(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１７記載の塩基配列を有し、かつアスパルトキナーゼをコードするＤＮＡ。
【請求項２】
請求項１記載のＤＮＡをベクターに組み込んで得られるコリネ型細菌で複製可能な組換え体ＤＮＡ。
【請求項３】
請求項１記載のＤＮＡを染色体上に有するコリネ型細菌。
【請求項４】
請求項２記載の組換え体ＤＮＡを保有する、コリネ型細菌に属する形質転換株。
【請求項５】
形質転換株が、コリネバクテリウム・グルタミカムTf-5（FERM BP-6689）である、請求項４記載の形質転換株。
【請求項６】
請求項３記載のコリネ型細菌、請求項４および５記載の形質転換株から選ばれる微生物または形質転換株を培地に培養し、培養物中にＬ−リジンを生成蓄積させ、培養物からＬ−リジンを採取することを特徴とする、Ｌ−リジンの製造法。
【請求項７】
請求項１記載のＤＮＡにコードされるアスパルトキナーゼ。
【請求項８】
配列番号１８に記載のアミノ酸配列を有するアスパルトキナーゼ
【請求項９】
請求項８に記載のアスパルトキナーゼをコードするＤＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明はコリネ型細菌由来の新規なアスパルトキナーゼ、該酵素をコードするDNA、該DNAを含有する組換え体DNA、該組換え体DNAを保有するコリネ型細菌、あるいは該DNAを染色体上に保有するコリネ型細菌、および該微生物を培養することを特徴とするL-リジンの製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
コリネバクテリウム属に属する微生物を用いた発酵法によるＬ−リジンの製造法としては以下の方法が知られている。
（１）Ｌ−リジン生産変異株を用いる方法としては、例えば、S-（2-アミノエチル）-システイン（以下、AECと略す）耐性変異株（アミノ酸発酵、1986年、273頁、学会出版センター）、Ｌ−ホモセリン要求変異株（アミノ酸発酵、1986年、273頁、学会出版センター）、呼吸系阻害剤耐性変異株（特公平5-55114）、ピリミジンアナログ耐性変異株（特開昭59-88094）、プリンアナログ耐性変異株（特公昭63-062199）等が知られている。
（２）遺伝子組換え技術を用いた組換え菌による方法としては、コリネバクテリウム属に属する微生物において、自律複製し、選択可能な表現型を与えるマーカー遺伝子を有するベクタープラスミド、およびそれを効率良く該細菌に導入する方法が開示されており、それらを用いてＬ−リジンを含む各種Ｌ−アミノ酸の合成に関与する遺伝子の細胞内コピー数を増し、該アミノ酸を効率良く製造する方法が開示されている（特公平5-11959、特公平7-55155）。
【０００３】
Ｌ−リジンの生合成制御としては、 Ｌ−アスパラギン酸からアスパラチルリン酸の生合成を触媒するアスパルトキナーゼ（以下、ＡＫと略す）に対するＬ−リジンとＬ−スレオニンによる協奏的フィードバック阻害が最も良く知られている。このフィードバック阻害が解除された変異型ＡＫ（以下、脱感作型ＡＫと略す）をコードする遺伝子（以下、脱感作型ＡＫ遺伝子と略す）を有するコリネバクテリウム属に属する微生物ではＬ−リジンを菌体外に分泌することが知られている（アミノ酸発酵、1986年、273頁、学会出版センター）。変異の塩基配列情報があれば、試験管内で塩基配列を望みのものに変換する技法（例えば、ストラタジーン社QuickChangeサイトダイレクテッド・ミュータジェネシス・キットを用いる方法）と組み合せ、野生型遺伝子を変異型に変換しうる。最近、上記脱感作型ＡＫ遺伝子の塩基配列レベルの解析が報告されている［Journal of Bacteriology, 175, 4096 (1993)； Molecular Microbiology 5, 1197 (1991)； 特開平6-62866］。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本願発明の課題は、コリネ型細菌におけるＬ−リジン生合成の鍵酵素であるＡＫをＬ−リジンおよびＬ−スレオニンによる協奏フィードバック阻害およびリジン単独によるフィードバック阻害から解除された脱感作型に改変し、Ｌ−リジンの生産に有利なものにすることである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本願発明者らは、コリネ型細菌による効率的なＬ−リジンの生産法に関して鋭意研究した結果、Ｌ−リジンおよびＬ−スレオニンによる協奏フィードバック阻害の解除された性質にさらにＬ−リジン単独でもフィードバック阻害が解除された脱感作型のＡＫを有する菌株が優れたＬ−リジン生産能を有することを見出し、本願発明を完成させた。
【０００６】
即ち、本願発明は以下（１）から（１２）に関する。
（１）  コリネ型細菌由来であり、配列番号１８記載のアミノ酸配列において３１１番目のアミノ酸残基がThr以外のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有し、かつＬ−リジンおよびＬ−スレオニンによる協奏的なフィードバック阻害が解除されたアスパルトキナーゼをコードするDNA。
（２）  DNAが、配列番号１７記載の塩基配列を有するDNAである、上    記（１）
のDNA。
（３）コリネ型細菌が、コリネバクテリウム属およびブレビバクテリウム属からなる群より選ばれる属に属するコリネ型細菌である、上記（１）のDNA。
（４）  上記（１）〜（３）いずれか１つのDNAをベクターに組み込んで得られる、コリネ型細菌で複製可能な組換え体DNA。
【０００７】
（５）  上記（１）〜（３）いずれか１つのDNAを染色体上に有する、コリネ型細菌。
（６）  上記（４）の組換え体DNAを保有する、コリネ型細菌に属する形質転換株。
（７）  形質転換株が、コリネバクテリウム・グルタミカムTf-5(FERM BP-6689)である、上記（６）の形質転換株。
【０００８】
（８）  上記（５）のコリネ型細菌、上記（６）および（７）の形質転換株から選ばれる微生物または形質転換株を培地に培養し、培養物中にＬ−リジンを生成蓄積させ、該培養物からＬ−リジンを採取することを特徴とする、Ｌ−リジンの製造法。
（９）  上記（１）〜（３）いずれか１つのDNAにコードされるアスパルトキナーゼ。
【０００９】
（１０）  コリネ型細菌由来であり、配列番号１８記載のアミノ酸配列の３１１番目のアミノ酸残基がThrである塩基配列を有する、アスパルトキナーゼをコードするDNA。
（１１）  配列番号１７記載の９３２番目の塩基がシトシンに置換された塩基配列を有する上記（１０）のDNA。
該DNAを用いることにより、上記（１）のアスパルトキナーゼをコードするDNAを作製することができる。
（１２）  上記（１０）または（１１）のDNAによりコードされるアスパルトキナーゼ。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本願発明について詳細に説明する。
ＡＫをコードする遺伝子（以下、ＡＫ遺伝子と略す）を含むDNAの供給菌としては、コリネ型細菌に属し、ＡＫ活性を有する微生物であればいかなる微生物でも良い。
本願発明におけるコリネ型細菌としてはアグロコッカス(Agrococcus)属、アグロマイセス(Agromyces)属、アースロバクター(Arthrobacter)属、オーレオバクテリウム(Aureobacterium)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、セルロモナス(Cellulomonas)属、クラビバクター(Clavibacter)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、ミクロバクテリウム(Microbacterium)属、ラサイバクター(Rathayibacter)属、テラバクター(Terrabacter)属、ツリセラ(Turicella)属に属する細菌があげられる。好適には、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属に属する細菌をあげることができる。具体例として、例えば下記の菌株が用いられる。
【００１１】
コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032  コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13869  コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13870  コリネバクテリウム・カルナエATCC15991  コリネバクテリウム・アセトグルタミカムATCC15806。
【００１２】
野生型株からはＬ−リジン、あるいはＬ−リジンとＬ−スレオニンによるフィードバック阻害のかかる、野生型のＡＫ遺伝子が供給される。該野生型のＡＫ遺伝子よりフィードバック阻害の解除された脱感作型ＡＫ遺伝子を取得する方法としては、例えば、野生型株から変異操作[例えばN-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン（NTG）を用いる方法；微生物実験マニュアル、1986年、131頁、講談社サイエンティフィック社]を施した後、AEC耐性を指標に選択され、Ｌ−リジン生産性となった変異株から取得する方法をあげることができる。好適な変異株としては、コリネバクテリウム・グルタミカム野生型株ATCC13032より変異処理により誘導されたＬ−リジン生産菌、あるいは野生型ＡＫ遺伝子を取得した後、上記NTG法あるいは試験管内変異法［例えばヒドロキシルアミンを用いる方法； Molecular and General Genetics, 145, 101 (1978)］によって該遺伝子に変異を誘起し、AEC耐性かつＬ−リジン生産性を指標に脱感作した脱感作型ＡＫ遺伝子を含む株等をあげることができる。
【００１３】
ＡＫ遺伝子は、ＡＫ遺伝子を含む株より、例えば斎藤らの方法［Biochimica et Biophysica Acta, 72, 619 (1963)］により単離することで取得することができる。即ち、染色体DNAを調製し、これを適当な制限酵素で切断する。切断後、得られた切断断片を微生物内で自律複製可能なベクター（例えばプラスミド）に連結し、これをＡＫ活性が欠損した宿主微生物に導入する。該微生物よりＡＫ活性を発現するようになった形質転換株を単離し、該形質転換株より該遺伝子を単離することにより取得することができる。
【００１４】
該宿主微生物としては、コリネ型細菌のＡＫ遺伝子が発現可能な微生物であれば、いずれも用いることができる。好適には大腸菌のＡＫ欠損株があげられる。
自律複製可能なベクターとしては、該ベクターを導入した微生物中で自律複製できるものならばいかなるものでも良い。例えば、pUC18（宝酒造社製）、pBluescriptSK(-)（東洋紡社製）等の大腸菌中で自律複製可能なベクター、pCE54（特開昭58-105999）等の大腸菌とコリネ型細菌の両方で自律複製可能なシャトルベクター等をあげることができる。
【００１５】
ベクターとＡＫ遺伝子を含むDNA断片との連結は、T4DNAリガーゼ等を用いる通常の方法で行なうことができる。
宿主への導入は例えば大腸菌の場合、ハナハンらの方法［Journal of Molecular Biology, 166, 557 (1983)］等により行なうことができる。
【００１６】
さらに、以下の方法によりＡＫ遺伝子を単離取得できる。
既に公知のコリネバクテリウム・グルタミカム由来ＡＫ遺伝子の塩基配列情報［例えば、ジェンバンク（GenBank）アクセッション・ナンバーE06825］を基にオリゴマーDNAを合成し、該DNAをプライマーとして用い、PCR法により該遺伝子を含むDNA断片を増幅単離する。該DNA断片を選択マーカー遺伝子を有するベクターに連結して大腸菌、コリネ型細菌等の適当な宿主微生物に導入する。該微生物より導入したベクターを単離することにより、ＡＫ遺伝子を取得することができる。宿主微生物にＡＫ欠損株を用いる必要はない。
【００１７】
本願発明でいう「コリネ型細菌で複製可能な組換え体DNA」作製のために用いられるベクターとしては、コリネ型細菌中で自律複製しうるものであればいかなるものでも良い。具体的には、pCG1（特開昭57-134500）、pCG2（特開昭58-35197）、pCG4（特開昭57-183799）、pCG11（特開昭57-134500）、pCG116、pCE54、pCB101（いずれも特開昭58-105999）、pCE51、pCE52、pCE53［Molecular and General Genetics, 196, 175 (1984)］、および本願発明において作製過程を示したpCS299P等があげられる。好適にはpCG116、pCS299Pなどのようにサイズが比較的小さく、クローニング部位を多数有し、薬剤耐性遺伝子などの選択可能なマーカー遺伝子を持つものが用いられる。
【００１８】
上記組換え体DNAをコリネ型細菌へ導入するための方法として、プロトプラスト法（例えば、特開昭57-186492および特開昭57-18649）、電気穿孔法［例えば、Journal of Bacteriology, 175, 4096 (1993)］等をあげることができる。
【００１９】
本願発明の新規ＡＫをコードするDNAを染色体上に有するコリネ型細菌とは、該ＡＫ遺伝子を染色体上に含むコリネ型細菌であればいかなるものでも良い。例えば、変異操作によって取得された株、相同組換え法［Bio/Technology, 9, 84 (1991)］、ファージやトランスポゾンを用いる方法［Escherichia coli and Salmonella typhimurium、1996年、2325頁、2339頁、アメリカン・ソサエティー・フォー・マイクロバイオロジー刊］等により該DNA断片を染色体内に人為的に挿入した微生物等をあげることができる。
【００２０】
以上のようにして取得した、新規ＡＫ遺伝子を含むDNAを有するコリネ型細菌に属する形質転換株を培養することにより、培養液中にＬ−リジンを生成蓄積させることができる。
【００２１】
培養培地としては、炭素源、窒素源、無機塩類などを含む通常の栄養培地を用いることができる。
炭素源としては、例えばグルコース、果糖、シュークロース、マルトース、でんぷん加水分解物等の糖類、エタノールなどのアルコール類、酢酸、乳酸、コハク酸等の有機酸類を用いることができる。
【００２２】
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウムなどの各種無機および有機アンモニウム塩類、尿素、その他窒素含有化合物、ならびに肉エキス、酵母エキス、コーン・スティープ・リカー、大豆加水分解物等の窒素含有有機物を用いることができる。
【００２３】
無機塩としてはリン酸第一水素カリウム、リン酸第二水素カリウム、硫酸アンモニウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム等を用いることができる。
その他、必要に応じて、ビオチン、チアミン等の微量栄養源を加えることができる。これら微量栄養源は、肉エキス、酵母エキス、コーン・スティープ・リカー、カザミノ酸等の培地添加物で代用することもできる。
【００２４】
培養は、振とう培養、深部通気撹拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は一般に20〜40℃が好適である。培地中のpHは、中性付近に維持することが好ましい。pHの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。培養期間は通常1〜6日間である。
【００２５】
培養終了後、菌体を除去する。得られた培養液より活性炭処理、イオン交換樹脂処理などの公知の方法によりＬ−リジンを回収することができる。
以下に本願発明の実施例を示すが、本願発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００２６】
発明を実施するための最良の形態
実施例１  プラスミドpCS299Pの造成
大腸菌とコリネ型細菌双方で自律複製可能なシャトルプラスミドpCS299Pを以下の方法で作製した。
pCG116［Bio/Technology, 11, 921 (1993)］をBglII（宝酒造社製）で切断し、BglII切断断片を取得した。
【００２７】
pHSG299（宝酒造社製）をBamHI（宝酒造社製）で切断後、得られたBamHI切断断片を常法にしたがってエタノール沈殿法により濃縮し、該断片をアルカリフォスファターゼで処理した。得られた上記２種類の断片を混合し、ライゲーションキットver.１（宝酒造社製）を用い、リガーゼ反応を行った。反応産物を用い、常法［Molecular Cloning, 第２版、1989年、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(以下、モレキュラー・クローニング第２版と略す)］に従って大腸菌NM522株を形質転換した。該菌株を、20μg/mlのカナマイシンを含むLB寒天培地［バクトトリプトン（ディフコ社製）10g、酵母エキス（ディフコ社製）5g、塩化ナトリウム 10g、バクトアガー（ディフコ社製）16gを水1Lに含み、pH7.0に調整された培地］上で培養し、形質転換株を選択した。該形質転換株を20μg/mlのカナマイシンを含むLB培地を用い終夜培養し、得られた培養液からアルカリSDS法（モレキュラー・クローニング第２版）によりプラスミドを調製し、pCS116-299Bgl1 DNAを取得した。
【００２８】
該pCS116-299Bgl1の制限酵素切断部位を常法に従って確認した。
pCS116-299Bgl1 DNAを用いて電気穿孔法［FEMS Microbiology Letters, 65, 299, (1989)］によりコリネバクテリウム・アンモニアゲネス ATCC6872を形質転換した。
該菌株を20μg/mlのカナマイシンを含むCM寒天培地[ポリペプトンＳ（日本製薬社製）]10g、酵母エキスＳ（日本製薬社製）5g、エルリッヒ肉エキス（極東製薬工業社製）10g、塩化ナトリウム 3g、ビオチン30μgを水1Lに含み、pH7.2に調整された培地]上で培養し、形質転換株を選択した。該形質転換株より常法に従ってプラスミドを抽出し、該プラスミドを制限酵素で切断することにより、該プラスミドがpCS116-299Bgl1であることを確認した。
【００２９】
pCS116-299Bgl1 DNAを、PstI（宝酒造社製）およびBamHIで切断した後、エタノール沈殿法により精製した。得られたDNAからキロシーケンシング用デリーションキット（宝酒造社製）を用いて部分欠失プラスミドを取得した。該プラスミドを用い、常法に従って大腸菌NM522株を形質転換した。該菌株を20μg/mlのカナマイシンを含むLB寒天培地上で培養し、形質転換株を選択した。該形質転換株を20μg/mlのカナマイシンを含むLB培地を用い終夜培養し、得られた培養液からアルカリSDS法にてプラスミドを調製した。常法に従って、得られた各プラスミドの制限酵素地図を作成し、部分欠失長の異なるプラスミドを選択した。
【００３０】
選択したプラスミドを用いて、電気穿孔法によりコリネバクテリウム・アンモニアゲネス ATCC6872を形質転換した。得られた形質転換株を20μg/mlのカナマイシンを含むCM寒天培地上に塗布後、30℃で2日培養し、カナマイシン耐性コロニーの出現の有無を指標としてコリネバクテリウム・アンモニアゲネス中で自律複製能を有するプラスミドを選択した。
【００３１】
自律複製能を有するプラスミドの中で最も長い欠失領域を有するプラスミドを選択し、このプラスミドをpCS299del6とした。
pCS299del6 DNAを常法に従って形質転換株より調製した後、制限酵素DraIおよびPvuII（いずれも宝酒造社製）を用いて切断した。該切断DNA断片をアガロースゲル電気泳動により分画後、pCG116由来のDNAを有する約2.7kbのDNA断片を分離し、DNA prep（旭硝子社製）を用いて抽出精製した。
【００３２】
pBluescript SK(+)（東洋紡績社製）DNAを、常法に従ってEcoRV（宝酒造社製）で切断した。得られた切断DNA断片をエタノール沈殿法により濃縮後、アルカリフォスファターゼ処理した。該処理DNA断片をアガロースゲル電気泳動により分画後、DNA prepを用いて抽出精製した。
【００３３】
上記2.7kb断片とpBluescript SK(+)断片をライゲーションキットver.１を用いて連結した後、該連結DNAを用いて、常法に従って大腸菌NM522株を形質転換した。該菌株を100μg/mlのアンピシリン、50 μg/mlのX-Gal（5-bromo-4-chloro-3-indoyl-β-D-galactoside）、1mmol/lのIPTG (isopropylthio-β-D-galactoside)を含むLB寒天培地上で培養し、形質転換株を選択した。該形質転換株を100μg/mlのアンピシリンを含むLB培地を用い終夜培養し、得られた培養液からアルカリSDS法によりプラスミドを調製した。常法に従って、得られた各プラスミドの制限酵素地図を作成した。EcoRI切断によって3.4kbと2kbの断片を生じるプラスミドをpCSSK21とした。
【００３４】
配列番号1、2に示したDNAを合成し、これらのDNAをプライマーとして、pHSG299DNAを鋳型として、Taq DNAポリメラーゼ（宝酒造社製）を用い、添付の反応条件に従って、PCR反応を行った。反応産物を常法に従ってエタノール沈殿した後、制限酵素PstIおよびXhoI（宝酒造社製）を用いて切断した。該切断DNA断片をアガロースゲル電気泳動により分画し、得られた約1.3kbのDNA断片をDNA prepを用いて抽出精製した。
【００３５】
配列番号3、4に示したDNAを合成し、これらのDNAをプライマーとして、pHSG299DNAを鋳型として、Taq DNAポリメラーゼを用い、添付の反応条件に従って、PCRを行った。反応産物を常法に従ってエタノール沈殿した後、制限酵素PstIおよびBglIIを用いて切断した。該切断DNA断片をアガロースゲル電気泳動により分画し、得られた約1.3kbのDNA断片をDNA prepを用いて抽出精製した。
【００３６】
上記で取得したプラスミドpCSSK21をSalI（宝酒造社製）およびBamHIを用いて切断した。該切断DNA断片をアガロースゲル電気泳動により分画し、得られた約2.7kbのDNA断片をDNA prepを用いて抽出精製した。抽出精製された上記の３種類のDNA断片を混合した後、ライゲーションキットver.１を用いて連結した。
【００３７】
該連結DNA断片を用いて常法に従って大腸菌NM522株を形質転換した。該菌株を20μg/mlのカナマイシン、50μg/mlのX-Gal、1mmol/lのIPTGを含むLB寒天培地上で培養し形質転換株を選択した。
【００３８】
該形質転換株を、20μg/mlのカナマイシンを含むLB培地を用い終夜培養し、得られた培養液からアルカリSDS法によりプラスミドを調製した。常法に従って、得られた各プラスミドの制限酵素地図を作成し、第１図に記載された構造を有するプラスミドをpCS299Pとした。
【００３９】
実施例２ Ｌ−リジン生産変異株の作出と該株由来ＡＫ遺伝子の塩基配列決定
コリネバクテリウム・グルタミカム野生型株（ATCC13032）にNTGによる変異処理（微生物実験マニュアル、1986年、131頁、講談社サイエンティフィック社）を施した後、1mg/ml AECおよび1mg/mlＬ−スレオニンを含む最少寒天培地［グルコース 5g、リン酸一水素二カリウム0.75g、リン酸二水素一カリウム0.75g、硫酸アンモニウム 1g、硫酸マグネシウム7水和物 0.5g、塩化ナトリウム 0.1g、硫酸第一鉄7水和物 10mg、硫酸マンガン7水和物 8mg、塩酸カルシウム 1mg、チアミン塩酸塩 1mg、ビオチン 0.03mg、寒天（ディフコ社製）16gを水1Lに含み、pH7.2に調整された培地］に塗布し、30℃で2日培養した。出現したコロニーを単離し、後述実施例5に示す方法でＬ−リジンの生産試験を行い、生産性が向上したクローンを選定した。
【００４０】
そのうちの一株（AEC11株）および野生型株ATCC13032より、以下のごとくPCR法によりＡＫ遺伝子を増幅し、塩基配列を決定した。
それぞれの株より、斎藤らの方法［Biochimica et Biophysica Acta, 72, 、619 (1963)］により染色体DNAを調製した。コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13869株において既知となっているＡＫ遺伝子の塩基配列［GenBank, アクセッション・ナンバーE06825］を元にして増幅用のDNAプライマーを設計した。該DNAプライマーを配列番号５および６に示した。上記で調製した染色体DNA、DNAプライマー、パーキンエルマー社製サーマルサイクラー（ジーンアンプPCRシステム 9600)、Pyrococcus sp.KOD株由来DNAポリメラーゼ（東洋紡社製）、および添付のバッファーを用い、PCRを行った。PCRは、94℃-30秒、60℃-30秒、74℃-60秒の反応を１サイクルとして30サイクル行った。増幅された約1.5KbのDNAをPCRプロダクト・プレシーケンシング・キット （アマシャム・ファルマシア社製）を用いて精製後、該精製DNAを鋳型としてサイクルシーケンシングを行った。シーケンス反応に用いるDNAプライマーは、上記ＡＫ遺伝子塩基配列を元にしてデザインした。該DNAプライマーを配列番号７〜16に示した。ABIプリズム・ダイ・ターミネーター・サイクル・シーケンシング・レディー・リアクション・キット （パーキンエルマー社製）を用い、96℃-10秒、50℃-5秒、60℃-4分の反応を１サイクルとして25サイクルシーケンス反応を行い、ABIプリズム377 DNAシーケンシング・システム（パーキンエルマー社製）により塩基配列を決定した。
【００４１】
AEC11株由来の変異型ＡＫ遺伝子の塩基配列および対応するオープン・リーディング・フレームのアミノ酸配列を配列番号17および18に示す。配列番号17に示した変異型ＡＫ遺伝子の塩基配列において、932番目のチミンが野生型ＡＫ遺伝子ではシトシンであった。該塩基置換により、野生型ＡＫの311番目のＬ−スレオニン残基（コドンACC）が、 AEC11株由来ＡＫ遺伝子ではイソロイシン残基（コドンATC）に置換されていた。コリネバクテリウム・グルタミカムのＡＫ遺伝子の脱感作変異としては、Ala279のAla以外のアミノ酸への変異（特開平6-62866、特開平6-261766）、Gly345Asp［Journal of Bacteriology, 175, 4096 (1993)］、Ser301Tyr［Molecular Microbiology, 5, 1197 (1991)］、Ser301Phe、Thr308Ile（いずれも特開平6-261766）などの報告があるが、本変異はそのいずれにも該当していなかった。
【００４２】
実施例３ 変異型ＡＫ遺伝子のクローニングとコリネ型細菌への導入
上記変異のＬ−リジン生産性への影響を以下の方法で評価した。
コリネバクテリウム・グルタミカム野性型株（ATCC13032）およびＬ−リジン生産菌AEC11株よりPCR法によりＡＫ遺伝子をクローニングした。実施例２と同様の方法で得られたATCC13032株由来またはAEC11株由来ＡＫ遺伝子を含む約1.5Kbの遺伝子断片をSalI、BamHI（宝酒造社製）で処理した後、アガロース電気泳動に供し、ゲルより切り出し、ジーン・クリーン・キット（BIO 101社製）により精製した。実施例１で示した、エシェリヒア・コリとコリネ型細菌内双方で自律増殖可能なシャトルベクターpCS299PをSalI、BamHIで切断し、ライゲーションキットver.1（宝酒造社製）を用いて、上記ＡＫ遺伝子断片と連結した。該連結産物を用い、エシェリヒア・コリDH5α株（東洋紡社製）を添付マニュアルに従って形質転換した後、アンピシリン100μg/mlを含むLB寒天培地で生育するコロニーを単離した。これらのコロニーを培養し、実施例１と同じ方法でプラスミドDNAを調製した。実施例２で示した方法により塩基配列決定を行ない、PCR過程での変異を含まないクローンを選定した。該選定により得られたATCC13032株由来ＡＫ遺伝子を含むプラスミドの一つをpAK1、AEC11株由来ＡＫ遺伝子を含むプラスミドをpAK2と名付けた。
【００４３】
実施例4 コリネバクテリウム・グルタミカムの野生型ＡＫと変異型ＡＫの酵素解析
コリネバクテリウム・グルタミカム野生型株ATCC13032にプラスミドpAK1、pAK2およびpCS299Pを、電気穿孔法［FEMS Microbiology Letters, 65, 299 (1989)］により、それぞれ導入した。得られたプラスミドpAK1を保有する株をTf-14、pAK2を保有する株をTf-5、pCS299Pを保有する株をTf-21と命名した。これら形質転換株のＡＫ活性をフォレッティーらの方法により［Journal of Bacteriology, 、175, 4096 (1993)］測定した。
第１表に形質転換株の粗抽出液のＡＫ比活性を示した。
【００４４】
ＡＫ遺伝子を含むプラスミドの導入株（Tf-14およびTf-5）では、ベクター導入株（Tf-21）に比べ、ＡＫ比活性が約６倍に増大することが示された。Tf-5はＬ−リジンとＬ−スレオニンによる協奏的阻害が解除されているだけでなく、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害も大幅に解除されていた。
Tf-5は、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号）に平成１１年４月２日付けで受託番号：FERM BP-6689 として寄託されている。
【００４５】
【表１】
0004526710.tif 000002
【００４６】
実施例５ コリネバクテリウム・グルタミカムにおける変異型ＡＫのＬ−リジン生産能への効果
実施例４で作出されたTf-5、Tf-14およびTf-21のＬ−リジン生産能を培養評価した。
各菌株を、種培地（ショ糖50g、大豆加水分解物30g、尿素3g、ペプトン20g、カザミノ酸20g、肉エキス20g、硫酸マグネシウム7水和物 0.5g、リン酸二水素一カリウム 2g、硫酸アンモニウム 8g、チアミン・塩酸塩 1mg、ビオチン0.1mg、パントテン酸カルシウム10mg、硫酸第一鉄7水和物 10mg、硫酸亜鉛7水和物 1mg、ニコチン酸 20mg及び炭酸カルシウム 10gを水１Lに含む。pH7.2）5mlに植菌し、30℃で16時間振とう培養を行った。
【００４７】
該培養で得られた種培養液1mlを本培養培地（廃糖蜜200g、硫酸アンモニウム45g、尿素1g、リン酸二水素一カリウム 0.5g、 硫酸マグネシウム７水和物 0.5g,
ビオチン0.3mg及び炭酸カルシウム 30gを水1Lに含む。pH7.0）10mlに植菌し、30℃で72時間振とう培養した。培養終了時のプラスミド保持率を、プラスミドの薬剤耐性マーカーであるカナマイシンの耐性を指標にして測定したところ、いずれもほぼ100％の高い安定性を示した。
培地中に蓄積したＬ−リジンの定量は、高速液体クロマトグラフィーにより行なった。
【００４８】
結果を第２表に示した。
本願発明の変異型ＡＫ遺伝子の導入により、Ｌ−リジン生産能が著しく向上することが示された。
【００４９】
【表２】
0004526710.tif 000003
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本願発明により、コリネ型細菌におけるＬ−リジン生合成の鍵酵素であるＡＫをＬ−リジンおよびＬ−スレオニンによる協奏フィードバック阻害およびリジン単独によるフィードバック阻害から解除された脱感作型に改変し、Ｌ−リジンの生産に有利なものにすることができる。
【配列表フリーテキスト】
【００５１】
配列番号 １：人工配列の説明−合成DNA
配列番号 ２：人工配列の説明−合成DNA
配列番号 ３：人工配列の説明−合成DNA
配列番号 ４：人工配列の説明−合成DNA
配列番号 ５：人工配列の説明−合成DNA
配列番号 ６：人工配列の説明−合成DNA
配列番号 ７：人工配列の説明−合成DNA
配列番号 ８：人工配列の説明−合成DNA
配列番号 ９：人工配列の説明−合成DNA
配列番号１０：人工配列の説明−合成DNA
配列番号１１：人工配列の説明−合成DNA
配列番号１２：人工配列の説明−合成DNA
配列番号１３：人工配列の説明−合成DNA
配列番号１４：人工配列の説明−合成DNA
配列番号１５：人工配列の説明−合成DNA
配列番号１６：人工配列の説明−合成DNA
【図面の簡単な説明】
【００００】
【図１】  第１図はpCS299Pの造成過程を示した図である。
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> KYOWA HAKKO KOGYO CO., LTD
<120> Novel desensitized Aspartate Kinase
<130> 11203WO1
<140>
<141>
<150> JP 99/110437
<151> 1999-04-19
<160> 18
<170> PatentIn Ver. 2.0
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence : Synthetic DNA
<400> 1
aaaaagatct cgacggatcg ttccactg                                    28
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence : Synthetic DNA
<400> 2
gtaaaacgac ggccatg                                                17
<210> 3
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence : Synthetic DNA
<400> 3
cgagtcgact cgcgaagtag cacctgtcac ttttg                            35
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence : Synthetic DNA
<400> 4
tggggatccg caccaacaac tgcgatggtg gtc                              33
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence : Synthetic DNA
<400> 5
aaaactcgag aggtctgcct cgtg                                        24
<210> 6
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence : Synthetic DNA
<400> 6
caggaaacag ctatgac                                                17
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence : Synthetic DNA
<400> 7
tgcagcggca gtgaatcccg ttccgcc                                     27
<210> 8
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence : Synthetic DNA
<400> 8
ttctgacacc actgcagttg cgttgg                                      26
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence : Synthetic DNA
<400> 9
tcgcaaccga caagtccgaa gccaaag                                     27
<210> 10
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence : Synthetic DNA
<400> 10
tgaagtctca cccaggtgtt accgcagag                                   29
<210> 11
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence : Synthetic DNA
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caagggactc aatagcgatg gcgacgag                                    28
<210> 12
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence : Synthetic DNA
<400> 12
cagcaacttc cagcatttct tcgaagc                                     27
<210> 13
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence : Synthetic DNA
<400> 13
gcatcccagt ggctgagacg catccgcta                                   29
<210> 14
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence : Synthetic DNA
<400> 14
ctgcgatggt ggtcattgta aaactactcc                                  30
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence : Synthetic DNA
<400> 15
catcgcgcag agcttccatg aactctgcgg                                  30
<210> 16
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence : Synthetic DNA
<400> 16
gggatcatta ctataagacg agcgtacgcg                                  30
<210> 17
<211> 1263
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<220>
<221> CDS
<222>
<400> 17
gtg gcc ctg gtc gta cag aaa tat ggc ggt tcc tcg ctt gag agt gcg   48
Val Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala
1               5                  10                  15
gaa cgc att aga aac gtc gct gaa cgg atc gtt gcc acc aag aag gct   96
Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala
20                  25                  30
gga aat gat gtc gtg gtt gtc tgc tcc gca atg gga gac acc acg gat   144
Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp
35                  40                  45
gaa ctt cta gaa ctt gca gcg gca gtg aat ccc gtt ccg cca gct cgt   192
Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg
50                  55                  60
gaa atg gat atg ctc ctg act gct ggt gag cgt att tct aac gct ctc   240
Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu
65                  70                  75                  80
gtc gcc atg gct att gag tcc ctt ggc gca gaa gcc caa tct ttc acg   288
Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr
85                  90                  95
ggc tct cag gct ggt gtg ctc acc acc gag cgc cac gga aac gca cgc   336
Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg
100                 105                 110
att gtt gat gtc act cca ggt cgt gtg cgt gaa gca ctc gat gag ggc   384
Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly
115                 120                 125
aag atc tgc att gtt gct ggt ttc cag ggt gtt aat aaa gaa acc cgc   432
Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg
130                 135                 140
gat gtc acc acg ttg ggt cgt ggt ggt tct gac acc act gca gtt gcg   480
Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala
145                 150                 155                 160
ttg gca gct gct ttg aac gct gat gtg tgt gag att tac tcg gac gtt   528
Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val
165                 170                 175
gac ggt gtg tat acc gct gac ccg cgc atc gtt cct aat gca cag aag   576
Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys
180                 185                 190
ctg gaa aag ctc agc ttc gaa gaa atg ctg gaa ctt gct gct gtt ggc   624
Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly
195                 200                 205
tcc aag att ttg gtg ctg cgc agt gtt gaa tac gct cgt gca ttc aat   672
Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn
210                 215                 220
gtg cca ctt cgc gta cgc tcg tct tat agt aat gat ccc ggc act ttg   720
Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu
225                 230                 235                 240
att gcc ggc tct atg gag gat att cct gtg gaa gaa gca gtc ctt acc   768
Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr
245                 250                 255
ggt gtc gca acc gac aag tcc gaa gcc aaa gta acc gtt ctg ggt att   816
Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile
260                 265                 270
tcc gat aag cca ggc gag gct gcg aag gtt ttc cgt gcg ttg gct gat   864
Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp
275                 280                 285
gca gaa atc aac att gac atg gtt ctg cag aac gtc tct tct gta gaa   912
Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu
290                 295                 300
gac ggc acc acc gac atc atc ttc acc tgc cct cgt tcc gac ggc cgc   960
Asp Gly Thr Thr Asp Ile Ile Phe Thr Cys Pro Arg Ser Asp Gly Arg
305                 310                 315                 320
cgc gcg atg gag atc ttg aag aag ctt cag gtt cag ggc aac tgg acc   1008
Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr
325                 330                 335
aat gtg ctt tac gac gac cag gtc ggc aaa gtc tcc ctc gtg ggt gct   1056
Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala
340                 345                 350
ggc atg aag tct cac cca ggt gtt acc gca gag ttc atg gaa gct ctg   1104
Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu
355                 360                 365
cgc gat gtc aac gtg aac atc gaa ttg att tcc acc tct gag att cgt   1152
Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg
370                 375                 380
att tcc gtg ctg atc cgt gaa gat gat ctg gat gct gct gca cgt gca   1200
Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala
385                 390                 395                 400
ttg cat gag cag ttc cag ctg ggc ggc gaa gac gaa gcc gtc gtt tat   1248
Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr
405                 410                 415
gca ggc acc gga cgc                                           1263
Ala Gly Thr Gly Arg
420
<210> 18
<211> 421
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 18
Val Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala
1               5                  10                  15
Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala
20                  25                  30
Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp
35                  40                  45
Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg
50                  55                  60
Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu
65                  70                  75                  80
Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr
85                  90                  95
Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg
100                 105                 110
Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly
115                 120                 125
Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg
130                 135                 140
Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala
145                 150                 155                 160
Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val
165                 170                 175
Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys
180                 185                 190
Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly
195                 200                 205
Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn
210                 215                 220
Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu
225                 230                 235                 240
Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr
245                 250                 255
Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile
260                 265                 270
Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp
275                 280                 285
Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu
290                 295                 300
Asp Gly Thr Thr Asp Ile Ile Phe Thr Cys Pro Arg Ser Asp Gly Arg
305                 310                 315                 320
Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr
325                 330                 335
Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala
340                 345                 350
Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu
355                 360                 365
Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg
370                 375                 380
Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala
385                 390                 395                 400
Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr
405                 410                 415
Ala Gly Thr Gly Arg
420
【図１】
0004526710.tif 000004