖の特異的な結合能を測定することができるため、免疫賦活多糖の免疫賦活剤としての有効性を精度が高く予測できる利点がある。
一方、蛍光標識免疫賦活多糖を含有する検出試薬を用いることに加えて、蛍光標識免疫賦活多糖と同じ多糖であって、蛍光標識されていない免疫賦活多糖を含有する標準試薬を用いると、免疫賦活多糖の蛍光標識化により、細胞への結合様式が変化していないことを確認でき、測定したい免疫賦活多糖自身の結合能を正確に測定でき、免疫賦活多糖の免疫賦活剤としての有効性を精度が高く予測できる。【００１９】
よって、蛍光標識免疫賦活多糖を含有する検出試薬を用いることに加えて、蛍光標識免疫賦活多糖とは異なる多糖の蛍光標識体を含有する第１の標準試薬（検出試薬に異なる多糖の非標識体あるいは別の蛍光色素による標識体を共存させる場合は第１の標準試薬を省略することができる）及び検出試薬で用いる蛍光標識免疫賦活多糖と同じ多糖であって、蛍光標識されていない免疫賦活多糖を含有する第２の標準試薬とを用いると、一層精度よく測定したい免疫賦活多糖自身の結合能を正確に測定でき、免疫賦活多糖の免疫賦活剤としての有効性をより精度が高く予測できる。
又、本発明のキットは、検出試薬、標準試薬、溶血・固定液、洗浄・分析液、採血管と組み合わせることにより、迅速、簡便に蛍光強度のズレ（差）、すなわち、個々人の免疫賦活多糖に対する特異的結合能を測定することができる。
次に本発明を実施例により詳細に説明する。
【実施例】
【００２０】
実施例１
Fluorescein標識レンチナン作製法
レンチナン原末（味の素社製）を乳鉢で練りながら蒸留水に分散させ、120℃、20分のオートクレーブにより溶解したものを溶液として用いた。
レンチナン原末溶液4mg/mlと、4mMのメタ過ヨウ素酸ナトリウムを等体積混合し、４℃で一昼夜攪拌した（酸化開裂反応により、反応基−ＣＨＯを導入した）。次いで、エチレングリコールを全体積の60分の１量加えてメタ過ヨウ素酸の不活化を行い、４℃で一昼夜蒸留水にて透析した。回収液にFluorescein 5-thiosemicarbazide（Molecular Probes社製） 200μg/mlを、最初のレンチナン原末溶液の２分の１体積加え、NaOH溶液によりpH=9.5に調製、遮光下にて４℃で一昼夜攪拌し、レンチナンを蛍光標識した。反応後、5mg/mlのSodium borohydrideを最初のレンチナン原末溶液の12.5分の1体積加え、遮光下にて４℃で一昼夜攪拌した（シッフ塩基の還元、アルデヒドのアルコール化）。最後に、HClによりpH=7.0に調製し蒸留水にて遮光下、４℃で一昼夜以上透析した。透析後、液を回収しアジ化ナトリウムを最終濃度0.02%で添加、遮光下での冷蔵保存とした。【００２１】
全血を用いた結合能測定法
ヘパリン入りシリンジを用い、エーテル麻酔下にてICRマウス（日本クレア（株）より購入、５〜８週齢、雌）より心採血を行った。氷冷下、Falcon2054チューブにヘパリン処理血液を90μl/本で分注し、Fluorescein標識レンチナンは10μl/本で添加した。30分以上経過後、マウス単球の表面抗原F4/80に対するPE（phycoerythrin）標識抗体（PE標識抗マウスF4/80抗体；Serotec社製）を3μl/本で添加、さらに30分以上経過後、FACS Lysing Solution（溶血・固定液BD社製；蒸留水にて10倍希釈）を3ml/本添加し、室温で10分放置し溶血した。４℃、1500rpm、5分の遠心分離後、洗浄用緩衝液 (PBS(-)+0.1%BSA+0.1%アジ化ナトリウム)1ml（洗浄・分析液）で洗浄し、洗浄用緩衝液0.5mlに懸濁、メッシュを通した後FACS Caliburによる２カラー(Fluorescein/PE)解析を行った。
データ解析は、FSC/SSCで単球画分（ＭＣ）、顆粒球画分（ＧＣ）、リンパ球画分（ＬＣ）に分け、Fluorescein/PEに展開、単球画分では、PE陽性細胞中のFluorescein陽性細胞の割合を、顆粒球画分、リンパ球画分では各画分におけるFluorescein陽性細胞の割合を解析した（結果を、例えば、図１のＦＬの項に示す）。
Fluorescein標識レンチナンの対象（標準試薬１）として、FITC標識デキストラン（分子量200万；シグマ）を用い、同様の解析を行った（結果を、例えば、図１のＦＤの項に示す）。【００２２】
レンチナンによる結合阻害試験
結合能測定の際、全血をチューブに分注する前に、氷冷下にてレンチナン原末溶液（標準試薬２）2mg/mlのPBS(-)による10倍希釈液を25μl/本で入れておき、全血を65μl/本添加、その後Fluorescein標識レンチナンを10μl/本で添加した（阻害用レンチナンの最終濃度は50μg/ml）。その後の操作は結合能測定法（前項）と同様に行った（結果を、例えば、図１のＦＬ＋Ｌ５０の項に示す）。
凍結保存した血液を用いた試験
Lewisラット（日本チャールスリバー（株）より購入、９〜１０週齢、雄）よりヘパリン入りシリンジを用いて採取し、-30℃の冷凍庫で凍結保存した血液を用いて結合阻害試験を行った。【００２３】
実験結果
用量依存性
Fluorescein標識レンチナンを最終濃度5、10、20、40μg/ml（FL5, FL10, FL20, FL40）でICRマウス全血と１時間反応させ、Fluorescein標識レンチナン結合細胞をFACSにて解析した結果を図１〜３に示す。単球画分では、Fluorescein標識レンチナンの濃度依存的な結合が認められ、40μg/mlでは、単球の約40%がFluorescein標識レンチナンと結合した（図１）。顆粒球画分においても濃度依存的な結合が認められ、Fluorescein標識レンチナン40μg/mlで顆粒球の約20%が結合した（図２）。リンパ球画分においても濃度依存的な結合が認められたが、Fluorescein標識レンチナン40μg/mlでも結合細胞の割合は１％未満であった（図３）。【００２４】
レンチナンによる結合阻害試験
Fluorescein標識レンチナンを最終濃度5、10、20、40μg/mlでICRマウス全血と１時間反応させるよりも先にレンチナン原末溶液50μg/mlを共存させた場合（FL5+L50, FL10+L50, FL20+L50, FL40+L50）には、Fluorescein標識レンチナンの結合が阻害された（図１〜３）。
FITC標識デキストランとの比較
FITC標識デキストランを最終濃度5、10、20、40μg/ml（FD5, FD10, FD20, FD40）でICRマウス全血と１時間反応させ、FITC標識デキストラン結合細胞をFACSにて解析した結果、単球画分では、20μg/ml以下では結合が認められなかったが、40μg/mlでは約5%に結合が認められた（図１）。顆粒球画分においても、20μg/ml以下では結合が認められなかったが、40μg/mlでは約10%に結合が認められた（図２）。リンパ球画分での結合は１％未満であった（図３）。
凍結保存した血液を用いた試験
Fluorescein標識レンチナンを最終濃度150μg/ml（FL150）で凍結融解後のラット全血と１時間反応させ、Fluorescein標識レンチナン結合細胞をFACSにて解析した結果、凍結融解しない血液と同程度の結合が認められた（図４）。【００２５】
まとめ
例えば、図１に示されるように、単球（ＭＣ）に対するFluorescein標識レンチナン（ＦＬ）の結合量（Ｂ）からFITC標識デキストラン結合の結合量（Ａ１）を引いた結合量が大きいので、レンチナンが有意にマウス単球に結合すること、及びこのことからレンチナンが当該マウスに対して免疫賦活剤として有効であることが推定される。
又、図１に示される単球（ＭＣ）に対するFluorescein標識レンチナン（ＦＬ）の結合量（Ｂ）から、未標識レンチナン及びFluorescein標識レンチナン[ＦＬ＋Ｌ５０]に対する結合量（Ａ２）を引いた結合量が大きいので、レンチナンが特異的にマウス単球に結合すること、Fluorescein標識レンチナンの結合様式と未標識レンチナンの結合様式が同じであることが確認できる。【００２６】
実施例２
ヒト血液を用いた結合能測定法
ヘパリン採血管に採血したヒト血液を250μl/本で分注し、一方には、実施例１で用いたのと同じFluorescein標識レンチナンを100μg/mlになるよう添加した。37℃で45分培養後、ヒトCD14に対するPE標識抗体(CALTAG社製)を添加、さらに37℃で30分培養後、0.83%塩化アンモニウム溶液（0.1%炭酸水素ナトリウム、0.0037%EDTA・4Naを含む）を10ml/本で添加し、溶血した。室温、1500rpm、5分の遠心分離後、洗浄用緩衝液（PBS(-)＋0.2%BSA+0.1%アジ化ナトリウム）で洗浄し、洗浄用緩衝液0.5mlに懸濁、メッシュを通した後FACS Caliburによる２カラー(Fluorescein/PE)解析を行った。
データ解析は、FSC/SSCで単球画分、顆粒球画分、リンパ球画分に分け、Fluorescein/PEに展開、単球画分では、PE陽性細胞中のFluorescein陽性細胞の割合を、顆粒球画分、リンパ球画分では各画分におけるFluorescein陽性細胞の割合を解析した。
Fluorescein標識レンチナンの対照（標準試薬１）として、FITC標識デキストラン（分子量200万；シグマ）を用い、同様の解析を行った。Fluorescein標識レンチナン結合細胞の割合からFITC標識デキストラン結合細胞の割合を引いた値を、レンチナン結合陽性細胞の割合とした（図５及び図６に示した。又図７においてＦＬとして示した）。
また、採血翌日まで室温保存あるいは冷蔵保存した血液、さらに別日に採血した血液についても検討を行った。【００２７】
レンチナンによる結合阻害試験
ヒト血液にレンチナン原末溶液（標準試薬２）を100μg/mlの濃度で添加、37℃、15分培養後、Fluorescein標識レンチナンを10μg/mlの濃度で添加、37℃でさらに30分培養した。その後、ヒトCD14に対するPE標識抗体(CALTAG社製)を添加、さらに37℃で30分培養後、FACS Lysing Solution（溶血・固定液BD社製；蒸留水にて10倍希釈）を2ml/本添加し、室温で10分放置し溶血した。その後の操作、解析は結合能測定法（前項）と同様に行った（図７においてＬＮＴ＋ＦＬで示した）。Fluorescein標識レンチナンの対象（標準試薬１）として、Fluorescein標識デキストランを用い、同様の解析を行った。
実験結果
ヒト血液を用いた結合能測定法
図５、図６に２例（例１、例２）の結果を示す。単球、顆粒球、リンパ球のいずれも個人差が認められ、強弱はいずれの画分も同様であった（図５）。１日室温あるいは冷蔵保存した血液および別日に採血した血液で検討した結果を示す。冷蔵、室温いずれの保存条件においても採血当日の結果と同等であった。また、別日に採血した場合も同等の結果であった（図６）。
レンチナンによる結合阻害試験
図７に２例（例３、例４）の結果を示す。Fluorescein標識レンチナンを最終濃度10μg/mlで血液と反応させるよりも先にレンチナン原末溶液100μg/mlを共存させた場合には、Fluorescein標識レンチナンの結合が阻害された。【００２８】
まとめ
例えば、図５及び図７に示されるように、単球（ＭＣ）に対するFluorescein標識レンチナン（ＦＬ）の結合量（Ｂ）からFITC標識デキストランの結合量（Ａ１）を引いた結合量（図に示されている）が大きいので、レンチナンが例１、例２、例３及び例４のヒトの単球に結合すること、また結合量の強弱から例２及び例３のヒトに対してレンチナンが免疫賦活剤としてより有効であることが推定される。
又、図７に示されるように、単球（ＭＣ）に対するFluorescein標識レンチナン（ＦＬ）の結合量（Ｂ）から、未標識レンチナン及びFluorescein標識レンチナン[ＬＮＴ＋ＦＬ]に対する結合量（Ａ２）を引いた結合量が大きいので、レンチナンが特異的に例３及び例４のヒトの単球に結合すること、また結合量の強弱から例３のヒトに対してレンチナンが免疫賦活剤としてより有効であることが推定される。
さらに、図６に示されるように、１日室温、冷蔵保存した血液および別日に採血した場合いずれにおいても同等の結果が得られたことから、本発明キットを用いれば多糖結合能を安定して測定することが可能であり、被験者固有の多糖結合能をより正確に測定することが可能である。【００２９】
実施例３
マウスの系統差に関する検討
ヘパリン入りシリンジを用い、エーテル麻酔下にてICRマウス（日本クレア(株)より購入、４〜６週齢、雌）、BALB/cマウス（日本チャールスリバー（株）より購入、１１〜１３週齢、雌）、C57BL/6マウス（日本クレア(株)より購入、１０〜１１週齢、雄）、C3H/HeNマウス、C3H/HeJマウス（日本クレア(株)より購入、６〜８週齢、雌）より心採血を行った。各マウスについて３例ずつ行った。氷冷下、Falcon2054チューブにヘパリン処理血液を90μl/本で分注し、Fluorescein標識レンチナンは10μl/本で添加した。30分以上経過後、マウス単球の表面抗原F4/80に対するPE標識抗体（PE標識抗マウスF4/80抗体；Serotec社製）を3μl/本で添加、さらに30分以上経過後、FACS Lysing Solution（溶血・固定液BD社製；蒸留水にて10倍希釈）を3ml/本添加し、室温で10分放置し溶血した。４℃、1500rpm、5分の遠心分離後、洗浄用緩衝液 (PBS(-)+0.1%BSA+0.1%アジ化ナトリウム)1ml（洗浄・分析液）で洗浄し、洗浄用緩衝液0.5mlに懸濁、メッシュを通した後FACS Caliburによる２カラー(Fluorescein/PE)解析を行った。
データ解析は、FSC/SSCで単球画分、顆粒球画分、リンパ球画分に分け、Fluorescein/PEに展開、単球画分のPE陽性細胞中におけるFluorescein陽性細胞の割合を解析した。
Fluorescein標識レンチナンの対象（標準試薬１）として、FITC標識デキストラン（分子量200万；シグマ）を用い、同様の解析を行った。【００３０】
実験結果
マウスの系統差に関する検討
図８にF4/80陽性単球におけるFluorescein陽性細胞の割合についての平均値を示す。Fluorescein標識レンチナン20μg/mlで反応させた場合、BALB/ｃで割合が高いほかは、いずれの系統も同等であった（図８A）。Fluorescein標識レンチナン5μg/mlで反応させた場合は、割合の高い順にBALB/c≧ICR＞C57BL/6≒C3H/HeN≧C3H/HeJという結果であった（図８B）。また、FITC標識デキストラン20μg/mlを反応した場合、結合はほとんど認められなかった（図８C）。
まとめ
例えば、図８Bに示されるように、BALB/c、ICRは結合量が多く、C3Hでは結合量が低いことから、レンチナンの免疫賦活剤としての有効性もBALB/c、ICRでは強く、C3Hでは弱いことが推定される。
これに対して、S180マウス肉腫細胞を異なる系統のマウスに皮下移植し、レンチナンの抗腫瘍効果を検討した結果がある（非特許文献１及び６）。これによれば、ICR、BALB/cのS180皮下移植モデルに対するレンチナンの抗腫瘍効果は強く、C57BL/6を用いた場合の抗腫瘍効果は中程度であり、C3Hを用いた場合の抗腫瘍効果は弱く、Fluorescein標識レンチナンの結合量の強弱と同様の傾向であった。
このことから、測定したい免疫賦活多糖の特異的な結合を測定することにより、免疫賦活多糖の免疫賦活剤としての有効性を予測できるものと考えられる（Int. J. Immunotherapy 5(4)：145 (1989)）。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】単球画分でのFluorescein標識レンチナン結合試験結果、FITC標識デキストラン結合試験結果、及びFluorescein標識レンチナンに未標識レンチナンを共存させた場合の結合試験結果を示す。
【図２】顆粒球画分でのFluorescein標識レンチナン結合試験結果、FITC標識デキストラン結合試験結果、及びFluorescein標識レンチナンに未標識レンチナンを共存させた場合の結合試験結果を示す。
【図３】リンパ球画分でのFluorescein標識レンチナン結合試験結果、FITC標識デキストラン結合試験結果、及びFluorescein標識レンチナンに未標識レンチナンを共存させた場合の結合試験結果を示す。
【図４】非凍結融解血液及び凍結融解血液の単球画分でのFluorescein標識レンチナン結合試験結果を示す。
【図５】CD14陽性単球画分、顆粒球画分、リンパ球画分でのFluorescein標識レンチナン結合試験結果を示す。
【図６】冷蔵あるいは室温保存した採血翌日の血液、さらに別日に採血した血液を用いた場合の単球画分でのFluorescein標識レンチナン結合試験結果を示す。
【図７】単球画分でのFluorescein標識レンチナンに未標識レンチナンを共存させた場合の結合阻害試験結果を示す。
【図８】F4/80陽性単球画分でのFluorescein標識レンチナン結合試験結果、FITC標識デキストラン結合試験結果を示す。図中、AはFluorescein標識レンチナン  20μg/mlの場合、BはFluorescein標識レンチナン 5μg/mlの場合、CはFITC標識デキストラン 20μg/mlである。*：p<0.05、***：p<0.001 (２群間での比較：Student's T test)図中、ＦＬはFluorescein標識レンチナン、ＦＤはFITC標識デキストラン、LNTは未標識レンチナン、＋ＬはFluorescein標識レンチナンに未標識レンチナンを共存させた場合を示し、数値は濃度（単位：マイクログラム/ミリリットル）である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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