(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
バレンセンの製造方法であって、
Ａ）ファルネシルピロリン酸と、
（ａ）配列番号９又は配列番号１０に少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を有する核酸並びに
（ｂ）配列番号４又は配列番号５に少なくとも９０％同一であるポリペプチドをコードする核酸
から選択される核酸によってコードされる少なくとも１種のバレンセン合成酵素とを接触させ、あるいは更に
Ｂ）Ａ）で産生されたバレンセンを単離する
ことを含む方法。
【請求項２】
核酸が、配列番号９又は配列番号１０に少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
核酸が、配列番号９又は配列番号１０に示されるヌクレオチド配列を有する、請求項２記載の方法。
【請求項４】
核酸が、配列番号９又は配列番号１０に示されるヌクレオチド配列からなる、請求項３記載の方法。
【請求項５】
核酸が、配列番号４又は配列番号５に少なくとも９５％同一であるポリペプチドをコードする、請求項１記載の方法。
【請求項６】
核酸が、配列番号４又は配列番号５のポリペプチドをコードする、請求項５記載の方法。
【請求項７】
接触時間においてｐＨが７又は７未満である、請求項１から６までのいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
バレンセン合成酵素をその核酸を有する宿主細胞の培養によって製造し、その際、宿主細胞が細菌細胞、酵母細胞、植物細胞及び動物細胞から選択される、請求項１から７までのいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
宿主細胞が大腸菌細胞である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
バレンセン合成酵素の製造方法であって、少なくとも１つの核酸配列を有する改変された宿主を、バレンセン合成酵素の産生に導く条件下に培養させることを含み、その際、前記の少なくとも１つの核酸が、バレンセン合成酵素をコードし、かつ
（ａ）配列番号９又は配列番号１０に少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を有する核酸並びに
（ｂ）配列番号４又は配列番号５に少なくとも９０％同一であるポリペプチドをコードする核酸
から選択される方法。
【請求項１１】
核酸が、配列番号９又は配列番号１０に少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有する、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
核酸が、配列番号９又は配列番号１０に示されるヌクレオチド配列を有する、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
核酸が、配列番号９又は配列番号１０に示されるヌクレオチド配列からなる、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
核酸が、配列番号４又は配列番号５に少なくとも９５％同一であるポリペプチドをコードする、請求項１０記載の方法。
【請求項１５】
核酸が、配列番号４又は配列番号５のポリペプチドをコードする、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
宿主細胞が細菌細胞、酵母細胞、植物細胞及び動物細胞から選択される、請求項１０から１５までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
宿主細胞が大腸菌細胞である、請求項１６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００２年１０月４日に出願された米国の仮出願番号第６０／４１５，７６５号の利益を特許請求の範囲とし、その内容はこの参照により開示に含まれる。また本願は、２００２年１２月２日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＩＢ０２／０５０７０号の優先権の利益を特許請求の範囲とし、その内容はこの参照により開示に含まれる。
【０００２】
本発明はセスキテルペン合成及びその製造方法及び使用に関する。一実施態様において、本発明は、本願に記載される少なくとも１種のセスキテルペン合成酵素をコードするヌクレオチド配列を有する核酸を提供する。更なる実施態様において、本発明はまたセスキテルペン合成酵素及びこれらの酵素の製造方法及び使用方法を提供する。例えば本発明のセスキテルペン合成酵素はファルネシルピロリン酸を種々の酸素化された脂肪族のセスキテルペン、例えばバレンセン、ビシクロゲルマクレン、クベボール及びδ−カジネンに変換するために使用できる。
【０００３】
発明の背景
テルペン化合物は、大きな構造多様性を有する広範な天然分子を表す。植物界は非常に多様なモノテルペン及びセスキテルペンを有している。しばしばこれらのテルペンは、病原、昆虫及び草食動物に対する植物の防衛において、かつ花粉媒介昆虫の誘引のために重要である。
【０００４】
テルペンの生合成は多くの生物において広い範囲にわたって研究されてきている。通常のテルペンの前駆体はイソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）であり、ＩＰＰに導く工程を触媒する多くの酵素が特徴付けられている。２種の異なるＩＰＰ生合成経路は近年に知られている（図１）。メバロン酸経路は植物の細胞質ゾル及び酵母において見出され、そして非メバロン酸経路（又はデオキシキシルロース−５−リン酸（ＤＸＰ）経路）は植物のプラスチド及び大腸菌中で見出されている。
【０００５】
例えばＩＰＰはＩＰＰイソメラーゼにより異性体化されて、ジメチルアリル二リン酸となり、そしてこれらの２種のＣ５化合物はフェニルトランスフェラーゼによって縮合されて、種々のクラスのテルペンのための非環式のピロリン酸テルペン前駆体、すなわちモノテルペンのためのゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）、セスキテルペンのためのファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）、ジテルペンのためのゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）が形成される。非環式前駆体の環化工程を触媒する酵素はテルペンシクラーゼ又はテルペン合成酵素と呼ばれ、これらを本願ではテルペン合成酵素と呼ぶ。
【０００６】
これらの酵素は複雑な多段階の環化を触媒して、テルペン又はセスキテルペン化合物の炭素骨格を形成しうることがある。例えば触媒される環化の最初の工程は二リン酸基をイオン化してアリルカチオンを形成させることであってよい。次いで、酵素の活性部位によって調節できるその基質の異性体化及び転位を行う。生成物は、例えば非環式、単環式、二環式又は三環式であってよい。次いでプロトンがカルボカチオンから遊離されうるか、又はカルボカチオンは水分子と反応し、そしてテルペン炭化水素又はアルコールが遊離される。幾つかのテルペン合成酵素は単一の生成物を産生するが、多くは複数の生成物を産生する。
【０００７】
多様性の大きなテルペン構造及びセスキテルペン合成酵素は天然に見られる。幾つかのセスキテルペン合成酵素をコードするｃＤＮＡ又は遺伝子はクローニングされており、かつ種々の植物源から特徴付けられている、例えば５−エピ−アリストロチェン合成酵素はタバコ（Facchini, P.J. and Chappell, J.(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89,11088-11092.）及びトウガラシ（Back, K., et al. (1998) Plant Cell Physiol. 39 (9), 899-904）から、ベチスピラジエン（vetispiradiene）合成酵素はヒヨスシアムス・ムチクス（Hyoscyamus muticus）（Back, K. and Chappell, J. (1995) J. Biol. Chem. 270 (13), 7375-7381.）から、（Ｅ）−β−ファルネセン合成酵素はセイヨウハッカ（Crock, J., et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94 (24), 12833-12838.）から、δ−セリネン合成酵素及びγ−フムレン合成酵素はグランドファー（Steele, C.L., et al. (1998) J. Biol. Chem. 273 (4), 2078-2089）から、δ−カンジネン合成酵素はキダチワタ（Chen, X.Y., et al. (1995) Arch. Biochem. Biophys. 324 (2), 255-266; Chen, X.Y., et al. (1996) J. Nat Prod. 59, 944-951）から、Ｅ−α−ビサボレン合成酵素はグランドファー（Bohlmann, J., et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95 (12), 6756-6761.）から、ゲルマクレンＣ合成酵素はトマト（Colby, S.M., et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95 (5), 2216-2221.）から、エピ−セドロール合成酵素及びアモルファ−４，１１−ジエン合成酵素はクソニンジン（Mercke, P., et al. (1999) Arch. Biochem. Biophys. 369 (2), 213-222; Mercke, P., et al. (2000) Arch. Biochem. Biophys. 381 (2), 173-180.）から、そしてゲルマクレンＡ合成酵素はレタス、チコリー及びソリダゴ・カナデンシス（Bennett, M.H., et al. (2002) Phytochem. 60, 255-261; Bouwmeester, H.J., et al. (2002) Plant Physiol. 129 (1), 134-144; Prosserl, et al. (2002) Phytochem. 60, 691-702）から特徴付けられている。
【０００８】
多くのセスキテルペン化合物は香料に使用され（例えばパチョウロール（patchoulol）、ヌートカトン、サンタロール、ベチボン、セネンサール）、そして多くは植物から抽出される。結果として、それらの利用性及び価格は植物の入手性及び産生国の安定性に関連して変動に付されることがある。従って植物に頼らないセスキテルペンの製造系の有効性に関心が持たれうる。幾つかのセスキテルペンの構造の複雑性のため、許容できる費用でのそれらの化学合成はいつも実行可能とはいえない。
【０００９】
発明の要旨
一実施態様では、本発明はセスキテルペン合成酵素をコードする単離された核酸に関する。本願で使用される場合には、セスキテルペン合成酵素は、該酵素により非環式のピロリン酸テルペン前駆体、例えばファルネシルピロリン酸と接触させることで生成する少なくとも１種の化合物によって指示されることもある。例えばビシクロゲルマクレンを生成物の１つとして生成しうるセスキテルペン合成酵素はビシクロゲルマクレン合成酵素と呼ばれることがある。この慣習を用いると、本発明の核酸の例は、例えばクベボール合成酵素（ＧＦＴｐｓＣ）（配列番号１）をコードするｃＤＮＡ；δ−カジネン合成酵素（ＧＦＴｐｓＥ）（配列番号２）をコードするｃＤＮＡ；ビシクロゲルマクレン合成酵素（ＧＦＴｐｓＢ）（配列番号３）をコードするｃＤＮＡ；バレンセン合成酵素（ＧＦＴｐｓＤ１とＧＦＴｐｓＤ２）（配列番号４と配列番号５）をコードするｃＤＮＡである。
【００１０】
一実施態様では、本発明は、（ａ）配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９又は配列番号１０に実質的に示されたヌクレオチド配列を有する核酸；（ｂ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５に実質的に示されたポリペプチドをコードする核酸並びに（ｃ）低いストリンジェンシー条件下に（ａ）又は（ｂ）の核酸にハイブリダイズする核酸から選択され、該核酸によってコードされるポリペプチドがセスキテルペン合成酵素である単離された核酸を提供する。有利には、本発明は、（ａ）配列番号６又は配列番号７に実質的に示されたヌクレオチド配列を有する核酸；（ｂ）配列番号１又は配列番号２に実質的に示されたポリペプチドをコードする核酸並びに（ｃ）低いストリンジェンシー条件下に（ａ）又は（ｂ）の核酸にハイブリダイズする核酸から選択され、該核酸によってコードされるポリペプチドがセスキテルペン合成酵素である単離された核酸を提供する。一実施態様において、規定の条件は中程度なストリンジェンシー条件であり、そして更なる実施態様では高いストリンジェンシー条件である。他の実施態様は、例えば本発明の核酸によってコードされるポリペプチド；本発明の核酸を有する宿主細胞；本発明の核酸を有する改変された非ヒト生物；並びに本発明の宿主細胞を培養することを含むポリペプチドの製造方法である。
【００１１】
もう一つの実施態様では、本発明は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５に実質的に示されたアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチドを提供する。有利には、本発明は、配列番号１又は配列番号２に実質的に示されたアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチドを提供する。
【００１２】
更なる一実施態様では、本発明は、（ａ）配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９又は配列番号１０に実質的に示されたヌクレオチド配列を有する核酸；（ｂ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５に実質的に示されたポリペプチドをコードする核酸並びに（ｃ）低いストリンジェンシー条件下に（ａ）又は（ｂ）の核酸にハイブリダイズする核酸から選択され、該核酸によってコードされるポリペプチドがセスキテルペン合成酵素である少なくとも１つの核酸を有するベクターを提供する。別の実施態様は、例えば組み換え宿主細胞の作成方法であって、本発明のベクターを宿主細胞に導入することを含む方法である。
【００１３】
一実施態様では、本発明は少なくとも１種のセスキテルペン合成酵素の製造方法であって、少なくとも１つの核酸配列を有する改変された宿主を、少なくとも１種のセスキテルペン合成酵素の製造に寄与する条件下に培養することを含む方法を提供する。一実施態様では、少なくとも１つの核酸は、（ａ）配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９又は配列番号１０に実質的に示されたヌクレオチド配列を有する核酸；（ｂ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５に実質的に示されたポリペプチドをコードする核酸並びに（ｃ）低いストリンジェンシー条件下に（ａ）又は（ｂ）の核酸にハイブリダイズする核酸から選択され、その際、該核酸によってコードされるポリペプチドはセスキテルペン合成酵素である。宿主は、例えば植物、微生物、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞及び動物細胞から選択してよい。
【００１４】
もう一つの実施態様では、本発明は、少なくとも１種のテルペノイドの製造方法であって、１）少なくとも１種の非環式のピロリン酸テルペン前駆体を、核酸によってコードされる少なくとも１種のポリペプチドと接触させることを含む方法を提供する。一実施態様では、核酸は、（ａ）配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９又は配列番号１０に実質的に示されたヌクレオチド配列を有する核酸；（ｂ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５に実質的に示されたポリペプチドをコードする核酸並びに（ｃ）低いストリンジェンシー条件下に（ａ）又は（ｂ）の核酸にハイブリダイズする核酸から選択され、その際、該核酸によってコードされるポリペプチドはセスキテルペン合成酵素であり、２）（１）で生成された少なくとも１種のテルペノイドが単離される。一実施態様では、少なくとも１種のテルペノイドはセスキテルペンから選択される。更なる一実施態様において、少なくとも１種の非環式のピロリン酸テルペン前駆体はファルネシルピロリン酸である。本発明の方法により製造されたセスキテルペンは、制限されないが、例えばビシクロゲルマクレン、クベボール、バレンセン、α−クベベン、ゲルマクレンＤ及びδ−カジネンである（図３）。
【００１５】
前記の一般的記載と以下の詳細な説明の両者は例示し、かつ説明するだけのものであって、特許請求の範囲としての本発明を制限するものではないと解すべきである。ここで本発明の例示的実施態様を詳細に言及する。
【００１６】
図面の簡単な説明
図１：イソペンテニルピロリン酸の生合成経路の例（メバロン酸経路（Ａ）及びデオキシキシルロース経路（Ｂ））。
【００１７】
図２：イソペンテニル二リン酸からのテルペン生合成の例。
【００１８】
図３：セスキテルペン化合物の例の構造。
【００１９】
図４：２つの群のセスキテルペン合成酵素のアライメントの中心部分（ゲルマクレンＣ トマト ８−カジネン合成酵素（配列番号１１）；（Ｅ）−β−ファルネセン セイヨウハッカ（配列番号１２）；δ−セリネン グランドファー（配列番号１３）；セスキテルペン合成酵素 ユズ（配列番号１６）；５−エピ−アルストロチェン タバコ（配列番号１５）；５−エピ−アリストロチェン トウガラシ（配列番号１６）；ベチスピラジエン ジャガイモ（配列番号１７）；ベチスピラジエン ヒヨスシアムス・ムチクス（配列番号１８）；δ−カジネン キダチワタ（配列番号１９）；アモルファ−４，１１−ジエン クソニンジン（配列番号２０）；エピ−セドロール クソニンジン（配列番号２１）；δ−フムレン グランドファー（配列番号２２））並びに推測された縮重プライマーの配列（ＴｐｓＶＦ１（配列番号２３）；ＴｐｓＶＦ２（配列番号２４）；ＴｐｓＶＲ３（配列番号２５）；ＴｐｓＣＦ１（配列番号２６）；ＴｐｓＣＦ２（配列番号２７）；ＴｐｓＣＲ３））各アライメントの下にある矢印は縮重プライマーの設計に使用したアライメントの領域とその方向を示している。
【００２０】
図５：グレープフルーツの全ＲＮＡでのＲＴ−ＰＣＲによって得られた増幅産物から推測されたアミノ酸配列のアライメント（ＧＦＴｐｓＡ（配列番号２９）；ＧＦＴｐｓＢ（配列番号３０）及びＧＦＴｐｓＣ（配列番号３１））。
【００２１】
図６：グレープフルーツ由来のセスキテルペン合成酵素ＧＦＴｐｓＡ（部分的クローン）（配列番号３２）、ＧＦＴｐｓＢ（配列番号３）、ＧＦＴｂｓＣ（配列番号１）、ＧＦＴｐｓＤ１（配列番号４）、ＧＦＴｐｓＤ２（配列番号５）及びＧＦＴｐｓＥ（配列番号２）のアミノ酸配列アライメント。
【００２２】
図７：組み換えグレープフルーツセスキテルペン合成酵素によって産生されるセスキテルペンのＧＣプロファイル。
【００２３】
図８：以下のそれぞれのアミノ酸及びヌクレオチドの配列：（ａ）ＧＦＴｐｓＡ（配列番号３２及び配列番号３３）、（ｂ）ＧＦＴｐｓＢ（配列番号３及び配列番号８）、（ｃ）ＧＦＴｂｓＣ（配列番号１及び配列番号６）、（ｄ）ＧＦＴｐｓＤ１（配列番号４及び配列番号９）、（ｅ）ＧＦＴｐｓＤ２（配列番号５及び配列番号１０）並びに（ｆ）ＧＦＴｐｓＥ（配列番号２及び配列番号７）。
【００２４】
発明の記載
テルペンは、非環式又は環式であってよいイソプレン単位（Ｃ５Ｈ８）を基礎とする不飽和炭化水素である。テルペン誘導体は、制限されないが、例えばカンファー、メントール、テルピネオール及びボルネオール、ゲラニオールである。本願で使用されるテルペン又はテルペノイドは、例えばテルペン及びテルペン誘導体であり、例えば１段階以上の官能化工程、例えばヒドロキシル化、異性体化、酸化還元又はアシル化がなされた化合物である。本願で使用される場合に、セスキテルペンはＣ１５構造を基礎とするテルペンであり、かつ例えばセスキテルペン及びセスキテルペン誘導体、例えば１段階以上の官能化工程、例えばヒドロキシル化、異性体化、酸化還元又はアシル化がなされた化合物である。
【００２５】
本願で使用される場合に、誘導体は、公知の又は仮想的な化合物から得られ、かつ親物質の必須構成を有する任意の化合物である。
【００２６】
本願で使用される場合には、セスキテルペン合成酵素はセスキテルペンの合成を触媒する任意の酵素である。
【００２７】
表現“同一”、“実質的に同一”又は“実質的に示された”とは、関連配列が所定の配列に少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であることを意味する。例としては、かかる配列はアレル変異体、様々な種から得られた配列であってよく、又はこれらの配列は所定の配列から欠損、欠失、アミノ酸置換又は付加によって得ることもできる。ポリペプチドに関しては、比較配列の長さは一般に少なくとも２０アミノ酸、３０アミノ酸、５０アミノ酸、１００アミノ酸又はそれ以上のアミノ酸である。核酸に関しては、比較配列の長さは一般に少なくとも２０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、１５０ヌクレオチド、３００ヌクレオチド又はそれ以上のヌクレオチドである。２つの配列間の同一性のパーセンテージは標準的なアライメントアルゴリズム、例えばAltschulら（１９９０年） J.Mol.Biol., 215:403-410に記載されるBasic Local Alignment Tool（ＢＬＡＳＴ）、Needlemanら（１９７０年） J.Mol.Biol., 48:444-453のアルゴリズム又はMeyersら（１９８８年） Comput.Appl.Biosci., 4:11-17のアルゴリズムによって測定される。
【００２８】
このように本発明は、一実施態様では、（ａ）配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９又は配列番号１０に実際に示されるヌクレオチド配列を有する核酸；（ｂ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５に実際に示されるポリペプチドをコードする核酸並びに（ｃ）低いストリンジェンシー条件下に（ａ）又は（ｂ）の核酸にハイブリダイズする核酸から選択され、該核酸によってコードされるポリペプチドがセスキテルペン合成酵素である単離された核酸を提供する。一実施態様において、規定の条件は中程度なストリンジェンシー条件であり、そして更なる実施態様では高いストリンジェンシー条件である。
【００２９】
本願で使用される場合に、本発明の核酸によってコードされるポリペプチドがセスキテルペン合成酵素であるかどうかは、本願実施例に記載される酵素特徴付けアッセイによって測定される。
【００３０】
本願で使用される場合に、一定の条件下でのハイブリダイゼーション又はその条件下でハイブリダイズするという用語は、互いに顕著な同一性又は相同性を示すヌクレオチド配列が互いに結合した状態にあるハイブリダイゼーション及び洗浄のための条件を説明することを意図している。前記条件は、少なくとも約７０％、例えば少なくとも約８０％、例えば少なくとも約８５〜９０％の同一性を示す配列が互いに結合した状態にある条件であってよい。低いストリンジェンシー、中程度のストリンジェンシー及び高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件の定義は本願で提供されている。
【００３１】
適切なハイブリダイゼーション条件は最低限の実験、例えばSambrookら（１９８９年） Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第２版、Cold Spring Harbor Press、第７章、第９章及び第１１章に例示される実験により当業者によって選択できる。更に、ストリンジェンシー条件は、Sambrookら（１９８９年） Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第２版、Cold Spring Harbor Press、第７章、第９章及び第１１章に記載されている。本願で使用される場合に、低いストリンジェンシーの規定の条件は以下のとおりである。ＤＮＡを含有するフィルタを、３５％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．５）、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のＰＶＰ、０．１％のフィコール、１％のＢＳＡ及び５００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡを含有する溶液中で４０℃において６時間前処理する。ハイブリダイゼーションは、同じ溶液中であるが以下の変更を加えて実施する：０．０２％のＰＶＰ、０．０２％のフィコール、０．２％のＢＳＡ、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ、１０％（質量／容量）のデキストラン硫酸及び５〜２０×１０６の３２Ｐ標識されたプローブを使用する。フィルタをハイブリダイゼーション混合物中で１８〜２０時間４０℃でインキュベートし、次いで２×ＳＳＣ、２５ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．４）、５ｍＭのＥＤＴＡ及び０．１％のＳＤＳを含有する溶液中で１．５時間５５℃で洗浄する。洗浄溶液を新鮮な溶液と取り替え、そして更に６０℃で１．５時間インキュベートする。フィルタをブロットドライし、そしてオートラジオグラフィーのために露出する。
【００３２】
本願で使用される場合に、中程度のストリンジェンシーの規定の条件は以下のとおりである。ＤＮＡを含有するフィルタを、３５％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．５）、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のＰＶＰ、０．１％のフィコール、１％のＢＳＡ及び５００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡを含有する溶液中で５０℃において７時間前処理する。ハイブリダイゼーションは、同じ溶液中であるが以下の変更を加えて実施する：０．０２％のＰＶＰ、０．０２％のフィコール、０．２％のＢＳＡ、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ、１０％（質量／容量）のデキストラン硫酸及び５〜２０×１０６の３２Ｐ標識されたプローブを使用する。
フィルタをハイブリダイゼーション混合物中で３０時間５０℃でインキュベートし、次いで２×ＳＳＣ、２５ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．４）、５ｍＭのＥＤＴＡ及び０．１％のＳＤＳを含有する溶液中で１．５時間５５℃で洗浄する。洗浄溶液を新鮮な溶液と取り替え、そして更に６０℃で１．５時間インキュベートする。フィルタをブロットドライし、そしてオートラジオグラフィーのために露出する。
【００３３】
本願で使用される場合に、高いストリンジェンシーの規定の条件は以下のとおりである。ＤＮＡを含有するフィルタのプレハイブリダイゼーションを、６×ＳＳＣ、５０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２％のＰＶＰ、０．０２％のフィコール、０．０２％のＢＳＡ及び５００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡから構成されるバッファー中で６０℃において８時間から一晩で実施する。フィルタを、１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ及び５〜２０×１０６ｃｐｍの３２Ｐ標識されたプローブを含有するプレハイブリダイゼーション混合物中で６５℃で４８時間ハイブリダイズさせる。フィルタの洗浄は、２×ＳＳＣ、０．０１％のＰＶＰ、０．０１％のフィコール及び０．０１％のＢＳＡを含有する溶液中で３７℃において１時間実施する。これに引き続き０．１×ＳＳＣ中で５０℃において４５分間洗浄する。
【００３４】
この分野でよく知られる低いストリンジェンシー、中程度のストリンジェンシー及び高いストリンジェンシーの他の条件（例えば種間ハイブリダイゼーションについて使用される場合）は、前記の条件が不適切であれば（例えば種間ハイブリダイゼーションについて使用される場合）使用してよい。
【００３５】
一実施態様では、本発明の核酸及び／又はポリペプチドは柑橘類、例えばグレープフルーツ又はオレンジから単離される。特定の一実施態様では、本発明は一定の単離されたヌクレオチド配列、例えば内在不純物質を実質的に含まない単離されたヌクレオチド配列に関する。用語“核酸”又は“核酸分子”は、一本鎖又は二本鎖の形のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドポリマーを示し、そして特に限定がなければ、天然のヌクレオチドと同様に機能しうる天然ヌクレオチドの公知のアナログを含む。また“ヌクレオチド配列”は、個々の断片の形の又はより大きな核酸の構成要素としてのポリヌクレオチド分子又はオリゴヌクレオチド分子を示す。またヌクレオチド配列又は分子は“ヌクレオチドプローブ”とも呼ばれることがある。幾つかの本発明の核酸分子は、少なくとも一回、実質的に純粋な形で、かつ標準的な生化学的手法によりヌクレオチド配列成分の同定、操作及び回収が可能な量又は濃度で単離されたＤＮＡ又はＲＮＡから誘導される。かかる方法、例えば本願で使用できるＰＣＲプロトコールのための方法は、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第２版、Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY （１９８９年）、F.A. Ausubelらにより編集されたCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc. （１９８７年）、及びInnis, Mら編、PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press（１９９０年）に開示されている。
【００３６】
本願で記載される場合に、本発明の核酸分子は、例えば一本鎖又は二本鎖の両者の形のＤＮＡ並びにそれらの相補ＲＮＡである。ＤＮＡは、例えばｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、化学合成ＤＮＡ、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ及びその組合せである。翻訳される領域、非翻訳領域及び調節領域を含むゲノムＤＮＡは、慣用の技術によって、例えば本発明の任意のｃＤＮＡの１つ又はその適当な断片をプローブとして用いて単離して、ゲノムＤＮＡの一部を同定し、次いで通常この分野で知られる方法を用いてクローニングできる。一般に本発明の範囲内での核酸分子は、例えば本発明の配列に、前記の、かつ本発明の配列のＤＮＡ対の溶融温度の５℃未満、１０℃未満、１５℃未満、２０℃未満、２５℃未満又は３０℃未満のハイブリダイゼーション及び洗浄条件下に、例えばこれらの範囲内に包含される任意の範囲の条件下にハイブリダイズする配列である。
【００３７】
別の実施態様では、本発明の核酸は、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９又は配列番号１０に実質的に示された配列を有する。一実施態様では、核酸は、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９又は配列番号１０のヌクレオチドに少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一である。一実施態様では、核酸は、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９又は配列番号１０のヌクレオチド配列を有する。更なる一実施態様では、核酸はセスキテルペン合成酵素であるタンパク質をコードし、これは例えば実施例に記載される酵素アッセイで裏付けられている。一実施態様では、該核酸は配列番号１又は配列番号２に実質的に示されたポリペプチドをコードする。異種間で保存された領域を有する核酸も提供される。
【００３８】
なおも別の実施態様では、核酸は、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９又は配列番号１０の少なくとも５０個、１００個、２５０個、５００個、７５０個の連続ヌクレオチドの連続配列を有する。これらのヌクレオチドのかかる連続断片は、突然変異配列が本来の配列の機能を保持し、かつ低い又は高いストリンジェンシー条件、例えば中程度又は高いストリンジェンシー条件下に前記のヌクレオチドにハイブリダイズする能力を保持する限りは少なくとも１つの突然変異を有してもよい。かかる断片は、例えば配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９又は配列番号１０のヌクレオチド（ｎｔ）２００〜ｎｔ１６００、ｎｔ８００〜ｎｔ１６００、ｎｔ１０００〜ｎｔ１６００、ｎｔ２００〜ｎｔ１０００、ｎｔ２００〜ｎｔ８００、ｎｔ４００〜ｎｔ１６００又はｎｔ４００〜ｎｔ１０００から得ることができる。
【００３９】
前記のように、本発明の核酸によってコードされるポリペプチドは本発明に含まれる。本発明の単離された核酸は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５に実質的に示されたポリペプチドをコードする核酸から選択してよい。一実施態様では、ポリペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５と少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一である。
【００４０】
一実施態様では、本発明のポリペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５に示されたアミノ酸配列を有する。有利には、本発明のポリペプチドは配列番号１又は配列番号２に示されたアミノ酸配列を有する。別の実施態様では、ポリペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５に実質的に示されたアミノ酸配列を有する。更なる別の実施態様では、ポリペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５に少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一である。一実施態様では、ポリペプチドはセスキテルペン合成酵素であり、これは、例えば以下に記載される酵素アッセイにおいて裏付けられている。
【００４１】
１以上のコドンが同じアミノ酸をコードできるという遺伝コードの縮重のゆえに、複数のＤＮＡ配列が同じポリペプチドをコードできる。かかる変異ＤＮＡ配列は、遺伝的浮動又は人工操作（例えばＰＣＲ増幅の間に又は本来の配列の故意の突然変異誘発の産物として生じる）から得ることができる。このように本発明は、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９又は配列番号１０から得られるタンパク質をコードしうる任意の核酸又はその変異体を含む。
【００４２】
本来の配列の故意の突然変異誘発は、この分野でよく知られる多数の技術を用いて実施できる。例えば、オリゴヌクレオチドの部位特異的突然変異誘発手法を使用でき、その際特に、遺伝子を、予め決められた制限ヌクレオチド又はコドンが置換、欠失又は挿入によって改変されるように突然変異させることが望ましい。かかる改変をもたらす方法の例は、Walderら（Gene 42: 133,1986）；Bauerら（Gene 37: 73, 1985）；Craik（BioTechniques, January 12-19, 1985）；Kunkel（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488, 1985）；Kunkelら（Methods in Enzymol. 154: 367, 1987）；及び米国特許第４，５１８，５８４号及び同第４，７３７，４６２号によって開示されている。
【００４３】
一実施態様では、本発明は単離されたポリペプチドを提供している。本願で使用される場合に、用語“ポリペプチド”は、本願に定義されるアミノ酸を包含するポリペプチド又はペプチド断片の類型並びにより小さい断片を示す。選択的に、ポリペプチドは、本発明の核酸配列によってコードされる任意のペプチドに対する抗原性関連の点で定義することができる。このように一実施態様では、本発明の範囲内でのポリペプチドは、本発明の核酸配列によってコードされる任意のペプチドと共通する線状又は三次元のエピトープを含むアミノ酸配列として定義される。選択的に、本発明の範囲内でのポリペプチドは、本発明の核酸によってコードされる任意のペプチドを特異的に認識する抗体によって認識される。抗体は、これらが本発明のポリペプチドと約１０７Ｍ−１以上のＫａ、例えば１０８Ｍ−１以上のＫａで結合する場合に特異的な結合であると定義される。
【００４４】
本願で呼称されるポリペプチド“変異体”とは、本来のポリペプチドと実質的に相同であるが、１つ以上の欠失、挿入又は置換のため本発明の任意の核酸配列によってコードされる配列とは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。
【００４５】
変異体は、保存的に置換された配列を含むことがあり、これは所定のアミノ酸前記が類似の生理化学的特徴を有する残基によって交換されていることを意味する。保存的置換の例は、例えばある脂肪族残基を別の脂肪族残基に置換すること、例えばＩｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ又はＡｌａを別の１つに置換すること、又はある極性残基を別の極性残基に置換すること、例えばＬｙｓとＡｒｇ；ＧｌｕとＡｓｐ；又はＧｌｎとＡｓｎの間での置換である。Zubay, Biochemistry, Addison-Wesley Pub.Co., (1983)を参照のこと。かかる置換の効果は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ（J. Mol. Biol. 219: 555-65, 1991）で議論されるＰＡＭ−１２０、ＰＡＭ−２００及びＰＡＭ−２５０のような置換スコア行列を用いて計算できる。他のかかる保存的置換、例えば類似の疎水特性を有する全領域の置換はよく知られている。
【００４６】
天然に存在するペプチド変異体も本発明に含まれる。かかる変異体の例は、選択的なｍＲＮＡスプライシング事象又は本願に記載されるポリペプチドのタンパク質分解から得られるタンパク質である。タンパク質分解を原因とする変異は、例えば種々の宿主細胞型で発現されることによるＮ末端又はＣ末端における差異であり、これは１つ以上の末端アミノ酸が本発明の配列によってコードされるポリペプチドからタンパク質分解により除去されることによるものである。
【００４７】
本発明のセスキテルペン合成酵素の変異体を用いることで、所望の増強された又は減衰された酵素活性、変更された位置化学性又は立体化学性又は変更された基質利用性又は生成物分布を達成することができる。変異体又は部位特異的突然変異体は、この分野で公知の任意の方法によって作成してよい。
【００４８】
前記のように、本発明は組み換え及び非組み換えの、例えば柑橘類植物から単離された及び精製されたポリペプチドを提供する。本来のポリペプチドの変異体及び誘導体は、天然に存在する変異体を単離するか、又は変異体のヌクレオチド配列、他のもしくは同じ植物株又は植物種のヌクレオチド配列を単離することによって、又は本来の柑橘類のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の人工的にプログラムされた突然変異によって得ることができる。本来のアミノ酸配列の改変は、多くの任意の慣用の方法によって達成できる。突然変異は、特定の遺伝子座で、突然変異配列とそれに隣接して本来の配列の断片にライゲーションが可能な制限部位を有するオリゴヌクレオチドを合成することによって導入できる。ライゲーションの後に、得られた再構築された配列は、所望のアミノ酸挿入、置換又は欠失を有するアナログをコードする。選択的に、オリゴヌクレオチドの部位特異的突然変異誘発の手法を用いて、予め決められたコドンが置換、欠失又は挿入によって改変されていてよい改変された遺伝子が提供される。
【００４９】
一実施態様では、本発明は本発明の核酸を有するベクターを考慮している。例えば、ベクターは、（ａ）配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９又は配列番号１０に実際に示されるヌクレオチド配列を有する核酸；（ｂ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５に実際に示されるポリペプチドをコードする核酸並びに（ｃ）低いストリンジェンシー条件下に（ａ）又は（ｂ）の核酸にハイブリダイズする核酸から選択され、該核酸によってコードされるポリペプチドがセスキテルペン合成酵素である少なくとも１つの核酸を有する。
【００５０】
本願で使用されるベクターは、任意の組み換えベクター、制限されないが例えばウイルスベクター、バクテリオファージ及びプラスミドである。
【００５１】
本発明の核酸配列を有する組み換え発現ベクターは、よく知られた方法を用いて調製できる。一実施態様では、発現ベクターは、適当な転写調節ヌクレオチド配列又は翻訳調節ヌクレオチド配列、例えば哺乳動物、微生物、ウイルス又は昆虫の遺伝子から得られたものに機能的に結合されたポリペプチドをコードするｃＤＮＡ配列を含む。調節配列の例は、例えば転写プロモーター、オペレーター又はエンハンサー、ｍＲＮＡリボソーム結合部位、及び転写と翻訳の開始及び終結を調節する適切な配列である。ヌクレオチド配列は、調節配列が本発明のｃＤＮＡ配列に機能的に対応づけられている場合に“機能的に結合”されている。このように、プロモーターのヌクレオチド配列は、プロモーターのヌクレオチド配列がｃＤＮＡ配列の転写を調節する場合にｃＤＮＡ配列に機能的に結合されている。所望の宿主細胞中での、通常は複製起点によって与えられる複製能及び形質転換体を同定する選択遺伝子は、発現ベクターに付加的に導入されてよい。
【００５２】
付加的に、本発明のポリペプチドと本来関連がない好適なシグナルペプチドをコードする配列を発現ベクターに導入してもよい。例えばシグナルペプチド（分泌リーダー）のためのＤＮＡ配列を枠内で本発明のヌクレオチド配列に融合してよく、結果として本発明のポリペプチドは該シグナルペプチドを有する融合タンパク質として翻訳される。意図される宿主細胞中で機能的なシグナルペプチドは、発現されるポリペプチドの細胞外分泌を促進する。該シグナルペプチドは、細胞からの分泌後にポリペプチドから分解されうる。
【００５３】
本発明のポリペプチドのアミノ末端部及びカルボキシ末端部での付加的なペプチド配列の融合を用いて、ポリペプチドの発現を促進するか、又はタンパク質の精製において補助として使用することができる。
【００５４】
一実施態様では、本発明は、例えば本発明の核酸を有する宿主細胞を含む。別の実施態様は、本発明のベクターを宿主細胞に導入することを含む組み換え宿主細胞の作成方法である。更なる一実施態様では、本発明の宿主細胞をポリペプチド産生条件下に培養することを含むポリペプチドの製造方法を考慮している。一実施態様ではそのポリペプチドが回収される。本発明の方法は、例えば少なくとも１種の本発明のセスキテルペン合成酵素の製造方法であって、本発明の核酸を有する宿主細胞を培養し、そして蓄積されたセスキテルペン合成酵素を回収することを含む方法である。
【００５５】
本発明のポリペプチドの発現のために適当な宿主細胞は、例えば原核生物、酵母又は高等真核細胞である。細菌宿主、菌類宿主、酵母宿主及び哺乳動物細胞宿主で使用するために好適なクローニングベクター及び発現ベクターは、例えば、Pouwelsら、Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, (1985)に記載されている。無細胞翻訳系を用い、本願に開示されるＤＮＡ構築物から得られるＲＮＡを使用して開示されたポリペプチドを製造することもできる。
【００５６】
原核生物は、例えばグラム陰性又はグラム陽性の生物、例えば大腸菌又は桿菌である。形質転換のために適当な原核性宿主細胞は、例えば大腸菌、バシラス・サチリス、サルモネラ・チフィムリウム及び、シュードモナス属、ストレプトマイセス属及びスタフィロコッカス属内の他の種々の種である。原核性宿主細胞、例えば大腸菌では、ポリペプチドは原核性宿主細胞における組み換えポリペプチドの発現を促すためにＮ−末端メチオニン残基を含んでよい。Ｎ−末端メチオニンは、発現された組み換えポリペプチドから分解してよい。
【００５７】
原核性宿主細胞のために有用な発現ベクターの例は、例えば商業的に入手可能なプラスミド、例えばクローニングベクターｐＥＴプラスミド（ノバジェン、マジソン、ＷＩ、米国）又はｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）から誘導されるベクターである。ｐＢＲ３２２は、アンピシリン耐性及びテトラサイクリン耐性のための遺伝子を有し、従って形質転換された細胞の同定のための簡単な手段が提供される。ｐＢＲ３２２を用いて発現ベクターを構築するために、適当なプロモーターと１つ以上の本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列をｐＢＲ３２２ベクターに挿入する。他の商業的に入手可能なベクターは、例えばｐＫＫ２２３−３（ファルマシアファインケミカル社、Uppsala、スウェーデン）及びｐＧＥＭ−１（プロメガバイオテック、マジソン、ＷＩ、米国）である。他の商業的に入手可能なベクターは、例えば、タンパク質の発現のために特別に設計されたベクターであり、これらは、例えばマルトース結合タンパク質に融合されたタンパク質の発現に使用されるｐＭＡＬ−ｐ２及びｐＭＡＬ−ｃ２ベクター（ニューイングランドバイオラボ、Beverly、ＭＡ、米国）である。
【００５８】
組み換え原核性宿主細胞発現ベクターに通常使用されるプロモーター配列は、例えばバクテリオファージＴ７プロモーター（Studier F.W. and Moffatt B.A., J.Mol.Biol. 189: 113, 1986）、ｐ−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトースプロモーター系（Changら、Nature 275: 615, 1978;及びGoeddelら、Nature 281: 544, 1979）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Goeddelら、Nucl.Acids Res. 8: 4057, 1980及びＥＰ−Ａ３６７７６号）及びｔａｃプロモーター（Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, p.412, 1982）である。特に有用な原核性宿主細胞発現系は、ファージλＰＬプロモーター及びｃＩ８５７ｔｓ易熱性リプレッサー配列を使用する。米国微生物系統保存機関（“ＡＴＣＣ”）から入手できるＰＬプロモーターの誘導体を導入するプラスミドベクターは、例えばプラスミドｐＨＵＢ２（大腸菌株ＪＭＢ９（ＡＴＣＣ３７０９２）に内在）及びｐＰＬｃ２８（大腸菌ＲＲ１（ＡＴＣＣ５３０８２）に内在）である。
【００５９】
本発明のポリペプチドは、酵母宿主細胞、有利にはサッカロマイセス属（例えばＳ．セレビシエ）からの宿主細胞において発現させてもよい。他の酵母の属、例えばピチア又はクルイベロマイセス（例えばＫ．ラクティス）を使用してもよい。酵母ベクターは屡々、２μ酵母プラスミドからの複製起点配列、自律複製配列（ＡＲＳ）、プロモーター領域、ポリアデニル化のための配列、転写終結のための配列及び選択可能なマーカー遺伝子を有する。酵母ベクターのために好適なプロモーター配列は、例えばなかでも、メタロチオニン、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（Hitzemanら、J.Biol.Chem. 255: 2073, 1980）又は他の解糖系酵素（Hessら、J.Adv. Enzyme Reg. 7: 149, 1968；及びHollandら、Biochem. 17: 4900, 1978）、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼのためのプロモーターである。酵母発現において使用するために適当な他のベクター及びプロモーターは、更にHitzemanのＥＰ−Ａ−７３，６５７号又はFleerら、Gene, 107: 285-195 (1991)；及びvan den Bergら、Bio/Technology, 8: 135-139 (1990)に記載されている。別の代替物は、Russellら（J. Biol. Chem. 258: 2674, 1982）及びBeierら（Nature 300: 724, 1982）によって記載されるグルコース抑制性のＡＤＨ２プロモーターである。酵母と大腸菌の両者において複製可能なシャトルベクターは、ｐＢＲ３２２からの大腸菌における選択及び複製のためのＤＮＡ配列（Ａｍｐｒ遺伝子及び複製起点）を前記の酵母ベクターに挿入することによって構築できる。
【００６０】
本発明の一実施態様は、本発明の核酸を有する改変された非ヒト生物である。非ヒト生物及び／又は宿主細胞は、遺伝子移入のためにこの分野で知られる任意の方法、例えば輸送措置、例えば脂質及びウイルスベクター、裸のＤＮＡの使用、エレクトロポレーション及び粒子媒介遺伝子移入によって改変してよい。一実施態様では、非ヒト生物は、植物、昆虫又は微生物である。
【００６１】
例えば一実施態様では、本発明は、少なくとも１種のセスキテルペン合成酵素の製造方法であって、少なくとも１つの核酸を有する改変された宿主を、少なくとも１種のセスキテルペン合成酵素の産生に導く条件下に培養させることを含み、その際、前記の少なくとも１つの核酸が、（ａ）配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９又は配列番号１０に実質的に示されたヌクレオチド配列を有する核酸；（ｂ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５に実質的に示されたポリペプチドをコードする核酸並びに（ｃ）低いストリンジェンシー条件下に（ａ）又は（ｂ）の核酸にハイブリダイズする核酸から選択され、該核酸によってコードされるポリペプチドがセスキテルペン合成酵素である方法を提供する。
【００６２】
更なる一実施態様では、その宿主は、植物、例えばタバコ、動物又は微生物、また制限されないが例えば細菌細胞、酵母細胞、植物細胞及び動物細胞である。本願で使用される場合に、植物細胞及び動物細胞は、例えば植物及び動物を宿主として使用することを含む。例えば本発明の幾つかの実施態様では、発現は遺伝子改変された非ヒト生物において行われる。
【００６３】
一実施態様では、哺乳動物又は昆虫の宿主細胞培養系を使用して、本発明の組み換えポリペプチドを発現させる。昆虫細胞における異種タンパク質の製造のためのバキュウロウイルス系は、Luckow and Summers, Bio/Technology 6: 47 (1988)によって調査されている。また哺乳動物起源の樹立細胞株も使用できる。適当な哺乳動物宿主細胞株の例は、例えばサル腎臓細胞のＣＯＳ−７株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１）（Gluzmanら、Cell 23: 175, 1981）、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ１６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞及びＢＨＫ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１０）細胞株及びMcMahanら（EMBO J. 10: 2821, 1991）によって記載されるアフリカミドリザル腎臓細胞株ＣＶ１から得られるＣＶ−１／ＥＢＮＡ−１細胞株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１０４７８）である。
【００６４】
ＤＮＡを哺乳動物細胞に導入するための確立された方法は、記載されている（Kaufman, R.J. Large Scale Mammalian Cell Culture, 1990, pp.15-69）。商業的に入手可能な試薬、例えばリポフェクタミン（ギブコ／ＢＲＬ）又はリポフェクタミン−プラスを用いる付加的なプロトコールを使用して、細胞のトランスフェクションを行ってよい（Felgnerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-7417, 1987）。付加的に、エレクトロポレーションを使用して、慣用の手法、例えばSambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第２版、第１〜３巻、Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)の手法を用いて哺乳動物細胞のトランスフェクションを行ってよい。安定な形質転換体の選択は、細胞毒性薬剤に対する耐性を用いて選択法として実施できる。Kaufmanら、Meth. in Enzymology 185: 487-511, 1990は、幾つかの選択計画、例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）耐性を記載している。ＤＨＦＲ選択のために適当な宿主株は、ＤＨＦＲに欠失があるＣＨＯ株ＤＸ−Ｂ１１であってよい（Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220, 1980）。ＤＨＦＲのｃＤＮＡを発現するプラスミドは株ＤＸ−Ｂ１１に導入でき、そしてそのプラスミドを有する細胞だけが適当な選択培地中で増殖できる。
【００６５】
哺乳動物宿主細胞発現ベクターのための転写調節配列及び翻訳調節配列はウイルスゲノムから切り出すことができる。通常使用されるプロモーター配列及びエンハンサー配列はポリオーマウイルス、アデノウイルス２、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）及びヒトのサイトメガロウイルスから得られる。ＳＶ４０ウイルスゲノムから得られるＤＮＡ配列、例えばＳＶ４０の起点、早期及び後期プロモーター、エンハンサー、スプライシング部位及びポリアデニル化部位を用いて、哺乳動物宿主細胞における構造遺伝子配列の発現のための他の遺伝子エレメントを提供できる。ウイルスの早期及び後期プロモーターは、その両者はウイルスゲノムから容易に、ウイルス複製起点も有しうる断片として得られるので有用である（Fiersら、Nature 273: 113, 1978；Kaufman, Meth. in Enzymology, 1990）。
【００６６】
遺伝子導入植物の作成についてこの分野で知られる幾つかの方法が存在する。これらは、制限されないが例えば：植物プロトプラストのエレクトロポレーション、リポソーム媒介形質転換、ポリエチレングリコール媒介形質転換、植物細胞のマイクロインジェクション及びウイルスを用いる形質転換である。一実施態様では、粒子衝撃による直接的な遺伝子移入が用いられる。
【００６７】
粒子衝撃による直接的な遺伝子移入は、植物組織の形質転換についての例を提供する。この技術では、ＤＮＡで被覆された粒子又は発射体が細胞の物理的障壁を通して打ち込まれる。粒子衝撃を用いて、ＤＮＡ被覆粒子により貫通可能な任意の標的組織中にＤＮＡを導入できるが、安定な形質転換のためには、再生可能な細胞を使用することが必須である。一般に、その粒子は金又はタングステンからなる。該粒子は、通常この分野で知られるＣａＣｌ２又はエタノール沈殿法のいずれかを用いてＤＮＡで被覆される。
【００６８】
ＤＮＡ被覆粒子はパーティクルガンから打ち込まれる。適当なパーティクルガンは、バイオラドラボラトリーズ社（Hercules, CA）から入手できる。粒子貫通は、種々のパラメータ、例えば爆発強度、粒径又は粒子が標的組織に到達するまでに経由せねばならない距離によって制御される。
【００６９】
粒子の被覆のために使用されるＤＮＡは、当該遺伝子に機能的に結合されたプロモーターを有する当該遺伝子発現を駆動するのに適当な発現カセットを有してよい。
【００７０】
粒子衝撃による直接的な遺伝子移入を実施する方法は、Tomesらに対する米国特許第５，９９０，３８７号に開示されている。
【００７１】
一実施態様では、本発明のｃＤＮＡは、センスＲＮＡ又はアンチセンスＲＮＡのいずれかを産生するように発現させてよい。アンチセンスＲＮＡは、遺伝子によってコードされるｍＲＮＡ（センスＲＮＡ）の逆相補である配列を有するＲＮＡである。アンチセンスＲＮＡの発現を駆動するベクターは、ｃＤＮＡがプロモーターに関して“逆方向”で配置され、その結果、非コード鎖（コーディング鎖ではなく）が転写されるベクターである。アンチセンスＲＮＡの発現を用いて、アンチセンスＲＮＡに相補的なｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現を下方調節することができる。アンチセンスＲＮＡを産生するベクターを用いて、前記のように遺伝子導入植物を作成できる。
【００７２】
一実施態様では、トランスフェクションされたＤＮＡを非ヒト生物の染色体に組み込み、その結果、安定な組み換え系が得られる。この分野で公知の任意の染色体組み込み方法、制限されないが例えば、レコンビナーゼ媒介カセット交換（ＲＭＣＥ）、ウイルス部位特異的染色体挿入、アデノウイルスと前核注入を本発明の実施において使用してよい。
【００７３】
本発明の更なる実施態様は、テルペノイド及びセスキテルペン化合物を、本発明のヌクレオチド及びポリペプチドを用いて製造する方法である。例としては、少なくとも１種のテルペノイドの製造方法であって、少なくとも１種の非環式のピロリン酸テルペン前駆体と、（ａ）配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９又は配列番号１０に実際に示されるヌクレオチド配列を有する核酸；（ｂ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５に実際に示されるポリペプチドをコードする核酸並びに（ｃ）低いストリンジェンシー条件下に（ａ）又は（ｂ）の核酸にハイブリダイズする核酸から選択され、該核酸によってコードされるポリペプチドがセスキテルペン合成酵素である少なくとも１つの核酸によってコードされる少なくとも１種のポリペプチドとを接触させる方法がある。もう一つの例としては、少なくとも１種のテルペノイドの製造方法であって、少なくとも１種の非環式のピロリン酸テルペン前駆体と、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５に実質的に示された少なくとも１種のポリペプチドとを接触させ、そして産生された少なくとも１種のテルペノイドを単離する方法がある。
【００７４】
本願で使用される場合に、非環式のピロリン酸テルペン前駆体は、少なくとも１種のテルペン、制限されないが例えばゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）、ファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）及びゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）の産生への前駆体である任意の非環式のピロリン酸化合物である。
【００７５】
一実施態様では、少なくとも１種のテルペノイドはセスキテルペンから選択される。一実施態様において、少なくとも１種の非環式のピロリン酸テルペン前駆体はファルネシルピロリン酸である。更なる一実施態様では、少なくとも１種のセスキテルペンは、ビシクロゲルマクレン（（Ｅ，Ｅ）−３，７，１１，１１−テトラメチル−ビシクロ［８．１．０］ウンデカ−２，６−ジエン）、クベボール（（１Ｒ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｒ，７Ｓ，１０Ｒ）−７−イソプロピル−４，１０−ジメチルトリシクロ［４．４．０．０（１，５）］デカン−４−オール、バレンセン（（＋）−（１Ｒ）−１，２，３，５，６，７，８，８Ａ−オクタヒドロ−７−イソプロペニル−１＠、８Ａ＠−ジメチルナフタレン）、α−クベベン、ゲルマクレンＤ及びδ−カジネン（ｒｅｌ−（１Ｒ，８ＡＳ）−１，２，３，５，６，８Ａ−ヘキサヒドロ−１−イソプロピル−４，７−ジメチルナフタレン）から選択される（図２）。本発明のテルペノイドは、この分野で使用される任意の方法、制限されないが例えばクロマトグラフィー、抽出及び蒸留によって単離してよい。
【００７６】
一実施態様では、生成物の分布又は形成される実際上の生成物を、該合成酵素が非環式のピロリン酸テルペン前駆体、例えばファルネシルピロリン酸と接触するｐＨを変化させることによって改変してよい。一実施態様では、ｐＨは７である。更なる一実施態様では、ｐＨは７未満、例えば６、５、４及び３である。
【００７７】
また本発明の実施内では、セスキテルペン合成酵素の基質（例えばＦＰＰ）の高レベルの産生のための及び本発明の核酸を生物に導入するための基盤を構築するために使用される生物（例えば微生物又は植物）である。例えば、セスキテルペン合成酵素をコードする本発明の少なくとも１つの核酸は、ＦＰＰを産生する非ヒト生物に導入され、それによりＦＰＰはセスキテルペンに変換され、そして引き続きセスキテルペンの代謝による産生がなされる。一実施態様では、このころは、セスキテルペンの高レベルの産生のための基盤をもたらす。
【００７８】
一実施態様では、本発明の核酸を使用して、セスキテルペン合成酵素をコードする他の核酸を作成できる。例えば本発明は、セスキテルペン合成酵素を同定する方法であって、本発明の核酸を用いてＤＮＡライブラリーを構築し、少なくとも１種のセスキテルペン合成酵素をコードする核酸について該ライブラリーをスクリーニングすることを含む方法を提供する。本発明の核酸を使用するＤＮＡライブラリーは、この分野で公知の任意の方法によって構築してよく、その際、ＤＮＡ配列は出発点として本発明の核酸を用いて、例えば制限されないがＤＮＡシャフリングで作成される。かかる方法において、該ライブラリーをセスキテルペン合成酵素について機能的アッセイを用いてスクリーニングして、セスキテルペン合成酵素をコードする標的核酸を見出してよい。セスキテルペン合成酵素の活性は、例えば本願に記載の方法を用いて分析してよい。一実施態様では、高処理量スクリーニングを用いて、コードされるポリペプチドの活性を分析する。
【００７９】
本願で使用される場合に、“ヌクレオチドプローブ”は、相補配列の標的核酸に１種以上の化学結合を介して、相補塩基対又は水素結合形成により結合可能なオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドとして定義される。前記のように、オリゴヌクレオチドプローブは天然の塩基（すなわちＡ、Ｇ、Ｃ又はＴ）又は修飾塩基（７−デアザグアノシン、イノシンなど）を含んでいてよい。付加的にオリゴヌクレオチドプローブにおける塩基を、ホスホジエステル結合以外の結合によって、それがハイブリダイゼーションを抑制しない限りは結合させてよい。このようにオリゴヌクレオチドプローブは、ホスホジエステル結合ではなくペプチド結合によって結合された構成塩基を有してよい。
【００８０】
本願の“標的核酸”は、ヌクレオチドプローブ又は分子が特異的にハイブリダイズできる核酸を示している。該プローブは、標的核酸の存在又は不在及び標的核酸の量を測定するように設計される。標的核酸は、その標的に向けられる相応のプローブの核酸配列に相補的な配列を有する。当業者に理解されるように、プローブはまた、標的に特異的に結合しなくてよい付加的な核酸又は他の成分、例えば標識を有してもよい。核酸という用語は、プローブが向けられる大きな核酸の特定のヌクレオチド配列又は全配列（例えば遺伝子又はｍＲＮＡ）を示してよい。当業者は、種々の条件下での完全な利用性を理解するはずである。
【００８１】
実施例又はそれ以外の指示を別として、成分の量を表す全ての数、反応条件、明細書及び特許請求の範囲で使用されるこれらは、全ての場合に“約”という用語によって変更されると解されるべきである。従って、それに対する指示がない限り、明細書及び特許請求の範囲に示される数的なパラメーターは近似値であり、これは本発明によって得られることが求められる所望の特性に依存して変更してよい。最少に見て、かつ特許請求の範囲の均等理論の適用の制限を試みることとしてではなく、各々の数的パラメータは有効数字数の見方で、かつ通常の丸めの手法で解釈すべきである。
【００８２】
本発明の広い範囲で示される数的範囲及び数的パラメータは近似値であるが、特定の実施例に示される数値はできる限り正確なものとして報告される。しかしながら任意の数値は本質的に、そのそれぞれの試験測定で見られる標準偏差から必然的に生ずる一定の誤差を含む。以下の実施例は本発明を説明することを意図するもので、結果としてその範囲を制限するものではない。パーセンテージは質量に対するものである。
【００８３】
以下の実施例は本発明を説明することを意図するもので、結果としてその範囲を制限するものではない。
【００８４】
実施例
材料
グレープフルーツ（Citrus paradisi）のフラベドを実施例に記載される実験のための出発物質として使用した。そのフラベド（外側の果皮の有色部分）はテルペン生合成の部位である油腺を有する。グレープフルーツのフラベドはシモーネガット（Simone Gatto）（シシリー）で摘み取られたばかりの成熟果実から調製した。フラベド（３〜４ｍｍ厚）を切り取り、直ちに凍結させ、かつ変質を回避するために輸送の間中及び全ての後続工程の間中凍結させたままにした。
【００８５】
実施例１：セスキテルペン合成酵素のｃＤＮＡのＲＴ−ＰＣＲを用いた単離
植物のセスキテルペン合成酵素の推測されたアミノ酸配列のアライメントを行い、保存された領域を同定し、そして植物のセスキテルペン合成酵素特異的なオリゴヌクレオチドを設計した。より良好な配列相同性を得るために、これらの配列を２つの群に分けた（図４）。第一の群は、トマト栽培品種VFNT cherry由来のゲルマクレンＣ合成酵素（Colbyら、１９９８年）、セイヨウハッカ由来の（Ｅ）−β−ファルネセン合成酵素（Crockら、１９９７年）、グランドファー由来のδ−セリネン合成酵素（Steeleら、１９９８年）、ユズ由来のセスキテルペン合成酵素（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ２８８４６５）、タバコ由来（Facchini and Chappell、１９９２年）及びトウガラシ由来（Backら、１９９８年）の５−エピ−アリストロチェン合成酵素、ジャガイモ由来及びヒヨスシアムス・ムチクス由来（Back and Chappel、１９９５年）のベチスピラジエン合成酵素の配列を含む。第二の群は、キダチワタ由来（Chenら、１９９５年）の（＋）−８−カジネン合成酵素、クソニンジン由来のエピ−セドロール合成酵素（Merckら、１９９９年）及びグランドファー由来（Steeleら、１９９８年）のγ−フムレン合成酵素の配列を含む。最も高い配列相同性は配列の中央部に見出された。十分に保存されたアミノ酸を有する３つの領域を選択し、そしてこれらの領域に特異的な縮重オリゴヌクレオチドを設計した（すなわち２つのフォワードプライマーと１つのリバースプライマーをそれぞれのアライメントから推定した）（図４）。
【００８６】
ＲＴ−ＰＣＲを高温ホウ酸塩技術（Hot Borate technique）によって調製されたグレープフルーツのフラベドからの全ＲＮＡを用いて実施した。全ＲＮＡ抽出のための高温ホウ酸塩技術は、WanとWilkins（Wanら（１９９４年）Anal.Biochem. 223,7-12）から改変した。組織を、乳鉢と乳棒を用いて液体窒素中で微粉末に粉砕した。その粉末を、８０℃に予熱された５ｍｌの抽出緩衝液（２００ｍＭのホウ酸塩、３０ｍＭのＥＧＴＡ、１０ｍＭのＤＴＴ、１％のＳＤＳ、１％のデオキシコール酸ナトリウム、２％のＰＶＰ、０．５％のノニデットＮＰ−４０）に添加した。該混合物をウルトラツラックス（Ultraturax）（商標）ホモジナイザを用いて均質化し、そして２層のミラクロス（Miracloth）（商標）フィルタ（カルビオケム）を通して濾過した。該混合物を０．５ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（タンパク質／リボヌクレアーゼ消化のため）の存在下に４２℃で９０分間インキュベートした。次いでＫＣｌを１Ｍの最終濃度にまで添加し、氷上で１時間インキュベートした後に、該混合物を１００００ｇ及び４℃で１０分間遠心分離器に入れた。上清を回収し、そして１／３容量の８ＭのＬｉＣｌを添加した。該混合物を４℃で一晩インキュベートし、そして１００００ｇ及び４℃で２０分間遠心分離器中に入れた。上清を廃棄し、そしてペレットを２ＭのＬｉＣｌで洗浄し、そして前記と同様に再度遠心した。次いでペレットをＲＮアーゼ不含の蒸留水中に再懸濁し、そして０．１５容量の２Ｍの酢酸カリウム溶液と２．５容量の無水エタノールを添加した。ＲＮＡを−２０℃で２時間インキュベートすることにより沈殿させ、そして前記と同様に遠心分離によりペレット化させた。そのＲＮＡペレットを８０％のエタノールで洗浄し、そしてＲＮアーゼ不含の蒸留水中に再懸濁した。
【００８７】
ＲＮＡの濃度を２６０ｎｍでのＯＤから見積もった。ＲＮＡの完全性を、アガロースゲル上でリボソームＲＮＡバンドの完全性の検査により評価した。
【００８８】
ＲＴ−ＰＣＲを、キアゲン社製のＯｎｅＳｔｅｐＲＴ−ＰＣＲキットとエッペンドルフ社製のマスターサイクラーグラジエント型のサーマルサイクラーを用いて実施した。典型的な反応混合物は、１０μｌの５×キアゲン社製ＯｎｅＳｔｅｐＲＴ−ＰＣＲ緩衝液、４００μＭの各ｄＮＴＰ、４００ｎＭの各プライマー、２μｌのキアゲン社製のＯｎｅＳｔｅｐＲＴ−ＰＣＲ酵素ミックス、１μｌのＲＮａｓｉｎＸ（登録商標）リボヌクレアーゼ阻害剤（プロメガ社）及び１μｇの全ＲＮＡを最終容量５０μｌ中に有していた。サーマルサイクラー条件は５０℃で３０分間（逆転写）；９５℃で１５分間（ＤＮＡポリメラーゼ活性化）；９４℃で４５秒間、４２〜４５℃で１０秒間（使用されるプライマーによる）、７２℃で４５〜９０秒間（増幅されるべきＤＮＡ断片のサイズによる）を４０周期；及び７２℃で１０分間であった。
【００８９】
ＰＣＲ産物のサイズを１％のアガロースゲル上で評価した。期待されたサイズに相当するバンドをゲルから切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）ゲル抽出キット（キアゲン社）を用いて精製し、そしてｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯベクター中にＴＯＰＯ ＴＡクローニングキット（インビトロジェン社）を用いてクローニングした。次いで挿入されたｃＤＮＡのＤＮＡ配列決定を行い、そして該配列をＧｅｎＢａｎｋの重複のないタンパク質データベース（ＮＣＢＩ）に対しＢＬＡＳＴＸアルゴリズム（Altschulら、１９９０年）を用いて比較した。
【００９０】
期待された長さ（８０〜２４０塩基対のサイズ）を有するＰＣＲ産物のＤＮＡ配列決定及びＢｌａｓｔ検索による分析により、３種の異なるセスキテルペン合成酵素の断片が明らかになり、これらをＧＦＴｐｓＡ、ＧＦｔｐｓＢ及びＧＦＴｐｓＣと名付けた。１８０塩基対のＧＦＴｐｓＡ断片をプライマーＴｐｓＶＦ１とＴｐｓＶＲ３で増幅させ、１１５塩基対のＧＦｔｐｓＢ断片をプライマーＴｐｓＶＦ２とＴｐｓＶＲ３で増幅させ、そして１１５塩基対のＧＦＴｐｓＡ断片をプライマーＴｐｓＶＦ１とＴｐｓＶＲ３で増幅させた。推定されたアミノ酸配列により、これら３種の断片の間に大きな差異が明らかになった（図５）。
【００９１】
実施例２：セスキテルペン合成酵素の５′／３′−ＲＡＣＥを用いた単離
セスキテルペン合成酵素の全長の配列を単離するために、まず５′／３′−ＲＡＣＥ法を使用した。ｃＤＮＡをＭａｒａｔｈｏｎ（商標）ｃＤＮＡ増幅キット（クロンテック社）を用いて、かつ高温ホウ酸塩技術で調製された全ＲＮＡから精製された１μｇのｍＲＮＡから出発して合成した。合成されたｃＤＮＡの量は少なく、本質的に小さいサイズのｃＤＮＡが得られた（平均サイズ０．５キロ塩基）しかしながら、このｃＤＮＡを用いて、ＧＦＴｐｓＢとＧＦＴｐｓＣの３′末端を、遺伝子特異的なプライマーＧＦＴｐｓＢＲＦ１とＧＦＴｐｓＢＲＦ２をＧＦＴｐｓＢについて用い、そして遺伝子特異的プライマーＧＦＴｐｓＣＲＦ１とＧＦＴｐｓＣＲＦ２をＧＦＴｐｓＣについて用いて得た（第１表を参照のこと）。チオシアン酸グアニジニウム／フェノール抽出により調製されたｍＲＮＡから、より高質の平均サイズ２キロ塩基を有するｃＤＮＡが得られ、これにより遺伝子特異的プライマーＧＦＴｐｓＣＲＲ１とＧＦＴｐｓＲＲ２を用いるＧＦＴｐｓＣの５′末端配列の単離が可能となり、このクローンの全長配列が完成された。ＧＦＴｐｓＢの５′末端とＧＦＴｐｓＡの５′末端及び３′末端は前記の手法により得られなかった。
【００９２】
チオシアン酸グアニジニウム／フェノール抽出法は、ChomczynskiとSacchiによって記載されたＴｈｅｒｍｏＨｙｂａｉｄ社製のＲＮＡ Ｃｌｅａｎ（商標）溶液を用いる技術に基づくものである（Chomczynski, P., and Sacchi, N., (1987) Anal. Biochem. 162, 156-159）。手短に言えば、２ｇの凍結組織を乳鉢と乳棒を用いて液体窒素中で微粉末に粉砕した。該粉末を２０ｍｌのＲＮＡ Ｃｌｅａｎ（商標）溶液に移し、そして該懸濁液をウルトラツラックス（商標）ホモジナイザを用いて均質化し、かつミラクロス（商標）フィルタ（カルビオケム社）を通して濾過した。０．１容量のクロロホルムを添加した後に、該試験管を氷上に置き、そして１２０００ｇ及び４℃で２０分間遠心分離した。上方の水相を回収し、そして１容量のイソプロパノールを添加した。−２０℃で２０分間インキュベートした後に、試料を１２０００ｇ及び４℃で２０分間遠心分離した。得られた多量の白色ペレットを７０％エタノールで洗浄し、そして室温で乾燥させた。全ＲＮＡを含有するこのペレットを、オリゴｄＴセルロース親和性クロマトグラフィーによるｍＲＮＡ精製をＦａｓｔＴｒａｃｋ（登録商標）２．０ ｍＲＮＡ単離キット（インビトロジェン社）を用いて実施した。製造元のプロトコールに従うが、但し、溶解緩衝液中で全ＲＮＡを再懸濁した後に、試料を６５℃の代わりに１００℃で加熱した。
【００９３】
ｃＤＮＡ末端の３′及び５′高速増幅をＭａｒａｔｈｏｎ（商標）ｃＤＮＡ増幅キット（クロンテック社）を用いて実施した。該方法は、ｍＲＮＡから出発する第一鎖ｃＤＮＡ合成を１つのオリゴ（ｄＴ）プライマーを用いて開始した。第二鎖合成の後に、特定のアダプターを二本鎖ｃＤＮＡ（ｄｓｃＤＮＡ）末端にライゲーションした。この方法により、アダプターとライゲーションされたｄｓｃＤＮＡの未知のクローンライブラリーが得られた。精製されたグレープフルーツのｍＲＮＡ（１μｇ）を出発材料として使用した。ｃＤＮＡの質と量とをアガロースゲル上で評価した。
【００９４】
特定のｃＤＮＡの３′末端又は５′末端をアドバンテージ（Advantage）（登録商標）２ポリメラーゼミックスにより遺伝子特異的オリゴヌクレオチドとアダプター特異的なオリゴヌクレオチドとの組合せを用いて増幅させた。典型的なＲＡＣＥ反応混合物は、最終容量５０μｌにおいて、５μｌの１０×ｃＤＮＡ ＰＣＲ反応緩衝液（クロンテック社）、２００ｎＭの各ｄＮＴＰ、１μｌのアドバンテージ（登録商標）２ポリメラーゼミックス、２００μＭのアダプター特異的なプライマー（クロンテック社）、２００μＭの遺伝子特異的なプライマー（第１表を参照のこと）及び５μｌの５０〜２５０倍に希釈されたアダプターにライゲーションされたｃＤＮＡを含有していた。増幅は、エッペンドルフ社製のマスターサイクラーグラジエント型のサーマルサイクラーで実施した。熱周期条件は以下のとおりである：９４℃で１分間、９４℃で３０秒間と７２℃で２〜４分間を５周期、９４℃で３０秒間と７０℃で２〜４分間を５周期、９４℃で３０秒間と６８℃で２〜４分間を２０周期。必要であれば、二回目の増幅を、内側のアダプター特異的なプライマー（nested adaptor-specific primer）（クロンテック社）及び内側の遺伝子特異的なプライマー（nested gene-specific primer）を用いて実施した。
【００９５】
増幅産物を評価し、サブクローニングし、そしてＲＴ−ＰＣＲ産物に関して前述したように配列分析を行った。
【００９６】
第１表：３′／５′−ＲＡＣＥ実験で以下のプライマーを使用した：
【００９７】
【表１】
0004571862.tif 000002
【００９８】
３′−ＲＡＣＥにより得られた部分的なＧＦＴｐｓＢのｃＤＮＡは、公共のデータベースで見出された推定のテルペン合成酵素のｃＤＮＡとの高い配列同一性が明らかにされ、それをユズから単離した。このテルペン合成酵素の配列に特異的なプライマーを設計した：１対のフォワードプライマーとリバースプライマー（ｊｕｎｏｓＦ１及びｊｕｎｏｓＲ１）はユズのテルペン合成酵素の非コード領域に対して設計され、そして１対のフォワードプライマーとリバースプライマー（junosＦ２及びｊｕｎｏｓＲ２）は開始コドンと停止コドンを含むコーディング領域中で設計された。グレープフルーツのＭａｒａｔｈｏｎ（商標）ｃＤＮＡライブラリーでプライマーｊｕｎｏｓＦ１とｊｕｎｏｓＲ１を用いるＰＣＲによりアンプリコンは作製されなかった。ｊｕｎｏｓＦ２及びｊｕｎｏｓＲ２プライマーを用いて１．６キロ塩基の断片が増幅された。ＤＮＡ配列決定により、このＰＣＲ産物がＧＦＴｐｓＢクローンの１６６９塩基対の全長セスキテルペン合成酵素であることが確認された。（図６）。
【００９９】
実施例３：ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング及びＥＳＴ配列決定
ＰＣＲ法により得られた部分的クローンの全長ｃＤＮＡを得るために、グレープフルーツのフラベドのｍＲＮＡから作製されたｃＤＮＡライブラリーを構築した。
【０１００】
ｃＤＮＡ合成及びライブラリーの構築を、Ｕｎｉ−ＺＡＰ（登録商標）ＸＲライブラリー構築キット（ストラタジェン社）を用いて製造元のプロトコールに従って、７．５μｇのグレープフルーツのフラベドのｍＲＮＡ（チオシアン酸グアニジニウム／フェノール法により調製した）から出発して実施した。そのライブラリーの本来の力価は２×１０７ＰＦＵ（プラーク形成単位）であり、そして平均挿入サイズは１．１キロ塩基であった。
【０１０１】
２つの手法を用いて、該ｃＤＮＡライブラリーからセスキテルペン合成酵素をコードするｃＤＮＡを単離した：ＥＳＴ配列決定及びＤＮＡプローブを用いるスクリーニング。ＥＳＴ（発現配列タグ）配列決定のために、ライブラリーの一部分を用いて、ストラタジェン社の多量切り出しプロトコール（mass excision protocol）に従ってＵｎｉ−ＺＡＰ ＸＲベクターからｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔファージミドを切り出した。得られた形質転換された細菌コロニー（５７６）を無作為に拾い、そしてプラスミドを精製した。各クローンについて１回の配列決定反応をＴ３プライマーを用いて実施した。その配列をまず編集し、ベクター配列を除去し、そして該配列をＧｅｎＢａｎｋの重複のないタンパク質データベース（ＮＣＢＩ）に対しＢＬＡＳＴＸアルゴリズム（Altschulら、１９９０年）を用いて比較した。
【０１０２】
該ライブラリーをジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識ＤＮＡプローブでスクリーニングした。ＤＩＧ−ｄＵＴＰをＤＮＡ断片中にＰＣＲによってＰＣＲ ＤＩＧ（ジゴキシゲニン）プローブ合成キット（ロシェ・ディアグノスティクス社）を用いてプローブを合成した。１４９塩基対のＧＦＴｐｓＡ由来のＤＮＡプローブを、ライブラリーの一部分から、フォワードプライマーＧＦＴｐｓＡｐｒｏＦ（配列番号５２）（５′−ＡＣＧＡＴＴＴＡＧＧＣＴＴＣＣＣＴＡＡＡＡＡＧＧ−３′）及びリバースプライマーＧＦＴｐｓＡｐｒｏＲ（配列番号５３）（５′−ＴＡＴＴＡＴＧＧＡＡＴＡＴＴＡＴＧＣＡＣＡＣＣＡＣ−３′）を用いて増幅させた。１０３６塩基対のＧＦＴｐｓＢ由来のＤＮＡプローブを、ｐＥＴ−ＧＦＴｐｓＢ２−２プラスミドから、フォワードプライマーｊｕｎｏｓＦ２（配列番号５４）（５′−ＡＡＡＴＧＴＣＣＧＣＴＣＡＡＧＴＴＣＴＡＧＣＡＡＣＧＧ−３′）及びリバースプライマーＧＦＴｐｓＢＲＲ２（配列番号４１）を用いて増幅させた。１００８塩基対のＧＦＴｐｓＣ由来のＤＮＡプローブを、ｐＥＴ−ＧＦＴｐｓＣプラスミドから、フォワードプライマーＧＦＴｐｓＣｐｅｔＦ１（配列番号５５）（５′−ＡＴＧＧＣＡＣＴＴＣＡＡＧＡＴＴＣＡＧＡＡＧＴＴＣＣ−３′）及びリバースプライマーＧＦＴｐｓＣＲＲ１（配列番号４４）を用いて増幅させた。
【０１０３】
プローブを、５０００〜２５０００ＰＦＵを有するプレートから調製されたプラークリフトに、４０℃でＤｉｇ Ｅａｓｙ Ｈｙｂハイブリダイゼーション溶液（ロシェ・ディアグノスティクス社）中でハイブリダイズさせた。プローブに標的されたハイブリッドをメンブレン上で検出することは、抗ジゴキシゲニンアルカリ性ホスファターゼ（ロシェ・ディアグノスティクス社）及びＣＤＰ−Ｓｔａｒアルカリ性ホスファターゼ基質（ロシェ・ディアグノスティクス社）を用いる化学発光によって実施し、そしてＶｅｒｓａＤｏｃ画像作製装置（バイオラド）で可視化させた。
【０１０４】
陽性シグナルからのファージを、寒天プレートから抜き出し、第二のスクリーニング、必要であれば第三のスクリーニングを行い、単一プラークの陽性シグナルが得られた。陽性の単離物をインビボ切り出しし、そして挿入物を前記のように配列決定した。
【０１０５】
該ライブラリーを、ＧＦＴｐｓＡ、ＧＦＴｐｓＢ及びＧＦＴｐｓＣから作製されたＤＮＡプローブを用いてスクリーニングした。この手法により、３種の異なるセスキテルペン合成酵素のｃＤＮＡが得られた。そのうち２種は今までに見出されていたクローンであった：第一のクローンはＧＦ２−３０−１と命名され、これはＧＦＴｐｓＣのｃＤＮＡの５′末端３００塩基対が欠損した形であり；第二のクローンは９−１３−６と命名され、これはＧＦｔｐｓＡの部分的クローンであり、他のセスキテルペン合成酵素と比較した結果、その５′末端で約１６８塩基対だけ欠損していた。クローン９−１３−６は、ＲＴ−ＰＣＲによって得られた前記の部分的ＧＦＴｐｓＡクローンと比較して６１８塩基対の付加的な５′末端の配列情報を提供している。その３′末端では、クローン９−１３−６も不完全であった。約６８０ヌクレオチドを欠いており、そして機能が定義されない６００塩基対の断片によって置換されている。ＧＦ２−５−１１のスクリーニングによって得られた、第三のセスキテルペン合成酵素をコードするｃＤＮＡは新規のセスキテルペン合成酵素をコードし、これをＧＦＴｐｓＤと命名した。このクローンは５′末端で欠損しているが、欠けている４１４塩基対は第１表に記載されるプライマーを用いる５′−ＲＡＣＥによって回復された。次いでその全長のＧＦＴｐｓＤをＭａｒａｔｈｏｎ（商標）ｃＤＮＡライブラリーから増幅させ、そして前記のように細菌性発現ベクターにクローニングした。幾つかの全長ＧＦＴｐｓＤのｃＤＮＡのＤＮＡ配列の分析により、小さい配列差異を有する２種の密接に関連したセスキテルペン合成酵素が存在することが明らかとなり、これらをＧＦＴｐｓＤ１とＧＦＴｐｓＤ２と命名した（図６）。２種のこれらの変異体の推定されたアミノ酸配列は互いに４残基だけ異なっていた。
【０１０６】
ＥＳＴ配列決定法のために、５７６個のクローンの配列決定を行った。それらのうち、３つだけのクローンが推定上のテルペン合成酵素様タンパク質をコードし、そしてより厳密には２種の異なるセスキテルペン合成酵素様のタンパク質と１種のモノテルペン合成酵素様のタンパク質をコードしていた。２種のセスキテルペン合成酵素様のクローンの１つ（クローンＧＦ００２−Ｇ３）は上記で同定されたクローンＧＦＴｐｓＤ１であった。第二のクローン（クローンＧＦ００６−Ｇ７）は新規のセスキテルペン合成酵素をコードする欠損したｃＤＮＡであり、これをＧＦＴｐｓＥと命名した。このクローンはまた５′末端に欠損（約８００塩基対だけ）があり、そしてその失われた断片は以下のように２段階の５′−ＲＡＣＥによって増幅できた。プライマーＧＦＴｐｓＥＲＲ１とＧＦＴｐｓＥＲＲ２（第１表を参照）を用いる第一の５′−ＲＡＣＥにより、５００個の付加的な５′末端ヌクレオチドが提供され、そしてプライマーＧＦＴｐｓＥＲＲ３とＧＦＴｐｓＥＲＲ４（第１表を参照）を用いる第二の５′−ＲＡＣＥにより、失われた５′末端ＤＮＡが提供され、それにより全長ＧＦＴｐｓＥのｃＤＮＡが再構築された（図６）。
【０１０７】
実施例４：プラスミドの構築と酵素発現
発現プラスミドの構築
該ｃＤＮＡを、セスキテルペン合成酵素の機能的発現のためにｐＥＴ１１ａ発現プラスミド（ノバジェン社）にサブクローニングした。ＧＦＴｐｓＢ、ＧＦＴｐｓＤ及びＧＦＴｐｓＥのために、全長のｃＤＮＡをＰＣＲによって増幅させ、開始コドンを含めて５′末端にＮｄｅＩ部位を導入し、そして３′末端で停止コドン直後にＢａｍＨＩ部位を導入した。ＧＦＴｐｓＢについては、フォワードプライマーＧＦＴｐｓＢＮｄｅＩ（配列番号５６）５′−ＧＣＡＴＧＴＴＣＣＡＴＡＴＧＴＣＣＧＣＴＣＡＡＧＴＴＣＴＡＧＣＡＡＣＧＧＴＴＴＣＣ−３′（ＮｄｅＩ部位はイタリックで、開始コドンは下線を引いた）及びリバースプライマーＧＦＴｐｓＢＢａｍ（配列番号５７）５′−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＡＴＧＧＴＡＡＣＡＧＧＧＴＣＴＣＴＧＡＧＣＡＣＴＧＣ−３′（ＢａｍＨＩ部位はイタリックで、開始コドンは下線を引いた）を使用した。同様に、フォワードプライマーＧＦＴｐｓＤＮｄｅｌ（配列番号５８）５′−ＧＣＡＴＧＴＴＣＣＡＴＡＴＧＴＣＧＴＣＴＧＧＡＧＡＡＡＣＡＴＴＴＣＧＴＣＣ−３′及びリバースプライマーＧＦＴｐｓＤＢａｍ（配列番号５９）５′−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡＡＡＡＴＧＧＡＡＣＧＴＧＧＴＣＴＣＣＴＡＧ−３′をＧＦＴｐｓＤのために使用し、そしてフォワードプライマーＧＦＴｐｓＥＮｄｅｌ（配列番号６０）５′−ＧＣＡＴＧＴＴＣＣＡＴＡＴＧＴＣＴＴＴＧＧＡＡＧＴＴＴＣＡＧＣＣＴＣＴＣＣＴＧ−３′及びリバースプライマーＧＦＴｐｓＥＢａｍ（配列番号６１）５′−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡＴＡＴＣＧＧＣＡＣＡＧＧＡＴＴＡＡＴＡＡＡＣＡＡＡＧＡＡＧＣ−３′をＧＦＴｐｓＥのために使用した。
【０１０８】
増幅は、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（プロメガ）を用いて、５μｌのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ１０×緩衝液、２００μＭの各ｄＮＴＰ、０．４μＭの各フォワードプライマー及びリバースプライマー、２．９単位のＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ及び５μｌの１００倍希釈されたｃＤＮＡ（前記のようにＭａｒａｔｈｏｎ（商標）ｃＤＮＡ増幅キット（クロンテック社）を用いて調製した）を含有する５０μｌの最終容量で実施した。熱周期条件は以下のとおりである：９５℃で２分間；９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間及び７２℃で４分間を２５周期；及び７２℃で１０分間。ＰＣＲ産物をアガロースゲル上で精製し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）ゲル抽出キット（キアゲン社）を用いて溶出させ、ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで消化し、そして同様に消化されたｐＥＴ１１ａプラスミド中にライゲーションした。
【０１０９】
ＧＦＴｐｓＣ−ｐＥＴ１１ａ発現ベクターの構築のために、２つの別個のＰＣＲを用いて、ＮｄｅＩとＢａｍＨＩ接着端に隣接した挿入物を作製した。第一のＰＣＲは前記と同じ条件中で、フォワードプライマーＧＦＴｐｓＣｐＥＴＦ１（配列番号６２）５′−ＴＡＡＴＧＧＣＡＣＴＴＣＡＡＧＡＴＴＣＡＧＡＡＧＴＴＣＣＴＣ−３′及びリバースプライマーＧＦＴｐｓＣｐＥＴＲ１（配列番号６３）５′−ＡＡＡＡＧＧＧＡＡＣＡＧＧＣＴＴＣＴＣＡＡＧＣＡＡＴＧ−３′を用いて行い、そして第二のＰＣＲを、フォワードプライマーＧＦＴｐｓＣｐＥＴＦ２（ＧＦＴｐｓＣｐＥＴＦ１と比較して５′末端でＡＴだけ短い）（配列番号６４）５′−ＡＴＧＧＣＡＣＴＴＣＡＡＧＡＴＴＣＡＧＡＡＧＴＴＣＣＴＣ−３′及びリバースプライマーＧＦＴｐｓＣｐＥＴＲ２（ＧＦＴｐｓＣｐＥＴＲ１と比較して５′末端でＧＡＴＣだけ長い）（配列番号６５）５′−ＧＡＴＣＡＡＡＡＧＧＧＡＡＣＡＧＧＣＴＴＣＴＣＡＡＧＣＡＡＴＧ−３′を用いて実施した。２種のＰＣＲ産物を前記のように精製し、合し、５分間煮沸することによって変性させ、そして氷上で５分間冷却した。得られたｃＤＮＡを、ｐＥＴ１１ａプラスミド中にライゲーションするために直接使用した。
【０１１０】
ライゲーション産物をまずＪＭ１０９大腸菌細胞中に形質転換させ、そしてその構築物を制限消化とＤＮＡ配列決定によって検査した。セスキテルペン合成酵素の発現
タンパク質発現のために、セスキテルペン合成酵素のｃＤＮＡと空のｐＥＴ１１ａプラスミドを有するｐＥＴ１１ａプラスミドをＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌細胞（ノバジェン社）中に形質転換させた。単独のコロニーを用いて、５ｍｌのＬＢ培地に接種した。３７℃で５〜６時間インキュベートした後に、その培養を２０℃のインキュベーターに移し、そして平衡化のために１時間置いた。次いでタンパク質の発現を０．５ｍＭのＩＰＴＧの添加によって誘導し、そして培養を２０℃で一晩インキュベートした。
【０１１１】
翌日、細胞を遠心分離によって回収し、０．５ｍｌの抽出緩衝液（５０ｍＭのＭＯＰＳＯ、ｐＨ７、５ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのＥＤＴＡ、１０％のグリセロール）中に再懸濁し、そして３０秒間の超音波処理を３回行った。細胞破壊片を１８０００ｇで３０分間遠心分離することによって沈殿させ、そして可溶性タンパク質を含有する上清を回収した。セスキテルペン合成酵素の発現をタンパク質抽出物の分離によってＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）を行い、クーマシーブルーで染色し、かつ空のプラスミドで形質転換された細胞から得られたタンパク質抽出物と比較することで評価した。
【０１１２】
期待された計算分子量を有する明瞭なバンドが全ての構築物について観察され、そして該バンドは空のプラスミドで形質転換された大腸菌からの可溶性タンパク質中には存在しなかった。
【０１１３】
実施例４：酵素機能アッセイ
酵素的アッセイを密封されたガラス試験管中で、１５ｍＭのＭｇＣｌ２及び１００〜２５０μＭのＦＰＰ（シグマ社）を加えた抽出緩衝液の最終容量５０〜１００μｌのタンパク質抽出物を用いて行った。その培地を１ｍｌのペンタンで成層させ、そして試験管を３０℃で一晩インキュベートした。ペンタン相はセスキテルペンを含有し、これを回収し、そして培地を第二容量のペンタンで抽出した。合したペンタン画分を窒素下に濃縮し、そしてガスクロマトグラフィーによってヒューレット−パッカード社６８９０シリーズのＧＣシステムにおいて０．２５ｍｍの内径の３０ｍのＳＰＢ−１（スペルコ社）キャピラリーカラムを用いて分析した。キャリヤーガスはＨｅであり、１．６ｍｌ／分の一定流であった。注入を２：１のスプリット比で、インジェクター温度を２００℃に設定して行い、オーブンを７．５℃／分で８０℃（０分固定）にしてから２００℃（０分固定）にし、引き続き２０℃／分で２８０℃（２分固定）にするようにプログラムした。検出は火炎イオン化検出器で行った。化合物の同定は、利用できれば基準スタンダードとの滞留時間の一致に基づくものである。生成物の一致の確認のために、試料を、０．２５ｍｍの内径の３０ｍのＳＰＢ−１（スペルコ社）キャピラリーカラムを備えたヒューレット−パッカード社６８９０シリーズのＧＣシステムを用いて組み合わされたキャピラリーＧＣ−ＭＳによって分析した。オーブンは、１．５ｍｌ／分の一定流のＨｅで８０℃（０分固定）から７．５℃／分で２８０℃になるようにプログラムした。スペクトルを７０ｅＶで２２００Ｖの電子倍増管電圧を用いて記録した。
【０１１４】
種々の組み換え酵素の酵素活性をこのアッセイにおいて可溶性タンパク質画分と基質としてのファルネシル二リン酸を用いて評価した。セスキテルペン合成酵素活性を試験される全てのクローンについて得て、そして形成された産物を滞留時間とＧＣ−ＭＳによって特徴付けした（図７）ＧＦＴｐｓＢのｃＤＮＡは、主要産物としてビシクロゲルマクレン（図３）を、かつ少なくとも１５種の少量のセスキテルペンオレフィン又は酸素化セスキテルペン、例えばδ−カジネン（図３）を産生するセスキテルペン合成酵素をコードする（ビシクロエレメン（図３）はビシクロゲルマクレンの熱転位により得られ、これもＧＣ微量分中に観察された）。ＧＦＴｐｓＣのｃＤＮＡは多数の産物を形成するセスキテルペン合成酵素をコードし、主要産物はクベボールであると同定された（図３）。該酵素はまた、比較的高い割合の（−）−α−クベベンと２種の酸素化セスキテルペンとの３種の他のセスキテルペンを産生し、そして少量で、少なくとも１１種のセスキテルペンオレフィン又は酸素化セスキテルペンを産生する。ＧＦＴｐｓＤは主要産物としてバレンセンを産生するセスキテルペン合成酵素をコードする。１０種の他の少量のピークはまたセスキテルペンオレフィン又はアルコールとして同定された。これらのうち、β−エレメンはゲルマクレンＡの熱分解生成物である。ＧＦＴｐｓＥはセスキテルペン化合物の複雑な混合物を産生し、その際、β−カジネン（図３）が僅かに最も豊富なものである。クベボールとゲルマクレンＤ（図３）はＧＦＴｐｓＥにより形成される産物の混合物中にも同定された。
【０１１５】
単離されたセスキテルペン合成酵素は、前記の実験において多数の産物を形成する特性を裏付けた。例えばクベボール合成酵素とδ−カジネンは比較的高い割合で３又は５種の産物を産生する。ビシクロゲルマクレン合成酵素は、主にセスキテルペンを産生し、そして幾つかの二次産物を微量に産生した。
【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１】図１は、イソペンテニルピロリン酸の生合成経路の例（メバロン酸経路（Ａ）及びデオキシキシルロース経路（Ｂ））を示す
【図２】図２は、イソペンテニル二リン酸からのテルペン生合成の例を示す
【図３】図３は、セスキテルペン化合物の例の構造を示す
【図４】図４は、２つの群のセスキテルペン合成酵素のアライメントの中心部分（ゲルマクレンＣ トマト ８−カジネン合成酵素（配列番号１１）；（Ｅ）−β−ファルネセン セイヨウハッカ（配列番号１２）；δ−セリネン グランドファー（配列番号１３）；セスキテルペン合成酵素 ユズ（配列番号１６）；５−エピ−アルストロチェン タバコ（配列番号１５）；５−エピ−アリストロチェン トウガラシ（配列番号１６）；ベチスピラジエン ジャガイモ（配列番号１７）；ベチスピラジエン ヒヨスシアムス・ムチクス（配列番号１８）；δ−カジネン キダチワタ（配列番号１９）；アモルファ−４，１１−ジエン クソニンジン（配列番号２０）；エピ−セドロール クソニンジン（配列番号２１）；δ−フムレン グランドファー（配列番号２２））並びに推測された縮重プライマーの配列（ＴｐｓＶＦ１（配列番号２３）；ＴｐｓＶＦ２（配列番号２４）；ＴｐｓＶＲ３（配列番号２５）；ＴｐｓＣＦ１（配列番号２６）；ＴｐｓＣＦ２（配列番号２７）；ＴｐｓＣＲ３））を示す
【図５】図５は、グレープフルーツの全ＲＮＡでのＲＴ−ＰＣＲによって得られた増幅産物から推測されたアミノ酸配列のアライメント（ＧＦＴｐｓＡ（配列番号２９）；ＧＦＴｐｓＢ（配列番号３０）及びＧＦＴｐｓＣ（配列番号３１））を示す
【図６】図６は、グレープフルーツ由来のセスキテルペン合成酵素ＧＦＴｐｓＡ（部分的クローン）（配列番号３２）、ＧＦＴｐｓＢ（配列番号３）、ＧＦＴｂｓＣ（配列番号１）、ＧＦＴｐｓＤ１（配列番号４）、ＧＦＴｐｓＤ２（配列番号５）及びＧＦＴｐｓＥ（配列番号２）のアミノ酸配列アライメントを示す
【図７】図７は、組み換えグレープフルーツセスキテルペン合成酵素によって産生されるセスキテルペンのＧＣプロファイルを示す
【図８】図８は、以下のそれぞれのアミノ酸及びヌクレオチドの配列：（ａ）ＧＦＴｐｓＡ（配列番号３２及び配列番号３３）、（ｂ）ＧＦＴｐｓＢ（配列番号３及び配列番号８）、（ｃ）ＧＦＴｂｓＣ（配列番号１及び配列番号６）、（ｄ）ＧＦＴｐｓＤ１（配列番号４及び配列番号９）、（ｅ）ＧＦＴｐｓＤ２（配列番号５及び配列番号１０）並びに（ｆ）ＧＦＴｐｓＥ（配列番号２及び配列番号７）を示す
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８ａ】
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【図８ｂ−１】
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【図８ｂ−２】
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【図８ｃ−１】
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【図８ｃ−２】
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【図８ｄ−１】
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【図８ｄ−２】
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【図８ｅ−１】
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【図８ｅ−２】
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【図８ｆ−１】
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【図８ｆ−２】
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