(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくともホスフォリパーゼＤ、ホスフォリパーゼＤの基質、グリコールエーテルジアミン四酢酸、およびジエチレントリアミン五酢酸を含有することを特徴とするカルシウムイオン測定用試薬組成物。
【請求項２】
さらにリン酸モノエステラーゼを含有することを特徴とする、請求項１に記載のカルシウムイオン測定用試薬組成物。
【請求項３】
少なくともホスフォリパーゼＤ、ホスフォリパーゼＤの基質、グリコールエーテルジアミン四酢酸、およびジエチレントリアミン五酢酸を含有するカルシウムイオン測定試薬組成物にカルシウムイオンを含有する試料溶液を添加した後、ホスフォリパーゼＤ生成物を測定することを特徴とするカルシウムイオンの測定方法。
【請求項４】
該カルシウムイオン測定試薬組成物が、さらにリン酸モノエステラーゼを含有することを特徴とする、請求項３に記載のカルシウムイオンの測定方法。
【請求項５】
ホスフォリパーゼＤをグリコールエーテルジアミン四酢酸およびジエチレントリアミン五酢酸処理することを特徴とする、カルシウムイオン測定用試薬組成物におけるホスフォリパーゼＤのカルシウムイオンに対する特異性を高める方法。
【請求項６】
ホスフォリパーゼＤをグリコールエーテルジアミン四酢酸およびジエチレントリアミン五酢酸処理することを特徴とする、カルシウムイオンの測定方法におけるホスフォリパーゼＤのカルシウムイオンに対する特異性を高める方法。
【請求項７】
請求項５に記載の方法を利用することを特徴とする、試料中のカルシウムイオンの測定方法。
【請求項８】
ホスフォリパーゼＤをグリコールエーテルジアミン四酢酸およびジエチレントリアミン五酢酸処理した水溶液に、マグネシウムイオンを共存させることを特徴とする、カルシウムイオン測定用試薬組成物の長期保存安定化方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、被検体中に含まれるカルシウムイオンの測定用試薬組成物ならびに該試薬組成物を用いる測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
血清または尿中に含まれるカルシウムイオンは、各種疾患の診断において有用な情報をもたらすため、その測定は、臨床検査分野において頻繁に行なわれている。各種疾患の例としてあげれば、低カルシウム血症として低蛋白血症、低リン血症、腎症、ネフローゼ、ビタミンＤ欠乏症、副甲状腺機能低下症、クル病等の疾患、高カルシウム血症としては、骨腫瘍、アジソン病、肺気腫、副甲状腺機能亢進症、腎不全等の疾患がある。
生体成分中のカルシウムイオン測定方法としては、O-ＣＰＣ（オルトクレゾールフタレインコンブレクソン）法が日常的に広く用いられている。この方法は、O-ＣＰＣがアルカリ性下でカルシウムイオンと反応して赤紫色の色素を生成するという原理に基づく発色法であるが、マグネシウムイオンの影響を受けるなど特異性に欠けることや、蛋白質や温度の影響を受けるなどの欠点がある。
【０００３】
そのため、近年、より特異性の高い酵素法が種々報告されている。これらの方法は、いずれも酵素のカルシウムイオンによって活性化される現象を利用した下記のとおりのものである。
（１）ホスフォリパーゼＤを用いるものとして例えば特開昭６２−１９５２９７号公報；レシチン、ホスォリパーゼＤおよびコリンオキシダーゼからなる組成物、特開平４−１８７０９８号公報；コリン系リン脂質、ホスフォリパーゼＤ、コリンオキシダーゼ、界面活性剤および２価金属塩からなる組成物、特開平４−２３９９９号公報；非天然型ホスファチジルコリン誘導体、ホスフォリパーゼＤおよびコリンオキシダーゼまたはコリンデヒドロゲナーゼからなる組成物、特開平７−１７０９９９；キレート剤を含むカルシウムイオン測定試薬。
【０００４】
（２）ホスフォリパーゼＡ２を用いる方法として例えば特開平１−２３１８９６号公報；ホスフォリルコリンチオエステルを基質にしてホスフォリパーゼＡ２酵素活性を測定する方法、特開平５−１６８４９８号公報；基質としてコリンリン脂質またはエタノールアミンリン脂質を用いてホスフォリパーゼＡ２酵素活性を測定する方法。
（３）カルモジュリンを用いる方法として例えば特開昭６２−３６１９９号公報。
（４）ピルビン酸キナーゼを用いる方法として例えば特開平２−１４２４９８号公報。
（５）アミラーゼを用いる方法として例えば特開平２−２７６５９７号公報。
（６）トランスアミナーゼを用いる方法として例えば特開平５−２１９９９２号公報。
【０００５】
これらの方法において、（１）はカルシウムイオン以外の２価陽イオンの影響を受ける点や、活性調節剤としてのキレート剤により酵素が不安定化する問題が、（２）は血清等の検体中に存在する内在性ホスホリパーゼの影響を受ける問題が、（３）はカルモジュリンの入手が困難である点や、２段階の活性化を利用するため反応時間が長いという問題がある。（４）はカルシウムイオンによる阻害作用を利用したものであるため測定精度に問題があった。また、（５）は検体中に含まれる内在性の膵臓アミラーゼ、唾液アミラーゼ等の影響を受けやすいという欠点がある。さらに、（６）は生成物のひとつであるヒドロキサム酸の特異性の高い定量法がないこと、また、もう一方の生成物であるアンモニアのを定量する際、検体中の内在性アンモニアの影響を受ける等の問題がある。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、ホスフォリパーゼＤのカルシウムイオンによる活性化反応に基づいた検体中のカルシウムイオンに特異性が高くて、高精度かつ簡便な測定方法、ならびに該方法に使用するカルシウム測定用試薬組成物を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記目的を達成するためになされたものであって、本発明者は、多方面から検討した結果、カルシウムイオンに対する特異性を飛躍的に高めるために、ホスフォリパーゼＤの活性調節剤としてのキレート剤に着目した。生化学反応に用いるキレート剤としてエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）が汎用されるが、本キレート剤処理ではマグネシウムイオンとも反応し、正確なカルシウムイオンの測定が不可能（図１参照）であったが、ホスフォリパーゼＤをグリコールエーテルジアミン四酢酸（ＧＥＤＴＡ）およびジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）処理することにより、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、マンガンイオン、ニッケルイオン、コバルトイオン、銅イオン、亜鉛イオン等の２価陽イオンの中で、カルシウムイオンに対する特異性を飛躍的に高めることができ（図２参照）、血清等の検体を使用したとき正確にカルシウムイオンが定量できることがわかった。さらに、ホスフォリパーゼＤをキレート剤処理することにより酵素が不安定になり、定量用試薬として長期保存に問題があったが、マグネシウムイオンを共存させることで試薬の保存安定性を高めることがわかり、本発明を完成させた。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の構成および好ましい形態について、さらに詳しく説明する。
本発明に用いるホスフォリパーゼＤは、酵素反応にカルシウムイオンが必須であるキャベツ、ストレプトマイセスｓｐ（特開２０００−２７０８５７号記載）、ノカルディア属（特開昭６０−１６４４８３号記載）由来酵素を使用できるが、安定供給、安定性等より、ストレプトマイセス・クロモフスカス由来の微生物酵素が好ましい。
【０００９】
本発明に使用されるホスフォリパーゼＤの基質は、ホスフォリパーゼＤと酵素反応した後、分光学的な検出に変換できる反応生成物を生じるものであればよく、例えばホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルグリセロール等のリン脂質やパラニトロフェニルホスフォリルコリン等を使用することができるが、中でもホスフォリパーゼＤ反応の生成物をリン酸モノエステラーゼにより容易に分光学的に検出できる色原基を有し、入手が容易で、水溶性であり、さらに、安定性の良好なパラニトロフェニルホスフォリルコリンが好ましい。ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルグリセロール等のリン脂質を使用した場合には、ホスフォリパーゼＤの生成物であるコリンをコリンオキシダーゼを用い酸化し、生成した過酸化水素をペルオキシダーゼ作用で発色させることで分光学的にカルシウムイオンを定量することができる。
【００１０】
本発明の測定原理を、基質としてパラニトロフェニルホスフォリルコリンを用いた場合を下記の式で表す。
ホスフォリパーゼＤ、カルシウムイオン
パラニトロフェニルホスフォリルコリン＋水  →  パラニトロフェニルリン酸＋コリン
リン酸モノエステラーゼ
パラニトロフェニルリン酸＋水  →  パラニトロフェノール（黄色）＋リン酸
【００１１】
本発明の試薬の各成分としては、ホスフォリパーゼＤの基質であるパラニトロフェニルホスフォリルコリンを０．５から５０ｍＭ、好ましくは１から１０ｍＭ、ホスフォリパーゼＤを０．０５から１０Ｕ／ｍｌ、好ましくは２から５Ｕ／ｍｌ使用すればいい。さらに、ホスフォリパーゼＤの活性調節剤としてのキレート剤であるグリコールエーテルジアミン四酢酸を５から２００ｕＭ、好ましくは１０から８０ｕＭ、ジエチレントリアミン五酢酸を１から５０ｕＭ、好ましくは５から２０ｕＭ使用すればいい。このキレート剤処理によりホスフォリパーゼＤは不安定化するが、安定化剤としてマグネシウムイオンを使用することができる。
その濃度は１から３００ｍＭ、好ましくは１０から１００ｍＭである。リン酸モノエステラーゼとしては微生物、動物起源の各種酵素でアルカリホスファターゼ、中性ホスファターゼが使用できるが、安定性に優れている大腸菌由来のアルカリホスファターゼが好ましい。その濃度は０．１Ｕ／ｍｌから２０Ｕ／ｍｌ、好ましくは０．５から５Ｕ／ｍｌである。緩衝液としては酵素活性を安定に保ち、その他の試薬を溶解し、所定のｐＨが得られるものであればいかなるものでも使用できるが、各種グッド緩衝液、トリス緩衝液、ジメチルグルタル酸緩衝液等が挙げられる。そのｐＨは５から９、好ましくは６から７．５であり、濃度は５から５００ｍＭ、好ましくは２０から１００ｍＭである。
【００１２】
本発明の試薬を用いてカルシウムイオンを定量するには、例えばホスフォリパーゼＤ、アルカリホスファターゼ、グリコールエーテルジアミン四酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、ホスフォリパーゼＤの基質であるパラニトロフェニルホスフォリルコリンを含む試薬溶液に被検液を加え、２０〜４０℃に加温し、生成されるパラニトロフェノールを３８０〜４５０ｎｍの任意の波長における吸光度の増加量を測定すればよい。
【００１３】
本発明のカルシウムイオン測定用組成物の調製にあたっては、反応試薬は一つまたは二つ以上に分け、二つ以上に分けた場合には、それらの各成分を適宜組み合わせたものもできる。吸光度の測定は分光光度計のみでなく、臨床検査室でよく用いられている自動分析機を用いた連続測定にも適応できる。
被検液としては、血液、例えば血漿、血清もしくは尿などの生体液等や排水、微生物培養液、動植物培養液、生体材料抽出液等が挙げられる。
【００１４】
【実施例】
次いで、本発明を実施例で説明するが、本発明は、これらの実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例１】
（キレート剤処理による二価陽イオンの反応性）
５０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．３）、５ｍＭパラニトロフェニルホスフォリルコリン、アルカリホスファターゼ（１Ｕ／ｍｌ；大腸菌由来、旭化成Ｔ−０８）、０．１％トリトンＸ１００、ホスフォリパーゼＤ（３Ｕ／ｍｌ；ストレプトマイセスクロモフスカス由来、旭化成Ｔ−０７）からなる反応液（１ｍｌ）に、図１に示した各種キレート剤を５０ｕＭになるように加え、３７℃に２分間加温した後、１０ｍｇ／ｄｌのカルシウムイオンあるいはマグネシウムイオン溶液を１０マイクロリットル添加して、３７℃で正確に５分間反応を行なった。次いで、０．１ｍｌの０．１Ｍエチレンジアミン四酢酸を加え反応を停止した後、波長４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。図１に示したようにグリコールエーテルジアミン四酢酸を用いた時のみマグネシウムイオンには反応せず、カルシウムイオンの特異性が確認された。しかし、グリコールエーテルジアミン四酢酸処理のみではマグネシウムイオン以外のイオンに対しても反応し、特異性が厳密でないことがわかった（図２）。グリコールエーテルジアミン四酢酸にジエチレントリアミン五酢酸を併用することにより、ニッケルイオン、コバルトイオン、銅イオン、亜鉛イオンでの反応性をほぼ完全に消失させることが明らかになった（図２）。
【００１５】
【比較例１】
（キレート剤にクエン酸塩を用いた時のマグネシウムイオン特異性）
実施例１に示した組成の反応液にキレート剤としてクエン酸ナトリウムを１０ｍＭになるように添加して、実施例１に記載した方法によりカルシウムイオンとマグネシウムイオンの特異性を調べた。表１に示すようにマグネシウムイオンにも反応し、イオンの特異性がなかった。
【００１６】
【表１】
0004577863.tif 000002
【００１７】
【実施例２】
（自動分析機による分析）
日立自動分析機（７１７０型）を用いてカルシウムイオンの定量を行なった。
２種類の試薬を用い〔試薬１；６１．１ｍＭ  ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．３）、４Ｕ／ｍｌホスフォリパーゼＤ（旭化成株式会社製Ｔ−０７）、５３．３ｕＭグリコールエーテルジアミン四酢酸、１３．３ｕＭジエチレントリアミン五酢酸、３３．３ｍＭ塩化マグネシウム、０．１３％トリトンＸ−１００の組成；１８０マイクロリットル、試薬２；５ｍＭＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．２）、１６ｍＭパラニトロフェニルホスフォリルコリン、５Ｕ／ｍｌアルカリホスファターゼの組成、６０マイクロリットル〕、図３に示した各種濃度のカルシウムイオン標準液を４マイクロリットル使用して３７℃で反応を行い、主波長４０５ｎｍ、副波長６６０ｎｍの吸光度を経時的に測定した。結果を図３に示した。
【００１８】
【実施例３】
（カルシウムイオン標準曲線）
実施例２で得られた反応曲線の吸光度増加速度から求めた標準曲線を図４に示した。カルシウムイオン濃度に比例した吸光度変化量が直線として得られた。
【００１９】
【実施例４】
（マグネシウムイオンによるホスフォリパーゼＤの安定化）
下記１から３の組成からなるホスホリパーゼＤ（旭化成株式会社製Ｔ−０７）含有試薬を３７℃、１５時間静置した後、実施例２に示した試薬２を加えカルシウムイオンに対する反応性を調べた。その結果を表２に示した。マグネシウムイオン無添加組成ではカルシウムイオンに対するシグナルが減少したが、マグネシウムを添加することでホスホリパーゼＤを含有する試薬を安定に保存することができた。
【００２０】
組成１；６１．１ｍＭ  ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．３）、４Ｕ／ｍｌホスフォリパーゼＤ、５３．３ｕＭグリコールエーテルジアミン四酢酸、１３．３ｕＭジエチレントリアミン五酢酸、０．１３％トリトンＸ−１００からなる組成物。
組成２；６１．１ｍＭ  ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．３）、４Ｕ／ｍｌホスフォリパーゼＤ、５３．３ｕＭグリコールエーテルジアミン四酢酸、１３．３ｕＭジエチレントリアミン五酢酸、０．１３％トリトンＸ−１００、５ｍＭ塩化マグネシウムからなる組成物。
組成３；６１．１ｍＭ  ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．３）、４Ｕ／ｍｌホスフォリパーゼＤ、５３．３ｕＭグリコールエーテルジアミン四酢酸、１３．３ｕＭジエチレントリアミン五酢酸、０．１３％トリトンＸ−１００、３０ｍＭ塩化マグネシウムからなる組成物。
【００２１】
【表２】
0004577863.tif 000003
【００２２】
【発明の効果】
本発明のように、  ホスフォリパーゼＤのカルシウムイオンによる活性化反応を利用したカルシウムイオン定量試薬中に、グリコールエーテルジアミン四酢酸とジエチレントリアミン五酢酸のキレート剤およびマグネシウムイオンを共存させることにより、カルシウムイオン以外の２価陽イオンの影響を受けず、簡便で高精度で安定なカルシウムイオン定量用試薬を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ホスフォリパーゼＤを各種キレート剤で処理したときのマグネシウムイオン特異性を示す図である。
【図２】ホスフォリパーゼＤを各種キレート剤で処理したときのマグネシウムイオン以外の２価陽イオン特異性を示す図である。
【図３】臨床検査用自動分析機を用いてカルシウムイオンを定量したときの反応の経時変化を示す図である。
【図４】カルシウムイオンの検量線を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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