(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物試料中のヒトErp57/Grp58とβ-アミロイドとの複合体を検出する方法であって、
生物試料中のヒトErp57/Grp58、β-アミロイド、またはヒトErp57/Grp58とβ-アミロイドとの複合体を特異的に認識するために、イムノアッセイまたは蛍光偏光アッセイを行う；
ことを含んで成る方法。
【請求項２】
ヒトErp57/Grp58、β-アミロイド、またはヒトErp57/Grp58とβ-アミロイドとの複合体を特異的に認識する１種以上の抗体を用いてイムノアッセイを行うことを含んで成る請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記生物試料が、ヒトまたは動物の中枢神経系からの生物材料を含む請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記生物試料が、ヒトまたは動物の脳脊髄液を含む請求項３に記載の方法。
【請求項５】
生物試料中の複合体のレベルをβ-アミロイド凝集の濃度と相関させることをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記生物試料が、ヒトの中枢神経系からの生物材料を含み、かつ、この方法が、複合体のレベルをアルツハイマー病への感受性と相関させることをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記生物試料が、ヒトの中枢神経系からの生物材料を含み、かつ、この方法が、複合体のレベルをアルツハイマー病の発生の可能性と相関させることをさらに含む請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記生物試料が、ヒトの中枢神経系からの生物材料を含み、かつ、この方法が、複合体のレベルを、生物試料を得たヒトにおける行動変化と相関させることをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項９】
β-アミロイドの凝集を検出する方法であって、
生物試料中のヒトErp57/Grp58のレベルを測定する；
ことを含む方法。
【請求項１０】
前記ヒトErp57/Grp58のレベルの低下を、β-アミロイドの凝集の増加と相関させることをさらに含む請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記ヒトErp57/Grp58が、ヒトErp57/Grp58およびβ-アミロイドを含む複合体の成分である請求項９記載の方法。
【請求項１２】
前記ヒトErp57/Grp58およびβ-アミロイドを含む複合体中のヒトErp57/Grp58のレベルを、β-アミロイドの凝集の増加と相関させることをさらに含む請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
前記β-アミロイドが、動物のβ-アミロイド1-42、動物のβ-アミロイド1-38、ヒトβ-アミロイド1-42またはヒトβ-アミロイド1-38を含む請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記生物試料が、ヒトまたは動物の中枢神経系からの生物材料を含む請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記生物試料が、ヒトまたは動物の脳脊髄液を含む請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
前記β-アミロイドの凝集の検出が、β-アミロイドプラークの形成を検出することを含む請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
前記β-アミロイドの凝集の検出が、アルツハイマー病に対する感受性の増加についてスクリーニングすることを含む請求項９に記載の方法。
【請求項１８】
アポＥ遺伝子型についてスクリーニングすることをさらに含む請求項９に記載の方法。
【請求項１９】
アルツハイマー病についてスクリーニングする方法であって、
ヒトの生物試料中のヒトErp57/Grp58のレベルを測定し；そして
上記ヒトErp57/Grp58のレベルをアルツハイマー病に対する感受性と相関させる；
ことを含む方法。
【請求項２０】
前記ヒトErp57/Grp58のレベルをアルツハイマー病に対する感受性と相関させることが、ヒトErp57/Grp58濃度のレベルを、β-アミロイドの凝集の増加と相関させることを含む請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
前記ヒトErp57/Grp58が、ヒトErp57/Grp58およびβ-アミロイドを含む複合体の成分である請求項19に記載の方法。
【請求項２２】
前記ヒトErp57/Grp58およびβ-アミロイドを含む複合体のレベルを測定することをさらに含む請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
前記複合体中のβ-アミロイドが、β-アミロイド1-42またはβ-アミロイド1-38である請求項21に記載の方法。
【請求項２４】
前記ヒトの生物試料が、中枢神経系からの生物材料を含む請求項19に記載の方法。
【請求項２５】
前記ヒトの生物試料が、脳脊髄液からの生物材料を含む請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
ヒトErp57/Grp58のレベルを、脳脊髄液中のヒトErp57/Grp58およびβ-アミロイドを含んで成る複合体の濃度ならびにβ-アミロイドの濃度と相関させることをさらに含む請求項19に記載の方法。
【請求項２７】
それぞれ、複合体中のβ-アミロイドが、ヒトβ-アミロイド1-42またはヒトβ-アミロイド1-38であり、かつ、脳脊髄液中のβ-アミロイドが、ヒトβ-アミロイド1-42またはヒトβ-アミロイド1-38である請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
アポＥ遺伝子型についてスクリーニングすることをさらに含む請求項19に記載の方法。
【請求項２９】
前記相関が、ヒトErp57/Grp58のレベルをアルツハイマー病の発生の可能性と相関させることを含む請求項19に記載の方法。
【請求項３０】
ヒトErp57/Grp58およびβ-アミロイドを含む複合体を特異的に認識する抗体。
【請求項３１】
前記複合体が、ヒトβ-アミロイド1-42、ヒトβ-アミロイド1-38、動物のβ-アミロイド1-42または動物のβ-アミロイド1-38を含む請求項30に記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
多くの生理学的問題、例えば筋肉塊の喪失、免疫系の機能不全、ホルモン（例えばインシュリンまたは成長ホルモン）の最大合成および放出量の減少、腎臓機能の障害ならびに認識力の低下が、老化に伴って生じる。これらの問題は、機能的能力の全体的低下に至る。これらの年齢に関連した生理学的問題を説明する幾つかのモデルが提案されてきた。そのようなモデルとしては、例えばプログラムされた細胞死（すなわちアポトーシス）の増加、オキシダント損傷の蓄積、細胞が、染色体の末端でテロマーを維持することができなくなること、および、ストレスへの応答の欠如が挙げられる。観察される、年齢に関連したストレスへの応答の欠如は、シャペロンタンパク質が関係し得る。
【０００２】
細胞レベルで、最も重要なストレスタンパク質はシャペロン（chaperon）である。シャペロンは、細胞機能において重要な役割を演じる。シャペロンは、タンパク質をその天然の状態へと再配列（realing）するのを助け、それによって、損傷したタンパク質を復元し、かつ新たに合成されたタンパク質をその最終の最適構造へと向かわせることによってタンパク質の折り畳み（refolding）の最終段階を助ける。シャペロンはまた、例えば分子内および分子間ジスルフィド結合の形成によって、最終タンパク質生成物を安定化するのを助ける。シャペロンの１つのそのような族は、チオール：タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼ(TPDO)として知られている。ストレスタンパク質およびシャペロンの研究は、年齢に関連した機能低下の多くが、シャペロン系の活性の低下に関連するという考えを支持する。シャペロンの濃度および活性の低下は、不適当に折り畳まれ、かつ不溶性のタンパク質塊の形成の増加をもたらし得る。
【０００３】
β-アミロイドタンパク質（アミロイド前駆体タンパク質から誘導された38〜43個のアミノ酸のペプチド）の不溶性のプラーク（plaque）は、アルツハイマー病に罹っている老人の脳に生ずる。アミロイド前駆体タンパク質は、小胞体で合成される内因性膜タンパク質である。合成および原形質膜への挿入中に、β-アミロイドは、アミロイド前駆体タンパク質から開裂され、細胞間隙へと分泌される。
【０００４】
生理的溶液中で、β-アミロイドは容易に凝集してアルツハイマー病に特有なプラークを形成する。しかしながら、アルツハイマー病は複雑であり、単なるβ-アミロイドペプチドの過剰発現(overexpression)以上のものを含む。アルツハイマー病の神経病理学は、大量の神経細胞損失および多数の老人性プラークの沈積および大脳皮質における神経原繊維錯綜(meurofibrillary tangle)によって特徴づけられる。少数の古典的老人プラークは正常な脳において加齢に伴って生成するが、多数のプラークは、ほとんどもっぱらアルツハイマー患者において見出される。
【０００５】
１つの研究は、脳脊髄液がβ-アミロイドに加えられるときに、β-アミロイドが凝集しないことを示し、脳脊髄液はβ-アミロイドの凝集を阻害する成分を含むことを示唆する。このことは、アルツハイマー病でない対象の脳脊髄液が、老人プラークの形成を防ぐ成分を含み得ることを示す。この成分は、シャペロンであり得る。かくして、アミロイド前駆体タンパク質のプロセシング、β-アミロイドプラークの形成およびアルツハイマー病におけるシャペロンの役割をよりよく特徴づけることが望ましい。アミロイド前駆体タンパク質またはβ-アミロイドの適当な折り畳みまたはプロセシングは、アルツハイマー病の病因論に関係し得る。
【０００６】
あるいは、アルツハイマー病の患者は、β-アミロイドプラークの核形成を促進するタンパク質を有し得る。１つの理論は、アポリポタンパク質Ｅがアルツハイマー病において役割を演じ得ることを示唆する。アポリポタンパク質Ｅは、アポＥ2、アポＥ3およびアポＥ4として知られる少なくとも３つの対立遺伝子形で存在する。証拠は、アポリポタンパク質Ｅ4（アポＥ4）の少なくとも１つの対立遺伝子を有する人がアルツハイマー病により罹りやすいことを示し、アポＥ4のタンパク質生成物がアルツハイマー病において役割を演じ得ることを示唆する。モイア(Moir)ら、Biochemistry, 38: 4595-4603 (1999)。例えば、アポＥ4は、β-アミロイドの凝集に寄与することによって、β-アミロイドプラークの核形成または形成に寄与し得る。
【０００７】
以前には、アルツハイマー病研究は、β-アミロイドの過剰生成に焦点を合わせてきた。例えば、多くの研究室が、β-アミロイドを生成する前駆体たんぱく質を開裂させることに関連するプロテアーゼの役割を研究してきた。なお多数の研究が、初期のアルツハイマー病の始まりおよびダウン症と共に見られる初期のアルツハイマー病の幾つかのまれな遺伝形を除いて、アルツハイマー病の患者は実際に、年齢に見合った対照より低い濃度のβ-アミロイドを脳脊髄液中に有することを示している。
【０００８】
さらに、クニッツ(Kunitz)プロテアーゼ阻害剤領域を欠くアミロイド前駆体タンパク質遺伝子を有するトランスジェニックマウスの最近の研究は、β-アミロイドの濃度増加は、アミロイド前駆体タンパク質（加齢に伴って変化しないままであるように思われる）の発現の増加によって説明できないことを示した。これらの研究は、β-アミロイドの濃度だけでは、アルツハイマー病を説明するのに十分でないことを示す。かくして、β-アミロイドプラークの形成およびアルツハイマー病におけるシャペロンの役割およびアミロイド前駆体タンパク質のプロセシングをよりよく特徴づけることが望ましい。アミロイド前駆体タンパク質またはβ-アミロイドの適当な折り畳みまたはプロセシングは、アルツハイマー病の病因論と関連し得る。
【０００９】
さらには、目下、β-アミロイドプラークの形成もしくはアルツハイマー病の傾向またはそのようなプラークもしくは病気の存在を検出する唯一の方法は、対象者の脳の切開または脳細胞の培養を含む。そのような侵襲性の処置はもちろん、ほとんどの対象者にとって望ましくない。このことは、先に概略を示したように、そのような切開後でさえ、プラーク形成または病気へ至るある種の因子についてどのように試験するかが以前は不明瞭であったので、特にそうである。これは、生きている無傷の患者においてプラークもしくは病気の傾向または存在を検出する方法の必要性を証明する。
【００１０】
発明の概要
本発明は一般に、上記した必要性に合う組成物およびこの組成物を検出する方法に関する。本発明は、シャペロンおよびβ-アミロイドタンパク質の単離された複合体を含む。好ましくは、複合体は、シャペロンQ2およびβ-アミロイドを含む。この複合体は、天然のものであることができるか、または生物工学的方法によって製造することができ、かつ精製することができる。
【００１１】
本発明はまた、Q2レベルを検出する方法を含む。この方法は、イムノアッセイ、化学的検出法、物理的検出法等を含むことができる。好ましくは、この方法はイムノアッセイを使用する。Q2レベルを検出する方法は、臨床または科学の実験室において試薬として、β-アミロイドのプラークを形成する生物系の傾向を決定するための方法として、またはアルツハイマー病もしくはアルツハイマー病に関連する症状の存在もしくは可能性を決定するための方法として、使用することができる。
【００１２】
発明の詳細な説明
本発明は、シャペロンタンパク質とβ-アミロイドの複合体、Q2の濃度を検出する方法、アルツハイマー病の診断においてそのような検出を使用する方法および、アルツハイマー病を治療または予防するためにこのシャペロンタンパク質のレベルを増加させる方法に関する。特に、本発明は、β-アミロイドおよびシャペロンQ2の単離された複合体、例えば臨床試料または剖検試料中のQ2レベルを検出する方法、臨床試料、例えば脳脊髄液中のQ2レベルの低下の検出に基づいてアルツハイマー病を診断する方法ならびに、Q2生成を刺激することによって、またはQ2を投与することによって、アルツハイマー病を治療する方法に関する。
【００１３】
アルツハイマー病およびβ-アミロイド
アルツハイマー病は、病気を有する対象の脳にβ-アミロイドプラークの形成を含む。プラークは、β-アミロイドの凝集から生じ、β-アミロイドは、アミロイド前駆体タンパク質の開裂および細胞間隙への分泌から生じる。β-アミロイドは、実験室系において溶液中で自由に凝集し、アルツハイマー病において形成されるプラークと同様の凝集塊を形成する。
【００１４】
アミロイド前駆体タンパク質、β-アミロイドおよびβ-アミロイドの種々の断片が特性決定されてきた。アミロイド前駆体タンパク質およびβ-アミロイドの公知の特徴は、それらをコードする哺乳動物遺伝子、これらのタンパク質のための組換え発現系（例えばベクター、プラスミド等）、これらのタンパク質、タンパク質配列および構造体を製造する方法ならびにアミロイド前駆体をβ-アミロイドへ開裂させるプロテアーゼを含む。アミロイド前駆体タンパク質、β-アミロイドまたはβ-アミロイドの種々の断片のいずれも、シャペロンタンパク質と相互作用することは以前には観察されていなかった。
【００１５】
β-アミロイドは、種々の形態で作られ、そして／または単離されることができる。哺乳動物組織におけるβ-アミロイドの最も優勢な形態はβ-アミロイド1-42であり、ここで、番号付けは、完全なβ-アミロイドのアミノ末端で始まるアミノ酸の数を表し、種に依存して38〜43個のアミノ酸を有する。哺乳動物組織におけるβ-アミロイドの２番目に優勢な形態はβ-アミロイド1-38である。
【００１６】
β-アミロイドは、化学的および／または生物工学的方法によって製造され、特性決定され、完全なβ-アミロイドの特性の多くを有することが示された。ここで使用されるβ-アミロイドは、β-アミロイドの種々の形態のすべてをいい、グリコシル化された、グリコシル化されていない、種々の長さの形態等を含む。
【００１７】
シャペロン
シャペロン(Chaperon)（またシャペロンタンパク質として知られ、シャペロニン(Chaperonin)およびある種の熱ショックタンパク質を含む）は、折り畳み、３次構造の形成、４次構造の形成および／または他のプロセシングを触媒して、活性タンパク質を作る。ここに記載されているように、幾つかのシャペロンは、加齢に伴って濃度が低下し得る。かつ年齢に関連した疾病および障害と相関し得る。特に、シャペロンBiP、カルレチクリン(calreticulin)、カルネキシン(calnexin)、Erp72、Q2およびQ5の１つ以上の組織レベルは、哺乳動物（例えばげっ歯動物またはヒト）の加齢に伴って低下し、疾患と相関し得る。
【００１８】
シャペロンは、チオール：タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼ(TPDO)として知られる族を含む。TPDOは、本発明の好ましいシャペロンを表す。好ましいTPDOは、TPDO-Q2である。TPDO-Q2はまた、ERp57およびGRp58と呼ばれてきた。ここで使用されるように、Q2は、このタンパク質についての任意の俗称をいい、TPDO-Q2、ERp57およびGRp58ならびにすべての天然に生じるこのタンパク質の変異体形態（グリコシル化された形態およびグリコシル化されていない形態を含む）を含む。
【００１９】
シャペロンは一般に、よく研究され、そして／または特性決定されたタンパク質である。多くのシャペロンのよく特性決定された特徴は、細菌からヒトまでの範囲にわたる生物においてそれらをコードする遺伝子、これらのタンパク質のための組換え発現系（例えばベクター、プラスミド等）、これらのタンパク質、タンパク質配列および構造体を製造する方法、ある種のタンパク質基質ならびにある種の生物学的機能を含む。シャペロンは、哺乳動物の年齢と共に減少することは以前には観察されなかったし、またアルツハイマー病またはβ-アミロイドプラークの形成に関係していなかった。
【００２０】
シャペロン合成の低下は、シャペロン転写の低下から生じ得る。アルツハイマー病および／またはβ-アミロイドプラークの形成に関連する、組織および／または流体中のシャペロンの量が加齢に伴って低下するかどうかを決定するために、種々のシャペロンについて特異的mRNAの濃度は、公知の方法、例えば標準のハイブリダイゼーション技術によって研究することができる。
【００２１】
シャペロンQ2およびβ-アミロイドの複合体
脳脊髄液中には他のシャペロンが存在し得るが、Q2だけが脳脊髄液中に同定された。Q2濃度は、年齢と共に、哺乳動物組織における正常なQ2濃度に比べて減少し得る。ここで使用される「正常なQ2濃度という語」は、対照個体群からの脳脊髄液中に典型的に見出すことができるQ2の平均濃度を含む。適当な対照個体群としては、例えば若者、アルツハイマー病でない年配者等が挙げられる。正常なQ2濃度は、約27±2ng/mlであり得る。
【００２２】
Q2はβ-アミロイドと複合体を形成することができる。この複合体は、脳脊髄液から単離することができ、実験室で作ることもできる。Q2およびβ-アミロイドは強く結合した複合体を形成すると考えられる。例えば、免疫ブロットは、複合体の非常に少ない解離を証明する。Q2およびβ-アミロイドの複合体は、アルツハイマー病にかかっていない対象においてアミロイド前駆体の正常なプロセシングにおける中間体であると考えられる。年をとった動物における正常なQ2レベルと比べたQ2レベルの減少は、複合体の量の減少および遊離のβ-アミロイドの量の増加に至り得る。β-アミロイドの量の増加は、アルツハイマー病に関連するアミロイドプラークの沈積の増加を引き起こし得る。
【００２３】
Q2およびβ-アミロイドの複合体は、タンパク質化学の通常の方法によって、脳脊髄液から分離し、精製し、特性決定することができる。例えば、複合体は、Q2またはβ-アミロイドの１方またはどちらにも親和性を有する系を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって分離し、そして／または精製することができる。複合体は次に、他の形のクロマトグラフィー、例えばセファクリルカラムおよび／またはモノＱカラムでの分離によって、さらに精製することができる。分離および／または精製後、標準的方法、例えばペプチドマッピング、配列決定、PAS反応（過ヨウ素酸‐シッフ反応）およびマトリックス介助レーザーデソープションイオン化‐飛行質量分析(flight mars spectrometry)(MALDI-TOF)を用いることによって、複合体を特性決定することができる。
【００２４】
Q2およびβ-アミロイドの複合体は、天然の系においてグリコシル化されることができる。複合体外のほとんどの環境下では、Q2またはβ-アミロイドのいずれも、グリコシル化されないと思われる。典型的には、複合体はグリコシル化され、例えば複合オリゴ糖を用いてアスパラギン残基にてN-グリコシル化される。
【００２５】
Q2濃度の検出
Q2およびβ-アミロイドの複合体ならびに未結合の成分Q2およびβ-アミロイドは、タンパク質、糖および／またはグリコシル化タンパク質の検出について公知の方法によって検出することができる。複合体は、穏やかにまたは適度に変性するゲル電気泳動で、約62kDの分子量を有し、Q2またはβ-アミロイドに対する抗体によって認識される。Q2またはβ-アミロイドを認識するポリクローナルもしくはモノクローナル抗体は、当技術分野で公知であり、標準の方法によって製造することができる。
【００２６】
そのような抗体は標識されるか、さもなければ標準のイムノアッセイにおいて使用することができる。好ましい標準のイムノアッセイとしては、ELISAアッセイ、免疫ブロット、サンドウィッチアッセイ、増強(enhanced)化学発光等を包含する。複合体またはその未結合成分を検出するさらなる方法としては、蛍光偏光アッセイ、カラムおよびアフィニティクロマトグラフィーによる標準のタンパク質精製、タンパク質分解性開裂、次いでエドマン(Edman)分解アッセイ、MALDI-TOFおよび飛行質量分析(flight mars spectrometry)を包含する。
【００２７】
生物試料中のQ2濃度を検出する方法は、アルツハイマー病に対する患者または対象の感受性を検出、測定、検査、診断、スクリーニング、またはさもなければ評価するための方法において使用することができる。ここで使用される「アルツハイマー病に対する感受性」という語は、対象または患者におけるアルツハイマー病の存在または不在、この疾病の症状の存在または不在、この疾病に至るもしくはこの疾病に関連する因子の存在または不在、この疾病を展開させる可能性の存在または不在等を包含する。ここで使用されるように、この疾病に至るもしくはこの疾病に関連する因子としては、β-アミロイドプラークの形成、アミロイド前駆体タンパク質のプロセシングにおける障害等を包含する。
【００２８】
ここで使用されるように、生物試料としては、β-アミロイドプラークの沈積、アミロイド前駆体タンパク質のプロセシングにおける障害、アルツハイマー病、アルツハイマー病を展開する見込み等についてスクリーニングされる必要があるかまたは、それらに罹りやすいかもしくは罹っていると疑われる動物またはヒトからの生物材料、例えば組織、細胞もしくは流体試料を包含する。生物試料はまた、β-アミロイドプラークもしくは凝集物を形成する傾向またはアミロイド前駆体タンパク質を不適当にプロセシングする傾向について検査される、実験動物、細胞または培養物からの実験室試料を包含する。
【００２９】
例えば組織または細胞を含む生物試料、例えば肝臓、血小板、血清または皮膚は、生きている動物または患者から、針生検、静脈穿刺または皮膚をこすること(skin scraping)のような方法によって回収することができる。本発明の１つの態様においては、生物試料は、ヒトまたは動物の中枢神経系からの生物材料を包含する。好ましい生物試料としては、生きている動物または患者においてアルツハイマー病に対する感受性を評価するための脳脊髄液からの生物材料を包含する。脳脊髄液は、手術中の脊椎穿刺によって、または当業者に公知の種々の方法のうちの任意の方法によって、回収することができる。
【００３０】
一般に、正常なQ2に対するQ2レベルの低下は、アルツハイマー病に対する感受性と相関する。Q2レベルは、生物試料中の遊離のQ2のレベル、β-アミロイドとの複合体において結合したQ2のレベル、遊離のQ2と結合したQ2とを合わせたレベル、および好ましくは全Q2のレベルを包含する。Q2レベルの低下は、アルツハイマー病に対する感受性の上昇と相関する。ここで使用されるように、感受性の上昇は、アルツハイマー病、この疾病の少なくとも１つの症状、この疾病に至るかまたは関連する少なくとも１つの因子、この疾病を展開させる可能性等が患者もしくは対象に存在することがないというよりありそうなことをいう。
【００３１】
例えば、１つの実施態様においては、正常なQ2レベルに対して少なくとも35％のQ2レベルの低下は、アルツハイマー病を展開させる可能性100％と相関する。別の実施態様においては、動物またはヒトにおけるβ-アミロイドの凝集は、生物試料中のQ2レベルを測定することによって検出できる。正常なQ2レベルに対するQ2レベルの低下は、β-アミロイドの凝集の増加の可能性の増加と相関し、かつそのことを示す。β-アミロイドの凝集を検出することによって、β-アミロイドプラークの形成がまた検出される。
【００３２】
アルツハイマー病に対する感受性はまた、遊離のQ2レベル、β-アミロイド濃度および複合体中のQ2：β-アミロイドのレベルを相関させることによって決定することができる。正常なQ2レベルに対するQ2レベルの関連性のある低下は、約35％、好ましくは約50％、より好ましくは約65％の低下を含む。そのような関連性のある低下は、アルツハイマー病に対する感受性の増加、例えばアルツハイマー病に至るかまたはこれと関連する因子、特にβ-アミロイドプラーク形成、アルツハイマー病、アルツハイマー病と関連する症状、アルツハイマー病の展開等と相関する。
【００３３】
正常なQ2濃度に対するQ2濃度の低下は、Q2濃度を神経精神病学的機能測定と比較することによって、アルツハイマー病に特有の症状と相関され得る。神経精神病学的機能測定は、例えば神経精神病学的評価、全病歴および物理的検査を行うことによって、かつこの情報を、例えばDSMIII-RおよびNinCDS-ADRDAにより定義される基準に基づいて評価することによってなされ得る。
【００３４】
幾つかの場合には、ほぼ正常なQ2レベルを有する個体がまた、アルツハイマー病に罹りやすいことがある。例えば、アポＥ4対立遺伝子以外は正常なQ2レベルを有する個体は、アルツハイマー病に対しての増加した感受性を有する。アルツハイマー病について他の危険因子があり得、これは正常なQ2レベルの存在中で、アルツハイマー病に対する感受性の増加をもたらす。
【００３５】
Q2レベルの増加
Q2レベルは、Q2発現を増加するのに適当な薬剤を投与することによって、またはQ2を投与することによって増加させることができる。Q2の投与は、例えば脳脊髄液中のQ2レベルを増加させるやり方で、このタンパク質の形態または前駆体でのQ2を投与することを含む。Q2レベルを増加させることによって、Q2とβ-アミロイドとの複合体の量を増加させ、適当にプロセシングされたβ-アミロイドおよび／またはアミロイド前駆体タンパク質のレベルを増加させ、そして／または対象においてβ-アミロイドプラークの量を減少させることができる。
【００３６】
例えば注射のような方法、脳室内ポンプ等の方法によって、製薬上許容される賦形剤中のQ2を脳脊髄液へ投与することができる。あるいは、Q2をコードする前駆体遺伝子またはベクターとしてQ2を投与することができ、これは、中枢神経系のために標的にされ、Q2の発現および濃度増加を提供することができる。Q2をコードすることができ、かつタンパク質を発現するベクターおよび／または標的脳細胞は、当業者に公知である。
【００３７】
好ましくはQ2または、Q2発現を促進するのに適当な薬剤を、例えば脳脊髄液中のQ2レベルを増加させ、Q2とβ-アミロイドとの複合体の量を増加させ、適当にプロセシングされたβ-アミロイドそして／またはアミロイド前駆体タンパク質の濃度を増加させ、および／または対象においてβ-アミロイドプラークの量を減少させる等に有効な量で、投与する。さらには、そのような投与は、アルツハイマー病の進行または結果に影響を及ぼすことができる。Q2または、Q2発現を促進するのに適当な薬剤の「有効な量」は、アルツハイマー病の症状および／または潜在する原因（Q2レベル、適当にプロセシングされたβ-アミロイドおよび／またはアミロイド前駆体タンパク質の濃度および／または、対象におけるβ-アミロイドプラークの量等を含む）を予防、治療、減少および／または改善するのに十分な量である。
【００３８】
幾つかの場合には、「有効な量」は、疾病の症状を除去し、おそらく疾病それ自体を克服するのに十分である。本発明においては、「処置」および「治療」等の語は、存在する疾病の軽減、進行を遅らせる、防御、弱化または治癒をいう。ここで使用される「予防」は、そのような脳の疾病または障害の開始を延期する、遅延する、遅くする、阻止する、またはさもなければ止める、減少させるまたは改善することをいう。
本発明は、以下の実施例についてさらによく理解され得る。これらの実施例は、本発明の特定の実施態様を説明することを意図され、本発明の範囲を限定するものとして意図されない。
【００３９】
実施例
実施例１．動物の肝臓ミクロソームにおけるシャペロンへの老化の影響の特徴付け
シャペロン濃度への老化の影響を測定して、年齢に関係する疾病、例えばプラークの沈積またはアルツハイマー病に関連し得る、濃度の減少を証明した。
【００４０】
材料および方法
この研究において使用した動物は、ハーラン  ラボラトリーズ(Harlan Laboratories)（Madison, WI）からの21日齢で購入したオスの特定の病原体を有さないスプラグ-ダウレイ(Sprague-Dawley)ラットであった。ラットは、その残りの生涯を、窓のない制御された環境、「従来の状態(state-of-the-art)」、22℃±2℃の一定温度で光サイクルが12時間オンで12時間オフの柵で囲んだ施設に収容された。湿度は50％±20％に維持した。
【００４１】
各ケージに２匹の動物を収容し、動物は食物と水に自由に接近した。試験動物を入れている各ケージは、空気フィルターカバーを備えていた。10％のケージがフィルターを有していなかった。フィルターなしのケージの動物は、滅菌条件に破損があるかどうかを決めるための「標識」として維持された。これらの動物は、日常的に新しいバッチの若い動物と入れ換えた。それらの動物は死亡率の増加を示すことなく、コロニーが病原体を有していないことを示す。
【００４２】
ケージを清掃したときに週に一度、および動物の体重測定をしたときに４〜６週間毎に、すべての動物をケージから取り出した。クリーン条件下でこれらの手順を行った。動物室に入る人はみな、滅菌手袋、ガウンおよびマスクを着けた。動物は、炭水化物が40％でん粉および25％ショ糖として供給されたこと以外はAIN76A推奨に基づいて給餌された（バイオサーブ(BioServe)、Frenchtown, NJ）。炭水化物組成物は、粉末の代わりにペレットからなるものへと食餌を好ましく適応させるために、かつ高ショ糖の食餌に関連する肥満の発生率を減らすために、変えられた。クエン酸カリウム（6.5％）を添加して、脈管系の疾患を防止した。食餌条件は、成獣ラットについてのNRC栄養標準（NRC1978）に合っていた。
【００４３】
動物は、成獣体重約600gに達し、維持した（図１）。しかしながら、750日齢後は、その平均体重は475gに低下した。研究の最後まで生き残った動物の平均体重のこの低下は、全個体群の平均体重と同じであった。成獣の平均肝重量は17.5gであり、その全成獣生涯の間そのままであった（図２）。肝臓1g当たりのミクロソームタンパク質のミリグラム量は、加齢に伴う有意の変化を示さなかった（図３）。約500日齢までは有意の死亡率はなかった（図４）。500日後、死亡率は96.1日毎に倍加してゴンペルツ効果(Gompertz effect)を示した（図５）。ヒトは、10年毎に死亡率の同様の倍加を示す。
【００４４】
最初の18ヶ月間、６週間の間隔で６匹の動物を殺した。残りの12ヶ月間、３ヶ月の間隔で動物を殺した。動物のおよそ３分の１から組織試料を得た。残りは自然の原因から死亡した。
【００４５】
スリバスタバ(Srivastava)ら、J. Biol. Chem., 265:8392-99 (1990)に従って分画遠心分離によって、ミクロソームを製造した。シャペロンの濃度決定のために、ミクロソーム懸濁物を凍結し、-70℃に維持した。以下のシャペロンを調べた：BiP、カルレチクリン、カルネキシン、ERp72、Q2およびQ5。当分野で公知の方法によってシャペロンを製造した。ミクロソームのシャペロン含量は、ゾウ(Zhou)ら、Arch. Biochem. Biophys., 322:390-94 (1995)；ゾウ(Zhou)ら(1996)；およびチェン(Chen)ら、Biochemistry, 25:8299-8306 (1996)に従って免疫ブロッティングにより決定した。プールしたミクロソーム懸濁物を各ゲル上でランし、標準として使用した。ミクロソームのシャペロン含量は、精製したシャペロンに対して較正した。個々のシャペロンについて線状範囲でイムノアッセイを行った。
【００４６】
シャペロンは、当分野で公知の方法によって製造した。スリバスタバ(Srivastava)ら、J. Biol. Chem., 265:8392-99 (1991)；チェン(Chen)ら、Biochemistry, 25:8299-8306 (1996)。
【００４７】
タウビン(Towbin)ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:4350-4354 (1979)の方法に従って、免疫ブロッティングを行った。また、スリバスタバ(Srivastava)ら、J. Biol. Chem., 265:8392-8399 (1991)；ゾウ(Zhou)ら、Arch. Biochem. Biophys., 322:390-394 (1995)；ゾウ(Zhou)ら、Chem. Res. Toxicol., 9:1176-1182 (1996)およびチェン(Chen)ら、Biochemistry, 25:8299-8306 (1996)参照。このタンパク質をまず、SDS-PAGEにより分離した。レムリ(Laemmli), Nature, 227:680-685 (1970)。このタンパク質は次に、PVDF膜（インモビリン(Immobilin) P, ミリポア(Millipore)社）に移され、膜は、ニワトリ抗シャペロン抗体と反応された。この次に、アルカリホスファターゼに結合したヤギ抗ニワトリIgY抗体と反応させた。
【００４８】
使用した指示薬色素は、ニトロブルーテトラゾリウムと5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルホスフェートの組合せである（バイオラッド(BioRad)、Richmond CA）。平らなベッドスキャナー（UMAX、Taiwan,R.O.C.）にてバンドの密度を測定し、パワー  PC（アップルコンピュータ(Apple Computer)）にてNIHイメージ(Image)（バージョン1.61）を用いて分析した。対照のミクロソームの懸濁物を含む各ゲル上の３つのチャンネルの平均密度に対応する種々の濃度との比較により濃度を決定した。ミクロソーム標準を、幾つかの濃度の精製したタンパク質に対して較正した。ミクロソーム中のシャペロンの測定は、すべてイムノアッセイの線状範囲内にあった。
【００４９】
BiPを除くすべてのシャペロンに対するポリクローナル抗体を、ダミアニ(Damiani)ら、J. Biol. Chem., 263:340-343 (1988)およびチェン(Chen)ら、Biochemistry, 25:8299-8306 (1996)により記載された、卵を産んでいるメンドリにおいて展開した。これらの抗体の特異性は、先の研究において実証されていた。スリバスタバ(Srivastava)ら、J. Biol. Chem., 265:8392-8399 (1991)；ゾウ(Zhou)ら、Arch. Biochem. Biophys., 322:390-394 (1995)；ゾウ(Zhou)ら、Chem. Res. Toxicol., 9:1176-1182 (1996)；チェン(Chen)ら、Biochemistry, 25:8299-8306 (1996)。
【００５０】
BiPに対する抗体は、ストレスゲン(StressGen)(Vancouver, BC, Canada)から得た。さらには、カルレチクリンに対して製造した抗体をまた、カルネキシンのためのプローブに使用した。というのは、カルネキシンの内腔部分は、カルレチクリンと高度に相同であるからである。ゾウ(Zhou)ら(1996)；チェン(Chen)ら(1996)；カラ(Cala)ら(1993)。
【００５１】
結果
これらの研究は、表１および図1〜13に報告された結果を生じた。特に、図６は、ラットが加齢するにつれてQ5濃度の低下を示し；図７は、ラットが加齢するにつれてストレス応答性に対するQ5濃度の低下を示し；図８は、ラットが加齢するにつれてQ2濃度の低下を示し；図９は、ラットが加齢するにつれてストレス応答性に対するQ2濃度の低下を示し；図10は、ラットが加齢するにつれてERp72濃度の低下を示す。図11は、ラットが加齢するにつれてBiP濃度の低下を示し；図12は、ラットが加齢するにつれてカルネキシン濃度の低下を示し；図13は、ラットが加齢するにつれてカルレチクリン濃度に有意の低下を示さない。
【００５２】
【表１】
0004571310.tif 000002
【００５３】
考察
ミクロソームの６つのシャペロンの含量への老化の影響は、著しく異なるパターンを示した（図６〜13；表１）。最も異常なパターンは、Q5（図６；表１）、Q2（図８；表１）およびBiP（付録図11；表１）で見られた。Q5の構成的濃度は最も若い動物において最高であり、動物が成熟に達したときに51％低下を示した（点線、図６）。このパターンは、成長および増殖に不可欠の成分について予測される。
【００５４】
成熟に達すると肝細胞はＧ0期に入るので、これらの細胞は、新しい膜成分のためにはるかに少ない要求を有する。それゆえに、観察されるように、膜合成に関連するシャペロンが有意の減少を示すことが予想される。200日齢後、Q5含量はゆっくりであるが安定した低下を示した。Q5はまた、顕著な季節的変動を示し、真冬および真夏に一致するピークを有する（図６）。構成的濃度が引かれ、残りが再プロットされるときに、このことはより明らかに説明される（図７）。
【００５５】
このリズムは、一年で最もストレスの多い季節と一致する。かくして、周期的変動は、それぞれのシャペロンの「ストレス応答性」を示す。このストレスは、一年中30〜70％の範囲にある湿度変化から生じた。最初の冬の初期のピークは、200日齢まで観察された非常に高い構成的濃度に由来する次の夏に比べて、著しく鈍い（図６）。それ故に、細胞はすでにほとんど最大量のそれぞれのシャペロンを生成していた。構成的濃度はもっと後の齢で低下するが、動物はなお著しいストレス応答を示した（図７）。他の研究によって示唆されたように、ストレス応答は加齢に伴って減少し、874日までに73％低下を示す。
【００５６】
Q2は、構成的濃度以外はQ5と同様のパターンを示した。Q2含量は、動物が成熟に達するにつれて増加する構成的濃度を示し、次いで、84日齢〜874日齢で32％低下を示した（図８）。濃度はまたストレス応答を示した。構成的濃度が引かれるとき、濃度は、巡る(circum)半年ごとのリズムを有する。これらのピークはまた、真冬および真夏に対応する（図９）。このストレス応答は、加齢に伴って71％低下を示す。
【００５７】
年齢に対応するQ2対Q5の構成的濃度の比の変化は重要である。Q5は、発生期の変性されたタンパク質のそれらの天然の３次構造への配置および、ジスルフィド結合の形成を触媒する。その上、それはトランスフェラーゼではないが、Q5はまた、膜および分泌タンパク質のN-グリコシル化のために必要とされる。近年の研究は、Q2がN-グリコシル化タンパク質の膜への挿入に関与することを示した。N-グリコシル化タンパク質の膜への挿入のための最高の要求は、動物が急速に成長している早い年齢にある。肝臓がその成熟重量に達した後、細胞は、もはや成長または増殖していないので、一定の環境条件下で、挿入を助ける高濃度のタンパク質についてずっと少ない必要性を有する。かくして、Q2は、少なくとも若い動物において、肝細胞における主たるシャペロンではない。
【００５８】
Q2およびQ5とは違って、ERp72は季節的変動を示さなかった。しかしながら、Q5と同様に、若い動物は最高濃度を有し、加齢に伴って30％低下を示した（図10；表１）。ERp72の正確な機能は明確に定義されていないが、それはシャペロンであることが知られており、動物界で最も高度に保存されたタンパク質の１つである。ヒトのERp72は聞くところによれば、線虫、セノルハブディティス  エレガンス(Caenorhabditis elegans)に一致する。任意のそのような高度に保存されたタンパク質が、細胞代謝において不可欠の役割を果たすようである。多分、このことは、そのシャペロン活性に関連する。
【００５９】
BiPは、不適当に編集されたタンパク質のスカベンジャーとして主として役立つと考えられるHSP 70族の一員である。BiPは、Q2およびQ5と同様のパターンを示し（図11）、加齢に伴う37％の低下および季節的変動を有する。
上記したシャペロンのすべてと違って、カルレチクリン（細胞機能のために不可欠のシャペロン）は、加齢に伴う有意の低下を示さなかった（図12）。なお、その膜結合同族体であるカルネキシンは、著しい低下を示したが、季節的変動は示さなかった（図13）。さらには、Q2と同様に、カルネキシンは若い動物において低い濃度を有し、84日齢でピークに達し、次いで、874日齢までに32％低下した。タンパク質合成におけるこのシャペロンの役割が広く研究され、膜および分泌タンパク質の両方の合成に不可欠である。
【００６０】
結論
ミクロソームタンパク質ミリグラム当たり上記のデータが報告されるので、カルレチクリンを除くそのすべてが、加齢に伴って、特定の含量における著しい統計的に有意の低下（30〜50％）（R2＝0.9586〜0.8414）を示した（すなわち、これらのタンパク質は、肝臓のERにおける他のタンパク質との釣り合いを失って低下していた）。さらには、この低下は、その機能が加齢に伴って比較的よく保存されたままであると考えられる器官、肝臓で生じた。CNS、免疫系、内分泌器官または腎臓と違って、肝臓は、重量を減らしもせず、明白に機能を損なうこともない。例えば、肝臓により生成される一次分泌タンパク質であるアルブミンの血清濃度は、タンパク質合成能力の明かな喪失にもかかわらず、加齢に伴って低下しない。
【００６１】
実施例２．ヒト脳脊髄液中のシャペロンの同定
シャペロンは、広範囲の分泌タンパク質と可溶性複合体を形成する。肝臓のミクロソームにおけるシャペロンの動物での研究は、動物が年をとるにつれて幾つかのシャペロンの濃度が低下することを示したので、これらのシャペロンのどれかが、ヒトの脳脊髄液と関連するかどうか、およびそれらがアルツハイマー病において役割を演じるのかどうかを決定することが重要である。
【００６２】
材料および方法
脳脊髄液試料は、脊髄麻酔のために脊髄穿刺を受けた、または髄膜炎についてのテストを受けた正常な健康な患者からの、アネステシア  サービス  オブ  ザ  VAMC  アンド  ザ  ラボラロリー  サービス(Anesthesia Service of the VAMC and the Laboratory Service)、リージョンズ  メディカル  センター(Regions Medical Center)、セント  ポール(St. Paul)、MNにより提供された臨床廃棄物であった。脳脊髄液試料を採取した患者は、３人の幼児、１人の若い成人、および４人の年配者の患者を含んでいた。
【００６３】
脳脊髄液は、６つのシャペロン（ERp72、カルネキシン、カルレチクリン、BiP、Q2および、Q5の形態のチオール：タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼ(Q5)）の存在について試験された。ERp72、カルレチクリン、カルネキシン、Q2およびQ5は、当技術分野で公知の方法により製造された。スリバスタバ(Srivastava)ら、J. Biol. Chem., 265:8392-99 (1991)；チェン(Chen)ら、Biochemistry, 25:8299-8306 (1996)。
【００６４】
実施例１に記載された方法に従う調製物を免疫ブロットすることにより、シャペロン含量を測定した。脳脊髄液の対照試料を含む各ゲル上で３つのチャンネルの平均密度と種々の濃度を比較することによって、シャペロンの濃度を決定した。脳脊髄液の標準液を、幾つかの濃度の標準脳脊髄液に対して較正した。脳脊髄液中のタンパク質の測定はすべて、イムノアッセイの線状範囲内にあった。すべてのシャペロンに対するポリクローナル抗体を展開し、または実施例１の方法にしたがって得た。
免疫ブロットをまた、β-アミロイド1-42に対する抗体（AMY-33；ザイメッド(Zymed)、South San Francisco, CA）と共にインキュベートした。
【００６５】
結果
Q2だけが、ヒト脳脊髄液中に同定された。存在するとしたら、他のシャペロンの濃度は検出不能であった。Q2は、分子量約62kDaに対応する広がったバンドを示した（図14A、レーン3-7および9-14）。ヒト脳脊髄液を、ラットの肝臓ミクロソームと比較した。ラットのミクロソームは、分子量約57kDaに対応する鋭いバンドを示した（図14A、レーン2）。同様に、精製したQ2は、分子量57kDaに対応する鋭いバンドを示した（図14A、レーン8）。Q2の同一性を、Q2に対するウサギモノクローナル抗体（GRP58、ストレスゲン(StressGen)、Vancouver、B.C.）を用いて確かめた（示されていない）。
β-アミロイド1-42に対する抗体は、ラットの肝臓ミクロソームと反応した（図14B、レーン2）が、精製したQ2とは反応しなかった（図14B、レーン8）。
【００６６】
考察
β-アミロイド1-42抗体のラット肝臓ミクロソームとの反応およびQ2に対する抗体のラット肝臓ミクロソームとの反応は、約57kDaに対応する分子量に同様のバンドを示したので、このことは、β-アミロイドおよびQ2が、肝臓において複合体を形成することを示唆する。さらに、β-アミロイド1-42抗体は精製したQ2と反応しなかったので、この結果は、交差反応性から生じない。
【００６７】
Q2抗体と共にインキュベートした免疫ブロットおよびβ-アミロイド1-42抗体と共にインキュベートした免疫ブロットは異なるパターンを示したが、このパターンはなお類似していた。このことは、２つが、密着複合体として脳脊髄液中に存在することを示唆する。
結論
シャペロンQ2は、ヒト脳脊髄液中に存在する。
【００６８】
実施例３．ヒト脳脊髄液からQ2およびβ-アミロイドの複合体の単離
Q2およびβ-アミロイドの複合体が見出され、ヒト脳脊髄液から分離された。これは、ヒト脳脊髄液およびアルツハイマー病におけるQ2の役割のよりよい理解へと導く。
【００６９】
材料および方法
実施例１にしたがって免疫ブロットを調製して、ヒト脳脊髄液に観察された62kDaのバンドを調べた。免疫ブロットをQ2に対するポリクローナル抗体と共にインキュベートし、第２の免疫ブロットをβ-アミロイド1-42に対するモノクローナル抗体（ザイメッド(Zymed)、South San Francisco, CAからの AMY-33）と共にインキュベートした。脳脊髄液について、62kDaに、広がったバンドがまた同定された。β-アミロイド1-42のモノマー形態についてのバンドは、分子量5.5kDaに対応していた。
【００７０】
ニワトリ抗β-アミロイド抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって、Q2：β-アミロイド複合体を分離した。あるいは、アフィニティークロマトグラフィーによる分離は、抗-Q2を用いて行った。実施例１に記載した免疫ブロッティングにより、複合体を同定した。セファクリルカラム、次いでモノＱカラムでのクロマトグラフィーによって、複合体をさらに精製した。
Q2の精製試料に対するポリクローナル抗体を、実施例１に記載した、卵を産んでいるメンドリにおいて展開した。合成β-アミロイド1-42抗体をまた、同じ方法によりニワトリにて調製した。
【００７１】
ニワトリ抗β-アミロイド抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィー、あるいは抗-Q2を用いたアフィニティークロマトグラフィーから溶出した脳脊髄液試料を、免疫ブロットにより調べた。Q2およびβ-アミロイドに対するニワトリ抗体は、CNBr-活性化セファロースに結合した。脳脊髄液試料を、NaCl(1M)のカラムに置いた。カラムを洗浄し、タンパク質をNaCl中のグリシン（.1M、pH9.0）で溶出した。
【００７２】
SDS-PAGEおよびPVDF膜上でのトランスブロッティング(transblotting)後に、免疫ブロットを行った。スリバスタバ(Srivastava)ら、J. Biol. Chem., 266:20337-20344 (1991)；チェン(Chen)ら、Biochemistry, 25:8299-8306 (1996)；タウビン(Towbin)ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:4350-54 (1979)。メルカプトエタノールの存在中で、試料を55℃に５分間加熱した。90℃に加熱されると、複合体は凝集し、バンドは観察されなかった。このバンドは、適当な、アルカリホスファターゼに結合したヤギ抗免疫グロブリン抗体と反応した。指示薬色素は、ニトロブルーテトラゾリウムと5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルホスフェートの組合せである（バイオラッド(BioRad)、Richmond CA）。バンド強度を、コンピュータスキャニングおよび分析によって定量した（NIHイメージ(Image)、バージョン1.60）。
【００７３】
結果
Q2に対する抗体と共にインキュベートしたブロットは、分子量約62kDaに対応する広がったバンドを示した（図15A、レーン3および4）。ブロットをβ-アミロイド1-42に対する抗体とともにインキュベートしたときに、同様のバンドがまた検出された（図15B、レーン3および4）。その上、抗β-アミロイド1-42は、Q2に対して反応性でないことが示された。
【００７４】
β-アミロイド1-42に対する抗体とともにインキュベートしたブロットはまた、分子量約62kDaに対応するバンドを示した。しかし、β-アミロイドは、約5.5kDaの分子量を有する。免疫ブロットにおいて同定された62kDaのバンドのほかに、抗-β-アミロイド1-42とともにインキュベートしたときに、27kDaのバンドが同定された（図15B、レーン3）。この27kDaのバンドはまた、合成β-アミロイド1-42を-20℃で数週間貯蔵した後、ゲル上でランしたときに観察された。したがって、これはβ-アミロイド1-42の５量体を表す。
【００７５】
モノクローナルβ-アミロイド抗体（AMY-33）は、β-アミロイドに対して高度に特異的であり、β-アミロイドの外側でフィブリノーゲンにのみ結合することが知られている。スターン(Stern)ら、FEBS Let., 245: 43-47 (1990)。しかし、この研究において観察された分子量バンドは、フィブリノーゲンを用いて観察されたものとは異なっていた。さらに、抗フィブリノーゲン抗体は、脳脊髄液中のどのタンパク質とも反応しなかった。
【００７６】
ブロットをスキャンすることによって、95％の免疫反応性β-アミロイドが62kDaのバンドと関連していたのに対して、5％は、より低い分子量のバンドと関連していたことが示された。このことは、高い結合親和性に対応する。
これらの結果は、100個のさらなる脳脊髄液試料で確かめられた。同じパターンの、Q2およびβ-アミロイドに対して免疫反応性のバンドが、100個の試料すべてについて観察された。
【００７７】
考察
β-アミロイドの脳脊髄液濃度へのアルツハイマー病の影響を調べたほとんどのグループは、種々のELISAまたは同様のアッセイを使用したが、５つは免疫ブロットの研究を行い、それぞれが著しく異なる結果を観察した。１つの研究は、低いMr免疫反応性バンドのみを観察した。イダ(Ida)ら、J. Biol. Chem., 271: 22908-22914 (1996)。なお本研究は、95％の免疫反応性β-アミロイド1-42が分子量62kDaに対応し、５％のみがより低分子量を有することを示した。他のグループは明らかに、それらの試料の調製において、本研究で使用されたより明らかに高度に変性する条件（多分、複合体を解離する）を使用した。本研究においては、複合体は解離されなかった。
【００７８】
他の研究は、異なる免疫反応性バンドを観察した。というのは、抗体は、ここで使用したものとは特異性において異なるものであり得たからである。スーベルト(Seubert)ら、Nature, 361: 260-63 (1993)；グロベク(Globek)ら、Neurosci. Let., 191: 79-82 (1995)。
【００７９】
β-アミロイドと高密度リポタンパク質との相互作用の研究において、62kDaの免疫反応性バンドが観察された（コーディノフ(Koudinov)ら、Biochem. Biophys. Res. Commun., 223: 592-97 (1996)；ギゾ(Ghiso)ら、Biochem. J., 293: 27-30 (1993)）が、62kDaのバンドを生じた画分から可溶性β-アミロイドは回収できず、62kDaのバンドを生じた画分は同定されず、または特性決定されなかった。
分子量62kDaに対応するバンドは、β-アミロイド1-42とQ2との間の複合体の表示である。このバンドは広がっているので、これは、β-アミロイド1-42とQ2との間の複合体がグリコシル化されていることを示唆する。
【００８０】
結論
Q2とβ-アミロイド1-42との複合体が、ヒト脳脊髄液中に見出された。β-アミロイド1-42に結合することによって、Q2は、溶液中にβ-アミロイド1-42を保持し、β-アミロイドの凝集および沈殿を防ぐのを助ける。
【００８１】
実施例４．Q2とβ-アミロイド1-42との複合体の特性決定
Q2とβ-アミロイド1-42との複合体を特性決定して、β-アミロイドプラークの形成の防止およびアルツハイマー病の防止におけるこの複合体の役割をよりよく理解した。
【００８２】
材料および方法
Q2とβ-アミロイドとの複合体を、実施例３において記載したように精製した。
複合体上の炭水化物部分の存在を、当業者に公知の方法によって決定した。特に、この複合体はPASと反応した。PASと反応した複合体を、ボロネート(boronate)カラムを通して溶出した。
【００８３】
結果
複合体がPASと反応したときに、分子量62kDaに対応するバンドが同定された。さらに、PASと反応した複合体はボロネート(boronate)カラムに結合し、これは、炭水化物部分の存在を示唆する。
【００８４】
考察
複合体のPASとの反応からの結果は、実施例３において記載した分子量62kDaに対応する広がったバンドの観察と一致する。これらの結果はまた、Q2がレクチンのような特性を有し、Q2はN-グリコシル化された後でのみタンパク質に結合し得ることを示した他の研究と一致する。オリバー(Oliver)ら、Science, 275: 86-88 (1997)；エリオット(Elliott)ら、J. Biol. Chem., 272: 13849-13855 (1997)。N-グリコシル化は、小胞体で合成される多くのタンパク質の翻訳後のプロセシングにおいて重要であり得る。スズキ(Suzuki)ら、J. Biol. Chem., 272: 10083-10086 (1998)。
【００８５】
複合体がN-グリコシル化される見込みはまた、SDS-PAGEおよび免疫ブロット分析のために試料を可溶化するのに使用される適度に厳しい変性条件下で、複合体が比較的安定であったという観察によって支持される。
【００８６】
結論
Q2およびβ-アミロイドは、複合体でないときに、グリコシル化されることは示されなかったが、これらの結果は、Q2：β-アミロイドが複合体としてグリコシル化されることを示唆する。
【００８７】
実施例５．β-アミロイドプラークの検出ならびにQ2濃度および／またはアポＥ遺伝子型に対するプラークの存在の相関関係
正常のQ2濃度に対してQ2濃度が低下するときには、人は、例えばβ-アミロイド凝集の発生、アルツハイマー病の感受性、アルツハイマー病に関連する症状の発生、またはアルツハイマー病の展開の可能性が増加し得る。この相関関係を理解することが望ましい。
【００８８】
方法および材料
脳脊髄液試料および脳試料を、剖検検体から採取した。検体は、研究に参加した21人の修道女から得、彼女らの健康状態および精神運動活性は、彼女らの死まで評価され、監視された。スノードン(Snowdon), JAMA, 277: 813-17 (1997)。脳脊髄液試料は、採取した時点で凍結し、-70℃で貯蔵した。
【００８９】
脳脊髄液試料を、実施例１に記載したようにして（幾つか変更点がある）シャペロンの存在について調べた。SDS-PAGEおよびニトロセルロース膜上でのトランスブロッティング後に、免疫ブロットを行った。レムリ(Laemmli)、Nature, 227: 680-85 (1970)；タウビン(Towbin)ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:4350-54 (1979)。SDSおよびメルカプトエタノールの存在中で、試料を55℃に5分間加熱した。90℃に加熱されると、複合体は凝集し、バンドは観察されなかった。第１の研究において、バンドは、興味ある分子について特異的な抗体と反応され、次いで適当な、アルカリホスファターゼに結合したヤギ抗免疫グロブリン抗体と反応された。
【００９０】
興味ある分子について特異的な抗体は、カルモジュリン、カルネキシン、BiP、ERp72、Q2、Q5および合成β-アミロイド1-42に対するポリクローナル抗体であった。BiPおよびQ2に対する抗体は、ストレスゲン(StressGen)（Vancouver,B.C.）から購入した。β-アミロイド1-42に対する抗体は、ザイメッド(Zymed)（AMY-33；South San Francisco, CA）から購入した。すべての他の抗体は、実施例１に記載したようにして卵を産んでいるメンドリにおいて調製した。使用した指示薬色素は、ニトロブルーテトラゾリウムと5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルホスフェートの組合せであった（バイオラッド(BioRad)、Richmond CA）。
【００９１】
第２の研究において、抗-Q2あるいは抗-β-アミロイド1-42を用いたアフィニティクロマトグラフィーから溶出した脳脊髄液試料を、免疫ブロットによって調べた。抗体をまず、CNBrで活性化したセファロースに結合させた。この樹脂をNaCl(1M)中に懸濁させ、1mlのCSF試料と混合し、4℃で一晩インキュベートした後、カラムに注いだ。溶出物が280nmに吸収を持たなくなるまで、NaClでカラムを洗浄した。結合したタンパク質をNaCl中のグリシン（0.1M、pH9.0）で溶出した。上記した免疫ブロッティング法にしたがって、Q2およびβ-アミロイド1-42を同定した。
【００９２】
第３の研究において、ペルオキシダーゼ反応を用いた増強(enhanced)化学発光（RPN2106；アメルシャム  ライフ  サイエンス(Amersham Life Science), Piscataway, NJ）によって、免疫ブロットからQ2の濃度を測定した。化学発光写真フィルムのコンピュータスキャニングによって、バンド強度を定量し、NIHイメージ(Image)（バージョン1.60）によって分析した。
【００９３】
修道女から得た脳の試料を調べて、β-アミロイドプラークの総数（広がったタイプおよび神経炎のタイプのプラークの両方を含む）を測定した。プラークの総数は、ネオコルテックスの前頭葉、側頭葉および頭頂葉のビールショースキー(Bielschoasky)染色された切片の５つの最も厳しく割当てられた顕微鏡視野から測定した。
修道女から得た脳の試料をまた調べて、対象のアポＥ遺伝子型を決定した。スノードン(Snowdon)ら、J. Am. Med. Assoc., 277: 813-17 (1997)。
【００９４】
結果
化学発光アッセイは、約5〜45ng／ml脳脊髄液でのQ2濃度について線形であった。
図16および表２は、Q2濃度とプラークの総数の間の有意の相関関係を示す（r=-0.52、p＜0.02、95％CI-0.25〜0.79、スペアマン(Spearman) 順位相関係数試験による）。
【００９５】
考察
修道女からの脳脊髄液試料は、３つの別個の群を示した。第１の群は、豊富な数のプラークおよび17ng/ml未満のQ2を有していた（21人のうちの6人）。第２の群は、正常な濃度のQ2および豊富な数のプラークを有していた（21人のうちの8人）。第３の群は、プラークがほとんどないか全くなく、正常な濃度のQ2を有していた。しかし、第３の群は、アポＥ2またはアポＥ3対立遺伝子のみを示した唯一の群である（表２）。
【表２】
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【００９６】
実施例３に記載されたように、約5％のβ-アミロイド1-42が、正常の対象において溶液中で遊離である。幾つかの研究は、アポＥ4が、アポリポタンパク質の他のイソ型より容易にβ-アミロイドとの不溶性複合体を形成することを示した。モイア(Moir)ら、Biochemistry, 38: 4595-4603 (1999)。表２に示された結果は、アポＥ4遺伝子型を有する個体は、他の遺伝子型より低い遊離β-アミロイド濃度でプラークを形成し得ることを示唆する。
【００９７】
図16および表２に示されたデータは、アポＥ4遺伝子型を有さず、かつ正常なQ2濃度を有する人が、プラークを全く有していないかわずかしか有してないことを示す。なお、Q2濃度が低い人は、アポＥ遺伝子型に関係なく、豊富な量のプラークの発生が増加した。すなわち、正常値に対してQ2濃度の低下を示した、研究した100％の人が、豊富な量のプラークを有していた。正常なQ2濃度を有するがアポＥ4対立遺伝子を有する人はまた、豊富な量のプラークの発生が増加した。しかしながら、正常なQ2濃度および豊富な量のプラークを有する人の半分だけが、アポＥ4対立遺伝子を有していたことに注意すべきである。かくして、第３の遺伝子またはタンパク質がまた、アルツハイマー病の展開に関係し得る。
【００９８】
修道女からの検体をまた、12人の若者（年齢3〜16歳）からの検体および12人のアルツハイマー病でない年配者（年齢66〜82歳）からの検体と比べた。若い対象からのQ2濃度（27.3±1.2ng/ml）および年配の対象からのQ2濃度（29.9±1.6ng/ml）は、老人プラークがわずかしかないかまたは全くない修道女で観察されたQ2濃度（24.6±1.9ng/ml）と同じであった。
【００９９】
結論
この研究は、少なくとも１つのアポＥ4対立遺伝子を有する個体および17ng/ml未満のQ2濃度を有する個体においては、アポＥ4遺伝子型と無関係に、アルツハイマー病の発病率の増加を証明する。
本発明は、種々の特定のかつ好ましい実施態様および技術について記載されてきた。しかしながら、本発明の意図および範囲内にありながら、多くの変形および変更がなされ得ることが理解されるべきである。
本明細書におけるすべての刊行物および特許出願は、本発明が属する分野の当業者のレベルの表示である。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、年齢の関数として、ラットの体重を示す。
【図２】  図２は、年齢の関数として、ラットの肝臓重量を示す。
【図３】  図３は、年齢の関数として、肝臓1g当たりのミクロソームタンパク質の量を示す。
【図４】  図４は、年齢の関数として、ラットの生存率を示す。
【図５】  図５は、年齢の関数として、ラットの死亡率を示す。
【図６】  図６は、年齢の関数として、ラット肝臓のミクロソームQ5濃度を示す。
【図７】  図７は、年齢の関数として、ラットのストレス‐応答性Q5濃度を示す。
【図８】  図８は、年齢の関数として、ラット肝臓のミクロソームQ2濃度を示す。
【図９】  図９は、年齢の関数として、ラットのストレス‐応答性Q2濃度を示す。
【図１０】  図10は、年齢の関数として、ラット肝臓のミクロソームErp72濃度を示す。
【図１１】  図11は、年齢の関数として、ラット肝臓のミクロソームBiP濃度を示す。
【図１２】  図12は、年齢の関数として、ラット肝臓のミクロソームカルネキシン(calnexin)濃度を示す。
【図１３】  図13は、年齢の関数として、ラット肝臓のミクロソームカルレチクリン(calreticulin)濃度を示す。
【図１４】  図14Aは、Q2に対するポリクローナル抗体を用いた生物試料の免疫ブロットを示す。
図14Bは、β-アミロイド1-42に対するモノクローナル抗体を用いた生物試料の免疫ブロットを示す。
【図１５】  図15Aは、Q2に対するポリクローナル抗体を用いた生物試料の別の免疫ブロットを示す。
図15Bは、β-アミロイド1-42に対するポリクローナル抗体を用いた生物試料の別の免疫ブロットを示す。
【図１６】  図16は、実施例５に記載した修道女の研究における参加者から測定した老人プラークのスコアと比べた、Q2の脳脊髄液濃度を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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