(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号４のアミノ酸配列からなり、HIV感染細胞を標的とする細胞障害性Ｔ細胞を誘導し得るペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のペプチドをコードするDNA分子。
【請求項３】
請求項１に記載のペプチド及び医薬的に許容される担体及び／又は希釈剤を含むAIDS予防・治療剤。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｖｉｒｕｓ、以下「ＨＩＶ」と略称する）タンパクの一部領域のアミノ酸配列をもち、ＨＩＶに対する免疫応答を誘導できるペプチド及び該ペプチドを含む抗ＡＩＤＳ予防・治療剤に関する。
後天的免疫不全症候群（以下「ＡＩＤＳ」と略称する）はＨＩＶの感染によって生じる病気である。この疾患を治療する薬剤の研究は活発に行われており、アジドチミジン（以下「ＡＺＴ」と略称する）、ジデオキシイノシシ（以下「ＤＤＩ」と略称する）などの薬剤が実用に用いられているが、効果や副作用の点で問題があり、ＨＩＶの感染によって生じる病気を完全に治療することができる薬剤は未だに発見されておらず、その見通しも立っていない。一方、ＨＩＶ感染予防とＡＩＤＳ発症の抑制手段としてＨＩＶに対する免疫抵抗力を増強させるワクチンもこの病気の急速な世界的広がりを抑制できる切り札として期待され広く研究が進められている。現在までに種々のタイプのワクチンが考案され、一部のものは臨床試験に入っている。
これまでに報告されているワクチンとしては以下のようなものが代表的である。
ｉ）不活化または弱毒化ウィルス粒子を用いるワクチン：ＨＩＶの病原性に関与する遺伝子を変異欠損させる方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，１４３４，（１９８７））、ＨＩＶと共通抗原性を持つサルなどの類縁ウイルスを用いるアプローチ（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３２，２３８，（１９８７））が考えられるが、潜在的危険性から容易には実用化できない。
ｉｉ）ウイルスの一部の抗原タンパクを用いるサブユニットワクチン：ウイルス粒子のうちの一部の抗原性タンパクのみを遺伝子組換え法などで生産し免疫原として用いるというアプローチ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，６９２４，（１９８７）、Ａｎｎ．Ｉｎｔ．Ｍｅｄ．，１１４，１１９，（１９９１）、Ｎａｔｕｒｅ，３５５，７２８，（１９９２））。最も広く試みられており、臨床試験例も多い。しかしながら中和抗体価が上がらなかったり、抗体価の持続性など克服すべき問題点が多い。またこのアプローチでは抗体産生など体液性免疫の増強には効果があると考えられるが、感染細胞を殺す細胞性免疫の活性化にはつながりにくく、ＨＩＶの感染様式から考えてこのアプローチのみの感染予防への効果は必ずしも期待できない。
ｉｉｉ）ワクシニアウイルスやＢＣＧ菌などの組換え生ワクチン：ヒトの細胞内で増殖可能なワクシニアウイルス（Ｎａｔｕｒｅ，３３２，７２８，（１９８８））やＢＣＧ菌（Ｎａｔｕｒｅ，３５１，４７９，（１９９１））の遺伝子にＨＩＶ由来の一部遺伝子配列を組み込み発現させる方法で、理論的には細胞性免疫増強効果が期待できる。しかし、免疫力の低下した患者では通常無害なワクシニアウイルスなどでも重篤な感染がおこったりする可能性（Ｌａｎｃｅｔ  ３３７，１０３４，（１９９１））と、少なくとも今までに作られたワクシニアの組換え生ワクチンでは充分な免疫応答を起こしていない等の問題がある。
ｉｖ）抗イディオタイプ抗体：ウイルス抗原のかわりに抗イディオタイプ抗体を免疫原として用いる方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，２５４６，（１９９２））が報告されている。
ｖ）合成ペプチドワクチン：中和抗体の決定領域のペプチド配列を化学合成したものなどが検討されている。
上に述べたこれらのワクチンは主として中和抗体を誘導する液性免疫増強型のものであるが、ＨＩＶがフリーのウイルス粒子としてよりも感染細胞と非感染細胞との融合によって伝播しやすいということから中和抗体による液性免疫よりも感染細胞を障害する細胞障害性Ｔ細胞（以下「ＣＴＬ」と省略する）による細胞免疫が感染防御に重要と考えられる。実際、ＨＩＶ感染の機会にさらされながら感染が成立しなかった患者について調べてみると、ＨＩＶ特異的ＣＴＬが検出されることが報告されている（Ｊ  Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９３，１２９３，（１９９４），Ｎａｔｕｒｅ，Ｍｅｄ．，１，５９，（１９９５））。また、変異型ＣＴＬエピトープを有するＨＩＶはＣＴＬの攻撃から逃れることが報告されており（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．，３，２０５，（１９９７））、ＨＩＶに慢性感染した患者がＡＩＤＳを発症するのはそのような変異型エピトープを有するＨＩＶが出現してくることによるものとされている（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．，３，２１２，（１９９７））。従って、早期のＣＴＬ誘導が感染予防に重要である。
ウイルス由来タンパク質などの抗原は細胞内部で短いペプチド断片にプロセッシングされ、主要組織適合性抗原複合体（以下「ＭＨＣ」と略称する）と結合した形で細胞表面に提示される。ＣＴＬは細胞表面に発現されるクラスＩＭＨＣ抗原によって抗原提示されたエピトープペプチドを認識して標的細胞を攻撃する。より詳しくは、ＣＴＬは標的細胞上のＭＨＣ分子の溝に結合したプロッセシングされた抗原断片とＭＨＣ分子の一部を同時に認識してこれを有する細胞を攻撃する。すなわち、ＣＴＬの抗原認識は細胞表面上のＭＨＣに強く依存しており、このような抗原認識をＭＨＣ拘束と呼ぶ。特定のＭＨＣクラスＩ抗原に結合して抗原提示されるエピトープペプチドは９アミノ酸長程度のペプチドであってそのアミノ酸配列には一定の法則性（モチーフ）があることが知られている（Ｎａｔｕｒｅ，３５１，２９０，（１９９１）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２２，２４５３，（１９９２）、Ｎａｔｕｒｅ，３５３，３２６，（１９９１）、Ｎａｔｕｒｅ，３６０，４３４，（１９９２）、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，３８，１６１，（１９９３））。
本発明者等はこれらの知見を基にＨＩＶ−１が感染した細胞を特異的に障害するＣＴＬペプチドを探索し、ヒトのクラスＩ  ＭＨＣであるクラスＩヒト白血球抗原（以下「ＨＬＡ」と略称する）のうちＨＬＡ−Ｂ３５、ＨＬＡ−Ｂ５１、ＨＬＡ−Ａ３１に結合してＨＩＶ−１特異的ＣＴＬを誘導し得るペプチドを明らかにしている（ＷＯ９５／１１２５５）。これらのペプチドは、それぞれのＨＬＡアロ抗原タイプ拘束性のＨＩＶ−１特異的ＣＴＬを誘導した。
ＨＬＡ遺伝子は極めて多型性に富む遺伝子であるため、ＨＬＡクラスＩ抗原に結合するペプチドも、一定の法則性に従うものの、多型性に富むものである。このことは、ＨＩＶ感染の予防・治療に効果を有するペプチドがその効力に関して個体間、民族集団間などで相違する可能性を示唆する。従って、このようなペプチドを利用したＨＩＶ感染の予防・治療においては、既に得られているペプチド群の他に、更に他のＨＬＡ拘束性のＣＴＬを誘導し得るペプチドセットが望まれている。
発明の開示
本発明はＨＩＶ−１に対する特異的ＣＴＬを誘導できるペプチドを提供することを目的とする。特にＨＬＡ−Ａ＊１１０１拘束性のＨＩＶ−１特異的ＣＴＬを誘導するペプチドを提供することを目的とする。
また、本発明は上記ペプチドをコードするＤＮＡを提供することを目的とする。
更に本発明は上記ペプチドを含む抗ＡＩＤＳ予防・治療剤を提供することを目的とする。
本発明はまたＨＩＶ−１ワクチン開発、特にアジアにおけるワクチン開発に有用なペプチドを提供することも目的とする。ＨＩＶワクチン開発の大きな問題点はＨＩＶが容易に変異を起こして宿主免疫を逃れる点にある。すなわち、免疫原として一つのエピトープのみを担ったワクチンはやがて効力を失う可能性が大である。本発明は、同時に使用し得る、免疫原として有効な複数のエピトープペプチドを提供することを目的とする。
本発明のペプチドは、ＨＬＡ−Ａ＊１１０１クラスＩ抗原に結合し、ＨＩＶ−１感染細胞を標的とするＨＬＡ−Ａ＊１１０１拘束性ＣＴＬを誘導し得るペプチドである。また、本発明のＤＮＡは前記ペプチドをコードするＤＮＡである。
本発明者等は、すでに述べたようにＨＬＡ−Ｂ＊３５０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５１０１、ＨＬＡ−Ａ＊３１０１クラスＩ抗原に結合し得るペプチドをこれまでに明らかにした（ＷＯ９５／１１２５５）。ＨＬＡは民族あるいは個体間で極めて多型性に富む分子であるが、本発明のペプチドはいずれもアジア人、特に日本人に多いＨＬＡ−Ａ１１分子（ＨＬＡ−Ａ＊１１０１）（Ｃｌａｙｔｏｎ  Ｊ，Ｌｏｎｊｏｎ  Ｃ，Ｗｈｉｔｔｌｅ  Ｄ：Ａｌｌｅｌｅ  ａｎｄ  ｈａｐｌｏｔｙｐｅ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ  ｆｏｒ  ＨＬＡ  ｌｏｃｉ  ｉｎ  ｖａｒｉｏｕｓ  ｅｔｈｎｉｃ  ｇｒｏｕｐ：ＨＬＡ  ｖｏｌｕｍｅ  Ｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＨＬＡ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ：Ｃｈａｒｒｏｎ  Ｄ．Ｐａｒｉｓ編集：ＥＤＫ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ；１９９７；６６５−８２０）に結合し得るＨＩＶ−１  ＰｏｌまたはＥｎｖ由来のペプチドであることを特徴とする。本発明のペプチドおよび本発明のＤＮＡによってコードされるペプチドは、ＨＩＶ−１  Ｐｏｌタンパク質またはＥｎｖタンパク質の断片であって、アミノ酸配列ＱＩＹＡＧＩＫＶＫ（配列番号１）、ＳＶＩＴＱＡＣＰＫ（配列番号２）、ＱＩＩＥＥＬＩＫＫ（配列番号３）、ＱＨＥＫＬＩＥＫ（配列番号４）、ＡＣＱＧＶＧＧＰＳＨＫ（配列番号５）、ＡＦＤＬＳＦＦＬＫ（配列番号６）および、ＡＬＤＬＳＨＦＬＫ（配列番号７）、のいずれかを有し、ＨＬＡ−Ａ＊１１０１結合モチーフを有し、実際にＨＬＡ−Ａ＊１１０１に結合し、かつ、ＨＩＶ−１感染細胞に対するＨＬＡ−Ａ＊１１０１拘束特異的ＣＴＬを誘導し得るペプチドである。
発明を実施するための最良の形態
ＨＩＶの全タンパク質は、例えば、Ｎａｔｕｒｅ  Ｖｏｌ．３１３，ｐ２７７−２８３（１９８５）やＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  Ｖｏｌ．８３，ｐ２２０９−２２１３（１９８６）などに記載されている。本発明のペプチドは、ＨＩＶタンパク質の断片であって、さらに、ＨＬＡ−Ａ＊１１０１結合モチーフを有し、実際にＨＬＡに結合する。ここで、ＨＬＡ−Ａ＊１１０１結合モチーフとしては８〜１２個のアミノ酸からなり、２番目のアミノ酸がＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、ＣｙｓまたはＰｈｅから選ばれるアミノ酸であり、Ｃ−末端アミノ酸がＬｙｓであるペプチドが挙げられる。このようなペプチドはペプチド合成機などによって合成することができる。ＨＬＡ−Ａ＊１１０１結合モチーフを有する本発明のペプチドが実際にＨＬＡ−Ａ＊１１０１に結合することはＨＬＡ−Ａ＊１１０１を発現している細胞を用いて確認することができる。このような細胞としては、ＨＬＡ−Ａ＊１１０１を発現しているＣ１Ｒ細胞またはＲＭＡ−Ｓ細胞を利用することができる。
本発明においては、合成したＨＩＶ−１由来ペプチドが実際に患者の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を刺激して細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を誘導し得ることが確認される。このような方法で、上記ＨＩＶ−１  Ｐｏｌタンパク質の断片であって、アミノ酸配列ＱＩＹＡＧＩＫＶＫ（配列番号１）、ＳＶＩＴＱＡＣＰＫ（配列番号２）、ＱＩＩＥＥＬＩＫＫ（配列番号３）、ＱＩＩＥＫＬＩＥＫ（配列番号４）、ＡＣＱＧＶＧＧＰＳＨＫ（配列番号５）、ＡＦＤＬＳＦＦＬＫ（配列番号６）および、ＡＬＤＬＳＨＦＬＫ（配列番号７）を有するペプチドが得られた。本発明のペプチドはペプチド合成機によって合成することもでき、あるいは、例えば配列番号１〜７のいずれかのアミノ酸配列を有するペプチドをコードするＤＮＡを適切なベクター−宿主細胞系で発現させることによって調製することもできる。この場合、使用する宿主細胞によりコドン使用頻度が異なることがあるため、各細胞において好まれるコドンを使用することができる。また、そのようなＤＮＡにストリンジェントな条件でハイブリダイズし、ＨＬＡ−Ａ１１抗原分子に結合してＨＩＶ感染細胞を標的とする細胞障害性Ｔ細胞を誘導し得るペプチドをコードするＤＮＡも利用することができる。ここでストリンジェントな条件とは、例えば温度および塩濃度について言えば、融解温度Ｔｍ（Ｔｍ＝８１．５℃＋ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］＋０．４１（Ｇ＋Ｃ含量％）−（６００／塩基長））よりも２０〜２５℃低い温度、２ｘＳＳＣ（２０ｘＳＳＣ：水１Ｌ中ＮａＣ１７５．３ｇ、クエン酸ナトリウム８８．２ｇ．ｐＨ７．０）でアニーリングを行い、Ｔｍよりも１２〜２０℃低い温度、０．１ｘＳＳＣの塩濃度で洗浄を行うような場合を言う。
このような組換えＤＮＡ技術を用いたＤＮＡ断片の単離、ベクターの構築、形質転換方法、ペプチドの製造法、およびＣＴＬ活性の測定法等は当業者によく知られたものである。
本発明のペプチドはＴ細胞エピトープとしてＨＩＶ−１特異的ＣＴＬを誘導することができるので、ワクチンとして非常に有用である。ワクチンとしては、ペプチド溶液をそのまま、あるいは生理的に共存できる補助剤と共に注射器で投与してもよく、噴霧などにより粘膜からの経皮的吸収などで投与してもよい。投与は１回０．１ｍｇ〜１００ｍｇで１回または複数回繰り返して行うことができる。また、複数のペプチドを同時に用いてもよく、単一のペプチドを使用するよりも効果的である場合がある。製剤としては凍結乾燥し、あるいは糖などの賦形剤を加えて顆粒等にしてもよく、特に制限されない。このようにして調製された本ペプチド製剤は、問題となる重篤な急性毒性は認められない。
ワクチンに添加して免疫原性を高める補助剤としてはＢＣＧ菌などの菌体成分、Ｍｏｒｅｉｎらにより開発されたＱｕｉｌｌＡという樹皮から抽出したＩＳＣＯＭ（Ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ）（Ｎａｔｕｒｅ，３０８，４５７，（１９８４）、Ｎａｔｕｒｅ，３４４，８７３，（１９９０））、サポニン系のＱＳ−２１（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８，１４３８，（１９９２））、リポソーム（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８，１５８５，（１９９２））、水酸化アルミニウム（アラム）、ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６５，４８９，（１９９１））などが利用できる。このような方法で生体内にＣＴＬなどの免疫応答を誘導できることは上記のそれぞれの先行文献やＳｃｉｅｎｃｅ，２５５，３３３，（１９９２）などにも述べられている。
患者から採取した細胞または同ハプロタイプのＨＬＡクラスＩ抗原をもつ細胞に試験管内で当該エピトープペプチドを与えて抗原提示させたのち患者血管中に投与して患者体内で効果的にＣＴＬを誘導させる方法、あるいは患者末梢血リンパ球に同ペプチドを加えて試験管内で培養し、試験管内でＣＴＬを誘導増殖させたのち患者にもどす方法も、本発明のエピトープペプチドを使うことにより有効に適用することができる。従って、配列番号１から７のうちいずれかのアミノ酸配列を有するペプチド存在下でＨＬＡ−Ａ＊１１０１抗原を有する末梢血リンパ球を培養して得られるＣＴＬを抗ＡＩＤＳワクチンとして用いることもできる。
実際には患者末梢血リンパ球１０７から１０９個に本発明のペプチド０．０１ｍｇから１ｍｇを加えて数時間から１口培養した後患者静脈中に投与するか、あるいはさらに組換えインターロイキン２を５０Ｕ／ｍｌと当該ペプチド１μｇ／ｍｌを加えた培養液で数週間培地交換しながら培養を継続して試験管内でＣＴＬを誘導してから患者静脈より注入する。培養の方法は当業者間でよく知られている通常の方法でよく、培養後は遠心分離等で培地成分を洗浄した後、生理食塩水等に培養細胞を懸濁して投与する。このような細胞注入による治療はすでに癌治療法として実施されており、当業者間ではよく知られている方法である（Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３１３，４１８５，（１９８５）、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３３，１３１８，（１９８６））。
また本発明で明らかにされたＣＴＬエピトープはワクシニアウイルスやＢＣＧ菌組換え生ワクチンなどでも有効に活用できる。すなわちこれらの組換え生ワクチンにおいて発現させる組換え抗原タンパク遺伝子中に配列番号１から７のうちいずれかのアミノ酸配列を有するペプチドをコードするＤＮＡを組み込んでおけば、該ペプチド配列が抗原タンパクの一部として発現したのち細胞内でプロセスされてＨＬＡ−Ａ＊１１０１抗原により提示され、これを認識するＣＴＬを誘導することができる。ＢＣＧ菌における外来遺伝子の発現方法は国際特許公開ＷＯ８８／０６６２６に詳しい。ＢＣＧ菌組換え生ワクチンについてはＪ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７８，１９７，（１９９３）に詳しい。投与量、投与方法は通常の種痘やＢＣＧワクチンに準じて行うことができる。急性毒性等も通常の種痘やＢＣＧワクチンと変わるところはない。ただしワクシニアウイルスの場合ＡＩＤＳが発症し、免疫能が低下している患者には重篤感染の危険性があり、治療用ワクチンとしては慎重に行う必要がある。ＢＣＧワクチンについてはこのような事例はまだない。このような方法で生体にＣＴＬなどの免疫応答を誘導できることはＮａｔｕｒｅ，３３２，７２８，（１９８８）やＮａｔｕｒｅ，３５１，４７９，（１９９１）などに示されている。
実施例１．ＨＬＡ−Ａ＊１１０１発現細胞の調製
ＨＬＡ−Ａ＊１１０１を発現しているＣ１Ｒ細胞（Ｃ１Ｒ−Ａ＊１１０１）およびＨＬＡ−Ａ＊１１０１を発現しているＲＭＡ−Ｓ細胞（ＲＭＡ−Ｓ−Ａ＊１１０１）は，文献記載の方法（Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ，５２，５０１−５０９，（１９９８））に従って調製した。ここで、ＲＭＡ−Ｓ細胞およびＣ１Ｒ細胞はトランスポーター分子ＴＡＰ（Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）に欠陥のある、それぞれマウス細胞株およびヒト細胞株である（Ｎａｔｕｒｅ，３４６，４７６，（１９９０））。Ｃ１Ｒ細胞およびＲＭＡ−Ｓ細胞は１０％ＦＣＳを添加したＲＰＭ１１６４０培地で培養した。Ｃ１Ｒ−Ａ＊１１０１細胞およびＲＭＡ−Ｓ−Ａ＊１１０１細胞は１０％ＦＣＳおよび０．１５ｍｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢを含むＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。エプスタイン−バールウイルスで形質転換した細胞株Ｔｍ−ＥＢＶ（ＨＬＡ−Ａ１１／Ａ２４、Ｂ５２／Ｂ５２、Ｃｗ７／Ｃｗ＊１２０２）は１０％ＦＣＳを添加したＲＰＭＩ１６４０中で維持した。
特に断らない限り、遺伝子のクローニング、細胞の形質転換等は、分子生物学の分野で一般的な手法に従って行った（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．（１９８９）、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）。
実施例２．ＨＬＡ−Ａ＊１１０１結合ＨＩＶ−１−ＳＦ２株由来ペプチドの推定２−１．ペプチドの合成
ペプチドはマルチペプチド合成機（島津モデルＰＳＳＭ−８、島津製作所）を用いて合成し、質量分光法によりその配列を確認した。以下の実施例においては９０％以上の純度のペプチドを使用した。
２−２．ペプチドのＨＬＡ−Ａ＊１１０１分子への結合能
ＨＩＶ−１由来ペプチドのＨＬＡ−Ａ＊１１０１分子への結合能を文献に記載されているように（Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ，５２，５０１−５０９，（１９９８））ペプチド安定化アッセイによって調べた。
以下にペプチド安定化アッセイ法を簡単に説明する。
ＲＭＡ−Ｓ細胞およびＣ１Ｒ細胞はトランスポーター分子ＴＡＰ（Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）に欠陥のある、それぞれマウス細胞株およびヒト細胞株である。このため、３７℃で培養した時には低レベルでしか細胞表面上にＭＨＣクラスＩ抗原が発現しない。しかし低温（２６℃）で培養するとペプチドと結合していないクラスＩ抗原が高レベルで細胞表面上に発現することが知られている（Ｎａｔｕｒｅ，３４６，４７６，（１９９０））。
ＲＭＡ−Ｓ−Ａ＊１１０１細胞およびＣ１Ｒ−Ａ＊１１０１細胞でも同様にＨＬＡ−Ａ＊１１０１抗原は２６℃で培養した時には高レベルで細胞表面上に発現するが、３７℃で培養するとその発現は低下する。また２６℃で培養しておいたＲＭＡ−Ｓ−Ａ＊１１０１細胞またはＣ１Ｒ−Ａ＊１１０１細胞上のＨＬＡ−Ａ＊１１０１抗原の発現は３７℃に３時間おくことにより、３７℃で培養した場合と同じに発現量は低くなる。しかしながらペプチドが結合していないＨＬＡ−Ａ＊１１０１抗原に外から加えたペプチドが結合すると、ペプチドの結合したＨＬＡ−Ａ＊１１０１抗原は３７℃においても消失せず高発現量が保たれる。これを利用してペプチドのＨＬＡ−Ａ＊１１０１抗原に対する結合性を測定した。実際には２６℃で培養したＲＭＡ−Ｓ−Ａ＊１１０１またはＣ１Ｒ−Ａ＊１１０１細胞に合成したペプチドを加えて２６℃で１時間、その後３７℃で３時間置いた後、抗ＨＬＡ−Ａ＊１１０１モノクローナル抗体を用いてフローサイトメトリーによってＨＬＡ−Ａ＊１１０１の細胞表面の発現レベルを測定することによってペプチドの結合性を測定した。抗ＨＬＡ−Ａ＊１１０１モノクローナル抗体としては、ＨＬＡ−Ａ抗原を認識する入手可能なモノクローナル抗体を使用したが、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＣｏｌｌｅｇｅのＤｒ．Ｓｏｌｄａｎｏ  Ｆｅｒｒｏｎｅから供与されたＴＰ２５．９９抗体またはＭＢ４０．５抗体（ＡＴＣＣ  ＨＢ−１１６）を主として使用した。
その結果、合成した９２種のペプチドのうち６１種がＨＬＡ−Ａ＊１１０１抗原分子に結合した。この６１種のペプチドについて更にＨＬＡ−Ａ＊１１０１拘束性ＣＴＬ誘導活性を調べた。
実施例３．ＨＬＡ−Ａ＊１１０１結合ペプチドを用いたＨＩＶ−１感染患者からのＣＴＬの誘導と、その細胞障害性活性
実施例２で得られたＨＬＡ−Ａ＊１１０１結合ペプチドを用いてＨＩＶ−１感染患者からＣＴＬを誘導し、その細胞障害性活性を調べた。
３−１．ＣＴＬの誘導
ＨＬＡ−Ａ＊１１０１を有するＨＩＶ−１セロポジティブ患者ＩＵ（ＨＬＡ−Ａ１１／Ａ２４、Ｂ３８／Ｂ５１、Ｃｗ７／−）およびＫＯＧ（ＨＬＡ−Ａ２／Ａ１１、Ｂ４６／Ｂ５４、Ｃ１／−）からの末梢血リンパ球を単離した。末梢血リンパ球の分離は通常のＦｉｃｏｌｌ−Ｃｏｎｒａｙ比重遠心法（矢田純一、藤原道夫編著、「新リンパ球機能検索法」、中外医学社（１９８７）、新生化学実験講座１２「分子免疫学Ｉ」東京化学同人（１９８９））によった。すなわちヘパリン加注射器で採血後、生理食塩水で希釈し、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ分離液（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）上に重層後４００ｘｇ、３０分室温で遠心した。中間層のリンパ球画分をピペットで回収、洗浄して以下に用いた。２４穴培養プレートの各ｗｅｌｌに２ｘ１０６個のリンパ球を入れさらに組換えヒトＩＬ−２および合成ペプチドの最終濃度がそれぞれ５０Ｕ／ｍｌおよび１０−６Ｍになるように調製したＲＰＭＩ１６４０（１０％ＦＣＳを含む）培養液で培養する。２日〜３日おきに、５０Ｕ／ｍｌ濃度の組換えヒトＩＬ−２を添加したＲＰＭＩ１６４０培養液を半量かえた。
３−２．ＨＬＡ−Ａ＊１１０１結合ペプチドを用いて誘導されたＣＴＬによる特異的細胞障害活性の測定（ＣＴＬアッセイ）
まず、バルクの培養物を、ＰＨＡで刺激したのち放射線照射した自己リンパ球（１ｘ１０６）および１０−６ＭのＨＬＡ−Ａ＊１１０１結合ペプチドをそれぞれ加えることによって１週間ごとに再刺激して特異的ＣＴＬ細胞を増殖させた。このようにして２〜３回リンパ球バルク培養物を再刺激した後、予め対応するペプチドでパルスした、ＨＬＡ−Ａ＊１１０１を発現しているＴｍ−ＥＢＶ形質転換細胞に対するそれぞれの培養物中のＣＴＬ活性を測定した。ＣＴＬアッセイは以下のように行った。
ＨＬＡ−Ａ＊１１０１を発現しているＴｍ−ＥＢＶ形質転換細胞（１ｘ１０５）を生理食塩水中で１００μＣｉのＮａ２５１ＣｒＯ４と３７℃で６０分間インキュベーションし、その後１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培養液で３回洗浄し標識標的細胞とした。次に、９６穴プレートの各ウェルに５０μｌの培養液中に浮遊させた５ｘ１０３個の標識標的細胞を加えた。さらに４ｘ１０−６Ｍから４ｘ１０−１１Ｍに希釈したそれぞれのＨＬＡ−Ａ＊１１０１結合ペプチドの溶液を５０μｌ加え３７℃にて３０分間、ＣＯ２インキュベーターに放置した後、同じペプチドで刺激して培養した患者末梢リンパ球をエフェクター細胞として、エフェクター：標的細胞比（Ｅ：Ｔ）＝２：１となるように（１００μｌの培養液に浮遊させる）加え、３７℃のＣＯ２インキュベーターに４時間放置した。
その後各ウェルの半量の培養液（１００μｌ）をとり、ガンマーカウンターにて培養した患者末梢リンパ球の細胞障害活性によって標的細胞から遊離された５１Ｃｒを測定した。標的細胞に対するＣＴＬクローンの細胞障害性活性（特異的相対溶解率、すなわち特異的な細胞溶解の相対的割合）を次のとおり計算した。
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ただし、最小遊離値は標的細胞のみ入っているウェルの測定値で標的細胞からの５１Ｃｒの自然遊離値を意味し、最大遊離値は標的細胞に界面活性剤ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を加えて細胞を破壊した際の標識遊離値を示している。
この結果、ＨＬＡ−Ａ＊１１０１特異的ＣＴＬを誘導し得る２つの新たなペプチドＳＦ２−Ｐｏｌ４２４−９（配列番号１）およびＳＦ２−Ｅｎｖ２０２−９（配列番号２）が２人の患者の少なくとも１方から得られた（図１および図３）。
実施例４． ＨＬＡ−Ａ＊１１０１結合ペプチドのＣＴＬエピトープとしての同定
本発明の２種のペプチドＳＦ２−Ｐｏｌ４２４−９（配列番号１）およびＳＦ２−Ｅｎｖ２０２−９（配列番号２）が確かにＨＩＶタンパク質の内部プロッセシングされてＨＬＡ−Ａ＊１１０１分子によって提示されるペプチドであることを、単離した特異的ＣＴＬクローンおよび、標的細胞として組換えワクシニアウイルスに感染させた細胞を使用することによって確かめた。
まず、ＨＩＶ−１ＳＦ−２分離株のｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子またはｅｎｖ遺伝子を有する組換えワクシニアウイルスを文献の記載（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１７５，１３９，（１９９０））に従って作製した。次に、細胞あたり１０プラーク形成ユニットの組換えウイルスまたは野生型ウイルスと共に一晩培養してこの組換えワクシニアウイルスに感染させた。得られた細胞は、細胞表面上に内部プロセッシングされたＨＩＶ遺伝子産物断片をＨＬＡ抗原分子と結合した形態で提示しているはずである。一方、ＳＦ−２−Ｐｏｌ４２４−９およびＳＦ２−Ｅｎｖ２０２−９の２種のペプチドに特異的なＣＴＬクローンを、それぞれＨＩＶ感染患者に由来するペプチド特異的バルク培養物から単離した。
前述のようにして得られたワクシニアウイルス感染細胞を標的細胞として、実施例３−２に記載した方法に準じてＣＴＬアッセイを行った。簡単に言えば、感染細胞（１ｘ１０５）を生理食塩水中で１００μＣｉのＮａ２５１ＣｒＯ４とインキュベーションし（Ｃ１Ｒ−Ａ＊１１０１細胞またはＲＭＡ−Ｓ−Ａ＊１１０１細胞を使用する場合は２６℃にて９０分間）、その後１０％ＮＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培養液で３回洗浄し標識標的細胞とした。次に、９６穴プレートの各ウェルに５０μｌの培養液中に浮遊させた５ｘ１０３個の標識標的細胞を加えた。さらに４ｘ１０−６Ｍから４ｘ１０−１１Ｍに希釈したそれぞれのＨＬＡ−Ａ＊１１０１結合ペプチドの溶液を５０μｌ加え３７℃にて３０分間、ＣＯ２インキュベーターに放置した後、前述のようにして単離したＨＩＶ−１  ＰｏｌまたはＥｎｖ特異的ＣＴＬクローンをエフェクター細胞として、エフェクター：標的細胞比（Ｅ：Ｔ）＝１：１〜４：１となるように（１００μｌの培養液中に浮遊）加え、３７℃のＣＯ２インキュベーターに４時間放置した。その後各穴の半量の培養液（１００μｌ）をとり、ガンマーカウンターにて培養患者末梢リンパ球の細胞障害活性によって標的細胞から遊離された５１Ｃｒを測定した。各ペプチドに対して２系統ずつＣＴＬクローンをテストし、標的細胞に対するＣＴＬクローンの細胞障害性活性を上述の式（Ｉ）によって計算した。
すべてのＣＴＬクローンは、対応するペプチドでパルスされたＣ１Ｒ−Ａ＊１１０１に対して細胞障害活性を示した（図１および図３、エフェクター：標的＝２：１）。一方、種々のエフェクター：標的比において、これらのＣＴＬクローンはいずれの場合もＨＩＶ−１  Ｐｏｌタンパク質またはＥｎｖタンパク質を発現している組換えワクシニアウイルスに感染したＣ１Ｒ−Ａ＊１１０１細胞を殺すことができたが、野生型ワクシニアウイルスに感染した細胞を殺さなかった（図２および図３）。これらのデータは本発明の２種のペプチドＳＦ２−Ｐｏｌ４２４−９およびＳＦ２−Ｅｎｖ２０９−２がＨＩＶ−１特異的なＨＬＡ−Ａ＊１１０１拘束性ＣＴＬエピトープを含むことを示すものである。
実施例５．各エピトープのＨＩＶ−１感染患者における共通性および特異的ＣＴＬ誘導能の比較
ＨＬＡ−Ａ＊１１０１を有するＨＩＶ−１感染患者において本発明のエピトープＳＦ２−Ｐｏｌ４２４−９（配列番号１）、および既知の２種のエピトープが一般的かつ強く提示されているかどうかを調べるために、ＨＬＡ−Ａ＊１１０１を有する６人のＨＩＶ−１セロポジティブ患者からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を本発明のペプチドおよびＨＬＡ−Ａ＊１１０１拘束ＨＩＶ−１特異的ＣＴＬエピトープであるとして報告されているＰｏｌ３１３−３２１（ＡＩＦＱＳＳＭＴＫ）（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９７，１５９：１６４８−１６５７）およびＰｏｌ４９６−５０５（ＨＩＶ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｌｏｓ  Ａｌａｍｌｏｓ，１９９７）と一緒に１週間培養した。これをエフェクター細胞として用い、対応するペプチドでパルスしておいたＣ１Ｒ−Ａ＊１１０１およびＣ１Ｒ細胞を標的細胞として、ＣＴＬ活性を測定した。その結果を表１に示した。
ＳＦ２−Ｐｏｌ４２４−９、Ｐｏｌ４９６−５０５に特異的なＣＴＬ活性は６人の患者のうち１人において誘導された。一方Ｐｏｌ３１３−３２１に対するＣＴＬ活性は３人の患者において誘導された。これらの結果は、ＰｏｌエピトープはＨＩＶ−１感染患者において個体差があるが、ＨＬＡ−Ａ１１拘束ＣＴＬの主要な標的分子の一つであることを示唆するものである。
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実施例６ＨＩＶ−１サブタイプＥとＨＩＶ−１サブタイプＢ由来のペプチドの特異的ＣＴＬ誘導能
同様の方法でＨＩＶ−１サブダイプＥおよびサブタイプＢ由来のエピトープペプチドの探索を行い、サブタイプＥよりＰｏｌ６７５−９−５Ｅ（ＱＩＩＥＥＬＩＫＫ）（配列番号３），Ｐｏｌ６７５−９−５Ｋ８Ｅ（ＱＩＩＥＫＬＩＥＫ）（配列番号４）、Ｇａｇ  ３４９−１１（ＡＣＱＧＶＧＧＰＳＨＫ）（配列番号５），Ｎｅｆ  ８４−９−２Ｆ６Ｆ（ＡＦＤＬＳＦＦＬＫ）（配列番号６）、サブタイプＢよりＮｅｆ  ８４−９−２Ｌ（ＡＬＤＬＳＨＦＬＫ）（配列番号７）をエピトープ候補として選抜した。そこでこれらのペプチドとそれぞれサブタイプＥおよびサブタイプＢのＨＩＶ−１に感染している人の末梢血単核球を一緒に１週間培養し、これをエフェクター細胞として用いＨＬＡ−Ａ＊１１０１の陽性ＥＢＶ形質転換細胞を標的細胞として、ＣＴＬ活性を測定した。その結果を表３、表４に示した。
Ｐｏｌ  ６７５−９−５Ｅは、７人中５人で、Ｐｏｌ  ６７５−９−５Ｋ８Ｅは６人中２人で、Ｎｅｆ  ８４−９−２Ｆ６Ｆは７人中６人で、Ｇａｇ  ３４９−１１−９Ｓは７人中３人で、またＮｅｆ  ８４−９−２Ｌは５人中３人で特異的なＣＴＬが誘導できた。これらのサブタイプＥ由来のペプチドは、対応するサブタイプＢ特異的ＣＴＬでは認識できず、またこれらのサブタイプＥ特異的ＣＴＬは対応するサブタイプＢペプチドを認識しないことから、サブタイプＥ特異的エピトープである。またＨＬＡ−Ａ１１陽性でＨＩＶ−１サブタイプＢに感染した５人中、Ｎｅｆ  ８４−９（ＡＶＤＬＳＨＦＬＫ）（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４６：１５６０−１５６５１９９１）では特異的ＣＴＬが誘導できるがＮｅｆ  ８４−９−２Ｌでは誘導できない人が１人おり、その逆にＮｅｆ  ８４−９−２Ｌでは誘導できるが、Ｎｅｆ  ８４−９ではできない人が１名いる（表４）ことから、Ｎｅｆ  ８４−９−２ＬはＮｅｆ  ８４−９とは独立したＣＴＬエピトープと考えられた。
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本発明により、ＨＩＶ−１タンパク質の新たな７つのエピトープが提供され、ＨＬＡ−Ａ１１拘束性ＣＴＬを誘導するワクチン開発のための強力な更なる手段が提供される。本発明のペプチドはアジア人、特に日本人に多く見られるＨＬＡ−Ａ１１に拘束される、ＨＩＶ−１タンパク質に特異的なＣＴＬを誘導できるため、アジアにおけるＡＩＤＳ研究の基礎およびＨＩＶ−１ワクチン開発のための極めて重要な手段を提供する。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、ＨＬＡ−Ａ＊１１０１拘束ＨＩＶ−１特異的ＣＴＬエピトープのＣＴＬクローンによる認識の程度を示したものである。図中、黒塗り記号はＣ１Ｒ−Ａ＊１１０１細胞を、白抜き記号はＣ１Ｒ細胞を表す。データはエフェクター：標的＝２：１のものである。各ペプチドに関してそれぞれ２系統ずつＣＴＬクローンを用いた。●及び○はＳＦ２−Ｐｏｌ４２４−９−２７ＣＴＬクローンを表す。▲および△はＳＦ２−Ｐｏｌ４２４−９−３４ＣＴＬクローンを表す。
図２はＨＩＶ−１のＰｏｌタンパク質を発現している組換えワクシニアウイルスに感染させた標的細胞に対するＣＴＬ活性を示したものである。斜線棒グラフはＨＩＶ−１のＰｏｌタンパク質を発現している組換えワクシニアウイルスに感染したＣ１Ｒ−Ａ＊１１０１に対する特異的溶解のパーセントを示す。白抜きの棒グラフは野生型ワクシニアウイルスに感染したＣ１Ｒ−Ａ＊１１０１に対する特異的細胞溶解のパーセントを示す。
図３は、ＨＩＶ−１のＥｎｖタンパク質を発現している組換えワクシニアウイルスに感染させた標的細胞に対するＣＴＬ活性を示したものである。図３Ａおよび図３Ｂにおいて棒グラフは上から、それぞれ、Ｅｎｖタンパク質を発現しているワクシニアウイルスに感染したＣ１Ｒ−Ａ＊１１０１、野生型ワクシニアウイルスに感染したＣ１Ｒ−Ａ＊１１０１、Ｅｎｖタンパク質を発現しているワクシニアウイルスに感染したＣ１Ｒ、野生型ワクシニアウイルスに感染したＣ１Ｒ、ＳＦ２−Ｅｎｖ２０２−９でパルスしたＣ１Ｒ−Ａ＊１１０１、ＳＦ２−Ｅｎｖ２０２−９でパルスしたＣ１Ｒに対する特異的細胞溶解のパーセントを表す。ペプチド濃度は１０−６Ｍとした。
【図１】
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【図２】
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【図３（Ａ）】
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【図３（Ｂ）】
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