(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マンノースとグルコースを含有する生体試料又は該生体試料から調製されたマンノースとグルコースを含有する試料にグルコース６位リン酸化酵素を作用させて該試料中のグルコースの６位をリン酸化する工程と、そのグルコース６位リン酸化工程を経た前記試料に、電子受容体の存在下、マンノースに対して脱水素による酸化能を有する酵素を作用させて該試料中のマンノースを脱水素により酸化する工程と、そのマンノース脱水素工程を経た前記試料中に生成した前記電子受容体の還元体を定量する工程とを含むことを特徴とするマンノースの定量法。
【請求項２】
前記酵素が、酵素番号ＥＣ１．１．１．１１９に分類されるグルコースデヒドロゲナーゼである請求項１記載のマンノースの定量法。
【請求項３】
前記酵素が、グルコノバクター属に属する微生物由来のアルドヘキソースデヒドロゲナーゼである請求項１又は２記載のマンノースの定量法。
【請求項４】
前記試料が、血液、血清、血漿、髄液及び尿からなる群より選ばれた１種の生体試料、又は該生体試料から調製された試料である請求項１〜３のいずれか１つに記載のマンノースの定量法。
【請求項５】
電子受容体の存在下でマンノースに対して脱水素による酸化能を有する酵素と、該酵素が利用できる前記電子受容体と、グルコース６位リン酸化酵素とを含むことを特徴とするマンノースの定量用試薬。
【請求項６】
前記酵素が、酵素番号ＥＣ１．１．１．１１９に分類されるグルコースデヒドロゲナーゼである請求項５記載のマンノースの定量用試薬。
【請求項７】
前記酵素が、グルコノバクター属に属する微生物由来のアルドヘキソースデヒドロゲナーゼである請求項５又は６記載のマンノースの定量用試薬。
【請求項８】
更にアデノシン三リン酸を含むものである請求項５〜７のいずれか一つに記載のマンノースの定量用試薬。
【請求項９】
前記電子受容体が、補酵素酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸である請求項５〜８のいずれか一つに記載のマンノースの定量用試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、酵素法による正確かつ簡便なマンノースの定量法及び定量用試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヘキソースの１種であるマンノースは、ヒト血中にも微量に存在しており、その供給経路は食物由来からの吸収はなく、主にグルコース代謝系からであることが知られている。マンノースの血中の濃度は、通常０．５ｍｇ／ｄｌ程度と微量であるが、血糖コントロール不良の糖尿病（Clinica. Climica Acta 251;1996 pp91-103）や真菌感染症（J. Clin. Microbiol. 21(6) ;1985 pp972-979）の患者で上昇することが知られており、これら疾患の診断に有用であることが示唆されている。
【０００３】
従来、マンノースの測定法としては、ガスクロマトグラフ法（Clin. Chem 25;1979; pp1384-1387）、液体クロマトグラフ法（日泌尿会誌 80; 1989 pp1816-1823）、酵素法（Clin. Chem 30(2); 1984 pp293-294）等が知られている。
【０００４】
例えば、酵素法は、試料中にグルコースが含まれていると正確に定量できないためグルコースを除去する必要があり、曽山等（Clin.Chem 30; 1984 pp293-294）の方法は、グルコースオキシダーゼとカタラーゼを用いて予め試料中のグルコースを除去している。そして、アデノシン三リン酸（以下、ＡＴＰという。）の存在下、マンノースにヘキソキナーゼを作用させてマンノース６リン酸に変換し、続いてマンノース６リン酸イソメラーゼを作用させてフルクトース６リン酸に変換した後、更にグルコース６リン酸イソメラーゼを作用させてグルコース６リン酸とし、最後に補酵素酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤという。）の存在下、グルコース６リン酸デヒドロゲナーゼを作用させて生じた還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤＨという。）の吸光度（３４０ｎｍ）を分光光度計で測定することによりマンノースを定量している。
【０００５】
また、上記酵素法の改良として、Pitkanen等により、グルコースやフルクトースが共存する試料に、ＡＴＰ及び酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以下、ＮＡＤＰという。）存在下、ヘキソキナーゼ、グルコース６リン酸イソメラーゼを作用させて、グルコースやフルクトースをグルコース６リン酸に変換し、更にグルコース６リン酸デヒドロゲナーゼを添加してグルコース６リン酸をグルコン酸６リン酸に変換し、このときに生じる還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以下、ＮＡＤＰＨという。）を塩酸酸性下で分解することによりグルコース等による影響を除去した後、上記方法と同様にして、ＡＴＰ及びＮＡＤＰ存在下、マンノースにヘキソキナーゼ、マンノース６リン酸イソメラーゼ、グルコース６リン酸イソメラーゼ、グルコース６リン酸デヒドロゲナーゼを作用させて生じたＮＡＤＰＨの吸光度（３４０ｎｍ）を測定するマンノースの定量方法が報告されている（Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem 35(10); 1997 pp761-766）。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上述した酵素法は、数種の酵素反応を組み合わせた複雑な酵素共役系を介することから、すべての酵素の至適化を行なうことが困難であり、また、高価な酵素を多数組み合わせて用いるためコスト面でも問題があった。更に、生体試料由来の成分や夾雑物の影響を受けやすい欠点があった。
【０００７】
一方、ガスクロマトグラフ法や液体クロマトグラフ法は、誘導体化や蛍光等の標識化などの煩雑な操作が必要であり、その上特殊な装置を必要とすることから、多数の検体処理には不向きであった。
【０００８】
したがって、本発明の目的は、正確かつ簡便で多数の検体処理が可能なマンノースの定量法及び定量用試薬を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するため、本発明の一つは、マンノースとグルコースを含有する生体試料又は該生体試料から調製されたマンノースとグルコースを含有する試料にグルコース６位リン酸化酵素を作用させて該試料中のグルコースの６位をリン酸化する工程と、そのグルコース６位リン酸化工程を経た前記試料に、電子受容体の存在下、マンノースに対して脱水素による酸化能を有する酵素を作用させて該試料中のマンノースを脱水素により酸化する工程と、そのマンノース脱水素工程を経た前記試料中に生成した前記電子受容体の還元体を定量する工程とを含むことを特徴とするマンノースの定量法を提供するものである。
【００１１】
また、前記定量法においては、前記酵素が、酵素番号ＥＣ１．１．１．１１９に分類されるグルコースデヒドロゲナーゼであることが好ましく、グルコノバクター属に属する微生物由来のアルドヘキソースデヒドロゲナーゼであることがより好ましい。また、試料としては、血液、血清、血漿、髄液及び尿からなる群より選ばれた１種の生体試料、又は該生体試料から調製された試料であることが好ましい。
【００１２】
本発明のもう一つは、電子受容体の存在下でマンノースに対して脱水素による酸化能を有する酵素と、該酵素が利用できる前記電子受容体と、グルコース６位リン酸化酵素とを含むことを特徴とするマンノースの定量用試薬を提供するものである。
【００１３】
前記試薬は、前記酵素が、酵素番号ＥＣ１．１．１．１１９に分類されるグルコースデヒドロゲナーゼであることが好ましく、グルコノバクター属に属する微生物由来のアルドヘキソースデヒドロゲナーゼであることがより好ましい。また、更にアデノシン三リン酸を含むものであることが好ましい。更に、前記電子受容体が、補酵素ＮＡＤＰであることが好ましい。
【００１４】
本発明によれば、複雑な酵素共役系を介することなく、マンノースに直接作用して脱水素による酸化能を有する酵素を用いるため、簡便にマンノースを定量でき、多数の検体処理が可能である。また、グルコース消去剤としてグルコース６位リン酸化酵素を用いるので、試料中のグルコースの影響を受けにくく、正確にマンノースを定量することができる。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明において、その試料（検体）は、マンノースとグルコースを含有する生体試料又は該生体試料から調製されたマンノースとグルコースを含有する試料である。血液、血清、血漿、髄液、尿などの生体試料、又はこれらの生体試料から調製された試料、例えばマンノースを測定しやすいように各種の方法で前処理した試料等が好ましく使用される。
【００１６】
本発明で用いられる酵素としては、電子受容体の存在下で、マンノースに対して脱水素による酸化能を有する酵素（以下「マンノース脱水素酵素」という）であればよく、特に制限はないが、好ましくは、酵素番号ＥＣ１．１．１．１１９に分類される酵素が挙げられる。具体的には、例えば、ＯＫＡＭＯＴＯの文献（J.Biochem. 53(5) 1963 pp348-353）に記載されたAcetobacter suboxydansから得られるＮＡＤＰ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ、ＡＶＩＧＡＤ等の文献（J. Biol. Chem. 243(8) 1968 pp1936-1941）に記載されたGluconobacter cerinusから得られるＮＡＤＰ依存性アルドヘキソースデヒドロゲナーゼ、ＤＡＨＭＳ等の文献（J.Biol.Chem. 247(7) 1972 pp2222-2227）に記載されたＮＡＤ依存性アルドヘキソースデヒドロゲナーゼ等が挙げられる。
【００１７】
上記酵素はグルコノバクター属に属する微生物由来のアルドヘキソースデヒドロゲナーゼであることが特に好ましい。グルコノバクター属に属する微生物としては、例えば、グルコノバクター・アサイ（G.asaii）ＩＦＯ  ３２７６、グルコノバクター・セリヌス（G.cerinus）ＩＦＯ  ３２６７、グルコノバクター・フラテオリ（G.frateurii）ＩＦＯ  ３２６４、グルコノバクター・オキシダンス（G.oxydans）ＩＦＯ  １４８１９等が挙げられ、これらの微生物を培養して菌体を回収し、この菌体を超音波処理等により破砕して得られる破砕液を、必要に応じて、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトゲル、ゲル濾過等のカラムクロマトグラフィを組み合わせて精製することにより酵素を得ることができる。
【００１８】
なお、マンノース脱水素酵素の使用濃度は、特に限定されないが、０．１〜１００単位／ｌ、特に１〜１０単位／ｌの範囲とすることが好ましい。
【００１９】
本発明において、電子受容体としては、ＮＡＤ、ＮＡＤＰ等の補酵素、酸素、フェナジンメトサルフェート、ジクロルフェノールインドフェノール、フェリシアン化合物、テトラゾリウム塩などを、１種又は２種以上適宜選択して使用することができ、特に補酵素ＮＡＤＰが好ましい。電子受容体の使用濃度は、０．１〜１０ｍｍｏｌ／ｌ、特に０．５〜２ｍｍｏｌ／ｌの範囲が好ましい。
【００２０】
また、電子受容体の還元体を定量するために、電子受容体が還元されることによって発色する発色剤を併用してもよい。かかる発色剤は、使用する電子受容体に応じて適宜選択すればよいが、例えば補酵素ＮＡＤＰの還元体であるＮＡＤＰＨを定量するために、電子キャリアーとして、フェナジンメトサルフェートやジアホラーゼとテトラゾリウム塩を共存させ、生成されるホルマザン色素を比色定量する方法が挙げられる。
【００２１】
更に、本発明で用いるマンノース脱水素酵素は、マンノース以外にグルコースにも作用を示すため、特に血清や血漿等の生体試料中のマンノースを測定する場合には、グルコースの影響を少なからず受けることになる。したがって、生体試料に対する測定精度をより高めるために、グルコース消去剤を併用する。このグルコース消去剤としては、グルコース６位リン酸化酵素を用いる。更にＡＴＰを含むものが好ましく用いられる。
【００２２】
上記グルコース６位リン酸化酵素としては、グルコキナーゼ、ヘキソキナーゼ等が挙げられ、ＥＣ２．７．１．２、ＥＣ２．７．１．１に分類されるものであれば特に制限はなく、市販のものを使用できるが、好ましくはグルコースに特異性の高いグルコキナーゼが用いられる。それらの使用量は、試料中のグルコース量により異なるが、概ね０．１〜５０ｕ／ｍｌである。また、グルコースのリン酸化に必要なＡＴＰ量は、試料中のグルコース量により異なるが、概ね１〜２０ｍＭである。更に、グルコースリン酸化反応を促進するものとして通常、無機、有機塩類としてマグネシウムイオンを５〜５０ｍＭ程度含有させる。グルコース消去のためのグルコースリン酸化反応は、ｐＨ６〜１０の緩衝液中、２０〜５０℃、望ましくは２５〜３７℃で、添加直後から１０分程度行なわれる。
【００２３】
本発明において使用できる緩衝液としては、ｐＨ６〜１０のリン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス塩酸緩衝液、グッド緩衝液、ホウ酸緩衝液等、通常使用されるものであればいずれも使用可能である。
【００２４】
本発明のマンノース定量用試薬は、グルコース消去剤と、定量用酵素とを別々に組合せてもよい。より具体的には、電子受容体とグルコース消去剤とを含む第１試薬と、マンノース脱水素酵素を含む第２試薬との２試薬で構成するのが好ましい。
【００２５】
生体試料に上記マンノース定量用試薬を添加して反応を行わせた後、反応液中で還元された電子受容体の測定は、例えば、電子受容体の還元体に特有な吸収波長における吸光度を測定したり、電子受容体の還元体によって発色する発色剤の発色強度を測定することなどによって行うことができる。
【００２６】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
酵素製造例（グルコノバクター・アサイ由来アルドヘキソースデヒドロゲナーゼの製造）
グルコノバクター・アサイ（ＩＦＯ  ３２７６）を酵母エキス０．５％、フルクトース１％からなる培地に植菌し、２８℃で２４時間振とう培養し、遠心分離して菌体を得た。この菌体を２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）に懸濁し、氷冷下で超音波破砕装置により処理し、破砕液を遠心分離して菌体残渣を除去し、粗酵素液を得た。
【００２７】
この粗酵素液に硫酸アンモニウム粉末を３０％飽和となるように加えて溶解させ、析出したタンパク質を遠心分離により取り除いた。得られた上清をＢｕｔｙｌトヨパールカラムに通して酵素を吸着させ、硫酸アンモニウムを３０〜０％飽和量含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）で酵素を溶出した。
【００２８】
各溶出画分の酵素活性を測定して活性画分を回収し、その活性画分を２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）にて透析して脱塩した後、これをＤＥＡＥトヨパールカラムに通して酵素を吸着させ、０〜０．２５ＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）で酵素を溶出した。
【００２９】
各溶出画分の酵素活性を測定して活性画分を回収し、その活性画分を２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）にて透析して脱塩した後、これを更にハイドロキシアパタイトカラムに通して酵素を吸着させ、２０〜１５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）で酵素を溶出させ、各溶出画分の酵素活性を測定して活性画分を回収し、これを精製酵素液とした。
【００３０】
実施例１
上記酵素製造例で得られたアルドヘキソースデヒドロゲナーゼと、電子受容体として補酵素ＮＡＤＰを用いて、以下に示す第１試薬及び第２試薬からなる定量用試薬を作成した。
・第１試薬（ｐＨ８．５）：
１２５ｍＭ  トリス塩酸緩衝液
１．２５ｍＭ  ＮＡＤＰ
０．７５ｍＭ  ＷＳＴ−１
１．２５％  Ｔｗｅｅｎ２０
６．２５ｕ／ｍｌ  ジアホラーゼ
・第２試薬（ｐＨ７．０）：
２０ｍＭ  リン酸緩衝液
２３ｕ／ｍｌ  アルドヘキソースデヒドロゲナーゼ
【００３１】
そして、この試薬を用いて、以下に示すようにして各種濃度（０〜５０μｇ／ｍｌ）のマンノース溶液を測定した。
【００３２】
各濃度のマンノース溶液各８μｌに対し、第１試薬２５６μｌを添加して３７℃で５分反応させ、次いで第２試薬５６μｌを添加して同じく３７℃で５分反応させた後、主波長４５０ｎｍ、副波長７００ｎｍの２波長とし、２ポイントアッセイにて吸光度を測定した。これらの操作は、日立７１５０形自動分析装置により行った。この結果を図１に示す。
【００３３】
図１から、マンノース濃度０〜５０μｇ／ｍｌまで、直線的な発色吸光度が得られ、低濃度域での正確なマンノースの定量が可能であることが分かる。
【００３４】
実施例２（グルコース消去剤を組合せた試薬系でのマンノースの定量）
上記酵素製造例で得られたアルドヘキソースデヒドロゲナーゼと、電子受容体として補酵素ＮＡＤＰと、グルコース消去剤としてグルコキナーゼ及びＡＴＰを用いて、以下に示す第１試薬及び第２試薬からなる定量用試薬を作成した。
・第１試薬（ｐＨ８．５）：
１２５ｍＭ  トリス塩酸緩衝液
１．２５ｍＭ  ＮＡＤＰ
０．７５ｍＭ  ＷＳＴ−１
１．２５％  Ｔｗｅｅｎ２０
６．２５ｕ／ｍｌ  ジアホラーゼ
１２．５ｕ／ｍｌ  グルコキナーゼ
１０ｍＭ  ＡＴＰ
２ｍＭ  酢酸マグネシウム
・第２試薬（ｐＨ７．０）：
２０ｍＭ  リン酸緩衝液
２３ｕ／ｍｌ  アルドヘキソースデヒドロゲナーゼ
【００３５】
そして、まず、実施例１と同様にして、この試薬を各種濃度（０〜５０μｇ／ｍｌ）のマンノース溶液と反応させ、反応液の吸光度を測定した。この結果を図２に示す。
【００３６】
次いで、上記試薬を、一定濃度（約１０μｇ／ｍｌ）のマンノースと、各種濃度（０〜１，０００ｍｇ／ｄｌ）のグルコースとを含有する溶液と反応させ、反応液の吸光度を測定した。この結果を図３に示す。
【００３７】
図２から、マンノース濃度０〜５０μｇ／ｍｌまで、直線的な発色吸光度が得られ、グルコース消去剤を組合せた試薬系においても正確なマンノースの定量が可能であることが分かる。
【００３８】
また、図３から、試料中のグルコース濃度が０〜１，０００ｍｇ／ｄｌまで変化しても、マンノース濃度に応じた一定の吸光度が得られることが分かる。このことから、グルコースを高濃度に含有する試料においても、試料中のマンノースを正確に定量できることが分かる。
【００３９】
実施例３
５種類の血清（血清１〜５）９容量に対して、１００μｇ／ｍｌのマンノース水溶液を１容量の割合で添加して調製した試料、及び対照としてマンノース水溶液の代わりに精製水を添加した試料について、実施例２の試薬を用いてマンノースを測定した。その測定値を実施例２で得られた検量線（図２）を用いて、マンノースの定量を行ない、添加したマンノース理論量（１０μｇ／ｍｌ）の回収量を算出した。その結果を表１に示す。
【００４０】
【表１】
0004526654.tif 000002
【００４１】
表１から、添加したマンノース理論量（１０μｇ／ｍｌ）に対して、添加回収率は良好で、血清中の正確なマンノースの定量が可能であることが分かる。
【００４２】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によれば、マンノースを含む試料に、電子受容体を添加し、これにマンノース脱水素酵素を作用させることにより、マンノース脱水素酵素がマンノースに直接作用して、マンノースを酸化すると共に、電子受容体を直接還元するので、生成された電子受容体の還元体を測定することにより、高感度でしかも正確なマンノースの定量が可能となる。また、反応系が簡単であるため、各種自動分析装置への適用も容易であり、多数の検体処理にも適している。
【００４３】
また、グルコース消去剤を併用して試料中に共存するグルコースを減少させることにより、グルコースの影響をほとんど無視できるレベルになるため、血清や血漿等の生体試料においても、簡単な操作で高い測定精度を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  電子受容体を含有する第１試薬と、アルドヘキソースデヒドロゲナーゼを含有する第２試薬とを用い、各種濃度のマンノース溶液を測定した結果を示す図表である。
【図２】  電子受容体及びグルコース消去剤を含有する第１試薬と、アルドヘキソースデヒドロゲナーゼを含有する第２試薬とを用い、各種濃度のマンノース溶液を測定した結果を示す図表である。
【図３】  電子受容体及びグルコース消去剤を含有する第１試薬と、アルドヘキソースデヒドロゲナーゼを含有する第２試薬とを用い、一定濃度のマンノースを含有する溶液にグルコース濃度を変化させて添加した溶液を測定した結果を示す図表である。
【図１】
0004526654.tif 000003
【図２】
0004526654.tif 000004
【図３】
0004526654.tif 000005