(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）配列番号５、配列番号７又は配列番号９に記載のヌクレオチド配列、又は
（ｉｉ）配列番号５、配列番号７又は配列番号９に記載のヌクレオチド配列と少なくとも９５％の配列同一性を有し、かつパントラクトンヒドロラーゼ活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列
からなるＤＮＡ。
【請求項２】
（ｉ）配列番号５、配列番号７又は配列番号９に記載のヌクレオチド配列、又は
（ｉｉ）配列番号５、配列番号７又は配列番号９に記載のヌクレオチド配列と少なくとも９５％の配列同一性を有し、かつパントラクトンヒドロラーゼ活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列
からなるＤＮＡを含む発現ベクター。
【請求項３】
請求項２に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項４】
（ｉ）配列番号６、配列番号８又は配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は
（ｉｉ）配列番号６、配列番号８又は配列番号１０に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつパントラクトンヒドロラーゼ活性を有するタンパク質
からなるパントラクトンヒドロラーゼ。
【請求項５】
Ｒ−又はＳ−パントラクトンの選択的加水分解のための、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質又は配列番号４に記載のアミノ酸において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつパントラクトンヒドロラーゼ活性を有するタンパク質からなるパントラクトンヒドロラーゼの使用。
【請求項６】
Ｒ−又はＳ−パントラクトンの選択的加水分解のための、請求項４に記載のパントラクトンヒドロラーゼの使用。
【請求項７】
請求項４に記載のパントラクトンヒドロラーゼ、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質又は配列番号４に記載のアミノ酸において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつパントラクトンヒドロラーゼ活性を有するタンパク質からなるパントラクトンヒドロラーゼの存在下にＲ−又はＳ−パントラクトンを選択的に加水分解する工程を含む、Ｒ−パントテン酸若しくはその塩又はＲ−パンテノールの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、パントラクトンのエナンチオマーの光学分割に有用な酵素、該酵素をコードする遺伝子、及びＲ−パントテン酸若しくはその塩又はＲ−パンテノールの製造方法における該酵素の使用に関する。
【０００２】
エナンチオマーは、その生理学的効果、即ち、毒物学的効果及び薬理学的効果、酵素との反応及び感覚的特徴において異なる。Ｒ−パントラクトンのみが、成長、再生及び正常な生理学的機能のためにヒト及び動物にとって必須のビタミン、Ｒ−パントテン酸の製造における中間体として知られている。補酵素Ａの前駆体として及び脂肪酸シンセターゼのアシル担体タンパク質として、パントテン酸は、炭水化物、タンパク質及び脂質のエネルギー代謝並びに脂質、神経伝達物質、ステロイドホルモン、ポルフィリン及びホルモンの合成を含む１００を越える種々の代謝経路に関与している。最近まで、Ｒ−パントラクトンを製造するために広く使用された技術は、化学的に合成されたＲ−及びＳ−パントラクトンの光学分割であった。このような方法は、非常にコストがかさむ。何故ならばそれは高価な光学分割剤の使用を必用とするからである。更に、パントラクトンのＲ−エナンチオマーの回収はより困難である。ゆえに、パントラクトンのＲ−及びＳ−エナンチオマーの光学分割に有用なパントラクトンヒドロラーゼを提供することは望ましい。パントラクトンのＳ−形及びＲ−形を特異的に分解するこのような酵素の使用は、パントラクトンの２つのエナンチオマーの分離のための費用が少なくそして取り扱いが容易な方法である。Ｒ−パントテン酸の塩の例は、Ｒ−パントテン酸カルシウムを含む。
【０００３】
１つの態様では、本発明は、ウマの肝臓、Ａ．ｎｉｇｅｒ  ＡＴＣＣ９１４２、Ａ．ｎｉｇｅｒ  ａｗａｍｏｒｉ  ＡＴＣＣ３８８５４、又はＡ．ｎｉｇｅｒ  ＭａｃＲａｅ  ＡＴＣＣ４６９５１に由来するパントラクトンヒドロラーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列を提供する。これらの菌株はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）、１０８０１、大学通り、マナッサス、２０１１０−２２０９、米国から入手可能である。
【０００４】
他の態様では、本発明は、ウマの肝臓に由来するときは配列番号１に示されたヌクレオチド配列、Ａ．ｎｉｇｅｒ  ＭａｃＲａｅ  ＡＴＣＣ４６９５１に由来するときは配列番号５に示されたヌクレオチド配列、Ａ．ｎｉｇｅｒ  ＡＴＣＣ９１４２に由来するときは配列番号７に示されたヌクレオチド配列及びＡ．ｎｉｇｅｒ  ａｗａｍｏｒｉ  ＡＴＣＣ３８８５４に由来するときは配列番号９に示されたヌクレオチド配列を含むパントラクトンヒドロラーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列を提供する。
【０００５】
ヌクレオチド配列は、示されたそれぞれのパントラクトンヒドロラーゼのコード配列及び調節配列を含むことができる。
【０００６】
「調節配列」は、作用可能に連結された（operably linked）核酸の転写を指向する核酸制御配列のアレーとして定義される。このような発現制御配列の例はプロモーターである。「プロモーター」は、転写の開始部位付近の必要な核酸配列を含む。プロモーターはまた転写の開始部位から数千塩基対も離れて位置することができる遠位エンハンサー又はリプレッサーエレメントも場合により含む。「構成的」プロモーターは、大抵の環境及び発生条件（developmental conditions）下に活性であるプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、環境又は発生調節下に活性であるプロモーターである。「作用可能に連結された」という用語は、核酸発現制御配列（例えば、プロモーター又は転写因子結合部位のアレー）と第２核酸配列間の機能的連結であって、発現制御配列が第２配列に相当する核酸の転写を指向する連結を指す。
【０００７】
ヌクレオチド配列の断片は、例えばハイブリダイゼーションアッセイにおけるプローブとして使用することができる。
【０００８】
ヌクレオチド配列が宿主生物中に挿入され、転写されそして翻訳されて、機能的ポリペプチドを産生する場合に、コドン縮重のため、多数のポリヌクレオチド配列が同じポリペプチドをコードすることを当業者は認識するであろう。これらの変異体は、特に、本発明の範囲内にある。更に、本発明は、互いに実質的に同じ（下記のごとく決定して）であるこれらの配列、及び野生型ポリペプチドの突然変異体であるか又はポリペプチドの機能を保持する（例えば、ポリペプチド中のアミノ酸の保存性置換から生じる）ポリペプチドをコードするこれらの配列を含む。更に、変異体は、下記する優性ネガティブ変異体をコードする変異体であることができる。
【０００９】
２つの核酸配列又はポリペプチドは、２つの配列においてそれぞれヌクレオチド又はアミノ酸残基の配列が、下記する最大対応（maximum correspondence）でアラインメントされる場合に同じであるならば同一であると言われる。２つ以上の核酸又はポリペプチド配列に関して、「同一」又は百分率「同一性」という用語は、下記の配列比較アルゴリズムの１つを使用して又はマニュアルアラインメント及び視覚検査により測定して、比較ウインドー（comparison window）に対して比較されそして最大対応でアラインメントされるとき、同じであるか又は同じであるアミノ酸残基若しくはヌクレオチドの特定の百分率を有する２つ以上の配列又はサブ配列（subsequences）を指す。配列同一性の百分率がタンパク質又はペプチドに関して使用される場合に、同一ではない残基位置は、アミノ酸残基が同様な化学的性質（例えば、電荷又は疎水性）を有する他のアミノ酸残基で置換されそしてそれゆえ分子の機能的性質を変えない、保存性アミノ酸置換によりしばしば異なることは認識される。配列が保存性置換において異なる場合に、百分率配列同一性は、上向きに調節されて置換の保存的性質を訂正することができる。典型的には、この調節をするための手段は当業者に周知されている。典型的には、これは、完全ミスマッチではなくてむしろ部分的ミスマッチとして保存性置換をスコア化し、それにより百分率配列同一性を増加させることを含む。ゆえに、例えば、同一アミノ酸が１のスコアを与えられそして非保存性置換がゼロのスコアを与えられる場合に、保存性置換がゼロと１との間のスコアを与えられる。保存性置換のスコア化は例えば、Meyers&Miller, Computer Applic.Biol.Sci.4: 11-17(1998）のアルゴリズムにしたがって、例えばプログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Intelligenetics, Mountain View, Calf., USA）において実施されたようにして計算される。
【００１０】
２つの核酸又はポリペプチドに関して「実質的に同一」というフレーズは、下記の配列比較アルゴリズムの1つを使用して又はマニュアルアラインメント及び視覚検査により測定して、比較ウインドーに対して最大対応でアラインメントされるとき、少なくとも６０%、好ましくは８０%、最も好ましくは９０〜９５%のヌクレオチド又はアミノ酸残基同一性を有する配列又はサブ配列を指す。この定義は、その配列の相補体が試験配列にハイブリダイゼーションする配列も指す。
【００１１】
配列比較のために、典型的には、１つの配列は、基準配列として作用し、これと試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを使用する場合に、試験配列及び基準配列をコンピュータに入力し、サブ配列協調（subsequence coordinate）を必要に応じて指定し、そして配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。デフォールトプログラムパラメーターを使用することができ、又は他のパラメーターを指定することができる。次いで配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメーターに基づいて基準配列に対する試験配列の百分率配列同一性を計算する。
【００１２】
本発明で使用される「比較ウインドー」は、２０〜６００、通常約５０〜約２００、更に通常約１００〜約１５０からなる群より選ばれる連続位置の数のいずれか１つのセグメントであって、それにおいて、２つの配列が最適にアラインメントされた後、配列を同じ数の連続位置の基準配列と比較することができる、セグメントを指すことを含む。比較のための配列のアラインメントの方法は当該技術分野で周知されている。
【００１３】
「保存的に修飾された変異体（"conservatively modified variants"）」は、アミノ酸及び核酸配列の両方に当てはまる。特定の核酸配列に関して、保存的に修飾された変異体は、同一の若しくは本質的に同一のアミノ酸配列をコードするこれらの核酸配列を指すか、又は核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一配列を指す。遺伝子コードの縮重のゆえに、多数の機能的に同一の核酸コドンは、いずれかの与えられたタンパク質をコードする。例えば、コドン、ＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ及びＧＣＵはすべてアミノ酸アラニンをコードする。ゆえに、アラニンがコドンにより特定されるすべての位置において、コドンは、コードされたポリペプチドを変えないで記載された対応するコドンのいずれかに変えることができる。このような核酸変異は、保存的に修飾された変異の1つの種である「サイレント変異（"silent variation"）」である。ポリペプチドをコードする本発明におけるすべての核酸配列は、核酸のすべての可能なサイレント変異も記載する。当業者は、核酸における各コドン（通常メチオニンのための唯一のコドンであるＡＵＧを除いて）を修飾して機能的に同一の分子を生じさせることができることを認識するであろう。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は各記載された配列に事実上含まれている。
【００１４】
アミノ酸配列に関して、当業者は、コードされた配列において単一のアミノ酸又は小さい百分率のアミノ酸（即ち、２０%未満、例えば、１５%、１０%、５%、４%、３%、２%又は１%）を変える、核酸に対する個々の置換、欠失若しくは付加、又はペプチド、ポリペプチド若しくはタンパク質配列に対する置換は、この変化がアミノ酸の化学的に類似したアミノ酸による置換をもたらす場合に、「保存的に修飾された変異体」であることを認識するであろう。機能的に類似したアミノ酸を与える保存性置換表は当該技術分野で周知されている。
【００１５】
下記の６つの基は、各々互いに保存性置換であるアミノ酸を含有する：
アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；
アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；
イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；及び
フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、（例えば、Creighton, Proteins(1984）参照）。
【００１６】
２つの核酸配列又はポリペプチドが実質的に同一であるという指示は、第１核酸によりコードされたポリペプチドが第２核酸によりコードされたポリペプチドに対して生じた抗体と免疫学的に交差反応性であるということである。かくして、ポリペプチドは、第２のポリペプチドに対して、例えば、該２つのペプチドが保存性置換によってのみ異なる場合には、典型的に実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一であるという指示は、２つの分子又はそれらの相補体が下記するとおりストリンジェントな条件（stringent conditions）下に互いにハイブリダイゼーションするということである。
【００１７】
「特異的にハイブリダイゼーションする」というフレーズは、その配列が複合混合物中に存在するとき（例えば全細胞又はライブラリーのＤＮＡ又はＲＮＡ）、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下に特定のヌクレオチド配列に対してのみ分子が結合すること、２本鎖化すること（duplexing）又はハイブリダイゼーションすることを指す。
【００１８】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」というフレーズは、プローブが典型的には核酸配列の複合混合物中のその標的配列にハイブリダイゼーションするが、他の配列にはハイブリダイゼーションしないような条件を指す。ストリンジェントな条件は、配列依存性でありそして異なる環境において異なるであろう。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイゼーションする。一般に、高度にストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度及びpHにおける特異的配列について融解温度（thermal melting point）（Ｔｍ）より約５〜１０℃低いように選ばれる。低いストリンジェンシー条件は、一般にＴｍより約１５〜３０℃低いように選ばれる。Ｔｍは、標的に対して相補的なプローブの５０%が平衡状態において標的配列にハイブリダイゼーションする（標的配列は過剰に存在しているので、Ｔｍにおいては、プローブの５０%が平衡状態である温度（規定されたイオン強度、pH及び核酸濃度の下に）である。ストリンジェントな条件は、塩濃度が、pH７．０〜８．３において約１．０Ｍより少ないナトリウムイオン、典型的には約０．０１〜１．０Ｍナトリウムイオン濃度（又は他の塩）でありそして温度は短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）では少なくとも約３０℃でありして長いプローブ（例えば、５０より多くのヌクレオチド）では少なくとも約６０℃である条件であろう。ストリンジェントな条件は、脱安定化剤、例えばホルムアミドを添加して達成することもできる。選択的又は特異的ハイブリダイゼーションでは、ポジティブシグナルはバックグラウンドの少なくとも２倍、好ましくは、バックグラウンドハイブリダイゼーションの１０倍である。
【００１９】
ストリンジェントな条件下に互いにハイブリダイゼーションしない核酸でも、それらがコードするポリペプチドが実質的に同一であるならば、やはり実質的に同一である。これは、例えば、核酸のコピーが遺伝子コードにより許容される最大コドン縮重を使用して創り出される場合に起こる。このような場合に、核酸は、典型的には、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下にハイブリダイゼーションする。
【００２０】
本発明においては、本発明の核酸を含有するゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）又はｃＤＮＡは、本発明に開示された核酸配列を使用してストリンジェントな条件下に標準サザンブロットにおいて同定することができる。この開示の目的で、このようなハイブリダイゼーションのための適当なストリンジェントな条件は、３７℃で４０%ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１%ドデシル硫酸ナトリウムＳＤＳの緩衝液中でのハイブリダイゼーション及び少なくとも約５０℃、通常約５５℃〜約６０℃の温度で２０分間の０．２Ｘ  ＳＳＣにおける少なくとも１回の洗浄又は同等な条件を含む条件である。ポジティブハイブリダイゼーションはバックグラウンドの少なくとも２倍である。当業者は別のハイブリダイゼーション及び洗浄条件を使用して同様なストリンジェンシーの条件を与えることができることを容易に認識するであろう。
【００２１】
ポリヌクレオチドが実質的に同一であるという更なる表示は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下にプローブとして使用されて、ｃＤＮＡもしくはゲノムライブラリーから試験配列を単離するか又は例えば、ノーザン若しくはサザンブロットにおいて試験配列を同定することができる、オリゴヌクレオチドプライマーの対により増幅される基準配列である。
【００２２】
本発明は、本明細書で定義された発現ベクターも含む。発現ベクターは、上記したポリヌクレオチド配列の各々の１つ以上のコピーを含む。本発明の発現ベクターは、本明細書で定義されたポリヌクレオチド配列のいずれをも含有することができる。
【００２３】
ゆえに、更なる態様では、本発明は、パントラクトンヒドロラーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列を含む発現ベクターであって、該パントラクトンヒドロラーゼがウマの肝臓、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ａ．ｎｉｇｅｒ  ＡＴＣＣ９１４２、Ａ．ｎｉｇｅｒ  ａｗａｍｏｒｉ  ＡＴＣＣ３８８５４若しくはＡ．ｎｉｇｅｒ  ＭａｃＲａｅ  ＡＴＣＣ４６９５１に由来するものである発現ベクター、又は配列番号２により示されるようなウマの肝臓に由来するパントラクトンヒドロラーゼ、配列番号４により示されるようなＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓに由来するパントラクトンヒドロラーゼ、配列番号８に示されるＡ．ｎｉｇｅｒ  ＡＴＣＣ９１４２に由来するパントラクトンヒドロラーゼ、配列番号１０により示されるようなＡ．ｎｉｇｅｒ  ａｗａｍｏｒｉ  ＡＴＣＣ３８８５４に由来するパントラクトンヒドロラーゼ、及び配列番号６により部分的に示されるようなＡ．ｎｉｇｅｒ  ＭａｃＲａｅ  ＡＴＣＣ４６９５１に由来するパントラクトンヒドロラーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列を含む発現ベクターを提供する。
【００２４】
発現ベクターにおけるポリヌクレオチド配列は、場合により上記した発現制御配列に作用可能に連結されていてもよい。
【００２５】
本明細書で使用された、「発現ベクター」というフレーズは、本明細書に記載のポリヌクレオチド配列をコードするＤＮＡ配列を有する複製可能なベヒクル及びそして本明細書に記載のポリヌクレオチド配列をコードするＤＮＡ配列の発現を媒介することができる複製可能なベヒクルである。これに関して、「複製可能な」という用語は、ベクターが導入されている与えられたタイプの宿主細胞において複製することができることを意味する。問題のポリヌクレオチド配列（１つ又は複数）のすぐ上流に、シグナルペプチドであって、その存在がベクターを宿らせる宿主により発現されるコードされたポリペプチドの分泌を確実にするシグナルペプチドをコードする配列を設けることができる。シグナル配列は、選ばれたポリヌクレオチド配列と自然に関連したシグナル配列又は他の起源のシグナル配列であることができる。
【００２６】
ベクターは、便利に組換えＤＮＡ処置を受けることができるいかなるベクターであってもよく、そしてベクターの選択は、ベクターが導入されるべき宿主細胞にしばしば依存するであろう。ゆえに、ベクターは、自律的に複製するベクター、即ち、染色体外実体（extrachromosomal entity）として存在するベクターであって、その複製は染色体複製に依存しないベクターであることができ、このようなベクターの例は、プラスミド、ファージ、コスミド又はミニ染色体である。別法として、ベクターは、宿主細胞に導入されるとき、宿主細胞ゲノム中に組み込まれそしてベクターが導入されている染色体（１つ又は複数）と共に複製されるベクターであることができる。本発明の発現ベクターは、本発明のＤＮＡ配列のいずれかを有することができそして本発明のポリペプチドのいずれかの発現のために使用することができる。
【００２７】
本発明は、ポリヌクレオチド配列の１つ以上及び／又は本明細書に開示された発現ベクターの１つ以上を含有する培養された細胞又は宿主細胞も含む。本明細書で使用された、「培養された細胞」は、規定された条件下に増殖することができそして本発明のポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドの１つ以上を発現することができるいかなる細胞も含む。好ましくは、培養された細胞は、酵母、真菌、バクテリア又は藻類である。更に好ましくは、培養された細胞は、Escherichia coli、Saccharomyces serevisiae、Pichia pastoris、Aspergillus niger又はBacillus subtilisである。
【００２８】
他の態様では、本発明は、ウマの肝臓、Ａ．ｎｉｇｅｒ  ＡＴＣＣ９１４２、Ａ．ｎｉｇｅｒ  ａｗａｍｏｒｉ  ＡＴＣＣ３８８５４、又はＡ．ｎｉｇｅｒ  ＭａｃＲａｅ  ＡＴＣＣ４６９５１に由来するパントラクトンヒドロラーゼを提供する。
【００２９】
更に他の態様では、本発明は、パントラクトンヒドロラーゼであって、そのアミノ酸配列が、ウマの肝臓に由来する場合には配列番号２により示さるアミノ酸配列、Ａ．ｎｉｇｅｒ  ＭａｃＲａｅ  ＡＴＣＣ４６９５１に由来する場合には配列番号６により示されるアミノ酸配列、Ａ．ｎｉｇｅｒ  ＡＴＣＣ９１４２に由来する場合には配列番号８により示されるアミノ酸配列及びＡ．ｎｉｇｅｒ  ａｗａｍｏｒｉ  ＡＴＣＣ３８８５４に由来する場合には配列番号１０により示されるアミノ酸配列を含む、パントラクトンヒドロラーゼを提供する。
【００３０】
配列番号２により示されるようなウマの肝臓に由来するパントラクトンヒドロラーゼ及び配列番号４により示されるようなＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓに由来するパントラクトンヒドロラーゼは、Ｓ−パントラクトンヒドロラーゼ活性を示す。配列番号８により示されるようなＡ．ｎｉｇｅｒ  ＡＴＣＣ９１４２に由来するパントラクトンヒドロラーゼ、配列番号１０により示されるようなＡ．ｎｉｇｅｒ  ａｗａｍｏｒｉ  ＡＴＣＣ３８８５４に由来するパントラクトンヒドロラーゼ及び配列番号６により部分的に示されるようなＡ．ｎｉｇｅｒ  ＭａｃＲａｅ  ＡＴＣＣ４６９５１に由来するパントラクトンヒドロラーゼはＲ−パントラクトンヒドロラーゼ活性を示す。
【００３１】
更なる態様では、本発明は、上記アミノ酸配列の断片であって、完全タンパク質の酵素活性を有する断片を含む。
【００３２】
本発明に従う「アミノ酸配列の断片」は、タンパク質の正しい折りたたみのために必要でありうるアミノ酸のストレッチの欠乏した（depleted of stretches）配列として定義することができる。しかしながら、一旦タンパク質が折りたたまれると、アミノ酸ストレッチはそれぞれのタンパク質の機能を破壊することなく欠乏させる（depleted）ことができる。これらのストレッチは、ループとして折りたたまれたタンパク質中に存在することができ又は折りたたまれたタンパク質の活性のための直接関連のないＮ−若しくはＣ−末端であることができる。
【００３３】
更に、本発明は、該Ｒ−及びＳ−パントラクトンヒドロラーゼの酵素活性を含むタンパク質の誘導体を包含する。該誘導体は、酵素が膜装置、例えば、中空繊維、ポリマーネットワーク又はマイクロカプセル内に保持されている、固定化された酵素、例えば包含すること（inclusion)により固定化された酵素を含む。酵素は、架橋又は酵素の結晶の発生により固定化することもできる。酵素を固定化するための更なる可能性は、成長しているポリマー、例えば、シリカゾルゲル若しくはシリカグラファイトゾルゲルへのその連結であるか又は前もって製造された担体、例えばＥｕｐｅｒｇｉｔＣ、Ｅｕｐｅｒｇｉｔ２５０Ｌ、ＰＥＧ、セライト（Celite）及びＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＸＡＤ−７に酵素を結合させることによる。本発明のＲ−及びＳ−パントラクトンヒドロラーゼに適用可能な酵素の固定化のための更なる技術は、水に非混和性有機溶媒にそれらを分散させることである。一般に、酵素的に活性なタンパク質、例えば、本発明の酵素は、当該技術分野で知られている固定化技術の殆どすべてにより固定化することができる。
【００３４】
本発明の更に他の態様では、本発明は、Ｒ−パントテン酸及びＲ−パントテノールの製造のための前駆体であるパントラクトンのＲ−エナンチオマーの工業的製造において適用可能なＲ−若しくはＳ−パントラクトンの選択的加水分解のための単離されたパントラクトンヒドロラーゼの使用に関する。
【００３５】
ゆえに、本発明の目的は、本明細書に記載された単離されたパントラクトンヒドロラーゼを使用してＲ−若しくはＳ−パントラクトンを選択的に加水分解する方法（process or method）を提供することである。
【００３６】
他の態様では、本発明は、本発明のパントラクトンヒドロラーゼの存在下にＲ−若しくはＳ−パントラクトンの選択的加水分解の工程を含むＲ−パントテン酸若しくはその塩又はＲ−パンテノールの製造方法を提供する。
【００３７】
更なる態様では、本発明は、既知の配列に直接隣接したヌクレオチド配列、例えば、新規なパントラクトンヒドロラーゼ又はその一部をコードするヌクレオチド配列のクローニングのための方法を提供する。
【００３８】
特に、本発明は、未知の配列の増幅を可能とする新規なＰＣＲストラテジーを含む。新規なＰＣＲストラテジーは、第１ＤＮＡ鎖及び第２ＤＮＡ鎖の両方の合成のための１つのプライマーの使用を含む。プライマーは、増幅されるべきｇＤＮＡの既知の区域にハイブリダイゼーションする。このプライマーは、この既知の配列に対して１００%相同性を示す。このプライマーの助けにより、第１ＰＣＲを行って、未知の配列に到達するゲノムＤＮＡの第１一本鎖コピーを得る。テンプレートとして第１ＰＣＲ反応の小アリクォートを使用し、第１ＰＣＲで使用されたプライマー（「ネステッド」）の３’方向に位置しているがしかし論理的にはまだ配列の既知の部分に位置したＤＮＡ断片にハイブリダイゼーションするプライマーを使用して、第２ＰＣＲを行う。第１ポリメラーゼ反応で産生された一本鎖ＤＮＡにこのネステッドプライマーをランダムハイブリダイゼーションさせた後、この一本鎖ＤＮＡの対向鎖（opposite strand）を発生させ、これは、それ自体、次いで第２鎖を産生する第２ＰＣＲのために使用されたのと同じプライマーのためのテンプレートとして役立つ。最後に、既知の配列の内側で始まりそして未知の隣接ゲノムＤＮＡ又は配列の一部が見つからないいかなる他の配列内に進むＤＮＡ断片を、その新規な断片の両端部でハイブリダイゼーションする１つのプライマーにより発生させる。
【００３９】
故に、他の態様では、本発明は、既知の配列に直接隣接したヌクレオチド配列のクローニングのための方法であって、
ａ）第１ＰＣＲで産生された一本鎖ＤＮＡにランダムにハイブリダイゼーションする第２ＰＣＲにおけるプライマーを使用し、第２ＰＣＲのためのテンプレートとして第１ＰＣＲの一本鎖ＤＮＡを使用すること；及び
ｂ）それにより、やはり工程ａ）のランダムにハイブリダイゼーションするプライマーを使用して第２鎖のためのテンプレートとしてそれ自体役立つ対向鎖を発生させること、
を含むＰＣＲ増幅を含む方法を提供する。
【００４０】
下記の実施例は、パントラクトンヒドロラーゼをコードする遺伝子の同定、特徴付け及び発現の詳しい説明を与える。これらの実施例は、本発明を説明するものであって、決して本発明の範囲を限定することを意図しない。
【００４１】
実施例１：商業的に入手可能なウマ肝臓エステラーゼアセトン粉末からの（Ｓ）−パントラクトン加水分解活性の精製
ウマ肝臓エステラーゼアセトン粉末（Fluka Holding AG, Industriestrasse 25, P.O.Box260, CH-9471 Buchs, Switzerland）１gを、２Ｍ硫酸アンモニウム、１mM  ＣａＣｌ2、１mM  ＭｇＣｌ2及び１０μM  ＥＤＴＡ（緩衝液Ａ）を含有する４０mlの５０mMトリス／ＨＣｌ、pH７．５に溶解させた。溶解しなかった物質を遠心及びその後、０．４５μMフィルターを通す無菌ろ過により分離した。タンパク質溶液を、緩衝液Ａと平衡化させたブチルセファロースカラムＨＲ２６／１０（Amersham Pharmacia Biotech Europe GmbH, Deubendorf, Switzerland）に適用した。カラムを緩衝液Ａ１００mlで洗浄した。この後、４００mlの線状勾配０〜１００%緩衝液Ｂ（硫酸アンモニウムなしの緩衝液Ａ）を適用した。ラクトナーゼはこの勾配の中央で溶離した。パントラクトン加水分解活性を示す画分をプールし、緩衝液を２０mMトリス／ＨＣｌ、pH８．０、１mM  ＣａＣｌ2、１mM  ＭｇＣｌ2及び１０μM  ＥＤＴＡに交換した。プールした画分を、０〜３５０mM  ＮａＣｌからの線状勾配を使用して、ＭｏｎｏＱを予め充填したカラムＨＲ２６／１０（Amersham Pharmacia Biotech Europe GmbH, Deubendorf, Switzerland）に適用した。タンパク質は勾配の始めに溶離した。再び活性画分をプールし、１mlに濃縮しそしてＳＵｐｅｒｄｅｘ２００カラム（Amersham Pharmacia Biotech Europe GmbH, Deubendorf, Switzerland）に適用した。溶離緩衝液として５０mM  トリス／ＨＣｌ、pH８．０、１mM  ＣａＣｌ2、１mM  ＭｇＣｌ2及び１０μM  ＥＤＴＡを使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより示されたサイズと一致している約３１kDaの分子サイズを示す最後のピークとしてラクトナーゼが溶離した。
【００４２】
見出された最も高い特異的活性は、２００mM  トリス／酢酸塩緩衝液、pH９．０、５mM  ＭｇＣｌ2中で３７℃で６０分間酵素をインキュベーションすることにより決定された１３．３U/（mgタンパク質）であった。（Ｓ）−及び（Ｒ）−パントラクトンの濃度をＨＰＬＣにより決定した。
【００４３】
実施例２：ウマ肝臓からの（Ｓ）−パントラクトン加水分解酵素の予備特徴付け
（ａ）分子サイズ、構造及び等電点：
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによれば、変性されたタンパク質は、約３５kDaの分子量を有する。較正されたゲルろ過カラムの溶離時間を使用して、ネイティブタンパク質の分子量は約３１kDaであることが計算された。これは、ウマ肝臓からのラクトナーゼは３０〜３５kDaのモノマーであることを意味する。２Ｄゲルを使用して、等電点はpH５．５の範囲にあることが決定された。
【００４４】
（ｂ）Ｎ−末端及び内部アミノ酸配列決定：
２Ｄゲル電気泳動後の濃縮されたタンパク質をトリプシンにより消化した。発生したペプチドを質量分光法により分析した。ペプチドＮｏ．６６のＮ−末端配列は配列番号１１として示される。
【００４５】
ＭＳスペクトルと合わせてこの配列は、タンパク質が、脊椎動物において主として見出されている老化マーカータンパク質−３０又はレグカルシンとして知られたタンパク質のクラスに属することを示した。ラット、マウス、ヒト、ニワトリ、ウサギ、ウシ、アフリカツメガエル（Xenopus laevis）からのレグカルシン配列及び、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）からの２つのより少なく相同性の配列は既に決定されている。しかしながら、ウマからの遺伝子は単離されておらずそしてまだ配列決定されていない。
【００４６】
（ｃ）金属依存性
ウマ肝臓酵素のパントラクトナーゼ活性に対する種々の二価金属イオンの効果を試験するために、１．３、２．６、５．２若しくは１０．４mMのＣａ2+、Ｍｇ2+又はＭｎ2+
を２００mMトリス／酢酸塩、pH9.０及び５０mM（Ｒ，Ｓ）−パントラクトンからなる反応混合物に加えた。反応混合物を３７℃で６０分間インキュベーションしそして２mM  ＥＤＴＡを含有する等しい容積のメタノールで停止させた。（Ｓ）−パントラクトンの減少をＨＰＬＣにより決定した。カルシウムは酵素活性を減少させたが、マグネシウム及びマンガンは酵素の活性を増加させた。
【００４７】
（ｄ）熱安定性
精製した酵素を５．２mM  ＭｇＣｌ2及び２００mMトリス／酢酸塩、pH９．０中で３０〜８０℃の温度で１５分間インキュベーションした。氷上で３０分の後、標準アッセイ（６０分、３７℃）により活性を決定した。酵素は６０℃まで安定であった。それは６５℃で不活性化し始めそして７０℃でその活性の５０%より多くを失った。
【００４８】
実施例３：ウマ肝臓からの（ｓ）−パントラクトナーゼのクローニング
すべての既知の哺乳動物遺伝子（下記参照）からの配列情報を使用して、Roche Molecular Biochemicals, Penzberg, Germanyによりここ快く提供された、Bavariaからの１年齢「Haflinger」からのウマ肝臓から作られたｃＤＮＡに対するＰＣＲのためのプライマーをデザインした。QIAGEN RNeasy Max Kit（Qiagen, Hilden, Germany）を使用して肝臓組織からトータルＲＮＡを調製した。
【００４９】
レグカルシンファミリーの他のメンバーに対するウマ肝臓ラクトナーゼの相同性は表１に示される。標準パラメーターによるＧＣＧプログラムパッケージのプログラムＧＡＰを使用して決定を行った。類似性についての数は表の対角線右側に示され、同一性についての数は対角線の左側にある。
【００５０】
【表１】
0004571936.tif 000002
【００５１】
Titan One Tube RT-PCR Kit（Roche Molecular Biochemicals, Penzberg, Germany）、並びに開始コドン及び停止コドンから上流の配列５０bpを包含する相同性プライマーを使用してＲＴ−ＰＣＲにより、８８５bp断片（配列番号１のヌクレオチド１〜８８５）を増幅させた。反応を供給者により推奨されたとおりに行った。
【００５２】
ウシに由来するＮ−末端配列（配列番号１４）、ウサギに由来するＮ−末端配列（配列番号１５）、ヒトに由来するＮ−末端配列（配列番号１６）、ラットに由来するＮ−末端配列（配列番号１７）、マウスに由来するＮ−末端配列（配列番号１８）、ニワトリに由来するＮ−末端配列（配列番号１９）及びＸｅｎｏｐｕｓに由来するＮ−末端配列（配列番号２０）並びにウシに由来するＣ−末端配列（配列番号２１）、ウサギに由来するＣ−末端配列（配列番号２２）、ヒトに由来するＣ−末端配列（配列番号２３）、ラットに由来するＣ−末端配列（配列番号２４）、マウスに由来するＣ−末端配列（配列番号２５）、ニワトリに由来するＣ−末端配列（配列番号２６）及びＸｅｎｏｐｕｓに由来するＣ−末端配列（配列番号２７）に基づく第１ＰＣＲのためのＮ−末端５’−プライマー（配列番号１２）及びＣ−末端３’−プライマー（３’−ＣＡＧＴＴＴＣＣＴＴＡＡＧＧＧＧＧＧＡＴＡ−５’）（配列番号１３）の構築。
【００５３】
断片をＴＡクローニングベクター（Invitrogen, Carlsberg, CA, USA）にクローニングした。配列決定は、それがウマ肝臓レグカルシンに由来することを証明した。見つからない５’−端部（missing 5'-end）を、Roche Molecular Biochemicals, Penzberg, Germanyにより供給されたそれぞれのキットを使用する５’／３’ＲＡＣＥと呼ばれる方法により単離した：完全にマッチングするプライマー（配列番号２８）を使用して単離されたウマ肝臓ｃＤＮＡに対する一本鎖ＤＮＡを産生した。一本鎖ＤＮＡを精製し、ポリＣテイルを付加しそして第１プライマーのネステッドプライマー５’及びポリＧプライマーを使用して他のＰＣＲを行った。遺伝子の見つからない５’−端部を表すＤＮＡ断片を増幅した。既知の配列に従って作られたフォーワードプライマー（配列番号２９）並びに主としてウシ及びウサギ遺伝子に従ってデザインされた遺伝子の最後のアミノ酸で出発する１つのプライマー（配列番号３０）を使用して３’−端部をクローニングした。最後のＰＣＲにおいて、遺伝子の開始コドン及び停止コドンを含む５’−及び３’−プライマーのデザインのための得られた配列情報を使用して、ラクトナーゼの全ｃＤＮＡを上記したトータルＲＮＡから単離した。ｃＤＮＡ及びアミノ酸配列は、配列番号１及び配列番号２に示される。遺伝子は９００bp／２９９アミノ酸からなる。
【００５４】
完全遺伝子を、ＱｉａｇｅｎからのｐＱＥ６０のような商業的に入手可能な発現ベクターの１つを使用してＨｉｓ−タグにＣ−末端で融合されたＥ．ｃｏｌｉで発現させた。標準プロトコールに従うＨｉｓ−タグ付きタンパク質の発現及び精製は、（Ｓ）−パントラクトナーゼ活性を示した３３kDaのタンパク質を生じさせた。
【００５５】
実施例４：Ａ．ｎｉｇｅｒ  リパーゼＡの商業的粗調製物からの（Ｒ）−パントラクトン加水分解活性の精製
（Ｒ）−パントラクトンを特異的に加水分解する活性を、Ａ．ｎｉｇｅｒ発酵に由来する種々の商業的に入手可能な酵素製品において同定した。それぞれの酵素を精製するために、Amano Pharmaceuticala Co.Ltd., Nagoya, JapanからのLipase A “Amano”と呼ばれる商業的調製物を使用した。ラクトナーゼ活性と共に共精製された２つの酵素から得られた配列データに従えば、調製物は、A.tubigensisからのリパーゼを過発現するＡ．ａｗａｍｏｒｉの凍結乾燥されそして破壊された（broken）細胞（発酵ブロスを含む）を表すと思われる。この物質を、２０mMトリス／ＨＣｌ、pH７．５、２．５mM  ＭｇＣｌ2（標準緩衝液）に溶解した。５%エタノールを加えてこの物質の溶解度を増加させた。溶液にならなかった物質を、遠心（３０分、１５０００rpm、４℃）により分離し、続いて０．４５μmフィルターを通してろ過した。溶解した部分を、最初にＡｍｉｃｏｎセル（５０kDaカットオフ）における限外ろ過により精製して、次のアニオン交換クロマトグラフィー段階を妨害することがありうるいかなる塩及び小さな分子サイズを有する化合物も除去した。次いで、タンパク質を、ＨＲ２６／１０を予備充填したＱ−セファロースカラム（Amersham Pharmacia Biotech Europe GmbH, Deubendorf, Switzerland）に適用した。カラムを２００mM標準緩衝液で洗浄し、次いでタンパク質を０〜３５０mM  ＮａＣｌの線状勾配（４００ml）により溶離した。活性を含有する画分をプールした。硫酸アンモニウムを加えて１．５Mの最終濃度とし、そのように処理したタンパク質溶液を、ＨＲ２６／１０ブチルセファロースを予備充填したカラム（Amersham Pharmacia Biotech Europe GmbH, Deubendorf, Switzerland）に適用した。１．５M硫酸アンモニウムを含有する標準緩衝液で２００mlの洗浄の後、タンパク質を、１．５〜０の減少していく硫酸アンモニウム勾配（４００ml）により分離した。ここで、活性を２つのピークにおいて溶離し、これらを別々にプールした。両プールの容積を２ml未満に減少させた。２つの濃縮物を標準緩衝液を使用するＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムでのゲルろ過により分離した。各分離の活性画分をプールしそして濃縮した。プールＩＩの活性はプールＩの活性よりも僅かに早く溶離する傾向があったが、これは対応するタンパク質の分子量が僅かにより高いことがありうることを示している。
【００５６】
８０U/ml（４０℃）は、それぞれプールＩ及びプールＩＩについて決定された最も高い活性であった。２Ｄゲルで示されたとおり、タンパク質調製物は完全に均一ではなく、これは真の特異的活性はより高くすらあることを意味する。しかしながら、ラクトナーゼ活性は、最終調製物の主たるタンパク質でもあるゲルろ過の溶離プロフィルにおける３８kDaのタンパク質バンドに相当するので、このバンドがラクトナーゼを表していることは最も確からしい。ゲルろ過に従えば、ネイティブラクトナーゼは７５kDaの分子質量を有する。これは酵素のホモ二量体構造を示唆する。
【００５７】
実施例５：（Ｒ）−パントラクトン加水分解酵素の予備特徴付け
（ａ）ネイティブ形態の構造及び分子量
実施例４に記載の条件を使用して７２mlのＳｕｐｅｒｄｅｘ２００（Amersham Pharmacia Biotech Europe GmbH, Deubendorf, Switzerland）で酵素を溶離した。標準曲線から推定されるとうり、これは７５kDaの分子質量を反映している。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは３８kDaの分子質量を示した。データの組み合わせは、Ａ．ｎｉｇｅｒからの（Ｒ）−パントラクトナーゼが、３８kDaの２つの同一サブユニットからなるホモ二量体であることを示唆した。
【００５８】
（ｂ）熱安定性
５０μlの希釈された酵素（０．１Ｕ）を、２０mMトリス／ＨＣｌ、pH７．５中で０、３０、４０、５０、５５、６０、７０℃で１時間インキュベーションした。氷上で１５分の後、標準アッセイを使用して残留活性を決定した。酵素は５０℃までは安定であった。より高い温度では、それはその活性を失い始めた。
【００５９】
（ｃ）最適温度
商業的ソースからの濃く濃縮した（Ｒ）−パントラクトナーゼ（実施例５参照）を、下記の条件下に２０、３０、４０、５０、５５及び６０℃で３０分間インキュベーションした：
１００mM（Ｒ，Ｓ）−パントラクトン、
１００mM  ＭｇＣｌ2
２００mM  トリス／ＨＣｌ、pH８．０
１００μl最終容積中の０．０５Ｕ（Ｒ）−パントラクトナーゼ。
【００６０】
市販のＡ．ｎｉｇｅｒｔ調製物からの（Ｒ）−パントラクトナーゼの最適温度は使用した条件下に５０℃付近であった。
【００６１】
（ｄ）補因子依存及び抑制
Ａ．ｎｉｇｅｒからの（Ｒ）−パントラクトナーゼは、その活性のためにＭｇ2+又はＭｎ2+イオンを必要とする。それは１mM  ＥＤＴＡの添加により完全に抑制された。
【００６２】
（ｅ）最適pH
酵素は、pHが７．０から１１．０まで変わるとき、「正常な」pH活性プロフィルを示さなかった。０．１%Ｓｐａｎ８０及び酢酸マグネシウム２０mMを含有する２００mM  ＴＥＡ−酢酸塩緩衝液（pH７．０〜１１）中のアミノリパーゼＡ１０mgを４０℃で２０分間インキュベーションした。サンプルを、５０mM  ＥＤＴＡを含有する等容積の５００mM  ＭＥＳ緩衝液、pH５．５でクエンチし、遠心し（１０，０００g、１０分）、次いで、７０：３０水−メタノール、１ml／分、２０℃で溶離した０．４６×１５cmＣＨＩＲＡＤＥＸカラムを使用するＨＰＬＣにより分析した。最も高い活性はpH１０付近で達成された。それからpH１１．０まで、活性はあまり変化しなかった。最も高い選択性はpH９．０付近で達成された。
【００６３】
実施例６：Ａ．ｎｉｇｅｒ  ＡＴＣＣ９１４２、９０２９、２６８７５、６２８６３及び１０８６４の培養及びその（Ｒ）−パントラクトナーゼ活性の評価
見出されたラクトナーゼ活性がAspergillus属に広範囲に広まっているかどうかを見出すために、５つのＡ．ｎｉｇｅｒ株を下記の条件下に培養した：
培地（量／リットル）：１．２３gＮａＮＯ3、０．５gＫＨ2ＰＯ4、０．２gＭｇＳＯ4ｘ７Ｈ2Ｏ、０．５g酵母抽出物、５%グルコース及びVishniac and Santer, Bacteriol.Rev.21: 195-213(1957）により記載された微量金属溶液０．０４ml。
【００６４】
５×１０6個の胞子／mlを使用して１ｌのフラスコ中で３０℃で予備培養物（pre-culture）３００mlを接種した。８時間後、予備培養物を、pH及び溶解酸素を制御して２ｌの発酵器中で培地１．７ｌに加えた。５Ｍ  ＮａＯＨの自動添加によりpH５．５でpHを一定に保った。細胞を少ない通気（５〜１０%空気飽和）下に１４時間細胞を増殖させた。その後溶解した酸素のレベルを３０〜５０%空気飽和に増加させた。５時間後、菌糸体を回収し、ろ過し、脱イオン水で２回洗浄しそして液体窒素中に凍結した。その一部をFrench Pressを使用することにより砕いた。培地及び細胞溶解物を標準アッセイを使用してパントラクトナーゼ活性を調べた。
【００６５】
（Ｒ）−パントラクトナーゼ活性は、試験されたすべてのＡ．ｎｉｇｅｒの溶解物中に主として見出された。培地中には非常に小さい活性しか見出されなかった。
【００６６】
実施例７：リパーゼ調製物からの濃縮した（Ｒ）−パントラクトナーゼのトリプシン消化により発生した小さなペプチドのアミノ酸配列の決定
実施例５の濃縮した調製物を２Ｄゲルで分析した。それぞれ、３３及び４０kDaの２つの主要スポット並びに４．７及び５．６のｐＩがトリプシンで消化された。発生したペプチドを、ＨＰＬＣ（機器：Hewlett Packard 1090, Column: Vydac C18（０．２１×２５cm）、２１０nmでの吸光度、流量：０．２０ml／分、緩衝液Ａ：０．０７５%ＴＦＡ、緩衝液Ｂ：８０%アセトニトリル中の０．０６５%ＴＦＡ、勾配：２%Ｂ（０〜１０分）、２〜７５%Ｂ（１０〜１２０分）により分離した。ペプチドの選択は、エドマン分解により配列決定された、スポットＣ［ｐＩ５．６、３９kDa（Ｐｏｌｌ  Ｃ）］：Ｆｘｎ４２（ペプチド１）（配列番号８１）、Ｆｘｎ５７（ペプチド３）（配列番号８２）、Ｆｘ３（ペプチド２）（配列番号８３）、Ｆｘ７４（配列番号８４）及びＦｘ８１（配列番号８５）、スポットＣ［ｐＩ４．７、３３kDa（ＰｏｌｌＡ／Ｂ］：Ｎ−末端（配列番号８６）、Ｆｘ５８（配列番号８７）、Ｆｘ６４（配列番号８８）、Ｆｘ６５（配列番号８９）、Ｆｘ７３（配列番号９０）及びＦｘ６８（配列番号９１）。Ｘは定義されていないアミノ酸を表し、括弧内のアミノ酸は明確に決定することができなかったアミノ酸である。
【００６７】
標的としてすべての短いペプチド配列を使用するデータベースサーチは、2つの主要なスポットのどれがラクトナーゼを表すかを同定するのを助けることができる信頼性のある情報をもたらさなかった。故に、我々は、他のアニオン交換クロマトグラフィーにより更に実施例５のラクトナーゼ調製物を濃縮した。タンパク質溶液（２０mMトリス／ＨＣｌ、pH７．５、２．５mMＭｇＣｌ2中の）を予備充填されたＭｏｎｏＱカラムＨＲ１６／１０（Amersham Pharmacia Biotech Europe GmbH, Deubendorf, Switzerland）で、０〜３５０mM  ＮａＣｌ勾配において分離した。すべての画分の活性を決定した。活性画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び供給者（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）により記載されたとおりに行った等電点フォーカシングにより分析した。画分の活性データをＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＩＥＦのゲルと比較すると、ラクトナーゼは３８〜４０kDaのタンパク質でありそしてそれはpH５．６付近のｐＩを有することが示唆された。このデータは、スポットＰｏｌｌＣに非常によく対応している。故に、このスポットのアミノ酸配列を、ＰＣＲプライマー及びサザンブロットのためのオリゴヌクレオチドをデザインするために使用した。最も活性な画分をプールしそして再び２Ｄゲルで分析すると、ＰｏｌｌＣは、先の２Ｄゲルと比べてＰｏｌｌＡ／Ｂを超えて明らかに富んでいることが示された。
【００６８】
実施例８：サザンブロットのための縮重したオリゴヌクレオチド（degenerated oligonucleotides）及びＡ．ｎｉｇｅｒからの（Ｒ）−パントラクトナーゼのクローニングのためのＰＣＲプライマーのデザイン
異なるAspergillus種からの１２の異なるフィターゼ配列を使用するＧＣＧプログラムパッケージバージョン１０．２からのプログラムＣＯＤＯＮＦＲＥＱＵＥＮＣＹにより作られたAspergillusのコドン使用頻度（codon usage）を使用して、遺伝子コードの縮重のため可能な異なるＤＮＡ配列組み合わせの数を減少させた。プライマーの３’端部においてすべての可能な組み合わせが実現されたが、いくらかのまれなコドンは決定的因子としてAspergillusコドン使用頻度を使用してプライマーの５’端部において省かれた。ハイブリダイゼーション実験を意図したオリゴヌクレオチドの場合には、３’−及び５’−端部を同じ方法で処理した。その名前が「Ｓ（センス）」又は「ＡＳ（アンチセンス）」を含むオリゴヌクレオチドをＰＣＲのために使用した。その名前がＳ又はＡＳを含まないオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション実験で使用することを意図した。
【００６９】
Ａ．ｎｉｇｅｒからの（Ｒ）−パントラクトナーゼのクローニングのために使用されるオリゴヌクレオチドは、Ｆｘｎ４２（配列番号３１）、Ｆｘｎ４２Ｓ（配列番号３２）、Ｆｘｎ４２ＡＳ（配列番号３３）、Ｆｘｎ５７（配列番号３４）、Ｆｘｎ５７Ｓ（配列番号３５）、Ｆｘｎ５７ＡＳ（配列番号３６）、Ｆｘ７３（配列番号３７）、Ｆｘ７３Ｓ（配列番号３８）、Ｆｘ７３ＡＳ（配列番号３９）、ＦＸ７４（配列番号４０）、Ｆｘ７４Ｓ（配列番号４１）及びＦｘ７４ＡＳ（配列番号４２）である。
【００７０】
実施例9：Ａ．ｎｉｇｅｒ  ＡＴＣＣ９１４２、Ａ．ｎｉｇｅｒＮＲＲＬ３１３５、Ａ．ｎｉｇｅｒ  ｓｓｐ．ａｗａｍｏｒｉ（ＡＴＣＣ３８８５４）及びＡ．ｎｉｇｅｒ  ＭａｃＲａｅ（ＡＴＣＣ４６９５１）からのゲノムＤＮＡの単離
ＹＰＤ培地［Sherman et al., Laboratory course manual for methods in yeast genetics, Cold Spring Harbor laboratory、Cold Spring Harbor, New York(1986)］３００mlに、１×１０6個の胞子／mlを接種した。培養物を激しい振とう（２００rpm）下に３０℃で一夜培養した。菌糸体をワットマンろ紙によるろ過により集め、ＰＢＳ（等張性リン酸塩緩衝液）で洗浄しそして液体窒素中で凍結させた。菌糸体を粉砕して氷冷乳針中で微細な粉末とした。粉末を、１／３容積の５０mMトリス／ＨＣｌ、pH８．０、１．０%ＳＤＳ、５０mM  ＥＤＴＡ中に再懸濁させそして頻繁に反転させながら６５℃で１５分間インキュベーションした。溶液を５０℃に冷却した。Proteinase K（１００μg／ml最終濃度）を加えた。溶液を５０℃で１時間インキュベーションした。更に１００mg/mlプロテイナーゼＫを加えそして更に３時間インキュベーションを続けた。１／３容積のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（５０／４９／１）を加えた。完全なしかし穏やかな混合の後、エマルションを遠心した（１２０００g、２０分、４℃）。水性相を除去しそして再び抽出した。更なる遠心段階（１２０００g、１０分、４℃）の後、水性相をクロロホルムで抽出した。０．７容積のイソプロパノールを水性相に加えそして溶液を１５分間穏やかに混合した。沈殿したＤＮＡを遠心（１００００g、３０分、４℃）により集めた。１／１０容積の３Ｍ  ＫＣｌ、pH５．２を残りの上澄液に加えそして穏やかな振とう下に１５分間インキュベーションした。更なる遠心段階の後、２つのペレットを７０%エタノールで２回洗浄し、空気上で乾燥し、そして水０．５mlに溶解した。最後に、ＤＮＡをＲＮアーゼで処理して残留ＲＮＡを除去した。
【００７１】
実施例１０：Ａ．ｎｉｇｅｒ  ＡＴＣＣ９１４２からの（Ｒ）−パントラクトナーゼのクローニング
Ａ．ｎｉｇｅｒ  ＡＴＣＣ９１４２のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を実施例６に記載のようにして製造した。ＰＣＲ機械としてStratagene (Stratagene、La Jolla, CA, USA)からのRobocycler Infinity及びRoche Molecular Biochemicals (Penzberg, Germany）からのTAQ polymerase KitをＰＣＲｓのために使用した：
ｇＤＮＡ（１／１０希釈した）１μl                      段階１：５分−９５℃
ヌクレオチド混合物１μl                                段階２：３０秒−９５℃
Ｍｇ2+を有するＰＣＲ標準緩衝液５μl                    段階３：３０秒−５０℃
プライマーＳ（１００pM／μl）１μl                    段階４：１分−７２℃
プライマーＡＳ（１００pM／μl）１μl
Roche Molecular BiochemicalsからのＴＡＱポリメラーゼ１μl
Ｈ2Ｏ４０μl
段階２〜４を３５回繰り返した。
【００７２】
【表２】
0004571936.tif 000003
【００７３】
すべてのプライマーを、自己プライミングについてチェックした。Ｆｘｎ５７ＡＳは、相当な量の３００〜３２０bpの付近の自己プライミング産物を発生した唯一のプライマーであった。５５℃のハイブリダイゼーション温度を使用して、ＰＣＲｓ５、６、８，１０及び１１は、依然として１つ以上の産物を生じさせた。６０℃、３０秒の増幅及び30サイクルでは、ＰＣＲｓ５、６，８、１０及び１１は、依然として１つ以上のＰＣＲ産物を発生させ、これらはより低いハイブリダイゼーション温度で産生された産物に相当する。
【００７４】
ＰＣＲ反応１２の弱い８４０bp産物をＱｕｉａｇｅｎ（Qiagen, Hilden, Germany）からのＱＩＡＥＸＩＩゲル抽出キットを使用してアガロースゲルから単離しそしてＨ2Ｏ４０μlに溶解した。
８４０bp断片（１／１０に希釈した）１μl      段階１：５分−９５℃
ヌクレオチド混合物１μl                      段階２：３０秒−９５℃
Ｍｇ2+を有するＰＣＲ標準緩衝液５μl           段階３：３０秒−５５℃
プライマーＳ１０pMol/μl）１μl              段階４：３０秒−７２℃
プライマーＡＳ１０pMol/μl）１μl
Roche Molecular BiochemicalsからのＴＡＱポリメラーゼ１μl
Ｈ2Ｏ４０μl
段階２〜４を３０回繰り返した。
【００７５】
反応２，５，１０、１１及び１３５のプライマー組み合わせを使用した。反応２の他に、すべての他の反応はＰＣＲ産物をもたらした。これは、プライマー４２Ｓ／ＡＳ、５７Ｓ／ＡＳ、７３Ｓ／ＡＳ及び７４Ｓ／ＡＳの配列が８４０bp断片の一部であることを意味する。これらの４つのプライマーのきわめて近いことは、８４０bp断片が問題のラクトナーゼ遺伝子の一部であることを強く示している。この推測は、配列決定により支持された。ペプチドＦｘ５７（配列番号９０）のアミノ酸配列は８４０bp断片において確かめられたが、ペプチドＦｘｎ４２（配列番号４５）の配列は部分的にしか確かめられなかった。
【００７６】
Ａ．ｎｉｇｅｒ  ＭａｃＲａｅの対応するＤＮＡ断片を単離することも可能であった。Ａ．ａｗａｍｏｒｉの場合には、プライマーＦｘｎ５７Ｓ及びＦｘ７３ＡＳの産物のみをこのアプローチにより単離することができた。これらのＡｓｐｅｒｇｉｌｌｉの配列は、Ａ．ｎｉｇｅｒ  ＡＴＣＣ９１４２の配列に対するＤＮＡレベルでのほぼ９０%同一性を有する。
【００７７】
ラクトナーゼ遺伝子の５’−及び３’−端部を単離するために、下記のアプローチを使用した：
（ａ）３’−端部の単離
Ａ．ｎｉｇｅｒ  ＡＴＣＣ９１４２のｇＤＮＡ  １μl    段階１：５分−９５℃
ヌクレオチド混合物１μl                              段階２：３０秒−９５℃
Ｍｇ2+を有するＰＣＲ標準緩衝液５μl                   段階３：３０秒−５５℃  
プライマーＯａｌ２ＡＳ又はＯａｌ３Ｓ                 段階４：３０秒−７２℃
（１０pMol/μl）１μl
Roche Molecular BiochemicalsからのＴＡＱポリメラーゼ１μl
Ｈ2Ｏ４０μl
段階2〜4を３０回繰り返した。
【００７８】
ＰＣＲ混合物を等容積のフェノール／クロロホルムで２回及びクロロホルムのみで１回抽出した。次いで、１／１０容積の３M酢酸カリウム、pH５．３２及び２容積のエタノールを加えることによりＤＮＡを沈殿させた。１５分の遠心（Eppendorf テーブル遠心機において１４０００rpm）の後、ペレットを７０%エタノールで洗浄し、空気乾燥しそして最後に無菌水２０μlに溶解した。
第２ＰＣＲ
第１ＰＣＲからのＤＮＡ４μl                          段階１：５分−９５℃
ヌクレオチド混合物１μl                              段階２：３０秒−９５℃
Ｍｇ2+を有するＰＣＲ標準緩衝液５μl                   段階３：３０秒−５８℃
プライマーＯａｌ４ＡＳ又はＯａｌ１ＡＳ               段階４：１分−７２℃
（１０pMol/μl）１μl
Roche Molecular Biochemicalsからの
High Fidelity  Ｍｉｘ  １μl
Ｈ2Ｏ  ３８μl
段階２〜４を３５回繰り返した。
【００７９】
Ｏａｌ４Ｓプライマーを使用して、９００bpのＤＮＡ分子を発生させた。配列決定は、それが遺伝子の３’−端部をコードすることを示した。
【００８０】
（ｂ）５’−端部の単離：
プローブとしてＤＩＧ標識されたオリゴヌクレオチドＦｘｎ４２、Ｆｘｎ５７、Ｆｘ７３及びＦｘ７４並びにＸ線フイルムでの化学発光検出（chemiluminescent detection）を伴うＤＩＧシステム（Roche Molecular Biochemicals）を使用して、Ａ．ｎｉｇｅｒ  ＡＴＣＣ９１４２のゲノムＤＮＡに関してハイブリダイゼーション実験を行った。ハイブリダイゼーション及び検出は供給者により推奨されるとおりに行われた。
【００８１】
ゲノムＤＮＡ１０μgを、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｃＩ及びＸｈｏＩにより消化した。Roche Molecular Biochemicalsハイブリダイゼーション溶液を使用して４２℃で一夜ハイブリダイゼーションを行った。２ｘＳＳＣ、０．１%ＳＤＳにおいて室温で２回洗浄段階の後、０．５ｘＳＳＣ、０．１%ＳＤＳにおいて５０℃で２回の洗浄を行った。アルカリホスファターゼの基質としてＣＳＰＤ（２−クロロ−５−（４−メトキシスピロ{１，２−ジオキセタン−３，２’−（５’−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン}−４−イル）−１−フェニルリン酸二ナトリウム）による検出処理の後、Ｘ線フイルムをフィルターに１時間（室温）露光した。フイルムに対する使用可能なシグナルがなかつた。
【００８２】
ゆえに、反応５及び１１のランダムプライムドＤＩＧ標識されたＰＣＲ産物（実施例１１参照）をプローブとして使用した。ハイブリダイゼーションを同じ方法で行い、ちょうど洗浄条件は、室温で２×５分及び５５℃で２×１５分にわずかに変化させた。下記のバンドがフイルムに現れた。
【００８３】
【表３】
0004571936.tif 000004
【００８４】
全体の遺伝子又は少なくともその欠けている５’−端部をクローニングするために、Ａ．ｎｉｇｅｒ  ＡＴＣＣ９１４２の染色体ＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、これによりハイブリダイゼーション実験に従うラクトナーゼ遺伝子を含有する約４ｋｂ断片を発生させる：
染色体ＤＮＡ  ２０μl
１０×緩衝液２０μl
ＨｉｎｄＩＩＩ（１０U/μl）５μl
Ｈ2Ｏ  １７５μl
３７℃で１６時間インキュベーション
【００８５】
消化されたＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ（Qiagen, Hilden, Germany）からのＰＣＲ精製キットにより精製しそして１００μl中で溶離した。下記のライゲーションを１６℃で一夜行った。精製されたＤＮＡを水で２mlに希釈した。リガーゼ及びリガーゼ緩衝液を製造者（Roche Molecular Biochemicals）の推奨に従って加えた。完了したライゲーションを、部分的に単離されたラクトナーゼ遺伝子の内部プライマーを使用する異なるＰＣＲｓのためのテンプレートとして使用した。
ライゲーション溶液５μl                        段階１：５分−９５℃
ヌクレオチド混合物１μl                        段階２：３０秒−９５℃
Ｍｇ2+ を有するＰＣＲ標準緩衝液５μl            段階３：３０秒−５５℃
センスプライマー（１０pMol/μl）１μl          段階４：３分−７２℃
アンチセンスプライマー（１０pMol/μl）１μl
Roche Molecular BiochemicalsからのHigh Fidelityポリメラーゼ混合物  １μl
Ｈ2Ｏ  ４０μl  
段階２〜４を３２回繰り返した。
【００８６】
4つのプライマー組み合わせＯａｌ３Ｓ／Ｆｘｎ５７ＡＳ、Ｏａｌ４Ｓ／Ｆｘｎ５７ＡＳ、Ｏａｌ３Ｓ／Ｏａｌ８ＡＳ及びＯａｌ４Ｓ／Ｏａｌ８ＡＳは、すべて単一４ｋｂＤＮＡ断片をもたらした。すべてのプライマー対を遺伝子の外側に向けた。かくして、ラクトナーゼ遺伝子は、自己ライゲーションしたＨｉｎｄＩＩＩ断片として環状化されたＤＮＡ分子上に位置しなければならない。
【００８７】
断片を、ＱｉａｇｅｎからのＱＩＡＥＸＩＩゲル抽出キットを使用してゲルから単離しそして製造者（Applied Biosystems, Foster City, CA, USA）により推奨されたジデオキシ方法を使用してＡＢＩ３１０Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒにより配列決定した。単離された断片がＡ．ｎｉｇｅｒ  ＡＴＣＣ９１４２からの（Ｒ）−パントラクトナーゼ遺伝子の両端を含むことを確証した。
【００８８】
プライマーＯａｌ１０Ｓ及びＯａｌ１２ＡＳを使用して、配列決定されたすべてのペプチドの正確なアミノ酸配列を含有する、Ａ．ｎｉｇｅｒ  ｓｓｐ．ａｗａｍｏｒｉの相同性遺伝子を単離することも可能であった。唯一の例外はペプチドＦｘｎ４２の配列である。Ｆｘｎ４２はその時点で２つのペプチド配列決定から得られた。たぶん、２つの異なるペプチドは、トリプシンで消化された酵素断片を分離するＨＰＬＣ実験において同じ時間に溶離した。しかしながら、配列決定は、強いバックグラウンドを有する主要ペプチドの配列のみを最初に示した。第１ペプチドを終えた後、第２ペプチドの配列は、他の４つのアミノ酸に対して発生した残りの配列であった：
ａ）Ｋ−Ｐ−Ｆ−Ａ−Ｈ−Ｑ−Ｖ−Ｋ（配列番号４３）及び
ｂ）Ｒ−Ｈ−Ｈ−Ｎ−Ａ−Ｐ−Ａ−Ｐ−Ｔ−Ｐ−Ｅ−Ｄ−Ｐ−Ｅ−Ｒ−Ｒ（配列番号４４）は、Ｆｘｎ４２であるＫ−Ｐ−Ｆ−Ａ−Ｈ−Ｑ−Ｖ−Ｋ−Ｔ−ｘ−Ｅ−Ｄ（配列番号４５）を与える。
【００８９】
これは、ペプチドＦｘｎ４２に基づくオリゴヌクレオチドＦｘｎ４２Ｓ及びＦｘｎ４２ＡＳが何故使用可能な結果を与えないかも説明する。アミノ酸配列に従えは、株ＡＴＣＣ９１４２からのタンパク質は、３６５７３Daの分子質量及び１．８３の２８０nmにおける評価された吸光度（１mg/mlタンパク質溶液）を有するが、Ａ．ｎｉｇｅｒ  ｓｓｐ．ａｗａｍｏｒｉからのアミノ酸配列は３６５４７Daの計算された分子質量及び１mg/mlタンパク質溶液について１．８３１の評価されたＥ280nmを有する（Pace et al., 1995）。
【００９０】
実施例１１：Ａ．ｎｉｇｅｒ  ＡＴＣＣ９１４２からの（Ｒ）−パントラクトナーゼ遺伝子のクローニング及び発現
実施例１０に記載のすべての３つの方法により得られた配列を比較及びアセンブルして全ラクトナーゼ遺伝子を包含する２４４３bpの連続配列を発生させた。遺伝子の開始コドン及び停止コドン及び可能なイントロンを決定するために、市販の調製物からの精製された遺伝子から得られたペプチドの入手可能なアミノ酸配列を、ＧＣＧプログラムパッケージリリース１０．２の２つのプログラムＴＥＳＴＣＯＤＥ及びＣＯＤＯＮＰＲＥＦＥＲＥＮＣＥの結果と一緒に使用した。停止コドン及び１つのイントロンは同じ方法で両プログラムにより決定されたが、開始コドンは、特にペプチドＦｘ７４（配列番号８４）のＮ−末端で利用可能な他の配列決定されたペプチドはなかったので、明らかではなかった。データベースサーチの期間中見出された相同性アミノ酸配列へのすべての可能な翻訳の比較も助けにならなかった。何故ならば、タンパク質のＮ−末端部分はまったく不均一であると思われるからである。ゆえに、ペプチドＦｘ７４の位置の上流にしかし同じリーディングフレームにおいて見出された２つのメチオニン残基が選ばれそして両者はそれぞれの発現カセットの構成のために使用された。ＣＴに富んだ領域は、配列番号７の塩基対６６６〜７４２間に見出された。しかしながら、このＣＴに富んだ領域の位置は、開始コドンとして１つのＭｅｔ他よりも実際に好まなかった。何故ならば、この領域と開始コドン間の距離は通常真菌において相当変動するである。また、可能なポリアデニル化部位は遺伝子の下流に同定された。
【００９１】
Ａ．ｎｉｇｅｒ  ＡＴＣＣ９１４２からの遺伝子の７２bpの長さのイントロンの場合に、ヌクレオチド９７６〜９８１からのＤＮＡストレッチは、最も確からしくは５’−スプライス部位を表し、ヌクレオチド１０２９〜１０３５又は１０１６〜１０２２からのストレッチは推定内部コンセンサス配列を表しそして１０４５〜１０４７からのＤＮＡストレッチは３’−スプライス部位（配列番号７）を表す。Ａ．ｎｉｇｅｒ  ＭａｃＲａｅ遺伝子の対応する配列は、５１bp長さのイントロン（配列番号７９）においてbp３２〜３７、６６〜７２及び８０〜８２に位置している。Ａ．ｎｉｇｅｒ  ｓｓｐ．ａｗａｍｏｒｉのｏａｌ遺伝子の５０bp長さのイントロンの場合には、５’−スプライス部位は、ヌクレオチド２０３（ＧＴＧＣＣＣ）で開始し、内部コンセンサス領域はヌクレオチド２３６で開始し（ＡＡＣＴＡＡＣ）、そして３’−スプライス部位はヌクレオチド２５０で開始する（ＣＡＧ）（配列番号９）。
【００９２】
【表４】
0004571936.tif 000005
【００９３】
５’−スプライス部位のためのコンセンサス配列は、ＧＴＰｕＮＧＰｙである。列挙された部位のどれも位置５にＧを有していない。ラリアット形成のための内部部位の酵母コンセンサス配列はＴＡＣＴＡＡＣである。３’−スプライス部位はコンセンサス配列ＰｙＡＧを有する［Unkles, Gene organization in industrial filamenous fungi.In Applied molecular genetics of filamentous fungi(Kinghorn, ed), pp.28-53.Blackie Academic & Professional, Wester Cleddens Road, Bishopbriggs, Glasgow G64 2NZ, UK, Glasgow(1992)］。
【００９４】
下記のｃＤＮＡを発生させた：
−Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現のためのｏａｌ（配列番号９８）
−Saccharomyces cerevisiaeにおける発現のためのｏａｌＥｃｏ（配列番号９４）
−S.cervisiaeにおける発現のためのｏａｌＥＳｈｏｒｔ（配列番号９５の位置３２における第２の可能なＭｅｔを使用する３１アミノ酸のより短いバージョン）
−Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現のためのｏａｌＳ（アーティファクトとして最終的に同定されたペプチドＦｘｎ４２のミスリーディング配列の故にｏａｌＳが作成された）
−Ｓ．ｃｅｒｖｉｓｉａｅにおける発現のためのｏａｌＳＥｃｏ
−Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現のためのＣ−末端ｈｉｓ−タグを含有するｏａｌｈｉｓ
−S.cervisiaeにおける発現のためのｏａｌＥｈｉｓ
−Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現のためのＮ−末端ｈｉｓ−タグを含有するｏａｌＮｈｉｓ（配列番号９２）
−S.cervisiaeにおける発現のためのｏａｌＥＮｈｉｓ（配列番号９６）（S.cervisiaeにおける発現及び分泌のためのA.terreus cbsのフィターゼのシグナルペプチドを含有する構築物ｏａｌｓｅｃ）
【００９５】
一般的手順
最初に、ｏａｌ遺伝子の推測されたコード配列（ｃＤＮＡ）を２つのＰＣＲｓにおいて単離した。２つのＰＣＲ産物を第３ＰＣＲによりアセンブルした。下記のプライマーを使用した：
Ｏａｌ１ＡＳ（配列番号４６）、Ｏａｌ２ＡＳ（配列番号４７）、Ｏａｌ３Ｓ（配列番号４８）、Ｏａｌ４Ｓ（配列番号４９）、Ｏａｌ５Ｓ（配列番号５０）、Ｏａｌ６ＡＳ（配列番号５１）、Ｏａｌ７ＡＳ（配列番号５２）、Ｏａｌ８ＡＳ（配列番号５３）、Ｏａｌ９ＡＳ（配列番号５４）、Ｏａｌ１０Ｓ（配列番号５５）、Ｏａｌ１０ＳＥｃｏ（配列番号５６）、ＯａｌＥＮｈｉｓ（配列番号５７）、Ｏａｌ１０ＳＳｈｉｓ（配列番号５８）、Ｏａｌ１１Ｓ（配列番号５９）、Ｏａｌ１２ＡＳ（配列番号６０）、Ｏａｌ１２ＡＳＥｃｏ（配列番号６１）、  Ｏａｌ１２ＡＳｈｉｓ（配列番号６２）、Ｏａｌ２ＡＳＨｉｓＥｃｏ（配列番号６３）、Ｏａｌ１３Ｓ（配列番号６４）、Ｏａｌ１３ＡＳ（配列番号６５）、Ｏａｌ１４Ｓ（配列番号６６）、Ｏａｌ１４ＡＳ（配列番号６７）、Ｏａｌ１５Ｓ（配列番号６８）、Ｏａｌ１５ＡＳ（配列番号６９）、Ｏａｌ１６Ｓ（配列番号７０）（第２Ｍｅｔ）、ＯａｌｓｅｃＳ（配列番号７１）、ＯａｌｓｅｃＡＳ（配列番号７２）、ｐＱＥ８０ＥｃｏＳ（配列番号７３）、ｐＱＥ８０ＥｃｏＮｈｉｓＳ（配列番号７４）、ｐＱＥ８０ＢａｍＡＳ（配列番号７５）、ｐＱＥ８０ＢａｍｈｉｓＡＳ（配列番号７６）、ｐＱＥ８０ＥｃｏＳｓｈｏｒｔ（配列番号７７）及びＣＰ−ａ（配列番号７８）。
【００９６】
Ｏａｌ１Ｓはより上流の開始コドンのすぐ前で始まるが、Ｏａｌ９ＡＳは推測された停止コドンの数ヌクレオチド下流で始まる。イントロンなしで第３ＰＣＲ反応における２つの発生したＰＣＲ産物のアセンブリングを可能とするために、Ｏａｌ１４Ｓ及びＯａｌ１４ＡＳは相補性でありそしてエキソンＩの端部及びエキソンＩＩの開始部からの配列を含有する。
【００９７】
ｇＤＮＡ（１／１０に希釈した）１μl            段階１：５分−９５℃
ヌクレオチド混合物１μl                        段階２：３０秒−９５℃
Ｍｇ2+ を有するＰＣＲ標準緩衝液５μl            段階３：３０秒−５５℃
Ｏａｌ１１Ｓ（１０pMol/μl）１μl              段階４：１分−７２℃
Ｏａｌ１４ＡＳ（１０pMol/μl）１μl
Roche Molecular BiochemicalsからのHigh Fidelityポリメラーゼ混合物１μl
Ｈ2Ｏ  ４０μl
段階２〜４を３５回繰り返した。
【００９８】
ｇＤＮＡ（１／１０に希釈した）１μl            段階１：５分−９５℃
ヌクレオチド混合物１μl                        段階２：３０秒−９５℃
Ｍｇ2+ を有するＰＣＲ標準緩衝液５μl            段階３：３０秒−５５℃
Ｏａｌ１４Ｓ（１０pMol/μl）１μl            段階４：１分−７２℃
Ｏａｌ９ＡＳ（１０pMol/μl）１μl
Roche Molecular BiochemicalsからのHigh Fidelityポリメラーゼ混合物  １μl
Ｈ2Ｏ  ４０μl  
段階２〜４を３５回繰り返した。
【００９９】
Ａ．ｎｉｇｅｒ  ＡＴＣＣ９１４２のｇＤＮＡに関するＰＣＲは、予想されたサイズのＰＣＲ産物を示した。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により精製した。それらを、Ｑｉａｇｅｎ（Qiagen, Hilden, Germany）からのＱＩＡＥＸＩＩキツトを使用してゲルから抽出しそして第３ＰＣＲのために使用した：
【０１００】
ＰＣＲ産物１及び２の各々０．５μl              段階１：５分−９５℃
ヌクレオチド混合物１μl                        段階２：３０秒−９５℃
Ｍｇ2+ を有するＰＣＲ標準緩衝液５μl            段階３：３０秒−５５℃
Ｏａｌ１２Ｓ（１０pMol/μl）１μl              段階４：１分−７２℃
Ｏａｌ１０ＡＳ（１０pMol/μl）１μl
Roche Molecular BiochemicalsからのHigh Fidelityポリメラーゼ混合物  １μl
Ｈ2Ｏ  ４０μl  
段階２〜４を３０回繰り返した。
【０１０１】
最終産物をアガロースゲル電気泳動により精製し、ゲルから抽出しそしてInvitrogen(Carlsbad, CA, USA）により供給されたＰＣＲ産物の直接クローニングのためのＴＡベクターにクローニングした。すべての他の必要なクローニング段階を、Sambrock et al.(1989）に記載のとおりに行った。配列決定によりチェックされた正しいインサート（ｏａｌ１）を含有するプラスミドを、すべてのやがて起こる構築段階のためのテンプレートとして使用した。
【０１０２】
（ａ）Ｅ．ｃｏｌｉ及びSaccharomyces cerevisiaeにおける発現のための構築物ｏａｌ及びｏａｌＥｃｏ：
ｏａｌ１に関してプライマーｐＱＥ８０ＥｃｏＳ及びｐＱＥ８０ＢａｍＡＳを使用するＰＣＲを行って下記のプロトコールを使用して構築物Ｅｃｏ−ｏａｌ−Ｂａｍを発生させた：
【０１０３】
インサート（１０ng）としてｏａｌ１を含有するプラスミド１μl              
ヌクレオチド混合物１μl                    
Ｍｇ2+を有するＰＣＲ標準緩衝液５μl       
ｐＱＥ８０ＥｃｏＳ（１０pMol/μl）１μl      
ｐＱＥ８０ＢａｍＡＳ（１０pMol/μl）１μl
Roche Molecular BiochemicalsからのHigh Fidelityポリメラーゼ混合物  １μl
Ｈ2Ｏ  ４０μl
段階１：５分−９５℃
段階２：３０秒−９５℃
段階３：３０秒−５５℃
段階４：１分−７２℃
段階２〜４を３０回繰り返した。
【０１０４】
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により精製し、問題の断片をゲル（QIAEXII、Qiagen）から抽出し、ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩにより消化し、再びアガロースゲル電気泳動により精製し、ＱｉａｇｅｎからのベクターｐＱＥ８０にライゲーションし、そしてＥ．ｃｏｌｉ  Ｔｏｐ１０中に形質転換した。４クローンのプラスミドを単離しそしてインサートを配列決定した。正しい構築物を含有するプラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉＭ１５又は同等なＥ．ｃｏｌｉ株に形質転換した。すべての分子処置は標準処置として当業者に知られている。
【０１０５】
酵母発現構築物のために、使用したプライマーをＯａｌ１０ＥｃｏＳ及びＯａｌ１２ＡＳＥｃｏにより置き換え、ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩ単独で消化し、そして最終産物を、ベクターのＥｃｏＲＩ制限部位を使用してｐＹＥＳ２又はS.cervisiaeのための同等な発現ベクターにクローニングした。S.cervisiae株、例えば、ＩＮＶＳｃ１（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）の形質転換を、Hinnen et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75: 1929-1933(1978）に従って又は上記株と共に供給されたマニュアルに従って行った。
【０１０６】
（ｂ）Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現するための構築物ｐＱＥ８０ｏａｌＳ（第２の可能なＭｅｔを使用して３１アミノ酸の短くしたバージョン：
上記したのと同じＰＣＲプロトコールを使用して、プライマーｐＱＥ８０ＥｃｏＳｓｈｏｒｔ及びｐＱＥ８０ＢａｍＡＳを同じテンプレートに対して使用した。完了したＰＣＲ反応を（ａ）に記載のように行った。
【０１０７】
（ｃ）Ｓ．ｃｅｒｖｉｓｉａｅにおける発現のための構築物ｏａｌＳ：
プライマーＯａｌ１６Ｓ及びＯａｌ１２ＡＳＥｃｏを使用した。他のすべては（ａ）に記載のように処理した。
【０１０８】
（ｄ）Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現のためのＣ−末端ｈｉｓ−タグを含有する構築物ｐＱＥ８０ｏａｌｈｉｓ：
プライマーｐＱＥ８０ＥｃｏＳ及びｐＱＥ８０ＢａｍｈｉｓＡＳをＰＣＲのために使用した。（ａ）参照。
【０１０９】
（ｅ）Ｓ．ｃｅｒｖｉｓｉａｅにおける発現のための構築物ｏａｌｈｉｓ：
プライマーＯａｌ１０Ｓｅｃｏ及びＯａｌ１２ＡＳＨｉｓＥｃｏをＰＣＲのために使用した。（ａ）参照。
【０１１０】
（ｆ）Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現のためのＮ−末端Ｈｉｓ−タグを含有する構築物ｐＱＥ８０ｏａｌＮｈｉｓ：
プライマーｐＱＥ８０ＥｃｏＮｈｉｓＳ及びｐＱＥ８０ＢａｍＡＳをＰＣＲのために使用した（ａ参照）
【０１１１】
（ｇ）Ｓ．ｃｅｒｖｉｓｉａｅにおける発現のための構築物ｏａｌＥＮｈｉｓ：
プライマーＯａｌＥＮｈｉｓ及びＯａｌ１２ＡＳＥｃｏをＰＣＲのために使用した（ａ参照）。
【０１１２】
（ｈ）Ｓ．ｃｅｒｖｉｓｉａｅにおける発現及び分泌のためのＡ．ｔｅｒｒｅｕｓ  ｃｂｓのフィターゼのシグナルペプチドを含有する構築物ｏａｌｓｅｃ：
３つの独立のＰＣＲｓを使用して構築物を調製した。最初に、コンセンサスフィターゼの遺伝子に対するＰＣＲによりシグナル配列を単離した［Lehmann et al., Protein Eng.13: 49-57(2000)］
【０１１３】
インサート（10ng）としてコンセンサスフィターゼの遺伝子を含有するプラスミド  １．０μl  
ヌクレオチド混合物１．０μl
Ｍｇ2+を有するＰＣＲ標準緩衝液５．０μl  
ＣＰ−ａ（１０pMol/μl）１．０μl
ｐＯａｌｓｅｃＡＳ（１０pMol/μl）１．０μl
Roche Molecular BiochemicalsからのHigh Fidelityポリメラーゼ混合物  １．０μl
Ｈ2Ｏ  ４０μl    
段階１：５分−９５℃
段階２：３０秒−９５℃    
段階３：３０秒−５５℃  
段階４：１分−７２℃    
段階２〜４を３０回繰り返した。
【０１１４】
ｏａｌ１遺伝子（10ng）を含有するプラスミド１．０μl              
ヌクレオチド混合物１．０μl                    
Ｍｇ2+を有するＰＣＲ標準緩衝液５．０μl       
ＯａｌｓｅｃＳ（１０pMol/μl）１．０μl      
Ｏａｌ１２ＡＳＥｃｏ（１０pMol/μl）１．０μl
Roche Molecular BiochemicalsからのHigh Fidelityポリメラーゼ混合物  １．０μl
Ｈ2Ｏ  ４０μl    
段階１：５分−９５℃
段階２：３０秒−９５℃    
段階３：３０秒−５５℃  
段階４：４５秒−７２℃    
段階２〜４を３０回繰り返した。
【０１１５】
ＰＣＲ産物を１．５%アガロースゲルでのアガロースゲル電気泳動により精製し、ゲル（QIAEXII, Qiagen）から抽出しそして第３ＰＣＲのために使用した：
ＰＣＲ１の産物０．５μl
ＰＣＲ２の産物０．５μl
ヌクレオチド混合物１．０μl                    
Ｍｇ2+を有するＰＣＲ標準緩衝液５．０μl       
ＣＰ−ａ（１０pMol/μl）１．０μl      
Ｏａｌ１２ＡＳＥｃｏ（１０pMol/μl）１．０μl
Roche Molecular BiochemicalsからのHigh Fidelityポリメラーゼ混合物１．０μl
Ｈ2Ｏ４０μl    
段階１：５分−９５℃
段階２：３０秒−９５℃    
段階３：３０秒−５５℃  
段階４：１分−７２℃    
段階２〜４を３０回繰り返した。
【０１１６】
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により精製し、ゲルから抽出し、ＥｃｏＲＩにより消化し、再びアガロースゲル電気泳動により精製し、そして上記したS.cervisiae発現ベクターにライゲーションした。
【０１１７】
実施例１２：ｏａｌの発現
（ａ）Ｅ．ｃｏｌｉにおける
構築物ｐＱＥ８０ｏａｌ、ｐＱＥ８０ｏａｌＳ、ｐＱＥ８０ｏａｌｈｉｓ及びｐＱＥ８０ｏａｌＮｈｉｓを、ｌａｃプロモーターのリプレッサーを含むｐＲＥＰ４を含有するＥ．ｃｏｌｉＭ１５において発現した（Qiagen, Hilden, Germanyの発現マニュアル参照）一夜の培養物を６００nmにおける０．１のＯＤに希釈しそして３０℃で１．５のＯＤ600nmに増殖させた。次いで培養物を０．５mM  ＩＰＴＧで誘導しそして３０℃で更に６時間培養した。細胞を遠心（５０００g、２０分）により回収しそして−８０℃で凍結した。製造者のロトコールに従ってＢ−ＰＥＲ（Pierce, Rockford, IL, USA）を使用してそれらを溶解した。更なる遠心段階の後、上澄液を（Ｒ）−パントラクトンの加水分解のために使用した。
【０１１８】
構築物ｐＱＥ８０ｏａｌＳ及びｐＱＥ８０ｏａｌＨｉｓを含有する形質転換体において、上澄液にも細胞溶解物（cell lysate）にも活性は見出されなかったが、これに対して構築物ｐＱＥ８０ｏａｌ及びｐＱＥ８０ｏａｌＮｈｉｓを使用すると、可溶性タンパク質のほぼ５%は活性な（Ｒ）−パントラクトナーゼであった。
【０１１９】
Ｎ−末端Ｈｉｓ−タグを含有する構築物をＨｉｓ−タグなしの遺伝子と同じ方法で発現した。Ｈｉｓ−タグ付きタンパク質の精製をＱｉａｇｅｎ（hilden, Germany）からの「QIAexpressionist」に記載のプロトコールを使用して細胞溶解物からネイティブな形態で行った。
【０１２０】
（ｂ）Ｓ．ｃｅｒｖｉｓｉａｅにおける
構築物ｏａｌＥｃｏ、ｏａｌＥＳ、ｏａｌＥｈｉｓ、ｏａｌＥＮｈｉｓ及びｏａｌｓｅｃをＳ．ｃｅｒｖｉｓｉａｅＩＮＶＳｃｌ又は匹敵する株において発現した。形質転換及びＳＤura-培地（［Sherman et al., Laboratory course manual for methods in yeast genetics, Cold Spring Harbor laboratory、Cold Spring Harbor, New York(1986）で平板培養の後、平板を３０℃で３〜４日インキュベーションし、成長したコロニーを突き砕きそしてＳＤura-液体培地２mlに移し、そして３０℃で３日間激しく振とうしながら培養した。これらの培養物をＳＤura-培地２５mlのための予備培養物として使用した。激しく振とうしながら3０℃で更に３日の培養の後、ＹＰＤ培地５００mlに２リットルフラスコ中で上記調製された培養物（Sherman et al., 上記）を接種した。同一条件下に更に３日間培養した後、細胞を遠心により培地から分離しそしてＹ−ＰＥＲ（Pierce, Rockford, IL）を使用して溶解した。
【０１２１】
Ｅ．ｃｏｌｉ発現の場合におけると同じく、構築物ｏａｌＥｃｏ及びｏａｌＥＮｈｉｓのみが、細胞溶解物中にのみ見出された活性（Ｒ）−パントラクトナーゼの発現をもたらした。ＹＰＤ培養物７５mlを使用して、（Ｒ）−パントラクトナーゼ３００Ｕを産生することが可能であった。対応する溶解物は全タンパク質（total protein）約５U/mgの特異的活性を示した。
【０１２２】
上記に示されたイントロンの位置の配列データを使用して、Ａ．ａｗａｍｏｒｉからのｏａｌ遺伝子及びＡ．ｎｉｇｅｒ  ＡＴＣＣ４６９５１からのｏａｌ遺伝子を匹敵する方法で構築しそして発現することができる。
【０１２３】
実施例１３：Ｅ．ｃｏｌｉ又はＳ．ｃｅｒｖｉｓｉａｅにおいて異種性に発現されたＯａｌの固定化及び（ＲＳ）−パントラクトンの加水分解分割へのその適用
バイオリアクターにおける多重の使用のために、Ａ．ｎｉｇｅｒからの（Ｒ）−パントラクトナーゼを固定化した。Ｅ．ｃｏｌｉ又はＳ．ｃｅｒｖｉｓｉａｅ中で発現の後、細胞をＢ−ＰＥＲ（Ｅ．ｃｏｌｉ）若しくはＹ−ＰＥＲ（S.cervisiae）（Pierce, Rockford, IL, USA）のような化学的手段又は音波処理若しくは高圧のような機械的手段により破壊した（disrupted）。溶解物を遠心により清澄化した。この調製物を固定化のために直接使用した。別法として、固定化の前に、硫酸アンモニウム沈殿のような更なる精製段階を含ませて、更に特異的Ｏａｌ活性を増加させた。
【０１２４】
生体触媒を下記のように固定化した：
（１）シリカ−ゾル−ゲルにおけるＯａｌの固定化
ポリ（グリセリルシリケート）−１．０（ＰＧＳ−１．０）を文献［Gill and Ballesteros, J.Am.Chem.Soc.120: 8587-8598(1998)］に従って調製し、そしてその重量の半分の氷冷水に溶解した。これの１００若しくは２００mg部分を、２ml又は５mlのバイアル中で５０mMリン酸塩、pH７．０中で生体触媒ストック（種々の調製物からの可溶性酵素）の氷冷調製物５０若しくは１００mgと完全に混合し、そしてバイアルを２分間穏やかに回転させてバイアルの壁にヒドロゲルの薄いコーティングを形成した。次いで、バイアルを２０分間氷上に放置し、次いで冷蔵庫に移した（開放した）。ヒドロゲルを５℃で４８〜７２時間エージングさせてキセロゲルを形成させた。キセロゲルコーテッドバイアルを、１００rpm、５℃で振とうすることにより、２×１若しくは２×４mlの５０mMリン酸塩緩衝液、pH７で洗浄し、続いて１０mMの酢酸マグネシムを含有する２×１若しくは２×４mlの５０mM  ＴＥＡ−酢酸塩、pH７によって洗浄した。
【０１２５】
（２）ゾル−ゲルシリカ−ポリビニルアルコール中のＯａｌの固定化
処置は、ＤＧＳ溶液をラクトナーゼ酵素ストックと組み合わせる前にポリビニルアルコール（AldrichからのＰＶＡ、水中の８５Ｋ１３%ｗ／ｗ）の適当な量と混合したことを除いて（１）における処置と同様であった。更なる処理は（１）の場合と同じであった。
【０１２６】
（３）グルタルアルデヒドで活性化された、支持されたポリエチレンイミン上へのＯａｌの固定化：
ポリエチレンイミン（Aldrichからの無水の高分子量の分岐状ポリマー１g）、ＣＡ（０．２g、３６%Ａｃ）及びセルロースアセテートブチレート（０．２g、Aldrichからの４８%アセテート及びブチレート含有率）をジクロロメタン５mLに溶解し、そして溶液を使用してフラーズアース（Fullers Earth）（３０〜６０メッシュ、Aldrichから）７gをコーティングした。湿潤コーティングされた物質を室温で０．５時間空気下に乾燥してコーティングされたフラーズアース約９gを得た。次いでこれをグルタルアルデヒド（５０%ｗ／ｗ、８mL、Aldrichから）及びリン酸塩緩衝液（５０mM、pH８、５０mL）の氷冷混合物中に、２００rpmで２時間攪拌しながら懸濁させた。活性化された支持体を水（４×１０mL）で洗浄し、次いでリン酸緩衝液（２０mM、pH８、４×１０mL）で洗浄し、次いで排出した（drained）。湿潤支持体をラクトナーゼ酵素ストックの氷冷した溶液（リン酸塩、５０mM、pH８中の）と混合し、そして懸濁液を２００rpmで２０〜３０時間攪拌した。液体を固定化された酵素からデカンテーションしそして湿潤した固定化物をリン酸塩（３×５mL）で洗浄し、エタノールアミン（２０mM、pH８、２０mL）で処理し、そして再びリン酸塩（２０mM、pH７、２×５mL）で洗浄し、次いで排出した。
【０１２７】
（４）（ＲＳ）−パントラクトンの加水分解分割のための反応条件：
生体触媒５０若しくは１００mg及び０．５ラセミラクトン（２０mM酢酸マグネシウムを含有する０．７５Mトリエチルアミン酢酸塩、pH８．５中の）１若しくは２mLを使用して２若しくは４mLのバイアル中で反応を行った。バイアルを必要な時間４０℃、２００rpmでインキュベーションし、溶液を排出し、キラルＨＰＬＣにより分析し、触媒を次のサイクルを始める前に新鮮な基質溶液（２×１又は２mL）で洗浄した。分析のためのサンプルを５０mM  ＥＤＴＡを含有する等容積の５００mM  ＭＥＳ緩衝液、pH５．５によりクエンチし、遠心し（１０，０００g、１０分）、次いで０．４６×１５cmのＣＨＩＲＡＤＥＸカラムを使用して、７０：３０水−エタノール、１mL／分、２０℃で溶離するＨＰＬＣにより分析した。最初の速度（initial rates）を１５分に測定しそしてＥ値を各サイクルの終わりに決定した。
【０１２８】
（ＲＳ）−パントラクトンのバッチ分割における選ばれた固定化された酵素調製物の性能を表２に要約する。ゾル−ゲル及び共有結合固定化プロトコールの両方共、２４サイクルの１時間バッチ反応の後ですら触媒がそれらの初期活性の６２〜７２%を残しそして（Ｒ）−パントラクトンのエナンチオマー過剰率及びエナンチオマー選択性、それぞれ８９〜９８%及び７１〜８８%を示して有効であることが証明された。更に、延長したバッチ試験で試験するとき、即ち、各バッチ反応を１時間ではなくて１日間進行させるとき、触媒はきわめて類似した方法で作用を果たし（performed）、良好な長期間操作安定性を示す。
【０１２９】
【表５】
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【０１３０】
実施例１４：固定化された組換えＥ．ｃｏｌｉ発現されたＯａｌの（ＲＳ）−パントラクトンの連続的分割への適用
実施例１４（２）で上記したように調製された、ゾル−ゲル−ＰＶＡ固定化された組換えラクトナーゼ生体触媒（Ｅ．ｃｏｌｉで発現された）を使用して、充填床反応器においてラセミラクトンの連続的分割を行った：固定化された生体触媒（１．１g、０．２１kUg−1、総計０．２３１kU）を、テフロン（登録商標）端部片を取り付けた０．４６×１５cmのＯｍｎｉｆｉｔジャケット付きガラスカラムに乾式で詰め込んだ。これを、５０mLガラス／テフロン（登録商標）注射器を備えた２つの注射器ポンプにより供給された１〜２mmのセルロースビーズを充填された１×１０cmＯｍｎｉｆｔジャケット付きガラスカラムに接続した。カラムを、循環水浴に接続しそして分割実験期間中４０℃に維持した。５ml／分の速度、室温で３０分間トリス−酢酸塩緩衝液（ステアリン酸マグネシウム１００mM、を含有する１００mM、pH７）を供給し、次いでラセミラクトン（水中１．５M）及びトリス−酢酸塩緩衝液（５０mM酢酸マクネシウムを含有する２．５M、pH８．２５）の溶液を１：１の容積比及び２mL／分の全流速、室温で３０分間一緒に供給することにより、反応器を状態調節した。次いで流速を１．２mL／分に降下させ、カラムを４０℃に加熱し、システムを１５分間平衡化させた。このようにして反応器を約４５分間操作し、溶離物を氷浴中に集め、その条件下に総計５２．７mLの供給物（５．１４gのＲＳＰＬに相当する）を４６〜４８%の持続した転化率で処理した。溶離物のpHを硫酸（１０%ｖ／ｖ／水性）によりpH６．５に調節し、溶液をジクロロメタン（１０×７５mL）で抽出しそして有機層を無水硫酸マグネシウム上で乾燥しそしてロータリーエバボレーションして、１０%ＲＰＬ及び９０%ＳＰＬ（キラルＨＰＬＣにより分析して）からなる濃縮した（Ｓ）−パントラクトン（２．６７g、理論の９８%）を得た。水性相を硫酸（４０%ｗ／ｗ）でpH１．５に酸性化し、１時間７０℃に加熱し、氷中で冷却し、塩化ナトリウムで飽和させ、次いでジクロロメタン（１０×７５mL）で抽出し、有機層を無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、ロータリーエバポレーションして９３%のエナンチオマー純度を有する濃縮した（Ｒ）−パントラクトン（２．２３g、理論知り収率の９２%）を得た。（Ｒ）−／（Ｓ）−ラクトンの合わせた回収率は９５%であった。
【０１３１】
実施例（１３）及び（１４）の結果は、組換えラクトナーゼがラセミパントラクトンの加水分解分割のための有効な生体触媒であること及び触媒を有効に固定化することができること及び固定化物を、バッチ操作及び連続操作の両方を使用するエナンチオマー過剰率９０〜９８%を有する高度に濃縮した（Ｒ）−パントラクトンの製造に適用することができることを明らかに示す。
【０１３２】
実施例１５：B.subtilisからの（Ｓ）−パントラクトン特異的ラクトナーゼのクローニング及び発現
ウシ及びウマ肝臓からのラクトナーゼのアミノ酸配列を使用して、我々は、これらの配列に対する限定された相同性を示したいくつかの他の配列を見出した。これらの中でも、B.subtilisからのｙｖｒｅ遺伝子（ＳＭＰ−３０／ＣＧＲ１  ＦＡＭＩＬＹ／仮想的３３．２kDaタンパク質のメンバーとして注釈されたＹＶＲＥ  ＢＡＣＳＵ）を、発現ベクターへの後者のクローニングのための必要な制限部位（ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩ）も含むその５’−端部及び３’−端部のプライマーを使用するゲノムＤＮＡからのＰＣＲによりクローニングした。ＰＣＲ条件は、Ａ．ｎｉｇｅｒのゲノムＤＮＡからのｏａｌ遺伝子の単離のために使用されたＰＣＲ条件と同じであった（実施例８参照）。ＰＣＲ産物及びベクター（Stratagene (La Jolla, CA, USA）からのＰＥＴ４１ａ））をＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩにより消化し、アガロースゲル電気泳動により清浄化し、ライゲーションしそしてＥ．ｃｏｌｉＴｏｐ１０細胞（Stratagene, La Jolla, CA, USA）に形質転換した。このストラテジーを使用して、遺伝子を、Ｅ．ｃｏｌｉからのＧＳＴタンパク質の遺伝子にフレーム内で融合した。
【０１３３】
製造者のプロトコールに従って発現及び精製を行った。追加的に５mMＣａＣｌ2
を含有する標準アッセイを使用して精製されたタンパク質の活性を４０℃で決定した。酵素は（Ｓ）−パントラクトンの非常に高い選択性を示した。調製は１〜２U/mgの濃縮した融合タンパク質の特異的活性を有していた。酵素はＭｇ2+又はＣａ2+イオンの存在下にのみ活性であった。
【配列表】
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