(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的物質を分析する分析装置であって、
光透過性の基板と、
前記光透過性の基板よりも屈折率が低い、低屈折率層と、
プラズモン共鳴を誘発する、複数の金属と、
標的物質を含む溶液を低屈折率層側に保持できるチャンバーと、
前記光透過性の基板と前記低屈折率層との界面において全反射するように、かつ、前記金属にエバネッセント光が照射されるように、基材側から光を照射する光源と、
前記エバネッセント光のプラズモン共鳴により前記標的物質から生じた光を検出する検出器と、を含み、
前記低屈折率層は前記光透過性の基板とは反対側の面から前記光透過性の基板まで貫通した複数の開口部を有し、
前記金属はこれら開口部に、開口部毎に１つずつ分離して配置されており、
前記各金属上には、異なる単分子プローブが１つずつ固定化されていることを特徴とする分析装置。
【請求項２】
請求項１記載の分析装置であって、
プラズモン共鳴を誘発する金属を含む複数の材料からなる構造体が前記開口部内に配置されていることを特徴とする分析装置。
【請求項３】
請求項１記載の分析装置であって、
前記低屈折率層上に低屈折率層を形成する材料よりも屈折率が高い高屈折率層が存在することを特徴とする分析装置。
【請求項４】
請求項１記載の分析装置であって、
前記開口部における最大開口距離が、検出に用いる光の波長よりも小さいことを特徴とする分析装置。
【請求項５】
請求項１記載の分析装置であって、
複数の開口部が、グリッド状に整列していることを特徴とする分析装置。
【請求項６】
請求項１記載の分析装置であって、
前記標的物質に蛍光標識が施され、前記標的物質を蛍光検出することを特徴とする分析装置。
【請求項７】
標的物質を分析する分析方法であって、
光透過性の基板と、前記光透過性の基板よりも屈折率が低い低屈折率層と、プラズモン共鳴を誘発する複数の金属と、を含み、前記低屈折率層は前記光透過性の基板とは反対側の面から前記光透過性の基板まで貫通した複数の開口部を有し、前記金属はこれら開口部に、開口部毎に１つずつ分離して配置されており、前記各金属上には、異なる単分子プローブが１つずつ固定化されている、検出デバイスを準備し、
標的物質を含む液体を前記検出デバイスに保持し、
前記光透過性の基板と前記低屈折率層との界面において全反射するように、かつ、前記金属にエバネッセント光が照射されるように、基材側から光を照射し、
前記エバネッセント光のプラズモン共鳴により前記標的物質から生じた光を検出する分析方法。
【請求項８】
請求項７記載の分析方法であって、
プラズモン共鳴を誘発する金属を含む複数の材料からなる構造体が前記開口部内に配置されていることを特徴とする分析方法。
【請求項９】
請求項７記載の分析方法であって、
前記低屈折率層上に低屈折率層を形成する材料よりも屈折率が高い高屈折率層が存在することを特徴とする分析方法。
【請求項１０】
請求項７記載の分析方法であって、
前記開口部における最大開口距離が、検出に用いる光の波長よりも小さいことを特徴とする分析方法。
【請求項１１】
請求項７記載の分析方法であって、
複数の開口部が、グリッド状に整列していることを特徴とする分析方法。
【請求項１２】
請求項７記載の分析方法であって、
前記標的物質に蛍光標識が施され、前記標的物質を蛍光検出することを特徴とする分析方法。
【請求項１３】
請求項１〜６記載の分析装置に用いるデバイスであって、
光透過性の基板と、前記光透過性の基板よりも屈折率が低い低屈折率層と、プラズモン共鳴を誘発する複数の金属と、を含み、前記低屈折率層は前記光透過性の基板とは反対側の面から前記光透過性の基板まで貫通した複数の開口部を有し、前記金属はこれら開口部に、開口部毎に１つずつ分離して配置されており、前記各金属上には、異なる単分子プローブが１つずつ固定化されている、デバイス。
【請求項１４】
請求項７〜１２記載の分析方法に用いるデバイスであって、
光透過性の基板と、前記光透過性の基板よりも屈折率が低い低屈折率層と、プラズモン共鳴を誘発する複数の金属と、を含み、前記低屈折率層は前記光透過性の基板とは反対側の面から前記光透過性の基板まで貫通した複数の開口部を有し、前記金属はこれら開口部に、開口部毎に１つずつ分離して配置されており、前記各金属上には、異なる単分子プローブが１つずつ固定化されている、デバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エバネッセント光により標的物質を検出する技術に関する。例えば、多数のＤＮＡやタンパク質等をエバネッセント光により蛍光検出する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡやタンパク質等の標的物質を検出する手段として、標的物質に蛍光標識を施し、所望のレーザ等の励起光を照射して発生する蛍光を検出する方法が広く用いられている。高いコントラストで蛍光を検出するための方式として、全反射によるエバネッセント光を励起光として用いる検出方法がある。この方式では、石英ガラスの裏面から入射されたレーザ光より石英ガラス表面と溶液層との界面で生じるエバネッセント光を励起光として石英ガラス表面の標識物質を検出する。一般に、エバネッセント光の強度は屈折率境界平面から離れるに従って指数関数的に減衰し、屈折率境界平面から１５０ｎｍ程度の距離で１／ｅとなる。従って、エバネッセント光を励起光とした蛍光検出では検出対象である標的物質以外からの蛍光発光の影響を大幅に低減することができ、結果として、高いコントラストで蛍光検出をすることが可能となる。
【０００３】
P.N.A.S. 2003、Vol. 100、pp. 3960-3964.（非特許文献１）では、上記の方法を用いて、ＤＮＡの伸長方法を検出している。詳細には、最初に、単一のＤＮＡ分子がビオチン−アビジンのタンパク質結合により固定化された石英ガラス上にＣｙ３分子で標識されたプライマを供給する。供給されたプライマとターゲットＤＮＡ分子とのハイブリダイズより得られた蛍光強度より、ターゲットＤＮＡの位置情報を認識する。その後、プライマ分子の伸長反応を行い、伸長反応で取り込まれたｄＮＴＰ分子からの蛍光、及び前記の位置情報より伸長反応を特異的に検出する。
【０００４】
Anal. Chem. 2003、75、6629-6633.（非特許文献２）では、石英ガラス上に銀薄膜を導入することによるプラズモン共鳴を用いてより高感度な蛍光検出を試みている。プラズモン共鳴とは、局在化した金属中の自由電子と入射光の振動電場がカップリングして共鳴する現象であり、共鳴より生じる電場増強により励起光および蛍光の増強が生じ、結果として、高感度な蛍光検出が期待できる。この様な、可視域において強い共鳴が得られる金属としては、金や銀などが知られている。
【０００５】
一方、米国特許第６９１７７２６号（特許文献１）では、光遮蔽効果が期待できるアルミニウム薄膜に存在する励起光波長よりも十分に小さい開口部より生じる近接場光を用いて標的物質の蛍光を検出する。
【０００６】
【特許文献１】米国特許第６９１７７２６号
【非特許文献１】P.N.A.S. 2003、Vol. 100、pp. 3960-3964.
【非特許文献２】Anal. Chem. 2003、75、6629-6633.
【非特許文献３】PNAS 2005、Vol. 102、pp. 5932-5937
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、非特許文献１の技術では、標的物質の測定位置の同定に煩雑な液交換作業が必要であるとともに、標的物質の近傍に存在する浮遊分子からの発光蛍光がノイズとなる。上記ノイズは標的物質の測定位置の誤認識を引き起こすとともに、測定位置を同定するための蛍光標識プライマが近傍に存在した場合には、これら測定位置を評価対象から省く必用が生じるため、結果として一度に数多くの異なる標的物質を測定することができない。
【０００８】
同様に、非特許文献２の技術においても、標的物質近傍の浮遊分子からのノイズが高いという問題がある。
【０００９】
一方、特許文献１においては、前記ノイズの低減を目的として、開口部以外に遮蔽効果が期待できるアルミニウムを配置している。しかしながら、石英ガラスとアルミニウム界面の反射率は１００％でないため、アルミニウム薄膜からの漏れ光によるノイズが生じる。このノイズは、浮遊する分子の濃度が高いほど顕著となる。
【００１０】
本発明の目的は、標的物質を高いコントラストで検出することに関する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、光透過性の基板と、プラズモン共鳴を誘発する金属と、を用いた標的物質の分析において、基板と界面を形成し、基板よりも屈折率が低く、開口部が存在する低屈折率層を設けたことに関する。界面において全反射するように、かつ、開口部に配置された金属にエバネッセント光が照射されるように、基材側から光を照射する。そして、エバネッセント光のプラズモン共鳴により標的物質から生じた光を検出する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、標的物質以外へのエバネッセント光の照射を低減でき、標的物質以外の物質、例えば、標的物質の周囲を浮遊する分子からの発光を低減できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、上記及びその他の本発明の新規な特徴と効果について、図面を参酌して説明する。尚、図面は発明の理解の為に用いるものであり、権利範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００１４】
図１を参照して、本実施例に係るデバイスの好適な形態について詳細に述べる。
【００１５】
本実施例のデバイスは、一度に数多くの標的物質を同時に検出するデバイスにおいて、光透過性の基材  及び基材上の基材よりも屈折率が低い材料からなる低屈折率層から成り、低屈折率層または低屈折層及びこれを含む基材上に数多くの開口部が存在する。低屈折率層の基材側界面で全反射させることで開口部以外からの漏れ光を完全に遮蔽することができるため、標的物質以外の浮遊する分子からの発光を大きく低減できる。
【００１６】
また、本実施例のデバイスは、開口部内にプラズモン共鳴を誘発することが可能な金属、あるいはこの金属を含む複数の材料からなる構造体が存在する。プラズモン共鳴による励起光の増強より、標的物質からの発光のみを特異的に高めることができる。
【００１７】
また、本実施例のデバイスは、低屈折率層上に低屈折率層を形成する材料よりも屈折率が高い高屈折率層が存在する。全反射より生じたエバネッセント光を低屈折率層と高屈折率層との界面で反射することができるため、開口部以外からのノイズをさらに大きく低減できる。
【００１８】
また、本実施例のデバイスは、金属構造体上に標的物質を検出するためのプローブが固定化されている。金属構造体ごとに異なるプローブを固定化することで、一度に数多くの標的物質を同時に検出できる。
【００１９】
また、本実施例のデバイスは、開口部の最大開口距離が検出で用いる光の波長よりも小さい。開口部からの近接場光による検出は、標的物質以外の浮遊分子からのノイズを大きく低減できる。
【００２０】
また、本実施例のデバイスは、開口部がグリッド上に整列している。標的物質間の距離が一定であるため、ごみなどによる非特異的な信号を簡便に無視できるとともに、標的物質の位置情報を容易に認識することができるため、一度に数多く標的分子をスループット高く検出できる。
【００２１】
また、本実施例の検出方法は、デバイスの低屈折率層の基材側界面で全反射させる。全反射が生じる界面と溶液が接する界面までの距離がエバネッセント波の光強度を大きく低減することができる。従って、標的物質以外の浮遊する分子からの発光を大きく低減できる。
【００２２】
また、本実施例の検出方法は、標的物質に蛍光標識を施し蛍光検出する。蛍光は広く用いられている標識手法であり、既存の検出方法を広く用いることができる。
【００２３】
また、本実施例の検出装置は、デバイスを保持する手段と、デバイス上に溶液交換可能な反応槽と、デバイスへ光を照射する手段と、開口部から光を検出する手段とを有する。これら要素を有する装置は、標的物質を含む溶液を連続的に高いスループットで検出することができる。
【００２４】
光透過性の基板である光透過性の基材１０１に用いられる材料は、光を透過することができるものであれば特に制限はない。この様なものとしては、プラスチック，無機高分子，金属，天然高分子及びセラミックから選ばれる１種又は２種以上が挙げられる。プラスチックとして具体的には、ポリエチレン，ポリスチレン，ポリカーボネート，ポリプロピレン，ポリアミド，フェノール樹脂，エポキシ樹脂，ポリカルボジイミド樹脂，ポリ塩化ビニル，ポリフッ化ビニリデン，ポリフッ化エチレン，ポリイミド及びアクリル樹脂などが、無機高分子としては、ガラス，水晶，カーボン，シリカゲル、及びグラファイトが、金属としては、金，白金，銀，銅，鉄，アルミニウム，磁石等の常温固体金属が、セラミックとしては、サファイア，アルミナ，シリカ，炭化ケイ素，窒化ケイ素、及び炭化ホウ素等を例示することができる。しかしながら、光透過性に優れ、基材界面の平坦性が高く、且つ、平坦性を保持しやすい石英，水晶，ＢＫ−７やＳＦ−２などの各種光学ガラス，サファイアなどが好ましい。
【００２５】
基板と界面を形成し、基板よりも屈折率が低く、開口部が存在する低屈折率層である低屈折率層１０２に用いられる材料は、基材を構成する材料より屈折率が小さい材料であれば特に制限はない。この様なものとしては、二酸化ケイ素，アルミナ，酸化ガリウム，酸化ハフニウム、または、酸化マグネシウムなどの各種酸化物，フッ化アルミニウム，フッ化カルシウム，フッ化セリウム，フッ化ランタン，フッ化リチウム，フッ化マグネシウム，フッ化ネオシウム，フッ化サマリウム、またはフッ化イッテリビウムなどの各種フッ化物が挙げられる。また、低屈折率層の厚さについても特に制限はないが、より好ましくは、少なくとも均一な膜が形成可能な厚さであって、励起光より生じるエバネッセント光の波長よりも小さい厚さが望ましく、より具体的には、５〜１０００ｎｍの範囲であることが望ましい。
【００２６】
プラズモン共鳴を誘発する金属が配置される開口部である微小開口部１０３は、最も大きい開口部での開口距離が検出で用いる光の波長より小さければその距離、及び形状ともに特に制限するものではない。
【００２７】
プラズモン共鳴を誘発することが可能な金属構造体（または金属）１０４は、プローブや溶液との界面で、プラズモンが生じる物質からなるものであれば特に制限はない。この様なものとしては、金，銀，銅，白金などの貴金属単体や、これら元素から構成される金属間化合物，合金などが挙げられる。また、大きさや形状についても特に制限はないが、より好ましくは、エバネッセント光や近接場光が到達しやすい１０００ｎｍ以下の大きさであることが望ましい。
【００２８】
プローブ１０５は、標的物質１０６と相互作用するものであれば特に制限はない。この様なものとしては、核酸，タンパク質，糖鎖，脂質及びそれらの複合体が挙げられる。より具体的には、ＤＮＡ，ＲＮＡ，アプタマー，遺伝子，染色体，細胞膜，ウイルス，抗原，抗体，レクチン，ハプテン，レセプター，酵素，ペプチド，スフィンゴ糖，スフィンゴ脂質などを挙げることができる。
【００２９】
標的物質１０６は、プローブ１０５と相互作用するものであれば特に制限はない。この様なものとしては、核酸，タンパク質，糖鎖，脂質及びそれらの複合体や化学反応や酵素反応などによりこれらの分子を構成することが可能な化合物が挙げられる。より具体的には、ＤＮＡ合成に用いられるデオキシヌクレオチド３リン酸や、ＲＮＡ合成に用いられるヌクレオチド３リン酸などが挙げられる。一方、標識に用いられる蛍光分子についても、蛍光を発光する分子であれば特に制限はない。
【００３０】
検出デバイスとしては、図１に示したものとは別に、図２〜図５に示す構造のものを用いることができる。図２の２０３は、基材２０１と金属構造体２０４との接着力の向上、及び基材２０１と低屈折率層２０２との接着力を向上するものである。この様なものとしては、クロム，タンタル，タングステン，バナジウム，イットリウム，コバルト，ネオジム，チタン，ニッケル及びそれらの合金，窒化物、または酸化物などが挙げられる。
【００３１】
図３の３０７は、標的物質以外の非特異的物質の吸着阻害や低屈折率層の溶解防止、または防錆びを目的とした保護層である。この様なものとしては、二酸化ケイ素やシリコンナイトナイドなどの無機化合物や、シラン化合物などの有機化合物が挙げられる。図４の４０７は、エバネッセント光の遮蔽効果を高める層である。この様なものとしては、一般的には屈折率が高く、且つ、低屈折率層との高い接着性が期待できる材料が良い。この様なものとしては、クロム，タンタル，タングステン、バナジウム，イットリウム，コバルト，ネオジム，チタン，ニッケル及びそれらの合金，窒化物、または酸化物などが挙げられる。
【００３２】
図５は、金属構造体５０４が開口部５０３内の全てを占有していない例である。一般に、開口部からの近接場光は開口部からの距離に応じて、その光強度が減衰する。従って、図５に示した検出デバイスは、開口部底面からプローブまでの距離が小さいためにより高い蛍光強度が期待できる。また、プラズモン共鳴による増強効果を高める方法として、金構造体５０４上に微細な金粒子を積層する方法がある。具体的には、上記デバイスを３５０℃で３時間アニールした後、金構造体表面にアミノエタンチオールの単分子膜を自己組織化により堆積したものを金コロイド懸濁液に浸して金ナノ粒子を堆積する。
【００３３】
＜デバイス＞
本実施例で使用した標的物質を検出するためのデバイスの作製手順について、図６を参照しながら説明する。基材６０１としては、厚さ０.５mmの３インチのサファイアウェハーを用いた。基材の上に、ポジ型の電子線レジスト（ＺＥＰ５２０）６０２をスピンコーターでコーティングした。その後、電子線描画装置を用いて、１mm角の領域に電子線を露光した後、現像を行い多数の開口部（φ：１００ｎｍ）６０３を１μｍピッチで設けた。さらに、スパッタリング装置を用いて金（厚さ：１００ｎｍ）をスパッタリングした後、リフトオフプロセスにより金構造体６０４を作製した。その後、二酸化ケイ素（厚さ：２００ｎｍ）をスパッタリングした後、ＳＦ６ガスを用いたＲＩＥ（Reactive Ion Etching）により二酸化ケイ素を異方的にエッチングして低屈折率層６０５を有するデバイスを作製した。最後に、得られたデバイスに対して、アセトン，イソプロピルアルコール、及び超純水による超音波洗浄を行った。得られたデバイスを６−アミノ−１−ヘキサンチオール溶液及びビオチン化スクシイミドエステル溶液で処理して、金構造体６０４の表面上にプローブ（ビオチン）６０６を導入した。
【００３４】
＜分析装置及び分析方法＞
また、図７を参照して、デバイスを用いた分析装置、及び分析方法を説明する。
【００３５】
標的物質を含む溶液を低屈折率層側に保持できるチャンバーである反応チャンバーに前記のデバイス７０５を設置する。反応チャンバーは、カバープレート７０１と検出窓７０２と溶液交換用口である注入口７０３と排出口７０４から構成される。お、カバープレート７０１と検出窓７０２の材質として、ＰＤＭＳ（Polydimethylsiloxane）を使用する。また、検出窓７０２の厚さは０.１７mmとする。
【００３６】
基材側から光を照射する光源であるＹＡＧレーザ光源（波長５３２ｎｍ，出力２０ｍＷ）７０７およびＹＡＧレーザ光源（波長３５５ｎｍ，出力２０ｍＷ）７０８から発振するレーザ光７０９および７１０を、レーザ光７０９のみをλ／４板７１１によって円偏光し、ダイクロイックミラー７１２（４１０ｎｍ以下を反射）によって、前記２つのレーザ光を同軸になるよう調整した後、レンズ７１３によって集光し、その後、プリズム７１４を介してデバイス７０５へ臨界角以上で照射する。レーザ照射により、デバイス７０５表面上に存在する蛍光体が励起され、その蛍光の一部は検出窓７０２を介して出射される。つまり、基材と低屈折率層の界面において全反射するように、かつ、プラズモン共鳴を誘発する金属にエバネッセント光が照射されるように、光源から光が照射される。
【００３７】
また、検出窓７０２より出射される蛍光は、対物レンズ７１５（×６０，ＮＡ１.３５，作動距離０.１５mm）により平行光束とされ、光学フィルタ７１６により背景光及び励起光が遮断され、結像レンズ７１７により２次元ＣＣＤカメラ７１８上に結像される。つまり、エバネッセント光のプラズモン共鳴により標的物質から生じた光を検出器が検出する。
【００３８】
以下、図８を用いて段階的伸長反応の工程を説明する。反応工程は非特許文献１および非特許文献３に則って行う。ストレプトアビジンを加えたバッファを注入口７０３より反応槽７０６に導入し、ストレプトアビジン８０１をデバイス７０５の金構造体６０４上のビオチン６０６に結合させ、ビオチン−アビジン複合体を形成させる（図８（ａ））。ビオチン修飾したターゲットである一本鎖鋳型ＤＮＡ８０２にプライマ８０３をハイブリさせ、前記鋳型ＤＮＡ−プライマ複合体と大過剰のビオチン８０４を加えたバッファを流路７０３へ導入し、ビオチン−アビジン結合を介して、単分子の前記鋳型ＤＮＡ−プライマ複合体を固定する（図８（ｂ））。固定反応後に、余剰な鋳型ＤＮＡ−プライマ複合体およびビオチンを洗浄用バッファにて洗い流す。次に、蛍光体Ｒ６Ｇで標識された３′末端がアリル基で修飾されたｄＡＴＰ（３′−Ｏ−allyl−ｄＡＴＰ−ＰＣ−Ｒ６Ｇ）８０５およびThermo Sequenaseポリメラーゼ８０６を加えたThermo Sequenase Reactionバッファを注入口７０３より流路７０６へ導入し、伸長反応を行う。この時、プライマ８０３の３′末端の塩基の次に位置するところの相補的な位置にある一本鎖鋳型ＤＮＡ８０２の配列上の塩基がＴであった場合、前記ｄＡＴＰ８０５はポリメラーゼ伸長反応によって前記鋳型ＤＮＡ−プライマ複合体に取込まれる。また、ｄＡＴＰ８０５の３′末端はアリル基で修飾されているため、前記鋳型ＤＮＡ−プライマ複合体に１塩基以上取込まれることはない。伸長反応後、未反応のｄＡＴＰ８０５とポリメラーゼ８０６を洗浄用バッファで反応槽７０６から洗い流し、ＹＡＧレーザ光源７０７より発振するレーザ光７０９をチップへ照射し、蛍光検出を行う（図８（ｄ））。この時、所定の位置の蛍光の有無によりｄＡＴＰが鋳型ＤＮＡ−プライマ複合体に取込まれたかを判断する。次に、ＹＡＧレーザ光源７０８より発振するレーザ光７１０をチップへ照射し、前記複合体に取込まれたｄＡＴＰ８０５に標識された蛍光体８０７を光切断により取除く（図８（ｅ））。次いで、パラジウムを含んだ溶液８０８を反応槽７０６内に導入し、パラジウム触媒反応により、前記複合体に取込まれたｄＡＴＰの３′末端のアリル基を水酸基に変える（図８（ｆ））。前記３′末端のアリル基を水酸基に変えることにより、前記鋳型ＤＮＡ−プライマ複合体の伸長反応が再開可能となる。前記触媒反応後に、洗浄用バッファにて反応槽７０６を洗浄する。図８（ｃ）から前記洗浄までのプロセスを各ｄＮＴＰ、つまり、Ａ→Ｃ→Ｇ→Ｔ→Ａ→と繰返すことにより、固定された一本鎖鋳型ＤＮＡ８０２の配列を決定する。本システムでは、複数の金構造体６０４からの蛍光を同時計測できるため、複数の異なる鋳型ＤＮＡ−プライマ複合体に取込まれたｄＮＴＰの塩基種を、つまり複数の鋳型ＤＮＡの配列を同時に決定できる。また、本実施例のデバイスを用いれば、金によるプラズモン共鳴による励起光の増強による標的物質からの蛍光のみを特異的に高めることができるとともに、低屈折率層６０５上に非特異的に吸着している蛍光分子からのノイズを低減することができる。以上より、本実施例によれば、一度に数多くの標的物質を高いコントラストで検出することができる。
【実施例２】
【００３９】
図９に、第２の実施例を示す。本実施例では、４種の蛍光体を用いた段階的伸長反応によるＤＮＡシーケンシングを行う。以下、実施例１との主な相違点について説明する。
【００４０】
チップの構成は図６、チャンバ部の構成は図７と同等である。
【００４１】
ＹＡＧレーザ光源（波長３５５ｎｍ，出力２０ｍＷ）９０１，Ａｒ−ｉｏｎレーザ光源（波長４８８ｎｍ，出力２０ｍＷ）９０２，ＹＡＧレーザ光源（波長５３２ｎｍ，出力２０ｍＷ）９０３，Ｈｅ−Ｎｅレーザ光源（波長５９４ｎｍ，出力２０ｍＷ）９０４のそれぞれから発振するレーザ光を、ＹＡＧレーザ光源９０１からのレーザ光以外をλ／４板９０５によって円偏光し、ダイクロイックミラー９０６（５５５ｎｍ以下を反射），９０７（５２０ｎｍ以下を反射），９０８（４１０ｎｍ以下を反射）によって、すべてのレーザ光の光軸が同軸となるよう調整し、レンズ９０９によって集光し、プリズム９１０を介してチップの下方より臨界角以上で入射する。
【００４２】
レーザ照射により得られた蛍光は検出窓９１１を介してチャンバ部外へ射出される。その後、射出した蛍光は、対物レンズ（×６０、ＮＡ１.３５、作動距離０.１５mm）９１２により平行光束とされ、バンドパスフィルタ９１３（５２０ｎｍから６５０ｎｍを透過）、ノッチフィルタ９１４（カット中心波長５３２ｎｍ，半値幅１４ｎｍ）およびノッチフィルタ９１５（カット中心波長５９４ｎｍ，半値幅２２ｎｍ）により不要な励起光および背蛍光が遮蔽され、プリズム９１６によって波長分散された後、結像レンズ９１７により２次元ＣＣＤカメラ９１８上に結像される。
【００４３】
段階的伸長反応の工程は、それぞれ異なる４種の蛍光体で標識された３′末端がアリル基で修飾された４種のｄＮＴＰ（３′−Ｏ−allyl−ｄＧＴＰ−ＰＣ−Bodipy−ＦＬ−５１０，３′−Ｏ−allyl−ｄＴＴＰ−ＰＣ−Ｒ６Ｇ，３′−Ｏ−allyl−ｄＡＴＰ−ＰＣ−ＲＯＸ，３′−Ｏ−allyl−ｄＣＴＰ−ＰＣ−Bodipy−６５０）を用いて一度に伸長反応を行う以外は基本的には実施例１と同様である。この時、実施例１と同様に、鋳型ＤＮＡ−プライマ複合体に取込まれたｄＮＴＰに標識された蛍光体の蛍光波長を特定することにより、前記ｄＮＴＰの塩基種を特定できる。なお、実施例１では、複数の鋳型ＤＮＡの１塩基を決定するためには、「ｄＮＴＰおよびポリメラーゼを流路に導入→伸長反応→洗浄→蛍光計測→蛍光切断→３′末端の水酸基化→洗浄」の一連のシーケンスを４種のｄＮＴＰ、つまり４回行う必要がある。本システムのように検出部内に分光素子を用いることで、４種のｄＮＴＰを同時に反応層内に流して伸長反応を行うことが可能なため、複数の鋳型ＤＮＡの１塩基を決定するために必要な前記一連のシーケンスの回数は１回で良い。そのため、本実施例におけるＤＮＡシーケンシングに要する時間は、実施例１に比べ１／４程度短縮できる。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】本発明の標的物質を検出するためのデバイスの一例を説明するための図である。
【図２】本発明の標的物質を検出するためのデバイスの一例を説明するための図である。
【図３】本発明の標的物質を検出するためのデバイスの一例を説明するための図である。
【図４】本発明の標的物質を検出するためのデバイスの一例を説明するための図である。
【図５】本発明の標的物質を検出するためのデバイスの一例を説明するための図である。
【図６】本発明の実施例１に示したデバイスの製造方法を説明するための図である。
【図７】本発明の実施例１に示した分析装置を説明するための図である。
【図８】本発明の実施例１に示した分岐方法を説明するための図である。
【図９】本発明の実施例２に示した分析装置を説明するための図である。
【符号の説明】
【００４５】
１０１，２０１，３０１，４０１，５０１，６０１  基材
１０２，２０２，３０２，４０２，５０２，６０５  低屈折率層
１０３，２０７，３０３，４０３，５０３，６０３  開口部
１０４，２０４，３０４，４０４，５０４，６０４  金属構造体
１０５，２０５，３０５，４０５，５０５，６０６  プローブ
１０６，２０６，３０６，４０６，５０６  標的物質
２０３，５０７  接着層
３０７，４０８  保護層
４０７  遮蔽層
６０２  電子線レジスト
７０１  カバープレート
７０２，９１１  検出窓
７０３  注入口
７０４  排出口
７０５  デバイス
７０６  反応層
７０７，７０８，９０１，９０３  ＹＡＧレーザ光源
７０９，７１０  レーザ光
７１１，９０５  λ／４板
７１２，９０６，９０７，９０８  ダイクロイックミラー
７１３，９０９  レンズ
７１４，９１０，９１６  プリズム
７１５，９１２  対物レンズ
７１６  光学フィルタ
７１７，９１７  結像レンズ
７１８  ２次元ＣＣＤカメラ
８０１  ストレプトアビジン
８０２  一本鎖鋳型ＤＮＡ
８０３  プライマ
８０４  ビオチン
８０５  ｄＡＴＰ（３′−Ｏ−allyl−ｄＡＴＰ−ＰＣ−Ｒ６Ｇ）
８０６  Thermo Sequenaseポリメラーゼ
８０７  蛍光体
８０８  パラジウムを含んだ溶液
９０２  Ａｒ−ｉｏｎレーザ光源
９０４  Ｈｅ−Ｎｅレーザ光源
９１３  バンドパスフィルタ
９１４，９１５  ノッチフィルタ
９１８  ２次元ＣＣＤ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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