(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１４、１８、２０、２２および２４からなる群より選択されるものと少なくとも９０％同一であり、かつジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、配列番号１４、１８、２０、２２および２４からなる群より選択される、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項３】
配列番号１１、１２、１３、１６、１７、１９、２１および２３からなる群より選択されるものと少なくとも９０％同一であり、かつジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項４】
前記核酸配列が、配列番号１１、１２、１３、１６、１７、１９、２１および２３からなる群より選択される、請求項３に記載の単離された核酸分子。
【請求項５】
請求項１または請求項３に記載の核酸分子と機能的に連結された、植物細胞において機能する異種プロモーターを含む発現カセットを含む、ＤＮＡ構築物。
【請求項６】
ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼのポリペプチドをコードする核酸と機能的に連結された、植物細胞において機能する第２の異種プロモーターを含む第２の発現カセットをさらに含む、請求項５に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項７】
請求項５に記載のＤＮＡ構築物を含む、植物または種子。
【請求項８】
トウモロコシ、ダイズ、カノーラ、アブラナ、綿、ゴマ、亜麻、ラッカセイ、ヒマワリ、ベニバナ、オリーブおよびアブラヤシからなる群より選択される、請求項７に記載の植物または種子。
【請求項９】
加工された、請求項７に記載の植物または種子。
【請求項１０】
食料、食事、油およびタンパク質からなる群より選択される製品を製造するために使用される、請求項９に記載の植物または種子。
【請求項１１】
請求項６に記載のＤＮＡ構築物を含む、植物または種子。
【請求項１２】
トウモロコシ、ダイズ、カノーラ、アブラナ、綿、ゴマ、亜麻、ラッカセイ、ヒマワリ、ベニバナ、オリーブおよびアブラヤシからなる群より選択される、請求項１１に記載の植物または種子。
【請求項１３】
加工された、請求項１１に記載の植物または種子。
【請求項１４】
食料、食事、油およびタンパク質からなる群より選択される製品を製造するために使用される、請求項１３に記載の植物または種子。
【請求項１５】
（Ａ）請求項５または請求項６に記載のＤＮＡ構築物で植物細胞を形質転換するステップ；および
（Ｂ）該植物細胞を、同様の遺伝バックグラウンドを有するが該ＤＮＡ構築物は欠いている植物から得た種子と比べて強化した油を有する稔性植物に再生させるステップ
を含む、植物の作製方法。
【請求項１６】
前記植物が、同様の遺伝バックグラウンドを有するが前記ＤＮＡ構築物は欠いている植物から得た種子と比べて高い油収率を有する種子を提供する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
配列番号１４、１８、２０、２２および２４からなる群より選択されるものと少なくとも８０％同一であり、ＡＹＶＦＧＹＥＰＨＳＶＸＰＩ（配列番号３３）およびＦＸＸＰＸＹＲ（配列番号３４）からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸モチーフを有し、かつジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００２年７月３１日に出願した米国仮出願第６０／３９９，４２７号（参照により本明細書に組み入れる）の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、ポリペプチドおよびそれに関連する核酸配列、ならびにこのような分子を精製、入手および遺伝子操作用途において使用する方法に関する。特に、本発明は、植物、真菌および哺乳動物におけるトリアシルグリセロールの生成に関連するポリペプチドに関する。
【背景技術】
【０００３】
ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（以下、ＤＧＡＴと称する）は、植物、真菌および哺乳動物におけるトリアシルグリセロールの生成における最終酵素ステップを触媒する内在性膜タンパク質である。ＤＧＡＴは、全般的に、Harwood, Biochem. Biophysics. Acta, 13017-13056 (1996)；Daumら, Yeast, 16:1471-1510 (1998)；およびColemanら, Annu. Rev. Nutr., 20:77-103 (2000)に記載されている。この酵素は、アシル−コエンザイムＡから１，２−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）のｓｎ−３位へアシル基を転移させ、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）を形成することに関与する。植物および真菌では、ＤＧＡＴは、特に脂肪種子において、膜および脂質体画分に伴い、エネルギーが蓄積される際に使用される炭素の貯蔵に寄与する。ＴＡＧは、細胞におけるエネルギー蓄積のための重要な化学物質であると考えられている。ＤＧＡＴは、ＴＡＧ構造を調節し、ＴＡＧ合成を指令することが知られている。さらに、ＤＧＡＴ反応は、油合成に特異的であることが知られている。
【０００４】
植物において、ＴＡＧは、種子発芽の間に使用されるエネルギーの貯蔵形態として種子によって使用される植物油の主要成分である。高等植物は、ケネディー経路（Kennedyら, J. Biol. Chem., 222:193 (1956)；Finnlaysonら, Arch. Biochem. Biophys., 199:179-185 (1980)）と一般的に称される同様の代謝経路を介して、油を合成すると考えられている。脂肪酸は、色素体中で、脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）として集合的に知られる酵素により触媒される一連の反応を経てアセチルＣｏＡから作られる。色素体において生成される脂肪酸は、細胞の細胞質画分に輸送され、コエンザイムＡにエステル化される。これらのアシルＣｏＡは、小胞体（ＥＲ）上でのグリセロ脂質合成の基質である。グリセロ脂質合成自体は、まずホスファチジン酸（ＰＡ）およびＤＡＧを生じる一連の反応である。これらの代謝中間体のいずれも、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、もしくはホスファチジルコリン（ＰＣ）等の膜リン脂質に方向付けられ得るか、または中性トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）を形成するように方向付けられ得る。
【０００５】
ＤＡＧは、グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（Ｇ３ＰＡＴ）、およびリゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）により順番に触媒されてＰＡを作るステップと、次いで、ホスファチジン酸ホスファターゼ（ＰＡＰ）により触媒される追加の加水分解ステップによってＤＡＧを作ることにより、グリセロール−３−リン酸および脂質アシル−ＣｏＡから合成される。ほとんどの細胞において、ＤＡＧは、膜リン脂質を作るために使用され、最初のステップはＣＴＰ−ホスホコリンシチジリルトランスフェラーゼにより触媒されるＰＣ合成である。貯蔵油を生成する細胞では、ＤＡＧは、ＤＧＡＴにより触媒される反応において第３の脂肪酸でアシル化される。
【０００６】
ＤＧＡＴタンパク質の２つの異なるファミリーが同定されている。ＤＧＡＴタンパク質の第１のファミリー（以下、ＤＧＡＴ１と称する）は、アシル−コエンザイムＡ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＡＣＡＴ）に関し、文献に記載されている（例えば、米国特許第６，１００，０７７号および同第６，３４４，５４８号を参照）。先に同定されたファミリーであるＤＧＡＴ１タンパク質とは無関係な、ＤＧＡＴタンパク質の第２のファミリー（以下、ＤＧＡＴ２と称する）は、本発明に記載する。このＤＧＡＴ２タンパク質のファミリーは、２００２年４月１５日に出願された米国特許出願第１０／１２１，８５７号にも記載されている。
【０００７】
グリセロール骨格への脂肪酸の取り込みに関する表現型の結果をもたらしうる核酸配列を得て、油を生成することは、様々な障害の課題であり、目的の代謝因子の同定、有用な動的性質を有するタンパク質供給源の選択および特徴決定、アミノ酸配列決定を可能にするレベルまでの目的のタンパク質の精製、アミノ酸配列データを利用してプローブとして使用可能な核酸配列を得て所望のＤＮＡ配列を回収すること、ならびに構築物の調製、得られた植物の形質転換および分析が挙げられるがこれらに限定されない。
【０００８】
従って、油構造および量を改変可能な酵素標的、およびこのような酵素標的の核酸配列の有用な組織供給源の同定が必要である。酵素標的は、単独で、あるいは油生成の増大もしくは低減、ＴＡＧ構造、脂肪酸プールにおける飽和対不飽和脂肪酸の比率、および／または脂肪酸プールに対する改変の結果としての他の新規油組成物に関連する他の核酸配列との組合せで１つ以上の用途に適応することが理想的である。
【発明の開示】
【０００９】
本発明は、植物中で生成される油の組成および種子の他の成分（例えば、その食事内容物が挙げられる）に対する油の内容量（％）を改変する両方のニーズに応える遺伝学的ツールを提供する。本発明は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）ポリペプチドおよびこれらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、植物および真菌供与源（例えば、モルティエレラ・ラマニアナ（Mortierella ramanniana）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、およびアカパンカビ（Neurospora crassa）が挙げられる）から誘導されたものを含む。
【００１０】
本発明は、ＤＧＡＴタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および部分的または完全ＤＧＡＴコード配列を含むポリヌクレオチドにさらに関する。本発明は、ＤＧＡＴ２タンパク質をコードするポリヌクレオチド、および部分的または完全ＤＧＡＴ２コード配列を含むポリヌクレオチドも提供する。
【００１１】
本発明は、植物および昆虫宿主細胞中でＤＧＡＴ２を発現可能な構築物を含む、ＤＧＡＴ２の転写および発現のために使用できる組換えＤＮＡ構築物も提供する。
【００１２】
本発明は、配列番号１４、１８、２０、２２、２４、２６および２８からなる群より選択されるポリペプチド配列を含むポリペプチド分子をコードする核酸配列を含む単離された核酸分子も含む。このような単離された核酸分子の好ましいものとしては、例えば、配列番号１１、１２、１３、１６、１７、１９、２１、２３、２５および２７が挙げられる。
【００１３】
本発明は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼと相同性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離された核酸分子であって、配列番号１１、１２、１３、１６、１７、１９、２１、２３、２５および２７からなる群より選択される核酸分子を含む。
【００１４】
本発明は、配列番号１４、１８、２０、２２および２４からなる群より選択されるポリペプチド配列を含むポリペプチド分子をコードする核酸分子と機能的に連結された、植物細胞において機能する異種プロモーターを含む発現カセットを含むＤＮＡ構築物も含む。具体的な実施形態では、ＤＮＡ構築物は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼのポリペプチドをコードする核酸と機能的に連結された、植物細胞において機能する第２の異種プロモーターを含む第２の発現カセットをさらに含む。第２の異種プロモーターは、最初に使用する異種プロモーターと異なるかまたは同じであることが好ましく、２つの異種プロモーターが異なることがより好ましい。
【００１５】
本発明は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼと相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子（配列番号１１、１２、１３、１６、１７、１９、２１および２３からなる群より選択される）と機能的に連結された、植物細胞において機能する異種プロモーターを含む発現カセットを含むＤＮＡ構築物も含む。特定の実施形態では、ＤＮＡ構築物は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼのポリペプチドをコードする核酸分子と機能的に連結された、植物細胞において機能する第２の異種プロモーターを含む第２の発現カセットをさらに含む。第２の異種プロモーターは、最初に使用する異種プロモーターと異なるかまたは同じであることが好ましく、２つの異種プロモーターは異なることがより好ましい。
【００１６】
本発明は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼと相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子（核酸分子は、配列番号１１、１２、１３、１６、１７、１９、２１および２３からなる群より選択される）と機能的に連結された、植物細胞において機能する異種プロモーターを含む異種発現カセットから構成されるＤＮＡ構築物を含む植物または種子も含む。植物または種子は、トウモロコシ、ダイズ、カノーラ、アブラナ、綿、ゴマ、亜麻、ラッカセイ、ヒマワリ、ベニバナ、オリーブおよびアブラヤシのうちの１つ以上であることが好ましい。
【００１７】
本発明は、配列番号１４、１８、２０、２２および２４からなる群より選択されるポリペプチド配列を含むポリペプチド分子をコードする核酸分子と機能的に連結された、植物細胞において機能する異種プロモーターを含む発現カセットを含むＤＮＡ構築物を含む植物または種子も含む。植物または種子は、トウモロコシ、ダイズ、カノーラ、アブラナ、綿、ゴマ、亜麻、ラッカセイ、ヒマワリ、ベニバナ、オリーブおよびアブラヤシのうちの１つ以上であることが好ましい。
【００１８】
本発明の植物または種子は処理されることが好ましい。植物または種子を使用して、例えば、飼料、食事、油またはタンパク質等の生成物を生成することがより好ましい。本明細書で使用する植物または種子は、植物細胞において機能する異種プロモーター、ならびに配列番号１１、１２、１３、１６、１７、１９、２１および２３からなる群より選択される核酸分子を含むＤＮＡ構築物を含む。
【００１９】
別の実施形態では、本発明の植物または種子は、配列番号１４、１８、２０、２２および２４からなる群より選択されるポリペプチド配列を含むポリペプチド分子をコードする核酸分子と機能的に連結された、植物細胞において機能する異種プロモーターを含む発現カセットを含むＤＮＡ構築物を含む。本発明の植物または種子は、（飼料、食事、油およびタンパク質であり得る）製品に加工されることが好ましい。
【００２０】
本発明は、宿主細胞またはその子孫におけるＤＧＡＴ２タンパク質の生成方法をさらに提供する。ＤＧＡＴ２を含む組換え細胞も提供する。
【００２１】
本発明は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼを発現するＤＮＡ構築物で植物細胞を形質転換するステップ、および該植物細胞を稔性植物に再生させるステップを含む、同様の遺伝バックグラウンドを有するが導入される核酸分子は欠いている植物から得た種子と比べて強化した油組成を有する植物の作製方法を提供する。本発明は、同様の遺伝バックグラウンドを有するが導入される核酸分子は欠いている植物から得た植物と比べて増大した油収率を有する稔性植物も含む。
【００２２】
別の態様では、本発明は、AYVFGYEPHSVXPI（配列番号３３）およびFXXPXYR（配列番号３４）（Ｘは任意のアミノ酸を示す）のアミノ酸モチーフの少なくとも１つを有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。このようなポリペプチドとしては、例えば、配列番号１４、１８、２０、２２および２４が挙げられる。
【００２３】
さらに別の実施形態では、本発明は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有し、AYVFGYEPHSVXPI（配列番号３３）およびFXXPXYR（配列番号３４）（Ｘは任意のアミノ酸を示す）のアミノ酸モチーフの少なくとも１つを有する断片およびタンパク質を含むポリペプチドを提供する。このようなポリペプチドとしては、例えば、配列番号１４、１８、２０、２２および２４が挙げられる。
【００２４】
配列表の簡単な説明
配列番号１  モルティエレラ・ラマニアナＤＧＡＴ２ＡのＤＮＡ配列
配列番号２  モルティエレラ・ラマニアナＤＧＡＴ２Ａのポリペプチド配列
配列番号３  モルティエレラ・ラマニアナＤＧＡＴ２ＢのＤＮＡ配列
配列番号４  モルティエレラ・ラマニアナＤＧＡＴ２Ｂのポリペプチド配列
配列番号５  サッカロミセス・セレビシエＤＧＡＴ２ＢのＤＮＡ配列
配列番号６  サッカロミセス・セレビシエＤＧＡＴ２Ｂのポリペプチド配列
配列番号７  ＮｃＤＧＡＴ２のＤＮＡプライマー
配列番号８  ＮｃＤＧＡＴ２のＤＮＡプライマー
配列番号９  ＮｃＤＧＡＴ２のＤＮＡプライマー
配列番号１０  ＮｃＤＧＡＴ２のＤＮＡプライマー
配列番号１１  モルティエレラ・ラマニアナＤＡＧＴ２Ｂ．ｎｎｏのＤＮＡ配列
配列番号１２  アカパンカビＤＧＡＴ．ｎｎｏのＤＮＡ配列
配列番号１３  アカパンカビＤＧＡＴ２のＤＮＡ配列
配列番号１４  アカパンカビＤＧＡＴ２のポリペプチド配列
配列番号１５  モルティエレラ・ラマニアナＤＧＡＴ２Ａ．ｎｎｏのＤＮＡ配列
配列番号１６  サッカロミセス・セレビシエＤＧＡＴ２．ｎｎｏのＤＮＡ配列
配列番号１７  ホルディウム・ブルガレ（Hordeum vulgare）ＤＧＡＴ２のＤＮＡ配列
配列番号１８  ホルディウム・ブルガレＤＧＡＴ２のポリペプチド配列
配列番号１９  ズィー・メイス（Zea mays）ＤＧＡＴ２のＤＮＡ配列
配列番号２０  ズィー・メイスＤＧＡＴ２のポリペプチド配列
配列番号２１  グリシン・マックス（Glycine max）ＤＧＡＴ２のＤＮＡ配列
配列番号２２  グリシン・マックスＤＧＡＴ２のポリペプチド配列
配列番号２３  トリチカム・アエスチバム（Triticum aestivum）ＤＧＡＴ２のＤＮＡ配列
配列番号２４  トリチカム・アエスチバムＤＧＡＴ２のポリペプチド配列
配列番号２５  キイロショウジョウバエＤＧＡＴのＤＮＡ配列
配列番号２６  キイロショウジョウバエＤＧＡＴのポリペプチド配列
配列番号２７  ホモ・サピエンスＤＧＡＴのＤＮＡ配列
配列番号２８  ホモ・サピエンスＤＧＡＴのポリペプチド配列
配列番号２９  シゾサッカロミセス・ポンベ１  ＤＧＡＴ２のポリペプチド配列
配列番号３０  シゾサッカロミセス・ポンベ２  ＤＧＡＴ２のポリペプチド配列
配列番号３１  カンジダ・アルビカンスＤＧＡＴ２のポリペプチド配列
配列番号３２  シロイヌナズナＤＧＡＴ２のポリペプチド配列
図面の簡単な説明
【００２５】
図１ａ、１ｂ及び１ｃは、特定の誘導型ＤＧＡＴ２ポリペプチド配列の配列アライメントを集合的に示す。ポリペプチド間の類似する配列を使用して、同様の活性を有する類似分子を同定できる。関連する分子間の保存された配列モチーフを同定するためにいくつかのコンピュータプログラムが使用でき、これにはＭＥＭＥまたはＧＥＮＥ  ＳＣＡＮがあるがこれらに限定されない。配列モチーフを同定した後、それらの機能をアッセイできる。例えば、ＤＧＡＴ中のモチーフ配列を使用して、他のＤＧＡＴポリペプチドを同定できる。本発明で開示するポリペプチド配列から新規モチーフを誘導でき、配列データベースをスクリーニングするために、または縮重核酸プローブの設計において使用して、ＤＧＡＴをコードする新規ＤＮＡ分子を単離できる。予測ＤＧＡＴ２ポリペプチドのアミノ酸配列は、クラスター（Clustal）マルチプル配列アライメントプログラムを使用してアライメントさせる。完全に保存された残基は、黒で網掛けし、灰色の網掛けは、３つ以上の配列のコンセンサスである。全ての配列が完全長配列である。アライメントの上に示す残基は、アシルトランスフェラーゼのモチーフＤおよびＥにおいて見とめられる高度に保存されたシグニチャー（signature）アミノ酸である（Neuwald, Curr. Biol., 7:465-466, (1997)）。この領域においては、ＤＧＡＴ２およびアシルトランスフェラーゼスーパーファミリー配列は同時にアライメントし、共通の保存アミノ酸残基のみを示す。表記（Ｋｅｙ）：ＭｒＤＧＡＴ２Ａ（配列番号２）、ＭｒＤＧＡＴ２Ｂ（配列番号４）、ＳｃＤＧＡＴ２Ｂ（配列番号６）；ＮｃＤＧＡＴ２（配列番号１４）、ＺｍＤＧＡＴ２（配列番号２０）、ＧｍＤＧＡＴ２（配列番号２２）、ＨｖＤＧＡＴ２（配列番号１８）、ＴａＤＧＡＴ２（配列番号２４）、ＣａＤＧＡＴ２（配列番号３１）、およびＡｔＤＧＡＴ２（配列番号３２）。
図２は、図１のＤＧＡＴ２ファミリーメンバーの系統樹を示す。系統樹はＤＮＡＳＴＡＲソフトウェアを使用して構築されている。
図３は、本発明で使用するＤＮＡプライマー分子の一覧である。
図４は、ベクターｐＣＧＮ８８３２の模式図である。
図５は、ベクターｐＭＯＮ６８７６２の模式図である。
図６は、ベクターｐＭＯＮ６８６５４の模式図である。
図７は、ベクターｐＭＯＮ７０９０４の模式図である。
図８は、ベクターｐＭＯＮ７０９２０の模式図である。
図９は、ベクターｐＭＯＮ７０９２３の模式図である。
図１０は、ベクターｐＭＯＮ７０９２５の模式図である。
図１１は、ベクターｐＭＯＮ７０９２７の模式図である。
図１２ａおよび１２ｂは、図中に示すように、特定の真菌種から誘導したＤＧＡＴ２ポリペプチド配列の配列アライメントを示す。この図を読み取るための情報（使用した略語および網掛けの意味を含む）は、上記図１ａ、１ｂおよび１ｃについて記載した通りである。網掛けおよび黒色で示す保存領域は、効果的に利用されて、他の種から誘導された他のＤＧＡＴ２ポリペプチドを同定しうる。具体的には、これらの配列の分析により、以下のモチーフが明らかになり、FXXPXYR（配列番号３４）（Ｘは任意のアミノ酸を表す）、これはさらなるＤＧＡＴ２配列（好ましくは真菌供与源のもの）を同定するために使用され得る。
図１３は、図中に示すように、特定の植物種に由来するＤＧＡＴ２ポリペプチド配列の配列アライメントを示す。この図を読み取るための情報（使用した略語および網掛けの意味を含む）は、上記図１ａ、１ｂおよび１ｃについて記載した通りである。網掛けおよび黒色で示す保存領域は、効果的に利用されて、他の種から誘導された他のＤＧＡＴ２ポリペプチドを同定しうる。具体的には、これらの配列の分析により、以下のモチーフが明らかになり、AYVFGYEPHSVXPI（配列番号３３）、これはさらなるＤＧＡＴ２配列（好ましくは植物供与源のもの）を同定するために使用され得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
発明の詳細な説明
本明細書で使用する場合、トリアシルグリセロール組成物という用語は、グリセロールの非水溶性脂肪酸トリエステルを含む（すなわち、化学式（ＣＨ２−Ｒ）３（式中、Ｒはエステルである））、生物に存在する化合物を意味する。
【００２７】
本明細書で使用する場合、ＤＧＡＴ１という用語は、１９９９年６月４日に出願された米国特許出願第０９／３２６，２０３号（参照により本明細書に全体的に組み入れる）に記載されるＤＧＡＴタンパク質を指し、これは、アシルＣｏＡ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＡＣＡＴ）遺伝子ファミリーに関連し、アシル−コエンザイムＡから１，２−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）のｓｎ−３位へアシル基を転移させてトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）を形成することに寄与する。
【００２８】
本明細書で使用する場合、ＤＧＡＴ２という用語は、アシル−コエンザイムＡから１，２−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）のｓｎ−３位へアシル基を転移させてトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）を形成することに寄与するが、上記定義した非ＤＧＡＴ１タンパク質を指す。ＤＧＡＴ２タンパク質は、典型的に、重量がほぼ４０ｋＤ未満であり、典型的に３３〜４２ｋＤの範囲にある。
【００２９】
本明細書で使用する場合、ＤＧＡＴ２Ａという用語は、配列番号２のアミノ酸配列を有するモルティエレラ・ラマニアナＤＧＡＴ２を指す。本明細書で使用する場合、ＤＧＡＴ２Ｂという用語は、配列番号４のアミノ酸配列を有するモルティエレラ・ラマニアナＤＧＡＴ２を指す。
【００３０】
本明細書で使用する場合、「油組成」という表現は、サンプル中の種々の脂肪酸または油成分の比率を意味する。このようなサンプルは、植物、または種子等の植物部分であり得る。このようなサンプルはまた、植物部分の集合であってもよい。
【００３１】
本明細書で使用する場合、好適な実施形態における「含有％」という表現は、好適な実施形態において、他の同様のまたは関連する成分に対する特定の成分の合計重量％を意味する。
【００３２】
本明細書で使用する場合、「強化油（強化した油）」という表現は、高い油収率または変化した油組成を含む。
【００３３】
本明細書で使用する場合、本発明のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）遺伝子は、酵素反応条件下で、１，２−ジアシルグリセロールおよび脂肪アシル基質からのトリアシルグリセロールの生成を触媒する能力を示す、細胞供与源から入手可能なアミノ酸（タンパク質、ポリペプチドまたはペプチド等）をコードするあらゆる核酸配列を含む。「酵素反応条件」とは、酵素を機能させるあらゆる必要な条件（すなわち、温度、ｐＨ、阻害物質の欠如等の因子）が環境中で整っていることを意味する。
【００３４】
本発明は、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）生成の最終ステップを触媒するアシルＣｏＡ：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（本明細書中ではＤＧＡＴと称する）に関する。特に、本発明は、ＤＧＡＴポリペプチド、および該ＤＧＡＴポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。本発明のＤＧＡＴポリペプチドおよびポリヌクレオチド分子は、植物および真菌供与源から単離される。昆虫および植物細胞中でのｃＤＮＡの発現により、これらの細胞から単離される膜に対して高レベルのＤＧＡＴ活性が付与される。本発明は、ＤＧＡＴ機能を有する酵素をコードする、真菌、植物および動物におけるメンバーを含む遺伝子ファミリーを提供する。
【００３５】
ＤＧＡＴタンパク質は、脂肪性（oleaginous）真菌モルティエレラ・ラマニアナの細胞から単離される。細胞溶解の後、ＤＧＡＴ活性は脂質体画分に伴っており、膜結合タンパク質を放出させて従来クロマトグラフィー技術を用いてそれらを精製するために界面活性剤による可溶化が必要とされる。ホモジネート中のＤＧＡＴ活性の刺激が、界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の添加後に見とめられる。５ステッププロトコールを用いると、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで得た３６ｋＤおよび３６．５ｋＤの２つのタンパク質がＤＧＡＴ活性を有すると同定される。これらのタンパク質は、ＭｒＤＧＡＴ２ＡおよびＭｒＤＧＡＴ２Ｂとそれぞれ称する。各タンパク質を含む最も純度が高く最も活性な画分について、それぞれ１．６％および４．２％の最終比活性回復が報告されている。昆虫細胞中でのクローン化ｃＤＮＡの発現によりＤＧＡＴを確認した。いくつかの植物および真菌ＤＧＡＴホモログについて完全長クローンを得て、昆虫細胞または植物細胞において発現タンパク質を評価する。テストしたホモログは、いくらかのレベルのＤＧＡＴ活性を示し、このファミリーにおける遺伝子が機能により関係することを実証した。
【００３６】
本発明は、多数の物質（例えば、アシル−コエンザイムＡから１，２−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）のｓｎ−３位へアシル基を転移させて、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）を形成することに関与する酵素と関連する核酸分子およびポリペプチド）を提供し、このような物質の使用を提供する。
【００３７】
核酸分子
本発明の物質は核酸分子を含む。本発明の好適な態様では、核酸分子は、配列番号１１、１２、１３、１６、１７、１９、２１、２３、２５および２７からなる群より選択される核酸配列を含む。
【００３８】
本発明の別の態様では、核酸分子は、配列番号１４、１８、２０、２２、２４、２６、２８およびそれらの断片からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。
【００３９】
本発明の好適な実施形態は、他のＤＧＡＴ遺伝子およびタンパク質を同定することを目的とした、モチーフ（すなわち、同定したＤＧＡＴ分子の配列において見とめられる保存配列）の使用に関する。従って、当業者であれば、例えば、配列番号３３または３４等のモチーフをモチーフ配列を逆転写するかまたは逆転写することなく使用して、ＤＧＡＴまたはＤＧＡＴ活性を有する他のポリペプチドをコードする他の遺伝子をスクリーニングすることができる。
【００４０】
本発明の第１の核酸配列は、他の核酸（またはその相補鎖）と最適にアライメントした際（適切なヌクレオチド挿入または欠失が基準配列の比較範囲において合計で２０％未満）に、少なくとも２０ヌクレオチド位置、好ましくは５０ヌクレオチド位置、より好ましくは少なくとも１００ヌクレオチド位置の比較範囲、そして最も好ましくは第１の核酸の全長にわたり、少なくとも約７５％のヌクレオチド配列同一性、好ましくは少なくとも約８０％の同一性、より好ましくは少なくとも約８５％の同一性、さらに好ましくは少なくとも約９０％、そして最も好ましくは少なくとも約９５％の同一性がある場合に、基準核酸配列と「実質的な同一性」を示す。比較範囲をアライメントするための配列の最適なアライメントは、SmithおよびWaterman, Adv. Appl. Math., 2:482(1981)の局所相同性アルゴリズムにより；NeedlemanおよびWunsch, J. Mol. Biol., 48:443 (1970)の相同性アライメントアルゴリズムにより；PearsonおよびLipman, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.), 85:2444 (1988)類似法の検索により；好ましくはWisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.におけるこれらのアルゴリズムのコンピュータ化実装（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）により実施され得る。基準核酸は、完全長分子またはより長い分子の一部であり得る。あるいはまた、２つの核酸は、一方が他方にストリンジェントな条件下でハイブリダイズした場合に実質的な同一性を有するとする。
【００４１】
本発明の別の態様では、核酸配列は、機能は変化することなく１つ以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたためにいずれのタンパク質とも異なるタンパク質をコードし得ることが理解される。例えば、このような保存アミノ酸置換をコード可能なコドンが当該分野で公知であると理解される。
【００４２】
本発明の核酸分子のサブセットの１つは、断片核酸分子である。断片核酸分子は、具体的に開示しているもの等、本発明の核酸分子の重要な部分または実際にほとんどの部分から構成され得る。あるいはまた、断片は、（約１５〜約４００ヌクレオチド残基、より好ましくは約１５〜約３０ヌクレオチド残基、または約５０〜約１００ヌクレオチド残基、または約１００〜約２００ヌクレオチド残基、または約２００〜約４００ヌクレオチド残基、または約２７５〜約３５０ヌクレオチド残基を有する）より小さいオリゴヌクレオチドを含み得る。
【００４３】
本発明の１つ以上の核酸分子の断片は、プローブ、具体的にはＰＣＲプローブであり得る。ＰＣＲプローブは、別の核酸と二本鎖構造を形成してポリメラーゼ活性を開始可能な核酸分子である。ＰＣＲプローブの構造を決定する様々な方法およびＰＣＲ技術が当該分野に存在する。例えばＧｅｎｅＵｐ（Pesoleら, BioTechniques, 25:112-123 (1998)）等のプログラムを使用したコンピュータによる検索を使用して、可能性のあるＰＣＲプライマーを同定できる。
【００４４】
本発明の核酸分子またはその断片は、特定の状況下で他の核酸分子と特異的にハイブリダイズすることができる。本発明の核酸分子は、配列番号１１、１２、１３、１６、１７、１９、２１、２３、２５および２７、ならびにそれらの相補配列からなる群より選択される核酸配列を有する核酸分子に特異的にハイブリダイズするものを含む。本発明の核酸分子は、配列番号１４、１８、２０、２２、２４、２６、２８およびそれらの断片から選択されるアミノ酸配列をコードする核酸分子に特異的にハイブリダイズするものも含む。
【００４５】
核酸分子は、分子同士が完全な相補性を示す場合に、別の核酸分子の「相補配列」であると言う。本明細書で使用する場合、１つの分子の全てのヌクレオチドが他方のヌクレオチドと相補的である場合に、これらの分子は「完全な相補性」を示すと言う。２つの分子は、十分な安定性をもって互いとハイブリダイズして少なくとも慣用的な「低ストリンジェント」な条件下において互いとアニーリングしたままでいられる場合に、「最低限に相補的」であると言う。同様に、分子は、十分な安定性をもって互いにハイブリダイズして慣用的な「高ストリンジェント」な条件下において互いとアニーリングしたままでいられる場合に、「相補的」であると言う。慣用的なストリンジェントな条件は、Sambrookら, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第二版, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)およびHaymesら, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985)に記載されている。従って、完全な相補性からの逸脱は、そのような逸脱が分子の二本鎖構造形成能力を完全に妨げない限り許容可能である。従って、核酸分子が、プライマーまたはプローブとして作用するためには、配列において十分に相補的であって、採用する特定の溶媒および塩条件下で安定した二本鎖構造を形成可能であることのみが必要である。
【００４６】
例えば、約４５℃における６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、その後２０〜２５℃での２．０×ＳＳＣの洗浄等の、ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェントな条件は、当業者に公知であるか、またはCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York (1989), 6.3.1-6.3.6から知ることができる。例えば、洗浄ステップにおける塩濃度は、５０℃で約２．０×ＳＳＣの低ストリンジェンシー〜６５℃で約０．２×ＳＳＣの高ストリンジェンシーから選択され得る。さらに、洗浄ステップにおける温度は、室温（約２２℃）での低ストリンジェンシー条件から、約６５℃の高いストリンジェンシー条件に上昇させてもよい。温度および塩の両方とも可変的であり得るか、または温度もしくは塩濃度のいずれかを一定に保持して、他方の変数を変えてもよい。
【００４７】
好適な実施形態では、本発明の核酸は、例えば約２．０×ＳＳＣおよび約６５℃の中度のストリンジェント条件下で、配列番号１１、１２、１３、１６、１７、１９、２１、２３、２５および２７に示される１つ以上の核酸分子ならびにそれらの相補配列に特異的にハイブリダイズする。
【００４８】
本発明の核酸分子は、ホモログポリペプチドもコードし得る。本明細書で使用する場合、ホモログポリペプチド分子またはその断片は、第２の種における対応するタンパク質分子またはその断片である（例えば、トウモロコシルビスコ（rubisco）小サブユニットは、シロイヌナズナルビスコ小サブユニットのホモログである）。ホモログは、分子進化またはＤＮＡシャッフリング技術によっても生成されて、分子に、元のポリペプチドの少なくとも１つの機能的または構造的特徴を保持させることもできる（例えば、米国特許第５，８１１，２３８号を参照）。
【００４９】
別の実施形態では、ホモログは、アルファルファ、シロイヌナズナ、オオムギ、ブラッシカ・カンペストリス（Brassica campestris）、アブラナ、ブロッコリー、キャベツ、カノーラ、シトラス、綿、ニンニク、オートムギ、ネギ属（Ａｌｌｉｕｍ）、亜麻、鑑賞植物、ラッカセイ、コショウ、ジャガイモ、ナタネ、イネ、ライムギ、ソルガム、イチゴ、サトウキビ、サトウダイコン、トマト、コムギ、ポプラ、マツ、モミ、ユーカリ、リンゴ、レタス、レンズマメ、ブドウ、バナナ、茶、シバクサ、ヒマワリ、ダイズ、トウモロコシ、インゲンマメ（Phaseolus）、ハマナ、カラシナ、トウゴマ、ゴマ、綿実、アマニ、ベニバナおよびアブラヤシからなる群より選択される。より具体的には、好ましいホモログは、カノーラ、トウモロコシ、ブラッシカ・カンペストリス、アブラナ、ダイズ、ハマナ、カラシナ、トウゴマ、ラッカセイ、ゴマ、綿実、アマニ、ナタネ、ベニバナ、アブラヤシ、亜麻およびヒマワリから選択される。さらに好適な実施形態では、ホモログは、カノーラ、ナタネ、トウモロコシ、ブラッシカ・カンペストリス、アブラナ、ダイズ、ヒマワリ、ベニバナ、アブラヤシおよびラッカセイからなる群より選択される。特に好適な実施形態では、ホモログは、ダイズである。特に好適な実施形態では、ホモログはカノーラである。特に好適な実施形態では、ホモログはアブラナである。
【００５０】
遺伝コードの縮重のために、異なるヌクレオチドコドンが特定のアミノ酸をコードするために使用され得る。宿主細胞は、コドン利用の好ましいパターンを示すことが多い。構造核酸配列は、特定の宿主細胞のコドン利用パターンを利用するように構築されることが好ましい。これにより、形質転換宿主細胞における構造核酸配列の発現が概して向上する。開示する核酸またはアミノ酸配列はいずれも、含まれる宿主細胞または生物のコドン利用を反映するように改変され得る。植物中のコドン利用についての構造核酸配列の改変は、例えば、米国特許第５，６８９，０５２号および同第５，５００，３６５号に記載されている。
【００５１】
好適な実施形態では、本発明の核酸分子はいずれも、植物細胞中で機能するプロモーター領域と機能的に連結され、ｍＲＮＡ分子を生成するが、その場合プロモーターに連結した核酸分子はそのプロモーターと異種である。本明細書で使用する場合、「異種」とは自然では一緒に存在しないことを意味する。
【００５２】
タンパク質およびペプチド分子
あるクラスの物質は、本発明の核酸物質によりコードされる１つ以上のポリペプチド分子を含む。別のクラスの物質は、本発明の１つ以上のポリペプチド分子を含む。特に好ましいクラスのタンパク質は、配列番号１４、１８、２０、２２、２４、２６および２８、ならびにそれらの断片からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するものである。ポリペプチド物質は、Ｃ末端またはＮ末端アミノ酸配列に延長部分（extension）を有し得る。
【００５３】
本明細書で使用する場合、「タンパク質」、「ペプチド分子」または「ポリペプチド」という用語は、５つ以上のアミノ酸を含む任意の分子を含む。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチド分子が修飾（限定されるものではないが、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、リン酸化、またはオリゴマー化等の翻訳後修飾が挙げられる）され得ることは当該分野で周知である。従って、本明細書で使用する場合、「タンパク質」、「ペプチド分子」、または「ポリペプチド」という用語は、生物学的または非生物学的プロセスにより修飾されるあらゆるタンパク質を含む。単数および複数の「アミノ酸」という用語は、全ての天然型Ｌアミノ酸を指す。この定義は、ノルロイシン、ノルバリン、オルニチン、ホモシステイン、およびホモセリンを含むことを意図する。
【００５４】
本発明の別の態様では、本発明のＤＧＡＴ２タンパク質は可溶化されている。「可溶化」とは、膜と結合していない酵素に典型的にみられる様式でその後作用するようにＤＧＡＴ酵素を膜から抽出することを指す。
【００５５】
様々な供与源からの植物ＤＧＡＴタンパク質を使用して、多様なｉｎ  ｖｉｖｏ用途におけるＴＡＧ生合成を研究できることに留意されたい。全ての植物種が、共通の代謝経路を経て脂質を合成すると考えられているため、異種植物宿主に対する植物ＤＧＡＴタンパク質の研究および／または用途は様々な種において容易に行い得る。他の用途では、植物ＤＧＡＴタンパク質は、ＤＧＡＴタンパク質の天然植物供与源以外で使用されて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成もしくは合成されるＴＡＧの生成を向上および／またはその組成を改変し得る。
【００５６】
配列同一性の％は、２本の最適にアライメントされた配列を比較範囲にわたり比較することにより決定される。ここで、２本の配列を最適にアライメントするため、ポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列の比較範囲内にある部分は（付加または欠失を含まない）基準配列と比べた場合に付加または欠失（すなわちギャップ）を含み得る。％は、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列において生じる位置の数を決定して、一致した位置の数を得て、一致した位置の数を比較範囲内の合計位置数で割り、結果に１００を乗じて配列同一性の％を得ることにより計算される。
【００５７】
ポリペプチドまたはポリヌクレオチド分子は、一般的に関連する分子と実質的に同一または実質的に相同であり得る。関連分子と実質的に同一のこれらのホモログは、他のポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列と比べて少なくとも７０％の配列同一性を有する少なくとも１つのポリペプチド配列または１つのポリヌクレオチド配列を含む。Genetics Computer Group, Inc.製のＷＩＳＣＯＮＳＩＮ  ＰＡＣＫＡＧＥバージョン１０．０−ＵＮＩＸのギャッププログラムは、ペアワイズ比較についてのデフォルトパラメータセット（アミノ酸配列比較の場合：ギャップ作成ペナルティー＝８、ギャップ延長ペナルティー＝２；ヌクレオチド配列比較の場合：ギャップ作成ペナルティー＝５０、ギャップ延長ペナルティー＝３）を使用するNeedlemanおよびWunsch（J. Mol. Biol., 48:443-453 (1970)）の方法；またはＢＬＡＳＴ２．２．１ソフトウェアスイート（Altschulら, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402）のＴＢＬＡＳＴＮプログラムを使用；ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス（HenikoffおよびHenikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.), 89:10915-10919 (1992)）およびペアワイズ比較についてのデフォルトパラメータセット（ギャップ作成コスト＝１１、ギャップ延長コスト＝１）の使用に基づく。ＢＬＡＳＴでは、Ｅ値、すなわち予測値は、データベース検索において偶然に起こると考えられる、実際のアライメントスコアＳと等しいかまたはそれよりも良いスコアを有する異なるアライメントの数を表す。Ｅ値が低いほど、一致がより有意である。データベースの大きさは、Ｅ値計算における要素であるため、ＧｅｎＢａｎｋ等の公開データベースに対して「ＢＬＡＳＴ」を行って得られるＥ値は、任意の所与のクエリー／登録適合について時間と共に増加している。タンパク質についての同一性％は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムによりアライメントされる配列部分の長さにわたり存在する完全に一致するアミノ酸残基の％を指す。
【００５８】
本発明の一態様は、ヌクレオチド配列またはその相補配列を含む単離されたポリ核酸分子を提供し、該ヌクレオチド配列は本発明のタンパク質アミノ酸配列と実質的に相同なポリペプチドをコードする。ここで、実質的に相同とは、配列番号１４、１８、２０、２２および２４からなる群より選択されるメンバーと少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％の配列同一性、または少なくとも約８５％、少なくとも約９０％の配列同一性、または少なくとも約９５％の配列同一性、または少なくとも約９８％の配列同一性を有することと定義する。
【００５９】
本発明の物質は、本発明のタンパク質の少なくとも約１０個の連続するアミノ酸領域、好ましくは少なくとも約２０個の連続するアミノ酸領域、より好ましくは少なくとも約２５、３５、５０、７５または１００個の連続するアミノ酸領域を含むタンパク質およびそれらの断片を含む。別の好適な実施形態では、本発明のタンパク質は、約１０〜約２５個の連続するアミノ酸領域、より好ましくは約２０〜約５０個の連続するアミノ酸領域、さらに好ましくは約４０〜約８０個の連続するアミノ酸領域を含む。
【００６０】
他のＤＧＡＴタンパク質または遺伝子の単離に加えて、他の関連アシルトラスフェラーゼタンパク質の遺伝子も、本発明のＤＧＡＴ配列および関連核酸またはアミノ酸配列からの配列情報を使用して得ることができる。例えば、アミノ酸配列番号２９および３０を含むＤＧＡＴ２タンパク質のシゾサッカロミセス・ポンベアミノ酸配列ホモログを開示する。別の例では、リゾホスホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ（ＬＰＣＡＴ）、リゾホスホスファチジルセリンアシルトランスフェラーゼ（ＬＰＳＡＴ）、リゾホスホスファチジルエタノールアミンアシルトランスフェラーゼ（ＬＰＥＡＴ）、ホスファチジルコリンジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＰＤＡＴ）、およびリゾホスホスファチジルイノシトールアシルトランスフェラーゼ（ＬＰＩＡＴ）を含む他のアシルトランスフェラーゼ酵素が植物脂質生合成に関与する。
【００６１】
ＤＮＡ構築物および植物形質転換体
本発明の１つ以上の核酸分子を植物の形質転換またはトランスフェクションに使用し得る。外因性遺伝物質は、植物細胞に導入され、植物細胞は全植物、稔性植物、または不稔植物の個体に再生され得る。外因性遺伝物質は、天然型であってもそうでなくても、任意の生物に挿入可能なあらゆる供与源に由来するあらゆる遺伝物質であり得る。細菌プラスミド維持エレメントは、ＤＮＡ構築物の構成要素である。これらのエレメントには、抗生物質マーカー（すなわち、ａａｄＡ遺伝子（ＳＰＣ／ＳＴＲ、スペクトマイシンおよびストレプトマイシン耐性）、Ｅｃ．ｎｐｔＩＩ（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、カナマイシン耐性））；プラスミドコピー数を制御する複製起点またはエレメント（すなわち、Ｅｃ．ｏｒｉＶ、Ｅｃ．ｏｒｉ３２２、ＯＲＩ−ＰＵＣおよびＥｃ．ＲＯＰ）が含まれる。これらのエレメントのさらなる情報は、特にSambrookら, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第二版, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)から得ることができる。
【００６２】
本発明の好適な態様では、外因性遺伝物質は、配列番号１１、１２、１３、１６、１７、１９、２１、２３およびそれらの相補配列、ならびにいずれかの断片からなる群より選択される核酸配列を含む。本発明の別の態様では、外因性遺伝物質は、配列番号１４、１８、２０、２２、２４およびそれらの断片からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。
【００６３】
本発明の一実施形態では、１つ以上の遺伝子を含む外因性遺伝物質を植物に導入する。一実施形態では、好ましい組合せの遺伝子としては、以下の遺伝子の１つ以上が挙げられるがこれらに限定されない：すなわち、ＭｒＤＧＡＴ２Ａ（配列番号１）、ＭｒＤＡＧＡＴ２Ａ．ｎｎｏ（配列番号１５）、ＭｒＤＧＡＴ２Ｂ（配列番号３）、ＭｒＤＧＡＴ２Ｂ．ｎｎｏ（配列番号１１）、ＳｃＤＧＡＴ２（配列番号５）、ＳｃＤＧＡＴ２．ｎｎｏ（配列番号１６）、ＮｃＤＧＡＴ２（配列番号１３）、およびＮｃＤＧＡＴ．ｎｎｏ（配列番号１２）。別の実施形態では、好ましい組合せの遺伝子としては、２つの別個のプロモーターの制御下で発現される以下の遺伝子のいずれかが挙げられるがこれらに限定されない：すなわち、ＭｒＤＧＡＴ２Ａ（配列番号１）、ＭｒＤＡＧＡＴ２Ａ．ｎｎｏ（配列番号１５）、ＭｒＤＧＡＴ２Ｂ（配列番号３）、ＭｒＤＧＡＴ２Ｂ．ｎｎｏ（配列番号１１）、ＳｃＤＧＡＴ２（配列番号５）、ＳｃＤＧＡＴ２．ｎｎｏ（配列番号１６）、ＮｃＤＧＡＴ２（配列番号１３）、およびＮｄＤＧＡＴ．ｎｎｏ（配列番号１２）。
【００６４】
このような組合せでは、１つ以上の遺伝子生成物が細胞質中で局所化され得る。このような遺伝子は、例えば、モノシストロン（monocistronic）もしくはポリシストロン（polycistronic）のいずれかの配置で単一構築物上に導入するか、異なる構築物であるが同じ形質転換事象において導入するか、または別々の植物に導入された後１回以上交配を行って所望の組合せの遺伝子を生成し得る。
【００６５】
このような遺伝物質は、単子葉植物または双子葉植物のいずれか（カノーラ、トウモロコシ、ダイズ、シロイヌナズナ、インゲンマメ、ラッカセイ、アルファルファ、コムギ、イネ、オートムギ、ソルガム、ナタネ、ライムギ、トリトルデウム（tritordeum）、キビ、フェスク、ペレニアルライグラス、サトウキビ、クランベリー、パパイヤ、バナナ、ベニバナ、アブラヤシ、亜麻、マスクメロン、リンゴ、キュウリ、デンドロビウム、グラジオラス、菊、ユリ科植物、綿、ユーカリ、ヒマワリ、ブラッシカ・カンペストリス、アブラナ、シバクサ、サトウダイコン、コーヒーおよびディオスコレアが挙げられるがこれらに限定されない）に導入され得る（Christou, Particle Bombardment for Genetic Engineering of Plants, Biotechnology Intelligence Unit, Academic Press, San Diego, California (1996)に掲載）。また、カノーラ、トウモロコシ、ブラッシカ・カンペストリス、アブラナ、ナタネ、ダイズ、ハマナ、カラシナ、トウゴマ、ラッカセイ、ゴマ、綿実、アマニ、ベニバナ、アブラヤシ、亜麻、およびヒマワリが好ましく、カノーラ、アウラヤシ、トウモロコシ、ブラッシカ・カンペストリス、アブラナ、ダイズ、ヒマワリ、ベニバナ、アブラヤシおよびラッカセイが好ましい。好適な実施形態では、ホモログは、トウモロコシ（maize）、ダイズ、カノーラ、綿実、ゴマ、亜麻、ラッカセイ、ヒマワリ、ベニバナおよびアブラヤシからなる群より選択される。より好適な実施形態では、遺伝物質はカノーラに導入される。別のより好適な実施形態では、遺伝物質はアブラナに導入される。別の特に好適な実施形態では、遺伝物質はダイズに導入される。
【００６６】
タンパク質をコードする核酸分子の導入により、形質転換細胞またはトランスジェニック植物においてポリペプチドの発現または過剰発現を生じる。本発明の核酸分子にコードされる１つ以上のタンパク質またはその断片は、形質転換細胞または形質転換植物において過剰発現され得る。このような発現または過剰発現は、外因性遺伝物質の一過性または安定性導入により生じ得る。
【００６７】
好適な実施形態では、植物における本発明のポリペプチドの発現または過剰発現は、同様の遺伝バックグラウンドを有する非形質転換植物に関連する植物と比べて、ＤＧＡＴ活性の増大との関連性をその植物に提供する。
【００６８】
生成物のレベルは、植物等の生物の全体にわたって高められ得るか、または生物の１つ以上の特定の器官または組織に局所化され得る。例えば、生成物のレベルは、植物の１つ以上の組織および器官（根、塊茎、幹、葉、茎、果実、液果、堅果、樹皮、鞘、種子および花が挙げられるがこれらに限定されない）において高められ得る。好ましい器官は種子である。
【００６９】
好適な態様では、同様の遺伝バックグラウンドは、比較する生物同士が、核遺伝物質の約５０％以上を共有するバックグラウンドである。より好適な態様では、同様の遺伝バックグラウンドは、比較する生物同士が核遺伝物質の約７５％以上、より好ましくは約９０％以上を共有するバックグラウンドである。別のより好適な態様では、同様の遺伝子バックグランドは、比較する生物が植物であるバックグラウンドであり、該植物は、植物形質転換技術を使用して最初に導入される遺伝物質以外は同質である。
【００７０】
構築物またはベクターは、選択したポリペプチドを発現させるための植物プロモーターを含み得る。好適な実施形態では、本明細書に記載するいずれの核酸分子も、植物細胞において機能してｍＲＮＡ分子を生成させるプロモーター領域に機能的に連結され得る。例えば、本明細書に記載するようなプロモーター等（これらに限定されない）、植物細胞において機能してｍＲＮＡ分子を生成するあらゆるプロモーターを使用し得る。好適な実施形態では、プロモーターは植物プロモーターである。
【００７１】
他のプロモーターも、種子または果実等の特定の組織においてポリペプチドを発現するために使用され得る。実際、好適な実施形態では、使用するプロモーターは、種子特異的プロモーターである。このようなプロモーターの例としては、ナピン（Kridlら, Seed Sci. Res., 1:209:219 (1991)）、ファセオリン（Bustosら, Plant Cell, 1(9):839-853 (1989)）、ダイズトリプシンインヒビター（Riggsら, Plant Cell, 1(6):609-621 (1989)）、ＡＣＰ（Baersonら, Plant Mol. Biol., 22(2):255-267 (1993)）、ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ（Slocombeら, Plant Physiol., 104(4):167-176 (1994)）、βコングリシニンのダイズａ’サブユニット（Ｐ−Ｇｍ７Ｓ、例えば、Chenら, Proc. Natl. Acad. Sci., 83:8560-8564 (1986)を参照）、ソラマメＵＳＰ（Ｐ−Ｖｆ．Ｕｓｐ、例えば、配列番号１、２および３、米国特許出願第１０／４２９，５１６号を参照）、ならびにズィー・メイスＬ３オレオシンプロモーター（Ｐ−Ｚｍ．Ｌ３、例えば、Hongら, Plant Mol. Biol., 34(3):549-555(1997)を参照）等の遺伝子に由来する５’側調節領域が挙げられる。トウモロコシ胚乳において見とめられる貯蔵タンパク質のグループであるゼインも含まれる。ゼイン遺伝子のゲノムクローンは単離されている（Pedersenら, Cell, 29:1015-1026 (1982)、およびRussellら, Transgenic Res., 6(2):157-168）、ならびにこれらのクローンから得たプロモーター（１５ｋＤ、１６ｋＤ、１９ｋＤ、２２ｋＤ、２７ｋＤ）および遺伝子も使用され得る。例えばトウモロコシにおいて機能することが知られている他のプロモーターとしては以下の遺伝子のプロモーターが挙げられる：すなわち、ｗａｘｙ、Ｂｒｉｔｔｌｅ、Ｓｈｒｕｎｋｅｎ２、分枝酵素ＩおよびＩＩ、デンプンシンターゼ、脱分枝酵素、オレオジン、グルテリンおよびショ糖シンターゼ。トウモロコシ胚乳発現に特に好ましいプロモーターは、イネに由来するグルテリン遺伝子のプロモーター、より具体的にはＯｓｇｔ−１プロモーター（Zhengら, Mol. Cell Biol., 13:5829-5842 (1993)）である。コムギにおける発現に適したプロモーターの例としては、ＡＤＰグルコースピロシンターゼ（pyrosynthase）（ＡＤＰＧＰＰ）サブユニット、顆粒結合および他のデンプンシンターゼ、分枝および脱分枝酵素、胚形成−多量（abundant）タンパク質、グリアジンおよびグルテニンのプロモーターが挙げられる。イネにおけるこのようなプロモーターの例としては、ＡＤＰＧＰＰサブユニット、顆粒結合および他のデンプンシンターゼ、分枝酵素、脱分枝酵素、ショ糖シンターゼおよびグルテリンのプロモーターが挙げられる。特に好ましいプロモーターは、イネグルテリンのプロモーターＯｓｇｔ−１である。オオムギのこのようなプロモーターの例としては、ＡＤＰＧＰＰサブユニット、顆粒結合および他のデンプンシンターゼ、分枝酵素、脱分枝酵素、ショ糖シンターゼ、ホルデイン、胚グロブリン、およびアリューロン(aleurone)特異的タンパク質のプロモーターが挙げられる。種子における発現に好ましいプロモーターは、本明細書においてＰ−Ｂｒ．Ｓｎａｐ２と称するナピンプロモーターである。発現のために好ましい別のプロモーターは、アルセリン５プロモーターである（米国特許公開第２００３／００４６７２７号）。さらに別の好ましいプロモーターはダイズ７Ｓプロモーター（Ｐ−Ｇｍ．７Ｓ）およびダイズ７Ｓα’βコングリシニンプロモーター（Ｐ−Ｇｍ．Ｓｐｈａｓ１）である。
【００７２】
本発明のポリペプチドの過剰発現を生じ得るプロモーターは、当該分野で一般的に知られている。例えば、ウイルスプロモーター（Ｐ−ＣａＭＶ３５Ｓ、米国特許第５，３５２，６０５号；Ｐ−ＦＭＶ３５ＳおよびそのエンハンサーエレメントＥ−ＦＭＶ３５Ｓ（天然の転写開始部を持たないＰ−ＦＭＶ３５Ｓの５’側部分（米国特許第５，３７８，６１９号および５，０１８，１００号）として同定される）、ならびに本発明においてＥ−ＦＭＶ３５Ｓ／Ｐ−Ａｔ．Ｔｓｆ１と称する、米国特許第６，４６２，２５８号に配列番号２８として記載されるキメラプロモーター分子）、ならびに様々な植物由来プロモーター（例えば、植物アクチンプロモーター（Ｐ−Ｏｓ．Ａｃｔ１、およびそこから誘導した遺伝エレメント（米国特許第５，６４１，８７６号および同第６，４２９，３５７号）））がある。
【００７３】
利用し得るさらなるプロモーターは、例えば、米国特許第５，３７８，６１９号；同第５，３９１，７２５号；同第５，４２８，１４７号；同第５，４４７，８５８号；同第５，６０８，１４４号；同第５，６０８，１４４号；同第５，６１４，３９９号；同第５，６３３，４４１号；同第５，６３３，４３５号；および同第４，６３３，４３６号に記載されている。さらに、組織特異的エンハンサーを使用してもよい（Frommら, The Plant Cell, 1:977-984 (1989)）。
【００７４】
構築物またはベクターは、目的のコード領域と共に、その領域の転写を終結させるように全体または部分的に作用する核酸配列も含みうる。多数のこのような配列が単離されており、Ｔｒ７ ３’配列およびＮＯＳ ３’配列（Ingelbrechtら, The Plant Cell, 1:671-680 (1989)；Bevanら, Nucleic Acids Res., 11:369-385 (1983)）が挙げられる。調節転写終結領域も、本発明の植物発現構築物において提供され得る。転写終結領域は、目的の遺伝子をコードするＤＮＡ配列、または異なる遺伝子供与源から誘導された都合の良い転写終結領域（例えば、転写開始領域を自然に伴う転写終結領域）により提供され得る。当業者は、植物細胞において転写を終結可能な都合の良いあらゆる転写終結領域が本発明の構築物において採用され得ることを理解するであろう。
【００７５】
ベクターまたは構築物は、追加の調節エレメントも含みうる。このような例としては、ペチュニア・ハイブリダＨｓｐ７０遺伝子から単離した翻訳リーダー（Ｌ−Ｐｈ．ＤｎａＫ、米国特許第５，３６２，８６５号）、Ａｄｈイントロン１（Callisら, Genes and Develop., 1:1183-1200 (1987)）、ショ糖シンターゼイントロン（Vasilら, Plant Physiol., 91:1575-1579 (1989)）、イネアクチンイントロン（Ｉ−Ｏｓ．Ａｃｔ１、米国特許第５，６４１，８７６号）、およびＴＭＶΩエレメント（Gallieら, The Plant Cell, 1:301-311 (1989)）が挙げられる。転写終結領域（例えば、ブラッシカ・ラパ（Brassica rapa）に由来する３’側非翻訳領域Ｔ−Ｂｒ．Ｓｎａｐ２）。これらおよび他の調節エレメントは、適切である場合には含まれうる。
【００７６】
ベクターまたは構築物は、選択可能マーカーも含んでもよい。選択可能マーカーは、外因性遺伝物質を含む植物または植物細胞を選択するために使用され得る。このような例としては、カナマイシン耐性をコードし、カナマイシン、ＲｐｔＩＩ、Ｇ４１８、ｈｐｔ等を使用するために選択され得るｎｐｔＩＩ遺伝子（Potrykusら, Mol. Gen. Genet., 199:183-188 (1985)）；ビアラホス耐性をコードするｂａｒ遺伝子；変異型ＥＰＳＰシンターゼ遺伝子（Hincheeら, Bio/Technology, 6:915-922 (1988)；Reynaertsら, Selectable and Scrrenable Markers）；GelvinおよびSchilperoort；Plant Molecular Biology Manual, Kluwer, Dordrecht(1988)；Reynaertsら, Selectable and Screenable Markersに掲載。GelvinおよびSchilperoort;Plant Molecular Biology Manual, Kluwer, Dordrecht (1988)に掲載）；ブロモキシニルに耐性を与えるニトリラーゼ遺伝子（Stalkerら, J. Biol. Chem. 263:6310-6314 (1988)）；イミダゾリノンまたはスルホニル尿素耐性を与える変異型アセト乳酸シンターゼ遺伝子（ＡＬＳ）（欧州特許出願第１５４，２０４号（１９８５年９月１１日））、ＡＬＳ（D'Halluinら, Bio/Technology, 10:309-314 (1992)）、およびメトトレキサート耐性ＤＨＦＲ遺伝子（Thilletら, J. Biol. Chem., 263:12500-12508 (1988)）が挙げられるがこれらに限定されない。特に好ましいマーカーは、グリホサート耐性であり、これは、グリホサート耐性ＥＰＳＰＳ（例えば、本明細書においてＡＧＲｔｕ．ａｒｏＡと称する、アグロバクテリウム・ツメファシエンスに由来するａｒｏＡ−ＣＰ４コード配列（米国特許第５，６３３，４３５号））を発現させることにより植物において達成され得る。ＡＧＲｔｕ．ａｒｏＡコード配列は、葉緑体移行ペプチド（ＣＴＰ）、例えば、本明細書でＴＳ−Ａｔ．ＳｈｋＦ−ＣＴＰ２と称する、シロイヌナズナＳｈｋＦ遺伝子から単離されたＣＴＰ２コード配列に連結されている。
【００７７】
本発明の好適な実施形態では、所望のタンパク質を発現するトランスジェニック植物を生成する。所望のタンパク質をコードする所望のポリヌクレオチド配列を植物細胞に導入するための様々な方法が利用可能および当業者に公知であり、（１）マイクロインジェクション、エレクトロポーレーションおよび微小推進媒介型送達（ビオリスティック（biolistic）または遺伝子銃技術）等の物理的方法；（２）ウイルス媒介型送達方法；および（３）アグロバクテリウム媒介型形質転換方法が挙げられるがこれらに限定されない。
【００７８】
植物細胞の形質転換のために最もよく使用される方法は、アグロバクテリウム媒介型ＤＮＡ導入プロセスおよびビオリスティックまたは微小推進ボンバードメント媒介型プロセス（すなわち、遺伝子銃）である。典型的に、核形質転換が望ましいが、葉緑体またはアミロプラスト等の色素体を特異的に形質転換することが望ましい場合、所望のポリヌクレオチドの微小推進媒介型送達を利用して植物色素体が形質転換され得る。
【００７９】
アグロバクテリウム媒介型形質転換は、アグロバクテリウム属に属する遺伝子操作された土壌菌を使用することで達成される。ＴｉまたはＲｉプラスミドを担持するアグロバクテリウム・ツメファシエンスおよびアグロバクテリウム・リゾゲンス（rhizogenes）の多数の野生型および無核（disarmed）株が植物への遺伝子導入に使用され得る。遺伝子導入は、任意の所望のＤＮＡ部分を担持するように遺伝子操作され得る「Ｔ−ＤＮＡ」として知られる特異的ＤＮＡを多くの植物種に導入することにより実行され得る。導入遺伝子は、ＤＮＡプラスミドベクターにおいて構築され、通常、アグロバクテリウムＴｉプラスミド右側境界ＤＮＡ領域（ＲＢ）と左側境界ＤＮＡ領域（ＬＢ）に隣接される。アグロバクテリウム媒介型形質転換のプロセスの間、ＤＮＡプラスミドは、右側および左側境界領域においてＶｉｒＤ１およびＶｉｒＤ２エンドヌクレアーゼで切断され、Ｔ−ＤＮＡ領域を植物ゲノムに挿入する。
【００８０】
植物のアグロバクテリウム媒介型遺伝子形質転換は、いくつかのステップを伴う。ビルレントアグロバクテリウムおよび植物細胞を最初に互いと接触させる第１のステップは、一般的に「植菌」と呼ばれる。植菌の後、アグロバクテリウムおよび植物細胞／組織を、数時間〜数日間以上の間、成長およびＴ−ＤＮＡ導入に適した条件下で共に成長させる。このステップは「共培養」と称される。共培養およびＴ−ＤＮＡ送達の後、植物細胞を殺菌剤または静菌剤で処理して、外植片と接触したままのおよび／または外植片を含む容器に入ったアグロバクテリウムを殺す。トランスジェニック対非トランスジェニック植物細胞の優先的な成長を促進するために任意の選択剤の不在下で行う場合、これは典型的に「遅延」ステップと称される。トランスジェニック植物細胞に有利な選択的圧力の存在下で行った場合、「選択」ステップと称される。「遅延」を採用する場合、典型的に１つ以上の「選択」ステップが後続する。
【００８１】
微小推進ボンバードメント（米国特許第５，５５０，３１８号；同第５，５３８，８８０号；および同第５，６１０，０４２号；それぞれ参照により本明細書に全体的に組み入れる）については、粒子を核酸で被覆し、推進力により細胞に送達する。粒子の例としては、タングステン、プラチナおよび好ましくは金から構成されるものが挙げられる。
【００８２】
微小推進ボンバードメント技術は広く適用可能であり、本質的にいかなる植物種も形質転換し得る。微小推進ボンバードメントにより、形質転換された種の例としては、トウモロコシ、オオムギ、コムギ（参照により本明細書に全体的に組み入れられる米国特許第５，５６３，０５５号）、イネ、オートムギ、ライムギ、サトウキビおよびソルガムを含む単子葉植物；ならびにタバコ、ダイズ（米国特許第５，３２２，７８３号、参照により本明細書に全体的に取り入れられる）、ヒマワリ、ラッカセイ、綿、トマトおよび一般的なマメ科（米国特許第５，５６３，０５５号、参照により本明細書に全体的に取り入れる）を含む多数の双子葉植物が挙げられる。
【００８３】
形質転換方法論とは関係なく形質転換植物細胞を選択またはスコア付けするために、細胞に導入されるＤＮＡは、再生可能植物組織において機能して植物組織に毒性化合物に対する耐性を付与する化合物を生成する遺伝子を含む。選択可能、スクリーニング可能またはスコア付け可能マーカーとして使用する目的の遺伝子としては、ＧＵＳ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ルシフェラーゼ（ＬＵＸ）、抗生物質または除草剤耐性遺伝子が挙げられるがこれらに限定されない。抗生物質耐性遺伝子の例としては、ペニシリン、カナマイシン（およびネオマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン）；メトトレキセート（およびトリメトプリム）；クロラムフェニコール；カナマイシン；ならびにテトラサイクリンが挙げられる。
【００８４】
様々な形質転換外植片からの植物の再生、発育および栽培は、当該分野で十分に報告されている。この再生および成長プロセスは、形質転換細胞を選択するステップ、およびそれらの個別の細胞を、通常の胚発達の段階から根付いた未発育植物段階を経て培養させるステップを典型的に含む。トランスジェニック胚および種子は同様に再生される。得られた根付いたトランスジェニック芽はその後、土壌等の適切な植物成長培地に植える。選択剤への暴露を生存した細胞、またはスクリーニングアッセイにおいて陽性であるとスコア付けされた細胞は、植物の再生を支持する培地において培養され得る。発達している未発育植物を、土壌が少量の植物成長混合物に移し、寒さに慣れさせてから、グリーンハウスまたは成長チャンバーに移して成熟させる。
【００８５】
本発明は、あらゆる形質転換可能細胞または組織に使用できる。本明細書で使用する場合、形質転換可能とは、さらに増殖して植物を生じることができる細胞または組織を意味する。当業者は、多数の植物細胞または組織が形質転換可能であり、外因性ＤＮＡの挿入および適切な培養状態の後、植物細胞または組織が分化植物に形成され得ることを理解しうる。これらの目的に適した組織としては、未熟胚、胚盤組織、懸濁細胞培養液、花部、芽分裂組織、結節性（nodal）外植片、カルス組織、胚軸組織、子葉、根および葉が挙げられるがこれらに限定されない。
【００８６】
あらゆる適切な植物培養培地が使用できる。適切な培地の例としては、追加の植物成長調節因子（オーキシン、サイトキニン、ＡＢＡおよびジベレリンが挙げられるがこれらに限定されない）を添加した、ＭＳベースの培地（MurashigeおよびSkoog, Physiol. Plant, 15:473-497 (1962)）またはＮ６ベースの培地（Chuら, Scientia Sinica, 18:659 (1975)）が挙げられるがこれらに限定されない。当業者は、様々な組織培養培地に精通しており、これらは、適切に添加された場合に、植物組織の成長および発育を助け、植物形質転換および再生に適している。これらの組織培養培地は、市販調剤として購入するかまたは注文調製されて、改変され得る。当業者は、形質転換および再生において使用する培地、ならびに栄養および成長調節因子等の培地添加剤、ならびに特定の種類の目的のために最適化され得るインキュベーション中の光強度、ｐＨ、およびインキュベーション温度等の他の培養条件を承知している。
【００８７】
アグロバクテリウム形質転換方法を使用して形成されるトランスジェニック植物は、典型的に、１つの染色体上に単一の遺伝子を含む。このようなトランスジェニック植物は、追加遺伝子についてヘテロ接合型であると呼ばれうる。追加の構造遺伝子に対してホモ接合性であるトランスジェニック植物（すなわち、２つの追加遺伝子（１つの遺伝子が染色体対の各染色体の同じ遺伝子座にある）を含むトランスジェニック植物）がより好ましい。ホモ接合性トランスジェニック植物は、単一の追加遺伝子を含む個別の分離体（segregant）トランスジェニック植物を性的に交配（自殖）させ、生成された種子のいくつかを発芽させ、目的の遺伝子について生成された植物を分析することにより得ることができる。
【００８８】
２つの異なるトランスジェニック植物を交配して、２つの独立した分離外因性遺伝子を含む子孫を生成することもできることも理解されよう。適切な子孫の自殖により、目的のポリペプチドをコードする追加外因性遺伝子の両方に対してホモ接合性の植物が生成できる。植物育種と同様に、親植物への戻し交配および非トランスジェニック植物での異系交配も意図される。
【００８９】
アンチセンス配向にある目的の遺伝子のＤＮＡを含む構築物の形質転換による導入での植物における遺伝子のアンチセンス抑制は、米国特許第５，１０７，０６５号；同第５，４５３，５６６号；同第５，７５９，８２９号；同第５，８７４，２６９号；同第５，９２２，６０２号；５，９７３，２２６号；および同第６，００５，１６７号（全て、参照により本明細書に取り入れる）に開示されている。
【００９０】
センス配向にある目的の遺伝子のＤＮＡを含む細胞質発現のための構築物の形質転換による導入での植物中の遺伝子の共抑制は、例えば、米国特許第５，０３４，３２３号；同第５，２３１，０２０号；同第５，２８３，１８４号；および同第６，２７１，０３３号（全て、参照により本明細書に取り入れる）に開示されている。
【００９１】
アンチセンス手法は、遺伝物質を標的化することにより遺伝子機能を妨害または低減するための手法である（Molら, FEBS Lett., 268:427-430 (1990)）。アンチセンス手法の目的は、標的遺伝子に相補的な配列を使用して、その発現をブロックし、単一の選択したタンパク質のレベルが選択的に低減または無くされる変異型細胞系または生物を作製することである。アンチセンス技術は他の「逆遺伝子」手法と比べていくつかの利点を有する。不活化の部位およびその発育上の効果は、アンチセンス遺伝子のプロモーターの選択により、または外部適用またはマイクロインジェクションのタイミングにより操作し得る。アンチセンスは、標的遺伝子の固有の領域または他の関係する遺伝子と相同性を共有する領域のいずれかを選択することでその特異性を操作することができる（Hiattら：Genetic Engineering, Setlow(編), New York: Plenum 11:49-63 (1989)に掲載）。
【００９２】
本発明は、本発明の植物の部分、特に再生または貯蔵部分を提供する。植物部分としては、種子、胚乳、胚珠および花粉が挙げられるがこれらに限定されない。本発明の特に好適な実施形態では、植物部分は種子である。一実施形態では、種子は動物飼料の構成成分である。
【００９３】
本発明のあらゆる植物またはそれらの部分は、飼料、食事、タンパク質、粉末、繊維、抽出可能栄養素または油調製物を含む加工品を提供し得る。この目的のために特に好ましい植物部分は、種子である。好適な実施形態では、加工品は、家畜もしくはヒト、または両方のために設計される。飼料、食事、タンパク質および油調製物の生成方法は当該分野で公知である。例えば、米国特許第４，９５７，７４８号；同第５，１００，６７９号；同第５，２１９，５９６号；同第５，９３６，０６９号；同第６，００５，０７６号；同第６，１４６，６６９号および同第６，１５６，２２７号（参照により本明細書に組み入れる）を参照のこと。好適な実施形態では、タンパク質調製物は、高タンパク質調製物である。このような高タンパク質調製物は、好ましくは５％ｗ／ｖ、より好ましくは１０％ｗ／ｖ、さらにより好ましくは１５％ｗ／ｖを上回るタンパク質含有量を有する。好ましい油調製物では、油調製物は、好ましくは５％ｗ／ｖ、より好ましくは１０％ｗ／ｖ、さらにより好ましくは１５％ｗ／ｖの本発明の植物またはその部分から誘導された油含有量を有する高油調製物である。好適な実施形態では、油調製物は液体であり、１、５、１０または５０リットルを上回る容量である。本発明は、本発明の植物から生成されたか、または本発明の方法により生成された油を提供する。このような油は、向上した酸化安定性を示し得る。このような油はまた、得られる生成物の主要でないかまたは主要な構成成分であり得る。さらに、このような油は他の油と共に配合され得る。好適な実施形態では、本発明の植物から生成されるかまたは本発明の方法により生成された油は、任意の生成物の油成分の０．５％、１％、５％、１０％、２５％、５０％、７５％または９０％を上回る容量または重量を構成する。別の実施形態では、油調製物は、配合されて、配合物の１０％、２５％、３５％、５０％または７５％の容量を構成し得る。本発明の植物から生成される油は、１つ以上の有機溶剤または石油蒸留物と混合され得る。
【００９４】
本発明の植物は、育種プログラムの一部であるか、育種プログラムから作製され得る。育種方法の選択は、植物再生の様式、改良する特性の遺伝力、および商業的に使用されている品種によって異なる（例えば、Ｆ１ハイブリッド品種、純品種等）。育種プログラムは、任意の交配の子孫のマーカーに基づく選択を使用して向上できる。あらゆる市販されているおよび市販されていない品種が育種プログラムに利用され得ることがさらに理解されよう。例えば、発生力（emergence vigor）、生長力、ストレス耐性、疾患耐性、枝分かれ、開花、結実、種子の大きさ、種子密度、起立性（standability）および脱穀性（threshability）等の要素は、一般的に選択に影響する。
【００９５】
使用例
本発明の核酸分子およびそれらの断片は、同じ種から他の核酸分子を得るために使用され得る（トウモロコシ由来の核酸分子を利用してトウモロコシから他の核酸分子を得ることができる）。このような核酸分子は、タンパク質の完全コード配列をコードする核酸分子、ならびにこのような分子のプロモーターおよびフランキング配列を含む。さらに、このような核酸分子は、他のイソ酵素または遺伝子ファミリーメンバーをコードする核酸分子を含む。このような分子は、上述した核酸分子またはそれらの断片を使用して、ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより容易に得ることができる。このようなライブラリーを形成するための方法は当該分野で周知である。
【００９６】
本発明の核酸分子およびそれらの断片はまた、核酸ホモログを得るためにも使用され得る。このようなホモログとしては、植物ならびに他の生物（細菌および真菌を含む）の核酸分子（他の植物種または他の生物のタンパク質ホモログを全体的または部分的にコードする核酸分子、遺伝エレメントの配列（プロモーターおよび転写調節エレメント等）を含む）が挙げられる。このような分子は、上述した核酸分子またはそれらの断片を使用して、このような植物種から得たｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーをスクリーニングすることで容易に得ることができる。このようなライブラリーを形成する方法は、当該分野で周知である。このようなホモログ分子は、配列番号１１、１２、１３、１６、１７、１９、２１、２３、２５および２７ならびにそれらの相補配列からなる群より選択される１つ以上の配列において見とめられるものとはヌクレオチド配列が異なりうる。なぜなら、完全な相補性は安定したハイブリダイゼーションのために必要ではないからである。従って、本発明の核酸分子は、核酸分子に特異的にハイブリダイズ可能であるが、「完全な相補性」は欠いている場合もある分子も含む。
【００９７】
開示した１つ以上の核酸配列に関連するプロモーター配列および他の遺伝エレメント（転写調節フランキング配列を含むがそれらに限定されない）は、本明細書で提供する開示核酸配列を使用しても得ることができる。一実施形態では、このような配列は、本発明の核酸分子を、ゲノムライブラリーのメンバーとインキュベートし、このような核酸分子とハイブリダイズするクローンを回収することにより得ることができる。第２の実施形態では、「染色体歩行」または逆ＰＣＲの方法を使用して、このような配列を得てもよい（Frohmanら, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.), 85:8998-9002 (1988)；Oharaら, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.), 86:5673-5677 (1989)；Pangら, Biotechniques, 22:1046-1048 (1977)；Huangら, Methods Mol. Biol., 69:89-96 (1997)；Huangら, Method Mol. Biol., 67:287-294 (1997)；Benkelら, Genet. Anal., 13:123-127 (1996)；Hartlら, Methods Mol. Biol., 58:293-301 (1996)）。「染色体歩行」という用語は、連続したハイブリダイゼーションステップにより遺伝マップを伸長するプロセスを意味する。
【００９８】
本発明の核酸分子を使用して、細胞増強、細胞特異的、組織増強、組織特異的、発達調節的または環境調節的発現プロファイルのプロモーターを単離してもよい。例えばゲノムスクリーニング方法およびＰＣＲ技術を使用した、ゲノムライブラリーから得たこれらの遺伝子の５’側フランキングプロモーター配列の単離および機能分析により、有用なプロモーターおよび転写調節エレメントが単離される。これらの方法は、当業者に公知であり、記載されている（例えば、Birrenら, Genome Analysis: Analyzing DNA, 1 (1997), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New Yorkを参照）。本発明の核酸分子を利用して得たプロモーターは、それらの制御特徴に影響するように改変され得る。このような改変の例としては、エンハンサー配列が挙げられるがこれに限定されない。このような遺伝エレメントを使用して、穀物改善のために新規および既存の形質の遺伝子発現を増強できる。
【００９９】
本発明の核酸分子の別のサブセットは、マーカーである核酸分子を含む。マーカーは、分子遺伝学の分野における多数の従来手法で使用され得る。このようなマーカーとしては、配列番号１１、１２、１３、１６、１７、１９、２１、２３、２５および２７、それらの相補配列の核酸分子、マーカーとして作用し得るそれらのいずれかの断片、ならびにマーカーとして作用し得る本発明の他の核酸分子が挙げられる。
【０１００】
本発明の一態様では、本発明の１つ以上の核酸分子を使用して、植物（好ましくは、カノーラ、トウモロコシ、ブラッシカ・カンペストリス、アブラナ、ナタネ、ダイズ、ハマナ、カラシナ、トウゴマ、ラッカセイ、ゴマ、綿実、アマニ、ベニバナ、アブラヤシ、亜麻またはヒマワリ）における、本発明の１つ以上の核酸分子により部分的または全体的にコードされるタンパク質の発現のレベル（サンプル中のｍＲＮＡの濃度）またはパターン（すなわち、発現の動態、分解速度、安定性プロファイル等）を測定する。
【０１０１】
細胞または組織の２つ以上のサンプル間の発現を比較するために、多数の方法が使用され得る。これらの方法としては、ノーザン、ＲＮアーゼ保護アッセイ、およびｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション等のハイブリダイゼーションアッセイが挙げられる。あるいはまた、これらの方法として、ＰＣＲ型アッセイが挙げられる。好ましい方法では、２つ以上のサンプルから得た核酸を、核酸アレイにハイブリダイズさせることにより発現を比較する。アレイは、サンプルの細胞または組織中に存在することが知られているか疑われる複数の予測配列を含む。
【０１０２】
本発明を全般的に記載してきたが、以下の実施例を参照することでより理解し易くなるであろう。なお、以下の実施例は例示目的のためで本発明を限定することを意図するものではない。
【実施例１】
【０１０３】
ＤＧＡＴ２核酸配列の単離、およびＤＧＡＴ活性の確認
Kamisaka, Y.ら, Lipids, 28:583-587 (1993)に記載されるようにモルティエレラ・ラマニアナを培養した。１０〜１３日間の培養液をミラクロス（Miracloth）に通し、手で絞って過剰分の液体を除去して、細胞を回収した。湿包装細胞を−７０℃にて保存した。モルティエレラ・ラマニアナからのＤＧＡＴ２タンパク質の精製を以下のように行った。７０〜７５ｇの湿包装細胞から脂質体を単離した。使用直前、細胞を氷上で解凍し、２００ｍＬの緩衝液Ｄ（１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．０）、１Ｍ  ＫＣｌ、０．５Ｍショ糖、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中に懸濁させた。「ホモジナイズ」に設定した細胞破砕機（Bead-Beater, Biospec Products, Bartlesville, OK）に入った等量の０．５ｍｍガラスビーズで、４５〜９０秒間かけてサンプルを溶解させた。ガラスビーズを含む細胞スラリーを、５００×ｇで遠心分離し、上清を取り出し、ペレットを別の５ｍＬの緩衝液Ｄで洗浄した。遠心分離の後、両方の遠心分離から得た上清を合わせた。６つの超遠心分離管（２５×８９ｍｍ）に分け、それぞれに５ｍＬの緩衝液Ｅ（１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．０）、１Ｍ  ＫＣｌおよび０．３Ｍショ糖）を重層した。サンプルを、１００，０００×ｇで４℃にて３時間遠心分離にかけた。重層部の上に浮いている脂質体画分を合わせて、５０ｍＬの緩衝液Ｆ（１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．０）、７５ｍＭ  ＫＣｌ、０．５Ｍショ糖および１．５％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）中に可溶化させた。非可溶化物質を、超遠心分離により（９０，０００×ｇにて１．８時間）除去した。浮遊脂質層を捨て、可溶化画分（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００抽出物）を含む上清はカラム精製のために保持した。ＤＧＡＴ活性を、［１−１４Ｃ］オレオイル−ＣｏＡおよび非標識化ジオレオイル−ＤＡＧからの１４Ｃトリアシルグリセロールの生成として測定した。非可溶化サンプルについて、反応混合液（０．１ｍＬ）は、酵素抽出物、１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．０）、１００〜１５０ｍＭ  ＫＣｌ、および０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（ｗ／ｖ）を含む緩衝液に入った、３．６７μＭ［１−１４Ｃ］オレオイル−ＣｏＡ、および１．５ｍＭ  １，２−１８：１ジアシルグリセロールから構成された。アッセイ混合液を、２５℃にて５分間インキュベートし、１．５ｍＬのヘプタン：イソプロパノール：０．５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４（１０：４０：１、ｖ／ｖ／ｖ）を添加して反応を止めた。可溶化サンプルについて、１，２−１８：１  ＤＡＧを０．５ｍＭに減らし、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を０．２％に増やし、３００μＭ  Ｌ−α−ホスファチジン酸を含めた。５００μＭではなく３００μＭホスファチジン酸を使用したこと以外はKamiskaら, J. Biochem., 119:520-523 (1996)に記載されるように界面活性剤での可溶化後に活性を回復するためにＬ−α−ホスファチジン酸が必要であった。これにより、より高い活性刺激がもたらされた。
【０１０４】
可溶化の後、生成物生成は、外因性ＤＡＧの添加に依存していた。これらの条件下では、反応速度は、１０分間まで時間に対して直線的であった。アッセイを終了した後、０．１ｍＬの１Ｍ  ＮａＨＣＯ３、および担体として１５ナノモル／ｍＬトリオレインを含む１ｍＬのヘプタンを添加することで、放射性標識化グリセロ脂質を単離した。混合液を攪拌し、上部有機層を新しいガラスバイアルに移した。有機抽出物を１ｍＬの１Ｍ  ＮａＣｌで逆抽出した。最終有機層の４０％を液体シンチレーション計数のために取り、残った有機層は窒素ガスの下で乾燥するまで蒸発させた。残留物をヘキサンに再懸濁させ、前吸着充填（preadsorbent loading）ゾーンを有するシリカゲルＧを用いたＴＬＣ(Analtech#31011, Newark, Delaware)に供した。ＴＬＣプレートをヘキサン：ジエチルエーテル：酢酸（５０：５０：１、ｖ／ｖ／ｖ）中で展開させた後、乾燥させ、放射画像分析器（AMBIS 3000, AMBIS, Inc., San Diego, California）で走査してＴＡＧに取り込まれた放射活性部分を決定した。ＴＬＣプレート上のＴＡＧ活性の確認は、ヨウ素蒸気への暴露の後の非標識化トリオレイン担体と［１４Ｃ］ＴＡＧとの同時移動により決定した。
【０１０５】
緩衝液Ｇ（１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．０）、０．１％（ｗ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１０％（ｗ／ｖ）グリセロール）に入った７５ｍＭ  ＫＣｌで平衡化した黄色８６−アガロースカラム（２．５ｃｍ×６．４ｃｍ）上での色素結合クロマトグラフィーにより、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００抽出物中のＤＧＡＴ活性をさらに精製した。２ｍＬ／分にて５容量の平衡化緩衝液でカラムを洗浄し、次いで、緩衝液Ｇに入った５００ｍＭ  ＫＣｌで活性を溶出した。この精製段階でＤＧＡＴ活性は冷凍／解凍するのに安定しているため、溶出画分をすぐにアッセイし、活性画分を−７０℃にて保存した。最大活性を維持するために、同じ日に、その後のクロマトグラフィーを行い、画分をアッセイした。黄色８６−アガロース精製活性の４つの調製物を合わせ、超音波処理（ＹＭ−３０膜、Amicon, Beverly, MA）により１２倍濃縮した。緩衝液Ｇに入った５００ｍＭ  ＫＣｌで平衡化した１．０ｃｍ×２５．５ｃｍカラム上でのヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにより活性をさらに精製した。４０ｍＬの平衡化緩衝液でカラムを洗浄した後、平衡化緩衝液中の１００ｍＭリン酸２カリウムを一段階勾配させて、結合したタンパク質を溶出した。ＤＧＡＴ活性を含むフロースルーから得た画分をプールし、緩衝液Ｇ中に１：３：３で希釈して、ＫＣｌ濃度を５００から１５０ｍＭに低減させた。希釈サンプルを、緩衝液Ｇに入った１５０ｍＭ  ＫＣｌで平衡化したヘパリンカラムＣＬ−６Ｂ（０．５５×４．７ｃｍ）にアプライした。カラムを５容量の平衡化緩衝液で０．５ｍＬ／分で洗浄し、結合タンパク質を１５０〜５００ｍＭ  ＫＣｌの１０ｍＬ直線勾配で、その後０．２５ｍＬ／分にて１０ｍＬの５００ｍＭ  ＫＣｌで溶出させた。１．１ｍＬの画分を回収した。２つの活性ピークをヘパリンカラムから溶出した（ｆｎｘ２２およびｆｘｎ２８）。タンパク質精製スキームをまとめたものを表１に示す。３００ｇのＭ．ラマニアナ細胞ペーストから単離された脂質体画分を調製に使用した。Ｍｒ−ＤＧＡＴ２Ａ（ヘパリンｆｘｎ２８）およびＭｒ−ＤＧＡＴ２Ｂ（ヘパリンｆｘｎ２２）の回収値が、最後のクロマトグラフィーステップにおいて別々に報告されている。
【表１】
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【０１０６】
ポリアクリルアミド勾配ゲル電気泳動（１０〜１３％）を、Delepelaire, Proc. Nat. Acad.Sci., 76:115-115 (1979)の変更をいくつか加えてLaemmli, Nature, 227680-227685(1970)の方法に従って実行した。分離ゲルは、ショ糖の０〜１０％直線勾配で安定化した１０〜１３％直線勾配のアクリルアミドストックを含んだ。Blumら, Electrophoresis, 8:93-99 (1987)の方法に従い銀で、またはクーマシーブルー（０．１％クーマシーブルーＲ−２５０、５０％メタノール（ｖ／ｖ）、１０％酢酸（ｖ／ｖ））で染色することによりタンパク質を可視化した。
【０１０７】
いくつかのタンパク質バンド（３６．５ｋＤ、３６ｋＤ、３５ｋＤおよび３４ｋＤ）は、第１の活性ピーク（ｆｘｎ２２）と関連していた。３４ｋＤバンドは、全てのクロマトグラフィーステップにおいてＤＧＡＴ活性と相関しなかったため、排除した（すなわち、データは示さない）。第２のピーク（ｆｘｎ２８）は、より高い比活性（表２）を有し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより３６ｋＤに主要なタンパク質バンドを含んでいた。精製により３つのタンパク質（３６．５ｋＤ、３６ｋＤおよび３５ｋＤ）が、可能性のあるＤＧＡＴ候補として同定された。
【０１０８】
３６ｋＤペプチドから誘導されたアミノ酸配列から設計した縮重プライマーを、センスおよびアンチセンス配向の両方で構築した。これらのプライマーを、異なる組合せで採用して、モルティエレラ・ラマニアナの総ＲＮＡから生成されたｃＤＮＡを増幅した。Jonesら, The Plant Cell, 7:359-371 (1995)に基本的に記載されるように湿包装細胞から総ＲＮＡを調製した。Ｍａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡ増幅キット（BD Biosciences Clontech, Inc. Palo Alto, California）を使用してＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。増幅混合液は、鋳型、ポリメラーゼ連鎖反応緩衝液、各プライマーを２００〜３００ｎｇ、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ、および１ユニットのＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄポリメラーゼ（Perkin Elmer, Norwalk, CT）を含む５０μＬで構成されていた。増幅プログラムは、９５℃にて１０分間維持を１回、３０サイクルの変性（９４℃、３０秒間）、アニーリング（６２℃、１０秒間、５０℃まで１０％の傾斜、１５秒間）、およびプライマー伸長（７２℃、２分間）で構成した。反応生成物を、ＱＩＡＰＲＥＰ  ＤＮＡ抽出ハンドブック（Qiagen, Santa Clara, California）に従って、０．７％アガロースゲル上で分離させ、切り出し、精製した。精製した生成物を、ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯベクター（Invitrogen, Carlsbad, California）にクローニングし、ＤＮＡ配列決定により分析した。プライマーを設計するためには使用しなかったエドマン（Ｅｄｍａｎ）分解により得られたペプチド配列とＰＣＲ生成物の推定アミノ酸配列との比較を使用して、断片の同一性を確認した。
【０１０９】
これらの断片に特異的なプライマーを使用したＲＡＣＥ反応（Ｍａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡ増幅キット）を行って、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターにクローニングされる１３１２塩基対（ｂｐ）の長さのｃＤＮＡを得た。このリーディングフレームの最も５’側のＡＴＧコドンは、塩基対７６に位置し、３５５アミノ酸長のポリペプチドが翻訳される（図１、ＭｒＤＧＡＴ２Ａ）。
【０１１０】
Ｇｅｎｂａｎｋ検索により、これらのポリペプチドは、既知のＤＧＡＴ１またはその他のアシルトランスフェラーゼに配列関連性を持たないが、真核生物（特に真菌、植物、動物および下等真核生物）の主要な門に存在するこれまで報告されていない遺伝子ファミリーのメンバーであることが示された。
【０１１１】
市販されているＢＡＣ−ｔｏ−ＢＡＣバキュロウイルス発現系（Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD）を使用して、培養昆虫（ｓｆ９）細胞中でモルティエレラ・ラマニアナＤＧＡＴ２ＡおよびＤＧＡＴ２Ｂの完全長タンパク質を発現させた。５’末端において制限部位（センスプライマーに対してＮｏｔＩおよびＳｐｅＩ、ならびにアンチセンスプライマーに対してＰｓｔＩ）を含むＰＣＲ用プライマーにより完全長ＤＧＡＴ２オープンリーディングフレームを増幅させた。ＰＣＲ生成物を、ｐＣＲ．２．１ＴＯＰＯベクターにクローニングし、構築物の忠実性を確認するために配列決定した。ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター中の完全長ｃＤＮＡを、ＮｏｔＩおよびＰｓｔＩで消化し、ｐＦＡＳＴＢＡＣ１ベクター（Life Technologies, Inc.）のＮｏｔＩおよびＰｓｔＩ制限部位にクローニングした。バキュロウイルス発現系を使用して、配列番号１８、２０、２２、２４、２６および２８に示すポリペプチドをコードする完全長ｃＤＮＡを発現させて、ＤＧＡＴ活性を決定することができる。
【０１１２】
昆虫細胞（１×１０６細胞／ｍＬ）を、０．０５〜０．１の感染多重度（ＭＯＩ）で感染させ、５日後に２７℃にて遠心分離により回収した。ペレット化細胞を緩衝液Ｈ（１００ｍＭトリシン−ＮａＯＨ（ｐＨ７．８）、１０％グリセロール、１００ｍＭ  ＮａＣｌ）に再懸濁し、超音波処理（２×１０秒間）により溶解させた。細胞壁および他の屑を遠心分離によりペレット化し、廃棄した。上清画分の遠心分離（１００，０００×ｇにて１時間）により膜を回収し、酵素アッセイのために緩衝液Ｈにペレットを再懸濁した。昆虫細胞膜中のＤＧＡＴ活性は、［１−１４Ｃ］オレオイル−ＣｏＡおよび非標識化ジオレオイル−ＤＡＧからの１４Ｃトリアシルグリセロールの生成として測定した。反応混合液（０．１ｍＬ）は、２５〜３０ｍＭトリシン（ｐＨ７．８）、５０〜６０ｍＭ  ＮａＣｌ、および０．０６％ＣＨＡＰＳ（ｗ／ｖ）を含む緩衝液に入った、単離された膜、３．５μＭ［１−１４Ｃ］オレオイル−ＣｏＡ、２１．５μＭオレオイル−ＣｏＡ、および２００μＭ  １，２−１８：１ジアシルグリセロールから構成されていた。アッセイ混合液を、２５℃にて５〜１０分間インキュベートし、１．５ｍＬのヘプタン：イソプロパノール：０．５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４（１０：４０：１、ｖ／ｖ／ｖ）を添加して反応を止めた。サンプルを上述したように処理した。アッセイは、タンパク質および時間に関して直線であった。
【０１１３】
モルティエレラ・ラマニアナＤＧＡＴ２Ａタンパク質（９４倍）およびＤＧＡＴ２Ｂタンパク質（３７倍）の両方について、非形質転換ｓｆ９細胞と比べてＤＧＡＴ活性の有意な上昇が検出された（表２）。
【表２】
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【０１１４】
発現したモルティエレラ・ラマニアナＤＧＡＴ２ＡおよびＤＧＡＴ２Ｂ遺伝子の酵素学的性質も調査した。ＤＧＡＴ活性に対するｐＨの影響を、４．０〜１１．０の範囲にわたり評価した。両方の酵素についてのｐＨ最適値が６．８において見とめられた。ｐＨについて、２つのポリペプチド間で差は検出されなかった。温度に対する応答で差が見とめられた。ＤＧＡＴ２Ａの温度最適値は３７℃である一方、ＤＧＡＴ２Ｂは最適温度を示さなかった。
【実施例２】
【０１１５】
アカパンカビＤＧＡＴ２核酸配列の単離およびＤＧＡＴ活性の確認
以下のプロトコールを使用して、アカパンカビ（Neurospora crassa）ＤＧＡＴ２タンパク質（ＮｃＤＧＡＴ２）に対応するコード領域全体を得た。Ｔｒｉ試薬（Sigma, St. Louis, MO）を製造元のプロトコールに従い使用して、アカパンカビＡ交配型（Fungal Genetics Stock Center, Kansas City, Kansas）菌糸体からＲＮＡを単離した。ＳＭＡＲＴ  ｃＤＮＡ増幅キット（Clontech, California）を使用して、一本目のｃＤＮＡ鎖合成を完了した。アカパンカビゲノム配列に対する配列比較に基づき、遺伝子特異的プライマーを設計して、ＮｃＤＧＡＴ２配列の完全長コード領域を増幅させた。クローニングし易くするために追加の制限部位を導入し（ＨｉｎｄＩＩＩおよびＲｓｒＩＩ）、配列番号７および配列番号８と称するプライマーを使用した（図３）。製造元のプロトコール（Invitrogen）に従いＰＣＲ生成物をプラスミドｐＣＲ２．１にクローニングして、プラスミドｐＭＯＮ６９８３４を得た。二本鎖ＤＮＡ配列決定を行って、配列を検証した（配列番号１３）。バキュロウイルス発現系を使用した昆虫細胞におけるＮｃＤＧＡＴ２タンパク質の発現のために、ｐＭＯＮ６９８３４のＲｓｒＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を、ＲｓｒＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化プラスミドｐＦＡＳＴＢＡＣ１（Gibco-BRL, Gaithersburg, MD）にクローニングした。得られたプラスミドｐＭＯＮ６９８３９を大腸菌ＤＨ１０ＢＡＣに形質転換し、組換えウイルスの回収をトランスフェクション５日後に行うこと以外は製造元の指示に従ってＢＡＣ−ｔｏ−ＢＡＣバキュロウイルス発現系（Gibco-BRL）を使用してタンパク質を発現させた。トランスフェクション混合液から得た上清を使用して、ウイルスストックを生成し、これを使用してＳｆ９細胞を感染させてアッセイに使用した。ＤＧＡＴ活性を、［１−１４Ｃ］オレオイル−ＣｏＡおよび非標識化ジオレオイル−ＤＡＧからの１４Ｃトリアシルグリセロールの生成として測定した。反応混合液（０．１ｍＬ）は、２５〜３０ｍＭトリシン（ｐＨ７．８）、５０〜６０ｍＭ  ＮａＣｌ、および０．０６％ＣＨＡＰＳ（ｗ／ｖ）を含む緩衝液に入った、単離膜、３．５μＭ［１−１４Ｃ］オレオイル−ＣｏＡ、２１．５μＭオレオイル−ＣｏＡ、および２００μＭ  １，２−１８：１ジアシルグリセロールから構成されていた。アッセイ混合液を、２５℃にて５〜１０分間インキュベートし、１．５ｍＬのヘプタン：イソプロパノール：０．５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４（１０：４０：１、ｖ／ｖ／ｖ）を添加して反応を止めた。サンプルを実施例１に記載したように処理した。ＤＧＡＴ活性は、非形質転換（ｓｆ９）細胞における活性と比較してプラスミドｐＭＯＮ６９８３９で形質転換した細胞において６倍増加した。
【０１１６】
植物におけるＮｃＤＧＡＴ２配列の発現について、プライマーオリゴＤＢ＃１９９１１（配列番号９）およびオリゴＤＢ＃１９９１２（配列番号１０）（図３）を使用してＮｏｔＩおよびＳｓｅ８３８７Ｉクローニング部位を導入するために、ｐＭＯＮ６９８３４から遺伝子をＰＣＲ増幅させた。ＰＣＲ生成物をＮｏｔＩ−Ｓｓｅ８３８７Ｉで消化し、１０７１ｂｐの断片を、ｐＭＯＮ６７１６４に由来するＮｏｔＩ−Ｓｓｅ８３８７Ｉ消化ベクターとライゲートさせて、ｐＭＯＮ６８７６２を形成した。このプラスミドにおいて、遺伝子はナピンプロモーターの制御下にある。プラスミドｐＭＯＮ６８７６２をアグロバクテリウム・ツメファシエンスＡＢＩ株に導入し、これを使用して、Ｍａｒｔｉｎｅｌｌら、米国特許第６，３８４，３０１号に記載されるようにダイズを形質転換した。
【実施例３】
【０１１７】
再合成ＤＧＡＴ２遺伝子の調製および形質転換
ダイズに由来する８種の高発現種子特異的タンパク質、すなわち、コングリシニン（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ００８６７８、ＡＢ００８６７９、ＡＢ００８６８０）、グリシニン（ＡＢ００３６８０、ＡＢ００４０６２）、およびグロブリン（Ｄ１６１０７、Ｕ５９４２５）、ならびにカノーラに由来する１４種の高発現種子特異的タンパク質、すなわち、クシフェリン（ｃｕｃｉｆｅｒｉｎ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号１６７１３３、１６７１３５、１７８００、１７８０４、１７８１０、２１１１７）およびナピン（ＡＡ３４９４０３、１６７１７６、１６７１７８、１６７１７４、１６７１５４、１７８３６、１７８３４、１７８３２）からコドン利用表を構築した。ＭｒＤＧＡＴ２ＢおよびＳｃＤＧＡＴ２アミノ酸配列（それぞれ配列番号４および配列番号６）を、上記コドン利用表と共に、Blue Heron Biotechnology Inc.（Bothell, WA）に送付した。その送付先では、独自のアルゴリズムを利用して、ＲＮＡ二次構造を形成するために最低の自由エネルギーを有する最終的なコドン最適化ヌクレオチド配列を生成した。Blue Heron Biotechnology, Inc.にＭｒＤＧＡＴ２Ｂのコドン最適化配列を合成してもらい、ＭｒＤＧＡＴ２Ｂ．ｎｎｏ（配列番号１１）と名付けた。ＳｃＤＧＡＴ２のコドン最適化配列をMidland Certified Reagent Company（Midland, TX）に合成してもらい、ＳｃＤＧＡＴ２．ｎｎｏ（配列番号１６）と名付けた。
【０１１８】
大腸菌発現ベクターにＭｒＤＧＡＴ２Ｂ．ｎｎｏを含むプラスミドｐＭＯＮ７０９２４を配列決定して、ＤＮＡがBlue Heron Biotechnologyに報告されるとおりであることを確認した。プラスミドＤＮＡを、ＸｈｏＩで消化し、末端を充填して平滑末端部をつくり、Ｓｓｅ８３８７Ｉで消化した。１０６８ｂｐ断片を、平滑末端／Ｓｓｅ８３８７Ｉ消化ベクターｐＭＯＮ７０９１８とライゲートして、ｐＭＯＮ７０９２５を形成した。このプラスミドでは、遺伝子はナピンプロモーターの制御下にある。
【０１１９】
ＳｃＤＧＡＴ２．ｎｎｏを含むプラスミドｐＭＯＮ７０９１７を配列決定して、ＤＮＡがMidland Certified Reagent Companyに報告されるとおりであることを確認した。プラスミドＤＮＡをＮｏｔＩ−Ｓｓｅ８３８７Ｉで消化し、１２６９ｂｐ断片をゲル精製した。断片をＮｏｔＩ−Ｓｓｅ８３８７Ｉ消化ｐＭＯＮ７０９１８にライゲートしてｐＭＯＮ７０９２０を形成した。このプラスミドでは、遺伝子はナピンプロモーターの制御下にある。同様の技術を用いてＳｃＤＧＡＴ２．ｎｎｏを別の発現ベクターにクローニングして、ＵＳＰ８８プロモーターの制御下で遺伝子を発現させた（ｐＭＯＮ７０９２３）。プラスミドｐＭＯＮ７０９２５、ｐＭＯＮ７０９２３およびｐＭＯＮ７０９２０をアグロバクテリウム・ツメファシエンスＡＢＩ株に導入し、それぞれを使用して、Martinellら、米国特許第６，３８４，３０１号に記載されるようにダイズを形質転換した。
【０１２０】
同様に、ＮｃＤＧＡＴ２アミノ酸配列（配列番号１４）および上記コドン利用表をBlue Heron Biotechnology, Inc.に送付した。送付先では、ＲＮＡ二次構造を形成するために最低の自由エネルギーを有するコドン最適化ヌクレオチド配列を生成した。Blue Heron Biotechnology, Inc.にＮｃＤＧＡＴ２のコドン最適化配列を合成してもらい、ＮｃＤＧＡＴ２．ｎｎｏ（配列番号１２）と名付けた。再合成ＮｃＤＧＡＴ２．ｎｎｏを配列決定して、ＤＮＡがBlue Heron Biotechnologyに報告されるとおりであることを確認した。プラスミドＤＮＡを、ＮｏｔＩ−Ｓｓｅ８３８７Ｉで消化し、断片をゲル精製した。断片を、ＮｏｔＩ−Ｓｓｅ８３８７Ｉ消化ｐＭＯＮ６７１６４にライゲートして、遺伝子がナピンプロモーターの制御下にあるプラスミドを作製した。
【０１２１】
植物宿主のゲノムにおいて配列番号１７、１９、２１および２３に示す配列を発現するベクターを構築して、表現型変化を生じるような配列の転写または転写および翻訳を得た。トランスジェニックダイズ植物は、Martinellら、米国特許第６，３８４，３０１号に記載されるようにアグロバクテリウム媒介型形質転換により得ることができる。
【実施例４】
【０１２２】
植物中でのＤＧＡＴ２の発現
再合成モルティエレラ・ラマニアナＤＧＡＴ２Ａ遺伝子、ＭｒＤＧＡＴ２Ａ．ｎｎｏ（配列番号１５）を、ダイズ７Ｓプロモーター配列（ｐＣＧＮ８８３２）の制御下でダイズ中で発現させた。粒子ボンバードメントにより植物を形質転換させ、プールした発育中のＲ１種子において酵素アッセイを行った。いくつかの植物は、非形質転換植物と比べてＤＧＡＴ活性の有意な増加（５〜２０倍、スチューデントｔ検定、α＝０．０５）を示し、表３に示すとおりである。
【表３】
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【０１２３】
植物中のＤＧＡＴ活性を以下のようにアッセイした。発育中の胚を、すり鉢とすりこぎを使って液体窒素中で砕いた。サンプルの一部を、トリシン緩衝液（１００ｍＭトリシン、ｐＨ７．５、２８０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール）で再構成し、Ｂｒａｄｆｏｒｄ試薬を用いてタンパク質濃度を決定した（Sambrookら, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第２版, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989）。サンプルを１ｍｇ／ｍｌに希釈し、１０μｌをアッセイで使用した。ＤＧＡＴ活性を、［１−１４Ｃ］オレオイル−ＣｏＡおよび非標識化ジオレオイル−ＤＡＧからの１４Ｃトリアシルグリセロールの生成として測定した。反応混合液（０．１ｍＬ）は、２５ｍＭトリシン（ｐＨ７．８）、２８ｍＭ  ＮａＣｌ、および０．０６％ＣＨＡＰＳ（ｗ／ｖ）を含む緩衝液に入った、タンパク質ホモジネート、３．５μＭ［１−１４Ｃ］オレオイル−ＣｏＡ、１０μＭオレオイル−ＣｏＡ、および１．５ｍＭ  １，２−１８：１ジアシルグリセロールから構成されていた。アッセイ混合液を、２５℃にて１０分間インキュベートし、１．５ｍＬのヘプタン：イソプロパノール：０．５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４（１０：４０：１、ｖ／ｖ／ｖ）を添加して反応を止めた。サンプルを実施例１に記載したように処理した。
【０１２４】
ＭｒＤＧＡＴ２Ａ．ｎｎｏ遺伝子を発現する植物からのＲ１種子を、次世代（Ｒ２）に進めた。油およびタンパク質レベルは、成熟Ｒ２種子の近赤外（ＮＩＲ）分析により測定した。個々の植物から回収したプールした種子サンプルのＮＩＲスペクトルを測定し、加速（accelerated）溶媒抽出の後に重量測定的に測定した様々な油レベルでのダイズ種子の分析から得られた標準曲線を用いた回帰分析に基づいて油レベルを計算した（Better Solutions for Food and Beverage Analysis, 第２版, Dionex Corporation, Sunnyvale, California (1997)）。１．７％の統計的に有意な増加が、ＭｒＤＧＡＴ２Ａ．ｎｎｏについてホモ接合性の種子の油平均値（oil mean）と、導入遺伝子を含まない（空）種子の油平均値との間で見とめられた（スチューデントｔ検定、α＝０．０５）。タンパク質データの統計的評価は、平均値に差はなかったことを示している（スチューデントｔ検定、α＝０．０５）。
【０１２５】
ナピンプロモーターの制御下における植物中での再合成ＭｒＤＧＡＴ２Ａ配列の発現について、ＮｏｔＩ−Ｓｓｅ８３８７Ｉ断片を、ＮｏｔＩ−Ｓｓｅ８３８７Ｉ消化バイナリーベクターｐＭＯＮ６７１６４とライゲートさせて、プラスミドｐＭＯＮ７０９０４を得た。プラスミドｐＭＯＮ７０９０４を、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＡＢＩ株に導入し、これを使用してダイズを形質転換させた。発育中のＲ１種子を、Ｒ０植物から回収し、ＤＧＡＴ活性についてアッセイした。活性の上昇した選択した数の事象を、一世代進めた（Ｒ２種子）。第２世代成熟種子における油レベルおよびタンパク質レベルを、近赤外透過率（ＮＩＴ）分光法により測定した。ここでは、個々の植物から回収したプールした種子サンプルのＮＩＴスペクトルを測定し、それぞれ加速溶媒抽出または元素（％Ｎ）分析の後に重量測定的に測定した様々な油レベルでのダイズ種子の分析から得た標準曲線を用いた回帰分析に基づいて油およびタンパク質レベルを計算した。導入遺伝子を含まない（空）種子の油平均値と比べて、ＭｒＤＧＡＴ２Ａ．ｎｎｏについてホモ接合性の種子の油平均値に２．６％の統計的に有意な増加が見とめられた（スチューデントｔ検定、α＝０．０５）。タンパク質データの統計的評価は、平均値に差はなかったことを示している（スチューデントｔ検定、α＝０．０５）。
【実施例５】
【０１２６】
多数プロモーターからのＤＧＡＴ２の発現
ＤＧＡＴ２活性を示す２つのタンパク質を、モルティエレラ・ラマニアナで同定した（ＭｒＤＧＡＴ２ＡおよびＭｒＤＧＡＴ２Ｂ）。２つのＤＧＡＴ遺伝子を発現可能なプラスミドを構築するために、２つの遺伝子を、単一のｔ−ＤＮＡ上の同じプラスミドにクローニングした。プラスミドｐＭＯＮ７０９２７は、７Ｓａ’プロモーターの制御下にＭｒＤＧＡＴ２Ａ．ｎｎｏ（配列番号１５）、そしてナピンプロモーターの制御下にＭｒＤＧＡＴ２Ｂ．ｎｎｏ（配列番号１１）を含んでいた。クローニングは以下の通りに行った：７Ｓａ’プロモーターの制御下にＭｒＤＧＡＴ２Ａ．ｎｎｏを含むｐＭＯＮ７０９００を、ＥｃｏＲＶで消化し、充填して平滑末端部を作った。次いで、ＮｏｔＩおよび７Ｓａ’で切断し：ＭｒＤＧＡＴ２Ａ．ｎｎｏ断片をゲル精製した。断片を、平滑末端／ＮｏｔＩ消化植物発現ベクターｐＭＯＮ６３６８９にライゲートして、ｐＭＯＮ７０９１２を形成した。ＭｒＤＧＡＴ２Ｂ．ｎｎｏを得るために、ｐＭＯＮ７０９２４をＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、端部を充填して、１０７１ｂｐの長さの平滑末端／平滑末端断片を作った。断片をゲル精製し、次いで、平滑末端／平滑末端ｐＣＧＮ７７７０（ナピンプロモーターおよび３’ＵＴＲを含む大腸菌発現ベクター）にライゲートして、ｐＭＯＮ７０９２６を形成した。ナピン発現カセット中にＭｒＤＧＡＴ２Ｂ．ｎｎｏを含むこのプラスミドを、ＮｏｔＩで消化し、断片を上記ＮｏｔＩ−消化ｐＭＯＮ７０９１２にライゲートして、ｐＭＯＮ７０９２７を形成した。ｐＭＯＮ７０９２７をＡ．ツメファシエンスＡＢＩ株に導入し、これを使用してダイズをMartinellら、米国特許第６，３８４，３０１号に記載されるように形質転換させた。
【０１２７】
他のＤＧＡＴ２遺伝子（ＭｒＤＧＡＴ２Ａ（配列番号１）、ＭｒＤＧＡＴ２Ｂ（配列番号３）、ＳｃＤＡＧＴ２（配列番号５）、ＮｃＤＧＡＴ２（配列番号１３）、ＮｃＤＧＡＴ２．ｎｎｏ（配列番号１２）、およびＳｃＤＧＡＴ２．ｎｎｏ（配列番号１６）が挙げられるがこれらに限定されない）を、対でまたは二連で同様にクローニングした。使用したプロモーターは、時間および／または強度に関して発現を制御する。
【実施例６】
【０１２８】
トウモロコシ胚（ｇｅｒｍ）中でのＭｒＤＧＡＴ２Ａの発現
トウモロコシにおいて再合成モルティエレラ・ラマニアナＤＧＡＴ２Ａ（配列番号１５）遺伝子の遺伝子標的化発現を操作するために発現ベクターを調製した。具体的には、イネアクチンイントロンが後続するトウモロコシＬ３オレオシンプロモーターのすぐ３’側、かつグロブリン１の３’ＵＴＲの５’側にあるｐＭＯＮ７２０２１のＢｓｐ１２０Ｉ／Ｓｓｅ８３８７Ｉ部位に、１０７６塩基対のＮｏｔ１／Ｓｓｅ８３８７Ｉ断片に含まれる完全長ＭｒＤＧＡＴ２Ａ．ｎｎｏ遺伝子（配列番号１５）をクローニングして、ｐＭＯＮ６８６５４を作製した（図６）。
【０１２９】
構築物ｐＭＯＮ６８６５４を、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＡＢＩ媒介型形質転換によりえり抜きの（elite）トウモロコシ系統ＬＨ５９において形質転換させた。この形質転換により生じた事象は、油の増加を示した。
【図面の簡単な説明】
【０１３０】
【図１ａ】特定の誘導型ＤＧＡＴ２ポリペプチド配列の配列アライメントを集合的に示す。
【図１ｂ】特定の誘導型ＤＧＡＴ２ポリペプチド配列の配列アライメントを集合的に示す。
【図１ｃ】特定の誘導型ＤＧＡＴ２ポリペプチド配列の配列アライメントを集合的に示す。
【図２】図１のＤＧＡＴ２ファミリーメンバーの系統樹を示す。系統樹はＤＮＡＳＴＡＲソフトウェアを使用して構築されている。
【図３】本発明で使用するＤＮＡプライマー分子の一覧である。
【図４】ベクターｐＣＧＮ８８３２の模式図である。
【図５】ベクターｐＭＯＮ６８７６２の模式図である。
【図６】ベクターｐＭＯＮ６８６５４の模式図である。
【図７】ベクターｐＭＯＮ７０９０４の模式図である。
【図８】ベクターｐＭＯＮ７０９２０の模式図である。
【図９】ベクターｐＭＯＮ７０９２３の模式図である。
【図１０】ベクターｐＭＯＮ７０９２５の模式図である。
【図１１】ベクターｐＭＯＮ７０９２７の模式図である。
【図１２ａ】特定の真菌種から誘導したＤＧＡＴ２ポリペプチド配列の配列アライメントを示す。
【図１２ｂ】特定の真菌種から誘導したＤＧＡＴ２ポリペプチド配列の配列アライメントを示す。
【図１３】特定の植物種に由来するＤＧＡＴ２ポリペプチド配列の配列アライメントを示す。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１３】
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【配列表】
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