(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の培養に使用する培養液を培養容器自体の内部に凍結させてなり、培養使用時に凍結培養液を溶解して細胞分離操作を行うことなく１．０μｌから１０ｍｌの血液検体を加え、該培養容器内において上記血液検体に含まれる細胞の増殖培養をおこなうようにしたことを特徴とする細胞増殖培養用キット。
【請求項２】
１．０μｌから１．０ｍｌの血液検体に含まれる細胞を増殖培養するための請求項１記載の細胞増殖培養用キット。
【請求項３】
培養時に炭酸ガス雰囲気を不要とした請求項１記載の細胞増殖培養用キット。
【請求項４】
インターロイキン２を使用するものであるところの請求項１〜３の何れか１に記載の細胞増殖培養用キット。
【請求項５】
抗ＣＤ３抗体を含むものであるところの請求項１記載の細胞増殖培養用キット。
【請求項６】
培養液中には抗ＣＤ３抗体をフラスコ内に固相化して含むものであるところの請求項１記載の細胞増殖培養用キット。
【請求項７】
増殖培養する細胞がリンパ球であるところの請求項１〜６のいずれか１に記載の細胞増殖培養用キット。
【請求項８】
細胞の培養に使用する培養液を培養容器自体の内部に凍結させてなり、培養使用時に凍結培養液を溶解し、該培養容器内に細胞分離操作を経ない１．０μｌから１０ｍｌの血液検体を加え、該血液検体に含まれる細胞の増殖培養をおこなうようにした細胞の増殖培養方法。
【請求項９】
増殖培養する細胞がリンパ球であるところの請求項８に記載の細胞の増殖培養方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、抗腫瘍効果を有するリンパ球等の細胞の増殖に際し、僅か１滴程度（１．０μｌ〜１０ｍｌ）の微量血液中に含まれる細胞からの安定的な増殖を可能とし、しかもあらかじめ赤血球とリンパ球との血液分離作業を必要としないばかりでなく、無菌状態での増殖培養を簡単におこなうことができる細胞増殖培養用キット、および該キットを用いて増殖培養をおこなう細胞の増殖培養方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
本発明者である関根は、これまでにリンパ球を固相化抗ＣＤ３抗体とインターロイキン２により増殖できること、及び本増殖させた自己由来リンパ球は、抗腫瘍効果を有することを報告している（特開平３−８００７６号公報）。  またこれ以外にも抗ＣＤ３抗体あるいはインターロイキン２により末梢血等に由来するリンパ球を増殖させられること、及び本自己由来リンパ球が抗腫瘍活性を有すること等が報告されている。
【０００３】
そして増殖させるリンパ球などの基細胞は、血液中から採取されるとともに、適当な容器内に市販の液体培養液等を入れ、上記した基細胞を培養液中に浸漬した状態で、しかも培養液中の水素イオン濃度（ｐＨ）を炭酸ガスによって制御するために細胞培養は、一般的に炭酸ガスインキューベーター中で行われ、かつ４℃程度の温度雰囲気下において運搬・保管される。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記した方法による場合においては、輸送中に液状の培養液が容器の開口縁部分に飛散し、雑菌の感染を起こす一因となり、また使用時に培養液を培養用の容器内に無菌的に分注する作業は非常に煩雑であり、しかも熟練を要することはいうまでもない。  またそればかりでなく、上記した方法による場合においては、その何れもが、少なくとも１０ｍｌ以上の血液を材料として単核球画分を分離し、培養するというものである。
【０００５】
また特に細胞のフェノタイプやゲノタイプを調べる場合においては、多数の細胞が必要となるところから、いずれにしても多くの血液採取を余儀なくされ、患者への肉体的もしくは精神的負担は大きいものといわざるを得ない。  さらに新生児や小児の場合においては、大量の細胞を採取することは一般的にきわめて困難である。  そして各種検査に使用できるような細胞を簡便に培養することができる手段の開発が望まれていた。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明者らは、鋭意検討の結果、培養容器自体の内部に培養液を凍結し、これを使用時に溶解させて、該培養容器内において細胞の培養をおこなうようにすることにより、各種検査に使用できるような細胞、あるいは癌や各種の感染症治療に適する細胞を、非常に簡便に且つ高度な無菌性を維持したまま細胞の増殖培養をおこなうことができることを見出した。  またこれにより特に採取した血液中から細胞分離操作を行うことなく０．１μｌから１０ｍｌ、より好ましくは１μｌから１ｍｌの血液中に含まれる細胞を簡便に増殖させることを可能とした。
【０００７】
またこれまでに、培養容器自体の中に凍結した培養液を含み、使用時に培養液を融解させて使用することを特徴とする細胞培養キットの報告はない。  また特に細胞分離操作を行うことなく０．１μｌから１０ｍｌ、より好ましくは１μｌから１ｍｌの血液中に含まれる細胞を増殖させる細胞培養キットの報告はない。
【０００８】
すなわち請求項１〜８に記載の発明は、細胞の培養に使用する培養液を培養容器自体の内部に凍結させてなり、培養使用時に上記した凍結培養液を溶解して細胞分離操作を行うことなく１．０μｌから１０ｍｌの血液検体を加え、該培養容器内において上記血液検体に含まれる細胞の増殖培養をおこなうようにしたことを特徴とする細胞増殖培養用キットに関する。
【０００９】
さらに請求項９〜１０に記載の発明は、細胞の培養に使用する培養液を培養容器自体の内部に凍結させてなり、培養使用時に上記凍結培養液を溶解し、該培養容器内に細胞分離操作を経ない１．０μｌから１０ｍｌの血液検体を加え、該血液検体に含まれる細胞の増殖培養をおこなうようにした細胞の増殖培養方法にも関する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下において本発明の具体的な内容を説明すると、培養容器としては例えば図１〜２にあらわしたような内部透明なプラスチック製、あるいはガラス製のフラスコ１などが用いられる。  本実施例のフラスコ１は、図１−Ａが正面図、図１−Ｂが右側面図をあらわしている通り、内部中空で底部３を形成した有底であるとともに、胴部２は横断面が内部中空の長方形をなし、しかも上方部を次第に絞り込んでショルダー部４が形成され、しかもその上端部には開口縁５が形成されている。
【００１１】
さらに開口縁５の外周面には雄螺子部（図示省略）が形成され、この雄螺子部には内周面に雌螺子部（図示省略）を形成したキャップ６が螺入被嵌されるようになっている。  なお本発明において使用される培養容器については、必ずしも上記したものに限られるものではなく、液体非透過性、ガスバリヤー性に優れ、抗体を固相化するに適したガラス、ポリウレタン、ポリオレフィン、ポリスチレン等の材質で、しかも内部中空・有底かつ開口部を閉塞する機能を有する容器であれば材質あるいは形状の如何を問わない。  一般的には入手が容易である適当な大きさの市販のプラスチック製滅菌済み細胞培養フラスコ等を使用することができる。
【００１２】
なお上記実施例においては、底面積２５ｃｍ２のフラスコ１を使用しているが、本底面積に限定されない。  実験結果によれば底面積２２５ｃｍ２から４ｃｍ２迄の培養容器が使用できた。  なお上記した底面積２５ｃｍ２のフラスコ１の場合は、培養液５ｍｌを使用しているが、培養液の量は、使用する培養容器やその種類によって適宜選択される。  例えば、底面積２５ｃｍ２のフラスコの場合は、培養液として１ｍｌから１０ｍｌが、底面積２２５ｃｍ２のフラスコの場合は、培養液として１０ｍｌから２５０ｍｌが使用できる。
【００１３】
また本実施例では培養容器としてフラスコ１を使用しているが、フラスコ１と同程度の底面積を有するシャーレや６穴プレート、２４穴プレート、４８穴プレート、９６穴プレート、テラサキプレート等の各種培養容器（いずれも図示省略）が使用できる。
【００１４】
また培養液としては、リンパ球細胞の培養に適したものであれば特に制限されず、血清等の生物由来の培養液、平衡塩類溶液にアミノ酸、ビタミン、核酸塩基などを加えた合成培地などが使用でき、ＲＰＭＩ−１６４０、ＡＩＭ−Ｖ、ＤＭＥＭ、ＩＭＤＭ等が好ましいものとして挙げられ、ＲＰＭＩ−１６４０が特に好ましいものとして挙げられる。  また培養用培地は、正常ヒト血清あるいはウシ胎児血清を添加したものが増殖効果に優れて好ましい。  なおこれらの培地は市販品を用いることができる。
【００１５】
内部無菌状態の培養容器１自体の内部に培養液７を規定量注入し、これを少なくとも０℃以下の冷凍庫内に入れて凍結７ａさせることにより細胞増殖培養用キットを構成する。  該細胞増殖培養用キットは冷凍庫内に使用直前まで保存され、細胞増殖培養時には上記細胞増殖用キットを冷凍庫から出し、凍結培養液７ａが完全に溶けるまで室温で一定時間放置あるいは加温し、溶けたところで細胞の増殖培養作業を開始する。
【００１６】
培養に使用できる検体としての血液量としては、０．１μｌから１０ｍｌ、より好ましくは１．０μｌから１．０ｍｌで十分である。  採血は、腕、足、耳、手、足の裏などの血管から行える。  新生児の場合は、足の裏等から採血した血液を使用することができる。  採血した血液は、抗凝固剤としてヘパリンやクエン酸を添加したものも使用できるが、抗凝固剤を添加していない血液自体も使用できる。  抗凝固剤を含まない血液は、凝固を起こす前に使用できる。
【００１７】
細胞増殖用キットのフラスコ１のキャップ６を取り外して、開口縁５の開口部より、採取した血液または細胞を、フラスコ１内に溶けた培養液７中に混入し、前記キャップ６をもって施蓋した後、フラスコ１を振って培養液７を混濁させた状態において、そのまま増殖培養させる。  増殖培養に際しては、図２にあらわしたように培養容器１のショルダー部４を有する胴部２の側面を下にして横転させた状態のまま維持する。
【００１８】
また培養は、一般的な細胞培養の方法に従うことができる。  上記した図２のフラスコ１を、例えば、ＣＯ２インキュベータ内あるいは孵卵器などの恒温槽内に静置させたまま実施することができる。  この場合、ＣＯ２濃度は０〜５０％のいずれの濃度でも培養可能である。  適当な緩衝液系を培養液に添加することにより培養液中のｐＨ（水素イオン濃度）を５．０〜７．５、特に６．０から７．２に保つことで炭酸ガス培養装置外であっても培養を可能としている。  本実施例では、緩衝液系としてＰＢＳ系を使用し、これにＨＥＰＥＳ系を添加しているが、本緩衝液系に限定されない。  ３５〜４０℃のいずれの温度でも培養できるが３７℃程度がより好ましい。
【００１９】
なお底面積２５ｃｍ２のフラスコ１の場合は、培養液５ｍｌを使用しているが、培養液の量は、使用する培養容器やその種類によって適宜選択される。  例えば、底面積２５ｃｍ２のフラスコ１の場合は、培養液として１ｍｌから１０ｍｌが、底面積２２５ｃｍ２のフラスコ１の場合は、培養液として１０ｍｌから２５０ｍｌが使用できる。
【００２０】
また細胞の培養は、フラスコ１内に固相化した抗体と各種増殖因子を含む培養液中で行うことができる。  とくにＴリンパ球の培養は、抗ＣＤ３抗体とインターロイキン２の、少なくとも一方を含む培養液中で行うことが出来るが、抗ＣＤ３抗体については、これ以外にもＴリンパ球を増殖させるような抗体であれば、特に限定されるものではない。  さらにリンパ球細胞の刺激に用いる抗ＣＤ３抗体は、この場合精製したＣＤ３分子を用いて動物又は細胞に産生させることもできるが、安定性、コスト等に優れた市販のＯＫＴ−３抗体（製造元：オーソファーマスーティカル）が使用できる。
【００２１】
また抗ＣＤ３抗体は、あらかじめ培養液中に混合して液相状態において培養キットとして凍結保存し、使用時に溶解して用いることもできるが、リンパ球細胞の増殖の効率向上、操作の容易性の観点から、固相化して用いることが好ましい。  固相化は、前記抗ＣＤ３抗体の希釈液を固相化する器具、すなわち培養液の注入前に、あらかじめフラスコ１におけるショルダー部４側の胴部２の内壁面に塗布し、これを例えば、４〜３７℃で２〜２４時間、静置することによってフラスコ１の内壁面に物理吸着させて抗体固相化層Ｋを形成することができる。  なおこの抗ＣＤ３抗体の固相化には、抗ＣＤ３抗体を滅菌したダルベッコりん酸緩衝液等の生理的な緩衝液中に１〜３０μｇ／ｍｌの濃度に希釈して用いることが好ましい。
【００２２】
またこれ以外にも、抗体を培養容器の内壁面に化学結合させたものも使用できる。  なおこの場合における固相化方法については、特に上記した手段に限定されない。  抗体は固相化後、使用時までコールドルームや冷蔵庫（４℃）で保存することができる。  使用時に、液を除去して、必要あれば、常温のダルベッコりん酸緩衝液等の生理的な緩衝液で洗浄できる。  また、本発明では培養用培地液中にインターロイキン２を用いることが、増殖の効率向上の観点から好ましい。
【００２３】
この場合に使用するインターロイキン２は市販されているものを用いることができ、またこの場合培養用培地液１〜２０００Ｕ／ｍｌの濃度となるように用いるのが好ましい。  またインターロイキン２は、水、生理食塩液、ダルベッコりん酸緩衝液、ＲＰＭＩ−１６４０、ＤＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ＡＩＭ−Ｖ等の一般に広く用いられる細胞培養用培地液等に溶解して使用することができ、一般的にはインターロイキン２をあらかじめ培養液中に混合した状態にてフラスコ１内において凍結させてキット化し、これを使用時に溶解して用いるようにするものとする。
【００２４】
【実施例】
以下、実施例により本発明の詳細を説明する
〔実施例１〕
▲１▼  細胞培養用フラスコの調製
ダルベッコりん酸緩衝液（発売元：株式会社ニプロ：１０００ｍｌ、以下ＰＢＳ（−）と略すこともある）で１μｇ／ｍｌに調製しておいたＯＫＴ３（輸入発売元：ヤンセン協和株式会社、製造元：オーソファーマスーティカル：ＯＫＴ３注）溶液を、培養用フラスコ（ナルジェヌンクインターナショナル株式会社製：１５２０９４）に５ｍｌ入れ、底面に溶液を均一に浸した。
【００２５】
一晩冷蔵庫で保存後、フラスコのＯＫＴ３溶液を吸引機で吸い取った。  ＰＢＳ（−）１０ｍｌをフラスコに注ぎ込みフラスコの蓋を閉め激しく振った後、蓋を開け、液を捨てた。  再度、クリーンベンチ内でＰＢＳ（−）１０ｍｌをフラスコに注ぎ込みフラスコの蓋を閉め激しく振った後蓋を開け、液を捨てた。  つぎにフラスコ内と蓋に残っている液を吸引機で丁寧に吸い取った。
【００２６】
このフラスコ内に培養用培地５ｍｌ｛培地［ＲＰＭＩ１６４０＋７］（株式会社日研生物研究所製）４３．５ｍｌ、３５，０００Ｕ／ｍｌＩＬ−２（シータス社製）１ｍｌ、ファンギゾン（輸入総発売元：ライフテックオリエンタル株式会社  １５２９５−０１７）０．５ｍｌ、ヒト血清５ｍｌ、を混合して培養用培地とした（以下、単に「培養用培地」と略すこともある。）｝を加え、冷凍庫内において冷凍してキット化し、これを冷凍庫内において使用直前まで保存した。
【００２７】
▲２▼  血液提供者からの採血
３人の血液提供者より、静脈からそれぞれ末梢血５ｍｌをヘパリン加採血した。
【００２８】
▲３▼  血液の培養
上記の▲１▼で調製した培養用フラスコのキットを冷凍庫から取り出し、室温で約１０分間放置し、凍結した培地が完全に溶けたことを確認してから、上記▲２▼において採血した血液の内１００μｌをそれぞれフラスコ内に入れ、血液が均一に混ざるように軽く攪拌した後、３７℃インキュベーター（三洋電機株式会社製：ステリカルトインキュベータＭＩＰ−３０３３、湿度９５％）内で培養を開始した（培養０日目）。
【００２９】
▲４▼  チュルク液による細胞数の測定
上記の▲２▼において採血した血液１０μｌを４０μｌのチュルク液（武藤化学薬品社製）と混合し、血球計算版（エルマー社製：９７３１）に１０μｌほどアプライし、顕微鏡（オリンパス光学工業株式会社製：２１１３２０）下において細胞数を測定した。  その結果、フラスコ内総細胞数はそれぞれ３．０×１０５個、４．５×１０５個、２．０×１０５個だった。
【００３０】
▲５▼  培養８日目のチュルク液による細胞数の測定
前記した▲３▼により培養を開始した後、８日目の細胞１０μｌを４０μｌのチュルク液（武藤化学薬品社製）と混合し、血球計算版（エルマー社製：９７３１）に１０μｌアプライし、顕微鏡（オリンパス光学工業株式会社製：２１１３２０）下で細胞数を測定した。  その結果、フラスコ内総細胞数はそれぞれ１．７×１０７個、１．９×１０７個、１．７×１０７個だった。
【００３１】
▲６▼  培養７日目の細胞のＦＡＣＳによる解析
前記▲４▼と同様にして、▲３▼より培養開始した細胞７日目の細胞のＦＡＣＳによる解析を行った。  その結果、ＣＤ３、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ４及びＣＤ８陽性細胞の占める比率はそれぞれ７７、７９、１６及び８４％、８０、７５、２２及び７８％、８４、９５、１４及び８６％であった。
【００３２】
〔実施例２〕各種血液量による培養
培養血液量を１μｌ、１０μｌ、１ｍｌにした以外は前記した実施例１の場合と同様に培養を行った結果、全ての場合において細胞の増殖が確認された。
【００３３】
〔実施例３〕培養細胞のＨＬＡの測定
異なる４名より採血した血液１００μｌを使用して実施例１と同様に培養を行った。  上記４名中３名について細胞表面抗原の解析をおこなった。  培養した細胞懸濁液を６．０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心して細胞を沈殿させた（遠心機は、株式会社佐久間製作所製、：Ｍ−１５０を使用した。）  上澄みをきれいに吸い取った後、ＰＢＳ（−）８μｌ、ＣＤ３／ＨＬＡ−ＤＲ抗体（輸入販売元：日本ベクトン・ディッキンソン株式会社：３４００４８）８μｌをそれぞれのチューブに入れ、よく攪拌した後、４℃で３０分間反応させた。
【００３４】
反応後、シース液（コールター株式会社製：アイソトン２）８００μｌをそれぞれのチューブ内に入れ、ボルテックスで攪拌した後、６，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心し、細胞を沈殿させた。  上澄みをきれいに吸い取った後、シース液を８００μｌ加え、ピペッティングし、細胞をほぐした後、ＦＡＣＳ測定用チューブ（輸入販売元：日本ベクトン・ディッキンソン株式会社：２０５２）内に入れた。  なおＦＡＣＳはＦＡＣＳｃａｎ（輸入販売元：日本ベクトン・ディッキンソン株式会社製）を使用した。
【００３５】
ＦＡＣＳの測定はマニュアルに従って行った。  その結果、ＣＤ３およびＨＬＡ−ＤＲ陽性細胞の占める比率は、それぞれ５２および３８％、６３及び３０％、４７及び１８％であった。  採血直後の血液及び培養細胞のＨＬＡのＤＲ  Ｌｏｃｕｓ測定を検査受託会社であるＳＲＬ社に依頼して測定を行った。  採血直後の血液を検体とした場合も培養細胞を検体とした場合もＤＲの測定結果は同一であった（１名目のＤＲはＤＲ２とＤＲ６、２名目のＤＲはＤＲ８とＤＲ１２（５）、３名目のＤＲはＤＲ４とＤＲ９、４名目のＤＲはＤＲ４）。  これにより本培養キットを使用して培養した細胞によってＨＬＡが測定できることを明らかとした。
【００３６】
〔実施例４〕３７℃インキュベータによる培養
採血した血液１００μｌを使用してＣＯ２インキュベーターの代わりに３７℃インキュベータ（ＥＹＥＬＡ社製ＳＲＩ−４５０）を使用し、実施例１の場合と同一手順に従い培養を行なった。  その結果２週間後に細胞の増殖が確認できた。
【００３７】
【発明の効果】
本発明は上記した通り、請求項１〜８および請求項９〜１０の発明にあっては、培養液を培養容器自体の内部に凍結させてなり、使用時に凍結培養液を溶解して該培養容器内において細胞の増殖培養をおこなうようにしたものであるために、各種検査に使用できるような細胞、あるいは癌や各種の感染症治療に適する細胞を、非常に簡便に且つ高度な無菌性を維持したまま細胞の増殖培養をおこなうことができる。
【００３８】
またこれにより特に採取した血液中から細胞分離操作を行うことなく、しかも僅か１滴程度の微量の血液により簡便に細胞増殖をおこなうことが可能となり、また正確な検査結果を得ることができる。  その結果新生児や乳幼児のように多量の血液採取が困難である場合にも適用が可能となる。
【００３９】
この場合において、抗ＣＤ３抗体を用いる場合においては細胞培養増殖の効率性・操作性が良好となり、また培養液中にインターロイキン２を含ませることにより、細胞の増殖効率を向上させることができる。  なお本発明において抗ＣＤ４０抗体及びインターロイキン４を含む培養液を使用することにより、Ｂリンパ球の培養を行うことが出来る。  またこれ以外にもマクロファージやデンドリックセル、各種幹細胞の培養を本発明の培養キットで簡便に行うことができる。
【００４１】
その他、本発明の各請求項に掲げた発明は、ヒトの細胞だけでなくマウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ウシ、ブタといった動物の細胞検査および研究をする場合、および治療を簡便におこなうためにも適用が可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明において使用される培養容器の一例を概略であらわしたフラスコの正面（Ａ）及び側面（Ｂ）図。
【図２】図１のフラスコの使用状態をあらわした側面図。
【符号の説明】
１          フラスコ
２          胴部
３          底部
４          ショルダー部
５          開口縁
６          キャップ
７          培養液
７ａ        凍結培養液
Ｋ          抗体固相化層
【図１】
0004461291.tif 000002
【図２】
0004461291.tif 000003