(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
汚染物に含有されたテトラクロロエチレンを分解する方法であって、
前記汚染物を、クロストリジウム・ビフェルメンタンスＤＰＨ−１株及びモラセスが存在する環境下に静置し、
汚染物に対して、Ｋ2ＨＰＯ4、ＫＨ2ＰＯ4及び（ＮＨ4）2ＳＯ4を添加することを特徴とするテトラクロロエチレンの分解方法。
【請求項２】
請求項１に記載のテトラクロロエチレンの分解方法であって、
汚染物に対して、メタノール、エタノール、グルコース、乳酸、蟻酸、酢酸からなる群から選ばれる少なくとも１つの電子供与体を添加することを特徴とするテトラクロロエチレンの分解方法。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載のテトラクロロエチレンの分解方法であって、
汚染物を、クロストリジウム・ビフェルメンタンスＤＰＨ−１株の初発菌体量が０．０１２ｍｇｐｒｏｔｅｉｎ／ｍｌ以上である環境下に静置することを特徴とするテトラクロロエチレンの分解方法。
【請求項４】
請求項１から請求項３のうちいずれか１項に記載のテトラクロロエチレンの分解方法であって、
汚染物は地下水であることを特徴とするテトラクロロエチレンの分解方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、微生物を用いて土壌中や水中等に存在するテトラクロロエチレンを分解するバイオレメディエーション技術に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、地下水や土壌などが重金属や有機化合物などによって汚染されていることが問題となっている。なかでも特に問題となっているのが、毒性が指摘され、水質汚濁防止法等により有害物質として規制されているトリクロロエチレン（TCE）やテトラクロロエチレン（PCE）などの有機塩素化合物による汚染である。これらの有機塩素化合物はクリーニング用洗浄溶剤や金属部品の脱脂洗浄、製品の原料などとして30年以上前から諸産業で有用な溶剤として用いられてきている。現在までに、PCE、TCEは以下のような毒性を持つことが分かっている。急性毒性としては中枢神経の抑圧、皮膚障害、腎臓や肝臓の障害など、微量を長期間摂取した場合の慢性毒性としては指の麻痺、呼吸器や心臓への障害、視覚・聴覚障害などである。また、発がん性も指摘されており、報告されている癌への関与は肝臓ガン、食道ガン、子宮頸部ガン、非ホジキンリンパ腫などである。また、PCE、TCEは土壌中に浸出すると、微生物の働きにより、cis-1,2-ジクロロエチレン(cDCE)へ分解されることも分かってきている。
【０００３】
PCEの人工的な浄化法としては、物理化学的手法と生物学的手法の２種類が考えられる。物理化学的手法では、PCEの揮発しやすいという性質を活かした「土壌ガス吸引技術」や「地下水揚水曝気技術」が開発・実用化されている。生物学的手法では、微生物などを利用して汚染環境を浄化するバイオレメディエーション(bioremediation)や、植物を利用したファイトレメディエーション(phytoremediation)が考えられている。前者のバイオレメディエーションは、基本的には分解や変換が可能な有機汚染物質が対象となるが、重金属のように金属そのものを除去しなければならない場合には、土壌から抽出して濃縮しなくてはならない。このような場合には後者のファイトレメディエーションの利用が可能である。ファイトレメディエーションで植物体に濃縮された重金属などは、燃焼させた後、取り出し、最終処分を行う必要がある。
【０００４】
バイオレメディエーションは微生物利用の形態から３つの方法に分類される。一つ目の方法はバイオスティミュレーション(biostimulation)と呼ばれる方法で、リンや窒素などの無機栄養塩類やエネルギー源となる基質を添加したり、酸素を吹き込んだりすることによって汚染現場に既に生息している汚染物質分解微生物の分解能力を活性化し浄化するものである。二つ目の方法はバイオオーギュメンテーション(bioaugmentation)と呼ばれるもので、純粋培養した分解微生物や、集積培養した分解微生物群を外部から投入し浄化を行わせる方法である（［非特許文献１］参照）。三つ目の方法はナチュラルアテニュエーション(naturalattenuaion)と呼ばれるもので、自然の浄化作用で分解されるのに任せて、どの程度分解されていくかをモニタリングするのものである。このようなバイオレメディエーション技術は現在、利用するプロセスにより以下の４種類に分類される。
●固体処理 (Solid phase bioremediation)
汚染した土壌を掘削・山積みにし、空気または酸素を通気しさらに水分や栄養塩類を添加して、土壌中の好気性微生物の活性を上げて浄化する方法。石油汚染の浄化に有効なバイオパイルに代表される。
●スラリー処理 (Slurry phasebaioremediation)
汚染土壌に水を加え、スラリー状にし、これを反応層中に移し、分解微生物や栄養物質を添加し、攪拌混合して処理する方法。汚染物質が難分解性でかつ高濃度である場合に適している。
●原位置処理 (In situ bioremediation)
有機物質で汚染された土壌に窒素やリンなどの栄養塩類さらに有機物、酸素、必要に応じて分解微生物を注入して微生物の活性を高める方法。
●バイオリアクター（Bioreactor）
汚染した地下水を汲み上げて地上で反応装置を用いて処理する方法。排水および排ガスの処理に適用できる。
【０００５】
また、PCEを分解する働きを持つ微生物として、クロストリジウム・ビフェルメンタンスDPH-1株（Clostridiumbifermentans DPH-1株）が従来知られている（［非特許文献２］参照）。
【０００６】
【非特許文献１】
加来伸夫，渡辺一哉，石油汚染バイオレメディエーションの安全性評価，生物工学会誌，80，527-529(2002)
【非特許文献２】
Chang Y. C.Hatsu，K. Takamizawa，Isolation  andcharacterization of a tetrachloroethylene dechlorination bacterium，Clostridiumbifermentans DPH-1．，J.Biosci.Bioeng，89，489-491，2000
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
バイオレメディエーションは現場で浄化ができ、省エネルギーで、低濃度、広範囲の汚染の修復ができ、薬品を用いないため処理に伴う二次廃棄物の発生も少ないなど優れた点が多く挙げられる。
本願発明は、このようなバイオレメディエーション技術の一つとして、上述したクロストリジウム・ビフェルメンタンスDPH-1株を用いることで汚染物中に存在するテトラクロロエチレン（PCE）をより効率的に分解する方法を提供することを課題とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
前記課題を解決するために、以下の（１）〜（４）に記載した発明が構成される。
（１）汚染物に含有されたテトラクロロエチレンを分解する方法であって、
前記汚染物を、クロストリジウム・ビフェルメンタンスＤＰＨ−１株及びモラセスが存在する環境下に静置し、
汚染物に対して、Ｋ2ＨＰＯ4、ＫＨ2ＰＯ4及び（ＮＨ4）2ＳＯ4を添加することを特徴とするテトラクロロエチレンの分解方法。
（２）前記（１）に記載のテトラクロロエチレンの分解方法であって、
汚染物に対して、メタノール、エタノール、グルコース、乳酸、蟻酸、酢酸からなる群から選ばれる少なくとも１つの電子供与体を添加することを特徴とするテトラクロロエチレンの分解方法。
（３）前記（１）または（２）に記載のテトラクロロエチレンの分解方法であって、
汚染物を、クロストリジウム・ビフェルメンタンスＤＰＨ−１株の初発菌体量が０．０１２ｍｇｐｒｏｔｅｉｎ／ｍｌ以上である環境下に静置することを特徴とするテトラクロロエチレンの分解方法。
（４）前記（１）から（３）のうちいずれか１項に記載のテトラクロロエチレンの分解方法であって、
汚染物は地下水であることを特徴とするテトラクロロエチレンの分解方法。
【０００９】
上記（１）〜（４）に記載した発明において、「汚染物」とあるのは、汚染物質としてのテトラクロロエチレンが含有された土壌や地下水等を表現するために便宜的に用いた用語である。本願発明は、テトラクロロエチレンが含有されている系であれば、土壌や地下水等に限らずどのような系に対しても適用可能である。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、図面を参照しながら本発明の実施の形態を詳細に説明する。
本実施の形態では、テトラクロロエチレン（以下PCEと称する）分解菌として知られているクロストリジウム・ビフェルメンタンスDPH-1株（以下DPH-1株と称する）を用いて、培地中に存在するPCEを分解する方法について説明する。
【００１１】
まず、本実施の形態において使われる菌株の種類、培養方法について説明する。
〔供試菌株〕
供試菌株にはクロストリジウム・ビフェルメンタンスDPH-1株（C.bifermentans DPH-1株）を用いた。本菌株は、イースト抽出物（以下yeastextractと称する）の発酵に伴って発生する水素を電子供与体とし、PCEをTCE（トリクロロエチレン）を経てcDCE（cis-1,2-ジクロロエチレン）にまで脱塩素分解することが確認されている。なお、Clostridium属の細菌は、偏性嫌気性の周鞭毛を有するグラム陽性の桿菌である。胞子は耐熱性を示し、また乾燥や化学薬品に対しても強い抵抗性を示すことが知られている。
【００１２】
〔培養方法〕
Clostridium属の細菌は偏性嫌気性であるため培養を嫌気条件下で行った。すなわち、培地調製時に窒素ガスを用いて嫌気性を保つ操作を行った。窒素ガスは窒素ガス中にわずかに混入している酸素ガスを除去するために、還元銅カラムを通過させて除去した。
【００１３】
１．DPH-1株のPCE分解に及ぼすyeast extract濃度及び各種電子供与体の影響
〔培養操作方法〕
（１） 培地調製
本実施の形態で用いるMY培地の成分を［表１］に示す。蒸留水にMY培地成分を溶解し、20-ml容バイアル瓶に9.5mlずつ分注した。窒素置換を液相10分間、気相5分間行った後、テフロン（登録商標）栓、アルミキャップにて密封し、高圧水蒸気滅菌(121℃、15分間)を行った。その後、あらかじめ0.22μmメンブランフィルター(MILLIPORE社製)を用いて濾過滅菌を行ったビタミン水溶液(p-aminobenzoicacid 0.1 g/l、biotin 0.001 g/l)および硫酸第一鉄水溶液(FeSO4・7H2O 0.02 g/l)を各100μlずつ無菌条件下で注入した。
また、培地中のyeast extract濃度の影響を確認するため、MY培地のyeastextract濃度のみを0、0.125、0.25、0.5、1.0、4.0 g/lに調整した培地を同様の操作で作成した。
（２）植菌および培養
上記（１）の方法により調製した培地に、PCE分解を確認した前培養液300μlを注入し、ドラフト内でPCEを6.0μMとなるように添加し、30℃のインキュベーターで静置培養を行った。一連の操作は無菌条件下で行った。
【００１４】
【表１】
0004530196.tif 000002
【００１５】
〔分析条件〕
（１）PCE、TCE及びcDCE分析
PCE、TCE及びcDCEはガスクロマトグラフを用いたヘッドスペース法により分析した。ヘッドスペース法は環境分析方法として一般的なもので、気液平衡状態となった気相部の一定量をガスクロマトグラフに導入する分析法である。
サンプルの入ったバイアル瓶を一定温度で30分以上保ち気液平衡状態とした。気相部250μlをガスタイトシリンジで抜き取り、水素炎イオン化検出器付きガスクロマトグラフ（FID-GC：SHIMADZUGC-14B）へ導入した。分析により得られた各ピーク面積と、あらかじめ作製しておいた標準曲線から気相濃度を算出した。
（２）タンパク質量測定
タンパク質量の測定はBradford法にて行った。
〈操作方法〉
培養液1.5 mlをエッペンドルフチューブに入れ、遠心分離し(13,000 rpm×5 min、4℃)、上清を捨て、菌体を回収した。ここに蒸留水300μlを入れ再懸濁し、密閉型超音波破砕装置(UCB-200TM型)を用いて白濁した菌液が透明になるまで超音波破砕を行った。破砕後の菌液60μlをプロテインアッセイCBB試薬1.5mlに添加し、よく攪拌した。分光光度計で波長595 nmにて吸光度を測定し、あらかじめ牛血清アルブミン(BSA)を用いて作製した検量線からタンパク質量を算出した。（３）濁度測定
菌体タンパク質量と菌体濁度は比例することが知られている。したがって、濁度よりおおよそのタンパク質量を推測することが可能である。分光光度計を使用して波長660 nm吸光度を測定し、あらかじめ作製したタンパク質量と濁度の検量線からタンパク質量を推測した。
【００１６】
〔電子供与体の影響〕
PCEの分解は電子のやり取りによって行われるため、PCE分解反応における電子供与体の影響を検討することは、PCE分解能の向上を考える際において有用であると考えた。PCE分解に用いられる電子供与体はPCE分解菌によって様々であるが、本菌株はyeastextractを発酵するときに生じる水素を電子供与体として用いることが分かっている。そこで、本実施の形態では、さらに異なった電子供与体を添加することにより、PCEの分解率を向上させることについても検討した。
【００１７】
〔操作方法〕
20-ml容バイアル瓶にMY培地を9.5 ml分注し、各種電子供与体（メタノール、エタノール、グルコース、乳酸、蟻酸、フマル酸、酢酸）を初発濃度が0.61mMとなるように添加した。窒素置換を行った後、テフロン栓とアルミキャップにて密封し、高圧水蒸気滅菌を行った。あらかじめ濾過滅菌を行ったビタミン水溶液(p-aminobenzoicacid 0.1 g/l、biotin 0.001 g/l)および硫酸第一鉄水溶液(FeSO4・7H2O 0.02 g/l)を無菌的に各100 μlずつ注入した。ここに前培養液を300μl注入し、PCEを培地中の濃度が6.0 μMとなるように添加した。30℃にて24時間静置培養を行った。
【００１８】
〔結果〕
（１）yeast extractの濃度条件の影響
yeast extract濃度と濁度の関係を図１に示す。yeastextract濃度0 g/lの条件を除く全ての濃度で濁度の上昇が確認され、yeast extract濃度が高いほど濁度は高くなった。48時間培養後にガスクロ分析を行ったところ、yeastextract 濃度4.0、2.0、1.0、0.5 g/lの条件ではPCEはほぼ完全に分解されていることが確認され、PCEとほぼ同モルのcDCEが検出された。一方、0.25、0.125g/lの条件においては48時間培養後には未分解のPCEが検出された。つまり、PCEをほぼ完全に分解するためには、培地のyeast extract濃度が0.5g/l以上であることが好ましいことが判明した。
（２）電子供与体の影響
各種電子供与体を添加した条件におけるPCE脱塩素分解率を図２に示す。フマル酸を添加した条件を除く全ての条件においてPCE脱塩素分解率の上昇が確認された。つまり、PCE脱塩素分解率の向上のためには、メタノール、エタノール、グルコース、乳酸、蟻酸、酢酸からなる群から選ばれる少なくとも１つの電子供与体を添加することが好ましいことが判明した。
【００１９】
〔DPH-1株を用いてPCEを分解する方法について〕
以上得られた結果より、DPH-1株を用いて汚染物中に含有されるPCEを効率的に分解する方法として、以下の方法が提供される。
（１）PCEを高効率で分解させるためには、MY培地中のyeast extract濃度が高い程よく、PCEを完全に分解させるためには、yeastextractの濃度が0.5 g/l以上の条件であることが好ましい。すなわち、培地中（汚染物中と読み替えてもよい）に含有されるPCEをより効率的に分解する方法として、その培地中のyeastextractの濃度が0.5 g/l以上であることを特徴とするPCEの分解方法が提供される。
（２）PCEを高効率で分解させるためには、メタノール、エタノール、グルコース、乳酸、蟻酸、酢酸からなる群から選ばれる少なくとも１つの電子供与体を添加することが好ましい。すなわち、培地中（汚染物中と読み替えてもよい）に含有されるPCEをより効率的に分解する方法として、その培地中にメタノール、エタノール、グルコース、乳酸、蟻酸、酢酸からなる群から選ばれる少なくとも１つの電子供与体を添加することを特徴とするPCEの分解方法が提供される。
【００２０】
２．DPH-1株のPCE分解に及ぼす各種培養条件の影響
〔温度条件の影響〕
DPH-1株は30℃にて培養を行っているが、例えば実際のPCE汚染現場である地下水の水温は年間を通して15℃前後と低温である。このため、より低温での菌体の増殖ならびにPCE分解について比較検討を行うことは有用であると考えた。
【００２１】
〔増殖温度の確認〕
MY培地を20-ml容のバイアル瓶に9.5 mlずつ分注し、窒素置換を行った後、テフロン栓、アルミキャップにて密封し、高圧水蒸気滅菌を行った。あらかじめ濾過滅菌したビタミン水溶液(p-aminobenzoicacid 0.1 g/l、biotin 0.001 g/l)および硫酸第一鉄水溶液(FeSO4・7H2O 0.02 g/l)を無菌的に各100μlずつ注入した。その後、前培養液300μlを注入し、PCEを初発濃度が6.0μMとなるように添加した後、培養温度4、10、15、20、30、37℃にて静置培養を行った。
【００２２】
〔増殖速度の比較〕
蒸留水にMY培地成分(［表１］参照)を溶解し、100-ml容バイアル瓶に57ml分注した。窒素置換を行った後、テフロン栓とアルミキャップにて密封し、高圧水蒸気滅菌を行った。あらかじめ濾過滅菌を行ったビタミン水溶液(p-aminobenzoicacid 0.1 g/l、biotin 0.001 g/l)および硫酸第一鉄水溶液(FeSO4・7H2O 0.02 g/l)を無菌的に各600μlずつ注入した。ここに前培養液を1800μl注入し、PCEを培地中の濃度が6.0μMとなるように添加した。15℃と30℃にて静置培養を行いながら、一定時間毎に培養液を1500μlずつ抜き取り、Bradford法にて菌体タンパク質量の定量を行った。
【００２３】
〔PCE分解速度の比較〕
MY培地にビタミン水溶液および硫酸第一鉄水溶液を添加し、前培養液300μlを注入した。ここにPCEを初発濃度が6.0μMとなるように添加し、15℃と30 ℃にて静置培養を行った。一定時間毎に気相部250μlをガスタイトシリンジで抜き取りPCE、TCE及びcDCEの分析を行った。
【００２４】
〔PCE濃度条件の検討〕
PCE濃度の菌体増殖への影響について検討した。
〈操作方法〉
MY培地にビタミン水溶液、硫酸第一鉄水溶液を添加し、前培養液300μlを注入した。ここにPCEをそれぞれ初発濃度が0、6.0、18.1、30.2、42.2、60.3、603.0μMとなるように添加し、30℃にて静置培養を行った。
【００２５】
〔初発菌体量の検討〕
初発菌体量の菌体増殖、PCE分解へ及ぼす影響を検討した。
〈操作方法〉
MY培地を作製し、無菌条件でDPH-1株の前培養液をそれぞれ50、100、300、1000、1500μl注入し、初発タンパク質量が0.002、0.004、0.012、0.040、0.012mg protein/mlとなるようにした。PCEを初発濃度が6.0μMとなるように添加し、30℃にて静置培養を行った。
【００２６】
〔結果〕
（１）培養温度の影響
培養温度と濁度の関係を図３に示す。4 ℃を除く全ての条件で菌体増殖が起こることが確認された。
24時間培養後のPCE分解率を図４に示す。4 ℃を除く全ての条件でPCEの脱塩素分解が確認された。
現在、PCE汚染が問題となっている地下水は年間を通じて水温が15℃前後（15℃±５℃程度）である。前述の結果より、DPH-1株は15℃前後においても菌体増殖が可能であり、PCE脱塩素分解も十分に可能であることが確認された。
（２）培養温度と増殖速度との関係
回分培養における細菌の一般的な増殖は、見かけ上菌体濃度に変化の無い誘導期、菌体濃度が対数的に増加する対数増殖期、増殖速度が低下する転移期、菌体濃度の変化しない静止期、細胞の自己消化が起こる死滅期の5つの時期から成る。対数増殖期は菌体濃度の増加という点で、全培養期間の核に当たると考えられる。対数増殖期の増殖速度はその時点に存在する菌体濃度に正比例すると仮定すると、以下の［１式］が与えられる。
ｄＸ／ｄｔ  ＝  μＸ                  ［１式］
パラメーター
Ｘ；菌体タンパク質濃度 (mg protein・ml-1)
μ；比増殖速度(h-1)
ｔ；時間 (h)
対数増殖期では比増殖速度μは一定とみなすことができる。本菌株も同様の増殖を行うと仮定し、対数増殖期の増殖速度の比較を行った。
15℃と30℃における菌体タンパク質量の変化を図５に示す。30℃の条件では培養3時間後から6時間後に最も菌体タンパク質量が増加し、それ以降はほぼ一定となった。培養3時間後から6時間後を対数増殖期と考え、増殖速度を算出したところ0.121mg protein・ml-1・h-1と求められた。15℃の条件では培養9時間後から24時間後を対数増殖期に当たるとし、増殖速度を算出したところ0.034mg protein・ml-1・h-1と求められた。以上の結果より30℃における増殖速度は15℃の3.5倍以上であることが確認された。
15℃と30℃におけるPCE濃度の変化を図６に示す。いずれの条件においても6.0μMのPCEは完全に分解されることが確認された。PCEの分解反応をみかけの一次反応であると仮定すると、以下の［２式］式が与えられる。
ｄＣ／ｄｔ  ＝  −ｋＸ                  ［２式］
パラメーター
Ｃ；PCE濃度（μM）
ｋ；ＰＣＥ分解の一次反応定数(μM・ml・mg protein-1・h-1)
Ｘ；菌体タンパク量(mg protein・ml-1)
ｔ；時間(h)
ここで、ｋは定数であることからｋXをAと表すことができ、以下の［３式］が与えられる。
ｄＣ／ｄｔ  ＝  −Ａ                    ［３式］
図６の単位時間当たりのPCE分解量は上記の式のAに相当すると考えられることから、各条件におけるのグラフの傾きを比較した。15℃の条件では0.179μM・h-1であったのに対し30℃の条件では約２倍の0.388 μM・h-1となった。以上より、汚染現場における本菌株のPCE脱塩素反応は、誘導期を考慮に入れると、2倍以上の期間を要すると考えられる。
（３）PCE濃度の影響
0〜60.3μMのPCE濃度条件の増殖への影響を図７に示す。培養温度は30℃、初発菌体濃度は0.012mg/mlとした条件で培養を行った。0〜60.3μMのPCE濃度条件において、ほぼ均等の速度で菌体が増殖し、PCEの影響はほとんど確認されなかった。
0、6.0、60.3、603.0μMの各濃度条件の増殖への影響を図８に示す。0〜603.0μMの全ての濃度条件において菌体の増殖が確認された。603.0μMの条件での増殖速度がそれ以下の濃度条件より遅くなることが確認されたが、しかし、濁度の最高値から菌体増殖量を比較した結果、ほとんど差が確認されなかった。
以上より、本菌株は60.3μM以下のPCEにはほとんど影響されずに増殖し、603.0μMのPCE存在下では増殖速度が遅くなるが最終的な菌体量にはほとんど影響がないということが確認された。
（４）初発菌体量の影響
初発菌体量の増殖への影響を図９に示す。全ての条件で濁度の上昇が確認された。菌体増殖速度は初発菌体濃度が高いほど速くなった。
初発菌体濃度とPCE分解率の関係を図１０に示す。0.002、0.004mg protein/mlの条件における48時間培養後のPCE分解率が20〜30 %の分解率であったのに対し、0.012、0.040、0.060 mgprotein/mlの条件ではほぼ全てのPCEがcDCEに脱塩素分解されていることが確認された。 すなわち、PCEを分解させるための初発菌体量としては、初発菌体濃度が0.012mgprotein/ml以上であることが最も好ましいことが判明した。
【００２７】
〔DPH-1株を用いてPCEを分解する方法について〕
以上得られた結果より、DPH-1株を用いて汚染物中に含有されるPCEを効率的に分解する方法として、以下の方法が提供される。
（１）PCEを高効率で分解させるためには、DHP-1株の培養温度が高い程よいが、本株菌は、例えば年間を通した地下水の温度である１５℃付近においても十分にPCE分解が可能である。
したがって、汚染物に含有されたテトラクロロエチレンを分解する方法であって、前記汚染物を、クロストリジウム・ビフェルメンタンスDPH-1株が存在し、かつ、１５℃付近の環境下に静置することを特徴とするテトラクロロエチレンの分解方法が提供される。この方法によれば、地下水中に含有されたテトラクロロエチレンをバイオリメディエーションにより効率的に分解することが可能になる。
（２）PCEを高効率で分解させるためには、DHP-1株の初発菌体濃度が0.012mg protein/ml以上であることが好ましい。すなわち、培地中（汚染物中と読み替えてもよい）に含有されるPCEをより効率的に分解する方法として、その培地中の初発菌体濃度が0.012mgprotein/ml以上であることを特徴とするPCEの分解方法が提供される。
【００２８】
３．DPH-1株のPCE分解に及ぼす培地栄養条件の影響
DPH-1株の培地成分であるyeast extractは高価であるため、実際にバイオレメディエーション等で大量に栄養源を調整する場合にコストが高くなることが問題となる。そこで、本願発明者らは、より安価で単純な培地組成として、yeastextractに代わりにモラセスを用いることによってPCE分解が可能であることを発見した。これについての実証結果を以下に説明する。
【００２９】
〔モラセスの組成〕
サトウキビや甜菜等から砂糖を精製する際に副産物として廃糖蜜（モラセス）が排出される。比重の大きい（1.4）粘着性のある茶褐色の液体で、一般的に40〜60％の糖分と各種窒素体、灰分、水分等から成り立っている。モラセスは安価で主に家畜の飼料や発酵工業の原料として利用されている。
本実施例では、以下のような組成から成るモラセスを使用した。
ビート糖蜜：ケーン糖蜜＝４：６
グルコース       78.6 g/l
フルクトース及びガラクトース   79.7 g/l
二糖類（主にスクロース） 170.9 g/l
三糖類（主にラフィノース）     10.2 g/l
上記合計Fermentable Sugarとして       339.4 g/l
上記の他に、モラセスは水分、窒素、リン及び微量の無機成分(灰分、カリウム、ナトリウム、カルシウム、マグネシウム)とビタミン成分（チアミン、リボフラビン、ニコチン酸、パントテン酸、ビオチン、ピリドキシン、葉酸）を含有している。なお、これらはモラセス組成の一例を示すものであり、本発明に使用できるモラセスはこのような組成に限定されるものではない。
【００３０】
〔培養操作方法〕
（１）培地調製
yeast extractを除いたMY培地の成分（以下 MY培地無機成分）を純水に溶解し、モラセスを0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0g/lの各濃度となるように加え、20-ml容バイアル瓶に9.5 mlずつ分注した。窒素置換を行った後、テフロン栓、アルミキャップにて密封し、高圧水蒸気滅菌を行った。あらかじめ滅菌したビタミン水溶液(p-aminobenzoicacid 0.1 g/l、biotin 0.001 g/l)および硫酸第一鉄水溶液(FeSO4・7H2O 0.02g/l)を無菌的に各100μl注入した。
（２） 植菌および培養
PCE分解を確認した前培養液300μlを注入し、PCEを6.0μMとなるように添加し、30℃のインキュベーターで静置培養した。一連の操作は無菌条件下で行った。
【００３１】
〔分析条件〕
（１）PCE、TCE及びcDCE分析
PCE、TCE及びcDCEはガスクロマトグラフを用いたヘッドスペース法によりにより分析した。
（２）タンパク質量測定
タンパク質量の測定はBradford法にて行った。ただし、モラセスを用いた培地では沈殿が生成するため、吸光度測定時に濃度毎にブランクを作成し沈殿の影響を少なくした。タンパク質量測定の操作方法は、１．「DPH-1株のPCE分解に及ぼすyeastextract濃度及び各種電子供与体の影響」で説明した方法と同様であるので説明を省略する。
（３）濁度測定
１．「DPH-1株のPCE分解に及ぼすyeast extract濃度及び各種電子供与体の影響」で説明した方法と同様であるので説明を省略する。
【００３２】
〔最小栄養培地の探索〕
（１）微量元素とMY培地無機成分の影響
より単純な培地組成とするためにMY培地無機成分及び微量元素の影響を確認した。
〈操作方法〉
蒸留水にモラセスを2.0 g/lとなるように溶解し、以下のような培地組成(A〜G及びコントロール)となるように各培地成分を溶解し、20-ml容バイアル瓶に9.5〜9.7ml分注した。窒素置換を行った後、テフロン栓とアルミキャップにて密封し、高圧水蒸気滅菌を行った。一部の培地にあらかじめ濾過滅菌を行ったビタミン水溶液(p-aminobenzoicacid 0.1 g/l、biotin 0.001 g/l)、硫酸第一鉄水溶液(FeSO4・7H2O 0.02g/l)を無菌的に100μl注入し、全ての培養液量が9.7 mlとなるようにした。ここにPCE分解を確認した前培養液300μlを注入し、PCEを6.0μMとなるように添加し、30℃で静置培養を行った。
〈培地組成〉
A      モラセス、硫酸第一鉄水溶液
B      モラセス、ビタミン水溶液
C      モラセス、硫酸第一鉄水溶液、ビタミン水溶液
D      モラセス、MY培地無機成分
E      モラセス、MY培地無機成分、硫酸第一鉄水溶液
F      モラセス、MY培地無機成分、ビタミン水溶液
G      モラセス、MY培地無機成分、硫酸第一鉄水溶液、ビタミン水溶液
Control       モラセスのみ
（２）必須無機成分の検討
MY培地無機成分中の成分の菌体増殖及びPCE分解へ及ぼす影響の確認を行った。なお、菌体内に必須成分を吸着又は貯蓄する可能性が考えられるため、二回連続して行った。
〈操作方法〉
蒸留水にモラセスを2.0 g/lとなるように溶解し、以下のような培地組成（a〜e及びコントロール）となるように各培地成分を溶解し、20-ml容バイアル瓶に9.7mlずつ分注した。窒素置換を行った後、テフロン栓、アルミキャップにて密封し、高圧水蒸気滅菌を行った。ここにPCE分解を確認した培養液300μlを注入し、PCEを6.0μMとなるように添加し、30℃で静置培養した。これを培養1回目とした。
培養1回目を7日間培養した後、それぞれの培養1回目の培養液を同様の組成の培地に300μlずつ注入した。PCEを6.0μMとなるように添加し、30℃にて静置培養を行った。これを培養2回目とした。
〈培地組成〉
a      モラセス、(NH4)2SO41.0 g/l、MgSO4・7H2O 0.1g/l、
b      モラセス、KH2PO42.0 g/l、(NH4) 2SO4 1.0 g/l、MgSO4・7H2O0.1 g/l
c      モラセス、K2HPO47.0 g/l、(NH4) 2SO4 1.0 g/l、MgSO4・7H2O0.1 g/l
d      モラセス、K2HPO47.0 g/l、KH2PO4 2.0 g/l、MgSO4・7H2O0.1 g/l
e      モラセス、K2HPO47.0 g/l、KH2PO4 2.0 g/l、(NH4) 2SO41.0 g/l
control       モラセス、K2HPO47.0 g/l、KH2PO4 2.0 g/l、(NH4) 2SO41.0 g/l、MgSO4・7H2O 0.1 g/l
（３）増殖速度及びPCE分解速度の検討
K2HPO4、KH2PO4及び(NH4)2SO4の存在が増殖速度に影響を及ぼすと考えられるため、以下のような培地組成（条件(i)、(ii)及びコントロール）にて培養を行い増殖への影響を確認した。さらに菌体の増殖が著しかった培地組成において、増殖速度及びPCE分解速度の比較検討を行った。
〈操作方法〉
以下のような培地組成（条件(i)、(ii)及びコントロール）となるように各培地成分を蒸留水に溶解し、20-ml容バイアル瓶に9.7mlずつ分注した。窒素置換を行った後、テフロン栓とアルミキャップにて密封し、高圧水蒸気滅菌を行った。ここにPCE分解を確認した前培養液300μlを注入し、PCEを6.0μMとなるように添加し、30℃で静置培養を行った。経時的に濁度を測定し、濁度の変化を確認した。比較のため、モラセス2.0g/lのみの培地を調製し同様の操作を行った。
濁度の変化が大きかった組成の培地を100-ml容バイアル瓶に58.2ml分注した。窒素置換を行った後、テフロン栓とアルミキャップにて密封し、高圧水蒸気滅菌を行った。ここに前培養液を1800μl注入し、PCEを培地中の濃度が6.0μMとなるように添加した。30℃にて静置培養を行いながら、一定時間毎に培養液を1500μlずつ抜き取ってから菌体タンパク質の定量を行い、菌体増殖速度を算出した。
次に、濁度の変化が大きかった組成の培地を20-ml容バイアル瓶に9.7mlずつ分注した。窒素置換を行った後、テフロン栓、アルミキャップにて密封し、高圧水蒸気滅菌を行った。ここにPCE分解を確認した培養液300μlを注入し、PCEを6.0μMとなるように添加し、30℃にて静置培養した。一定時間毎にPCE、TCE及びcDCEの分析を行い、PCE分解速度を算出した。
〈培地組成〉
（i）  モラセス2.0 g/l、K2HPO4 7.0 g/l、(NH4) 2SO41.0g/l
（ii） モラセス 2.0g/l、K2HPO4 7.0 g/l、KH2PO4 2.0 g/l、(NH4)2SO4 1.0 g/l
（control）   モラセス2.0 g/l、K2HPO4 7.0 g/l、KH2PO4 2.0g/l、(NH4) 2SO4 1.0 g/l、MgSO4・7H2O0.1 g/l
【００３３】
〔結果〕
（１）モラセス濃度の影響
モラセス濃度の増殖への影響を図１１に示す。全ての濃度条件で濁度の上昇が確認され、モラセス濃度が高いほど濁度は高くなった。48時間培養後のガスクロ分析の結果、モラセス濃度4.0、2.0、1.0、0.5 g/lの条件でPCEはほぼ完全に分解されていることが確認され、PCEとほぼ同モルのcDCEが検出された。一方、0.25、0.125g/lの条件では48時間培養後にPCEはほとんど分解されていなかった。
（２）微量元素とMY培地無機成分の影響
微量元素、MY培地無機成分の増殖への影響を図１２に示す。ビタミン水溶液、硫酸第一鉄水溶液の有無による菌体増殖への影響は確認されなかった。MY培地無機成分の菌体増殖への影響は大きく、MY培地無機成分が含まれる条件（D、E、F及びG）での濁度はMY培地無機成分が含まれない条件（A、B、C及びcontrol）の約3倍となった。また、72時間培養後のPCE分解率はMY培地無機成分が含まれない条件では約20％であったのに対し、MY培地無機成分が含まれる条件ではほぼ100％であった。
これより、モラセスを用いた本菌株の培養において、微量元素添加の有無による影響はほとんど無く、MY培地無機成分が大きく影響している事が確認された。
モラセスを用いたより単純な培地組成を発見するために、MY培地無機成分の構成成分の必要性を検討した。
（３）必須無機成分の検討
MY培地無機成分（K2HPO4 7.0 g/l、KH2PO42.0 g/l、(NH4) 2SO4 1.0 g/l、MgSO4・7H2O0.1 g/l）の各構成成分を変化させた条件の増殖への影響を図１３及び図１４に示す。培養１回目（図１３）と2回目（図１４）に大きな変化は確認されず、いずれもe及びcontrolの培地条件の濁度が最も高くなった。この結果より、モラセスを培地成分に用いる場合、ＭＹ培地無機成分のMgSO4・7H2Oは添加する必要が無いと考えられた。また、b及びdの濁度の上昇が小さかったことから、K2HPO4及び(NH4)2SO4は菌体量の増加に影響を及ぼす成分であり、培地に添加する必要がある成分であると判明した。cの濁度もe及びcontrolと比較して低かったかったことから、KH2PO4も菌体量の増加に影響を及ぼす成分であると判明した。
（４）増殖速度及びPCE分解速度の検討
K2HPO4、KH2PO4及び(NH4)2SO4の菌体増殖への影響を図１５に示す。(i)、(ii)のいずれの培地条件においてもコントロールとほぼ同様の濁度の上昇が確認され、モラセスのみを用いた条件と比較してほぼ2倍の菌体増殖量となった。
次に、経時的に菌体タンパク質量及びPCE分解量を測定した。
(i)、(ii)及びコントロールの各条件における菌体タンパク質量の変化を図１６に示す。いずれの組成においても菌体は増殖し、30時間後の菌体量は(i)の条件では0.515mg protein・ml-1、(ii)の条件では0.627 mg protein・ml-1、コントロールでは0.602mg protein・ml-1であった。次に、増殖速度の比較を行った。増殖速度は菌体濃度に比例すると仮定すると、前述の［１式］式が与えられる。対数増殖期の比増殖速度μは一定とみなすことができることから、対数増殖期の増殖速度の比較を行った。(i)の条件では培養3時間後から9時間後に最も菌体タンパク質量が増加し、それ以降はほぼ一定となった。培養3時間後から９時間後を対数増殖期と考え、増殖速度を算出したところ0.072mg protein・ml-1・h-1と求められた。(ii)の条件及びコントロールでは培養3時間後から6時間後に最もタンパク質が増加していることから、この期間を対数増殖期に当たるとし、増殖速度を算出したところ0.135mg protein・ml-1・h-1、0.163 mg protein・ml-1・h-1と求められた。増殖速度は条件(i)、(ii)、コントロールの順に速くなり、コントロールにおけるμは(i)の条件の2.2倍以上であることが確認された。以上の結果より、KH2PO4は本菌体の増殖に影響を与える成分であると確認された。
条件(i)、(ii)及びコントロールにおけるPCE分解量の変化を図１７に示す。いずれの条件においても6.0μMのPCEは完全に分解されることが確認された。PCEの分解反応をみかけの一次反応であると仮定すると、前述の［３式］が与えられる。図１７の単位時間当たりのPCE分解量は［３式］式のAに相当すると考えられる。それぞれの培地条件でのグラフの傾きを算出したところ、条件(i)では0.382μM・h-1、(ii)では0.398μM・h-1、コントロールでは0.396μM・h-1と求められた。条件(i)と(ii)及びコントロールではPCE分解速度に大きな変化は確認されなかったことから、KH2PO4及びMgSO4・7H2Oの添加はPCE分解にあまり影響を及ぼさないと考えられた。
以上の結果より、モラセスを用いて本菌株を培養する際に、無機成分としてK2HPO47.0 g/l及び(NH4)2SO4 1.0 g/lを添加すれば約0.38μM・h-1の速度でPCEは分解されるということが確認された。また、さらにKH2PO42.0 g/lを添加することにより菌体増殖量が約1.2倍増殖し、増殖速度が約2倍上昇するということが確認された。
【００３４】
〔DPH-1株を用いてPCEを分解する方法について〕
以上得られた結果より、DPH-1株を用いて汚染物中に含有されるPCEを効率的に分解する方法として、以下の方法が提供される。
（１）DPH-１株によりPCEを分解させるためには、モラセスを培地として用いることが可能である。モラセスを培地として用いた場合であっても、yeastextractを培地として用いた場合とほぼ同等に菌体増殖及びPCE分解を行わせることができる。
したがって、汚染物に含有されたテトラクロロエチレンを分解する方法であって、前記汚染物を、DPH-1株が存在し、かつ、モラセスが存在する環境下に静置することを特徴とするテトラクロロエチレンの分解方法が提供される。この方法によれば、菌体の栄養源として、イースト抽出物（yeastextract）よりも安価なモラセスを利用することができる。このモラセスは、サトウキビや甜菜等から砂糖を精製する際に副産物として排出されるので、廃物利用による省エネルギー的な効果は多大である。
（２）DPH-1株を効率的に増殖させるためには、モラセス培地に対して、K2HPO4、KH2PO4及び(NH4)2SO4からなる群より選ばれる少なくとも１つの無機成分を添加することが好ましい。すなわち、モラセス培地中（汚染物中と読み替えてもよい）に含有されるPCEをより効率的に分解する方法として、その培地中にリン酸水素二カリウム（K2HPO4）、リン酸二水素カリウム（KH2PO4）及び硫酸アンモニウム（(NH4)2SO4）からなる群から選ばれる少なくとも１つの無機成分を添加することを特徴とするPCEの分解方法が提供される。この方法によれば、モラセスのみを用いるよりも菌体の増殖速度が大きくなるので、より早く効率的にPCEの分解を行わせることが可能になる。
【００３５】
なお、上記実施の形態では、クロストリジウム・ビフェルメンタンスDPH-１株を用いて汚染物に含有されるテトラクロロエチレン(PCE)を分解する例について説明したが、本願発明は、例えばトリクロロエチレン（TCE）を分解する方法に対しても適用可能性を有している。
すなわち、PCEの分解反応では、これよりも塩素数が１少ないTCEを経由することが一般に知られているので、本願発明のPCEを分解する方法は、全体として見ると、TCEを分解する方法であると捉えることが可能である。したがって、本願発明は、汚染物中に含有されるPCEを分解することを主目的とするものであるが、汚染物中に含有されるTCE等の他の有機化合物に対しても好適に適用し得る。さらには、PCEやTCEのみならず、塩素数が１であるクロロエチレンや、塩素以外の他のハロゲン化炭化水素に対しても適用可能性を有している。
【００３６】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によれば、クロストリジウム・ビフェルメンタンスDPH-1株を用いることで汚染物中に存在するテトラクロロエチレン（PCE）をより効率的に分解する方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】イースト抽出物濃度と濁度の関係を示すグラフである。
【図２】各種電子供与体を添加した条件におけるPCE脱塩素分解率を示す表である。
【図３】DPH-１株の培養温度と濁度との関係を示すグラフである。
【図４】DPH-１株の24時間培養後のPCE分解率を示す表である。
【図５】15℃と30℃における菌体タンパク質量の変化を示すグラフである。
【図６】15℃と30℃におけるPCE濃度の変化を示すグラフである。
【図７】0〜60.3μMのPCE濃度条件の菌体増殖への影響を示すグラフである。
【図８】0、6.0、60.3、603.0μMの各PCE濃度条件の菌体増殖への影響を示すグラフである。
【図９】初発菌体量の菌体増殖への影響を示すグラフである。
【図１０】初発菌体濃度とPCE分解率の関係を示す表である。
【図１１】モラセス濃度の菌体増殖への影響を示すグラフである。
【図１２】微量元素、MY培地無機成分の菌体増殖への影響を示すグラフである。
【図１３】MY培地無機成分の各構成成分を変化させた条件の菌体増殖への影響を示すグラフであり、培養１回目の結果を示す。
【図１４】MY培地無機成分の各構成成分を変化させた条件の菌体増殖への影響を示すグラフであり、培養２回目の結果を示す。
【図１５】K2HPO4、KH2PO4及び(NH4)2SO4の菌体増殖への影響を示すグラフである。
【図１６】条件（i）、(ii)及びコントロールの各条件における菌体タンパク質量の変化を示すグラフである。
【図１７】条件(i)、(ii)及びコントロールの各条件におけるPCE分解量の変化を示すグラフである。
【図１】
0004530196.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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