(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ｉ）および（ii）を含んでなる、ポリペプチド：
（ｉ）次の（ａ）および（ｂ）を含んでなる、リーダー配列：
（ａ）分泌プレ配列、および
（ｂ）以下のモチーフ：
−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−
（式中、
Ｘ１はフェニルアラニン、トリプトファンまたはチロシンであり、
Ｘ２はイソロイシン、ロイシン、バリン、アラニンまたはメチオニンであり、
Ｘ３はロイシン、バリン、アラニンまたはメチオニンであり、
Ｘ４はセリンまたはトレオニンであり、かつ、
Ｘ５はイソロイシン、バリン、アラニンまたはメチオニンである）、および
（ii）そのリーダー配列に対して異種の目的タンパク質。
ここで、分泌プレ配列は、
（ａ）アルブミン分泌プレ配列、または、
（ｂ）その変異体であって、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４またはＸ５により定義されたモチーフ以外の１個以上の位置にアミノ酸の挿入、欠失または置換が存在し、かつ、該モチーフ以外で、アルブミン分泌プレ配列と少なくとも７個の同一アミノ酸を有する、アルブミン分泌プレ配列を含むもの。
【請求項２】
変異体が、アルブミン分泌プレ配列と少なくとも９個の同一アミノ酸を有する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
Ｘ１がフェニルアラニンであり、および／または
Ｘ２がイソロイシンであり、および／または
Ｘ３がバリンであり、および／または
Ｘ５がイソロイシンである、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
モチーフのアミノ酸を天然アミノ酸の代用としてポリペプチド中に含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ５、の少なくとも２つが、請求項２で定義されている通りのものである、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項６】
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ５、の少なくとも３つが、請求項２で定義されている通りのものである、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項７】
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ５が、請求項２で定義されている通りのものである、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項８】
モチーフが−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−である、請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項９】
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４およびＸ５がそれぞれ−２０、−１９、−１８、−１７および−１６位に、それらの位置の天然アミノ酸の代わりに存在し、そのナンバリングが天然のアルブミン分泌プロ配列のＣ末端アミノ酸を−１番残基とするものであり、かつ、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４およびＸ５が請求項１〜８のいずれか一項により定義されるアミノ酸である、請求項１〜８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
アルブミン分泌プレ配列またはその変異体がヒトアルブミン分泌プレ配列またはその変異体である、請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
分泌プレ配列ＭＫＷＶＦＩＶＳＩＬＦＬＦＳＳＡＹＳを含んでなる、請求項１０に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
リーダー配列が分泌プロ配列を含んでなる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
アルブミン分泌プレ配列またはその変異体が、そのＣ末端において分泌プロ配列またはその変異体のＮ末端アミノ酸とペプチド結合により融合され、それにより、プレ−プロ配列を形成する、請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
分泌プロ配列がアルブミン分泌プロ配列またはその変異体である、請求項１２または１３に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
アルブミン分泌プロ配列がヒト血清アルブミン分泌プロ配列またはその変異体である、請求項１４に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
分泌プロ配列モチーフが酵母ＭＦα−１分泌プロ配列またはその変異体である、請求項１４または１５に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
下記配列、またはその変異体を含んでなる、請求項１２に記載のポリペプチド：
【化１】
0004597668.tif 000050
（式中、
Ｙ１がＧｌｙまたはＳｅｒであり、
Ｙ２がＶａｌまたはＬｅｕであり、
Ｙ３がＰｈｅまたはＡｓｐであり、
Ｙ４がＡｒｇまたはＬｙｓであり、かつ、
Ｙ５がＡｒｇまたはＬｙｓである）。
【請求項１８】
Ｙ１がＧｌｙであり、Ｙ２がＶａｌであり、かつ、Ｙ３がＰｈｅであるか、または
Ｙ１がＳｅｒであり、Ｙ２がＬｅｕであり、かつ、Ｙ３がＡｓｐである、請求項１７に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
Ｙ４がＡｒｇであり、かつ、Ｙ５がＡｒｇであるか、
Ｙ４がＬｙｓであり、かつ、Ｙ５がＡｒｇであるか、
Ｙ４がＬｙｓであり、かつ、Ｙ５がＬｙｓであるか、または、
Ｙ４がＡｒｇであり、かつ、Ｙ５がＬｙｓである、請求項１７または１８に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
該モチーフの少なくとも一部が分泌プレ−配列中に存在する、請求項１〜８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
目的タンパク質の配列がそのＮ末端においてリーダー配列のＣ末端アミノ酸と融合される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
目的タンパク質がアルブミンまたはその変異体、断片もしくは融合物である、請求項１〜２１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２３】
目的タンパク質が、アルブミンの３つのドメインの１つまたは２つのドメインを含む、請求項２２に記載のポリペプチド。
【請求項２４】
アルブミンがヒトアルブミンである、請求項２２または２３に記載のポリペプチド。
【請求項２５】
成熟ポリペプチドがトランスフェリンまたはその変異体、断片もしくは融合物である、請求項１〜２２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２６】
トランスフェリンがヒトトランスフェリンである、請求項２５に記載のポリペプチド。
【請求項２７】
請求項１〜２６のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする配列を含んでなる、単離ポリヌクレオチド。
【請求項２８】
配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８または配列番号３４の配列を含んでなる、請求項２７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２９】
配列番号２４の配列を含む、請求項２８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３０】
配列番号２５の配列、またはその変異体を含んでなる、請求項２９に記載のポリヌクレオチドであって、
該変異体が、配列番号２４のリーダー配列を有し、かつ、配列番号２５によりコードされるアルブミンの変異体もしくは断片をコードするものである、ポリヌクレオチド。
【請求項３１】
配列番号２７の配列を含む、請求項２８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３２】
配列番号２１の配列、またはその変異体を含んでなる、請求項３１に記載のポリヌクレオチドであって、
該変異体が、配列番号２７のリーダー配列を有し、かつ、配列番号２１によりコードされるアルブミンの変異体もしくは断片をコードするものである、ポリヌクレオチド。
【請求項３３】
アルブミンの変異体もしくは断片が、アルブミンの３つのドメインの１つまたは２つのドメインを含む、請求項３２に記載のポリペプチド。
【請求項３４】
配列番号２１の配列を含んでなる、ポリヌクレオチド。
【請求項３５】
ポリヌクレオチドが、異種タンパク質をコードしているＤＮＡ配列と、配列番号２５のＤＮＡ配列または配列番号２１のＤＮＡ配列のいずれかとの、連続したまたは不連続な融合物であるＤＮＡ配列を含んでなる、請求項３１、３３または３４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３６】
請求項２７〜３５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドの相補鎖である、ポリヌクレオチド。
【請求項３７】
作動可能なように連結された転写調節領域を含んでなる、請求項２７〜３６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３８】
転写調節領域が転写プロモーターを含んでなる、請求項３７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３９】
請求項２７〜３８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含んでなる、自己複製可能なポリヌクレオチド。
【請求項４０】
請求項２７〜３９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含んでなる、細胞。
【請求項４１】
真核生物細胞である、請求項４０に記載の細胞。
【請求項４２】
真菌細胞である、請求項４１に記載の細胞。
【請求項４３】
アスペルギルス属の細胞である、請求項４２に記載の細胞。
【請求項４４】
酵母細胞である、請求項４２に記載の細胞。
【請求項４５】
サッカロミセス属、クルイベロミセス属、シゾサッカロミセス属またはピキア属の細胞である、請求項４４に記載の細胞。
【請求項４６】
請求項４０〜４５のいずれか一項に記載の細胞および培養培地を含んでなる、細胞培養物。
【請求項４７】
その培地が、請求項１〜２３のいずれか一項に記載のポリペプチドの産生の結果として、成熟した目的タンパク質を含有する、請求項４６に記載の細胞培養物。
【請求項４８】
成熟した目的タンパク質を作製する方法であって、
（１）請求項４０〜４５のいずれか一項に記載の細胞を培養培地で培養し、ここで、その細胞が請求項１〜２６のいずれか一項に記載のポリペプチドの産生の結果として、成熟した目的タンパク質を培養培地中に分泌し、かつ
（２）分泌された成熟タンパク質を含有する培養培地を細胞から分離する
ことを含んでなる、方法。
【請求項４９】
成熟した目的タンパク質を培地から分離し、必要に応じて、成熟した目的タンパク質をさらに精製する工程をさらに含んでなる、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
このようにして分離および／または精製された、成熟した目的タンパク質を、治療上許容されうる担体または希釈剤とともに製剤し、それにより、ヒトまたは動物への投与に好適な治療用製品を生産する工程をさらに含んでなる、請求項４９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、宿主細胞からタンパク質を分泌させるためのポリペプチドおよびポリヌクレオチド配列に関する。
【０００２】
背景技術
宿主細胞から目的ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質（以下、本明細書では、これらの用語は同義的に用いる）を分泌させることを目的に、多くの天然または人工ポリペプチドシグナル配列（分泌プレ領域とも呼ばれる）が使用または開発されている。シグナル配列は、初期のタンパク質を、タンパク質をその細胞から周囲の媒質へ、または、場合によっては、ペリプラスム間隙へと輸送する細胞の機構に導くものである。シグナル配列は、通常、必ずではないが、一次翻訳産物のＮ末端に位置しており、一般に、必ずではないが、分泌プロセス中にその配列が目的タンパク質から切り離されて、「成熟」タンパク質が得られる。
【０００３】
いくつかの目的タンパク質の場合では、シグナル配列の除去後、最初に分泌される存在物はそのＮ末端に「プロ」配列と呼ばれる付加的アミノ酸を含んでおり、その中間存在物は「プロ−タンパク質」と呼ばれている。これらのプロ配列は、最終的なタンパク質の折り畳みおよび機能化を手助けし、通常、その後に切り離される。他の例では、そのプロ領域はプレ−プロ領域を切り離す酵素の切断部位を容易に提供するもので、別の機能は有していないと思われている。
【０００４】
プロ配列は、細胞からの目的タンパク質の分泌中、またはその細胞からの周囲の媒質またはペリプラスム間隙への輸送後のいずれかに除去される可能性がある。
【０００５】
タンパク質の分泌を導くポリペプチド配列はまた、それらがシグナル（すなわち、プレ）配列またはプレ−プロ分泌配列と似ていようがいよまいが、リーダー配列と呼ばれることもある。タンパク質の分泌は翻訳、転座および翻訳後プロセシングを伴う動的プロセスであり、これらの工程の１以上は、別のものが開始する前、または完了する前に、必ずしも完了しなくてよい。
【０００６】
酵母、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)およびピキア・パストリス(Pichia pastoris)などの真核生物種においてタンパク質を産生させるための既知のリーダー配列としては、Ｓ．セレビシエ酸性ホスファターゼタンパク質（Ｐｈｏ５ｐ）（ＥＰ３６６４００を参照）、転化酵素タンパク質（Ｓｕｃ２ｐ）（Smith et al. (1985) Science, 229, 1219-1224を参照）および熱ショックタンパク質−１５０（Ｈｓｐ１５０ｐ）（ＷＯ９５／３３８３３を参照）のものが挙げられる。さらに、Ｓ．セレビシエ接合因子α−１タンパク質（ＭＦα−１）のリーダー配列ならびにヒトリゾチームおよびヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）タンパク質のリーダー配列が使用されているが、限定されるものではないが、ヒトアルブミンの分泌に向けては後者のものが特に利用されている。ＷＯ９０／０１０６３は、ＭＦα−１リーダー配列を使用する場合に比べて混入するヒトアルブミン断片の産生が有利に減少する、ＭＦα−１とＨＳＡリーダー配列との融合物を開示している。
【発明の概要】
【０００７】
本発明者らは、予想外にも、分泌されたタンパク質の収量がアミノ酸配列モチーフの導入により、好ましくは、リーダー配列の改変により、増大し得ることを見出した。この改変は、完全な天然アルブミンリーダー配列に行うか、その変異体に行うか、またはＷＯ９０／０１０６３にて開示されているＭＦα−１とＨＳＡリーダー配列との融合物などのヒトアルブミンリーダー配列の関連部分を用いた他のリーダー配列に行うかを問わず有効である。後者の場合、アルブミンが分泌されるタンパク質であるならば、このようにして産生されたアルブミンは混入する断片が減少するという有利な特徴を保有し、同時に収量も増大する。
【０００８】
ＷＯ９０／０１０６３の融合されたリーダー配列の保存的改変は 、ＷＯ９０／０１０６３に概要が開示されている（例えば、ＷＯ９０／０１０６３の８頁を参照）が、ここではおよそ８×１０１２ポリペプチドの群が得られることが明らかになっている。遺伝子コードの縮退に従い、典型的なリーダー配列についてポリヌクレオチドコード配列が示された。これはまた、多数の可能性を示すものである。ＷＯ９０／０１０６３では、本発明により提供される、改変されたリーダー配列の特定群が分泌されるタンパク質の発現に有利な特性を有しているという理解はなされていない。
【０００９】
本発明の第１の態様において、下記（ｉ）および（ii）を含んでなるポリペプチドが提供される：
（ｉ）下記（ａ）および（ｂ）を含んでなるリーダー配列
（ａ）分泌プレ配列、および
（ｂ）以下のモチーフ：
−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−
（式中、
Ｘ１はフェニルアラニン、トリプトファンまたはチロシンであり、
Ｘ２はイソロイシン、ロイシン、バリン、アラニンまたはメチオニンであり、
Ｘ３はロイシン、バリン、アラニンまたはメチオニンであり、
Ｘ４はセリンまたはトレオニンであり、かつ、
Ｘ５はイソロイシン、バリン、アラニンまたはメチオニンである）、および
（ii）そのリーダー配列に対して異種の目的タンパク質。
【００１０】
言い換えれば、そのポリペプチドは下記配列番号１の配列を含む。
【化１】
0004597668.tif 000002
配列番号１
【００１１】
本発明の第１の態様の好ましい態様では、Ｘ１はフェニルアラニンである。よって、好ましいポリペプチドは下記配列番号２の配列を含む。
【化２】
0004597668.tif 000003
配列番号２
【００１２】
本発明の第１の態様のもう１つの好ましい態様では、Ｘ２はイソロイシンである。よって、もう１つの好ましいポリペプチドは下記配列番号３の配列を含む。
【化３】
0004597668.tif 000004
配列番号３
【００１３】
本発明の第１の態様のもう１つの好ましい態様では、Ｘ３はバリンである。よって、もう１つの好ましいポリペプチドは下記配列番号４の配列を含む。
【化４】
0004597668.tif 000005
配列番号４
【００１４】
もう１つの好ましいポリペプチドでは、Ｘ４はセリンであり、よって、下記配列番号５の配列を含む。
【化５】
0004597668.tif 000006
配列番号５
【００１５】
本発明の第１の態様のもう１つの好ましい態様では、Ｘ４はトレオニンである。よって、もう１つの好ましいポリペプチドが配列番号２９の配列を含む。
【化６】
0004597668.tif 000007
配列番号２９
【００１６】
本発明の第１の態様のもう１つの好ましい態様では、Ｘ５はイソロイシンである。よって、もう１つの好ましいポリペプチドは配列番号６の配列を含む。
【化７】
0004597668.tif 000008
配列番号６
【００１７】
より好ましくは、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４およびＸ５のうちの少なくとも２つ、なおいっそう好ましくは、少なくとも３つ、さらに好ましくは、少なくとも４つが上記の好ましい態様で定義されたとおりである。
【００１８】
そのモチーフはリーダー配列に（すなわち、付加物として）挿入してもよいし、または１個、２個、３個、４個、５個以上の連続したアミノ酸の代用としてリーダー配列内に含めることもできる。
【００１９】
１つの好ましい態様では、そのモチーフが天然アミノ酸の代用としてリーダー配列に含められている。言い換えれば、そのモチーフのアミノ酸が、本発明によるその最適化を行う前にリーダー配列内に存在していたか、または存在していたであろう５個の連続したアミノ酸の代わりに含められている。これに関連して使用する「天然（の）」(nathurally occurring)とは、本発明を天然のリーダー配列の最適化に限定するものではないことは読む人にも理解できるであろう。それどころか、本発明はその最適化が本明細書において例示されているＨＳＡ／ＭＦα−１リーダー配列融合物などの人工リーダー配列の最適化にも適用できる。
【００２０】
そのモチーフを代用物としてリーダー配列に含める場合にはＸ４が天然アミノ酸またはその変異体であることが好ましい。言い換えれば、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ５だけを置換して、Ｘ４を変えないでおくか、または、その位置にある天然アミノ酸の、好ましくは、以下で定義する保存的置換として、変異体に単に変えることが好ましい。
【００２１】
本発明の第１の態様の特に好ましい態様では、Ｘ１はフェニルアラニンであり、Ｘ２はイソロイシンであり、Ｘ３はバリンであり、Ｘ４はセリンであり、かつ、Ｘ５はイソロイシンである。よって、本発明の第１の態様の特に好ましい態様では、下記配列番号７の配列を含むポリペプチドが提供される。
【化８】
0004597668.tif 000009
配列番号７
【００２２】
上記スキームにおいて、「Ｎ」および「Ｃ」はポリペプチド配列の方向を示し、それらの実際の末端についてのそれらの解釈を限定するものではない。言い換えれば、ポリペプチド配列は、Ｎ末端もしくはＣ末端のいずれか一方にて、または最も一般的にはそれら両方の末端において、１以上の他のポリペプチド配列と結合される（例えば、融合されるか、コンジュゲートされるか、または連結される）。
【発明の具体的説明】
【００２３】
本発明の第１の態様のポリペプチドは、リーダー配列に対して異種の成熟した目的タンパク質の配列を含んでなる。成熟した目的タンパク質の配列は、本発明のポリペプチドが発現される発現系による翻訳後プロセシング後の発現産物に存在するであろう一次アミノ酸配列である。目的タンパク質は、好ましくは、本発明のポリペプチドが発現される細胞から分泌させるのに好適であるものである。
【００２４】
目的タンパク質はリーダー配列に対して異種である。言い換えれば、本発明の第１の態様のポリペプチドは、それらのリーダー配列内に上記のモチーフ−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−を有する天然のタンパク質を含まないものである。好ましい態様では、本発明の第１の態様のポリペプチドは、任意の位置に上記のモチーフ−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−を有する天然のタンパク質を含まないものである。これに関連して、「天然（の）」とは、組換えテクノロジー、部位特異的突然変異誘発またはヒトの介入を必要とする同等の人工的な技術による改変を受けていない天然に存在する生物によりコードされるタンパク質を指す。
【００２５】
目的タンパク質は、天然タンパク質（チモーゲン(zymogen)を含む）、ポリペプチドもしくはペプチド、または天然タンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドの変異体もしくは断片（例えば、一ドメインであってよい）；あるいは完全合成タンパク質、ポリペプチドもしくはペプチド；あるいは異なるタンパク質、ポリペプチドもしくはペプチド（天然または合成）の単一もしくは多重融合物であれば、いずれの配列を含んでなってもよい。このようなタンパク質は、限定されるものではないが、それらの開示内容が引用することにより本明細書の一部とされる、ＷＯ０１／７９２５８、ＷＯ０１／７９２７１、ＷＯ０１／７９４４２、ＷＯ０１／７９４４３、ＷＯ０１／７９４４４およびＷＯ０１／７９４８０にて記載されているリスト、またはその変異体もしくは断片から選択することができる。これらの特許出願はアルブミンの融合パートナーという観点からタンパク質のリストを示しているが、本発明はそのように限定されず、本発明の目的では、本明細書に列挙するいかなるタンパク質も単独でまたはアルブミン、免疫グロブリンのＦｃ領域、トランスフェリンもしくは目的ポリペプチドとしての他のタンパク質の融合パートナーとして与えてよい。
【００２６】
本発明による発現に向けた目的タンパク質の好ましい例としては、アルブミン、トランスフェリン、ラクトフェリン、エンドスタチン、アンギオスタチン、コラーゲン、免疫グロブリン、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２、ＳｃＡｂ、ＳｃＦｖ、インターフェロン、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ２、インターフェロンα種および亜種、インターフェロンβ種および亜種、インターフェロンγ種および亜種、ＩＬ１−受容体アンタゴニスト、ＥＰＯ、ＴＰＯ、プロサプチド(prosaptide)、シアノビリン−Ｎ、５−ヘリックス、Ｔ２０ペプチド、Ｔ１２４９ペプチド、ＨＩＶ  ｇｐ４１、ＨＩＶ  ｇｐ１２０、フィブリノーゲン、ウロキナーゼ、プロウロキナーゼ、ｔＰＡ（組織プラスミノーゲン活性化因子）、ヒルジン、血小板由来増殖因子、副甲状腺ホルモン、プロインスリン、インスリン、インスリン様増殖因子、カルシトニン、成長ホルモン、形質転換増殖因子β、腫瘍壊死因子、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、限定されるものではないが、プラスミノーゲン、フィブリノーゲン、トロンビン、プレトロンビン、プロトロンビン、フォン・ウィルブランド因子、α１−アンチトリプシン、プラスミノーゲン活性化因子、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、第Ｘ因子および第XIII因子をはじめとするプレ型および活性型いずれもの凝固因子、神経成長因子、ＬＡＣＩ（組織因子経路阻害剤または外因経路阻害剤としても知られているリポタンパク質由来凝固阻害剤）、血小板由来内皮細胞増殖因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）、グルコースオキシダーゼ、血清コリンエステラーゼ、アプロチニン、アミロイド前駆体、インターαトリプシン阻害剤、アンチトロンビンIII、アポ−リポタンパク質種、プロテインＣ、プロテインＳ、上記のものの変異体または断片が挙げられる。
【００２７】
目的タンパク質に関連して、「変異体」とは、１箇所以上の位置にアミノ酸の挿入、欠失、または保存的置換もしくは非保存的置換のいずれかの置換が存在するタンパク質を指すが、そのような変化の結果として、タンパク質の基礎特性、例えば、酵素活性または受容体結合（種類および比活性度）、熱安定性、特定のｐＨ範囲における活性（ｐＨ安定性）が有意に変わっていないタンパク質が得られるという条件においてである。これに関連して「有意に」とは、当業者によって、その変異体の特性はまだ異なっているかもしれないが、最初のタンパク質の特性に関しては自明であると思われることを意味する。
【００２８】
「保存的置換」とは、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｍｅｔ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ；およびＰｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐなどの組合せを意図するものである。好ましい保存的置換としては、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；およびＰｈｅ、Ｔｙｒが挙げられる。
【００２９】
「変異体」は、その変異体が誘導されるポリペプチドと通常、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％または少なくとも７０％、好ましくは、少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも９０％、なおいっそう好ましくは、少なくとも９５％、さらに好ましくは、少なくとも９９％、最も好ましくは、少なくとも９９．５％の配列同一性を有する。
【００３０】
２ポリペプチド間の配列同一性パーセントは、好適なコンピュータープログラム、例えば、ウィスコンシン大学遺伝子コンピューティンググループ(University of Wisconsin Genetic Computing Group)のＧＡＰプログラムを用いて決定することができ、当然のことではあるが、同一性パーセントは、最適に配列をアラインメントしたポリペプチドと比較して計算される。
【００３１】
アラインメントは、また、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗプログラムを用いて実施してもよい(Thompson et al., (1994) Nucleic Acids Res., 22 (22), 4673-80)。使用されるパラメーターは以下の通りである：
・ファストペアワイズアラインメントパラメーター：Ｋ−ｔｕｐｌｅ（ワード）サイズ；１、ウインドウサイズ；５、ギャップペナルティー；３、トップダイアゴナル(top diagonals)数；５。スコアリング法：ｘパーセント。
・マルチプルアラインメントパラメーター：ギャップオープンペナルティー；１０、ギャップエクステンションペナルティー；０．０５。
・スコアリングマトリックス：ＢＬＯＳＵＭ。
【００３２】
このような変異体は天然のものであってよいし、または当技術分野で周知のタンパク質工学手法および部位特異的突然変異誘発手法を用いて作製されたものであってよい。
【００３３】
目的タンパク質に関連して、「断片」とは、１箇所以上の位置に欠失が存在するタンパク質を指す。よって、その断片が全長成熟ポリペプチドの完全配列の最大限５、１０、２０、３０、４０または５０％を含んでなると思われる。通常、一断片は、全長の目的タンパク質の完全配列の最大６０％、より通常は最大７０％、好ましくは、最大８０％、より好ましくは、最大９０％、なおいっそう好ましくは、最大９５％、さらに好ましくは、最大９９％を含んでなる。目的タンパク質の特に好ましい断片は、目的タンパク質の１以上の完全ドメインを含んでなる。例えば、目的タンパク質がアルブミンであってよい。アルブミンは３つのドメインを有している。アルブミンの特に好ましい断片は、１つまたは２つのドメインを含み得るため、通常、アルブミンの完全配列の少なくとも３３％または少なくとも６６％を含んでなる。
【００３４】
アルブミンおよびトランスフェリン、またはその変異体もしくは断片が、とりわけそれらがヒト起源のものである場合、すなわち、それらが自然に産生されたヒトタンパク質において見つけられるものと同じ配列を有している場合には、目的タンパク質として特に好ましい。
【００３５】
「ヒトアルブミン」とは、本明細書において、ヒト血清アルブミンと区別できない材料、またはその変異体もしくは断片である材料を示すために用いる。「変異体」とは、挿入、欠失、および保存的置換または非保存的置換のいずれかの置換を含み、そのような変化によってアルブミンの膨張特性、有用なリガンド結合特性または免疫原特性が実質的に変わらないものである。例えば、ＥＰ−Ａ−３２２ ０９４で開示されているヒトアルブミンまたはヒトアルブミン類似体の自然発生する多形変異体が挙げられる。一般に、ヒトアルブミンの変異体または断片はヒト血清アルブミンのリガンド結合活性（例えば、ビリルビン結合）の少なくとも１０％（好ましくは、少なくとも５０％、８０％、９０％または９５％）およびヒト血清アルブミンの膨張活性の少なくとも５０％（好ましくは、少なくとも８０％、９０％または９５％）、ｗ／ｗを有している。アルブミン、アルブミン変異体またはアルブミン断片の、膠質浸透圧としても知られている膨張活性は、Hoefs, J. C. (1992) Hepatology 16: 396-403により記載されている方法により決定してもよい。ビリルビン結合は、５２７ｎｍでの蛍光増感により、ＨＳＡと比較して測定してもよい。ビリルビン（１．０ｍｇ）を５０μＬの１Ｍ  ＮａＯＨに溶かし、脱塩水で１．０ｍＬに希釈する。このビリルビンストックを１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡで希釈して、蛍光光度計キュベット中０．６ｎｍｏｌビリルビンｍＬ−１とする。ＨＳＡ：ビリルビン比  ０〜５ｍｏｌ：ｍｏｌの範囲にわたるＨＳＡでの滴定中においての４４８ｎｍでの励起および５２７ｎｍでの発光（１０ｎｍ  スリット幅）により蛍光を測定する。
【００３６】
好ましい態様では、目的タンパク質がトランスフェリンであってよい。このようなものとしては、トランスフェリンファミリーのメンバー(Testa, Proteins of iron metabolism, CRC Press, 2002; Harris & Aisen, Iron carriers and iron proteins, Vol. 5, Physical Bioinorganic Chemistry, VCH, 1991)およびそれらの誘導体、例えば、トランスフェリン、突然変異型トランスフェリン(Mason et al, 1993, Biochemistry, 32, 5472; Mason et al, 1998, Biochem. J., 330 (1), 35)、末端切断型トランスフェリン、トランスフェリンローブ(Mason et al, 1996, Protein Expr. Purif., 8, 119; Mason et al, 1991, Protein Expr. Purif., 2, 214)、ラクトフェリン、突然変異型ラクトフェリン、末端切断型ラクトフェリン、ラクトフェリンローブまたは上記のものと他のペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質との融合物(Shin et al, 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 2820; Ali et al, 1999, J. Biol. Chem., 274, 24066; Mason et al, 2002, Biochemistry, 41, 9448)が挙げられる。トランスフェリンがヒトトランスフェリンであってよい。
【００３７】
「ヒトトランスフェリン」とは、本明細書において、ヒト由来のトランスフェリンと区別できない材料、またはその変異体もしくは断片である材料を示すために用いる。「変異体」とは、挿入、欠失、および保存的置換または非保存的置換のいずれかの置換を含み、そのような変化によってトランスフェリンの有用なリガンド結合特性または免疫原特性が実質的に変わらないものである。例えば、ヒトトランスフェリンまたはヒトトランスフェリン類似体の自然発生する多形変異体が挙げられる。一般に、ヒトトランスフェリンの変異体または断片はヒトトランスフェリンのリガンド結合活性（例えば、鉄結合）の少なくとも５０％（好ましくは、少なくとも８０％、９０％または９５％）、ｗ／ｗを有している。トランスフェリンまたは試験サンプルの鉄結合活性は、分光光度法で、鉄遊離状態および鉄飽和状態におけるそのタンパク質の４７０ｎｍ：２８０ｎｍ吸光度比により決定することができる。特に断りのない限り、試薬は鉄を含まないものであるべきである。鉄は、０．１Ｍクエン酸塩、０．１Ｍ酢酸塩、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ４．５に対する透析によりトランスフェリンまたは試験サンプルから除去することができる。タンパク質は、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３  ｐＨ８．０中、約２０ｍｇ／ｍＬにて存在するはずである。２８０ｎｍでの吸光度を分光光度法で正確に決定することができるように（０％鉄結合）、水で希釈したアポトランスフェリン(Calbiochem, CN Biosciences, Nottingham, UK)の４７０ｎｍ：２８０ｎｍ吸光度比を測定する。１９１ｍｇニトロ三酢酸を２ｍＬ  １Ｍ  ＮａＯＨに溶かして２０ｍＭ鉄−ニトリロ三酢酸（ＦｅＮＴＡ）溶液を調製した後、２ｍＬ  ０．５Ｍ塩化第二鉄を添加する。脱イオン水で５０ｍＬに希釈する。新たに調製した２０ｍＭ  ＦｅＮＴＡを十分に過剰に添加して、アポトランスフェリンを鉄飽和させ（１００％鉄結合）た後、４７０ｎｍ：２８０ｎｍでの吸光度比を測定する前に、ホロトランスフェリン調製物を１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３  ｐＨ８．０に対して完全に透析して残留しているＦｅＮＴＡを除去する。最初は鉄を含まないものであるべき試験サンプルを用いてこの手順を繰り返し、最終的な比を対照と比較する。
【００３８】
さらに、上記のものの単一もしくは多重異種融合物；またはアルブミン、トランスフェリンもしくは免疫グロビンあるいはこれらのものの変異体もしくは断片との単一もしくは多重異種融合物を使用してもよい。このような融合物としては、ＷＯ０１／７９２７１により例示されている、アルブミンＮ末端融合物、アルブミンＣ末端融合物およびＮ末端およびＣ末端アルブミン同時融合物、ならびにトランスフェリンＮ末端融合物、トランスフェリンＣ末端融合物、およびＮ末端およびＣ末端トランスフェリン同時融合物が挙げられる。
【００３９】
好ましい態様では、本発明の第１の態様のポリペプチドが以上で定義されたＸ１−Ｘ５ペンタペプチドモチーフの少なくとも一部を含む分泌プレ配列を含んでなる。言い換えれば、成熟した目的ポリペプチドの分泌を行うように作用するリーダー配列の領域が、Ｘ１−Ｘ５ペンタペプチドモチーフのアミノ酸のうちの１個、２個、３個、４個または５個のアミノ酸を含有する。分泌プレ配列領域がＸ１−Ｘ５ペンタペプチドモチーフのうちの５個より少ないアミノ酸を含有する場合、そのプレ配列に含まれるモチーフのそれらのアミノ酸は、それらがＸ１−Ｘ５ペンタペプチドモチーフの残りのアミノ酸の近傍に存在するように、プレ配列領域の一方の境界に位置している。
【００４０】
より好ましい態様では、本発明の第１の態様のポリペプチドが、本発明の第１の態様により以上で定義されたモチーフを含む分泌プレ配列を含むことを特徴とするリーダー配列を含んでなる。そのリーダー配列は、通常、必ずではないが、一次翻訳産物のＮ末端に位置しており、一般に、必ずではないが、分泌プロセス中にタンパク質から切り離されて、成熟した「目的」タンパク質が得られる。
【００４１】
分泌リーダー配列は、通常、必ずではないが、Ｎ末端のアミノ酸配列であり、そのアミノ酸配列が、そのアミノ酸配列が一部を形成するポリペプチドを、それが産生される宿主細胞から分泌させる。分泌は、リン脂質二重層、一般に、限定されるものではないが、真核生物の小胞体または原核生物の原形質膜を通じた細胞質のコンパートメントからのタンパク質の翻訳後転座の共翻訳により定義される。分泌されたタンパク質は、細胞の範囲内（一般に、限定されるものではないが、小胞体、ゴルジ体、液胞、リソソームまたはペリプラスム間隙内）にとどまるか、または細胞から培養培地へと分泌される。ある配列が、分泌プレ配列を含まない同等のポリペプチドに比べて、いっそう多くのポリペプチドを、それが産生される宿主細胞から分泌させる場合には、その配列は分泌リーダー配列としての役割を果たしている。一般的に言えば、リーダー配列を有するポリペプチドは分泌されるが、リーダー配列を有さないポリペプチドは分泌されない。しかしながら、本発明は、異なるリーダー配列の効率レベルは異なるという状況を意図している。よって、リーダー配列は、細胞により産生された成熟タンパク質の少なくとも１０％、２０％、３０％もしくは４０％または５０％、一般に、少なくとも６０％または７０％、好ましくは、少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも９０％、なおいっそう好ましくは、少なくとも９５％、さらに好ましくは、少なくとも９８％、最も好ましくは、少なくとも９９％を細胞から分泌させ得る。成熟ポリペプチドの細胞からの分泌は、例えば、宿主細胞に好適なＤＮＡ構築物を提供し、分泌された成熟タンパク質（例えば、ヒトアルブミン）の量を細胞内に産生されたいずれもの成熟タンパク質と比較して測定することにより決定することができる。
【００４２】
好ましい分泌リーダー配列は、宿主細胞が酵母細胞（例えば、サッカロミセス・セレビシエまたはピキア・パストリス）である場合には、上記レベルの分泌を導く。酵母宿主細胞からの成熟ポリペプチドの分泌は、例えば、以下の実施例にて記載するものなどの方法により決定することができる。
【００４３】
従って、分泌は、試験リーダー配列を含んでなるタンパク質の分泌レベルを対照リーダー配列を含んでなるタンパク質の分泌レベルと比較することにより測定することができる。所与の配列（「試験配列」）が一定の分泌レベルを達成し得るかどうかを判定するために、ＬＥＵ２遺伝子とｒＨＡをコードするポリヌクレオチドとともに、ＰＲＢ１プロモーターおよび以下で記載するＡＤＨ１ターミネーターなどの機能的酵母調節領域に作動可能なように連結された配列番号２６で定義される改変リーダー配列を有する「スターター」プラスミド、一般に、ＥＰ ０ ２８６ ４２２で記載されているタイプの酵母分解ベクターを、試験配列をコードするポリヌクレオチド配列を、リーダー配列の相当する領域の代わりに含めるよう改変し、そうすることによって、試験プラスミドを提供するといった第１のプロトコールを用いてよい。第１の対照として、ＷＯ９０／０１０６３で記載されているリーダー配列をコードする改変されていない「スターター」プラスミドを使用する。サッカロミセス・セレビシエ株ＡＨ２２ｃｉｒ°(Hinnen et al, 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 (4), 1929-33; Mead et al, 1986, Mol. Gen. Genet., 205, 417)、復帰変異したＨｉｓ４を試験宿主として使用する。ＡＨ２２（ｌｅｕ２、ｈｉｓ４、ｃａｎ１）のＨＩＳ４復帰突然変異体（すなわち、Ｈｉｓ＋）は、十分なＡＨ２２細胞を０．００２％（ｗ／ｖ）ロイシンを補給したＢＭＭＤ寒天でコロニーが現れるまで培養することによって得ることができる。そのコロニーを試験し、０．００２％（ｗ／ｖ）ロイシンを補給したＢＭＭＤ寒天（プレート１）、０．００２％（ｗ／ｖ）ロイシンを補給し、０．００２％（ｗ／ｖ）ヒスチジンを補給したＢＭＭＤ寒天（プレート２）、およびＢＭＭＤ寒天（プレート３）に播種することによりそれらがＬｅｕ−およびＨｉｓ＋（すなわち、ＡＨ２２  Ｈｉｓ＋（ｌｅｕ２、ｃａｎ１））であることを確認する。ＡＨ２２  Ｈｉｓ＋（ｌｅｕ２、ｃａｎ１）単離物はプレート１およびプレート２では増殖するが、プレート３では増殖しない。試験宿主を試験および対照プラスミドを用いてロイシンプロトトロフィー(prototrophy)に形質転換する。これらの形質転換体を２％（ｗ／ｖ）グルコースを含有する緩衝最小培地（ＢＭＭ、Kerry-Williams, S. M. et al. (1998) Yeast 14, 161-169により記載されている)（ＢＭＭＤ）にパッチアウト(patched out)し、さらなる解析に向けて十分に増殖するまで３０℃にてインキュベートする。形質転換体をフィル＆ドロー手順による高細胞密度発酵にて、ＷＯ９６／３７５１５にてフェドバッチ手順に関して記載されているある培地で、制御パラメーターを使用して培養する：フェドバッチ培養手順供給期の終了後、培養物量の９０％を発酵容器から取り出す。供給物の添加を開始する前に、残りの１０％量の培養物に、ＷＯ９６／３７５１５に記載されている培地および制御パラメーターを使用してバッチ培地を添加する（ｐＨを制御しながら）。フィル＆ドロー手順は無制限に繰り返してもよい。試験および対照プラスミドを含有する形質転換体のヒトアルブミン生産性（ＹＰ／Ｓ）を細胞を含まない全培養物のＳＤＳ−ＰＡＧＥのスキャンニングデンシトメトリーにより評価する。ＹＰ／Ｓは発酵中に培養物に添加したスク���ース１ｇ当たりのヒトアルブミンタンパク質（ｍｇ）の比率を表す。
【００４４】
試験および第１の対照形質転換体を比較できる発酵槽配置で比較できる時間培養するとき、本発明のリーダー配列は、上記の第１のプロトコールにより測定するＹＰ／Ｓにより判定した場合、第１の対照により得られる分泌レベルよりも少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、３００％、３１０％、３２０％、３３０％、３４０％、３５０％、３６０％、３７０％、３８０％、３９０％、４００％、４１０％、４２０％、４３０％、４４０％、４５０％、４６０％、４７０％、４８０％、４９０％または５００％高い分泌レベルを獲得し得る。よって、本発明のリーダー配列が第１の対照よりも最大４００％、４５０％、５００％、５５０％、６００％、６５０％、７００％、７５０％、またはそれ以上に高い分泌レベルであることが証明し得る。本発明のリーダー配列が、第１の対照により得られる分泌レベルよりも少なくとも４００％、例えば、４０８％、または少なくとも４４０％、例えば、４４２％高い分泌レベルを獲得することが特に好ましい。
【００４５】
第１のプロトコールに代わる方法として、第２のプロトコールを用いて、所与の配列（「試験配列」）が一定の分泌レベルを達成し得るかどうかを判定してもよい。第２のプロトコールは第１のプロトコールと本質的に同じである。しかしながら、第２のプロトコールでは、プラスミドが、配列番号２６の代わりに、配列番号２２で定義されるポリヌクレオチド配列を有し、ｒＨＡをコードするポリヌクレオチドに連結されたＷＯ９０／０１０６３で記載されているアミノ酸配列を有するリーダー配列もコードする（「第２のスターター」プラスミド）ことを除いて上記の通りの「スターター」プラスミドを利用する。試験プラスミドは第２のスタータープラスミドを、試験配列をコードするポリヌクレオチド配列を、第２のスタータープラスミドのリーダー配列の相当する領域の代わりに含めるよう改変することにより作製する。第２の対照として、改変されていない第２のスタータープラスミドを使用する。試験および第２の対照プラスミドを含む形質転換体を第１のプロトコールに関して以上で記述したように調製し、フェドバッチ手順による高細胞密度発酵にて、ＷＯ９６／３７５１５にて記載されているある培地で、制御パラメーターを使用して培養する。ＹＰ／Ｓは上記の通りに評価する。
【００４６】
試験および第２の対照形質転換体を比較できる発酵槽配置で比較できる時間培養するとき、本発明のリーダー配列は、上記の第２のプロトコールにより測定するＹＰ／Ｓにより判定した場合、第２の対照により得られる分泌レベルよりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％，１７％，１８％、１９％または２０％高い分泌レベルを獲得し得る。よって、本発明のリーダー配列が第２の対照よりも最大２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％またはそれ以上に高い分泌レベルであることが証明し得る。本発明のリーダー配列が、第２の対照により得られる分泌レベルよりも少なくとも５％、例えば、６％、または少なくとも１０％、例えば、１２％、１３％、１４％、１５％または１６％高い分泌レベルを獲得することが特に好ましい。
【００４７】
１つの態様では、本発明のリーダー配列が第１のプロトコールに関して以上で記述した分泌レベルを獲得する。もう１つの態様では、本発明のリーダー配列が第２のプロトコールに関して以上で記述した分泌レベルを獲得する。特に好ましい態様では、本発明のリーダー配列が第１および第２のプロトコール両方に関して以上で記述した分泌レベルを獲得する。
【００４８】
細胞バイオマス由来の可溶性タンパク質および培養物上清中に分泌されたタンパク質は：
１．ゲル透過高速液体クロマトグラフィー
２．ＳＤＳ−ＰＡＧＥのデンシトメトリー
３．ロケット免疫電気泳動
により分析することができる。
【００４９】
分泌された目的タンパク質の量および細胞内の目的タンパク質の量を、目的タンパク質の標準曲線と比べて定量し、当業者ならば周知のようにバイオマスの量に標準化する。
【００５０】
通常、リーダー配列が、その配列を付けるか、または付けることが意図される未熟型の成熟タンパク質から誘導される場合が好ましい。よって、例えば、成熟タンパク質がアルブミンである場合には、天然のアルブミン分泌プレ配列またはプロ配列あるいはプレ−プロ配列を含んでなる配列を使用することが好ましい。しかしながら、リーダー配列は、もう１つの方法として、成熟タンパク質のもの以外の起源から誘導されてもよい。
【００５１】
よって、１つの好ましい態様では、本発明の第１の態様のポリペプチドのリーダー配列がアルブミン分泌プレ配列またはその変異体から誘導された分泌プレ配列を含んでなる。
【００５２】
以上で用いたアルブミンプレ配列の「変異体」とは、以上のＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４またはＸ５により定義された位置以外の、１箇所以上の位置にアミノ酸の挿入、欠失、または保存的置換（上記の通り）もしくは非保存的置換のいずれかの置換が存在するアルブミンプレ配列を指すが、そのような変化によってもそのペプチドがプレ配列の機能を果たし得るという条件においてである。
【００５３】
好ましくは、アルブミンプレ配列の「変異体」が、以上のＸ１〜Ｘ５と定義される残基以外に、天然のアルブミンプレ配列、最も好ましくは、図１のアルブミンプレ配列と少なくとも２個、少なくとも３個または少なくとも４個、好ましくは、少なくとも５個、より好ましくは、少なくとも６個、なおいっそう好ましくは、少なくとも７個、さらに好ましくは、少なくとも８個、最も好ましくは、少なくとも９個の同一アミノ酸を有する。
【００５４】
なおいっそう好ましくは、分泌プレ配列がアルブミン分泌プレ配列から誘導される場合に、本発明の第１の態様のポリペプチドがそれぞれ−２０、−１９、−１８、−１７および−１６番にある天然アミノ酸の代わりに、それらの位置にＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４およびＸ５を有する、ここで、そのナンバリングが天然のアルブミン分泌プロ配列のＣ末端アミノ酸を−１位の残基とするものであり、かつ、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４およびＸ５が上記のようなアミノ酸である。
【００５５】
例えば、上記のナンバリングをヒトアルブミン分泌プレ配列の配列に適用する（例えば、ＷＯ９０／０１０６３で開示されている通り）と、以下のものが得られる：
【化９】
0004597668.tif 000010
【００５６】
特に好ましい態様では、使用される分泌プレ−配列がヒトアルブミン分泌プレ配列の配列から誘導される。
【００５７】
よって、例えば、Ｘ１−Ｘ５ペンタペプチドがそのＮ末端において、以下の配列番号８の配列：
【化１０】
0004597668.tif 000011
配列番号８
またはその保存的に置換されたその変異体、すなわち：
【化１１】
0004597668.tif 000012
配列番号３３
のＣ末端と直接または間接的に融合され得る。
【００５８】
さらに、またはあるいは、それがそのＣ末端において、以下の配列
【化１２】
0004597668.tif 000013
配列番号９
または保存的に置換されたその変異体、すなわち：
【化１３】
0004597668.tif 000014
配列番号１０
もしくは
【化１４】
0004597668.tif 000015
配列番号１１
もしくは
【化１５】
0004597668.tif 000016
配列番号３０
の少なくとも１つのＮ末端と直接または間接的に融合され得る。
【００５９】
配列番号９で示す配列は天然ヒトアルブミンプレ配列の最後の９個のアミノ酸を表している。配列番号１１の場合、これがＷＯ９０／０１０６３の２つの主要な融合リーダー配列のうちの一方の最後の６個のアミノ酸と融合され、配列番号３０の場合、配列番号９が天然ヒトアルブミンプロ配列の最後の６個のアミノ酸と融合される。
【００６０】
好ましくは、いずれの場合にも、Ｘ１はＦであり、Ｘ２はＩであり、Ｘ３はＶであり、Ｘ４はＳまたはＴであり、かつ、Ｘ５はＩである。
【００６１】
好ましい態様では、ペンタペプチドがそのＮ末端において配列番号８の配列または保存的に置換されたその変異体のＣ末端と融合され、かつ、そのＣ末端において配列番号９の配列、保存的に置換されたその変異体、配列番号１０、１１もしくは３０のＮ末端と融合され、その結果として、例えば、以下の配列：
【化１６】
0004597668.tif 000017
配列番号１２
または
【化１７】
0004597668.tif 000018
配列番号１３
または
【化１８】
0004597668.tif 000019
配列番号１４
【化１９】
0004597668.tif 000020
配列番号３１
（式中、Ｘ１〜Ｘ５は上記のとおりである）、
あるいは以上で定義された保存的に置換されたその変異体
のうちの１つを形成する。
【００６２】
特に好ましい態様は分泌プレ配列として、配列番号２８の配列：
【化２０】
0004597668.tif 000021
配列番号２８
を有する、すなわち、プレ配列がヒト血清アルブミン分泌プレ配列から誘導されたものであり、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４およびＸ５が、−２０、−１９、−１８、−１７および−１６番に存在し、かつ、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４およびＸ５が配列番号７により示されるとおりである。
【００６３】
以上のことからわかるように、以上で定義された分泌プレ配列、例えば、配列番号１２または２８の配列を分泌プロ配列と組み合わせて、機能的プレ−プロ分泌配列を作製してもよい。好ましい態様では、プレ配列モチーフをそのＣ末端において分泌プロ配列モチーフのＮ末端アミノ酸とペプチド結合により融合し、その結果として、プレ−プロ配列モチーフを形成する。リーダー配列を付けるか、または付けることが意図される未熟型の成熟タンパク質から誘導されたプロ配列を使用することも好ましくある。関連リーダー由来の改変されていないプレ配列またはプロ配列、もしくはその一部と事実上結合するプロ配列を使用することもまた好ましくある。
【００６４】
好ましくは、プロ配列がそのＣ末端において、二塩基性アミノ酸対、すなわち、各々がＬｙｓまたはＡｒｇである、で終結する。
【００６５】
一般に、分泌プロ配列モチーフが、アルブミン分泌プロ配列または二塩基性アミノ酸対を含み、その他の位置には保存的置換しかを有さないようなその変異体、通常、ヒトアルブミン分泌プロ配列、すなわち、配列Ｎ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｃを有するものまたはその変異体である。もう１つの好ましい態様では、プロ配列が酵母ＭＦα−１分泌プロ配列、すなわち、Ｎ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｃまたはアルブミンプロ配列に関して定義されたその変異体の全てまたは一部の配列を含んでなる。
【００６６】
ＷＯ９０／０１０６３に記載されているリーダーおよびヒトアルブミンリーダーの相当する部分と比べて、本発明のポリペプチドは少なくとも４個のアミノ酸、すなわち、Ｓｅｒ−２０ＰｈｅまたはＴｒｐまたはＴｙｒ；Ｐｈｅ−１９ＩｌｅまたはＬｅｕまたはＶａｌまたはＡｌａまたはＭｅｔ；Ｉｌｅ−１８ＬｅｕまたはＶａｌまたはＡｌａまたはＭｅｔ；およびＬｅｕ−１６ＩｌｅまたはＶａｌまたはＡｌａまたはＭｅｔが変化している、この表記法では、一例として挙げると、最初に名前を挙げた変異は−２０番（すなわち、リーダー配列を用いて分泌されるであろう成熟タンパク質のＮ末端に対してマイナス２０）にあるセリン残基がフェニルアラニン残基に変化していることを意味している。これについては図１にて例示する。
【００６７】
１つの好ましいプレ−プロ配列は、下記配列を含んでなる：
【化２１】
0004597668.tif 000022
（式中、Ｙ１はＧｌｙまたはＳｅｒであり、Ｙ２はＶａｌまたはＬｅｕであり、Ｙ３はＰｈｅまたはＡｓｐであり、Ｙ４はＡｒｇまたはＬｙｓであり、かつ、Ｙ５はＡｒｇまたはＬｙｓである）。
【００６８】
好ましい態様では、Ｙ１はＧｌｙであり、Ｙ２はＶａｌであり、かつ、Ｙ３はＰｈｅである。もう１つの好ましい態様では、Ｙ１はＳｅｒであり、Ｙ２はＬｅｕであり、かつ、Ｙ３はＡｓｐである。
【００６９】
一般に、Ｙ４はＡｒｇであり、かつ、Ｙ５はＡｒｇである。あるいは、Ｙ４がＬｙｓであり、かつ、Ｙ５がＡｒｇである場合が好ましい。もう１つの好ましい別のものがＹ４がＬｙｓであり、かつ、Ｙ５がＬｙｓである場合である。Ｙ５がＬｙｓである場合にはＹ４はＡｒｇであってもよい。
【００７０】
特に好ましい態様は分泌プレプロ配列として、下記配列番号３２の配列を有する。
【化２２】
0004597668.tif 000023
配列番号３２
【００７１】
本発明の第２の態様は、本発明の第１の態様により定義されたモチーフをコードする配列を有する単離ポリヌクレオチドを提供する。
【００７２】
本明細書において、「単離」とは、ポリヌクレオチドが、ＤＮＡ分子の場合、それが自然に見つけられる染色体の少なくとも大部分から独立して存在していること、また、ＲＮＡ分子の場合、それが自然に転写される無傷細胞から独立して存在しているという意味を含む。言い換えれば、ポリヌクレオチドが、それがそれまでに存在していた、例えば、自然界での形態にあるとは言えない。よって、本発明の第２の態様のポリヌクレオチドは、細菌もしくは真菌ベクター、例えば、プラスミド、またはウイルスベクター、例えば、バクテリオファージにクローニングされたポリヌクレオチドを含む。好ましくは、このようなクローンは、関連染色体のＤＮＡライブラリーを構成しているクローンから独立して存在している。
【００７３】
線形アミノ酸配列は、大部分のアミノ酸が２以上のトリヌクレオチドコドンによってコードされているという標準的な遺伝子コード（図２）の縮重を用いてＤＮＡ配列へと逆翻訳することができる。
【００７４】
例えば、配列番号１と定義されたペプチドをコードするＤＮＡ配列が、下記配列であると推測される：
【化２３】
0004597668.tif 000024
配列番号１５
（式中、「３’」および「５’」は実際の末端というよりもポリヌクレオチド配列の方向を示し；言い換えれば、ポリヌクレオチド配列はいずれかの末端において、または両方の末端において、他のポリヌクレオチド配列と結合され得（例えば、融合され得るか、または連結され得）、かつ、Ｙ、Ｒ、ＨおよびＮは図２で定義されたとおりである）。
【００７５】
同じ変換手順を利用して、下記ＤＮＡ配列が、配列番号７のポリペプチドをコードすると推測される。
【化２４】
0004597668.tif 000025
配列番号１６
【００７６】
ヒトアルブミンのような天然の成熟タンパク質をコードする配列を含んでなるポリヌクレオチド配列の場合では、これがヒトアルブミン遺伝子配列などの天然のコード配列、または相補ＤＮＡ配列(ｃＤＮＡ)もしくは１以上のイントロンを含むｃＤＮＡのいずれかであり得る。
【００７７】
さらなる配列の改変を、例えば、コード領域に導入してもよい。本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを改変するための所望の方法は、Saiki et al (1988) Science 239, 487-491により開示されているポリメラーゼ鎖反応を利用することである。この方法では、酵素により増幅しようとするＤＮＡの両側に２つの特定のオリゴヌクレオチドプライマーを置くが、それらのプライマー自体が増幅されるＤＮＡに組み込まれることとなる。該特定のプライマーは制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含み、これらの部位は当技術分野で公知の方法を利用した発現ベクターへのクローニングに使用することができる。
【００７８】
本発明のリーダー配列をコードするポリヌクレオチドは、最も便宜には、当技術分野では周知であり、かつ、以下でより詳細に記述する方法により、オリゴヌクレオチドを化学合成し、続いて、遺伝子構築物の他のエレメントと連結することにより作製される。
【００７９】
成熟アルブミンをコードするポリヌクレオチドを改変することが望まれる場合には、最も便宜には、天然のｃＤＮＡ配列からの部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲ突然変異誘発により、または合成オリゴヌクレオチドのアセンブリングからこれを行ってよい。さらに、このような技術は当技術分野では標準的なものであり、また、いずれにせよ以下でより詳細に記述する。
【００８０】
コード配列に対する改変は、特定の生物において、高度に発現されるあるタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列が特定のアミノ酸に対してあるコドンに偏って使用していること；これはコドンバイアスと呼ばれていることである、から有利である場合がある。本発明の第２の態様の好ましい態様では、標準的な遺伝子コードを最適な宿主生物に対する好ましいコドンに変えることができる。本発明の第２の態様の特に好ましい態様では、標準的な遺伝子コードを酵母の好ましいコドンに変えることができる。（Sharp and Crowe (1991) Yeast 7, 657-678の表４を参照）有利には、好ましい酵母コドンのこのリストはアスパラギンコドン５’−ＧＡＴ−３’を含めることにより改変される（図３）。
【００８１】
一例として、配列番号１のペプチド配列を用いて、酵母のこのペプチドをコードするコドンに偏りのあるＤＮＡ配列が下記のものであると推測され得る。
【化２５】
0004597668.tif 000026
配列番号１７
【００８２】
同じ変換手順を利用して、配列番号７の配列を有する特に好ましいポリペプチドモチーフについてのコドンに偏りのある縮重ＤＮＡ配列：
【化２６】
0004597668.tif 000027
配列番号１８
が推定されるが、配列番号７の配列を有するポリペプチドモチーフをコードする最も好ましいコドンに偏りのあるＤＮＡ配列は下記のものである。
【化２７】
0004597668.tif 000028
配列番号３４
【００８３】
図２で示す遺伝子コードまたは対象となる宿主に使用可能な好ましいコドンバイアス表もしくは図３で示す好ましいコドンバイアスを利用して、目的のアミノ酸配列を同じ変換手順により部分的に冗長なポリヌクレオチド配列に変換することができる。この方法によりＤＮＡ配列に変換するアミノ酸配列は、限定されるものではないが、本発明の第１の態様のポリペプチドから選択してよい。例えば、成熟ヒトアルブミンのコード領域の配列はこの方法により誘導することができる。ＥＰ３０８３８１はヒトアルブミンの酵母コドン最適化部分的コード配列を開示している。本明細書における配列番号２０はそういった配列のさらなるものである。有利には、ＤＮＡ配列の冗長性が許せば、コードされたアミノ酸配列（または図３を利用する場合にはコドンバイアス）を乱すことなく、ドメインおよびサブドメインの境界に制限部位を導入することができる。
【００８４】
残るＤＮＡ配列の冗長性を解明し、別のコドンの発生頻度を冗長なＤＮＡ配列を有する各アミノ酸に対して均等化することができる。縮重コドンのＤＮＡ配列の冗長性を利用することにより可能であれば、可能性ある転写終結配列を示すＤＮＡ配列を除くか、または縮小することが有利である。最後に、冗長なＤＮＡ配列を有するアミノ酸の別のコドンのバランスを再度均等化することができるが、これまでの改変と矛盾することはない。
【００８５】
本発明の第２の態様のポリヌクレオチドは、その５’および／または３’末端において、１以上の他のヌクレオチド配列と直接または間接的に融合し、その結果として、例えば、完全な遺伝子または発現カセットを形成することができる。よって、発現カセットは転写開始および終結部位、ならびに、転写された領域内に、翻訳開始のためのリボソーム結合部位も含むことが望ましい（１９９８年４月２３日に公開されたHastings et al、ＷＯ９８／１６６４３)。
【００８６】
従って、本発明の第２の態様は、異種タンパク質をコードするＤＮＡと、本発明の第１の態様のポリペプチド、特に、目的タンパク質がアルブミンである場合、をコードするＤＮＡ配列またはその変異体もしくは断片のいずれかとの連続したまたは不連続な融合物であるＤＮＡ配列を含んでなるポリヌクレオチドを含む。これに関連して、「異種タンパク質」とは、それが「目的タンパク質」と同じではないこと、すなわち、ホモ二量体を形成しないことを意味する。
【００８７】
従って、ポリヌクレオチドはその５’末端においてプロモーター（ＲＮＡポリメラーゼの結合および転写を起こさせるＤＮＡ配列により形成された発現制御エレメント）と、かつ／またはその３’末端において他の調節配列、例えば、翻訳終結配列と直接または間接的に融合されていてもよい。よって、ポリヌクレオチドが１以上の調節領域、通常、転写調節領域に作動可能なように連結されていてもよい。「作動可能なように連結された」とは、調節領域が、それがポリヌクレオチド配列に対して作用を及ぼし得るように連結されていることを意味する。どの調節領域を使用するかの選択は、想定される宿主（すなわち、意図される発現系）にある程度依存するが、好ましい配列の選択は当業者には知られている。
【００８８】
数多くの発現系が知られているが、そのような系としては、例えば、組換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（例えば、枯草菌(Bacillus subtilis)または大腸菌(Escherichia coli)）；例えば、酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、サッカロミセス・セレビシエまたはピキア・パストリス）；例えば、ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）で形質転換された昆虫細胞系；例えば、ウイルスまたは細菌発現ベクターで形質転換された植物細胞系；例えば、アデノウイルス発現ベクターで形質転換された、動物細胞系の細胞培養物、動物細胞系トランスジェニック細胞、または遺伝子療法としての動物細胞系のいずれか、を使用する系が挙げられる。宿主細胞は、好ましくは、酵母（最も好ましくは、サッカロミセス属(Saccharomyces)種、例えば、Ｓ．セレビシエまたはピキア属(Pichia)種、例えば、Ｐ．パストリス)である。
【００８９】
従って、本発明の第３の態様は、本発明の第２の態様のポリヌクレオチドで形質転換された宿主細胞を提供する。その宿主細胞は、原核生物細胞でも真核生物細胞でもよい。細菌細胞が、特に、バチルス属(Bacillus)およびエシェリキア属(Escherichia)のいくつかの種が可能なようにそれらがタンパク質を分泌し得るならば好ましい原核生物の宿主細胞である。好ましい真核生物宿主細胞としては、植物、真菌、酵母および動物細胞、好ましくは、脊椎動物細胞、より好ましくは、哺乳類細胞、例えば、マウス、ラット、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、バッファロー、ヤク、ウマもしくは他の家畜、サルまたはヒト由来のものが挙げられる。好適なヒト細胞としては、ヒト繊維芽細胞細胞系の細胞が挙げられる。よって、宿主細胞がin situの哺乳類のトランスジェニック細胞であってよく、それゆえ、遺伝子療法アプローチまたはトランスジェニック個体の作製による産物であり得る。後者の場合では、個体が非ヒト哺乳類であることが好ましい。
【００９０】
細菌宿主の典型的な種類としては、大腸菌および枯草菌が挙げられる。
【００９１】
植物宿主の典型的な種類としては、種子植物類、シダ植物類（例えば、シダ類、ヒカゲノカズラ類、トクサ類）、コケ植物類（例えば、ゼニゴケ類およびセン類）、および藻類が挙げられる。一般に、植物宿主細胞は多細胞植物、通常、裸子植物または被子植物などの種子植物から誘導されたものである。好適な裸子植物としては、針葉樹類（例えば、マツ、カラマツ、モミ、トウヒおよびヒマラヤスギ）、ソテツ類、イチイ類およびイチョウ類が挙げられる。より一般には、植物宿主細胞が単子葉植物または双子葉植物、好ましくは、作物であり得る被子植物の細胞である。好ましい単子葉植物としては、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、サトウモロコシ、タマネギ、カラスムギ、カモガヤおよび他のイチゴツナギ亜科（Pooideae）が挙げられる。好ましい双子葉植物の作物としては、トマト、ジャガイモ、テンサイ、タピオカノキ、アブラナ科の作物（アブラナを含む)、アマニ、タバコ、ヒマワリ、繊維作物、例えば、綿、ならびに豆科植物、例えば、エンドウ、インゲンマメ、特に、ダイズ、およびアルファルファが挙げられる。よって、宿主細胞は自律的細胞(autonomous cell)、例えば、単細胞植物の細胞または細胞培養で維持される細胞であってよいし、または多細胞植物のin situ細胞であってもよい。従って、本発明は、好ましくは、安定した遺伝性のトランスジェニック表現型を保持する完全トランスジェニック植物の生産を意図する。
【００９２】
真菌宿主の典型的な種類としては、アスペルギルス属(Aspergillus)（例えば、Ａ．ニガー(A. niger)およびＡ．オリゼー(A. oryzae)）、ストレプトミセス属(Streptomyces)、ペニシリウム属(Penicillium)および酵母が挙げられる。本発明の実施において有用であると考えられる酵母の典型的な種類としては、ピキア属（ハンセヌラ属(Hansenula)）、サッカロミセス属、クルイベロミセス属(Kluyveromyces)、カンジダ属(Candida)、トルロプシス属(Torulopsis)、トルラスポラ属(Torulaspora)、シゾサッカロミセス属(Schizosaccharomyces)、サイテロミセス属(Citeromyces)、パキソレン属(Pachysolen)、デバロミセス属(Debaromyces)、メチニコウィア属(Metschunikowia)、ロドスポリジウム属(Rhodosporidium)、ロイコスポリジウム属(Leucosporidium)、ボトリオアスクス属(Botryoascus)、スポリジオボルス属(Sporidiobolus)、エンドミコプシス属(Endomycopsis)などがある。好ましい属は、ピキア属（ハンセヌラ属）、サッカロミセス属、クルイベロミセス属およびヤロウィア属(Yarrowia)からなる群から選択されるものである。サッカロミセス属種の例として、Ｓ．セレビシエ、Ｓ．イタリクス(S. italicus)およびＳ．ルキシー(S. rouxii)がある。クルイベロミセス属種の例として、Ｋ．フラギリス(K. fragilis)およびＫ．ラクティス(K. lactis)がある。ピキア属（ハンセヌラ属）種の例として、Ｐ．パストリス、Ｐ．アノマラ(P. anomala)およびＰ．カプスラータ(P. capsulata)がある。好適なヤロウィア属種の例としては、Ｙ．リポリチカ(Y. lipolytica)がある。酵母宿主細胞としては、一般に、Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, USAから市販されているＹＰＨ４９９、ＹＰＨ５００およびＹＰＨ５０１が挙げられる。
【００９３】
好ましい哺乳類宿主細胞としては、ＡＴＣＣからＣＣＬ６１として入手可能であるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＡＴＣＣからＣＲＬ１６５８として入手可能であるＮＩＨ Ｓｗｉｓｓマウス胚細胞ＮＩＨ／３Ｔ３、およびＡＴＣＣからＣＲＬ１６５０として入手可能であるサル腎臓由来のＣＯＳ−１細胞が挙げられる。好ましい昆虫細胞としては、バキュロウイルス発現ベクターでトランスフェクトすることができるＳｆ９細胞がある。
【００９４】
上述したように、ポリヌクレオチド調節領域の選択は、意図される宿主の性質にある程度依存する。
【００９５】
細菌宿主細胞における使用に好適なプロモーターとしては、大腸菌ｌａｃＩおよびｌａｃＺプロモーター、Ｔ３およびＴ７プロモーター、ｇｐｔプロモーター、ファージλＰＲおよびＰＬプロモーター、ｐｈｏＡプロモーターおよびｔｒｐプロモーターが挙げられる。本発明のＤＮＡセグメントの挿入に便宜な制限部位を含むプラスミドベクターには、通常、典型的な細菌宿主に適合するプロモーター配列が提供される。
【００９６】
真核生物のプロモーターとしては、ＣＭＶ前初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、初期および後期ＳＶ４０プロモーターならびにレトロウイルスＬＴＲのプロモーターが挙げられる。他の好適なプロモーターは、当業者には公知である。
【００９７】
Ｓ．セレビシエに好適なプロモーターとしては、ＰＧＫ１遺伝子、ＧＡＬ１またはＧＡＬ１０遺伝子、ＣＹＣ１、ＰＨＯ５、ＴＲＰ１、ＡＤＨ１、ＡＤＨ２、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、グルコキナーゼ、α接合因子フェロモン、ａ−接合因子フェロモンに関する遺伝子に関連するもの、ＰＲＢ１プロモーター、ＧＰＤ１プロモーター、ならびに、５’調節領域の部分と、その他のプロモーターの５’調節領域の部分とのハイブリッド、あるいは、上流活性化部位とのハイブリッドを含むハイブリッドプロモーター（例えば、ＥＰ−Ａ−２５８  ０６７のプロモーター）が挙げられる。
【００９８】
もう１つの好適な宿主細胞であるシゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharoonyces pombe)における使用に便宜な調節プロモーターとしては、Maundrell (1990) J. Biol. Chem. 265, 10857-10864に記載されているｎｍｔ遺伝子に由来するチアミン抑制プロモーター、ならびにHoffman & Winston (1990) Genetics 124, 807-816に記載されているグルコース抑制ｆｂｐ１遺伝子プロモーターある。がある。
【００９９】
ピキア属に好適なプロモーター、形質転換プロトコールおよび培養条件については、米国特許第５９８６０６２号（引用することにより本明細書の一部とされる）で見つけることができる。例えば、ＨＳＡ産生宿主(またはＨＳＡ産生株)の作製は、組換えプラスミドを染色体に導入するという方法（ＥＰ−Ａ−３９９４５５に対応するＪＰ−Ａ−３−７２８８９）、ＨＳＡを酵母で発現させるという方法（ＥＰ−Ａ−１２３５４４に対応するＪＰ−Ａ−６０−４１４８７、ＥＰ−Ａ−２４８６５７に対応するＪＰ−Ａ−６３−３９５７６およびＥＰ−Ａ−２５１７４４に対応するＪＰ−Ａ−６３−７４４９３）、およびＨＳＡをピキア属で発現させるという方法（ＥＰ−Ａ−３４４４５９に対応するＪＰ−Ａ−２−１０４２９０）を利用して行い得る。ＨＳＡ産生宿主の培養（ＨＳＡ産生プロセス）は、米国特許第５，９８６，０６２号に記載されている方法などの既知の方法を利用して、例えば、ＪＰ−Ａ−３−８３５９５またはＪＰ−Ａ−４−２９３４９５（ＥＰ−Ａ−５０４８２３に対応）に開示されている方法により実施することができる。形質転換された宿主を培養するための培地は、米国特許第５，９８６，０６２号に従って調製し得、宿主の培養は、米国特許第５，９８６，０６２号の開示内容に従って、静置もしくは振盪培養または攪拌および通気下でのバッチ式、半バッチ式もしくは連続培養により、好ましくは、1５〜４３℃（より好ましくは、２０〜３０℃）にて１〜１，０００時間実施することができる。
【０１００】
好適な転写終結シグナルは当技術分野では周知である。宿主細胞が真核生物である場合、転写終結シグナルは、好ましくは、適正な転写終結シグナルおよびポリアデニル化シグナルを含む真核生物の遺伝子の３’フランキング配列由来のものである。好適な３’フランキング配列が、例えば、使用される発現制御配列に自然に連結された遺伝子のものであってよい、すなわち、それらがプロモーターと一致したものであってもよい。あるいは、それらが異なっていてもよい。その場合には、宿主が酵母、好ましくは、Ｓ．セレビシエであれば、Ｓ．セレビシエＡＤＨ１遺伝子の終結シグナルが好ましい。
【０１０１】
よって、本発明の第２の態様のポリヌクレオチドは、以上で記述したような方法を利用することによりいかなる所望の宿主に対しても開発することができる。
【０１０２】
成熟ヒトアルブミンをコードするＤＮＡ配列は、以上で記述した、天然の遺伝子、ｃＤＮＡまたは１以上のイントロンを含むｃＤＮＡと、以上で記述した方法により誘導したコドンに偏りのあるヒトアルブミンＤＮＡ配列とのＤＮＡ融合物から開発することができる。
【０１０３】
配列番号１９は、翻訳開始部位の５’に２２ヌクレオチド、分泌リーダー配列  配列番号３２の好ましいポリヌクレオチドコード配列、および成熟ヒトアルブミンコード領域  配列番号２０を含んでなるポリヌクレオチド配列である。コード配列は翻訳終止コドンで終わる。このコドンは、一般には、ＴＧＡ、ＴＡＧまたはＴＡＡであるが、酵母ではＴＡＡが最も有効である。好ましくは、さらなる翻訳終止コドン(好ましくは、各々ＴＡＡである）、通常１つまたは２つが、好ましくは、互いに隣接してまたは終止コドンの各対間３塩基対以下で含まれる。配列番号１９は両末端に好適なクローニング部位がフランキングする。
【０１０４】
本発明の第２の態様のポリヌクレオチドはまた、好適な宿主への導入に向けて多くの種類の他のＤＮＡ配列と結合し得る。コンパニオン配列は、宿主の性質、ポリヌクレオチドの宿主への導入方法、およびエピソーム維持または組込みが所望か否かに依存する。例えば、ベクターを他の非原核生物細胞型での発現に使用する場合でも、ベクターが原核生物における増殖のためのＣｏｌ  Ｅ１  ｏｒｉなどの原核生物レプリコンを含むことがある。
【０１０５】
一般に、本発明の第２の態様のポリヌクレオチドは、プラスミドなどの発現ベクターに、適正な方向および正確な発現用リーディングフレーム内に挿入される。
【０１０６】
よって、ポリヌクレオチドを本明細書に記載の教示に照らして好適に改変された既知の技術に従って使用して、限定されるものではないが、組込みベクター、動原体ベクターおよびエピソームベクターをはじめとする発現ベクターを構築し得る。
【０１０７】
よって、本発明の第２の態様の１つの態様では、ポリヌクレオチドがベクターである。
【０１０８】
一般的な原核生物ベクタープラスミドとしては、Biorad Laboratories(Richmond, CA, USA)から市販されているｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２およびｐＢＲ３２９；Pharmacia(Piscataway, NJ, USA)から市販されているｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０およびｐＲＩＴ５；Stratagene Cloning Systems(La Jolla, CA 92037, USA)から市販されているｐＢＳベクター、Phagescriptベクター、Bluescriptベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６Ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａがある。
【０１０９】
一般的な哺乳類細胞ベクタープラスミドとしては、Pharmacia(Piscataway, NJ, USA)から市販されているｐＳＶＬがある。このベクターはＳＶ４０後期プロモーターを使用してクローニングされた遺伝子の発現を推進するが、ＣＯＳ−１細胞などのＴ抗原産生細胞において最高レベルの発現が認められる。誘導性哺乳類発現ベクターの例としては、Pharmacia(Piscataway, NJ, USA)からも市販されているｐＭＳＧがある。このベクターはマウス乳癌ウイルスの長い末端反復配列のグルココルチコイド誘導性プロモーターを使用してクローニングされた遺伝子の発現を推進する。
【０１１０】
有用な酵母エピソームプラスミドベクターとしては、ｐＲＳ４０３−４０６およびｐＲＳ４１３−４１６、これらは、一般に、Stratagene Cloning Systems(La Jolla, CA 92037, USA)から市販されている、ＹＥｐ２４(Botstein, D., et al. (1979) Gene 8, 17-24)、ならびにＹＥｐｌａｃ１２２、ＹＥｐｌａｃ１９５およびＹＥｐｌａｃ１８１(Gietz, R. D. and Sugino. A. (1988) Gene 74, 527-534)がある。他の酵母プラスミドは、ＥＰ−Ａ−２８６  ４２４の「分解ベクター」に加えてさらに、ＷＯ９０／０１０６３およびＥＰ４２４１１７で記載されている。プラスミドｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５およびｐＲＳ４０６は、ＹＩｐｌａｃ２０４、ＹＩｐｌａｃ２１１およびＹＩｐｌａｃ１２８(Gietz, R. D. and Sugino. A. (1988) Gene 74, 527-534)がそうであるように、酵母組込み型プラスミド（ＹＩｐ）であり、酵母選択マーカーＨＩＳ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２およびＵＲＡ３を組み込んでいる。プラスミドｐＲＳ４１３−４１６は、ＹＣｐｌａｃ２２、ＹＣｐｌａｃ３３およびＹＣｐｌａｃ１１１(Gietz, R. D. and Sugino. A. (1988) Gene 74, 527-534)がそうであるように、酵母動原体プラスミド（ＹＣｐ）である。
【０１１１】
当業者には周知の方法を利用して、コード配列と、例えば、好適な転写または翻訳制御物を含む発現ベクターを構築することができる。このような１つの方法では、突出末端を介した連結を必要とする。好適な制限酵素の作用によりＤＮＡ断片およびベクターに適合する突出末端を作成することができる。これらの末端を相補塩基対合により迅速にアニーリングし、残るニックをＤＮＡリガーゼの作用により閉じることができる。
【０１１２】
さらなる方法では、合成二本鎖オリゴヌクレオチドリンカーとアダプターを使用する。平滑末端を有するＤＮＡ断片を、凸部３’末端を除去し、凹部３’末端を埋めるバクテリオファージ  Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼまたは大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩにより作製する。合成リンカーおよび特定の制限酵素の認識配列を含む平滑末端を有する二本鎖ＤＮＡの断片をＴ４  ＤＮＡリガーゼにより平滑末端を有するＤＮＡ断片に連結することができる。続いて、それらを好適な制限酵素で消化して突出末端を作り出し、適合する末端を有する発現ベクターに連結する。また、アダプターが連結に用いる１つの平滑末端を含み、また、１つの成形した突出末端も保有する化学合成されたＤＮＡ断片でもある。あるいは、１ＤＮＡ断片または複数のＤＮＡ断片を、所望により、突出末端を有していてもよい１以上の合成二本鎖オリゴヌクレオチドの存在または不在下で、ＤＮＡリガーゼの作用により一緒に連結してもよい。
【０１１３】
種々の制限エンドヌクレアーゼ部位を含む合成リンカーが、Sigma-Genosys Ltd, London Road, Pampisford, Cambridge, United Kingdomをはじめとする多数の供給源から市販されている。
【０１１４】
このようにして作製される本発明のベクターを、本発明の第１の態様で定義されたとおりの配列を含んでなるポリペプチドの発現および産生に向けて好適な宿主細胞を形質転換するために使用してもよい。このような技術としては、その全てが引用することにより本明細書の一部とされる、１９８４年４月３日に発行されたRutter et alの米国特許第４，４４０，８５９号、１９８５年７月２３日に発行されたWeissmanの同第４，５３０，９０１号、１９８６年４月１５日に発行されたCrowlの同第４，５８２，８００号、１９８７年６月３０日に発行されたMark et alの同第４，６７７，０６３号、１９８７年７月７日に発行されたGoeddelの同第４，６７８，７５１号、１９８７年１１月３日に発行されたItakura et alの同第４，７０４，３６２号、１９８７年１２月１日に発行されたMurrayの同第４，７１０，４６３号、１９８８年７月１２日に発行されたToole, Jr. et alの同第４，７５７，００６号、１９８８年８月２３日に発行されたGoeddel et alの同第４，７６６，０７５号、および１９８９年３月７日に発行されたStalkerの同第４，８１０，６４８号で開示されているものが挙げられる。
【０１１５】
本発明のＤＮＡ構築物での好適な細胞宿主の形質転換は、周知の方法により実施されるが、一般に、使用するベクターのタイプよって異なる。原核生物宿主細胞の形質転換に関しては、例えば、Cohen et al (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2110およびSambrook et al (2001) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3'd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NYを参照のこと。酵母細胞の形質転換については、Sherman et al (1986) Methods In Yeast Genetics, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NYで記載されている。Beggs (1978) Nature 275,  104-109の方法もまた有用である。Ｓ．セレビシエを形質転換する方法については、その全てが引用することにより本明細書の一部とされる、ＥＰ２５１７４４、ＥＰ２５８０６７およびＷＯ９０／０１０６３で一般的に教示されている。脊椎動物細胞に関し、このような細胞をトランスフェクトするのに有用な試薬、例えば、リン酸カルシウムおよびＤＥＡＥ−デキストランまたはリポソーム製剤は、Stratagene Cloning Systems、またはLife Technologies Inc., Gaithersburg, MD 20877, USAから市販されている。
【０１１６】
エレクトロポレーションもまた、細胞の形質転換に有用であり、酵母細胞、細菌細胞および脊椎動物細胞を形質転換する技術分野では周知のことである。エレクトロポレーションにより酵母を形質転換する方法については、Becker & Guarente (1990) Methods Enzymol. 194, 182で開示されている。
【０１１７】
ＤＮＡを動物および植物細胞に導入するために物質的な方法を使用してもよい。例えば、マイクロインジェクションでは、極細のピペットを使用して、ＤＮＡ分子を形質転換しようとする細胞の核に直接注入する。もう１つの例では、高速マイクロプロジェクタイル、通常、ＤＮＡでコーティングした金またはタングステンの粒子の細胞への撃ち込みを使用する。
【０１１８】
植物は多くの当技術分野において承認されている方法により形質転換し得る。当業者ならば、その選択する方法が形質転換の対象となる植物のタイプに依存することが分かるであろう。植物細胞を形質転換する好適な方法の例としては、マイクロインジェクション(Crossway et al., BioTechniques 4: 320-334 (1986))、エレクトロポレーション(Riggs et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 5602-5606 (1986)、アグロバクテリウム(Agrobacterium)媒介形質転換(Hinchee et al, Biotechnology 6: 915-921 (1988)；トウモロコシの形質転換についてはIshida et al., Nature Biotechnology 14: 745-750 (1996)も参照のこと)、直接遺伝子導入(Paszkowski et al., EMBO J. 3: 2717-2722 (1984)；Hayashimoto et al., Plant Physiol. 93: 857-863 (1990)（イネ）)、およびAgracetus, Inc., Madison, Wisconsin and Dupont, Inc., Wilmington, Delawareから市販されている装置を使用した弾道学的粒子加速（例えば、Sanford et al., 米国特許第４，９４５，０５０号；およびMcCabe et al., Biotechnology 6: 923-926 (1988)を参照）が挙げられる。また、Weissinger et al., Annual Rev. Genet. 22: 421-477 (1988)；Sanford et al., Particulate Science and Technology 5: 27-37 91987)（タマネギ）；Svab et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 8526-8530 (1990)（タバコ葉緑体）；Christou et al., Plant Physiol. 87: 671-674 (1988)（ダイズ）；McCabe et al., Bio/Technology 6: 923-926 (1988)（ダイズ）；Klein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 4305-4309 (1988)（トウモロコシ）；Klein et al., Bio/Technology 6: 559-563 (1988)（トウモロコシ）；Klein et al., Plant Physiol. 91: 440-444 (1988)（トウモロコシ）；Fromm et al., Bio/Technology 8: 833-839 (1990)；およびGordon-Kamm et al., Plant Cell 2: 603-618 (1990)（トウモロコシ）；Koziel et al., Biotechnology 11: 194-200 (1993)（トウモロコシ）；Shimamoto et al., Nature 338: 274-277 (1989)（イネ）；Christou et al., Biotechnology 9: 957-962 (1991)（イネ）；Datta et al., Bio/Technology 8: 736-740 (1990)（イネ）；欧州特許出願ＥＰ−Ａ−３３２  ５８１（カモガヤおよび他のイチゴツナギ亜科）；Vasil et al., Biotechnology 11: 1553-1558 (1993)（コムギ）；Weeks et al., Plant Physiol. 102: 1077-1084 (1993)（コムギ）；Wan et al., Plant Physiol. 104: 37-48 (1994)（オオムギ）；Jahne et al., Theor. Appl. Genet. 89: 525-533 (1994)（オオムギ）；Umbeck et al., Bio/Technology 5: 263-266 (1987)（綿）；Casas et al., Proc.Natl. Acad. Sci. USA 90: 11212-11216 (1993)（サトウモロコシ）；Somers et al., Bio/Technology 10: 1589-1594 (1992)（カラスムギ）；Torbert et al., Plant Cell Reports 14: 6
35-640 (1995)（カラスムギ）；Weeks et al., Plant Physiol. 102. 1077-1084 (1993)（コムギ）；Chang et al., ＷＯ９４／１３８２２（コムギ）ならびにNehra et al., The Plant Journal 5: 285-297 (1994)（コムギ）も参照のこと。アグロバクテリウム媒介形質転換は、一般的には、単子葉植物に対して効果がなく、この種の植物には以上で記述した他の方法が好ましい。
【０１１９】
一般に、ベクターが宿主の全てを形質転換するのではないため、形質転換する宿主細胞に対してベクターを選択する必要がある。１つの選択手法では、形質転換される細胞において選択可能な特徴をコードする、必要な制御エレメントを含むＤＮＡ配列マーカーの発現ベクターへの組込みを利用する。これらのマーカーとしては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、Ｇ４１８または真核細胞培養に関するネオマイシン耐性、ならびに大腸菌および他の細菌での培養に関するテトラサイクリン、カナマイシンまたはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。あるいは、このような選択可能な特徴に関連する遺伝子が、所望の宿主細胞を同時に形質転換するために使用されるもう１つのベクターにあってもよい。
【０１２０】
マーカー遺伝子を使用して形質転換体を同定することができるが、どの細胞が組換えＤＮＡ分子を含んでいるのか、また、どれが自己連結したベクター分子を含んでいるのかが判定できることが望ましい。これは、ＤＮＡ断片を挿入することによってその分子に存在する遺伝子のうちの１つの完全性を破壊するクローニングベクターを利用することによって行うことができる。よって、組換え体はその遺伝子の機能の喪失によって同定することができる。
【０１２１】
首尾よく形質転換された細胞を同定するもう１つの方法では、本発明のポリペプチドを産生させるための本発明の発現構築物の導入により得られた細胞を増殖させる。細胞を回収し、それらを溶解し、それらのＤＮＡ含量をＤＮＡの存在について、Southern (1975) J. Mol. Biol. 98, 503またはBerent et al (1985) Biotech. 3, 208により記載されているような方法を利用して調べてもよい。あるいは、形質転換細胞の培養物上清中の成熟タンパク質の存在を抗体を用いて検出してもよい。
【０１２２】
組換えＤＮＡの存在について直接アッセイすることに加えて、組換えＤＮＡがタンパク質の発現を誘導し得る場合には周知の免疫学的方法により形質転換の成功を確認することができる。例えば、発現ベクターで首尾よく形質転換された細胞は、好適な抗原性を提示するタンパク質を産生する。形質転換されたと思われる細胞のサンプルを回収し、好適な抗体を用いてそのタンパク質についてアッセイする。
【０１２３】
よって、形質転換された宿主細胞自体に加えて、本発明はまた、これらの細胞の培養物、好ましくは、モノクローナル（クローン的に同質な）培養物、または栄養培地においてモノクローナル培養物から誘導された培養物も意図する。
【０１２４】
従って、本発明の第４の態様では、本発明の第３の態様の細胞と培養培地を含んでなる細胞培養物を提供する。一般に、培養培地は本発明の第１の態様のポリペプチドの発現系内での発現により、通常、プレおよび／またはプロ配列の除去などのさらなる翻訳プロセシングにより生じる成熟ポリペプチドを含有する。
【０１２５】
大腸菌などの原核生物宿主細胞、ならびに哺乳類細胞などの真核生物宿主細胞の培養方法は当技術分野では周知である。酵母の培養方法はＥＰ３３０４５１およびＥＰ３６１９９１で一般的に教示されている。
【０１２６】
本発明の組換えＤＮＡにより形質転換された宿主細胞を本明細書に開示されている教示に照らして、十分な時間、当業者には公知の好適な条件下で培養することにより、本発明の第１の態様のポリペプチドの発現が可能になる。このようにして産生されたポリペプチドに、プレおよび／またはプロ配列が除去されるように宿主細胞によるプロセシングをさらに行ってもよい。従って、「成熟した」目的タンパク質が最初に翻訳されたタンパク質とは異なっている場合がある。
【０１２７】
よって、本発明はまた、第５の態様として、以上で定義された成熟した目的タンパク質を作製する方法を提供する。この方法は、本発明の第３の態様の細胞を培養培地で培養する工程（ここで、その細胞は、本発明の第１の態様で定義されたとおりのポリペプチドの発現の結果として、成熟した目的タンパク質を分泌し、その際、そのタンパク質はペリプラスム間隙、その培養培地またはそれらの両方に蓄積するが、好ましくは、その培養培地に蓄積する）を含んでなる。次いで、分泌された目的タンパク質を含有する培養培地を細胞培養物中の細胞から分離する。細胞壁と結合した分泌されたタンパク質は、一般に、浸透性補助（例えば、ソルビトール）条件下（選択的に分泌されたタンパク質を徐々に放出する）、細胞壁融解酵素を用いて解離させることができる。Elango et al., J. Biol. Chem. 257: 1398-1400 (1982)を参照のこと。この目的に好適な細胞壁融解酵素の例としては、lyticase、Zymolyase-60,000およびGlusulaseが挙げられ、それらの全てが市販されており、例えば、後の２つの場合では、Seikagaku KogyoまたはKirin Breweryから、また、各々Boehringer Mannheimから市販されている。
【０１２８】
好ましくは、培養培地の単離後、成熟した目的タンパク質をその培地から分離する。なおいっそう好ましくは、このようにして得られた成熟した目的タンパク質をさらに精製する。
【０１２９】
目的の成熟タンパク質は当技術分野で公知の多くの方法により培養培地から抽出し得る。例えば、組換えにより発現されるアルブミンの回収に関する精製技術は、ＷＯ９２／０４３６７、基質由来の色素の除去；ＥＰ４６４５９０、酵母由来の染料の除去；ＥＰ３１９０６７、アルカリ沈殿およびその後のアルブミンの親油相への適用；ならびに全精製方法を記述しているＷＯ９６／３７５１５、米国特許第５７２８５５３号およびＷＯ００／４４７７２で開示されており、その全てが引用することにより本明細書の一部とされる。本発明の改変リーダー配列は成熟タンパク質それ自体に影響を及ぼさないため、アルブミン以外のタンパク質を、このようなタンパク質の精製に有用であることが分かっているいずれかの技術により培養培地から精製してもよい。
【０１３０】
このような周知の方法としては、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈降、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーが挙げられる。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）を精製に用いる。
【０１３１】
得られたタンパク質は、その知られた有用性のいずれかに向けて使用することができ、アルブミンの場合では、重度の火傷、ショック状態および失血を治療するための患者へのi.v.投与物、培養培地への補給物、ならびに他のタンパク質製剤の賦形剤としての使用を含む。
【０１３２】
本発明の方法により得られる治療上有用な目的タンパク質は、単独で投与することが可能であるが、そのタンパク質を１種以上の許容される担体または希釈剤とともに医薬製剤として提供することが好ましい。担体または希釈剤は、目的タンパク質と適合し、かつ、その受容者に対して有害ではないという意味において「許容される」ものでなければならない。一般に、担体または希釈剤は、無菌かつ発熱物質を含まない水または生理食塩水である。
【０１３３】
よって、本発明の第６の態様は、本発明の第５の態様の方法により得られる目的タンパク質を治療上許容される担体または希釈剤とともに製剤し、そうすることによって、ヒトまたは動物への投与に好適な治療用製品を生産する方法を提供する。
【０１３４】
治療用製品は、単位投与形で提供することが便宜であり、製薬分野では周知の方法のいずれによっても調製し得る。好ましい単位投与形製剤は、有効成分の、１日用量もしくは単位、１日用量以下の量またはその好適な分割量を含むものである。
【０１３５】
当然のことながら、治療用製品は、以上で特記した成分に加えて、問題の製品のタイプを考慮し、当技術分野で常用の他の薬剤を含んでいてもよい。
【０１３６】
以下、本発明を添付の限定されない図面および実施例を参照してより詳細に説明する。
【実施例】
【０１３７】
実施例１
下記の２種類の一本鎖オリゴヌクレオチドＰＲＢＪＭ１およびＰＲＢＪＭ２を用いたＰＣＲにより、サッカロミセス・セレビシエ  ＰＲＢＩプロモーターを酵母ゲノムＤＮＡから単離した。
ＰＲＢＪＭ１：
【化２８】
0004597668.tif 000029
配列番号３５
ＰＲＢＪＭ２：
【化２９】
0004597668.tif 000030
配列番号３６
【０１３８】
ＰＣＲ条件  ９４℃で３０秒間、５０℃で４０秒間、７２℃で１２０秒間、次いで、７２℃で６００秒間、その後、４℃で維持を４０サイクル。０．８５ｋｂ  ＤＮＡ断片をＮｏｔＩとＨｉｎｄIIIの両方で消化し、ＷＯ９７／２４４４５で記載されている、ＮｏｔＩとＨｉｎｄIIIで同様に消化したｐＢＳＴ＋に連結して、プラスミドｐＡＹＥ４３８（図４）を作出した。プラスミドｐＡＹＥ４３８をＨｉｎｄIIIとＢａｍＨＩで消化し、ＷＯ００／４４７７２で従前に開示されているｐＡＹＥ４４０由来の０．４８ｋｂ  ＨｉｎｄIII／ＢａｍＨＩ  ＡＤＨＩターミネーターＤＮＡ断片と連結して、プラスミドｐＡＹＥ４４１（図５）を作出した。プラスミドｐＡＹＥ４４１を独自のＨｉｎｄIII部位にて線状化し、従前に開示されている (Sleep, D. et al. (1991) Bio/Technology 9, 183-187およびＥＰ−Ａ−０４３１８８０)ｐＡＹＥ３０９（図６）由来の１．８ｋｂ  ＨｉｎｄIII／Ｂｓｕ３６Ｉ断片および二本鎖オリゴヌクレオチドリンカー：
【化３０】
0004597668.tif 000031
配列番号３７
【化３１】
0004597668.tif 000032
配列番号３８
と連結して、ｐＡＹＥ４６７（図７）を作出した。ｐＡＹＥ４６７由来の３．２ｋｂ  ＮｏｔＩ、発現カセットを、仔ウシ小腸ホスファターゼ（ＣＩＰ）で予め処理しておいたＮｏｔＩ線状化ｐＳＡＣ３５(Sleep et al. (1991), Bio/Technology 9: 183-187)に連結して、プラスミドｐＡＹＥ４４３（図８）を作出した。配列番号２２は、ｐＡＹＥ４６７およびｐＡＹＥ４４３両方のＤＮＡ配列内に見られるＨＳＡ／ＭＦα−１融合リーダー配列のコード領域と成熟ヒトアルブミンコード領域を含んでなるポリヌクレオチドを示すものである。ＨＳＡ／ＭＦα−１融合リーダー配列をコードするポリヌクレオチド配列を、ＤＮＡ配列：
【化３２】
0004597668.tif 000033
配列番号２３
を有するＣＰＫ１と呼ばれる一本鎖オリゴヌクレオチドを用いた部位特異的突然変異誘発により改変した。
【０１３９】
部位特異的突然変異誘発（ＳＤＭ）を標準的なプロトコール(引用することにより本明細書の一部とされるBotstein and Shortle, "Strategies and Applications of In Vitro Mutagenesis," Science, 229: 193-1210 (1985))に従って実施したが、他の好適な技術を利用してもよい。ＣＰＫ１のヌクレオチド配列は、ＨＳＡ／ＭＦα−１融合リーダー配列のアミノ酸配列を改変して、以下の変異Ｔｈｒ−２０Ｐｈｅ、Ｐｈｅ−１９Ｉｌｅ、Ｉｌｅ−１８ＶａｌおよびＬｅｕ−１６Ｉｌｅを導入するよう設計されたものである、ここで、そのナンバリング（−２０など）がＨＳＡ／ＭＦα−１融合リーダー配列のＣ末端アミノ酸を−１位の残基とするものである。
【０１４０】
突然変異を誘発させたプラスミドのＤＮＡ配列をジデオキシヌクレオチド配列決定法により確認し、ポリヌクレオチド配列が突然変異誘発を受けて目的の配列となったことおよび他のＤＮＡ配列の変化が導入されていないことをこの方法により確認した。この新規プラスミドをｐＡＹＥ６５３（図９）と名づけた。配列番号２４は、改変されたＨＳＡ／ＭＦα−１融合リーダー配列のコード領域を含んでなるポリヌクレオチド配列を示し、配列番号２５は、ｐＡＹＥ６５３のポリヌクレオチド配列内に見られる改変されたＨＳＡ／ＭＦα−１融合リーダー配列のコード領域と成熟ヒトアルブミンコード領域を含んでなるポリヌクレオチド配列を示すものである。
【０１４１】
ｐＡＹＥ６５３からＮｏｔＩヒトアルブミン発現カセットを単離し、プラスミドｐＳＡＣ３５の独自のＮｏｔＩ部位に連結して、プラスミドｐＡＹＥ６５５（図１０）を作製した。
【０１４２】
実施例２
配列番号１９は、サッカロミセス・セレビシエＰＲＢＩプロモーター由来の５’ＵＴＲを含む非コード領域；本発明の改変されたＨＳＡ／ＭＦα−１融合リーダー配列をコードするポリヌクレオチド領域；成熟ヒトアルブミンのコドン最適化コード領域および翻訳終結部位を含んでなるＤＮＡ配列を示すものである。
【０１４３】
配列番号１９のリーダー配列にもたらされる配列の改変の効果を比較するための対照として、配列番号４０が、配列番号４０のＤＮＡ配列が、本発明の第２の態様を示す１５ポリヌクレオチド領域の代わりに、改変されていないＨＳＡ／ＭＦα−１融合リーダー配列、すなわち、ＳＦＩＳＬの５個のアミノ酸をコードする１５ポリヌクレオチド領域を含んでなることを除いて配列番号１９と本質的に同じであるＤＮＡ配列を示すものである。
【０１４４】
いずれのＤＮＡ配列もオーバーラッピング一本鎖オリゴヌクレオチドからGenosys, Inc (Cambridge, UK)により合成した。
【０１４５】
プラスミドｐＡＹＥ６３９（図１１）では、配列番号４０を１．８６５ｋｂ  ＳａｃＩ−ＨｉｎｄIII  ＤＮＡ断片として合成し、プラスミドｐＢＳＳＫ−(Stratagene Europe, P. O. Box 12085, Amsterdam, The Netherlands)のＳａｃＩ−ＨｉｎｄIII部位にクローニングした。
【０１４６】
２種類の一本鎖オリゴヌクレオチドＰＲＢＪＭ１およびＰＲＢＪＭ３（下記）を用いたＰＣＲによりサッカロミセス・セレビシエＰＲＢＩプロモーターを酵母ゲノムＤＮＡから単離した。
ＰＲＢＪＭ３：
【化３３】
0004597668.tif 000034
配列番号３９
【０１４７】
ＰＣＲ条件  ９４℃で３０秒間、５０℃で４０秒間、７２℃で１２０秒間、次いで、７２℃で６００秒間、その後、４℃で維持を４０サイクル。０．８１ｋｂ  ＤＮＡ断片をＮｏｔＩとＨｉｎｄIIIの両方で消化し、ＷＯ  ９７／２４４４５で記載されている、ＮｏｔＩとＨｉｎｄIIIで同様に消化したｐＢＳＴ＋に連結して、プラスミドｐＡＹＥ４３９（図１２）を作出した。プラスミドｐＡＹＥ４３９をＨｉｎｄIIIとＢａ７ｎＨＩで消化し、ＷＯ００／４４７７２で従前に開示されているｐＡＹＥ４４０由来の０．４８ｋｂ  ＨｉｎｄIII／ＢａｍＨＩ  ＡＤＨＩターミネーターＤＮＡ断片と連結して、プラスミドｐＡＹＥ４６６（図１３）を作出した。
【０１４８】
配列番号４０の１．８６５ｋｂ  ＨｉｎｄIII  ＤＮＡ断片をプラスミドｐＡＹＥ４６６の独自のＨｉｎｄIII部位にクローニングして、プラスミドｐＡＹＥ６４０を作出した。このプラスミドが配列番号４０の１．８６５ｋｂ  ＨｉｎｄIII  ＤＮＡ断片をＰＲＢ１プロモーターとＡＤＨ１ターミネーターとの間に、ＰＲＢ１プロモーターからの発現に対して適正な方向で含むことが分かった（図１４）。
【０１４９】
プラスミドｐＡＹＥ６４０をＮｏｔＩ／ＰｖｕＩで消化完了し、ＮｏｔＩ  ３．２ｋｂ、ＰＲＢＩプロモーター／配列番号４０のＨｉｎｄIII  ＤＮＡ断片遺伝子／ＡＤＨＩターミネーター発現カセットを精製した。発現カセット（３．２ｋｂ）とｐＢＳＴ＋プラスミドバックボーン（３．１５ｋｂ）は大きさが同じであるため、ｐＡＹＥ６４０のＮｏｔＩ／ＰｖｕＩ二重消化がＮｏｔＩ消化だけの場合よりも望ましい。ｐＡＹＥ６４０由来の３．２ｋｂ  ＮｏｔＩ、発現カセットを、仔ウシ小腸ホスファターゼ（ＣＩＰ）で予め処理しておいたＮｏｔＩ線状化ｐＳＡＣ３５(Sleep et al. (1991), Bio/Technology 9: 183-187)に連結して、プラスミド  ｐＡＹＥ６３８（図１５）を作出した。プラスミドｐＡＹＥ６３８が、ｐＳＡＣ３５のＮｏｔＩ部位に挿入され、ＨＳＡ遺伝子の発現がＬＥＵ２栄養要求性マーカーから離れ、２μｍ複製起点に向かうように方向付けられたＮｏｔＩ  ＨＳＡ発現カセットを含むことが分かった。プラスミドｐＡＹＥ６４２は同じＨＳＡ発現カセットを含むが、正反対の方向に配列されている（図１５）。
【０１５０】
プラスミドｐＡＹＥ６４３（図１６）では、配列番号１９を１．８６５ｋｂ  ＳａｃＩ−ＨｉｎｄIII  ＤＮＡ断片として合成し、ｐＢＳＳＫ−(Stratagene Europe, P. O. Box 12085, Amsterdam, The Netherlands)にクローニングした。ｐＡＹＥ６４３内のＨＳＡ／ＭＦα−１融合リーダー配列−アルブミン融合物をコードするＤＮＡ配列を配列番号２７で示す。ｐＡＹＥ６４３から配列番号１９の１．８６５ｋｂ  ＨｉｎｄIII断片を単離し、ｐＡＹＥ４６６の独自のＨｉｎｄIII部位に連結して、プラスミドｐＡＹＥ６４５（図１７）を作出した。ＮｏｔＩ／ＰｖｕＩでの消化によりｐＡＹＥ６４５からＮｏｔＩ  ＰＲＢＩ  ｒＨＡ発現カセットを単離し、ｐＳＡＣ３５の独自のＮｏｔＩ部位に連結して、プラスミドｐＡＹＥ６４６（図１８）およびｐＡＹＥ６４７（図１９）を作製した。プラスミドｐＡＹＥ６４６内のＮｏｔＩ  発現カセットはプラスミドｐＡＹＥ６３８およびｐＡＹＥ４４３と同じ方向に配向したが、プラスミドｐＡＹＥ６４７内のＮｏｔＩ発現カセットは逆方向に配向し、プラスミドｐＡＹＥ６４２と同じにした。
【０１５１】
実施例３
３種の異なる酵母株、Ａ、ＢおよびＣをプラスミドｐＡＹＥ４４３、ｐＡＹＥ６３８、ｐＡＹＥ６４６およびｐＡＹＥ６５５を用いてロイシンプロトトロフィーに形質転換した。これらの形質転換体を２％（ｗ／ｖ）グルコースを含有する緩衝最小培地（ＢＭＭ、Kerry-Williams, S. M. et al. (1998) Yeast 14, 161-169により記載されている)（ＢＭＭＤ）にパッチアウトし、さらなる解析のために十分に増殖するまで３０℃にてインキュベートした。２％（Ｗ／Ｖ）グルコースを含有する１０ｍＬ  ＹＥＰ（１％（ｗ／ｖ）酵母抽出物；２％（Ｗ／Ｖ）バクトペプトン）（ＹＥＰＤ）およびＢＭＭＤ振盪フラスコ培養（３０℃、２００ｒｐｍ、７２時間）から細胞を含まない培養上清のロケット免疫電気泳動により形質転換体のヒトアルブミン生産性を解析した（図２０）。
【０１５２】
これらの結果から、ｐＡＹＥ６３８で形質転換された３種類全ての株のヒトアルブミン生産性が富栄養培地および規定培地の両方においてｐＡＹＥ４４３で形質転換された同じ株で観察された生産性よりも約４〜５倍低いことが分かった（それらのいずれもがＨＳＡ／ＭＦα−１融合リーダー配列を含むが、それらは異なるポリヌクレオチド配列によってコードされている）。予想外にも、ｐＡＹＥ６４６またはｐＡＹＥ６５５で形質転換された３種類全ての株のヒトアルブミン生産性はｐＡＹＥ６３８で観察された生産性よりもかなり高く、ｐＡＹＥ４４３で形質転換された同じ株で観察された生産性と同等か、またはそれよりも少し高かった。
【０１５３】
実施例４
酵母株Ｃ［ｐＡＹＥ４４３］、株Ｃ［ｐＡＹＥ６５５］、株Ｃ［ｐＡＹＥ６３８］および株Ｃ［ｐＡＹＥ６４６］、ならびに株Ｂ［ｐＡＹＥ４４３］および株Ｂ［ｐＡＹＥ６４６］をフェドバッチおよびフィル＆ドロー両手順による高細胞密度発酵にて培養した。フェドバッチ手順では、ＷＯ９６／３７５１５に記載されている培地および制御パラメーターを使用した。フィル＆ドロー手順では、以上で記述したフェドバッチ手順を使用するが、以下の工程もさらに含めた：フェドバッチ培養手順供給期の終了後、培養物量の９０％を発酵容器から取り出し、供給物の添加を開始する前に、残りの１０％量の培養物に、ＷＯ  ９６／３７５１５に記載されている培地および制御パラメーターを使用してバッチ培地を添加した（ｐＨを制御しながら）。ヒトアルブミン生産性（ＹＰ／Ｓ）およびヒトアルブミン濃度（ｇ／Ｌ）を細胞を含まない全培養物のＳＤＳ−ＰＡＧＥのスキャンニングデンシトメトリーにより評価した。重量測定によりバイオマス収率（ＹＸ／Ｓ）も計算した。これらの結果により（図２１）、実施例３ですでに分かったように、ＨＳＡ／ＭＦα−１融合リーダー配列と成熟ヒトアルブミの両方のアミノ酸配列が同一であっても、ヒトアルブミン発現プラスミド  ｐＡＹＥ６３８（天然のポリペプチド配列で酵母の偏りのあるコドン）を含有する酵母株のヒトアルブミン生産性（ＹＰ／Ｓ）およびヒトアルブミン濃度（ｇ／Ｌ）が、ヒトアルブミン発現プラスミド  ｐＡＹＥ４４３（天然のポリペプチド配列でリーダーおよび成熟アルブミンの自然コドンバイアス）を含有する同じ株よりもかなり低い生産性を有することが示された。
【０１５４】
株Ｃの発酵をフェドバッチ様式で行った場合、株Ｃ［ｐＡＹＥ６５５］および株Ｃ［ｐＡＹＥ６４６］（本発明に従って改変されたリーダー配列を組み込んだヒトアルブミン発現プラスミド）をそれぞれ、同等の時間培養すると、ヒトアルブミン生産性（ＹＰ／Ｓ）の、株Ｃ［ｐＡＹＥ４４３］の生産性に比べて１６％および１２％の上昇が観察された。株Ｂの発酵をフェドバッチ様式で行った場合、株Ｂ［ｐＡＹＥ６４６］（本発明に従って改変されたリーダー配列を組み込んだヒトアルブミン発現プラスミド）を同等の時間培養すると、ヒトアルブミン生産性（ＹＰ／Ｓ）の、株Ｂ［ｐＡＹＥ４４３］の生産性に比べて２４％の上昇が観察された。
【０１５５】
株Ｃの発酵をフィルアンドドロー様式で行った場合、株Ｃ［ｐＡＹＥ６５５］および株Ｃ［ｐＡＹＥ６４６］（本発明に従って改変されたリーダー配列を組み込んだヒトアルブミン発現プラスミド）をそれぞれ、同等の時間培養すると、ヒトアルブミン生産性（ＹＰ／Ｓ）の、株Ｃ［ｐＡＹＥ４４３］の生産性に比べて１３％および６％の上昇が観察された。株Ｃ［ｐＡＹＥ６５５］および株Ｃ［ｐＡＹＥ６４６］（本発明に従って改変されたリーダー配列を組み込んだヒトアルブミン発現プラスミド）をそれぞれ、同等の時間培養すると、この生産性は株Ｃ［ｐＡＹＥ６３８］の生産性に比べて４４２％および４０８％まで上昇した。
【０１５６】
概要
プラスミドｐＡＹＥ４４３およびｐＡＹＥ６３８はいずれもＨＳＡ／ＭＦα−１融合リーダー配列由来のリーダー配列を有するヒトアルブミンをコードするが、前者は天然のポリヌクレオチド配列の自然のコドンバイアスを用い、一方、後者は酵母発現に向けて十分にコドン最適化されたポリヌクレオチド配列を用いる。ｐＡＹＥ６３８から得られたヒトアルブミンの発現は、ｐＡＹＥ４４３を用いて得られたものより４〜５倍低い。本発明に従って改変されたリーダー配列をコードするポリヌクレオチド配列を、ｐＡＹＥ４４３およびｐＡＹＥ６３８の両方のＨＳＡ／ＭＦα−１融合リーダー配列をコードするポリヌクレオチド配列の代わりに使用して、各々、ヒトアルブミン発現プラスミドｐＡＹＥ６６５およびｐＡＹＥ６４６を作出した。本発明のポリペプチド配列を導入することによって、目的ポリペプチドの産生におけるかなりの改善がもたらされた。
【０１５７】
【化３４】
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【図面の簡単な説明】
【０１５８】
【図１】天然のＨＳＡリーダー（プレ領域およびプロ領域を有する）（上列）とＷＯ９０／０１０６３で開示されているＨＳＡ／ＭＦα−１融合リーダー配列（第２列）および本発明の好ましい改変リーダー配列（第３列）との比較。
【図２】標準的な遺伝子コード。
【図３】好ましいＳ．セレビシエコドンの改変リスト。
【図４】ｐＡＹＥ４３８のプラスミドマップ。
【図５】ｐＡＹＥ４４１のプラスミドマップ。
【図６】ｐＡＹＥ３０９のプラスミドマップ。
【図７】ｐＡＹＥ４６７のプラスミドマップ。
【図８】ｐＡＹＥ４４３のプラスミドマップ。
【図９】ｐＡＹＥ６５３のプラスミドマップ。
【図１０】ｐＡＹＥ６５５のプラスミドマップ。
【図１１】ｐＡＹＥ６３９のプラスミドマップ。
【図１２】ｐＡＹＥ４３９のプラスミドマップ。
【図１３】ｐＡＹＥ４６６のプラスミドマップ。
【図１４】ｐＡＹＥ６４０のプラスミドマップ。
【図１５】ｐＡＹＥ６３８およびｐＡＹＥ６４２のプラスミドマップ。
【図１６】ｐＡＹＥ６４３のプラスミドマップ。
【図１７】ｐＡＹＥ６４５のプラスミドマップ。
【図１８】ｐＡＹＥ６４６のプラスミドマップ。
【図１９】ｐＡＹＥ６４７のプラスミドマップ。
【図２０】ロケット免疫電気泳動によるｒＨＡ生産性の解析。酵母をＹＥＰ、２％（Ｗ／Ｖ）スクロースまたはＢ／ＭＭ、２％（Ｗ／Ｖ）スクロースにおいて３０℃にて２００ｒｐｍ、７２時間培養した。定量はＨＳＡ標品（ｍｇ．Ｌ−１）を参照することにより行った。
【図２１】高細胞密度発酵におけるアルブミン生産性。＊ヒトアルブミンレベルが低すぎて定量不可能であることを意味する。
【図２２】実施例にて使用する構築物の特性の要約。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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