(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターロイキン−６レセプターとインターロイキン−６とが直接ペプチド結合した融合蛋白質を有効成分として含む白血球増多剤。
【請求項２】
インターロイキン−６レセプターとインターロイキン−６とが直接ペプチド結合した融合蛋白質を添加することで、白血球を増多させる方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、インターロイキン−６（以下ＩＬ−６と略する）とインターロイキン−６レセプター（以下ＩＬ−６Ｒと略する）を有効成分として含む白血球増多剤、そして、ＩＬ−６ＲとＩＬ−６との融合蛋白質を投与することからなる白血球増多方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
白血球は末梢血の血球の中で核を有する細胞である。起源や形態から、顆粒球、単球及びリンパ球に分けられ、顆粒球は更に好中球、好酸球及び好塩基球に分けられる。白血球は、生体防御に関する重要な機能を担っていることから、癌に対する化学療法や放射線治療により、白血球が減少している場合等には、白血球を増多することが有効な治療方法となる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
白血球を増多させる造血因子として、従来から、顆粒球コロニー刺激因子（以下Ｇ−ＣＳＦと略する）が知られており、医薬品としての開発が進められているが、Ｇ−ＣＳＦによる増多作用は、主に好中球に対するものであり、他の顆粒球や、単球更にはリンパ球をも増多するものではない。
【０００４】
本発明は、Ｇ−ＣＳＦによっては増多されない、好中球以外の白血球も生体防御の重要な役割を担っていることに鑑み、それらを増多させる造血因子を提供しようとするものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するためになされた本発明は、好中球以外の白血球を増多する増血因子に関するものであり、ＩＬ−６及びＩＬ−６Ｒを有効成分として含む白血球増多剤である。また本発明は、ＩＬ−６ＲとＩＬ−６との融合蛋白質を有効成分として含む白血球増多剤である。
【０００６】
また本発明は、好中球以外の白血球を増多する方法に関するものであり、ＩＬ−６及びＩＬ−６Ｒを投与する、白血球増多方法である。更に本発明は、ＩＬ−６ＲとＩＬ−６との融合蛋白質を投与する、白血球増多方法である。以下、本発明を詳細に説明する。
【０００７】
本発明は、ＩＬ−６のシグナルを伝達する細胞表面上のｇｐ１３０蛋白質（以下ｇｐ１３０と略する）を刺激する蛋白質として、ＩＬ−６とＩＬ−６Ｒ、又は、ＩＬ−６ＲとＩＬ−６との融合蛋白質をマウスに投与することで、好中球に限らず、それ以外の白血球も増多する、という新たな知見に基づくものである。
【０００８】
ＩＬ−６Ｒは、全長４６８アミノ酸残基で構成される膜蛋白質で、シグナル領域、細胞外領域、膜貫通領域、そして細胞内領域を有し（Ｙａｍａｓａｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４１、８２５頁、１９８８年参照）、本来膜に存在する分子量８万の糖蛋白質であり、ＩＬ−６と結合すると、更に細胞膜上のｇｐ１３０と結合して細胞内にシグナルを伝える。ＩＬ−６との結合及びｇｐ１３０との結合には、その細胞外領域のみが必要であり、膜貫通領域や細胞内領域を欠失した可溶性ＩＬ−６Ｒであっても、ＩＬ−６と結合した後、更にｇｐ１３０と結合してシグナルを伝達することができる（アメリカ特許第５１７１８４０号公報等参照）。
【０００９】
例えばヒトＩＬ−６Ｒの場合、シグナル領域はＮ末端１番目のメチオニン残基付近から１９番目のアラニン残基付近まで、細胞外領域は２０番目のロイシン残基付近から３５８番目のアスパラギン酸残基付近まで、膜貫通領域は３５９番目のセリン残基付近から３８６番目のロイシン残基付近まで、細胞内領域は３８７番目のアルギニン残基付近から４６８番目のアルギニン残基付近までと考えられている。細胞外領域はイムノグロブリン様領域とサイトカインレセプター領域に分けられ、イムノグロブリン様領域は２０番目のロイシン残基付近から１１１番目のアスパラギン酸残基付近まで、サイトカインレセプター領域は１１２番目のバリン残基付近から３２３番目のアラニン残基付近までと考えられている。そしてＩＬ−６ＲにおいてＩＬ−６との結合に必須なのはサイトカインレセプター領域であり、イムノグロブリン様領域は不要であることが知られている。
【００１０】
従って本願発明において使用するＩＬ−６Ｒとしては、前記全長のＩＬ−６Ｒに限られず、細胞内領域を欠失した可溶性のものでも良い。より具体的には、例えばチャイニーズハムスター卵母細胞（ＣＨＯ細胞）で発現された、細胞外領域の３２５アミノ酸（Ｎ末端側２０〜３４４位までのアミノ酸残基）で構成されるリコンビナントＩＬ−６Ｒ（Ｙａｓｕｋａｗａら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０８巻、６７３−６７６頁、１９９０年参照）や、ピキア・パストリス種の酵母で発現された細胞外領域（Ｎ末端側１１４〜３５５位までのアミノ酸残基）で構成されるリコンビナントＩＬ−６Ｒ（特開平９−１６３９８６号公報参照）を例示することができる。
【００１１】
ＩＬ−６は、４つのαへリックスから構成される全長２１２アミノ酸残基の可溶性蛋白質で、分子量約３万の糖蛋白質であり、ＩＬ−６Ｒと結合すると更に細胞膜上のｇｐ１３０と結合して細胞内にシグナルを伝える（Ｈｉｒａｎｏら、Ｎａｔｕｒｅ，３２４，７３１巻、１９８６年参照）。ＩＬ−６が活性を示すためには、これら４つのαへリックス全てが必要であることが知られている。従って本発明において使用するＩＬ−６としては、全長のＩＬ−６のほか、４つのαへリックス全てを有するものであれば特に制限はなく、例えば大腸菌で発現された、Ｎ末端２８番目のアラニン残基又は２９番目のプロリン残基から２１２番目のメチオニン残基までの、１８４アミノ酸残基又は１８５アミノ酸残基のリコンビナントＩＬ−６であっても良い（Ｔｏｎｏｕｃｈｉら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０４巻、３０−３３頁、１９８８年参照、Ｙａｓｕｋａｗａら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｌｅｔｔ．、１２巻、４１９−４２５頁、１９９０年参照）。
【００１２】
ＩＬ−６やＩＬ−６Ｒは、ヒトに限らず、マウス等でも見いだされている。従って、ＩＬ−６やＩＬ−６Ｒは、本発明の白血球増多剤や白血球増多方法を適用しようとする動物種に応じたものを使用することが好ましい。
【００１３】
本発明では、前記のようなＩＬ−６とＩＬ−６Ｒを、別個の蛋白質として混合する等して使用しても良いし、融合されたこれら蛋白質を使用しても良い。ここで、ＩＬ−６のＩＬ−６Ｒに対する重量比を１０を越えない範囲にすることが好ましく、特に０．１〜１０の範囲とすることが好ましい。ＩＬ−６とＩＬ−６Ｒとの融合蛋白質では、ＩＬ−６とＩＬ−６Ｒとの分子数の比は１であるが、重量比では０．７となる（Ｎ末端２０〜３３３位のアミノ酸残基からなるＩＬ−６Ｒの場合）。
【００１４】
ＩＬ−６ＲとＩＬ−６との融合蛋白質は、ＩＬ−６ＲとＩＬ−６が１本のポリペプチドでつながったリコンビナント蛋白質で、Ｎ末端側にＩＬ−６Ｒが、Ｃ末端側にＩＬ−６がそれぞれ位置し、細胞膜上のｇｐ１３０と結合して細胞内にシグナルを伝えるものである。ＩＬ−６ＲとＩＬ−６の融合は、投与した際に予想される抗原反応を低く抑えるために、リンカー配列を介さずに、ＩＬ−６Ｒを構成するアミノ酸残基の一つが、ＩＬ−６を構成するアミノ酸残基の一つと、直接に、ペプチド結合している融合蛋白質が好ましい。リンカーを用いる場合には、例えば公知のリンカー配列（Ｆｉｓｈｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、１５、１４２頁、１９９７年；Ｃｈｅｂａｔｈら、Ｅｕｒ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｎｅｔｗ．、８、３５９頁、１９９７年）を使用したり、ＩＬ−６Ｒの３４４番目のロイシン残基のＣ末端にセリン残基−セリン残基−グルタミン酸残基−ロイシン残基−バリン酸残基というリンカーを結合し、更にそのＣ末端側にＩＬ−６を結合させることが例示できる。
【００１５】
リンカーを介さずに、ＩＬ−６ＲとＩＬ−６を直接結合して融合蛋白質とする場合には、例えばＩＬ−６ＲのＮ末端３２３番目のアラニン残基からＮ末端３６１番目のセリン残基までの３９個のアミノ酸残基のいずれか一つのアミノ酸残基のＣ末端側にＩＬ−６のＮ末端のアミノ酸残基を直結したものや、例えばピキア・パストリス種の酵母で発現されたリコンビナントＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質（特願平１０−１９０５９７号）を例示することができる。なお、ピキア・パストリス種の酵母を宿主細胞としてＩＬ−６ＲとＩＬ−６との融合蛋白質を発現させる場合は、ＩＬ−６Ｒ遺伝子とＩＬ−６遺伝子から該融合蛋白質をコードする遺伝子を調製したうえで、適当なプロモーター等を組み込んで発現ベクターを調製し、通常の手法を用いて酵母を形質転換等すれば良いが、融合蛋白質のシグナルペプチドとしてＩＬ−６Ｒ本来のシグナルペプチドやサッカロミセス酵母のα因子シグナルぺプチドを組み込むことが好ましい。
【００１６】
融合していないＩＬ−６とＩＬ−６Ｒを用いて白血球増多を行う場合は、上記のように、ＩＬ−６とＩＬ−６Ｒを別個に製造しておき、混合して同時に投与するほかに、これらを別個に投与しても良い。なお、融合蛋白質を含む白血球増多剤を投与することは、ＩＬ−６とＩＬ−６Ｒを同時に投与することに他ならない。
【００１７】
本発明の白血球増多剤は、非経口投与、例えば静脈内投与、筋肉内投与、経皮投与等により投与することが好ましい。投与量は、白血球の不足症状を示す疾患の種類、患者の状態等により適宜決定されるが、一般に１〜５００μｇ／ｋｇ／日の範囲であり、白血球の増多の様子を監視しつつ、継続的に投与等すれば良い。
【００１８】
【発明の実施の形態】
以下本発明を、その一実施形態である実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００１９】
実施例１
ヒト臍帯血２０ｍｌより、文献記載の方法（Ｓｕｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ，９２巻，２５８９頁，１９９５年参照）に従ってＣＤ３４陽性細胞を精製分離した。得られた細胞５００個、１．２％メチルセルロース（信越化学（株）製）、３０％ウシ胎児血清アルブミン（Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．社製）、１％ウシ血清アルブミン（以下ＢＳＡと略する）（Ｓｉｇｍａ社製）、０．０５mM  ２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ社製）、ＳＣＦ（幹細胞因子）（１００ｎｇ／ｍｌ）、各種濃度のＩＬ−６及びＩＬ−６Ｒ、或いは各種濃度のＩＬ−６ＲとＩＬ−６との融合蛋白質を含む、α−ＭＥＭ（Ｆｌｏｗ社製）１ｍｌを３５ｍｍ浮遊培養用プラスチック培養皿（Ｎｕnｃ社製）に分注し、３７℃、５％ＣＯ２，湿度１００％の条件で培養した。
【００２０】
２週間後、倒立顕微鏡下の観察でコロニーの同定を行い、顆粒球コロニー（Ｇ）、マクロファージコロニー（Ｍ）、顆粒球・マクロファージの混合コロニー（ＧＭ）、芽球コロニー（Ｂｌａｓｔ）、顆粒球・マクロファージ・赤芽球の混合コロニー（Ｍｉｘ）、赤芽球コロニー（ＢＦＵ−Ｅ）の６種類に分類した。結果を図１に示す。
【００２１】
図１から明らかなように、ＩＬ−６（１００ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ−６Ｒ（２００ｎｇ／ｍｌ）の共存条件下（Ｂ）、ＩＬ−６ＲとＩＬ−６との融合蛋白質（３００ｎｇ／ｍｌ）の共存条件下（Ｃ）、ＩＬ−６ＲとＩＬ−６との融合蛋白質（６００ｎｇ／ｍｌ）の共存条件下（Ｄ）では、対照群（Ａ）と比較して、マクロファージコロニー、顆粒球・マクロファージの混合コロニー、顆粒球・マクロファージ・赤芽球の混合コロニーが多数出現した。このことは、ＩＬ−６及びＩＬ−６Ｒ、或いはＩＬ−６ＲとＩＬ−６との融合蛋白質が、顆粒球だけでなく単球の前駆細胞に対する増殖活性が強いこと、すなわち、ＩＬ−６及びＩＬ−６Ｒ、或いはＩＬ−６ＲとＩＬ−６との融合蛋白質が白血球の増多効果をもつことを意味する。
【００２２】
実施例２
８週令のＣ５７ＢＬ／６系雄性マウス（日本エスエルシー（株）製）を１５匹ずつ３群（Ａ、Ｂ、Ｃ群）に分けた。コントロール群であるＡ群には０．１％のＢＳＡを含むＰＢＳ（０．３ｍｌ）を、Ｂ群には０．１％のＢＳＡと５μｇのＩＬ−６を含むＰＢＳ（０．３ｍｌ）を、Ｃ群には、０．１％のＢＳＡ、５μｇのＩＬ−６及び２００μｇのＩＬ−６Ｒを含むＰＢＳ（０．３ｍｌ）を、それぞれ１日２回５日間連続で腹腔に投与した。
【００２３】
投与開始後３、６、１０日目に、各群でマウスを５匹ずつ採血した。採血は心臓より行い、白血球数を血球カウンターＣｅｌｌｔａｃα（日本光電（株）製）にて測定した。結果を図２に示す。
【００２４】
図２から明らかなように、Ｂ群では、Ａ群に対して３、６、１０日目の白血球に有意差は認められなかった。一方、Ｃ群では、３日目の白血球数はＡ群に対して有意差はないが、６、１０日目ではいずれもＡ群との間に有意差（Ｐ＜０．０１）が認められた。この結果は、ＩＬ−６ＲとＩＬ−６を併用投与することにより白血球数が増多することを示す。
【００２５】
【発明の効果】
本発明によれば、ＩＬ−６及びＩＬ−６Ｒ、或いはＩＬ−６ＲとＩＬ−６との融合蛋白質という、リコンビナント技術により、大量に製造することが可能となっている蛋白質を投与するすることで、白血球を増多することが可能となる。これにより、白血球の減少を伴う疾患や、疾患の治療過程で白血球の減少が生じた患者に対し、白血球を増多させるための有効な治療薬、治療方法を提供することができる。
【００２６】
特に、本発明の白血球増多剤等と従来の治療法を併用することにより、癌に対する化学療法や放射線療法の治療成績の向上が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１に示す方法でヒトＣＤ３４陽性細胞を培養したときに出現したコロニーを示す。
【図２】実施例２に示す方法でマウスにＰＢＳのみ（左のバー；Ａ群）、ＩＬ−６（真中のバー；Ｂ群）、ＩＬ−６Ｒ及びＩＬ−６（右のバー；Ｃ群）を投与したときの白血球数の推移を示す。
【図１】
0004591636.tif 000002
【図２】
0004591636.tif 000003