(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の複数のアナライトのアッセイであって、サンプルを、異なる複数のアナライトに対して特異性を有する異なる複数のリガンドのアレイを提供するバイオチップと接触させ、アナライトに結合してその利用可能な濃度を減少させるスカベンジャー物質をも含むことを特徴とするアッセイ。
【請求項２】
前記アナライトがアンフェタミン、メタンフェタミン、ＴＨＣ、ベンゾジアゼピン、アヘン、バルビツール、ベンゾイルエクゴニン、メタドン、ＰＣＰおよびＬＳＤからなる群から選択される１またはそれ以上を含む濫用薬物である請求項１に記載のアッセイ。
【請求項３】
前記スカベンジャー物質が抗体である、請求項１または２のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項４】
添加される抗体の量が、カットオフ領域周辺での検量線の感受性を最大化する量である、請求項３に記載のアッセイ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、例えば、その上にアナライト特異的なリガンドのアレイを備えたバイオチップまたはマイクロチップを用いる、マルチアナライトイムノアッセイに関する。
【０００２】
【従来の技術】
バイオチップ／マイクロチップは、イムノアッセイまたはヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイのいずれかでの多数のアレイの測定に関して記載されている。作製されたアレイは、通常、多数の、固体支持体上で空間的に異なる領域に位置する個別の反応部位を有するように設計されている。アレイは、固体支持体表面上に固定された、高密度の同一または異なる分子を含み得る。
【０００３】
マルチアナライトパネルが試験される場合、それは必ず、未知のサンプル中に存在する各アナライトの量を正確に定量する必要がある。従って、マルチアナライトパネル上に提示される各アナライトについて最適な検量線（標準曲線）が作製されなければならない。この検量線は、提示される特定のアナライトの測定に適した動的範囲（dynamic-range)をカバーしていなければならず、そして測定する患者サンプルのタイプに適していなければならない。この動的範囲は、測定されるアナライトに対するアッセイの感受性の指標である。
【０００４】
各アナライトについて、検出されなければならない濃度範囲で困難が生じる。
測定されるべき濃度範囲がパネル上の各アナライト毎で大きく異なりうるので、各検量線の最適化は感受性の問題を引き起こすかもしれない。
【０００５】
マルチアナライトパネルの検量線内に包含されねばならない動的範囲のこの多様性は、各バイオチップに付加されねばならないマルチ結合体（multi-conjugate)の製造に際する実際上の問題へとつながる。マルチ結合体とは、これのおかげで各々個別のイムノアッセイに適した検出マーカーがバイオチップに付加されるような試薬のことである。検出マーカーとは、どのようにしてイムノアッセイが可視化され、続いてバイオチップ上で定量されるかに係る。
【０００６】
例えば、バイオチップフォーマットでは濫用薬物に結合するリガンドのアレイについて検量線の形状を制御する必要がある。現在のスクリーニングガイドラインは、広い範囲の濃度にわたっている；例えば、カットオフ（cut-off）範囲は、ＬＳＤに関する０．５ng／mlから、アヘンに関する２０００ng／mlまでである。
【０００７】
問題となる分子が分子量および免疫原性という点で非常に類似する場合、このことを達成するのは極めて困難である。従って、これらの分子に対する抗体は全て達成し得る検出限界という点で非常に類似する特性を有する。現在の試験方法では、各薬物はそれ自体に特有の試験がある。これにより、試験業者は各個別の試験を改変して特定の薬物試験についてのスクリーニングガイドラインに最も良く適応させることができる。しかしながら、マルチアナライトフォーマットでは、条件は、バイオチップ上に存在するアッセイの全範囲に適用される。従って、広範囲のカットオフ限界に適応させるために利用可能な選択肢は限定されている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
ＵＳ−Ａ−４７２２８８９およびＵＳ−Ａ−５０２６６５３は、アナライトに対する特異性を有する標識抗体を用いる反応によるサンプル中のアナライトのアッセイを開示している。さらに、アナライトに対しては特異性が低いが、干渉物として働くアナログに対しては特異性が高いスカベンジャーモノクローナル抗体を使用することができる。
【０００９】
ＷＯ−Ａ−９８／２６６４４は、アナライトと反応する「検出抗体」を用いる、サンプル中のアナライト（例えば、濫用薬物）に対するアッセイを開示している。第２の反応は、アナライトと結合する「中和抗体」（これは検出抗体と同一であっても良い）を使用し、これにより検出抗体を用いて行われるアッセイで陽性反応が生じることを防ぐ。かくして、検出抗体とは陽性反応を示すが、第２の反応では減少した反応を示すサンプルは、真のアナライトを含有する；両方で類似の陽性反応を示すサンプルは干渉物を含む。この手順の利点は、干渉物の正確な性質を知る必要性を避けていることである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明は、パネル上の各アナライトが往々にして他とは非常に異なる濃度で検出されねばならず、そして各結合体が、それが認識する特定のアナライトに対して適した濃度／希釈度でマルチ結合体試薬中に提示されねばならない、と考えられる場合には、動的範囲の最適化が困難でありうるという認識に基づく。現在、パネル内のアナライトは互いに非常に異なる濃度で検出され、定量される必要があるだろうということが理解されている。
【００１１】
具体的には、本発明は、（アナライト）／（考慮中のマルチアナライトパネル中に見出されるアナライトの範囲）に関して、ある領域では感受性が非常に高いが、別の領域では感受性が十分でないと認められる検量線の感受性を変更することに関する。これは、特定の量のスカベンジャー抗体または他のスカベンジャー物質の、アッセイ系（例えば、アッセイ緩衝液）への添加を伴う。このスカベンジャー物質は、アナライトを捕獲するためにバイオチップ表面に固定されているものと同一であっても良いし、同一でなくてもよい。スカベンジャー物質の目的は、サンプル（コントロールまたは患者サンプル）中のアナライトのいくらかを特異的に清掃／除去し、これによって利用可能な測定しうる濃度を低下させることである。これは、次いで、検量線の非常に感度の高い部位の感度を減少する効果およびグラフ中の別の領域の感受性を改善する効果を有している。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明で使用するためのバイオチップは、公知の方法により製造することができる。例えば、ＧＢ−Ａ−２３２４８６６を参照のこと。
【００１３】
このようなバイオチップはリガンド（例えば、抗体）のアレイを提供する。異なるアナライトに対して特異性を有するいくつかの異なるリガンドが存在し得る。新規なアッセイは、このようなアナライトの１つまたはそれ以上について試験するために使用することができ、それは１つ以上の抗体の使用を伴うであろう。
使用し得るスキャベンジャー物質は当業者にとって容易に明らかであり、例えばアプタマーが挙げれられる。典型的には、スカベンジャー物質はアッセイ緩衝液中に含まれ、それ以外には、通常、溶媒などのような従来的な成分を含有する。
【００１４】
検量線の感受性は、Ｂ／Ｂｏの関数であり、ここでＢおよびＢＯは、それぞれ、結合種に対する光単位の値、およびゼロ標準を表す。検量線は、定量アッセイが必要とされるそれぞれの場合に構築され得る。あるいは、例えば、濫用薬物アッセイに関しては、その目的には検量線１００％カットオフが適切であるyes/noアッセイでも満足のいくものである。
【００１５】
例示として、本発明を、濫用薬物のマルチアナライトパネルおよびスカベンジャーとしての抗体の使用に関連して考察する。このようなパネルの典型は、以下の濫用薬物に関する競合的イムノアッセイを含む：アンフェタミン、メタンフェタミン、ＴＨＣ、ベンゾジアゼピン、アヘン、バルビツール、ベンゾイルエクゴニン（benzoylecgonine）、メタドン、ＰＣＰおよびＬＳＤ。
【００１６】
濫用薬物の検量線（０％〜３００％）に関して、１００％スタンダードにはこれらの各薬物のカットオフ濃度（すなわち、その濃度未満ではサンプルが薬物に関して陰性であると断言され、それを超える濃度ではサンプルが薬物に関して陽性であると断言される濃度）が含まれる。以下に列挙するように、マルチ結合物の添加により、全アナライトに関して適切な検量線を得る際の問題の原因は、広範な範囲のカットオフ濃度である。
【化１】
0004571353.tif 000002
【００１７】
使用されるべきスカベンジャー抗体の量を決定する際には、一般的に、スタンダード０％〜２５％の間におけるＢ／Ｂｏ値の増加と、７５％〜１００％〜１２５％の間でのドロップを減少させないこととの間で妥協を図らなければならない。言いかえると、０％〜２５％の間の検量線の感受性をより低くするように努力されるべきであるが、各薬物に関するカットオフ決定がなされる７５％〜１２５％の間では感受性を低下させてはならない。従って、カットオフ領域付近の感受性を最大にすることは重要であり、これによりサンプルの陽性または陰性の正確な決定を行うことができる。
【００１８】
任意の特定のアナライトに対するカットオフ領域は公知であり、当業者により容易に決定され得る。また、当業者はどのようにすれば検量線の感受性を目的の点の付近で最大にすることができるかを容易に決定することができる。
【００１９】
【実施例】
【００２０】
様々な量の適切なスカベンジャー抗体を添加することにより検量線のカットオフ領域で達成される変化の程度を証明するために、ＰＣＰ、ＢＺＧおよびアンフェタミンを用いて実験を行った。より具体的には、ＰＣＰ、ＢＺＧおよびアンフェタミンに関する以下のデータは、スカベンジャー抗体の添加無しでは検量線がカットオフ領域で十分に感受性でないことを示している（各々の場合において、０％〜２５％の間では過度に感受性であった）。本発明の目的から、およびこれらのアナライトに関して、検量線は０％〜２５％の間では過度に感受性であり、この点を超えると感受性が不十分である。
【００２１】
ＰＣＰに関する結果は以下の通りである：
【表１】
0004571353.tif 000003
【００２２】
１〜２mg／Ｌ  ＰＣＰ抗体を添加することにより、７５〜１２５％のカットオフ領域付近の検量線の感受性はかなり改善される。このことは、阻害ドロップ率（％）が抗体を添加しない場合には１１．４５％（Ｂ／Ｂｏ  ７５％で３１．７９〜１２５％で２０．３４）であり、２mg／Ｌ  ＰＣＰ抗体の添加ありの場合には４６．２２％（Ｂ／Ｂｏ  ７５％で９５．７２〜１２５％で４９．５０）であることにより、明確に証明されている。
【００２３】
ＢＺＧに関する結果は以下の通りである：
【表２】
0004571353.tif 000004
【００２４】
この検量線の感受性を有意に変更するためには、実質的な量のＢＺＧ抗体を添加しなければならない。カットオフ領域の感受性を改善するためには、５０〜８０mg／Ｌの添加が必要である。抗体を添加しない場合、阻害ドロップ率は４．９９％（Ｂ／Ｂｏ  ７５％で１４．４６〜１２５％で９．４７）であるが、ＢＺＧ抗体を８０mg／Ｌ添加すると１７．５１％（Ｂ／Ｂｏ  ７５％で４７．８９〜１２５％で３０．３８）まで改善される。
【００２５】
アンフェタミンに関する結果は以下の通りである：
【表３】
0004571353.tif 000005
【００２６】
検量線のカットオフ領域の感受性を改善するために最適なアンフェタミン抗体の添加量は１．２５mg／Ｌである。１．２５mg／Ｌを超える濃度は、結果をこれ以上改善することはなかった。抗体を添加しない場合、阻害ドロップ率は２．１２％（Ｂ／Ｂｏ  ７５％で５．６１％〜１２５％で３．４９％）であるが、アンフェタミン抗体を１．２５mg／Ｌ添加すると２６．９２％（７５％でのＢ／Ｂｏ  ６７．８３％〜１２５％での４０．９１）まで改善される。