(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
(１) ｈＣＫＩδおよび／またはｈＣＫＩεタンパク質、並びにｈＰＥＲ１、ｈＰＥＲ２およびｈＰＥＲ３からなる群より選択される一またはそれ以上のヒトPeriodタンパク質からなるスクリーニング系に試験化合物を添加すること、および
(２) ヒトPeriodタンパク質のリン酸化のレベルを測定すること
からなる、一またはそれ以上のヒトPeriodタンパク質のリン酸化を変える試験化合物の能力を測定する方法。
【請求項２】
該化合物がｈＣＫＩεによるヒトPeriodタンパク質のリン酸化を変えるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該化合物がｈＣＫＩδによるヒトPeriodタンパク質のリン酸化を促進するものである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
スクリーニング系が細胞系または無細胞系である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
スクリーニング系が無細胞系である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
部分精製または精製したヒトPeriodタンパク質、ｈＣＫＩδまたはｈＣＫＩεを無細胞系で使用する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ヒトPeriodタンパク質およびｈＣＫＩεが組換え体源から得られる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
スクリーニング系が細胞をベースとした系である、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
細胞をベースとした系が原核細胞である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
原核細胞が細菌細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
細胞をベースとした系が真核細胞である、請求項４に記載の方法。
【請求項１２】
真核細胞が酵母細胞である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
酵母細胞が S. cerevisiaeである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
細胞をベースとした系が昆虫細胞である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
細胞をベースとした系が哺乳類細胞である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
哺乳類細胞がヒト細胞である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
哺乳類細胞がリンパ球細胞、繊維芽細胞、腫瘍細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、胎芽腎臓細胞、脳細胞、神経細胞、骨髄球細胞、グリア細胞および星状膠細胞である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
(１) 試験化合物をｈＣＫＩδおよび／またはｈＣＫＩεタンパク質、並びにｈＰＥＲ１、ｈＰＥＲ２およびｈＰＥＲ３からなる群より選択される二またはそれ以上の異なるｈＰＥＲタンパク質からなるスクリーニング系に添加すること、および
(２) ヒトPeriodタンパク質のリン酸化のレベルを測定すること
からなる、ヒトPeriodタンパク質のリン酸化を変える試験化合物の能力を測定する方法。
【請求項１９】
該化合物がｈＣＫＩεによるヒトPeriodタンパク質のリン酸化を変えるものである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
該化合物がｈＣＫＩδによるヒトPeriodタンパク質のリン酸化を変えるものである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
スクリーニング系が無細胞系である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
無細胞系で部分精製または精製したヒトPeriodタンパク質、ｈＣＫＩδまたはｈＣＫＩεを使用する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ヒトPeriodタンパク質、ｈＣＫＩδまたはｈＣＫＩεが組換え体源から得られる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
スクリーニング系が細胞をベースとした系である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
細胞をベースとした系が原核細胞である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
原核細胞が細菌細胞である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
細胞をベースとした系が真核細胞である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
真核細胞が酵母細胞である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
酵母細胞が S. cerevisiaeである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
真核細胞が昆虫細胞である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
真核細胞が哺乳類細胞である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
哺乳類細胞がヒト細胞である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
哺乳類細胞がリンパ球細胞、繊維芽細胞、腫瘍細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、胎芽腎臓細胞、脳細胞、神経細胞、骨髄球細胞、グリア細胞および星状膠細胞である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
(１) ｈＣＫＩδおよび／またはｈＣＫＩεタンパク質、並びにｈＰＥＲ１、ｈＰＥＲ２およびｈＰＥＲ３からなる群より選択されるｈＰＥＲタンパク質からなるスクリーニング系に試験化合物を添加すること、および
(２) ｈＣＫＩδおよび／またはｈＣＫＩεタンパク質、並びにｈＰＥＲ１、ｈＰＥＲ２およびｈＰＥＲ３からなる群から選択される一つのｈＰＥＲタンパク質からなるスクリーニング系に試験化合物を添加すること、ただしここで（２）で選択されたｈＰＥＲタンパク質は（１）で選択されたｈＰＥＲタンパク質ではない；
(３) （１）および（２）のヒトPeriodタンパク質のリン酸化のレベルを測定すること；並びに
(４) ｈＰＥＲ１、ｈＰＥＲ２および／またはｈＰＥＲ３のリン酸化を変える上記試験化合物が選択的であるかどうかを調べる目的で、各ヒトPeriodタンパク質について（３）で得られた結果を比較すること
からなる、ヒトPeriodタンパク質のリン酸化を選択的に変える試験化合物の能力を測定する方法。
【請求項３５】
該化合物がｈＣＫＩεによるヒトPeriodタンパク質のリン酸化を変えるものである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
該化合物がｈＣＫＩδによるヒトPeriodタンパク質のリン酸化を促進するものである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
スクリーニング系が細胞をベースとした系または無細胞系である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
スクリーニング系が無細胞系である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
無細胞系で部分精製または精製したヒトPeriodタンパク質、ｈＣＫＩδまたはｈＣＫＩεを使用するものである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
ヒトPeriodタンパク質およびｈＣＫＩεが組換え体源から得られるものである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
スクリーニング系が細胞をベースとした系である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４２】
細胞をベースとした系が原核細胞である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
原核細胞が細菌細胞である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
細胞をベースとした系が真核細胞である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４５】
真核細胞が酵母細胞である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
酵母細胞が S. cerevisiaeである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
細胞をベースとした系が昆虫細胞である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４８】
細胞をベースとした系が哺乳類細胞である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４９】
哺乳類細胞がヒト細胞である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
哺乳類細胞がリンパ球細胞、繊維芽細胞、腫瘍細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、胎芽腎臓細胞、脳細胞、神経細胞、骨髄球細胞、グリア細胞、星状膠細胞である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
(１) 試験化合物をｈＣＫＩδおよび／またはｈＣＫＩεタンパク質、並びにｈＰＥＲ１、ｈＰＥＲ２およびｈＰＥＲ３からなる群より選択される一つのｈＰＥＲタンパク質からなるスクリーニング系に添加すること、
(２) 試験化合物の添加後、ヒトPeriodタンパク質の量を測定すること、および
(３) 工程（２）で得られたヒトPeriodタンパク質の量とスクリーニング系におけるヒトPeriodタンパク質の量とを比較すること
からなる、ヒトPeriodタンパク質の分解を変える試験化合物の能力を測定する方法。
【請求項５２】
(１) 試験化合物およびｈＣＫＩδおよび／またはｈＣＫＩεタンパク質を、ｈＰＥＲ１、ｈＰＥＲ２およびｈＰＥＲ３からなる群より選択される一つのｈＰＥＲタンパク質からなるスクリーニング系に添加すること、
(２) 試験化合物およびｈＣＫＩδおよび／またはｈＣＫＩεタンパク質の添加後、ヒトPeriodタンパク質の量を測定すること、および
(３) 工程（２）で得られたヒトPeriodタンパク質の量と、スクリーニング系におけるヒトPeriodタンパク質の量とを比較すること
からなる、ヒトPeriodタンパク質の分解を変える試験化合物の能力を測定する方法。
【請求項５３】
(１) ｈＣＫＩδおよび／またはｈＣＫＩεタンパク質を、試験化合物並びにｈＰＥＲ１、ｈＰＥＲ２およびｈＰＥＲ３からなる群から選択される一つのｈＰＥＲタンパク質からなるスクリーニング系に添加すること、
(２) ｈＣＫＩδおよび／またはｈＣＫＩεタンパク質の添加後、ヒトPeriodタンパク質の量を測定すること、および
(３) 工程（２）で得られたヒトPeriodタンパク質の量と、スクリーニング系におけるヒトPeriodタンパク質の量とを比較すること
からなる、ヒトPeriodタンパク質の分解を変える試験化合物の能力を測定する方法。
【請求項５４】
ヒトPeriodタンパク質がヒトPeriod１である、請求項１に記載の方法。
【請求項５５】
ヒトPeriodタンパク質がヒトPeriod２である、請求項１に記載の方法。
【請求項５６】
ヒトPeriodタンパク質がヒトPeriod３である、請求項１に記載の方法。
【請求項５７】
(１) 試験化合物をｈＣＫＩδおよび／またはｈＣＫＩεタンパク質、並びにｈＰＥＲ１、ｈＰＥＲ２およびｈＰＥＲ３からなる群より選択される一またはそれ以上のヒトPeriodタンパク質からなるスクリーニング系に添加すること、および
(２) 試験化合物が存在しない場合の哺乳類の概日リズムを基準にして哺乳類の概日リズムに与える効果を測定すること
からなる、哺乳類の概日リズムを変える試験化合物の能力を測定する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術的分野】
本発明は哺乳類の概日リズムを変える試験化合物、および更に具体的にはヒトClockタンパク質、ヒトPeriod１、ヒトPeriod２およびヒトPeriod３をリン酸化するヒトカゼインキナーゼＩδおよび／またはεの能力を変える試験化合物を同定する方法に関する。
【０００２】
【発明の背景】
内因性の生物学的なペースメーカーにより生じる概日リズムは、ヒト、真菌、昆虫および細菌を含む多くの様々な生物に存在する（Dunlap, J.C. (1999) Cell, 96, 271-290；Hastings, J.W., et al., (1991) in Neural and Integrative Animal Physiology, ed. Prosser, C.L. (New York: Wiley-Liss), pp.435-546; Allada, R., et al., (1998) Cell, 93, 791-804; Kondo, T., et al., (1994) Science, 266, 1233-1236; Crosthwaite, S.K., et al., (1997) Science, 276, 763-769）。概日時計は生物学的リズムの維持に不可欠である。概日時計は自動的に継続し、完全に暗い条件下ですら一定であるが、光および温度変化のような環境シグナルにより別の細胞周期に同調する。
【０００３】
内因性時計は行動、食事の摂取および睡眠／覚醒サイクルにおける日変動およびホルモン分泌のような生理学的変化、および体温の変動を含む活動のパターンを制御する（Hastings, M., (1997) Trends Neurosci. 20, 459-464; Kondo, T., et al., (1993) Proc. Natｌ. Acad. Sci. USA, 90, 5672-5676; Reppert, S.M., & Weaver, D.R. (1997) Cell, 89, 487-490)。
【０００４】
概日リズムに関するいくつかの遺伝子の説明のためにショウジョウバエにおける遺伝学的および分子的研究が考慮されてきた。これらの研究から分かったことは、厳密に自動制御され、転写／翻訳に基づく負のフィードバックループから構成される１つの経路である（Dunlap, J.C. (1999) Cell, 96, 271-290; Dunlap, J.C. (1996) Annu. Rev. Genet. 30, 579-601; Hall, J.C. (1996) Neuron, 17, 799-802）。中央時計の２つの重要な構成要素はPeriodまたはＰＥＲおよびTimelessまたはＴＩＭと称される分子である。
【０００５】
ショウジョウバエで最初に発見されたｐｅｒ遺伝子座は、成虫の脱蛹行動および運動行動における概日リズム制御に必要な要素である（Konopka, R.J., & Benzer, S. (1971) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 68, 2112-2116）。ＰＥＲのミスセンス突然変異は概日リズムの周期を短縮（ｐｅｒs）または長くする(ｐｅｒL)ことができ、一方ナンセンス突然変異（ｐｅｒo）はそれらの活動上の非周期性の原因となる（Hall, J.C. (1995) Trends Neurosci. 18, 230-240）。哺乳類の視交叉上核（ＳＣＮ）においては、３つのＰＥＲホモログであるｐｅｒ１、ｐｅｒ２、およびｐｅｒ３が同定されている。これら哺乳類遺伝子のタンパク質産物はいくつかの互いに相同な領域を共有する（zylka, M.J., et al., (1998) Neuron 20, 1103-1110; Albrecht, U., et al., (1997) Cell 91, 1055-1064.）。ＰｅｒのｍＲＮＡおよびタンパク質のレベルは日周期で変動するが、ＰＥＲ１およびＰＥＲ２のみは光に応答して変動する（Zylka, M.J., et al., (1998) Neuron 20, 1103-1110., Shearman, L.P., et al., (1997) Neuron 19, 1261-1269）。
【０００６】
ＰＥＲタンパク質は全て、ダイマー形成に必要なＰＡＳドメインと称するタンパク質／タンパク質相互作用領域を含有する（Zylka, M.J., et al., (1998) Neuron 20, 1103-1110）。ＰＡＳを含有する他のタンパク質であるＴＩＭはベイトとしてＰＥＲを用いた酵母２−ハイブリット遺伝学的スクリーニングにより単離された（Gekakis, N., et al., (1995) Science 270, 811-815）。ＰＥＲタンパク質レベルが増加するに従い、ＰＥＲはＴＩＭと共にヘテロダイマーを形成する。ＴＩＭ／ＰＥＲヘテロダイマー形成はＰＥＲの調節に必要である。その理由は、ｔｉｍ変異がｐｅｒ ｍＲＮＡ変動喪失およびＰＥＲの核移行不能に伴って生じる概日リズム喪失の原因となるからである（Sangoram, A.M., et al., (1998) Neuron 21, 1101-1113; Zylka, M.J., et al., (1998) Neuron 21, 1115-1122)。
【０００７】
最近、ＣＬＯＣＫおよびＢＭＡＬ／ＭＯＰ３を含む概日リズムの構成要素であるいくつかの別の分子が、遺伝学的スクリーニングおよび生化学的特徴づけの手法を用いて発見された（Gekakis, N., et al., (1998) Science 280, 1564-1569; King, D.P., et al., (1997) Cell 89, 641-653; Allada, R., et al., (1998) Cell 93, 791-804）。
【０００８】
その後の研究で、ＰＥＲが転写レベルでどのように調節されるのか明らかになった。ＣＬＯＣＫおよびＢＭＡＬ／ＭＯＰ３は、どちらもベーシック−へリックス−ループ−へリックス ドメインであるＰＡＳドメインを含有し、そして互いにヘテロダイマーを形成する。ＰＥＲが転写され、翻訳され、そして蓄積すると、ＰＥＲは核移行し、それらの共通のＰＡＳドメインを介してＣＬＯＣＫに結合し、負のフィードバックループ形成して、それ自身の転写をダウンレギュレーションする（Allada, R., et al., (1998) Cell 93, 791-804; Darlington, T.K., et al., (1998) Science 280, 1599-1603; Hao, H., et al., (1997) Mol. Cell. Biol. 17, 3687-3693; Jin, X., et al., (1999) Cell 96, 57-68）。
【０００９】
さらに、ＰＥＲは調節され、転写後レベルで制御される。ＰＥＲおよびＴＩＭのどちらも概日変動に影響されるリン酸化を受けるようである（Edery, I., et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 2260-2264; Lee, C., et al., (1998) Neuron 21, 857-867）。ダブルタイム（ＤＢＴ）と称されるショウジョウバエのキナーゼが最近クローン化された（Price, J.L., et al., (1998) Cell 94, 83-95, Kloss, B., et al., (1998) Cell 94, 97-107）。ＤＢＴにおける変異は行動リズムの周期を短くするかまたは長くするかのいずれかの原因となる。ＤＢＴにおけるＰ因子挿入突然変異により、幼虫の脳におけるＰＥＲの概日変動をなくす。これはＤＢＴがショウジョウバエ時計の不可欠な構成要素であることを指し示している。ＰＥＲはこれらの変異体に高レベルで蓄積し、低リン酸化される。ＤＢＴはＰＥＲを直接リン酸化することが示されなかった。ＣＫＩεは哺乳類における密接な関係があるＤＢＴのホモログである（Kloss, B., et al., (1998) Cell  94, 97-107)。ＣＫＩεおよびＤＢＴはキナーゼドメインのアミノ酸レベルが８６％相同である。Fishらにより最初に同定されたｈＣＫＩεはセリン／スレオニンプロテインキナーゼ活性を有するＣＫＩのアイソフオーム（α,β,γ,δ）のひとつである（Fish, K.J., et al., (1995) J. Biol. Chem. 270, 14875-14883; Rowles, J., et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 9548-9552)。ＣＫＩは細胞のＤＮＡ代謝制御に関連がある。ＨＲＲ２５遺伝子（哺乳類のＣＫＩのホモログ）欠損型サッカロミセス突然変異体は二本鎖ＤＮＡ切断に感受性を示す（Hoekstra, M.F., et al., (1991) Science 253, 1031-1034)。ｈＣＫＩに対するインビトロの基質のいくつかが同定されており、それにはＲＮＡポリメラーゼＩおよびII、ｐ５３、ＩκＢα、およびシミアンウイルス４０ラージＴ抗原が含まれる。しかし、基質の機能を変化させるｈＣＫＩのリン酸化に関係するという証拠はほとんど無く、そして現在まで、どのclock遺伝子もｈＣＫＩδおよびε基質であると示されていない。
【００１０】
概日リズムは概日経路において鍵となる特定のタンパク質の連続的なリン酸化、およびそのタンパク質レベルの変化により制御される。概日時計経路の中心の構成要素であるPeriod（ＰＥＲ）は、その量およびリン酸化状態における日変動を受ける。ＰＥＲ遺伝子はショウジョウバエＰＥＲ（ｄＰＥＲと示す）、マウスＰＥＲ（ｍＰＥＲと示す）、およびヒトＰＥＲ（ｈＰＥＲと示す）が同定されている。ショウジョウバエではＰＥＲが一種だけであり、ＰＥＲ１タンパク質と最も相同性がある。ヒトおよびマウスの両方は３種のＰＥＲ（ＰＥＲ１、２および３と示す）を有する。
【００１１】
【発明の概要】
本発明は、ｈＣＫＩδおよびεがヒトPeriodタンパク質をリン酸化し、リン酸化されたヒトPeriodタンパク質が分解するという発見に関する。その結果、本発明は、哺乳類の概日リズムを変える試験化合物を同定する方法、およびさらに具体的には、ｈＣＫＩδおよびεによるヒトPeriodタンパク質のリン酸化を変える試験化合物の能力を測定する方法に関する。また本発明は、リン酸化されたヒトPeriodタンパク質の分解を変える試験化合物の能力を測定する方法に関する。また本発明は１種またはそれ以上のヒトPeriodタンパク質のリン酸化あるいは分解を選択的に変える試験化合物の能力を、異なるPeriodタンパク質のリン酸化あるいはまた分解を変え、引き続き哺乳類の概日リズムを変えるその能力に比較して測定する方法に関する。
【００１２】
添付図面において：
図１．組換えｈＣＫＩεによるカゼイン、ＩκＢα、およびｈＰＥＲ１のインビトロのリン酸化
組換えカゼインキナーゼ（複数可）の精製およびキナーゼアッセイ条件は、後記の“実験材料および実験方法”に記載する。(Ａ）ｈＣＫＩε（レーン１〜３)、ｈＣＫＩε−Ｋ３８Ｒε（レーン４〜６）、またはコントロールとしての緩衝液（レーン７および８）は、単独で（レーン１および４）、カゼインと共に（レーン２および５）、またはＩκＢαと共に（レーン３および６）インキュベートし、そして“実験材料および実験方法”に記載のとおりにキナーゼアッセイを実施する。分子量マーカーを左に示す。（Ｂ）ベクター（レーン１、４および８）、ルシフェラーゼ（レーン２、５および９）またはｈＰＥＲ１（レーン３、６および１０）をトランスフェクションした２９３Ｔ細胞溶解物を調製し、Ｍ２抗−フラッグモノクローナル抗体を用いて免疫沈降し、次いでキナーゼアッセイをｈＣＫＩε（レーン１〜６）、ｈＣＫＩε−Ｋ３８Ｒε（レーン７）またはコントロールとしての緩衝液（レーン８〜１０）を用いて実施する。キナーゼアッセイ前に免疫沈降物を６５℃、３０分間の熱処理により不活化する（レーン４〜６）。試料を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離する。ゲルをクマシーＲ−２５０で染色し、乾燥してオートラジオグラフィーに付す。
【００１３】
図２．(ＡおよびＢ)ｈＰＥＲ１およびｈＣＫＩεのウエスタンブロット分析
２９３Ｔ細胞にｈＰＥＲ1およびベクター（レーン１）、ｈＰＥＲ１およびｈＣＫＩε（レーン２）、ｈＰＥＲ１およびｈＣＫＩε−Ｋ３８Ｒ（レーン３）、ベクターおよびｈＣＫＩε（レーン４）、またはベクターおよびｈＣＫＩε−Ｋ３８Ｒ（レーン５）をトランスフェクションする。トランスフェクション後２４時間で、細胞を採集し溶解物を“実験材料および実験方法”に記載のように調製する。４０μｇの２９３Ｔ細胞溶解物総量を３〜８％勾配ＮＵ−ＰＡＧＥにロードする。タンパク質をＰＶＤＦ膜に転写してＭ２抗−フラッグモノクローナル抗体（１:１０００）または抗−ｈＣＫＩεモノクローナル抗体（１:７５０）を用いてウエスタンブロットする。（Ｃ）ｈＰＥＲ１のラムダホスファターゼ処理。２９３Ｔ細胞にｈＰＥＲ１およびベクター（レーン１および４）、ｈＰＥＲ１およびｈＣＫＩε（レーン２および５）、またはｈＰＥＲ１およびｈＣＫＩε−Ｋ３８Ｒ（レーン３および６）をトランスフェクションし、［35Ｓ］メチオニン（２５０μCi／ml）で標識する。溶解物をＭ２抗−フラッグモノクローナル抗体を用いて免疫沈降し、次に組換えラムダフォスファターゼで処理（レーン４、５および６）または偽処理（レーン１、２および３）のいずれかを行う。
【００１４】
図３．ｈＣＫＩεを同時にトランスフェクションしたｈＰＥＲ１のパルス−チェイス標識
２９３Ｔ細胞にｈＰＥＲ１およびベクター（パネルＡ）またはｈＰＥＲ１およびｈＣＫＩε（パネルＢ）のいずれかを同時にトランスフェクションする。トランスフェクション後３時間で、２９３Ｔ細胞を［35Ｓ］メチオニンおよびシステイン（１０００μCi／ml）を用いて３０分間パルス標識し、次いで各ゲルの上に示した時間でチェイスする。細胞を溶解し、Ｍ２抗−フラッグモノクローナル抗体を用いて免疫沈降し、ｈＰＥＲ１を８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離する。分子量マーカーを左に示す。（Ｃ）各レーンからのｈＰＥＲ１バンドを取り囲みかつ含有する領域のホスホイメージングスキャンを表した棒グラフ。バー（２〜３０時間）はゼロ時点のカウントと比較した１分当りの総カウント（cpm）の百分率に基づく。黒いバーはベクターと同時にトランスフェクションしたｈＰＥＲ１を示す。縞のバーは、ｈＣＫＩεと同時にトランスフェクションしたｈＰＥＲ１を示す。
【００１５】
図４．ｈＰＥＲ１およびｈＣＫＩε間のタンパク質相互作用（Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ）
２９３Ｔ細胞にベクターおよびｈＣＫＩε（レーン１）、ベクターおよびｈＰＥＲ１（レーン２）、およびｈＣＫＩεおよびｈＰＥＲ１（レーン３）をトランスフェクションする。トランスフェクション後２４時間で、細胞を採集し、溶解物を調製する。溶解物をＭ２抗−フラッグモノクローナル抗体（パネルＡおよびＣ）、ＨＡモノクローナル抗体（パネルＢ）、または抗−ｈＣＫＩεモノクローナル抗体（パネルＤ）を用いて免疫沈降し、抗−ＨＡモノクローナル抗体（パネルＡ）、Ｍ２抗−フラッグモノクローナル抗体（パネルＢおよびＤ）、または抗−ｈＣＫＩεモノクローナル抗体（パネルＣ）を用いてウエスタンブロットする。レーン４では、ウエスタンブロット分析を上記のモノクローナル抗体を用いた免疫沈降前の粗溶解物について実施する。全てのタンパク質を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離する。
【００１６】
図５．ｈＣＫＩεのリン酸化部位のマッピング
（Ａ）トランケーションして組換えたｈＰＥＲ１変異体の略図。トランケーション変異体を後記の“実験材料および実験方法”に記載のとおりに構築する。ＯＲＦはｈＰＥＲ１の完全なオープン・リーデイング・フレームであるアミノ酸残基１〜１２８９を示す。Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、およびＣ５作製のために使用した制限酵素部位を表１に示す。白抜きのバーは分子量の移動を示さなかった変異体を表す。黒いバーは分子量の移動を示した変異体を表す。ＯＲＦ、Ｎ２、Ｎ３、およびＮ４の縞の領域は、ｈＣＫＩεによるｈＰＥＲ１の推定リン酸化領域を表す。（Ｂ）同時にトランスフェクションした２９３Ｔ細胞溶解物由来のｈＰＥＲ１トランケーション変異体をのウエスタンブロット分析。ｈＰＥＲ１およびベクター（レーン１）、ｈＰＥＲ１およびｈＣＫＩε（レーン２）、またはｈＰＥＲ１およびｈＣＫＩε−Ｋ３８Ｒ（レーン３）を２９３Ｔ細胞に同時にトランスフェクションして、ｈＰＥＲ１をＭ２抗−Ｆｌａｇモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロット分析により分析する。分子量マーカーを左に示す。矢印は各トランケート変異体タンパク質の移動位置を示す。ｈＰＥＲ１ＯＲＦおよび変異体Ｎ１およびＮ２を規定通りに１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、一方ｈＰＥＲ１変異体であるＮ３、Ｎ４、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ５、およびＣ６を規定通りに１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離する。
【００１７】
図６．Period ｍＲＮＡ濃度
横軸に時間単位で時間を示す；縦軸は時間経過における活性、体温およびＰｅｒ ｍＲＮＡレベルである。Ｐｅｒ ｍＲＮＡレベルは２４時間周期で変動し、ショウジョウバエでは周期長と逆相関している。同様な変動が正常Ｐｅｒマウスにて観察される；ところが、Ｐｅｒノックアウトマウスは異常な概日リズムを有する。
【００１８】
図７．Clockタンパク質経路
これはClockタンパク質経路の略図である。ｈＣＫＩδおよび／またはεはPeriodを、ＰＯ4で表されるように、リン酸化し、次いでその分解に至る。ClockおよびＢＭａｌはＰＡＳドメインで相互作用し、そしてPeriodのｍＲＮＡの転写を開始し、Periodタンパク質レベルを増加する結果になる。
【００１９】
図８．時間経過におけるPeriodタンパク質およびリン酸化のレベル
横軸は２４時間周期に対する時間表示の時間であり；もう一方の軸はPeriodタンパク質（白で示される）およびリン酸化レベル（色で示される）である。概日周期の最初に、Periodタンパク質のレベルは低く、相対的にリン酸化されていない。Periodタンパク質のレベルが増加して午後８時ごろにピークを迎えるに従い、Periodタンパク質の相対的なリン酸化もまた増加し、Periodタンパク質のレベルが減少するにつれてそのリン酸化はなおも続く。
【００２０】
図９．ＣＫＩε／ヒトPeriod１の同時トランスフェクション
右上のパネルはｈＰｅｒ１のリン酸化を示す。最初のカラムは試験化合物１μＭを示す；第２カラムは試験化合物１０μＭを示す; 第３カラムは試験化合物３０μＭを示す；第４カラムはＰｅｒのみを示す；第５カラムおよび最終カラムはＰｅｒおよびｈＣＫＩεを示す。右上のパネルはコントロールの試験化合物を示す。中央のパネルはＣＫＩε阻害剤試験化合物Ｓ９４３１６６を示し、右下のパネルはＣＫＩε阻害剤試験化合物Ｗ０２３６を示す。これらの結果はＰｅｒリン酸化の阻害がタンパク質の安定性およびレベルの増加という結果になることを証明する。
【００２１】
図１０．ヒトPeriod ｍＲＮＡレベル
上のグラフは下のグラフで示したデータを絵で表現したものを提供する。横軸は時間で表された時間である；もう片方の軸はＲＴ−ＰＣＲにより測定したＲａｔ１繊維芽細胞またはラットＳＣＮ（視交叉上核）のいずれかの相対的なリアル−タイムの内因性ｈＰＥＲ１ ｍＲＮＡレベルである。２つの試験化合物の説明をする；ボックスで示される試験化合物は“Ｃ”であり、１０μＭで細胞に添加する。三角で示される第２の試験化合物は“Ｆ”（フルオキシチン）であり、１０μＭで細胞に添加する。培養細胞の概日リズムは時間が経過するにつれ減少し、従って応答の振幅が時間が経過するにつれ減少する。これらの結果はコントロールの化合物がＣＫＩ活性を変えないということ、また細胞の概日リズムも変えないということを示す。
【００２２】
図１１．ヒトPeriod ｍＲＮＡレベル
上のグラフは下のグラフで示したデータを絵で表現したものを提供している。横軸は時間表示の時間である；他方の軸はＲＴ−ＰＣＲにより測定したＲａｔ１繊維芽細胞またはラットＳＣＮ細胞のｈＰＥＲ１の相対的なリアル−タイムのｍＲＮＡのレベルである。２つの試験化合物を説明する；ボックスで示される試験化合物は“Ｃ”であり、１０μＭで細胞に添加し、三角で示される第２の試験化合物はＳ９４３１６６であり、１０μＭで細胞に添加する。これらの結果は、試験化合物Ｓ９４３１６６がｈＰＥＲ１のｍＲＮＡの変動をシフトすることにより細胞の概日リズムを変化させ、そして概日リズムを約２０時間に短縮するという結果を示す。
【００２３】
【発明の詳述】
本発明は哺乳類の概日リズムを変える試験化合物を同定する方法に関し、さらに具体的には、ｈＣＫＩδおよび／またはεによるヒトPeriodタンパク質、好ましくはヒトPeriod１、ヒトPeriod２および／またはヒトPeriod３に対するリン酸化を変える試験化合物の能力を測定する方法に関する。さらに、本発明はリン酸化されたヒトPeriodタンパク質の分解を変化させる試験化合物の能力を測定する方法に関する。また本発明は異なるヒトPeriodタンパク質のリン酸化（または分解）を変化させる試験化合物の能力に関する１種またはそれ以上のヒトPeriodタンパク質のリン酸化（または分解）を選択的に変える試験化合物の能力を測定する方法に関する。
【００２４】
本発明はｈＣＫＩδおよび／またはεによるｈＰＥＲ１、ｈＰＥＲ２および／またはｈＰＥＲ３のリン酸化を変える試験化合物の能力を測定する方法、および細胞におけるｈＣＫＩδおよび／またはεによりリン酸化されたｈＰＥＲ１、ｈＰＥＲ２および／またはｈＰＥＲ３の分解を変える化合物を同定する方法に関する。また本発明はｈＰＥＲ１、ｈＰＥＲ２および／またはｈＰＥＲ３の安定性を変える、またはｈＰＥＲ１、ｈＰＥＲ２および／またはｈＰＥＲ３のタンパク質分解を増加する試験化合物の能力を測定する方法に関する。本発明は哺乳類の概日リズムを変える試験化合物の能力を測定する方法を提供する。
【００２５】
本発明の特徴の１つは、ｈＣＫＩδおよび／またはεによるｈＰＥＲ１、ｈＰＥＲ２およびｈＰＥＲ３のリン酸化を変える試験化合物の能力を測定することである。本発明の他の特徴はリン酸化が可能な条件下でｈＰＥＲ１、ｈＰＥＲ２およびｈＰＥＲ３からなる群より１種選択されるヒトPeriodタンパク質、およびｈＣＫＩδおよび／またはεからなるスクリーニング系に試験化合物を添加し、そしてヒトPeriodタンパク質のリン酸化のレベルを測定することからなるｈＣＫＩδおよび／またはεによるｈＰＥＲ１、ｈＰＥＲ２およびｈＰＥＲ３のリン酸化を阻害する試験化合物の能力を測定することである。一つの好ましい実施態様で、スクリーニング系はホスフェート源を含む。好ましいホスフェート源の１つはＡＴＰである。
【００２６】
「アミノ酸」という用語は光学異性体、すなわち天然型および非天然型アミノ酸のＬ型異性体およびＤ型異性体をどちらも含む意味である。従って、「ペプチド」という用語は、Ｌ−アミノ酸のみにより構成されるペプチドだけでなく、部分的または完全にＤ−アミノ酸により構成されるペプチドを含む意味である。
【００２７】
さらに、「アミノ酸」という用語は、天然のタンパク質を構成する２０のみの天然型アミノ酸残基、並びに他のα−アミノ酸、β−、γ−およびδ−アミノ酸、および非天然型アミノ酸等を含む。従って、該タンパク質、ヒトPeriodおよびヒトｈＣＫＩδおよび／またはεは、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基すなわち保存的アミノ酸残基、例えば天然タンパク質を構成するα−アミノ酸残基、並びに他のα−アミノ酸残基、β−、γ−およびδ−アミノ酸残基、非天然型アミノ酸残基等のうちの１つと同様の電荷、極性または他の性質を有するもので修飾され得る。適当なβ−、γ−およびδ−アミノ酸の例には、β−アラニン、γ−アミノブタン酸およびオルニチンが含まれる。天然型タンパク質を構成するもの以外の他のアミノ酸残基または非天然型アミノ酸の例には、３,４−ジヒドロキシフェニルアラニン、フェニルグリシン、シクロへキシルグリシン、１,２,３,４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボキシル酸またはニペコチン酸が含まれる。
【００２８】
「ｈＰＥＲ１」、「ｈＰＥＲ２」、「ｈＰＥＲ３」、「ｈＣＫＩδ」および「ｈＣＫＩε」という用語は、それぞれヒトPeriod１、ヒトPeriod２、ヒトPeriod３、ヒトカゼインキナーゼＩδおよびヒトカゼインキナーゼＩεの全長タンパク質、ｈＰＥＲ１、ｈＰＥＲ２、ｈＰＥＲ３、およびｈＣＫＩδおよび／またはεタンパク質のアレルおよび誘導体を含む。誘導体はこれらのタンパク質の天然型からの（１種またはそれ以上の異なるアミノ酸、トランケートタンパク質、および３′または５′−のいずれかに‘タグ’を含む全長またはトランケートしたタンパク質との融合タンパク質、並びに前記引用文献にて提供されそしてGeneBank等の公共のデータベースに提示された天然型および非天然型変異体の配列による）交互変化を含む。これらのタンパク質誘導体にはリーダー、エピトープまたは他のタンパク質の配列、例えばＭｙｃTM−タグ付き、ヒスチジンのタグ付き、またはＦｌａｇTMエピトープタグ付き配列を含有するタンパク質が含まれる。ヒトPeriod１配列はH. Teiにより１９９７年３月２４日に提示されたGene Bank Accession AB002107、NID g2506044で得られる。また、ヒトPeriod１配列はTei, H., et al., Nature 389: 512−516 (1997）に公開されている。ヒトPeriod２配列はT. Nagaseらにより提示されたGene Bank Accession NM003894、NID g4505710にて利用できる。また、ヒトPeriod２配列はNagase, T., et al., DNA Res. 4(2): 141−150 (1997）およびShearman, L.P., et al., Neuron 19(6): 1261−1269 (1997）に公開されている。ヒトPeriod３のゲノム配列はGene Bank Accession Z98884で得られる。ヒトカゼインキナーゼＩδ配列はGene Bank Accession U29171で得られる。またヒトカゼインキナーゼＩδはKusda, J., et al, Genomics 32: 140−143 (1996）に公開された。ヒトカゼインキナーゼＩε配列はGeneBank Accession L37043にて得られる。またヒトカゼインキナーゼＩεはFish, K.J. et al., J. Biol. Chem. 270: 14875-14883 (1995）に公開された。ｃ−ＭＹＣタグ付きＣＫＩδはDavid Virshup博士からの寄付であった。
【００２９】
「塩基配列」という用語は、ｈＰＥＲ１、ｈＰＥＲ２、ｈＰＥＲ３、またはｈＣＫＩεをコードするＲＮＡ配列並びにＤＮＡ配列、およびその誘導体を意味する。
【００３０】
本発明に関する「ｈＣＫＩδ」および「ｈＣＫＩε」タンパク質はここに記載されたようなヒトＰｅｒタンパク質に対して実質的に同様なリン酸化活性を有する、タンパク質またはその誘導体である。ｈＣＫＩδおよび／またはεタンパク質は天然に存在するｈＣＫＩδおよび／またはε、アレルおよびその誘導体と実質的に同様な活性を有するタンパク質である。ｈＣＫＩδおよび／またはεは、ｈＰＥＲ１、ｈＰＥＲ２、および／またはｈＰＥＲ３に対してそのキナーゼ活性を保持するか、またはｈＰＥＲ１、ｈＰＥＲ２、および／またはｈＰＥＲ３をリン酸化するそれの能力が本質的には変わらない方法で修飾された他の哺乳類のカゼインキナーゼＩタンパク質を含む。ヒト型ｈＣＫＩδおよび／またはεが好ましい。しかし、他の哺乳類型ｈＣＫＩδおよび／またはεを用いてもよい。その理由は、例えば、ヒトｈＣＫＩδおよびラットｈＣＫＩδは９７％の相同性であり、そのキナーゼドメイン（２８４アミノ酸残基）の配列は完全に相同だからである。修飾されたタンパク質にはｈＣＫＩδおよび／またはεのトランケート型、アミノ酸の置換、欠失、付加等を含有するｈＣＫＩδおよび／またはεの誘導体が含まれ、それらはｈＰＥＲ１、ｈＰＥＲ２および／またはｈＰＥＲ３をリン酸化する能力を保持している。カゼインキナーゼＩ誘導体はリーダー、エピトープまたは他のタンパク質配列、例えばＭｙｃTMタグ付き、ヒスチジンタグ付き、またはＦｌａｇTMエピトープタグ配列を含有するタンパク質を含み、かつｈＰＥＲ１リン酸化活性を有する。このような誘導体は精製を容易にするか、セファロースビーズへの吸着または簡単な検出を可能にする。
【００３１】
ｈＰＥＲ１、ｈＰＥＲ２および／またはｈＰＥＲ３の誘導体にはリーダー、エピトープまたは他のタンパク質配列、例えばＭｙｃTMタグ付き、ヒスチジンタグ付き、またはＦｌａｇTMエピトープタグ配列を含有するタンパク質が含まれており、ｈＣＫＩεによりリン酸化される能力を保持する。このような誘導体は精製を容易にするか、セファロースビーズへの吸着または簡単な検出を可能にする。
【００３２】
好ましいヒトPeriodタンパク質は１またはそれ以上のｈＣＫＩεリン酸化共通配列‘ＤＸＸＳ’を有するタンパク質からなり、ここでＤはグルタミン酸残基、Ｘはいずれかのアミノ酸残基、そしてＳはセリン残基である。Ｓ−Ｘn−Ｓモチーフ（ここでｎは１、２、３または４である）に適合するセリンでリン酸化は起こり、過リン酸化を生ずることもある。カゼインキナーゼＩのリン酸化優先はFlotow, H. and Roach, P.J., J. Biol. Chem. 266(6): 3724-3727 (1991）に特徴付けられている。本発明の好ましい実施態様において、ヒトPeriodタンパク質は過リン酸化できる。推定ＣＫＩ相互作用ドメインの遺伝子破壊の場合にはヒトＰＥＲ１では４８６〜５０３アミノ酸であるIQELSEQIHRLLLQPVH、ヒトＰＥＲ２では４６０〜４７７アミノ酸であるIQELTEQIHRLLLQPVH、および／またはヒトＰＥＲ３ではITELQEQIYKLLLQPVHにある。ｈＰＥＲ１のリン酸化部位はｈＰＥＲ１の７４３〜８８９アミノ酸、好ましくはｈＰＥＲ１の８００〜８２０アミノ酸および最も好ましくはｈＰＥＲ１の８０８〜８１５アミノ酸の間にあるか、あるいはまた本発明の実施態様の一つにおいて、ｈＰＥＲ１、ｈＰＥＲ２および／またはｈＰＥＲ３の好ましい誘導体は、ｈＰＥＲ１の７４３〜８８９アミノ酸からなる群から選択されるリン酸化部位を含有し、または推定ＣＫＩ相互作用ドメインの遺伝子破壊の場合にはｈＰＥＲ１では４８６〜５０３アミノ酸（IQELSEQIHRLLLQPVH）、ヒトＰＥＲ２では４６０〜４７７アミノ酸（IQELTEQIHRLLLQPVH）、およびヒトＰＥＲ３ではITELQEQIYKLLLQPVHを含有する。
【００３３】
“プロテインキナーゼ活性を有するタンパク質”という用語は、当業者ならばプロテインキナーゼ活性を有すると評価されるタンパク質、例えば、スクリーニング系で１種またはそれ以上のヒトPeriodタンパク質をリン酸化できるタンパク質を意味する。スクリーニング系は後記実施例のいずれかに記載のように、同じ（または実質的に同様な）条件であってよい。しかし、リン酸化、分解、または概日周期アッセイのセットアップ方法は、当業者によく知られており、本発明はここで提供する具体的な実施例に限定されるものではない。
【００３４】
本発明で用いるタンパク質は、例えば標準的遺伝子組換え技術により組換え体として発現させ、および／または場合により化学的修飾されたヒト組織から得ることができる。タンパク質の組換え発現体が好ましい。
【００３５】
タンパク質の「誘導体」としてはアミノ末端（Ｎ−末端）のアミノ基またはアミノ酸側鎖のアミノ基の全てまたは一部、および／またはカルボキシル末端（Ｃ−末端）のカルボキシル基またはアミノ酸側鎖のカルボキシル基の全てまたは一部、および／またはアミノ酸側鎖のアミノ基およびカルボキシル基以外の官能基、例えば水素、チオール基またはアミド基が他の適当な置換基により修飾されたタンパク質を挙げることができる。他の適当な置換基による修飾は、例えばタンパク質の官能基の保護、安全性の改良またはアッセイの促進、例えばタンパク質をセファロースビーズに付着させる官能基の付加という目的で実施される。一例として５′末端タグ付きプライマーまたはヒスチジンタグ付プライマーに付いたＦｌａｇTMエピトープタグ配列の付加である。
【００３６】
そのタンパク質の誘導体には以下のものが含まれる；
(１) アミノ末端（Ｎ−末端）にあるアミノ基またはアミノ酸側鎖のアミノ基の一部または全てのうちの置換または非置換のアルキル基（直鎖または分枝鎖または環状鎖であることができる）例えばメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、イソブチル基、ブチル基、t−ブチル基、シクロプロピル基、シクロへキシル基またはベンジル基、置換または非置換のアシル基、例えばホルミル基、アセチル基、カプロイル基、シクロへキシルカルボニル基、ベンゾイル基、フタロイル基、トシル基、ニコチノイル基またはピペリジンカルボニル基、ウレタン型保護基、例えばｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル基、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル基、ｐ−ビフェニルイソプロピル−オキシカルボニル基またはｔ−ブトキシカルボニル基、または尿素型置換基、例えばメチルアミノカルボニル基、フェニルカルボニル基またはシクロへキシルアミノカルボニル基で置換されているタンパク質；
(２) カルボキシル末端（Ｃ−末端）またはアミノ酸側鎖の一部または全てにおけるカルボキシル基がエステル化されている（例えば、水素原子がメチル、エチル、イソプロピル、シクロへキシル、フェニル、ベンジル、ｔ−ブチルまたは4−ピコリルにより置換される）またはアミド化されている（例えば、未置換のアミドまたは例えばメチルアミド、エチルアミドまたはイソプロピルアミドのようなＣ1〜Ｃ6アルキルアミドが形成される）タンパク質；または
(３) アミノ酸側鎖のアミノ基およびカルボキシル基以外の官能基の一部または全て、例えば水素、チオール基またはアミノ基が、（１）に記載の置換基またはトリチル基により置換されているタンパク質。
【００３７】
「変える」という用語は、試験化合物のない場合のリン酸化に対してｈＣＫＩδおよび／またはεによるｈＰＥＲ１、ｈＰＥＲ２、および／またはｈＰＥＲ３のリン酸化を阻害または促進する試験化合物の能力を意味する。あるいは、「変える」はまた例えば標準物質のような異なる化合物のリン酸化に対してｈＣＫＩδおよび／またはεによるｈＰＥＲ１、ｈＰＥＲ２、および／またはｈＰＥＲ３のリン酸化を阻害または促進する試験化合物の能力を意味する。ｈＰＥＲ１、ｈＰＥＲ２、および／またはｈＰＥＲ３のリン酸化を阻害または促進する化合物の能力は天然型ｈＣＫＩδおよび／またはεタンパク質に対して測定されることが好ましい。
【００３８】
「スクリーニング系」という用語はｈＣＫＩδおよび／またはεによるｈＰＥＲ１、ｈＰＥＲ２、および／またはｈＰＥＲ３のリン酸化をするのに適した条件セットの意味である。一般的に、スクリーニング系にはいつでも利用可能なホスフェート源が含まれる。好ましいホスフェート源はいつでも利用可能なＡＴＰ源である。スクリーニング系は細胞をベースとしたものか、インビトロが可能である。細胞をベースとしたスクリーニング系はｈＰＥＲ１、ｈＰＥＲ２、ｈＰＥＲ３および／またはｈＣＫＩδおよび／またはεのいずれかまたは各々を発現する細胞の使用を含む。スクリーニング方法は細胞系または無細胞系のいずれかであり得る。適した細胞系はS. cerevisiaeのような酵母細胞、E. coliのような細菌細胞、バキュロウイルス発現系で使用されるような昆虫細胞、線虫細胞、ＣＯＳ細胞のような哺乳類細胞、リンパ球、繊維芽細胞（３Ｙ１細胞、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、Ｒａｔ１細胞、Ｂａｌｂ／３Ｔ３細胞等）、２９３Ｔ細胞のようなヒト胎児腎臓細胞、ＣＨＯ細胞、血球、腫瘍細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、脳細胞を含む。好ましい細胞系は視交叉上核細胞、神経細胞、骨髄球、膠細胞および星状膠細胞である。細胞をベースとした系では、細胞系がヒトPeriodタンパク質および／またはｈＣＫＩεを発現しない場合、一方または両方のヒトPeriodタンパク質および／またはｈＣＫＩεを発現する目的で細胞にトランスフェクションあるいは形質転換させなければならない。あるいは、無細胞系を利用してもよい。部分精製または精製したｈＰＥＲ１、ｈＰＥＲ２、および／またはｈＰＥＲ３、およびｈＣＫＩδおよび／またはεは、ｈＰＥＲ１、ｈＰＥＲ２、および／またはｈＰＥＲ３のそれぞれ、およびｈＣＫＩδおよび／またはεを発現する組換え体源から得ることができ、またはそのために該タンパク質をコードする元来のｍＲＮＡの内在する塩基配列が修飾される。
【００３９】
細胞内でのヒトPeriodタンパク質および／またはｈＣＫＩδおよび／またはεの組換え発現は例えば、プロモーターおよびｈＰＥＲ１、ｈＰＥＲ２、ｈＰＥＲ３および／またはｈＣＫＩδおよび／またはεをコードするｃＤＮＡを含む１つまたはそれ以上の適当な発現ベクターを用いたトランスフェクションの結果であり得る。また細胞をベースとしたスクリーニング系にはヒトPeriodタンパク質および／またはｈＣＫＩδおよび／またはεが、例えばＨＩＶから得られるＴＡＴタンパク質、アンテナペディア形質導入フラグメント、または細胞に外因性タンパク質を導入する何か他の方法のような形質導入または形質導入配列を有する融合タンパク質として細胞に導入または形質導入される細胞の使用がある。
【００４０】
好ましいインビトロのスクリーニング系は、すぐ利用可能なホスフェート源含有水溶性組成物を含む。好ましいインビトロのスクリーニング系はＡＴＰを含む。
【００４１】
ヒトPeriodタンパク質のリン酸化のレベルを測定する方法の例は、タンパク質のリン酸化の量を検出する標準方法、例えば放射性標識されたリンおよびオートラジオグラフィーの使用、または放射性標識されたリンの添加量と得られた非結合リンの量を比較することにより間接的に検出する方法を含む。あるいは、カラーメトリックまたは他の検出方法がリン酸化のレベルを測定するのに使用されることもある。ヒトPeriodタンパク質のリン酸化のレベルを測定するのに適した他の方法は、ヒトPeriodタンパク質またはｈＣＫＩεのいずれかがセファロースビーズのような固形支持体に結合し、かつｈＣＫＩεまたはヒトPeriodタンパク質のいずれかが添加されるグルタチオンセファロースビーズを用いた無細胞系を含む。さらに、後でヒトPeriodタンパク質の量を測定する多数の別法が利用でき、35Ｓで標識されたヒトPeriodタンパク質の分解、カラーメトリック検定、結合したヒトPeriodタンパク質の溶出などの使用が含まれる。
【００４２】
ここで開示されたスクリーニング方法は、ヒトPeriodタンパク質のリン酸化のレベルおよび／または分解を効果的に調節しまたは変え、従って哺乳類の概日リズムを変える試験化合物を同定する目的で、無作為にデザインされた試験化合物または合理的にデザインされた試験化合物のいずれかの多数の試験化合物のスルー−プットの高いスクリーニングを可能にし、それらが自動化できるという点で特に有用である。
【００４３】
「哺乳類」という用語はヒト、霊長類、イヌ、ブタ、牛および他の高等生物を意味する。ヒトおよび霊長類はさらに好ましくは哺乳類である。ヒトは最も好ましい。
【００４４】
本発明に使用される試験化合物は任意の生物学的または低分子化合物、例えば簡単なまたは複雑な有機分子、ペプチド、ペプチド類似物、タンパク質、オリゴヌクレオチド、微生物培養物由来化合物、天然型または合成有機化合物、および／または天然型または合成無機化合物を含む。選別されるべき試験化合物の選択は当業者に既知である。
【００４５】
また本発明は一種またはそれ以上のヒトPeriodタンパク質のリン酸化を変える試験化合物の能力を測定する方法を提供する。この方法は以下の工程：
(１) 試験化合物をｈＣＫＩδおよび／またはεタンパク質およびｈＰＥＲ１、ｈＰＥＲ２およびｈＰＥＲ３からなる群より選択される１種またはそれ以上のヒトPeriodタンパク質を含むスクリーニング系に添加すること、および
(２) ヒトPeriodタンパク質のリン酸化のレベルを測定すること
からなる。
【００４６】
また本発明はヒトPeriodタンパク質のリン酸化を変える試験化合物の能力を測定する方法を包含することも理解される。その方法は以下の工程：
(１) 試験化合物をｈＣＫＩδおよび／またはεタンパク質およびｈＰＥＲ１、ｈＰＥＲ２およびｈＰＥＲ３からなる群より選択される２種またはそれ以上の異なるｈＰＥＲタンパク質を含むスクリーニング系に添加すること、および
(２) ヒトPeriodタンパク質のリン酸化のレベルを測定すること
からなる。
【００４７】
別法として、本発明はヒトPeriodタンパク質のリン酸化を選択的に変える試験化合物の能力を測定する方法を含む。その方法は以下の工程：
(１) 試験化合物をｈＣＫＩδおよび／またはεタンパク質並びにｈＰＥＲ１、ｈＰＥＲ２およびｈＰＥＲ３からなる群より選択される１種のｈＰＥＲタンパク質を含むスクリーニング系に添加すること、および
(２) 試験化合物をｈＣＫＩδおよび／またはεタンパク質およびｈＰＥＲ１、ｈＰＥＲ２およびｈＰＥＲ３からなる群より選択される１種のｈＰＥＲタンパク質からなるスクリーニング系に添加すること、但し（２）で選択されたｈＰＥＲタンパク質は（１）で選択されたｈＰＥＲタンパク質ではない；
(３) （１）および（２）におけるヒトPeriodタンパク質のリン酸化のレベルを測定すること；および
(４) ｈＰＥＲ１、ｈＰＥＲ２、および／またはｈＰＥＲ３のリン酸化を変えるのに試験化合物が選択的であるかどうかを測定するために、（３）で得られた各ヒトPeriodタンパク質について得られた結果を比較すること
からなる。
【００４８】
別法として、本発明はヒトPeriodタンパク質の分解を変える試験化合物の能力を測定する方法を含む。それは以下の工程：
(１) 試験化合物をｈＣＫＩδおよび／またはεタンパク質並びにｈＰＥＲ１、ｈＰＥＲ２およびｈＰＥＲ３からなる群より選択される１種のｈＰＥＲタンパク質からなるスクリーニング系に添加すること、
(２) 試験化合物の添加後ヒトPeriodタンパク質の量を測定すること、および
(３) 工程（２）で得られたヒトPeriodタンパク質の量とスクリーニング系におけるヒトPeriodタンパク質の量とを比較すること
からなる。
【００４９】
別法として、本発明は試験化合物がヒトPeriodタンパク質の分解を変える能力を測定する方法を含む。それは以下の工程：
(１) 試験化合物およびｈＣＫＩδおよび／またはεタンパク質をｈＰＥＲ１、ｈＰＥＲ２およびｈＰＥＲ３からなる群より選択される１種のｈＰＥＲタンパク質を含むスクリーニング系に添加すること、
(２) 試験化合物およびｈＣＫＩδおよび／またはεタンパク質の添加後、ヒトPeriodタンパク質の量を測定すること、および
(３) 工程（２）で得られたヒトPeriodタンパク質の量とスクリーニング系におけるヒトPeriodタンパク質の量とを比較すること
からなる。
【００５０】
別法として、本発明はヒトPeriodタンパク質の分解を変える試験化合物の能力を測定する方法を含む。その方法は以下の工程:
(１) ｈＣＫＩδおよび／またはεタンパク質を試験化合物並びにｈＰＥＲ１、ｈＰＥＲ２およびｈＰＥＲ３からなる群より選択される１種のｈＰＥＲタンパク質を含むスクリーニング系に添加すること、
(２) ｈＣＫＩδおよび／またはεタンパク質の添加後ヒトPeriodタンパク質の量を測定すること、および
(３) 工程（２）で得られたヒトPeriodタンパク質の量とスクリーニング系のヒトPeriodタンパク質の量とを比較すること
からなる。
【００５１】
本発明はｈＣＫＩδおよび／またはεタンパク質ｈＰＥＲ１の７４３〜８８９アミノ酸、好ましくはｈＰＥＲ１の８００〜８２０アミノ酸、および最も好ましくはｈＰＥＲ１の８０８〜８１５アミノ酸の部位で、または推定ＣＫＩ相互作用ドメインの遺伝子破壊の場合にはヒトＰＥＲ１では４８６〜５０３アミノ酸であるIQELSEQIHRLLLQPVH、ヒトＰＥＲ２では４６０〜４７７アミノ酸であるIQELTEQIHRLLLQPVH、および／またはヒトＰＥＲ３ではITELQEQIYKLLLQPVHでｈＰＥＲ１をリン酸化する能力を変える化合物によりｈＰＥＲ１の分解を変える方法を含む。
【００５２】
以下に記載のように、リン酸化されたｈＰＥＲ１タンパク質は急速に分解し、それ故に本発明によるスクリーニング方法はｈＰＥＲ１の分解を選択的に活性化または阻害する試験化合物の同定のために使用され得る。リン酸化されたｈＰＥＲ２およびｈＰＥＲ３タンパク質は急速に分解するので、本発明方法はｈＰＥＲ２またはｈＰＥＲ３それぞれの分解を選択的に活性化または阻害する試験化合物を同定するのに用いることができる。また本発明方法は、ｈＰＥＲ１、ｈＰＥＲ２および／またはｈＰＥＲ３のいずれかのリン酸化の活性化または阻害に及ぼすその化合物の効果を測定し、そして同一または異なる試験化合物を用いて得られた結果を比較することにより、ｈＰＥＲ１、ｈＰＥＲ２および／またはｈＰＥＲ３のリン酸化を選択的に活性化または阻害する化合物を測定する方法も提供する。
【００５３】
また、リン酸化されたｈＰＥＲ１タンパク質は急速に分解するので、本発明の方法は、試験化合物の不在下での同じまたは異なるヒトPeriodタンパク質のレベルと比較して、細胞中のヒトPeriodタンパク質のレベルを選択的に増加または減少する試験化合物の同定に用いることができる。本発明の一つの好ましい実施態様において、その方法は試験化合物の不在下のｈＰＥＲ１レベルと比較して細胞内ｈＰＥＲ１のレベルを選択的に増加または減少させる試験化合物の同定に用いられる。本発明の好ましい他の実施態様において、その方法は試験化合物の不在下のｈＰＥＲ２レベルと比較して細胞内のｈＰＥＲ２のレベルを選択的に増加または減少させる試験化合物の同定に用いられる。
【００５４】
さらに、本発明は試験化合物の存在下のｈＰＥＲ２の分解量と比較して細胞中のｈＰＥＲ１の分解量を選択的に阻害する試験化合物を同定する方法を含む。本発明の他の実施態様において、その方法は試験化合物の存在下のｈＰＥＲ１の分解量と比較して細胞内ｈＰＥＲ２の分解量を選択的に阻害する試験化合物の同定に用いられる。
【００５５】
あるいは、本発明は試験化合物の不在下のｈＰＥＲ２および／またはｈＰＥＲ３それぞれのレベルと比較して、または異なるヒトPeriodタンパク質のレベルと比較して、細胞内のｈＰＥＲ２および／またはｈＰＥＲ３のレベルを選択的に増加または減少させる試験化合物を同定することに用いることができる。本発明方法は細胞内のｈＰＥＲ１、ｈＰＥＲ２および／またはｈＰＥＲ３のレベルをその本来のレベルと比較して選択的に増加または減少させる化合物を同定するのに使用できる。またヒトPeriodタンパク質のレベルに関する種々の試験化合物の結果の比較は、生物学的処理または化学的処理、例えば光、成長因子、転写因子等の内因性および／または外因性刺激の添加、阻害または変質の後であってもよい。
【００５６】
リン酸化されたｈＰＥＲタンパク質は哺乳類の概日周期の調節に密接に関係していることが知られている。それ故に、本発明は試験化合物または刺激の不在下で哺乳類の概日周期の生理的反応に影響を与え、調節を行い、または変化を与える試験化合物を同定するのに用いることができる。哺乳類の概日周期の調節は、試験化合物の不在下で刺激に応答する哺乳類の正常の概日周期の変化の防止を含む。従って、本発明は哺乳類の概日リズムを正常に変える刺激に応答する哺乳類の概日リズムの変化を妨げることができる試験化合物を同定する方法を含む。
【００５７】
ヒトカゼインキナーゼＩε（ｈＣＫＩε）がヒトPeriod１のリン酸化に与える効果を証明する後記実施例を変形させてヒトPeriod２および／またはヒトPeriod３に置き換えることができる。同様な結果がヒトカゼインキナーゼＩｈＣＫＩδで得られる。
【００５８】
ｈＣＫＩε（ｈＣＫＩε−Ｋ３８Ｒ）のキナーゼネガティブ変異体ではなく、精製した組換えｈＣＫＩεは、インビトロでｈＰＥＲ１をリン酸化する。２９３Ｔ細胞において野生型ｈＣＫＩεを同時にトランスフェクションすると、ｈＰＥＲ１は分子量での１つのシフトにより証明されるように、リン酸化の著しい増加を示す。また、ｈＰＥＲ１タンパク質はトランスフェクションされたｈＣＫＩε並びに内因性ｈＣＫＩεと共に免疫沈降することができ、それはインビボでｈＰＥＲ１およびｈＣＫＩεタンパク質間の物理的会合を示している。さらに、ｈＣＫＩεによるｈＰＥＲ１のリン酸化はｈＰＥＲ１でのタンパク質の安定性を減少させる。リン酸化されないｈＰＥＲ１は、２４時間周期を通して細胞が安定なままであり、一方リン酸化されたｈＰＥＲ１は半減期が約１２時間である。多様なｈＰＥＲ１トランケート変異体を用いて、ｈＰＥＲ１のリン酸化可能な部位は７４３〜８８９アミノ酸であり、これはＣＫＩ共通リン酸化部位を１つ含有する。
【００５９】
ショウジョウバエＤＢＴの哺乳類のホモログであるｈＣＫＩεがｈＰＥＲ１をリン酸化できるかどうか調べるために、組換えｈｉｓタグ付き野生型ｈＣＫＩεをE. coli．で発現させ、精製し、カゼインおよびＧＳＴ−ＩκＢαのような一組の既知の基質、並びにｈＰＥＲ１をリン酸化するその能力をアッセイした。組換えｈＣＫＩεはカゼインおよびＩκＢα基質の両方をリン酸化する（図１Ａのレーン２および３）。精製した野生型ｈＣＫＩεは自己リン酸化する。自己リン酸化の能力はｈＣＫＩε活性を示す（図１Ａのレーン１および２）。組換えｈＣＫＩε不存在下ではリン酸化は観察されない（図１Ａのレーン７および８）。
【００６０】
キナーゼネガティブ変異体ｈＣＫＩε−Ｋ３８Ｒ（ここではＡＴＰ結合ドメインのリジン３８をアルギニンに変異させる）をカゼインおよびＩκＢα両基質のリン酸化についてアッセイする。ｈＣＫＩε−Ｋ３８Ｒは自己リン酸化活性を有さず、カゼインまたはＧＳＴ−ＩκＢα両基質をリン酸化しない（図１Ａのレーン４〜６）。これは前のリン酸化活性が野生型ｈＣＫＩεに特異的であることを証明している。
【００６１】
また組換えｈＣＫＩεはインビトロでｈＰＥＲ１をリン酸化することを示す。図１Ｂに示すように、組換えｈＣＫＩεの不在下ではリン酸化は全く観察されない（レーン８〜１０）。インビトロでｈＣＫＩεの存在によりｈＰＥＲ１がリン酸化されるが、Ｆｌａｇタグ付ルシフェラーゼはリン酸化されない結果になる（レーン２および３）。ｈＣＫＩεはまた熱処理で不活化したｈＰＥＲ１免疫沈降物をリン酸化したように、ｈＰＥＲ１のリン酸化はｈＰＥＲ１関連キナーゼ活性が原因ではない（レーン６）。さらに、ｈＣＫＩε−Ｋ３８ＲはｈＰＥＲ１に対するキナーゼ活性がない（レーン７）。それ故に、ｈＣＫＩεはインビトロでｈＰＥＲ１を直接リン酸化する。
【００６２】
ｈＣＫＩεはフラッグタグ付ｈＰＥＲ１およびベクターコントロール、野生型ｈＣＫＩεまたはｈＣＫＩε−Ｋ３８Ｒのいずれかを同時にトランスフェクションした２９３Ｔ細胞においてｈＰＥＲ１を特異的にリン酸化する。トランスフェクションの後２４時間後に溶解し、溶解物を３〜８％のＳＤＳ ＮＵ−ＰＡＧＥで分離し、続いてウエスタンブロット解析を行う。図２Ａは野生型ｈＣＫＩεおよびｈＰＥＲ１を同時にトランスフェクションした細胞内では、コントロールのベクターまたはｈＣＫＩε−Ｋ３８Ｒのいずれかと同時にトランスフェクションした細胞と比較して、ｈＰＥＲ１タンパク質の分子量の著しいシフトが観察されることを示す（レーン１〜３）。ｈＰＥＲ１分子量の同様なシフトは、異なる百分率のＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いたいくつかの同時トランスフェクション実験で常に観察される。ウエスタンブロット解析は野生型ｈＣＫＩεおよびｈＣＫＩε−Ｋ３８Ｒタンパク質の両方が等量で発現することを示す（図２Ｂのレーン２〜５）。
【００６３】
Ｆｌａｇタグ付ｈＰＥＲ１およびコントロールのベクター、ｈＣＫＩεまたはｈＣＫＩε−Ｋ３８Ｒキナーゼネガティブ変異体のいずれかを同時にトランスフェクションし、［35Ｓ］メチオニンおよびシステインで放射性同位体標識した２９３Ｔ細胞では、リン酸化後にｈＰＥＲ１の分子量に変化が生じることが証明される。35Ｓで標識したｈＰＥＲ１を免疫沈降し、精製した組換えラムダフォスファターゼで処理または未処理する。図２Ｃに示すように、細胞にコントロールのベクターまたはキナーゼネガテイブｈＣＫＩε−Ｋ３８Ｒとではなく、野生型ｈＣＫＩεと同時にトランスフェクションすると、35Ｓ−放射性同位体標識された免疫沈降したｈＰＥＲ１は分子量に一つのシフトを示す（レーン１、２、および３）。ｈＰＥＲ１および野生型ｈＣＫＩεを同時にトランスフェクションした細胞からのタンパク質の分子量変化は、ラムダフォスファターゼ処理の１時間後著しく減少する。これはｈＰＥＲ１の移動性変化はリン酸化が原因であることを証明する（図２Ｃのレーン２および５）。ラムダフォスファターゼの処理後１時間後に、コントロールのベクターおよびキナーゼネガティブを同時にトランスフェクションした細胞に対する、ｈＣＫＩεを同時にトランスフェクションした細胞由来の全ｈＰＥＲ１の移動性は互いに本質的に見分けがつかない（図２Ｃのレーン４、５および６）。
【００６４】
ラムダフォスファターゼの移動性変化は汚染プロテアーゼが原因ではない。ラムダフォスファターゼ反応に５０mMフッ化ナトリウム（ホスファターゼ阻害剤）を添加することにより、ｈＰＥＲ１の移動性の変化減少がブロックされた。免疫沈降物中には分子量のより高い形態のその他のｈＰＥＲ１は全く存在しない；これはｈＰＥＲ１翻訳後の移動性シフトはリン酸化が原因ということを示している。
【００６５】
概日周期の間、ＰＥＲタンパク質が蓄積し、この蓄積に続いてＰＥＲは分解する（Edery, I., et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 2260-2264, Dembinska, M.E., et al.(1997) J. Biol. Rhythms 12, 157−172)。ＰＥＲタンパク質が蓄積するフェイズの間に、そのタンパク質のリン酸化が原因と思われる分子量の著しいシフトがある。ＰＥＲが消える直前に該移動性シフトはその最大値に達する（Edery, I., et al. (1994) supra)。ｈＰＥＲ１および野生型ｈＣＫＩεの両方をコードする発現プラスミド、またはコントロールのベクターを同時にトランスフェクションした２９３Ｔ細胞は、ｈＰＥＲ１のリン酸化が細胞内でｈＰＥＲ１が不安定になる結果であることを証明するのに用いられる。トランスフェクション後約２０時間経過してから、細胞を３０分間［35Ｓ］メチオニン／システインを用いてパルス標識し、次に０〜３０時間チェイスする。適切な時間経過の後、ｈＰＥＲ１を採集し、免疫沈降してＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析する。図３Ａで示すように、ｈＰＥＲ１およびベクターのみを同時にトランスフェクションした細胞は、タイムコースの間の移動性についてはほとんどシフトを示さなかった（レーン１〜７）。１２時間後そのタンパク質のスミアで示されるが、３０時間の時点で僅かに増加した（レーン１、５、および７）分子量の僅かなシフトが現れた。コントロールの細胞に存在するｈＰＥＲ１量はそのタイムコースの間相対的に一定である。放射性同位体標識後２時間経過後に、約５０％のｈＰＥＲ１タンパク質が依然として細胞内に存在し、このレベルはタイムコースの間一定である（図３Ｃの黒い棒）。コントロールのベクターとは対照的に、ｈＰＥＲ１および野生型ｈＣＫＩεを同時にトランスフェクションした細胞は放射性同位体標識後２時間ですぐに、移動性のシフトを示した（図３Ｂのレーン１および２）。この分子量シフトはタイムコースの間ますます顕著になり続け、２４〜３０時間の間に移動値が最大になった（図３Ｂのレーン２〜７）。コントロールのベクターとは対照的に、ｈＣＫＩεを同時にトランスフェクションした２９３Ｔ細胞由来ｈＰＥＲ１はタンパク質安定性の減少を示した。コントロールのベクターと同様に、２時間の時点でＣＫＩδを同時にトランスフェクションした細胞由来のｈＰＥＲ１総量の５０％が細胞に存在する（図３Ｂのレーン２、および図３Ｃの縞の棒）。コントロールのベクターとは異なり、リン酸化されたｈＰＥＲ１の２分の１のみは１２時間後細胞に残存していた。２４時間ではリン酸化されたｈＰＥＲ１の約１４％が存在する（図３Ｂのレーン５および６並びに図３Ｃの縞の棒）。この実験は３回繰り返して同様な結果である。野生型ｈＣＫＩεによるｈＰＥＲ１のリン酸化により、タンパク質の安定性が減少し、続いて、ｈＰＥＲ１が分解するという結果になる。
【００６６】
ｈＰＥＲ１およびｈＣＫＩεは２９３Ｔ細胞内で物理的に相互作用する。２９３Ｔ細胞にＦｌａｇタグ付ｈＰＥＲ１およびベクターのみまたはＨＡタグ付ｈＣＫＩεのいずれかを同時にトランスフェクションする。トランスフェクションした２９３Ｔ細胞を溶解し、ｈＰＥＲ１を抗ＦｌａｇｍＡｂを用いて免疫沈降し、次に抗ＨＡｍＡｂを用いてイムノブロットする。あるいは、ｈＣＫＩεを抗ＨＡｍＡｂで免疫沈降し、次に抗ＦｌａｇｍＡｂでイムノブロットする。図４Ａおよび図４Ｂには組換えｈＣＫＩεはｈＰＥＲ１と共沈するということが証明されているが、これはｈＣＫＩεがｈＰＥＲ１と直接会合することを示している。２９３Ｔ細胞にｈＰＥＲ１のみをトランスフェクションしてそのようなｈＰＥＲ１を証明する。細胞を溶解し、ｈＰＥＲ１を抗ＦｌａｇｍＡｂを用いて免疫沈降し、次に抗ｈＣＫＩεｍＡｂを用いてイムノブロットする。あるいは、内因性ｈＣＫＩεを抗ｈＣＫＩεｍＡｂを用いて免疫沈降し、次いで抗ＦｌａｇｍＡｂを用いてイムノブロットする。内因性ｈＣＫＩεがｈＰＥＲ１と共に免疫沈降したが、これはこの２つのタンパク質間の物理的な会合を示している（図４Ｃおよび図４Ｄ）。
【００６７】
ｈＣＫＩεはｈＰＥＲ１の６２１〜８８９アミノ酸をリン酸化する。図２ＡはｈＰＥＲ１の分子量シフトがｈＣＫＩεによるリン酸化の結果であることを示す。ｈＣＫＩεによりリン酸化されたｈＰＥＲ１のリン酸化部位を同定するために、トランケート型のｈＰＥＲ１を図５Ａおよび後記の実験材料および実験方法に記載のように調製する。これらの構築物をベクター、ｈＣＫＩε、またはｈＣＫＩε−Ｋ３８Ｒのいずれかと共に２９３Ｔ細胞にトランスフェクションし、分子量シフトを検定する。図５Ｂのレーン２に示すように、ｈＣＫＩεおよび全長オープンリーデイングフレームｈＰＥＲ１（ＯＲＦ）、Ｎ２、Ｎ３またはＮ４のいずれかを同時にトランスフェクションした細胞は、タンパク質の分子量シフトを示す。トランケートｈＰＥＲ１タンパク質をラムダフォスファターゼ処理するとｈＣＫＩεによるリン酸化が原因でシフトが消失するという結果になり、Ｎ１またはＣ−末端構築物Ｃ１、Ｃ２、Ｃ５またはＣ６を同時にトランスフェクションしたｈＣＫＩεは該タンパク質の分子量シフトを示さなかった（図５Ｂおよび図５Ｃのレーン２）。分子量シフトを示したトランケート構築物（ＯＲＦ、Ｎ２、Ｎ３、およびＮ４）は、６２１〜８８９アミノ酸の相同性のある領域を共有する(図５Ａ参照)。５８４〜７４３アミノ酸を含有するＣ１は、シフトを示さなかったので、ｈＰＥＲ１はｈＣＫＩεにより７４３〜８８９アミノ酸の間でリン酸化される。いくつかのＣＫＩリン酸化共通配列はｈＰＥＲ１内に位置しており、ｈＣＫＩεによりリン酸化される上記ｈＰＥＲ１領域内の一つ、具体的には８０８〜８１５アミノ酸：ＤＳＳＳＴＡＰＳを含む配列を包含する。セリンおよびスレオニンの全てがｈＣＫＩεの基質として供され、そのことは観察された劇的な移動性シフトを説明しているかもしれない。
【００６８】
実験材料および実験方法
実施例１  プラスミドの構築、発現、およびタンパク質の精製
野生型ｈＣＫＩεをコードするｃＤＮＡはヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーから前記方法（Fish, K.J., et al., (1995) J. Biol. Chem. 270, 14875-14883）を用いて単離する。細菌用ベクターにｈＣＫＩεをクローニングしたもの（ｐＲＳＴ−Ｂ−ＣＫＩε）および哺乳類用発現ベクターにｈＣＫＩεをクローニングしたもの（ｐＣＥＰ４−ＣＫＩε）は前述の通りである（Cegielska, A., et al., (1998) J. Biol. Chem. 273, 1357-1364, Rivers, A., et al., (1998) J. Biol. Chem. 273, 15980-15984)。ヘマグルチニン（ＨＡ）エピトープタグ（YPDYDVPDYA）はｐＣＥＰ４−ＣＫＩεにおいてｈＣＫＩεの５′末端に付加する。全長ｈＰＥＲ１（Tel, H., et al, (1997) Nature 389, 512-516）をEcoRＩおよびSalＩで切断し、プラスミドベクターｐＣＭＶ−ＴａｇTM（Stratagene）にライゲーションしてイン−フレームでＦｌａｇタグのついた融合タンパク質を作製する。トランケートされたＮ末端変異体（Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｃ５）はＰＥＲ１をEcoRＩ／EcoRＶ、EcoRＩ／XhoＩ、EcoRＶ／XhoＩ、Pvu II／XhoＩ、またはBamHＩ／SalＩそれぞれで切断し、同じベクターにライゲーションすることにより生成される。変異体Ｃ１、Ｃ２およびＣ６を構築するために、鋳型としてｈＰＥＲ１ｃＤＮＡを用い、５８４〜７４３、９９８〜１１６０、または１１６１〜１２８９アミノ酸それぞれをコードするＤＮＡフラグメントを増幅するためのＰＣＲ反応でオリゴヌクレオチドプライマーを使用する。得られたフラグメントを表１に要約する。
【００６９】
【表１】
0004583682.tif 000002
【００７０】
ＦｌａｇTMエピトープタグ配列をプライマーの５′末端に付加する。ＰＣＲ産物を哺乳類用発現ベクターｐｃＤＮＡ３ Topo vectorTM（Invitrogen）にクローン化する。細菌で発現させたヒスチジンタグ付ｈＣＫＩεおよびｈＣＫＩε−Ｋ３８Ｒを、Cegielska, A., et al, (1998) J. Biol. Chem. 273, 1357-1364に記載のように精製する。ｃ−ＭＹＣタグ付ＣＫＩδはDavid Virshup博士の寄贈であった。９０％以上の相同性を有する分子量約５４kDaのタンパク質が精製される。
【００７１】
実施例２  ２９３Ｔ細胞のトランスフェクションおよび放射性同位体標識
ヒト胎児腎臓２９３Ｔ細胞を１０％ウシ胎児血清（Hyclone）を補充したＤＭＥＭ入り６ウェルプレートで培養する。約８０％密度になった時点でlipofectAMINETM reagent（Life Technologies）を用い、メーカーの使用説明書に従い、２μｇのＤＮＡを細胞にトランスフェクションする。２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクション効率は、コントロールのＧＦＰプラスミドのトランスフェクションによりモニターされるように典型的には３０〜５０％である。
【００７２】
トランスフェクションの１６時間後に２９３Ｔ細胞をメチオニンおよびシステイン欠乏培地で０.５μCi／ml［35Ｓ］メチオニン／システインを用いて３０分間放射性標識する。その後、細胞を洗い、指定された時間まで通常のＤＭＥＭで培養する。細胞を溶解緩衝液（20mM Tris, １％ Triton X-100TM, 0.5％ IgepalTM, 150mM NaCl, 20mM NaF, 0.2mM Na2VO4, １mM EDTA, １mM EGTA, Complete protease inhibitor cocktail [Boeringer Mannheim], pH 7.5）を用いて溶解する。溶解物を１２,０００rpmで遠心分離することにより、細胞の残骸を取り除く。上澄みを回収し、使用するまで−７０℃で保存する。
【００７３】
実施例３  免疫沈降およびウエスタンブロット分析
等量のタンパク質を含有する溶解物（全１００μｇ）を抗−Ｆｌａｇ、抗−ＨＡ、または抗−ｈＣＫＩεｍＡｂいずれかを１：５００で希釈した５μｌと混合し、４℃で一晩インキュベートする。抗体とのインキュベーション後、３０μｌのＧタンパク質セファロースビーズの１：１スラリーを添加し、更に２〜４時間インキュベーションする。ビーズを溶解緩衝液中で５回洗浄し、その後３０μＬの５mM ＤＴＴ入りＳＤＳサンプルバッファーに再懸濁し、煮沸し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する。タンパク質のウエスタンブロットは前述のように抗−ＦｌａｇTM（Sigma）（１：１０００希釈）、抗−ＨＡ（Invitrogen)（１：１０００希釈）、または抗−ｈＣＫＩε（Transduction Laboratories）（１：７５０希釈）のいずれかを用いてトランスフェクションされた２９３Ｔ細胞由来の上澄みまたは免疫沈降したタンパク質のいずれかについて実施する（Yao, Z., et al, (1997) J. Biol. Chem. 272, 32378-32383)。
【００７４】
実施例４  キナーゼおよびフォスファターゼの検定
基質としてカゼインまたはＧＳＴ−ＩκＢαのいずれかを用い、ｈＣＫＩεの活性について検定する。カゼインまたはＧＳＴ−ＩκＢα（０.５μｇ）は、２００nM ＡＴＰ、１０mM ＭｇＣｌ2、０.６mM ＥＧＴＡおよび０.２５mM ＤＴＴを含有するＰＢＳ中でｈＣＫＩε（０.１μｇ）および５μCi［γ−32Ｐ］ＡＴＰ（Amersham）と結合する。反応混合物を室温で３０分間インキュベートし、ＳＤＳサンプルバッファーの添加により反応を停止させ、それからＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する。ＧＳＴ−ＩκＢαはＳＤＳ−ＰＡＧＥでｈＣＫＩεと同じような位置まで泳動されたので、プロトコールを少し改変して実施した。３０分間インキュベーションした後、グルタチオン−セファロースビーズの添加によりＧＳＴ−ＩκＢαをキナーゼ反応から除去する。ＳＤＳサンプルバッファーの添加前にｈＣＫＩεの汚染を除去するため、ビーズを溶解緩衝液中で５回洗浄する。ゲルをCoomassie blue R-250で染色し、乾燥し、次いでオートラジオグラフィーに付す。
【００７５】
35Ｓで標識されたｈＰＥＲ１の免疫沈降は上記のとおりである。ｈＰＥＲ１含有のビーズをフォスファターゼ緩衝液（１００mM ＭＥＳ、０.５mMジチオスレイトール（ＤＴＴ）、０.２mMフェニルメチルスルホニルフロリド、２０μｇ／mlアプロチニン、１０μｇ／mlロイペプチン、１０μｇ／mlペプスタチンＡ、ｐＨ６.０）で更に３回洗浄し、２０μｌのフォスファターゼ緩衝液に再懸濁する。１０×反応溶液（５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、０.１mM ＥＤＴＡ、５mM ＤＴＴ、０.０１％ Ｂｒｉｊ ３５、２mM ＭｎＣｌ2、ｐＨ７.０）、および精製したラムダフォスファターゼ４０単位を添加することにより、フォスファターゼ処理を開始する。その反応を３７℃で１時間続行させる。フォスファターゼ活性の阻害は５０mMフッ化ナトリウムの添加により達成される。適切なインキュベーションの後、ＳＤＳサンプルバッファーの添加により反応を停止する。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分離し；ゲルを乾燥し、次いでオートラジオグラフィーに付す。画像はMolecular Dynamics PhospholmagerTMを用いて視覚化される。
【００７６】
実施例５  ｈＣＫＩεのヒトＰＥＲ１との相互作用およびリン酸化
以下の例により、ｈＣＫＩεがヒトＰＥＲ２と相互作用してリン酸化することの証明に用いる実験材料および実験方法を示す。これらの結果を要約すると、ｈＣＫＩεを２９３Ｔ細胞に同時にトランスフェクションすると、32Ｐの取り込み並びに分子量シフトでも分かるようにｈＰＥＲ２はリン酸化状態の著しい増加を示す。さらにｈＣＫＩεおよびｈＰＥＲ１のように、ｈＣＫＩεはトランスフェクションされたｈＰＥＲ２と共に免疫沈降する。トランスフェクションされた細胞をｈＣＫＩε阻害剤であるＣＫＩ−７で処理すると、ｈＰＥＲ１およびｈＰＥＲ２のリン酸化が減少する。パルス／チェイスの調査により、トランスフェクションされたｈＣＫＩεによるｈＰＥＲ２のリン酸化の増加がｈＰＥＲ２を分解させたことが明らかである。これらのデータには、ＣＫＩおよびヒトＰＥＲ１ではIQELSEQIHRLLLQPVHの４８６〜５０３アミノ酸、ヒトＰＥＲ２ではIQELTEQIHRLLLQPVHの４６０〜４７７アミノ酸、および／またはおそらくヒトＰＥＲ３ではITELQEQIYKLLLQPVHの間でインビボでのｈＣＫＩεおよびヒトperiodタンパク質との間の物理的会合並びにｈＰＥＲ１およびｈＰＥＲ２のリン酸化によるperiodの安定性の調節が示されている。
【００７７】
ｈＰＥＲ２に関する実験材料および実験方法
実施例６  プラスミドの構築、発現、およびタンパク質の精製
ヒトperiod２オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）全長は、Clonetech社製ヒト脳ｃＤＮＡライブラリーからフォワードプライマーATCTAGATCTAGAATGAATGGATACGCGGAATTTCCGおよびリバースプライマーTCTGCTCGAGTCAAGGGGGATCCATTTTCGTCTTを用いたＰＣＲによりクローン化する。ＯＲＦは１２４６アミノ酸のタンパク質をコードする。ＤＮＡをｐＹＧＦＰリビングカラーベクター（living color vector）(Clonetech社）にサブクローン化して、ｈＰＥＲ２−Ｃ末端ＹＧＦＰタンパク質を作製する。細菌で発現させたヒスチジンタグ付ｈＣＫＩεを前記のように精製する。９０％以上の相同性を有する分子量約５４kDaのタンパク質が精製された。
【００７８】
実施例７  ２９３Ｔ細胞へのトランスフェクション
ヒトPeriod１ＤＮＡの代わりにヒトPeriod２ＤＮＡを用いて、前記実験材料および実験方法でヒト胎児腎臓２９３Ｔ細胞にトランスフェクションした。溶解物および上澄みを前述のように回収して保存した。
【００７９】
実施例８  免疫沈降およびウエスタンブロット分析
ｈＰＥＲ１溶解物の代わりにｈＰＥＲ２溶解物を用いて、前記実験材料および実験方法で、溶解物は免疫沈降およびウエスタンブロット分析に使用する。その結果を後記の表２に示す。２９３Ｔ細胞にｈＰＥＲ２およびｈＣＫＩεを同時トランスフェクションした後、細胞をトランスフェクションの２４時間後に溶解し、免疫沈降して溶解物を８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、次いでウエスタンブロット分析をする。表２に示すように、ＨＡ−ｈＣＫＩεの免疫沈降、それに続くウエスタンブロット分析により、ｈＣＫＩεがｈＰＥＲ１と同様にｈＰＥＲ２と相互作用することが明らかである。プラスは相互作用することを意味し、マイナスは相互作用しないことを意味する。
【００８０】
実施例９  ｈＣＫＩεはｈＰＥＲ２と会合してｈＰＥＲ２をリン酸化する
ＰＥＲ１のリン酸化の結果、そのタンパク質が不安定になり分解する。それ故に、ｈＣＫＩεはＰＥＲ２をリン酸化するかどうか測定する目的で、２９３Ｔ細胞にＣＫＩεおよびｈＰＥＲ２またはコントロールとしてのｈＰＥＲ１を同時にトランスフェクションしてタンパク質をウエスタンブロット分析により視覚化した。ｈＣＫＩεおよびｈＰＥＲ２を同時にトランスフェクションした細胞では、表２に示すように、タンパク質分子量において１つのシフトが観察され、それはｈＣＫＩεおよびｈＰＥＲ１で見られた結果と同様である。
【００８１】
【表２】
0004583682.tif 000003
【００８２】
移動性シフトがｈＰＥＲ２のリン酸化に依存するのかどうかを測定するため、ｐ３２で標識実験を実施してｐ３２標識のｈＰＥＲ２への取り込みを検定した。表３に示すように、ｈＰＥＲ２またはｈＰＥＲ１をＣＫＩεと同時にトランスフェクションすると、両方のＰＥＲタンパク質へｐ３２が取り込まれる結果になった。ｐ３２の取り込み量はｈＰＥＲ２よりもｈＰＥＲ１の方がより多いようであった。ｈＰＥＲ２に対するｈＰＥＲ１のこのリン酸化の違いは、ｈＰＥＲ２に対してＣＫＩによるｈＰＥＲ１のリン酸化の増強した反応速度に起因している。他の解釈は、ｈＰＥＲ１はｈＰＥＲ２よりも多数のＣＫＩリン酸化共通部位（ｈＰＥＲ１で９個に対してｈＰＥＲ２では７個）を有するということである。
【００８３】
【表３】
0004583682.tif 000004
【００８４】
ｈＰＥＲ２のリン酸化がタンパク質を不安定にさせる：ｈＰＥＲ１のリン酸化によりタンパク質が不安定になり分解するという結果になる。ｈＰＥＲ２はｈＣＫＩεにより同様にリン酸化されるので、ｈＰＥＲ２タンパク質の安定性におけるリン酸化の影響を測定する目的で、ＨＥＫ２９３細胞にＰＥＲ２単独またはＰＥＲ１単独のいずれかをコードするｃＤＮＡをトランスフェクションするか、またはｈＣＫＩεおよびＰＥＲ２、またはｈＣＫＩεおよびＰＥＲ１の両方をコードするｃＤＮＡを同時にトランスフェクションする。細胞を３５−Ｓメチオニンでパルスし、次いで３２時間、表４に要約した時間に免疫沈降する。表４に記載のように、ｈＰＥＲ２またはｈＰＥＲ１のシングルトランスフェクションは、ｈＰＥＲ１またはｈＰＥＲ２のいずれかが内因性のキナーゼによりリン酸化されて分解するという結果になる。各タンパク質の半減期はｈＰＥＲ１では約１４時間でありｈＰＥＲ２では４時間である。けれども、ｈＰＥＲ１またはｈＰＥＲ２のいずれかをｈＣＫＩεと共に同時トランスフェクションすると、両方のタンパク質の過リン酸化という結果になる。さらに、この過リン酸化は約２〜４時間のタンパク質半減期の変動ないし短縮を生じる。ｈＰＥＲ２はｈＰＥＲ１より低い程度でリン酸化されるようであるけれども、それはｈＣＫＩεによるリン酸化後ではもはやｈＰＥＲ１よりも安定ではないようである。
【００８５】
【表４】
0004583682.tif 000005
【００８６】
実施例１０  ｈＣＫＩδおよびε阻害剤の検定
以下のアッセイを用いて、ｈＰＥＲ１のリン酸化を変え、その結果、同時にトランスフェクションされた細胞のｈＰＥＲ１レベルを増加させる化合物の能力およびラットＰＥＲ１細胞内ｍＲＮＡ変動を変える化合物の能力について該化合物を試験する。ｈＣＫＩε−ＰＥＲ１の同時トランスフェクション（一過性）検定を用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を６ウェルプレートで約８０％コンフルエントになるまで培養し、次にLipofectamine plus reagent（GibcoＢＲＬ）を用いてｈＣＫＩεおよびＰＥＲ１またはＰＥＲ２を同時にトランスフェクションする。１６時間後、トランスフェクション培地を除去し、それらの細胞に１、１０、または３０μMのＣＫＩ阻害剤および不活性の類似化合物を１６時間投与する。さらに１６時間後、培地を除去し、細胞を２回ＰＢＳで洗浄し、溶解させ、遠心分離し、上澄みを８〜１６％または８％トリスグリシンゲルに流す。ウエスタンブロットをフラッグ−タグ付きｈＰＥＲ１またはＧＦＰ−タグの付いたｈＰＥＲ２で実施する。ｈＣＫＩεの存在は、抗−ＨＡ抗体を用いたウエスタンブロットにより各サンプルで検出される。
【００８７】
図９に示すように、細胞にｈＣＫＩεおよびｈＰＥＲ１を同時にトランスフェクションし、増加する濃度のコントロール試験化合物（例えば、ｈＣＫＩεを阻害しないもの）に曝しても、ｈＰＥＲ１のレベルには何の増加も観察されない。しかし、ｈＣＫＩε阻害剤で処理した同時トランスフェクションされた細胞は、投与量に依存したｈＰＥＲ１のレベルの相対的な増加を示す。このｈＰＥＲ１レベルの増加は、ＣＫＩリン酸化活性の阻害およびｈＰＥＲ１リン酸化の相対的減少それに続くタンパク質の安定性の増加による。ＣＫＩ阻害剤がＰＥＲ１タンパク質の安定性および半減期を変える場合には、細胞のＰＥＲ１レベルの増加が概日変動または細胞周期に何らかの効果を与えるということが論考できる。
【００８８】
ＴａｑＭａｎ ＲＴ−ＰＣＲ（Perkin Elmer Biosystems）を用いた定量的ＰＣＲによりラットＰＥＲ１の変動を変えるＣＫＩ阻害剤の効果を試験するために、ｒａｔ−１繊維芽細胞を５％ウシ胎児血清およびペニシリン−ストレプトマイシン−グルタミンの混合物を補充したDulbecco's modified Eagle mediumで培養する。ＳＣＮ細胞を１０％ウシ胎児血清、ペニシリン−ストレプトマイシン−グルタミン、および２％グルコースを補充したDulbecco's Minimum Eagle mediumで培養する。本実験の３〜５日前に約５×１０5個の細胞を１０cmぺトリ皿に播種する。プレートがコンフルエントになったらすぐに、それを時刻＝０と設定して、富血清培地、即ち５０％ウマ血清含有血清に交換する。５０％ウマ血清中での血清ショックの２時間後、この培地を無血清培地に置き換える。指示された時間に、デイッシュをＰＢＳで洗って、全細胞ｍＲＮＡの抽出まで−８０℃で凍結保存する。ｈＣＫＩε阻害剤またはコントロールを無血清培地が添加される時に添加する。
【００８９】
全ての細胞ｍＲＮＡをRNeasy MidiキットまたはRneasy 96キット（Qiagen）を用いて抽出し、次いでDnase処理をする（Ambion DNA-free）。定量的ＰＣＲをリアルタイムTaq-Man technology（PE Biosystems）を用いて実施し［C.A. Heid et al., Genomes Res. 6, M (1996) 参照］、ABI PRISM 7700で分析する（T. Takumi et al., Genes Cells 4, 67: 1999参照)。ｒＰＥＲＩ用プライマーは以下の通りである：フォワード5′-TCTGGTTAAGGCTGCTGACAAG-3′；リバース、5′-GTGTAGCCCCAACCCTGTGA-3′、およびTaqMan、プローブ5′-TCCAAATCCCAGCTGAGCCCGA-3′。ＲＮＡの内部コントロールとして、同じ条件でrActinの発現を調べる。ｒＰＥＲ１対rActinの比を計算して標準化した。図１０に示すように、ＰＥＲ１のｍＲＮＡ変動により示されたように、化合物なしで、または不活性なｈＣＫＩε低分子類似物である試験化合物で処理した細胞は約２４時間の正常な概日周期を示す。しかし、ＣＫＩ阻害剤である試験化合物で処理した細胞は、図１１の変化した日内振動の概日周期を示す。これらの細胞におけるＰＥＲ１のｍＲＮＡレベルは、正常な２４時間周期の代わりに約１８〜２０時間の短縮したリズムを明らかに示す。短縮された周期は、即ち、ＣＫＩのリン酸化の阻害が原因であり、ＰＥＲのリン酸化レベルが低いという結果になる。より少ないリン酸化を受けたＰＥＲは、ＰＥＲタンパク質の安定性の増加およびＰＥＲの細胞内レベルの増加をもたらし、それは哺乳類の概日リズムを変える。
【００９０】
全ての上記引用文献は、参照によりこの明細書に組み込まれる。上記実施例は、本発明の特定の実施態様を限定するものではなく、単に説明のためだけのものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】  組換えｈＣＫＩεによるカゼイン、ＩκＢα、およびｈＰＥＲ１のインビトロのリン酸化を示す。
【図２】  ｈＰＥＲ１およびｈＣＫＩεのウエスタンブロット分析（ＡおよびＢ）およびｈＰＥＲ１のラムダホスファターゼ処理（Ｃ）を示す。
【図３】  ｈＣＫＩεを同時にトランスフェクションしたｈＰＥＲ１のパルス−チェイス標識を示す。
【図４】  ｈＰＥＲ１およびｈＣＫＩε間のタンパク質相互作用を示す。
【図５】  ｈＣＫＩεのリン酸化部位のマッピングを示す。
【図６】  Period ｍＲＮＡ濃度を示す。
【図７】  Clockタンパク質経路を示す。
【図８】  時間経過におけるPeriodタンパク質およびリン酸化のレベルを示す。
【図９】  ＣＫＩε／ヒトPeriod１の同時トランスフェクションを示す。
【図１０】  ヒトPeriod ｍＲＮＡレベルを示す。
【図１１】  ヒトPeriod ｍＲＮＡレベルを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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