(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
二〜五量体のプロアントシアニジンオリゴマーを含有する原料又はその粗精製物から、酢酸メチルを液相として用いた固液抽出法により該プロアントシアニジンオリゴマーを抽出することを特徴とする二〜五量体のプロアントシアニジンオリゴマーの精製方法。
【請求項２】
二〜五量体のプロアントシアニジンオリゴマーを含有する原料又はその粗精製物が植物由来である請求項１記載の精製方法。
【請求項３】
液相に酢酸メチルと混合可能な有機溶媒を加える請求項１記載の精製方法。
【請求項４】
酢酸メチルと混合可能な有機溶媒が、アルコール系溶媒、エステル系溶媒、ケトン系溶媒、ニトリル系溶媒、エーテル系溶媒、炭化水素系溶媒及びカルボン酸系溶媒からなる群から選ばれる溶媒である請求項３記載の精製方法。
【請求項５】
酢酸メチルと混合可能な有機溶媒が、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ギ酸メチル、ギ酸エチル、酢酸エチル、アセトン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ヘキサン及び酢酸からなる群から選ばれる溶媒である請求項３記載の精製方法。
【請求項６】
(i)請求項１記載の精製方法と、(ii)二〜五量体のプロアントシアニジンオリゴマーを含有する原料もしくはその粗精製物、又はそれらを含有する溶液を、予め加水分解酵素で処理することを含む二〜五量体のプロアントシアニジンオリゴマーの精製方法とを組み合わせる二〜五量体のプロアントシアニジンオリゴマーの精製方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、抗腫瘍、抗炎症、抗老化、抗酸化、抗アレルギー、抗菌、育毛等の多様な生理活性を有し、食品や化粧品あるいは医薬品等の用途に有用なプロアントシアニジンオリゴマーを高純度でしかも効率よく精製する方法に関する。
背景技術
高等植物の生体防御物質として知られるプロアントシアニジンは、一般に、フラバン−７−オールを構成ユニットとして４β→６、４β→８、４β→８・２βＯ→７等の結合様式によって重合した二量体以上の重合体の総称であり、縮合型タンニンとも呼称される（「スタインエッガー・ヘンゼル  生薬学［上］  化学・薬理学へのアプローチ」（糸川秀治他訳、（株）廣川書店発行）２０４〜２０８頁（１９７７年）；Ｐｏｒｔｅｒ  Ｌ．Ｊ．，Ｆｌａｖａｎｓ  ａｎｄ  ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎｓ，Ｉｎ：Ｈａｒｂｏｒｎｅ  Ｊ．Ｂ．（ｅｄ．），“Ｔｈｅ  Ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８６”，Ｃｈａｐｍａｎ  ＆  Ｈａｌｌ，１９９４，ｐｐ．２３−５５）。これらは、酸処理によりアントシアニジンを生成して紅色になることからプロアントシアニジンと総称されている。プロアントシアニジンは多様な生理活性を示すことが知られており、該活性としては、抗腫瘍、抗炎症、抗老化、抗酸化、抗アレルギー、抗菌、育毛等の活性が報告されている［バート・シュビッタース／ジャック・マスケリエ著、「２１世紀の生体防御物質ＯＰＣ」（佐々木瞭訳、フレグレンスジャーナル社発行、１９９７年）５０−１３５頁；Ｔｏｍｏｙａ  Ｔａｋａｈａｓｈｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，１１２，３１０−３１６，１９９９］。これらの生理活性とプロアントシアニジンの重合度数との構造活性相関に関しては、全て明確にされているわけではないが、例えば、育毛活性については、プロアントシアニジンのうち二〜五量体（特に二量体と三量体）のプロアントシアニジンオリゴマーが最も高い活性を有することが報告されている（ＷＯ９６／００５６１）。
植物からのプロアントシアニジンの分離精製に関しては、従来より、ブドウ種子、松樹皮、イチョウ葉、ピーナッツ、カカオ豆等の各種植物体からの分離が試みられている。このうち、原料からの工業的抽出例としては、ブドウ種子（特開平３−２００７８１、ＷＯ９７／３９６３２、ＵＳ５４８４５９４）あるいは松樹皮（ＵＳ４６９８３６０、ＷＯ９７／４４４０７）からの抽出等が挙げられる。特開平３−２００７８１記載の方法では、白ブドウ種子と７０℃未満の水とを接触させて前処理を行った後、熱水抽出に付し、得られた抽出液をセファデックスＬＨ−２０カラムに通塔した後、７０％エタノールで溶出し、純度約９０％のプロアントシアニジン含有粉末を得ている。ＵＳ４６９８３６０記載の方法では、海岸松樹皮１ｔを加圧状態で温水抽出に付し、酢酸エチルによる溶出及びクロロホルム添加による沈殿を繰り返し、プロアントシアニジン含有粉末を得ている。しかしながら、前記の各方法で精製された精製物の中に、二〜五量体のプロアントシアニジンオリゴマーのみを９０％以上含有するものはなく、いずれの精製物も、モノマーや、六量体以上のポリマー、あるいは他の有機酸を含有するものである。
向流液液分配法を用いたプロアントシアニジンの精製方法としては、例えば、水と酢酸エチルを用いる方法が、Ａｎｄｒｅｗ  Ｇ．Ｈ．Ｌｅａ著，Ｊ．Ｓｃｉ．Ｆｄ．Ａｇｒｉｃ．，２９，４７１−４７７（１９７８）、特開昭６１−１６９８２等に記載されている。
また、固液抽出法を用いたプロアントシアニジンの精製方法として、酢酸エチルを用いる方法が、特開平８−１７６１３７及びＥＰ  ０７０７００５に記載されている。例えば、破砕したブドウの実１００ｋｇを水（１６５０Ｌ）、塩化ナトリウム（３００ｋｇ）、アセトン（５５０  Ｌ）の混合溶液で抽出し、蒸留によってアセトンを除去して得た残留物を、酢酸エチルを用いた固液抽出に付し、次いでジクロロエタン（４５Ｌ）を添加することにより、プロアントシアニジンの沈殿物１．５ｋｇ〜２．５ｋｇが得られる（ＥＰ０７０７００５）。
更に、クロマトグラフィーを用いたプロアントシアニジンの精製方法としては、前述のセファデックスＬＨ−２０カラムを用いた方法（ブドウ種子からの抽出法、特開平３−２００７８１）や、ポリスチレン系吸着樹脂を用いた方法（小豆からの抽出法、特公平７−６２０１４）等が知られている。例えば、乾物小豆より得た浸漬水にポリスチレン系吸着樹脂「セパビーズＳＰ−８５０」（三菱化成株式会社）を添加し攪拌してプロアントシアニジンを吸着させた後、７０℃以下で樹脂を乾燥させ、７０℃の８０％（ｖ／ｖ）エタノールで溶出することにより、純度約６０％の粗プロアントシアニジン含有粉末が得られる。
しかしながら、これらの方法は、いずれも重合度数に無関係なプロアントシアニジン混合物の精製方法であり、二〜五量体のプロアントシアニジンオリゴマーを選択的に効率よく得るための手法ではなく、二〜五量体のプロアントシアニジンオリゴマーの回収率が低い。
プロアントシアニジンの重合度数別分離に関しては、順相シリカゲル液体クロマトグラフィーを用いた方法［カカオ豆からの抽出法：Ｊ．Ｒｉｇａｕｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ，６５４，２５５−２６０（１９９３）、ブドウ種子からの抽出法：Ｃｏｒｉｎｅ  Ｐｒｉｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６，７８１−７８４（１９９４）］が知られている。前者の場合、カカオ豆をメタノール抽出して得られたプロアントシアニジン含有試料液をシリカゲル充填カラムに負荷し、移動相にジクロロメタン：メタノール：ギ酸：水［（４１→５）：（７→４３）：１：１］の混合溶媒を用いてグラジエント溶出を行う。後者の場合、ブドウ種子をメタノール抽出して得られたプロアントシアニジン含有試料液をシリカゲル充填カラムに負荷し、移動相にジクロロメタン：メタノール：水：トリフルオロ酢酸［（８２→１０）：（１８→８６）：２：０．０５］の混合溶媒を用いてグラジエント溶出を行う。
しかしながら、これらの方法では、使用溶媒に塩素系の溶媒が含まれており、かつ溶媒組成が複雑なため溶媒の回収再使用が難しく、また移動相に濃度勾配をかけるグラジエント溶出法が必須とされる等の問題があり、従って、これらの方法は、安全性や経済性の面から大量精製を目的とする工業的分離方法としては適さない。
発明の開示
本発明の目的は、プロアントシアニジンを含有する原料又はその粗精製物から、二〜五量体のプロアントシアニジンオリゴマーを高純度で効率よく精製する方法を提供することにある。
従来の方法の組み合わせでは、目的成分である二〜五量体プロアントシアニジンオリゴマー以外のフラボノイド類、カテキン、エピカテキン等のプロアントシアニジン構成モノマー、六量体以上の高重合プロアントシアニジンポリマー、あるいは他の夾雑物を除去することは難しく、本発明の目的成分である二〜五量体のプロアントシアニジンオリゴマーを高純度で効率よく得ることは困難である。また、従来知られている方法は、使用する溶媒の組成が複雑であったり、経済性や、安全性の面から工業化プロセスとしては不適当な例がほとんどである。
本発明者らは、これらの問題点を解決すべく種々の検討を重ねた結果、高純度の二〜五量体のプロアントシアニジンオリゴマーを効率的に精製する方法を完成するに至った。
本願第一の発明は、二〜五量体のプロアントシアニジンオリゴマーを含有する原料又はその粗精製物から、酢酸メチルを液相として用いた固液抽出法により該プロアントシアニジンオリゴマーを抽出することを特徴とする二〜五量体のプロアントシアニジンオリゴマーの精製方法である。
前記液相としては、酢酸メチルの単一溶媒を用いてもよいが、酢酸メチルに酢酸メチルと混合可能な有機溶媒を加えて、酢酸メチル及び酢酸メチルと混合可能な有機溶媒の組み合わせからなる混合溶媒を用いてもよい。
本願第二の発明は、二〜五量体のプロアントシアニジンオリゴマーを含有する原料もしくはその粗精製物、又はそれらを含有する溶液を、予め加水分解酵素で処理することを特徴とする二〜五量体のプロアントシアニジンオリゴマーの精製方法である。
本願第三の発明は、二〜五量体のプロアントシアニジンオリゴマーを含有する原料又はその粗精製物から、エステル系溶媒、ケトン系溶媒、炭化水素系溶媒、エーテル系溶媒及びアルコール系溶媒からなる群から選ばれる単一溶媒又は２種以上の混合溶媒を移動相として用いた順相シリカゲル液体クロマトグラフィーにより、該プロアントシアニジンオリゴマーを重合度別に分離精製することを特徴とする重合度数の均一な二〜五量体のプロアントシアニジンオリゴマーの精製方法である。前記移動相としては、２種以上の混合溶媒を使用することが好ましい。
更に、本発明により、前記各精製方法により得ることができる純度９０（ｗ／ｗ）％以上の二〜五量体のプロアントシアニジンオリゴマー精製物、純度９０（ｗ／ｗ）％以上の二量体プロアントシアニジン精製物及び純度９０（ｗ／ｗ）％以上の三量体プロアントシアニジン精製物が提供される。
プロアントシアニジンは、各種の植物体中に存在する縮合型タンニンで、フラバン−７−オールが、４β→６、４β→８、４β→８・２βＯ→７等の結合により順次縮合又は重合により結合した基本構造を有する。本明細書中では、これらのうち、二〜五量体のものをプロアントシアニジンオリゴマー、六量体以上のものをプロアントシアニジンポリマーと定義するものとする。また、フラバン−７−オールの単量体をプロアントシアニジン構成モノマーと定義するものとする。プロアントシアニジンオリゴマーとしては、プロシアニジン、プロデルフィニジン、プロペラルゴニジン等のプロアントシアニジン及びこれらの立体異性体が全て含まれる。プロアントシアニジン構成モノマーは、次式（Ｉ）：
0004582917.tif 000002
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、同一又は異なり、水素、水酸基又はガロイル基を表す）で示される。
本発明で用いる原料又はその粗精製物は、プロアントシアニジンオリゴマーを含有するものであればいずれでもよいが、特に植物の果実、果皮、種子、樹皮等の植物原料、これらの抽出物、又はそれらの粗精製物が好適である。例えば、ブドウ、柿、リンゴ、コケモモ等の果実の搾汁液又は果皮もしくは種子の抽出液、あるいはピーナッツや栗の渋皮、大麦フスマや蕎麦の殻、柿の葉、松樹皮、ヤシ等の抽出液等、プロアントシアニジンオリゴマーを多く含むものが望ましい。
また、原料としては、非酵素的方法又は酵素的方法により得られる粗生成物又はその粗精製物を用いることもできる。プロアントシアニジンオリゴマーの合成法としては、エピカテキン又はカテキンの二量体の製造方法が、ジャーナル・オブ・ケミカル・ソサイエティー・パーキン・トランサクションＩ、１５３５〜１５４３頁（１９８３年）に、エピカテキン又はカテキンの三量体の製造方法が、ファイトケミストリー、２５巻、１２０９〜１２１５頁（１９８６年）にそれぞれ記載されており、これらの方法あるいはこれらに準じて得られる粗生成物又はその粗精製物を本発明方法の原料として用いることもできる。
本願第一の発明で用いる酢酸メチルと混合可能な有機溶媒としては揮発性のものが好ましく、その具体例として、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等のアルコール系溶媒；ギ酸メチル、ギ酸エチル、酢酸エチル等のエステル系溶媒；アセトン等のケトン系溶媒；アセトニトリル等のニトリル系溶媒；テトラヒドロフラン、１，２−ジメトキシエタン等のエーテル系溶媒；ヘキサン等の炭化水素系溶媒；酢酸等のカルボン酸系溶媒等が挙げられる。酢酸メチルと混合可能な有機溶媒を使用する場合、抽出溶媒全体中に酢酸メチルが５０％（容量）以上含まれるのが好ましく、７０％（容量）以上含まれるのがより好ましく、更には９０％（容量）以上含まれるのが好ましい。
本願第二の発明で用いる加水分解酵素としては、グリコシダーゼ、エステラーゼ等が挙げられる。
グリコシダーゼとしては、アミラーゼ、セルラーゼ、グルカナーゼ、キシラナーゼ、グルコシダーゼ、デキストラナーゼ、キチナーゼ、ガラクツロナーゼ、ライソザイム、ガラクトシダーゼ、マンノシダーゼ、フルクトフラノシダーゼ、トレハラーゼ、グルコサミニダーゼ、プルラナーゼ、セラミダーゼ、フコシダーゼ、アガラーゼ等から選ばれる単独物又は２種以上の混合物が挙げられ、エステラーゼとしては、カルボキシエステラーゼ、アリールエステラーゼ、リパーゼ、アセチルエステラーゼ、コリンエステラーゼ、ペクチンエステラーゼ、コレステロールエステラーゼ、クロロフィラーゼ、ラクトナーゼ、タンナーゼ、ハイドロラーゼ等から選ばれる単独物又は２種以上の混合物が挙げられる。
本願第二の発明において、二〜五量体のプロアントシアニジンオリゴマーを含有する原料又はその粗精製物を含有する溶液としては、通常、水溶液、又は１０％以下のアルコール、エステル、ケトン系等の有機溶媒を含有する水性溶液が用いられる。
本願第三の発明において移動相として用いるエステル系溶媒としては、ギ酸メチル、ギ酸エチル、ギ酸プロピル、ギ酸イソプロピル、ギ酸ブチル、ギ酸イソブチル、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、酢酸イソブチル、プロピオン酸メチル、プロピオン酸エチル、プロピオン酸プロピル、プロピオン酸イソプロピル、プロピオン酸ブチル、プロピオン酸イソブチル、酪酸メチル、酪酸エチル、酪酸プロピル、醋酸イソプロピル、酪酸ブチル、酪酸イソブチル等が挙げられ、ケトン系溶媒としては、アセトン、メチルエチルケトン、メチルプロピルケトン、メチルイソプロピルケトン、メチルブチルケトン、メチルイソブチルケトン、メチル  ｔｅｒｔ−ブチルケトン、ジエチルケトン、ジイソプロピルケトン、メチルビニルケトン、シクロブタノン、シクロペンタノン、シクロヘキサノン等が挙げられ、炭化水素系溶媒としては、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ノナン、デカン、ノナデカン、シクロヘキサン、キシレン、トルエン等が挙げられ、エーテル系溶媒としては、テトラヒドロフラン、１，２−ジメトキシエタン等が挙げられ、アルコール系溶媒としては、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール等が挙げられる。
植物原料からの抽出・粗精製は、例えば次のような公知の方法で行うことができる。
植物の果実、果皮、種子、渋皮、殻、葉、樹皮等の植物原料は、通常空気乾燥等の乾燥工程に付した後、抽出原料とするが、そのまま抽出原料とすることもできる。
前記抽出原料からのプロアントシアニジンの粗抽出は、公知の方法［Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，３８，３２１８（１９９０）、同，４０，８８９−８９８（１９９２）］を参考にして行うことができる。例えば、植物原料を破砕又は細切した後、溶媒を用いて抽出を行う。抽出溶媒としては、水、メタノール、エタノール、イソプロパノール等のアルコール系溶媒、アセトン、メチルエチルケトン等のケトン系溶媒、酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル系溶媒等の親水性又は親油性の溶媒を単独で又は混合溶媒として用いることができる。抽出温度は、通常０〜１００℃、好ましくは５〜５０℃である。内部に油分を含有している種子等は、破砕せずにそのまま抽出処理に供することもできる。抽出操作は、必要に応じて２〜３回繰り返してもよい。前記の操作で得られる粗抽出液から、不溶性残渣をろ過又は遠心分離により取り除き、粗抽出液とする。植物原料が植物の搾汁液、樹液等の場合は、そのまま抽出原料として用いてもよいし、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４５，１８８５−１８８７（１９８１）を参考に縮合型タンニンの濃縮粗抽出液を調製してもよい。
非酵素的方法、酵素的方法等の化学的方法により得られる粗生成物からの抽出・粗精製も、前記と同様にして行うことができる。
次に、本発明の精製方法について、例をあげて更に詳しく説明する。
本願第一の発明において、二〜五量体のプロアントシアニジンオリゴマーは、該プロアントシアニジンオリゴマーを含有する原料又はその粗精製物を、酢酸メチルの単一溶媒、又は酢酸メチル及び酢酸メチルと混合可能な有機溶媒の組み合わせからなる混合溶媒のいずれかを液相に用いた固液抽出に付すことにより精製される。原料又はその粗精製物が液体の場合は、予めスプレードライや凍結乾燥により粉末化しておくのが好ましい。通常、固体と、酢酸メチル、又は酢酸メチル及び酢酸メチルと混合可能な有機溶媒の組み合わせからなる混合溶媒との混合比（ｗ／ｖ）は、１：１〜１：１０００程度で、抽出は、室温下又は加熱しながら、撹拌を併用して短時間で行う。固体と、酢酸メチル、又は酢酸メチル及び酢酸メチルと混合可能な有機溶媒の組み合わせからなる混合溶媒との混合比（ｗ／ｖ）は、１：５〜１：１００が好ましく、室温で約１時間程度抽出を行い、更に同条件で抽出残渣を数回再抽出すればより好ましい。また、効率よく固液抽出を行うには、粉末体の粒径は細かい方が望ましい。混合溶媒を用いて抽出を行う場合、該混合溶媒は、溶媒の混合により酢酸メチルと類似の溶媒極性を有することが望ましい。これら溶媒を用いた固液抽出法により、プロアントシアニジンポリマーや他の夾雑物質の溶出を抑制し、効率よく二〜五量体のプロアントシアニジンオリゴマーを精製することができる。本願第一の発明においては、二〜五量体のプロアントシアニジンオリゴマーは、得られた酢酸メチル抽出液を濃縮した後、濃縮残渣を水、又は緩衝液等の水性溶媒等に再溶解させ、凍結乾燥を行って回収してもよいし、スプレードライを行って回収してもよい。
本願第二の発明において、二〜五量体のプロアントシアニジンオリゴマーは、該プロアントシアニジンオリゴマーを含有する原料もしくはその粗精製物、又はそれらを含有する溶液を、予め加水分解酵素で処理することにより精製される。通常、該原料又はその粗精製物には、プロアントシアニジンオリゴマー以外の夾雑物が多く含まれ、特に原料又はその粗精製物が植物由来の場合、プロアントシアニジンオリゴマー以外のポリフェノール配糖体やエステル体が高い割合で存在する。夾雑成分である該配糖体や該エステル体を前記の加水分解酵素での処理により予めアグリコン化することにより、次精製工程における夾雑成分の除去を効率的に行うことができ、プロアントシアニジンオリゴマーの純度向上が図れる。例えば、タデ科のソバの全草に多く含まれるフラボノイド配糖体であるルチンは、β−グルコシダーゼで処理することによりケルセチンにアグリコン化される。双子葉植物の果実や葉に多く含まれるヒドロキシ桂皮酸エステル体であるクロロゲン酸及びｐ−クマリルキナ酸は、ヒドロキシ桂皮酸エステルハイドロラーゼで処理することにより分子内エステル結合であるデプシド結合が加水分解され、カフェー酸とキナ酸及びｐ−クマル酸とキナ酸となる。加水分解酵素処理の反応条件は、酵素の種類等により異なるが、通常、ｐＨ３〜８、２５〜５５℃、１〜２４時間である。加水分解酵素処理によって生成した前述のアグリコン成分、遊離の糖類又はカルボン酸類は、冷却処理、液液もしくは固液抽出処理又はカラム吸着処理等の既存の方法、あるいはこれらと順相クロマトグラフィーとの組み合わせにより、容易に除去できる。以上の操作を行うことにより、二〜五量体のプロアントシアニジンオリゴマーを含有する原料又はその粗精製物中の夾雑成分の除去が効果的に行われ、目的成分である二〜五量体のプロアントシアニジンオリゴマーの純度を向上させることができる。
本願第三の発明において、二〜五量体のプロアントシアニジンオリゴマーを含有する原料又はその粗精製物から、エステル系溶媒、ケトン系溶媒、炭化水素系溶媒、エーテル系溶媒及びアルコール系溶媒からなる群から選ばれる単一溶媒又は２種以上の混合溶媒を移動相として用いた順相シリカゲル液体クロマトグラフィーにより、該プロアントシアニジンオリゴマーを重合度別に分離精製し、重合度数の均一な二〜五量体のプロアントシアニジンオリゴマーを得ることができる。前記順相シリカゲル液体クロマトグラフィーには、オープンカラムクロマトグラフィーによる方法及び高速液体クロマトグラフィーによる方法のいずれも適応可能である。二〜五量体のプロアントシアニジンオリゴマーは、該プロアントシアニジンオリゴマーを含有する溶液から溶媒又は水を除去した後、あるいは該プロアントシアニジンオリゴマーを含有する原料又はその粗精製物が固体の場合はそのまま、移動相又は移動相に可溶な有機溶媒に溶解又は転溶させる。必要により、メンブランフィルター等でろ過後、カラムへチャージする。目的成分の溶出に際しては、移動相に濃度勾配をかけないイソクラティック溶出法で行うことが、作業簡素化の面でより望ましい。イソクラティック溶出法における移動相としては、ヘキサン／メタノール／酢酸エチル、ヘキサン／アセトン、ヘキサン／メタノール／テトラヒドロフラン／酢酸、ヘキサン／メタノール／テトラヒドロフラン／ギ酸、ヘキサン／メタノール／酢酸メチル／酢酸、ヘキサン／メタノール／酢酸メチル、ヘキサン／酢酸メチル／アセトン等の混合溶媒が好ましい。
本願第三の発明の精製方法を用いることにより、夾雑成分である（＋）−カテキン、（＋）−ガロカテキン、（−）−エピカテキン、（−）−エピガロカテキン等のプロアントシアニジン構成モノマーや六量体以上のプロアントシアニジンポリマーの効果的な除去が可能になると同時に、目的成分である二〜五量体のプロアントシアニジンオリゴマー成分を重合度別に分離精製することができる。
本願第一〜第三の発明による精製方法は、抽出源となる原料及び目的とする精製度等により、自由に選択し、繰り返しても組み合わせてもよい。
二〜五量体のプロアントシアニジンオリゴマーの精製には、本願第一〜第三の発明による精製方法の２種以上を組み合わせることが好ましく、重合度数の均一な二〜五量体のプロアントシアニジンオリゴマーの精製には、本願第一の発明による精製方法及び／又は本願第二の発明による精製方法と、本願第三の発明による精製方法とを組み合わせることが好ましい。また、他の公知の方法と組み合わせてもよい。精製方法を組み合わせる場合の各精製方法の使用段階及び使用順番は自由である。
これらの方法により、二〜五量体のプロアントシアニジンオリゴマー、二量体プロアントシアニジン及び三量体プロアントシアニジンの高純度体［純度９０（ｗ／ｗ）％以上］を効率よく得ることができる。
本発明の精製方法により精製された二〜五量体のプロアントシアニジンオリゴマー、二量体プロアントシアニジン及び三量体プロアントシアニジンは、食品、化粧品、医薬品等の製造原料として使用可能である。
本明細書は本願の優先権の基礎である特願平１１−１１６３８０号の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例に基づいて更に詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例等に何ら制約されるものではない。
（実施例１）固液抽出法による精製（Ａ）
参考例１で得られたプロアントシアニジン画分３０ｇに酢酸メチル３００ｍｌを加え、室温で１時間固液抽出を行った。抽出は計二回行い、二回分の抽出液を混合してろ別した後、少量の酢酸メチルで抽出残渣を洗浄した。酢酸メチル抽出液と洗浄液を合わせて減圧濃縮した後、少量の蒸留水を添加して再度減圧濃縮を行い、抽出成分を水溶液として転溶した。得られた水溶液を凍結乾燥し、酢酸メチル抽出粉末品１７．５ｇを得た。また、抽出残渣を乾燥し、酢酸メチル非抽出物の粉末品１２．５ｇを得た。更に、両粉末中に含まれる二量体プロアントシアニジン成分であるプロシアニジンＢ１（エピカテキン−（４β→８）−カテキン；以下ＰＢ１と略）及びプロシアニジンＢ２（エピカテキン−（４β→８）−エピカテキン；以下ＰＢ２と略）並びに三量体成分であるプロシアニジンＣ１（エピカテキン−（４β→８）−エピカテキン−（４β→８）−エピカテキン；以下ＰＣ１と略）の含有量を、参考例２記載の逆相液体グロマトグラフィー法で定量した。酢酸メチル抽出時の固形分回収率とあわせて表１に結果を示す。
0004582917.tif 000003
表１から明らかなように、酢酸メチルによる固液抽出により、ＰＢ１、ＰＢ２及びＰＣ１に代表されるプロアントシアニジンオリゴマー成分の選択的抽出と純度向上が効果的に達成された。
（実施例２）固液抽出法による精製（Ｂ）
酢酸メチルと各種溶媒を９：１（酢酸メチル：ヘキサンは９５：５）の容量比で混合し、固液抽出溶媒を用意した。該各種溶媒においては、酢酸メチルと混合可能な有機溶媒として、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ギ酸エチル、酢酸エチル、アセトン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ヘキサン又は酢酸を使用した。参考例１で得られたプロアントシアニジン画分１ｇに、各抽出溶媒１０ｍｌを加え、室温で１時間固液抽出（一回抽出）を行った。抽出液を遠心分離して固形成分を除いた後、一定量を蒸留水で１００倍希釈（０．０１→１ｍｌ）して、抽出液中のＰＢ１、ＰＢ２及びＰＣ１の含有量を、参考例２記載の逆相液体クロマトグラフィー法で定量した。同時に、抽出液の１ｍｌを分取して溶媒を除去した後、凍結乾燥して抽出固形分量を求めた。各抽出溶媒による固液抽出時のＰＢ１、ＰＢ２及びＰＣ１の抽出効率と固形分回収率をあわせて表２に示す。また、比較例として、前記と同様にして酢酸エチル単独で固液抽出を行った（但し、プロアントシアニジン画分２ｇに酢酸エチル２０ｍｌを使用した）。その結果も表２に示す。
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（実施例３）固液抽出法による精製（Ｃ）
酢酸メチルと酢酸エチルを表３に示す容量比で混合し、固液抽出を行った。参考例１で得られたプロアントシアニジン画分１ｇに、各容量比の抽出溶媒１０ｍｌを加え、３０℃で１．５時間固液抽出を行い、これを３回繰り返した。これらの抽出液を合わせて減圧濃縮後、抽出成分を凍結乾燥して抽出粉末品を得た。粉末品中に含まれるＰＢ１、ＰＢ２及びＰＣ１の含有量を、参考例２記載の逆相液体クロマトグラフィー法で定量した。各容量比の溶媒により抽出したときの固形分回収率、ＰＢ１、ＰＢ２及びＰＣ１のそれぞれの抽出量及び回収率、並びにＰＢ１、ＰＢ２及びＰＣ１の合計の抽出量、回収率及び純度を表３に示す。
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表３から明らかなように、酢酸メチルを含む抽出溶媒を用いた固液抽出により、ＰＢ１、ＰＢ２及びＰＣ１に代表されるプロアントシアニジンオリゴマー成分の選択的抽出と、回収率の向上が効果的に達成された。
（実施例４）酵素分解処理を併用した精製
参考例１で得られたポリフェノール抽出液を食品加工用の市販酵素製剤で酵素処理した。酵素製剤としては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属由来のリパーゼ製剤（リパーゼ三共、三共株式会社）及びハイドロラーゼ製剤（ヒドロキシ桂皮酸エステルハイドロラーゼ、株式会社盛進）を使用した。予めポリフェノール抽出液１００ｍｌを５ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＯＨでｐＨ５に調整し、更に蒸留水で１０倍希釈した試料液  １Ｌに対し、前記リパーゼ製剤及び前記ハイドロラーゼ製剤をそれぞれ１ｇ（最終濃度：０．１％）ずつ添加し、４５℃で１６時間酵素反応を行った。反応前と反応後の試料液について参考例２記載の逆相液体クロマトグラフィー分析を行った結果をそれぞれ図１−ａと図１−ｂに示す。図からもわかるように、前記酵素反応を行うことにより、主要な夾雑成分であるクロロゲン酸やフロリジンはほとんど消失し、代わりに遊離のカフェー酸、ｐ−クマル酸及びフロレチンが増加した。次に、反応終了後の溶液を濃縮、スプレードライを行って粉末体２０ｇを得た。更に、酢酸メチルを２００ｍｌ添加し固液抽出を行い得られた酢酸メチル抽出液のクロマトグラムを図１−ｃに示した。図１−ａや図１−ｂにおいてベースライン上の隆起として現れているプロアントシアニジンポリマー類が固液抽出処理により除去された。更に、本抽出液に少量の蒸留水を加えた後、減圧濃縮により酢酸メチルを除去することで抽出成分を水に転溶した。得られた水溶液５０ｍｌに対し等量の酢酸エチル／ｎ−ヘキサン（８／２）を加え、液液抽出を行った。その結果得られた有機溶媒層（上層）と水層（下層）のクロマトグラムをそれぞれ図１−ｄと図１−ｅに示した。結果として、酢酸エチル／ｎ−ヘキサン（８／２）による液液抽出処理により、プロアントシアニジン構成モノマー（カテキン、エピカテキン）の一部と先の酵素処理時の反応主生成物である遊離のカフェー酸、ｐ−クマル酸、フロレチンの大部分が有機溶媒層へと除去された（図１−ｄ）。ＰＢ１、ＰＢ２及びＰＣ１に代表される二〜五量体のプロシアニジンオリゴマーは、ほとんど液液抽出後の水層に残留した（図１−ｅ）。最終的に得られた水層を濃縮後、凍結乾燥し、５．７ｇの粉末体を得た。一連の処理の結果、ＰＢ１＋ＰＢ２＋ＰＣ１の総固形分中純度は１１．５％から４０．３％へと約４倍向上した。このように、原料抽出液に対し酵素分解処理を行い、更に複数の精製方法を組み合わせることにより、目的成分である二〜五量体のプロアントシアニジンオリゴマーの効果的な純度向上が達成された。
（実施例５）順相液体クロマトグラフィーによる精製（Ａ）
参考例１で得られたプロアントシアニジン画分１０ｇに酢酸メチル１００ｍｌを加えて固液抽出を行った。抽出液を減圧濃縮して２０ｍｌ濃縮液として定容し、シリカゲルを充填剤とする順相液体クロマトグラフィー法による成分分離を行った。クロマトグラフィーの条件は、以下のとおりである。
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＳＩＬ（４．６ｍｍＩ．Ｄ．×１５０ｍｍ、ＧＬサイエンス）
イソクラティック分離用移動相：ヘキサン／メタノール／酢酸エチル（７０／３０／１０）
試料負荷量：０．０１ｍｌ
流速：１．８ｍｌ／分
検出：ＵＶ２８０ｎｍ
得られたクロマトグラムを図２に示す。本条件下では、プロアントシアニジンオリゴマー成分は、二量体から順に重合度数別に分離してカラムから溶出した。即ち、シリカゲルを充填剤とする順相液体クロマトグラフィー分離で、二量体、三量体等の目的に応じた重合度数の均一なオリゴマー成分の選択的な分離が達成されることが確認できた。
更に、同一の濃縮液試料を用いて、分取スケールでの順相液体クロマトグラフィー分画を行った。分画条件は、以下のとおりである。
シリカゲル充填剤：球状多孔シリカゲル（７５μｍ，１２０Ａ）
カラムサイズ：６ｍｍＩ．Ｄ．×５００ｍｍ×２本
イソクラティック分離用移動相：ヘキサン／メタノール／酢酸エチル（７０／３０／１０）
試料負荷量：０．５ｍｌ
流速：３ｍｌ／分
分画：１５ｍｌ／５分／１画分
検出：ＵＶ２８０ｎｍ
このとき、図３に示したように、分取スケールにおいても、試料中のプロアントシアニジンオリゴマーは、重合度数別に分離された。
次いで、クロマトグラム上の単量体、二量体、三量体に相当する溶出画分を分取し、参考例２記載の逆相液体クロマトグラフィーで各溶出画分中のオリゴマー成分の構成を調べた。その結果、図４−［５］及び図４−［６］に示すとおり、単量体画分は主としてカテキンとエピカテキン、図４−［７］〜［１１］に示すとおり、二量体画分は主としてＰＢ１とＰＢ２、図４−［１２］〜［２０］に示すとおり、三量体画分は主としてＰＣ１から構成されており、分離した各画分は、それぞれ重合度数の均一なオリゴマー成分から構成されていた。
以上のようにして得られた二量体プロアントシアニジン精製物及び三量体プロアントシアニジン精製物の純度は、それぞれ９３及び９２（ｗ／ｗ）％であった。
（実施例６）順相液体クロマトグラフィーによる精製（Ｂ）
実施例５で得られた濃縮液試料を用いて、順相液体クロマトグラフィー分画を行った。分画条件は、以下のとおりである。
シリカゲル充填剤：球状多孔シリカゲル（７５μｍ，１２０Ａ）
カラムサイズ：６ｍｍＩ．Ｄ．×５００ｍｍ×２本
イソクラティック分離用移動相：ヘキサン／アセトン（４０／６０）
試料負荷量：０．０５ｍｌ
流速：３ｍｌ／分
分画：１５ｍｌ／５分／１画分
検出：ＵＶ２８０ｎｍ
得られたクロマトグラムを図５に示す。更に、クロマトグラム上の単量体、二量体、三量体に相当する溶出画分を分取し、参考例２記載の逆相液体クロマトグラフィーで各溶出画分中のオリゴマー成分の構成を調べた。その結果、図６−［２］〜［４］に示すとおり、単量体画分は主としてカテキンとエピカテキン、図６−［５］〜［９］に示すとおり、二量体画分は主としてＰＢ１とＰＢ２、図６−［１０］〜［１５］に示すとおり、三量体画分は主としてＰＣ１から構成されており、実施例５と同様、分離した各画分はそれぞれ重合度数の均一なオリゴマー成分から構成されていた。
以上のようにして得られた二量体プロアントシアニジン精製物及び三量体プロアントシアニジン精製物の純度は、それぞれ９５及び９３（ｗ／ｗ）％であった。
（参考例１）リンゴ果実からのプロアントシアニジン画分の調製
Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，１１，３１−３６（１９９７）に記載の方法に従い、リンゴ果実からのポリフェノール抽出液及びプロアントシアニジン画分の調製を行った。主要栽培品種である「ふじ」の未熟果実３ｋｇを原料とし、メタ重亜硫酸カリウム３ｇを添加しながら果実を破砕、搾汁した。搾汁液を遠心分離及びろ過に付して清澄化処理を行い、１．８Ｌの清澄果汁液を得た。次に、該果汁液をＳｅｐａｂｅａｄｓ  ＳＰ−８５０（日本練水）充填カラム（２５ｍｍＩ．Ｄ．×２８５ｍｍ）に通塔して果汁中のポリフェノール成分を吸着させ、３００ｍｌの蒸留水洗浄により果汁中に混在する糖類や有機酸類を除去した後、２００ｍｌの８０％エタノール水溶液でポリフェノール成分を溶出させた。更に、回収溶出液を６５ｍｌまで減圧濃縮し、ポリフェノール抽出液とした。得られたポリフェノール抽出液のうち２５ｍｌを更にＴＳＫ−ＧＥＬ  ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ−４０ＥＣ（東ソー）充填カラム（２５ｍｍＩ．Ｄ．×２８５ｍｍ）に通塔し、２００ｍｌの蒸留水で洗浄することにより夾雑成分であるフェノールカルボン酸類の大部分を除去し、次に、２５０ｍｌの４０％エタノール水溶液を通液して他の低分子ポリフェノール類を溶出させた後、１００ｍｌの６０％アセトン水溶液を通液してプロアントシアニジン類の大部分を溶出、回収した。なお、４０％エタノール水溶液溶出液中には二〜五量体のプロアントシアニジンオリゴマーの一部が混在しているため、減圧濃縮により脱エタノールした溶出液を更にＳｅｐ−ｐａｋ  Ｃ１８ＥＮＶカラム（Ｗａｔｅｒｓ）に通液し、混在プロアントシアニジン成分のみを再精製、回収した。この回収溶液と先の６０％アセトン水溶液溶出液を混合し、減圧濃縮後、凍結乾燥してプロアントシアニジン画分を得た（清澄果汁１．８Ｌ→８ｇ）。別途質量分析の結果、本画分は、単量体〜１５量体のプロアントシアニジン類により構成されていた。なお、必要に応じ、本工程をスケールアップし、個々の実施例における必要量のポリフェノール抽出液又はプロアントシアニジン画分を調製した。
（参考例２）ポリフェノール分析
実施例に記載の各種試料中のポリフェノール成分組成については、必要に応じて、以下の条件に基づく逆相液体クロマトグラフィー法で分析した。
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３（４．６×１５ｍｍ、ＧＬサイエンス）溶離液：Ａ）０．１ｍｏｌ／Ｌ  リン酸緩衝液（ｐＨ  ２）／メタノール（８／２）Ｂ）０．１ｍｏｌ／Ｌ
リン酸緩衝液（ｐＨ２）／メタノール（５／５）
グラジエント溶出条件：０→１０分（１００％  Ａ）、１０分→５０分（１００％  Ａ→１００％  Ｂ）、５０分→６５分（１００％  Ｂ）
試料負荷量：１０μｌ、流速：１ｍｌ／分
検出：２８０ｎｍ
（参考例３）プロアントシアニジンオリゴマーの重合度数分布の解析
実施例１で得られた酢酸メチル抽出物と酢酸メチル非抽出物の粉末品に含まれるプロアントシアニジンオリゴマーの重合度数分布を、ゲル浸透クロマトグラフィーにより解析した。解析条件は、以下のとおりである。
カラム：ＴＳＫ−ＧＥＬ  ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ−４０Ｆ（２．５×９５ｃｍ，東ソー）
溶離液：アセトン／８ｍｏｌ／Ｌ尿素（６／４）
流速：１．０ｍｌ／分
分画：３ｍｌ／３分／１画分（最初の８０ｍｌは廃棄）
検出：フェノール試薬添加による比色法（ＶＩＳ７６０ｎｍ検出）
また、カテキン類標準品混合物（エピカテキン、ＰＢ２、ＰＣ１／各２ｍｇ）、プロアントシアニジン混合物（１０ｍｇ）、同混合物の酢酸メチル抽出粉末品（５．８３ｍｇ）、酢酸メチル非抽出粉末品（４．１７ｍｇ）を、それぞれ溶離液０．５ｍｌに溶解して分析に供した。結果を図７に示す。
本分析条件下では、図７に示すように、試料中の構成プロアントシアニジンオリゴマーが充填剤の分子ふるい効果に基づき重合度数の大きいものから順番に溶出し、特に三量体、二量体、単量体成分については、独立したピークとしてクロマトグラム上に現れる。図７に示すように、酢酸メチル抽出粉末品は、主として単量体、及び二、三量体からなるプロアントシアニジンオリゴマー成分で構成されていた。一方、酢酸メチル非抽出物粉末品は、主として分子量の大きなプロアントシアニジンポリマー成分から構成されていた。
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
産業上の利用の可能性
本発明により、プロアントシアニジンを含有する原料又はその粗精製物から、二〜五量体のプロアントシアニジンオリゴマー及び重合度数の均一な二量体、三量体プロアントシアニジンを高純度でしかも効率よく精製することができる。本発明により得られるプロアントシアニジンオリゴマーは、抗腫瘍、抗炎症、抗老化、抗酸化、抗アレルギー、抗菌、育毛等の多様な生理活性を有し、食品や化粧品あるいは医薬品等の用途に有用である。
【図面の簡単な説明】
図１は、逆相液体クロマトグラフィーの結果を示す図である。図１中の符号のの意味は以下のとおりである。
１  ＰＢ１
２  （＋）−カテキン
３  ＰＢ２
４  クロロゲン酸
５  カフェー酸
６  ＰＣ１
７  （−）−エピカテキン
８  ｐ−クマル酸エステル
９  ｐ−クマル酸
１０  フロリジン
１１  フロレチン
図２は、順相液体クロマトグラフィーの結果を示す図である。
図３は、順相液体クロマトグラフィーの結果を示す図である。
図４は、逆相液体クロマトグラフィーの結果を示す図である。図４中の符号のの意味は以下のとおりである。
１  ＰＢ１
２  （＋）−カテキン
３  ＰＢ２
４  ＰＣ１
５  （−）−エピカテキン
［５］，［６］      単量体画分、図３の分画番号に対応。
［７］〜［１１］    二量体画分、図３の分画番号に対応。
［１２］〜［２０］  三量体画分、図３の分画番号に対応。
図５は、順相液体クロマトグラフィーの結果を示す図である。
図６は、逆相液体クロマトグラフィーの結果を示す図である。図６中の符号のの意味は以下のとおりである。
１  ＰＢ１
２  （＋）−カテキン
３  ＰＢ２
４  ＰＣ１
５  （−）−エピカテキン
［２］〜［４］      単量体画分、図５の分画番号に対応。
［５］〜［９］      二量体画分、図５の分画番号に対応。
［１０］〜［１５］  三量体画分、図５の分画番号に対応。
図７は、プロアントシアニジンオリゴマーの重合度数分布の解析結果を示す図である。
【図１】
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0004582917.tif 000009
0004582917.tif 000010
【図２】
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【図３】
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【図４】
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0004582917.tif 000014
0004582917.tif 000015
0004582917.tif 000016
【図５】
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【図６】
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0004582917.tif 000019
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【図７】
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