(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然物を含む水溶液からの伝染性海綿状脳症（TSEs）に関係した異常な感染性プリオン蛋白質の除去方法であって、多孔性材料の固体粒子を含み、6μm未満の保持を提供する孔サイズを有するマトリックスから形成されるデプスフィルターに該水溶液を通す工程であって、こうして液体中に存在するかもしれない任意の異常な伝染性プリオン蛋白質を除去する工程を含み、前記天然物が全血又は血漿製剤であり、固体多孔性粒子が珪藻土又はパーライト粒子若しくはそれらの混合物である、前記除去方法。
【請求項２】
マトリックスが結合剤を含む請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項３】
結合剤がセルロースである請求の範囲第２項記載の方法。
【請求項４】
カチオン性又はアニオン性荷電材料の非存在下で行われる請求の範囲第１項から第３項のいずれか1項記載の方法。
【請求項５】
4から10の範囲のpHで行われる請求の範囲第１項から第４項のいずれか1項記載の方法。
【請求項６】
孔のサイズが0.6から6μmの範囲である請求の範囲第１項から第５項のいずれか1項記載の方法。
【請求項７】
孔のサイズが0.6から1.5μmの範囲である請求の範囲第１項から第６項のいずれか1項記載の方法。
【請求項８】
デプスフィルターが2から5mmの厚さである請求の範囲第１項から第７項のいずれか1項記載の方法。
【請求項９】
血漿製剤がアルブミン、免疫グロブリン、第IX因子、トロンビン、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、第VIII因子、第II因子、第VII因子、第IX因子又は第X因子である請求の範囲第１項から第８項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、天然物を含む水溶液からの伝染性（transmissable）海綿状脳症（TSEs）関係がある異常な感染性プリオン蛋白質、特に生理活性蛋白質の除去方法に関する。また、本発明は、蛋白質（栄養素及び生理活性蛋白質を含む）及び感染性プリオンが除去され、又は不活性化されている医薬組成物に関する。
TSEs（例えば、血液又は血液製剤バイオ医薬品全体によるクロイツフェルト-ヤーコプ病（CJD））の伝染の可能性に関する懸念がある。この懸念は、牛海綿状脳症（BSE）とヒトの新変異型CJD（VCJD）との間の仮定上の関連によって強まった。CJDは、リンパ細網組織及びその宿主の中枢神経系に複製する異常な感染性病原体によって生じる進行性神経変性疾患である。病原体の性質は、今のところ未解決であるが、2つの主要な仮説が提案されている。第1は、プリオン又は感染性蛋白質仮説であり、第2は、宿主コード化蛋白質と調節核酸との組み合わせを包囲するビリオン仮説である。
静脈内注射用、筋肉内注射用及び局所的適用医薬組成物は、医薬品加工工場の特定のセクションであるが重要なセクションにおいて、40年にわたってヒトの血漿から調製されてきた。これらの製品の安全性における懸念の主な領域は、血液運搬ウイルスの潜在的混入である。しかし、潜在的に混入しているウイルスの不活性化又は除去のための技術と共にスクリーニング方法の開発は、血液及びそれから派生する製剤の安全性を大いに改善した。
【０００２】
現在、ヒト又は動物源由来のバイオ医薬品製品がTSEsを伝染させるかもしれない可能性についてかなりの懸念がある。TSEsの感染性病原体の詳細な性質は、現在明らかではないが、TSEs（例えばヒツジのスクレイピー及び、ヒトのCJD又はVCJD）は、異常なプリオン類似蛋白質（PrPs）と関係している。適したスクリーニング方法の記載は、不活性化の物理的及び化学的方法に極度に抵抗する異常なPrPsについて、いまだ開発されていない。例えば、EEC調節記録（EEC regulatory document）（医薬製品による海綿状脳症を生じる伝染性病原体のリスクを最小にするためのCPM指針: Biologicals, 20, pp155-158, 1992）は、約130℃で1時間加圧滅菌すること、1時間の1Nの水酸化ナトリウム処理又は1時間の次亜塩素酸ナトリウム処理を推奨する。しかし、そのような技法は生理活性蛋白質含有物質の処理に全く不適であり、それらは蛋白質の全体的な不活性化を生じる。
【０００３】
従って、製品の生理活性又は栄養価を実質的に分解せず、及び／又は除去しない、効果的な、動物又はヒト由来の医薬製品又は食物製品由来の異常な感染性プリオン蛋白質の除去又は不活性化の方法を開発することが必要である。
主な問題は、異常なプリオン蛋白質の病気の定義された性質に関係する。この蛋白質の通常の形態は、哺乳類の細胞内で見出され、脳及びリンパ細網組織内に高いレベルで存在する。それは、プロテイナーゼＫによる消化に完全に感受性がある33-35 kDaのホスホイノシトール糖蛋白質と高度に関係した膜で構成される。蛋白質の（異常な）感染性の形態は、変化した高次構造上の形態で存在することが示され、高レベルのβプリーツシートを含み、プロテイナーゼＫによる消化に抵抗する。高次構造の変化は、極端に不溶性の蛋白質を生じると考えられ、次いで、原繊維又はアミロイドプラークとして感染した組織に沈着する凝集を形成する。異常なプリオン蛋白質の未知の性質、特に凝集状態は、適した除去又は不活性化技法の予測を大変困難にしている。
【０００４】
従来技術において、クロマトグラフィー技法による除去又は不活性化が試みられた。Hunter及びMillson（J. Gen. Microbiol., 1964, vol.37 pp251-258）はDEAEセルロース吸着及びリン酸カルシウムカラム上のスクレイピー感染した脳ホモジネートのクロマトグラフィーの振る舞いの例を示した。国際特許出願WO97/3454は、アルブミンの溶液から異常なプリオン蛋白質の除去又は典型的には、高価な混合性イオン交換及び疎水性固相を用いた試薬グレード動物血清に関する。
Blumら（BioPharm. 11(4) pp28-34, 1998）は、アプロチニンの産生における種々の工程（即ち、加熱、沈殿、フィルター助剤による吸収及びイオン交換クロマトグラフィー）の有効性及びTSEのモデル源としてスクレイピーの加えられたスパイク（spikes）の除去におけるウシ血清アルブミンを研究した。しかし、上記要素がスクレイピー病原体の除去において必須であり、又は必要であるかは不明確である。
特許明細書EP0798003は、不必要な混入物を除去する方法としてろ過を開示する。カチオン性樹脂を有する0.25から2.0μmの孔サイズの正に帯電したデプスフィルターは、生理活性蛋白質溶液からウイルスを除去するために使用された。Morgenthaler（TSE issues, Cambridge Health Teck. Institute CHI, November, 1998, Lisbon, Portugal）は、ろ過工程（ナノフィルトレーションを含む）がヒトの血漿の分画において加えられたTESスパイクを実質的に除去できることを示した。
【０００５】
本発明の目的は、蛋白質の性質又は生理活性への許容できないような影響なしに、蛋白質含有液体、特にヒトの血漿由来のものから異常な感染性プリオン蛋白質の除去を、さらに開発し、特徴づけることである。
本発明の別の目的は、使い捨てフィルターであり、プロセスストリームから異常なプリオン蛋白質を除去して処分できるデプスフィルターを提供することである。
本発明は、粒子を含み、6μm未満の孔サイズを有するデプスフィルターを用いるろ過が異常な感染性プリオン蛋白質の除去に驚くほど効果的である驚くべき発見に基づいている。
【０００６】
特に、本発明は、天然物（特に生理活性蛋白質）を含む水溶液から伝染性海綿状脳症（TSEs）と関係した異常な感染性プリオン蛋白質の除去の方法を提供し、多孔性材料の固体粒子を含むマトリックスから形成され、6μm未満の保持を提供する孔サイズを有するデプスフィルターに液体を通す工程を含む。典型的には、フィルターは使い捨てフィルターであってもよい。
“除去”の用語は、所望する蛋白質を含む液体から異常な感染性プリオン蛋白質の実際の物理的除去を意味する。実用的な目的のために、その本来の生物学的状態の所望する蛋白質の回収は、少なくとも50％、好ましくは80％、より好ましくは90％を超えるレベルで実質的に維持されるべきである。
異常な感染性プリオン蛋白質の除去は、少なくとも102.5、103、好ましくは104、より好ましくは105の程度で達成してもよい。
フィルターマトリックスの孔サイズは、好ましくは0.6から6μm、特に0.6から1.5μmの範囲である。孔サイズは、その上に保持した粒子の粒子サイズによって定義される。典型的には、定義されたサイズの粒子（例えば微生物）は、較正目的で使用される。
【０００７】
また、本発明は処理された液体に関する。
血漿製剤の分画に対す特別な重要性は、ろ過が生理活性蛋白質の非変性状態下で、及び製品蛋白質の溶解性を減少させない状態下で効果的に行われるという発見である。さらに、フィルターを用いた、又はフィルターを用いないろ過は、懸濁された固形物を除去するために使用される。
本方法は、4から10、好ましくは5から9、特に6から8の範囲のpHで行ってもよい。
加熱の適用は必須ではなく、方法は実質的に室温以下で、特に-5から+20℃の範囲で行われる。
好ましくは、液体及びフィルターは、生理活性蛋白質の生理活性の減少に寄与してもよく、特に高感度血液凝固因子の活性化を生じてもよいカチオン性又はアニオン性荷電物質を含まない。本方法は、特に血液全体又はアルブミン、免疫グロブリン、第IX因子、トロンビン、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、第VIII因子及び第II、第VII、第IX及び第X因子及び血漿由来のその他の蛋白質を含む液体の処理に適用される。また、それは血漿、第XI因子、第XIII因子、ヘモグロビン、α-2-マクログロブリン、ハプトグロビン、トランスフェリン、アポリポ蛋白質、マンナン結合蛋白質、蛋白質Ｃ、蛋白質Ｓ、セルロプラスミン、C-1-エステラーゼ阻害剤、インター-α-トリシン阻害剤、Van Willebrand因子の処理に適用できる。また、これらの組換え類縁体を処理してもよい。さらに、本発明は、食物、飲み物、化粧品等を含むその他の天然物の処理に適用できる。また、それは動物由来のその他の非血漿製剤（例えばヘパリン及びホルモン）に適用できる。
【０００８】
デプスフィルターは、通常、固体多孔性粒子材料（例えば珪藻土、パーライト又は珪藻土）と共に結合剤（例えばセルロース）を含む。
デプスフィルターは、通常、1から10mm、特に2から5mmの範囲の厚さを有する。デプスフィルターで使用される材料は、関係する所望する蛋白質にあまり影響を与えず、又はまったく影響を与えない。
ここで本発明の実施態様を、実施例としてのみ記載する。
【０００９】
方法論
1）  ハムスタースクレイピースパイクの準備
ハムスター適応スクレイピー（H3）病原体（系263K）をリン酸緩衝食塩水に感染した脳組織の均質化により準備した。この方法において産生された病原体の力価は、ハムスターの脳内ルートによって評価した場合、通常、107から109 LD50ユニットml-1のオーダーである。ハムスター適応スクレイピー系病原体（263K）の貯蔵物を-70℃以下で貯蔵する。
粗製脳ホモジネートに由来するミクロソームのフラクションをすべてのスパイク実験で使用した。
ミクロソームのフラクションをMillsonらの方法に従って準備した（Millson GC, Hunter GD and Kimberlin RH (1971); “An experimental examination of the scrapie agent in the cell membrane mixtures. The association of scrapie activity with membrane fractions”, J. Comp Path. 81, 255-265）。Dounce 均質化によって263Kの感染した脳から準備した粗製脳ホモジネートを10,000gで7分間ペレット状にして、核、壊れていない細胞及びミトコンドリアを除去した。次いで、上澄みに残っているミクロソームを100,000gで90分間の遠心分離によりペレット状にし、その後PBSに再懸濁した。
【００１０】
2）結果の計算
クリアランス（C）及び減少（R）因子をウエスタンブロット法によって解析した後、サンプルの最終希釈度に基づいて計算した。最終希釈度を、スクレイピープリオン蛋白質（PrPsc）が検出されない初期希釈度に基づいて計算する。次いで、この希釈度の逆数は、病原体の力価として得られ、こうしてすべての力価は、任意の単位で表現される。最終希釈度によって決定される力価に基づいて、サンプルのPrPscの合計量は、サンプルの体積に基づいて計算され、適用する必要のある任意の補正因子を考慮する。クリアランス因子は、理論的にインプットされるスパイクに関して計算される。減少因子は、付加サンプルで決定されるPrPscのレベルに関して計算される。
PrPscが試験したサンプルの最も高い濃度で検出されない場合、希釈度の逆数は、1として与えられ、クリアランス及び減少因子は、対数値にして≧の符号で表される。
【００１１】
3）スクレイピー感染性のウエスタンブロット評価
本研究で使用した263Kの貯蔵物の力価、同様に研究の際に発生したすべてのサンプルに存在する力価をウエスタンブロット手順で決定した。この方法は、プロテインキナーゼＫ消化に対する感染性（PrPsc）及び非感染性（PrPc）の感受性の相違に基づいている。サンプルをプロテアーゼＫで処理して、任意のPrPcを消化し、SDSポリアクリルアミドゲルに進み、その後ニトロセルロースでのブロット法を行う。次いで、プロテアーゼ消化後残っている任意のPrPは、PrPscに対応して、PrP特異的抗体を用いて検出される。貯蔵物と比較したサンプルのスクレイピーの相対的なレベルを、すべてのサンプルの終点（シグナルを検出しない点）までの連続的な希釈によって決定した。
【００１２】
さらに、情報は、A. Bailey,“Strategies for the Validation of Biopharmaceutical Processes for the Removal of TSE's”, Cambridge Healthtech Institute, Nov.1998, Lisbon, Portugalで与えられる。
表１は、種々のデプスフィルターによってスパイクされたハムスタースクレイピープリオン蛋白質（PrPsc）の除去の効率を示す。除去は、クリアランス因子Ｃ（接種物の量／ろ液の量）として又は減少因子Ｒ（原材料の量／ろ液の量）として表される。本発明の0.6から1.5μmの孔サイズのSeitz KS80フィルターは、プリオン蛋白質の除去において効率が高い。より大きな孔サイズを有し、又はカチオン性種を含む比較目的のために示したその他のフィルターは効率がより小さい。
【００１３】
実施例
実施例１（本発明のアルブミンの処理）
モデルシステムをセットアップして、通常の血漿分画方法におけるアルブミンのデプスフィルトレーションを実験的スケールで複製し、異なるタイプのフィルターを使用した。アルブミン含有サンプル（フラクションV）を、上述のようにして産生されたハムスタースクレイピープリオン蛋白質でスパイクし、その濃度を、本明細書に記載したようにウエスタンブロット法によって評価した。
フィルターは、有効ろ過面積128 cm2の142 mm径のディスク状にカットされたSeitz KS80（登録商標）パッドであった。エタノール及びNaClを35分間流して、フィルターを予め処理した。サンプル材料は、pH 6.9及び85.0 g/lの濃度で再懸濁された約1リットルのフラクションVであり、通常の血漿分画方法から得られ、+4℃で保たれた。
【００１４】
通常の方法は、853 mlのサンプルのバッチろ過を含む。この実験において、サンプルの同一の合計体積をフィルターに通したが、最後の100 mlのみを、ミクロソームのハムスタースクレイピーでスパイクした。100 mlのサンプル開始材料を9.5 mlのミクロソームのハムスター（263k）のスクレイピーの標本でスパイクし、スパイクされた材料のサンプルをPrPscのレベルの解析のために除去した。スパイクされた材料を6.4 ml/minの流速でフィルターに通し、PrPscのレベルの解析のためにろ液を収集した。PrPscのレベルの解析が行われるまで、すべてのサンプルを-70℃以下で保存した。サンプルをウエスタンブロット法により解析する前に、サンプルにおける任意のスクレイピーを超遠心で遠心分離した。
表１は、クリアランス因子Ｃ及び減少因子Ｒによって評価される除去がろ液において異常なプリオン蛋白質が検出されない（検出限界）log単位で4を超えることを示す。従って、フィルターは、ハムスタースクレイピープリオン蛋白質の加えられたスパイクの除去において最も効果的である。
【００１５】
実施例２（アルブミン処理-比較例）
フラクションVアルブミン含有サンプルを実施例１と同様の方法において異なるフィルターでろ過した。
使用したフィルターは、有効ろ過面積27 cm2のCuno（登録商標）Delipid Del 1ミニカートリッジであった。エタノール及びNaClでフィルターを予め処理した。
サンプル材料はpH 6.9及び85 g/lのフラクションVであり、Seitz KS80フィルターを通す通常のろ過後得られ、+4℃に保たれた。この場合に、最後の50 mlのみを、ミクロソームのハムスタースクレイピーでスパイクした。スパイクされた材料を3.2 ml/minの流速でフィルターに通し、ろ液を前述のようにプリオン蛋白質で解析した。クリアランスの程度を表１に示す。クリアランス及び除去は、それぞれ2.8及び2.3 logのみであり、異常なプリオン蛋白質はろ液において検出された。
【００１６】
実施例３（IGG-比較例）
実施例１の手順を、通常の血漿分画由来のIgG含有上澄みI及びIIIで繰り返した。
フィルターは、12.5 cm2の有効ろ過面積を有する47 mm径のミリポアライフガードCP20ディスクであった。サンプル材料は、通常の血漿分画手順由来の約800 mlの上澄みI及びIII（予備ろ過）であり、+４℃に保たれた。それは、約12％のエタノールを含み、pH 5.1を有した。
680 mlのサンプルを処理し、最後の50 mlをミクロソームのハムスタースクレイピーでスパイクした。
プリオン蛋白質の除去の程度を表１に示した。クリアランス因子Ｃは3.0 logであり、除去Ｒは1 log未満であり、異常なプリオン蛋白質はろ液において検出された。
【００１７】
実施例４（IGG-本発明）
実施例１の一般的手順を通常の血漿分画由来のIgG含有フラクションII懸濁液で繰り返した。
フィルターは、142 mm径及び有効ろ過面積128 cm2のSeitz K200（登録商標）であった。サンプル材料は、通常の血漿分画由来の再懸濁されたフラクションIIであり、+4℃に保たれた。
600 mlのサンプルをフィルターに通し、最後の100 mlをミクロソームのハムスタースクレイピーでスパイクした。PrPscの除去の程度は、前述のようにして決定され、結果を表１に示す。クリアランスＣ及び除去Ｒの両方は、ろ液において異常なプリオン蛋白質を検出限界まで示さなかった（Ｃ≧3.4及びＲ≧2.8）。
このように、異常な感染性プリオン蛋白質の104回以上の除去は、2μm未満の孔サイズを有する中性フィルターを用いて達成され、102.5回以上の除去は、3.5から6.0μmの孔サイズの中性フィルターを用いて達成されることが、実施例から明らかである。これらは検出限界である。換言すれば、検出可能な異常なプリオン蛋白質は、ろ液中に存在しなかった。
【００１８】
実施例５（繊維フィルター-比較例）
繊維から形成される4つのフィルターを実施例１と同様の方法でプリオン除去について試験した。
血液全体を3.8 log10のハムスタースクレイピー（Hs 263K）でスパイクし、クリアランスＣ及び除去Ｒを決定した。
表２に示される結果は、これらの繊維フィルターが＜1 log除去を示し、従ってプリオン蛋白質を除去することに無効であった。
【００１９】
【表１】
0004524045.tif 000002
【００２０】
【表２】
0004524045.tif 000003