(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリーブの果実及び葉及び枝の混合物からエタノール溶媒で抽出したオリーブ抽出物を含有することを特徴とする抗アレルギー皮膚外用組成物。
【請求項２】
請求項１のオリーブ抽出物とオリーブ油を配合することを特徴とする抗アレルギー皮膚外用組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、優れた抗アレルギー作用を有し、更に活性酸素種による酸化的ストレス、紫外線等による皮膚障害を予防し、改善し得る抗アレルギー皮膚外用組成物に関する。
更に詳しくは、オリーブの果実及び葉及び枝の混合物から得られた抽出物を配合することを特徴とする抗アレルギー皮膚外用組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年の食習慣の変化、生活様式の変化や様々な環境条件の悪化による環境科学物質の影響をはじめ、社会生活におけるストレスの増大等により、蕁麻疹、接触性皮膚炎、アトピー性皮膚炎などのアレルギー反応の関与する皮膚疾患が増大している。
アレルギー反応は、Ｉ型〜IV型に分類される。
Ｉ型アレルギー反応は、IgE抗体が主として関与している。外来性の抗原に対してIgE 抗体が産生され、 肥満細胞や好塩基球にIgE 抗体が固着し感作が成立し、再び抗原が接触することにより感作細胞にて抗原抗体反応が起こり、ヒスタミン、セロトニンなどの化学伝達物質が遊離し、血管透過性の亢進、浮腫、平滑筋の収縮などを引き起こして各種のアレルギー症状を発現する。
II型アレルギー反応は、IgG 、IgM抗体が関与している。抗体が抗原細胞に結合すると、補体系を形成するタンパク質が連鎖的に活性化され細胞膜を破壊する複合体が形成されることにより、細胞破壊が起こる。また、補体系の活性化の過程で、アナフィラトキシンが過剰に生じると、血管透過性の亢進、平滑筋の収縮、ヒスタミンの遊離などが起こり、各種のアレルギー症状が発現する。
III 型アレルギー反応は、主にIgG 抗体が関与する。発症は、補体系や多形核白血球など多くの因子が関与する複雑な機構で起こるといわれている。
IV型アレルギーは、感作Ｔリンパ球と抗原との反応により生じる。先のＩ〜III 型が即時型であるのに対して遅延型反応であり、アレルギー性接触皮膚炎などのように外部からの接触物が皮膚から吸収され、接触部位に一致して湿疹反応を起こす。
【０００３】
アレルギー疾患の治療においては、肥満細胞の細胞膜安定化作用を有する薬物、ケミカルメディエーターの産生又は遊離を抑制する薬物、あるいはケミカルメデイエーターに対し拮抗作用を有する薬物等の抗アレルギー薬、抗コリン薬、抗ヒスタミン薬、キサンチン系薬、交換神経刺激薬、ステロイド薬等の対症療法的薬物の適用が検討されている。
【０００４】
一方、化粧料をはじめとする皮膚外用剤では、高い安全性を有するものや、 作用が穏和で、日常的な皮膚の手入れにも使用できるような抗アレルギー剤の需要も高く、甘草由来のグリチルリチン誘導体が主に使用されてきた。また、天然指向の向上も相俟って、植物起原の抗アレルギー剤のスクリーニングも盛んに行われており、 ウラジオガシ（特開平６−２３９７５７号）、エンゴサク（特開平７−１０７６４号）、ウルシ科植物（特開平７−１０７６５号）、ハイビスカス（特開平９−８７１８８号）、ザクロ（特開平９−１１０７１０号）、イヌカタヒバ（特開平９−２６３５２６号）、ジュズダマ属植物・ドクダミ科植物等（特開平１０−１２０５８３号）、ゴマ・レンギョウ等（特開平１１−１８０８８５号）の抽出成分が有効成分として開示されている。
【０００５】
しかしながら、従来の抗アレルギー薬の中には、局所刺激性、粘膜刺激性等を有したり、抗ヒスタミン薬に代表されるように、副作用を有するものが存在していた。また、植物起原の抗アレルギー剤の中には、十分な作用効果が得られなかったり、製剤化において支障となる色・匂いの問題があるものも多く、一定した品質のものが得られにくいといった問題点があった。
【０００６】
従って、本発明の目的は、皮膚安全性及び効果の面から化粧料添加剤として優れた抗アレルギー作用、抗炎症作用、活性酸素種消去作用を有する植物抽出物を配合することによりアレルギー性の皮膚疾患、過敏症・敏感肌といった皮膚トラブルの予防改善、ついては皮膚の老化防止に有効で、安全性の高い皮膚外用剤・浴剤を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
このような事情に鑑み、本発明者らは、抗アレルギーあるいは抗炎症作用に優れ、かつ皮膚学上副作用がなく、皮膚に緩和に作用する物質について、広く天然界に存在する植物について鋭意検討を行なった結果、オリーブの果実、葉、枝の混合物よりの抽出物に高いヒアルロニダーゼ活性阻害作用、β-hexosaminidase遊離抑制作用を見出し、本発明を完成するに至った。
本願は、下記の請求項１及び請求項２により構成されている。
請求項１：オリーブの果実及び葉及び枝の混合物からエタノール溶媒で抽出したオリー
ブ抽出物を含有することを特徴とする抗アレルギー皮膚外用組成物。
請求項２： 請求項１のオリーブ抽出物とオリーブ油を配合することを特徴とする抗アレルギー皮膚外用組成物。
【０００８】
本発明で用いるオリーブとは、オリーブ  Olea europaea L.（モクセイ科）で、地中海沿岸地方、北アフリカ原産の植物で、現在地中海沿岸地方をはじめ世界各地の比較的気温の高い土地で栽培されている。一方本発明に係るオリーブ抽出物は、OLEA EUROPAEA (OLIVE) FRUIT EXTRACT 、OLEA EUROPAEA (OLIVE) LEAF EXTRACTとしてInternational Cosmetic Ingredient Dictionary and Handbook (Eighth Edition 2000) に記載されており、化粧品添加剤として広く使用されている。
しかしながら、これら抽出物は、果実又は葉がそれぞれ単独で抽出されたもので、混合物から抽出されたものは見当たらない。
また、オリーブ葉抽出物の効果としては、活性酸素種消去作用や抗酸化作用（Phytochemistry,Vol31,No.4,p.1173-1178,1992、特開２０００−１２８７６５、特開２００１−２５５０、特開２０００−２６５１８）、美白効果（特開２００１−２５５０）が知られている。オリーブ果実抽出物の効果としては、美白効果（特開平８−１１９８２５号）、抗酸化作用（特開平９−７８０６１号）が知られている。また、オリーブ未精製油の抗酸化作用については、古くから知られている。
しかしながら、オリーブ果実、葉、枝の混合物からの抽出物に関する、これらの相加・相乗効果、抗アレルギー・抗炎症効果については、これまで全く知られていない。
【０００９】
本発明の必須成分であるオリーブ抽出物に用いるオリーブの果実、葉、枝は、必要に応じ、生又は乾燥したものをそのまま又は粉砕したものを使用し、有機栽培された果実、葉、 枝も同様に使用することができる。さらに、オリーブの果実は、オリーブ油を搾油した後の粕をそのまま又は乾燥して同様に使用できる。抽出物の調製方法は、オリーブの果実、葉及び枝を混合したものから抽出するが、その混合比率は特に限定されるものではなく、種々の適当な溶媒を用い、室温又は加温下において抽出する方法があげられる。
【００１０】
具体的に抽出溶媒としては、水、メタノール、エタノール等の低級一価アルコール、グリセリン、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール等の液状多価アルコール、酢酸エチル等の低級アルキルエステルが例示され、これらの一種又は二種以上の混合溶媒を用いることができるが、好ましくは、水又はエタノール溶液又は１，３−ブチレングリコール溶液を用いるのが良い。
【００１１】
本発明のオリーブ抽出物は、上記のようにして得られた抽出液をそのまま用いてもよいが、得られた抽出液を濃縮した濃縮物として用いることもできる。また、スプレードライや凍結乾燥などの操作により、エキス粉末として用いることもできる。さらに、カラムクロマトグラフィー、向流分配クロマトグラフィーなどにより精製したものを用いることができる。抽出物の加工、精製法に限定されるものではない。
【００１２】
本発明で使用するオリーブ油は、オリーブの果実より圧搾した油であるが、その製法に限定されるものではない。また、オーガニック栽培されたオリーブの果実を用いることもできる。好ましくは、オーガニック栽培されたオリーブ果実の低温圧搾の一番絞りを用いるのがよい。
【００１３】
本発明に係る抗アレルギー皮膚外用組成物の必須成分であるオリーブ抽出物の含有量は、何ら限定されるものではないが、乾燥固形物に換算して０．０００１〜５．０重量％（以下、単に「％」で示す）、好ましくは、０．００１〜０．５％がよい。
【００１４】
本発明におけるオリーブ抽出物とオリーブ油の配合割合は特に限定されないが、オリーブ油は、０．０１％〜２０．０％、好ましくは０．１〜１０．０％がよい。
【００１５】
本発明の皮膚外用剤には、上記必須成分の他、化粧料成分として一般に使用されている界面活性剤、油類、高給脂肪酸、合成エステル、シリコーン、保湿剤、紫外線吸収剤、ビタミン類、天然水溶牲高分子、半合成水溶牲高分子、合成水溶牲高分子、粉末成分、色素、防腐剤、酸化防止剤、キレート剤、その他多価アルコール、低級アルコール、増粘剤、散乱剤、ｐＨ調整剤、香料等を適宜配合することができる。これらの添加成分の具体例を示すと次のとおりである。
【００１６】
界面活性剤としては、
（イ）石けん用素地、脂肪酸石けん、高級アルキル硫酸エステル、アルキルエーテル硫酸エステル塩、N −アシルサルコシン酸、高級脂肪酸アミドスルホン酸塩、リン酸エステル塩、スルホコハク酸塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、Ｎ−アシルグルタミン酸塩、高級脂肪酸エステル硫酸エステル塩、硫酸化油、ＰＯＥアルキルエーテルカルボン酸塩、ＰＯＥアルキルアリルエーテルカルボン酸塩、α−オレフィンスルホン酸塩、高級脂肪酸エステルスルホン酸塩、二級アルコール硫酸エステル塩、高級脂肪酸アルキロールアミド硫酸エステル塩、ラウロイルモノエタノールアミドコハク酸塩、Ｎ−パルミトイルアスパラギン酸ジトリエタノールアミン、カゼインナトリウム等のアニオン界面活性剤。アルキルトリメチルアンモニウム塩、ジアルキルジメチルアンモニウム塩、アルキルピリジウム塩、アルキル四級アンモニウム塩、アルキルジメチルベンジルアンモニウム塩、アルキルイソキノニウム塩、ジアルキルモルホニウム塩、ＰＯＥアルキルアミン、アルキルアミン塩、ポリアミン脂肪酸誘導体、アミルアルコール脂肪酸誘導体、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム等のカチオン界面活性剤
（ロ）イミダゾリン系界面活性剤、ベタイン系界面活性剤等の両性界面活性剤
（ハ）ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、硬化ヒマシ油誘導体、グリセリンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン・メチルポリシロキサン共重合体等の親油性非イオン界面活性剤
（ニ）ＰＯＥソルビタン脂肪酸エステル、ＰＯＥソルビット脂肪酸エステル、ＰＯＥグリセリン脂肪酸エステル、ＰＯＥ脂肪酸エステル、ＰＯＥアルキルエーテル、ＰＯＥアルキルフェニルエーテル、ＰＯＥ・ＰＯＰアルキルエーテル、テトラＰＯＥ・テトラＰＯＰエチレンジアミン縮合物、ＰＯＥ硬化ヒマシ油誘導体、ＰＯＥミツロウ・ラノリン誘導体、アルカノールアミド、ＰＯＥプロピレングリコール脂肪酸エステル、ＰＯＥアルキルアミン、ＰＯＥ脂肪酸アミド、ショ糖脂肪酸エステル等の親水性非イオン界面活性剤
等が挙げられる。
【００１７】
油類としては、
（イ）アボカド油、オリーブ油、ゴマ油、ツバキ油、月見草油、タートル油、マカデミアンナッツ油、トウモロコシ油、ミンク油、ナタネ油、卵黄油、パーシック油、小麦胚芽油、サザンカ油、ヒマシ油、アマニ油、サフラワー油、綿実油、エノ油、大豆油、落花生油、茶実油、カヤ油、コメヌカ油、キリ油、ホホバ油、カカオ脂、ヤシ油、馬油、パーム油、パーム核油、牛脂、羊脂、豚脂、ラノリン、鯨ロウ、ミツロウ、カルナウバロウ、モクロウ、キャンデリラロウ、スクワラン等の動植物油及びその硬化油
（ロ）トリパルミチン酸グリセリン等の合成トリグリセリン
（ハ）流動パラフィン、ワセリン等の鉱物油。
等が挙げられる。
【００１８】
高級脂肪酸としては、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、１２−ヒドロキシステアリン酸、イソステアリン酸、ウンデシン酸、トール酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸などがある。高級アルコールとしては、例えば、ラウリルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、ベヘニルアルコール、ミリスチルアルコール、オレイルアルコール、セトステアリルアルコール、ホホバアルコール、ラノリンアルコール、バチルアルコール、２−デシルテトラテセシノール、コレステロール、フィトステロール、イソステアリルアルコール等がある。
又、合成エステルとしては、例えば、オクタン酸セチル、ミリスチン酸オクチルドデシル、ミリスチン酸イソプロピル、ミリスチン酸ミリスチル、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、ラウリン酸ヘキシル、オレンイ酸デシル、ジメチルオクタン酸、乳酸セチル、乳酸ミリスチル等がある。シリコーンとしては、例えば、ジメチルポリシロキサン、メチルフェニルポリシロキサン等の鎖状ポリシロキサン、デカメチルシクロポリシロキサン等の環状ポリシロキサン、シリコーン樹脂等の三次元網目構造のもの等がある。
【００１９】
保湿剤としては、例えば、グリセリン、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ヘキシレングリコール、キシリトール、ソルビトール、マルチトール、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、ムコイチン硫酸、アテロコラーゲン、尿素、乳酸ナトリウム、胆汁酸塩、dlピロリドンカルボン酸塩、可溶性コラーゲン、等のほか、各種動植物抽出物、酵母抽出物等がある。
【００２０】
紫外線吸収剤としては、パラアミノ安息香酸、パラアミノ安息香酸誘導体等の安息香酸系紫外線吸収剤、ホモメンチル−Ｎ−アセチルアントラニレート等のアントラニル酸系紫外線吸収剤、アミルサシリレート等のサリチル酸系紫外線吸収剤、オクチルシンナメート等の桂皮酸系紫外線吸収剤、２，４−ジヒドロキシベンゾフェノン等のベンゾフェノン系紫外線吸収剤、４−メチルベンジリデンカンファー、３−ベンジリデンカンファー、２−フェニル−５−メチルベンゾキサゾール等がある。
【００２１】
ビタミン類としては、例えば、ビタミン油、レチノール等のビタミンＡ類、リボフラビン等のビタミンＢ2 類、ピリドキシン塩酸塩等のビタミンB6類、Ｌ−アスコルビン酸等のビタミンＣ類、パントテン酸カルシウム等のパントテン酸類、エルゴカルシフェノール等のビタミンＤ類、ニコチン酸アミド等のニコチン酸類、酢酸トコフェノール等のビタミンＥ類、ビタミンＰ、ビオチン等がある。
【００２２】
天然水溶性高分子としては、例えば、アラビアガム、トラガントガム、ガラクタン、グアガム、キャロブガム、カラヤガム、カラギーナン、ペクチン、カンテン、クインスシード、アルゲコロイド、デンプン、キサンタンガム、デキストラン、サクシノグルカン、プルラン、コラーゲン、カゼイン、ヒアルロン酸、アルブミン、ゼラチンなどがある。
半合成水溶性高分子としては、例えば、メチルセルロース、ニトロセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等のセルロース系高分子、カルボキシメチルデンプン等のデンプン系高分子、アルギン酸ナトリウム等のアルギン酸系高分子等がある。
合成水溶性高分子としては、例えば、ポリビニルアルコール、カルボキシビニルポリマー等のビニル系高分子、ポリエチレングリコール2000等のポリオキシエチレン系高分子、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体等の共重合高分子系、ポリアクリルアミド等のアクリル系高分子、ポリエチレンイミン、カチオンポリマー等がある。
【００２３】
粉末成分としては、例えば、タルク、カオリン、雲母、セリサイト、炭酸マグネシウム、炭酸カルシウム、ケイ酸塩、シリカ、硫酸バリウム、焼セッコウ、フッ素アパタイト、セラミックパウダー等の無機粉末、ナイロン粉末、ポリエチレン粉末、ポリスチレン粉末、セルロース粉末等の有機粉末などがある。
色素剤としては、二酸化チタン、酸化鉄、カーボンブラック、コバルトバイオレツト等の無機顔料、赤色２０１号、赤色３号、黄色２０５号、黄色４号等の有機顔料、クロロフィル、リボフラビン、β−カロチン等の天然色素、ベニバナ、ウコン等の植物抽出物色素等がある。
防腐剤としては、安息香酸塩、サリチル酸塩、ソルビン酸塩、デヒドロ酢酸塩、パラオキシ安息香酸エステル、塩化ベンザルコニウム、ヒノキチオール、レゾルシン、エタノール等がある。
酸化防止剤としては、トコフェノール、アスコルビン酸、ブチルヒドロキシアニソール、ジブチルヒドロキシトルエン、没食子酸エステル等がある。
キレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸ナトリウム、ポリリン酸ナトリウム、クエン酸等がある。
【００２４】
さらに、抗菌、細胞賦活、皮脂分泌調整、消炎、収斂、抗酸化、美白、活性酸素抑制、抗アレルギー等の生理活性作用を有する植物抽出物及びこれらの抽出分画、精製物を併用することもできる。また、上記の他、香料、アルコール、水等を適宜配合することができる。
【００２５】
本発明の皮膚外用剤組成物は、一般皮膚化粧料に限定されるものではなく、医薬品、医薬部外品、薬用化粧料等を包含するものである。本発明の皮膚外用剤組成物の剤型は、可溶化系、乳化系、粉末分散系等何れでもよく、用途も、化粧水、乳液、クリーム、パック等の基礎化粧料、ファンデーション等のメークアップ化粧料、シャンプー、リンス、石けん、ボディーシャンプーなどのトイレタリー製品、浴用剤等を問わない。
【００２６】
次に実施例をあげて説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。
【００２７】
（製造例１）
乾燥したオリーブの果実１００ｇ、乾燥したオリーブの葉１００ｇ、及び乾燥したオリーブの枝１０ｇに３０％１，３−ブチレングリコール溶液３ｋｇを加え、４０℃にて８時間抽出する。抽出後、ろ過し、ろ液を５℃にて５日間静置し、さらにろ過して抽出物Ａ、約２．４ｋｇを得る。この抽出物の固形分は、１．１％であった。
【００２８】
（製造例２）
オリーブ油を製造するために圧搾したオリーブ果実の圧搾粕の乾燥物１ｋｇ、乾燥したオリーブの葉２ｋｇ及びオリーブの枝２００ｇに、５０ｖｏｌ％エタノール溶液５０Ｌを加え、５０℃にて１０時間抽出を行い、冷後、ろ過し、抽出物約４０ｋｇを得る。抽出物を減圧下、３０℃以下にて約２ｋｇまで濃縮する。濃縮液を凍結乾燥機にて凍結乾燥した後、粉砕し、抽出物Ｂのエキス末約４５０ｇを得る。
【００２９】
（製造例３）
オリーブ果実の圧搾粕の乾燥物１００ｇ、乾燥したオリーブの葉５００ｇ及びオリーブの枝１０ｇに３０ｖｏｌ％エタノール溶液１０Ｌを加え、室温にて１０日間抽出を行い、ろ過し、抽出物約８ｋｇを得る。抽出物を減圧下、濃縮乾固する。乾固物に５０％１，３−ブチレングリコール３．５ｋｇを加え、加温溶解した後、ろ過し、 抽出物Ｃを得る。この抽出物の固形分は、２．０％であった。
【００３０】
（製造例４）
オリーブの成熟した果実２５０ｇ、乾燥したオリーブの葉２５０ｇ、オリーブの枝５０ｇに水１０ｋｇを加え、８０℃にて８時間抽出を行い、冷後ろ過する。
抽出物を減圧下、約１ｋｇまで濃縮する。濃縮物を、径６０ｍｍ、長さ１０００ｍｍのガラスカラムに高分子吸着体（ダイヤイオンＨＰ−２０、三菱化学株式会社製）２Ｌを充填して水に置換したカラムに、約２気圧で充填する。水４Ｌにて溶出後、更に３０％ｖｏｌエタノール溶液５Ｌで溶出し、溶出液を合わせて回収する。回収液を減圧下約５００ｇまで濃縮する。濃縮液を凍結乾燥機にて乾燥後、粉砕し、約８０ｇの抽出物Ｄを得る。
【００３１】
（試験例１）ヒアルロニダーゼ活性阻害作用の測定
ヒアルロニダーゼは、結合組織に分布するヒアルロン酸の加水分解酵素であり、炎症時において活性化され、結合組織のマトリックスを破壊し、炎症系の細胞及び血管の透過性を高める役割を演じると考えられている。また起炎酵素として知られており、抗炎症剤や抗アレルギー剤により阻害されることもしられている。従って、ヒアルロニダーゼ活性阻害作用は、抗アレルギー活性の一つとされている。
【００３２】
（試験方法）
本発明のオリーブ抽出物は、製造例２に示した凍結乾燥抽出物を精製水にて０．５％濃度となるように溶解し、試料とした。
別に、製造例２と同様の方法にて、圧搾したオリーブ果実の圧搾粕のみ３ｋｇを用いて凍結乾燥抽出物を製造し、上記と同様に操作して試験試料を調製した。
乾燥したオリーブの葉及びオリーブの枝についても同様に製造、試験試料を調製した。
陽性対照として、阻害活性が既に知られているクロモグリク酸ナトリウム（藤沢薬品工業製）を試験に用いた。試験方法は、Morgan-Elson法を応用する方法にて行なった。
【００３３】
試料を適当量に０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０に調製）にて希釈した溶液０．２ｍＬにヒアルロニダーゼ（Sigma 社製，TypeIV-S，最終酵素活性を４００NFunit／ｍＬ）０．１ｍＬを加え、３７℃にて２０分間で放置後、活性化剤としてcompound４８／８０(Sigma社製) の酢酸緩衝液溶液（０．１ｍｇ／ｍＬ）０．２ｍＬを加え、更に３７℃にて２０分間放置する。これにヒアルロン酸カリウム（和光純薬工業製）溶液（最終濃度ｍｇ／ｍＬ）０．５ｍＬを加え、３７℃にて４０分間放置する。次に、氷上にて０．４Ｎ水酸化ナトリウム溶液０．２ｍＬを加えて反応を停止させた後、ホウ酸溶液（ホウ酸４．９５ｇに水５０ｍＬを加え、１Ｎ水酸化ナトリウム溶液にてｐＨ９．１に調製した後、水を加えて１００ｍＬとする）０．２ｍＬを加え、混和後沸騰水浴中にて３分間加熱し酵素を失活させる。次に氷上にて室温まで冷却し、ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒド試薬（和光純薬工業製、１０ｇに１０Ｎ塩酸溶液１２．５ｍＬ、酢酸８７．５ｍＬを混合溶解し、使用直前に酢酸にて１０倍に希釈する）６ｍＬを加え、３７℃にて２０分間放置した後、５８５ｎｍにて吸光度を測定する。なお、試料溶液の代わりに酢酸緩衝液を入れたものを対照とし、各資料溶液、対照について酵素を入れないものブランクとし、次式により阻害活性率を求め、試料濃度を調整することにより５０％阻害活性濃度（ＩＣ50）を求めた。
阻害率（％）＝〔１−（試料溶液の吸光度−試料溶液ブランクの吸光度）／（対照溶液の吸光度−対照溶液ブランクの吸光度）〕×１００
【００３４】
（試験結果）
表１のごとく、本発明のオリーブ抽出物は、果実、葉、枝の単独の抽出物に比べて高い活性阻害を示し、相乗効果があることが確認された。また、本発明のオリーブ抽出物は、阻害活性が既知のクロモグリク酸ナトリウムより低いものの、十分に抗アレルギー作用が期待できる結果であった。
【００３５】
【表１】
0004583655.tif 000002
【００３６】
（試験例２）ラット好塩基球白血病（ＲＢＬ−２Ｈ３）細胞からのβ-hexosaminidase 遊離抑制作用
ＲＢＬ−２Ｈ３細胞は継代が可能で無限増殖能を獲得した樹立細胞系の細胞であり、正常の皮膚組織中の肥満細胞や血液中の好塩基球と同様に細胞膜上の高親和性IgE リセプターがIgE 抗体と抗原により架橋されることにより活性化され、脱顆粒現象が生じてβ-hexosaminidase やセロトニン、ヒスタミン等の化学伝達物質を遊離する即時型アレルギー反応機構を備えた細胞である。従って、ＲＢＬ−２Ｈ３細胞からのβ-hexosaminidase 遊離抑制作用は、抗アレルギー作用の可能性を示す指標の一つと考えられている。
【００３７】
（試験方法）
試験に使用した反応混合液は、試験例１で使用した試験試料１０μＬ、ビオチン化マウス抗ＤＮＰIgE 抗体（３μg/ｍＬ）、アビジン（１μg/ｍＬ）を加え、放出溶媒（１１６．９ｍＭ塩化ナトリウム、５．４ｍＭ塩化カリウム、０．８ｍＭ硫酸マグネシウム、２．０ｍＭ塩化カルシウム・２水和物、５．６ｍＭＤ−グルコース、２５ｍｍＨＥＰＥＳ、１ｍｇ／ｍＬＢＳＥ、ｐＨ７．７）で全量を１ｍＬとする。
【００３８】
ＲＢＬ−２Ｈ３細胞（５×１０5 個／穴）を４８穴プレートの穴中で３％ＦＣＳ（HyClone 製）を含むＲＰＭＩ−１６４０（Gibco 製）培養液と共に３７℃、５％二酸化炭素下で２４時間培養する。培養液を除去後、穴を放出溶媒５００μＬで２回洗浄し、反応混合液２５０μＬを加え、３７℃にて１時間反応させる。
その後、穴から細胞外液１００μＬを分取し、残余の細胞外液を吸引除去する。
次に、０．２％Triton  Ｘ−１００  ２５０μＬを穴に加え、１０分後に細胞溶解液（細胞内液）１００μＬを分取する。
【００３９】
β-hexosaminidase 活性の測定は、細胞外液（Ａ）、細胞内液（Ｂ）に５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）で，５ｍＭ  ｐ−ニトロフェニル−２−アセタミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシド（和光純薬製）とした基質溶液４００μＬを加えて、３７℃で３０分間反応させる。反応停止液として、０．２Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ１０．７）１ｍＬを加え、生成したｐ−ニトロフェノールの吸光度を４０５ｎｍで測定する。試験試料を含まない反応混合液による遊離率（net ％release of control）は４５％、放出溶媒のみの反応混合液は、３．５％であった。
【００４０】
β-hexosaminidase の遊離抑制率は、次式により求める。
Net % release ofβ-hexosaminidase ＝[ Ａ／（Ａ＋Ｂ）] ×１００
抑制率（％）＝１００×（１−Net ％ release of sample／Net ％ release of control ）
【００４１】
（試験結果）
表２のごとく、本発明のオリーブ抽出物は、果実、葉、枝の単独の抽出物に比べて高い活性阻害を示し、相乗効果があることが確認され、抗アレルギー作用が期待できる結果であった。
【００４２】
【表２】
0004583655.tif 000003
【００４３】
（試験例３）パネルテスト−１
軽度のアトピー性皮膚症状を有する２０〜３９歳の女性３０名（平均年齢２４．８歳）を対象として、表３の抗アレルギー皮膚外用組成物を１日２回（朝、夕）連続２ケ月顔面に塗布、使用せしめた結果の評価を同じく表３に示す。
評価は、次の基準で評価した。
有効    ：炎症に伴う赤みやかゆみ、肌荒れが改善された
やや有効：炎症に伴う赤みやかゆみ、肌荒れが改善された
無効    ：使用前と変化なし
【００４４】
【表３】
0004583655.tif 000004
【００４５】
（試験例４）パネルテスト−２
２０〜３５歳の健常人女性５０名（平均年齢２４．２歳）を対象として、パネルテスト−１で使用した抗アレルギー皮膚外用組成物を用いて、１日２回（朝、夕）連続３ケ月間顔面に塗布、使用せしめた結果を表４に示す。
官能評価は、潤い、きめ、皺、日焼けによるしみ・そばかすの４項目とした。
【００４６】
【表４】
0004583655.tif 000005
【００４７】
表４より明らかなように、本発明のオリーブ抽出物、オリーブバージン油を含有する抗アレルギー皮膚外用組成物の使用により、本組成物について、皮膚の炎症の改善に優れた効果があること、及び皮膚改善効果、紫外線によるしみ・そばかすの防止効果があることが確認された。
【００４８】
（試験例５）皮膚安全性試験
製造例３に示した抽出物を試験溶液として用いた。
皮膚一次刺激性試験は、ニュージーランドホワイト種ウサギ３匹を用いて行なった結果、皮膚一次刺激指数は０．０であった。連続皮膚刺激性試験は、雌雄各３匹のDunkin Hartley系モルモツトを用いて、１４日間連続反復投与した結果、最大週別平均刺激指数は０．０となり、無刺激と判定された。
眼刺激性試験は、ニュージーランドホワイト種ウサギ３匹の眼について行い、最大群平均評点は０．０で非刺激性と判定された。
皮膚感作性試験は、白色モルモットをAdjuvant/Patch法にて、試験動物、対照動物各１０匹によって行い、発現率０／１０で感作性のないものであることが確認された。
光毒性及び光感作性試験は、Dunkin Hartley系モルモット雌各５匹を使用して行なったところ、光毒性及び光感作性の兆候を引き起こさなかった。
これらの皮膚安全性の結果から、本発明のオリーブ抽出物は、皮膚安全性の上で、非常に安全性が高いものであることが明白である。
【００４９】
（試験例６）パッチテスト
２０歳〜５１歳（平均年齢２６．３歳）までの男女各２０名からなる健常人４０名のボランティアを用いた。
被験物質は、先の製造例３の抽出物及びパネルテストで使用した抗アレルギー皮膚外用組成物Ａを用い、対照として５０％１，３−ブチレングリコール溶液及び生理食塩水を使用した。試験は、２４時間閉塞塗布試験を行なった。人体貼付試験用フィンチャンバー（径１１ｍｍ、大正製薬）を使用し、被験物質をそれぞれ０．１ｍＬ塗布した後、直ちに被験者の背部に貼付し、２４時間放置した。そして、２４時間後にフィンチャンバーを除去して、３０分後及び翌日（４８時間後）に判定基準に従って皮膚反応を観察した。
【００５０】
判定基準は、本邦パッチテスト研究会の判定基準に従った。
無反応                    ・・・・  （−）
僅かな紅斑                ・・・・  （±）
明らかな紅斑              ・・・・  （＋）
紅斑＋腫脹                ・・・・  （＋＋）
紅斑＋腫脹＋丘疹又は小水泡・・・・  （＋＋＋）
大水泡                    ・・・・  （＋＋＋＋）
【００５１】
試験結果を表５に示す。陽性反応（＋以上）を示した例は認められなかった。
なお、僅かな紅斑（±）を生じた例は各検体群において、５０％１，３−ブチレングリコール溶液や生理食塩水例とほぼ同程度の頻度であった。従って、皮膚刺激性は低いものと判断され、皮膚外用剤に配合するにあたって安全性の面で問題のないことが明らかとなった。
【００５２】
【表５】
0004583655.tif 000006
【００５３】
0004583655.tif 000007
0004583655.tif 000008
【００５４】
（実施例２）乳液
（成分）                                      （重量％）
（１）オリーブ油                                ６．０％
（２）植物性スクワラン                          ２．０％
（３）ビタミンＡ油                              ０．０５％
（４）ｄ−δ−トコフェノール                    ０．１％
（５）ステアリン酸                              ２．０％
（６）ベヘニルアルコール                        ０．５％
（７）ポリオキシエチレンフィトステロール        ０．６％
（８）水素添加大豆リン脂質                      ０．５％
（９）吸着精製ラノリン                          １．０％
（10）パラオキシ安息香酸エステル                ０．４％
（11）製造例３のオリーブ抽出物                  ５．０％
（12）１，３−ブチレングリコール              １１．０％
（13）カルボキシビニルポリマー                  ６．０％
（14）ケイ酸アルミニウムマグネシウム            １．５％
（15）ヒアルロン酸ＦＣＨ水溶液                  １．０％
（16）グリチルリチン酸ジカリウム                ０．０５％
（17）プラセンターエキス                        ０．５％
（18）エバーセルホワイト                        ０．５％
（19）アロエ液汁                                ０．５％
（20）水酸化カリウム                            ０．０７％
（21）精製水                                  ６０．７３％
【００５５】
（実施例３）化粧水
（成分）                                      （重量％）
（１）１，３−ブチレングリコール              １０．０％
（２）ｄｌ−ピロリドンカルボン酸ナトリウム液    ３．０％
（３）製造例１のオリーブ抽出物                  ５．０％
（４）ソルビトール発酵多糖類                    １．０％
（５）トレハロース液                            １．０％
（６）Ｌ−セリン                                ０．１５％
（７）グリチルリチン酸ジカリウム                ０．０５％
（８）アラントイン                              ０．０２％
（９）クエン酸ナトリウム                        ０．１％
（10）クエン酸                                  ０．０３％
（11）パラオキシ安息香酸エステル                ０．１２％
（12）精製水                                  ７９．５３％
【００５６】
（実施例４）石けん
（成分）                                      （重量％）
（１）石けん素地                                ５３．２％
（２）スクロール                                １９．４％
（３）オリーブ油                                  ０．２５％
（４）製造例１のオリーブ抽出物                    ５．０％
（５）還元ハチミツ液                              ０．２５％
（６）濃グリセリン                                ６．５％
（７）ヒドロキシエタンジホスホン酸                ０．１５％
（８）常水                                      １５．２５％
【００５７】
（実施例５）クレンジングジェル
（成分）                                      （重量％）
（１）モノミリスチン酸ヘキサグリセリル          ２０．０％
（２）流動パラフィン                            ５４．７％
（３）オリーブ油                                  ５．０％
（４）パラオキシ安息香酸エステル                  ０．３％
（５）製造例２のオリーブ抽出物                    ０．１％
（６）濃グリセリン                                ５．９％
（７）ソルビトール                                ５．０％
（８）香料                                        ０．１％
（９）精製水                                      ８．９％
【００５８】
（実施例６）パック剤
（成分）                                      （重量％）
（１）ポリビニルアルコール                      ２０．０％
（２）グリセリン                                  ５．０％
（３）カオリン                                    ６．０％
（４）製造例４のオリーブ抽出物                    ０．０５％
（５）塩化ベンザルコニウム                      ２０．０％
（６）エタノール                                ２０．０％
（７）パラオキシ安息香酸エステル                  ０．２％
（８）香料                                        ０．１％
（９）精製水                                    ２７．７％
【００５９】
（実施例７）シャンプー
（成分）                                              （重量％）
（１）Ｎ−ヤシ油脂肪酸グルタミン酸トリエタノールアミン  ２５．０％
（２）ラウリン酸ジエタノールアミド                        ５．０％
（３）ミリスチン酸カリウム                                ５．０％
（４）ジステアリン酸エチレングリコール                    ２．０％
（５）ポリエチレングリコール４００                      １５．０％
（６）オリーブ油                                          １．０％
（７）製造例１のオリーブ抽出物                            ３．０％
（８）クロルキシレノール                                  ０．１％
（９）ビタミンＥ                                          ０．１％
（10）パラオキシ安息香酸エステル                          ０．２％
（11）香料                                                ０．３％
（12）精製水                                            ４３．３％
【００６０】
（実施例８）浴用剤
（成分）                                        （重量％）
（１）乾燥硫酸ナトリウム                          ４０．０％
（２）炭酸水素ナトリウム                          ５７．５％
（３）オリーブ油                                    ０．２％
（４）実施例２のオリーブ抽出物                      ０．１％
（５）軽質無水ケイ酸                                ０．３％
（６）香料                                          １．７％
（７）黄色２０２号の（１）                          ０．２％
【００６１】
【発明の効果】
以上、詳述したように、本発明の必須成分であるオリーブ抽出物は、優れたヒアルロニダーゼ活性阻害作用、β-hexosaminidase 遊離抑制作用を有し、安全性に優れ、これを含有する皮膚外用組成物は、炎症に伴う赤みやかゆみ、肌荒れを改善する。
さらにこれらの効果は、本発明オリーブ抽出物とオリーブバージン油を併用することにより、より大きな効果として発揮され、かつ安全性にも優れたものである。