(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記する４種のペプチドの少なくともひとつを含有する、アコヤ貝残渣のアルカリプロテアーゼ処理による加水分解物を有効成分として含有すること、を特徴とするＡＣＥ阻害活性を有する組成物。
Ｐｈｅ−Ｔｙｒ、
Ａｌａ−Ｔｒｐ、
Ｖａｌ−Ｔｒｐ、
Ｇｌｙ−Ｔｒｐ。
【請求項２】
該加水分解物が、真珠を除去したアコヤ貝残渣に加水し、ｐＨ調整した後、加熱処理し、アルカリプロテアーゼ処理した後に得られた上清であること、を特徴とする請求項１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アンジオテンシンＩ変換酵素（以下、ＡＣＥということもある）阻害作用を有するペプチド及びそれを含有する組成物に関し、血圧降下の用途等に広く利用できるものである。
【０００２】
【従来の技術】
腎臓、他各組織中に存在するレニン酵素によって、肝臓、各組織中にて合成されたレニン基質であるアンジオテンシノーゲンが切断され、血中、各組織中にアンジオテンシンＩを生じる。このアンジオテンシンＩは、ほとんど降圧作用を示さないが、アンジオテンシンＩ変換酵素（以下ＡＣＥと略す）の作用によりカルボキシル末端からジペプチドのヒスチジルロイシンを遊離して、アンジオテンシンIIに転換され、強い昇圧作用を引き起こす。また、ＡＣＥは、血圧降下物質であるブラジキニンの分解を触媒するキニナーゼIIと同一物質であることが確認されており、本酵素の阻害物質は血圧降下作用を示し、動脈硬化や心疾患をも改善する効果を有することが知られている。１９７７年Ｏｎｄｅｔｔｉらは、経口投与可能なＡＣＥ阻害剤としてカプトプリルを合成し、その後、高血圧の治療薬として有用であることが明らかとなった。
【０００３】
現在、食品タンパク質の酵素的加水分解物から数多くのＡＣＥ阻害ペプチドが認められているが、実際に、その有効性が証明されているものは少ない。ましてや、実用に供されているものは更に少ない。
【０００４】
一方、瀬戸内海の南、宇和島地方を中心に養殖されている真珠は、三重県のアゴ湾、長崎県沿岸と共に三大生産地として、年々増加しており、真珠の浜揚げ時に生じるアコヤ貝の残渣は５００トン以上に上ろうとしている。しかしながら、真珠を取り除いた後のアコヤ貝は、このように貝柱は珍味として食用されているが、残りの貝肉の部分は有効な利用方法がなく、飼料や肥料に混入する、もしくは海洋投棄されているのが現状であり、環境汚染防止等公害防止の面、アコヤ貝が貴重な天然資源のひとつである面、といった双方の観点から、アコヤ貝残渣の有効利用の開発が求められている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、未利用資源である真珠除去後のアコヤ貝残渣を有効に利用することを目的とし、すぐれたＡＣＥ阻害組成物を新たに開発する目的でなされたものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記目的を達成するためになされたものであって、各方面から検討の結果、真珠を除去した後のアコヤ貝残渣を酵素処理し、得られた酵素分解液についてＡＣＥ阻害活性のＩＣ50値の測定等を行い、その結果、アコヤ貝残渣をアルカリプロテアーゼ処理して得た加水分解物にすぐれたＡＣＥ阻害活性があることをはじめて見出した。
【０００７】
そして、更に、この加水分解液からＡＣＥ阻害活性を有するペプチドを単離し、その同定にもはじめて成功し、本発明の完成に至ったものである。
【０００８】
本発明を実施するには、先ず、原料としてアコヤ貝を使用する。アコヤ貝としては、真珠を除去した後の内容物を利用するが、貝柱は珍味として利用される場合が多いので、通常、貝柱を除いた貝肉の部分を利用する。なお、本発明において、アコヤ貝から真珠を除去した後の内容物をアコヤ貝残渣と称するが、希望するのであれば、更に貝柱を除きその残りの部分をアコヤ貝残渣として利用することも可能である。
【０００９】
アコヤ貝残渣は、先ずはじめに、脱イオン水を用い、５〜３０℃、好ましくは１８〜２８℃で、５〜１５分程度攪拌する等によって、洗浄する。水切りした後、脱イオン水を加え、塩酸等無機酸のほか、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、酢酸、マレイン酸等の有機酸を用いてｐＨ３〜５に調整し、１１０〜１３０℃で０．５〜４時間加圧煮沸する。
【００１０】
次いでセルレースを加えて、その作用温度（例えば４０〜６０℃）で１〜５時間反応した後、アンモニア、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウムその他のアルカリ剤を加えてｐＨを８．５〜１１．５等使用するアルカリプロテアーゼの作用ｐＨに調整し、その作用温度（例えば４０〜６０℃）で５〜２４時間加水分解する。
【００１１】
酵素反応の停止を、例えば１００℃で１５分間加熱することによって行い、濾過、遠心分離後、上清を例えばブリックス２０まで濃縮した後に、必要に応じて再度遠心分離を行い、上清を酵素分解液として得る。
【００１２】
そこで得られたアコヤ貝酵素分解液のＡＣＥ阻害活性を合成疑似基質であるＨｉｐｕｒｙｌ−Ｈｉｓｔｉｄｉｌｅ−Ｌｅｕｃｉｎ（Ｈｉｐ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ）を用いてＬｉｅｂｅｒｍａｎの変法に準じて測定したところ、５０％  ＡＣＥを阻害するときの検体の濃度、すなわちＩＣ50値は、０．０９１ｍｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍｌであって、ここに、アコヤ貝酵素分解液がＡＣＥ阻害活性を充分に有することがはじめて確認された。
【００１３】
ＡＣＥ阻害活性の測定は、ＡＣＥが下記の反応を触媒する点を利用して行うものであって、生成するＨｉｐを２２８ｎｍにおける吸光度（Ａ228）測定によって行うものである。
Ｈｉｐ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ  →  Ｈｉｐ＋Ｈｉｓ−Ｌｅｕ
【００１４】
本発明においては、このようにＡＣＥ阻害活性を有するアコヤ貝酵素分解液の創製にはじめて成功しただけでなく、更に活性の高い画分を分離するのにもはじめて成功した。
【００１５】
すなわち、ＡＣＥ阻害活性を有するアコヤ貝分解液をＳｅｐ−ｐａｋ  ＶａｃＣａｒｔｒｉｇｅに負荷し、エタノール濃度によるステップワイズグラジエント溶出により精製を行い、その結果、１０％エタノール溶出画分（以後Ｆ１画分と略す）において、０．０４５ｍｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬと原液と比較して、約２倍高活性な画分を得ることができた。
【００１６】
更に本発明においては、ＡＣＥ阻害活性を有するＦ１画分を新たに分画するのに成功しただけでなく、Ｆ１画分に存在するＡＣＥ阻害物質本体を明らかにするため、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１５充填カラム、Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ１８カラムその他常用されるカラムを用いたゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等の分離、精製手段により、更に分離、精製処理を行い、その結果、ＡＣＥ阻害性を示すフラクションを得、該フラクションを更に分離、精製することによりＡＣＥ阻害性を示すピークを得た。
【００１７】
そして、このようにして単離したＡＣＥ阻害活性を有する物質について、アミノ酸分析及びプロテインシーケンサーに供した。その結果、これらの物質が、Ｐｈｅ−Ｔｙｒ、Ａｌａ−Ｔｒｐ、Ｖａｌ−Ｔｒｐ、Ｇｌｙ−Ｔｒｐと同定された。そして、これらのペプチドについて、ＩＣ50値、ＡＣＥ阻害力価、Ｆ１画分によるＡＣＥ阻害率をそれぞれ測定、計算することにより、ＡＣＥ阻害活性を有することを確認した。これらのペプチドがＡＣＥ阻害作用を有することは、従来全く知られておらず、今回、本発明者らによってはじめて見出されたことである。
【００１８】
したがって本発明は、これらのペプチドの内の少なくともひとつのペプチドからなるＡＣＥ阻害ペプチド、及び、これらのペプチドの内の少なくともひとつのペプチドを含有する組成物（例えば、アコヤ貝のアルカリプロテアーゼ加水分解物、それを更に分離、精製してなるＦ１画分その他のエタノール画分等）に関するものである。
【００１９】
本発明の各ペプタイドは、１種もしくは２種以上によってＡＣＥ阻害剤としての利用、例えば血圧降下剤ないし血圧降下を目的として特定保健用食品向けペプチドとしても使用することができる。したがって本ペプチドは、調味料、栄養強化用食品といった食品ないしは動物飼料添加剤として使用されるほか、上記した独特の生理活性の故に、高血圧性疾病の予防、ある場合には治療のために、医薬として、または輸液、健康食品、臨床栄養食品等としても巾広く使用することができる。
【００２０】
食品として使用する場合には、ペプチドをそのまま添加したり、他の食品ないし食品成分と併用したりして適宜常法にしたがって使用できる。また、医薬として使用する場合には、経口又は非経口投与することができる。経口投与の場合には、例えば常法にしたがい、錠剤、顆粒剤、粉末剤、カプセル剤、散剤とすることができ、又、非経口投与の場合には、例えば注射薬製剤、点滴剤、坐剤等として使用することができる。また、酵素分解物、Ｆ１画分等該ペプチド含有組成物の場合も同様である。
【００２１】
【実施例１】
愛媛県宇和島産のアコヤ貝を用い、次のフローにてアコヤ貝加水分解物を調製した。
【００２２】
0004571289.tif 000002
【００２３】
そこで、得られたアコヤ貝酵素分解液のＡＣＥ阻害活性を合成疑似基質であるHipuryl-Histidile-Leucineを用いて、Libermanの変法に準じて測定した。
その結果、５０％ＡＣＥを阻害するときの検体の濃度、すなわちＩＣ50値は  ０．０９１mg-protein／ｍｌであることが確認された。
【００２４】
【実施例２】
上記で得たＡＣＥ阻害活性を有するアコヤ貝酵素分解液について、これをＳｅｐ−ｐａｋ  Ｖａｃ  Ｃａｒｔｒｉｇｅ（Ｃ18）に負荷し、エタノール濃度（１０〜９９．５％）によるステップワイズグラジエント溶出により精製を行った。
Ｓｅｐ−ｐａｋ（Ｃ18）を用いたアコヤ貝加水分解物の各分画画分について、ＩＣ50（ｍｇ蛋白／ｍｌ）を測定し、下記表１の結果を得た。その結果、例えば１０％エタノール溶出画分（以下、Ｆ１画分ということもある）については、ＩＣ50値が０．０４５ｍｇ蛋白／ｍｌであることが示され、原液と比較して、約２倍活性が高い画分であることが確認された。
【００２５】
0004571289.tif 000003
【００２６】
【実施例３】
（１）上記で得たＡＣＥ活性を有する新規画分、Ｆ１画分について、同画分に存在するＡＣＥ阻害物質本体を明らかにする目的で、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１５充填カラムによるＦ１画分のゲル濾過クロマトグラフィーを行い、図１の結果を得た。
【００２７】
図中、Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ（２．５ｍｌ／ｔｕｂｅ）は、フラクション  ナンバー（２．５ｍｌ／チューブ）、ＡＣＥ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ（％）はＡＣＥ阻害（％）、Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ（２２０ｎｍ）は吸光度（２２０ｎｍ）をそれぞれ示し、クロマトグラフィーは下記の条件にて行った。
カラム：  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１５（φ１．６ｃｍ×４５ｃｍ）
溶出液：  １５０ｍＭ  ＮａＣｌ中  ５０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4（ｐＨ７．４）
流  速：  ６．０ｍｌ／ｈ
【００２８】
本実施例では、消化耐性を有し、かつ消化管内で吸収されるペプチドを対象としたことから、高いＡＣＥ阻害率と吸光度値を与えたＦｒａｃｔｉｏｎ  Ｎｏ．３９ならびに、吸光度値は低かったものの相対的に高い阻害活性を示したＦｒａｃｔｉｏｎ  Ｎｏ．４３をさらなる単離・精製に供した。
【００２９】
（２）先ずフラクションＮｏ．３９について、Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ18カラムを用いた逆相ＨＰＬＣに供したところ、ＡＣＥ阻害活性を示す３つのピーク（Ａ−ｂ、Ａ−ｃ、Ａ−ｄ）を得た。更に、これらのピークについて、フェニル基を修飾したカラムＣｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｐｈを用いて分離処理を行い、ＡＣＥ阻害活性を有するピーク（Ａ−ｂ１、Ａ−ｃ１、Ａ−ｄ１）の単離を行った。得られた結果を図２に示す。
【００３０】
図中、Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ（ｍｉｎ）は保持時間（分）を示す。なお、クロマトグラフィーはそれぞれ下記の条件にて行った。
カラムＣｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ18−ＡＲ（φ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）：
０．１％ＴＦＡ中５−３６％ＣＨ3ＣＮ（６０分）
流速：０．４ｍｌ／分
カラムＣｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｐｈ（φ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）：
０．１％ＴＦＡ中５−１９％ＣＨ3ＣＮ（５０分）
流速：０．３ｍｌ／分
【００３１】
（３）また、フラクションＮｏ．４３についても、上記と同じく、カラムＣｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ18−ＡＲ及びＣｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｐｈを用い、上記と同一条件にて逆相クロマトグラフィーを行って、ＡＣＥ阻害活性を有するピークを２つ（Ｂ−ｂ１、Ｂ−ｃ１）単離した。得られた結果を図３に示した（図中、Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ（ｍｉｎ）は保持時間（分）を示す。）。
【００３２】
（４）次に、Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｎｏ．３９及び４３から単離された５つのＡＣＥ阻害活性を有する物質をアミノ酸分析ならびにプロテインシーケンサーに供した。
その結果、Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｎｏ．３９から単離された物質は、Ｐｈｅ−Ｔｙｒ、Ａｌａ−Ｔｒｐ、Ｖａｌ−Ｔｒｐであることが明らかとなった。
さらに、Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｎｏ．４３からはピークＢ−ｃ１のみがＧｌｙ−Ｔｒｐであると同定された。
なお、今回アコヤ貝加水分解物から単離された４種のＡＣＥ阻害ペプチドのＩＣ50値は１．１μＭから４４μＭの範囲であり、これまで報告されているペプチドと比較して、いずれも高い阻害活性を有していることが明らかとなった（表２）。
【００３３】
（表２）
0004571289.tif 000004
【００３４】
（５）そこで、アコヤ貝加水分解物のＳｅｐ−ｐａｋでの１０％エタノール溶出画分、すなわちＦ１画分中に存在する４種のＡＣＥ阻害ペプチドの定量を行った。
まず、Ｆ１画分をフェニル基を修飾したカラム（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｐｈ）を用いた逆相ＨＰＬＣに供し、合成ペプチドにおける保持時間の前後１分間を分取した。
さらに、分取した画分をＯＤＳカラムにより分離した結果、図４にＶａｌ−Ｔｒｐの例を示したが、このように良好な分離が認められた。
また、他の３種のペプチドについても、同様に良好な分離を確認した。
【００３５】
（６）そこで、合成ペプチドを用いて作成した検量線より、定量を行った結果、Ｆ１画分１００ｇ中に４種のペプチドはそれぞれ、３０．０ｍｇ、１５９ｍｇ、２０．４ｍｇ、１６．４ｍｇ含まれることが明らかとなった。
さらに、Ｆ１画分によるＡＣＥ阻害に対するこれら４種のペプチドの寄与率を、ＩＣ50値の逆数をＡＣＥ阻害力価と定義することによって、このような式に従って算出した。
【００３６】
阻害力価（ｍｇ／ｍｌ）-1＝１／ＩＣ50（ｍｇ／ｍｌ）
Ｆ１画分中での寄与率（％）＝（Ａ／Ｂ）×１００
Ａ＝Ｆ１画分１００ｇ中の含有量（ｇ）×阻害ペプチドの阻害力価（ｍｇ／ｍｌ）-1
Ｂ＝１００（ｇ）×Ｆ１画分の阻害力価（１８×（ｍｇ／ｍｌ）-1）
【００３７】
その結果、Ｆ１画分によるＡＣＥ阻害への、これら４種のＡＣＥ阻害ペプチドの寄与率は合計で７．４％と見積もられた。
さらに、Ａｌａ−ＴｒｐならびにＶａｌ−Ｔｒｐの寄与率が共に３．５％であることから、Ｆ１画分によるＡＣＥ阻害における主要なペプチドの一つであると推察された。（表３）
【００３８】
（表３）
0004571289.tif 000005
【００３９】
【発明の効果】
各ペプチド及びそれを含有する組成物（アコヤ貝酵素分解液、Ｆ１画分等）は、すぐれたＡＣＥ阻害活性を示し、血圧降下剤、血圧降下性を有する飲食品として有利に利用することができ、呈味性や安全性にも問題はない。
【００４０】
また、本発明は、従来よりその処理が問題となっていた真珠を取り除いた後のアコヤ貝残渣の有効利用に新しい途を拓くものであって、天然物の有効利用及び公害防止の面からも非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１５充填カラムによるＦ１画分のゲル濾過クロマトグラフィーの分画パターンを示す。
【図２】画分Ｎｏ．３９の逆相クロマトグラフィーによるＡＣＥ阻害物質の単離を示す。
【図３】画分Ｎｏ．４３の逆相クロマトグラフィーによるＡＣＥ阻害物質の単離を示す。
【図４】画分Ｆ１中に存在するＡＣＥ阻害ペプチドの定量方法を示す。
【図１】
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【図２】
0004571289.tif 000007
【図３】
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【図４】
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