(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定塩基配列を含む試料中の標的ＲＮＡを鋳型として、プロモーター配列を有し前記特定塩基配列又は前記特定塩基配列と相補的な配列からなるＲＮＡを転写可能な２本鎖ＤＮＡを生成し、ＲＮＡポリメレースによって前記特定塩基配列又は前記特定塩基配列に相補的な配列からなるＲＮＡ転写産物を生成し、更に、該ＲＮＡ転写産物を鋳型として前記２本鎖ＤＮＡを生成する工程からなるＲＮＡ増幅工程を、ＲＮＡ転写産物に相補的な配列を有し、ＲＮＡ転写産物との相補結合によって、複合体を形成していない場合と比較して蛍光特性が変化するインターカレーター性蛍光色素で標識されたプローブ存在下で生じさせ、ＲＮＡ転写産物とインターカレーター性蛍光色素で標識されたプローブを相補結合させて当該結合によって変化する蛍光強度を経時的に測定し、測定された経時的な蛍光強度の変化について、該蛍光強度が所定の基準を満たす時刻を算出し、該算出された時刻より試料中の標的核酸濃度を決定する、標的核酸の分析方法。
【請求項２】
前記所定の基準を満たす時刻が、一定の蛍光強度に至る時刻であることを特徴とする、特許請求項１に記載の分析方法。
【請求項３】
前記所定の基準を満たす時刻が、蛍光強度の単位時間当たりの増加率が最大を示した時刻であることを特徴とする、特許請求項１に記載の分析方法。
【請求項４】
前記所定の基準を満たす時刻を、少なくとも２種類の異なる既知濃度の特定塩基配列を含むＲＮＡ試料の当該時刻と比較することを特徴とする、特許請求項１〜３いずれかに記載の分析方法。
【請求項５】
前記ＲＮＡ増幅工程が、特定塩基配列に相補的な配列を有するプライマー及び特定塩基配列に相同的な配列を有するプライマー（ここで一方のプライマーは、５’側にＲＮＡポリメレースのプロモーター配列を有するプロモータープライマーである）を用い、標的ＲＮＡを鋳型としてＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースにより１本鎖ＤＮＡを生成し、該１本鎖ＤＮＡを鋳型としてＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースを用いることで、特定塩基配列又は特定塩基配列に相補的な配列からなるＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡを生成すること、そして、該２本鎖ＤＮＡがＲＮＡポリメレース存在下でＲＮＡ転写産物を生成し、該ＲＮＡ転写産物が引き続き前記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースによる１本鎖ＤＮＡ生成の鋳型となることを特徴とする、特許請求項１に記載の分析方法。
【請求項６】
前記インターカレーター性蛍光色素で標識されたプローブが、ＲＮＡ転写産物との相補結合によって、そのインターカレーター性蛍光色素が生成したＲＮＡとプローブの間にインターカレーションする性質を有することを特徴とする、特許請求項１に記載の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＤＮＡやＲＮＡ等の遺伝子混合物中に含まれると予想される、特定塩基配列を含む標的ＲＮＡを定性又は定量分析方法に関し、遺伝子診断等の臨床診断分野での利用に有用であり、更には、食品中、室内、土壌中、河川中、海洋中等の環境中の微生物の定性又は定量するのに有用な分析方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
一般的に、生体成分の分析には高い特異性と感度が求められる。特定塩基配列を含む核酸（標的核酸）の分析では、該核酸が特定塩基配列に相補的な配列を有する核酸（核酸プローブ）と配列特異的に複合体を形成する性質が利用される。
【０００３】
特定塩基配列を有する標的核酸の定量には、形成された複合体の量に関連した測定可能な信号を得る手段が重要であり、更に臨床診断等の目的においては、試料中に存在し得る標的核酸量は極微量であることから、該手段は極微量核酸を増幅する工程が必要となる。
【０００４】
ウイルス感染症の診断では、臨床試料中の標的核酸（ウイルス核酸）は極微量であることが多いため、高感度かつ良好な再現性の測定を実現するために信号強度を向上し高感度化する目的から、ポリメレースチェインリアクション（ＰＣＲ）法、特に競合ＰＣＲ法が知られている。この方法は、既知濃度のコンペティター（標的核酸と共通のプライマー認識領域を持つ異種核酸配列）を試料に添加してＰＣＲを実施し、コンペティターと標的核酸の増幅程度を比較することによって試料中の標的核酸濃度を推定するものである。より具体的には、末端にプライマーと相補的な配列を有し、しかも電気泳動法等の分離手段によって標的核酸の増幅産物とは識別が可能な（例えば鎖長が異なる等）核酸を用意し、これを各濃度となるように試料中に混合し、それらについて同時にＰＣＲを実施するのである。
【０００５】
また、ＰＣＲを用いた標的核酸の定量方法として、均一系での分析法も提案されている。例えば、インターカレーター性蛍光色素の存在下でＰＣＲを行い、反応液の蛍光を各ＰＣＲサイクルごとに測定してその変化から標的核酸の初期量を決定する分析法が提案されている（特開平５−２３７０００号公報；医学のあゆみ、１７３（１２）、９５９−９６３（１９９５年）；Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２２９、２０７−２１３（１９９５年）参照）。この分析法では、ＰＣＲによる増幅産物が２本鎖ＤＮＡであることから、２本鎖核酸にインターカレーションして蛍光強度が増大する等、その蛍光特性が変化する性質を有するインターカレーター性蛍光色素を用い、これをＰＣＲによる増幅操作前に予め反応溶液に添加し、反応溶液の蛍光強度を経時的に測定しその立ち上がりサイクル等から標的核酸の初期量を決定するのである。
【０００６】
一方、ＲＮＡの増幅法としては、ＮＡＳＢＡ法や３ＳＲ法も知られている。この方法は、標的ＲＮＡに対し、プロモーター配列を含むプライマー、逆転写酵素及びリボヌクレエースHにより、プロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを合成し、ＲＮＡポリメレースによって標的ＲＮＡの特定塩基配列を含むＲＮＡを合成し、該ＲＮＡが引き続きプロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡ合成の鋳型となる連鎖反応を行うものである。そして、ＲＮＡが増幅された段階で反応を終了し、電気泳動法または標識核酸プローブを用いたハイブリダイゼイション法により増幅されたＲＮＡを定量する。
【０００７】
標識核酸プローブを用いたハイブリダイゼイション法は測定可能な可視光、蛍光、発光等の信号を発生するように標識した核酸プローブと標的核酸との複合体を形成後、未反応の核酸プローブを洗浄又は分解し、標識物質を測定し標的核酸を定量する方法である。一般には特定核酸の異なる部位の特定配列に対して相補結合を形成し得る配列からなる２種類のプローブを用いるサンドイッチアッセイと呼ばれる方法が知られている。この方法では、第１のプローブは不溶性担体に固定化されており、一方第２のプローブはその一部に可視部に色を持つ色素や蛍光物質あるいはそれらを生成し得る酵素で標識されている。そして、試料にこれらのプローブを添加し、試料中の特定核酸を第１及び第２のプローブと相補結合させ、これら３者からなる複合体を不溶性担体上に形成させる。引き続き、試料反応中の上清と不溶性担体とを分離し、上記複合体を形成していない第２のプローブを分離する（Ｂ／Ｆ分離工程）。しかる後、不溶性担体上の複合体中の標識物質を測定することにより、試料中の特定核酸の有無及び量を決定するのである。ここで、可視部に色を持つ色素や蛍光物質を生成し得る酵素を第２の標識として用いる場合は、上記複合体形成工程後、複合体を形成していない第２のプローブを除去した後に、それらの前駆体である酵素基質を試料反応液に添加し、その反応産物である色素や蛍光物質を測定することにより、試料中の標的核酸の有無及びその量を決定する。
【０００８】
サンドイッチアッセイでは、反応液中に不溶性担体を利用することから、第２のプローブがこの不溶性担体に非特異的に吸着し、不溶性担体上の非特異的に吸着し、不溶性担体上の複合体中の標識を測定する段階で、この不溶性担体上に非特異的に吸着した第２のプローブの標識の存在により測定結果に誤差が生じ試料中の特定核酸の有無及びその量を決定する際に問題が生じる。特に、ウイルス感染症の診断では、臨床試料中の極微量のウイルス核酸を良好な再現性で高感度に検出することが要求されることから、上記の非特異吸着に由来する問題は解決すべき重要な課題となっている。
【０００９】
この問題を回避する目的で、不溶性担体の表面の親水化処理、蛋白質等による担体表面の吸着点のブロッキング、Ｂ／Ｆ分離工程に続いて不溶性担体を十分洗浄すること等が試みられている。
【００１０】
しかしながら、担体表面を化学的に親水化処理等することは、その可否が担体の材質に依存するうえ、技術的に必ずしも容易ではない。また担体表面の吸着点を予めブロッキングする目的で担体表面を蛋白質によって被覆する方法では、その蛋白質が第２のプローブの核酸部分又は標識と相互作用し、担体への新たな非特異的吸着を招く可能性もある。更に、Ｂ／Ｆ分離工程においては、不溶性担体の洗浄回数を増やすことは操作上の限界があり、例えば洗浄液に界面活性剤を添加する等した場合、担体に形成されている複合体の分解を促す可能性もある。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
競合ＰＣＲ法では、１検体を分析するために想定核酸濃度を含む各濃度のコンペティターを調製し、これを添加した試料についてＰＣＲを実施する必要がある。しかもＰＣＲ終了後には、試料を反応容器から取り出して電気泳動等の分離操作を行わなければならない。このため多数の検体を迅速かつ簡便に処理する必要性の高い臨床検査に適用するには不適当である。また、試料を反応溶液から取り出さなければならないことから、増副産物の飛散に由来する擬陽性の惹起という課題を解決し得ない。さらに、標的がＲＮＡの場合は、ＲＮＡを鋳型として逆転写酵素の作用によって一旦ｃＤＮＡを合成してからＰＣＲを行う、所謂ＲＴ−ＰＣＲを行うこととなり、実質的には２段階の工程を行わなけばならない。
【００１２】
インターカレーター性蛍光色素の存在下でＰＣＲを実施する方法では、２本鎖核酸にインターカレーションすることを原理としているため、試料中に特定核酸以外の２本鎖ＤＮＡ、例えば大量のゲノムＤＮＡ等、が混在する場合には、インターカレーター性蛍光色素がこれらにもインターカレーションして大きなバックグラウンドを生じてしまうという課題がある。また、ＰＣＲ法では特定核酸配列に相補的な一対のオリゴヌクレオチドを伸長反応用プライマーとして用いるが、このプライマーの配列によってはこれらが互いに相補結合し、この結果、互いに他方のプライマーを鋳型としてプライマーダイマーが生産されることがある。インターカレーター性蛍光色素は２本鎖に非特異的にインターカレーションするため、このようなプライマーダイマーの生産に由来してバックグラウンドが増加するという課題もある。
【００１３】
ＮＡＳＢＡ法や３ＳＲ法等を用いた場合、ＲＮＡが十分検出可能な量まで増幅された後に反応を終了し、電気泳動法あるいは標識核酸プローブを用いたハイブリダイゼイション法にて増幅された核酸を定量可能であるが、試料中に元来存在した増幅前の標的ＲＮＡの定量は不可能である。また、電気泳動や標識核酸プローブを用いたハイブリダイゼイション法を行うに当たり、増副産物の飛散に由来する擬陽性の惹起という課題がある。
【００１４】
そこで本発明の目的は、試料中に元来存在した特定塩基配列を含む標的ＲＮＡ（１本鎖ＲＮＡ）を定量するための、迅速、簡便で、精度の高い方法であって、特に好適な態様においては密閉した容器内で全操作を完了し得る方法を提供することにある。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、標的核酸の特定塩基配列に相補的な核酸配列を有し、標的核酸と結合した場合に測定可能な蛍光信号を発するようにインターカレーター性蛍光色素を標識した核酸プローブを開発した（特開平８−２１１０５０号公報；ＥＰ公開第７１４９８６号公報；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２４（２４）、４９９２−４９９７（１９９６年）参照）。この核酸プローブは、標的核酸と相補結合を形成することで測定可能な蛍光信号を発するため、相補結合を形成していないプローブを反応系から分離することなしに、相補結合の形成の有無及び形成された相補結合体の定量を可能とするものである。そこで本発明者らは、この核酸プローブの共存状態で核酸プライマー及び核酸ポリメレースの作用によりＲＮＡを増幅し、経時的な蛍光強度の測定によって得られた蛍光強度と時間の関係より元来試料中に存在した標的ＲＮＡの定量分析を、好適には密閉条件で行い得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１６】
すなわち本発明は、特定塩基配列を含む試料中の標的ＲＮＡを鋳型として、プロモーター配列を有し前記特定塩基配列又は前記特定塩基配列と相補的な配列からなるＲＮＡを転写可能な２本鎖ＤＮＡを生成し、ＲＮＡポリメレースによって前記特定塩基配列又は前記特定塩基配列に相補的な配列からなるＲＮＡ転写産物を生成し、更に、該ＲＮＡ転写産物を鋳型として前記２本鎖ＤＮＡを生成する工程からなるＲＮＡ増幅工程を、ＲＮＡ転写産物に相補的な配列を有するインターカレーター性蛍光色素で標識されたプローブ存在下で生じさせ、経時的に蛍光強度を測定し、測定された経時的な蛍光強度の変化について、該蛍光強度が所定の基準を満たす時刻を算出し、該算出された時刻より試料中の標的核酸濃度を決定する、標的核酸の分析方法である。以下、本発明を詳細に説明する。
【００１７】
本願請求項の１の発明は、試料中の特定塩基配列を含む１本鎖ＲＮＡ（標的ＲＮＡ）を分析する方法である。ここで分析とは、試料中に該ＲＮＡが存在するか否かを分析することと、そして、試料中に元来存在した該ＲＮＡの存在量を分析することの両方を含む。
【００１８】
本願発明は、標的ＲＮＡを含むと予想される試料に、少なくとも以下（Ａ）〜（Ｉ）の試薬を用意し、試料にこれらを順次添加するか、これらの２以上を一度に添加するか、又はこれらを一度に添加する操作（（Ａ）〜（Ｉ）は、この順に添加することを要しない）と、蛍光信号を経時的に測定する操作を含む。
【００１９】
（Ａ）前記標的ＲＮＡ中の特定塩基配列の３’側末端配列に相補的な配列を有する第１の１本鎖オリゴヌクレオチド、
（Ｂ）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース、
（Ｃ）デオキシリボヌクレオシド三燐酸、
（Ｄ）リボヌクレエースH又は同等のＲＮＡ分解活性を有する酵素、
（Ｅ）５’末端側から順に（１）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレースのプロモーター配列、（２）該プロモーターのエンハンサー配列及び（３）標的ＲＮＡ中の特定塩基配列の５’末端配列と同一の塩基配列を有する第２の１本鎖オリゴヌクレオチド、
（Ｆ）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース、
（G）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレース、
（Ｈ）リボヌクレオシド三燐酸、
（Ｉ）特定塩基配列に相補的な配列を有し、該配列を有する核酸と結合した場合に測定可能な蛍光信号を発するように標識された第３の１本鎖オリゴヌクレオチド。
【００２０】
また、上記試薬（Ａ）、試薬（Ｅ）及び試薬（Ｉ）の、第１、第２及び第３の１本鎖オリゴヌクレオチドの組み合わせを用いる以外に、以下の試薬（Ｊ）〜（Ｌ）の第１〜第３の１本鎖オリゴヌクレオチドの組み合わせを用いてもよい。
【００２１】
（Ｊ）５’末端側から順に（１）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレースのプロモーター配列、（２）該プロモーターのエンハンサー配列及び（３）標的ＲＮＡ中の特定塩基配列の３’側末端配列に相補的な配列を有する第１の１本鎖オリゴヌクレオチド、
（Ｋ）標的ＲＮＡ中の特定塩基配列の５’側末端配列と同一の塩基配列を有する第２の１本鎖オリゴヌクレオチド、
（Ｌ）標的ＲＮＡ中の特定塩基配列に相同的（同一）な配列を有し、該配列を有する核酸と結合した場合に測定可能な蛍光信号を発するように標識された第３の１本鎖オリゴヌクレオチド。
【００２２】
上記において、特定塩基配列とは、上記（Ａ）及び（Ｅ）の第１及び第２の１本鎖オリゴヌクレオチドを使用した場合、５’末端が（Ｅ）の第２の１本鎖オリゴヌクレオチドにおける（３）の配列で始まり、３’末端が（Ａ）の第１の１本鎖オリゴヌクレオチドと相補的な配列で終わる、標的ＲＮＡ中に存在する塩基配列部分である。また上記（Ｊ）及び（Ｋ）の第１及び第２の１本鎖オリゴヌクレオチドを使用した場合には、５’末端が（Ｋ）の第２の１本鎖オリゴヌクレオチドと同一な配列で始まり、３’末端が（Ｊ）の第１の１本鎖オリゴヌクレオチドにおける（３）の配列に相補的な配列で終わる、標的ＲＮＡ中に存在する塩基配列部分である。特定塩基配列は任意に決定することができるが、標的ＲＮＡを他の核酸から区別し得る程度に特異的な配列部分を含むようにすることが重要である。
【００２３】
試薬（Ａ）は、特定塩基配列に対し、配列特異的に結合する、相補的な配列を有する第１の１本鎖オリゴヌクレオチドである。該試薬は標的ＲＮＡに相補結合し、後述する試薬（Ｂ）及び（Ｃ）の存在下で、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースによる標的ＲＮＡを鋳型とするｃＤＮＡ合成が行われる際に、該ｃＤＮＡの５’側末端に特定塩基配列の３’末端と相補的な配列が位置するようにするためのものである。
【００２４】
試薬（Ｂ）はＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースであり、試薬（Ｃ）はその基質となるデオキシリボヌクレオシド三燐酸である。試薬（Ａ）〜（Ｃ）の存在下で、標的ＲＮＡ中の特定塩基配列の３’末端に相補的な配列を５’末端に持つｃＤＮＡが合成される。このｃＤＮＡは、鋳型となった標的ＲＮＡと、ＤＮＡ−ＲＮＡ２本鎖を形成した状態である。
【００２５】
試薬（Ｄ）は、上記ＤＮＡ−ＲＮＡ２本鎖中のＲＮＡを切断する活性を有するリボヌクレエースＨであるが、同等のＲＮＡ分解活性を有する酵素を用いることもできる。トリ筋芽細胞腫ウイルス逆転写酵素（以下、ＡＭＶ逆転写酵素）に代表される逆転写酵素は、ＤＮＡ−ＲＮＡ２本鎖中のＲＮＡを切断する活性を有しており、この種の酵素を用いることを例示できる。
【００２６】
試薬（Ｅ）は、５’末端側から順に（１）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレースのプロモーター配列、（２）該プロモーターのエンハンサー配列及び（３）特定塩基配列の５’末端配列と同一の塩基配列を有する第２の１本鎖オリゴヌクレオチドである。第２のオリゴヌクレオチドにおいて、（３）の部分は試薬（Ａ）〜（Ｄ）が共存することで合成されるｃＤＮＡの３’末端に結合する。従って試薬（Ｃ）と（Ｆ）の共存により、第２のオリゴヌクレオチドの３’末端から該ｃＤＮＡを鋳型として、また同時に該ｃＤＮＡの３’末端から該第２のオリゴヌクレオチドを鋳型として、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースによりそれぞれの相補鎖が合成され、転写可能なプロモーター配列を有する完全な２本鎖ＤＮＡが合成される。
【００２７】
試薬（Ｆ）はＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースである。ＡＭＶ逆転写酵素に代表される逆転写酵素には、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース活性を有するものがあり、この種の酵素を用いてもよい。
【００２８】
試薬（Ｇ）は、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレースであり、試薬（Ｈ）はその基質となるリボヌクレオシド三燐酸である。試薬（Ｃ）、（Ｅ）及び（Ｆ）の共存により合成される２本鎖ＤＮＡは、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレースのプロモーター領域を末端に有する。このため、試薬（Ｇ）及び（Ｈ）の存在下では該ＤＮＡ合成後、直ちに特定塩基配列からなる１本鎖ＲＮＡの合成が開始される。試薬（Ｇ）におけるＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレースとしては、具体的に例えばＴ７ＲＮＡポリメレースやＴ３  ＲＮＡポリメレース、ＳＰ６  ＲＮＡポリメレース等を例示することができる。
【００２９】
試薬（Ｇ）及び（Ｈ）の共存により合成される１本鎖ＲＮＡは特定塩基配列からなるＲＮＡである。従って、これらが合成されて試薬（Ａ）〜（Ｆ）と共存することにより、上述した一連の反応が繰り返し生じることとなる。このように、本発明では試料中に存在する極微量の標的ＲＮＡをもとにして前記の如きプロモータ領域を末端にもつ２本鎖ＤＮＡが合成され、これが特定塩基配列からなる１本鎖ＲＮＡの合成源となる。合成された１本鎖ＲＮＡは新たな２本鎖ＤＮＡの合成に寄与し、結果として時間の経過とともに特定塩基配列からなる１本鎖ＲＮＡ量は飛躍的に増大する。
【００３０】
試薬（Ｉ）は、特定塩基配列に相補的な配列を有し、該配列を有する核酸と結合した場合に測定可能な蛍光信号を発するように標識された第３の１本鎖オリゴヌクレオチドである。第３のオリゴヌクレオチドは、例えばインターカレーター性蛍光色素が結合されたＤＮＡであれば良い。該ＤＮＡ部分は、特定塩基配列の特異的分析のため、６〜１００ヌクレオチド、更に好ましくは１０〜３０ヌクレオチドとすることが好ましい。むろん該ＤＮＡ部分は、特定塩基配列中に存在する配列であって、標的核酸以外の核酸と十分に区別可能な配列部分と相補的な配列であることが重要である。
【００３１】
ＤＮＡ部分は合成された特定塩基配列からなる１本鎖ＲＮＡと相補結合を形成した場合に、既に添加されている試薬（Ｃ）のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースが作用してその３’末端からの伸長が生じないように、該３’末端が特定塩基配列と非相補的な配列が付加されているか、または、その３’末端が化学的に修飾されていることが好ましい。
【００３２】
インターカレーター性蛍光色素は、ＤＮＡ部分が他の核酸と相補結合を形成すると２本鎖部分にインターカレーションして蛍光特性が変化するものである。この目的のためには、インターカレーター性蛍光色素を、２本鎖部分へのインターカレションを妨げない程度の適当な分子長リンカーを介してＤＮＡと結合することが例示できる。かかるリンカーとしては、インターカレーター性蛍光色素が２本鎖部分にインターカレーションすることを妨げない分子であれば特に制限はない。特に両末端に官能基を有する二官能性炭化水素から選択されるリンカー分子は、オリゴヌクレオチドへの修飾を行う上で簡便で好ましい。また、例えば、市販の試薬セット（Ｃ６−Ｔｈｉｏｌｍｏｄｉｆｉｅｒ，商品名、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）等を使用することもできる。
【００３３】
インターカレーター性蛍光色素としては、２本鎖にインターカレーションすることで、例えば発する蛍光波長が変動したりする等、その蛍光特性が変化するものであれば特に制限はないが、測定の容易さ等の観点からインターカレーションにより蛍光強度が増加する性質を有するものが特に好ましい。より具体的には特に蛍光強度の変化が著しいチアゾールオレンジ、オキサゾールイエロー又はそれらの誘導体を特に好ましいインターカレーター性蛍光色素として例示できる。
【００３４】
インターカレーター性蛍光色素をリンカーを介して結合させるＤＮＡの位置は、ＤＮＡの５’末端、３’末端または中央部等、インターカレーター性蛍光色素の２本鎖へのインターカレーションが妨げられず、かつ、ＤＮＡ部分とＲＮＡとの相補結合を阻害しない限り特に制限はない。
【００３５】
プロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡを鋳型として試薬（Ｇ）及び試薬（Ｈ）により合成される１本鎖ＲＮＡ量は経時的に増加する。本反応系において該１本鎖ＲＮＡのある特定の配列に相補的な配列を有する上記の性質を合わせ持つ試薬（Ｉ）を共存させることにより、合成されるＲＮＡ量に比例して蛍光強度が増加することが確認されている。（医学のあゆみ、１８４（３）、２３９−２４４、（１９９８年）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２４（２４）、４９９２−４９９７（１９９６年））
試薬（Ｉ）を、標的ＲＮＡを含むと予想される試料に、少なくとも試薬（Ａ）〜（Ｈ）とともに共存させ、増加する特定塩基配列からなる１本鎖ＲＮＡを、蛍光信号として測定する。ここで、合成された1本鎖ＲＮＡと試薬（Ｉ）の第３のオリゴヌクレオチドが相補結合を形成し、蛍光信号を発した場合であっても、このＲＮＡは試薬（Ａ）〜（Ｃ）共存下でのＤＮＡ合成の際の鋳型として機能することが明らかとなった。即ち本発明では、各試薬の共存状態においてＲＮＡからのｃＤＮＡ合成、２本鎖ＤＮＡの合成、２本鎖ＤＮＡからのＲＮＡ合成という一連の現象が、第３のオリゴヌクレオチド共存下で生じ、ＲＮＡの増加に比例して蛍光強度が増加する。
【００３６】
上記試薬（Ａ）、試薬（Ｅ）及び試薬（Ｉ）の第１〜第３の１本鎖オリゴヌクレオチドの組み合わせを用いる代わりに、上記試薬（Ｊ）〜（Ｌ）の第１〜第３の１本鎖オリゴヌクレオチドの組み合わせを用いてた場合について説明する。
【００３７】
試薬（Ｊ）は、５’側末端から順に（１）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレースのプロモーター配列、（２）該プロモーターのエンハンサー配列及び（３）標的ＲＮＡ中の特定塩基配列の３’側末端配列に相補的な配列を有する第１の１本鎖オリゴヌクレオチドである。該試薬の（３）の部分は特定塩基配列中の３’側末端に相補結合し、試薬（Ａ）を用いた場合と同様に、試薬（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）の存在下で、標的ＲＮＡに相補的なｃＤＮＡが合成される。
【００３８】
試薬（Ｋ）は、標的ＲＮＡの特定の塩基配列の５’側末端に相同的配列を有する１本鎖オリゴヌクレオチドである。該試薬（Ｋ）が該ｃＤＮＡの特定塩基配列中の３’側末端に相補的結合をした後、試薬（Ｃ）及び試薬（Ｆ）の共存により、ＲＮＡポリメレースのプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡが合成される。
更に該２本鎖ＤＮＡは、試薬（Ｇ）及び試薬（Ｈ）の共存により、特定塩基配列に相補的な第２の１本鎖ＲＮＡが合成される。
【００３９】
更に、該第２のＲＮＡの３’側末端は試薬（Ｋ）と相補結合し、試薬（Ｂ）〜（Ｄ）の共存下で、該第２のＲＮＡの第２のｃＤＮＡが合成される。該第２のｃＤＮＡの３’末端は試薬（Ｊ）の（３）部分と相補結合し、試薬（Ｃ）及び試薬（Ｆ）によりプロモーター配列を含有する２本鎖ＤＮＡが合成され、試薬（Ｇ）及び試薬（Ｈ）により該第２のＲＮＡが合成される。合成された特定塩基配列に相補的な該第２のＲＮＡは、新たな２本鎖ＤＮＡの合成源となり、一連の反応が繰り返し生じることにより、結果として該第２のＲＮＡの量は飛躍的に増大する。
【００４０】
ここで得られた該第２のＲＮＡは、標的ＲＮＡ中の特定塩基配列と相補的な配列を有する。特定塩基配列と同一な配列を有し、かつインターカレーター性蛍光色素で標識された第３の１本鎖オリゴヌクレオチドである試薬（Ｌ）を共存させることにより、合成された該第２のＲＮＡ量に比例して蛍光強度が増加する。
【００４１】
また、本発明では、試料中に元来存在した特定塩基配列を含むＤＮＡを分析することも可能である。即ち、公知の方法により調製した転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡを標的核酸とすれば、該２本鎖ＤＮＡは、前記増幅反応の鋳型となり得、ＲＮＡポリメレースにより、ＲＮＡ転写産物を生成することが可能だからである。転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡ調製方法には、例えばプロモータープライマーとＤＮＡポリメレースを用い、標的ＤＮＡに対してプロモーター配列を付与する方法、あるいはＤＮＡライゲースを用い、プロモーター配列を有するＤＮＡ鎖を標的ＤＮＡに結合させる方法等を例示できる。
【００４２】
本発明における蛍光信号の測定は、好ましくは試薬（Ａ）〜（Ｉ）の添加直後から、又は、添加後所定時間経過後から経時的に行う。試薬（Ｉ）の第３のＤＮＡは、１本鎖ＲＮＡの合成過程において、合成されたＲＮＡと結合・解離を繰り返すが、結合時に測定される蛍光信号は各測定時における該ＲＮＡの存在量を反映するため、１本鎖ＲＮＡの増加する様子を経時的に追跡することが可能である。なお、測定自体は連続的なものであっても一定時間毎の間欠的なものであっても良い。また、蛍光信号の測定装置は、本発明の一部を構成しないが、１本以上の反応管中の蛍光信号を連続的又は一定時間毎の間欠的に測定できるものであれば如何なる装置を用いても良い。
【００４３】
蛍光信号の測定時間は、一定量の標的ＲＮＡを含んだ試験区の蛍光強度が増加する時間が標的ＲＮＡを含まない試験区と有為に差の見られる時間を含み、一定量の標的ＲＮＡを含んだ試験区の蛍光強度がほぼ一定になるまでの時間で、概ね４時間、好適条件では１時間である。
【００４４】
上記増幅及び経時的な蛍光強度の測定工程において、増幅反応の経過時間と蛍光強度の増加の関係より、試料中に元来存在した標的ＲＮＡ（初期ＲＮＡ量）が少なくなるに従い、一定の割合で、蛍光強度が増加する時刻が遅れる現象に基づき、所定の基準を満たす時刻を算出し、該算出された時刻より初期ＲＮＡ量を決定する。
【００４５】
ここで用いられる所定の基準を満たす時刻は、標的ＲＮＡを含まないコントロール区又はＲＮＡ増幅工程初期の蛍光強度の有為な増加が観察されない時刻と比較して、一定の蛍光増加率（所定時間の蛍光強度値÷バックグラウンドの蛍光強度値）に至る時刻が挙げられる。より具体的には、標的ＲＮＡを含まない複数のコントロール区の所定時間における蛍光増加率の標準偏差の３倍を越えた時刻を用いることができる。また、蛍光増加率の常用対数と時刻との関係において、蛍光増加率の常用対数値がコントロール区と比較し有為に増加する時刻を用いることができる。
【００４６】
また、ある基準によって算出した時刻は、上記蛍光増加率において単位時間当たりの蛍光増加率が最大になる時刻を用いても定量分析が可能である。更に本分析法の容易に考えられる応用例として、蛍光増加率および時刻について、微分、対数表示、近似曲線等の数学的処理を行うことによる解析も可能である。更に、算出された時刻について、少なくとも２種類の異なる既知濃度の試料の場合と比較するすることによって、初期ＲＮＡ量を決定しても良い。
【００４７】
【発明の実施形態】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
【００４８】
実施例１
ヒトＣ型肝炎ウイルスＲＮＡについて、試料中に元来存在したＲＮＡ定量のための検量線を作成した。
【００４９】
（１）ヒトＣ型肝炎ウイルスＲＮＡの塩基番号１１３〜２６７（加藤ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、１９９０年、８７、９５２４〜９５２８）を標準ＲＮＡ試料とし、２６０ｎｍの紫外部吸収により定量後、以下のＲＮＡ希釈液で１０9、１０8、１０7、１０6、１０5、１０4コピー／４μｌとなるよう希釈した。コントロール試験区には、希釈液のみを用いた。
【００５０】
ＲＮＡ希釈液の組成
１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ８．０）
０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ
（２）以下の組成の反応液２１．２μｌを０．５ｍｌ容ＰＣＲ用チューブ（Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー製）に分注し、これに上記ＲＮＡ試料４μｌを添加後、ミネラルオイル５０μｌを重層した。
【００５１】
反応液の組成  （各濃度は最終反応液量３０μｌにおける濃度）
６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−酢酸緩衝液  （ｐH８．１）
１３．５ｍＭ  酢酸マグネシウム
１２０ｍＭ  酢酸カリウム
１６％  ソルビトール
１０ｍＭ  ＤＤＴ
各０．５ｍＭのｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ
各１ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ
１．２５ｍＭのＩＴＰ
０．２μＭの第１のオリゴヌクレオチド（配列番号１）
０．２μＭのＳＰ６プロモータ配列を有するの第２オリゴヌクレオチド
（配列番号２；該配列中、５’端１から１７番目までの塩基はＳＰ６プロモータ配列であり、１８から２５番目までの塩基はエンハンサー配列である。）
０．０２５μＭのインターカレーター性蛍光色素で標識された第３のオリゴヌクレオチド（図１、配列番号３；該配列中、５’端から５番目のＣに色素が結合している）
３０ユニット  リボヌクレエース  インヒビター
２％  ＤＭＳＯ
容量調製用蒸留水
（３）上記の反応液を、５０℃で５分間保温後、以下の組成の酵素液４．８μｌを添加した。
【００５２】
酵素液の組成
４２ユニット  ＡＭＶ逆転写酵素  （宝酒造製）
１７１ユニット  ＳＰ６  ＲＮＡポリメレース  （宝酒造製）
３μｇ  牛血清アルブミン
容量調製用蒸留水
引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付蛍光分光光度計を用い、５０℃に保温して、励起波長４９０ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍで、ＰＣＲチューブ内の反応溶液の蛍光強度を５分間隔で測定した。
【００５３】
なお上記操作は、各サンプルについて５回ずつ行った。
【００５４】
酵素液添加時の時刻を０分として、各サンプル濃度の蛍光増加率（所定時刻の蛍光強度値÷バックグランドの蛍光強度値）を図２〜図７に示す。
【００５５】
希釈液のみを用いた０コピーサンプルをコントロール区とし、６０分後の蛍光増加率の平均に標準偏差の３倍を加えた値、即ち蛍光増加率１．２の値に達する時刻の平均および最小二乗法による回帰直線を図８に示す。相関係数  −０．９９０の良好な相関を示す直線が得られた。各濃度の変動係数は、１０4コピーで４．４％、１０5コピーで２．１％、１０6コピーで３．１％、１０7コピーで７．４％、１０8コピーで９．１％、１０9コピーで４．２％であり、良好な再現性を示した。
【００５６】
上記蛍光増加率において、単位時間当たりの蛍光増加率、即ち［（蛍光増加率−ひとつ前の測定における蛍光増加率）÷測定間隔（５分）］が最大となる時刻の平均および最小二乗法による回帰直線を図９に示す。相関係数  −０．９５５で、各濃度の変動係数は、１０4コピーで７．８％、１０5コピーで０％、１０6コピーで７．２％、１０7コピーで０％、１０8コピーで０％、１０9コピーで１１．９％であった。
【００５７】
以上のことから、本法により、再現性の良好な検量線が得られることが示された。
【００５８】
実施例２
標準ＲＮＡを含む試料Ａおよび試料Ｂについて、再現性および特異性を検証した。
【００５９】
（１）実施例１の方法に従い、１０4〜１０9コピーの標準ＲＮＡを用い、検量線を作製した。蛍光増加率１．２に達する時刻を基準とした場合の検量線を図１０に、単位時間当たりの蛍光増加率が最大となる時刻を基準とした場合の検量線を図１１に示す。
【００６０】
（２）標準ＲＮＡを含む試料ＡおよびＢの各４μｌについて、各4連で実施例１と同様の方法で反応液および酵素液を添加後、５０℃に保温し、５分間隔で蛍光測定を行った。なお、試料ＡおよびＢは、各々１０5コピー／４μｌおよび１０8コピー／４μｌの標準ＲＮＡを含むように調製した。
【００６１】
（３）定量結果を表１に示す。（初期ＲＮＡ量の常用対数値をインデックス値と表す。）試料ＡおよびＢにおいて、理論値とほぼ一致する定量結果が得られた。
すべての試験区において１桁以内の誤差範囲で定量が可能であり、また、変動係数が５％以内であり、再現性にも優れていた。以上のことから、本法により、簡便かつ迅速に試料中に元来存在した特定ＲＮＡ濃度を、再現性良く定量することが可能であることが示された。
【００６２】
【表１】
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【００６３】
【発明の効果】
以上の説明から明らかなように、本発明によれば、試料中の特定塩基配列を含む標的ＲＮＡ（１本鎖ＲＮＡ）について、概ね一定温度で、反応開始時に行う１段階の手動操作のみで、かつ、迅速に試料中に元来存在した標的ＲＮＡ量を定量分析することが可能となる。
【００６４】
本発明では、試料中の標的ＲＮＡをもとにして、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレースのプロモーター領域を末端にもつ２本鎖ＤＮＡが合成され、これが多量の１本鎖ＲＮＡの合成源になり、さらに合成された１本鎖ＲＮＡ量は飛躍的に増大し、インターカレーター性蛍光色素で標識されたプローブが、生成した１本鎖ＲＮＡと相補結合することによる蛍光増加を測定する工程において、蛍光強度が増加する過程を解析することにより、簡便かつ、迅速に初期ＲＮＡ量を決定することが可能である。
【００６５】
また本定量分析方法は、第１〜第３のオリゴヌクレオチドの配列を変更するのみで、臨床診断分野におけるウイルス由来のＲＮＡの定量分析以外にも、病原細菌、抗生物質耐性細菌などの定量分析を始め、食品中や土壌中の微生物の定量分析が可能となる。
【００６６】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１で用いたインターカレーター性蛍光色素で標識された第３のオリゴヌクレオチドのインターカレーター性蛍光色素部分の化学構造である。Ｂ1〜Ｂ3は核酸塩基を示す。
【図２】実施例１で行った各サンプル濃度（初期ＲＮＡ量）における、反応時間と蛍光増加率のグラフである。
【図３】実施例１で行った各サンプル濃度（初期ＲＮＡ量）における、反応時間と蛍光増加率のグラフである。
【図４】実施例１で行った各サンプル濃度（初期ＲＮＡ量）における、反応時間と蛍光増加率のグラフである。
【図５】実施例１で行った各サンプル濃度（初期ＲＮＡ量）における、反応時間と蛍光増加率のグラフである。
【図６】実施例１で行った各サンプル濃度（初期ＲＮＡ量）における、反応時間と蛍光増加率のグラフである。
【図７】実施例１で行った各サンプル濃度（初期ＲＮＡ量）における、反応時間と蛍光増加率のグラフである。
【図８】実施例１で行った各濃度における反応時間と蛍光増加率の関係において、蛍光増加率が１．２に達する時刻の平均から検量線を作製した。エラーバーは、±標準偏差を示す。
【図９】実施例１で行った各濃度における反応時間と蛍光増加率の関係において、蛍光増加率の最大となる時刻の平均から検量線を作製した。エラーバーは、±標準偏差を示す。
【図１０】実施例２で行った各濃度における反応時間と蛍光増加率の関係において、蛍光増加率が１．２に達する時刻から検量線を作製した。
【図１１】実施例２で行った各濃度における反応時間と蛍光増加率の関係において、蛍光増加率の最大となる時刻から検量線を作製した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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