(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
カナダアザミから分離されたフォーマ  cf.  マクロストマ、その抽出物、その接種培地またはこれらの混合物を、広葉雑草にまたは広葉雑草が繁殖する土壌に投与することを特徴とする1種以上の広葉雑草の制御方法。
【請求項２】
前記１種以上の広葉雑草が、キク科、ナデシコ科、ヒルガオ科、オーバコ科およびアカネ科からなる群から選ばれた科の種である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記１種以上の広葉雑草が、カナダアザミ、多年生ノゲシ、タンポポ、無臭カモミル、ヤエムグラ、ハコベ、ソバカズラ、セイヨウヒルガオ、オオバコおよびプレイリーヒマワリからなる群から選ばれる、請求項１記載の方法。
【請求項４】
1種以上のカナダアザミから分離されたフォーマ  cf.  マクロストマ分離物、その抽出物、その接種培地、またはこれらの混合物を含み、雑草制御活性、繁殖増強活性、またはこれらの組合せを示すことを特徴とするバイオ制御剤。
【請求項５】
前記1種以上のフォーマ属分離物が下記からなる群から選ばれる、請求項４記載のバイオ制御剤：
a)  85-24B  (IDAC  230201-1、2001年2月23日寄託)；
b)  89-25A  (IDAC  110401-1、2001年4月11日寄託)；
c)  94-26  (IDAC  230201-2、2001年2月23日寄託)；
d)  94-44B  (IDAC  230201-3、2001年2月23日寄託)；
e)  94-134  (IDAC  230201-4、2001年2月23日寄託)；
f)  94-359A  (IDAC  110401-2、2001年4月11日寄託)；
g)  95-54A1  (IDAC  230201-5、2001年2月23日寄託)；
h)  95-268B  (IDAC  110401-3、2001年4月11日寄託)；
i)  97-12B  (IDAC  230201-6、2001年2月23日寄託)；
j)  97-15B2  (IDAC  110401-4、2001年4月11日寄託)；および、これらの組合せ。
【請求項６】
前記抽出物が、熱死菌大麦接種物、前記フォーマ属分離物のクロロホルム抽出物、前記フォーマ属分離物のメタノール抽出物、および前記フォーマ属分離物の酢酸エチル抽出物からなる群から選ばれる、請求項４または５に記載のバイオ制御剤。
【請求項７】
前記接種培地が、粗接種培地、濾過接種培地、濃縮接種培地または遠心処理接種培地からなる群から選ばれる、請求項４から６のいずれかに記載のバイオ制御剤。
【請求項８】
請求項４記載のバイオ制御剤と、前記１種以上のフォーマ属分離物の生存を維持するための培地とを含むバイオ制御組成物。
【請求項９】
前記培地が、寒天、ペスタ、ピート小球、蛭石、クレー、澱粉、ポテトデキストロース培地、野菜ジュース培地、作物粒子および豆粒子からなる群から選ばれる、請求項８記載のバイオ制御組成物。
【請求項１０】
a)  有効量の請求項４から７のいずれかに記載のバイオ制御剤を加えて処理土壌を調製し；b)  作物を前記処理土壌に植付け、c)  該作物を繁殖させることを特徴とする作物繁殖中の雑草発生の制御方法。
【請求項１１】
a)  作物を植付け、b)  該作物を植付けた土壌に、有効量の請求項４から７のいずれかに記載のバイオ制御剤を加え、c)  該作物を繁殖させることを特徴とする作物繁殖中の雑草発生の制御方法。
【請求項１２】
a)  有効量の請求項４から７のいずれかに記載のバイオ制御剤を作物種子に加えて処理作物種子を調製し、b)  該処理作物種子を植付け、c)  該作物を繁殖させることを特徴とする作物繁殖中の雑草発生の制御方法。
【請求項１３】
a)  有効量の請求項４から７のいずれかに記載のバイオ制御剤を樹立作物に加え、b)  該作物を繁殖させることを特徴とする樹立作物の繁殖中の雑草発生の制御方法。
【請求項１４】
a)  有効量の請求項８または９に記載のバイオ制御組成物を加えて処理土壌を調製し；b)  作物を前記処理土壌に植付け、c)  該作物を繁殖させることを特徴とする作物繁殖中の雑草発生の制御方法。
【請求項１５】
a)  作物を植付け、b)  該作物を植付けた土壌に、有効量の請求項８または９に記載のバイオ制御組成物を加え、c)  該作物を繁殖させることを特徴とする作物繁殖中の雑草発生の制御方法。
【請求項１６】
a)  有効量の請求項８または９に記載のバイオ制御組成物を作物種子に加えて処理作物種子を調製し、b)  該処理作物種子を植付け、c)  該作物を繁殖させることを特徴とする作物繁殖中の雑草発生の制御方法。
【請求項１７】
a)  有効量の請求項８または９に記載のバイオ制御組成物を樹立作物に加え、b)  該作物を繁殖させることを特徴とする樹立作物の繁殖中の雑草発生の制御方法。
【請求項１８】
請求項４から７のいずれかに記載のバイオ制御剤を、雑草が繁殖する土壌に適用することを特徴とする雑草発生の制御方法。
【請求項１９】
前記バイオ制御剤が前記１種以上のフォーマ  マクロストマ分離物からの抽出物である、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
請求項８または９に記載のバイオ制御組成物を、雑草が繁殖する土壌に適用することを特徴とする雑草発生の制御方法。
【請求項２１】
前記バイオ制御剤が前記１種以上のフォーマ  マクロストマ分離物である、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記適用処置が、散布、こすり付け、拡散、ドリリング、バンディング、ブロードキャスティング、スプレー、液体注入、流し込みまたは土壌浸漬を含む、請求項１８から２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
請求項４から７のいずれかに記載のバイオ制御剤を雑草に適用することを特徴とする雑草発生の制御方法。
【請求項２４】
請求項８または９に記載のバイオ制御組成物を雑草に適用することを特徴とする雑草発生の制御方法。
【請求項２５】
前記適用処置が散布、こすり付け、拡散、ブロードキャスティング、スプレーまたは流し込みを含む、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
１種以上のカナダアザミからのフォーマ  cf.  マクロストマ分離物とバインダーとを含むことを特徴とする被覆作物種子。
【請求項２７】
１種以上のカナダアザミからのフォーマ  cf.  マクロストマ分離物から得た接種培地または抽出物と、バインダーとを含むことを特徴とする被覆作物種子。
【請求項２８】
前記フォーマ  cf.  マクロストマ分離物が下記からなる群から選ばれる、請求項２６または２７に記載の被覆作物種子：
a)  85-24B  (IDAC  230201-1、2001年2月23日寄託)；
b)  89-25A  (IDAC  110401-1、2001年4月11日寄託)；
c)  94-26  (IDAC  230201-2、2001年2月23日寄託)；
d)  94-44B  (IDAC  230201-3、2001年2月23日寄託)；
e)  94-134  (IDAC  230201-4、2001年2月23日寄託)；
f)  94-359A  (IDAC  110401-2、2001年4月11日寄託)；
g)  95-54A1  (IDAC  230201-5、2001年2月23日寄託)；
h)  95-268B  (IDAC  110401-3、2001年4月11日寄託)；
i)  97-12B  (IDAC  230201-6、2001年2月23日寄託)；および、
j)  97-15B2  (IDAC  110401-4、2001年4月11日寄託)。
【請求項２９】
前記作物が多年生作物である、請求項１０から１７のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
前記多年生作物が芝、多年生緑草および冬季穀物からなる群から選ばれる、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
a)  有効量の請求項４から７のいずれかに記載のバイオ制御剤を加えて処理土壌を調製し、b)  該処理土壌に芝草の種子を植付け、c)  該芝草種子からの芝草を繁殖させることを特徴とする芝草繁殖中の雑草発生の制御方法。
【請求項３２】
a)  芝草の種子を植付け、b)  該芝草種子を植付けた土壌に、有効量の請求項４から７のいずれかに記載のバイオ制御剤を加え、c)  該芝草種子からの芝草を繁殖させることを特徴とする芝草繁殖中の雑草発生の制御方法。
【請求項３３】
a)  有効量の請求項４から７のいずれかに記載のバイオ制御剤を芝草の種子に加えて処理芝草種子を調製し、b)  該処理芝草種子を植付け、c)  該処理芝草種子からの芝草を繁殖させることを特徴とする芝草繁殖中の雑草発生の制御方法。
【請求項３４】
a)  有効量の請求項４から７のいずれかに記載のバイオ制御剤を樹立芝草に加え、b)  該芝草を繁殖させることを特徴とする樹立芝草繁殖中の雑草発生の制御方法。
【請求項３５】
a)  有効量の請求項８または９に記載のバイオ制御組成物を加えて処理土壌を調製し、b)  該処理土壌に芝草の種子を植付け、c)  該芝草種子からの芝原を繁殖させることを特徴とする芝草繁殖中の雑草発生の制御方法。
【請求項３６】
a)  芝草の種子を植付け、b)  該芝草種子を植付けた土壌に、有効量の請求項８または９に記載のバイオ制御組成物を加え、c)  該芝草種子からの芝草を繁殖させることを特徴とする芝草繁殖中の雑草発生の制御方法。
【請求項３７】
a)  有効量の請求項８または９に記載のバイオ制御組成物を緑草の種子に加えて処理緑草種子を調製し、b)  該処理緑草種子を植付け、c)  該処理緑草種子からの芝原を繁殖させることを特徴とする作物繁殖中の雑草発生の制御方法。
【請求項３８】
a)  有効量の請求項８または９に記載のバイオ制御組成物を樹立芝草に加え、b)  該芝原を繁殖させることを特徴とする樹立芝草繁殖中の雑草発生の制御方法。
【請求項３９】
前記バイオ制御剤を雑草発生前の土壌に適用する、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項４０】
前記バイオ制御剤を雑草発生後の土壌に適用する、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項４１】
前記バイオ制御組成物を雑草発生前の土壌に適用する、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項４２】
前記バイオ制御組成物を雑草発生後の土壌に適用する、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項４３】
a)  有効量の請求項４から７のいずれかに記載のバイオ制御剤を加えて処理土壌を調製し；b)  作物の種子を前記処理土壌に植付け、c)  該作物種子からの作物を繁殖させることを特徴とする作物繁殖の増強方法。
【請求項４４】
a)  作物の種子を土壌に植付け、b)  該作物種子を植付けた土壌に、有効量の請求項４から７のいずれかに記載のバイオ制御剤を加え、c)  該作物種子からの作物を繁殖させることを特徴とする作物繁殖の増強方法。
【請求項４５】
a)  有効量の請求項４から７のいずれかに記載のバイオ制御剤を樹立作物に加え、b)  該作物を繁殖させることを特徴とする樹立作物繁殖の増強方法。
【請求項４６】
a)  有効量の請求項４から７のいずれかに記載のバイオ制御剤を作物種子に加えて処理作物種子を調製し、b)  該処理作物種子を植付け、c)  該作物を繁殖させることを特徴とする作物繁殖の増強方法。
【請求項４７】
前記作物が緑草である、請求項４３から４５のいずれかに記載の方法。
【請求項４８】
前記作物が緑草であり、前記作物種子が緑草の種子である、請求項４６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオ除草剤に関する。さらに詳細には、本発明は、真菌系バイオ除草剤および真菌系バイオ除草剤を含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
昆虫類、雑草類および他の疾病有害生物を死滅させるための農薬の使用は、農業において一般的である。カナダの農業者は農薬に7.5億ドル以上を費やしているものと推定されており、米国およびヨーロッパの推定額は、おそらくその数倍も高いであろう。カナダプレイリーにおいては、小麦、大麦、キャノーラおよび亜麻を植付けた土地の95％は、１種以上の農薬で処理されている。しかしながら、大々的な農薬の使用にもかかわらず、雑草類は、毎年カナダのみで、推定10億ドルの作物損害の原因であり続けている。
雑草類は、空間、日光および栄養素に関して作物植物に打ち勝ち得るために、農作物に対して有害である。とりわけ問題のある雑草類としては、カナダアザミ(Cirsium  arvense)、並びに多年生ノゲシ(Sonchus  arvense)およびタンポポ(Taraxacum  officinale)のような他のアスター(Aster)科の１員がある。
カナダアザミは、畑作物、牧草および道路脇における攻撃的な多年生雑草であり、とりわけカナダ西部において蔓延しており、そこでは、全領域の約50％において発生している。カナダアザミは、雑草密度にもよるが、穀物、脂肪種子および豆類作物において約15〜60％の作物収穫量の損失をもたらしている。穀類作物においては、平方メートル当り6〜20本のカナダアザミ植体密度で、穀粒収穫量の18〜30％の損失が生じている。カナダアザミは、カナダ連邦種苗法(Canadian  Federal  Seeds  Act)によって有害雑草に指定されている。
【０００３】
アスター科の雑草、例えば、カナダアザミおよびタンポポは、開花によって繁殖し得るものの、その根系の多さ故に根絶させるのは困難である。それらの根は、全く脆く、耕作中に容易く寸断する。この寸断は、刺激を受けた芽からのより多量の苗条発生をもたらしている。制御の困難性に加え、根断片は、悪条件下において長期間生存するのに十分な肥料蓄積を有する。
畑作物におけるカナダアザミの制御は、現在、上部繁殖を抑制するためまたは根を死滅させるために十分な割合で適用した除草剤による植付け前、栽培期(in-crop)または収穫後の化学制御によって達成されている。例えば、グリホサート(glyphosate)は、カナダアザミを死滅させるための植付け前処理として、あるいはグリホサート寛容性作物の栽培中に使用されている。クロフィラリッド(Clopyralid)は、栽培期制御において使用されて同じ効果を達成しているが、数種の作物においては翌年において残留活性を示すという問題を有する。チフェンスルフロン(thifensulfuron)とトリベヌロン-メチル(tribenuron-methyl)またはフェノキシ-プロップ(fenoxy-prop)とMCPAのような他の製品の併用は、上部繁殖抑制のみを与えている。他の制御選択枝としては、競争力のある作物を繁殖させること、早期に植付けしてカナダアザミが発生する前に活力のある作物繁殖を得ること、および土壌を浅く耕して根の寸断および新たな苗条成長を少なくすることである。また、草刈りも、道路脇、水路、枕地およびフェンス沿いの雑草制御においては採用し得る。耕地全体の代りに数区画の制御も、しばしば、コスト節減のために推奨されている。
【０００４】
上述の欠点以外に、カナダアザミの非化学的制御においては多くの欠点が存在する。先ず、カナダアザミのような雑草に打ち勝つことのできる作物は極めて少数であり、多くの作物は、カナダアザミに対し競合的に優位性を有する作物を得るように十分に早期に植え付けることはできない。さらに、通常よりも早い作物の植付けは、農業者にとって不都合である。また、土壌の浅い耕作並びに雑草を死滅させるためまたは雑草の開花を阻止するための草刈りも、単に一時的な解決法であり、カナダアザミのような雑草の制御においてはせいぜい限界的な効果でしかない。
また、カナダアザミのような雑草類を制御するための化学除草剤の使用においても、幾つかの欠点が存在する。除草剤は、高価であり、農業者の誰もが使用するには高価すぎる。さらに、雑草類を死滅させるのに農業者が必要投与量よりも少量の除草剤を使用した場合、幾つかの雑草が除草剤耐性を発現するリスクが増大する。また、除草剤の使用過多による除草剤耐性のリスクも増大する。しかも、除草剤は、すべての作物およびすべての状況下において使用し得るものではない。例えば、豆類およびレンティルのような作物において使用し得る有効な除草剤は存在しないし、一方、幾つかの栽培期化学除草剤は、雑草類の上部繁殖を抑制するのみで根の繁殖は制御せず、小麦、大麦およびキャノーラのような作物においてしばしば使用される短期的戦略でしかない。また、残留除草剤活性も幾つかの作物において転作を制約し、ある種の農業経営上の除草剤手法は、雑草密度を増大させ得る。また、消費者および環境の双方に対する除草剤の短期および長期安全性についての懸念も存在する。
【０００５】
化学農薬の使用を低減させるという終局の目的による化学有害生物制御製品の代替物を開発することを含む農業食品産業における環境問題は、連邦および州政府による優先事項となっている。農業投入物、スプレー漂流物、農薬残留物、および雑草における除草剤耐性の発現に沿った農薬使用低減についての政府立法に伴う経済的、環境的および社会的コストの上昇により、生物学的制御剤が農業および家庭内使用の双方において雑草制御の魅力的な戦略となっている。
芝地、公園およびゴルフコースのような芝生環境における広葉雑草は、所望の視的均一性を破壊し(即ち、見苦しく)、雑草の無様さと繁殖性向に基づく芝生のメンテナンス問題をもたらし、日光、栄養素および水に対して芝生と競合する。また、雑草類は、その花粉または雑草制御のために適用した薬品に対してアレルギー反応が生ずる場合、人々にとって刺激物である。芝草内の重要な雑草類は、キク科(Compositae)  (タンポポ、ノゲシのような)、ナデシコ科(Caryophyllaceae)  (ハコベのような)、アカネ科(Rubiaceae)、およびヒルガオ科  (Convolvulaceae)に属する。典型的には、芝生内の雑草制御は、種々の時期(植付け前、発生前、および発生後)において施す選択性、非選択性、系統性および接触性除草剤によっている。公園のような公的場所および個人所有芝地における化学除草剤の使用を阻止する公的な圧力は増大しつつあり、例えば、付随定款は、それら除草剤の使用に対して、アルバータ州カルガリーおよびノバスコシア州ハリファックス(共にカナダ)において最近通過している。これらの領域において使用される化学除草剤は、子供、ペット類および高齢者のような集団における感受性群への化学薬品暴露の増大をもたらしている。
【０００６】
多くの細菌類および真菌類は雑草類の天然病原体であり、このことは、化学因子よりもむしろ生物学的因子から調製したバイオ除草剤、即ち、雑草キラーが化学農薬に対する代替物を提供し得ることを示唆している。例えば、米国特許第6,008,159号は、例えば真菌ピレノホラ(Pyrenophora)を使用して１年生雑草を制御することを開示している。米国特許第5,993,802号および第5,472,690号は、それぞれ、低温担子菌(bacidiomycete  fungus)またはミコヘルビシド(mycoherbicide)  (フサリウム  ニバリス(Fusarium  nivalis)およびコレトトリチューム  カラマグラスチジス(Colletotrichum  calamagrastidis)の少なくとも１つまたは双方を含む)の分離物を使用してカルモグロスチス  カナデンシス(Calmagrosis  Canadensis)の繁殖を抑制することを教示している。米国特許第5,952,264号および第5,635,4,44号は、それぞれ、真菌コクリオボルス  インターメヂウス(Cochliobolus  intermedius)、またはクルブラリア(Culvularia)属から選ばれた真菌を使用してヒメシバを制御することを教示している。米国特許第5,747,029号は、真菌ミロテシウム  ベルカリア(Myrothecium  verrucaria)によるシクルポッドウィード(siklepod  weed)類の制御を開示している。米国特許第5,698,491号およびWO  98/08389号は、真菌ダクチラリア  ヒッギンシー(Dactylaria  higginsii)によるハマスゲ草の制御を開示している(WO  98/08389号および米国特許第5,698,491号)。米国特許第4,606,751号は、モロコシ紫斑点病菌(Bipolaris  sorghicola)の胞子によるジョンソン草および同様な雑草の制御を教示している。当該胞子は、水と界面活性剤の溶液中に懸濁させて雑草が繁殖している土地にスプレーしている。米国特許第5,795,845号は、逆生エマルジョン担体と弱または非病原性細菌または真菌である微生物とを含むバイオ除草剤組成物を開示している。この組成物は、ブタクサ、ヒレアザミ、ベルベット  リーフ(velvet  leaf)およびホオズキ(ground  cherry)を制御するのに使用している。米国特許第4,636,386号は、イタリアアザミ制御のためのアルタナリア属(Alternaria)の分離物を開示している。米国特許第5,994,27号は、葉の立ち枯れ病を起させ広葉雑草種を腐敗させてその繁殖を抑制するスクレロチニア  ミノール(Sclerotinia  minor)の分離物であるバイオ除草剤を含む組成物を開示している。このバイオ除草剤は、タンポポ、広葉オオバコ、ブタクサ、セイヨウキズタ、タデ、ノゲシおよびシロツメクサのような広葉雑草類の繁殖を制御するのに使用し得る。
BrebaumとBolandは、タンポポ(Taraxacum  officinale)の病原体としてのフォーマ  エグジグア(Phoma  exigua)およびフォーマ  ヘルバルム(Phoma  herbarum)を開示しているが(1999,Plant  Disease  83:2000)、これらの種を使用した雑草制御活性は報告されていない。
確認した文献において、フォーマ  マクロストマ(Forma  macrostoma)由来の真菌分離物を、カナダアザミ、タンポポ、または他の雑草種の制御用に適するバイオ制御組成物として開示しているものはない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
当該技術においては、雑草類制御用の新規なバイオ除草剤およびバイオ制御組成物が求められている。さらに、当該技術においては、雑草植物、例えば、カナダアザミ、多年生ノゲシ、タンポポ、プレイリーヒマワリ、セイヨウヒルガオ、ソバカズラ、無臭カモミル、クリーバーズ、およびハコベを制御するための新規なバイオ除草剤およびバイオ制御組成物が求められている。さらに、当該技術においては、生物学的制御剤と、雑草の制御に使用する場合に該生物学的制御剤の生存を維持するための増殖培地とを含むバイオ制御組成物が求められている。
本発明の目的は、従来技術の欠点を克服することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上述の目的は、各独立特許請求項の特徴の組合せによって満たされる。各従属特許請求項は、本発明のさらに有利な実施態様を開示している。
本発明は、バイオ除草剤に関する。さらに詳細には、本発明は、真菌系バイオ除草剤、および真菌系バイオ除草剤を含む組成物に関する。
本発明によれば、フォーマ  cf.  マクロストマ(Forma  cf  macrostoma)分離物、その抽出物、その接種培地またはこれらの混合物を、1種以上の広葉雑草にまたはこれらの雑草が繁殖する土壌に投与することを特徴とする1種以上の広葉雑草の制御方法が提供される。
また、本発明は、上記1種以上の広葉雑草が、キク科(Compositae)、ナデシコ科(Caryophyllaceae)、ヒルガオ科(Convolvulaceae)、オーバコ科(Plantaginaceae)およびアカネ科(Rubiaceae)からなる群から選ばれた科の種である、上述の方法にも関する。好ましくは、
上記１種以上の広葉雑草は、カナダアザミ、多年生ノゲシ、タンポポ、無臭カモミル、ヤエムグラ(false  cleavers)、ハコベ、ソバカズラ、オオバコ、プレイリーヒマワリおよびセイヨウヒルガオからなる群から選ばれる。
【０００９】
また、本発明は、1種以上のフォーマ属分離物、その抽出物、その接種培地またはこれらの組合せを含み、これら１種以上のフォーマ属分離物、その抽出物またはその接種培地が雑草制御活性、繁殖増強活性またはその両方を示すことを特徴とするバイオ制御剤にも関する。また、本発明は、当該バイオ制御剤と、上記１種以上のフォーマ属分離物の生存を維持するための培地とを含むバイオ制御組成物にも関する。好ましくは、上記１種以上のフォーマ属分離物は、フォーマ  cf.  マクロストマの分離物である。より好ましくは、上記１種以上のフォーマ属分離物は、下記からなる群から選ばれる：
a)  85-24B  (IDAC  230201-1、2001年2月23日寄託)；
b)  89-25A  (IDAC  110401-1、2001年4月11日寄託)；
c)  94-26  (IDAC  230201-2、2001年2月23日寄託)；
d)  94-44B  (IDAC  230201-3、2001年2月23日寄託)；
e)  94-134  (IDAC  230201-4、2001年2月23日寄託)；
f)  94-359A  (IDAC  110401-2、2001年4月11日寄託)；
g)  95-54A1  (IDAC  230201-5、2001年2月23日寄託)；
h)  95-268B  (IDAC  110401-3、2001年4月11日寄託)；
i)  97-12B  (IDAC  230201-6、2001年2月23日寄託)；
j)  97-15B2  (IDAC  110401-4、2001年4月11日寄託)；および、これらの組合せ。
【００１０】
また、１種以上のフォーマ  cf.  マクロストマ分離物由来の抽出物または接種培地を含むバイオ制御剤も提供する。好ましくは、上記抽出物または接種培地は、下記からなる群から選ばれるフォーマ属分離物から取得する：
a)  85-24B  (IDAC  230201-1、2001年2月23日寄託)；
b)  89-25A  (IDAC  110401-1、2001年4月11日寄託)；
c)  94-26  (IDAC  230201-2、2001年2月23日寄託)；
d)  94-44B  (IDAC  230201-3、2001年2月23日寄託)；
e)  94-134  (IDAC  230201-4、2001年2月23日寄託)；
f)  94-359A  (IDAC  110401-2、2001年4月11日寄託)；
g)  95-54A1  (IDAC  230201-5、2001年2月23日寄託)；
h)  95-268B  (IDAC  110401-3、2001年4月11日寄託)；
i)  97-12B  (IDAC  230201-6、2001年2月23日寄託)；
j)  97-15B2  (IDAC  110401-4、2001年4月11日寄託)；および、これらの組合せ。
本発明は、上記抽出物が、熱死菌大麦接種物、上記フォーマ属分離物のクロロホルム抽出物、上記フォーマ属分離物のメタノール抽出物、および上記フォーマ属分離物の酢酸エチル抽出物からなる群から選ばれ、上記接種培地が、粗接種培地、濾過接種培地または遠心処理接種培地からなる群から選ばれる、上述の方法に関する。
【００１１】
また、本発明は、下記を含むことを特徴とする作物繁殖中の雑草発生の制御方法にも関する：
a)  １種以上のフォーマ  cf.  マクロストマ分離物、その抽出物、その接種培地またはこれらの組合せを含む有効量のバイオ制御剤を土壌に加えて、処理土壌を調製すること、上記１種以上のフォーマ  cf.  マクロストマ分離物、その抽出物またはその接種培地が雑草制御活性を示すこと；
b)  上記処理土壌に、作物を植付けること；および、
c)  上記作物を繁殖させること。
また、本発明によれば、下記を含むことを特徴とする作物繁殖中の雑草発生の制御方法も提供される：
a)  作物を植付けること；
b)  １種以上のフォーマ  cf.  マクロストマ分離物、その抽出物、その接種培地またはこれらの組合せを含む有効量のバイオ制御剤を、作物を植付けた土壌に加えること、上記１種以上のフォーマ  cf.  マクロストマ分離物、その抽出物またはその接種培地が雑草制御活性を示すこと；
c)  上記作物を繁殖させること。
また、本発明は、下記を含むことを特徴とする作物繁殖中の雑草発生の制御方法にも関する：
a)  １種以上のフォーマ  cf.  マクロストマ分離物、その抽出物、その接種培地またはこれらの組合せを含む有効量のバイオ制御剤を作物の種子に加えて、処理作物種子を調製すること、上記１種以上のフォーマ  cf.  マクロストマ分離物、その抽出物またはその接種培地が雑草制御活性を示すこと；
b)  上記処理作物種子を植付けること；および、
c)  上記作物を繁殖させること。
また、本発明には、処理作物種子が、家庭用および特定仕様芝草の種子；チモシー(オオアワガエリ)、ウシノケグサ、イチゴツナギ、多年生ライグラス、スズメノチャヒキ、カナリヤクサヨシ、コヌカグサおよびカモガヤの１種以上の種子を含む動物用牧草または干草の種子混合物のような緑草の種子である、上述の方法も包含される。
本発明の方法は、好ましくは、多年生作物繁殖中の雑草発生を制御するのに使用する。好ましくは、多年生作物は、芝、多年生緑草および冬季穀物からなる群から選ばれる。
【００１２】
また、本発明は、下記を含むことを特徴とする樹立(established)作物繁殖中の雑草発生の制御方法も提供する：
a)  １種以上のフォーマ  cf.  マクロストマ分離物、その抽出物、その接種培地またはこれらの組合せを含む有効量のバイオ制御剤を樹立作物に加えること、上記１種以上のフォーマ  cf.  マクロストマ分離物、その抽出物またはその接種培地が雑草制御活性を示すこと；および、
b)  上記作物を繁殖させること。
また、本発明には、樹立作物が、家庭用および特定仕様の芝草；チモシー、ウシノケグサ、イチゴツナギ、多年生ライグラス、スズメノチャヒキ、カナリヤクサヨシ、コヌカグサおよびカモガヤの１種以上を含む動物用牧草または干草の混合物のような緑草である、上述の方法も包含される。
また、本発明は、作物の繁殖の増強方法にも関し、下記を含むことを特徴とする：
a)  １種以上のフォーマ  cf.  マクロストマ分離物、その抽出物、その接種培地またはこれらの組合せを含む有効量のバイオ制御剤を土壌に加えて処理土壌を調製すること；
b)  上記処理土壌に、作物を植付けること；および、
c)  上記作物を繁殖させること。
また、本発明は、作物の繁殖の増強方法にも関し、下記を含むことを特徴とする：
a)  土壌に作物を植付けること；
b)  １種以上のフォーマ  cf.  マクロストマ分離物、その抽出物、その接種培地またはこれらの組合せを含む有効量のバイオ制御剤を、上記作物を植付けた土壌に加えること；および、
c)  上記作物を繁殖させること。
【００１３】
さらに、本発明は、樹立作物の繁殖の増強方法も提供し、該方法は下記を含むこと特徴とする：
a)  １種以上のフォーマ  cf.  マクロストマ分離物、その抽出物、その接種培地またはこれらの組合せを含む有効量のバイオ制御剤を樹立作物に加えること；および、
b)  上記作物を繁殖させること。
また、本発明には、樹立作物が、家庭用および特定仕様の芝草；チモシー、ウシノケグサ、イチゴツナギ、多年生ライグラス、スズメノチャヒキ、カナリヤクサヨシ、コヌカグサおよびカモガヤの１種以上を含む動物用牧草または干草の混合物のような緑草である、上述の方法も包含される。
また、本発明は、作物の繁殖の増強方法にも関し、下記を含むことを特徴とする：
a)  １種以上のフォーマ  cf.  マクロストマ分離物、その抽出物、その接種培地またはこれらの組合せを含む有効量のバイオ制御剤を作物の種子に加えて、処理作物種子を調製すること；
b)  上記処理作物種子を植付けること；および、
c)  上記作物を繁殖させること。
また、本発明には、上記処理作物種子が、家庭用および特定仕様芝草の種子；チモシー、ウシノケグサ、イチゴツナギ、多年生ライグラス、スズメノチャヒキ、カナリヤクサヨシ、コヌカグサおよびカモガヤの１種以上の種子を含む動物用牧草または干草の種子混合物のような緑草の種子である、上述の方法も包含される。
【００１４】
また、本発明の方法は、１種以上のフォーマ  cf.  マクロストマ分離物、その抽出物、その接種培地またはこれらの組合せ；および上記１種以上のフォーマ  cf.  マクロストマ分離物の生存を維持するための培地を含むバイオ制御組成物の使用にも関する。
また、本発明は、上記バイオ制御剤または組成物を雑草発生の前または後、好ましくは発生前に土壌に適用する、上述の方法のいずれかを提供する。
また、本発明は、上記バイオ制御剤または組成物を、散布、こすり付け、拡散、ドリリング、バンディング、ブロードキャスティング(ばら撒き法)、スプレー、液体注入、流し込みまたは土壌浸漬によって適用する、上述の方法のいずれかを提供する。
本発明は、１種以上のフォーマ属分離物とバインダーを含む被覆作物種子を包含する。また、本発明は、１種以上のフォーマ属分離物から得た抽出物とバインダーを含む被覆作物種子も包含する。被覆する作物種子は、好ましくは、家庭用および特定仕様芝草の種子；チモシー、ウシノケグサ、イチゴツナギ、多年生ライグラス、スズメノチャヒキ、カナリヤクサヨシ、コヌカグサおよびカモガヤの１種以上の種子を含む動物用牧草または干草の種子混合物のような緑草の種子である。
上記の要約は、本発明の必要な特徴のすべてを必ずしも説明していないが、本発明は、説明した特徴の下位の組合せにも存在し得る。
本発明のこれらおよび他の特徴は、添付図面に関連してなされる以下の説明から明らかとなろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明は、バイオ除草剤に関する。さらに詳細には、本発明は、真菌系バイオ除草剤、および真菌系バイオ除草剤を含む組成物に関する。
以下の説明は、例としてのみの好ましい実施態様であり、本発明を有効に実施するために必要な特徴の組合せに限定を加えるものではない。
“雑草繁殖の制御”または“雑草制御活性”なる用語は、１種以上の真菌分離物、その抽出物、その接種培地またはこれらの組合せが、雑草にまたはその近くに適用したとき、雑草の正常な繁殖および発生を干渉すること意味する。雑草繁殖制御活性の例としては、限定するものではないが、根繁殖の抑制、苗条生長の抑制、苗条発生の抑制、雑草生体量の低下、種子形成の抑制、または白化を誘発させるあるいは水、栄養素またはこれらの組合せ(何もなければ、作物植体が利用するであろう)に対する雑草の競争力を低下させる能力がある。また、上記真菌分離物は、雑草を死滅させることによっても雑草を制御し得る。好ましいのは、真菌分離物が雑草繁殖を選択的に制御し、繁殖を望む植物、例えば、農業上重要な植物または住居用または商業的緑草のような非ターゲット植物に対し何ら実質的な作用を有さないことである。
【００１６】
雑草繁殖を制御する、即ち、雑草制御活性を示す真菌分離物は、約20％〜100％の雑草制御係数(WCI)を有することに特徴を有し得る(WCIが高いほど、その真菌分離物は有効である)。WCIは、以下で定義するように、１年生雑草WCI(WCIA)または多年生雑草WCI(WCIP)のいずれかである。好ましくは、真菌分離物は、約50％〜100％のWCIを有することを特徴とする。より好ましくは、真菌分離物は、約70％〜100％のWCIを有することを特徴とする。しかしながら、低いWCIを有する真菌分離物も雑草繁殖の制御を助長するのにまだ有効であることが分っており、非ターゲット植物に1種以上の雑草を凌ぐ競合上の利点を提供することを理解すべきである。さらにまた、低WCIを示す1種以上の真菌分離物を使用して、非ターゲット植物が当該バイオ除草剤によって確実に影響を受けないようにすることも望ましい。
上記雑草制御係数は、下記のような、１年生雑草類の評価のためのWCIAまたは多年生雑草の評価のためのWCIPのいずれかを使用して決定する：
WCIA={[(100−FFW)+(%M)+(%IOC)]/300}×100%
WCIP={[(100−RW)+(100−FFW)+(%M)+(%IOC)]/400}×100%
（式中、RWは、根の重量であり；
FFWは、葉の生体重量であり；
Mは、死滅率であり；そして、
IOCは、格付け3〜6を有する植物体の数によって決定する白化の発生率であり；格付けは次のとおりである：1=正常、暗緑色の葉；2=僅かに黄緑色の葉；3=主として黄色、若干黄緑色の葉；4=主として白色、僅かに黄緑色の葉；5=完全に白色の植物体；6=植物体死滅)。
【００１７】
“真菌分離物”とは、生物学的に活性なフォーマ属種、またはフォーマ属種から得られたまたは分離した生物学的に活性な画分、成分を意味する。真菌分離物の画分または成分とは、真菌類から得られたその菌糸体の画分、または1種以上の胞子、粉胞子、分生子、厚膜胞子またはこれらの組合せを意味する。真菌分離物は、所望の雑草、例えば、限定するものではないがカナダアザミの葉および茎の白化および壊死小病変から、本明細書において説明しているようにして、あるいは当業者にとって公知の標準方法を使用して得ることができる。好ましくは、真菌分離物は、フォーマ  cf.  マクロストマ株である。本発明に従って使用し得、いかなる形でも限定するものではないフォーマ  cf.  マクロストマ分離物の例としては、下記のものがある：
・85-24B  (IDAC  230201-1、2001年2月23日寄託)；
・89-25A  (IDAC  110401-1、2001年4月11日寄託)；
・94-26  (IDAC  230201-2、2001年2月23日寄託)；
・94-44B  (IDAC  230201-3、2001年2月23日寄託)；
・94-134  (IDAC  230201-4、2001年2月23日寄託)；
・94-359A  (IDAC  110401-2、2001年4月11日寄託)；
・95-54A1  (IDAC  230201-5、2001年2月23日寄託)；
・95-268B  (IDAC  110401-3、2001年4月11日寄託)；
・97-12B  (IDAC  230201-6、2001年2月23日寄託)；
・97-15B2  (IDAC  110401-4、2001年4月11日寄託)；および、これらの組合せ。
【００１８】
“抽出物”とは、雑草の近くであるいは雑草に適用したときに雑草繁殖を制御し得る真菌分離物から得られた1種以上の活性化合物を含む粗またはより精製された状態の水または溶媒抽出物を意味する。
“接種培地”とは、雑草繁殖を制御し得る１種以上の活性化合物を含む、本明細書において定義するような1種以上のフォーマ属分離物の培養から得られた培地(実施例５参照)を意味する。接種培地は、当該技術における公知の方法、例えば、限定するものではないが、蒸発、回転蒸発または凍結乾燥によって濃縮し得る。
“飽和”とは、土壌の最大保持能力を意味し、土壌の上層部分内の土壌孔が水で満たされるときに生ずるものとして定義する。“土地能力”または“土地水分能力”とは、飽和させた後で且つ自由排水が本質的に止まった後の2日または3日間土壌内に残存する水の割合を意味する。
“永久しおれ点”とは、植物体がしおれ、暗および湿潤雰囲気に置いたときに膨張を回復できないような土壌の臨界的水分を意味する。
【００１９】
好ましい実施態様においては、真菌分離物は、１種以上の真菌分離物、真菌分離物から得られた１種以上の抽出物、接種培地またはこれらの組合せを含むバイオ制御組成物中で調製し、このバイオ制御組成物を、土壌に加え；堆肥に加え；ピートタイプのペレットに加え；植付け用培地、例えば、限定するものではないが木材チップに加えまたはこの植付け用培地を被覆するのに使用し；バインダー、例えば、限定するものではないがメチルセルロース、澱粉、クレー、砂糖またはこれらの組合せの存在下に、植物の種子を被覆または処理するのに使用し；または植物に適用して、例えば、限定するものではないが植物上にスプレーまたはこすり付けて、雑草を制御する。さらにまた、液体注入を使用しても、1種以上の分離物(例えば、胞子、菌糸体)、真菌分離物から得られた抽出物、接種培地またはこれらの組合せを土壌に適用することができる。液体注入は、多年生用途、例えば、限定するものではないが芝草管理において使用し得る。
“バイオ制御組成物”なる用語は、適切な培地中に本発明の１種以上のバイオ制御剤を含む組成物を意味する。バイオ制御剤は、上記で定義したような１種以上の真菌分離物、その接種培地、その抽出物、またはこれらの組合せからなる。例えば、バイオ制御組成物が真菌分離物を含む場合、その適切な培地は、バイオ制御組成物を土壌に適用する前および適用した後に、真菌分離物の生存を維持するための増殖培地を含み得る。真菌分離物の抽出物、１種以上の真菌分離物またはこれらの組合せを雑草または土壌に投与するのに使用する場合、その適切な培地は、当業者にとって公知であるような安定剤、界面活性剤等を含み得る。例えば、いかなる形でも限定するものではないが、培地は、真菌分離物を生存させたままにし得る限り、補充寒天、ペスタ(pesta)、ピート小球、蛭石、クレー、澱粉、ポテトデキストロース培地(PDB)、V8Rジュース培地；例えば、限定するものではないがレンティルもしくはヒヨコマメのような豆類粒子、または穀物粒子、例えば、小麦、大麦もしくはとうもろこしの粒子全体または粒子断片；またはこれらの任意の組合せもしくは変形を含み得る。
【００２０】
ペスタは、穀粒粉とバイオ制御剤とから調製した粒状製品についての用語である。その方法は、バイオ制御剤をペスタ様生成物いわゆるペスタ中に封入する(Connick等、1991年、該文献は、参考として本明細書に引用する)。そのような培地中で調製した細菌類は、延長された保存および野外安定性を有する(例えば、Connick等、1996年；Connick等、1998年)。これらの特徴は、使用前に保存しあるいは野外での雑草制御において使用する前に長距離輸送され得る製品において望まれるものである。従って、本発明の真菌分離物を含むバイオ制御組成物は、適切な培地、例えば、限定するものではないがペスタ中で調製し得る。
適切な培地が増殖培地である場合、その増殖培地は、本発明の真菌分離物を増殖させるかあるいは生存し得るままにする任意の液体、半液体または固形培地を含み得る。真菌分離物を維持し得る当該技術で公知の任意の増殖培地を使用し得る。適切な増殖培地の例としては、いかなる形においても限定するものではないが、ポテトデキストロース寒天、ポテトデキストロース培地、V8Rジュース培地等がある。好ましくは、増殖培地は、固形培地、例えば、限定するものではないが粒子、例えば、その粒子全体または断片、例えば、限定するものではないが、レンティルもしくはヒヨコ豆のような豆類粒子、または穀物粒子、例えば、小麦、大麦もしくはとうもろこしである(実施例３参照)。また、増殖培地は、有効量の真菌分離物が作物土壌に適切な期間適用後に、例えば、限定するものではないが適用後約7日〜約18ヶ月間まで生存したままであるようにすべきである。真菌分離物は、好ましくは約14日〜約12ヶ月間、より好ましくは約14日〜約90日間生存し得る。土壌への適用においては、胞子、菌糸体(粒子上で増殖中の)、または粒子上で増殖中の胞子と菌糸体を土壌と一緒に混合するか、あるいは土壌上に適当するかもしくは混合し得る。さらにまた、液体注入を使用して、１種以上の分離物、例えば、胞子もしくは菌糸体、真菌分離物から得られた抽出物、またはこれらの混合物を土壌に適用してもよい。好ましい増殖培地上で増殖させた真菌分離物の典型的な適用割合は、限定するものではないが、49〜840ミクロンの粒度および60〜100％の粒子生存度を使用しての0.001kg/m2〜5kg/m2である。好ましい適用割合は、0.1kg/m2〜1.0kg/m2である。しかしながら、雑草制御活性を生ずる任意の適用割合を使用し得る。
【００２１】
１種以上の真菌分離物を固形培地、例えば、裸大麦を使用して適用させる場合、実施例３のようにして調製した感染大麦粒子は、土壌に適用する前に粉砕し得る。任意の適切な粒度、例えば、約50μ〜約1mmを使用し得る。適用において使用する粒子の好ましい生存度は、約60〜100％である。表２０(実施例３)に示すように、粒度が小さいほど、低適用量割合(g/m2)で同等またはより良好な雑草制御活性が達成される。
また、本発明は、２種以上の真菌分離物を使用して雑草を制御することも意図する。同様に、バイオ制御組成物も２種以上の真菌分離物を含み得る。特定の雑草を制御し得る複数の真菌分離物を使用してもよく、あるいは各々が識別可能なタイプの雑草を制御し得る複数の真菌分離物を混合して上述のようにして使用してもよい。また、真菌分離物またはバイオ制御組成物は、雑草制御活性が１種以上のターゲット雑草においては観察されるが非ターゲット植物においては雑草制御活性が観察されない点で、宿主選択性を有することも好ましい。非ターゲット植物の例としては、農業上重要な植物類、および家庭用または商業用緑草(イネ科)がある。
【００２２】
雑草とは、あらゆる望ましくない植物を意味する。好ましくは、雑草は、広葉(双子葉)雑草、例えば、限定するものではないが、キク科、ナデシコ科、タデ科、ヒルガオ科、オーバコ科およびアカネ科の１員である。より好ましくは、雑草は、下記からなる群から選ばれる：
キク科[Compositae  (Composite  family)]：タンポポ(Taraxacum  officinale  L.)；フランスギク(Chrysanthemum  leucanthemum)；ゴボウ類、例えば、普通のゴボウ(Arctium  minus)；ヤマブキショウマ類(例えば、Tragopogon  dubius)；オナモミ類(例えば、Xanthium  strumarium)；ブタクサ類、例えば、普通のブタクサ(Ambrosia  artemisiifolia)またはジャイアントブタクサ(Ambrosia  trifolia)；無臭カモミル(Matricaria  perforata  Merat.)；ノゲシ類、例えば、多年生ノゲシ(Sonchus  arvensis  L.)；およびアザミ類、例えば、カナダアザミ[Cirsium  arvense  L.  (Scop.)]のような；
ナデシコ科[Caryophyllaceae  (Pink  family)]：ハコベ(Stellaria  media  (L.)  Vill.)のような；
タデ科[Polygonaceae  (Buckwheat  Family)]：ソバカズラ(Polygonum  convolvulus  L.)のような；
ヒルガオ科[Convolvulaceae  (Morning  Glory  Family)]：セイヨウヒルガオ(Convolvulus  arvensis  L.)のような；
オーバコ科[Plantaginaceae  (Plantain  Family)]：オオバコ(Plantago  lanceolata)のような；または、
アカネ科[Rubiaceae  (Rubus  family)]：ヤエムグラ(Gallium  spurium)のような。
【００２３】
好ましくは、本発明の真菌分離物、バイオ制御組成物またはその両方は、種子が生長しているかあるいは生長し得る土壌に加える。土壌は、１種以上の真菌分離物が雑草の根系または根断片の極めて近くに存在するように混合し得る。また、真菌分離物が雑草の種子(そのような種子が存在する場合)の極めて近くに存在させることも好ましい。本発明の真菌分離物およびバイオ制御組成物は、土壌または雑草に、当該技術において公知の任意の方法、例えば、限定するものではないが、散布、こすり付け、拡散、ドリリング、バンディング、ブロードキャスティング(混合してまたは混合しないで)、スプレー法、液体注入、流し込みまたは土壌浸漬によって適用し得る。また、本発明の真菌分離物およびバイオ制御組成物は、任意の適切な時期、例えば、限定するものではないが、土壌の耕作中または耕作後に適用し得る。好ましくは、本発明のバイオ制御組成物は、春または初夏に適用させる。真菌分離物単独またはバイオ制御組成物の固形調製物、例えば、限定するものではないが、感染大麦粒子は、約0.1kg/m2〜約5kg/m2の量で土壌に加える。約103〜約109cfu/mLの懸濁液を約1L/m2〜約5L/m2の割合で適用し得る。しかしながら、雑草制御活性を生ずる任意の量を適用し得る。
また、１種以上の真菌分離物から得られた抽出物を配合して、液体として、例えば、スプレー、注入、浸漬、こすり付け、散布により、あるいは適切に配合した抽出物のオートクレーブ処理感染大麦粒子の散布またはこすり付けを含む固形物として土壌または雑草に適用することも、本発明の範囲に属する。当業者であれば決定できるように、適切な投与量は、抽出物または固形物内の活性成分の濃度に依存する。好ましくは、抽出物は、初期容量の約100倍に濃縮した4週間経過粗培地または3：1比の抽出菌糸体対メタノールから得られた抽出物のいずれかに由来する。そのような抽出物の適用割合の例は、限定するものではないが、活性成分の濃度によって約0.1〜約2.5L/m2である。しかしながら、雑草制御活性を生ずる任意の量を適用できる。
【００２４】
1種以上の真菌分離物、1種以上の真菌分離物から得られた抽出物、接種培地またはこれらの組合せを含む本発明のバイオ制御剤またはバイオ制御組成物は、植付け用培地、例えば、堆肥に加えることができ、あるいは別の植付け用培地、例えば、限定するものではないが、当業者にとっては自明である木材チップ、造園布地、蛭石等に加えあるいはこれらを被覆するのに使用することができる。さらにまた、本発明のバイオ制御剤またはバイオ制御組成物は、植物の種子を被覆または処理するのに使用し得る。被覆種子は、バインダー、例えば、限定するものではないが、メチルセルロース、澱粉、クレー、砂糖またはこれらの組合せの使用を含む。
従って、本発明によれば、１種以上の真菌分離物を含むバイオ除草剤、または1種以上の真菌分離物、真菌分離物から得られた1種以上の抽出物、接種培地もしくはこれらの組合せを含むバイオ制御剤またはバイオ制御組成物によるある範囲の雑草の制御方法が提供される。雑草繁殖を制御するのに使用し得る真菌分離物またはそれらの組合せを、限定するものではないが、下記の表１に列挙する。
【００２５】
0004597483.tif 000002
【００２６】
下記の表２(関連プロトコールについては実施例２参照)においては、１例として、ある範囲の真菌分離物によるカナダアザミにおける葉生体重量の低下、根重量の低下、白化または死滅率によって指標されるような雑草制御活性を示している。
0004597483.tif 000003
【００２７】
表２から、幾つかの真菌株、例えば、限定するものではないが、85-24B、94-26、94-44B、94-134、95-54A1、97-12B、95-268Bおよび97-15B2が、未接種対照に比較して、カナダアザミにおいて葉生体重量を約40％〜約92％低下させ且つ根重量を約47％〜約85％抑制し得ることに注目し得る。これらの真菌分離物は、約47〜88％のWCIPを有することを特徴とし、雑草繁殖の制御において有効であり、このことは、植物体の約80％までが上記処理によって死滅するという観察によって裏打ちされている。真菌分離物89-25Aおよび94-359Aも、葉生重量、根重量の抑制において有効であり、約30〜32％のWCIPを示している。
従って、本発明は、真菌分離物85-24B、94-26、94-44B、94-134、95-54A1、97-12B、89-25A、94-359A、95-268B、97-15B2、またはこれらの組合せを含むカナダアザミ制御用のバイオ除草剤に関する。
図１においては、カナダアザミにおける真菌分離物85-24Bを含む接種物懸濁液の効果を示している。図１は、カナダアザミに対する損傷は接種物レベルが高いほど大きいことを例証している。約5g/0.01m2〜約50g/0.01m2の範囲またはそれ以上の投与量がカナダアザミを制御し得ている。同様な結果は、感染大麦粒の粒子を土壌に適用することによっても観察された。
理論によって拘束することは望まないが、本発明の真菌分離物は、植物の繁殖および発生に関連する過程、例えば、光合成、即ち、根における貯蔵産生物の蓄積に影響を与え、苗条発生を低下させ、根の生長を低下させ、白化症状(植物葉の黄変化)を誘発させることによって、カナダアザミまたは以下で説明するような他の1年生または多年生雑草類を衰弱させる能力を有し得る。
【００２８】
本発明の幾つかの真菌分離物の雑草制御活性の特性決定によれば、真菌分離物の雑草制御活性は、その真菌分離物の土壌または植物への適用時期にもよるが、およそ１繁殖シーズン持続し得ることが示唆されている。表１８(実施例３)においては、真菌分離物の春または夏の適用が１以上の繁殖シーズンに亘って雑草制御活性を発揮することを示している。秋の適用においては、雑草制御活性は観察されなかった。さらにまた、表１９(実施例３)において示すように、雑草制御活性は、土壌水分含有量が高いほど増大している。
また、多くの真菌分離物を試験して、カナダアザミ以外の雑草類、例えば、多年生ノゲシ(Sonchus  arvense)、プレイリーヒマワリ(Helianthus)、タンポポ(Taraxacum  officinale)、無臭カモミル(Matricaria  perforate)のようなアスター科のメンバー、並びにハコベ(Stellaria  media)、野生カラスムギ、グリーンフォックステール、およびヤエムグラ(Gallium  spurium)のような他の植物の制御における有効性を測定した。
真菌分離物85-24B、89-25A、94-26、94-359A、94-44B、94-134、95-54A1、95-268B、97-15B2および97-12Bを、実施例２に記載する接種物マットバイオアッセイを使用して、多年生ノゲシに適用した。図２に示すように、真菌分離物94-44B、94-26、95-54A1および97-12Bは、温室試験において、未接種対照に比較して根の重量を低下させていた。同様な根重量の低下は、実施例２の表８において示されているように、殆どの他の真菌分離物においても観察された。さらに、真菌分離物94-44Bは、対照に比較し、葉生体量を有意に低下させ(図３)、苗条発生を低下させていた(図４)。３種の分離物(94-44B、89-25Aおよび97-12B)は、図５および表８において示すように、雑草の死滅率を増大させていた。
従って、真菌分離物94-44B、89-25A、94-26、95-54A1および97-12Bは、多年生ノゲシ(Sonchus  arvense)の制御において使用し得る。好ましい実施態様においては、94-44Bを含む真菌分離物またはバイオ制御組成物を多年生ノゲシの制御に使用する。
【００２９】
上記各真菌分離物の効果についての同様な結果は、例えば、表３(実施例２も参照のこと)に示すようなある範囲の雑草種のWCIを測定することによって例証されているように、多年生および１年生雑草双方の他の雑草類においても観察された。
0004597483.tif 000004
【００３０】
従って、本発明は、真菌分離物85-24B、94-26、94-44B、94-134、95-54A1、97-12B、  89-25A、94-359A  95-268B、97-15B2、またはこれらの組合せを含み、１年生および多年生双方の任意の感受性雑草制御用のバイオ除草剤に関する。好ましくは、雑草は広葉雑草である。より好ましくは、これらの広葉雑草は、キク科、ナデシコ科、タデ科、オーバコ科、アカネ科またはヒルガオ科に由来し、例えば、限定するものではないが、無臭カモミル、ヤエムグラ、ハコベ、ソバカズラ、セイヨウヒルガオ、多年生ノゲシ、タンポポ、およびカナダアザミである。
接種物マットバイオアッセイ(実施例２に概略する方法)を使用して、多くの真菌分離物を、それらのヒマワリ(Helianthus)雑草を制御する能力について測定した。種子の発芽は真菌分離物85-24Bによって影響を受け、ヒマワリ発芽は約10％低下した。5種の真菌分離物(85-24B、94-44B、89-25A、95-54A1、97-15B2)は、プレイリーヒマワリにおいて葉の生体量を低下させた(表１０(B)、実施例２も参照のこと)。即ち、真菌分離物85-24B、94-44B、89-25A、95-54A1、97-15B2は、プレイリーヒマワリを制御するのに使用し得る。
また、本発明のこれらの真菌分離物および真菌分離物を含むバイオ制御組成物は、雑草植物のターゲット群、例えば、アスター(キク)科の雑草類に対して特異性であることも観察した。一般に、本発明の真菌分離物は、緑草類、例えば、野生カラスムギおよびグリーンフォックステールの繁殖を制御するには有効ではない(それぞれ、表１２および１３参照)。しかしながら、94-44Bは野生カラスムギにおいて雑草制御活性を示し、85-24Bと95-359Aはグリーンフォックステールにおいて雑草制御活性を示している(WCIの要約についての表１７および実施例２参照)。
【００３１】
また、本発明の真菌分離物は、高接種物負荷量(野外条件下において使用する量よりも有意に高い)においてさえも、作物植物においては分離物が無視し得る疾病症状しか示し得ない(あるいは全く示し得ない)点で、選択性を有する(表２２および２３、実施例４参照)。試験した作物植物の例は、下記のとおりである：
1)  穀物および他の単子葉植物
小麦(栽培種)：カテプワ(Katepwa)、AC  ドメイン(Domain)、
AC  カーマ(Karma)、ビッガー(Biggar)、キール(Kyle)
大麦(栽培種)：ハーリントン(Harrington)、シルキー(Silky)
カラス麦(栽培種)：ダービー(Derby)またはウォルデン(Walden)
雑穀(栽培種)：ミンコ(Minco)またはプレイリーゴールド(Prairie  Gold)
カナリア草の実(栽培種)：キート(Keet)
2)  脂肪種子作物
キャノーラ(栽培種)：AC  エクセル(Excel)、AC  パークランド(Parkland)
マスタード(栽培種)：カットラス(Cutlas)、オクレ(Ochre)
亜麻(栽培種)：ヴィミー(Vimy)
ヒマワリ(栽培種)：カーギル(Cargill)  SF270またはIS7111
紅花(栽培種)：レトブリッジ(Lethbridge)
3)  豆類作物
レンティル(レンズ豆)  (栽培種)：ライード(Laird)、エストン(Eston)
えんどう豆(栽培種)：エクスプレス(Express)
ヒヨコマメ(栽培種)：サンフォード(Sanford)
そら豆(栽培種)：CDC  ファティマ(Fatima)
4)  飼料作物
クローバー類：
イエロークローバー(栽培種)：ノルゴールド(Norgold)
ホワイトクローバー(栽培種)：ポララ(Polara)およびソンジャ(Sonja)
普通クローバー
レッドクローバー(栽培種)：アルタスウェド(Altaswede)またはフロレックス
(Florex)
鳥用飼料シロツメグザ(栽培種)：クリー(Cree)
アルファルファ(栽培種)：ビーバー(Beaver)
【００３２】
例えば、いかなる形でも限定するつもりはないが、94-44Bは、高接種物負荷量においても疾病症状が観察されていないので、穀物作物における使用に適している。しかしながら、高接種物負荷量での94-44Bの使用は、豆類作物における使用には、豆類作物がこれらの条件下においてはある種の疾病症状を示すので望ましくない。低めの94-44B接種物負荷量を使用する場合には、豆類における疾病症状は最小化され、この真菌分離物は豆類作物において使用し得る。低減された接種物負荷量においても、これらの分離物は、依然として雑草制御活性を示している。当業者であれば、投与量を調整して、雑草制御活性の獲得と非ターゲット作物、即ち、農業上または商業上重要な作物における疾病症状の回避との均衡を最適にし得るであろう。
また、本発明は、本発明の１種以上の真菌分離物に由来する接種培地または抽出物の使用も意図する。実施例５に記載しているように、本発明の１種以上の真菌分離物から得られ、適切な培地(例えば、限定するものではないが、水またはメタノール)中で再構築された接種培地(濃縮接種培地のような)、水系または溶媒抽出物は、土壌または植物の葉に適用されて、雑草制御活性を示し得る。また、本発明の接種培地または抽出物を雑草制御剤としての化学除草剤または非フォーマ属分離物を含む真菌分離物と併用することも意図される。
また、本発明は、１種以上のフォーマ  cf.  マクロストマ分離物、その抽出物、その接種物培地またはこれらの混合物の、例えば表１８A(実施例３)に例示しているような、樹立中または樹立した作物、例えば、上述したような、限定するものではないが、家庭用および特定仕様の芝草；チモシー、ウシノケグサ、イチゴツナギ、多年生ライグラス、スズメノチャヒキ、カナリヤクサヨシ、コヌカグサおよびカモガヤの１種以上を含む動物用牧草または干草混合物のような緑草の繁殖中の雑草発生を制御するための使用方法も意図する。
【００３３】
さらに、本発明は、１種以上のフォーマ  cf.  マクロストマ分離物、その抽出物、その接種物培地またはこれらの混合物の、例えば表１８A(実施例３)、２１(C)および２１(D)(実施例３)に例示しているような、樹立中または樹立した作物、例えば、上述したような、限定するものではないが、家庭用および特定仕様の芝草；チモシー、ウシノケグサ、イチゴツナギ、多年生ライグラス、スズメノチャヒキ、カナリヤクサヨシ、コヌカグサおよびカモガヤの１種以上を含む動物用牧草または干草混合物のような緑草の繁殖(例えば、生体量を増大している)を増強するための使用方法も意図する。
また、本発明は、１種以上のフォーマ  cf.  マクロストマ分離物、その抽出物、その接種物培地またはこれらの混合物の、雑草発生前または後に葉スプレー適用によって樹立中または樹立した作物の繁殖中の雑草発生を制御するための使用も意図する。当該作物は、例えば、表２１(D)  (実施例３)に例示するような、上述したような、限定するものではないが、家庭用および特定仕様の芝草；チモシー、ウシノケグサ、イチゴツナギ、多年生ライグラス、スズメノチャヒキ、カナリヤクサヨシ、コヌカグサおよびカモガヤの１種以上を含む動物用牧草または干草混合物のような緑草であり得る。
真菌分離物と組合せた本発明の接種物培地または抽出物の適用は、分離物そのままの適用に比較して、急速な形で雑草制御活性を示す。理論によって拘束することは望まないが、接種物培地または抽出物は、真菌分離物の増殖およびそれに伴う雑草制御活性を得る前の増殖中の真菌分離物からの１種以上の化合物の産生のための条件が存在しないので、より急速な形で機能し得る。そのような組合せ適用は、急速且つより一貫した雑草制御活性を、抽出物-分離物または接種物培地-分離物混合物への植物の暴露中に与える。
【００３４】
また、本発明は、真菌分離物または真菌分離物と１種以上の化学除草剤との任意の組合せの使用も意図する。さらに、本発明は、本発明の１つの真菌分離物または複数の真菌分離物を１種以上の化学除草剤および真菌分離物の生存を維持するための増殖培地と一緒に含むバイオ制御組成物も意図する。また、本発明は、真菌分離物または真菌分離物と１種以上の非フォーマ属真菌株との任意の組合せも包含する。さらに、本発明は、本発明の真菌分離物または複数の非フォーマ属真菌分離物を１種以上の除草剤および真菌分離物の生存を維持するための増殖培地と一緒に含むバイオ制御組成物も意図する。
以上の説明は、特許請求する本発明をいかなる形でも限定するものではない。さらにまた、説明した特徴の組合せは、本発明の解決において絶対的必要なものではあり得ない。
【００３５】
本発明を以下の実施例においてさらに具体的に説明する。しかしながら、これらの実施例は、単に例示を目的とし、本発明の範囲をいかなる形でも限定するのに使用してはならないと理解すべきである。
【実施例１】
【００３６】
真菌分離物の分離、保存および増殖
真菌分離物
各真菌株は、畑、牧場および道路脇から集めたカナダアザミ植物体の葉および茎組織の白化および壊死病変部から分離した。植物体組織から分離した精製真菌を確認して、コッホの条件(Koch’s  postulates)を使用して疾病を生じさせた。
0004597483.tif 000005
【００３７】
真菌分離物の分離
上述のようにして得た各真菌分離物を0.5％次亜塩素酸ナトリウム中で2分間表面滅菌し、滅菌蒸留水で洗浄し、Difco  PDA  (ポテトデキストロース寒天)プレート上で12時間の照光下に24℃で3〜7日間放置する。組織からの増殖中の各真菌を、それぞれ、新鮮培地に移し、増殖成熟させる。各分離物を切取った葉のバイオアッセイによるコッホの条件を使用して病原性についてスクリーニングする。カナダアザミから新しく切取った葉を表面滅菌し、ガラスペトリ皿内の湿ったWhatman  #3濾紙上に置く。精製真菌培養物からの寒天プラグを各々の葉の中央に置き、ペトリ皿を密閉して水分損失を防止し、上述のようにインキュベートする。疾病症状の発症を観察する。各精製病原性培養物の複数のコピーを後述するような低温保存収納室内に置く。
各精製真菌培養物は、10％脱脂粉乳(質量/容量)溶液対40％グリセリン(容量/容量)溶液の1：1混合物を使用しての−78℃での胞子および菌糸体の低温保存によって保存する。
下記の10種の真菌培養物は、オランダのCBSにより、フォーマ  cf.  マクロストマ  モンターニュとして同定され、IDACに下記のように寄託した：
・85-24B  (IDAC  230201-1、2001年2月23日寄託)；
・89-25A  (IDAC  110401-1、2001年4月11日寄託)；
・94-26  (IDAC  230201-2、2001年2月23日寄託)；
・94-44B  (IDAC  230201-3、2001年2月23日寄託)；
・94-134  (IDAC  230201-4、2001年2月23日寄託)；
・94-359A  (IDAC  110401-2、2001年4月11日寄託)；
・95-54A1  (IDAC  230201-5、2001年2月23日寄託)；
・95-268B  (IDAC  110401-3、2001年4月11日寄託)；
・97-12B  (IDAC  230201-6、2001年2月23日寄託)；および、
・97-15B2  (IDAC  110401-4、2001年4月11日寄託)。
【００３８】
真菌分離物の培養および保存
125  mLのポテトデキストロース培地(PDB)またはV8Rジュース培地(Dhingra,  O.D.,  and  Sinclair,  J.B.  1995,  Basic  Plant  Pathology  Methods,  Second  Edition,  CRC  Press  Inc.,  Boca  Raton,  FL.)を含む各フラスコに、1  x  105分生子/Lで接種し、シェーカー(150rpm)上で、周囲温度条件(20℃)下において最低7〜14日間、好ましくは14〜28日間インキュベートする。その後、各フラスコの内容物を真空濾過して胞子と菌糸体を分別した。分生子濃度と菌糸体の新鮮重量を測定する。
各真菌は、固形または液体培地において増殖させ得る。固形培地培養においては、すべての真菌分離物を培地1リットル当り3mlの85％乳酸を加えたDifcoポテトデキストロース寒天(PDA；製造業者の指示書に従って調製した)上で増殖させる。低温保存から取出した１バイアルの真菌培養物を室温に解凍し、内容物を、3枚以上の調製したプレート上に流し込みまたはピペット操作によって無菌的に分布させる。接種物を各プレートの表面上で無菌ガラスホッケースティックを使用して拡散させる。各寒天プレートを、室温の実験台上または12時間照光(20W冷白色蛍光球)による23/18℃のインキュベーター内のいずれかで1〜2週間インキュベートする。
液体培地培養においては、125mlのDifco  PDBを500mlのエーレンマイヤーフラスコに入れる。このフラスコを胞子懸濁液または寒天プラグのいずれかと一緒にインキュベートする。胞子懸濁液においては、成熟Difco  PDAプレートに滅菌蒸留水を溢れさせ、胞子を無菌ガラスホッケースティックによって穏やかに取出す。胞子懸濁液を1×106胞子/mlの濃度に希釈し、次いで、1mlの希釈胞子液を各フラスコの液体培地に加える。液体培地に寒天プラグで接種するためには、5〜8mm直径の寒天プラグをDifco  PDAプレート上の成熟培養物から採取する。接種した各フラスコをベンチトップシェーカー上で150rpmにて2週間周囲光および温度条件下においてインキュベートする。
液体培養物からの菌糸体(10g)を20mLの5％脱脂粉乳：20％グリセリン低温保存溶液中に入れ、均質化する。各サンプルを凍結し、−18℃と−73℃で30日間保存し、均質化直後に調製した対照と比較する。30日間の保存後、生存度を、500μLの懸濁液を1/2強度のPDAプレート上に拡散させ、4日間インキュベートし、菌糸体増殖および分生子産生を評価することによって測定する。１例として、PDBまたはV8Rジュース培地中で増殖させ−18℃または−73℃で1ヶ月間保存した後の真菌分離物85-24Bの生存度において損減は無かった。
【実施例２】
【００３９】
各真菌分離物を使用しての雑草繁殖の制御
雑草制御における投与量の効果
各真菌分離物をPDAおよび乳酸上で10〜14日間増殖させる。各真菌と一緒に培養した寒天プレートを50g(寒天プレート全体に等しい)、10g、5g、2.5gおよび0g(対照)の投与量として秤量し、次いで、滅菌蒸留水で解離させ、各接種物懸濁液投与量を最終の50mL容量とする。例として、85-24Bを試験する。
根を適切な長さに切断し(例えば、カナダアザミの根は10cmの長さである)、秤量し、土壌を充填した10cm四方の植木鉢に入れる。投与量の接種物懸濁液を根の表面上に注ぎ込み、1cmの土壌で覆い、飽和点まで水掛けをし、温室(日中20℃、夜間15℃；16時間日光)入れる(6個の複製)。植物を、苗条発生、白化および死滅について2週間、4週間および6週間で格付けする。6週間で、根を収穫し秤量する。分離物85-24Bを使用したこの試験の結果を図１に示す(格付け度は、1=正常、暗緑色の葉；2=僅かに黄緑色の葉；3=主として黄色、若干黄緑色の葉；4=主として白色、僅かに黄緑色の葉；5=完全に白色の植物体；6=植物体死滅である)。
これらの結果は、本発明の真菌分離物が雑草繁殖を制御し得ること、およびこの効果は根への投与接種物量が増大するにつれてより顕著であることを例証している。
【００４０】
接種物マットバイオアッセイ
根を水道流水で1時間洗浄して過剰の土壌を除去し、各々の長さが少なくとも1個の莟みを有する10cmの長さに切断する。複製において使用するすべての植木鉢において同じような根重量を持たせた2〜10cm長の根の重量を記録する。2週間経過後の接種寒天プレートは、根切片上で裏返しにする。対照は、真菌を接種しなかった寒天プレートである。寒天プレートと根を2〜3cmの土壌混合物で覆い、各植木鉢を20/15℃および自然光の温室に入れる。根接種後2週間、4週間および6週間での苗条または植物体の総数、死滅苗条または植物の数、または症状(即ち、白化、壊死および病変)を有する植物体の苗条の総数を記録する。6週間後、葉生体量と根重量を測定した。データを幾つかのパラメーターについて分析した：
i)  ％根生長[処理の最終根重量/処理の出発根重量]÷[対照の最終根重量/対照の出発根重量]×100；
ii)  葉生体量
iii)  対照に対する％としての苗条発生率；および、
iv)  症状を有する苗条の％。
カナダアザミの繁殖および発生における本発明の幾つかの真菌分離物の効果を下記の表５に示す。
【００４１】
0004597483.tif 000006
表５の結果は、各分離物が、土壌に適用したとき、雑草制御活性において、例えば、カナダアザミの繁殖と発生の制御に有効であることを例証している。
【００４２】
A)  カナダアザミ制御における各真菌株の比較
接種物マットバイオアッセイを使用し、ある範囲の真菌分離物を、雑草としてカナダアザミを使用して、雑草制御活性について試験した。
カナダアザミの繁殖と発生に対する幾つかの真菌分離物の効果の上記バイオアッセイを使用しての結果を、下記の表６に示す。
0004597483.tif 000007
これらの結果は、ある範囲のフォーマ属分離物がカナダアザミにおける根重量、葉生体量、白化および死滅率に負のインパクトを有し、カナダアザミの繁殖と発生の制御に使用し得ることを例証している。
【００４３】
上記の結果を平均した(表７)。これらの結果は、ある範囲の真菌分離物が、WCIPが20％よりも高い点で、雑草制御活性を示すことを示唆している。
0004597483.tif 000008
【００４４】
B)  ある範囲の植物における各真菌株の雑草制御活性の比較
数種の１年生および多年生雑草類並びに他の植物に対するある範囲の真菌分離物の雑草制御活性を、上記マットバイオアッセイを使用して試験した。試験した植物体は、下記のとおりである：
多年生ノゲシ：              表８
タンポポ：                  表９
無臭カモミル：              表１０(A)
プレイリーヒマワリ：        表１０(B)
ヤエムグラ：                表１１
野生カラスムギ：            表１２
グリーンフォックステール：  表１３
ハコベ：                    表１４
ソバカズラ：                表１５
セイヨウヒルガオ：          表１６
オーバコ：                  表１６(A)
WCIの要約                  表１７
表８〜１７においては、下記の頭字語を使用している：
RW  =  根重量；
FFW  =  葉の生体重量；
IOC  =  白化の発生率；
WCIP  =  多年生雑草制御係数  (WCIP  %  =  {[(100‐根重量)  +  (100‐葉生体重量)  +  (%死亡率)  +  (%白化発生率)]÷400}×100%；
WCIA  =  １年生雑草制御係数  (WCIA  =  {[(100‐葉生体重量)  +  (%死滅率)  +  (%白化発生率)]÷300}×100％)；
集計S.E.  =  各分離物と対照間の平均集計標準偏差。
【００４５】
0004597483.tif 000009
【００４６】
0004597483.tif 000010
【００４７】
0004597483.tif 000011
【００４８】
0004597483.tif 000012
【００４９】
0004597483.tif 000013
【００５０】
0004597483.tif 000014
【００５１】
0004597483.tif 000015
【００５２】
0004597483.tif 000016
【００５３】
0004597483.tif 000017
【００５４】
0004597483.tif 000018
【００５５】
0004597483.tif 000019
【００５６】
0004597483.tif 000020
【００５７】
集合的に、これらの結果は、ある範囲フォーマ  マクロストマ分離物が雑草繁殖を選択的に制御するのに有効であることを例証している。これらの分離物は、オーバコ科、例えば、オーバコ；キク科、例えば、無臭カモミル、タンポポ、多年生ノゲシ、ヤエムグラ、およびカナダアザミ；ナデシコ科、例えば、ハコベ；タデ科、例えば、ソバカズラ；ヒルガオ科、例えば、セイヨウヒルガオのような広葉雑草類の雑草制御に有効である。フォーマ  マクロストマは、イネ科雑草、例えば、野生カラスムギおよびグリーンフォックステールの雑草制御活性を示さず、従って、緑草類中の広葉雑草の制御に使用し得る。
【実施例３】
【００５８】
雑草制御活性の特性決定
裸大麦バイオアッセイ
真菌分離物を接種するための大麦を調製するために、裸大麦、例えば、限定するものではないが、品種CDCシルキー大麦を蒸留水中に浸漬する。過剰水を水切りし、121℃で45分間合計3回オートクレーブ処理する。オートクレーブ処理後、冷却したときの各フラスコに接種する。
接種物懸濁液を調製するためには、2週間経過寒天培養プレートを広口ビン中に滅菌蒸留水と共に入れ、抗生剤原液(ストレプとミシンおよびバンコマイシン)を添加し、寒天抗生剤混合物を均質化する。
滅菌大麦粒子の容器の各々に上記の均質化接種物懸濁液を接種し、周囲実験条件下において2週間インキュベートする。インキュベーション後、容器から大麦を取出し、感染粒子をトレー上の薄層中に拡散させて周囲室温条件下に4日間乾燥させる。乾燥粒子をミル(即ち、Arther  H.  Thomas社)で粉砕する。粉砕した接種物は、室温で3ヶ月間までは保存でき、あるいはより長時間冷凍保存できる。対照は、同じ方法で処理した未接種滅菌粒子からなる。粉砕接種物の生存度は、PDAプレート上に25粒を撒き、3日後のコロニー生長を有する粒子数および7日後の元の真菌分離物に似たあるいは汚染物であるコロニー数を記録することによって測定する。
上記バイオアッセイを実施するには、正常な根を10cm長のセグメントに切断し、各根セグメントが少なくとも1個の莟みを確実に有するようにする。洗浄した各根セグメントを秤量し植木鉢当り2本入れる。粉砕接種物を根および土壌表面上に、例えば、約5g(他の投与量も使用し得る)均一にばら撒き、2〜3cmの土壌混合物で覆い、各植木鉢を温室内入れる。根接種後の2週間、4週間および6週間での苗条の総数、死滅した苗条または植物体数、症状(即ち、白化、壊死、病変)を有する苗条または植物体の総数を記録する。また、6週間で集め、洗浄し、植木鉢内に残存している根の生体重量および葉組織の生体重量も記録する。データは、幾つかのパラメーターについて分析する：
i)  ％根生長(即ち、[処理の最終根重量/処理の出発根重量]÷[対照の最終根重量/対照の出発根重量]×100)；
ii)  葉生体量
iii)  対照に対する％としての苗条発生率；および、
iv)  症状を有する苗条の％。
【００５９】
A)  適用の持続性
本発明の真菌分離物の単独適用のその後の年数に亘っての有効性を測定するために、真菌分離物サンプル(上述したように調製した裸大麦接種物)を、1kg/m2の割合で(50〜840μの粒度範囲；下記の表２０参照)、繁殖シーズン内の3つの異なる時期に土壌に適用した：即ち、春後期(カナダアザミの発生時)；夏中期；および秋。各試験区画に残存するカナダアザミ数を２繁殖シーズンに亘って検証した。この試験の結果を表１８に示す。
【００６０】
0004597483.tif 000021
これらのデータは、本発明の真菌分離物の単独適用が１以上の繁殖シーズンに亘って雑草制御活性を発揮するのに有効であることを例証している。雑草制御活性は、接種物を春または夏に適用した場合に最大であり、秋に適用した場合には低下する。
【００６１】
芝生における雑草制御活性
種子からの芝生樹立中または以前に樹立した多年生芝中での雑草制御における本発明の真菌分離物の単独適用の有効性を測定するために、真菌分離物サンプル(上述したように調製した裸大麦接種物)を、250〜1000g/m2の割合で(50〜840μの粒度範囲；下記の表２０参照)、土壌に春適用した。接種物、芝の種子および雑草の種子は、この野外試験を開始する前に秤量した。芝草の“過剰播種(Overseeding)”混合物を、1/4m2当り5.7g  (1エーカー当り200ポンド)で適用した。当該混合物は、40％の多年生ライムギ(Manhattan  IIIおよびCalypso  II)、25％のケンタッキーブルーグラス(Quantum  LeapおよびAlene)、15％のチューイングス  フェスキュー(Chewings  Fescue)、10％のクリーピング  レッド  フェスキュー(Creeping  Red  Fescue)、10％のポア  トリヴィアリス(Poa  trivialis)  Lを含有していた。この量から、10％の雑草混合物(5％のタンポポ種子および5％のハコベ種子)が1/4m2当り0.6gであると算出された。接種分離物を適用量に従って秤量した。播種芝地野外試験の準備は、土壌を回転耕作し、次いで、苗床を1  m2の合板片上で踏付けることによって強固に固めることであった。平滑でない面は、かき均し再度固めた。各1/4m2区画を固めた面の中心に設けた。芝種子、雑草種子および接種物を上部にばら撒き、2方向に手で均した。その後、5m長の畝カバーを各区画の上に２週間置き、この間、各区画に、丁度表面を湿らせるに十分で且つ発芽中に緑草種子が乾し上がらないように毎日水掛けを行った。以前から樹立している芝においては、芝が20年以上繁殖している面内に各1/4m2区画を設けた。雑草種子および接種物を表面にばら撒き、2方向に手で均した。各区画を表面の湿りを保つには十分であるが接種物が水によって流出するには十分でないように2週間毎日水掛けを行った。各試験区画のタンポポおよびハコベの植体数を繁殖シーズンに亘って測定した。生体量は、草目のグラム数での生体重量として測定した。この試験の結果を表１８Aに示す。
【００６２】
0004597483.tif 000022
これらの結果は、芝地樹立中および樹立芝地内でのタンポポおよびハコベの制御を例証している。また、これらの結果は、緑草繁殖を増強させるための85-24Bの使用も示唆している。
【００６３】
B)  土壌水分および気温
さらなる試験により、接種物として裸大麦(上述参照)を使用して、幾つかの真菌分離物の雑草制御活性に対する土壌水分と温度の効果を検証する。これらの試験においては、日中20℃または日中30℃に沿った3点の土壌水分条件(飽和、土地能力および永久しおれ点)を考慮した。これら試験の結果を表１９に示す。
【００６４】
0004597483.tif 000023
これらの結果は、土壌水分または温度のいずれかが高いほど良好な雑草制御活性が得られていることを例証している。
【００６５】
C)  適用方法
真菌分離物の適用方法も検証した。この試験は、裸大麦接種物または液体接種物の適用の結果としての雑草制御活性を考慮した。裸大麦においては、粒度と感染大麦の投与量応答性を試験した(表２０参照)。液体接種物においては、菌糸体均質物(2種の堆肥、即ち酪農堆肥、または養豚-養鶏堆肥と混合した)の雑草制御活性効果を試験した(表２１)。
オートクレーブ処理大麦を前述したような真菌接種物の調製に使用した。接種滅菌大麦粒子を周囲実験条件下に2週間インキュベートし、乾燥させ、ミル(即ち、Arther  H.  Thomas社)で粉砕した。対照は、同じ方法で処理した未接種滅菌粒子からなる。粉砕接種物の生存度は、PDAプレート上に25粒を乗せ、3日後のコロニー生長を有する粒子数および7日後の元の真菌分離物に似たあるいは汚染物であるコロニー数を記録することによって測定する。
上記バイオアッセイを実施するには、正常な根を10cm長のセグメントに切断し、各根セグメントが少なくとも1個の莟みを確実に有するようにする。洗浄した各根セグメントを秤量し植木鉢当り2本入れる。粉砕接種物を根および土壌表面上に、例えば、約5g(他の投与量も使用し得る)均一にばら撒き、2〜3cmの土壌混合物で覆い、各植木鉢を温室内置く。根インキュベーション6週間後の根重量の変化を記録する。結果を表２０に示す。
【００６６】
0004597483.tif 000024
表２０に示す結果は、ある範囲の大麦粒度と適用割合が雑草繁殖の制御に有効であることを例証している(根の生長低下によって指標される)。有効性の増大は、粒度が小さく適用量割合が高いほど得られている。
【００６７】
堆肥バイオアッセイ
真菌を、前述したようにして、液体培養において増殖させる(真菌分離物の培養、実施例１参照)。チーズ・クロスの二重層を使用して、液体を菌糸体から重力により排水する。約1：3.2(容量/容量)比の菌糸体対水を均質化して約105〜106cfu/mLを生成させる。この均質物を堆肥化肥料と約1.：2(容量/容量)比で混合する。
雑草の根、例えば、カナダアザミの根の約10cmの2本のセグメントを、土壌混合物(砂土壌3：ミズゴケピートモス1：培地級蛭石1：洗浄選別9mm砂1)で3/4満たし強固に固めた植木鉢中に入れる。各根セグメントを秤量し、植木鉢当り2本入れる。処理堆肥(堆肥-均質物混合物)を植木鉢内に入れ、次いで、十分に水掛けする前に追加の土壌混合物で覆う。各植木鉢を温室に入れ、2週間、4週間および6週間での植木鉢当りの苗条総数、症状(即ち、白化、壊死、病変)を有する苗条または植物体の総数を記録する。また、6週間で根を集め、洗浄し、葉組織の生体重量のようにして、根生体重量を記録する。データは、幾つかのパラメーターについて分析する：
i)  ％根生長(即ち、[処理の最終根重量/処理の出発根重量]÷[対照の最終根重量/対照の出発根重量]×100)；
ii)  葉生体量。
結果を表２１(A)に示す。
【００６８】
0004597483.tif 000025
これらの結果は、各種の堆肥培地を使用して均質物として調製した液体接種物が雑草繁殖の制御において有効であること例証している。
【００６９】
土壌浸漬バイオアッセイ
真菌を、前述したようにして、液体培養において増殖させた(真菌分離物の培養、実施例１参照)。一方の処理は約4〜8週間増殖した94-359A、94-44Bおよび85-24Bの混合物を使用し、もう一方の処理は2週間増殖した85-24Bを使用した。菌糸体と液体培養培地を均質化させて約103〜104cfu/mLを生成させた。対照は、未接種液体培養培地であった。25個のタンポポ種子を100mLの無土壌植付け用混合物(0.02m2に等価)中に6mmの深さで播き、100mLの均質物を土壌上に注ぎ込む。発生したタンポポ実生数および5日、7日および14日後の白化実生数の計数を行った。結果を表２１(B)に示す。
【００７０】
0004597483.tif 000026
これらの結果は、約103〜104cfu/mLを有する真菌均質物が雑草制御活性のために土壌浸漬物として約5L/m2の割合で適用し得ること、およびより速くて大きな雑草制御活性が熟成接種物混合物によって得られていることを例証している。
【００７１】
種子処理バイオアッセイ
分離物94-44Bを、前述したようにして、液体培養において4週間増殖させた(真菌分離物の培養、実施例１参照)。菌糸体と液体培養培地を均質化させて約103〜104cfu/mLを生成させた。この真菌均質物(1mL)と1mLの2％メトシル(methocil；セルロース粘着剤)を使用して、ガラスペトリ皿内でカテプワ(Katepwa)小麦の36粒の種子(138cfu/種子)またはクリーピング  レッド  フェスキュー芝種の173粒の種子(29cfu/種子)を被覆した。被覆種子を層流フード内で１夜風乾させた。上記小麦種子と20粒のタンポポ種子を無土壌植付け用倍地を含む4インチ(10.16cm)植木鉢に植付け、十分に水掛けした。白化を有するタンポポ植物体の％および小麦の新鮮重量生体量を14日後に記録した。下記の表２１(C)を参照されたい。
【００７２】
0004597483.tif 000027
これらの結果は、本発明の真菌分離物が作物の種子処理によってタンポポを制御し得ることを例証している。また、多めのcfu/種子を有する大きめの種子の方が少なめのcfu/種子を有する小さめの種子よりも高い制御を与えるような投与量効果も例証している。
【００７３】
発生前および発生後の葉スプレー適用
分離物94-44Bを、前述したようにして、液体培養において4週間増殖させた(真菌分離物の培養、実施例１参照)。この液体培養物をナイロンメッシュ布で濾過し、液体培養培地と菌糸体画分を別々に保存した。液体培養培地の150mlアリコートを0.45μmの酢酸セルロースフィルターで濾過して、濾過培養培地処理物を調製した。液体培養培地のもう１つの150mlアリコートは、これに加えた15％の菌糸体(質量/容量)を有し、その後、均質化させて、処理物いわゆる106〜107珠芽/mlを含有する未濾過液体培養培地を調製した。(珠芽は、菌糸体画分と胞子からなっていた)。これら2つの処理物と水対照を、トラックスプレヤーを使用して480L/haの速度で6〜4インチ(15.24〜10.16cm)植木鉢上にスプレーした。各植木鉢を無土壌植付け用培地中の0.11gの芝草栽培用過剰播種混合物(Overseeding  Mixture)と20粒のタンポポ種子で種付けした。各植木鉢に葉発生前スプレー適用として種付け後1〜2日でスプレーした。また、各植木鉢に葉発生後スプレー適用として種付け後２週間でスプレーした。スプレー後3週間で、次のデータを記録した：植木鉢毎のタンポポ総数、植木鉢毎の白化タンポポ数、グラム数での植木鉢毎の芝草の生体重量、グラム数での植木鉢毎のタンポポの生体重量。表２１(D)を参照されたい。
【００７４】
0004597483.tif 000028
これらの結果は、本発明の真菌分離物が植物体発生前または発生後のスプレー適用法によってタンポポを制御し、発生前スプレー適用によって芝草の繁殖を改良し得ることを例証している。
【実施例４】
【００７５】
農業上重要な植物に対する本発明の各真菌分離物の効果
適用方法の効果
A)  接種物マットバイオアッセイ
ある範囲の農業上重要な植物を試験して本発明の真菌分離物の宿主特異性を検証した。各真菌分離物を、油脂種子、穀物、豆類および飼料作物に、実施例２において概略した接種物マットバイオアッセイを使用して適用した。これら真菌分離物の発芽、白化、葉生体重量、および死滅率についての効果を検証した。
宿主範囲試験のための作物
各真菌分離物に対する作物類の選択性を、接種物マットバイオアッセイ(実施例２参照)を使用し、高接種物負荷量を使用して試験した。従って、より自然感染条件下において生ずるであろうよりも高い感受性反応を示す。
【００７６】
試験した作物類および品種は、下記のとおりである：
1)  穀物および他の単子葉植物
小麦(栽培種)：カテプワ(Katepwa)、AC  ドメイン(Domain)、
AC  カーマ(Karma)、ビッガー(Biggar)、キール(Kyle)
大麦(栽培種)：ハーリントン(Harrington)、シルキー(Silky)
カラス麦(栽培種)：ダービー(Derby)またはウォルデン(Walden)
雑穀(栽培種)：ミンコ(Minco)またはプレイリーゴールド(Prairie  Gold)
カナリア草の実(栽培種)：キート(Keet)
2)  脂肪種子作物
キャノーラ(栽培種)：AC  エクセル(Excel)、AC  パークランド(Parkland)
マスタード(栽培種)：カットラス(Cutlas)、オクレ(Ochre)
亜麻(栽培種)：ヴィミー(Vimy)
ヒマワリ(栽培種)：カーギル(Cargill)  SF270またはIS7111
紅花(栽培種)：レトブリッジ(Lethbridge)
3)  豆類作物
レンティル(栽培種)：ライード(Laird)、エストン(Eston)
えんどう豆(栽培種)：エクスプレス(Express)
ヒヨコマメ(栽培種)：サンフォード(Sanford)
そら豆(栽培種)：CDC  ファティマ(Fatima)
4)  飼料作物
クローバー類：
イエロークローバー(栽培種)：ノルゴールド(Norgold)
ホワイトクローバー(栽培種)：ポララ(Polara)およびソンジャ(Sonja)
普通クローバー
レッドクローバー(栽培種)：アルタスウェド(Altaswede)またはフロレックス
(Florex)
鳥用飼料シロツメグザ(栽培種)：クリー(Cree)
アルファルファ(栽培種)：ビーバー(Beaver)
これらの試験の結果を下記の表２２(発芽および白化に対する効果)および表２３(葉生体重量および死滅率に対する効果)に示す。
【００７７】
0004597483.tif 000029
【００７８】
0004597483.tif 000030
【００７９】
表２２および２３に示す結果は、重要な農業種の多くの植物品種が高接種物負荷量で適用したときに本発明の真菌分離物によって影響を受けないこと、並びにこれらの分離物をバイオ除草剤として使用して作物類の存在中の雑草活性を制御し得ることを例証している。雑草制御活性を示すのに有効であるが作物植物に対して有害でない低めの接種物負荷量は、必要に応じて、農作物に対するインパクトを最低限にするのに使用し得る。
B)  裸大麦接種物
野外繁殖させた農業上の重要な作物に対する本発明の真菌分離物の単独適用の残留作用を測定するために、真菌分離物サンプルを、裸大麦接種物を使用し、繁殖シーズン内に3つの異なる時期に1kg/m2で土壌に適用してカナダアザミを制御した(実施例３、適用の持続性参照)。品種ライード(Laird)のレンティル種子を、処理および対照区域に、バイオ除草剤適用時のおよそ10〜14ヶ月後に70〜80kg/haの割合で播いた。区画毎の発現レンティル植物体の数および白化を有する植物体の数を計数した。この試験の結果を表２４(A)に示す。カナダアザミについての同様な試験のデータは、表１８に示している。
【００８０】
0004597483.tif 000031
これらの結果は、本発明の真菌分離物が、自然感染条件下の春および夏に高割合の野外適用において適用したときに、農業上重要な作物類に有害な残留作用を有していないことを例証している。
【実施例５】
【００８１】
フィトトキシン(植物毒素)の調製
加熱死菌化真菌分離物の雑草制御活性を検証した。裸大麦接種物を加熱死菌化し、カナダアザミに適用し、あるいは得られた加熱死菌化接種物を以下に述べるような5％のタンポポ種子に汚染された芝草種子と混合した(表２４(B)および表２４(C)参照)。結果は、加熱死菌化真菌分離物が雑草制御活性を保持していること示唆している。従って、本発明の真菌分離物の濾過接種培地または抽出物の雑草繁殖に対する効果も検証した(表２５)。
真菌剤によるまたは真菌剤によって産生された代謝物による雑草制御
裸大麦粒子接種物を前述したようにして調整する(実施例３)。この大麦接種物をオートクレーブ処理し、カナダアザミを繁殖させた土壌に適用するか、あるいは該接種物を5％のタンポポ種子に汚染された芝草種子と混合する(実施例３参照)。対照として、普通の大麦粒子または非感染大麦接種物を土壌に適用する。これらの結果を温室および野外条件下で繰り返した。これらの試験の結果を表２４Bおよび表２４Cに示す。
【００８２】
0004597483.tif 000032
これらの試験は、加熱死菌化伸筋接種物が雑草制御活性を示すこと、および生真菌接種物は雑草制御活性に必要でないことを例証している。これらの結果は、自然産生物が本発明の真菌分離物によって生成されることを示唆している。フィトトキシン成分の粗抽出物を得て雑草制御活性について分析した。
【００８３】
0004597483.tif 000033
これらの結果は、上記真菌剤または上記真菌剤から産生された代謝物が芝地内のタンポポを制御し得ること、および該代謝物が芝草の繁殖を改良し得ることを例証している。
【００８４】
フィトトキシン抽出およびバイオアッセイ
真菌分離物を、シェーカー上の液体培養培地中で、周囲光および温度条件下において４週間増殖させた。培養物を、ワットマン#１濾紙と2〜4層のチーズ・クロスと連結させたブフナー漏斗を使用する真空濾過によって、培地と菌糸体画分に分離した。培地画分(濾過した接種培地)を、回転蒸発器(40℃)または凍結乾燥機のいずれかを使用して、減量乾固させた。菌糸体画分をクロロホルム中に3時間〜１夜放置し、次いで、ワットマン#１濾紙により真空濾過して溶媒と菌糸体を分別した。濾過した溶媒を回転蒸発させて乾固させた。対照は、培地画分と同じように処理した未接種液体培養培地であった。乾燥抽出物を冷蔵庫内のフラスコで使用するまで保存した。試験においては、培地画分および菌糸体画分双方からお乾燥抽出物を先ず2〜5mlの蒸留水中に溶解させ、次いで、等量の80%メタノールを各フラスコに加えた。対照処理は、40%メタノールであった。メタノールおよび酢酸エチル抽出物も、上記クロロホルム抽出処置の後の菌糸体画分から得て、以下に述べるようにして雑草制御活性について試験した。
バイオアッセイを使用して、感受性植物(この試験においては、そら豆を試験植物として使用した)またはカナダアザミ(雑草宿主)の葉上に真菌によって生じた症状と類似する白化症状を生じさせた画分の液滴中のフィトトキシンの存在を検証した。そら豆種子を土壌混合物に植え付け、植木鉢ごとに5本の植物体まで間引きし、処理毎に2個の植木鉢を使用した。カナダアザミの根を土壌混合物に植付け、3週間後、2〜3本の苗条を有する植木鉢を選んだ。2〜10μlの抽出物液滴を、そら豆植物体毎に2枚の葉およびカナダアザミ苗条毎に3枚の葉に適用する；刺し孔上の液滴は昆虫ピンによって施し、もう一方の液滴は葉表面上に直接施す。各植物体を10日間毎日白化について観察した。
異なるバイオアッセイを使用して、そら豆の生体重量に対する上記各画分からのフィトトキシンのインパクトを検証した。このアッセイにおいては、そら豆種子を1mlの抽出物および1mlの2%メトシルと混合して種子を被覆しその後１夜風乾させた。植木鉢毎に、5粒の種子を土壌混合物に植付けた。各植物体を10日後の発現と白化、4週間後の葉生体量(生体重量)について格付けした。
【００８５】
これら溶媒抽出物の雑草制御活性を、表２５(A；クロロホルム抽出物)および表２５(B；クロロホルム、メタノールまたは酢酸エチル抽出物)に示す。
真菌分離物94-26から得られたクロロホルム抽出物の液滴受入れ10日後に観察された白化植物体(そら豆(FB)またはカナダアザミ(CT))の割合によって検証される雑草制御活性を表２５(A)に示す。
【００８６】
0004597483.tif 000034
【００８７】
クロロホルム、メタノールまたは酢酸エチル画分の雑草制御活性も検証する。雑草制御活性は、94-26からの各溶媒抽出物または未接種対照培地で処理した種子を有するそら豆の発生、白化および葉生体重量をモニターすることによってアッセイした。この試験の結果を表２５(B)に示す。
0004597483.tif 000035
表２５(A)および(B)に示した結果は、本発明の真菌分離物から得られた濾過接種培地および各溶媒抽出物が感受性植物において疾病症状を誘発させ、繁殖を低下させ、雑草制御活性を示すことを例証している。従って、濾過接種培地、菌糸体からの抽出物、またはこれらの組合せが雑草繁殖の制御において使用し得る。
【００８８】
すべての文献は、参考として本明細書に引用する。
本を好ましい実施態様について説明してきた。しかしながら、多くの変更および修正を本発明の範囲を逸脱することなくなし得ることは、当業者にとって自明であろう。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】カナダアザミ植物体における種々の量の接種物懸濁液85-24Bの効果を示すグラフである。格付度は次のとおりである：1=正常、暗緑色の葉；2=僅かに黄緑色の葉；3=主として黄色、若干黄緑色の葉；4=主として白色、僅かに黄緑色の葉；5=完全に白色の植物体；6=植物体死滅。
【図２】多年生ノゲシの根繁殖比における真菌分離物94-44B、94-26、95-54A1および97-12Bの効果を示すグラフである。
【図３】多年生ノゲシの葉生体量における真菌分離物94-44Bの効果を示すグラフである。
【図４】多年生ノゲシの発芽における真菌分離物94-44Bの効果を示すグラフである。
【図５】多年生ノゲシに真菌分離物94-44B、89-25Aおよび97-12Bを適用した後の雑草死滅率を示すグラフである。
【図１】
0004597483.tif 000036
【図２】
0004597483.tif 000037
【図３】
0004597483.tif 000038
【図４】
0004597483.tif 000039
【図５】
0004597483.tif 000040