(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２に示すアミノ酸配列を有するか、あるいは配列番号２に示すアミノ酸配列に対して１個のアミノ酸の付加、欠失及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されているアミノ酸配列を有し、且つ、植物細胞の液胞のｐＨを制御する活性を有する蛋白質をコードする遺伝子。
【請求項２】
請求項１に記載の遺伝子を含むベクター。
【請求項３】
請求項２に記載のベクターにより形質転換された宿主細胞。
【請求項４】
請求項１に記載の遺伝子によりコードされた蛋白質。
【請求項５】
請求項３に記載の宿主細胞を培養し又は生育させ、そして該宿主細胞から液胞のｐＨを制御する活性を有する蛋白質を採取する工程を含む、該蛋白質の製造方法。
【請求項６】
請求項１に記載の遺伝子、又は請求項２に記載のベクターが導入され形質転換された植物若しくはその子孫又はそれらの組織。
【請求項７】
切り花である、請求項６に記載の植物若しくはその子孫又はそれらの組織。
【発明の詳細な説明】
発明の技術分野
本発明は液胞のｐＨを制御する活性を有する蛋白質をコードする遺伝子およびその利用方法に関するものである。
背景技術
花き産業においては、顕花植物の新規なあるいは多様性に富んだ新品種の開発が重要であり、なかでも、花の色は花きの最も重要な形質のひとつである。交配による従来の育種により、さまざまな色の品種が育種されてきたが、単一の植物種がすべての色の品種を有することはまれであり、さまざまな色の品種開発が望まれている。
花の色の主な成分は、アントシアニンと総称されるフラボノイドの一群の化合物である。植物には多様なアントシアニンが存在することは知られており、それらの多くの構造が既に決定されている。アントシアニンの色は、一部は、その構造に依存している。アントシアニンの生合成に関わる酵素や遺伝子に関しても研究が進んでおり、分子生物学的手法と植物への遺伝子導入により、アントシアニンの構造を変換し、花の色を変えた例もある（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，７（１９９５）Ｈｏｌｔｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｒｎｉｓｈ，ｐ．１０７１、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３９（１９９８）Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ，ｐ１１１９．）。また、アントシアニンの色は、水溶液のｐＨにも依存し、同じアントシアニンでも水溶液のｐＨが中性から弱いアルカリ性で青く見える（現代化学、（１９９８年５月）本田と斉藤、ｐ．２５）。
アントシアニンは細胞の液胞に存在するため、液胞のｐＨが花の色に大きな影響を与えることも知られている（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，７（１９９５）Ｈｏｌｔｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｒｎｉｓｈ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．３（１９９８）Ｍｏｌ  ｅｔ  ａｌ．ｐ２１２）。たとえば、アサガオ（Ｉｐｏｍｅａ  ｔｒｉｃｏｌｏｒ）においては、赤紫色のつぼみが開花したときに青くなるのは、花弁上皮細胞の液胞のｐＨが６．６から７．７に上昇するためであることが知られている（Ｎａｔｕｒｅ，３７３（１９９５），Ｙｏｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．ｐ２９１）。
植物細胞の液胞はおもに液胞プロトン輸送ＡＴＰａｓｅと液胞プロトン輸送ピロフォスファターゼによって制御されているとされる（Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｖａｃｕｏｌｅ，（１９９７）Ｌｅｉｇｈ  ｅｔ  ａｌ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）が、これらのプロトンポンプが花の色にどのように関わっているかは明確ではない。また、ナトリウムイオン−プロトンアンチポーター（以下、Ｎａ＋−Ｈ＋アンチポーターと記載）が植物の液胞に存在すること、また、Ｎａ＋−Ｈ＋アンチポーターは、液胞の外と中のプロトン濃度勾配に依存してナトリウムイオンを液胞内に輸送し、その際プロトンが液胞外に輸送され、プロトン濃度勾配が減少することが知られていた。
さらに、Ｎａ＋−Ｈ＋アンチポーターは、分子量約１７万の蛋白質であることが示唆されていた。しかしながら、液胞のｐＨの制御には多くの未知の要因があり、どのようにして液胞、特に花弁液胞のｐＨが制御されているのかは、不明確である（以上Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｖａｃｕｏｌｅ，（１９９７）Ｌｅｉｇｈ  ｅｔ  ａｌ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）。また、植物液胞のｐＨを人為的に上昇させ、産業上有用な形質が得られたこともなく、花の色との関連も不明である。
また、分子量約７万のＮａ＋−Ｈ＋アンチポーター遺伝子がアラビドプシスからクローニングされ、この遺伝子を導入した酵母は耐塩性を獲得したことは知られているが（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９６（１９９９）Ｇａｘｉｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．ｐ１４８０〜１４８５）、このアンチポーターが植物細胞の液胞のｐＨを制御しているかどうか、あるいは花の色に関わっているかどうかは知られていない。
一方、ペチュニアには花弁の液胞のｐＨ制御に関わっている遺伝子座が７種あることがわかっており、これらのうちの一つがホモの劣性になることにより花弁の液胞のｐＨが上昇するとされている（Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１３（１９９８）ｖａｎ  Ｈｏｕｗｅｌｉｎｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｐ３９，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．３（１９９８）Ｍｏｌ  ｅｔ  ａｌ．ｐ２１２）。そのうちの一つＰｈ６はすでにクローン化されていて、転写調節因子の一種であることがわかったが（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ５（１９９３）Ｃｈｕｃｋ  ｅｔ  ａｌ．ｐ３７１）、実際にどのような生化学的な機構で液胞のｐＨを制御しているかは不明である。
また、アサガオ（Ｉｐｏｍｅａ  ｎｉｌ）においては、変異体の解析から花と葉の色や形に関わる遺伝子座がいくつかあり、これらのうち１９が易変異性であることが知られている（植物細胞工学シリーズ５（１９９６）ｐ１３２，飯田ら  秀潤社、Ａｎｎａｌ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，（１９９９）Ｉｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．ｐ８７０）。これらの内で、青色ではなく紫色の花を咲かせるようになった劣性の変異により規定される１遺伝子座をＰｕｒｐｌｅ遺伝子座と呼び（Ｔ．Ｈａｇｉｗａｒａ（１９３１）Ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｆｌｏｗｅｒ  ｃｏｌｏｕｒｓ  ｉｎ  Ｐｈｒａｒｂｉｔｉｓ  ｎｉｌ．Ｊ．Ｃｏｌｌ．Ａｇｒ．Ｉｍｐ．Ｕｎｉｖ．Ｔｏｋｙｏ  ５１，２４１−２６２．；Ｙ．Ｉｍａｉ（１９３１）Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｆｌｏｗｅｒ  ｃｏｌｏｕｒ  ｉｎ  Ｐｈａｒｂｉｔｉｓ  ｎｉｌ．Ｊ．Ｇｅｎｅｔ．，２４：２０３−２２４．）、紫の花弁に青いセクターを生じる花を咲かせる易変性変異のアリールは、ｐｕｒｐｌｅ−ｍｕｔａｂｌｅ（ｐｒ−ｍ）と名付けられた（Ｊ．Ｃｏｌｌ．Ａｇｒｉｃ．Ｉｍｐ．Ｕｎｉｖ．Ｔｏｋｙｏ，１２（１９３４）Ｉｍａｉ，ｐ４７９）。なお、Ｐｕｒｐｌｅ遺伝子座に由来する遺伝子をＰｕｒｐｌｅ遺伝子と記す。
この青い部分は劣性のｐｕｒｐｌｅからの体細胞復帰突然変異により生じたと考えられ、さらに生殖細胞復帰突然変異体も分離できる。これら復帰突然変異体の復帰突然変異により生じたアリールをここではＰｕｒｐｌｅ−ｒｅｖｅｒｔａｎｔ（Ｐｒ−ｒ）と名付ける。このような古典遺伝学的解析は、このＰｕｒｐｌｅ遺伝子に関しては行われていたが、このＰｕｒｐｌｅ遺伝子の実体や花弁液胞のｐＨの調節との関連等は全く不明であった。
液胞のｐＨを改変できれば、たとえば液胞のｐＨを上昇させることにより、花の色を青くすることができるであろうと考えられる。青い色のない植物種の代表例として、バラ、キク、カーネーション、ガーベラなどがあり、これらはきわめて重要な切り花である。液胞ｐＨの改変の重要性は認識されてきたが、いままでに花弁の液胞のｐＨを制御する蛋白質の実態は不明であり、これをコードする遺伝子の単離が望まれていた。
発明の開示
本発明は、植物細胞の液胞のｐＨを制御する蛋白質の遺伝子、好ましくは液胞でプロトンを輸送する蛋白質の遺伝子、より好ましくはＮａ＋−Ｈ＋アンチポーター遺伝子を提供しようとするものである。本発明の遺伝子を植物に導入し、発現させることで、花色を調節し、好ましくは青色化することが可能である。
従って、本発明は、液胞のｐＨを制御する活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を提供する。この遺伝子は、好ましくはＮａ＋−Ｈ＋アンチポーターをコードする遺伝子であり、例えば、配列番号：２記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子、あるいは配列番号：２記載のアミノ酸配列に対して１個又は複数個のアミノ酸の付加、欠失及び／または他のアミノ酸による置換により修飾されているアミノ酸配列を有し、且つ液胞のｐＨを制御する活性を有する蛋白質をコードする遺伝子；配列番号：２記載のアミノ酸配列に対して２０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、且つ液胞のｐＨを制御する活性を有する蛋白質をコードする遺伝子；あるいは配列番号：２記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する核酸の一部または全部に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ液胞のｐＨを制御する活性を有する蛋白質をコードする遺伝子である。
本発明はまた、前記の遺伝子を含んでなるベクターを提供する。
本発明はまた、前記のベクターにより形質転換された宿主細胞を提供する。
本発明はまた、前記の遺伝子によってコードされる蛋白質を提供する。
本発明はさらに、前記の宿主細胞を培養し、又は生育させ、そして該宿主細胞から液胞のｐＨを制御する活性を有する蛋白質を採取することを特徴とする該蛋白質の製造方法を提供する。
本発明はまた、前記の遺伝子、または前記のベクターが導入された植物もしくはこれと同じ性質を有するその子孫またはそれらの組織を提供する。
本発明はまた、前記の植物又はこれと同じ性質を有するその子孫の切り花を提供する。
本発明はさらに、前記の遺伝子、または前記のベクターを植物又は植物細胞に導入し、該遺伝子を発現せしめることによる、液胞のｐＨを制御する方法を提供する。
本発明はさらに、前記の遺伝子、または前記のベクターを植物又は植物細胞に導入し、該遺伝子を発現せしめることによる、植物体の花の色を調節する方法を提供する。
発明の実施の形態
アサガオの遺伝子座Ｐｕｒｐｌｅは優性であると花弁の色は青で、ホモの劣性となると青い花弁が紫となる。この遺伝子座が花の色に関わっていることは明らかではあるが、その機構については不明である。
まず、ｐｒ−ｍ変異体とその復帰突然変異体の花弁色素を化学分析したところ、両者の色素組成に差違は認められなかった。青色花アサガオの蕾は赤紫色で開花に伴って青色に変化するのは、前述のように、花弁細胞液胞のｐＨ変化によると考えられる。
ｐｒ−ｍ変異体では、開花に伴って青色に変化せず、さらに開花した花弁細胞の液胞のｐＨは、ｐｒ−ｍ変異体のほうがＰｒ−ｒに比べて低かった。それゆえ、Ｐｕｒｐｌｅ遺伝子は開花時の花弁細胞液胞内のｐＨを制御し、花色を調節する遺伝子と考えられる。そこで、ｐｒ−ｍ変異体とその復帰突然変異体を用いて、トランスポゾン・ディスプレー法により、まずｐｒ−ｍに特異的に存在するＰｕｒｐｌｅ遺伝子配列を含むゲノムＤＮＡの断片を同定し、ついでＰｕｒｐｌｅ遺伝子を同定した。今回得られたＰｕｒｐｌｅ遺伝子は驚くべきことにアラビドプシスなどのＮａ＋−Ｈ＋アンチポーターと相同性を持ち、ｐｒ−ｍ変異はＰｕｒｐｌｅ遺伝子の５’非翻訳領域中にトランスポゾンが挿入されていた。
本発明の遺伝子としては、例えば配列番号：２に記載するアミノ酸配列をコードするものが挙げられる。しかしながら、複数個のアミノ酸の付加、欠失および／または他のアミノ酸との置換によって修飾されたアミノ酸配列を有する蛋白質も、もとの蛋白質と同様の活性を維持することが知られている。従って本発明は、液胞のｐＨを制御する活性を有している蛋白質である限り、配列番号：２に記載のアミノ酸配列に対して１個または複数個のアミノ酸配列の付加、欠失および／または他のアミノ酸との置換によって修飾されたアミノ酸配列を有する蛋白質および当該蛋白質をコードする遺伝子も本発明に属する。
本発明はまた、配列番号：１に記載の塩基配列または配列番号：２に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列、またはそれらの塩基配列の一部分をコードする塩基配列に対して、ストリンジェントな条件下、例えば５ｘＳＳＣ、５０℃の条件下でハイブリダイズし、且つ液胞のｐＨを制御する活性を有する蛋白質をコードする遺伝子に関するものである。なお、適切なハイブリダイゼーション温度は塩基配列やその塩基配列の長さによって異なり、例えばアミノ酸６個をコードする１８塩基からなるＤＮＡフラグメントをプローブとした場合には５０℃以下の温度が好ましい。
このようなハイブリダイゼーションによって選択される遺伝子としては、天然由来のもの、例えば植物由来のもの、例えば、ペチュニアやトレニア由来の遺伝子が挙げられるが、植物以外の由来であってもよい。また、ハイブリダイゼーションによって選択される遺伝子はｃＤＮＡであってもよく、ゲノムＤＮＡであってもよい。
また、Ｎａ＋−Ｈ＋アンチポーター遺伝子はスーパーファミリーを形成しており（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４２４（１９９８）Ｄｅｂｒｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，ｐｌ）、アミノ酸配列で２０％以上の相同性を有する（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１９９７）Ｏｒｌｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，ｐ２２３７３）。
そこで本発明はさらに配列番号：２に記載のアミノ酸配列に対して約２０％以上、好ましくは５０％以上、例えば６０％または７０％以上、の相同性を有するアミノ酸配列を有し、且つ液胞のｐＨを制御する活性を有する蛋白質をコードする遺伝子に関するものである。
生来の塩基配列を有する遺伝子は実施例に具体的に示すように、例えばｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングによって得られる。また、修飾されたアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡは生来の塩基配列を有するＤＮＡを基礎として、常用の部位特定変異誘発やＰＣＲ法を用いて合成することができる。例えば修飾を導入したいＤＮＡ断片を生来のｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡの制限酵素処理によって得、これを鋳型にして、所望の変異を導入したプライマーを用いて部位特異的変異誘発またはＰＣＲ法を実施し、所望の修飾を導入したＤＮＡ断片を得る。その後、この変異を導入したＤＮＡ断片を目的とする酵素の他の部分をコードするＤＮＡ断片と連結すればよい。
あるいはまた、短縮されたアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡを得るには、例えば目的とするアミノ酸配列より長いアミノ酸配列、例えば全長アミノ酸配列をコードするＤＮＡを所望の制限酵素により切断し、その結果得られたＤＮＡ断片が目的とするアミノ酸配列の全体をコードしていない場合は、不足部分の配列からなるＤＮＡ断片を合成し、連結すればよい。
本発明はアサガオ由来の液胞のｐＨを制御する活性を有する蛋白質をコードする遺伝子のみに限定されるものではなく、起源としては、植物でも動物でも微生物であってもよく、液胞においてプロトンを汲み出すトポロジーを持っていればよい。
また、得られた遺伝子を大腸菌または酵母での遺伝子発現系を用いて発現させ、活性を測定することにより、得られた遺伝子が液胞のｐＨを制御する活性を有する蛋白質をコードすることを確認することができる。さらに、当該遺伝子を発現させることにより、遺伝子産物である液胞のｐＨを制御する活性を有する蛋白質を得ることができる。あるいはまた、配列番号：２に記載のアミノ酸配列に対する抗体を用いても、液胞のｐＨを制御する活性を有する蛋白質を得ることができ、抗体を用いて他の生物の液胞のｐＨを制御する活性を有する蛋白質をクローン化することもできる。
従って本発明はまた、前述の遺伝子を含む組換えベクター、特に発現ベクター、及び当該ベクターによって形質転換された宿主細胞に関するものである。宿主としては、原核生物または真核生物を用いることができる。原核生物としては細菌、例えばエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属する細菌、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属微生物、例えばバシルス．スブシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）など常用の宿主を用いることができる。真核性宿主としては、下等真核生物、例えば真核性微生物、例えば真菌である酵母または糸状菌が使用できる。
酵母としては例えばサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属微生物、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等が挙げられ、また糸状菌としてはアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属微生物、例えばアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス．ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属微生物が挙げられる。さらに動物細胞または植物細胞が使用でき、動物細胞としては、マウス、ハムスター、サル、ヒト等の細胞系が使用される。さらに昆虫細胞、例えばカイコ細胞、またはカイコの成虫それ自体も宿主として使用される。
本発明の発現ベクターはそれらを導入すべき宿主の種類に依存して発現制御領域、例えばプロモーターおよびターミネーター、複製起点等を含有する。細菌用発現ベクターのプロモーターとしては、常用のプロモーター、例えばｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター等が使用され、酵母用プロモーターとしては、例えばグリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、ＰＨ０５プロモーター等が使用され、糸状菌用プロモーターとしては例えばアミラーゼプロモーター、ｔｒｐＣプロモーター等が使用される。
また動物細胞宿主用プロモーターとしてはウイルス性プロモーター、例えばＳＶ４０アーリープロモーター、ＳＶ４０レートプロモーター等が使用される。発現ベクターの作製は制限酵素、リガーゼ等を用いて常用に従って行うことができる。また、発現ベクターによる宿主細胞の形質転換も常法に従って行うことができる。
前記の発現ベクターによって形質転換された宿主細胞を培養、栽培または飼育し、培養物等から常法に従って、例えば、濾過、遠心分離、細胞の破砕、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等により目的とするタンパク質を回収、精製することができる。
さらに本発明は、液胞のｐＨを制御する活性を有する蛋白質をコードする遺伝子、具体的には、Ｎａ＋−Ｈ＋アンチポーター遺伝子を導入することにより、色合いが調節された植物もしくはその子孫又はこれらの組織に関するものであり、その形態は切り花であってもよい。本発明で得た液胞のｐＨを制御する活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を用いると、液胞においてプロトンの細胞質への汲み出しとナトリウムイオンの汲み入れを行うことができ、液胞内に蓄積しているアントシアニンを青くでき、結果として花の色を青くすることができる。
また、本発明の遺伝子の発現を抑制することにより、液胞のｐＨを下げることも可能である。現在の技術水準をもってすれば、植物に遺伝子を導入し、その遺伝子を構成的あるいは組織特異的に発現させることは可能であるし、またアンチセンス法やコサプレッション法によって目的の遺伝子の発現を抑制することも可能である。
形質転換可能な植物の例としては、バラ、キク、カーネーション、金魚草、シクラメン、ラン、トルコギキョウ、フリージア、ガーベラ、グラジオラス、カスミソウ、カランコエ、ユリ、ペラルゴニウム、ゼラニウム、ペチュニア、トレニア、チューリップ、イネ、オオムギ、小麦、ナタネ、ポテト、トマト、ポプラ、バナナ、ユーカリ、サツマイモ、ダイズ、アルファルファ、ルーピン、トウモロコシなどがあげられるがこれらに限定されるものではない。
実施例
以下実施例に従って、発明の詳細を述べる。分子生物学的手法はとくに断らない限り、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）に依った。
実施例１．生殖細胞復帰突然変異体の取得
生殖細胞復帰突然変異体の取得に関しては、すでに報告がある（植物細胞工学シリーズ  ５（１９９６）ｐ１３２，飯田ら  秀潤社、Ａｎｎａｌ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，（１９９９）Ｉｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．ｐ８７０、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，６（１９９４）Ｉｎａｇａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．ｐ３７５、Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．９２（１９９６）Ｉｎａｇａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．ｐ４９９）。
遺伝子型（Ｐｒ−ｒ／ｐｒ−ｍ）を有するアサガオ（Ｉｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．ｐ８７０、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，６（１９９４）Ｉｎａｇａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．ｐ３７５、Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．９２（１９９６）Ｉｎａｇａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．ｐ４９９）を自家受粉し、後代の種子を蒔き、それら自殖後代の花を観察して、復帰突然変異により青花を咲かせる個体を選抜し、さらにこの生殖細胞復帰突然変異体の自殖後代で、紫花を咲かせる分離体が得られるか否かでホモかヘテロかを検証し、遺伝子型（Ｐｒ−ｒ／Ｐｒ−ｒ）および（ｐｒ−ｍ／ｐｒ−ｍ）を有するものを選択した。
実施例２．復帰変異体花弁のアントシアニン
アサガオに含まれるアントシアニンはおもにヘブンリブルーアントシアニンであり、その他にいくつかのアントシアニンが含まれる（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３１（１９９２）Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｐ６５９）。実施例１で得られたＰｒ−ｒ／Ｐｒ−ｒ株とｐｒ−ｍ／ｐｒ−ｍ株の開いた花弁を同様に解析したところ、両者に含まれるアントシアニンはほぼ同一であった。
セロハンテープを表側の花弁に貼り、剥がすことにより一層の上皮細胞だけを回収し、ここから細胞液をメスなどで掻き取り遠心して搾汁を得た。搾汁をホリバＢ２１２ｐＨメーター（株式会社堀場製作所）にてｐＨを測定した。Ｐｒ−ｒ／Ｐｒ−ｒ株の花弁上皮細胞のｐＨは約７．１であったのに対し、ｐｒ−ｍ／ｐｒ−ｍ株の花弁上皮細胞のｐＨは約６．５であった。この結果は、ｐｕｒｐｌｅの変異による花色の変化は、アントシアニンの構造によるものではなく液胞のｐＨの変化によるものであることを示す。
実施例３．ｐｒ−ｍに特異的に存在するゲノム断片の単離
遺伝子の単離にはトランスポゾンディスプレー法（たとえばＰｌａｎｔ  Ｊ．１３（１９９８）Ｆｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．ｐ７１７，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１３（１９９８）Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｒｏｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．ｐ１２１）あるいは類似の方法（植物細胞工学シリーズ７（１９９７）、土生ら、ｐ１４４，秀潤社）を用い、ｐｒ−ｍ／ｐｒ−ｍ株とＰｒ−ｗ／ｐｒ−ｍ株には存在し、Ｐｒ−ｒ／Ｐｒ−ｒ株と野性株には存在しないＤＮＡのバンドを探した。アサガオにおいてはＴｐｎ１関連のトランスポゾンが主に易変異性に関与していると考えられるので、ここでもＴｐｎ１関連のトランスポゾンに着目した。
具体的には、ｐｒ−ｍ／ｐｒ−ｍ株から染色体ＤＮＡを抽出し、１２５ｎｇを２０μｌ中でＭｓｅｌで消化した。消化したＤＮＡに８０ｐｍｏｌｅのＭｓｅｌアダプター（５’−ＧＡＣＧＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＧ−３’（配列番号：３）と５’−ＴＡＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＡＴ−３’（配列番号：４）をアニールしたもの）を２５μｌ中で２０℃で２時間付加した。７５℃で１０分間保持した後、−２０℃で保管した。これを１０倍希釈した後、２μｌを鋳型とし、これを４．８ｐｍｏｌｅのＴＩＲプライマー（５’−ＴＧＴＧＣＡＴＴＴＴＴＣＴＴＧＴＡＧＴＧ−３’（配列番号：５）、トランスポゾンＴｐｎ１の末端逆位繰り返し配列を含む）と４．８ｐｍｏｌｅのＭｓｅｌプライマー（５’−ＧＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＧＴＡＡ−３’）（配列番号：６）を用いて２０μｌ中でＰＣＲにより増幅した。
ＰＣＲは、Ｔａｑポリメラーゼ（宝酒造株式会社）９４℃０．５分、５６℃１分、７２℃１分を１サイクルとし、２０サイクル反応し、１０倍に希釈した。このうち２μｌを鋳型として、４．８ｐｍｏｌｅのＴＩＲ＋Ｎプライマー（５’−ＴＧＴＧＣＡＴＴＴＴＴＣＴＴＧＴＡＧＮ−３’（配列番号：７）Ｎ＝Ａ，Ｃ，ＧまたはＴ．混合ではなく４種合成する。）と４．８ｐｍｏｌｅのＭｓｅｌ＋Ｎプライマー（５’−ＧＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＧＴＡＡＮ−３’，（配列番号：８）Ｎ＝Ａ，Ｃ，ＧまたはＴ．混合ではなく４種合成する。５’端をフルオロセインで標識（アマシャムファルマシアバイオテク株式会社Ｖｉｓｔｒａ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ５’−オリゴラベリングキットを使用））を用いて２０μｌ中でＰＣＲを行った。
反応はそれぞれのプライマーの組み合わせで行うため１６反応をおこなう。ＰＣＲは、９４℃０．５分、６５℃１分（１サイクルごとに０．７℃づつ下げる）、７２℃１分を１サイクルとし、１３サイクル反応し、さらに９４℃０．５分、５６℃１分、７２℃１分を１サイクルとし、１３サイクル反応した。同様の操作をＰｒ−ｒ／Ｐｒ−ｒ株から得た染色体ＤＮＡについても行い、ＤＮＡシークエンサー３７７（ピーイーバイオシステムズジャパン株式会社）のシークエンスゲルにて電気泳動を行い、ＦＭＢＩＯＩＩ（宝酒造株式会社）を用いてバンドを検出した。
Ｐｒ−ｒ／Ｐｒ−ｒ株とｐｒ−ｍ／ｐｒ−ｍ株由来のバンドを比較したところ、約１３０ｂｐのＤＮＡ断片がｐｒ−ｍを有する株に特異的に発現していた。この１３０ｂｐのＤＮＡ断片を回収し、２０ｐｍｏｌｅ  ＴＩＲプライマーと２０ｐｍｏｌｅ  Ｍｓｅｌプライマーを用いてＰＣＲ（９４℃０．５分、５６℃１分、７２℃１分を１サイクルとし、３０サイクル反応）により増幅し、ｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）にサブクローニングし、塩基配列を決定した。その
配列は、
0004596721.tif 000002
であった（１本下線部は使用したプライマー、２本下線はエクソン、その他はイントロンに対応）。配列番号：９に記載の配列をプローブとしてノザン解析を行ったところ、Ｐｒ−ｒを有するアサガオの蕾には約２．３ｋｂの転写産物が存在したが、ｐｒ−ｍ／ｐｒ−ｍ株には対応する転写産物は存在しなかった。従って、この２．３ｋｂの転写産物がＰｕｒｐｌｅ遺伝子に対応することがわかった。
実施例４．ｃＤＮＡの単離
野生株アサガオ（Ｐｒ−ｗ／Ｐｒ−ｗ）由来のｃＤＮＡライブラリー（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，６（１９９４）Ｉｎａｇａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．ｐ３７５）の約６００万個クローンを１３０ｂｐＤＮＡ断片をプローブとしてスクリーニングし、２クローンの陽性クローンを得た。そのうち１クローンは、２２３７ｂｐのｃＤＮＡを持ち、その中には１６２６ｂｐからなるオープンリーディングフレームが見られた（配列番号：１）。予測されるアミノ酸配列は、酵母とアラビドプシスのＮａ＋−Ｈ＋アンチポーター（それぞれＮｈｘ１，ＡｔＮｈｘ１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９６（１９９９）Ｇａｘｉｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．ｐ１４８０〜１４８５）に対して２９．３％、７３．４％の同一性を示した。
この結果からアサガオのＰｕｒｐｌｅ遣伝子はＮａ＋−Ｈ＋アンチポーターをコードしていることが判明した。なお、アラビドプシスから得られたＮａ＋−Ｈ＋アンチポーターは、酵母において耐塩性を与えるタンパク質として注目されているが、Ｎａ＋−Ｈ＋アンチポーターと花の色との関連が見出されたのは今回が初めてである。
実施例５．酵母Ｎａ＋−Ｈ＋アンチポーター変異体の相補実験
アサガオのＰｕｒｐｌｅ遺伝子がコードする推定アミノ酸配列は、酵母やアラビドプシスのＮａ＋−Ｈ＋アンチポーターのそれらに相同性がある。そこで実際に、アサガオＰｕｒｐｌｅ遺伝子産物が、Ｎａ＋−Ｈ＋アンチポーター蛋白として機能できるか酵母Ｎａ＋−Ｈ＋アンチポーター変異体を用いた相補実験で確認した。
まず最初に、以下の２種類のＤＮＡ断片を合成した。
0004596721.tif 000003
この２つのＤＮＡ断片からは、ＣＩａＩ−ＢｇＩＩＩ−ＳａＩＩ−ＣＩａＩという制限酵素部位をもつリンカーができる。ｐＹＥＳ２ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）のＣＩａＩ部位にＢｇＩＩＩサイトがＵＲＡ３遺伝子側に位置するよう定法にしたがって上記のリンカーを挿入し、プラスミドｐＩＮＡ１４５を作成した（図３）。プラスミドｐＪＪ２５０（Ｊｏｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｋａｓｈ，１９９０，Ｙｅａｓｔ，６，３６３−３６６）をＢａｍＨＩとＳａＩＩで消化して得られる２ｋｂのＤＮＡ断片をＢｇＩＩＩとＳａＩＩで消化したプラスミドｐＩＮＡ１４５とライゲーションし、プラスミドｐＩＮＡ１４７を作成した（図４）。プラスミドｐＩＮＡ１４７のＧＡＬ  １プロモーターの制御下にＰｕｒｐｌｅ  ｃＤＮＡを連結してプラスミドｐＩＮＡ１５１を作成した。ｐＩＮＡ１４７およびｐＩＮＡ１５１をＮａ＋−Ｈ＋アンチポーターの変異株である酵母Ｒ１０１株にそれぞれ形質転換した。酵母Ｒ１０１株はＮａ＋−Ｈ＋アンチポーター遺伝子の変異により４００ｍＭ  ＮａＣｌ添加ＡＰＧ培地（Ｎａｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，２６１４５；Ｇａｘｉｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，９６．１４８０−１４８５）では生育できない。ｐＩＮＡ１４７を形質転換したＲ１０１株も同様に生育できなかったが、ｐＩＮＡ１５１を形質転換したＲ１０１株のみ４００ｍＭ  ＮａＣｌ添加ＡＰＧ培地でも生育が可能であった。この結果から、アサガオＰｕｒｐｌｅ遺伝子産物はＮａ＋−Ｈ＋アンチポーター機能を有していることが明らかになった。
実施例６．植物での発現ベクターの構築
アサガオＰｕｒｐｌｅ  ｃＤＮＡ１０ｎｇを鋳型として、合成プライマーＰＲ−５（５’−ＧＧＧＡＴＣＣＡＡＣＡＡＡＡＡＴＧＧＣＴＧＴＣＧＧＧ−３’）（配列番号：１０）とＰＲ−３（５’−ＧＧＧＴＣＧＡＣＴＡＡＧＣＡＴＣＡＡＡＡＣＡＴＡＧＡＧＣＣ−３’）（配列番号：１１）を用いてＰＣＲを行った。ポリメラーゼは、Ｔａｑポリメラーゼ（東洋紡績株式会社）を使用し、９５℃４５秒反応後、９５℃４５秒、５０℃４５秒、７２℃４５秒を１サイクルとし、２５サイクル反応し、さらに７２度で１０分反応した。得られた約１．６ｋｂのＤＮＡ断片をｐＣＲ２．１−Ｔｏｐｏ（クロンテック株式会社）にライゲーションし、ｐＣＲ−ｐｕｒｐｌｅとした。このプラスミド上のＰｕｒｐｌｅ  ｃＤＮＡの塩基配列にＰＣＲによるエラーがないことを確認した。
ｐＢＥ２１１３−ＧＵＳ（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７（１９９６）Ｍｉｔｓｕｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．ｐ４９）をＳａｃＩで消化し、平滑末端化した後、ＸｈｏＩリンカー（東洋紡績株式会社）を挿入し、得られたプラスミドをｐＢＥ２１１３−ＧＵＳｘとした。これをＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化して得られる約２．７ｋｂのＤＮＡ断片をｐＢｉｎＰＬＵＳのＨｉｄＩＩＩとＥｃｏＲＩ消化物と連結し、得られたプラスミドをｐＢＥＸＰとした。
一方、ｐＣＧＰ４８４（特表平８−５１１６８３号公報）をＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩで消化して得られる約１．２ｋｂのＤＮＡ断片と、ｐＣＲ−ｐｕｒｐｌｅをＸｂａＩとＳａＩＩで消化して得られる約１．６ｋｂのＤＮＡ断片と、ｐＢＥＸＰをＨｉｎｄＩＩＩとＸｈｏＩで消化して得られる約１３ｋｂのＤＮＡ断片をライゲーションし、ｐＳＰＢ６０７を得た（図１）。このプラスミドは、アグロバクテリウムによる植物の形質転換用のバイナリーベクターで、このプラスミド上で、Ｐｕｒｐｌｅ  ｃＤＮＡは、キンギョソウ由来カルコンシンターゼプロモーターと、アグロバクテリウム由来のノパリンシンターゼターミネーターの制御下にある。
また、ｐＣＧＰ６６９（特表平８−５１１６８３号公報）をＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩで消化して得られる約０．８ｋｂのＤＮＡ断片と、ｐＣＲ−ｐｕｒｐｌｅをＢａｍＨＩとＳａＩＩで消化して得られる約１．６ｋｂのＤＮＡ断片と、ｐＢＥＸＰをＨｉｎｄＩＩＩとＸｈｏＩで消化して得られる約１３ｋｂのＤＮＡ断片をライゲーションし、ｐＳＰＢ６０８を得た（図２）。このプラスミドは、アグロバクテリウムによる植物の形質転換用のバイナリーベクターで、このプラスミド上で、Ｐｕｒｐｌｅ  ｃＤＮＡは、ペチュニア由来カルコンシンターゼＡプロモーターと、アグロバクテリウム由来のノパリンシンターゼターミネーターの制御下にある。
このようにして得られた発現ベクターを用いて植物の形質転換を行うことにより、液胞のｐＨを制御し、花色を調節することができる。
実施例７．Ｐｕｒｐｌｅ遺伝子のホモログの単離
ペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ  ｈｙｂｒｉｄａ品種Ｏｌｄ  Ｇｌｏｒｙ  Ｂｌｕｅ）、ニーレンベルギア（Ｎｉｅｒｅｍｂｅｒｇｉａ  ｈｙｂｒｉｄａ品種ＮＢ１７）、トレニア（Ｔｏｒｅｎｉａ  ｈｙｂｒｉｄａ品種サマーウェーブ・ブルー）の花弁由来ｃＤＮＡ  ｌｉｂｒａｒｙをｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＵＳＡ）を用いてそれぞれ作成した。作成方法は、製造者の推奨する方法に従った。それぞれ約２０万個のクローンを定法に従って、スクリーニングした。なお、メンブレンの洗浄には、５ｘＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ水溶液を用い、５０℃で１０分間、３回行った。得られた陽性クローンのうち、それぞれの最長クローンの塩基配列を決定した。ペチュニアのクローンの塩基配列及び対応するアミノ酸配列を配列番号：１４及び１５に、ニーレンベルギアのクローンの塩基配列及び対応するアミノ酸配列を配列番号：１６及び１７に、そしてトレニアのクローンの塩基配列及び対応するアミノ酸配列を配列番号：１８及び１９に示す。ペチュニア、ニーレンベルギア及びトレニアのＰｕｒｐｌｅ遺伝子のホモログは、アサガオのＰｕｒｐｌｅ遺伝子に対してアミノ酸レベルでそれぞれ７５％、７６％及び７１％の同一性を示した。
アサガオＰｕｒｐｌｅ遺伝子がコードするＮａ＋−Ｈ＋アンチポーターとアラビドプシスのＡｔＮｈｘ  １がコードするＮａ＋−Ｈ＋アンチポーターのアミノ酸配列の同一性が約７３％であることから、ここで得たペチュニア、ニーレンベルギア、トレニアのＰｕｒｐｌｅ遺伝子のホモログは、Ｎａ＋−Ｈ＋アンチポーターをコードしていると判断される。
実施例８．アサガオＰｕｒｐｌｅ  染色体クローンの単離
変異型アサガオ（ｐｒ−ｍ／ｐｒ−ｍ）と復帰型アサガオ（Ｐｒ−ｒ／Ｐｒ−ｒ）の染色体ＤＮＡをＢｇＩＩＩで切断後、０．８％アガロースゲルで電気泳動し、アサガオＰｕｒｐｌｅのｃＤＮＡをプローブにそれぞれゲノミックサザン解析を行った。その結果、変異型アサガオでは無く、復帰型アサガオには存在する約７．５ｋｂのバンドを検出した。
野性型アサガオ（Ｐｒ−ｗ／Ｐｒ−ｗ、ＫＫＺＳＫ２系統）の染色体ＤＮＡ５０μｇをＢｇＩＩＩで切断後、０．８％アガロースゲルで電気泳動し、約７〜９ｋｂの部分を切り出してＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩＩ  ＫＩＴ（ＢＩＯＩ０１）を用いてＤＮＡを抽出した。このＤＮＡをλＺａｐ  ｅｘｐｒｅｓｓ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＵＳＡ）にライゲーションし、アサガオＰｕｒｐｌｅのｃＤＮＡをプローブとしてスクリーニングした。得られたポジティブクローンの塩基配列を決定したところ、この約７．５ｋｂのＤＮＡ断片にＰｕｒｐｌｅのプロモーター上流約６．３ｋｂとエキソン３の途中までの領域が存在した。この配列のうちＰｕｒｐｌｅ遺伝子の開始コドンまでの配列を配列番号：２０に示す。
Ｐｕｒｐｌｅ遺伝子は、アサガオの開花約２４時間前にのみ強く発現が誘導されること、また、５’−非翻訳領域へのトランスポゾンの挿入により、Ｐｕｒｐｌｅ遺伝子の発現が抑制されることが判明している。このことから、得られたＰｕｒｐｌｅ遺伝子のプロモーター領域には、アサガオ花弁で時期特異的、器官特異的にＰｕｒｐｌｅ遺伝子を発現させるために必要な因子を含んでいる。このプロモーター領域の下流に目的遺伝子を配置すれば、時期特異的、器官特異的に目的遺伝子の発現が制御できる。
産業上の利用可能性
本発明により得られた遺伝子が液胞のｐＨおよび花の色の調節に関わっていることがはじめて明らかとなった。また、本発明の遺伝子を花弁で発現することにより、液胞のｐＨを上昇させ、花の色を青く変化させることができる。また、本発明の遺伝子の発現を抑制することにより、液胞のｐＨを低下させ、花の色を赤く変化させることができる。液胞のｐＨを制御する蛋白質をコードする遺伝子としては、本発明において得られたアサガオ由来のものだけでなく、他の生物の同様な遺伝子も用いることができる。
【配列表】
0004596721.tif 000004
0004596721.tif 000005
0004596721.tif 000006
0004596721.tif 000007
0004596721.tif 000008
0004596721.tif 000009
0004596721.tif 000010
0004596721.tif 000011
0004596721.tif 000012
0004596721.tif 000013
0004596721.tif 000014
0004596721.tif 000015
0004596721.tif 000016
0004596721.tif 000017
0004596721.tif 000018
0004596721.tif 000019
0004596721.tif 000020
0004596721.tif 000021
0004596721.tif 000022
0004596721.tif 000023
0004596721.tif 000024
0004596721.tif 000025
0004596721.tif 000026
0004596721.tif 000027
0004596721.tif 000028
0004596721.tif 000029
0004596721.tif 000030
0004596721.tif 000031
0004596721.tif 000032
0004596721.tif 000033
0004596721.tif 000034
0004596721.tif 000035
0004596721.tif 000036
0004596721.tif 000037
0004596721.tif 000038
0004596721.tif 000039
0004596721.tif 000040
0004596721.tif 000041
0004596721.tif 000042
【図面の簡単な説明】
図１は、プラスミドｐＳＰＢ６０７の構造を示す図である。
図２は、プラスミドｐＳＰＢ６０８の構造を示す図である。
図３は、プラスミドｐＩＮＡ１４５の構造を示す図である。
図４は、プラスミドｐＩＮＡ１４７の構造を示す図である。
【図１】
0004596721.tif 000043
【図２】
0004596721.tif 000044
【図３】
0004596721.tif 000045
【図４】
0004596721.tif 000046