(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
(1)リジン残基を含有し、且つ、リジン残基のε-アミノ基が予め保護されていない状態である、アミノ末端が修飾されたタンパク質を化学的または生化学的手段により切断する工程、
(2)(1)の工程で得られるペプチドのアミノ基のうちのアミノ末端α-アミノ基を選択的にｐＨ５以下で一般式〔１〕
（Ｒ1ＣＯ）2Ｏ        〔１〕
（式中、Ｒ1はアルキル基を表わす。）
で示されるカルボン酸無水物を作用させるか、ｐＨ６以下で一般式〔２〕
Ｒ2ＮＣＯ        〔２〕
（式中、Ｒ2は置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいフェニル基、置換されていてもよいナフチル基または置換されていてもよいピリジル基を表わす。）
で示されるイソシアネート化合物を作用させる工程、
(3)(2)の工程の前後におけるペプチドの質量分析を行い、両者を比較して質量変化がないピークと質量増加をしたピークとを見出し、質量変化がないピークをタンパク質のアミノ末端由来のペプチドに基づくピークとして特定する工程、および
(4)該特定されたピークに対応するペプチドのアミノ酸配列を決定する工程
を含むことを特徴とするアミノ末端が修飾されたタンパク質のアミノ末端のアミノ酸配列の決定方法。
【請求項２】
(1)アミノ末端が修飾されていないタンパク質のアミノ基のうちのアミノ末端α-アミノ基を選択的にｐＨ５以下で一般式〔１〕
（Ｒ1ＣＯ）2Ｏ        〔１〕
（式中、Ｒ1はアルキル基を表わす。）
で示されるカルボン酸無水物を作用させるか、ｐＨ６以下で一般式〔２〕
Ｒ2ＮＣＯ        〔２〕
（式中、Ｒ2は置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいフェニル基、置換されていてもよいナフチル基または置換されていてもよいピリジル基を表わす。）
で示されるイソシアネート化合物を作用させる工程、
(2)(1)の工程の前後におけるタンパク質それぞれを化学的または生化学的手段により切断する工程、
(3)(2)の工程で得られるペプチドの質量分析をそれぞれ行い、両者を比較して質量変化がないピークと質量増加をしたピークとを見出し、質量変化がないピークをタンパク質のアミノ末端由来のペプチドに基づくピークとして特定する工程、および
(4)該特定されたピークに対応するペプチドのアミノ酸配列を決定する工程
を含むことを特徴とするアミノ末端が修飾されていないタンパク質のアミノ末端のアミノ酸配列の決定方法。
【請求項３】
(1)リジン残基を含有し、且つ、リジン残基のε-アミノ基が予め保護されていない状態である、アミノ末端が修飾されたタンパク質を化学的または生化学的手段により切断する工程、
(2)(1)の工程で得られるペプチドのアミノ基のうちのアミノ末端α-アミノ基を選択的にｐＨ５以下で一般式〔１〕
（Ｒ1ＣＯ）2Ｏ        〔１〕
（式中、Ｒ1はアルキル基を表わす。）
で示されるカルボン酸無水物を作用させるか、ｐＨ６以下で一般式〔２〕
Ｒ2ＮＣＯ        〔２〕
（式中、Ｒ2は置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいフェニル基、置換されていてもよいナフチル基または置換されていてもよいピリジル基を表わす。）
で示されるイソシアネート化合物を作用させる工程、および
(3)(2)の工程の前後におけるペプチドの質量分析を行い、両者を比較して質量変化がないピークと質量増加をしたピークとを見出し、質量変化がないピークをタンパク質のアミノ末端由来のペプチドに対応するピークとして特定する工程
を含むことを特徴とするアミノ末端が修飾されたタンパク質のアミノ末端由来のペプチドの特定方法。
【請求項４】
(1)アミノ末端が修飾されていないタンパク質のアミノ基のうちのアミノ末端α-アミノ基を選択的にｐＨ５以下で一般式〔１〕
（Ｒ1ＣＯ）2Ｏ        〔１〕
（式中、Ｒ1はアルキル基を表わす。）
で示されるカルボン酸無水物を作用させるか、ｐＨ６以下で一般式〔２〕
Ｒ2ＮＣＯ        〔２〕
（式中、Ｒ2は置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいフェニル基、置換されていてもよいナフチル基または置換されていてもよいピリジル基を表わす。）
で示されるイソシアネート化合物を作用させる工程、
(2)(1)の工程の前後におけるタンパク質それぞれを化学的または生化学的手段により切断する工程、および
(3)(2)の工程で得られるペプチドの質量分析をそれぞれ行い、両者を比較して質量変化がないピークと質量増加をしたピークとを見出し、質量変化がないピークをタンパク質のアミノ末端由来のペプチドに基づくピークとして特定する工程
を含むことを特徴とするアミノ末端が修飾されていないタンパク質のアミノ末端由来のペプチドの特定方法。
【請求項５】
(1)の工程に先立ち、リジン残基を含有し、且つ、リジン残基のε-アミノ基が予め保護されていない状態である、アミノ末端が修飾されたタンパク質に還元Ｓアルキル化を行う請求項１または３に記載の方法。
【請求項６】
(1)の工程に先立ちアミノ末端が修飾されていないタンパク質に還元Ｓアルキル化を行う請求項２または４に記載の方法。
【請求項７】
リジン残基を含有し、且つ、リジン残基のε-アミノ基が予め保護されていない状態である、タンパク質またはペプチドのアミノ基のうちのアミノ末端α-アミノ基を選択的にｐＨ５以下で一般式〔１〕
（Ｒ1ＣＯ）2Ｏ        〔１〕
（式中、Ｒ1はアルキル基を表わす。）
で示されるカルボン酸無水物を作用させることを特徴とするタンパク質またはペプチドのアミノ末端α−アミノ基のアシル化方法。
【請求項８】
リジン残基を含有し、且つ、リジン残基のε-アミノ基が予め保護されていない状態である、タンパク質またはペプチドのアミノ基のうちのアミノ末端α-アミノ基を選択的にｐＨ６以下で一般式〔２〕
Ｒ2ＮＣＯ        〔２〕
（式中、Ｒ2は置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいフェニル基、置換されていてもよいナフチル基または置換されていてもよいピリジル基を表わす。）
で示されるイソシアネート化合物を作用させることを特徴とするタンパク質またはペプチドのアミノ末端α−アミノ基のカルバモイル化方法。
【請求項９】
カルボン酸無水物〔１〕のＲ1がＣ１−６アルキル基である請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
イソシアネート化合物〔２〕のＲ2がフェニル基またはＣ１−６アルキル基である請求項１〜６または８のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、タンパク質のアミノ末端のアミノ酸配列の決定方法及び、タンパク質またはペプチドのアミノ末端アミノ基の選択的修飾方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
タンパク質のアミノ酸配列の決定は、タンパク質の構造を確認、同定する手段として重要である。特にタンパク質のアミノ末端部分のアミノ酸配列を決定することは、有用タンパク質をコードする遺伝子の取得などにおいて重要である。
天然に存在するタンパク質にはそのアミノ末端（以下、Ｎ末端と記す。）が修飾されている場合と修飾されていない２種類のタンパク質が存在する。Ｎ末端が修飾されていないタンパク質（以下、Ｎ末端未修飾タンパク質と記す。）、即ちＮ末端アミノ基に置換基を有さないタンパク質のＮ末端アミノ酸配列決定には、例えば、エドマン分解法が利用されている。一方、Ｎ末端が修飾されたタンパク質（以下、Ｎ末端修飾タンパク質と記す。）、即ち末端アミノ基の水素原子がアセチル基等により置換されたタンパク質のＮ末端アミノ酸配列決定にはエドマン分解法が利用できないので、その目的のために質量分析法等が使用されている。例えば、タンパク質を消化酵素等を用いて切断し、得られるペプチドをそれぞれタンデム質量分析することにより各ペプチドのアミノ酸配列が決定できる。
【０００３】
Ｎ末端修飾タンパク質のＮ末端のアミノ酸配列を決定するためには、タンパク質の切断により生成するペプチドの中から、元のタンパク質のＮ末端由来のペプチドを特定し、このペプチドのアミノ酸配列を決定する必要がある。Ｎ末端修飾タンパク質のＮ末端由来のペプチドの特定方法としては、タンパク質の切断により生成するペプチド（以下、切断ペプチドと記す。）をBrCN活性化セファロースカラム処理し、吸着されずに溶出されるペプチドを採取する方法（Anal. Biochem., 222, 210-216 (1994)）や、切断ペプチドをアセチル化処理し、該アセチル化処理前後の試料の逆相クロマトグラフィーにおける溶出位置を比較することにより元のタンパク質のＮ末端由来のペプチドを特定する方法（特開平8-27180）等が知られている。これらはいずれも切断ペプチドＮ末端α−アミノ基の他にリジン残基に由来するε−アミノ基が存在する。このリジン残基に由来するε−アミノ基も前記試薬等と同様に反応するので、タンパク質のＮ末端由来のペプチドを特定するためには、タンパク質のリジン残基のε−アミノ基を例えばスクシニル化等により予め修飾した上で、該タンパク質を切断し、切断ペプチドのＮ末端α−アミノ基を修飾し、特定することが必要とされていた。
【０００４】
一方、タンパク質あるいは切断ペプチドのＮ末端α−アミノ基の選択的修飾方法としては、グルカゴンにおいて無水酢酸を用いるアセチル化方法（Eur. J. Biochem. 60, 335-347, (1975)）や、切断ペプチドに無水ヨード酢酸をカップリング試薬として使用する方法（Anal. Chem., 65, 1703, (1993)； Bioconjugate Chem., 1, 114-122, (1990)）が知られているものの、これらの方法においてその選択性のためには、基質であるタンパク質あるいはペプチドと修飾試薬との使用比率を厳密に制御する必要があった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、タンパク質のＮ末端部分のアミノ酸配列を効率的に決定する方法およびタンパク質、ペプチド等のＮ末端アミノ基を選択的に修飾する方法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
このような状況下、本発明者らはタンパク質のＮ末端アミノ酸配列の決定方法につき検討した結果、タンパク質または切断ペプチドに対する修飾剤の使用量を厳密に制御しなくとも比較的広い範囲で、ε−アミノ基共存下においてもＮ末端アミノ基を極めて選択性良く修飾できる方法を見出すとともに、この方法をタンパク質のＮ末端アミノ酸配列決定に適用することにより効率的にその目的が達成されることを見出し、本発明に至った。
すなわち本発明は、
(1)アミノ末端が修飾されたタンパク質を化学的または生化学的手段により切断する工程、
(2)(1)の工程で得られるペプチドにｐＨ５以下で一般式〔１〕
（Ｒ1ＣＯ）2Ｏ        〔１〕
（式中、Ｒ1はアルキル基を表わす。）
で示されるカルボン酸無水物を作用させるか、ｐＨ６以下で一般式〔２〕
Ｒ2ＮＣＯ        〔２〕
（式中、Ｒ2は置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいフェニル基、置換されていてもよいナフチル基または置換されていてもよいピリジル基を表わす。）
で示されるイソシアネート化合物を作用させる工程、
(3)(2)の工程の前後におけるペプチドの質量分析を行い、両者を比較してタンパク質のアミノ末端由来のペプチドを特定する工程、および
(4)該特定されたペプチドのアミノ酸配列を決定する工程
を含むことを特徴とするアミノ末端が修飾されたタンパク質のアミノ末端のアミノ酸配列の決定方法および
【０００７】
(a)アミノ末端が修飾されていないタンパク質にｐＨ５以下で一般式〔１〕
（Ｒ1ＣＯ）2Ｏ        〔１〕
（式中、Ｒ1はアルキル基を表わす。）
で示されるカルボン酸無水物を作用させるか、ｐＨ６以下で一般式〔２〕
Ｒ2ＮＣＯ        〔２〕
（式中、Ｒ2は置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいフェニル基、置換されていてもよいナフチル基または置換されていてもよいピリジル基を表わす。）
で示されるイソシアネート化合物を作用させる工程、
(b)(a)の工程の前後におけるタンパク質それぞれを化学的または生化学的手段により切断する工程、
(c)(b)の工程で得られるペプチドの質量分析をそれぞれ行い、両者を比較してタンパク質のアミノ末端由来のペプチドを特定する工程、および
(d)該特定されたペプチドのアミノ酸配列を決定する工程
を含むことを特徴とするアミノ末端が修飾されていないタンパク質のアミノ末端のアミノ酸配列の決定方法に関するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明においてタンパク質とは、α−アミノ酸がペプチド結合により連結したポリペプチド鎖からなる高分子化合物を言い、通常は分子量４０００以上を言う。ペプチドとは、２個以上のα−アミノ酸がペプチド結合により結合したものを言い、通常はアミノ酸数が５０以下のものを言う。アミノ末端が修飾されたとは、タンパク質またはペプチドのアミノ末端のアミノ基の少なくとも１個の水素原子がアシル基等により置換されていることを言う。
【０００９】
１．Ｎ末端修飾タンパク質のアミノ末端のアミノ酸配列決定方法
(1)Ｎ末端修飾タンパク質の切断工程
Ｎ末端修飾タンパク質の切断方法は特に限定されず、例えば、A Practical Guide to Protein and Peptide Purification for Microsequencing, Second Edition, Academic Press, (1993)やMethods in Enzymology, 193, 389-412, (1990)等に記載の化学的切断方法、消化酵素を用いた生化学的切断方法等をあげることができる。具体的には例えば、化学的切断方法としてはBrCNによる切断方法が挙げられ、消化酵素による生化学的切断方法としては、トリプシン、キモトリプシンなどを用いた消化を挙げることができる。
Ｎ末端修飾タンパク質を切断することにより、該タンパク質が切断された通常は分子量３０００以下のペプチドが得られる。
また、Ｎ末端修飾タンパク質がそれを構成するアミノ酸としてシステインを含む場合には、予め例えばヨードアセトアミドや4-ビニルピリジンなどにより還元Sアルキル化処理を行った後、前記タンパク質の切断を行うことが実用上好ましい。この還元Ｓアルキル化処理自体は公知であり、例えば、A Practical Guide to Protein and Peptide Purification for Microsequencing, Second Edition, Academic Press, (1993)等に記載の方法に準じて行うことができる。
【００１０】
(2)ペプチドへのカルボン酸無水物またはイソシアネート化合物処理工程
ｉ）カルボン酸無水物〔１〕処理
前記工程で得られるペプチドにｐＨ５以下でカルボン酸無水物〔１〕を作用させることによりＮ末端が選択的にアシル化されたペプチドが得られる。
カルボン酸無水物〔１〕におけるＲ1は直鎖または分岐アルキル基であり、好ましくはメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基等のＣ１〜６の直鎖または分岐アルキル基を挙げることができ、具体的には、無水酢酸、プロピオン酸無水物、酪酸無水物、吉草酸無水物等を挙げることができる。
【００１１】
本工程の反応はｐＨ５以下、好ましくはｐＨ２〜５の範囲、さらに好ましくはｐＨ３〜５の範囲で行われる。
本工程において、通常は前記ｐＨを保持するための緩衝液を溶媒として使用する。該溶媒としては、酢酸水溶液、ぎ酸水溶液、ピリジン−酢酸緩衝液、トリフルオロ酢酸水溶液等の揮発性溶媒が、後処理の簡便さの点で好ましい。通常は、本工程の反応は、ペプチドおよび該溶媒からなる溶解または懸濁液に、カルボン酸無水物〔１〕またはそのテトラヒドロフラン等の溶液を添加することにより行われる。反応は、選択性の点から約１０℃以下で、使用する溶媒が凍らない範囲の温度で行うことが好ましい。反応時間は通常、１〜６０分程度である。
カルボン酸無水物〔１〕の反応系内の濃度は反応系内の初期濃度として通常、pH5で反応を行う場合には、約10〜30mM程度、pH3.3で反応を行う場合には、約60〜300mM程度である。
本工程において反応後、反応液からペプチドを回収する。例えば、反応液に揮発性の溶媒を用いた場合は、反応液を減圧下に留去すればよい。不揮発性の塩を含む溶媒を用いた場合には、脱塩処理を行った後溶媒を減圧留去すればよい。
本工程の処理を行うことにより、Ｎ末端のみが選択的に使用するカルボン酸無水物〔１〕に対応してアシル化されたペプチドを製造することができる。
【００１２】
ii）イソシアネート化合物〔２〕処理
Ｎ末端修飾タンパク質の切断により得られるペプチドに、ｐＨ６以下でイソシアネート化合物〔２〕を作用させることにより、Ｎ末端アミノ基が選択的にカルバモイル化されたペプチドが得られる。
イソシアネート化合物〔２〕におけるＲ2は、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいフェニル基、置換されていてもよいナフチル基または置換されていてもよいピリジル基である。置換されていてもよいアルキル基としては、例えばフッ素原子、塩素原子、臭素原子、よう素原子等のハロゲン原子で置換されていても良いアルキル基を挙げることができ、具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基等のＣ１〜６アルキル基、クロロメチル基、ヨードメチル基、ジブロモメチル基、トリフルオロメチル基、ヨードエチル基等のＣ１〜６ハロアルキル基を挙げることができる。置換されていてもよいフェニル基、置換されていてもよいナフチル基としては、例えばフェニル基、ｐ−クロロフェニル基、ｏ−ブロモフェニル基、２，４−ジクロロフェニル基等のハロゲン置換フェニル基、１−ナフチル基、２−ナフチル基等のナフチル基、１−ヨードナフチル基、２−クロロナフチル基等のハロゲン置換ナフチル基、フルオレセイン基、ダンシルアミノフェニル基等の蛍光性の置換基を有するフェニル基等を挙げることができる。置換されていても良いピリジル基としては、例えば２−ピリジル基、３−ピリジル基、４−ピリジル基等のピリジル基や、２−クロロ−４−ピリジル基、３，５−ジフルオロ−２−ピリジル基等のハロゲン置換ピリジル基を挙げることができる。
イソシアネート化合物〔２〕としては具体的には、フェニルイソシアネート、ｐ−クロロフェニルイソシアネート、１−ナフチルイソシアネート、２−ナフチルイソシアネート、ブチルイソシアネート、エチルイソシアネート、４−ピリジルイソシアネート、３−ピリジルイソシアネート、フルオレセインイソシアナート、ダンシルアミノフェニルイソシアナート等を挙げることができる。
本工程の反応はｐＨ６以下で行われ、好ましくはｐＨ約３〜６の範囲、さらに好ましくはｐＨ約５〜６で行われる。
【００１３】
本工程において、通常は前記ｐＨを保持するための緩衝液を溶媒として使用する。該溶媒としては、酢酸水溶液、ぎ酸水溶液、ピリジン−酢酸緩衝液、トリフルオロ酢酸水溶液等の揮発性溶媒が、後処理の簡便さの点で好ましい。通常は、本工程の反応は、ペプチドおよび該溶媒からなる溶解または懸濁液に、イソシアネート化合物〔２〕またはそのテトラヒドロフラン等の溶液を添加することにより行われる。反応は、例えば使用する溶媒が凍らない程度の低温から５０℃程度の範囲を挙げることができる。反応時間は通常、１〜６０分程度である。
イソシアネート化合物〔２〕の反応系内の濃度は反応系内の初期濃度として通常、pH６で反応を行う場合には、約2〜300mM程度である。
本工程の反応後、反応液からペプチドを回収する。例えば、反応液に揮発性の溶媒を用いた場合は、反応液を減圧下に留去すればよい。不揮発性の塩を含む溶媒を用いた場合には、脱塩処理を行った後溶媒を減圧留去すればよい。
本工程の処理を行うことにより、Ｎ末端のみが選択的に、使用するイソシアネート化合物〔２〕に対応してカルバモイル化されたペプチドを製造することができる。
【００１４】
(3)タンパク質のアミノ末端由来のペプチドの特定工程
(2)の工程の前におけるペプチドの質量分析及び(2)の工程の後におけるペプチドの質量分析をそれぞれ行い、質量変化していないペプチドを特定することにより、これをＮ末端修飾タンパク質のＮ末端に由来するペプチドであるとすることができる。例えば、ペプチドを無水酢酸により処理した場合には、Ｎ末端修飾タンパク質のＮ末端を含むペプチドは該処理により質量変化はしないので、(2)の工程の前後で同じ質量のピークが検出されるのに対し、Ｎ末端修飾タンパク質のＮ末端を含まないペプチドにおいては、該ペプチドのＮ末端のα-アミノ基がアセチル化されることにより42の質量増加が検出される。また、例えば、イソシアン酸フェニルで処理した場合においては、Ｎ末端修飾タンパク質のＮ末端を含まないペプチドは119の質量増加が検出される。
【００１５】
質量分析の方法としては、ペプチドの質量を分析できる方法であればよく、質量分析装置の種類やイオン化法は特に限定されない。例えば、二重収束型の質量分析装置を用いてFABイオン化法にて分析することができる。
(4)該特定されたペプチドのアミノ酸配列を決定する工程
かくして特定されたタンパク質のＮ末端由来のペプチドを、例えば、タンデム質量分析に供することにより、そのアミノ酸配列を決めることができる。タンデム質量分析の方法としては、(3)の工程で適用可能な方法を同様に用いることができる。
【００１６】
２．Ｎ末端未修飾タンパク質のアミノ末端のアミノ酸配列決定方法
(a)Ｎ末端未修飾タンパク質へのカルボン酸無水物またはイソシアネート化合物処理工程
ｉ）カルボン酸無水物〔１〕処理
Ｎ末端未修飾タンパク質にｐＨ５以下でカルボン酸無水物〔１〕を作用させることによりＮ末端が選択的に使用したカルボン酸無水物〔１〕に対応してアシル化されたタンパク質が得られる。
本工程の処理においては、前記１．(2)ｉ）の工程におけるペプチドに代えて、Ｎ末端未修飾タンパク質を用いる以外は１．(2)ｉ）の工程の方法を同様に適用することができる。
【００１７】
ii）イソシアネート化合物〔２〕処理
Ｎ末端未修飾タンパク質にｐＨ６以下でイソシアネート化合物〔２〕を作用させることによりＮ末端が選択的に使用したイソシアネート化合物〔２〕に対応してカルバモイル化されたタンパク質が得られる。
本工程の処理においては、前記１．(2) ii）の工程におけるペプチドに代えて、Ｎ末端未修飾タンパク質を用いる以外は１．(2) ii）の工程の方法を同様に適用することができる。
また、Ｎ末端未修飾タンパク質がそれを構成するアミノ酸としてシステインを含む場合には、予め例えばヨードアセトアミドや4-ビニルピリジンなどにより還元Sアルキル化処理を行った後、前記タンパク質へのカルボン酸無水物〔１〕またはイソシアネート化合物〔２〕処理を行うことが実用上好ましい。この還元Ｓアルキル化処理も前記したＮ末端修飾タンパク質に対する処理と同様に行うことができる。
【００１８】
(b)(a)の工程の前後におけるタンパク質の切断工程
(a)の工程の原料として用いられるＮ末端未修飾タンパク質および、(a)の工程により得られたタンパク質をれぞれを化学的または生化学的手段により切断することにより、それぞれのタンパク質が切断された通常は分子量３０００以下のペプチドが得られる。
該タンパク質の切断方法については、１．(1)の工程において用いたＮ末端修飾タンパク質に代えて、(a)の工程の原料として用いられるＮ末端未修飾タンパク質および、(a)の工程により得られたタンパク質を用いる以外は１．(1)の工程の方法を同様に適用することができる。
【００１９】
(c)タンパク質のアミノ末端由来のペプチドの特定工程
(b)の工程で得られる、・(a)の工程の原料として用いられるＮ末端未修飾タンパク質を切断して得られるペプチドの質量分析および、・(a)の工程により得られたタンパク質を切断して得られるペプチドの質量分析を行い、両者を比較して質量変化が検出されるペプチドを特定することにより、これをタンパク質のＮ末端に由来するペプチドであると特定することができる。例えば、タンパク質を上記のようにＮ末端選択的なアセチル化処理した場合は、タンパク質のＮ末端を含まないペプチドにおいては、処理の前後で質量変化がないのに対し、タンパク質のＮ末端を含むペプチドにおいては、そのＮ末端のα-アミノ基のアセチル化により42の質量増加が検出される。また、例えば、イソシアン酸フェニルで処理した場合、タンパク質のＮ末端を含むペプチドは119の質量増加が検出される。
ペプチドの質量分析の方法としてはペプチドの質量変化が分析できる方法であればよく、質量分析装置の種類やイオン化法は特に限定されない。例えば、二重収束型の質量分析装置を用いてFABイオン化法にて切断ペプチドの質量変化を検出することができる。
【００２０】
(d)該特定されたペプチドのアミノ酸配列を決定する工程
かくして特定されたタンパク質のＮ末端由来のペプチドを、例えば、タンデム質量分析に供することにより、そのアミノ酸配列を決めることができる。タンデム質量分析の方法としては、(c)の工程で適用可能な方法を同様に用いることができる。
尚、本発明のＮ末端修飾タンパク質のアミノ末端のアミノ酸配列決定方法および、Ｎ末端未修飾タンパク質のアミノ末端のアミノ酸配列決定方法については、電気泳動によって分離されたタンパク質をゲルに保持させた状態で適用することも可能である。
【００２１】
本発明のＮ末端修飾タンパク質のアミノ末端のアミノ酸配列決定方法および、Ｎ末端未修飾タンパク質のアミノ末端のアミノ酸配列決定方法は、多検体の並列処理が可能であり、並列処理した多検体試料については質量分析法にて迅速に測定することができる。さらに、これらの工程は自動化が可能であるため、多検体を迅速に処理することができる。
【００２２】
上記に示した方法により、多くのタンパク質のＮ末端配列を迅速に決定することが可能となり、例えばゲノム配列と対比することにより、開始コドンの確定や翻訳開始シグナルの同定が迅速にできる。
【００２３】
さらに、タンパク質一般について、Ｎ末端α-アミノ基選択的な修飾処理を施し、該処理前後の質量を質量分析法で分析することにより、処理前後で質量の変化が検出されないタンパク質を元来そのＮ末端が修飾されているタンパク質であると判定することもでき、例えば、そのＮ末端アミノ酸配列の解析にあたって適当な方法を事前に選択することができる。
また、タンパク質一般について、上記と同様にＮ末端α-アミノ基選択的な修飾処理を施し、該処理前後のタンパク質を等電点電気泳動法や二次元電気泳動法で分析することにより、処理前後で等電点の変化が検出されないタンパク質を元来そのＮ末端が修飾されているタンパク質であると判定することもできる。
【００２４】
【実施例】
以下、本発明を参考例および実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１
リジンを含有し、かつ、Ｎ末端が修飾されていないペプチドとしてダイノルフィンＡ（アミノ酸配列；YGGFLRRIRPKLKWDNQ、ペプチド研究所製）100pmolを0.1Mピリジン-酢酸（pH6.0）、0.1Mピリジン-酢酸（pH5.0）、0.1%酢酸水溶液（pH3.3）および1%酢酸水溶液（pH2.7）各12μLにそれぞれ溶解し、氷上で１分間インキュベートした後、0.005M〜5Mの無水酢酸／無水テトラヒドロフランを5μL添加し、氷上で５分間インキュベートした。該反応液から溶媒を減圧下に留去し、残渣を質量分析用試料とした。
質量分析は二重収束型質量分析計（日本電子、型式JMS-HX/HX110A）を用い、FABイオン化法を使用した。上記試料を水・メタノール・酢酸（５０・５０・１）2μLに溶解し、該試料溶液1μLをグリセロール・チオグリセロール（１・１）1μLと混合して上記分析計に供し、FAB-MSおよびFAB-MS/MS測定を行った。
無水酢酸処理後に原料のダイノルフィンＡに比し質量が42増加したピークについてMS/MS分析を行ったところ、Ｎ末端α-アミノ基のみがアセチル化されたダイノルフィンＡであることが確認できた。
各ｐＨおよび無水酢酸量条件におけるＮ末端のみアセチル化されたダイノルフィンＡの選択率を表１に示す。
【００２５】
表１中の記号の説明
Ｎ末端のみアセチル化されたダイノルフィンＡの選択率
◎：７５％超
○：７０％超７５％以下
△：６０％超７０％以下
×：６０％以下
【００２６】
【表１】
0004524823.tif 000002
【００２７】
実施例２
リジンを含有し、かつ、Ｎ末端が修飾されていないペプチドとしてダイノルフィンＡ（アミノ酸配列；YGGFLRRIRPKLKWDNQ、ペプチド研究所製）100pmolを0.1Mピリジン-酢酸（pH6.0）、0.1Mピリジン-酢酸（pH5.0）および0.1%酢酸水溶液（pH3.3）各12μLにそれぞれ溶解し、氷上で１分間インキュベートした後、0.1Mイソシアン酸フェニル／無水テトラヒドロフランを5μL添加し、氷上で５分間インキュベートした。該反応液から溶媒を減圧下に留去し、残渣を質量分析用試料とした。
質量分析は二重収束型質量分析計（日本電子、型式JMS-HX/HX110A）を用い、FABイオン化法を使用した。上記試料を水・メタノール・酢酸（５０・５０・１）2μLに溶解し、該試料溶液1μLをグリセロール・チオグリセロール（１・１）1μLと混合して上記分析計に供し、FAB-MSおよびFAB-MS/MS測定を行った。
その結果、使用した全ての溶媒において原料のダイノルフィンＡに比し質量が119増加したピークが検出された。MS/MS分析を行ったところ、該ピークがＮ末端α-アミノ基のみが修飾されたダイノルフィンＡであることが確認できた。
【００２８】
実施例３
(1)  Ｎ末端が修飾されたタンパク質であるウマチトクロムｃ（シグマ社製）200μgを1%炭酸水素アンモニウム溶液200μLに溶解し、1mg/mLキモトリプシン4μLを添加し、37℃で18時間インキュベートした。
(2)  前記キモトリプシン消化物の反応液10μLを減圧濃縮し、残渣に0.1Mピリジン-酢酸（pH 5.0）を24μL添加し、半量をアセチル化用検体として以下の処理を行い、半量をアセチル化しないコントロール用検体として分取した。アセチル化検体は、氷上で１分間インキュベートした後、0.1M無水酢酸／無水テトラヒドロフランを5μL添加し、氷上で５分間インキュベートした。反応後、溶媒を減圧下に留去し、残渣を質量分析用反応試料とした。別途前記コントロール用検体の溶媒を減圧下に留去し、残渣を質量分析用コントロール試料とした。
質量分析は実施例１と同じ装置を使用し、各試料を水・メタノール・酢酸（５０・５０・１）2μLに溶解し、試料溶液１μLをグリセロール・チオグリセロール（１・１）１μLと混合して質量分析計に供し、FAB-MS測定を行った。
図１にアセチル化処理前後の試料のFAB-MSスペクトルを示す。コントロール試料において検出されたウマチトクロムｃ由来のピークのうちm/z1162.5のピークはアセチル化処理後の試料においても検出されたが、それ以外のピークはアセチル化処理後の試料において検出されず、それぞれ質量が42増加したピークが検出された。従って、m/z1162.5のピークがウマチトクロムｃのＮ末端由来のペプチドと特定できた。このm/z1162.5ピークのFAB-MS/MSスペクトルを取得し、Ｎ末端構造をAc-GDVEKGKKIFと決定した。尚、このＮ末端構造は既に知られているチトクロムcのＮ末端構造と一致していた。
【００２９】
実施例４
実施例３の(1)で得られたキモトリプシン消化物の反応液2μLを減圧濃縮し、残渣に0.1Mピリジン-酢酸（pH 6.0）を24μL添加し、半量をイソシアン酸フェニル処理用検体として以下の処理を行い、半量をイソシアン酸フェニルで処理しないコントロール用検体として分取した。
前記イソシアン酸フェニル処理用検体を氷上で１分間インキュベートした後、これに0.1Mイソシアン酸フェニル／無水テトラヒドロフランを5μL添加し、氷上で５分間インキュベートした。反応後、溶媒を減圧下に留去し、残渣を質量分析用反応試料とした。別途前記コントロール用検体の溶媒を減圧下に留去し、残渣を質量分析用コントロール試料とした。
質量分析は実施例１と同じ装置を使用し、試料を水・メタノール・酢酸（５０・５０・１）2μLに溶解し、試料溶液１μLをグリセロール・チオグリセロール（１・１）１μLと混合して質量分析計に供し、FAB-MS測定した。
図２にイソシアン酸フェニル処理前後の試料のFAB-MSスペクトルを示す。コントロール試料において検出されたウマチトクロムｃ由来のピークのうちm/z1162.5のピークはイソシアン酸フェニル処理後の試料においても検出されたが、それ以外のピークはイソシアン酸フェニル処理後の試料において検出されず、それぞれ質量が119増加したピークが検出された。従って、m/z1162.5のピークがウマチトクロムｃのＮ末端由来のペプチドと同定できた。
【００３０】
実施例５
(1)  Ｎ末端が修飾されていないタンパク質である組換えヒト成長ホルモン（以下、hGHと記す。）200pmolを0.1Mピリジン-酢酸（pH 5.0）12μLに溶解し、氷上で１分間インキュベートした後、0.1M無水酢酸／無水テトラヒドロフランを5μL添加し、氷上で５分間インキュベートした。反応後、溶媒を減圧下に留去した。
(2)  (1)で得られたＮ末端選択的アセチル化処理したhGH200pmolを100mM炭酸水素アンモニウム溶液50μLに溶解し、0.1mg/mLトリプシン5μLを添加し、37℃で18時間インキュベートした。前記トリプシン消化物の反応液を減圧濃縮し、反応試料を調製した。
(3)(1)で得られたＮ末端選択的アセチル化処理したhGHに代えて、(1)の原料として用いたhGHを用いた以外は(2)と同様の操作を行い、コントロール試料を調製した。
(4)  質量分析は二重収束型質量分析計（日本電子、型式JMS-HX/HX110A）を用い、FABイオン化法を使用した。反応試料、コントロール試料のそれぞれを水・メタノール・酢酸（５０・５０・１）4μLに溶解し、試料溶液1μLをグリセロール・チオグリセロール（１・１）1μLと混合して質量分析計に供し、FAB-MS測定した。
図３にアセチル化処理前後の試料（処理前：コントロール試料、処理後：反応試料）のFAB-MSスペクトルを示す。コントロール試料において検出されたhGH由来のピークのうちm/z930.4のピークは反応試料において質量が42増加したピークとなって検出された。従って、m/z930.4のピークがhGHのＮ末端由来のペプチドと特定できた。このm/z930.4ピークのFAB-MS/MSスペクトルを取得し、Ｎ末端構造をFPTIPLSRと決定した。尚、該構造は既に知られているhGHのＮ末端構造と一致した。
【００３１】
実施例６
(1)  Ｎ末端が修飾されていないタンパク質である組換えヒト成長ホルモン（以下、hGHと記す。）を試料として使用して電気泳動ゲル上のタンパク質のＮ末端の解析を行った。電気泳動はMultiphorIIシステム（ファルマシア）、SDS-PAGE用ゲルExcelGel SDS gradient 8-18（ファルマシア）を用い、hGH試料0.5μgを泳動した。泳動後のゲルはクーマシーブリリアントブルー（以下、CBBと記す。）を水／メタノール／酢酸（４０・６０・１）で0.1%濃度に調製した溶液で10分間浸して染色し、水／メタノール／酢酸（４０・６０・１）中で１時間浸して脱色を行った。CBB染色操作後、hGHに相当するバンドを切り出した。
(2)  システインの還元アルキル化処理を以下のように行った。ゲルを1.5mLのチューブに入れ、50μLの0.1M炭酸水素アンモニウム溶液と50μLのアセトニトリルを添加して３０分浸透した。この操作を３回繰り返した後、10mMジチオスレイトール／0.1M炭酸水素アンモニウム溶液を添加して１時間56℃で保温した。溶液を廃棄した後、55mMヨードアセトアミド／0.1M炭酸水素アンモニウムを添加して室温で45分反応させた。溶液を廃棄した後、50μLの0.1M炭酸水素アンモニウム溶液と50μLのアセトニトリルを添加して３０分浸透する操作を３回繰り返し、ゲルに含まれている溶媒を減圧下で留去した。
(3)  前項により得られた二組の還元アルキル化処理したゲルを準備し、一つはイソシアン酸フェニルで処理し、もう一つはイソシアン酸フェニルで処理しないコントロールゲルとした。還元アルキル化処理したゲルに12μLの0.1Mピリジン−酢酸（pH6.0）と5μLの0.1M イソシアン酸フェニル／無水テトラヒドロフランを添加し、氷中で10分反応させた後、減圧下で溶媒を留去することでフェニルイソシアネート処理した。
(4)  (3)で得られたイソシアン酸フェニル処理したゲルおよびコントロールゲルに0.1mg/mLのトリプシンを5μLと15μLの0.1M炭酸水素アンモニウムを添加して、37℃で18時間反応させることによってタンパク質を切断した。切断後、ゲルに水／アセトニトリル／ぎ酸（５０・５０・５）を50μL添加して40分間浸透させ、上清を集める操作を２回繰り返して、切断ペプチドを抽出し、溶媒を減圧下に留去した後、残渣を質量分析に供した。
質量分析は二重収束型質量分析計（日本電子、型式JMS-HX/HX110A）を用い、FABイオン化法を使用した。グリセロール・チオグリセロール（１・１）を水・メタノール・酢酸（５０・５０・１）で２０％に希釈したマトリックスを使用した。試料を水・メタノール・酢酸（５０・５０・１）1μLに溶解し、試料溶液１μLをマトリックス１μLと混合して質量分析計に供し、FAB-MS測定した。コントロール試料において検出されたhGH由来のピークのうちm/z930.4のピークはイソシアン酸フェニル処理後の試料において質量が119増加したピークが検出された。従って、m/z930.4のピークがhGHのＮ末端由来のペプチドと特定できた。このm/z930.4ピークのFAB-MS/MSスペクトルを取得し、Ｎ末端構造をFPTIPLSRと決定した。尚、この構造は既に知られているhGHのＮ末端構造と一致した。
【００３２】
実施例７
実施例1において無水酢酸に代えて表２に記載のイソシアネート化合物〔２〕を用い、表２に記載した条件とした以外は実施例１と同様に実験を行った。結果を表２に示す。
【００３３】
【表２】
0004524823.tif 000003
＊１：シアネート化合物の添加量を添加したシアネート化合物／ＴＨＦ５μＬ中のシアネート化合物のモル濃度（ｍＭ）として表示する。
＊２：Ｎ末端のみアセチル化されたダイノルフィンＡの選択率
◎：７５％超
○：７０％超７５％以下
△：６０％超７０％以下
×：６０％以下
【００３４】
【発明の効果】
本発明によれば、タンパク質のＮ末端アミノ酸配列を効率的に決定する方法を提供できる。また、タンパク質やペプチドのＮ末端アミノ基を効率的に修飾することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ウマチトクロムcのキモトリプシン消化物について、Ｎ末端α-アミノ基選択的アセチル化処理前後の試料の質量スペクトルを対比して示す。上段はアセチル化処理前の試料の質量スペクトルであり、図中の●印をつけたピークがウマチトクロムcのキモトリプシン消化物に由来する。下段はアセチル化処理後の試料の質量スペクトルである。
【図２】ウマチトクロムcのキモトリプシン消化物について、Ｎ末端α-アミノ基選択的なイソシアン酸フェニル処理前後の試料の質量スペクトルを対比して示す。上段はイソシアン酸フェニル処理前の試料の質量スペクトルであり、図中の●印をつけたピークがウマチトクロムcのキモトリプシン消化物に由来する。下段はイソシアン酸フェニル処理後の試料の質量スペクトルである。
【図３】Ｎ末端α-アミノ基選択的アセチル化処理前後のhGHのトリプシン消化物について、質量スペクトルを対比して示す。上段はアセチル化処理前の試料の質量スペクトルであり、図中の●印をつけたピークがhGHのトリプシン消化物に由来する。下段はアセチル化処理後の試料の質量スペクトルである。
【図１】
0004524823.tif 000004
【図２】
0004524823.tif 000005
【図３】
0004524823.tif 000006