(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト免疫不全ウイルス  １型（ＨＩＶ−１）のｇｐ１２０エンベロープ糖タンパク質の１１２番のトリプトファン（Ｗ）のアミノ酸変異を有する単離精製された変異体であって、
前記変異が、トリプトファン（Ｗ）の、セリン（Ｓ）、イソロイシン（Ｉ）またはフェニルアラニン（Ｆ）による置換からなる
ヒト免疫不全ウイルス  １型（ＨＩＶ−１）のｇｐ１２０エンベロープ糖タンパク質の単離精製された変異体。
【請求項２】
３３８番のトリプトファン（Ｗ）のセリン（Ｓ）による置換、４２７番のトリプトファン（Ｗ）のセリン（Ｓ）での置換、及び９６番のトリプトファン（Ｗ）のフェニルアラニン（Ｆ）での置換の少なくとも一つを更に有する請求項１に記載の単離精製された変異体。
【請求項３】
ヒト免疫不全ウイルス  １型（ＨＩＶ−１）のｇｐ１２０エンベロープ糖タンパク質の単離精製された変異体であって、
（１）４２７番のトリプトファン（Ｗ）のセリン（Ｓ）による置換からなるアミノ酸の変異、または
（２）３３８番のトリプトファン（Ｗ）のセリン（Ｓ）による置換からなるアミノ酸の変異、
を有するヒト免疫不全ウイルス  １型（ＨＩＶ−１）のｇｐ１２０エンベロープ糖タンパク質の単離精製された変異体。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の単離精製された変異体の、ＨＩＶワクチンの製造における抗原としての使用方法。
【請求項５】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のｇｐ１２０エンベロープ糖タンパク質（ＨＩＶ  ｇｐ１２０）の感染性を抑制するための方法であって、
前記ＨＩＶ  ｇｐ１２０を請求項１〜３のいずれかに記載の変異体を用いる工程を有する
ＨＩＶ  ｇｐ１２０の感染性を抑制するための方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ｇｐ１２０の変異体とその応用に関するものである。
【０００２】
ターゲット細胞のＣＤ４とＨＩＶのｇｐ１２０との間の相互作用が、ｇｐ１２０の保存された領域、とりわけＫｗｏｎｇ他によるアミノ酸の番号付けによれば位置４２７におけるトリプトファン（Ｗ）をもたらすことが知られている（本明細書に添付の参考文献リストの１参照）。
【０００３】
その共同執筆者のうち数人が本願の共同発明者であるＭｉｓｓｅ他の論文（２）では、Ｃ１ゾーンに含まれ、ｇｐ１２０の保存領域と呼ばれる安定構造、すなわち、両親媒性α１ヘリックスが、ＣＤ４受容体との相互作用中に関与していることが証明された。さらに、α−１ヘリックスをもたないｇｐ１２の構造は、ターゲット細胞、とりわけリンパ球上のケモカインに対する受容体である、ＣＸＣＲ４受容体と常に相互作用が可能であることを証明することができた。
【０００４】
ｇｐ１２０、とりわけα２ヘリックスの保存構造中に特異な一時的変異を誘発することによって、本発明者は、直接的であれ、間接的であれ、ターゲット細胞との相互作用においてこれらの構造によって果たされる主な役割を明らかにした。というのも、任意の変異によって、これらの構造のトランスコンフォメーションは、実施例に示されているように、これらの相互作用に関与する、通常隠された領域を明らかにし、その結果、ワクチンのターゲットとなることができる分子を手に入れることが可能になった。
【０００５】
したがって、本発明は、ｇｐ１２０の変異体を対象とし、それら変異体が、とりわけｇｐ１２０のα２ヘリックス、場合によってはα１ヘリックスの芳香族アミノ酸に富んだ領域に少なくとも１つの変異を含むことを特徴とする。
【０００６】
本発明による変異体は、少なくとも１つの変異を含み、この変異は、ＣＤ４との相互作用のための空隙に相当するｇｐ１２０の領域内に位置する。
【０００７】
本発明は、とりわけ、位置１１２におけるＷが、Ｓセリンなどの非芳香族アミノ酸で置き換えられた、ｇｐ１２０の変異体を対象とする。
【０００８】
このような変異によって、細胞融合がまったく起こらなくなる。以下の実施例の部分で報告される細胞融合テストでは、そのようにして、Ｗ１１２Ｓ置換が、ＨｅＬａ−Ｔａｔ細胞（この変異を含むｇｐ１６０を表している）とＨｅＬａ  Ｐ４細胞との間のシンシチウムの形成を破壊することがわかった。さらに、この同じ変異を含むウィルスは、人体のリンパ球に感染させることはできない。芳香族残基（単環式）によるこの同一のＷ（二環式芳香族残基）の置換が、これらの機能を減少させるが、除去するわけではない。
【０００９】
さらに、このような変異体においては、特異抗体による、Ｃｏｒｄｏｎｎｉｅｒ他（３）によって定義されたＣＤ４への共結合部位の認識は、大きく減少する。
【００１０】
したがって、これらの結果は、ＣＤ４の定着のためのα１ヘリックスの保存構造の重要な役割を示す。
【００１１】
また、位置１１２における変異に加えて、このような変異体は、位置３８３のＦのアラニンへの変異、場合によっては、位置４２７のトリプトファンのグリシンでの置換、及び／または、位置４７９のトリプトファンの、セリンまたはイソロイシンのような非芳香族アミノ酸での置換を含むことができる。
【００１２】
（１）に公表された結晶学データによって、一方では、この三次元構造におけるｇｐ１２０のα１ヘリックスの位置と、他方ではトリプトファン残基を視覚化することが可能になった。
【００１３】
これらデータは、上述の生物学的実験結果を追認した。
【００１４】
とりわけ、Ｗ１１２は、ＣＤ４に対するｇｐ１２０の相互作用嚢として説明される疎水性嚢内に存在する。この嚢は、他の芳香族残基とＣＤ４のＦ４３を相互作用させる、芳香族残基の「クラスタ」で構成される。さらに、この研究から、トリプトファン残基が、この嚢内で戦略的位置を有することがわかった。すなわち、それらの中のいずれか１つの何らかの変異が、この「空隙」を不安定にし、ＣＤ４のＦ４３とのあらゆる結合を妨げる。
【００１５】
本発明による他の変異体は、場合によっては、α１ヘリックス構造内の上記の変異に加えて、ｇｐ１２０のＶ３球の下流で、α２ヘリックス構造に対応するｇｐ１２０の領域内に位置する、少なくとも１つの変異を有する。
【００１６】
本発明は、とりわけ、位置３３８におけるＷが、セリンで置き換えられた変異体を対象とする。
【００１７】
この単一変異は、ターゲット細胞ＣＤ４+、ＣＸＣＲ４+と、Ｗ３３８Ｓ変異したｇｐ１２０を発現する細胞とを存在させると、細胞融合をまったく起こさないことが可能になる。
【００１８】
ｇｐ１２０のレベルでＷ３３８Ｓ変異を含むエンベロープで相補結合されたウィルスは、もはや細胞を感染させることはできなくなる（図１参照）。
【００１９】
上述したように、Ｗは、保存されたα２構造の一部を成すことから、このアミノ酸は、芳香族残基および疎水性残基を含む第２の嚢内に存在する。
【００２０】
したがって、この変異は、生物学的結果を考慮に入れると、この構造がたとえばＣＸＣＲ４など共受容体との相互作用に関与することを暗示している。
【００２１】
本発明による変異体は、保存構造の役割を研究することを可能にしながら、感染物質とターゲット細胞との相互作用にアプローチする新しい方法を構成する。病原物質とターゲット細胞との相互作用に関与する種々の保存構造の機能をよりよく理解することによって、実際に、ＨＩＶに対する治療用分子または免疫用分子の設計が可能になる。
【００２２】
本発明は、これら相互作用嚢を明らかにし、それを利用することによって、ＣＤ４を模倣することができ、したがって、ｇｐ１２０に対する抑制特性を備えた化合物を対象とする。
【００２３】
本発明はまた、前記の疎水性嚢内に納まることができる、共受容体の細胞外ループを模倣するペプチドを対象とする。
【００２４】
本発明はまた、上述のｇｐ１２０の一定領域を模倣することができ、ワクチンの候補となることができるペプチドに関するものである。このようにして、本発明は、このような候補をつくりだすためのモデルを提供する。
【００２５】
さらに、第１の空隙において変異を行うことによって、第２の空隙をできるだけ露出させることができるｇｐ１２０の変換、さらにそこから抗原としてのｇｐ１２０の変換を引き起こすことができる。有利にも、こうして、通常は隠されたこれらの一定領域に適合した免疫性応答を得ることができる。
【００２６】
このような変換によって、さらに、ｇｐ１２０とｇｐ４１とを分離させることが可能になる。以下の実施例に示されているように、ｇｐ１２０のレベルでの変異を含むｇｐ１６０で相補結合されたウィルスを使用すると、いかなる融合も認められないのに対して、融合の原因となるグリコプロテインはｇｐ４１である。したがって、ｇｐ１２０における変異は、ウィルスの融合を妨げるためのターゲットとなる。このようにして、ＨＩＶによる感染を防ぐための鍵となるエピトープを手に入れることができる。
【００２７】
添付の図１から８をそれぞれ参照して、以下の実施例によって、本発明の他の特徴および利点を説明する。
【００２８】
例：ｇｐ１２０の変異体の獲得および研究
これらのｇｐ１２０の変異体は、いくつかの生物システムでテストされた。
【００２９】
（ｉ）細胞融合（細胞の表面において変異したエンベロープ）、（ｉｉ）ウィルスによる感染（変異したｇｐ１２０で相補結合された擬ウィルス）、（ｉｉｉ）「ＣＤ４結合部位」におけるｇｐ１２０の種々のエピトープを認識する種々のモノクローン抗体によってなされる変異したこれらｇｐ１２０の形状の分析、および（ｉｖ）結晶学データを通したｇｐ１２０の分析。
【００３０】
これらの実験は以下の具体的な方法を用いて行われた。
【００３１】
・プラスミド、抗体、擬ウィルス
ｐＨＸＢ２ＥＮＶ（ＨＩＶ−ＩＩＩＢのｇｐ１６０エンベロープのためのコード）プラスミド、ｐＣＭＶ−ｒｅｖ（ＣＭＶ助触媒の調整下でのＲｅｖ蛋白質のためのコード）プラスミド、およびモノクローン抗体９０２（ｇｐ１２０のＶ３ループに対して誘導された）は、ＮＩＨ  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ（ＥＵ）によって得られた。ｐＮＬ４−３ｅｎｖ−ＧＦＰ擬ウィルスは、Ｄａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ癌研究所、ボストン、ＥＵによって提供された。このプラスミドは、Ｅｎｖ遺伝子の欠失したＨＩＶ−１  ＮＬ４−３のゲノムと、さらにＧＦＰ蛋白質（緑色蛍光蛋白質）のためのコード化遺伝子によってＮｅｆ遺伝子の置換を含む。
【００３２】
・ｇｐ１２０のα１ヘリックスにおいて誘導された変異源
ｇｐ１２０のα１ヘリックス構造内に存在するＷ残基を研究する目的で、ｇｐ１２０のためのコード化遺伝子のＮｄｅＩ−ＨｉｎｃＩＩ領域が再構成された。そのため、α１ヘリックスを取り囲む２カ所の制限部位（ＨｐａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ）が入れられたオリゴヌクレオチドが使用された（２）。ｇｐ１２０のα１ヘリックスは、２つのトリプトファン残基（Ｗ９６およびＷ１１２）を有する（４）。ＨｐａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位は、各構造について、野生のＨｐａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を、変異したＨｐａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片によって交換することが可能になった。変異は、２つのＷにおいて同時に、もしくはただ１つのトリプトファンにおいて行われた。誘導された変異源は、ｐＢＳプラスミドのＨｐａｌおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に含まれた重なり合うオリゴヌクレオチドの方法によって行われた。以下の表１には、望ましい変異を含むオリゴヌクレオチドのみが記載されている。
【００３３】
【表１】
0004489299.tif 000002
・細胞と細胞の融合
種々のｇｐ１６０エンベロープ（ｐＨＸＢ２ＥＮＶ、５００ｎｇ）を含む発現ベクターは、ＨｅＬａ−Ｔａｔ細胞内でｐＣＭＶ−ｒｅｖの５００ｎｇと共トランスフェクションされた。使用されたトランスフェクション方法は、（２）に記載されているようなリポフェクション（リポフェクタミン、ＧＩＢＣＯ）であった。
【００３４】
ｐＣＭＶ−ｒｅｖは、プラスミドｐＨＸＢ２  ＥＮＶ内に存在するＥＮＶ遺伝子の発現を活性化するために必要不可欠である。次に、トランスフフェクションされた細胞は、（２）以外に記載されているようなＨｅＬａＰ４細胞（ＣＤ４−ＬＴＲ  ＬａｃＺ）と共同培養された。
【００３５】
・変異したｇｐ１２０の細胞表面における発現
使用されたトランスフェクション技術は、細胞と細胞の融合の場合に使用された技術と同じであった。
【００３６】
共トランスフェクションより２４時間前に、ＨｅＬａ−Ｔａｔ細胞は、カバーガラス（直径１２ｍｍ）で覆われた直径３．５ｃｍのウェル内に置かれた。細胞は、１０μｇ／ｍｌの濃度においてＡｃＭ９０２（ｇｐ１２０のＶ３ループに対して誘導された）との共トランスフェクションから４８時間後に培養された。こうした培養は、ナトリウムアジド（ＮａＮ3）の０．１％の存在と、ＰＢＳ緩衝液とによって行われた。ＰＢＳ０．３％ＢＳＡ／０．１  ＮａＮ3における２回の洗浄後、細胞は、Ｔｅｘａｓ−ｒｅｄでマーキングされたマウスの抗ＩｇＧ抗体によって培養された（分子プローブ）。３回の拡張洗浄後、細胞は、エタノール−アセトン混合物（１：２）で２分間定着された。Ｍｏｗｉｏｌとともに、スライドガラス上にカバーガラスを取り付けた後、細胞が共焦点顕微鏡で認められた。
【００３７】
・ＥＬＦＡ（酵素結合蛍光分析）によるｐ２４の定量
ｐ２４の定量は、ＶＩＤＡＳ  ＨＩＶ  ＤＵＯ（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）自動システムで行われる。このテストは、抗原ｐ２４と抗ＨＩＶ−１抗体および抗ＨＩＶ−２抗体の同時検出に基づくものである。このテストの原理は、２つの免疫−酵素反応を蛍光による検出に関連付ける。このテストは、固体相と同時にピペット吸入システムとして役立つ単用途テーパを備える。テーパの下部には、アルカリホスファターゼでマーキングされた人体抗ＩｇＧマウスのＡｃＭに共役された３つの合成ペプチド（ｇｐ４１、ｇｐ３６およびタイプＯの特異ペプチド）が定着される。テーパの上部には、抗ｐ２４  ＡｃＭｓが定着される。テスト実施時には、ビオチニル化された抗ｐ２４ラビットの抗体（ストレプトアビジン−ホスファターゼアルカリンに共役された）が、サンプルと同時に付加される。基質、４−メチル−オンベリフェリル−ホスフェートは、サンプル内に存在する抗ＨＩＶ  Ａｃおよび／またはＡｇ  ｐ２４の量に比例する蛍光を測定することができる。反応は９０分間で行われ、蛍光の読取りは、ＶＩＤＡＳテストの固有読取装置によってなされる（波長４５０ｎｍ）。
【００３８】
相補性テストで得られた変異擬ウィルスによる人体リンパ球の感染
細胞２９３は、１０μｇのｐＮＬ４−３  ＧＦＰ擬ウィルスと２μｇのｐＨＸＢ２  ＥＮＶプラスミド（ＳＵ  ｇｐ１２０内に種々の変異を含むまたは含まない）と、１．５μｇのｐＣＭＶ−ｒｅｖプラスミドで共トランスフェクションさせた。そのために、リン酸カルシウムへのトランスフェクション方法が使用された。トランスフェクションから４８時間後、細胞の表面残留物が採取され、濾過され、使用されるまで−８０℃で保存された。次に、これら種々の表面残留物においてｐ２４の測定が行われた。１０μｇ／ｍｌのＰＨＡ（植物凝集素）、すなわちＲＰＭＩ  １６４０−１０％ＳＶＦ（牛の胎児の血清）培養基におけるＩＬ−２の５０  Ｕによって３日間、あらかじめ刺激された人体リンパ球は、トランスフェクションされた２９３細胞の種々の表面残留物（同じ濃度のｐ２４を含む）とともに培養された。
【００３９】
種々の表面残留物の感染能力は、蛍光による顕微鏡検査（リンパ球におけるＧＦＰ蛋白質を表す）によって視覚化され、感染したリンパ球の培養用表面残留物におけるｐ２４の定量（３日ごとの定期的検査）によって決定された。
【００４０】
・構造分析
ＣＤ４の最初の２つの領域と、１７ｂを中和する抗体のＦａｂ断片である、ｇｐ１２０の芯によって構成された複合体の構造は、最近、Ｘ線による結晶学研究によって決定された（１）。この構造は、蛋白質データベース（ｐｄｂ）にアクセスコード「Ｉｇｃｌ」の下で寄託された。この複合体の構造座標が、酸素グラフィックステーション（グラフィックシリコンＯ2）において、インサイトＩソフトウェア（分子シミュレーションのためのＭＳＩ）によって分析された。ｇｐ１２０およびＣＤ４の領域の視覚化とモデル化が、インサイトＩＩ環境の下でディスカバー・プログラム（ＭＳＩ）を用いて行われた。
【００４１】
・結果
・ｇｐ１６０エンベロープの融合発生能力
トランスフェクションされたＨｅＬａ−Ｔａｔ細胞の表面に発現された種々のｇｐ１６０エンベロープの融合発生能力を評価するために、これら細胞は、ＨｅＬａ  Ｐ４（ＣＤ４  ＬＴＲ  ＬａｃＺ）細胞と共培養された。
【００４２】
以下の表２に得られた結果が示されている。
【００４３】
【表２】
0004489299.tif 000003
これらの結果を検討すると、セリンまたはイソロイシンにおけるα１ヘリックスの２つのトリプトファン残基（Ｗ９６およびＷ１１２）における同時に起きる変異は、ｇｐ１６０エンベロープを、細胞間でシンシチウムを引き起こすことができなくしてしまうと確認される。同じ現象が、１１２Ｗ／Ｓおよび／または３３８Ｗ／Ｓの一時的変異を含むｇｐ１６０エンベロープとともに認められる。反対に、近い疎水性指数を有するフェニールアラニン芳香族残基（Ｆ）によるトリプトファン残基（Ｗ）の置換は、変異したエンベロープの融合発生能力をおよそ５０％減少させる。構造がいかなるものであれ、この現象は、単に、Ｗ１１２残基および／またはＷ３３８残基がもたらされる場合にのみ認められ、そのことはｗ９６基に対する（それらの実験の枠内での）、この残基またはこれらの残基の生物学的重要性を表わす。これらの結果はすべて、野生のｇｐ１６０エンベロープ（およそ１５００の融合源が認められる）とともに得られた結果と比較された。ネガティブ検査は、ＨｅＬａ  Ｐ４細胞とトランスフェクションしないＨｅＬａ−Ｔａｔ細胞を共培養させた（いかなる融合源も認められなかった）。
【００４４】
これらの結果は、Ｗ１１２残基および／またはＷ３３８残基が、細胞融合現象に先立つ、ｇｐ１２０とターゲット細胞との相互作用に関与していることを示している。
【００４５】
・ｇｐ１２０蛋白質の細胞表面における発現
ｇｐ１２０は、ｇｐ１２０のループＶ３に対して誘導される、ＡｃＭ９０２によって検出された。次に、このｇｐ１２０は、Ｔｅｘａｓ  ｒｅｄに結合されたマウスの抗ＩｇＧによって明らかになった。ｇｐ１２０  １１２Ｗ／Ｓと同じように野生のｇｐ１２０は、細胞の表面に発現されることが確認される。トランスフェクションされていないＨｅＬａ−Ｔａｔ細胞との９０２抗体の培養はいかなるシグナルも与えない。
【００４６】
・補足された擬ウィルスの感染能力
図１は、以下と接触したリンパ球（ＰＨＡの１０μｇ／ｍｌおよびＩＬ２の５０Ｕ／ｍｌによってあらかじめ活性化された）の表面残留物におけるｐ２４の含有率の推移を示している。
【００４７】
−野生型のｇｐ１２０で相補結合された擬ウィルス（曲線−●−）
−変異したｇｐ１２０（ｇｐ１２０  １１２Ｗ／Ｓ）で相補結合された擬ウィルス（曲線−○−）
−変異したｇｐ１２０（ｇｐ１２０  ３３８Ｗ／Ｓ）で相補結合された擬ウィルス（：黒四角）
第１の場合には、ｐ２４の含有率は、まず最初に減少してから著しく増大する（感染後１０日めから）。このことから、ウィルス感染から生じた、新しく合成されたｐ２４の存在が証明される。
【００４８】
第２の場合には、ｐ２４の含有率は次第に減少して２０日目（接触後）に完全に消滅する。したがって、ｇｐ１２０における１１２Ｗ／Ｓ変異によって細胞の感染が起きなかった。このことは、１１２Ｗ／Ｓおよび／または３３８Ｗ／Ｓ変異ウィルスとともに培養された細胞内にＧＦＰ蛋白質が発現されないことによって追認された（蛍光式顕微鏡検査による視覚化）。
【００４９】
第３の場合に認められる細胞に感染がないことは、ｇｐ１２０  １１２Ｗ／Ｓおよび／またはｇｐ１２０  ３３８Ｗ／Ｓ表面において発現される細胞とともに先に視覚化されたシンシチウムの形成がないことによって説明することができる。
【００５０】
・なされた変異の三次元分析と構造的局所化
複合体ｇｐ１２０−ＣＤ４−１７ｂ  Ｆａｂの結晶学的構造は、最近、２．５Åの分解能（図２）で決定された（３）。
【００５１】
この構造座標は、本発明者等のアプローチの最初であった予測可能モデルよりはるかに分解能が大きい三次元のコンテキストでアミノ酸を位置付けることができる、インサイトＩＩソフトウェアを用いて分析された。
【００５２】
ｇｐ１２０−ＣＤ４複合体の結晶学的構造の分析は、２つの蛋白質の間にインターフェースを形成する少ない数の残基を明らかにする。ｇｐ１２０とＣＤ４との間の大半の相互作用は、ｇｐ１２０のＷ４２７アミノ酸とＣＤ４のＦ４３残基をもたらす疎水性嚢のレベルで局所化される（Ｗｙａｔｔ他、１９９８年）。
【００５３】
さらに、図３に示されているように、Ｗ１１２は、芳香族残基に富んだこの空隙中に戦略的に局所化され、ＣＤ４のＦ４３と直接的に相互作用する。Ｆ４３残基は、この嚢の中央に収まり、Ｗ１１２と直接的に相互作用を行うことになる。Ｆ４３とＷ４２７とのＷ１１２の相互作用は、疎水性嚢全体を安定させることができる。Ｗ１１２とＷ４２７は、互いに５Å以下の距離をあけて位置し、そのことから、これら２つのトリプトファン残基は、大きく相互作用を及ぼすことができるとわかる。
【００５４】
こうした相互作用は、これら２つの残基間の芳香核の積重ね作用によって、または、双極子と双極子の結合によって行うことができる。さらに、これらの距離は、実際には、生体内の分子の相互作用の力学的側面を考慮に入れると、はるかに小さくなることが証明できる。
【００５５】
結晶分析は、さらに、α２ヘリックスのＷ３３８が、疎水性および芳香族残基によって構成される、第２の空隙（ｇｐ１２０の内部に含まれる合計２つの空隙のうちの）の安定性のなかで重要な役割を果たすことができることが証明できる。これらの条件において、この空隙は、ｇｐ１２０と、たとえばＣＸＣＲ４といった共受容体との相互作用において重要なものとみなすことができる。
【００５６】
・その構造とその機能という観点から、ＨＩＶ−１  ＩＩＩＢのＨＸＢ２クローンのＨＩＶ−１のｇｐ１２０について、Ｗ３８６Ｓ変異の結果を明らかにする実験
機能：トランスフェクションした細胞の表面に現われるｇｐ１２０の融合発生能力と、変異したまたはしていないｇｐ１２０をともなうエンベロープを有するウィルスの感染能力
ＨＩＶ−１  ＩＩＩＢ株のｐＨＸＢ２クローンのエンベロープとともにトランスフェクションＨｅＬａ−Ｐ４（ＣＤ４＋／ＣＸＣＲ４＋）細胞とＨｅＬａΔ２０（Ｔａｔ）細胞との間の融合テストにおいていかなる融合源も認められない。野生のエンベロープによるポジティブ検査では、１８００から２０００の融合源が示された。ＭｏＭｕＬＶレトロウィルスのエンベロープとともにネガティブ検査が実施されたが、それによるとこれらの条件における融合源は示されなかった。
【００５７】
ＨＸＢ２  ＥＮＶ−（ｐＮＬ４．３ΔＥＮＶ）のゲノムの補足後に得られる擬タイプウィルスをともなうインターロイキン２（ＩＬ−２）をともない、ｇｐ１２０  Ｗ３３８Ｓをともなうエンベロープ（ｐＨＸＢ２  ＥＮＶ）と、さらに２つの発現ベクターとともにトランスフェクションされた２９３Ｔ細胞の内部におけるエンベロープをともない、ＰＨＡ（フィトヘマグルチニン）で活性化されたリンパ球細胞に感染が見られない。ポジティブ検査は、ｐＮＬ４．４ΔＥＮＶとｐＨＸＢ２  ＥＮＶ（野生型）によって構成される。ネガティブ検査は、ｐＨＸＢ２  ＥＮＶ発現ベクターによってのみトランスフェクション細胞の表面残留物によって構成される。
【００５８】
構造：
ＥＬＩＳＡ研究：溶解可能なＣＤ４においてのみ行われるｇｐ１２０の定着
図４から８には、ＡｃＭ  ＣＧ１０（図４）、ＡｃＭ  ４．８ｄ（図６）およびＡｃＭ  １７ｂ（図８）とのｇｐ１２０ΔαＨＸ１とｇｐ１２０α３  Ｗ３３８Ｓ野生ｒｇｐ１２０の反応性の結果が報告されている。これらの試験において、ｒｇｐ１２０は、１μｇ／ｍｌの濃度で沈殿した。ＡｃＭは、横座標に示された濃度で沈澱した。図５および図７には、ＡｃＭ  ＧＧ１０（図５）とＡｃＭ  ４．８ｄ（図７）によってＣＤ４と複合化されたｒｇｐ１２０の反応性が示されている。この実験では、ｒｇｐ１２０は１μｇ／ｍｌの濃度で沈澱した。ＣＤ４の濃度は２０μｇ／ｍｌであり、ＡｃＭは横座標に示された濃度で沈殿した。
【００５９】
こうした変異は、ＣＤ４上にｇｐ１２０が定着した後に明らかにされたエピトープであるＣＤ４ｉエピトープ（誘導ＣＤ４）（図４、５、６、７および８）に対して誘導されたモノクローン抗体１７ｂ、４．８ｄ、Ｇ１０に対してできるだけさらすことを可能にするトランスコンフォメーションを引き起こす。このトランスコンフォメーションは、以下のように実施されたＥＬＩＳＡシステムにおいて検出することができた。
【００６０】
１．ウェルの底部は、溶解可能なＣＤ４（参照番号ＮＩＨ）または、ｇｐ１２０のＣ末端領域（この抗体は、ＣＤ４ｉエピトープの解明を得るためにトランスコンフォメーションを引き起こさない）の線形ペプチドに対して誘導されたＡａｌｔｏＤ７３２４（ヤギの抗体である）で覆われる。
【００６１】
２．３％ＢＳＡによる飽和後、ｇｐ１２０は、１時間３７℃で、ＣＤ４またはＤ７３２４抗体によって培養される。
【００６２】
３．２回の洗浄に続いて、抗ＣＤ４ｉ（１７ｂまたは４．８ｄまたはＣＧ１０）ＡｃＭのいずれか１つは、３７℃で１時間、あらかじめ結合されたｇｐ１２０によって培養される（野生型または変異型）。
【００６３】
４．ＣＤ４ｉ抗体は、ペロキシダーゼ（ＰＯＤ）に結合された抗ＩｇＧ抗体とともに明らかになる。
【００６４】
５．反応の強さは、反応停止後ＥＬＩＳＡ読取装置において読み取られる。
【００６５】
コントロール（ｇｐ１２０をもたない細胞）によって表される基礎雑音が、実験箇所の結果から差し引かれる。
【００６６】
注記：コントロールは、ｇｐ１２０に対して誘導されたラビットのポリクローン抗体によって検出されたｇｐ１２０によって作成された（図３）。
【００６７】
ＥＬＩＳＡで行われたこれらの実験は、実際に、ＡｃＭ抗ＣＤ４ｉ  １７ｂおよび４．８ｄが、これらのエピトープを明らかにすることができる、溶解可能なＣＤ４に結合される場合には、野生のｇｐ１２０および変異したｇｐ１２０をよりよく認識していることが確認できた。ＡｃＭ  ＣＧ１０がＣＤ４に複合化されていない野生のｇｐ１２０をまったく認識していないのに対して、このＡｃＭは、ＣＤ４に複合化されることなく、変異ｇｐ１２０を認識する。
【００６８】
解釈：
ｇｐ１２０におけるＷ３３８Ｓ変異は、ＣＤ４ｉエピトープ、とりわけＡｃＭ  ＣＧ１０によって認識されるエピトープを明らかにする。
【００６９】
この結果は重要である。なぜなら、この変異は、この変異体を、感染性ウィルスにおいて隠されたエピトープをさらす有効なワクチン候補にするからである。
【００７０】
ＦＡＣＳ研究：ＣＥＭリンパ球の系統の細胞の表面に存在する少なくとも２つの受容体、ＣＤ４およびＣＸＣＲ４におけるｇｐ１２０の同時定着
ｇｐ１２０が、それぞれＣＤ４およびＣＸＣＲ４上に定着されることを確認するために、以下の実験が行われた。ＣＥＭ細胞は、まず第１にｇｐ１２０によって培養され、次に、ＣＤ４受容体（ＯＲＴＨＯ  ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃのＡｃＭ  ＯＫＴ４ａ  ＦＩＴＣ）に対して、また、ＣＸＣＲ４受容体（ＰｈａｒｍｉｎｇｅｎのＡｃＭ  １２Ｇ５）に対して、さらにマウスの適切な抗体、抗ＩｇＧとともに、モノクローン抗体によって培養される。
【００７１】
表３には、ＡｃＭ抗ＣＤ４によって認識された、ＣＥＭ  ＣＤ４＋／ＣＸＣＲ４＋細胞上に定着されるｇｐ１２０の蛍光の強さの平均値が報告されている。
【００７２】
【表３】
0004489299.tif 000004
いかなるマーキングも読み取ることができなかった。そのことは、ｇｐ１２０が、ＣＤ４およびＣＸＣＲ４上に実際に定着されることを意味する。
【００７３】
ＲＰＭＩ  １０％  ＳＶＦ内で培養されたＣＥＭ細胞は、３７℃で１時間、野生および変異ｇｐ１２０と接触させるために、洗浄用緩衝液ＰＢＳ／０．３％／ＢＳＡ／０．０２％Ｎａ−アジド（ＴＬ）によって洗浄され、培養用緩衝液ＰＢＳ／３％／ＢＳＡ／０．０２％Ｎａ−アジド（ＴＩ）内に置かれた。
【００７４】
細胞は、ＴＬで２度洗浄され、その後１０μｇ／ｍｌで濃縮された抗ＣＤ４Ｉ抗体（１７ｂ、４．８ｄまたはＣＧ１０）のいずれか１つとともにＴＩ中で２５℃で１時間培養される。次に、細胞はＴＬによって２度洗浄され、さらに、ＦＩＴＣまたはＰＥに結合された適切な抗ＩｇＧ抗体とともにＴＩ内で２５℃で４５分間培養された。ＴＬによる３回の洗浄後に、細胞は、ＴＩ内に再び浮遊し、フラックスの細胞蛍光光度計（ＦＡＣＳｏｒｔ）に通される。こうして１０，０００個の細胞が１つずつ分析される。
【００７５】
図５に結果が報告されている。抗体１７ｂおよび４．８ｄは、変異したｇｐ１２０を正確に認識するが、野生ｇｐ１２０については、ほとんど認識しない。反対に、ＡｃＭ  ＣＧ１０は、野生ｇｐ１２０においても、変異したｇｐ１２０においても、その認識部位にもはやアクセスしない。
【００７６】
解釈
ＡｃＭ  ＣＧ１０がもはやその部位にアクセスせず、反対にＡｃＭ  １７ｂおよび４．８ｄがその部位にアクセスする場合には、それは、ＣＸＣＲ４共受容体へのｇｐ１２０の定着の中に多量にもたらされるｇｐ１２０のエピトープが、特にＣＧ１０によって認識されるエピトープであることを意味している。
【００７７】
結論
ｇｐ１２０におけるＷ３３８Ｓ変異は、融合と感染を妨げるトランスコンフォメーションを引き起こす。というのも、エンベロープがトランスフェクションされた細胞の表面に現われる場合には、この変異は、融合を妨げ、このエンベロープが補足されたウィルス上に位置する場合には感染を妨げる。さらに、このトランスコンフォメーションは、主に、変異したｇｐ１２０が、このｇｐ１２０がＣＤ４に複合化されることなく、ＡｃＭ  ＣＧ１０によって認識されることから、野生ｇｐ１２０上で隠された部位を明らかにすることができる。この蛋白質がＣＤ４およびＣＸＣＲ４に結合される場合に、この同一ＡｃＭ  ＣＧ１０がそのエピトープにもはやアクセスせず、抗ＣＤ４ｉ抗体が、ＣＤ４と衝突しないという事実は、ＣＸＣＲ４への定着内にもたらされるのは、ｇｐ１２０上でＡｃＭ  ＣＧ１０によって認識されたエピトープであることを意味している。このような変異体は、ＨＩＶ感染に対する保護目的での免疫化を行うための候補を構成する。
引用文献の図書目録
1. Kwong PD., Wyatt R., Robinson J., Sweet R.W., Sodroski J. and Hendrickson W. A., 1998, Structure of an VIH gp120 envelope glycoprotein in complex with the CD4 receptor and neutralizing antibody. Nature, 393:648.  
2. Misse D., Cerruti M., Schmidt I., Jensen A., Devauchelle G., Jansen F. and Veas F., 1998. Dissociation of the CD4 and CXCR4 binding properties of human immunodeficiency virus type 1 gp120 by deletion of the first putative alpha-helical conserved structure. J. Virol 72:7280.
3. Cordonnier A., Montagnier L., and Emmerman M. 1989. Single amino-acid changes in VIH envelope affect viral tropism and receptor binding. Nature 340:571.
4. Hansen J. E., Lund O., Nielsen JO., Brunak S. and Hansen JES. 1996. Prediction of the secondary structure of HIV-1 gp120. Proteins 25:1.
【図面の簡単な説明】
【図１】  ｇｐ１２０のレベルにおいて本発明による変異を含むエンベロープで相補結合されたＨＩＶ−１擬ウィルスの感染性テストの結果を示す図である。
【図２】  ｇｐ１２０の結晶構造を示す図である。
【図３】  抗ｇｐ１２０ラビットのポリクローン抗体による、ｒｇｐ１２０の生物学的活性テストの結果を示す図である。
【図４】  ＡｃＭ  ＣＧ１０とのｒｇｐ１２０の反応性を示す図である。
【図５】  ＡｃＭ  ＣＧ１０との、ＣＤ４で複合化されたｒｇｐ１２０の反応性を示す図である。
【図６】  ＡｃＭ  ４．８ｄとのｒｇｐ１２０の反応性を示す図である。
【図７】  ＡｃＭ  ４．８ｄとの、ＣＤ４で複合化されたｒｇｐ１２０の反応性を示す図である。
【図８】  ＡｃＭ  １７ｂとのｒｇｐ１２０の反応性を示す図である。
【図１】
0004489299.tif 000005
【図３】
0004489299.tif 000006
【図４】
0004489299.tif 000007
【図２Ａ】
0004489299.tif 000008
【図２Ｂ】
0004489299.tif 000009
【図５】
0004489299.tif 000010
【図６】
0004489299.tif 000011
【図７】
0004489299.tif 000012
【図８】
0004489299.tif 000013