(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アデノシンモノフォスフェート、アデノシンジフォスフェート、およびフェニルフォスフェートから選択される少なくとも一つのりん酸供与体を共存させることを特徴とするホタルルシフェラーゼの安定化方法。
【請求項２】
りん酸供与体の濃度が１．００〜１００ｍＭである請求項１に記載の安定化方法。
【請求項３】
ホタルルシフェラーゼが一部アミノ酸を置換した変異型ホタルルシフェラーゼであることを特徴とする請求項１〜２に記載の安定化方法。
【請求項４】
ホタルルシフェラーゼが他の物質と結合したホタルルシフェラーゼ標識物であることを特徴とする請求項１〜３に記載の安定化方法。
【請求項５】
ホタルルシフェラーゼとアデノシンモノフォスフェート、アデノシンジフォスフェート、およびフェニルフォスフェートから選択される少なくとも一つのりん酸供与体を含み、ルシフェリンを含まないことを特徴とするホタルルシフェラーゼ溶液。
【請求項６】
りん酸供与体の濃度が１．００〜１００ｍＭである請求項５に記載のホタルルシフェラーゼ溶液。
【請求項７】
ｐＨが６．０〜９．０である請求項５〜６に記載のホタルルシフェラーゼ溶液。
【請求項８】
ホタルルシフェラーゼが一部アミノ酸を置換した変異型ホタルルシフェラーゼであることを特徴とする請求項５〜７に記載のホタルルシフェラーゼ溶液。
【請求項９】
ホタルルシフェラーゼが他の物質と結合したホタルルシフェラーゼ標識物であることを特徴とする請求項５〜８に記載のホタルルシフェラーゼ溶液。
【請求項１０】
アデノシンモノフォスフェート、アデノシンジフォスフェート、およびフェニルフォスフェートから選択される少なくとも一つのりん酸供与体を共存させることを特徴とするルシフェリンの安定化方法。
【請求項１１】
りん酸供与体の濃度が１．００〜１００ｍＭである請求項１０に記載の安定化方法。
【請求項１２】
ルシフェリンとアデノシンモノフォスフェート、アデノシンジフォスフェート、およびフェニルフォスフェートから選択される少なくとも一つのりん酸供与体を含み、ホタルルシフェラーゼを含まないことを特徴とするルシフェリン溶液。
【請求項１３】
りん酸供与体の濃度が１．００〜１００ｍＭである請求項１２に記載のルシフェリン溶液。
【請求項１４】
ｐＨが６．０〜９．０である請求項１２〜１３に記載のルシフェリン溶液。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ホタルルシフェラーゼおよびルシフェリンの安定化に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
臨床および他の応用分野においてリガンドとレセプターからなる特異的な結合を利用した分析方法が微量物質の分析のために利用されている。一般的にリガンドとレセプターの結合反応と呼ばれるものには抗原抗体反応、相補的な核酸のハイブリダイゼーション、糖とレクチン、あるいはホルモンとホルモン受容体といった物質同士の結合をあげることができる。これらの物質同士の結合は特異的かつ親和性の高いものであり、類似性の高い他の物質が混在していても互いの結合相手であるリガンドあるいはレセプターを識別し、強固に結合することができる。このような特異的結合による分析方法（アッセイ）としては、競合アッセイ、サンドイッチアッセイ等が利用されている。
【０００３】
検出の対象となる物質は、いずれも検体中においてごく微量にしか存在しないため、通常その分析においては特異的な結合に関わる結合成分を標識成分により標識して、その標識成分を検出するという方法が採られている。標識成分としては放射性同位元素、蛍光物質、発光物質、および各種酵素等が用いられる。放射性同位元素による標識は、比較的簡便であり高感度が得られるが、半減期の問題があり、作業者の安全管理や廃棄物の処理も煩雑なため、酵素等の非放射性物質による標識が広く普及してきている。
【０００４】
酵素標識による特異的反応の検出系の代表的なものに、酵素免疫測定法があげられる。酵素免疫測定法では、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、あるいはペルオキシダーゼ等を用いた吸光法による検出系が一般的である。検出感度を上げるためには結合成分により多くの標識成分を結合させればよいが、先にあげた酵素は比較的分子量が大きく、そのために結合成分に導入可能な酵素の分子数には自ずと制限がある。また、吸光法による検出系ではその原理上およそ10-9mol/lが測定感度の限界である[1]。
【０００５】
より微量に存在する物質を検出するための高感度の検出系として、近年発光法を利用した酵素免疫測定法が実用化されつつあり、例えば、発光蛋白質であるリコンビナントAEQUORIN(AQUALITERSeaLite Sciences,Inc.)を用いたものがある。また、化学発光法を利用した免疫(酵素)測定法も、様々な改良、工夫がなされさらに有用なものになりつつある。例えば、検出反応に電気化学的な発光反応を用い、抗原・抗体などを測定するものがある[2]。一方、従来から量子効率の面から生物発光法が優れているといわれており、特にホタルルシフェラーゼによる生物発光はその量子効率が0.88と大きい。しかし、ホタルルシフェラーゼや発光基質であるルシフェリンの安定性の問題もあり実用化された例は少ない。
【０００６】
ホタルルシフェラーゼの安定化技術としては、エチレングリコールを添加する方法[3]、ポリオールを添加する方法[4]、さらにグリセロールまたはスクロースと無機塩類を組み合わせて添加する方法[5]が知られている。また、遺伝子組み換えにより熱安定性を改良したホタルルシフェラーゼも公知である[6][7]。
【０００７】
一方、ルシフェリンの安定化技術としては、安定化剤としてポリオールを添加し、ｐＨを５．５〜７．４としたルシフェラーゼ・ルシフェリンの水溶液[4]が知られている。この発明では、ルシフェリンはｐＨ５．５〜７．４で安定性が向上するとされている。しかし、ルシフェラーゼによる発光反応の至適ｐＨ（８．５付近）をはずれている点や、ｐＨ６．０以下ではルシフェリンの溶解度が小さくなる点など、実用上の問題が多い。
【０００８】
また、ウミホタルルシフェリンをｐＨ６．０以下の溶液で保存する方法[8]も知られているが、ウミホタルルシフェリンと（ホタル）ルシフェリンでは全く構造が異なるため、先に述べたｐＨ６．０以下におけるルシフェリンの溶解度の問題と併せて、そのままルシフェリンに適用できるとは言い難い。
【０００９】
アデノシンモノフォスフェート（ＡＭＰ）は、ホタルルシフェラーゼ−ルシフェリンの発光反応において、反応開始時にアデノシントリフォスフェート（ＡＴＰ）として添加され、ルシフェリンと結合してルシフェリン−ＡＭＰという反応中間体を形成する物質である。ＡＭＰをホタルルシフェラーゼとルシフェリンを含む発光反応系に添加した例はいくつか知られているが[9]-[12]、いずれも発光強度の増加や発光反応の持続を目的としたものであり、これらの先行技術はホタルルシフェラーゼおよびルシフェリンの安定性とＡＭＰとの関連について何ら示唆するものではない。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明が解決すべき課題は、新たなホタルルシフェラーゼおよびルシフェリンの安定化方法と、その方法を用いた安定な生物発光試薬溶液の提供である
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記課題の解決のために鋭意検討を行った結果、新たなホタルルシフェラーゼおよびルシフェリンの安定化方法を見いだした。本発明は以下の構成からなる。
【００１２】
（１）りん酸供与体を共存させることを特徴とするホタルルシフェラーゼの安定化方法。
【００１３】
（２）りん酸供与体が以下にあげる化合物で構成される群から選択された少なくとも一つの化合物である（１）に記載のホタルルシフェラーゼの安定化方法。
アデノシンモノフォスフェート
アデノシンジフォスフェート
フェニルフォスフェート
【００１４】
（３）りん酸供与体の濃度が１．００〜１００ｍＭである（１）〜（２）に記載の安定化方法。
【００１５】
（４）ホタルルシフェラーゼが一部アミノ酸を置換した変異型ホタルルシフェラーゼであることを特徴とする（１）〜（３）に記載の安定化方法。
【００１６】
（５）ホタルルシフェラーゼが他の物質と結合したホタルルシフェラーゼ標識物であることを特徴とする（１）〜（４）に記載の安定化方法。
【００１７】
（６）ホタルルシフェラーゼとりん酸供与体を含むことを特徴とするホタルルシフェラーゼ溶液。
【００１８】
（７）りん酸供与体が以下にあげる化合物で構成される群から選択された少なくとも一つの化合物である（６）に記載のホタルルシフェラーゼ溶液。
アデノシンモノフォスフェート
アデノシンジフォスフェート
フェニルフォスフェート
【００１９】
（８）りん酸供与体の濃度が１．００〜１００ｍＭである（６）〜（７）に記載のホタルルシフェラーゼ溶液。
【００２０】
（９）ｐＨが６．０〜９．０である（６）〜（８）に記載のホタルルシフェラーゼ溶液。
【００２１】
（１０）ホタルルシフェラーゼが一部アミノ酸を置換した変異型ホタルルシフェラーゼであることを特徴とする（６）〜（９）に記載のホタルルシフェラーゼ溶液。
【００２２】
（１１）ホタルルシフェラーゼが他の物質と結合したホタルルシフェラーゼ標識物であることを特徴とする（６）〜（１０）に記載のホタルルシフェラーゼ溶液。
【００２３】
（１２）りん酸供与体を共存させることを特徴とするルシフェリンの安定化方法。
【００２４】
（１３）りん酸供与体が以下にあげる化合物で構成される群から選択された少なくとも一つの化合物である（１２）に記載のルシフェリンの安定化方法。
アデノシンモノフォスフェート
アデノシンジフォスフェート
フェニルフォスフェート
【００２５】
（１４）りん酸供与体の濃度が１．００〜１００ｍＭである（１２）〜（１３）に記載の安定化方法。
【００２６】
（１５）ルシフェリンとりん酸供与体を含むことを特徴とするルシフェリン溶液。
【００２７】
（１６）りん酸供与体が以下にあげる化合物で構成される群から選択された少なくとも一つの化合物である（１５）に記載のルシフェリン溶液。
アデノシンモノフォスフェート
アデノシンジフォスフェート
フェニルフォスフェート
【００２８】
（１７）りん酸供与体の濃度が１．００〜１００ｍＭである（１５）〜（１６）に記載のルシフェリン溶液。
【００２９】
（１８）ｐＨが６．０〜９．０である（１５）〜（１７）に記載のルシフェリン溶液。
【００３０】
【発明の実施の形態】
本発明が提供するりん酸供与体は、ホタルルシフェラーゼ溶液に添加した場合に、いずれもホタルルシフェラーゼに対する安定性向上効果が認められるが、以下にあげる化合物で構成される群から選択された少なくとも一つの化合物が好ましい。
アデノシンモノフォスフェート
アデノシンジフォスフェート
フェニルフォスフェート
上にあげた化合物の中ではＡＭＰが安定性向上効果が大きく特に好ましい。
【００３１】
本発明において安定化剤として作用するりん酸供与体は、ホタルルシフェラーゼ溶液に１．００〜１００ｍＭの濃度になるように添加するのが好ましい。１．００ｍＭ未満では安定化の効果は認められず、また、１００ｍＭ以上添加しても安定性は向上しない。より好ましくは、５．００〜５０．０ｍＭの濃度になるように添加する。
【００３２】
本発明を適用するホタルルシフェラーゼ溶液のｐＨは６．０〜９．０とするのが好ましい。ホタルルシフェラーゼはｐＨ７．０で安定性が最大となり、酸性側、塩基性側のどちらにふれても安定性が低下する。より好ましくはｐＨ６．５〜７．５の範囲に調製する。
【００３３】
本発明が提供する安定化方法は、Luciola属の他、Photinus属等のホタルに由来するホタルルシフェラーゼにも適用可能である。また、野生型のホタルルシフェラーゼはもちろん、遺伝子組み換えによって発光波長が改変されたり、安定性が改良されたホタルルシフェラーゼにも適用できる。しかしながら、野生型のホタルルシフェラーゼは安定性が著しく悪く、本発明を適用してもなお実用に適した安定性を備えているとは言い難い。したがって、本発明は遺伝子組み換え等によりあらかじめ安定性がある程度改良されたホタルルシフェラーゼに適用するのが望ましい。このようなホタルルシフェラーゼとしては、[6]および[7]に記載の熱安定性の改良されたホタルルシフェラーゼ、[13]に記載の発光波長の異なる変異型ホタルルシフェラーゼ、および[14]に記載のビオチン化ホタルルシフェラーゼ等をあげることができる。
【００３４】
また、本発明は、ホタルルシフェラーゼとりん酸供与体、特に以下にあげる化合物で構成される群から選択された少なくとも一つを含む、安定なホタルルシフェラーゼ溶液も提供する。
アデノシンモノフォスフェート
アデノシンジフォスフェート
フェニルフォスフェート
上にあげた化合物の中ではＡＭＰが安定性向上効果が大きく特に好ましい。
【００３５】
本発明が提供するりん酸供与体はホタルルシフェラーゼの場合と同様に、ルシフェリン溶液に添加した場合にもルシフェリンに対する安定性向上効果が認められる。その中でも以下にあげる化合物で構成される群から選択された少なくとも一つの化合物が好ましい。
アデノシンモノフォスフェート
アデノシンジフォスフェート
フェニルフォスフェート
上にあげた化合物の中ではＡＭＰが安定性向上効果が大きく特に好ましい。
【００３６】
本発明において安定化剤として作用するりん酸供与体は、ルシフェリン溶液に１．００〜１００ｍＭの濃度になるように添加するのが好ましい。１．００ｍＭ未満では安定化の効果は認められず、また、１００ｍＭ以上添加しても安定性は向上しない。より好ましくは、５．００〜５０．０ｍＭの濃度になるように添加する。
【００３７】
本発明を適用するルシフェリン溶液のｐＨは６．０〜９．０とするのが好ましい。ルシフェリンはｐＨ７．０で安定性が最大となり、酸性側、塩基性側のどちらにふれても安定性が低下する。また、ｐＨ６．０以下ではルシフェリンの溶解度が低下するので実用的ではない。より好ましくはｐＨ６．５〜７．５の範囲に調製する。
【００３８】
ＡＭＰをホタルルシフェラーゼ溶液またはルシフェリン溶液の安定化剤として使用する際には、ＡＭＰが発光反応を阻害する物質であることに注意しなければならない。ＡＭＰが発光反応系に１０ｍＭの濃度で含まれている場合、発光値は３〜７割も減少する。したがって、発光反応を行う際にはホタルルシフェラーゼ溶液またはルシフェリン溶液に含まれるＡＭＰを何らかの方法で除去しておくのが望ましい。ＡＭＰの除去ができない場合には、発光反応溶液中のＡＭＰ濃度が５ｍＭを越えないように、添加するＡＭＰ濃度を制限する必要がある。
【００３９】
上にあげた安定化方法はホタルルシフェラーゼとルシフェリンの両方を含む生物発光試薬にも応用可能である。このような生物発光試薬はＡＴＰ検出用試薬として用いることができる。ルシフェラーゼ−ルシフェリンのＡＴＰ検出用試薬はＡＴＰを高感度に検出できるので、ＡＴＰ抽出試薬と組み合わせて微生物の高感度検出等に用いられる。また、イムノアッセイや核酸のハイブリダイゼーションアッセイにおいて、抗原、抗体、あるいはプローブＤＮＡをホタルルシフェラーゼで標識した酵素標識試薬としても使用可能である。
【００４０】
本発明の好ましい実施様態を以下に記載する。
ＡＴＰ検出試薬として用いる場合には、中性付近のｐＨの緩衝液をベースとしてホタルルシフェラーゼとＤ−ルシフェリンを添加する。この溶液に本発明の安定化剤であるＡＭＰを加える。ベースとなる緩衝液は任意であるが、りん酸緩衝液、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、あるいはＧＯＯＤ’Ｓ緩衝剤のうちｐＫａが７付近のもの（ＨＥＰＥＳ等）を用いるのが好ましい。その他に安定剤としてＥＤＴＡ、ジチオスレイトール、ＢＳＡ等を、防腐剤としてアジ化ナトリウム等を加えることも可能である。また、ＡＴＰ抽出試薬と組み合わせて使用する場合には、ＡＴＰ抽出試薬の成分（界面活性剤等）による酵素反応の阻害を抑制するためにシクロデキストリンを添加することも可能である。
【００４１】
このようなＡＴＰを指標とした微生物の検出法では、抽出後のＡＴＰにＡＴＰ検出試薬を加えて直ちに発光を測定するのが一般的なので、ＡＴＰ検出試薬に安定化剤であるＡＭＰが大量に含まれていると発光反応が阻害される。したがって、反応液中のＡＭＰの最終濃度が５ｍＭを越えないように、ＡＴＰ検出試薬に添加するＡＭＰ濃度を調節する必要がある。
【００４２】
イムノアッセイの酵素標識試薬とする場合には、適当な緩衝液にホタルルシフェラーゼで標識した抗原、抗体等の蛋白質とＡＭＰを添加して調製する。ここでも先に述べたように他の安定剤や防腐剤を任意に添加してもよい。ホタルルシフェラーゼで蛋白質を標識する場合には、アルカリフォスファターゼやパーオキシダーゼによる標識の際に一般的に用いられる架橋剤による標識は、酵素活性を損なうので好ましくない。遺伝子組み換え技術を利用して作製されたビオチン化ホタルルシフェラーゼとビオチン化した蛋白質をストレプトアビジンを介して結合させる方法や、ホタルルシフェラーゼと抗体との融合蛋白質として製造する方法による標識が、ホタルルシフェラーゼの活性に対する影響が少ない。このようにしてホタルルシフェラーゼで標識された抗原あるいは抗体は、競合法あるいはサンドイッチ法の酵素免疫測定法に用いることが可能である。
【００４３】
核酸のハイブリダイゼーションアッセイに利用する場合にも、核酸を直接ホタルルシフェラーゼで標識する方法は、酵素活性を損なうおそれがあるので以下のような方法が採られる。
ホタルルシフェラーゼは遺伝子組み換えによりビオチン化ホタルルシフェラーゼとしたものが用いられる。プローブとなるＤＮＡは、ビオチン化ヌクレオチド（bio-11-deoxyUTP等）を用いてあらかじめ化学的に、あるいはＤＮＡポリメラーゼにより合成しておく。プローブＤＮＡと検体とのハイブリダイズ後に、プローブＤＮＡに結合したビオチンとビオチン化ホタルルシフェラーゼをストレプトアビジンを介して結合させて発光反応を行い、ターゲットのＤＮＡあるいはＲＮＡの有無を検出する。
【００４４】
ホタルルシフェラーゼをイムノアッセイや核酸のハイブリダイゼーションの標識酵素として使用する場合には、余剰の標識酵素を除去するＢＦ分離の工程で、ホタルルシフェラーゼ溶液中のＡＭＰも同時に除かれるので、発光反応におけるＡＭＰの影響はほとんどない。
【００４５】
【実施例】
実施例１（各種安定化剤の検討）
・２倍濃度ホタルルシフェラーゼ溶液の調製
ホタルルシフェラーゼbL248（特開平8-308578記載）は以下の組成のホタルルシフェラーゼ溶解液で溶解し、100ng/mlのホタルルシフェラーゼ溶液とした。
ホタルルシフェラーゼ溶解液
BSA                0.2%
Casein            0.02%
NaN3              0.05%
りん酸緩衝液      50mM(pH7.0)
【００４６】
・２倍濃度安定化剤溶液の調製
以下にあげる化合物をホタルルシフェラーゼ溶解液で溶解し100mMの溶液を調製した。さらにこの溶液をホタルルシフェラーゼ溶解液で倍々希釈し、それぞれ6.25、12.5、25.0、50.0mMの溶液を調製した。
検討した安定化剤
ＡＭＰ
フェニルフォスフェート
トリポリフォスフェート
ナフチルフォスフェート
ジフェニルフォスフェート
【００４７】
・安定性試験
96穴プレートの各ウェルに２倍濃度ホタルルシフェラーゼ溶液を150μlずつ分注し、続いて順次希釈した各種化合物の溶液を150μl、２ウェルずつに分注した。プレートを攪拌した後に密封し、37℃で７日間インキュベートした。
【００４８】
・発光反応
インキュベートしたプレートの各ウェルから30ulを別のプレートにサンプリングし、発光溶液（470μM ルシフェリン、1mM ATP、1.25mg/ml DTT、0.13mM EDTA-2Na、8mM 硫酸マグネシウム、0.1mM ピロりん酸カリウム、0.08% サッカロースを含む20mM Tricine緩衝液(pH7.5)）を100μl加え、ルミネッセンスリーダーで5秒間積算した。
【００４９】
・対照品
安定性試験と同じように試薬を分注したプレートをもう１枚用意し、こちらは、インキュベートせずに直ちに30μlを別のプレートにサンプリングして発光強度を測定した。このときの発光強度(RLU:Relative Light Unit)を100%とし、インキュベート後の発光強度をホタルルシフェラーゼの残存活性として計算した。
【００５０】
・結果
７日間インキュベート後のホタルルシフェラーゼの残存活性を図１に示す。
ＡＭＰは試験した全濃度にわたって80%以上の活性を維持している。フェニルフォスフェートも12.5mM以上の濃度では60%以上の活性を維持している。ナフチルフォスフェートは低濃度では70〜80%の活性を維持しているが、12.5mM以上の濃度では急激に活性が低下するので好ましくない。ジフェニルフォスフェートはほとんど効果がなかった。
【００５１】
実施例２（各種ヌクレオチド類の比較）
実施例１と同様の方法で、各種ヌクレオチド類について安定化効果を検討した。
・２倍濃度安定化剤溶液の調製
以下にあげる化合物をホタルルシフェラーゼ溶解液で溶解し10mMの溶液を調製した。さらにこの溶液をホタルルシフェラーゼ溶解液で倍々希釈し、それぞれ0.625、1.25、2.50、5.00mMの溶液を調製した。
検討した安定化剤
ＡＭＰ
ウラシルモノフォスフェート（ＵＭＰ）
シトシンモノフォスフェート（ＣＭＰ）
グアニンモノフォスフェート（ＧＭＰ）
その他の試薬、操作は実施例１と同一であるが、インキュベート時間は７日間とした。
【００５２】
・結果
７日間インキュベート後のホタルルシフェラーゼの残存活性を図２に示す。
ＡＭＰは良好な結果を示したが、他のヌクレオチド類はホタルルシフェラーゼ溶液に対する安定化効果はほとんど見られなかった。
【００５３】
実施例３（りん酸基の数の比較）
実施例２と同様にしてりん酸基の数の異なるアデノシンりん酸塩の安定化効果を検討した。
・２倍濃度安定化剤溶液の調製
以下にあげる化合物をホタルルシフェラーゼ溶解液で溶解し10mMの溶液を調製した。さらにこの溶液をホタルルシフェラーゼ溶解液で倍々希釈し、それぞれ0.625、1.25、2.50、5.00mMの溶液を調製した。
検討した安定化剤
ＡＭＰ
アデノシンジフォスフェート（ＡＤＰ）
アデノシントリフォスフェート（ＡＴＰ）
アデノシン（Ａ）
その他の試薬、操作は実施例２と同一である。
【００５４】
・結果
７日間インキュベート後のホタルルシフェラーゼの残存活性を図３に示す。
ＡＭＰにつづいて、5.00mMのＡＤＰを添加したものが、約50%の活性を維持していた。
【００５５】
実施例４（野生型ホタルルシフェラーゼの安定性）
野生型ホタルルシフェラーゼに対するＡＭＰの安定化効果を確認した。
・２倍濃度ホタルルシフェラーゼ溶液の調製
ゲンジボタル由来のホタルルシフェラーゼをホタルルシフェラーゼ溶解液で溶解し、100ng/mlのホタルルシフェラーゼ溶液とした。
【００５６】
・２倍濃度安定化剤溶液の調製
ＡＭＰをホタルルシフェラーゼ溶解液で溶解し200mMの溶液を調製した。さらにこの溶液をホタルルシフェラーゼ溶解液で希釈し、それぞれ0.200、2.00、20.0mMの溶液を調製した。
【００５７】
・安定性試験
96穴プレートの各ウェルに２倍濃度ホタルルシフェラーゼ溶液を150μlずつ分注し、続いて  順次希釈したＡＭＰの溶液を150μl、２ウェルずつに分注した。このプレートを４枚用意し、１枚は攪拌した後に直ちに30μlを別のプレートにサンプリングして発光強度を測定した。他の３枚は密封し、37℃で0.5、2、4時間インキュベートしてから発光強度を測定した。
【００５８】
・結果
インキュベート後のホタルルシフェラーゼの残存活性を図４に示す。ＡＭＰを添加しない場合には、４時間後の残存活性は10%程度であるが、ＡＭＰを10mM以上添加したものは80%以上の活性が残っている。
【００５９】
実施例５（ルシフェリンの保存安定化）
・安定性試験
InteLite（キッコーマン（株）製）の発光基質溶液に、ＡＭＰを終濃度0,1,3,10mMになるように加え、25℃にて、０日、３日、７日間保存した。23ng/mlのビオチン化ルシフェラーゼbL248[15]を5μl添加し、ルミノメーター（キッコーマン（株）製ルミノテスターC-100）で発光量を測定した。
・結果
保存試験開始時（０日）の発光量を100%とした時の、各保存期間後の発光量を図５に示す。
【００６０】
【発明の効果】
以上に説明したように、本発明が提供する安定化剤は溶液中のホタルルシフェラーゼならびにルシフェリンの安定性を向上させ、長期間にわたって活性を維持することが可能である。また、本発明が提供する安定化剤は、公知のルシフェラーゼの安定化剤であるエチレングリコールやポリオールはもちろんのこと、蛋白質の安定化剤として一般的に用いられるＥＤＴＡ、ジチオスレイトール、ＢＳＡ、カゼイン等とも異なる作用を持つと考えられる。したがって、これらの公知の安定化剤と組み合わせることにより、ホタルルシフェラーゼおよびルシフェリンの安定性を相乗的に高めることができる。
【００６１】
参考文献
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[4]WO 9411528
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[6]特開平 5-244942
[7]特表平 9-510610
[8]特開平 8-154699
[9]US 5618682
[10]特公昭58-  5678
[11]特公昭61-  5720
[12]特開昭56- 26200
[13]特開平 3-285683
[14]特開平 8-308578
[15]辰巳ら  Analytical Biochemistry 243:176-180(1996)
【図面の簡単な説明】
【図１】各種有機りん酸化合物の検討結果
【図２】各種ヌクレオチドの検討結果
【図３】アデノシン誘導体の検討結果
【図４】野生型ホタルルシフェラーゼの安定性の検討結果
【図５】ＡＭＰ添加によるルシフェリンの安定化
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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