(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
フローサイトメーターの光電子倍増管で蛍光試料の蛍光を定量する際に取得される信号ピーク最大値、信号積分値、信号検出時間の３つのデータから２つのデータを選択し、選択した２つのデータの比率に基づいて以下に示す判定手法により蛍光試料の蛍光の局在態様を調べる方法。
（１）信号積分値に対して信号ピーク最大値が大きいほど局在程度が大きいと判定する
（２）信号ピーク最大値に対して信号検出時間が小さいほど局在程度が大きいと判定する
（３）信号積分値に対して信号検出時間が小さいほど局在程度が大きいと判定する
【請求項２】
蛍光試料が蛍光を発する真核細胞である請求項１記載の方法。
【請求項３】
信号ピーク最大値と信号積分値のデータを選択し、信号積分値に対して信号ピーク最大値が大きいほど蛍光が核内に局在していると判定する請求項２記載の方法。
【請求項４】
蛍光が細胞内で発現させた蛍光タンパク質に由来する請求項２または３記載の方法。
【請求項５】
請求項１記載の方法で蛍光試料の蛍光の局在態様を調べた後、蛍光試料を蛍光の局在態様ごとに選別して分取する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フローサイトメーターを利用して蛍光試料の蛍光の局在態様を調べる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
フローサイトメーターは、蛍光標識された細胞や粒子（ＤＮＡやウイルスなど）などの蛍光試料の懸濁液を高速の水流にしてレーザー光（励起光）を照射し、発生した散乱光や蛍光を定量することで、試料の大きさや量を測定したり、分離・分取したりするための装置であり、今日、分子生物学などの分野における実験を行う際にはなくてはならないものであることは当業者によく知られた事実である。
【０００３】
フローサイトメーターにおける蛍光試料の蛍光の定量は光電子倍増管（「フォトマル」や「ＰＭＴ」ともいう）で行われ、定量の際には、信号ピーク最大値（以下「ＦＬ−Ｈ」）、信号積分値（以下「ＦＬ−Ａ」）、信号検出時間（以下「ＦＬ−Ｗ」）などの各種のデータが取得される。しかしながら、これらのデータを有効利用する方法はほとんど知られておらず、本発明者が知る範囲においては、細胞内の蛍光標識したＤＮＡを定量する場合において、ＦＬ−Ｈに対してＦＬ−ＷやＦＬ−Ａが異常に大きい信号を複数の細胞がくっついた状態でレーザー光の中を通過したものとしてその信号を定量から省くために利用する方法があるにすぎない（例えば非特許文献１を参照のこと）。
【非特許文献１】Wersto, R. P. et al., Cytometry, vol. 46, 296-306, 2001
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで本発明は、フローサイトメーターの光電子倍増管で蛍光試料の蛍光を定量する際に取得されるＦＬ−Ｈ、ＦＬ−Ａ、ＦＬ−Ｗの３つのデータの新規な利用方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、上記の点に鑑みて鋭意研究を重ねた結果、ＦＬ−Ｈ、ＦＬ−Ａ、ＦＬ−Ｗの３つのデータから２つのデータを選択し、選択した２つのデータの比率を求めれば、当該比率は蛍光試料の蛍光の局在態様（蛍光の集積度）を反映していることを見出した。
【０００６】
上記の知見に基づいてなされた本発明は、請求項１記載の通り、フローサイトメーターの光電子倍増管で蛍光試料の蛍光を定量する際に取得されるＦＬ−Ｈ、ＦＬ−Ａ、ＦＬ−Ｗの３つのデータから２つのデータを選択し、選択した２つのデータの比率に基づいて以下に示す判定手法により蛍光試料の蛍光の局在態様を調べる方法である。
（１）ＦＬ−Ａに対してＦＬ−Ｈが大きいほど局在程度が大きいと判定する
（２）ＦＬ−Ｈに対してＦＬ−Ｗが小さいほど局在程度が大きいと判定する
（３）ＦＬ−Ａに対してＦＬ−Ｗが小さいほど局在程度が大きいと判定する
また、請求項２記載の方法は、請求項１記載の方法において、蛍光試料が蛍光を発する真核細胞であるものである。
また、請求項３記載の方法は、請求項２記載の方法において、ＦＬ−ＨとＦＬ−Ａのデータを選択し、ＦＬ−Ａに対してＦＬ−Ｈが大きいほど蛍光が核内に局在していると判定するものである。
また、請求項４記載の方法は、請求項２または３記載の方法において、蛍光が細胞内で発現させた蛍光タンパク質に由来するものである。
また、本発明は、請求項５記載の通り、請求項１記載の方法で蛍光試料の蛍光の局在態様を調べた後、蛍光試料を蛍光の局在態様ごとに選別して分取する方法である。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、フローサイトメーターの光電子倍増管で蛍光試料の蛍光を定量する際に取得されるＦＬ−Ｈ、ＦＬ−Ａ、ＦＬ−Ｗの３つのデータの新規な利用方法としての蛍光試料の蛍光の局在態様を調べる方法が提供される。これまで、例えば細胞内における特定分子の局在態様を調べたい場合、当該分子を細胞内で蛍光タンパク質（例えば緑色蛍光タンパク質変異体：ＥＧＦＰ(Enhanced Green Fluorescent Protein)や緑色蛍光タンパク質：ＧＦＰ(Green Fluorescent Protein)や赤色蛍光タンパク質：ＤｓＲｅｄ(Discosoma sp. Red Fluorescent Protein)など）との融合タンパク質として発現させたり、当該分子に選択的に結合する蛍光色素（例えばＤＮＡに対してインターカレート(intercalate)する蛍光色素など）を細胞内に導入したりすることで蛍光標識し、蛍光顕微鏡でのイメージングによって調べていたが、このような方法では多数の細胞１つ１つについて細胞内における特定分子の局在態様を高速かつ定量的に数値化して調べることはできず、また、その局在態様ごとに細胞を選別して分取することもできなかった。しかしながら、本発明の方法によれば、多数の細胞１つ１つについて高速かつ定量的に数値化して細胞内における特定分子の局在態様を調べることが可能となり、また、その局在態様ごとに細胞を選別して分取することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明は、フローサイトメーターの光電子倍増管で蛍光試料の蛍光を定量する際に取得されるＦＬ−Ｈ、ＦＬ−Ａ、ＦＬ−Ｗの３つのデータから２つのデータを選択し、選択した２つのデータの比率に基づいて以下に示す判定手法により蛍光試料の蛍光の局在態様を調べる方法である。
（１）ＦＬ−Ａに対してＦＬ−Ｈが大きいほど局在程度が大きいと判定する
（２）ＦＬ−Ｈに対してＦＬ−Ｗが小さいほど局在程度が大きいと判定する
（３）ＦＬ−Ａに対してＦＬ−Ｗが小さいほど局在程度が大きいと判定する
【０００９】
蛍光試料は、フローサイトメーターにおいて測定や分離・分取などが可能なものであれば特段制限されるものではなく、例えば直径０．１μｍ〜３５μｍ程度の蛍光標識された細胞や粒子などが挙げられる。
【００１０】
本発明は、フローサイトメーターの光電子倍増管で蛍光試料の蛍光を定量する際に取得されるＦＬ−Ｈ、ＦＬ−Ａ、ＦＬ−Ｗの３つのデータの利用方法に特徴がある。従って、これらのデータを取得するためのフローサイトメーターの運転方法などについては通常行われるものであってよい。以下に本発明の蛍光試料の蛍光の局在態様を調べる方法の原理を、蛍光試料が蛍光を発する真核細胞である場合を例にとって図面を参照しながら説明する。
【００１１】
図１は、細胞がレーザー光の中を通過するときの光電子倍増管に発生する信号と取得されるパラメーターを示すものである。図１に示すように、光電子倍増管で発生する信号はピークをもった曲線で表され、このときのピークの最大値がＦＬ−Ｈ、ほぼ蛍光総量に相当する積分値がＦＬ−Ａ、通過時間がＦＬ−Ｗとしてデータが取得される。図２は、細胞内における蛍光の局在態様の違いによる信号の違いを示すものである。同じ蛍光総量（ＦＬ−Ａ）の細胞で比較した場合、例えば蛍光が核内（狭い領域）に片寄って存在すると、信号のピーク値は高くなる、即ち、ＦＬ−ＨをＦＬ−Ａで割ったＦＬ−Ｈ／ＦＬ−Ａは大きくなるので、ＦＬ−Ａに対してＦＬ−Ｈが大きいほど蛍光が核内に局在していると判定することができる。従って、ＦＬ−ＨとＦＬ−Ａの比率から、蛍光が核内に局在しているのか、細胞全体に拡散している（非局在している）のかといった情報を得ることができるので、本発明によれば、疾患に伴う細胞内における特定タンパク質の局在変化の解析を通じた疾患原因の解明や、医薬品候補化合物による細胞内における特定タンパク質の局在変化の解析を通じた医薬品スクリーニングを、当該タンパク質を例えば細胞内で蛍光タンパク質との融合タンパク質として発現させておくことで高速かつ正確に行うことができる。なお、レーザー光は、細胞の進行方向に対して細く絞り込んであればあるほど正確な測定が可能となり、通常、細胞の進行方向に対するレーザー光の照射径は、細胞の大きさを勘案して１μｍ〜３０μｍ程度の範囲から選択することができる。
【００１２】
また、本発明によれば、以上のような方法で細胞の蛍光の局在態様を調べた後、細胞を蛍光の局在態様ごとに、例えば蛍光が核内に局在している細胞と細胞全体に拡散している細胞を選別して分取することができる。このような細胞の分取は、自体公知のセルソーターを用いて行うことができる。
【００１３】
なお、以上の説明は、ＦＬ−Ｈ、ＦＬ−Ａ、ＦＬ−Ｗの３つのデータからＦＬ−ＨとＦＬ−Ａのデータを選択して蛍光試料の蛍光の局在態様を調べる方法についてのものであるが、ＦＬ−ＨとＦＬ−Ｗのデータを選択した場合やＦＬ−ＡとＦＬ−Ｗのデータを選択した場合でも、選択した２つのデータの比率を求めれば、当該比率は蛍光試料の蛍光の局在態様を反映しており、前者の場合はＦＬ−Ｈに対してＦＬ−Ｗが小さいほど局在程度が大きいと、後者の場合はＦＬ−Ａに対してＦＬ−Ｗが小さいほど局在程度が大きいと判定することができる。
【実施例】
【００１４】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載によって何ら限定して解釈されるものではない。
【００１５】
実施例１： 
ヒトＨＥｐ−２細胞中で蛍光タンパク質であるＥＧＦＰを以下の３種類の局在態様で発現させた（発現方法の詳細は必要であれば例えばSambrook & Russell, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Third Edition, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New YorkあるいはTanaka, J., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. Vol. 264, 938-943, 1999を参照のこと）。
（ａ）ＥＧＦＰ自体を発現させてＥＧＦＰが細胞全体に均一に存在するような態様（図３ａ）
（ｂ）ＥＧＦＰと転写因子であるテトラサイクリンリプレッサー（ＴｅｔＲ）との融合タンパク質を発現させてＥＧＦＰが核内にある程度片寄るが細胞質にも少し存在するような態様（同ｂ）
（ｃ）融合タンパク質にさらにＳＶ４０核移行シグナル（ＳＶ４０ＮＳＬ）を付加して発現させてＥＧＦＰを核内に局在化させた態様（同ｃ）
なお、蛍光強度の解析はｌｏｇではなくｌｉｎｅａｒで行うため、それぞれの細胞の蛍光強度、即ち、ＥＧＦＰの発現レベルはある程度揃えておくことが望ましい。この操作は発現プロモーターの選択によって可能であり、この実施例では、態様ａで用いる発現プロモーターは態様ｂと態様ｃで用いる発現プロモーターよりも弱いものとし、態様ａではＳＲαプロモーターを用い、態様ｂと態様ｃではＣＡＧプロモーターを用いた。
【００１６】
上記の３種類の細胞を各々フローサイトメーターとしてベクトン・ディッキンソン社の商品名：ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（レーザー光の試料の進行方向の照射径は２０μｍ）にアプライし、ＦＬ−Ｈ、ＦＬ−Ａ、ＦＬ−Ｗの３つのデータを取得した。データは横軸をＦＬ−Ａ，縦軸をＦＬ−Ｈで２次元表示し、データを取得する際、細胞集団が前記の２次元表示のコンピューター画面上でなるべく対角線に近いところにプロットされるように、電圧（Ｖｏｌｔａｇｅ）とゲイン（Ｇａｉｎ）の値を調整した。コンピューター画面上で多角形のゲートを設定し、ゲート内の全細胞についての平均ＦＬ−１Ｈと平均ＦＬ−１Ａを求め、平均ＦＬ−１Ｈ／平均ＦＬ−１Ａを算出した。さらにＦＬ−１Ｈ／ＦＬ−１Ａの高い領域と低い領域にわけてそれぞれに含まれる細胞の割合を算出した。結果を図３に示す。図３から明らかなように、平均ＦＬ−１Ｈ／平均ＦＬ−１Ａ（図３においてＦＬ−Ｈ／ＦＬ−Ａで表示する値）は態様ｃ（「核」：０．９７８３）＞態様ｂ（「核＞細胞質」：０．９１５８）＞態様ａ（「均一」：０．８７９６）の順になっていた。また、ＥＧＦＰが細胞全体に均一に存在する態様ａでは９０％以上の細胞がＦＬ−１Ｈ／ＦＬ−１Ａが低い領域に存在し（ｌｏｗ＝９２．２％）、ＥＧＦＰが核内にある程度片寄るが細胞質にも少し存在する態様ｂでは約７０％の細胞がＦＬ−１Ｈ／ＦＬ−１Ａが低い領域に存在するのに対し（ｌｏｗ＝７２．８％）、ＥＧＦＰが核内に局在している態様ｃでは８０％以上の細胞がＦＬ−１Ｈ／ＦＬ−１Ａが高い領域に存在することが判明した（ｈｉｇｈ＝８２．２％）。以上の結果から、ＦＬ−Ａに対してＦＬ−Ｈが大きいほどＥＧＦＰが核内に局在していると判定できることがわかった。よって、本発明によれば、ＥＧＦＰを細胞内で発現させた多数の細胞１つ１つについて、細胞内におけるＥＧＦＰの局在態様を高速かつ定量的に数値化して調べることが可能であること、細胞をＥＧＦＰの局在態様ごとに選別して分取することが可能であることがわかった。
【００１７】
実施例２：
実施例１と同様にしてヒトＨＥｐ−２細胞中で蛍光タンパク質であるＥＧＦＰを以下の４種類の局在態様で発現させた。
（ａ）実施例１の態様ｃ（図４ａ：「核」）
（ｂ）同、態様ｂ（同ｂ：「核＞細胞質」）
（ｃ）同、態様ａ（同ｃ：「均一」）
（ｄ）ＥＧＦＰと細胞骨格タンパク質であるアクチンとの融合タンパク質を発現させてＥＧＦＰを核外の細胞質に局在化させた態様（同ｄ：「核外」）
【００１８】
上記の４種類の細胞を各々フローサイトメーターとしてベクトン・ディッキンソン社の商品名：ＦＡＣＳＡｒｉａ（レーザー光の試料の進行方向の照射径は９μｍ）にアプライし、ＦＬ−Ｈ、ＦＬ−Ａ、ＦＬ−Ｗの３つのデータを取得した。データは横軸をＦＬ−Ａ，縦軸をＦＬ−Ｈで２次元表示するとともに、横軸がＦＬ−Ｈ／ＦＬ−Ａ，縦軸が細胞数のヒストグラムで表示し、データを取得する際、細胞集団が前記の２次元表示のコンピューター画面上でなるべく対角線に近いところにプロットされるように、電圧（Ｖｏｌｔａｇｅ）とゲイン（Ｇａｉｎ）の値を調整した。コンピューター画面上で多角形のゲートを設定し、ゲート内の全細胞についてＦＬ−１Ｈ／ＦＬ−１Ａの計測を行い、さらにＦＬ−１Ｈ／ＦＬ−１Ａの高い領域と低い領域にわけてそれぞれに含まれる細胞の割合を算出した。結果を図４に示す。図４から明らかなように、ＥＧＦＰが核内に局在している態様ａでは約９０％の細胞がＦＬ−１Ｈ／ＦＬ−１Ａが高い領域に存在するのに対し、ＥＧＦＰが核内にある程度片寄るが細胞質にも少し存在する態様ｂでは約３０％の細胞しかＦＬ−１Ｈ／ＦＬ−１Ａが高い領域に存在しないことが判明した。さらにＥＧＦＰが細胞全体に均一に存在する態様ｃやＥＧＦＰが核外の細胞質に局在している態様ｄではＦＬ−１Ｈ／ＦＬ−１Ａが高い領域に存在する細胞が減少する傾向はいっそう顕著になり、それぞれ約６％の細胞と約２％の細胞しかＦＬ−１Ｈ／ＦＬ−１Ａが高い領域に存在しないことが判明した。また、４種類の細胞ごとのＦＬ−１Ｈ／ＦＬ−１Ａの平均は、１０２４段調に換算された値（図４右のヒストグラムの横軸）で、態様ａが６３０，態様ｂが４６２，態様ｃが４１３，態様ｄが３８６であった。以上の結果から、ＦＬ−Ａに対してＦＬ−Ｈが大きいほどＥＧＦＰが核内に局在していると判定できることがわかった。
【００１９】
本発明の応用例その１：
あるタンパク質の細胞内における局在態様を調べたい場合、当該タンパク質を蛍光タンパク質との融合タンパク質として細胞内で発現させてそのＦＬ−Ｈ／ＦＬ−Ａを求める一方、比較対照細胞として細胞内における蛍光の局在態様が判明している細胞、例えば蛍光が核内に局在している細胞，蛍光が細胞全体に拡散している細胞，蛍光が核外に局在している細胞を作製してそれぞれのＦＬ−Ｈ／ＦＬ−Ａを求め、各細胞のＦＬ−Ｈ／ＦＬ−Ａを比較することで、細胞内における当該タンパク質の局在態様を知ることができる。なお、蛍光が核内に局在している細胞は、蛍光タンパク質と核移行シグナルとの融合タンパク質を細胞内で発現させたり、ＤＮＡに対してインターカレートする蛍光色素、例えばＤＡＰＩ（4',6-Diamidino-2-phenylindole），Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２，Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８などで核を染色したりすることで作製することができる。また、蛍光が細胞全体に拡散している細胞は、ＥＧＦＰやＧＦＰを単独で細胞内で発現させることで作製することができる（ＥＧＦＰやＧＦＰは細胞内で発現させると細胞全体に拡散した状態になる）。また、蛍光が核外に局在している細胞は、例えば細胞骨格タンパク質であるアクチンやチューブリンのような核内に入らない大きさのタンパク質と蛍光タンパク質との融合タンパク質を細胞内で発現させたり、クロンテック社の商品名：ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓのような自己集合性の蛍光タンパク質を細胞内で発現させたりすることで作製することができる。
【００２０】
本発明の応用例その２：
一般に「核内受容体」と総称される様々なホルモン受容体のように、普段は細胞質（核外）に存在するが、リガンドと結合すると核に移行するようなタンパク質（標的タンパク質）と蛍光タンパク質との融合タンパク質を細胞内で発現させておき、標的タンパク質に対する候補薬物を細胞に作用させて本発明の方法によって当該融合タンパク質の局在変化を調べることで、候補薬物の中から実際に標的タンパク質に結合して当該タンパク質の核への移行を引き起こすアゴニスト薬物（細胞に作用させることでＦＬ−Ｈ／ＦＬ−Ａが大きくなる薬物）のスクリーニングを行うことができる。また逆に、本来のリガンドと競合して標的タンパク質と結合し、その機能を阻害するようなアンタゴニスト薬物のスクリーニングも行うことができる。
【００２１】
本発明の応用例その３：
普段は細胞膜上に存在するが、リガンドと結合すると細胞内の小胞体に移行するような受容体タンパク質と蛍光タンパク質との融合タンパク質を細胞膜上で発現させておき、受容体タンパク質に対する候補薬物を細胞に作用させて本発明の方法によって当該融合タンパク質の局在変化を調べることで、候補薬物の中から実際に受容体タンパク質に結合して当該タンパク質を活性化することにより細胞内の小胞体への移行を引き起こすアゴニスト薬物（細胞に作用させることでＦＬ−Ｈ／ＦＬ−Ａが大きくなる薬物）のスクリーニングを行うことができる。また逆に、本来のリガンドと競合して受容体タンパク質と結合し、その活性化を阻害するようなアンタゴニスト薬物のスクリーニングも行うことができる。このように、本発明の方法は、細胞内における標的タンパク質の核内への局在程度を調べる場合に限らず、細胞内の小胞体やミトコンドリアなどへの局在程度を調べる場合にも利用できる。
【産業上の利用可能性】
【００２２】
本発明は、フローサイトメーターの光電子倍増管で蛍光試料の蛍光を定量する際に取得されるＦＬ−Ｈ、ＦＬ−Ａ、ＦＬ−Ｗの３つのデータの新規な利用方法としての蛍光試料の蛍光態様の局在を調べる方法を提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】細胞がレーザー光の中を通過するときの光電子倍増管に発生する信号と取得されるパラメーターを示す図である。
【図２】細胞内における蛍光の局在態様の違いによる信号の違いを示す図である。
【図３】実施例１の３種類のヒトＨＥｐ−２細胞内におけるＥＧＦＰの局在態様を示す光学顕微鏡写真（写真左）と蛍光顕微鏡写真（写真右）および横軸をＦＬ−Ａ，縦軸をＦＬ−Ｈで２次元表示した局在態様の解析結果を示す図である。
【図４】実施例２の４種類のヒトＨＥｐ−２細胞内におけるＥＧＦＰの局在態様を示す模式図（左）、横軸をＦＬ−Ａ，縦軸をＦＬ−Ｈで２次元表示した局在態様の解析結果を示す図（中央）、横軸がＦＬ−Ｈ／ＦＬ−Ａ，縦軸が細胞数のヒストグラムで表示した局在態様の解析結果を示す図（右）である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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