(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質またはポリペプチドをスクリーニングして生物学的に活性な目的のタンパク質またはポリペプチドを同定する方法であって、
（i）遺伝子ライブラリーを形成させる工程であって、前記遺伝子ライブラリーのポリヌクレオチドがアレイ上に分配される前記工程、
（ii）前記ポリヌクレオチドライブラリーからタンパク質またはポリペプチドをin vitro転写および翻訳（IVTT）によって発現させ、個々に同定し得るタンパク質又はポリペプチドのアレイを生成する工程、
（iii）前記タンパク質またはポリペプチドを工程(ii)で得られたアレイ上に固定化する工程、
（iv）工程（iii）のアレイ上に固定化されたタンパク質またはポリペプチドをサンプルと接触させる工程、
（v）工程（iv）のアレイから、前記サンプルとの相互作用が検出された個々のタンパク質またはポリペプチドを選択する工程、
（vi）工程（v）で選択した目的のタンパク質またはポリペプチドを、前記元の遺伝子ライブラリーから工程（v）で選択したタンパク質またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列決定を行うことにより同定する工程、
を含む、前記方法。
【請求項２】
遺伝子ライブラリーがDNAライブラリーまたはRNAライブラリーである、請求項1記載の方法。
【請求項３】
固定化が固相に対して行われる、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
固相がマイクロタイタープレートであり、タンパク質またはポリペプチドがプレート表面の特定の位置に固定化されている、請求項３記載の方法。
【請求項５】
サンプルとの相互作用がタンパク質-タンパク質結合相互作用である、請求項１〜４のいずれか1項記載の方法。
【請求項６】
タンパク質-タンパク質相互作用がアレイ中の合成タンパク質またはポリペプチドの酵素的修飾を生じさせる、請求項５記載の方法。
【請求項７】
サンプルが組織由来特異的分子、細胞由来特異的分子、細胞抽出物または組織抽出物である、請求項１〜６のいずれか1項記載の方法。
【請求項８】
サンプルが特定の疾患、健康管理状態または薬剤治療状態に影響されない対照を含む、請求項７記載の方法。
【請求項９】
遺伝子ライブラリーが単鎖抗体（SCA）をコードするポリヌクレオチドを含むcDNAライブラリーである、請求項１〜８のいずれか1項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、タンパク質及びポリペプチドのスクリーニングのための方法及び組成物に関する。詳しくは、本発明は、遺伝子ライブラリーの形成及び様々な方法でスクリーニング可能な個々のタンパク質又はポリペプチドの合成を含む方法に関する。特別の態様では、いわゆる「リボソーム提示」タンパク質又はポリペプチドアレイの使用を含む。したがって、本発明は、生物学的活性ポリペプチド、受容体に結合するタンパク質、及びタンパク質と他の分子との相互作用、のスクリーニングにおける提示されたタンパク質又はポリペプチドアレイの新規な実用的な適用を提供する。
【０００２】
配列決定を先導して進めていることから、ヒトゲノムは、ヒト疾患との因果関係を有するかも知れないヒトゲノムにおける多型性又は突然変異、さらに疾患に関連するかも知れない遺伝子の発現変化を発見するための主な主導的役割を果たしてきた。これは、そのような多型性、突然変異又は遺伝子発現における変化を見出すために、多くの高処理量スクリーニング技術を生じさせた。さらに、そのような分析は、ある種の治療に対するヒトの応答を分析し、それによりこれらの治療に対する応答性を予想するためにも現在着手されつつある。一般に、多型性、突然変異及び遺伝子発現変化は、これらの遺伝子により産生されるタンパク質に反映され、疾患の発生又は治療に対する応答等の生物学的な結果を直接決定することができるのはこれらのタンパク質の作用である。さらに、ほとんどの真核生物のタンパク質は翻訳後修飾される。そして、そのような修飾は遺伝子レベルでは分析することができない。したがって、タンパク質及びタンパク質修飾のスクリーニングの分析は、ＤＮＡ又はＲＮＡの分析に比べて変化と疾患との正確な相関関係を示す可能性がより高いということになる。
【０００３】
今日までタンパク質と疾患との関連性の分析は、ヒト組織又は細胞からの２Ｄ（二次元）タンパク質ゲル分析が優勢であった。この技術では、通常、細胞タンパク質を一次元で電荷に基づいてそして他の次元でサイズに基づいて分離する。タンパク質は、既知のタンパク質の電気泳動上の移動パターンを参照するか、又は電気泳動により分離したスポットからタンパク質を溶出して質量分析及び核磁気共鳴等の方法で分析することにより同定することができる。しかしながら、２Ｄタンパク質ゲル法には、細胞由来のタンパク質の分解能及び検出の限界（通常５０００細胞タンパク質のみしか明確に検出されない）、分離したタンパク質の同定に対する限界（例えば、質量分析は通常、同定のために１００フェムトモル以上のタンパク質を要する）及び技術の専門家的性質などの限界がある。さらに、２Ｄゲル分析によるタンパク質の翻訳後修飾の分析には限界があり、タンパク質−タンパク質結合相互作用はこの方法では検出することができない。
【０００４】
細胞の多数のプロセスは、修飾酵素とそのタンパク質基質との間の一過性の相互作用により制御される。そのような相互作用は慣用の方法により検出することが困難である。キナーゼ、ホスファターゼ、トランスフェラーゼ、プロテアーゼ等のタンパク質修飾酵素は、根本的な細胞プロセスのすべての様式を制御し（ポーソン（Pawson) ，Nature, 373 (1995), 573 頁) 、そして疾患経路にも関与することが示された。これらの一過性タンパク質／タンパク質相互作用は幾つかの異なる効果を生じることができ、その一部は測定可能である。タンパク質の動力学的性質は変化させることができ、これは基質の結合の変化（プレリッヒ（Prelich)ら，Nature, 326, (1989), 517頁) 又は変化した触媒（ポルパシー(Porpaczy)ら，Biochim. Biophys. Acta, 749 (1983), 172 頁) を結果として生じさせる。タンパク質／タンパク質相互作用は新しい結合部位の形成の原因となることができ、例えば、ＡＴＰ結合部位は、大腸菌ＡＴＰアーゼのａ及びｂサブユニット間の相互作用により形成される（ウェーバー（Weber)ら，J. Biol. Chem., 268, (1993), 6241 頁) 。タンパク質の基質特異性は、特異的プロモーターにポリメラーゼを配向させる種々の転写因子とＲＮＡポリメラーゼとの相互作用により例示されるように、タンパク質／タンパク質相互作用により変化しうる（ホワイト（White)とジャクソン(Jackson) 、Trends Genet., 8, (1988), 284 頁) 。また、タンパク質／タンパク質相互作用は、例えば、タンパク質が阻害剤と相互作用する場合に不活性化を生じさせうる（ビンセント(Vincent) とラズンスキー(Lazdunski) ，Biochemistry, 11, (1972), 2967頁) 。
【０００５】
遺伝子ライブラリー由来のタンパク質又はポリペプチドの産生に依存する諸方法が、当該技術分野で開示されている。しかしながら、そのような方法に伴う一つの主要な不都合は、タンパク質又はポリペプチドが「プール」として産生され、次いでスクリーニングされるということである。個々のタンパク質又はポリペプチドの迅速な同定を可能にし、次にはそのようなタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子の同定をも可能にするスクリーニング方法が必要である。
【０００６】
したがって、第１の側面において、本発明は遺伝子ライブラリーを作製する工程、及び次いでスクリーニングされうる個々のタンパク質又はポリペプチドを合成する工程を含むタンパク質又はポリペプチドのスクリーニング方法を提供する。本発明においては、「個々のタンパク質又はポリペプチド」という用語は、遺伝子ライブラリーから発現されたタンパク質又はポリペプチドがプールの一部を形成するというよりはむしろ別々に同定可能であることを意味する。したがって、例えば、タンパク質又はポリペプチドは、アレイとして発現可能である。ここで、各タンパク質又はポリペプチドは、アレイ内の別個の点又は領域を占有する。例えば、遺伝子ライブラリーは、コロニー又はプラークの形で作製し、次にそれらを別個に拾い上げてアレイに配列することができる。次に、遺伝子を発現させると、アレイフォーマット中でタンパク質又はポリペプチドのアレイが生じる。そしてアレイ中のタンパク質又はポリペプチドのそれぞれは別個の点又は領域を占有する。
【０００７】
遺伝子ライブラリーから形成させたタンパク質又はポリペプチドは、イン・ビトロ転写及び翻訳、リボソーム提示並びにファージ提示等のイン・ビトロでの方法により製造された「合成タンパク質又はポリペプチド」と称してもよい。したがって、それらは、その基準に基づいて、組織又は細胞抽出物から直接に由来する「天然のタンパク質」とは区別することができる。
【０００８】
こうして、本明細書に記載された方法は、「合成」タンパク質又はポリペプチドの合成に関する出発点として遺伝子ライブラリーを用いて、タンパク質及びポリペプチド並びに翻訳後修飾のスクリーニングを可能にする。一般的に、これは、それらをスクリーニングするための手段としてのタンパク質又はポリペプチドのアレイの作製により達成される。特に、アレイは、イン・ビトロの転写及び翻訳方法により作製される。
【０００９】
本発明の共通のテーマは、提供される方法それぞれがその対応するｍＲＮＡ又は遺伝子配列の助けにより「合成」タンパク質又はポリペプチドの迅速な同定を可能にすることである。
【００１０】
本発明の他の態様は、リボソーム上にタンパク質を提示する新規な技術、タンパク質又はポリペプチド及び翻訳後修飾のスクリーニングのためのそのような方法の使用、並びに受容体等の他の分子に結合する特異的タンパク質又はポリペプチドのスクリーニングのための新規な方法を提供する。
【００１１】
リボソームは、その協調された活性が翻訳の行為を完成させるタンパク質の集合を表す。原核生物及び真核生物のリボソーム並びにオルガネラにおいてＲＮＡとタンパク質のサイズと割合にははっきりと感知できる相違があるけれども、リボソームの基本的な型は保存されている。すべてのリボソームは、二つの主要なサブユニット、細菌では５０Ｓ及び３０Ｓサブユニット、そして真核生物では６０Ｓ及び４０Ｓサブユニットから構成される。タンパク質合成は、真核生物では５’キャップで又は原核生物では翻訳開始コドン（通常ＡＵＧ）に隣接してリボソームがｍＲＮＡに付着したときに開始し、ｍＲＮＡ配列に指示されながら、発生期のポリペプチド鎖を保持するペプチジル−ｔＲＮＡ分子上にアミノ酸を連続的に結合させることにより続いていく。翻訳は、通常、リボソームがｍＲＮＡから解離する所である停止コドンで終結する。停止コドンの非存在下では、リボソームは、解離が放出因子の助けにより起こる前にｍＲＮＡ分子の末端まで進行すると考えられる。したがって、翻訳終結は、タンパク質をコードするｍＲＮＡ分子からそのタンパク質を切り離す。リボソームがタンパク質合成中に阻止されたときは、タンパク質とｍＲＮＡはリボソームと複合体を形成している間は結合した状態に留まるであろう。
【００１２】
リボソーム上で合成タンパク質を生成する生化学的過程は、生きた生物を用いる合成タンパク質の生成のための現存する方法を越えるいくつかの利点を有する。特定の表現型の保持体としてのタンパク質を選択し、その後に対応する遺伝型を決定する方法は、所望のタンパク質を提示するバクテリオファージ、ウイルス及び細菌細胞を通常用いて、遺伝子とタンパク質との間の連結を提供するために生きた細胞に主として依存してきた。ＤＮＡライブラリーによりコードされるタンパク質の多様な収集のための生きた細胞の使用は、いくつかの不都合を有する。例えば、タンパク質の多様性は、ＤＮＡまたは感染性粒子の取り込みの低効率により制限される細菌細胞又は真核細胞の形質転換又は感染を必要とすることにより低下しうる。さらに、多様なタンパク質の生物学的生産は、所定のタンパク質に対して選択可能な生きた細胞の特定の環境、及び所定のタンパク質に対しても選択可能なタンパク質の折り畳みにおける変化を生じ得る環境に曝される。最後に、連続的な選択ラウンドの間に個々のタンパク質の多様性が要求される場合、遺伝子突然変異技術は、多様化及びスクリーニングのためにＤＮＡと生きた細胞との間の切替えが必要であることにより、イン・ビボの系に適用することが困難である。
【００１３】
ポリペプチド選択のためのイン・ビトロの方法は、遺伝子の細胞内への取り込みの必要性を除くことにより、そしてｍＲＮＡ及びタンパク質の製造のための環境を制御することにより、イン・ビボの方法に優る長所を潜在的に提供する。イン・ビトロの転写及び翻訳反応は、何年もの間ＤＮＡから直接ポリペプチドを生産させる手段として用いられており、特異的なポリペプチドを選択するための抗体を用いてポリソームの免疫沈降（例えば、ペイバー(Payvar, F.)とシムケ(Schimke, R. T.)、Eur. J. Biochem., 第101 巻 (1979) 1844-1848 頁）により特異的なｍＲＮＡを濃縮できることがわかった。このいわゆる「リボソーム提示」技術は、ごく最近、ペプチドの選択（マッテアキス(Mattheakis, L.)ら，PNAS 91: 9022, 1994 及びPCT95/11922)及びタンパク質の選択（カワサキ(Kawasaki, G.)、PCT91/05058 及びハーネス(Hanes) とプラックタン(Pluckthun) ，PNAS, 第94巻[10]: 4937, 1997) に適応されている。
【００１４】
マッテアキス(Mattheakis, L.)ら(PNAS 91: 9022, 1994) により記載された方法は、ペプチドライブラリーからリガンドを同定するためのリボソーム提示系を用いる。前記方法は、原核細胞のリボソーム複合体の５０Ｓサブユニットに結合することによりリボソーム翻訳での失速を誘導するリボソーム翻訳停止用のクロラムフェニコールを用いる。この方法の不利な点は、発生期のペプチドの長さに関わらず翻訳停止を生じさせ、こうして、ほとんどのポリペプチド分子が不完全となるという点である。転写／翻訳後のＤＮＡライブラリーからのポリペプチドの効率的なスクリーニングのためには、ｍＲＮＡに関連する全長ポリペプチドの収率を最大にすることが明らかに望まれる。
【００１５】
マッテアキス(Mattheakis)とドーワー(Dower) がPCT95/11922 に記載した方法は、融合ポリペプチド分子のペプチド部であり、スクリーニングのためのポリペプチド部に隣接し、ｍＲＮＡに関連する全長のポリペプチドの収率を最大にするためにコードするポリヌクレオチドと相互作用するか結合する「つながれた発生期のペプチド」の使用を通じて原理的にリボソームを失速させるさらなる手段を含む。マッテアキス(Mattheakis, L.)ら(PNAS,同書) と同様に、この方法は、未成熟な翻訳停止を生じさせると予想され、スクリーニングのためのいくつかのタンパク質の適切な折り畳みをも歪めると予想されるであろう。従って、ポリペプチド分子のサイズ範囲はマッテアキスとドーワーにより記載された方法により予想され、ＤＮＡライブラリーによりコードされる特異的なポリペプチドを単離する蓋然性を低減するであろう。ヘインズ(Hanes) とプラックタン(Pluckthun) （同書）の方法において、正しく折り畳まれたタンパク質とそれをコードするｍＲＮＡの収量をその両者がリボソームにまだ付着している間に最適化する方法が提供される。前記方法は、酢酸マグネシウムの濃度を増加させることにより翻訳過程を失速させる工程及び物理的反応条件の操作によるタンパク質の正しい折り畳み工程を含む。しかしながら、全長タンパク質の収量を増加させる唯一の手段は、リボソーム上の折り畳まれたタンパク質をつなぐために、対応する遺伝子を操作し、３’スペーサー領域を付加することによりｍＲＮＡから停止コドンを除くことである。この方法は、初期の方法に比べた場合全長ポリペプチドの割合を増加させるであろうが、一方、この方法は、ｍＲＮＡの末端からのラン−オフ翻訳を予防する何の手段も提供せず、提供された失速ストラテジーは、マッテアキスとドーワー（同書）と同様の制限を欠点にもち、それによって未成熟な翻訳上の停止が予想されるであろう。前記方法のそれぞれに関して記載した制限に加え、翻訳されたポリペプチドの試験に先立って翻訳反応の後期の新しい翻訳開始を阻止する手段を提供する方法は存在しない。したがって、ポリペプチド分子のサイズ範囲はこれらの方法により予想され、ＤＮＡライブラリーによりコードされる特異的なポリペプチドを単離する蓋然性を低下させるであろう。したがって、特異的ポリペプチドに関してＤＮＡライブラリーを効率的にスクリーニングするために、発生期の不完全ポリペプチド鎖の存在を最小限にしながら、全長ポリペプチドの収量を最大にするリボソーム提示に関する新規な方法が必要である。
【００１６】
したがって、本発明の別の態様（「リボソーム提示」）は、対応するｍＲＮＡに連結したリボソーム上のタンパク質を提示するための新規なイン・ビトロの方法を提供する。本発明のさらなる態様は、生物学的に活性な又は阻害的なポリペプチドをこれらのポリペプチドに対する分子標的のいかなる知識もなく特異的に発見するため、細胞又は組織に結合するポリペプチドの分子結合部位を特異的に発見するために、及び新規なタンパク質−タンパク質結合相互作用を特異的に発見するために、ポリペプチド提示法、特にリボソーム提示を用いる。
【００１７】
生物学的に活性なポリペプチドの発見（「生物学的スクリーニング」）のための本発明の特別の態様においては、ＤＮＡライブラリーによりコードされ、ポリペプチド提示を介して発現される生物学的な表現型を直接選択する新規な方法が提供される。微生物上でのポリペプチドの提示法及び転写／翻訳法が、有用な結合表現型と遺伝子型との間の連結を提供する一方、これらの方法は、抗原又は化学品等の既知であって、通常適度に純粋な標品で利用可能なリガンドへの結合によるポリペプチドの検出に大部分限定されている。生きた細胞全体への直接的な結合により提示されたポリペプチドの同定は困難であることが証明された。多くの場合、結合する表現型のスクリーニングは、標的の生きた細胞との相互作用の際に有用な生物学的な表現型を提示する生物学的活性ポリペプチドの単離の代用である。そのような場合、結合する表現型を単離し、対応する遺伝型を決定し、次いで、生物学的活性に関して結合する表現型を試験することが必要である。特異的な結合表現型を有するポリペプチドの割合のみが要求される生物学的活性を提供するので、この表現型選択過程は効率的でなく、生物学的活性ポリペプチドを選択しない代理結合スクリーンに依存する。表現型スクリーニング用のリガンドが利用できないか又は知られていない場合には、新規な生物学的活性ポリペプチドのスクリーニングは可能でないことがある。したがって、本発明は、ＤＮＡライブラリーによってコードされポリペプチド提示を介して発現される生物学的な表現型を直接選択する新規な方法も提供する。
【００１８】
細胞又は組織に結合するポリペプチドの分子結合部位を発見するための本発明の特別の態様（「リガンド配向性スクリーニング」）においては、目的のタンパク質分子をコードするＤＮＡ分子、特に本発明の方法で標識されるものの複製を可能にするような様式でスクリーニング可能な、タンパク質分子をコードする大きなＤＮＡライブラリーに適用する方法が提供される。特定のリガンド分子に対する標的受容体タンパク質を決定するために、標的のその後の分析及びその分子の同定に先立ち、標的受容体の選択的単離のためにそのリガンドを用いることが可能である。しかしながら、その受容体へのリガンドの結合親和性が低いか、リガンド及び／又は受容体が豊富に存在しない場合、そのリガンドを用いて受容体を単離することは非常に困難であり、受容体の同一性を決定するためには通常、競合検定法等により普通の候補受容体を試験しなければならない。さらに、リガンド結合を阻害する分子（受容体アンタゴニスト等）又はリガンドの結合を代替する分子（アゴニスト等）のその後の解明のためには、精製又は濃縮受容体標品を、リガンド結合部位で結合する分子の単離のために、結合分子候補（抗体等）の範囲を試験しなければならない。受容体が精製又は濃縮型で利用できない場合か、受容体の同一性が知られていない場合は、受容体結合分子の単離が非常に困難であることは明らかである。したがって、標的受容体の効率的な単離のため、そして、例えば、アゴニスト、アンタゴニスト又は単純な標的化分子等として作用するかも知れない受容体上のリガンド結合部位に特異的に結合する分子の単離のために新規な道具が要求される。細胞又は組織に結合するポリペプチドの分子結合部位を発見しうることが、本発明の特別な側面である。この方法は、リガンドに直近の受容体に結合する他のタンパク質複合体を標識するため、タンパク質性受容体に結合するリガンドを用いるという原理に基づいている。次いで、これに基づいて、これらの隣接して結合するタンパク質は、受容体を単離するために、そして、場合によっては、受容体に隣接したタンパク質分子を単離するためにも、結合剤として使用することができる。さらに、これらの隣接して結合したタンパク質は、リガンド結合部位で結合するタンパク質を含む他のタンパク質に沿って受容体にその後に再結合することができる。そのときは隣接して結合したタンパク質は、リガンド結合部位で結合するタンパク質を含む自身に直近して結合する他のタンパク質複合体を標識することができる。このようにして、リガンド結合部位で結合する一以上のタンパク質複合体を標識し、その後、単離し、そして受容体阻害、受容体のアゴニズム又はアンタゴニズム等の有用な性質について試験することができる。本発明は、細胞表面上、特に組織全体の分子の標識化及び単離に特に有用である。したがって、本発明は、目的のタンパク質分子をコードするＤＮＡ分子の複製を可能にするように、タンパク質分子をコードするＤＮＡライブラリーのスクリーニング方法を提供する。
【００１９】
細胞内ポリペプチド間で起こるものを含め、新規なタンパク質−タンパク質結合相互作用（「タンパク質−タンパク質相互作用」）に特異的に関連する本発明のさらなる態様においては、次には結合するポリペプチドをコードする遺伝子の単離を可能にする検出可能又は選択可能な特性を創出するように、ポリペプチドとリガンド又はポリペプチドと他のポリペプチドとの結合方法が提供される。
【００２０】
以下、本発明の様々な態様をさらに詳細に記載する。
【００２１】
タンパク質「アレイ」−本発明のこの態様では、合成タンパク質の合成の開始点として遺伝子ライブラリーを用いるタンパク質及びポリペプチド及び翻訳後修飾の新規なスクリーニング方法が提供される。この態様において、これらの遺伝子ライブラリーは、ポリペプチドの検出及びポリペプチド修飾の検出のために、個々のタンパク質又はタンパク質群を分離する基礎を提供する。その方法は、タンパク質ゲル電気泳動の使用を回避する。本発明は、原理的には正常タンパク質と疾患タンパク質との間の相違を検出するため、また薬物と他の疾患治療との関係におけるタンパク質の変化を分析するためにも、正常及び疾患の組織又は細胞におけるタンパク質の高処理量分析方法を提供する。また、この方法は、生きた細胞又は組織に曝した場合にタンパク質又はポリペプチドのライブラリーの結合又は生物学的活性の高処理量分析をも提供する。さらに、この方法は、個体及び異なる組織又は細胞を同定するために、遺伝子のフィンガープリント法の代替物として、個体のタンパク質「フィンガープリント法」をも提供する。タンパク質がプールの状態で又は個々のタンパク質のアレイ中で分析され、それにより、一旦修飾、結合又は生物学的活性が種々の方法で検出されたならば、タンパク質の同一性は、特定のプール中でのその局在によるか又はアレイ中での特定の位置でのその局在のいずれかにより直接又は間接に決定されうることが、本発明の重要な性質である。同様に、この方法が異なる組織又は細胞間でのタンパク質又はタンパク質修飾の相違の比較検出を可能にし、したがって、この方法がこれらの相違のスクリーンを構成するということが、本発明の重要な側面である。
【００２２】
この方法は、第一に、組換えＤＮＡ法により形成された合成タンパク質、特にイン・ビトロの転写及び翻訳（ＩＶＴＴ）により１以上の遺伝子から形成されたタンパク質、の使用に基づいている。本発明の一つの好ましい側面は、タンパク質修飾又はタンパク質−タンパク質結合相互作用のスクリーニングに先立ち、固相上へのその後の固定を伴う、ＩＶＴＴによる合成タンパク質の形成である。合成タンパク質がタンパク質の修飾、結合活性又は生物学的活性について試験された場合、これらの合成タンパク質をコードする元の遺伝子を参照することにより容易に同定されうるように、遺伝子（ＩＶＴＴを容易にするように設計されたベクターにクローニングされたｃＤＮＡ等）のアレイからの合成タンパク質の形成が行なわれること、そしてそれによりこの遺伝子配列がタンパク質の同一性を明らかにすること、が本発明のこの態様の重要な側面である。そのような遺伝子アレイは、例えば、個々のｃＤＮＡクローン又はクローン混合物を一つのアレイの特定の位置（ミクロタイタープレートのウェル中等）に拾い上げることにより作成される。ＩＶＴＴの後（通常、ＰＣＲ等の方法によるｃＤＮＡの増幅の後）、前記アレイ中の各位置からタンパク質試料を取り出し、別のアレイの特定の位置、例えば、代わりのミクロタイタープレート内又は個々の位置に試料を分配できる固相上に固定又は分配することができる。特異的なタンパク質の修飾又はタンパク質の結合事象が前記アレイにおけるタンパク質試料から検出されるときは、目的のタンパク質を同定するために、これらのタンパク質をコードする特異的遺伝子の位置を決めてその配列決定をすることができる。
【００２３】
ｃＤＮＡライブラリーが免疫グロブリン可変領域（通常、一本鎖Ｆｖ領域として、ＳＣＡｓ（単鎖抗体）と称する）等の１組の可変分子をコードしてもよいことも、本発明の好ましい態様の範疇である。そのような可変分子は、アレイ中の特定の位置に分配されたときは細胞又は組織の試料由来の他の特異的分子（通常はタンパク質）に結合する能力を有する。次いで、これらの細胞又は組織の分子は、アレイ中の可変分子への結合により、細胞又は組織の分子の整列したアレイを本質的に生ずる。次いで、そのようなアレイ中の細胞又は組織の分子の存在、又はリン酸化又は他の分子との相互作用等によるのこれらの分子の修飾に対し、アレイ中で番地を付与することができる。そのような細胞又は組織の分子の同一性は、特に元の可変分子を単離状態で回収し、単離状態の細胞又は組織の分子（単数又は複数）を回収するために用いる場合、その後にいくつかの方法により決定することができる。次いで、そのような細胞又は組織の分子の同一性は、古典的な生化学手段により、あるいはこれらがタンパク質の場合タンパク質の配列決定又は２Ｄゲル移動特性等の方法により決定することができる。あるいは、そのようなタンパク質性の細胞又は組織の分子の同一性は、本願特許に含まれるリボソーム系等のタンパク質提示系を用いて決定することができ、それによりｃＤＮＡライブラリーを用いて、特定の可変分子に結合する際にその結合タンパク質の同一性を関連する遺伝子のヌクレオチド配列を決定することにより決定することが可能であるように、それらの遺伝子（又は遺伝子のＲＮＡ表示）に連結したタンパク質のライブラリーを作製する。
【００２４】
タンパク質アレイの作製における合成タンパク質の生産のためのＩＶＴＴの使用の代替として、本発明のミクロアレイ態様の別の側面は、ポリペプチドの大規模な混合物をコードする遺伝子ライブラリーから有用な表現型を有する合成ポリペプチドを生成させ、それにより対応する遺伝子が迅速かつ容易に回収可能な「ポリペプチド提示」法の使用である。細胞に基づく提示系そして特に対応するｍＲＮＡ（次いでタンパク質の同一性を解明するために配列決定されうる）へのリボソーム複合体を介して連結したタンパク質を提供可能なリボソームに関連するタンパク質の特定の提示（「リボソーム提示」）よりもタンパク質の種類に関してより大きな範囲を提示させるイン・ビトロのポリペプチド提示法が、開発された。また、本発明の方法は、ファージ提示等の他のタンパク質提示法をも取り込むことができる。
【００２５】
本発明の方法の一つの態様において、タンパク質の修飾は、遺伝子ライブラリーの形成によってスクリーニングされ、次いで、前記ライブラリーを用いて、好ましくはｍＲＮＡから解離した全長の合成タンパク質の収量を最大にするような条件下で、そのようなベクターから連続的にｍＲＮＡとタンパク質を製造するＩＶＴＴ等により合成タンパク質を作成する。豊富なｍＲＮＡ種からのタンパク質又はポリペプチドの過剰提示を回避するために、遺伝子ライブラリーを規格化する。ビオチン化リジン等の修飾アミノ酸の取り込み又はプラスミドベクターによりコードされるかＰＣＲにより導入されるアミノ酸配列タグの取り込みを通じて、あるいはタンパク質の化学修飾を通じて、次に合成タンパク質を、ビオチン結合性タンパク質（ストレプトアビジン等）を介し又は抗タグ抗体等のタグ結合性タンパク質配列を介し磁気ビーズ等の固相上に固定化することができる。タンパク質の修飾のスクリーニングにおいて、出発遺伝子の適当な分布を通じて、タンパク質の小さなプール又は個々のタンパク質を、ミクロタイターウェル内等のアレイに形成させ、これらのアレイに固定する。
【００２６】
あるいは、合成タンパク質は、タンパク質の個々の小さなプール又は個々のタンパク質としてアレイ中に製造され、次いで、個々にガラス「チップ」上等の平坦な固相上の異なる位置に（手動によるか又は自動分配機の使用によるかして）移されるかも知れず、それにより、タンパク質は固相上の官能部と相互作用し、固定化を生ずる。次に、これらの合成タンパク質を組織又は細胞の抽出物で処理し、それにより、これらの組織又は細胞中に存在する酵素が合成タンパク質を修飾することができる。次いで最後に、そのような修飾を、蛍光標識抗ホスホチロシン抗体等の特異的検出系を用いて検出する。前記検出系から得られるシグナルを組織又は細胞の異なる抽出物により修飾した合成タンパク質の複製アレイと比較すると、複製合成タンパク質間のこれらのシグナルの相違から、これらの異なる組織又は細胞由来のタンパク質修飾活性における相違が示される。
【００２７】
本発明の方法の別の態様において、タンパク質−タンパク質結合相互作用を遺伝子ライブラリーの創出によりスクリーニングし、次いで、前記ライブラリーを用いて、好ましくはｍＲＮＡから解離した全長の一次合成タンパク質の収量を最大にするようなベクター及び条件下で、ＩＶＴＴ等により合成タンパク質を生成させる。修飾アミノ酸又はアミノ酸配列タグの取り込みを通じて、あるいはタンパク質の化学修飾を通じて、あるいは化学反応性固相の使用により、合成した一次タンパク質を合成直後に又はタンパク質−タンパク質相互作用を形成させる二次タンパク質との相互作用後に固相に固定化することができる。出発遺伝子の適当な分布を通じて、タンパク質の修飾に関するスクリーニングの場合と同様に、一次タンパク質の小さなプール又は個々のタンパク質を、ミクロタイターウェル中又はガラスチップ上等のアレイ中で形成させ、これらのアレイに固定化する。次に、これらの合成した一次タンパク質を任意選択的に組織又は細胞の抽出物で処理してもよく、それによりこれらの組織又は細胞中に存在する酵素が合成タンパク質に対して修飾をもたらしうる。次に、前記一次タンパク質と適当な二次タンパク質との適当な結合相互作用を形成させるために、一以上の二次タンパク質（二次タンパク質のライブラリーを含む）を添加する。任意選択的に、これらの二次タンパク質を合成し、二次タンパク質の同一性がその後決定できるようにリボソーム又はファージ上に提示してもよい。
【００２８】
また、二次タンパク質は、組織又は細胞由来の天然のタンパク質であってもよいであろう。次いで、一次タンパク質と二次タンパク質の間のタンパク質−タンパク質結合相互作用を種々の方法により検出することができる。例えば、一次タンパク質を固相上に固定化し、合成した二次タンパク質の存在を、蛍光標識抗タグ抗体等の特異的検出系を用いる検出で、二次タンパク質内に取り込まれたアミノ酸配列タグを介して決定することができる。あるいは、二次タンパク質がリボソーム又はファージ提示等に関してそれをコードする核酸と会合するときは、二次タンパク質を会合した核酸についてのＰＣＲ法により検出することができる。あるいは、二次タンパク質の結合は、前記アッセイ系で検出されて二次タンパク質が結合するとブロックされるようになる、合成した一次タンパク質上の部位のブロッキングにおける二次タンパク質の作用を通じて検出してもよい。あるいは、二次タンパク質が天然のタンパク質の場合、ＵＶ活性化が可能なビオチン分子の付加等により、結合後に直接標識化して直接検出してもよく、又は二次タンパク質をレーザー気化してＭＡＬＤＩ（マトリックス補助レーザー脱着イオン化）及び質量分析法により検出してもよい。合成した一次タンパク質の複製アレイへの二次タンパク質の結合を組織又は細胞の異なる抽出物間で比較すると、複製した合成タンパク質間のこれらのシグナルにおける相違から、これらの異なる組織又は細胞由来のタンパク質−タンパク質結合活性における相違が示される。
【００２９】
タンパク質の修飾の範囲を検出することにより、そしてタンパク質タグ又はエピトープに対する蛍光標識抗体の使用による等の慣用の検出フォーマットでタンパク質−タンパク質結合を検出することにより、多数の異なるタンパク質の修飾についての同時スクリーニングが、異なる組織及び細胞間の相違をスクリーニングするために行ないうるであろうことは明らかである。
【００３０】
本発明の別の態様においては、タンパク質−タンパク質相互作用は、二次タンパク質、特に標準的な技術を用いて包括的に整列化させることが通常非常に困難であると思われる天然の組織又は細胞由来のタンパク質のアレイを形成させるための基礎として用いられる。一次タンパク質には、組織若しくは細胞抽出物由来の天然のタンパク質又はリボソーム若しくはファージに提示されたタンパク質ライブラリー由来の合成タンパク質等の二次タンパク質のセットに対する様々なセットの結合特異性を提供する免疫グロブリン等の高度に多様なセットのタンパク質が含まれる。一例として、一次タンパク質は、哺乳動物Ｂリンパ球由来の免疫グロブリン可変領域の直接ＰＣＲ増幅により形成され、イン・ビトロ転写用の適当なベクターにクローニングされたリボソームに提示された単鎖抗体（ＳＣＡ）可変領域ライブラリーから誘導されるであろう。ＳＣＡライブラリーの構成物は、ミクロタイターウェル中に別々に又は群として、又はガラスチップ等の固相上に直接のいずれかで整列させ、ＳＣＡタンパク質をＩＶＴＴにより形成させ、タンパク質タグを介し又は直接化学カップリングにより固相に固定化する。次いで、組織若しくは細胞抽出物由来の天然のタンパク質の混合物又は遺伝子ライブラリーに起源を有する合成タンパク質の混合物（例えば、リボソーム又はファージに提示されたタンパク質）を、ＳＣＡｓ等の一次タンパク質のアレイにまとめて添加し、それにより、一次タンパク質により二次タンパク質に伝えられる結合特異性が、個々のＳＣＡｓに結合する単一の二次タンパク質又は二次タンパク質群のいずれかを有する二次タンパク質の整列化に導く。達成された二次タンパク質のアレイを組織又は細胞の異なる抽出物の間で比較し、次いで、複製した合成タンパク質間のこれらのシグナルにおける相違がこれらの異なる組織又は細胞由来のタンパク質の存在における相違を示すことになる。あるいは、これらのタンパク質を、リン酸化等の種々の修飾を例えば、これらの修飾を検出する蛍光標識化抗体を用いることにより試験することもできる。
【００３１】
アレイの個々の単一又は複数のタンパク質の構成物の存在又は修飾を異なる組織又は細胞抽出物間で比較するために、あるいは、生きた細胞又は組織上のこれらのタンパク質構成物の結合又は生物学的活性を分析するために、合成か又は天然のタンパク質を単一又は複数のタンパク質のアレイ中に分配することは、本発明の具体的な側面である。ミクロタイタープレートの個々のウェル中のｃＤＮＡライブラリー由来のクローン群の個々の構成物を分配することにより、アレイをそのプレート中で容易に行なうことができるが、この手動の（又はロボット管理の）整列化技術は、異なる試料間でウェルの壁という物理的バリアーを生じさせ、これは、洗浄溶液や二次タンパク質ライブラリー等のその後の溶液を迅速かつ正確に添加することを困難にする。さらに、ミクロタイタープレートの使用は、整列化したタンパク質の密度に対して一つの制限を与え、そのような制限は、利用可能なミクロタイタープレート内のウェルの密度により規定される。したがって、タンパク質間に物理的なバリアーなしにタンパク質の整列化を要しない方法が望まれる。
【００３２】
タンパク質のアレイが物理的なバリアーなしに形成される本発明の別の態様においては、アレイ内のタンパク質の空間的な分布は、リボソーム提示等の遺伝子ライブラリーに由来する個々の合成タンパク質を直接空間的に固定化させることによるか、あるいは、タンパク質ライブラリーの構成物を間接的に空間的に固定化させるために合成タンパク質ライブラリーと会合した核酸がアニーリングする核酸、特に合成ＤＮＡを空間的に固定化することのいずれかにより達成される。直接の空間的固定化のためには、組織又は細胞遺伝子ライブラリー由来の合成タンパク質を固定化するか又は、二次タンパク質の混合物を次に添加でき、それにより、これらは個々のタンパク質プローブに対する結合特異性に従って空間的に分配されるであろうように、ＳＣＡｓ等の合成タンパク質プローブを固定化する。したがって、本発明は、新規な型のタンパク質チップを提供する（ハッチェンス(Hutchens)とイップ(Yip) 、Rapid Comms. Mass Spec. 7, (1993), 576頁を参照のこと) 。チップ上の合成タンパク質の固定化は、共有結合又は非共有結合のいずれかにより達成される。翻訳反応中にビオチン化リジンｔＲＮＡの添加によりタンパク質に取り込まれたビオチン部分を用いる固定化が、特に便利である。ビオチンを取り込むと、合成タンパク質分子は、次に、固相ストレプトアビジン又は固相抗ビオチン抗体上に容易に固定化することができる。典型的には、これは、イン・ビトロ転写及び翻訳により製造されたタンパク質試料を、マルチウェルプレートの特定の位置又はガラスチップ等の固相上に等分に分けることができるロボット分配機の使用により簡便化される。そのようなロボット分配機は、複製固相内の同一の位置で同一のタンパク質を固定化して作成する合成タンパク質の複製アレイを作製するのに特に重要である。ビオチン化リジンを用いる直接固定化に関連して、合成タンパク質中に取り込まれなかった遊離のビオチン化リジンｔＲＮＡは、いくつかの試料で、遊離のビオチン基が、固定化されたストレプトアビジン分子へのアクセスをブロックするという困難な問題を生じうる。都合のよいことに、これは、翻訳反応混合物中のビオチン化リジンｔＲＮＡの枯渇を確保することにより克服することができる（次いで、発生期のタンパク質は、非修飾リジンｔＲＮＡの添加により完成されうる）；これに代わるストラテジーは、固相のビオチン結合部位数に比べて過剰のリジン結合ビオチン分子数を使用するか又はビオチン化リジンｔＲＮＡ等の小分子を除去するための分子ふるい濾過工程の使用である。別のストラテジーは、翻訳期間の終わりにリジンの豊富な（ポリ）ペプチドをコードする合成ｍＲＮＡ鋳型を翻訳反応混合物中に添加することである。この鋳型は過剰の遊離ビオチン化ｔＲＮＡを取り込むことが可能である。そのような鋳型は、反応混合物からリジンの豊富な合成タンパク質を除去するために後で使用できる（例えば、ポリヒスチジンテールに対する抗体を有するビーズを用いて）ペプチド配列（例えば、ポリヒスチジンテール）もコードするであろう。そのような様式で、合成タンパク質の固定化に先立ち、遊離のビオチン化リジン基は翻訳混合物から除去されるであろう。
【００３３】
また、タンパク質の非共有結合による付着は、次にはアビジンと反応するＳｕｌｆｏ−ＳＢＥＤ(Pierce & Wariner, Chester, UK) 等の市販の試薬を用い、ビオチン等でタンパク質を標識することによっても容易にできる。タンパク質の共有結合による付着は、オーサリバン(OSullivan) ら(Anal. Biochem. 100 (1979), 108)に記載されたもの等のいかなる慣用の方法でも架橋を容易にする反応種で、タンパク質を活性化させることによっても達成されうる。タンパク質の付着は、固定化の達成手段として次に固相のニッケルキレートか又は抗ポリヒスチジン抗体に結合可能な末端のポリヒスチジン配列等の合成タンパク質内の特異的アミノ酸配列を包含させることによっても容易になりうる。合成タンパク質の直接結合の代替法には、例えば、ＲＮＡ結合タンパク質（ＨＩＶｔａｔタンパク質等）を用いて会合したＲＮＡを固定化することによるか又は固相上の合成ＤＮＡ分子にＲＮＡをアニーリングさせることによるリボソーム提示タンパク質の結合が含まれよう。
【００３４】
核酸を介するタンパク質の間接的な固定化に関しては、タンパク質−リボソーム−ｍＲＮＡ複合体中の会合したｍＲＮＡを、そのｍＲＮＡをコードするプラスミドベクターにより元々コードされるヌクレオチド配列タグとともに調製してもよい。ヌクレオチド配列タグは可変性であってもよく、例えば、（ベクターにアニーリングする適当な末端を有する）ランダムオリゴヌクレオチド混合物によりコードされる合成領域を用いてプラスミドベクターを作成して、例えば、ｍＲＮＡの５’末端に配列標識をランダムに置くことにより、プラスミドベクター標品中でランダム化されてもよい。遺伝子ライブラリーからタンパク質−リボソーム−ｍＲＮＡ複合体を調製した後、ｍＲＮＡ配列タグを、スライドグラス（「ＤＮＡバイオチップ」）等の固相表面に個々に位置する合成オリゴヌクレオチドのアレイにアニーリングさせてもよい。このようにして、個々のタンパク質を、バイオチップ上の特定の位置に最後に配置してもよい。次いで、空間的に整列化されたタンパク質を、これらの修飾のスクリーニングのために蛍光抗体等を用いて組織又は細胞抽出物による修飾について分析してもよい。さらに、アレイは、バイオチップ上の個々のタンパク質に結合するかそのタンパク質を修飾するタンパク質の同定に使用してもよい。修飾されたタンパク質、又はタンパク質−タンパク質相互作用に関わるタンパク質の同一性については、前記チップ上に固定化されたオリゴヌクレオチドの知られた配列からその後に決定してもよく、それにより、この配列は、プラスミドライブラリー中の相補的配列タグと会合する特定の遺伝子を同定するために、（例えば、ＰＣＲにより）プラスミドライブラリーを探索するために用いられる。あるいは、タンパク質の同一性は、個々のタンパク質に会合するｍＲＮＡ配列のＰＣＲ増幅により達成されてもよい。したがって、この態様は、原理的にはチップ上の個々の位置に配置された個々のタンパク質を有するタンパク質アレイバイオチップに関連する。あるいは、タンパク質の同一性は、一次又は二次合成タンパク質が生産されているかどうかをタンパク質配列タグに対する抗体の混合物等を用いて探索可能なタンパク質配列タグのランダムセットを用いて、決定してもよい。例えば、合成タンパク質は、一方の末端がアミノ酸のランダム又はセミランダムストレッチのいずれかを含み、その各々が適当な標識を有する抗体のライブラリー由来の抗体により検出可能なときは、一以上の特異的抗体の結合が合成タンパク質の同一性を決定することができる。例えば、タンパク質の一方の末端がランダムな８アミノ酸配列タグを含み、そしてＳＣＡｓのライブラリーが構築され合成ペプチドの等価な混合物に対するＳＣＡｓの結合が濃縮されているときは、個々の又は小さい群のＳＣＡｓは特異的ペプチドに結合し、そのペプチド（したがって合成タンパク質）は、個々のＳＣＡｓの特異性という知見により同定することができる。
【００３５】
また、異なる組織又は細胞間の相違の分析に先立って、修飾されたタンパク質又は相互作用するタンパク質の混合物が予め選択されるという方法も、本発明に包含される。例えば、タンパク質をコードする個々のｍＲＮＡ分子がタンパク質に付着したままであるリボソーム提示等の提示法により作製される一次合成タンパク質  を、組織又は細胞の抽出物による処理に付し、次いで、固相に固定化されたこれらの修飾に対する抗体を用いる選択に付す。こうして、会合した核酸を有する修飾されたタンパク質を単離し、例えば、アガロースゲル電気泳動等のＰＣＲ産物の単純分析及び異なる細胞又は組織での処理から得られる結果の比較を含むいくつかの手段により、単離されたタンパク質のプロフィールを決定することができる。同様に、タンパク質−タンパク質結合による二次合成タンパク質を「捕捉」するために次に使用される一次天然タンパク質に関しては、相互作用するタンパク質を、例えば、二次合成タンパク質上のタグに対する抗体及び前記合成タンパク質と会合する核酸由来のＰＣＲ産物の分析により再び決定される相互作用するタンパク質のプロフィールを用いて単離することができる。
【００３６】
また、遺伝子ライブラリーから作製された合成タンパク質を、タンパク質の修飾又はタンパク質−タンパク質結合の分析用のタンパク質ゲル電気泳動に付す方法も本発明に包含される。タンパク質の加水分解又はリン酸化等の翻訳後修飾がタンパク質の電気泳動上の移動度を変化させることは、よく証明されている（フィジッキー(Phizicky)とフィールド(Fields) Microbiol. Rev., 59, (1995), 94頁) 。したがって、本発明の１つの態様は、疾患に関連するタンパク質の修飾が２Ｄゲル電気泳動を用いて検出される方法を提供する。例えば、その後のＩＶＴＴ又はリボソーム提示用のｃＤＮＡライブラリーを構築することになろう。タンパク質のその後の精製を容易にするために、Ｈｉｓ又はＦｌａｇ等の３タグを、用いる転写ベクター中に取り込んでもよい。これは、当業者によく知られた標準的な分子生物学的技術により達成される。タンパク質のその後の検出を容易にするために、それらを３５Ｓ又はビオチン等の標識で翻訳過程中に標識してもよい。翻訳後、必要ならばタンパク質を精製して、例えば、タンパク質が３ｆｌａｇ又はポリヒスチジンタグを有する場合抗Ｆｌａｇ抗体又はニッケル等のリガンドを含むアフィニティー媒体に翻訳混合物を通過させることにより、抗リボソーム抗体を用いてリボソーム成分を固相上に除去することにより、あるいはリボソームの単純な限外濾過によりリボソーム及び他の因子を除去することができよう。次いで、臨床試料由来のタンパク質（未標識又は蛍光部との反応等を通じて標識された）を、精製したイン・ビトロ翻訳ライブラリーと共にインキュベートし、修飾したり又は合成タンパク質とのタンパク質相互作用を生じたりするであろう。次いで、全反応物を２Ｄゲル電気泳動により分離し（キャッシュ(Cash)、J. Chromatography 698 (1995), 203 頁) 、Ｐｈｏｒｅｔｉｘ−２Ｄ(Phoretix International, Newcastle upon Tyne, UK) 等の適当なコンピュータソフトウエアを用いて得られたゲルを分析することになろう。対照反応は、合成タンパク質ライブラリーが臨床試料代替物、例えば、最初の試料が疾患試料の場合は正常試料、由来の全タンパク質と反応するように行なうことになろう。疾患関連修飾又はタンパク質／タンパク質相互作用は、疾患試料で見られ、対照タンパク質では見られないユニークバンドとして同定されるであろう。２Ｄゲル分析により同定されたタンパク質に関連する遺伝子の迅速な同定を容易にするために、合成タンパク質ライブラリーを最初に、各プールがライブラリーの一部を含むようないくつかのプールに再分割することができる。これは、遺伝子の最初の混合物を分割することにより達成される。次いで、各プールを前記したようにスクリーニングして、目的のタンパク質を含むプールを同定することになろう。次いで、そのプールに対する転写混合物を再び細分割して、スクリーニング過程を繰り返す。この手法は、目的のタンパク質をコードする単一のクローンが同定されるまで、リボソームに提示されたタンパク質を段々小さくしたプールを用いて繰り返されるであろう。あるいは、２Ｄゲル分析による潜在的な疾患関連タンパク質の同定の後、そのタンパク質を標準的なプロトコールによりゲルから精製し（ハガー(Hager) とバーゲス(Burgess) 、Anal. Biochem., 109, (1980), 76 頁）、���製したタンパク質をｓｃＦｖライブラリーで探索し、そのタンパク質を認識する抗体（１又は複数）を同定する。次いで、その抗体（単数又は複数）を用いて、疾患試料のｃＤＮＡから構築された合成タンパク質ライブラリーをスクリーニングし、会合した遺伝子タグを有するタンパク質を同定することになろう。タンパク質の同定のための代替となる高度に革新的な方法として、例えば、ベクター由来の若しくはベクターへのその後のクローニングのためのｃＤＮＡをコピーするために使用される合成オリゴヌクレオチドの混合物由来のクローニングされたｃＤＮＡ中にリーダー配列を取り込むことにより、元々プラスミドベクターにコードされ、その後にタンパク質中に取り込まれるアミノ酸配列タグを持つ各組換えタンパク質を作成してもよい。ヌクレオチド配列タグは可変性であってもよく、例えば、（ベクターにアニーリングする適当な末端を有する）ランダムオリゴヌクレオチド混合物によりコードされる合成領域を用いてプラスミドベクターを作成し、ｍＲＮＡの５’末端等に配列タグをランダムに置くことにより、プラスミドベクター標品中でランダム化されてもよい。ＩＶＴＴ又はリボソーム提示等によるタンパク質混合物の製造及び２Ｄゲル電気泳動によるこれらのタンパク質の分離後、個々のタンパク質を、配列の様々な並べ替えに特異的な抗体を用いる探索により分析することができよう。
【００３７】
主な適用がヒト疾患又はヒトの健康管理、個体若しくは薬物治療状態に関連するタンパク質、タンパク質の修飾及びタンパク質−タンパク質相互作用の分析にあるであろうことは、本発明にとって自明である。本発明は、「臨床試料」の使用を取り込み、そのような用語は、組織、血液又は特定の疾患により影響されると予想されうるその他のものであってもよい試料をいう。疾患試料とは疾患、健康管理又は薬物治療状態により影響されると示唆されうる試料をいう。正常試料とは、疾患により影響されない試料をいい、正常な健康管理状態を表すが、個体間で変化してもよく、その後の薬物治療の結果に関連性があってもよい。疾患に関連するタンパク質又はタンパク質修飾／相互作用の探究における比較目的のために、正常及び疾患試料は、集団に誘導された不均一性を低減するように理想的に適合されるであろう。これは、ひとりの患者から正常及び疾患試料を得ること（例えば癌の胸部組織と癌に冒されていない胸部組織）により、あるいは、多数の異なる患者から疾患及び正常試料をプールすることにより達成してもよい。
【００３８】
正常及び臨床試料の両方からのｃＤＮＡライブラリーの作製は、ｍＲＮＡの単離後に逆転写によるｃＤＮＡを生成させることを含む標準的な技術により行なう（サムブルック(Sambrook)ら、Molecular Cloning: A Laboratory Mannual,  第2 版,Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989))か、あるいは、ＰｏｌｙＡＴｒａｃｔ  Ｓｙｓｔｅｍ(Promega, Southampton, UK)等の市販のキットを用いて達成してもよい。リボソーム提示によるイン・ビトロ提示及びタンパク質のイン・ビトロ提示に関する条件等の合成タンパク質の生成に適するベクターへのｃＤＮＡのクローニングは、以前に記載された通りである（例えば、ハーネス(Hanes) とプラックタン(Pluckthun) 、Proc. Natl. Acad. Sci. 94 (1997) 4937 頁に記載) 。試料からの全タンパク質の単離は、ボラーグ(Bollag)とエーデルスタイン(Edelstein)(Protein Methods, Wiley-Leiss, 1991) に詳細に記載されている標準的な方法で達成される。リボソーム提示−本発明の第２の態様において、リボソーム複合体が全長ポリペプチドに連結したままであるように、ｍＲＮＡの３’末端でｍＲＮＡの翻訳を選択的に停止することによりリボソームからの全長ポリペプチドの発現を最大にする新規なイン・ビトロリボソーム提示法が提供される。本発明は、ｍＲＮＡ分子の特異的部位に結合したタンパク質がポリペプチドに会合したｍＲＮＡ−リボソーム複合体の失速を可能にするｍＲＮＡのさらなる翻訳をブロックするであろうという発見に基づいている。また、本発明は、ポリペプチドのスクリーニングの直前に新規な翻訳開始を防止する任意の手段をも含む。
【００３９】
まず、本発明の方法は、通常プラスミドベクター中にＤＮＡ分子のライブラリーの創出を含む、そのようなＤＮＡ分子は様々なポリペプチドをコードし、それにより、これらのポリペプチドをコードするＤＮＡがｍＲＮＡ分子に転写される。通常、ＤＮＡ分子のクローニングベクターは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター等の上流のプロモーターを含む。したがって、ＤＮＡ分子のプールされたライブラリーを、例えば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ及びリボヌクレオチドの添加により転写し、ｍＲＮＡ分子のライブラリーを作製する。その後、ＲＮＡ分子のライブラリーを大腸菌Ｓ−３０画分等のリボソーム標品を用いて翻訳する（チェン(Chen H Z)とツバイ(Zubay G), Methods in Enzymology, 第101 巻 (1983) 674-690 頁) 。その後、連結したポリペプチド、リボソーム及びｍＲＮＡを含有するリボソーム複合体を、典型的には固相に固定化したリガンドへの結合に関してスクリーニングし、標的リガンドに結合するポリペプチドをコードするＤＮＡ分子を濃縮するための逆転写及びＰＣＲによる増幅のため、生じた固定化複合体からｍＲＮＡを放出する。これらのＤＮＡ分子は、直接転写に使用可能であり、あるいは標的分子に結合するポリペプチドをコードするＤＮＡの配列を決定するためにクローニングすることができる。本発明のこの態様に目的のため、ＤＮＡ分子によりコードされるｍＲＮＡは、５’から３’にむかって、任意に可変セグメントの５’側に抗開始セグメントを有する可変セグメント、スペーサーセグメント及び終結セグメントを含有する３つのセグメントを含むと考えられる。ポリペプチドは、リボソーム複合体を介してｍＲＮＡの可変セグメントからタンパク質に翻訳されたタンパク質又はペプチド配列を意味する。可変セグメントは、全長のポリペプチドをコードするｍＲＮＡ配列を意味する。スペーサーセグメントは、完成したタンパク質がリボソームから完全に現われ、かつ、リボソーム複合体を通じてコードするｍＲＮＡにまだ付着している間最適の三次元構造を採用することを可能にする可変セグメントにつながったタンパク質セグメントをコードするｍＲＮＡ配列を意味する。終結セグメントは、直接若しくは間接に結合部が付着するｍＲＮＡ配列、あるいは、翻訳をブロックするために特異的タンパク質が付着するスペーサーセグメントにつながって若しくは上流にポリペプチド結合部をコードするｍＲＮＡを意味する。結合部は、リボソーム複合体上のｍＲＮＡに結合可能ないかなる分子又は翻訳の停止を生じさせるリボソーム複合体上の翻訳されたポリペプチドに結合可能ないかなる分子のいずれかを意味する。通常、結合部は、配列特異的様式でｍＲＮＡに直接結合するか又は、合成ＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子をｍＲＮＡにアニーリング後にこれらの分子上のリガンドを介する結合部の付加等、ｍＲＮＡに間接的に結合してもよい。任意の抗開始セグメントは、翻訳開始コドンに隣接し、異なる結合部の付着のための配列を通常提供する。抗開始セグメントは、翻訳されたポリペプチドのスクリーニングの直前の新規な翻訳開始を防止するであろう。標的リガンドは、特異的タンパク質の結合及び会合したｍＲＮＡのその後の回収に関してライブラリーをスクリーニングする対象である。
【００４０】
ｍＲＮＡ分子の可変セグメントは、単鎖抗体（ＳＣＡｓ、重鎖及び軽鎖に由来し、共に連結して一官能性結合ドメインを生じる免疫グロブリン可変領域を含有する）等の全長の公知のポリペプチド型又はランダム又はセミランダム配列のいずれかを含有する。公知のポリペプチド型又は領域のランダム／セミランダム会合により創出されたキメラ配列も使用してもよい。ＳＣＡｓ等の公知のポリペプチド型に関しては、遺伝子の特異的セグメントを、ＳＣＡｓにおけるＣＤＲｓのようにランダム化してもよい。公知、ランダム又はセミランダム配列をコードするＤＮＡ分子の大収集物を最初に製造し、次いで、転写ベクターにクローニングする。この転写ベクターは、以下に詳細に記載するその後のｍＲＮＡ分子における封入に関して他のセグメントを提供する。通常、前記ベクターは、翻訳開始コドン及びｍＲＮＡに対するリボソーム結合部位をも提供するであろう。ＤＮＡによりコードされるさらに長いポリペプチド分子に関しては、翻訳を終結させるｍＲＮＡの停止コドンの存在を減らすか除去する必要があるであろう。特定のタンパク質にとっては天然である停止コドンを含むそのような停止コドンを、全長のポリペプチドを得るために除去することは、本発明の必要条件である。単鎖抗体等の公知のタンパク質をコードするＤＮＡに関しては、これは、通常の停止コドンの除去かあるいは、停止コドンの位置で特異的アミノ酸を挿入するために翻訳反応でナンセンスサプレッサーｔＲＮＡの使用を単に要求するだけである。化学合成により製造されたランダム又はセミランダムＤＮＡの混合物に関しては、いかなる特定の配列に存在する停止コドンの頻度は、合成反応中のＤＮＡ塩基組成の操作により低下させることができ、ナンセンスサプレッサーｔＲＮＡも、翻訳反応に使用することができるであろう。ｍＲＮＡ分子のスペーサーセグメントは、全長ポリペプチドをリボソームから十分に出現することを可能にして適切なタンパク質の折り畳み及び標的リガンドへの妨害されない接近を可能にするために、リボソームの溝にまたがる可変セグメントの下流のポリペプチド領域を提供する。通常、このセグメントは、５０アミノ酸を越える領域をコードし、別のタンパク質由来の完全なドメイン等の全長ポリペプチド又は（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）１０等のグリシン／アラニンの豊富なリンカーの折り畳みを妨害しそうにない領域をコードするであろう。いくつかの翻訳されたタンパク質に関しては、スペーサーセグメントは、タンパク質自体から連続する部分を含み、この部分は、可変セグメントの正しい折り畳み又は標的リガンドへの結合には要求されない。
【００４１】
終結セグメントは、完全な可変セグメントの翻訳後の翻訳終結を防止するよう設計された結合部の直接又は間接付着のための下流のｍＲＮＡ配列を提供する。結合部の特に好ましい結合方法は、終結セグメントに最初に付着する中間の合成オリゴヌクレオチド分子を間接的に用いることである。そのような合成ヌクレオチドを結合部の特異的結合部位に装着した場合、そのときは、結合部が今度はアニーリングされた合成オリゴヌクレオチドに結合し、それによりｍＲＮＡの下流端に付着して翻訳をブロックすることができる。この好ましい方法の一例は、その後にストレプトアビジンが結合し、よって翻訳をブロックする分子を提供する１以上のビオチン化ヌクレオチドを取り込んだオリゴヌクレオチドを使用することである。また、ストレプトアビジン等の分子の使用は、発生中のタンパク質がイン・ビトロ翻訳反応混合物中で取り込まれたビオチン化リジン（又は別のビオチン化アミノ酸）によりそれ自体ビオチン化されうる、発生中のタンパク質のｍＲＮＡ分子への架橋の単なる可能性をも提供する。この好ましい方法の別の例は、次にはモノクローナル抗体若しくはその断片に結合しうる蛍光又はジニトロフェノール等のリガンドを有する１以上のヌクレオチド誘導体を取り込んだオリゴヌクレオチドを使用することである。また、これは、一方で合成オリゴヌクレオチドを介してｍＲＮＡに結合し、他方が翻訳されたタンパク質又はポリペプチド上のアミノ酸配列により翻訳されたタンパク質又はポリペプチドにも結合する二重特異性抗体等の二重特異性分子の使用も可能にする。その他の方法は、いかなる中間のアニーリング工程もなく直接特異的タンパク質が結合する配列を有する終結セグメントを提供することを含む。そのような結合部の一例は、鉄制御タンパク質（ＩＲＰ）である。終結セグメントは、低濃度の鉄の条件下でのＩＲＰの添加により安定化され、よってリボソーム翻訳に対して立体障害を生じさせるステム−ループ構造を提供するであろう。この後、発生中のペプチドの選択が起こりうる。リボソームを停止させるためのＩＲＰの使用は、鉄の添加が翻訳を再開させそして終結させるように可逆的なブロックを導入する。これは、その後の転写、配列決定又はｃＤＮＡクローニングに関するポリペプチドの選択後にｍＲＮＡの放出を容易にするであろう。終結セグメント中の配列に結合するｍＲＮＡ結合部のさらなる例は、ＴＡＲと称するＲＮＡステム−ループに結合するＨＩＶタンパク質ｔａｔ（ディングウォール(Dingwall)ら，PNAS, 第86巻 (1989) 6925-6929 頁）、ＲＮＰモチーフに結合するＬａ抗原（チャン(Chan E K L)とタン(Tan E M), Mol. Cell. Biol. 第7 巻 (1987) 2588-2591 頁）及び一本鎖若しくは二本鎖ＲＮＡのいずれかで、後者はヘアピンループを介してｍＲＮＡに創出可能な特異的ＲＮＡ配列に結合するその他のＲＮＡウイルス由来のタンパク質を含む。あるいは、終結セグメントは、翻訳終結の防止に関して結合部をさらに安定化させるために合成されたポリペプチド自体又はリボソームタンパク質複合体に付加的に結合する結合部の付着部位をコード可能である。任意に、終結セグメントは、ｌｐｐ（大腸菌リポタンパク質）及びファージＴ３ターミネーター等のエキソヌクレアーゼに対するｍＲＮＡの安定性を高める１以上のさらなるｍＲＮＡの領域を含むであろう。本発明のこの他の主要な側面に関して、ｍＲＮＡは、様々な結合部が合成オリゴヌクレオチド若しくは他の分子の最初のアニーリングを通じて間接的に、又はｍＲＮＡ分子に対する直接的な認識及び直接的な結合部の結合を介してのいずれかで結合可能な様々な終結セグメントとともに製造することができる。
【００４２】
隣接する任意の抗開始セグメントは、全長のポリペプチドを生ぜずそれ故に標的リガンドへの非特異的結合を提供する恐れのある不完全な折り畳みを有するポリペプチドを提供するかもしれない翻訳反応の後期で翻訳開始を防止するように設計される。抗開始セグメントは、例えば、シグナル認識タンパク質（ＳＲＰ）が結合可能な翻訳されたポリペプチド中の分泌性リーダー配列をコードしてもよい。一旦、ＳＲＰがポリペプチドに結合したならば、ポリペプチドとｍＲＮＡとの架橋によりさらなる翻訳の停止を生じさせる。また、翻訳停止は、発生中のペプチド及びｍＲＮＡにそれぞれ結合するＳＲＰのＳＲＰ５４とＳＲＰ９／１４サブユニットとの組合せを用いることによっても達成されるかもしれない（シーゲル(Siegel)とウォルター(Walter)，Cell Biol., 第100 巻 (1985) 1913-1921)。抗開始配列の別の例は、下流のシストロンの翻訳を抑制する上流の２２コドンを含むヒトサイトメガロウイルスｇｐ４８遺伝子のもの等の一定の真核細胞転写リーダーにより提供される（ガオ(Gao J) とゲバーレ(Geballe A P), Mol. Cell. Biol. 第16巻 (1996) 7109-7114 頁) 。そのようなリーダーは、下流のシストロンに対するリボソームの進行をブロックするペプチドをコードすると考えられる。抗開始配列のさらなる例は、前記した終結セグメント等の結合部により認識される配列であり、これらは、ＩＲＰ、ｔａｔ、Ｌａ抗原及びその他のウイルスタンパク質により結合される配列を含む。
【００４３】
したがって、本発明は、任意に抗開始セグメントを有する可変、スペーサー及び終結セグメントを有するｍＲＮＡ分子をコードするｃＤＮＡライブラリーの組成物を提供する。好ましくは、本発明は、スペーサー及び終結セグメントをコードし、抗開始セグメントは任意であるＤＮＡベクターを提供する。通常、ＤＮＡベクターは、翻訳開始コドンも提供し、原核細胞のリボソームを用いる翻訳に対しては、リボソーム結合部位はシャイン−ダルガーノ配列を含む。真核細胞の翻訳系に対しては、共通のＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧを有するコザックの翻訳開始配列を含んでもよく、翻訳開始部位から上流に、タバコモザイクウイルス等のある種のウイルス由来の非翻訳リーダー配列を含むエンハンサー又はアクティベーター配列等の翻訳を促進する他の公知の配列を含むことが望ましい。通常、ＤＮＡベクターは、ＲＮＡポリメラーゼとともに用いてＤＮＡライブラリーに対応するｍＲＮＡ分子のライブラリーを作製する強力な転写プロモーターも提供する。そのようなプロモーターには、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ及びＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼのものが含まれ、さらに、ＲＮＡ依存性ポリメラーゼ、ＱｂレプリカーゼのプロモーターもＤＮＡによりコードされてもよい。ＤＮＡベクターは、例えば、大腸菌リポタンパク質のターミネーター又はファージＴ３の初期ターミネーター等の強力な転写ターミネーターも提供する。本発明の方法において、可変セグメントを含むＤＮＡ断片をＤＮＡベクターにクローニングし、それによりＤＮＡ断片は最小の停止コドンを持つか全く持たない。ＳＣＡｓ等の公知のポリペプチド型をコードするライブラリーに関しては、ＤＮＡ断片を適当な制限部位を用いて単一の方向にクローニングする。プラスミド、バクテリオファージ、ファージミド及びウイルスベクターを含む様々な複製可能なＤＮＡベクターを本発明の方法に用いることができることは当業者にとって明らかであろう。ＰＣＲ等の方法によるＤＮＡ増幅を生きた細胞中のＤＮＡの複製のための代替として使用できることも、明らかであろう。ＤＮＡライブラリーを創出するための可変セグメントが、ＤＮＡ断片、合成ＤＮＡ又は増幅したＤＮＡのベクターライブラリーを含む多数の供給源から提供されうることも、明確であろう。また、可変セグメントは、エラーしやすいＰＣＲ等を用いて、固定された鋳型を用いる突然変異導入反応の結果として提供されうる。可変セグメントＩＲＰは、生きた生物のゲノムから直接に又はその生物のｍＲＮＡのｃＤＮＡコピーからＤＮＡを構成させうることも、明確である。例えば、ＤＮＡライブラリーが単鎖抗体断片を含有する場合、これらの断片は、免疫グロブリン可変領域をコードするｍＲＮＡに由来し、生物内でＢ細胞により発現されうる。あるいは、前記断片は、ゲノムの可変領域に由来することができる。そのような様式で、本発明は、ヒト等の特定の生物由来の単鎖抗体ライブラリーの創出を提供する。
【００４４】
また、本発明は、任意に抗開始セグメントを有する可変、スペーサー及び終結セグメントを有するｍＲＮＡ分子のライブラリーの組成物をも提供する。好ましくは、本発明は、スペーサー及び終結セグメントをコードし、任意に抗開始発現を有するｍＲＮＡ分子のライブラリーを提供する。ｍＲＮＡ分子は、それぞれ、翻訳開始コドンを含み、原核細胞のリボソームを用いる翻訳に対しては、リボソーム結合部位はシャイン−ダルガーノ配列を含む。真核細胞のリボソームを用いる翻訳に対しては、ｍＲＮＡは、５’キャッピングヌクレオチドとともに合成されてもよく、あるいは、これは、前もって合成されたｍＲＮＡに酵素により導入されてもよい。翻訳開始部位から上流に、共通のコザックの翻訳開始配列及びある種のウイルス由来の非翻訳リーダー配列を含むエンハンサー又はアクティベーター配列等の翻訳を促進する他の公知の配列をも含まれてもよい。翻訳過程の前に又は最中に、１以上の結合部をｍＲＮＡ分子の終結セグメントと会合するようにし、よって、翻訳を失速させるであろう。また、翻訳過程の最中に、１以上の結合部をｍＲＮＡ分子内又はｍＲＮＡ分子にコードされる任意の抗開始セグメントに会合するようにし、よって、新規な翻訳の開始を防止してもよい。
【００４５】
また、本発明は、任意に抗開始リーダー配列を有する可変及びスペーサーセグメントを有する翻訳されたポリペプチド分子のライブラリーの組成物をも提供する。これらのタンパク質分子は、結合部とｍＲＮＡとの相互作用を介してリボソーム内に引き止められたさらに長いポリペプチドの一部として全長の可変セグメントを提供する。ポリペプチドの５’末端
本発明は、リボソームとの作用に関し、よって、ｍＲＮＡ分子上のさらなる翻訳を防止する。あるいは、５’末端は、５’末端の相補的配列への合成オリゴヌクレオチドのアニーリングし、合成オリゴヌクレオチド中に取り込まれたビオチン分子を介する等のその後の結合部のこのオリゴヌクレオチドへの結合等を介して、間接的に結合部と会合するようになってもよい。
【００４６】
本発明の方法の範疇において、様々な手段を用いて、特にＲＮＡｓｅによる分解からｍＲＮＡ分子の安定性を最適化することは、当業者にとって明らかであろう。例えば、Ｒｎａｓｉｎ及びバナジルリボヌクレオシド複合体等のＲＮＡｓｅの様々な阻害剤を転写反応に使用することができる。
【００４７】
代替として又は追加として、様々な構造が、通常、転写のターミネーターにより提供されるもののような３’ステム−ループを含むｍＲＮＡ分子に含まれうる。また、転写及び翻訳反応は別々に行なわれるか又は特に原核細胞系を用いて、共役したイン・ビトロ転写／翻訳反応に結合されるかのいずれかであることは、当業者にとって明らかである。好ましくは、転写及び翻訳反応は、異なる最適試薬を要求するであろうｍＲＮＡ及びポリペプチドの産生を最適化するために別々に行なう。
【００４８】
本発明の方法の範疇で、様々な手段を用いてタンパク質分子の折り畳み及び特にプロテアーゼによる分解からタンパク質分子の安定性を最適化することは、当業者にとって明らかである。正しいタンパク質の折り畳みに関しては、例えば、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ等の分子シャペロンの使用を通じて、ジスルフィド結合の形成を最適化するための特別の手段で、最適の酸化的タンパク質折り畳み条件を翻訳反応に使用する。安定性に関しては、大腸菌のペプチドタグ付加システムは、ハーネス(Hanes) とプラックタン(Pluckthun) （同書）の方法等の方法を用いて、ｓｓｒＡ  ＲＮＡの阻害により機能停止されうる。一旦最終のポリペプチド／リボソーム／ｍＲＮＡ複合体が形成されたなら、クロラムフェニコール等の標準的な翻訳阻害剤を用いてこれらの複合体を安定化させることが有益であるかもしれない。ポリペプチド鎖及び／又はｍＲＮＡとリボソームとの追加の化学的、光化学的又は酵素的架橋も有益であるかもしれない。例えば、酵素トランスグルタミナーゼは、発生中のポリペプチド鎖上に位置するＣ末端グルタミンを使用して用い、遊離のアミノ基に架橋するための基質を提供してもよく、好ましくは相補的合成オリゴヌクレオチドを使用してＲＮＡ分子の３末端に提供する。代替例として、化学的に修飾したアミノ酸（セレニウムアミノ酸等）を、チオール化ヌクレオチド等の化学的に修飾したＲＮＡヌクレオチドとのその後の反応にために、タンパク質鎖中に取り込む。
【００４９】
一旦ポリペプチド／リボソーム／ｍＲＮＡ複合体が形成されたなら、次いで、うまく結合した複合体を連続的に回収できるような様式で、標的リガンドへの結合に関して、混合物をスクリーニングすることができる。これは、プラスチック若しくはガラス表面又はラテックス若しくは磁気ビーズの表面等の固相上に固定した標的リガンドへの結合により達成されうる。本発明の他の態様は、細胞及び組織への結合並びにポリペプチド／リボソーム／ｍＲＮＡ複合体を形成するために使用したのと同じｍＲＮＡによりコードされるタンパク質分子を含有する溶液中の他の分子への結合を含む。また、これは、その後に複合体の分離の基礎を提供する別の反応又は一連の反応に影響を及ぼす標的リガンドの結合によっても達成することができ、例えば、ここで、細胞の表面での標的リガンドへの結合は、表面抗原の出現等のその細胞における変化を生じさせ、それにより、その細胞は、結合したポリペプチド／リボソーム／ｍＲＮＡ複合体とともに集団内の他の細胞から分離することができる。
【００５０】
別法として、ポリペプチドを特定の酵素活性に関してスクリーニングすることができ、それにより、標的リガンドは、例えば、酵素に不可逆的に結合する酵素基質であり、又は、ここで、基質は酵素により、ポリペプチド／リボソーム／ｍＲＮＡ複合体に結合できるか又は酵素活性を含むポリペプチド／リボソーム／ｍＲＮＡ複合体の全混合物から分離できるようにある種の他の変化を及ぼすことができる産物に変換される。
【００５１】
標的リガンドへの非特異的結合を回避するために、様々なブロッキング剤を、特にｍＲＮＡと標的との非特異的会合を回避するために、標的リガンドとのインキュベーションの際にポリペプチド／リボソーム／ｍＲＮＡ複合体に添加する。血清アルブミン又はカゼイン等の様々な標準ブロッキング剤が有益であるが、非特異的ｍＲＮＡ結合を特異的にブロックする好ましい方法は、合成オリゴヌクレオチド及び逆転写酵素を用いてポリペプチド／リボソーム／ｍＲＮＡ複合体の結合の前にｃＤＮＡを生成させることである。標的リガンドへの結合後に、ｍＲＮＡ：ｃＤＮＡハイブリッド中のｍＲＮＡを分解するＲＮアーゼＨを用いるｍＲＮＡのその後の酵素による破壊を可能にするが、この工程の使用は、酵素による分解からのｍＲＮＡの保護をも提供する。
【００５２】
一旦、ポリペプチド／リボソーム／ｍＲＮＡ複合体が標的リガンドへの結合により分離されたなら、その複合体を標準法により調製的に精製するか又はＥＤＴＡ等を用いて単にＲＮＡを放出させるか又はｃＤＮＡへの逆転写の前に単に加熱するかのいずれかが可能である。あるいは、ｍＲＮＡを、ポリペプチド／リボソーム／ｍＲＮＡ複合体の結合の前にｃＤＮＡにコピーし、次いで、前記したようにＲＮアーゼＨで破壊することができる。次いで、ＰＣＲ等の方法によるｃＤＮＡの増幅が行なわれる。次いで、増幅したＤＮＡを、ライブラリーをさらに分割するために再び転写及び翻訳するか又はサブライブラリーを作製するためのクローニングすることのいずれかができる。標的リガンドに結合するポリペプチドが突然変異により進化する分子進化ストラテジーに関しては、突然変異導入は、エラーしやすいＰＣＲ等を用いるｃＤＮＡの増幅の段階で影響されうるか又はポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントの特異的領域に突然変異を導入する混合オリゴヌクレオチド等を用いて、クローニングされたサブライブラリーを突然変異導入に付すことにより影響されうるのいずれかである。必要ならば、転写／翻訳用の最初のＤＮＡライブラリー又はスクリーニング後のサブライブラリーを、スクリーニングに付されたポリペプチドの混合物の複雑さを低下させるために、スクリーニング用のプール又は個々のクローンに再分割することができる。ＤＮＡライブラリー由来の１以上のポリペプチドを最終的に同定した後、次いで、必要ならばスペーサーセグメント又はいかなるその他のフランキングセグメントなしに高レベルの所望タンパク質を製造するために、目的の特定のポリペプチドをコードするＤＮＡを発現ベクターにサブクローニングすることができる。
【００５３】
本発明は、ＳＣＡｓ等の公知のポリペプチド型の改変体又は現存するタンパク質よりも優れた生化学的若しくは生物学的活性を有する全体的に新規なタンパク質の単離を含む様々な適用を有することは、当業者にとって明らかであろう。公知のポリペプチド由来の領域と新規なポリペプチド配列の領域とのハイブリッドとして創出されたキメラタンパク質も、製造されるかもしれない。抗体等の複数鎖ポリペプチド型に関しては、重鎖及び軽鎖可変領域の機能的又は新規な組合わせも製造されるかもしれない。
【００５４】
生物学的スクリーニング−本発明の第３の態様において、ＤＮＡライブラリーによりコードされポリペプチド提示を介して発現される生物学的表現型を直接選択する新規な方法が提供される。前記方法は、提示されたポリペプチドの結合表現型の前知識を要することなく、生物学的表現型と遺伝子型との直接な連結を提供する。本発明のこの態様の１つの側面において、提示された生物学的に活性なポリペプチドの結合による生物学的応答の刺激（又は阻害）は、標的の生きた細胞での変化を生じさせ、このことは変化した細胞の分離の基礎を提供する。次には、生物学的に活性なポリペプチドをコードする１又は複数の遺伝子が、変化した細胞の回収を介して次いで回収されうる。この態様の別の好ましい側面において、提示された生物学的に活性なポリペプチドの結合による生物学的応答の刺激（又は阻害）は、標的の生きた細胞からの分子（本明細書において「モジュレーター」と称する）の製造（又は製造の休止）を生じさせ、このことは、次には生物学的に活性なポリペプチドをコードする遺伝子の回収に導く。本発明は、以下のように、生物学的に活性なポリペプチドをコードする遺伝子の２つの広範な回収方法を提供する。
【００５５】
（１）「タグ付加」−この方法において、標的の生きた細胞により製造されたモジュレーターは、提示されたタンパク質／ポリペプチドを含む複合体に結合し、よって、その後の単離のためにこの複合体にタグを付加する。例えば、標的の生きた細胞は、生物学的に活性なポリペプチドの結果として、そのポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む生物学的に活性なポリペプチドを提示するリボソーム複合体に結合するタンパク質又はタンパク質性複合体を生成するかもしれない。モジュレーターと生物学的に活性なポリペプチドを提示する複合体との好ましい結合は、例えば、標的細胞の表面で又は標的細胞内で、この複合体の標的の生きた細胞への非常な接近の結果としてであろう。標的細胞によるモジュレーターの製造後、次いで、提示されたポリペプチドを含むタグ付加複合体を、例えば、モジュレーターに結合して生物学的に活性なポリペプチドを提示する複合体を生物学的に活性なポリペプチドを欠く他の複合体から分離する抗体を用いることにより、単離することができる。これらの複合体を分離した後、生物学的に活性なポリペプチドをコードする遺伝子型を決定することができる。リボソーム提示におけるその適用に加えて、タグ付加法は、生きた微生物を用いるポリペプチド提示法とともに用いることもできる。例えば、モジュレーターを用いて、その後のタグ付加ファージの単離及び生物学的に活性なポリペプチドをコードする遺伝子の回収のためにバクテリオファージにタグを付加する。
【００５６】
（２）「相補性」−この方法において、標的の生きた細胞により製造されたモジュレーターは、生きた微生物のその後の生存力に必要である。例えば、標的の生きた細胞は、生物学的に活性なポリペプチドの結果として、生物学的に活性なポリペプチドを提示する欠陥バクテリオファージの感染能を回復させるのに必要なモジュレーターを製造し、それによりそれをコードする遺伝子を含む。次いで、感染能の回復の際に、バクテリオファージを、生物学的に活性なポリペプチドをコードする遺伝子を増幅するために、感染した宿主を通じて増殖することができる。モジュレーターと生物学的に活性なポリペプチドを提示するバクテリオファージとの好ましい結合は、例えば、標的細胞の表面で又は標的細胞内で、この複合体が標的の生きた細胞に非常に接近したことの結果としてであろう。バクテリオファージの増幅後、生物学的に活性なポリペプチドをコードする遺伝子型を決定することができる。バクテリオファージ提示におけるその適用に加え、相補性方法も、生きた細菌を用いるポリペプチド提示法とともに使用できるであろう。例えば、モジュレーターは、適当な選択条件下で、標的の生きた細胞に非常に接近した細菌の選択的生育を可能にし、よって、生物学的に活性なポリペプチドをコードする遺伝子型の増幅を可能にする抗生物質、薬剤耐性酵素／因子又は必須栄養素でありうる。
【００５７】
タグ付加又は相補性方法のための標的の生きた細胞から放出されたモジュレーターが、例えば、誘導されたリポソームの溶解を介するリポソーム又は他の分子区画からのこれらの放出により、間接的にタグ付加又は相補性部をも提供でき、ここでモジュレーターはホスホリパーゼ又はある種のリポポリサッカリドに基づくリポソーム、ガラクトシダーゼ等であることは、当業者にとって明らかであろう。リポソーム又は他の分子区画から放出された可能なタグ付加部又は相補的部の中では、核酸又は感染性微生物でありうる。放出された核酸は、アニーリングにより提示された生物学的に活性なポリペプチドを含むリボソーム複合体のｍＲＮＡ又はｒＲＮＡ成分にタグを付加することができる合成オリゴヌクレオチドを含有することができる。放出された感染性微生物は、生物学的に活性なポリペプチドを提示する細菌細胞に感染し、その細胞のその後の生存力、よって遺伝子型の増幅につながる１以上の遺伝子を提供することができることができるバクテリオファージを含みうる。放出されたモジュレーターは、基質をタグ付加部又は相補性部として作用する産物に変換する効果を有する酵素でもありうる。モジュレーターが、そのような放出が生物学的に活性なポリペプチドによりブロックされうる標的細胞から構成的に放出されうることも当業者にとって明らかであろう。また、生物学的に活性なポリペプチドによる結合の結果として、標的の生きた細胞中の他の変化が、タグ付加又は相補性のいずれかに生じるということも自明である。例えば、標的の生きた細胞中の生物学的な変化は、生物学的に活性なポリペプチドを含む複合体又は微生物との相互作用のために放出されるモジュレーターを含むリポソームを有するその細胞の融合に導くかもしれない。
【００５８】
本発明のこの態様を実施するための最初の方法において、異なる遺伝子を含むプラスミドのライブラリーを、転写及び次いで、哺乳動物細胞で生物学的効果を試験するポリペプチド分子に翻訳する。具体的には、プラスミドライブラリーは、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターの下流にクローニングされ、ｍＲＮＡ転写物を生成し、次いでイン・ビトロで翻訳される遺伝子のライブラリーを含む。次いで、そのＲＮＡがまだ会合したままの翻訳されたポリペプチド混合物を、細胞に投与して細胞の表現型の変化が測定される。次いで、所望の変化した表現型を有する細胞を単離し、リボソーム／ポリペプチド複合体にまだ会合したままのｍＲＮＡ分子に特異的なプライマーを用いるＰＣＲに付す。この様式において、所望の細胞表現型効果を誘導するポリペプチドをコードする遺伝子を増幅し、配列を決定し、遺伝子によりコードされるタンパク質のその後の再試験のために発現ベクターに再クローニングするか転写ベクターに再クローニングすることができる。したがって、エラーしやすいＰＣＲの使用等による突然変異導入ストラテジーの使用を通じて、タンパク質は、最大の生物学的活性を有するポリペプチドを生成させるために、必要な表現型の誘導のための連続回の試験を通じて進化されうる。
【００５９】
転写され、ｍＲＮＡが翻訳されるプラスミドベクターの代替として、他の方法を本発明の範囲内で使用し、決定可能な遺伝子型に連結したポリペプチドを製造してもよく、そのような方法は、バクテリオファージ粒子の表面上でのタンパク質の提示用のバクテリオファージベクター及びこのポリペプチドをコードするＤＮＡに結合することを試験されるポリペプチドを生じさせるＤＮＡ結合ポリペプチドに融合するポリペプチドをコードするプラスミドベクターを含む。
【００６０】
決定可能な遺伝子型に連結したポリペプチドを製造し、本発明は、標的の生きた細胞で生物学的な活性を誘導するための方法の範囲を提供し、それにより生物学的な活性の遺伝子型を決定することができる。１つの単純な方法は、細胞表面マーカーの出現又は消滅により生物学的な活性を検出することであり、そのマーカーは、次いで、生物学的に活性な細胞を不活性な細胞から分離するための基礎として使用することができる。通常、これは、細胞表面マーカーに結合する抗体を用いて、次いで抗体結合細胞を未結合細胞から分離するための方法を用いて達成されるであろう。そのような方法は、抗体への磁気ビーズの結合を介する（例えば、ビーズ会合抗免疫グロブリンを用いて）か又は蛍光標示式細胞分取法（ＦＡＣＳ）を介するものであり、それにより、抗体（又は二次抗体）を蛍光標識する。要求される生物学的な活性を有する細胞を単離し、次いで、対応する遺伝子型を、試験ポリペプチドと会合した核酸のＰＣＲによる増幅か又は分離した細胞に結合したバクテリオファージの増殖により決定することができる。
【００６１】
遺伝子型に対して生物学的な活性を連結する別の方法は、試験ポリペプチドをその遺伝子型に連結する複合体に直接結合する１以上のタグ付加部を製造（又は製造を中断する）ために、標的細胞を操作することである。例えば、細胞を操作して、ｍＲＮＡ／リボソーム／ポリペプチド複合体と会合するｍＲＮＡに結合するＲＮＡ結合ポリペプチド（ＨＩＶ  ｔａｔタンパク質等）を製造する。そのようなプロモーターの一例は、Ｔ細胞受容体の刺激等の結果として活性化されたＩＬ−２プロモーターである。このＲＮＡ結合ポリペプチドは、生物学的効果の一部として活性化されたプロモーターに連結してもよく、生物学的効果の一部として活性化された別のポリペプチドに関連した融合タンパク質として製造してもよい。細胞溶解又は試験ポリペプチドの生物学的に活性な細胞への結合の他の放出後、次いで、ｍＲＮＡを、タグ付加部に結合する抗体等を用いて単離することができる。また、細胞を操作して、損傷したファージにおける他のポリペプチドを相補可能なバクテリオファージポリペプチドを製造し、よって、そのファージを感染性にしてもよい。
【００６２】
生物学的な活性が細胞表面マーカーの出現又は消滅により伴う場合において、本発明の別の適用は、この表面マーカーをタグ付加部又は相補性部の放出又は創出に関連付けることである。これは、例えば、様々なタグ付加部又は相補性部を放出するためにホスホリパーゼＣ（又はある種のリポポリサッカリドを含むリポソームに対してはβ−ガラクトシダーゼ）によるリポソームの酵素による溶解により、あるいは例えば、反応性ビオチン部を創出させるためにビオチニル−チラミドの西洋ワサビペルオキシダーゼによる酵素による変換により、細胞表面マーカーに結合しその後タグ付加部又は相補性部の放出を触媒する抗体−酵素コンジュゲート等の使用により達成することができる。
【００６３】
表面抗原に対する代替として、細胞内で製造された部分を選択の基礎として使用することができることは、当業者により理解されるであろう、それにより、生物学的応答の刺激（又は阻害）の後に細胞を浸透性にし、この部分を抗体等の結合タンパク質により接近させるか、又はタグ付加部若しくは相補性部が最終的に創出され次いでポリペプチド提示複合体に結合できるような方法で、酵素による変換のために使用する。
【００６４】
リガンド指向スクリーニング−本発明のこの態様は、表面受容体の付近で分子を標識するために、細胞又は組織の表面に受容体を結合するリガンドを用いる方法を提供する。特に、本発明は、細胞表面上のリガンドに付着した別の分子を案内するためのリガンドを使用し、ここで、この他の分子は、次いで、標識反応を行なうことができる。特に、この態様は、提示されたタンパク質をコードする対応する遺伝子を単離することができるように、リガンドの付近で細胞／組織に前もって結合した提示されたタンパク質の標識を提供する。以下の本明細書において、受容体という用語は、リガンドが結合できるタンパク質性部分をいう。リガンドという用語は、受容体に結合する通常はタンパク質の分子をいう。結合タンパク質という用語は、ＤＮＡライブラリーによりコードされるタンパク質をいう。タンパク質−複合体とは、結合タンパク質と核酸との複合体をいい、それにより、標的分子に結合する際に、結合タンパク質をコードする個々の遺伝子は結合タンパク質が再生できるように回収することができる。標識とは、標識部により放出され、かつ、標識−受容体を介してタンパク質−複合体と結合又は反応可能な分子をいう。標識部とは、一般に、その後に標識の放出を触媒することが可能な酵素をいう。標識−受容体とは、標識な結合するタンパク質−複合体上の部位をいう。
【００６５】
本発明のこの態様の好ましい特徴は、リガンドに隣接して直結したタンパク質−複合体を標識する標識を提供するための標識部としてのリポソームの使用であり、それにより、リガンドは、リガンドの付近で包まれた内容物を放出させるリポソームと会合するか又は会合するようになりうる。これは、本発明の方法における異なる標識の使用での多用途性を提供する。ＵＳ５１９６３０６に記載の酵素活性化系等の他の標識系も、本発明の方法の範疇で使用することができる。
【００６６】
この態様の好ましい特徴は、それぞれがｍＲＮＡ分子、１以上のリボソーム及び１以上の翻訳されたタンパク質を含有するタンパク質−複合体の使用である。そのような複合体において、１又は複数のタンパク質は、１又は複数の結合タンパク質として作用し、それにより、うまく結合した際に、タンパク質−複合体を回収することができ、ｍＲＮＡは、ｃＤＮＡへの変換、一般にはＰＣＲを用いて、及びその後の転写（合成ＤＮＡにより導入された転写プロモーターにより）又は複製可能なベクターへのクローニングにより、通常複製される。この態様の別の好ましい特徴は、タンパク質−複合体が派生されうる複製可能な核酸遺伝子ライブラリーである。他のタンパク質のライブラリーは、外部アミノ酸及びタンパク質構造／形の変化を有する保存された内部タンパク質枠組みをコードするライブラリーをも特に使用することができるけれども、一般に、このライブラリー由来の遺伝子は、抗体可変領域（一般に、単鎖Ｆｖ’ｓ又はｓｃＦｖｓの型で）をコードする。タンパク質−複合体を、標識されたタンパク質−複合体が未標識タンパク質−複合体から優先的に単離できるような方法で、標識により標識できることは、本発明の態様の必要条件である。
【００６７】
好ましくは、本発明のこの態様において、細胞又は組織切片の表面で前もってキャラクタライズされていない受容体に結合するタンパク質性リガンドが提供される。前記リガンドは、化学結合による細菌性ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）との結合前に直接結合されるか又は通常ＰＬＣにコンジュゲート化した抗リガンド抗体自体等との結合後に間接的に結合される。リガンドの細胞への結合後に、ＤＮＡライブラリーに由来するタンパク質−複合体を細胞／組織に添加してタンパク質成分を細胞／組織に結合させ、過剰の非結合剤を洗浄により除去する。これは、そのリガンドのキャラクタライズされていない受容体に実際に結合したものを含む結合したリガンドに非常に近接したいくつかの複合体を含む表面に結合したタンパク質−複合体の多重度のままに細胞又は組織を有効にしておく。次の工程で、標識を包むリポソームの標品を添加する。リポソームと表面に結合したタンパク質−複合体を有する細胞又は組織との接触の際に、脂質の頭部を分解してＰＬＣの接触点でリポソームを脱安定化させるＰＬＣとの接触を通じてリポソームの溶解のみが起こるであろう。これは、リポソームからの標識の漏れとなる。
【００６８】
標識がＰＬＣの接触部位から拡散されうる間、適当な標識がＰＬＣの付近のみの適当な標識受容体と効率的に反応することができることは、本発明の原理である。そのような標識は、通常、アニーリングした合成オリゴヌクレオチドによりｍＲＮＡ成分上で、タンパク質−複合体と会合したビオチン分子と強固に結合可能なストレプトアビジンである。代替標識は、適当なｍＲＮＡ分子上のヘアピン−ループ（ＴＡＲ）に結合可能なＨＩＶ  ｔａｔタンパク質又はそのペプチド断片である。隣接するタンパク質−複合体と反応させ、過剰のリポソーム及び標識を細胞／組織から洗浄除去し、標識されたタンパク質−複合体を回収する。回収は、通常、固定化された標識又は標識誘導体（ビオチン等）又は標識に特異的に結合する抗体（抗ビオチン、抗ｔａｔ等）を用いて行なうことができる。タンパク質−複合体の遺伝子成分は、ＥＤＴＡ等の添加によい優先的に除去さてｍＲＮＡ／リボソーム／タンパク質複合体を解離することもできるけれども、様々な手段を用いて、タンパク質−複合体を解離させることなく、細胞／組織表面から標識したタンパク質−複合体を除去することができる。次いで、回収された標識されたタンパク質−複合体又はタンパク質−複合体の遺伝子成分は、核酸分子の数を拡大させて適当な複製可能なベクターへのＤＮＡのその後の再クローニングを容易にするために、転写／翻訳を用いる場合は、遺伝子増幅に使用した合成ＤＮＡを介して導入したプロモーターによるその後の転写を可能にするために、核酸増幅に付すことができる。したがって、リガンドに近接した細胞／組織に結合する１以上の結合タンパク質をコードする遺伝子は、それ故に、受容体の分子単離及び恐らく細胞内部へのシグナル伝達において受容体により活性化される分子を含むかもしれない受容体付近の分子の分子単離をもを容易にする豊富な結合タンパク質源を提供するために単離することができる。
【００６９】
受容体の分子単離を容易にすることに加えて、本発明のこの態様の方法により単離された結合タンパク質は、それ自体、細胞／組織結合のその後のラウンドのリガンドとして有効に使用することができ、それにより、最初の結合タンパク質は、それ自体、１以上のＰＬＣ分子にコンジュゲート化又は付着化される。細胞／組織への受容体部位でのこれらの結合タンパク質−ＰＬＣコンジュゲートの結合後、次いで、遺伝子−由来タンパク質−複合体のライブラリーを細胞／組織への結合のために添加する。適当なライブラリーから、これは、受容体自体の天然のリガンド結合部位に及び受容体の付近の他のタンパク質にも両方に結合する結合タンパク質を提供するだろう。ＰＬＣ分子との接触の際のリポソームの添加と溶解の際に、新規なタンパク質−複合体をその後の単離又は濃縮を可能にするストレプトアビジン又はｔａｔ等の標識で標識する。これらの標識された結合タンパク質−複合体における結合タンパク質をコードする遺伝子の回復により、受容体及び隣接する分子の単離のための多数の追加の道具が提供されるかもしれない。しかしながら、より望ましいいくつかの場合において、１以上の新らしく標識されたタンパク質−複合体が天然のリガンド結合部位に結合し、よって、天然のリガンドの結合をブロックするか又は受容体の活性化において天然のリガンドと置換するか又は天然のリガンドにより正常にアップ−レギュレーションされた活性の受容体により誘導されたダウンレギュレーションを通じて受容体でアンタゴニスト様の応答を誘導する新規の結合タンパク質を提供するだろう。いくつかの場合において、個々の結合タンパク質は、医薬候補分子を提供するであろう。
【００７０】
本発明のこの態様の方法は、その内のいくつかは標的受容体に結合するかもしれない異なるタンパク質型をコードする遺伝子のコレクションを含有するＤＮＡライブラリーを用いて通常行なわれるであろうことは、当業者により認識されるであろう。
【００７１】
リガンド分子は、直接若しくは間接のいずれかで付着可能であり、標識部が標識を放出してタンパク質−複合体に付着可能な天然のタンパク質性又は非タンパク質性のいかなる分子でもありうるということは、当業者により認識されるであろう。
【００７２】
結合タンパク質は、いくつかの分子型に基づきうることは、当業者により認識されるであろう。タンパク質型が通常抗体可変領域によりコードされる抗体であろうが（通常、単鎖Ｆｖ’ｓ又はｓｃＦｖｓの型で）、他のタンパク質は、特に保存された内部タンパク質の枠組みを有するものも使用可能であり、それにより、外部アミノ酸における変化及びタンパク質の構造／形は、異なるタンパク質分子のライブラリーを創出するであろう。そのような非抗体タンパク質分子に採用される形のいくつかは、比較的平らな結合面を有する他のタンパク質分子への結合に適するが大きなタンパク質性リガンドを適応させるための凹状等の複雑な形を有するタンパク質分子への結合にはあまり適さない抗体自体よりも、標的受容体への結合により適合するかもしれない。
【００７３】
タンパク質−複合体は複数の型の内の１つでありうるし、それにより、結合タンパク質が直接又は間接のいずれかでそれをコードする核酸配列に連結するということは、当業者により認識されるであろう。好ましい態様において、タンパク質−複合体は、すでに終結してリボソームよってｍＲＮＡとの会合から遊離するようになる翻訳されたタンパク質にとって好ましいように複合体の収量を最適化するように設計された条件下で、ｍＲＮＡの翻訳により形成されたｍＲＮＡ／リボソーム／タンパク質の複合体である。他の態様において、タンパク質−複合体は、ファージ表面に結合タンパク質を提示する遺伝子ライブラリー由来のバクテリオファージ粒子を含有するであろう。
【００７４】
あるいは、タンパク質−複合体は、細菌表面に結合タンパク質を提示する遺伝子ライブラリー由来の細菌粒子を含有するであろう。他の態様は、ｌａｃＩと結合タンパク質との融合物を含有するｌａｃＩ融合タンパク質を含むであろう、それにより、ｌａｃは、結合タンパク質をコードするプラスミド並びにバキュロウイルス及びレトロウイルスを含む他のウイルスタンパク質提示系上のｌａｃオペレーターに結合する。
【００７５】
標識は、標識を放出する標識部の付近でタンパク質−複合体中の他のタンパク質性分子又は核酸分子に結合可能な多くの分子の内の１つでありうることは、当業者により認識されるであろう。また、対応する標識受容体は、標識に適合するいくつかの分子の内の１つでありうることも、当業者により認識されるであろう。適する標識（及び標識受容体）は、ストレプトアビジン（ビオチン）、ｔａｔ（ｍＲＮＡ上のＴＡＲヘアピンループ）、シグナル認識粒子（ＳＲＰ）（タンパク質の真核細胞リーダー配列）、抗体（抗原）、ＲＮＡ結合分子（ｍＲＮＡ）、特異的タンパク質結合分子（タンパク質の結合配列）、Ｆ線毛（バクテリオファージＦ受容体）及びニッケル（タンパク質上のヒスチジン「タグ」）を含むであろう。
【００７６】
標識部は、通常、標識の放出を生じさせる酵素であろうことは、当業者により認識されるだろう。そのような標識部は、ＰＬＣ（リポソーム、赤血球又は他の細胞の溶解用）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ビオチン化チラミド用）及び細菌酵素β−ガラクトシダーゼ（グリコリポソームの溶解用）を含むであろう。
【００７７】
他のリポソームの溶解機構は、酵素溶解に対する代替として本発明の範囲内で用いられうることは、当業者により認識されるであろう。例えば、受容体へのリガンド結合をまだ可能にするような様式で、脂質尾部でリガンドをリポソーム膜にカプセル化することによる等の直接的に、又は表面抗体で飽和させたリポソーム若しくはリポソームをリガンドに標的化させる他の結合タンパク質を用いることによる等の間接的にのいずれかでリポソーム全体をリガンドに付着することは、可能であるかもしれない。そのような環境下では、リポソーム溶解は、界面活性剤による溶解又は加熱又はリポソーム溶解を達成させる他のいかなる方法により単純に達成されうるであろう。
【００７８】
本発明の方法を用いて、タンパク質−複合体を標識することよりもむしろ受容体の付近で受容体及び他の分子を直接標識することができることは、当業者により認識されるであろう。例えば、ストレプトアビジンを含むＰＬＣをコンジュゲートしたリガンド及びリポソームを用いて、ビオチン−ＮＨＳエステル等を用いて細胞／組織全体を化学的にビオチン化することができ、次いで、ＰＬＣ−リガンド及びその後のリポソーム溶解を、受容体を含むリガンドの付近で特異的にストレプトアビジン分子を置くであろう、よって、それはストレプトアビジンで標識されるようになり、固定化されたビオチン等を用いる分子分離の基礎を提供するであろう。
【００７９】
タンパク質−タンパク質相互作用  −本発明のこの態様は、遺伝子の単離の基礎としてタンパク質／ポリペプチドとリガンドの両方に分子タグを提供することにより、リガンドに結合する提示されたタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子の単離方法を提供する。前記方法は、特に、リガンド自体が提示されたタンパク質／ポリペプチドである遺伝子の単離を含む。本発明のこの態様は、ポリペプチドのリガンド（又は他のポリペプチド）への結合に基づいており、それにより、ポリペプチド及びリガンド上の分子タグを未結合のポリペプチド及びリガンドから結合したポリペプチド−リガンドの分子分離の基礎として使用することができ、それにより、ポリペプチドはその遺伝子（又は遺伝子転写物）と会合したままである。リガンドに結合するポリペプチドの選択に関して、特に好ましい方法は、ポリペプチドとそのリガンドの両方に分子タグを提供することであり、それにより、方法は、次いで、両方の分子タグを含む複合体の単離に適用される。例えば、リポソーム提示の技術を用いて、ｍＲＮＡをＲＮＡ結合タンパク質（ＨＩＶ  ｔａｔタンパク質等）でタグ付加してもよいが、リガンド（ポリペプチドの場合）は、抗タグ抗体及びニッケルを含有するアフィニティーマトリックスでのｍＲＮＡ−リポソーム−ポリペプチド複合体のライブラリーの連続的な継代がポリペプチドの会合したｍＲＮＡへの結合を選択するように、ポリヒスチジンテールでタグ付加されてもよく、次いで、これは、結合したポリペプチドをコードする遺伝子配列を提供することができる。あるいは、リポソーム提示を用いて、例えば、ポリヒスチジンテールでポリペプチドのみをタグ付加し、ニッケルキレート等のアフィニティーマトリックスを通過させてもよく、会合したいかなるＲＮＡも、ＰＣＲによるｃＤＮＡコピーへの変換により単純に入手してもよい。２以上の結合ポリペプチドの選択に関して、特に好ましい方法は、１以上のＤＮＡライブラリー由来の結合ポリペプチド候補の生成のためにジ（又はポリ）シストロニックｍＲＮＡを使用するリポソーム提示の技術を用いることである。ポリペプチドの内の一方に対するシストロンが、翻訳されたポリペプチドを翻訳後にｍＲＮＡから解離するように構築され、他方のポリペプチドに対するシストロンが、翻訳されたポリペプチドが翻訳後もｍＲＮＡと会合したままであるように構築される場合、そのときは、２つのポリペプチドの翻訳の並置は、適用可能ならばこの並置により会合が容易になるようなものであり、よって、結合ポリペプチド（単数又は複数）及びｍＲＮＡを含む複合体の分離のための分子的基礎を提供し、後者は、次いで、結合ポリペプチド（単数又は複数）をコードする遺伝子の同一性のために使用されうる。
【００８０】
本発明のこの態様の別の側面は、２つのポリペプチドの結合に基づいており、その内の１つ又は両方は、対応する遺伝子と会合し、他のポリペプチド鎖と融合（又は会合）し、並置された場合に選択可能な特性を生じ、次いで、結合ポリペプチド（１又は複数）に対する遺伝子（１又は複数）をコードする生きた微生物の単離を可能にする。この態様の範囲内では、２つのポリペプチドの会合による酵素活性の生成が特に興味深い。そのように生成された酵素活性は、様々な選択方法に使用することができる。これらは、うまく対合したポリペプチドと、会合した遺伝子（又はｍＲＮＡ）との複合体に付着する分子タグを生成する酵素活性を含む。微生物でのポリペプチド提示に関して、これらは、リガンドに結合するＤＮＡライブラリーに由来するポリペプチドを提示する微生物の選択に導く微生物の付近で分子を生成（又は放出）する酵素活性をも含む。この態様の範囲内では、２つのポリペプチドの会合による結合タンパク質活性の生成が特に興味深く、それにより、結合タンパク質は、結合タンパク質（１又は複数）をコードする遺伝子の同定の基礎として使用することができる選択可能な特性を間接的に生じさせる。例えば、結合タンパク質は、抗生物質耐性タンパク質又は栄養素生成タンパク質等の微生物に対して有利な選択を提供する遺伝子を活性化する転写活性因子等のＤＮＡ結合タンパク質でありうる。
【００８１】
微生物に提示された結合ポリペプチドに対する本発明の適用に関して、ポリペプチドとリガンドとの会合が、結合ポリペプチドを提示する微生物の選択又は分離の基礎を提供する新しい分子（１又は複数）を生成させうる両方の場合において、本発明は、リガンド（又は第２のポリペプチド）を外部から微生物に添加する方法又はリガンドが微生物中で内部から合成される方法を提供する。本発明は、ともに会合した場合に酵素活性を再構成する酵素の２つ（以上）のサブユニットの組合せを通じた酵素活性の相補性に基づくことができる。次いで、酵素活性の再構成は、酵素活性を提供する微生物の正又は負の選択のいずれかを提供するであろう。本発明のこの態様の１例において、微生物又は細胞で発現可能な改変体ポリペプチドをコードするＤＮＡライブラリーが提供され、それにより、結合ポリペプチドをコードする遺伝子が酵素の酵素的に不活性な断片をコードする遺伝子の一部に融合し、それにより、酵素のこの部分は、酵素活性を再構成するために酵素の別の部分を相補することができる。適する酵素は、大腸菌β−ガラクトシダーゼ及びシー．ペルフリンゲンス（C. perfringens) ホスホリパーゼＣを含む。酵素の他の部分は、イン・ビトロ選択用の微生物培養培地中に提供されるか又はイン・ビボ選択用の同一の微生物内でこの部分をコードする遺伝子の発現により提供されるかのいずれかである。大腸菌β−ガラクトシダーゼ及びシー．ペルフリンゲンス（C. perfringens) ホスホリパーゼＣ等の酵素は、酵素の不活性サブユニットが溶液中で自己会合して酵素活性を再構成することができるという特性を有し、よって、本発明は、不活性な酵素断片をコードする遺伝子に融合された結合ポリペプチドがそのリガンドに結合して、結合を促進（リガンドが他の不活性サブユニットに融合する場合）又は抑制（立体障害を通じてポリペプチド−リガンド結合が不活性な酵素サブユニットにより酵素活性の再構成を抑制する場合）のいずれかをすることができる。酵素活性の回復又は廃止は、ポリペプチド／酵素サブユニット遺伝子融合物を発現する微生物に有益な又は有害な効果を有するかもしれない。これは、非毒性基質の毒性基質への変換を生じさせる等、再構成された酵素の直接的な酵素作用によるものか又は、毒物若しくは微生物の成長／増殖用の必須の栄養素／因子を含む外部からのリポソームの溶解を生じさせる等、再構成された酵素の間接的な酵素作用によるものかのいずれかであろう。
【００８２】
本発明のこの態様の別の側面は、非タンパク質又は一定のタンパク質部分を有するポリペプチドの結合に基づいており、それにより、ポリペプチド又は非タンパク質又は一定のタンパク質部分上の分子タグは、未結合のポリペプチド及び非タンパク質又は一定のタンパク質部分から非タンパク質又は一定のタンパク質部分と相互作用するポリペプチドの単離の基礎として使用することができ、それによりポリペプチドは、その遺伝子（又は遺伝子転写物）といまだ会合したままである。非タンパク質部分は、核酸（ＤＮＡ若しくはＲＮＡ）又は化学品（合成若しくは天然）等の主として非アミノ酸成分からなる分子として定義してもよい。一定のタンパク質部分は、例えば、全血清免疫グロブリン標品等のその同一性が公知であるタンパク質であろう。それにより、血清免疫グロブリンは、一定のポリペプチドの相互作用するであろう。ポリペプチドとその遺伝子転写物との会合は、ポリペプチドがリポソーム／ｍＲＮＡ複合体に付着したままである発生中のタンパク質の一部であり、ｍＲＮＡ自体が非タンパク質又は一定のタンパク質部分をコンジュゲートした（又は連結した）ＲＮＡ結合タンパク質（ＨＩＶ  ｔａｔタンパク質等）オリゴヌクレオチドでタグ付加されてもよく、あるいはｍＲＮＡが非タンパク質又は一定のタンパク質部分をコンジュゲートした（又は連結した）ハイブリダイズする合成オリゴヌクレオチドでタグ付加されてもよいリポソーム提示の技術を用いて達成されるであろう。タンパク質と非タンパク質又は一定のタンパク質との並置は、非タンパク質部分をｍＲＮＡ分子にハイブリダイズする合成オリゴヌクレオチドに付着させることにより達成することができる。あるいは、非タンパク質又は一定のタンパク質部分は、ポリヒスチジン等でタグ付加されてもよいが、ポリペプチド部分は、ｍＲＮＡ−リボソーム−ポリペプチド及び非タンパク質又は一定のタンパク質部分の複合体のライブラリーを抗タグ抗体及びニッケルを含有するアフィニティーマトリックスを通した連続的な継代が会合したｍＲＮＡを有する結合ポリペプチドを選択するように、前記したようにｍＲＮＡに連結される。例えば、非タンパク質部分はＤＮＡ及び結合したポリペプチドＤＮＡ結合タンパク質でありうるし、別の例において、一定のタンパク質部分は、リンホカイン及び結合したポリペプチドリンホカイン受容体又はその領域であってもよい。
【００８３】
非タンパク質又は一定のタンパク質部分のハイブリダイズするオリゴヌクレオチド又はｍＲＮＡ結合タンパク質への付着は、一般にオーサリバン(Osullivan) ら(Anal. Biochem. 100 (1979), 108)に記載されたもの等の架橋ポリペプチドのいかなる慣用の方法でも達成されうる。そのような架橋は、一定のタンパク質又はｍＲＮＡ結合タンパク質に、特異的アミノ酸、特に遊離のシステイン残基又は遊離のリジン残基を導入することにより容易になるであろう。あるいは、一定のタンパク質部分の付着は、ビオチンをハイブリダイズするオリゴヌクレオチド又はｍＲＮＡ結合タンパク質と非タンパク質又は一定のタンパク質部分との両方に取り込んだ後（ランガー(Langer)ら, PNAS 78, (1981), 6633 により記載されたように）、アビジンを添加してオリゴヌクレオチド又はｍＲＮＡ結合タンパク質を非タンパク質又は一定のタンパク質部分に架橋することにより達成されてもよい。
【００８４】
本発明のこの態様の別の側面は、一定の生化学的経路のアゴニスト及びアンタゴニストのスクリーニングを提供し、それにより、前記経路の成分を含有する個々のタンパク質を、失速されたリボソームを介してポリシストロニックｍＲＮＡに付着したままである全長のポリペプチドとして連続的に発現するであろう。例えば、リボソーム提示の技術を用いて、生物学的経路を含有するタンパク質を適当なベクターに連続的にクローニングして提示させることができるであろう。密接な物理的近接により促進されたポリペプチド間の相互作用は、その経路での最終のポリペプチドでの検出可能な変化を生じるであろう。例えば、ポリペプチドの連続的な会合は、末端のリン酸化又は構造変化等の他の事象を生じさせるリン酸化カスケードを生じるであろう。活性化及び非活性化の両状態での最終ポリペプチドのリン酸化又は構造の検出のための特に好ましい方法は、抗体を用いることであろう。前記経路のアンタゴニストの選択に関して、特に好ましい方法は、生化学的経路におけるタンパク質の提示に対する連続的に並置されたポリシストロニックｍＲＮＡを用いるリボソーム提示の技術を使用することである。次いで、提示されたタンパク質を候補分子でスクリーニングし、それにより、候補分子は、例えば、１以上のＤＮＡライブラリーに由来するリボソーム提示されたポリペプチドであってもよく、経路タンパク質の活性の阻害を測定する。
【００８５】
以下の実施例は、本発明を説明するために提供されるが、本発明の範疇を限定するものと見なすべきではない。
【００８６】
実施例１
合成タンパク質ライブラリーの新たな作成と組織による修飾
出発点は、クローンテック・ユーケー社(Clontech UK Ltd) （バサインストーク(Basingstoke) 、英国）から購入した「マラソン−レディー」ヒトクローンｃＤＮＡから、ｃＤＮＡライブラリーを調製することであった。アドバンテージｃＤＮＡキットを用いて、供給者（クローンテック社）の推奨条件にて、プライマーＡＰ１[5'ccatcctaatacgactcactatagggc] とプライマーＡＰ２[5'-ttctagaattcagcggccgc(t)30nn]を用いてのＰＣＲによってこのライブラリーを増幅した。得られたＰＣＲ産物を、マーチュック(Marchuck)ら（マーチュック  ディー(Marchuck D.) ら、1991, Nucl. Acids Res. 19:1154）の方法で調製した、ＳｍａＩで直線化したｐＵＣ１９中に、Ｔ／Ａクローニング手法を用いてクローニングした。一方、モレキュラークローニング、アラボラトリーマニュアル、サンブロック  ジェー、フリッツ  イーエフ、マニアティス  ティー編、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス(Molecular Cloning, A Laboratory Manual eds. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Cold Spring Harbor Laboratory Press) 、1989、ニューヨーク、アメリカ合衆国に記載の標準的な方法を用いて組織から直接的にヒトクローンｍＲＮＡを単離し、このものからヒトクローンｃＤＮＡライブラリーを構築した。（前掲のモレキュラークローニング）ＲＮアーゼＨ法を用いてこのｍＲＮＡをｃＤＮＡに変換し、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを具備するｐＧＥＭＴ７ＧＥＭＴ７／ＳＰ６プラスミド（プロメガ社、サザンプトン(Promega, Southampton)、英国）のＳｍａＩサイトに再びクローニングした。ハーネスとプルクサン(Hanes and Pluckthun) 、Proc. Natl. Acad. Sci. 94(1997),p4937 に記載のように、長鎖の合成オリゴヌクレオチドとＰＣＲを適用して、上流側に細菌のリボソーム結合部位、下流側にＭ１３ファージ遺伝子III 由来のスペーサー及び大腸菌ｌｐｐターミネーター由来の３’転写ターミネーターを提供した。
【００８７】
ＲｉｂｏＭＡＸTMキット（プロメガ社、サザンプトン、英国）を用いて、メーカーの説明書に従って、ｐＴ７プラスミドのインビトロ転写を実施した。得られたｍＲＮＡを、メーカーの手順に従って精製した。35Ｓメチオニン含有物が備わった大腸菌Ｓ３０エキストラクトシステム(Extract System)（プロメガ社、サザンプトン、英国）を用いて、メーカーの説明書に従って、ｐＴ７プラスミドのインビトロ翻訳を実施した。（前掲の）ハーネスとプルクサンによって記載されたように、ＥＤＴＡ処理を行ってタンパク質からリボソームを解離させ、（100,000gで３０分間の）遠心分離によってリボソームを除去した。
【００８８】
冷ＲＩＰＡ緩衝液（ＲＩＰＡ緩衝液＝５０ｍＭのトリス−塩酸、ｐＨ７．４、１％(v/v) のＮＰ−４０、０．２５％のデオキシコール酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭのＰＭＳＦ、１ｍＭのＮａ3 ＶＯ4 、１ｍＭのＮａＦ及びそれぞれ１μｇ／ｍｌのアプロチニン、ロイペプチン及びペプスタチン）中で組織を破壊することによって、正常の結腸サンプルと結腸ガンのサンプルから粗タンパク質抽出物を調製した。いくつかの実験では、ホスファターゼ活性を示した抽出成分もあり、本ケースでは、１ｍＭのＮａ3 ＶＯ4 を含まないＲＩＰＡ緩衝液を用いて溶解物を得た。組織サンプルを氷上で溶かし、滅菌処理済みの使い捨て組織用粉砕機（「ペレットペストル(pellet pestle) 」アナケム社(Anachem Ltd) 、ルートン、英国）を用いて破壊した。ホモゲナイズは、１容量の組織に対して２容量の氷冷ＲＩＰＡ緩衝液を用いて実施した。この溶解物を氷上で１５分間ゆっくりとかきまぜながらインキュベートし、次いで、４℃、13,000×ｇで１０分間の遠心分離によって不溶性の成分の清澄化を行った。上清を取り除き、供給者（ピアース社、チェスター、英国、カタログ番号２３２２５）が提供した手順に従って、ビシンコニン酸法(bicinhoninic acid method)を用いてタンパク質濃度を測定した。この溶解物を等量ずつ複数に分割し、ドライアイス上で瞬間的に凍結させ、液体チッ素中で保存した。
【００８９】
１ｍｇ／ｍｌのバナジル(vanadyl) リボヌクレオシド複合体と１０単位のＲＮアシンとの存在下で、溶かした溶解物を３７℃で３０分間インキュベートすることによって、正常の結腸溶解物と結腸ガン溶解物をインビトロ翻訳化タンパク質と反応させた。次いで、このタンパク質混合物をカッシュ(Cash)ら(Electrophoresis 18 (1997)、p2580)のプロトコールに従って可溶化した。溶解性タンパク質を次いで二次元ＰＡＧＥ（カッシュら、前掲）で分析し、オートラジオグラフィーでタンパク質を検出した（パットン(Patton)ら、BioTechniques 8 (1990)、p518）。画像解析システムに結合したビデオカメラを用いてゲルの画像を取り込み、次いで、さらなる分析のためにフォレティックス−２Ｄ(Phoretix-2D) に転送した。メーカーの説明書に従って、フォレティックス−２Ｄを用いて分析を行った。
【００９０】
正常のものと結腸ガンの抽出物とを比較した場合、インビトロ翻訳化タンパク質混合物から検出された全２２６２のタンパク質スポットのうちの１２スポットが異なる移動度を示していた。
【００９１】
実施例２
合成タンパク質のリン酸化
ポリヒスチジンタグを含みそのタンパク質のアミノ末端が融合されている精製組み換えラットＥＲＫ−２を、ストラタジーン社(Stratagene)、ラジョラ(La Jolla)、アメリカ合衆国（カタログ番号２０６１２）から購入した。この産物は、タンパク質の非活性体であり、リン酸化部位を含まない。０．５μｇの非活性化ＥＲＫ−２を、（２ｍｇ／ｍｌの全タンパク質を含む）５μｌのＡ４３１細胞溶解物と（アップステートバイオテクノロジーズ社(Upstate Biotechnologies) 、レークプラシッド、ニューヨーク州、アメリカ合衆国、カタログ番号１２−１１０）又は組織培養中に生育した細胞からここで代替的に生産したものと反応させた。細胞溶解物又は組織用怪物と標的タンパク質とを反応させる手法は、コンディショニングリアクション(Conditioning Reaction) として言及している。
【００９２】
５００μｌの氷冷ＲＩＰＡ緩衝液中に、約５×１０6 個のサブコンフルエントな(sub-confluent) 細胞を懸濁することによって細胞溶解物を得た。氷冷ＰＢＳを用いて、培地の洗浄を前もって行っておいた細胞を、氷上のＲＩＰＡ緩衝液中で１５分間緩やかに振とうしてインキュベートした。４℃、13,000×ｇで１０分間遠心分離することにより、この溶解物の不溶物の清澄化を行った。上清を除去し、供給者（ピアース社、チェスター、英国、カタログ番号２３２２５）が提供した手順に従って、ビシンコニン酸法を用いてタンパク質濃度を測定した。この溶解物を等量ずつ複数に分割し、ドライアイス上で瞬間的に凍結させ、コンディションリアクションで用いる前に液体チッ素中で保存した。組織サンプル及び他の細胞型由来の溶解物を同様に処理した。
【００９３】
３７℃で１５分間にてコンディションリアクションを実施し、次いで氷上に置いた。磁力による分類（試験管１）又はマイクロタイタープレートウェルへの結合（試験管２）のいずれかを用い、両者の場合のいずれも捕捉試薬として抗ヒスチジン抗体を用いて、リン酸化ＥＲＫ−２を検出するために反応物を２本の試験管に（容量で）等量に分割した。
【００９４】
試験管１では、供給者が推奨する被覆条件を用いて抗ヒスチジン抗体（シグマ社、プール、英国、カタログ番号１０２９）で前もって被覆したマグネチックビーズ（ダイナル社(Dynal) 、ウィラール(Wirral)、英国、カタログ番号１１０．１１）を用いてＥＲＫ−２を捕らえた。４℃で１時間の間を通してビーズが懸濁し続けるようなゆるやかな混合を一定的に行って捕捉反応を実施した。捕捉した後、磁性粒子濃縮器を用いてこのビーズを集め、ＰＢＳで十分に洗浄した。ビーズを最終的に４０μｌの容量で再懸濁し、１０μｌずつの等量をマイクロタイタープレートウェルに入れ、そして、個々のものを、抗リン酸化ＥＲＫ抗体（アップステートバイオテクノロジーズ社、カタログ番号０５−４８１）、抗ホスホチロシン−ＨＲＰ複合モノクローナルカクテル（ザイメド社(Zymed) 、ケンブリッジ、英国、番号１３６６２０）、抗ホスホセリン／ホスホトレオニン／ホスホチロシンポリクローナル調製物（ザイメド社、カタログ番号９０−０２００）又はネガティブコントールとしての、ヒト免疫グロブリン軽鎖特異的抗ＨＲＰ複合物（バインディングサイト社(The Binding Site)、バーミンガム、英国、カタログ番号ＡＰＯ０１５）のいずれかの希釈物と反応させた。それぞれの二次試薬／発色基質で検出する前に、抗体を４℃で１時間インキュベートした。プレートを４５０ｎｍで読んだ。
【００９５】
前もって抗ヒスチジン抗体（シグマ社、プール、英国、カタログ番号Ｈ１０２９）で一番被覆し、室温下ＰＢＳ／５％(w/v) ＢＳＡ溶液で４０分間インキュベートして予備ブロックしておいたマイクロタイタープレートウェルを用いて、試験管２のＥＲＫ−２を捕捉した。ＰＢＳを用いてコンディションリアクションを希釈して総容量１００μｌとし、マイクロタイタープレートに添加した。捕捉反応は室温下、１時間で行った。上記のネガティブコントロール試薬を含む抗体のパネルを用いて、直接ＥＬＩＳＡ形式でリン酸化ＥＲＫ−２を検出した。
【００９６】
上記の両検出法を利用して、次の、Ａ４３１細胞由来の溶解物とのインキュベーションによってリン酸化ＥＲＫ−２の存在を明確に示した。
【００９７】
実施例３
ストレプトアビジン被覆化プレート上でのアレイング(arraying)のための、インビトロ翻訳化ｃＤＮＡクローンの調製方法。
ヒト胎児全脳ｃＤＮＡライブラリーをストラタジーンクローニングシステム社(Stratagene Cloning System) 、（ラジョラ、アメリカ合衆国）から得た。
供給されたそのライブラリーを、ラムダベクターＵｎｉ−ＺＡＰ  ＸＲに、平均挿入サイズが１．３ｋｂｐで一方向クローニングした。このライブラリーは２×１０6 ｐｆｕを含んでいると算出され、約２．４×１０10ｐｆｕ／ｍｌの力価を与えた。原版のラムダＵｎｉ−ＺＡＰ  ＸＲライブラリーを、次の単一ラウンドの複製に付した。この１×の増幅物についての（以下の）マスエクシジョン反応を実行することにより、生育できる大腸菌の個々のクローンであって、次に続くラムダファージの感染の細胞溶解性プラークとしてではないクローンの濃度にまで実施されるプレーティング、産物の複製及び原版のストックの貯蔵等の操作を可能とする（ジェルセス、ビー(Jerseth, B.) ら(1992)、Strategies 5:81-83）。標準的な手法（モレキュラークローニング、アラボラトリーマニュアル、サンブロック  ジェー、フリッツ  イーエフ、マニアティス  ティー編、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス、1989、ニューヨーク、アメリカ合衆国）にて、残りのライブラリーをさらにもう一回増幅し、原版のストックと同じように、複数のグリセリンストックを−８０℃で保存した。
【００９８】
マスエクシジョン反応のためと、供給者（ストラタジーン社、ラジョラ、アメリカ合衆国）によるプロトコールに従った、細菌コロニーとしてプレーティングを行うために、このライブラリーを調製した。概略を言えば、ライブラリーから供給された細菌株（ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ及びＳＯＬＲ’）を選択培地（それぞれＬＢテトラサイクリン及びＬＢカナマイシン）上に広げ、そして０．２％(w/v) のマルトースと１０ｍＭのＭｇＳＯ4 を追加した５０ｍｌのＬＢブロス（１０ｇ／リットルのＮａＣｌ、１０ｇ／リットルのトリプトン、５ｇ／リットルのイーストエキストラクト、ｐＨ７．０）中に３０℃で一晩培養するために、単一のコロニーを選び出した。遠心分離により細胞を集め、１０ｍＭのＭｇＳＯ4 中に、８×１０8 細胞／ｍｌの濃度（ＯＤ600 ＝１．０）で再懸濁した。ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ細胞には、ラムダファージ：細胞が１：１０の感染多重度にて、ラムダＵｎｉ−ＺＡＰ  ＸＲライブラリーの一部が結合されていた。ヘルパーファージ株ＥｘＡｓｓｉｓｔを基礎としたＭ１３（ストラタジーン社、ラジョラ、アメリカ合衆国）を、ヘルパーファージ：細胞が１０：１の割合で添加し、この混合物を３７℃で１５分間インキュベートした。２０ｍｌのＬＢブロスを添加し、この混合物を３７℃でさらに３時間、振とうしながらインキュベートした。この混合物を７０℃で２０分間加熱し、遠心分離により細胞部分を集めた。削り取られたファージミドを含有する上清を集め、２００μｌのＳＯＬＲ’細胞に対して１μｌ添加した。この混合物をＬＢアンピシリンプレート上に広げ、３７℃で一晩インキュベートした。典型的な例として、各プレートには多くの１０００のコロニーが生じ、削り取られたファージミドのさらなる希釈物には、コロニーを選び出すための好ましいプレーティング密度を得ることを必要とした。
【００９９】
格子形成の実行を可能とするためには、ライブラリーの発現が維持できる程度にまで個々のｃＤＮＡクローンの総数を減らすことである。この標準化は、次のソアレス(Soares)ら（ソアレス，エム．ビー．ら、1994、Proc. Natl. Acad. Sci USA vol 91:922-923）の手法により達成される。この手法には、ファージミドライブラリーのヘルパーファージ感染による単鎖分子の生産が必要であった。この単鎖環は、制御されたプライマー伸張処理に付され、次いで、極めて多様な分子が再会合する（低Ｃ0 ｔ）という条件下で変性と再アニーリングが行われ、そしてヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーによって混合物から除去できた。再会合しない環は流出液から回収し、コンピテント細菌に直接形質転換した。
【０１００】
ヘルパーファージＶＣＭ１３と、供給者（ストラタジーン社）によるプロトコールを用いて、ファージミドライブラリー上で単鎖の回収を行った。回収された単鎖ＤＮＡをソアレスら（前掲のソアレス）の方法にしたがって精製し、特定の工程に組み込むことにより混入した二本鎖ＤＮＡを減らした。制御されたプライマー伸張は、ソアレスらの条件を用いて、5'ggaaacagctatgaccatg のプライマーを用いて単鎖環状ＤＮＡの精製を行っている。ＤＮＡポリメラーゼはベーリンガー社から得、ヌクレオチドトリホスファターゼはライフテクノロジーズ社(Life Technologies) （ペーズリー、英国）から得た。トレーサとしての32ＰｄＣＴＰは、アマシャムインターナショナル社(Amersham International)（アマシャム(Amersham)、英国）から得た。ヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーは、ソアレスらに記載の６０℃にて実施した。標準化された単鎖環の回収の後、精製ＤＮＡをコンピテントＸＬ１−ｂｌｕｅ大腸菌細胞に直接的に形質転換し、既に述べたようにして、ＬＢ−アンピシリンプレート上に広げた。
【０１０１】
標準化されたライブラリーからのＸＬ１−ｂｌｕｅ細胞の個々のクローンを、さらなる分析と複製の生産のために選び出した。概略は、１００μｌＬＢアンピシリン培地を含む９６穴プレートへ、コロニーを手動で選び出し、３７℃で３時間培養した。各プレートの一つの複製を実施するために、BioRobot9600 (キアゲンユーケーリミテッド(Qiagen UL Ltd) 、クローレイ(Crawley) 、英国）ラボラトリーワークステーションを使用した。１０％(v/v) グリセリンを含む培地に培養物の５０μｌをピペットで入れるようにこのロボットをプログラムし、このプレートを密封して原版と同じく−８０℃で貯蔵した。残りの５０μｌの培養物を、１．８ｍｌのＬＢ−アンピシリン培地を含む、２ｍｌ容の正方形ウェルを具備する９６穴平底ブロックに植菌した。各ブロックの頂部に微孔のあるシート上テープを貼り、３７℃にて一晩、そのブロックを軌道を描くように振とうしてインキュベートした。インキュベートの後、BioRobot9600 (キアゲンユーケーリミテッド、クローレイ、英国）上で標準プログラムと、供給者 (キアゲンユーケーリミテッド、クローレイ、英国）が提供したキューアイエーウルトラリージェントシステム(QIAwell Ultra reagent system)とを用いて、９６ウェルのそれぞれからファージミドＤＮＡを調製した。
【０１０２】
Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ及びプロメガユーケーリミテッド（サザンプトン、英国）が提供するウサギ網状赤血球溶解物システムを用いて、リンクしたインビトロ転写翻訳（ＩＶＴＴ）のための精製ＤＮＡの一部を鋳型として直接使用した。残りのＤＮＡは密封して−２０℃で保存した。ＩＶＴＴ反応混合物には、ストレプトアビジンで被覆された固相上でインビトロ翻訳化タンパク質を捕捉できるように、２％(v/v) のｔＲＮＡ−ビオチニル−リジン（プロメガユーケーリミテッド、サザンプトン、英国）を追加した。ＩＶＴＴ反応を、総容量２５μｌの９６ウェルアレイにて、３０℃で６０分間実施した。インキュベートの後、予めReacti-Bind TMストレプトアビジンで被覆した予備ブロック済のプレート（ピアース社、チェスター、英国）に添加していたｐＨ８．０、１００μｌのＴＳＢ（５０ｍＭのトリス、１３８ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍｌのＫＣｌ）に、それぞれ５μｌの反応物を加えた。残りのＩＶＴＴ反応プレートを密閉し、−２０℃で保存した。、スミゾノ及びタザキ(Nishiguchi, M., Yoshida, K., Sumizono, T. and Tazaki, T.)(1997)。ロビニア  シュードアカシア由来樹皮レクチンの糖結合特性についての、部位特異的突然変異誘発法による研究。FEBS Letters, 403, 294-298。Reacti-Bind TMストレプトアビジンプレートを室温で６０分間、緩やかに振とうさせながらインキュベートし、ビオチン化ＩＶＴＴ産物のプレート表面への結合を促進した。組織タンパク質結合アッセイに使用する前に、このプレートを３×２００μｌの洗浄緩衝液（ＴＢＳ、０．１％(w/v) のＢＳＡ、０．０５％(v/v) のツィーン２０）で洗浄した。
【０１０３】
実施例４
インビトロ翻訳タンパク質アレイの組織抽出物の修飾の実現方法と、アレイ化タンパク質のリン酸化の検出
ニューロリソース社(NeuroResouce)（ロンドン、英国）からヒト脳組織サンプルを得た。正常の脳とアルツハイマー病の脳の適合したサンプルが提供された。一般的に、各サンプルの１〜１０ｇが提供され、全ての症例のサンプルについて、解剖学的に準じた位置が知られており、全ての臨床的な詳細事項について相互に参照付けられていた。全てのサンプルはサンプリングの時点で瞬間的に凍結され、ドライアイスの上で輸送され、処理前まで液体チッ素中で保存されていた。カテゴリー２の封じ込めレベル下で処理を実施した。
【０１０４】
組織を氷冷ＲＩＰＡ緩衝液中で破壊することにより、脳組織リン酸化成分抽出物を得た。いくつかの実験では、ホスファターゼ活性のための抽出成分は次のようにしても得た：この場合、１ｍＭのＮａ3 ＶＯ4 を抜いたＲＩＰＡ緩衝液を用いて溶解物を得た。組織サンプルは氷上で溶解させ、滅菌処理済みの使い捨て組織用粉砕機（「ペレットペストル」アナケム社、ルートン、英国）を用いて破壊した。ホモゲナイズは、１容量の組織に対して２容量の氷冷ＲＩＰＡ緩衝液を用いて実施した。この溶解物を氷上で１５分間ゆっくりと振とうしながらインキュベートし、次いで、４℃、13,000×ｇで１０分間の遠心分離によって不溶性の成分の清澄化を行った。供給者（ピアース社、チェスター、英国、カタログ番号２３２２５）が提供した手順に従って、ビシンコニン酸法を用いてタンパク質濃度を測定した。この溶解物を等量ずつ複数に分割し、ドライアイス上で瞬間的に凍結させ、液体チッ素中で保存した。
【０１０５】
溶かした溶解物と、３７℃で３０分間洗浄したアレイとのインキュベートにより、９６穴に区切った中で、脳組織溶解物をＩＶＴＴタンパク質アレイと反応させた。一般的に、１０μｌの溶解物をタンパク質アレイの各ウェルに添加した。インキュベートの後、１ウェル当たり２００μｌの洗浄緩衝液を用いてそのプレートを３回洗浄し、いくつかの、希釈された抗リン酸化タンパク質抗体調製物のすべてとインキュベートした。抗ホスホチロシン−ＨＲＰ複合モノクローナルカクテル（ザイメド社、ケンブリッジ、英国、番号１３６６２０）を用いてリン酸化タンパク質を検出した。抗ホスホセリン／抗ホスホトレオニン／ホスホチロシンのポリクローナル調製物（ザイメド社、ケンブリッジ、英国、番号９０−０２０００）を用いてホスホセリン／ホスホトレオニン修飾を検出した。全てのケースにおいて、５％ＢＳＡを含むＴＢＳで希釈した抗体を用いて、少なくとも３７℃で１時間、あるケースでは４℃で一晩の間抗体のインキュベートを実施した。次の標準プロトコール（アンティボディーズ  アラボラトリー  マニュアル、ハーロウ，イー．及びレイン，ディー編(Antibodies A Laboratory Manual eds. Harlow, E. and Lane, D.) 、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス、1988、ニューヨーク、アメリカ合衆国）に従って、それぞれの二次試薬／発色基質で検出する前に、前もってプレートを洗っておいた。４９２ｎｍでプレートを読んだ。
【０１０６】
実施例５
インビトロ翻訳化タンパク質アレイ上での、ラベルされた組織を用いてのタンパク質−タンパク質結合の検出方法
シグマ社（プール、英国）から供給されるFluroTagTMFITCコンジュゲーションシステムを用いて、脳組織溶解物のタンパク質をフルオレセインで標識化した。典型的な例として、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）の０．１Ｍの炭酸−重炭酸緩衝液の溶液の１ｍｇ／ｍｌ希釈液の２５０μｌと、５ｍｇの脳タンパク質を反応させた。Ｇ−２５セファデックスカラムクロマトグラフィーを用いて組み込まれていないＦＩＴＣを精製する前に、標識化反応を室温で２時間的続けた。カラムや操作はFluroTagTMキット（シグマ社、プール、英国）中にあった通りとした。標識化された脳タンパク質を含むカラム溶出物を、遮光下４℃で保存した。
【０１０７】
標識化組織溶解物を、既述のように、ＩＶＴＴタンパク質アレイと反応させた。ＩＶＴＴタンパク質アレイの一部に捕捉された標識化脳タンパク質を検出するために、プレートを前もって洗っておき、そして抗フルオレセイン抗体（シグマ社番号Ｆ−５６３６、シグマ社、プール、英国）と共にインキュベートした。５％のＢＳＡを含むＴＢＳにて１／２５００に抗体を希釈し、室温で３０〜６０分間インキュベートした。抗マウスＨＲＰ複合体を用いて抗体を検出し、次いで、標準的な手法（前掲のアンティボディーズ  アラボラトリー  マニュアル）に従って発色基質のｏ−フェニレンジアミン（シグマ社、プール、英国）と反応させた。４９２ｎｍでプレートを読んだ。
【０１０８】
実施例６
リボソーム提示ライブラリーによって同定されるタンパク質−タンパク質結合パートナー
この実施例では、インビトロタンパク質アレイは結合パートナーのためのリボソーム提示ライブラリーを検索するために用いられ、ライブラリーに存在する結合パートナーのための遺伝子は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって同定される。本実施例でのこの目的のために、リボソーム提示ライブラリーは実施例１に記載されているように必須であり、実際のところ、スクリーニングのためにＩＶＴＴタンパク質アレイを使用する時点では、リボソーム提示ライブラリーは、起源が同じｍＲＮＡ分子への連鎖によって、それぞれが個々に発生期のタンパク質につながるリボソームの大集団（１０9 〜１０12）からなっている。
【０１０９】
氷冷希釈緩衝液（５０ｍＭのトリス酢酸、ｐＨ７．５、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、５０ｍＭの酢酸マグネシウム、０．１％のツィーン２０、２００単位／ｍｌのＲＮアシン（プロメガユーケーリミテッド、サザンプトン、英国））５中にライブラリーを１で希釈した。希釈ライブラリーの５０μｌを、ＩＶＴＴタンパク質アレイの各ウェルに添加し、４℃でゆるやかに振とうさせながら１時間インキュベートした。インキュベートの後、アレイのウェルを１００μｌの氷冷希釈緩衝液で５回洗浄した。ｍＲＮＡ／リボソーム／タンパク質複合体に結合するあらゆるものからのｍＲＮＡを、５０ｍＭのトリス酢酸、ｐＨ７．５、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、２０ｍＭのＥＤＴＡの２０μｌを加えて溶出し、氷上で１０分間緩やかに振とうさせながらインキュベートした。溶出されたｍＲＮＡを第二の９６穴プレートに集め、グリコーゲン担体（ベーリンガー社、ルイス、英国）の２０ｇの存在下でエタノールを用いて−２０℃で一晩かけて沈殿させることによって濃縮した（前掲のモレキュラークローニング、アラボラトリーマニュアル）。得られたｍＲＮＡをＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（ＲＴ）による逆転写の鋳型として使用し、プライマーＲＤ３[5'(T)18nn] の１ｎＭの存在下でｍＲＮＡを７０℃、１０分間で熱変性させた。２００単位のＭ−ＭＬＶ−ＲＴと反応緩衝液（ライフテクノロジーズ社、ペーズリー、英国）の添加の前に、氷上でこの混合物を冷却した。この混合物を３７℃で６０分間インキュベートし、次いで、７０℃で１５分間に移してＲＴを不活性化した。これに続くＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを、プライマーＴ７５Ｌ[5'cggtttccctctagaaata] とＲＤ３を用いて、ＰＣＲの鋳型として用い、９５℃で３０秒間、５０℃で３０秒間、７２℃で３０秒間のサイクルを４０回行った。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（ExpandTM、ハイフィデリティ(High Fidelity) ）、反応緩衝液及びヌクレオチド三リン酸は、ベーリンガー社（べーリンガー社、ルイス、英国）から得た。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によって解析した（前掲のモレキュラークローニング、アラボラトリーマニュアル）。ＰＣＲ産物の存在により、ＩＶＴＴタンパク質アレイにおける推定される正の結合パートナーが同定された。タンパク質アレイが翻訳され、ファージミドＤＮＡが配列解析のために同定された。ポリソーム提示ライブラリーからのＰＣＲ産物の配列解析は、プライマーＴ７５Ｌを用いて直接なされた。供給者（アマシャムインターナショナル社、アマシャム、英国）からのプロトコールに従ったダイターミネーター現象を用いて配列解析を行った。自動化された配列解析システム（アプライドバイオシステムズ社(Applied Biosystems)、ウォリントン、英国）を用いて反応物の分析を行った。
【０１１０】
実施例７
表面をストレプトアビジンで被覆したガラス上でのインビトロ翻訳化タンパク質ライブラリーのマイクロアレイ
表面をストレプトアビジンで被覆したガラス上に、ロボットに個々のＩＶＴＴタンパク質で格子を作らせることによって、ＩＶＴＴタンパク質アレイの縮小型を作成した。一方の表面にストレプトアビジンが共有結合的に付着したガラス「チップ」は、ラディアス社(Radius Inc)（メドフィールド(Medfield)、マサチューセッツ州、アメリカ合衆国）から購入した。ガラスチップは５５ｍｍ×２５ｍｍであった。グリッディングロボット(gridding robot)（ラディアス社、メドフィールド、マサチューセッツ州、アメリカ合衆国）を使って、９６ＩＶＴＴ反応のそれぞれの０．５μｌを、８×１２の低密度アレイにてチップの乾燥面に添加した。さらなる実験では、グラスチップ１枚あたり１９２の個々のタンパク質である倍密度アレイが作られた。以下に続く実験では、多量のスクリーニング処理量に適した超高密度のアレイを組み立てた。格子を作らせた後、チップの表面をリン酸緩衝化塩水溶液（ＰＢＳ）で洗浄し、３％(w/v) のＢＳＡと０．０２％のアジ化ナトリウムを含むＰＢＳ中で４℃にてスライドガラスを保存した。
【０１１１】
ＩＶＴＴタンパク質チップアレイを組織溶解物で処理し、脳組織溶解物のインキュベートの前に、実施例２で得られた抗リン酸化タンパク質抗体で広範囲に綿密に調べた。タンパク質チップアレイをトリス緩衝化塩水溶液（ＴＢＳ）で浸漬法にて広範囲に洗浄した。１５μｌの脳組織溶解物を直接タンパク質アレイを包む領域上の表面に添加する前に、残りの洗浄溶液をスライドガラスから振り落とした。アレイの領域全体に溶解物を広げるのを助けたり、次に続くインキュベートの間に毛細管効果の停止による明らかな溶液の不足を抑制するために組織溶解物溶液上にカバーガラスを置いた。加湿容器中にガラスチップを置き、３７℃で３０分間のインキュベートを行った。インキュベートの後、カバーガラスを取り除き、スライドガラスを洗浄緩衝液を用いて浸漬法にて洗浄した。実施例２のように希釈した抗リン酸化タンパク質抗体の一つかそれを組み合わせたもので、ガラスチップをインキュベートした。タンパク質アレイに抗体溶液を少量（１０〜２０μｌ）添加し、既述のようにカバーガラスの下の同じ場所で保持した。スライドガラス上で得られた不溶性の沈殿の発色基質を使用して、結合した抗体の検出を行った。典型的な例としては、基質ＤＡＢ（ジアミノベンジジン  テトラヒロクロライド）（シグマ社、プール、英国）を用いた。低拡大率下での目視試験により低密度アレイでの陽性シグナルを同定した。いくつかの実験のために、強化化学ルミネセンス基質（ピアースアンドワリナー社(Pierce and Warriner Ltd) 、チェスター、英国）を、一次又は二次抗体を結合させたペルオキシダーゼと組み合わせて用いた。モレキュラーイメージャー(Molecular Imager)ＦＸ（バイオラッドラボラトリーズ社(BioRad Laboratories Ltd) 、ハートフォードシア(Herts) 、英国）ホスホルイメージャーシステム(phosphor imager system)を用いて陽性シグナルを検出した。
【０１１２】
ＦＩＴＣ標識化脳タンパク質を使用し、実施例５であまねく記載したように、ＩＶＴＴタンパク質ガラスチップアレイ上でタンパク質−タンパク質結合アッセイを行った。１０〜２０μｌのＦＩＴＣ標識化脳タンパク質調製物を、洗浄済みのＩＶＴＴタンパク質アレイの表面に直接添加した。標識化組織溶解物溶液の上にカバーガラスを置き、そして、３７℃で３０分間、加湿容器中で、この完成したスライドガラスをインキュベートした。
【０１１３】
いくつかの実験においては、ＦＩＴＣ標識化タンパク質の結合したものを、蛍光顕微鏡で直接検出した。顕微鏡観察のために、一滴の抗消失マウンタント(antifade mountant) （ベクターラボズ(Vector Labs) 、ピーターバラ、英国）と油浸蛍光顕微鏡観察のための常用のカバーガラスとでタンパク質アレイを覆った。顕微鏡は、蛍光顕微鏡観察のためのＦＩＴＣ互換性フィルターセットを備えたニコン１０５型であった。蛍光照明下での顕微鏡のステージからのＸ−Ｙ軸の３桁の示数を参照して、陽性シグナルを与えるタンパク質スポットの位置を解読した。ロボットによる格子形成の前に各ガラス表面に描いたインデックススポットの試験の後で、これらの示数はタンパク質アレイの座標と関連性を示す。タンパク質アレイに対応するその位置についてのＸ−Ｙ示数を与える通常の照明下で、このインデックススポットを同定した。
【０１１４】
結合した標識化タンパク質の間接検出を用いていくつかの実験を行った。このために、抗ＦＩＴＣモノクローナル抗体を用い、次いで抗マウスペルオキシダーゼ複合体とレポーター基質としてのＤＡＢを使用しての比色分析検出を行った。この例においては、試薬はシグマ社（プール、英国）から得、希釈抗体を少量（１０〜２０μｌ）用いて、直接ガラス表面に添加し、既述のようにカバーグラス下で保持してインキュベートした。通常の照明下、低拡大率にてアレイの目視による試験により、陽性シグナルを同定した。また、さらなる実験でも、強化化学ルミネセンス基質（ピアースアンドワリナー社、チェスター、英国）と既述のホスホルイメージャーシステムを使用しての画像化を用いた。
【０１１５】
実施例８
組織抽出物との反応のための、固相アレイ上に固定化された単鎖抗体ライブラリーの生産方法。
実施例４で調製された正常ヒト脳抽出物を用いて、２匹のBalbC マウスを免疫した。投与の間としては４週間の間隔を空けて、腹膜内への２回の投与を行った。２回目の接種後から３〜４日目にマウスを殺し、切開して脾臓を取り出した。２５ｃｍ2 の組織培養フラスコを、炭酸／重炭酸緩衝液、ｐＨ９．０の１ｍｌあたり２５μｇの脳抽出物タンパク質で覆った。１時間で３７℃のインキュベートの後、抗原調製物を取り除き、滅菌済みブロッキング緩衝液（２％脱脂粉乳を含むＰＢＳ）を加えて１時間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した後、組織培養培地中の脾臓細胞懸濁液の２５ｍｌをそのフラスコに添加し、５％ＣＯ2 雰囲気中で３７℃で一晩インキュベートした。非付着性脾臓細胞を含む培地を除去した。次いで、QuickPrep TMｍＲＮＡ精製キット（ファルマシア社、セントオールバンズ、英国）の抽出緩衝液の１．５ｍｌをフラスコに添加して表面を攪拌することによって、付着した選択細胞からのＲＮＡの調製を開始した。次いで、３ｍｌの溶出緩衝液を添加して混合した。次いで、このフラスコの内容物を１５ｍｌの遠心分離に移して、メーカーの説明書に従ってQuickPrep TMｍＲＮＡ精製を続けた。
【０１１６】
ファルマシアリコンビナントファージアンチボディーシステム（ファルマシア社、ミルトンキーンズ、英国）を用いて、抗ヒト脳マウス単鎖Ｆｖｓ（ＳｃＦｖ）のライブラリーを作成した。Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素とランダムの６塩基プライマーを用いて、ｍＲＮＡから単鎖ｃＤＮＡを新たに作成した。次いで、抗体の可変ドメインに隣接する保存配列に相補的な特定の重鎖と軽鎖プライマーを用いて、抗体の重鎖遺伝子と軽鎖遺伝子を増幅した。重鎖ＤＮＡと軽鎖ＤＮＡのそれぞれに対応して新たに作成された３４０塩基対生産物及び３２５塩基対生産物を、次のアガロースゲル電気泳動で別々に精製した。次いで、ＤＮＡリンカー−プライマー混合物を用いて、これらを一つのＳｃＦｖ構築物となるように組み立てて、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）3 ペプチドがＶＬ領域に結合したＶＨ領域を得た。それぞれ５’末端と３’末端の位置にＳｆｉＩサイトとＮｏｔＩサイトが挿入されるように設計されたプライマーを用いて、組み立てられたＳｃＦｖを増幅し、８００塩基対の生成物を得た。この断片を精製し、ＳｆｉＩとＮｏｔＩとで連続的に消化して再精製した。
【０１１７】
インビトロ転写され翻訳されたＳｃＦｖライブラリーの生産のために、ベクターpBluescript SK+ の多重クローニングサイト領域中のＨｉｎｄIII サイトとＥｃｏＲＩサイトの間に、リンカーを挿入するという修飾を施した。
リンカー配列：
【０１１８】
【外１】
0004524445.tif 000002
【０１１９】
Ｔ７プロモーターからの転写が正しい方向となるように挿入されるように、このベクターのＳｆｉＩサイトとＮｏｔＩサイトの間に増幅されたＳｃＦｖをクローニングした。一方、ヒトネイティブファージ抗体ライブラリー（ニッシン(Nissin)、ＭＲＣ）を使用した。ファージミドＤＮＡを調製し、ＳｆｉＩとＮｏｔＩとで連続的に切断した。ＳｃＦｖ断片を精製し、上記の修飾されたpBluescript SK+ ベクター中にクローニングした。
【０１２０】
固相アレイとして使用するために、個々のpBluescript クローンを取り出し、実施例３のマルチウェルディッシュ中で培養した。ＤＮＡの調製、ＩＶＴＴ及びビオチン化タンパク質のアレイは実施例３に記載の通りとした。
【０１２１】
ファージ抗体ライブラリーとして使用するために、ファルマシア社のプロトコールに従った。それぞれ５’末端と３’末端の位置にＳｆｉＩサイトとＮｏｔＩサイトが挿入されるように設計されたプライマーで、組み立てられたＳｃＦｖを増幅し、８００塩基対の産物を得た。この断片を精製し、ＳｆｉＩとＮｏｔＩとで連続的に消化し、再精製して、ＳｆｉＩとＮｏｔＩとで切断したpCANTAB 5 ファージミドベクター中に結合した。pCANTAB 5 はファージ遺伝子３タンパク質（ｇ３ｐ）をコードする遺伝子を含み、そしてｇ３ｐ融合タンパク質として発現されるように、ｇ３シグナル配列に隣接したところにＳｃＦｖを挿入する。pCantab 5/ScFvファージミドを用いて、大腸菌ＴＧ１の内容物の形質転換を行い、次に、M13KO7ヘルパーファージを用いて連続的に感染させた。得られた組み換えファージはＳｃＦｖ遺伝子をコードする遺伝子を含んでおり、末端の位置の融合タンパク質としての組み換え抗体の一以上のコピーを提示した。
【０１２２】
次いで、ヒト脳抗原に結合するファージに提示されるＳｃＦｖをパニング(panning) により選択又は濃くした。概略は、９６穴マイクロタイタープレートのウェル上で脳抗原調製物が被覆された。２％の脱脂粉乳を含むＰＢＳでブロッキングをした後、ファージ調製物を添加して１時間インキュベートした。ＰＢＳで十分に洗浄した後、組み換えファージに反応性を示す脳抗原を含むウェルを、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗Ｍ１３抗体を用いて検出し、ｏ−フェニレンジアミン発色性基質で示された。
【０１２３】
実施例９
標識化組織タンパク質により格子を形成され、処理されたＩＶＴＴ提示ライブラリー
単鎖抗体ＩＶＴＴ提示ライブラリーをインビトロにて翻訳し、実施例３に記載のように、ストレプトアビジン表面に整列させた。単鎖抗体アレイは、実施例５に調製されたＦＩＴＣ標識化タンパク質と反応した。反応の手順とタンパク質の検出：タンパク質の結合は実施例５の通りとした。異なる組織タンパク質を用いて処理した複製ＩＶＴＴアレイからの陽性シグナルのパターンを比較した。アレイの特定の位置における個々のタンパク質を同定するために、ｃＤＮＡライブラリーの原版のプレートから対応する単鎖抗体遺伝子を回収した。次いで、対象の単鎖抗体遺伝子を、より規模の大きいＩＶＴＴに再び付し、そして、実施例６に記載のＩＶＴＴタンパク質ライブラリーからの結合パターンの検索と同定のためか、又は実施例１に記載の天然組織タンパク質の（二次元ゲルによる）検索と同定のために使用した。
【０１２４】
実施例１０
リボソーム提示を形成するためのＤＮＡチップの使用
ｃＤＮＡをＩＶＴＴベクターにクローニングするために使用するプライマーの一つが、チップ上のＤＮＡ分子にアニーリングされるように設計され転写された配列の中に種々の配列の広がりを伴った混合プライマーであること以外は、実施例１の記載に本質的に従って、ＤＮＡチップ上で連続的な固定化を行うためのポリソーム提示ライブラリーを形成するためにライブラリーを形成した。一方、転写された配列及びクローニングされた合成オリゴヌクレオチドの混合物の中で、提示ライブラリーからのプラスミドプールがただ一つの制限酵素によって消化された。よって、生産されたｍＲＮＡ分子のそれぞれがただ一つの配列タグ、これは少なくとも１５ヌクレオチド、好ましくは約２０ヌクレオチドである、を含むように、このライブラリーは構築された。
【０１２５】
単鎖抗体（ｓｃＡｂｓ）遺伝子の修飾されたものの一対を用いて、ＤＮＡチップタンパク質アレイ法を試験するための実験を行った。二つの修飾されたｓｃＡｂｓは、Ｎ末端エピトープタグ、重鎖可変領域（ＶＨ）、１４アミノ酸リンカー（ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＶＤ）、軽鎖可変領域（ＶＬ）を含んで調製され、ヒトκ定常領域のｃＤＮＡに融合したものであった。ヒトκ定常領域配列、これはポリヒスチジンタグを３’末端に含む、は修飾を受けて停止コドンが削除されていた。ヒトκ定常領域はスペーサーとして機能するものが含まれ、インビトロ翻訳システムにおいてリボソーム複合体になお付着している場合であっても、生成期の単鎖Ｆｖを正しくフォールディングさせる。
【０１２６】
これらの構築物はベクターｐＥＴ  ５ｃ（ローゼンベルグ(Rosenberg AH)ら、Gene, 56:125-135. 1987）にクローニングされ、これはＴ７プロモーターと、それに次くＴ７の遺伝子１０からリボソーム結合サイトを提供した。エピトープタグと、次のＴ７の遺伝子１０最初のＡｔｇとをコードする配列となるように、ｓｃＡｂ構築物はベクターのＮｄｅＩの位置に挿入された。シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)に対するｓｃＡｂからなる構築物（モリー(Molloy P.) ら、Journal of applied Bacteriology, 78:359-365, 1995 ）であって、ＦＬＡＧエピトープ（ＭＤＹＫＤＤＤＫ）（ナピックとプルックサム(Knappik A and Pluckthum A) 、Bio Techiques, 17:754-761, 1994 ）を持つ最初のものをＮ末端に加えた。第二のものは、抗体３４０（デュラント(Durrant LG)ら、Prenatal Diagnosis, 14:131-140, 1994）のＮ末端にポリヒスチジンタグが付いたものから構築されたｓｃＡｂからなっていた。
【０１２７】
これらのプラスミドは次の誘導タンパク質の親の役割をした。抗シュードモナス・アエルギノーサ（α−Ｐｓ）とその３４０ｓｃＡｂは次のようにして構築した。それぞれ５’ＦＬＡＧエピトープ配列を導入し、３’停止コドンを除去するプライマーＲＤ５’ＦＬＡＧ：5'gcggatcccatatggactacaaagacgatgacgacaaacaggtgcagctgcag3' （ゲノシスバイオテクノロジーズユーラポ社(Genosys Biotechnologies Europe Ltd)、ケンブリッジ、英国）及びＲＤ３’：5'gcgaattcgtggtggtggtggtggtgtgactctcc3' （ゲノシス社）を用いて、ベクターｐＰＭ１Ｈｉｓ（前掲のモリーら）中のα−ＰｓｓｃＡｂＤＮＡを増幅した。反応混合物は、０．１μｇの鋳型ＤＮＡ、２．６単位のExpandTMハイフィデリティＰＣＲ酵素混合物（ベーリンガーマンハイム社、ルイス、英国）、エキスパンドＨＦ緩衝液（ベーリンガーマンハイム社）、１．５ｍＭのＭｇＣｌ2 、２００μＭのデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）（ライフテクノロジーズ社、ペーズリー、英国）及び２５ピコモルの各プライマーを含んでいた。サイクルは、９６℃で５分間、次いで〔９５℃で１分間、５０℃で１分間、７２℃で１分間〕を５回、〔９５℃で４５秒間、５０℃で１分間、７２℃で１分３０秒間〕を８回、〔９５℃で４５秒間、５０℃で１分間、７２℃で２分間〕を５回、最後に７２℃で５分間というものであった。得られた１１２３塩基対生成物をＢａｍＨIII とＥｃｏＲＩとで切断し、ベクターｐＵＣ１９（ベーリンガーマンハイム社）中にクローニングした。[33P] ジデオキシヌクレオチドを用いたサーモシーケナーゼラジオラベルドターミネーターサイクルシーケンシングキット(Thermo Sequenase radiolabeled terminator cycle sequencing kit) （アマシャムライフサイエンス社(Amersham Life Science) 、アマシャム、英国）を使用してこのＤＮＡ配列を確認した。この構築物を、ＮｄｅＩからＥｃｏＲＩへの断片（モレキュラークローニング、アラボラトリーマニュアル、サンブロック  ジェー、フリッツ  イーエフ、マニアティス  ティー編、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス、1989、ニューヨーク、アメリカ合衆国を参照すること）としてｐＥＴ５ｃベクター（プロメガユーケー社、サザンプトン、英国）中にクローニングした。Wizard（登録商標）プラスエスブイミニプレップスディーエヌエーピューリフィケーションシステム(Plus SV Minipreps DNA purifications System)（プロメガユーケー社）を使用して、又はより大規模のキアゲンプラスミドミディキット(Qiagen Plasmid Midi Kit) （キアゲン社、クローレイ、英国）を使用してプラスミドＤＮＡを調製した。新しく作成されたこの新規プラスミドを、ｐＥＴ５ｃ  ＦＬＡＧ−αＰｓ  ｓｃＡｂと名付けた。
【０１２８】
ｐｐＭ１ＨｉｓのαＰｓＶＨとＶＫの代わりに抗体３４０のＶＨとＶＫを置換することによって、３４０ｓｃＡｂを生産した。プライマー5'cagctgcaggagtctgggggaggcttag3'（ゲノシス社）や5'tcagtagacggtgaccgaggttccttgaccccagta3'（ゲノシス社）を用いて３４０ＶＨを増幅した。反応混合物は、０．１μｇの鋳型ＤＮＡ、２．６単位のExpandTMハイフィデリティＰＣＲ酵素混合物、エキスパンドＨＦ緩衝液、１．５ｍＭのＭｇＣｌ2 、２００μＭのｄＮＴＰｓ及び２５ピコモルの各プライマーを含んでいた。サイクルは、９６℃で５分間、次いで〔９５℃で１分間、５０℃で１分間、７２℃で１分間〕を５回、〔９５℃で４５秒間、５０℃で１分間、７２℃で１分３０秒間〕を８回、〔９５℃で４５秒間、５０℃で１分間、７２℃で２分間〕を５回、最後に７２℃で５分間というものであった。得られた３５７塩基対生成物をＰｓｔＩとＢｓｔＥIIとで切断し、ＰｓｔＩとＢｓｔＥIIとで切断したｐＰＭ１Ｈｉｓ（前掲のモレキュラークローニング、アラボラトリーマニュアル）中にクローニングした。同様に、プライマー5'gtgacattgagctcacacagtctcct3'や5'cagcccgttttatctcgagcttggtccg3'（ゲノシス社）を用いて３４０ＶＫを増幅した。３３９塩基対生成物をＳｓｔＩとＸｈｏＩとで切断し、ＳｓｔＩとＸｈｏＩとで切断した、修飾されたｐＰＭ１Ｈｉｓ（上記で生産されたもの）中にクローニングした。[33P] ジデオキシヌクレオチド（アマシャム）を用いたサーモシーケナーゼラジオラベルドターミネーターサイクルシーケンシングキットを使用してこのＤＮＡ配列を確認した。それぞれ５’末端にヒスチジン６残基を導入し、３’停止コドンを除去するプライマーＲＤ５’ＨＩＳ：5'gcggatcccatatgcaccatcatcaccatcaccaggtgcagctgcag3' （ゲノシス社）及び（上記の）ＲＤ３’を用いてベクターｐＰＭ１Ｈｉｓ中の３４０ｓｃＡｂのＤＮＡを増幅した。試薬と増幅条件は、α−Ｐｓ構築物のそれと全く同じであった。得られた１１１４塩基対の産物を、ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩとで切断し、ベクターｐＵＣ１９にクローニングした（前掲のモレキュラークローニング、アラボラトリーマニュアルを参照すること）。このＤＮＡ配列を前記のようにして確認し、この構築物をＮｄｅＩからＥｃｏＲＩへの断片としてベクターｐＥＴ５ｃにクローニングして、プラスミドｐＥｔ５ｃ  ＨＩＳ  ３４０  ｓｃＡｂを新たに作成した。
【０１２９】
核酸「捕捉ドメイン」配列を含有させるためにモデル遺伝子を修飾した。使用した合成オリゴヌクレオチドは次の通りであった。
【０１３０】
【外２】
0004524445.tif 000003
【０１３１】
捕捉ドメイン配列は、SFFVフレンド赤白血病ウイルス由来であり、哺乳動物ｃＤＮＡデータベースには相補的配列がないことが以前より知られている（タビチアン(Tavitian)ら(1998)、Nature Medicine 4:467-471 ）。捕捉ドメインは上記のモデル遺伝子の５’ＵＴＲ配列中に挿入されているか、又は該遺伝子の３’領域に融合されている。構築物はそれぞれＣＡＰ５変異体又はＣＡＰ３変異体と名付けられた。ＣＡＰ５ドメイン及びＣＡＰ３ドメインの挿入は、利用可能なモデル遺伝子のそれぞれに万能となるように設定されたプライマーを用いてのＰＣＲにより実施された。ＣＡＰ５の挿入のために、プライマーＣＡＰ５インナーとＲＤ３とを用い、次いで、プライマーＣＡＰ５アウターとＲＤ３を用いる第二のＰＣＲという二連続のＰＣＲを実施した。得られた産物を精製し、インビトロ転写反応に直接使用した。同じ計画にてＣＡＰ３ドメインの挿入を続けたものの、プライマーＣＡＰ３インナーはプライマーＴ７ループと共に最初のＰＣＲにて使用し、次いで、第二のＰＣＲにてプライマーＣＡＰ３アウターとＴ７ループを使用した。精製産物はインビトロ転写反応に直接使用した。Ｔ７ポリメラーゼとRiboMAX システム（プロメガ社、サザンプトン、英国）を使用し、供給者の推奨する条件にて転写反応を実施した。
【０１３２】
マイクロタイタープレートの表面に共有結合させた合成オリゴヌクレオチドにＲＮＡをハイブリダイズさせた。捕捉オリゴヌクレオチドはＲＮＡ内の捕捉ドメインと相補的な配列であった。いくつかの実験において、捕捉オリゴヌクレオチドは５’アミノ−リンカー部位を介して付着しており、他の実験においては、付着はその分子の３’末端を介したものであった。オリゴヌクレオチドが付着したマイクロタイタープレートは、ゲノシスバイオテクノロジーズユーラポ社（ケンブリッジ、英国）と契約して提供を受けた。ハイブリダイズ反応は、マスコスとサザン(Maskos and Southern)(Maskos U and Southern E.M. (1992) Nucleic Acids Res. 20:1675-1678)の記載に従って、テトラメチルアンモニウムクロライドを含有する反応緩衝液中で５５℃、６０分間で実施した。ハイブリダイズ後の洗浄を、０．１％(v/v) ＳＤＳを含むＳＳＰＥ緩衝液（１×ＳＳＰＥ緩衝液＝１８０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．７、１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸）の希釈液を用いて高いストリンジェンシーで行った。
【０１３３】
最後の洗浄に続けて、完全アミノ酸混合物を追加したウサギ網状赤血球溶解物（プロメガ社）の２５μｌを添加することによりインビトロ翻訳反応を開始した。いくつかの実験においては、アミノ酸混合物からメチオニンを引いたものを使用し、この場合、35Ｓ−メチオニン（アマシャム）を加えた。３０℃で６０分間の翻訳反応を行い、次いで氷上に置いた。１％(w/v) のＢＳＡを含む氷冷ＰＢＳを用いてウェルを洗浄した。モデル遺伝子構築物のそれぞれについて計画されたＦｌａｇか又はｈｉｓ６エピトープのいずれかに対する抗体を用いて翻訳産物を検出した。希釈したＰＢＳで洗浄したウェルに抗体を添加した。ゆるやかに混合しながら、４℃で６０分間インキュベートした。推奨された希釈の程度となるように二次試薬（抗マウス−ＨＲＰ複合体）をＰＢＳ中に加え、４℃で３０分間インキュベートした。発色基質で発色させる前に、２００μｌのＰＢＳを用いてウェルを３回洗浄した。４９２ｎｍでプレートを読んだ。反応混合物に35Ｓ−メチオニンを含めたものについては、シンチレーションの測定により翻訳産物を検出した。この結果から、会合したｍＲＮＡへの付着によって正しいタンパク質の固定化が成功したことが、次には相補領域の配列によって対応する固定化ＤＮＡにアニーリングすることが示された。
【０１３４】
実施例１１
ｔａｔ及びＳＲＰによるリボソーム提示
抗体３４０由来の上皮増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ）に特異的な、そして抗体Ｊ５９１由来の前立腺表皮膜抗原（ＰＳＭＡ）に特異的な二つの単鎖抗体遺伝子（ｓｃＦｖ）、それぞれ大腸菌発現ベクターｐＰＭｈｉｓにクローニングされている、が出発点であった。長鎖合成オリゴヌクレオチドとＰＣＲとを使用するＴ７ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターを上流に備えたｐＧＥＭ  Ｔ７／ＳＰ６プラスミド（プロメガ社、サザンプトン、英国）にｓｃＦｖ断片が再クローニングされ、そして上流の細菌リボソーム結合部位、下流のＭ１３ファージ遺伝子III 由来のスペーサーセグメント、及び大腸菌ｌｐｐターミネーター由来の３’転写末端領域が提供された。ｓｃＦｖの両者について、翻訳停止コドンをＰＣＲ反応により除去した。結果として得られたプラスミドを、ｐＴ７３４０Ａ（ＥＧＦＲのためのもの）及びｐＴ７５９１Ａ（ＰＳＭＡのためのもの）と名付けた。
【０１３５】
上記の基本的なプラスミドの変異体として、ストランドオーバーラップエクステンションＰＣＲによって抗開始セグメントと下流側の末端セグメントとが提供され、ＡＴＧ開始コドンとｓｃＦｖ遺伝子間の分泌性リーダー配列と、スペーサーセグメントと転写末端配列間の末端配列ＴＡＲ配列のそれぞれを挿入した。結果として得られたプラスミドを、ｐＴ７３４０Ｂ（ＥＧＦＲのためのもの）及びｐＴ７５９１Ｂ（ＰＳＭＡのためのもの）と名付けた。
【０１３６】
ＲｉｂｏＭＡＸTMキット（プロメガ社、サザンプトン、英国）を用いて、メーカーの説明書に従ってｐＴ７プラスミドのインビトロ転写を行った。得られたｍＲＮＡをメーカーのプロトコールに従って精製した。
【０１３７】
（前掲の）ハーネスとプルクサンに記載されたように変更し、そしてＨＩＶのＴａｔ３７〜７２ペプチドを追加した（前掲の）チェンとズバイ(Chen and Zubay)に記載されたように、大腸菌Ｓ−３０システム中でインビトロ翻訳を行った。翻訳から１０分後、（ロミシュ、ウェブ、ヘルツ、プレーン、フランク、ブレナー及びワルター(Romisch K, Webb J, Herz J, Prehn S, Frank R, Brenner S and Walter P) 、Nature vol 340 (1989) p478-482の方法で生産された）ＳＲＰの調製物を添加し、翻訳をさらに１０分間続けた。翻訳を停止し、混合物を（前掲の）ハーネスとプルクサンに記載されたように遠心分離した。次いで、プレート内をＥＧＦＲ又はＰＳＭＡのいずれかで被覆したマイクロタイタープレート上で、翻訳反応物を室温で１時間インキュベートした。残ったリボソーム複合体を洗浄して解離させ、ｍＲＮＡの単離、逆転写ＰＣＲ及び転写−翻訳の繰り返しを、（前掲の）ハーネスとプルクサンに記載されたように行った。配列決定と、選択された遺伝子集団における原版のｓｃＦｖの発現の測定のために、リボソーム提示の５ラウンド後のＰＣＲ産物をｐＵＣ１８中にクローニングした。この測定のために、少なくとも５０のｐＵＣ１８クローン中の挿入物の配列を決定した。
【０１３８】
ＥＧＦＲ抗原調製物のスクリーニングのために、１：１のモル比のｐＴ７３４０Ａ：ｐＴ７５９１Ａを含む原版のプラスミド混合物を、最終的なｐＵＣ１８ライブラリーが８４％のｐＴ７３４０Ａ配列と１６％のｐＴ７５９１Ａからなるように上昇させた。１：１のモル比のｐＴ７３４０Ａ：ｐＴ７３４０Ｂ、又は１：１のモル比のｐＴ７３４０Ｂ：ｐＴ７５９１Ｂによって、最終的なｐＵＣ１８ライブラリーは、両方のケースともにｐＴ７３４０Ｂが１００％となった。
【０１３９】
実施例１２
出発点は、二つの単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、一方がジゴキシンに特異的なもの（タン(Tang)ら、Journal of Biological Chemistry 270 (1995) p7829-7835 ）で、もう一方がフルオレセインに特異的なもの（デンジンとボス(Denzin and Voss) 、Journal of Biological Chemistry 267 (1992) p8925-8931 ）であった。フォワードプライマー、ｆｄｉｇ１：CCG TAT AGA TCT CAG GTC AAA CTG CAG GAG TCT 及びリバースプライマー、ｒｄｉｇ１：CCG TAT GGA TCC CCG TTT TAT TTC CAA CTT TGT を用いて、ｐＣＡＮＴＡＢベクター（タンら）から抗ジゴキシンｓｃＦｖをＰＣＲ増幅した。ベーリンガーエキスパンドハイフィデリティＰＣＲシステムを用いてＰＣＲ増幅反応を行った。ＤＮＡ断片の増幅のための反応条件は、１×エキスパンドＨＦ緩衝液、２．５ｍＭのＭｇＣｌ2 、４ｍＭの各種ｄＮＴＰ、２．５単位のポリメラーゼ、１０ｎｇの鋳型ＤＮＡ及び３０ピコモルのプライマーＤＮＡであった。反応物をサーマルサイクラー中で、次のプログラム：９２℃で５分間、（プライマー配列によって）５３〜６７℃で５分間、７２℃で１分間、次いで、９２℃で１分間、５３〜６７℃で１分間、７２℃で１分間の３０サイクルにてインキュベートした。得られた７２０塩基対断片を、次に、ウィザードＰＣＲ精製カラム（プロメガ社）を用いて精製し、メーカーの説明書に従ってＰＣＲ産物とベクターとをＢｇｌIIとＢａｍＨＩとで消化することにより、大腸菌発現ベクターｐＥＴ−９（プロメガ社）のＢａｍＨＩサイトにクローニングした。このプラスミドは、バクテリオファージＴ７遺伝子１０由来のプロモーター、翻訳開始サイト、及びターミネーターを含むものである。得られたプラスミドをｐＤＩＧ１と名付けた。マレンダー、カレロ及びボス(Mallender, Carrero and Voss) 、(Journal of Biological Chemistry 271 (1996), p5338-5346)に記載のようにして、フォワードプライマー、ｆｏｘ１：CCG TAT AGA GAT GTC GTG ATG ACC CAA ACT 及びリバースプライマー、ｒｏｘ１：CCG TAT GGA TCC TGA GGA GAC GGT GAC TGA GGT を用いて、発現ベクターｐＧＸ８７７３から抗フルオレセインｓｃＦｖＤＮＡ配列を新たに作成した。この断片はＰＣＲによって新たに作成されたものであり、次いで、上記のようにしてｐＥＴ−９ベクター中へクローニングされてｐＯＸ１と名付けた。
【０１４０】
次の２セットのプライマーを用いての、二本鎖Ｍ１３ＤＮＡの調製物についてのＰＣＲの実施によって、繊維状ファージＭ１３の遺伝子III のグリシンリッチリンカーに基いたスペーサー配列を新たに作成した。
【０１４１】
【外３】
0004524445.tif 000004
【０１４２】
ｍ１３ｆ１とｍ１３ｒ１とのプライマーの組み合わせ、又はｍ１３ｆ２とｍ１３ｒ２とのプライマーの組み合わせを用いて、２セットのＰＣＲ反応を行った。これら２セットの反応によって、二つの産物の集団、一つは５’ＢｇｌIIと３’ＸｈｏＩに制限サイトを持つものであり、もう一つは５’ＳａｌＩと３’ＢｃｌＩに制限サイトを持つものが新たに作成された。制限サイトには、３０アミノ酸のリンカーの多量体の構築を促進するものが含まれていた。ＢｇｌII／ＸｈｏＩＰＣＲ産物を２回消化し、リン酸化して、次に、ＳａｌＩ／ＢｃｌＩで消化したもののＰＣＲ産物と結合した。このようにして、５’から３’のみに結合された多量体（これは消化によって確認できた。）を形成させた。９００塩基対の断片を、アガロースゲル電気泳動によって単離し、そして、メーカーの説明書に従って、ウィザードＰＣＲ精製カラム（プロメガ社）を用いて精製した。次いで、この断片をＢｇｌIIとＢｃｌＩで消化し、そしてｓｃＦｖ断片の下流にある、ｐＤＩＧ１とｐＯＸ１のＢａｍＨＩサイトにクローニングして、それぞれｐＤＩＧ２とｐＯＸ２とを新たに作成した。
【０１４３】
上記の基本的なプラスミドの変異体として、ＡＵＧ開始コドンとｓｃＦｖ遺伝子間に上流の抗開始セグメントを挿入したものがあった。これは、ネズミＶｈシグナル配列をこのｓｃＦｖプライマーｆｄｉｇ１とｆｏｘ１とに組み込むことによって実施した。
【０１４４】
【外４】
0004524445.tif 000005
【０１４５】
ｒｄｉｇ１とｒｏｘ１を組み合わせてＰＣＲを行った後、得られたそれぞれのＰＣＲ産物をＢｇｌIIとＢａｍＨＩとで消化して、既に記載したようにしてｐＥＴベクター中にクローニングし、ｐＤＩＧ３とｐＯＸ３を新たに作成した。
【０１４６】
さらに、（上記のようにして新たに作成された）ＢｃｌＩで消化した９００塩基対を次のとおりのＨＩＶのＴＡＲをコードする自己アニーリングしたオリゴヌクレオチドへ結合することにより、ＨＩＶのトランスアクチベーション応答因子（ＴＡＲ）配列をＭ１３スペーサーセグメントから下流側に挿入した。
【０１４７】
【外５】
0004524445.tif 000006
【０１４８】
この断片を精製し、ｐＤＩＧ３とｐＯＸ３のＢａｍＨＩサイトにクローニングしてｐＤＩＧ４とｐＯＸ４を新たに作成した。
【０１４９】
クローニングの後に、ＰＣＲで新たに作成した挿入物の配列解析を、二本鎖プラスミドＤＮＡ鋳型（クラフト(Kraft) ら、Bio Techniques 6 (1988), p544 ）とＴ７シークエンシングプライマーを用いるシークエナーゼ（アマシャム社）を用いてのチェインターミネーター法にて行った。
【０１５０】
メーカーの説明書に従って、RiboMAX ラージスケールＲＮＡ生成システム（プロメガ社）を用いて、構築物ｐＤＩＧ３、ｐＯＸ３及びｐＤＩＧ４、ｐＯＸ４のインビトロ転写を行った。得られたｍＲＮＡを、ポリＡトラクトシステム（プロメガ社）を用いて精製した。
【０１５１】
（前掲の）ハーネスとプルクサンに記載されたように変更し、そして１０μｇ／ｍｌのＨＩＶのＴａｔ３７〜７２ペプチド（ナリシュキン(Naryshkin) ら、Biochemistry 36 (1997), p3496-3505）の存在下又は非存在下で、（前掲の）チェンとズバイに記載されたように、大腸菌Ｓ−３０システム中で抗ジゴキシンｓｃＦｖのｍＲＮＡと抗フルオレセインｓｃＦｖのｍＲＮＡの混合物のインビトロ翻訳を行った。いくつかのサンプルでは、翻訳から１０分後、（ロミシュら、Nature vol 340 (1989) p478-482の方法で生産された）ＳＲＰの調製物を添加し、翻訳をさらに１０分間続けた。翻訳を停止し、混合物を（前掲の）ハーネスとプルクサンに記載されたように遠心分離した。次いで、プレート内をジゴキシン又はフルオレセインのいずれかで被覆したマイクロタイタープレート上で、翻訳反応物を室温で１時間インキュベートした。残ったリボソーム複合体を洗浄して解離させ、ｍＲＮＡの単離、逆転写ＰＣＲ及び転写−翻訳の繰り返しを、（前掲の）ハーネスとプルクサンに記載されたように行った。配列決定と、選択された遺伝子集団における原版のｓｃＦｖの発現の測定のために、リボソーム提示の５ラウンド後のＰＣＲ産物をｐＵＣ１８中にクローニングした。この測定のために、少なくとも５０のｐＵＣ１８クローン中の挿入物の配列決定を行った。
【０１５２】
表１には、ＳＲＰの添加による選択の増加を示唆するいくつかのものと共に、ｔａｔを添加したことによる翻訳反応が標的リガンドに対するｓｃＦｖをコードするｍＲＮＡの選択を増加させたことを示す分析結果が示されている。
【０１５３】
実施例１３
ジシストロニック(dicistronic) ｍＲＮＡ由来のタンパク質−タンパク質結合
ジシストロニック構築物の使用によって、リボソーム提示がタンパク質の相互作用を同定するのに使用できることを示すために、ヒトＩＬ−５タンパク質が用いられた。三つの基本的な発現プラスミドが、下記のようにして構築された。
【０１５４】
構築物１：
ヒトＩＬ−５遺伝子を、下記のプライマーを用いてｐＵＣ１８（アールアンドディーシステムズ社(R and D Systems) 、アビンドン(Abingdon)、英国）から増幅した。
【０１５５】
【外６】
0004524445.tif 000007
【０１５６】
ベーリンガーエキスパンドハイフィデリティＰＣＲシステム（ベーリンガー社、ルイス、英国）を用いてＰＣＲ増幅反応を行った。ＤＮＡ断片の増幅のための反応条件は、１×エキスパンドＨＦ緩衝液、２．５ｍＭのＭｇＣｌ2 、４ｍＭの各種ｄＮＴＰ、２．５単位のポリメラーゼ、１０ｎｇの鋳型ＤＮＡ及び３０ピコモルのプライマーＤＮＡであった。反応物をサーマルサイクラー中で、次のプログラム：９２℃で５分間、（プライマー配列によって）５３〜６７℃で５分間、７２℃で１分間、次いで、９２℃で１分間、５３〜６７℃で１分間、７２℃で１分間の３０サイクルにてインキュベートした。得られた４４８塩基対断片を、次に、ウィザードＰＣＲ精製カラム（プロメガ社）を用いて精製し、メーカーの説明書に従ってＰＣＲ産物とベクターとをＢｇｌIIとＢａｍＨＩとで消化することにより、大腸菌発現ベクターｐＥＴ−９（プロメガ社）のＢａｍＨＩサイトにクローニングした。このプラスミドは、バクテリオファージＴ７遺伝子１０由来のプロモーター、翻訳開始サイト、及びターミネーターを含むものである。得られたプラスミドをｐＩＬ５ａと名付けた。
【０１５７】
構築物２：
下記のプライマーを用いてｐＵＣ１８からヒトＩＬ−５遺伝子を増幅した。
【０１５８】
【外７】
0004524445.tif 000008
【０１５９】
ＰＣＲ増幅と精製は上記のようにして行った。ＰＣＲ産物を次にＢｇｌIIとＢａｍＨＩとで消化し、ｐＥＴ９ベクター（プロメガ社）のＢａｍＨＩサイトにクローニングして、ｐＩＬ５ｂと名付けた。
配列が上記にある、次のプライマーｍ１３ｆ１、ｍ１３ｒ１、ｍ１３ｆ２、ｍ１３ｒ２を用いての、二本鎖Ｍ１３ＤＮＡの調製物についてのＰＣＲの実施によって、繊維状ファージＭ１３の遺伝子III のグリシンリッチリンカーに基いたスペーサー配列を新たに作成した。
【０１６０】
ｍ１３ｆ１とｍ１３ｒ１とのプライマーの組み合わせ、又はｍ１３ｆ２とｍ１３ｒ２とのプライマーの組み合わせを用いて、２セットのＰＣＲ反応を行った。これら２セットの反応によって、二つの産物の集団、一つは５’ＢｇｌIIと３’ＸｈｏＩに制限サイトを持つものであり、もう一つは５’ＳａｌＩと３’ＢｃｌＩに制限サイトを持つものが新たに作成された。制限サイトには、３０アミノ酸のリンカーの多量体の構築を促進するものが含まれていた。ＢｇｌII／ＸｈｏＩＰＣＲ産物を２回消化し、リン酸化して、次に、ＳａｌＩ／ＢｃｌＩで消化したもののＰＣＲ産物と結合した。このようにして、５’から３’のみに結合された多量体（これは消化によって確認できた。）を形成させた。９００塩基対の断片を、アガロースゲル電気泳動によって単離し、そして、メーカーの説明書に従って、ウィザードＰＣＲ精製カラム（プロメガ社）を用いて精製した。
【０１６１】
（上記のようにして新たに作成された）ＢｃｌＩで消化した９００塩基対のスペーサーセグメントを、ＨＩＶのＴＡＲをコードする自己アニーリングしたオリゴヌクレオチドＴＡＲ１、ＴＡＲ２へ結合することにより、ＨＩＶのトランスアクチベーション応答因子（ＴＡＲ）配列をＭ１３スペーサーセグメントから下流側に挿入した。
【０１６２】
この断片を再精製し、ＢｇｌIIで消化してｐＩＬ５ｂのＢａｍＨＩサイトにクローニングしてｐＩＬ５ｃを新たに作成した。
【０１６３】
構築物３：
ｐＩＬ５ｃをＨｉｎｄIII とＢａｍＨＩとで消化して、構築物２において記載の挿入物を放出させ、次いで、これを、同じくＨｉｎｄIII とＢａｍＨＩとで消化しておいたｐＩＬ５ａの中にクローニングした。得られた構築物をｐＩＬ５ｄと名付けた。
【０１６４】
クローニングの後に、ＰＣＲによって新たに作成された挿入物の配列解析を、二本鎖プラスミドＤＮＡ鋳型（クラフトら、Bio Techniques 6 (1988), p544 ）とＴ７シークエンシングプライマーを用いるシークエナーゼ（アマシャム社、リトルカルフォント(Little Chalfont) 、英国）を用いてのチェインターミネーター法にて行った。
【０１６５】
メーカーの説明書に従って、RiboMAX ラージスケールＲＮＡ生成システム（プロメガ社）を用いて、構築物ｐＩＬ５ａ、ｐＩＬ５ｃ及びｐＩＬ５ｄのインビトロ転写を行った。得られたｍＲＮＡを、ポリＡトラクトシステム（プロメガ社）を用いて精製した。
【０１６６】
（前掲の）ハーネスとプルクサンに記載されたように変更し、そしてＨＩＶのｔａｔ３７〜７２ペプチド（ナリシュキンら、Biochemistry 36 (1997), p3496-3505）を追加して、（前掲の）チェンとズバイに記載されたようにして大腸菌Ｓ−３０システム中でインビトロ翻訳を行った。翻訳を停止し、混合物を（前掲の）ハーネスとプルクサンに記載されたように遠心分離した。ノバジェン(Novagen) （ケンブリッジバイオサイエンス社(Cambridge Biosciences) 、ケンブリッジ、英国）に記載されたようにｐＥＴ−Ｈｉｓ−Ｔａｇシステムを用いての迅速アフィニティーカラムクロマトグラフィーを使用して、変性条件下で翻訳混合物の精製を行った。結合したタンパク質をメーカーの説明書に記載の方法によって溶出した。
【０１６７】
前掲のアンティボディーズ、アラボラトリー  マニュアルに記載のＭＢＳを使用し、Ｎ末端システイン残基を介してＫＬＨに複合化したｔａｔペプチド３７〜７２を用いて抗ｔａｔ抗体を作成した。上記のようにして、１０μｇの複合体を用いてBalb/cマウスを免疫し、血清を集めて１：１００に希釈してさらなる実験に使用した。上記からのｐＥＴ−Ｈｉｓ−ＴａｇＡ−溶出物を希釈したものを、メーカーの説明書に従って、イムロン２  ９６穴マイクロタイタープレート（ダイナテック社(Dynatech)、シャンティー(Chantilly) 、バージニア州、アメリカ合衆国）に添加し、次いで、抗ｔａｔ抗体を添加して室温下２時間インキュベートした。次に、プレートをＰＢＳで３回洗浄し、ＨＲＰ標識化ヤギ抗マウス抗体複合体（番号Ａ４４１６、シグマ社、プール、英国）の１：１０００希釈液を添加し、さらに室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄後、前掲のアンティボディーズ、アラボラトリー  マニュアルに従ってＴＭＢ基質を添加した。
【０１６８】
この結果から、ジシストロニックプラスミドｐＩＬ５ｄ由来のＥＬＩＳＡアッセイにおいて、溶出されたＨｉｓタグが付着したタンパク質はｔａｔタンパク質と関係があることが示され、しかしながら、ｔａｔの結合が検出されなかったモノシストロニックプラスミドｐＩＬ５ａとｐＩＬ５ｃとの１：１混合物に由来しないことが示された。このことは、翻訳されたＩＬ−５はジシストロニックプラスミドからホモダイマー化されたものであり、モノシストロニックプラスミドからではないことを示した。
【０１６９】
実施例１４
ビオチン化オリゴヌクレオチド及びストレプトアビジンを用いるリボソーム提示
ヒトκ定常領域のｃＤＮＡに融合させたＮ−末端エピトープ・タグ、重鎖可変領域（ＶH ）、１４アミノ酸リンカー（ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＶＤ）、軽鎖可変領域（ＶL ）からなる二個の修飾単鎖抗体（ｓｃＡｂ’ｓ）を調製した。このヒトκ定常領域配列は、３’末端にポリ−ヒスチジンタグを含んでおり、停止コドンを欠失するように修飾したものであった。
【０１７０】
修飾された抗−シュードモナスｓｃＡｂ及び修飾された３４０ｓｃＡｂは、実施例１０に記述したように構築した。上記プラスミドのイン・ビトロの共役した転写及び翻訳は、環状ＤＮＡに対する大腸菌Ｔ７Ｓ３０エキストラクト・システム（プロメガ社）を用い、すべての反応にＲＮａｓｉｎ（登録商標）（プロメガ社）を８０ユニット／反応加えて、プロメガ・テクニカル・ブレタンＮｏ．２１９に記述されたように行った。ビオチン化オリゴヌクレオチドＣκ３’ブロック（５’ＴＴＧＡＡＧＣＴＣＴＴＴＧＴＧＡＣＧＧＧＣＧＡＡＣＴＣ３’）及びストレプトアビジンを添加しそして添加せずに、２μｇの鋳型ＤＮＡ，ｐＥＴ５ｃＦＬＡＧ−αＰｓ・ｓｃＡｂ又はｐＥＴ５ｃＨＩＳ−３４０ｓｃＡｂを反応混合物中で転写及び翻訳した。さらに、反応混合物には、総量５０μｌに１μｌのＵＴＰα33Ｐ（０．３７ＭＢｑ）（ＩＣＮリミティッド、テーム、オックスフォードシャー、英国）を含ませた。これらの反応液は、５μＭの３’ビオチン化Ｃκ３’ブロックオリゴヌクレオチド及び１ｎｇのストレプトアビジン（ベーリンガー・マンハイム）を含んでいた。反応液を３０℃で３０分間インキュベートし、５０ｍＭまで酢酸マグネシウムを添加し氷上で冷却して反応を停止させた（ヘインズ及びプルックサン，Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 4937-4942, 1997）。２００μｌの氷冷洗浄緩衝液（５０ｍＭのトリス−塩酸，ｐＨ７．５、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、５０ｍＭの酢酸マグネシウム、０．１％のトゥイーン２０（ヘインズ及びプルックサン，上記）並びに１μｌ（４０ユニット）のＲＮａｓｉｎ（登録商標）（プロメガユーケイリミティッド））を添加して、反応混合物を五倍に希釈した。
【０１７１】
生産されたタンパク質は、標準的プロトコル（アンティボディーズ  アラボラトリー  マニュアル、ハーロウ，イー．及びレイン，ディー編、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス、1988、ニューヨーク、アメリカ合衆国、並びにキアゲンウエスタンアンドドットブロッティングプロトコールズ  1997年９月）を用い、翻訳されたタンパク質をＰｅｎｔａ  Ｈｉｓ（登録商標）抗体（０．１μｇ／ｍｌ）（キアゲンリミティッド）又は抗−ＦＬＡＧＭ２抗体（１．４μｇ／ｍｌ）（コダック・サイエンティフィック・イメージング・システムズ・リミティッド、ニューヨーク、アメリカ合衆国）を用いて検出するウエスタン・ドットブロットにより、そしてその後抗−マウスＩｇＧＨＲＰ複合体（０．５μｇ／ｍｌ）（シグマ、プール、英国）で処理することにより、特性決定を行った。抗−ヒトＣκ特異的ＨＲＰ複合体（０．５μｇ／ｍｌ）（ザ・バインディング・サイト、バッキンガム、英国）は直接使用した。タンパク質は化学発光検出法（ＥＣＬ、アマシャム・インターナショナル・リミティッド）によりそしてオートラジオグラフィーにより可視化した。既知の濃度の抗−シュードモナス・アエルギノーザｓｃＡｂ（モロイら，上記）及びＴ７Ｓ３０エキストラクト（プロメガユーケイリミティッド）と共に供給されたＰｉｎｐｏｉｎｔ（登録商標）対照プラスミドから転写翻訳されたタンパク質をそれぞれ正及び負の対照として使用するウエスタン・ドット・プロットによる分析に付した。
【０１７２】
イミュロン４ＨＢＸ９６ウェルプレート（ダイナテック）のウェルを、５０ｍＭの炭酸−重炭酸緩衝液ｐＨ９．５（シグマ）中の２μｇ／ウェルでの抗−ＦＬＡＧＭ２抗体、５０ｍＭの炭酸−重炭酸緩衝液ｐＨ９．５中の２μｇ／ウェルでのＰｅｎｔａ−Ｈｉｓ（登録商標）抗体、５０ｍＭの炭酸−重炭酸緩衝液ｐＨ９．５中の５μｇ／ｍｌＢＳＡ（シグマ）又は５０μｌ／ウェルの加熱殺菌したシュードモナス・アエルギノーザ調製物（マックグレゴル，ディーら、上記）で被覆した。ウェルを１％  ベーリンガーブロック剤（ベーリンガー・マンハイム）で室温で６０分間ブロックした。氷冷洗浄緩衝液でウェルを３回洗浄した後、転写／翻訳反応物の試料５０μｌを種々の捕獲ウェル中に注入して０度で６０分間ゆすりながらインキュベートした。未結合の物質を新たなチューブに除去した。このウェルを氷冷洗浄緩衝液で５回洗浄した。５０ｍＭのトリス−塩酸ｐＨ７．５、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、２０ｍＭのＥＤＴＡの２０μｌを添加し、氷上で１０分間インキュベートすることによりｍＲＮＡを溶出した。収穫したＲＮＡの量を定性的に評価するため、未結合物質の２μｌ及び溶出された物質の２０μｌニトロセルロース膜上にスポットし、風乾してオートラジオグラフにかけた。より定量的測定のために、未結合物質及び溶出物質の二連各５μｌをマークされたＧＦ／Ｃガラスファイバーフィルター（ワットマン・インターナショナル・リミティッド、メイドストーン、ケント、英国）上にスポットし、室温で乾燥させた。フィルターの各対の一方を氷冷した５％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）及び２０ｍＭのピロリン酸ナトリウムを含むビーカーに移し、２分間かき混ぜた。フィルターを次いで、ＴＣＡ／ピロリン酸塩を含む新たなビーカーに移し、そしてこの洗浄操作をさらに２回繰り返した。洗浄したフィルターを７０％エタノールに短時間移し、ついで室温で乾燥した。洗浄したフィルター及び洗浄しないフィルターをシンチレーションバイアルに移し、シンチレーション液を添加した。液体シンチレーションカウンター中でフィルターのカウントを行った。洗浄しないフィルターは試料中の放射活性の総量を示し、洗浄したフィルターは核酸に取り込まれた放射活性の量を示す。
【０１７３】
この分析の結果を表１に示す。表１は、ビオチン化ブロッキングオリゴヌクレオチド及びストレプトアビジンを添加した翻訳反応液が標的リガンドに対するｓｃＦｖをコードするｍＲＮＡの選択を増加させる結果となることを示す。
【０１７４】
これらの実験は環状ＤＮＡに対する大腸菌Ｔ７Ｓ３０エキストラクト・システムの代わりにＴＮＴ（登録商標）カプルッド・レティキュロサイト・ライゼート・システム（プロメガユーケイリミティッド）を用いて繰り返された。転写翻訳反応液は、プロメガ・テクニカル・ブレタンＮｏ．１２６の指示のように構成し、ＴＮＴ（登録商標）ラビット・レティキュロサイト・ライゼート、ＴＮＴ（登録商標）緩衝液、完全アミノ酸混合物、ＲＮａｓｉｎ（登録商標）リボヌクレアーゼ阻害剤、ＴＮＴ（登録商標）Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、１μｇの鋳型ＤＮＡ，ｐＥＴ５ｃＦＬＡＧ−αＰｓｓｃＡｂ又はｐＥＴ５ｃＨＩＳ−３４０ｓｃＡｂを含んでいた。この反応は３０℃で行われた。
【０１７５】
この実験の結果は、表２に要約されている。表２は、ビオチン化ブロッキングオリゴヌクレオチド及びストレプトアビジンを添加した翻訳反応は標的リガンドに対するｓｃＦｖをコードするｍＲＮＡの選択を増加させる結果となることを示す。
【０１７６】
実施例１５
実施例１４に詳述した実験を大腸菌Ｔ７Ｓ３０エキストラクト・システムを用いて繰り返した。転写／翻訳反応は、１ｎｇのストレプトアビジンに対しブロッキングオリゴヌクレオチドの濃度をそれぞれ１０ｎＭ及び２０ｎＭに増加させたこと及び反応を二時間行わせたことを除き、上に述べたと全く同様に行った。
【０１７７】
翻訳されたタンパク質の部分標本を上述のようにウエスタン・ドット・ブロットにより特性決定した。反応混合物の残りの４５μｌを氷上で急速に冷却し、酢酸マグネシウムを最終濃度が５０ｍＭになるまで添加した。ついで、この反応混合物を氷冷洗浄緩衝液で２００μｌに希釈した。この反応混合物の５０μｌを４本の被覆したＥＬＩＳＡプレートウェル（５０μｌの加熱殺菌したシュードモナス・アエルギノーザ細胞又は１００μｌの抗−ＦＬＡＧＭ２モノクローナル抗体（２．８μｇ／ｍｌ）、又は１００μｌのＰｅｎｔａ−Ｈｉｓ（登録商標）抗体（０．２μｇ／ｍｌ）又は１００μｌの２％ＢＳＡ）のそれぞれに添加し、次いで洗浄し、そしてブロック（上述のように）し、そして氷上で１．５時間インキュベートした。ウェルを氷冷洗浄緩衝液で５回洗浄した。溶出緩衝液（上述のような）と共に氷上でさらに１０分間振盪しながらインキュベートすることにより洗浄したプレートからｍＲＮＡを溶出した。
【０１７８】
このｍＲＮＡを２０μｇのグリコーゲンキャリア（ベーリンガー・マンハイム）の存在下に−２０℃に一晩おいてエタノールで沈殿させた（モレキュラー・クローニング，ア・ラボラトリー・マニュアル，上記）。その結果得られたｍＲＮＡをＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（ＲＴ）と共に逆転写反応の鋳型として使用した。簡単に述べれば、ｍＲＮＡを７０℃、１０分間で加熱変性させ、そして氷上で冷却して１ｎＭのプライマーＨｕＣＫ・ＦＯＲ：５’ＡＧＧＣＡＧＴＴＣＣＡＧＡＴＴＴＣ３’、配列２ｓｃＡｂ：５’ＧＴＧＡＧＣＴＣＧＡＴＧＴＣＡＴＣＣ３’及びＲＤ３’とアニーリングさせた。Ｍ−ＭＬＶ・ＲＴ（ライフテクノロジーズ）の２００ユニットを添加しそして３７℃で６０分間インキュベートし、その後７０℃で１５分間加熱してこのＲＴを失活させた。次に、その後得られるＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを、上記の正向きプライマー（１０ｎＭ）と共にＲＤ５’Ｆｌａｇ逆向きプライマーを用いるＰＣＲの鋳型として使用した。サーマルサイクラー中で、反応液を９６℃で５分間、それに続く４０サイクルの９５℃で３０秒間、５０℃で３０秒間、７２℃で３０秒間、次いで７２℃で６分間、インキュベートした。ＰＣＲ産物はアガロースゲル電気泳動により分析した。
【０１７９】
この実験から得られた結果から、ブロッキングオリゴヌクレオチドの濃度を増加するとｓｃＦｖ遺伝子の選択を増加させる結果となることが証明された。
【０１８０】
実施例１６
実施例１４に記述した実験を繰り返した。転写／翻訳反応は、鋳型がｐＥＴ５ｃＦＬＡＧαＰｓｓｃＡｂ及びｐＥＴ５ｃＨＩＳ３４０ｓｃＡｂの等量混合物であったことを除き、上に述べた方法と全く同様に行った。ＥＬＩＳＡプレートのウェルを、前と同様に、１００μｌの２．８μｇ／ｍｌαＦＬＡＧＭ２抗体及び５０μｌの加熱殺菌ピー．アエルギノーザ調製物で被覆した。タンパク質−リボソーム−ｍＲＮＡ複合体を捕獲し、溶出し、そして核酸を沈殿させた後、ＤＮアーゼ処理を実施例４で述べたように行った。この生産物を低溶融点アガロースゲル（ライフ・テクノロジーズ）を通す電気泳動により分離し、そして全長ＰＣＲ生産物（約１１００ｂｐ）を単離した。これは、それぞれ原核的及び真核的翻訳に対するＴ７プロモーター、リボソーム結合部位及びＫｏｚａｋ配列（Ｋｏｚａｋ，Ｍ．Nucl. Acids Res. 18: 2828, 1990)を含む上流の非翻訳ＤＮＡ配列、及び翻訳開始コドンを導入するためのプライマーを用いるさらなるラウンドのＰＣＲのための鋳型として使用した。その結果得られるＰＣＲ産物を、次に、直鎖状ＤＮＡ（プロメガユーケイリミティッド）用に調製されたＳ３０抽出物を用いて転写し翻訳した。前と同様に、タンパク質−リボソーム−ｍＲＮＡ複合体を捕獲し、ｍＲＮＡを溶出し、核酸を回収し、そしてＤＮアーゼで処理した後、ＲＴ・ＰＣＲ及び次のラウンド用の鋳型ＤＮＡを作成するためＰＣＲによるプロモーター及びリボソームの結合部位の導入を行った。リボソーム提示の４から５ラウンドの後に、回収したＤＮＡを元のベクター中に挿入しそし２０クローンのＤＮＡ配列を決定した。２０クローンすべてが抗−シュードモナスｓｃＦｖ配列を含むことが見出された。
【０１８１】
実施例１７
生物学的スクリーニング
生物学的応答の刺激の結果としてモジュレーターを生産する細胞系のモデルとして、細胞系Ａ４３１（ＥＣＡＣＣ No.85090402, ＥＣＡＣＣ、ポートンダウン、英国から）及びヒーラのＥＧＦＲ変異体（ＥＣＡＣＣ No.85060701)(ホスフォリパーゼＣに結合した抗−ＥＧＦＲ抗体を用いて選択される）がこの実験に使用された。両ケース共、モジュレータータンパク質であるＨＩＶｔａｔを分泌する変異体を使用した。細胞を１０％ＦＢＳを補足したＤＭＥＭ中で生育させた。両方の系から下記のように、ｔａｔタンパク質を分泌する組み換え体細胞系が誘導された。すなわち、合成ＨＩＶｔａｔ遺伝子をアールアンドディー・システムズ（エイビングドン、英国）から購入し、そして下記のプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。
【０１８２】
【外８】
0004524445.tif 000009
【０１８３】
その結果得られるＰＣＲ産物をＸｈｏＩ及びＥｃｏＲＩで消化しそしてＸｈｏＩ及びＥｃｏＲＩで消化したｐＣＩ−ｎｅｏベクター（プロメガ、サウサンプトン、英国）中にサブクローニングした。このｔａｔ発現プラスミドをＡ４３１及びＥＧＦＲヒーラ中にバイオラド・ジーンパルサーII（バイオラド、ヘメル・ヘンプステッド、英国）を用いる電気穿孔法によりトランスフェクトさせ、そしてＧ４１８で選択した。ｔａｔの選択は次のようにしてＥＬＩＳＡにより確認した。すなわち、ｔａｔペプチド３７−７２を用いて抗−ｔａｔ抗体を作成した。これを Antibodies, A Laboratory Manual上記に従ってＭＢＳを用いてそのＮ−末端システイン残基を介してＫＬＨに結合させた。この複合体の１０μｇを用いて、上記のように、Ｂａｌｂ／ｃマウスを免疫化し、そして血清を集め、１：１００の希釈でＥＬＩＳＡ実験に用いた。抗体の１０μｇ部分を、製造業者の指示に従ってイミュロン２・９６ウェルミクロタイタープレート（ダイナテック、チャンティリー、ＶＡ、米国）中に注入し、次いで細胞上清の試料を添加して室温で二時間インキュベートし、プレートを次にＰＢＳで３回洗浄し、そして１：１０００希釈のＨＲＰ−標識化ヤギ抗−マウス抗体複合体（＃Ａ４４１６、シグマ、プール、英国）を添加し、室温でさらに 1時間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した後、 Antibodies, A Laboratory Manual（上記）に従ってＴＭＢ基質を添加した。これにより、トランスフェクトされたＡ４３１及びＥＧＦＲヒーラ細胞の培養上清中にＨＩＶｔａｔタンパク質が存在することそしトランスフェクトされていないＡ４３１及びＥＧＦＲヒーラ細胞の培養上清中には存在しないことが確認された。
【０１８４】
モデルのタンパク質リガンドとしては、抗−ＥＧＦＲ（表皮成長因子受容体）（ＰＣＴ 00443) 及び抗−フルオレッセイン（デニジン及びボス，Journal of Biological Chemistry, vol267 (1992) p8925-8931)をコードする二個の単鎖抗体（ｓｃＦｖ）遺伝子を使用した。この抗−ＥＧＦＲｓｃＦｖは下記のプライマーを用いてクローニングされたＶｈ及びＶｋ鎖からＰＣＲ修飾されたものであった。
【０１８５】
【外９】
0004524445.tif 000010
【０１８６】
ＰＣＲ増幅反応は拡大高忠実度ＰＣＲシステム（ベーリンガー、リューズ、英国）を用いて行った。ＤＮＡ断片の増幅のための反応条件は、１×拡大ＨＦ緩衝液、２．５ｍＭのＭｇＣｌ2 、４ｍＭの各ｄＮＴＰ、２．５ユニットのポリメラーゼ、１０ｎｇの鋳型ＤＮＡ及び３０ｐモルのプライマーＤＮＡであった。反応液は、サーマルサイクラー中、次のプログラムを用いてインキュベートした。すなわち、９２℃で５分間、５３−６７℃（プライマー配列に依存する）で５分間、７２℃で１分間、その後９２℃で１分間、５３−６７℃で１分間、そして７２℃で１分間の３０サイクル。その結果得られた断片を、次に、ウィザードＰＣＲ精製カラム（プロメガ）を用いて精製した。Ｖｈ及びＶｋのこのＰＣＲ断片をＰｓｔＩ／ＢｓｔＥII及びＳａｃＩ／ＸｈｏＩでそれぞれ消化した。このｓｃＦｖベクターはｐＰＭ１Ｈｉｓ（モロイら、上記）であった。これをＰｓｔＩ及びＢｓｔＥIIで消化し、その３．５ｋｂベクター断片を精製し、そしてＰｓｔＩ／ＢｓｔＥIIＶｈＰＣＲ断片をライゲートして大腸菌ＴＧ１中に形質転換して３４０Ｖｈ組み換え体を作成した。この３４０Ｖｈプラスミドを次にＳａｃＩとＸｈｏＩで消化し、そしてＳａｃＩ／ＸｈｏＩＶｋＰＣＲ断片をそのベクター断片中にクローニングして３４０ｓｃＦｖ−生産性ＴＧ１細胞を作成した。
【０１８７】
Ｔ７ポリメラーゼ転写ベクター中にクローニングするため、前向きプライマー５’−ＣＣＧＴＡＴＡＧＡＴＣＴＡＴＧＧＡＡＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧ−３’及び逆向きプライマー５’−ＣＣＧＴＡＴＧＧＡＴＣＣＴＧＣＡＧＣＣＡＣＡＧＴＣＣＧＴＴＴＧＡＴ−３’を用いて前記３４０ｓｃＦｖを増幅した。このＰＣＲ断片をＢｇｌII及びＢａｍＨＩで消化し、そして大腸菌発現ベクターｐＥＴ−９（プロメガ）のＢａｍＨＩ部位にクローニングした。このプラスミドはバクテリオファージＴ７遺伝子１０由来のプロモーター、翻訳開始部位及び翻訳停止部位を含んでいる。その結果得られるプラスミドはｐＥＧＦＲ１と名づけた。抗−フルオレセインｓｃＦｖＤＮＡ配列は、前向きプライマー、ｆｏｘ１  ５’−ＣＣＧＴＡＴＡＧＡＴＣＴＧＡＴＧＴＣＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＡＡＣＴ−３’及び逆向きプライマー、ｒｏｘ１  ５’−ＣＣＧＴＡＴＧＧＡＴＣＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＴＧＡＧＧＴ−３’を用い、発現ベクターｐＧＸ８７３３から、マレンダー、カレロ及びボス（Journal Biological Chemistry, vol 271 (1996), p5338-5346) により記述されたように形成した。この断片をＰＣＲにより形成させ、ついで上述のようにｐＥＴ−９ベクター中にクローニングし、そしてｐＯＸ１と名づけた。
【０１８８】
繊維状ファージＭ１３の遺伝子III のグリシンの多いリンカーに基づくスペーサー配列は、二本鎖Ｍ１３ＤＮＡの調製に関するＰＣＲをプライマーｍ１３ｆ１、ｍ１３ｒ１、ｍ１３ｆ２及びｍ１３ｒ２を用いて従来のように行うことにより形成させた。
【０１８９】
二セットのＰＣＲ反応は、ｍ１３ｆ１とｍ１３ｒ１又はｍ１３ｆ２とｍ１３ｒ２のプライマー組合せを用いて行った。これらの二セットの反応により、２集団の生産物、すなわち、５’ＢｇｌII及び３’ＸｈｏＩ制限部位及び５’ＳａｌＩ及び３’ＢｃｌＩ制限部位を持つ集団を形成した。これらの制限部位は、３０アミノ酸リンカーのマルチマーの構築を容易にするために含められた。ＢｇｌII／ＸｈｏＩＰＣＲ産物は二重消化しそしてリン酸化し、次いで消化したＳａｌＩ／ＢｃｌＩ産物と連結した。このようにして、５’から３’に連結したマルチマー（これは消化により確認できるであろう）のみが形成されるであろう。９００ｂｐの断片をアガロースゲル電気泳動により単離し、そして製造者の指示に従いウィザードＰＣＲ精製カラム（プロメガ）を用いて精製した。次いで、この断片をＢｇｌII及びＢｃｌＩで消化し、ｐＥＧＦＲ１のＢａｍＨＩ部位及びｓｃＦｖ断片の下流のｐＯＸ１中にクローニングしてそれぞれｐＥＧＦＲ２及びｐＯＸ２を形成させた。
【０１９０】
このＨＩＶトランス活性化応答因子（ＴＡＲ）配列を、ＢｃｌＩで消化した９００ｂｐのスペーサー断片（上記のようにして形成したもの）を従来のようにＨＩＶ・ＴＡＲをコードする自己アニールしたオリゴヌクレオチドＴＡＲ１及びＴＡＲ２に連結することにより、Ｍ１３スペーサー断片の下流に挿入した。
【０１９１】
この断片を精製し、ｐＥＧＦＲ２及びｐＯＸ２のＢａｍＨＩ部位にクローニングしてｐＥＧＦＲ３及びｐＯＸ３を形成させた。クローニングの後、二本鎖プラスミドＤＮＡ鋳型（クラフトら，Bio Techniques 6 (1988), p544)及びＴ７配列決定用プライマーを用いるシーケナーゼ（アマシャム）を用いるジデオキシ・チェイン・ターミネーション法によりＰＣＲで形成させた挿入物の配列決定を行った。
【０１９２】
構築物ｐＥＧＦＲ３及びｐＯＸ３のイン・ビトロ転写は、製造者の指示に従い、リボマックス・ラージスケールＲＮＡ生産システム（プロメガ）を用いて行った。その結果得られたｍＲＮＡをポリＡＴトラクト・システム（プロメガ）を用いて精製し、そして１：１の比（ｗ／ｗ）で混合した。
【０１９３】
イン・ビトロ翻訳は、チェン及びズベイ（上記）により記述され、ヘインズ及びプルックサン（上記）により修正された大腸菌Ｓ−３０システムで行った。翻訳の１０分後に、ＳＲＰ（ロミッシュら，Nature 340, (1989), p478-482) の調製物を添加し、そしてその翻訳をさらに１０分間継続した。翻訳を停止し、混合物をヘインズ及びプルックサン（上記）により記述されたように遠心分離した。この翻訳反応物を次いでＰＢＳ中に希釈した。細胞を成長させ、トリプシン／ＥＤＴＡ中に収穫し、ＰＢＳ中で２回洗浄した後、１０6 Ａ４３１と１０6 ／ｍｌＥＧＦＲ−ヒーラ細胞の混合物としてか又は個々の細胞型のそれぞれの２×１０6 ／ｍｌかの２×１０6 細胞／ｍｌでＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ中に再懸濁した。それぞれの場合に、ｔａｔ+ 形質転換細胞又はｔａｔ- 形質転換細胞のいずれかを用いた。次いで、１００μｌの細胞懸濁液を、１００μｌＢＢＳ＋０．１％ソジウムカルボキシメチルセルロース（ＩＣＩ、ティーサイド、英国）中のライブラリーＤＮＡの最初の１μｇ由来の翻訳反応物と３７℃で１時間混合した。次いで、細胞を遠心分離し、０．１％（ｖ／ｗ）ＢＳＡを含むＰＢＳ中で２回洗浄し、この緩衝液の１００μｌ中に再懸濁した。
【０１９４】
ヘインズ及びプルックサン（上記）により記述されたようにＥＤＴＡ緩衝液中でｍＲＮＡを解離させた後、Antibodies, A Laboratory Manual （上記）に従って調製されたタンパク質Ａビーズ上のポリクローナル抗−ｔａｔ抗体を含むカラムを通すことにより、ｔａｔに結合したｍＲＮＡを回収した。保持されたリボソーム複合体の洗浄及び解離、ｍＲＮＡの単離、逆転写ＰＣＲ及び転写−翻訳の繰り返しは、ヘインズ及びプルックサン（上記）により記述された通りに行った。リボソーム提示の２ラウンドの後、選択された遺伝子集団における最初のｓｃＦｖの決定及び配列決定のために、そのＰＣＲ産物をｐＵＣ１８中にクローニングした。この決定のため、少なくとも５０ｐＵＣ１８クローン中の挿入物について、クローンの同一性を決定するため、部分的に配列決定した。その結果、表３に示すように、Ａ４３１細胞から分泌されるｔａｔは、Ａ４３１に結合しない抗−フルオレセインｓｃＦｖよりも翻訳された抗−ＥＧＦＲｍＲＮＡに対し優先的な選択性を示すことが明らかになる。ｔａｔもＥＧＦＲヒーラ細胞もそのような優先的選択性を与えないことから、標的細胞への結合とｔａｔ分泌の両者が選択のために要求されることが示される。
【０１９５】
実施例１８
リガンド配向性リボソームの提示
モノクローナル抗体３４０（ＰＣＴ00443 ）を表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）リガンドとして用いた。１ｍｇの抗体３４０を、架橋剤としてスルホ−ＭＢＳ（ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド・エステル）（ピアス、チェスター、英国、＃22312 ）を用いて１０ｍｇのＰＬＣ（シグマ、プール、英国、＃Ｐ4039）に結合させた。結合は、製造者の推奨するプロトコルを用いて行った。試薬類は結合の後Ｇ２５セフェデックスカラム（ファルマシア、ミルトンケインズ、英国、＃17-0851-01）及び透析を用いて脱塩し精製した。結合は、標準的プロトコル（ Antibodies, A Laboratory Manual、上記）に従って、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動及びクーマシーブルー染色により確認した。
【０１９６】
モノクローナル及びポリクローナル抗−ＥＧＦＲ抗体を生産する方法は、実質的には Antibodies, A Laboratory Manual、上記に記述された通りの標準的方法であった。ＥＧＦＲに反応性のマウスモノクローナル抗体は、ヒト乳癌ＭＤＡ−ＭＢ４６８をＢＡＬＢ／ｃマウスに対する免疫原として用いて得た。一次及び二次注射は両方とも５×１０5 細胞を用いて腹腔内に行い、３週間後に尾部静脈に２日にわたって４回の注射を行った。さらに５日後に、脾臓を取り出し、ケネット，Ｒ．Ｈ．Methods Enzymol. vol 58 (1978) p345-359 の手順に従って、ＳＰ２／０マウス骨髄腫細胞に融合させた。プールしたハイブリドーマを、モジタヘディ，エイチら、Br. J. Cancer, vol 67 (1993) p247-253 により記述されたように、ＥＧＦＲ結合活性についてテストし、そして５×１０7 細胞まで増殖させ、ファスト・トラックｍＲＮＡ単離キット（インビトロゲン、ＮＶリーク、オランダ国）を用いてｍＲＮＡを単離した。次いで、ファルマシア・リコンビナント・ファージ・抗体・システム・キット（ファルマシア、ミルトンケインズ、英国）を用い、製造者の指示に従ってｍＲＮＡを処理し、ｐＣＡＮＴＡＢ５ベクターから１０7 ｃｆｕのライブラリーを作成した。
【０１９７】
転写のために、バクテリオファージＴ７遺伝子１０由来のプロモーター、翻訳開始部位及び停止部位を具備するベクターｐＥＴ−５（プロメガ、サウサンプトン、英国）を使用した。まず、３’スペーサー配列を繊維状ファージＭ１３の遺伝子III のグリシンの多いリンカーに基づき、従来のように、下記のプライマーｍ１３ｆ１、ｍ１３ｒ１、ｍ１３ｆ２及びｍ１３ｒ２を用いてＰＣＲにより作成されたこのベクターの中にクローニングした。
【０１９８】
２セットのＰＣＲ反応をｍ１３ｆ１とｍ１３ｒ１又はｍ１３ｆ２とｍ１３ｒ２のプライマー組合せを用いて行った。これらの２セットの反応は２集団の生産物を形成した。すなわち、５’ＢｇｌIIと３’ＸｈｏＩの制限部位を持つもの及び５’ＳａｌＩと３’ＢｃｌＩの制限部位を持つものである。この制限部位は３０アミノ酸リンカーのマルチマーの構築を容易にするために含められた。ＢｇｌII／ＸｈｏＩＰＣＲ産物を二重に消化しそしてリン酸化し、ついで消化したＳａｌＩ／ＢｃｌＩＰＣＲ産物と連結した。このようにして、５’から３’に連結したマルチマーはだけが形成された。９００ｂｐのマルチマーを選択し、ＢｃｌＩで消化し、従来同様に、ＨＩＶ・ＴＡＲ応答因子をコードする自己アニールした合成オリゴヌクレオチドＴＡＲ１及びＴＡＲ２に連結した。
【０１９９】
この断片を精製し、ＢｇｌIIで消化し、ｐＥＴ−５のＢａｍＨＩ部位にクローニングして、遺伝子III ／ＴＡＲ挿入物、下流のＢａｍＨＩ部位を含むが下流には部位を持たないプラスミドｐＥＴ−５III を作成する。
【０２００】
ｐＣＡＮＴＡＢ５中の挿入物は下記のプライマーを用いて増幅した。すなわち前向き：５’ＣＣＧＴＡＴＧＧＡＴＣＣＧＣＧＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣ３’、
逆向き：５’ＣＣＧＴＡＴＧＧＡＴＣＣＣＣＣＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧ３’。
ＰＣＲ増幅反応はベーリンガー拡大高忠実度ＰＣＲシステムを用いて行った。ＤＮＡ断片の増幅のための反応条件は、１×拡大ＨＦ緩衝液、２．５ｍＭのＭｇＣｌ2 、４ｍＭの各ｄＮＴＰ、２．５ユニットのポリメラーゼ、１０ｎｇの鋳型ＤＮＡ及び３０ｐモルのプライマーＤＮＡであった。反応物はパーキンエルマー・サーマル・サイクラー４８０中、次のプログラムを用いてインキュベートした。すなわち、９２℃で５分間、６７℃で５分間、７２℃で１分間、その後９２℃で１分間、６７℃で１分間及び７２℃で１分間の３０サイクルであった。その結果得られた７９５ｂｐの断片を、次に、ウィザードＰＣＲ精製カラム（プロメガ）を用いて精製し、そしてそのＰＣＲ産物をＢａｍＨＩでそしてベクターをＭｂｏＩで消化することにより修飾されたベクターｐＥＴ−５III 中にクローニングした。
【０２０１】
混合したＤＮＡライブラリー１０μｇのイン・ビトロ転写を、製造者の指示に従って、リボマックス・ラージスケールＲＮＡ生産システム（プロメガ）を用いて行った。その結果得られたｍＲＮＡをポリＡＴトラクトシステム（プロメガ）を用いて精製した。
【０２０２】
イン・ビトロ翻訳はチェン及びズベイ（上記）により記述され、ヘインズ及びプルクサン（ＰＮＡＳ，vol 94 [10]:4937, 1997) により修正された大腸菌Ｓ−３０システムに、ＨＩＶｔａｔ３７−７２ぺプチド（ナリシュキンら，Biochemistry vol 36 (1997) p3496-3505)を補足して行った。翻訳は１０分後に停止させ、混合物をヘインズ及びプルクサン（上記）が記述したように遠心分離した。
【０２０３】
リポソーム−ｔａｔ調製のために、脂質Ｌ−ホスファチジルコリン及びオレオイル−パルミトイルコレステロールを混合することによりリポソーム小胞を作成した。１０ｍＭのトリスｐＨ８．０中１００ｍＭ濃度のｔａｔ３７−７２ぺプチドを、１．５：１のＬ−アルファ−ホスファチジルコリンとコレステロール（シグマ、プール、英国、＃ 13906 )の混合物１０ｍｇに添加した。激しい攪拌と室温での放置のサイクルの繰り返しの後、小胞が形成された。このリポソーム溶液の容積は１０ｍＭトリスｐＨ８．０の添加により増加し、そしてホウ酸緩衝化食塩水（ＢＢＳ：０．２Ｍメタホウ酸ナトリウム、７．５ｇ／ｌのＮａＣｌ、１．８ｇ／ｌのＣａＣｌ2 ２Ｈ2 Ｏ、ｐＨはホウ酸で７．０に調整）を用いてＧ２５セファデックスカラムを通すゲル濾過により未取り込み成分からリポソームを精製した。溶出されたリポソームの完全性は顕微鏡により評価した。顕微鏡下で、１％（ｖ／ｖ）ＮＰ−４０の溶液（ピアス、チェスター、英国、＃ 28324) で処理することにより溶解した対照調製品と完全なリポソームを比較した。リポソームは、最終濃度が１０ｍＭｔａｔ３７−７２ぺプチドになるようにＢＢＳで希釈した。
【０２０４】
抗−ｔａｔ抗体はｔａｔぺプチド３７−７２を用いて調製した。ｔａｔぺプチド３７−７２を、Antibodies, A Laboratory Manual 上記に従いＭＢＳを用いてそのＮ−末端システイン残基を介してＫＬＨに結合させた。その複合体１０μｇを用いて上記のようにＢａｌｂ／ｃマウスを免疫化し、血清を集め、さらなる実験では１：１００希釈で使用した。７９１Ｔ／３６細胞（ドーラン，エムら，Br J Cancer, vol 62 (1990) p500)に対するウサギのポリクローナル抗体をAntibodies, A Laboratory Manual 上記に従って調製した。
【０２０５】
７９１Ｔ／３６細胞は、生育させ、トリプシン／ＥＤＴＡ中で回収し、ＲＰＭＩ１６４０培地で２回洗浄した後、５×１０5 細胞／ｍｌでＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ中に再懸濁した。１００μｌの細胞懸濁液を、次に、０．１％（ｗ／ｖ）牛血清アルブミン（ＢＳＡ）（シグマ、＃Ａ7906、プール、英国）を補充したＰＢＳ中、１００μｇ／ｍｌの３４０−ＰＬＣ複合体の１００μｌと混合し、３７℃で１時間インキュベートした。次に、細胞を遠心分離し、氷冷ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡで２回洗浄し、１００μｌのＰＢＳ中に再懸濁した。ついで、ライブラリーＤＮＡの元の１μｇから誘導された翻訳反応液に１００μｌのＰＢＳを添加してさらに１時間３７℃でインキュベートした。細胞を再び遠心分離し、ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡで２回洗浄し、そしてこの緩衝液の１００μｌに再懸濁した。１００μｌの調製したリポソーム懸濁液を添加し、３７℃で１時間インキュベートした。続いて細胞をＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ中で５分間×３回洗浄した。
【０２０６】
ｔａｔ−結合ｍＲＮＡは、ヘインズ及びプルクサン（上記）により記述されたようにＥＤＴＡ緩衝液中でのｍＲＮＡの解離により、そしてその後のAntibodies, A Laboratory Manual 上記に従って調製されたタンパク質Ａビーズ上のポリクローナル抗−ｔａｔ抗体を含むカラムを通過させることにより回収された。保持されたリボソーム複合体の洗浄及び解離、ｍＲＮＡの単離、逆転写ＰＣＲ、及び５０μＣｉ／ｍｌの３５Ｓメチオニン標識（アマシャム・インターナショナル、アマシャム、英国）を用いる最終ラウンドでの標識化を伴う転写−翻訳の繰り返しは、ヘインズ及びプルクサン（上記）により記述されたとおりに行った。７９１Ｔ細胞上でのリボソーム提示の３ラウンドの後、そのＰＣＲ産物は３５Ｓメチオニンで転写されそして翻訳され、そしてこの混合物は次に抗体３４０免疫アフィニティカラム（ＰＣＴ0043) を用いて調製されたヒト胎盤由来のＥＧＦＲ抗原調製物で被覆されそして製造者のプロトコルに従って被覆緩衝液中でプレート上に被覆されたイミュロン２・９６−ウェルミクロタイタープレート（ダイナテック、チャンティリ、ＶＡ、米国）に注入した。約１μｇの翻訳されたタンパク質複合体を０．１μｇのＢＳＡ単独か又は１μｇの３４０抗体又は５μｇのポリクローナル抗−ＥＧＦＲ（上記のようなもの）と共に各ウェルに添加した。プレートを１時間インキュベートし、０．１％トゥイーン２０（シグマ）を含むＰＢＳで５回洗浄し、そして結合しているタンパク質を０．１Ｍトリエチルアミンで溶出し、シンチレーションカウンターで計測した。３回の測定の平均として（ＳＤ＜１０％）表４に示すように、その結果は、抗−ｔａｔカラムを用いて７９１Ｔ細胞から溶出されたｍＲＮＡ／リボソーム／タンパク質の三重複合体から誘導された翻訳されたタンパク質が特異的に結合すること、しかし抗−ｔａｔ富化なしに溶出され処理された三重複合体又はＤＮＡライブラリーから直接の三重複合体由来のものは結合しないことが示された。さらに、３４０抗体による結合の阻害の欠如、これは本実験におけるＰＬＣ−標識化リガンドを含むが、そしてポリクローナル抗−７９１Ｔ血清による陽性の阻害は、結合が３４０のそれ以外のＥＧＦＲ上のエピトープに特異的であることを示すものである。
【０２０７】
実施例１９
リポソーム選択によるタンパク質−タンパク質結合
自己ダイマー化ヒトＩＬ−５タンパク質を用いてその二つの不活性サブユニット、ＰＬＣ１−２４６（ＰＬ１）及びＰＬＣ２４７−３７０（ＰＬ２）由来のホスフォリパーゼＣ（ＰＬＣ）の相補性及びその後のリポソームの溶解を明らかにした。ヒトＩＬ−５遺伝子（アールアンドディー・システムズ、エイビングドン、英国）を、下記のプライマーを用いてｐＵＣ１８からＰＣＲ増幅した。
【０２０８】
【外１０】
0004524445.tif 000011
【０２０９】
ＩＬ−５の対照として、ジゴキシンに特異的な単鎖抗体遺伝子（ｓｃＦｖ）（タングら，Journal of Biological Chemistry 270 (1995) p7829-7835)をも、前向きプライマー、fdig1:ＣＣＧＴＡＴＡＧＡＴＣＴＣＡＧＧＴＣＡＡＡＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣＴ及び逆向きプライマー、rdig1:ＣＣＧＴＡＴＧＧＡＴＣＣＣＣＧＴＴＴＴＡＴＴＴＣＣＡＡＣＴＴＴＧＴを用い、ｐＣＡＮＴＡＢベクター（タングら）から出発してクローニングした。
【０２１０】
ＰＣＲ増幅反応は、ベーリンガー拡大高忠実度ＰＣＲシステム（ベーリンガー、リューズ、英国）を用いて行った。ＤＮＡ断片の増幅のための反応条件は、１×拡大ＨＦ緩衝液、２．５ｍＭののＭｇＣｌ2 、４ｍＭの各ｄＮＴＰ、２．５ユニットのポリメラーゼ、１０ｎｇの鋳型ＤＮＡ及び３０ｐモルのプライマーＤＮＡであった。反応物はサーマル・サイクラー中、次のプログラムを用いてインキュベートした。すなわち、９２℃で５分間、５３−６７℃（プライマー配列に依存する）で５分間、７２℃で１分間、その後９２℃で１分間、５３−６７℃で１分間及び７２℃で１分間の３０サイクルであった。その結果得られた断片を、次にウィザードＰＣＲ精製カラム（プロメガ）を用いて精製し、製造者の指示に従いそのＰＣＲ産物とベクターをＢｇｌII及びＢａｍＨＩで消化することにより大腸菌発現ベクターｐＥＴ−９（プロメガ、サウサンプトン、英国）のＢａｍＨＩ部位にクローニングした。このプラスミドはバクテリオファージＴ７遺伝子１０由来のプロモーター、翻訳開始部位及びターミネーターを含む。結果として得られるプラスミドをｐＩＬ５ａ（ＳｍａＩ部位）及びｐＩＬ５ｂ（ＳｍａＩ及びＮｃｏＩ部位）又はｐＤＩＧ（抗−ジゴキシンｓｃＦｖ）と名づけた。
【０２１１】
ｐＩＬ５ｂとｐＤＩＧはさらに下記のように修飾した。すなわち、繊維状ファージＭ１３の遺伝子III のグリシンの多いリンカーに基づくスペーサー配列を、実施例１７に記述したように、プライマーｍ１３ｆ１、ｍ１３ｒ１、ｍ１３ｒ２及びｍ１３ｆ２を用い、二本鎖Ｍ１３ＤＮＡの調製品についてのＰＣＲを行うことにより作成した。
【０２１２】
２セットのＰＣＲ反応をｍ１３ｆ１とｍ１３ｒ１又はｍ１３ｆ２とｍ１３ｒ２のプライマー組合せを用いて行った。これらの２セットの反応は二つの集団の生産物を形成した。すなわち、５’ＢｇｌIIと３’ＸｈｏＩの制限部位を持つもの及び５’ＳａｌＩと３’ＢｃｌＩの制限部位を持つものである。これらの制限部位は３０アミノ酸リンカーのマルチマーの構築を容易にするために含められた。ＢｇｌII／ＸｈｏＩＰＣＲ産物を二重に消化しそしてリン酸化し、ついで消化したＳａｌＩ／ＢｃｌＩＰＣＲ産物と連結した。このようにして、５’から３’に連結したマルチマーはだけが形成されるであろう（これは消化により確認されるであろう）。９００ｂｐの断片をアガロースゲル電気泳動により単離し、製造者の指示に従ってウィザードＰＣＲ精製カラム（プロメガ）を用いて精製した。ＨＩＶトランス活性化応答因子（ＴＡＲ）配列は、実施例１７に記述したように、ＢｃｌＩで消化した９００ｂｐスペーサー断片（上記のようにして形成したもの）をＨＩＶ・ＴＡＲをコードする自己アニールしたオリゴヌクレオチドＴＡＲ１及びＴＡＲ２に連結することによりＭ１３スペーサー断片から下流に挿入した。
【０２１３】
この断片を再精製し、ＢｇｌIIで消化し、ｐＩＬ５ｂ又はｐＤＩＧのＢａｍＨＩ部位にクローニングして、それぞれｐＩＬ５ｂ／Ｍ１３／ＴＡＲ及びｐＤＩＧ／Ｍ１３／ＴＡＲを得た。
【０２１４】
このＰＬＣをコードするプラスミドｐＴ２．２（ティトボール，アールら，Infection and Immunity, 57 (1989) p367-376) を下記のプライマー対を用いてＰＣＲ（条件は上記の通り）に付した。
【０２１５】
【外１１】
0004524445.tif 000012
【０２１６】
ＰＬ１プライマー対でＰＣＲにより得られたＰＬ１断片を、ＮｃｏＩ及びＳｍａＩで消化し、ＮｃｏＩ／ＳｍａＩ消化ｐＩＬ５ｂ（又はｐＤＩＧ）／Ｍ１３／ＴＡＲ中にクローニングしてｐＩＬ５ｂ（ｐＤＩＧ）／ＰＬ１／Ｍ１３／ＴＡＲを得た。ＰＬ２ｆｏｒ１及びＰＬ２ｂｃｋ１のプライマーを用いてＰＣＲから得られたＰＬ２断片は、ＳｍａＩ及びＨｉｎｄIII で消化し、ＳｍａＩ／ＨｉｎｄIII 消化ｐＩＬ５ａ中にクローニングしてｐＩＬ５ａ／ＰＬ２を生じた。ＰＬ２ｆｏｒ２及びＰＬ２ｂｃｋ２のプライマーを用いてＰＣＲから得られたＰＬ２断片をＢｇｌII及びＢａｍＨＩで消化し、ＢａｍＨＩ消化ｐＥＴ−９中にクローニングするとＰＬ２を生じた。
【０２１７】
これらのプラスミド構築物のイン・ビトロ転写は、製造者の指示に従い、リボマックス・ラージスケールＲＮＡ生産システム（プロメガ）を用いて行った。その結果得られたｍＲＮＡはポリＡＴトラクトシステム（プロメガ）を用いて精製した。
【０２１８】
リポソーム−ｔａｔ調製物のためには、脂質Ｌ−ホスファチジルコリンとオレオイル−パルミトイルコレステロールを混合することによりリポソーム小胞を調製した。１０ｍＭトリスｐＨ８．０中１００ｍＭの濃度でｔａｔ−３７−７２ぺプチドを、１．５：１のＬ−アルファ−ホスファチジルコリンとコレステロール（シグマ、プール、英国、＃ 13906) の混合物の１０ｍｇに添加した。小胞は激しい攪拌と室温でのその溶液の放置のサイクルを繰り返した後に形成された。リポソーム溶液の容積は１０ｍＭのトリスｐＨ８．０の添加により増加し、そしてホウ酸緩衝化食塩水（ＢＢＳ：０．２Ｍメタホウ酸ナトリウム、７．５ｇ／ｌのＮａＣｌ、１．８ｇ／ｌのＣａＣｌ2 ２Ｈ2 Ｏ、ｐＨはホウ酸で７．０に調整）を用いてＧ２５セファデックスカラムを通すゲル濾過により未取り込み成分からリポソームを精製した。溶出されたリポソームの完全性は顕微鏡により評価した。顕微鏡下で、１％（ｖ／ｖ）ＮＰ−４０の溶液（ピアス、チェスター、英国、＃ 28324) で処理することにより溶解した対照調製品と完全なリポソームを比較した。リポソームは、最終濃度が１０ｍＭｔａｔ３７−７２ぺプチドになるようにＢＢＳで希釈した。
【０２１９】
抗−ｔａｔ抗体はｔａｔぺプチド３７−７２を用いて調製した。ｔａｔぺプチド３７−７２を、Antibodies, A Laboratory Manual （上記）に従いＭＢＳを用いてそのＮ−末端システイン残基を介してＫＬＨに結合させた。その複合体１０μｇを用いて上記のようにＢａｌｂ／ｃマウスを免疫化し、血清を集め、さらなる実験では１：１００希釈で使用した。
【０２２０】
イン・ビトロ翻訳は、チェン及びズベイ（上記）により記述され、ヘインズ及びプルックサン（上記）により修正された大腸菌Ｓ−３０システムで行った。翻訳を停止し、混合物をヘインズ及びプルックサン（上記）により記述されたように遠心分離した。調製されたリポソーム−ｔａｔ懸濁液の１００μｌを１００μｌの翻訳混合物に添加し、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、翻訳反応物を Antibodies, A Laboratory Manual (上記) に従って調製されたタンパク質Ａビーズ上にポリクローナル抗−ｔａｔ抗体を含むカラムを通過させた。保持されたリポソーム複合体の洗浄及び解離、ｍＲＮＡの単離、逆転写ＰＣＲ及び転写−翻訳の繰り返しはヘインズ及びプルックサン（上記）により記述された通りであった。
【０２２１】
ｔａｔぺプチド−標識ｍＲＮＡのその後の翻訳と分離のために、プラスミドｐＩＬ５ａ、ｐＩＬ５ａ／ＰＬ２又はｐＰＬ２（「モデルリガンド」ＩＬ５、ＩＬ５／ＰＬ２融合タンパク質又はＰＬ２単独をコードする）のいずれかから誘導されるｍＲＮＡの部分標品とウサギベータグロブリンｍＲＮＡ（「グロブリン」）を、プラスミドｐＩＬ５ｂ／ＰＬ１／Ｍ１３／ＴＡＲとｐＤＩＧ／ＰＬ１／Ｍ１３／ＴＡＲ（「モデル受容体」ＩＬ−５／ＰＬ１融合タンパク質又は抗−ジゴキシンｓｃＦｖ／ＰＬ１融合体をコードする）の１：９ｗ／ｗ混合物と１：１ｗ／ｗ比で混合した。すべての反応は三連で行った。ｍＲＮＡ（ＩＬ−５又はＤＩＧ）の同一性は、ｐＵＣ１８中の５０のクローンの最少からその後に決定された。この分析の結果は表５に示す（３回の決定の平均、ＳＤ＜１０％）。表５から、ＩＬ−５／ＰＬＣリガンドを使用すると、抗−ジゴキシンｓｃＦｖに優る、ＩＬ−５をコードするｍＲＮＡの強い選択が得られることが示される。このことは、ＩＬ−５のホモダイマー化がＰＬＣのＰＬ１サブユニットとＰＬ２サブユニットを結合させリポソームの効率的に溶解させ、そしてＩＬ−５ダイマーと会合した翻訳複合体において抗−ＩＬ−５ｍＲＮＡに結合するｔａｔの放出を有利にすることを示す。
【０２２２】
【表１】
0004524445.tif 000013
【０２２３】
【表２】
0004524445.tif 000014
【０２２４】
【表３】
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【０２２５】
【表４】
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【０２２６】
【表５】
0004524445.tif 000017