(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
高度不飽和脂肪酸を含有する油脂である原料トリグリセライドを第一の１，３リパーゼであるカンジダ アンタルクティカ（Candida antarctica）由来のリパーゼでアルコリシスして２−モノグリセライドを製造することを特徴とするグリセライドの製造方法。
【請求項２】
高度不飽和脂肪酸を含有する油脂である原料トリグリセライドを第一の１，３リパーゼであるカンジダ アンタルクティカ（Candida antarctica）由来のリパーゼでアルコリシスして得られる２−モノグリセライドを経由し第二の１，３−リパーゼで１，３位に脂肪酸残基を導入することで２位に原料トリグリセライド由来の脂肪酸残基を有し、１、３位に新たに導入した同一の脂肪酸残基を有する構造のトリグリセライドを得ることを特徴とするグリセライドの製造方法。
【請求項３】
２位の脂肪酸残基がＤＨＡ、ＥＰＡまたはＡＬＡ残基である請求項１または２のグリセライドの製造方法。
【請求項４】
１，３位に導入される脂肪酸残基が炭素数８、１０または１２の中鎖飽和脂肪酸残基である請求項２または３のグリセライドの製造方法。
【請求項５】
上記の高度不飽和脂肪酸を含有する油脂がＤＨＡ濃縮油脂、ＥＰＡ濃縮油脂またはＡＬＡ濃縮油脂である請求項１ないし４のいずれかのグリセライドの製造方法。
【請求項６】
上記の高度不飽和脂肪酸を含有する油脂が魚油である請求項１ないし５のいずれかのグリセライドの製造方法。
【請求項７】
高度不飽和脂肪酸を含有する油脂である原料トリグリセライドがトリＤＨＡ−トリグリセライド、トリＥＰＡ−トリグリセライド、またはトリＡＬＡ−トリグリセライドである請求項１ないし４のいずれかのグリセライドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業の属する技術分野】
本発明はリパーゼを用いたグリセライドの製造方法に関する。より詳細には本発明は、リパーゼを用いた２−モノグリセライドまたはトリグリセライド、特にｓｎ-２位に高度不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）残基を有するトリグリセライド（ＴＧ）の製造方法に関する。
本発明において、「ＤＨＡ」はドコサヘキサエン酸、「ＥＰＡ」はエイコサペンタエン酸、「ＡＬＡ」はアラキドン酸の略称として使用している。なお、ＤＨＡ濃縮油脂、トリＤＨＡ−トリグリセライドという使い方の場合、ドコサヘキサエン酸残基の略称として使用している。
また、「ＭＧ」はモノグリセライド、「２−ＭＧ」は２−モノグリセライド、「ＴＧ」はトリグリセライドの略称として使用している。
また、「第一のリパーゼ」とは１、３位に選択的で、アルコリシスを行った場合に、鎖長の長い脂肪酸にも作用するリパーゼを意味する。
「第二のリパーゼ」とは１、３位に選択的で，２−ＭＧと脂肪酸エステルまたは遊離脂肪酸を反応させた場合にＴＧを生成するリパーゼを意味する。
【０００２】
【従来の技術】
１，３位に特異的なリパーゼを用いてＴＧの１，３位に任意の脂肪酸を導入する場合、一般的には目的脂肪酸でアシドリシスする、または目的脂肪酸エステルをエステル交換するなどの方法が用いられる。しかし、この場合には非常に過剰量の脂肪酸やエステルを用いなければならず、また確率論的に一部は元の１，３位の脂肪酸が残存するため目的構造脂質を高純度で得ることは比較的むづかしい。
さらにリパーゼによっては脂肪酸の鎖長に応じて活性が大きく変化し、ＤＨＡなどの長鎖脂肪酸に対する活性が著しく弱いため、目的の構造脂質を得られない場合もある。
【０００３】
また、リパーゼの反応には加水分解反応、エステル交換反応、アシドリシス、エステル化反応などが挙げられるが全てのリパーゼが何れの反応に対しても同条件で同程度の活性を示すわけではなく様々な特性のリパーゼが存在する。例えば、アシドリシスに対して強い活性を持った１，３−リパーゼを利用すれば１，３位の脂肪酸の置換に有利であるが、このリパーゼがＤＨＡなどに対して十分な活性を持っていない場合には１，３位にＤＨＡが位置したＴＧから他の目的脂肪酸への置換は非常に困難となる。もちろん、アシドリシスに高活性でＤＨＡにも活性の高いリパーゼを用いれば目的は達成できるがこのようなリパーゼは入手が困難であるか、極めて高価であるため工業的な用途に用いるのは好ましくない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、２−ＭＧまたはＴＧ、特にｓｎ-２位に高度不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）残基を有するＴＧを非常に高純度で高効率で製造する方法の提供を目的としている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、高度不飽和脂肪酸を含有する油脂である原料ＴＧを第一の１，３リパーゼであるカンジダ アンタルクティカ（Candida antarctica）由来のリパーゼでアルコリシスして２−ＭＧを製造することを特徴とするグリセライドの製造方法を要旨としている。
【０００６】
２位の脂肪酸残基がＤＨＡ、ＥＰＡまたはＡＬＡ残基であり、その場合、本発明は、高度不飽和脂肪酸を含有する油脂である原料ＴＧを第一の１，３リパーゼであるカンジダ アンタルクティカ（Candida antarctica）由来のリパーゼでアルコリシスして２位の脂肪酸残基がＤＨＡ、ＥＰＡまたはＡＬＡ残基であるＭＧを製造することを特徴とするグリセライドの製造方法である。
【０００７】
上記の高度不飽和脂肪酸を含有する油脂がＤＨＡ濃縮油脂、ＥＰＡ濃縮油脂またはＡＬＡ濃縮油脂であり、その場合、本発明は、ＤＨＡ濃縮油脂、ＥＰＡ濃縮油脂またはＡＬＡ濃縮油脂である原料ＴＧを第一の１，３リパーゼであるカンジダ アンタルクティカ（Candida antarctica）由来のリパーゼでアルコリシスして２−ＭＧを製造することを特徴とするグリセライドの製造方法である。
【０００８】
上記の高度不飽和脂肪酸を含有する油脂が魚油であり、その場合、本発明は、魚油、好ましくはＤＨＡ濃縮魚油、またはＥＰＡ濃縮魚油である原料ＴＧを第一の１，３リパーゼであるカンジダ アンタルクティカ（Candida antarctica）由来のリパーゼでアルコリシスして２−ＭＧを製造することを特徴とするグリセライドの製造方法である。
【０００９】
高度不飽和脂肪酸を含有する油脂である原料ＴＧがトリＤＨＡ−ＴＧ、トリＥＰＡ−ＴＧ、またはトリＡＬＡ−ＴＧであり、その場合、本発明は、トリＤＨＡ−ＴＧ、またはトリＥＰＡ−ＴＧ、またはトリＡＬＡ−ＴＧを第一の１，３リパーゼであるカンジダ アンタルクティカ（Candida antarctica）由来のリパーゼでアルコリシスして２−ＭＧを製造することを特徴とするグリセライドの製造方法である。
【００１０】
また、本発明は、高度不飽和脂肪酸を含有する油脂である原料トリグリセライドを第一の１，３リパーゼであるカンジダ アンタルクティカ（Candida antarctica）由来のリパーゼでアルコリシスして得られる２−ＭＧを経由し第二の１，３−リパーゼで１，３位に脂肪酸残基を導入することで２位に原料トリグリセライド由来の脂肪酸残基を有し、１、３位に新たに導入した同一の脂肪酸残基を有する構造のトリグリセライドを得ることを特徴とするグリセライドの製造方法法を要旨としている。
【００１１】
２位の脂肪酸残基がＤＨＡ、ＥＰＡまたはＡＬＡ残基であり、その場合、本発明は、高度不飽和脂肪酸を含有する油脂である原料ＴＧを第一の１，３リパーゼであるカンジダ アンタルクティカ（Candida antarctica）由来のリパーゼでアルコリシスして得られる２位の脂肪酸残基がＤＨＡ、ＥＰＡまたはＡＬＡ残基であるＭＧを経由し第二の１，３−リパーゼで１，３位に脂肪酸残基を導入することで目的ＴＧを得ることを特徴とするグリセライドの製造方法である。
【００１２】
１，３位に導入される脂肪酸残基が炭素数８，１０または１２の中鎖飽和脂肪酸残基であり、その場合、本発明は、高度不飽和脂肪酸を含有する油脂である原料ＴＧを第一の１，３リパーゼであるカンジダ アンタルクティカ（Candida antarctica）由来のリパーゼでアルコリシスして得られる２−ＭＧ、好ましくは２位の脂肪酸残基がＤＨＡ、ＥＰＡまたはＡＬＡ残基であるＭＧを経由し第二の１，３−リパーゼで１，３位に炭素数８，１０または１２の中鎖飽和脂肪酸残基を導入することで目的ＴＧを得ることを特徴とするグリセライドの製造方法である。
【００１３】
上記の高度不飽和脂肪酸を含有する油脂が、ＤＨＡ濃縮油脂、ＥＰＡ濃縮油脂またはＡＬＡ濃縮油脂であり、その場合、本発明は、ＤＨＡ濃縮油脂、ＥＰＡ濃縮油脂またはＡＬＡ濃縮油脂である原料ＴＧを第一の１，３リパーゼであるカンジダ アンタルクティカ（Candida antarctica）由来のリパーゼでアルコリシスして得られる２−ＭＧを経由し第二の１，３−リパーゼで１，３位に脂肪酸残基を導入することで目的ＴＧを得ることを特徴とするグリセライドの製造方法である。
【００１４】
上記の高度不飽和脂肪酸を含有する油脂が魚油であり、その場合、本発明は、魚油、好ましくはＤＨＡ濃縮魚油、またはＥＰＡ濃縮魚油である原料ＴＧを第一の１，３リパーゼであるカンジダ アンタルクティカ（Candida antarctica）由来のリパーゼでアルコリシスして得られる２−ＭＧを経由し第二の１，３−リパーゼで１，３位に脂肪酸残基を導入することで目的ＴＧを得ることを特徴とするグリセライドの製造方法である。
【００１５】
高度不飽和脂肪酸を含有する油脂である原料ＴＧがトリＤＨＡ−ＴＧ、トリＥＰＡ−ＴＧ、またはトリＡＬＡ−ＴＧであり、その場合、本発明は、トリＤＨＡ−ＴＧ、トリＥＰＡ−ＴＧ、またはトリＡＬＡ−ＴＧを第一の１，３リパーゼであるカンジダ アンタルクティカ（Candida antarctica）由来のリパーゼでアルコリシスして得られる２−ＭＧを経由し第二の１，３−リパーゼで１，３位に脂肪酸残基を導入することで目的ＴＧを得ることを特徴とするグリセライドの製造方法である。
【００１６】
【発明の実施の形態】
本発明のグリセライドの製造方法の好ましい態様は、原料ＴＧを第一の１，３リパーゼでアルコリシスして得られる２−ＭＧを経由し第二の１，３−リパーゼで１，３位に脂肪酸残基を導入することで目的ＴＧを得ることを特徴とする。すなわち、本発明は、リパーゼの反応を二段階に分け、ＴＧから第一の１，３−リパーゼを用いてアルコリシスによって２−ＭＧを調製し、その後、１，３位に導入したい脂肪酸の低級アルキルエステルまたは遊離脂肪酸を用いて第二の１，３−リパーゼで２−ＭＧのエステル化反応によってＴＧを調製する方法である。
【００１７】
本発明者らは、ある種のリパーゼがＴＧとの反応でアシドリシスや加水分解では望む結果が得られない場合であっても、アルコリシスを行なうことにより、ＤＨＡなどリパーゼの作用しにくい脂肪酸が１，３位にある場合でも、ほぼ完璧に１，３位の脂肪酸を除去し２−ＭＧを得ることができることを発見した。ついで２−ＭＧには１，３位に導入したい脂肪酸のエステルまたは遊離脂肪酸を作用させることで目的の構造のＴＧを非常に高純度で高効率で得られることを発見し、これらの手順を順番に組み合わせることによって本発明を完成した。
【００１８】
第一段階で使用される第一のリパーゼは、１，３位に選択的で、エタノリシス、メタノリシスなどのアルコリシスを行なった場合にＤＨＡなどの鎖長の長い脂肪酸にも作用できるものであれば特に限定されない。この目的で利用できるリパーゼとしてＣａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ  リパーゼ（例えばＮｏｖｏｚｙｍ４３５［ノボノルディスクバイオインダストリー(株)］ ）が好ましいものとして例示される。
【００１９】
第二段階で使用される第二のリパーゼは１，３位に選択的で、２−ＭＧと脂肪酸エステルまたは遊離脂肪酸を減圧下で反応させＴＧを生成できるのであれば特に限定されない。この目的で利用できるリパーゼとして  Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒｍｉｅｈｅｉ  リパーゼ（例えば  ＬｉｐｏｚｙｍｅＩＭ［ノボノルディスクバイオインダストリー(株)］）が好ましいものとして例示される。脂肪酸エステルとしてエチルエステルなどの低級アルキルエステルが例示される。
【００２０】
本発明の製造方法の最も好ましい態様は、原料ＴＧをＮｏｖｏｚｙｍ４３５でアルコリシスして得られる２−ＭＧを経由しＬｉｐｏｚｙｍｅ ＩＭで１，３位に脂肪酸残基を導入することで目的構造のＴＧを得ることを特徴とする。
【００２１】
原料ＴＧは、好ましくは高度不飽和脂肪酸を含有する油脂であり、高度不飽和脂肪酸はＤＨＡ、ＥＰＡまたはＡＬＡである。本発明の方法で用いられる原料ＴＧは例えば魚油であり、好ましくはＤＨＡ濃縮油脂、またはトリＤＨＡ−ＴＧ、あるいはＥＰＡ濃縮油脂、またはトリＥＰＡ−ＴＧ、あるいはＡＬＡ濃縮油脂またはトリＡＬＡ−ＴＧである。本発明の方法で用いられる１，３位に導入される脂肪酸は好ましくは炭素数８、１０または１２の飽和脂肪酸である。
【００２２】
本発明において原料のＴＧとして高度に精製されたＤＨＡのみから構成されるトリＤＨＡ−ＴＧを用いた場合、高純度でＸ−ＤＨＡ−Ｘ型のＴＧを得ることが可能であり、これは従来のアシドリシスと市販リパーゼの組み合わせでは調製が非常に困難である。また、このとき１，３位に導入する脂肪酸に炭素数８〜１２の中鎖脂肪酸を選択すれば吸収性に優れたＤＨＡ含有ＴＧを得ることができ乳児用の粉乳などに利用すれば大きな効果が期待できる。
【００２３】
また、ＥＰＡを含有した構造脂質も同様に調製可能で吸収性の高いＥＰＡ含有ＴＧを得た場合にはＥＰＡの持つ多くの生理活性を期待した食品、医薬品などが期待できる。
【００２４】
さらに魚油にはもともとｓｎ２位にＤＨＡが局在していることが知られており、本発明をＤＨＡ含量の比較的高いマグロ油やカツオ油に適用すれば吸収性を増大させた栄養面に優れた油脂を得ることができる。また、原料の魚油のＤＨＡ濃度をウィンタリングなどの手法で濃縮した魚油を用いればさらにＤＨＡを高含量とした目的の構造のＴＧが得られる。
【００２５】
【作用】
リパーゼの反応を二段階に分け、第一段階でＴＧから第一の１，３−リパーゼを用いてアルコリシスすることで、ＤＨＡなどリパーゼの作用しにくい脂肪酸が１，３位にある場合にも、ほぼ完ぺきに１，３位の脂肪酸を除去し２−ＭＧを得ることができる。
その後、第二段階で１，３位に導入したい脂肪酸の低級アルキルエステルまたは遊離脂肪酸を用いて第二の１，３−リパーゼで２−ＭＧのエステル化反応をすることで、目的の構造のＴＧを非常に高純度で高効率で得ることができる。
【００２６】
【実施例】
本願発明の詳細を実施例で説明する。本願発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。
【００２７】
実施例１
カツオ油１ｇ、エタノール３ｇ、Ｎｏｖｏｚｙｍ４３５  ０．４ｇを混合し、窒素気流下３５℃で２時間攪拌した。反応後、反応混合物の脂質組成をイアトロスキャンにて測定した結果、エチルエステル６９．５％、ジグリセライド２．３％、ＭＧ２８．３％でありＴＧ、遊離脂肪酸は検出されなかった。薄層クロマトグラフィー分析の結果、ＭＧは２−ＭＧであることを確認した。またガスクロマトグラフィーにて脂肪酸組成を測定した結果、原料カツオ油のＤＨＡは２７．９％であったのに対し、ＭＧのＤＨＡは５１．５％であった。
【００２８】
実施例２
イワシ油を原料として、ＰＵＦＡの濃縮を目的にアセトンを溶媒としたウインタリングを行い得られた油１ｇ、エタノール３ｇ、Ｎｏｖｏｚｙｍ４３５  ０．４ｇを混合し、窒素気流下３５℃で３時間攪拌した。反応後、反応混合物の脂質組成をイアトロスキャンにて測定した結果、エチルエステル６７．７％、ジグリセライド１．９％、ＭＧ３０．４％でありＴＧ、遊離脂肪酸は検出されなかった。薄層クロマトグラフィー分析の結果、ＭＧは２−ＭＧであることを確認した。またガスクロマトグラフィーにて脂肪酸組成を測定した結果、ウインタリング油のＤＨＡは１３．０％であったのに対し、ＭＧのＤＨＡは２８．８％であった。
【００２９】
実施例３
グリセリン０．１８４ｇ、水０．１８４ｇ、Ｎｏｖｏｚｙｍ４３５  ０．２３９ｇを混合し３０分間攪拌後、ＤＨＡ１．９７１ｇを加え、６０℃、３〜５ｍｍＨｇの減圧下で一夜攪拌した。酵素を濾別し、反応混合物をシリカゲルカラムで精製した結果、トリＤＨＡ−ＴＧ１．８３ｇ（純度９９％、収率８９％）を得た。
得られたトリＤＨＡ−ＴＧ０．１０２ｇ、エタノール０．３０６ｇ、Ｎｏｖｏｚｙｍ４３５  ０．０４６ｇを混合し３５℃、窒素気流中で４時間攪拌した。酵素を濾別し、グリセリド画分の組成をイアトロスキャンで分析したところ、ＭＧ９２．７％、ジグリセライド５．３５％、ＴＧ１．９６％であった。薄層クロマトグラフィーによりＭＧは１００％２−ＭＧであることを確認した。
【００３０】
実施例４
実施例３と同様に操作して得られた反応混合物から酵素を濾別後残存するエタノールを減圧下留去したもの全量に、オクタン酸エチル０．３４５ｇ、水０．０１０ｇ、Ｌｉｐｏｚｙｍｅ  ＩＭ  ０．０５０ｇを加え、窒素気流下３５℃で３０分間攪拌した。次いで真空ポンプで反応容器を３〜５ｍｍＨｇに減圧し、３５℃で３．５時間攪拌を継続した。得られた反応混合物のグリセリド画分の組成をガスクロマトグラフィーおよび銀イオンカラム高速液体クロマトグラフィーにより分析した結果、２位にＤＨＡ，１、３位にオクタン酸を有するＴＧが８１．４％含まれていた。
【００３１】
実施例５
実施例３と同様に操作して得られた反応混合物から分画して得られた２−ＤＨＡ−ＭＧ０．０４０ｇに、オクタン酸０．２８９ｇ、水０．０１０ｇ、Ｌｉｐｏｚｙｍｅ  ＩＭ  ０．０５０ｇを加え、窒素気流下３５℃で３０分間攪拌した。次いで真空ポンプで反応容器を３〜５ｍｍＨｇに減圧し、３５℃で３．５時間攪拌を継続した。得られた反応混合物のグリセリド画分の組成をガスクロマトグラフィーおよび銀イオンカラム高速液体クロマトグラフィーにより分析した結果、２位にＤＨＡ，１、３位にオクタン酸を有するＴＧが７８．８％含まれていた。
【００３２】
実施例６
グリセリン０．１８４ｇ、水０．１８４ｇ、Ｎｏｖｏｚｙｍ４３５  ０．２３９ｇを混合し３０分間攪拌後、ＥＰＡ１．８１５ｇを加え、６０℃、３〜５ｍｍＨｇの減圧下で一夜攪拌した。酵素を濾別し、反応混合物をシリカゲルカラムで精製した結果、トリＥＰＡ−ＴＧ１．７４ｇ（純度９９％、収率９２％）を得た。
得られたトリＥＰＡ−ＴＧ０．０９４ｇ、エタノール０．２８３ｇ、Ｎｏｖｏｚｙｍ４３５  ０．０３８ｇを混合し３５℃で４時間攪拌した。酵素を濾別し、グリセリド画分の脂質組成をイアトロスキャンで分析したところ、ＭＧ９８．５％、ジグリセライド５．３５％、ＴＧ０．４２％であった。薄層クロマトグラフィーによりＭＧは１００％２−ＭＧであることを確認した。
【００３３】
実施例７
実施例６と同様に操作して得られた反応混合物から酵素を濾別後残存するエタノールを減圧下留去したもの全量に、デカン酸エチル０．４００ｇ、水０．０１０ｇ、Ｌｉｐｏｚｙｍｅ  ＩＭ  ０．０５０ｇを加え、窒素気流下３５℃で３０分間攪拌した。次いで真空ポンプで反応容器を３〜５ｍｍＨｇに減圧し、３５℃で３．５時間攪拌を継続した。反応後得られたグリセリド画分の組成をガスクロマトグラフィーおよび銀イオンカラム高速液体クロマトグラフィーにより分析した結果、２位にＥＰＡ，１、３位にデカン酸を有するＴＧが７２．７％含まれていた。
【００３４】
実施例８
実施例６と同様に操作して得られた反応混合物から分画して得られた２−ＥＰＡ−ＭＧ０．０３７ｇに、デカン酸０．３４５ｇ、水０．０１０ｇ、Ｌｉｐｏｚｙｍｅ ＩＭ ０．０５０ｇを加え、窒素気流下３５℃で３０分間攪拌した。次いで真空ポンプで反応容器を３〜５ｍｍＨｇに減圧し、３５℃で３．５時間攪拌を継続した。反応後得られたグリセリド画分の組成をガスクロマトグラフィーおよび銀イオンカラム高速液体クロマトグラフィーにより分析した結果、２位にＥＰＡ，１、３位にデカン酸を有するＴＧが７０．６％含まれていた。
【００３５】
【発明の効果】
目的の構造のＴＧ、特にｓｎ-２位にＰＵＦＡを有するＴＧを非常に高純度で高効率で製造するＴＧの製造方法を提供することができる。
また、目的の構造のＴＧ製造のための中間体として特に有用な２−ＭＧを製造する方法を提供することができる。