(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
乾燥状態におかれていたガングリオシド抗原を界面活性作用を有する物質及び／又はタンパク質と接触させることよりなる、乾燥状態におかれていたガングリオシド抗原の活性化方法。
【請求項２】
界面活性作用を有する物質が界面活性剤である、請求項１記載の活性化方法。
【請求項３】
界面活性作用を有する物質が、非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤及び両性界面活性剤から選ばれる少なくとも１種の界面活性剤である、請求項１又は２記載の活性化方法。
【請求項４】
界面活性作用を有する物質が、両性界面活性剤以外の界面活性作用を有する物質である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の活性化方法。
【請求項５】
タンパク質が、アルブミンである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の活性化方法。
【請求項６】
ガングリオシド抗原が担体に固定化されたものである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の活性化方法。
【請求項７】
ガングリオシド抗原が乾燥状態におかれてその抗原活性が低下したものである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の活性化方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、糖脂質抗原の活性化及び試料中の抗糖脂質抗体の測定に関するものである。
本発明は、糖脂質分野、生化学分野、分析化学分野、臨床検査分野及び生命科学分野等において重要なものであるが、特に神経疾患等の診断において重要なものである。
【０００２】
【従来の技術】
糖脂質は、従来より神経組織に多く存在することが知られており、神経組織の糖脂質に反応する抗体が体液中に産生されると重篤な神経症状を起こすことが知られるようになってきた。
これらの自己抗体は、先行感染した菌体に対するものとして体内に産生され、これが神経組織の糖脂質抗原と交差反応し、自己抗体として神経を傷害する自己免疫型の神経疾患を起こすことが知られている。
【０００３】
例えば、糖脂質抗原に対する抗体（抗糖脂質抗体）の一つであるＩｇＧ型の抗ＧＭ１ａ抗体は、急性軸策型ギラン・バレー症候群などの運動神経疾患に関与することが知られている。
急性軸策型ギラン・バレー症候群の場合、食中毒菌として知られる菌体Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉが先行感染し、菌体のリポ多糖（ＬＰＳ）上のＧＭ１ａと類似の糖鎖構造部分に対する抗体が体内に産生されることにより発病する。（結城ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７８巻，１７７１〜１７７５頁，１９９３年）
そして、この抗体は血液中に見い出されることが判明している。（Ａ．Ｊ．Ｋｏｒｎｂｅｒｇら，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．，３５巻，２３４〜２３７頁，１９９４年；Ｌ．Ｈ．Ｖｉｓｓｅｒら，Ｂｒａｉｎ，１１８巻，８４１〜８４７頁，１９９５年）
【０００４】
現状では効果的な治療法は、血漿交換療法、免疫グロブリンの大量静脈注射療法、又は免疫吸着療法であるが、病因である抗ＧＭ１ａ抗体が測定されることは少ない。
なぜなら、国内では測定試薬もなく、海外の検査センターに血清試料を送って検査している程度であるからである。
【０００５】
また、別の抗糖脂質抗体であるＩｇＧ型の抗ＧＱ１ｂ抗体は、フィッシャー症候群やビッカースタッフ型脳幹脳炎などの神経疾患に関与しており、その所見は脳幹梗塞などの他の中枢神経系疾患と類似しているが、その治療法は全く異なる。
この抗体も患者血清中に見い出される。（千葉ら，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．，３１巻，６７７〜６７９頁，１９９２年；結城ら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．，１１８巻，８３〜８７頁，１９９３年）
その他、感覚失調型ポリニューロパシーで抗ＧＤ２抗体、抗ＧＴ１ｂ抗体、抗ＧＱ１ｂ抗体が上昇するとの報告や感覚神経疾患で抗スルファチド抗体が高いとの報告がある。
また、糖脂質抗原と反応する抗体が癌患者由来試料より検出されるとの報告もある。
【０００６】
以上のように、研究レベルでは各種疾患と抗糖脂質抗体の関係が解き明かされ、臨床現場で使用できる抗糖脂質抗体の測定試薬及び測定方法が待たれているが、ヒト由来試料中の抗糖脂質抗体の測定試薬及び測定方法はその実用化の困難さゆえ、未だ実用化されるには至っていない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、試料中の抗糖脂質抗体を簡便かつ正確に測定することができる方法及び試薬を開発すべく研究を進めている中で、以下のことに気が付いた。
すなわち、試料に含まれていた抗糖脂質抗体を、糖脂質抗原と抗原抗体反応により特異的に結合させ、この糖脂質抗原に結合した抗糖脂質抗体を測ることにより、試料に含まれていた抗糖脂質抗体を測定しようとする際に、糖脂質抗原の抗原活性が低下してしまっており、試料に含まれていた抗糖脂質抗体と充分に反応（結合）することができず、このため測定により得られるシグナルが低いものとなってしまい、低い感度でしか測定が行えないということである。
この糖脂質抗原の抗原活性の低下は、特に乾燥状態におかれていたものにおいて顕著であった。
【０００８】
そこで、本発明者らは、この糖脂質抗原の抗原活性を活性化すること、そして、糖脂質抗原を用いた試料中の抗糖脂質抗体の測定を高感度に行えるようにし、正確な測定値が得られるようにすることを課題として検討を行い、その結果解決手段を見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
以下の本発明の構成により、前記の課題を解決することができる。
【００１０】
（１）  界面活性作用を有する物質及び／又はタンパク質よりなる、乾燥状態におかれていたガングリオシド抗原の活性化剤。
（２）  界面活性作用を有する物質が界面活性剤である、前記（１）記載の活性化剤。
（３）  界面活性作用を有する物質が、非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤及び両性界面活性剤から選ばれる少なくとも１種の界面活性剤である、前記（１）又は（２）記載の活性化剤。
（４）  界面活性作用を有する物質が、両性界面活性剤以外の界面活性作用を有する物質である、前記（１）〜（３）のいずれか１項に記載の活性化剤。
（５）  タンパク質が、アルブミンである、前記（１）〜（４）のいずれか１項に記載の活性化剤。
（６）  ガングリオシド抗原が担体に固定化されたものである、前記（１）〜（５）のいずれか１項に記載の活性化剤。
（７）  ガングリオシド抗原が乾燥状態におかれてその抗原活性が低下したものである、前記（１）〜（６）のいずれか１項に記載の活性化剤。
【００１１】
（８）  乾燥状態におかれていたガングリオシド抗原を界面活性作用を有する物質及び／又はタンパク質と接触させることよりなる、乾燥状態におかれていたガングリオシド抗原の活性化方法。
（９）  界面活性作用を有する物質が界面活性剤である、前記（８）記載の活性化方法。
（１０）  界面活性作用を有する物質が、非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤及び両性界面活性剤から選ばれる少なくとも１種の界面活性剤である、前記（８）又は（９）記載の活性化方法。
（１１）  界面活性作用を有する物質が、両性界面活性剤以外の界面活性作用を有する物質である、前記（８）〜（１０）のいずれか１項に記載の活性化方法。
（１２）  タンパク質が、アルブミンである、前記（８）〜（１１）のいずれか１項に記載の活性化方法。
（１３）  ガングリオシド抗原が担体に固定化されたものである、前記（８）〜（１２）のいずれか１項に記載の活性化方法。
（１４）  ガングリオシド抗原が乾燥状態におかれてその抗原活性が低下したものである、前記（８）〜（１３）のいずれか１項に記載の活性化方法。
【００１２】
（１５）  試料中のガングリオシドに対する抗体を、ガングリオシド抗原と抗原抗体反応させることにより測定を行う方法において、乾燥状態におかれていた前記ガングリオシド抗原を界面活性作用を有する物質及び／又はタンパク質よりなるガングリオシド抗原の活性化剤と接触させた後に、前記ガングリオシド抗原を前記試料に含まれていたガングリオシドに対する抗体と接触させ、反応させることを特徴とする、試料中のガングリオシドに対する抗体の測定方法。
（１６）  界面活性作用を有する物質が界面活性剤である、前記（１５）記載の測定方法。
（１７）  界面活性作用を有する物質が、非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤及び両性界面活性剤から選ばれる少なくとも１種の界面活性剤である、前記（１５）又は（１６）記載の測定方法。
（１８）  界面活性作用を有する物質が、両性界面活性剤以外の界面活性作用を有する物質である、前記（１５）〜（１７）のいずれか１項に記載の測定方法。
（１９）  タンパク質が、アルブミンである、前記（１５）〜（１８）のいずれか１項に記載の測定方法。
（２０）  ガングリオシド抗原が担体に固定化されたものである、前記（１５）〜（１９）のいずれか１項に記載の測定方法。
（２１）  ガングリオシド抗原が乾燥状態におかれてその抗原活性が低下したものである、前記（１５）〜（２０）のいずれか１項に記載の測定方法。
【００１３】
（２２）  試料中のガングリオシドに対する抗体を、ガングリオシド抗原と抗原抗体反応させることにより測定を行う測定試薬キットにおいて、界面活性作用を有する物質及び／又はタンパク質よりなる乾燥状態におかれていたガングリオシド抗原の活性化剤を含有する試薬を含むことを特徴とする、試料中のガングリオシドに対する抗体の測定試薬キット。
（２３）  界面活性作用を有する物質が界面活性剤である、前記（２２）記載の測定試薬キット。
（２４）  界面活性作用を有する物質が、非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤及び両性界面活性剤から選ばれる少なくとも１種の界面活性剤である、前記（２２）又は（２３）記載の測定試薬キット。
（２５）  界面活性作用を有する物質が、両性界面活性剤以外の界面活性作用を有する物質である、前記（２２）〜（２４）のいずれか１項に記載の測定試薬キット。
（２６）  タンパク質が、アルブミンである、前記（２２）〜（２５）のいずれか１項に記載の測定試薬キット。
（２７）  ガングリオシド抗原が担体に固定化されたものである、前記（２２）〜（２６）のいずれか１項に記載の測定試薬キット。
（２８）  ガングリオシド抗原が乾燥状態におかれてその抗原活性が低下したものである、前記（２２）〜（２７）のいずれか１項に記載の測定試薬キット。
【００１４】
〔１〕  糖脂質抗原の活性化剤
本発明の糖脂質抗原の活性化剤は、界面活性作用を有する物質及び／又はタンパク質よりなるものである。
【００１５】
なお、界面活性作用とは、二つの相が接するとき、その界面に一つ又は二つの相に溶けている物質が強く吸着し界面張力を低下させる作用のことである。
本発明における界面活性作用を有する物質は、界面活性作用を有する物質であれば、特に制限なく用いることができる。
この界面活性作用を有する物質は、その分子内に親水性原子団と疎水性原子団を持つ両親媒性物質が代表的なものである。
【００１６】
この界面活性作用を有する物質としては、例えば、界面活性剤等の界面活性作用を有することが知られている物質を挙げることができる。
界面活性剤としては、例えば、非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、及び両性界面活性剤等を挙げることができる。
【００１７】
▲１▼  非イオン性界面活性剤としては、例えば、以下のもの等を挙げることができる。
（ａ）  ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシプロピレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンポリスチリルフェニルエーテル、又はポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールなどのポリオキシアルキレンエーテル化合物。
【００１８】
（ｂ）  グリセリン脂肪酸部分エステル、ソルビタン脂肪酸部分エステル、ペンタエリスリトール脂肪酸部分エステル、プロピレングリコールモノ脂肪酸エステル、又はショ糖脂肪酸部分エステルなどの多価アルコール部分エステル化合物。
【００１９】
（ｃ）  ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸部分エステル、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸部分エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸部分エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸部分エステル、又はポリオキシエチレン化ひまし油などのポリオキシエチレン化多価アルコール脂肪酸エステル。
【００２０】
（ｄ）  脂肪酸ジエタノールアミド、Ｎ，Ｎ−ビス−２−ヒドロキシアルキルアミン、ポリオキシエチレンアルキルアミン、トリエタノールアミン脂肪酸エステル、又はトリアルキルアミンオキシドなどのアミド若しくはアミン化合物。
【００２１】
▲２▼  陰イオン性界面活性剤としては、例えば、以下のもの等を挙げることができる。
（ａ）  脂肪族モノカルボン酸塩、Ｎ−アシロイルサルコシン塩、Ｎ−アシロイル−β−アラニン塩、若しくはＮ−アシロイルグルタミン酸塩などの脂肪族化合物カルボン酸塩；又はアビエチン酸塩などの環式化合物カルボン酸塩。
【００２２】
（ｂ）  ジアルキルスルホコハク酸塩、アルカンスルホン酸塩、若しくはヒドロキシアルカンスルホン酸塩などの脂肪族化合物スルホン酸塩；直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキル（分岐鎖）ベンゼンスルホン酸塩、アルキルナフタレンスルホン酸塩、アルキルフェノキシポリオキシエチレンプロピルスルホン酸塩、ポリオキシエチレンアルキルフェノールスルホン酸塩、若しくはナフタレンスルホン酸塩−ホルムアルデヒド縮合物などの環式化合物スルホン酸塩；又はＮ−メチル−Ｎ−オレイルタウリンナトリウム、若しくはＮ−アルキルスルホコハク酸モノアミド二ナトリウム塩などの含窒素化合物スルホン酸塩。
【００２３】
（ｃ）  硫酸化ひまし油、硫酸化牛脚油、脂肪酸アルキルエステル・硫酸エステル塩、アルキル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸エステル塩、脂肪酸モノグリセリド硫酸エステル塩、若しくはポリオキシエチレンアルキロイルアミド硫酸塩などの脂肪族化合物硫酸エステル塩；又はポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸エステル塩、若しくはポリオキシエチレンスチリルフェニルエーテル硫酸エステル塩などの環式化合物硫酸エステル塩。
【００２４】
（ｄ）  アルキルリン酸エステル塩、若しくはポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸エステル塩などの脂肪族化合物リン酸エステル塩；又はポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルリン酸エステル塩などの環式化合物リン酸エステル塩。
【００２５】
（ｅ）  スチレン−無水マレイン酸共重合物の部分けん化物、又はオレフィン−無水マレイン酸共重合物の部分けん化物などの重合型高分子化合物のけん化物。
【００２６】
（ｆ）  ナフタレンスルホン酸塩−ホルマリン縮合物などの重縮合型高分子化合物。
【００２７】
▲３▼  陽イオン性界面活性剤としては、例えば、以下のもの等を挙げることができる。
（ａ）  モノアルキルアミン塩、ジアルキルアミン塩、又はトリアルキルアミン塩などの脂肪族化合物アミン塩。
【００２８】
（ｂ）  テトラアルキルアンモニウム塩などの脂肪族化合物第四級アンモニウム塩；又はトリアルキルベンジルアンモニウム塩、アルキルピリジニウム塩、２−アルキル−１−アルキル−１−ヒドロキシエチルイミダゾリニウム塩、若しくはＮ，Ｎ−ジアルキルモルホリニウム塩などの環状化合物第四級アンモニウム塩。
【００２９】
（ｃ）  ポリエチレンポリアミン脂肪族アミド塩、ポリエチレンポリアミン脂肪族アミドの尿素縮合物の塩、又はポリエチレンポリアミン脂肪族アミド尿素縮合物の第四級アンモニウム塩などのポリエチレンポリアミン誘導体。
【００３０】
▲４▼  両性界面活性剤としては、例えば、以下のもの等を挙げることができる。
（ａ）  Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−アルキル−Ｎ−カルボキシアルキレンアンモニウムベタインなどのカルボキシベタイン化合物。
【００３１】
（ｂ）  Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノアルキレンカルボン酸塩などのアミノカルボン酸化合物。
【００３２】
（ｃ）  Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリアルキル−Ｎ−スルホアルキレンアンモニウムベタインなどのスルホベタイン化合物。
【００３３】
（ｄ）  Ｎ−アルキル−Ｎ，Ｎ−ビスポリオキシエチレン硫酸エステル塩などのアミノ硫酸エステル化合物。
【００３４】
（ｅ）  ２−アルキル−１−ヒドロキシエチル−１−カルボキシメチルイミダゾリニウム塩などのイミダゾリン化合物。
【００３５】
本発明の糖脂質抗原の活性化剤においては、１種類の界面活性作用を有する物質だけを用いてもよく、又は２種類以上の界面活性作用を有する物質を組み合わせて用いてもよい。
【００３６】
本発明におけるタンパク質は、タンパク質であれば特に制限なく用いることができる。
【００３７】
タンパク質としては、例えば、アルブミン、カゼイン、又はゼラチン等を挙げることができる。
これらのタンパク質は、ヒト由来、ウシ由来、ブタ由来、ウマ由来、鶏卵由来、又は遺伝子工学技術により調製したもの等、いずれに由来するものでも制限なく用いることができる。
【００３８】
本発明の糖脂質抗原の活性化剤においては、１種類のタンパク質だけを用いてもよく、又は２種類以上のタンパク質を組み合わせて用いてもよい。
【００３９】
本発明の糖脂質抗原の活性化剤においては、前記の界面活性作用を有する物質だけを用いてもよく、若しくは、前記のタンパク質だけをもちいてもよく、又は前記の界面活性作用を有する物質と前記のタンパク質とを組み合わせて用いてもよい。
【００４０】
本発明における糖脂質抗原の抗原活性の活性化は、界面活性作用を有する物質及び／又はタンパク質を糖脂質抗原と接触させることにより達成することができる。
【００４１】
これは、例えば、界面活性作用を有する物質及び／又はタンパク質を含有する溶液を、糖脂質抗原に接触させることにより、界面活性作用を有する物質及び／又はタンパク質と糖脂質抗原との接触を行うことができる。
【００４２】
すなわち、本発明の糖脂質抗原の活性化剤は、界面活性作用を有する物質及び／又はタンパク質を含有する水溶液等の溶液であってもよく、好適である。
【００４３】
この際の、溶液中の界面活性作用を有する物質の濃度であるが、これは、適宜適した濃度を用いればよいが、通常、０．０００１％（ｗ／ｖ）以上の濃度とすることが好ましく、０．００１％（ｗ／ｖ）以上の濃度とすることがより好ましく、そして、０．００４％（ｗ／ｖ）以上の濃度とすることが特に好ましい。
【００４４】
なお、この濃度の上限であるが、この濃度が余りに高くなり過ぎると、担体に固定化された糖脂質抗原が剥離してくる可能性も考えられる。
よって、通常は、５％（ｗ／ｖ）以下の濃度とすることが好ましく、０．５％（ｗ／ｖ）以下の濃度とすることがより好ましく、０．１％（ｗ／ｖ）以下の濃度とすることが更に好ましく、０．０１％（ｗ／ｖ）以下の濃度とすることが特にに好ましい。
【００４５】
また、溶液中のタンパク質の濃度であるが、これは、適宜適した濃度を用いればよいが、通常、０．００１％（ｗ／ｖ）以上の濃度とすることが好ましく、０．０１％（ｗ／ｖ）以上の濃度とすることがより好ましく、そして、０．１％（ｗ／ｖ）以上の濃度とすることが特に好ましい。
【００４６】
なお、この濃度の上限は特にはないものの、コスト上の観点より、通常は、２０％（ｗ／ｖ）以下の濃度とすることが好ましく、１０％（ｗ／ｖ）以下の濃度とすることがより好ましい。
【００４７】
本発明において、糖脂質抗原とは、その分子内に水溶性糖鎖と脂溶性基の両者を含む物質（糖脂質）であり、測定を行おうとする抗糖脂質抗体と特異的に結合することが可能な物質のことである。
【００４８】
本発明における糖脂質抗原には、スフィンゴ糖脂質、及びグリセロ糖脂質等が含まれるものである。
【００４９】
また、本発明における糖脂質抗原には、シアル酸を含む糖脂質であるガングリオシド、硫酸を含む糖脂質であるスルファチド（スルホリピド）、ウロン酸を含む糖脂質、又はリン酸を含む糖脂質などの酸性糖脂質、及び中性糖脂質等が含まれるものである。
【００５０】
なお、ガングリオシド（シアロ糖脂質）は、シアル酸を含むスフィンゴ糖脂質の総称である。
このガングリオシドとしては、例えば、ＧＭ１ａ、ＧＭ１ｂ、ＧＭ１−Ｆｕｃ、ＧＭ２、ＧＭ３、ＧＭ３（ＮｅｕＧｃ）、ＧＭ４、ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＤ３（ＮｅｕＡｃ／ＮｅｕＧｃ）、ＧＤ３（ＮｅｕＧｃ）２、ＧＴ１ａ、ＧＴ１ｂ、ＧＴ１ｃ、ＧＱ１ａ、ＧＱ１ｂ、ＧＱ１ｃ、ＧＰ１ａ、ＧＰ１ｂ、ＧＰ１ｃ、又はＬＭ１等を挙げることができる。
【００５１】
本発明の糖脂質抗原の活性化剤においては、糖脂質抗原がガングリオシド（ガングリオシド抗原）である場合に好適である。
【００５２】
本発明の糖脂質抗原の活性化剤には、界面活性作用を有する物質及び／又はタンパク質とともに他の物質を共存させてもよい。
この他の物質としては、例えば、塩類；各種糖類；脱脂粉乳；正常ウサギ血清、正常マウス血清、正常ウシ血清、若しくは正常ウマ血清などの各種動物血清、アジ化ナトリウム又は抗生物質などの各種防腐剤等の１種又は２種以上等を適宜共存させてもよい。
これらを糖脂質抗原の活性化剤に存在させる際の濃度は、特に限定されるものではないが、０．００１〜１０％（ｗ／ｖ）が好ましく、特に０．０１〜５％（ｗ／ｖ）が好ましい。
【００５３】
また、本発明の糖脂質抗原の活性化剤には、界面活性作用を有する物質及び／又はタンパク質とともに緩衝剤を共存させてもよい。
この緩衝剤としては、例えば、ＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓプロパン、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＰＳＯ、ＥＰＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、リン酸、リン酸塩、リン酸等張化緩衝液（ＰＢＳ）、ホウ酸、ホウ酸塩、グリシン、グリシルグリシン、イミダゾール、又はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン〔Ｔｒｉｓ〕等を挙げることができる。
この緩衝剤を糖脂質抗原の活性化剤に存在させる際の濃度は、特に限定されるものではないが、１〜２０００ｍＭが好ましく、特に５〜１０００ｍＭが好ましい。
【００５４】
本発明の糖脂質抗原の活性化剤は、担体に固定化された糖脂質抗原に対して特に好適である。
【００５５】
この担体としては、粒子、マイクロタイタープレート（マイクロプレート）、試験管、トレイ、マイクロカプセル、ビーズ、スティック、試験片、イムノクロマト法用の担体、その他の容器、又はその他の測定器具等を挙げることができる。
【００５６】
この担体の材質としては、例えば、ポリスチレン、ポリカーボネイト、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、メタクリル酸重合体、ポリアクリルアミド、ラテックス、リポソーム、ゼラチン、アガロース、セルロース、セファロース、ガラス、シリカゲル、カーボン、ベントナイト、リン脂質、エマルジョン、金属、又は磁性体等を挙げることができる。
【００５７】
なお、糖脂質抗原を固定化する担体の材質としては、ポリ塩化ビニルが好適である。
【００５８】
糖脂質抗原の担体への固定化の方法としては、例えば、化学結合法、又は物理吸着法等を挙げることができる。
【００５９】
なお、糖脂質抗原の抗原活性の低下は、特に乾燥状態におかれていたものにおいて顕著であるため、本発明の糖脂質抗原の活性化剤は、乾燥状態におかれていた糖脂質抗原の抗原活性の活性化において特に好適である。
【００６０】
この糖脂質抗原の乾燥状態としては、例えば、凍結乾燥されたもの、真空乾燥されたもの、風を当てられ乾燥されたもの、又は自然乾燥されたもの等を挙げることができる。
【００６１】
〔２〕  糖脂質抗原の活性化方法
本発明の糖脂質抗原の活性化方法は、糖脂質抗原を界面活性作用を有する物質及び／又はタンパク質と接触させることよりなる。
【００６２】
糖脂質抗原を、界面活性作用を有する物質及び／又はタンパク質と接触させることにより、この糖脂質抗原の抗原活性の活性化が達成される。
【００６３】
なお、界面活性作用を有する物質、タンパク質、及び糖脂質抗原等については、前記〔１〕に記載した通りである。
【００６４】
本発明の糖脂質抗原の活性化方法における界面活性作用を有する物質及び／又はタンパク質としては、界面活性剤が好適である。
【００６５】
また、本発明の糖脂質抗原の活性化方法は、担体に固定化された糖脂質抗原に対して好適である。
【００６６】
そして、本発明の糖脂質抗原の活性化方法は、乾燥状態におかれていた糖脂質抗原に対して好適である。
【００６７】
更に、本発明の糖脂質抗原の活性化方法においては、糖脂質抗原がガングリオシド（ガングリオシド抗原）である場合に好適である。
【００６８】
界面活性作用を有する物質及び／又はタンパク質を、糖脂質抗原と接触させる時間であるが、これは、適宜適した時間接触させればよいが、通常、３０秒間以上が好ましく、１分間以上がより好ましく、４分間以上が特に好ましい。
【００６９】
なお、この接触時間の上限は特にはない。
但し、強いて挙げるとすると、作業時間が長くなることによりコストが上昇するとの観点に立てば、接触時間は１０時間以内とすることが好ましく、３時間以内とすることがより好ましく、１時間以内とすることが特に好ましい。
【００７０】
界面活性作用を有する物質及び／又はタンパク質を、糖脂質抗原と接触させる際の温度であるが、これは、糖脂質抗原、界面活性作用を有する物質、及び／又はタンパク質が、熱で変性、失活してしまわない程度の温度（通常、５５℃以下）で接触を行えばよい。
通常、２〜３７℃の範囲内の温度において接触させることが好ましく、２〜３０℃の範囲内の温度がより好ましく、１５〜３０℃の範囲内の温度が特に好ましい。
【００７１】
〔３〕  試料中の抗糖脂質抗体の測定方法
本発明の試料中の抗糖脂質抗体の測定方法は、試料中の抗糖脂質抗体を、糖脂質抗原と抗原抗体反応させることにより測定を行う方法において、前記糖脂質抗原を界面活性作用を有する物質及び／又はタンパク質と接触させた後に、前記糖脂質抗原を前記試料に含まれていた抗糖脂質抗体と接触させ、反応させることを特徴とするものである。
【００７２】
糖脂質抗原を、界面活性作用を有する物質及び／又はタンパク質と接触させて、この糖脂質抗原の抗原活性を活性化させ、その後に、この活性化させた糖脂質抗原を試料に含まれていた抗糖脂質抗体と接触させ、反応させることにより、抗糖脂質抗体の高感度な測定が達成されるものである。
【００７３】
なお、界面活性作用を有する物質、タンパク質、及び糖脂質抗原等については、前記〔１〕に記載した通りであり、この界面活性作用を有する物質及び／又はタンパク質による糖脂質抗原の活性化方法等については、前記〔２〕に記載した通りである。
【００７４】
本発明の試料中の抗糖脂質抗体の測定方法における界面活性作用を有する物質及び／又はタンパク質としては、界面活性剤が好適である。
【００７５】
そして、本発明の試料中の抗糖脂質抗体の測定方法においては、糖脂質抗原が担体に固定化されている場合に好適である。
【００７６】
また、本発明の試料中の抗糖脂質抗体の測定方法においては、糖脂質抗原が乾燥状態におかれていた場合に好適である。
【００７７】
更に、本発明の試料中の抗糖脂質抗体の測定方法においては、糖脂質抗原がガングリオシド（ガングリオシド抗原）である場合に好適である。
【００７８】
本発明の試料中の抗糖脂質抗体の測定方法においては、試料に含まれていた抗糖脂質抗体を、糖脂質抗原と接触させ、両者間の抗原抗体反応により結合を行わせて測定を行う際に、この抗原抗体反応の前に、糖脂質抗原を界面活性作用を有する物質及び／又はタンパク質と接触させ、糖脂質抗原の抗原活性を活性化させることを特徴とするものである。
【００７９】
なお、本発明の試料中の抗糖脂質抗体の測定方法においては、界面活性作用を有する物質及び／又はタンパク質（界面活性作用を有する物質及び／又はタンパク質を含有する溶液）を糖脂質抗原と接触させた後に、この界面活性作用を有する物質及び／又はタンパク質（界面活性作用を有する物質及び／又はタンパク質を含有する溶液）を糖脂質抗原より分離、除去し、その後に、糖脂質抗原と試料に含まれていた抗糖脂質抗体とを接触、反応させてもよい。
【００８０】
また、界面活性作用を有する物質及び／又はタンパク質（界面活性作用を有する物質及び／又はタンパク質を含有する溶液）を糖脂質抗原と接触させた後に、この界面活性作用を有する物質及び／又はタンパク質（界面活性作用を有する物質及び／又はタンパク質を含有する溶液）を糖脂質抗原より分離、除去することなく、更に、糖脂質抗原を試料に含まれていた抗糖脂質抗体と接触させ、反応させてもよい。
【００８１】
本発明の試料中の抗糖脂質抗体の測定方法において、試料は、抗糖脂質抗体が存在する可能性があり、抗糖脂質抗体の測定を行おうとするものであれば、どのようなものでもよい。
このようなものの例として、ヒト若しくは動物の血液、血清、血漿、若しくは髄液などの体液；ヒト若しくは動物の臓器若しくは筋肉などの抽出液；又は細胞若しくは菌体などの抽出液等を挙げることができる。
【００８２】
また、本発明の試料中の抗糖脂質抗体の測定方法において、抗糖脂質抗体は、糖脂質に対して特異的に結合することができる抗体である。
【００８３】
本発明において、抗糖脂質抗体としては、例えば、スフィンゴ糖脂質に対する抗体、又はグリセロ糖脂質に対する抗体等を挙げることができる。
【００８４】
更に、本発明において、抗糖脂質抗体としては、例えば、酸性糖脂質に対する抗体、又は中性糖脂質に対する抗体等を挙げることができる。
【００８５】
そして、酸性糖脂質に対する抗体としては、例えば、ガングリオシドに対する抗体、スルファチドに対する抗体、ウロン酸を含む糖脂質に対する抗体、又はリン酸を含む糖脂質に対する抗体等を挙げることができる。
【００８６】
また、ガングリオシドに対する抗体としては、例えば、抗ＧＭ１ａ抗体、抗ＧＭ１ｂ抗体、抗ＧＭ１−Ｆｕｃ抗体、抗ＧＭ２抗体、抗ＧＭ３抗体、抗ＧＭ３（ＮｅｕＧｃ）抗体、抗ＧＭ４抗体、抗ＧＤ１ａ抗体、抗ＧＤ１ｂ抗体、抗ＧＤ２抗体、抗ＧＤ３抗体、抗ＧＤ３（ＮｅｕＡｃ／ＮｅｕＧｃ）抗体、抗ＧＤ３（ＮｅｕＧｃ）２抗体、抗ＧＴ１ａ抗体、抗ＧＴ１ｂ抗体、抗ＧＴ１ｃ抗体、抗ＧＱ１ａ抗体、抗ＧＱ１ｂ抗体、抗ＧＱ１ｃ抗体、抗ＧＰ１ａ抗体、抗ＧＰ１ｂ抗体、抗ＧＰ１ｃ抗体、又は抗ＬＭ１抗体等を挙げることができる。
【００８７】
本発明の試料中の抗糖脂質抗体の測定方法においては、抗糖脂質抗体がガングリオシドに対する抗体である場合に好適である。
【００８８】
本発明の試料中の抗糖脂質抗体の測定方法において、試料中の抗糖脂質抗体を、糖脂質抗原と抗原抗体反応させることにより測定を行う方法の測定原理は、特に制限はなく、どのような測定原理のものであってもよい。
【００８９】
例えば、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法、若しくは発光免疫測定法などの標識物質を用いる免疫測定法（標識免疫測定法）；ラテックス比濁法；ラテックス凝集反応測定法、赤血球凝集反応測定法、若しくは粒子凝集反応測定法などの間接凝集反応測定法；イムノクロマト法；ウエスタンブロット法；又は特開平９−２２９９３６号公報及び特開平１０−１３２８１９号公報などに記載された測定対象物質（被検物質）に対する特異的結合物質が固定され被覆された面を有する担体並びに測定対象物質（被検物質）に対する特異的結合物質が固定された粒子を用いる測定法等を挙げることができる。
【００９０】
そして、前記の標識免疫測定法の場合、サンドイッチ法、競合法、又は均一系法（ホモジニアス系法）等のいずれの手法においても本発明を適用することができる。
【００９１】
なお、本発明の試料中の抗糖脂質抗体の測定方法においては、測定は用手法により行ってもよいし、又は分析装置等の装置を用いて行ってもよい。
【００９２】
また、測定は、１ステップ法（１試薬法）により行ってもよいし、又は２ステップ法（２試薬法）等の複数の操作ステップにより行う方法によって実施してもよい。
【００９３】
なお、本発明の試料中の抗糖脂質抗体の測定方法においては、いずれの測定原理（測定法）に基づいて実施するにしても、その測定原理（測定法）の公知の手法に従って、測定を行えばよい。
【００９４】
本発明の試料中の抗糖脂質抗体の測定方法を、酵素免疫測定法などの標識免疫測定法を測定原理とする方法により実施する場合を例にとって、以下具体的に説明を行う。
標識免疫測定法のサンドイッチ法により測定を行う場合の一例を示す。
【００９５】
▲１▼  測定を行おうとする抗糖脂質抗体と特異的に結合することができる糖脂質抗原を固定化した担体を用意する。（例えば、抗ＧＭ１ａ抗体の測定においては、ＧＭ１ａをウェルに固定化したマイクロタイタープレートを用意する。）
【００９６】
▲２▼  前記▲１▼の担体の糖脂質抗原を固定化した部位に、界面活性作用を有する物質及び／又はタンパク質を含有する溶液を添加し、接触させる。
これにより、担体に固定化された糖脂質抗原に、界面活性作用を有する物質及び／又はタンパク質を接触させて、この糖脂質抗原の抗原活性の活性化を行う。
【００９７】
▲３▼  一定時間後、前記▲２▼で担体に添加した、界面活性作用を有する物質及び／又はタンパク質を含有する溶液を吸い取り、除去する。
【００９８】
▲４▼  次に、試料としてヒト血清を、担体の糖脂質抗原を固定化した部位に一定量添加し、一定時間接触させる。
これにより、試料中に測定対象物質である抗糖脂質抗体が存在する場合には、抗原抗体反応により、「担体−糖脂質抗原−抗糖脂質抗体」の結合を形成させる。（例えば、「マイクロタイタープレートのウェル−ＧＭ１ａ−抗ＧＭ１ａ抗体」）
【００９９】
▲５▼  この試料の添加、接触と同時に、若しくは一定時間のうちに、又は洗浄の後に、前記の抗糖脂質抗体と特異的に結合することができる物質に酵素等の標識物質を結合させたものの一定量を、担体の糖脂質抗原を固定化した部位に添加して、一定時間接触させる。
【０１００】
なお、抗糖脂質抗体と特異的に結合することができる物質としては、例えば、この抗糖脂質抗体に対する抗体、又はこの抗糖脂質抗体と結合することができる抗原等を挙げることができる。
【０１０１】
より具体的には、この抗糖脂質抗体に対する抗体としては、例えば、抗ヒトＩｇＧ抗体、抗ヒトＩｇＡ抗体、抗ヒトＩｇＭ抗体、抗ヒトＩｇＤ抗体、及び抗ヒトＩｇＥ抗体より選ばれる１種又は２種以上の抗体等を挙げることができる。
【０１０２】
また、この抗糖脂質抗体と結合することができる抗原としては、例えば、この抗糖脂質抗体と結合することができる糖脂質抗原等を挙げることができる。（例えば、抗糖脂質抗体が抗ＧＭ１ａ抗体である場合には、ＧＭ１ａを挙げることができる。）
【０１０３】
この操作により、試料中に測定対象物質である抗糖脂質抗体が存在する場合には、「担体−糖脂質抗原−抗糖脂質抗体−抗糖脂質抗体と特異的に結合することができる物質−標識物質」の結合が形成される。（例えば「マイクロタイタープレートのウェル−ＧＭ１ａ−抗ＧＭ１ａ抗体−抗ヒトＩｇＧ抗体−標識酵素」）
【０１０４】
▲６▼  次に、担体に結合していない未結合の「標識物質を結合した、抗糖脂質抗体と特異的に結合することができる物質」を洗浄し、除去する。
【０１０５】
▲７▼  そして、「担体−糖脂質抗原−抗糖脂質抗体−抗糖脂質抗体と特異的に結合することができる物質−標識物質」の結合により担体に結合した標識物質を検出することにより、試料に含まれていた抗糖脂質抗体の測定を行う。
【０１０６】
この測定においては、担体と標識物質が、試料に含まれていた抗糖脂質抗体を介して、「担体−糖脂質抗原−抗糖脂質抗体−抗糖脂質抗体と特異的に結合することができる物質−標識物質」と結合するので、担体に結合した標識物質の量を測定することにより、試料に含まれていた抗糖脂質抗体の有無、又は量を測定することができるものである。
【０１０７】
なお、前記▲５▼において用いる「標識物質を結合した、抗糖脂質抗体と特異的に結合することができる物質」として、「標識物質を結合した、クラス別のヒト免疫グロブリンに対する抗体」を使用することにより、試料中の抗糖脂質抗体を免疫グロブリンのクラス別に測定することが可能となる。
このクラス別のヒト免疫グロブリンに対する抗体としては、例えば、抗ヒトＩｇＧ抗体、抗ヒトＩｇＡ抗体、抗ヒトＩｇＭ抗体、抗ヒトＩｇＤ抗体、又は抗ヒトＩｇＥ抗体等を挙げることができる。
【０１０８】
また、これらの「標識物質を結合した、クラス別のヒト免疫グロブリンに対する抗体」を、適当な割合で混合して使用することにより、免疫グロブリンのクラスに依存しない抗糖脂質抗体の測定を行うことができる。
【０１０９】
更に、前記▲５▼において用いる「標識物質を結合した、抗糖脂質抗体と特異的に結合することができる物質」として、「標識物質を結合した、サブクラス別のヒト免疫グロブリンに対する抗体」を使用することにより、試料中の抗糖脂質抗体を免疫グロブリンのサブクラス別に測定することが可能となる。
このサブクラス別のヒト免疫グロブリンに対する抗体としては、例えば、抗ヒトカッパー（κ）抗体、抗ヒトラムダ（λ）抗体、抗ヒトＩｇＧ１抗体、抗ヒトＩｇＧ２抗体、抗ヒトＩｇＧ３抗体、又は抗ヒトＩｇＧ４抗体等を挙げることができる。
【０１１０】
また、これらの「標識物質を結合した、サブクラス別のヒト免疫グロブリンに対する抗体」を、適当な割合で混合して使用することにより、免疫グロブリンのサブクラスに依存しない抗糖脂質抗体の測定を行うことができる。
【０１１１】
なお、「担体−糖脂質抗原−抗糖脂質抗体−抗糖脂質抗体と特異的に結合することができる物質−標識物質」の結合により担体に結合した標識物質の検出であるが、酵素免疫測定法等の標識物質として酵素を用いて測定を行う方法及び試薬においては、標識酵素にその至適条件下で基質を反応させ、その反応生成物の量を反応促進物質の吸光度を測るなどの光学的方法等により測定を行う。
【０１１２】
蛍光免疫測定法等の標識物質として蛍光物質を用いて測定を行う方法及び試薬においては、標識蛍光物質による蛍光強度を測定することにより測定を行う。
【０１１３】
放射免疫測定法等の標識物質として放射性物質を用いて測定を行う方法及び試薬においては、標識放射性物質による放射線量を測定することにより測定を行う。
【０１１４】
発光免疫測定法等の標識物質として発光反応に係わる物質を用いて測定を行う方法及び試薬においては、標識物質が係わる発光反応系における発光量を測定することにより測定を行う。
【０１１５】
なお、前記の標識物質であるが、標識物質として酵素を用いる酵素免疫測定法等により測定を行う場合には、パーオキシダーゼ（ＰＯＤ）、アルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸脱水素酵素、又はα−アミラーゼ等の酵素を用いることができる。
【０１１６】
また、標識物質として蛍光物質を用いる蛍光免疫測定法等により測定を行う場合には、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、置換ローダミンイソチオシアネート、又はジクロロトリアジンイソチオシアネート等の蛍光物質を用いることができる。
【０１１７】
そして、標識物質として放射性物質を用いる放射免疫測定法等により測定を行う場合には、トリチウム、ヨウ素１２５、又はヨウ素１３１等の放射性物質を用いることができる。
【０１１８】
また、測定を発光免疫測定法により行う場合には、アクリジニウムエステル、アルカリ性ホスファターゼ、パーオキシダーゼ、又はグルコースオキシダーゼ等を標識物質として用い、アクリジニウムエステル系、ジオキセタン化合物系、ルミノール−過酸化水素−ＰＯＤ系、又はＮＡＤＨ−ＦＭＮＨ２−ルシフェラーゼ系等により担体に結合した標識物質の検出を行うことができる。
【０１１９】
〔４〕  試料中の抗糖脂質抗体の測定試薬キット
本発明の試料中の抗糖脂質抗体の測定試薬キットは、試料中の抗糖脂質抗体を、糖脂質抗原と抗原抗体反応させることにより測定を行う測定試薬キットにおいて、界面活性作用を有する物質及び／又はタンパク質を含有する試薬を含むことを特徴とするものである。
【０１２０】
本発明の試料中の抗糖脂質抗体の測定試薬キットに含まれる、界面活性作用を有する物質及び／又はタンパク質を含有する試薬を用い、測定時に、糖脂質抗原を、界面活性作用を有する物質及び／又はタンパク質と接触させ、この糖脂質抗原の抗原活性を活性化させて測定を行うことにより、試料中に含まれていた抗糖脂質抗体の高感度な測定が達成されるものである。
【０１２１】
なお、界面活性作用を有する物質、タンパク質、及び糖脂質抗原等については、前記〔１〕に記載した通りであり、この界面活性作用を有する物質及び／又はタンパク質による糖脂質抗原の活性化方法等については、前記〔２〕に記載した通りであり、試料中の抗糖脂質抗体の測定の方法については、前記〔３〕に記載した通りである。
【０１２２】
本発明の試料中の抗糖脂質抗体の測定試薬キットにおける界面活性作用を有する物質及び／又はタンパク質としては、界面活性剤が好適である。
【０１２３】
そして、本発明の試料中の抗糖脂質抗体の測定試薬キットにおいては、糖脂質抗原が担体に固定化されている場合に好適である。
【０１２４】
また、本発明の試料中の抗糖脂質抗体の測定試薬キットにおいては、糖脂質抗原が乾燥状態におかれていた場合に好適である。
【０１２５】
更に、本発明の試料中の抗糖脂質抗体の測定試薬キットにおいては、糖脂質抗原がガングリオシド（ガングリオシド抗原）である場合に好適である。
【０１２６】
本発明の試料中の抗糖脂質抗体の測定試薬キットは、試料中の抗糖脂質抗体を測定するための試薬とともに、界面活性作用を有する物質及び／又はタンパク質を含有する試薬を含むものである。
【０１２７】
この試料中の抗糖脂質抗体を測定するための試薬としては、例えば、糖脂質抗原を固定化した担体；標識物質を結合した、抗糖脂質抗体と特異的に結合することができる物質；発色などのシグナルの生成に係わる物質；試料希釈液；試薬希釈液；洗浄液；緩衝液；又は校正（キャリブレーション）を行うための物質等を挙げることができる。
【０１２８】
なお、本発明の試料中の抗糖脂質抗体の測定試薬キットに含まれる、界面活性作用を有する物質及び／又はタンパク質を含有する試薬の組成、及び使用方法等については、前記の〔１〕、〔２〕、及び〔３〕の記載の通りである。
【０１２９】
また、前記の試料中の抗糖脂質抗体を測定するための試薬については、各々の測定原理（測定法）における公知の測定試薬の通りでよい。
【０１３０】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【０１３１】
なお、下記の実施例における各測定は、２重測定又はそれ以上の測定を行っているものであり、これらの測定により得た値の平均値を以下測定値として示した。
【０１３２】
〔実施例１〕（界面活性作用を有する物質による糖脂質抗原の活性化の効果の確認）
界面活性作用を有する物質（界面活性剤）であるＴｗｅｅｎ２０による、各種の糖脂質抗原の活性化の効果を確かめた。
【０１３３】
〔１〕試料中の抗ＧＭ１ａ抗体の測定
【０１３４】
１．試薬の調製
（１）リン酸等張化緩衝液（ＰＢＳ）の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように精製水に溶解し、試薬の調製を行った。（ｐＨ７．５）
１３７ｍＭ  塩化ナトリウム
２．７ｍＭ  塩化カリウム
８．１ｍＭ  リン酸一水素二ナトリウム
１．５ｍＭ  リン酸二水素一カリウム
【０１３５】
（２）アジ化ナトリウム含有ＰＢＳの調製
０．１ｇのアジ化ナトリウムに、前記（１）で調製したリン酸等張化緩衝液（ＰＢＳ）を加え、１００ｍＬとして、１５ｍＭアジ化ナトリウム含有ＰＢＳを調製した。
【０１３６】
（３）ＢＳＡ含有ＰＢＳの調製
１．０ｇのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に、前記（１）で調製したリン酸等張化緩衝液（ＰＢＳ）を加え、１００ｍＬとして、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ含有ＰＢＳを調製した。
【０１３７】
（４）トリス等張化緩衝液（ＴＢＳ）の調製
トリス等張化緩衝液粉末〔Ｔ−６６６４〕（シグマ社）を精製水に溶解し、全量を１Ｌとして、試薬の調製を行った。
【０１３８】
（５）アジ化ナトリウム含有ＴＢＳの調製
０．１ｇのアジ化ナトリウムに、前記（４）で調製したトリス等張化緩衝液（ＴＢＳ）を加え、１００ｍＬとして、１５ｍＭアジ化ナトリウム含有ＴＢＳを調製した。
【０１３９】
（６）糖脂質抗原活性化剤の調製
Ｔｗｅｅｎ２０〔ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート〕（和光純薬工業社）の０．０５ｇに、前記（２）で調製したアジ化ナトリウム含有ＰＢＳを加え、１００ｍＬとして、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含むアジ化ナトリウム含有ＰＢＳよりなる糖脂質抗原活性化剤を調製した。
【０１４０】
（７）試料希釈液の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように精製水に溶解し、試薬の調製を行った。
２５％（ｖ／ｖ）  ウマ血清
１％（ｗ／ｖ）  ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
２００ｍＭ  塩化ナトリウム
１０ｍＭ  リン酸一水素二ナトリウム
【０１４１】
（８）酵素標識抗体
ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体〔Ｐ０２１４〕（ダコ社）を、酵素標識抗体として用いた。
【０１４２】
（９）標識抗体希釈液の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように精製水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．５（２０℃）に調整して、試薬の調製を行った。
１０％（ｖ／ｖ）  ウマ血清
１％（ｗ／ｖ）  ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
５０ｍＭ  塩化ナトリウム
８．１ｍＭ  リン酸一水素二ナトリウム
１．７ｍＭ  リン酸二水素一ナトリウム
【０１４３】
（１０）基質液
ペルオキシダーゼ基質液〔３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン及び過酸化水素を含有〕（サイテック社）を、基質液として用いた。
【０１４４】
（１１）反応停止液
反応停止液〔ＴＳＢ９９９〕（サイテック社）を、反応停止液として用いた。
【０１４５】
（１２）洗浄液の調製
Ｔｗｅｅｎ２０〔ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート〕（和光純薬工業社）の０．０５ｇに、前記（１）で調製したリン酸等張化緩衝液（ＰＢＳ）を加え、１００ｍＬとして、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳよりなる洗浄液を調製した。
【０１４６】
（１３）糖脂質抗原固定化担体の調製
【０１４７】
▲１▼ＧＭ１ａ抗原固定化担体の調製
【０１４８】
ＧＭ１ａ〔ウシ脳由来〕（シグマ社）を０．１ｍｇ／Ｌとなるように前記（５）のアジ化ナトリウム含有ＴＢＳに溶解し、その１００μＬをマイクロタイタープレート〔ＥＬＩＳＡ用Ｅタイプ〕（住友ベークライト社）のウェルに分注した。
【０１４９】
そして、このマイクロタイタープレートを、一定時間放置し、ＧＭ１ａをマイクロタイタープレートのウェルに固定化させた。
【０１５０】
その後、このウェル内の液を除去した。
【０１５１】
次に、このウェルに前記（３）のＢＳＡ含有ＰＢＳの２００μＬを分注し、一定時間放置してブロッキング処理を行った。
【０１５２】
次に、このマイクロタイタープレートのウェル内を精製水で洗浄した後、真空乾燥を行い、ＧＭ１ａ抗原固定化担体を調製した。
【０１５３】
▲２▼対照担体の調製
【０１５４】
前記（５）のアジ化ナトリウム含有ＴＢＳの１００μＬをマイクロタイタープレート〔ＥＬＩＳＡ用Ｅタイプ〕（住友ベークライト社）のウェルに分注した。
【０１５５】
そして、このマイクロタイタープレートを、一定時間放置した。
【０１５６】
その後、このウェル内の液を除去した。
【０１５７】
次に、このウェルに前記（３）のＢＳＡ含有ＰＢＳの２００μＬを分注し、一定時間放置してブロッキング処理を行った。
【０１５８】
次に、このマイクロタイタープレートのウェル内を精製水で洗浄した後、真空乾燥を行い、いずれの糖脂質抗原も固定化させていない対照用の担体（対照担体）を調製した。
【０１５９】
２．試料
【０１６０】
抗ＧＭ１ａ抗体陽性血清：
神経疾患の患者の血清で、抗ＧＭ１ａ抗体を含むことが確認されている血清を、抗ＧＭ１ａ抗体陽性血清として用意した。
【０１６１】
３．試料中の抗糖脂質抗体の測定
【０１６２】
（１）糖脂質抗原活性化剤を用いた場合
【０１６３】
▲１▼  本実施例の〔１〕の１の（１３）の▲１▼のＧＭ１ａ抗原固定化担体のウェルに、本実施例の〔１〕の１の（６）の糖脂質抗原活性化剤を２００μＬ分注し、これを室温（２５℃）で６０分間放置して、担体に固定化されたＧＭ１ａ抗原にＴｗｅｅｎ２０を接触させた。
【０１６４】
▲２▼  前記のウェルより、前記の糖脂質抗原活性化剤を吸引して除去した。
【０１６５】
▲３▼  試料である本実施例の〔１〕の２の抗ＧＭ１ａ抗体陽性血清を本実施例の〔１〕の１の（７）の試料希釈液で１／４００，０００に希釈した後、前記のウェルに１００μＬ分注し、これを低温庫（５℃）にて一晩保管した。
【０１６６】
これにより、担体に固定化されているＧＭ１ａ抗原と試料に含まれていた抗ＧＭ１ａ抗体を接触させ、反応させた。
【０１６７】
▲４▼  次に、前記のウェルより、前記の試料（抗ＧＭ１ａ抗体陽性血清）を吸引して除去した。
そして、このウェルを、本実施例の〔１〕の１の（１２）の洗浄液で洗浄した。
【０１６８】
▲５▼  本実施例の〔１〕の１の（８）の酵素標識抗体を、本実施例の〔１〕の１の（９）の標識抗体希釈液で１／４，０００に希釈し、この１００μＬを前記のウェルに分注して、３７℃にて３時間反応させた。
【０１６９】
▲６▼  次に、前記のウェルより、未結合の酵素標識抗体を吸引して除去した。
そして、このウェルを、本実施例の〔１〕の１の（１２）の洗浄液で洗浄した。
【０１７０】
▲７▼  本実施例の〔１〕の１の（１０）の基質液の１００μＬを、前記のウェルに分注し、室温（２３．５℃）で４０分間反応させた。
これにより、担体に固定化された標識酵素（ペルオキシダーゼ）と、基質液の３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン及び過酸化水素を反応させて、色素を生成させた。
【０１７１】
▲８▼  ４０分後に、本実施例の〔１〕の１の（１１）の反応停止液の１００μＬを、前記のウェルに分注して、前記の反応を停止させた。
【０１７２】
▲９▼  マイクロプレートリーダー〔３５５０型〕（バイオラッド社）にて、前記のウェル中の液の吸光度（主波長：４５０ｎｍ、副波長：５５０ｎｍ）を測定して、吸光度測定値〔吸光度Ａ〕を得た。
【０１７３】
▲１０▼  対照として、本実施例の〔１〕の１の（１３）の▲１▼のＧＭ１ａ抗原固定化担体に替えて本実施例の〔１〕の１の（１３）の▲２▼の対照担体を用いる他は、前記▲１▼〜▲９▼の記載の通りに操作を行い、ＧＭ１ａ抗原を固定化させていない担体である対照担体を用いた場合の吸光度測定値〔吸光度Ｂ〕を得た。
【０１７４】
これらの測定結果（吸光度測定値）を表１に示した。
【０１７５】
（２）糖脂質抗原活性化剤を用いない場合
【０１７６】
▲１▼  本実施例の〔１〕の１の（１３）の▲１▼で調製したＧＭ１ａ抗原固定化担体のウェルに、試料である本実施例の〔１〕の２の抗ＧＭ１ａ抗体陽性血清を本実施例の〔１〕の１の（７）の試料希釈液で１／４００，０００に希釈した後、前記のウェルに１００μＬ分注し、これを低温庫（５℃）にて一晩保管した。
これにより、担体に固定化されているＧＭ１ａ抗原と試料に含まれていた抗ＧＭ１ａ抗体を接触させ、反応させた。
【０１７７】
▲２▼  以下の操作は、前記（１）の▲４▼〜▲９▼の記載の通りに行い、担体に固定化されたＧＭ１ａ抗原に糖脂質抗原活性化剤を接触させることなく、試料の測定を行い、吸光度測定値〔吸光度Ｃ〕を得た。
【０１７８】
▲３▼  また、対照として、本実施例の〔１〕の１の（１３）の▲１▼のＧＭ１ａ抗原固定化担体に替えて本実施例の〔１〕の１の（１３）の▲２▼の対照担体を用いる他は、前記▲１▼及び▲２▼の通りに操作を行い、ＧＭ１ａ抗原を固定化させていない担体である対照担体を用い、かつ糖脂質抗原活性化剤を用いない場合の吸光度測定値〔吸光度Ｄ〕を得た。
【０１７９】
これらの測定結果（吸光度測定値）を表１に示した。
【０１８０】
〔２〕試料中の抗ＧＤ１ａ抗体の測定
【０１８１】
１．試薬の調製
【０１８２】
（１）リン酸等張化緩衝液（ＰＢＳ）の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように精製水に溶解し、試薬の調製を行った。（ｐＨ７．５）
１３７ｍＭ  塩化ナトリウム
２．７ｍＭ  塩化カリウム
８．１ｍＭ  リン酸一水素二ナトリウム
１．５ｍＭ  リン酸二水素一カリウム
【０１８３】
（２）ＢＳＡ含有ＰＢＳの調製
０．１ｇのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に、前記（１）で調製したリン酸等張化緩衝液（ＰＢＳ）を加え、１００ｍＬとして、０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ含有ＰＢＳを調製した。
【０１８４】
（３）アジ化ナトリウム含有トリス等張化緩衝液（アジ化ナトリウム含有ＴＢＳ）の調製
トリス等張化緩衝液粉末〔Ｔ−６６６４〕（シグマ社）及びアジ化ナトリウム１ｇを精製水に溶解し、全量を１Ｌとして、試薬の調製を行った。
【０１８５】
（４）糖脂質抗原活性化剤の調製
Ｔｗｅｅｎ２０〔ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート〕（和光純薬工業社）の０．０５ｇに、前記（１）で調製したリン酸等張化緩衝液（ＰＢＳ）を加え、１００ｍＬとして、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳよりなる糖脂質抗原活性化剤を調製した。
【０１８６】
（５）試料希釈液の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように精製水に溶解し、試薬の調製を行った。
１０％（ｖ／ｖ）  ウマ血清
１％（ｗ／ｖ）  ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
２００ｍＭ  塩化ナトリウム
８．１ｍＭ  リン酸一水素二ナトリウム
１．５ｍＭ  リン酸二水素一カリウム
【０１８７】
（６）酵素標識抗体
ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体〔Ｐ０２１４〕（ダコ社）を、酵素標識抗体として用いた。
【０１８８】
（７）標識抗体希釈液の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように精製水に溶解し、試薬の調製を行った。
３％（ｖ／ｖ）  ウマ血清
０．１％（ｗ／ｖ）  ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
１３７ｍＭ  塩化ナトリウム
２．７ｍＭ  塩化カリウム
８．１ｍＭ  リン酸一水素二ナトリウム
１．５ｍＭ  リン酸二水素一カリウム
【０１８９】
（８）基質液の調製
３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン塩酸塩（同仁化学社）を１．３ｍＭとなるように、及びＥＤＴＡ・２Ｎａ・２Ｈ２Ｏを０．２ｍＭとなるように精製水に溶解し、そしてｐＨをｐＨ２．０に調整して、ＴＭＢＺ溶液を調製した。
次に、クエン酸一水和物を４１ｍＭとなるように、リン酸一水素二ナトリウムを２３ｍＭとなるように、及びＥＤＴＡ・２Ｎａ・２Ｈ２Ｏを０．２ｍＭとなるように精製水に溶解し、そしてｐＨをｐＨ４．３に調整して、クエン酸緩衝液を調製した。
このクエン酸緩衝液に、過酸化水素水を５ｍＭとなるように混合して過酸化水素溶液を調製した。
使用直前に、前記のＴＭＢＺ溶液と前記の過酸化水素溶液を、等量ずつ混和して、基質液を調製した。
【０１９０】
（９）反応停止液の調製
硫酸を０．７Ｎとなるように精製水に溶解して反応停止液を調製した。
【０１９１】
（１０）洗浄液の調製
Ｔｗｅｅｎ２０〔ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート〕（和光純薬工業社）の０．０５ｇに、前記（１）で調製したリン酸等張化緩衝液（ＰＢＳ）を加え、１００ｍＬとして、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳよりなる洗浄液を調製した。
【０１９２】
（１１）糖脂質抗原固定化担体の調製
【０１９３】
▲１▼ＧＤ１ａ抗原固定化担体の調製
ＧＤ１ａ〔ウシ脳由来〕（シグマ社）を１．０ｍｇ／Ｌとなるように前記（３）のアジ化ナトリウム含有ＴＢＳに溶解し、その１００μＬをマイクロタイタープレート〔ＥＬＩＳＡ用Ｅタイプ〕（住友ベークライト社）のウェルに分注した。
【０１９４】
そして、このマイクロタイタープレートを、一定時間放置し、ＧＤ１ａをマイクロタイタープレートのウェルに固定化させた。
その後、このウェル内の液を除去した。
【０１９５】
次に、このウェルに前記（２）のＢＳＡ含有ＰＢＳの２００μＬを分注し、一定時間放置してブロッキング処理を行った。
【０１９６】
次に、このマイクロタイタープレートのウェル内を精製水で洗浄した後、真空乾燥を行い、ＧＤ１ａ抗原固定化担体を調製した。
【０１９７】
▲２▼対照担体の調製
前記（３）のアジ化ナトリウム含有ＴＢＳの１００μＬをマイクロタイタープレート〔ＥＬＩＳＡ用Ｅタイプ〕（住友ベークライト社）のウェルに分注した。
【０１９８】
そして、このマイクロタイタープレートを、一定時間放置した。
その後、このウェル内の液を除去した。
【０１９９】
次に、このウェルに前記（２）のＢＳＡ含有ＰＢＳの２００μＬを分注し、一定時間放置してブロッキング処理を行った。
【０２００】
次に、このマイクロタイタープレートのウェル内を精製水で洗浄した後、真空乾燥を行い、いずれの糖脂質抗原も固定化させていない対照用の担体（対照担体）を調製した。
【０２０１】
２．試料
抗ＧＤ１ａ抗体陽性血清：
神経疾患の患者の血清で、抗ＧＤ１ａ抗体を含むことが確認されている血清を、抗ＧＤ１ａ抗体陽性血清として用意した。
【０２０２】
３．試料中の抗糖脂質抗体の測定
【０２０３】
（１）糖脂質抗原活性化剤を用いた場合
▲１▼  本実施例の〔２〕の１の（１１）の▲１▼のＧＤ１ａ抗原固定化担体のウェルに、本実施例の〔２〕の１の（４）の糖脂質抗原活性化剤を２００μＬ分注し、これを室温にて２３分間放置して、担体に固定化されたＧＤ１ａ抗原にＴｗｅｅｎ２０を接触させた。
【０２０４】
▲２▼  前記のウェルより、前記の糖脂質抗原活性化剤を吸引して除去した。
【０２０５】
▲３▼  試料である本実施例の〔２〕の２の抗ＧＤ１ａ抗体陽性血清を本実施例の〔２〕の１の（５）の試料希釈液で１／８０，０００に希釈した後、前記のウェルに１００μＬ分注し、これを低温庫（５℃）にて一晩保管した。
これにより、担体に固定化されているＧＤ１ａ抗原と試料に含まれていた抗ＧＤ１ａ抗体を接触させ、反応させた。
【０２０６】
▲４▼  次に、前記のウェルより、前記の試料（抗ＧＤ１ａ抗体陽性血清）を吸引して除去した。
そして、このウェルを、本実施例の〔２〕の１の（１０）の洗浄液で洗浄した。
【０２０７】
▲５▼  本実施例の〔２〕の１の（６）の酵素標識抗体を、本実施例の〔２〕の１の（７）の標識抗体希釈液で１／４，０００に希釈し、この１００μＬを前記のウェルに分注して、３７℃にて３時間反応させた。
【０２０８】
▲６▼  次に、前記のウェルより、未結合の酵素標識抗体を吸引して除去した。
そして、このウェルを、本実施例の〔２〕の１の（１０）の洗浄液で洗浄した。
【０２０９】
▲７▼  本実施例の〔２〕の１の（８）の基質液の１００μＬを、前記のウェルに分注し、２５℃で６０分間反応させた。
これにより、担体に固定化された標識酵素（ペルオキシダーゼ）と、基質液の３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン及び過酸化水素を反応させて、色素を生成させた。
【０２１０】
▲８▼  ６０分後に、本実施例の〔２〕の１の（９）の反応停止液の１００μＬを、前記のウェルに分注して、前記の反応を停止させた。
【０２１１】
▲９▼  マイクロプレートリーダー〔３５５０型〕（バイオラッド社）にて、前記のウェル中の液の吸光度（主波長：４５０ｎｍ、副波長：５５０ｎｍ）を測定して、吸光度測定値〔吸光度Ａ〕を得た。
【０２１２】
▲１０▼  対照として、本実施例の〔２〕の１の（１１）の▲１▼のＧＤ１ａ抗原固定化担体に替えて本実施例の〔２〕の１の（１１）の▲２▼の対照担体を用いる他は、前記▲１▼〜▲９▼の記載の通りに操作を行い、ＧＤ１ａ抗原を固定化させていない担体である対照担体を用いた場合の吸光度測定値〔吸光度Ｂ〕を得た。
【０２１３】
これらの測定結果（吸光度測定値）を表１に示した。
【０２１４】
（２）糖脂質抗原活性化剤を用いない場合
▲１▼  本実施例の〔２〕の１の（１１）の▲１▼で調製したＧＤ１ａ抗原固定化担体のウェルに、試料である本実施例の〔２〕の２の抗ＧＤ１ａ抗体陽性血清を本実施例の〔２〕の１の（５）の試料希釈液で１／８０，０００に希釈した後、前記のウェルに１００μＬ分注し、これを低温庫（５℃）にて一晩保管した。
これにより、担体に固定化されているＧＤ１ａ抗原と試料に含まれていた抗ＧＤ１ａ抗体を接触させ、反応させた。
【０２１５】
▲２▼  以下の操作は、前記（１）の▲４▼〜▲９▼の記載の通りに行い、担体に固定化されたＧＤ１ａ抗原に糖脂質抗原活性化剤を接触させることなく、試料の測定を行い、吸光度測定値〔吸光度Ｃ〕を得た。
【０２１６】
▲３▼  また、対照として、本実施例の〔２〕の１の（１１）の▲１▼のＧＤ１ａ抗原固定化担体に替えて本実施例の〔２〕の１の（１１）の▲２▼の対照担体を用いる他は、前記▲１▼及び▲２▼の通りに操作を行い、ＧＤ１ａ抗原を固定化させていない担体である対照担体を用い、かつ糖脂質抗原活性化剤を用いない場合の吸光度測定値〔吸光度Ｄ〕を得た。
【０２１７】
これらの測定結果（吸光度測定値）を表１に示した。
【０２１８】
〔３〕試料中の抗ＧＱ１ｂ抗体の測定
【０２１９】
１．試薬の調製
（１）リン酸等張化緩衝液（ＰＢＳ）の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように精製水に溶解し、試薬の調製を行った。（ｐＨ７．５）
１３７ｍＭ  塩化ナトリウム
２．７ｍＭ  塩化カリウム
８．１ｍＭ  リン酸一水素二ナトリウム
１．５ｍＭ  リン酸二水素一カリウム
【０２２０】
（２）ＢＳＡ含有ＰＢＳの調製
０．１ｇのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に、前記（１）で調製したリン酸等張化緩衝液（ＰＢＳ）を加え、１００ｍＬとして、０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ含有ＰＢＳを調製した。
【０２２１】
（３）アジ化ナトリウム含有トリス等張化緩衝液（アジ化ナトリウム含有ＴＢＳ）の調製
トリス等張化緩衝液粉末〔Ｔ−６６６４〕（シグマ社）及びアジ化ナトリウム１ｇを精製水に溶解し、全量を１Ｌとして、試薬の調製を行った。
【０２２２】
（４）糖脂質抗原活性化剤の調製
Ｔｗｅｅｎ２０〔ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート〕（和光純薬工業社）の０．０５ｇに、前記（１）で調製したリン酸等張化緩衝液（ＰＢＳ）を加え、１００ｍＬとして、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳよりなる糖脂質抗原活性化剤を調製した。
【０２２３】
（５）試料希釈液の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように精製水に溶解し、試薬の調製を行った。
２５％（ｖ／ｖ）  ウマ血清
１％（ｗ／ｖ）  ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
２００ｍＭ  塩化ナトリウム
８．１ｍＭ  リン酸一水素二ナトリウム
１．５ｍＭ  リン酸二水素一カリウム
【０２２４】
（６）酵素標識抗体
ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体〔Ｐ０２１４〕（ダコ社）を、酵素標識抗体として用いた。
【０２２５】
（７）標識抗体希釈液の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように精製水に溶解し、試薬の調製を行った。
１０％（ｖ／ｖ）  ウマ血清
１％（ｗ／ｖ）  ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
１３７ｍＭ  塩化ナトリウム
２．７ｍＭ  塩化カリウム
８．１ｍＭ  リン酸一水素二ナトリウム
１．５ｍＭ  リン酸二水素一カリウム
【０２２６】
（８）基質液
ペルオキシダーゼ基質液〔３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン及び過酸化水素を含有〕〔ＴＭＢＷ−１０００−０１〕（バイオＦＸラボラトリーズ社）を、基質液として用いた。
【０２２７】
（９）反応停止液
反応停止液〔ＴＳＢ９９９〕（サイテック社）を、反応停止液として用いた。
【０２２８】
（１０）洗浄液の調製
Ｔｗｅｅｎ２０〔ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート〕（和光純薬工業社）の０．０５ｇに、前記（１）で調製したリン酸等張化緩衝液（ＰＢＳ）を加え、１００ｍＬとして、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳよりなる洗浄液を調製した。
【０２２９】
（１１）糖脂質抗原固定化担体の調製
【０２３０】
▲１▼ＧＱ１ｂ抗原固定化担体の調製
ＧＱ１ｂ〔ウシ脳由来〕（シグマ社）を１．０ｍｇ／Ｌとなるように前記（３）のアジ化ナトリウム含有ＴＢＳに溶解し、その１００μＬをマイクロタイタープレート〔ＥＬＩＳＡ用Ｅタイプ〕（住友ベークライト社）のウェルに分注した。
【０２３１】
そして、このマイクロタイタープレートを、一定時間放置し、ＧＱ１ｂをマイクロタイタープレートのウェルに固定化させた。
その後、このウェル内の液を除去した。
【０２３２】
次に、このウェルに前記（２）のＢＳＡ含有ＰＢＳの２００μＬを分注し、一定時間放置してブロッキング処理を行った。
【０２３３】
次に、このマイクロタイタープレートのウェル内を精製水で洗浄した後、真空乾燥を行い、ＧＱ１ｂ抗原固定化担体を調製した。
【０２３４】
▲２▼対照担体の調製
前記（３）のアジ化ナトリウム含有ＴＢＳの１００μＬをマイクロタイタープレート〔ＥＬＩＳＡ用Ｅタイプ〕（住友ベークライト社）のウェルに分注した。
【０２３５】
そして、このマイクロタイタープレートを、一定時間放置した。
その後、このウェル内の液を除去した。
【０２３６】
次に、このウェルに前記（２）のＢＳＡ含有ＰＢＳの２００μＬを分注し、一定時間放置してブロッキング処理を行った。
【０２３７】
次に、このマイクロタイタープレートのウェル内を精製水で洗浄した後、真空乾燥を行い、いずれの糖脂質抗原も固定化させていない対照用の担体（対照担体）を調製した。
【０２３８】
２．試料
抗ＧＱ１ｂ抗体陽性血清：
神経疾患の患者の血清で、抗ＧＱ１ｂ抗体を含むことが確認されている血清を、抗ＧＱ１ｂ抗体陽性血清として用意した。
【０２３９】
３．試料中の抗糖脂質抗体の測定
【０２４０】
（１）糖脂質抗原活性化剤を用いた場合
▲１▼  本実施例の〔３〕の１の（１１）の▲１▼のＧＱ１ｂ抗原固定化担体のウェルに、本実施例の〔３〕の１の（４）の糖脂質抗原活性化剤を２００μＬ分注し、これを室温にて２０分間放置して、担体に固定化されたＧＱ１ｂ抗原にＴｗｅｅｎ２０を接触させた。
【０２４１】
▲２▼  前記のウェルより、前記の糖脂質抗原活性化剤を吸引して除去した。
【０２４２】
▲３▼  試料である本実施例の〔３〕の２の抗ＧＱ１ｂ抗体陽性血清を本実施例の〔３〕の１の（５）の試料希釈液で１／５０，０００に希釈した後、前記のウェルに１００μＬ分注し、これを低温庫（５℃）にて一晩保管した。
これにより、担体に固定化されているＧＱ１ｂ抗原と試料に含まれていた抗ＧＱ１ｂ抗体を接触させ、反応させた。
【０２４３】
▲４▼  次に、前記のウェルより、前記の試料（抗ＧＱ１ｂ抗体陽性血清）を吸引して除去した。
そして、このウェルを、本実施例の〔３〕の１の（１０）の洗浄液で洗浄した。
【０２４４】
▲５▼  本実施例の〔３〕の１の（６）の酵素標識抗体を、本実施例の〔３〕の１の（７）の標識抗体希釈液で１／４，０００に希釈し、この１００μＬを前記のウェルに分注して、３７℃にて３時間反応させた。
【０２４５】
▲６▼  次に、前記のウェルより、未結合の酵素標識抗体を吸引して除去した。
そして、このウェルを、本実施例の〔３〕の１の（１０）の洗浄液で洗浄した。
【０２４６】
▲７▼  本実施例の〔３〕の１の（８）の基質液の１００μＬを、前記のウェルに分注し、２５℃で６０分間反応させた。
これにより、担体に固定化された標識酵素（ペルオキシダーゼ）と、基質液の３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン及び過酸化水素を反応させて、色素を生成させた。
【０２４７】
▲８▼  ６０分後に、本実施例の〔３〕の１の（９）の反応停止液の１００μＬを、前記のウェルに分注して、前記の反応を停止させた。
【０２４８】
▲９▼  マイクロプレートリーダー〔３５５０型〕（バイオラッド社）にて、前記のウェル中の液の吸光度（主波長：４５０ｎｍ、副波長：５５０ｎｍ）を測定して、吸光度測定値〔吸光度Ａ〕を得た。
【０２４９】
▲１０▼  対照として、本実施例の〔３〕の１の（１１）の▲１▼のＧＱ１ｂ抗原固定化担体に替えて本実施例の〔３〕の１の（１１）の▲２▼の対照担体を用いる他は、前記▲１▼〜▲９▼の記載の通りに操作を行い、ＧＱ１ｂ抗原を固定化させていない担体である対照担体を用いた場合の吸光度測定値〔吸光度Ｂ〕を得た。
【０２５０】
これらの測定結果（吸光度測定値）を表１に示した。
【０２５１】
（２）糖脂質抗原活性化剤を用いない場合
▲１▼  本実施例の〔３〕の１の（１１）の▲１▼で調製したＧＱ１ｂ抗原固定化担体のウェルに、試料である本実施例の〔３〕の２の抗ＧＱ１ｂ抗体陽性血清を本実施例の〔３〕の１の（５）の試料希釈液で１／５０，０００に希釈した後、前記のウェルに１００μＬ分注し、これを低温庫（５℃）にて一晩保管した。
これにより、担体に固定化されているＧＱ１ｂ抗原と試料に含まれていた抗ＧＱ１ｂ抗体を接触させ、反応させた。
【０２５２】
▲２▼  以下の操作は、前記（１）の▲４▼〜▲９▼の記載の通りに行い、担体に固定化されたＧＱ１ｂ抗原に糖脂質抗原活性化剤を接触させることなく、試料の測定を行い、吸光度測定値〔吸光度Ｃ〕を得た。
【０２５３】
▲３▼  また、対照として、本実施例の〔３〕の１の（１１）の▲１▼のＧＱ１ｂ抗原固定化担体に替えて本実施例の〔３〕の１の（１１）の▲２▼の対照担体を用いる他は、前記▲１▼及び▲２▼の通りに操作を行い、ＧＱ１ｂ抗原を固定化させていない担体である対照担体を用い、かつ糖脂質抗原活性化剤を用いない場合の吸光度測定値〔吸光度Ｄ〕を得た。
【０２５４】
これらの測定結果（吸光度測定値）を表１に示した。
【０２５５】
〔４〕測定結果
【０２５６】
【表１】
0004524446.tif 000002
【０２５７】
（１）  抗ＧＭ１ａ抗体陽性血清を試料として測定を行った場合、担体に固定化されたＧＭ１ａ抗原に糖脂質抗原活性化剤を接触させて測定を行ったときの測定値（吸光度差：吸光度Ａ−吸光度Ｂ）は、担体に固定化されたＧＭ１ａ抗原に糖脂質抗原活性化剤を接触させずに測定を行ったときの測定値（吸光度差：吸光度Ｃ−吸光度Ｄ）の１．５８１倍の値が得られていることが分かる。
【０２５８】
（２）  また、抗ＧＤ１ａ抗体陽性血清を試料として測定を行った場合、担体に固定化されたＧＤ１ａ抗原に糖脂質抗原活性化剤を接触させて測定を行ったときの測定値（吸光度差：吸光度Ａ−吸光度Ｂ）は、担体に固定化されたＧＤ１ａ抗原に糖脂質抗原活性化剤を接触させずに測定を行ったときの測定値（吸光度差：吸光度Ｃ−吸光度Ｄ）の５．８２３倍の値が得られていることが分かる。
【０２５９】
（３）  そして、抗ＧＱ１ｂ抗体陽性血清を試料として測定を行った場合、担体に固定化されたＧＱ１ｂ抗原に糖脂質抗原活性化剤を接触させて測定を行ったときの測定値（吸光度差：吸光度Ａ−吸光度Ｂ）は、担体に固定化されたＧＱ１ｂ抗原に糖脂質抗原活性化剤を接触させずに測定を行ったときの測定値（吸光度差：吸光度Ｃ−吸光度Ｄ）の２．１７８倍の値が得られていることが分かる。
【０２６０】
（４）  以上のことより、糖脂質抗原がＧＭ１ａ、ＧＤ１ａ、又はＧＱ１ｂのいずれの場合においても、界面活性作用を有する物質であるＴｗｅｅｎ２０を、糖脂質抗原に接触させることにより、この糖脂質抗原の抗原活性を活性化することができることが確かめられた。そして、これにより、試料中の抗糖脂質抗体を感度高く測定することができることが確かめられた。
【０２６１】
（５）  なお、糖脂質抗原を固定化させていない担体である対照担体を用いた場合の測定値（吸光度Ｂ及び吸光度Ｄ）が、いずれも低い値にとどまっていることより、非特異的反応が生じていないことが分かる。
【０２６２】
〔実施例２〕（界面活性作用を有する物質の濃度と糖脂質抗原の活性化の効果との関係の確認）
【０２６３】
界面活性作用を有する物質（界面活性剤）であるＴｗｅｅｎ２０の濃度を変えたときの、糖脂質抗原の活性化の効果を確かめた。
【０２６４】
１．試薬の調製
【０２６５】
（１）リン酸等張化緩衝液（ＰＢＳ）の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように精製水に溶解し、試薬の調製を行った。（ｐＨ７．５）
１３７ｍＭ  塩化ナトリウム
２．７ｍＭ  塩化カリウム
８．１ｍＭ  リン酸一水素二ナトリウム
１．５ｍＭ  リン酸二水素一カリウム
【０２６６】
（２）アジ化ナトリウム含有ＰＢＳの調製
０．１ｇのアジ化ナトリウムに、前記（１）で調製したリン酸等張化緩衝液（ＰＢＳ）を加え、１００ｍＬとして、１５ｍＭアジ化ナトリウム含有ＰＢＳを調製した。
【０２６７】
（３）ＢＳＡ含有ＰＢＳの調製
１．０ｇのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に、前記（１）で調製したリン酸等張化緩衝液（ＰＢＳ）を加え、１００ｍＬとして、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ含有ＰＢＳを調製した。
【０２６８】
（４）トリス等張化緩衝液（ＴＢＳ）の調製
トリス等張化緩衝液粉末〔Ｔ−６６６４〕（シグマ社）１ｇを精製水に溶解し、全量を１Ｌとして、試薬の調製を行った。
【０２６９】
（５）アジ化ナトリウム含有ＴＢＳの調製
０．１ｇのアジ化ナトリウムに、前記（４）で調製したトリス等張化緩衝液（ＴＢＳ）を加え、１００ｍＬとして、１５ｍＭアジ化ナトリウム含有ＴＢＳを調製した。
【０２７０】
（６）糖脂質抗原活性化剤の調製
Ｔｗｅｅｎ２０〔ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート〕（和光純薬工業社）を下記の濃度となるように、前記（２）のアジ化ナトリウム含有ＰＢＳに加えて、各濃度のＴｗｅｅｎ２０を含むアジ化ナトリウム含有ＰＢＳよりなる糖脂質抗原活性化剤を調製した。
【０２７１】
▲１▼  １％（ｗ／ｖ）
▲２▼  ０．５％（ｗ／ｖ）
▲３▼  ０．２５％（ｗ／ｖ）
▲４▼  ０．１３％（ｗ／ｖ）
▲５▼  ０．０６３％（ｗ／ｖ）
▲６▼  ０．０３１％（ｗ／ｖ）
▲７▼  ０．０１６％（ｗ／ｖ）
▲８▼  ０．００７８％（ｗ／ｖ）
▲９▼  ０．００３９％（ｗ／ｖ）
【０２７２】
また、比較のため、アジ化ナトリウム含有ＰＢＳを、Ｔｗｅｅｎ２０濃度が０％の糖脂質抗原活性化剤とした。
▲１０▼  ０％（ｗ／ｖ）
【０２７３】
（７）試料希釈液の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように精製水に溶解し、試薬の調製を行った。
２５％（ｖ／ｖ）  ウマ血清
１％（ｗ／ｖ）  ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
２００ｍＭ  塩化ナトリウム
８．１ｍＭ  リン酸一水素二ナトリウム
１．７ｍＭ  リン酸二水素一ナトリウム
【０２７４】
（８）酵素標識抗体
ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体〔Ｐ０２１４〕（ダコ社）を、酵素標識抗体として用いた。
【０２７５】
（９）標識抗体希釈液の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように精製水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．５（２０℃）に調整して、試薬の調製を行った。
１０％（ｖ／ｖ）  ウマ血清
１％（ｗ／ｖ）  ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
５０ｍＭ  塩化ナトリウム
８．１ｍＭ  リン酸一水素二ナトリウム
１．７ｍＭ  リン酸二水素一ナトリウム
【０２７６】
（１０）基質液
ペルオキシダーゼ基質液〔３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン及び過酸化水素を含有〕（サイテック社）を、基質液として用いた。
【０２７７】
（１１）反応停止液
反応停止液〔ＴＳＢ９９９〕（サイテック社）を、反応停止液として用いた。
【０２７８】
（１２）洗浄液の調製
Ｔｗｅｅｎ２０〔ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート〕（和光純薬工業社）の０．０５ｇに、前記（１）で調製したリン酸等張化緩衝液（ＰＢＳ）を加え、１００ｍＬとして、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳよりなる洗浄液を調製した。
【０２７９】
（１３）糖脂質抗原固定化担体の調製
【０２８０】
▲１▼ＧＭ１ａ抗原固定化担体の調製
ＧＭ１ａ〔ウシ脳由来〕（シグマ社）を０．１ｍｇ／Ｌとなるように前記（５）のアジ化ナトリウム含有ＴＢＳに溶解し、その１００μＬをマイクロタイタープレート〔ＥＬＩＳＡ用Ｅタイプ〕（住友ベークライト社）のウェルに分注した。
【０２８１】
そして、このマイクロタイタープレートを、一定時間放置し、ＧＭ１ａをマイクロタイタープレートのウェルに固定化させた。
その後、このウェル内の液を除去した。
【０２８２】
次に、このウェルに前記（３）のＢＳＡ含有ＰＢＳの２００μＬを分注し、一定時間放置してブロッキング処理を行った。
【０２８３】
次に、このマイクロタイタープレートのウェル内を精製水で洗浄した後、真空乾燥を行い、ＧＭ１ａ抗原固定化担体を調製した。
【０２８４】
▲２▼対照担体の調製
前記（５）のアジ化ナトリウム含有ＴＢＳの１００μＬをマイクロタイタープレート〔ＥＬＩＳＡ用Ｅタイプ〕（住友ベークライト社）のウェルに分注した。
【０２８５】
そして、このマイクロタイタープレートを、一定時間放置した。
その後、このウェル内の液を除去した。
【０２８６】
次に、このウェルに前記（３）のＢＳＡ含有ＰＢＳの２００μＬを分注し、一定時間放置してブロッキング処理を行った。
【０２８７】
次に、このマイクロタイタープレートのウェル内を精製水で洗浄した後、真空乾燥を行い、いずれの糖脂質抗原も固定化させていない対照用の担体（対照担体）を調製した。
【０２８８】
２．試料
抗ＧＭ１ａ抗体陽性血清：
神経疾患の患者の血清で、抗ＧＭ１ａ抗体を含むことが確認されている血清を、抗ＧＭ１ａ抗体陽性血清として用意した。
【０２８９】
３．試料中の抗糖脂質抗体の測定
糖脂質抗原活性化剤として、本実施例の１の（６）の▲１▼〜▲９▼の各濃度のＴｗｅｅｎ２０を含む糖脂質抗原活性化剤、及び▲１０▼のＴｗｅｅｎ２０を含まない糖脂質抗原活性化剤をそれぞれ用いること以外は、前記実施例１の〔１〕の３の「（１）糖脂質抗原活性化剤を用いた場合」の記載の通りに測定を行った。
【０２９０】
４．測定結果
【０２９１】
以上の測定結果（各吸光度測定値）を表２に示した。
【０２９２】
【表２】
0004524446.tif 000003
【０２９３】
測定値（吸光度差：吸光度Ａ−吸光度Ｂ）は、糖脂質抗原活性化剤のＴｗｅｅｎ２０の濃度が０％のときの値に比較して、糖脂質抗原活性化剤にＴｗｅｅｎ２０が含まれている場合には、いずれの濃度においても１．８６１倍〜２．２４７倍の値が得られていることが分かる。
【０２９４】
これにより、界面活性作用を有する物質であるＴｗｅｅｎ２０を、糖脂質抗原に接触させることによる糖脂質抗原の抗原活性の活性化が、広い濃度域において達成されることが確かめられた。そして、これにより、試料中の抗糖脂質抗体を感度高く測定することができることが確かめられた。
【０２９５】
なお、糖脂質抗原を固定化させていない担体である対照担体を用いた場合の測定値（吸光度Ｂ）が、いずれの濃度においても、低い値にとどまっていることより、非特異的反応が生じていないことが分かる。
【０２９６】
〔実施例３〕（界面活性作用を有する物質を糖脂質抗原に接触させる際の温度と糖脂質抗原の活性化の効果との関係の確認）
【０２９７】
界面活性作用を有する物質（界面活性剤）であるＴｗｅｅｎ２０を糖脂質抗原に接触させる際の温度を変えたときの、糖脂質抗原の活性化の効果を確かめた。
【０２９８】
１．試薬の調製
【０２９９】
（１）リン酸等張化緩衝液（ＰＢＳ）の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように精製水に溶解し、試薬の調製を行った。（ｐＨ７．５）
１３７ｍＭ  塩化ナトリウム
２．７ｍＭ  塩化カリウム
８．１ｍＭ  リン酸一水素二ナトリウム
１．５ｍＭ  リン酸二水素一カリウム
【０３００】
（２）アジ化ナトリウム含有ＰＢＳの調製
０．１ｇのアジ化ナトリウムに、前記（１）で調製したリン酸等張化緩衝液（ＰＢＳ）を加え、１００ｍＬとして、１５ｍＭアジ化ナトリウム含有ＰＢＳを調製した。
【０３０１】
（３）ＢＳＡ含有ＰＢＳの調製
１．０ｇのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に、前記（１）で調製したリン酸等張化緩衝液（ＰＢＳ）を加え、１００ｍＬとして、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ含有ＰＢＳを調製した。
【０３０２】
（４）トリス等張化緩衝液（ＴＢＳ）の調製
トリス等張化緩衝液粉末〔Ｔ−６６６４〕（シグマ社）を精製水に溶解し、全量を１Ｌとして、試薬の調製を行った。
【０３０３】
（５）アジ化ナトリウム含有ＴＢＳの調製
０．１ｇのアジ化ナトリウムに、前記（４）で調製したトリス等張化緩衝液（ＴＢＳ）を加え、１００ｍＬとして、１５ｍＭアジ化ナトリウム含有ＴＢＳを調製した。
【０３０４】
（６）糖脂質抗原活性化剤の調製
Ｔｗｅｅｎ２０〔ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート〕（和光純薬工業社）を下記の濃度となるように、前記（２）のアジ化ナトリウム含有ＰＢＳに加えて、各濃度のＴｗｅｅｎ２０を含むアジ化ナトリウム含有ＰＢＳよりなる糖脂質抗原活性化剤を調製した。
【０３０５】
▲１▼  ０．５％（ｗ／ｖ）
▲２▼  ０．０５％（ｗ／ｖ）
▲３▼  ０．００５％（ｗ／ｖ）
【０３０６】
また、比較のため、アジ化ナトリウム含有ＰＢＳを、Ｔｗｅｅｎ２０濃度が０％の糖脂質抗原活性化剤とした。
▲４▼  ０％（ｗ／ｖ）
【０３０７】
（７）試料希釈液の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように精製水に溶解し、試薬の調製を行った。
２５％（ｖ／ｖ）  ウマ血清
１％（ｗ／ｖ）  ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
２００ｍＭ  塩化ナトリウム
８．１ｍＭ  リン酸一水素二ナトリウム
１．７ｍＭ  リン酸二水素一ナトリウム
【０３０８】
（８）酵素標識抗体
ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体〔Ｐ０２１４〕（ダコ社）を、酵素標識抗体として用いた。
【０３０９】
（９）標識抗体希釈液の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように精製水に溶解し、ｐＨをｐＨ７．５（２０℃）に調整して、試薬の調製を行った。
１０％（ｖ／ｖ）  ウマ血清
１％（ｗ／ｖ）  ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
５０ｍＭ  塩化ナトリウム
８．１ｍＭ  リン酸一水素二ナトリウム
１．７ｍＭ  リン酸二水素一ナトリウム
【０３１０】
（１０）基質液
ペルオキシダーゼ基質液〔３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン及び過酸化水素を含有〕（サイテック社）を、基質液として用いた。
【０３１１】
（１１）反応停止液
反応停止液〔ＴＳＢ９９９〕（サイテック社）を、反応停止液として用いた。
【０３１２】
（１２）洗浄液の調製
Ｔｗｅｅｎ２０〔ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート〕（和光純薬工業社）の０．０５ｇに、前記（１）で調製したリン酸等張化緩衝液（ＰＢＳ）を加え、１００ｍＬとして、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳよりなる洗浄液を調製した。
【０３１３】
（１３）糖脂質抗原固定化担体の調製
【０３１４】
▲１▼ＧＭ１ａ抗原固定化担体の調製
ＧＭ１ａ〔ウシ脳由来〕（シグマ社）を０．１ｍｇ／Ｌとなるように前記（５）のアジ化ナトリウム含有ＴＢＳに溶解し、その１００μＬをマイクロタイタープレート〔ＥＬＩＳＡ用Ｅタイプ〕（住友ベークライト社）のウェルに分注した。
【０３１５】
そして、このマイクロタイタープレートを、一定時間放置し、ＧＭ１ａをマイクロタイタープレートのウェルに固定化させた。
その後、このウェル内の液を除去した。
【０３１６】
次に、このウェルに前記（３）のＢＳＡ含有ＰＢＳの２００μＬを分注し、一定時間放置してブロッキング処理を行った。
【０３１７】
次に、このマイクロタイタープレートのウェル内を精製水で洗浄した後、真空乾燥を行い、ＧＭ１ａ抗原固定化担体を調製した。
【０３１８】
▲２▼対照担体の調製
前記（５）のアジ化ナトリウム含有ＴＢＳの１００μＬをマイクロタイタープレート〔ＥＬＩＳＡ用Ｅタイプ〕（住友ベークライト社）のウェルに分注した。
【０３１９】
そして、このマイクロタイタープレートを、一定時間放置した。
その後、このウェル内の液を除去した。
【０３２０】
次に、このウェルに前記（３）のＢＳＡ含有ＰＢＳの２００μＬを分注し、一定時間放置してブロッキング処理を行った。
【０３２１】
次に、このマイクロタイタープレートのウェル内を精製水で洗浄した後、真空乾燥を行い、いずれの糖脂質抗原も固定化させていない対照用の担体（対照担体）を調製した。
【０３２２】
２．試料
抗ＧＭ１ａ抗体陽性血清：
神経疾患の患者の血清で、抗ＧＭ１ａ抗体を含むことが確認されている血清を、抗ＧＭ１ａ抗体陽性血清として用意した。
【０３２３】
３．試料中の抗糖脂質抗体の測定
【０３２４】
▲１▼  本実施例の１の（１３）の▲１▼のＧＭ１ａ抗原固定化担体のウェルに、本実施例の１の（６）の▲１▼、▲２▼、▲３▼、又は▲４▼の糖脂質抗原活性化剤を２００μＬ分注した。
これを、５℃、２５℃、又は３７℃で６０分間放置して、担体に固定化されたＧＭ１ａ抗原にＴｗｅｅｎ２０を接触させた。
【０３２５】
▲２▼  前記のウェルより、前記の糖脂質抗原活性化剤を吸引して除去した。
【０３２６】
▲３▼  試料である本実施例の２の抗ＧＭ１ａ抗体陽性血清を本実施例の１の（７）の試料希釈液で１／４００，０００に希釈した後、前記のウェルに１００μＬ分注し、これを低温庫（５℃）にて一晩保管した。
これにより、担体に固定化されているＧＭ１ａ抗原と試料に含まれていた抗ＧＭ１ａ抗体を接触させ、反応させた。
【０３２７】
▲４▼  次に、前記のウェルより、前記の試料（抗ＧＭ１ａ抗体陽性血清）を吸引して除去した。
そして、このウェルを、本実施例の１の（１２）の洗浄液で洗浄した。
【０３２８】
▲５▼  本実施例の１の（８）の酵素標識抗体を、本実施例の１の（９）の標識抗体希釈液で１／４，０００に希釈し、この１００μＬを前記のウェルに分注して、３７℃にて３時間反応させた。
【０３２９】
▲６▼  次に、前記のウェルより、未結合の酵素標識抗体を吸引して除去した。
そして、このウェルを、本実施例の１の（１２）の洗浄液で洗浄した。
【０３３０】
▲７▼  本実施例の１の（１０）の基質液の１００μＬを、前記のウェルに分注し、室温（２４．５℃）で４５分間反応させた。
これにより、担体に固定化された標識酵素（ペルオキシダーゼ）と、基質液の３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン及び過酸化水素を反応させて、色素を生成させた。
【０３３１】
▲８▼  ４５分後に、本実施例の１の（１１）の反応停止液の１００μＬを、前記のウェルに分注して、前記の反応を停止させた。
【０３３２】
▲９▼  マイクロプレートリーダー〔３５５０型〕（バイオラッド社）にて、前記のウェル中の液の吸光度（主波長：４５０ｎｍ、副波長：５５０ｎｍ）を測定して、吸光度測定値〔吸光度Ａ〕を得た。
【０３３３】
▲１０▼  対照として、本実施例の１の（１３）の▲１▼のＧＭ１ａ抗原固定化担体に替えて本実施例の１の（１３）の▲２▼の対照担体を用いる他は、前記▲１▼〜▲９▼の記載の通りに操作を行い、ＧＭ１ａ抗原を固定化させていない担体である対照担体を用いた場合の吸光度測定値〔吸光度Ｂ〕を得た。
【０３３４】
４．測定結果
【０３３５】
以上の測定結果（各吸光度測定値）を表３に示した。
【０３３６】
【表３】
0004524446.tif 000004
【０３３７】
（１）  糖脂質抗原活性化剤を糖脂質抗原に接触させたときの温度が５℃の場合、測定値（吸光度差：吸光度Ａ−吸光度Ｂ）は、糖脂質抗原活性化剤のＴｗｅｅｎ２０の濃度が０％のときの値に比較して、糖脂質抗原活性化剤にＴｗｅｅｎ２０が含まれている場合には、いずれの濃度においても１．４６４倍〜１．５８３倍の値が得られていることが分かる。
【０３３８】
（２）  また、糖脂質抗原活性化剤を糖脂質抗原に接触させたときの温度が２５℃の場合、測定値（吸光度差：吸光度Ａ−吸光度Ｂ）は、糖脂質抗原活性化剤のＴｗｅｅｎ２０の濃度が０％のときの値に比較して、糖脂質抗原活性化剤にＴｗｅｅｎ２０が含まれている場合には、いずれの濃度においても１．４７８倍〜１．５８１倍の値が得られていることが分かる。
【０３３９】
（３）  そして、糖脂質抗原活性化剤を糖脂質抗原に接触させたときの温度が３７℃の場合、測定値（吸光度差：吸光度Ａ−吸光度Ｂ）は、糖脂質抗原活性化剤のＴｗｅｅｎ２０の濃度が０％のときの値に比較して、糖脂質抗原活性化剤にＴｗｅｅｎ２０が含まれている場合には、いずれの濃度においても１．４３０倍〜１．９０６倍の値が得られていることが分かる。
【０３４０】
（４）  以上のことより、界面活性作用を有する物質であるＴｗｅｅｎ２０を、糖脂質抗原に接触させることによる糖脂質抗原の抗原活性の活性化が、広い温度域において達成されることが確かめられた。そして、これにより、試料中の抗糖脂質抗体を感度高く測定することができることが確かめられた。
【０３４１】
（５）  なお、糖脂質抗原を固定化させていない担体である対照担体を用いた場合の測定値（吸光度Ｂ）が、いずれの温度においても、低い値にとどまっていることより、非特異的反応が生じていないことが分かる。
【０３４２】
〔実施例４〕（界面活性作用を有する物質を糖脂質抗原に接触させる際の時間と糖脂質抗原の活性化の効果との関係の確認）
【０３４３】
界面活性作用を有する物質（界面活性剤）であるＴｗｅｅｎ２０を糖脂質抗原に接触させる際の時間を変えたときの、糖脂質抗原の活性化の効果を確かめた。
【０３４４】
１．試薬の調製
【０３４５】
（１）リン酸等張化緩衝液（ＰＢＳ）の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように精製水に溶解し、試薬の調製を行った。（ｐＨ７．５）
１３７ｍＭ  塩化ナトリウム
２．７ｍＭ  塩化カリウム
８．１ｍＭ  リン酸一水素二ナトリウム
１．５ｍＭ  リン酸二水素一カリウム
【０３４６】
（２）ＢＳＡ含有ＰＢＳの調製
０．１ｇのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に、前記（１）で調製したリン酸等張化緩衝液（ＰＢＳ）を加え、１００ｍＬとして、０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ含有ＰＢＳを調製した。
【０３４７】
（３）アジ化ナトリウム含有トリス等張化緩衝液（アジ化ナトリウム含有ＴＢＳ）の調製
トリス等張化緩衝液粉末〔Ｔ−６６６４〕（シグマ社）及びアジ化ナトリウム１ｇを精製水に溶解し、全量を１Ｌとして、試薬の調製を行った。
【０３４８】
（４）糖脂質抗原活性化剤の調製
Ｔｗｅｅｎ２０〔ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート〕（和光純薬工業社）の０．０５ｇに、前記（１）で調製したリン酸等張化緩衝液（ＰＢＳ）を加え、１００ｍＬとして、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳよりなる糖脂質抗原活性化剤を調製した。
【０３４９】
（５）試料希釈液の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように精製水に溶解し、試薬の調製を行った。
２５％（ｖ／ｖ）  ウマ血清
１％（ｗ／ｖ）  ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
２００ｍＭ  塩化ナトリウム
８．１ｍＭ  リン酸一水素二ナトリウム
１．７ｍＭ  リン酸二水素一ナトリウム
【０３５０】
（６）酵素標識抗体
ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体〔Ｐ０２１４〕（ダコ社）を、酵素標識抗体として用いた。
【０３５１】
（７）標識抗体希釈液の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように精製水に溶解し、試薬の調製を行った。
１０％（ｖ／ｖ）  ウマ血清
１％（ｗ／ｖ）  ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
１３７ｍＭ  塩化ナトリウム
２．７ｍＭ  塩化カリウム
８．１ｍＭ  リン酸一水素二ナトリウム
１．５ｍＭ  リン酸二水素一カリウム
【０３５２】
（８）基質液
ペルオキシダーゼ基質液〔３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン及び過酸化水素を含有〕〔ＴＭＢＷ−１０００−０１〕（バイオＦＸラボラトリーズ社）を、基質液として用いた。
【０３５３】
（９）反応停止液
反応停止液〔ＴＳＢ９９９〕（サイテック社）を、反応停止液として用いた。
【０３５４】
（１０）洗浄液の調製
Ｔｗｅｅｎ２０〔ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート〕（和光純薬工業社）の０．０５ｇに、前記（１）で調製したリン酸等張化緩衝液（ＰＢＳ）を加え、１００ｍＬとして、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳよりなる洗浄液を調製した。
【０３５５】
（１１）糖脂質抗原固定化担体の調製
【０３５６】
▲１▼ＧＭ１ａ抗原固定化担体の調製
ＧＭ１ａ〔ウシ脳由来〕（シグマ社）を０．１ｍｇ／Ｌとなるように前記（３）のアジ化ナトリウム含有ＴＢＳに溶解し、その１００μＬをマイクロタイタープレート〔ＥＬＩＳＡ用Ｅタイプ〕（住友ベークライト社）のウェルに分注した。
【０３５７】
そして、このマイクロタイタープレートを、一定時間放置し、ＧＭ１ａをマイクロタイタープレートのウェルに固定化させた。
その後、このウェル内の液を除去した。
【０３５８】
次に、このウェルに前記（２）のＢＳＡ含有ＰＢＳの２００μＬを分注し、一定時間放置してブロッキング処理を行った。
【０３５９】
次に、このマイクロタイタープレートのウェル内を精製水で洗浄した後、真空乾燥を行い、ＧＭ１ａ抗原固定化担体を調製した。
【０３６０】
▲２▼対照担体の調製
前記（３）のアジ化ナトリウム含有ＴＢＳの１００μＬをマイクロタイタープレート〔ＥＬＩＳＡ用Ｅタイプ〕（住友ベークライト社）のウェルに分注した。
【０３６１】
そして、このマイクロタイタープレートを、一定時間放置した。
その後、このウェル内の液を除去した。
【０３６２】
次に、このウェルに前記（２）のＢＳＡ含有ＰＢＳの２００μＬを分注し、一定時間放置してブロッキング処理を行った。
【０３６３】
次に、このマイクロタイタープレートのウェル内を精製水で洗浄した後、真空乾燥を行い、いずれの糖脂質抗原も固定化させていない対照用の担体（対照担体）を調製した。
【０３６４】
２．試料
抗ＧＭ１ａ抗体陽性血清：
神経疾患の患者の血清で、抗ＧＭ１ａ抗体を含むことが確認されている血清を、抗ＧＭ１ａ抗体陽性血清として用意した。
【０３６５】
３．試料中の抗糖脂質抗体の測定
【０３６６】
▲１▼  本実施例の１の（１１）の▲１▼のＧＭ１ａ抗原固定化担体のウェルに、本実施例の１の（４）の糖脂質抗原活性化剤を２００μＬ分注し、これを室温で放置して、担体に固定化されたＧＭ１ａ抗原にＴｗｅｅｎ２０を接触させた。
【０３６７】
なお、この糖脂質抗原活性化剤を担体に固定化されたＧＭ１ａ抗原に接触させる時間は、それぞれ下記の時間において行った。
【０３６８】
６０分間
３０分間
１５分間
１０分間
７分間
５分間
４分間
２分間  又は、
１分間
【０３６９】
また、比較のため、前記のＧＭ１ａ抗原固定化担体のウェルに、前記の糖脂質抗原活性化剤を接触させないものを、接触時間が０分間のものとした。
０分間
【０３７０】
▲２▼  前記のウェルより、前記の糖脂質抗原活性化剤を吸引して除去した。
【０３７１】
▲３▼  試料である本実施例の２の抗ＧＭ１ａ抗体陽性血清を本実施例の１の（５）の試料希釈液で１／２００，０００に希釈した後、前記のウェルに１００μＬ分注し、これを低温庫（５℃）にて一晩保管した。
これにより、担体に固定化されているＧＭ１ａ抗原と試料に含まれていた抗ＧＭ１ａ抗体を接触させ、反応させた。
【０３７２】
▲４▼  次に、前記のウェルより、前記の試料（抗ＧＭ１ａ抗体陽性血清）を吸引して除去した。
そして、このウェルを、本実施例の１の（１０）の洗浄液で洗浄した。
【０３７３】
▲５▼  本実施例の１の（６）の酵素標識抗体を、本実施例の１の（７）の標識抗体希釈液で１／４，０００に希釈し、この１００μＬを前記のウェルに分注して、３７℃にて３時間反応させた。
【０３７４】
▲６▼  次に、前記のウェルより、未結合の酵素標識抗体を吸引して除去した。
そして、このウェルを、本実施例の１の（１０）の洗浄液で洗浄した。
【０３７５】
▲７▼  本実施例の１の（８）の基質液の１００μＬを、前記のウェルに分注し、２５℃で６０分間反応させた。
これにより、担体に固定化された標識酵素（ペルオキシダーゼ）と、基質液の３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン及び過酸化水素を反応させて、色素を生成させた。
【０３７６】
▲８▼  ６０分後に、本実施例の１の（９）の反応停止液の１００μＬを、前記のウェルに分注して、前記の反応を停止させた。
【０３７７】
▲９▼  マイクロプレートリーダー〔３５５０型〕（バイオラッド社）にて、前記のウェル中の液の吸光度（主波長：４５０ｎｍ、副波長：５５０ｎｍ）を測定して、吸光度測定値〔吸光度Ａ〕を得た。
【０３７８】
▲１０▼  対照として、本実施例の１の（１１）の▲１▼のＧＭ１ａ抗原固定化担体に替えて、本実施例の１の（１１）の▲２▼の対照担体を用いる他は、前記▲１▼〜▲９▼の記載の通りに操作を行い、ＧＭ１ａ抗原を固定化させていない担体である対照担体を用いた場合の吸光度測定値〔吸光度Ｂ〕を得た。
【０３７９】
４．測定結果
【０３８０】
以上の測定結果（各吸光度測定値）を表４に示した。
【０３８１】
【表４】
0004524446.tif 000005
【０３８２】
測定値（吸光度差：吸光度Ａ−吸光度Ｂ）は、糖脂質抗原活性化剤のＴｗｅｅｎ２０を糖脂質抗原に接触させないときの値に比較して、糖脂質抗原に接触させたときは、接触時間がいずれの場合においても３．２６４倍〜３．７２２倍の値が得られていることが分かる。
【０３８３】
そして、たとえ、接触時間が１分間であっても、糖脂質抗原は充分に活性化されていることが分かる。
【０３８４】
以上のことより、界面活性作用を有する物質であるＴｗｅｅｎ２０を、糖脂質抗原に接触させる時間が１分間でも、又は６０分間であっても、糖脂質抗原の抗原活性の活性化が達成され、試料中の抗糖脂質抗体を感度高く測定することができることが確かめられた。
【０３８５】
なお、糖脂質抗原を固定化させていない担体である対照担体を用いた場合の測定値（吸光度Ｂ）が、いずれの接触時間においても、低い値にとどまっていることより、非特異的反応が生じていないことが分かる。
【０３８６】
〔実施例５〕（界面活性作用を有する物質を糖脂質抗原に接触させる方法と糖脂質抗原の活性化の効果との関係の確認）
【０３８７】
界面活性作用を有する物質（界面活性剤）であるＴｗｅｅｎ２０を糖脂質抗原に接触させる方法を変えたときの、糖脂質抗原の活性化の効果を確かめた。
【０３８８】
１．試薬の調製
【０３８９】
（１）リン酸等張化緩衝液（ＰＢＳ）の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように精製水に溶解し、試薬の調製を行った。（ｐＨ７．５）
１３７ｍＭ  塩化ナトリウム
２．７ｍＭ  塩化カリウム
８．１ｍＭ  リン酸一水素二ナトリウム
１．５ｍＭ  リン酸二水素一カリウム
【０３９０】
（２）ＢＳＡ含有ＰＢＳの調製
０．１ｇのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に、前記（１）で調製したリン酸等張化緩衝液（ＰＢＳ）を加え、１００ｍＬとして、０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ含有ＰＢＳを調製した。
【０３９１】
（３）アジ化ナトリウム含有トリス等張化緩衝液（アジ化ナトリウム含有ＴＢＳ）の調製
トリス等張化緩衝液粉末〔Ｔ−６６６４〕（シグマ社）及びアジ化ナトリウム１ｇを精製水に溶解し、全量を１Ｌとして、試薬の調製を行った。
【０３９２】
（４）糖脂質抗原活性化剤の調製
Ｔｗｅｅｎ２０〔ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート〕（和光純薬工業社）の０．０５ｇに、前記（１）で調製したリン酸等張化緩衝液（ＰＢＳ）を加え、１００ｍＬとして、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳよりなる糖脂質抗原活性化剤を調製した。
【０３９３】
（５）試料希釈液の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように精製水に溶解し、試薬の調製を行った。
１０％（ｖ／ｖ）  ウマ血清
１％（ｗ／ｖ）  ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
２００ｍＭ  塩化ナトリウム
８．１ｍＭ  リン酸一水素二ナトリウム
１．５ｍＭ  リン酸二水素一カリウム
【０３９４】
（６）酵素標識抗体
ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体〔Ｐ０２１４〕（ダコ社）を、酵素標識抗体として用いた。
【０３９５】
（７）標識抗体希釈液の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように精製水に溶解し、試薬の調製を行った。
３％（ｖ／ｖ）  ウマ血清
０．１％（ｗ／ｖ）  ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
１３７ｍＭ  塩化ナトリウム
２．７ｍＭ  塩化カリウム
８．１ｍＭ  リン酸一水素二ナトリウム
１．５ｍＭ  リン酸二水素一カリウム
【０３９６】
（８）基質液の調製
３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン塩酸塩（同仁化学社）を１．３ｍＭとなるように、及びＥＤＴＡ・２Ｎａ・２Ｈ２Ｏを０．２ｍＭとなるように精製水に溶解し、そしてｐＨをｐＨ２．０に調整して、ＴＭＢＺ溶液を調製した。
次に、クエン酸一水和物を４１ｍＭとなるように、リン酸一水素二ナトリウムを２３ｍＭとなるように、及びＥＤＴＡ・２Ｎａ・２Ｈ２Ｏを０．２ｍＭとなるように精製水に溶解し、そしてｐＨをｐＨ４．３に調整して、クエン酸緩衝液を調製した。
このクエン酸緩衝液に、過酸化水素水を５ｍＭとなるように混合して過酸化水素溶液を調製した。
使用直前に、前記のＴＭＢＺ溶液と前記の過酸化水素溶液を、等量ずつ混和して、基質液を調製した。
【０３９７】
（９）反応停止液の調製
硫酸を０．７Ｎとなるように精製水に溶解して反応停止液を調製した。
【０３９８】
（１０）洗浄液の調製
Ｔｗｅｅｎ２０〔ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート〕（和光純薬工業社）の０．０５ｇに、前記（１）で調製したリン酸等張化緩衝液（ＰＢＳ）を加え、１００ｍＬとして、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳよりなる洗浄液を調製した。
【０３９９】
（１１）糖脂質抗原固定化担体の調製
【０４００】
▲１▼ＧＭ１ａ抗原固定化担体の調製
ＧＭ１ａ〔ウシ脳由来〕（シグマ社）を０．１ｍｇ／Ｌとなるように前記（３）のアジ化ナトリウム含有ＴＢＳに溶解し、その１００μＬをマイクロタイタープレート〔ＥＬＴＳＡ用Ｅタイプ〕（住友ベークライト社）のウェルに分注した。
【０４０１】
そして、このマイクロタイタープレートを、一定時間放置し、ＧＭ１ａをマイクロタイタープレートのウェルに固定化させた。
その後、このウェル内の液を除去した。
【０４０２】
次に、このウェルに前記（２）のＢＳＡ含有ＰＢＳの２００μＬを分注し、一定時間放置してブロッキング処理を行った。
【０４０３】
次に、このマイクロタイタープレートのウェル内を精製水で洗浄した後、真空乾燥を行い、ＧＭ１ａ抗原固定化担体を調製した。
【０４０４】
▲２▼対照担体の調製
前記（３）のアジ化ナトリウム含有ＴＢＳの１００μＬをマイクロタイタープレート〔ＥＬＩＳＡ用Ｅタイプ〕（住友ベークライト社）のウェルに分注した。
【０４０５】
そして、このマイクロタイタープレートを、一定時間放置した。
その後、このウェル内の液を除去した。
【０４０６】
次に、このウェルに前記（２）のＢＳＡ含有ＰＢＳの２００μＬを分注し、一定時間放置してブロッキング処理を行った。
【０４０７】
次に、このマイクロタイタープレートのウェル内を精製水で洗浄した後、真空乾燥を行い、いずれの糖脂質抗原も固定化させていない対照用の担体（対照担体）を調製した。
【０４０８】
２．試料
抗ＧＭ１ａ抗体陽性血清：
試料として、神経疾患の患者の血清で、抗ＧＭ１ａ抗体を含むことが確認されている血清を、抗ＧＭ１ａ抗体陽性血清として用意した。
【０４０９】
３．試料中の抗糖脂質抗体の測定
【０４１０】
（１）糖脂質抗原活性化剤を接触させた後に除去することなく試料を接触させた場合
【０４１１】
▲１▼  本実施例の１の（１１）の▲１▼のＧＭ１ａ抗原固定化担体のウェルに、本実施例の１の（４）の糖脂質抗原活性化剤を１００μＬ分注し、これを室温で１９分間放置して、担体に固定化されたＧＭ１ａ抗原にＴｗｅｅｎ２０を接触させた。
【０４１２】
▲２▼  次に、前記の糖脂質抗原活性化剤を除去することなく、試料である本実施例の２の抗ＧＭ１ａ抗体陽性血清を本実施例の１の（５）の試料希釈液で１／１５０，０００に希釈した後に前記のウェルに１００μＬ分注し、これを低温庫（５℃）にて一晩保管した。
これにより、担体に固定化されているＧＭ１ａ抗原と試料に含まれていた抗ＧＭ１ａ抗体を接触させ、反応させた。
【０４１３】
▲３▼  次に、前記のウェルより、前記の糖脂質抗原活性化剤及び試料を吸引して除去した。
そして、このウェルを、本実施例の１の（１０）の洗浄液で洗浄した。
【０４１４】
▲４▼  本実施例の１の（６）の酵素標識抗体を、本実施例の１の（７）の標識抗体希釈液で１／４，０００に希釈し、この１００μＬを前記のウェルに分注して、３７℃にて３時間反応させた。
【０４１５】
▲５▼  次に、前記のウェルより、未結合の酵素標識抗体を吸引して除去した。
そして、このウェルを、本実施例の１の（１０）の洗浄液で洗浄した。
【０４１６】
▲６▼  本実施例の１の（８）の基質液の１００μＬを、前記のウェルに分注し、室温（２５℃）で４０分間反応させた。
これにより、担体に固定化された標識酵素（ペルオキシダーゼ）と、基質液の３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン及び過酸化水素を反応させて、色素を生成させた。
【０４１７】
▲７▼  ４０分後に、本実施例の１の（９）の反応停止液の１００μＬを、前記のウェルに分注して、前記の反応を停止させた。
【０４１８】
▲８▼  マイクロプレートリーダー〔３５５０型〕（バイオラッド社）にて、前記のウェル中の液の吸光度（主波長：４５０ｎｍ、副波長：５５０ｎｍ）を測定して、吸光度測定値〔吸光度Ａ〕を得た。
【０４１９】
▲９▼  対照として、本実施例の１の（１１）の▲１▼のＧＭ１ａ抗原固定化担体に替えて、本実施例の１の（１１）の▲２▼の対照担体を用いる他は、前記▲１▼〜▲８▼の記載の通りに操作を行い、ＧＭ１ａ抗原を固定化させていない担体である対照担体を用いた場合の吸光度測定値〔吸光度Ｂ〕を得た。
【０４２０】
（２）糖脂質抗原活性化剤を接触させた後に除去し、その後試料を接触させた場合
【０４２１】
▲１▼  本実施例の１の（１１）の▲１▼のＧＭ１ａ抗原固定化担体のウェルに、本実施例の１の（４）の糖脂質抗原活性化剤を１００μＬ分注し、これを室温で１９分間放置して、担体に固定化されたＧＭ１ａ抗原にＴｗｅｅｎ２０を接触させた。
【０４２２】
▲２▼  前記のウェルより、前記の糖脂質抗原活性化剤を吸引して除去した。
【０４２３】
▲３▼  試料である本実施例の２の抗ＧＭ１ａ抗体陽性血清を本実施例の１の（５）の試料希釈液で１／３００，０００に希釈した後、前記のウェルに２００μＬ分注し、これを低温庫（５℃）にて一晩保管した。
これにより、担体に固定化されているＧＭ１ａ抗原と試料に含まれていた抗ＧＭ１ａ抗体を接触させ、反応させた。
【０４２４】
▲４▼  次に、前記のウェルより、前記の試料を吸引して除去した。
そして、このウェルを、本実施例の１の（１０）の洗浄液で洗浄した。
【０４２５】
以下の操作は、前記の「（１）糖脂質抗原活性化剤を接触させた後に除去することなく試料を接触させた場合」の▲４▼〜▲９▼の記載の通りに測定を行った。
【０４２６】
（３）糖脂質抗原活性化剤と試料を同時に接触させた場合
【０４２７】
▲１▼  試料である本実施例の２の抗ＧＭ１ａ抗体陽性血清を本実施例の１の（５）の試料希釈液で１／１５０，０００に希釈した後、この２００μＬを本実施例の１の（４）の糖脂質抗原活性化剤の２００μＬと混合した。
【０４２８】
▲２▼  前記の糖脂質抗原活性化剤と試料の混合液の２００μＬを、本実施例の１の（１１）の▲１▼のＧＭ１ａ抗原固定化担体のウェルに分注し、これを低温庫（５℃）にて一晩保管した。
これにより、糖脂質抗原活性化剤であるＴｗｅｅｎ２０及び試料である抗ＧＭ１ａ抗体陽性血清を、担体に固定化されたＧＭ１ａ抗原に接触させた。
【０４２９】
▲３▼  次に、前記のウェルより、前記の糖脂質抗原活性化剤及び試料を吸引して除去した。
そして、このウェルを、本実施例の１の（１０）の洗浄液で洗浄した。
【０４３０】
以下の操作は、前記の「（１）糖脂質抗原活性化剤を接触させた後に除去することなく試料を接触させた場合」の▲４▼〜▲９▼の記載の通りに測定を行った。
【０４３１】
（４）糖脂質抗原活性化剤を用いない場合
【０４３２】
▲１▼  本実施例の１の（１１）の▲１▼のＧＭ１ａ抗原固定化担体のウェルに、試料である本実施例の２の抗ＧＭ１ａ抗体陽性血清を本実施例の１の（５）の試料希釈液で１／３００，０００に希釈した後、前記のウェルに２００μＬ分注し、これを低温庫（５℃）にて一晩保管した。
これにより、担体に固定化されているＧＭ１ａ抗原と試料に含まれていた抗ＧＭ１ａ抗体を接触させ、反応させた。
【０４３３】
▲２▼  次に、前記のウェルより、前記の試料を吸引して除去した。
そして、このウェルを、本実施例の１の（１０）の洗浄液で洗浄した。
【０４３４】
以下の操作は、前記の「（１）糖脂質抗原活性化剤を接触させた後に除去することなく試料を接触させた場合」の▲４▼〜▲９▼の記載の通りに測定を行った。
【０４３５】
４．測定結果
【０４３６】
以上の測定結果（各吸光度測定値）を表５に示した。
【０４３７】
【表５】
0004524446.tif 000006
【０４３８】
測定値（吸光度差：吸光度Ａ−吸光度Ｂ）は、糖脂質抗原活性化剤のＴｗｅｅｎ２０を糖脂質抗原に接触させないときの値に比較して、「（１）糖脂質抗原活性化剤を接触させた後に除去することなく試料を接触させた場合」及び「（２）糖脂質抗原活性化剤を接触させた後に除去し、その後試料を接触させた場合」においては、２．１２１倍、及び１．７７３倍の値がそれぞれ得られていることが分かる。
【０４３９】
これに対して、「（３）糖脂質抗原活性化剤と試料を同時に接触させた場合」においては、１．２９１倍であり、糖脂質抗原の活性化度は先の（１）及び（２）の場合よりも低いことが分かる。
【０４４０】
以上のことより、糖脂質抗原を糖脂質抗原活性化剤であるＴｗｅｅｎ２０と接触させた後に、試料に含まれていた抗糖脂質抗体と接触させ、反応させた場合には、糖脂質抗原の抗原活性の活性化が顕著であり、試料中の抗糖脂質抗体を感度高く測定することができることが確かめられた。
【０４４１】
なお、糖脂質抗原を固定化させていない担体である対照担体を用いた場合の測定値（吸光度Ｂ）が、いずれの接触方法においても、低い値にとどまっていることより、非特異的反応が生じていないことが分かる。
【０４４２】
〔実施例６〕（種々の界面活性作用を有する物質又はタンパク質を糖脂質抗原に接触させたときの糖脂質抗原の活性化の効果の確認）
【０４４３】
種々の界面活性作用を有する物質又はタンパク質を、糖脂質抗原に接触させたときの、糖脂質抗原の活性化の効果を確かめた。
【０４４４】
１．試薬の調製
【０４４５】
（１）リン酸等張化緩衝液（ＰＢＳ）の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように精製水に溶解し、試薬の調製を行った。（ｐＨ７．５）
１３７ｍＭ  塩化ナトリウム
２．７ｍＭ  塩化カリウム
８．１ｍＭ  リン酸一水素二ナトリウム
１．５ｍＭ  リン酸二水素一カリウム
【０４４６】
（２）ＢＳＡ含有ＰＢＳの調製
０．１ｇのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に、前記（１）で調製したリン酸等張化緩衝液（ＰＢＳ）を加え、１００ｍＬとして、０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ含有ＰＢＳを調製した。
【０４４７】
（３）アジ化ナトリウム含有トリス等張化緩衝液（アジ化ナトリウム含有ＴＢＳ）の調製
トリス等張化緩衝液粉末〔Ｔ−６６６４〕（シグマ社）及びアジ化ナトリウム１ｇを精製水に溶解し、全量を１Ｌとして、試薬の調製を行った。
【０４４８】
（４）糖脂質抗原活性化剤の調製
下記の界面活性作用を有する物質又はタンパク質を、下記の濃度となるように、前記（１）のリン酸等張化緩衝液（ＰＢＳ）に加えて、各々の糖脂質抗原活性化剤を調製した。
【０４４９】
ａ．非イオン性界面活性剤
【０４５０】
▲１▼  ０．０５％（ｗ／ｖ）  Ｔｗｅｅｎ２０〔ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート〕（相光純薬工業社）
【０４５１】
▲２▼  ０．５％（ｗ／ｖ）  Ｔｗｅｅｎ２０〔ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート〕（和光純薬工業社）
【０４５２】
▲３▼  ０．０１％（ｗ／ｖ）  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００〔ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル〕（ナカライテスク社）
【０４５３】
▲４▼  ０．０１％（ｗ／ｖ）  ＢＴ−７〔ポリオキシエチレン（７）２級アルキルエーテル〕（日光ケミカル社）
【０４５４】
ｂ．陰イオン性界面活性剤
【０４５５】
▲１▼  ０．０１％（ｗ／ｖ）  ＳＤＳ〔ドデシル硫酸ナトリウム〕（和光純薬工業社）
【０４５６】
▲２▼  ０．０１％（ｗ／ｖ）  サルコシネート  ＬＮ〔ラウロイルサルコシンナトリウム〕（日光ケミカル社）
【０４５７】
ｃ．陽イオン性界面活性剤
【０４５８】
▲１▼  ０．０１％（ｖ／ｖ）  ＣＡ−１０１〔５０％塩化ベンサルコニウム水溶液〕（日光ケミカル社）
【０４５９】
▲２▼  ０．０１％（ｖ／ｖ）  ＣＡ−２３５０〔５０％塩化セチルトリメチルアンモニウム〕（日光ケミカル社）
【０４６０】
ｄ．両性界面活性剤
【０４６１】
▲１▼  ０．０１％（ｗ／ｖ）  ＡＭ−３０１〔３５％ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン水溶液〕（日光ケミカル社）
【０４６２】
▲２▼  ０．０１％（ｗ／ｖ）  ＡＭ−３１３０Ｎ〔３０％ヤシ油脂肪酸アミドプロピルジメチルアミノ酢酸ベタイン水溶液〕（日光ケミカル社）
【０４６３】
ｅ．タンパク質
【０４６４】
▲１▼  ０．１％（ｗ／ｖ）  ウシ血清アルブミン
【０４６５】
▲２▼  １％（ｗ／ｖ）  ウシ血清アルブミン
【０４６６】
また、下記のタンパク質を含む、２００ｍＭ塩化ナトリウム及び１．５ｍＭリン酸二水素一カリウムを含有する８．１ｍＭリン酸一水素二ナトリウム水溶液よりなる糖脂質抗原活性化剤を調製した。
【０４６７】
１０％（ｖ／ｖ）  ウマ血清  及び  １％（ｗ／ｖ）  ウシ血清アルブミン
【０４６８】
（５）試料希釈液の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように精製水に溶解し、試薬の調製を行った。
１０％（ｖ／ｖ）  ウマ血清
１％（ｗ／ｖ）  ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
２００ｍＭ  塩化ナトリウム
８．１ｍＭ  リン酸一水素二ナトリウム
１．５ｍＭ  リン酸二水素一カリウム
【０４６９】
（６）酵素標識抗体
ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体〔Ｐ０２１４〕（ダコ社）を、酵素標識抗体として用いた。
【０４７０】
（７）標識抗体希釈液の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように精製水に溶解し、試薬の調製を行った。
３％（ｖ／ｖ）  ウマ血清
０．１％（ｗ／ｖ）  ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
１３７ｍＭ  塩化ナトリウム
２．７ｍＭ  塩化カリウム
８．１ｍＭ  リン酸一水素二ナトリウム
１．５ｍＭ  リン酸二水素一カリウム
【０４７１】
（８）基質液の調製
３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン塩酸塩（同仁化学社）を１．３ｍＭとなるように、及びＥＤＴＡ・２Ｎａ・２Ｈ２Ｏを０．２ｍＭとなるように精製水に溶解し、そしてｐＨをｐＨ２．０に調整して、ＴＭＢＺ溶液を調製した。
次に、クエン酸一水和物を４１ｍＭとなるように、リン酸一水素二ナトリウムを２３ｍＭとなるように、及びＥＤＴＡ・２Ｎａ・２Ｈ２Ｏを０．２ｍＭとなるように精製水に溶解し、そしてｐＨをｐＨ４．３に調整して、クエン酸緩衝液を調製した。
このクエン酸緩衝液に、過酸化水素水を５ｍＭとなるように混合して過酸化水素溶液を調製した。
使用直前に、前記のＴＭＢＺ溶液と前記の過酸化水素溶液を、等量ずつ混和して、基質液を調製した。
【０４７２】
（９）反応停止液の調製
硫酸を０．７Ｎとなるように精製水に溶解して反応停止液を調製した。
【０４７３】
（１０）洗浄液の調製
Ｔｗｅｅｎ２０〔ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート〕（和光純薬工業社）の０．０５ｇに、前記（１）で調製したリン酸等張化緩衝液（ＰＢＳ）を加え、１００ｍＬとして、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳよりなる洗浄液を調製した。
【０４７４】
（１１）糖脂質抗原固定化担体の調製
【０４７５】
▲１▼ＧＭ１ａ抗原固定化担体の調製
ＧＭ１ａ〔ウシ脳由来〕（シグマ社）を０．１ｍｇ／Ｌとなるように前記（３）のアジ化ナトリウム含有ＴＢＳに溶解し、その１００μＬをマイクロタイタープレート〔ＥＬＩＳＡ用Ｅタイプ〕（住友ベークライト社）のウェルに分注した。
【０４７６】
そして、このマイクロタイタープレートを、一定時間放置し、ＧＭ１ａをマイクロタイタープレートのウェルに固定化させた。
その後、このウェル内の液を除去した。
【０４７７】
次に、このウェルに前記（２）のＢＳＡ含有ＰＢＳの２００μＬを分注し、一定時間放置してブロッキング処理を行った。。
【０４７８】
次に、このマイクロタイタープレートのウェル内を精製水で洗浄した後、真空乾燥を行い、ＧＭ１ａ抗原固定化担体を調製した。
【０４７９】
▲２▼対照担体の調製
前記（３）のアジ化ナトリウム含有ＴＢＳの１００μＬをマイクロタイタープレート〔ＥＬＩＳＡ用Ｅタイプ〕（住友ベークライト社）のウェルに分注した。
【０４８０】
そして、このマイクロタイタープレートを、一定時間放置した。
その後、このウェル内の液を除去した。
【０４８１】
次に、このウェルに前記（２）のＢＳＡ含有ＰＢＳの２００μＬを分注し、一定時間放置してブロッキング処理を行った。
【０４８２】
次に、このマイクロタイタープレートのウェル内を精製水で洗浄した後、真空乾燥を行い、いずれの糖脂質抗原も固定化させていない対照用の担体（対照担体）を調製した。
【０４８３】
２．試料
抗ＧＭ１ａ抗体陽性血清：
試料として、神経疾患の患者の血清で、抗ＧＭ１ａ抗体を含むことが確認されている血清を、抗ＧＭ１ａ抗体陽性血清として用意した。
【０４８４】
３．試料中の抗糖脂質抗体の測定
【０４８５】
（１）糖脂質抗原活性化剤を用いた場合
▲１▼  本実施例の１の（１１）の▲１▼のＧＭ１ａ抗原固定化担体のウェルに、本実施例の１の（４）の糖脂質抗原活性化剤を１００μＬ分注し、これを室温にて２０分間放置して、担体に固定化されたＧＭ１ａ抗原に、前記糖脂質抗原活性化剤に含まれる界面活性作用を有する物質又はタンパク質を接触させた。
【０４８６】
▲２▼  前記のウェルより、前記の糖脂質抗原活性化剤を吸引して除去した。
【０４８７】
▲３▼  試料である本実施例の２の抗ＧＭ１ａ抗体陽性血清を本実施例の１の（５）の試料希釈液で１／３００，０００に希釈した後、前記のウェルに１００μＬ分注し、これを低温庫（５℃）にて一晩保管した。
これにより、担体に固定化されているＧＭ１ａ抗原と試料に含まれていた抗ＧＭ１ａ抗体を接触させ、反応させた。
【０４８８】
▲４▼  次に、前記のウェルより、前記の試料を吸引して除去した。
そして、このウェルを、本実施例の１の（１０）の洗浄液で洗浄した。
【０４８９】
▲５▼  本実施例の１の（６）の酵素標識抗体を、本実施例の１の（７）の標識抗体希釈液で１／４，０００に希釈し、この１００μＬを前記のウェルに分注して、３７℃にて３時間反応させた。
【０４９０】
▲６▼  次に、前記のウェルより、未結合の酵素標識抗体を吸引して除去した。
そして、このウェルを、本実施例の１の（１０）の洗浄液で洗浄した。
【０４９１】
▲７▼  本実施例の１の（８）の基質液の１００μＬを、前記のウェルに分注し、２５℃で６０分間反応させた。
これにより、担体に固定化された標識酵素（ペルオキシダーゼ）と、基質液の３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン及び過酸化水素を反応させて、色素を生成させた。
【０４９２】
▲８▼  ６０分後に、本実施例の１の（９）の反応停止液の１００μＬを、前記のウェルに分注して、前記の反応を停止させた。
【０４９３】
▲９▼  マイクロプレートリーダー〔３５５０型〕（バイオラッド社）にて、前記のウェル中の液の吸光度（主波長：４５０ｎｍ、副波長：５５０ｎｍ）を測定して、吸光度測定値〔吸光度Ａ〕を得た。
【０４９４】
▲１０▼  対照として、本実施例の１の（１１）の▲１▼のＧＭ１ａ抗原固定化担体に替えて、本実施例の１の（１１）の▲２▼の対照担体を用いる他は、前記▲１▼〜▲９▼の記載の通りに操作を行い、ＧＭ１ａ抗原を固定化させていない担体である対照担体を用いた場合の吸光度測定値〔吸光度Ｂ〕を得た。
【０４９５】
（２）糖脂質抗原活性化剤を用いない場合
▲１▼  本実施例の１の（１１）の▲１▼のＧＭ１ａ抗原固定化担体のウェルに、試料である本実施例の２の抗ＧＭ１ａ抗体陽性血清を本実施例の１の（５）の試料希釈液で１／３００，０００に希釈した後、前記のウェルに１００μＬ分注し、これを低温庫（５℃）にて一晩保管した。
これにより、担体に固定化されているＧＭ１ａ抗原と試料に含まれていた抗ＧＭ１ａ抗体を接触させ、反応させた。
【０４９６】
▲２▼  以下の操作は、前記の「（１）糖脂質抗原活性化剤を用いた場合」の▲４▼〜▲１０▼の記載の通りに測定を行った。
【０４９７】
４．測定結果
【０４９８】
以上の測定結果（各吸光度測定値）を表６に示した。
【０４９９】
【表６】
0004524446.tif 000007
【０５００】
この表より、界面活性作用を有する物質又はタンパク質を糖脂質抗原に接触させた場合は、これを接触させない場合に比べて、界面活性作用を有する物質又はタンパク質がいずれの場合においても、測定値（吸光度差：吸光度Ａ−吸光度Ｂ）が高くなっていることが分かる。
【０５０１】
このことより、非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、又はタンパク質と糖脂質抗原とを接触させた後に、試料に含まれていた抗糖脂質抗体と糖脂質抗原とを接触させ、反応させることにより、糖脂質抗原の抗原活性が活性化されて、試料中の抗糖脂質抗体を感度高く測定することができることが確かめられた。
【０５０２】
なお、糖脂質抗原を固定化させていない担体である対照担体を用いた場合の測定値（吸光度Ｂ）が、いずれの場合においても、低い値にとどまっていることより、非特異的反応が生じていないことが分かる。
【０５０３】
〔実施例７〕（ＩｇＭ型抗ＧＭ１ａ抗体の測定）
【０５０４】
そのクラスがＩｇＭである抗ＧＭ１ａ抗体を測定する際の、糖脂質抗原活性化剤による糖脂質抗原の活性化の効果を確かめた。
【０５０５】
１．試薬の調製
【０５０６】
（１）リン酸等張化緩衝液（ＰＢＳ）の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように精製水に溶解し、試薬の調製を行った。（ｐＨ７．５）
１３７ｍＭ  塩化ナトリウム
２．７ｍＭ  塩化カリウム
８．１ｍＭ  リン酸一水素二ナトリウム
１．５ｍＭ  リン酸二水素一カリウム
【０５０７】
（２）ＢＳＡ含有ＰＢＳの調製
０．１ｇのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に、前記（１）で調製したリン酸等張化緩衝液（ＰＢＳ）を加え、１００ｍＬとして、０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ含有ＰＢＳを調製した。
【０５０８】
（３）アジ化ナトリウム含有トリス等張化緩衝液（アジ化ナトリウム含有ＴＢＳ）の調製
トリス等張化緩衝液粉末〔Ｔ−６６６４〕（シグマ社）及びアジ化ナトリウム１ｇを精製水に溶解し、全量を１Ｌとして、試薬の調製を行った。
【０５０９】
（４）糖脂質抗原活性化剤の調製
Ｔｗｅｅｎ２０〔ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート〕（和光純薬工業社）の０．０５ｇに、前記（１）で調製したリン酸等張化緩衝液（ＰＢＳ）を加え、１００ｍＬとして、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳよりなる糖脂質抗原活性化剤を調製した。
【０５１０】
（５）試料希釈液の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように、トリス等張化緩衝液粉末〔Ｔ−６６６４〕（シグマ社）とともに１Ｌの精製水に溶解し、試薬の調製を行った。
１０％（ｖ／ｖ）  ウマ血清
１％（ｗ／ｖ）  ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
【０５１１】
（６）酵素標識抗体
ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＭ抗体〔Ｐ０２１５〕（ダコ社）を、酵素標識抗体として用いた。
【０５１２】
（７）標識抗体希釈液の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように、トリス等張化緩衝液粉末〔Ｔ−６６６４〕（シグマ社）とともに１Ｌの精製水に溶解し、試薬の調製を行った。
１０％（ｖ／ｖ）  ウマ血清
１％（ｗ／ｖ）  ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
【０５１３】
（８）基質液
ペルオキシダーゼ基質液〔３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン及び過酸化水素を含有〕〔ＴＭＢＷ−１０００−０１〕（バイオＦＸラボラトリーズ社）を、基質液として用いた。
【０５１４】
（９）反応停止液
反応停止液〔ＴＳＢ９９９〕（サイテック社）を、反応停止液として用いた。
【０５１５】
（１０）洗浄液の調製
Ｔｗｅｅｎ２０〔ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート〕（和光純薬工業社）の０．０５ｇに、前記（１）で調製したリン酸等張化緩衝液（ＰＢＳ）を加え、１００ｍＬとして、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳよりなる洗浄液を調製した。
【０５１６】
（１１）糖脂質抗原固定化担体の調製
【０５１７】
▲１▼ＧＭ１ａ抗原固定化担体の調製
ＧＭ１ａ〔ウシ脳由来〕（シグマ社）を０．１ｍｇ／Ｌとなるように前記（３）のアジ化ナトリウム含有ＴＢＳに溶解し、その１００μＬをマイクロタイタープレート〔ＥＬＩＳＡ用Ｅタイプ〕（住友ベークライト社）のウェルに分注した。
【０５１８】
そして、このマイクロタイタープレートを、一定時間放置し、ＧＭ１ａをマイクロタイタープレートのウェルに固定化させた。
その後、このウェル内の液を除去した。
【０５１９】
次に、このウェルに前記（２）のＢＳＡ含有ＰＢＳの２００μＬを分注し、一定時間放置してブロッキング処理を行った。
【０５２０】
次に、このマイクロタイタープレートのウェル内を精製水で洗浄した後、真空乾燥を行い、ＧＭ１ａ抗原固定化担体を調製した。
【０５２１】
▲２▼対照担体の調製
前記（３）のアジ化ナトリウム含有ＴＢＳの１００μＬをマイクロタイタープレート〔ＥＬＩＳＡ用Ｅタイプ〕（住友ベークライト社）のウェルに分注した。
そして、このマイクロタイタープレートを、一定時間放置した。
【０５２２】
その後、このウェル内の液を除去した。
次に、このウェルに前記（２）のＢＳＡ含有ＰＢＳの２００μＬを分注し、一定時間放置してブロッキング処理を行った。
【０５２３】
次に、このマイクロタイタープレートのウェル内を精製水で洗浄した後、真空乾燥を行い、いずれの糖脂質抗原も固定化させていない対照用の担体（対照担体）を調製した。
【０５２４】
２．試料
ＩｇＭ型抗ＧＭ１ａ抗体陽性血清：
試料として、神経疾患の患者の血清で、そのクラスがＩｇＭである抗ＧＭ１ａ抗体を含むことが確認されている血清を、ＩｇＭ型抗ＧＭ１ａ抗体陽性血清として用意した。
【０５２５】
３．試料中の抗糖脂質抗体の測定
【０５２６】
（１）糖脂質抗原活性化剤を用いた場合
【０５２７】
▲１▼  本実施例の１の（１１）の▲１▼のＧＭ１ａ抗原固定化担体のウェルに、本実施例の１の（４）の糖脂質抗原活性化剤を２００μＬ分注し、これを室温にて７８分間放置して、担体に固定化されたＧＭ１ａ抗原にＴｗｅｅｎ２０を接触させた。
【０５２８】
▲２▼  前記のウェルより、前記の糖脂質抗原活性化剤を吸引して除去した。
【０５２９】
▲３▼  試料である本実施例の２のＩｇＭ型抗ＧＭ１ａ抗体陽性血清を本実施例の１の（５）の試料希釈液で１／２０，０００に希釈した後、前記のウェルに１００μＬ分注し、これを低温庫（５℃）にて一晩保管した。
これにより、担体に固定化されているＧＭ１ａ抗原と試料に含まれていたＩｇＭ型抗ＧＭ１ａ抗体を接触させ、反応させた。
【０５３０】
▲４▼  次に、前記のウェルより、前記の試料（ＩｇＭ型抗ＧＭ１ａ抗体陽性血清）を吸引して除去した。
そして、このウェルを、本実施例の１の（１０）の洗浄液で洗浄した。
【０５３１】
▲５▼  本実施例の１の（６）の酵素標識抗体を、本実施例の１の（７）の標識抗体希釈液で１／１，０００に希釈し、この１００μＬを前記のウェルに分注して、３７℃にて３時間反応させた。
【０５３２】
▲６▼  次に、前記のウェルより、未結合の酵素標識抗体を吸引して除去した。
そして、このウェルを、本実施例の１の（１０）の洗浄液で洗浄した。
【０５３３】
▲７▼  本実施例の１の（８）の基質液の１００μＬを、前記のウェルに分注し、２５℃で６６分間反応させた。
これにより、担体に固定化された標識酵素（ペルオキシダーゼ）と、基質液の３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン及び過酸化水素を反応させて、色素を生成させた。
【０５３４】
▲８▼  ６６分後に、本実施例の１の（９）の反応停止液の１００μＬを、前記のウェルに分注して、前記の反応を停止させた。
【０５３５】
▲９▼  マイクロプレートリーダー〔３５５０型〕（バイオラッド社）にて、前記のウェル中の液の吸光度（主波長：４５０ｎｍ、副波長：５５０ｎｍ）を測定して、吸光度測定値〔吸光度Ａ〕を得た。
【０５３６】
▲１０▼  対照として、本実施例の１の（１１）の▲１▼のＧＭ１ａ抗原固定化担体に替えて、本実施例の１の（１１）の▲２▼の対照担体を用いる他は、前記▲１▼〜▲９▼の記載の通りに操作を行い、ＧＭ１ａ抗原を固定化させていない担体である対照担体を用いた場合の吸光度測定値〔吸光度Ｂ〕を得た。
【０５３７】
（２）糖脂質抗原活性化剤を用いない場合
【０５３８】
▲１▼  本実施例の１の（１１）の▲１▼のＧＭ１ａ抗原固定化担体のウェルに、試料である本実施例の２のＩｇＭ型抗ＧＭ１ａ抗体陽性血清を本実施例の１の（５）の試料希釈液で１／２０，０００に希釈した後、前記のウェルに１００μＬ分注し、これを低温庫（５℃）にて一晩保管した。
これにより、担体に固定化されているＧＭ１ａ抗原と試料に含まれていたＩｇＭ型抗ＧＭ１ａ抗体を接触させ、反応させた。
【０５３９】
▲２▼  以下の操作は、前記の「（１）糖脂質抗原活性化剤を用いた場合」の▲４▼〜▲１０▼の記載の通りに測定を行った。
【０５４０】
４．測定結果
【０５４１】
以上の測定結果（各吸光度測定値）を表７に示した。
【０５４２】
【表７】
0004524446.tif 000008
【０５４３】
測定値（吸光度差：吸光度Ａ−吸光度Ｂ）は、糖脂質抗原活性化剤のＴｗｅｅｎ２０を糖脂質抗原に接触させないときの値に比較して、糖脂質抗原に接触させたときは、１．６４９倍の値が得られていることが分かる。
【０５４４】
このことより、そのクラスがＩｇＧである抗糖脂質抗体の測定の場合だけでなく、そのクラスがＩｇＭである抗糖脂質抗体の測定の場合においても、糖脂質抗原を糖脂質抗原活性化剤と接触させた後に、試料に含まれていた抗糖脂質抗体と接触させ、反応させることにより、糖脂質抗原の抗原活性が活性化されて、試料中の抗糖脂質抗体を感度高く測定することができることが確かめられた。
【０５４５】
なお、糖脂質抗原を固定化させていない担体である対照担体を用いた場合の測定値（吸光度Ｂ）が、低い値にとどまっていることより、非特異的反応が生じていないことが分かる。
【０５４６】
〔実施例８〕（コレラトキシンＢサブユニットとの反応による糖脂質抗原の活性化効果の確認）
【０５４７】
界面活性作用を有する物質（界面活性剤）であるＴｗｅｅｎ２０による、糖脂質抗原の活性化の効果を、ＧＭ１ａと特異的に結合することが知られているコレラトキシンＢサブユニットと糖脂質抗原との反応により確かめた。
【０５４８】
１．試薬の調製
【０５４９】
（１）リン酸等張化緩衝液（ＰＢＳ）の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように精製水に溶解し、試薬の調製を行った。（ｐＨ７．５）
１３７ｍＭ  塩化ナトリウム
２．７ｍＭ  塩化カリウム
８．１ｍＭ  リン酸一水素二ナトリウム
１．５ｍＭ  リン酸二水素一カリウム
【０５５０】
（２）ＢＳＡ含有ＰＢＳの調製
０．１ｇのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に、前記（１）で調製したリン酸等張化緩衝液（ＰＢＳ）を加え、１００ｍＬとして、０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ含有ＰＢＳを調製した。
【０５５１】
（３）アジ化ナトリウム含有トリス等張化緩衝液（アジ化ナトリウム含有ＴＢＳ）の調製
トリス等張化緩衝液粉末〔Ｔ−６６６４〕（シグマ社）及びアジ化ナトリウム１ｇを精製水に溶解し、全量を１Ｌとして、試薬の調製を行った。
【０５５２】
（４）糖脂質抗原活性化剤の調製
Ｔｗｅｅｎ２０〔ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート〕（和光純薬工業社）の０．０５ｇに、前記（１）で調製したリン酸等張化緩衝液（ＰＢＳ）を加え、１００ｍＬとして、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳよりなる糖脂質抗原活性化剤を調製した。
【０５５３】
（５）酵素標識コレラトキシンＢサブユニット希釈液の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように精製水に溶解し、試薬の調製を行った。
１％（ｗ／ｖ）  ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
１３７ｍＭ  塩化ナトリウム
２．７ｍＭ  塩化カリウム
８．１ｍＭ  リン酸一水素二ナトリウム
１．５ｍＭ  リン酸二水素一カリウム
【０５５４】
（６）酵素標識コレラトキシンＢサブユニット
コレラトキシンＢサブユニット−ペルオキシダーゼコンジュゲート〔Ｃ−４６７２〕（シグマ社）を、酵素標識コレラトキシンＢサブユニットとして用いた。
【０５５５】
（７）基質液の調製
３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン塩酸塩（同仁化学社）を１．３ｍＭとなるように、及びＥＤＴＡ・２Ｎａ・２Ｈ２Ｏを０．２ｍＭとなるように精製水に溶解し、そしてｐＨをｐＨ２．０に調整して、ＴＭＢＺ溶液を調製した。
次に、クエン酸一水和物を４１ｍＭとなるように、リン酸一水素二ナトリウムを２３ｍＭとなるように、及びＥＤＴＡ・２Ｎａ・２Ｈ２Ｏを０．２ｍＭとなるように精製水に溶解し、そしてｐＨをｐＨ４．３に調整して、クエン酸緩衝液を調製した。
このクエン酸緩衝液に、過酸化水素水を５ｍＭとなるように混合して過酸化水素溶液を調製した。
使用直前に、前記のＴＭＢＺ溶液と前記の過酸化水素溶液を、等量ずつ混和して、基質液を調製した。
【０５５６】
（８）反応停止液の調製
硫酸を０．７Ｎとなるように精製水に溶解して反応停止液を調製した。
【０５５７】
（９）洗浄液の調製
Ｔｗｅｅｎ２０〔ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート〕（和光純薬工業社）の０．０５ｇに、前記（１）で調製したリン酸等張化緩衝液（ＰＢＳ）を加え、１００ｍＬとして、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳよりなる洗浄液を調製した。
【０５５８】
（１０）糖脂質抗原固定化担体の調製
【０５５９】
▲１▼ＧＭ１ａ抗原固定化担体の調製
【０５６０】
ＧＭ１ａ〔ウシ脳由来〕（シグマ社）を０．１ｍｇ／Ｌとなるように前記（３）のアジ化ナトリウム含有ＴＢＳに溶解し、その１００μＬをマイクロタイタープレート〔ＥＬＩＳＡ用Ｅタイプ〕（住友ベークライト社）のウェルに分注した。
【０５６１】
そして、このマイクロタイタープレートを、一定時間放置し、ＧＭ１ａをマイクロタイタープレートのウェルに固定化させた。
その後、このウェル内の液を除去した。
【０５６２】
次に、このウェルに前記（２）のＢＳＡ含有ＰＢＳの２００μＬを分注し、一定時間放置してブロッキング処理を行った。
【０５６３】
次に、このマイクロタイタープレートのウェル内を精製水で洗浄した後、真空乾燥を行い、ＧＭ１ａ抗原固定化担体を調製した。
【０５６４】
▲２▼対照担体の調製
【０５６５】
前記（３）のアジ化ナトリウム含有ＴＢＳの１００μＬをマイクロタイタープレート〔ＥＬＩＳＡ用Ｅタイプ〕（住友ベークライト社）のウェルに分注した。
【０５６６】
そして、このマイクロタイタープレートを、一定時間放置した。
その後、このウェル内の液を除去した。
【０５６７】
次に、このウェルに前記（２）のＢＳＡ含有ＰＢＳの２００μＬを分注し、一定時間放置してブロッキング処理を行った。
【０５６８】
次に、このマイクロタイタープレートのウェル内を精製水で洗浄した後、真空乾燥を行い、いずれの糖脂質抗原も固定化させていない対照用の担体（対照担体）を調製した。
【０５６９】
２．糖脂質抗原とコレラトキシンＢサブユニットとの反応の確認
【０５７０】
（１）糖脂質抗原活性化剤を用いた場合
【０５７１】
▲１▼  本実施例の１の（１０）の▲１▼のＧＭ１ａ抗原固定化担体のウェルに、本実施例の１の（４）の糖脂質抗原活性化剤を２００μＬ分注し、これを室温にて２３分間放置して、担体に固定化されたＧＭ１ａ抗原にＴｗｅｅｎ２０を接触させた。
【０５７２】
▲２▼  前記のウェルより、前記の糖脂質抗原活性化剤を吸引して除去した。
【０５７３】
▲３▼  本実施例の１の（６）の酵素標識コレラトキシンＢサブユニットを本実施例の１の（５）の酵素標識コレラトキシンＢサブユニット希釈液で１／２００，０００に希釈した後、前記のウェルに１００μＬ分注し、これを恒温庫（２５℃）にて３時間保管した。
これにより、担体に固定化されているＧＭ１ａ抗原と酵素標識コレラトキシンＢサブユニットを接触させ、反応させた。
【０５７４】
▲４▼  次に、前記のウェルより、未結合の酵素標識コレラトキシンＢサブユニットを吸引して除去した。
そして、このウェルを、本実施例の１の（９）の洗浄液で洗浄した。
【０５７５】
▲５▼  本実施例の１の（７）の基質液の１００μＬを、前記のウェルに分注し、２５℃で４２分間反応させた。
これにより、担体に固定化された標識酵素（ペルオキシダーゼ）と、基質液の３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン及び過酸化水素を反応させて、色素を生成させた。
【０５７６】
▲６▼  ４２分後に、本実施例の１の（８）の反応停止液の１００μＬを、前記のウェルに分注して、前記の反応を停止させた。
【０５７７】
▲７▼  マイクロプレートリーダー〔３５５０型〕（バイオラッド社）にて、前記のウェル中の液の吸光度（主波長：４５０ｎｍ、副波長：５５０ｎｍ）を測定して、吸光度測定値〔吸光度Ａ〕を得た。
【０５７８】
▲８▼  対照として、本実施例の１の（１０）の▲１▼のＧＭ１ａ抗原固定化担体に替えて本実施例の１の（１０）の▲２▼の対照担体を用いる他は、前記▲１▼〜▲７▼の記載の通りに操作を行い、ＧＭ１ａ抗原を固定化させていない担体である対照担体を用いた場合の吸光度測定値〔吸光度Ｂ〕を得た。
【０５７９】
（２）糖脂質抗原活性化剤を用いない場合
【０５８０】
▲１▼  本実施例の１の（１０）の▲１▼で調製したＧＭ１ａ抗原固定化担体のウェルに、（６）の酵素標識コレラトキシンＢサブユニットを本実施例の１の（５）の酵素標識コレラトキシンＢサブユニット希釈液で１／２００，０００に希釈した後、前記のウェルに１００μＬ分注し、これを恒温庫（２５℃）にて３時間保管した。
これにより、担体に固定化されているＧＭ１ａ抗原と酵素標識コレラトキシンＢサブユニットを接触させ、反応させた。
【０５８１】
▲２▼  以下の操作は、前記（１）の▲４▼〜▲８▼の記載の通りに行い、担体に固定化されたＧＭ１ａ抗原に糖脂質抗原活性化剤を接触させることなく、一連の操作を行い、吸光度測定値〔吸光度Ｃ〕を得た。。
【０５８２】
▲３▼  また、対照として、本実施例の１の（１０）の▲１▼のＧＭ１ａ抗原固定化担体に替えて本実施例の１の（１０）の▲２▼の対照担体を用いる他は、前記▲１▼及び▲２▼の通りに操作を行い、ＧＭ１ａ抗原を固定化させていない担体である対照担体を用い、かつ糖脂質抗原活性化剤を用いない場合の吸光度測定値〔吸光度Ｄ〕を得た。
【０５８３】
３．測定結果
【０５８４】
以上の測定結果（各吸光度測定値）を表８に示した。
【０５８５】
【表８】
0004524446.tif 000009
【０５８６】
糖脂質抗原活性化剤のＴｗｅｅｎ２０を糖脂質抗原（ＧＭ１ａ）に接触させたときの測定値（吸光度差：吸光度Ａ−吸光度Ｂ）は、接触させないときの測定値（吸光度差：吸光度Ｃ−吸光度Ｄ）に比較して、２．１６４倍の値が得られていることが分かる。
【０５８７】
このことより、ＧＭ１ａとコレラトキシンＢサブユニットとの結合反応においても、本発明の糖脂質抗原活性化剤を糖脂質抗原と接触させることにより、糖脂質抗原の抗原活性が活性化されることが確かめられた。
【０５８８】
なお、糖脂質抗原を固定化させていない担体である対照担体を用いた場合の測定値（吸光度Ｂ及び吸光度Ｄ）が、低い値にとどまっていることより、非特異的反応が生じていないことが分かる。
【０５８９】
【発明の効果】
本発明の糖脂質抗原の活性化剤及び活性化方法は、糖脂質抗原の抗原活性を活性化することができるものである。
たとえ、その抗原活性が低下してしまった糖脂質抗原であっても、本発明の活性化剤又は活性化方法により、活性化が図れるものである。
【０５９０】
また、本発明の試料中の抗糖脂質抗体の測定方法及び測定キットは、試料中の抗糖脂質抗体の測定を高感度に行うことができるものである。
たとえ、測定に用いる糖脂質抗原の抗原活性が低下してしまって、試料に含まれていた抗糖脂質抗体と充分に反応（結合）することができないようになってしまっている場合であっても、本発明の測定方法又は測定キットにおいては、この糖脂質抗原の抗原活性を活性化して、正確な試料中の抗糖脂質抗体の測定値を得ることができるものである。