(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ピエリシンをコードすることを特徴とする単離されたＤＮＡであって、配列番号１４のうち塩基番号92〜2641のヌクレオチドで表す塩基配列、配列番号１６のうち塩基番号82〜2631のヌクレオチドで表す塩基配列、から選択される配列を有することを特徴とするＤＮＡ。
【請求項２】
ピエリシンをコードすることを特徴とする単離されたＤＮＡであって、配列番号１４で表される塩基配列、配列番号１６で表される塩基配列、から選択される配列を有することを特徴とするＤＮＡ。
【請求項３】
該ＤＮＡが配列番号１４で表される請求項１〜２記載のＤＮＡ。
【請求項４】
請求項３に記載のＤＮＡの配列を含む発現ベクター。
【請求項５】
請求項４に記載の発現ベクターで形質転換された細胞。
【請求項６】
ピエリシンの生産方法であって、ピエリシンを生産させる条件下で請求項５に記載の細胞を培養し、必要に応じてピエリシンを回収することを特徴とする上記方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法によって生産されたピエリシンを使用してピエリシンと特異的に免疫反応する抗体を調製する方法。
【請求項８】
請求項３に記載のＤＮＡの配列またはその相補配列によってコードされる単離されたＲＮＡ。
【請求項９】
請求項８に記載のＲＮＡ配列に相補配列を有する一本鎖ＤＮＡ。
【請求項１０】
ＤＮＡがピエリシンの発現を調節する請求項９に記載のＤＮＡ。
【請求項１１】
該ＤＮＡが配列番号１６で表される請求項１〜２記載のＤＮＡ。
【請求項１２】
請求項１１に記載のＤＮＡの配列を含む発現ベクター。
【請求項１３】
請求項１２に記載の発現ベクターで形質転換された細胞。
【請求項１４】
ピエリシンの生産方法であって、ピエリシンを生産させる条件下で請求項１３に記載の細胞を培養し、必要に応じてピエリシンを回収することを特徴とする上記方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法によって生産されるピエリシンと免疫反応する抗体。
【請求項１６】
請求項１１に記載のＤＮＡの配列またはその相補配列によってコードされる単離されたＲＮＡ。
【請求項１７】
請求項１６に記載のＲＮＡ配列に相補配列を有する一本鎖ＤＮＡ。
【請求項１８】
ＤＮＡがピエリシンの発現を調節する請求項１７に記載のＤＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、モンシロチョウ由来の、アポトーシス（細胞死）を誘導するタンパク質をコードする核酸に関する。
【０００２】
【従来の技術】
無脊椎動物の免疫システムは、脊椎動物の免疫システムとは異なっている。細菌感染に対する防御システムとして、無脊椎動物は、セクロピン（cecropins）、デフェンシン（defensins）、およびリゾチーム（lysozymes）を含む抗菌タンパク質を産生することが知られている（Boman, H.G. et al.: Annu. Rev. Microbiol., 41: 103-126, 1987; Hultmark, D.: Trends Genet., 9: 178-183, 1993; HoffmanJ.A. :Curr. Opin. Immunol., 7: 4-10, 1995; Beck, G. & G,S. Habicht, Sci.Am., 275: 42-46, 1996）。これらの抗菌タンパク質に加うるに、無脊椎動物レクチンは、自己防御メカニズムに重要な役割を果たすと考えらている（Komano, H. & Natori, S. :  Dev. Comp. Immunol., 9: 31-40, 1985; Lackie, A.M. : Parasitology, 80: 393-412, 1980; Jomori, T. & Natori, S. : HEBS Lett., 296: 283-286, 1992; Kawasaki, K. et al.: Comp. Biochem. Physiol., 106B: 675-680, 1993）。セクロピンは、また、哺乳動物のリンパ腫、および白血病の細胞に対して毒性であることが明らかにされている（Moore, A.J. et al.:  Pept. Res., 7: 265-269, 1994）。さらに、ザルコファーガーレクチンは、in vivoで、ネズミの腹水および固形腫瘍に対して、毒性であることが報告されている（Itoh, A. et al.: Jpn. J. Cancer Res.,76: 1027-1033, 1985）。これらの観察から、昆虫は、抗癌剤を含む新規な生物活性物質のよい資源となるであろうということが示唆される。本発明者らは、最近、２０種類のチョウおよび蛾の、成虫およびさなぎからの抽出物を調べた。そして、３種のチョウ、すなわち、モンシロチョウ（Pieris rapae）、エゾスジグロシロチョウ（Pieris napi）、およびオオモンシロチョウ（Pieris brassicae）が、ヒト胃がん培養細胞ＴＭＫ-１に対する毒性物質を含むことを見出した（Koyama, K. et al.: Jpn. J. Cancer Res., 87: 1259-1262, 1996）。  モンシロチョウおよびオオモンシロチョウのさなぎ中の活性本体は、熱に不安定で、硫安により沈澱し、プロテアーゼで消化されることが明らかとなり、これらがタンパク質であることを示唆した（Koyama, K. et al.: Jpn. J. Cancer Res., 87: 1259-1262, 1996; Kono, T. et al.: Proc. Jpn. Acad., 73B: 192-194, 1997）。
ピエリシンと名付けられたモンシロチョウ中の毒性物質は、さなぎから、カラムクロマトグラフィーの組合わせによって精製され、その分子量は98kDaと算定された。ピエリシンは、ＴＭＫ-１細胞系に対して、ＩＣ50が0.75 ng/mlと、強力な毒性を有しており、アポトーシス細胞死に特有の変化を引き起こす（Watanabe, M. et al.: Jpn. J. Cancer Res., 89: 556-561, 1998）。
ピエリシン誘導アポトーシスの過程で、カスペース３の基質であるポリ（ＡＤＰ-リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）が分解されることが明らかとなり、カスペース３、または、それ様の酵素が活性化されていることを示唆する。一方、抗Ｆａｓ抗体およびＴＮＦ-αに対する耐性の有無およびｐ５３の遺伝子型または表現型との関連が認められないことから、これら因子に依存せずに、ピエリシンによるアポトーシスが起こることが示唆されている。
そこで、このモンシロチョウ由来の、アポトーシス誘導作用を有するタンパク質の作用機構を突き止めるためには、該タンパク質をコードするｃＤＮＡをクローニングし、組換え体タンパク質を作製し、その機能を解析することが必須である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明は、Pieris属チョウ由来の、アポトーシス誘導作用を有するタンパク質をコードする核酸を提供することを課題とする。また、本発明は、悪性腫瘍の遺伝子治療剤を提供することを課題とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ピエリシンの部分アミノ酸配列を決定した。そして該配列に対応するＰＣＲプライマーを作成し、ハイブリッド形成法により、ピエリシンの全長をコードするｃＤＮＡをクローニングした。そして、該ｃＤＮＡを無細胞転写系で発現させて、発現タンパクの分子量を測定したところ、モンシロチョウのさなぎから単離・精製したピエリシンの分子量(Watanabe, M. et.al.: Jpn. J. Cancer Res., 89: 556-561, 1998)と一致した。さらに、該発現タンパク質の癌細胞に対するアポトーシス誘導による細胞死を調べたところ、該発現タンパク質は、上記ピエリシンと同様のアポトーシス誘導活性を示した。すなわち、本発明は、（１）ピエリシンをコードすることを特徴とする単離されたＤＮＡであって、配列番号１４のうち塩基番号92〜2641のヌクレオチドで表す塩基配列、配列番号１６のうち塩基番号82〜2631のヌクレオチドで表す塩基配列、から選択される配列を有することを特徴とするＤＮＡ、（２）ピエリシンをコードすることを特徴とする単離されたＤＮＡであって、配列番号１４で表される塩基配列、配列番号１６で表される塩基配列、から選択される配列を有することを特徴とするＤＮＡ、（３）該ＤＮＡが配列番号１４で表される（１）〜（２）記載のＤＮＡ、（４）（３）に記載のＤＮＡの配列を含む発現ベクター、（５）（４）に記載の発現ベクターで形質転換された細胞、（６）ピエリシンの生産方法であって、ピエリシンを生産させる条件下で（５）に記載の細胞を培養し、必要に応じてピエリシンを回収することを特徴とする上記方法、（７）（６）に記載の方法によって生産されたピエリシンを使用してピエリシンと特異的に免疫反応する抗体を調製する方法、（８）（３）に記載のＤＮＡの配列またはその相補配列によってコードされる単離されたＲＮＡ、（９）（８）に記載のＲＮＡ配列に相補配列を有する一本鎖ＤＮＡ、（１０）ＤＮＡがピエリシンの発現を調節する（９）に記載のＤＮＡ、（１１）該ＤＮＡが配列番号１６で表される（１）〜（２）記載のＤＮＡ、（１２）（１１）に記載のＤＮＡの配列を含む発現ベクター、（１３）（１２）に記載の発現ベクターで形質転換された細胞、（１４）ピエリシンの生産方法であって、ピエリシンを生産させる条件下で（１３）に記載の細胞を培養し、必要に応じてピエリシンを回収することを特徴とする上記方法、（１５）（１４）に記載の方法によって生産されるピエリシンと免疫反応する抗体、（１６）（１１）に記載のＤＮＡの配列またはその相補配列によってコードされる単離されたＲＮＡ、（１７）（１６）に記載のＲＮＡ配列に相補配列を有する一本鎖ＤＮＡ、（１８）ＤＮＡがピエリシンの発現を調節する（１７）に記載のＤＮＡ、に関する。
【０００５】
【発明の実施の形態】
本発明者らは、Watanabeらの方法（Watanabe, M. et al.: Jpn. J. Cancer R-es., 89: 556-561, 1988）で、モンシロチョウのさなぎから、ピエリシンタンパク質を精製し、その部分アミノ酸配列に対応するセンス、およびアンチセンスＰＣＲプライマーを作製した。モンシロチョウの各発生段階のうち、ヒト胃がん培養細胞ＴＭＫー１に対して、最も細胞傷害活性を示す発生段階の５令幼虫のＲＮＡからＰＣＲでピエリシンｃＤＮＡを増幅し、塩基配列を解析した。そして、ＰＣＲプライマーを用いてピエリシンタンパクのコーディング領域を増幅し、λgt10ベクターにサブクローニングし、組換えファージクローンを得た。ついで、in vitro translationを行い、HeLa細胞に対して、細胞傷害活性を示すタンパク質を合成しているクローンを選択した。該クローンのインサートをプラスミドpMAL-p2にクローン化した。同様に、オオモンシロチョウについても、内部のアミノ酸配列を決定し、対応するＰＣＲプライマーを用いて細胞傷害活性を示すタンパク質をコードするｃＤＮＡを単離した。
すなわち、配列番号１５で表されるアミノ酸配列を有するモンシロチョウ由来のタンパク質をコードする、配列番号１４で表される、単離されたポリヌクレオチドからなる核酸を提供する。該核酸配列中には、最初のATGである開始コドン（92〜94のヌクレオチド）と終止コドン（2642〜2644のヌクレオチド）との間の850個のアミノ酸配列をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。
また、本発明は、配列番号１７で表されるアミノ酸配列を有するオオモンシロチョウ由来のタンパク質をコードする、配列番号１６で表される、単離されたポリヌクレオチドからなる核酸を提供する。該核酸配列中には、最初のATGである開始コドン（82〜84のヌクレオチド）と終止コドン（2632〜2634のヌクレオチド）との間の850個のアミノ酸配列をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。
上記ピエリシン遺伝子（配列番号：１４）を、rabbit reticulocyte lysateを用いた無細胞転写系を用いて発現させ、10%SDS-PAGE で解析すると、モンシロチョウのさなぎから精製したピエリシンタンパク質と同じ分子量、約 98,000（Wa-tanabe, M. et al.: Jpn. J. Cancer Res., 89: 556-561, 1988） を示す（図７）。ヒト胃がん培養細胞ＴＭＫ-１およびヒト子宮頸がん細胞 HeLa に、該発現タンパク質をlysateとして最終濃度３％および0.6％になるようにそれぞれ加え、37℃で18時間培養した場合、位相差顕微鏡（図８）およびHoechst33342で染色した蛍光顕微鏡解析（図９）より、両細胞とも、モンシロチョウさなぎからのピエリシンを最終濃度  2.5ng/mlおよび0.5ng/mlになるように加えた時と同様の形態変化を起こし、発現タンパク質が正常に機能していることを示す。細胞からDNAを抽出し、アガロース電気泳動を行うと、該発現タンパク質、該ピエリシン処理細胞ともにヌクレオソーム単位への ＤＮＡの断片化が観察され、アポトーシスが起こっていることが明らかである（図１０）。
オオモンシロチョウから得られた上記核酸（配列番号：１６）から推定されるアミノ酸配列（配列番号：１７）は、モンシロチョウから得られた上記核酸（配列番号：１４）から推定されるアミノ酸配列（配列番号：１５）とは、91％のアミノ酸相同性を有している。そして、in vitro で発現したタンパク質は、TMK-1、および HeLa 細胞に対して細胞傷害活性を示す（図１１）。
【０００６】
核酸
本発明の核酸は、上記ＤＮＡ情報に基づき、当業者公知の標準技法を用いて、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはＲＮＡから調製され、合成で調製され、または技術の組合わせで調製できる。
本発明のＤＮＡに代表される核酸配列は、ＲＮＡの形態、例えばｍＲＮＡ、あるいはＤＮＡの形態、例えば、クローニングまたは合成で作製されるｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを含む。該ＤＮＡは二本鎖（double-strand）、または一本鎖（single-strand）であってもよい。一本鎖ＤＮＡ、またはＲＮＡは、コーディング鎖（センス鎖）であってもよく、また、ノンコーディング鎖（アンチセンス鎖）であってもよい。
“単離された”本発明の核酸分子とは、Pieris属チョウを含むチョウ類から単離された核酸分子、ＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。例えば、ベクター中に含まれる組換えＤＮＡ分子は、本発明の目的のために単離されたと考えられる。さらに、単離されたＤＮＡ分子の例は、異種の宿主細胞中に保持される組換えＤＮＡ分子を含むか、または、溶液中の精製された（部分的にまたは実質的に）ＤＮＡ分子を含む。さらにまた、本発明の核酸が、非タンパク質医薬担体、またはビヒクルと混合されている組成物をも含む。単離されたＲＮＡ分子は、本発明のＤＮＡ分子のin vivoまたはin vitro転写産物を含む。また、本発明においては、単離された核酸分子は、化学合成の核酸分子を含む。
本発明の単離された核酸分子は、ピエリシンタンパク質に対するコーディング配列からなる配列番号１４および１６のＯＲＦとは、遺伝暗号（genetic code）の縮重（degeneracy）のために、実質的に異なる配列を含む。遺伝暗号は、当業者に公知である。このような縮重変異体を生じることは、当業者にとって公知である。
【０００７】
本発明は、また、配列番号１４、あるいは１６に示されるヌクレオチド配列に対して、実質的に相同性を有する核酸分子を提供する。「実質的に相同性」とは、核酸部分（セグメント）、またはそれらの相補鎖が、最適な対応づけがなされ（アラインメント）、比較される場合、セグメント、またはそれらの相補鎖が、少なくとも約３０％のヌクレオチド、通常、４０％のヌクレオチドが、適当なヌクレオチドの挿入、または欠失を有するとしても、同一であることを意味する。
あるいは、セグメントが標準的条件で一本鎖またはその相補鎖とハイブリダイズするならば、実質的な相同性が存在する。標準的なハイブリダイゼーション条件は、Sambrook, J.らに記載されている［Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(1989)］。さらに、これらの用語は、コードされる本発明のタンパク質に変化があるが、このような変化が、該タンパク質の生物活性（アポトーシス誘導活性等）に影響しないＤＮＡコドンの変化をも含む。
本発明は、また、配列番号１４、あるいは１６に開示のＤＮＡ配列に特異的にハイブリダイズする能力を有する、比較的短いＤＮＡ、またはＲＮＡを提供する。このような核酸プローブは、アポトーシス誘導活性を有するPieris属由来のタンパク質以外のタンパク質（ポリペプチドを含む）をコードする核酸に特異的にハイブリダイズし得る。
特定の実施態様においては、オリゴヌクレオチドプライマーを用いることが有利である。このようなヌクレオチド配列は、少なくとも約１５ヌクレオチドの断片であり、さらに好ましくは、少なくとも２０ヌクレオチドである。もちろん、それより長い２５〜６００ヌクレオチドの断片も、また、全てではないが、クローン化されたヌクレオチド配列、または配列番号１４および１６に示されるポリヌクレオチド配列のほとんどに対応する断片も有用である。このようなプライマー配列は、アポトーシス細胞死を誘導するPieris属チョウ由来のタンパク質以外のタンパク質をコードする遺伝子単位の核酸セグメント、またはポリヌクレオチドの検出、増幅、または、変異誘発に用いるため、ＰＣＲ技術を用いて、本発明のポリヌクレオチドを用いてデザインすることができる。
【０００８】
さらに、本発明は、ピエリシンの部分、アナログまたは誘導体をコードする本発明の核酸分子の変異体に関する。変異は、例えば、自然のアレル変異のように自然に発生する。人為的に生じる変異は、当該技術分野で公知の部位特異的突然変異誘発技術を用いて作製できる。
このような変異は、一つまたは二つ以上のヌクレオチドを含むヌクレオチドの置換、欠失、または付加によって作製される変異を含む。該変異は、コーディング領域、または非コーディング領域、またはその両方を変異させ得る。コーディング領域の変更は、保存的、または非保存的アミノ酸置換、欠失、または付加を生じ得る。
精製、または発現されたピエリシンタンパク質の活性は、癌細胞に対するアポトーシス誘導活性を調べることにより可能である。
【０００９】
発現系
ピエリシンは、大腸菌の培養液に添加しても、毒性は観察されないが、クローン化遺伝子をpET32に組込み、大腸菌に導入し、遺伝子発現を行うと、大腸菌は短時間で死滅する。したがって、組換えピエリシンタンパクの発現系として、大腸菌発現系は用いることができない。ピエリシンのコーディング領域の5'側にＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を付加し、Ambion社のMEGAscriptを用いて、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼにより、ｍＲＮＡを合成し、Ambion社のrabbit reticulocyte lysate中でピエリシンを合成する、いわゆる、無細胞系を用いてピエリシン遺伝子を発現することが可能である。
【００１０】
センチニクバエの生体防御物質の一つであるザルコトキシンＩは、グラム陰性菌に対し殺菌作用があり、通常の大腸菌を用いた遺伝子組換えによる方法では生産できない。そこで、酵母を組換え体の宿主として選択することにより、ザルコトキシンＩを大量に生産することを可能とした例（特開平4-341179）がある。
そこで、本発明のピエリシンをコードする遺伝子の発現系として、酵母発現系を用いることができると考えられる。酵母発現系の実際については、多くの文献［例えば、“タンパク実験プロトコール１機能解析編”, 細胞工学別冊, 秀潤社, p. 64(1997)］が参照できる。
ピエリシンタンパク質は適切な形、例えば、融合タンパク質として発現することができ、また、分泌シグナルのみならず、付加的な異種の機能領域を含むことができる。例えば、付加的なアミノ酸領域、特に、荷電したアミノ酸が、精製の間、あるいは引き続くハンドリングおよび貯蔵のあいだ、宿主細胞中での安定性および持続性を改善するために、該タンパク質のＮ末端に付加することができる。また、ペプチドの一部分を精製を容易にするために付加することができる。
このような領域は、該タンパク質の最終調整に先だって除くことができる。安定性を改善し、精製を容易にすべく、分泌を生じさせるために、ポリペプチドに対して、ペプチドの一部の付加は、当業者によく知らた慣用技術である。好ましい融合タンパク質は、可溶性のタンパク質に有用であるイムノグロブリン由来の異種領域を含む。例えば、EP-464533は、別のヒトタンパク質、またはその部分とともにイムノグロブリンの定常部のさまざまな部位からなる融合タンパク質を開示している。多くのケースで、融合タンパクにおけるＦｃ部分は、治療および診断での使用に、好都合であり、かくして、薬物動態特性の改善をもたらす（EP-A 0232262）。一方、ある目的のためには、融合タンパクが発現し、適切な方法で検出および精製した後、Ｆｃ部分を除くことが要求される。
【００１１】
抗体
本発明は、ピエリシンに対する特異的抗体、および該抗体と特異的に反応するタンパク質（あるいはポリペプチド）を提供する。該抗体は、ポリクローナル、またはモノクローナル抗体、ヒト化抗体、さらには、ヒト抗体を包含する。ピエリシン、もしくはそれらの変種、またはそれらを発現する細胞を抗原として、好ましくは、非ヒト動物にアジュバントとともに投与することにより、該抗原に対して該抗体を生じさせることができる。モノクローナル抗体は、当業者によく知られた技術を用いて調製することができる（Kohler, et al., Nature 256 : 495, 1975; Curret Protocols in Molecular Biology, Ausubel, et al., ed., 1989）。ピエリシンに対するポリクローナル抗体も、当業者に公知の方法を用いて調製できる（Antibodies: A Laboratory Manual ed. by Harlow and Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1988))。
モノクローナル抗体の調製のために、連続的セルライン培養によって産生される抗体を提供する技術は、いずれも用いることができる。このような技術は、例えば、ハイブリドーマ技術（Kohler, et al., Nature 256 : 495, 1975）、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kozbor, et al., 1983, Immunology Today 4 : 72)、およびＥＢＶハイブリドーマ技術（Cole, et al., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96)、等が挙げられる。
【００１２】
最近、Smithらの考案によるファージ・ディスプレイ・ベクター（Smith G. P.,Science, 228: 1315, 1985)のコートタンパク質に発現させたペプチドライブラリー、あるいは抗体ライブラリーを、目的のリガンドでスクリーニングし、該リガンドに結合するファージクローンを、アフィニティーカラムなどの精製手法を用いて選択し、ファージ表面に提示されたタンパク質を回収したり、あるいは該タンパク質の性質（表現型）を指標として、該タンパク質をコードする遺伝子をクローニングすることが行われるようになってきている（Burton D.R. et al.: Adv. Immunol., 57: 191,1994; Winter G. et al.: Ann. Rev. Immunol., 12: 433, 1994; O'Neil K.T. et al.: Curr. Opin. Struct. Biol., 5: 443, 1995)。
組換えピエリシンタンパクに対するヒト化抗体、ヒト抗体、アゴニスト、あるいはアンタゴニストなどを取得する場合も、また、これらの機能改変にも、原理的に、この手法（ファージ・ディスプレイ・スクリーニング）を用いることが可能である。例えば、ヒト抗体のファージ・ディスプレイ・ライブラリー（Griffiths, A.D. et al.: EMBO J., 13: 3245, 1994)から、ピエリシンに対するヒト抗体を得ることが考えられる。
【００１３】
用途／医薬組成物
本発明のピエリシンをコードする核酸配列は、これを含むベクターを用いて、悪性腫瘍の形成および／または転移を抑制する遺伝子治療剤として用いることができる。遺伝子治療剤は、HVJリポソーム法、本発明の核酸を、注射等によってそのまま投与する方法、リンサンカルシウム法、DEAE-デキストラン法、エレクトロポレーション法、遺伝子銃による方法、あるいはリポフェクションによって投与する方法、適当なベクター、例えば、アデノウイスルベクター、アデノ関連ベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レトロウイルスベクター、等を用いて、ヒトを含む哺乳類に投与することができる。
本発明の遺伝子治療剤は、局所的、または一時的アポトーシスの誘導の必要性から、ピエリシンが一過性に発現するような状況で投与することが望ましい。そのためには、ピエリシンをコードする核酸配列を注射等によって、そのまま投与する方法、HVJリポソーム法、アデノウイスルベクターを用いる方法、ワクシニアウイルスベクターを用いる方法、等が挙げられる。
本発明の組換えピエリシンは、その有するアポトーシス誘導乃至促進能に基づいて、各種疾患に適用でき、所望の薬理効果を期待できる。該適用疾患としては、より具体的には、例えば、癌，ＡＩＤＳ、ＡＲＣ（ＡＩＤＳ関連疾患）、ＡＴＬ（成人Ｔ細胞白血病：Adult T-cell leukemia）、毛様細胞性白血病、脊髄症（HAM/TSP）、呼吸器障害（HAB/HABA）、関節症（HAAP）、ブドウ膜炎（HAU）、等のHTLV-I関連疾患、自己免疫疾患、例えば、ＳＬＥ（全身性エリテマトーデス）、慢性関節リュウマチ（ＲＡ）等の膠原病、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、原発性胆汁性肝硬変、突発性血小板減少性紫斑病（Idiopathic Thrombocytopenic Purapura : ITP）、自己免疫性溶血性貧血、重症筋無力症、橋本病、インスリン依存性（Ｉ）型糖尿病、等を例示できる。また、血小板減少を伴う各種の疾患、例えば、骨髄異形成症候群、周期性血小板減少症、再生不良性貧血、突発性血小板減少症、周期性血小板減少症、再生不良性貧血、突発性血小板減少性、汎発性血管内凝固症等にも、本発明のアポトーシス誘導剤が適用できる。さらに、本発明の誘導剤は、Ｃ型、Ａ型、Ｂ型、Ｆ型等の各種の肝炎、アルツハイマー病、アルツハイマー型老年痴呆症、心筋炎、ＡＲＤＳ（成人呼吸急迫症候群）、感染症、肝硬変、前立腺肥大症、子宮筋腫、気管支喘息、動脈硬化症、各種先天性奇形症、腎炎、老人性白内障、慢性疲労症候群（Chronic Faligiu Syndrome）、筋シストロフィー（Myolonic dyslrophy）等の各種疾患にも適用できる。
【００１４】
本発明の組換えピエリシンを、制癌剤として用いる場合、その投与により、癌細胞に対してアポトーシスを誘導乃至はこれを促進でき、かくして、制癌作用を発揮する。また、この場合、ピエリシンは、その製剤形態、および投与経路にかかわらず、例えば、これを癌の化学療法剤として知られている他の各種の制癌剤や放射線療法と併用することができる。かくして、組換えピエリシンは、優れた制癌効果を有するため、併用する他の制癌剤の効果を一層助長し、相乗効果を発揮することができる。したがって、併用する制癌剤を通常用いられる量よりもかなり少量とする場合でも、十分な癌治療効果が期待でき、これにより、併用制癌剤の副作用の軽減化を図ることができる。かかる化学療法剤としては、例えば、５ーフルオロウラシル（５-ＦＵ）、マイトマイシン、フトラフール、エンドキサン、トヨマイシン等を例示できる。
組換えピエリシンは、これを血小板減少症治療剤に用いる場合、例えば、ＲＡＥＢやＲＡＥＢ-t等のＭＤＳ患者では、本発明誘導剤の投与により、芽球の増殖が抑制され、かくして、成熟細胞の増殖を起こさせ得る。
さらに、組換えピエリシンは、アポトーシスを誘導乃至促進することにより、薬剤性ウイルス性肝炎患者における肝炎の治療乃至肝細胞の繊維化防止を行い得、したがって、肝硬変予防剤として利用することができる。
組換えピエリシンは、公知の非毒性で薬学的に許容できる担体、アジュバント、およびビヒクルを含む投薬単位処方で、非経口的（例えば、静脈内、筋肉内、あるいは点滴）に投与される。
注射用調製物（例えば、滅菌注射用水溶液、または油性の懸濁液）は、適切な分散剤、または湿潤剤、および沈殿防止剤を用いる公知の技術により処方される。滅菌注射用調製物は、例えば、1,3-ブタンジオール溶液のような、非毒性で非経口的に受容可能な希釈剤または溶媒の滅菌注射用溶液または懸濁液でもよい。
薬学的に許容可能なビヒクルおよび溶媒としては、水、リンゲル液、およびNaCl等張液が挙げられる。さらに、滅菌オイルが溶媒または懸濁媒体として通常使用される。この目的のために、任意の無刺激性オイル（例えば、合成モノ-またはジ-グリセリド）が用いられる。さらに、オレイン酸のような脂肪酸が、注射用調製物に用いられる。
悪性腫瘍の治療のために必要なピエリシンの投与量は、用法、患者の年令、性別、症状の程度、等を考慮して適宜決定されるが、通常、成人１日当たり、約0.1〜500mg程度であり、１日１回または数回に分けて投与する。
【００１５】
【実施例】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００１６】
［実施例１］  ピエリシンの内部アミノ酸配列の解析
ピエリシンは、モンシロチョウのさなぎから、Watanabeらの方法で精製した（Watanabe, M. et al.: Jpn. J. Cancer Res., 89: 556-561,1998)。ピエリシンをジチオスレイトールで還元後、４-ビニルピリジンでシステイン残基をピリジルエチル化した。これをリジルエンドペプチダーゼで限定分解後、逆相 HPLC でペプチドを分離した。分離ペプチドのアミノ酸配列を島津プロテインシーケンサー PSQ-1 で解析した。
【００１７】
［実施例２］  cDNA の合成
モンシロチョウの各発生段階から RNA を調製し(P. Chomczynsky and N. Sacchi, Anal. Biochem., 162, 156(1987))、Ambion 社の Retic Lysate IVT in vitro translation kit を用いてタンパク質を合成し、ヒト胃がん培養細胞 TMK-1 に対する細胞傷害性を検討した。最も細胞傷害性の高かった発生段階（５齢幼虫）の RNA から CLONTECH 社の CapFinder PCR cDNA library construction kit を用いて二本鎖 cDNA を合成した。得られた cDNA の 5' 側には既知の配列が付加されており、また 3' 側は poly-A 配列になっている（図１）。
【００１８】
［実施例３］  cDNA の単離と塩基配列の解析
ピエリシンの内部アミノ酸配列 （配列番号：１、および配列番号：２）を用いて degenerate primer を合成し、degenerate primer 同士、および degenerate primer と oligo(dT) primer を用いて PCR (PE Applied Biosystems 社の DNA thermal cycler model 9600 使用）を行った。PCR 反応液は 0.5 μL amplified cDNA, 1 μM each degenerate primer or 0.1 μM (dT)25 primer, 200 μM each dNTP, 2 mM MgCl2, 5 μL 10 x buffer for LA Taq (TAKARA), 2.5 units LA Taq DNA polymerase / 50 μL で、反応条件は 94℃, 1 min / 97℃-5 sec, 50℃-30 sec, 68℃-5 min X 5 cycle / 97℃-5 sec, 45℃-30 sec, 68℃-5 min X 5 cycle / 97℃-5 sec, 40℃-30 sec, 68℃-5 min X 20 cycle である。２つの内部アミノ酸配列から合成した degenerate primer の組み合わせ （配列番号：３、および配列番号：４） から約 1 kb のピエリシンの内部 cDNA が増幅された。また 3' 側の degenerate primer （配列番号：５）と oligo(dT) primerとの組み合わせから約 2 kb の 3' 側 cDNA が増幅された。1 kb、および ２kb断片をそれぞれ pBluescript KS+, pT7Blueに組込み、部分塩基配列を PE Applied Bi-osystems 社の ABI PRISM BigDye terminator cycle sequencing ready reacti-on kit と ABI377 PRISM DNA sequencer を用いて解析した。得られた情報から新たに primer（配列番号：６）を合成し、これと cDNA の 5' 側に付加されている既知の配列の primer（配列番号：７）から PCR を行い、5' 側の cDNA の増幅を行った。PCR 反応液は、primer 濃度がそれぞれ 0.3 μM である他は上記と同様で、反応条件は 94℃, 1 min / 97℃-5 sec, 55℃-30 sec, 68℃-4 min X 40 cycle である。約 1 kb の cDNA が増幅されたため、これを pBluescript KS+ に組込み、部分塩基配列を解析した。得られた情報からピエリシン cDNA の 5' 末端と 3' 末端の primer（配列番号：８および配列番号：９）を合成し、PCR を行い完全長の cDNA （約 4 kb）を合成した。PCR 反応液は、primer が異なる以外は 5' 側 cDNA の増幅を行った時と同一で、反応条件は 94℃, 1 min / 97℃-5 sec, 55℃-30 sec, 68℃-5 min X 30 cycle である（図２）。合成 cDNA から PCR-direct sequence によって、ピエリシン cDNA の塩基配列（配列番号：１４）および推定アミノ酸配列（配列番号：１５）をそれぞれ決定した（図３）。
【００１９】
［実施例４］  cDNA のプラスミドベクターへのクローン化
ピエリシン遺伝子の coding region (+ 293 bp 3' flanking region) を primer（配列番号：１０および配列番号：１１）を用いて PCR で増幅した。PCR は約 10 ng の 4 kb cDNA を template とし、増幅回数を20 cycle とする以外 4 kb の cDNA を増幅した条件と同様である。得られた DNA 断片は両端に EcoRI site をもち、その一方、増幅に用いた primer に存在しているミスマッチ配列により cDNA 内に存在していた唯一の EcoRI site は破壊されている。なお、この塩基配列変化は、アミノ酸配列を変えない。増幅 DNA 断片を EcoRI で分解後、λ gt10 のEcoRI site に組込み、組換えファージクローンを分離した（図４）。各ファージクローンについて PCR で T7 RNA promoter 配列を付加した後 T7 RNA polymerase を用いた in vitro transcription, ついで in vitro translation を行い、HeLa 細胞に対して細胞傷害活性を持つタンパク質が合成されたクローンを５つ選択した。５クローンのインサートの DNA 塩基配列を解析し、すべての塩基配列の変化を同定した。このうち、一つのクローンはインサート内の XbaI-XhoI 断片内にアミノ酸配列を変える塩基配列の変化が存在せず、別の一つのクローンは、その断片のみにアミノ酸配列を変える塩基配列の変化が存在した。そこで、これら２つのクローンを組換え、アミノ酸配列を変える塩基配列の変化がないクローンを作成した。クローンのインサートを pMAL-p2 の EcoRI site に組込み、プラスミドクローンを作成した（図５）。なおインサートは、pMAL-p2 の tac promoter に対して反対の方向に挿入されたクローンのみが得られた。単一クローンからプラスミドを調製し、インサートの DNA 塩基配列を解析し、新たな塩基配列変化がないことを確認し、ピエリシン cDNA クローン (clone 16-7) とした（図６）。
【００２０】
［実施例５］  in vitro でのタンパク質の発現および発現タンパク質の性質
本研究では、クローニングの過程で得られた PCR 産物、lambda phage clone, plasmid clone が機能性タンパク質をコードしているか否かを確認するために、以下の方法で in vitro でタンパク質を発現した。まず T7 RNA polymerase promoter 配列を上記 DNA の coding region の 5' 側に導入するために、primer（配列番号：１２および配列番号：１３）を用いて PCR を行った。PCR 条件は、cDNA のクローン化のときと同様である。得られた DNA から Ambion 社の MEGAscript を用いて RNA を合成し、得られた RNA から Ambion 社の rabbit reticulocyte lysate に 35S または cold のメチオニンを添加してタンパク質を合成した。10%ポリアクリルアミドゲルを用いたSDS-PAGE の結果（図７）から、clone 16-7 から発現したタンパク質はさなぎから精製したタンパク質と同じ分子量、約 98,000 であることが推定された。 TMK-1 細胞およびヒト子宮頸がん細胞 HeLa に発現タンパク質をlysateとして最終濃度3%および0.6%になるようにそれぞれ加え、37℃で18時間培養した場合、位相差顕微鏡（図８）およびHoechst33342で染色した蛍光顕微鏡解析（図９）より、両細胞とも、さなぎからのタンパク質を最終濃度  2.5ng/mlおよび0.5ng/mlになるように加えた時と同様の形態変化を起こし、発現タンパク質が正常に機能していることを示唆した。細胞からDNAを抽出し、アガロース電気泳動を行ったところ、発現タンパク質、さなぎからのタンパク質ともにヌクレオソーム単位への DNA の断片化が観察され、アポトーシスが起こっていることが明らかとなった（図１０）。
【００２１】
［実施例６］  タンパク質の大腸菌に対する毒性
さなぎから精製したタンパク質を、大腸菌の培養液に添加しても毒性は観察されない。しかし、クローン化遺伝子を pET32 に組込み大腸菌に導入し、遺伝子の発現を行うと、大腸菌は短時間で死滅した。また、PCR で増幅した coding region を pBluescript に組込みクローニングを試みたが、得られたクローンの大部分は機能性タンパク質をコードしておらず、活性が（弱いながら）あった３クローンの塩基配列は、いずれも A が８塩基つながった A455-462 のところが１塩基欠失していた。これらのことから、ピエリシンは、大腸菌内では非常に毒性が強い一方、大腸菌の外から中には侵入しないことが推定された。
【００２２】
［実施例７］  オオモンシロチョウから類似遺伝子のクローニング
オオモンシロチョウさなぎからタンパク質を精製し、モンシロチョウと同様に内部アミノ酸配列を用いて cDNA （配列番号：１６）を単離した。遺伝子から推定されたタンパク質のアミノ酸残基数はモンシロと同じ 850（配列番号：１７）, 分子量は 97,986 であった。91% のアミノ酸残基が同一であった。in vitro で発現したタンパク質は、TMK-1 および HeLa 細胞に細胞傷害活性を示した（図１１）。
【００２３】
【発明の効果】
本発明のPieris属由来タンパク質は低濃度で強い抗癌活性を示す。また、健常細胞に対する毒性が低いので、抗癌剤としての利用が期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】Pieris rapae幼虫組織中mRNAからのcDNAを得るためのフローチャートである。
【図２】PCRによるアポトーシス死誘導タンパク質cDNAの調製方法を示す図である。
【図３】Pieris rapae由来アポトーシス死誘導タンパク質のcDNA配列および推定アミノ酸配列を示す図である。
【図４】アポトーシス死誘導タンパク質cDNAのクローニング方法を示す図である。
【図５】Non-silent Mutationなしにアポトーシス死誘導タンパク質cDNAの構築する方法を示す図である。
【図６】アポトーシス死誘導タンパク質cDNAのクローン16-7を示す図である。
【図７】(a)アポトーシス死誘導タンパク質の発現方法を示す図である。(b)発現したアポトーシス死誘導タンパク質の10%ポリアクリルアミドゲルを用いたSDS-PAGEを示す図である。
【図８】TMK-1細胞およびHeLa細胞にrecombinant(Expressed)およびさなぎから精製した(Native)アポトーシス死誘導タンパク質を加えた時の位相差顕微鏡図である。
【図９】TMK-1細胞およびHeLa細胞にrecombinant(Expressed)およびさなぎから精製した(Native)アポトーシス死誘導タンパク質を加えた時の蛍光顕微鏡図である。
【図１０】TMK-1細胞およびHeLa細胞にrecombinant(Expressed)およびさなぎから精製した(Native)アポトーシス死誘導タンパク質(0.1μg/ml)を加えた時の細胞中のDNAの断片化を1.5%アガロースゲルを用いて調べた図である。
【図１１】TMK-1細胞およびHeLa細胞にオオモンシロチョウさなぎから精製した(Native)アポトーシス死誘導タンパク質を加えた時の位相差顕微鏡図である。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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