(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンチトロンビン（ＩＩＩ）に対して高親和性であるＨＡヘパリンに富んだヘパリンを含む組成物を使用する方法において、前記組成物中のＨＡヘパリンを結合させた動脈血栓形成防止用非血栓形成性表面を体外にて形成するために、前記組成物を体外にて使用することを特徴とするヘパリンを含む組成物の使用方法。
【請求項２】
請求項１に記載のヘパリンを含む組成物の使用方法において、アミノ、アルデヒド、ヒドロキシル、カルボン酸、及びカルボジイミドからなる官能基、あるいは、ヘパリン中に存在するかヘパリンに導入される官能基と結合できる他の反応性官能基を有する有機化合物からなる群から選択され少なくとも1種の有機化合物からなるキャリアと一緒に用い、
前記有機化合物は、塩化トリドデシルメチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウム誘導体、エチルジメチルアミノプロピルカルボジイミドおよびグルタルアルデヒド、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）またはポリリシンからなる群から選択されたポリアミン、
ポリアクリル酸からなるポリカルボン酸、及び
ポリビニルアルコールまたは多糖類からなるポリアルコール、の内の少なくとも一種であるかまたはこれらの混合物であることを特徴とするヘパリンを含む組成物の使用方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のヘパリンを含む組成物の使用方法において、前記高親和性のＨＡヘパリンが精製されたものであることを特徴とするヘパリンを含む組成物の使用方法。
【請求項４】
請求項１乃至３の内のいずれか1項に記載のヘパリンを含む組成物の使用方法において、前記ＨＡヘパリンが、アルデヒドグループの共有結合によって、前記表面に結合していることを特徴とするヘパリンを含む組成物の使用方法。
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれか１項に記載のヘパリンを含む組成物の使用方法において、前記高親和性の，ＨＡヘパリンが医療機器の表面に結合していることを特徴とするヘパリンを含む組成物の使用方法。
【請求項６】
請求項５に記載のヘパリンを含む組成物の使用方法において、前記医療機器は、ステント、グラフト、ステントグラフト、カテーテル、心臓弁、フィルタ、管類および膜式装置からなる群から選択されることを特徴とするヘパリンを含む組成物の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、動脈血流との接触時に非血栓形成性表面コーティング剤として使用されるヘパリンを含む組成物に関する。また、本発明は、表面をかかる組成物で処理される装置にも関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
血栓症は先進国での大きな健康問題の１つである。血栓症に関連する疾患が原因で毎年数百万人もの人々が死に至っており、米国だけでも医療費は９００億米ドルを超えるものと見られてきた。
【０００３】
血栓症には動脈血栓症と静脈血栓症の２種類がある。名前のとおり、動脈血栓症は動脈内で発生し、静脈血栓症は静脈内で発生する。動脈血栓は高速流において形成され、血小板が主な成分である。血小板は直径約２μｍの小さな細胞で、血液中を循環している。その主な機能は止血に関与することである。損傷した血管壁や変質した血管壁、あるいは傷などでコラーゲンと接した場合や異質の表面に接した場合、血小板はその表面に付着し、活性化され、凝集塊を形成しはじめる。このような凝集が動脈で起こると、凝集した血小板による血栓が形成される。動脈血栓は白色血栓とも呼ばれているが、これは血小板が主体で赤血球（ＲＢＣ）はほとんど含まれないための見た目によるものである。
【０００４】
静脈血栓は低速流において形成され、血液凝固系が主な起因源である。血漿中には、両方で凝固系をなす多数の酵素前駆体とエフェクタータンパク質とが存在する。この系は、１つの酵素が酵素前駆体を活性化し、このようにして形成された酵素が次の酵素前駆体を活性化するといった連鎖プロセスでさまざまな方法によって誘発され得る。形成される最終的な酵素はトロンビンであるが、このトロンビンによって血漿タンパク質のフィブリノーゲンから２つのペプチドが切断され、結果として変性したフィブリノーゲンが急速に凝集してゲルを形成し、フィブリン塊や血栓が形成される。静脈血栓にはフィブリンに巻き込まれた赤血球が含まれるため、静脈血栓は赤色血栓とも呼ばれる。
【０００５】
動脈血栓症に関連のある疾患として、心筋梗塞、血栓性脳卒中、末梢動脈疾患があげられる。心筋梗塞では、冠動脈に血栓が生じて心筋の対応する部分への血液供給が停止するか、あるいは大幅に低減されるため、心筋のその部分が壊死する。血栓性脳卒中では血栓によって大脳動脈の血流が遮断される。この血栓は、通常は循環経路中の他の場所で形成され、血液の流れとともに脳にたどりついたものである。脳は酸素欠乏に対して非常に敏感であるため、脳内のこの動脈からの血液が流れる部分が損傷を受けることになる。
【０００６】
心筋梗塞と血栓性脳卒中は死亡率が非常に高い危険な状態であるため、今日の治療努力の多くはこれを防ぐことを目的としている。主に使用される薬剤にアスピリン（アセチルサリチル酸）があるが、この薬剤は血小板の活性化と凝集を抑制することで動脈血栓の形成を防止するものである。大規模な臨床研究から、アスピリンを１日当たり１錠服用することで心筋梗塞になる危険性が大幅に低くなることが分かった。血栓性脳卒中の予防については、広く一般に用いられている薬剤がもう１つある。それはチクロペジン（Ｔｉｃｌｏｐｅｄｉｎ）であり、アスピリンと同じく血小板の凝集を抑制するものであるが、その作用機序は若干異なっている。
【０００７】
静脈血栓症に関連のある疾患が深部静脈血栓症（ＤＶＴ）と肺塞栓である。深部静脈血栓症では四肢（通常は脚部）の静脈に血栓が形成される。この血栓によって血液の還流が減り、脚や腕のその部分への血液供給量が少なくなってしまう。脚や腕がむくみ、痛みを伴う。このような状態自体は生命を脅かすものではないが、治療をせずにおくと血栓が次第に大きくなって、小片が還流に残り、部分的に肺に到達する場合がある。このような生命に危険のある状態が肺塞栓と呼ばれるものである。静脈血栓症に対処する臨床的な診療は予防と治療とに分けられる。しかしながら、使用される薬剤は同じであるため、違いといえば用量と治療期間である。
【０００８】
使用される薬剤は、ヘパリン、低分子ヘパリン、ジクマロール誘導体である。これらの薬剤はいずれも、静脈血栓症における重要な過程である凝集とフィブリンの形成を抑える働きをするものである。ヘパリンは硫酸エステルを含有する多糖類であり、ブタの腸の粘液から大規模に単離される。これは、静脈血栓症を治療および予防するための作用薬として何十年にもわたって臨床現場で使用されている。ヘパリンは、分子量５，０００〜３０，０００ダルトン、平均分子量約１２，０００〜１５，０００ダルトンのヘテロ接合体である。ヘパリンおよび低分子ヘパリンは、生理的な凝固抑制因子であるアンチトロンビンIII（ＡＴ）が活性化凝固因子を不活性化する割合を大幅に高めることによって、抗凝固活性を発揮する。ＡＴと結合して強い抗凝固活性を示すヘパリン分子は全体の約１／３程度にすぎない。これは、ヘパリン分子がＡＴとの親和性の高い特定の五糖配列を含むことに関連している。このようなヘパリンフラクションは高親和性フラクションまたはＨＡフラクションと呼ばれる。残りの部分である低親和性（ＬＡ）フラクションは基本的に抗凝固活性を欠いている。さらに重要なこと、すなわち生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での抗血栓活性についてみると、ＡＴの活性化が重要であるだけでなく、外因系血液凝固抑制因子（ＴＦＰＩ）の放出などの他の機序も抗血栓作用を助長するため、状況はさらに複雑である。抗凝固活性がないにもかかわらず、ＬＡヘパリンはＴＦＰＩを放出することでヘパリン全体の抗血栓作用を助長する。
【０００９】
ヘパリンは血小板にも影響するが、血小板凝集に対する弱い刺激因子として作用し、アデノシン二リン酸の血小板凝集促進作用を高める。この点での血小板に影響をおよぼす機能についてみると、Ｈｏｌｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．  Ｒｅｓ．  １９８０，１８：８６１〜８６９に示されるようにＨＡヘパリンとＬＡヘパリンとで何ら違いはない。
【００１０】
ジクマロール誘導体には、生物学的に活性な形でいくつかの凝固因子の合成を抑えることによる抗血栓作用がある。このプロセスにはいくぶん時間を要し、そのためジクマロール誘導体を即時性の抗血栓治療に使用することができずにいる。
【００１１】
過去二十年の間に、血液との接触がある多種多様な移植用装置や機械で利用される装置の開発には大きな進歩があった。しかしながら、これによって新たなタイプの血栓症が生じている。血液が健常な血管の血管壁以外の物質と接触すると凝固系の活性化が起こりはじめ、これが血栓形成につながる場合がある。外来物の表面が動脈血流と接触した場合、形成される血栓は血小板を主成分とする動脈タイプである（Ｈａｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，  １９８２，５１９〜５３０）。静脈血流では、凝固と血小板の両方が関与する混在した状況になる。
【００１２】
装置での血栓症を防止するために、抗血小板剤や抗血栓剤を使用することができる。しかしながら、これには出血の危険が伴う上に薬物治療は長期にわたって行わなければならない場合が多いことが欠点となるため、理想的な解決策とはいえない。血栓症が形成される可能性の低い材料を見出すために多大の努力がなされてきたのはこのためである。さまざまなポリマーや可塑性材料を試し、表面の親水性／疎水性を変えてみたが、画期的な組成物は見出されていない。生理的なｐＨで血小板は負に帯電するため、負の電荷を持つ表面について、静電反発が原因で付着が少なくなるとの期待から、研究が行われてきた。今日までのところ、負に帯電したポリマーで表面をコーティングして血栓形成性の低い表面を得ることに成功した最も良い例として、コーティングにヘパリンを用いて血小板の付着を抑制することがあげられる。ヘパリンは、生理的な化合物であるという点で合成ポリマーよりも都合がよい。また、人体で見出すことのできる分子のうち最も強く負に帯電する分子である。この点に関してはＨＡヘパリンとＬＡヘパリンとの間に差はない。
【００１３】
表面の血栓形成性を抑えるために、ヘパリンを表面に結合させるさまざまな技術が開発されている。ポリカチオン表面に対するヘパリンのイオン結合を試したが、ヘパリンが表面から浸出して抗血栓特性が失われたため、失敗に終わっている。
【００１４】
医療機器を非血栓形成性にするのに最も成功したプロセスの１つは、改質した医療機器の表面にヘパリン断片を共有結合することで達成されている。汎用的な方法とその改良については、欧州特許第００８６１８６号明細書、欧州特許出願第００８６１８７号明細書および欧州特許出願第０４９５８２０号明細書に記載されている。
【００１５】
これらの特許には、第１に、亜硝酸での酸化によってアルデヒド基を導入しながらヘパリンの多糖鎖を選択的に切断して達成される表面改質物質の調製について説明されている。第２に、医療装置の表面にアミノ基を持つ表面改質層を１つまたはそれ以上導入し、その後に多糖鎖のアルデヒド基と表面改質層の第１級アミノ基とを反応させ、次いで中間のシッフ塩基を還元して、たとえばシアノボロハイドライドとの安定した第２級アミン結合にする。
【００１６】
この技術によって、医療装置用の安定かつ十分に定義された抗血栓形成性表面改質物を調製することができた。
【００１７】
同様の結果あるいは一層良い結果が得られるとされる周知の他の表面改質物が多く存在する。たとえば、亜硝酸または過ヨウ素酸エステルでの酸化によってアルデヒド基を含むように改質されたヘパリンが共有結合によって結合できるポリウレタン尿素の層を有する基材をもとにした、欧州特許出願公開第０２００２９５号明細書（米国特許第４，６００，６５２号明細書、米国特許第６，６４２，２４２号明細書）に記載されている。
【００１８】
ここでとりあげることのできる別の抗血栓形成性表面改質物が、欧州特許第０３０９４７３号明細書に記載されている。リゾチームの層をコーティングするか、ヘパリンが付着するリゾチームの誘導体をコーティングすることで、装置の表面を改質する。
【００１９】
抗血栓形成性物品を得るためのさらに他の表面改質物が、米国特許第４，３２６，５３２号明細書に記載されている。この場合、階層状の抗血栓形成性表面が、ポリマー基材と、ポリマー基材に結合したキトサンと、キトサンコーティングに結合する抗血栓形成剤とを含む。特開平４−９２６７３号公報は、ヘパリンを結合するのにキトサン層を用いた抗血栓形成性ヘモフィルタに関する。抗血栓形成性表面を得るための従来技術のプロセスについての記載事項は決して完全なものではなく、患者に問題なく使用するのに必要な特性を示す、すなわち、コーティングの安定性があり、コーティング対象となる基材の特性が悪化することがなく、抗血栓形成活性が長期にわたって維持される、コーティグされた医療用物品を得るのは困難であることを明確に示すものである。
【００２０】
したがって、表面をヘパリンでコーティングすることで血栓形成性を抑えることに成功したとしても、依然として改良の必要性があり、最適な特性を有するヘパリンのフラクションを使用することが非常に大きな進歩につながる可能性がある。
【００２１】
本発明は、基質結合ＡＴでのアフィニティクロマトグラフィによって得られるような、表面コーティング用のＨＡヘパリンおよびＬＡヘパリンの調製と特性化について説明するものである。また、ＨＡヘパリン調製物およびＬＡヘパリン調製物での装置表面のコーティングについても取り上げる。表面へのカップリング前にヘパリンのＨＡフラクションとＬＡフラクションを分離することが、Ｙｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．によってすでに行われている（Ｊ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｍａｔｅｒ．  Ｒｅｓ．  １９９３，２７：８１１〜８２０およびＪ．  Ａｐｐｌ．  Ｂｉｏｍａｔｅｒ  １９９５，ｖｏｌ６：２５９〜２６６）。Ｙｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．による研究（１９９５）において、ＬＡヘパリンをコーティングした表面の方が、ＨＡヘパリンをコーティングした表面よりも抗第Ｘａ因子活性として測定した抗凝固活性が高いことが明らかになった。
【００２２】
本発明では、動物の実験用血栓症モデルにおいて、表面コーティングした血管インプラント（ステント）を調査した。使用した動物モデルは、ヒヒの動静脈シャントモデルである。このモデルでは、１本の動脈からの血液が、検討対象の材料を含む管を通って静脈に達する。このモデルで形成される血栓は動脈血栓のタイプであり、血栓が形成されたら放射線標識した血小板の凝集を測定する。
【００２３】
主に血小板が関与するという、すでに解明されている動脈血栓症の機序から予想可能なことや、血小板に対してＨＡヘパリンやＬＡヘパリンがおよぼす作用について知られていることなどに反して、表面に結合させた場合はＨＡフラクションの方がＬＡフラクションよりも動脈血栓形成の防止効率が高いことが明らかになった。
【００２４】
本発明によって、改善された非血栓形成活性を得ることができ、結果として以下のような利点が得られる。
【００２５】
従来よりも少ない量の固定化ヘパリンで十分な非血栓形成性が得られる。これは、大量のヘパリンを固定化することに困難を伴う材料および装置では特に重要である。
【００２６】
同量の固定化ヘパリンを用いて一層高い非血栓形成性が得られる。これは、低血流の状況などの血栓形成刺激の強い用途や、ルーメンの細いカテーテルや血管グラフトなどの用途、あるいは他の場合であれば必要のない全身へのヘパリン処置が患者に必要なときに特に重要である。
【００２７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の一目的は、動脈血流との接触時に非血栓形成性表面コーティングとして用いられるヘパリンを含む組成物の使用方法を提供することにある。
【００２８】
本発明の他の目的は、表面をかかる組成物で処理した装置を提供することにある。
【００２９】
【課題を解決するための手段】
本発明によれば、アンチトロンビン（ＩＩＩ）に対して高親和性であるＨＡヘパリンに富んだヘパリンを含む組成物を使用する方法において、前記組成物中のＨＡヘパリンを結合させた動脈血栓形成防止用非血栓形成性表面を体外にて形成するために、前記組成物を体外にて使用することを特徴とするヘパリンを含む組成物の使用方法が得られる。
【００３０】
また、本発明によれば、前記ヘパリンを含む組成物の使用方法において、アミノ、アルデヒド、ヒドロキシル、カルボン酸、及びカルボジイミドからなる官能基、あるいは、ヘパリン中に存在するかヘパリンに導入される官能基と結合できる他の反応性官能基を有する有機化合物からなる群から選択され少なくとも1種の有機化合物からなるキャリアと一緒に用い、前記有機化合物は、塩化トリドデシルメチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウム誘導体、エチルジメチルアミノプロピルカルボジイミドおよびグルタルアルデヒド、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）またはポリリシンからなる群から選択されたポリアミン、ポリアクリル酸からなるポリカルボン酸、及びポリビニルアルコールまたは多糖類からなるポリアルコール、の内の少なくとも一種であるかまたはこれらの混合物であることを特徴とするヘパリンを含む組成物の使用方法が得られる。
【００３１】
また、本発明によれば、前記いずれか一つに記載のヘパリンを含む組成物の使用方法において、前記高親和性のＨＡヘパリンが精製されたものであることを特徴とするヘパリンを含む組成物の使用方法が得られる。
【００３２】
また、本発明によれば、前記いずれかのヘパリンを含む組成物の使用方法において、前記高親和性のＨＡヘパリンが、アルデヒドグループの共有結合によって、前記表面に結合していることを特徴とするヘパリンを含む組成物の使用方法が得られる。
【００３４】
また、本発明によれば、前記いずれかのヘパリンを含む組成物の使用方法において、前記高親和性の，ＨＡヘパリンが医療機器の表面に結合していることを特徴とするヘパリンを含む組成物の使用方法が得られる。
【００３５】
さらに、本発明によれば、前記ヘパリンを含む組成物の使用方法において、前記医療機器は、ステント、グラフト、ステントグラフト、カテーテル、心臓弁、フィルタ、管類および膜式装置からなる群から選択されることを特徴とするヘパリンを含む組成物の使用方法が得られる。
【００３６】
【発明の実施の形態】
本発明についてさらに詳細に説明する。
【００３７】
本発明における一目的は、医療装置の表面に結合される高親和性のＨＡヘパリンの含有率が高いヘパリンと、任意に好適なキャリアとを含む組成物を提供することにある。
【００３８】
好ましくは、この組成物は、高親和性のＨＡヘパリンについて精製されたヘパリンを含む。本発明による組成物を任意にキャリアと併用し、医療装置の表面にヘパリンを固定化する。
【００３９】
キャリアは、アミノ、アルデヒド、ヒドロキシル、カルボン酸、カルボジイミドなどの官能基、あるいは、ヘパリン中に存在するかヘパリンに導入される官能基と結合できる他の反応性官能基を有する有機化合物からなる群から選択される。
【００４０】
この官能性化合物は、低分子化合物またはポリマーであってもよい。官能基を有する低分子化合物の例としては、塩化トリドデシルメチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウム誘導体、エチルジメチルアミノプロピルカルボジイミドおよびグルタルアルデヒドがあげられる。ポリマーの例としては、たとえば、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）またはポリリシンなどのポリアミン、ポリアクリル酸などのポリカルボン酸、ポリビニルアルコールまたは多糖類などのポリアルコール、他の官能性ポリマーまたはこれらの混合物があげられる。官能基は、十分な量のＨＡヘパリンが結合でき、強い抗血栓形成活性が得られる程度に存在する。
【００４１】
本発明の別の目的は、本発明による組成物で表面を処理した装置を提供することにある。好適な装置は、ステント、グラフト、ステントグラフト、カテーテル、心臓弁、フィルタ、管類および膜式装置からなる群から選択されるが、これに限定されるものではない。
【００４２】
Ｌａｒｍ  ｅｔ  ａｌ．による欧州特許第００８６１８６号明細書に記載されているようにして、ブタの粘膜のヘパリンを亜硝酸で解重合した。得られる解重合ヘパリンを、基質結合抗トロンビンＩＩＩ上でのアフィニティクロマトグラフィによって、ＨＡフラクションとＬＡフラクションとに分画した（Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ  ＬＯ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｏｍｂ．  Ｒｅｓ．  １９７９，９：５７５〜８３）。予想通り、ＨＡフラクションは極めて高い抗凝固活性を示したが、ＬＡフラクションの活性は極めて低かった。ステンレス鋼製ステント（Ｐａｌｍａｚ−Ｓｃｈａｔｚ，ＰＳ１５３，Ｃｏｒｄｉｓ，Ｗａｒｒｅｎ，Ｎ．Ｊ．ＵＳＡ）を２つのグループに分け、上記の２種類のフラクションをコーティング（Ｌａｒｍ  ｅｔ  ａｌ．欧州特許第００８６１８６号明細書）した。ステントは血管壁の支持に用いられるチューブ状ネットの一種であり、観血式の心臓血管の処置に使用される。ヘパリンの結合度を求めたところ、基本的には同量のＨＡフラクションとＬＡフラクションがそれぞれ、２つのグループに分けたステントの表面に結合したことが分かった。２つの表面での抗血栓形成特性を評価するために、確立された動物モデルを使用した。使用したモデルはヒヒの動静脈シャントモデルである。このモデルでは、１本の動脈からの血液が、検討対象の材料を含む管を通って静脈に達する。このモデルで形成される血栓は動脈血栓のタイプであり、血栓が形成されたら放射線標識した血小板の凝集を測定する（Ｃａｄｒｏｙ  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｌａｂ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｅｄ．  １９８９，Ｖｏｌ．１１３：４３６〜４４８）。
【００４３】
放射線標識した血小板を注射した非抗凝固ヒヒにて、ステントを半生体内（ｅｘ  ｖｉｖｏ）で動静脈シャントに留置して膨らませた。ステント表面での血小板の凝集をガンマカメラで断続的に監視し、２時間にわたって記録した。コーティング処理をしていないステントを対照として用いた。対照のステントの血小板はすぐに付着しはじめ、実験を行っている間堆積しつづけた。ＬＡヘパリンフラクションをコーティングしたステントでは、最初は血小板の堆積量は対照に比べて大幅に少なかったが、４０分経過後に堆積しはじめて２時間後には対照のステントと同程度の血小板が堆積していた。これに対して、ＨＡヘパリンフラクションをコーティングしたステントでは血小板の堆積は全く認められなかった。２時間経過後も血小板が堆積している様子は見られなかった。このように、ＨＡヘパリンフラクションをコーティングしたステントの方が抗血栓形成特性の面で優れている。
【００４４】
上述したように、表面にヘパリンをコーティングすると血栓の形成がかなりのレベルで抑えられた。しかしながら依然として改良の必要性があり、抗血栓作用の重要な部分にはヘパリンのＨＡフラクションが関与しているように見えるため、このフラクションの率が高い表面にすることには利点があろう。
【００４５】
本研究では、装置および調査対象の人工表面のタイプとしてステントを選択した。理由は、この動物モデルで動脈血栓症を評価するにはステントが非常に都合が良いためである。しかしながら、装置のタイプがカテーテル、フィルタ、管類、血管グラフトであるかステントであるかは、表面の血栓形成性という点では重要ではない。血栓形成性は、装置自体や装置のバルク材ではなく表面の性質によって変わってくる。このため、表面の抗血栓形成性に関してステントを用いて得られる結果は、ステントに限定されるものではなく、動脈血と接触するあらゆるタイプの人工装置表面にあてはまるものである。
【００４６】
材料および方法
Ｌａｒｍ  ｅｔ  ａｌ．による欧州特許第００８６１８６号明細書に記載されているようにして、ブタの粘膜のヘパリンを亜硝酸で解重合した。得られた解重合ヘパリンを、基質結合ＡＴ上でのアフィニティクロマトグラフィによって、ＨＡフラクションとＬＡフラクションとに分画した（Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ  ＬＯ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｏｍｂ．  Ｒｅｓ．  １９７６，Ｖｏｌ．９：５７５〜８３）。ストックホルムのファルマシア＆アップジョン社からヒトＡＴを入手した。また、スウェーデン、ウプサラのファルマシアバイオテク社から活性化ＣＨセファロース４Ｂを入手した。米国ウォーレンのコーディス社から冠動脈用のＰａｌｍａｚ-ＳｃｈａｔｚステントＰＳ１５３の提供を受けた。さらに、スウェーデン、ムルンダールのＣｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ社から色素ペプチド基質Ｓ−２２３８およびＳ−２７６５を入手した。ヘパリン活性についての第４次国際標準を英国ハートフォードシャー州の国立生物学的基準標準品研究所（ＮＩＢＳＣ）から入手した。
【００４７】
ゲルの製造業者による指示通りにＡＴ−セファロースを調製した。凍結乾燥ゲル（１２５ｇ）を緩衝液中でもどし、４ｇのＡＴと反応させた。このようにして得られるＡＴ−セファロース（４００ｍｌ）はＨＡヘパリン約１００ｍｇを結合することができた。トロンビン抑制アッセイおよび第Ｘａ因子抑制アッセイによって、基本的に低分子量ヘパリンに対する欧州薬局方規定の方法に従い、色素ペプチド基質Ｓ−２２３８およびＳ−２７６５を用いてヘパリンフラクションの抗凝固活性を求めた。ヘパリンに対する第４次国際標準を使用して標準曲線を作出し、比活性を１ｍｇあたりの国際単位（ＩＵ／ｍｇ）で表した。カルバゾールＨ２ＳＯ４法によってヘパリンサブフラクションのヘパリン含有量を求めた。表面に結合したヘパリン量（ヘパリン密度）を化学的な方法で求め、単位表面積あたりのヘパリン量（μｇ／ｃｍ２）で表した。
【００４８】
以下、実施例を参照して本発明について説明する。これらの実施例は一例にすぎず、本発明を何ら限定するものではない。
【００４９】
本願明細書に引用した刊行物はいずれも、その内容を本願明細書に援用するものとする。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という表現については、本願発明者らは「含むが、これに限定されるものではない」という意味に解している。したがって、本願明細書では触れていない物質や添加物も含まれる場合がある。
【００５０】
【実施例】
実施例１
亜硝酸で部分解重合させたヘパリンを、基本的にはＡｎｄｅｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９７６に従って、ＡＴ−セファロースでのアフィニティクロマトグラフィによってＨＡフラクションとＬＡフラクションに分離した。０．１５ＭのＮａＣｌ  ４ｍｌ中ヘパリン含量２００ｍｇでカラムに塗布し、０．１５ＭのＮａＣｌ  ５００ｍｌで溶出した後、２．０ＭのＮａＣｌ  ５００ｍｌで溶出した。溶出液を１０ｍｌだけチューブに回収し、そのヘパリン含有量をカルバゾール法で解析した。それぞれＬＡヘパリンとＨＡヘパリンを含むチューブを回収した。各実験での収率はＬＡヘパリン約１４０ｍｇＨＡヘパリン５０ｍｇであった。このようにして得られたＨＡフラクションおよびＬＡフラクションを抗凝固活性について特性化した。結果を表１に示す。
【００５１】
ＨＡフラクションは、トロンビン抑制アッセイで３４４ＩＵ／ｍｇ、第Ｘａ因子抑制アッセイで３１８ＩＵ／ｍｇという高い抗凝固活性を示した。ＬＡフラクションは、どちらのアッセイでも本質的に活性を欠いていた（＜５ＩＵ／ｍｇ）（表１）。
【００５２】
実施例２
基本的に上述した（Ｌａｒｍ  ｅｔ  ａｌ．欧州特許第００８６１８６号明細書）ような技術を用いて、冠動脈ステントにヘパリンフラクションをコーティングした。５０個のステントのロット２組に対し、それぞれＨＡフラクションとＬＡフラクションをコーティングした。次いで、コーティング済みのステントを酸化エチレン（ＥＯ）で滅菌した。ステントのヘパリン密度を表２に示す。ヘパリン密度は、両調製物で本質的に同一の約５μｇ／ｃｍ２であった。
【００５３】
霊長類の動物実験モデルにおいて、ステントに対する２種類のヘパリンコーティングの非血栓形成特性について検討した。放射線標識した血小板を注射した非抗凝固ヒヒにて、ステントを半ビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）で動静脈（ＡＶ）シャントに留置して膨らませた。ステント表面への血小板の付着をガンマカメラで断続的に監視し、２時間にわたって記録した。コーティング処理をしていないＰＳ１５３ステントを対照として用いた。結果を図１に示す。ＨＡステントでは血小板の付着は認められなかった。一方、コーティングを施していない対照のステントを移植すると血小板はすぐに付着しはじめ、この付着は実験が終わるまで続いた。ＬＡステントでは、１時間の時点までは対照のステントよりも若干付着量が少ない程度であったが、２時間経過後にはその差がなくなり、ＬＡステントは対照のステントと本質的に同じ反応を示した。
【００５４】
【表１】
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【００５５】
【表２】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  ＨＡヘパリンフラクションおよびＬＡヘパリンフラクションをそれぞれコーティングしたステントと対照のステントへの血小板の付着を示すグラフである。コーティングを施していないＰＳ１５３ステントを対照として用いた。カッコ内の数字は実験回数と各実験で用いた動物の個体数と関連している。
【図１】
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