(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物または鳥である個体が心理学的ストレス要因への曝露から生じる変化した生理学的状態を経験しているか否かを決定するための方法であって、
（ａ）そのような刺激に適切な条件下で、前記個体から得られた好中球を含む全血試験サンプルを、好中球におけるスーパーオキシド産生を刺激し得る誘導剤と接触させるステップと；
（ｂ）ストレスにより誘導される活性化を免れたかもしくは実質的に免れた、または心理学的ストレス要因として試験すべき因子を含まない同じ措置に曝露された１または複数の個体に少なくとも由来する全血対照サンプル中の同じ種の好中球が同じインビトロ条件下でスーパーオキシド産生を示す時間の後に、前記試験サンプル中の基準を上回るスーパーオキシド産生の増大を決定するステップと；
（ｃ）同じ条件下で、前記試験サンプル中で観察された基準を上回るスーパーオキシド産生の増大を、上記（ｂ）で規定されるような対照サンプル中で観察された基準を上回るスーパーオキシド産生の増大と比較するステップと
を含み、前記試験サンプル中のより低いスーパーオキシド産生が個体の生理学的状態に対する心理学的ストレス要因の影響の指標となる方法。
【請求項２】
前記対照サンプル中と比較して、前記試験サンプル中の基準を上回るより低下したスーパーオキシド産生が観察され、前記試験サンプル中のインビトロで誘導されたスーパーオキシド産生の程度が、心理学的ストレス要因への対処能力の測定として決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
個体がヒト、鳥、家畜または野生哺乳動物である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
好中球におけるスーパーオキシド産生を刺激し得る誘導剤が、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）、Ｎ−ホルミル−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ（ｆＭＬＰ走化性ペプチド）、ザイモサン、リポ多糖またはアドレナリンである、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
スーパーオキシド産生を、増幅剤としてルミノールまたはイソルミノールを使用して検出し、得られる化学発光を測定する、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
好中球におけるスーパーオキシド産生を刺激し得る誘導剤が、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）であり、スーパーオキシド産生を増幅剤としてルミノールを使用して検出し、得られる化学発光を測定する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
ストレス緩和薬物についてスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験化合物が投与された非ヒト哺乳動物を心理学的ストレス要因に曝露させて、請求項２に記載の方法を使用して前記非ヒト哺乳動物の対処能力を測定するステップと；
（ｂ）試験化合物投与後の前記非ヒト哺乳動物の対処能力を試験化合物の非存在下での前記非ヒト哺乳動物の対処能力と比較するステップと
を含み、試験化合物投与後の対処能力の増大が試験化合物のストレス緩和能力の指標となる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトまたは非ヒト動物であり得る個体における心理学的ストレスへの曝露を定量するインビトロの方法に関する。より詳細には、本発明は、好中球、好ましくは全血サンプル中の好中球の、曝露により誘導されるスーパーオキシドアニオン産生を示す（すなわち、インビトロの活性化に応答して「呼吸バースト」を生じる）保持された能力を測定することに依る、心理学的ストレスへの曝露を定量する方法を提供する。このような方法はまた、ストレス緩和薬物についてスクリーニングに適用できる。
【発明の背景】
【０００２】
心理学的ストレスの客観的、定量的かつ実行可能な測定は、野生生物の保護および管理を含む脊椎動物の生物学の多くの部門における研究にとっての中心であり、かつまた農業、動物福祉および獣医サービスに関係する。ヒトのストレスのレベルを定量するための技術は、医学的観点から重要であるが、職業上の安全性および健康についても関心事である。英国においておよそ１０人に１人の人が、仕事に関連したストレスを被っており（Ｈｅａｌｔｈ  ＆  Ｓａｆｅｔｙ  Ｅｘｅｃｕｔｉｖｅ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｈｅｅｔ：１／０１／ＥＭＳＵ  ２００２年２月に更新された）、そのコストは社会に対して３７億ポンドである。ストレス関連の状態または影響には、免疫障害、心血管疾患、筋骨格障害および心理学的障害、仕事場での傷害ならびに潰瘍が含まれる。
【０００３】
知覚されたストレスのアンケート（Ｃｏｈｅｎら、Ｊ．Ｈｅａｌｔｈ  ＆  Ｓｏｃｉａｌ  Ｂｅｈａｖｉｏｕｒ（１９８３）２４、３８５−３９６）、血液、尿、唾液および糞便中のコルチゾルおよびホルモンのレベルの測定（Ｂｅｅｒｄａら、Ｈｏｒｍ．Ｂｅｈａｖ．（１９９６）３０、２７２−２７９）、血液学的値（例えば、Ｍｉｌｌｓｐａｕｇｈら、Ｃａｎ．Ｆｉｅｌｄ−Ｎａｔ．（２０００）１１４、１９６−２００）ならびに行動観察（Ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｓｔｒｅｓｓ  Ｂａｓｉｃ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  Ａｎｄ  Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｆｏｒ  Ａｎｉｍａｌ  Ｗｅｌｆａｒｅ（２０００）におけるＲｕｓｈｅｎによる概説、編者ＭｏｂｅｒｇおよびＭｅｎｃｈ、Ｗａｌｌｉｎｇｆｏｒｄ：ＣＡＢＩ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）を含む種々の方法が、ストレス応答を評価するための試みにおいて、従来、適用されてきた。しかし、これらのアプローチは種々の欠点を有し、特定の状況においては使用するのが不適切であり得る。知覚されたストレスのアンケートは主観的であるので、ストレスの客観的測定を提供できない。さらに、例えば文化的理由に起因して、質問は常に正直に回答されるわけではない可能性があり、かつストレスのこの測定は、動物または鳥を試験するためには使用できない。例えば血液および尿中のコルチゾルおよびホルモンのレベルの測定は、動物においてストレスを評価するためにしばしば使用されるが、これらの測定は、そのレベルが一年を通じて変化するので理想的ではない。言及の絶対名辞は存在せず、このタイプの試験は時間がかかる。行動観察もまたしばしば主観的であり、定量が困難である。
【０００４】
つい最近、ヒトボランティアを短期間の精神的ストレス要因へ曝露すると、末梢血サンプル中に存在する好中球において観察可能なスーパーオキシドアニオン産生の増大を引き起こすことが示された（Ｅｌｌａｒｄら、Ｉｎｔｅｒ．Ｊ．Ｐｓｙｃｈｏｐｈｙｓ．（２００１）４１、９３−１００）。心理学的ストレスへの動物およびヒトの曝露は、好中球を活性化するための公知の化学物質誘導剤であるホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）による曝露に応答してスーパーオキシドアニオンを産生する、末梢血サンプル中の好中球の保持された能力の測定に依って、迅速かつ容易に定量できることが現在見出されている（Ｈｕら、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ（１９９９）１１、３５５−３６０）。この手段によって初めて、既知または疑われる心理学的ストレス要因に対する動物およびヒトの対処能力の定量的な測定を得ることが可能であることが証明されている。
【発明の概要】
【０００５】
ストレスを定量するための本発明の方法は、免疫系の兵器庫の一部を形成する細胞性応答の直接的測定に基づく。これは、潜在的にストレスの多い事象の後に攻撃により誘導される免疫応答を開始する個体の能力に依る。各個体が免疫攻撃に応答する能力を、免疫系活性のそれら自身のベースラインレベルと比較する。既知または疑われる心理学的ストレス要因への曝露の後、好中球におけるスーパーオキシドアニオン産生がインビトロで刺激され、好中球がスーパーオキシドをさらに産生する能力が測定され、結果において、スーパーオキシド産生が既知または疑われるストレスの多い事象によってどの程度減じられたかが決定される。ストレスの多い事象の後に好中球がこのようなインビトロ攻撃に応答する能力は、個体の対処能力として規定される。より高い対処能力を有する個体は、より高い潜在的なスーパーオキシド産生を有し、生理学的に、ストレス後に細菌攻撃によりよく対処することができる。したがって対処能力は、その個体の現在の生理学的状態のインビトロ評価である。
【０００６】
したがって、その最も広い態様において、本発明は、個体（ヒトを含む哺乳動物または鳥であり得る）が、心理学的ストレス要因から生じる変化した生理学的状態を経験しているか否かを決定するための方法を提供し、この方法は、
（ａ）そのような刺激に適切な条件下で、上記個体から得られた好中球を含む試験サンプルを、好中球におけるスーパーオキシド産生を刺激し得る誘導剤と接触させるステップ；
（ｂ）ストレスにより誘導される活性化を免れたかもしくは実質的に免れた、または心理学的ストレス要因として試験すべき要因を含まない同じ措置に曝露された１または複数の個体に少なくとも由来する対照サンプル中の同じ種の好中球が同じインビトロ条件下でスーパーオキシド産生を示す時間後に、試験サンプル中の基準を上回るスーパーオキシド産生の増大を決定するステップ；ならびに
（ｃ）同じ条件下で、上記試験サンプル中で観察された基準を上回るスーパーオキシド産生の増大を、上記（ｂ）で規定される対照サンプル中で観察された基準を上回るスーパーオキシド産生の増大と比較するステップ
を含み、ここで、試験サンプル中のより低いスーパーオキシド産生は、個体の生理学的状態に対する心理学的ストレス要因の影響を示す。必要な場合または所望される場合、各サンプルについての基準を上回る測定されたスーパーオキシド産生は、サンプル中の白血球または好中球の数を参照して補正され得る（ある範囲の白血球は呼吸バーストを生じ得るが、好中球はスーパーオキシド産生の大部分を担う）。上に示したように、インビトロで誘導されたスーパーオキシド産生についての基準を上回る、白血球またはより具体的には好中球の剰余の能力が、対処能力と称され得る。
【０００７】
対照好中球は、ストレスにより誘導される活性化を完全に免れていない可能性があるが、研究のために選択される、疑わしいまたは既知の心理学的ストレス要因への個体の曝露の前に、同じ個体または同じ種の個体から必ず得られる。例えば、実施例１は、輸送されたアナグマ由来の攻撃により誘導された好中球の活性化についての剰余の能力と、捕獲されたが輸送されていないアナグマ（対照）由来の好中球のこのような剰余の能力との比較に基づいて、単に捕獲されただけのアナグマと比較して輸送のさらなるストレス誘導効果を定量した、アナグマに対するこのような方法の適用を示す。実施例２は、野生哺乳動物（例えば、英国の田舎において見出され得るような野生哺乳動物）に対する取扱いのストレス誘導効果を定量するための本発明の適用をさらに示す。実際、本発明は、動物の健康状態を改善するために野生生物の保護、獣医科学および動物管理の分野において広い適用を有し、以下にさらに議論されるようなヒトへの適用も同様に有する。
【０００８】
本発明の方法において使用されるサンプルは、最も簡便には全末梢血サンプルでよく、したがって、このような方法は迅速な結果を提供し、フィールドまたは実験室で利用され得る。このような方法は、心理学的ストレス要因を解明するため、または個体が心理学的ストレス要因への最近の曝露もしくは継続する曝露を被っているか否かを決定するために使用できる。上に示したように、最も重要なことに、本発明は、既知または疑わしい心理学的ストレス要因に対処する個体の能力を定量する手段を初めて提供する。
【０００９】
したがって、好ましい実施形態において、心理学的ストレス要因への曝露に対する個体の対処能力を決定するための方法が提供され、ここで、上に規定されるような方法中のステップ（ａ）の前に、上記個体がある時間にわたって心理学的ストレス要因に曝露され、それにより、このストレス要因によって誘導されたストレスに対して感受性の同じ種の個体中の好中球は増大したスーパーオキシド産生を示し、ここで、ステップ（ｃ）で決定された基準を上回る試験サンプル中のインビトロで誘導されたさらなるスーパーオキシド産生の程度は対処能力の測定である。
【発明の詳細な説明】
【００１１】
本発明の方法は、好中球が化学物質により誘導されたスーパーオキシド産生に適切な全血サンプル中に存在する任意の様式で個体から得た好中球に対して実施され得る。例えば、ヒトの場合、このようなサンプルは単純な指刺しによって得られる。必要な場合、本発明の方法において使用するための全血サンプルは、抗凝固薬で処理され得る。
【００１２】
直接的にかまたはさらなる処理の後に試験すべきサンプルは、疑わしいまたは既知の心理学的ストレス要因に関する個体の曝露の間またはその直後に得られる。１つまたは複数のサンプルが、既知または疑われる心理学的ストレス要因への曝露の後に採取される場合、最初のこのようなサンプルは一般に、できるだけ速やかに得られる。疑わしいまたは既知の心理学的ストレス要因への曝露の間および／またはその後の異なる時点（例えば、疑わしいまたは既知の心理学的ストレス要因への曝露の１分〜５分、１０分、１５分、２０分または３０分以内）で採取された同じ個体由来の複数のサンプルを試験することができる。ストレス応答のピークおよび／または個体の回復速度を決定するために、心理学的ストレス要因への曝露の後の異なる時点で得られた複数のサンプルを試験することができる。あるいは、単純さおよび速度のために、既知のストレス要因に対する個体の対処能力が、このストレス要因への曝露の後の単一の時点で試験され得る。動物におけるストレスについて試験する場合、動物の麻酔下、このサンプルは得られる。
【００１３】
本発明に従って試験すべきサンプルは、好中球におけるスーパーオキシド産生を刺激し得る任意の化学物質誘導剤と接触できる。この方法において使用される誘導剤は、好ましくはホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）でよく、より具体的には、例えばＳｉｇｍａから入手可能な微生物産物であるホルボール１２−ミリステート１３−アセテートであってよい。しかし、使用できる代替的な誘導剤は周知である。これらには、Ｎ−ホルミル−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ（ｆＭＬＰ  走化性ペプチド）、ザイモサン、リポ多糖またはアドレナリンが含まれる。適切なリポ多糖は、グラム陰性細菌（例えば、大腸菌）の細胞壁から得られる。誘導剤の組合せ（例えば、ＰＭＡとｆＭＬＰとの組合せ）が使用できる。誘導剤の適切な濃度ならびに誘導の期間および温度は、必要な場合、単純な実験によって決定できる。ＰＭＡの場合、典型的に、ＰＭＡは約１０−６Ｍ〜１０−３Ｍで全血サンプルに添加すればよく、サンプルの温度は約３７℃に維持できる。スーパーオキシド産生は、種々の時点で測定できるか、または適切な単一の測定時点を決定できる。
【００１４】
誘導剤に応答したスーパーオキシド産生は、任意の公知の手段によって測定できる。しかし、好ましくは、化学発光測定が使用され、それは、高い感度と合せて簡便だからである。この目的のために、Ｈｕら、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ（１９９９）１１、３５５−３６０に記載されるように、ルミノール（５−アミノ−２，３−ジヒドロフタラジン）またはイソルミノール（６−アミノ−２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン）などの適切な増幅剤がスーパーオキシドを検出するために利用され得る。化学発光は、携帯用化学ルミノメータを使用して簡便に測定できる。この方法において、ストレス要因に対する対処能力は、実験室の外でさえ容易に定量できる。上に示されたように、スーパーオキシド産生のレベルは、サンプルへの誘導剤の添加後の１つの時点で測定されてもよく、複数の時点で測定されてもよい。典型的に、スーパーオキシド産生は、誘導剤の添加後に１分と１０分との間の間隔の複数の時点で（例えば５分毎に）、５分間と１時間との間の合計時間期間にわたって（例えば３０分間にわたって）測定される。好ましくは、スーパーオキシド産生のレベルは、同じ種の対照好中球（ストレスにより誘導される活性化を免れたかもしくは実質的に免れた）が同じインビトロ条件下で最大のスーパーオキシド産生を示す時間後に測定する。この時点は、心理学的ストレス要因に曝露されていない個体から得られたサンプルを試験し、誘導剤の添加後に種々の時点でスーパーオキシド産生を測定することによって決定できる。好ましい時点で、ストレスに曝露された個体由来のサンプルとストレスに曝露されていない個体由来のサンプルとの間のスーパーオキシド産生の差異がその最高値にあることが予測される。したがって、この試験は、理想的にはストレスの結果としての任意の変化に対してより敏感である。
【００１５】
誘導剤に応答したスーパーオキシドの産生は、同じサンプルまたは同じ個体から採取したさらなるサンプルの、誘導剤の非存在下での基準のスーパーオキシド産生と比較される。上に示されるように、サンプル中の測定されたスーパーオキシド産生はまた、ドナー中の循環白血球の差異を考慮するために、白血球数または好中球数によって除算され得る。
【００１６】
本発明の方法は、同じ心理学的ストレス要因に対する個体の応答を評価し、特定の心理学的ストレス要因に対する対処能力を個体間で比較するために使用できる。例えば、２以上の個体（例えば２人以上のヒト）は、上に示した本発明の好ましい実施形態に従って、既知のストレス要因に曝露でき、それらの対処能力が同じ時点で測定できる。次いで、これらの結果は、試験した個体のどれがその心理学的ストレス要因への曝露に最良に対処したかを見出すために比較できる。好中球におけるインビトロで誘導されたスーパーオキシド刺激によって決定した場合により低い対処能力を有する個体は、同じストレス要因への曝露後に同じ様式で決定されたより高い対処能力を有する個体よりも、このストレス要因にうまく対処することができない。したがってこの方法は、ストレスの多い事象の後に、対処する個体の能力の迅速な評価が必要であるか、または他の個体よりも良好に認識された心理学的ストレス要因に対処する能力に基づいて個体を選択することが所望される状況において、特に使用される。このような方法は、例えば、仕事が心理学的ストレス要因への曝露をもたらすことが既知である場合に、ヒト個体にとっての仕事選択手順の一部を形成することがある。
【００１７】
本発明の方法はまた、同じ個体または個体の群（例えば、同じ種由来の個体のサンプル）に対する異なるストレス要因の影響を比較するために使用できる。この場合、各ストレス要因に応答した個体の対処能力は、どれが最もストレスを与えるものかを決定するために、定量および比較される。あるいは、推定ストレス要因を、ストレスを示す個体の生理学的状態の変化を生じるか否かを決定するために試験することができる。
【００１８】
上に示したように、本発明の方法は、ヒトだけでなく、非ヒト哺乳動物およびさらには鳥にも適用可能である。例えば、本発明の方法は、ウシ、ブタ、ヒツジ、子ヒツジおよび家禽（例えばニワトリ）などの家畜に適用できる。重要なことに、このような方法は、家畜が「ストレスなし」と表示され得る食肉製品を提供することを目的とした屠殺の前に有意なストレスを被っているか否かを評価するために使用できる。本発明の方法はまた、「ストレスなし」または「ストレスのない動物から得られた」と表示され得る広範な他の製品（例えば、乳製品（例えば、ミルク、粉ミルク、チーズ、エバミルク、コンデンスミルクおよびアイスクリーム）、本発明に従って試験したヒツジおよび子ヒツジ由来の羊毛、本発明に従って試験したアラパカ、ラマ、ラクダ、ヤクおよびヤギのような動物由来の動物の微細な毛、ならびに刷毛（筆）製造のための動物の粗い毛）を提供する目的で家畜に適用できる。本発明の方法は、「ストレスのないニワトリ」由来として売買され得る玉子を得る目的のためにニワトリに適用できる。本発明の方法はまた、牧畜技術を改善するために家畜に適用できる。例えば、このような方法は、「ストレスなしの農場」としての農場の証明のために適用できる。本発明の方法はまた、すでに上記したアナグマの研究によって示され、以下の実施例１においてさらに記載されるように、野生生物の保護およびケアにおいて適用を見出す。
【００１９】
本発明の方法は、ヒトの労働環境の人間工学的効率を評価および改善する際に適用できる。したがって、本発明の方法は、オフィス設計、家具設計、照明、彩色、労働環境の暖房、ならびにコンピュータのようなオフィス機器の設計において適用を有し得る。本発明の方法は、健康状態およびストレス要因の減少を増強するために、輸送設計、レジャー設備（例えば、スパおよびジム）の設計およびショッピング設備のような多様な分野でさらに適用を見出し得る。本発明の方法はまた、「ストレスなし」としての動物用小屋（例えば、ネコおよび／またはイヌ用）を証明するための適用を見出し得る。
【００２０】
本発明に従う対処能力の評価は、スポーツ科学の分野で多数の適用を有することもまた想定される。実施例５は、マラソン後にマラソン走者から採取した血液サンプル中の白血球対処能力の減少によって証明されるように、マラソン走行のストレスが攻撃に応答する免疫系の能力を低下させるという予測を確認するための本発明の方法の使用を記載している。他のスポーツ活動に参加しているスポーツマンおよびスポーツウーマンに適用される同様の研究は、彼らのパフォーマンスおよび健康状態を改善する際に価値のあるものであり得る。
【００２１】
本発明はまた、医療（例えば手術）の前に患者のストレスを評価するため、医療手順に関連するストレスを評価するため、および回復を助けてさらなる感染のリスクを低下させ得る患者へのストレスを最小化するためのこのような手順の最適化において、医学の分野で適用できる。
【００２２】
さらなる態様において、本発明はまた、ストレス緩和薬物についてスクリーニングする方法を提供し、この方法は、試験化合物を非ヒト哺乳動物に投与するステップ、非ヒト哺乳動物を心理学的ストレス要因に曝露させて、本発明に従う方法を使用して非ヒト哺乳動物の対処能力を測定するステップ、および試験化合物の投与後の非ヒト哺乳動物の対処能力をこの試験化合物の非存在下での非ヒト哺乳動物の対処能力と比較するステップを含み、ここで、試験化合物の投与後の対処能力の増大は、この試験化合物のストレス緩和能力を示す。
【００２３】
上記のスクリーニング方法において使用される非ヒト哺乳動物は、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモットまたは他の哺乳動物であり得る。この非ヒト哺乳動物は、例えば不愉快な刺激またはストレスの多い状況であり得るストレス要因に供される。動物において、このストレス要因は不慣れな環境への曝露であり得る。例えば、ラットは、「高架式十字」のような不慣れな環境中に配置され得る。このストレス要因は社会的ストレスでもあり得、例えば、ストレスは、マウスを個々の籠に収容し、次いで新参のマウスを導入することによってマウスにおいて誘導され得る。他の適切な心理学的ストレス要因は、このようなストレス要因への曝露を決定するための本発明の方法を使用して同定できる。
【００２４】
上記のスクリーニング方法において試験され得る適切な試験物質には、コンビナトリアルライブラリー、規定された化学物質および化合物、ペプチドおよびペプチド類似体、オリゴヌクレオチドおよび天然物ライブラリー（例えば、ファージディスプレイライブラリー）ならびに抗体産物が含まれる。典型的に、有機分子、好ましくは５０ダルトン〜２５００ダルトンの分子量を有する有機低分子がスクリーニングされる。候補物質は、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、それらの誘導体、構造アナログまたは組合せを含む生体分子であり得る。候補薬剤は、合成化合物または天然化合物のライブラリーを含む広範な種々の供給源から得られる。公知の薬理学的薬剤が、指向性または無作為な化学的改変（例えば、構造アナログを生成するためのアシル化、アルキル化、エステル化またはアミド化）に供され得る。
【００２５】
上記のようなスクリーニング方法によって同定されたストレス緩和薬物は、合成および／または医薬組成物へと処方することができる。薬学的に許容される担体および／または賦形剤を用いた処方は、薬学の分野で慣用の方法を使用して実施できる。したがって、処方様式は、物質の性質および処置すべき状態のような要因に依存する。任意のこのような物質が種々の投薬形態で投与できる。これは例えば、経口的に（例えば、錠剤、トローチ剤、ロゼンジ、水性または油性の懸濁物、分散可能な粉末または顆粒として）、非経口的に、皮下に、静脈内に、筋肉内に、胸骨内に、経皮的に、または注入技術によって投与できる。
【００２６】
一旦個体が本発明の方法によってストレスを被っていると診断されると、彼らにストレス緩和処置が提供できる（例えば、彼らに公知のストレス緩和薬物が投与され得る）。したがって、なおさらなる態様において、本発明は、本発明の方法によってストレスを被っていると同定された個体（例えばヒト）を処置するための医薬の製造におけるストレス緩和薬物の使用を提供する。例えばストレス緩和薬物の投与によってストレスについて個体を処置する方法がさらに提供され、ここでこの個体は、本発明の方法によってストレスを被っていると同定されている。
【００２７】
このような方法において使用するためのストレス緩和薬物は、ストレスを低減し、ストレスの症状を改善または軽減する薬物、あるいはストレス関連障害を処置する薬物であり得る。例えば、この薬物は、公知の抗不安剤もしくは抗鬱剤、またはこのような薬物治療への添加物（例えばトリプトファンのような薬物）であり得る。抗不安薬物の主なクラスは、ベンゾジアゼピン類（例えば、ジアゼパムおよびアルプラゾラム）；５−ＨＴ１Ａ受容体アゴニスト（例えば、ブスピロン）；およびβ−アドレナリン受容体アンタゴニスト（例えば、プロプラノロール）である。抗鬱薬物の主なクラスは、三環式抗鬱剤（例えば、イミプラミンおよびアミトリプチリン）；選択的セロトニン再取り込み阻害剤（例えば、フルオキセチン、フルボキサミン、パロキセチンおよびセルトラリン）；モノアミンオキシダーゼインヒビター（例えば、フェネルジン、トラニルシプロミン、クロルジリンおよびモクロベミド）；ならびに異型の抗鬱剤（例えば、ノミフェンシン、マプロチリン、ミアンセリン、ブプロピオンおよびトラゾドン）である。
【００２８】
本発明は、提案されたストレス緩和処置の有効性を試験する方法に使用することができ、この方法は、この処置の存在下および非存在下で個体（例えばヒト）を心理学的ストレス要因に曝露させるステップ、ならびに上記のようにこれらの個体の対処能力を決定するステップを含む。試験すべき処置は、例えば、ストレスの緩和をもたらす目的で設計されたデバイス、仕掛けもしくはおもちゃの取扱い、またはストレスの緩和をもたらすことを目的として構成された特定の環境（例えば、アロマテラピーにおける匂い、光および／もしくは画像または音のパターン）への曝露であり得る。任意のこのような処置の有効性は、対処能力の増大を示す攻撃により誘導されたスーパーオキシド産生の増大によって示される。
【００３１】
以下の実施例は、野生動物およびヒトボランティアの両方に対する本発明の適用を示す。
【実施例】
【００３２】
実施例１  野生アナグマの捕獲および輸送
上に示したように、インビトロの活性化に対する血液の好中球の剰余の能力から決定されるより低い対処能力に反映されるように、アナグマの輸送が、輸送なしのこのような動物の捕獲と比較して実質的なさらなる心理学的ストレスを引き起こすという予測を試験するために本実験を実施した。
【００３３】
方法
【００３４】
（ａ）アナグマの捕獲および輸送
アナグマを、２００１年の８月および１１月に、落花生を餌として籠罠で、英国オックスフォードシャー州、Ｗｙｔｈａｍ  Ｗｏｏｄｓにおいて捕らえた（この研究の場所およびアナグマ集団の詳細については、ＭａｃｄｏｎａｌｄおよびＮｅｗｍａｎ（２００２）Ｊ．Ｚｏｏｌ．２５６、１２１−１３８を参照のこと）。この種についてのストレスの測定は、その特異な社会システム（ＭａｃｄｏｎａｌｄおよびＮｅｗｍａｎ  ２００２）およびウシＴＢの疫学におけるその役割の研究において直接有用であるので、アナグマを選択した。また、アナグマの研究、保護および管理はアナグマの捕獲および取扱いを必要とするので、代替的な手順を評価する手段は有用である。その集団の個体の生活史が、利用される罠および取扱いの手順が最高の福祉標準へと洗練された１４年間にわたってモニタリングされているので、その特定の集団を選択した。アナグマ罠を、１４．００時と１７．００時との間にアナグマの巣穴の隣に設置した。罠を毎朝０６．３０時と０７．００時との間にチェックし、罠で捕らえたアナグマを個々の保持籠に移した。
【００３５】
次いで動物を、以下の２つの実験措置のうち１つに割当てた：輸送なしで捕獲の場所でのサンプリング（非輸送、ｎ＝８）または輸送直後のサンプリング（輸送、ｎ＝８）。輸送は、全地形型四輪バイクによって牽引されたトレーラー上での１０分未満の短い車載からなった。保持籠に入れている間は、アナグマを布で覆った。アナグマを、０．２ｍｌ／ｋｇの用量の塩酸ケタミン（「Ｋｅｔａｓｅｔ」、Ｆｏｒｔ  Ｄｏｄｇｅ、米国）の筋内注射を使用して、捕獲の場所でまたは輸送後のいずれかで麻酔した。処理は、アナグマの体重および体長の測定、ならびに性別および状態の記録からなった。他の測定値もまた、進行中のアナグマ集団研究の一部として採取した。血液を、頚静脈の針静脈穿刺によって採取し、抗凝固薬のカリウムＥＤＴＡ（ＢＤ  Ｖｕｃｕｔａｉｎｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｐｌｙｍｏｕｔｈ、英国）を含むチューブ中に収集して、ＰＭＡ攻撃のために即座に採取した。分画血球数を、アルコール中で固定した血液スメアから行い、Ｍａｙ−Ｇｒｕｎｗａｌｄ染色およびＧｉｅｍｓａ染色で染色した（スライド１枚当たり最少１００細胞）。
【００３６】
（ｂ）ＰＭＡ攻撃および対処能力の測定
バックグラウンドの血液の化学発光レベルを測定するために、１０μｌの全血をシリコン反射防止チューブ（Ｌｕｍｉｖｉａｌ、Ｅ  Ｇ  ＆  Ｇ  Ｂｅｒｔｈｏｌｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に移し、これに、リン酸緩衝液で希釈した１０−４Ｍのルミノール（５−アミノ−２，３−ジヒドロフタラジン；Ｓｉｇｍａ  Ａ８５１１）９０μｌを添加した。次いでこのチューブを穏やかに振盪した。攻撃に応答して産生された化学発光を測定するために、別のチューブを、１０−６Ｍ濃度の微生物産物であるホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ；Ｓｉｇｍａ  Ｐ８１３９）１０μｌを添加して、上記のように準備した。ＰＭＡを少量のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ；Ｓｉｇｍａ  Ｄ５８７９）に溶解し、次いでＰＢＳで１０−６Ｍの濃度まで希釈した。各チューブについて、化学発光を、携帯用化学ルミノメータ（Ｊｕｎｉｏｒ  ＬＢ  ９５０９  Ｅ  Ｇ  ＆  Ｇ  Ｂｅｒｔｈｏｌｄ、ドイツ）中で、合計３０分間にわたり、５分毎に３０秒間にわたって測定した。化学ルミノメータ内に入れていない場合、チューブは３７℃でインキュベートした。
【００３７】
ある範囲の白血球は呼吸バーストを生じ得るが、好中球は酸素フリーラジカル産生の大部分を担うので、好中球１０９個／ｌの量当たりの白血球対処能力（ＬＣＣ）もまた試験した。これはまた、ストレス後の循環好中球の数の変化の潜在的な影響に関してＬＣＣを試験する方法を提供した。
【００３８】
（ｃ）統計的分析
輸送ありおよび輸送なしでのアナグマにおける対処能力の差異を比較するために、従属変数として各時間間隔での応答を、処理変数として輸送措置を用いて、多変量分散分析（ＭＡＮＯＶＡ）を使用した。この手順を、Ｗｉｎｄｏｗｓリリース１０．０．５用ＳＰＳＳで実施した。データを、このデータが多変量正規性の仮定を満たすことを確実にするために、分析前に対数変形した（ＴａｂａｃｈｎｉｃｋおよびＦｉｄｅｌｌ（１９９６）、Ｕｓｉｎｇ  Ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ、第三版、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：ＨａｒｐｅｒＣｏｌｌｉｎｓ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）。ウィルコクスンの符号付き検定（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ  Ｓｉｇｎｅｄ  Ｒａｎｋｓ  Ｔｅｓｔｓ）を使用して、個体の対処能力をその基準の応答と比較した。
【００３９】
（ｄ）動物福祉の考慮
Ｗｙｔｈａｍ  Ｗｏｏｄｓのアナグマ集団は長期の科学的調査下にあり、アナグマはその生涯を通じて定期的に罠で捕らえられて輸送される。輸送ストレスを試験することは、最良の実施の継続的な改良の一部である。研究をＥｎｇｌｉｓｈ  Ｎａｔｕｒｅライセンス１９９１５３７およびＨｏｍｅ  ＯｆｆｉｃｅライセンスＰＰＬ  ３０／１８２６の下で実施した。
【００４０】
結果
２群の動物（輸送群（ｎ＝８）および非輸送群（ｎ＝８））における基準のスーパーオキシド産生および対処能力を図１に示す。輸送は、アナグマにおいて対処能力を有意に低下させた（Ｆ７，８＝４．５、ｐ＜０．０５）。輸送個体と非輸送個体との間の対処能力の差異は、１５分目で最大であった（Ｆ１，１４＝８，９、ｐ＜０．０５；図１）。しかし、非輸送個体のうち２匹は、周囲温度が予期せず氷点より下に下がった夜間に捕獲され、これらの個体はこの群についての典型的な応答を示さなかった。また両方の場合において、これらの個体の対処能力はその基準の応答以下であった（ウィルコクスンの符号付き検定、両方の場合についてＺ＜−１．０、ｐ＞０．１）。輸送措置は、基準のスーパーオキシド産生に対して影響を有さなかった（Ｆ７，８＝２．５、ｐ＞０．０５）。しかし、化学発光の非刺激レベルにおける個体の差異に起因したＬＣＣ結果の偏りがないことを確実にするために、本発明者らは、各動物についてＰＭＡ刺激値からこの基準値を差し引いた（ＰＭＡ非刺激）。
【００４１】
輸送は、１０分目からＰＭＡ非刺激値に対して影響を有して（Ｆ１，１４＝４．１；Ｐ＝０．０６）、その差異は１５分目にピークに達し（Ｆ１，１４＝９．４；Ｐ＝０．００８）、したがって、上記のＬＣＣ値と一致したパターンを示した。
【００４２】
２つの群の間で白血球数における差異が存在し、輸送個体は有意により低い数の白血球を有した（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ＝１１．０、ｐ＜０．０５）。さらに、白血球組成も群間で異なった。輸送動物は、より高い割合で好中球を有し（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ＝１３．５、ｐ＝０．０５）、対応してより低い割合でリンパ球を有した（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ＝７．５、ｐ＜０．０１）。好中球１０９個／ｌ当たりのＬＣＣの計算により全体的なＬＣＣと同じパターンが得られ、このことは、好中球１個当たりの活性が非輸送個体においてより高かったことを示す（図２を参照）。
【００４３】
これらの結果は、フリーラジカルを産生する循環白血球の能力をストレスが劇的に低下させることを示し、対処能力が特定の事象に関連したストレスの定量可能な測定であることを支持する。全ての輸送個体における対処能力のかなり均一な低下は、このストレス要因が、非輸送個体の対処応答を特徴付けた個々の変動の源を無効にしたことを示唆する。
【００４４】
実施例２  野生小動物の取扱いによって誘導されるストレスの定量
本研究の目的は、ＰＭＡ攻撃に応答してスーパーオキシドを産生する動物の循環白血球の能力を測定することによって、野生の小動物、より具体的にはモリネズミ（Ａｐｏｄｅｍｕｓ  ｓｙｌｖａｔｉｃｕｓ）およびハタネズミ（Ｃｌｅｔｈｒｉｏｎｏｍｙｓ  ｇｌａｒｅｏｌｕｓ）、における取扱いに対するストレス応答を調査することであった。
【００４５】
方法
【００４６】
（ａ）実験設計
１群の動物を、生態学的研究または行動研究についてと同じ方法で取り扱い、次いで麻酔した。取扱いにより、増大した心拍数および試みられた逃亡行動を特徴としたストレス応答がもたらされ、取扱いは、野生動物にとって一般にストレスが多い。別の群の動物を取扱いなしに麻酔した。取扱い動物を、プラスチックのバッグ中に優しくひっくり返すことによって罠から取り出し、次いでその首筋で取り扱い、種を同定して、保持ポット中に配置し、麻酔した。非取扱い動物を、取り出しも取扱いもなしに罠の中で麻酔した。最初に、各罠の正面ドアを開放し、内側の動物を簡単に観察して、麻酔を受けるのに適切な状態であることを確認した。次いで全ての罠を、実験の前に少なくとも３０分間にわたって暗い静かな部屋の中に放置して、最初の観察が実験を妨害しなかったことを確認した。非取扱い動物は、取扱いが対処能力の抑制を引き起こすか否かを決定するために使用できる動物の比較可能なサンプルを提供するように作用した。全ての動物を、酸素とイソフルランとの混合物を使用して麻酔した（Ｍａｔｈｅｗｓら、Ｖｅｔ．Ｒｅｃ．（２００２）１５０、７８５−７８７）。
【００４７】
本研究に使用した小さい哺乳動物は、Ｓｏｕｔｈ−Ｗｅｓｔ  Ｅｎｇｌａｎｄの２つの商業的な酪農場の生垣の列に沿って５ｍ間隔で対にして配置したＬｏｎｇｗｏｒｔｈライブトラップ中で一晩罠により捕らえた。罠は、食料および水の供給源として約１４ｇの「Ｊｏｓｉｅ」ウサギ食（Ｄｅｌｔａ  Ｐｅｔ  Ｆｏｏｄｓ  Ｌｔｄ．、Ｌｌａｎｄｏｖｅｒｙ、Ｃａｍａｒｔｈｅｎｓｈｉｒｅ、ＵＫ）およびリンゴ（約５ｇ）を餌とした。実験室での試験により、この餌混合物が両方の種によって直ぐに食べ尽くされることが明らかとなった。提供された餌の量は、罠中に居る期間の間に餌が任意に有効に入手可能であったことを意味した。罠を１５００時に設置し、次の朝０８００時に収集した。
【００４８】
麻酔下で、動物の性別および生殖状態（オスにおける精巣の状態およびメスにおける交尾または妊娠の指標に基づく）を決定した。繁殖状態にあるオスおよびメスのみを研究に含めた。次いで動物をデジタル秤上で０．１ｇの単位まで計量し、鼻先から肛門までの体長を１ｍｍの単位まで測定した。数匹の若い動物をサンプリングするには小さすぎるとみなし、結果として成体の動物（１５ｇ以上）のみをこの分析に含めた。動物にはまた、再捕獲された場合にこれらの動物を後に同定するために使用できる個体の毛皮クリップマークを付けた。動物にとって利用可能な資源の指標として体重を使用した。小さい哺乳動物について、体重は計算された身体状態の指標よりも保存された蓄えのレベルとより密接に関連するので、これは適切である。本発明者らはノミの存在または非存在もまた記録した。なぜならこれらの比較的一般的な寄生虫の存在は、動物のエネルギーバランスに潜在的に影響を与え得るからである。研究をＨｏｍｅ  Ｏｆｆｉｃｅライセンス  ＰＰＬ  ３０／１８２６の下で実施した。
【００４９】
【表１】
0004571864.tif 000002
【００５０】
（ｂ）ＰＭＡ攻撃および対処能力の測定
血液を、尾部の静脈穿刺によって動物から採取し、各動物から３０μｌをヘパリン化キャピラリーチューブに収集した。非刺激血液化学発光レベルを測定するために１０μｌの全血をシリコン反射防止チューブ（Ｌｕｍｉｖｉａｌ、Ｅ  Ｇ  ＆  Ｇ  Ｂｅｒｔｈｏｌｄ、ドイツ）に移し、これに、リン酸緩衝液で希釈した１０−４Ｍのルミノール（５−アミノ−２，３−ジヒドロフタラジン；Ｓｉｇｍａ  Ａ８５１１）９０μｌを添加した。次いでこのチューブを穏やかに振盪した。攻撃に応答して産生された化学発光を測定するために、別のチューブを、１０−４Ｍの濃度で１０μｌのホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ；Ｓｉｇｍａ  Ｐ８１３９）を添加して上記のように準備した。ＰＭＡを、少量のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ；Ｓｉｇｍａ  Ｄ５８７９）に溶解し、次いでＰＢＳで１０−４Ｍの濃度で希釈した。各チューブについて、化学発光を、携帯用化学ルミノメータ（Ｊｕｎｉｏｒ  ＬＢ  ９５０９  Ｅ  Ｇ  ＆  Ｇ  Ｂｅｒｔｈｏｌｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中で合計３０分間、５分毎に測定した。化学ルミノメータ内に入れていない場合、チューブは３７℃でインキュベートした。白血球対処能力（ＬＣＣ）を、ＰＭＡ攻撃に応答して測定された全血化学発光非刺激全血において測定された化学発光として各個体について計算した。
【００５１】
（ｃ）統計的分析
取扱いありおよびなしの対処能力の差異を比較するために、多変量ＧＬＭ（一般線形モデル）を使用した。各時間間隔での化学発光レベルが従属変数であった。このアプローチは各時間間隔での処置の効果の試験を可能にし、処置の効果の性質についてのさらなる詳細を与え、処置効果が最大であった時間間隔の同定を可能にするので、このアプローチを選択した。一変量ＧＬＭもまた、ピーク対処能力に有意に影響を与えた要因を試験するために使用した。対処能力値を、データの正規性のＧＬＭ要件を満たすように分析前に対数変形した。少数の負の値（−１０以上）をゼロとして扱った。この手順を、Ｗｉｎｄｏｗｓリリース１０．０．５用ＳＰＳＳで実施した。
【００５２】
結果
４０匹の動物を本研究のために捕獲し、麻酔前に、これらのうち２５匹を取り扱い（１６匹のハタネズミおよび９匹のモリネズミ）、１５匹は取り扱わなかった（９匹のハタネズミおよび６匹のモリネズミ）。取扱いにより、ＬＣＣの顕著な低下がもたらされ、ＬＣＣの変動が減少した（図３を参照のこと）。多変量ＧＬＭにより、取扱いがＬＣＣを有意に低下させ（Ｆ６，３３＝５．１、Ｐ＝０．００１）、これが全ての時間間隔で当てはまったことが明らかとなった（５分  Ｆ１，３８＝９．９、Ｐ＝０．００３；１０分  Ｆ１，３８＝２０．７、Ｐ＝０．００１；１５分  Ｆ１，３８＝２６．３、Ｐ＝０．００１；２０分  Ｆ１，３８＝３０．４、Ｐ＝０．００１；２５分  Ｆ１，３８＝２４．９、Ｐ＝０．００１；３０分  Ｆ１，３８＝２２．７、Ｐ＝０．００１）。このモデルにおいて、それ自体で変数としても（Ｆ６，３１＝０．３、Ｐ＝０．９）、取扱い処置との相互作用変数としても（Ｆ６，３１＝０．４、Ｐ＝０．９）、種の影響は存在しなかった。
【００５３】
ＬＣＣは、２５分後に取扱い動物および非取扱い動物について最も変化し、この２５分後の時点はＬＣＣのピークでもあった。取扱い動物のより均一な応答を考慮してさえ、これらの個体における２５分後のＬＣＣの範囲は、２２０相対光単位（最小−１０、最大２１０、平均３９．３、ＳＤ  ６２．９）であった。ＧＬＭを２５分目のＬＣＣデータ（ＬＣＣ２５）を使用して生成し、これは、処置、処置×体重相互作用および処置×ノミ相互作用を含んだ。このモデルは、ＬＣＣ２５で、有意な処置×体重相互作用が存在する（Ｆ２，３５＝４．１、Ｐ＝０．０２４）が、有意な処置×ノミ相互作用の証拠は存在しなかった（Ｆ２，３５＝０．３４、Ｐ＝０．９１）ことを示した。処置×体重相互作用を調査するために、本発明者らは、取扱い動物および非取扱い動物についての個々のＧＬＭをさらに生成した。これらのモデルは、非取扱い動物において体重が有意かつ正にＬＣＣ２５と関連した（図２；Ｆ１，１３＝５．６、Ｐ＝０．０３４）が、動物を取り扱った場合にはこの関係が失われた（Ｆ１，２３＝０．６、Ｐ＝０．４２）ことを示した。
【００５４】
したがって本研究は、白血球対処能力がストレスの定量可能な測定であることを再度示した。認識されたストレス要因である取扱いは、ＰＭＡに対する循環白血球の応答を抑制した。取扱いによってもたらされた抑制のレベルが動物の体重に関連するという証拠はなかったが、より重い非取扱い動物は、より大きいピークＬＣＣ値を有した。取扱いしていない動物の応答と比較してかなり低下したものの、ＰＭＡに対する取扱い動物の応答には変動が存在したが、個々の動物にとって利用可能な資源のレベルがこの変動を説明し得ることを支持する証拠は見出されなかった。
【００５５】
実施例３  架空のストレスの多い事象の観察
本研究の目的は、潜在的にストレスの多い事象を見ることがヒトボランティアに対して与える影響を評価することであった。
【００５６】
方法
【００５７】
（ａ）被験者
ヘルシンキ宣言に従って、Ｃｏｖｅｎｔｒｙ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅからの地方倫理委員会の認可およびインフォームドコンセントを、本試験の開始前に得た。１４人の被験者全てが適正に適合し、２０歳〜２６歳の間の健常人被験者が本試験に参加した。除外基準には、精神疾患、呼吸疾患もしくは心血管疾患に罹患していること、喫煙者、またはその前の月の内の処方薬の摂取が含まれた。
【００５８】
（ｂ）設計
実験は、十分に標準化された手順に従って午後に実施した。被験者は、試験の前の４８時間に運動およびアルコールも避け、試験開始前２時間断食するように指示した。両群を１５分間静かに座らせて、安静時血圧、心拍数および安静時血液サンプルを得た。次いで、ストレスなし（対照条件）またはホラー映画への曝露の形態での心理学的ストレスのいずれかに曝露させる１５分前に、全ての被験者から血液サンプルを採取した。この時点を−１５分とした。被験者は、自分たちが割当てられる群について事前の知識を有さなかった。
【００５９】
８人の被験者を、被験者の誰もが以前に見たことのない８３分間のホラー映画（Ｔｈｅ  Ｔｅｘａｓ  Ｃｈａｉｎｓａｗ  Ｍａｓｓａｃｒｅ、１９７４、Ｔｏｂｅ  Ｈｏｏｐｅｒ監督および製作、Ｅｖｅｒｅｔｔ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｉｎｃ）の形態での心理学的ストレスに曝露させた。残りの６人の被験者は対照群とした。この６人に、類似の照明条件下で同じ長さの時間（８３分間）静かに座っているように指示し、彼らがそう望む場合には感情的に刺激しない読み物を与えた。これは、教科書、雑誌の記事および健康情報のリーフレットからなった。反復した測定設計を以下の２群：実験群（ホラー映画を見ている）および対照群で実施した。血液サンプル、心拍数および血圧の測定を、「ストレスの多い事象」または対照条件のいずれかへの曝露の１５分前および直後（８５分目）に得た。
【００６０】
（ｃ）心拍数および血圧の測定
心拍数トランシーバ（Ｐｏｌａｒ、Ｈｅａｒｔ  ｒａｔｅ  ｍｏｎｉｔｏｒ）を胸部に直接取り付けて心拍数をモニタリングした。参加者を座らせ、気楽にしてもらい、目を閉じて鼻から呼吸してもらった。この手順を、実験室への到着の前または到着の際に経験される可能なストレスレベルを最小化するために、１５分間の期間にわたって実施した。この期間の最後に、ベースライン心拍数を記録し、第一の血液サンプルを採取した（以下のサンプルプロトコールを参照のこと）。次いで参加者に、静かに読書するようにかまたは別室でホラー映画を見るように指示した。課題の完了時に、心拍数を再度記録し、さらなる血液サンプルを採取した。全身血圧（ＢＰ）を、アネロイド血圧計（Ａｃｃｏｓｏｎ，（Ｓｕｒｇｉｃａｌ）Ｌｔｄ、Ｌｏｎｄｏｎ）および聴診器（Ｈａｒｖａｒｄ  Ｌｔｄ、Ｅｄｅｎｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）を使用して測定した。２０μｌの指刺し血液サンプルを指定された時点で得た。
【００６１】
（ｄ）ＰＭＡ攻撃および対処能力の測定
バックグラウンドの血液の化学発光レベルを測定するために、２０μｌの全血をシリコン反射防止チューブ（Ｌｕｍｉｖｉａｌ、Ｅ  Ｇ  ＆  Ｇ  Ｂｅｒｔｈｏｌｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に移し、これに、１０−４Ｍのルミノール（５−アミノ−２，３−ジヒドロフタラジン；Ｓｉｇｍａ  Ａ８５１１）９０μｌを添加した。次いでこのチューブを穏やかに振盪した。細菌攻撃に応答して産生された化学発光を測定するために、１０−３Ｍの濃度で２０μｌのホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（Ｓｉｇｍａ  Ｐ８１３９）を添加した。各チューブについて、化学発光を、携帯用化学ルミノメータ（Ｊｕｎｉｏｒ  ＬＢ  ９５０９  Ｅ  Ｇ  ＆  Ｇ  Ｂｅｒｔｈｏｌｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中で合計３０分間、５分毎に３０秒間にわたって測定した。化学ルミノメータ内に入れていない場合、チューブは３７℃でインキュベートした。ＰＭＡに対する最大の応答を書き留めた。
【００６２】
（ｅ）データ分析
データを、平均±平均からの標準偏差として表す。引き続いて、両側の対応のないｔ検定を使用して、ベースラインおよび８５分で２群を比較した。
【００６３】
結果
表２は、ホラー映画群（ｎ＝８）と対照群（ｎ＝６）との間のＰＭＡへの応答の差異を示す。対照群と比較した場合ホラー映画群において、８５分に高度に統計的に有意な（ｐ＜０．０５）低下が見出された。ホラー映画群についての＋１４の平均心拍数変化は、２０．６％の増大に相当する。収縮期血圧および拡張期血圧は、それぞれ１０％および１６％上昇した。対照群はこのような変化を示さなかった。
【００６４】
【表２】
0004571864.tif 000003
【００６５】
ホラー映画を見ることは、視床下部の刺激、末梢抵抗の変化ならびにカテコールアミンおよびコルチゾルを含むストレスホルモンの放出の増大を含む、Ｃａｎｏｎの恐怖逃避攻撃防御反応（いわゆる「ストレス応答」）に匹敵する精神生理学的喚起を惹起する。本試験はまた、ストレスが末梢血液サンプルの応答性に影響を与えたことを示す。したがって、これはストレスの指標として使用できる。
【００６６】
ＰＭＡに対する変更された応答性は、白血球活性化の状態に対するインビボの変化を示す。ストレスの状態において、白血球が、それらの顆粒の内容物をすでに放出した顆粒の内容物を実際に放出する（したがって、ＰＭＡに対して応答できない）ということが可能である。このような白血球は、日和見感染に対して応答することができず、したがって、疾患ならびに宿主のタンパク質溶解酵素および酸素フリーラジカルからの潜在的な組織損傷に対して宿主をより感受性にする。
【００６７】
実施例４  ストレス要因課題
【００６８】
方法
【００６９】
（ａ）被験者
ヘルシンキ宣言に従って、Ｃｏｖｅｎｔｒｙ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅからの地方倫理委員会の認可およびインフォームドコンセントを、本試験の開始前に得た。１２人の学部在学生（１８歳〜２３歳）を、実験群（試験を与えた）に割当てたかまたは同じ時間にわたって静かに座っているように依頼した。除外基準には、精神疾患、呼吸疾患もしくは心血管疾患に罹患していること、喫煙者またはその前の月の内の処方薬の摂取が含まれた。
【００７０】
（ｂ）ストレス要因課題
試験は、３６問の質問を含む、記載された視空間課題試験であり、１５分間の制限を課した（Ｒａｖｅｎｓ  Ｊ．Ｃ．Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  Ｍａｔｒｉｃｅｓ、セットＩＩ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｐｓｙｃｈｏｌｏｇｉｓｔｓ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９９４）。少量の指刺し血液サンプル（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｓｏｆｔ  Ｃｌｉｘ）を、課題完了の前および直後に採取した。２０μｌの血液をピペット中に収集した。
【００７１】
（ｃ）ＰＭＡ攻撃および対処能力の測定
バックグラウンドの血液の化学発光レベルを測定するために、２０μｌの全血をシリコン反射防止チューブ（Ｌｕｍｉｖｉａｌ、Ｅ  Ｇ  ＆  Ｇ  Ｂｅｒｔｈｏｌｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に移し、これに、１０−４Ｍのルミノール（５−アミノ−２，３−ジヒドロフタラジン；Ｓｉｇｍａ  Ａ８５１１）９０μｌを添加した。次いでこのチューブを穏やかに振盪した。化学発光を測定するために、１０−３Ｍの濃度で２０μｌのホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（Ｓｉｇｍａ  Ｐ８１３９）を添加した。各チューブについて、化学発光を、携帯用化学ルミノメータ（Ｊｕｎｉｏｒ  ＬＢ  ９５０９  Ｅ  Ｇ  ＆  Ｇ  Ｂｅｒｔｈｏｌｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中で合計３０分間、５分毎に３０秒間にわたって測定した。化学ルミノメータ内に入れていない場合、チューブは３７℃でインキュベートした。ＰＭＡに対する最大の応答を書き留めた。
【００７２】
（ｄ）データ分析
データを、平均±平均からの標準偏差として表す。両側の対応のないｔ検定を引き続いて使用して、ベースラインおよび１５分で２群を比較した。
【００７３】
結果
表３は、ＰＭＡに対する白血球の応答性に対するストレス要因課題の完了の影響を示す。実験群は、対照と比較して有意に低下したＰＭＡに対する応答（ｐ＜０．０５、対応のないｔ検定）を有した。したがって、ストレス要因課題の完了は、ＰＭＡに対する応答性を減じた。
【００７４】
【表３】
0004571864.tif 000004
【００７５】
実施例５  血液の好中球がインビトロのＰＭＡ攻撃に応答する能力に対する、マラソン走行の影響の決定
【００７６】
試験設計
試験過程の間にロンドンマラソンを引き受けた１６人のマラソン走者を本試験に含めた。血液サンプルを、競技の前日および競技の直後にこれらの走者から採取した。各血液サンプルについて、基準の化学発光およびＰＭＡ攻撃での化学発光を、上記の実施例に記載されるのと類似の様式で決定した。化学発光の測定を、３５分まで５分間隔で行った。
【００７７】
結果
【００７８】
図４は、単一の走者についての典型的なデータを示す。マラソンの前日に、この走者は、競技前の応答線における相対光単位（ＲＬＵ）中のスパイクによって実証されるように、ＰＭＡ攻撃に対する応答を示した。対称的に、競技後の応答線はこのようなスパイクを示さない。
【００７９】
ほとんどの競技前の血液サンプルは、１５分後〜２０分後にＰＭＡ攻撃に対するピーク応答を示した（図５（ａ）を参照のこと）。ピーク応答の大きさは、高度に変動的であった。対称的に、競技後のサンプルについてのデータは、対照の競技前サンプルと比較して、ＰＭＡにより誘導されるスーパーオキシド産生の強い減衰を示した。同じサンプルについての非ＰＭＡ刺激結果を図５（ｂ）に示す。このデータは、エリートの競技者が、他の人々よりも特定の型の感染のリスクがより高いという周知の現象と一致しており、スポーツマンおよびスポーツウーマンにおけるストレスのよりよい理解のため、ならびにこのような人々においてストレスの影響を軽減するかまたはストレスを低下させるための手段を見出すことにおける、広範なスポーツ活動にわたる本発明の有用性を示唆する。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】実施例１は、以下の図面を参照して、アナグマ（Ｍｅｌｅｓ  ｍｅｌｅｓ）が、罠に供され次いで輸送される場合に、罠で捕らえられるが輸送のさらなるストレスを経験しない場合よりも低い対処能力を有するという予測を試験するための、本発明の方法の使用を示す：図１は、ＰＭＡでの攻撃後の全血におけるスーパーオキシド産生の化学発光測定によって決定した、８匹の輸送後のアナグマ（四角）および輸送なしの８匹のアナグマ（丸）における相対光単位（実線、平均±ＳＥ）として測定した対処能力を示す図である。点線は、基本の白血球活性を示す。
【図２】図２は、好中球１０９個／ｌ当たりの相対光単位（ＲＬＵ）として計算した対処能力を示す図である。実線は、輸送後（四角）および輸送なし（丸）のアナグマにおける対処能力（平均±ＳＥ）を示す。点線は、基本の活性を示す。
【図３】実施例２は、以下の図面を参照して、取扱いによる野生の小動物（モリネズミおよびハタネズミ）において誘導されたストレスを定量するための本発明の使用を示す：図３は、ＰＭＡでの攻撃後の全血サンプル中のスーパーオキシド産生の化学発光測定によって決定した、非取扱い動物（上の線）と比較した取扱い動物（下の線）の相対光単位で測定した対処能力を示す図である。
【図４】実施例５は、以下のさらなる図面を参照して、マラソンをすることのストレスが、攻撃に応答する免疫系の能力の低下を引き起こすか否かを決定するための本発明の適用を示す：図４は、マラソン前およびマラソン後に採取した血液サンプルを使用し、ＰＭＡ攻撃に応答してスーパーオキシドを産生する血液サンプル中の白血球の能力を決定することによって得られた単一のマラソン走者についての典型的なデータを示す図である（黒四角：競技前の対照；白四角：競技後のサンプルにおける応答）。
【図５】図５（ａ）は、マラソン前およびマラソン後に採取した血液サンプルを使用し、ＰＭＡ攻撃に応答してスーパーオキシドを産生する血液サンプル中の白血球の能力を決定することによって得られた１６人のマラソン走者についての合せたデータを示す図である（黒四角：マラソン前の対照サンプル；白四角：マラソン後のサンプル）。図５（ｂ）は、同じ血液サンプルについて同じ時点で測定された非ＰＭＡ刺激化学発光を示す図である（黒四角：マラソン前の対照サンプル；白四角：マラソン後のサンプル）。
【図１】
0004571864.tif 000005
【図２】
0004571864.tif 000006
【図３】
0004571864.tif 000007
【図４】
0004571864.tif 000008
【図５】
0004571864.tif 000009