(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
a)1つ以上の標的分析物に結合する1つ以上のプローブ分子を得る段階と、
b)1つ以上のカンチレバーにプローブ分子を結合する段階と、
c)1つ以上の標的分析物を含有することが疑われる少なくとも1つの試料にプローブ分子を曝露する段階と、
d)カンチレバーを偏向する段階と、
e)カンチレバーを元の位置に戻すために対抗力を与える段階と、
f)カンチレバーを元の位置に戻すための対抗力の大きさから、分析物を検出および／または同定する段階と
を含む、分析物を検出および／または同定する方法。
【請求項２】
標的分析物が正味電荷を有する、請求項1記載の方法。
【請求項３】
カンチレバーが、電位の傾きに応答して偏向される、請求項2記載の方法。
【請求項４】
カンチレバーが、表面張力の変化に応答して偏向される、請求項1記載の方法。
【請求項５】
標的分析物が、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、抗体、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、糖、炭水化物、オリゴ糖、多糖、脂肪酸、脂質、ホルモン、代謝物、増殖因子、サイトカイン、ケモカイン、受容体、神経伝達物質、抗原、アレルゲン、抗体、基質、代謝物、補因子、阻害物質、薬物、薬剤、栄養素、生物学的危険物、感染性物質、プリオン、ビタミン、複素環式芳香族化合物、発癌物質、変異原、廃棄物、ウイルス、細菌、サルモネラ(Salmonella)、ストレプトコッカス(Streptococcus)、レジオネラ(Legionella)、大腸菌(E. coli)、ジアルジア(Giardia)、クリプトスポリジウム(Cryptosporidium)、リケッチア(Rickettsia)、胞子、カビ、酵母、藻類、アメーバ、渦鞭毛藻類、単細胞生物、病原体、プリオン、および細胞からなる群より選択される、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
プローブ分子が、抗体、抗体断片、1本鎖抗体、遺伝的に操作された抗体、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、核酸、核酸類似物、ペプチド核酸、タンパク質、ペプチド、合成ペプチド、結合タンパク質、受容体タンパク質、輸送タンパク質、レクチン、基質、阻害物質、活性化物質、リガンド、ホルモン、神経伝達物質、増殖因子、およびサイトカインからなる群より選択される、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
プローブ分子がオリゴヌクレオチドであり、標的分析物が核酸である、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
標的分析物がタンパク質またはペプチドである、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
プローブ分子が、抗体、抗体断片、遺伝的に操作された抗体、または1本鎖抗体である、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
対抗力が磁気的なものである、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
対抗力が電気的なものである、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
対抗力が放射性のものである、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
カンチレバーが、湾曲した表面を有する透明な物体に取り付けられる、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
光線が、カンチレバーの平面に向けられる、請求項12記載の方法。
【請求項１５】
a)少なくとも1つのカンチレバーと、
b)カンチレバーに結合された少なくとも1つのプローブ分子と、
c)カンチレバーの一方の側の第1の電極と、
d)カンチレバーの他方の側の第2の電極と、
e)第1および第2の電極に機能的に接続された直流電源と、
f)カンチレバーを元の位置に戻すための対抗力の大きさから、少なくとも一つのプローブ分子に結合する１つ以上の分析物を検出および／または同定するように構成された情報処理および制御システムと
を含む装置。
【請求項１６】
情報処理および制御システムがコンピュータである、請求項15記載の装置。
【請求項１７】
カンチレバーの偏向を検出するための検出ユニットをさらに含む、請求項15記載の装置。
【請求項１８】
検出ユニットがレーザーおよび位置検知型光検出器を含む、請求項１７記載の装置。
【請求項１９】
検出ユニットが、圧電型検出器、圧電抵抗型検出器、または圧電磁気型検出器を含む、請求項１７記載の装置。
【請求項２０】
カンチレバーに取り付けられた電磁石をさらに含む、請求項15記載の装置。
【請求項２１】
電磁石に機能的に接続された第2の電源をさらに含む、請求項２０記載の装置。
【請求項２２】
第2の電源がコンピュータによって制御される、請求項２１記載の装置。
【請求項２３】
カンチレバーに取り付けられた誘導電荷保存層をさらに含む、請求項15記載の装置。
【請求項２４】
誘導電荷保存層に機能的に接続された第2の電源をさらに含む、請求項２３記載の装置。
【請求項２５】
第2の電源がコンピュータによって制御される、請求項２４記載の装置。
【請求項２６】
カンチレバーに取り付けられた湾曲した表面を有する透明な物体をさらに含む、請求項15記載の装置。
【請求項２７】
レーザーおよび対物レンズをさらに含む、請求項２６記載の装置。
【請求項２８】
検出ユニットに機能的に接続されたコンピュータをさらに含む、請求項１７記載の装置。
【請求項２９】
各々が異なる種類のプローブ分子に結合されているカンチレバーアレイをさらに含む、請求項15記載の装置。
【請求項３０】
a)1つ以上の標的分析物に結合する1つ以上のプローブ分子を得る段階と、
b)1つ以上のカンチレバーに1つ以上の標的分析物を結合する段階と、
c)プローブ分子に標的分析物を曝露する段階と、
d)カンチレバーを偏向する段階と、
e)カンチレバーを元の位置に戻すために対抗力を与える段階と、
f)カンチレバーを元の位置に戻すための対抗力の大きさから、分析物を検出および／または同定する段階と
を含む、分析物を検出および／または同定する方法。
【請求項３１】
標的分析物が、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、抗体、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、糖、炭水化物、オリゴ糖、多糖、脂肪酸、脂質、ホルモン、代謝物、増殖因子、サイトカイン、ケモカイン、受容体、神経伝達物質、抗原、アレルゲン、抗体、基質、代謝物、補因子、阻害物質、薬物、薬剤、栄養素、生物学的危険物、感染性物質、プリオン、ビタミン、複素環式芳香族化合物、発癌物質、変異原、廃棄物、ウイルス、細菌、サルモネラ、ストレプトコッカス、レジオネラ、大腸菌、ジアルジア、クリプトスポリジウム、リケッチア、胞子、カビ、酵母、藻類、アメーバ、渦鞭毛藻類、単細胞生物、病原体、および細胞からなる群より選択される、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
プローブ分子が、抗体、抗体断片、1本鎖抗体、遺伝的に操作された抗体、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、核酸、核酸類似物、ペプチド核酸、タンパク質、ペプチド、結合タンパク質、受容体タンパク質、輸送タンパク質、レクチン、基質、阻害物質、活性化物質、リガンド、ホルモン、神経伝達物質、増殖因子、およびサイトカインからなる群より選択される、請求項３０または３１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2003年9月24日に出願され、現在係属中の発明の名称「Detecting Molecular Binding by Monitoring Feedback Controlled Cantilever Deflections」の一部継続出願10/254,201号であり、その優先権を主張するものである。
【０００２】
発明の分野
本明細書に記載する方法および装置100、200、300は分析物の検出および／または同定の分野に関する。特に、開示する方法および装置100、200、300は、分析物の検出および／または同定のためのフィードバック制御式カンチレバー110、210、310、400、510偏向の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
関連技術
種々の方法がタンパク質、ペプチド、受容体、核酸、ホルモン、代謝物等など生体分子分析物の検出および／または同定のために使用されている。抗体に基づいたアッセイ法は大多数の分析物を検出および／または同定するために使用されている。特異的な結合抗体を作製することができる任意の化合物、組成物、分子または凝集物は、ELISA、ウェスタンブロット法等などの種々のイムノアッセイ法によって検出されている。一般に、関心対象の分析物(抗原)または関心対象の分析物に対する抗体が固体支持体に結合される。分析物を支持体に結合する場合には、分析物に結合する抗体を蛍光標識、酵素標識または他の標識で標識し、分析物の結合体に対する抗体の結合を検出することができる。第1の抗体を支持体に結合する場合には、第1の抗体に対する分析物の結合を、分析物に対する第2の標識抗体の結合によって検出することができる(サンドイッチアッセイ法)。抗体に基づいたアッセイ法は、抗体と種々の抗原との交差反応、(アッセイ法の感度の低下を生ずる)標的分析物の低い抗原性、種々の表面への抗体の非特異的な結合等によって、受け入れがたいほど高いレベルの偽陽性または偽陰性の結果を示すことがある。
【０００４】
オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションに基づいたアッセイ法は、標的オリゴヌクレオチド、メッセンジャーリボ核酸(mRNA)、ゲノムデオキシリボ核酸(DNA)等を検出するために広範に使用されている。このようなアッセイ法では、配列が核酸標的分析物に相補的であるプローブオリゴヌクレオチドを標識し、標的核酸を含有することが疑われる試料にハイブリダイゼーションさせる。サザンブロット法、ドット-ブロット法またはスロット-ブロット法などのこの技法の種々の変形法が既知である。さらに最近では、数百または数千もの個々のオリゴヌクレオチドプローブを含有することができるDNAチップが設計されている。標的核酸のプローブオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションは、蛍光標識、放射能等を使用して検出することができる。このようなアッセイ法の感度および／または特異性の問題が生じることがある。核酸ハイブリダイゼーションは、ミスマッチハイブリダイゼーションにより正確に相補的でない配列間で生じることがあり、偽陽性結果を生じることがある。
【０００５】
酵素活性アッセイ法、受容体-リガンド結合アッセイ法等などの他の種類の分析物検出アッセイ法が知られている。上記に考察する技法の場合と同様に、選択性および／または感度の問題が任意の標準的な検出技法に生じることがある。種々の分析物を検出および／または同定するための選択性があり、感度の高い方法の必要性が当技術分野において存在する。
【０００６】
添付の図面は本明細書の一部を形成し、本発明のある態様をさらに実証するために含まれる。本発明の態様は、本明細書に提供する詳細な説明と合わせて、これらの図面の1つ以上を参照することによってより良く理解することができる。
【発明の開示】
【０００７】
例示的な態様の詳細な説明
定義
本明細書において使用する「1つの（a）」および「1つの（an）」は、1つまたは複数の物を意味することができる。
【０００８】
本明細書において使用する「約」は、数のプラスまたはマイナス5パーセント以内を意味する。例えば、「約100」は95〜105の任意の数を意味する。
【０００９】
本明細書において使用する「機能的に結合している」は、2つ以上の装置の間に機能的な相互作用があることを意味する。例えば、表面の位置または湾曲などの表面の特性の変化を検出することができるように検出ユニットが配列されている場合には、検出ユニットは表面に「機能的に結合」されうる。
【００１０】
「分析物」130、230、330および「標的」130、230、330は、検出および／または同定する関心対象の任意の分子、化合物、組成物または凝集物を意味する。分析物130、230、330の非制限的な例には、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、抗体、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、糖、炭水化物、オリゴ糖、多糖、脂肪酸、脂質、ホルモン、代謝物、増殖因子、サイトカイン、ケモカイン、受容体、神経伝達物質、抗原、アレルゲン、抗体、基質、代謝物、補因子、阻害物質、薬物、薬剤、栄養素、プリオン、生物学的危険物、感染性物質、プリオン、ビタミン、複素環式芳香族化合物、発癌物質、変異原および／または廃棄物が含まれる。「分析物」130、230、330は、単一の分子または原子に限定されるのではなく、ウイルス、細菌、サルモネラ(Salmonella)、ストレプトコッカス(Streptococcus)、レジオネラ(Legionella)、大腸菌(E. coli)、ジアルジア(Giardia)、クリプトスポリジウム(Cryptosporidium)、リケッチア(Rickettsia)、胞子、カビ、酵母、藻類、アメーバ、渦鞭毛藻類、単細胞生物、病原体、または細胞などの複雑な凝集物も含んでもよい。ある態様において、癌細胞などの特定の特徴または疾患状態を示す細胞が標的分析物130、230、330であってもよい。実質的に任意の化学的または生物学的化合物、分子または凝集物が標的分析物130、230、330であってもよい。
【００１１】
「プローブ」120、220、320、520は、関心対象の分析物130、230、330に選択的および／または特異的に結合することができる任意の分子をいう。プローブ120、220、320、520には、抗体、抗体断片、1本鎖抗体、遺伝的に操作された抗体、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、核酸、核酸類似物、ペプチド核酸、タンパク質、ペプチド、結合タンパク質、受容体タンパク質、輸送タンパク質、レクチン、基質、阻害物質、活性化物質、リガンド、ホルモン、サイトカイン等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１２】
本明細書に開示する方法および装置100、200、300は、分析物130、230、330を迅速に感度よく検出および／または同定するのに有用である。本発明のある態様において、分析物130、230、330は、1つの分析物130、230、330分子と同じくらい低いところまでの感度で検出および／または同定することができる。本発明のいくつかの態様において、蛍光または放射性標識を使用しないで分析物130、230、330を検出および／または同定することができることは有利である。
【００１３】
以下の詳細な説明は、開示されている本発明の態様のさらに十分な理解を提供するために数多くの具体的な詳細を含む。しかし、本発明の態様はこれらの具体的な詳細がなくても実施することができることは当業者に明らかである。他の態様において、当技術分野において既知の装置、方法、手法および個々の成分は本明細書において詳細に記載されていない。
【００１４】
ナノテクノロジーは、目標が、個々の原子を制御して、現在の技術が可能にするものと比較して数千倍小さいコンピュータチップおよび他の装置を作製することである科学分野であると考えられる。現在の製造方法は、半導体材料に回路を刻み込むリトグラフィーを使用している。リトグラフィーは、製造プラントによっては1ミクロンより小さい(1,000ナノメーター)回路を製造することができるものもあるところまで、この20年間で劇的に改善したが、以前として数百万の原子の凝集物を取り扱っている。リトグラフィーは、物理的な限界に急速に近づいていると広く考えられている。半導体サイズの減少を止めないためには、個々の原子を操る新規技術が必要である。これはナノテクノロジーの領域である。一般紙において、ナノテクノロジーという用語は、リトグラフィーを含む任意のサブ-ミクロン方法をいうために使用されているときがある。このため、多数の科学者は、分子レベルの真のナノテクノロジーについて述べるときには、分子ナノテクノロジーという用語を使用し始めている。
【００１５】
カンチレバー
本発明のある態様は、1つ以上のカンチレバー110、210、310、400、510、600、700に結合したプローブ分子120、220、320、520または分析物130、230、330を使用して、分析物130、230、330を検出および／または同定するための方法および装置100、200、300に関する。カンチレバー110、210、310、400、510、600、700は、一方の末端660が取り付けられ、他方の末端420、620が遊離である小型の薄い弾性レバーである(例えば、図4、図5および図6)。典型的には、プローブ分子120、220、320、520がカンチレバー110、210、310、400、510、630表面に結合されて、1つ以上の標的分析物130、230、330に結合させられる。または、標的分析物130、230、330がカンチレバー110、210、310、400、510、630表面に結合されて、1つ以上のプローブ120、220、320、520に結合させられる。1つ以上のプローブ分子120、220、320、520または標的分析物130、230、330を各カンチレバー110、210、310、400、510、630に結合することができる。種々の態様において、カンチレバー110、210、310、400、510、600、700はナノスケールまたはマイクロスケールカンチレバー110、210、310、400、510、600、700であってもよい。
【００１６】
マイクロスケールまたはナノスケールカンチレバー110、210、310、400、510またはカンチレバーアレイ500を製造する技法は既知である(例えば、Ballerら、Ultramicroscopy. 82: 1-9,2000；Langら、Appl. Phys. Lett. 72: 383, 1998；Langら、Analytica Chimica Acta 393: 59, 1999；Hansenら、Anal. Chem. 73: 1567-71, 2001；Wuら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 1560-64, 2001；Fritzら、2000；Ilicら、Appl. Phys. Lett. 77: 450-452, 2000；米国特許第6,074,484号；同第6,079,255号；http://monet.physik.unibas.ch/nose/inficon/；http://www.phantomsnet.com/phantom/net/phantomsconf/doc/Abadal.pdf；http://lmn.web.psi.ch/annrep/mntech3.pdf；http://www.nnf.cornell.edu/2001cnfra/200138.pdf；http://www.princeton.edu/〜cml/html/research/biosensor.htmlも参照されたい)。任意のこのような既知の製造方法を、特許請求の範囲に記載されている主題を実施する際に使用することができる。原子間力顕微鏡の分野において既知のカンチレバー110、210、310、400、510は、典型的には、長さ約100〜500マイクロメーター(μm)で、厚さ約1μmである。長さ15〜500μm、幅5〜50μmおよび厚さ320ナノメーター(nm)まで様々であり、1個の大腸菌細胞の結合を検出することができた二酸化シリコンカンチレバー110、210、310、400、510、600、700が、既知の方法で製造されている(Ilicら、Appl. Phys. Lett. 77:450, 2000)。材料は限定されず、ケイ素または窒化ケイ素などのカンチレバー110、210、310、400、510、600、700構成に既知の任意の他の材料を使用することができる。本発明の他の態様において、長さ約50μm、幅10μmおよび厚さ100 nmのカンチレバー110、210、310、400、510を使用することができる。本発明のある態様において、長さ100 nmほどの小さいナノスケールカンチレバー110、210、310、400、510を使用することができる。いくつかの態様において、長さ10〜500μm、幅1〜100μm、厚さ100 nm〜1μmのカンチレバー110、210、310、400、510を使用することができる。
【００１７】
本発明の種々の態様において、カンチレバー110、210、310、400、510、600を一定の位置に維持するためにカンチレバー110、210、310、400、510、600、700に適用される力のバランスを保つことができる。カンチレバー110、210、310、400、510、630の表面が1つ以上のプローブ分子120、220、320、520に結合される場合には、標的分析物130、230、330のプローブ分子120、220、320、520への結合が、カンチレバー110、210、310、400、510に適用される最初の力の変化を生じ、カンチレバー110、210、310、400、510を屈曲または偏向させることができる。第2に、対抗力をカンチレバー110、210、310、400、510、610に適用して、カンチレバー110、210、310、400、510、600、700を最初の位置に戻すことができる。カンチレバー110、210、310、400、510、680の偏向は、例えば、コンピュータに機能的に接続されている検出ユニットによって検出することができる。コンピュータは第2の対抗力610の適用を調節して、カンチレバー110、210、310、400、510、600、700を一定の位置に維持するフィードバックループを形成することができる。フィードバックループを使用してカンチレバー110、210、310、400、510の位置を制御するための方法および装置100、200、300は、例えば、原子間力顕微鏡分野において一般に既知である。
【００１８】
本発明の特定の態様において、カンチレバー110、210、310、400、510、600、700表面に結合されるプローブ分子120、220、320、520は荷電した標的分析物130、230、330に結合することができる(図1〜図3)。外部から適用される電場が存在する場合には、カンチレバー110、210、310、400、510、600、700に結合したプローブ120、220、320、520に荷電した標的分析物130、230、330が結合することにより、カンチレバー110、210、310、400、510に適用される最初の力が生じ、カンチレバー110、210、310、400、510、690を一定の(ニュートラルな)位置から偏向する傾向がある。第2の対抗力695、795の適用を使用して、カンチレバー110、210、310、400、510、600を元の位置に戻すことができる。種々の態様において、対抗力は磁気的(図1)、電気的／ヒーター(図2、図6)または電磁放射(図3)であってもよい。タンパク質などのある種の分析物130、230、330の荷電は、溶液のpHに応じて変わることを当業者は理解している。分析物130、230、330の適当な荷電を維持するためのpHの操作は当技術分野において技術の範囲内である。本発明の種々の態様において、分析物130、230、330の荷電は、例えば、荷電基を導入することによって、分析物130、230、330の共有結合を改変することによっても操作することができる。このような変更は、分析物130、230、330がプローブ分子120、220、320、520に結合する能力に影響を与えることなく実施するべきである。
【００１９】
分析物130、230、330のカンチレバー110、210、310、400、510への結合は、偏向を開始するためにカンチレバー110、210、310、400、510、600、700の表面荷電の変化をかならず生じなくてもよいことを当業者は理解している。本発明の他の態様において、分析物130、230、330またはプローブ120、220、320、520のカンチレバー110、210、310、400、510、600表面への結合は、表面張力の変化による変更を生じることができる。このような場合には、カンチレバー110、210、310、400、510、600、700に磁気的、電気的または放射性対抗力610を適用して、それをもとの位置に戻すことができる。従って、開示されている装置100、200、300および方法を使用して、荷電または未荷電分析物130、230、330の結合を検出することができる。
【００２０】
本発明のある態様において、試料中の分析物130、230、330分子の濃度は、カンチレバー110、210、310、400、510を一定の(ニュートラルな)位置に維持するのに必要な第2の対抗力の大きさによって求めることができる。カンチレバーをニュートラルな位置に戻す1つの利点は、これらのカンチレバー110、210、310、400、510、600、700は、分析物130、230、330が結合する結果カンチレバー110、210、310、400、510、600、700の変更程度を測定する方法の場合よりも、測定することができる分析物130、230、330濃度のダイナミックレンジが大きいからである。また、カンチレバー110、210、310、400、510、600、700は一定の位置に維持されるので、カンチレバー110、210、310、400、510、600、700の寿命は、反復的な屈曲を受け、機械的ストレスおよび構造上の欠陥を生じることがあるカンチレバー110、210、310、400、510、600、700よりずっと長い。
【００２１】
カンチレバー110、210、310、400、510、600、700の位置は、などのカンチレバー110、210、310、400、510、600、700の位置をモニターするために検出ユニットを使用するなどの、当技術分野において既知の任意の方法によって測定することができる(例えば、米国特許第6,079,255号および同第6,033,852号)。いくつかの態様において、検出ユニットは、光検出器180、280、370、550に機能的に結合しているレーザー170、270、365、540などの信号源を含むことができる。または、カンチレバー110、210、310、400、510、600、700に取り付けられているまたは組み入れられている圧電型センサーは、検出器180、280、370、550に機能的に結合されてもまたはデータ処理制御装置に直接接続されてもよい。本発明の例示的な態様において、低出力レーザー光線を、カンチレバー110、210、310、400、510、600、700の表面に集束することができる。レーザー光線はカンチレバー110、210、310、400、510、670、680表面に反射して、位置検知型光検出器180、280、370、550(PSD)に衝突する。カンチレバー110、210、310、400、510、600、700がプローブ120、220、320、520または標的分析物130、230、330の結合に応答して曲がると、反射されたレーザー光線がPSD180、280、370、550に衝突する位置が移動して、偏向信号680、780を発生する。カンチレバー110、210、310、400、510、600、700の偏向程度は、反射されたレーザー光線のPSD180、280、370、550、680上での移動量から求めることができる。対抗力610、710を適用することによるカンチレバー110、210、310、400、510、600の最初の位置695、795への戻りは、PSD180、280、370、550、695、795上の最初の位置への反射されたレーザー光線の戻りによって検出することができる。カンチレバー110、210、310、400、510、600、700の位置のバランスをとるために、多数の異なる種類のセンサーおよび制御システムを使用することができ、これらのいずれかを特許請求の範囲に記載されている主題を実施する際に使用することができることを当業者は理解している。
【００２２】
一態様において、カンチレバーは、図6および7に例示されているヒーター610、710を備えることができる。カンチレバーの一般的な構造は4つの構成要素を有することができる：(1)ケイ素などの標準的な材料から製造することができるカンチレバー620、720本体；(2)電気抵抗が比較的高い金属からおそらく製造されるヒーター610、710；(3)例えば、非導電性でヒーターを保護するために使用することができる絶縁層640、740および(4)少なくとも1つの結合面630、730(官能基を結合した表面)、これは、例えば、ヒーターの反対側の部位に位置してもよい。
【００２３】
一態様において、カンチレバーは、具体的な方法、例えば、例示するように(図7)、水平方向に対称に配向されたヒーターを備えることができる。これは、別の方法で配向されたヒーターによって生じる可能性のある任意のねじれひずみを軽減する。また、カンチレバー700自体への改良は、2種以上の物質でカンチレバーをコーティングすることであってもよい。ケイ素-コーティングした表面単独ではカンチレバーを曲げる適切な温度に達しないことが知られている。ケイ素の熱膨張係数はわずか2.6 e-6/K(室温)であるので、カンチレバーを元の位置に曲げ戻させるのに十分な熱が得られない。従って、カンチレバー表面をコーティングして加熱を可能にするために考えられることは、バイメタルまたはケイ素および金属物質などの物質の組み合わせを使用することであってもよい。物質の上部と底部の熱膨張係数が大きく異なる材料の任意の組み合わせが有効である場合がある。バイメタルなどのバイモルフ物質は熱による屈曲を生じさせる。バイメタルは、インバールと銅などの熱膨張係数が異なる2つの金属を隣接させることによって製造することができる。一態様において、インバールと銅などのバイメタルを使用してカンチレバーをコーティングすることができ、ヒーター710はカンチレバーの一方の面に配置してもまたは2つのバイメタル材料の間に配置してもよい。
【００２４】
分析物分子が結合面630、730に結合する一例において、カンチレバーは、表面張力ストレスにより結合面690、790の背面方向に曲がる。屈曲は、カンチレバー670 680 770 780からの光線反射をモニターすることによって検出することができる。屈曲力は、電気ヒーター610、710によりカンチレバーを加熱することによって相殺されうる。カンチレバーの温度は、ヒーターの抵抗の変化をモニターすることによって測定することができる。カンチレバーの温度は、通過する電流650、750またはヒーターに適用される電圧を制御することによって調節することができる。光学的な検出器とヒーターコントローラーの間にはフィードバックループが存在しうる。光学的-電気的制御システムは、標準的な電気工学方法によって製造することができる。一例において、温度変化が分析物のカンチレバー600、700への結合に影響しないように、ヒーター610、710と結合領域630、730は重複しない。ヒーター610、710によって形成される屈曲力は、光学的検出器で較正することができる。
【００２５】
一例において、カンチレバーの製造は、カンチレバー620、720の本体を製造する当技術分野において既知の標準的な手法を含んでもよい。ヒーター610、710を製造するためには、チタン(Ti)の薄層(10 nm)をカンチレバーの一方の側に成膜させることができる。電圧を適用したとき確実に十分な抵抗が生ずるように、Ti層の上面に、特定のパターンを有する金の薄層を成膜させることができる。絶縁層は、電気分解を防ぐために使用されるケイ素であってもよい。絶縁層640、740は、カンチレバー620、720の本体構造(例えば、500 nm)より薄くてもよい(例えば、50 nm)。任意で、薄い金属層を絶縁層640、740の外側に成膜させてもよい。金属層は、(1)カンチレバーの他方の側と比較したとき、官能基結合をより困難にする、および(2)熱を均一に分布させる、2つの機能を提供することができる。
【００２６】
例示的な一方法において、カンチレバー600、700は、例えば、酸素プラズマでカンチレバーのケイ素側を処理して、薄い酸化ケイ素層を形成することによって機能化することができる。この処理後、当技術分野において既知の標準的な手法に従ってシラン処理試薬を使用してカンチレバー600、700に官能基を結合することができる(http://cgr.harvard.edu/macbeath/research/sm_microarrays/sm_microarrays.html)。プローブ(抗体または受容体)結合に使用するリンカー基には、例えば、アミン、アルデヒド、カルボキシル、チオールまたはヒドロキシル基が挙げられる。
【００２７】
本発明のある態様において、カンチレバー110、210、310、400、510、600、700に結合するプローブ分子120、220、320、520または標的分析物130、230、330の量は制限されることがある。本発明の他の態様において、プローブ分子120、220、320、520は、最適な信号を得るために、特定のパターンおよび／または配向で1つ以上のカンチレバー110、210、310、400、510、600、700に結合することができる。プローブ分子120、220、320、520または分析物130、230、330パターニングは、表面を種々の既知の官能基でコーティングすることによって実施することができる(例えば、Ballerら、2000年)。パターニングはまたフォトリソグラフ方法を使用して実施することができる。フォトマスクを使用して、表面の選択した領域を光線から保護または光線に露出することができる。光線は特定の領域の化学性を活性化して、プローブ分子120、220、320、520または標的分析物130、230、330を活性化された領域に結合させ、保護されている領域に結合させない。フォトリソグラフ方法は当技術分野において既知である。他の別の態様において、プローブ分子120、220、320、520は、既知のインクジェットプリンティング方法によってカンチレバー110、210、310、400、510、600、700表面にプリントすることができる。いくつかの例において、プローブ分子120、220、320、520は、カンチレバー110、210、310、400、510、600、700を支持する構造物に送達され、プローブ分子120、220、320、520は毛管作用によってカンチレバー110、210、310、400、510、600、700表面に移動することができる。
【００２８】
検出ユニット
検出ユニットは、カンチレバー110、210、310、400、510、600、700の偏向を検出するために使用することができる。カンチレバー110、210、310、400、510、600、700の偏向は、例えば、光学的および／または圧電抵抗型検出器170、270、365、540(例えば、米国特許第6,079,255号)および／または表面応力検出器170、270、365、540(例えば、Fritzら、Science 288:316-8, 2000)を使用して検出することができる。
【００２９】
圧電抵抗型検出器
本発明の例示的な態様において、圧電抵抗型検出器180、280、370、550は、カンチレバー110、210、310、400、510、600、700アーム410の固定端に組込むことができる。カンチレバー110、210、310、400、510、600の遊離端420、620の偏向はカンチレバー110、210、310、400、510、600、700に応力を生ずる。応力は、カンチレバー110、210、310、400、510、600、700の偏向程度に比例して検出器180、280、370、550の抵抗を変化させる。抵抗を測定する装置を圧電抵抗型検出器180、280、370、550に接続して、抵抗を測定し、カンチレバー110、210、310、400、510、600、700の偏向に対応する信号を発生することができる。検出器180、280、370、550に情報処理制御システムを接続することによって、カンチレバー110、210、310、400、510、600、700の偏向の程度を求め、カンチレバー110、210、310、400、510、60、7000を元の位置に戻すのに必要な対抗力695、795の量を算出するために使用することができる。圧電抵抗型検出器170、270、365、540は、カンチレバー110、210、310、400、510、600、700が偏向されたとき検出器180、280、370、550が大きな応力を受けるように、カンチレバー110、210、310、400、510、600の固定端の狭窄部に形成することができる(PCT特許出願国際公開公報第97/09584号)。
【００３０】
限定するものではない例において、圧電抵抗型カンチレバー110、210、310、400、510、600、700は、シリコン-オン-インシュレーター(SOI)ウエハーの上層に1つ以上のカンチレバー110、210、310、400、510、600、700形状を規定することによって形成することができる。カンチレバー110、210、310、400、510、600にホウ素または別のドーパントを塗布して、p型導電層を形成することができる。塗布層に電気的に接触するために金属を成膜させることができ、カンチレバー110、210、310、400、510、600、700は、その下層のバルクシリコンを除去することによって遊離される。このような方法は既知のリトグラフィーおよびエッチング技法を使用することができる。
【００３１】
本発明の別の態様において、ドーパント導入後に薄い酸化物層を成長させて、圧電抵抗器に本質的なノイズを低下することができる。圧電抵抗器カンチレバー110、210、310、400、510、600、700はまた、既知の技法を使用して、気相成長によって成長させることもできる。本発明のある態様において、圧電抵抗器を基準抵抗器と共にホイートストンブリッジ回路に組み入れることによって、カンチレバー110、210、310、400、510、600、700の抵抗性をモニターすることができる。
【００３２】
光学的検出器
本発明の他の態様において、カンチレバー110、210、310、400、510、600、700の偏向は光学的検出ユニットを使用して検出することができる。光学的検出ユニットは、光源、例えば、レーザーダイオード170、270、365、540またはアレイ状の面発光レーザー170、270、365、540(VCSEL)および1つ以上の位置検知型光検出器170、270、365、540を備えることができる。前置増幅器を使用して光電流を電圧に変換することができる。光源170、270、365、540によって放射された光線はカンチレバー110、210、310、400、510、600、700の表面に向かい、1つ以上のフォトダイオード170、270、365、540に反射される。本発明のある態様において、カンチレバー110、210、310、400、510、600、700の一部に銀などの反射率の高い面をコーティングして、反射される光線の強度を増加することができる。カンチレバー110、210、310、400、510、600、700の偏向により、反射される光線の位置が変化する。この変化は位置検知型光検出器180、280、370、550によって検出されて、分析されてカンチレバー110、210、310、400、510、600、700の偏向を求めることができる。次いで、カンチレバー110、210、310、400、510、600、700の移動を使用して、カンチレバー110、210、310、400、510、600、700を最初の位置に戻すのに必要な対抗力の量を求めることができる。
【００３３】
他の検出器
本発明の他の態様において、カンチレバー110、210、310、400、510、600、700の偏向は、圧電(piezoelectric)(PE)および／または圧電磁気型(piezomagnetic)検出ユニットを使用して測定することができる(例えば、Ballato、「Modeling piezoelectric and piezomagnetic devices and structures via equivalent networks」、IEEE Trans. Ultrason. Ferroelectr. Freq. Control 48: 1189-240, 2001)。圧電検出ユニットは、検出部の圧電効果を使用して、チャージ出力を生ずる。PE検出ユニットは、作動のために外部電源を必要としない。「スプリング」検出部は、適用されるストレスの量に比例して所定の数の電子を発生する。結晶、セラミックおよび少数のポリマーなどの多数の天然および人工材料がこの特徴を示す。これらの材料は規則的な結晶分子構造を有し、正味電荷の分布は、歪みが生じると変化する。
【００３４】
圧電材料はまた、ストレスがない状態において双極子を有することができる。このような材料では、電場はストレスによる変形によって発生し、圧電応答を生じることができる。電荷は実際に発生するのではなく、移動される。電場が双極子の方向に発生すると、移動性の電子が生じ、圧電材料の一方の端から、信号検出器180、280、370、550を介して圧電材料の他方の端に移動して回路を閉じる。移動する電子の量は、圧電材料のストレスの程度とシステムの電気容量の関数である。
【００３５】
本明細書に考察する検出技法は例示的にすぎないことおよびカンチレバー110、210、310、400、510、600、700の偏向を検出するための任意の既知の技法を使用することができることを当業者は理解している。
【００３６】
マイクロ-エレクトロ-メカニカルシステム(MEMS)
本発明のいくつかの態様において、1つ以上のカンチレバー110、210、310、400、510、600、700をマイクロ-エレクトロ-メカニカルシステム(MEMS)に組み入れることができる。MEMSは、機械的要素、センサー、アクチュエーターおよび電子工学を含む総合システムである。それらの要素は全て、既知のマイクロ加工技法によって、シリコン-系または等価な基板を含む共通のチップ上に製造することができる(例えば、Voldmanら、Ann. Rev. Biomed. Eng. 1: 401-425, 1999)。MEMSのセンサー要素を使用して、機械的、熱的、生物学的、化学的、光学的および／または磁気的現象を測定することができる。電子工学はセンサーからの情報を処理して、ポンプ、弁、ヒーター、クーラー、フィルター等などのアクチュエーター要素を制御し、それによってMEMSの機能を制御することができる。本発明の例示的な態様において、センサー要素は1つ以上のカンチレバー110、210、310、400、510、600、700の偏向を測定すると同時に、カンチレバー110、210、310、400、510、600、700を試料溶液に曝露することができる、またはカンチレバー110、210、310、400、510、600、700を一定の位置に維持するための対抗力を提供するためにアクチュエーター要素を制御する。別の例示的な態様において、カンチレバー110、210、310、400、510、600、700またはカンチレバーアレイ500は流体チャンバーに含まれてもよい。種々のポンプ、弁および他のアクチュエーターを使用して、試料の流体チャンバーの流入および流体のチャンバーからの流出を制御することができる。例示的なMEMS装置は、レーザー170、270、365、540、光検出器180、280、370、550並びに電源140、195、240、295、340、560および電極150、160、250、260、350、360などの他の電子的要素を含むこともできる。
【００３７】
MEMSの電子的要素は、集積回路(IC)方法(例えば、CMOS、バイポーラまたはBICMOS方法)を使用して製造することができる。それらは、コンピュータチップ製造に既知のフォトリソグラフおよびエッチング方法を使用してパターニングすることができる。マイクロメカニカル要素は、シリコンウエハーの一部を選択的にエッチングするまたは新たな構造層を付加して、機械的および／またはエレクトロメカニカル要素を形成するマイクロ加工方法を使用して製造することができる。MEMS製造の基本的な技法は、基板に薄いフィルム状の材料を成膜させる段階と、フォトリソグラフによるイメージングまたは他の既知のリトグラフ方法によってフィルムの上面にパターン形成したマスクを適用する段階と、フィルムを選択的にエッチングする段階とを含む。薄いフィルムは、数ナノメーター〜100マイクロメーターの範囲の厚さを有することができる。有用な成膜技法には、化学気相蒸着(CVD) 、化学蒸着、電気化学蒸着、電気メッキ、熱拡散および蒸発などの化学的手法、物理的気相蒸着、ゾル-ゲル蒸着、電着、エピタキシーおよび熱酸化並びに物理的気相蒸着(PVD)および鋳造のような物理的手法を挙げることができる。
【００３８】
製造方法は限定的ではなく、レーザーアブレーション、射出成形、分子線エピタキシー、ディップ-ペンナノリトグラフィー、反応性イオンビームエッチング、化学反応を利用したイオンビームエッチング、マイクロ波を利用したプラズマエッチング、集束イオンビームミリング、電解酸化、スキャニングプローブ方法、化学エッチング、電子ビームもしくは集束イオンビーム技術またはインプリンティング技法などの当技術分野において既知の任意の方法を使用することができる(例えば、米国特許第6,146,227号；http://www.mdatechnology.net/techsearch.asp?articleid=510；Blochら，「Optics with an atom laser beam」、Phys. Rev. Lett. 87: 123-321, 2001；Ivanisevicら、「Dip-Pen Nanolithography on Semiconductor Surfaces」、J. Am. Chem. Soc., 123: 7887-7889, 2001；Siegel、「Ion Beam Lithography」、VLSI Electronics、Microstructure Science、Vol. 16、EinspruchおよびWatts編、Academic Press, New York, 1987)。ナノエレクトロケミカルシステムを製造する方法を本発明のある態様に使用することができる(例えば、Craighead、Science 290: 1532-36, 2000)。種々の形態のマイクロ加工チップは、例えば、Caliper Technologies Inc.(Mountain View, CA)およびACLARA BioSciences Inc. (Mountain View, CA)。ガラス、プラスチック、セラミック、ケイ素、酸化ケイ素、二酸化ケイ素、窒化ケイ素、ゲルマニウム、ヒ化ガリウム並びに金属および／または金属酸化物などの金属系組成物を含むが、これらに限定されない任意の種類の既知の材料をMEMS装置の構成に使用することができる。
【００３９】
本発明の種々の態様において、図1〜図7に例示する装置100、200、300の要素の一部または全てを集積されたMEMS装置の一部として構成することができる。
【００４０】
適用
一態様において、先に例示した方法を使用して、感染性物質の核酸(DNA、mRNA、RNA、PNA)を検出することができる。当技術分野において既知の手法に基づいて、特異的な核酸プローブを設計し、合成することができる。例えば、EDC化学を使用してカルボキシル基(リンカー基)で官能基化したカンチレバーの表面にアミン修飾したDNAオリゴプローブを固定することができる(Bensonら、Science, 193, (2001), 1641-1644)。検出する前に、核酸を試料から抽出し、DNase消化(例えば、0.01単位/ul DNase、TE緩衝液中、37℃において30分、次に95℃において10分間加熱不活性化)または例えば、機械的剪断によって約200 ntの平均サイズに断片化する。200 mM NaCl、10 mM TrisHCl、pH 7.8、1 mM EDTAプラス1 ug/ml酵母tRNAを含有する緩衝液で希釈することができる。次いで、95℃において15分間DNA試料を加熱することによって試料を変性することができる。次いで、試料を4℃に冷却してから、カンチレバーに曝露することができる。次いで、カンチレバーを試料と共に、ハイブリダイゼーションのために約45℃に加熱する。その後、100 mM NaCl、10 mM TrisHCl、pH 7.8、1 mM EDTAプラス1 ug/ml酵母tRNAを含有する緩衝液でカンチレバーを洗浄する。システムは事前較正することができるので、核酸結合により発生する屈曲力を相殺するのに必要な力の量によってカンチレバー上の結合物質(DNA標的分子)の量を求めることができる。
【００４１】
別の態様において、先に例示する例をタンパク質検出に使用することができる。例えば、抗体表面の大多数のアミン基により、先の例に詳細に記載するものと同じEDC化学によって抗体をカンチレバーに固定することができる。一例において、患者の血液のタンパク質試料を希釈することができる(例えば、1×PBSプラス0.1% Tween-20)。タンパク質(抗原)をカンチレバー表面に結合し、非特異的結合物質を洗浄してから、特異的な結合を上記の方法によって検出することができる。
【００４２】
別の態様において、先に例示した例を使用して、特定の細胞および／またはウイルスを検出することができる：特異的な抗体が入手可能である場合には、タンパク質の検出(以前に例示されている)と同様の手法を使用することができる。癌細胞は、カンチレバーに固定されている抗体との細胞表面抗原相互作用(例えば、腫瘍抗原)を測定することによって検出することができる。
【００４３】
別の態様において、先に例示した例を使用して、特異的な1つ以上のリガンドおよび／またはリガンド-受容体(例えば、リガンドタンパク質)を検出することができる。例えば、先に例示するように、EDC化学を使用して、リガンド受容体をカンチレバーに固定することができる。検出方法は、タンパク質の検出に使用するものと同様であってもよい。
【００４４】
別の態様において、先に例示した例を使用して、任意の他の分子相互作用を検出することができる。原則的に、任意の既知の検出分子をカンチレバーの表面に固定し、タンパク質の検出と同様の方法を使用して結合事象を検出することができる。
【００４５】
適用の多くにおいて、洗浄段階を実施しないで、つまりカンチレバーを試料に曝露した後にリアル-タイム(即時的な)検出を実施することができ、システムを安定化させられるので、過剰の試料を除去しないでデータを収集し、結果を分析することができる。他の生化学的プロトコールは、Cold Spring Harbor Press, N. Y.発行のJoseph Sambrook、David W. Russellによる「Molecular Cloning：A Laboratory Manual」を参照されたい。
【００４６】
プローブ分子の作製
特許請求の範囲に記載されている主題を実施する際に多種多様のプローブ分子120、220、320、520を使用することができる。以下の考察は、本発明の種々の態様に有用な2つの種類のプローブ120、220、320、520-オリゴヌクレオチドおよび抗体に焦点を絞っている。しかし、任意の種類の既知のプローブ分子120、220、320、520を使用することができることを当業者は理解している。他の種類のプローブ120、220、320、520を作製し、使用する方法は当技術分野において既知である。
【００４７】
オリゴヌクレオチドプローブ
本発明のある態様において、オリゴヌクレオチドプローブ120、220、320、520は、メッセンジャーリボ核酸(RNA)、ゲノムデオキシリボ核酸(DNA)、クローニングされた核酸挿入物、核酸増幅産物または任意の他の種類の核酸などの種々の核酸分析物130、230、330を検出するために使用することができる。
【００４８】
オリゴヌクレオチド120、220、320、520は、アデニン(「A」)残基はチミン(「T」)またはウラシル(「U」)残基と水素結合し、シトシン(「C」)残基はグアニン(「G」)残基と水素結合する、標準的なワトソン-クリック塩基対形成によって核酸分析物130、230、330に結合することができる。オリゴヌクレオチドプローブ120、220、320、520を作製する方法は当技術分野において既知である。オリゴヌクレオチド120、220、320、520は市販の合成装置(例えば、Applied Biosystems、Foster City、CA)で合成してもまたは業者(例えば、Midland Certified Reagents、Midland、TX；Proligo、Boulder、CO)から購入してもよい。標準的なオリゴヌクレオチド120、220、320、520を使用することができるが、ペプチド核酸120、220、320、520などのオリゴヌクレオチド120、220、320、520の改変物または類似物を開示されている方法に使用することができる。
【００４９】
一般に、鎖長少なくとも6、7または8塩基のオリゴヌクレオチドを核酸ハイブリダイゼーションのプローブ120、220、320、520として使用することができる。本発明のある態様において、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、60、75、100以上の塩基のさらに長いオリゴヌクレオチド120、220、320、520を使用することができる。13塩基以上のオリゴヌクレオチド120、220、320、520の使用は、選択した標的核酸分析物130、230、330への特異的な結合を容易にすることができる。当業者は、標的核酸配列の独自の部分のコンピュータデータベース検索を実施するなどの、標的核酸分析物130、230、330に特異的に結合するオリゴヌクレオチドプローブ120、220、320、520を選択し、作製する技法に精通している。本発明の種々の態様において、所定の標的配列に対して選択的または特異的な結合を示すオリゴヌクレオチドプローブ120、220、320、520を作製することができる。
【００５０】
種々の程度の緊縮性を使用して、オリゴヌクレオチド120、220、320、520を標的核酸130、230、330にハイブリダイゼーションすることができる。高い選択性を要求する適用は、典型的には、ハイブリッドを形成するために比較的緊縮的な条件、例えば、約50℃〜約70℃の温度において約0.02 M〜約0.10 M NaClなどの比較的低い塩および／または高温条件を使用する。このような高度に緊縮性の条件は、プローブ120、220、320、520と標的鎖130、230、330の間のミスマッチがあったとしてもわずかであり、特異的な核酸標的を検出するのに特に好適であると思われる。または、ハイブリダイゼーションは、例えば、約20℃〜約37℃の温度において50 mM Tris-HCl(pH 8.3)、75 mM KCl、3 mM MgCl2、10 mMジチオスレイトールの条件下で実施することができる。使用される他のハイブリダイゼーション条件は、約40℃〜約72℃の温度において約10 mM Tris-HCl(pH 8.3)、50 mM KCl、1.5μM MgCl2を含んでもよい。ホルムアミドの量を漸増して添加することによって条件はさらに緊縮性になりうることが一般に理解されている。
【００５１】
本発明のある態様において、プローブ120、220、320、520の分析物130、230、330への結合速度または効率は、集束電場を使用して、カンチレバー110、210、310、400、510付近に荷電分析物130、230、330を移動させて濃縮することによって増加することができる。いくつかの例において、プローブ120、220、320、520の分析物130、230、330へのハイブリダイゼーションの緊縮性は電子的に制御することもできる。分析物130、230、330の移動およびハイブリダイゼーションを制御する方法および装置100、200、300は当技術分野において既知である(例えば、米国特許第6,051,380号および同第6,207,373号)。
【００５２】
抗体プローブ
抗体プローブ120、220、320、520を作製し、使用する方法は当技術分野において既知である(例えば、HarlowおよびLane、Antibodies：A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、1988年)。抗体120、220、320、520はポリクローナルであっても、モノクローナルであってもよい。ポリクローナル抗体120、220、320、520を作製するためには、関心対象の抗原をウサギなどの被験動物に注射する。抗原の活性は、フロイントの完全または不完全アジュバントなどのアジュバントを同時投与することによって増加することができる。抗原性は、抗原をウシ血清アルブミンまたはキーホールリンペットヘモシアニンなどの担体に結合することによって増加することができる。動物の免疫応答は、抗原を定期的に追加免疫注射することによって増加することができる。抗体120、220、320、520は動物の循環液中に分泌され、放血または心穿刺によって入手することができる。抗体120、220、320、520は、血液凝固、遠心分離、ろ過および／またはインムノアフィニティー精製(例えば、抗-ウサギ抗体を使用)またはアフィニティークロマトグラフィー(例えば、プロテイン-Aセファロースカラムクロマトグラフィー)などの既知の方法によって他の血液成分から分離することができる。
【００５３】
モノクローナル抗体120、220、320、520(MAb)は、米国特許第4,196,265号に例示されているものなどの既知の技法を使用することによって作製することができる。典型的には、その技法は、マウスなどの好適な動物を抗原で免疫化することに関係する。上記に開示する担体および／またはアジュバントを、定期的な追加抗原注射と共に使用することができる。例えば、脾臓またはリンパ節を切除し、リンパ球を精製することによって、抗体産生B細胞を免疫化した動物から得る。これらを骨髄腫細胞系統の不死化した細胞と融合して、抗体産生ハイブリドーマ細胞を作製する。このような細胞は抗体120、220、320、520を培地中に分泌し、これを上記のようにさらに精製することができる。1つの種類の抗体120、220、320、520を分泌する個々のハイブリドーマクローンは連続希釈および細胞培養によって得ることができる。所定の標的分析物130、230、330に対する異なる抗体120、220、320、520クローンの選択性は、ウェスタンブロット法などの標準的な方法によって測定することができる。
【００５４】
本発明の種々の態様において、FAb断片120、220、320、520などの抗体断片120、220、320、520を既知の方法で作製し、プローブ120、220、320、520として使用することができる。修飾抗体120、220、320、520、遺伝的に操作された抗体120、220、320、520、ヒト化抗体120、220、320、520および／または1本鎖抗体120、220、320、520を作製する方法は既知である。任意のこのような抗体、抗体断片または抗体類似物をプローブ分子120、220、320、520として使用することができる。
【００５５】
標的分子または標的分析物の表面への結合
本発明の種々の態様において、プローブ分子120、220、320、520または標的分析物130、230、330を1つ以上のカンチレバー110、210、310、400、510、の表面に結合することができる。種々の種類の分子を表面に結合する方法は当技術分野において既知である。本発明の以下の例示的な態様は例示目的だけのために提供されており、特許請求の範囲に記載されている主題の範囲を制限するものではない。
【００５６】
本発明の種々の態様において、関心対象のプローブ分子120、220、320、520または分析物130、230、330は共有結合または非共有結合的相互作用によって表面に結合することができる。限定するものではない例において、結合は表面をストレプトアビジンまたはアビジンでコーティングし、次いでビオチン化したプローブ分子120、220、320、520または標的分析物130、230、330の結合によって生じうる。または、結合は、シリコンまたは他の表面をポリ-L-Lys(リジン)でコーティングし、次に二官能性架橋試薬を使用して、アミノ-またはスルフヒドリル-含有プローブ分子120、220、320、520または標的分析物130、230、330を共有結合することによって生じうる(Runningら、BioTechniques 8: 276-277, 1990；Newtonら、Nucleic Acids Res. 21: 1155-62, 1993)。例えば、カルボジイミド架橋試薬を使用することによって、カルボキシル-含有プローブ120、220、320、520または分析物130、230、330をリジンアミノ側鎖に直接共有結合するなどの別の結合技法を使用してもよいことを当業者は理解している。
【００５７】
本発明の他の態様において、ニトレン、カルベンまたはケチル基などの光反応性種を含有するフォトポリマーを使用して、プローブ分子120、220、320、520または標的分析物130、230、330を表面に結合することができる(米国特許第5,405,766号および米国特許第5,986,076号を参照されたい)。結合はまた、表面を誘導化した金属でコーティングし、次にアミノ-またはスルフヒドリル-含有プローブ分子120、220、320、520または標的分析物130、230、330を共有結合することによっても生じうる。未処理のプローブ120、220、320、520または分析物130、230、330がアミノまたはスルフヒドリル基を含有しない場合には、プローブ120、220、320、520または分析物130、230、330は、適当な基を含むように既知の方法によって共有結合により修飾することができる。
【００５８】
分子を架橋するための他の例示的な方法は米国特許第5,603,872号および米国特許第5,401,511号に開示されている。種々のリガンドを、アミン残基の架橋により表面に共有結合することができる。限定するものではない別の例において、ヘテロ二官能性架橋試薬およびこの架橋試薬を使用する方法は米国特許シリアル番号第5,889,155号に開示されている。この架橋試薬は、例えば、求核性ヒドラジド残基を親電子性マレイミド残基と組み合わせて、一例において、アルデヒドの遊離チオールへのカップリングを可能にする。使用する架橋試薬は種々の官能基を架橋するように設計することができる。
【００５９】
プローブ120、220、320、520または分析物130、230、330を固体支持体に固定する別の技法は、シランなどの自己-組織化モノマーに基づいている。このような分子は、プローブ120、220、320、520または分析物130、230、330を固定するために使用することができる秩序よく、高密度に充填されているモノマーを形成することができる。アミン基は、アミノシランを使用することにより表面にコーティングすることができる。別の有用なシランには、3-グリシドキシプロピルトリメトキシシラン(GOP)またはアミノプロピルトリメトキシシラン(APTS)が挙げられる。種々の種類のプローブ120、220、320、520または分析物130、230、330を、直接または架橋試薬の使用によりシランに結合することができる。
【００６０】
オリゴヌクレオチドまたは核酸プローブ120、220、320、520または分析物130、230、330に関係する本発明の態様において、結合は、5'-リン酸化核酸を化学的に修飾した表面に直接共有結合することによって生じうる(Rasmussenら、Anal. Biochem. 198: 138-142, 1991)。核酸と表面の共有結合は、例えば、水溶性カルボジイミドとの縮合によって形成されうる。この方法は、5'-リン酸塩を介する核酸の5'-結合を主に促進する。
【００６１】
二官能性架橋試薬は結合に有用となりうる。例示的な架橋試薬には、グルタールアルデヒド(GAD)、二官能性オキシラン(OXR)、エチレングリコールジグリシジルエーテル(EGDE)および1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドなどのカルボジイミド(EDC)が挙げられる。本発明のいくつかの態様において、表面の官能基は架橋化合物に共有結合して、分析物130、230、330に対するプローブ120、220、320、520の結合相互作用への表面の立体障害を低下することができる。典型的な架橋基にはエチレングリコールオリゴマーおよびジアミンが挙げられる。特許請求の範囲に記載されている方法および装置100、200、300は本明細書に開示されている例に限定されるのではなく、プローブ分子120、220、320、520または標的分析物130、230、330をカンチレバー110、210、310、400、510に結合するための任意の既知の方法を使用することができる。
【００６２】
各表面に結合するプローブ分子120、220、320、520または標的分析物130、230、330の数は、表面の感受性およびシステムのノイズレベルに応じて変わる。長さ約500μmの大型のカンチレバー110、210、310、400、510、600、700は、カンチレバー110、210、310、400、510、600、700あたり1010分子もの多くの結合プローブ120、220、320、520または分析物130、230、330を使用することができる。しかし、小型のカンチレバー110、210、310、400、510、600、700を使用すると、結合プローブ120、220、320、520または分析物130、230、330の数は大幅に低下することがある。本発明のある態様において、カンチレバー110、210、310、400、510、600、700に結合したプローブ分子120、220、320、520への1つの標的分析物130、230、330の結合は開示されている方法によって検出することができる。
【００６３】
本発明のある態様において、プローブ分子120、220、320、520または分析物130、230、330は特定のパターンでカンチレバー110、210、310、400、510、600、700表面に結合することができる。このような結合パターンは当技術分野において既知の種々の方法によって提供することができる。例えば、既知のナノリトグラフィーおよびエッチング方法を使用して、金フィルムなどの結合表面をカンチレバー110、210、310、400、510、600、700にコーティングすることができる。金表面は、スルフヒドリルまたはアミン基を有する分子に共有結合することができる。または、プローブ120、220、320、520または分析物130、230、330を結合することができる反応性基を、ディップ-ペンナノリソグラフィーなどの任意の既知の方法を使用して選択したパターンでカンチレバー110、210、310、400、510、600、700の表面に沈着することができる。他の選択肢において、光活性化性の反応性基を、例えば、レーザーリトグラフィーを使用して特定のパターンで表面に均一に沈着し、活性化することができる。
【００６４】
追加の適用
医師は、疾患を同定する分子を誘導して、飛び込み台に似ている顕微鏡サイズのカンチレバーに結合させて曲げることによって疾患を同定する分子を検出する少なくとも1つの高感度な装置を使用して数ダースの疾患を試験することができると考えられる(図1〜図7を参照されたい)。この技術は、前立腺癌に特徴的なタンパク質マーカーである前立腺特異的抗原(PSA)の診断試験として働くのに十分に感度が高いことを1つの検討は明らかにしている。また、この技術は、生物の多様性の最も一般的な形態である、一塩基多型またはSNPs(「snips」と発音される)と呼ばれるDNAのわずかな変更を見つけるための有望性を示している。
【００６５】
1つの研究チーム(University of Southern California(USC) in Los Angeles、the University of California in Berkeley(UCB)およびOak Ridge National Laboratory(ORNL))はマイクロカンチレバー技術を研究し、開発した。これらの研究者らは、コンピュータマイクロプロセッサーを製造するために使用されるものと同じ技法を使用して、窒化ケイ素からカンチレバーを作製した。他の研究者らは、特定のタンパク質を検出するための抗体またはSNPsを検出するための1本鎖DNA配列でカンチレバーの上面をコーティングする方法を完成させた。この適用の詳細な方法を使用して、分析物の結合およびカンチレバーの屈曲によって形成される偏向を戻すための装置を組み入れることによって、これらの研究室で現在実施されている技法を改善することができる。カンチレバーに結合するタンパク質またはDNA濃度が高くなるほど、カンチレバーの偏向およびストレスは大きくなるので、これらの改善が必要とされる。
【００６６】
一例において、カンチレバーは幅約50ミクロン(ヒトの毛髪の幅の半分)、長さ200ミクロン(1ミリメーターの1/50)および厚さ1/2ミクロンであってもよい。いくつかの例において、分子が表面に結合すると、カンチレバーは約10〜20ナノメーターだけ移動する。
【００６７】
カンチレバー技法は、今日においてPSA(prostate specific antigen)のようなタンパク質マーカーを検出するための標準である、時間のかかるELISA[enzyme-linked immunosorbent]アッセイ法より感度が高くないとしても同様に良好である臨床的に関連のある閾値より20倍低いレベルを検出するのに十分感度が高いことを最初のPSA試験結果は報告している。
【００６８】
例えば、乳癌、結腸直腸癌および嚢胞性線維症のような疾患を予測するDNA突然変異の他のマーカーは、患者が症状を示す前でもこれらのミスマッチにより検出されると思われる。カンチレバーが下方ではなく上方に曲がるのが、1塩基変化などのいくつかの場合において観察されている。カンチレバーが異なる方向に曲がっても、図6および／または図7に例示するようにカンチレバー内に配置したヒーターを使用してもカンチレバーを元の位置に戻すことができることが考慮されている。
【００６９】
提案される具体的な試験
前立腺-特異的抗原
一態様において、PSA前立腺-特異的抗原のレベルは、本明細書に詳細に記載する方法の任意の1つ以上を使用してモニターすることができる。PSAは正常および異常な前立腺細胞によって産生される。PSAレベルの上昇は、前立腺炎(前立腺の炎症)および両性の前立腺過形成(BPH)などの良性の前立腺状態または前立腺における悪性(癌性)の増殖が認められる男性の血液中で見ることができる。PSAによって医師は良性の前立腺状態(高齢の男性に非常に一般的である)と癌を識別することはできないが、PSAレベルの上昇は、癌が存在するかどうかを判定するために他の試験が必要であることを示すことができる。
【００７０】
PSAレベルは、前立腺癌治療の有効性をモニターする際および治療が終了した後の再発をチェックする際に有用であることが示されている。再発をチェックする際、1つの試験は、有意な変化にならない可能性のあるPSAレベルのわずかな上昇を示すことがある。医師は、一般に、1回の高い結果に焦点を絞るではなく、経時的に多数回の試験においてPSAレベルを着実に上昇させるなどの傾向を探す。
【００７１】
冠動脈性心疾患
約700万人の米国人が、心疾患の最も一般的な形態である、CHDを患っている。この種類の心疾患は、心臓に供給している冠動脈の狭窄によって生じる。CHDは米国における男女の第1位の死亡原因である。毎年、500,000人を超える米国人がCHDによって生じる心臓発作で死亡している。食品医薬品局(FDA)は、医師が冠動脈性心疾患(CHD)のリスクを予測する能力を増加する新規検査室用血液試験を市場に出すことを最近明らかにした。
【００７２】
PLACと呼ばれる試験は、リポタンパク質関連ホスホリパーゼA2と呼ばれる酵素を測定することによって機能する。この酵素は、マクロファージと呼ばれる種類の白血球細胞によって産生される。マクロファージは大量のこの酵素を産生し、ヒトがCHDになると血液中にそれを放出する。一態様において、リポタンパク質関連ホスホリパーゼA2のレベルは、CHDのリスクを求めるための1つの試験としてカンチレバーを使用する技術のこのような適用を使用して測定することができる。最も高いPLAC試験結果および130 mg/dLより低いLDLコレステロールレベルの被験者において最も高いリスクの増加が見られることが1つの検討において発見された。
【００７３】
PLAC試験はCHDを予測する最終的な試験ではない。この試験は、臨床評価および患者のリスク評価のための他のツールと共に使用されるとき、支持的な情報を提供する。高いPLAC試験結果は130mg/dLより低いLDL-コレステロールスレベルと共に、低いPLAC試験結果を有する患者と比較したとき、冠動脈性心疾患であるリスクを患者が2〜3倍有するという高い信頼性を医師に提供する。
【００７４】
他の適用
一態様は、呼気中の一酸化窒素濃度の低下の関連と抗-炎症治療が喘息に関連する肺の炎症を低下している可能性があるという関連により呼気中の一酸化窒素の検出を含むことができる。一酸化窒素レベルは喘息のあるヒトの呼気中で増加していることおよび一酸化窒素レベルの変化は喘息の治療が機能しているかどうかを示すことができることを最近の証拠は示している。喘息は世界中で数百万人のヒトに影響をあたえている多様性の大きい疾患である。喘息の場合、肺は炎症を生じ、収縮し、気流を制限し、呼吸を困難にする。米国における喘息の発現率はここ数年増加しており、今ではほぼ5百万人の小児を含む約1500万人の米国人に影響を与えている。毎年、喘息は約200万人の救急治療室への来院を生じ、約500,000人が入院し、4,500人が死亡する。
【００７５】
一態様は乳癌のスクリーニングを含み、例えば、ある種の遺伝子(例えば、CA 15-3、CA 549、CA M26、M29、TPA、MCA、MSA、CAM26)をモニターすることができると同時に卵巣癌、CA-125などの他の癌もモニターすることができる。
【００７６】
さらに別の例は、現在の1時間試験より時間がかからない迅速なStrep-咽喉試験(A群ストレプトコッカス、A群β溶血性ストレプトコッカス検出)を含むことができる。別の例は、アルツハーマー病に関連するTau/Aβ42遺伝子の分析であってもよい。また、高コレステロールおよびトリグリセリドレベルに至る遺伝的要素またはアルツハーマー病が起こりうるという診断に関連する他の素因となる症状を有すると疑われる場合には、ApoE 遺伝子型解析(アポリポタンパク質E遺伝子型解析)も血液試料から分析することができる。
【００７７】
一例において、異なるポリマー層をコーティングしたシリコンカンチレバーアレイを作製した。分析対象のガスはポリマーの異なる層を異なる速度で拡散して、ポリマーを膨張させ、カンチレバーを曲げた。(ニューラルネットワークまたは主成分分析(PCA)などの技法を使用する)8つのカンチレバーの屈曲パターンの調査はガス検出の明確な特徴を提供した。Hans Peter Lang of IBM's Zurich Research Laboratory。従って、これらの技法は、プロセス制御および品質管理、環境モニタリング、複雑な臭気および蒸気の特徴づけ、香料の設計、エノロジー(ワインの研究)において並びに患者の呼気を分析する(例えば、糖尿病発症に関連する一酸化窒素)医学において用途を有する。
【００７８】
癌などの複雑な疾患の診断およびモニタリングは多数のタンパク質の定量的検出を必要とする。生物医学的調査における最近の迅速な進歩の結果として、利用可能な遺伝的試験の数が増加している。遺伝的試験は、多数の疾患を診断する方法を激変する可能性があることが言われている。しかし、遺伝的試験は、医者が疾患を診断する助けにはならない。遺伝的試験が実施される数多くの異なる理由が存在する。これらには以下が挙げられる：臨床的遺伝的試験(現在または将来の疾患を診断する)、ファルマコゲノミクス(治療薬による治療の評価)、犯罪調査または法医学研究の同定試験(「DNA試験」と呼ばれる場合もある)、親子関係の試験(正式には父子鑑定試験と呼ばれる)、移植のための組織適合試験、細胞遺伝学(染色体分析)および感染性疾患試験。
【００７９】
遺伝的試験に関しては、一塩基多型(SNPs)および他の形態の遺伝的変化が、疾患の罹患性および治療反応を予測する際に役割を果たすと考えられることにより、集中的な調査の焦点である。含まれる方法の任意の1つ以上を使用して、1つ以上のSNP(s)の有無を検出することができる(例えば、状態または疾患の関連性のために)。また、含まれる方法を使用して、他の種類の多型(すなわち、可変反復配列(variable repeats)および遺伝子欠損)も評価することができる。
【００８０】
DNAおよび他の生物分子が、分子の特異的なコードまたは生化学を使用して弁などの機構を作動することができることは医学において用途を有しうる。癌の増殖を攻撃するシステムおよび生体内の適当な部位への適切な用量の化学物質の放出は、標的腫瘍種から生化学信号を得た場合のみ開くように化学的にプログラムされたナノ-弁が備えられているちっぽけなマイクロカプセルを使用して実施することができる。カンチレバー技術はこれらの変化をモニタリングするのに十分に感度が高いことが考えられる。これにより、副作用を最小にし、侵襲的な手術を行わないで、正しい時期に正しい部位において正しい治療を行うことが可能になると思われる。この方法は、特定の生化学的認識をナノメカニカルな動きに直接変換することに基づいている。
【００８１】
情報処理制御システムおよびデータ解析
本発明のある態様において、装置100、200、300のカンチレバー110、210、310、400、510検出ユニットまたは他の要素にデータ処理制御システムを接続することができる。本発明の例示的な態様において、本発明のシステムは情報を通信するためのバスまたは他の通信手段と、情報を処理するためにバスに接続されているプロセッサーまたは他の処理手段を備えるコンピュータを組み入れている。本発明の一態様において、プロセッサーは、Intel Corp.(Santa Clara、CA)社製のPentium(登録商標)IIファミリー、Pentium(登録商標)IIIファミリーおよびPentium(登録商標)4ファミリーのプロセッサーを含むPentium(登録商標)ファミリーのプロセッサーから選択される。本発明の別の態様において、プロセッサーはCeleron(登録商標)、Itanium(登録商標)、X-ScaleまたはPentium Xeon(登録商標)プロセッサー(Intel Corp.、Santa Clara、CA)であってもよい。本発明の種々の他の態様において、プロセッサーはIntel IA-32またはIntel IA-64アーキテクチャなどのIntelアーキテクチャに基づいてもよい。または、他のプロセッサーを使用してもよい。
【００８２】
コンピュータは、情報およびプロセッサーによって実行される命令を保存するために、バスに接続されているランダムアクセスメモリー(RAM)または他の動的記憶装置(メインメモリー)をさらに備えることができる。メインメモリーは、プロセッサーによる命令の実行中に一時的数値変数または他の中間情報を保存するためにも使用することができる。コンピュータは、静的情報およびプロセッサーの命令を保存するために、バスに接続されているリードオンリーメモリー(ROM)または他の静的記憶装置をさらに備えることができる。ディスプレイ装置、キーボード、マウス、モデム、ネットワークカードまたは当技術分野において既知の他の要素などの他の標準的なコンピュータ要素を、情報処理制御システムに組み入れることができる。本明細書に記載する例とは異なる装備の情報処理制御システムをある種の実行のために使用することができることを当業者は理解している。従って、システムの構成は本発明の範囲内で変更することができる。
【００８３】
本発明の特定の態様において、検出ユニットはバスに機能的に接続することができる。プロセッサーは検出ユニットからのデータを処理することができる。処理後のデータおよび／または生データはメインメモリーに記憶することができる。プロセッサーは検出ユニットからのデータを分析して、試料に存在する標的分析物130、230、330の正体および／または量を求めることができる。
【００８４】
情報処理制御システムは、カンチレバー110、210、310、400、510をニュートラルな位置に維持するために適用される対抗力の大きさなどの、カンチレバー110、210、310、400、510装置100、200、300の自動制御をさらに提供することができる。プロセッサーからの命令は、バスを介して種々の出力デバイス、例えば、電源、レーザー170、270、365、540装置、エレクトロマグネット、コントロールポンプ、電気泳動または電気浸透流リードおよび装置100、200、300の他の要素に送信することができる。
【００８５】
本明細書に記載する処理はプログラム式プロセッサーの制御下で実施することができるが、本発明の別の態様において、処理は、例えば、Field Programmable Gate Arrays(FPGA)、TTLロジックまたはApplication Specific Integrated Circuits(ASIC)などの任意のプログラム式またはハードコードされたロジックによって完全にまたは部分的に実行することができることに注目すべきである。さらに、記載する方法は、プログラム式汎用コンピュータ要素および／または特注ハードウェア要素の任意の組み合わせによって実施することができる。
【００８６】
本発明のある態様において、特注設計されたソフトウェアパッケージを使用して検出ユニットから得られるデータを分析することができる。本発明の別の態様において、データ分析は、データ処理および制御システム並びに入手可能な公開ソフトウェアパッケージを使用して実施することができる。
【００８７】
実施例
実施例1：チャージ-マグネットバランストカンチレバー
図1は、分析物130を検出および／または同定するための例示的な装置100および方法を例示する。装置100は、1つ以上のプローブ分子120に結合された1つ以上のカンチレバー110を含む。プローブ分子120は、電気的に荷電した標的分析物130に結合する。電位の傾きは、カンチレバー110に隣接する1対の電極150、160に取り付けられた直流電源140によって与えられる。荷電標的分析物130が結合すると、カンチレバー110は一方の電極150または他方の電極160の方向に偏向される。本発明のある態様において、電極150、160は、分析物130のプローブ分子120方向への移動を最初に制御するために使用することができる。分析物130がプローブ120に結合したら、(例えば、未結合の分析物を適当な緩衝液を使用して洗浄することによって)未結合の分析物130をカンチレバー110から離れるように移動させることができる。プローブ120が分析物130に結合したら、電極150、160を使用して、カンチレバー110の偏向を生ずる電場を与えることができる。
【００８８】
上記に考察するように、本発明の別の態様において、カンチレバー110表面に結合されているプローブ分子120への中性の分析物130の結合によってもカンチレバー110の偏向を生じることができる。カンチレバー110の偏向が表面荷電または表面張力の変化によって生じるかどうかにかかわらず、カンチレバー110をニュートラルな位置に維持するために同じ種類の対抗力を使用することができることを当業者は理解している。このような態様において、図1に例示する第1の電源140による電場の傾きの適用は選択的であってもよい。
【００８９】
カンチレバー110の偏向は、例えば、レーザー170および位置検知型検出器180を含む検出ユニットによって検出することができる。レーザー170からの光線はカンチレバー110の表面から反射されて、検出器180に当たる。カンチレバー110が、分析物130の結合に応答して曲がるとき、反射されたレーザー光線が当たる検出器180の位置はシフトする。反射されたレーザー光線がシフトする量は、カンチレバー110の曲がりの程度に比例する。
【００９０】
対抗力は、カンチレバー110を元の一定の位置に戻すために適用することができる。図1に示す本発明の例示的な態様において、対抗力は磁気的である。電磁石190は、例えば、カンチレバー110にナノワイヤーコイルを被覆し、コイルに絶縁材を被覆することによってカンチレバー110に取り付けるまたは組み入れることができる。第2の電源195を使用して電場を適用すると、ナノワイヤーコイルは磁化する。磁化したコイルは、例えば、外部から適用した傾斜磁場(示していない)と相互作用してカンチレバー110を元の一定の位置に戻すことができる。
【００９１】
本発明のある態様において、検出器280並びに第1の電源140および第2 の電源195は、コンピュータなどの情報処理制御システムに機能的に接続される。いくつかの態様において、カンチレバー110に加わる力は、リアルタイムでコンピュータで正確に均衡することができ、その結果分析物130の結合は、電磁石190に対する電圧の増加によって速やかに相殺される。この場合には、カンチレバー110は一定の決まった位置にある。適当に較正して、プローブ分子120に結合する分析物130の数は、カンチレバー110の偏向を防止するのに必要な電磁石190に供給される電力の増加量から求めることができる。いくつかの場合において、開示する方法によって1つの分析物130のカンチレバー110への結合を検出することができる。
【００９２】
実施例2：チャージ-バランストカンチレバー
図2は、分析物230を検出および／または同定するための別の例示的な装置200および方法を例示する。装置200は、荷電または中性の分析物230に結合することができる1つ以上のプローブ分子220に結合したカンチレバー210を含む。荷電分析物230の結合により、1対の電極250、260に取り付けられた第1の電源240によって適用される電場の傾きに応答してカンチレバー210の偏向を生ずる。中性の分析物230の結合は、表面張力の変化によりカンチレバー210の偏向を生ずることができる。カンチレバー210の偏向は、レーザー270および位置検知型光検出器280を備える検出ユニットによって検出することができる。
【００９３】
図2に例示する本発明の例示的な態様において、対抗力は、カンチレバー210に取り付けられているまたは組み入れられている誘導荷電貯蔵層290によって提供される。例えば、カンチレバー210上に成膜され、絶縁樹脂が被覆されている薄層状の半導体材料または強誘電材料を含む荷電貯蔵層290を第2の電源295に接続する。一般に、誘導電圧に応答して、荷電貯蔵層290は、結合した分析物230または分析物230の結合に関連する表面張力に関連する荷電を相殺することができる有効電荷296を蓄積する。対抗力を適用することによって、カンチレバー210に加わる正味の力はゼロに低下し、カンチレバー210は元の一定の位置に維持されるかまたは戻される。実施例1と同様に、結合する分析物230の数は、カンチレバー210を一定の位置に維持するのに必要な力の量によって決定することができる。
【００９４】
実施例3：放射圧によって均衡されるカンチレバー
種々の物体に力を適用するための電磁的な(例えば、光線)照射は、例えば、光ピンセットの構成および使用において既知である(例えば、Walkerら、FEBS Lett. 459: 39-42, 1999；Benninkら、Cytometry 36: 200-208, 1999；Mehtaら、Science 283:1689-95, 1999；Smithら、Am. J. Phys. 67: 26-35, 1999)。図3は、分析物330を検出および／または同定するための別の例示的な装置300および方法を例示する。
【００９５】
放射圧対抗力を提供するために別の構成が利用可能である。図3に例示する本発明の態様において、局面(例えば、ビーズ390)および周囲の媒体とは異なる屈折率を有する透明な物体をカンチレバー310の任意の部分に取り付けることができる。集束光線375は透明な物体390に焦点を形成して、対抗力を発生することができる。本発明の別の態様において、光線375を、反射性が大きくてもよい平坦な面に向けることができる。表面はカンチレバー310の一部または全てを含んでもよい。または、平坦な面をカンチレバー310に取り付けることができる。対抗力の強度を調節するように光線375強度を制御することができる。本発明の他の別の態様において、2つ以上の光線375を、カンチレバー310の同じ面またはカンチレバー310の異なる面に向けて、対抗力の強度を制御することができる。光線375を平坦な面に向ける場合には、光線375は集束されてもまたは集束されなくてもよい。局面390を有する透明な物体を使用する場合には、光線は集束されうる。
【００９６】
図3に例示する装置300は、プローブ分子320が結合されている1つ以上のカンチレバー310を含む。プローブ分子320は荷電または未荷電標的分析物330に結合することができる。分析物330が荷電している場合には、カンチレバー310は、電源340に取り付けられている1対の電極350、360が隣接しており、電場の傾きを形成することができる。電場の傾きが存在する場合における荷電分析物330の結合は、カンチレバー310を偏向する傾向のある力を発生する。蒸気に考察するように、未荷電分析物330の結合は、表面張力の変化を誘導することによってカンチレバー310を偏向することができる。レーザー365および光検出器370はカンチレバー310の偏向程度に関する情報を提供することができる。
【００９７】
カンチレバー310に取り付けられた曲線状の透明な物体390を使用する本発明の態様において(図3)、分析物320の結合に応答するカンチレバー310の偏向は、光ピンセットに使用するものと同様の放射力によって相殺することができる。レーザー光線375は、透明な誘電性の球体またはビーズ390上の対物レンズ380により集束することができる。球体またはビーズ390は、周囲の媒体より大きい屈折率を有する。対物レンズ380は、球体またはビーズ390に隣接する2つ以上の焦点385、395を同時に形成することができる。例えば、カンチレバー310の偏向による焦点385、395方向への球体またはビーズ390の移動は、カンチレバー310を一定の位置に戻す傾向がある対抗力を形成する。本発明の別の態様において、焦点385、395を移動するように光線の通路を変更することができるおよび／または対物レンズ380を移動することができる。ある態様において、光学経路に多数の連続する焦点285、395を置くことが可能である。
【００９８】
対抗力は、光ピンセットについて既知であるように、散乱力と勾配力の均衡を提供する。対抗力の強度は、レーザー光線375の強度と、ビーズ390と焦点385、395の距離の関数である。従って、カンチレバー310の偏向に応答してレーザー光線375の強度、光線通路および／または対物レンズ380の位置を調節するコンピュータ制御式のフィードバックループを使用して、カンチレバー310を一定の位置に維持することができる。上記に考察するように、カンチレバー310を一定の位置に維持するのに必要な対抗力の強さは、カンチレバー310に結合しているプローブ分子320に結合した荷電分析物330の数に比例する。図3はカンチレバー310の一方の端に取り付けられた透明な物体390を示すが、透明な物体390はカンチレバー310の任意の一部に取り付けられてもよいことを当業者は理解している。
【００９９】
実施例4：カンチレバーの設計
例示的なカンチレバー400、510の設計を図4および図5に例示する。図4は、幅広い端部420に取り付けられている長くて、薄く、幅の狭いバー410を含む1つのカンチレバー400を示す。プローブ分子120、220、320、520はカンチレバー400の端部420に結合されると思われる。この設計は、分析物130、230、330の結合に応答してカンチレバー400の偏向程度を最大にすると思われる。
【０１００】
図5はカンチレバー510の例示的なアレイ500を例示する。各カンチレバー510は結合されているプローブ分子520を含む。本発明の異なる態様において、各カンチレバー510は同じプローブ分子520に結合してもまたは異なるプローブ分子520に結合してもよい。カンチレバー510の偏向は、レーザー540および位置検知型光検出器550によって検出することができる。荷電分析物130、230、330がプローブ分子520に結合することにより、与えられる電場の傾き530または表面張力の変化に応答してカンチレバー510の偏向を生ずる。上記の実施例1および2に考察するように、本発明のある態様において、電圧調整器(電源)560を使用して対抗力をカンチレバー510に適用することができる。カンチレバー510のアレイ500が存在する場合には、各カンチレバー510への電圧入力値は、各カンチレバー510を一定の(ニュートラルな)位置に均衡させるように個別に調節することができる。
【０１０１】
実施例5
直接変換の主要な利点は、検討対象の分子を、例えば、蛍光または放射性標識で事前に標識する必要性をなくすということである。偏向したカンチレバーを戻す別の主要な利点は、カンチレバー自体へのストレスを低下することによってカンチレバーの寿命を延長することである。
【０１０２】
例示的な一方法において、ハイブリダイゼーション実験は、ハイブリダイゼーション緩衝液に浸漬したシリコンカンチレバーアレイを含有する液体セル中で実施される(J. FritzらTranslating Biomolecular Recognition into Nanomechanics, Science 14 April 2000, v288, pp.316〜318)。各カンチレバーの屈曲は、光ビーム偏向、次いでカンチレバー技法の回復を使用してその場で測定される。異なる塩基配列を有する合成5'チオ-修飾オリゴヌクレオチドをカンチレバーの金コーティング側に共有結合により固定する。12-merオリゴヌクレオチドによる一方のカンチレバーの官能基化および16-merオリゴヌクレオチドによる他方の官能基化は同一条件下において平行して実施される。カンチレバーアレイは、差別的な信号が安定になるまで、ハイブリダイゼーション緩衝液中で平衡させる。次いで、相補的な16-merオリゴヌクレオチド溶液を液体セルに注入し、次に相補的な12-merオリゴヌクレオチド溶液を注入する。注入によりオリゴヌクレオチドは、カンチレバー表面に固定されているマッチしているオリゴヌクレオチドと溶液中でハイブリダイゼーションする。これにより、カンチレバーを曲げる、官能基化した金と未官能基化シリコン表面との間の表面ストレスによって生じる、カンチレバーを元の位置に戻すのに必要な移動力を生ずる。過程の間中、カンチレバーの回復対個々のカンチレバーの絶対的な偏向が記録される。同時に、差別的な信号の結果としての修復(16-merのオリゴヌクレオチドによってカバーされるカンチレバーの偏向マイナス12-merのオリゴヌクレオチドによってカバーされるカンチレバーの偏向)が抽出され、比較される。
【０１０３】
個々のカンチレバーの非特異的な信号は、2つのカンチレバーから差別的な信号を抽出することによって除去される。アレイの全てのカンチレバーは物理的には同一であるので、差別的な信号は、相補的なオリゴヌクレオチドを認識する個々のカンチレバーの能力にのみ感受性である。非特異的な結合は平行してカンチレバーを曲げるので、回復力は同じであると思われ、全体的な差別的信号を生じない。差別的な屈曲は明らかに配列-特異的であり、結合に対して明白な「yes」または「no」応答を提供することをこれらの実験は実証している。
【０１０４】
例えば、配列
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(配列番号：1、12-merオリゴヌクレオチド)および
0004398375.tif 000003
(配列番号：2、16-merオリゴヌクレオチド)で官能基化した2つのカンチレバーを使用するハイブリダイゼーション実験を作製する。ベースライン(インターバルI)を取り、相補的な16-merオリゴヌクレオチド
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(配列番号：4、16-merオリゴヌクレオチド)(1 ml、HB、ハイブリダイゼーション緩衝液中400 nM)を注入する(インターバルII)。次いで、液体セルを3 mlのHBで20分間洗浄する。次いで、相補的な12-merオリゴヌクレオチド
0004398375.tif 000005
(配列番号：3、12-merオリゴヌクレオチド)(1 ml、HB中400 nM)を注入する(インターバルIII)。再度液体セルを3 mlのHBで20分後に洗浄する。絶対的な偏向後の回復対16-merおよび12-merオリゴヌクレオチドでカバーされる2つの個々のカンチレバーの時間を測定する。
【０１０５】
実施例6
ナノメカニカルな変換の分析能力の重大な試験は、2つのDNA配列間の1塩基ミスマッチを検出できるかどうかである。従って、固定した12-merオリゴヌクレオチドの1つの塩基だけが異なる2つのカンチレバーを作製する。第1の相補的なオリゴヌクレオチドの注入は回復信号の差を増加する。ハイブリダイゼーションおよびナノメカニカルな屈曲への変換が1塩基の差に感受性でない場合には、差別的な信号は記録されない。これは、第2のカンチレバーの配列に相補的なオリゴヌクレオチドを注入することによって確認される。差別的な信号は、2つの12-mer信号間で、出発値への回復信号の差だけ観察される。この実験はナノメカニカルな応答による1塩基ミスマッチの検出を実証しており、この方法は、例えば、SNPsおよび挿入等を検出するのに必要な固有の感度を有することを示しており、ハイブリダイゼーションにより1塩基突然変異を求めるまたはDNAを配列決定する能力を示唆している。
【０１０６】
1塩基ミスマッチを有するオリゴヌクレオチドはわずかな程度しかハイブリダイゼーションしないことを考慮すると、マッチングが完璧でない配列を有するカンチレバーはわずかしか曲がらず、差別的な信号の大きさを低下する。この差を測定された最終的な対抗力から引くことができる。
【０１０７】
結合後、相補的な塩基間の水素結合を切断することが既知の高濃度尿素(30%のH2O液)などの変性剤で液体セルを洗浄することによって化学的に変性することができる。これにより、実験の最初の状態を再確立し、同じアレイを数日にわたっていくつかの追加の実験に再使用することができる。溶液中のオリゴヌクレオチドの濃度を変更することによって、表面結合するハイブリダイゼーションの平衡特性から予想されるように、オリゴヌクレオチドの濃度の増加に伴って差別的な信号の大きさは増加する。
【０１０８】
全ての実験において、固定したオリゴヌクレオチドの密度は一定に保つ。カンチレバーあたり〜1010のオリゴヌクレオチドという表面被覆率を達成することができることが示されている。緩衝液の組成および表面固定を最適化することにより、検出される回復の差別的信号は増加する。追加の利点は、小型のセル容量および〜107のオリゴヌクレオチドを収容するカンチレバーを使用して、実験に必要な分子の数を大幅に減少することである。
【０１０９】
また、この方法は、標識化、光学的励起または外部プローブを必要とせず、結合は「リアル-タイム」で測定されるという点において重要な利点を有する。さらに、結合した物質を除去して(例えば、変性等)、カンチレバーを2回以上使用することができる場合には、変換過程は反復可能である。この方法はシリコン技術(例えば、チップ技術)に匹敵し、その場での作業に好適である。
【０１１０】
実施例7
この実施例では、共鳴周波数に基づいた集団検出生物学的センサーを使用する細菌の検出を使用する。生物学的センサーは、当技術分野において既知のバルクマイクロ加工技法を使用して製造される低ストレス窒化ケイ素カンチレバービームのアレイを含むことができる(Ilicら、2000「Mechanical resonant immunospecific biological detector」Applied Physics Letters 77: 450-452)。共鳴構造の信号変換は、光学的偏向システムを使用して、面外振動共鳴モードに対抗する回復(例えば、温度)信号を測定することによって実施される。光学的測定は、カンチレバーからの光線の反射をモニタリングすることによってであってもよく(例えば、Dimension 3000 Digital Instruments(DI)原子間力顕微鏡)、カンチレバーを元の位置に戻すのに必要なカンチレバーの温度は、ヒーター610、710の抵抗の変化をモニターすることによって測定することができる。一例において、カンチレバーの先端から反射されるレーザービームは、位置検知型光検出器(PSD)として使用する分割フォトダイオードによって感知される。PSDのA-B信号は、HP3562Aダイナミックシグナルアナライザーを使用して、DIシグナルアクセスモジュールから直接抽出される。
【０１１１】
カンチレバーを製造する方法は、320 nmの定圧または600 nmのプラズマ励起(plasma-enhanced)化学的蒸着(LPCVDまたはPECVD)低圧窒化ケイ素を被覆したシリコンウエハーから開始する。カンチレバーの厚さは、エリプソメーター(Rudolph Research モデル43603)を使用して実証することができる。共鳴ビームおよびカンチレバー基板を規定するために、フォトリソグラフィーを前面に実施して、露出した窒化ケイ素を、CF4を使用して反応性イオンエッチング(RIE)チャンバーにおいてエッチングする。次に、背面のアラインメントを実施することができ、カンチレバー基板の背面もRIEによって規定する。その後のKOHエッチング中の前面の窒化ケイ素の起伏化を防ぐために、2μmのPECVD酸化物を沈着してもよい。背面のエッチングが前面に接近する場合には、緩衝化した酸化物エッチング溶液(例えば、6:1)によりPECVD酸化物を除去し、カンチレバーが遊離されるまで、両方の面からエッチングを継続する。カンチレバーの長さは100〜500μmと異なる。高圧CO2臨界点ドライヤーを使用することにより、その溶液の表面張力を低下することによって、長い(>300μm)カンチレバーを取り出すことができるが、カンチレバーの破壊を生ずる傾向がある。短い(<300μm)カンチレバーは細胞検出などの実験に使用することができる。
【０１１２】
遊離後、基質、例えば、大腸菌血清型O157:H7抗体(KirkegaadおよびPerry Laboratories Inc.、Gaithersburg、MD)などの抗体を含有する溶液にカンチレバーを5分間浸漬する。次いで、カンチレバーを脱イオン水ですすぎ、窒素で乾燥する。平均抗体厚さは、タッピングモード原子間力トポグラフを、ダイヤモンドコーティングしたタッピングモードエッチングシリコンプローブを使用する表面スクラッチング走査型プローブ顕微鏡技法と併用することによって得ることができる(例えば、明らかにされたデータは、10個の基板で40 nmとなりうる)。次いで、異なる濃度の抗原、例えば、106〜109の大腸菌細胞/mlの範囲の大腸菌を含有する緩衝溶液にカンチレバーを浸漬することができる。細胞を室温において15分間インキュベーションする。最初に、装置を溶液(例えば、0.05% Tween)ですすいで、結合がゆるい任意の細胞を除去し、次いで脱イオン水ですすぎ、窒素乾燥する。細胞の結合をモニターして(例えば、Leo 982走査型電子顕微鏡(SEM)、細胞結合後の共鳴体の形態を評価する。
【０１１３】
アレイ中のカンチレバーの各々に結合する集合体を求めるために、カンチレバーに新たな成分を導入する、例えば、抗体に細胞を結合する前後に周波数スペクトルを取ることができる。結合事象が生じると、追加の細胞集合体の添加は、マイクロメカニカルオシレーターの共鳴周波数をシフトする。結合事象の特異性を確認するために、固定化抗体などの新たな成分が存在しない場合のカンチレバーを、細胞を含有する緩衝溶液で処理することができる。これらの細胞はカンチレバーに結合せず、オシレーターの共鳴周波数は変化しない。追加の実験を使用して、新たな成分の特異性を試験する、例えば、大腸菌抗体をコーティングしたカンチレバーにサルモネラ・ティフィムリウム(Salmonella typhimurium)細胞を適用することができる。任意の結合事象は光学的および熱的に確認される。この例において、適用の特異性を任意の他の細胞生物に対して分析することができる。
【０１１４】
本明細書に開示され、特許請求の範囲に記載されている方法および装置100、200、300は全て、本開示に鑑みて過度な実験を行うことなく作製し、実行することができる。特許請求の範囲に記載されている手段の概念、精神および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載されている方法および装置100、200、300に変更を適用することができることは当業者に明らかである。さらに具体的には、化学的および生理学的に関連しているある物質を本明細書に記載されている物質と置換しても、同じまたは同様の結果が得られると思われることが明らかである。当業者に明らかなこのような同様の置換および変更は全て、特許請求の範囲に記載されている主題の精神、範囲および概念の範囲内であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】例示的な装置100(縮尺は異なる)およびチャージ-マグネット-バランスドカンチレバー110システムを使用して分析物130を検出する方法を示す。
【図２】チャージ-バランスドカンチレバー210システムを使用して分析物230を検出するための例示的な装置200(縮尺は異なる)を示す。
【図３】放射圧-バランスドカンチレバー310システムを使用して分析物330を検出する例示的な装置300(縮尺は異なる)を示す。
【図４】例示的なカンチレバー400(縮尺は異なる)を示す。
【図５】カンチレバー510(縮尺は異なる)の例示的なアレイ500を示す。
【図６】ヒーター(610) (縮尺は異なる)を含む例示的なカンチレバー600を示す。
【図７】水平方向に対称なヒーター(710) (縮尺は異なる)を含む例示的なカンチレバー700を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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