(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リジン残基を含み、且つ、リジン残基のε-アミノ基が予め保護されていない状態である、アミノ末端が修飾されたタンパク質が断片化されてなるペプチドに当該ペプチドのアミノ末端α-アミノ基を選択的に修飾する処理（但し、前記ペプチドに含まれるリジン残基のε-アミノ基に作用するものを除く。）をする工程と、前記処理工程前後のペプチドの質量を質量分析法により分析し質量変化が検出されないペプチドを特定する工程を含むことを特徴とするアミノ末端修飾タンパク質のアミノ末端由来ペプチドの同定方法。
【請求項２】
ペプチドのアミノ末端α-アミノ基を選択的に修飾する処理がアセチル化処理である請求項１記載のアミノ末端修飾タンパク質のアミノ末端由来ペプチドの同定方法。
【請求項３】
アセチル化処理が、ｐＨ６の溶媒中、１０℃以下且つ溶媒が液体状態である温度下に、ペプチド１ｎｍｏｌに対してアセチル化試薬を０．００５Ｍ〜０．０５Ｍの濃度にて作用させる処理である請求項２記載のアミノ末端修飾タンパク質のアミノ末端由来ペプチドの同定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アミノ末端が修飾されたタンパク質のアミノ末端に由来するペプチドの同定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
タンパク質のアミノ酸配列の決定は、タンパク質の構造を確認、同定する手段として極めて重要であり、有用タンパク質をコードする遺伝子の取得や有用タンパク質の生産などにおいて利用されている。
天然に存在するタンパク質の多くはそのアミノ末端（以下、Ｎ末端と記す。）が修飾されており、そのようなＮ末端が修飾されたタンパク質（以下、Ｎ末端修飾タンパク質と記す。）のＮ末端アミノ酸配列決定にはエドマン分解法が利用できず、質量分析法等が使用されている。例えば、タンパク質を消化酵素等を用いて断片化し、得られたペプチドをそれぞれタンデム質量分析することにより各ペプチドのアミノ酸配列を決定できるが、元のタンパク質のＮ末端のアミノ酸配列を同定するためには、タンパク質の断片化により生成されたペプチドの中から、元のタンパク質のＮ末端由来のペプチドを同定する必要がある。
Ｎ末端修飾タンパク質のＮ末端由来のペプチドの同定方法としては、例えば、タンパク質の断片化により生成されるペプチド全てをエドマン分解法に供し、Ｎ末端のアミノ酸配列が解析できないペプチドを同定する方法、タンパク質の断片化により生成されるペプチドをBrCN活性化セファロースカラムにかけ、吸着されずに溶出されるペプチドを同定する方法（Anal. Biochem. 222, 210-216 (1994)）、タンパク質中のリジン残基のε-アミノ基を保護した後、該タンパク質を断片化して生成されるペプチドをアセチル化処理し、該アセチル化処理前後の試料の逆相クロマトグラフィーにおける溶出位置の比較から元のタンパク質のＮ末端由来のペプチドを同定する方法（特開平8-27180）等が知られている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、このような方法は、必要工程数、操作の煩雑性、試料の使用量等の点で必ずしも満足できる方法とは言い難い。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
このような状況下、本発明者らは、より簡便で少ない試料でも実施可能な、Ｎ末端修飾タンパク質のＮ末端由来のペプチドの同定方法につき鋭意検討を行った結果、本発明に至った。
すなわち本発明は、Ｎ末端が修飾されたタンパク質が断片化されてなるペプチドのＮ末端α-アミノ基を選択的に修飾処理する工程と、前記処理工程前後のペプチドの質量を質量分析法により分析し質量変化が検出されないペプチドを特定する工程を含むＮ末端修飾タンパク質のＮ末端由来ペプチドの同定方法を提供するものである。
【０００５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
Ｎ末端が修飾されたタンパク質の断片化の方法は特に限定されず、例えば、新生化学実験講座１タンパク質II一次構造（東京化学同人）等に記載の化学的断片化、消化酵素を用いた断片化等が使用できる。具体的には例えば、化学的断片化としてはBrCNによる断片化方法が挙げられ、消化酵素による断片化としては、トリプシン、キモトリプシンなどを用いた消化を挙げることができる。このような方法で調製され得る「アミノ末端が修飾されたタンパク質が断片化されてなるペプチド」は、種々のペプチドの混合物のまま、下記のようなＮ末端α-アミノ基の選択的な修飾処理に供することができる。
【０００６】
ペプチドのＮ末端α-アミノ基を選択的に修飾する処理は、リジン残基のε-アミノ基には作用せず、かつ、修飾の前後でペプチドに質量変化をもたらす反応であればよい。例えば、Ｎ末端α-アミノ基を選択的にアセチル化する処理があげられ、具体的には、pH約６の溶媒中にて氷冷しながらペプチドにアセチル化試薬を作用させる方法をあげることができる。該方法において、反応系に用いる溶媒は、後処理の簡便さを考慮すると揮発性のものが望ましい。反応温度は、室温付近ではリジン残基のε-アミノ基のアセチル化も生じるため、およそ１０℃以下、溶媒が凍らない範囲の低温が好ましい。アセチル化試薬としては例えば無水酢酸、無水ヨード酢酸等をあげることができ、その反応液中の濃度は試料1nmolに対して、アセチル化試薬を0.1Mとするとリジン残基のε-アミノ基のアセチル化も生じるため、約0.005M〜約0.05M程度とすることが望ましい。反応時間は、通常３分間〜１時間程度である。具体的には例えば、約1nmolのペプチド試料に対して、0.1Mピリジン-酢酸（pH 6.0）溶液12μL中で、0.01M無水酢酸／無水テトラヒドロフラン5μLを添加し、氷中で5分間保温する方法をあげることができる。
このようにしてアセチル化処理を行った後、反応液からペプチドを回収する。例えば、反応液に揮発性の溶媒を用いた場合は、溶媒を減圧下に溜去すればよく、不揮発性の塩を含む溶媒を用いた場合は脱塩処理を行った後溶媒を減圧溜去すればよい。
【０００７】
上記のような修飾処理を行う前後のペプチド試料について質量分析を行い、質量変化が検出されないペプチドを特定することにより、これをＮ末端修飾タンパク質のＮ末端に由来するペプチドであると同定することができる。例えば、ペプチド試料を上記のようにアセチル化処理した場合は、Ｎ末端修飾タンパク質のＮ末端を含むペプチドは処理の前後で質量変化が検出されないのに対し、Ｎ末端修飾タンパク質のＮ末端を含まないペプチドは、そのＮ末端のα-アミノ基のアセチル化により42の質量増加が検出される。ここで、ペプチドの質量分析の方法としては前記のような質量変化が分析できる方法であればよく、質量分析装置の種類やイオン化法は特に限定されない。例えば、二重収束型の質量分析装置を用いてFABイオン化法にて断片化物の質量変化を検出することができる。
【０００８】
このようにして同定されたＮ末端修飾タンパク質のＮ末端由来のペプチドは、例えば、タンデム質量分析法に供することにより、そのＮ末端の修飾基の同定およびアミノ酸配列決定が可能である。
なお、Ｎ末端が修飾されたタンパク質の断片化により生成され逆相クロマトグラフィーにより分離・精製されたペプチドについても、上記と同様の方法を用いて元のタンパク質のＮ末端を含むペプチドを同定することができ、このようにして同定されたペプチドをタンデム質量分析法に供することによりそのＮ末端の修飾基の同定およびアミノ酸配列決定が可能であり、また、新生化学実験化学講座１タンパク質II一次構造（東京化学同人）等の記載に準じてそのＮ末端修飾基を除去しエドマン分解法によりアミノ酸配列を解析することも可能である。
さらに、Ｎ末端が修飾されたタンパク質の断片化により生成されるペプチドに限らず、ペプチド一般について、上記と同様にＮ末端α-アミノ基選択的な修飾処理を施し、該処理前後のペプチドの質量を質量分析法で分析することにより、処理前後で質量変化が検出されないペプチドを元来そのＮ末端が修飾されているペプチドであると判定することができ、例えば、そのＮ末端アミノ酸配列の解析にあたって適当な方法を事前に選択することができる。
【０００９】
【実施例】
以下、本発明を参考例および実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００１０】
参考例１  ペプチドのアミノ末端α-アミノ基特異的な修飾と質量分析
Ｎ末端が修飾されていないペプチドとしてブラジキニン（アミノ酸配列；RPPGFSPFR、和光純薬）およびダイノルフィンＡ（アミノ酸配列；YGGFLRRIRPKLKWDNQ、ペプチド研究所）の２種類を使用し、Ｎ末端が修飾されているペプチドとしてＮ末端がピログルタミル化されたフィブリノペプチドＢ（アミノ酸配列；pEGVNDNEEGFFSAR、シグマ）を用いた。これら３種類のペプチドを混合し以下のようにアセチル化処理を行った。前記の３種類のペプチド各1nmolの混合物を0.1Mピリジン-酢酸（pH6.0）12μLに溶解し、氷上で１分間インキュベートした後、0.01M無水酢酸／無水テトラヒドロフランを5μL添加し、氷上で５分間インキュベートした。該反応液から溶媒を減圧下に溜去し、残渣を質量分析に供した。
質量分析は二重収束型質量分析計（日本電子、型式JMS-HX/HX110A）を用い、FABイオン化法を使用した。上記試料を水・メタノール・酢酸（５０・５０・１）4μLに溶解し、該試料溶液1μLをグリセロール・チオグリセロール（１・１）1μLと混合して上記分析計に供し、FAB-MS測定した。図１にアセチル化処理前後の試料のFAB-MSスペクトルを示す。元来Ｎ末端が修飾されていないブラジキニンおよびダイノルフィンＡは、アセチル化処理後はもとのピークが完全に消失し、質量が42増加したピークが検出された。これら質量が増加したピークに相当するペプチドは、さらにMS/MS分析に供することにより、Ｎ末端α-アミノ基がアセチル化されていることが確認された。一方、N末端が元来ピログルタミル化されているフィブリノペプチドBは、上記のアセチル化処理前後で質量変化が検出されなかった。
【００１１】
実施例１  Ｎ末端修飾タンパク質のＮ末端由来ペプチドの同定
Ｎ末端が修飾されたタンパク質であるウマチトクロムｃ（シグマ）を使用し、消化酵素キモトリプシンを用いて、以下のように該タンパク質を断片化した。すなわち、ウマチトクロムｃ200μgを1%炭酸水素アンモニウム溶液200μLに溶解し、1mg/mLキモトリプシン4μLを添加し、37℃で18時間インキュベートした。
前記キモトリプシン消化物の反応液10μLを減圧濃縮し、残渣に0.1Mピリジン-酢酸（pH 5.5）を24μL添加し、半量をアセチル化試料として以下の処理を行い、半量をアセチル化しないコントロール試料として分取した。アセチル化試料は、氷上で１分間インキュベートした後、0.05M無水酢酸／無水テトラヒドロフランを5μL添加し、氷上で５分間インキュベートした。反応試料およびコントロール試料は溶媒を減圧下に溜去した後、残渣を質量分析に供した。
質量分析は実施例１と同じ装置を使用し、試料を水・メタノール・酢酸（５０・５０・１）2μLに溶解し、試料溶液1μLをグリセロール・チオグリセロール（１・１）1μLと混合して質量分析計に供し、FAB-MS測定した。図２にアセチル化処理前後の試料のFAB-MSスペクトルを示す。コントロール試料において検出されたウマチトクロムｃ由来のピークのうちm/z1162.5のピークはアセチル化処理後の試料においても検出されたが、それ以外のピークはアセチル化処理後の試料において検出されず、それぞれ質量が42増加したピークが検出された。従って、m/z1162.5のピークがウマチトクロムｃのＮ末端由来のペプチドと同定できた。このm/z1162.5ピークのFAB-MS/MSスペクトルを取得したところ、既に知られているチトクロムcのＮ末端構造Ac-GDVEKGKKIFと一致した。
【００１２】
【発明の効果】
本発明により、Ｎ末端修飾タンパク質のＮ末端に由来するペプチドを、簡便に少ない試料でも同定することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】３種類のペプチドについて、Ｎ末端α-アミノ基選択的アセチル化処理前後の試料の質量スペクトルを対比して示す。(a)がアセチル化処理前の試料、(b)がアセチル化処理後の試料である。
【図２】ウマチトクロムcのキモトリプシン消化物について、Ｎ末端α-アミノ基選択的アセチル化処理前後の試料の質量スペクトルを対比して示す。上段はアセチル化処理前の試料の質量スペクトルであり、図中の●印をつけたピークがウマチトクロムcのキモトリプシン消化物に由来する。下段はアセチル化処理後の試料の質量スペクトルである。
【図１】
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【図２】
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