(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
-  ２０〜３０重量％のフラボノールグリコシド、
-  総量２．５〜４．５重量％のギンコリドＡ、Ｂ、ＣおよびＪ
-  ２．０〜４．０重量％のビロバリド
-  １０ｐｐｍ未満のアルキルフェノール化合物
-  １０重量％未満のプロアントシアニジン
-  ５０ｐｐｍ未満の４’−Ｏ−メチルピリドキシン
-  １００ｐｐｍ未満のビフラボン
を含有するイチョウ葉抽出物の生成方法であって、以下の工程の数値および順番：
ａ）含水アセトン、１〜３個の炭素原子を有する含水アルカノールまたは無水メタノールによるイチョウ葉を抽出、
ｂ）有機溶媒を１０重量％を越えない濃度まで濃縮することによる、最終蒸留工程において水を添加してもよい該溶媒の分離、
ｃ）残留水溶液を水によって固体含量５〜２５重量％に希釈し、温度を２５℃未満になるまで冷まし、沈殿が生じるまで静置、
ｄ）残留水溶液を硫酸アンモニウムによって処理し、メチルエチルケトンまたはメチルエチルケトンとアセトンとの混合物による少なくとも１回の抽出、
ｅ）得られた抽出物を濃縮し、エタノール−水混合物によって該溶液を５０重量％の水およびエタノール、および１０重量％の固体をそれぞれ含むように希釈、
ｆ）溶液を鉛化合物または不溶性ポリイミドによる処理、
ｇ）溶液を濾過、および強酸陽イオン交換体への透過である、水または含水メタノールを用いた該陽イオン交換体による溶離、
ｈ）溶離液の活性炭処理、
ｉ）沸点６０〜１００℃である脂肪族化合物溶媒または脂環式化合物溶媒による濾液の抽出、
ｊ）残留水−アルコール溶液を濃縮し、続いて硫酸アンモニウムによって処理し、メチルエチルケトンおよびアセトンによる抽出、
ｋ）得られた有機相を固体含量５０〜７０重量％に濃縮、および
ｌ）濃縮物を真空中にて乾燥し、水分含量５％未満の乾燥抽出物にする、
を特徴とする、前記方法。
【請求項２】
工程ｇ）および工程ｈ）が互いに交換可能である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程ｇ）および工程ｈ）を工程ｉ）の後にのみ実行する、請求項１または２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は４’−Ｏ−メチルピリドキシンおよびビフラボン含量低減イチョウ（ｇｉｎｋｇｏ  ｂｉｌｏｂａ）葉抽出物、それらの製造方法、および該抽出物を含有し、高用量においても４’−Ｏ−メチルピリドキシン還元体とビフラボンによる有害な副作用を伴わない薬剤に関する。
【０００２】
イチョウ葉抽出物は、治療を目的に３０年間使われている。ベルリンにある連邦健康理事会（Ｂｕｎｄｅｓｇｅｓｕｎｄｈｅｉｔｓａｍｔ）Ｅ委員会は、特定の抽出物からなる薬剤が、行動障害、末梢性閉塞症、目眩および耳鳴りの症状改善に有効であることを承認している（ＢＡｎｚ  Ｎｏ．１３３，１９９４年７月１９日）。該抽出物は、フラボングリコシドを２２〜２７％、ギンコリド（ｇｉｎｋｇｏｌｉｄｅ）Ａ、ギンコリドＢおよびギンコリドＣが２．８〜３．４％であり、ビロバリドが２．６〜３．２％であるテルペンラクトンを５〜７％、およびギンコル酸（ｇｉｎｋｇｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）（アルカリフェノール化合物）を最大５ｐｐｍ含有する特徴がある。このようなイチョウ葉抽出物およびその製造方法は、ＤＥ３９４００９１（ＥＰ−Ｂ−０４３１５３５）およびＤＥ３９４００９２（ＥＰ−Ｂ−０４３１５３６）によって知ることができる。
【０００３】
４’−Ｏ−メチルピリドキシン（４’−メトキシピリドキシン）が  イチョウ種子に含まれていることは、Ｗａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．３３（１９８５），３５５５−３５５７に記載されている。該化合物は、痙攣、意識不明のような中毒症状（“ギンナン食中毒”および“ギンナンシトトキシズム（ｓｉｔｏｔｏｘｉｓｍ）”）を来し、該症状は通常より大量のイチョウ種子を食した後に起こり得るものである。そのため、発見者は前記化合物を“ギンコトキシン（ｇｉｎｋｇｏｔｏｘｉｎ）”と命名した。同じ研究グループはその後の研究によって、４’−Ｏ−メチルピリドキシンはイチョウ葉に含まれていないことを見出した（Ｗａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．１６（１９９３），２１０−２１２）。この報告と対照的に、イチョウ葉からの４’−Ｏ−メチルピリドキシンの単離と同定に関する報告が近年発刊された文書に報告されている（Ａｒｅｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔａ  Ｍｅｄｉｃａ  ６２（１９９６），５４８−５５１）。
【０００４】
この研究では、イチョウ葉抽出物を含有する市販製剤が、抗ビタミンＢ６剤（４’−Ｏ−メチルピリドキシン）含有量に関して分析され、約４μｇ／ｍｌから１０μｇ／ｍｌの濃度の液体医薬形態が見出された。これは製剤化された乾燥抽出物の約１００〜２５０ｐｐｍに相当する。
【０００５】
治療目的に用いられるイチョウ抽出物は、さらに１０００ｐｐｍ以下のビフラボンを含有している。我々自身の研究によって、文献既知の生物活性以外に、これらの化合物には免疫毒活性もあることが明らかになっている。マウスを用いた膝窩リンパ節アッセイにおいて、我々はエタノール−水によるイチョウ葉の総抽出物の酢酸エチル可溶分画に、リンパ節が反応することを確認した；実施例１を参照。クロマトグラフィー分離によって得られたサブフラクションを用いた試験によって、免疫毒活性は、ビフラボンを７０％より多く含むサブフラクションの投与後にしか起こらないことが明らかになった。イチョウにおいて見出されたビフラボンは、以下の化合物である：シアドピチシン、ギンケチン、イソギンケチン、セコイアフラボン、およびビロベチン。
【０００６】
本発明に関する技術的課題は、４’−Ｏ−メチルピリドキシンおよびアルキルフェノール化合物（ギンコル酸、ギンコール（ｇｉｎｋｇｏｌ））を事実上含まず、ビフラボン含有量は技術的に可能な最小量であり、活性決定成分であると認められたフラボノールグリコシドおよびテルペンラクトン含有量は、Ｅ委員会（ＢＡｎｚ  Ｎｏ．１３３，１９９４年７月１９日）が規定した量である、イチョウ葉抽出物を提供することである。
【０００７】
本発明による抽出物は、以下を含有する：
−２０〜３０重量％のフラボノールグリコシド、
−総量２．５〜４．５重量％のギンコリドＡ、Ｂ、ＣおよびＪ
−２．０〜４．０重量％のビロバリド
−１０ｐｐｍ未満、好ましくは１ｐｐｍ未満のアルキルフェノール化合物（ギンコル酸、ギンコール）
−１０重量％未満のプロアントシアニジン
−５０ｐｐｍ未満の４’−Ｏ−メチルピリドキシン
−１００ｐｐｍ未満のビフラボン
さらに本発明は、このようなイチョウ葉抽出物の生成方法に関する。
【０００８】
この技術的課題は、イチョウ抽出物の既知の生成方法に、新たな２工程を導入することによって解決された：
１．陽イオン交換体による４’−Ｏ−メチルピリドキシンの低減
２．活性炭へのビフラボンの吸着
【０００９】
これらの操作は、ＤＥ３９４００９１の請求項３による製法中、好ましくは工程ｇ）において実施される。したがって、工程ｆ）において得られた溶液の濾過後、該溶液を陽イオン交換体カラムに通し、該カラムを含水エタノールまたは含水メタノールによって溶離する。得られた溶離液を活性炭処理する。陽イオン交換体の溶離には２０〜８０重量％、好ましくは５０重量％のエタノールまたはメタノールを用いることができる。本発明による前記２操作の順番は互いに交換可能であり、いずれの場合も結果は変わらない。その後下記実施例３に従って操作を継続し、溶液を脂肪族化合物溶媒または脂環式化合物溶媒によって抽出し、アルキルフェノール化合物を除去する。
【００１０】
前記方法の工程ｃ）によって、脂溶性成分、すなわち水に溶けにくい成分が除去されるが、該成分にはビフラボンの量の大部分が含まれる。
したがって、本発明の請求項１による抽出物調整の好ましい方法は、以下の工程の数値および順番に特徴がある。
【００１１】
ａ）含水アセトン、１〜３個の炭素原子を有する含水アルカノールまたは無水メタノールによるイチョウ葉を抽出、
ｂ）有機溶媒を１０重量％を越えない濃度まで濃縮することによる、最終蒸留工程において水を添加してもよい該溶媒の分離、
ｃ）残留水溶液を水によって固体含量５〜２５重量％に希釈し、温度を２５℃未満になるまで冷まし、沈殿が生じるまで静置、
ｄ）残留水溶液を硫酸アンモニウムによって処理し、メチルエチルケトンまたはメチルエチルケトンとアセトンとの混合物による少なくとも１回の抽出、
【００１２】
ｅ）得られた抽出物を濃縮し、エタノール−水混合物によって該溶液を５０重量％の水およびエタノール、および１０重量％の固体をそれぞれ含むように希釈、ｆ）溶液を鉛化合物または不溶性ポリイミドによる処理、
ｇ）溶液を濾過、および強酸陽イオン交換体への透過である、水または含水メタノールを用いた該陽イオン交換体による溶離、
ｈ）溶離液の活性炭処理、
ｉ）沸点６０〜１００℃である脂肪族化合物溶媒または脂環式化合物溶媒による濾液の抽出、
ｊ）残留水−アルコール溶液を濃縮し、続いて硫酸アンモニウムによって処理し、メチルエチルケトンおよびアセトンによる抽出、
ｋ）得られた有機相を固体含量５０〜７０重量％に濃縮、および
ｌ）濃縮物を真空中にて乾燥し、水分含量５％未満の乾燥抽出物にする。
【００１３】
本発明のさらなる態様においては、工程ｇ）および工程ｈ）は交換可能である。
本発明のさらなる態様においては、前記方法の工程ｇ）および工程ｈ）は工程ｉ）の後にのみ実行される。
【００１４】
フラボノールグリコシドおよびテルペンラクトンを濃縮する、吸着樹脂を用いる既知の方法（ＥＰ−Ｂ−０３６０５５６、ＪＰ−Ａ−０４１８２４３４）において、本発明による前記２工程は、脱着工程においては抽出物のメタノール−水溶液によって（ＥＰ−Ｂ−０３６０５５６、実施例ＩＩＩ、請求項１２参照）、およびエタノール−水溶液の場合はＪＰ−Ａ−０４１８２４３４によって、それぞれ行われる。
有用な陽イオン交換体の例は、酸陽イオン交換体である。最も好ましい陽イオン交換体は、ＭｅｒｃｋＩのような酸陽イオン交換体である。
【００１５】
本発明による抽出物は、薬学的試験モデルにおいて循環促進活性、虚血性障害防止活性、ラジカル捕食活性、および血栓凝集阻害活性を示し、これまで知られていたイチョウ抽出物と対照的に、４’−Ｏ−メチルピリドキシンおよびビフラボンが誘発する危険がある有害な影響を高投薬量でも生じせしめない。
【００１６】
さらに、本発明は、本発明によるイチョウ抽出物を含有することが特徴である薬剤に関する。
薬剤を製剤する場合、本発明による抽出物は従来法に従って製造してもよく、例えば、溶液、被覆錠剤、錠剤または注射用製剤にしてもよい。該薬剤は、末梢性循環障害および脳動脈循環障害の処置に使用してよい。
【００１７】
実施例１
膝窩リンパ節試験：１８〜２４ｇのＣ５７ＢＬ／６の雄マウスを用いた（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，Ｓｕｌｚｆｅｌｄ）。動物を餌および水を自由に得られる標準環境条件下に保持した。膝窩リンパ節反応（ＰＬＲ）誘導のため、ＤＭＳＯ１０μｌ中の試験物質を、足底下（ｓｕｂｐｌａｎｔａｒ）から左後脚に注射した。対照群の動物にはＤＭＳＯ１０μｌの注射１回のみを処理した。各単一抽出物は、２ｍｇの量を投与した。異なる亜抽出物の用量は、開始時点における各抽出物の割合に一致させた。
【００１８】
試験動物を、エーテル麻酔下、頸部切断により７日後に屠殺した。膝窩リンパ節を両方除去し、付着組織を除去した後、湿った濾紙を敷いたペトリ皿に集めた。その直後にリンパ節の重量を、０．１ｍｇ感度の電子秤にて計量した。ＰＬＲ強度を、同側性膝窩リンパ節および対側性膝窩リンパ節の重量差を指標として求めた。
0004530533.tif 000002
【００１９】
実施例２
ＤＥ３９４００９１（ｃｏｌ．４，?．６７）の実施例１による鉛−タンニン沈殿操作の上清に活性炭２．５ｇを添加し、５０重量％のエタノール中に乾物残渣を１０重量％含むようにする。該混合物を室温下にて３０分間攪拌する。活性炭を濾過して除去し、濾液を２０ｍｌの強酸性陽イオン交換体（ＭｅｒｃｋＩ）を担持したカラムに通す。ＤＥ３９４００９１の実施例１に記載の方法によって、溶離液をさらに処理する。
【００２０】
乾燥抽出物２２．２５ｇが、ギンコフラボングリコシド（ｇｉｎｋｇｏ  ｆｌａｖｏｎｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）を２３．９％、ギンコリドを３．３％、ビロバリドを２．９％、プロアントシアニジンを７．１％，アルキルフェノール化合物を１ｐｐｍ未満、４’−Ｏ−メチルピリドキシンを５０ｐｐｍ未満*)、およびビフラボンを６０ｐｐｍ**)未満含有して、メチルエチルケトン／エタノール中の最終産物溶液を乾燥後に得られる。
【００２１】
実施例３
吸着樹脂Ｄｕｏｌｉｔｅ  Ｓ−７６１から、ＥＰ−Ｂ−０３６０５５６実施例ＩＩＩの第５頁第４１行に従ってフラボンおよびテルペンラクトンを脱着して得た９０％メタノール−水溶液２５０ｍｌを、９０重量％メタノール中に乾燥残渣を１０％含有する状態で、１５ｍｌの強酸性陽イオン交換体を担持したカラムに通す。活性炭３．７５ｇを添加して該溶液の一部を真空下において除去し、水を添加して該溶液のメタノール濃度を５０重量％に調整し、室温下にて３０分間攪拌する。
【００２２】
濾過床を通る吸引によって活性炭を濾過し、５０重量％メタノール２０ｍｌにて濯ぐ。乾燥抽出物２３．２ｇが、ギンコフラボングリコシドを２２．８％、ギンコリドを３．１％、ビロバリドを２．８％、プロアントシアニジンを９．６％，アルキルフェノール化合物を１ｐｐｍ未満、４’−Ｏ−メチルピリドキシンを５０ｐｐｍ未満、およびビフラボンを２８ｐｐｍ未満含有して、真空下乾燥による溶液の濃縮後に得られる。
【００２３】
実施例４
イチョウ抽出物錠剤の製剤：
【表１】
0004530533.tif 000003
*）Ａｒｅｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔａ  Ｍｅｄｉｃａ，Ｖｏｌ．６２（１９９６），５４８−５５１による分析方法
**) Ｇｏｂｂａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｉｔｏｔｅｒａｐｉａ，Ｖｏｌ．６７（１９９６），１５２−１５８による分析方法
***)ＤＡＢ  １０＝Ｄｅｕｔｓｈｅｓ  Ａｒｚｎｅｉｎｂｕｃｈ１０＝ドイツ薬局方１０