(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
亜硫酸アンモニウム塩の存在下グリシノニトリル水溶液に微生物またはその処理物を作用させることを特徴とするグリシンの着色を防止した微生物学的製造法であって、微生物またはその処理物を作用させる条件がpHを調整するための酸、アルカリまたは緩衝液の添加をしない反応条件である方法。
【請求項２】
グリシノニトリルがホルムアルデヒド、青酸、およびアンモニアの反応で得られことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
微生物がアシネトバクター（Accinetobacter）属、ロドコッカス（Rhodococcus）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属やアルカリゲネス（Alcaligenes）属に属する微生物であることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
反応条件が閉鎖的反応条件であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
反応条件が反応液中に生成するアンモニアを反応液から分離する反応条件であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
アンモニアを反応液から分離する方法が反応蒸留であることを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項７】
反応蒸留を減圧下で行うことを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
反応蒸留を不活性ガスの存在下で行うことを特徴とする請求項６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は，グリシンの着色を防止した微生物学的製造方法に関する。更に詳しくは、亜硫酸塩の存在下グリシノニトリル水溶液に微生物またはその処理物を作用させることを特徴とするグリシンの着色を防止した微生物学的製造方法に関する。得られるグリシンは食品添加物、、洗浄剤、医農薬合成原料として有用である。本発明の製造法は、有用なグリシンを効率よく工業的に製造するため利用することが出来る。
【０００２】
【従来の技術】
グリシノニトリルを弱アルカリ水溶液で微生物を用いて加水分解しグリシンを得る方法が知られている。特公昭５８−１５１２０号明細書にはブレビバクテリウム  R312株をpH８に維持して用いる方法、特開平３−６２３９１号明細書にはｐＨ７．２に調整した反応液にコリネバクテリウムN-774株を用いる方法、また特開平３−280889号明細書にはｐＨを７．７付近に調整した反応液にロドコッカス属、アルスロバクター属、カセオバクター属、シュードモナス属、エンテロバクター属、アシネトバクター属、アルカリゲネス属、コリネバクテイリア属、またはストレプトマイセス属の微生物を用いる方法が開示されている。
【０００３】
こうした弱アルカリ水溶液中ではグリシノニトリルは不安定であることが知られている。例えばpHが２．５以上では安定性が悪く、ｐＨが高いほど、温度が高いほど、および経過時間が長いほど分解や着色等の変成をし易いことが開示されている（特開昭４９−１４４２０号、特開昭５４−４６７２０号、特開昭５４−４６７２１号明細書）。こうした分解や変成はグリシンの収率を低下するだけでなく、脱色するには、活性炭や特殊なイオン交換樹脂を用いた煩雑な処理が必要である（特開平３−１９０８５１号、平４−２２６９４９号明細書）。更に、従来法はグリシンの生成に伴い等量のアンモニアが水性溶媒中に蓄積するため、ｐＨは更に高くなり強アルカリ性となるため、グリシノニトリルの着色や変成は避けられない問題があった。このように従来の微生物を用いる方法はグリシン収率の低下、脱色するため煩雑な操作が必要で、工業的に実施できるものではなかった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、微生物を用いグリシノニトリルからグリシンを生産するにあたり、分解や着色反応を伴わず、乾燥菌体当たり、且つ単位時間当たり高活性であって菌体や培地の多量廃棄を伴わず、反応液のpHを調整するための酸、アルカリまたは緩衝液の添加や廃棄を伴わず、グリシンとアンモニアが定量的に生成し、これらの分解および消費を伴わなず、グリシンとアンモニアを別々に回収するグリシンの製造法を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者はこのような工業的諸問題を解決するため、分解や着色反応を伴わず、菌体当たり、且つ単位時間当たり高い活性を持ち、反応系で生成したグリシンやアンモニアを分解または消費せず、グリシンとアンモニアを別々に、定量的に、且つに容易に回収できる反応系を構築すべく検討を鋭意行った。驚くべき事に、特定の化合物がこうした微生物の活性を損なわず反応液の着色を抑制し高いグリシン収率が得られることを見いだし本発明を完成するに至った。
【０００６】
即ち、本発明によれば、亜硫酸化合物の存在下グリシノニトリルに微生物またはその処理物を作用させることで、好ましくはpHを調整するための酸、アルカリまたは緩衝液の添加をしない反応条件で、且つ閉鎖系の反応条件下もしくは生成するアンモニアを反応と同時に系外に分離する反応条件下で亜硫酸化合物の存在下グリシノニトリルに微生物またはその処理物を作用させることで、分解や着色反応を伴わず、乾燥菌体当たり、且つ単位時間当たり高活性であって菌体や培地の多量廃棄を伴わず、反応液のpHを調整するための酸、アルカリまたは緩衝液の添加や廃棄を伴わず、グリシンとアンモニアが定量的に生成し、これらの分解および消費を伴わなず、グリシンとアンモニアを別々に回収するグリシンの製造法が提供される。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明について、以下具体的に説明する。
本発明で用いられるグリシノニトリルは純粋なグリシノニトリルだけでなくホルムアルデヒドや青酸とアンモニアの反応物やグリコロニトリルとアンモニアの反応物など反応条件下でグリシノニトリルを生成しうる反応物も使用することが出来る。
【０００８】
本発明で反応液に共存させる亜硫酸化合物として制限はないが、例えば、亜硫酸ガス、亜硫酸、亜硫酸二ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸二カリウム、亜硫酸水素カリウム、亜硫酸二アンモニウム等が用いられる。好ましくは、亜硫酸のアンモニウム塩として亜硫酸二アンモニウムが用いられる。亜硫酸化合物の添加量はグリシノニトリルに対し０．００１ｍｏｌ％〜５ｍｏｌ％、好ましくは０．０１ｍｏｌ％から２ｍｏｌ％でよい。
【０００９】
本発明に使用する微生物としては、例えば、アシネトバクター（Ａｃｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属やアルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属に属する微生物が適していることが新たに発見されたが、これに限定されるものではない。本発明に適した微生物として選択されたアシネトバクターｓｐ．ＡＫ２２６株（Ａ．ｓｐ．ＡＫ２２６）（以下ＡＫ２２６と略称する）、やアシネトバクターｓｐ．ＡＫ２２７株（Ａ．ｓｐ．ＡＫ２２７）（以下ＡＫ２２７と略称する）は１９８５年年５月２８日に工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されそれぞれ微工研菌寄第８２７１号と 微工研菌寄第８２７２号の 受託番号を付与されており、微生物学的性質は以下表１に示す通りである。
【００１０】
【表１】
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【００１１】
菌株の同定に際しては、バージェイズ・マニュアル・オブ・システマティク・バイオテリオロジー（Bergy's Manual of Determinative Bacteriolog）第８版(1974)に従って分類した。
また、本発明に適した微生物として選択されたロドコッカス・マリスBP-479-9株は１９９３年１１月２日に工業技術院微生物工業技術研究所に原寄託され、１９９５年９月１日に国際寄託に移管されＦＥＲＭ  ＢＰ−５２１９の受託番号を付与されており、微生物学的性質は以下表２に示す通りである。
【００１２】
【表２】
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【００１３】
菌株の同定に際しては、バージェイズ・マニュアル・オブ・システマティク・バイオテリオロジー（Bergy's Manual of Determinative Bacteriolog）第2巻（1986）およびザ・プロカリオート（The Prokaryotes）第２版（1992）に従って分類した。
また、本発明に適した微生物として選択されたコリネバクテリウム  sp.  Ｃ５株（以下C5と略称する）は工業技術院微生物工業技術研究所に寄託され微工研菌寄第8931号の 受託番号を付与されており、微生物学的性質は、特開昭６３−１２９９８８号公報に示す通りである。
【００１４】
また、本発明に適した微生物として選択されたコリネバクテリウム  ニトリロフィラス  ATCC２１４１９株、アルカリゲネス  フェカリス  ＡＴＣＣ８７５０株も使用することが出来る
本発明に使用される微生物の培養には、通常用いられる炭素源、例えば、グルコース、グリセリン、有機酸、デキストリン、マルトース等が用いられ、窒素源としてはアンモニアとその塩類、尿素、硝酸塩および有機窒素源、例えば、酵母エキス、麦芽エキス、ペプトン、肉エキス等が用いられる。
【００１５】
また、培地にはリン酸塩、ナトリウム、カリウム、鉄、マグネシウム、コバルト、マンガン、亜鉛等の無機栄養源が適宜添加される。培養はpH5から9、好ましくはpH6から8、温度２０から３７℃、好ましくは２７から32℃で好気的に行われる。本発明の微生物の培養において、上記の培地に酵素誘導剤を加えても良い、例えば、ラクタム化合物（γ-ラクタム、δ-ラクタム、ε-カプロラクタム等）、ニトリル化合物、アミド化合物等を用いてもよい。
【００１６】
本発明の微生物はそのまま工業使用できるが、適当な変異剤で突然変異を誘発する方法もしくは遺伝子工学的手法により改良された変異株、例えば、酵素を構成的に生産する変異株を育成し用いることもできる。本発明の菌体とは培養液から採取した菌体または菌体処理物（菌体の破砕物、菌体破砕物より分離した酵素、および菌体または菌体から分離抽出された酵素を固定化した処理物）である。培養液からの菌体の採取は公知の方法で行うことが出来る。
【００１７】
本発明においては、上述の方法で分離した菌体および菌体処理物はグリシノニトリル水溶液に懸濁することで、速やかに加水分解反応が進行しグリシンを製造することができる。則ち、通常、前記微生物菌体または菌体処理物を、例えば０．０１から5重量％、基質のグリシノニトリルを1から30重量％、更にグリシノニトリルに対し０．００１ｍｏｌ％〜５ｍｏｌ％、好ましくは０．０１ｍｏｌ％から０．２ｍｏｌ％の亜硫酸化合物を含む水性懸濁液を反応装置に仕込み温度として例えば0から60℃、好ましくは10から50℃にて、反応時間を例えば1時間ないし24時間、好ましくは３時間から８時間反応させれば良い。
【００１８】
この場合、グリシノニトリルを薄い濃度で仕込み経時的に追加添加したり、反応温度を経時的に変化させても良い。また、反応後の廃棄物を減らす上でｐＨを調整するための緩衝液、酸やアルカリを反応液に添加しないことが好ましい。また、生成するアンモニアを回収するため、密閉型の反応容器を用い生成するアンモニアを応容器中に一旦蓄積してもよいが、ｐＨの上昇を抑えるために生成するアンモニアを反応と同時に分離する反応分離装置を付属することが好ましい。こうしたアンモニアの反応分離法としてはアンモニアの反応蒸留法や不活性ガスの流通法で実施することができる。
【００１９】
反応蒸留を行う場合、加水分解反応装置に、アンモニアと同伴する水を冷却回収する冷却器の付いた単管搭、棚段搭、または充填塔を備え、反応水溶液の沸騰圧以上、例えば６０℃で２０．０ｋＰａ以上から０℃で０．６ｋＰａ以上の圧力条件下で、連続的にまたは間欠的に減圧反応蒸留することが好ましい。更に好ましくは、１２．６ｋＰａから１．３ｋＰａの圧力条件下で減圧反応蒸留することができる。不活性ガスを流通する場合、不活性ガスの吹き込みノズルと、アンモニアや同伴する水を不活性ガスから回収する冷却トラップとを備え、微加圧から減圧条件下で連続的にまたは間欠的にアンモニアを不活性ガスに同伴し反応液から分離することができる。更に、アンモニア分離を促進するため減圧反応蒸留を不活性ガス流通条件下で行うこともできる。反応方式はバッチ型方式や流通型反応方式、またはこれらを組み合わせた方式で行うことが出来る。
【００２０】
かくして、グリシノニトリルは、ほぼ100％のモル収率で加水分解し、生成するアンモニアの全部は密閉型反応容器中に一旦グリシンのアンモニウム塩を含むグリシンの高濃度水溶液として生成蓄積させることができる。また、生成するアンモニアの全部または殆どは反応と同時に反応蒸留法や不活性ガスの流通法で反応液から分離し冷却回収される。
【００２１】
もし、グリシンアミドが残存する場合はグリシンアミドの加水分解活性をもつ菌体もしくは酵素を追添加することにより、完全にグリシンおよびアンモニアに転換することも可能である。グリシンのアンモニウム塩を含むグリシンの高濃度水溶液からのグリシンの回収は、例えば、反応液から菌体を遠心濾過、膜分離等によって除いた後、グリシンは晶析法、イオン交換法または貧性溶媒による分別沈澱法にて回収できる、またアンモニアは一部の水と一緒に蒸発後、蒸留や抽出によって回収することができる。
本発明を実施例に基づいて説明するが、本発明はこれらの例に制限される物ではない。
【００２２】
【実施例１】
酸素の混入を防ぐため、全ての反応操作は窒素雰囲気下で行い、反応に用いる全ての水溶液は約５℃に冷却し窒素ガスで一旦加圧後、再び常圧に戻す操作を数回繰り返し空気との置換を行った。
（１）グリシノニトリルの合成
窒素雰囲気下でホルマリンに等量の青酸をを作用させて一旦生成したグリコロニトリル水溶液に、過剰量のアンモニア水溶液を添加し２時間反応した後、未反応のアンモニアと過剰の水を減圧除去し３０重量％グリシノニトリル水溶液を得た。波長３８０nmで水溶液の吸光度を測定したところグリシノニトリル１ｍｏｌ、１０ｍｍ石英セル当たり０．０８であった。
【００２３】
（２）菌体の培養
アシネトバクターAK226株を、下記の条件で培養した。
(1)培地
フマル酸                    1.0重量%
肉エキス                    1.0
ペプトン                    1.0
食塩                        0.1
ε−カプロラクタム          0.3
リン酸第一カリウム          0.2
硫酸マグネシウム・7水塩     0.02
塩化アンモニウム            0.1
硫酸第二鉄・7水塩           0.003
塩化マンガン・４水塩        0.002
塩化コバルト・６水塩        0.002
pH                          7.5
(2)培養条件
３０℃／１日
【００２４】
（３）グリシノニトリルの加水分解
菌体は、得られた培養液から遠心分離により集菌し、蒸留水で洗浄した後、窒素ガスで置換し反応に用いた。窒素ガスで置換した100mlの硝子オートクレーブに乾燥菌体量として49mgと亜硫酸二アンモニウム一水和物を2.4ｍｇ含む30重量%グリシノニトリル水溶液３mlを１７mlの蒸留水に調合した、２０℃にて反応を開始した。反応開始後２時間後、ｐＨは10に成っていた。この反応液を液体クロマトグラフィー法で分析し、グリシノニトリルは無くなりグリシンが定量的に生成していた。
【００２５】
そこで２時間毎に反応温度を５℃昇温し、上記30重量%グリシノニトリル水溶液3mlを追加添加し反応液を液体クロマトグラフィー法で分析した。この操作を４回切り返し合計１０時間反応を行った。得られた３２ｇの反応液のうち２ｇを用い、生成したアンモニアはネスラー法により定量し、原料のグリシノニトリルと生成したグリシンは液体クロマトグラフィー法で分析し、グリシノニトリルは無くなりグリシンとアンモニアが定量的に生成していた。乾燥菌体当たりのグリシンの生成量は１２０g/g乾燥菌体であり、グリシンの生成活性は１２ｇ／ｇ・Ｈｒであった。反応液２ｍｌをrpm１０５００の遠心分離濾過に１５分掛け菌体を分離し、上澄み液の紫外可視吸収スペクトルを測定した。波長３８０nmでの吸光度はグリシン１ｍｏｌ１ｃｍ当たり０．１２であった。
【００２６】
【比較例１】
実施例１と同様の反応を亜硫酸二アンモニウム一水和物を添加せずに行った。乾燥菌体当たりのグリシンの生成量は変わらず１２０g/g乾燥菌体であり、グリシンの生成活性は１２ｇ／ｇ・Ｈｒであった。遠心濾過後の上澄み液の吸光度はグリシン１ｍｏｌ１ｃｍ当たり０．７９であった。
【００２７】
【実施例２から５】
実施例１と同様の培養操作と反応を菌体および亜硫酸化合物を表３のように変え行った。結果は表３に実施例１や比較例１と合わせ示す。
【００２８】
【表３】
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【００２９】
【実施例６】
実施例１で合成した３０重量％グリシノニトリル水溶液を用い、反応方式を代えて実施した。菌体は、得られた培養液から遠心分離により集菌し、蒸留水で洗浄した後、窒素ガスで置換し反応に用いた。撹拌器の付いた1000mlの恒温ジャケット槽型３つ口セパラブルフラスコに、ドライアイストラップを経て減圧ポンプに接続した単管型の蒸留塔、圧力センサー、温度計、および液送ポンプに接続したサンプリング管を備えた。
【００３０】
このセパラブルフラスコを窒素ガスで置換した後、乾燥菌体量として６５０mg、亜硫酸二アンモニウム一水和物を24ｍｇ含む30重量%グリシノニトリル水溶液30mlと蒸留水170mlを調合した。減圧ポンプでフラスコ内の圧力を１０ｋＰａに調整し、30℃にて反応を開始した。反応開始１時間後、この反応液を液体クロマトグラフィー法で分析したところ、グリシノニトリルが消失しグリシンが定量的に生成していた。
【００３１】
そこで基質の30重量%グリシノニトリル水溶液30mlを追加添加した。１時間毎にこの操作を更に３回繰り返し合計５時間反応を行った。ドライアイストラップには固体が２０ｇ回収された。固体を50mlの水にとかしネスラー法により定量したところアンモニアが１４g回収されていた。反応液は３００ｇ回収された。この反応液のうち２ｇを用い、生成したアンモニアをネスラー法により定量し、原料のグリシノニトリルと生成したグリシンは液体クロマトグラフィー法で分析した。グリシノニトリルは無くなりグリシンが定量的に生成しトレース量のアンモニアが残存していた。乾燥菌体当たりのグリシンの生成量は８８g/g乾燥菌体であり、グリシンの生成活性は１８ｇ／ｇ・Ｈｒであった。反応液２ｍｌをrpm１０５００の遠心分離濾過に１５分掛け菌体を分離し、上澄み液の紫外可視吸収スペクトルを測定した。波長３８０nmでの吸光度はグリシン１ｍｏｌ１ｃｍ当たり０．０８であった。
【００３２】
【発明の効果】
本発明の製造方法は、亜硫酸化合物の存在下グリシノニトリルに微生物またはその処理物を作用させることで、好ましくはpHを調整するための酸、アルカリまたは緩衝液の添加をしない反応条件で、且つ閉鎖系の反応条件下もしくは生成するアンモニアを反応と同時に系外に分離する反応条件下で亜硫酸化合物の存在下グリシノニトリルに微生物またはその処理物を作用させることで、分解や着色反応を伴わず、乾燥菌体当たり、且つ単位時間当たり高活性であって菌体や培地の多量廃棄を伴わず、反応液のpHを調整するための酸、アルカリまたは緩衝液の添加や廃棄を伴わず、グリシンとアンモニアが定量的に生成し、これらの分解および消費を伴わなず、グリシンとアンモニアを別々に回収出来る効果を有する。