(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の標的被検体の存在を測定する方法であって、
ａ）電極の少なくとも１つが
ｉ）当該電極に共有結合により付着した捕捉結合リガンド；
ii）標的被検体；および
iii）電子伝達部分；
を含むアッセイ複合体を含む電極である、複数の電極を含んでなるアレイに当該サンプルを適用させること；
ｂ）当該電極に入力波形を印加し、２以上の調波数を有する少なくとも１つの高調波成分を含む出力波形を発生させること；
ｃ）当該出力波形を当該電極で検出すること；
ｄ）調波数が２以上である当該高調波成分を分析し、当該標的被検体の存在を測定すること、
を含んでなる方法。
【請求項２】
当該標的被検体が、核酸である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
当該標的被検体が、タンパク質である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
当該分析が、ピーク認識機構の使用を含んでなる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
当該分析が、デジタルフィルタを含んでなる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
当該電極が、当該入力波形に対する非対称応答を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
当該電子伝達部分が、分解可能である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
当該電子伝達部分が、遷移金属の複合体である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
当該遷移金属の複合体が、メタロセンである、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
当該メタロセンが、フェロセンである、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
当該電子伝達部分が、酸化還元タンパク質である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
当該入力波形が電圧波形であり、当該出力波形が電流波形であり、
当該入力波形が、第一の周波数及び第一の振幅を有する交流素子を含み、かつ
当該第一の振幅は、当該出力波形が少なくとも１つの非直線性高調波成分を含むように選択される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
当該高調波成分が、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９および第１０の高調波成分からなる高調波成分の群から選択される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記出力波形が、複数の高調波成分を含み、かつ
該方法が、前記複数の高調波成分を分析することを含む、請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本願は、1998年９月17日に出願されたU.S.S.N. 60/100,730の継続出願である。
【０００２】
発明の分野
本発明は、対ノイズ比がより高度なシグナルを達成して標的被検体の検出限界を向上することを目的とする、シグナルプロセス化方法の使用に関する。これらの技術は、より高度な高調波振動数(harmonic frequencies)での出力シグナルをモニターすることを含む。
【０００３】
発明の背景
液体または気体中の特異的な物質の存在および／または濃度を検出することについては、多くのアッセイまたはセンサーがある。これらの多くは、検出のためのメカニズムとして特異的なリガンド/抗リガンド(リガンド／抗リガンド)の反応によっている。すなわち、対の物質（即ち、結合対やリガンド／抗リガンド）は、互いには結合するが、他の物質とはほとんどまたはまったく結合しないことが分かっている。多くの技術において複合体の検出にこれらの結合対が使用されてきた。一般的にこれらの方法は、複合体の１つの成分をなんらかの方法、例えば、放射性同位体、蛍光物質および他の光学活性分子、酵素などを用いて標識し、複合体全体を検出可能にして実施される。
【０００４】
他のアッセイは検出に電子的シグナルを用いる。とくに興味深いのはバイオセンサーである。少なくとも２種のバイオセンサーが知られている。それらは酵素をベースとするかまたは代謝性のバイオセンサー、および結合性またはバイオ親和性センサーである。例えば、米国特許4,713,347; 5,192,507; 4,920,047; 3,873,267およびこれらの特許に開示の文献参照。これらの既知センサーのいくつかは交流電流(ＡＣ)技術を利用しているが、この技法は、バルク（または誘導）インピーダンスの相違を検出することに限定される。
【０００５】
同様に、電極を使用する核酸の電子検出も既知である；例えば、ＵＳＰ５，５９１，５７８；５，８２４，４７３；５，７０５，３４８；５，７８０，２３４および５，７７０，３６９；ＵＳＳＮ０８／９１１，５８９；およびＷＯ９８／２０１６２；ＰＣＴ／ＵＳ９８／１２４３０；ＰＣＴ／ＵＳ９８／１２０８２；ＰＣＴ／ＵＳ９９／１０１０４；ＰＣＴ／ＵＳ９９／０１７０５；およびＰＣＴ／ＵＳ９９／０１７０３参照。
【０００６】
電気化学検出の領域には、採用されている多くの電気化学的技法がある。伝統的に、電気化学的方法ではパルス波形、すなわち、一般に示差パルスポーラログラフィーおよび方形波ボルタンメトリーなどを適用することによって時間領域におけるファラデー（誘導）電流シグナルをバックグラウンド成分から識別することにより、そのシグナル−ノイズ比を改善する。パルス法では時間領域での変化する電流からファラデー電流を識別することができる。変化する電流はファラデー電流よりもかなり急速に減衰する；すなわち、逆平方根と比較すると指数関数的である。同様に、シグナル−ノイズ比を改善するために変調技法も使用されている；これらの方法ではシグナル上変調した搬送波（正弦波）の負荷を利用する。
【０００７】
周波数領域はシグナル−ノイズ比を高めるために二三の電気化学的技法に使用されているのみである。ＡＣボルタンメトリーでは、電位ランプが電極に適用され、小さな振幅正弦波が線型ランプに重ねられる。しかし、大きな振幅正弦波ボルタンメトリーの使用は、フーリエ変換を用いるより高度な調和振動数での検出と併用するとき、有用な方法であると証明されている。参照：U.S. Patent No. 5,650,061; Singhai et al., Anal. Chem. 69:1552 (1997); Singhal and Kuhr, Anal. Chem. 69:4828 (1997); Singhal et al., Anal. Chem. 69:3553 (1997); and Dontha et al., Anal. Chem. 69:2619 (1997)（これらすべての文献は出典明示により本明細書の一部とする）。
【０００８】
しかし、標的被検体などの生物分子を検出する際のシグナル処理をさらに有利にするには、さらなる方法がなお必要である。
従って、本発明の目的はＡＣ技法を使用して、被検体を検出するための新規な方法と組成物を提供することにある。これらの技法では、アレイ方式での特定の使用と、核酸およびタンパク質などの生物分子を検出するための特定の使用を見出す。
【０００９】
（発明の要約）
上に概説した目的に従い、本発明はサンプル中の標的被検体検出において有用な組成物と方法を提供する。本方法は複数の電極を含むアレイを提供することを含み、該電極の少なくとも一つはアッセイ複合体を含んでなる。該アッセイ複合体は電極に共有結合により付着した捕捉結合リガンド、標的被検体、および電子伝達部分を含む。少なくとも最初の入力シグナルはアッセイ複合体に印加され、出力シグナルが受信される。次いで、出力シグナルは当該標的被検体の存在を検出するために処理される。好適な態様ではそれぞれがアレイの異なるセルまたは電極端子に付着した複数のアッセイ複合体を利用する。
【００１０】
（図面の簡単な説明）
図１Ａ、１Ｂおよび１ＣはＤＮＡチップからの実際の結果を示す。図２Ａは陽性および陰性例を一緒にプロットする；図２Ｂは陽性例であり、図２Ｃは陰性例である。実験は実施例１に示したとおりに実施した。
図２Ａ、２Ｂ、２Ｃおよび２Ｄは異なるＡＣ振幅を使用したことと関連する資料を描出する。図２Ａはセルが小さなＡＣ振幅により励起された場合に、システムの応答が相対的に直線となり、小さな高調波成分のみを生ずることを示す。図２Ｂはセルが大きなＡＣ振幅により励起された場合に、システムの応答が高次に非直線性となり、シグナルの周波数スペクトルで観察されるように強い高調波成分のみを生ずることを示す。図２ＣはＶＡａｃ＝１００ｍＶにより励起された表面結合ＤＮＡシステムの周波数スペクトルと第４高調波ＡＣボルタンモグラムを示す。図２ＤはＶＡａｃ＝１００ｍＶにより励起されたＤＮＡシステムの応答が、ＶＡｄｃ＝１５０ｍＶでＥ０以下であることを示す。
図３は方形波ＡＣＶの高調波を示す；図３Ａは第２高調波であり、図３Ｂは第４高調波であり、３Ｃは第６高調波であり、３Ｄは第８高調波であり、３Ｅは第１０高調波であり、３Ｆは第１、３、５および９高調波であり、そして図３Ｇは高調波と対する電流のグラフを示す。
図４は実施例２の結果を示す；（Ａ）の周波数スペクトルはチップのバッファー液による測定値、（Ｂ）のスペクトルは同じチップの１μＭ相補性ＤＮＡによる測定値を示す。高調波ピークの傾斜は、（Ａ）は（Ｂ）に比較してより急峻である。
図５は図４に示したスペクトルのピーク振幅である。ｎ≧２に対する振幅の差の大きいことに注目されたい。
図６は周波数スペクトルの最初の４つのピークの細部を描出し、（Ａ）はバッファー中での測定値、および（Ｂ）は１μＭ−ＤＮＡでの測定値である。
図７は検出レベルの研究からの結果を示す。ｙ軸は異なるＤＮＡ濃度（１μＭ〜１ｎＭ）での高調波（ｎ≧２）のピーク振幅であり、ｘ軸は周波数と調波数である。また、バッファー溶液測定値からのデータを示す。
図８はＳＴＦＴアルゴリズムを用いるＪＴＦＴスペクトル写真の等高線プロットを示す。等高線の強度はシグナルの振幅に対応する。下部スペクトル写真はＡＣＶ走査の未加工のシグナルである。上部右隅の周波数スペクトルはＦＦＴから得られる。
図９はチップのＡＣＶ走査の三次元スペクトル写真を示す。セル電流の振幅はｌｏｇ目盛りでプロットし、より高い調波を強調する。このスペクトル写真は同調またはロックイン増幅器なしの、ごく普通の第１および第４高調波ボルタンモグラムを明瞭に示す。他の高調波も存在する。
図１０はＦＦＴを用いる基本波、第２、第３および第４高調波でのＡＣボルタンモグラム応答を示す。
【００１１】
（発明の詳細な説明）
本発明は標的被検体の電気化学的検出において使用するシグナル処理方法の使用を目的とする。一般に、いずれのシステムにおいても、観察されるシグナルは標的被検体からのシグナル（サンプルシグナル）とバックグラウンドからのシグナル（またはノイズ）との組合わせである。例えば、ＡＣボルタンメトリーにおいては、２つのタイプの電流が生じる：即ちファラデー電流およびバックグラウンド電流である。バックグラウンド電流はシステムそれ自体の結果であり得る；例えば、容量性バックグラウンド電流が発生するが、これは本発明システムの出力シグナルの主成分であり得る；これは一般に二重層容量の産物である。
【００１２】
本発明はシグナルを増大させるか、ノイズを減少させるか、またはノイズのバックグラウンドにおいてよりシグナルを明瞭にするかもしくは検出可能とするために使用し得る技法を目的とする。すなわち、バックグラウンド・ノイズ内のシグナルをより良好に同定するのに役立ち得る技法はいずれも本発明での使用が可能である。これらの技法は、一般に３つの方法に分類される：（１）開始シグナルを適用するタイプまたは方法の変法（すなわち、“入力”を変化させてサンプルシグナルを最大化するかまたは同定し得るようにする）；（２）データ処理、すなわち、サンプルシグナルを最大化するかまたは同定し得るようにするための“出力”シグナルに使用する技法；および（３）アッセイそれ自体の変法、すなわち、電極表面またはシステムの成分を、サンプルシグナルの良好な同定を可能とするようにする。このように、例えば、適切な“入力”方法とは、多重周波数を使用すること；ＡＣ振幅を増大させること；方形波ＡＣＶの使用；特別のまたは複雑な波形の使用、などであるが、これらに限定されるものではない。同様に、適切な“出力”ＡＣ技法とは、より高い調和振動数をモニターすること；位相分析またはフィルタ；バックグラウンド引き算技法（インピーダンス分析およびシグナル認識またはピーク認識技法の使用などであるが、これらに限定されるものではない）；デジタルフィルタ技法；バンド幅狭隘化技法（ロックイン検出機構、高速フーリエ変換（ＦＦＴ）法を含む）；相関および／またはコンボリューション技法；シグナル平均化；スペクトル分析、などであるが、これらに限定されるものではない。さらに、アッセイ成分の変更は、サンプルシグナルとノイズシグナルが非平行様式で変化するように実施し得る；すなわち、２つのシグナルが互いに非直線的に応答する。
【００１３】
一般に、電気化学的検出に依存するアッセイ方法は本発明の技法から利益を得ることができる。例えば、本発明の方法は単層を利用しないシステム、並びに外因性ＥＴＭを使用しないシステム、およびＡＣ以外の技法に依存するシステムに使用し得る。しかし、本発明は一般的に以下の特許に記載されたようなシステムにおいて特に使用し得る：U.S. Patent Nos. 5,591,578; 5,824,473; 5,705,348; 5,780,234 and 5,770,369; U.S.S.N.s 08/873,598 08/911,589; and WO 98/20162; PCT/US98/12430; PCT/US98/12082; PCT/US99/10104; PCT/US99/01705, and PCT/US99/01703。これらのシステムは、電極表面に標的被検体を固定し、アッセイ複合体を形成するために、捕捉結合リガンド（標的被検体が核酸である場合は捕捉プローブと呼称する）の使用に依存する。該アッセイ複合体はさらに電子伝達部分（ＥＴＭ）を含んでなり、それが直接または間接的に標的被検体に付着する。すなわち、電極表面近傍でのＥＴＭの存在は標的被検体の存在に左右される。ＥＴＭと電極間の電子伝達は以下に概説する様々な技法を用い開始されるが、さらに以下に概説するように出力シグナルを受信し、任意に処理する。このように、電子伝達を検出することにより、標的被検体の存在または不存在が測定される。
【００１４】
一般的には、使用し得る２つの基本的メカニズムがある。好適な態様において、ＥＴＭの検出は二本鎖核酸の積層したπ−軌道を介しての電子伝達に基づく。この基本的メカニズムは、U.S. Patent Nos. 5,591,578, 5,770,369, 5,705,348,およびPCT US97/20014に記載されており、本明細書では“メカニズム−１”と呼ぶ。簡単に説明すると、以前の研究では、電子伝達は二本鎖核酸の積層したπ−軌道を介して急速に進むが、一本鎖核酸ではそれが有意に遅い。従って、これはアッセイのバイアスとして働く。このように、検出電極に導電性オリゴマーを介して付着する核酸にＥＴＭを（下記のように、鎖の一方に共有結合によりまたはハイブリダイゼーション指標の使用を介してハイブリダイゼーション複合体に非共有結合により）付加することによって、ＥＴＭと電極間の電子伝達は、核酸と導電性オリゴマーを介して検出し得る。
【００１５】
これは標的被検体が核酸である場合に実施し得る；あるいは、非核酸標的被検体は（標的被検体を検出電極に付着させるための）任意の捕捉結合リガンドおよび核酸“尾部”を有する可溶性結合リガンドと共に使用するが、それが次いで検出を実施する表面上の検出プローブに直接または間接的に結合し得る。
別法として、ＥＴＭの存在または不存在は単層の表面上で直接的に検出することができる。すなわち、ＥＴＭからの電子はシグナルを発生させるために積層したπ軌道を経て移動する必要がない。上記のように、この態様において、検出電極は、好ましくは、サンプル中の酸化還元活性種から電極を遮蔽するように働く自己集合単層（ＳＡＭ）を含んでなる。この態様において、僅かな“欠陥”（場合により、“ミクロ管路”、“ナノ管路”または“電気管路”という）を含んで構成されたＳＡＭ表面上にＥＴＭの存在することは、直接に検出することができる。この基本的考え方を本明細書では“メカニズム−２”という。本質的に、電気管路は特定のＥＴＭが表面に接近するのを可能とする。理論に囚われずに銘記すべきことは、電気管路の形状は選定したＥＴＭに一部左右されることである。例えば、比較的疎水性のＥＴＭを使用すると、疎水性の電気管路形成種を使用することが可能であり、それが親水性または荷電ＥＴＭを効果的に排除する。同様に、ＳＡＭに親水性または荷電種を使用すると、疎水性のＥＴＭを排除するように作用する。
【００１６】
留意すべきは、これらの欠陥は、サンプル成分が検出電極と直接接触するのを可能とする“穴(holes)”とは区別すべきことである。以下により詳細に説明するように、電気管路は幾つかの一般的方法で生成させることが可能であり、例えば、これらに限定されるものではないが、ＰＣ回路板上に形成させた金電極などの粗電極表面の使用；または単層に少なくとも２つの異なる種を包含させること、すなわち、“混合単層”を使用することであり、少なくともその一つは電気管路形成種（ＥＦＳ）である。このように、標的被検体の結合に基づき、ＥＴＭを含んでなる可溶性結合リガンドは表面に搬送され、推定ではあるが電極へつながる“電気管路”を経てＥＴＭの検出が進行する。本質的には、欠陥を含んでなるＳＡＭの役割はＥＴＭが電極の電子表面と接触させ得ることであり、一方で溶液成分から電極を遮蔽し、電極に対し非特異結合量を低減する利益を提供することである。異なる観点では、結合リガンドの役割はＥＴＭを表面に取り込むための特異性を提供することであり、その場合は直接検出することができる。
このように、いずれかの態様において、以下により詳細に説明するように、アッセイ複合体はＥＴＭを含むように形成し、次いで本明細書に概説する検出電極とシグナル処理技法を用いて、それを検出する。
【００１７】
従って、本発明はサンプル溶液中の標的被検体を検出する方法を提供する。当業者が認めるように、サンプル溶液は以下の相当数の対象物を含んでなるがこれらに限定されるものではない：体液（例えば、血液、尿、血清、リンパ液、唾液、肛門および膣分泌液、汗および精液などであるが、これらに限定されるものではなく、実質的に生体からのもの、好ましくは哺乳動物のサンプル、特にヒトのサンプルであることが好ましい）；環境サンプル（例えば、空気、農業、水および土壌の各サンプルなどであるが、これらに限定されるものではない）；生物学的戦闘剤サンプル；研究サンプル（すなわち、核酸の場合、サンプルは増幅反応の産物であってもよく、例えば、ＰＣＲ増幅反応など、ＰＣＴ／ＵＳ９９／０１７０５に一般的に記載されているような標的およびシグナル増幅のサンプルを含む）；精製したサンプル、例えば、精製したゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質など；粗製サンプル（バクテリア、ウイルス、ゲノムＤＮＡなど）。当業者が認めるように、サンプルについては実質的にどのような実験的取扱いもなし得る。
【００１８】
本方法は標的被検体の検出を目的とする。本明細書での“標的被検体”またはその文法的等価物とは、検出すべき分子または化合物を意味する。以下に概説するように、標的被検体は、好ましくは、結合リガンドに結合するが、それについては以下により詳細に説明する。当業者が認めるように、大多数の被検体は本方法により検出することが可能である；基本的に、対応する下記の結合リガンドが作製し得る標的被検体は本発明方法によって検出することができる。
【００１９】
適切な被検体は有機および無機分子であり、生体分子を包含する。好適な態様において、被検体は以下のとおりである：環境汚染物（害虫駆除剤、殺虫剤、毒素などを含む）；化学物質（溶媒、有機材料などを含む）；治療剤分子（治療および誤用薬物、抗生物質などを含む）；生物分子（ホルモン、サイトカイン、タンパク質、脂質、炭化水素、細胞膜抗原およびレセプター（中性、ホルモン性、栄養性、および細胞表面レセプター）またはそれらのリガンドなどを含む）；全細胞（原核細胞（病原性バクテリアなど）および哺乳動物腫瘍細胞を含む真核細胞などを含む）；ウイルス（レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、レンチウイルスなどを含む）；および胞子など。特に好適な被検体は環境汚染物、核酸、タンパク質（酵素、抗生物質、抗原、成長因子、サイトカインなどを含む）、治療および誤用薬物、細胞、およびウイルスなどである。
【００２０】
特に好適な標的被検体はタンパク質および核酸である。本明細書にて使用する際の“タンパク質”とはタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドである。該タンパク質は天然産アミノ酸とペプチド結合から造られているか、または合成ペプチド模倣構造であってもよい。その側鎖は（Ｒ）または（Ｓ）いずれの立体配置であってもよい。好適な態様において、アミノ酸は（Ｓ）またはＬ−配置である。非天然の側鎖を用いる場合、非アミノ酸置換基を用い、例えば、生体内での分解を防止または遅延させることができる。
【００２１】
適切な標的被検体は、これらに限定されるものではないが、以下のとおりである：（１）免疫グロブリン、特に、ＩgＥ、ＩgＧおよびＩgＭ、および治療上または診断学的に関連する抗体、例えば、これらに限定されるものではないが、ヒトアルブミン、アポリポタンパク質（アポリポタンパク質Ｅを含む）、絨毛性性腺刺激ホルモン、コルチゾール、α−フェトプロテイン、チロキシン、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、抗トロンビンなどに対する抗体、薬物に対する抗体（例えば、抗てんかん剤（フェニトイン、プリミドン、カルバリエゼピン、エトスクシイミド、バルプロン酸、およびフェノバルビトール）、心臓作用性剤（ジゴキシン、リドカイン、プロカインアミド、およびジソピラミド）、気管支拡張剤（テオフィリン）、抗生物質（クロラムフェニコール、スルホンアミド類）、抗うつ剤、免疫抑制剤、濫用薬物（アンフェタミン、メタアンフェタミン、カンナビノイド、コカインおよびアヘン製剤）などに対する抗体）、および多くのウイルスに対する抗体（例えば、オルソミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、呼吸器合胞体ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス）、アデノウイルス、ライノウイルス、コロナウイルス、レオウイルス、トガウイルス（例えば、風疹ウイルス）、パルボウイルス、ポックスウイルス（例えば、痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス）、エンテロウイルス（例えば、ポリオウイルス、コクサッキーウイルス)、肝炎ウイルス（Ａ型、Ｂ型およびＣ型を含む）、ヘルペスウイルス（例えば、単純疱疹ウイルス、水痘・帯状ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタイン−バーウイルス）、ロタウイルス、ノーウォークウイルス、ハンタウイルス、アレナウイルス、ラブドウイルス（例えば、狂犬病ウイルス)、レトロウイルス（ＨＩＶ、ＨＴＬＶ−Ｉおよび−IIを含む）、パポバウイルス（例えば、パピローマウイルス）、ポリオーマウイルス、およびピコルナウイルスなどに対する抗体）、および細菌に対する抗体（例えば、多様な病原性および非病原性対象原核生物、例えば、バシラス；ビブリオ、例えば、ビブリオ・コレレ（V. cholerae）；エシェリキア、例えば、腸毒素産生性大腸菌；赤痢菌（Shigella）、例えば、志賀赤痢菌（S. dysenteriae）；サルモネラ、例えば、サルモネラ・ティフィ（S. typhi）；マイコバクテリウム（Mycobacterium）、例えば、結核菌（M. tuberculosis）、癩菌（M. leprae）；クロストリジウム（Clostridium）、例えば、ボツリヌス菌（C. botulinum）、破傷風菌（C. tetani）、クロストリジウム・ディフィシレ（C. difficile）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（C.perfringens）；コリネバクテリウム（Cornyebacterium）、例えば、ジフテリア菌（C. diphtheriae）；ストレプトコッカス（Streptococcus）、例えば、化膿連鎖球菌（S. pyogenes）、肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）；スタヒロコッカス（Staphylococcus）、例えば、黄色ブドウ球菌（S. aureus）；ヘモフィルス（Haemophilus）、例えば、ヘモフィルス・インフルエンザ（H. influenzae）；ナイセリア（Neisseria）、例えば、髄膜炎菌（N. meningitidis）、淋菌（N. gonorrhoeae）；エルシニア（Yersinia）、例えば、エルシニア・ランブリア（Y. lamblia）、ペスト菌（Y. pestis）；シュードモナス（Pseudomonas）、例えば、緑膿菌（P. aeruginosa）、シュードモナス・プチダ（P. putida）；クラミジア（Chlamydia）、例えば、クラミジア・トラコマチス（C. trachomatis）；ボルデテラ（Bordetella）、例えば、百日咳菌（B. pertussis）；トレポネーマ（Treponema）、例えば、梅毒トレポネーマ（T.  palladium）、など；（２）酵素（およびその他のタンパク質）、例えば、これらに限定されるものではないが、心臓疾患の指標として、または治療に使用される酵素、例えば、クレアチンキナーゼ、乳酸脱水素酵素、アスパラギン酸アミノ転移酵素、トロポニンＴ、ミオグロビン、フィブリノーゲン、コレステロール、トリグリセリド、トロンビン、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）；膵臓疾患指標、例えば、アミラーゼ、リパーゼ、キモトリプシンおよびトリプシン；肝臓機能酵素およびタンパク質、例えば、コリンエステラーゼ、ビリルビン、およびアルカリホスファターゼ；アルドース、プロスタン酸ホスファターゼ、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ、および細菌性およびウイルス性酵素、例えば、ＨＩＶプロテアーゼなど；（３）ホルモンおよびサイトカイン（これらの多くは細胞レセプターのリガンドとして働く)、例えば、エリスロオポイエチン（ＥＰＯ）、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン（ＩＬ−１ないしＩＬ−７を含む）、インシュリン、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ−１および−２）、表皮成長因子（ＥＧＦ）、形質転換成長因子（ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−βを含む）、ヒト成長ホルモン、トランスフェリン、表皮成長因子（ＥＧＦ）、低密度リポタンパク質、高密度リポタンパク質、レプチン、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、毛様神経栄養因子、プロラクチン、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、カルシトニン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、コトリソール、エストラジオール、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、プロゲステロンおよびテストステロンなど；および（４）その他のタンパク質（α−フェトプロテイン、癌胎児性抗原ＣＥＡ、癌マーカー、などを含む）。
【００２２】
さらに、抗体の検出され得る生物分子が同様に直接検出し得る；すなわち、ウイルスまたは細菌細胞、治療薬物および濫用薬物などの検出が直接になし得る。
適切な標的被検体は、炭水化物類、例えば、これらに限定されるものではないが、乳癌（ＣＡ１５−３、ＣＡ５４９、ＣＡ２７.２９）、ムチン様癌関連抗原（ＭＣＡ）、卵巣癌（ＣＡ１２５）、膵臓癌（ＤＥ−ＰＡＮ−２）、前立腺癌（ＰＳＡ）、ＣＥＡ、および結腸直腸および膵臓癌（ＣＡ１９、ＣＡ５０、ＣＡ２４２）などのマーカー類を包含する。
【００２３】
適切な標的被検体は、金属イオン、特に重金属および／または毒性金属であり、これらに限定されるものではないが、アルミニウム、砒素、カドミウム、セレン、コバルト、銅、クロム、鉛、銀およびニッケルなどを包含する。
特に好適な標的被検体は核酸である。好適な態様において、標的被検体は核酸であり、標的配列が検出される。本明細書における“標的配列”または“標的核酸”という用語、またはその文法的等価物は一本鎖核酸上の核酸配列を意味する。標的配列とは遺伝子、調節配列、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡとｒＲＮＡを含むＲＮＡの一部分、またはその他の一部分である。配列はどのような長さであってもよいが、より長い配列がより特異的であると理解されている。当業者が認めるように、相補的標的配列は多くの形を採ることできる。例えば、配列はより大きな核酸配列、すなわち、遺伝子またはｍＲＮＡの全部または一部、取分けプラスミドまたはゲノムＤＮＡの制限フラグメント内に含まれていてもよい。以下により詳しく説明するように、プローブは、サンプル中の標的配列の存在または不存在を測定するために、標的配列にハイブリダイズするように調製する。一般的に言って、当業者はこの用語を理解している。標的配列はまた異なる標的ドメインからなっていてもよい；例えば、サンプル標的配列の第一標的ドメインは捕捉プローブまたは捕捉エクステンダー・プローブにハイブリダイズし、第二標的ドメインが増幅プローブの一部分、標識プローブ、または異なる捕捉プローブまたは捕捉エクステンダー・プローブなどにハイブリダイズすることが可能である。標的ドメインは隣接していてもよく、または離れていてもよい。“第一”および“第二”という用語は標的配列の５’−３’方向に関して該配列の方向を付与することを意味しない。例えば、相補性標的配列の５'−３’方向を仮定すると、第一標的ドメインは第二ドメインに対し５’に位置するか、あるいは第二ドメインに対し３’に位置する。
【００２４】
本明細書で「核酸」または「オリゴヌクレオチド」またはそれらと均等内容の語は、一緒に共有結合されている少なくとも２個のヌクレオチドを意味する。本発明の核酸は一般にホスホジエステル結合を含むが、場合によっては、下記で概説されている通り、交互のバックボーンを有し得る核酸類似体が含まれ、例えばホスホルアミド（Beaucageら、Tetrahedoron ４９（１０）：１９２５（１９９３）およびそれに記載された参考文献、Letsinger, J. Org. Chem. ３５：３８００（１９７０）、Sprinzlら、Eur. J. Biochem. ８１：５７９（１９７７）、Letsingerら、Nucl. Acids Res. １４：３４８７（１９８６）、Sawaiら、Chem. Lett. ８０５（１９８４）、Letsingerら、Ｊ. Am. Chem. Soc. １１０：４４７０（１９８８）、およびPauwelsら、Chemica Scripta ２６：１４１ ９１９８６））、ホスホロチオエート（Magら、Nucleic Acids Res. １９：１４３７（１９９１）、および米国特許第５６４４０４８号）、ホスホロジチオエート（Briuら、J. Am. Chem. Soc. １１１：２３２１（１９８９）、Ｏ−メチルホスホルアミダイト連鎖（Eckstein、Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach、オクスフォード・ユニバーシティー・プレス参照）、およびペプチド核酸バックボーンおよび連鎖（Egholm、J. Am. Chem. Soc. １１４：１８９５（１９９２）、Meierら、Chem. Int. Ed. Engl.、３１：１００８（１９９２）、Nielsen、Nature、３６５：５６６（１９９３）、Carissonら、Nature ３８０：２０７（１９９６）参照、これら全てを引用して説明の一部とする）が含まれる。他の類似核酸には、正のバックボーン（Denpcyら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、９２：６０９７（１９９５））、非イオン性バックボーン（米国特許第５３８６０２３,５６３７６８４,５６０２２４０,５２１６１４１および４４６９８６３号、Kiedrowshiら、Angew. Chem. Intl. Ed. English、３０：４２３（１９９１）、Letsingerら、J. Am. Chem. Soc.、１１０：４４７０（１９８８）、Letsingerら、Nucleoside & Nucleotide、１３：１５９７（１９９４）、２および３章、ＡＳＣシンポジウムシリーズ５８０、“Carbohydrate Modifications in Antisense Research”、Y.S. SanghuiおよびP. Dan Cook編、Mesmaekerら、Bioorganic & Medicinal Chem. Lett.、４：３９５（１９９４）、Jeffsら、J. Biomolecular NMR、３４：１７（１９９４）、Tetrahedron Lett.３７：７４３（１９９６））および非リボースバックボーンを伴うもの、例えば米国特許第５２３５０３３および５０３４５０６号、および６および７章、ＡＳＣシンポジウムシリーズ５８０、“Carbohydrate Modifications in Antisense Research”、Y.S. SanghuiおよびP. Dan Cook編記載のものがある。また、１個またはそれ以上の炭素環状糖類を含む核酸も核酸の定義内に含まれる（Jenkinsら、Chem. Soc. Rev.（１９９５）１６９−１７６頁参照）。幾つかの核酸類似体は、Rawls、C & E News １９９７年６月２日号、３５頁に報告されている。これらの参考文献は全て特に引用して説明の一部とする。リボース−リン酸バックボーンにこれらの修飾を加えることにより、ＥＴＭの付加が簡易化され、または生理学的環境における上記分子の安定性および半減期が増加され得る。
【００２５】
当業界の技術者が認めるように、これらの核酸類似体は全て本発明で使用され得る。さらに、天然に存する核酸および類似体の混合物が製造され得る。例えば、伝達性オリゴマーまたはＥＴＭ結合部位では、類似構造が使用され得る。別法として、異なる核酸類似体の混合物、および天然核酸および類似体の混合物も製造され得る。
【００２６】
特に好ましいのは、ペプチド核酸類似体を含むペプチド核酸（ＰＮＡ）である。天然に存する核酸の高荷電ホスホジエステルバックボーンとは対照的に、これらのバックボーンは中性条件下では実質的に非イオン性である。これによって、２つの利点が得られる。まず、ＰＮＡバックボーンは、改善されたハイブリダイゼーション速度論を呈する。ＰＮＡは、誤対合対完全適合塩基対において融解温度（Ｔｍ）のより大きな変化を有する。ＤＮＡおよびＲＮＡは、内部誤対合の場合典型的にはＴｍの２−４℃降下を呈する。非イオン性ＰＮＡバックボーンの場合、降下は７−９℃に近い。これは不一致をよりよく検出することを可能とする。同様に、それらの非イオン的性質故に、これらのバックボーンに結合された塩基のハイブリダイゼーションは、塩濃度に対して比較的非感受性である。
【００２７】
核酸は、明記されている通り１本または２本鎖であるか、または２本鎖または１本鎖の両配列の一部を含み得る。核酸は、ＤＮＡ、ゲノム性およびｃＤＮＡの両方、ＲＮＡまたはハイブリッドであり得、その場合核酸はデオキシリボ−およびリボ−ヌクレオチドの任意の組み合わせ、並びにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、イソグアニンなどを含む塩基の任意の組み合わせを含む。好ましい態様は、米国特許第５６８１７０２号で総括的に記載されている通り、非特異的ハイブリダイゼーションを低減化するために、標的配列ではなく、他のプローブと相補的になるように設計された核酸においてイソシトシンおよびイソグアニンを用いる。ここで使用されている、「ヌクレオシド」の語は、ヌクレオチド並びにヌクレオシドおよびヌクレオチド類似体、および修飾ヌクレオシド、例えばアミノ修飾ヌクレオシドを包含する。さらに、「ヌクレオシド」は、非天然的類似構造を包含する。すなわち、例えば各々塩基を含む、ペプチド核酸の個々の単位は、ここではヌクレオシドと称される。
【００２８】
従って、好ましい実施態様として、本発明の構成物は電極を含む。本明細書での“電極”は、電子装置に接続したとき、電流または荷電を感知し、それをシグナルに変換し得る構成物を意味する。あるいは、電極を、電位を電子に適用し得る、および/または、溶液中の種へまたは種から電子を移し得る構成物として定義することができる。このように、電極とは本明細書中のＥＴＭである。好適な電極は技術上既知であり、これらに限定されるものではないが、ある種の金属およびその酸化物、例えば、金、白金、パラジウム、シリコン、アルミニウム；金属酸化物電極、例えば、酸化白金、酸化チタン、酸化スズ、酸化スズインジウム、酸化パラジウム、酸化けい素、酸化アルミニウム、酸化モリブデン（Ｍｏ２Ｏ６）、酸化タングステン（ＷＯ３）および酸化ルテニウム；および炭素（ガラス状電極、黒鉛およびカーボンペースト）などを包含する。好適な電極は金、白金、けい素、炭素および金属酸化物電極などであり、金が特に好ましい。
【００２９】
本明細書に記載の電極は平らな表面として図示しているが、これは電極の可能な一形状であって、図式化を目的とするのみのものである。電極の形状は使用される検出法により変わる。例えば、平面状の電極は光検出法に好適であり、あるいは合成および検出のために処理可能な位置を必要として連なった核酸を調製する場合に好適である。あるいは、伝導性オリゴマーと内部表面に結合した核酸を含んでなるＳＡＭの場合には、単一プローブ分析のために、電極をチューブの形状とすることができる。電極コイルも、幾つかの実施態様では同様に好ましい。これは少容量のサンプルに露出すべき核酸の表面積を最大とするのを可能にする。
【００３０】
好適な態様において、検出電極は基板上に形成する。さらに、本明細書における検討は一般的に金電極の形成に向けられているが、当業者も認めるように、他の電極も同様に使用し得る。基板は、当業者も認めるように、多様な材料を含むが、プリント回路基板（ＰＣＢ）材料がとりわけ好ましい。このように、一般的に、適切な基板はこれらに限定されるものではないが、ファイバーグラス、テフロン、セラミック、ガラス、シリコン、雲母、プラスティック（アクリル、スチレンと他の物質とのポリスチレンおよびコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリカーボネート、ポリウレタン、テフロン（商標）、およびその誘導体など）、ゲテック（ＧＥＴＥＫ）（プロピレンオキシドとファイバーグラスの混合物）などである。ある実施態様では、ガラスは基板として適切ではない。
【００３１】
一般に、好適な材料はプリント回路基板材料である。プリント回路基板材料は電導層で被覆されている絶縁基板を含んでなる材料であり、リトグラフィー技法、特に露光リトグラフィーにより処理加工して、電極と相互接続体の型を形成する（場合により技術上、相互接続またはリード線という）。絶縁基板はすべてというわけではないが、一般にポリマーである。技術上知られているように、１層または複数層を使用し、“二次元”基板（例えば、すべての電極および相互接続体が同一平面にある）または“三次元”基板（この場合、電極は１方の表面にあり、相互接続体が基板を貫通して他側へ出てもよい）を作製する。三次元系は多くの場合、穿孔またはエッチングを使用し、次いで、銅などの金属で電気メッキし、“貫通基板”相互接続を作製するようにする。回路基板材料はしばしば基板にすでに付着した銅箔などの箔を備えており、必要により（例えば、相互接続のために）、例えば、電気メッキによりさらに銅が加えられる。銅の表面は、次いで、粘着層の付着を可能とするために、例えば、エッチングによりざらつかせる必要がある。
【００３２】
従って、好適な態様において、本発明は複数の電極、好ましくは金電極を含んでなる基板を含むバイオチップ（場合により本明細書では“チップ”という）を提供する。電極数はアレイについて概説したとおりとする。各電極は、好ましくは、本明細書に概説したように自己集合した単層を含んでなる。好適な態様において、単層形成種の１つは本明細書に概説したように捕獲リガンドを含んでなる。さらに、各電極は相互接続をもち、それが一端で電極に付着し、最終的に電極を制御し得る装置に付着している。すなわち、各電極は独立してアドレス参照可能である。
【００３３】
該基板はより大きな装置の部分であってもよく、該装置は検出電極に一定容量のサンプルを暴露する検出チャンバーを含む。一般に、検出チャンバーは約１ｎＬないし１ｍｌの範囲であり、好ましくは約１０μＬないし５００μＬである。当業者が認めるように、実験条件およびアッセイによっては、より少量またはより大量を用いてもよい。
【００３４】
一部の態様において、検出チャンバーと電極は電極構成要素（ＡＣ／ＤＣ電圧源、電流計、プロセッサ、読み出しディスプレー、温度制御器、光源など）を含む装置内に配設し得るカートリッジの部分である。この態様において、各電極からの相互接続は、装置内にカートリッジを挿入することにより、電極と電子組成間の接続が確立するような位置に配置する。
【００３５】
回路基板材料（または他の基板）上の検出電極は一般に多様な方法で調製される。一般に、高純度の金を用い、真空蒸着法（スパッタリングおよび蒸発）または溶液析出（電気メッキまたは無電解方法）により被覆してもよい。電気メッキを実施する場合には、基板は先ず電導性物質を含まねばならない；ファイバーグラスの回路基板は多くの場合銅箔を備えている。多くの場合、基板によっては、良好な機械的安定性を保証するために、基板と金の間に粘着層が用いられる。このように、好適な態様では、粘着金属、例えば、クロム、チタン、チタン／タングステン、タンタル、ニッケルまたはパラジウムなどの析出層を利用するが、これらの金属は上記金同様に析出させ得る。電気メッキ金属（粘着金属または電極金属）を使用する場合、粒状精製添加物（多くの場合、業界では光沢剤という）を任意に加えて、表面析出性を変化させる。好適な光沢剤は有機物および無機物の混合物であり、コバルトとニッケルが好ましい。
【００３６】
一般に、粘着層は約１００Åから約２５ミクロン（１,０００マイクロインチ）の厚さである。もし粘着金属が電気化学的に活性であるならば、電極金属は“染み出し”を防止する厚さで被覆しなければならない；もし粘着金属が電気化学的に不活性であるならば、電極金属は薄くてもよい。一般に、電極金属（好ましくは金）は約５００Åから約５ミクロン（２００マイクロインチ）の範囲の厚さで、好ましくは約３０マイクロインチないし約５０マイクロインチの厚さで析出させる。一般には、金を析出させて、直径約５ミクロンないし約５ｍｍの範囲、好ましくは約１００ないし２５０ミクロンのサイズの電極とする。このようにして形成される検出電極は、好ましくは、清浄とし、以下に検討するようにＳＡＭを付加する。
【００３７】
このように、本発明は複数の金電極を含んでなる基板の作製法を提供する。この方法は先ず基板上に、ニッケルまたはパラジウムなどの粘着金属を（選択肢として光沢剤と共に）被覆することを含む。電気メッキが好ましい。次いで、電極金属、好ましくは金を粘着金属上に（好ましくは再度電気メッキにより）被覆する。次いで、電極とそれに繋がる相互接続を含む装置の型をリトグラフ技法、特に技術上既知の露光リトグラフィー技法、および湿式化学エッチングにより作製する。多くの場合、非電導性化学抵抗性絶縁材料、例えば、蝋マスクまたはプラスティックを露光リトグラフィー技法により敷き、露光した電極とリード線への接続点のみを残す；リード線はそれ自体一般に被覆されている。
【００３８】
本方法ではＳＡＭの付加が続く。好適な態様においては、点滴析出技法を用い、必要な化学物質、すなわち、単層形成種であって、その一つは、好ましくは捕獲リガンド構成種、などを付加する。点滴析出技法は“スポット”アレイ作製について周知である。これは各電極に異なる構成物を付加するために実施する、すなわち、異なる捕獲リガンドを含む配列を作製する。あるいは、ＳＡＭ種は各電極について同一であってもよく、この場合は点滴析出技法またはその溶液に基板全体もしくは基板表面を浸漬する方法により実施してもよい。
【００３９】
この系はアレイ方式での特定用途が明らかになっている；すなわち、アドレス参照可能な検出電極のマトリックスがある場合である（本明細書では“パッド”、“アドレス”または“ミクロ領域”と一般的にいう）。本明細書において、“アレイ”とは複数の捕獲リガンドがアレイ方式にあることを意味する；アレイのサイズはアレイの構成物および最終用途に左右される。約２つの異なる捕獲リガンドから数千ものリガンドを含むアレイを作製し得る。一般に、該アレイは電極のサイズ並びにアレイの最終用途によって、２個から１００,０００以上にも及んで構成される。好適な範囲は約２個から約１０,０００個であり、好ましくは約５個から約１０００個であり、特に好ましいのは約１０個ないし約１００個である。一部の態様において、本発明の構成物はアレイ方式でない場合もある；すなわち、一部の態様では単一の捕獲リガンドを含んでなる構成物が同様に作製し得る。さらに、一部のアレイにおいて、異なる構成物または同一の構成物を含む複数の基板を用い得る。このように、例えば、大型のアレイは複数の小型基板から構成されてもよい。
【００４０】
多くのシステムでは必要ではないが、好ましい態様では、検出電極は自己集合単層(ＳＡＭ)を含む。本明細書に概説するように、検体が電極から少し離れているとき、標的被検体結合の有効性(例えば、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション)は増加し得る。同様に、単層が存在すると、生体分子(標的被検体を含む)の電極への非特定結合は、一般に減少する。このように、単層は電極表面から離れている被検体の維持を容易にする。さらに、単層は荷電種を電極表面から離れているようにするのに役立つ。このように、この層は、溶媒内で各電極と溶媒内で各ＥＴＭ間または電極と他種電気活性種間の電気的接触を防止するのに役立つ。かかる接触は、直接の“短絡”またはサンプル内に存在する可能性のある荷電種を介した間接の短絡となり得る。したがって、この単層は、好ましくは電極表面上の均一層にきっちりと詰込まれ、“孔”が存在するのを最少にする。単層は電極への溶媒接近をブロックする物理的障壁として作用する。
【００４１】
本明細書における“単層”または“自己集合単層”または“ＳＡＭ”とは、表面に自然発生的に化学吸着した分子の比較的規則的な集合を意味し、そこでの分子は互いに略平行に、平面に対しては大まかに垂直に方向づけられている。それぞれの分子は表面に付着する官能基と、単層の近傍分子と相互作用する部分を有し、比較的規則正しいアレイを形成する。“混合”単層は異質の単層を含んでなるものであり、すなわち、そこでは少なくとも２種の異なる分子が単層を作り上げている。
【００４２】
一般に、本発明のＳＡＭは多くの方法で生成させ得るものであり、使用する電極表面とシステムにより、多くの異なる成分を含んでなる。“メカニズム−１”の態様では、２種類の単層形成種、すなわち、単層形成種（絶縁体または導電性オリゴマーを含む）および捕捉結合リガンドを含んでなる導電性オリゴマー種を利用するが、当業者が認めるように、さらなる単層形成種をさらに含んでもよい。“メカニズム−２”の態様では、ＳＡＭの組成物は検出電極表面に左右される。一般に、２つの基本的な“メカニズム−２”システムが記載されている；金ボール電極などの“滑らかな”表面を含んでなる検出電極、およびＰＣ回路板上に工業用工程を用いて調製される電極などの“粗い”表面を含んでなる電極である。一般に、理論に囚われなければ、不完全な表面、すなわち、“粗い”表面とした単層は電気管路形成種（ＥＦＳ）の不存在下でも充分な電気管路を含む単層を自然発生的に形成すると思われるが、多分粗い表面上に均一な単層を形成するのが難しいという事実による。しかし、均一な表面はより均一な単層の形成を可能とするので、“より滑らかな”表面は電気管路を生成させるための十分な数のＥＦＳを包含している必要がある。再び、理論に囚われなければ、単層の均一性を損なう種を包含させること、例えば、より柔軟性の種の背面に硬い分子を包含させると、電気管路を形成させることになる。かくして、“滑らかな”表面は３種の成分、すなわち、絶縁体種、ＥＦＳ、および捕捉リガンドを含む種を含んでなる単層を含むが、場合によっては、例えば、捕捉リガンド種が高密度で含まれる場合、捕捉リガンド種がＥＦＳとして作用し得る。これに関連する“滑らかさ”は物理的に測定されないが、ＥＦＳを含む場合は、測定したシグナルの増加の関数として測定される。すなわち、単層形成種を被覆した検出電極からのシグナルを、ＥＦＳを含む単層形成種で被覆した検出電極からのシグナルと比較する。その増加は表面が比較的滑らかであることを示しているが、その理由はＥＦＳの包含が電極に対するＥＴＭの接近を容易にするように作用するからである。留意すべきことは、ここでの考察は主に金電極とチオール含有単層形成種に向けられているが、他のタイプの電極と単層形成種も使用し得ることである。
【００４３】
留意すべきことは、メカニズム−２システムの“電気管路”は電極表面とサンプル成分の直接接触には至らしめないこと、すなわち、電気管路は電極に物理的な接近を可能とする大きなポア(pores)または穴ではないことである。むしろ理論に囚われなければ、電気管路はある種の型のＥＴＭ、特に疎水性のＥＴＭが十分な単層への貫入を許し、検出を可能とすると思われる。しかし、ある種の疎水性種を含む他の型の酸化還元活性種は、電気管路が存在していても、単層へ貫入しない。このように、一般に、サンプル中に存在する可能性のある酸化還元活性種は、電気管路の結果としての実質的なシグナルを与えない。確実なシステムはＳＡＭの組成とＥＴＭの選択により変化するが、一般に、ＥＴＭ検出用の十分な電気管路をもつ非特異結合を減少させる適切なＳＡＭについて試験するには、フェロセンかまたはフェロシアニドをＳＡＭに添加することである；前者はシグナルを生じ、後者は生じないはずである。
【００４４】
従って、メカニズム−１のシステムにおいて、単層は第一の種として以下に詳しく説明するように捕捉結合リガンドを含む導電性オリゴマーを含んでなる種、および第二の種として絶縁体または導電性オリゴマーのいずれかまたは双方を包含する単層形成種を含む種を含んでなる。
好適な態様において、単層は電気管路形成種を含んでなる。本明細書において“電気管路形成種”または“ＥＦＳ”とは、一般にアルキル基などの絶縁体の単層に十分な電気管路を生成させ、表面でＥＴＭの検出を可能とし得る分子である。一般に、ＥＦＳは一つ以上の以下の特質を有する：それらは、例えば、アルキル鎖に比べた場合、比較的硬い分子であってもよい；それらは他の単層形成種と異なる形状をもつ電極表面に付着し得る（例えば、チオール基をもつ金表面に付着したアルキル鎖は大よそ４５°の角度で付着すると考えられ、チオールを介して金に付着したフェニル−アセチレン鎖は９０°の角度で降下すると考えられる）；それらは、例えば、アルキル基などの分枝基を包含すること、またはポリエチレングリコール単位などの高度に柔軟性の種を包含することを介して、きっちりと詰込まれた単層の形成を立体的に阻害または阻止する構造を有していてもよい；またはそれらは電気管路を形成するように活性化され得るものでもよい；例えば、光活性化可能種は光活性化により表面から選択的に除去され、電気管路を残す。
好適なＥＦＳは下記定義の導電性オリゴマー、およびフェニルアセチレン−ポリエチレングリコール種を含む。しかし、一部態様において、ＥＦＳは導電性オリゴマーではない。
【００４５】
好適な態様において、単層は伝導性オリゴマー(conductive oligomer)を含んでなる。本明細書において“伝導性オリゴマー”は実質的に伝導性のオリゴマーを意味し、好ましくは線状であり、そのある態様では文献上“分子線”という。本明細書において“実質的に伝導性”とは該オリゴマーが１００Ｈｚで電子を移動し得ることを意味する。一般に、伝導性オリゴマーは、伝導性オリゴマーの単量体単位間のように、実質的に重なり合うπ−軌道、すなわち、共役π−軌道を有するが、伝導性オリゴマーは１つ以上のシグマ（σ）結合をも含んでいる。さらに、伝導性オリゴマーは会合したＥＴＭへの電子の注入またはＥＴＭからの受け入れ能力によって機能的に定義することもできる。さらに、伝導性オリゴマーは本明細書に定義した絶縁体よりもより伝導性である。さらに、本発明の伝導性オリゴマーは電気活性ポリマーとは区別すべきもので、これはそれ自体で電子を供与または受容できるものである。
【００４６】
好適な態様において、伝導性オリゴマーは約１０−６ないし１０４Ω−１ｃｍ−１の伝導性Ｓを有し、好ましくは約１０−５ないし１０３Ω−１ｃｍ−１であって、これらのＳ値は約２０Åないし約２００Åの範囲の分子から計算される。以下に記載するように、絶縁体は約１０−７Ω−１ｃｍ−１以下の伝導性Ｓ、好ましくは１０−８Ω−１ｃｍ−１より低い値を有する。一般的には、Gardner et al., Sensors and Actuators A51 (1995) 57-66 (参照により本明細書に取込む) を参照されたい。
【００４７】
伝導性オリゴマーの所望の性質は、高い伝導性、本発明の構成物の合成と使用のために有機溶媒および／または水への十分な溶解性、および反応に対する好適な化学的抵抗などであるが、該反応が起こるのは、１）結合リガンド合成の際（すなわち核酸合成であり、本発明の構成物合成に際し、伝導性オリゴマーを含むヌクレオシドを核酸シンセサイザーに加えることができる）、２）伝導性オリゴマーが電極に付着する際、または３）結合アッセイの際、である。さらに、自己集合単層の形成を促進する伝導性オリゴマーが好ましい。
【００４８】
本発明のオリゴマーは、本明細書に記載のように、少なくとも２つの単量体サブユニットを含む。下記に詳しく説明するが、オリゴマーには、ホモおよびヘテロオリゴマーがあり、ポリマーも含む。
【００４９】
好ましい実施態様では、伝導性オリゴマーは、構造１に示した構造を持つ：
構造１
【化１】
0004530541.tif 000002
当業者には理解されるとおり、ここに示した構造は全て、更なる原子または構造を有し得る。即ち、構造１の伝導性オリゴマーは、電極、遷移金属錯体、有機ＥＴＭ、およびメタロセンなどのＥＴＭに、および核酸などの結合リガンドに、またはこれら数種に結合させることができる。特記しない限り、ここに示した伝導性オリゴマーは、その左側で電極に結合させる。つまり、構造１３の場合は、左側の“Ｙ”を本明細書に記載の電極につなげる。伝導性オリゴマーを結合リガンドに結合させるとき、右側の“Ｙ”は、存在するならば、直接的にまたは本発明に記載のリンカーを用いて、核酸などの結合リガンドに結合させる。
【００５０】
本実施態様では、Ｙは芳香族基であり、ｎは１から５０の整数であり、gは１または０のいずれかであり、ｅは０から１０の整数であり、ｍは０または１である。gが１のとき、Ｂ−Ｄは隣接した結合と共有し得る結合であり(本明細書中でＡ共役結合＠とよぶ)、好ましくは、アセチレン（Ｂ−Ｄは、好ましくはアセチレンから選択される共有結合である）、アルケン、置換アルケン、アミド、アゾ、−Ｃ＝Ｎ−(−Ｎ＝Ｃ−、−ＣＲ＝Ｎ−および−Ｎ＝ＣＲ−を含む)、−Ｓi＝Ｓi−および−Ｓi＝Ｃ−(−Ｃ＝Ｓi−、−Ｓi＝ＣＲ−および−ＣＲ＝Ｓi−を含む)から選択される。gが０のとき、ｅは好ましくは１であり、Ｄは好ましくはカルボニルまたはヘテロ原子部であり、このヘテロ原子は、酸素、硫黄、窒素、ケイ素またはリンから選択される。そのため、適切なヘテロ原子部には、−ＮＨおよび−ＮＲ、式中、Ｒは本明細書に定義のとおりである；置換硫黄；スルホニル(−ＳＯ２−)スルホキシド(−ＳＯ−)；酸化ホスフィン(−ＰＯ−および−ＲＰＯ−)；およびチオホスフィン(−ＰＳ−および−ＲＰＳ−)があるが、これらに限定されない。しかしながら、下記に概略説明するとおり、伝導性オリゴマーを金電極に結合させるような場合、硫黄誘導体は好ましくない。
【００５１】
“芳香族基”またはその均等物とは、本書では、一般に５から１４の炭素原子を含む芳香族単環式または多環式炭化水素部(より大きい多環式環構造を作ることもできるが)およびそれらの炭素環式ケトンまたはチオケトン誘導体で、その遊離の原子価を持つ炭素原子が芳香族環の一員であるものを意味する。芳香族環には、アリーレン基および２つ以上の原子を除いた芳香族基がある。本願の目的には、芳香族は複素環を含む。“複素環”または“ヘテロアリール”とは、１から５個の指定炭素原子を、窒素、酸素、硫黄、リン、ホウ素およびケイ素から選択されるヘテロ原子で置換した、そしてその遊離の原子価を持つ原子が芳香族環の一員である芳香族基、およびそれらの複素環式ケトンおよびチオケトン誘導体を意味する。従って、複素環には、チエニル、フリル、ピロリル、ピリミジニル、オキサリル、インドリル、プリニル、キノリル、イソキノリル、チアゾリル、イミドジル等がある。
【００５２】
重要なのは、伝導性オリゴマーのＹ芳香族基が異なっていてもよいこと、即ち、伝導性オリゴマーがヘテロオリゴマーであり得ることである。つまり、伝導性オリゴマーは、単一型のＹ基または複数型のＹ基のオリゴマーを含むことができる。
【００５３】
芳香族基は、本書中で一般にＲで表す置換基で置換できる。Ｒ基は、必要に応じて加え、伝導性オリゴマーのパッキングに影響を及ぼすことができる、即ち、Ｒ基を用いて単層におけるオリゴマーの会合を変化させることができる。Ｒ基を加えて、１)オリゴマーまたはオリゴマーを含む組成物の溶解度を変える；２)システムの共役または電子化学電位を変える；および３)単層表面の電荷または特性を変えることもできる。
【００５４】
好ましい実施態様では、伝導性オリゴマーが３つのサブユニットより大きいとき、Ｒ基は、溶液合成を行う場合の溶解度を高めるのに好ましい。しかしながら、Ｒ基およびその位置は、下記のように、表面上、特に単層内での伝導性オリゴマーのパッキングへの影響を最小限にするよう選択される。一般に、単層内では小さいＲ基のみが使用され、大きいＲ基は一般に単層表面上にある。そのため、例えば、単層内の伝導性オリゴマー部分にメチル基を付けて溶解度を高めるのが好ましく、例えば、Ｃ３からＣ１０のより長いアルコキシ基を単層表面上に付けるのが好ましい。一般に、本明細書に記載のシステムでは、このことは、一般に、立体的に重要なＲ基は、単層を形成する分子の平均長さによるが、最初の２つまたは３つのオリゴマーサブユニットのいずれにも結合させないことを意味する。
【００５５】
適切なＲ基には、水素、アルキル、アルコール、芳香族、アミノ、アミド、ニトロ、エーテル、エステル、アルデヒド、スルホニル、ケイ素部、ハロゲン、硫黄含有部、リン含有部、およびエチレングリコールがあるが、これらに限定されない。本明細書に示した構造では、Ｒは、その位置が置換されていない場合は水素である。ある位置では、２つの置換基、ＲおよびＲ'が可能であり、その場合、ＲおよびＲ'基は同一であるかまたは異なっているかのいずれかでよい。
【００５６】
“アルキル基”またはその均等物とは、直鎖状または分枝状アルキル基を意味し、直鎖アルキル基が好ましい。分枝状ならば、１箇所以上の、特記しなければ任意の位置で枝分かれしている。このアルキル基は、約１から約３０の炭素原子(Ｃ１−Ｃ３０)の範囲であり得、好ましい実施態様では、約１から約２０の炭素原子(Ｃ１−Ｃ２０)を利用し、約Ｃ１から約Ｃ１２ないしＣ１５が好ましく、Ｃ１ないしＣ５が特に好ましいが、ある実施態様では、アルキル基は、もっと大きくてもよい。アルキル基の定義の中に含まれるものには、Ｃ５およびＣ６環などのシクロアルキル基や、窒素、酸素、硫黄、またはリンを持つ複素環式環もある。アルキルはまた、好ましくは硫黄、酸素、窒素およびケイ素のヘテロ原子を持つヘテロアルキルも含む。アルキルは、置換アルキル基も含む。“置換アルキル基”とは、更に上記定義の１以上の置換基部“Ｒ”を含むアルキル基を意味する。
【００５７】
“アミノ基”またはその均等物とは、−ＮＨ２、−ＮＨＲおよび−ＮＲ２基を意味し、Ｒは本明細書に定義のとおりである。
【００５８】
“ニトロ基”とは、−ＮＯ２基を意味する。
【００５９】
“硫黄含有部”とは、硫黄原子を含有する化合物を意味し、チア−、チオ−およびスルホ−化合物、チオール(−ＳＨおよび−ＳＲ)、スルフィド(−ＲＳＲ−)、スルホキシド(−Ｒ−ＳＯ−Ｒ−)、スルフォン(−Ｒ−ＳＯ2−Ｒ−)、ジスルフィド(−Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｒ−)およびスルフォニルエステル(−Ｒ−ＳＯ2−Ｏ−Ｒ−)、があるが、これらに限定されない。“リン含有部”は、リンを含有する化合物を意味し、ホスフィンおよびホスフェートがあるが、これらに限定されない。“シリコン含有部”とは、シリコン含有化合物を意味する。
【００６０】
“エーテル”とは、−Ｏ−Ｒ−基を意味する。好ましいエーテルはアルコキシ基であり、−Ｏ−(ＣＨ2) 2ＣＨ3および−Ｏ−(ＣＨ2)4ＣＨ3が好ましい。
【００６１】
“エステル”とは、−ＣＯＯＲ基を意味する。
【００６２】
“ハロゲン”とは、臭素、ヨウ素、塩素またはフッ素を意味する。好ましい置換アルキルは、部分的にまたは全体的にハロゲン化したアルキル、例えばＣＦ３等である。
【００６３】
“アルデヒド”とは、−ＲＣＯＨ基を意味する。
【００６４】
“アルコール”とは、−ＯＨ基およびアルキルアルコール−ＲＯＨを意味する。
【００６５】
“アミド”とは、−ＲＣＯＮＨ−またはＲＣＯＮＲ−基を意味する。
【００６６】
“エチレングリコール”または“(ポリ)エチレングリコール”とは、−(Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２)ｎ−基を意味するが、エチレン基の各炭素原子は、一重にまたは二重に置換されていてもよく、即ち、−(Ｏ−ＣＲ２−ＣＲ２)ｎ−、但しＲは上記定義のとおりである、であってよい。酸素の位置に他のヘテロ原子を持つエチレングリコール誘導体(即ち、−(Ｎ−ＣＨ２−ＣＨ２)ｎ−または−(Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２)ｎ−または置換基を持つ)も好ましい。
【００６７】
好ましい置換基には、メチル、エチル、プロピル、−Ｏ−(ＣＨ２)２ＣＨ３および−Ｏ−(ＣＨ２)４ＣＨ３などのアルコキシ基およびエチレングリコールおよびそれらの誘導体があるが、これらに限定されない。
【００６８】
好ましい芳香族基には、フェニル、ナフチル、ナフタレン、アントラセン、フェナントロリン、ピロール、ピリジン、チオフェン、ポルフィリンおよび縮合環誘導体を含むこれらそれぞれの誘導体があるが、これらに限定されない。
【００６９】
本明細書に示した伝導性オリゴマーでは、gが１のとき、Ｂ−Ｄは２つの原子または化学部分をつなげる結合である。好ましい実施態様では、Ｂ−Ｄは、重複または共役π軌道を含有する共役結合である。
【００７０】
好ましいＢ−Ｄ結合は、アセチレン(−Ｃ≡Ｃ−、アルキンまたはエチンとも呼ばれる)、アルケン(−ＣＨ＝ＣＨ−、エチレンとも呼ばれる)、置換アルケン(−ＣＲ＝ＣＲ−、−ＣＨ＝ＣＲ−および−ＣＲ＝ＣＨ−)、アミド(−ＮＨ−ＣＯ−および−ＮＲ−ＣＯ−または−ＣＯ−ＮＨ−および−ＣＯ−ＮＲ−)、アゾ(−Ｎ＝Ｎ−)、エステルおよびチオエステル(−ＣＯ−Ｏ−、−Ｏ−ＣＯ−、ＣＳ−Ｏ−および−Ｏ−ＣＳ−)および他の共役結合(−ＣＨ＝Ｎ−、−ＣＲ＝Ｎ−、−Ｎ＝ＣＨ−および−Ｎ＝ＣＲ−)、(−ＳiＨ＝ＳiＨ−、−ＳiＲ＝ＳiＨ−、−ＳiＨ＝ＳiＲ−、およびＳiＲ＝ＳiＲ−)、(−ＳiＨ＝ＣＨ−、−ＳiＲ＝ＣＨ−、−ＳiＨ＝ＣＲ−、−ＳiＲ＝ＣＲ−、−ＣＨ＝ＳiＨ−、−ＣＲ＝ＳiＨ−、−ＣＨ＝ＳiＲ−および−ＣＲ＝ＳiＲ−)などから選択される。特に好ましいＢ−Ｄ結合は、アセチレン、アルケン、アミドおよびこれら３種の置換誘導体およびアゾである。とりわけ好ましいＢ−Ｄ結合は、アセチレン、アルケンおよびアミドである。二重結合に結合させたオリゴマー成分は、トランスまたはシス配置、または混合型であってよい。そのため、ＢまたはＤのいずれかは、炭素、窒素またはケイ素を含むことができる。置換基は、上記Ｒのところで定義したとおりである。
【００７１】
構造１伝導性オリゴマーのg＝０のとき、ｅは好ましくは１であり、Ｄ部分は上記定義のカルボニルまたはヘテロ原子部分であり得る。
【００７２】
上記Ｙ環のように、どの単一伝導性オリゴマー内でも、Ｂ−Ｄ結合(またはg＝０のときＤ部分)は、全て同じでもよく、または少なくとも１つが異なっていてもよい。例えば、ｍが０のとき、末端Ｂ−Ｄ結合は、アミド結合であることができ、残りのＢ−Ｄ結合はアセチレン結合であることができる。一般に、アミド結合が存在するとき、アミド結合はできるだけ少ない方が好ましいが、ある実施態様では、全てのＢ−Ｄ結合がアミド結合である。よって、上記Ｙ環のところで概略説明したとおり、単層内ではある一つの型のＢ−Ｄ結合が伝導性オリゴマー中に下記のように存在でき、そして、単層レベル上に別の型のＢ−Ｄ結合、例えば核酸が伝導性オリゴマーを介して結合している場合核酸ハイブリダイゼーションにより大きな柔軟性を与えるために存在できる。
【００７３】
本明細書に示した構造中、ｎは１から５０の整数であるが、より長いオリゴマーもまた使用できる(例えば、Schumm et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1994 33(13): 1360参照)。理論に縛られることなく、表面上での効率のよい核酸ハイブリダイゼーションのためには、ハイブリダイゼーションが表面から少し離れて起こるべきであり、ハイブリダイゼーション速度は、特に２００から３００塩基対の長いオリゴヌクレオチドの場合、表面からの距離の関数として上昇すると思われる。従って、核酸が伝導性オリゴマーを介して結合しているとき、以下でより詳しく記すように、伝導性オリゴマーの長さは、その核酸の最も近いヌクレオチドが電極表面から約６Åから約１００Å(但し、５００Åまでの距離が使用できる)に位置するような長さであり、約１５Åから約６０Åが好ましく、約２５Åから約６０Åも好ましい。従って、ｎは芳香族基のサイズ応じて変わるが、一般に、約１から約２０であって、約２から約１５が好ましく、約３から約１０が特に好ましい。
【００７４】
本明細書に示した構造中、ｍは０または１のいずれかである。つまり、ｍが０のとき、伝導性オリゴマーの末端には、Ｂ−Ｄ結合またはＤ部分があり、即ち、Ｄ原子が直接的かまたはリンカーを介するかのいずれかで核酸に結合している。ある実施態様では、例えば、伝導性オリゴマーを核酸のリボース−ホスフェート主鎖のホスフェートに結合させるとき、伝導性オリゴマーと核酸の間に結合させたリンカーなどの別の原子があってもよい。更に、下記に概略説明するとおり、Ｄ原子は、アミノ修飾リボースの窒素原子であり得る。あるいは、ｍが１のとき、伝導性オリゴマーの末端にはＹ、芳香族基があり、即ち、その芳香族基は、核酸またはリンカーに結合している。
【００７５】
当業者には明らかなように、多数の伝導性オリゴマーが利用できる。これらは、例えば、縮合芳香族環または、−(ＣＦ２)ｎ−、−(ＣＨＦ)ｎ−および−(ＣＦＲ)ｎ−などのテフロン(登録商標)様オリゴマーを含む化合物などの当分野で知られている他の伝導性オリゴマーと同じく、構造１や構造８式の範囲内にある伝導性オリゴマーを含む。例えば、Schumm et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 1361 (1994); Grosshenny et al., Platinum Metals Rev. 40 (1): 26-35 (1996); Tour, Chem. Rev. 96: 537-553 (1996); Hsung et al., Organometallics 14: 4808-4815 (1995);およびここに引用されている文献参照、これらは全てはっきりと出典明示により本明細書に組込まれている。
【００７６】
本実施態様の特に好ましい伝導性オリゴマーは、下記である：
構造２
【化２】
0004530541.tif 000003
構造２は、gが１のときの構造１である。構造２の好ましい実施態様には、ｅが０であり、Ｙがピロールまたは置換ピロールであるもの；ｅが０であり、Ｙがチオフェンまたは置換チオフェンであるもの；ｅが０であり、Ｙがフランまたは置換フランであるもの；ｅが０であり、Ｙがフェニルまたは置換フェニルであるもの；ｅが０であり、Ｙがピリジンまたは置換ピリジンであるもの；ｅが１であり、Ｂ−Ｄがアセチレンであり、Ｙがフェニルまたは置換フェニルであるもの(例えば、下記構造４参照)がある。構造２の好ましい実施態様はまた、下記構造３に示した、ｅが１である場合のものである：
【００７７】
構造３
【化３】
0004530541.tif 000004
構造３の好ましい実施態様は、Ｙがフェニルまたは置換フェニルであり、Ｂ−Ｄがアゾであるもの；Ｙがフェニルまたは置換フェニルであり、Ｂ−Ｄがアセチレンであるもの；Ｙがフェニルまたは置換フェニルであり、Ｂ−Ｄがアルケンであるもの；Ｙがピリジンまたは置換ピリジンであり、Ｂ−Ｄがアセチレンであるもの；Ｙがチオフェンまたは置換チオフェンであり、Ｂ−Ｄがアセチレンであるもの；Ｙがフランまたは置換フランであり、Ｂ−Ｄがアセチレンであるもの；Ｙがチオフェンまたはフラン(または置換チオフェンまたはフラン)であり、Ｂ−Ｄがアルケンおよびアセチレン交互の結合であるものである。
【００７８】
本明細書に示した構造の殆どが構造３の伝導性オリゴマーを利用している。しかしながら、どの構造３オリゴマーも、本明細書中の他の構造、即ち構造１または８オリゴマー、または他の伝導性オリゴマーで置換でき、かかる構造３の使用は、本発明の範囲を限定する意味を持たない。
【００７９】
構造３の特に好ましい実施態様は、下記の構造４、５、６および７を含む：
構造４
【化４】
0004530541.tif 000005
構造４の特に好ましい実施態様には、ｎが２であり、ｍが１であり、Ｒが水素であるもの；ｎが３であり、ｍが０であり、Ｒが水素であるもの、および溶解度を高めるためのＲ基の使用がある。
【００８０】
構造５
【化５】
0004530541.tif 000006
構造５のようにＢ−Ｄ結合がアミド結合であるとき、伝導性オリゴマーは、擬似ペプチドオリゴマーである。構造５中のアミド結合は、カルボニルを左側にして、即ち、ＣＯＮＨ−で示すが、逆、即ち−ＮＨＣＯ−も使用できる。構造１７の特に好ましい実施態様には、ｎが２であり、ｍが１であり、Ｒが水素であるもの；ｎが３であり、ｍが０であり、Ｒが水素であるもの(この実施態様では、末端窒素(Ｄ原子)はアミノ修飾リボースの窒素であり得る)、および溶解度を高めるためのＲ基の使用がある。
【００８１】
構造６
【化６】
0004530541.tif 000007
構造６の好ましい実施態様には、第一のｎが２であり、第二のｎが１であり、ｍが０であり、全てのＲ基が水素であるもの、または溶解度を高めるためのＲ基の使用がある。
【００８２】
構造７
【化７】
0004530541.tif 000008
構造７の好ましい実施態様には、第一のｎが３であり、第二のｎが１−３であり、ｍが０または１のいずれかであるもの、および溶解度を高めるためのＲ基の使用がある。
【００８３】
好ましい実施態様では、伝導性オリゴマーは、構造８で示した構造を持つ：
構造８
【化８】
0004530541.tif 000009
この実施態様では、Ｃは炭素原子であり、ｎは１から５０の整数であり、ｍは０または１であり、Ｊは酸素、窒素、ケイ素、リン、硫黄、カルボニルまたはスルホキシドからなる群から選択されるヘテロ原子であり、Ｇはアルカン、アルケンまたはアセチレンから選択される結合であって、２つの炭素原子と一緒になってＣ−Ｇ−Ｃ基がアルケン(−ＣＨ＝ＣＨ−)、置換アルケン(−ＣＲ＝ＣＲ−)またはそれらの混合物(−ＣＨ＝ＣＲまたは−ＣＲ＝ＣＨ−)、アセチレン(−Ｃ≡Ｃ−)またはアルカン(−ＣＲ２−ＣＲ２−、Ｒは水素または本明細書に記載の置換基のいずれかである)であるようにする。各サブユニットのＧ結合は、他のサブユニットのＧ結合と同一かまたは異なっていてもよく、つまり、アルケンとアセチレン結合が交互にあるオリゴマーが使用できる。しかしながら、Ｇがアルカン結合であるとき、オリゴマー中のアルカン結合数は最小に維持すべきであり、伝導性オリゴマー当りシグマ結合約６以下が好ましい。アルケン結合が好ましく、本明細書に総括的に示しているが、アルカンおよびアセチレン結合は、当業者には明らかなように、本明細書に記載したどの構造または実施態様でも置換できる。
【００８４】
ある実施態様では、例えば、ＥＴＭが存在しないとき、ｍ＝０ならば少なくとも１つのＧ結合はアルカン結合である。
【００８５】
好ましい実施態様では、構造８のｍは０である。特に好ましい実施態様では、構造９に示したように、ｍは０であり、Ｇはアルケン結合である：
構造９
【化９】
0004530541.tif 000010
構造９のアルケンオリゴマーおよび本明細書に示した別のものは、一般に、好ましいトランス配置で示しているが、シスまたはトランスとシスの混合したオリゴマーも使用できる。上記のように、Ｒ基を加えて、電極上での組成物のパッキング、オリゴマーの親水性または疎水性、およびオリゴマーの柔軟性、即ち、回転、ねじれ、または縦の柔軟性を変えることができる。ｎは上記定義のとおりである。
【００８６】
好ましい実施態様では、Ｒは水素であるが、Ｒはアルキル基およびポリエチレングリコールまたは誘導体であってもよい。
【００８７】
別の実施態様では、伝導性オリゴマーは、異なる型のオリゴマー、例えば、構造１や８の混合物であってもよい。
【００８８】
伝導性オリゴマーは末端基を有していても有していなくてもよい。従って、好ましい実施態様では、余分な末端基がなく、伝導性オリゴマーはその末端が、例えばアセチレン結合などのＢ−Ｄ結合のような基の1つで終る構造１から９を示す。あるいは、好ましい実施態様では、本明細書中でしばしば“Ｑ”として示す末端基を加える。末端基はいくつかの理由、例えば、ＥＴＭの検出用の伝導性オリゴマーの電子的利用可能性を改善するために、またはＳＡＭの表面を例えば非特異的結合を防ぐなどの他の事由によって変えるために、使用することができる。例えば、標的被検体が核酸である場合、ハイブリダイゼーションを促進するために、末端で陰性に荷電した基として陰性荷電表面を形成させ、核酸がＤＮＡまたはＲＮＡである場合、核酸が表面上に着地するのに反発するか、妨げるようにし得る。好ましい不動態化剤末端基は、−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＨ３等のアルキル基、および、(ポリ)エチレングリコールのような(ポリ)アルキルオキサイドを含み、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−(ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ)２Ｈ、−(ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ)３Ｈ、および−(ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ)４Ｈが好ましい。
【００８９】
一実施態様において、異なるタイプの末端基を有する伝導性オリゴマーの混合物を使用することが可能である。従って、例えば、いくつかの末端基は検出を容易にし、いくつかは非特異的結合を防止し得る。
【００９０】
単層は異なる伝導性オリゴマー種を含み得るが、適度に同一なＳＡＭが形成され得るように、異なる種を選択するのが好ましいことが、理解されるであろう。従って、例えば、核酸などの捕獲結合リガンドを伝導性オリゴマーを用いて電極に共有結合させるとき、１つのタイプの伝導性オリゴマーを使用して核酸を結合させ、別のタイプをＳＡＭ中で用いることは可能である。同様に、異なる長さの伝導性オリゴマーの混合物を単層に有して、非特異的シグナルの減少を促進するのが望ましい。従って、例えば、好ましい実施態様は、単層の残部の表面下、つまり使用されているなら、絶縁層の下で、または他の伝導性オリゴマーの特定のフラクション下で終わる伝導性オリゴマーを利用する。同様に、異なる伝導性オリゴマーを使用して、単層の形成を容易にしたり、別の特性を持つ単層をつくることもできる。
【００９１】
好ましい実施態様において、単層はさらに絶縁部を含み得る。本明細書における“絶縁体”とは、実質的に非伝導性オリゴマーを意味し、好ましくは線状である。本明細書において、“実質的に非伝導性”とは、絶縁体が１００Ｈｚで電子を伝達しないことを意味する。絶縁体を介した電子伝達の比率は、好ましくは本明細書に記載の伝導性オリゴマーを介した比率よりも遅い。
【００９２】
好ましい実施態様において、絶縁体は、約１０−７Ω−１cm−１以下の導電率Ｓを有し、約１０−８Ω−１cm−１より低いのが好ましい。一般にGardner et al.前掲を参照。
【００９３】
通常、絶縁体はシグマ結合を有する、アルキルまたはヘテロアルキルオリゴマーまたは部分であるが、いずれの具体的な絶縁体分子も芳香族基または１以上の共役結合を含み得る。本明細書において“ヘテロアルキル”とは、少なくとも１つのヘテロ原子、つまり鎖に含まれた窒素、酸素、硫黄、リン、シリコンまたはホウ素を有するアルキル基を意味する。あるいは、絶縁体は、好ましくは電子伝達を実質的に阻害するかまたは遅らせる１以上のヘテロ原子または結合を添加した伝導性オリゴマーと非常に類似であり得る。
【００９４】
適切な絶縁体は当業者に既知であり、−(ＣＨ２)ｎ−、−(ＣＲＨ)ｎ−および−(ＣＲ２)ｎ−、エチレングリコールまたは酸素の代わりの他のヘテロ原子、つまり窒素または硫黄(電極が金のとき、硫黄誘導体は好ましくない)を用いる誘導体を含むが、これらに限定しない。
【００９５】
伝導性オリゴマーについて、絶縁体は本明細書に定義のＲ基で置換され得、電極でのその部分または伝導性オリゴマーのパッキング、絶縁体の親水性または疎水性、および絶縁体の柔軟性、すなわち回転の、捩れのまたは縦の柔軟性を変える。例えば、分枝アルキル基を使用し得る。同様に、上記概説のように絶縁体は特に単層の表面に作用する末端基を含み得る。
【００９６】
単層をつくる種の長さは必要に応じて変化する。上記に概説のように、標的被検体の結合(例えば核酸のハイブリダイゼーション)は、表面から離れてより有効であるように見える。核酸が結合する種(下記に概説のように、これらは絶縁体または伝導性オリゴマーのいずれかであり得る)は、基本的に単層を形成する種と同じ長さかそれらより長く、捕獲結合リガンドがハイブリダイゼーションのための溶媒により接近可能となる。いくつかの実施態様において、捕獲結合リガンドが結合する伝導性オリゴマーは単層より短い。
【００９７】
当業者には明らかなように、単層をつくる異なる種の、実際の組合せと比率は、そしてメカニズム−１またはメカニズム−２の何れが使用されている。一般に、メカニズム−２システムでは３成分システムが好ましく、第一の種は、種を含有する捕獲プローブを含み、絶縁体または伝導性オリゴマーのいずれかを介して電極に結合している。第二の種はＦＥＳ、好ましくは伝導性オリゴマー、であり、第三の種は絶縁体である。この実施態様において、第一の種は約９０％から約１％を含み得、約２０％から約４０％が好ましい。約３０％から約４０％が短いオリゴヌクレオチド標的に特に好ましく、約１０％から約２０％が長い標的に好ましい。第二の種は約１％から約９０％を含み得、約２０％から約９０％が好ましく、約４０％から約６０％が特に好ましい。第三の種は約１％から約９０％を含み得、約２０％から約４０％が好ましく、約１５％から約３０％が特に好ましい。これらの近似比率を達成するための、ＳＡＭ構成溶媒中の第一：第二：第三の種の好ましい比率は、短い標的については２：２：１、長い標的については１：３：１であり、全チオール濃度(これらの種との結合に使用する場合、以下で詳記)は、５００μMから１mMの範囲および８３３μMが好ましい。
【００９８】
あるいは、第一種および第二種を含む２成分システムを使用することができる。ある実施態様では、メカニズム−１またはメカニズム−２のシステムの何れかでの使用する、２成分は第一および第二の種である。この実施態様において、第一の種は約１％から約９０％を含み得、約１０％から約４０％が好ましく、約１０％から約４０％が特に好ましい。第二の種は約１％から約９０％を含み得、約１０％から約６０％が好ましく、約２０％から約４０％が特に好ましい。
あるいは、メカニズム−１システムでは、２成分は第一および第三の種である。この実施態様において、第一の種は約１％から約９０％を含み得、約１０％から約４０％が好ましく、約１０％から約４０％が特に好ましい。第二の種は約１％から約９０％を含み得、約１０％から約６０％が好ましく、約２０％から約４０％が特に好ましい。
【００９９】
好ましい実施態様として、水性溶液中でＳＡＭの析出を行なう。Steel et al., Anal. Chem. 70: 4670 (1998), Herne et al., J. Am. Chem. Soc. 119:8916 (1997)およびA. J. Bard, Electroanalytical Chemistry: A Series of Advances, Vol. 20. Dekker N.Y. 1996-のFinklea, Electrochemistry of Organized monolayers of Thiols and Related molecules on Electrodesに概略説明されているように、ＳＡＭ形成種の析出を水性溶液(しばしば塩を含む)から行なうことができる(これらすべては出典明示により本明細書に組込む)。
【０１００】
伝導性オリゴマーと絶縁体の電極への共有結合は、様々な方法で達成され、使用する電極、および絶縁体と伝導性オリゴマーの組成に依存する。好ましい実施態様として、本明細書に記載のヌクレオシドまたは核酸と共有結合した結合リンカーは、電極に共有結合している。従って、結合リンカーの一方の端または末端がヌクレオシドまたは核酸に結合しており、もう一方が電極に結合している。ある実施態様において、結合リンカーが末端以外の位置で結合するか、またはさらに、分枝結合リンカーが一方の末端で電極に結合し、他の末端で２またはそれ以上のヌクレオシドに結合するのが望ましいことであるが、これは好ましくない。同様に、一般に構造１１−１３に記載されるように、結合リンカーは２つの部位で電極に結合し得る。一般に構造１０でＡとして下記に示すように、あるタイプのリンカーが使用される。構造１０において、“Ｘ”は伝導性オリゴマー、“Ｉ”は絶縁体であり、斜線の表面は電極である：
【０１０１】
【化１０】
0004530541.tif 000011
【０１０２】
本実施態様において、Ａはリンカーまたは原子である。“Ａ”の選択は、電極の特徴に一部依存する。従って、例えば、Ａは、金電極を使用する場合、硫黄部である。あるいは、酸化金属電極を使用するとき、Ａはオキサイドの酸素に結合したシリコン(シラン)部である(例えば、Chen et al., Langmuir 10: 3332-3337 (1994); Lenhard et al., J. Electroanal. Chem. 78: 195-201 (1977)参照、両方とも出典明示により本明細書の一部とする)。炭素ベースの電極を使用するとき、Ａはアミノ部である(好ましくは、１級アミン；例えば、Deinhammer et al., Langmuir 10: 1306-1313 (1994)参照)。従って、好ましいＡ部は、シラン部、硫黄部(アルキル硫黄部を含む)およびアミノ部を含むが、これらに限定されない。好ましい実施態様において、当分野で既知のようなレドックスポリマーとのエポキシドタイプ結合は使用しない。
【０１０３】
本明細書には一つの部分としてしか記載していないが、絶縁体および伝導性オリゴマーは、１個以上の“Ａ”部で電極と結合し得る；“Ａ”部は同一または異なり得る。従って、例えば、電極が金電極であり、“Ａ”が硫黄原子または部分であるとき、一般に下記構造１１、１２および１３に記載のように、複数の硫黄原子が、電極に伝導性オリゴマーを結合させるのに使用し得る。当業者に認められるように、このような他の構造が製造できる。構造１１、１２および１３において、Ａ部は硫黄原子だけであるが、置換硫黄部も使用し得る。
【０１０４】
【化１１】
0004530541.tif 000012
【０１０５】
【化１２】
0004530541.tif 000013
【０１０６】
【化１３】
0004530541.tif 000014
【０１０７】
構造１３と同様に、３つの硫黄部が電極に結合している一つの炭素原子で終了する伝導性オリゴマーを有することが可能であることも留意すべきである。さらに本明細書に必ずしも記載されていないが、伝導性オリゴマーと絶縁体はまた“Ｑ”末端基を含み得る。
【０１０８】
好ましい実施態様において、電極は金電極であり、結合は当分野で既知のように硫黄結合を介しており、すなわち、Ａ部は硫黄原子または部分である。金−硫黄結合の正確な特徴は知られていないが、この結合は本発明の目的で、共有結合と考える。代表的な構造は構造３の伝導性オリゴマーを用いて構造１４に記載するが、本明細書に記載のすべての構造について、いずれの伝導性オリゴマーまたは伝導性オリゴマーの組合せも使用し得る。同様にいずれの伝導性オリゴマーまたは絶縁体も本明細書に記載の末端基を含み得る。構造１４は、“Ａ”リンカーが硫黄原子のみを含むように記載しているが、他の原子も存在し得る(すなわち、硫黄から伝導性オリゴマーへのまたは置換基へのリンカー)。
さらに、構造１４は、Ｙ芳香族基に結合した硫黄原子を表わしているが、当業者に明らかであろうように、Ｂ−Ｄ基(すなわち、アセチレン)と同様に結合したものであってもよい。
【０１０９】
【化１４】
0004530541.tif 000015
【０１１０】
一般的には、チオール結合が好ましい。
【０１１１】
好ましい実施態様において、電極は炭素電極、すなわち、ガラス状炭素電極であり、結合はアミン基の窒素原子を介している。代表的な構造を構造１５に示す。また別の原子が存在し得、すなわち、ＺタイプリンカーおよびＸまたは末端基であり得る。
【０１１２】
【化１５】
0004530541.tif 000016
【０１１３】
【化１６】
0004530541.tif 000017
【０１１４】
構造１６において、酸素原子は金属酸化物電極の酸化物からのものである。Ｓｉ原子は他の原子を含んでもよく、すなわち、置換基含有の珪素部分であってもよい。他の電極に対するＳＡＭの他の付着は技術上既知である；例えば、インジウム酸化スズ電極に対する付着、およびインジウム酸化スズ電極に対するリン酸エステルの化学吸着についてはナピエールら（Napier et al., Langmuir, 1997)の文献参照（ＣＨＩ会議（１９９８年５月４〜５日）でのホールデン・ソープ（H. Holden Thorpe)の講演）。
【０１１５】
本発明のＳＡＭは種々の方法、例えば、有機溶液からの析出および水性溶液からの析出などにより作製し得る。本明細書にて概説した方法では、例として金電極を使用するが、当業者が認めるように、他の金属および方法も同様に使用し得る。好適な一態様においては、インジウム−スズ−酸化物（ＩＴＯ）が電極として用いられる。
【０１１６】
好適な態様において、金表面は先ず洗浄する。様々な洗浄手法が採用可能であり、例えば、これらに限定されるものではないが、化学的洗浄またはエッチング用試薬（ピランハ（Piranha）溶液（過酸化水素／硫酸）または王水（塩酸／硝酸））、電気化学的方法、火炎処理、プラズマ処理またはそれらの併用などである。
【０１１７】
洗浄に続いて、金基板はＳＡＭ種に露呈する。電極がＩＴＯである場合、ＳＡＭ種はリン酸エステル含有種である。この処理も様々な方法で実施し得るものであり、例えば、溶液析出、気相析出、微小接触プリンティング、スプレー析出、ニート成分を用いる析出などであるが、これらに限定されるものではない。好適な態様では、溶液中で種々のＳＡＭ種、一般にはチオール含有種の混合物を含む析出溶液を利用する。標的被検体、特にＤＮＡを含む混合単層は通常２工程手法を用い調製する。チオール化ＤＮＡは（一般に少なくとも１種の他の単層形成種の存在下）最初の析出工程に際し析出し、混合単層形成はＤＮＡを含まない第二チオール溶液を加える第二工程の間に完結する。第二工程は多くの場合、単層再構成を促進するための緩和な加熱を含む。
【０１１８】
好適な態様において、析出溶液は有機析出溶液である。この態様において、清浄金表面は清浄バイアル中に入れる。有機溶媒中の結合リガンド析出溶液は、総チオール濃度がマイクロモルと飽和の間にあるように調製する；好適な範囲は約１μＭないし１０ｍＭであり、特に好ましくは約４００μＭないし１.０ｍＭである。好適な態様において、析出溶液はチオール修飾ＤＮＡ（すなわち、付着リンカーに付着した核酸）およびチオール希釈分子（電導性オリゴマーまたは絶縁体であるが、後者が好ましい）を含有する。ＤＮＡと希釈剤（もしあるとすれば）との比は通常１０００：１と１：１０００との間であり、好ましくは約１０：１ないし約１：１０であり、特に好ましいのは１：１である。好適な溶媒はテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、エタノール、またはその混合物である；一般に、捕獲リガンドを溶解するのに十分な極性の溶媒であれば、その溶媒が表面と反応するような官能基をもたない限り、使用可能である。十分なＤＮＡ析出溶液をバイアルに加えて電極の表面を完全に蔽うようにする。この金基板は外界温度または外界温度より少し高い温度で、数秒ないし数時間、好ましくは５分ないし３０分間インキュベートする。最初のインキュベーション後、析出溶液を取出し、希釈分子のみの有機溶媒溶液（約１μＭないし１０ｍＭ,好ましくは約１００μＭないし約１.０ｍＭ）を添加する。金基板は室温または室温以上の温度で所定時間（数秒ないし数日、好ましくは約１０分ないし約２４時間）インキュベートする。金サンプルを溶液から取出し、清浄な溶媒にすすいで使用する。
【０１１９】
好適な態様においては、水性析出溶液を用いる。上記のように、清浄金表面を清浄バイアル内に入れる。ＤＮＡの析出水性溶液は総チオール濃度が約１μＭと１０ｍＭの間、好ましくは約１μＭないし２００μＭであるように調製する。水性溶液は多くの場合、塩を存在させている（飽和まで、好ましくは約１Ｍである）が、精製水が使用し得る。析出溶液はチオール修飾ＤＮＡおよびしばしばチオール希釈分子を含有する。ＤＮＡと希釈剤との比は通常１０００：１と１：１０００との間であり、好ましくは約１０：１ないし約１：１０であり、特に好ましいのは１：１である。ＤＮＡ析出溶液は電極の表面を完全に蔽うような容量でバイアルに加える。この金基板を外界温度または外界温度より少し高い温度で１〜３０分間インキュベートするが、通常５分で十分である。最初のインキュベーション後、析出溶液を取出し、希釈分子のみ（１０μＭないし１.０ｍＭ）の水性溶液または有機溶媒溶液を添加する。金基板は室温または室温以上の温度で、完全な単層が形成されるまで（１０分〜２４時間）インキュベートする。金サンプルを溶液から取出し、清浄な溶媒にすすいで使用する。
【０１２０】
好適な態様においては、本明細書に説明するように、回路基板が金電極用の基板として使用される。金表面上ＳＡＭの形成は、先ず基板を、本明細書に記載のように、例えば、１０％硫酸溶液中３０秒間、デタージェント溶液、王水、プラズマなどで清浄とすることにより一般に実施する。硫酸処理に続いて、基板は、例えば、２個のミリ−Ｑ水浴にそれぞれ１分間浸漬することにより洗浄する。この基板を次いで、例えば、窒素気流下に乾燥する。基板上に析出溶液をスポットするには、相当数の既知スポット・システムを用い、一般には基板をＸ−Ｙテーブル上に置き、調湿チャンバー中で実施する。スポット滴のサイズは基板上の電極サイズと溶液送達に使用する器具により変わる；例えば、２５０μＭサイズの電極では、３０ナノリットルの液滴が用いられる。この容量は電極表面を完全に蔽うのに十分でなければならない。液滴は室温で所定時間（秒ないし一夜であるが、５分間が好適）インキュベートし、次いでミリ−Ｑ水浴中ですすぐことにより液滴を除去する。基板は次いで、好ましくは、第二析出溶液、一般に有機溶媒、好ましくはアセトニトリル中に絶縁体を含んでなる溶液により、４５℃の浴に浸漬することによって処理する。３０分後、基板を取出し、アセトニトリル浴に３０秒間浸漬し、次いでミリ−Ｑ水浴中３０秒間浸漬する。基板を窒素気流下に乾燥する。
【０１２１】
好適な態様においては、検出電極はさらに捕獲結合リガンド、好ましくは共有結合付着したリガンドを含む。本明細書において“結合リガンド”または“結合種”とは、標的被検体の存在を探査するために用いる化合物であって、標的被検体に結合する化合物を意味する。一般に、本明細書に記載された態様の殆どについて、標的被検体１分子当たり少なくとも２つの結合リガンドが存在する；すなわち、本明細書に記載の検出電極に付着する“捕獲”または“アンカー”結合リガンド（本明細書では、特に核酸結合リガンドに関して“捕獲プローブ”という）および可溶性結合リガンドであって、標的被検体に独立に結合し、直接または間接に少なくとも１個のＥＴＭを含んでなるリガンドである。
【０１２２】
一般に、捕獲結合リガンドは検出を目的として、検出電極に標的被検体が付着するのを可能とする。以下により詳細に説明するように、標的被検体が捕獲結合リガンドに付着するのは直接的（すなわち、標的被検体が捕獲結合リガンドに付着する）または間接的（１種以上の捕獲エクステンダーリガンドを使用し得る）であってもよい。
【０１２３】
好適な態様において、結合は特異的であり、結合リガンドは結合対の部分である。本明細書において“特異的に結合”とは、該リガンドが、試験サンプルの被検体と他の成分または混入物とを識別するのに十分な特異性もって被検体に結合することを意味する。しかし、当業者には明らかなように、それ程特異的ではない結合を用いても被検体を検出することが可能である；例えば、このシステムには異なる結合リガンド、例えば、異なるリガンドのアレイを使用でき、特定のどの被検体の検出も、結合リガンドのパネルへの結合の“サイン”を介するが、これは“電子の鼻”が作用する様式に類似している。この結合は、被検体が非特異結合を除去するための洗浄工程を含むアッセイの条件下でも結合したままであるために十分なものでなければならない。ある態様においては、例えば、ある生体分子の検出では、結合リガンドに対する被検体の結合定数は少なくとも約１０４〜１０６Ｍ−１であり、好ましくは約１０５ないし１０９Ｍ−１であり、そして特に好ましいのは約１０７〜１０９Ｍ−１である。
【０１２４】
当業者には明らかなように、結合リガンドの組成は標的被検体の組成に依存する。広範な被検体に対する結合リガンドが既知であるか、または既知技法を用いて容易に見出すことができる。例えば、被検体が一本鎖核酸である場合、結合リガンドは、一般に、実質上相補性核酸であろう。あるいは、米国特許第5,270,163、5,475,096、5,567,588、5,595,877、5,637,459、5,683,867、5,705,337、および出典明示により明細書に組込まれている関連特許に概略説明されている通り、核酸 “アプトマー(aptomer)”を、任意の標的被検体と実質的に結合させるために発生させることができる。同様に、被検体は核酸結合タンパク質であってもよく、捕獲結合リガンドは一本鎖または二本鎖核酸である；あるいは、結合リガンドは、被検体が一本鎖または二本鎖核酸である場合、核酸結合タンパク質であろう。被検体がタンパク質である場合、結合リガンドは、タンパク質(とりわけ、それらの抗体またはフラグメント(ＦＡｂｓなど)を含む)、小分子、または上記したアプトマーを含む。好適な結合リガンドタンパク質はペプチドを包含する。例えば、被検体が酵素である場合、適切な結合リガンドは基質、阻害剤、および酵素と結合する他のタンパク質(すなわち、多重酵素(またはタンパク質)複合体の成分)を包含する。当業者には明らかなように、会合する任意の２つの分子を、被検体としてかまたは結合リガンドとして、好ましくは特異的に、使用し得る。適切な被検体／結合リガンド対は、抗体／抗原、受容体／リガンド、タンパク質／核酸；核酸／核酸、酵素／基質および／または阻害剤、炭水化物（糖タンパク質および糖脂質を含む）／レクチン、炭水化物と他の結合パートナー、タンパク質／タンパク質；およびタンパク質／小分子などを含むが、これらに限定されるものではない。これらは野生型または誘導配列であってもよい。好適な態様において、結合リガンドは多量化することの知られる細胞表面受容体、例えば、成長ホルモン受容体、グルコース輸送体（特にＧＬＵＴ４受容体）、トランスフェリン受容体、表皮成長因子受容体、低密度リポタンパク質受容体、高密度リポタンパク質受容体、レプチン受容体、インターロイキン受容体（ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、およびＩＬ−１７受容体を含む）、ＶＥＧＦ受容体、ＰＤＧＦ受容体、ＥＰＯ受容体、ＴＰＯ受容体、毛様神経栄養因子受容体、プロラクチン受容体、およびＴ細胞受容体などの部分である。同様に、結合化学方法に基づく、結合パートナーの発展に関係する多くの文献がある。
【０１２５】
本実施態様において、結合リガンドが核酸である場合、好ましい組成と技術はＷＯ98/20162；PCT/US98/12430；PCT/US98/12082；PCT/US99/01705；PCT/US99/01703；およびU.S.S.N.s 09/135,183；60/105,875および09/295,691に概略説明されており、これらすべては出典明示により本明細書の一部とする。
【０１２６】
捕獲結合リガンドを付着リンカー(絶縁体または伝導性オリゴマーの何れか)に付着させる方法は、一般に当該技術分野で知られているように実施されるが、付着リンカーの組成と捕獲結合リガンドの両方に左右される。一般に、捕獲結合リガンドは官能基の使用を経て付着リンカーに付着させるが、各官能基は次いで付着に用い得るものである。付着に好適な官能基は、アミノ基、カルボキシ基、オキソ基およびチオール基である。これらの官能基は次いで直接または間接的に本明細書では“Ｚ”で表すリンカーの使用を経て付着させ得る。リンカーは当技術分野でよく知られている；例えば、ホモ−またはヘテロ−二官能性リンカーがよく知られたものである（参照：１９９４ピアース・ケミカル・カンパニーカタログ、架橋に関する技術の項、１５５〜２００頁；出典明示により本明細書の一部とする）。好適なＺリンカーは、アルキル基（置換アルキル基およびヘテロ原子部分を含むアルキル基）、短鎖アルキル基を有するエステル、アミド、アミン、エポキシ基およびエチレングリコール、および好ましい誘導体などであり、プロピル、アセチレン、およびＣ２アルケンがとりわけ好ましいが、これらに限定されるものではない。Ｚはスルホンアミドを形成するスルホン基であってもよい。
【０１２７】
この様式で、タンパク質、レクチン、核酸、小型有機分子、炭水化物などを含む捕獲結合リガンドを付加し得る。
【０１２８】
好適な態様ではタンパク質性の捕獲結合リガンドを利用する。当技術分野で知られているように、相当数の技法がタンパク質性の捕獲結合リガンドを付着リンカーに付着させるのに使用し得る。ある部分をタンパク質に付加させるための広範な技術が知られている。
【０１２９】
好適な態様では核酸を捕獲結合リガンドとして利用する。当業者には明らかなように、下記概説の幾つかの方法を、同様の方法で非核酸システムに同じように適用することができる。
【０１３０】
核酸捕獲結合リガンドは、伝導性オリゴマー(メカニズム−１システム)であるか、または絶縁体を介している“付着リンカー”を介して電極に共有結合により付着している。本明細書において“共有結合により付着した”とは、２つの部分が少なくとも１つの結合により付着していることを意味し、該結合はシグマ結合、パイ結合および配位結合を包含する。
【０１３１】
このようにして、付着リンカーの一端を核酸(あるいは他の結合リガンド)に付着させ、他端（当業者が認めるところであるが、いずれの場合にも正確な末端である必要はない）を電極に付着させる。このように、本明細書中に描出した構造のいずれもさらに末端基として有効な核酸を含み得る。このように、本発明は、下記構造１７に一般的に描出したように、電極に共有結合により付着した核酸を含む組成物を提供する。
【０１３２】
【化１７】
0004530541.tif 000018
【０１３３】
構造１７において、左側の斜線記号は、電極を表す。本明細書に定義するように、Ｘは伝導性オリゴマーであり、Ｉは絶縁体である。Ｆ１は、電極および伝導性オリゴマーまたは絶縁体の共有結合をもたらす結合であり、本明細書に記載され、例えば下記に“Ａ”と定義されるように、結合、原子またはリンカーを含む。Ｆ２は、核酸に伝導性オリゴマーまたは絶縁体を共有結合させる結合であり、本明細書に記載のように結合、原子または結合であり得る。Ｆ２は伝導性オリゴマーの一部、絶縁体の一部、核酸の一部であり得、または例えば本明細書で“Ｚ”について定義するように両方に外因性であり得る。
【０１３４】
好適な態様において、捕獲プローブ核酸は伝導性オリゴマーを介して電極に共有結合により付着している。核酸と伝導性オリゴマーの共有結合付着は、幾つかの方法で達成することができる。好適な態様において、その付着は下記説明のように、ヌクレオシド塩基への付着によるか、核酸のバックボーン（リボース、リン酸エステル、または核酸類似体バックボーンの類似基）への付着によるか、または遷移金属リガンドへの付着による。下に概説する技法は一般に天然に存在する核酸について説明しているが、当業者も認めるように、同様の技法は核酸類似体にも使用し得、そして幾つかの場合では他の結合リガンドを使用することができる。
【０１３５】
好適な態様において、伝導性オリゴマーは核酸のヌクレオシド塩基に付着させる。これは下記説明のように、オリゴマーの種類に応じて幾つかの方法で実施し得る。一態様において、オリゴマーは末端のヌクレオシド、すなわち、核酸の３’または５’ヌクレオシドに付着させる。あるいは、伝導性オリゴマーを内部ヌクレオシドに付着させる。
【０１３６】
塩基への付着点は塩基により異なる。一般に、いずれの位置での付着も可能である。一部の態様では、例えば、ＥＴＭを含むプローブがハイブリダイゼーション(すなわち、メカニズム−１システム)に使用される場合、相補塩基の水素結合に関与しない位置に付着させるのが好ましい。このように、例えば、一般に付着はウリジン、シトシンおよびチミンなどのピリミジン類の５または６位置に対するものである。アデニンおよびグアニンなどのプリン類については、結合は、好ましくは８位置を介する。非標準の塩基に対する付着は、相当する位置で好適になされる。
【０１３７】
一態様において、付着は直接的である；すなわち、伝導性オリゴマーと塩基の間に介在する原子はない。この態様において、例えば、末端アセチレン結合を有する伝導性オリゴマーを塩基に直接付着させる。構造１８はこの結合の一例であり、ここでは構造３の伝導性オリゴマーと塩基としてウリジンを使用しているが、当業者も認めるように、他の塩基と伝導性オリゴマーを使用することもできる。
【０１３８】
【化１８】
0004530541.tif 000019
【０１３９】
本明細書に示したペントース構造には、水素、ヒドロキシ、ホスフェートまたはアミノ基などの他の基が結合していることに留意すべきである。更に、本明細書に示したこのペントースおよびヌクレオシド構造は、通常表現の鏡像として非慣用的に示す。更に、ペントースおよびヌクレオシド構造はまた、任意の位置に、例えば、合成中に必要に応じて、保護基などの新たな基を含有できる。
【０１４０】
加えて、塩基は、必要に応じて更なる修飾を含むこともあり、即ち、カルボニルまたはアミン基を変更したり、保護することもできる。
【０１４１】
別の実施態様では、結合は、一般に、塩基としてウリジンおよび構造３のオリゴマーを用いる構造１９に示したように、アミドおよびアミン結合を含む、多くの異なるＺ−リンカーを介する：
【０１４２】
【化１９】
0004530541.tif 000020
【０１４３】
この実施態様では、Ｚはリンカーである。好ましくは、Ｚは約１から約１０原子の短いリンカーであり、１から５原子が好ましく、アルケン、アルキニル、アミン、アミド、アゾ、イミンなどの結合を含有してもよく、含有しなくてもよい。リンカーは当分野では知られており、例えば、よく知られているとおり、ホモまたはヘテロ二官能性リンカーである(1994 Pierce Chemical Company catalog, technical section on cross-linker, pages 155-200参照、出典明示により本明細書の一部とする)。好ましいＺリンカーには、アルキル基（置換アルキル基およびヘテロ原子部分を含有するアルキル基を含む）があるが、これらに限定されず、好ましいのは、短いアルキル基、エステル、アミド、アミン、エポキシ基およびエチレングリコールおよび誘導体であり、特に好ましいのは、プロピル、アセチレンおよびＣ２アルケンである。Ｚはまた、スルホン基であってもよく、下記のようにスルホンアミド結合を形成する。
【０１４４】
好ましい実施態様では、核酸と伝導性オリゴマーの結合は、核酸主鎖への結合を介して行う。これは、リボース−ホスフェート主鎖のリボースへの結合または主鎖のホスフェートへの結合、または類似主鎖の他の基への結合を含む多くの方法で実施できる。
【０１４５】
予備事項として、下記に十分説明するように、本実施態様における結合部位は、３'または５'末端ヌクレオチド、または内部ヌクレオチドであると理解されるべきである。
【０１４６】
好ましい実施態様では、伝導性オリゴマーをリボース−ホスフェート主鎖のリボースへ結合させる。これは、幾つかの方法で実施できる。当分野では知られているように、リボースの２'または３'位のいずれかにアミノ基、硫黄基、ケイ素基、リン基またはオキソ基で修飾したヌクレオシドを作成できる(Imazawa et al., J. Org. Chem., 44: 2039 (1979); Hobbs et al., J. Org. Chem. 42 (4): 714 (1977); Verheyden et al., J. Org. Chem. 36 (2): 250 (1971); McGee et al., J. Org. Chem. 61: 781-785 (199); Mikhailopulo et al., Liebigs. Ann. Chem. 513-519 (1993); McGee et al., Nucleosides & Nucleotides 14 (6): 1329 (1995)、全て出典明示により本明細書の一部とする)。次いで、伝導性オリゴマーを加えるためにこれらの修飾ヌクレオシドを用いる。
【０１４７】
好ましい実施態様は、アミノ修飾ヌクレオシドを利用する。このとき、これらのアミノ修飾リボースを用いて、伝導性オリゴマーに対してアミドまたはアミン結合を形成できる。好ましい実施態様では、アミノ基を直接リボースに結合させるが、当業者には明らかであるように、“Ｚ”について記載したような短いリンカーをアミノ基とリボースとの間に与えることができる。
【０１４８】
好ましい実施態様では、リボースに結合させるためにアミド結合を使用する。好ましくは、構造１〜３の伝導性オリゴマーを用いるならば、ｍが０であるので、伝導性オリゴマーの末端はアミド結合である。この実施態様では、アミノ修飾リボースのアミノ基の窒素は、伝導性オリゴマーの“Ｄ”原子である。よって、本実施態様の好ましい結合を、構造２０に示す(構造３の伝導性オリゴマーを用いる)。
【０１４９】
【化２０】
0004530541.tif 000021
【０１５０】
当業者には明らかなように、構造２０は、アミド結合として固定された末端結合を有する。
【０１５１】
好ましい実施態様では、ヘテロ原子結合、即ち、オキソ、アミン、硫黄等を用いる。好ましい実施態様はアミン結合を利用する。また、アミド結合について上記で概説したとおり、アミン結合の場合も構造３の伝導性オリゴマーを用いると、アミノ修飾リボースの窒素が伝導性オリゴマーの“Ｄ”原子であり得る。よって、例えば、構造２１および２２は、それぞれ構造３および９の伝導性オリゴマーを持つヌクレオシドを示し、ヘテロ原子として窒素を用いているが、他のヘテロ原子を使用することもできる：
【０１５２】
【化２１】
0004530541.tif 000022
【０１５３】
構造２１では、好ましくは、ｍもｔも０ではない。ここで好ましいＺはメチレン基またはその他の脂肪族アルキルリンカーである。この位置にある１、２または３つの炭素は特に合成の際に有用である。
【０１５４】
【化２２】
0004530541.tif 000023
【０１５５】
構造２２では、Ｚは上記定義のとおりである。適切なリンカーには、メチレンおよびエチレンがある。
【０１５６】
別の実施態様では、伝導性オリゴマーを、核酸のリボース−ホスフェート主鎖(または類似体)のホスフェートを介して核酸に共有結合させる。この実施態様では、結合は直接的か、またはリンカーまたはアミド結合を利用する。構造２３は、直接結合を示しており、構造２４は、アミド結合を介した結合を示している(両方とも、構造３の伝導性オリゴマーを利用しているが、構造８の伝導性オリゴマーも可能である)。構造２３および２４は、３'位の伝導性オリゴマーを示しているが、５'位も可能である。更に、構造２３および２４とも、天然のホスホジエステル結合を示しているが、当業者には明らかなように、ホスホジエステル結合の非標準類似体も使用できる。
【０１５７】
【化２３】
0004530541.tif 000024
【０１５８】
構造２３中、末端にＹが存在する(即ちｍ＝１)場合、Ｚは存在しない(即ち、ｔ＝０)のが好ましい。末端にＹが存在しない場合、Ｚは存在するのが好ましい。
【０１５９】
構造２４は、末端Ｂ−Ｄ結合がアミド結合であり、末端にＹが存在せず、Ｚが上記定義のリンカーである好ましい実施態様を示す。
【０１６０】
【化２４】
0004530541.tif 000025
【０１６１】
好ましい実施態様では、伝導性オリゴマーは、遷移金属リガンドを介して核酸に共有結合する。本実施態様では、伝導性オリゴマーを遷移金属に１以上の配位原子を提供するリガンドに共有結合させる。一実施態様では、下記構造２５に総括的に示したように、伝導性オリゴマーが結合するリガンドには、核酸も結合している。あるいは、下記構造２６に総括的に示したように、伝導性オリゴマーは１つのリガンドに結合しており、核酸は別のリガンドに結合している。よって、遷移金属の存在下で伝導性オリゴマーは核酸に共有結合する。これらの構造はいずれも構造３の伝導性オリゴマーを示しているが、その他のオリゴマーを利用する
こともできる。構造２５および２６は、核酸用の２つの代表的な構造を示す：
【０１６２】
【化２５】
0004530541.tif 000026
【０１６３】
【化２６】
0004530541.tif 000027
【０１６４】
本明細書記載の構造中、Ｍは金属原子であり、遷移金属が好ましい。本発明に使用するのに適した遷移金属はカドミウム（Ｃｄ）、銅（Ｃｕ）、コバルト（Ｃｏ）、パラジウム（Ｐｄ）、亜鉛（Ｚｎ）、鉄（Ｆｅ）、ルテニウム（Ｒｕ）、ロジウム（Ｒｈ）、オスミウム（Ｏｓ）、レニウム（Ｒｅ）、白金（Ｐｔ）、スカンジウム（Ｓｃ）、チタニウム（Ｔｉ）、バナジウム（Ｖ）、クロム（Ｃｒ）、マンガン（Ｍｎ）、ニッケル（Ｎｉ）、モリブデン（Ｍｏ）、テクネチウム（Ｔｃ）、タングステン（Ｗ）、およびイリジウム（Ｉｒ）などであるが、これらに限定されるものではない。すなわち、遷移金属の第一シリーズ、白金族（Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ｏｓ、ＩｒおよびＰｔ）並びにＦｅ、Ｒｅ、Ｗ、ＭｏおよびＴｃが好ましい。特に好ましいのはルテニウム、レニウム、オスミウム、白金、コバルトおよび鉄である。
【０１６５】
Ｌは補助リガンドであり、金属イオン結合のための配位原子を提供する。当業者が認識するように、補助リガンドの数と性質は金属イオンの配位数に依存する。単座、二座または多座補助リガンドはどの位置で使用してもよい。従って、例えば、金属が６の配位数を有する場合、伝導性オリゴマーの末端からのＬ、核酸から与えられるＬ、およびｒを６まで加える。従って、金属が六配位数の場合、ｒは０(全配位原子が他の２つのリガンドによって与えられる場合)から４(全ての補助リガンドが一座配位の場合)の範囲であろう。従って、一般に、金属イオンの配位数および他のリガンドの選択に依存してｒは０ないし８であるであろう。
【０１６６】
ある実施態様において、金属イオンは６の配位数を有し、そして伝導性オリゴマーに付着したリガンドおよび核酸に付着したリガンドは、両方共、少なくとも２量体である；すなわち、ｒは、好ましくは、０、１(すなわち残った補助リガンドは２量体である)または２(２つの一座配位補助リガンドが使用される)である。
【０１６７】
技術的に認識されるように、補助リガンドは同一であっても異なってもよい。適切なリガンドは２つの範疇に入る：配位原子（一般的には文献上、シグマ（σ）供与体という）として（金属イオンに依存して）、窒素、酸素、イオウ、炭素またはリン原子を用いるリガンド、およびメタロセンリガンドなどの有機金属リガンド（一般的には文献上、パイ（π）供与体といい、本明細書ではＬｍで図示する）である。適切な窒素供与リガンドは技術上周知であり、以下のものを包含するがこれらに限定されるものではない：ＮＨ２；ＮＨＲ；ＮＲＲ'；ピリジン；ピラジン；イソニコチンアミド；イミダゾール；ビピリジンおよびビピリジンの置換誘導体；テルピリジンおよび置換誘導体；フェナントロリン、特に１，１０−フェナントロリン（ｐｈｅｎと略記）およびフェナントロリンの置換誘導体、例えば、４，７−ジメチルフェナントロリンおよびジピリド［３，２−ａ：２'，３'−ｃ］フェナジン（ｄｐｐｚと略記）；ジピリドフェナジン；１，４，５，８，９，１２−ヘキサアザトリフェニレン（ｈａｔと略記）；９，１０−フェナントレンキノン・ジイミン（ｐｈｉと略記）；１，４，５，８−テトラアザフェナントレン（ｔａｐと略記）；１，４，８，１１−テトラ−アザシクロテトラデカン（ｃｙｃｌａｍと略記）、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡおよびイソシアニド。融合した誘導体を包含する置換誘導体も使用することができる。ある態様においては、ポルフィリンおよびポルフィリンファミリーの置換誘導体を使用してもよい。例えば、Comprehensive Coordination Chemistry, Ed. Wilkinson et al., Pergammon Press, 1987, Chapters 13.2 (pp 73-98), 21.1 (pp 813-898) and 21.3 (pp 915-957)参照。この文献の全部を特に参照により本明細書に取込む。
【０１６８】
炭素、酸素、イオウおよびリンを用いる適切なシグマ供与リガンドは技術上既知である。例えば、適切なシグマ炭素供与体はCotton and Wilkenson, Advanced Organic Chemistry, 5th Edition, John Wiley & Sons, 1988に見出されるが、この文献を参照により本明細書に取込む；例えば、３８ページ参照。同様に、適切な酸素リガンドは、クラウンエーテル、水、および技術上既知の他のものを包含する。ホスフィンおよび置換ホスフィンも適切である；Cotton and Wilkensonの３８ページ参照。
【０１６９】
酸素、イオウ、リンおよび窒素−供与リガンドは、ヘテロ原子が配位原子として作動するような様式で付着する。
【０１７０】
好適な態様においては、有機金属リガンドを用いる。レドックス部分として使用する純有機化合物、およびヘテロ環状またはエキソ環状置換基として供与原子をもつδ−結合有機リガンドとの種々の遷移金属配位複合体に加えて、π−結合有機リガンドをもつ多様な遷移金属有機金属化合物が入手可能である（Advanced Inorganic Chemistry, 5th Ed., Cotton & Wilkinson, John Wiley & Sons, 1988, Chapter 26; Organometallics, A Concise Introduction, Elschenbroich et al., 2nd Ed., 1992, VCH; およびComprehensive Organometallic Chemistry II, A Review of the Literature 1982-1994, Abel et al. Ed., Vol. 7, Chapters 7, 8, 10 & 11, Pergamon Press, 特に参照により本明細書に取込む）。かかる有機金属リガンドは、シクロペンタジエニド・イオン［Ｃ５Ｈ５（−１）］などの環状芳香族化合物および種々の環置換および環融合誘導体、例えば、インデニリド（−１）イオンなどであって、一群のビス（シクロペンタジエニル）金属化合物（すなわち、メタロセン）を産生する；例えば、Robins et al., J. Am. Chem. Soc., 104: 1882-1893 (1982); およびGassman et al., J. Am. Chem. Soc., 108: 4228-4229 (1986)参照；これらを出典明示により本明細書に組込まれている。これらの内、フェロセン［（Ｃ５Ｈ５）２Ｆｅ］およびその誘導体が多様な化学的（Connelly e al., Chem. Rev. 96: 877-910 (1996), 出典明示により本明細書に組込まれている）および電子化学的（Geiger et al., Advances in Organometallic Chemistry 23: 1-93; およびGeiger et al., Advances in Organometallic Chemistry 24: 87, 出典明示により本明細書に組込まれている）電子移動または“レドックス”反応に使用されているプロトタイプの例である。様々な第一、第二および第三列遷移金属のメタロセン誘導体は、核酸のリボース環またはヌクレオシド塩基の何れかに共有結合により付着しているレドックス部分としての有力な候補である。他の潜在的に適切な有機金属リガンドは、ベンゼンなどの環状アレンなどを包含し、ビス（アレン）金属化合物とその環置換および環融合誘導体を産生するが、そのビス（ベンゼン）クロミウムはプロトタイプの例である。アリル（−１）イオンなどの他の非環状π−結合リガンドまたはブタジエンは潜在的に適切な有機金属化合物を産生し、かかるリガンドはすべて他のπ−結合およびδ−結合リガンドと連携して、金属−炭素結合をもつ一般クラスの有機金属化合物を構成する。架橋有機リガンドおよびさらなる非架橋リガンドを有し、同様に金属−金属結合を有し、また有さない、かかる化合物の種々のダイマーおよびオリゴマーの電気化学的研究は、核酸分析における有力な候補レドックス部分である。
【０１７１】
１種以上の補助リガンドが有機金属リガンドである場合、該リガンドは一般に有機金属リガンドの炭素原子の一つを介して付着するが、ただし付着はヘテロ環状リガンドに対し他の原子を介してであってもよい。好適な有機金属リガンドは、置換誘導体およびメタロセンオファンを含むメタロセンリガンドを包含する（上記Cotton and Wilkensonの１１７４ページ参照）。例えば、メチルシクロペンタジエニルなどのメタロセンリガンドの誘導体、好ましくは複数のメチル基を有する例えば、ペンタメチルシクロペンタジエニルなどを用い、メタロセンの安定性を増大させることができる。好適な態様において、メタロセンの２つのメタロセンリガンドの１つのみが誘導化される。
【０１７２】
本明細書に記載のように、リガンドの任意の組み合わせを使用し得る。好ましい組み合わせは：ａ)全リガンドが窒素供与リガンドである；ｂ)全リガンドが有機金属リガンドである；そしてｃ)伝導性オリゴマーの末端のリガンドがメタロセンリガンドであり、核酸により提供されるリガンドは窒素投与リガンドであることを含み、必要により、他のリガンドと一緒であり、それは窒素供与リガンドまたはメタロセンリガンドまたはその混合物である。これらの組み合わせは、構造３の伝導性オリゴマーを使用した代表例に記載され、構造２７(フェナンスロリンおよびアミノを代表的リガンドとして使用して)、２８(フェロッセンを金属−リガンド組み合わせとして使用して)および２９(シクロペンタジエニルおよびアミノを代表的リガンドとして使用して)に記載する。
構造２７
【化２７】
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構造２８
【化２８】
0004530541.tif 000029
構造２９
【化２９】
0004530541.tif 000030
【０１７３】
導電性オリゴマーおよび電極の付着に作用することに加え、上記の組成物はＥＴＭ標識としても使用し得る。すなわち、図１９および２０に概説するように、導電性オリゴマーに付着した遷移金属（または他のＥＴＭ）は検出用の核酸に加えることができる。この態様において、理論に囚われなければ、導電性オリゴマー、好ましくはＦ１結合（表面に対する導電性オリゴマーの付着を可能とする結合）はＳＡＭを貫入させ、ＥＴＭと電極間の電子伝達を容易にする。理論に囚われなければ、これは“メカニズム−１”システム同様に、電子の直接経路を提供することにより、急速な電子伝達を可能とすると思われる；本明細書ではこれを場合により“配線化”という。
【０１７４】
驚くべきことに、実施例３に概括するように、このシステムはＦ１部分が保護されるか否かで作用すると思われる；すなわち、直接の付着はＥＴＭの周波数応答を増大させるためには必要ない。このように、導電性オリゴマーはＦ１部分、保護基により保護されたＦ１部分（上記Greene参照）で終結し得るか、あるいはＦ１部分でまったく終結する必要がない；ＳＡＭの表面に使用されるような末端基を使用してもよい。あるいは、導電性オリゴマーのむき出しの末端で十分である。
【０１７５】
この態様においては、“分枝”当たり複数のＥＴＭを使用してもよい。それらは導電性オリゴマーで終結する基として、例えば、メタロセンポリマーとして付着させるか、または導電性オリゴマーから置換基を除かれていてもよい。一般に、好適な態様ではＥＴＭと導電性オリゴマー間の電子共役を利用し、電子伝達を容易にするか、または少なくとも非共役結合の数を最少化する。
一般に、この態様における導電性オリゴマーの長さは電極上のＳＡＭの長さと共に変わり、好適な態様では２単位または３単位のオリゴマーを利用する。この態様における好適な導電性オリゴマーは、核酸が電極に付着するについて上記したと同じであり、フェニル−アセチレン・オリゴマーが最も好適である。
この態様においては、付着した導電性オリゴマーをもつＥＴＭを一般的に合成し、次いで、図２０に一般的に描出したようにホスファーアミダイト部分を調製する。
【０１７６】
好適な態様において、本発明に使用するリガンドは、キレート化した金属イオンの酸化還元状態に左右されて変化した蛍光性を示す。以下に説明するように、これは結果としてＥＴＭと電極間の電子伝達のさらなる検出モードとして作用する。
好適な態様において、以下により詳しく説明するように、核酸に付着したリガンドはリボース−リン酸バックボーンのリボース２’または３’位に付着したアミノ基である。このリガンドは金属イオンに結合するポリデンテート・リガンドを形成するような多様なアミノ基を含んでもよい。他の好適なリガンドはシクロペンタジエンおよびフェナンスロリンを包含する。
【０１７７】
核酸に連結する金属イオンの使用は、表面上の利用可能な核酸数を評価する際に、システムの内部調整または校正として役立ち得る。しかし、当業者が認めるように、もし金属イオンを用いて核酸が導電性オリゴマーに連結するようにするならば、以下に説明するように、この金属イオンはシステムの残りに使用されるＥＴＭとは異なる酸化還元力をもつようにすることが一般に望ましい。これは一般に捕捉プローブの存在と標的配列の存在を識別するようにする上で正しい。これは同定、校正および／または定量にとって有用である。このように、電極上の捕捉プローブの量をハイブリダイズした二本鎖核酸の量に比較し、サンプル中の標的配列の量を定量することができる。これはセンサまたはシステムの内部調整として作用するためにきわめて意味がある。これは、同様ではあるが異なる制御システムに依存するよりもむしろ、検出に使用する同じ分子に関しては、標的の添加に先立つまたはその後の測定を可能とする。このように、検出に使用する実際の分子は何らかの実験に先立ち定量することが可能である。これが先行方法にまさる有意な利点である。
好適な態様において、捕捉プローブ核酸は絶縁体を介して共有結合により電極に結合する。アルキル基などの絶縁体に核酸が付着することは周知であり、これらの部分を含むバックボーンとしてのリボースまたはリン酸エステルを包含する基礎またはバックボーンに対して、または核酸類似体の代替バックボーンに対して実施し得る。
【０１７８】
好適な態様においては、図中に一般的に描出するように、表面上に１つ以上の異なる捕捉プローブ種が存在してもよい。ある態様では、以下により詳しく説明するように、１つの型の捕捉プローブまたは１つの型の捕捉プローブエクステンダーが存在してもよい。あるいは、異なる複数の捕捉プローブ、または多様な異なる捕捉エクステンダープローブと共に一個のプローブを使用することもできる。同様に、比較的短いプローブ配列を含む補助的補足プローブであって、表面でのＥＴＭ濃度を上昇せしめるこのシステムの“タックダウン”（張付け）成分、例えば、リクルート・リンカーに対して使用し得るプローブを使用することが望ましい。
【０１７９】
このように、本発明は導電性オリゴマーと捕捉プローブを含む単層を含んでなる、核酸の検出システムに有用な電極を提供する。好適な態様において、該組成物はさらに標識プローブを含んでなる。標識プローブは核酸であり、一般に一本鎖であるが、以下により詳しく説明するように、二本鎖部分を含んでいてもよい。標識プローブは下記定義のアッセイ複合体成分にハイブリダイズし得る第一部分と、アッセイ複合体成分にハイブリダイズしない第二成分を含んでなり、少なくとも１つの共有結合により付着したＥＴＭを含んでなる。
このように、共有結合により付着したＥＴＭを有する標識プローブが提供される。本明細書において“電子供与部分”、“電子受容部分”、および“ＥＴＭ”（ＥＴＭ）という用語またはその文法的等価物は一定条件下において電子伝達し得る分子をいう。理解すべきことは、電子供与および受容能力は相対的であるということである；すなわち、一定の実験条件下で電子を失い得る分子が異なる実験条件下で電子を受け入れることができるということである。理解すべきことは、可能な電子供与部分および電子受容部分の数が非常に多いということ、また、電子伝達化合物の当業者は本発明において多数の化合物を利用し得るということである。好適なＥＴＭは、これらに限定されるものではないが、遷移金属複合体、有機ＥＴＭ、および電極などである。
【０１８０】
好適な態様において、ＥＴＭは遷移金属複合体である。遷移金属とはその原子が部分的なまたは完全な電子のｄ殻をもつものである。本発明に適切な遷移金属は上に掲載した。
遷移金属は上記定義の様々なリガンドＬと複合体を形成し、技術上周知の適切な遷移金属複合体となる。
遷移金属複合体に加えて、他の有機電子供与体および受容体が本発明に使用する核酸に共有結合により付着し得る。これらの有機分子は、これらに限定されるものではないが、リボフラビン、キサンテン染料、アジン染料、アクリジンオレンジ、二塩化Ｎ，Ｎ’−ジメチル−２，７−ジアザピレニウム（ＤＡＰ２＋）、メチルビオロゲン、臭化エチジウム、二塩化Ｎ，Ｎ’−ジメチルアントラ（２，１，９−ｄｅｆ：６，５，１０−ｄ’ｅ’ｆ’）ジイソキノリン（ＡＤＩＱ２＋）などのキノン類；ポルフィリン類（四塩化［メゾ−テトラキス（Ｎ−メチル−ｘ−ピリジニウム）ポルフィリン］）、塩酸バルラミン・ブルーＢ、ビンドシェドラー・グリーン（Bindschedler's green）；２，６−ジクロロインドフェノール、２，６−ジブロモフェノールインドフェノール；ブリリアント・クレスト・ブルー（塩化３−アミノ−９−ジメチル−アミノ−１０−メチルフェノキシアジン）、メチレン・ブルー；ナイル・ブルーＡ（硫酸アミノナフトジエチルアミノフェノキサジン）、インジゴ−５，５’，７，７’−テトラスルホン酸、インジゴ−５，５’，７−トリスルホン酸；フェノサフラニン、インジゴ−５−モノスルホン酸；サフラニンＴ；塩化ビス（ジメチルグリオキシマト）鉄（II）；インズリン・スカーレット、ニュートラル・レッド、アントラセン、コロネン、ピレン、９−フェニレンアントラセン、ルブレン、ビナフチル、ＤＰＡ、フェノチアジン、フルオランテン、フェナントレン、クリセン、１，８−ジフェニル−１，３，５，７−オクタテトラセン、ナフタレン、アセナフタレン、ペリレン、ＴＭＰＤおよびその類似体、およびこれら化合物の置換誘導体などである。
【０１８１】
好適な態様において、ＥＴＭは標的被検体または標的被検体に結合するアッセイ複合体の他の成分に固有のものであってもよい。例えば、（標的配列および第二プローブを含む）核酸のグアニン塩基は酸化可能であって、ＥＴＭで作用し得る；参照：PCT WO97/01646 and U.S. Patent No. 5,871,918（これらはすべて出典明示により本明細書の一部とする）。同様に、本明細書に概説した電気化学技法の多くは他のシステムにおいて有用である；参照：U.S. Patent No. 5,650,061; Singhai et al., Anal. Chem. 69:1552 (1997); Singhal and Kuhr, Anal. Chem. 69:4828 (1997); Singhal et al., Anal. Chem. 69:3553 (1997); and Dontha et al., Anal. Chem. 69:2619 (1997)（これらはすべて出典明示により本明細書の一部とする）。このシステムにおいて、核酸のリボース部分は酸化され、アッセイ用のＥＴＭとして作用する。本明細書に概説した電気化学技法は特にこれらのシステムにおいて有用である。同様に、酸化還元活性アミノ酸はタンパク質の検出においてＥＴＭとして作用し得る。
一態様において、電子供与体および受容体は技術上知られるように酸化還元タンパク質である。しかし、多くの態様において酸化還元タンパク質は好ましくない。
【０１８２】
特異的ＥＴＭの選択は以下に一般的に概説するように、使用される電子伝達検出のタイプにより影響を受ける。好適なＥＴＭはメタロセンであり、特にフェロセンが好適である。
理論に囚われなければ、“メカニズム−２”のシステムにおいて、電子伝達はＥＴＭがある程度単層に貫入する（“寄り付く”）ことができる場合に容易となると思われる。すなわち、一般に、疎水性ＳＡＭと共に用いる疎水性ＥＴＭは、荷電しているかまたはより親水性であるＥＴＭより、より良好な（より大きな）シグナルを生じる。このように、例えば、溶液中のフェロセンは実施例の単層に貫入することが可能であり、電気管路が存在する場合にシグナルを生じる一方、溶液中のフェロシアニドのシグナルは僅かであるか、まったく生じない。このように、一般に、疎水性のＥＴＭはメカニズム−２のシステムにおいて好適である；しかし、ＲuおよびOs複合体などの遷移金属複合体は、荷電を有しはするが、ビピリジンまたはフェナンスロリンなど、１つ以上の疎水性リガンドをもち、好適なシグナルをも生じる。同様に、ＥＴＭと電極間の電子伝達は、ＥＴＭにある程度の柔軟性を可能とするリンカーまたはスペーサーの使用により容易となり、単層に貫入する；かくして、本発明のＮ６組成物はＥＴＭを核酸に付着させる炭素４個のリンカーを有する。
【０１８３】
好適な態様においては、複数のＥＴＭが使用される。実施例に示すように、多数のＥＴＭの使用はシグナルの増幅を可能とし、かくして、より高感度の検出限界を可能とする。以下に考察するように、相補性鎖にハイブリダイズする核酸上に多数のＥＴＭを使用すると、その数、付着部位および多数のＥＴＭ間の空間に依存して、ハイブリダイゼーション複合体のＴｍｓに減少を引起すが、一方、これは相補性配列にハイブリダイズしないので、ＥＴＭがリクルート・リンカー上にある場合、因子とはならない。従って、複数のＥＴＭが好ましく、リクルート・リンカー当たり少なくとも約２個のＥＴＭが好ましく、特に少なくとも約１０個が好ましく、取分け少なくとも約２０ないし５０個が好ましい。ある場合には、非常に大量のＥＴＭ（１００〜１,０００）が使用し得る。
【０１８４】
当業者が認めるように、ＥＴＭを含んでなる標識プローブ（またはある態様においては標的）の部分（本明細書では“リクルート・リンカー”または“シグナル搬送体”という）は核酸であるか、あるいはＥＴＭに標識プローブの第一ハイブリッド形成性部分を連結する非核酸リンカーであり得る。すなわち、この標識プローブ部分は容易に合成し得るが、ハイブリダイゼーションを必要としないので、核酸である必要はない。ある態様においては、以下に詳しく説明するように、リクルート・リンカーは二本鎖部分を含んでいてもよい。このようにして、当業者が認めるように、使用し得る様々な形状が存在する。好適な態様において、リクルート・リンカーは核酸（類似体も含む）であり、ＥＴＭの付着は以下のものを経由し得る：（１）塩基；（２）バックボーン、例えば、リボース、リン酸エステル、または核酸類似体の相当する構造；（３）下記のヌクレオシド置換；または（４）下記のごときメタロセン・ポリマー。好適な態様においては、リクルート・リンカーは非核酸であり、ＥＴＭ置換基を含むメタロセン・ポリマーまたはアルキル型ポリマー（以下により詳しく説明するように、ヘテロアルキルを包含する）であり得る。これらの選択を一般的に図に示す。
【０１８５】
好適な態様において、リクルートリンカーは核酸であり、共有結合により付着したＥＴＭを含んでいる。ＥＴＭは様々な位置で核酸内のヌクレオシドに付着していてもよい。好適な態様は、（１）ヌクレオシド塩基への付着、（２）塩基置換体としてのＥＴＭの付着、（３）リボース−リン酸バックボーンのリボースまたはリン酸部分への、または核酸類似体の類似構造へなどの核酸バックボーンへの付着、および（４）メタロセンポリマーを介しての付着、などであるが、これらに限定されるものではないが、後者が好ましい。
【０１８６】
さらに、下記のように、リクルートリンカーが核酸である場合、第二のラベルプローブを用いることが望ましく、該プローブは本明細書に定義のように第一ラベルプローブの一部にハイブリッド形成する第一部分とリクルートリンカーを含んでなる第二部分を有する。これは一般的に図１６Ｈに図示される；これはアンプリファイアープローブの使用に似ているが、第一および第二ラベルプローブ両者がＥＴＭを含んでなる場合は例外である。
【０１８７】
好適な態様において、伝導性オリゴマーの付着のために、既に一般的に概説されているようにヌクレオシドの塩基に付着する。付着は内部ヌクレオシドまたは末端ヌクレオシドに対してなされる。
【０１８８】
共有結合による塩基への付着は選定されたＥＴＭ上の部分に依存するが、一般には上記されているように、伝導性オリゴマーが塩基に付着するのに似ている。付着は、一般には、塩基のどの部位になされてもよい。好適な態様において、ＥＴＭは遷移金属複合体であり、かくして、適切な金属リガンドの塩基への付着がＥＴＭの共有結合による付着に導く。あるいは、当業者が認識するように、同様のタイプの結合を有機ＥＴＭの付着に使用してもよい。
【０１８９】
一態様において、シトシンのＣ４付着アミノ基、アデニンのＣ６付着アミノ基、またはグアニンのＣ２付着アミノ基が遷移金属リガンドとして使用し得る。
【０１９０】
芳香族基を含むリガンドは技術上既知のようにアセチレン結合を介して付着することができる（Comprehensive Organic Synthesis, Trost et al., Ed., Pergamon Press, Chapter 2.4; Coupling Reactions Between sp2 and sp Carbon Centers, Sonogashira, pp 521-549, and pp 950-953参照; 出典明示により本明細書に組込まれている）。構造３０は金属イオンと他の必要なリガンド存在下での代表的な構造を図示する；構造３０ではウリジンを図示しているが、本明細書全体について、他の塩基を使用することも可能である。
【０１９１】
【化３０】
0004530541.tif 000031
Ｌａはリガンドであり、窒素、酸素、イオウまたはリン供与リガンドまたはメタロセンリガンドなどの有機金属リガンドを包含する。適切なリガンドＬａはフェナントロリン、イミダゾール、ｂｐｙおよびｔｅｒｐｙなどであるが、これらに限定されるものではない。ＬｒおよびＭは上記定義のとおりである。再度、当業者が認識するように、リンカー（“Ｚ”）はヌクレオシドとＥＴＭの間に含まれる。
【０１９２】
同様に、伝導性オリゴマーとしては、その結合がリンカーを用いてなされるが、リンカーはアミド結合を利用することができる（一般的に、Telser et al., J. Am. Chem. Soc. 111: 7221-7226 (1989); Telser et al., J. Am. Chem. Soc. 111: 7226-7232 (1989)参照；両文献を特に出典明示により本明細書に組込まれている）。これらの構造は下記構造３１に一般的に図示する。再度ここではウリジンを塩基として使用しているが、上記同様、他の塩基も使用し得る。
【化３１】
0004530541.tif 000032
【０１９３】
この態様において、Ｌは上記定義のリガンドであり、ＬｒおよびＭも上記定義のとおりである。好ましくは、Ｌはアミノ、ｐｈｅｎ、ｂｙｐおよびｔｅｒｐｙである。
【０１９４】
好適な態様において、ヌクレオシドに付着したＥＴＭはメタロセンである；すなわち、構造３１のＬおよびＬｒは両者ともメタロセンリガンドであり、上記のＬｍ'である。構造３２は好適な態様を図示するものであり、この場合メタロセンはフェロセン、塩基はウリジンであるが、他の塩基も使用可能である。
【化３２】
0004530541.tif 000033
【０１９５】
予備データが示唆するところでは、構造３２は環化可能であって、第二アセチレン炭素原子がカルボニル酸素を攻撃し、フラン様構造を形成する。好適なメタロセンはフェロセン、コバルトセンおよびオスミウムオセンなどである。
【０１９６】
好適な態様において、ＥＴＭは核酸のリボース−リン酸バックボーンのいずれかの位置、すなわち、５'または３'末端またはいずれかの内部ヌクレオシドでリボースに付着している。この場合のリボースはリボース類似体を包含する。技術的に知られているように、リボースの２'または３'位置のいずれかで修飾されているヌクレオシドは、窒素、酸素、イオウおよびリン−含有修飾により可能となし得る。アミノ−修飾および酸素−修飾リボースが好ましい。一般的には、ＰＣＴ公開ＷＯ９５／１５９７１（出典明示により本明細書に組込まれている）を参照されたい。これらの修飾基は遷移金属リガンドとして、または他の遷移金属リガンドおよび有機金属リガンド付着のための化学的に官能性の部分、または当業者認知の有機電子供与体部分として使用することができる。この態様において、本明細書において“Ｚ”として図示したようなリンカーも同様に、またはリボースとＥＴＭ間の伝導性オリゴマーも使用可能である。好適な態様では、リボースの２'または３'位での付着を利用するが、２'位置が好ましい。このように例えば、構造１３、１４および１５に図示された伝導性オリゴマーはＥＴＭに置換えることができる；あるいは、ＥＴＭは伝導性オリゴマーの遊離末端に加えてもよい。
【０１９７】
好適な態様において、メタロセンはＥＴＭとして作動し、下記構造３３に図示するようにアミド結合を介して付着する。例示ではメタロセンがフェロセンである場合の好適な化合物につきその合成を概説する。
【化３３】
0004530541.tif 000034
【０１９８】
好適な態様においては、アミンの結合が構造３４に一般的に図示するように使用される。
【化３４】
0004530541.tif 000035
Ｚは本明細書に定義のごときリンカーであり、１〜１６原子のものが好ましく、２〜４原子がとりわけ好ましい。ｔは１または０である。
【０１９９】
好適な態様においては、オキソ結合が構造３５に一般的に図示するように使用される。
【化３５】
0004530541.tif 000036
構造３５において、Ｚは本明細書に定義のとおりのリンカーであり、ｔは１または０である。好適なＺリンカーは、（ＣＨ２）ｎおよび（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎなどのヘテロアルキル基を含むアルキル基を包含し、ｎは１ないし１０が好ましく、ｎ＝１ないし４がとりわけ好ましく、ｎ＝４が特に好ましい。
【０２００】
他のヘテロ原子を利用する結合も可能である。
【０２０１】
好適な態様において、ＥＴＭは核酸のリボース−リン酸バックボーンのいずれかの位置でリン酸エステルに付着する。これは様々な様式でなされる。一態様において、ホスホジエステル結合類似体、例えば、ホスホラミドまたはホスホルアミダイト結合は核酸中に取込まれていてもよく、その場合、ヘテロ原子（すなわち、窒素）が遷移金属リガンドとして作動する（ＰＣＴ公開ＷＯ９５／１５９７１参照；出典明示により本明細書に組込まれている）。あるいは、構造２３および２４に図示されている伝導性オリゴマーをＥＴＭに置換えてもよい。好適な態様において、組成物は構造３６に示した構造を有する。
【化３６】
0004530541.tif 000037
【０２０２】
構造３６において、ＥＴＭはリン酸エステル結合を介して、一般にはリンカーＺを使用することにより付着する。好適なＺリンカーは、（ＣＨ２）ｎ、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎなどのヘテロアルキル基を含むアルキル基を包含し、ｎは１ないし１０が好ましく、ｎ＝１ないし４がとりわけ好ましく、ｎ＝４が特に好ましい。
【０２０３】
ＥＴＭがヌクレオシドの塩基またはバックボーンに付着している場合、より詳しく下に概説するように、“樹枝状”構造を介してＥＴＭを付着させることが可能である。図に一般的に示すように、アルキルベースのリンカーを用い、各枝の末端に１個またはそれ以上のＥＴＭを含む複数の分枝構造を創り出すことができる(内部ＥＴＭを同様に使用することもできるが)。一般に、これは多数のヒドロキシ基を含む分枝点を創り出すことにより実施されるが、このヒドロキシ基を用いてさらなる分枝点を加えることができる。末端のヒドロキシ基は次いでホスホルアミダイト反応に用い、一般的にはヌクレオシド置換およびメタロセンポリマー反応のために以下に実施するように、ＥＴＭに加えることができる。分枝点は内部にあっても末端にあってもよく、化学的分枝点であってもヌクレオシド分枝点であってもよい。
【０２０４】
好適な態様において、メタロセンなどのＥＴＭは、ＥＴＭとして作動するように“ヌクレオシド置換体”として使用する。例えば、フェロセンの２つのシクロペンタジエン環の間の距離は、二本鎖核酸中の２つの塩基間の直交距離に類似している。フェロセンに加え、他のメタロセン、例えば、コバルトまたはルテニウムなどを含むメタロセンなどの空気安定性メタロセンを使用することができる。このように、メタロセン部分は、構造３７（リボース−リン酸バックボーンを有する核酸）および構造３８（ペプチド核酸バックボーン）に一般的に図示するように、核酸のバックボーンに取込んでもよい。構造３７および３８ではフェロセンを図示しているが、当業者が認識するように、他のメタロセンも同様に使用し得る。一般に、空気に安定なメタロセンが好ましく、金属としてルテニウムおよびコバルトを利用するメタロセンが包含される。
【０２０５】
【化３７】
0004530541.tif 000038
構造３７において、Ｚは上記定義のリンカーであり、一般的には短いアルキル基をもち、酸素などのヘテロ原子を含むものが好ましい。一般に、重要なことはリンカーの長さであり、より詳しく以下に説明するように、二本鎖核酸の最少の摂動がもたらされるようにする。このように、メチレン、エチレン、エチレングリコール、プロピレンおよびブチレンがすべて好適であり、エチレンおよびエチレングリコールが特に好ましい。さらに、各Ｚリンカーは同一であっても、異なってもよい。構造３７はリボース−リン酸バックボーンを表示しているが、当業者が認識するように、リボース類似体およびリン酸エステル結合類似体などの核酸類似体を使用してもよい。
【０２０６】
【化３８】
0004530541.tif 000039
構造３８において、好適なＺ基は上記掲載のとおりであるが、再度、各Ｚリンカーは同一または異なってもよい。上述のように、他の核酸類似体も同様に使用し得る。
【０２０７】
さらに、上記の構造と検討ではメタロセン、特にフェロセンを描出しているが、同じ一般的な着想を用い、下記のように、メタロセンに加えヌクレオシドの置換体として、またはポリマーの態様において、ＥＴＭを付加することができる。このように、例えば、１、２または３個（またはそれ以上）のリガンドを含んでなる、メタロセン以外の遷移金属複合体である場合、該リガンドをフェロセンについて表現したように機能化し、ホスホルアミダイト基の付加を可能とすることができる。特に、この態様において好ましいのは、少なくとも２つの環（例えば、アリールおよび置換アリール）リガンドを含んでなる複合体であり、その場合、各リガンドはホスホルアミダイト化学による付着のための官能基を含んでなる。当業者が認識するように、このタイプの反応は、ここで生じるシグナルの増幅を可能とするために、核酸バックボーンの一部としてまたは核酸の“側鎖基”としてＥＴＭのポリマーを創出するが、正しい化学基を含むように官能化し得る実質的にいずれのＥＴＭによっても実施することができる。
【０２０８】
このように、フェロセンなどのメタロセン（または他のＥＴＭ）を核酸のバックボーンに挿入することにより、核酸類似体が調製される；すなわち、本発明は少なくとも１個のメタロセンを含んでなるバックボーンをもつ核酸を提供する。このことはバックボーンに付着した、すなわち、リボース、リン酸エステルなどを介して、メタロセンを有する核酸から識別される。すなわち、伝統的な核酸または類似体から造られた２つの核酸（この場合の核酸は単一のヌクレオシドを包含する）それぞれは、メタロセンを介して互いに共有結合により付着することができる。異なる観点で、メタロセン誘導体または置換メタロセンが提供されるが、その場合は、メタロセンの２つの芳香環それぞれが核酸置換基を有する。
【０２０９】
さらに、より詳しく以下に説明するように、間にヌクレオチドをもつか、および／または隣接するメタロセンをもつ１個より多いメタロセンをバックボーンに取込ませることが可能である。隣接するメタロセンをバックボーンに付加する場合、これは“メタロセンポリマー”としての下記の工程と同じである；すなわち、バックボーン内にメタロセンポリマーの領域が存在する。
【０２１０】
核酸置換基に加え、ある場合には、メタロセン（またはＥＴＭ）の芳香環の一方または双方にさらなる置換基を付加することが望ましい。例えば、これらのヌクレオシド置換体は一般に実質的に相補的な核酸、例えば、標的配列またはもう一つのプローブ配列とハイブリッド形成すべきプローブ配列の部分なので、置換基をメタロセン環に付加して、反対鎖上の１個または複数個の塩基に水素結合形成するのを容易にすることが可能である。これらはメタロセン環上のどの位置に付加してもよい。適切な置換基は、アミド基、アミン基、カルボン酸、および置換アルコールを含むアルコール類であるが、これらに限定されるものではない。さらに、これらの置換基は同様にリンカーを介して付着させることができるが、一般的には好ましくない。
【０２１１】
さらに、ＥＴＭ、特にフェロセンなどのメタロセン上に置換基を付加してＥＴＭのレドックス性を変化させてもよい。このように、例えばある態様では、より詳しく以下に記載するように、異なる様式で（すなわち、塩基またはリボース付着）、異なるプローブ上、または異なる目的で（例えば、校正または内部基準として）付着した異なるＥＴＭを有することが望ましい。このように、メタロセン上に置換基を付加することは、２つの異なるＥＴＭの識別を可能とする。
【０２１２】
これらのメタロセン−バックボーン核酸類似体を生成させるために、中間成分も提供される。このように、好適な態様において、本発明は構造３９に一般的に表示するように、ホスホルアミダイト・メタロセンを提供する。
【化３９】
0004530541.tif 000040
【０２１３】
構造３９において、ＰＧは保護基であり、一般に核酸の合成に適した基であって、ＤＭＴ、ＭＭＴおよびＴＭＴなどがすべて好適である。芳香環はメタロセンの環であるか、または遷移金属複合体もしくは他の有機ＥＴＭ用リガンドの芳香環であることができる。芳香環は同一または異なってもよく、また、本明細書に検討するように置換されていてもよい。
【０２１４】
構造４０はフェロセン誘導体を図示する：
【化４０】
0004530541.tif 000041
【０２１５】
これらのホスホルアミダイト類似体は技術上既知の標準的オリゴヌクレオチド合成に追加することができる。
【０２１６】
構造４１はフェロセンペプチド核酸（ＰＮＡ）モノマーを図示し、技術上既知であり、各図および各実施例中に示しているようにＰＮＡの合成に追加することができる：
【化４１】
0004530541.tif 000042
構造４１において、ＰＧ保護基はペプチド核酸合成に使用するのに適しており、ＭＭＴ、ｂｏｃ、およびＦｍｏｃなどが好ましい。
【０２１７】
これら同一の中間化合物を用いてＥＴＭまたはメタロセンポリマーを形成することが可能であり、これらは、より詳しく以下に説明するように、バックボーン置換体としてよりもむしろ核酸に付加される。
【０２１８】
好適な態様において、ＥＴＭはポリマーとして、例えば、メタロセンポリマーとして、本明細書およびＵＳ特許番号５，１２４，２４６に概説されているように、“分枝したＤＮＡ”態様と同様の“分枝した”構成で、修飾した機能化ヌクレオチドを用い付着させる。一般的な着想は以下のとおりである。修飾されたホスホルアミダイトヌクレオチドが生成されるが、それはメタロセンなどのホスホルアミダイトＥＴＭの付着に使用し得る遊離のヒドロキシ基を最終的に含むことができる。この遊離のヒドロキシ基は塩基またはリボースもしくはリン酸エステルなどのバックボーン上に存在し得る（当業者も認識するであろうが、他の構造を含む核酸類似体も使用し得る）。修飾されたヌクレオチドを核酸に取込み、ヒドロキシ保護基を除去し、遊離のヒドロキシを生じる。構造３９および４０において上述したように、メタロセンなどのホスホルアミダイトＥＴＭの付加により、メタロセンＥＴＭなどのＥＴＭを付加する。別のメタロセン類などのホスホルアミダイトＥＴＭ類の付加により、本明細書中で特にフェロセンについて示したような“メタロセンポリマー群”を含む“ＥＴＭポリマー群”を形成することができる。さらに、ある態様においては、図１２に一般的に描出したように、“キャッピング”基をポリマー中の末端ＥＴＭに、例えば、最終リン酸エステル基をメタロセンに付加することによりポリマーの溶解性を上昇させることが望ましい。他の適切な溶解度上昇性“キャッピング”基は当業者が認識するであろう。留意すべきことは、これらの溶解度上昇性基は、リガンド環、例えば、本明細書で検討したメタロセンの他の位置でポリマーに付加させることができることである。
【０２１９】
この一般的な着想の好適な態様を図面に概説する。この態様において、ホスホルアミダイトヌクレオチドのリボースの２'位置は、この場合はオキソ結合を介して保護されたヒドロキシ基を含むように先ず官能化するが、リンカーの数については、Ｚリンカーについて本明細書で一般的に記載するようにいずれの数も使用し得る。保護修飾されたヌクレオチドは、次いで標準的なホスホルアミダイトの化学により伸長する核酸中に取込む。保護基を除去し、遊離のヒドロキシ基を用い、再び標準的なホスホルアミダイトの化学を用い、フェロセンなどのホスホルアミダイトメタロセンを付加させる。同様の反応は核酸の類似体についても可能である。例えば、構造４１に示したペプチド核酸とメタロセンモノマーを用い、メタロセンポリマーを含むペプチド核酸構造を生成させることができた。
【０２２０】
このように、本発明は、メタロセンポリマーの“分枝”を含む核酸のリクルートリンカーを提供する。好適な態様ではメタロセンの長さが１ないし約５０個、好ましくは約５ないし約２０個、とりわけ好ましくは約５ないし約１０個のメタロセンポリマーを利用する。
【０２２１】
好適な態様においては、ＥＴＭは核酸の合成後に付着させる。“櫛状”構造または“樹木状”構造のＥＴＭを含んでなるヌクレオシドの付着が上手く作用する一方で、この方式により付着させ得るＥＴＭの数には制限があるが、それは合成に際しての固相支持体のポアサイズの制限によるものであり；大きな核酸は大きなポアサイズを必要とすること、その結果、この方式で付着させ得るＥＴＭ、特にフェロセンの数に制限があることである。このように、核酸当たりのＥＴＭが大量に必要な場合には、合成後のＥＴＭ添加を実施してもよい。以下に概説するように、これはアッセイに先立ち、またはアッセイの最中に実施してもよい。さらに、本説明はＥＴＭの付着に関するものであるが、この合成後添加は発蛍光団など他の検出可能な標識物の付着に使用してもよい。
【０２２２】
好適な態様において、標識物の付加はアッセイに先立って起こる。図１８に概説するように、核酸は付加位置において１個以上の官能基を含むように調製される。付着に好適な官能基はアミノ基、カルボキシ基、マレイミド基、オキソ基およびチオール基であり、アミノ基とチオール基が特に好ましい。付加位置は所望の反応と使用する核酸によって異なり、核酸の合成には使用しない位置であるのがよい。例えば、核酸がリボース−リン酸エステルバックボーンを含む場合、付加位置はリボースの２’位であるのがよい。あるいは、ＥＴＭの付着について本明細書に概説したように、塩基から離れた位置を使用し得る。
一般に、付加位置での官能基は、図１８に一般的に描出するように、第一官能基と核酸との間に、アルキル基などのリンカーをも含むことができる。
【０２２３】
標識を含む部分、例えばＥＴＭは、官能基をも含む。当業者が認めるように、多種の配置を使用し得る。一態様においては、ＥＴＭそれ自体が第二の官能基を含む。あるいは、そして好適には、大量のＥＴＭを加えるとき、複数のＥＴＭを含むリンカーまたはポリマーが存在し、そのリンカーまたはポリマーが官能基を含む。例えば、図１８に描出するように、第二官能基を含むアルキルリンカーに付着したフェロセンポリマーが使用し得る。
次いで、２つの官能基を直接またはリンカーを用いて結合させる。リンカーは技術上既知である；例えば、周知のように同種の−または異種の−二官能性リンカー（参照：ピアス・ケミカル・カンパニー（Pierce Chemical Company）１９９４年カタログ、架橋剤に関するテクニカルセクション、１５５〜２００頁；出典明示により本明細書の一部とする）。リンカーの選択は結合する官能基に左右される。例えば、アミノ基とスルフヒドリル基を結合させる場合、好適なリンカーは、Ｎ−（γ−マレイミドブチリルオキシ）スルホスクシンイミド・エステル（上記ピアス）を含む。さらなる好適なリンカーは、これらに限定されるものではないが、短鎖アルキル基、エステル、アミド、マレイミド基、エポキシ基およびエチレングリコールをもつアルキル基（置換アルキル基およびヘテロ原子部分を含むアルキル基を包含する）およびその好適な誘導体である。
当業者が認めるように、付加の順序は変え得る。例えば、第一の官能基を核酸に付加させ、次いでリンカーを付加し、次いでＥＴＭ種を付加することができる。あるいは、リンカーをＥＴＭ種に付加させ、次いで核酸に付加させることもできる。あるいは、２つの官能基を直接付着させる。他の組合わせもさらに可能である。
この方式で、大量のＥＴＭをリクルート・リンカーに付加させ得る。
【０２２４】
好適な態様において、標識物、例えば、ＥＴＭの付加は実際にハイブリダイゼーション後にさらに起こり得る。図２１ＡおよびＢに示すように、官能基は合成に際し、直接または少なくとも１個の、好ましくは複数の官能基を含むリンカーの使用を介して核酸内に取込ませ得る。次いで、核酸は、例えば、標識プローブとしてハイブリダイゼーション・アッセイに使用し、捕捉プローブにハイブリダイゼーションした後、標識物を加える。再び、上記のように、官能基は直接または官能基と標識物両方を含むリンカーとして標識物に取込まれる。この方式で、大量の標識物、特にＥＴＭをアッセイ複合体に加えることができる。
さらに、リクルート・リンカーが核酸である場合、ＥＴＭ付着を任意の組合わせをなし得る。
【０２２５】
好適な態様において、リクルートリンカーは核酸ではなく、代りに如何なる種類のリンカーまたはポリマーであってもよい。当業者が認識するように、ＥＴＭを含むように修飾し得る一般的なリンカーまたはポリマーを用いることができる。一般に、ポリマーまたはリンカーは適度に溶解すべきであり、ＥＴＭ付加のための適切な官能基を含むべきである。
【０２２６】
本明細書にて用いる場合、“リクルートポリマー”とは少なくとも２または３個のサブユニットを含んでなり、共有結合により付着している。モノマーサブユニットの少なくともある部分はＥＴＭの共有結合による付着のための官能基を含む。ある態様において、カップリング部分はサブユニットとＥＴＭとを共有結合させるために用いる。付着のための好適な官能基は、アミノ基、カルボキシ基、オキソ基およびチオール基などであって、アミノ基が特に好ましい。当業者が認識するように、多様なリクルートポリマーが可能である。
【０２２７】
適切なリンカーとしては、アルキルリンカー（ヘテロアルキル（（ポリ）エチレングリコール型構造を含む）、置換アルキル、アリールアルキルリンカーを含む）を包含するが、これらに限定されるものではない。ポリマーについては上記のごとく、リンカーはＥＴＭ付着のための１個以上の官能基を含んでなり、付着は当業者認識のとおりに、例えば、周知のホモ−またはヘテロ−二官能性リンカーを使用することによって実施される（１９９４年Pierce Chemical Companyのカタログ、架橋剤に関する技術のセクション、１５５〜２００ページ参照。出典明示により本明細書の一部とする）。
【０２２８】
適切なリクルートポリマーは、機能化したスチレン、例えば、アミノスチレン、機能化したデキストラン、およびポリアミノ酸などを包含するが、これらに限定されるものではない。好適なポリマーは、ポリリジンなどのポリアミノ酸（ポリ−Ｄ−アミノ酸およびポリ−Ｌ−アミノ酸両方）、およびリジンと特に好適な他のアミノ酸を含むポリマーなどである。他の適切なポリアミノ酸は、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、リジンとグルタミン酸またはアスパラギン酸との共重合体、リジンとアラニン、チロシン、フェニルアラニン、セリン、トリプトファン、および／またはプロリンとの共重合体などである。
【０２２９】
好適な態様において、リクルートリンカーは上記のようにメタロセンポリマーが含まれる。
【０２３０】
ラベルプローブ第一部分へのリクルートリンカーの付着は、当業者が認識するように、リクルートリンカーの組成に依存する。リクルートリンカーが核酸である場合、これは、一般に、要求されるＥＴＭ含有ヌクレオシドの取込みとともに、標識プローブの第一部分の合成の際に形成される。あるいは、ラベルプローブの第一部分とリクルートリンカーが別個に造られ、次いで付着してもよい。例えば、相補性の重なり合う区分があって、例えば、技術的に既知のプソラレンを使用することにより、化学的に架橋し得る二本鎖核酸の区分を形成させてもよい。
【０２３１】
非核酸リクルートリンカーを使用する場合、リクルートリンカーのリンカー／ポリマー付着は一般に、当業者が認識するような標準的化学技法を用いて実施される。例えば、アルキル−ベースのリンカーを使用する場合、付着は核酸への絶縁体付着と同様である。
【０２３２】
さらに、核酸と非核酸の混合物であるリクルートリンカーを、線状形態（すなわち、核酸セグメントがアルキルリンカーとともに結合している）または分枝形態（ＥＴＭを含み、かつ、さらに分枝していてもよいアルキル“分枝”をもつ核酸）で入手することが可能である。
【０２３３】
好適な態様において、ＥＴＭを担持するのは、標識プローブのリクルートリンカーよりもむしろ標的配列それ自体である。例えば、以下により詳しく説明するように、本発明の各ＥＴＭを含むヌクレオチド三リン酸を、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に際し、増殖する核酸に酵素的に加えることが可能である。当業者が認めるであろうように、幾つかの酵素は修飾したヌクレオチドに対し一般に寛容(tolerate)であることが示されているが、本発明の修飾ヌクレオチドの一部、例えば、“ヌクレオシド置換”の態様および恐らく一部リン酸エステルの付着は、増殖する核酸への取込みを可能とする酵素により認識されることもあり、されないこともある。したがって、この態様での好適な付着はヌクレオチドの塩基またはリボースに対するものである。
【０２３４】
このように、例えば、当業者周知のように、標的配列のＰＣＲ増幅は、その配列に一般にランダムに取込まれたＥＴＭを含んでいる標的配列を与えることとなる。本発明のシステムは、図１６Ａ、１６Ｂおよび１６Ｄに一般的に描出したように、これらのＥＴＭを用いて検出可能となるように構成することができる。
【０２３５】
別法として、より詳細に以下に説明するように、ＥＴＭを含んでなるヌクレオチドを核酸の末端、例えば、標的核酸に酵素的に付加することが可能である。この態様においては、有効な“リクルートリンカー”を標的配列の末端に付加させ、それを検出に使用することができる。このように、本発明は、伝導性オリゴマーの単層と捕獲プローブを含んでなる電極を利用する組成物、およびアッセイ複合体の成分にハイブリッド形成することの可能な第一部分と、アッセイ複合体の成分にハイブリッド形成せず、少なくとも１つの共有結合により付着した電子移動部分を含んでなる第二部分とを含んでなる標的配列を提供する。同様に、これらの組成物を利用する方法も提供する。
【０２３６】
プローブ配列、すなわち、相補性配列にハイブリッド形成するように設計された配列にＥＴＭを連接させることも可能である。このように、ＥＴＭは非リクルートリンカーにも同様に付加させることができる。例えば、アッセイ複合体の成分にハイブリッド形成するラベルプローブ断片、例えば、第一部分に、または上記に記載の標的配列に付加したＥＴＭが存在してもよい。これらのＥＴＭは一部の態様において電子移動検出に使用してもよく、あるいはその位置とシステムによっては使用することができない。例えば、ある態様において、例えば、図１６Ａに図示したように、無作為に取込ませたＥＴＭを含有する標的配列が捕獲プローブに直接ハイブリッド形成する場合には、捕獲プローブにハイブリッド形成する部分にＥＴＭが存在する。もし捕獲プローブが伝導性オリゴマーを用いる電極に付着するならば、これらのＥＴＭはすでに説明したように電子移動を検出するのに使用することができる。あるいは、これらのＥＴＭは特異的に検出し得ない可能性もある。
【０２３７】
同様に、ある態様においては、リクルートリンカーが核酸である場合、リクルートリンカーの一部またはすべてが二本鎖であることが望ましい。一態様においては、第二リクルートリンカーが存在し、それが実質的に第一リクルートリンカーに相補的であり、第一リクルートリンカーにハイブリッド形成し得ることがある。好適な態様において、第一リクルートリンカーは共有結合により付着したＥＴＭを含んでなる。別の態様において、第二リクルートリンカーはＥＴＭを含み、第一リクルートリンカーは含まず、ＥＴＭは第二リクルートリンカーが第一に対してハイブリッド形成することによりその表面に集められる。さらにもう一つの態様においては、第一および第二リクルートリンカー双方がＥＴＭを含んでなる。留意すべきことは、上記のように、大量数のＥＴＭを含んでなる核酸は、同様にはハイブリッド形成しない、すなわち、ＥＴＭの付着部位と特性に依存してＴｍが低下することがある。かくして、一般に、多数のＥＴＭが鎖のハイブリッド形成に用いられるとき、一般には約５より小さく、好ましくは約３より小さくする。あるいはＥＴＭは、介在するヌクレオチドが充分にハイブリッド形成して良好な反応速度が可能となるように十分な空間距離をとるべきである。
【０２３８】
一態様において、非共有結合により付着させたＥＴＭを使用し得る。一態様において、ＥＴＭはハイブリダイゼーションの指標である。ハイブリダイゼーションの指標は、二本鎖核酸と優先的に会合するＥＴＭがミランらの方法と同様に、通常とは逆に加えられるときに機能する（Millan et al., Anal. Chem. 65:2317-2323 (1993); Millan et al., Anal. Chem. 662943-2948 (1994)；両文献を出典明示により本明細書の一部とする）。この態様においては、表面でＥＴＭハイブリダイゼーション指標と二本鎖核酸との会合により、ＥＴＭの局部濃度が増大するなら、導電性オリゴマーを含む単層を用い、それをモニターすることができる。ハイブリダイゼーション指標はインターカレーターおよび小溝および／または主溝結合部分を包含する。好適な態様においては、インターカレーターを用いてもよい；インターカレーション（挿入）は一般に二本鎖核酸の存在下にのみ起こるので、二本鎖核酸の存在下においてのみＥＴＭは濃縮される。遷移金属複合体ＥＴＭのインターカレーションは技術上既知である。同様に、小溝および主溝結合部分、例えばメチレンブルーなどは本態様においても使用し得る。
【０２３９】
同様に、本発明のシステムは、ナピアーらが一般的に記載しているように、非共有結合により付着させたＥＴＭを利用し得る（Napier et al., Bioconj. Chem. 8:906 (1997)；出典明示により本明細書の一部とする）。この態様においては、ＤＮＡ存在の結果としての一定分子の酸化還元状態の変化（すなわち、ルテニウム複合体によるグアニン酸化）が、同様に導電性オリゴマーを含んでなるＳＡＭを用い、検出することができる。
このように、本発明は導電性オリゴマーを含む単層を含んでなる電極であって、一般に、捕捉プローブ、および標的配列またはＥＴＭ含有のリクルート・リンカーを含む標識プローブを包含する電極を提供する。
【０２４０】
核酸システム用に、本発明のプローブは標的配列に相補性（下に説明するように、サンプルの標的配列または他のプローブ配列に対し）となるように設計し、標的配列と本発明プローブのハイブリダイゼーションが起こるようにする。下に概説するように、この相補性は完全である必要はない；標的配列と本発明の一本鎖核酸間のハイブリダイゼーションを阻害するような、相当数の塩基対ミスマッチがあってもよい。しかし、もし突然変異の数が多すぎて、最少の緊縮ハイブリダイゼーション条件下でもハイブリダイゼーションが起こらないならば、その配列は相補的標的配列ではない。このように、本明細書において“実質的に相補的”とは、プローブが正常の反応条件下でハイブリダイズするために標的配列に十分に相補的であることを意味する。
【０２４１】
一般に、本発明の核酸組成物はオリゴヌクレオチドプローブとして有用である。当業者には明らかなように、プローブの長さは、標的配列の長さおよびハイブリダイゼーションと洗浄条件により変わる。一般に、オリゴヌクレオチドプローブは約８ないし約５０ヌクレオチドの範囲であり、好ましくは約１０ないし約３０であり、特に好ましいのは約１２ないし約２５である。ある場合には、非常に長いプローブ、例えば、５０ないし２００〜３００ヌクレオチドの長さのものを用いてもよい。このように、本明細書に描出した構造において、ヌクレオシドは核酸と置換え得る。
【０２４２】
多様なハイブリダイゼーション条件が本発明において使用し得るが、高度、中程度および低度の緊縮条件などである；例えば、Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, 1989, and Short Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel, et al.（出典明示により本明細書の一部とする）参照。
【０２４３】
ハイブリダイゼーション条件は技術上知られるように、非イオン性バックボーン、すなわちＰＮＡを用いても変わり得る。さらに、架橋剤が標的結合に続いて二本鎖のハイブリダイゼーション複合体を架橋する、すなわち、共有結合により付着させるために加えられてもよい。
【０２４４】
当業者には明らかなように、本発明のシステムは、図に一般的に描出したように、多数の異なる形状の上に取り得る。一般に、使用し得るシステムには３つのタイプがある：（１）標的配列それ自体がＥＴＭで標識されるシステム（図１６Ａ、図１６Ｂ、および図１６Ｄ参照）；（２）標識プローブが直接標的配列にハイブリダイズするシステム（図１６Ｃおよび図１６Ｈ参照）；および（３）標識プローブが間接的に標的配列に、例えば、増幅プローブの使用を介してハイブリダイズするシステム（図１６Ｅ、図１６Ｆおよび図１６Ｇ参照）。
【０２４５】
これら３つのシステムすべてにおいて、要求されるというわけではないが、電極表面に標的配列を固定するのが好ましい。これは捕獲結合リガンドと所望により１つまたはそれ以上の捕獲伸長プローブを用いて好適に実施される。捕獲プローブのみを利用する場合には、各標的配列に対しユニークな捕獲プローブをもつことが必要である；すなわち、表面はユニークな捕獲プローブを含むように設計しなければならない。あるいは、捕獲伸長プローブを使用することが可能であり、それが“普遍的”表面、すなわち、全ての標的配列を検出するのに使用し得る単一タイプの捕獲プローブを含む表面を可能とする。“捕獲伸長”プローブは一般的に図１４などに描出され、捕獲プローブの全部または一部にハイブリダイズする第一部分と、標的配列の一部分にハイブリダイズする第二部分とをもつ。これが次いで設計された可溶性プローブの生成を可能とするが、当業者も認めるように、一般により簡単でコストも掛らない。本明細書(例えば図１４Ｃ)に示すように、２つの捕獲伸長プローブを使用し得る。これは一般にアッセイ複合体を安定化するためになされる（例えば、標的配列が大きい場合、または大きな増幅プローブ（特に、分枝または樹枝状増幅プローブ）が使用される場合）。
【０２４６】
好適な態様において、核酸は以下に検討するＳＡＭの形成後に加えられる(上記(４))。これは、当業者が認識するように種々の方法で実施し得る。一態様において、末端官能基を有する伝導性オリゴマーは、活性化させたカルボン酸エステルとイソチオシアン酸エステルを利用する好適な態様により調製されるが、それは、図６に一般的に示すように、活性化させたカルボン酸エステルを用いて、核酸に取付けた一級アミンと反応しうる。これら二種類の試薬は水溶液中で安定であるという利点をもち、さらに一級アルキルアミンと反応する。しかし、塩基のうち、一級芳香族アミンおよび二級および三級アミンは反応してはならず、そのようにして、表面への、核酸の部位特異的付加が可能となるようにしなければならない。これがその表面上に既知方法（インクジェット、スポッティングなど）によるプローブ（捕獲プローブまたは検出プローブのいずれか、または両方）のスポッティングを可能とする。
【０２４７】
さらに、核酸を表面上に固定化するために用い得る多くの非核酸方法がある。例えば、結合パートナー対が利用し得る；すなわち、一方の結合パートナーは伝導性オリゴマーの末端に付着させ、他方は核酸の末端に付着させる。これはまた核酸捕獲プローブを使用せずに実施し得る；すなわち、一方の結合パートナーは捕獲プローブとして作用し、他方は標的配列または捕獲伸長プローブのいずれかに付着する。すなわち、標的配列が結合パートナーを含むか、または標的配列にハイブリッド形成する捕獲伸長プローブが結合パートナーを含むかのいずれかである。適切な結合パートナー対は、ビオチン／ストレプトアビジンなどのハプテン対、抗原／抗体、ＮＴＡ／ヒスチジンタグなどであるが、これらに限定されるものではない。一般に、より小型の結合パートナーが好ましく、そのようにして電子は核酸から伝導性オリゴマー中へ移動し、検出を可能とする。
【０２４８】
好適な態様において、標的配列それ自体が修飾され結合パートナーを含む場合、結合パートナーは標的配列に酵素的に付着し得る修飾ヌクレオチドを介して、例えば、ＰＣＲ標的増幅工程に際して付着する。あるいは、結合パートナーは標的配列に容易に付着する。
【０２４９】
あるいは、標的にハイブリッド形成するための核酸部分並びに結合パートナーを有する捕獲伸長プローブを利用してもよい（例えば、捕獲伸長プローブは結合パートナーに付着するのに使用されるアルキルリンカーなどの非核酸部分を含んでいてもよい）。この態様においては、安定のために標的の二本鎖核酸と捕獲伸長プローブとを、例えば、技術上既知のプソラレンを用い架橋することが望ましい。
【０２５０】
一態様において、該標的は捕獲プローブを用いる電極表面に結合しない。この態様において重要なことは、本明細書のすべてのアッセイについて、過剰のラベルプローブは検出前に除去すべきであり、アッセイ複合体(リクルートリンカー)は表面に接近させるべきことである。当業者が認識するように、これは他の方法で実施するのがよい。例えば、アッセイ複合体は、単層を含んでなる電極に付加されるビーズ上に存在してもよい。ＥＴＭを含むリクルートリンカーは、表面上へのビーズの重力沈降、ビーズ成分と表面間の静電気的または磁気的相互作用などの当技術分野で周知の技法を用い、上述の結合パートナー付着を用いて伝導性オリゴマー表面に近接して設置することができる。あるいは、過剰のラベルプローブなどの過剰の試薬を除去した後、アッセイ複合体を、例えば、アッセイ複合体を表面に移動させるのに十分な電圧でシステムにパルスを与えて、表面に移着させることが可能である。
【０２５１】
しかし、好適な態様では、核酸捕獲プローブを介して付着させたアッセイ複合体を利用する。
【０２５２】
好ましい実施態様として、標的配列自体がＥＴＭを含む。上記に検討したように、このことは相当数の位置に取込まれたＥＴＭをもつ標的配列により実施し得ることであり、上記概説のとおりである。代表的な例を図１６Ａ、図１６Ｂおよび図１６Ｄに示す。この態様においては、このシステムのその他について、プローブと標的の３’−５’配向が、ＥＴＭ含有構造（すなわち、リクルートリンカーまたは標的配列）が可能な限り単層の表面に接近するように、また、正しい配向となるように選択される。これは図面に一般的に示したように、絶縁体または伝導性オリゴマーを介する付着により実施することができる。さらに、当業者が認めるであろうように、複数の捕獲プローブは、捕獲プローブの５’−３’配向が異なる場合である図５Ｄに描出したような形状で、または複数の捕獲プローブを用いた場合に標的の“ループ”が生成する場所で利用することができる。
【０２５３】
好ましい実施態様として、図１６Ｃに一般的に描出したように、標識プローブが標的配列に直接ハイブリダイズする。これらの態様において、標的配列は、好ましくは、捕獲伸長プローブを含む捕獲プローブにより表面に固定するが、必ずしも必要ではない。次いで、標識プローブを用い、伝導性オリゴマーからなる単層の表面近傍にＥＴＭをもってくる。好適な態様においては、複数の標識プローブを用いる；すなわち、標識プローブは標的配列(図中の標識化した１４１)にハイブリダイズする部分が多数の異なる標識プローブに対して異なり得るように設計し、その結果、シグナルの増幅が起こるが、その理由は複数の標識プローブがそれぞれの標識配列に結合し得るからである。このように、図に描出したように、ｎは少なくとも１の整数である。所望の感度、標的配列の長さ、標識プローブ当たりのＥＴＭ数により、ｎの好適な範囲は１〜５０、特に好ましくは約１ないし約２０、そしてとりわけ好ましいのは約２ないし約５である。さらに、もし“一般の”標識プローブが望ましいのであれば、増幅プローブの使用について一般的に下に説明したように、標識伸長プローブを用いることができる。
【０２５４】
上記のように、この態様においては一般に、システムの形状と標識プローブの配置は単層表面に可能な限り近接してＥＴＭが集まるように設計する。
好適な態様において、標識プローブは間接的に標的配列にハイブリダイズさせる。すなわち、本発明はシグナル増幅技術と電極上での電子伝達検出との新規な組合わせに用途を見出だすが、これは核酸実施態様について図１６に一般的に描出したように、サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイにとりわけ有用である。これらの態様において、本発明の増幅プローブはサンプル中の標的配列に直接または間接的に結合する。増幅プローブは、好ましくは標識プローブの結合に利用し得る比較的多数の増幅配列を含むので、検出可能なシグナルが有意に増加し、標的の検出限界が有意に改善され得る。これらの標識と増幅プローブ、および本明細書に記載の検出方法は、本質的に既知の核酸ハイブリダイゼーションによるいずれかの方式、例えば、標的を直接固相に結合する方式で、または標的が１つ以上の核酸に結合し、それが次いで固相に結合するサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイにて、使用可能である。
【０２５５】
一般に、これらの態様は、以下のように説明し得る。増幅プローブは標的配列に直接（例えば、図１６Ｅ）または標識伸長プローブの使用を介して（例えば、図１６Ｆおよび図１６Ｇ）ハイブリダイズするが、これは“一般的な”増幅プローブの調製を可能とする。標的配列は、好ましくは捕獲プローブを使用して電極上に固定するが、必ずしも必要ではない。好ましくは、増幅プローブは多様な増幅配列を含むが、ある態様においては、下記説明のように、増幅プローブは唯１つの増幅配列を含む。増幅プローブは多くの異なる形状をとることができる；例えば、分枝立体配座、樹枝状立体配座、または増幅配列の線状“ひも”などである。これらの増幅配列を使用して標識プローブとのハイブリダイゼーション複合体を形成し、電極を用いてＥＴＭを検出することができる。
【０２５６】
したがって、本発明は少なくとも１つの増幅プローブからなるアッセイ複合体を提供する。本明細書において“増幅プローブ”または“核酸多量体”または“増幅多量体”または文法上の等価物とはシグナル増幅を容易にするために用いる核酸プローブを意味する。増幅プローブは以下に定義するように、少なくとも１つの一本鎖核酸プローブ配列、および少なくとも１つの一本鎖核酸増幅配列、好ましくは多様な増幅配列を含んでいる。
【０２５７】
増幅プローブは標識配列にハイブリダイズするために、直接または間接に使用する第一プローブ配列を含む。すなわち、増幅プローブ自体が標的配列に実質的に相補的である第一プローブ配列をもち得るか（例えば、図１６Ｅ）、またはそれが追加のプローブの一部に実質的に相補的である第一プローブ配列をもち、その追加のプローブはこの場合標識伸長プローブと呼ばれるものであって、標的配列に実質的に相補的である第一部分を有する（例えば、図１６Ｆ）。好適な態様において、増幅プローブの第一プローブ配列は標的配列に実質的に相補的であり、それを図１６Ｅに一般的に描出してある。
【０２５８】
一般に、本明細書のプローブすべてについて、第一プローブ配列は特異性と安定性を与えるに十分な長さのものである。このように一般に、もう一つの核酸にハイブリダイズするように設計された本発明のプローブ配列（すなわち、プローブ配列、増幅配列、より大きなプローブの部分またはドメイン）は少なくとも約５個のヌクレオシドの長さであり、好ましくは少なくとも約１０個であり、そして特に好ましくは少なくとも約１５個である。
【０２５９】
好適な態様において、図１４に示すように、増幅プローブまたは本発明の他のプローブのいずれかは、それら標的の不存在下でヘアピン基部−ループ構造を形成することがある。基部二本鎖配列の長さは、ヘアピン構造が標的の存在下で有利とならないように選択する。本発明のシステムにおいて、またはいずれかの核酸検出システムにおいて、これらの型のプローブを使用すると非特異結合が有意に減少し、結果としてシグナル−ノイズ比が増大するに至る。
【０２６０】
一般に、これらのヘアピン構造は４つの成分を含む。その第一成分は標的結合配列、すなわち、標的に相補的領域（サンプル標的配列であるか、または結合が要望どおりである他のプローブ配列であってもよい）であって、約１０個のヌクレオチドの長さがあり、好ましくは約１５個である。第二成分はループ配列であり、核酸ループの形成を容易にし得るものである。この観点で特に好ましいのはＧＴＣの反復であり、脆弱Ｘ症候群において屈曲部を形成するものとして同定されている。（ＰＮＡ類似体を使用する場合、屈曲部はプロリン残基を含むものが好ましい）。一般に、３ないし５つの反復が用いられるが、４ないし５が好ましい。第三の成分は自己相補性領域であり、これは標的配列領域の一部に相補的な第一部分と標識プローブ結合配列の第一部分を含む第二部分を有する。第四の成分は標識プローブ（または場合によっては他のプローブ）に実質的に相補的である。第四の成分はさらに“付着末端”、すなわち、プローブの他の部分にハイブリダイズしない部分を含み、好ましくは、すべてではないが、ＥＴＭの殆どを含む。図１４に一般構造を示す。当業者が認めるであろうように、本明細書に記載したプローブのいずれかまたはすべてが、増幅、捕獲、捕獲伸長、標識、および標識伸長プローブを含め、それらの標的不存在下でヘアピンを形成するように配列することができる。
【０２６１】
好適な態様においては、数種の異なる増殖プローブを用いるが、そのそれぞれが標的配列の異なる部分にハイブリダイズする第一プローブ配列をもつ。すなわち、１以上の増幅レベルがある；増幅プローブは多数の標識事象によりシグナルを増幅し、また、それぞれ多様な標識をもつ数種の異なる増幅プローブが各標的配列に対して使用される。このように、好適な態様では少なくとも２種類の異なる増幅プローブのプールを利用するが、それぞれのプールは標的配列の異なる部分に対しハイブリダイズするための異なるプローブ配列をもつ；異なる増幅プローブの数に関して唯一実際の制限は、当初標的配列の長さであろう。さらに、一般に好ましいことではないが、異なる増幅プローブが異なる増幅配列を含むことも可能である。
【０２６２】
好適な態様において、増幅プローブはサンプルの標的配列と直接ハイブリダイズしないが、代りに、図１６Ｆに一般的に描出したように、標識伸長プローブの第一部分にハイブリダイズする。これは“一般的な”増幅プローブ、すなわち、様々な異なる標的と共に使用し得る増幅プローブの使用を可能とするためにとりわけ有用である。これは増幅プローブの幾つかが特別の合成技術を必要とするという理由で望ましいことである。このように、標識伸長プローブとして比較的短いプローブを加えることが好ましい。このように、増幅プローブの第一プローブ配列は、第一標識伸長一本鎖核酸プローブの第一部分またはドメインに実質的に相補性である。標識伸長プローブはまた、標識配列の一部に実質的に相補性である第二部分またはドメインをも含む。これらの部分双方が、好ましくは少なくとも約１０ないし約５０ヌクレオシドの長さであり、好ましくは約１５ないし約３０の範囲である。“第一”および“第二”という用語は標的またはプローブ配列の５’−３’配向に関して、配列の配向を付与することを意味するものではない。例えば、相補標的配列の５’−３’配向を仮定すると、第一部分は第二部分に対して５’に位置してもよく、あるいは第二部分に対して３’に位置してもよい。本明細書では便宜上、プローブ配列の順序を一般に左から右に示すこととする。
【０２６３】
好適な態様において、１つ以上の標識伸長プローブ増幅プローブ対が使用される、すなわち、ｎは１以上である。すなわち、複数の標識伸長プローブを用い、その各々が標的配列の異なる部分に実質的に相補性である部分をもつ；これはもう一つの増幅レベルとして役立ち得る。このように、好適な態様では少なくとも２つの標識伸長プローブのプールを利用するが、その上限は標的配列の長さにより決まる。
【０２６４】
好適な態様においては、図５Ｇに描出し、またＵＳＰ５,６８１,６９７（出典明示により本明細書の一部とする）に一般的に概説されているように、１つ以上の標識伸長プローブを単一の増幅プローブと共に用い、非特異結合を減少させる。この態様において、第一標識伸長プローブの第一部分は標的配列の第一部分にハイブリダイズし、第一標識伸長プローブの第二部分は増幅プローブの第一プローブ配列にハイブリダイズする。第二標識伸長プローブの第一部分は標的配列の第二部分にハイブリダイズし、第二標識伸長プローブの第二部分は増幅プローブの第二プローブ配列にハイブリダイズする。これらの形状構造は、ある場合に“十字型”構造または形状といい、一般に、大型の分枝または樹枝状増幅プローブを用いる場合には、安定性を付与するために実施される。
【０２６５】
さらに、当業者が認めるであろうように、標識伸長プローブは下記のように、直接増幅プローブとよりもむしろプレ増幅プローブと相互作用する可能性がある。
同様に、上記に概説したように、好適な態様では数種の異なる増幅プローブを利用するが、それぞれが標識伸長プローブの異なる部分にハイブリダイズする第一プローブ配列をもつ。さらに、上に概説したように、これは一般に好ましいことではないが、異なる増幅プローブが異なる増幅配列を含むことも可能である。
【０２６６】
第一プローブ配列に加えて、増幅プローブはまた、少なくとも１つの増幅配列を含んでいる。本明細書において“増幅配列”または“増幅セグメント”または文法上の等価物とは、下記により詳しく説明するように、標識プローブの第一部分に結合させるために、直接または間接に使用する配列を意味する。好ましくは、増幅プローブは多様な増幅配列を含んでおり、好ましくは約３ないし約１０００からなり、特に好ましくは約１０ないし約１００からなり、そしてとりわけ好ましいのは約５０である。ある場合には、例えば、線状の増幅プローブを使用する場合、１ないし約２０が好ましく、特に、約５ないし約１０が好ましい。
【０２６７】
増幅配列は当業者が認めるであろうように、様々な様式で互いに結合することができる。これらは互いに共有結合により直接結合するか、またはリン酸ジエステル結合、ＰＮＡ結合などの核酸結合を介して、またはアミノ酸、炭水化物またはポリオールブリッジなどの挿入結合剤を介して、または他の架橋剤または結合パートナーを介して、介在配列もしくは化学的部分に結合してもよい。結合部位はセグメントの末端であっても、および／または１つ以上の鎖内の内部ヌクレオチドであってもよい。好適な態様において、増幅配列は核酸結合を介して付着する。
【０２６８】
好適な態様においては、ＵＳＰ５,１２４,２４６（出典明示により本明細書の一部とする）に一般的に説明されているように、分枝状の増幅配列を使用する。分枝状の増幅配列は“フォーク様”または“櫛様”の立体配座を採ることが可能である。“フォーク様”分枝状増幅配列は一般に分枝状構造を形成する起点から発生する３つ以上のオリゴヌクレオチドセグメントをもつ。起点とは、少なくとも３つのセグメントが共有結合によりまたは堅固に結合し得るもう一つのヌクレオチドセグメントまたは多機能分子である。“櫛様”分枝状増幅配列とは、線状の背骨をもち、その背骨から多数の側鎖オリゴヌクレオチドが伸び出しているものである。いずれの立体配座においても、張り出したセグメントは、通常、修飾したヌクレオチドに、またはオリゴヌクレオチド付着用の適切な官能基をもつ他の有機部分に左右される。さらに、いずれの立体配座においても、多数の増幅配列が、検出プローブに直接もしくは間接に結合させるために利用し得る。一般に、これらの構造は修飾した多機能ヌクレオチドを用い、とりわけＵＳＰ５,６３５,３５２および５,１２４,２４６に記載されているように、技術上既知として調製される。
【０２６９】
好適な態様において、樹枝状増幅プローブは、ＵＳＰ５,１７５,２７０（出典明示により本明細書の一部とする）に記載されているように使用する。樹枝状増幅プローブはハイブリダイゼーションを介して付着する増幅配列をもち、その結果、それらの構造の成分として二本鎖核酸の部分をもつ。樹枝状増幅プローブの外表面は多様な増幅配列をもつ。
【０２７０】
好適な態様においては、線状の増幅プローブを用いるが、これは個々の増幅配列が末端−末端で直接結合するか、または短い介在配列と結合してポリマーを形成する配列をもつ。他の増幅形状でのように、増幅配列間に追加の配列または部分があってもよい。さらに、本明細書に概説するように、線状の増幅プローブは図１４に描出したように、ヘアピン基部−ループ構造を形成してもよい。
【０２７１】
一態様において、線状の増幅プローブは単一の増幅配列をもつ。これは、ハイブリダイゼーション／解離のサイクルが起こって増幅プローブのプールを形成し、それが標的にハイブリダイズして、次いで除去されてさらにプローブが結合するのを可能とする場合、または大量のＥＴＭを各プローブに対し使用する場合に有用である。しかし、好適な態様においては、線状の増幅プローブは多様な増幅配列を含む。
【０２７２】
さらに、増幅プローブは全体が線状であるか、全体が分枝であるか、全体が樹枝状であるか、またはその組合わせであってもよい。
増幅プローブの増幅配列を直接または間接に用い、検出を可能とする標識プローブに結合させる。好適な態様において、増幅プローブの増幅配列は実質的に標識プローブの第一部分に相補的である。あるいは、増幅伸長プローブを用いるが、これは増幅配列に結合する第一部分と、標識プローブの第一部分に結合する第二部分をもつ。
【０２７３】
さらに、本発明の組成物は“プレ増幅”分子を含んでもよいが、これは標識伸長分子と増幅プローブ間の架橋部分としての役割をもつ。この方法で、さらに多くの増幅因子と、したがて、さらに多くのＥＴＭが最終的に検出プローブに結合される。プレ増幅分子は線状であっても分枝状であってもよく、典型的には約３０〜３０００個の範囲でヌクレオチドを含む。
【０２７４】
以下に概括する反応は、当業者が認めるであろうように様々な方法で実施することができる。反応成分は同時に加えてもよいし、何らかの順序で順番に加えてもよいが、好適な態様は以下に概括するとおりである。さらに、この反応はアッセイに含まれてもよい種々の他の試薬を含んでもよい。これらは塩、バッファー、中性タンパク質、例えば、アルブミン、洗剤などの試薬類を含み、最適なハイブリダイゼーションと検出を容易にし、および／または非特異もしくはバックグランド相互作用を減少させるために使用することができる。他の条件でアッセイ効率を改善する試薬として、例えば、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗微生物剤などを、サンプル調製方法および標的の純度に応じて使用してもよい。
【０２７５】
本方法を以下に概説する。好適な態様においては、最初に、標的を電極に固定化または付着させる。一態様において、これは捕獲プローブと標的配列の一部との間にハイブリダイゼーション複合体を形成させることにより実施する。好適な態様では捕獲エクステンダープローブを利用する；この態様においては、ハイブリダイゼーション複合体を標的配列の一部と捕獲エクステンダー・プローブの第一部分との間に形成させ、さらなるハイブリダイゼーション複合体を捕獲エクステンダー・プローブの第二部分と捕獲プローブの一部との間に形成させる。別の好適な態様では、別の捕獲プローブを利用し、標的配列の一部と第二捕獲エクステンダー・プローブの第一部分との間にハイブリダイゼーション複合体を形成させ、第二捕獲エクステンダー・プローブの第二部分と捕獲プローブの第二部分との間に別のハイブリダイゼーション複合体を形成させる。
【０２７６】
別法として、電極に対する標的配列の付着は他の反応と同時に実施する。
この方法は、もし利用するのであれば、増幅プローブの導入で始める。好適な態様においては、増幅プローブは標的配列の一部分に実質的に相補的な第一プローブ配列と、少なくとも１つの増幅配列を含む。
【０２７７】
一態様において、増幅プローブの第一プローブ配列は標的配列にハイブリダイズし、ハイブリッド未形成の増幅プローブは除かれる。これは技術上既知のとおりに実施されるが、アッセイのタイプに依存する。標的配列が電極などの表面に固定化されると、過剰の試薬の除去は一般に、当業者が認めるであろうように、１回以上の洗浄工程により実施される。この態様において、標的は固形支持体上に固定される可能性がある。標的配列が表面に固定されない場合、本発明プローブなど、過剰の試薬の除去は、該プローブに相補的な配列を含むビーズ（すなわち、固形の支持体粒子）を添加することにより実施することができるが、その場合、過剰のプローブはビーズに結合する。次いで、ビーズは、例えば、遠心分離、濾過、磁場または静電場の適用などにより除去し得る。
【０２７８】
次いで、反応混合物は、増幅プローブが標的配列から解離する条件（温度、高濃度塩、ｐＨ変化など）に付し、増幅プローブを取得する。次いで、増幅プローブは増幅プローブ用の捕獲プローブからなる電極に加え、標識プローブを添加し、次いで検出を実施する。
【０２７９】
好適な態様においては、標的配列にさらに増幅プローブを添加することにより、より大きなプローブ・プールが生成し、ハイブリダイゼーション／解離反応が繰返され、増幅プローブのより大きなプールを生成する。この増幅プローブのプールは、次いで、増幅捕獲プローブからなる電極に添加し、標識プローブを添加し、次いで検出を始める。
【０２８０】
この態様においては、本明細書に記載の方法を用い、電極を含む固形支持体上に標的配列を固定化するのが好ましい；当業者が認めるところであるが、代りの固形支持体付着技術、例えば、ガラス、ポリマーなどへの付着技術を用いてもよい。１つの固形支持体上で反応を行い、次いでプールした増幅プローブを検出用の電極に加えることも可能である。
【０２８１】
好適な態様において、増幅プローブは多様な増幅配列を含む。
一態様において、増幅プローブの第一プローブ配列は標的配列にハイブリダイズし、ハイブリッド非形成増幅プローブを除去する。再度、好適な態様では固定化した標的配列を利用するが、ここでは電極に付着した捕獲プローブとのハイブリダイゼーションにより固定化するか、または捕獲伸長プローブにハイブリッド形成し、それを次いで本明細書に記載のように固定化した捕獲プローブとハイブリダイズさせることにより固定化する。一般に、これらの態様においては、捕獲プローブと検出プローブを電極上、一般には同一の“アドレス”に固定する。
【０２８２】
好適な態様において、増幅プローブの第一プローブ配列は少なくとも一つの標識伸長プローブの第一部分にハイブリダイズし、標識伸長プローブの第二部分は標的配列の一部分にハイブリダイズする。他の好適な態様では、１を超える標識伸長プローブを利用する。
好適な態様において、増幅プローブの増幅配列は、少なくとも１つの標識プローブ配列にハイブリダイズさせることにより、直接検出に使用する。
【０２８３】
本発明はこのように、標的配列と標識プローブとを最小限に含んでいるアッセイ複合体を提供する。本明細書で“アッセイ複合体”とは、核酸を含むハイブリダイゼーション複合体の集合体を意味し、少なくとも１つのＥＴＭを含み、それ故に検出を可能とするプローブおよび標的を含む。アッセイ複合体の組成物は本明細書に概説した異なるプローブ成分の用途に依存するものである。このように、アッセイ複合体は捕獲プローブと標的配列を含む。アッセイ複合体はまた、標識プローブ、捕獲伸長プローブ、標識伸長プローブ、および増幅プローブを包含するが、本明細書に概説するように、使用する形状に依る。
【０２８４】
このアッセイは、標的の存在下にのみ標識プローブハイブリダイゼーション複合体の形成を可能とするストリンジェンシー条件下に一般に実施する。ストリンジェンシーは熱力学的変動である工程パラメーターを変えることにより制御し得る。パラメーターは温度、ホルムアミド濃度、塩濃度、カオトロピック塩濃度ｐＨ、有機溶媒濃度などであるが、これらに限定されるものではない。ストリンジェンシーには、非特異的(すなわち低ストリンジェンシー)物質を駆動して検出電極から離すために電気泳動工程の使用を含めてもよい。（Ｕ,Ｓ,Ｓ,Ｎ,０９，１３４，０５８に記載のように、標的被検体を、電気泳動を用いてそれらの結合リガンドに結合させることができるのと同様に(出典明示により本明細書の一部とする)。）
【０２８５】
これらのパラメーターは、ＵＳＰ５,６８１,６９７に一般的に概説されているように、核酸における非特異結合を制御するためにも使用することができる。このように、一定の工程は高い緊縮条件で実施するのが望ましい；例えば、最初のハイブリダイゼーション工程が標的配列と標識エクステンダーと捕獲伸長プローブの間で実施される場合である。特定の結合を優先させる条件でこの工程を実施すると、非特異結合の減少が可能となる。
【０２８６】
好適な態様において、本明細書に概括した成分のすべてを使用する場合、好適な方法は以下のとおりである。一本鎖標的配列はハイブリダイゼーション条件下で捕獲伸長プローブおよび標識伸長プローブと培養する。好適な態様ではこの反応を電極の存在下に固定化捕獲プローブとで行うが、この反応は最初のインキュベーションと引続く電極への付加による２工程で実施してもよい。過剰の試薬は洗浄除去し、次いで増幅プローブを添加する。もしプレ増幅プローブを用いるならば、それらは増幅プローブの前に、または増幅プローブと同時に加えるとよい。過剰の試薬は洗浄除去し、次いで標識プローブを添加する。過剰の試薬は洗浄除去し、下に概説するように検出を始める。
【０２８７】
一態様においては、標的配列の異なる部分にそれぞれ実質的に相補性である多くの捕獲プローブ（または捕獲プローブと捕獲伸長プローブ）が使用される。
再度、本明細書に概説するように、増幅プローブを用いる場合、このシステムは、一般に、標識プローブ結合に際し、ＥＴＭを含んでいるリクルートリンカーが、単層表面の近接位に配置される。このように、本明細書に概説するように、ＥＴＭが“樹枝状”型構造を介して付着する場合、核酸の付着点からＥＴＭまでのリンカーの長さは、特に、捕獲伸長プローブを用いる場合に捕獲プローブの長さと共に変わり得る。すなわち、より長い捕獲プローブは、捕獲エクステンダーをもち、より短い捕獲プローブにおいてよりも、表面からさらに離れて“保持”された標的配列となる。プローブ核酸とＥＴＭの間に余分の連結配列を加えると、ＥＴＭが表面に空間的に近接することとなり、より良好な結果を与える。
【０２８８】
さらに、所望により、本発明に利用される核酸は検出に先立ち、もし適用可能であれば、リガーゼ使用などの標準的分子生物学技法を用いることにより結合させることもできる。同様に、安定性を望むのであれば、架橋剤を加え、構造を安定させることが可能である。
【０２８９】
本発明の組成物は、一般に、下記のように、一般に当分野で既知の方法を使用して合成する。当業者に認められるように、下記に概説の多くの方法は、リボース−ホスフェート主鎖を含む核酸に関する。しかしながら、上記に概説のように、多くの別の核酸類似体を使用し得、そのいくつかは主鎖にリボースまたはホスフェートを含まない。これらの実施態様において、塩基以外の位置での結合に関して、結合は、主鎖に依存して、当業者に認められるように行う。従って、例えば、結合はＰＮＡ主鎖の炭素原子で、下記に記載のように、またはＰＮＡのいずれかの末端で行うことができる。
【０２９０】
本組成物はいくつかの方法で製造し得る。好ましい方法は最初にヌクレオシドに結合した伝導性オリゴマーを、更にヌクレオシドを添加して捕獲プローブを形成し、続いて電極へ結合させて、合成する。あるいは、全捕獲プローブを製造し、次いで、完全な伝導性オリゴマーを添加し、続いて電極に結合する。あるいは、伝導性オリゴマーの単層(そのいくつかは、捕獲プローブの結合のための官能基を有する)を最初に電極に結合し、続いて捕獲プローブを結合する。後者の二つの方法は、使用する伝導性オリゴマーが、溶媒中でおよび慣用的核酸合成の条件下で安定でないとき、好ましいことがある。
【０２９１】
好ましい実施態様において、本発明の組成物は、最初に、ヌクレオシドに共有結合した伝導性オリゴマーを形成し、続いて、さらにヌクレオシドを添加して捕獲プローブ核酸を形成し、伝導性オリゴマーを電極へ添加することを含む最後の工程により製造される。
【０２９２】
伝導性オリゴマーのヌクレオシドへの結合はいくつかの方法で行い得る。好ましい実施態様において、全てまたは一部の伝導性オリゴマーを、最初に合成し(一般に、電極への結合のために官能基を末端に有する)、これを次いでヌクレオシドに結合させる。次いで、さらにヌクレオシドを必要に応じて添加し、最後の工程で一般に電極へ結合させる。あるいは、オリゴマー単位を一度にヌクレオシドに添加し、さらにヌクレオシドを添加し電極へ結合させる。多くの代表的な合成をＰＣＴ  ＵＳ９７/２００１４の図面に示し、出典明示により本明細書の一部とする。
【０２９３】
次いで、伝導性オリゴマーを、本明細書に記載のように結合した、１個(またはそれ以上の)オリゴマー単位を含み得るヌクレオシドに結合させる。
【０２９４】
好ましい実施態様において、結合はリボース−ホスフェート主鎖のリボースに対してである。従って、アミドおよびアミン結合を介した付着が可能である(ＰＣＴ  ＵＳ９７／２００１４の図１および図２を参照)。好ましい実施態様において、リボースに結合した窒素と伝導性オリゴマーの芳香族環の間に、少なくとも一つのメチレン基または他の短い脂肪族アルキル基(Ｚ基として)が存在する。代表的な合成がＰＣＴ  ＵＳ９７／２００１４の図１６に示されている。
【０２９５】
あるいは、結合はリボース−ホスフェート主鎖のホスフェートを介している２種の合成スキームの例がＰＣＴ  ＵＳ９７／２００１４の図４および図５に示されている。両図はリボースの３'位での結合を示しているが、２'位を介して結合することもできる。図５、Ｚでは、エチレンリンカーであるが、当業者に分かるように、他のリンカーを同様に使用して得る。
【０２９６】
好ましい実施態様において、結合は塩基を介している。一般的なスキームはＰＣＴ  ＵＳ９７／２００１４の図３に示されており、ヌクレオシドとしてウリジンを使用し、フェニレン-アセチレン伝導性オリゴマーを使用している。当業者に認められ得るように、当業者に一般的に知られている技術を使用してアミド結合も可能である。好ましい実施態様において、保護基を、ＰＣＴ  ＵＳ９７／２００１４の図１０および図１１に一般的に概説されているように、伝導性オリゴマーの付加の前に塩基に添加してもよい。加えて、パラジウム交差結合反応を変えて、二量体化問題；すなわち、二つの伝導性オリゴマーが塩基に結合せずむしろ二量体化するのを防止することもできる。
【０２９７】
あるいは、塩基への結合を、一単位のオリゴマーを有するヌクレオシドを製造し、続いて他を添加することによりなし得る。
【０２９８】
修飾ヌクレオシドを製造し、保護して活性化したら、電極への結合の前に、標準合成法(Gait, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, UK 1984; Eckstein)により、成長しているオリゴヌクレオチドに、幾通りかの方法でそれらを包含させ得る。
【０２９９】
好ましい実施態様において、１またはそれ以上の修飾ヌクレオシドを三ホスフェート形態に変形させ、成長しているオリゴヌクレオチド鎖に、酵素ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、Taq  ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼを用いるなど、標準分子生物学手法を用いて包含させる。３'修飾ヌクレオシドの核酸への包含には、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを使用し得る。(Ratliff, Terminal deoxynucleotidyltransferase.In The Enzymes, Vol. 14A. P. D. Boyer ed. pp 105-118. Academic Press, San Diego, CA 1981)。従って、本発明は、共有結合したＥＴＭを含むデオキシリボヌクレオシド三ホスフェートを提供する。好ましい実施態様は、一般に下記構造４２および４３に示すように、リボース（好ましくは２'位で）などの塩基または主鎖へのＥＴＭ結合を利用する。
【０３００】
【化４２】
0004530541.tif 000043
【０３０１】
【化４３】
0004530541.tif 000044
【０３０２】
従って、いくつかの実施態様において、ＥＴＭを含む核酸をその場で産生させることができる。例えば、標的配列の末端をさらす、すなわち非ハイブリダイズするように、標的配列は捕獲プローブ(例えば、表面上の)にハイブリダイズし得る。酵素とＥＴＭで標識した三ホスフェートヌクレオチドの添加により、その場での標識の製造が可能となる。同様にポリメラーゼにより認識される標識ヌクレオチドを用いると、ＰＣＲと検出とを同時に行い得る；つまりその場で標的配列が生成する。
【０３０３】
好ましい実施態様において、修飾ヌクレオシドをホスホルアミデイトまたはＨ−ホスホネート形に変換し、これを次いでオリゴヌクレオチド合成の固相または溶液合成に使用する。この方法で、リボースでの(すなわち、アミノ−またはチオール−修飾ヌクレオシド)または塩基での結合用の、修飾ヌクレオチドをオリゴヌクレオチドに内部位置または５'末端で包含させる。これは、一般に、二つの方法の一つで行う。第一に、リボースの５'位を４',４−ジメトキシトリチル(ＤＭＴ)で保護し、続いて２−シアノエトキシ−ビス−ジイソプロピルアミノホスフィンとジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド存在下で反応させるか、または２'−シアノエトキシホスフィンクロロジイソプロピルアミノと反応させ、当分野で既知のようにホスホルアミデイトを得る；しかしながら、他の方法を当業者に認められるように使用し得る。Gait 前掲; Caruthers, Science 230: 281 (1985)参照、両方とも出典明示により本明細書の一部とする。
【０３０４】
基の３'末端への結合のために、好ましい方法は制御孔ガラス(ＣＰＧ)または他のオリゴマー支持体への修飾ヌクレオシド（またはヌクレオシド代替物）の結合を使用する。この実施態様において、修飾ヌクレオシドを５'末端でＤＭＴで保護し、次いで、無水コハク酸と活性化しながら反応させる。得られるスクシニル化合物をＣＰＧまたは当分野で既知の他のオリゴマー支持体に結合させる。更に、修飾しているか、またはしていないホスホルアミデイトヌクレオシドを、脱保護後に５'末端に結合させる。従って、本発明はＣＰＧのような固体オリゴマー支持体に結合したヌクレオシドに共有結合した伝導性オリゴマーまたは絶縁体、および本発明のヌクレオシドのホスホルアミデイト誘導体を提供する。
【０３０５】
本発明はさらにＥＴＭを含むリクルートリンカーを有する標識プローブの製造方法を提供する。当業者には明らかなように、これらの合成反応はリクルートリンカーの特徴とＥＴＭの結合方法に依存する。核酸リクルートリンカーについて、標識プローブは、本明細書で概説したように、１以上の位置でＥＴＭを包含させて一般につくられる。遷移金属錯体をＥＴＭとして使用する場合、合成はいくつかの方法で行われる。好ましい実施態様において、リガンド、続いて遷移金属イオンをヌクレオシドに添加し、次いで、遷移金属錯体が結合しているヌクレオシドをオリゴヌクレオチドに添加する、つまり、核酸合成機に添加する。あるいは、リガンドを結合させ、続いて成長しているオリゴヌクレオチド鎖に包含させ、金属イオンを添加する。
【０３０６】
好ましい実施態様において、ＥＴＭをリボース−ホスフェート主鎖のリボースに結合させる。これは、伝導性オリゴマーについて本明細書に概説したように通常行われ、本明細書およびＰＣＴ公開ＷＯ９５/１５９７１に記載のように、アミノ−修飾またはオキソ−修飾ヌクレオシドを使用して、リボースの２'または３'位に行う。次いで、リガンドとして、例えば金属イオンの結合のための遷移金属リガンドとして、または、例えばアミド結合を介した、他のリガンドまたは有機ＥＴＭの結合に使用できる化学的官能基として、当分野で認められるように、アミノ基を使用し得る。例えば、例として、リボースを介して結合した種々のＥＴＭを有するヌクレオシドの合成を記載する。
【０３０７】
好ましい実施態様において、ＥＴＭはリボース−ホスフェート主鎖のホスフェートに結合する。本明細書に概説のように、これは、ホスホルアミデイト結合のようなホスホジエステル類似体を使用して行われてもよく(一般に、ＰＣＴ公開ＷＯ９５/１５９７１参照）、またはＰＣＴ  ＵＳ９７／２００１４の図４および図５に記載のものと同様の方法を使用し、但し、実施例の概説と同様に、伝導性オリゴマーを遷移金属リガンドまたは錯体または有機ＥＴＭと置きかえて行なうこともできる。
【０３０８】
別の主鎖、例えば、ペプチド核酸または別のホスフェート結合への結合は、当業者に認められるように行う。
【０３０９】
好ましい実施態様において、ＥＴＭはヌクレオシドの塩基に結合する。これは、種々の方法でなし得る。一実施態様において、天然に存在するか、または本明細書に記載ように添加した(例えば、図参照)塩基のアミノ基を、遷移金属錯体のリガンドとして、または例えば、アミド結合を介して他のリガンドをまたは有機ＥＴＭを添加するのに使用できる化学的官能基として使用する。これは、当業者に認められるように行う。あるいは、ヘテロ環式環に結合したハロゲン原子を含むヌクレオシドは商品として入手可能である。アセチレン結合リガンドは、一般的に既知のように、ハロゲン化塩基を使用して添加し得る；例えば、Tzalis et al., Tetrahedron Lett. 36(34): 6017-6020 (1995); Tzalis et al., Tetrahedron Lett. 36(2): 3489-3490 (1995); およびTzalis et al., Chem. Communications (投稿中) 1996参照、全て出典明示により本明細書の一部とする。また、塩基へのアセチレン結合を介して結合したメタロセン（この場合では、フェロセン）の合成を記載した図面および実施例も参照。
【０３１０】
一実施態様において、ヌクレオシドを、核酸に包含させた遷移金属リガンドを有して製造し、次いで、遷移金属イオンおよび残りの必要なリガンドを当分野で既知のように添加する。別の実施態様において、遷移金属イオンおよび付加的リガンドを、核酸への包含前に添加する。
【０３１１】
本発明の核酸を、共有結合した結合リンカー（つまり、絶縁体または伝導性オリゴマーのいずれか）を有して製造し、結合リンカーを電極に結合させる。本方法は、使用する電極のタイプによって変化する。本明細書に記載のように、結合リンカーは一般に末端“Ａ”リンカーを有して製造され、電極への結合を促進する。本適用の目的のために、硫黄−金結合は共有結合とみなす。
【０３１２】
好ましい実施態様において、伝導性オリゴマー、絶縁体および結合リンカーは硫黄結合を介して電極に共有結合する。しかしながら、驚くべきことに、分子の金電極への結合に使用する慣用的保護基は、一般に、本明細書に記載の組成物の合成およびオリゴヌクレオチド合成反応への包含の両方への使用に理想的でない。従って、本発明は、図に記載のようなエチルピリジンおよびトリメチルシリルエチルを含む、普通でない保護保護基を使用した、伝導性オリゴマーの金電極への結合の新規方法を提供する。しかしながら、当業者が理解するように、伝導性オリゴマーが核酸を含まないとき、アセチル基などの慣用的保護基を使用し得る。参照、Greene et al.、前掲。
【０３１３】
これは、いくつかの方法でなし得る。好ましい実施態様において、電極への結合のために硫黄原子を含む伝導性オリゴマーのサブユニットをエチル−ピリジンまたはトリメチルシリルエチル基で保護する。前者に関して、これは一般に硫黄原子(好ましくはスルフヒドリルの形で)を含むサブユニットをビニルピリジン基またはビニルトリメチルシリルエチル基と、エチルピリジン基またはトリメチルシリルエチル基が硫黄原子に添加されるような条件下で接触させることにより行う。
【０３１４】
このサブユニットはまた、一般に、付加的サブユニットの結合のために官能部を含み、従って、付加的サブユニットが結合して伝導性オリゴマーを形成する。次いで、伝導性オリゴマーをヌクレオシドに結合させ、付加的ヌクレオシドが結合する。保護基を次いで除去し、硫黄−金共有結合を行う。あるいは、伝導性オリゴマーの全てまたは一部を製造し、次いで、保護硫黄原子を含むサブユニットを添加するか、硫黄原子を添加して、保護する。伝導性オリゴマーを次いでヌクレオシドに結合させ、付加的ヌクレオチドを結合させる。あるいは、核酸に結合した伝導性オリゴマーを製造し、次いで保護硫黄原子を含むサブユニットを添加するか、硫黄原子を添加して、保護する。あるいは、エチルピリジン保護基を上記のように使用してもよいが、１以上の工程の後に除去し、ジスルフィドのような標準的な保護基に置き換える。このように、エチルピリジンまたはトリメチルシリルエチル基は、合成反応のいくつかで保護基として作用し得、次いで、除去して慣用的保護基に置き換えられる。
【０３１５】
本明細書の伝導性ポリマーの“サブユニット”は、硫黄原子が結合する伝導性オリゴマーの少なくとも一部を意味するが、伝導性オリゴマーの付加的成分の添加を可能にする官能基、または伝導性オリゴマーの付加的成分を含む付加的原子も存在し得る。従って、例えば、構造１のオリゴマーを使用するとき、サブユニットは少なくとも第一Ｙ基を含む。
【０３１６】
好ましい方法は、１)一般に、ビニルピリジンまたはトリメチルシリルエチル基をスルフヒドリルに添加して行う、伝導性オリゴマーの第一サブユニットに結合した硫黄原子への、エチルピリジンまたはトリメチルシリルエチル保護基の添加；２)伝導性オリゴマーの形成のための付加的サブユニットの添加；３)少なくとも第一ヌクレオシドの伝導性オリゴマーへの添加；４)核酸を形成するための付加的ヌクレオシドの第一ヌクレオシドへの添加；４)伝導性オリゴマーの金電極への結合を含む。これはまた実施例に記載のように、ヌクレオシドの不存在下でも行い得る。
【０３１７】
上記の方法は、金電極への絶縁分子の結合にも使用し得る。
【０３１８】
好ましい実施態様において、伝導性オリゴマー（および所望により絶縁体）を含む単層を電極に添加する。一般に、添加の化学は、伝導性オリゴマーの電極への添加と類似か同じであり、即ち、金電極への結合に硫黄原子を使用するなどである。核酸に共有結合した伝導性オリゴマーに加えて、単層を含む組成物を、少なくとも５つの方法の一つでなし得る：(１)単層の添加、続く結合リンカー−核酸錯体の連続的添加；(２)結合リンカー−核酸錯体の添加、続く単層の添加；(３)単層と結合リンカー−核酸錯体の同時添加；(４)完全な核酸の結合に適した官能部で終了している結合リンカーを含む単層の形成(１,２または３のいずれかを使用した)；または(５)核酸合成に適した官能部で終了している結合リンカーを含む単層の形成、即ち、核酸を当分野で既知のように単層表面で合成する。このような適当な官能部は、ホスホルアミデイト添加のためのヌクレオシド、アミノ基、カルボキシル基、保護硫黄部、またはヒドロキシル基を含むが、これらに限定されない。例としては、好ましい方法(１)を用いた金電極上の単層の形成を記載する。
【０３１９】
好ましい実施態様において、核酸はペプチド核酸または類似体である。この実施態様において、本発明は、少なくとも一つの共有結合したＥＴＭまたは結合リンカーを有するペプチド核酸を提供する。好ましい実施態様において、これらの部分はＰＮＡの単量体サブユニットに共有結合する。本明細書の“ＰＮＡの単量体サブユニット”は、−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｎ(ＣＯＣＨ２−塩基)−ＣＨ２−ＣＯ−単量体またはＰＮＡの誘導体(ここでは“ヌクレオシド”の定義内に含まれる)を意味する。例えば、ＰＮＡ主鎖の炭素原子の数を変え得る；一般に、ＰＮＡ誘導体の数を記載したNielsen et al., Chem. Soc. Rev. 1997, 73頁参照、出典明示により本明細書の一部とする。同様に、塩基を主鎖に結合させるアミド結合を変え得る；ホスホロアミドおよびスルファーアミド結合を使用し得る。あるいは部分を内部単量体サブユニットに結合する。本明細書で“内部”は、単量体サブユニットがＮ−末端単量体サブユニットまたはＣ−末端単量体サブユニットでないことを意味する。本実施態様において、部分を単量体サブユニットの塩基または主鎖に結合できる。塩基の結合は、本明細書に概説のように、または文献から既知のように行う。一般に、部分を塩基に添加し、これを次いで本明細書に概説のようにＰＮＡに包含させる。塩基は、化学置換基の添加前またはその後に、ＰＮＡ合成反応に加入させるために必要となるように保護されているか、加入が可能となるように誘導体化されていることができる。塩基の保護および誘導体化をＰＣＴ  ＵＳ９７／２００１４の図２４〜図２７に示す。ＰＣＴ  ＵＳ９７／２００１４の図２８に示すように、塩基を次いで単量体サブユニットに加入させ得る。ＰＣＴ  ＵＳ９７／２００１４の図２９および図３０は、２種の異なる化学的置換基、１種の塩基と結合した１種のＥＴＭおよび１種の伝導性オリゴマー、を示している。図２９は、ウラシル塩基に結合したフェロセンを有する、ＰＮＡ単量体サブユニットの代表的な合成を示す。図３０は、ウラシル塩基と結合した３ユニットの伝導性オリゴマーの合成を示す。
【０３２０】
好ましい実施態様において、部分はＰＮＡ単量体の主鎖に共有結合する。結合は、一般に、単量体サブユニットの非置換炭素原子の一つ、好ましくは図３１および図３２に示すように主鎖のα−炭素に行われるが、１または２位の炭素、または塩基を主鎖に結合させるアミド結合のα−炭素での結合もなし得る。ＰＮＡ類似体の場合、他の炭素または原子も同様に置換し得る。好ましい実施態様において、部分を、α−炭素原子に末端単量体サブユニットまたは内部の末端単量体サブユニットへ添加する。
【０３２１】
この実施態様において、修飾単量体サブユニットを、ＥＴＭ、結合リンカーまたはその結合のための官能基で合成し、次いで塩基を添加し、修飾単量体を成長しているＰＮＡ鎖に加入させ得る。ＰＣＴ  ＵＳ９７／２００１４の図３１は、ＰＮＡ単量体サブユニットの骨格と共有結合する伝導性オリゴマーの合成を示しており、ＰＣＴ  ＵＳ９７／２００１４の図３２は、単量体サブユニットの骨格と結合するフェロセンの合成を示している。
【０３２２】
製造した共有結合部分を有する単量体サブユニットを、Will et al., Tetrahedron 51(44): 12069-12082 (1995)およびVanderlaan et al., Tett. Let. 38: 2249-2252 (1997)（両方ともその全体を出典明示により本明細書の一部とする）に概説のような方法を使用して、ＰＮＡに包含させる。これらの方法は、ペプチド核酸への化学置換基の添加を、化学置換基を破壊させることなく可能にする。
【０３２３】
当業者に認められるように、電極は、核酸、伝導性オリゴマーおよび絶縁体の任意の組み合わせを有するように製造し得る。
【０３２４】
本発明の組成物は、更に、一個以上の標識を任意の位置で含み得る。本明細書での“標識”は、化合物の検出を可能にするために結合した元素(例えば、アイソトープ)または化学化合物を意味する。好ましい標識は放射活性同位体標識、着色または蛍光色素である。標識は、任意の位置で化合物に包含し得る。加えて、本発明の組成物は、架橋剤のような他の部分も含み得、標的−プローブ錯体の架橋を促進する。例えば、Lukhtanov et al., Nucl. Acids. Res. 24(4): 683 (1996)およびTabone et al., Biochem. 33: 375 (1994)参照、両方とも出典明示により本明細書の一部とする。
【０３２５】
理論に囚われなければ、電極上のＳＡＭの存在が、非特異結合、特にアッセイを妨げる電気活性種の低減を大きく促進する一方、上記考察のように、ＥＴＭが単層に貫入して電極へより好適に接近し得るか、または単層が存在しない場合は、電子伝達を促進すると思われる。すなわち、単層が“短い程”より良好なシグナルを生じ得る。
このように、好適な態様において、本発明方法は、第一単層を形成させ、標的被検体を捕捉し、次いで該単層を除去するか、またはＥＴＭが電極により好適に接近させ得るような他のタイプの単層と置換えることを含む。これがＳＡＭを有することの利益（非特異結合の減少）を効果的に生じ、さらに電極に対するＥＴＭの良好な接近を可能とし、シグナル送達を容易にする。
【０３２６】
従って、この態様において、本方法は捕捉結合リガンドを含む第一ＳＡＭ形成種と少なくとも第二ＳＡＭ形成種を有する電極に標的被検体を添加することを含む。第二ＳＡＭ形成種は、例えば、粗い表面上に絶縁体を、または絶縁体とＥＦＳの混合物を含み得る。捕捉結合リガンドと標的被検体は結合複合体を形成する（捕捉結合リガンドと標的被検体が核酸である場合、ハイブリダイゼーション複合体という；本明細書に概説するように、このハイブリダイゼーション複合体は捕捉エクステンダー・プローブなどの追加の核酸を含んでもよい）。この結合複合体はＥＴＭを含んでいてもよく、その場合にはそれがアッセイ複合体であるか、またはＥＴＭを溶液結合リガンド（核酸の場合には標識プローブという）の形状で置換工程の後に加えてもよい。
【０３２７】
次いで、第三のＳＡＭ形成種を加え、第二ＳＡＭ形成種を置換える。興味深いことに、“不足している”単層形成種、例えば、Ｃ２ないしＣ６のアルキルチオール種などは非捕捉結合リガンド単層形成種に置換わると思われる；すなわち、捕捉結合リガンド種は優先的に維持され、一方で他のＳＡＭ形成種が置換わる。このように、この置換工程は表面から結合複合体を有意に除去するとは思われない。しかし、ＥＴＭからの有意なシグナル増大が見られる。さらに、特にＣ２種との置換後、なお荷電した親水性ＥＴＭがシグナル送達を可能とするが、これは電極が有意に保護されないことを結論として意味する。
【０３２８】
次いで、アッセイ複合体が形成される；すなわち、もし未だ存在しないならば、溶液結合リガンドの形状でＥＴＭを添加し、アッセイ複合体が標的被検体、捕捉結合リガンド、および少なくとも１つの電子伝達部分（ＥＴＭ）を含むようにする。次いで、下記のように検出を進行させる。
核酸に加えて、他の型の標的被検体を検出することが可能である。好適な態様において、本システムは下記システム１に描出するように、有機汚染物質などの汚染物質を検出するために使用する：
【０３２９】
【化４４】
0004530541.tif 000045
システム１では下記するように、斜線部分が電極を表し、好ましくは表面上に単層が存在する。Ｆ１は、電極と導電性オリゴマーまたは絶縁体との共有結合を可能にする連結であって、本明細書に記載のような結合、原子またはリンカーなどを含み、例えば、“Ａ”として下記に定義している。Ｆ２は、導電性オリゴマーまたは絶縁体の共有結合を可能にする連結であり、本明細書に記載するような結合、原子、または連結であり得る。Ｆ２は、導電性オリゴマーの部分、絶縁体の部分、末端基の部分、またはレドックス活性複合体または成分の部分であり得る。また、両方とは異なるもの、例えば、“Ｚ”で定義したようなものでもあり得る。Ｘはスペーサー（導電性オリゴマー、不動態化剤または絶縁体、必要に応じて）である。ＲＡＭはレドックス活性分子であり、本明細書中ではときにＥＴＭとして言及している。ＴＧは末端基であり、有機汚染物などの標的汚染物の結合に影響を及ぼすように選択される。例えば、この実施態様ではＴＧは疎水性である。表面の汚染物の結合がＲＡＭの局所的環境に影響を与える。例えば、ＲＡＭのＥ０すなわち溶媒再編成エネルギーの変化によるものであり、分析物の存在においてシステムのファラデーインピーダンスが変化する。この場合の結合は特定の分析物に特異的でない。
【０３３０】
システム２、３、４および５は、特異的な相互作用が起きる点を除き、同様の状態を表す。標的分析物は、結合リガンドに特異的に結合し、結合リガンドおよびＲＡＭに比べて一般的に大きい。結合に際してＲＡＭの局所的環境が影響を受ける。例えば、ＲＡＭのＥ０すなわち溶媒再編成エネルギーの変化によるものであり、分析物の存在においてシステムのファラデーインピーダンスが変化する。この場合における標的分析物はタンパク質、細胞などであり得る。さらに、これらのシステムのいずれかまたはすべてにおいて、同時還元剤を用い得る。標的分析物が結合すると、同時還元剤のＲＡＭへの接近が制限され、相違のシグナルまたはシグナルの喪失のいずれかまたは両方をもたらす。さらに、ここに記載のすべてのシステムについて、単層の個々の分子についての順序や近接は決定的なものでない。
【化４５】
0004530541.tif 000046
システム２では、１つの結合リガンド（ＢＬ）につき２以上のＲＡＭが存在し得る。すなわち、表面におけるＢＬに対するＲＡＭの比率（標的分析物の相対的な大きさに依存的）は１：１から１００：１以上である。シグナルの増幅が可能であり、１を越えるＲＡＭが単一の標的分析物の検出に使用できる。
【０３３１】
【化４６】
0004530541.tif 000047
【化４７】
0004530541.tif 000048
【化４８】
0004530541.tif 000049
【０３３２】
システム６は、標的分析物の結合がＲＡＭと電極との間のＨＡＢに理論的に影響を及ぼすシステムを表す。
【化４９】
0004530541.tif 000050
【０３３３】
システム７は同様の状態を表すが、結合リガンドがＲＡＭの電極との連結に固有である点が相違する。例えば、ペプチドまたは核酸に分析物が結合する。
【化５０】
0004530541.tif 000051
【０３３４】
システム８は、分析物がレドックス活性分子としても働く状態を表す。これは、毒性のある重金属などの金属のイオンの検出に特に有用である。システム８は金属イオンＭおよび金属リガンドＭＬを表すが、当業者はわかるように、この場合、分析物がメタロ酵素、ＢＬなどであることも可能である。当業者はわかるように、システム８は、相違のリガンドの配置を用いて、相違の金属イオンの検出に特に有用である。１つの金属が他の金属に優先して結合することが金属リガンド結合に相関し得る評価判定結果をもたらす。さらに、相違の金属は、相違するＥ０を有し、相違するシグナルを与える。
【化５１】
0004530541.tif 000052
【０３３５】
システム９は、検出用のシグナルの低下に基づく競合型アッセイを表す。この場合、標的分析物は、一酸化炭素（ＣＯ）などのリガンドであり、システムの弱い金属リガンド（ＷＭＬ）より特定の金属にさらに強いリガンド（ＳＭＬ、高い結合定数を有す）である。
【化５２】
0004530541.tif 000053
【０３３６】
システム１０は、同様のアッセイ型を表し、シグナルの低下よりもシグナルの変化が起きる。例えば、Ｅ０およびλの両方が新しいリガンド結合の結果として変化する。
【化５３】
0004530541.tif 000054
【０３３７】
システム１１は、ファラデーインピーダンスおよびマス伝達の変化についての分析物の結合に対する拡散係数の変化を利用する。この実施態様において、リガンドが電極に共有結合していないときは、拡散係数の変化がマス伝達インピーダンスを変え、さらに全ファラデーインピーダンスを変える。すなわち、ある状態において、レドックス活性複合体の周波数応答がその拡散係数によって制限される。また、伝達インピーダンスの変化が分析物の結合によっても変化し得る。高い周波数において、レドックス活性複合体が十分迅速に拡散しないので、強い出力シグナルを生み出すのに十分な速度で、その電子を電極に可逆的に伝達する。低い周波数では、分子が拡散するのに十分な時間があり、出力シグナルを検出できる。この実施態様において単層の使用は一般的に好ましくない。
アッセイ複合体を形成する結合がレドックス活性分子の拡散係数を一般的に変える。結果として、ファラデーインピーダンスが変化する。この作用が最大になるのは、結合相手がレドックス活性部分に比して大きいときである。レドックス活性部分が複合体への結合に際し比較的小さいと迅速に拡散し、比較的大きいと緩やかに拡散する。このことが最大の変化をもたらすので好ましい。同様に、ほぼ同じ大きさの結合相手であると、検出可能なシグナルが得られる。
あるいは、レドックス活性部分の結合相手との結合が大きさの低下を起こすこともある。例えば、抗体などのある種のタンパク質構造は立体的にかさばった配座を“緩め”、その相手（すなわち抗原）との結合の結果として“締め上げる”。
【化５４】
0004530541.tif 000055
【０３３８】
システム１２は、システム１０および１１に類似しており、相違するリガンドのセンサーであるが、リガンドの変化によってシステムのＥ０に変化が起きる。同様のシステムが２種の金属とともに使用される。すなわち、強い金属リガンドを加える代わりにリガンドについての異なる親和性を有する相違の金属を加えて、電気化学的変化を得る。
【化５５】
0004530541.tif 000056
【０３３９】
システム１３は前述のシステムの変形であり、ＲＡＭおよびＢＬが密接に結合またはリンクしている。
【化５６】
0004530541.tif 000057
【０３４０】
システム１４は、Ｅ０またはＨＡＢの変化の結果としてファラデーインピーダンスに変化がある。この場合、結合リガンドはなんらかの方法で自己結合し、ＲＡＭを電極に非常に近接せしめる。例えば、結合リガンドは核酸（例えば、核酸結合タンパク質の検出のために）またはタンパク質（例えば、結合リガンドタンパク質を阻害または結合するタンパク質の検出のために）であり得る。タンパク質などの標的が結合すると、ＲＡＭの立体配座および局所的環境が変化し、検出可能なシグナルをつくる。システム１５は“可逆的”にすることもでき、分析物が結合するとＲＡＭを表面に近接せしめる。
【化５７】
0004530541.tif 000058
【０３４１】
システム１５は、同一または異なる２つの結合リガンド、ＢＬ１とＢＬ２を利用して、ＲＡＭの環境を変える。望ましくは、結合リガンドの一つがなんらかの“一般的”結合リガンドであることである。Ｅ０および／またはインピーダンスの変化が検出可能なシグナルをもたらす。
【化５８】
0004530541.tif 000059
【０３４２】
システム１６もシグナルの低下に基づく。この実施態様で、使用の標的分析物が金属イオン結合リガンド複合体を結合して、利用できない金属をレドックス活性分子として働かす。
【化５９】
0004530541.tif 000060
【０３４３】
システム１７は、特定の結合リガンドに対する金属イオン親和性の変化を利用し、存在する相違の金属を基にしたシグナルの変化（相違のＥ０を生じる）を検出する。
【化６０】
0004530541.tif 000061
【０３４４】
システム１８はシステム９に類似し、標的分析物を検出するための競合型アッセイを表す。システム１５において、共有結合した標的分析物または標的類似体（ＴＡ）が標的分析物の添加によって結合リガンドから競合的に外れて、シグナルの低下をもたらす。
【化６１】
0004530541.tif 000062
【０３４５】
システム１９は，システム２および１８の混合であって、かさばる類似体（ＴＡ）を小さい標的分析物（Ｔ）で置換すると、相違するシグナルをもたらす。例えば、同時レドックス反応が起こり得る。他方、“ホール”を有する単層が類似体の不存在で電流を生じ、類似体の存在で電流を生じないので、これも使用できる。
【化６２】
0004530541.tif 000063
【０３４６】
システム２０は競合型アッセイにおける２電極システムを表す。この有用な点は、第２電極上のシグナルの増加を検出し得ることにある。シグナルの増加はその消失よりも一般的に好ましい。
【化６３】
0004530541.tif 000064
【０３４７】
当業者は分かるように、システム２０もいくつかのやり方で配置し得る。ＢＬ１とＢＬ２とは、標的分析物または類似体に対し同じ部位での異なる親和性を有する。すなわち、異なる部位に結合する。同様に他のシステムも２電極システムで用い得る。
さらに、他の実施態様において上記したシステムを用いることが可能である。例えば、熱がファラデーインピーダンスを変えるので、上記システムを熱センサーとして用いることができる。同様に、反応活性または開裂性の結合を使用して電極にＲＡＭを連結すると、シグナルの低下に基づく開裂剤のセンサーが可能となる。例えば、光線遊離結合が光線の検出に用いられ，基質が酵素（プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、カルボヒドラーゼ、リパーゼなど）のセンサーとして用いられ、核酸を切断する薬剤などの開裂剤が用いられる。
【０３４８】
上記のシステムにおいて、レドックス活性複合体が電極に共有結合している。当業者は分かるように、このことは多くの方法でなし得る。好ましい実施態様において、レドックス活性分子および結合リガンドの一つまたは両方がスペーサーを介して電極に連結する。下記に概説する技術および組成物が使用される。“スペーサー”とは、電極の表面から離れたレドックス活性複合体を保持する部分を意味する。好ましい実施態様において、レドックス活性分子と連結するのに使用されるスペーサーは、概説するように導電性オリゴマーであり、適当なスペーサー部は下記するように不動態化剤および絶縁体を含む。スペーサー部は実質的に非導電性であり得る。一般的に、スペーサーの長さは導電性ポリマーおよび不動態化剤について述べた通りである。当業者は分かるように、スペーサーが長すぎると、レドックス活性分子と電極との電子的カプリングが急速に低下する。
好ましい実施態様において、レドックス活性分子が導電性オリゴマーを介して連結し、レドックス活性分子と電極との間のファラデーインピーダンスの変化が検出される。システムの他の成分が他のスペーサーを用いて連結される。例えば、システム２に一般的に表すように、結合リガンドとレドックス活性分子が別個に連結されると、結合リガンドは非導電性オリゴマー・スペーサーを介して連結される。
【０３４９】
少なくとも１つの標的被検体と１つのＥＴＭ、好ましくは１つの捕獲結合リガンド、を含む本発明のアッセイ複合体が形成されると、検出が電子的イニシエーションにより進行する。メカニズムまたは理論に制限されなければ、検出は、ＥＴＭから電極への電子伝達に基づいており、π軌道の介在を含んでいる。
【０３５０】
上記概略のように、本発明は、シグナルの増加、ノイズの減少、またはノイズのバックグラウンドからシグナルをより明瞭化するかまたは検出可能にする、技術を教示する。すなわち、バックグラウンドノイズ中のシグナルの同定をよりよくするために機能し得る何の技術も、本発明で使用することができる。これらの技術は一般的に３つの方法に分類される：(１)イニシエーションシグナルを適用するタイプまたは方法での変更(すなわち、"入力"を変更して最大にするまたはサンプルシグナルを同定する)；(２)データ処理、すなわち"出力"シグナルに使用して、サンプルシグナルを最大化または同定する技術；および(３)アッセイ自体の変更、すなわち、サンプルシグナルのよりよい同定を可能にする、電極表面またはシステムの成分の変更。
【０３５１】
電子伝達の検出、すなわち、ＥＴＭの存在は一般に好適な電圧により電子的に開始される。電位はアッセイ複合体に加える。加えられる電位の正確な制御と変化はポテンショスタットおよび３つの電極システム（１つは参照用、１つはサンプル用（または作業用）、１つは対向電極用）または２つの電極システム（１つはサンプル用、１つは対向電極用）による。これは一部ＥＴＭの選択に左右されるシステム、また一部使用した伝導性オリゴマー、単層の組成と整合性、およびどのタイプの参照電極を使用したかに左右されるシステムのピーク電位に、印加した電位がマッチすることを可能とする。
【０３５２】
好適な態様においては、交流電流(ＡＣ)入力シグナルを使用する。上記のように、広範囲の異なるＡＣシグナルを使用することができる。例えば、入力シグナルは、ＡＣ成分のみまたはＡＣ成分とＤＣ成分の両方、特にＤＣスウィープ、を含み得る。基本振動数ｆ0のＡＣ電圧を電極に適用し、ＤＣ電圧をＥＴＭのレドックス電位を介してスキャンする。
【０３５３】
理論に拘束されることなく、電極に連結したＥＴＭは、つながっている抵抗とコンデンサーを流れる交流電圧に同様に反応する。基本的に、これらの抵抗とコンデンサーとして働く複合体の性質を測定し得る方法は、検出の基本とすることができる。驚くべきことに、従来からの電気化学理論、例えば、Laviron et al., J. Electroanal. Chem. 97:135(1979) および Laviron et al., J. Electroanal. Chem. 105:35(1979)（出典明示により本明細書の一部とする）は、非常に小さいＥＡＣ（１０mV以下）および比較的多数の分子を除き、本明細書に記載のシステムのモデルとはならない。すなわち、交流電流（Ｉ）は、Lavironの式に正確には記載されていない。このことは、この理論が電子の限界のない源とシンクを想定していることに部分的には由来するものであり、これは本発明のシステムには当てはまらない。
【０３５４】
これらのシステムのよいモデルとなるＡＣ電圧理論は、O' Connor et al., J. Electroanal. Chem. 466(2):197-202 (1999)(出典明示により本明細書の一部とする)に概略説明されている。これらのシステムを予測する式を、式１として下に示す：
式１
【数１】
0004530541.tif 000065
式１中で、ｎはレドックス分子毎の酸化または還元電子数、ｆは適用振動数、Ｆはファラデー定数、Ｎ全はレドックス分子の総数、Ｅ０はレドックス分子の形式的電位、Ｒはガス定数、ＴはKelvin度数での温度、そしてＥＤｃは電極電位である。このモデルは実験データと非常によく適合している。ある場合に、電流が予測より小さくなるが、これは、フェロセンの減少によるものであり、多くの方法で回復させ得る。
【０３５５】
加えて、ファラデー電流も、式２に示すとおり、時間の関数として表わすことができる：
式２
【数２】
0004530541.tif 000066
ＩFはファラデー電流であり、ｑeは電気素量である。
【０３５６】
。しかし、電子伝達速度の影響も機器による因子も、式１に組み入れられてない。電子伝達速度は、応用周波数に近いか、それより低いと、重要である。このように真のｉＡＣは下記の式１２に示すような３因子の関数である。
式３
ｉＡＣ＝ｆ(Nernst因子)ｆ(ｋＥＴ)ｆ(機器因子)
【０３５７】
これらの式は、交流素子および直流素子を含む入力シグナルを利用するシステムにおける期待交流電流をモデル化し、予測できる。上記したように、驚くべきことに従来の理論は、非常に低電圧の場合以外は、これらのシステムをまったくモデル化しない。
【０３５８】
一般に、非特異的結合標識プローブ/ＥＴＭは、ＥＴＭを含む標識プローブが正確な方向に特異的に結合したときよりも、インピーダンスに相違を示す（すなわち、高いインピーダンス）。好ましい実施態様において、非特異的結合物質を洗い落とすと、無限大の効果的なインピーダンスをもたらす。このように、一般的に下記するように交流検出はいくつかの利点があり、それには、感受性の増加およびバックグラウンドのノイズを拙除する能力が含まれる。特に、インピーダンスの変化（例えばバルクインピーダンスを含む）を、ＥＴＭ含有プローブの非特異的結合と標的特異的アッセイ複合体形成の差として監視できる。
【０３５９】
従って、ＡＣ開始および検出方法を用いると、システムの周波数応答がＥＴＭ存在の結果として変化する。“周波数応答”は、電極とＥＴＭとの間の電子伝達の結果としてのシグナル修飾を意味する。この修飾はシグナル周波数に従って相違する。周波数応答には、1以上の周波数での交流電流、位相シフト、直流オフセット電圧、ファラデーインピーダンス等が含まれる。
【０３６０】
標的配列および標識プローブを含むアッセイ複合体がつくられると、第一入力電子シグナルはシステムに用いられ、好ましくは少なくともサンプル電極（本発明の複合体を含む）および逆電極を介してシステムに用いられ、電極とＥＴＭとの電子伝達が開始される。電極システムも対照および実施電極に適用される電圧で用いられる。第一入力シグナルは少なくとも１つの交流素子を含む。交流素子は変化し得る振幅と周波数である。一般的に、本発明方法での使用において、交流振幅は約１ｍＶ−１.１Ｖであり、約１０ｍＶ−８００ｍＶが好ましく、特に約１０−５００ｍＶが好ましい。交流周波数は約０.０１Ｈｚ−１００ＫＨｚであり、約１０Ｈｚ−１０ＭＨｚが好ましく、約１００Ｈｚ−２０ＭＨｚが特に好ましい。
【０３６１】
交流と直流シグナルとの組み合わせ使用は、驚くべき感受性とシグナル最大化を含む種々の利点がある。
【０３６２】
好ましい実施態様において第一入力シグナルは交流素子および直流素子を含む。すなわち、作動電極と逆電極直流オフセット電圧は、ＥＴＭ（例えば、フェロセンを用いると、掃引は一般に０から５００ｍＶ）（あるいは、作動電極をグラウンドすると、逆電極は０から−５００ｍＶで掃引される）の電子化学的電位を介して掃引される。この掃引はシステムの最大応答が見られる直流電圧を同定するのに用いられる。これは一般にＥＴＭの電子化学的電位かその周辺である。この電圧が測定されると、掃引または１以上のユニホーム直流オンセット電圧が用いられる。直流オンセット電圧は約−１Ｖから＋１.１Ｖであり、約−５００ｍＶから＋８００ｍＶが望ましく、約−３００から５００ｍＶが特に望ましい。好ましい実施態様において直流オンセット電圧はゼロではない。直流オンセット電圧のトップで、変化し得る振幅および周波数のシグナル交流素子が適用される。もしＥＴＭが存在して交流摂動に応答し得ると、電極とＥＴＭとの間の電子伝達によって、交流電流が生じる。
【０３６３】
確立したシステムにおいて、ＥＴＭ（即ち標的配列の存在する）核酸の有無を識別するのに、単一の入力シグナルを用いて十分である。他方、複数の入力シグナルも適応される。これには、多くの種類があり、多重周波数、、多重交流振幅あるいはこれらの組合せが用いられる。
【０３６４】
このように好ましい実施態様において、多重直流オンセット電圧を用いると、直流電圧掃引が好ましい。これは単一の周波数または２以上の周波数で行われる。
【０３６５】
好ましい実施態様において、交流周波数は変更することができる。異なる周波数においては、異なる分子が異なる方法で応答する。当業者には明らかなように、周波数を上げると、一般に出力電流が増す。しかし、周波数が、電子が電極とＥＴＭの間を移動する速度より大きい場合は、高い周波数は出力シグナルの減少または損失を招くこととなる。ある場合は、周波数はＥＴＭと電極の間の電子伝達速度より速くなり得、そうすると出力シグナルも落ちるであろう。
【０３６６】
好適な態様において、小ＡＣ電圧による多重周波数を印加し、それぞれの基本波を評価する。あるいは、好適な態様では大ＡＣＶでの幾つかの周波数を利用し、それぞれの高調波を評価する。同様に、好適な態様では大ＡＣＶでの幾つかの周波数を利用し、その場合システム上の異なる周波数の作用が個々の周波数での出力合計と異なる出力となし得る。
一態様において、検出には単一周波数での出力シグナルの単一測定値を利用する。すなわち、標的配列不存在下でのシステムの周波数応答、および従ってＥＴＭ含有標識プローブの不在が特定の高周波数で非常に低い値として予め測定することが可能である。この情報を使用すると、特定周波数での如何なる応答もアッセイ複合体の存在を示すものとなる。すなわち、特定周波数での如何なる応答もアッセイ複合体の特性である。このように、必要なのは単一入力周波数を使用することのみであり、周波数応答の何らかの変化はＥＴＭの存在すること、従って標的配列の存在することの表示である。
【０３６７】
好適な態様において、入力シグナルとデータ処理工程はシステムの非直線性を増大させるために実施する。すなわち、例えば、フェロセン応答は非直線的に反応し、バックグラウンドの応答を越えたシグナルの高調波応答を生じる；このＡＣボルタンメトリーからの調波シグナルは恐らく電気化学セルの非直線的応答による高調波ひずみの結果である；参照：Yap, J. of Electroanalytical Chem. 454:33 (1998)（出典明示により本明細書の一部とする）。このように、この非直線性を増大させる何らかの技法が望まれる。好適な態様において、技法はより高い調波シグナルを増大させるために使用する；このように、周波数と位相感受性ロックイン検出が適用した波形の基本周波数で実施され、また多重基本周波数（すなわち、より高い調波）でも実施される。バックグラウンド静電容量は比較的直線的にＡＣシグナルに応答する（正弦波入力ＡＣ電圧は比較的ひずみのない正弦波出力に結果として帰着する）ので、非常に小さな上部高調波電流がバックグラウンドに生じる。これはシグナル−ノイズ比に劇的な増大をもたらす。このように、より高い調和振動数、特に第３、第４および第５高調波（第２または第１０以上の高調波も使用し得るが）は、標的分子からのシグナルを圧倒し得る非ファラデー過程（二重層荷電のように）と関連するバックグラウンド電流の劇的な抑制に帰着することが示される。この方式において、より高い調和振動数と位相でのシステムの評価は、検出限界とシグナルの明瞭さに有意な改善をもたらす。しかし、ある態様においては、より高い調波の分析は望ましくない。
【０３６８】
このように、好適な態様において、非直線性調波応答を増大させる一つの方法は、ＡＣ摂動の振幅を増加または変化させることであるが、これはさらに基本周波数をモニターするのにも使用し得る。理論に囚われなければ、振幅を増加させることは駆動力を非直線的に増加させることと思われる。このように、一般に、単一の周波数で、その周波数ではより高い超過電位を使用することで、同じシステムが改善された応答（すなわち、より高い出力シグナル）を与える。このように、振幅は高い周波数で増大し、システムを介して電子伝達率を増大させ、結果としてより高い感度を与える。さらに、これは、例えば、最適な空間的形状を持たないシステムなど低速システムでの応答を誘発するのに使用することができる。
【０３６９】
好適な態様において、システムの測定値は少なくとも２つの別個の振幅または過電圧で測定されるが、好ましくは複数振幅での測定値である。上記のように、振幅変化の結果としての応答における変化は、システムの同定、校正および数量化の基礎をなす。さらに、１つ以上のＡＣ周波数が同様に使用し得る。等式４は任意の駆動電位Ｖに対する可逆的表面酸化還元反応の電流出力を説明する。
【０３７０】
等式４
【数３】
0004530541.tif 000067
これはネルンストの分散を（電流）＝（電気素量）（酸化された分子数の変化ｗ.ｒ.ｔ.時間）に置換する；参照：O'Connor et al, J. Electroanal. Chem. 466:197 (1999)（出典明示により本明細書の一部とする）。ＡＣボルタンメトリーにおいては、等式５に示すように、駆動電圧がＤＣランプ上に重ね合わされたＡＣシグナルである：
等式５
【数４】
0004530541.tif 000068
これはＩ(ｔ)に対し次の式（等式６）に導く：
等式６：
【数５】
0004530541.tif 000069
【０３７１】
上の式から計算すると、１００ｍＶ／ｓＤＣランプおよび１００Ｈz２５ｍＶのＡＣ振動で走査したとき、２９５Ｋでの１０６表面酸化還元分子の系に対しＥ０＝２００ｍＶ近辺でのファラデー電流は図２Ａに示される。この系の出力は極めて直線性であり、そのファラデー応答は殆ど正弦波的である（そして駆動力により位相から９０°）。これはＥ０±２５ｍＶで利用し得る電子数に僅か２１％の変動があることによる（ネルンスト分散のＦＷＨＭはｎ＝１、２９５Ｋで９０ｍＶである）。もし代りに１００ｍＶのＡＣ振幅を用いるならば、等式は図２Ｂに示した走査を生じるが、そのデータはＶac＝１００ｍＶで励起した表面結合ＤＮＡ系の周波数スペクトルと第４高調波ＡＣボルタンモグラムについて図２Ｃに示す。観察される非直線性はネルンスト分散の大きなフラクションが掃引されているという事実を原因とするが、振動の極値で利用し得る酸化還元電子数はＥ０で利用し得る電子数の７.５％にすぎない。応答は、純粋に正弦波的ではないために、駆動周波数よりも高い周波数に固定することにより測定される調和成分をもつ。さらに、シグナルの対称性はＤＣ電位の関数として変化する。図２Ｄは図２Ｃと同一のシグナルを描出するが、ＶＤＣでは大まかに１５０ｍＶ、Ｅ０より下である。対称性のこれら変動は、本発明において調波走査を測定する際に観察されるピーク・パターンと節点を生じるＤＣ電圧の関数として表される。
【０３７２】
好適な態様においては、調和方形波ＡＣＶが用いられる；参照：Baranski et al., J. Electroanal. Chem. 373:157 (1994)（出典明示により本明細書の一部とする）；しかし、ある態様では、これは好ましくない。これは幾つもの潜在的な利点を提供する。例えば、方形波は数値化して表すのが容易であり、方形波のパルス形状は充電容量に対しより良好な識別を可能とする。正弦調波ＡＣボルタンメトリーにおいて、高調波シグナルは、ファラデー応答が充電容量よりもより非線形であり得るため、バックグラウンドに対してより良好なシグナルを提供する。同じ概念はＳＷ調波ＡＣＶに当てはまる。２つの技法間の重要な相違はＡＣ波形の周波数スペクトルである。単一の周波数正弦波波形は正しく基本周波数を含み、その場合単一の方形波は基本周波数並びにすべての奇数高調波を含む。この技法は容量電流に対するファラデー電流の比が強調される場合、偶数の高調波を検査する。奇数高調波はすべて単一のＡＣＶピークをもち、一方偶数の高調波は二重のＡＣＶピークをもつ。これは非可逆的酸化還元対を有する系の正弦調波ＡＣＶの場合と反対である。図３参照。
【０３７３】
好適な態様においては、多重周波数ＡＣＶが使用される。この考えは同じ振幅または異なる振幅をもつ多くの周波数からなる波形を創造し、ＡＣＶ様式で電気化学セルを励起することである。本方法はセル応答を分析するために高速フーリエ変換または同時時間−周波数変換から利益を得る。多重周波数ＡＣＶのＪＴＦＴスペクトル写真は励振（または基本）周波数並びにその調和成分に関する情報を提供する。幾つかの可能なデータ分析は以下のとおりである：１）基本周波数の応答比較；２）調和振動数すべての比較；３）すべての励起周波数の１つの特定調和振動数の応答比較；および４）標準単一周波数ＡＣＶによる可能なすべての分析。
【０３７４】
従って、好適な態様においては、実施例に一般的に概説するように、高速フーリエ変換を実施する。フーリエ変換分析はノイズに対するシグナルを改善し、正弦波電気化学を実施する場合に所望のシグナルを単離するための好適な方法である。典型的なＡＣ技法は一次周波数のみの測定値に依存する。正弦波ボルタンメトリー（および他の入力）により、より高い周波での観察が主として速度論に基づくシグナルの識別を可能とする。例えば、急速および遅速酸化還元事象両方が一次周波数において同様のピーク（ＡＣ周波数が高すぎなければ）を与える。しかし、より高い周波では、一部の酸化還元分子がシグナルを生成し、他は生成しない。ＦＦＴ分析を用いると、正弦波入力に対する応答の様々な周波数成分がすべて一度に観察し得る。
【０３７５】
同様に、好適な態様においては、実施例に一般的に概説するように、同時時間−周波数変換（ＪＴＦＴ）を実施する。
多重周波数ＡＣ励起波形の使用は個々周波数の慎重な選択を必要とする。電気化学セルの応答は高度に非直線性であり得るので、基礎周波数とその高調波の変調から生じる“非励起”周波数は、もしそれらの非励起周波数が基礎周波数と同時に生じるならば、間違ったフーリエ変換データを生じる可能性がある。さらに、多重周波数をもつ波形によると、個々の周波数の振幅は個々の正弦波の位相関連性によって、大きく異なり得る。その秘訣は最も小さな総励起振幅をもつ波形を作ることであり、一方で個々の振幅はできる限り大きく、かつ互いに近接させて維持することである。その一例は（構築と破壊の干渉並びに変調を最少化することにより）最適化した位相をもつ多重周波数正弦波波形を作り、総計した正弦波の総振幅を最少化することである。モンテカルロ法に類似の技法を用い、ランダム生成演算子を使用して位相最適化を実施することができる。ｎ周波数をもつ波形については、相互変調の最低確立をもつｎ−１高調波を選択する。次いで、ランダム生成演算子を用いて、各周波数に対するｎ−１ランダム位相を生成させる。３つの波形はこれらのランダム位相を用いて計算するが、その一つは生成した位相θに、他の一つはθ＋π／２をもち、そして他の一つはθ＋π／２をもつ。次いで、反復ルーチンを用いてこれら波形からの振幅の最小絶対値をもつ波形を同定、選択する。この手法はπ／４、π／８、１／４π／３６０または１次数に達するまで繰返す。留意しなければならないのは、この特定の方法は局所最小値を定めるのみで、必ずしも大局的最小値を定めるものではないということである。
【０３７６】
好適な態様において、インピーダンスの分析は多重周波数ＡＣＶからのデータを用い実施する。この概念は様々な周波数にて交流（ＡＣ）シグナルを用い、電気化学セルを励起することである；参照：Hazi et al., J. Electroanal. Chem. 437:1 (1997)（出典明示により本明細書の一部とする）。多重周波数ＡＣシグナルはＤＣ階段の最上段に印加する。高速フーリエ変換を用い、セルの応答を各ＤＣ電位で半波長値を介して記録する。バックグラウンドの引き算はセル応答のインピーダンス分析により実施する。この技法は充電電流と未補償の溶液抵抗に対する良好な識別を可能とする；参照：Baranski et al., J. Electrochemistry 453:29 (1998)（出典明示により本明細書の一部とする）。
理論的には、ＣＭＳ電気化学セルのバックグラウンド電流は、等式７に示すように印加した電位ｄＥ／ｄｔの電荷率に比例して充電電流（Ｉc）による荷電電気二重層から生じる：
【０３７７】
等式７
【数６】
0004530541.tif 000070
この“一定”の比例定数はよく知られた二重層静電容量である。しかい、ファラデー電流は等式８に示すように、濃度ｃと印加した電位の変化率の平方根に比例する（参照：Laviron et al., J. Electroanal. Chem. 101:19 (1979)；出典明示により本明細書の一部とする）：
等式８
【数７】
0004530541.tif 000071
これら２つの単純な関連は、ｃが低下するか、またはＡＣ励起の周波数が上昇するにつれて、バックグラウンド電流はファラデーシグナルを越え得ることを示す。
【０３７８】
理想限度において、充電電流とファラデー電流は印加した励起電位に関して異なる位相関係をもつ（それぞれ−π／２および−π／４）。従って、セル出力ＥＦＴの同相成分（実部分）のみをプロットすることにより、充電電流が排除され得る一方で、ファラデーシグナルは僅かに減少するのみである（これは本質的に何がロックイン増幅器となっているかということである）。しかし、充電電流に対する識別効率は“未補償”溶液抵抗Ｒuの値に強く影響を受ける。未補償溶液抵抗は充電電流とファラデー電流両方の位相関係を周波数依存性様式で変化させ得る。シーベら（Schiewe at al. J. Electroanal. Chem. 451:129 (1998)；出典明示により本明細書の一部とする）は、励起周波数が増大するに従い、充電電流はセル出力の実部分に益々寄与する。同様の減少が本システムにおいて見られるが、ＡＣＶ周波数が増大するに従い、バックグラウンド・インピーダンスがそれに応じて増大し、位相情報は劇的に変化する（すなわち、励起周波数とサイクルが比較的低い場合、何故充電電流を識別するために位相を使用するのが好ましいかの理由である）。その結果、単一周波数情報のみをもつＲuを評価、訂正するのが困難である。インピーダンス分析を介して、またランドレス曲線を使用することによりＲuを引き出すことができる（インピーダンスの実部分と虚部分、対するω−１／２）。
【０３７９】
充電電流と未補償抵抗を補正するには一般に２つの方法がある。二重層静電容量と未補正抵抗両方が陰性の対照実験から評価し得るが、その場合、僅かしかまたはまったくファラデー反応が起こらない。この場合には、Ｒuはセルインピーダンスの実部分（Ｚ’）であり、Ｃdlはプロット１／Ｚ”対ωの勾配であるが、その場合、Ｚ”はセルインピーダンスの虚部分である。このシナリオは、セルの対応が電極ごとに変化するので、本システムには恐らく適応できない。より魅惑的な方法は電位領域を用いる“バックグラウンド”の差引きからなり、その場合ファラデー過程は走査内で起こらない；すなわち、ＣdlおよびＲuはガウスの状態電子分布のピーク電位よりもより陰性であり、またより陽性である電位にて測定された測定値から得られる。理論的には、Ｒuはいずれかの電位において実成分の測定インピーダンスの外挿高周波数切片から評価可能であり、Cdlはファラデー過程の存在下、高周波数アドミッタンスの大きさから評価し得る。
【０３８０】
単層表面にＥＴＭが存在することは様々な方法で検出し得る。様々な検出方法を使用し得るが、例えば、これらに限定されるものではないが、（酸化還元状態の変化に基づくスペクトル変化の結果としての）光学的検出、例えば、蛍光、燐光、発光、化学発光、電気化学発光、および屈折率など、および電子検出、例えば、これらに限定されるものではないが、アンペロメトリー、ボルタンメトリー、静電容量およびインピーダンスなどを使用し得る。これらの方法は、ＡＣまたはＤＣ電流、パルス法、ロックイン技法、フィルター（高域、低域、および帯域）、および時間分解蛍光法などの時間分解技法などに基づく時間または周波数依存方法を包含する。
【０３８１】
一態様において、ＥＴＭから電極への効率的な電子伝達はＥＴＭの酸化還元状態に変化をもたらす。ビピリジン、ピリジンおよびイミダゾール環を含むルテニウム複合体からなる多くのＥＴＭにより、酸化還元状態におけるこれらの変化はスペクトルの性質の変化と関連する。吸光度の有意な相違がこれらの分子での還元状態および酸化状態間で観察される。参照：例えば、Fabbrizzi et al., Chem. Soc. Rev. 1995 pp197-202。これらの相違は分光光度計または簡単な光電子増幅管装置を使用してモニターし得る。
この態様において、可能な電子供与体および受容体は光活性化または開始について上掲した誘導体すべてを包含する。好適な電子供与体および受容体は特徴として酸化および還元による大きなスペクトル変化をもち、その結果、高感度の電子伝達モニターを可能とする。かかる実例は好適な例示として、Ｒu(NH3)4ＰyおよびＲu(bpy)２imである。理解すべきことは、吸光度によりモニターされる供与体および受容体のみが理想的なスペクトル特性をもつ必要のあることである。
【０３８２】
好適な態様において、電子伝達は蛍光測定により検出する。多くの遷移金属複合体、例えば、ルテニウム複合体は蛍光特性を有する。それ故に、核酸に付着した電子供与体および電子受容体の酸化還元状態における変化は、例えば、Ｒu（４，７−ビフェニル２−フェナンスロリン）３２＋による蛍光を使用し、高感度でモニターすることができる。本化合物の産生は標準的蛍光アッセイ技法を用い容易に測定し得る。例えば、レーザー誘発蛍光は、標準的な単一セル蛍光光度計、フロースルー“オンライン” 蛍光光度計（クロマトグラフィー・システムに連結した光度計など）、または９６穴免疫アッセイ用に市販されているものに類似の多重サンプル“プレート・リーダー”に記録し得る。
【０３８３】
別法として、蛍光は溶液中核酸プローブをもつ、または光ファイバーに接続した光ファイバーセンサを用いて測定することができる。蛍光は光ファイバーに接続した光電子増幅管または他の光検出装置を用いモニターする。このシステムの利点はアッセイ可能な極端に少ないサンプル容量にある。
さらに、モレキュラー・ダイナミックス（Molecular Dynamics)が販売するフルオルイメージャー（FluorImager）などの走査蛍光検出計が固形表面上に整列させた修飾核酸分子の蛍光をモニターするのに理想的であり適している。このシステムの利点は多数の別個の核酸プローブで蔽われたチップを使用し、一度に大量の電子伝達プローブを走査し得ることにある。
【０３８４】
多くの遷移金属複合体は大きなストークスシフトをもつ蛍光を示す。適切な例は、ルテニウムなど遷移金属のビス−およびトリスフェナンスロリン複合体およびビス−およびトリスビピリジル複合体などである（参照：Juris, A., Balzani, V., et. al. Coord. Chem. Rev., V. 84, p. 85-277, 1988)。好適な例は効率的な蛍光（合理的な高量子収率）並びに低再組織化エネルギーを示す。これらはＲu（４，７−ビフェニル２フェナンスロリン）３２＋、Ｒu（４，４’−ジフェニル−２，２’−ビピリジン）３２＋および白金複合体などである（参照：Cummings et al., J. Am. Chem. Soc. 118:1949-1960 (1996)；出典明示により本明細書の一部とする）。あるいは、ハイブリダイゼーションと関連する蛍光の減少はこれらのシステムを用いて測定し得る。
【０３８５】
さらなる態様において、電気化学発光は電子伝達検出を基礎として使用される。Ｒu２＋(bpy)３などの一部のＥＴＭにより、直接発光は励起状態の減衰を伴う。この性質の変化は核酸ハイブリダイゼーションと関連し、簡単な光電子増幅管装置によりモニターし得る（参照：Blackburn, G. F.  Clin. Chem. 37:  1534-1539 (1991); and Juris et al.、上記）。
好適な態様において、電子検出にはアンペロメトリー、ボルタンメトリー、静電容量、およびインピーダンスなどが使用される。適切な技法は、これらに限定されるものではないが、電解重量分析、クーロメトリー（定電位電量分析および定電流クーロメトリー）；ボルタンメトリー（サイクリックボルタンメトリー、パルスボルタンメトリー（正常パルスボルタンメトリー、方形波ボルタンメトリー、示差パルスボルタンメトリー、オスターヤング方形波ボルタンメトリー、およびクーロスタット・パルス技法）；ストリッピング分析（陰イオンストリッピング分析、陽イオンストリッピング分析、方形波ストリッピングボルタンメトリー））；電気伝導度測定（電解コンダクタンス、直接分析）；時間依存電気化学分析（クロノアンペロメトリー、クロノポテンショメトリー、サイクリック・クロノポテンショメトリーおよびアンペロメトリー、ＡＣポログラフィー、クロノガルバメトリー、およびクロノクーロメトリー）；ＡＣインピーダンス測定；静電容量測定；ＡＣボルタンメトリー；および光電気化学などである。
【０３８６】
好適な態様において、電子伝達のモニターはアンペロメトリー検出による。この検出方法は対象の標的遺伝子を含むサンプル中で、核酸共役電極と参照電極（または対極）との間に電位を印加することからなる。異なる効率の電子伝達がサンプル中で標的核酸の存在または不存在下に誘導される；すなわち、標的核酸の存在または不存在、およびその結果の標識プローブの有無は、異なる電流に帰着し得る。
アンペロメトリーによる電子伝達の測定装置は鋭敏な電流検出器からなり、電圧電位を調節する手段、通常は定電位装置を含む。この電圧は標識プローブ上の電子供与複合体の電位に関連して最適化する。可能な電子供与複合体は以前に考察した鉄、オスミウム、白金、コバルト、レニウムおよびルテニウムとの複合体が好ましく、鉄の複合体が最も好ましい。
【０３８７】
好適な態様においては、代わり得る電子検出方式を利用する。例えば、電位差測定（またはボルタンメトリー）法は非ファラデー（正味の電流のない）過程を含み、伝統的にｐＨおよび他のイオン検出計に利用されている。同様のセンサがＥＴＭと電極の間での電子伝達をモニターするために使用される。さらに、絶縁体（抵抗など）および導電体（導電性、インピーダンスおよび静電容量）の他の性質を使用し、ＥＴＭと電極の間での電子伝達をモニターすることが可能である。最終的に、電流を発生するいずれのシステム（電子伝達など）も小さな磁場を発生させ、それをある種の態様によりモニターすることが可能である。
本発明の組成物に観察される電子伝達の迅速性の一利益は、時間分解が吸光度、蛍光および電子流に基づくモニターのシグナル対ノイズの結果を高め得るということであるということを理解すべである。本発明の電子伝達の迅速性は高いシグナルを与え、電子伝達開始と完結との間に定型化した遅延を生じる。特定の遅延シグナルを増幅することとは、電子伝達のパルス開始と検出の“ロックイン”増幅器の使用、およびフーリエ変換などである。
【０３８８】
好適な態様において、電流ベクトルと位相最適化のバックグラウンド引き算が実施される。電気化学的セルからの出力は本質的に電流である。電流増幅のバックグラウンド引き算のみでは幾分不正確であるということになり、そのために、振幅そのものではなく、総電流から静電容量電流ベクトルを差引くのがよい。バックグラウンド引き算の図式はベクトルを含むので、これらのベクトルの位相を走査し、バックグラウンドに対するシグナルを高めることが有用である。例示のアルゴリズムは以下のとおりである。多項式曲線は同時にバックグラウンド静電容量電流ベクトルに適合し、検索はファラデー電流ベクトルが最大となる位相を見出すためにバイナリー様式で実施する。全体の位相空間を試すためには、πまで走査する必要のあるだけで、０、８π／４５、１６π／４５、２４π／４５、３２π／４５、および８π／９にて８π／４５ごとにデータを分析する。シグナルが最大となる位相は次の反復での新たな開始点である。次いで、アルゴリズムでは最終最良位相θlastと２つの新たな位相とをθlast±４π／４５で比較する。シーケンスはθlast±２π／４５、θlast±π／４５、θlast±π／９０、およびθlast±π／１８０に対し繰返す。この方法はバックグラウンドに対するシグナルが小さい場合、良好なピーク検出を可能とする。さらに、該方法は、位相変化がより高い調波においてより大きいので、基本波よりも大きな調波においてより有効である。
【０３８９】
好適な態様において、相関および／またはたたみ込み技法が用いられる。この態様において、多くの場合同じ電極で走査する。一回の走査で一つのピークを探すよりも、走査を繰返して、走査間の共通する相関性を見る。例えば、フェロセンが存在しなくても、陰性については１８０ｍV近辺にノイズのこぶが現われる可能性がある。しかし、複数周波数を走査するならば、同じこぶが同じ場所に現われることはありそうにない。このように、好適な態様では多くの周波数で走査し、もしそのすべてでピークが現われるならば、その場合のみ陽性とみなす。これは非常に簡単な相関である；より複雑な相関をさらに実施してもよい。
例えば、好適な態様では電圧Ｖ(ｔ）を利用し、それをセル（電極）に印加する。出力シグナルｉ(ｔ）はフィルタ（filter）し、データに帰着する：Ｖ(ｔ）×セル＝ｉ(ｔ）×フィルタ＝データ（ｔ）。増幅器のロックを用い、簡単なノッチフィルタを行ってもよい；同様に、数学的フィルタをＦＦＴなどに使用してもよい。
【０３９０】
しかし、より複雑な分析がなし得る。以下の表に示すように、様々なフィルタを使用しうる。
Ｖ(ｔ）×セル＝ｉ(ｔ）×フィルタ１＝データ１（ｔ）
Ｖ(ｔ）×セル＝ｉ(ｔ）×フィルタ２＝データ２（ｔ）
Ｖ(ｔ）×セル＝ｉ(ｔ）×フィルタ３＝データ３（ｔ）
Ｖ(ｔ）×セル＝ｉ(ｔ）×フィルタ４＝データ４（ｔ）
Ｖ(ｔ）×セル＝ｉ(ｔ）×フィルタ５＝データ５（ｔ）
Ｖ(ｔ）×セル＝ｉ(ｔ）×フィルタ６＝データ６（ｔ）
Ｖ(ｔ）×セル＝ｉ(ｔ）×フィルタ７＝データ７（ｔ）
データセットはすべて他の数学的フィルタに付してもよい：
データ１＊データ２＊データ３＊データ４＊データ５＊データ６＊データ７        ＝データ最終
【０３９１】
個々のデータファイルはなおピークのように見えないかも知れない。しかし、共に相関させると、データ最終は標的被検体シグナルに特異的な特徴的応答を示し得る。最も単純な例ではすべてのフィルタが同じであり、最終の相関が単純に平均となる。あるいは適用した波形を変化させ得る：
Ｖ１(ｔ）×セル＝ｉ(ｔ）×フィルタ１＝データ１（ｔ）
Ｖ２(ｔ）×セル＝ｉ(ｔ）×フィルタ２＝データ２（ｔ）
Ｖ３(ｔ）×セル＝ｉ(ｔ）×フィルタ３＝データ３（ｔ）
Ｖ４(ｔ）×セル＝ｉ(ｔ）×フィルタ４＝データ４（ｔ）
Ｖ５(ｔ）×セル＝ｉ(ｔ）×フィルタ５＝データ５（ｔ）
Ｖ６(ｔ）×セル＝ｉ(ｔ）×フィルタ６＝データ６（ｔ）
Ｖ７(ｔ）×セル＝ｉ(ｔ）×フィルタ７＝データ７（ｔ）
再度、データに関する相関がデータ最終を得るために実施し得る。
ここでの例は周波数応答曲線である；１００Ｈｚの適用は１００Ｈｚフィルタにより、１ｋＨｚは１ｋＨｚフィルタなどとし、次いでピーク情報をプロットする。ピーク情報の特徴的曲線は陽性を意味する。
本明細書に概説するように、各セルの電極シグナルは実際に、セル＝ｉフェロセン＋ｉ静電容量＋ｉノイズに分解される。これはｉフェロセンがＥ１／２周辺を常に中心とするネルンスト分布をもつ唯一の部分であるべきであるという理由で使用され得る。数学的に好適な態様ではＶ１(ｔ）など、およびフィルタ１などの最適値を決定し、データに関する数学的相関を実施する。フェロセンはＥＴＭの一例としてのみ用いられる。
【０３９２】
好適な態様において、シグナル再生はシグナルの認識とバックグラウンド引き算を用いて実施する。この態様において、このアイデアはセル応答を２つの関数、すなわち、一方はシグナルを描写し、他方はバックグラウンドを形成させる関数に適合することである。一旦、関数が構築されると、シグナルはバックグラウンドを差引くことで応答から容易に再生される。このシグナル認識の機構は、シグナルが比較的よく知られた挙動をもつシステムに適用し得る。以下の例はどのようにかかる機構が本発明のシステムに適用し得るかを説明する。
【０３９３】
電気化学セルからの応答はロックイン増幅器により加工処理し得る。これはバンド幅狭窄技法のある形式を用い、バックグラウンドに対するシグナルを増大させる多くの方法の一つである。セル応答の第４の調和成分は２つの電流ベクトルＸ(ｖｄｃ）およびＹ(ｖｄｃ）により表される。電流の第４の高調波Ｘ(ｖｄｃ）およびＹ(ｖｄｃ）成分は２つの曲線により近似するが、各曲線は２つの関数から構成される（等式９および１０）
【数８】
0004530541.tif 000072
曲線（Ｆ１ｉ(Ｖｄｃ））の第一部分はファラデーシグナルの第４高調波に近似する改良ガウス分布の第３導関数である。第２成分（Ｆ２ｉ(Ｖ））はバックグラウンドに近似する第５次多項式である。
【０３９４】
アルゴリズムに使用される改良ガウス分布の分析的式を等式に示す：
等式１１
【数９】
0004530541.tif 000073
従って、等式１１の第３導関数は等式１２により与えられる：
等式１２
【数１０】
0004530541.tif 000074
改良ガウス（１２）の第３導関数は３つのパラメーターに左右される：Ａ０はシグナルの振幅を制御する；Ａ１は曲線の幅ならびに振幅を決定する；また、Ａ２はシグナルの中心または中間である。改良ガウス第３導関数の中心ピークの最大振幅は関係式（等式１３）に従うＡ０およびＡ１の関数である：
等式１３
【数１１】
0004530541.tif 000075
【０３９５】
等式１３における値は、改良ガウスの第４導関数のゼロ時、改良ガウスの第３導関数を評価することにより得られる。改良ガウスの第４導関数のゼロは式（等式１４）により与えられる：
等式１４
【数１２】
0004530541.tif 000076
等式１４はＡ０およびＡ１がどのように第４高調波においてシグナルの振幅を決めるかを説明せる。
【０３９６】
曲線適合およびピーク認識は、最小二乗法（Lawson et al., Solving Least Squares Problems, N.J. Prentice Hall (1974)）およびカイ二乗フィッティング（Bevington et al., Data Reduction and Error Analysis for the Physical Sciences, N.Y. McGraw Hill (1969); von Mises Mathematical Theory of Probability and Statistics, NY Academic Press (1964)）などの直線性モデルまたはレーベンベルグ−マルクアルト法（Marquardt, J. of the Society for Industrial and Applied Mathematics vol. 11, pp431-441）および他の非直線性最小二乗法（More, Numerical Analysis, Lecture Notes in Mathematics, vol. 630 Watson, Berlin: Springer-Verlag）などの非直線性モデルを用いてデータを合わせることにより達成し得る（参照：Press et al., Numerical Recipes in C, The Art of Scientific Computing, 2d Ed., N.Y. Cambridge University Press (1996); Forsyth et al, Computer Methods for Mathematical Computations (1977)）。我々の例で、我々はレーベンベルグ−マルクアルト・アルゴリズムを用い、等式９を電流ベクトルＸ(ｖｄｃ）およびＹ(ｖｄｃ）に最もよく適合させるＡｘおよびＡｙの最適セットを見出した。我々はＸ(ｖｄｃ）およびＹ(ｖｄｃ）と等式９および１０について等式１５および１６として２つの誤差係数を定義する。
【数１３】
0004530541.tif 000077
標準偏差はデータ・セットの各点に重みをつけ、通常は１とする。パラメーター（Ａ）の最適セットは誤差係数を最小化するようなものである。これは誤差係数の導関数がゼロに等しい場合に起きる。
等式１７および１８
【数１４】
0004530541.tif 000078
第２項を省略した後の誤差係数の第２導関数が等式１９および２０である：
【数１５】
0004530541.tif 000079
【０３９７】
等式１９および２０をテイラー級数に拡張することで、我々は以下のマトリックスを得る：
等式２１および２２：
【数１６】
0004530541.tif 000080
これは等式２３として表される：
【数１７】
0004530541.tif 000081
【０３９８】
レーベンベルグ−マルクアルト法は無次元数λをマトリックスαの対角線に取込み、収束性を速める。新たなマトリックスを次いで等式２４により定義する：
α'ｊｊ＝αｊｊ(１＋λ)
α'ｋｊ＝αｋｊ
ｋ≠ｊに対して
このシステムの等式はニュートン−ラフソン（アクトン（Acton）、適合する数値法、ワシントン：アメリカ数学学会、１９９０年；Press、上記）インタラクティブ式により解答を得る。Ａの良好な最初の推測により、この方法はデータを最良に表すＡの最適セットに集める。
【０３９９】
シグナル認識アルゴリズムの例は以下のとおりである。データを読み込んだ後、この適用ではＸに対する“良好な適合”を見出すことを先ず試みる。“良好な適合”は多くのパラメーター、例えば、“真の”走査と“最良の適合”間の最小平均二乗誤差（ＭＳＥ）などにより決定されるが（下記識別手法参照）、これらに限定されるものではない。現在この適用では先ずＸを０度で適合させようとする。もしこれが余りに“不適切な”適合であるならば、この適用ではＸにおけるシグナル（ピーク）を見出すことができず、現時点ではＩpまたはＥＯについての解答を得ることができない。これらの条件下、この適用では誤りコード（−９９９）を生じ、さらなる分析を遂行しなくなる。
【０４００】
もしＸについて“良好な適合”が見出されるならば、その場合、この適用ではＹについて“良好な適合”を見出そうとする。もし（まさしく‘もし’であるが）この適用において同じ角度でＸとＹについて“良好な適合”を見出し得るならば、それは続いてＩpとＥＯを解くことになる。現時点で、この適用では同じ角度でＸとＹについて“良好な適合”を見出し得ないならば、それは誤りコード（−９９９）を生じ、さらなる分析を遂行しなくなる。まさに一つの電流ベクトルに適合させることも可能であが、この特定のアルゴリズムは現在分析のために２つのベクトルを必要とする。この２つのベクトルの拘束を除くことにより、シグナル−バックグラウンド比が非常に小さい場合の認識を可能とする。
【０４０１】
ＸまたはＹのいずれかについて“良好な適合”を決定するためには、この適用では適合するアルゴリズムに使用する９つの係数について最初の“推測”を先ず規定しなければならない。この最初の推測は各角度においてＸおよびＹ両方についてなされなければならない。さらに、最初の“推測”は当初データおよびガウスの第３導関数のすでに記載された特徴に基づかねばならない。
最初の推測は以下のとおりである。最初の第５次数多項式は特異値分解法（Press、上記）を用いてデータに適合させる。この多項式は“当初の”データ（ＸまたはＹ）から差引かれる。もし我々がこの曲線の最大値および最小値がガウスの中心ピークに対応し、また中心ピークの位置が等式１４のｖ２およびｖ３により与えられるとすれば、その場合、我々は等式２４による改良ガウスの第３導関数適合化のために、良好な最初の推測を得ることができる：
【０４０２】
等式２４
【数１８】
0004530541.tif 000082
【０４０３】
多くの場合、シグナルの衛星ピークは中心ピークと間違え、そのためにアルゴリズムはデータに適合させ得ない。この“失敗”は等式２５をチェックすることにより検出される：
等式２５：
【数１９】
0004530541.tif 000083
等式２５が適正であるとすれば、これは適合の衛星ピークがガウス適合増幅の１／４以上により真のデータから分離されることを示している。これらの条件下で、我々は２つのパラメーターを規定した（等式２６および２７）：
等式２６および２７
【数２０】
0004530541.tif 000084
ただし、式中、Ｄは等式１４から得られたものであり、改良ガウスの第３導関数の２つのピーク間距離である。次いで、我々は同じ最初の条件下で等式２８および２９により新たな適合を試みた：
等式２８および２９
Ａ０ｎｅｗ＝−Ａ０ｏｌｄ
Ａ２ｎｅｗ＝Ａ２ｏｌｄ＋Ｄζ
【０４０４】
この二番目の適合に失敗するか、または等式２５が真正でなかった場合は、当初条件の３番目のセットをデータのフィットのために送り出した。当初条件の３番目のセットはＡ０＝−１であること以外、最初のものと同じであった。
計算された係数のセットがＸまたはＹのいずれかについて“良好な適合”を与えるかどうかを決定するためには多くの基準が使用される。ＸおよびＹ両方に対し特定次数に適用されるこれらの基準は以下のとおりである（適用の順に）。基準１は、良好な適合に対して“真の”データと適合間の差が最小でなければならないことを要する。それによって、我々は加重平均二乗誤差の項をコンピュータ処理し、一方、ＭＳＥは等式３０および３１におけるデータのガウス成分振幅により加重する（この値は予備的な第５次多項式適合を差引いたデータの最大値と最小値の差を取ることにより得られる）：
等式３０および３１
【数２１】
0004530541.tif 000085
この加重ＭＳＥ誤差は１×１０−３未満であるべきである。もしそうでなければ、我々は上記のように係数の幾つかを再規定し、データを再適合させる。
【０４０５】
第二の基準は、“良好な適合”に対してガウス項（Ａ１）の幅が典型的に１２と１４の間であるということである。このアルゴリズムは良好な適合として分類されるための適合として１０＜Ａ１＜２０とする。
この適合が最初の２つの基準を通過したならば、加重ＭＳＥは１×１０−２未満でなければならない。条件２または３のいずれかが失敗であるならば、この適用では角度を変え、もう一度３つの基準（１〜３）すべてを満足するように試行する。上記のように、もしこの適用がＸまたはＹに対する０度と４５度での３つの基準すべてを満足し得ないならば、ＩpおよびＥＯに対する解答を得ることができない（誤りコード＝−９９９）。
ＸおよびＹ両方に対して“良好な適合”が見出されたならば（すなわち、ＸおよびＹに対する適合が基準１〜３を通過したならば）、この適用は２つの最終基準に適用させる；一つはＸに対する適合をＹに対する適合と比較すること、今一つはＲに対する適合を“真の”Ｒに比較すること（走査）である。Ｘに対する適合をＹに対する適合と比較するためには、この適用ではＸおよびＹについての計算された（Ａ２ＸおよびＡ２ｙ）ＥＯ位置間の差を検討する。これら２つの値間の絶対差は５０ｍＶより大きくてはならない。この値は、適合アルゴリズムがＸまたはＹいずれかのデータの衛星ピークに中心ピークを適合させていないということを確証する。ピーク間の距離は改良ガウスの第３導関数極値の位置によって与えられる。
【０４０６】
ＸまたはＹいずれかにおいて“間違った”ピークに“ロックイン”することが可能である。例えば、もしＸが１８０ｍＶでのピークと２５０ｍＶでのピークを有するならば、この適用は２２５ｍＶでのピークを適合（見出）し得るが、もしＹに対するＥＯが１８０ｍＶに見出されるならば、両ＥＯにおける絶対差は５０ｍＶを越える原因となる。この場合を説明するために、もしＥＯ間の絶対差が５０ｍＶを越えるならば、コードはシフトし（Ａ２経由）、反転し（ＡＯ＝−ＡＯ）、ユーザーの規定した予測ＥＯから最も遠いシグナル（ＸまたはＹ）を再適合させる。このシフトは予測したＥＯの方向にある。もしシフトしたことと反転したことが適合を改善（＜加重ＭＳＥ）するならば、我々は新たに見出した係数を使用する；さもなければ、コードは以前の係数に戻り、ＥＯ分離誤差（誤りコード＝−７７７）を報告する。
Ｒに対する適合を真のＲ（走査）に比較するために、我々は等式３２の適合ＲＭＳにより分割したＩｐをコンピュータ処理する：
等式３２
【数２２】
0004530541.tif 000086
等式３２の値は経験的に決定された。もしＩｐ／ＲＭＳが３.７０未満であるならば、この適用は−８８８の誤りコードを与える。
【０４０７】
好適な態様において、この適用はＩｐおよびＥＯに答えを与える。この適用の変形において、ＸおよびＹは共にＩｐおよびＥＯに解答（陽性結果）を与えるために適合させねばならない。その理由はＲの振幅が等式３３として定義されるからである：
等式３３
【数２３】
0004530541.tif 000087
等式３４の関係を用い、唯一の成分（ＸまたはＹいずれか単独）からＲの振幅を引き出すことが可能である：
等式３４
【数２４】
0004530541.tif 000088
しかし、もし位相の情報が乏しいならば、等式３４を再構築するのは難しい。一旦ＸおよびＹについての適合が得られるならば、ピークの高さ（ＩｐまたはＧ'''ｍａｘ）およびシグナルの中心（ＥＯまたはＡ２）は以下の等式３５および３６により与えられる：
等式３５および３６
【数２５】
0004530541.tif 000089
もしこの適用により誤差なしにＩｐおよびＥＯを計算し得るならば、陽性の指標が示されるであろう（緑色光）。もし他方でこの適用によりユーザー定義の“設定”（定数を介して緑色／黄色または黄色／赤色を制御）内でこれらの値を計算し得ないならば、指標は黄色（限界陽性）または赤色（陰性結果）となるだろう。
【０４０８】
好適な態様においては、シグナルのスペクトル分析がなされる。この態様において、周波数領域におけるフィルタ技法は平均、分散、密度、自己相関関数、およびシグナルのパワースペクトル密度を使用し、それを本システムに適用し、シグナル−ノイズ比を高める（参照：Schwartz et al., Signal Processing: Discrete Spectral Analysis, Detection, and Estimation, N.Y. McGraw HIll, 1975；出典明示により本明細書の一部とする）。
好適な態様においては、デジタル・フィルタ技法を用いる。これらは整合フィルタ、ワイナー(Weiner）フィルタ、カルマン（Kalman）フィルタ、有限インパルス応答、有限インパルス応答、狭帯域フィルタなどを包含するが、これらに限定されるものではない。
【０４０９】
好適な態様においては、整合フィルタが使用される；整合フィルタはシグナルの処理技法であり、測定された応答（シグナルおよびノイズ）に“重みを加え”、ある種の対応する既知シグナル振幅により標本抽出し、それらを一緒に加えてノイズに対するシグナルを高める。
好適な態様においては、ワイナーフィルタが使用される（参照：Press上記；およびElliot et al., Fast Transforms: Algorithm, Analysis, Applications N.Y. Academic Press (1982)；両文献を出典明示により本明細書の一部とする）。ワイナーフィルタは“原形の損なわれた”シグナルからノイズまたはバックグラウンドを除去する最適なフィルタを見出すものである。このシグナル処理方法はフーリエ変換技法と関連して働く。この考えは以下のとおりである。ノイズまたは大きなバックグラウンドに対する乏しいシグナルにより、機器からの出力は“原形の損なわれた”シグナルである：
ｃ(ｔ）＝ｓ(ｔ）＋ｎ(ｔ）
ただし、式中、ｓ(ｔ）はシグナルであり、ｎ(ｔ）はノイズである。ｓ(ｔ）は我々が追跡するシグナルではなく、それはある既知応答関数ｒ(ｔ）により巻き込まれている真の原形の損なわれていないシグナルｕ(ｔ）から構成されているということに注目されたい（酸化還元対をもつＣＭＳシステムの場合には、ｒ(ｔ）はネルンスト関数である）。換言すると、
【数２６】
0004530541.tif 000090
である。
周波数空間において、その関係は以下のとおりである：
【数２７】
0004530541.tif 000091
（ただし、式中、Ｓ、Ｒ、およびＵはそれぞれｓ、ｒ、およびｕのフーリエ変換である）
【０４１０】
原形の損なわれていないシグナルは最適フィルタΦ(ｔ）またはそのフーリエカウンターパートΦ(ω)を見出すことにより回収し得るが、Φ(ω)は測定したシグナルｃ(ｔ）またはＣ(ω)に適用され、次いでｒ(ｔ）またはＲ(ω)により解き放たれた場合に、原形の損なわれていないシグナルｕ(ｔ）または
【数２８】
0004530541.tif 000092
をもつＵ(ω)に近似するシグナルを生じる。
一般に、最適フィルタは
【数２９】
0004530541.tif 000093
と定義される。
好適な態様においては、カルマンフィルタが使用されるが、これは変化するシグナルの電流値を追跡する再帰的評価フィルタ技法である。
【０４１１】
好適な態様において、非直線性調波応答は非対称応答を誘発することにより増大する。好適な態様において、これは非可逆的酸化還元対をもつシステムを使用することにより実施する。例えば、フェロセンは極めて可逆的な酸化還元対である。このように、所定のポイントでａｃ電圧により対となったフェロセンは、ａｃ電圧の上昇により酸化され、下降により還元される。しかし、もし半可逆的または非可逆的酸化還元対が使用されるなら、例えば、その分子は上昇により酸化され、下降により還元（または部分的）されない；またはその逆である。これが一定の周波数にてさらにより大きな非直線性を生じる。
これを実施する方法について３つの例を掲げる：ルミノールなど酸化型に分解されたＥＴＭ分子を用いる；同時還元または酸化還元の媒介を用いる；および酵素結合媒介を用いる。
【０４１２】
好適な態様においては、分解可能なＥＴＭが使用される。基本的に、この考えは以下のとおりである：もしシステムに使用されるＥＴＭがほんの僅かずつ各サイクルごとに劣化するならば、ＥＴＭによるシグナルは経時的に劣化するが、バックグラウンドのシグナルは劣化しない；経時的に変化するシグナルはバックグラウンドのノイズに対して一般に容易に検出し得る。一例がルミノールである；ルミノールは上昇時に酸化され、分子の一部分が化学反応を受けて（すなわち、Ｈ２Ｏ２が触媒となって）、その結果、新しい分子に変換される。ａｃ電圧の下降前に変換される分子は最早ａｃ電流に寄与することはない。ａｃ周波数と振幅を注意深く制御すると、この様式で挙動する分子の数を調整することができる。本発明のシステムに使用し得る可逆的酸化還元挙動を受けない分子の他の多くの例がある。ＤＮＡのグアニンそれ自体が一例である。
【０４１３】
好適な態様において、非直線性は同時還元的または同時酸化的システムを介して達成される。従って、同時還元剤または同時酸化剤（集約して同時酸化還元剤）がさらなる電子供給源または貯留体として使用される。一般的に参照：Sato et al., Bull. Chem. Soc. Jpn. 66: 1032 (1993); Uosaki et al., Electrochimica Acta 36: 1799 (1991); and Alleman et al., J. Phys. Chem. 100: 17050 (1996);これらの文献すべてを出典明示により本明細書の一部とする。
好適な態様において、溶液中の入力電子供給源は、電子伝達の開始に際し、好ましくは、拡散に制限のないＤＣ電流を用いるかまたはＡＣ周波数にて開始と検出を実施する場合に使用する。一般に、当業者が認めるように、好適な態様では最少の“穿孔”を含む単層、例えば、システムのショート（短絡）を回避するような単層を利用する。これは幾つかの一般的方法で実施し得る。好適な態様において、入力電子供給源は標識プローブのＥＴＭより低いまたは同等の酸化還元能力をもつものが使用される。このように、入力電子供給源の酸化還元能力を越えた電圧では、ＥＴＭと入力電子供給源双方が酸化され、その結果として電子を供与する；ＥＴＭは電極に電子を供与し、入力供給源がＥＴＭに供与する。例えば、実施例に記載したように、本発明の組成物に付着したＥＴＭとしてのフェロセンは、水溶液中において大よそ２００ｍＶの酸化還元能力をもつ（この能力は、フェロセンが何に結合しているか、その結合の様式、および何らかの置換基の存在に影響を受けて有意に変化し得る）。フェロシアニドも電子供給源であり、同様に（水溶液中において）大よそ２００ｍＶの酸化還元能力をもつ。従って、大よそ２００ｍＶの電圧で、またはそれ以上で、フェロセンはフェリセニウムに変換され、それが次いで電子を電極に伝達する。フェリシアニドも酸化されて、ＥＴＭに電子を伝達し得る。この様式において、電子供給源（または同時還元剤）は、電子供給源分子が核酸に付着したＥＴＭに迅速に繰返し電子を供与するにつれて、システム内に発生するシグナルを増幅するように作用する。電子の供与または受容の速度は、同時還元剤の拡散速度、同時還元剤とＥＴＭ間の電子伝達（濃度とサイズにより影響される）などにより制限される。
別法として、ＥＴＭよりも低い酸化還元能力をもつ入力電子供給源が使用される。ＥＴＭの酸化還元能力未満の電圧ではあるが、電子供給源の酸化還元能力よりも高い電圧では、フェロシアニドなどの入力供給源は酸化され得ず、その結果ＥＴＭに電子を供与し得ない；すなわち、電子伝達は起こらない。フェロセンは酸化されると、そこには電子伝達用の経路が存在する。
【０４１４】
代わり得る好適な態様において、入力電子供給源は標識プローブのＥＴＭよりも高い酸化還元能力を有するものが使用される。例えば、電子供給源であるルミノールは大まかに７２０ｍＶの酸化還元能力を有する。ＥＴＭの酸化還元能力よりも高いが、電子供給源の酸化還元能力よりも低い電圧、すなわち、２００〜７２０ｍＶでフェロセンが酸化され、導電性オリゴマーを介して電極に１個の電子を伝達する。しかし、ＥＴＭはルミノール電子供給源からの如何なる電子も受容し得ない；その理由は電圧がルミノールの酸化還元能力よりも低いからである。しかし、ルミノールの酸化還元能力で、またはそれ以上では、ルミノールがＥＴＭに電子を伝達し、迅速な繰返し電子伝達を可能にする。この様式で、電子供給源（または同時還元剤）は、電子供給源分子が標識プローブのＥＴＭに電子を迅速に繰返し供与するにつれて、システム内に発生したシグナルを増幅するのに役立つ。
【０４１５】
ルミノールは酸化により化学発光種になるというさらなる利点を有し（参照：Jirka et al., Analytica Chimica Acta 284: 345 (1993)）、それによってＥＴＭから電極へ向かう電子伝達の光検出を可能とする。このように、ルミノールが直接電極と接触し得ない限り、すなわち、電極への有効な電子伝達経路が存在しないようなＳＡＭの存在下で、ルミノールは標識プローブ上のＥＴＭに電子伝達することによりのみ酸化され得る。ＥＴＭが存在しない場合、すなわち、標的配列が本発明の組成物にハイブリダイズしない場合、ルミノールは有意に酸化されず、光子放出が低く、その結果ルミノールからのシグナルは（存在するとしても）低いものとなる。標的の存在下では、相当に大きなシグナルが生成する。このように、光子放出によるルミノール酸化を測定することは、ＥＴＭが電極に電子を供与する能力を間接的に測定することである。さらに、光子検出は一般に電子検出よりもより感度が高いので、システムの感度が向上し得る。当初の結果は、発光が過酸化水素濃度、ｐＨ、およびルミノール濃度に左右され、その後者は非直線性であると思われることを示唆した。
適切な電子供給源分子は技術上周知であり、フェリシアニドおよびルミノールなどを包含するが、これらに限定されるものではない。
【０４１６】
別法として、出力電子受容体または貯留体が使用し得る；すなわち、上記の反応が逆に進行し、メタロセンなどのＥＴＭが電極から電子を受容し、メタロセンをメタリセニウムに変換し、出力電子受容体が次いで迅速に繰返し電子を受容する。この態様においては、コバルチセニウムが好適なＥＴＭである。
この態様において、非直線性は、同時還元剤が電流に寄与はするが、酸化電流に対してのみであって、還元側には寄与しない（同時酸化剤ではこの逆）という理由で達成される。
好適な態様において、非直線性はグルコースペルオキシダーゼ・バイオセンサーなどの酵素結合反応の使用を介して達成される。これらのセンサは我々の同時還元センサと同様の挙動を示す。しかし、応答の非直線性を観察するのが有利である。
【０４１７】
好適なシステムでは、奇数の高調波が全時間二重のピークを生じるように見えると思われる。偶数の高調波は常に１つのピークを与える。また、偶数ピークは奇数よりも約１０倍大きい。思い起こしてもらいたいのは、可逆性対では、ピークの３個が高調波の数であり、２は２、３は３、等々ということである。
【０４１８】
好ましい実施態様において、交流電流(ＡＣ)方法を使用して電子伝達を開始する。さらに交流技法を用いると、ＥＴＭ以外の物質によるすべての単一周波数でのバックグラウンドシグナルの顕著な低下をもたらす。すなわち、望まないシグナルの“閉め出し”または“濾去”である。溶液中の電荷キャリヤーすなわちレドックス活性分子の周波数応答が、その拡散係数および電荷伝達係数によって制限される。従って、高周波数では、電荷キャリヤーはその電荷を電極に伝達するのに十分速く拡散し得ず、および／または電荷伝達速度が十分に速くない。このことは、適切な単層を用いない場合あるいは部分的または不完全な単層を用いる場合、すなわち溶媒が電極に到達し得ない場合に著しい。すでに概記したように、直流技法において、電極に溶媒が到達し得る“ホール”の存在は、システムの“短絡”溶媒電荷キャリヤーをもたらすことがある。すなわち、電極への到達およびバックグラウンドシグナルの生成である。しかし、現在の交流技法を利用すると、１以上の周波数が選ばれて、単層の存在・不存在にかかわらず溶液中の１以上の電荷キャリアーの周波数応答を防ぐ。このことは血液などの多くの生物体液が、アンペロメトリー検出を妨害し得るレドックス活性分子を顕著な量で含有しているので、特に意味がある。
【０４１９】
好ましい実施態様において、システムの測定は少なくとも２つの単離された周波数で行われ、複数の周波数の測定が好ましい。複数の周波数には走査がある。例えば交流電流は、１−２０Ｈｚなどの低い入力周波数で、１０−１００ｋＨｚなどの高い周波数での出力シグナルに対する応答と比較すると、ＥＴＭの存在の有無による周波数応答の相違を示す。好ましい実施態様において、周波数は少なくとも２、好ましくは約５、さらに好ましくは少なくとも約１０周波数で測定される。
【０４２０】
電子伝達を開始するために入力シグナルを伝導した後に、出力シグナルが受けられ、すなわち検出される。出力シグナルの存在および増大は多くの因子に依存する。すなわち、入力シグナルの過電位／振幅；入力交流シグナルの周波数；介在媒体の組成物；直流オンセット；システムの環境；ＥＴＭの性質；溶媒；塩の種類と濃度である。１つの与えられた入力シグナルにおいて、出力シグナルの存在および増大は、一般的にＥＴＭの存在の有無、単層表面からのＥＴＭの位置と距離および入力シグナルの性質に依存する。いくつかの実施態様において、標識プローブの非特異的結合と標識プローブを含む標的特異的アッセイ複合体の形成との相違をインピーダンスに基づき識別することは、可能である。
【０４２１】
好ましい実施態様において、出力シグナルは交流電流を含む。上記したように、出力電流の大きさはパラメーターの数に依存する。これらのパラメーターを変えると、数においてシステムが最適化される。
【０４２２】
本発明で生じる交流電流は一般的に、約１femptoamp−約１milliampにあり、約５０femptoamp−約１００microampが好ましく、約１picoamp−約１microampが特に好ましい。
【０４２３】
好ましい実施態様において、出力シグナルは入力シグナルに比較すると交流素子でシフトする位相である。理論にとらわれることなしに、本発明のシステムを充分にユニホームにすると、位相シフトの検出が可能となるようである。すなわち、本発明の電子伝達が起きるバイオ複合体は、均質に交流入力と反応し、これは標準の電子素子と同じであり、位相シフトが測定できる。このことは、ＥＴＭの存在の有無の検出の基礎として、および／または標識プローブを含む標的特異的アッセイ複合体の存在とシステム成分に対する物質の非特異的結合との差異として働く。
【０４２４】
出力シグナルはＥＴＭの存在を特徴とする。すなわち出力シグナルは、標識プローブとＥＴＭを含む標的特異的アッセイ複合体の存在を特徴とする。好ましい実施態様において、検出の基礎は、アッセイ複合体の形成の結果としてのシステムのファラデーインピーダンスの相違にある。ファラデーインピーデンスは、電極とＥＴＭの系のインピーデンスである。ファラデーインピーデンスはバルクすなわち２電子インピーデンスとまったく異なり、バルクインピーデンスは電極間のバルク溶液のインピーデンスである。多くの因子がバルクインピーデンスに作用しないファラデーインピーデンスを変えることができ、その逆も可能である。このように核酸を含む本系のアッセイ複合体は一定のファラデーインピーデンスを有し、これはＥＴＭと電極の距離、その電子的性質、介在媒体の組成物などに依存している。本発明方法で重要なことは、ＥＴＭと電極との間のファラデーインピーダンスが、ＥＴＭを含む標識プローブが電極に特異的または非特異的に結合するかどうかにより非常に異なることである。
【０４２５】
従って、本発明はさらに、本発明の組成物を用いて被検体を検出するための電子器具または装置を提供する。この装置は、少なくとも第一測定すなわちサンプル電極および第二測定または逆電極を有する、サンプル溶液受取用の試験室を含む。３電極系も用いられる。第一および第二測定電極は試験サンプル受け領域に接触し、液体試験サンプルの存在下で、2つの電気泳動電極は電子的に接触していてもよい。
【０４２６】
好ましい実施態様において、第一測定電極は、取付リンカー、および上述の伝導性オリゴマーを含む単層を介して共有結合した一本鎖核酸捕獲プローブを含む。
【０４２７】
装置は、試験室すなわち測定電極に電気的に連結した交流電圧源を含む。好ましくは、交流電圧源はオフセット電圧も同様に放出し得る。
【０４２８】
好ましい実施態様において、装置はさらに、入力シグナルと出力シグナルとを比較し得るプロセッサーを含む。プロセッサーは電極に結合しており、出力シグナルを受けるように配置され、表面ヌクレオシドの存在を検出する。
従って本発明の組成物は、種々の研究、臨床、品質管理、野外試験などに用いられる。
【０４２９】
好ましい実施態様において、これらのプローブは遺伝子診断に使用される。例えば、本明細書中に開示した技術を使用して、プローブを、例えば、非茸腫結腸癌遺伝子、ＢＲＣＡ１胸部癌遺伝子、各種の癌関連遺伝子であるＰ５３、アルツハイマー病の最大リスク指標であるアポＥ４遺伝子、などの標的配列を検出するために調製し、患者の前駆症状スクリーニング、全身性繊維症遺伝子変異、あるいはその他の当技術分野で周知のすべてを容易にすることができる。
【０４３０】
別の実施態様では、ウイルスおよびバクテリアの検出は、本発明の複合体を使用して実施できる。この実施態様では、プローブは、各種ウイルスおよびバクテリアから標的配列を検出するためにデザインされる。例えば、現今の血液スクリーニングは坑ＨＩＶ抗体の検出に依存している。本明細書中に開示した方法は、臨床サンプルのＨＩＶ核酸配列、殊に高度に保存性のＨＩＶ配列を検出する直接スクリーニングを可能とする。さらにこれは、坑ウイルス治療の効果を評価する改良方法として、患者の体内を循環しているウイルスを直接モニターすることを可能とする。同様に、リューケミア関連ウイルス、ＨＬＴＶ−IやＨＬＴＶ−IIをこの方法で検出することができる。バクテリア感染症、例えば、結核、クリミディアおよび他の性的伝染症も検出できる。
【０４３１】
好ましいある実施態様では、本発明の各核酸は、水あるいは食品サンプルのスクリーニングにおいて毒性バクテリアのプローブとしても使用される。例えば、各サンプルは、バクテリアを溶解処理してその核酸を遊離させ、次いでバクテリア株を認識するようにプローブをデザインする。但し、該バクテリアは、Salmonella, Campylobacter, Vibrio cholerae, Leishmania,  腸毒性のE. Coli株、およびレジオネア病バクテリア、などの病原性株を含むがそれらに限定はされない。同様にして、本発明の組成物を使用して生体治癒戦術を、評価できる。
【０４３２】
さらなる実施態様では、犠牲者や容疑者から採取したサンプルについて、犯罪−現場を一致させる法医学的「ＤＮＡ指紋鑑定」に使用される。
【０４３３】
さらなる実施態様では、あるアレイ配列のプローブは、ハイブリダイゼーションによる配列決定に使用される。
【０４３４】
このように、本発明は、ある実施態様においては、ハイブリダイズしていないプローブを除去することなく標的配列を検出し得る、極めて特異的で感受性の高いプローブを提供するものである。これは、自動化遺伝子プローブアッセイの形成に有用である。
【０４３５】
あるいは、本発明の組成物は、ＰＣＲにおける成功した遺伝子増幅を検出するのに有用であり、かくして成功したＰＣＲ反応を標的配列の存在または不存在の指標とすることができる。ＰＣＲはこのような手法で数種の方法に使用される。例えば、ある実施態様では、このＰＣＲ反応は当技術分野で知られているようにして実施され、次いで、標的核酸とＥＴＭとを含む本発明の組成物に加え、伝導性オリゴマーを介して電極に共有結合させ、続いて標的配列を検出する。あるいは、ＥＴＭで標識化したヌクレオチドを用い、電極の存在下にまたは続いて電極を加えるかのいずれかで、伝導性オリゴマー及び標的核酸とともにＰＣＲを実施する。ＥＴＭを含有するＰＣＲ生成物の電極組成物との結合は、電子移動により検出される。最終的に、伝導性ポリマーを介して電極に結合した核酸は、ＥＴＭで標識化した第二プライマーの添加により、ＰＣＲプライマーの１種となるだろう。伸長させると、ＥＴＭおよび共有結合した電極を有する２本鎖核酸を生じる。このような方法で、本発明は各標的配列のＰＣＲ検出に使用される。
【０４３６】
好ましいある実施態様では、これらの配列はｍＲＮＡ検出に使用される。好ましいある実施態様は、これらのｍＲＮＡの３’ポリアデニル化末端近くにハイブリダイズする捕獲プローブまたは捕獲伸長プローブのいずれかを利用するものである。これにより、標的結合プローブの１種、即ち、ｍＲＮＡ標的のポリ−Ａ末端と結合するポリ−Ｔ部分を含有するプローブ、を標的に使用することが可能となる。一般的に、このプローブは、好ましくは非ポリ−Ｔであり、検出プローブ（または他のプローブ）と結合する第二部分、を含有する。これにより、１種標的結合プローブの調製、および、異種プローブ合成実施量の減少が可能となる。
【０４３７】
好ましいある実施態様では、制限酵素およびライゲーション手法を使用することにより、「ユニバーサル」アレイ配列の創製が可能となる。この実施態様では、図６に一般的に示した、制限エンドヌクレアーゼ末端を含む捕獲プローブを含む単層である。核酸の相補的部分を利用することにより、「粘着性末端」を残しつつ、制限エンドヌクレアーゼ部位のすべてを含むアレイ配列が調製される。これらの制限エンドヌクレアーゼの１種またはそれ以上で標的サンプルを処理することにより、それらの標的をアレイ配列に結合させることが可能となる。これは、標的の配列を知らなくても実施できる。それらの標的は、所望により、標準的手法例えばリガーゼを用いてライゲートされ得、そして標準的標識または本発明方法のいずれかを使用して標的配列を検出できる。
【０４３８】
本発明は、核酸類を感受性よく検出し得る方法を提供するものである。好ましい実施態様では、約１０×１０６以下、好ましくは約１０×１０５以下、より好ましくは約１０×１０４以下、特に好ましくは約１０×１０３以下、最も好ましくは約１０×１０２以下の分子が検出される。これは標的配列とレポーター分子との１：１相関を推認するものであり、もし各標的配列に対して１以上のレポーター分子（即ち、電子伝達分子）を使用すれば、感受性がより高くなるはずであることは、当業者には明かであろう。
【０４３９】
現今、検出限界は刊行物発表されたＤＮＡを介しての電子伝達率に基づいて評価されており、それは大まかに言って、８ベースペア分離につき１×１０６電子／秒／デュープレックスであり（Meade et al., Angw. Chem. Eng. Ed., 34:352 (1995)参照) 、高い推進力、約１００ｋＨｚのＡＣ振動数を可能とするものである。予試験結果が示しているように、これらのシステムを介しての電子伝達は、極めて効率的であり、ほぼ１００×１０３電子／秒に達し、非常に僅かの分子に対しても有力でフェムトアンプな感受性をもたらす。
【０４４０】
本明細書中に引用したすべての参照文献は、参照によりそれらの全部を本書中の記載として導入する。
【０４４１】
実施例
実施例１
基板および単層の一般的作製法
基板上のＳＡＭ形成−一般手法
自己集合単層は清浄金表面に形成した。金表面は様々な異なる方法で調製することができる；溶融または研磨金線；ガラスまたは雲母またはシリコン・ウエハーまたはある種の他の基板にスパッタもしくは蒸着した金；回路基板材料またはガラスまたはシリコンまたはある種の他の基板に電気メッキもしくは無電解メッキした金。真空蒸着金サンプル（減圧およびスパッタ）および溶液析出金サンプル（無電解および電気メッキ）双方について、好適な機械的安定性を保証するために、基板と金との間に粘着層を使用しなければならない。クロム、チタン、チタン／タングステンまたはタンタルが多くの場合スパッタおよび蒸着金と共に採用される。電気メッキしたニッケルは通常電気メッキおよび無電解メッキした金と共に採用され、他の粘着材料が使用し得る。
金基板は単層を形成する前に清浄にする。様々な異なる手法が採用されている。化学溶液による浄化が最も一般的である。ピランハ溶液（過酸化水素／硫酸）または王水（塩酸／硝酸）清浄化が最も一般的であるが、電気化学的方法、火炎処理、プラズマ処理法なども採用されている。
【０４４２】
清浄化に続いて、金基板は析出溶液中でインキュベートする。析出溶液は溶媒中種々チオールの混合物を含む。エタノールなどの有機溶媒中アルカンチオールの混合物が最も一般的な手法であるが、様々な変法も開発されている。替わり得る手法としてはアルカンチオールの気相析出、微小接触プリンティング、ニート・チオールを使用する析出、水性溶媒からの析出などであるが、２工程手法が開発されている。析出溶液におけるアルカンチオールの濃度はモルないしサブミクロモルの範囲であり、０.５〜２.０ミリモルの範囲が最も一般的である。金基板はその手法に応じて１秒以下ないし数日間、析出溶液と接触させ、インキュベート／静置する。最も一般的な時間は１時間ないし一夜のインキュベーションである。インキュベーションは通常室温で実施するが、５０℃までの温度が一般的である。
【０４４３】
ＤＮＡを含む混合単層は通常２工程手法により調製する。チオール化ＤＮＡは第一析出工程に際して析出し、混合単層形成はＤＮＡを含まない第二チオール溶液を加える第二工程で完了する。第二工程は多くの場合緩和な加熱であり、単層の再構成を促進する。
【０４４４】
ＳＡＭ形成の一般手法−有機溶液からの析出
浄化金表面を浄化バイアルに入れた。ＤＮＡ析出有機溶媒溶液を調製し、総チオール濃度を４００μＭと１.０ｍＭの間とした。析出溶液はチオール修飾ＤＮＡとチオール希釈分子とを含んでいた。ＤＮＡと希釈剤との比は通常１０：１と１：１０の間にあり、好ましくは１：１であった。好適な溶媒は、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）またはその混合物である。十分な量のＤＮＡ析出溶液をバイアルに加え、電極表面が完全に蔽われるようにする。金基板は外界温度または僅かに高い温度で５〜３０分間インキュベートする。最初のインキュベーションの後、析出溶液を除き、希釈分子のみの有機溶媒溶液（１００μＭ〜１.０ｍＭ）を加える。金基板は室温または室温より高い温度で完全な単層が形成されるまで（１０分ないし２４時間）インキュベートする。金サンプルを溶液から取出し、浄化溶媒中ですすぎ、使用する。
【０４４５】
ＳＡＭ形成の一般手法−水性溶液からの析出
浄化金表面を浄化バイアルに入れる。ＤＮＡ析出水性溶液を調製し、総チオール濃度を１μＭと２００μＭの間とする。この水性溶液は多くの場合、塩を含む（約１Ｍ）が、精製水を使用してもよい。析出溶液はチオール修飾ＤＮＡとしばしばチオール希釈分子とを含んでいる。ＤＮＡと希釈剤との比は通常１０：１と１：１０の間にあり、好ましくは１：１である。電極表面が完全に蔽われる容量のＤＮＡ析出溶液をバイアルに加える。金基板は外界温度または僅かに高い温度で１〜３０分間インキュベートするが、通常５分で十分である。最初のインキュベーションの後、析出溶液を除き、希釈分子のみの水性溶液または有機溶媒溶液（１０μＭ〜１.０ｍＭ）を加える。金基板は室温または室温より高い温度で完全な単層が形成されるまで（１０分ないし２４時間）インキュベートする。金サンプルを溶液から取出し、浄化溶媒中ですすぎ、使用する。
【０４４６】
Ａｕボール電極上の単層
Ａｕボール電極の創製：かみそりの刃を使用し、金線（直径１２７μｍ、９９．９９％純度、アルドリッチから）を１０ｃｍの長さに切断する。１６ゲージの針を使用し、金線を＃４天然ゴム隔壁（１／２ｍＬのＰＣＲエッペンドルフ・チューブに適合するサイズ）を通す（これは金線を支持し、析出に際しチューブを密封する。下記参照）。浄化焼成火炎（メタンまたはプロパン）を使用し、金線の１センチメートルを溶融して金線末端に付着した球体を形成する。金線の長さを調整し、ＰＣＲチューブに封入したときに、金ボールが底部近傍に位置して２０μＬの液体に没入し得るようにする。使用当日に、電極を王水（４：３：１のＨ２Ｏ：ＨＣｌ：ＨＮＯ３）に２０秒間浸け、次いで水で十分にすすぐ。
【０４４７】
誘導化：ＰＣＲチューブ中、析出溶液（ＤＭＦ中８３３μＭ総量で２：２：１ＤＮＡ／Ｈ６／Ｍ４４）２０μＬ量をＰＣＲブロック上で５０℃に５分間加熱する。次いで、各電極を析出溶液に浸け（金ボールが沈む程度−金線の“柄”はできるだけ少なくする）、室温に移す。電極をＰＣＲチューブに移す前に、ＤＭＦ中２００μＬの４００μＭ−Ｍ４４で１５分間インキュベートする（金線の多くを同様に沈める）。Ｍ４４中に室温で５分間放置し、次いで、ＰＣＲブロック上に載せ、ＨＣＬＯＮＧを実施する。電極をＭ４４溶液から取出し、６×ＳＳＣに浸け、ハイブリダイゼーション溶液２０μＬを容れたＰＣＲチューブに入れる。ＡＣＶ測定に先立ち電極を６×ＳＳＣに浸ける。
ＨＣＬＯＮＧ：６５℃２’、−０.３℃／ｓ〜４０℃、４０℃２’、＋０.３℃／ｓ〜５５℃、５５℃２’、−０.３℃／ｓ〜３０℃、３０℃２’、＋０.３℃／ｓ〜３５℃、３５℃２’、−０.３℃／ｓ〜２２℃。
【０４４８】
回路基板の製造
両側に半オンスの銅箔をもつＦＲ−４の１８”×２４”×０.０４７”パネル（ジェネラル・エレクトリック）に明細どおりに穿孔した（ガーバー・ファイル）。ＦＲ−４パネルは無電解銅でメッキ（５００マイクロインチ）して特定の穿孔を電導性とし、次いでパネルにはさらに５００マイクロインチの電気メッキ銅を貼り付ける。銅メッキに続いて、パネルは塩化第二銅エッチング（酸エッチング）により明細どおりにエッチングする。次いで、エッチングしたパネルに光沢剤を有する４００マイクロインチの電気メッキニッケルを張付け、次いで５０マイクロインチの軟質金（９９．９９％純度）を貼り付ける。金パネルにはその両側に液状光画像形成蝋マスク（プロビマー５２、チバ−ガイギー社）を被覆する。画像形成を明細どおりに実施する。直径２５０ミクロンの１４個のセンサー電極と２個のより大きい電極（直径５００ミクロン）を、基板の縁に金貼付け接点につながる絶縁リード線と共に創製する。次いで、蝋マスク化パネルに明細どおりに刻み目を入れ、１”×１”の個々のウエアーを創製する。銀／塩化銀のペーストを２個の大きい方の電極（ＥＲＣＯＮ Ｒ−４１４）の一方に塗付する。次いで、パネルをアルゴン／酸素プラズマ混合物でプラズマ浄化する。浄化に続いて、パネルは箔を内張りしたバッグに入れ用時まで保存する。
【０４４９】
回路基板上の単層析出
回路基板を箔内張りバッグから取出し、１０％硫酸溶液中に３０秒間浸漬する。硫酸処理に続き、基板をミリ−Ｑ水に２回それぞれ１分間浸漬する。基板は次いで窒素気流下で乾燥する。基板を調湿チャンバー内のＸ−Ｙテーブルに置き、ＤＮＡ析出溶液の３０ナノリットル液滴を１４個の電極それぞれに載せる。ＤＮＡ析出溶液は、３３μＭチオール化ＤＮＡ、３３μＭ２ユニットのフェニルアセチレンワイヤ（Ｈ６）、および６×ＳＳＣ（９００ｍＭ塩化ナトリウム、９０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７）ｗ／１％トリエチルアミン中の１６μＭ−Ｍ４４を含む。液滴を室温で５分間インキュベートし、次いで、液滴はミリＱ水浴中ですすぎ取除く。基板をアセトニトリル中Ｍ４４の４５℃浴に浸漬する。３０分後、基板を取出し、アセトニトリル浴に３０秒、次いでミリＱ水浴に３０秒間浸漬する。基板を窒素気流下に乾燥する。
【０４５０】
実施例２
標的配列の検出
回路基板上の単層析出
上記のように、回路基板を箔内張りバッグから取出し、１０％硫酸溶液中に３０秒間浸漬する。硫酸処理に続き、基板をミリ−Ｑ水に２回それぞれ１分間浸漬する。基板は次いで窒素気流下で乾燥する。基板を調湿チャンバー内のＸ−Ｙテーブルに置き、ＤＮＡ析出溶液の３０ナノリットル液滴を１４個の電極それぞれに載せる。ＤＮＡ析出溶液は、３３μＭチオール化ＤＮＡ、３３μＭ２ユニットのフェニルアセチレンワイヤ（Ｈ６）、および６×ＳＳＣ（９００ｍＭ塩化ナトリウム、９０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７）ｗ／１％トリエチルアミン中の１６μＭウンデセン−１−エン−１１−イルトリ（エチレングリコール）（（ＨＳ−ＣＨ２)１１−(ＯＣＨ２ＣＨ２)３−ＯＨ）を含む。３個の電極にＤＮＡ１（５’−ＡＣＣＡＴＧＧＡＣＡＣＡＧＡＴ(ＣＨ２)１６ＳＨ−３’）含有溶液をスポットした。４個の電極にはＤＮＡ２（５’ＴＣＡＴＴＧＡＴＧＧＴＣＴＣＴＴＴＴＡＡＣＡ（ＣＨ２)１６ＳＨ−３’）含有溶液をスポットした。４個の電極にはＤＮＡ３（５’ＣＡＣＡＧＴＧＧＧＧＧＧＡＣＡＴＣＡＡＧＣＡＧＣＣＡＴＧＣＡＡＡ(ＣＨ２)１６ＳＨ−３’）をスポットした。３個の電極にはＤＮＡ４（５’−ＴＧＴＧＣＡＧＴＴＧＡＣＧＴＧＧＡＴ(ＣＨ２)１６ＳＨ−３’）をスポットした。析出溶液を室温で５分間インキュベートし、次いで、液滴はミリＱ水浴中ですすぎ取除く。基板をアセトニトリル中Ｍ４４の４５℃浴に浸漬する。３０分後、基板を取出し、アセトニトリル浴に３０秒、次いでミリＱ水浴に３０秒間浸漬する。基板を窒素気流下に乾燥し、窒素ガスを吹き込んだ箔内張りバッグに使用時まで保存する。
【０４５１】
ハイブリダイゼーションおよび測定
修飾した基板を箔内張りバッグから取出し、射出成形サンプル・チャンバー（カートリッジ）を取付けた。チャンバーは両面粘着テープで基板に接着したが、その総容量は２５０マイクロリットルであった。ハイブリダイゼーション溶液を調製した。この溶液は１０ｎＭのＤＮＡ標的（５’−ＴＧＴＧＣＡＧＴＴＧＡＣＧＴＧＧＡＴＴＧＴＴＡＡＡＡＧＡＧＡＣＣＡＴＣＡＡＴＧＡＧＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＴＧＧＧＡＴＡＧＡＧＴＣＡＴＣＣＡＧＴ−３’)（Ｄ−９９８）、３０ｎＭシグナル・プローブ（Ｄ−１０５５)および１０ｎｍ ５’−ＴＣＴＡＣＡＧ(Ｎ６)Ｃ(Ｎ６)ＡＴＣＴＧＴＧＴＣＣＡＴＧＧＴ−３’（Ｎ６はＰＣＴ／ＵＳ９９／０１７０５の図１Ｄに示されている；ヌクレオシドのリボース２’酸素に４炭素鎖により連結したフェロセンを含む）を含む。
【０４５２】
シグナリング・プローブは以下のとおりである：
5'-(C23)4-N87-N87-N87-N87-ATC CAC GTC AAC TGC ACA-3'(D- 1055)
I   I   I  I
C23 C23 C23 C23
C23 C23 C23 C23
C23 C23 C23 C23
C23 C23 C23 C23
Ｎ８７はリング構造を含んでなる分岐点である。Ｃ２３はＰＣＴ／ＵＳ９９／０１７０５の図１Ｆに示されている。２５％キアゲン（Qiagen）溶解バッファーＡＬ、４５５ｍＭ−ＮａＣｌＯ４、１９５ｍＭ−ＮａＣｌ、１.０ｍＭメルカプトヘキサノールおよび１０％仔ウシ血清を含む溶液中、２５０マイクロリットルの混成溶液をカートリッジに注入し、１２時間ハイブリダイズさせた。１２時間後、ハイブリダイズしたチップは切換え回路構成をもつ自家製相互コンダクタンス・アンプに挿し込んだ。相互コンダクタンス増幅器はコンピューターＤＡＱからのＤＣランプおよびロックイン増幅器（ＳＲ８３０スタンフォード・インストルーメント）からのＡＣ正弦波を組合わせる加算回路構成を備えていた。各電極は連続的に走査し、データをセーブし、ラブビュー(Labview）(ナショナル・インストルーメント）を用い設計した自家製プログラムにより操作した。チップはＤＣ−１００ｍＶと５００ｍＶ（疑似Ａｇ／Ａｇ／Ｃｌ参照電極）間で、２５ｍＶ（５０ｍＶピーク対ピーク）、１０００Ｈｚ重畳正弦波により走査した。出力電流はロックイン増幅器に供給し、１０００Ｈｚシグナルを記録した（ＡＣＶ技法）。パッド各セットのデータを蓄積し、平均した。
【表１】
0004530541.tif 000094
【０４５３】
実施例３
シグナル処理に対するＦＦＴの使用
ロックイン増幅器を除いて、ＦＦＴシステムの前後エレクトロニクスはアナログ機器と本質的に同じである。ＤＣ電位ランプ上に載せたＡＣ電圧がバイオチップを掃引する。チップの出力電流はトランスインピーダンス増幅器を通過し、そこでシグナルは増幅され、ボルトに変換される。この時点で、ロックイン増幅器に向かう替りに、シグナルは直接デジタル化され、分析される。最近、我々はデジタル化の前に抗エイリアスフィルタを加えた。この抗エイリアスフィルタはデジタル化に先立ち対象周波数上の白色雑音を削減するのに使用する。デジタル化前に高周波数を濾過することが必要であるが、その理由はアナログ−デジタル変換（ＡＤＣ）後のフィルタは、もし我々が我々のシグナル帯域幅を制限しないならば、エイリアス効果を受けるからである。アナログ抗エイリアスフィルタは実質的に高極または順位低域フィルタである。
【０４５４】
シグナルはアナログ−デジタル変換器（例えば、１２ビット、１.２５ＭＳ／ｓデータ捕捉カード、ナショナル・インストルーメント（ＮＩ−ＤＡＱモデルＰＣＩ−ＭＩＯ−１６Ｅ−１）を用いてデジタル化する。注文作製によりラボビュウ（Labview）プログラムを開発し、データを分析した。代表的には、１.２５×１０６サンプルはウインドウなしに１２.５秒間１００ｋＨｚで捕捉した。これらの値は以下のファクターに基づき選択した：１）我々が分析しようとするサンプル数を制限する計算時間を急速化することへの要望、および２）エイリアス効果を最小とすること。そこで、我々は一回当たりのサンプル数を１.２５×１０６とし、ｆサンプルリング＝１００ｋＨｚとすることを最適とした。サンプリング速度がアナログ−デジタル変換（ＡＤＣ）の発生回数を決めることを思い起こされたい。急速なサンプリング速度がサンプリング時間内により多くのポイントを捕捉し、従って、遅速サンプリング速度よりも最初のシグナル提示をよりよく形成し得る。遅すぎるサンプリングはアナログシグナルの提示が貧弱なものとなる。劣ったサンプリングの影響は、シグナルが真の周波数とは異なる周波数を有するかのように現われることである。シグナルの誤った提示をエイリアスと呼ぶ。低域フィルタの使用および高速サンプリングは我々のデータにおいてエイリアスを最小化する。
【０４５５】
結  果
バッファー溶液対相補性ＤＮＡ
正弦波ＡＣボルタンメトリー技法はＤＣランプの上に正弦波、典型的には１０〜１０００Ｈｚを加えることからなる。この報告に示されたデータはすべて１ｋＨｚで取得した。固定した周波数での正弦波の周波数スペクトルはその周波数での単純な単一ピークであり、ピークの高さは波の振幅である。例えば、１０Ｖｒｍｓでの１０００Ｈｚ正弦波は周波数領域において１０００Ｈｚで１０Ｖｒｍｓピークとして顕著に表れる。しかし、バイオチップは非線形デバイスであるため、正弦波の高調波ひずみが現われ、チップの応答は高調波を含むこととなる。
【０４５６】
図４Ａはバッファー溶液（７００ｍＭ−ＮａＣlＯ４：３００ｍＭ−ＮaＣ1）のみによるバイオチップの周波数スペクトルである。１０００Ｈｚピークはスペクトルの優性ピークである。また、そこには１ｋＨｚの高調波があるが、直ぐに落ち込む。事実、基礎の周波数と第二高調波間の差は略２桁の大きさである。このことはむしろ高調波のひずみが弱く、弱いが測定可能であることを示唆する。高調波の振幅（基礎の周波数は除く）は指数的に低下する。この場合、指数的減衰はｌｏｇ目盛りでｋ＝２.１５の傾斜をもつ（我々はｋ値について本報告の残りの部分で調波減衰という）。
【０４５７】
図４Ｂは１μＭの相補正ＤＮＡとハイブリダイゼーションした後のバイオチップの周波数スペクトルである。この測定ではバッファー溶液測定と同じチップを対照の目的で使用した。同一のチップを使用したので、２つの測定値のバックグラウンド符号定数は本質的に同じである。図４ｂと図４ａの明らかな差は高調波、特により高い調波の振幅である。このことは有意なファラデーインピーダンス成分を有する酸化還元化学系の存在下で高調波ひずみが強いことを示唆する。図６は２つの測定値間の２つの重要な差、すなわち、シグナルサイズと形状を強調したものである。上に、ｋ＝１.２５の調波減衰値をバッファー溶液測定について報告した。１μＭの相補正ＤＮＡ測定の場合には、ｋ＝−０.８３であり、高調波シグナルが極めて大きいことを示している。相補正ＤＮＡ測定のもう一つの顕著な特徴は調波ピークの構造である。図７はその結果を描出する。我々の観察するところ、電子のネルンスト分布存在下に多重ピーク構造が存在し、典型的にはそれが対となって調波ピークに存在している。多重ピーク構造は結合した分子をもつすべてのサンプル中に、すべての高ｎ（ｎ≧２）調波数で観察される。シグナルのピークは調和振動数にはなく、ｖｎ±Δｖに存在することに注意されたい。
【０４５８】
検出レベル
図７に、１μＭ、１００ｎＭ、１０ｎＭ、および１ｎＭのＤＮＡ測定値について、ＦＦＴスペクトルのピーク振幅を異なる周波数でプロットする。また、我々は比較と基準化のためにバッファー溶液測定からのデータをも含めた。幾つかの明らかな結論は図７からなし得る。その第一はピークの振幅である。予測されるように、高濃度での測定は大きなシグナルを生じる。しかし、驚くべきことに、その振幅は濃度により直線的に目盛り得ない（すなわち、１μＭのシグナルは１００ｎＭの値の１０倍とはならない）。恐らくこれは各濃度についての正確なＴ１/２が分かっていないためである。図６のデータは我々が１μＭの濃度を測定したのが早すぎた（１μＭのｔ＜Ｔ１/２）か、または１００ｎＭでの測定が遅すぎた（１００ｎＭのｔ＞Ｔ１/２）ことを示唆する。測定値の共通する傾向は調波ピークの傾斜にあり（ｎ≧２）、傾斜は高調波ひずみの強さおよび／または系の非直線性の表示である。傾斜が緩いほど、調波ピークは大きくなり、系はより非直線性である。１μＭ、１００ｎＭ、および１０ｎＭの場合には、その場合我々は良好なシグナルを得たが、その傾斜は比較的にｋ＝−１と同じである。我々は濃度が下がるにつれて傾斜はより急峻となり、ノイズに対するシグナル（Ｓ／Ｎ）が劣化するのを見る。１μＭ、１００ｎＭ、および１０ｎＭのＤＮＡシグナルのもう一つの共通性は調波ピークの極く普通の構造である（ピークの分裂、図６参照）。１ｎＭでの測定は良好なデータを生じなかった。我々は調波ピークのいずれにも構造を見ず、また、調波の傾斜は高濃度の測定値に比べてさらに急峻である。事実、１ｎＭ調波シグナルの傾斜はｋ＝２に近接し、バッファー溶液での測定値と略同じレベルにある。
【０４５９】
実施例４
ＪＴＦＴの使用
ＦＦＴと同様に、生データｉ(ｔ）を記録し、デジタル処理した。未処理データは記録されているので、より完全な解析は処理工程後に実験者の都合のよいときに実施し得る。このシステムは即データ解析のために走査後（２〜３分以内）に迅速に周波数スペクトルを得るために使用することができる。あるいはＪＴＦＴアルゴリズム（シグナル・プロセシング・ツールセット、ナショナル・インスツルーメント・コープ（Signal Processing Toolset, National Instrumentation Corp.)）を使用することにより、データを後処理し、スペクトル写真が時間波形（または電流対ＤＣ電位波形）を与える場合には、アナログ機により得られるのと同様ではあるが、全高調波に対し一回の走査で完全なスペクトル写真を得ることができる。従って、時間依存性周波数スペクトルは時間波形または時間非依存性スペクトルにおける他の方法では観察し得ないシグナルのパターンを明らかにし得る。ＪＴＦＴにより提供される他の利点はノイズ改変シグナルの検出である。ランダムまたは白色雑音は典型的に時間または周波数依存性をもち、一方でシグナルは通常時間と周波数空間に濃縮されるので、もしＪＴＦＴを用いるならばシグナル−ノイズ比が上昇するであろう。
【０４６０】
同時時間−周波数変換
同時時間−周波数変換スペクトル写真を評価する最速で最も簡単な方法は短時間フーリエ変換であり、それによって時間依存性シグナルは重なり合う時間ビンに分割される（参照：Qian et al., Joint time frequency analysis; Englewood Cliffs, N.J. Prentice Hall 1996; Wexler et al., Signal Processing 21.3: 207 (1990); Qian et al., Signal Processing 25.2125 (1992); Cohen et al., J. Math. Phys. 7: 781 (1966); Choi et al., IEEE Trans. Acoustics, Speech, Signal Processing 37.6: 862 (1989); and Zhao et al., IEEE Trans. Acoustics, Speech, Signal Processing 38.7: 1084 (1990)；これらの文献すべてを出典明示により本明細書の一部とする）。各時間ビンにフーリエ変換を適用し、大まかな同時時間−周波数スペクトル写真を得る。他の同時時間−周波数アルゴリズムはガボル（Gabor）変換、およびウイグナー−ビレ（Wigner-Ville）、疑似ウイグナー−ビレ（Wigner-Ville）、コーエン（Cohen's）クラス、コイ−ウイリアムス（Choi-Williams）、および円錐形分布を用いる変換などである。それぞれのアルゴリズムには利点と欠点がある。例えば、ＳＴＦＴスペクトル写真は迅速で堅固であるが、分解能が劣り、非負の結果を生じる。適応性のあるスペクトル写真はシグナルが直線性チャープからなり、人工的交差項を生じない場合に非常に高い分解能を与える；しかし、アルゴリズムは遅くなり、また負の結果を与えない。
【０４６１】
図８は処理後ルーチンを用いるバイオチップからのスペクトル写真を説明する。下のグラフはセルが生み出す総電流の時間波形である。このシグナルは本質的に交流ボルタンメトリー（ＡＣＶ）走査からの生の出力である。標準高速フーリエ変換（ＦＦＴ）右上に周波数スペクトルを生じた。この走査はデータ記録後直ちに実施し得る。一般に、走査は１５秒以内であり、ＦＦＴは約３０秒であり、ペンチアム（Pentium）IIＰＣを要する。ラボビュウ（Labview)の現行版は三次元のプロットを維持せず、そのため我々は現在ラボビュウによる輪郭スポットに限定している。スペクトル写真調製に使用する処理後ルーチンはＪＴＦＡアルゴリズムに依存して２〜３分（５分以内）を要する。
【０４６２】
図９はＡＣＶ走査からのスペクトル写真の３−Ｄプロットである。図９から我々は基本波（１ｋＨｚ）と第４調和（４ｋＨｚ）振動数に極く普通の電流対ＤＣ電位ボルタンモグラムを見る。さらに、第２および第３の調和ボルタンモグラムがまったく同じ走査で得られる。我々が同じ走査ですべての高調波を取得し得るという事実は、我々に我々のシステムのより良好な研究を可能とする。
ＪＴＦＴデータからのバックグラウンドに対するシグナルの挙動に注目されたい。図１０は基本波と最初の３つの調和振動数でのＡＣＶボルタンモグラムを説明する。これらのプロットで示されるデータは図１０のスペクトル写真から由来する。明らかに、バックグラウンド静電容量は基本調波で最大である。高調波では、静電容量が劇的に降下する（２桁以上の大きさ）。このことは二重層と単層の静電容量が略直線性であり、強い調波シグナルを生じないという概念と矛盾がない。しかし、ファラデー成分は非直線性であり、強い高調波を生じる。従って、我々のシグナル−バックグラウンド比は高調波数で上昇する。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１Ａ、１Ｂおよび１ＣはＤＮＡチップからの実際の結果を示す。
【図２】  図２Ａは陽性および陰性例を一緒にプロットする；図２Ｂは陽性例であり、図２Ｃは陰性例である。
【図３】  図３は方形波ＡＣＶの高調波を示す；図３Ａは第２高調波であり、図３Ｂは第４高調波であり、３Ｃは第６高調波であり、３Ｄは第８高調波であり、３Ｅは第１０高調波であり、３Ｆは第１、３、５および９高調波であり、そして図３Ｇは高調波と対する電流のグラフを示す。
【図４】  図４は実施例２の結果を示す；（Ａ）の周波数スペクトルはチップのバッファー液による測定値、（Ｂ）のスペクトルは同じチップの１μＭ相補性ＤＮＡによる測定値を示す。高調波ピークの傾斜は、（Ａ）は（Ｂ）に比較してより急峻である。
【図５】  図５は図４に示したスペクトルのピーク振幅である。ｎ≧２に対する振幅の差の大きいことに注目されたい。
【図６】  図６は周波数スペクトルの最初の４つのピークの細部を描出し、（Ａ）はバッファー中での測定値、および（Ｂ）は１μＭ−ＤＮＡでの測定値である。
【図７】  図７は検出レベルの研究からの結果を示す。ｙ軸は異なるＤＮＡ濃度（１μＭ〜１ｎＭ）での高調波（ｎ≧２）のピーク振幅であり、ｘ軸は周波数と調波数である。また、バッファー溶液測定値からのデータを示す。
【図８】  図８はＳＴＦＴアルゴリズムを用いるＪＴＦＴスペクトル写真の等高線プロットを示す。等高線の強度はシグナルの振幅に対応する。下部スペクトル写真はＡＣＶ走査の未加工のシグナルである。上部右隅の周波数スペクトルはＦＦＴから得られる。
【図９】  図９はチップのＡＣＶ走査の三次元スペクトル写真を示す。セル電流の振幅はｌｏｇ目盛りでプロットし、より高い調波を強調する。このスペクトル写真は同調またはロックイン増幅器なしの、ごく普通の第１および第４高調波ボルタンモグラムを明瞭に示す。他の高調波も存在する。
【図１０】  図１０はＦＦＴを用いる基本波、第２、第３および第４高調波でのＡＣボルタンモグラム応答を示す。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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