(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列を含んで成る組換えタンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載の組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項２に記載のポリヌクレオチドを含んで成る発現ベクター。
【請求項４】
請求項３に記載の発現ベクターで形質転換した原核または真核宿主細胞。
【請求項５】
化学療法が誘起する毒性の防止または処置のための薬剤の製造に使用するための請求項１に記載の組換えタンパク質の使用。
【請求項６】
化学療法が誘起する毒性が骨髄毒性、腎毒性、神経毒性、粘膜毒性または肝毒性である、請求項５に記載使用。
【請求項７】
医薬的に許容できる賦形剤と組み合わせた効果的量の請求項１に記載の組換えタンパク質を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は肝細胞増殖因子（HGF）およびマクロファージ刺激タンパク質（MSP）のαサブユニットに由来する構造ドメインの組み合わせから得られる組換えタンパク質に関する。
【０００２】
特に本発明の工作された因子は、介在リンカー配列を持つ２つのスーパードメインを有する構造を得るために、HGFおよび／またはMSPのα鎖のヘアピンループおよびクリングルドメインの組み合わせにより得られる。さらに本発明は、上記の組換えタンパク質をコードするDNA配列、該DNA配列を含んで成る発現ベクター、および該発現ベクターを含む宿主細胞に関する。本発明の組換えタンパク質は生物学的に活性で、そしてそれらの活性はMetチロシンキナーゼ受容体の活性化を誘導するそれらの能力、上皮細胞に及ぼすそれらの「分散」効果、および化学療法剤により誘導される細胞死に対するそれらの保護効果により測定することができる（以下を参照にされたい）。それゆえにこのような分子は腫瘍の化学的治療の毒性的副作用を防止、または処置するために、そして他の種類の薬剤により誘起される医原性の細胞傷害を減らすために都合よく使用することができる。
【０００３】
技術的背景
肝細胞増殖因子（HGF）およびマクロファージ刺激タンパク質（MSP）は構造的および機能的の両方で高度に関連している（図１および２）。このような両因子は不活性な前駆体（これは、分子内の開裂部位を認識する特異的プロテアーゼによりプロセッシングされる）、として分泌され、タンパク質は２つのサブユニットに分割される。α鎖およびβ鎖と命名されたこのようなサブユニットは、ジスルフィド結合でつながれている。このように成熟因子はα−β二量体タンパク質である。この因子の成熟（二量体）形のみが、標的細胞の表面でその受容体を活性化することができ（HGFの場合はMetチロシンキナーゼ、そしてMSPの場合はRonチロシンキナーゼ）、そしてそれゆえに生物学的反応を媒介する（Naldini,L.ら、1992、EMBO J.11:4825-4833；Wang,M.ら、1994,J.Biol.Chem.269;3436-3440；Bottaro,D.ら、1991,Science 25:802-804;Naldini,L.ら、1991、EMBO J.10:2867-2878；Wang,M.ら、1994,Science 266:117-119；Gaudino,Gら、1994、EMBO J.13:3524-3532)。
【０００４】
両方因子のα鎖はヘアピンループ（HL）構造およびクリングルという名のタングル-様構造をもつ４つのドメインを含む（K1-K4；Nakamura Tら、1989、Nature 342：440-443；Han,S.ら、1991,Biochemistry 30:9768-9780)。前駆体は粗面小胞体中で除去される31アミノ酸（HGFの場合）または18アミノ酸(MSPの場合）の、新しく形成された(neoformed)ペプチドを選択的経路に向けるシグナル配列（LS）も含む。β鎖は典型的であるが、触媒活性は無いセリンプロテアーゼに相同的な配列を持つボックスを含む（Nakamura Tら、1989、Nature 342：440-443；Han,S.ら、1991、Biochemistry 30:9768-9780)。両αおよびβ鎖は増殖因子を個々の受容体に結合させることに寄与する（HGFにはMet、そしてMSPにはRon）。
【０００５】
HGFおよびMSPポリペプチドは、細胞増殖に加えて種々の生物学的効果を誘導することができる。このような分子の主な生物活性は：細胞分割（有糸分裂）の刺激；運動性の刺激（分散）；分極および細胞分化の誘導；細管形成（枝分かれ形態形成）の誘導；細胞生存の増加（アポトーシスからの保護）である。HGFおよびMSP刺激に反応する組織は、細胞がそれぞれMet（HGF）およびRon（MSP）受容体を発現する場所である。このような因子の最も重要な標的組織は、肝臓、腎臓、肺、胸部、膵臓および胃のような種々の器官の上皮細胞、ならびに血液生成および神経系の細胞の幾つかである。種々の組織におけるHGFおよびMSPの生物学的効果の詳細な総説は、Tamagnone,L.& Comoglio,P.、1997、サイトカイン アンド 増殖因子 レ-ビュー（Cytokine & Growth Factor Re-views)、８：129-142、エスセビア サイエンス社（Elsevier Science Ltd)；Zarneger,R.& Michalopoulos,G.、1995、J.Cell Biol.129：1177-1180；Medico,E.ら、1996、Mol.Biol.Cell.、7:495-504；Banu,N.ら、1996,J.Immumol.156:S2933-2940に見いだすことができる。
【０００６】
HGFの場合は、ヘアピンループおよび最初の２つのクリングルがMet受容体との直接的な相互作用の部位を含むことが知られている（Lokker NAら、EMBO J.、11:2503-2510；Lokker N.ら、1994、Protein Engineering 7:895-903)。別のスプライシングにより幾つかの細胞で生成される天然に存在する２つのHGFの切り詰められた形が記載された。最初の１つは、第１クリングルを含んで成り（NK1-HGF Cioce,V.ら、1996,J.Biol.Chem.271:13110-13115)、一方２番目は第２クリングルまで伸びている（NK2-HGF Miyazawa,K.ら、1991,Eur.J.Biochem.197:15-22)。NK2-HGFは細胞分散を誘導するが、完全な増殖因子のように分裂促進性ではない（Hartmann,G.ら、1992、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:11574-11578)。しかしNK2-HGFはヘパリン（これは第１クリングルに含まれるドメインを通じてHGFに結合するグルコサミノグルカンであり、そしてNK2-HGFの二量化を誘導するようである(Schwall,R.ら、1996,J.Cell.Biol.133:709-718)）の存在下で分裂促進性を回復する。さらにMetの部分的アゴニストであるNK2-HGFは、分裂促進性に関する限りHGFの競合的インヒビターとして行動する（Chan,A.ら、1991,Science 254:1382-1385)。NK1-HGFはMetの部分的刺激およびHGF分裂促進活性の競合的阻害を現すとも記載された（Cioce,V.ら、1996、J.Biol.Chem.271:13110-13115)。いずれにせよ切り詰められた因子は、実施例３に示すような本発明に記載の組換え因子よりも際立って低い活性が賦与される。
【０００７】
MSPの場合は、Ron受容体との相互作用部位は十分に解明されていない：幾つかの予備的研究ではHGFとは反対の状況、すなわちβ鎖が受容体に直接結合するが、α鎖は複合体の安定化に役立つことを示唆している（Wang MHら、1997、J.Biol.Chem.272:16999-17004)。
【０００８】
HGFおよびMSPのような分子の治療的使用は、広範囲の病状に価値があるかもしれない（Abdulla,S.、1997,Mol.Med.Today 3:233)。にもかかわらず多数の技術的および生物学的な複雑さがこのような分子の臨床的応用を困難にしている。第１に、このような因子の多面発現的性質が選択性がよくない選択的生物反応を引き起こし、これは望ましくない副作用を含む。例えば化学療法剤であるシスプラチンの幾つかの副作用を防ぐためにHGFの使用が提案された（Kawaida Kら、1994、Proc.Natl.Acad.Sci.91:4357-4361)。この薬剤で処置された癌患者は、近位細管上皮細胞に対するシスプラチンの細胞傷害性作用による急性の腎臓傷害を被る。HGFはこのような細胞をシスプラチンにより誘導されるプログラムされた死（アポトーシス）に対して保護することができるが、同時に望ましくない腫瘍性細胞の増殖を誘導し得る。HGFおよびMSPの医薬的使用に関連する他の問題は、それらのタンパク質溶解的活性化およびそれらの安定性の必要性があり、これらは技術的問題を生じる。HGFの切り詰められた形態であるNK1およびNK2は、タンパク質溶解的活性化を必要とはしないが、それらは生物学的活性が減少している。
【０００９】
発明の要約
本発明は、上記の従来技術の問題を克服するHGFおよび／またはMSPのα鎖に由来する構造ドメインの組み合わせから成る組換え分子を提供する。本発明の分子はリンカーにより連結された２つのスーパードメインから成る。各スーパードメインは、HGFおよび／またはMSPのα鎖のHLおよびK1-K4ドメインの組み合わせから成る。このような工作された因子は選択的な生物反応を誘導し、タンパク質溶解的活性化を必要とせず、安定で、しかも前述のHGFの切り詰められた形よりも活性である。
【００１０】
発明の詳細な開示
本発明は、各々がスペーサー配列またはリンカーにより連結されたHGFおよび／またはMSPのα鎖に由来するHLおよびK1-K4の組み合わせから成る２つのスーパードメインを含んで成る構造を特徴とする組換えタンパク質（これは今後、タンパク質、分子、工作されたまたは組換え因子とこだわらずに称する）に関する。特に本発明は一般式（I）
［Ａ］−Ｂ−［Ｃ］−（Ｄ）ｙ        (I)
式中、
［Ａ］は、配列（LS)m-HL-K1-(K2)n-(K3)o-(K4)pに対応し、ここで（アミノ酸に続く数字は、それぞれ図１および２に報告するようなHGFおよびMSPを意味する）；ＬＳは、HGFの残基１〜31またはMSPの残基１〜18に対応するアミノ酸配列であり；
ＨＬは、残基32〜70の間から始まり、そして残基96〜127の間で終わるHGFのα鎖に由来するアミノ酸配列であるか；または残基19〜56の間から始まり、そして残基78〜109の間で終わるMSPのα鎖に由来するアミノ酸配列であり；
Ｋ１は、残基97〜128の間から始まり、そして残基201〜205の間で終わるHGFのα鎖に由来するアミノ酸配列であるか；または残基79〜110の間から始まり、そして残基186〜190の間で終わるMSPのα鎖に由来するアミノ酸配列であり；
Ｋ２は、残基202〜206の間から始まり、そして残基283〜299の間で終わるHGFのα鎖に由来するアミノ酸配列であるか；または残基187〜191の間から始まり、そして残基268〜282の間で終わるMSPのα鎖に由来するアミノ酸配列であり；
Ｋ３は、残基284〜300の間から始まり、そして残基378〜385の間で終わるHGFのα鎖に由来するアミノ酸配列であるか；または残基269〜283の間から始まり、そして残基361〜369の間で終わるMSPのα鎖に由来するアミノ酸配列であり；
Ｋ４は、残基379〜386の間から始まり、そして残基464〜487の間で終わるHGFのα鎖に由来するアミノ酸配列であるか；または残基362〜370の間から始まり、そして残基448〜481の間で終わるMSPのα鎖に由来するアミノ酸配列であり；
ｍ、ｎ、ｏ、ｐは、０または１であり；
和ｎ＋ｏ＋ｐは１〜３の整数または０であるが、ただしｎ＞ｏ＞ｐであり；
Ｂは、配列[(Ｘ)qＹ]rであり、ここでＸ＝GlyおよびＹ＝SerまたはCysまたはMetまたはAla；
ｑは、２〜８の整数であり；
ｒは、１〜９の整数であり；
[Ｃ]は、配列 HL-K1-(K2)s-(K3)t-(K4)uに対応し、
ここでHL、K1-K4は上記定義の通りであり、
ｓ、ｔ、ｕは０または１であり；和ｓ＋ｔ＋ｕは１〜３の整数または０であるが、ただしｓ＞ｔ＞ｕであり；
Ｄは、配列Ｗ−Ｚであり、ここでＷは通例のタンパク質溶解部位であり、Ｚはタンパク質の精製および検出に有用な任意の標識配列であり；ｙは０または１である、
のタンパク質に関する。
【００１１】
Ｗの非限定的例は、エンテロキナーゼプロテアーゼ、トロンビン、第Xａ因子およびIgAプロテアーゼに関するコンセンサス配列である。
【００１２】
一般式（I）の好適なタンパク質は；HLドメインがアミノ酸32〜127の範囲のHGF α 鎖の配列であるか、またはアミノ酸19〜98の範囲のMPS α 鎖の配列であり；Ｋ１ドメインがアミノ酸128〜203の範囲のHGF α 鎖の配列であるか、またはアミノ酸99〜188の範囲のMPS α 鎖の配列であり；Ｋ２ドメインがアミノ酸204〜294の範囲のHGF α 鎖の配列であるか、またはアミノ酸189〜274の範囲のMPS α 鎖の配列であり；Ｋ３ドメインがアミノ酸286〜383の範囲のHGF α 鎖の配列であるか、またはアミノ酸275〜367の範囲のMPS α 鎖の配列であり；Ｋ４ドメインがアミノ酸384〜487の範囲のHGF α 鎖の配列であるか、またはアミノ酸368〜477の範囲のMPS α 鎖の配列である。
【００１３】
一般式（I）の可能なドメインの組み合わせの中で、それぞれメトロン因子(Metron Factor)-１およびマジック因子(Magic Factor)-１と命名された２つの組換え因子に関する以下の（II）および（III）が好適である：
ＬＳMSP-ＨＬMSP-Ｋ１MSP-Ｋ２MSP-Ｌ-ＨＬHGF-Ｋ１HGF-Ｋ２HGF-Ｄ
（メトロン因子-１）（II）
および
ＬＳHGF-ＨＬHGF-Ｋ１HGF-Ｋ２HGF-Ｌ-ＨＬHGF-Ｋ１HGF-Ｋ２HGF-Ｄ
（マジック因子-１）（III）
両分子に関し、Ｌはリンカー配列（Gly4Ser)3であり、Ｄは標識配列Asp4-Lys-His6である。
【００１４】
メトロン因子-１について、LSMSPはMSPの配列１〜18であり、HLMSPはMSPの配列19〜56であり、K1MSPはMSPの配列99〜188であり、K2MSPはMSPの配列189〜274であり、HLHGFはHGFの配列32〜127であり、K1HGFはHGFの配列128〜203であり、K2HGFはHGFの配列204〜294である。
【００１５】
マジック因子-１について、HLHGF、K1HGF、K2HGFは上記定義の通りであり、LSHGFはHGFの配列１〜31である。
【００１６】
本発明のハイブリッド分子は、以下の工程を含む方法に従い遺伝子工学的に調製される：
ａ）所望のタンパク質をコードするDNAの構築；
ｂ）発現ベクターへのDNAの挿入；
ｃ）宿主細胞を組換えDNA（rDNA）で形質転換；
ｄ）形質転換した宿主細胞を組換えタンパク質が発現するように培養；
ｅ）生成された組換えタンパク質の抽出および精製。
【００１７】
HGFまたはMSP構造ドメインに対応するDNA配列は、２つの天然の因子をコードするDNAを合成、またはそれから出発することにより得ることができる。例えばcDNAライブラリーのスクリーニングは、HGFまたはMSP cDNAを単離するために適当なプローブを使用して行うことができる。あるいはHGFまたはMSP cDNAは、適当な細胞に由来する精製したmRNAからの逆転写により得ることができる。
【００１８】
HGFおよびMSP β鎖の断片をコードするcDNAは、PCRにより増幅することができ（Mullis,K.B.およびFaloona,F.A.、1987、Methods in Enzymol.155,335-350)、そして増幅した生成物は因子の配列中に自然に存在する適当な制限部位を利用して組換えるか、または増幅に使用したオリゴヌクレオチド配列中に人工的に導入することができる。
【００１９】
さらに詳細には、上記の方法の１つは次の通りであり得る：
LS、HL、K1、K2、K3およびK4ドメインをコードするDNAの部分を、HGFまたはMSP cDNAからPCRにより増幅させ、そして組換えて[Ａ]および[Ｃ]に対応するハイブリッド配列を得る。増幅させるドメインの２つの末端に位置するオリゴヌクレオチド認識配列をプライマーとして使用する。プライマーはドメインのDNAと隣との間の組換えを可能にする配列を含むように設計される。該組換えはエンドヌクレアーゼ開裂、そして続いてリガーゼ反応により行うか、または組換えPCR法（Innis、NAら、1990、PCRプロトコールズ（PCR Protocols)中、アカデミック出版（Academic Press）、177〜183）を使用して行うことができる。
【００２０】
ドメインＢ（リンカー）をコードする配列は、二本鎖オリゴヌクレオチドの合成により得ることができ、これは[Ａ]と[Ｃ]の間に適当な制限部位を使用して挿入することができる。
【００２１】
[Ａ]、[Ｂ]および[Ｃ]をコードする生成した３つの断片を、次に適当なベクター中に正しい配列で挿入する。この工程で、断片[Ｃ]の下流にドメインＢに類似して合成することにより得られたドメインＤ（標識）を付加するか、しないかを決定することができる。
【００２２】
組換え発現ベクターは組換え構築物に加えて、プロモーター、リボゾーム結合部位、開始コドン、終結コドン、場合により発現エンハンサーのコンセンサス部位を含むことができる。
【００２３】
ベクターはDNA構築物を含有する宿主細胞を単離するための選択マーカーを含んで成ることもできる。酵母または大腸菌（Escherichia Coli)に適当なプラスミドのような細菌プラスミドはベクターとして使用でき、ならびにバクテリオファージ、ウイルス、レトロウイルスまたはＤＮＡを使用することができる。
【００２４】
ベクターは好ましくは細菌細胞、例えば大腸菌（Escherichia Coli)中に、Sambrook J.,1989,モレキュラークローニング(Molecular Cloning)、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版（Cold Spring Harbor Laboratory Press)、ニューヨークに記載されているようにクローン化され、そしてコロニーを例えば放射性標識オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションにより選択することができ；陽性コロニーから抽出したrDNA配列を、既知の方法により決定する。
【００２５】
組換え構築物を持つベクターを、コンピテント細胞法、プロトプラスト法、リン酸カルシウム法、DEAE-デキストラン法、電気的インパルス法、インビボパッケージング法、ウイルスベクター法、微量注射法または他の適当な技法に従い宿主細胞に導入することができる。
【００２６】
宿主細胞は、細菌、酵母または哺乳動物細胞のような原核または真核細胞であることができ、そしてそれらは組換えタンパク質を効果的に生産するようなものであろう。
【００２７】
形質転換後、細胞を適当な培地（これは例えば哺乳動物細胞の場合、MEM，DMEMまたはRPMI1640であることができる)中で成長させる。
【００２８】
組換えタンパク質は培養基に分泌され、そこからタンパク質を回収し、そして質量排除（mass exclusion)、吸着、アフィニティクロマトグラフィー、塩析、沈殿、透析、超遠心のような方法により精製することができる。
【００２９】
本発明の分子の生産のための簡便で迅速な系は、例えば哺乳動物細胞中での一過性発現である。
【００３０】
したがって組換えDNA断片、例えばPMT2を含むプラスミド(Sambrook,J.ら、1989、モレキュラークローニング、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版）を、Cos7（Sambrook,J.ら、同上）のような適当な受容細胞に、リン酸カルシウム法または他の均等な技法によりトランスフェクトする。トランスフェクションの数日後、トランスフェクトした細胞のコンコンディショニングした培地を集め、遠心により清澄化し、そして因子中のその含量を分析する。この分析には、HGFまたはMSPに向けた抗体、または任意の標識配列に対する抗体を使用することができる：上清を免疫沈降させ、そして次に同じ抗体を用いてウエスタンブロットにより分析する。組換え因子を含有する上清は、生化学的および生物学的試験に直接使用することもできる。タンパク質は例えばポリ−ヒスチジン標識配列を使用してニッケル樹脂カラム上への吸着により、そして続いてイミダゾールを用いて溶出することにより精製することができる。
【００３１】
本発明の組換え因子の生化学的特性は、それらがMetおよびRon受容体を活性化する能力に関連して試験した。
【００３２】
サブ-マイクロモル濃度の因子は、ヒトの上皮細胞A549においてMetチロシンのリン酸化を誘導する一方、Ronを発現している細胞では基底値より高くリン酸化を誘導しないことが証明された。全体的に試験は最初の２つのHGFのクリングルがそれらの能力を維持してMetチロシンキナーゼ受容体と相互反応し、そして活性化する一方、対応する最初の２つのMSPのクリングルは十分にRon受容体の触媒的活性をモジュレーションするには十分ではなかった。しかしRonとの相互作用は低い親和性ではあるが細胞表面での因子の再集合に貢献し、ヘアピン−結合ドメインを通してHGF完全分子を再集合させる低い親和性の（成熟糖タンパク質の）受容体と同様の役割を果たす。
【００３３】
本発明の分子は、分散法により測定される顕著な生物学的活性、およびシスプラチンまたはエトポシドにより誘導される細胞アポトーシスに対する保護活性を有する。
【００３４】
特に組換え因子を含有する上清は、ナノモル濃度でも種々の性質の上皮細胞の分散を促進することが見いだされた。このような試験では、腎臓の上皮細胞（MDCK）または肝細胞前駆体（MLP29）を使用した。
【００３５】
アポトーシス細胞で典型的なDNA断片化がTUNEL法（Gavrieli,Y.ら、1992、J.Cell.Biol.117,493-501）により評価されるインビトロの実験系では、組換え因子は、HGFに匹敵し、そしてMSPよりも著しく高いレべルで化学療法剤により誘導されるアポトーシスに対して保護する。工作された分子は近位細管（PTEC)に由来するヒト初代上皮細胞に対して、不滅化されたPTECs系（Los）に対して、そしてすでに述べたマウス肝細胞MLP29に対して活性となることが示された。
【００３６】
本発明の組換え分子の応用の中でも、以下を挙げることができる：
−骨髄毒性の防止；特にそれらは造血前駆体の増殖を増すために、またはそれらがサークルへ入るのを刺激するため骨髄前駆体の拡張に使用することができる；−抗腫瘍処置後の肝臓または腎臓毒性、および粘膜炎の防止；特に組換え因子は肝臓、腎臓および胃腸管の粘膜の分化した細胞要素に対する毒性（アポトーシス）を防止するために、そして皮膚のスタミナル要素(staminal element)および粘膜を刺激して胚芽層の再生を可能にするために使用することができる；
−化学療法の神経毒性の防止。
【００３７】
一般に、本発明のタンパク質は元の分子のHGFおよびMSPと比較して以下の利点を提供する：
−それらはより小さい構造のより低分子である；
−それらはより安定で、しかもよい大量に生産される；
−それらは活性化に内部タンパク質溶解的開裂を必要とせず、これはHGFおよびMSP前駆体を各々の活性形に変換する；
−それらは種々の機能的ドメインと組み合わせるように工作され、これにより生物学的効果をモジュレートし、好ましいものを増し、そして望ましくないものは減らす（例えば、アポトーシスからの保護対細胞増殖）。
【００３８】
本発明は、例えば遺伝子コードの縮重（それゆえにアミノ酸配列の変更は無い）に由来する、あるいは当該技術分野で可能なすべての方法に従いヌクレオチドおよび／または塩基の欠失、置換、挿入、逆転または付加に由来する修飾を有する式（I）に関するアミノ酸およびヌクレオチド配列も対象とすると考えなければ成らない。
【００３９】
さらに本発明は、プラスミド、バクテリオファージ、ウイルス、レトロウイルおよびその他であることができる一般式（I）のタンパク質をコードする配列を含んで成る発現ベクター、および該発現ベクターを含有する宿主細胞に関する。
【００４０】
最後に、本発明は治療薬としての組換えタンパク質の使用、および効果的量の組換えタンパク質を医薬的に許容できる賦形剤と一緒に含む医薬組成物に関する。
【００４１】
以下の実施例は本発明をより詳細に具体的に説明する。
【００４２】
【実施例】
実施例１ａ：メトロン因子−１をコードする組換え構築物の調製
HGF cDNAは、RT-PCR技法（逆転写酵素PCR（Reverse Transcriptase PCR)：Innis,M.A.ら、1990,PCR プロトコール、アカデミック出版（Academic Press）、21-27)により、ヒト肺の繊維芽細胞系（MRC5;Naldini,L.ら、1991,EMBO J.10:2867-2878)から得た。MSP cDNAは同じ技法によりヒトの肝臓から得た（Gaudino,G.ら、1994,EMBO J.13:3524-3532)。
【００４３】
MSP LS-HL-K1-K2に対応する断片は、鋳型としてMSP cDNAおよびプライマーとして以下のオリゴヌクレオチドを使用してPCRにより増幅した：
【００４４】
【化１】
0004478329.tif 000002
【００４５】
ここで、下線の回文配列は酵素EcoRI（オリゴヌクレオチドＰ１）およびXhoI（オリゴヌクレオチドＰ２）に関する制限部位である。PCR生成物は制限酵素 EcoRIおよびXhoIで消化し、そして次にアガロースゲルで電気泳動により精製した。
【００４６】
HGFのHL-K1-K2に対応する断片は、鋳型としてHGF cDNAおよびプライマーとして以下のオリゴヌクレオチドを使用してPCRにより増幅した：
【００４７】
【化２】
0004478329.tif 000003
【００４８】
ここで、下線の回文配列は酵素 XbaI（オリゴヌクレオチドＰ３）およびHindIII（オリゴヌクレオチドＰ４）に関する制限部位である。PCR生成物は制限酵素 XbaIおよびHindIIIで消化し、そして次にアガロースゲルで電気泳動により精製した。
【００４９】
リンカー配列に関しては、以下の部分的な相補的オリゴヌクレオチドを合成し、そして続いてアニーリングして粘着末端を持つ二本鎖DNA断片を得た：
【００５０】
【化３】
0004478329.tif 000004
【００５１】
ここで、下線の塩基は酵素 XhoI（オリゴヌクレオチドＰ５）およびXbaI（オリゴヌクレオチドＰ６）に関する制限部位と適合する。
【００５２】
生成した３つのDNA断片を、発現ベクターpRK7（Gaudino.G.ら、1994,EMBO J.13:3524-3532)のEcoRI−HindIII部位にサブクローン化して、標識配列を除きすべてのメトロン-因子-1を含む組換えプラスミドpRK7−メトロン-Ｆ-１を得た。
【００５３】
標識配列の挿入については、以下の部分的に相補的なオリゴヌクレオチドを合成し、そして続いてアニーリングして粘着末端を有する二本鎖DNA断片を得た：
【００５４】
【化４】
0004478329.tif 000005
【００５５】
ここで、下線の塩基はHindIII制限部位と適合し、そしてボックス化回文配列は、酵素SalIのコンセンサス配列である。生成した二本鎖DNA断片を、前段階で得られた組換えプラスミドの制限部位HindIIIに挿入して（HindIII部位を破壊し、そしてSalI部位を作成する）、プラスミドpRK7−メトロン-F-1-Hisを得た。
【００５６】
実施例１ｂ：メトロン因子−１の生産
発現ベクターpRK7は、ヒトサイトメガロウイルス極初期遺伝子（immediate-early gene)(CMV)のプロモーターおよびDNAウイルスSV40のエピソーム複製起点を含む。したがってこのプラスミドは腎臓の上皮BOSC細胞のようなウイルスSV40の大きなＴ抗原を発現している細胞中でタンパク質を発現させるために特に適する（Sambrook,J.ら、1989、モレキュラークローニング、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版）。メトロン因子−１は次に、BOSC細胞中でプラスミドpRK7−メトロン-F-1-Hisの一過性トランスフェクションにより生成することができる。
【００５７】
トランスフェクションには、106の細胞を０日に、100mmプレート中の90％ダルベッコの改良イーグル培地（DMEM)-10％ウシ胎児血清に播種する（10ml／プレート）。１日に、細胞を10μg／プレートのpRK7−メトロン-F-1-Hisを用いてリポフェクチン製造元(ギブコ(Gibco)-BRL)により提供されているプロトコールを使用してリポフェクチンによりトランスフェクトする。２日に、DNAを含有する培地を低濃度の血清（99.5％ DMEM-0.5％ウシ胎児血清）を含む新しい培地と交換する。４日に（トランスフェクションの終了から48時間後）、培地を集め、遠心により清澄化し、そしてメトロン-F-1中のその含量について分析する。
【００５８】
この分析は様々な様式で行うことができる。例えば、澄んだ上清中に存在する組換えタンパク質は、抗-MSP抗体と免疫沈降させ、そして次に同じ抗体を用いてウエスタンブロットにより検出することができる（図４）。図４に示すこの実施例では、4,500μlの上清（遠心により清澄化、25mM HEPESで緩衝化し、そしてプロテアーゼインヒビターカクテルを加えた）を、２μlの抗−MSPポリクローナル抗体と共有結合させた20μlのSepharose-Aビーズ（ファルマシア:Pharmacia)と免疫沈降させた（４℃で２時間）。ビーズのペレットを500μlの洗浄バッファー（20mM HEPES pH7.4；150mM NaCl；0.1mM NaCl；0.1％ Triton X-100；10％ グリセロール）で３回洗浄し、そして90℃に２分間、100μlのレムリーバッファー中で加熱した。溶出したタンパク質をSDS-PAFEにより８％BIS-アクリルアミドゲルで分離し、膜（Hybond-C；アマーシャム(Amersham)）に移し、そしてウエスタンブロットにより分析した。この分析のために、１次抗体として1:1000に希釈した免疫沈降に使用したものと同じウサギ血清および２次抗体としてペルオキシダーゼと結合したプロテインＡ（アマーシャム）を使用した。プロテインＡをECL（アマーシャム）により製造元により提供されたプロトコールに従い検出した。
【００５９】
あるいは組換えタンパク質はヘパリンを結合したSepharose-Ａビーズ上への吸着により部分精製し、そして続いてポリヒスチジン標識に対する抗体を使用するウエスタンブロットにより分析することができる（図５）。
【００６０】
図５に示す実施例では、Sepharose-Ａ-ヘパリンビーズ（20μl；ピアス(Pierce)）を500μlの上清（遠心により清澄化、25mM HEPESで緩衝化し、そしてプロテアーゼインヒビターカクテルを加えた）と、500mM NaClの存在下でインキューベーションし（４℃で４時間）、適当なバッファー（500mM NaCl；20mM HEPES pH7.4：0.1％ Triton X-100；10％ グリセロール）で洗浄し、そして90℃に２時間、100μlのレムリーバッファー中で加熱した。溶出したタンパク質をSDS-PAGEで８％ビス-アクリルアミドゲルで分離し、膜（Hybond-C；アマーシャム）に移し、そしてウエスタンブロットにより分析した。この分析のために、１次抗体として1:5000倍に希釈したポリ-ヒスチジン（インビトロゲン:Invitrogen）に対するマウスモノクローナル抗体を使用し、そして２次抗体としてペルオキシダーゼ（アマーシャム）と結合した抗−マウスIgGヒツジ抗体を使用した。２次抗体をECL（アマーシャム）により製造元により提供されたプロトコールに従い検出した。
【００６１】
ヘパリンビーズ上への吸着手順は、組換えタンパク質の半−精製のためのプロトコールとしても使用することができる。さらにこの分子は、ニッケルのような重金属に対するポリ-ヒスチジンの親和性を利用してさらに精製することができる。ポリ-ヒスチジン標識を含むタンパク質は、ニッケル樹脂カラム（インビトロゲン）に吸着することができ、そして続いてイミダゾールで溶出することができる（詳細なプロトコールは製造元により提供されている）。
【００６２】
実施例１ｃ：昆虫細胞中でのメトロン-F-1の生産
メトロン-F-1をコードするcDNAを、適当な発現ベクター（p-FASTBAC)にサブクローン化して、メトロン-F-1を遺伝子を含む組換えプラスミドを生成した（p-FASTBAC-メトロン）。コンピテントな大腸菌（E.coli）株（DH10 Bac）をp-FASTBAC-メトロンで形質転換させて、BACMID DNAを生成した。陽性コロニーのDNAを単離し、そしてPCRにより検査して発現ベクターの正しい組み込みを示した。続いて３つのコロニーからのDNAを、Sf9昆虫細胞にCellFECTION試薬を用いてトランスフェクトして、ウイルス粒子を形成した。ウイルス力価はプラークアッセイにより試験した。１つのプラークを単離し、そしてさらなるバキュロウイルスの増殖に使用した。ウイルスのストックを続いて昆虫細胞中でメトロン−F-1生産に拡張した。タンパク質発現を確認するために、昆虫細胞を１の感染多重度で小規模反応槽中で感染させた。上清のサンプルをSDS-PAGE、続いてウエスタンブロットにより分析した。
【００６３】
インビボ試験に十分な量を生成するために、昆虫細胞を2.5リットルの撹拌タンクバイオリアクター中で増殖させた。細胞を1.106ml-1の密度に成長させた後、それらを１MOIで感染させた。細胞懸濁液は感染の３日後に回収した。組換えタンパク質を含有する上清を、遠心により分離した。上清中のメトロン F-1の存在は、SDS-PAGE、続いてウエスタンブロッティングにより証明した。メトロン F-1は６℃でヘパリンsepharose（ヘパリン-Hi Trap、ファルマシア(Pharmacia)）で２段階のアフィニティークロマトグラフィーにより前精製した。インビボ試験、またはさらなる精製工程には、メトロン F-1を含有する溶出画分をSephadexG-25クロマトグラフィー(PD-10またはHiPrep 26/10、ファルマシア)により脱塩した。メトロン F-1はさらにHisTrap カラム（ファルマシア）により精製し、そしてイミダゾール勾配（０〜0.5Ｍ）により低圧システム(Econo System、バイオラッド（BIO-RAD)）またはFPLCシステム（ファルマシア）のいずれかを使用して溶出した。メトロン F-1は約0.15Ｍのイミダゾール濃度で溶出した。インビボ試験には、メトロン F-1を含有する溶出画分をすでに記載したように、動物処置に使用するバッファーを用いてSephadexG-25クロマトグラフィーによりイミダゾールを除いた。
【００６４】
実施例２ａ：マジック 因子-1をコードする組換え構築物の調製
上記のHGF cDNAおよびプラスミドpRK7-メトロン−F-1-Hisを、出発DNAとして使用した。HGFのLS-HL-K1-K2に対応する断片は、鋳型としてHGF cDNAおよびプライマーとして以下のオリゴヌクレオチドを使用してPCRにより増幅した：
【００６５】
【化５】
0004478329.tif 000006
【００６６】
ここで、下線の回文配列は酵素BamHI（オリゴヌクレオチドＰ９）およびHindIII（オリゴヌクレオチドＰ１０）に関する制限部位である。PCR生成物は制限酵素 BamHIおよびHindIIIで消化し、そして次にアガロースゲルで電気泳動により精製した。
【００６７】
リンカーには、以下の一部相補的なオリゴヌクレオチドを合成し、そして続いてアニーリングして粘着末端を有する二本鎖DNAを得た：
【００６８】
【化６】
0004478329.tif 000007
【００６９】
ここで、下線の塩基は酵素HindIII（オリゴヌクレオチドＰ１１）およびXbaI（オリゴヌクレオチドＰ１２）に関する制限部位と適合する。PCRにより生成した断片および二本鎖リンカー配列を、EcoRI-BamHIアダプターにより断片EcoRI-XbaIの代わりにプラスミドpRK7-メトロン-F-1-Hisに挿入して、プラスミドpRK7−マジック-F-1-Hisを得た。
【００７０】
実施例２ｂ：マジック-因子-1の生産
マジック-因子-1は、メトロン-因子-1について記載した方法に準じてBOSC細胞の一過性トランスフェクションにより小規模で生産する。半-精製はヘパリンを結合したSepharose-Aビーズ上への吸着、続いて抗-ポリ-ヒスチジン抗体を使用してウエスタンブロットにより行う（図５）。
【００７１】
実施例３：上皮細胞への生物的活性（分散）
組換えHGF、NK2-HGF、メトロン因子-1およびマジック因子-1の生物的活性を、MDCK上皮細胞について「分散」アッセイにより試験し、細胞を０日に96ウェル-プレート中の90％DEME-10％ウシ胎児血清に入れた（103細胞／ウェル）。１日に培地を、50mM HEPES pH7.4で緩衝化した新しい培地と交換し、そして組換えタンパク質を含有する上清を異なる希釈で加える。２日に細胞をDPBS（ダルベッコのリン酸緩衝塩溶液）で洗浄し、11％のグルタルアルデヒドで固定し、クリスタル−バイオレット溶液で染色し、そして顕微鏡により分析した。分散活性はコロニーの形態を観察することにより評価し、形態は陰性対照（非−刺激細胞または因子を含有しない上清により刺激）ではクラスターとなり、一方それらは陽性対照（HGF-His）では分散する。細胞自体の形態も刺激により変化する：実際には図６のように観察することができるが、HGF-Hisおよびメトロン因子-1で刺激した細胞は仮足と呼ばれる細胞膜の突起が特徴的なより長円の紡錘体形を有する。このような形態的変化は、特別なプロテアーゼによる細胞マトリックスの消化および運動性の上昇のような一連の細胞パラメーターの変更が関与する遺伝的プログラムの因子が誘導した活性化の結果である。
【００７２】
表は、MDCK細胞について因子HGF、NK2-HGF、メトロン因子-1およびマジック因子-1の様々な試験結果をまとめている。報告された分散単位は、因子を含有するコンディショニングした上清の最大希釈を示し、ここでモトジェニック活性（motogenic activity)を観察できた。値は、上記のようにウエスタンブロットで測定したタンパク質含量について標準化した（図５を参照にされたい）。このようなデータは、ハイブリッド因子メトロン因子-1およびマジック因子-1が、NK2-HGF-Hisの切り詰められた形よりもおよそ３マグニチュード高く、そしてHGF-Hisの元の因子よりも１マグニチュード高いことを示している。
【００７３】
【表１】
0004478329.tif 000008
【００７４】
表。腎臓の上皮細胞（MDCK）について測定したHGF-His、NK2-HGF-Hisメトロン因子-1の分散活性。報告された分散単位は、因子を含有するコンディショニングした上清の最大希釈を示し、ここでモトジェニック活性を観察できた。値は、ウエスタンブロットで測定したタンパク質含量について標準化した。
【００７５】
実施例４ａ：プログラムされた細胞死（アポトーシス）に対する保護の評価試験
化学療法剤シスプラチンの最も特徴的な副作用の１つは、近位細管の上皮細胞のプログラムされた細胞死（アポトーシス）の誘導であり、これは急性の腎不全（ARF）を導く。このように、シスプラチンが誘導する細胞傷害に対して保護する因子は、高度に望ましい。インビトロの機能試験を使用し、これは生存因子の存在または不在下でシスプラチンで処理したアポトーシス細胞の割合を評価することができる。この系は、SV40大Ｔ抗原の異所発現により不滅化したヒトの腎臓近位細管の上皮細胞に由来する細胞系（LOC）を利用する。機能試験には、細胞を０日に96ウェルプレート中、90％DMEM-10％ウシ胎児血清中にまく（103細胞／ウェル）。１日に、培地を、0.5％ウシ胎児血清を含有し、50mM HEPES pH7.4で緩衝化した新しい培地と交換し、これに組換え因子を含有する上清を異なる希釈で加える。細胞はこのような因子と６時間プレインキューベーションし、そして次にさらに10μg／mlのシスプラチンの存在下でインキューベーションする。２日に、細胞をDPBSで洗浄し、そしてアポトーシス細胞の割合をTUNEL法（ベーリンガーマンハイム：Boehringer Mannheim）により評価する。この種類の試験は、ヒトの腎臓の近位細管の上皮細胞（PTEC）の初代培養物を使用して行うことができる。このような試験で、メトロン因子-1およびマジック因子-1はシスプラチンが誘導するプログラムされた細胞死に対して保護活性を有することが証明された。
【００７６】
実施例４ｂ：メトロン因子-1およびマジック因子-1の一過性の遺伝子送達によるシスプラチンが誘導する細胞傷害に対する保護
メトロン因子-1およびマジック因子-1のシスプラチンが誘導する細胞傷害に対する保護効果を、さらに一過性の遺伝子送達法により示した。サルの腎臓上皮細胞(COS)を、対照の空ベクター、メトロンF-1用の発現ベクター、またはマジックF-1用の発現ベクターでトランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞をシスプラチン（20μl／ml)で16時間処理し、そして各トランスフェクション中の生存細胞の割合を測定した。シスプラチン処理は、陰性対照において細胞の約20％に死を引き起こすと算出された。メトロンF-1またはマジックF-1の異所性の発現は、生存率をそれぞれ92.3％および94.0％に上げた。
【００７７】
実施例５：メトロン因子-1およびマジック因子-1によるMet受容体の活性化
メトロン因子-1およびマジック因子-1がMet受容体を活性化する能力は、ヒトの上皮細胞(A549）中でチロシンリン酸化を誘導する組換え因子の能力を分析することにより試験した。この分析のために、100mmペトリ皿中で90％の集密度のA549細胞を、10分間、メトロン因子-1、マジック因子-1を含むか、または因子を含まない（陰性対照）１mlのコンディショニングした上清（DMEM中で1:25または1:10に希釈した）で刺激し、刺激後、細胞を氷中でPBSを用いて洗浄し、200μlの溶解溶液(１％ Triton X-100、５mM EDTA、150mM NaCl、20mM Tris-HCl pH7.4）で溶解し、プロテアーゼインヒビターのカクテルを加え、抗-Metモノクローナル抗体と共有的に結合した10μlのSepharose-Aビーズと４℃で２時間、免疫沈降させ（Naldini,Lら、1991,EMBO J.10:2867-2878)、同じ溶解溶液で３回洗浄し、そして90℃で２分間加熱して吸着したタンパク質を溶出した。これらをSDS-PAGEにより８％BIS-アクリルアミドで分離し、膜（Hybond-C：アマーシャム）に移し、そしてウエスタンブロットにより分析した。１：10000倍に希釈したホスホチロシンに対するマウスモノクローナル抗体(UBI)を１次抗体として使用し、そしてペルオキシダーゼに結合した抗-マウスIgGヒツジ抗体（アマーシャム）を２次抗体として使用した。２次抗体はECL（アマーシャム）により製造元により提供されたプロトコールに従い検出した。この分析で、メトロンＦ-1およびマジックＦ-1は、Met受容体を強力に活性化することが明らかとなった（図７）。
【００７８】
実施例６：インビボで化学療法が誘導する腎不全に対するメトロンＦ-1による保護
メトロンＦ-1は、Balb-cマウスを対象として腎毒性のモデルで試験した。使用したこの方法は、実質的に記載されている（Kawaida Kら、1994、肝細胞増殖因子はマウスの急性腎不全を防止し、そして腎臓の再生を促進する（Hepatocyte growth factor prevents acute renal failure and accelerates renal regeneration in mice)、Proc.Natl.Acad.Sci.91:4357-4361)。簡単に説明すると、腎不全は体重20〜25gのオスのBalb-cマウスに、7.5mg/kgのHgCl2をi.v.注射することにより誘導した（７動物／群）。腎臓傷害は、HgCl2注射の72時間後の血液尿窒素（BUN）分析により、および組織学的評価により評価した。メトロン-F-1は0.01％のTween 80および0.25％のヒト血清アルブミンを含む0.2M NaClに溶解し、HgCl2注射の0.5時間前、および６、12、24、36および48時間後にi.v.投与（100μg/kgを6.6ml/kgの薬量学で量で）した。対象動物は、同量の賦形剤を同じスキームで処置した。
【００７９】
メトロン-F-1は、BUNで評価したHgCl2により誘導される急性の腎不全の発症を有意に防止した(図８)。BUN値は独立した調査者により採点された組織学的知見に、緊密に対応していた。
【００８０】
以下の配列表において：
配列番号１：マジックF-1 DNA コード配列
配列番号２：マジックF-1 アミノ酸配列
配列番号３：メトロンF-1 DNA コード配列
配列番号４：メトロンF-1 アミノ酸配列
【００８１】
【図面の簡単な説明】
【図１】  ａ）ヒトHGFのヌクレオチドおよびアミノ酸配列（ジーンバンク#M73239；Weidner,K.M.ら、1991,Proc.Acad.Sci.USA,88:70０１−７００５）。引用した参照文献とは対照的に、本明細書で使用する番号付けにおいて、No.１は開始コドンの第１塩基（最初のATGのA）である。第１アミノ酸はメチオニンに対応する。5'および3'のcDNA非翻訳領域は表さないか、または番号に含めない。
ｂ）ヒトMSPのヌクレオチドおよびアミノ酸配列（ジーンバンク#L11924；Yoshimura,Tら、1993,J.Biol.Chem.,268:15461-15468）。引用した参照文献とは対照的に、本明細書で使用する番号付けにおいて、No.１は開始コドンの第１塩基（最初のATGのA)。第１アミノ酸はメチオニンに対応する。5'および3'のcDNA非翻訳領域は表さないか、または番号に含めない。
【図２】  ａ）メトロン因子-1の分子構造。リーダー配列は分泌前に生産のために使用された細胞から除去されるので、成熟分子中には存在しない。ポリ-ヒスチジン標識は、プロテアーゼのエンテロキナーゼを用いた消化により除去することができる。
ｂ）メトロン因子-1のヌクレオチドおよびアミノ酸配列。ヌクレオチド配列はEcoRI部位から始まり、そしてSalI部位で終わる（それぞれ最初の６塩基および最後の６塩基）。開始コドン（ATG）および終結コドン（TAG）に下線を付す。
【図３】  ａ）マジック因子-1の分子構造。リーダー配列は分泌前に生産のために使用された細胞から除去されるので、成熟分子中には存在しない。ポリ-ヒスチジン標識は、プロテアーゼのエンテロキナーゼを用いた消化により除去することができる。
ｂ）マジック因子-1のヌクレオチドおよびアミノ酸配列。ヌクレオチド配列はSalI部位から始まる（それぞれ最初の６塩基および最後の６塩基）。開始コドン（ATG）および終結コドン（TAG）に下線を付す。
【図４】  哺乳動物細胞の一過性のトランスフェクションによるメトロン-F-1の生産。対照プラスミド（CTRL）またはpRK7-メトロン F-1-Hisで形質転換したBOSC細胞からのコンディショニングした上清を、抗-MSPポリクローナル抗体と免疫沈降させ、そして同抗体を用いてウエスタンブロットにより検出した。
【図５】  ウエスタンブロットによる組換えタンパク質の定量。（Ａ）タンパク質はSepharose-A-ヘパリンビーズに吸着し、そして抗-ポリ-ヒスチジンモノクローナル抗体により検出された。（Ｂ）タンパク質は抗-MSPポリクローナル抗体と免疫沈降させ、そして抗-ポリ-ヒスチジンモノクローナル抗体により検出された。
【図６】  分散試験は、一過性のトランスフェクションにより調製された組換えタンパク質を使用して、腎臓上皮細胞（MDCK）について行った。タンパク質含量はウエスタンブロットにより定量した（図５を参照にされたい）。（Ａ）非−刺激細胞；（Ｂ）対照上清で刺激した細胞；（Ｃ）HGF-Hisで刺激した細胞；（Ｄ）NK2-HGF-Hisで刺激した細胞；（Ｅ）メトロン因子-1で刺激した細胞；（Ｆ）マジック因子-1で刺激した細胞。
【図７】  ハイブリッド因子であるメトロン因子-1によるMet受容体の活性化（リン酸化）。ヒト上皮細胞（A549）を、対照プラスミド（CTRL）または示した希釈のpRK7-メトロン-F-1-His(メトロンF-1)を用いてトランスフェクトしたBOSC細胞からの上清で刺激した。刺激した細胞の細胞のライゼートを、抗-Metモノクローナル抗体と免疫沈降させ、そして抗-ホスホチロシンモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロットにより検出した。
【図８】  インビボでHgCl2により誘起された急性腎不全に対するメトロン-F-1の保護効果。Balc-cマウスにメトロン-F-1または賦形剤を、HgCl2のi.v.注射の0.5時間前、および６、12、24、36および48時間後にi.v.注射した。BUNおよび腎臓壊死の組織学的評価は、72時間で測定した。
データは７動物／群（BUN）または３動物／群（組織学）の平均＋e.s.として表した。
【配列表】
0004478329.tif 000009
0004478329.tif 000010
0004478329.tif 000011
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0004478329.tif 000015
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【図１ａ】
0004478329.tif 000017
0004478329.tif 000018
0004478329.tif 000019
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【図１ｂ】
0004478329.tif 000021
0004478329.tif 000022
0004478329.tif 000023
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【図２ａ】
0004478329.tif 000025
【図２ｂ】
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0004478329.tif 000027
0004478329.tif 000028
【図３ａ】
0004478329.tif 000029
【図３ｂ】
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0004478329.tif 000031
0004478329.tif 000032
【図４−５Ｂ】
0004478329.tif 000033
【図６−７】
0004478329.tif 000034
【図８】
0004478329.tif 000035