(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）窒素、リン酸及びカリウムのための無機栄養塩を含む液体培地にアガリクス属の担子菌の菌体を接種する工程、
（ｂ）該液体培地と、液体培地１リットル当りシュクロース換算で５０ｇ〜７０ｇの範囲の量の粗製ケインシュガーとを混合する工程、
（ｃ）該液体培地と、液体培地１リットル当り乾燥状態で０．２ｇ〜１５ｇの範囲の量の、サトウキビ粉砕物、サトウキビの搾り粕、マツの木の組織及びふすまからなる群から選ばれた水不溶性増殖支持物質とを混合する工程、
（ｄ）該液体培地を撹拌しながら２０〜３０℃の範囲の温度に保持する工程及び
（ｅ）０．１２〜０．５ＭＰａ（絶対圧）の範囲の圧力下、液体培地１リットル当り０．０１〜１．０リットル／分の範囲の速度で３０〜９０体積％の酸素を含む酸素濃縮空気を該液体培地中に吹き込む工程
を包含してなる水性液体培地におけるアガリクス属の担子菌の培養方法。
【請求項２】
（ｃ）工程において該液体培地に添加された水不溶性増殖支持物質が、１００メッシュのふるいを通過する粒径を有する粉末状である請求項１記載の水性液体培地におけるアガリクス属の担子菌の培養方法。
【請求項３】
（ｃ）工程において該液体培地に添加された水不溶性増殖支持物質が、２００メッシュのふるいを通過する粒径を有する粉末状である請求項２記載の水性液体培地におけるアガリクス属の担子菌の培養方法。
【請求項４】
（ｆ）該液体倍地上の気相中の二酸化炭素濃度を制御する工程をさらに包含する請求項１記載の水性液体培地におけるアガリクス属の担子菌の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、新規かつ効率的な水性液体培地における担子菌の培養方法、特には、マッシュルーム・アガリクス・ブラゼイ・ムリル（Mushroom Agaricus Blazei Murill）、コルチネルス・シイタケ（Cortinellus shiitake）、リオフィルム・アグレガツム（Lyophyllum aggregatum）、プレウロツス・オストレアツス（Pleurotus ostreatus）などのような食用担子菌を水性液体培地において培養して数センチメーターの大きさの菌体集塊を得るための方法並びにその培養方法を実施するためのバイオリアクターに関する。
【０００２】
背景技術
液体培地において担子菌を培養する方法は、例えば、アメリカ合衆国特許明細書第2,693,665号、第2,761,246号及び第2,850,841号などに開示され知られている。先行技術に用いられた代表的な液体培地は、それぞれ、液体倍地１リットル当りシュクロース５０ｇ、硝酸アンモニウム１０ｇ、リン酸ナトリウム５ｇ、硫酸マグネシウム２．５ｇ及び硫酸鉄（II）０．２ｇを含む。菌糸のような菌体を接種された液体培地は、空気中で数日間、比較的低回転数で回転する撹拌機で緩やかに撹拌されて、直径３〜４０ｍｍの球状塊又は多面体粒子になるまで菌糸を増殖させる。そのような菌糸の集塊は、菌糸表面に形成された粘着性の多糖類物質が接着剤のように働くことによって形成されると一般には認められている。しかしながら、菌の増殖速度が遅いこと及び培地から増殖した菌体を回収する際の困難さにより、これらの先行技術の生産性はとても低い。
【０００３】
したがって、本発明は、液体培地においてマッシュルーム・アガリクス・ブラゼイ・ムリル（Mushroom Agaricus Blazei Murill）（以後アガリクス菌と称する）などの担子菌を培養するための新規かつ効率的な工業的方法を提供することを目的とする。本発明の二次的な目的は、該菌の液体培地における前記の培養方法を実施するのに適した新規なバイオリアクターを提供することである。
【０００４】
発明の開示
すなわち、本発明の水性液体培地におけるアガリクス属の担子菌培養方法は、
（ａ）窒素、リン酸及びカリウムのための無機栄養塩を含む液体培地にアガリクス属の担子菌の菌体を接種する工程、
（ｂ）該液体培地と、液体培地１リットル当りシュクロース換算で５０ｇ〜７０ｇの範囲の量の粗製ケインシュガーとを混合する工程、
（ｃ）該液体培地と、液体培地１リットル当り乾燥状態で０．２ｇ〜１５ｇの範囲の量の、サトウキビ粉砕物、サトウキビの搾り粕、マツの木の組織及びふすまからなる群から選ばれた水不溶性増殖支持物質とを混合する工程、
（ｄ）該液体培地を撹拌しながら２０〜３０℃の範囲の温度に保持する工程及び
（ｅ）０．１２〜０．５ＭＰａ（絶対圧）の範囲の圧力下、液体培地１リットル当り０．０１〜１．０リットル／分の範囲の速度で３０〜９０体積％の酸素を含む酸素濃縮空気を該液体培地中に吹き込む工程を包含してなる。
【０００５】
上記本発明培養方法を実施するためのバイオリアクターは、
（Ａ）液体培地を収容するための耐圧容器、
（Ｂ）０．１２〜０．５ＭＰａ（絶対圧）の範囲の大気圧を超える圧力下で、該液体培地中に酸素濃縮空気を吹き込むことが可能なガス導入管、
（Ｃ）該耐圧容器内の圧力を０．１２〜０．５ＭＰａ（絶対圧）の範囲の圧力に調節する手段を有するガス排出管及び
（Ｄ）該耐圧容器内に収容された液体培地を撹拌する手段
を包含してなる。
【０００６】
発明を実施する最良の態様
上記したように、本発明の担子菌、代表的にはアガリクス菌の培養方法は、液体培地中の構成要素とそのような液体培地における培養工程の操業条件の両方に特徴がある。培養工程が最も望ましい条件で行われる場合には、もし栄養分が培地に十分与えられれば、菌体細粒の集塊は急速な増殖を示し、１０〜２０ｍｍの直径を有する集塊となるが、該集塊の核部は、液体培地中の溶存酸素の局所的な欠乏によるものと思われる黒色を呈することが時おりある。この問題は該培地中の溶存酸素濃度を１５〜３０ｍｇ／リットルまで上昇させることによって解決できるので、３〜４日間連続して培養操業することによって、菌体細粒の集塊を、核部の黒変なしで、約４０ｍｍの直径を有するまで増殖させることができる。
【０００７】
無機栄養塩の種類と濃度は特に限定されないが、窒素源として硝酸アンモニウム１０〜１５ｇ／リットル、リン酸源としてリン酸ナトリウム５〜７ｇ／リットル、カリウム源として硫酸カリウム又はリン酸水素二カリウム３〜７ｇ／リットル、硫酸マグネシウム２．５〜３．５ｇ／リットル及び硫酸鉄（ＩＩ）０．２〜０．３ｇ／リットルのように従来通りでよい。
【０００８】
本発明培養方法に用いられる液体培地は、特徴的には、精製糖状ではなく、粗製ケインシュガー状での炭素源としてのシュクロースと混合される。液体培地中の粗製ケインシュガーの初期量は、純シュクロース換算で４０〜２００ｇ／リットルの範囲内である。シュクロースが、粗製ビートシュガーではなく粗製ケインシュガーとして培地に添加されることが必須である。粗製ケインシュガーに限定する理由はまだ解明されていないが、サトウキビ又はビート由来の粗糖は通常シュクロースのほかにかなりの量の不純物を含むが、粗製ケインシュガーと粗製ビートシュガーとの間では粗糖不純物の種類が異なり、マンガン、亜鉛及びコバルトのようなある種の金属元素並びに他の同定されない微量元素を含む粗製ケインシュガー中の不純物には、特にアガリクス菌の増殖を促進する効果があると推定される。
【０００９】
さらに特徴的には、本発明方法において用いられる液体培地は、乾燥材料換算で０．２〜１５ｇ／リットルの範囲の量の、サトウキビ粉砕物、サトウキビの搾り粕及びふすま並びに木部、葉及び実を含むマツの木の組織粉砕物からなる群から選ばれた水不溶性増殖支持物質と混合される。該培地に添加された該増殖支持物質は、タイラー標準における１００メッシュのふるい、好ましくは２００メッシュのふるいを通過する微紛度の微粒子状でなければならない。これらの増殖支持物質の粒子は、菌体集塊がより安定して増殖するための核となる。
【００１０】
本発明者らは、当然ながら、それぞれ微粒子状のトウモロコシの茎葉部、米ぬか、大麦の穀粒並びにクワの木の葉及び他の部分を含む種々の植物から誘導された他の増殖支持物質を発見するための選別試験を広範囲にわたって行い、増殖促進及び増殖安定化効果は、サトウキビ粉砕物、サトウキビの搾り粕、ふすま及びマツの木の組織に特有であるとの結論に達した。
【００１１】
上記液体培地においてアガリクス菌のような担子菌を培養する本発明方法を行うことにおいて、第一工程は、上記の種々の成分を含む液体培地に、好ましくは該菌の菌糸である菌体を接種することである。
【００１２】
本発明に導く最も思いがけない発見は、液体培地１リットル当り少なくとも７ｍｇＯ2の溶存酸素濃度を得られるように、加圧下、上記液体培地中へ酸素濃縮空気を吹き込むことによって遂行される酸素濃縮条件下で培養工程を行うことにより、アガリクス菌の増殖が安定しながら大いに促進されることである。この溶存酸素濃度を達成するために、液体培地に吹き込まれる酸素濃縮空気は、少なくとも３０体積％の酸素又は、好ましくは３０〜９０体積％の酸素を含有し、酸素濃縮空気は、０．１２〜０．５ＭＰａ（絶対圧）の範囲の圧力を有するように加圧される。酸素濃縮空気の吹き込み速度は、もちろん、相当に重要であり、液体培地１リットル当り少なくとも０．０１リットル／分でなければならない。吹き込み速度には特に上限はないが、バイオリアクターのガス排出管からの排気によって搬出される飛沫拡散の増加を考慮すると、吹き込み速度は液体培地１リットル当り、好ましくは、０．０１〜１．０リットル／分の範囲内である。いうまでもなく、液体培地に吹き込まれる酸素濃縮空気は、所望の担子菌の安定した増殖を抑制しかねない種々の微生物による液体培地の汚染のリスクを最小にするために、例えば適切なフィルターを通過させることによって除菌されなければない。
【００１３】
アガリクス菌の培養工程を行う温度は、もちろん、最良の培養成果を得るためにはとても重要である。通常、その温度は担子菌類については２０〜３０℃の範囲内であるべきであり、培養中の菌の個別の種に応じて最適温度をこの範囲内で選ばれなければならない。その温度が低過ぎたり高過ぎたりする時には該菌の増殖速度は不利に低下する。上記した種々の因子についての要求が満たされれば、回分処理のアガリクス菌の培養工程は２、３日中に完了する。
【００１４】
ここで、菌の急速な増殖の結果として、菌体による炭素源栄養の同化により多量の二酸化炭素ガスが生じるということに注意すべきである。気相の二酸化炭素が適切に除去されなければ、菌糸からの酸性外部分泌の結果、液体培地のｐHの値が時には３．５又はそれ以下までにも低下すること並びに液体培地上の気相中の酸素分圧の低下により溶存酸素濃度が低下することにより、菌体の増殖が妨げられる。
【００１５】
次に、添付図面を参照しながら、本発明の培養工程及びそれに用いられるバイオリアクターを説明する。
図１は、散気装置５Ａを備えたガス導入管５をその下方部に有する耐圧円筒体１からなる培養容器、容器１の上方部に接続されたガス排出管６及び液体培地２を緩やかに撹拌するためのパドルブレードを備えた、最上部のモーターＭによって動く撹拌機７を包含するバイオリアクターシステムを簡略的に示す。酸素濃縮空気は、圧縮機３によって加圧され、圧力制御器８によって調節された特定の圧力下で除菌フィルター４を通過することによって除菌されて、ガス導入管５を通じて液体培地２中に吹き込まれる。容器１中の液体培地２上の気相の圧力は監視され、ガス排出管６に接続された排気圧力調節器６Ａの制御下、定圧バルブによって制御される。放出空気の一部を空気供給配管に還流させて、供給された新鮮な空気と混合させるのは任意である。
【００１６】
図２は、本発明方法を実施するための別のバイオリアクターシステムの略解図であり、それにはブロア１２によって過剰な二酸化炭素を排出するための二酸化炭素濃度制御器９及び酸素濃度制御器１１に結合された酸素改質器１０とが装備されている。ガス排出管６を通じで放出される容器１内の液体培地２上の酸素濃縮空気は、制御器９内で二酸化炭素の一部を除去され、ブロア１２を通ってガス導入管５に循環される。
【００１７】
図３は、本発明方法を実施するための、さらに異なるバイオリアクターシステムの略解図である。担子菌を液体培地２に該菌の菌糸を接種することにより培養システム中で培養する場合、酸素濃縮空気を吹き込むことによって生じた、培養中の菌の菌糸を含む液体培地２の飛沫が、放出される空気によって搬出され、除菌フィルター４、排気バルブ、配管の内壁などを含む該システムの様々な部分への菌糸の堆積を引き起こし、これらの部分が目詰まりするので培養運転が中断されることが時々ある。そのような問題を避けるために、バイオリアクターシステムに湿式サイクロン１３を配設し、サイクロン１３中で分離され、サイクロン１３内に沈殿した菌糸は、サイクロン１３の円錐部で、そこに送られた液で洗い出される。そのように洗い出された菌糸を含む洗い出し液は、サイクロン１３の底部から排出され、サイクロン１３の底部に接続されたレシーバタンク１４に貯留され、そこから該液は、圧力制御器１６によって制御された圧力下、ポンプＰ１によって反応容器１へ戻される。適切に設計されて操業されれば、担子菌の培養工程は４日間あるいはそれ以上中断されることなく継続することができる。
【００１８】
図４は、連続工程として本発明方法を実施するのに適したバイオリアクターシステムの略解図であり、そこでは、菌の培養によって発生した二酸化炭素ガスは、二酸化炭素吸収器１８を運転することにより除去され、二酸化炭素濃度が低下した空気は、二酸化炭素濃度制御器９を通して培養システムに戻される。空気導入管５は外筒管１９により取り囲まれていて、その外筒管中では、液体培地の上方への流れが可能になるので、撹拌機のような機械的撹拌手段がなくても菌集塊の増殖速度を高めることができる。液体培地２は、調製タンク２２内で、配管２３を通して栄養成分を追加添加されて調製されるが、浮遊菌糸を除去するためマイクロフィルター又は限外ろ過膜２０，２１を通して循環される。
【００１９】
実施例
次に、本発明方法を実施例によってさらに詳細に説明するが、アガリクス菌を担子菌の代表的な種とした。
【００２０】
実施例１
容量１リットルの耐圧円筒状ステンレス鋼製バイオリアクター容器に、それぞれ、液体培地１リットル当り、純シュクロース６０ｇ、硝酸アンモニウム１０ｇ、リン酸ナトリウム５ｇ、硫酸マグネシウム七水和物ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２．５ｇ、リン酸水素二カリウムＫ2ＨＰＯ4 ５ｇ及び硫酸鉄（ＩＩ）七水和物ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．２ｇを含有する液体培地１リットルを装填した。
このようにして調製された液体培地に放線菌で汚染されたアガリクス菌の菌糸を乾燥状態で３ｍｇ接種し、２５℃で３日間ゆっくり撹拌して、乾燥状態で２５ｇの菌体細粒を得た。
【００２１】
このようにして得られた細粒塊体から、目視検査により真正細菌特有の色素がない菌細粒２個を採集し、クリーンベンチで磨砕した。それぞれ液体培地１リットル当り、シュクロース５８ｇに相当する粗製ケインシュガー６０ｇ、２００メッシュのふるいを通過する粒子粉末度を有するサトウキビ粉砕物の乾燥粉１０ｇ、硝酸アンモニウム１２ｇ、リン酸ナトリウム４ｇ、硫酸マグネシウム七水和物２．５ｇ、硫酸鉄（ＩＩ）七水和物０．２ｇ及びリン酸水素二カリウム５ｇが溶解又は分散された容量１リットルの別の液体培地に、磨砕された菌細粒を接種して、回分処理で培養を行った。この回分処理の培養を同じ条件で再び繰り返した後、菌糸を従来の寒天培地上で培養して、汚染されていない菌体細粒を得た。
同じ液体培地に放線菌で汚染された最初の細粒を接種して培養を行い、放線菌で汚染された着色部分をナイフを使用して削り落とすことにより、同様の汚染されていないアガリクス細粒を得ることができた。
【００２２】
実施例２
図３に図示されたサイクロンに連結された容量１リットルの耐圧ステンレス鋼製バイオリアクター容器に、それぞれ、液体培地１リットル当り、精製シュクロース６０ｇ、硝酸アンモニウム１０ｇ、リン酸ナトリウム５ｇ、硫酸マグネシウム七水和物２．５ｇ、硫酸鉄（ＩＩ）七水和物０．２ｇ及びリン酸水素二カリウム７ｇが溶解された１リットル容量の第１の培地、以後培地Ａと称する、を装填した。
【００２３】
別の容量１リットルの耐圧ステンレス鋼製バイオリアクター容器に、それぞれ、液体培地１リットル当り、粗製ケインシュガー５０ｇ、２００メッシュのふるいを通過する粒子粉末度を有するサトウキビの搾り粕の粉末を乾燥状態で１５ｇ、硝酸アンモニウム１２ｇ、リン酸ナトリウム４ｇ、硫酸マグネシウム七水和物２．５ｇ、硫酸鉄（ＩＩ）七水和物０．２ｇ及びリン酸水素二カリウム６ｇが溶解又は分散された１リットル容量の第２の培地、以後培地Ｂと称する、を装填した。
【００２４】
培地Ａ及びＢのそれぞれに、実施例１で得られた汚染されていないアガリクス菌細粒を接種し、酸素を３０〜３５体積％含む酸素濃縮空気を０．８リットル／分の速度で液体培地の中に吹き込みながら、液体培地をゆっくりと撹拌して２５℃で菌の培養を行った。液体培地に吹き込まれる酸素濃縮空気の圧力を、上流側圧力をはじめの２４時間は０．１２〜０．１５ＭＰａ（絶対圧）に、第２〜４日間は０．１５〜０．３０ＭＰａ（絶対圧）に保ち、下流側圧力を常に０．１０〜０．１３ＭＰａ（絶対圧）に保つように制御した。
【００２５】
５日間まで培養することによって得られた菌集塊の量（乾燥状態基準）を、液体培地（Ａ）及び（Ｂ）に対しそれぞれ曲線Ａ及びＢで図５に示す。図５中の曲線Ａ´は撹拌機で撹拌せずに液体培地（Ａ）において得られた結果を示す。図５中の曲線Ｃは、シュクロースを同量のグルコースに置き換えたこと以外は液体培地（Ａ）と同じの従来の液体培地中での培養で得られた結果を示す。
【００２６】
実施例３
実施例２と同じアガリクス菌の培養工程を液体培地（Ｂ）を用いて繰り返した。２４時間操業後、液体表面がかなりの量の泡で覆われたので、それらをすくいとり、保存した。アガリクスの別の培養操業を液体培地（Ｂ）の新たな部分で実施例２と同様にして行い、３時間操業後、液体培地に上記で保存した泡を液体培地の約１０％の体積分加え、さらに５日間まで培養操業を継続した。
この操業で得られた培養の結果は、図５中の曲線Ｂで示されたものとほとんど同じであり、該泡は真正細菌類や真菌類に対して抗菌性活性を示した。
【００２７】
実施例４
アガリクス菌の同じ培養手順は、図３に図示されたサイクロンを備えたバイオリアクター又はサイクロンを省いたこと以外は同じリアクター中で実施例１と同様にして４日間にわたって行われた。バイオリアクターから排気によって運ばれて排出された液体を、飛沫に同伴してもれ出るアガリクス菌糸の含有量として分析し、サイクロンの有無での操業をそれぞれ実線曲線と破線曲線によって図６に示す結果を得た。この図に示されているように、サイクロンが装備されていると、飛沫中のアガリクス菌糸の含有量は液体１リットル当り乾燥状態で０．１ｇを超えることなく保たれるが、サイクロンが装備されていない場合、菌糸含有量は液体１リットル当り乾燥状態で０．４ｇに達した。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は本発明方法を実施するための代表的なバイオリアクターシステムの断面略解図である。
【図２】  図２は本発明方法を実施するための、別のバイオリアクターシステムの断面略解図である。
【図３】  図３は本発明方法を実施するための、また別のバイオリアクターシステムの断面略解図である。
【図４】  図４は本発明方法を連続工程として実施するためのバイオリアクターシステムの断面略解図である。
【図５】  図５は種々の液体培地におけるアガリクス菌の増殖曲線を示す。
【図６】  ガスサイクロンが備えられた（実線曲線）又は備えられていない（破線曲線）バイオリアクターから搬出された飛沫中のアガリクス菌の菌糸濃度を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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