(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
外来性ＤＮＡが導入された幼若Ｔリンパ球を調製し、該幼若Ｔリンパ球を非ヒト哺乳動物の胸腺へ移入し、次いで、非ヒト哺乳動物の胸腺器官内で該幼若Ｔリンパ球を分化、成熟させて、免疫システムの再構築を行なうことを特徴とする外来性ＤＮＡ及び／又はその発現産物に対する後天的免疫寛容の獲得方法。
【請求項２】
外来性ＤＮＡが導入された幼若Ｔリンパ球を調製し、該幼若Ｔリンパ球を非ヒト哺乳動物の胸腺に移入し、次いで、非ヒト哺乳動物の胸腺器官内で、該幼若Ｔリンパ球の分化、成熟の間に、前記外来性ＤＮＡを発現させることを特徴とする請求項１記載の外来性ＤＮＡ及び／又はその発現産物に対する後天的免疫寛容の獲得方法。
【請求項３】
外来性ＤＮＡが、少なくともアレルギー性疾患惹起物質又は自己免疫性疾患惹起物質をコードする遺伝子を含むＤＮＡであることを特徴とする請求項１又は２記載の外来性ＤＮＡ及び／又はその発現産物に対する後天的免疫寛容の獲得方法。
【請求項４】
外来性ＤＮＡが、少なくともペプチド性治療薬をコードする遺伝子を含むＤＮＡであることを特徴とする請求項１又は２記載の外来性ＤＮＡ及び／又はその発現産物に対する後天的免疫寛容の獲得方法。
【請求項５】
外来性ＤＮＡが、少なくとも遺伝子及びベクターを含むＤＮＡであることを特徴とする請求項１又は２記載の外来性ＤＮＡ及び／又はその発現産物に対する後天的免疫寛容の獲得方法。
【請求項６】
ベクターが外来遺伝子導入用ウイルスベクターであることを特徴とする請求項５記載の外来性ＤＮＡ及び／又はその発現産物に対する後天的免疫寛容の獲得方法。
【請求項７】
ウイルスベクターが、レトロウイルスに由来するベクターであることを特徴とする請求項６記載の外来性ＤＮＡ及び／又はその発現産物に対する後天的免疫寛容の獲得方法。
【請求項８】
外来性ＤＮＡが導入された幼若Ｔリンパ球を調製し、該幼若Ｔリンパ球を非ヒト哺乳動物の胸腺へ移入し、次いで、非ヒト哺乳動物の胸腺器官内で該幼若Ｔリンパ球を分化、成熟させて、免疫システムの再構築を行なうことを特徴とする遺伝子治療における遺伝子治療効果の持続方法。
【請求項９】
外来性ＤＮＡが導入された幼若Ｔリンパ球を調製し、該幼若Ｔリンパ球を非ヒト哺乳動物の胸腺へ移入し、次いで、非ヒト哺乳動物の胸腺器官内で該幼若Ｔリンパ球を分化、成熟させて、免疫システムの再構築を行なうことを特徴とする請求項８記載の遺伝子治療において遺伝子治療効果の持続と外来性ＤＮＡ及び／又はその発現産物により惹起される免疫応答を回避する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、幼若Ｔリンパ球を介する胸腺へのＤＮＡ導入による、ウイルスベクター由来成分等の外来性ＤＮＡ及び／又はその発現産物に対する後天的免疫寛容の獲得方法や、遺伝子治療における外来性ＤＮＡ及び／又はその発現産物に対する拒絶応答を回避する遺伝子治療効果の持続方法や、ウイルスベクター由来成分等の外来性ＤＮＡ及び／又はその発現産物に対して後天的免疫寛容を獲得したマウス等の非ヒト動物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体は一般に自己を構成する抗原に対しては免疫応答を示さない。これは自然ないし先天的免疫寛容と呼ばれている。一方、本来異種の抗原であっても投与の時期（特に胎生期ないし新生期）、投与の方法（たとえば免疫抑制剤を用いるとか）、投与するときの性状（タンパク質抗原なら変性物を除いて投与する）によっては、その後の免疫応答に対して反応性を示さない状態を誘導できる。これは、後天的ないし獲得寛容と呼ばれている。また、免疫応答とは、一般に自己と自己以外のもの（非自己）とを識別し、非自己に対して細胞性や体液性の反応を起こしたものと捉えられている。この識別は、リンパ球表面にある抗原受容体によって行われ、非自己と認識した場合には、リンパ球が増殖して細胞傷害性を発揮したり抗体を産生するようになる。しかし、リンパ球による認識の最初の段階では、まず、樹状細胞やマクロファージが異物（非自己）を取込み、Ｔリンパ球によって認識されうる形で提示するという段階が必要なので、自己と非自己の認識は樹状細胞やマクロファージとＴリンパ球との相互作用のレベルで行われているとも考えられている。
【０００３】
一方、組換えＤＮＡ等の実験により得られた外来遺伝子を患者の体細胞に導入して、その遺伝子の機能により該患者の遺伝子疾患を治療する遺伝子治療は、癌、免疫不全、心血管疾患等の多くの遺伝子疾患に適用されつつある。しかし、遺伝子治療を阻んでいる最も大きな原因は、遺伝子を導入する際に用いるベクター（遺伝子導入のための運び屋）成分に対する上記免疫応答である。すなわち、細胞に遺伝子を導入することそのものは技術的に完成しつつあるが、遺伝子導入の為には必ず何らかのベクターを用いなければならない。また、このベクターの遺伝子導入方法としては、レトロウイルス・アデノウイルス・レンチウイルス等いろいろなウイルス系を用いるウイルスベクター法や、ＤＮＡを包み込んだ膜を細胞と融合させるリポソーム法や、直接遺伝子を導入するマイクロインジェクション法や、挿入ＤＮＡのサイズが制限されずかつ細胞親和性が高いというセンダイウイルス（ＨＶＪ）法（J. Biol. Chem. 264, 12126-12129, 1989、J. Biol. Chem. 266, 3361-3364, 1991、Bioche. Biophys. Res. Commun. 186, 129-134, 1992、Circ. Res. 73, 898-905, 1993、Science 243, 375-378, 1989、J. Clin. Invest 94, 978-984, 1994）等が知られている。
【０００４】
上記のいずれの遺伝子導入方法においても、導入するベクターは我々の身体にとっては異物であるために、これらベクターの成分に対する免疫応答が惹き起こされ、その結果、早晩のうちに（通常２週間から１ヶ月のうちに）生体はベクターを排除してしまう。例えばウイルスベクターの場合、ベクター成分が感染細胞内でタンパク質として発現し、そのタンパク質が細胞表面にペプチドとして発現され、Ｔリンパ球がベクター由来のペプチドを認識して感染細胞を殺し、ベクター（ウイルス）を排除してしまう。このように、現在の遺伝子治療においては、遺伝子導入そのものには成功しても、長期の持続性効果を得ることには再現よく成功していない欠点があった。
【０００５】
また従来、後天的免疫寛容の獲得方法に関して、脂溶性成分又は脂溶性成分含有物質を抗原と同時には摂取させないことにより哺乳動物に対して免疫寛容を誘導する方法（特開平９−１９４３９３号公報）や、経口投与によって実質的に薬理効果を奏さず、注射によって薬理的効果を奏し、かつ注射による繰り返し投与によって薬理効果が発揮されなくなる薬物を有効成分とする医薬製剤であって、経口免疫寛容を誘導するのに十分な投与単位数の該薬物含有経口投与用製剤と、経口免疫寛容が誘導された後に投与するための該薬物含有注射用製剤とからなる医薬製剤を用いる方法（特開平１０−２９８１０１号公報）や、移植受け入れ患者に対応した特異的な免疫寛容を得た動物から臓器を摘出することにより、移植された臓器のリンパ球などで構成される末梢性免疫機構が、移植された後ヒトの組織適合抗原を攻撃せず、良好な臓器生着を有する人工臓器を用いて移植患者に免疫寛容を成立させる方法（特開平９−１８７４７０号公報）が知られている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
ＦＴＯＣ（幼若胸腺組織培養）においてレトロウイルスを介して遺伝子を直接導入する方法やＴリンパ球発達におけるＭＡＰキナーゼの役割に関する情報が報告（Cell 86, 243-251, 1996）されており、従来も胸腺に遺伝子を導入しようとする試みがあったが、正常の実験動物においても大変効率が悪く、既存のＴリンパ球による排除作用を抑える効果に乏しく、そのため実用性に乏しかった（FASEB. J. 6, 2853-2858, 1992、Ann. Surg. 222, 229-242, 1995、J. Clin. Invest. 98, 2640-2647, 1996）。
【０００７】
本発明者らは、遺伝子治療を受けさせる個体のモデル動物として、マウスを用いて、グリーン蛍光蛋白質（ＧＦＰ）遺伝子とレトロウイルスベクター（ｐＧＤ）とを結合させたｐＧＤ−ＧＦＰを皮内や腹腔内に注入したところ、かかるマウスがベクター成分に対して免疫応答を示し、ＧＦＰ遺伝子が組み込まれたウイルスベクターを２週間から１ヶ月のうちに体内から消失していたが、Ｔリンパ球を欠損した免疫不全マウスを用いて同様に実験を行ったところ、かかる免疫応答が起こらなかった。この原因はＴリンパ球を介した細胞性免疫応答、すなわちＴリンパ球が遺伝子疾患の治療に有用なベクター遺伝子やその発現産物を非自己として認識し排除しているものと考えられた。
【０００８】
本発明の課題は、上記のように遺伝子治療用等の有用な外来遺伝子が組み込まれたベクター等の外来性ＤＮＡやその発現産物を「非自己」ではなく「自己」として認識させることができる、外来遺伝子が組み込まれたベクター等の外来性ＤＮＡやその発現産物に対する後天的免疫寛容の獲得方法や、外来遺伝子が組み込まれたベクター等の外来性ＤＮＡやその発現産物に対する拒絶応答を回避することができる遺伝子治療効果の持続方法や、外来遺伝子が組み込まれたベクター等の外来性ＤＮＡやその発現産物に対する後天的免疫寛容を獲得した非ヒト動物を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、生体のＴリンパ球が遺伝子導入用ウイルスベクターの成分を「非自己」ではなく「自己」として認識するように、生体のＴリンパ球系を再教育し、かかる導入遺伝子ベクターに対する免疫応答を回避させる方法を鋭意研究した結果、本発明者らの胸腺での幼若Ｔリンパ球への遺伝子導入テクニック（J. Immunol. 161, 2888-2894, 1998、Immunity 9, 565-574, 1998）を用いてマウス幼若Ｔリンパ球にｐＧＤ−ＧＦＰ遺伝子を導入し、かかる遺伝子導入細胞をＧＦＰの発現による蛍光染色を利用して精製し、正常のマウスのＴリンパ球を一過性に抑制するため低線量の放射線を照射し、遺伝子導入幼若Ｔリンパ球を胸腺に移入し、このマウスの放射線照射からの回復を持ってから、ｐＧＤ−ＧＦＰレトロウイルスを皮内や腹腔内に注射したところ、幼若Ｔリンパ球前処理の効果で、マウス内で導入遺伝子ＧＦＰの発現は長期間にわたり持続していた。すなわち、抗ベクター免疫応答を回避させることができ、持続的な遺伝子治療が可能になることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
またこのとき、ベクター成分以外の外来分子に対する免疫応答は正常に保たれており、マウスの免疫系全体が傷害を受けたわけではなく、遺伝子治療用のベクターに対しての特異的免疫寛容が誘導されたことや、他の臓器で遺伝子導入に用いるベクターをそのまま幼若Ｔリンパ球に発現させることは問題なく可能であることがわかった。この方法を用いることによって、自己・非自己の識別をもたらす中心機関である胸腺に、幼若Ｔリンパ球を介して効率よく遺伝子を導入することができ、胸腺気管内でのベクター成分の効率のよい発現と、それによる効率のよいＴリンパ球の自己寛容の成立がもたらされることがわかった。
【００１１】
すなわち本発明は、外来性ＤＮＡが導入された幼若Ｔリンパ球を調製し、該幼若Ｔリンパ球を非ヒト哺乳動物の胸腺へ移入し、次いで、非ヒト哺乳動物の胸腺器官内で該幼若Ｔリンパ球を分化、成熟させて、免疫システムの再構築を行なうことを特徴とする外来性ＤＮＡ及び／又はその発現産物に対する後天的免疫寛容の獲得方法（請求項１）や、外来性ＤＮＡが導入された幼若Ｔリンパ球を調製し、該幼若Ｔリンパ球を非ヒト哺乳動物の胸腺に移入し、次いで、非ヒト哺乳動物の胸腺器官内で、該幼若Ｔリンパ球の分化、成熟の間に、前記外来性ＤＮＡを発現させることを特徴とする請求項１記載の外来性ＤＮＡ及び／又はその発現産物に対する後天的免疫寛容の獲得方法（請求項２）や、外来性ＤＮＡが、少なくともアレルギー性疾患惹起物質又は自己免疫性疾患惹起物質をコードする遺伝子を含むＤＮＡであることを特徴とする請求項１又は２記載の外来性ＤＮＡ及び／又はその発現産物に対する後天的免疫寛容の獲得方法（請求項３）や、外来性ＤＮＡが、少なくともペプチド性治療薬をコードする遺伝子を含むＤＮＡであることを特徴とする請求項１又は２記載の外来性ＤＮＡ及び／又はその発現産物に対する後天的免疫寛容の獲得方法（請求項４）や、外来性ＤＮＡが、少なくとも遺伝子及びベクターを含むＤＮＡであることを特徴とする請求項１又は２記載の外来性ＤＮＡ及び／又はその発現産物に対する後天的免疫寛容の獲得方法（請求項５）や、ベクターが外来遺伝子導入用ウイルスベクターであることを特徴とする請求項５記載の外来性ＤＮＡ及び／又はその発現産物に対する後天的免疫寛容の獲得方法（請求項６）や、ウイルスベクターが、レトロウイルスに由来するベクターであることを特徴とする請求項６記載の外来性ＤＮＡ及び／又はその発現産物に対する後天的免疫寛容の獲得方法（請求項７）からなる。
【００１２】
また本発明は、外来性ＤＮＡが導入された幼若Ｔリンパ球を調製し、該幼若Ｔリンパ球を非ヒト哺乳動物の胸腺へ移入し、次いで、非ヒト哺乳動物の胸腺器官内で該幼若Ｔリンパ球を分化、成熟させて、免疫システムの再構築を行なうことを特徴とする遺伝子治療における遺伝子治療効果の持続方法（請求項８）や、外来性ＤＮＡが導入された幼若Ｔリンパ球を調製し、該幼若Ｔリンパ球を非ヒト哺乳動物の胸腺へ移入し、次いで、非ヒト哺乳動物の胸腺器官内で該幼若Ｔリンパ球を分化、成熟させて、免疫システムの再構築を行なうことを特徴とする請求項８記載の遺伝子治療において遺伝子治療効果の持続と外来性ＤＮＡ及び／又はその発現産物により惹起される免疫応答を回避する方法（請求項９）からなる。
【００１３】
なお本発明は、請求項１〜７のいずれか記載の外来性ＤＮＡ及び／又はその発現産物に対する後天的免疫寛容の獲得方法により、外来性ＤＮＡ及び／又はその発現産物に対する後天的免疫寛容を獲得した非ヒト哺乳動物（請求項１０）や、非ヒト哺乳動物が、齧歯類に属する非ヒト哺乳動物であることを特徴とする請求項１０記載の外来性ＤＮＡ及び／又はその発現産物に対する後天的免疫寛容を獲得した非ヒト哺乳動物（請求項１１）や、齧歯類に属する非ヒト哺乳動物がマウスであることを特徴とする請求項１１記載の外来性ＤＮＡ及び／又はその発現産物に対する後天的免疫寛容を獲得した非ヒト哺乳動物（請求項１２）に関係する。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明の外来性ＤＮＡ及び／又はその発現産物に対する後天的免疫寛容の獲得方法は、幼若Ｔリンパ球を介して胸腺へ外来性ＤＮＡを導入することを特徴とし、詳しくは、外来性ＤＮＡが導入された幼若Ｔリンパ球を胸腺に移入して、胸腺器官内で前記外来性ＤＮＡを発現させることを特徴とする。
【００１５】
本発明において外来性ＤＮＡとは、後天的免疫寛容を獲得しようとする動物に元来存在しないＤＮＡをいい、その翻訳産物が該動物にとって非自己として認識されるＤＮＡをいう。また、本発明において外来遺伝子とは、後天的免疫寛容を獲得しようとする動物に元来存在しない遺伝子をいい、その翻訳産物が該動物にとって非自己として認識される遺伝子をいう。そして、前記外来性ＤＮＡとしては、外来遺伝子やベクターや目的遺伝子が組み込まれたベクター等を具体的に挙げることができ、外来遺伝子としては、例えば、少なくともアレルギー性疾患惹起物質や自己免疫性疾患惹起物質、特に深刻なアレルギー性疾患惹起物質や慢性関節リウマチの疾患惹起物質であるＭＢＰ（ミエリン塩基性タンパク質）分子等の自己免疫性疾患惹起物質をコードする遺伝子等や、少なくともペプチド性抗癌剤やペプチド性糖尿病治療薬等をコードする遺伝子等を挙げることができ、また、ベクターとしては、前記外来遺伝子の導入用等のウイルスベクター、プラスミドベクター、ファージベクター、酵母人工染色体（ＹＡＣ）ベクター等のベクターを例示することができるが、ウイルス粒子として感染させた場合に形質転換効率が非常に高い点でウイルスベクター、特にレトロウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス等に由来するウイルスベクターを用いることが好ましい。これらウイルスベクターを用いる場合、該ウイルスベクターを予め宿主細胞に感染させ、ウイルスプロデューサー細胞として用いることが好ましい。
【００１６】
本発明において用いられる幼若Ｔリンパ球とは、抗原受容体及び機能的コレセプターＣＤ４／ＣＤ８などを発現する成熟Ｔリンパ球になる前のＴリンパ球をいい、例えば、成体胸腺リンパ球から分画・精製することにより、また胎生１４〜１８日頃の胸腺葉から得ることができる。胎生１４〜１５日頃の胸腺葉は、左右両葉が個別に心臓上方に存在し、透明感のある球体で周辺組織とは区別しやすく成熟Ｔリンパ球の混入がない点で、この時期の胸腺葉を用いることが好ましい。
【００１７】
本発明における外来性ＤＮＡを幼若Ｔリンパ球へ導入する方法としては、本発明者らが開発した遺伝子導入テクニック（J. Immunol. 161, 2888-2894, 1998、Immunity 9, 565-574, 1998）、例えば、幼若Ｔリンパ球とウイルスプロデューサー細胞を共培養し、ウイルスプロデューサー細胞よりも大きさが小さく、密集度が低いことを利用して、遺伝子が導入された幼若Ｔリンパ球をフォーワード＆サイドスキャッター（forward and side scatter）により分離し、蛍光活性化セルソーターにより、生存能力のある幼若Ｔリンパ球を分離・精製する方法や、造血細胞マーカーＣＤ４５に対する抗体を染色したものを使用して、フローサイトメトリーセルソーターでＧＦＰ+ＣＤ４５+細胞をソートすることにより遺伝子が導入された幼若Ｔリンパ球を、繊維芽細胞由来のウイルスプロデューサー細胞から識別して分離・精製する方法を用いることが、Ｔリンパ球の教育器官である胸腺器官内で、外来性ＤＮＡ導入細胞を分化・成熟させることができる点で好ましい。
【００１８】
本発明の外来性ＤＮＡの発現産物に対する後天的免疫寛容は、例えば、上記方法により得られた幼若Ｔリンパ球に前記外来遺伝子等の目的遺伝子が組み込まれたベクターを導入し、かかるベクターが導入された幼若Ｔリンパ球を、胸腺への直接注射や、経静脈注射することにより胸腺に移入させ、胸腺器官内でかかる外来性ＤＮＡを発現させることにより獲得することができる。その際、外来性ＤＮＡにより惹起される免疫応答も同時に回避することができる。
【００１９】
本発明における遺伝子治療効果の持続方法は、遺伝子治療における外来性ＤＮＡを幼若Ｔリンパ球を介して胸腺へ導入することを特徴とし、特に遺伝子治療における外来性ＤＮＡが導入された幼若Ｔリンパ球を胸腺に移入して、胸腺器官内で外来性ＤＮＡを発現させることにより、外来性ＤＮＡ及び／又はその発現産物により惹起される免疫応答を例えば１ヶ月以上の長期間にわたり回避することを特徴とするものであり、遺伝子治療効果の持続は、前記外来性ＤＮＡ及び／又はその発現産物に対する後天的免疫寛容の獲得方法における外来性ＤＮＡとして、遺伝子治療に有用な外来性ＤＮＡを用いる場合に達成することができる。
【００２０】
本発明における外来性ＤＮＡ及び／又はその発現産物に対する後天的免疫寛容を獲得した非ヒト動物は、幼若Ｔリンパ球を介して胸腺へ外来性ＤＮＡを導入することを特徴とし、特に外来性ＤＮＡが導入された幼若Ｔリンパ球を胸腺に移入して、胸腺器官内で前記外来性ＤＮＡを発現させることを特徴とする。かかる非ヒト動物としては、非ヒト哺乳動物、例えばマウス、ラット、ウサギ等の哺乳動物を例示することができるが、育成、使用の簡便さ等からしてマウスが好ましい。以下、本発明を、非ヒト動物がマウスの場合を例にとった実施例を挙げて更に具体的に説明するが、この発明の技術的範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２１】
【実施例】
実施例１（培養液の調製）
ＲＰＭＩ１６４０［最終濃度で、５０μＭの２−メルカプトエタノール（シグマケミカル社製）、１０ｍＭのヘペス（Gibco BRL社製）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Gibco BRL社製）、１×非必須アミノ酸（Gibco BRL社製）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Gibco BRL社製）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン（Gibco BRL社製）、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Gibco BRL社製）を含む培地］に、５６℃で３０分間前処理をした１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を添加した培養液（１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０培地）を調製した。なお、実施例における操作はすべてクリーンフード内で無菌的に行った。
【００２２】
実施例２（マウス胎仔胸腺葉の採取）
妊娠日齢１５〜１６日目のマウスを頸部切断により殺し、７０％のエタノールでマウスの腹部を清拭した後、胎仔を子宮ごと１００ｍｍ無菌皿に取り出した。
この子宮から胎仔を取り出して、実施例１の培地２０〜３０ｍｌの入った１００ｍｍ無菌皿に胎仔を移し、２〜３回静かに皿を回転させ洗浄して血液とその余の夾雑物を取り除いた。かかるマウス胎仔を顕微鏡下に置き、静かに胸部を切開して２つの胸腺葉を取り出し、ガーゼの上に置き血液を取り除き、マウス胎仔胸腺葉を採取した。
【００２３】
実施例３（培養ウェルの調製）
殺菌したヘリスタット（Helistat）スポンジ（Colla-Tec, Inc., Plainsboro, NJ 08536）の小片を２４ウェルプレート（直径１６ｍｍ、無菌）の培養ウェルに置き、実施例１の培地１ｍｌを入れ、スポンジのなめらかな面を上に向け、無菌ポリカーボネートフィルター膜（Costar, Nucleopore Corp. PC membrane, #110409,直径１１３ｍｍ）をその上に置き、フィルター膜を鉗子で裏返して、フィルター膜の両面を培地で完全に浸した後、そこから０．５ｍｌの培地をウェルから静かに抜き取り、最終の培地を１ウェル当たり０．５ｍｌに調製した。
【００２４】
実施例４（マウス胸腺葉の組織培養）
実施例２で得られた４〜６葉の胸腺葉を、実施例３で調製した培養ウェルのスポンジ上のフィルター膜に載置し、胸腺葉が培地液に浸漬しない状態で、ＣＯ2インキュベーター中にて培養した。
【００２５】
実施例５（胎仔胸腺組織培養後の単細胞浮遊液の調製）
３０ｍｍ皿の蓋裏側の中心に、１００μｌの染色緩衝液［０．２％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と０．１％のＮａＮ3を含むｐＨ７．２のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）］を滴下し、その中に実施例４で組織培養した胸腺葉を移し、７型鉗子を用いて胸腺葉の数をカウントした。次に小さいナイロンメッシュ（およそ５ｍｍ2）を胸腺葉が移された緩衝液の上に載せ、針先の曲がった２６ゲージ針（先端から５ｍｍ、９０度の角度）と１ｍｌシリンジを用いて、これらをナイロンメッシュに押しつけながら胸腺葉をそっと裂き、得られた単細胞浮遊液をシリンジ内のプラスチックチューブに移し、細胞の数をカウントして所定濃度の細胞懸濁液を調製した。
【００２６】
実施例６（ウイルスプロデューサー細胞の作製）
ＧＦＰ遺伝子から調製したＳ６５Ｔ変異体をコードする７４０ｂｐのＤＮＡ（クローンテック社製）をｐＧＤ′のＢｃｌＩサイト（図１ａ）又はｐＭＳＣＶのＨｐａＩサイト（図１ｂ）にクローニングした。このクローニングにより得られた組み換えベクターをＧＰ＋Ｅ−８６細胞にトランスフェクションした。Ｇ４１８耐性細胞の中から、ＦＡＣＳバンテージセルソーター（Becton Dickinson社製）を用いてＧＦＰhighクローンを分離した。分離されたクローンから得られた濾過上清の希釈液とＮＩＨ−３Ｔ３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５８）のＧ４１８耐性細胞とをいっしょに１日間培養し、ウイルスの力価を測定し、１０6ＣＦＵ／ｍｌ以上の力価を有するウイルスプロデューサー細胞（組み換えベクターをインフェクションしたＧＰ＋Ｅ−８６細胞）を以下の実施例に用いた。
【００２７】
実施例７（ウイルス感染幼若Ｔリンパ球の作製）
上記実施例５によって得られた単細胞の幼若Ｔリンパ球浮遊液を最終的に０．５〜２×１０4個／ウェルとなるように９６フラットウェルに分注し、さらにあらかじめトリプシン処理し、１日間培養した上記ウイルスプロデューサー細胞を１ウェル当たりに２〜５×１０3個加えて、これらをウェル内で混合した。この混合物を、最終濃度１〜５ｎｇ／ｍｌのマウスの組換えＩＬ−７（インターロイキン７；Ｇｅｎｚｙｍｅ社製）、又はこれと最終濃度１〜５ｎｇ／ｍｌの幹細胞因子（ＳＣＦ）の存在下において１〜２日間培養した。その後、共培養した幼若Ｔリンパ球を静かにピペッティングしながら回収した。幼若Ｔリンパ球はプロデューサー細胞よりも小さく、密集度が低いことを利用して、遺伝子が導入された幼若Ｔリンパ球（図２のａ部分）をフォーワード＆サイドスキャッター（forward and side scatter）により分離し（図２）、蛍光活性化セルソーターにより、生存能力のある幼若Ｔリンパ球を分離・精製した。
また、造血細胞マーカーＣＤ４５に対する抗体を染色したものを使用して、フローサイトメトリーセルソーターでＧＦＰ+ＣＤ４５+細胞をソートすることにより、遺伝子が導入された幼若Ｔリンパ球を、繊維芽細胞由来のウイルスプロデューサー細胞から識別して分離・精製した。
【００２８】
実施例８（遺伝子導入幼若Ｔリンパ球による導入遺伝子の発現）
正常なマウス（Ｂ６）のＴリンパ球を一過性に抑制するために低線量の放射線を照射し、上記実施例７により得られた遺伝子導入幼若Ｔリンパ球を胸腺へ直接注射することにより胸腺に移入した。このマウスの放射線照射からの回復を待ってから、ｐＧＤ−ＧＦＰレトロウイルスを導入した脾細胞を腹腔内に注射し、２週間後、抗ＧＦＰ抗体を酵素抗体法を用いて血中抗体価で測定した。また、コントロールとして抗ＢＳＡ（仔牛血清アルブミン）抗体をも同様に測定した。結果を図３に示す。図３中、“No treatment”は無処理の正常なマウス（Ｂ６）における血中抗体価を意味し、当然のことながら抗体が生成しないことがわかる。 “pGD-GFP ip”は、正常なマウス（Ｂ６）にｐＧＤ−ＧＦＰレトロウイルス導入脾細胞を腹腔内に注射したときの血中抗体価を意味し、ＧＦＰの発現により抗ＧＦＰ抗体が生成していることが示されている。“pGD -GFP it”は、ｐＧＤ−ＧＦＰレトロウイルス導入脾細胞を腹腔内に注射していない上記実施例７により得られた遺伝子導入幼若Ｔリンパ球胸腺移入マウス（Ｂ６）の血中抗体価を意味し、このマウスでは抗ＧＦＰ抗体が殆ど生成しないことがわかる。“pGD -GFP it→ pGD-GFP ip”は、上記実施例７により得られた遺伝子導入幼若Ｔリンパ球胸腺移入マウス（Ｂ６）に、ｐＧＤ−ＧＦＰレトロウイルス導入脾細胞を腹腔内に注射したときの血中抗体価を意味し、このマウスにおいて抗ＧＦＰ抗体が殆ど出現していないことがわかる。以上の結果から、上記実施例７により得られた遺伝子導入幼若Ｔリンパ球胸腺移入マウス（Ｂ６）において、ウイルスベクター由来のＧＦＰ成分に免疫寛容が成立したことを確認した。すなわち、抗ベクター免疫応答を回避させることができ、持続的な遺伝子治療が可能となることがわかった。またこのとき、ベクター成分以外の外来分子に対する免疫応答は正常に保たれており、マウスの免疫系全体が傷害を受けたわけではなく、遺伝子治療用のベクターに対しての特異的免疫寛容が誘導されたことも確認した。
【００２９】
【発明の効果】
本発明によると、外来遺伝子が組み込まれたベクター等の外来性ＤＮＡが導入された幼若Ｔリンパ球を胸腺に移入して、胸腺器官内で上記外来性ＤＮＡを発現させることにより当該外来性ＤＮＡやその発現産物に対して後天的免疫寛容を獲得させることができ、また、かかる外来性ＤＮＡやその発現産物に対する拒絶応答を回避させ、遺伝子治療の効果を長期間安定して持続して行うこともできる。
さらに、本発明の外来遺伝子が組み込まれたベクター等の外来性ＤＮＡやその発現産物に対する後天的免疫寛容を獲得した非ヒト動物は、遺伝子治療等の研究開発に用いると極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明における遺伝子導入に用いたベクターの構成を示す図である。
【図２】フォーワード＆サイドスキャッターによる遺伝子導入幼若Ｔリンパ球とウイルスプロデューサー細胞の分析結果を示す図である。
【図３】遺伝子導入幼若Ｔリンパ球胸腺移入マウスにおける免疫応答の結果を示す図である。
【図１】
0004552056.tif 000002
【図２】
0004552056.tif 000003
【図３】
0004552056.tif 000004