(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下：
ヒト抗体またはヒト化抗体のＦａｂ領域、ＣＤ８α、ＨＳＡあるいは輸送タンパク質由来の配列の少なくとも一部を含む第一領域；および
ＩｇＧの少なくともＨＣＨ２領域の少なくとも３コピーを含む第二領域であって、該ＨＣＨ２領域が少なくともアミノ酸残基２１６〜３４０を含む、第二領域；
を含むポリペプチドであって、ここで、該ポリペプチドは、ＦｃγＲを発現する細胞を標的化し、ＦｃγＲに結合し、そして／または補体成分に結合する、ポリペプチド。
【請求項２】
前記ＨＣＨ２領域が、ヒトＩｇＧ１由来のＨＣＨ２領域である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
免疫グロブリンフレームワーク領域をさらに含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドが、単鎖、２量体、または３量体である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記ポリペプチドが、凝集ＩｇＧおよび免疫複合体と、ＦｃγＲとの機能的相互作用を模倣するために適応する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６】
哺乳動物免疫グロブリンのアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記アミノ酸配列が、免疫グロブリンの少なくとも２つの配列を含む、請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記哺乳動物免疫グロブリンが、ヒト、げっ歯類、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ネコまたはブタの免疫グロブリンである、請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記哺乳動物免疫グロブリンが、マウス免疫グロブリンである、請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
前記哺乳動物免疫グロブリンが、ヒト免疫グロブリンである、請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥまたはＩｇＭのアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＭからなる群に由来する少なくとも２つの配列を含むアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
ＦｃγＲ、ＦｃαＲ、ＦｃεＲ、ＦｃμＲ、ＦｃδＲまたはＦｃＲｎの１つ以上を発現する細胞を標的化するために適応する、請求項１０に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
ＦｃγＲ、ＦｃαＲ、ＦｃεＲ、ＦｃμＲ、ＦｃδＲまたはＦｃＲｎの群に由来する少なくとも２つに結合するために適応するようにさらに定義された、請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
請求項１に記載のポリペプチドであって、該ポリペプチドが、免疫欠損障害、皮膚筋炎−多発筋炎、感染症、自己免疫性甲状腺炎、間質性膀胱炎、前立腺炎、炎症性疾患、自己免疫疾患、アレルギー疾患、中枢神経系の変性疾患、炎症性ニューロパシー、慢性関節リウマチ、狼瘡および／または喘息を処置するために適応される、ポリペプチド。
【請求項１６】
請求項１に記載のポリペプチドであって、該ポリペプチドが、アポトーシス、壊死または溶解を促進させるか、あるいは、新生物細胞および／もしくはウイルス感染細胞の細胞分裂を減少させるために適応される、ポリペプチド。
【請求項１７】
補体結合を変更するために適応される、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
水溶液中に溶解性である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
ＮＫ細胞、単球、マクロファージ、Ｔ細胞またはＢ細胞を標的化し得る、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
ワクチンとしての使用のために適用される、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
前記第二領域が、前記ポリペプチドの凝集する傾向を変更させるアミノ酸置換を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
前記第二領域が、前記ポリペプチドの補体への結合を増強させるか、または選択的に低減させるアミノ酸置換を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項２３】
前記第二領域が変更されたヒンジ領域を含む、請求項１に記載のポリペプチドであって、該変更されたヒンジ領域は、ＦｃγＲおよび／または補体結合を保存し、かつ分子間ジスルフィド結合形成を防ぐ、ポリペプチド。
【請求項２４】
前記第二領域が、前記ポリペプチドのＦｃγＲサブタイプへの結合を増強させるか、または選択的に低減させるアミノ酸置換を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項２５】
２６ｋＤａと１５００ｋＤａとの間である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項２６】
４５ｋＤａと６００ｋＤａとの間である、請求項２５に記載のポリペプチド。
【請求項２７】
抗体配列およびＩｇＧの少なくともＨＣＨ２領域の少なくとも３コピーを含み、該ＨＣＨ２領域が少なくともアミノ酸残基２１６〜３４０を含む、ポリペプチド。
【請求項２８】
ポリペプチドをコードする核酸であって、該ポリペプチドは、以下：
ヒト抗体またはヒト化抗体のＦａｂ領域、ＣＤ８α、ＨＳＡあるいは輸送タンパク質由来の配列の少なくとも一部を含む第一領域；および
ＩｇＧの少なくともＨＣＨ２領域の少なくとも３コピーを含む第二領域であって、該ＨＣＨ２領域が、少なくともアミノ酸残基２１６〜３４０を含む、第二領域；
を含むポリペプチドであって、ここで、該ポリペプチドは、ＦｃγＲを発現する細胞を標的化し、ＦｃγＲに結合し、そして／または補体成分に結合する、ポリペプチド、
をコードする、核酸。
【請求項２９】
前記ＨＣＨ２領域が、ヒトＩｇＧ１由来のＨＣＨ２領域である、請求項２８に記載の核酸。
【請求項３０】
免疫グロブリンフレームワーク領域をコードする領域をさらに含む、請求項２８に記載の核酸。
【請求項３１】
前記第一および第二領域が、タンパク質ドメインおよび／またはリンカー基によって作動可能に連結される、請求項２８に記載の核酸。
【請求項３２】
前記第一領域が、細胞表面マーカーに対する結合部位を含む、請求項２８に記載の核酸。
【請求項３３】
前記細胞表面マーカーが抗原である、請求項３２に記載の核酸。
【請求項３４】
前記Ｆａｂ配列が、適切な条件下で、腫瘍関連抗原に結合し得る、請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
前記Ｆａｂ配列が、ヒト抗体またはヒト化抗体に由来する、請求項２８に記載の核酸。
【請求項３６】
前記Ｆａｂ配列が、２つの別個の抗原または細胞表面マーカーに結合する、請求項２８に記載の核酸。
【請求項３７】
前記結合部位が、細胞レセプター、レセプターリガンドまたは接着分子の結合部位を含む、請求項３２に記載の核酸。
【請求項３８】
前記ポリペプチドが免疫グロブリン融合タンパク質としてさらに定義される、請求項２８に記載の核酸。
【請求項３９】
免疫グロブリンＨＣＨ２のヒンジ領域およびＣＨ２領域の少なくとも３コピーを含む前記領域が、組換えタンパク質として発現可能である、請求項３８に記載の核酸。
【請求項４０】
クローニングベクターとしてさらに定義される、請求項２８に記載の核酸。
【請求項４１】
ヒト抗体またはヒト化抗体のＦａｂ領域、ＣＤ８α、ＨＳＡあるいは輸送タンパク質由来の配列の少なくとも一部を含む第一領域およびＩｇＧの少なくともＨＣＨ２領域の少なくとも３コピーを含む第二領域を含むポリペプチドを含む、組成物であって、ここで、該ポリペプチドは、ＦｃγＲを発現する細胞を標的化し、ＦｃγＲに結合し、そして／または補体成分に結合し、該ＨＣＨ２領域は少なくともアミノ酸残基２１６〜３４０を含み、該組成物は、少なくとも１つの細胞に投与されるのに適している、組成物。
【請求項４２】
前記ポリペプチドが、免疫グロブリンフレームワーク領域をさらに含む、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４３】
前記組成物が哺乳動物を治療するためのものである、請求項４１に記載される組成物。
【請求項４４】
前記組成物が、経口、経鼻、または注射を介して投与されるのに適している、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
前記組成物が、静脈内、腹腔内、筋肉内または皮下の注射を介して投与されるのに適している、請求項４４に記載の組成物。
【請求項４６】
前記組成物が、０．７５ｍｇ／ｋｇ体重で投与されるのに適している、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４７】
前記哺乳動物が、ヒトまたはげっ歯類である、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４８】
請求項４３に記載の組成物であって、ここで、前記哺乳動物は、免疫欠損障害、皮膚筋炎−多発筋炎、感染症、自己免疫性甲状腺炎、間質性膀胱炎、前立腺炎、炎症性疾患、自己免疫疾患、アレルギー疾患、中枢神経系の変性疾患、炎症性ニューロパシー、慢性関節リウマチ、狼瘡および／または喘息を有する、組成物。
【請求項４９】
前記組成物が炎症性疾患を処置するためのものである、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５０】
前記炎症性疾患が、多発性硬化症、クローン病、潰瘍性大腸結腸炎、狼瘡、慢性関節リウマチ、ブドウ膜網膜炎、アレルギー性鼻炎、アルツハイマー病、ＡＬＳ、脊髄損傷、免疫欠損障害、皮膚筋炎、多発筋炎、感染症、喘息、エリテマトーデス、重症筋無力症、自己免疫性甲状腺炎、間質性膀胱炎または前立腺炎である、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５１】
前記組成物が、哺乳動物において免疫性を変更させるためのものである、請求項４３に記載の組成物。
【請求項５２】
前記組成物が、新生物細胞を殺傷するためのものである、請求項４１に記載の組成物。
【請求項５３】
前記新生物細胞が癌腫細胞である、請求項５２に記載の組成物。
【請求項５４】
前記組成物の投与が、補体依存的細胞傷害を生じる、請求項５２に記載の組成物。
【請求項５５】
前記新生物細胞が、哺乳動物に含まれる、請求項５２に記載の組成物。
【請求項５６】
前記哺乳動物が、ヒトまたはげっ歯類である、請求項５５に記載の組成物。
【請求項５７】
前記組成物が、ウイルス感染細胞を殺傷するためのものである、請求項４１に記載の組成物。
【請求項５８】
前記組成物の投与が、補体依存的細胞傷害性を生じる、請求項５７に記載の組成物。
【請求項５９】
前記ウイルス感染細胞が、哺乳動物に含まれる、請求項５７に記載の組成物。
【請求項６０】
前記哺乳動物が、ヒトまたはげっ歯類である、請求項５９に記載の組成物。
【請求項６１】
免疫学的産物を調製する方法であって、該方法は、以下の工程：
リガンド結合ドメインを含む第一領域、およびＩｇＧの少なくともＨＣＨ２領域の少なくとも３コピーを含む第二領域を含む、抗原およびポリペプチドの量で、非ヒト哺乳動物を免疫する工程であって、該第一領域は抗体の一部または全体を含み、該ＨＣＨ２領域は少なくともアミノ酸残基２１６〜３４０を含む、工程；ならびに
該非ヒト哺乳動物において、免疫学的産物を産生させる工程であって、該産物が、Ｔ細胞、Ｔ細胞によって産生される産物、Ｂ細胞、またはＢ細胞によって産生される抗体である、工程、
を包含する、方法。
【請求項６２】
前記免疫学的産物が、前記哺乳動物から得られる、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記第一領域が、腫瘍、ウイルス、真菌、リケッチア属、マイコプラズマ、細菌、原生動物寄生虫または後生動物寄生虫への結合に適応する、請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
前記第一領域が、腫瘍、ウイルス、真菌、リケッチア属、マイコプラズマ、細菌、原生動物寄生虫または後生動物寄生虫に由来する、タンパク質または非タンパク質分子に結合体化されている、請求項６１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（Ａ．発明の背景）
本発明は、概して、免疫学の分野に関する。より具体的には、本発明は、免疫複合体、ならびに免疫グロブリンの複数のヒンジ領域およびＣＨ２領域を含む組換えタンパク質の発現および使用に関する。
【技術分野】
【０００２】
（Ｂ．関連分野の説明）
免疫複合体（ＩＣ）は、多様な生物学的活性を示し；そのいくつかは、疾患の一因となるが、別のものは疾患を回復させる。ＩＣを含むＩｇＧの組織表面上への沈着は、糸球体での例に関しては、抗体が媒介する自己免疫疾患の病態の一因であり得る。一方、ＩＣは、免疫細胞上に発現されるＦｃレセプターへの結合を介するＴ細胞およびＢ細胞の活性化経路を有利に調節し得る。凝集ＩｇＧ（ａｇｇｒｅｇａｔｅｄ  ＩｇＧ）（ＡＩＧ）は、多くの特性および生物学的活性をＩＣと共有している。この特性および生物学的活性の両方が、Ｔ細胞サプレッサ機能（Ａｎｔｅｌら、１９８１；Ｄｕｒａｎｄｙら、１９８１）、サイトカイン合成、ＩｇＧ選択、およびリンパ球増殖（Ｂｅｒｇｅｒら、１９９７；Ｗｉｅｓｅｎｈｕｔｔｅｒら、１９８４；Ｐｔａｋら、２０００）を調節する。
【０００３】
単量体のＩｇＧ、またはそのＦｃフラグメントは、自己免疫疾患の動物モデルにおいて疾患の進行を和らげる（Ｍｉｙａｇｉら、１９９７；Ｇｏｍｅｚ−Ｇｕｅｒｒｅｒｏら、２０００）。単量体のＩｇＧは、治療上、一般に、ヒトにおいて抗体が媒介する疾患を処置するために、大用量で広く使用される。抗体が媒介する疾患における保護効果は、ＩＣのＦｃγＲへの結合が妨げられるように、ＦｃγＲの遮断を介して部分的に達成され得る（Ｃｌｙｎｅｓら、１９９８）。ＩｇＧ投与はまた、Ｔ細胞が媒介する自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症）の過程に有利に作用する（Ｆａｚｅｋａｓら、１９９７；Ｓｏｒｅｎｓｅｎら、１９９８；Ａｃｈｉｒｏｎら、１９９８）。本明細書で、利益の基準は、十分に理解されていないが、ＩＶ  ＩｇＧの結合により開始される抗炎症性サイトカインの産生、またはそこからＦｃγＲへと誘導される複合体の産生の増加に関与すると仮定される。抗体およびＴ細胞が媒介するプロセスの両方において、ＦｃγＲ関与の機構および結果は、自己免疫疾患の理解および処置に必要である。
【０００４】
凝集ＩｇＧは、ヒトの自己免疫疾患の処置として提唱されている。凝集ＩｇＧの使用は、多発性硬化症および他の自己免疫疾患の処置として研究されている。しかし、凝集ＩｇＧには、重大な制限がある。ＩｇＧは、一般に、熱への暴露によって凝集し；生じた凝集体は、ある調製物から次の調製物への再現性を限定するランダムな様式で一緒に結合される。調製物は、多様なコンホメーションで、変動サイズの凝集の不均一な収集物を含む。
【０００５】
免疫グロブリン融合タンパク質の形成は、当該分野で公知である。例えば、米国特許第５，７１４，１４７号および同５，４５５，１６５号は、新規なハイブリッド免疫グロブリン分子およびそれらをコードする発現ベクターを開示する。これらのキメラ分子は、リガンド結合分子の循環するプラズマ半減期の改善において使用され、そして免疫グロブリン定常領域に融合するリンパ球ホーミングレセプターを含む。免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の定常領域を優性に含むホモ二量体もしくはヘテロ二量体または４量体のハイブリッド免疫グロブリンが使用される。米国特許第６，０４６，３１０号は、自己免疫障害の処置における使用のための、抗原または細胞表面マーカーに特異的に結合し得るポリペプチドを含むＦＡＳリガンド融合タンパク質を開示する。この融合タンパク質は、好ましくは、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４アイソタイプを含み、そして１またはそれ以上のドメイン（例えば、ＣＨ２、ＣＨ１またはヒンジ）が除去された抗体を含み得る。Ｍａｊｅａｕら（１９９４）は、Ｉｇ融合タンパク質がＴ細胞応答の阻害に使用されることを考察している。これらの融合タンパク質は、ＩｇＧ１およびＬＦＡ−３を含む。Ｅｉｌａｔら（１９９２）は、ＴＣＲ鎖がヒトＩｇＧ１のヒンジ領域、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインに融合することにより産生される可溶性キメラＩｇヘテロ二量体を開示する。
【０００６】
免疫グロブリン融合タンパク質は、哺乳動物細胞および昆虫細胞で多くのタンパク質を発現するために使用されている（Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、１９９７）。融合タンパク質のプラットフォームは、さらなる機能（例えば、アミノ末端ＣＤ８αドメインの封入が、リンパ球上のＦｃＲの、抗原提示細胞上のＭＨＣ  Ｉへの供結合を生じ得る）の導入を可能にし得る（Ａｌｃｏｖｅｒら、１９９３；Ｍｅｙｅｒｓｏｎら、１９９６）。
【０００７】
他のＩｇタンパク質および改変体（ＩｇＭの補体活性を模倣する組換え重合体ＩｇＧを含む）はまた、自己免疫疾患に対するそれらの治療効果について研究されており（ＳｍｉｔｈおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ，１９９４）、ここで、その重合体ＩｇＧは、Ｈ２Ｌ２サブユニットの重合によって形成される。Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄら（１９９３）は、ヒトＩｇＧ抗体、ＩｇＧ１、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４に関する構造モチーフに関連する治療効力を考察している。米国特許第５，９９８，１６６号は、自己免疫疾患の治療および／または診断に使用され得るヒトＦｃγＲ−ＩＩＩ改変体を開示している。米国特許第５，８３０，７３１号は、その発明に従ってクローン化された細胞表面抗原が、免疫媒介性感染における診断用途および治療用途を有する新規の発現ベクターを開示している。リンパ球活性化を調節するために使用される細胞表面抗原は、リンパ球を固定化されたリガンドもしくは抗体またはそれらのフラグメントと共にインキュベートすることにより、インビトロでの抗原凝集を達成する（Ｗ０９９４２０７７）。しかし、タンパク質のランダムかつ不均一な混合物を含むこの凝集ＩｇＧおよびＦｃ凝集体は、再現性を制限し、それによって凝集ＩｇＧおよびＦｃ凝集体の治療剤としての効果を制限する。他の問題としては、単一の薬剤での多くの細胞型を標的化する能力の欠如およびサイズ制限が挙げられる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、変化する量のＦｃγＲおよび／または補体結合ドメインを含む新規のポリペプチドを提供する。これらのポリペプチドは、他のＦｃγＲ結合モチーフ（ＩｇＧ、Ｆｃフラグメント、ＩｇＧ融合タンパク質、ならびにそれらの複合体および／または凝集体を含む）にわたるいくつかの利点を提供する。これらの利点としては、以下が挙げられる：構成デザイン（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ  ｄｅｓｉｇｎ）およびタンパク質産物を変化させることによってＦｃγＲとの相互作用を変化させる（ｈｏｎｅ）能力、および凝集ＩｇＧ（ＡＩＧ）を用いる場合のバッチ間の異質の性質および多数の改変とは対照的に、既知数のＦｃγＲ結合ドメインを含む正確に規定された構成物およびタンパク質産物を得る能力；ＡＩＧと比較しての効力の増加；ならびに単一の薬剤を用いて多くの細胞型（例えば、ＮＫ細胞、単球、およびＢ細胞）を標的化する能力。従って、本発明は、疾患の重症度を調節し得る、複数のＦｃγＲ結合部位および模倣の集合タンパク質を含むポリペプチドを設計することを可能にする。本発明に従う本明細書の技術を用いて、当業者は、小サイズの範囲およびコンホメーションを有する均質なタンパク質を作製し得る。また、一定の濃度範囲にわたる用量応答曲線の作成を容易にするような可溶性融合タンパク質を作製し得る。
【０００９】
本発明のいくつかの実施形態は、タンパク質またはその一部分を含む第一領域およびＩｇＧのＨＣＨ２領域の少なくとも一部分の１つより多くのコピーを含む第二領域を含む、ポリペプチドに関する。これらのポリペプチドは、ＦｃγＲを発現する細胞を標的化し、ＦｃγＲに結合し、そして／または補体成分に結合し得る。これらのポリペプチドはさらに、免疫グロブリンのフレームワーク領域を含む。本発明のいくつかの局面において、このポリペプチドは、ＩｇＧ定常領域を含まない。いくつかの好ましい実施形態において、このポリペプチドは、活性型である場合、単鎖、二量体、または三量体であり得る。このポリペプチドの好ましいサイズは、２６ｋＤａと１５００ｋＤａとの間であるか、またはより好ましくは４５ｋＤａと６００ｋＤａとの間である。このポリペプチドが、水溶液に可溶性であることは、本発明の１つの局面である。
【００１０】
本発明のいくつかの局面は、ＦｃγＲとの相互作用における凝集ＩｇＧおよび免疫複合体機能を模倣するようにポリペプチドを適合させることを含む。このアミノ酸配列は、好ましくは、哺乳動物免疫グロブリンのアミノ酸配列である。場合によっては、このポリペプチドは、少なくとも２つの免疫グロブリン配列を含み得る。その免疫グロブリンは、任意の供給源（ヒト、齧歯類、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ネコ、またはブタが挙げられるが、これらに限定されない）の免疫グロブリンであり得る。この免疫グロブリンは、より好ましくは、マウスまたはヒトの免疫グロブリンである。より具体的には、このポリペプチドは、ヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥまたはＩｇＭのアミノ酸配列を含み得、そして場合によっては、ヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、およびＩｇＭの少なくとも２つの配列を含むアミノ酸配列を含み得る。場合によっては、このポリペプチドは、適切な条件下で１つ以上のＦｃγＲ、ＦｃαＲ、ＦｃεＲ、ＦｃμＲ、ＦｃδＲ、またはＦｃＲｎを発現する細胞を標的化するように適合される。いくつかの実施形態において、このポリペプチドは、ＦｃγＲ、ＦｃαＲ、ＦｃεＲ、ＦｃμＲ、ＦｃδＲ、またはＦｃＲｎの少なくとも２つに結合するよう適合される。
【００１１】
いくつかの好ましい実施形態において、このポリペプチドの第一領域は、生物内または細胞上の一部分に対する結合部位を含む、少なくとも一部分を含む。例えば、第一領域は、抗体タンパク質または抗体様タンパク質、ＣＤ８α、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、またはトランスポータータンパク質のＦａｂ由来の配列、を含み得る。第一領域がＦａｂ由来の配列を含むいくつかの好ましい場合において、このＦａｂは、ヒト抗体またはヒト化抗体由来である。いくつかの好ましい実施形態において、生物内または細胞上の一部分は、細胞表面マーカーであり、ある場合にはこの細胞表面マーカーは、抗原である。例えば、その配列は、腫瘍関連抗原またはウイルス感染を示す抗原に結合し得る。他の場合には、この結合は、細胞レセプター、レセプターリガンド、または接着分子の結合部位の少なくとも一部分であり得る。いくつかの好ましい実施形態において、このポリペプチドの第一領域は、２つの別個の抗原に結合する結合部位または細胞表面マーカーを含む。
【００１２】
このポリペプチドの第二領域は、ＨＣＨ２領域の少なくとも一部分の任意の数のコピー（２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、および／または２５以上のコピーを含むが、これらに限定されない）を含み得る。さらに、本発明は、上記の整数値のいずれかの間で誘導可能な任意の範囲を企図する。本発明の１つの局面は、ポリペプチドが凝集する傾向を変化させるアミノ酸置換および／または変化したヒンジ領域の作製を含み、これは、ＦｃγＲおよび／または補体結合を保存し、そして分子間のジスルフィド結合形成を阻害する。これらの置換は、当業者に公知でありかつ本明細書中に記載される任意の様式で作製され得る。
【００１３】
いくつかの好ましい実施形態において、ＨＣＨ２領域は、ヒトＩｇＧｌ由来のＨＣＨ２領域である。さらに、いくつかの好ましい実施形態において、このＨＣＨ２領域は、ヒトＩｇＧ１重鎖の少なくともアミノ酸残基２３３〜２３９（Ｅｕが番号付けした）を含む。いくつかの他の実施形態において、このＨＣＨ２領域は、ヒトＩｇＧ１重鎖の少なくともアミノ酸残基２１６〜３４０（Ｅｕが番号付けした）を含み、これらの残基は、ヒトＩｇＧ１ヒンジおよびＣＨ２部分の全てを含む。しかし、当業者が本明細書中の開示を理解する場合、本発明の教示に従って調製されそして試験され得る、クレームしたポリペプチドの多くの異なる明確な実施形態が存在する。個々のＨＣＨ２領域が、ＩｇＧのヒンジ領域およびＣＨ２領域から選択される任意の数の残基を含むことは、ポリペプチドに対して必要な活性が得られる限り、可能である。従って、本発明は、ポリペプチドを含み、そして本明細書はポリペプチドについて記載し、ここで、そのＨＣＨ２領域は、任意の１つの隣接部分または任意の型のいずれかのＨＣＨ２の隣接部分の組み合わせを含み、このＨＣＨ２部分または隣接部分は、変異され得るか、またはポリペプチドが、本明細書中に記載されるように、活性を有する限り、任意の可能な様式で、ネイティブＨＣＨ２配列から離れて改変され得る。
【００１４】
本発明のさらなる局面は、ポリペプチドの第二領域（ＦｃγＲの特定のサブタイプに対するポリペプチドの特異的結合を増加させ、そして／またはＦｃγＲの他のサブタイプに対するポリペプチドの特異的結合を減少させる）にアミノ酸置換を含む。当業者は、本明細書の以下の教示によって、このような変異を含むポリペプチドを調製し、試験し、そして使用し得る。
【００１５】
リンカーは、ポリペプチドの第一および第二領域に作動可能に連結することは、本発明の別の局面である。このリンカーは、共有結合力または非共有結合力のいずれかによって、第一および第二領域に連結する、任意の形態の分子であり得る。特に、このリンカーは、本発明の文脈において機能する任意の長さのペプチドまたはポリペプチドであり得、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、またはそれ以上のアミノ酸、あるいは本発明の目的のために作用する任意の数または任意の範囲のアミノ酸が挙げられる。当業者は、任意の数の型または長さのリンカーを決定し、そして試験し得る。
【００１６】
このポリペプチドが、免疫不全障害、皮膚筋炎−多発筋炎、感染症、自己免疫性甲状腺炎、間質性膀胱炎、前立腺炎、炎症性疾患、自己免疫疾患、アレルギー疾患、中枢神経系の変性疾患、血小板の疾患、血管の疾患、炎症性ニューロパシー、外傷性状態（ｔｒａｕｍａｔｉｃ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）、慢性関節リウマチ、狼瘡、および／または喘息の処置に適することは、本発明の１つの局面である。好ましい実施形態において、このポリペプチドは、中枢神経系の炎症性疾患（例えば、多発性硬化症）、炎症性腸疾患（例えば、クローン病または潰瘍性大腸炎）、目の自己免疫疾患（例えば、ブドウ膜炎または網膜炎）、アレルギー疾患（例えば、アレルギー性鼻炎）、中枢神経系の変性疾患（例えば、アルツハイマー病またはＡＬＳ（ルー・ゲーリグ病））、白血球の疾患（例えば、リンパ腫または白血病）、血小板の疾患（例えば、免疫性血小板減少性紫斑病）、血管の疾患（例えば、川崎病またはアテローム）、炎症性ニューロパシー（例えば、ギヤン−バレー症候群）、および／または外傷性状態（例えば、脊髄損傷）の処置に適する。このポリペプチドはまた、アポトーシス、ネクローシス、または溶解の促進、あるいは新生物細胞またはウイルス感染細胞の細胞分裂の減少、あるいは補体結合の変更に、適し得る。
【００１７】
このポリペプチドがＮＫ細胞を標的とし得ること、またはこのポリペプチドがＮＫ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、Ｔ細胞あるいはＢ細胞を標的とし得ることは、本発明のさらなる局面である。さらに、このポリペプチドは、免疫寛容の誘導に適し得る。このポリペプチドは同様に、ワクチンとしての使用、または抗原提示ビヒクルとしての使用に適し得る。
【００１８】
本発明のさらなる実施形態は、本発明に従ってポリペプチドをコードする核酸に関する。これらの核酸は、いくつかの実施形態において、タンパク質またはその一部分を含む第一領域およびＩｇＧのＨＣＨ２領域の少なくとも一部分の１より多いコピーを含む第二領域の両方をコードする。他の実施形態において、この核酸は、タンパク質またはその一部分を含む第一ポリペプチド領域およびＩｇＧのＨＣＨ２領域の少なくとも一部分の１より多いコピーを含む第二領域のうちの１つだけをコードする。さらに、当業者は、本発明に従ういくつかの核酸が、これらの領域のいずれかの一部のみをコードし得、そしてこのような核酸を使用し得ることを理解する。
【００１９】
本発明のいくつかの好ましい局面において、この核酸は、発現可能である。このポリペプチドは、原核生物細胞または真核生物細胞において発現され得るか、または無細胞系において発現され得る。発現のための好ましい細胞としては、昆虫細胞および哺乳動物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい哺乳動物細胞としては、ヒトの細胞および齧歯類の細胞（マウス細胞およびＣＨＯ細胞を含む）が挙げられる。この核酸は、導入遺伝子として発現可能であり得るか、または遺伝的に改変された動物（例えば、マウス）において発現可能であり得る。このポリペプチドはさらに、免疫グロブリン融合タンパク質として定義され得る。
【００２０】
特定の好ましい実施形態において、この核酸は、さらなる任意のタンパク質の必要性も機能のための他の成分も必要とすることなく、単一の活性融合ポリペプチドのような第一領域および第二領域を含むポリペプチドの発現を可能にする。他の実施形態において、この核酸は、第一領域または第二領域いずれか、あるいはいずれかの領域の一部分の発現を可能にする。ポリペプチドの単一の領域のみまたはその一部分が核酸によってコードされる場合、当業者は、それらの部分をどのように発現させるかを知っており、そしてそのように所望する場合、本発明に従ってそれらを完全に機能的なポリペプチドに構築し、そして／またはプロセスする。このようなアセンブリーおよび／またはプロセシングは、本明細書中に記載の任意の方法もしくは当業者に公知の方法を使用し得、そして／または本明細書中に記載の任意のリンカーもしくは当業者に公知のリンカーを使用し得る。
【００２１】
本発明の別の局面は、本発明のポリペプチドの全てまたは一部分をコードする核酸を含むベクターを含む。このベクターは、例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであり得る。ある場合には、これらのベクターは、ＩｇＧのＨＣＨ２領域の少なくとも一部分の１より多いコピーを含む第二領域をコードする核酸配列が、存在する抗体配列（モノクローナル抗体配列または任意の発現可能なタンパク質の配列を含む）中に挿入される方法によって作製される。
【００２２】
本発明のクローニングベクターは、本明細書中の他の箇所で記載されるか、または当業者に公知であるような、任意の適切な組換え宿主細胞中に含まれ得る。
【００２３】
他の局面において、本発明は、以下の工程を包含する方法に関する：本発明に従ってポリペプチドを得る工程（すなわち、タンパク質またはその一部を含む第一領域、およびＩｇＧのＨＣＨ２領域の少なくとも一部分の１より多いコピーを含む第二領域をコードする核酸配列を含むポリペプチド）；およびこのポリペプチドを細胞に投与する工程。いくつかのこのような方法において、タンパク質またはその一部は、可溶性タンパク質ドメイン、トランスポータードメインおよび／またはリガンド結合ドメインを含むように、明確に定義される。さらに、このポリペプチドは、免疫グロブリンフレームワーク領域をさらに含む。
【００２４】
本発明の方法はさらに、ある場合には、本発明のポリペプチドを用いて生物を処置する方法として定義される。多くの好ましい実施形態において、この生物は哺乳動物であり、例えば、ヒト、齧歯類、ウマ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、またはヤギが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの特定の好ましい実施形態において、この哺乳動物は、疾患、状態、または障害についての処置を必要とするヒトである。齧歯類に関して、いくつかの特定の好ましい齧歯類は、マウスおよびラットである。
【００２５】
本発明の方法において、生物の処置は、任意の様式（経口処置、鼻腔内処置、または注射が挙げられるが、これらに限定されない）で行われ得る。例えば、注射としては、静脈内注射、腹腔内注射、筋内注射、または皮下注射が挙げられ得るが、これらに限定されない。もちろん、当業者は、処置可能な多くの経路が存在し、そして本明細書によってそれらを実施し得ることを理解している。
【００２６】
生物を処置する方法は、生物が有するか、または有すると疑わしい疾患、状態、または障害を処置するに有効な量のポリペプチド、あるいは所望の生理学的効果をもたらすに有効な量のポリペプチドによる処置を含む。多くの場合、この量は、同程度の疾患、状態、または障害を処置するためか、または同程度の所望の生理学的効果をもたらすために使用されるＩｇＧまたは凝集ＩｇＧタンパク質の量より少ない。いくつかの好ましい実施形態において、ポリペプチドの量は、０．０５〜１０ｍｇ／ｋｇ重の濃度で投与されるか、またはより好ましくは、０．２〜５ｍｇ／ｋｇ重の濃度で投与されるか、またはなおより好ましくは、０．５〜２ｍｇ／ｋｇ重もしくは０．５ｍｇ／ｋｇ重、０．６ｍｇ／ｋｇ重、０．７ｍｇ／ｋｇ重、０．８ｍｇ／ｋｇ重、０．９ｍｇ／ｋｇ重、１．０ｍｇ／ｋｇ重、１．２ｍｇ／ｋｇ重、１．４ｍｇ／ｋｇ重、１．６ｍｇ／ｋｇ重、１．８ｍｇ／ｋｇ重もしくは２．０ｍｇ／ｋｇ重で投与される。いくつかの条件に関しては、投薬量は約０．７５ｍｇ／ｋｇ重であることが好ましい。もちろん、当業者は、本発明の方法において多くの濃度を使用可能であることを認識しており、所定の状況で所望の結果を得る濃度を見出すために、任意の数の濃度を調製し、そして試験し得る。例えば、本発明のポリペプチドが、所定の疾患、状態、または障害についての１つ以上の他の治療剤と組み合わせて投与される場合、他の治療剤とこのポリペプチドとの間で、ポリペプチドがほとんど必要とされないほどの相乗効果を得ることが可能である。
【００２７】
いくつかの特定の実施形態において、本発明のポリペプチドを使用して、免疫不全障害、皮膚筋炎−多発筋炎、感染症、自己免疫性甲状腺炎、間質性膀胱炎、前立腺炎、炎症性疾患、任意の自己免疫疾患、アレルギー疾患、中枢神経系の変性疾患、血小板の疾患、血管の疾患、炎症性ニューロパシー、外傷性状態、慢性関節リウマチ、狼瘡、および／または喘息を有する哺乳動物を処置する。好ましい実施形態において、このポリペプチドを使用して、中枢神経系の炎症性疾患（例えば、多発性硬化症）、炎症性腸疾患（例えば、クローン病または潰瘍性大腸炎）、目の自己免疫疾患（例えば、ブドウ膜炎または網膜炎）、アレルギー疾患（例えば、アレルギー性鼻炎）、中枢神経系の変性疾患（例えば、アルツハイマー病またはＡＬＳ（ルー・ゲーリグ病））、白血球の疾患（例えば、リンパ腫または白血病）、血小板の疾患（例えば、免疫性血小板減少性紫斑病）、血管の疾患（例えば、川崎病またはアテローム）、炎症性ニューロパシー（例えば、ギヤン−バレー症候群）、および／または外傷性状態（例えば、脊髄損傷）を処置する。またこのポリペプチドを使用して、アポトーシス、ネクローシス、または溶解を促進し得るか、あるいは新生物細胞またはウイルス感染細胞の細胞分裂の減少させ得るか、あるいは補体結合を変更し得る。
【００２８】
本発明のいくつかの局面では、本発明の方法はさらに、本発明のポリペプチドを哺乳動物に投与する工程を包含する、哺乳動物における免疫を変更する方法と定義される。
【００２９】
本発明はまた、本発明の１以上のポリペプチドで新生物性細胞で処理する工程を包含する、新生物性細胞を殺傷する方法に関する。このような多くの場合、新生物性細胞は、癌細胞、腫瘍および／または他の形態の癌細胞である。いくつかの好ましい実施形態では、この処理は、新生物性細胞の補体依存性細胞傷害性、抗体依存性細胞媒介細胞傷害性、または補体依存性細胞媒介細胞傷害性をもたらす。多くの場合、新生物性細胞は、例えば、上記の生物および本明細書中のどこかに記載の生物のいずれかであるがこれらに限定されない生物中に含まれる。いくつかの特に好ましい実施形態では、本発明は、本明細書中に記載される通りの本発明のポリペプチドを用いて、癌を有するヒトを処置する方法に関する。他の場合、新生物性細胞は、細胞培養物中に存在する。
【００３０】
本発明の方法は、ウイルス感染細胞を本発明のポリペプチドで処理する工程を包含する、ウイルス感染細胞を殺傷する方法とさらに定義され得る。このようないくつかの好ましい場合、処理は、ウイルス感染細胞の補体依存性細胞傷害性、抗体依存性細胞媒介細胞傷害性、または補体依存性細胞媒介細胞傷害性をもたらす。いくつかの実施形態では、ウイルス感染細胞は、哺乳動物（例えば、ヒトまたは齧歯動物）中に含まれる。
【００３１】
本発明の方法の商業的により価値のある局面の多くは、何らかの形態の疾患、障害または状態を有する生物（特にヒト）を処置する方法に関するとはいえ、動物を本発明のポリペプチドで処置する他の理由が存在する。例えば、ポリペプチドが、現実の状況でヒトまたは他の動物を処置する際に有用であるか否かを試験するために、このポリペプチドで実験動物を処置することが可能である。
【００３２】
本発明の方法の他の局面では、本発明のポリペプチドを使用して、細胞培養中の細胞を処理し得る。培養中の細胞をこのポリペプチドで処理することを望む、当業者に公知の多数の理由が存在する。例えば、本明細書中に記載の方法に従って産生されたポリペプチドを、本明細書中に記載される所定の特定の方法についての何らかの有用性に関して試験することを所望し得る。また、本発明のポリペプチドを用いて、培養中の新生物性細胞もしくはウイルス感染細胞を殺傷すること、またはインビトロで免疫細胞機能をアッセイすることを所望し得る。
【００３３】
本発明はまた、以下の工程を包含する、治療因子を哺乳動物中の送達部位に送達する方法に関する：送達部位を標的化する第一領域およびＩｇＧのＨＣＨ２領域の少なくとも一部の１より多くのコピーを含む第二領域を含むポリペプチドを提供する工程；ならびに哺乳動物に治療因子を提供する工程；ここで、この治療因子は、送達部位へと送達されて、哺乳動物を処置する。本発明のこの局面におけるポリペプチドは、免疫グロブリンフレームワーク領域をさらに含み得る。治療因子は、当業者に公知の任意の形態の治療因子であり得る。例えば、治療因子は、ワクチン成分、モノクローナル抗体、サイトカイン、インターロイキン、ステロイド、インターフェロン、毒素、化学療法剤、放射性同位体、または免疫調節剤（例えば、グラチラマーアセテート（ｇｌａｔｉｒａｍｅｒ  ａｃｅｔａｔｅ）およびインターフェロン−β）であり得る。さらに、本発明は、画像化または他の関連の手順のために標識を哺乳動物中の部位に送達する方法に関する。これらの標識は、蛍光標識、親和性標識、放射性標識などを含むがこれらに限定されない、当業者に公知の任意の形態の標識部分であり得る。
【００３４】
さらに、本発明は、以下の工程を包含する、１以上の免疫学的産物を調製する方法に関する：ある量の抗原およびＩｇＧのＨＣＨ２領域の少なくとも一部の１より多くのコピーを含む第一領域を含むポリペプチドで、哺乳動物を免疫する工程；ならびに哺乳動物中で免疫学的産物を産生する工程。本発明のこれらの実施形態では、ポリペプチドは、上記のポリペプチドのうちのいずれかであり得る。さらに、免疫学的産物は、少なくとも１つのＴ細胞、Ｔ細胞によって産生された産物、Ｂ細胞、またはＢ細胞によって産生された抗体を含み得、ここで、この産物は、抗原に対して指向される。いくつかの場合、この方法は、さらなる用途のために免疫学的産物を得る方法であり、そして免疫学的産物は、哺乳動物から得られる。他の場合、この方法は、哺乳動物中で抗原に対してワクチン接種するかまたは免疫を誘導する方法である。本発明のこれらの方法のいくつかの局面では、第一領域は、抗体の一部または全てを含む。さらに、第一領域は、腫瘍、ウイルス、真菌、リケッチア、マイコプラスマ、細菌、原生動物寄生生物または後生動物（ｍｅｔａｚｏａｌ）寄生生物に結合するように適応され得る。さらに、第一領域は、腫瘍、ウイルス、真菌、リケッチア、マイコプラスマ、細菌、原生動物寄生生物または後生動物寄生生物に由来するタンパク質分子または非タンパク質分子に結合体化され得る。
【００３５】
本明細書および特許請求の範囲では、用語「１つ（ａ）」および「１つ（ａｎ）」は、接続詞「含む」とともに使用される場合、「少なくとも１つ」または「１以上」を意味する。
【００３６】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、そして本発明の特定の局面をさらに実証するために含まれる。本発明は、本明細書中に提示する特定の実施形態の詳細な説明とともにこれらの図面のうちの１以上を参照すれば、よりよく理解され得る。
【００３７】
（例示的な実施形態の説明）
本発明は、ポリペプチドをコードする領域を有する核酸のファミリー、およびＦｃγＲとの相互作用に関して、凝集ＩｇＧ（ＡＩＧ）および免疫複合体の機能を模倣し得、かつ第二タンパク質ドメインを含むことおよびＦｃγＲを発現する細胞にこのドメインを標的化することを可能にする、この核酸によってコードされるポリペプチドを記載する。本発明はまた、融合タンパク質の発現を指向するクローニングベクターのファミリーを記載し、ならびにＦｃγＲとの相互作用に関して凝集ＩｇＧ（ＡＩＧ）および免疫複合体機能を模倣し得、かつ第二タンパク質ドメインを含むことおよびＦｃγＲを発現する細胞にこのドメインを標的化することを可能にする融合タンパク質を記載する。ヒトＩｇＧ１のフレームワーク領域に融合された、ヒトＩｇＧ１のヒンジドメインおよびＣＨ２ドメイン（ＨＣＨ２）の少なくとも一部の直鎖状コピーを複数発現することにより、これらの特徴を有する組換えタンパク質が得られる。便利な制限部位は、さらなるアミノ末端ドメインの容易な導入を可能にする。得られる分子は、三部構成（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）である。カルボキシル−ＩｇＧ１フレームワークドメインは、安定性を提供し、そして二量化を可能にする；介在ＨＣＨ２ポリマーは、増大したエフェクター機能（ＦｃＲを発現する細胞のサブセットに標的化することを含む）、増大したＦｃＲ連結能力および／または増大した補体成分結合能力を付与し、一方で、アミノ末端ドメインは、ＦｃγＲを発現する細胞に対してさらなるシグナルを送達し得る。
【００３８】
本発明の別の局面は、本発明のポリペプチドおよび融合タンパク質を調製する方法、ならびに本発明のポリペプチドおよび融合タンパク質の使用のための方法を記載する。方法は、炎症性疾患を処置する工程、免疫を変更する工程、新生物性細胞を殺傷する工程および治療因子を送達部位に送達する工程を包含する。
【００３９】
（Ａ．抗体の構造）
抗体は、共通の構造的特徴を有する大きなファミリーの糖タンパク質を含む。抗体は、文字Ｙに似た三次元構造を形成する４つのポリペプチドから構成される。代表的に、抗体は、２つの異なるポリペプチド（重鎖および軽鎖）から構成される。
【００４０】
抗体分子は代表的に、以下の３つの機能的ドメインからなる：Ｆｃ、Ｆａｂおよび抗原結合部位。Ｆｃドメインは、Ｙの基部に位置する。Ｙのアームは、Ｆａｂドメインを含む。抗原結合部位は、Ｙの各アームの末端に位置する。Ｙのアームの支点領域は、ヒンジ領域である。
【００４１】
α、δ、ε、γおよびμと称される５つの異なる種類の重鎖ポリペプチドが存在する。κおよびλと称される２つの異なる種類の軽鎖ポリペプチドが存在する。抗体は代表的に、１種類のみの重鎖および１種類のみの軽鎖を含むが、任意の軽鎖が、任意の重鎖に会合し得る。
【００４２】
抗体分子は、以下の５つのクラスに分類される：ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＤ。ＩｇＧクラスは、ヒトＩｇＧについてＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含むサブクラスにさらに分けられる。抗体分子は、１以上のＹユニットから構成され、各Ｙは、２つの重鎖および２つの軽鎖を含む。例えば、ＩｇＧは、１つのＹユニットからなる。ＩｇＭは、５つのＹ様ユニットから構成される。
【００４３】
各重鎖ポリペプチドのカルボキシル末端は、定常（Ｆｃ）領域として公知である。各重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドのアミノ末端は、可変（Ｖ）領域として公知である。鎖の可変領域内には、相補性決定領域（ＣＤＲ）として公知の超可変領域が存在する。１つの重鎖鎖の可変領域と、１つの軽鎖の可変領域とが会合して、抗原結合部位を形成する。各重鎖および各軽鎖は、３つのＣＤＲを含む。抗原結合部位の６つのＣＤＲは、実際の抗原結合部位を形成するアミノ酸残基を規定する。ＣＤＲの変異性は、抗原認識の多様性を説明する。
【００４４】
成熟ヒトＩｇＧ１重（Ｈ）鎖は代表的に、４４７アミノ酸残基にわたる。Ｈ鎖のＦｃ領域は、全てのＩｇＧ１重鎖分子について本質的に同じである。Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１ポリペプチドのうちの、Ｆｃレセプターと相互作用する部分である。Ｆｃ領域は、３つの連続領域（ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメイン）にさらに細分され得る。Ｆｃレセプター結合部位は、ヒトＩｇＧ１のヒンジドメインおよびＣＨ２（ＨＣＨ２）ドメイン内に見出される。ＨＣＨ２領域は、ヒトＩｇＧ１のＨ鎖のアミノ酸残基２１６〜３４０（Ｅｕの番号付け）を含む。ヒンジ領域は、残基２１６〜２３７にわたり、一方、ＣＨ２ドメインは、残基２３８〜３４０を含む。
【００４５】
（Ｂ．免疫グロブリン融合タンパク質）
組換え免疫グロブリン融合タンパク質は、当該分野で周知である。例えば、Ｃａｐｏｎら，１９８９；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら，１９８９；Ｃｈａｍｏｗら，１９９６；Ａｓｈｋｅｎａｚｉら，１９９７を参照のこと。代表的に、組換え免疫グロブリン融合タンパク質は、Ｉｇのヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域から構成されるカルボキシル末端に融合された、リガンド結合ドメインから構成されるアミノ末端を有する。最も普通に用いられるＩｇのクラスは、ＩｇＧ１である。ＩｇＧのヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域は集合的に、ＩｇＧのＦｃ領域と呼ばれる。ヒンジ領域は、Ｆｃ領域とリガンド結合ドメインとの間に可橈性リンカーを提供する。ヒンジ領域はまた、鎖間ジスルフィド結合の形成部位、すなわち、１つの抗体鎖を別の抗体鎖へと共有結合して、馴染みのある二量体構造を作製する部位である。ヒンジ領域（特に、ヒンジ近位領域として公知の、ＣＨ２ドメインに最も近い部分）は、分子認識、ならびにＦｃγレセプターおよび補体成分への結合に必要である。従って、組換え免疫グロブリン融合タンパク質は、Ｉｇに類似するが、可変領域およびＣＨ１ドメインを欠き、これらは、リガンド結合ドメインによって置換されている。代表的に、組換え分子は、組換えＤＮＡ技術を用いてｃＤＮＡレベルで作製され、そして細胞培養において発現される。最も頻繁には、組換え免疫グロブリン融合タンパク質は、ジスルフィド結合したホモダイマーである。上記の代表的な融合タンパク質についてのバリエーションは、考慮すべきである。例えば、リガンド結合ドメインに加えて、多くの他の融合パートナー（例えば、リガンド、酵素およびペプチドエピトープ）は、アミノ末端に配置される。
【００４６】
本発明のポリマーは、以下に記載のように、ヒンジドメインおよびＣＨ２ドメインの少なくとも一部の直鎖状ポリマー（ＨＣＨ２ポリマー）から構成されるさらなる領域を含む。ポリマーの長さは変動する。ＩｇＧ融合タンパク質におけるフレームワークドメインとアミノ末端ドメインとの間でのポリマー単位の導入は、機能が三部構造である分子をもたらす。フレームワークドメインは、ＩｇＧ融合タンパク質に共通の特徴（例えば、安定性、共有結合的二量体化、一工程精製、および検出の容易さ）を提供する（Ｃｈａｍｏｗら，１９９６）。介在のＨＣＨ２ポリマーは、増大したエフェクター機能（ＦｃＲを発現する細胞のサブセットを標的化することを含む）、増大したＦｃＲ連結能力および増大した補体成分結合能力を付与する。アミノ末端ドメインは、第二シグナルを送達し得る。従って、複数の分子シグナルは、ドメイン間の相乗的相互作用の可能性を伴って、単一分子中に組み込まれ得る。記載される分子は、さらなる機能の導入を可能にすることによって、ＩｇＧ融合タンパク質プラットフォームにさらなる次元を付加する。
【００４７】
本発明のポリマーは、複数のＨＣＨ２反復ユニットから構成される。このポリマーは、ヒトＩｇＧ１フレームワーク発現ベクターへのＨＣＨ２ユニットの迅速な付加をもたらすクローニング系を用いて開発された。ＨＣＨ２反復単位は、ＩｇＧ１のようなＩｇ由来のヒンジドメインおよびＣＨ２ドメインから構成され、これは、ＦｃＲおよび補体に結合することが公知の領域を含む。ポリマーのＨＣＨ２ユニット間の鎖間ジスルフィド結合形成を防ぐために、ＨＣＨ２モノマーユニットのヒンジ領域のシステインを、セリンに変異させた。これらの変異は、ＦｃＲおよび補体と相互作用することが公知のヒンジ残基をインタクトなままにする。フレームワーク発現ベクター中のヒンジは変異させなかったので、ＩｇＧの二量体構造は保持された。５’末端のいくつかの独特の制限部位は、ポリマー発現構築物へのアミノ末端ドメインの指向性クローニングを可能にする。
【００４８】
本発明のいくつかの実施形態では、ポリマーを作製する際にＨＣＨ２領域全体が用いられることは必要ではない。上記のように、ヒトＩｇＧ１のＨＣＨ２全体は、ヒトＩｇＧ１のＨ鎖のアミノ酸残基２１６〜３４０（Ｅｕの番号付け）を含み、ヒンジ領域は、残基２１６〜２３７にわたり、そしてＣＨ２ドメインは、残基２３８〜３４０を含む。ＩｇＧとＦｃレセプターとの間の相互作用は、野生型Ｆｃおよび変異Ｆｃを用いた生化学的研究および構造的研究において分析されている。多数の研究から生じたコンセンサスは、Ｆｃレセプターへの結合に重要な領域が、ヒンジ領域のうちの、ＣＨ２ドメインに最も近い部分およびＣＨ２ドメインのうちの、ヒンジに隣接するアミノ末端に存在するということである。特に重要なのは、残基２３３〜２３９（Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ）である。この領域内の変異は、Ｆｃレセプターへの実質的に変更された結合をもたらす。この領域はまた、結晶学的研究によって決定したところ、Ｆｃレセプターとの直接的相互作用のうちの多くを担う。ＣＨ２ドメイン中へ、そしてヒンジから離れてさらに、少なくともいくつかの状況で、Ｆｃレセプター結合に重要な他の残基が存在する。これらの中でも、Ａｓｎ−２９７およびＰｒｏ−３２９である。Ｐｒｏ−３２９は、Ｆｃレセプターとの直接的接触に関与する。Ａｓｎ−２９７は、Ｆｃ領域内の唯一のＮ結合型グリコシル化部位である。この残基の糖質が存在することは、Ｆｃレセプターへの結合に重要である。しかし、ＩｇＧ１のＦｃの残基２３３〜２３９にわたるペプチドが、ＦｃγＲＩＩＩにそれほど結合しないことに留意しなければならない。従って、この領域が、ＨＣＨ２領域の構造全体の状況においてＦｃレセプターを係合する際に最も有効であることが考察され得る。
【００４９】
以下に提示する実施例では、ポリマーを、ヒトＩｇＧ１のＨ鎖のアミノ酸残基２１６〜３４０を含むヒトＩｇＧ１のＨＣＨ２領域を用いて構築した。この領域は、Ｆｃレセプター結合に極めて重要であることが既知の配列、ならびにさらなる隣接残基を含む。この隣接残基は、構造的安定性およびＨＣＨ２ユニット間の間隔を提供する。本発明者らは、いくつかの実施形態では、ＨＣＨ２ユニット全体の代わりにＨＣＨ２内の領域を含むＨＣＨ２ポリマーを構築することが有利であり得ると考える。これは、例えば、ＨＣＨ２ユニット、それゆえポリマーのサイズを低減するために行われ得る。これが達成され得る１つの方法は、Ｆｃレセプター結合に極めて重要であることが公知の領域のいずれかの側での隣接残基の欠失を介してである。例えば、ヒンジは、本明細書中に提示した実施例において用いられたように、残基２１６〜２３７の代わりに残基２３３〜２３７にわたるように短縮され得る。同様の考慮事項は、残基２３８〜３４０にわたるＣＨ２領域、ならびにＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４およびＩｇＥを含め、他のＩｇのヒンジ領域およびＣＨ２領域に適用される。もちろん、当業者は、本明細書の教示を考慮して、本発明の状況においてＨＣＨ２領域の部分の多数の異なる構成を作製し、試験し、そして使用し得る。
【００５０】
本発明のポリマーは、低親和性ＦｃＲに結合する。いくつかの例において、ポリマーは、高親和性ＦｃＲレセプター（例えば、ＦｃγＲＩレセプター）を結合する。このことは、ＨＣＨ２領域に対する高親和性ＦｃＲレセプターの結合高親和性の自然な結果である。
【００５１】
いくつかの例において、低親和性ＦｃγＲレセプター（例えば、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩａおよびＦｃγＲＩＩＩｂ）の全ての形態を結合するＨＣＨ２ポリマーを構築することが、有利であり得る。他の実施形態において、このポリマーを構成するＨＣＨ２単位の数および間隔は、１つの型のＦｃＲレセプターへの結合を増加するように、または逆に、別の型のＦｃＲレセプターへの結合を減少するように変化される。さらに他の実施形態において、ＨＣＨ２モノマー単位に対する変更は、１つの型のＦｃγＲレセプターに対する特異的結合を増加するように、および／または別の型のＦｃγＲレセプターに対するポリマーの特異性を減少するようになされ得る。このような変更は、ＨＣＨ２配列内の特定のアミノ酸残基を他のアミノ酸に変異させることによって達成される。ＨＣＨ２単位内で変異させる残基の選択は、標的レセプター特異性の選択によって決定され、そして当業者に周知である。例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓら、２００１；Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎら、２０００；Ｍｏｒｇａｎら、１９９５；Ｈｕｌｅｔｔら、１９９４を参照のこと。他の実施形態において、異なるＦｃγＲレセプターに対するＨＣＨ２ポリマーの特異的結合は、ＨＣＨ２ポリマーのグリコシル化の存在および型によって増強され得る。ＨＣＨ２ポリマーを産生する発現系の選択は、グリコシル化の程度および型を部分的に決定する。
【００５２】
本明細書中で示される例において、ポリマーは、ヒトＩｇＧ１由来のＤＮＡ配列を使用して構築された。いくつかの実施形態において、ヒトにおける免疫治療剤として使用するために、ヒト配列のみから構成されるＨＣＨ２ポリマーを構築することは有利であり得る。しかし、いくつかの実施形態において、ポリマーは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＥを含む他のＩｇの配列からアセンブリされる。他の実施形態において、ポリマーは、１つより多い型のＩｇの配列からアセンブリされる。例えば、ＩｇＧ配列由来のＨＣＨ２単位を含むポリマーが、ＩｇＥ配列由来のＨＣＨ２単位に連結される。他の実施形態において、ＨＣＨ２ポリマーは、非ヒト配列から構成される。ポリマーおよびポリマー融合タンパク質を構築するために使用される配列の選択は、標的レセプターおよび宿主同一性（ヒトまたは非ヒト）によって決定される。なお他の実施形態において、ヒンジ領域システインは、セリン以外のアミノ酸残基に変異される。いくつかの実施形態において、ＨＣＨ２単位は、補体成分を結合するがＦｃＲに結合しないように変更および／または変異され得る。他の実施形態において、ＨＣＨ２単位は、ＦｃＲを結合するが補体を結合しないように変更および／または変異され得る。
【００５３】
本明細書中に示される例において、ポリマーは、ヒトＩｇＧ１由来のＤＮＡ配列を使用して構築された。発現されたタンパク質は、低親和性ＦｃγＲレセプターとの相互作用について評価された。しかし、いくつかの実施形態において、ポリマーは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＥを含む他のＩｇの配列からアセンブリされ、そして、これらのポリマーは、ＦｃαＲ、ＦｃεＲ、ＦｃμＲ、ＦｃδＲおよびＦｃＲｎを含む、他のＩｇに対するＦｃＲに結合し、そしてこれらと相互作用する。他の実施形態において、ポリマーは、１つより多い型のＩｇの配列からアセンブリされる。例えば、ＩｇＧ配列およびＩｇＥ配列由来のＨＣＨ２単位を含むポリマータンパク質は、１つより多い型のＩｇに対するＦｃＲと相互作用および結合する。
【００５４】
本明細書中に示される例において、ポリマーは、全長ＨＣＨ２単位から構成されるモノマーから構築される。いくつかの実施形態において、全長ＨＣＨ２単位より小さなモノマーを含むポリマーを構築することは、有利であり得る。より小さなＨＣＨ２単位由来のＨＣＨ２ポリマータンパク質は、より小さなサイズおよび質量を有し、ＦｃＲおよび／または補体に効果的に結合しかつＦｃＲおよび／または補体を効果的に活性化する能力をなお保持する。ＨＣＨ２単位のサイズの減少は、ＦｃＲおよび／または補体に対する結合に関与しない配列の除去によって達成される。ＦｃＲおよび／または補体に対する結合に関与しない配列の同一性は、周知であり、ＨＣＨ２モノマー単位からのこれらの除去のための方法も同様である。これらの配列の除去は、所望の結合に影響せず、より小さな質量のポリマーを生じる。
【００５５】
組換えＨＣＨ２ポリマー構築物は、凝集ＩｇＧ（ＡＩＧ）および凝集Ｆｃの免疫複合体（ＩＣ）の生物学的活性および機能を模倣し得る。組換えＨＣＨ２ポリマー構築物の使用は、ＡＩＧ凝集体またはＦｃ凝集体を超えるいくつかの利点を提供する。ＨＣＨ２単位の数および間隔は、ＦｃＲとの相互作用をよくする（ｈｏｎｅ）ために変更され得る。凝集体は、元来、バッチ間でかなりの変化を有して不均一であるが、組換えＨＣＨ２ポリマーは、正確に規定される。本明細書中に示されるように、ＨＣＨ２ポリマーは、ＡＩＧよりもかなり強力である。おそらく、この結果は、ＦｃＲ凝集体の連結に必要であるそれらの決定基のみを発現すること、および／または特に都合よい配置でこれらを提示すること、によって達成される。
【００５６】
レセプターは、種々の数のＨＣＨ２単位を含む構築物で特異的に活性化され得る。本明細書中で示されるように、レセプターを結合するために利用可能なＨＣＨ２反復単位の数は、細胞機能に顕著に影響する。細胞機能は、単一のＨＣＨ２単位の付加に伴って変化する。本発明の構築物は、ＩＣサイズに基づいてレセプター機能における変化の測定を可能にする。ポリマー構築物内に含まれるＨＣＨ２反復単位は、変化し得、そして生物学的活性を最適化するために選択される。１つの実施形態において、ＨＣＨ２ポリマーは、ジスルフィド結合したホモダイマーとしてアセンブリされる。いくつかの実施形態において、ＨＣＨ２ポリマーは、モノマー（単鎖ポリペプチド）、またはヘテロマルチマーもしくはホモログマルチマー、および特にダイマー、テトラマーおよびペンタマーとしてアセンブリされる。
【００５７】
種々のタンパク質（ヒトＣＤ８αおよびヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む）の細胞外ドメインは、ＨＣＨ２ポリマー融合タンパク質として発現され得る。これらの組換えＣＨ２ポリマーの生物学的活性は、ＡＩＧおよび抗ＣＤ１６モノクローナル抗体の活性と都合よく匹敵する。この融合タンパク質の活性は、ＨＣＨ２単位の数とポジティブに相関する。ＣＤ８α細胞外ドメインまたはＨＳＡドメインのいずれかを使用して試験した最大のポリマーは、同様の濃度でＡＩＧより数倍強力であった。
【００５８】
多くのタンパク質ドメインが、ＨＣＨ２ポリマー融合タンパク質として発現され得る。このようなタンパク質の非限定的な例としては、リガンド結合ドメイン、レセプターの細胞外ドメイン、酵素、接着分子、サイトカイン、ペプチドホルモン、免疫グロブリンフラグメント（Ｆａｂ’）、リガンドおよび抗原が挙げられる。タンパク質ドメインの融合物が作製される部位は、周知であり、そして生物学的活性、安定性、分泌、親和力および結合特異性を最適化するために選択され得る。ＩｇＧ１を含むＨＣＨ２ポリマー融合タンパク質は、指標としてのヒトＩｇＧ１定常領域遺伝子（登録番号＃Ｚ１７３７０）からの配列データを使用して設計された。２つのアミノ末端ドメイン（ヒトＣＤ８α（登録番号＃Ｍ１２８２４）の細胞外ドメインおよびヒト血清アルブミン（登録番号＃Ｖ００４９４）のドメインＩ）は、ＨＣＨ２ポリマーに融合されて発現された。いくつかの例では、さらなるタンパク質ドメインまたはフレームワーク配列に融合されていないＨＣＨ２ポリマー領域から構成されるＨＣＨ２ポリマーを構築することは、有利であり得る。
【００５９】
特定の好ましい実施形態において、本発明の融合タンパク質は、ＨＣＨ２ポリマー領域を、存在する抗体配列または組換えタンパク質の配列に挿入することによって産生される。このプロセスは、好ましい治療剤に結合させるために使用され得る多くの抗体に対して多くの研究が存在するという点で、有利である。この方法の別の利点は、その簡単さである。ＨＣＨ２ポリマー領域は、あるｃＤＮＡ構築物から別のｃＤＮＡ構築物へ容易に移入するために設計された、別々の、モジュラーＤＮＡエレメントである。モジュラーＤＮＡエレメントは、時折「クローニングカセット」といわれる。ＨＣＨ２ポリマー領域は、クローニングカセットとして使用され得、そして任意のタンパク質について存在するｃＤＮＡに単純にスプライシングされ得、よって形成プロセスからいくつかの工程を除去し得る。特定の環境下で、タンパク質配列内の正確な挿入部位が、慣用的な実験によって決定される。しかし、免疫グロブリン、およびこの免疫グロブリン由来のタンパク質についての適切な挿入部位は周知である。このアプローチを使用して、存在するモノクローナル抗体および組換え免疫グロブリン融合タンパク質は、ＨＣＨ２ポリマー領域の付加を介して容易に改変され得る。
【００６０】
（Ｃ．免疫系）
免疫系は、内在的および適応性の免疫系として知られる２つのアーム（ａｒｍ）に分けられ得る。この内在的な免疫系は、侵入する微生物または他の傷害に対する防御の第一線を提供する。内在的な免疫系防御に関与する細胞型としては、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、天然の抗体産生を請け負うＢ細胞もよび単球／マクロファージが挙げられる。適応性の免疫系は、より精巧によくされ（ｈｏｎｅ）、免疫学的記憶を示し、そして第２のより特異的な防御線を提供する。適応性の免疫に関与する細胞型としては、Ｔ細胞、Ｔ細胞依存的抗体応答に関与するＢ細胞、およびまた単球／マクロファージが挙げられる。内在的な系と適応性の系との間の相互作用は、いくつかの環境下での強化、および他の環境下での拮抗作用を伴い、複合である。これらの相互作用のいくつかとしては、本発明が免疫複合体についての模倣物を提供する限り、本発明による免疫複合体によって、および伸長によって、発揮される制御が挙げられる。
【００６１】
（１．ＮＫ細胞）
ＮＫ細胞は、骨髄で生成される大きな顆粒性のリンパ球である。ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞の異なる形態、およびＮＫ細胞が発現するかまたは発現しないかのいずれかである表面マーカー分子によって認識され得る。ＮＫ細胞は、ＣＤ１６＋、ＣＤ５６＋およびＣＤ３−である。ＮＫ細胞は、脾臓、血液および組織中に見出されるが、リンパ節には見出されない。ＮＫ細胞は、いくつかの腫瘍細胞、いくつかのウイルス感染細胞を殺傷する能力、およびサイトカイン（特にインターフェロンγおよび腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）（これらの両方が、ウイルス感染の最初の制御に寄与し、そしてこれらの両方が、適応性の免疫および自己免疫疾患に関与するＴ細胞およびＢ細胞にわたる調節効力（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ）を発揮する））を放出する能力を有する。本発明は、ＮＫ細胞を活性化して、ＮＫ細胞を増殖させ、そして漸増量のインターフェロンγおよびＴＮＦを放出させる。ＮＫ細胞が発現するＣＤ１６表面マーカーは、本発明が結合するＦｃγＲＩＩＩａレセプターである。この結合が、ＮＫ細胞の活性化の原因となる。ＮＫ細胞自体は、少なくともいくつかの自己免疫プロセスにおける防護的役割を有する。なぜなら、これらの枯渇が、ヒトの主要な自己免疫疾患の１つである多発性硬化症についての動物モデルにおける実験的自己免疫脳脊髄炎の重篤度を増強するからである。従って、本発明によるＮＫ細胞の活性化は、自己免疫プロセスのための改善された処置の見込みを提供する。
【００６２】
ＨＣＨ２ポリマー融合タンパク質を使用してＮＫ細胞を活性化し、ＮＫ細胞を駆動してインビボおよびインビトロの両方で数を拡張させ、そして新生物細胞、腫瘍を作製する悪性細胞、癌細胞またはウイルス感染細胞を標的化、除去またはさもなくば破壊するために、公知の抗腫瘍活性および抗ウイルス活性を有するサイトカインを分泌させることは、本発明の１つの実施形態である。高用量のＩＬ−２を含むヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）の培養物は、リンホカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ細胞）と証される細胞傷害性細胞の生成を生じる（Ｒｏｓｅｎｓｔｅｉｎ，Ｍ．ら、１９８４）。ＬＡＫ細胞は、ＮＫ細胞とＴ細胞との混合物である。ＬＡＫ細胞の特徴は、非ＭＨＣ制限様式で種々の腫瘍細胞を溶解する能力である。ＮＫ細胞による腫瘍細胞認識は、抗原非依存的である。癌治療に対する１つのアプローチは、高用量のＩＬ−２を静脈内投与して、ＮＫ／ＬＡＫ細胞をＰＢＬからインビボで生成させることである。しかし、治療レベルの静脈内ＩＬ−２の実質的な毒性は、癌治療葯としてのその使用を制限した。従って、ＮＫ／ＬＡＫ細胞は、患者ＰＢＬから高用量のＩＬ−２とともにインビトロで培養され、細胞数を数サイクル拡張した後、患者に戻された（Ｈａｙｅｓ，Ｒ．ら、２００１）。関連のアプローチとしては、腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）を、切除された腫瘍から単離することが挙げられ、これもまた、高用量のＩＬ−２とともにインビトロで拡張される。これらのアプローチは、免疫担当細胞の全ての集団の小画分を示すが、活性化ＮＫ細胞は、ＴＩＬの重要な成分である（Ｂｒｉｔｔｅｎｄｅｎ．Ｊ．ら、１９９６）。本発明のポリペプチドは、ＩＬ−２と合わせて、ＮＫ細胞の有力なアクチベーターである。ＮＫ細胞は、ＨＣＨ２ポリマーによって、ＩＬ−２単独で起こり得るレベルよりかなり高いレベルに活性化される（実施例１３）。ＨＣＨ２ポリマーは、ＩＬ−２治療単独を超える異なる２つの利点を提供する。第一に、ＨＣＨ２ポリマーとＩＬ−２との同時投与は、ＩＬ−２単独で使用される場合よりも実質的に低レベルのＩＬ−２でのＮＫ細胞活性化を達成し得、よって、インビボでの高レベルのＩＬ−２治療に関連する多くの毒性を回避し得る。本発明のＨＣＨ２ポリマーは、ＬＡＫ／ＴＩＬ細胞のインビトロでの拡張に対する適用を見出すことが同様に予期される。第二に、ＨＣＨ２ポリマーはまた、ＮＫ細胞からのＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γの分泌を強力に誘導する（実施例１６）。ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γの両方は、公知の抗腫瘍効果および抗ウイルス効果を有する（Ｆｏｒｔｉｓ，Ｃ．ら、１９９９）。
【００６３】
（２．単球およびマクロファージ）
マクロファージは、単球に由来し、そしてこれらの機能の多くを共有する。このため、これら２つの細胞は、一緒にみなされる。単球は、骨髄内で成熟する。これらは、血液中に見出され、そして組織全体に見出される。これらは、内在的な防御および適応性の防御の両方において機能する。ウイルス感染の結果、これらは、インターフェロンγおよびＴＮＦを産生するためにＮＫ細胞を活性化するタンパク質であるＩＬ−１２を放出する。ウイルス性防御および腫瘍防御におけるＩＬ−１２の重要性は、上記で議論されている。単球は、抗原提示細胞として機能し、このためＴ細胞の活性化、よって適応性の免疫に重要である。同様に、これらは、活性化Ｔ細胞により放出される産物による食作用について活性化され、一旦活性化されると、侵入する生物、ならびに生物の侵入または自己免疫プロセスによって損傷される細胞および組織の両方を清澄化する。
【００６４】
単球はまた、単球が放出する産物によって発揮される調節特性を示す。これらの産物は、免疫応答（自己免疫応答を含む）を阻害するように作用する。単球によって放出される調節分子は、ＩＬ−１０およびプロスタグランジンＥ２である。
【００６５】
単球は、Ｆｃレセプターの３つのクラス全てを発現する。単球上に発現するＦｃＲに対するＨＣＨ２ポリマーの結合は、ＦｃγＲＩＩの連結、ＦｃγＲＩＩＩａの連結を生じ得るか、またはＦｃγＲＩＩレセプターおよびＦｃγＲＩＩＩａレセプターの両方の同時凝集を生じ得る。単球上でのＦｃγＲＩＩＩａレセプターの連結は、単球によるＩＬ−１０およびプロスタグランジンＥ２の産生を強力に誘導することが公知であり（Ｐａｓｓｗｅｌｌら、１９７９；Ｆｅｒｒｅｒｉら、１９８６；Ｂｅｒｇｅｒら、１９９６）、このことは、本発明が、同様の誘導を介して、自己免疫プロセスの制御に寄与し得ることの予想を提供する。
【００６６】
（３．Ｂ細胞）
Ｂ細胞は、抗体を産生する。ＩｇＭクラスの抗体の最初の産生は、Ｔ細胞の影響に非依存的であるが、続くＩｇＧおよび他のクラスの抗体へのスイッチは、Ｔ細胞の指揮下で生じる。Ｔ細胞非依存性抗体およびＴ細胞依存性抗体の両方が、自己免疫応答に関係し得る。Ｂ細胞は、ＦｃγＲＩＩｂレセプター（ＣＤ３２）を発現する。このＦｃγＲＩＩｂレセプターは、そのレセプターの細胞質テール内に位置される免疫レセプターチロシンベースのインヒビターモチーフ（ＩＴＩＭ）として知られる特定化されたシグナル伝達モチーフを介して媒介されるネガティブシグナルを送達する。ＩＴＩＭモチーフは、ＦｃγＲＩＩｂレセプターに独特な特徴であり、他のＦｃγレセプタークラスのいずれにも存在しない。このレセプターの連結は、ネガティブシグナル、よって、抗体産生についての阻害シグナルをＢ細胞に提供する。ＦｃγＲＩＩｂレセプターは、ＩｇＧ含有免疫複合体およびＩｇＧ凝集体を認識し、そしてこれらに応答する。従って、結果として、ＩｇＭクラスおよびＩｇＧクラス両方の免疫グロブリン産生の阻害を有する本発明に対して応答することが予期される。
【００６７】
Ｂ細胞による抗体産生はまた、Ｔ細胞および単球によって放出される産物により及ぼされるダウンレギュレート制御を受けやすい。このような制御には、調節性ＣＤ８細胞（時折、サプレッサー細胞といわれる）によって発揮される制御がある。ＣＤ８細胞が、ＩｇＧ凝集体を結合するＦｃγレセプターを発現しなくても、インビトロでの末梢血単核細胞調製物に加えられたＩｇＧ凝集体は、免疫グロブリン産生のＣＤ８媒介性阻害を活性化する。この結果は、ＩｇＧ凝集体が結合するＮＫ細胞および単球により放出される産物によるＣＤ８細胞活性の誘導に依存すると考えられている。本発明は、ＩｇＧ凝集体の活性を模倣するので、間接的に媒介されるＣＤ８細胞媒介性調節活性の誘導、よって自己免疫に対する有利な効果が予想され、そして実際に見出された。
【００６８】
（４．Ｔ細胞）
Ｔ細胞は、胸腺で成熟する小さなリンパ球であり、ここからＴリンパ球は、リンパ器官に進む。Ｔ細胞は、ＣＤ４細胞およびＣＤ８細胞として知られる、２つの主要なカテゴリーに分けられ得る。この２つのカテゴリーは、たとえ重複しても、異なる機能を有する。ＣＤ４細胞は、時折、遅延型過敏性としていわれる細胞性免疫の原因である。細胞性免疫は、多くの自己免疫疾患の病原性に関与する。ＣＤ４細胞は、細胞表面上に発現するＴ細胞レセプターによって抗原を認識する。抗原性ペプチドフラグメントは、抗原提示細胞（例えば、単球）の表面に発現されるＭＨＣクラスＩＩ分子によって、ＣＤ４細胞に提示される。Ｔ細胞は、この提示によって活性化されるが、第２の活性化シグナルが抗原提示細胞によって提供される場合にのみである。活性化ＣＤ４細胞は、これらの生物学的効果の原因であるサイトカインを放出する。ＣＤ４細胞は、Ｔｈ１細胞およびＴｈ２細胞として知られる２つのサブクラスに分けられ得る。Ｔｈ１細胞は、細胞性免疫の原因であるが、Ｔｈ２細胞は、ＩｇＧおよび他のクラスの免疫グロブリンの、Ｂ細胞による産生を指向する。
【００６９】
ＣＤ４細胞応答は、緊密に調節されており、そしてこの調節機構は、自己免疫疾患を処置するために活用され得る。ＣＤ４細胞は、Ｆｃγレセプターを発現しないが、ＣＤ４細胞の制御は、サイトカイン（例えば、Ｆｃγレセプター連結の結果として単球によって産生されるＩＬ１０）により発揮され得る。Ｆｃγレセプター連結の結果としてＮＫ細胞により放出されるサイトカインはまた、ＣＤ４細胞の不活化に寄与し得る。さらに、ＣＤ８細胞により放出される産物（以下を参照のこと）は、ＣＤ４細胞を阻害し得る。ＣＤ８細胞は、ＮＫ細胞および単球の表面上に発現されるＦｃγレセプターの連結に続いてＮＫ細胞および単球により放出される産物による調節活性についてプライムされる。これらの理由の全てのために、本発明は、自己免疫プロセスの病原性に寄与するＴｈ１細胞およびＴｈ２細胞の活性を阻害する予想を提供する。
【００７０】
ＣＤ８細胞は、Ｔ細胞の第２の主要なカテゴリーを含む。ＣＤ８細胞は、抗原提示細胞の表面上に発現されるＭＨＣクラスＩ分子によってＣＤ８細胞に対して提示されるペプチドの認識する。ＣＤ４細胞と同様に、同時刺激シグナルが、ＣＤ８細胞の活性化に必要とされる。ＣＤ８細胞の大多数は、Ｆｃγレセプターを発現しない。ＣＤ８細胞は、確立された２つの主要な機能を有する。その第一は、細胞内に存在するウイルスおよび他の病原体による感染の制御における重要な成分である、細胞傷害性である。第二の主要な機能は、既に議論された調節性機能である。
【００７１】
上記した免疫系機能の簡単な概略は、不十分である。その目的は、本発明が自己免疫プロセスに対する有利な効果を有することを期待させ得るいくつかの機構を強調することである。
【００７２】
（Ｄ．Ｆｃレセプターおよびその補体の系）
Ｆｃレセプターの３つのクラスが存在する（Ｇｅｓｓｎｅｒら、１９９８；Ｒａｇｈａｖａｎら、１９９６）。ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）は、モノマーのＩｇＧを高い親和性で結合するのに対して、ＡＩＧおよびＩＣは、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）（Ｆｃに対する低親和性レセプター）に優先的に結合する。ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩは、それらのリガンド結合ドメインの構造において密接に関連する。ヒトの３つの独立した遺伝子（ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、およびＦｃγＲＩＩＣ）において、これらの２個は、交互にスプライシングされた（ＦｃｇＲＩＩをコードする）改変体を生じる。ＦｃγＲＩＩａが、活性化シグナルを送達するのに対して、ＦｃγＲＩＩｂは、阻害シグナルを送達する。互いに異なるシグナルに関する機能的基盤は、レセプターの細胞質テイル内に局在するシグナル伝達モチーフから生じる。ＦｃγＲＩＩｂの細胞質テイルに局在化する免疫レセプターチロシンベースインヒビターモチーフ（ＩＴＩＭ）が、ネガティブレセプターシグナル伝達に関して重要である。ＩＴＩＭモチーフは、ＦｃγＲＩＩｂレセプターの独特な特徴であり、他のいずれのＦｃγレセプタークラスにも存在しない。対照的に、活性化性の免疫レセプターチロシンベースアクチベーターモチーフ（すなわちＩＴＡＭ）は、ＦｃγＲＩＩａの細胞質テイルに局在化する。ＩＴＡＭモチーフは、活性化シグナルを変換する。これらは、ＦｃＲ  γ鎖にもまた見出され、このγ鎖は、高親和性ＩｇＥレセプター（ＦｃεＲＩ）のγ鎖と同一である。ＦｃγＲＩＩａおよびＦｃγＲＩＩｂが、骨髄性細胞およびいくつかのＴ細胞サブセット上で広く発現される一方、ＦｃγＲＩＩａおよびＦｃγＲＩＩｂは、ＮＫ細胞には全く存在しない。
【００７３】
ヒトＦｃγＲＩＩＩはまた、２つの異なる遺伝子（ＦｃγＲＩＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＢ）由来の複数のアイソフォームで存在する。ＦｃγＲＩＩＩｂは、グリコシルホスファチジルアンカーを介する、細胞膜への結合という点で特異である。ＦｃγＲＩＩＩｂの発現は、好中球に限定されるが、ＦｃγＲＩＩＩａは、マクロファージ、およびＮＫ細胞（両方、ＦｃγＲＩＩＩａ）によって発現される。ＦｃγＲＩＩＩａはまた、いくつかのγδ  Ｔ細胞サブセットおよび特定の単球によっても発現される。ＦｃγＲＩＩＩａは、細胞表面発現およびシグナル伝達に対して、ＦｃＲ  γ鎖および／またはＣＤ３  ζ鎖の存在を要求する。ＦｃＲ  γ鎖およびＣＤ３  ζ鎖は、ダイマーであり、そしてＩＴＡＭモチーフを有する。ＦｃγＲＩＩＩａは、これらのサブユニットと多量体化した複合体を形成し、シグナル伝達は、これらを通して伝達される。従って、かなりのＦｃγＲレセプターの不均一性および多様な発現プロフィールが存在する。
【００７４】
ＡＩＧおよびＩＣは、免疫細胞上でＦｃγＲＩＩＩａを標的化するために使用されるが、以前に示されたように、規定されたＡＩＧおよびＩＣの産生は、不確定であるように見えた。物理的または化学的方法による複合体のアセンブリは、正確に制御することが困難であり、調製と貯蔵中の組成物の変化との間の変動に加えて、類似する分子量の複合体内の不均一性を生じる。分子クローニングを、本発明において使用し、それらのＦｃＲとの相互作用に関するＡＩＧおよびＩＣの機能を模倣または近似し得、かつＦｃＲを発現する細胞に対する第２のタンパク質ドメインを含むことそしてこのドメインがこの細胞を標的化することを可能にする分子を作製する。
【００７５】
ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩに対する結合部位は、ＩｇＧのＣＨ２ドメインのヒンジ領域および隣接領域（最初に、ＦｃγＲＩに対して同定された同じ領域）に位置する（Ｄｕｎｃａｎら、１９８８；Ｍｏｒｇａｎら、１９９５；Ｌｕｎｄら、１９９１）。Ｗｈｉｔｅら（２００１）は、ＩｇＧ１のＦｃ領域に融合されるヒンジおよびＣＨ２（ＨＣＨ２）の直線状ポリマーのクローニングおよび発現を記載し、それらの生物学的活性を示す。Ｌｅｇｇｅら（２０００）は、最近、モノマー形態と異なり、凝集ＰＬＰ１免疫吸着が、自己免疫性脳脊髄炎実験（多発性硬化症に関する齧歯類モデル）において疾患の重篤度を和らげることを示した。この変化は、複合体中の凝集ＦｃおよびＰＬＰ部分の二重機能性に起因する。
【００７６】
初期免疫応答の末期または慢性応答において、巨大なＩＣＳは形成する。これらの複合体は、ＩＣＳまたはＩｇＧ凝集を優先的に認識する、低親和性ＩｇＧレセプターを通して、シグナルを送る。この低親和性レセプターは、２つのクラスのＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）に属する。ＦｃγＲＩＩｂは、ＩｇＧ分泌を含む免疫グロブリン分泌を増大させるサイトカインの分泌に対する阻害シグナルを提供する。ＦｃγＲＩＩＩａ（ＮＫ細胞、単球およびγδ  Ｔ細胞上に見られる）は、優先的にＩｇＧ１を認識する。本発明の１つの趣旨は、ＦｃγＲＩＩＩａの活性化に指向される。
【００７７】
ＦｃγＲのＩｇＧに結合する能力および細胞にシグナルを伝達する能力は、発現されるＦｃγＲ対立遺伝子、グリコシル化、およびこのレセプターがどのようにシグナル伝達サブユニットと結合するかに依存する。さらに、グリコシル化のパターンは、細胞型の間で異なり、このパターンは、ＦｃγＲＩＩＩａに結合するリガンドにも影響し得る。ＮＫ細胞上のＦｃγＲＩＩＩａが、マンノースオリゴ糖で高度にグリコシル化されるが、単球／マクロファージＦｃγＲＩＩＩａは、グリコシル化されない。おそらくこれは、単球／マクロファージＦｃγＲＩＩＩａに、ＮＫ細胞ＦｃγＲＩＩＩａに比べて低いレセプター親和性を付与し、レセプター機能に、さらに別のレベルの改変を付加する（Ｇａｌｏｎら、１９９７；Ｅｄｂｅｒｇら、１９９７）。従って、ＦｃγＲの機能は、いくつかのレベルで制御され、この機能は、リガンド結合およびレセプターシグナル伝達に対する影響力を有し得る。
【００７８】
最近、本発明者らは、ヒト自己免疫症候群における免疫複合体（ＩＣ）の潜在的な免疫調節的役割の研究を開始した。本研究の主要部は、ＩＣとＦｃＲとの間の相互作用である。しかし、規定されるＩＣの産出は、正確に制御することが困難である。分子クローニングを、使用して、それらのＦｃＲとの相互作用に関するＩＣの機能を模倣または近似し得、かつＦｃＲを発現する細胞に対する第２のタンパク質ドメインを含むことそしてこのドメインがこの細胞を標的化することを可能にする分子を作製する。追跡された戦略は、ＦｃＲに結合するＩｇＧフレームワーク領域の複数の直線状コピーを発現することである。ＦｃＲの関与に必要なこれらの決定因子のみを発現すること、および特に好ましい配置で、これらの決定因子を提示することは、ＩＣよりかなり強力な新規タンパク質群を生じる。従って、本明細書に記載される組換えＩＣ擬似タンパク質は、ＩＣ沈着の試験に関する貴重なツールおよび自己免疫障害におけるＦｃＲの治療的標的化における貴重なツールの両方を提供する。
【００７９】
（１．ＦｃγＲＩＩＩａおよびＮＫ細胞）
ＮＫ細胞は、ライゲーションによって、リンフォカインの発現および構成的に発現される低親和性ＩＬ−２レセプター（ＩＬ−２Ｒ（ｐ７５））のアップレギュレーションを生じる、ただ１つの型のＦｃγＲ（ＦｃγＲＩＩＩａ）を発現する（Ａｎｅｇｏｎら、１９８８）。多量のＩＬ−２に曝すだけで、リンフォカインの発現、増加したＩＬ−２Ｒの発現、強化された細胞傷害性機能を生じるが、ＮＫ細胞によってほんの控えめな増殖応答を生じる（Ｎａｇｌｅｒら、１９９０）。多量のＩＬ−２ならびにＦｃγＲＩＩＩａライゲーションでの共刺激によって、ＩＬ−２単独で達成されるよりも大きなＮＫ細胞活性化（ｂｒｉｓｋｅｒ増殖を含む）を生じる（Ｈａｒｒｉｓら、１９８９）。ＮＫ細胞の増殖性応答は、ＦｃγＲ−リガンド相互作用に対する生物学的読み取りとして使用される。例えば、４つのＨＣＨ２ポリマー構築物を２．５μｇ／ｍＬのＰＢＭＣで試験し、結果を抗ＣＤ１６  ｍＡｂおよびＡＩＧを用いて得られた結果と比較した。予期されるように、抗ＣＤ１６  ｍＡｂおよびＡＩＧは、ＩＬ−２の存在下で、増殖性応答を誘導した。ＨＣＨ２ポリマー構築物によって推進される増殖性応答は、反復単位の数に関連し、ＣＤ８Ｒ０が、ＩＬ−２単独の７．５倍の誘導を付与したのに対して、ＣＤ８Ｒ４は、１５倍の誘導を付与した。ＣＤ８Ｒ４は、最大レベルの活性化を誘導したが、ＣＤ８Ｒ３による誘導のレベルは、ＣＤ８Ｒ４のレベルにほぼ等しく、これらの間の差異は、統計的に有意ではなかった。両方の構築物は、ＦｃγＲを最適に作動するために必要なＨＣＨ２単位の数であるかまたはそれに近い数であり得る。ＣＤ８Ｒ４とＡＩＧとの間の直接の比較によって、ＣＤ８Ｒ４が、ＡＩＧよりかなり強力である（ＣＤ８Ｒ４が、５μｇ／μＬで１８倍の誘導を生じるのに対して、１２５μｇ／μＬのＡＩＧが、類似するレベルの誘導を生じるために必要とされる）ことが示される。
【００８０】
凝集ＩｇＧの機能に近く、同時に、第２のシグナルを送達する組換えタンパク質の有用性によって、ＡＩＧの免疫調節性の役割を説明するために仮定される相対的に重要な種々の機構の精密な吟味が可能になり得る。ＦｃγＲの阻害は、おそらく、免疫細胞上のＡＩＧの複数の効果を説明するのに十分ではない。他の可能性のある機構としては、Ｔ細胞による抗原認識の阻害、ＮＫ細胞上のＦｃγＲＩＩＩの活性化、および改変されたサイトカイン合成および分泌が挙げられる。ＨＣＨ２ポリマーはまた、ＩＣ沈着の試験に関する貴重なツールを提供し得る。
【００８１】
ＮＫ細胞上のＦｃγＲＩＩＩａに対するリガンドの結合は、ＩＦＮ−γ分泌およびＴＮＦα分泌、抗体依存性細胞内細胞障害性（ＡＤＣＣ）、増殖、ならびにいくつかの（全てではない）環境下で、アポトーシスを誘導する。いくつかの機能は、ＩＬ−２によって提供され得る第２のシグナルを必要とする。ＮＫ細胞上のＦｃγＲＩＩＩａは、高親和性ＩｇＥレセプター（ＦｃεＲＩ）のγ鎖またはＴ細胞レセプターのζ鎖のいずれかと結合し得る（Ｌａｎｉｅｒら、１９８９；Ｌａｎｉｅｒら、１９９１；Ｋｕｒｏｓａｋｉら、１９９１）。いずれかの鎖は、ＦｃγＲＩＩＩａへのリガンド結合後に、細胞内シグナルを伝達し得る。
【００８２】
ＮＫ細胞上のＣＤ２レセプターを通したシグナル伝達はまた、ζ鎖を通しても生じ（Ｖｉｖｉｅｒら、１９９１；Ｍｏｉｎｇｅｏｎら、１９９２）、そして、抗ＣＤ２抗体は、ＮＫ細胞の機能およびサプレッサー機構を研究するために、有効に使用されてきた。従って、ＣＤ２またはＣＤ１６を通したＮＫ細胞の活性化によって、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦαの分泌、ならびに増殖を含む、重複するエフェクターの機能が誘導される。ＣＤ２を通したＮＫ細胞の活性化によって、ＣＤ８  Ｔ細胞上で作用するＴＧＦβの分泌が誘導され、次いで、このＣＤ８  Ｔ細胞は、Ｂ細胞によるＩｇ分泌を阻害する（Ｇｒａｙら、１９９４；Ｏｈｔｓｕｋａら、１９９８）。活性化ＮＫ細胞による可溶性ＣＤ１６（インビトロでのＩｇ分泌の強力なインヒビター）の放出は、ＮＫ細胞の活性化による、Ｉｇ調節の潜在的な第２の機構を提供する。
【００８３】
（２．補体系）
ＮＫ細胞上のＣＤ２レセプターを通したシグナル伝達はまた、ζ鎖を通しても生じ（Ｖｉｖｉｅｒら、１９９１；Ｍｏｉｎｇｅｏｎら、１９９２）、そして、抗ＣＤ２抗体は、ＮＫ細胞の機能およびサプレッサー機構を研究するために、有効に使用されてきた。従って、ＣＤ２またはＣＤ１６を通したＮＫ細胞の活性化によって、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦαの分泌、ならびに増殖を含む、重複するエフェクターの機能が誘導される。ＣＤ２を通したＮＫ細胞の活性化によって、ＣＤ８  Ｔ細胞上で作用するＴＧＦβの分泌が誘導され、次いで、このＣＤ８  Ｔ細胞は、Ｂ細胞によるＩｇ分泌を阻害する（Ｇｒａｙら、１９９４；Ｏｈｔｓｕｋａら、１９９８）。活性化ＮＫ細胞による可溶性ＣＤ１６（インビトロでのＩｇ分泌の強力なインヒビター）の放出は、ＮＫ細胞の活性化による、Ｉｇ調節の潜在的な第２の機構を提供する。
【００８４】
古典的な活性化経路およびＣＤＣＣは、本発明の融合タンパク質に最も関連した補体媒介性機構である。ＩｇＧ１のＦｃ部位上の補体結合部位は、ヒンジおよびＣＨ２領域を含む。本発明者らは、古典的経路およびＣＤＣＣ媒介性の標的細胞の除去を大いに容易にする、本発明のＨＣＨ２ポリマーの使用を考える。他の環境において、補体の活性化は、望まれないかつ不確定の副反応を引き起こし得る。これらの場合、本発明者らは、補体の活性化を減少するまたは除去するように、ＨＣＨ２ポリマー−Ｃ１ｑ相互作用の改変を考える。
【００８５】
（Ｅ．インビボおよびインビトロでの免疫学的薬剤としてのＨＣＨ２ポリマー融合タンパク質の使用）
（１．抗体の臨床的使用）
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）技術の出現によって、細胞機能に関連する特定の細胞表面抗原と反応する可能性のある治療薬を開発する基礎が提供された。この型の治療薬は、本発明の融合タンパク質に組み込まれ得る。
【００８６】
モノクローナル抗体の臨床的に成功した使用の１つは、免疫系の抑制であり、従って、器官移植または組織移植の効力を強化することである。米国特許第４，６５８，０１９号は、新規のハイブリドーマ（ＯＫＴ３と呼ぶ）を記載する。このハイブリドーマは、本質的に全ての、正常なヒト末梢Ｔ細胞上で見られる抗原に対するモノクローナル抗体を産出し得る。この抗体は、これらＴ細胞上の単一の抗原決定基に対して、単一特異的であるといわれ、他の正常末梢血液リンパ系細胞と反応しない。前記特許に記載されるＯＫＴ３  ｍＡｂは、腎臓移植拒絶反応を阻害するために、現在使用されている（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，１９８７）。
【００８７】
モノクローナル抗体は、新規のクラスの強力な治療薬である。いくつかの治療薬は、癌を含む悪性腫瘍の処置に対して是認され、多くは、臨床的開発の過程にある。例えば、リツキマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ，Ｍａｂｔｈｅｒａ）は、Ｂ細胞の表面に発現されるＣＤ２０分子を標的化するｍＡｂである。リツキマブは、悪性腫瘍（この場合、非ホジキン性リンパ腫）の治療に対して是認される、最初の治療的ｍＡｂであった。リツキマブは、マウス可変ドメインおよびヒト定常領域から構成されるキメラのＩｇＧ１  ｍＡｂである。リツキマブは、いくつかの機構を通して、その効果を発揮する：Ｂ細胞中でのアポトーシスの誘導、直接の補体殺傷（ＣＤＣ）ならびに抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）のような細胞性エフェクター機構および補体依存性細胞性細胞傷害性（ＣＤＣＣ）の関連する経路（Ｊｏｈｎｓｏｎら、２００１）。ＣＤＣおよび細胞性エフェクター機構は、ｍＡｂのＦｃ領域を通して媒介され、さらにＡＤＣＣは、Ｆｃ−ＦｃＲレセプター相互作用に依存する。２系列の証拠が、リツキマブの治療効果に対して重大なものとして、リツキマブとＦｃγＲＩＩＩａレセプターとの間の相互作用の関与を強く立証する。第１に、ＦｃＲγＩＩＩａレセプター１５８Ｖアロタイプを有する患者は、ＦｃγＲＩＩＩａレセプター１５８Ｆアロタイプを有する患者に比べて、（悪性腫瘍細胞の完全な除去を含む）リツキマブの治療に対する実質的により大きな臨床的応答を有する。ＦｃγＲＩＩＩａレセプター１５８Ｖアロタイプは、ＦｃγＲＩＩＩａレセプター１５８Ｆアロタイプに比べて、ヒトＩｇＧ１に対してより高い親和性を有する。ＦｃγＲＩＩＩａレセプター１５８Ｖアロタイプはまた、ＡＤＣＣの増加を誘導する（Ｃａｒｔｒｏｎら、２００２）。第２に、ＦｃγＲＩＩＩａレセプターおよびＦｃγＲＩレセプターの発現の減少を生じる、遺伝子ノックアウトを有するマウスは、（リツキマブを含む）抗ＣＤ２０  ｍＡｂ治療への応答が欠損する（Ｃｌｙｎｅｓら、２０００）。
【００８８】
（ａ．ＨＣＨ２ポリマーの誘導による組換えモノクローナル抗体の改変）
組換えモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を、Ｆｃ領域への１つ以上のＨＣＨ２単位の導入によって改変し、モノクローナル抗体内に適切な長さのＨＣＨ２ポリマーを作製し得ることが、本発明の実施形態である。この方法で改変されたモノクローナル抗体が、これらの標的特異性を保持する一方で、改善されたおよび／またはより選択的なエフェクター機能を獲得する。ＨＣＨ２ポリマーは、Ｆｃ−ＦｃＲレセプター相互作用を大いに強化する。本発明のより特異的なＨＣＨ２ポリマーは、本治療的使用において、ｍＡｂのＦｃ部位を使用して見られるものより、ＦｃγＲＩＩＩａレセプターへの、大いに改善された結合およびそれの大いに強化された活性化を有する。ＦｃＲγＩＩＩａとのｍＡＢの強化された相互作用が、悪性腫瘍の処置における治療的利点を有することが示されてきたように、本発明者らは、ｍＡｂのＦｃ領域へのＨＣＨ２ポリマーの導入を用いた、現存するｍＡｂの改変を考える。この改変を有するモノクローナル抗体は、ＦｃγＲＩＩＩａレセプターとの強化された相互作用を有する。
【００８９】
ｍＡｂの発現を指向する、機能的ＩｇＧ遺伝子は、重鎖遺伝子セグメントおよび軽鎖遺伝子セグメントから構成される。軽鎖（Ｌ）遺伝子は、疎水的なリーダー配列、可変領域およびＬ定常領域（ＣＬ）を含む３つのエキソンからなる。介在配列（またはイントロン）が、エキソンを分割する。同様に、機能的Ｉｇ重鎖（Ｈ）遺伝子の可変領域は、リーダー配列、可変領域、およびＨ鎖定常領域（ＣＨ１）のそれぞれに対する別々のエキソンを有する。このＨ遺伝子はまた、ヒンジ、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域に対する別々のエキソンから構成される、Ｆｃ領域を含む。これらのエキソンは、もう一度、イントロンによって分割される。哺乳動物細胞におけるｍＡｂの発現は、代表的には、機能的なＩｇ遺伝子由来のＨ遺伝子セグメントおよびＬ遺伝子セグメントの両方を、単一の発現ベクターまたはＩｇプロモーター領域を有する別々の発現ベクター（Ｌ遺伝子に対して１つ、Ｈ遺伝子に対して１つ）にクローニングすることを含む。一旦、サブクローニングされると、Ｌ遺伝子およびＨ遺伝子を有する発現ベクターは、発現に適切な細胞株にトランスフェクトされる。遺伝子セグメントの使用によって、Ｂ細胞および骨髄腫細胞における高レベルのＩｇ発現を集合として可能にする、エンハンサーおよび他のエレメントを含む、イントロン性配列の存在が保証される。しかし、Ｉｇプロモーターおよびイントロン性遺伝的エレメントを使用するＩｇ発現系は、リンパ球性誘導体細胞に対してタンパク質の発現を制限する。
【００９０】
ごく最近、ＣＭＶのような、ウイルスプロモーターおよびエンハンサーの組合せを使用するＩｇ発現系が開発された。ウイルスプロモーター／エンハンサーの組合せを使用することによって、リンパ球および（ＣＨＯおよびＣＯＳのような）非リンパ球細胞株の両方において、強力な発現を可能にする（Ｎｏｒｄｅｒｈａｕｇら、１９９７）。Ｉｇ  Ｈ遺伝子由来のイントロン性エンハンサーの包含によって、リンパ系細胞中での高レベルの発現もまた指向される。さらに、Ｈ遺伝子セグメントおよびＬ遺伝子セグメントは、効率的な発現にはもはや必要なく、これらの対応するｃＤＮＡによって置換され得る（ＭｃＬｅａｎら、２０００）。
【００９１】
ｍＡｂへのＨＣＨ２ポリマーの導入は、いくつかのアプローチのうちのいずれかによって達成され得る。１つの方法では、当業者に周知の分子クローニング技術を使用して、発現ベクター内のＨ鎖遺伝子セグメントを、ヒンジエキソンの５’末端へのＨＣＨ２ポリマークローニングカセットの挿入によって改変する。ここで、この改変されたヒンジエキソンは、ヒンジ配列にインフレームで融合されたＨＣＨ２ポリマーからなる。改変されたＨ遺伝子を含むベクターは、Ｌ遺伝子と結合して、ｍＡｂ発現に適切な細胞株に導入される。より好ましい方法は、Ｆｃ遺伝子セグメントを、スプライスアクセプターシグナル、Ｉｇ  Ｆｃ  ｃＤＮＡに融合されたＨＣＨ２ポリマーおよびポリＡシグナルを含むｃＤＮＡセグメントと置換する方法である。次いで、この改変されたＨ遺伝子は、Ｉｇ遺伝子イントロン性配列を有さずにＩｇ発現を指向することが可能なＩｇ発現ベクターに移される。改変されたＨ遺伝子を含むベクターは、Ｌ遺伝子と結合して、発現に適切な細胞株に導入される。
【００９２】
発現ベクター内にクローニングされたｃＤＮＡから発現されるｍＡｂへのＨＣＨ２ポリマーの挿入はまた、類似する技術を使用して達成され得る。例えば、Ｆｃ領域をコードするｃＤＮＡは、Ｈ鎖ｃＤＮＡから除去され、Ｆｃ  ｃＤＮＡに融合されたＨＣＨ２ポリマーをコードするＤＮＡセグメントと置換される。逆に言えば、Ｈ鎖のリーダー領域、可変領域およびＣＨ１領域をコードするｃＤＮＡは、切除され、Ｆｃ  ｃＤＮＡに遺伝的に融合されたＨＣＨ２ポリマー領域を含むベクターに移され得る。あるいは、ＨＣＨ２ポリマーカセットは、適切な部位で、Ｈ鎖  ｃＤＮＡに導入され得る。この部位は、最も通常には、ＣＨ１領域とヒンジ領域との間の連結部である。導入の方法は、当業者に周知である。その後続いて、この改変されたＨ鎖ｃＤＮＡは、Ｉｇ遺伝子イントロン性配列を有さずにＩｇ発現を指向することが可能なＩｇ発現ベクターに移される。この改変されたＨ鎖ｃＤＮＡを含むベクターは、Ｌ鎖発現ベクターと結合して、発現に適切な細胞株に導入される。
【００９３】
ＦｃγＲＩＩＩａレセプターとの相互作用が、臨床的使用におけるいくつかのｍＡｂの効力について重要であるのに対して、上に記載される改変の方法は、一般的である。他の適用において、ＨＣＨ２ポリマーは、ｍＡｂに導入され、ＦｃＲレセプターに対する、または補体因子への結合に対するブロッキング試薬として、他の個々のＦｃＲレセプター、ＦｃＲレセプターのクラスに対する特異性を強化し得る。
【００９４】
（２．モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の調製）
モノクローナル抗体（ＭＡｂ）を産出する方法は、一般に、ポリクローナル抗体を調製する方法と同じ手法で始める。簡単には、ヒトは、動物を免疫原で免疫することによって開始し、そしてこの免疫化動物から抗血清を回収し、ポリクローナル抗体を調製する。広い範囲の動物種が、抗血清の産出に使用され得る。代表的には、抗血清の産出に使用される動物は、ウサギ、マウス、ラット、ハムスターまたはモルモットである。ウサギの比較的大きい血量に起因して、ウサギは、ポリクローナル抗体の産出について好ましい選択である。
【００９５】
当該分野で周知であるように、所定のポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、その免疫原性が変化し得る。従って、免疫原をキャリアと一緒にすることがしばしば必要である。例示的でかつ好ましいキャリアは、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である。オボアルブミン、マウス血清アルブミンまたはウサギ血清アルブミンのようなほかのアルブミンもまた、キャリアとして使用され得る。
【００９６】
ポリペプチドまたはポリヌクレオチドをキャリアタンパク質と結合体化する手段は、当該分野で周知であり、その方法としては、グルタルアルデヒド、ｍ−マレイミドベンゾイル（ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｅｎｃｏｙｌ）−Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル、カルボジイミドおよびビス−ビアゾチル化ベンジジンが挙げられる。
【００９７】
当該分野でまた周知であるように、特定の免疫原に対する免疫原性は、アジュバントとして公知の免疫応答の非特異的刺激物質の使用によって、強化され得る。例示的でかつ好ましいアジュバントとしては、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバントおよび水酸化アルミニウムアジュバントが挙げられる。
【００９８】
ポリクローナル抗体の産出に使用される免疫原の量は、免疫原の性質および免疫に使用される動物によって、とりわけ変化する。種々の経路が、免疫原の投与に使用され得る（皮下的、筋肉内的、皮内的、静脈内的および腹腔内的）。免疫後の種々の時点で、免疫動物の血液をサンプリングし、ポリクローナル抗体の産出をモニターする。所望のレベルの免疫原性が得られた場合、免疫動物は、採血され得、血清を単離し、保存する。
【００９９】
モノクローナル抗体は、本明細書中で参考として援用される、米国特許第４，１９６，２６５号に例示されるような周知の技術の使用を介して容易に調製され得る。代表的に、技術は、免疫応答を提供するのに十分な様式で、選択された抗原（例えば、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチド）を用いて適切な動物を最初に免疫化する工程を包含する。マウスおよびラットのようなげっ歯類が、好ましい動物である。次いで、免疫された動物由来の脾臓細胞が、不死化骨髄腫細胞と融合される。免疫動物がマウスである場合、好ましい骨髄腫細胞は、マウスのＮＳ−１骨髄腫細胞である。
【０１００】
融合された脾臓／骨髄腫細胞は、親細胞由来の融合された脾臓／骨髄腫細胞を選択するために選択培地で培養される。例えば、組織培養培地におけるヌクレオチドのデノボ合成を妨害する因子の添加によって、融合細胞は、非融合親細胞の混合物から分離される。例示的かつ好ましい因子は、アミノプテリン、メトトレキセート、およびアザセリンである。アミノプテリンおよびメトトレキセートは、プリンおよびピリミジンの両方のデノボ合成を妨害するが、アザセリンは、プリン合成のみを妨害する。アミノプテリンまたはメトトレキセートが使用される場合、培地に、ヌクレオチドの供給源としてヒポキサンチンおよびチミジンを補充する。アザセリンが使用される場合、培地に、ヒポキサンチンを補充する。
【０１０１】
この培養工程は、ハイブリドーマの集団を提供し、この集団から特定のハイブリドーマが選択される。代表的に、ハイブリドーマの選択は、マイクロタイタープレート中での単一クローンの希釈によって細胞を培養する工程に続いて、抗原ポリペプチドとの反応性について個々のクローンの上清を試験する工程によって実行される。次いで、この選択されたクローンは、無制限に増殖してモノクローナル抗体を提供し得る。
【０１０２】
モノクローナル抗体を生成するための特定の実施例において、ポリペプチドを含む約１〜２００μｇの間の抗原をマウスに腹腔内注射する。フロイント完全アジュバント（殺傷したＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを含む免疫応答の非特異的刺激物質）のようなアジュバントと共に抗原を注射することによって、増殖するようにＢリンパ球を刺激する。１回目の注射後、しばらくして（例えば、少なくとも２週間）フロイント不完全アジュバントと混合した２回目の用量の抗原を注射することによって、マウスを追免疫する。
【０１０３】
２回目の注射の数週間後、マウスの尾部から採血し、そして血清を、放射標識抗原に対する免疫沈降によって滴定する。好ましくは、適切な滴定値が達成されるまで、追免疫および滴定のプロセスを繰り返す。最も高い滴定値を有するマウスの脾臓は、除去され、そしてシリンジを用いて脾臓を均質化することによって、脾臓のリンパ球が得られる。代表的に、免疫マウス由来の脾臓は、約５×１０７〜２×１０８個のリンパ球を含む。
【０１０４】
骨髄腫細胞として公知の変異リンパ球細胞は、実験動物から得られ、ここで、このような細胞は、種々の周知の方法によって増殖するように誘導されている。骨髄腫細胞は、ヌクレオチド生合成のサルベージ経路を欠いている。骨髄腫細胞は、腫瘍細胞であるため、これらは、組織培養において無制限に増殖され得、従って不死といわれる。マウスおよびラット由来の骨髄腫細胞の多数の培養細胞株（例えば、ネズミＮＳ−１骨髄腫細胞）が、樹立されている。
【０１０５】
融合を助成するのに適切な条件下で、骨髄腫細胞は、抗原／ポリペプチドを注射されたマウスまたはラットの脾臓由来の正常な抗体産生細胞と結合される。融合条件としては、例えば、ポリエチレングリコールの存在が挙げられる。生じた融合細胞は、ハイブリドーマ細胞である。骨髄腫細胞のように、ハイブリドーマ細胞は、培養物中で無制限に増殖する。
【０１０６】
ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）のような選択培地中で培養することによって、ハイブリドーマ細胞は、融合していない骨髄腫細胞から分離される。融合していない骨髄腫細胞は、サルベージ経路からヌクレオチドを合成するために必要な酵素を欠損している。なぜならば、これらは、アミノプテリン、メトトレキセート、またはアザセリンの存在下で失活されるからである。融合していないリンパ球はまた、組織培養中で増殖し続けない。従って、都合よく融合した細胞（ハイブリドーマ細胞）のみが、選択培地中で増殖し得る。
【０１０７】
生存しているハイブリドーマ細胞の各々が、単一の抗体を産生する。次いで、これらの細胞は、抗原／ポリペプチドとの特異的な抗体免疫反応物の産生についてスクリーニングされる。ハイブリドーマの限界希釈は、単一細胞のハイブリドーマを単離する。ハイブリドーマは、数倍連続希釈され、そして希釈物を増殖させた後、上清が、モノクローナル抗体の存在について試験される。次いで、抗体を産生するクローンは、都合のよい量の抗体を産生するために大量に培養される。
【０１０８】
（３．ＨＣＨ２ポリマー融合タンパク質のインビトロでの使用）
上記の使用に加えて、特許請求したペプチドは、種々のインビトロでの使用を有する。これらのいくつかが、以下に記載され；当業者は、他を理解する。
【０１０９】
（ａ．免疫学的検定）
所望の因子の量を正確に定量する免疫学的検定の成功は、特定の様式において因子を捕捉する工程、特定の様式において因子を検出する工程、または両方のいずれかに大部分基づく。本発明者らは、本発明の融合タンパク質が、Ｆｃレセプターの特異的な検出、またはＦｃレセプターの捕捉における有用であり得ることを予測する。Ｆｃレセプターへの本発明の融合タンパク質の結合は、これらのレセプターの特異的な捕捉または検出におけるその使用を可能にする。本発明の融合タンパク質は、適切な表面上に固定化され得、そしてＦｃレセプターを捕捉するために使用され得る。続いて、捕捉されたＦｃレセプターは、他の因子（例えば、レセプターの非競合部位に対する抗体）を用いて検出され得る。あるいは、融合タンパク質は、適切な表面上で非特異的、または特異的のいずれかで捕捉される、Ｆｃレセプターを検出するために使用され得る。免疫学的検定手順を改変することによって、本発明の融合タンパク質は、種々の様式でＣＤ１６およびＣＤ３２の検出のために利用され得る。
【０１１０】
本発明者らは、本発明の融合タンパク質が、広範な範囲の因子を検出または捕捉することにおいて有用であることを、さらに予測する。免疫学的検定は、ノイズに対するシグナルの比を増幅する手順における工程を含むことによって、因子の検出および定量、特に少量の因子の存在および定量を可能にする。本発明の融合タンパク質は、その繰り返しＨＣＨ２領域の利点によって広範な種々の免疫学的検定におけるノイズに対するシグナル比を増幅するために使用され得る。本発明のこの実施形態において、融合タンパク質は、融合タンパク質に特異性を与える目的の因子に特異的に結合し得るリガンド結合ドメインを同時発現する。繰り返しＨＣＨ２領域は、当業者に公知の広範な種々の因子によって標的化され得る多数の繰り返し単位を含むような、増幅工程を可能にする。例えば、ＨＣＨ２領域と反応性の酵素または他の適切なシグナル生成因子に結合するポリクローナル血清が、検出手順において使用され得る。繰り返しＨＣＨ２領域は、ＨＣＨ２領域と反応性のポリクローナル血清中に存在する多数のＩｇの結合を可能にする。本発明の融合タンパク質は、融合タンパク質において同時発現されるリガンド結合タンパク質を改変することによって、広範な種々の免疫学的検定における因子の検出において有用であり得る。本発明の融合タンパク質の助けで検出され得る因子の非制限的なリストとしては、サイトカイン、可溶性レセプター、ステロイド、可溶性タンパク質およびホルモンが挙げられる。種々の免疫学的検定手順が、本発明者らによって予測され、そして当業者に公知である。上記で意図された、本発明の融合タンパク質の使用は、免疫学的検定の文脈において考察されるが、筆者らは、特定の因子の検出が所望される場合、これが、多数のインビトロでの使用に容易に適用可能であることを予測する。このようなインビトロでの使用の非制限的なリストとしては、蛍光活性化細胞分類におけるその使用、免疫組織化学におけるその使用、および免疫沈降におけるその使用が挙げられる。
【０１１１】
本発明の融合タンパク質は、ＣＤ１６の検出のための免疫学的検定における有用性を見出す。免疫学的検定の最初に戻り、その最も単純かつ直接的なセンスにおいて、本発明の好ましい免疫学的検定としては、当業者に公知の種々の型の酵素連結免疫吸収アッセイ（ＥＬＩＳＡ）が挙げられる。しかし、抗体の有用性は、このようなアッセイに制限されず、そして他の有用な実施形態が、ＲＩＡおよび他の非酵素結合イムノソルベントアッセイまたは手順を含むことが、容易に理解される。
【０１１２】
好ましいＥＬＩＳＡアッセイにおいて、ＣＤ１６について試験されるサンプルは、選択された表面、好ましくはポリスチレンマイクロタイタープレートのウェルのようなタンパク質親和性を示す表面上に固定化される。不完全な吸着物質を除去するために洗浄した後、融合タンパク質と抗原的に中性であることが公知の非特異的タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼインまたは牛乳粉末の溶液）を、ウェル上に結合するか、またはコーティングすることが所望される。これは、固定化表面上の非特異的吸着部位の妨害を可能にし、従って、表面上の抗体の非特異的結合によって生じるバックグラウンドを減少する。
【０１１３】
ウェルへの抗原性物質の結合後、バックグラウンドを減少するために非反応性物質でコーティングし、そして結合していない物質を除去するために洗浄し、そして固定化表面を、免疫複合体（抗原／抗体）形成をうながす様式で、本発明の融合タンパク質と接触させる。このような条件としては好ましくは、希釈剤（例えば、ＢＳＡ、ウシγグロブリン（ＢＧＧ）およびリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）／Ｔｗｅｅｎ）で希釈することが挙げられる。これらの添加因子はまた、非特異的バックグラウンドの減少を助ける傾向がある。次いで、層状の抗体を、好ましくは２２℃〜２５℃の温度で、２〜４時間インキュベートする。インキュベーション後、非免疫複合化物質を除去するために抗体接触表面を、洗浄する。好ましい洗浄手順としては、溶液（例えば、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ、またはホウ酸緩衝液）で洗浄することが挙げられる。
【０１１４】
融合タンパク質と結合抗原との間の特異的免疫複合体の形成、およびこれに続く洗浄の後、免疫複合体形成物の存在および量が、本発明の融合タンパク質に対する特異性を有する第２の抗体にこの免疫複合体を供することによって、決定され得る。当然、融合タンパク質が、代表的にヒトＩｇＧ領域を有することにおいて、第２の抗体は、好ましくは、ヒトＩｇＧについて一般に特異性を有する抗体である。検出手段を提供するために、第２の抗体は、好ましくは、適切な色素産生性基質と共にインキュベートする際に、発色する関連酵素を有する。従って、例えば、免疫複合体形成を発達するために好ましい条件（例えば、ＰＢＳ−ＴｗｅｅｎのようなＰＢＳ含有溶液中で室温で２時間のインキュベーション）下で、抗血清結合表面を、一定期間、ウレアーゼまたはペルオキシダーゼ結合抗ヒトＩｇＧと接触させて、そしてインキュベートすることが所望される。
【０１１５】
第２の酵素タグ化抗体と共にインキュベートし、続いて結合していない物質を除去するために洗浄した後、ペルオキシダーゼを酵素標識とする場合において、標識の量を、色素産生性基質（例えば、尿素およびブロモクレゾールパープルまたは２，２’−アジノ−ジ−（３−エチル−ベンズチアゾリン−６−スルホン酸［ＡＢＴＳ］およびＨ２Ｏ２）と共にインキュベートすることによって定量する。次いで、色素産生性の程度を測定することによって（例えば、可視スペクトルスペクトロメーターを用いて）、定量を達成する。
【０１１６】
（ｂ．蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ））
蛍光活性化細胞分類；フローサイトメトリーまたはフローマイクロフルオロメトリーは、抗原の存在について個々の細胞をスキャンするための手段を提供する。この方法は、液体培地中の標識細胞の励起放射を活性化および検出し得る計測装置を用いる。
【０１１７】
ＦＡＣＳは、生細胞または固定された細胞いずれかの迅速、信頼性のある、定量的かつマルチパラメーターの分析を提供するその能力において、特有である。本発明のペプチドは、個々の細胞の抗原性特徴、生物物理学的特徴および生化学的特徴の分析および定量のための有用な手段を提供する。静電偏向技術と共に使用される場合、本発明の融合タンパク質は、細胞の副集団の特異的な単離のために使用され得る。
【０１１８】
（ｃ．免疫組織化学）
本発明の融合タンパク質はまた、免疫組織化学による研究のために調製された新鮮な凍結組織ブロック、およびホルマリン固定組織ブロック、パラフィン包埋組織ブロックまたは他の固定組織ブロックと組み合わせて使用され得る。
【０１１９】
（ｄ．免疫沈降）
本発明の融合タンパク質は、免疫沈降によるＣＤ１６およびＣＤ３２の単離のために特に有用である。免疫沈降は、複合混合物由来の標的抗原成分の分離を含み、そして微少量のタンパク質を区別または単離するために使用される。膜タンパク質の単離のために、細胞は、洗浄ミセル中に溶解されなければならない。他の因子（例えば、胆汁酸塩）は、酸性のｐＨまたは二価カチオンの存在下で沈殿するので、非イオン性の塩が好ましい。
【０１２０】
（Ｆ．自己免疫疾患）
自己免疫疾患は、免疫系が体組織成分に対する攻撃を増加するプロセスである。この攻撃は、Ｂリンパ球によって生成される抗組織成分抗体によってか、またはＴ細胞、ＮＫ細胞、および単球／マクロファージによって媒介される細胞媒介性組織破壊性プロセスによって媒介され得る。いくつかの自己免疫疾患において、いくつかの組織損傷機構は、並行してか、または経時的に作用し得る。本発明の融合タンパク質は、自己免疫疾患の処置に使用され得る。これらは、免疫性を変化するため、および治療剤が有効である患者の送達部位に治療剤を送達するために使用され得る。
【０１２１】
多数の自己免疫疾患が重要であり、そして幾人の人が、１つよりも多い自己免疫疾患を有し得る。同様に、徴候と症状は、広い範囲をカバーし得、そして重得度はまた、罹患した個体間で広く、時間を超えて変化し得る。幾人かの人が自己免疫を発達する一方で、他の人が自己免疫を発達しない理由は、完全には理解されていないが、特定の再発機能が、示唆され得る。多くの自己免疫プロセスにおいて、疾患を発達するために遺伝的に決定された傾向がある。自己免疫性を発達する傾向に関連している遺伝子間には、主要な組織適合性複合体がある。さらに、環境因子が、役割を果たすと考えられる。胚の発生の間、自己成分に対して反応し得る多くの免疫系細胞が、排除されるが、いくつかは残り、その結果、本質的に全ては、少なくとも理論的に自己免疫応答を増強し得る。この観察は、正常な環境下で、潜在的に自己攻撃細胞が、生理的制限機構によって抑制され、そして自己免疫性の病原性への貢献が、正常な制限機構の欠陥であることを示す。
【０１２２】
一般に遭遇する自己免疫障害の例としては、以下が挙げれるがそれらに限定されない：いくつかのより一般に遭遇する実体を挙げると、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、１型糖尿病、ギヤン−バレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシー、多発性硬化症を含む他の免疫媒介神経病、ならびに他の免疫媒介性中央神経系脱髄疾患、慢性関節リウマチ、クローン病、潰瘍性大腸炎、重症筋無力症、強皮症／全身性硬化症、および皮膚筋炎／多発性筋炎。さらなる自己免疫疾患としては、急性糸球体腎炎、ネフローゼ症候群、および腎臓に影響する自己免疫プロセス間の特発性ＩｇＡニューロパシーが挙げられる。
【０１２３】
形成された血液の要素に影響する自己免疫プロセスの例としては、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性溶血性貧血、および特発性血小板減少性紫斑病がある。
【０１２４】
内分泌器官に影響する自己免疫疾患としては、アディソン病、特発性上皮小体機能低下、グレーヴズ病、橋本甲状腺炎、リンパ球性下垂体炎、自己免疫卵巣炎、および雄性における免疫学的不妊症が挙げられる。
【０１２５】
肝臓はまた、自己免疫プロセスの標的であり得る。例としては、自己免疫肝炎、Ｃ型肝炎ウイルス関連自己免疫、免疫アレルギー性反応薬物誘導肝炎、原発性胆汁性肝硬変、および原発性硬化性胆管炎が挙げられる。
【０１２６】
腸管の自己免疫プロセスとしては、悪性貧血、自己免疫胃炎、セリアック病、クローン病および潰瘍性大腸炎が挙げられる。
【０１２７】
皮膚の自己免疫疾患としては、疱疹状皮膚炎、表皮水疱症、全脱毛症、円形脱毛症、白斑、線状ＩｇＡ皮膚症、天疱瘡、類天疱瘡、乾癬、妊娠性ヘルペス、および新生児エリテマトーデスを含む皮膚エリテマトーデスが挙げられる。
【０１２８】
リウマチ性の特徴を有するさらなる自己免疫疾患としては、ＣＲＥＳＴ症候群、強直性脊椎炎、ベーチェット病、若年性関節リウマチ、シェーグレン症候群、および好酸球増多−筋痛症候群が挙げられる。
【０１２９】
自己免疫疾患は、心臓に影響し得る。例としては、心筋炎および特発性拡張型心筋症、リウマチ熱、シャーガス病ならびにアテローム性動脈硬化症の可能性のあるいくつかの要素が挙げられる。
【０１３０】
血管の炎症性疾患の自己免疫要素があり得る。例としては、巨細胞性動脈炎、川崎病、ヘーノホ−シェーンライン紫斑病、結節性多発性動脈炎、グッドパスチャー症候群、免疫複合体脈管炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、チャーグ−ストラウス症候群、高安動脈炎、壊死性脈管炎、および抗ホスホリピド抗体症候群が挙げられる。
【０１３１】
中枢神経系および末梢神経系の自己免疫疾患は、悪性腫瘍の遠隔効果として存在し得る。これらと同じ実体は、腫瘍が存在しない際にはめったに存在しない。例としては、ランバート−イートン症候群、腫瘍随伴性ミエロパシー、腫瘍随伴性小脳変性、辺縁脳炎、眼球筋クローヌス、スティッフマン症候群、腫瘍随伴性知覚神経障害、ＰＯＥＭＳ症候群、脊髄神経節炎、および急性全自律神経ニューロパシーが挙げられる。
【０１３２】
自己免疫疾患は、視覚系に影響し得る。例としては、モーレン潰瘍、ブドウ膜炎、およびフォークト−小柳−原田症候群が挙げられる。
【０１３３】
他の自己免疫プロセス、または自己免疫性が、障害に貢献し得る自己免疫プロセスとしては、間質性膀胱炎、尿崩症、再発性多発性軟骨炎、じんま疹、反射性交感神経性ジストロフィー、および蝸牛迷路炎が挙げられる。
【０１３４】
上で与えられた自己免疫プロセスのリストは、広範であるが、完全であることを意図されない。むしろ、自己免疫性は、広範囲の臨床的現象であると実証される傾向がある。この分野における例示的な疾患（例えば、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、ギヤン−バレー症候群、および自己免疫血小板減少性紫斑病）は、これらの消耗性および潜在的な致死障害の診断および処置に関する問題のいくつかの理解を提供する観点で、以下にさらに詳細に考察される。
【０１３５】
（１．全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ））
複数の器官系が、ＳＬＥに関し、そして疾病の発現が多様である。非びらん性関節炎および一般の非変形性関節炎ならびに日光過敏性発疹は、７５％を超える場合において累積的に生じるが、漿膜炎、中枢神経系（ＣＮＳ）併発、および腎性の併発が、約５０％の場合において生じる。リンパ球減少症は、大半の選択されていない場合において生じ、そしてほぼ不変的に活性疾患に存在する。溶血性貧血および血小板減少症は、約５０％の場合において存在する。ＳＬＥは、体における任意の器官を含み得る。一般に罹患する器官としては、皮膚、腎臓、漿膜、間接、心臓およびＣＮＳが挙げられる。病理学的に、免疫複合体は、腎臓の糸球体中に蓄えられ、そして免疫グロブリンが、皮膚表皮接合部で皮膚に累積することは規則である。ＳＬＥは、多数の自己抗体の変化する特異性によって特徴付けられ、ここで、抗核抗体（ＡＮＡ）は、ネイティブな２本鎖ＤＮＡに対する抗体および変性された１本鎖ＤＮＡに対する抗体として大半が不変的に存在する。このような抗体は、診断において有用である。フィブリノイドは、血管内に累積し、そして漿膜表面上は、別の病理学的特徴である。
【０１３６】
ＳＬＥの臨床的症状は変化するため、疾患の最終的な診断の前に満たされるべき診断基準のリストが、すでに開発されている。１４個の基準が列挙され、４個以上の基準が、診断について満たされなければならない（Ｃｏｈｅｎら、１９７１）。この基準としては、顔の紅斑、円板状エリテマトーデス発疹、レーノー現象、脱毛症、羞明、口腔の潰瘍、鼻腔の潰瘍または咽頭の潰瘍、変形を伴わない関節炎、ＬＥ細胞、梅毒に対する偽陽性試験、蛋白尿（＞３．５ｇ／日）、胸膜炎、心膜炎、精神病、痙攣、溶血性貧血、白血球減少症、および．血小板減少症が挙げられる。
【０１３７】
ＳＬＥは、主に、抗体媒介疾患であると考えられる。ＡＮＡ抗体およびＤＮＡ抗体は、核タンパク質に対して指向されるが、以下の数例に対して指向される多数のさらなる自己抗体があり得る：ミトコンドリア、リボソーム、リソソーム、可溶性細胞質構成物質、赤血球、白血球、血小板および凝固因子。これらの抗体がなぜ出現するかは明らかではないままであるが、ＳＬＥにおける処置の試みの主要な要点は、自己抗体の力価を下げることである。
【０１３８】
ＳＬＥに対して特異的な処置はないが、種々の薬物が、疾患の自然な過程を有利に改変すると知られている（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら、１９８８；ＳｔｅｉｎｂｅｒｇおよびＳｔｅｉｎｂｅｒｇ、１９９１；ＶｙｓｅおよびＷａｌｐｏｒｔ、１９９３；Ｗｉｌｋｅら、１９９１；Ｍｉｌｌｅｒ、１９９２；Ｌｕｂｂｅら、１９８３；Ｓｉｌｍａｎら、１９８８）。許容された処置としては、非ステロイド性抗炎症性薬物（ＮＳＡＩＤ；Ｋｉｍｂｅｒｌｙ、１９８８）、鎮痛薬、グルココルチコイド（Ｌｕｂｅら、１９８３；Ｅｄｗａｒｄｓら、１９８７）、ヒドロキシクロロキン、アザチオプリン（Ｓｉｌｍａｎら、１９８８）、シクロホスファミド（ＳｔｅｉｎｂｅｒｇおよびＳｔｅｉｎｂｅｒｇ、１９９１）、プラケニル（ｐｌａｑｕｅｎｉｌ）（Ｗａｌｌａｃｅ、１９９３）およびアタブリンが挙げられる。にもかかわらず、処置は、決して最適でないままで、そして、言及された薬剤は、多数の潜在的に有害な副作用を有する。紫外光は、ＳＬＥの症状を悪化させることが知られている。この理由で、バリヤークリームが、時折処方される。ＳＬＥの治療技術においてここ数年はほとんど変化がないことが、当業者によって認められている（Ｖｅｎａｂｌｅｓ、１９９３）。本発明は、この疾患のより良い治療技術の見通しを提供する。
【０１３９】
免疫グロブリン融合タンパク質を用いたＳＬＥにおけるＡｂ調節の処置および研究が、本発明で意図される。本発明の融合タンパク質は、ＳＬＥにおけるＡｂ調節の研究のために、様々な可能性のある利点を提供する。これらは、ＦｃγＲ  Ａｂ（例えば、抗−ＣＤ１６）を介する細胞活性化よりも、インビボでの生理状態により近い。以前に、低親和性のＦｃγＲの機能的研究は、ＣＤ１６に指向されたｍＡｂ、ＣＤ２（ＮＫ細胞中でＣＤ１６と同じ経路を使用する）に対して指向されたｍＡｂ、または熱凝集体化Ｉｇを利用していた。これらの試薬はＦｃγＲを活性化したが、レセプター機能の研究へのそれらの適用には限度がある。抗−ＣＤ１６  ｍＡｂは、ＣＤ１６の特異的エピトープに結合し、そして、このレセプターを架橋するが、長期治療のためには、ｍＡｂでは問題がある。ＣＤ１６に対するＡｂは、それらの結合部位に依存して、ＮＫ細胞の機能に対して異なる効果を及ぼす。これは、その作用機構が、生理学的な機構からかけ離れていることを示唆する。ｍＡｂは、レセプターの小さな領域に結合するが、自然のリガンドは、協調的にレセプター機能を調節するように作用する、レセプター上の多数の部位に結合する。
【０１４０】
（２．多発性硬化症）
この疾患は、ＣＮＳミエリンの破壊、およびミエリンが鞘で覆う軸索の破壊によって特徴付けられる。この疾病は、最も一般的には、ＣＮＳの白質における組織破壊の病巣発作（これは、ニューロン機能の損失を引き起こす）から、および、ある発作が、別の進行的に蓄積している障害に付随する場合、発症する。しばらくして、大半の多発性硬化症の患者は、発作の頻度の減少を経験するが、この減少は、この疾病の自然な過程における、神経障害のゆっくりではあるが容赦ない悪化へのシフトにより達成される。再発−緩和の経過から進行性の経過への転換は、最終的には、８０％よりも多くの多発性硬化症の罹患者において起こる。
【０１４１】
多発性硬化症は、炎症性疾患である。リンパ球およびマクロファージは、血管からＣＮＳに移動し、そして、ミエリン、および、最終的には稀突起膠細胞として公知のミエリン形成細胞を攻撃し、そして破壊する。このプロセスは、自己免疫の１つであるが、その免疫応答が指向されるＣＮＳ内の正確な標的は、未知のままである。多発性硬化症を発達させるような遺伝的に決定された素因はあるが、環境的因子も同様に役割を有するという説得力のある証明がある。しかし、原因におけるこの環境的因子の性質は未知のままである。
【０１４２】
近年、多発性硬化症の処置において進歩があった。３つの薬剤が、ＭＳの処置のために認可されている。これらは、インターフェロンβ１ａ、インターフェロンβ１ｂおよび酢酸グラチラマーである。３つ全ては、これまでの希望がないＭＳの自然な過程を有利に変更する様式で、免疫応答を調節する。残念なことに、３つ全ては、そこそこの程度しか有効でなく、そして、各々は、しばしば厄介である副作用を有する。本発明は、ＭＳのより効率的かつ有効な治療の見通しを提供する。
【０１４３】
実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）は、ＭＳについて広範に使用される動物モデルであり、そして、自己免疫疾患の研究のための有用なモデルとして役立つ。ＥＡＥは、中枢神経系の疾患であり、そして、感受性のある動物において、神経抗原（ｎｅｕｒｏａｎｔｉｇｅｎ）で免疫化することにより誘導され得る。ＥＡＥはまた、ミエリンタンパク質の脳炎誘発決定因子に対するＴ細胞反応性の連続的な移送によってか、またはミエリンタンパク質の脳炎誘発決定因子に対するＴ細胞クローン反応性の注射によって、ある動物から次の動物に養子的に移送され得る。自己反応性応答の標的であり得るミエリンタンパク質としては、プロテオリピドアポタンパク質（ＰＬＰ）、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、およびミエリン稀突起膠細胞タンパク質（ＭＯＧ）が挙げられる。使用される動物の型および系統、導入の様式、および投与される神経抗原に依存して、疾患は、急性および本質的には単相性か、あるいは慢性か、または再発性−緩和性であり得る。
【０１４４】
罹患した動物は、弛緩した尾、後肢の麻痺、および失禁を発症する。いくつかの疾患において、前肢の移動がまた損なわれ得、そして、動物は、瀕死となり得る。ＣＮＳの組織学分析は、疾患の慢性期の間のニューロンの脱髄により達成され得る、疾患の急性局面の間における炎症性細胞浸潤を示す。ＥＡＥは、自己免疫疾患の研究のために広範に使用され、そして、ＭＳの処置のため、および一般的な自己免疫疾患の処置のための実験的薬物の潜在的効力を試験するためのモデルとして役立つ。
【０１４５】
本発明のタンパク質を、ＥＡＥのマウスモデルにおいて、疾患活性に対する効果について試験して、ＭＳおよび他の自己免疫疾患の処置のための治療薬としての潜在的な用途の見識を得た。実施例１８に示すように、本発明の生成物は、ＳＪＬ／ＪマウスにおいてＥＡＥを阻害した。構築物ＨＳＡＲ０、特にＨＳＡＲ４の投与は、生理食塩水処置コントロールと比較して、疾患の初期急性局面の間の臨床的疾患活性を減少し、そして、その後の時点で、再発の頻度および重篤度を減少した。減少された炎症性細胞湿潤が、生理食塩水処置コントロールと比較して、構築物処置動物のＣＮＳにおいて観察された。
【０１４６】
（３．ギヤン−バレー症候群）
ギヤン−バレー症候群（ＧＢＳ）は、末梢神経の運動機能が、僅かに検出可能なほどの衰弱から換気支持体を必要とする全運動性麻痺の範囲にわたる可変的な程度まで失われる、自己免疫ニューロパシーの一群の亜急性開始を含む。西洋におけるＧＢＳ症候群の最も一般的な形態は、たいていの場合、通常は呼吸性か胃腸性である感染疾病を伴う。末梢神経は、神経線維を鞘で覆うミエリンを攻撃し、そしてそれを破壊するＴ細胞およびマクロファージにより浸潤される。ミエリンの欠損は、神経インパルス伝導を妨害し、そして、これは、衰弱、極端な場合は、麻痺を引き起こす。このプロセスは、通常は自己制限されており、そして、ミエリンの欠損は、続いて、可変的な程度までの機能の回復により修復される。ＧＢＳ症候群の処置は、不完全である。いくつかの利点は、免疫グロブリンの血漿交換または静脈内注射から得られるが、病的状態はかなり残り、そして、より良い処置が必要である。本発明は、ＧＢＳ症候群の改良された治療のための見通しを提供する。
【０１４７】
ＧＢＳ症候群の第２の形態がまた認められる。この形態は、主に東洋で起こる。この形態において、運動衰弱または運動麻痺が再び見られるが、自己免疫プロセスは、神経線維自身の表面で発現される糖脂質に対して指向される自己抗体により、媒介される。この形態において、より一般的に遭遇された形態におけるように、血漿交換または静脈内投与された免疫グロブリンに対する有利な応答が、時々見られる。
【０１４８】
（４．自己免疫（特発性）血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ））
この自己免疫疾患において、血小板は、個々自身の血小板膜上に存在する抗原に対して指向される自己抗体により、破壊される。この疾患は、急性プロセスとして、または慢性プロセスとして存在し得る。急性プロセスは、主に、性別にかかわらず、幼児に罹患する。慢性プロセスは、通常は、３０代〜５０代の成体に罹患し、そして、３：１で女性の優勢を示す。血小板数が、１０，０００未満に落ちた場合に観察される、一般的な臨床特性としては、点状出血、紫斑、歯肉出血、鼻出血および月経過多が挙げられる。血小板およびその前駆物の表面上に発現される糖タンパク質に対して指向される自己抗体は、大多数の患者で明白である。ＩｇＧが結合した表面を有する血小板は、大部分が、マクロファージ上で発現されるＦｃγＲＩＩＩａレセプターへのＩｇＧの結合を介して、損傷された血小板を認識する食細胞性マクロファージによって、脾臓中で取り除かれる。血小板減少の消散は、ＦｃγＲＩＩＩａレセプターに対して指向されるモノクローナル抗体の注射後に報告されている（Ｃｌａｒｋｓｏｎら、１９８６）。ＮＫ細胞活性は、自己免疫血小板減少性紫斑病において減少されると報告される（Ｓｅｍｐｌｅら、１９９１）。本発明は、ＦｃγＲＩＩＩａレセプターに結合し、そして、ＮＫ細胞を活性化し、従って、この自己免疫疾患のより有効な処置の見通しを提供する。ＡＴＰのための現在許容された処置としては、グルココルチコイド、および静脈内免疫グロブリンが挙げられ、これらが疾患を制御することに失敗した場合（残念なことに、たいていの場合であるが）、免疫抑制剤および細胞傷害剤が、それらの危険にもかかわらず、投与され得なければならない場合がある。
【０１４９】
（５．ＩｇＧ治療によって有利に作用される疾患）
本発明者らは、静脈内免疫グロブリンが以前に使用されていた任意の疾患において、本発明の融合タンパク質の治療的使用を企図する。静脈内免疫グロブリンは、ＡＴＰの処置のためのＦＤＡ認可を有する。この薬剤は、二重盲検対照臨床試験に基づいて、ギヤン−バレー症候群、重症筋無力症および皮膚筋炎の処置において有効であることが証明されている。静脈内免疫グロブリンは、３０よりも多い免疫学的疾患において有益であることが報告されている。これらの疾患における有益な薬効についての機構は、現在のところ未知であるが、静脈内免疫グロブリンの様々な免疫調節特性によって媒介され得る（Ａｓｇｈａｒら、１９９６；Ｄｗｙｅｒら、１９９２；Ｇｅｈａら、１９９６；Ｙｕら、１９９９）。免疫グロブリンが処置のために使用されているいくつかの疾患を、表１中に示す（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ．ｏｒｇ／２０００／ｖ５／ｅ／ａｓｇｈａｒ／ｆｕｌｌｔｅｘｔ．ｈｔｍ）。
【０１５０】
表１．静脈内免疫グロブリンの有益な効果が、少数（または群）の患者で実証されている疾患
【０１５１】
【表１】
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（Ｇ．生物学的機能等価物）
改変および／または変化が、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはタンパク質の構造においてなされ得るが、類似または改良された特徴を有する取得された分子（例えば、生物学的機能等価物）もまた本発明に含まれる。
【０１５２】
（１．改変されたポリヌクレオチドおよびポリペプチド）
生物学的機能等価物は、異なる配列を含むが同時に「野生型」または標準的タンパク質をコードする能力を保持するように操作されているポリヌクレオチドを含み得る。これは、同一のアミノ酸をコードする遺伝暗号の縮重性（すなわち、複数のコドンの存在）のもとで達成され得る。一例において、当業者は、ポリヌクレオチドに制限酵素認識配列を導入するが、タンパク質をコードするそのポリヌクレオチドの能力を妨げないことを所望し得る。
【０１５３】
別の例において、ポリヌクレオチドは、より有意な変化を有する生物学的機能等価物を生じる（およびコードする）特定の配列を含むように操作され得る。特定のアミノ酸は、構造（例えば、抗体の抗原結合領域、基質分子、レセプター上などの結合部位）との相互作用的な結合能力のかなりの欠損なしに、タンパク質構造において他のアミノ酸によって置換され得る。いわゆる「保存的」変化は、このタンパク質の生物学的活性を破壊しない。なぜなら、構造変化は、その指定された機能を実行するタンパク質の能力に対して影響するものではないからである。従って、様々な変化が、本明細書中で開示される遺伝子およびタンパク質の配列においてなされるが、本発明の目的をなお満たしているということが、本発明者らによって意図される。
【０１５４】
機能的等価物に関して、「生物学的機能等価の」タンパク質および／またはポリヌクレオチドの定義の固有の性質として、この分子が許容されるレベルの等価な生物活性（例えば、ＦｃγＲへの結合）を維持しつつ、この分子の定義された部分内でなされ得る変化の数には制限があるという概念があることは、当業者に十分に理解される。従って、生物学的機能等価物は、選択されたアミノ酸（またはコドン）が置換され得るこれらのタンパク質（およびポリヌクレオチド）として、本明細書中で定義される。
【０１５５】
一般に、分子長が短いほど、機能を維持しながら分子内でなされ得る変化は少なくなる。より長いドメインは、中間数の変化を有し得る。全長タンパク質は、より多数の変化に対して最も耐性を有する。しかし、それらの構造に非常に依存的である特定の分子またはドメインは、ほとんどまたは全く改変に耐性であり得ないということは、理解されなければならない。
【０１５６】
アミノ酸置換は、一般的に、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性（例えば、疎水性、親水性、荷電、大きさ、など）に基づく。アミノ酸側鎖置換基の大きさ、形状および／もしくは型の分析は、以下を明らかにしている：アルギニン、リジンおよび／またはヒスチジンは全て正に荷電した残基であること；アラニン、グリシン、および／もしくはセリンは、全て類似の大きさであること；ならびに／またはフェニルアラニン、トリプトファンおよび／もしくはチロシンは全て、一般的に類似の形状を有すること。従って、これらの考慮に基づいて、アルギニン、リジンおよび／もしくはヒスチジン；アラニン、グリシンおよび／またはセリン；ならびに／またはフェニルアラニン、トリプトファンおよび／またはチロシン；は、生物学的機能等価物として本明細書中に定義される。
【０１５７】
より定量的な変化をもたらすために、アミノ酸の疎水性指数が考慮され得る。各アミノ酸は、それらの疎水性および／または荷電の特性に基づいて、疎水性指数に割り当てられ、これらは以下である：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；および／またはアルギニン（−４．５）。
【０１５８】
タンパク質に相互作用的な生物学的機能を与えるときの疎水性アミノ酸指数の重要性は、一般的に当該分野で理解される（ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２（本明細書中に参考として援用される））。特定のアミノ酸が、類似の疎水性指数または疎水性スコアを有する他のアミノ酸によって置換され得、および／または、類似の生物学的活性をなお有するということは、当該分野で公知である。疎水性指数に基づいて変化を作製する際、疎水性指数が±２以内のアミノ酸の置換が好ましく、±１以内のアミノ酸置換が特に好ましく、および／または、±０．５以内のアミノ酸置換がなおさらに、特に好ましい。
【０１５９】
本発明の特定の実施形態におけるように、特に、このように作製された生物学的機能等価物タンパク質および／またはペプチドが免疫学的実施形態における用途を意図される場合、類似のアミノ酸の置換が、親水性に基づいて効率的になされ得るということもまた、当該分野で理解される。米国特許第４，５５４，１０１号（本明細書中に参考として援用される）は、タンパク質の最大の局所平均親水性（ｇｒｅａｔｅｓｔ  ｌｏｃａｌ  ａｖｅｒａｇｅ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙ）（これは、その隣接したアミノ酸の親水性によって支配される）が、その免疫原性および／または抗原性（すなわち、タンパク質の生物学的特性）と関連することを述べている。
【０１６０】
米国特許第４，５５４，１０１号において詳述されるように、以下の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。類似の親水性値に基づく変化を作製する際、親水性値が±２以内のアミノ酸の置換が好ましく、±１以内のアミノ酸置換が特に好ましく、および／または、±０．５以内のアミノ酸置換がなおさらに、特に好ましい。
【０１６１】
（２．コドン）
議論は、アミノ酸変化から生じる機能的に等価なポリペプチドに焦点を合わせているが、これらの変化は、コードするＤＮＡの改変により及ぼされ得ることが理解され；遺伝暗号が縮重されること、および、２つ以上のコドンが、同じアミノ酸をコードし得るということもまた考慮される。アミノ酸およびそれらのコドンについての表を、このような実施形態での使用のため、ならびに、例えば、プローブおよびプライマーなどの設計での使用のために、以下に提示する。
【０１６２】
【表２】
0004524074.tif 000004
用語「機能的に等価なコドン」は、同一のアミノ酸をコードするコドン（例えば、アルギニンまたはセリンについては、６つのコドン）をいうために、そしてまた、生物学的に等価なアミノ酸をコードするコドンをいうために、本明細書中で使用される（上記のコドン表を参照のこと）。
【０１６３】
配列が上記の基準（タンパク質発現が関係する生物学的タンパク質活性の維持を含む）に合致する限り、アミノ酸配列および核酸配列がさらなる残基（例えば、さらなるＮ末端アミノ酸もしくはＣ末端アミノ酸、または５’配列もしくは３’配列）を含み得、そしてなお依然として本明細書中で開示される配列の１つに、本質的に記され得ることもまた、理解される。末端配列の付加は、特に、例えば、コード領域の５’部分または３’部分のいずれかに隣接する種々の非コード配列を含み得るか、または種々の内部配列（すなわち、遺伝子中に存在することが公知であるイントロン）を含み得る核酸配列に、適用される。
【０１６４】
（３．変更されたアミノ酸）
本発明は、多くの局面において、適当なポリヌクレオチドの転写および翻訳を介するｉｎ  ｃｙｔｏでのペプチドおよびポリペプチドの合成に、依存する。これらのペプチドおよびポリペプチドとしては、２０個の「天然の」アミノ酸およびそれらの翻訳後修飾物が挙げられる。しかし、インビトロのペプチド合成は、修飾アミノ酸および／または普通でないアミノ酸の使用を可能にする。例示的な（しかし、これらに限定されない）、修飾アミノ酸および／または普通でないアミノ酸の表は、本明細書中の以下に提供される。
【０１６５】
【表３】
0004524074.tif 000005
（４．模倣物）
上記の生物学的な機能的等価物に加え、本発明者らはまた、構造的に類似する化合物を定式化して本発明のペプチドまたはポリペプチドの重要な部分を模倣し得ることを企図する。このような化合物（ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）と名付けられ得る）は、本発明のペプチドとして同様の様式で使用され得、そしてそのため、また機能的等価物でもある。
【０１６６】
タンパク質の二次構造および三次構造の要素を模倣する特定の模倣物は、Ｊｏｈｎｓｏｎら（１９９３）に記載される。ペプチド模倣物の使用の裏に潜在する原理は、タンパク質のペプチド骨格が、分子相互作用（例えば、抗体および／または抗原の相互作用）を促進するような方法で、主としてアミノ酸側鎖を方向付けるために存在することである。従って、ペプチド模倣物は、天然分子と同様に、分子相互作用を可能とするように設計される。
【０１６７】
ペプチド模倣物の概念に首尾よいいくつかの適用は、タンパク質内のβ−ターン（これらは高度に抗原性であることが知られている）の模倣物に着目していた。ポリペプチド内の可能性あるβ−ターン構造は、コンピューターベースのアルゴリズムにより予測され得る。一旦、このターンの成分アミノ酸が決定されると、模倣物を構築して、アミノ酸側鎖の本質的要素についての類似な空間的配向を達成し得る。
【０１６８】
別のアプローチは、大きなタンパク質の結合部位を模倣する、生物学的に活性な高次構造を生成するための魅力的な構造テンプレートとして、小さな、複数のジスルフィドを含むタンパク質の使用に着目している（Ｖｉｔａら、１９９８）。特定の毒素において進化的に保存されるようである構造モチーフは、小さく（３０〜４０アミノ酸）、安定で、そして変異を高度に許容である。このモチーフは、３つのジスルフィドにより内部コアにおいて架橋されるβシートおよびαヘリックスから構成される。
【０１６９】
βＩＩターンは、環状Ｌ−ペンタペプチドおよびＤ−アミノ酸を有する環状ペンタペプチドを使用して、首尾よく模倣されている（Ｗｅｉｓｓｈｏｆｆら、１９９９）。また、Ｊｏｈａｎｎｅｓｓｏｎら（１９９９）は、逆ターンを誘導する特性を有する二環式トリペプチドについて報告する。
【０１７０】
特定の構造を生成する方法は、当該分野で開示されている。例えば、α−ヘリックスの模倣物は、米国特許第５，４４６，１２８号；同第５，７１０，２４５号；同第５，８４０，８３３号；および同第５，８５９，１８４号に開示される。これらの構造は、ペプチドまたはタンパク質を、より熱安定にさせ、またタンパク質性分解に対する耐性を増加させる。６員環、７員環、１１員環、１２員環、１３員環および１４員環の構造体が、開示される。
【０１７１】
高次構造的に限定されたβターンおよびβバルジ（ｂｕｌｇｅ）を生成する方法は、例えば、米国特許第５，４４０，０１３号；同第５，６１８，９１４号；および同第５，６７０，１５５号に開示される。β−ターンは、対応する骨格高次構造の変更を有することなく、側面の置換基を変更可能とし、そして標準的な合成手順によって、ペプチド中への組み込みのための適切な終端を有する。模倣したターンの他の型としては、逆ターンおよびγターンが挙げられる。逆ターンの模倣物は、米国特許第５，４７５，０８５号および同第５，９２９，２３７号に開示され、そしてγターンの模倣物は、米国特許第５，６７２，６８１号および同第５，６７４，９７６号に開示される。
【０１７２】
（Ｈ．タンパク質性組成物）
特定の実施形態において、本発明は、少なくとも１つのタンパク質性分子（例えば、複数のＨＣＨ２領域を有する融合タンパク質）を含む、新規の組成物に関する。本明細書中で使用される場合、「タンパク質性分子」、「タンパク質性組成物」、「タンパク質性化合物」、「タンパク質性鎖」または「タンパク質性物質」は一般的に、約２００アミノ酸よりも多いタンパク質、もしくは遺伝子から翻訳される全長の内在性配列；約１００アミノ酸より多いポリペプチド；および／または約３〜約１００アミノ酸のペプチドをいうが、それらに限定されない。上記の全ての「タンパク質性」という語は、本明細書中で互換可能に使用され得る。
【０１７３】
特定の実施形態において、少なくとも１つのタンパク質性分子のサイズは、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９、約５０、約５１、約５２、約５３、約５４、約５５、約５６、約５７、約５８、約５９、約６０、約６１、約６２、約６３、約６４、約６５、約６６、約６７、約６８、約６９、約７０、約７１、約７２、約７３、約７４、約７５、約７６、約７７、約７８、約７９、約８０、約８１、約８２、約８３、約８４、約８５、約８６、約８７、約８８、約８９、約９０、約９１、約９２、約９３、約９４、約９５、約９６、約９７、約９８、約９９、約１００、約１１０、約１２０、約１３０、約１４０、約１５０、約１６０、約１７０、約１８０、約１９０、約２００、約２１０、約２２０、約２３０、約２４０、約２５０、約２７５、約３００、約３２５、約３５０、約３７５、約４００、約４２５、約４５０、約４７５、約５００、約５２５、約５５０、約５７５、約６００、約６２５、約６５０、約６７５、約７００、約７２５、約７５０、約７７５、約８００、約８２５、約８５０、約８７５、約９００、約９２５、約９５０、約９７５、約１０００、約１１００、約１２００、約１３００、約１４００、約１５００、約１７５０、約２０００、約２２５０、約２５００またはより大きなアミノ分子残基、およびここで導き出せる可能な任意の範囲を含み得るが、これらに限定されない。
【０１７４】
本明細書中で使用される場合、「アミノ分子」とは、当業者に公知である、任意のアミノ酸、アミノ酸誘導体またはアミノ酸模倣物をいう。特定の実施形態において、タンパク質性分子の残基は連続的であり、任意の非アミノ酸分子が、アミノ分子残基の配列を中断しない。他に実施形態において、この配列は、１つ以上の非アミノ酸分子部分を含み得る。特定の実施形態において、タンパク質性分子の残基の配列は、１つ以上の非アミノ分子部分によって中断され得る。
【０１７５】
従って、用語「タンパク質性組成物」は、天然で合成されたタンパク質中の２０個の共通のアミノ酸残基のうちの少なくとも１つを含むか、または少なくとも１つの修飾アミノ酸もしくは普通でないアミノ酸を含むアミノ分子配列を含み、修飾アミノ酸もしくは普通でないアミノ酸としては、表３に示されるアミノ酸があげられるが、それらに限定されない。
【０１７６】
特定の実施形態において、タンパク質性組成物は、少なくとも１つのタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを含む。さらなる実施形態において、タンパク質性組成物は、生体適合性のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを含む。本明細書中で使用される場合、用語「生体適合性」とは、本明細書中に記載される方法および量に従って所定の生物体に対して適用または投与される場合に、有意な不適当な効果を全く生成しない物質をいう。生物としては、ウシ属、爬虫類、両生類、魚類、げっ歯類、鳥類、犬科、ネコ科、真菌類、植物、古細菌（ａｒｃｈｅｂａｃｔｅｒｉａ）、または原核生物の生物が挙げられるが、これらに限定されず、選択された動物またはヒトの被験体が好ましい。そのような不適当な効果または所望されない効果とは、有意な毒性または有害な免疫学的反応のような効果である。好ましい実施形態において、生体適合性のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを含む組成物は、一般的に哺乳動物のタンパク質もしくはペプチド、または合成タンパク質もしくはペプチドであり、各々は本質的に、毒素、病原体および有害な免疫原がない。
【０１７７】
タンパク質性組成物は、当業者に公知な任意の技術によって作製され得、標準的な分子生物学的技術によるタンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドの発現、天然供給源からのタンパク質性化合物の単離、またはタンパク質性物質の化学合成、を含む。種々の遺伝子についてのヌクレオチド、ならびにタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドの配列は、以前に開示されており、そして当業者に公知のコンピューター化されたデータベースで見出され得る。そのようなデータベースの１つは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ’ｓ  Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｎｄ  ＧｅｎＰｅｐｔデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）である。これら公知の遺伝子のコード領域を、本明細書中に開示される技術、または当業者に公知である技術を使用して、増幅および／または発現し得る。あるいは、タンパク質、ポリペプチドおよびペプチドの種々の商業的な調製物は、当業者に公知である。
【０１７８】
特定の実施形態において、タンパク質性化合物が精製され得る。一般的に、「精製される」とは、種々の他のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを取り除くために画分に供された、特定のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの組成をいい、そしてその組成は、例えば、特定のまたは所望のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドについて、当業者に公知であるようなタンパク質アッセイによって評価され得る場合、その活性を実質的に保持する。
【０１７９】
特定の実施形態において、タンパク質性組成物は、少なくとも１つの抗体を含み得る。本明細書中で使用される場合、用語「抗体」は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥのような、任意の免疫学的結合物質を広範にいうことが意図される。一般的に、ＩｇＧおよび／またはＩｇＭが好ましい。なぜなら、これらが生理学的状況において最も一般的な抗体であり、そしてこれらは研究室の設定で最も容易に作製されるからである。
【０１８０】
タンパク質性化合物のポリペプチド領域は、リンカー基を介して連結され得る。リンカー基は、生物学的に解除可能な結合（例えば、選択的に切断可能なリンカーまたはアミノ酸配列）を介して、目的の化合物を連結し得る。
【０１８１】
用語「抗体」は、抗原結合領域を有する任意の抗体様の分子をいうために使用され、そしてＦａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、単一のドメイン抗体（ＤＡＢ）、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（単鎖Ｆｖ）などのような抗体フラグメントを含む。種々の抗体ベースの構築物およびフラグメントを調製および使用するための技術は、当該分野で周知である。抗体の調製および特徴付けをするための方法もまた、当該分野で周知である（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。
【０１８２】
実際に、任意のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを含む成分が、本明細書中に開示される組成物および方法において使用され得ることが、企図される。しかし、タンパク質性物質が生体適合性であることが好ましい。本発明における使用に適したタンパク質およびペプチドは、自己のタンパク質またはペプチドであり得るが、本発明は、このような自己のタンパク質の使用については明確には限定されない。本明細書中で使用される場合、用語「自己のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチド」とは、ある生物由来の、またはある生物体から取得される、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをいう。使用され得る生物としては、ウシ属、爬虫類、両生類、魚類、げっ歯類、鳥類、イヌ科、ネコ科、真菌類、植物または原核生物の生物が挙げられるが、それらに限定されず、選択された動物またはヒトの被験体が好ましい。次いで、この「自己のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチド」は、選択された動物またはヒトの被験体への適用が意図された組成物の１つの成分として使用され得る。好ましくは、それは生体適合性である（すなわち、哺乳動物起源由来の物を哺乳動物に対して、好ましくは、ヒト起源由来の物をヒトに対して、イヌ起源由来物をイヌに対して、など；これは自己であり；非アレルギー性であり、そして／またはこれは非免疫原性である）
（Ｉ．作用機構と適用）
自己免疫疾患はしばしば、Ｔ細胞媒介成分およびＢ細胞媒介成分の両方を含み、それらの成分は、お互いに依存的にかまたは非依存的に、同時にかまたは連続的に作用し得、その結果、組織または細胞の寛解、および１つ以上の生体機能の消失によりしばしば特徴付けられる、宿主損傷性の疾患を生じる。Ｆｃレセプターおよび補体カスケードのタンパク質は、しばしば自己免疫応答の生成、進行中の免疫応答の調節、および免疫応答のエフェクター期（すなわち、組織もしくは細胞の崩壊または組織もしくは細胞の損傷へと導く機構）と密接に関係する。本発明の融合タンパク質は、Ｆｃレセプターおよび／または補体を結合する融合タンパク質の能力により、１つ以上のＦｃレセプターおよび／または補体の領域に対する融合タンパク質の影響により、疾患の結果を影響し得る。
【０１８３】
本発明の融合タンパク質は、融合タンパク質の設計および処置される疾患型に依存して、複数の経路により疾患の活性を良好に変化させ得る。本発明の融合タンパク質は、Ｆｃレセプターに結合可能な、複数ユニットのＨＣＨ２領域もしくはその部分、補体成分に結合可能な、複数ユニットのＨＣＨ２領域、またはそれらの両方の領域、を含むように設計され得る。特定の疾患の処置における融合タンパクの使用により達成される潜在的な利益を最大化するように融合タンパク質の設計が改変され得、そして融合タンパク質の組成物がある疾患からその次へと変動し得ることが、企図される。例えば、いくつかの疾患の処置のため、融合タンパク質のＦｃレセプター結合能力を保持するが、補体カスケードの成分の結合を除外または低減させることが、好ましくあり得る。この逆が、他の疾患の処置のために好ましくあり得る。
【０１８４】
疾患の結果に対する融合タンパク質の効果は、単に融合タンパク質がＦｃレセプターを結合し得る複数のユニット、補体成分を結合し得る複数のユニット、またはその両方を含むか否かだけではなく、融合タンパク質にさらなる機能、結合能力または他の付加される特性を付与するために、融合タンパク質中に同時発現され得る他のタンパク質ドメインにもまた、依存する。本発明の融合タンパク質に対するさらなる改変は、さらなるタンパク質、タンパク質ドメインまたはペプチドと融合タンパク質との結合を含み、このことは、さらなる機能、結合能力または他の付加される特性を融合タンパク質に付与する。融合タンパク質設計の可撓性により、発明者らは、疾患型に依存して、本発明の融合タンパク質を改変してその治療的潜在性を最大化することを可能とする。上記の融合タンパク質の改変が、自己免疫疾患の処置に加え、新生物の処置、ウイルスもしくは他の病原体による感染の処置、いぼの処置、および特定の抗原に対する免疫応答の意図的な誘導における使用に適用可能であることは、本発明の１つの実施形態である。
【０１８５】
Ｆｃレセプターを結合し得る融合タンパク質は、複数の機構（内因性に生成されたＩｇおよび免疫複合体へのＦｃレセプターの接近性をブロックすることが挙げられるが、それに限定されない）を通して疾患の結果を影響し得る。このようなブロックは、抗原提示細胞による自己抗原の提示を制限すること、そして結果として、自己免疫応答を低減させることが期待される。Ｆｃレセプターのブロックはまた、組織および細胞の崩壊を制限または低減し得る。自己免疫疾患における組織崩壊および細胞崩壊は、しばしば、組織または細胞に結合している自己抗原反応性Ｉｇを結合する、Ｆｃレセプター発現エフェクター細胞（単球、好中球、マクロファージ、ミクログリア、ＮＫ細胞、および他の細胞型）により媒介される。例えば、ＡＴＰにおいて、本発明の融合タンパク質は、Ｆｃレセプター媒介性機構を介して、肝臓および脾臓のクップファー細胞による血小板の取り込みを低下させることにより、血小板の崩壊および生体によるクリアランスを制限し得る。同様に、融合タンパク質は、標的組織中の自己Ａｇに結合しているＩｇへのマクロファージの接近性を低下させることにより、多発性硬化症におけるＣＮＳでの髄鞘脱落、または重症筋無力症における運動ニューロン終板のアセチルコリンレセプターの崩壊を、制限し得る。この融合タンパク質は、同様の機構を介する多くの自己免疫疾患を都合よく変化し得る。
【０１８６】
本発明の融合タンパク質は、Ｆｃレセプターを介して細胞を活性化することにより自己免疫疾患を改変し得、そしてそれによって免疫調節因子の分泌、特異的な細胞表面マーカーの発現、または特定の細胞機能の型もしくは大きさを変化し得る。タンパク質分泌の調節としては、インターロイキン（ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８が挙げられるが、これらに限定されない）；サイトカイン（ＴＧＦβ、ＴＮＦα、ＴＮＦβが挙げられるが、これらに限定されない）；インターフェロンγ、インターフェロンβおよびインターフェロンα；増殖因子、ならびにアラキドン酸カスケード生成物の、産生の低下または増加が挙げられ得る。変化され得る細胞機能としては、細胞の細胞傷害性、細胞分裂および活性状態が挙げられる。
【０１８７】
本発明の融合タンパク質をまた使用して、特定の抗原に対する免疫を抑制または増幅し得る。自己免疫疾患は、特定の抗原に対する寛容性を誘導することによってか、または特定の抗原に対する自己免疫応答を、有害な病原性の抗原からより有害性の低い型へと偏向させることによって、処置され得る。例えば、多発性硬化症において、自己抗原に応答した１型サイトカイン（ＩＬ−１２、ＩＬ−２）の同化は、一般的に、宿主に有害であると考えられているが、２型の応答（ＩＬ−４、ＩＬ−１０）の誘導は、保護的であると考えられている。免疫応答のＴｈ１型からＴｈ２型への意図的な偏向は、多発性硬化症の処置において有益であるようである。対照的に、Ｔｈ２型の応答は、エリテマトーデスのような他の自己免疫疾患において有害であると考えられ、そして結果的に、この疾患における自己抗原に対する応答の、Ｔｈ２型応答からＴｈ１型応答への意図的な偏向は、有益であるようである。従って、本発明の融合タンパク質の改変は、関連する疾患型およびその機構に依存して変化する。
【０１８８】
特定の抗原の１つ以上のタンパク質ドメインを同時発現させること、または１つ以上の特異的な抗原もしくは抗原決定基を、保護的な免疫応答を誘導する融合タンパク質に結合させること、有害な免疫応答をより有害性の低い免疫応答へと偏向させること、または抗原に対して無応答の状態を誘導すること（Ｌａｓａｌｌｅら、１９９４）は、本発明の１つの実施形態である。例えば、本発明者らは、多発性硬化症の処置において、保護的なＴｈ２型応答または無応答状態を誘導する融合タンパク質中に、神経抗原（ｎｅｕｒｏａｎｔｉｇｅｎ）ペプチドを同時発現することを企図する。多発性硬化症の処置のために使用され得る、潜在的神経抗原の非限定的な列挙として、プロテオリピドタンパク質、ミエリン塩基性タンパク質、およびミエリン稀突起神経膠細胞糖タンパク質が挙げられる。同様に、Ｔ細胞レセプターまたはＩｇドメインは、保護的な抗Ｔ細胞レセプター応答または抗イディオタイプ応答を誘導する融合タンパク質中に、発現され得る。本発明者らは、疾患型に基づいて同時発現されるタンパク質を変化させることにより、本発明の融合タンパク質が、多数の自己免疫疾患の処置のために使用されるべきであることを、企図する。
【０１８９】
先に述べたように、適応性免疫系はしばしば、細胞性免疫（またはＴｈ１型応答）および体液性免疫（またはＴｈ２型応答）の、２つの成分を有するといわれる。抗原に対する応答は、これらの成分の一方または両方を惹起する。一方の成分を促進するリンホカインおよびモノカインのような免疫調節因子は、しばしば他方の成分を阻害する。従って、強力な細胞性応答はしばしば、鈍化した体液性応答の存在下で発生し、逆の場合もまた同様である。一方もしくは他方の応答の発達に重要な因子は、サイトカインの存在または非存在、同時刺激因子、および当業者に公知である他の因子を含む（Ｌａｓａｌｌｅら、１９９４）。例えば、ＩＬ−４の存在は、Ｔｈ２型応答を増強することが示されているが、インターフェロンγの存在は、Ｔｈ１型応答を誘導する（Ｓｗａｉｎら、１９８８）。自己免疫疾患、新生物、もしくはウイルス感染の処置において、またはワクチンベースの治療法による、病原体に対する免疫の誘導において、これらの成分の一方または両方を選択的に調節することが好しくあり得る。サイトカイン、ステロイドまたは他の免疫調節因子の同時投与は、変化する疾患の処置において、または所望される応答型に基づいた抗原に対する免疫を誘導することを企図する場合に、好ましくあり得る。
【０１９０】
（Ｊ．癌および感染症のための免疫療法における組換えＨＣＨ２ポリマー構築物）
本発明の別の実施形態において、ＨＣＨ２ポリマー融合タンパク質は、細胞を特異的に標的化するように構築され得る。１つの実施形態において、本発明の融合タンパク質は、腫瘍細胞、この腫瘍を構成する悪性細胞、または癌細胞を標的化するように構築され得る。腫瘍細胞、癌細胞、すなわち、腫瘍を構成する悪性細胞は、この腫瘍細胞の比較的特異的なマーカーに対する結合が可能な領域を有する、リガンドまたは二重特異性リガンドを使用して標的化され得る。特異的な実施形態において、本発明の融合タンパク質は、Ｆａｂ’フラグメントあるいは遺伝的または化学的手段によってポリマーと共有結合したＦａｂ’フラグメントを使用して、直接的にこの標的細胞に結合する。本発明の別の局面は、ＨＣＨ２融合タンパク質を使用して、トキシン送達のために腫瘍細胞を含む送達部位を標的化することを含む。トキシンは、この腫瘍細胞を殺傷する。本発明の別の局面は、治療剤送達のために腫瘍細胞を含む送達部位を標的化する、ＨＣＨ２融合タンパク質を使用することを含む。同様に、本発明のＨＣＨ２融合タンパク質が、細菌性病原体、原生動物性病原体、真菌性病原体、マイコプラズマ性病原体、リケッチア性病原体、およびウイルス性病原体による感染から引き起こされる病理状態の処置を求めて、この標的細胞を標的化するために使用され得る。
【０１９１】
ＨＣＨ２ポリマーは、Ｆｃレセプターへの結合およびＦｃレセプターの活性化に対して高い機能的親和性を生じる、多価である。さらに、ＨＣＨ２ポリマーの特定の調製物は、複数の補体成分に結合し得、従って、相補的な活性化カスケードを誘発し得る。当該分野で周知のＨＣＨ２モノマー単位に対する変更を使用して、ＨＣＨ２ポリマーは、Ｆｃレセプターへと特異的結合するため、補体因子へと特異的結合するため、または、Ｆｃレセプターおよび相補的因子の両方へと同時に結合するために作製され得る。ＨＣＨ２ポリマーは、本明細書中に記載された、一特異性（ｍｏｎｏ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）または二特異性（ｂｉ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）のＦａｂフラグメントまたは他の結合ドメインに融合されたＨＣＨ２ポリマーは、多重特異的（ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）結合決定因子を有する分子を生じる。これらが補体および／または免疫細胞上でＦｃＲを結合させる能力、および標的細胞で発現される１以上の抗原に結合する能力に基づいて、ＨＣＨ２ポリマーの特定の実施形態は、癌を含む腫瘍性疾患を処置するためまたはこれらの疾患の再発を防ぐために使用され得る。同様にして、本発明のＨＣＨ２ポリマーは細菌性病原体、原生生物性病原体、真菌性病原体、リケッチア性病原体、およびウイルス性病原体から生じる病理状態を処置するために使用され得る。
【０１９２】
ＨＣＨ２ポリマーは、任意の１つまたは組み合わせた、抗体媒介性細胞エフェクター機構によって、標的細胞の直接的な破壊、または除去を指向し得る。ＨＣＨ２ポリマーは、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を介する標的細胞殺傷を誘導し得る。ＡＤＣＣは、標的細胞に結合したＨＣＨ２ポリマーがＮＫ細胞のような免疫細胞上で発現したＦｃγＲと相互に結びつき、そして凝集するときに、誘発される。一旦、このＮＫ細胞上のＦｃγＲが結合されると、例えば、これらが、標的細胞膜のパーフォリン媒介性溶解、リソソーム酵素放出、および細胞傷害性スーパーオキシド生成を生じる１連の事象を誘発する。単球／マクロファージ上のＦｃγＲの活性化（これは、３つ全てのクラスのＦｃγＲを発現する）は、インタクトな細胞の食作用、ならびに可溶性細胞傷害性因子の放出を導き得る。例えば、ＦｃγＲおよびｅｒｂＢ−２タンパク質を標的化する二重特異性抗体が当該分野で公知である。このｅｒｂＢ−２タンパク質は、胸部、卵巣の癌および他の癌において過剰発現されている。ＭＤＸ−Ｈ２１０は、ｅｒｂＢ−２タンパク質を認識するフラグメントに対する、ＦｃγＲＩ（高親和性Ｆｃレセプター）を認識するＦ（ａｂ）’フラグメントの化学的相互連結（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ）を介して構築される二重特異性抗体である。ＡＤＣＣ媒介性腫瘍細胞殺傷は、マクロファージ上に発現するＦｃγＲＩレセプターに腫瘍細胞結合性抗体の連結の結果として生じることが想定される（Ｃｕｒｎｏｗ，１９９７）。
【０１９３】
補体活性化は、標的細胞のクリアランスのための他の主要な抗体媒介性経路である。ＨＣＨ２ポリマーは、補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）を介して標的細胞殺傷を誘導し得る。ＣＤＣは、標的細胞抗原に結合しているＨＣＨ２領域（Ｆｃ領域）に対するＣ１ｑの結合により開始する。Ｃ１ｑの結合によって、最終的に膜侵襲複合体（因子Ｃ５ｂ−９）の形成および細胞膜の破壊を生じる古典的な補体経路活性化が導かれる。古典的な経路活性は、細胞媒介性ではなく、循環する補体因子にのみ依存している。ＣＤＣに加え、標的細胞の殺傷は、補体依存性細胞性細胞障害（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）（ＣＤＣＣ）を介して誘導され得る。ＣＤＣＣは、ＨＣＨ２領域内にある補体結合部位に対する補体結合Ｃ１ｑの結合で開始する。他の補体因子（例えば、Ｃ３ｂおよびＣ４ｂ）は、続いて沈着し、そしてこれらは、マクロファージ、多型核白血球（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｎｕｌｅａｒ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ）、およびＮＫ細胞による食作用および細胞傷害性殺傷の増大を誘発する。ＣＤＣは、主要なエフェクター機構として同定されてきており、この機構によって、治療学的に投与されたモノクローナル抗体Ｒｉｔｕｘｉｍａｂが、低度の非ホジキンリンパ腫の処置において効果を発揮する（Ｈａｒｊｕｎｐａａら、２０００）。
【０１９４】
本発明の融合タンパク質は、現在の用途におけるモノクローナル抗体およびモノクローナル抗体のフラグメントについてすでに議論されている利点に加え、標的細胞のＦｃレセプター媒介性殺傷についてのいくつかの潜在的な利点を与える。このポリマー領域に含まれるＨＣＨ２単位の数は、ＦｃＲとの相互作用および／または補体との相互作用を鍛え上げるように変更され得る。第２に、ＦｃＲを標的化するために抗体のＦｃ領域を使用することは、２つのさらなるエピトープに対する標的化のためにＦ（ａｂ）２領域を開発し、三重特異的である分子を生じる。この更なる特異性によって、目的の細胞に対する正確な標的化を可能にする。第３に、このポリマー領域におけるＨＣＨ２単位の変更は、ＦｃＲのみ、補体のみ、または両方の特異的結合を可能にする。さらに、このＨＣＨ２ポリマーは、免疫複合体の様式と同じ様式でＦｃＲと相互作用する。これは、ＦｃＲ上のリガンド結合部位の外にあるエピトープに対するモノクローナル抗体の結合から生じる結果とは定性的に異なる、細胞傷害性エフェクター細胞に対するシグナルを提供し得る。
【０１９５】
本明細書中の記載のように、ＨＣＨ２融合タンパク質は、腫瘍抗原を発現する細胞を特異的に標的化するために構築され得る。腫瘍細胞すなわち、腫瘍を構成する悪性細胞は、この腫瘍細胞の比較的特異的なマーカーに対する結合が可能な領域を有する、リガンドまたは二重特異性リガンドを使用して標的化され得る。本発明の融合タンパク質は、腫瘍細胞を標的化するように構築され得る。本発明の別の局面は、治療剤の送達のために腫瘍細胞を含む送達部位を標的化するためにＨＣＨ２融合タンパク質を使用することを含む。
【０１９６】
（１．腫瘍細胞標的）
多くの、所謂、「腫瘍抗原」は、本発明の併用局面に関連した標的として使用され得る任意の１つの抗原であると記載されてきた。多くの例示的な固形腫瘍関連抗原が、本明細書中において、以下に列挙される。このような抗原に対する抗体の調製および使用は、当業者にとって周知であり、そして、例示的な抗体としては、以下が挙げられる：婦人科的な腫瘍部位由来：
【０１９７】
【数１】
0004524074.tif 000006
。
【０１９８】
標的可能な腫瘍を定義づける別の手段は、腫瘍細胞によって発現される抗原の生化学的特性を記載することであるというよりも、腫瘍細胞それ自体の特徴に関する。従って、当業者は、（ＡＴＣＣカタログから）公的に利用可能なヒト腫瘍細胞株を例示する目的で、ＡＴＣＣカタログを参照する。例示的な細胞株としては、以下が挙げられる：
【０１９９】
【数２】
0004524074.tif 000007
。
【０２００】
他の適切な細胞株を同定するために任意の引き続く年についてのＡＴＣＣカタログを参照し得る。また、特定の細胞型が所望される場合に、このような細胞を入手するための手段および／またはこれらのすぐに利用可能な供給源が特定の分野の当業者にとって、公知である。従って、科学文献を解析することによって、標的化されることが所望される任意の腫瘍細胞型のための適切な細胞の選択を容易に明らかにすることができる。
【０２０１】
近年の技術進歩によって、当業者が容易かつ効率的に、腫瘍組織における遺伝子発現を正常組織における遺伝子発現と比較することが可能になる。これらの技術的な進歩としては、遺伝子チップアレイおよびタンパク質アレイを使用する差次的遺伝子分析が挙げられるが、これらに限定されない。これらの技術的な進歩を利用することによって、正常組織で見出されるｍＲＮＡ種およびタンパク質と、腫瘍組織で発現されるｍＲＮＡ種およびタンパク質を比較することが可能である。正常組織と比較して腫瘍組織において差次的に発現されるｍＲＮＡ種またはタンパク質は、容易に識別され得る。これらのスクリーニング技術を利用して、腫瘍組織または腫瘍細胞において優先的に発現されることが見出されるタンパク質は、さらなる癌または腫瘍に特異的な治療のさらなる開発についての有望な候補として役割を果たす。このような技術を用いて発見される、腫瘍関連タンパク質または腫瘍特異的タンパク質は、本発明の併用的局面に関連する標的として使用され得ることが本発明の１つの実施形態である。
【０２０２】
（２．抗腫瘍細胞抗体）
腫瘍抗原標的を認識する直接的手段は、特定の抗原について結合親和性を有する抗体の使用を介する。固形腫瘍抗原に対して指向される大規模な数の抗体が公知である。特定の有用な抗腫瘍抗体は、上記に列挙される。しかし、当業者にとって瞬時に理解されるように、これらの列挙された抗体のうちの特定のものは、治療に有用な、適切な生化学的特性を有し得ず、または、十分に腫瘍特異性であり得ない。例は、細胞質抗原を認識するＭＵＣ８−２２である。このような抗体は、一般的に、モデル系またはスクリーニングアッセイのような調査目的の実施形態においてのみ有用である。
【０２０３】
一般的にいって、本発明のこれらの局面における用途のための抗体は、好ましくは、細胞表面で接触可能であり、かつ優先的または特異的に腫瘍細胞によって発現される抗原を認識する。このような抗体はまた、好ましくは、例えば、２００ｎＭ未満のＫｄ、および好ましくは１００ｎＭ未満のＫｄを提示するような高い親和性の特性を提示し、そして、生命を維持する（ｌｉｆｅ−ｓｕｓｔａｉｎｉｎｇ）正常組織との有意な反応性を示さず、このような正常組織は、以下から選択される１以上の組織である：心臓、腎臓、脳、肝臓、骨髄、結腸、胸部、前立腺、甲状腺、胆嚢、肺、副腎、筋肉、神経線維、膵臓、皮膚、またはヒトの身体における他の生命維持器官もしくは生命維持組織。本発明の目的にとって最も重要な「生命維持」組織は、低反応性の観点から、心臓、腎臓、中枢神経系および末梢神経系の組織、および肝臓が挙げられる。用語「有意な反応性（ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ）」は、本明細書中で使用されるとき、免疫組織化学的に適切な条件下で特定の組織に適用される場合に陰性の細胞の中に散在する少数の陽性の細胞との染色または僅かな染色のいずれも誘発しない、抗体または抗体フラグメントをいう。
【０２０４】
腫瘍関連標的を定義づける別の手段は、腫瘍細胞によって発現される抗原の生化学的特性を記述するというよりも、腫瘍細胞の特徴に関する。従って、本願発明者らは、腫瘍細胞に優先的に結合する任意の抗体が免疫毒素または凝集複合体（ｃｏａｇｕｌｉｇａｎｄ）の標的化成分として使用され得ることを企図する。優先的な腫瘍細胞結合は、上述のように、腫瘍細胞に対する高親和性を提示し、そして生命を維持する正常な細胞または組織に対する有意な反応性を持たない抗体にさらに基づく。
【０２０５】
腫瘍細胞特異的な抗体を生成するために、腫瘍細胞抗原を含む組成物で動物を免疫し、以下でより完全に記載されるように、適切な特異性を有する得られた抗体を選択する。この免疫化組成物は、上で列挙した抗原のうちのいずれかの、精製されたか、または部分的に精製された調製物；上に列挙した抗原のいずれかについて濃縮した膜調製物のような組成物；上に列挙したいずれかの細胞；または上に列挙した細胞型のいずれかを含む細胞の混合物または調製物を含み得る。
【０２０６】
当然のこととして、抗体の供給源にかかわらず、ヒト処置における本発明の実施において、臨床的に標的化された腫瘍が、最終的に選択された抗原を発現することを、予め、確認することを選択する。これは、腫瘍組織サンプル（例えば、外科的生検）の抗原試験、または可能なら循環で与えられる抗原（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｓｈｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ）を試験することを含むかなり直接的な手段によって達成される。これは、免疫学的なスクリーニングアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ））において容易に実施され得、このＥＬＩＳＡにおいて、ハイブリドーマの「バンク（ｂａｎｋ）」による抗体の結合親和性が、腫瘍に対する反応性について試験される。次いで、適切な腫瘍選択性および腫瘍親和性を実証する抗体は、本発明の二重特異性抗体の調製のために選択される。
【０２０７】
交差反応性という周知の現象のために、有用な抗体が、当初使用される抗体（ｏｒｉｇｉｎａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ）がヒト細胞から得られ得るアッセイに加え、当初使用される抗原が動物（例えば、マウスまたは霊長類）に由来した免疫プロトコルからも生じ得ることが企図される。ヒト起源の抗原が使用される場合、これらは、ヒト腫瘍細胞株から取得され得るか、または、問題としている特定の患者由来の生物学的サンプルを得ることによって調製され得る。実際、この患者の腫瘍に対して「特注された」抗体の開発方法が公知であり（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら、１９９０）、その方法は、本発明の融合タンパク質の用途のために企図される。
【０２０８】
（３．さらなる腫瘍細胞標的および結合リガンド）
抗体の使用に加え、他のリガンドは、腫瘍細胞抗原に結合することによって、ＨＣＨ２融合タンパク質を腫瘍部位に指向するために使用され得る。過剰発現されるレセプター（例えば、エストロゲンレセプター、ＥＧＦレセプター）または変異レセプターである腫瘍抗原のために、これらに対応するリガンドは、標的化薬剤として使用され得る。
【０２０９】
（Ｋ．抗原提示細胞（ＡＰＣ）に対する抗原提示におけるＨＣＨ２ポリマー）
本発明の別の実施形態において、本発明のポリマーは、抗原に連結される。本明細書中で使用される場合、用語「抗原」は、（米国特許第５９２２８４５号，１３頁において定義されるように）任意の天然免疫原性物質または合成免疫原性物質、免疫原性物質のフラグメントまたは一部分、ペプチドエピトープ、またはハプテンを意味する。１つの実施形態において、本発明のポリマーは、抗原を細胞に標的化して、これらの細胞による抗原の内在化および提示のプロセスを増強し、最終的に免疫応答を刺激するように使用される。別の実施形態において、本発明のポリマーは、この抗原に直接的に特異的に結合するか、または、この抗原に結合するエピトープに特異的に結合する（例えば、抗原また抗原に結合したエピトープを認識し、そして、内在化、プロセシング、および提示のために抗原提示細胞（ＡＰＣ）に対して、この結合した抗原を標的化する、遺伝的な手段または化学的手段によってこのポリマーと共有結合したクローン化されたＦａｂ’フラグメント）。別の実施形態において、この抗原は、本発明のポリマーに結合し、そして、同時に、抗原提示細胞の表面レセプターに結合する。好ましい実施形態において、この抗原は、遺伝的手段または化学的手段によって本発明のポリマーと共有結合する。
【０２１０】
より広範には、本発明のポリマーは、細胞表面マーカーに結合する。細胞表面マーカーは、タンパク質、炭水化物、糖脂質などであるが、最も一般的なのは、細胞膜表面に局在したタンパク質であり、この細胞は、細胞外領域に露出した部分（例えば、複合膜タンパク質または膜貫通糖タンパク質）を有し、その結果、この細胞外部分は、抗体または他のリガンドによって特異的に結合され得る。細胞表面マーカーという用語はまた、細胞表面タンパク質のようなものをコードする、ポリヌクレオチド配列をいう。多くの細胞表面タンパク質は、細胞表面マーカー（例えば、造血系列の細胞上に存在するＣＤ（分化クラスター）抗原（ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２１）、γグルタミルトランスぺプチダーゼ、接着タンパク質（ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＥＬＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１）、ホルモン、増殖因子、サイトカインレセプター、イオンチャネル、および膜結合形態の免疫グロブリン鎖）として使用され得る。
【０２１１】
（１．ワクチンにおける用途のためのＨＣＨ２ポリマー）
従来のワクチンは、免疫応答を発生させるために投与される、殺傷されたか、また、弱毒化された、病原性生物またはそれらの産物からなる。従来のアプローチの欠点としては、望まない有害な免疫応答、潜在的に感染性である病原体でのワクチン接種、および乏しい免疫応答が挙げられる。代表的には、これらのワクチンは、効果的な抗体応答を誘発する強力なアジュバントの同時投与を必要とする。ワクチンは、防御免疫を与える可能性が最もあるこれらの抗原性決定因子を送達することによってより効果的に作製され得る。ペプチドに基づくワクチンを開発する為の初期の試みは、ＡＰＣによる抗原の非効率的な提示に部分的に起因して、乏しい免疫応答を生じた。
【０２１２】
ＡＰＣは、抗原を捕捉し、内在化し、そして、提示する。さらに、これらは、Ｔ細胞に対して重要な同時刺激シグナルを与える。このようにして、活性化されたＴ細胞は、抗体を形成するＢ細胞の産生を刺激し得る。単球、特にマクロファージおよび樹状細胞は、ＡＰＣとして機能する。マクロファージは、構成的にＦｃγＲの３つのクラスを全て発現するが、その一方、樹状細胞は、ＦｃγＲＩおよびＦｃγＲＩＩを発現する。
【０２１３】
樹状細胞（ＤＣ）は、高度に特殊化しており、そして、Ｔ細胞に対する強力なＡＰＣである。この能力の結果として、ＤＣは、しばしば、「潜在的ＡＰＣ」と称される。ＤＣは、ＭＨＣ  ＩおよびＭＨＣ  ＩＩ上において抗原を効果的に提示し、それぞれ、ＣＤ８＋応答およびＣＤ４＋応答の開始を生じる。ＤＣは、ナイーブ（ｎａｉｖｅ）Ｔ細胞を初回抗原刺激し得る。ＤＣによる活性化に続いて、Ｔ細胞は、他のＡＰＣと相互作用し得る。ＤＣは、増殖性の未熟段階、その後の非増殖性成熟段階への終端分化を有する。未熟ＤＣは、ＦｃγＲＩおよびＦｃγＲＩＩを発現し、そして、抗原の内在化および提示を行い得、そして、大量のＭＨＣ  ＩＩを合成し得る。対照的に、成熟ＤＣは、もはやＦｃγＲを発現せず、完全に活性なＡＰＣとなり、Ｔ細胞を活性化、そして大量にＩＬ−１２（これは、Ｔ細胞の分化をスパー（ｓｐｕｒ）する）を分泌する。ＤＣは、ずっと少ない数を介して、マクロファージよりも強力なＡＰＣである。
【０２１４】
ＡＰＣ上に発現するＦｃγＲに対しての抗原の標的化によって抗原提示の増強することに、大変な興味がもたれている。抗原性決定因子が、ＩｇＧの可変領域にグラフトされるペプチドワクチンは、当該分野で公知である。これらの「抗原化−抗体（ａｎｔｉｇｅｎｉｚｅｄ−ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、抗原の半減期を長期化し、そしてＦｃγＲＩレセプターを介してＡＰＣによる抗原の取り込みを促進した（Ｚａｇｈｏｕａｎｉら、１９９３；Ｚａｎｅｔｔｉら、１９９２）。抗原化−抗体の使用は、ペプチド単独よりも、抗原特異的Ｔ細胞応答を初回抗原刺激することにおいて、より効率的であることが示されている。抗原化−抗体は、以下のいくつかの限定的な特徴を有する：抗原化−抗体は、ＦｃγＲＩのみに対して指向されるので、抗原化−抗体は、単量体の血清ＩｇＧによって効率的に競合され得る。第２に、この分子の設計は、抗原化決定因子のサイズを低分子ペプチドフラグメントに限定する。
【０２１５】
より最近、抗原は、ＦｃγＲＩおよびＦｃγＲＩＩに対するモノクローナル抗体およびＦａｂフラグメントとの融合タンパク質としてか、またはこれらに化学的に結合体化されて発現されている（Ｌｉｕら、１９９６ｂ；Ｇｕｙｒｅら、１９９７）。抗ＦｃγＲＩモノクローナル抗体に結合体化した破傷風トキソイドエピトープを使用して、１つのグループは、ＦｃγＲＩに対するペプチドが、Ｔ細胞刺激において、ペプチド単独よりも１００〜１０００倍効果的であることを見出した（Ｌｉｕら、１９９６ａ）。しかし、抗ＦｃγＲＩ  Ｆａｂ’の使用は、抗原に対する最大の応答を達成するために化学的に架橋されることを必要とし、従って、低親和性ＩｇＧレセプターに関連した（Ｋｅｌｅｒら、２０００）。このアプローチの欠点としては、非ＡＰＣ上で発現されたＦｃγＲＩに対する抗原連結モノクローナル抗体の無差別の結合が挙げられる。モノクローナル抗体は、エフェクター機能を不十分に誘発する。Ｆａｂ’フラグメントは、循環における短い半減期というさらなる欠点を有する。
【０２１６】
ＡＰＣを標的化する目的のための、本明細書中に記載されるＨＣＨ２ポリマーに対する抗原の結合は、既存のストラテジーを上回る明確な利点を有する。ＨＣＨ２ポリマーは、低親和性レセプター（ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩ）に対して抗原を提示し、従って、ＦｃγＲＩに対する結合について、モノマー血清ＩｇＧからの競合をバイパスする。さらに、抗ＦｃγＲＩ  Ｆａｂ’を使用する場合に必要な、化学的架橋の必要性がない。ＨＣＨ２ポリマーは、免疫複合体を模倣する。免疫複合体に関して提示される抗原は、ＡＰＣについての特に適切な基質であり得る。抗原連結ＨＣＨ２ポリマーは、免疫応答を増強するエフェクター機能を効果的に誘発する。
【０２１７】
（２．寛容誘導におけるＨＣＨ２ポリマー）
免疫寛容は、免疫系の他の応答はインタクトなままでの、特定の抗原に対する病原性免疫応答の欠如を含む、免疫応答の選択的欠如によって特徴付けられる。特定の抗原に対するＴ細胞非応答性の誘導および維持は、１）クローン除去；２）アネルギー；および３）抑制として広く要約され得るいくつかの機構によって達成され得る。クローン除去は、ネガティブ選択のプロセスであり、これによって、自己抗原に対する高い親和性を有するＴ細胞が、胸腺において除去される。除去は、プログラム細胞死（アポトーシス）によって達成される。胸腺におけるこのネガティブ選択プロセスは、「中心寛容」として知られる。アネルギーは、増殖およびサイトカイン応答がなくなっていることによって特徴付けられる免疫不活化状態を示す。これは、以前に所定の抗原に対して応答し、そして抗原での再刺激の際に非応答性状態を生じる細胞において誘導される。この機構は、胸腺を出て末梢区画に存在する成熟Ｔ細胞に対して作用するので、この形態の寛容は、「末梢寛容」と称される。アネルギーは、任意の多数の分子事象によって誘導され、そして永続的である必要はない：これは、特定のサイトカインによって逆転され得る。３つの共通のアネルギー誘導機構は、同時刺激シグナルなしのＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）刺激、同時刺激の存在下でさえの準最適ＴＣＲ刺激、およびＩＬ−１０のオートクライン阻害作用である。Ｔ細胞機能の抑制は、Ｔ細胞寛容が達成され得る第三の機構である。抑制は、調節Ｔ細胞がその近位にある抗原特異的Ｔ細胞に対する「非特異的」抑制効果を発揮するように誘導される場合に、生じる。この微小環境効果はまた、「バイスタンダー抑制」とも称される。
【０２１８】
Ｂ細胞寛容は、Ｔ細胞寛容において遭遇する概念および機構と類似ではあるが同一ではない概念および機構を含む。成熟Ｂ細胞において、寛容は、Ｂ７同時刺激分子の減少した発現を生じる、Ｉｇレセプターシグナル伝達のブロックによって誘導され得る。
【０２１９】
自己抗原または外来抗原のいずれかに対する寛容の誘導は、アレルギー、自己免疫疾患および対宿主性移植片病（移植拒絶）の処置に対する重要な治療アプローチを提供する。さらに、多くの外来の生物学的に活性な因子の治療能力は、その免疫原性によって制限される。寛容誘導は、生物学的に活性な外来の因子に対する免疫応答の制御、従って、治療能力を改善するための、１つのアプローチを示す。ほとんどの例において、寛容化される抗原は、経口的、皮内または静脈内に提示される。抗原の供給源は、ペプチド、タンパク質、またはペプチドもしくはタンパク質を発現し得る核酸の形態であり得る。次いで、この抗原は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって内在化され、そして最も代表的にはＭＨＣ  Ｉ−抗原複合体またはＭＨＣ  ＩＩ−抗原複合体として、細胞の表面上に提示される。
【０２２０】
本発明のＨＣＨ２ポリマーは、寛容誘導のためのビヒクルとして使用するための、いくつかの有利な局面を有する。化学的手段または遺伝学的手段によってＨＣＨ２ポリマーに連結された抗原は、ＡＰＣ（例えば、マクロファージ、Ｂ細胞および樹状細胞（ＤＣ））上に発現されたＦｃレセプターに対して標的化される。Ｆｃレセプター媒介性の内在化は、抗原のプロセシングおよび細胞表面での抗原提示（これは、寛容誘導における最初の重要な工程である）を生じる。
【０２２１】
マクロファージおよび樹状細胞は、ＩｇＧおよびＩｇＥの両方についてのＦｃレセプターを発現する。両方のクラスのＦｃレセプターに同時に結合するＨＣＨ２ポリマーが発現可能である−異なるＦｃレセプタークラスの凝集は、単一のクラスのレセプターを標的化することを上回る利点を有し得る。ＦｃＲの連結は、特定の免疫細胞からのＩＬ１０の分泌を誘導し、そしてすでに注目されたように、ＩＬ１０は、Ｔ細胞においてアネルギーを誘導する。免疫複合体について観察されるように、ＦｃＲに対するＨＣＨ２ポリマーの結合は、ＴＨ１型応答からＴＨ２型応答へとＴ細胞免疫応答を逸脱させる、サイトカイン分泌パターンを誘導し得る。ＴＨ２型Ｔ細胞は、免疫寛容の確立および維持を促進する。従って、ＨＣＨ２ポリマーに連結された抗原は、ＡＰＣに対する効率的な抗原提示および免疫寛容の確立を促進する機構の同時誘導の両方によって、寛容誘導を促進し得る。
【０２２２】
（Ｌ．毒素）
特定の適用について、治療的因子または薬理学的因子は、ＨＣＨ２融合タンパク質、特に新生物細胞を殺傷するか、または新生物細胞の増殖もしくは細胞分裂を抑制する能力を有する細胞傷害性因子またはさもなければ抗細胞性因子に結合されることが想定される。一般に、本発明の１局面は、特定の領域を標的化するように構築され、そして標的化細胞に対して活性な形態で送達されるＨＣＨ２融合タンパク質に結合体化され得る任意の薬理学的因子の使用を意図する。例示的な抗細胞性因子としては、化学療法剤、放射性同位体および細胞毒素が挙げられる。化学療法剤の場合、ホルモン（例えば、ステロイド）のような因子、代謝拮抗物質（例えば、シトシンアラビノシド、フルオロウラシル、メトトレキサートまたはアミノプテリン）；アントラサイクリン；マイトマイシンＣ；ビンカアルカロイド；デメコルチン；エトポシド；ミトラマイシン；または抗腫瘍アルキル化剤（例えば、クロラムブシルまたはメルファラン）が、特に好ましい。他の実施形態は、サイトカイン、増殖因子、細菌性内毒素または細菌性内毒素のリピドＡ部分のような因子を含み得る。
【０２２３】
特定の好ましい実施形態において、免疫毒素としては、一般に、植物由来の毒素、真菌由来の毒素または細菌由来の毒素（例えば、ほんのいくつかの例を挙げれば、Ａ鎖毒素、リボソーム不活性化タンパク質、α−サルシン、アスペルギリン、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎｅ）、リボヌクレアーゼ、ジフテリア毒素またはシュードモナス外毒素）が挙げられる。毒素タンパク質構築物の使用は、免疫毒素の分野で周知であり、抗体に対するそれらの結合も同様である。これらのうち、特に好ましい毒素は、脱グリコシル化リシンＡ鎖である。脱グリコシル化リシンＡ鎖は、極度の効力および長い半減期に起因して、好ましい。
【０２２４】
（１．標的化因子−毒素結合体の調製）
一般に、免疫毒素の調製は、当該分野で周知であるが（例えば、米国特許第４，３４０，５３５号およびＥＰ  ４４１６７（これらは両方とも、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）、本発明者らは、免疫毒素の調製およびその後の臨床的投与のための精製の両方において、特定の利点が、特定の好ましい技術の適用によって達成され得ることを理解している。
【０２２５】
さらに、多数の型のジスルフィド結合含有リンカーが公知であり、これは、毒素部分を標的化因子と結合体化するために首尾よく使用され得るが、特定のリンカーが、一般に、異なる薬理学的特徴および能力に基づいて、他のリンカーよりも好まれる。例えば、立体的に「妨害された」ジスルフィド結合を含むリンカーは、インビボでのより高い安定性（従って、作用部位での結合の前に毒素部分が放出されるのを予防する）に起因して好まれる。ＨＣＨ２ポリマーに結合体化され得る広範な種々の細胞傷害性因子が公知である。例としては、多数の有用な植物由来の毒素、真菌由来の毒素または細菌由来の毒素さえもが挙げられ、これらには、例として、いくつか挙げれば、種々のＡ鎖毒素、特にリシンＡ鎖、リボソーム不活性化タンパク質（例えば、サポリン（ｓａｐｏｒｉｎ）またはゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ））、α−サルシン、アスペルギリン、レストリクトシン、リボヌクレアーゼ（例えば、胎盤リボヌクレアーゼ）、ジフテリア毒素およびシュードモナス外毒素が挙げられる。
【０２２６】
融合タンパク質の一部として使用される特定の毒素化合物に依存して、ジスルフィド結合ループ構造へと折り畳まれ得る、標的化因子および毒素化合物を作動可能に結合するペプチドスペーサーを提供することが必要であり得る。次いで、このループ内のタンパク質分解性切断によって、ヘテロ二量体ポリペプチドが生じ、ここで、標的化因子および毒素化合物は、単一のジスルフィド結合のみによって連結される。例えば、Ｌｏｒｄら（１９９２）を参照のこと。このような毒素の例は、リシンＡ鎖毒素である。
【０２２７】
特定の他の毒素化合物が利用される場合、切断不能なペプチドスペーサーが、標的化因子および融合タンパク質の毒素化合物を作動可能に結合するために提供され得る。切断不能なペプチドスペーサーと共に使用され得る毒素は、それ自体、タンパク質分解性切断によって細胞傷害性ジスルフィド結合形態へと転換され得る毒素である（例えば、Ｏｇａｔａら、１９９０を参照のこと）。このような毒素化合物の例は、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｍａｓ）外毒素化合物である。
【０２２８】
本明細書中で利用され得る核酸は、目的の標的化因子をコードする核酸配列および目的の毒素因子をコードする核酸配列を含む。このような標的因子コード核酸配列および毒素因子コード核酸配列は、核酸の翻訳によって本発明の標的化因子／毒素化合物が生じるような様式で結合される。
【０２２９】
（２．標的化因子に対する他の因子の結合）
本発明のさらなる免疫毒素の局面の最も治療的な適用は、腫瘍細胞への毒素部分の標的化を含むことが意図される。このことは、ほとんどの毒素が、他の潜在的な因子と比較して、細胞殺傷効果を送達する能力がずっと高いことに起因する。しかし、標的抗原が標的化因子／毒素化合物（例えば、免疫毒素）による効果的な中毒と一致する経路によって内在化されないような場合、化学療法剤（例えば、抗腫瘍薬物、他のサイトカイン、代謝拮抗物質、アルキル化剤、ホルモン）を標的化することが所望される場合など、場合による。非標的化因子結合体化対応物を超えるこれらの因子の利点は、標的化因子（例えば、ＨＣＨ２ポリマー融合タンパク質）によって得られるさらなる選択性である。因子の例として、例えば、ステロイド、シトシンアラビノシド、メトトレキサート、アミノプテリン、アントラサイクリン、マイトマイシンＣ、ビンカアルカロイド、デメコルチン、エトポシド、ミトラマイシンなどに言及し得る。もちろん、このリストは、組織への特異的送達のために、標的化因子（例えば、抗体または抗体融合タンパク質）に薬学的因子を結合させるための技術が十分確立されているので、単に例示である（例えば、ＧｈｏｓｅおよびＢｌａｉｒ、１９８７を参照のこと）。
【０２３０】
種々の化学療法剤および他の薬理学的因子は、現在、抗体に首尾よく結合体化されており、そして薬理学的に機能することが示されている（例えば、Ｖａｉｃｋｕｓら、１９９１を参照のこと）。調査されてきた例示的な抗新生物因子としては、ドキソルビシン、ダウノマイシン、メトトレキサート、ビンブラスチンなどが挙げられる（Ｄｉｌｌｍａｎら、１９８８；Ｐｉｅｔｅｒｓｚら、１９８８）。さらに、他の因子（例えば、ネオカルチノスタチン（Ｋｉｍｕｒａら、１９８３）、マクロマイシン（ｍａｃｒｏｍｙｃｉｎ）（Ｍａｎａｂｅら、１９８４）、トレニモン（ｔｒｅｎｉｍｏｎ）（Ｇｈｏｓｅ、１９８２）およびα−アマニチン（ＤａｖｉｓおよびＰｒｅｓｔｏｎ、１９８１）の結合が記載されている。
【０２３１】
（Ｍ．二重特異的抗体）
二重特異的抗体（ＢｓＡｂ）の使用は、本発明の融合タンパク質、ならびに疾患を処置する方法および送達部位を標的化するための方法において意図される。一般に、ＢｓＡｂの調製はまた、Ｇｌｅｎｎｉｅら（１９８７）によって例示されるように、当該分野で周知である。
【０２３２】
ＢｓＡｂはまた、免疫治療剤としての使用のために特に開発された。抗原誘導に関して上記したように、特定のこれらの抗体は、リンパ球および腫瘍抗原を架橋するために開発された（Ｎｅｌｓｏｎ、１９９１；Ｗｕｎｄｅｒｌｉｃｈら、１９９２）。例としては、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ３で）および腫瘍抗原に結合し、そして標的細胞のごく近位でＴＣＲ／ＣＤ３複合体を物理的に架橋することによってリンパ球活性化を誘発するキメラ分子が挙げられる（Ｓｔａｅｒｚら、１９８５；Ｐｅｒｅｚら、１９８５；１９８６ａ；１９８６ｂ；Ｔｉｎｇら、１９８８）。
【０２３３】
実際、癌腫、リンパ腫、白血病および黒色腫の腫瘍細胞は、Ｔ細胞によるＢｓＡｂ媒介性の殺傷に感受性であることが報告されている（Ｎｅｌｓｏｎ、１９９１；Ｓｅｇａｌら、１９９２）。これらの型のＢｓＡｂはまた、多様な腫瘍標的に対するいくつかの第Ｉ相臨床試験において使用されてきた。二重特異的架橋抗体は、Ｋｒｏｅｓｅｎら（１９９７）；Ｂｏｌｈｕｉｓら（１９９２）；およびＮｉｔｔａら（１９９０）のような参考文献に記載されるように投与され得る。
【０２３４】
ＢｓＡｂの調製について多数の方法が当該分野で公知であるが、Ｇｌｅｎｎｉｅら（１９８７）の方法は、２つの選択された抗体からのペプシン処理Ｆ（ａｂ’γ）２フラグメントの調製、その後各々を還元して別個のＦａｂ’γＳＨフラグメントを提供することを含む。次いで、カップリングされる２つのパートナーの一方のＳＨ基は、架橋試薬（例えば、ｏ−フェニレンジマレイミド）でアルキル化されて、一方のパートナー上に遊離のマレイミド基を提供する。次いで、このパートナーは、チオエーテル結合によって他方に結合体化されて、所望のＦ（ａｂ’γ）２ヘテロ結合体を生じ得る。
【０２３５】
ＢｓＡｂを生成するための別の方法は、２つのハイブリドーマを融合してクアドローマ（ｑｕａｄｒｏｍａ）を形成することによる（Ｆａｎｇｅｒら、１９９２；Ｎｏｌａｎら、１９９０；Ｍｅｎａｒｄら、１９８９）。本明細書中で使用する場合、用語「クアドローマ」は、２つのＢ細胞ハイブリドーマの生産的融合を説明するために使用される。現在の標準的な技術を使用して、２つの抗体産生ハイブリドーマを融合して娘細胞を生じ、次いで、クローン型（ｃｌｏｎｏｔｙｐｅ）免疫グロブリン遺伝子の両方のセットの発現を維持した細胞を、選択する。
【０２３６】
クアドローマを作製する好ましい方法は、親ハイブリドーマの少なくとも１つの酵素欠損変異体の選択を含む。次いで、この第一の変異体ハイブリドーマ細胞株は、例えば、その連続的な生存を防止するヨードアセトアミドに致死的に曝露された第二のハイブリドーマの細胞と融合される。細胞融合は、致死的に処理されたハイブリドーマ由来の酵素欠損についての遺伝子を獲得することによって、第一のハイブリドーマのレスキューを可能にし、そして第一のハイブリドーマへの融合を介して第二のハイブリドーマのレスキューを可能にする。同じアイソタイプであるが異なるサブクラスの免疫グロブリンの融合は、必要ではないが好ましい。混合サブクラスの抗体は、好ましいクアドローマの単離のための代替的アッセイの使用を可能にする。
【０２３７】
より詳細には、クアドローマの開発およびスクリーニングの１つの方法は、第一の選択されたＭＡｂを分泌するハイブリドーマ株を獲得する工程、および必須代謝酵素であるヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）についてこれを欠損させる工程を包含する。欠損変異体ハイブリドーマを得るために、細胞を、漸増濃度の８−アザグアニン（１×１０−７Ｍ〜１×１０−５Ｍ）の存在下で増殖させる。この変異体を限界希釈によってサブクローニングし、そしてヒポキサンチン／アミノプテリン／チミジン（ＨＡＴ）感受性について試験する。培養培地は、例えば、１０％ＦＣＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび１ｍＭ  ペニシリン−ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭからなり得る。
【０２３８】
第二の所望のＭＡｂを産生する補完的ハイブリドーマ細胞株は、標準的な細胞融合技術（Ｇａｌｆｒｅら、１９８１）によってか、またはＣｌａｒｋら（１９８８）によって記載されるプロトコルを使用することによって、クアドローマを作製するために使用される。簡潔には、４．５×１０７のＨＡＴ感受性の第一の細胞を、２．８×１０７のＨＡＴ耐性の第二の細胞（これは、致死用量の不可逆的生化学的インヒビターであるヨードアセトアミド（リン酸緩衝化生理食塩水中に５ｍＭ）を用いて、融合前に氷上で３０分間前処理されている）と混合する。細胞融合を、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を使用して誘導し、そして細胞を９６ウェルのマイクロカルチャープレートにプレートする。クアドローマを、ＨＡＴ含有培地を使用して選択する。ＢｓＡｂ含有培養物を、例えば、固相アイソタイプ特異的ＥＬＩＳＡおよびアイソタイプ特異的免疫蛍光染色をを使用して同定する。
【０２３９】
同定実施形態において、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、免疫蛍光染色、イディオタイプ特異的抗体、抗原結合競合アッセイおよび抗体の特徴付けの分野で一般的な他の方法を、好ましいクアドローマを同定するために、本発明と組み合わせて使用し得る。
【０２４０】
クアドローマの単離後、ＢｓＡｂを他の細胞産物から精製する。これは、免疫グロブリン精製の分野で当業者に公知の種々のタンパク質単離手順によって達成され得る。抗体を調製および特徴付けするための手段は、当該分野で周知である（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、１９８８を参照のこと）。
【０２４１】
例えば、選択されたクアドローマ由来の上清を、（アイソタイプに依存して）ＩｇＧを結合するために、プロテインＡセファロースカラムまたはプロテインＧセファロースカラムを通過させる。次いで、結合した抗体を、例えば、ｐＨ３．０のクエン酸緩衝液で溶出する。ＢｓＡｂを含む溶出した画分を、等張な緩衝液で透析する。あるいは、この溶出液を、抗免疫グロブリン−セファロースカラムを通過させる。次いで、このＢｓＡｂを、３．５Ｍの塩化マグネシウムで溶出する。次いで、このようにして精製したＢｓＡｂを、例えば、上記のような、標的細胞のアイソタイプ特異的ＥＬＩＳＡおよび免疫蛍光染色アッセイによって、結合活性について試験する。
【０２４２】
精製したＢｓＡｂおよび親抗体はまた、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動、その後の銀またはクマシーブルーでの染色によって、特徴付けおよび単離され得る。これは、親抗体の１つが他方よりも高い分子量を有する場合に可能であり、ここで、ＢｓＡｂのバンドは、２つの親抗体の間の中ほどに移動する。サンプルの還元により、２つの異なる見かけの分子量を有する重鎖の存在を確認する。
【０２４３】
さらに、組換え技術は、現在、抗体の調製のために一般に利用可能であり、所望の二重特異性を有する抗体をコードする組換え抗体遺伝子の調製を可能にする。従って、最も好ましい結合特徴を有するモノクローナル抗体を選択した後、これらの抗体についてのそれぞれの遺伝子を、例えば、ファージ発現ライブラリーの免疫学的スクリーニングによって単離し得る（ＯｉおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ、１９８６；ＷｉｎｔｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、１９９１；Ｍａｒｋｓら、１９９１）。次いで、Ｆａｂコードドメインの再編成によって、適切なキメラ構築物を容易に獲得し得る。
【０２４４】
（Ｎ．組み合わせ治療）
本発明の融合タンパク質と他の治療剤との組み合わせが、変化する免疫、炎症または新生物を含む種々の疾患の臨床処置における使用に対して意図される。
【０２４５】
当然、広範囲での使用の前に、動物研究および臨床試験が実施される。臨床試験を実行する種々の要素（患者の処置およびモニタリングを含む）が、本開示を考慮して当業者に公知である。
【０２４６】
本発明は、融合タンパク質が他の治療と組合わせて使用され得ることを意図する。自己免疫疾患に対する治療としては、インターフェロン−β、インターフェロン−α、ｉ．ｖ．免疫グロブリン、モノクローナル抗体（例えば、ｈ５Ｇ１．１−ｍＡｂ）、ポリクローナル抗体（例えば、抗ＲｈｏＤ（ＷｉｎＲｈｏ  ＳＤＦ））、レチノイン酸および他の免疫調節剤（例えば、酢酸グラチラマーが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２４７】
炎症を含む疾患のための治療としては、非ステロイド炎症剤（ＮＳＡＩＤ）（例えば、シクロ−オキシゲナーゼ２（ＣＯＸ−２）インヒビター）が挙げられるが、これに限定されない。
【０２４８】
本発明は、融合タンパク質がワクチンと組合わせてアジュバントとして使用され得ることを意図する。ワクチンとしては、例えば、ｍＡｂ  １０５ＡＤ７抗イディオタイプワクチン、ｍＡｂ  １１Ｄ１０抗イディオタイプワクチン、ｍＡｂ  ３Ｈ１抗イディオタイプワクチン、ＧＭ２、ＧＭ２−ＫＬＨ、およびＭＵＣ−１抗原などが挙げられる。
【０２４９】
キャリア治療としては、免疫学的処置、化学的処置および放射線に基づく処置を含む、本発明の融合タンパク質と共に意図される種々の組み合わせ治療が挙げられる。組み合わせ免疫治療としては、例えば、インターロイキン−２、モノクローナル抗体および／または二重特異的抗体（例えば、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、ｍＡｂ  Ｌｙｍ−１、ｍＡｂ  ｍ１７０、ｍＡｂ  ＢＣ８、ｍＡｂ  抗Ｂ１（トシツモマブ（ｔｏｓｉｔｕｍｏｍａｂ））、Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈ、抗ＣＥＡ  ｍＡｂ  ＭＮ−１４、ｍＡｂ  ＨｕＧ１−Ｍ１９５、ｍＡｂ  ＨｕＭ２９１、ｍＡｂ  ３Ｆ８、ｍＡｂ  Ｃ２２５（セツキシマブ（ｃｅｔｕｘｉｍａｂ））、抗Ｔａｃ  ｍＡｂ（ダクリズマブ（ｄａｃｌｉｚｕｍａｂ））、およびｍＡｂ  ｈＬＬ２（エプラツズマブ（ｅｐｒａｔｕｚｕｍａｂ）））が挙げられる。
【０２５０】
組み合わせ免疫治療はまた、毒素または他の因子に連結されたモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を含む。例としては、ｍＡｂ  ゲムツズマブオゾガミシン（ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ  ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ）（ミロトラグ（ｍｙｌｏｔａｒｇ））、ｍＡｂ  Ｍｏｎｏ−ｄｇＡ−ＲＦＢ４、ｍＡｂ  イブリツモマブチウキセタン（ｉｂｒｉｔｕｍｏｍａｂ  ｔｉｕｘｅｔａｎ）（ＩＤＥＣ−Ｙ２Ｂ８）、および抗Ｔａｃ（Ｆｖ）−ＰＥ３８が挙げられる。組み合わせ化学療法としては、例えば、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、カンプトテシン、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ビスルファン、ニトロソウレア（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリコマイシン（ｐｌｉｃｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン、エトポシド（ＶＰ１６）、タモキシフェン、タキソール、トランスプラチナム（ｔｒａｎｓｐｌａｔｉｎｕｍ）、５−フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、およびメトトレキサートまたはこれらの任意のアナログもしくは誘導改変体が挙げられる。
【０２５１】
前癌性状態（例えば、良性前立腺過形成）に対して、第２の治療剤は、α−１アドレナリン作用性レセプターブロッカー（例えば、テラゾシン、ドキサゾシン、プラゾシン、ブナゾシン（ｂｕｎａｚｏｓｉｎ）、インドラミン、タムスロシン（ｔａｍｓｕｌｏｓｉｎ）、プラゾシン（ｐｒａｚｉｃｉｎ）もしくはアルフゾシン（ａｌｆｕｚｏｓｉｎ））；５−α−レダクターゼ酵素ブロッカー（例えば、フィナステリド（ｆｉｎａｓｔｅｒｉｄｅ）誘導体もしくはアザステロイド（ａｚａｓｔｅｒｏｉｄ）誘導体）；α−１アドレナリン作用性レセプターブロッカー、５−α−レダクターゼ酵素ブロッカー、カリウムチャネル開放因子（ｏｐｅｎｅｒ）（例えば、ミノキシジル）、およびレチノイン酸誘導体の組み合わせから選択される。
【０２５２】
種々の組み合わせが使用され得、例えば、ここで、本発明の融合タンパク質は「Ａ」であり、放射線治療剤、化学治療剤または他の治療剤は、「Ｂ」である。
【０２５３】
【表４】
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用語「接触された」および「曝露された」は、細胞に対して適用される場合、治療組成物および化学治療剤もしくは放射線治療剤が標的細胞に送達されるか、または治療組成物および化学治療剤もしくは放射線治療剤が標的細胞に直接並置して配置されるプロセスを記載するために本明細書中において使用される。細胞の殺傷または細胞の停止を達成するために、両方の薬剤は、細胞を殺傷するためかまたは細胞が分裂することを妨げるに有効な組合わせた量で、細胞に送達される。
【０２５４】
本発明の融合タンパク質を含む治療は、数分から数週間の範囲の間隔での他の薬剤の治療に先行するか、またはこのような治療の後であり得る。他の薬剤および融合タンパク質が細胞に別々に適用される実施形態において、一般的に、当業者は、各送達時間の間に失効しない有意な期間を確保し、その結果、この薬剤および融合タンパク質は、その細胞に対して有利に組み合わされた効果をなおも発揮する。このような場合、当業者が、両方の様相と互いに約１２〜２４時間以内（より好ましくは、互いに約６〜１２時間内、約１２時間だけ遅い時間が最も好ましい）に、細胞とを接触させることが意図される。しかし、いくつかの状況において、処置のための期間を有意に延ばすことが望ましくあり得、ここで、数日（２、３、４、５、６または７日）から数週間（１、２、３、４、５、６、７、または８）週間が、それぞれの投与間で経過する。
【０２５５】
（Ｏ．薬学的組成物）
本発明の薬学的組成物は、薬学的に受容可能なキャリア中に溶解または分散された、有効量の１つ以上の融合タンパク質、治療剤またはさらなる薬剤を含む。本発明の水性組成物は、薬学的に受容可能なキャリアまたは水性媒体中に溶解または分散された、有効量の融合タンパク質を含む。句「薬学的に受容可能なまたは薬理学的に受容可能な」とは、動物（または、適切な場合、ヒト）に投与された場合に、有害な反応、アレルギー反応または他の不都合な反応を生成しない、分子実体および組成物をいう。
【０２５６】
本明細書中に使用される場合、「薬学的に受容可能なキャリア」としては、当業者に公知であるように、任意および全ての、溶媒、分散媒体、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、保存剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、保存剤、薬物、薬物安定化材、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、矯味矯臭剤、色素、このような材料およびこれらの組み合わせが挙げられる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄ．Ｍａｃｋ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０，  ｐｐ．１２８９−１３２９（これは、本明細書中に参考として援用される））。薬学的に活性な物質に対するこのような媒体および薬剤の使用は、当該分野で周知である。任意の従来の媒体または薬剤がその活性な成分と不適合である範囲以外は、治療組成物におけるその使用が意図される。補充の活性成分もまた、この組成物中に組込まれ得る。ヒト投与について、調製物は、ＦＤＡ局のＢｉｏｌｏｇｉｃ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓによって要求されるような、無菌性、発熱性、一般的な安全性および純度の基準を満たさなければならない。
【０２５７】
生物学的材料は、所望されない低分子量分子を除去するために徹底的に透析されるべきであるか、および／または所望のビヒクル（適切である場合）へのより容易な処方のために凍結乾燥される。次いで、この活性な化合物は、一般的に、非経口投与のために（例えば、静脈経路、筋内経路、皮下経路、鼻腔内経路、病変内経路、またはさらには腹腔内経路を介した注射のために）処方される。代表的に、そのような組成物は、注射可能なように（液体溶液または懸濁液のいずれかとして）として調製され得；注射前に液体を添加して溶液または懸濁液を調製するために使用するのに適した固体形態もまた、調製され得；そしてこれらの調製物はまた、乳濁化され得る。
【０２５８】
注射可能な用途に適した薬学的形態としては、滅菌水溶液または滅菌分散液；ゴマ油、ピーナッツオイル、または水性プロピレングリコールを含む処方物；および滅菌した注射可能な溶液または分散液の即時調製のための滅菌散剤が挙げられる。全ての場合において、その形態は、滅菌である必要があり、そして容易なシリンジ操作が存在する程度まで流体である必要がある。これはまた、製造および保存の条件下で安定である必要があり、そして微生物（例えば、細菌および真菌）の汚染作用に対して保存される必要がある。
【０２５９】
塩基も薬理学的に受容可能な塩も含まない活性化合物の溶液は、界面活性剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース）と適切に混合された水の中で調製され得る。分散液もまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびこれらの混合物の中、ならびにオイル中で調製され得る。保存および使用の通常の条件下において、これらの調製物は、微生物の増殖を妨害するための保存剤を含む。
【０２６０】
本発明の融合タンパク質は、塩基を含まない、中性形態または塩形態で組成物中に処方され得る。薬学的に受容可能な塩としては、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基と共に形成され、そして無機酸（例えば、塩酸またはリン酸）と共に形成されるか、有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸など）と形成される塩）が挙げられる。遊離のカルボキシル基と共に形成される塩もまた、無機塩基（例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化鉄）および有機塩基（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなど）から誘導され得る。
【０２６１】
キャリアもまた、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、これらの適切な混合物、ならびに植物油を含む、溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、コーティング（例えば、レシチン）の使用によって、分散液の場合は必要とされる粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持され得る。微生物の作用の妨害は、種々の抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなど）によってもたらされ得る。多くの場合、等張剤（例えば、糖または塩化ナトリウム）を含むことが好ましい。注射可能な組成物の延長した吸収は、吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）の組成物中での使用によってもたらされ得る。
【０２６２】
滅菌した注射可能な溶液は、必要とされる量の活性化合物を適切な溶媒中に、上記に列挙した種々の他の成分と共に（必要とされる場合）組込むこと、続いて、濾過滅菌することによって、調製され得る。一般的に、分散液は、種々の滅菌された活性成分を、塩基性分散媒体および上記に列挙した成分からの必要とされる他の成分を含む滅菌ビヒクル中に組込むことによって、調製される。滅菌した注射可能な溶液の調製のための滅菌散剤の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥技術および凍結乾燥技術であって、これらの技術は、活性な成分の散剤およびそれらの以前に滅菌濾過した溶液由来の任意のさらなる所望の成分を生じる。直接注射のためのより濃縮された溶液（すなわち、高度に濃縮された溶液）の調製もまた、意図され、ここで、極めて迅速な浸透を引き起こす溶媒としてＤＭＳＯの使用が、想定され、非常に高い濃度の活性薬剤を小さな領域に送達する。
【０２６３】
処方の際、溶液は、投薬処方物と適合した様式かつ治療的に有効であるような量で投与される。処方物は、種々の投薬形態で容易に投与される（例えば、上記の注射可能な溶液の型）が、薬物放出カプセルなどもまた、使用され得る。
【０２６４】
水性溶液での非経口投与について、例えば、その溶液は、必要である場合、適切に緩衝化されるべきであり、そして液体希釈剤は、最初に、十分な生理食塩水またはグルコースを用いて等張にされる。これらの特定の水性溶液は、静脈内投与、筋内投与、皮下投与、鼻腔内投与、および腹腔内投与に対して特に適切である。これに関して、使用され得る滅菌水性媒体は、本開示を考慮して当業者に公知である。例えば、１投薬量は、１ｍｌの等張性ＮａＣｌ溶液中に溶解され得、そして１０００ｍｌの皮下注射流体に添加されるか、または指定された注入部位に注射されるかのいずれかである（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、第１５版、頁１０３５−１０３８および頁１５７０−１５８０を参照のこと）。投薬量におけるいくらかのバリエーションが、処置される被験体の条件に依存して必然的に生じる。投与の責任者である人が、いかなる場合においても、個々の被験体に対する適切な用量を決定する。
【０２６５】
非経口投与（例えば、静脈内注射または筋内注射）のために処方された化合物に加えて、他の薬学的に受容可能な形態としては、例えば、錠剤または経口投与のための他の固体；リポソーム処方物；時間放出性カプセル；ならびに現在使用される任意の他の形態（クリームを含む）が挙げられる。
【０２６６】
特定の実施形態において、融合タンパク質および／またはそのアナログの処方および投与のために、リポソームおよび／またはナノ粒子の使用が意図される。リポソームの処方および使用は、一般的に、当業者に公知であり、そしてまた、以下に記載される。
【０２６７】
ナノカプセルはまた、一般的に、安定かつ再現可能な様式で化合物を捕捉し得る。細胞内でのポリマーの過剰な充填に起因する副作用を回避するために、このような超微細粒子（約０．１μｍのサイズ）は、インビボで分解され得るポリマーを使用して設計されるべきである。これらの要求を満たす生分解性ポリアルキル−シアノアクリレートナノ粒子が、本発明における使用に対して意図され、そしてそのような粒子は、容易に作製される。
【０２６８】
リポソームは、水性媒体中に分散され、そして自発的に多層同心性二分子層小胞（多層小胞（ＭＬＶ）とも呼ばれる）を形成するリン脂質から形成される。ＭＬＶは、一般的に２５ｎｍ〜４μｍの直径を有する。ＭＬＶの超音波処理は、２００〜５００Åの範囲の直径を有し、そのコアに水溶液を含む、小さい単層小胞（ＳＵＶ）の形成をもたらす。
【０２６９】
以下の情報はまた、リポソーム処方物を生成する際に利用され得る。リン脂質は、水に分散された場合、脂質  対  水のモル比に依存して、リポソーム以外の種々の構造を形成し得る。低い比において、リポソームが好ましい構造である。リポソームの物理特徴は、ｐＨ、イオン強度、および二価カチオンの存在に依存する。リポソームは、イオン性物質および極性物質に対して低い浸透性を示し得るが、高温において、その浸透性を著しく変化させる相転移を受ける。この相転移は、緊密に詰まった順序だった構造（ゲル状態として公知）から緩く詰められたあまり順序だっていない構造（流体状態として公知）への変化を含む。これは、特徴的な相転移温度で生じ、そしてイオン、糖、および薬物の浸透性の増加を引き起こす。
【０２７０】
リポソームは、４つの異なる機構を介して細胞と相互作用する：マクロファージおよび好中球などの細網内皮系の食細胞によるエンドサイトーシス；非特異的な弱い疎水性力もしくは静電力によってか、または細胞表面成分との特異的な相互作用のいずれかによる、細胞表面への吸着；細胞質へのリポソーム内容物の同時の放出を伴なう、原形質膜へのリポソームの脂質二重層の挿入による形質細胞膜との融合；ならびに、リポソーム内容物のいかなる会合も伴なわない、細胞膜または亜細胞膜へのリポソーム脂質の移入（または、逆もあり得る）。リポソーム処方物を変化させることは、どの機構が作用するかを変化させ得るが、１つより多くの機構が同時に作用し得る。
【０２７１】
治療剤は、固体形態、液体形態、またはエアロゾル形態で投与されるか否か、そして注射のような投与経路に対して滅菌である必要かあるか否かに依存して、異なる型のキャリアを含み得る。本発明は、静脈内投与、皮内投与、動脈内投与、腹腔内投与、病変内投与、頭蓋内投与、関節内投与、前立腺内投与、胸膜腔内投与、気管内投与、鼻腔内投与、硝子体内（ｉｎｔｒａｖｉｔｒｅａｌｌｙ）投与、膣内投与、直腸内投与、局所投与、腫瘍内投与、筋内投与、腹腔内投与、皮下投与、結膜下投与、小胞内投与、粘膜投与、心膜内投与、臍内投与、眼内投与、経口投与、局所投与、局部投与、吸入によって（例えば、エアロゾル吸入）、注射によって、注入によって、連続注入によって、標的細胞を直接浸す局在化された散水、カテーテルを介して、洗浄を介して、クリーム中、脂質組成物（例えば、リポソーム）中、あるいは、当業者に公知であるような他の方法または上記の任意の組み合わせによって、投与され得る（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版、Ｍａｃｋ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０（これは、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。
【０２７２】
動物患者に投与される本発明の組成物の実際の投薬量は、物理的因子および生理学的因子（例えば、体重、状態の重篤度、処置される疾患の型、以前または同時の治療介入、患者の特発症、および投与経路）によって決定され得る。投与の責任者である実施者が、いかなる場合においても、個々の被験体に対する組成物中の活性成分の濃度および適切な用量を決定する。
【０２７３】
特定の実施形態において、薬学的組成物は、例えば、少なくとも約０．１％の活性化合物を含み得る。他の実施形態において、活性化合物は、その単位の重量のうちの、約２％〜約７５％の間を含み得るか、または、例えば、約２５％〜約６０％の間、およびこれらの中の誘導可能な任意の範囲を含み得る。他の非限定的な例において、用量はまた、１投与当たり、１μｇ／ｋｇ／体重、約５μｇ／ｋｇ／体重、約１０μｇ／ｋｇ／体重、約５０μｇ／ｋｇ／体重、約１００μｇ／ｋｇ／体重、約２００μｇ／ｋｇ／体重、約３５０μｇ／ｋｇ／体重、約５００μｇ／ｋｇ／体重、約１ｍｇ／ｋｇ／体重、約５ｍｇ／ｋｇ／体重、約１０ｍｇ／ｋｇ／体重、約５０ｍｇ／ｋｇ／体重、約１００ｍｇ／ｋｇ／体重、約２００ｍｇ／ｋｇ／体重、約３５０ｍｇ／ｋｇ／体重、約５００ｍｇ／ｋｇ／体重、〜約１０００ｍｇ／ｋｇ／体重またはそれより多く、ならびにこれらの中の誘導可能な任意の範囲を含み得る。本明細書中に列挙される数字から誘導可能な範囲の非限定的な例において、上記の数に基づいて、約５ｍｇ／ｋｇ／体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ／体重、約５μｇ／ｋｇ／体重〜約５００ｍｇ／ｋｇ／体重の範囲などが、投与され得る。
【０２７４】
任意の場合において、組成物は、１つ以上の成分の酸化を遅らせるための種々の抗酸化剤を含み得る。
【０２７５】
組成物が液体形態である実施形態において、キャリアは、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、脂質（例えば、トリグリセリド、植物油、リポソーム）ならびにこれらの組み合わせを含む（これらに限定されない）、溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、コーティング（例えば、レシチン）の使用によって；キャリア（例えば、液体ポリオールまたは脂質）における分散による必要とされる粒子サイズの維持によって；界面活性剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース）の使用によって；またはこれらの組み合わせによって、維持され得る。多くの場合、等張剤（例えば、糖、塩化ナトリウムまたはこれらの組み合わせ）を含むことが好ましい。
【０２７６】
他の実施形態において、本発明において、点眼剤、鼻腔溶液またはスプレー、エアロゾルまたは吸入薬が、使用され得る。そのような組成物は、一般的に、標的組織の型と適合性であるように設計される。非限定的な例において、鼻腔溶液は、通常、液滴またはスプレーで鼻腔通路に投与されるように設計される水溶液である。鼻腔溶液は、多くの点で鼻腔分泌物に類似するように調製され、その結果、通常の繊毛状作用が維持される。従って、好ましい実施形態において、鼻腔水溶液は、通常、等張であるかまたはわずかに緩衝化されて、約５．５〜約６．５のｐＨを維持する。さらに、眼用の調製物において使用されるものに類似した抗細菌保存剤、薬物、または適切な薬物安定化剤が、必要とされる場合、その処方物中に含まれ得る。例えば、種々の市販の鼻腔調製物が公知であり、そして抗生物質または抗ヒスタミン剤のような薬物を含む。
【０２７７】
特定の実施形態において、融合タンパク質は、経口摂取のような経路によって投与するために調製される。これらの実施形態において、固体組成物は、例えば、溶液、懸濁液、乳濁液、錠剤、丸剤、カプセル（例えば、硬性の殻のゼラチンカプセルまたは軟性の殻のゼラチンカプセル）、徐放性処方物、バッカル錠、トローチ、エリキシル、懸濁液、シロップ、カシェ剤、またはこれらの組み合わせを含み得る。経口組成物は、食事中の食物によって直接組込まれ得る。経口投与のための好ましいキャリアは、不活性な希釈剤、同化可能な可食キャリアまたはこれらの組み合わせを含む。本発明の他の局面において、経口組成物は、シロップまたはエリキシルとして調製され得る。シロップまたはエリキシルは、例えば、少なくとも１つの活性薬剤、甘味剤、保存剤、矯味矯臭剤、色素、保存剤、またはこれらの組み合わせを含み得る。
【０２７８】
特定の好ましい実施形態において、経口組成物は、結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、およびこれらの組み合わせの１つ以上を含み得る。特定の実施形態において、組成物は、以下のうちの１つ以上を含み得る：結合剤（例えば、トラガカントゴム、アカシア、コーンスターチ、ゼラチンまたはこれらの組み合わせ）；賦形剤（例えば、リン酸二カルシウム、マンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム、またはこれらの組み合わせ）；崩壊剤（例えば、コーンスターチ、ポテトスターチ、アルギン酸、またはこれらの組み合わせ）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム）；甘味剤（例えば、スクロース、ラクトース、サッカリンまたはこれらの組み合わせ）；矯味矯臭剤（例えば、ペパーミント、ヒメコウジのオイル、サクランボのフレーバー、オレンジのフレーバーなど）；または上記の組み合わせ。投薬量単位形態がカプセルである場合、それは、上記の型の材料に加えて、液体キャリアのようなキャリアを含み得る。種々の他の材料が、コーティングとして存在し得るか、またはそうでなければその投薬量単位の物理的形態を改変するために存在し得る。例えば、錠剤、丸剤、またはカプセルが、セラック、糖、またはこれら両方によってコーティングされ得る。
【０２７９】
投与の他の形態に適切なさらなる処方物としては、坐薬が挙げられる。坐薬は、種々の重量および形状の、通常は薬物の混入した、直腸、膣または尿道の中への挿入のための、固体の投薬形態である。挿入後、坐薬は腔の液体中で軟化、融解または溶解する。一般的に、坐薬について、従来の担体としては、例えば、ポリアルキレングリコール、トリグリセリドまたはそれらの組み合わせが挙げられ得る。特定の実施形態において、坐薬は、例えば、約０．５％〜約１０％の範囲の活性成分を含む混合物から作製され得、好ましくは約１％から約２％である。
【０２８０】
この組成物は、製造および貯蔵の条件の下で安定であり、そして細菌および真菌のような微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。エンドトキシン汚染は、安全レベルで最小限に（例えば、１ｍｇのタンパク質当たり、エンドトキシン０．５ｎｇ未満）保たれるべきである。
【０２８１】
特定の実施形態において、注射可能な組成物の遅延された吸収は、組成物中における、吸収を遅滞させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウム、ゼラチンまたはそれらの組み合わせ）の使用によりもたらされ得る。
【０２８２】
（Ｐ．キット）
本明細書中に記載される全ての組成物は、キット中に含まれ得る。非限定的な例として、免疫グロブリン融合タンパク質、免疫グロブリン融合タンパク質をコードする核酸、および／またはさらなる薬剤が、キット中に含まれ得る。従ってこのキットは、適切な容器手段中に、本発明の融合タンパク質、融合タンパク質をコードする核酸、および／またはさらなる薬剤を含み得る。本発明者らは、キット中に含まれ得る別の成分を想定する。これら成分としては、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体と連結されたペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼのような免疫検出剤、プロテインＡまたはプロテインＧが連結されたビーズのような免疫沈降試薬、磁気ビーズのような免疫細胞精製試薬、発現ベクターを取り扱うことを目的とするクローニング試薬、タンパク質発現の目的のための原核細胞株および真核細胞株を含む、タンパク質発現試薬、が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２８３】
キットは、適切にアリコートされた融合タンパク質および／または本発明のさらなる薬剤組成物を含み得、標識されるにせよされないにせよ、検出アッセイについての標準曲線を作成するために使用され得る。キットの成分は、水性溶媒中または凍結乾燥された形態でのいずれかで包装され得る。キットの容器手段は、一般的に、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジまたは他の容器手段を含み、この容器の中に成分が置かれ得、そして好ましくは、適切にアリコートされ得る。キット中に１つより多くの成分が存在する場合、このキットはまた第２の、第３の、または他のさらなる容器を含み、これらの中に、さらなる成分が別々に収納され得る。しかし、成分の種々の組み合わせは、バイアル中に含まれ得る。本発明のキットはまた、商用販売のための密閉制限の中で、融合タンパク質、脂質、さらなる薬剤、および他の全ての試薬容器を含む手段を、代表的に含む。このような容器としては、注射用容器または中空成形プラスチック容器が挙げられ得、これらの中に所望のバイアルが保持される。
【０２８４】
本発明の治療的キットは、免疫グロブリン融合タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、インヒビター、遺伝子、ベクターおよび／または他のエフェクターを含む。このようなキットは、一般的に、適切な容器手段中で、薬学的に受容可能な処方物において、免疫グロブリン融合タンパク質の薬学的に受容可能な処方物を含み得る。このキットは単一の容器手段を有し得、そして／またはこのキットは各化合物に対して異なる容器手段を有し得る。
【０２８５】
キットの成分が１種および／またはそれ以上の液体溶液中に提供される場合、この液体は水性溶液であり、滅菌済みの水性溶液であることが特に好ましい。免疫グロブリン融合タンパク質組成物はまた、注射器で注入可能な組成物に処方され得、この場合、その容器手段は、それ自体がシリンジ、ピペット、および／または他のそのような器具であり得、これらの容器から処方物が体の注入される領域に適用され得、動物に注入され得、そして／またはそのキットの他の成分に対してさらに適用され得、そして／または他の成分と混合され得る。
【０２８６】
しかし、キットの成分は、乾燥粉末として提供され得る。試薬および／または成分が乾燥粉末として提供される場合、この粉末は、適切な溶媒の添加により再構築され得る。その溶媒がまた別の容器手段において提供され得ることが、想定される。
【０２８７】
容器手段としては、一般的に、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジおよび／または他の容器手段が挙げられ、これらの中に免疫グロブリン融合タンパク質処方物が配置され、好ましくは、適切に配分される。キットはまた、滅菌済みの薬学的に受容可能な緩衝液および／または他の希釈液を含むための、第２の容器手段を含み得る。
【０２８８】
本発明のキットはまた、商用販売のための密閉制限の中で、バイアルを含むための手段（例えば、所望のバイアルが保持される、注射容器および／または中空成形プラスチック容器）を、代表的に含む。
【０２８９】
容器の数および／または型に関係無く、本発明のキットはまた、動物の体内に究極的な免疫グロブリン融合タンパク質の注入／投薬および／または設置を補助するための器具を含み得、そして／またはその器具で包装され得る。このような器具は、シリンジ、ピペット、ピンセット、および／または任意のそのような医学的に承認された送達ビヒクルであり得る。
【０２９０】
本明細書中で使用される場合、「ａ」または「ａｎ」は、１以上を意味し得る。本明細書中の特許請求の範囲において使用される場合、語「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と組み合わせて使用される場合、語「ａ」または「ａｎ」は、１または１より大きいことを意味し得る。本明細書中で使用される場合、「別の（ａｎｏｔｈｅｒ）」は、少なくとも２番目またはそれ以降を意味する。
【０２９１】
ＡＩＧは凝集ＩｇＧであり、ＩＣは免疫複合体であり；ＨＣＨ２ユニットは、免疫グロブリンのヒンジドメインおよびＣＨ２ドメインを含み；ＦｃγＲはＦｃγレセプターであり；ＳＬＥは全身性エリテマトーデスであり；ＭＳは多発性硬化症であり；ＣＤＣＣは補体依存性細胞毒性であり；ＡＤＣＣは抗体依存性の細胞媒介性の細胞毒性であり；ＣＤＣは補体依存性の細胞毒性であり；ＥＡＥは実験的な自己免疫性脳脊髄炎であり；ＮＫ細胞はナチュラルキラー細胞であり；そしてＰＢＭＣは末梢血単球細胞である。
【実施例】
【０２９２】
（Ｑ．実施例）
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために挙げられる。以下の本実施例において開示される技術が、本発明の実施において十分に機能することが本発明者らによって発見された技術を表し、従って、これら技術が本発明の実践のために好ましいモデルを構築することを考慮され得ることが、当業者によって理解されるべきである。しかし、当業者は、本開示を参考して、多くの変更が、開示される特定の実施例において成され得、そしてこれらの変更が、依然として本発明の精神および範囲から逸脱すること無く、同様の結果または類似の結果を達成することを理解するべきである。
【０２９３】
（実施例１−フレームワークベクター）
Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３から構成される、ヒトＩｇＧ１のフレームワーク領域を、細胞株ＡＲＨ−７７由来の総ＲＮＡから単離し、そしてＲＴ−ＰＣＲ、ヒンジ領域の直ぐ５’にＨｉｎｄＩＩＩ部位を導入したプライマーＦＲＭ−５ｐ−Ｈ３、終止コドンの直ぐ３’側にＳａｌＩ部位を導入した２番目のプライマーＦＲＭ−３ｐ−Ｓａｌを使用して、サブクローニングした（表５）。クローンｐＦＲＭ−ＨＳを、ＤＮＡ配列決定により特徴付けを行い、そしてさらなる構築物の組立のために使用した。この工程およびＩｇＧ１のクローニングに関連する後の工程のためのプライマーを、手引きとしてヒトＩｇＧ１定常領域の遺伝子（登録番号  Ｚ１７３７０）由来の配列データを使用して、設計した。
【０２９４】
（表５）
ＰＣＲ増幅のために使用されるプライマーの配列
【０２９５】
【表５】
0004524074.tif 000009
小文字は、クランプまたはスペーサーとして使用された塩基を示す。太字は、制限酵素部位の位置を示す。
【０２９６】
（実施例２−ヒンジの変異誘発およびＣＨ２のサブクローニング）
ＦｃのＦｃγＲ結合領域（ヒンジドメインおよびＨＣＨ２ドメイン（ＨＣＨ２）からなる）を、分離した単量体ユニットとして単離した。ＨＣＨ２単量体ユニット内のヒンジ領域を、ＰＣＲ変異誘発を使用して改変して、Ｆｃユニット間の鎖間（ｉｎｔｅｒ−ｃｈａｉｎ）ジスルフィド架橋を生成する３つのシステインをセリンに変更した。このＦｃγＲ結合ドメインを、５’プライマーＨｉｎｇｅ１（表５）（これは、３つのヒンジのシステインコドン中に単一ヌクレオチド変更を導入し、その結果これらの変更がセリン残基への変更をもたらす）を使用して、増幅した。この５’プライマーはまた、ヒンジ領域の直ぐ５’側にＥｃｏＲＩ部位を導入した。３’プライマーＣＨ２ＮＨ３（表５）は、ＣＨ２ドメインの増幅を導き、そしてＨｉｎｄＩＩＩ部位から６ヌクレオチドのスペーサーにより分けられた、３’ＮｒｕＩ部位をインフレーム（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）に導入した。このＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化して、そしてベクターｐＢＳＫＳ＋の中にクローニングした。この構築物（５’ＥｃｏＲＩ−ＨＣＨ２−ＮｒｕＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ  ３’からなる）を、制限酵素部位の配列を示すために「ＥＮＨ」と名付けて、そしてポリマー構築物のための出発ユニットとして提供した。クローンｐＥＮＨ１８を、ＤＮＡ配列決定法により特徴付けて、そしてその後のクローニング工程において使用した。
【０２９７】
２つのさらなる構築物、ｐＳＮＨと名付けられた伸長ユニット、およびｐＳＨ３と名付けられたキャッピングユニットを、生成した。これらは、側方の制限酵素部位においてのみｐＥＮＨ１８から変動した。ｐＳＮＨは、５’ＳｍａＩ−ＨＣＨ２−ＮｒｕＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ  ３’を有して、そしてテンプレートとしてのｐＥＮＨ１８、および側面の制限酵素部位を導入したプライマー（表５）を使用して増幅された。２番目の構築物ｐＳＨ３は、５’ＳｍａＩ−ＨＣＨ２−ＨｉｎｄＩＩＩ  ３’を含み、そして５’プライマーＳＭＡ−ＤＥＬＨおよび３’プライマーＣＨ２Ｈ３（表５）（これは、ＣＨ２ドメインの３’末端に隣接する１つのＨｉｎｄＩＩＩ部位を導入する）を使用して、ｐＥＮＨ１８テンプレートから増幅された。このｐＳＮＨプラスミドおよびｐＳＨ３プラスミドの両方をＳｍａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。そのインサートをゲル精製して、そして後の使用のために保存した。
【０２９８】
（実施例３−ポリマーの構築）
ＨＣＨ２ユニットからなるポリマーを、図１に提示されるスキームを使用して組み立てた。ＨＣＨ２ポリマーを、１つの出発ユニット（ＥＮＨ）、複数の伸長ユニット（ＳＮＨ）の連続的な添加により構築して、そして１つのキャッピングユニット（ＳＨ３）を添加することにより終結させた。クローンｐＥＮＨ１８をＮｒｕＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化して、その結果５’平滑末端および３’突出末端を生じた。次いで、ＳＮＨインサートを上記のように消化し、そして直線化したベクターの中にライゲーションして、ｐＥＮＨ１８出発ユニットの３’末端に、ＨＣＨ２繰り返しユニットのインフレームなインサートを生じた。このインサートはまた、次回の伸長において使用される、元の配列の制限酵素部位（ＮｒｕＩ−スペーサー−ＨｉｎｄＩＩＩ）を再生した。この伸長過程は、ＮｒｕＩおよびＨｉｎｄＩＩＩの消化、その後、上記のように次のＳＮＨインサートとのライゲーションの工程を用いて、継続した。この、消化および挿入のサイクルを、直鎖のポリマーを生成するために必要とされるまで繰り返した。ポリマー構築の最終ラウンドにおいて、「キャッピング」ユニット（ＳＨ３インサート）を、ＳＮＨインサートの代りにポリマーの中にライゲーションした。このことは、内部のクローニング部位の消失を生じた。この結果は、フレームワークの発現ベクター中にＨＣＨ２ユニットの段階的な挿入であった。ＨＣＨ２挿入の方向性を、互換性のない側方の制限酵素部位の使用により維持した。ＨＣＨ２ユニット間の連結は、５’ＮｒｕＩの半分の部位の、３’ＳｍａＩの半分の部位との融合から構成され、その結果、タンパク質ドメインの間にインフレームなＧｌｙ−Ｓｅｒスペーサーを生じた。完了したポリマー構築物を、ＥｃｏＲＩ部位およびＨｉｎｄＩＩＩ部位でｐＢＳＫＳ＋クローニングベクターから遊離させて、そして同様に消化したｐＦＲＭ−ＨＳの中へとクローニングし、その結果、ＨＣＨ２ポリマーのＩｇＧ１フレームワーク領域へのインフレームな連結を生じた。
【０２９９】
（実施例４−ヒトＣＤ８αの細胞外ドメインのクローニング）
ヒトＣＤ８αの分泌シグナルおよび細胞外ドメインの最初の１１９残基を、ＰＦＵポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＣＤ８α  ｃＤＮＡ、および隣接の５’ＸｈｏＩ部位および３’ＥｃｏＲＩ部位を導入するプライマー（表５）を使用して、増幅した。プライマーは、手引きとしてヒトＣＤ８α  ｃＤＮＡ（登録番号  Ｍ１２８２４）由来の配列データを使用して設計した。ＰＣＲ生成物を、ＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩで消化して、そして同様に消化されたｐＢｌｕｅＢａｃ４．５バキュロウイルス輸送ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の中へとクローニングした。生じた構築物ｐＣＤ８Ｂａｃを、後のクローニング工程のためのホストとして使用した。
【０３００】
ポリマー−フレームワーク構築物を、ｐＢＳＫＳ＋クローニングベクターから、ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで消化することにより遊離させて、そして同様に消化したｐＣＤ８Ｂａｃの中へのライゲーションにより、ＣＤ８α配列と結合させた。このＣＤ８−ＨＣＨ２ポリマー構築物を、ＢａｍＨＩ部位およびＳａｌＩ部位でｐＣＤ８Ｂａｃから遊離させて、ゲル精製して、そしてｐＩＥ１−４昆虫細胞発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）中の同じ部位においてライゲーションした。このｐＩＥ１−４ベクターを予め改変して、インサートに隣接する制限酵素部位に適合させておく。生じた発現構築物は、中央にＨＣＨ２ポリマーユニットと融合された５’末端に、ＣＤ８α分泌シグナルおよび細胞外ドメイン、ならびに３’末端にフレームワークドメインを有する（図２）。
【０３０１】
（実施例５−安定に発現するポリクローナルな細胞株の構築）
トランスフェクション用に定められたプラスミドＤＮＡを、ＱｉａｇｅｎプラスミドＤＮＡ単離カラム（Ｑｉａｇｅｎ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｃｏｌｕｍｎｓ）（Ｑｕｉａｇｅｎ）を使用して精製した。ペレット化したＤＮＡを７０％エタノールで繰り返し洗浄して、風乾させて、そして滅菌ＴＥ緩衝液に再懸濁した。Ｓｆ９昆虫細胞（ＡＴＣＣ）を、１００ｕ／ｍＬのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を含むＥｘＣｅｌｌ４２０培地（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で増殖させた。トランスフェクションの１日前に、１０％のＳｆ９調整済み培地で補充したＥｘＣｅｌｌ４２０培地中で、２×１０６細胞を６０ｍｍ培養ディッシュ上にプレートした。
【０３０２】
Ｓｆ９細胞を、１回洗浄して、そして培地を、抗生物質を含まない２ｍＬのＥｘＣｅｌｌ４２０で交換した。トランスフェクションは、カチオン性脂質Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ（Ｇｉｂｃｏ）により媒介された。５μｇの発現構築物を、１μｇのｐＩＥ−Ｎｅｏまたはネガティブコントロールとして６μｇのｐＢＳＫＳを一緒にして、２９０μＬの抗生物質を含まないＥｘＣｅｌｌ４２０に添加した。別のチューブの中で２８０μＬの抗生物質を含まない培地を２０μＬのＣｅｌｌｆｅｃｔｉｎ試薬と混合した。これらのチューブの内容物を混ぜ合せて、そしてＤＮＡ−脂質複合体は３０分間にわたって形成し得、その時間の後、その複合体を各６０ｍｍ培養ディッシュに滴下して添加した。細胞を８時間培養して、その後、２ｍＬの培地を添加した。ＤＮＡ−脂質複合体とのインキュベーションを一晩続けた。トランスフェクション後のその日に、培地を除去して、そして１０％のＳｆ９調整済み培地で補充された、抗生物質を含む培地で交換した。トランスフェクション後２日目に、細胞を、１０％の調整済みＳｆ９培地、４００μｇ／ｍＬのジェネティシン（Ｇ４１８）（Ｇｉｂｃｏ）、および抗生物質で補充したＥｘＣｅｌｌ４２０からなる選択培地を有するＴ２５フラスコの中に分離した。フラスコを、細胞死についてモニターした；ｐＢＳＫＳコントロール細胞は、１０日以内に死亡した。ｐＩＥ−Ｎｅｏを含むトランスフェクタントは、活発な増殖を示した。この培養物をＴ７５フラスコ中に拡大させて、タンパク質発現のシードストックとして使用した。
【０３０３】
（実施例６−タンパク質発現および精製）
より多量のタンパク質を発現させるために、２５０ｍＬ培養物を、スピナーフラスコおよび／またはシェーカーフラスコにおいて開始した。培養物を、１００μｇ／ｍＬのＧ４１８、０．１％のプルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）Ｆ−６８および抗生物質を補充したＥｘＣｅｌｌ４２０中で増殖させた。培養物上清を遠心分離して、細胞残渣を除去した。ＰＭＳＦ（Ｓｉｇｍａ）およびＰｅｐｓｔａｔｉｎＡ（Ｓｉｇｍａ）をそれぞれ最終濃度１ｍＭおよび１μＭまで添加した。
【０３０４】
調整済み培地を、０．４５μｍフィルターを介した通過により清澄にして、１ｍＬ／分の速度で１ｍＬのプロテインＧ−セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムに適用した。カラムを１００ｍＬのＰＢＳ、ｐＨ７．０で洗浄して、そしてタンパク質を３ｍＬの溶出緩衝液（２０ｍＭのグリシン、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ３．０）で溶出させた。１００μＬの１Ｍトリス、ｐＨ９．０を添加することにより、溶離液を直ちに中性ｐＨに移した。組換えタンパク質をＲＰＭＩ培地中で平衡化して、そしてＭＷ  ｃｕｔｏｆｆ  ｏｆ  ３０ｋＤ（Ａｍｉｃｏｎ／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いる遠心濃縮を使用して、濃縮した。タンパク質濃度を、標準品としてヒトＩｇＧを用いるＢｒａｄｆｏｒｄ法（Ｂｉｏｒａｄ）を使用して、決定した。
【０３０５】
（実施例７−アミノ末端のヒトＣＤ８αドメインと融合されたＨＣＨ２ポリマーの発現）
ベクターの有用性を実証するために、ヒトＣＤ８αの細胞外ドメインを、ＨＣＨ２ポリマー融合タンパク質として発現した。ヒトＣＤ８αの分泌シグナルおよび最初の１１９残基をＨＣＨ２ポリマーのアミノ末端の中にクローニングした。この発現構築物をｐＩＥ１−４ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）中にインサートした。このベクターは、Ｓｆ９細胞中で構築的に活性なバキュロウイルスｉｅ１遺伝子プロモーター（Ｊａｒｖｉｓら、１９９６）の制御の下に融合構築物を置く。トランスフェクトされた昆虫細胞の使用は、ウイルスに感染した細胞において達成されるよりも、より効率的なプロセッシングおよび分泌に起因して、グリコシル化された分泌タンパク質の改善された発現を生じ得る（ＭｃＣａｒｒｏｌｌら、１９９７；Ｐｆｅｉｆｅｒら、１９９８）。
【０３０６】
４つの構築物を発現分析のために選択して、ＣＤ８Ｒ０〜ＣＤ８Ｒ４と名付けた。これらは、フレームワーク内にＨＣＨ２ユニットに加えて、０個と４個との間のＨＣＨ２ユニットをポリマー中に含む（表６および図２）。フレームワークドメインの共有結合性の二量体化の結果、成熟したタンパク質は、ＣＤ８Ｒ０〜ＣＤ８Ｒ４のタンパク質中に、それぞれ、２個と１０個との間のＨＣＨ２ユニットを含む（表６）。この融合タンパク質は、トランスフェクションおよびＧ４１８を用いた選択の後にＳｆ９細胞中に樹立されたポリクローナルな細胞株から、有用な量で分泌された。組換えタンパク質を、プロテインＧ−セファロースカラムに通過させることにより、調整された培養物の培地から１回の工程で単離した。発現されたポリマーは、安定で、分泌性で、可溶性でそして有用なレベルまで容易に濃縮される。これらのタンパク質は、予想される分子量および観察される分子量における差異により実証されるように、グリコシル化される。収量は、タンパク質の大きさとは逆の相関があり、そして調整済み培地に対して、０．８〜２．０μｇ／ｍＬの範囲に低下する。
【０３０７】
（表６）
ＨＣＨ２ユニットの数、潜在的にＮ−連結されるグリコシル化部位、予想される分子量、およびＮ−連結されるグリコシル化の、ＩｇＧ１−Ｆｃフレームワークと融合されたＣＤ８−ＨＣＨ２ポリマーの見かけの分子量に対する寄与。
【０３０８】
【表６】
0004524074.tif 000010
（実施例８−構造的整合性）
構造的整合性および抗原性含量を試験するために、組換えタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で解離させて、そしてウエスタンブロットにより分析した。タンパク質を７％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に電気泳動され（Ｌａｅｍｍｌｉら、１９７０）、そしてニトロセルロース膜（ＭＳＩ）に転写された。膜を、トリス緩衝化生理食塩水ｐＨ７．４（ＴＢＳ）中の５％脱脂乳中で、一晩ブロックした。Ｆｃドメインの分析のために、総量５０ｎｇの組換えタンパク質または０．５μｇのコントロールタンパク質（ヒトＩｇＧおよびＢＳＡ）を、ゲル上に装填した。この膜を、ＴＢＳ中の０．１％の脱脂乳および０．１％の正常ヤギ血清からなる結合緩衝液中で、１：１００００希釈で使用される、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識されたヤギ抗ヒトＦｃポリクローナル抗体（Ｃａｌｔａｇ）で、２時間インキュベーションした。このブロットをＴＢＳ−ｔｗｅｅｎで洗浄して、そして製造業者の指示書に従ってＥＣＬ−ｐｌｕｓ化学発光試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して検出を実施した。
【０３０９】
ＣＤ８αのウエスタンブロット分析については、組換えタンパク質をゲル上に２００ｎｇで装填し、そしてコントロールを１ウェル当たり０．５μｇで装填した。この膜を、ＴＢＳ中の０．２％の脱脂乳および０．１％の正常ヒト血清からなる結合緩衝液中で、１：８００希釈で使用される、マウス抗ヒトＣＤ８αモノクローナル抗体（クローン  ＨＩＴ８ａ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で、２時間インキュベートした。ブロットを上記のように洗浄して、そして、トリス緩衝化生理食塩水中の０．１％の脱脂乳、０．１％の正常ヒト血清、０．１％正常ヤギ血清、および０．０３％のＴｗｅｅｎからなる結合緩衝液中で、１：１０００希釈で使用される、ＨＲＰ複合体化されたウサギ抗マウスＩｇＧ（ＤＡＫＯ）でインキュベーションした。ブロットを、上記のように洗浄して、そして検出した。タンパク質の直接的な目視化のために、ゲルをＣｏｏｍａｓｓｉｅ  ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  ｂｌｕｅで染色した。
【０３１０】
（結果）図３Ａに示されるように、ＨＣＨ２ポリマーが、発現され、安定であり、そして分泌される。観察された分子量は、ペプチド骨格単独について推定されるよりも大きく（図２）、このことは、このタンパク質がグリコシル化されることを示す（表６もまた参照のこと）。ヒトＦｃに対する抗体でプロービングされるウェスタンブロットにより、ＩｇＧコントロールと類似した様式でのＨＣＨ２ポリマーへの結合が明らかである（図３Ｂ）。ヒトＣＤ８αに対する抗体でプロービングされた同様のブロットは、組換えタンパク質に対してのみの結合を示す（図３Ｃ）。まとめると、これらの結果は、ＨＣＨ２ポリマーが、ＣＤ８αおよびＦｃ抗原決定基の両方を含むことを示し、このことは、このタンパク質が、正確に発現されそして分泌されることを示す。精製されたタンパク質の量ともとの馴化培地の体積との相関性により、培地１ｍＬあたり２μｇ（ＣＤ８Ｒ０）〜０．８μｇ（ＣＤ８Ｒ４）の範囲の収量が得られる。収量は、タンパク質のサイズおよび／またはＨＣＨ２反復単位の数と負に相関した。ミスフォールディングされたか凝集した組換えタンパク質の蓄積の証拠は、Ｓｆ９細胞ペレットにおいて見出されなかった。このことは、より大きなタンパク質に対する偏りについての他のいくつかの原理を暗示する。
【０３１１】
（実施例９−ジスルフィド結合を使用するＨＣＨ２ポリペプチドのダイマー化）
予期された１つの困難性は、オリゴマー化の間にネイティブヒンジ領域と競合する変異ＨＣＨ２単位の能力であった。このことは、かなりの量のモノマー生成を潜在的に生じ得た。このタンパク質を、還元条件下および非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分析して、そのＨＣＨ２ポリマーが抗体様共有結合オリゴマーを形成するか否かを決定した。すべての場合において、その組換えタンパク質はダイマーを形成し、そのダイマーは、２−メルカプトエタノールにより還元し得た。このことは、ＩｇＧ様オリゴマー化が生じたことを示す。しかし、ＣＤ８Ｒ０およびＣＤ８Ｒ４の両方が、検出可能なレベルのモノマーを生じた。このことが、分泌後のジスルフィド結合還元から生じたのかまたはオリゴマー化の失敗から生じたのかは、未解決のままである。しかし、ＣＤ８Ｒ０調製物中のモノマーの存在は、競合的機構に対する反証である。
【０３１２】
（実施例１０−ＨＣＨ２ポリマーに融合されたヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）ドメインＩのクローニングおよび発現）
以前、ＨＣＨ２ポリマーが、ヒトＣＤ８αの細胞外ドメインとの融合物として発現された。どの効果がＨＣＨ２ポリマーに起因しそしてどの効果がアミノ末端融合パートナーに起因するのかを識別するために、ＨＣＨ２ポリマーに融合したＨＳＡのドメインＩを用いて、融合タンパク質を構築した。その後、ＣＤ８α−ＨＣＨ２ポリマーの生物学的活性を、ＨＳＡ−ＨＣＨ２ポリマーのものと比較した。これらの実験はまた、その発現系の一般的有用性を示すためにもまた役立つ。ＨＳＡのドメインＩの分泌シグナルおよび最初の１９７残基を、ＲＴ−ＰＣＲ、細胞株ＨＥＰ  Ｇ２（ＡＴＣＣ  ＨＢ−８０６５）由来の全ＲＮＡ、および隣接する５’  ＸｈｏＩ部位および３’  ＥｃｏＲＩ部位を導入するプライマーを使用して、増幅した。プライマーは、ＨＳＡ  ｃＤＮＡからの配列データ（アクセッション番号Ｖ００４９４）を指針として使用して設計した。そのＰＣＲ産物を、ＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、そして同様に消化したｐＦＲＭ−ＨＣＨ２ベクター中にクローニングした。このｐＦＲＭ−ＨＣＨ２ベクターは、種々の数のＨＣＨ２反復を含むＨＣＨ２ポリマーとインフレームに融合されたＮ末端タンパク質ドメインの発現を指向する。このベクター骨格は、ｐＩＥ１−４昆虫細胞発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）に由来し、このベクター骨格は、バキュロウイルスｉｅ１遺伝子プロモーターの制御下に融合タンパク質構築物を配置する。
【０３１３】
このＨＳＡ−ＨＣＨ２融合構築物を、以前にＣＤ８α−ＨＣＨ２構築物について行ったのと同様に、ＳＦ９細胞中に安定にトランスフェクトした。同様に、４つの構築物を発現分析のために選択し、ＨＳＡＲ０〜ＨＳＡＲ４と名付けた。これらは、フレームワーク中のＨＣＨ２単位に加えて、０個と４個との間のＨＣＨ２単位を含む（図２）。このフレームワークドメインの共有結合ダイマー化の結果として、その成熟タンパク質は、ＨＳＡＲ０タンパク質〜ＨＳＡＲ４タンパク質中に、それぞれ、２個と１０個との間のＨＣＨ２単位を含む。組換えタンパク質を、上記実施例６に記載したように馴化培地から単離した。そのタンパク質を、７％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、そして染色してタンパク質を明らかにした。
【０３１４】
（結果）  ＨＳＡ−ＨＣＨ２融合タンパク質が、発現され、分泌され、そして安定であった。そのタンパク質は、馴化培地から単離され得、そして有用なレベルまで濃縮され得る。収量は、ＣＤ８α構築物について観察された収量に匹敵する。これらの結果は、２つの異なる融合パートナーを含むＨＣＨ２発現ベクターの一般的有用性を示す。また、これらの結果は、異なる融合パートナーとともに発現されるＨＣＨ２融合タンパク質の安定性を示す。下記の実験は、それらの組換えタンパク質の相対的生物学的活性を評価および比較する。
【０３１５】
（実施例１１−ＰＢＭＣ精製、増殖アッセイ、およびサイトカイン分析）
６人の健常ドナーの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ勾配（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ）上のヘパリン化血液から単離し、そしてＡＩＭ  Ｖ規定無血清培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）において懸濁した。組換えタンパク質ストックを、まずＲＰＭＩ  １６４０中に調製した（濃度≧１ｍｇ／ｍｌ）。組換えタンパク質ストックを、図面に示される所望の最終濃度を達成するまで、ＡＩＭ  Ｖ培地（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で希釈した。ＩｇＧ凝集物を調製するために、４ｍｇのヒトＩｇＧ（Ｏｒｇａｎｅｎ  Ｔｅｋｎｉｋａ  Ｃｏｒｐ．）を、２ｍｌの生理食塩水中に溶解し、そして５７℃にて１時間インキュベートした。得た熱凝集ＩｇＧ（ＡＩＧ）を、図面に示される所望の最終濃度までＡＩＭ  Ｖ培地中で希釈した。ｒＩＬ−２（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を、最終濃度１ｎｇ／ｍｌで添加した。抗ＣＤ１６  ｍＡｂ  ３Ｇ８（Ｃａｌｔａｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）でＰＢＭＣを刺激するために、重炭酸緩衝液（ｐＨ８．４）中の５０μｌのｍＡｂ  ３Ｇ８（１０μｇ／ｍｌまたはその希釈物）を、９６ウェル平底組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ）の各ウェル中に、室温で３時間重層した。その後、そのウェルを生理食塩水で徹底的に洗浄し、吸引し、その直後に細胞培養のために使用した。ＰＢＭＣを、９６ウェル平底プレート中に最終濃度２×１０６細胞／ｍｌ（０．２００ｍｌ／ウェル最終体積）または４８ウェル平底プレート中に最終濃度２×１０６細胞／ｍｌ（１ｍｌ／ウェル最終体積）でプレーティングした。サイトカイン誘導のために、細胞を、５％大気ＣＯ２中で３７℃にて加湿インキュベーター中で４８時間インキュベートし、そして上清を採集し、そして２１００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、細胞および細胞破片をペレットにした。無細胞上清を、サイトカイン含量についてアッセイするまで−８０℃にて凍結した。増殖アッセイのために、細胞を、５％大気ＣＯ２中で３７℃にて加湿インキュベーター中で７２時間インキュベートした。培養の最後の５時間の間、ウェルを、１μＣｉの［メチル−３Ｈ］チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｃｏｒｐ）でパルスした。ＰｈＤ細胞採集器（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、細胞を採集した。Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  Ｃｏｕｎｔｅｒ  ＬＳ  ５０００ＴＤ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して、放射能を測定した。
【０３１６】
（実施例１２−ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α  ＥＬＩＳＡ）
ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αを検出するために、サンドイッチＥＬＩＳＡを使用した。ＩＦＮ−γを検出するために、マウス抗ヒト抗体クローンＮＩＢ４２を、捕捉抗体として使用し、そして抗体クローン４Ｓ．Ｂ３を、検出抗体として使用した（両方とも、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから得た）。ＴＮＦ−αを検出するために、マウス抗ヒト抗体クローンＭＡｂ１を、捕捉抗体として使用し、そして抗体クローンＭＡｂ１１を、検出抗体として使用した（両方とも、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから得た）。ＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を、炭酸緩衝液（０．５Ｍ、ｐＨ８．５）中０．７５μｇ／ｍｌの捕捉抗体を０．１ｍｇ／ウェルで、コーティングした。プレートを、室温（ＲＴ）で一晩インキュベートした。ダルベッコリン酸緩衝化生理食塩水（ＤＰＢＳ）中の２％結晶化ＢＳＡを０．１００ｍｌ、各ウェルに室温でさらに３〜６時間添加した。プレートをＤＰＢＳで徹底的に洗浄し、そして組換えＩＦＮ−γもしくはＴＮＦα（標準物質として）（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）または細胞上清を、添加した。組換えＩＦＮ−γまたはＴＮＦαを、１０ｎｇ／ｍｌ〜０．１５ｎｇ／ｍｌに１：３連続希釈した。細胞上清を、５０％希釈物および１０％希釈物にてアッセイした。；プレートを、４℃で一晩インキュベートし、ウェルを洗浄し、そしてＤＰＢＳ中の０．２％  ＢＳＡ中０．７５μｇ／ｍｌのビオチン化結合抗体０．２００ｍｌを室温で２時間重層した。ウェルを洗浄し、そしてビオチンと反応性のヤギポリクローナル親和性精製ＩｇＧ（１％  ＤＰＢＳ中１：４００）（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）０．２００ｍｌを室温で１時間重層した。ウェルを洗浄し、そしてクエン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ４．５）中のオルトフェニレンジアミン（４ｍｇ／ｍｌ）０．２００ｍｌを、各ウェルに添加した。プレートを、Ｔｈｅｒｍｏｍａｘ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｃｏｒｐ．，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）上で読み取った。
【０３１７】
（実施例１３−ＨＣＨ２ポリマー−ＦｃγＲＩＩＩ相互作用の評価）
可能なＨＣＨ２ポリマー−ＦｃγＲＩＩＩ相互作用を評価するために、ＨＣＨ２ポリマーを、ＰＢＭＣ単離物中のＮＫ細胞を活性化する能力について評価した。ＮＫ細胞は、低親和性ＩＬ−２レセプターと、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）との両方を発現する（Ｎａｇｌｅｒら、１９９０）。高レベルＩＬ−２（１ｎｇ／ｍＬ）で刺激した場合、ＮＫ細胞は、ＣＤ１６連結物に対する増殖応答を開始する。誘発されるこの応答を、ＦｃγＲと係合するＩＣ分子、ＡＩＧ分子および組換え分子の適合性の試験として使用した。２つの異なるＨＣＨ２ポリマー構築物の組を、ＰＢＭＣを活性化する能力について試験した。１組は、ＣＤ８αの細胞外ドメインを発現し（ＣＤ８Ｒ０、ＣＤ８Ｒ２、ＣＤ８Ｒ３、およびＣＤ８Ｒ４と呼んだ）、もう一組は、ＨＳＡのドメイン１を発現した（ＨＳＡＲ０、ＨＳＡＲ２、ＨＳＡＲ３およびＨＳＡＲ４と呼んだ）。
【０３１８】
（結果）  固定抗ＣＤ１６  ｍＡｂ  ３Ｇ８は、ＩＬ−２の存在下で、ＦｃγＩＩＩレセプターの活性化を介して、ＮＫ細胞の増殖およびサイトカイン放出を誘発した。ＰＢＭＣ単離物を、培地単独、ＩＬ−２（１ｎｇ／ｍｌ）単独、固定抗ＣＤ１６  ｍＡｂ単独とか、またはＩＬ２＋抗ＣＤ１６  ｍＡｂとともにインキュベートし、そして３日後に増殖応答を測定した。ＩＬ−２単独も抗ＣＤ１６  ｍＡｂ単独も、ＰＢＭＣから有意な増殖応答を誘導しなかった。培地単独の存在下での増殖応答は、７８７±４４７であり、ＩＬ−２単独の存在下で１９５７±１１１７であり、固定抗ＣＤ１６  ｍＡｂ単独の存在下で５９２±１０２であった。しかし、ＩＬ−２および抗ＣＤ１６  ｍＡｂの両方の存在下で、増殖応答の顕著な増加が存在した。ＩＬ−２および固定抗ＣＤ１６  ｍＡｂの両方の存在下での増殖応答は、１５４９９±２９６２であった。データは、４人の個体からの平均±平均標準誤差を示す。
【０３１９】
同様に、ＣＤ８αの細胞外ドメインを発現するＨＣＨ２ポリマー構築物もまた、ＰＢＭＣにおける増殖応答を誘導する能力について試験した。表７に示されるように、ＣＤ８α発現構築物であるＣＤ８Ｒ０、ＣＤ８Ｒ２、ＣＤ８Ｒ３、およびＣＤ８Ｒ４はすべて、ＩＬ−２の存在下で、ＰＢＭＣにおいて増殖応答を誘導する。従って、ＰＢＭＣ増殖を誘導する能力は、その構築物がＡＩＧ機能を模倣することを示すＨＣＨ２単位の数と相関する。表７に示されるように、ＣＤ８Ｒ４がこのアッセイにおいて最も有効な構築物であったので、ＣＤ８Ｒ４を、ＡＩＧと直接比較した。ＣＤ８Ｒ４は、１２５μｇ／ｍＬのＡＩＧと５μｇ／ｍＬにて同等に有効であり、増殖は、抗ＣＤ１６  ｍＡｂを使用した観察された増殖と同じ大きさであった。５μｇ／ｍＬのＣＤ８Ｒ４およびＩＬ−２の存在下での増殖応答は、２１６９４±４６３８（ＩＬ−２単独の１８倍の誘導）であり、１２５μｇ／ｍＬのＡＩＧおよびＩＬ−２の存在下で、１７３８８±１３４２（ＩＬ−２の１６倍の誘導）であった。ＨＳＡの最初のドメインを含むＨＣＨ２ポリマーもまた、ＰＢＭＣにおいて増殖応答を誘導する能力について試験した。図４に示されるように、このＨＣＨ２ポリマータンパク質ＨＳＡＲ４は、固定抗ＣＤ１６  Ａｂ  ３Ｇ８と同程度にＰＢＭＣが増殖するように活性化させる際に有効であり、凝集ＩｇＧよりも何倍も有効であった。
【０３２０】
（表７）
（組換えＨＣＨ２ポリマーおよびＩＬ−２によるＰＢＭＣの同時刺激からの増殖応答）
【０３２１】
【表７】
0004524074.tif 000011
0004524074.tif 000012
＊平均±平均標準誤差。
【０３２２】
（実施例１４−種々のＨＣＨ２反復単位を含むＨＣＨ２ポリマータンパク質による、ＰＢＭＣ活性化）
ＨＣＨ２ポリマータンパク質によるＰＢＭＣ活性化は、ＨＣＨ２領域反復の数と相関し、このことは、ＨＣＨ２ポリマータンパク質中のＨＣＨ２の数に対するＦｃγレセプターによる高レベルの感受性を示す（図５）。ＰＢＭＣを、ＩＬ−２の存在下で、種々の数のＨＣＨ２ドメインを含む、種々の濃度の異なるＨＣＨ２ポリマータンパク質に曝した（図５）。結果：各ＨＣＨ２ポリマータンパク質について、用量依存性応答が観察される。ＰＢＭＣは、より数の多い反復ＨＣＨ２単位を含むＨＣＨ２ポリマータンパク質に対して、良好に応答する。従って、ＨＣＨ２ポリマータンパク質は、Ｉｇに対するレセプター反応性の微妙な差異を識別するために使用され得る。図５の凡例に示されるように、ＩＬ−２の非存在下でのＨＣＨ２ポリマータンパク質に対する増殖応答は、培地単独において見出される増殖応答と近かった。従って、ＰＢＭＣが増殖するように活性化させるＨＣＨ２ポリマータンパク質の能力は、固定抗ＣＤ１６  Ａｂを用いて観察されたのと同様に、ＩＬ−２による同時刺激に依存する。示されるデータは、４人の異なるドナー由来のＰＢＭＣを使用して得た平均を示す。
【０３２３】
（実施例１５−異なるタンパク質ドメインを発現するＨＣＨ２ポリマータンパク質が、類似する様式でＰＢＭＣを活性化する）
異なるタンパク質由来のドメインとともに反復ＨＣＨ２単位を用いて構築されたＨＣＨ２ポリマータンパク質の生物学的機能を直接比較するために、ＨＳＡのドメイン１を発現するＨＣＨ２ポリマータンパク質（ＨＳＡＲ０およびＨＳＡＲ４）がＰＢＭＣを活性化させる能力を、ＣＤ８αの細胞外ドメインを発現するＨＣＨ２ポリマータンパク質（ＣＨ８Ｒ０およびＣＤ８Ｒ４）の能力と比較した。ＨＳＡＲ０、ＨＳＡＲ４、ＣＤ８Ｒ０およびＣＤ８Ｒ４を、実施例８に記載されるようにＰＢＭＣを活性化させるために、ＩＬ−２（１ｎｇ／ｍｌ）とともに濃度５μｇ／ｍｌで使用した。結果：表８に示されるように、ＨＳＡＲ０、ＨＳＡＲ４、ＣＤ８Ｒ０およびＣＤ８Ｒ４はすべて、ＩＬ−２の存在下でＰＢＭＣが増殖するように活性化させる。増殖応答の増加が、共発現されるタンパク質ドメインに関わらず、より多くの数のＨＣＨ２反復単位を含む構築物と用いて着目される。従って、異なる型のタンパク質由来のドメインを共発現しなおそのＨＣＨ２反復単位の生物学的活性化特性を保持する、ＨＣＨ２ポリマータンパク質が、種々の数のＨＣＨ２反復単位を用いて構築され得る。
【０３２４】
（表８）
（組換えＨＣＨ２ポリマーおよびＩＬ−２によるＰＢＭＣの同時刺激からの増殖応答）
【０３２５】
【表８】
0004524074.tif 000013
（実施例１６−ＨＣＨ２ポリマータンパク質による刺激後のサイトカイン分泌）
ＨＣＨ２ポリマータンパク質は、天然のＩｇＧ１リガンドおよび抗ＣＤ１６  ｍＡｂと同様の様式で、ＰＢＭＣがサイトカインを分泌するように活性化させる（表９）。ＰＢＭＣを、ＩＬ−２単独でか、またはＩＬ−２＋固定抗ＣＤ１６抗体３Ｇ８（１０μｇ／ｍｌ）、ＩＬ−２＋凝集ＩｇＧ（４０μｇ／ｍｌ）もしくはＩＬ−２＋ＨＳＡＲ４（４０μｇ／ｍｌ）を用いて活性化した（表９）。ＰＢＭＣによるＩＦＮγ生成およびＴＮＦα生成の両方が、抗ＣＤ１６  Ａｂ、ＡＩＧ、およびＨＳＡＲ４の存在下で、ＩＬ−２単独と比較して増加する。
【０３２６】
（表９）
（ＩＬ−２単独でか、または固定抗ＣＤ１６  ｍＡｂ、凝集ＩｇＧ、もしくはＨＳＡＲ４で刺激された、ＰＢＭＣからのサイトカイン分泌）
【０３２７】
【表９】
0004524074.tif 000014
ＨＣＨ２ポリマータンパク質は、用量依存性様式で、ＰＢＭＣからＩＦＮγおよびＴＮＦαの分泌を誘導する（表１０）。
【０３２８】
（表１０．ＨＣＨ２ポリマータンパク質による刺激の後の、サイトカイン分泌）
【０３２９】
【表１０】
0004524074.tif 000015
ＰＢＭＣを、種々の濃度の２つのＨＣＨ２ポリマー構築物に曝した。その２つのＨＣＨ２ポリマー構築物の一方（ＨＳＡＲ０）は、Ｆｃフレームワーク領域のダイマー化の結果として成熟ポリペプチド中に２つのＨＣＨ２ドメインが存在するが、挿入されたＨＣＨ２ドメインを有さず、もう一方（ＨＳＡＲ４）は、成熟ポリペプチド中に合計１０個のＨＣＨ２ドメインを有する（表６を参照のこと）。ＩＮＦγおよびＴＮＦαの両方の分泌が、両方の構築物で刺激したＰＢＭＣにおいて誘導された。これらの高濃度において、ＨＳＡＲ０構築物のうちのいくらかが、ウェルの表面上に固定され、そしてＦｃγＲＩＩＩａを有効に刺激するようである。より低濃度のタンパク質では、ＨＣＨ２ポリマーＨＳＡＲ４のみが、サイトカイン分泌を誘導し、このことは、レセプター活性化に対するさらなるＨＣＨ２ドメインの効果を示す。
【０３３０】
（実施例１７−ＨＣＨ２ポリマーは、補体因子Ｃ１ｑとの相互作用を最小にするように発現され得る）
特定の治療適用のために、ＨＣＨ２ポリマーへの補体の結合は、望ましくなく潜在的に有害な副作用を引き起こし得る。さらに、このＨＣＨ２ポリマーへの補体結合は、特定の研究における結果を混乱し得る。昆虫細胞は、変化した糖質部分を有するタンパク質を発現することが公知である。これらの変化は、これらのタンパク質への補体因子Ｃ１ｑの結合を弱め得る。この理由のために、昆虫細胞株ＳＦ９において発現されるＨＣＨ２ポリマーへのＣ１ｑの結合を、調査した。昆虫細胞において発現されるヒトＩｇＧまたはＨＣＨ２ポリマーへのＣ１ｑの結合を試験するアッセイを、行った。種々の濃度のヒトＣ１ｑを、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートのウェル上に前もって固定した、ヒトＩｇＧまたはＨＣＨ２ポリマーであるＨＳＡＲ０およびＨＳＡＲ４のいずれかに、結合させた。Ｃ１ｑ結合の程度を、ヤギ抗ヒトＣ１ｑポリクローナル抗体を使用して検出した。その結果（図６に図示される）は、昆虫細胞発現系から単離されたＨＣＨ２ポリマーが、ネイティブＩｇＧよりも弱くＣ１ｑと係合することを示す。
【０３３１】
（実施例１８−ＥＡＥ誘導）
ＥＡＥを、６〜７週齢のＳＪＬ／Ｊマウスにおいて誘導した。各マウスに、合計０．１ｍｌのアジュバントを、背中の３つの部位にわたって分布するように投与した。注射は、側腹部の上および肩の肩甲骨の間の、剃毛した皮膚領域中に皮内送達した。免疫のためのアジュバントを調製するために、ミエリンプロテオリピドタンパク質ペプチド１３９〜１５１（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，ＫＹ）を、１．５μｇ／ｍｌでＰＢＳ中に溶解し、そして等容量の完全フロイントアジュバント（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）で乳化した。０．１ｍｌの生理食塩水中の２００ｎｇの百日咳毒素（Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｓ  Ｉｎｃ．，Ｃａｍｐｂｅｌｌ、ＣＡ）を、免疫１日後および３日後の各マウスの尾静脈中に注射した。疾患の重篤度に対するその構築物の効果を決定するために、マウスに、生理食塩水単独（１５０μｌ総容積）をか、またはＨＳＡＲ０を含む生理食塩水（５０μｇ  ＨＳＡＲ０／１５０μｌ生理食塩水）をか、またはＨＳＡＲ４を含む生理食塩水（５０μｇ  ＨＳＡＲ４／１５０μｌ生理食塩水）を、腹腔内注射した。マウスに、これらの構築物または生理食塩水コントロールを、免疫３日前、免疫１日後、および免疫３日後に注射した。臨床疾患を、重篤度が増加する以下の０〜５のスケール上に段階分けした：０（異常なし）；１（弛緩性の尾）；２（軽度の後肢衰弱を伴う弛緩性の尾）；２．５（完全には麻痺していない中程度の後肢の衰弱）；３（後肢の全体的麻痺）；４（前肢の衰弱または麻痺を伴う、後肢の麻痺）；５（瀕死）。瀕死状態になったマウスを、安楽死させた。
【０３３２】
ＳＪＬ／ＪマウスにおけるＥＡＥを、そのマウスが部分的にかまたは完全に回復する初期急性疾患によって特徴付ける。その後、その疾患は再発し、そしてマウスがめったに回復しない慢性再発疾患となる。結果：図７に示されるように、ＨＳＡＲ４を注射したマウスは、生理食塩水単独またはＨＳＡＲ０を注射したマウスと比較して、重篤度が弱い急性疾患を提示した。ＨＳＡＲ０を注射したマウスは、ＨＳＡＲ４または生理食塩水単独を注射されたマウスと比較して、中程度の重篤度の急性疾患を有した。ＨＳＡＲ４またはＨＳＡＲ０を注射されたマウスはすべて、その急性疾患から回復したが、生理食塩水単独で処理したマウスの大部分は、その疾患の急性期から決して回復しなかった。ＨＳＡＲ４を注射したマウスは、ＨＳＡＲ０または生理食塩水単独で処理したマウスよりも少ない再発を提示した。示されるデータは、平均の臨床疾患スコアである。生理食塩水についてｎ＝８マウスであり、ＨＳＡＲ０についてｎ＝８であり、そしてＨＳＡＲ４についてｎ＝６である。ＨＳＡＲ０で処理された１匹のマウスは、１４日目に瀕死状態となった。それを安楽死させた。スコア５を、１４日目のデータ中に入れた。その後、この動物についてエントリーは行わなかった。
【０３３３】
ＨＳＡＲ４で処理したマウスは、生理食塩水よりも有意に重篤度が低い疾患を、急性期の間およびその疾患の再発期の間に有した。そしてこのことは、ＨＳＡＲ０処理動物について観察されたよりも長期間かつ大きな程度持続した（８日目の疾患開始から１３日目まで、および１５日目〜４１日目（２６日目を含まない）の各観察日について生理食塩水に対してｐ＜０．０５；片側スチューデント検定）。ＨＳＡＲ０処理マウスは、生理食塩水処理コントロールと比較して有意に重篤性が低い疾患を、疾患の急性期および再発期の両方の間で有した（９日目〜１２日目および１６日目〜１９．５日目の各観察日について生理食塩水に対してｐ＜０．０５；片側スチューデント検定）。生理食塩水コントロールと比較して有意に低い疾患活性が、ＨＳＡＲ０処理群およびＨＳＡＲ４処理群の両方において、より後の時点でも観察された。
【０３３４】
（参考文献）
以下の参考文献は、それらが本明細書中に示される例示的手順または他の詳細を補充する例示的手順または他の詳細を提供する程度に、本明細書中で参考として援用される。
【０３３５】
【表１１】
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【図面の簡単な説明】
【０３３６】
【図１】図１−模式図は、ＨＣＨ２ポリマーの構築において利用された設計の理論的根拠を示す。このうちの重要な特徴は、伸長工程におけるクローニング部位の反復再生である。この模式図に示されるΔＨＣＨ２は、ヒンジシステインがセリンに変化しているＨＣＨ２モノマーを表す。
【図２】図２−融合タンパク質構築物を表す模式図。三角は、ヒトＣＤ８αの細胞外ドメインまたはＨＳＡのドメインＩのいずれか由来の最初の１１９アミノ酸残基を含む、リーダー配列およびアミノ末端ドメインを表す。ＨＣＨ２と標記された四角は、ヒトＩｇＧ１のヒンジドメインおよびＣＨ２ドメイン（アミノ酸残基２２６〜３５０）から構成される反復ユニットを表す。ＦＲＭと標記されたエレメントは、ヒトＩｇＧ１のヒンジドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン（アミノ酸残基２２６〜４５７）から構成されるフレームワーク領域を表す。ＲＯは、反復ユニットのないフレームワークを示し、Ｒ２は、２つの反復ユニットを有するフレームワークを、Ｒ３は、３つの反復ユニットを有するフレームワークを、Ｒ４は、４つの反復ユニットを有するフレームワークを示す。
【図３】図３Ａおよび図３Ｂおよび図３Ｃ−ウェスタンブロット分析。図３Ａ。組換えタンパク質を７％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、そしてクーマシーブリリアントブルー染料で染色して、タンパク質を示した。図３Ｂ。組換えタンパク質を、ニトロセルロースメンブレンにトランスファーし、そしてヒトＦｃに対する抗体で染色した。ヒトＩｇＧコントロールおよび融合タンパク質が抗Ｆｃ抗体によって認識されることに留意すること。図３Ｃ。組換えタンパク質をニトロセルロースメンブレンにトランスファーし、そしてヒトＣＤ８αに対する抗体で染色した。融合タンパク質のみが抗ＣＤ８α抗体によって認識されて、ＣＤ８αの特異的検出を示すことに留意すること。
【図４】図４−ＨＳＡＲ４、固定化抗ＣＤ１６  ｍＡｂ  ３Ｇ８、および凝集ＩｇＧは、用量依存性でかつＩＬ−２依存性の様式で、ＰＢＭＣからの増殖応答を誘導する。２×１０５の新鮮に単離されたＰＢＭＣを、ＩＬ−２（１ｎｇ／ｍＬ）および固定化抗ＣＤ１６  ｍＡｂ  ３Ｇ８が一緒の存在下で、ＩＬ−２（１ｎｇ／ｍＬ）およびＨＳＡＲ４が一緒の存在下で、またはＩＬ−２（１ｎｇ／ｍＬ）およびＡＩＧが一緒の存在下で、７２時間にわたって、９６ウェルプレート中にプレーティングした。最後の５時間の間、細胞に、１μＣｉの［メチル−３Ｈ］チミジンをパルスした。このグラフは、種々の希釈の各試薬に対するＰＢＭＣの増殖応答を比較する。ＣＰＭをＹ軸に示し、そして用いた刺激物質のマイクログラム／ｍｌをＸ軸に示す。培地単独の存在下での増殖応答は７８７±４４７であり、そしてＩＬ−２単独の存在下では１９５７±１１１７であった。データは、４つの個体からの平均±ＳＥＭを表す。
【図５】図５−ＨＣＨ２ポリマータンパク質を用いたＰＢＭＣ活性化は、ＨＣＨ２領域反復の数に相関し、ＨＣＨ２ポリマータンパク質中のＨＣＨ２数に対するＦｃγレセプターの高レベルの感度を示す。２×１０５の新鮮に単離されたＰＢＭＣを、培地単独の存在下で、またはＩＬ−２（１ｎｇ／ｍＬ）および種々の濃度のＨＳＡＲ０、ＨＳＡＲ２、ＨＳＡＲ３またはＨＳＡＲ４の存在下で、７２時間にわたって、９６ウェルプレート中にプレーティングした。最後の５時間の間、細胞に、１μＣｉの［メチル−３Ｈ］チミジンをパルスした。このグラフは、種々の希釈の用いた各ＨＣＨ２ポリマータンパク質に対するＰＢＭＣの増殖応答を比較する。ＣＰＭをＹ軸に示し、そして用いたＨＣＨ２ポリマータンパク質のマイクログラム／ｍｌをＸ軸に示す。培地単独の存在下での増殖応答は８０３±１０６９であり、そしてＩＬ−２単独の存在下では２９０３±９６２であった。ＩＬ−２の不存在下で、ＨＳＡＲ０、ＨＳＡＲ２、ＨＳＡＲ３およびＨＳＡＲ４の存在下での増殖応答は、それぞれ、１０２７±１７６、１５３１±５０４、１２３７±３７９、および１６６１±５９２であった。データは、４つの個体からの平均±ＳＥＭを表す。
【図６】図６−Ｃ１ｑ結合アッセイ。ヒトＩｇＧ、ＨＳＡＲ０またはＨＳＡＲ４を、１μｇ／ｍＬの濃度で、９６ウェルプレートに一晩結合させた。翌日、プレートを洗浄し、そして固定化されたタンパク質を、示された濃度で、ＰＴＧ緩衝液中で４時間にわたって、ヒトＣ１ｑとともにインキュベートした。結合したＣ１ｑを、ヤギ抗ヒトＣ１ｑポリクローナル抗体を用いて検出した。この結果は、昆虫細胞中で発現されたＨＣＨ２ポリマーが、Ｃ１ｑと弱く係合することを実証する。
【図７】図７−ＥＡＥを、完全フロイントアジュバント中のＰＬＰペプチドを用いて、ＳＪＬ／Ｊマウスにおいて誘導した。マウスを、ＰＬＰペプチドでの免疫の３日前に、１日後に、そして３日後に、ＨＳＡＲ４（５０μｇ／０．１５０ｍｌ生理食塩水、ｉ．ｐ．で与えた）、ＨＳＡＲ０（５０μｇ／０．１５０ｍｌ生理食塩水、ｉ．ｐ．で与えた）または生理食塩水単独で処置した。臨床疾患を、重篤度が徐々に増す、０〜５のスケールでグレードに分けた；０、異常なし；１、尾部が弛緩；２、尾部が弛緩し、後肢がわずかに弱る；２．５、後肢が中程度に弱るが、完全には麻痺しない；３、後肢が完全に麻痺；４、後肢が麻痺し、前肢が弱るかまたは麻痺する；５、瀕死。瀕死になったマウスを屠殺した。図７は、生理食塩水単独で処置したマウスの疾患スコアを、ＨＳＡＲ４またはＨＳＡＲ０で処置したマウスの疾患スコアと比較する。ＨＳＡＲ４を注射したマウスは、生理食塩水単独またはＨＳＡＲ０を注射したマウスほどは重篤でない急性疾患を提示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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