(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の一本鎖もしくは二本鎖の第１の核酸の存在または不存在を、デュアルチャンバ反応容器内での該第１の核酸の自動化等温増幅によって検出する方法であって、該デュアルチャンバ反応容器は第１および第２の２つの反応チャンバを具備し、該反応チャンバは互いに液通が可能なように配置されており、それにより該液通を制御可能に遮断することが可能となっており、
該検出は、
ａ）該第１の反応チャンバ内で、潜在的に該第１の核酸を含む試料と、反応バッファと、遊離ヌクレオチドの混合物と、第１および第２の特異的オリゴヌクレオチドプライマーとを組み合わせ、かつ該反応容器を自動装置内に収容し、該自動装置は次のように
ｂ）自動装置は、第１の反応チャンバを、試験しようとする試料中のいかなる二本鎖の第１の核酸でもハイブリダイゼーション産物の形成が可能となるのに十分な一本鎖の核酸となるような十分な温度で、かつ十分な時間加熱する一方、該ハイブリダイゼーション産物は該第１の核酸および少なくとも１つの該第１および第２のオリゴヌクレオチドプライマーとからなるものであり；
ｃ）自動装置は、該第１核酸が存在する場合に該ハイブリダイゼーション産物が形成するのに十分な温度に第１の反応チャンバを冷却し；
ｄ）自動装置は、反応混合物を該制御可能な液通により第１の反応チャンバから該第２の反応チャンバに、該反応混合物が核酸重合酵素と接触するように移送し；
ｅ）自動装置は、第２の反応チャンバの温度を、該第１の核酸が存在する場合、該第１の核酸の特異的オリゴヌクレオチドプライマー介在増幅を可能とするのに十分な温度に維持し；
ｆ）自動装置は、特異的に結合する核酸−キャプチャープローブハイブリダイゼーション複合体の形成が可能となるように、第２の反応チャンバ内にある第１の核酸からのあらゆるアンプリコン産物と、該第１の核酸からの該アンプリコンに対して特異的なキャプチャー核酸とを接触させ；
ｇ）自動装置は、必要により、ハイブリダイゼーション複合体混合物を、非特異的に結合した核酸が特異的に結合した核酸−キャプチャープローブ複合体から洗い落とされるように洗浄し；
ｈ）自動装置は、特異的に結合した核酸−キャプチャープローブ複合体と、該第１の核酸からの該アンプリコン産物に対して特異的な標識核酸プローブとを接触させ、特異的に結合した核酸−キャプチャープローブ−標識プローブ複合体の形成が可能となるようにし；
ｉ）自動装置は、必要により、特異的に結合した核酸−キャプチャープローブ−標識プローブ複合体を洗浄し、非特異的に結合した標識プローブ核酸が特異的に結合した核酸−キャプチャープローブ−標識プローブ複合体から洗い落とされるようにし；および
ｊ）自動装置は、特異的に結合した核酸−キャプチャープローブ−標識プローブ複合体を、該アンプリコンおよび第１の核酸が存在する場合には、検出可能な信号を発生させるものが含まれている溶液と接触させ、該試料から試料中の該第１の核酸の量に比例する量の信号を生成し、該生成した信号の存在もしくは不存在を検出し、必要により該信号の値を表示し、かつ必要により該信号の値を記録することを備えるものであって、ここで、工程ｈ、ｉ、およびｊの各々は順次行っても同時に行ってもよいものである検出方法。
【請求項２】
前記核酸増幅酵素が前記第２の反応チャンバ内に凍結乾燥ペレットの形態で一回のアッセイ用の量として配置され、かつ該反応チャンバが使用前には密封されている請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
核酸増幅酵素が熱安定性酵素である請求項１に記載の検出方法。
【請求項４】
熱安定性の核酸増幅酵素が第１の反応チャンバ内に配置されている請求項３に記載の検出方法。
【請求項５】
内部対照分子がさらに組み込まれている請求項１に記載の検出方法。
【請求項６】
標的核酸配列の増幅および検出をさらに包含する請求項１に記載の検出方法。
【請求項７】
プライマー対照配列の検出をさらに包含する請求項１に記載の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、標的試験試料中の特定の核酸配列の検出に関する。特に、本発明は、増幅されていない、もしくは増幅されている核酸配列（アンプリコン）のいずれかである特定の核酸配列の自動化検出に関する。加えて、本発明は、自動化複製の使用、複製がうまくいくように監視するための方法および組成物、汚染の機会を減少させるための改良法、並びに増幅用の統合化された反応バッファ並びに反応成分の単位適用量のアリコートの使用に関するものである。
【０００２】
最後に、本発明は、単一のアッセイにおける１つもしくは２つ以上の異なる核酸配列の従来の、もしくは自動化された検出のための独特な構築物、および方法にも関する。
【０００３】
【従来の技術】
核酸を操作し、必要であればそのような核酸を増幅し、およびそれに続いて核酸もしくはアンプリコンの特定な配列を検出するための技術開発は、疾患の診断および／または試験試料中の病原性微生物を同定することに対して、非常に高感度であって、核酸配列に特異的なアッセイを生み出している。
【０００４】
１．核酸の増幅
必要であれば、核酸配列の酵素的増幅がそのような核酸配列を検出する能力を高める。一般に、現在知られている増幅スキームは、その酵素的増幅反応が変性温度、プライマーアニーリング温度、およびアンプリコン（核酸の酵素的増幅の産物）合成温度との間の温度で、連続した循環によって進められるのか、またはその酵素的増幅プロセスを通じて温度が一定に保たれる（等温増幅、isothermal amplification）のかに基づいて、大まかに２つのクラスにグループ分けすることができる。典型的な循環核酸増幅技術（熱循環、thermocycling ）はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）である。これらの反応の具体的なプロトコルは、例えば、Short Protocols in Molecular Biology、第２版や、A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology （Ausubel ら編、John Wiley & Sons,New York、1992）の第１５章で論じられている。等温（isothermal）である反応には、転写介在増幅（transcription-mediated amplification、ＴＭＡ）、核酸配列に基づく増幅（nucleic acid sequence-based amplification 、ＮＡＳＢＡ）、および鎖置換増幅（strand displacement amplification 、ＳＤＡ）が含まれる。
【０００５】
核酸の増幅を論じている米国特許文献には、４，６８３，１９５号；４，６８３，２０２号；５，１３０，２３８号；４，８７６，１８７号；５，０３０，５５７号；５，３９９，４９１号；５，４０９，８１８号；５，４８５，１８４号；５，４０９，８１８号；５，５５４，５１７号；５，４３７，９９０号および５，５５４，５１６号（これらの各々は参照することによりそれら全体をここに引用する）が含まれる。これらの特許に記述されるもののような方法はクローン化を必要とすることなく核酸の増幅および検出を可能にし、核酸配列の最も感度の高いアッセイであることがよく知られている。しかしながら、核酸の増幅において高感度な検出が可能ではあるが、微量の望ましくない外来性の核酸配列による汚染が非常に簡単に起こりやすいことも同時によく認識されている。望ましくない外来性のＤＮＡまたはＲＮＡの核酸による汚染も同様である。増幅反応の有用性は、望ましくない外来性の核酸および他の汚染物質の混入を制御する方法によって高められる。
【０００６】
熱安定性酵素が発見される以前は、変性に必要な最初の温度の上昇がポリメラーゼをも不活性化するため、変性工程が終了するたびに新鮮な酵素を添加することが必要であることから、熱循環を用いる方法は非常に困難であった。一度、熱安定性酵素が発見されると、循環核酸増幅は、酵素の添加が反応の開始時にのみに必要な、より簡潔な手順となった。したがって、反応容器が開放されている必要はなく、かつ反応の間に新たな酵素を添加する必要もなく、これにより汚染の危険性を低下させながら効率および正確性を改善することが可能となり、酵素のコストも低下した。熱安定性酵素の例は、微生物、サーモフィラス・アクアチクス（Thermophilus aquaticus）から単離されるポリメラーゼである。
【０００７】
一般に、等温増幅では、酵素活性について最適の熱安定性変種が述べられていない複数の酵素活性を組み合わせてなる活性を必要とする。増幅反応の最初の工程は通常、核酸標的の変性を必要とし、例えば、ＴＭＡ反応においては、最初の変性工程は通常≧６５℃で、典型的には≧９５℃であってもよいが、標的核酸の二次構造を取り除く必要がある場合に用いられる。
【０００８】
次に、この反応混合物を、プライマーがアニーリングするのを可能にし、かつ増幅酵素の組み合わされた活性に対し最適の反応温度であるような、より低い温度に冷却する。例えば、ＴＭＡにおいては、この酵素は一般にはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼと逆転写酵素（これは、エンドＲＮＡアーゼＨ活性を有する）である。この反応温度は、次の等温増幅サイクルの間中一定に保たれる。
【０００９】
適切な熱安定性酵素を欠くため、等温増幅では、一般に、高温で変性し、より低い温度に冷却した後に、反応混合物に酵素を添加することが必要となることがある。このような要求は不便なものであり、増幅用反応容器を開封することを必要とし、これにより汚染の機会が増大することになる。
【００１０】
したがって、そのような反応が、マニュアル操作で酵素を移すような必要なしに、一体化された変性と増幅とを可能にする方法によって、汚染の危険性を低下させながらより容易に行うことができるようになれば最も有用となるであろう。
【００１１】
２．増幅バッファ、および、試薬の単一反応用のアリコート
典型的な反応プロトコルは、その反応の特定の工程で用いられる特定の酵素の活性を最適化するようにあつらえられた、または反応成分の最適の再懸濁のための幾つかの異なるバッファを使用することを必要とする。例えば、典型的なＰＣＲ  １０×増幅バッファは５００ｍＭ  ＫＣｌと１００ｍＭ  トリスＨＣｌ、ｐＨ８．４とを含み、ＭｇＣｌ2 の濃度は核酸標的配列および対象となるプライマーの組に依存する。逆転写用バッファ（５×）は、典型的には４００ｍＭ  トリス−Ｃｌ、ｐＨ８．２；４００ｍＭ  ＫＣｌおよび３００ｍＭ  ＭｇＣｌ2 を含むものであるが、一方、ネズミ・モロニー白血病ウイルス逆転写酵素用バッファ（５×）は典型的には２５０ｍＭ  トリス−Ｃｌ、ｐＨ８．３；３７５ｍＭ  ＫＣｌ；５０ｍＭ  ＤＴＴ（ジチオトレイトール）と１５ｍＭ  ＭｇＣｌ2 とを含んでいる。
【００１２】
そのような反応バッファはストック化合物からバルクで調製することもできるが、ほとんどの市販の増幅用製品はその増幅プロトコルで用いられるパッケージ化された試薬および特定のバッファのバルクで提供される。例えば、臨床上重要な病原体を検出するための市販のマニュアル操作の増幅アッセイ（例えば、ジェン−プローブ社（Gen-Probe Inc.）、クラミジアおよび結核菌検出アッセイ）はそのアッセイを行うのに幾つかのマニュアル操作を必要とし、これには、サンプル希釈バッファ（sample dilution buffer、ＳＤＢ）への試験試料の希釈や、希釈した試料と増幅反応試薬、例えば増幅再構成バッファ（amplification reconstitution buffer、ＡＲＢ）中に再構成されているオリゴヌクレオチドや特定のオリゴヌクレオチドプロモーター／プライマーとの組み合わせや、また、最終的に、酵素希釈バッファ（enzyme dilution buffer、ＥＤＢ）中で再構成された酵素の反応混合物への添加などが含まれる。
【００１３】
反応混合物へのマニュアル操作での添加を必要とする複数のバッファの調製および使用は、汚染の大きな機会を持ち込むことになる。増幅プロトコルの全ての相で用いることができる単一の統合されたバッファであることが最も有用である。特に、上述の市販のＴＭＡアッセイでは、３種類のバッファを必要とすることがそのプロトコルの自動化を非常に複雑にしている。
【００１４】
製造者による酵素や他の反応成分のパッケージされているバルクは、それらの成分を多量に再構成することを必要とするであろうし、ストック量の複数の試薬の使用では、最大数を下回る数の反応が行われる場合には、これらの成分のうちの幾つかは短期間しか安定でないことがあり、不経済である可能性がある。また、この再構成の工程はユーザーによるストック試薬の複数回の操作と、原料試薬から個々の反応量の試薬に小分けすることとを必要とし、これが汚染の大きな機会を作り出す。
【００１５】
バルク量の保存されたタンパク質を調製するための方法やその組成物は公知であり、例えば、米国特許５，０９８，８９３号；４，７６２，８５７号；４，４５７，９１６号；４，８９１，３１９号；５，０２６，５６６号並びに国際特許公開ＷＯ８９／０６５４２号；ＷＯ９３／００８０６号；ＷＯ９５／３３４８８号およびＷＯ８９／０００１２号を参照のこと。これらの全ては参照することによりその全体がここに引用される。しかしながら、単一反応量／適用量の、予め小分けされ、かつ保存された試薬成分を使用することが非常に有用かつ経済的である。酵素試薬の単一のアリコートによりバルク試薬の使用が回避され、これにより無駄が減り、汚染の機会が非常に低くなる。さらに、そのような単一反応用のアリコートは反応プロセスの自動化に最も適切である。
【００１６】
多くのバッファに変えることの必要性および試薬を複数回添加することの必要性は、このような反応の自動化を複雑にする。反応バッファ混合物の一回の適用量で、統合された組み合わせバッファはそのプロセスの自動化を単純化し、かつ汚染の機会を減らであろう。
【００１７】
３．増幅を伴う、もしくは伴わない核酸検出の自動化
核酸プローブアッセイと増幅／プローブアッセイの組み合わせとは迅速で、高感度で、非常に特異的なものである。そして通常は、非特異的な核酸による汚染を最小にするために厳密な取り扱いを必要とするが、これらは自動化のための第１の候補となる。通常の核酸検出プロトコルを用いた場合には、一般に、特定の手段によって検出可能な信号生成成分と結合されている検出プローブオリゴヌクレオチド配列を使用することが必要である。可能性のあるプローブ検出系の１つが米国特許４，５８１，３３３号に記述されており、これは参照することによりその全体をここに引用する。
【００１８】
加えて、増幅されていないもしくは増幅された核酸を標的とする核酸検出システムの自動化、もしくは組み合わせられた自動化増幅／検出システムは、一般には、特定の形態の固体担体系に結合している核酸キャプチャーオリゴヌクレオチドを使用するように適応させることができる。このような結合および固体担体への核酸の結合方法の例は米国特許５，４８９，６５３号および５，５１０，０８４号にあり、これらの両者を参照することによりここに引用する。
【００１９】
増幅、検出、並びに増幅と検出とを組み合わせた自動化は、そのアッセイに関する複数のユーザー相互のやり取りを減らすためにも望ましい。試験材料を光学的に分析するための装置および方法が、例えば米国特許５，１２２，２８４号（これを参照することによりその全体をここに引用する）に記載されている。自動化は、一般に、臨床でのアッセイの処理に対してより経済的で、効率的で、再現性が高く、かつ正確であると信じられている。このように核酸検出の優れた感度および特異性を有することから、核酸配列の増幅を使用することおよびアッセイプロトコルの１以上のフェーズで自動化することは、そのアッセイプロトコルの有用性および臨床環境における有用性を高めることができる。
【００２０】
４．内部対照配列（Internal Control Sequence ）の利点
核酸の増幅は反応条件に対して非常に敏感であり、試料中のいかなる特定の核酸配列をも増幅および／または検出できないことは、所望の標的配列が存在しないことと同時に、増幅プロセスにおける過失によるものである可能性が高い。増幅反応が反応条件に対して敏感であることは周知であり、一般に、同時に処理される別の反応容器での既知の核酸標的とプライマーとの対照反応を含めることが必要となる。しかして、この試験反応混合物に添加される内部対照配列は、その対象となる試験反応混合物における増幅プロセスを成功に導くために正しく調節されるであろうし、これが最も有用なこととなる。米国特許５，４５７，０２７号（これを参照することによりその全体を引用する）は、結核菌についての等温増幅反応における内部オリゴヌクレオチド標準として有用な特定の内部対照配列を教示する。
【００２１】
しかしながら、標的微生物、宿主微生物に存在する核酸配列、または正常なフローラ中もしくは環境中に存在する核酸配列の影響を受けないように特にあつらえられた、様々な増幅手順の内部対照として有用である内部対照配列を得る一般的な方法があれば極めて有用である。一般には、そのよう内部対照配列は、その内部対照配列の増幅および検出を妨げる、ヒト、病原微生物、正常なフローラ中の微生物、もしくは環境中の微生物を含む臨床的な環境中に存在するいかなる核酸配列とも実質的に類似するべきではない。
【００２２】
５．１回のアッセイにおける２つ以上の核酸配列の検出
一般には、核酸配列を検出するための１回のアッセイ反応は１つの標的核酸配列の検出に限定される。この標的が１つという制限は、臨床診断アッセイおよび対照反応の検証を行うのに必要となるコストおよび時間を増大させる。１回のアッセイを用いて試料中の２つ以上の核酸配列の検出を行うことは試料分析の効率を大きく高め、コストを下げるものであって、例えば複数の臨床アッセイの必要性を減らすのを助け、非常に経済的にも有益なものとなる。
【００２３】
１回のアッセイにおいて複数の分析物を検出することは、例えば国際特許公開ＷＯ８９／００２９０号およびＷＯ９３／２１３４６号（これらの両者を参照することによりその全体をここに引用する）におけるもののように分析物の抗体検出に適用されている。
【００２４】
必要とされるコスト、時間を減少させることに加えて、１回のアッセイにおける２つ以上の核酸標的配列の検出は、間違った結果となる機会を低減させる。特に、多重検出は内部対照配列を用いることの有用性と利得とを大きく高め、陰性結果を迅速に立証することを可能にする。
【００２５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、以上のべた従来技術の問題点を解決するためのものであり、以下に詳しく説明する。
【００２６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、試験しようとする試験試料中の特定の核酸配列の自動化等温増幅および検出方法であって、
ａ）試験しようとする試験試料を第１の反応容器中でバッファ、遊離ヌクレオチドの混合物、特定のオリゴヌクレオチドプライマー、および、必要により、熱安定性核酸重合酵素とを組み合わせ、かつ該反応容器を自動装置内に収容し、該自動装置では次のようにして増幅および検出を行う、；
ｂ）自動装置は、必要であれば、第１の反応容器を、試験しようとする試料中の核酸を変性させるのに十分な温度に、かつ十分な時間加熱し；
ｃ）自動装置は、オリゴヌクレオチドプライマーが標的核酸に特異的にアニールすることができるように第１の反応容器を冷却し；
ｄ）自動装置は、反応混合物を第１の反応容器から第２の反応容器に移し、該反応混合物を熱不安定性核酸増幅酵素と接触させ；
ｅ）自動装置は、第２の反応容器の温度を、核酸のプライマー介在増幅を可能にする温度に維持し；
ｆ）自動装置は、第２の反応容器中の増幅した核酸を、試験しようとする核酸に特異的なキャプチャー核酸と接触させ、それらが特異的に結合した核酸−キャプチャープローブ複合体を形成するようにし；
ｇ）自動装置は、必要により、特異的にキャプチャーされた増幅核酸を洗浄し、非特異的に結合した核酸が特異的に結合した核酸−キャプチャープローブ複合体から洗い落とされるようにし；
ｈ）自動装置は、特異的に結合した核酸−キャプチャープローブ複合体を、増幅した核酸に対して特異的な標識核酸プローブと接触させ、該特異的に増幅した核酸と該標識核酸プローブとの間に複合体を形成するようにし、；
ｉ）自動装置は、該特異的に結合した核酸−キャプチャープローブ−標識プローブ複合体を洗浄し、非特異的に結合した標識プローブ核酸が特異的に結合した複合体から洗い落とされるようにし；
ｊ）自動装置は、該特異的に結合した複合体を信号を生じさせるものを含む溶液と接触させ、標識核酸プローブ間の検出反応が該溶液と核酸に結合した標識との間で生じ、検出可能な信号が試料中の特異的に結合した増幅核酸の量に比例して試料から生じるようにし、ここで、工程ｈ、ｉ、およびｊは順次に、または同時に行ってもよいものであって；
ｋ）自動装置は、該信号を検出し、必要により、該信号の値を表示するか、または必要により該信号の値を記録する、
こととを備える方法を含む。
【００２７】
ここで用いられる、試験試料には、生存する患者から、生存してはいない患者から、表面、気体、真空吸引器もしくは液体から、体表面もしくは体腔に由来する組織、体液、スワブから、および類似のあらゆる源から採取される試料が含まれる。ここで用いられるバッファという用語は、標識（例えば、活性にとって適切な温度で処理し、必要に応じて適切な酵素基質および鋳型を加える際にそのようなバッファ中に加えられる酵素）の有効な活性をサポートすることができる適切な処方のバッファを包含する。特異的なオリゴヌクレオチド核酸プライマーという用語は、対象となる標的核酸に実質的に相補的であってそれに特異的にハイブリダイズ／アニールする核酸配列を有するオリゴヌクレオチドであり、必要により、ＲＮＡポリメラーゼによって認識されるプロモーター配列を有していてもよいオリゴヌクレオチドを意味する。反応容器という用語は、化学反応を行うことが可能であり、かつ、好ましくは、−８０℃ないし１００℃のいずれの温度にも耐えることが可能な容器を意味する。
【００２８】
本発明では、さらに、反応バッファが統合バッファであってそれが核酸の変性および核酸のアニーリングに適するものであり、さらに核酸の重合酵素および増幅酵素の酵素活性を持続させることが可能である上述の方法をも提供する。さらに、核酸増幅酵素が第２の反応チャンバに凍結乾燥ペレットの形態の１回のアッセイ用の量で導入されており、かつその反応チャンバが増幅工程の前に密封されている方法が本発明に包含される。
【００２９】
本発明は、２つ以上の核酸標的配列またはアンプリコンの自動検出のための装置であって、キャプチャー核酸オリゴヌクレオチドが少なくとも２つの異なる区域に被覆されている固相の受容部（ＳＰＲ（登録商標）ピペット様装置）を備える装置を開示する。
【００３０】
本発明は、２つ以上の核酸標的配列を自動検出するための方法であって、１つもしくは複数の区域で、少なくとも２種類の異なるキャプチャー核酸オリゴヌクレオチドが被覆されている固相の受容部（ＳＰＲ（登録商標）ピペット様装置）と、試験しようとする試料とを接触させ、特異的に結合したプローブからの信号を検出することを包含する方法を教示する。本発明の一態様においては、ＳＰＲ（登録商標）は、異なる核酸配列標的に対して特異的なキャプチャー核酸オリゴヌクレオチドが２つの異なる区域に被覆されている。本発明の別の態様においては、ＳＰＲ（登録商標）は、標的核酸配列のための少なくとも１種のキャプチャープローブと、それが検出された場合には増幅が生じたことが確認される増幅対照核酸配列のためのキャプチャープローブとが被覆されている。
【００３１】
また、本発明は、ＲＩＣ１の核酸配列を含むランダムに生成された内部増幅陽性対照核酸と、ＲＩＣ２の核酸配列を有する別の内部増幅陽性対照核酸とをも包含する。
【００３２】
また、本発明は、ＣＲＩＣ−２、ＧＲＩＣ、ＭＲＩＣ、およびＨＲＩＣの核酸配列を有する内部増幅陽性対照核酸をも包含する。
【００３３】
さらに、本発明は次に示す内部増幅陽性対照核酸を生成する方法を含み、該内部増幅陽性対照核酸は、少なくとも１０ヌクレオチドの長さのランダムな核酸配列を生成し、該ランダムな核酸配列をスクリーニングして特定の機能性について選択し、該機能的に選択された多数の核酸配列を直列に結合し、結合した核酸配列をスクリーニングし、必要により、鎖内核酸二量体の形成またはヘアピン構造の形成に対して選択して得られる。
【００３４】
【発明の実施の形態】
ここで、本発明の好ましい態様を添付の図面と連携させて説明する。これらの図面においては、同じ参照番号は様々な観点からの同じ要素を示す。
【００３５】
以下の例は、本発明の範囲を限定しようとするものではなく、本発明の特定の態様をより十分に説明するために提供されるものである。
【００３６】
例１．一回適用量の試薬および統合バッファ
ＶＩＤＡＳとオンラインの状態での、もしくは別々の装置におけるオフラインの状態での（ＶＩＤＡＳ装置で検出する）ＴＭＡ反応を実施（参照することにより引用される米国特許５，４３７，９９０号を参照）するには、この反応をマニュアル操作で行うために用いられる化学薬品を改変する必要がある。第１にバルクのパッケージ化試薬を一回適用量のアリコートに変更しておかなければならず、第２に反応のバッファ成分は単一の包括的多機能性統合バッファ溶液を形成するように変更されていなければならない。
【００３７】
現在のマニュアル操作の技術の下では、試薬は複数回のアッセイ量の凍結乾燥「ケーキ」として調製されている。したがって、増幅試薬および酵素試薬はバルクの形で再構成し、個々のアッセイ用に小分けしなければならない。
【００３８】
したがって、ＶＩＤＡＳシステムでのＴＭＡの自動化は、試料を希釈すること、核酸を変性すること、核酸をアニーリングすること、および所望の酵素活性をサポートする単一の統合バッファ中に再懸濁することができる凍結乾燥した反応成分の一回適用量のペレットを用いることにより、上述のマニュアル操作による方法を改善することができる。
【００３９】
Ａ）統合バッファおよび一回適用量の試薬
一回適用量の増幅試薬の実現可能性を試験するため、バルク試薬である標準的なクラミジアＴＭＡ増幅試薬および酵素試薬（ジェン−プローブ社）を０．７５ｍｌの水で再構成した。水で再構成した増幅試薬もしくは酵素試薬のいずれか（すなわち、一回適用量のアリコート）１２．５μｌを微量遠心管に小分けした。これらの管を低温加熱しながら真空遠心して水を除去した。この手順で得られた最終結果は、管底部に酵素もしくは増幅試薬のいずれかの少量の乾燥ケーキを収容する微量遠心管となった。
【００４０】
この例において用いられる組み合わせ統合バッファは、標準的な市販のジェン−プローブ社のサンプル希釈バッファ（ＳＤＢ）、増幅再構成バッファ（ＡＲＢ）、および酵素希釈バッファ（ＥＤＢ）を２：１：１の比で組み合わせたものであった。乾燥した増幅試薬の微量遠心管の各々に、この組み合わせ統合バッファ１００μｌおよび陽性対照核酸（＋）を添加し、１００μｌのシリコーン油で覆った。次に、この管を９５℃で１０分間加熱した後、４２℃に５分間冷却した。次いで、合計容量２００μｌを乾燥酵素試薬を収容する管に移した。その後、これらを穏やかに混合して酵素試薬を再懸濁させ、その溶液を４２℃で１時間加熱した。
【００４１】
対照反応液を、ジェン−プローブキットに添付の指示に従って通常の１．５ｍｌのＡＲＢもしくはＥＤＢで再構成されたジェン−プローブ対照試薬を用いて調製した。対照反応液の各々において、２５μｌの再構成した増幅試薬を陽性対照核酸（＋）を含むＳＤＢ  ５０μｌと組み合わせた。この混合物も９５℃に１０分間加熱した後、４２℃に５分間冷却した。これに２５μｌの再構成した酵素試薬を添加し、４２℃で１時間インキュベートした。陰性対照には核酸を含めなかった。
【００４２】
次に、試験統合バッファ反応液（統合）および標準対照反応液（対照）の両者をジェン−プローブ社の標準ハイブリダイゼーション保護アッセイ（Hybridization Protection Assay 、ＨＰＡ）プロトコルに処した。簡単に述べると、１００μｌのトラコーマ病原体（Chlamydia trachomatis ）特異的核酸プローブを各管に添加し、６０℃で１５分間ハイブリダイズさせた。その後、３００μｌの選別試薬を各管に添加し、ハイブリダイズしたプローブおよびハイブリダイズしないプローブの差別的加水分解を１０分間行った。次いで、これらの管をジェン−プローブ社のリーダー（Leader）５０ルミノメータで読み取り、下記表１に示されるように、得られたデータを標識から検出される相対光単位（Relative Light Unit 、ＲＬＵ）として記録した。データはＲＬＵ、トラコーマ病原体（C. Trachomatis）ＴＭＡ／ＨＰＡ反応として報告した。
【００４３】
【表１】
0004526609.tif 000002
【００４４】
表１のデータは、乾燥した増幅試薬および酵素試薬の一回適用量アリコートを用いた場合に、比較に値する結果が得られることを示す。加えて、このデータは、試薬の再懸濁および反応を実行するために、３種類の別々のバッファ（ＡＲＢ、ＥＤＢおよびＳＤＢ）と、単一の統合組み合わせバッファ（２：１：１の比率で組み合わされたＳＤＢ、ＡＲＢおよびＥＤＢ）とを用いて、それらの結果が比較に値するものであったことを示す。
【００４５】
Ｂ）一回適用量の試薬のペレット化
試薬の一回適用量の小分けを簡素化するため、これらの試薬を一回適用量アリコートにペレット化することを可能にする方法を用いた。簡単に述べると、試薬ペレット（もしくはビーズ）は、選択した試薬の水溶液（Ｄ（＋）トレハロース（α−Ｄ−グルコピラノシル−α−Ｄ−グルコピラノシド、ファンスティール・ラボラトリーズ社（Pfanstiehl Laboratories, Inc. ）、ウォーケガン、ＩＬから購入）のような適切な賦形剤と組み合わされている）を低温ストック液に小分けした後、昇華を用いてペレットから水を除去することにより作製することができる。試薬／トレハロース混合物を極低温の液（滴）に小分けすると、球状の凍結ペレットが形成される。次いで、これらのペレットを、真空サイクルの間に凍結水分子が昇華する凍結乾燥器に入れる。この手順の結果は少量の安定なフレーク状でない試薬ペレットが得られ、これは適切なパッケージに分配することができる。ＲＴ、Ｔ７および糖を含む試薬の一回適用量アリコートペレットを広範囲の温度に処してペレットの安定性を調べた。試験温度で１０分間処した後、これらのペレットをＣＴ増幅に用いた。それらの結果を図１にグラフとして表示する。これらの結果は、一回適用量試薬ペレットが高温に１０分間晒した後であっても安定のままであることを示す。
【００４６】
トレハロース中における乾燥した酵素の顕著な安定性は従来報告されており（Colacoら、1992、Bio/Technology,10,1007）、これには、関心の的になっているタンパク質の長期安定化に関する研究において再び関心が集まっている（Franks、1994、Bio/Technology,12,253 ）。得られた増幅試薬および酵素試薬のペレットをトラコーマ病原体（C.Trachmomatis）ＴＭＡ／ＨＰＡ反応に用いることにより試験した。
【００４７】
調製した増幅ペレットを管に入れ、これに陽性対照核酸を含むＡＲＢおよびＳＤＢの混合物（１：２の比で混合）７５μｌを添加した。次いで、この試料を９５℃で１０分間加熱した後、４２℃で５分間冷却した。これに、標準的なジェン−プローブ社の手順を用いて再構成した酵素試薬２５μｌを添加した。この混合物を４２℃で１時間インキュベートした。次に、これらの反応物を上述のようにＨＰＡ法により分析した。この試験の結果を表２にＲＬＵとして報告し、ＡＭＰペレット（＋）と表示する。上記と同様に、陰性対照反応液は核酸なし（−）で実行する。
【００４８】
調製した酵素ペレットを、陽性対照核酸を含むＳＤＢと、ＥＤＢと、標準の再構成した増幅試薬とを（２：１：１の比率での）組み合わせたもの１００μｌを９５℃で１０分間加熱した後、４２℃で５分間冷却することにより試験した。この反応混合物の総容量を、調製した酵素ペレットに添加した。ペレットを溶解した後、この反応物を４２℃に１時間加熱し、次いで上述のようにＨＰＡ分析に処した。この試験の結果をＲＬＵとして下記表２に報告し、酵素ペレット（＋）と表示する。対照反応液は標準手順に従う標準的なジェン−プローブ社の試薬を用いて調製した。データを、ＲＬＵ、標準のトラコーマ病原体（C. Trachomatis）ＴＭＡ／ＨＰＡ反応として報告する。
【００４９】
【表２】
0004526609.tif 000003
【００５０】
表２のデータは、標準的なジェン−プローブ社の試薬、または乾燥し調製した一回適用量の増幅試薬ペレットもしくは酵素試薬ペレットを用いた際に、大きな相違がないことを示す。したがって、試薬の一回適用量のアリコートは、ＶＩＤＡＳシステムを用いる自動化への適用に対して単一統合バッファと共に用いるのに適している。
【００５１】
例２．熱不安定性酵素を用いる自動等温増幅
ＶＩＤＡＳ装置（バイオメリュー  ヴァイテック社）のような臨床アッセイ装置で用いられる等温増幅アッセイ反応を自動化するため、新規なデュアルチャンバ反応容器は、スタンドアロン型処理ステーションとの組み合わせで用いることができる試験試料の等温増幅アッセイにおいて、上述の統合バッファと一回反応アリコート試薬ペレットとを用いることができるように設計されている。
【００５２】
Ａ）デュアル反応チャンバ
２つのチャンバの使用は、熱安定性の試料／増幅試薬（特定のプライマーおよび核酸を含む）を熱不安定性の酵素性成分（すなわち、ＲＮＡ逆転写酵素、ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡアーゼＨ）から分けておくことを容易にする。
【００５３】
図３は、本発明の１つの可能な態様によるＴＭＡ反応を行うための使い捨てデュアルチャンバ反応容器１０およびそれに関連する加熱工程を模式的に示すものである。チャンバＡは増幅混合物、すなわち、ヌクレオチド、プライマー、ＭｇＣｌ2 、並びに他の塩やバッファ成分を収容する。チャンバＢは増幅反応を触媒する増幅酵素、例えば、Ｔ７および／またはＲＴを収容する。標的（または患者の試料）をチャンバＡに添加した後、チャンバＡを加熱してＤＮＡ核酸標的を変性させ、および／またはＲＮＡの二次構造を取り除く。次いで、チャンバＡの温度を下げてプライマーをアニールさせる。続いて、チャンバＡの溶液をチャンバＢと接触させる。この時点で互いに液通にあるチャンバＡおよびＢを増幅反応に最適の温度、例えば４２℃、に維持する。チャンバＡをチャンバＢから空間的に分離し、変性のためにチャンバＡのみを加熱することにより、チャンバＢ内の熱不安定性の酵素は変性工程の間の不活性化から保護される。
【００５４】
図４は本発明の代わりの形態を模式的に示すものであり、２つの別々の反応チャンバ１２および１４が組み合わされてデュアルチャンバ反応容器１０を形成する。図３の態様と同様に、製造工程の間にチャンバＡに増幅用混合物、すなわち、ヌクレオチド、プライマー、ＭｇＣｌ2 並びに他の塩やバッファ成分を前もって導入しておく。製造する間に、チャンバＢに、増幅反応を触媒する増幅酵素、例えば、Ｔ７および／またはＲＴを前もって導入しておく。次に、液体試料をチャンバＡに導入する。これらの標的を変性させるためにチャンバＡは９５℃に加熱される。チャンバＡを４２℃に冷却した後、チャンバＡ内の溶液をチャンバＢ内の酵素と接触させ、等温増幅反応を誘発する。
【００５５】
チャンバＡおよびＢの内容物を接触させた後に、増幅チャンバが周囲の環境との間でいかなる物質の交換をも許容しないように反応容器が設計される場合、非相同の標的との増幅反応またはそれ以前の反応からの増幅産物で汚染される危険性を最小にする、閉じた系での増幅が実現される。
【００５６】
図５は２つの代わりのデュアルチャンバ反応容器１０および１０′を模式的に示すものであり、これらは、本発明の好ましい態様に従って固相の受容部と光学機器とで処理するための試験ストリップ１９にはめ込まれる。図３〜５の態様においては、一定方向の流動システムが導入される。まず、試料は変性温度に加熱するためにチャンバＡに導入される。チャンバＡは乾燥増幅試薬混合物１６を収容している。冷却した後、その液体をペレットの形態の乾燥酵素１８を収容するチャンバＢに移す。液体試料をチャンバＢに導入した後、チャンバＢは４２℃に維持される。チャンバＢにおいて最適反応温度（例えば、４２℃）で増幅反応が起こる。反応が完結してから、試験ストリップ１９を、本発明の譲受人であるバイオメリュー  ヴァイテック社から入手可能なＶＩＤＡＳ装置のような機器で処理する。当該技術分野における熟練者はＶＩＤＡＳ装置に習熟している。
【００５７】
チャンバＡの加熱および冷却工程は、デュアルチャンバ使い捨て反応容器１０もしくは１０′を試験ストリップ１９に挿入する前に行うことが可能であり、あるいは、その代わりに、反応チャンバＡを適切に温度制御するために試験ストリップ１９の左手端部２４に隣接して適切な加熱エレメントを配置することもできる。以下に説明される図６〜１６のスタンドアロン型増幅処理ステーションには、反応容器１０を適切に温度制御するために適切な加熱エレメントおよび制御システムが組み込まれている。
【００５８】
図６は、デュアルチャンバ反応容器１０″の代替態様を、図５に上述されるもののような試験ストリップ１９に配置される、組み合わせデュアルチャンバ容器１０″と共に模式的に示すものであり、このデュアルチャンバ容器１０″は、一方のチャンバの流体試料が他方に流動することを許容するような様式で組み合わせられている別々の２つの連結される容器１０Ａおよび１０Ｂから形成されている。液体試料を、乾燥増幅試薬混合物１６を収容するチャンバＡに導入する。次に、容器Ａを取り外した状態で９５℃に加熱した後、４２℃に冷却する。２つの容器ＡおよびＢを、チャンバＢの突起２６とチャンバＡの凹状溝との管の相補的かみ合わせ表面の間を通常するようにはめ込むことにより一体にする。矢印３０で示されるようにこれらの２つのチャンバは互いに液的に連通するため、チャンバＡからの試料溶液とチャンバＢからの酵素との混合が起こる。その後、この組み合わせられたデュアルチャンバ使い捨て反応容器１０″中において、取り外した状態で、またはこの組み合わせ使い捨て容器１０″を改変したＶＩＤＡＳストリップにはめ込むことにより取り付けた状態で、試料を増幅させることができる。ＶＩＤＡＳ装置は増幅反応の検出を既知の様式で行うことができる。
【００５９】
Ｂ）増幅ステーション
図７は、本発明の現時点で好ましい形態に従うデュアルチャンバ反応容器を有する試験ストリップ１９のためのスタンドアロン型増幅処理システム２００の斜視図である。このシステム２００は２つの等しい増幅ステーション２０２および２０４、電源モジュール２０６、制御回路モジュール２０８、真空タンク２１０および電源モジュール２０６へのコネクタ２１２からなる。タンク２１０は、第１のチャンバから第２のチャンバへの流体の移送を容易にするために上述の様式で増幅ステーション２０２および２０４、および最終的には複数の真空供給パイプ（ストリップ当たり１本）に真空を供給するホース３２０および３２４を有する。この真空サブシステムは図１６に関連させて以下に説明する。
【００６０】
増幅ステーション２０２および２０４は、各々、ストリップの少なくとも一つを受け入れ、また、ストリップの反応ウェルを適切な温度に加熱し、流体をデュアルチャンバ反応ウェルの第１のチャンバから第２のチャンバに移送し、およびシンブルバルブ（弁）もしくは、好ましくはボールバルブのようなバルブを始動させて流体通路を開放して２つのチャンバ間を流体が流動することを可能にするための関連する温度制御、真空およびバルブ始動サブシステムを有するトレイを有する。
【００６１】
ステーション２０２および２０４は、患者の、もしくは臨床的試料が上述のデュアルチャンバ反応容器の第１のチャンバに添加された後に自動化された方式で増幅反応を行うためのスタンドアロン型増幅ステーションとして設計されている。ＳＰＲによる反応が完結した後のストリップの処理はＶＩＤＡＳ装置のような別の機械において行われる。具体的には、ストリップをステーション２０２および２０４に配置してそれらのステーションで反応を実行した後、ストリップをステーション２０２および２０４から取り外してＶＩＤＡＳ装置に入れ、既知の方法により続けて処理と分析を行う。
【００６２】
システム２００の全体は、増幅システムインターフェースボード（図７には示さず）によるマイクロプロセッサの制御下にある。この制御システムは図１４にブロック図として示されており、後に説明する。
【００６３】
図８を参照すると、増幅ステーション２０２の１つが斜視図で示されている。
他の増幅ステーションは同じ設計および構成のものである。図９は図８のモジュールの前面の斜視図である。
【００６４】
これらの図を参照すると、このステーションは、真空供給パイプスライドモータ２２２および真空供給パイプスライドカムホイール２４６を備え、これらは、一組の真空供給パイプ２４４（図７に示される）を真空供給パイプスライド２４６に対してシンブルバルブを上下に摺動させて、シンブルバルブを開放し、真空を供給して流体が反応容器１０の第１のチャンバから第２のチャンバに吸引されるように作動する。真空供給パイプ２４４は真空供給パイプスライド２４６に備えられる環状凹部内を往復運動する。トレイ上に装着された際に、試験ストリップにおいてピン構造および対応する構造を有する真空供給パイプ２４４の適切な組み合わせが必要であることが明らかである。
【００６５】
ステーションは、ステーション２０２の枠を形作る側壁２２８および２３０を有する。トレイコントローラボード２２９はこの側壁２２８および２３０の間に載置される。ステーション２０２の電子モジュールはトレイコントローラボード２２９上に据え付けられる。
【００６６】
一組のトレイ熱遮断カバー２２０は熱サブシステムの一部であり、１つ以上の試験ストリップを受け入れるトレイ２４０（図９）を覆うために提供される。熱遮断カバー２２０はトレイ２４０の温度を適切な温度に維持するのを助ける。熱サブシステムは４２℃ペルチェヒートシンク２４２をも含み、その一部は試験ストリップ内のデュアルチャンバ反応容器の第２のチャンバに隣接して位置し、そのチャンバを酵素増幅反応に対して適正な温度を維持する。試験ストリップ内の反応ウェルの第１のチャンバを変性温度に維持するため、９５℃ヒートシンク２５０がトレイ２４０の前面に設けられている。
【００６７】
図１０は図９のモジュールの別の斜視図であり、９５℃ヒートシンク２５０および一組のフィン２５２を示す。９５℃ヒートシンク２５０はトレイ２４０の前面かつ僅かに下方に位置することに注意されたい。４２℃ヒートシンク２４２はヒートシンク２５０の背後に位置する。
【００６８】
図１１は、上記から理解される試験ストリップ（図示せず）を保持するトレイ２４０の一部の詳細な斜視図である。トレイ２４０は、基部２５４と、試験ストリップを受け入れるための凹状スロット２５８を備える複数の不連続で起立した平行なリッジ構造２５６とを有する前方部を含む。トレイ２４０の前方２５４の基部は９５℃ヒートシンク２５０と接触する。位置２５６Ａおよび２５６Ｂで平行に起立するリッジ２５６の側壁は、熱抵抗を減少させるため、図３の反応容器１０の第１および第２チャンバのできる限り近くに配置される。トレイ２４０後方の基部は、図１０において最もよく分かるように、４２℃ペルチェヒートシンクに接触する。トレイ後方の位置２５６Ｂの起立したリッジはトレイ前方の位置２５６Ａから物理的に分離されており、位置２５６Ｂは試験ストリップ内の反応容器の第２チャンバが適切な温度に保たれるように４２℃ヒートシンクと接触している。
【００６９】
さらに図１１を参照すると、真空供給パイプ２４４はゴムガスケット２６０を有する。真空供給パイプ２４４が真空供給パイプモータ２２２（図８）によって下降すると、ガスケット２６０は、緊密に密封して真空系が第２チャンバ上に下降することが可能となるように、試験ストリップの上面でデュアルチャンバ反応容器内の真空ポートを取り巻くように配置されている。
【００７０】
図１２は、図１１の試験ストリップホルダ、すなわちトレイ２４０を分離した斜視図であり、トレイ２４０に据え付けられた２つの試験ストリップを示している。トレイ２４０は、同時に処理するために６つまでの試験ストリップ１９を受け入れる複数のレーンもしくはスロット２４１を有する。図１２は、トレイ２４０およびリッジ２５６のそれぞれの部分を適切な温度に維持するためのヒートシンク２４２および２５０を示している。
【００７１】
図１３は、下記から理解される試験ストリップホルダ、すなわち２４０の詳細な斜視図である。トレイ２４０の後方部の下方の後部ヒートシンク２４２をよりよく説明するため、前方部２５４の下方に位置する９５℃ペルチェヒートシンクが取り外されている。
【００７２】
図１４は、図７の増幅処理システムの電気系および制御システムのブロック図である。この制御システムは２つのボード３１０および３１１に分割され、この図の頂部の区画Ａ３１０は増幅モジュール、すなわちステーション２０２に充てられており、他方のボード３１１（区画Ｂ）は他のモジュール２０４に充てられている。これらの２つのボード３１０および３１１は同一であり、頂部区画３１０のみについて説明する。これらの２つのボード３１０および３１１は増幅ステーションインターフェースボード３００に接続されている。
【００７３】
このインターフェースボード３００は高速データバス３０２を介してスタンドアロン型パーソナルコンピュータ３０４と接続されている。パーソナルコンピュータ３０４は、ハードディスクドライブ、ビデオモニタ等を備える通常のＩＢＭ互換コンピュータである。好ましい態様において、ステーション２０２および２０４はこのインターフェースボード３００による制御下にある。
【００７４】
ステーション２０２用のボード３１０は、トレイ２４０の前方部２５４に組み込まれている２つのペルチェヒートシンクモジュール、一対のファンおよび温度センサによって９５℃の温度に維持される前方トレイ２４０を制御する。トレイの後部は、２つのペルチェモジュールおよび温度センサによって４２℃に維持される。真空供給パイプ２４４の移動は供給パイプモータ２２２によって制御される。真空供給パイプ２４４の位置に関してトレイコントローラボードに入力信号を付与するため、位置センサが備えられている。トレイコントローラボード３１０は、温度センサおよび位置センサからのデータを受信し、アクティブ構成要素、すなわちモータ、ファン、ペルチェモジュール等に命令を発する、システムのアクティブおよびパッシブ構成要素用の一組のドライバ３１２を含む。これらのドライバは増幅インターフェースボード３００からのコマンドに応答する。また、このインターフェースボードは、図示されるように、真空サブシステムのための真空ポンプにも命令を発する。
【００７５】
図１５は、図７の増幅処理ステーション２０２および２０４のための真空サブシステム３２０の図である。このサブシステムは１リットルのプラスチック製真空タンク２１０を含んでおり、これはタンク２１０に真空を発生させるための真空ポンプ３２３へ吸引ライン３２０を介して接続している。真空供給ライン３２４は、一対のピンチソレノイドバルブ２２４（図８を参照）へ供給ライン３２４Ａおよび３２４Ｂを介して真空を供給するために備えられている。これらの真空供給ライン３２４Ａおよび３２４Ｂは、真空供給パイプ２４４に真空を分配する多分岐管２２６に真空を供給する。ストリップ１９を覆うフィルムもしくは膜６４を穿孔するための真空供給パイプ２４４の先細の先端２４５に注意されたい。また、真空システム３２０は、タンク２１０内の真空状態を監視するための示差圧変換器（Differential Pressure Transducer）３２１をも有する。この変換器３２１は圧力信号を図１４のインターフェースボード３００に供給する。
【００７６】
図１６は、図７のステーションの熱サイクルの概要を示すグラフである。線４００に示されるように、１分未満の時間で持続する温度の最初の上昇４０２の後、第１の温度Ｔ１に到達し（例えば、変性温度）、これは所定の時間、例えば５−１０分間維持され、その時に反応容器の第１チャンバ内で反応が生じる。その後、４０４で示されるように温度の下降が生じ、反応容器１０の第１チャンバ内の反応溶液の温度が温度Ｔ２に冷却される。温度Ｔ２に冷却され、指定された時間の経過後、第１チャンバ内の溶液が第２チャンバに移され、流体の移動が生じる。対象である反応のための適切で充分な時間、例えば１時間Ｔ２の温度に維持される。時間４０６で、増幅反応を停止させるため、６５℃の温度である温度Ｔ３に急速に上昇させる。ＴＭＡ反応については、時間４０６から時間４０８への上昇時間が短いこと、すなわち２分未満、好ましくは１分未満であることが重要である。好ましくは、温度の上昇および下降の全ては１分未満である。
【００７７】
反応容器および増幅ステーションの構成要素の他の態様も想起されるが、そのような代替態様は本願開示に包含される。
【００７８】
例３  結核菌（Mycobacterium tuberculosis、Ｍ．ｔｂ）の非増幅検出および増幅検出のための自動化ＶＩＤＡＳ試験
４２℃に改変されたＶＩＤＡＳ装置（バイオメリュー  ヴァイテック社）を用いて、我々は、試験試料中のＭ．ｔｂの検出ための、短時間で完了させることが可能な臨床検査室向けのインラインの簡潔な迅速核酸増幅および検出アッセイを開発した。このアッセイ全体は単一の試験ストリップで行うことが指示されており、これにより標的またはアンプリコンの汚染の可能性を最小にすることができる。この増幅に基づくアッセイはＭ．ｔｂの検出が可能であり、これは、ジェン−プローブの市販キットによって達成される感度と同様の僅か５個の細胞しか含まないような試料でも可能となる。
【００７９】
この増幅に基づくアッセイは、ｒＲＮＡの独特な配列を標的とする等温転写介在増幅（ＴＭＡ）、続いてＶＩＤＡＳ装置でのハイブリダイゼーションと、核酸プローブ（アンプリコン）の酵素結合の蛍光検出とを用いる。
【００８０】
この増幅／検出アッセイは、１試験当たり約１ｆｇのＭ．ｔｂ  ｒＲＮＡすなわち１個以下のＭ．ｔｂ微生物を検出することが可能であり、Ｍ．ｔｂの全てのメンバーに対して特異的である。Ｍ．ｔｂを検出するための特異的プローブは、C.Mabilat,1994,J.Clin.Microbiol.,32,2707に記載がある。
【００８１】
抗酸性の桿菌（バチルス）の標準スミアは診断ツールとして常に信頼できるものではなく、陽性の場合であってもＭ．ｔｂ以外のマイコバクテリアである可能性がある。現在、結核を診断するための標準的な方法は成長が遅い細菌の培養を必要とし、６週間、もしくはそれ以上かかることがある。この期間、患者は通常隔離される。当初の結果は、この自動化試験がこの培養法の臨床的感度と一致するか、もしくはこれを越えるもので、感染試料中のＭ．ｔｂを迅速に（３時間未満で）検出する非常に高感度の方法を提供し、それにより迅速な診断、隔離および治療の助けとなるというものであった。
【００８２】
Ａ）試料調製
４５０μｌの容量の検体をガラスビーズを収容する溶解管内のサンプル希釈バッファ５０μｌに添加し、室温で１５分間超音波処理して微生物を溶解し、９５℃で１５分間加熱し不活性化する。必要であれば、標準キット試薬を用いるキットの指示に従い、市販のマニュアル操作アッセイキット（ジェン−プローブ社）の通りに等温増幅を行う。しかしながら、上述の例において説明したように、改変した成分を用いて同様のアッセイを行うことが可能である。
【００８３】
Ｂ）検出
自動化検出アッセイを行うためには、検出システムは、固体担体（ＶＩＤＡＳシステムにおいては「固相の受容部」ＳＰＲ（登録商標）ピペット様装置と呼ばれる）および標識検出プローブ核酸（例えば、標識はアルカリホスファターゼ、化学発光シグナル化合物、もしくは結合したプローブの特異的な検出を可能にする他の試薬であり得る）に結合する特異的キャプチャー核酸に対する標的核酸またはアンプリコンのハイブリダイゼーションを必要とする。
【００８４】
ＶＩＤＡＳのような自動化システムにおいては、未結合のプローブを除去するための幾つかの洗浄工程の後、ＳＰＲ（登録商標）がプローブ−標的ハイブリッドを酵素基質に移送し、それにより結合したプローブから検出可能な信号を誘発してアッセイ装置により検出する。一つの態様においては、検出プローブはアルカリホスファターゼに結合しており、一旦、基質、メチルウンベリフェリルホスフェート（ＭＵＭＰ）と接触すると、その基質はアルカリホスファターゼにより４−メチルウンベリフェロン（４−ＭＵ）に変換される。４−ＭＵは蛍光を生じ、それが標準ＶＩＤＡＳ装置によって検出されて相対蛍光単位（relative fluorescence unit、ＲＦＵ）として記録される。標的核酸が存在しない場合、検出プローブは結合せず、かつ基質は変換されず、したがって蛍光が検出されることはない。
【００８５】
Ｃ）分析感度：対照（Contol）
一般には、対照は、５ｆｇのＭ．ｔｂ  ｒＲＮＡすなわち約１個のＭ．ｔｂ細胞と等価のｒＲＮＡを含む陽性対照をサンプル希釈バッファのマトリックス中に調製する。自動化プローブアッセイの感度は、溶解したＭ．ｔｂ細胞の希釈液を試験することにより決定することができる。細胞溶解物は、一般に、１μｌ白金耳の細胞を用いて調製することができる（従来の力価測定およびコロニー形成単位（ＣＦＵ）実験に基づいて、１μｌ白金耳一杯当たり約１×１０9 ＣＦＵが存在すると仮定することができる）。その後、このＭ．ｔｂ溶解物の希釈液を自動化プローブアッセイを用いて試験することができる。
【００８６】
図２３は、ジェン−プローブキットによるＭ．ｔｂアンプリコンの検出を示すグラフである。図２４は、ＶＩＤＡＳ装置による図２３と同じ反応からのＭ．ｔｂアンプリコンの検出を示すグラフである。
【００８７】
図２５は、改変ＶＩＤＡＳ装置でのＭ．ｔｂ核酸の増幅および検出を示すグラフである。酵素は液体の形で用い、増幅はＶＩＤＡＳアッセイ装置とインラインの状態で行った。
【００８８】
図２６は、二元（バイナリー）／デュアルチャンバ使い捨て反応容器を用いる改変ＶＩＤＡＳ装置でのＭ．ｔｂ核酸の増幅および検出を示すグラフである。変性工程はＶＩＤＡＳ装置とオフラインの状態で行い、増幅およびアンプリコン検出はＶＩＤＡＳ装置とインラインの状態で行った。
【００８９】
例４  トラコーマ病原体（Chlamydia trachomatis 、ＣＴ）の増幅検出のた  めの自動化ＶＩＤＡＳ試験
ＶＩＤＡＳ装置（バイオメリュー  ヴァイテック社）を用いて、我々は、試験試料からトラコーマ病原体（Chlamydia trachomatis 、ＣＴ）を迅速に検出するための簡単で完全に自動化された非常に特異的なアッセイを開発している。この試験は、ｒＲＮＡに特有の配列を標的とする等温ＴＭＡ、次いでハイブリダイゼーションおよび酵素結合の蛍光検出を用いる。この自動化試験は、トラコーマ病原体（ＣＴ）の臨床上重要な血清型亜型（serovar ）を泌尿生殖器の検体から、２時間未満で特異的に検出する。我々は、０．５ｆｇのｒＲＮＡ、すなわちトラコーマ病原体（ＣＴ）の基本小体（elementary body ）の約１／１０に等しい分析感度を得た。２０７例の臨床的子宮頸管内スワブおよび尿についての自動化試験とジェン−プローブの増幅ＣＴとは完全な一致を示した。
【００９０】
トラコーマ病原体（Chlamydia trachomatis 、ＣＴ）感染は米国および欧州における性行為感染症の第１の原因である。米国においては、毎年約４００万の新たなＣＴ感染が生じているものと見積もられている。
【００９１】
トラコーマ病原体（Chlamydia trachomatis 、ＣＴ）は、女性および男性、成人および新生児の両者に感染を引き起こす小さな偏性細胞内寄生体である。ＣＴ感染の制御に対する最も大きな挑戦は、感染女性の７５％および感染男性の５０％もが無症候性であるというものである。これは、ＣＴ感染を伝染させることが可能な無自覚の感染個体が多数蓄積されることになる結果を生じる。ＣＴ感染の迅速かつ簡単な検出は感染個体の識別の大きな助けとなる。
【００９２】
Ａ）患者の検体および試料の調製
コード化された試料（ｎ＝２０７）はＣＴ感染と一致する症状を呈する患者から得た。頸部の試料は、ジェン−プローブの搬送媒体を含有するジェン−プローブの試料収集キットを用いて集め、尿の試料は標準的な尿収集装置に集めた。全ての試料を４℃で保存した。
【００９３】
頸部スワブを４２５×ｇで５分間遠心し、全ての液体を管の底部に沈めた。その後、スワブを４０μｌのジェン−プローブの検体調製試薬で処理し、６０℃で１０分間インキュベートした。次いで、処理した試料２０μｌをピペットで４００μｌのサンプル希釈バッファ（ＳＤＢ）に移した。
【００９４】
尿試料の各々の２ｍｌを３７℃に１０分間加温し、１２，０００×ｇで５分間微量遠心した。上清を廃棄し、３００μｌのサンプル希釈バッファを各検体に添加した。１５種の血清型亜型のＣＴの全てを包括的試料として用い、検体を定量し、各血清型亜型４×１０2 ＩＦＵ／ｍｌ（ｍｌ当たりの封入形成単位、inclusion formation unit）を含む検体２０μｌを４００μｌのＳＤＢに添加した。排他的泌尿生殖器微生物のパネルを得て定量し、２×１０9 ／ｍｌの微生物２０μｌをピペットで４００μｌのＳＤＢに移した。０．５ｆｇのｒＲＮＡすなわち０．１ＣＴ基本小体に等しい量を含む陽性対照をＳＤＢで希釈した。
【００９５】
Ｂ）試料増幅およびＶＩＤＡＳ検出
ＴＭＡプロトコルを用いて試料を増幅し、ｒＲＮＡ標的をＡＭＶＥ共重合体に結合したオリゴマーおよびアルカリホスファターゼに結合したオリゴマーにハイブリダイズさせた。例えば、米国特許５，４８９，６５３号および５，５１０，０８４号を参照のこと。上述のように、固相反応の受容部（ＳＰＲ（登録商標）ピペット様装置）は連続する洗浄工程を通してこの結合されたハイブリッドを保持し、最終的には基質４−ＭＵＰとなる。アルカリホスファターゼはこの基質を蛍光性の４−ＭＵに変換し、これをＶＩＤＡＳアッセイ機で検出して相対蛍光単位として記録する。
【００９６】
下記表３は、増幅に続くＶＩＤＡＳ自動化アッセイによるＣＴの検出を、ＣＴｒＲＮＡの濃度に対するＲＦＶ（ＲＦＶ＝ＲＦＵ−バックグランドのＲＦＵ）として示す。０ないし２００分子のトラコーマ病原体（C. trachomatis）の精製ｒＲＮＡの希釈液を増幅し（ｎ＝３）、ＶＩＤＡＳ自動化プローブアッセイで検出した。検出限界は精製ｒＲＮＡ２０分子である。
【００９７】
【表３】
0004526609.tif 000004
【００９８】
Ｃ）分析特異性および結果
下記ＡＴＣＣ微生物の各々の存在下において増幅および検出を行い、下記表４にＲＦＶとして報告される検出結果が得られた。
【００９９】
【表４】
0004526609.tif 000005
【０１００】
ＲＦＶとして報告されるクラミジアの血清型亜型データに対する分析特異性を下記表５に示す。
【０１０１】
【表５】
0004526609.tif 000006
【０１０２】
下記表６は、ジェン−プローブのマニュアル操作ＡＭＰ−ＣＴアッセイおよびＶＩＤＡＳ自動化プローブアッセイからの結果を比較する、ＣＴについての臨床頸部スワブ検体試験の結果を示す。
【０１０３】
【表６】
0004526609.tif 000007
【０１０４】
下記表７は、マニュアル操作ＡＭＰ−ＣＴアッセイおよびＶＩＤＡＳ自動化プローブアッセイの結果を比較する、臨床尿検体試験の結果を示す。
【０１０５】
【表７】
0004526609.tif 000008
【０１０６】
このように、ＶＩＤＡＳ装置を用いる自動プローブアッセイのアッセイとマニュアル操作のジェン−プローブＡＭＰ−ＣＴアッセイとの結果は完全に一致した。
【０１０７】
例５  多重（複数配列）核酸検出
核酸プローブに基づく診断試験の価値は、複数の異なる核酸分子の検出および内部陽性対照の使用により実質的に高まり得る。少なくとも２つの異なる核酸配列を１回のアッセイ反応で別々に検出することが可能なＶＩＤＡＳ装置（バイオメリュー  ヴァイテック社)を使用する、自動化方法が考案されており、これを多重プロトコルと呼ぶ。したがって、核酸増幅手順、もしくは処理された試験試料を同一のアッセイで２つ以上の増幅核酸分子についてスクリーニングすることができる。この方法は、ＶＩＤＡＳ装置のＳＰＲピペット様装置での、異なる標的核酸配列（アンプリコン）を特異的に捕捉することができる個別の核酸プローブを空間的に分離することに依存している。ＳＰＲは、アフィニティ捕捉（キャプチャー）のための固体担体として作用するとともに、流体の移動を可能にする使い捨てピペット様チップである。ＳＰＲによる多重捕捉（マルチプレックスキャプチャー）を、トラコーマ病原体（Chlamydia trachomatis 、ＣＴ）および淋菌（Neisseria gonorrhoeae 、ＮＧ）に特異的なキャプチャープローブを用いて示した。
【０１０８】
図１７は多重ＶＩＤＡＳ検出の操作を模式的に示すものである。ＳＰＲチップは、アルカリホスファターゼ（ＡＫＰ）で標識された対応する特異的レポータープローブ核酸または検出プローブ核酸を用いて相補体の核酸配列を特異的に捕捉するのに用いられる核酸配列（アンプリコン）のオリゴヌクレオチドにより２つの異なる区域に被覆されている。未結合レポータープローブを除去する洗浄の後、ＳＰＲ（登録商標）の底部に局在するＡＫＰを蛍光性基質４−ＭＵＰを用いて検出する。ＡＫＰは、ＮａＯＨや、核酸のハイブリッドの変性を促進するような試薬またはアルカリホスファターゼの活性を不活性化するような他の試薬を用いて、ＳＰＲ（登録商標）の底部から除かれる。酵素反応ウェルを空にし、洗浄して新鮮な４−ＭＵＰを再充填する。ＳＰＲ（登録商標）の底部からＡＫＰが除去されていることを確認するために、新たな基質をＳＰＲ（登録商標）の底部に晒し、残留する蛍光を測定する。最後に、ＳＰＲ（登録商標）の頂部に結合しているＡＫＰ−レポータープローブを、ＳＰＲ（登録商標）を４−ＭＵＰに浸漬することにより検出し、第２のアンプリコンの存在を表示する。
【０１０９】
図１８は、２つの異なるキャプチャー区域を有するＳＰＲ（登録商標）の製造を示す。ＳＰＲ（登録商標）を、ラックに保持されるシリコンプラグに先端から挿入する。差動的圧力を用いて、ＡＭＶＥ共重合体に結合した約１μｇ／ｍｌの特異的キャプチャープローブ溶液を均一に吸引して、全てのＳＰＲ（登録商標）に一度につける。各ＳＰＲに吸引される液体の量と、従って、区域の大きさとはシステムの圧力を調整することによりコントロールされる。ＳＰＲ（登録商標）の表面への結合体の付着は室温で数時間受動的に吸着させることにより行われる。洗浄および乾燥の後、ＳＰＲ（登録商標）を小さい接着性ディスクで蓋をし、新たなラックに先端を下にして挿入する。その後、ＳＰＲ（登録商標）の低部を第２のキャプチャープローブ結合体で同様に被覆する。ＳＰＲ（登録商標）は乾燥状態、４℃で保存した場合、安定である。
【０１１０】
図１９は、多重検出のためのＶＩＤＡＳ装置のストリップの構成の好ましい態様を示す。このストリップは、ウェルＸ１にハイブリダイゼーションバッファ中のＡＫＰ−プローブ混合物２００μｌ（各々約１×１０12分子のプローブ）を、ウェルＸ３、Ｘ４、Ｘ５に６００μｌの洗浄バッファを、ウェルＸ６とＸ７に６００μｌの除去試薬を、およびＸ８に４００μｌのＡＫＰ基質を予め充填し、ホイルで密封してある。３００μｌの４−ＭＵＰを収容するホイルで密封した光学キュベット（ＸＡ）をこのストリップにはめ込み、これらのストリップを３７℃でＶＩＤＡＳ装置に挿入する。次に、多重ＶＩＤＡＳプロトコルを、異なる区域を２種類のキャプチャープローブで被覆したＳＰＲ（登録商標）を用いて実行した。
【０１１１】
ＶＩＤＡＳ多重プロトコルは多くの工程を含むことができる。例えば、検証試験プロトコルは以下のように１３個の基礎的な工程を含む。
【０１１２】
１．２０３μｌの標的を、Ｘ０からＸ１内のＡＫＰ−プローブへ移送する、
２．ＳＰＲ（登録商標）の全体に対するハイブリダイズおよび取り込み（キャプチャー）、
３．ＳＰＲ（登録商標）をＰＢＳ／ツィーン（Ｘ３、Ｘ４）で２回洗浄（３１６μｌ）する、
４．４−ＭＵＰ（８９．６μｌ）をＸＡ中でＳＰＲ（登録商標）底部に５．３分間導入した後、信号の読み取り、
５．４−ＭＵＰ（８９．６μｌ）をＸＡ中でＳＰＲ（登録商標）底部に１４．８分間導入した後、（必要に応じ）信号の読み取り、
６．使用した基質をＸＡからＸ２に移送（５×６７．１μｌ）、
７．ＮａＯＨ（Ｘ７）を用いてＳＰＲ（登録商標）底部からＡＫＰを除去（１１２．６μｌ）、
８．新鮮なＮａＯＨでＸＡを洗浄（３×１１２．６μｌ；Ｘ６→ＸＡ→Ｘ６）、
９．新鮮なＰＢＳ／ツィーンでＸＡを洗浄（３×１１２．６μｌ；Ｘ５→ＸＡ→Ｘ５）、
１０．新鮮な４−ＭＵＰをＸ８からＸＡに移送（６×４８μｌ）、
１１．４−ＭＵＰ（８９．６μｌ）をＸＡ中でＳＰＲ（登録商標）底部に１０．７間分導入した後、信号の読み取り、
１２．４−ＭＵＰ（２９４μｌ）をＸＡ中でＳＰＲ（登録商標）上部に５．５分間導入した後、信号の読み取り、
１３．４−ＭＵＰ（２９４μｌ）をＸＡ中でＳＰＲ（登録商標）上部に１５分間導入した後、（必要に応じ）信号の読み取り。
【０１１３】
ハイブリダイゼーション、基質、洗浄および除去の工程は、全て、それぞれの溶液のＳＰＲ（登録商標）へのピペッティングと、所定の時間の溶液の保持と、ＳＰＲ（登録商標）からの溶液のピペッティングとの複数のサイクルを含む。ハイブリダイゼーションと、基質と、洗浄もしくは除去のための保持時間は、それぞれ、３．０、０．５および０．１７分である。蛍光の信号はその装置により検出される。この研究プロトコルの合計アッセイ時間は約１．７５時間であるが、約７５分に減少させることが可能である。
【０１１４】
図２０は上述の通りに実行されたＶＩＤＡＳ多重プロトコルの検証の結果を示すグラフであり、ＳＰＲ（登録商標）は淋菌（Neisseria gonorrhoeae 、ＮＧ）に対する単一のキャプチャープローブだけで均一な被覆がされている。試験試料中のＮＧオリゴヌクレオチド標的の数は、試験試料中、０、１×１０10、もしくは１×１０11分子と変化させた。示されるデータは反復した試料の平均である。示されるグラフは２つの部分に分けられ、左および右半分は、それぞれ、ＳＰＲ（登録商標）の下部および上部の区域からの２つの蛍光測定の結果を示す。下部領域から結合した核酸を除去し、新鮮な４−ＭＵＰ基質に約１１分晒した後に行なった底部区域の測定では、試験した全ての試料について約４６ＲＦＵであり、これは測定されたバックグランドの蛍光に等しかった。この測定は、グラフの中央に０時点で示されている。したがって、このグラフは単一のＳＰＲ（登録商標）からの蛍光の測定の２つの連続する組を示し、測定の第１の組はＳＰＲ（登録商標）の下半分から得られたものであり（グラフの左半分）、測定の第２の組はＳＰＲ（登録商標）の上半分から得られたものである（グラフの右）。この実験では、多重プロトコルと区域ごとに被覆されたＳＰＲの手法とが実質的に同一の結果を生じることが検証されており、このことはグラフの左側と右側とに示されている、ＳＰＲの上部区域および下部区域からの蛍光強度からわかる。
【０１１５】
図２１〜２２は、異なる投入量のＣＴおよびＮＧオリゴヌクレオチド標的の多重検出を示す。図２１は、１×１０12個のＣＴ標的を、０、１×１０9 、１×１０10、１×１０11、または１×１０12個のＮＧ標的と混合し、ＳＰＲ（登録商標）の底部区域をＣＴキャプチャープローブで被覆し、かつ頂部区域をＮＧキャプチャープローブで被覆したＳＰＲ（登録商標）を用い、多重プロトコルにより、ＶＩＤＡＳ装置で検出した場合の結果を示すグラフである。図２２は、１×１０12個のＮＧ標的を、０、１×１０9 、１×１０10、１×１０11、または１×１０12個のＣＴ標的と混合し、ＳＰＲ（登録商標）の底部区域をＣＴキャプチャープローブで被覆し、かつ頂部区域をＮＧキャプチャープローブで被覆したＳＰＲ（登録商標）を用い、多重プロトコルにより、ＶＩＤＡＳ装置で検出した場合の結果を示す。これらのデータは、上記と同様にグラフに表示されており、単一のＳＰＲ（登録商標）からの蛍光の測定の２つの連続する組を示し、測定の第１の組はＳＰＲ（登録商標）の下半分から得られたもの（グラフの左半分）であり、測定の第２の組はＳＰＲ（登録商標）の頂部から得られたものである（グラフの右）。また、グラフの中央部はＳＰＲの除去についての検証を行ったものである。重要なことは、この実験がＳＰＲの２つの区域がそれぞれ、多重プロトコルにおいて独立に機能するということを示すことであり、これは、２番目の区域から得られた信号が高い（１×１０12）場合でも、低い（１×１０9 、検出されたもの）場合でも、もしくは陰性の場合であっても、１つの区域からの高い蛍光信号が２番目の区域から得られた信号を妨害しないからである。
【０１１６】
下記表８は、様々な標的レベルの試料におけるＣＴおよびＮＧの多重ＶＩＤＡＳ検出により得られたもので、ＲＦＵで報告されたデータをまとめてある。
【０１１７】
【表８】
0004526609.tif 000009
【０１１８】
このように、多重ＶＩＤＡＳプロトコルは明らかに有効であり、試料中の２種類以上の異なる核酸を迅速に、かつ区別して検出することを可能にする。このプロトコルおよびＳＰＲ（登録商標）コーティングは、２またはそれ以上の検出区域の間に異なる大きさの間隙を有する異なる表面積のコーティング区域を提供する多くの様式で行うことができる。ＳＰＲ（登録商標）は、検出する同じ核酸配列の異なる領域、例えば、トランケートされた遺伝子、異なる対立遺伝子もしくは交互にスプライスされた遺伝子を捕まえるように設計されている核酸により被覆することができる。ＳＰＲ（登録商標）は、核酸増幅反応がうまくいったことを検出し、確認するのに用いる内部対照核酸分子からのアンプリコンを捕まえるように被覆することができる。このように、ＶＩＤＡＳ多重プロトコルは、同じ試料中の２つ以上の核酸配列を単一のアッセイで検出するための柔軟な方法である。
【０１１９】
例６  内部対照配列および方法
増幅反応の内部陽性対照として用いられる、選択される機能的構築ブロックを含んでなる内部対照配列の核酸配列のランダムな生成による構築は、理想的には、その対照配列は、ＰＣＲ、ＬＣＲ、ＴＭＡ、ＮＡＳＢＡおよびＳＤＡに限定されるものではないが、これらの様々な核酸の増幅プロトコルに用いられるように独自に設計されることを必要とする。オリゴヌクレオチドプライマーまたはプロモーター−プライマーに特異的な適切な配列と組み合わせられている内部対照核酸配列は、増幅反応が成功裏に完了した場合、陽性増幅信号を生成する。
【０１２０】
理想的には、内部対照核酸は、標的微生物や宿主生物中に存在する核酸配列、または正常な微生物フローラもしくは環境中に存在する核酸の配列の存在に拘わらず有用である。一般には、内部対照配列は、その内部対照配列の増幅および検出を妨げる可能性のある、ヒト、病原性微生物、正常な微生物フローラ、または環境中の微生物を含む臨床環境に存在するいかなる核酸配列とも実質的に類似するべきではない。
【０１２１】
本発明の内部対照配列は、ランダムに生成させた核酸配列のリストから選択される配列の機能的ブロックからなる。この機能的ブロックは、増幅や、捕捉（キャプチャー）や、および増幅産物の検出を可能とするのに必要とされる特別な特性を備えるセグメントである。例えば、ＴＭＡ反応においては、この機能的ブロックがその増幅プロトコルの特定の機能的要求、例えば、ａ）アンチセンス鎖のプライマー結合部位、ｂ）捕捉（キャプチャー）部位、ｃ）検出プローブ結合部位；ｄ）センス鎖のプライマー結合部位を含むＴ７−プロモーター、のような機能的要求を含を満たす場合、その内部対照配列は最も有用となる。これらの機能的な要素の各々には、それら自身の特定の制約、例えば、長さ、Ｇ−Ｃ含有％、Ｔｍ、既知の配列に対する相同性の欠如、および二次構造の特徴が存在しない（すなわち、二量体の形成やヘアピン構造がない）などがあり、これらは適切な配列を選択するために用いることができる。このように、ランダムに生成した配列の機能的ブロックは、内部対照配列を構築する前に、所望の機能的特性についてスクリーニングすることができる。
【０１２２】
特定の数の機能的ブロックを含み、各々のブロック内で所望の制約を満たし、所望の特性を有する内部対照配列を構築するため、ランダムシーケンス生成器を用いて各々の数が０．０００ないし４．０００の範囲に限定されている数の列を生成させた。これらの列の長さは自由に変えることが可能であり、機能的ブロックの所望の長さに基づいて選択する。
【０１２３】
次に、この列の各々の数（すなわち、ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４、．．．ｎｘであり、ここで、ｘはこの列の長さであるが）を次のようにして、対応するヌクレオチドに割り当てた：０＜ｎ≦１である場合にはグアノシン（Ｇ）；１＜ｎ≦２である場合にはアデノシン（Ａ）；２＜ｎ≦３である場合にはチミジン（Ｔ）；および３＜ｎ≦４である場合にはシトシン（Ｃ）。そのような列の大きな集合を作製し、機能的ブロックの各々の配列と構造的要件とを満たすものについてスクリーニングした。図２７は説明される方法によって生じた結果を示すものであり、核酸配列の列の集合および特定の機能的パラメータについてのスクリーニングを示す。ＤＮＡでの用語体系を用いて示される配列は必要に応じて適切な核酸に容易に適合させることができるので、内部対照配列はＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾オリゴヌクレオチド、または核酸のいかなる組み合わせを含むことができる。
【０１２４】
次に、これらの（ランダムに選択された）機能的ブロックを適切な順序で組み立てることにより、有用な内部対照（ＩＣ）を構築する。最後に、組み立てた内部対照配列は、全体の配列および構造的制約が維持されていることを確かめるために試験される。例えば、ＴＭＡ反応においては、内部対照配列が、２つのプライマーの結合部位の間で大きな塩基対形成潜在能力を有するべきではなく、また、安定な３′二量体構造を形成するべきではない。次いで、これらのスクリーニングを通った内部対照配列をオーバーラップするオリゴヌクレオチドを用いて物理的に作製し、実際の増幅／検出アッセイにおける性能について試験した。
【０１２５】
機能的なブロックのいずれもが臨床環境に存在する配列といくらかの相同性を有することはあり得るが（４ｅ１２の配列、すなわち約４×１０12の配列ごとに１つのランダムな頻度で２１のヌクレオチドブロックの完全な一致が考えられる；生成した配列をジーンバンク（GenBank ）のデータベースに対してスクリーニングした）、全ての機能的配列が実質的な相同性を有することが見出されることはほとんど考えられない。内部対照核酸配列は直列に配置された機能的ブロックの群で構成されるため、天然の核酸配列が同じ直列構造をとる同一の核酸配列ブロックの列を有する可能性は非常に少ない。
【０１２６】
上述の方法を用いて２種類の特異的内部対照配列が構築されている。ランダム内部対照１（Random Internal Control 1 、ＲＩＣ１）が、この対照配列の増幅および検出のための可能性のあるオリゴヌクレオチドプライマー／プローブと共に図２８に示されている。図２９はＲＩＣ１分子の可能性のある二次構造の分析を示す。ＲＩＣ１は、ランダムに生成した列ｒａｎ１６、ｒａｎ１９、ｒａｎ２１およびｒａｎ３３を用いて構築した。プライマーの結合を必要とする機能的ブロックはｒａｎ１６およびｒａｎ１９によって満たされ、捕捉（キャプチャー）部位はｒａｎ２１によって満たされ、検出プローブ結合部位はｒａｎ３３によって満たされた。キャプチャープローブまたは検出プローブ配列の指定の選択は、適切なリンカー分子が適切なプローブに結合し、ここでレポータープローブオリゴヌクレオチドが検出可能な信号を生成する手段に結合し、かつキャプチャープローブオリゴヌクレオチドがそのキャプチャープローブを適切な担体に付着させる手段に結合する限り、入れ替えることが可能である。これらのプローブおよびオリゴ体は、二本鎖ＤＮＡの場合には、相補鎖が標的であってもよく、あるいは、適切である限り、検出用の鎖として用いるために変換されていてもよいと理解されている。したがって、適切な状況において、当該技術分野における熟練者が、ここに説明されるものと均等な様式で用いるのに適切な代替プローブおよびプライマーが生成するように開示されている配列を修正することが可能である。
【０１２７】
ランダム内部対照２（Random Internal Control 2 、ＲＩＣ２）が、この対照配列の増幅および検出のための可能性のあるオリゴヌクレオチドプライマー／プローブと共に図３０に示されている。図３１はＲＩＣ２配列の可能な二次構造の分析を示す。ＲＩＣ１と同様に、ＲＩＣ２はランダムに生成した列ｒａｎ２７、ｒａｎ３２、ｒａｎ３９およびｒａｎ５１を用いて構築した。したがって、プライマー結合、キャプチャープローブ結合、検出プローブ結合を必要とする機能的ブロックが上述の方法によって生成される他のランダム配列によって満たされ得ることもあり得ることが示される。
【０１２８】
図３２は、ｒａｎ２１がキャプチャープローブであり、かつｒａｎ３３が酵素結合検出プローブであるＲＩＣ１  ＤＮＡの検出の結果を示すものであり、標準アッセイ条件下において予期される蛍光強度で検出がなされることを示す。図３３は、ＴＭＡによって増幅され、酵素結合検出系を用いるＶＩＤＡＳ装置（バイオメリュー  ヴァイテック社）で検出されたＲＩＣ１  ＲＮＡは、（条件を最適化することなしには）ＲＩＣ１  ＲＮＡ約１０００分子の感度の限界を有することを示す。ＲＩＣ２配列の類似の分析を行い、ＲＩＣ１と類似することが見出された。内部対照の増幅および検出系が、選択された標的に最適化された条件下において有効に機能することは重要である。
【０１２９】
内部対照（ＩＣ）を用いる多重検出のための代替アプローチとして、ＳＰＲ（登録商標）の１個のＳＰＲ（登録商標）の全ての区域を異なるキャプチャー核酸配列の混合物で均一な被覆をすることが可能である。例えば、２種類のキャプチャー核酸配列、すなわち１つは標的試験配列に特異的なもの、もう１つは内部対照配列に特異的なものを１つの区域内に組み合わせることができる。標的アンプリコンが存在する場合には、標的アンプリコンと内部対照アンプリコンとは、標的アンプリコン試験核酸配列に特異的な標識プローブ配列の存在下において、同時にＳＰＲ（登録商標）にハイブリダイズされる。洗浄の後、最初の信号の読み取りを行い、ＳＰＲ（登録商標）上の標識の存在もしくは不存在を決定して試験標的の存在もしくは不存在を確認する。次いで、内部対照に対して特異的な検出標識プローブを用いて、ＳＰＲ（登録商標）に対して第２のハイブリダイゼーションを行う（順次ハイブリダイゼーション）。ＳＰＲ（登録商標）を洗浄して過剰の未結合検出プローブを除去し、第２の標識を測定して内部対照の存在もしくは不存在を示す。第１の信号が陰性である場合、ＩＣからの第２の読み取りからの陽性信号は増幅／検出系の機能性を裏付ける。もし、第１および第２の標識が同じであれば、陽性の第１の読み取りおよび陽性の第２のＩＣの読み取りからの付加された信号が生じる。第１の信号が陰性であり、かつ第２のＩＣ信号も陰性である場合には、その増幅／検出は機能性を欠き、これは、例えば、試料の妨害または機械的な失敗のためであり得る。この場合、試験結果は無効である（偽陰性）と報告され、再試験が推奨される。もし、標識が異なっているのであれば、順次起こるハイブリダイゼーションも検出ステップのいずれも必要とはならないであろう。
【０１３０】
内部対照の使用には大きな関心があり、その根底をなす根拠は「その試料が内部対照の増幅をサポートしない場合、標的核酸配列の増幅をサポートするものとは考えられない。」というものである（NCCLS Document MM3-A,Molecular Diagnostic Methods for Infectious Diseases;Approved Guideline,p.55,March 1995）。
【０１３１】
複数の検出プローブを用いる順次ハイブリダイゼーションアプローチを用いて、第１の読み取り信号（すなわち、純粋なＣＴ信号）および付加的に「混合された」第２の読み取り信号（すなわち、付加されたＣＴおよびＩＣ信号；下記表９を参照）の別々の検出を許容するプロトコルを設計することが可能となっている。このプロトコルは「除去すること」を必要としない。例えば、表９は、ＣＴとＩＣとの合成標的の異なる混合物がまず均一に被覆されたＳＰＲ（登録商標）（ＣＴおよびＩＣキャプチャープローブ）で捕捉され、ＣＴ検出プローブと最初にハイブリダイズする場合の結果を示す。第１の読み取りの後、ＩＣ検出プローブとのハイブリダイゼーションを行い、次いで第２の読み取り（同じ基質）を行った。
【０１３２】
この型のプロトコルは、スクリーニングアプローチが許容されている（第１の読み取りの際にＧＣおよび／またはＣＴ陽性の間に区別がない）場合、組み合わせＧＣ／ＣＴ／内部対照アッセイに用いることもできる。ＧＣおよびＣＴ特異的信号は、陽性試料（罹患率に応じて症例の５−１０％）のスクリーニングに関して、ＣＴおよびＧＣ特異的アッセイを実行することにより分離しなければならない。ＳＰＲ（登録商標）は３種類のキャプチャープローブ（ＣＴ／ＧＣ／内部対照）で均一な被覆をする。その代わりに、ＩＣをＣＴもしくはＧＣのキャプチャープローブのいずれかとすることもできる。
【０１３３】
【表９】
0004526609.tif 000010
【０１３４】
このように、上述の内部対照配列は、被覆ＳＰＲ（登録商標）を備えたＶＩＤＡＳ装置への適用に有効であり、また、核酸の組み合わせアッセイ検出ならびに反応を成功させるための対照のモニタリングを行う多重システムでの使用に有効となる。
【０１３５】
例７  内部対照配列
ランダムに生成した内部対照配列の精製は、そのような内部対照配列を特異的なアッセイシステムに対して最適化することを可能にする。上述の方法に続いて、ＣＲＩＣ−２として認識されるトラコーマ病原体（Chlamydia trachomatis 、ＣＴ）アッセイ用の内部対照；ＧＲＩＣとして認識される淋菌（Neisseria gonorrhoeae 、ＮＧ）アッセイ用の内部対照；およびＭＲＩＣとして認識される結核菌（Mycobacterium tuberculosis、ＭＴ）用の内部対照を含む内部対照核酸配列が様々な増幅および検出システムにおいて用いるために設計され、検証されている。ＨＲＩＣとして認識されるＨＩＶアッセイ用の内部対照を生成した。この内部対照においては、キャプチャープローブ配列およびレポータープローブ配列の両者はランダム配列から誘導されたものである。この内部対照の配列および対応する標的配列を図３４に示す。これらの内部対照配列の各々においては、前に説明されるようにレポーター分子に適切に結合されるならば、ランダム配列プローブ＃１０８２をレポータープローブとして用いることができる。ＨＩＶ内部対照においては、キャプチャーオリゴヌクレオチドランダム配列プローブ＃１０８１は、この対照配列の捕捉において、標的アンプリコンとＩＣアンプリコンとの間で従来のキャプチャープローブに対して競合して排除することにより改良された定量分析が可能なものとして用いることができるように設計されている。
【０１３６】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】一回適用量の試薬ペレットの温度安定性を示すグラフである。
【図２】一般的なＴＭＡプロトコルを示す図である。
【図３】本発明の可能な態様の１つに従って、ＴＭＡ反応を行うための使い捨てデュアルチャンバ反応容器およびそれに関連する加熱工程を模式的に示す図である。
【図４】２つの別々の反応チャンバを組み合わせてデュアルチャンバ反応容器を形成する本発明の代わりの形態について模式的に示す図である。
【図５】本発明の好ましい態様に従って２つの固相の受容部および光学機器で処理するために試験ストリップの所定の位置にはめ込まれるデュアルチャンバ反応容器の別の態様を模式的に示す図である。
【図６】一方のチャンバ内の流体試料を他方のチャンバに移すことが可能であるような様式で組み合わされた２つの別のチャンバから形成されたデュアルチャンバ反応容器の別の態様を、図５に示されるような試験ストリップに配置させたものと併せて模式的に示す図である。
【図７】本発明の現時点で好ましい形態に従うデュアルチャンバ反応容器を有する試験ストリップのためのスタンドアロン型増幅処理ステーションの斜視図である。
【図８】図７の増幅モジュールの１つを、このモジュールの後方から見た斜視図である。
【図９】図８のモジュールの前面の斜視図である。
【図１０】図９のモジュールの別の斜視図である。
【図１１】図８〜１０のモジュールの試験ストリップホルダの一部および９５℃ペルチェ加熱サブシステムの詳細な斜視図である。
【図１２】図１１の試験ストリップホルダの分離斜視図であって、２つの試験ストリップがこの試験ストリップホルダに装着されている様子を示す。
【図１３】図９の試験ストリップホルダもしくはトレイの詳細な斜視図である。
【図１４】図９の増幅処理ステーションの電気系のブロック図である。
【図１５】図８の増幅処理ステーションの真空サブシステムの図である。
【図１６】図８のステーションの熱サイクルを示すグラフである。
【図１７】多重ＶＩＤＡＳ検出の操作を模式的に示す図である。
【図１８】２つの異なるキャプチャー（捕捉）区域を有するＳＰＲ（登録商標）の作製を示す図である。
【図１９】多重検出のためのＶＩＤＡＳ装置のストリップの構成を示す図である。
【図２０】淋菌（Neisseria gonorrhoeae 、ＮＧ）標的のみを検出するＶＩＤＡＳ多重プロトコルの検証の結果を示すグラフである。
【図２１】１×１０12のトラコーマ病原体（Chlamydia trachomatis 、ＣＴ）標的を、０、１×１０9 、１×１０10、１×１０11、もしくは１×１０12のＮＧ標的と混合し、ＳＰＲ（登録商標）の底部区域がＣＴキャプチャープローブで被覆され、かつ上部区域がＮＧキャプチャープローブで被覆されているＳＰＲ（登録商標）を用い、多重プロトコルによりＶＩＤＡＳ機器を用いて検出した場合の結果を示すグラフである。
【図２２】１×１０12のＮＧ標的を、０、１×１０9 、１×１０10、１×１０11、もしくは１×１０12のＣＴ標的と混合し、ＳＰＲ（登録商標）の底部区域がＣＴキャプチャープローブで被覆され、かつ上部区域がＮＧキャプチャープローブで被覆されているＳＰＲ（登録商標）を用い、多重プロトコルによりＶＩＤＡＳ機器を用いて検出した場合の結果を示すグラフである。
【図２３】増幅後のＶＩＤＡＳ装置によるＭ．ｔｂ核酸の検出を示す図である。
【図２４】ＶＩＤＡＳ装置によるＭ．ｔｂ核酸の検出を示す図である。
【図２５】増幅後のＶＩＤＡＳ装置によるＭ．ｔｂ核酸の検出を示す図である。
【図２６】二元／デュアルチャンバプロトコルを用いる増幅の後のＶＩＤＡＳ装置によるＭ．ｔｂ核酸の検出を示すグラフである。
【図２７】説明した方法によって得られた結果を示す図であり、核酸配列を示す列の収集および特定の機能的パラメータに関するスクリーニングについて示すものである。
【図２８】ランダム内部対照１（ＲＩＣ１）の核酸配列を、この対照配列の増幅および検出のための可能なオリゴヌクレオチドプライマー／プローブとして示す図である。
【図２９】ＲＩＣ１配列の可能性のある二次構造のおける成分の検討結果を示す図である。
【図３０】ランダム内部対照２（ＲＩＣ２）の核酸配列を、この対照配列の増幅および検出のための可能なオリゴヌクレオチドプライマー／プローブとして示す図である。
【図３１】ＲＩＣ２配列の可能性のある二次構造における成分の検討結果を示す図である。
【図３２】ＲＩＣ１  ＤＮＡの検出から得られる結果を示す図であって、ｒａｎ２１はキャプチャープローブ、ｒａｎ３３は酵素結合検出プローブであり、かつ標準アッセイ条件下で増幅および検出できることを示す。
【図３３】ＴＭＡによって増幅されたＲＩＣ１  ＲＮＡおよび酵素結合検出システムを用いるＶＩＤＡＳ装置（バイオメリュー  ヴァイテック社）で検出された化学的に活性化された信号の感度の限界が約１０００分子のＲＩＣ１  ＲＮＡである（条件の最適化なし）ことを示す図である。
【図３４】ＣＲＩＣ−２として識別されるトラコーマ病原体（Chlamydia trachomatis 、ＣＴ）；ＧＲＩＣとして識別される淋菌（Neisseria gonorrhoeae 、ＮＧ）；ＭＲＩＣとして識別される結核菌（mycobacterium tuberculosis、ＭＴ）を検出するアッセイ用に設計された内部対照オリゴヌクレオチドの核酸配列、およびＨＲＩＣとして識別されるＨＩＶ用の内部対照の核酸配列を示す図である。
【符号の説明】
１０  デュアルチャンバ反応容器
１９  試験ストリップ
２００  スタンドアロン型増幅処理システム
２０２、２０４  増幅ステーション
２４０  トレイ
２４４  真空供給パイプ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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