(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
黄色ブドウ球菌が培養可能な半流動培地に、食塩、黄色ブドウ球菌によって分解され酸を生成する１種以上の糖類、ｐＨ指示薬、４−メチルウンベリフェリルリン酸（ＭＵＰ）、およびエリスロマイシンを含むことを特徴とするＭＲＳＡスクリーニング用培地
【請求項２】
半流動培地１Ｌあたり以下の成分を含むことを特徴とするＭＲＳＡスクリーニング培地
【成分１】
（１Ｌ）
──────────────────────
ペプトン                      ８−１２ｇ
酵母エキス                    ３−５ｇ
塩化リチウム                  ４−６ｇ
塩化ナトリウム                ８−１２ｇ
マンニット                    ８−１２ｇ
フェノールレッド            ２０−４０ｍｇ
ＭＵＰ                    １００−２００ｍｇ
エリスロマイシン            ２０−４０ｍｇ
ポリミキシンＢ              １０−３０ｍｇ
アムホテリシンＢ              １−３ｍｇ
寒天                          ２−６ｇ
──────────────────────
ｐＨ７．３±０．３
【請求項３】
請求項１−２記載の半流動培地に検体を添加して培養後、色の変化及び蛍光強度を測定することを特徴とするＭＲＳＡのスクリーニング方法
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、複数の細菌が混合して存在する被検体から、多剤耐性を示すブドウ球菌すなわちメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）の存否を、容易に検出（スクリーニング）できる培地に関する。
なお、本発明では次の略語を使用することがある。
【０００２】
【略語表】
ＭＲＳＡ：メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Methicillin Resistant Staphylococcus aureus）
ＭＳＳＡ：メチシリン感受性黄色ブドウ球菌（Methicillin Sensitive Staphylococcus aureus）
ＭＵＰ：４−メチルウンベリフェリルリン酸（4-Methyl-Umbelliferyl Phosphate）
ＣＡＭＨＢ：陽イオン調整ミューラー・ヒントン液体培地 (Cation Adjusted Mueller Hinton Broth)
ＮＣＣＬＳ：米国臨床検査標準委員会 (National Commitee for Clinical Laboratory Standards)
ＭＩＣ：最小発育阻止濃度 (Minimum Inhibitory Concentration)
【０００３】
【従来の技術】
近年臨床的に院内感染が重要な問題になっており、特に院内感染症の起因菌として多剤耐性を獲得したＭＲＳＡが注目されている。ＭＲＳＡは通常鼻腔や咽頭などに常在、あるいは床や壁などの周辺環境に常在することができる細菌である。これを保有する保菌者を介して、あるいは周辺環境との接触により、癌、免疫不全などの疾患、あるいは術後の抵抗力の低下した患者などが感染した場合には重篤な症状を呈することがある。
このため保菌者や床などの周辺環境の状況を、前もって簡単に、あるいはスクリーニング的に把握できるならば、保菌者の鼻腔や咽頭を消毒する、あるいは保菌者と患者との接触を低減する、周辺環境の消毒を行うなどの方策をとり、感染の伝播防止に寄与することができる。
【０００４】
これらの問題に対して、たとえば医療関係者の鼻腔内、咽頭などや壁・床などの周辺環境より得られた検体中にＭＲＳＡが存在するか否かを確認しようとした場合には、検体中にはＭＲＳＡではない S.aureus も含めた複数種類の細菌が混在している。また選択分離培養をするにしても、検出対象の細菌の存在量が少ないこともある。それ故、目的の細菌（ＭＲＳＡ）が低濃度でも培養でき、かつ発育の有無を簡単に感知することを可能とする検出用培地を提供することが重要である。
検体中にＭＲＳＡが存在するか否かを確認するには、ＭＲＳＡの保菌者の鼻腔や咽頭などを綿棒などで拭った被検物（擦過物）等を検体とし、ＭＲＳＡを選択的にスクリーニングできる培地にそれを接種し、培養して判定する。また、この被検物中には必ずしも目的の細菌が多量に含まれているわけではないので、可能な限り低濃度の対象細菌に対しても培養ができる培地であることが必要である。
【０００５】
このＭＲＳＡを培養・検出するための培地としてすでに特開平05 - 227992号、特開平06 - 178696号、特開平06 - 233696号、特開平07 - 000181号がすでに出願されている。また市販されているものでは、テルモ社ＭＲＳＡスクリーニング用培地やコロナ技研社ＳＴチューブＭＲＳＡ等が知られている。しかしながらこれらの培地は、選択剤としてオキサシリンやセフチゾキシムを用いており、これらの薬剤が溶液状態では安定性が悪いため培地に直接添加されずに薬剤だけを乾燥濾紙（ディスク）として供給されたり、また粉末培地部分と液体培地部分と２部に分けて供給され、用時調製されたりしており、使い勝手の良いものではない。また調製後の保存安定性も不良である。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
従って本発明の目的は、検体中にＭＲＳＡが存在するかどうかを、簡便な操作で正確かつ迅速に検出することが可能なスクリーニング用培地を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
かかる実状において本発明者は、エリスロマイシンの使用によりＭＲＳＡとＭＳＳＡの分別が可能であることを見いだし、鋭意努力の結果、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち本発明は、
（１）黄色ブドウ球菌が増殖可能な培地に、食塩、黄色ブドウ球菌によって分解され酸を生成する１種以上の糖類、ｐＨ指示薬、ＭＵＰ、及びエリスロマイシンを添加したことを特徴とするＭＲＳＡスクリーニング用培地である。
【０００９】
黄色ブドウ球菌が培養可能な培地としては、ハートインフュージョン培地、トリプトソイ培地、マンニット食塩培地、エッグヨーク食塩培地、スタヒロコッカスNo.１１０培地等が挙げられるが、基本的に黄色ブドウ球菌が増殖可能な培地であれば本発明に使用可能である。
【００１０】
食塩は非耐塩性の菌の増殖を抑制する作用がある。黄色ブドウ球菌は高濃度の食塩を含む培地でも発育することができるが、ほかの菌は発育ができない。
黄色ブドウ球菌により分解され酸を生成する糖として、マンニット、トレハロース、サリシンなどが知られており、その中でもマンニットが本発明には適している。マンニットは、黄色ブドウ球菌により発酵分解され、酸を生成する。このマンニット発酵分解能は、黄色ブドウ球菌の特異的な性状とされているものである。本発明においては、マンニットの分解により酸が生成し、培地のｐＨが低下することを利用し、当該ｐＨの低下をｐＨ指示薬により検出する。
このｐＨ指示薬としては中性域と酸性域で呈色が異なる指示薬、例えばフェノールレッドやブロムクレゾールパープルが本発明には好ましい。
【００１１】
ＭＵＰは、ホスファターゼにより分解され、４−メチルウンベリフェロン（蛍光物質）を生成する蛍光基質である。黄色ブドウ球菌はホスファターゼ産生菌であるので、検体中に黄色ブドウ球菌があれば、ＭＵＰが分解され、蛍光物質が生成する。ここに３６５nm付近の紫外線を照射すると青色の蛍光を発する。もし、蛍光分光光度計等で検出するのであれば４５０nm付近の波長で検出すると良い。
【００１２】
本培地に添加されるエリスロマイシンは、検体中の細菌のうちメチシリン感受性菌の増殖を抑制し、メチシリン耐性菌のみを選択的に増殖させるために用いられる。
エリスロマイシンは水溶性でありアルコールに易溶性である。従って５−１０％程度のエタノール水溶液で容易に溶解し、それを培地に添加してもエリスロマイシンの析出は起こらない。さらに温度安定性が高く、かつ溶液状態でも安定性が優れている。それ故、本発明に適した選択剤である。
【００１３】
（２）具体的に本発明は、培地１Ｌあたり以下の成分を含むことを特徴とするＭＲＳＡスクリーニング用培地である。
【成分３】
（１Ｌ）
0004583559.tif 000002
【００１４】
ペプトン、酵母エキスは栄養源として黄色ブドウ球菌の増殖に必要であり、塩化リチウムはブドウ球菌以外の菌に対して増殖抑制効果がある。マンニットは黄色ブドウ球菌により分解され、酸を生成する。フェノールレッドはｐＨ指示薬であり、中性で赤、酸性で黄色の発色を示す。ポリミキシンＢはグラム陰性菌及び緑膿菌に対して増殖抑制作用があり、シノキサシンはグラム陰性菌に対して増殖抑制作用があり、アムホテリシンＢは真菌に対して増殖抑制作用がある。
【００１５】
また寒天は培地の固化に関係し、添加した濃度により培地を液状培地、半流動培地、固形培地（平板）とすることができる。つまり寒天濃度が０〜０．０４％（０〜０．４g/L）の時は培地は液状培地となり、寒天濃度が０．０５〜０．６％（０．５〜６．０g/L）の時は培地は半流動培地となり、寒天濃度が１〜２％（１０．０〜２０．０g/L）の時は培地は固形培地となる。
液状培地はマイクロプレート等を用いた微量液体希釈法に有用であり、半流動培地は穿刺培養に適しているので菌の保存や検体の輸送用培地として有用であり、固形培地（寒天平板）は一般的な細菌培養や平板希釈法に有用である。
【００１６】
（３）さらに具体的に本発明は、培地１Ｌあたり以下の成分を含むことを特徴とするＭＲＳＡスクリーニング用培地である。
【成分４】
（１Ｌ）
0004583559.tif 000003
【００１７】
本培地は寒天量を２−６gとし半流動培地としたので、試験管等に分注して綿棒を挿入して菌を接種しても固すぎて培地が割れてしまうことが無い。それ故、綿棒擦過物を検体として用いることが多いＭＲＳＡのスクリーニングに適している。
【００１８】
（４）さらに本発明は上記（１）−（３）記載の培地を用いたＭＲＳＡのスクリーニング方法でもある。
検体中にＭＲＳＡが存在すると、ｐＨ指示薬が酸性色を示し、さらに紫外線を当てると蛍光を発することより、容易にＭＲＳＡの存在が判定できる。なお、一部の菌ではマンニット分解能を示したり、フォスファターゼ産生能を示すものが存在するが、その両方を示すものはほとんどなく、高い確率で酸性色及び発蛍光を示した菌はＭＲＳＡと判断できる。
【００１９】
以下、実施例に基づき本発明をさらに詳細に説明する。なお、下記実施例は単に説明のためのものであり、本発明を何ら限定するものではない。
【実施例】
【００２０】
実施例１  エリスロマイシン添加量の決定
以下に示す組成の本培地Ａ（液状培地）を調製し、微量液体希釈法でエリスロマシンに対するＭＩＣを調べた。
ＣＡＭＨＢ培地に食塩、マンニット及びフェノールレッドを加えて溶解し高圧蒸気滅菌（１２１℃、１５分）した。ＭＵＰ、エリスロマイシンは少量の滅菌精製水に溶解し濾過滅菌（０．４５μm）した。約５０℃に冷却後、両者を混合し、以下に示す組成の本培地Ａ（液体培地）を調製した。ＮＣＣＬＳの微量液体希釈法及び日本化学療法学会標準法（CHEMOTHERAPY,38(1),102-105,1990 及び CHEMOTHERAPY,41(2),183-189,1993）に準じて操作し、ＭＲＳＡ、ＭＳＳＡ、その他の菌についてエリスロマイシンのＭＩＣを測定した。
エリスロマイシンを０−１２８μg/mL含有する本培地Ａの２倍希釈系列を作成し、９６穴マイクロプレートに１００μLづつ分注した。各ウェルそれぞれに、ＭＲＳＡ（１０8cfu/mL）、ＭＲＳＡ（１０4cfu/mL）、ＭＳＳＡ（１０8cfu/mL）、ＭＳＳＡ（１０4cfu/mL)、S.epidermidis（１０8cfu/mL）それぞれ１０μLを接種し、３５℃で１晩培養し、各菌の発育を見た。結果を表１に示す。なお、発育したＭＲＳＡは培地色は黄色であり、暗所で３６５nmの紫外線を当てると青色の蛍光を発した。ＭＳＳＡ及びS.epidermidis(表皮ブドウ球菌)はエリスロマイシン濃度が０の時のみ発育した。
【００２１】
【組成１】
0004583559.tif 000004
【００２２】
結果
【表１】
0004583559.tif 000005
【００２３】
菌数が１０8cfu/mLのＭＲＳＡはエリスロマイシン濃度１２８μg/mLで発育し、菌数が１０4cfu/mLのＭＲＳＡはエリスロマイシン濃度６４μg/mLで発育した。ＭＳＳＡはエリスロマイシン濃度８μg/mLで発育が抑制された。本発明のスクリーニング培地に用いるエリスロマイシンの濃度は１６−６４μg/mLが適当であった。
【００２４】
実施例２  本培地によるＭＲＳＡの検出
以下に示す組成の本培地Ｂ（半流動培地）を調製し、試験管に３mLづつ分注し、ＭＲＳＡ、ＭＳＳＡ、その他の社内保存菌を綿棒にて接種し、本培地の性能をしらべた。
ペプトン、酵母エキス、塩化リチウム、塩化ナトリウム、マンニット、フェノールレッド、寒天を精製水約９５０mLに溶解し、高圧蒸気滅菌した。ＭＵＰ、エリスロマイシン、ポリミキシンＢ、シノキサシン、アムホテリシンＢを約５０mLの滅菌精製水に溶解し、濾過滅菌した。約５０℃に冷却後、両者を混合し、直径１２mm長さ９０mmの試験管に３mLづつ分注し、本培地Ｂ（半流動高層培地）を調製した。
ＭＲＳＡ、ＭＳＳＡ、その他の社内保存菌をハートインフュージョン寒天培地で１夜培養し、滅菌生理食塩液で所定の菌濃度に調整した。使用菌株及び濃度は表２に記載した。
次いで各菌液に綿棒（栄研器材（株）製、吸水量約１００μL）を浸し、その綿棒を本培地Ｂに穿刺し、綿棒を培地内に留置したまま密栓して培養した。３５℃で２０時間培養後、陽性／陰性を判定した。判定は外観（培地色）が赤色から黄色になったものを培地色：陽性、３６５nmの紫外線照射で蛍光が認められたものを蛍光：陽性と判定した。結果を表２に示す。
【００２５】
【組成２】
0004583559.tif 000006
【００２６】
結果
【表２】
0004583559.tif 000007
0004583559.tif 000008
0004583559.tif 000009
【００２７】
ＭＲＳＡでは培地色は黄色になり、蛍光を発光し、どちらも陽性を示した。ＭＳＳＡはどちらも陰性（−）であった。
その他の菌では培地色・発蛍光のどちらかが陽性（＋）を示すことがある。例えば、S.epidermidis（表皮ブドウ球菌）では発蛍光を示すものがあり、E.feacalis（腸球菌）やE.feacium（腸球菌）では培地色が陽性を示すものが認められ、特に接種菌数が高濃度（１０8cfu/mL）のとき顕著であった。しかし、両方とも陽性を示す菌は無かった。
【００２８】
実施例３  本培地によるＭＲＳＡ検出時間
本培地Ｂを用い、ＭＲＳＡ接種菌数と陽性となる時間を調べた。菌株はS.aureus MRSA1076を用い、ハートインフュジョン寒天培地で１夜培養後、滅菌生理食塩液で１０1、１０2、１０4、１０6cfu/mLに調整した。各菌液を綿棒に吸わせて培地に接種した。 ３５℃で培養し、８時間後〜２４時間後まで判定した。結果を表３に示す。
【００２９】
結果
【表３】
0004583559.tif 000010
【００３０】
接種菌数が１０1cfu/mLでは１９時間、１０2cfu/mLでは１８時間、１０4cfu/mLでは１３時間で陽性となった。従って１０1cfu/mLや１０2cfu/mLといった極少量の接種菌数であっても本培地Ｂを用いることにより、２０時間以下の培養でＭＲＳＡの検出が可能であった。
【００３１】
実施例４  本培地Ｂの保存安定性
本培地Ｂのエリスロマイシン３２mg/Lをオキサシリン４mg/Lに変更したオキサシリン培地を作成し、本培地Ｂとともに冷所に密栓して保存し、本培地の保存安定性を調べた。
本培地Ｂと本培地Ｂのエリスロマイシンをオキサシリン４mg/Lに変更したオキサシリン培地を作製した。各培地を４℃に密栓して保存し、０、１ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、８ヶ月後にＭＲＳＡ、ＭＳＳＡ及びその他の菌を接種して保存安定性試験を行った。試験は各菌株をハートインフュージョン寒天培地で１夜培養したものを滅菌生理食塩液でＭＲＳＡは１０2cfu/mLに調整し、他の菌は１０6cfu/mLに調整した。各菌液を綿棒に吸わせた後培地に接種し、３５℃で２０時間培養し、外観色と蛍光を測定した。結果を表４、表５に示す。
【００３２】
結果
【表４】
0004583559.tif 000011
【００３３】
【表５】
0004583559.tif 000012
【００３４】
エリスロマイシンを含有する本培地Ｂでは少なくとも６ヶ月間は保存安定性がみられた。オキサシリンを用いた培地では１ヶ月でＭＳＳＡが陽性となった。
【００３５】
実施例５  鼻腔擦過検体のＭＲＳＡスクリーニング及び確認
健常者１０名の鼻腔を綿棒で擦過し、本培地Ｂ、テルモ社ＭＲＳＡスクリーニング培地（テルモ培地）を用いて、スクリーニングを行った。さらにＭＲＳＡ陽性を示した検体はポアメデイアＭＲＳＡ分離培地（栄研化学株式会社）で釣菌し、次いてフローズンプレート（栄研化学株式会社）にて、オキサシリンに対するＭＩＣを測定し、ＮＣＣＬＳの基準に従い、ＭＲＳＡの判定を行った。結果を表６に示す。
【００３６】
【組成３】
0004583559.tif 000013
テルモ培地はオキサシリンを含む粉末部と滅菌精製水の液体部よりなり、用時に溶解して調製する。ＭＲＳＡが存在すると培地色が赤色から黄色に変化する。
なお、調製法・使用法はその添付文書に従った。
【００３７】
結果
【表６】
0004583559.tif 000014
【００３８】
テルモ培地ではフェノールレッドによる培地色の変化のみでＭＲＳＡを分別している。そのため、マンニット分解性の菌が発育すると陽性を示すことがある。
表６では検体２（腸球菌）がそれに当たる。
ＭＲＳＡと腸球菌はＭＵＰの利用性で鑑別できる。本培地ＢはＭＵＰを含有しているので発蛍光の有無でＭＲＳＡと腸球菌との鑑別が可能である。テルモ培地ではマンニット分解性の腸球菌が発育し陽性を示した。テルモ培地はＭＵＰが入っていないため腸球菌が発育すると区別がつかない。
【００３９】
【発明の効果】
選択薬剤として水溶性で安定性に優れたエリスロマイシンを用いたことにより、調製した培地の保存安定性が改善され、調製済みの「生培地」として市場に流通させることが可能になった。また寒天量を増減することにより、液状培地、半流動培地、固形培地とすることが可能であり、本培地の使用者は、培地の用時調製といった面倒な手技から解放され、適当な形状の調製済みの本培地を市場から購入し、それに被検菌を接種するだけの簡単な操作でＭＲＳＡのスクリーニングが可能になった。
さらに本培地はフェノールレッドの発色とＭＵＧの発蛍光でダブルチェックするのでＭＲＳＡ確認の正確度が高く、他の菌の影響を受け難い。さらに短時間でのスクリーニングが可能となり、例えばＭＲＳＡ１０6cfu/mLであれば１０時間で検出される。
【００４０】
本培地を半流動培地として試験管に分注した形（高層培地）で用いると、綿棒擦過検体を培地内に挿入したままで検体の保存・輸送さらには培養（スクリーニング）が可能となり、広い用途で使用可能となる。また綿棒擦過検体は培地に挿入されたまま培養され、培養後は滅菌処理後に廃棄されるので衛生的である。
本発明は、綿棒で被検体を拭うだけの簡単な操作で、短時間でかつ正確にＭＲＳＡを検出でき、院内感染・日和見感染等を早期に発見でき、その早期の治療や予防に有用である。