(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液回路内に固定化し、血中のカルボニル化合物を除去するための、スルホニルヒドラジン基を結合したポリスチレン樹脂を含むカルボニル化合物トラップ剤。
【請求項２】
血液透析に用いるための、請求項１に記載のカルボニル化合物トラップ剤。
【請求項３】
カルボニル化合物トラップ剤が、血液に不溶性の担体に固定化されたものである請求項１に記載のカルボニル化合物トラップ剤。
【請求項４】
担体が透析膜である、請求項３に記載のカルボニル化合物トラップ剤。
【請求項５】
透析膜がポリスルフォン膜である、請求項４に記載のカルボニル化合物トラップ剤。
【請求項６】
スルホニルヒドラジン基を結合したポリスチレン樹脂を含むカルボニル化合物トラップ剤を有効成分とする、血液回路内に固定化するための生体のカルボニルストレス状態改善剤。
【請求項７】
スルホニルヒドラジン基を結合したポリスチレン樹脂を含むカルボニル化合物トラップ剤を有効成分とする、血液回路内に固定化するための血液におけるカルボニルストレス状態改善剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、血中のカルボニル化合物の除去に関する。具体的には、カルボニル化合物トラップ剤を用いる、血中のカルボニル化合物の除去に関する。
背景技術
血液透析は慢性腎不全患者に対して一般的に行われる治療であり、半透膜を介して血液と透析液が接触することにより、血中の老廃物や毒性物質が除去される。しかし、腎不全の病態は、透析により完全に食い止められるものではない。そのような病態として、腎不全患者におけるＡＧＥ（ａｄｖａｎｃｅｄ  ｇｌｙｃａｔｉｏｎ  ｅｎｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ）やその前駆体であるカルボニル中間体のレベルの上昇が挙げられる。ＡＧＥは、タンパク質を構造的および機能的に修飾し、透析アミロイドーシスや動脈硬化などの透析合併症の発症に関与することが報告されている（Ｍａｋｉｔａ  Ｚ，ｅｔ  ａｌ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３２５：８３６−８４２，１９９１；Ｍｉｙａｔａ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ９２：１２４３−１２５２，１９９３；Ｍｉｙａｔａ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ９３：５２１−５２８，１９９４；Ｍｉｙａｔａ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９３：２３５３−２３５８，１９９６；Ｈｏｒｉｅ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １００：２９９５−３００４，１９９７；Ｍｉｙａｔａ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．ＦＥＢＳ  ｌｅｔｔｅｒｓ  ４４５：２０２−２０６，１９９９）。腎不全では血漿中にグリオキサール、メチルグリオキサール、３−デオキシグルコソン、アラビノース（Ｏｄａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２５６：８９−９３，１９９９；Ｎｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｐｈｒｏｎ  ６９：４３８−４４３，１９９５；Ｍｉｙａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．５５：３８９−３９９，１９９９；Ｍｉｙａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．９：２３４９−２３５６，１９９８）などのカルボニル中間体が蓄積すること（いわゆるカルボニルストレス）により、ＡＧＥ産物レベルが上昇することが、近年明らかにされた（Ｍｉｙａｔａ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  ９：２３４９−２３５６，１９９８；Ｍｉｙａｔａ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ  ５５：３８９−３９９，１９９９）。ＡＧＥ前駆体であるさまざまなカルボニル中間体は、主として炭水化物および脂質に由来する（Ｍｉｙａｔａ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ  ５５：３８９−３９９，１９９９；Ｍｉｙａｔａ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ  ５４；１２９０−１２９５，１９９８；Ｍｉｙａｔａ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ  ５１：１１７０−１１８１，１９９７）。腎不全患者における、これらＡＧＥやカルボニル中間体のレベルの上昇、すなわち、「カルボニルストレス」は、現行の血液透析では有効に改善することはできない。
発明の開示
本発明は、血中のカルボニル化合物を除去するためのカルボニル化合物トラップ剤の提供を課題とする。また、本発明は、生体のカルボニルストレス状態を改善するための方法および薬剤の提供を課題としている。本発明により、特にカルボニルストレス状態に陥りやすい血液透析患者において、カルボニル化合物による障害を防止することが可能となる。血液透析患者のカルボニル化合物による障害をできるだけ小さくすることが本発明の課題である。
本発明者は、まず、血液透析に使用される血液透析膜が、患者血中のカルボニル化合物量にどのような影響を及ぼすのかを検討した。カルボニル中間体の蓄積（カルボニルストレス）を表すマーカーであるペントシジンの血中含量を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により定量し、患者が透析に使用している透析膜の種類別に比較した。その結果、遊離ペントシジンは、いずれの透析膜を使用した場合でも透析により顕著に除去されるものの、体内のペントシジンの大半を占める蛋白結合型ペントシジンは、透析によっては効果的に除去できていないことが判明した。
透析膜の種類別では、ｌｏｗ−ｆｌｕｘセルロース、ｈｉｇｈ−ｆｌｕｘポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、およびＡＮ６９においては、蛋白結合型および遊離型ペントシジンは、両者とも同様の値を示したが、ｈｉｇｈ−ｆｌｕｘポリスルフォン（ＰＳ）においては低い値を示した（ｐ＜０．０１）。患者が日本人であるかベルギー人であるか、またはＰＳ膜のメーカーなどで差は認められなかった。患者が使用する透析膜をＡＮ６９からＰＳに変更した３人の患者では、蛋白結合型ペントシジンのレベルが低下し、再びＡＮ６９に戻すと、もとのレベルまで上昇した。これらの結果から、カルボニル化合物の生成を抑制するための透析膜としては、ポリスルフォン膜が有効であることが判明した。
本発明者は次に、血中のカルボニル化合物をより効果的に除去するため、カルボニル化合物トラップ剤を利用することを考えた。透析患者血液から血漿を調製し、カルボニル化合物トラップ剤を固定化した担体と共にインキュベートし、血中カルボニル化合物量の定量を行った。その結果、カルボニル化合物トラップ剤を固定化した担体とのインキュベーションにより、血中カルボニル化合物量は有意に低下することが判明した。
このようなことから、本発明者は、血中に蓄積するカルボニル化合物をより重視し、タンパク質修飾を中心とした透析患者のカルボニルストレスを改善するためには、血中に蓄積するカルボニル化合物の除去が必要と考えた。そこでこの課題の解決のために、カルボニル化合物との化学的な反応や吸着によってカルボニル化合物のタンパク質に対する修飾活性を失わせる、または低下させる機能を有する化合物の利用が有効であることを見出し本発明を完成した。本発明において、このような機能を有する化合物を固定化した担体、あるいはこのような化合物そのものを「カルボニル化合物トラップ剤」と呼ぶ。
すなわち本発明は、以下に記載の、血中のカルボニル化合物を除去するための、カルボニル化合物トラップ剤、および生体のカルボニルストレス状態を改善するための方法および薬剤に関する。
〔１〕  血中のカルボニル化合物を除去するための、カルボニル化合物トラップ剤。
〔２〕  血液透析に用いるための、〔１〕に記載のカルボニル化合物トラップ剤。
〔３〕  カルボニル化合物トラップ剤が、血液に不溶性の担体に固定化されたものである〔１〕に記載のカルボニル化合物トラップ剤。
〔４〕  担体が透析膜である、〔３〕に記載のカルボニル化合物トラップ剤。
〔５〕  透析膜がポリスルフォン膜である、〔４〕に記載のカルボニル化合物トラップ剤。
〔６〕  カルボニル化合物トラップ剤がメイラード反応阻害剤である、〔１〕に記載のカルボニル化合物トラップ剤。
〔７〕  メイラード反応阻害剤が、アミノグアニジン、ピリドキサミン、ヒドラジン、ＳＨ基含有化合物、およびそれらの誘導体からなる群から選択された少なくとも１つの化合物である、〔６〕に記載のカルボニル化合物トラップ剤。
〔８〕  カルボニル化合物トラップ剤が、血液に不溶性の化合物からなることを特徴とする〔１〕に記載のカルボニル化合物トラップ剤。
〔９〕  血液に不溶性の化合物が、イオン交換樹脂、活性炭、シリカゲル、アルミナ、および炭酸カルシウムからなる群から選択された少なくとも１つの化合物である、〔８〕に記載のカルボニル化合物トラップ剤。
〔１０〕      カルボニル化合物トラップ剤を有効成分とする、生体のカルボニルストレス状態改善剤。
〔１１〕      カルボニル化合物トラップ剤を有効成分とする、血液におけるカルボニルストレス状態改善剤。
〔１２〕      血液回路内に固定化するための、〔１１〕に記載のカルボニルストレス状態改善剤。
〔１３〕      カルボニル化合物トラップ剤がメイラード反応阻害剤である、〔１１〕に記載のカルボニルストレス状態改善剤。
〔１４〕      メイラード反応阻害剤が、アミノグアニジン、ピリドキサミン、ヒドラジン、ＳＨ基含有化合物、およびそれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも１つの化合物である、〔１３〕に記載のカルボニルストレス状態改善剤。
〔１５〕      患者血液を血液回路内においてカルボニル化合物トラップ剤に接触させる工程を含む、カルボニルストレス状態の改善方法。
〔１６〕      カルボニル化合物トラップ剤が血液に不溶性の担体に固定化されていることを特徴とする、〔１５〕に記載の方法。
あるいは本発明は、カルボニル化合物トラップ剤の、血中のカルボニル化合物の除去における使用に関する。更に本発明は、カルボニル化合物トラップ剤の、血中のカルボニルストレス状態改善剤の製造のための使用に関する。
本発明において、トラップの対象となるカルボニル化合物とは、例えば腎不全患者の血中に酸化ストレスにともなって蓄積する以下のような化合物が含まれる。
炭水化物に由来するカルボニル化合物：
・アラビノース
・グリオキサール
・メチルグリオキサール
・３−デオキシグルコゾン
アスコルビン酸に由来するカルボニル化合物：
・デヒドロアスコルビン酸
脂質に由来するカルボニル化合物：
・ヒドロキシノネナール
・マロンジアルデヒド
・アクロレイン
本発明におけるカルボニル化合物トラップ剤としては、これら全てのカルボニル化合物に対し、化学的な反応や吸着によってカルボニル化合物のタンパク質に対する修飾活性を失わせる、または低下させるものであることが望ましいが、これらのカルボニル化合物の中で主要なもののみに対して有効な場合も含まれる。本発明において使用することができるカルボニル化合物トラップ剤には、例えば以下のようなものが含まれる。
・アミノグアニジン（Ｆｏｏｔｅ，Ｅ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓ．，２５：４２０−４２５（１９９５））
・±２−イソプロピリデネヒドラゾノ−４−オクソ−チアゾリジン−５−イルアセタニリド（±２−ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｉｄｅｎｅｈｙｄｒａｚｏｎｏ−４−ｏｘｏ−ｔｈｉａｚｏｌｉｄｉｎ−５−ｙｌａｃｅｔａｎｉｌｉｄｅ：ＯＰＢ−９１９５）（Ｓ．Ｎａｋａｍｕｒａ，１９９７，Ｄｉａｂｅｔｅｓ．４６：８９５−８９９）
さらにカルボニル化合物トラップ剤としては、例えば以下のような化合物またはそれらの誘導体であって、カルボニル化合物トラップ剤として機能する化合物を用いることができる。なお、誘導体とは、化合物のいずれかの位置で原子または分子の置換が起きている化合物を指す。これらの化合物は血液との分離を容易にするために担体に結合させて本発明によるカルボニル化合物トラップ剤とすることができる。あるいは、化合物自体が血液に対して不溶性であれば、担体に固定することなく本発明のカルボニル化合物トラップ剤として用いることができる。
（１）メチルグアニジンなどのグアニジン誘導体（特開昭６２−１４２１１４号、特開昭６２−２４９９０８号、特開平１−５６６１４号、特開平１−８３０５９号、特開平２−１５６号、特開平２−７６５号、特開平２−４２０５３号、特開平６−９３８０号、特表平５−５０５１８９号）。
（２）スルホニルヒドラジンなどのヒドラジン誘導体。
（３）ピラゾロン（特開平６−２８７１７９号）、ピラゾリン（特開平１０−１６７９６５号）、ピラゾール（特開平６−１９２０８９号、特開平６−２９８７３７号、特開平６−２９８７３８号）、イミダゾリジン（特開平５−２０１９９３号、特開平６−１３５９６８号、特開平７−１３３２６４号、特開平１０−１８２４６０号）、ヒダントイン（特開平６−１３５９６８号）などの２個の窒素原子を有する５員複素環式化合物。
（４）トリアゾール（特開平６−１９２０８９号）などの３個の窒素原子を有する５員複素環式化合物。
（５）チアゾリン（特開平１０−１６７９６５号）、チアゾール（特開平４−９３７５号、特開平９−５９２５８号）、チアゾリジン（特開平５−２０１９９３号、特開平３−２６１７７２号、特開平７−１３３２６４号、特開平８−１５７４７３号）などの１個の窒素原子と１個の硫黄原子を有する５員複素環式化合物。
（６）オキサゾール（特開平９−５９２５８号）などの１個の窒素原子と１個の酸素原子を有する５員複素環式化合物。
（７）ピリジン（特開平１０−１５８２４４号、特開平１０−１７５９５４号）、ピリミジン（特表平７−５００８１１号）などの含窒素６員複素環式化合物。
（８）インダゾール（特開平６−２８７１８０号）、ベンゾイミダゾール（特開平６−３０５９６４号）、キノリン（特開平３−１６１４４１号）などの含窒素縮合複素環式化合物。
（９）ベンゾチアゾール（特開平６−３０５９６４号）などの含硫含窒素縮合複素環式化合物。
（１０）ベンゾチオフェン（特開平７−１９６４９８号）などの含硫縮合複素環式化合物。
（１１）ベンゾピラン（特開平３−２０４８７４号、特開平４−３０８５８６号）などの含酸素縮合複素環式化合物。
（１２）カルバゾイル（特開平２−１５６号、特開平２−７５３号）、カルバジン酸（特開平２−１６７２６４号）、ヒドラジン（特開平３−１４８２２０号）などの窒素化合物。
（１３）ベンゾキノン（特開平９−３１５９６０号）、ヒドロキノン（特開平５−９１１４号）などのキノン類。
（１４）脂肪族ジカルボン酸（特開平１−５６６１４号、特開平５−３１０５６５号）。
（１５）ケイ素含有化合物（特開昭６２−２４９７０９号）。
（１６）有機ゲルマニウム化合物（特開平２−６２８８５号、特開平５−２５５１３０号、特開平７−２４７２９６号、特開平８−５９４８５号）。
（１７）フラボノイド類（特開平３−２４０７２５号、特開平７−２０６８３８号、特開平９−２４１１６５号、ＷＯ９４／０４５２０）。
（１８）アルキルアミン類（特開平６−２０６８１８号、特開平９−５９２３３号、特開平９−４０６２６号、特開平９−１２４４７１号）。
（１９）アミノ酸類（特表平４−５０２６１１号、特表平７−５０３７１３号）。
（２０）アスコクロリン（特開平６−３０５９５９号）、安息香酸（ＷＯ９１／１１９９７）、ピロロナフチリジニウム（特開平１０−１５８２６５号）などの芳香族化合物。
（２１）ポリペプチド（特表平７−５００５８０号）。
（２２）ピリドキサミンなどのビタミン類（ＷＯ９７／０９９８１）。
（２３）グルタチオンやシステインなどのＳＨ基含有化合物。
（２４）還元型アルブミンなどのＳＨ基含有蛋白。
（２５）テトラサイクリン系化合物（特開平６−２５６２８０号）。
（２６）キトサン類（特開平９−２２１４２７号）。
（２７）タンニン類（特開平９−４０５１９号）。
（２８）第４級アンモニウムイオン含有化合物。
（２９）メトホルミン、フェンホルミン、およびブホルミンなどのビグアナイド。
（３０）イオン交換樹脂などの高分子化合物。
（３１）活性炭、シリカゲル、アルミナ、炭酸カルシウム等の無機化合物。
以上のような化合物の多くは、一般にメイラード反応阻害剤として知られている。メイラード反応とは、グルコースなどの還元糖とアミノ酸やタンパク質との間に生じる非酵素的な糖化反応であり、１９１２年にメイラード（Ｍａｉｌｌａｒｄ）がアミノ酸と還元糖の混合物を加熱すると褐色に着色する現象に注目して報告した（Ｍａｉｌｌａｒｄ，Ｌ．Ｃ．，Ｃｏｍｐｔ．Ｒｅｎｄ．Ｓｏｃ．Ｂｉｏｌ．，７２：５９９（１９１２））。メイラード反応は、食品の加熱処理や貯蔵の間に生じる褐変化、芳香成分の生成、呈味、タンパク質変性などに関与していることから、食品化学の分野で研究が進められてきた。
ところが、１９６８年ヘモグロビンの微小画分であるグリコシルヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）が生体内で同定され、さらにこれが糖尿病患者において増加することが判明し（Ｒａｈｂａｒ．Ｓ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，２２：２９６（１９６８））、それを契機に生体内におけるメイラード反応の意義並びに糖尿病合併症、動脈硬化などの成人病の発症や老化の進行との関係が注目されるようになってきた。そして、このような生体内のメイラード反応を阻害する物質の探索が精力的に行われ、前述の化合物類がメイラード反応阻害剤として見いだされた。
しかし、このようなメイラード反応阻害剤が、血中のカルボニル化合物を排除して血液透析患者等のカルボニルストレス状態を改善することができるということは知られていなかった。
本発明におけるカルボニル化合物のトラップ剤を固定化する担体としては、血液に不溶性で、人体に対して無害なもの、血液に直接接触する材料として安全性および安定性を有するものであれば特に制限されない。具体的には、例えば、合成または天然の有機高分子化合物や、ガラスビーズ、シリカゲル、アルミナ、活性炭などの無機材料、およびこれらの表面に多糖類、合成高分子などをコーティングしたものなどが挙げられる。
高分子化合物からなる担体としては、例えば、ポリメチルメタクリレート系重合体、ポリアクリロニトリル系重合体、ポリスルフォン系重合体、ビニル系重合体、ポリオレフィン系重合体、フッ素系ポリマー系重合体、ポリエステル系重合体、ポリアミド系重合体、ポリイミド系重合体、ポリウレタン系重合体、ポリアクリル系重合体、ポリスチレン系重合体、ポリケトン系重合体、シリコン系重合体、セルロース系重合体、キトサン系重合体などがあげられる。具体的には、アガロース、セルロース、キチン、キトサン、セファロース、デキストラン等の多糖類およびそれらの誘導体、ポリエステル、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリスルフォン、ポリエーテルスルフォン、ポリプロピレン、ポリビニルアルコール、ポリアリルエーテルスルフォン、ポリアクリル酸エステル、ポリメタクリル酸エステル、ポリカーボネート、アセチル化セルロース、ポリアクリロニトリル、ポリエチレンテレフタレート、ポリアミド、シリコン樹脂、フッ素樹脂、ポリウレタン、ポリエーテルウレタン、ポリアクリルアミド、それらの誘導体などが挙げられる。これらの高分子材料は単独、あるいは２種以上を組み合わせて使用され得る。２種以上組み合わせる場合は、そのうち少なくとも１種にカルボニル化合物トラップ剤が固定化される。固定化されるカルボニル化合物トラップ剤は、単独で固定化するほか、２種類以上を固定化してもよい。またこれらの高分子材料には、適当な改質剤を添加したり、放射線架橋や過酸化物架橋などの変性処理を施すこともできる。
担体の形状に制限はなく、例えば膜状、繊維状、顆粒状、中空系状、不織布状、多孔形状、ハニカム形状などがあげられる。これらの担体は、厚さ、表面積、太さ、長さ、形状、および／または大きさを種々変えることにより、血液との接触面積を制御することができる。
上記担体にカルボニル化合物トラップ剤を固定化するには、公知の方法、例えば、物理的吸着法、生化学的特異結合法、イオン結合法、共有結合法、グラフト化などを用いればよい。また必要によりスペーサーを担体とカルボニル化合物トラップ剤の間に導入してもよい。トラップ剤に毒性がある場合など、担体からの溶出が問題となる場合には、溶出量をできるだけ少なくするためにトラップ剤は担体に共有結合で固定化されていることが好ましい。カルボニル化合物トラップ剤を担体に共有結合するには、担体に存在する官能基を用いればよい。官能基としては、例えば、水酸基、アミノ基、アルデヒド基、カルボキシル基、チオール基、ヒドロキシル基、シラノール基、アミド基、エポキシ基、サクシニルイミド基等が挙げられるが、これらに制限されない。共有結合の例としてエステル結合、エーテル結合、アミノ結合、アミド結合、スルフィド結合、イミノ結合、ジスルフィド結合等が挙げられる。
カルボニル化合物トラップ剤が固定化された担体としては、例えば、スルホニルヒドラジン基を有するポリスチレン担体（ＰＳ−ＴｓＮＨＮＨ２，ＡＲＧＯＮＡＵＴ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）などの市販のものを用いることもできる。
本発明のカルボニル化合物トラップ剤を固定化した担体の滅菌は、公知の滅菌法から、トラップ剤や担体などの種類により適当な滅菌法が選択される。滅菌処理には高圧蒸気滅菌、ガンマ線照射滅菌、ガス滅菌などが挙げられる。
カルボニル化合物トラップ剤を固定化した担体と血液との接触は、種々の形態が考えられる。例えば、カルボニル化合物トラップ剤を固定化した担体が充填された血液バッグに採血した患者の血液を入れ、この中で患者血液のカルボニル化合物をトラップする方法、カルボニル化合物トラップ剤を固定化したビーズ状、または繊維状等の担体をカラムに充填したものに血液を循環させる方法、などが挙げられる。血液は、全血でなくても、血漿を分離したのち、血漿を処理してもよい。処理された血液は患者に戻されるか、必要に応じて血液バッグ中などに保存することもできる。血液バッグ内にカルボニル化合物トラップ剤を固定化した担体を含めておくことにより、血液バッグ内に保存中の血液で生成・蓄積するカルボニル化合物をトラップすることも可能である。
本発明のカルボニル化合物トラップ剤を固定化した担体と血液との接触は、血液透析や血液濾過、血液濾過透析、血液吸着、血漿分離を含む血液浄化の過程で行うことができる。
例えば、血液透析患者に対しては、血液透析回路内にカルボニル化合物トラップ剤を固定化した担体を配置させることにより、血液透析とカルボニル化合物のトラップとを同時に行うことができる。この場合、血液透析膜を担体として利用し、カルボニル化合物トラップ剤を血液透析膜に固定化しておくことが好ましい。担体として用いられる透析膜の種類は公知のものを使用することができる。例えば、再生セルロース、セルローストリアセテート等のセルロース誘導体、ポリメチルメタクリレート、ポリオレフィン、ポリスルフォン、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）、ポリアミド、ポリイミド、ポリエーテルナイロン、シリコン、ポリエステル系共重合体等が挙げられ、特に限定されない。実施例に示されたように、透析膜としてポリスルフォンを用いた場合に、カルボニル中間体（ペントシジン）レベルの低下が認められた。従って、上記透析膜の中でも、特にポリスルフォン膜を担体として用いるのが好ましい。もちろん透析膜を担体とせず、上記のように、カルボニル化合物トラップ剤を固定化した担体を充填したカラムを血液透析回路中に配置させてもよい。このように患者血液をカルボニル化合物トラップ剤を固定化した担体に接触させることにより、血中由来のカルボニル化合物が捕捉され、その生体に対する障害活性がうばわれ、無害化される。体外循環時に血液の凝固を防ぐため、抗凝固剤を併用することもできる。抗凝固剤としては、例えば、ヘパリン、低分子ヘパリン、フサン（メシル酸ナファモスタット）等が挙げられる。これらは、担体に固定化されていてもよい。
血液との接触時に用いるトラップ剤が少ないと、透析時に患者血中のカルボニル化合物を処理することができなくなるケースが予想される。特に患者血中のカルボニル化合物の量をあらかじめ予測することは困難なので、患者に対する安全性を保障できる範囲内でできるだけ多量のトラップ剤が活性を維持できるようにするのが効果的である。トラップ剤の用量は、担体へのトラップ剤の固定化量、またはトラップ剤が固定化された担体の使用量を変更して調整することができる。
本発明のカルボニル化合物トラップ剤には、上述のメイラード反応阻害剤に代表される有機化合物の他、イオン交換樹脂などの高分子化合物、あるいは活性炭やシリカゲル、アルミナ、炭酸カルシウムなどの無機化合物も使用できる。これらの化合物は、クロマトグラフィーの充填剤として知られているものであるが、その吸着能を利用してカルボニル化合物をトラップすることができる。このような化合物は、それ自体が担体として機能するため、例えば、外部血液循環回路に装置された濾過器内に充填して使用することができる。このような化合物も、本発明によるカルボニルストレス状態改善剤を構成する「カルボニル化合物トラップ剤」として利用することができる。この場合、これらの化合物そのものが、前記カルボニル化合物トラップ剤を固定化した担体として機能する。あるいは、このような自らカルボニル化合物トラップ能を有する担体に、更に他のカルボニル化合物トラップ剤を固定化することもできる。
なお、活性炭を使用した吸着型血液浄化器が公知である。吸着型血液浄化器は、薬物中毒や肝性昏睡時の血液浄化、多臓器不全としての急性腎不全発症の初期に増加する内因性・外因性の各種トキシンや血管作動性物質の除去を目的とした血液透析の補助療法として使用されている。しかしながら、かかる吸着型血液浄化器が、カルボニル化合物トラップ剤として有効であるということは全く知られていなかった。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
［実施例１］血漿ペントシジンに及ぼす血液透析膜の種類の影響
１．  患者
ベルギー人（ｎ＝２９）または日本人（ｎ＝９７）で、週３回の血液透析を行っている患者１２６名（男性６９名、女性５７名）を調査した。年齢は６１．２±１３（標準偏差）歳であった。２名のみが、軽いＩＩ型糖尿病であった。すべての患者は、少なくとも３ヶ月間（または、２、３名の患者は３ヶ月以内であるが、血液透析の開始以来）にわたって同じ種類の血液透析膜を使用していた。ベルギー人患者２９名中２６名においては、透析膜を再使用したが、日本人患者においては、再使用はなかった。各患者のカルテから、残存腎機能（ｍｌ／ｄａｙ）、透析膜表面積、および血液透析の透析時間のデータを得た。
２．  膜の種類
血液透析膜は、ｈｉｇｈ−ｆｌｕｘ（ＵＦインデックス＞１０ｍｌ／ｍｍＨｇ／ｈ）ＡＮ６９（Ｈｏｓｐａｌ（Ｆｒａｎｃｅ）社製）（ＡＮ６９群）、ｈｉｇｈ−ｆｌｕｘポリスルフォン（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ（Ｇｅｒｍａｎｙ）社製）（ＰＳ群）、ｈｉｇｈ−ｆｌｕｘポリスルフォン（旭メディカル（Ｊａｐａｎ）社製）（ＡＰＳ群）、ｈｉｇｈ−ｆｌｕｘポリメチルメタクリレート（ｐｏｌｙｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）（Ｔｏｒａｙ（Ｊａｐａｎ）社製）（ＰＭＭＡ群）、およびｌｏｗ−ｆｌｕｘセルロース（旭メディカル（Ｊａｐａｎ）社製）（セルロース群）を使用した。
３．  血漿試料
血漿試料は、１回目の血液透析開始に先立って１２６名の患者全員から採取し、毎週の透析後に６６名から採取した。
すべての試料は直ちに遠心分離を行い、−２０℃に凍結した血漿について下記の検査をおこなった。
４．  全ペントシジンおよび遊離ペントシジンの定量
全ペントシジンの定量には、試料（５０μｌ）を凍結乾燥させ、１００μｌの６Ｎ  ＨＣｌに溶解させ窒素封入後１１０℃で１６時間インキュベートし、１００μｌの５Ｎ  ＮａＯＨおよび２００μｌの０．５Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．４）で中和後、孔径０．５μｍのフィルターで濾過し、ＰＢＳで２０倍に希釈した。遊離型ペントシジンの定量には、試料（５０μｌ）に等量の１０％ＴＣＡを混合後、５０００×ｇ１０分で遠心した。上清を孔径０．５μｍのフィルターで濾過し、蒸留水で４倍に希釈した。
これらの試料中のペントシジンをＣ１８逆相カラム（Ｗａｔｅｒｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いた逆相ＨＰＬＣ（Ｍｉｙａｔａ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  ７：１１９８−１２０６，１９９６）で分析した。蛍光検出器（ＲＦ−１０Ａ；Ｓｈｉｍａｄｚｕ）を用い、励起波長／検出波長を３３５／３８５ｎｍで流出液をモニターした。合成ペントシジンを用いて標準曲線を作成した。
蛋白結合型ペントシジン（ペントシジン／蛋白）（ｐｍｏｌ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）は、［血漿全ペントシジン（ｐｍｏｌ／ｍｌ）−遊離ペントシジン（ｐｍｏｌ／ｍｌ）］／［血漿蛋白濃度（ｍｇ／ｍｌ）］により算出した。
５．  患者群間の統計解析
ペントシジンレベルの定量の結果を含む各数値は平均±標準偏差またはパーセンテージ（％）として表した。残存腎機能のデータはｌｏｇ変換した。一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）（Ｆ検定つき）により、個人データとペントシジンレベルを、異なる透析膜を用いている血液透析患者のグループ間で比較した。さらにＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ  ｔ−ｔｅｓｔを用いて透析膜のグループを比較分析した。カイ二乗検定により、残存腎機能の程度を、さまざまな群間で比較した。
５群の患者間のｃｒｏｓｓ−ｓｅｃｔｉｏｎａｌな解析の結果を表１に示す。年齢に関してはグループ間に大きな違いはなかった。血漿蛋白レベルはＡＮ６９およびセルロース群ではより高かった。透析膜面積はＡＰＳ群において大きく、また研究前の血液透析期間・１回の透析時間もＡＰＳ群で長かった。一方、残存腎機能はＰＳ群で高かった。
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透析前の蛋白結合型ペントシジンおよび遊離型ペントシジンの血漿レベルは、ＡＮ６９、ＰＭＭＡ、およびセルロース群では同じレベルであり、ＰＳ群およびＡＰＳ群では有意に低かった。ＰＳ群とＡＰＳ群との間では有意差はなかった（表２）。
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透析前の血漿ペントシジンに対し影響を与えうる様々な因子を、単変量分析により分析した結果、残存腎機能が、蛋白結合型および遊離ペントシジンに対し有意に影響を与えることが判明した。具体的には、残存腎機能が高いほど、ペントシジンレベルは低かった。血漿蛋白レベルやアルブミンレベル・年齢・透析歴は、ペントシジンレベルと相関は認められなかった（表３）。ポリスルフォン群（ＰＳ群およびＡＰＳ群）の場合、Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ社または旭メディカル社（Ａｓａｈｉ社）のポリスルフォン膜による透析を受けたベルギー人患者または日本人患者の透析前のペントシジンレベルは同様の値を示した（表４）。
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以上のように、ポリスルフォン透析膜を使用する透析患者は、他の透析膜による透析患者よりもペントシジンレベルが低いことが判明した。ポリスルフォン膜で透析を行った患者は、国に関わらずペントシジンレベルの低下が認められ、さらに異なるメーカーの透析膜でも同様の結果が得られた。更に、旭メディカル社製ポリスルフォン透析膜による透析を受ける患者は、実質的に無尿であるにもかかわらず、ペントシジンレベルは同様に低かった。Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ社製ポリスルフォン群では、尿量が３００ｍｌ／ｍｉｎを超える患者を除外してもペントシジンレベルの差異における統計学的な有意性に変化は来さなかった。
ＡＮ６９もｈｉｇｈ−ｆｌｕｘであり、また、ｈｉｇｈ−ｆｌｕｘのＡＮ６９とｌｏｗ−ｆｌｕｘのセルロースによる透析が、透析前のペントシジンレベルに関して同様の結果を示したことから、ペントシジンレベルの差異と透析膜の除去性能は無関係であると考えられる。
蛋白補正ペントシジンレベルおよび遊離ペントシジンレベルと残存腎機能との関係を、線形回帰分析により分析した。従属変数（蛋白補正ペントシジンレベル・遊離ペントシジンレベル）に対する各説明変数の効果を、変数選択−重回帰分析（変数増加法）（Ｆｏｒｗａｒｄ  ｓｔｅｐｗｉｓｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ）により検定した。すべての分析は、ＢＭＤＰ統計ソフトウェア（ＢＭＤＰはＮｅｗ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ：Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，１９９５の商標）を用いて行った。Ｐ＜０．０５を有意とした。
分析の結果、透析膜の種類と残存腎機能のみが、蛋白結合型および遊離ペントシジンレベルの独立決定因子であることが示された（表５）。相互作用はどれも有意でなかったことから、ペントシジンレベルに対する残存腎機能の影響は、透析膜の種類によって影響されないと考えられる。
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６．  血液透析前後のペントシジンレベルに及ぼす透析膜の効果
透析前のペントシジンレベルに対して透析膜が効果を及ぼす機構をさらに解析するため、ｈｉｇｈ−ｆｌｕｘポリスルフォン（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ）、ＡＮ６９、ＰＭＭＡ、またはｌｏｗ−ｆｌｕｘセルロース透析膜を使った４群の患者に対し、透析前および後のペントシジンレベルを定量した（表６）。
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上記の実験により予想された通り、蛋白結合型ペントシジンはほとんど変化せず、また、透析膜の種類とも無関係であった。唯一、遊離ペントシジンが顕著に減少したが、その比率はすべての群で似ており、７６％（ＡＮ６９）から６７％（ＰＭＭＡ）の間であった。グループ間に有意な差はなかった。従って、ポリスルフォン膜による透析患者で透析前のペントシジンレベルが低かったことを、透析膜の透析能力の差異によって説明することはできないことが判明した。
本発明者は、以前、血液透析そのものは、全ペントシジンまたは蛋白結合型ペントシジンレベルに変更を与えないことを示した（Ｍｉｙａｔａ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ  ５１：８８０−８８７，１９９７）。この知見は、ペントシジンの９５％は、透析で除去されないアルブミンと結合している（Ｍｉｙａｔａ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  ７：１１９８−１２０６，１９９６）という事実に一致する。この知見は、上記の４つの異なる種類の透析膜による実施例で裏付けられた。これに対し、遊離ペントシジンは血液透析により減少し、すべての透析膜で似た現象が観察されたが、この結果は、遊離ペントシジンの分子量（３７９Ｄａ）を考えれば予想されることである。血液透析の前後のペントシジンレベルが、すべての透析膜で同様であったことは、受動輸送だけでなく、ペントシジンの吸収も、ポリスルフォンや他の透析膜による透析中に同様に起こっていることを示唆している。インビトロにおいて、放射性標識された遊離ペントシジンの吸収を測定したところ、吸収はセルロース膜およびポリスルフォン膜ではごく僅かであり、事実上、差は認められなかった。  従って、ポリスルフォン膜によりペントシジンの除去が向上するということで、透析前のペントシジンの低レベルを説明することはできないと思われる。別の可能性としては、ポリスルフォン膜による透析が、ペントシジン産生の抑制と係わっている可能性が考えられる。
既に指摘したように、ペントシジンレベルは炭水化物に由来するカルボニル中間体の濃度を反映している。ポリスルフォン膜は、これらのカルボニル化合物の除去に特異的な効果を有しており、それによりペントシジン産生に効果を発揮している可能性がある。または、ポリスルフォン膜は尿毒症に関連しているとされる酸化的ストレスを減少させる可能性も考えられる（Ｍｉｙａｔａ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ  ５４；１２９０−１２９５，１９９８；Ｍｉｙａｔａ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ  ５１：１１７０−１１８１，１９９７；Ｌｏｕｇｈｒｅｙ  ＣＭ，ｅｔ  ａｌ．Ｑ  Ｊ  Ｍｅｄ  ８７：６７９−６８３，１９９４；Ｕｅｄａ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２４５：７８５−７９０，１９９８；Ｋｕｍａｎｏ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．Ａｄｖ  Ｐｅｒｉｔ  Ｄｉａｌ  １９９２；８：１２７−１３０；Ｗｉｔｋｏ−Ｓａｒｓａｔ  Ｖ，ｅｔ  ａｌ．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ  ４９：１３０４−１３１３，１９９６）。酸化的ストレスの減少により、カルボニル化合物の産生が抑えられ、それによりペントシジンの生成が減少する可能性もある（Ｍｉｙａｔａ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ  ５１：１１７０−１１８１，１９９７）。
７．  ペントシジンレベルに及ぼす透析膜の変更の効果
ポリスルフォン膜において特異的にペントシジンレベルが低くなる効果を確かめるため、長期間（＞５年）ＡＮ６９による透析を受けている３人の無尿症患者についてｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌな解析を行った。患者は１０週間の間、同様の表面積を持つポリスルフォンの透析膜（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ）による透析に変更し、その後ＡＮ６９に再変更した。ＰＳへの変更の２週間前の透析前試料（２試料）、ＰＳ透析期間中の透析前試料（５試料）、およびＡＮ６９へ戻した後、１４〜１６週の透析前試料（２試料）を採取した。
ＰＳの透析へ変更後、各患者の蛋白結合型ペントシジンレベルは次第に減少し、ＡＮ６９の透析へ戻した後は、ＰＳに変更前のＡＮ６９使用時のレベルまで戻ることが判明した（図１）。
ＡＮ６９からＰＳによる透析に移行した患者のｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌな研究において観察されたペントシジンレベルの減少は、ｃｒｏｓｓ−ｓｅｃｔｉｏｎａｌな研究において観察されたＰＳ群とＡＮ６９群との間の違いの１／３に過ぎない（３．６に対し１０．４ｐｍｏｌ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）。この相異は、ＰＳ透析移行による観察が、１０週間しか行われなかったことによることが考えられる。ポリスルフォンが、ペントシジンの生成速度を減少させているとすれば、蛋白結合型ペントシジンの減少がこのように緩やかであったことも説明できると思われる。このような環境下では、蛋白結合型ペントシジンレベルの減少は、そのタンパク質の代謝によってしか起こらないと考えられる。同様の観察が、腎臓移植成功後においてもなされている。このとき、蛋白結合型ペントシジンの減少は、血漿β２ミクログロブリンの減少と比べ、非常にゆっくりとしか起こらず、蛋白結合型ペントシジンの崩壊が遅いことが示されている（Ｍｉｙａｔａ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ  ５１：８８０−８８７，１９９７；Ｈｒｉｃｉｋ  ＤＥ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  １０：５６８−５７３，１９９６）。
［実施例２］カルボニル化合物トラップ剤固定化担体による血中カルボニル化合物の除去
架橋したポリスチレン樹脂にスルホニルヒドラジン基を結合したもの（ＰＳ−ＴｓＮＨＮＨ２，ＡＲＧＯＮＡＵＴ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）をカルボニル化合物トラップビーズとして用いて、血中カルボニル化合物の除去効果を検討した。透析患者血漿及びカルボニル化合物トラップビーズを添加した透析患者血漿を３７℃でインキュベートし、ペントシジンの形成抑制効果を確認した。カルボニル化合物トラップビーズの入ったチューブに、ジメチルスルホキシド１００μｌ加え膨潤させた後、濾過滅菌した透析患者の透析前の血漿を添加し、３７℃で１週間インキュベートした。インキュベート終了後、ポアーサイズ０．２２μｍの遠心式フィルター（ミリポア製、ＵＦＣ３０ＧＶ００）を用いてビーズを除去した。つぎに、ビーズを除去した溶液５０μｌに１０％トリクロル酢酸５０μｌを加え、遠心してタンパク質を沈殿させた。タンパク質を３００μｌの５％トリクロル酢酸で洗浄し、乾固させた。つぎに、６Ｎ  ＨＣｌを１００μｌ添加し、１１０℃で１６時間加熱した後、ＨＰＬＣでペントシジンを定量した（Ｔ．Ｍｉｙａｔａら，１９９６，Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．，７：１１９８−１２０６，Ｔ，Ｍｉｙａｔａら，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：２３５３−２３５８）。
３７℃でインキュベートしたときに生成するペントシジン量を図２に示した。カルボニル化合物トラップビーズの添加により、ペントシジンの生成が抑制されることが判明した。また、ペントシジンの生成の抑制は添加したカルボニル化合物トラップビーズの量に依存した。
これらの結果から、カルボニル化合物トラップ剤を固定化した担体を用いて、血中のカルボニル化合物を除去できることが明らかとなった。また、血液透析膜としては、特にポリスルフォン膜が、カルボニルストレス状態の改善に好適であることが判明した。
［実施例３］活性炭によるジカルボニル化合物溶液中のカルボニル化合物の除去作用
活性炭（和光純薬製）２５ｍｇまたは５０ｍｇの入ったチューブに、グリオキサール、メチルグリオキサール、３−デオキシグルコソンをＰＢＳ（−）に溶解したジカルボニル溶液（各１００μＭの濃度）をそれぞれ９００μｌ添加しローテーターを用いて室温で１９時間攪拌した。次に、溶液をポアーサイズ０．２２μｍの遠心式濾過チューブ（ミリポア製、ＵＦＣ３０ＧＶ００）で濾過し、濾液中のグリオキサール、メチルグリオキサール、３−デオキシグルコソン濃度を高速液体クロマトグラフィーを用いて測定した。
活性炭２５ｍｇにジカルボニル溶液を９００μｌ添加した場合、グリオキサールは７１％、メチルグリオキサールは９６％、３−デオキシグルコソンは９７％トラップされた。活性炭５０ｍｇの場合、グリオキサールは８５％、メチルグリオキサールは９８％、３−デオキシグルコソンは９８％トラップされた（図３）。
［実施例４］活性炭による腹膜透析液中のジカルボニル化合物の除去作用
腹膜透析液は通常、高濃度のブドウ糖を含有することから、滅菌時や保存時にブドウ糖由来のカルボニル化合物が生成し、これらのカルボニル化合物が腹膜透析施工中に生体内に導入され、カルボニルストレス状態の発生の一因となる。そこで、本発明のカルボニル化合物トラップ剤による腹膜透析液中のカルボニル化合物の除去効果を検討した。
活性炭２５ｍｇまたは５０ｍｇの入ったチューブに、腹膜透析液（バクスター製、ダイアニール  ＰＤ−４，１．５）を９００μｌ添加しローテーターを用いて室温で１９時間攪拌した。次に、溶液をポアーサイズ０．２２μｍの遠心式濾過チューブ（ミリポア製、ＵＦＣ３０ＧＶ００）で濾過し、濾液中のグリオキサール、メチルグリオキサール、３−デオキシグルコソン濃度を高速液体クロマトグラフィーを用いて測定した。
活性炭２５ｍｇに腹膜透析液を９００μｌ添加した場合、グリオキサールは５６％、メチルグリオキサールは７１％、３−デオキシグルコソンは６２％トラップされた。活性炭５０ｍｇに腹膜透析液を９００μｌ添加した場合、グリオキサールは６４％、メチルグリオキサールは７８％、３−デオキシグルコソンは７７％トラップされた（図４）。
［実施例５］活性炭による透析患者血漿を３７℃でインキュベートしたときのペントシジンの生成抑制効果
ＰＢＳ（−）に懸濁させた活性炭１２ｍｇの入ったチューブに、濾過滅菌した透析患者の透析前の血漿２５０μｌを添加し、３７℃で１週間インキュベートした。インキュベート終了後、遠心後の上清５０μｌに、１２Ｎ  ＨＣｌを５０μｌ添加し、１１０℃で１６時間加熱し、加水分解した後、高速液体クロマトグラフィーを用いてペントシジンを定量した（Ｔ．Ｍｉｙａｔａら，１９９６，Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．，７：１１９８−１２０６，Ｔ．Ｍｉｙａｔａら，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９３：２３５３−２３５８）。
３７℃でインキュベートしたときに生成するペントシジン量を図５に示した。活性炭の添加により、対照と比較してペントシジンの生成が５１％抑制された。このことから、ペントシジンの前駆体となるカルボニル化合物が活性炭により吸着されることが示唆された。
［実施例６］活性炭による血漿中のカルボニル化合物の除去作用
活性炭（和光純薬製）２０ｍｇ、または５０ｍｇの入ったチューブに、腎不全患者の血漿を５００μｌ添加しローテーターを用いて室温で１２時間撹拌した。つぎに、遠心により活性炭を分離後、血漿中のグリオキサールとメチルグリオキサール濃度を高速液体クロマトグラフィーを用いて測定した。
血漿中のグリオキサールとメチルグリオキサール濃度は、以下のようにして測定した。すなわち、血漿２００μｌに０．６７Ｍ過塩素酸３００μｌを添加して撹拌後、遠心して上清を分離した。この上清１５０μｌに１％  ｏ−フェニレンジアミン２０μｌ、内部標準として１０μＭの２，３−ブタンジオン５０μｌを加え撹拌後、２５℃で１時間反応させた。Ｏｈｍｏｒｉらの方法（Ｏｈｍｏｒｉ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．４１４：１４９−１５５，１９８７）によりグリオキサールあるいはメチルグリオキサールと  ｏ−フェニレンジアミンとの反応で生成するキノキサリン誘導体を逆相カラムを用いたＨＰＬＣ分離し定量した。
結果は図６に示した。血漿に活性炭２０ｍｇを添加することにより、グリオキサールは５８％、メチルグリオキサールは６５％トラップされた。活性炭５０ｍｇを添加した場合には、グリオキサールは７５％、メチルグリオキサールは８０％がトラップされた。
［実施例７］スルホニルヒドラジン結合ポリスチレンビーズ（Ｐｓ−ＴｓＮＨＮＨ２）による血漿中のカルボニル化合物の除去作用
スルホニルヒドラジン結合ポリスチレンビーズ１０ｍｇ、または２０ｍｇの入ったチューブに、腎不全患者の血漿を５００μｌ添加しローテーターを用いて室温で１２時間撹拌した。  つぎに、遠心によりスルホニルヒドラジン結合ポリスチレンビーズを分離後［実施例６］と同様の方法により血漿中のグオキサールとメチルグリオキサール濃度を高速液体クロマトグラフィーを用いて測定した。結果は図６に示した。血漿にスルホニルヒドラジン結合ポリスチレンビーズ１０ｍｇを添加することにより、グリオキサールは４５％、メチルグリオキサールは３９％トラップされた。スルホニルヒドラジン結合ポリスチレンビーズ２０ｍｇを添加した場合には、グリオキサール、メチルグリオキサールともに７５％がトラップされた。
［実施例８］アミノグアニジンによる血漿中のカルボニル化合物の除去作用
アミノグアニジンを０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）に溶かした溶液（５０ｍＭ，１００ｍＭ）５０μｌと腎不全患者の血漿を４５０μｌを混合し室温で１２時間静置した。１２間後に血漿中のグリオキサールとメチルグリオキサール濃度を［実施例６］と同様の方法により高速液体クロマトグラフィーを用いて測定した。
結果は図７に示した。血漿のアミノグアニジン濃度が５ｍＭのとき、グリオキサールは５０％、メチルグリオキサールは４６％トラップされた。アミノグアニジン濃度が１０ｍＭの場合には、グリオキサールは５８％、メチルグリオキサールは７０％がトラップされた。
［実施例９］カルボニル化合物トラップ剤を固定化した担体によるカルボニル化合物の除去作用
カルボニル化合物トラップ剤を固定化した担体によるカルボニル化合物の除去作用を、ジアミノグアニジン結合ポリアミドを用いて検討した。ジアミノグアニジン結合ポリアミドは、ポリアミドにエピクロルヒドリンを反応させた後、ジアミノグアニジンの水溶液（ｐＨ１２）を添加し８０℃で約１時間反応させることにより作製した（図８）。反応後、得られたジアミノグアニジン結合ポリアミドを水で洗浄し乾燥させたのち、実験に用いた。
ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶かしたジカルボニル化合物溶液（グリオキサール、メチルグリオキサール、３−デオキシグルコソン各１μＭ）１ｍｌを、ジアミノグアニジン結合ポリアミド３０ｍｇを含むチューブに添加し、ローテーターを用いて室温（２５℃）で５時間攪拌した。溶液１００μｌを遠心し、上清に残留したグリオキサール、メチルグリオキサール、３−デオキシグルコソンの濃度を、これらを誘導体に転換したのち、高速液体クロマトグラフィーを用いて測定した。結果を図９に示した。グリオキサールは３０％、メチルグリオキサールは５６％、３−デオキシグルコソンは１１％がトラップされた。同じ条件下で、ジアミノグアニジンを結合していないポリアミドをネガティブコントロールとして用いた場合、上記カルボニル化合物に対するトラップ作用は観察されなかった。
以上の結果から、カルボニル化合物トラップ剤を固定化した担体により、効果的に液体中のカルボニル化合物を除去できることが確認された。
産業上の利用の可能性
本発明によれば、血中のカルボニル化合物を効果的に取り除くことができる。本発明のカルボニルストレス状態改善剤は、血液透析用透析膜に固定化することにより、またはその他の担体に固定化して血液回路内に配置することにより簡単に実施することができる。これにより、腎不全患者等を苦しめていたカルボニル化合物による障害（カルボニルストレス）を改善することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
図１は、３人の患者における、血漿ペントシジンレベル（ｐｍｏｌ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）に及ぼす血液透析膜の種類の変更の効果を示す図である。結果は初期値（患者１（◇）、患者２（□）、患者３（△）で、それぞれ４１．８、２２．１、２８．５ｐｍｏｌ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）に対する％で表した。各値は各期間の最後に２週間の間隔をあけて採取された２サンプルの平均である（ＡＮ６９で透析していた−２および０週目、ＰＳに変更後の８および１０週目、ＡＮ６９に戻した後の１４および１６週目）。
図２は、カルボニル化合物トラップ剤を固定化したビーズとのインキュベーションによる、透析患者血漿中のペントシジンレベルの抑制効果を示す図である。
図３は、活性炭によるジカルボニル化合物溶液中のカルボニル化合物のトラップ作用を示す図である。
図４は、活性炭による腹膜透析液中のジカルボニル化合物のトラップ作用を示す図である。
図５は、透析患者血漿を３７℃でインキュベートしたときの、活性炭によるペントシジンの生成抑制効果を示す図である。
図６は、活性炭、あるいはスルホニルヒドラジン結合ポリスチレンビーズによる、腎不全患者血漿におけるカルボニル化合物の除去作用を示す図。図中、縦軸はカルボニル化合物の濃度を示す。
図７は、アミノグアニジンによる、腎不全患者血漿におけるカルボニル化合物の除去作用を示す図。図中、縦軸はカルボニル化合物の濃度を示す。
図８は、ジアミノグアニジン結合ポリアミドの作製方法を示す図である。
図９は、ジアミノグアニジン結合ポリアミドによるジカルボニル化合物溶液中のカルボニル化合物の除去作用を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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