(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
胃腸管の受容体ＨＰＴ１と特異的に結合するｄ型レトロ反転されたペプチドであって、該ｄ型レトロ反転されたペプチドが、アミノ酸配列rtrlrrnhsshkant（ＺＥｌａｎ１４４）又はアミノ酸配列gtsngngccnydgp（ＺＥｌａｎ１４６）を含むペプチド。
【請求項２】
胃腸管を経由する全身、門脈又は肝臓の循環系への活性剤の運搬を向上させる、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
前記ペプチドが、５０以下のアミノ酸残基を含む、請求項１又は２に記載のペプチド。
【請求項４】
前記ペプチドが、４０以下のアミノ酸残基を含む、請求項１又は２に記載のペプチド。
【請求項５】
前記ペプチドが、３０以下のアミノ酸残基を含む、請求項１又は２に記載のペプチド。
【請求項６】
前記ペプチドが、２０以下のアミノ酸残基を含む、請求項１又は２に記載のペプチド。
【請求項７】
活性剤を含む物質に結合している請求項１ないし６のいずれか１項に記載のペプチドを含む組成物であって、前記活性剤が哺乳動物の疾病又は疾患の治療に価値がある組成物。
【請求項８】
前記活性剤が薬物である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記物質が、前記活性剤を含む粒子である、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
前記物質が薬物を含む遅延放出デバイスである、請求項７に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ペプチドが、前記物質に共有結合的に又は非共有結合的に結合している、請求項７に記載の組成物。
【請求項１２】
活性剤を含む物質に結合しているキメラタンパク質を含む組成物であって、前記キメラタンパク質が、第２のタンパク質のアミノ酸配列に共有結合を経由して融合している、アミノ酸配列rtrlrrnhsshkant（ＺＥｌａｎ１４４）又はアミノ酸配列gtsngngccnydgp（ＺＥｌａｎ１４６）を含み、前記活性剤が哺乳動物の疾病又は疾患の治療に価値がある組成物。
【請求項１３】
薬物を含む粒子に非共有結合的に結合している、請求項１、２、３、４、５、又は６のペプチドを含む組成物。
【請求項１４】
薬物に共有結合的に結合している、請求項１、２、３、４、５、又は６のペプチドを含む組成物。
【請求項１５】
ヒト又は動物の胃腸の組織を経由する活性剤の輸送を促進する、請求項７に記載の組成物。
【請求項１６】
前記活性剤がヒト又は動物の選択された部位又は選択された組織を標的とする、請求項７に記載の組成物。
【請求項１７】
精製された請求項７に記載の組成物を非ヒトである対象に投与することを含む、活性剤をｉｎ  ｖｉｖｏで運搬する方法。
【請求項１８】
精製された請求項１３に記載の組成物を非ヒトである患者に投与することを含む、薬物をｉｎ  ｖｉｖｏで運搬する方法。
【請求項１９】
精製された請求項１４に記載の組成物を非ヒトである患者に投与することを含む、薬物をｉｎ  ｖｉｖｏで運搬する方法。
【請求項２０】
前記投与が経口である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記活性剤が薬物である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記組成物が、非ヒトである動物の胃腸の組織を経由する前記活性剤の輸送を促進する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
前記投与が経口である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
ヒトにｉｎ  ｖｉｖｏで使用するために適した医薬的に受容可能な担体中に請求項７に記載の組成物を含む医薬組成物。
【請求項２５】
請求項１ないし６のいずれか１項に記載のペプチドに、免疫特異的に結合することが可能である抗体（但し、抗ダンシル抗体を除く）。
【請求項２６】
請求項１ないし６のいずれか１項に記載のペプチド及び医薬的に受容可能な担体を含む組成物の、治療的に有効な量を含む医薬組成物。
【請求項２７】
疾病又は疾患を治療又は予防する方法であって、このような治療又は予防が望ましい非ヒトである対象に、治療的に有効な量の請求項７に記載の組成物を投与することを含む方法。
【請求項２８】
疾病又は疾患を治療又は予防する方法であって、このような治療又は予防が望ましい非ヒトである対象に、治療的に有効な量の請求項１３に記載の組成物を投与することを含む方法。
【請求項２９】
疾病又は疾患を治療又は予防する方法であって、このような治療又は予防が望ましい非ヒトである対象に、治療的に有効な量の請求項１４に記載の組成物を投与することを含む方法。
【請求項３０】
前記疾病又は疾患が、高血圧、糖尿病、骨粗鬆症、血友病、貧血、癌、偏頭痛、及び狭心症からなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
請求項１、２、３、４、５、又は６のペプチドを含む組成物であって、前記ペプチドがナノ又はマイクロ粒子の表面に、塗付又は吸収或いは共有結合されたペプチドである組成物。
【請求項３２】
請求項１、２、３、４、５、又は６のペプチドから形成された、ナノ又はマイクロ粒子。
【請求項３３】
前記ナノ又はマイクロ粒子が、薬物を充填した又は薬物をカプセル化したナノ又はマイクロ粒子である、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３４】
前記薬物が、インスリン又はロイプロリド（ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ）である、請求項７に記載の組成物。
【請求項３５】
前記疾病又は疾患が、高血圧、糖尿病、骨粗鬆症、血友病、貧血、癌、偏頭痛、及び狭心症からなる群から選択される、請求項７に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術の分野
本発明は、一般的に胃腸管（ＧＩＴ）の輸送受容体を標的とするか、又はそれと特異的に結合することが可能なペプチドに関する。特に本発明は、ＧＩＴの管腔側の内側を覆う上皮細胞のような組織を経由する薬物の運搬及び輸送を増強するペプチド配列及びモチーフのレトロ反転された型（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｆｏｒｍ）、並びにその誘導体に関する。ペプチド及び抗体の製造法も更に提供される。本発明は、更に医薬組成物、調剤物及び関連する方法にも関する。
【０００２】
発明の背景
プロテアーゼは、隣接するＬ−アミノ酸間のペプチド結合を切断し、これらのペプチドをＧＩＴ中での分解を受けやすくする。Ｄ−アミノ酸を含む人工のタンパク質又はペプチドは、タンパク質分解に対して充分に抵抗性がある。然しながら、ペプチド／タンパク質の全てのＬ−アミノ酸をＤ−アミノ酸が置換した場合、対応するＤ−ペプチド／タンパク質は、本来のペプチド／タンパク質の鏡像であり、そしてこのコンホメーションの変化のために、恐らくは改変され又は生物学的活性を失う。レトロ反転されたペプチドは、全てＤ−アミノ酸を有するペプチドであるが、しかし本来のＬ−ペプチド／タンパク質と比較して、反転された順序又は配列で合成される。本来のペプチド／タンパク質のカルボキシ末端は、レトロ反転されたペプチド／タンパク質のアミノ末端（そして逆も同じ）となり、そして得られたレトロ反転されたペプチド／タンパク質の側鎖の面は、本来のＬ−ペプチド／タンパク質と同じである。Ｄ−鏡像体及び反転された合成の組み合わせの最終的な結果は、それぞれのアミド結合のカルボニル及びアミン基の位置が交換され、一方、側鎖基の位置は保持されることになる（Ｂｒａｄｙ，Ｌ．及びＤｏｄｓｏｎ，Ｇ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６８Ｌ：６９２−６９３（１９９４）；Ｊａｍｅｓｏｎ等、Ｎａｔｕｒｅ，３６８；７４４−７４６（１９９４））。このタンパク質骨格の変更は、水素結合供与体が水素結合受容体となり（アミドカルボニル基）、そして逆も同じであることにおいて自己補償である。骨格に対する側鎖の位置が変化しない場合、レトロ反転されたペプチド／タンパク質の改変された面は、本来のＬ−ペプチド／タンパク質と対比してたいてい変わらない。
【０００３】
以前に、本明細書中にその全てが参考文献として援用される、ＷＯ９８／５１３２５で開示し、そして特許請求したように、Ｄ２Ｈ、ｈＳＩ、ＨＰＴ１及びｈＰＥＰＴ１受容体のようなＧＩＴの輸送受容体に特異的に結合することが可能な、ランダムペプチド及びその断片、モチーフ、誘導体、類似体又はそのペプチド模倣体が同定された（本明細書中で以降“ＧＩＴ標的剤”）。これらのＧＩＴ標的剤は、ヒト又は動物の胃腸組織を経由して活性剤の輸送を促進することが可能であり、そして例えば、ＧＩＴの管腔側から全身の血液系への活性剤の輸送を促進すること及び／又は活性剤にＧＩＴを標的とさせることにおいて用途を有する。従って、例えばＧＩＴ標的剤を経口投与される活性剤と結合する（共有結合的又は非共有結合的に）ことによって、活性剤にヒトの胃腸管で機能していることが知られている、特定の受容体部位又は輸送経路を標的とさせ、従ってその全身系への吸収を促進することができる。好ましくは、活性剤は、薬物又は薬物を含むナノ又はミクロ粒子である。
【０００４】
発明の開示
驚くべきことに、ＧＩＴ標的剤のレトロ反転された型が、ｉｎ  ｖｉｖｏで特定の受容体部位を標的とし、及び／又は活性剤の取り込みを増進し、及び／又はＧＩＴを経由する全身の循環系への活性剤の運搬を向上させることが見出された。レトロ反転されたＤ−ペプチドの合成を使用することによって、ＧＩＴ標的剤と同じ機能を保有するが、しかしヒト又は動物のＧＩＴ中のプロテアーゼに対する増強した安定性を有するＧＩＴ標的剤のレトロ反転されたＤ−ペプチドが見出された。これらのレトロ反転されたペプチド及びこれらのレトロ反転されたペプチドを含む組成物は、薬物又は薬物を含むナノ又はミクロ粒子のような活性剤を、薬物を必要とする患者の状態の治療のために、ｉｎ  ｖｉｖｏで上記に引用したＷＯ９８／５１３２５中で開示されている任意の用途又は方法によって、運搬するために使用することができる。更に、本発明は、本発明のレトロ反転されたペプチドを免疫特異的に結合することが可能な抗体を提供する。
【０００５】
発明の実施の形態
本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏで特定の受容体部位を標的とする、及び／又は活性剤の取り込みを増進する及び／又はＧＩＴを経由する全身、門脈又は肝臓の循環系への活性剤の運搬を増強する、レトロ反転されたペプチド（本明細書中ではまた“標的化するレトロ反転されたペプチド”又は“標的化するレトロ反転ペプチド”としても呼ばれる）に関する。特に、これらのレトロ反転されたペプチドは、一つ又はそれ以上のヒトの胃腸管の受容体ＨＰＴ１、ＨＰＥＰＴ１、Ｄ２Ｈ又はｈＳＩ又は他の動物のこれらの対等物に特異的に結合し、そして活性剤に、受容体が発現された身体中の選択された部位及び／又は選択された組織を標的とさせる一般的な用途を有する。これらのペプチドは、Ｄ−アミノ酸から合成され、そして上記に引用したＷＯ９８／５１３２５に開示され、そして特許請求されているＧＩＴ標的剤と反転された配列順序を有する。本発明は、更にこれらのレトロ反転されたペプチドの誘導体（制限されるものではないが断片を含む）にも関し、これら誘導体は機能的にレトロ反転されたペプチドと同様である（即ち、一つ又はそれ以上の、レトロ反転されたペプチドの既知の機能的活性を示すことが可能である）。これらの機能的活性は、制限されるものではないが、胃腸管の受容体ＨＰＴ１、ＨＰＥＰＴ１、Ｄ２Ｈ又はｈＳＩとの結合又は結合に競合する能力、或いはレトロ反転されたペプチドに対して指向された抗体によって結合される能力を含む。誘導体は、所望の活性に対して、受容体ドメイン又はＣａｃｏ−２細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏで、或いは腸管組織にｉｎ  ｖｉｔｒｏで又はｉｎ  ｖｉｖｏで結合することを含む、当該技術分野において既知の方法によって試験することができる。
【０００６】
誘導体は、レトロ反転されたペプチドの配列を、機能的に対等な活性を与える置換、付加又は欠失により変更することによって、製造することができる。誘導体は、制限されるものではないが、一次アミノ酸配列として、機能的に対等なアミノ酸残基が配列中の残基を置換して、サイレント変化となっている、変更された配列を含む全て又は一部のレトロ反転されたペプチドのアミノ酸配列を含むものを含む。例えば、配列中の一つ又はそれ以上のアミノ酸残基は、機能的に対等に作用する同じ極性の他のアミノ酸で置換されて、サイレント変化となることができる。配列中のアミノ酸の置換体は、そのアミノ酸が属する種類の他のものから選択される。例えば非極性（疎水性）アミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンを含む。極性が中性アミノ酸は、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミンを含む。正に荷電された（塩基性）アミノ酸は、アルギニン、リシン及びヒスチジンを含む。負に荷電された（酸性）アミノ酸は、アスパラギン酸及びグルタミン酸を含む。
【０００７】
本発明の範囲に含まれるものは、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／遮断基による誘導体化、タンパク質分解による切断、抗体分子又は他の細胞のリガンドへの結合、等によって修飾されるレトロ反転されたペプチド又は誘導体である。多くの化学的修飾のいずれをも、既知の技術によって行うことができる。特定の態様において、アミノ末端及び／又はカルボキシ末端は修飾される。更に、所望する場合、非古典的アミノ酸又は化学的アミノ酸類似体を、レトロ反転されたペプチド配列に置換又は付加として導入することができる。非古典的アミノ酸は、制限されるものではないが、α−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、γ−Ａｂｕ、ε−Ａｈｘ、６−アミノへキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、フルオロ−アミノ酸、デザイナーアミノ酸、例えばβ−メチルアミノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸、Ｎα−メチルアミノ酸、及び一般的なアミノ酸類似体を含む。
【０００８】
本発明は、更に治療及び診断の方法並びに標的化するレトロ反転されたペプチドを含む組成物に関する。
本発明は、活性剤を含む物質に結合された、本発明の標的化するレトロ反転されたペプチドを含む組成物を提供する。このような組成物は、活性剤にＧＩＴを標的にさせること及び／又はヒト又は動物の対象のＧＩＴの管腔を経由する全身循環への輸送を促進することにおいて用途を有する。レトロ反転されたＤ−ペプチドは、更にヒト又は動物の対象の、受容体又は他の関連する受容体が発現している、選択された部位／選択された組織を活性剤に標的とさせることにおいて一般的な用途を有する。例えば、レトロ反転されたＤ−ペプチドが、関連する受容体のような他の受容体、受容体のスプライス変異体又はスーパーファミリーとして存在する関連する受容体に結合している場合、或いはペプチドが、非特異的イオン対の会合、水素結合又は疎水対結合のような非特異的相互反応により結合している場合、これらは、薬物をこれらの受容体が発現している哺乳動物又はヒトの組織若しくはセルタイプに運搬するために使用することができる。更に、活性剤が画像化剤の場合、このような組成物はＧＩＴ（又はその特定の輸送受容体）のような選択された部位／選択された組織を画像化するためにｉｎ  ｖｉｖｏで投与することができる。他の活性剤は、制限されるものではないが、ヒト又は動物の生物学的反応を導き出すことが可能な、いかなる薬物又は抗原、或いはいかなる薬物若しくは抗原を充填された、又は薬物若しくは抗原をカプセル化したナノ粒子、ミクロ粒子、リポソーム、又はミセル製剤を含む。薬物若しくは抗原を充填された又は薬物若しくは抗原をカプセル化した製剤の例は、活性剤が、生分解可能なナノ若しくはミクロ粒子のような、ナノ若しくはミクロ粒子中にカプセル化され又は充填され、そしてこれがナノ若しくはミクロ粒子の表面に吸着、被覆又は直接結合或いは結合分子を経由して結合しているような、共有的に結合された、標的化するレトロ反転されたペプチドを有するものを含む。更に、標的化するレトロ反転されたペプチドは、ナノ又はミクロ粒子そのものを形成することができ、或いは標的化するレトロ反転されたペプチドは、生分解可能なナノ若しくはミクロ粒子或いは薬剤を充填された又は薬剤をカプセル化したナノ若しくはミクロ粒子の製造に使用されるポリマー又は複数のポリマーに共有結合的に結合されることができ、或いはペプチドは活性剤に直接結合することができる。このような活性剤への結合は、レトロ反転されたペプチドが、対象となるタンパク質又はペプチド活性剤と直接結合しているタンパク質を含む。更に、本発明のレトロ反転されたペプチドは、基剤ポリマーの合成に使用される構成単位又はサブユニット或いはポリマーのモノマーに結合させることができる。
【０００９】
好ましい態様において、本発明は治療用化合物（本明細書中で、“治療剤”と名付ける）の投与による各種の疾病及び疾患の治療を提供する。このような“治療剤”は、制限されるものではないが、疾病又は疾患（好ましくは哺乳動物、更に好ましくはヒトの疾病又は疾患）の治療又は予防に価値のある活性剤に結合している、標的化するレトロ反転されたペプチドを含む。活性剤は好ましくは薬物である。
【００１０】
治療又は予防される疾病或いは疾患、及び薬物が投与される対象の種類にもよるが、当該技術分野において既知のいかなる薬物も使用することができる。本明細書中で使用される“薬物”の用語は、制限するものではないが、いかなる医薬的に活性な薬剤をも含む。代表的な薬物は、制限されるものではないが、ペプチド又はタンパク質、ホルモン、鎮痛剤、抗偏頭痛剤、抗凝血剤、抗嘔吐剤、心臓血管剤、抗高血圧剤、麻薬拮抗薬、キレート化剤、抗狭心症剤、化学治療剤、鎮静剤、抗腫瘍剤、プロスタグランジン、及び抗利尿剤を含む。典型的な薬物は、ペプチド、タンパク質又はインスリンのようなホルモン、カルシトニン、カルシトニン遺伝子調節タンパク質、心房性ナトリウム利尿タンパク質、コロニー刺激因子、ベタセロン（ｂｅｔａｓｅｒｏｎ）、エリトロポエチン（ＥＰＯ）、α、β又はγインターフェロンのようなインターフェロン、ソマトロピン、ソマトトロピン、ソマトスタチン、インスリン様成長因子（ソマトメジン）、黄体ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）、オキシトシン、エストラジオール、成長ホルモン、酢酸ロイプロリド（ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ）、第ＶＩＩＩ因子、インターロイキン例えばインターロイキン−２、及びその類似体；鎮痛剤例えばフェンタニル、スフェンタニル（ｓｕｆｅｎｔａｎｉｌ）、ブトルファノール（ｂｕｔｏｒｐｈａｎｏｌ）、ブプレノルフィン、レボルファノール、モルヒネ、ヒドロモルホン、ヒドコドン（ｈｙｄｃｏｄｏｎｅ）、オキシモルホン、メサドン、リドカイン、ブピバカイン、ジクロフェナック（ｄｉｃｌｏｆｅｎａｃ）、ナプロキセン、パベリン（ｐａｖｅｒｉｎ）、及びこれらの類似体；抗偏頭痛剤例えばヘパリン、ヒルジン、及びこれらの類似体；抗凝血剤例えばスコポラミン、オンダンセトロン（ｏｎｄａｎｓｅｔｒｏｎ）、ドムペリドン（ｄｏｍｐｅｒｉｄｏｎｅ）、エトクロプラミド（ｅｔｏｃｌｏｐｒａｍｉｄｅ）、及びこれらの類似体；心臓血管剤、抗高血圧剤及び血管拡張剤例えばジルチアゼム、クロニジン、ニフェジピン、ベラパミル、イソソルビド（ｉｓｏｓｏｒｂｉｄｅ）−５−モノニトラート、有機硝酸塩、心臓疾患の治療に使用される薬剤及びこれらの類似体；沈静剤例えばベンゾジアゼイン（ｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｉｎｅ）、フェノチオジン、及びこれらの類似体；麻薬拮抗薬例えばナルトレキソン、ナロキソン及びこれらの類似体；キレート化剤例えばデフェロキサミン（ｄｅｆｅｒｏｘａｍｉｎｅ）、及びこれらの類似体；抗利尿剤例えばデスモプレシン、バソプレシン及びこれらの類似体；抗アンギナ剤例えばニトログリセリン及びその類似体；抗腫瘍剤例えば５−フルオロウラシル、ブレオマイシン及びこれらの類似体；プロスタグランジン及びその類似体；化学治療剤例えばビンクリスチン及びその類似体を含む。代表的な薬物は、制限されるものではないが、更にアンチセンスオリゴヌクレオチド、遺伝子、遺伝子補正ハイブリッドオリゴヌクレオチド、リボザイム、アプタメリック（ａｐｔａｍｅｒｉｃ）オリゴヌクレオチド、三重ヘリックス形成オリゴヌクレオチド、シグナル伝達経路の阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤及びＤＮＡ修飾剤を含む。使用することができる薬物は、制限するものではないが、更に治療剤遺伝子を運搬するための非ウィルス並びにウィルス精製にレトロ反転されたペプチドより修飾された治療剤遺伝子のためのウィルスベクター系を含む遺伝子治療剤を含む系を含む。
【００１１】
好ましい態様において、治療剤は治療的に又は予防的にヒトの患者に投与される。
本発明によって使用することができる治療剤の更なる説明及び出典は、本明細書中の種々の文節に見出される。
【００１２】
本発明は、本発明の治療剤の効果的な量を対象に投与することによる、治療（及び予防）の方法を提供する。好ましい側面において、治療剤は実質的に精製される。対象は好ましくは、制限されるものではないが、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌ、等を含む動物であり、そして好ましくは哺乳動物、そして更に好ましくはヒトである。
【００１３】
明白になるように、薬物をｉｎ  ｖｉｖｏで全身的に与えることによる、或いは薬物に、ｉｎ  ｖｉｖｏで、受容体又は、関連する受容体、受容体のスプライス変異体、スーパーファミリーとして存在する又はレトロ反転されたペプチドが非特異的イオン対結合若しくは水素結合又は疎水対結合のような非特異的相互作用によって、これに相互作用する関連する受容体のような、他の受容体を含むＧＩＴ又は他の選択された部位、選択された組織若しくはセルタイプを標的とさせる（本発明の標的化するレトロ反転されたペプチドとの結合により）ことによる、治療又は予防による影響を受けやすい、対象となるいかなる疾病又は疾患は（いかなる投与経路を使用しても）、本発明の治療剤を投与することによって治療又は予防することができる。このような疾病は、制限されるものではないが、いくつかの名前を挙げれば、高血圧、糖尿病、骨粗鬆症、血友病、貧血、癌、偏頭痛及び狭心症を含む。
【００１４】
制限されるものではないが、経口、経鼻、局所、静脈、腹腔内、皮内、粘膜、鞘内、筋肉等を含む、当該技術分野において既知のいかなる投与経路も使用することができる。好ましくは投与は経口である；このような態様において、本発明による標的化するレトロ反転されたペプチドは、都合よくＧＩＴの管腔を経由する門脈、肝臓又は全身の循環系への治療活性剤の輸送を促進するように作用する。
【００１５】
本発明は、更に治療用組成物又は製剤を提供する。本発明の特定の態様において、標的化するレトロ反転されたペプチドは、治療的又は予防的な活性剤、好ましくは薬物又は薬物を含むナノ若しくはミクロ粒子に伴なわれる。更に好ましくは、活性剤は、薬物をカプセル化して含む又は薬物を充填されたナノもしくはミクロ粒子であり、例えばその中にペプチドが物理的に吸着又は被覆された、或いはナノ若しくはミクロ粒子の表面に直接結合又は結合分子を経由して結合しているような共有結合的に結合した、生分解可能なナノ若しくはミクロ粒子である。別の方法として、ペプチドはナノ若しくはミクロ粒子そのものを形成することができ、又は活性剤に直接結合することができる。好ましくは粒子の大きさの範囲は、１０ｎｍないし５００μｍ、さらに好ましくは５０ないし８００ｎｍ、最も好ましくは２００−６００ｎｍである。
【００１６】
従って、特定の態様において、標的化するレトロ反転されたペプチドは、薬物を含む遅延放出（制御放出）デバイスに結合される。特定な態様において、高分子物質を使用することができる（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｓｅ（ｅｄｓ．），ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，Ｓｍｏｌｅｎ  ａｎｄ  Ｂａｌｌ（ｅｄｓ．），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４）；Ｒａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｐｅｐｐａｓ，Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１（１９８３）を参照されたく、更にＬｅｖｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１９０（１９８５）；Ｄｕｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１（１９８９）；Ｈｏｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５（１９８９）を参照されたい）。
【００１７】
本発明は、更に医薬組成物を提供する。このような組成物は、治療的に有効な量の治療剤及び医薬的に受容可能な担体を含む。特定の態様において、“医薬的に受容可能な”の用語は、連邦又は州政府の監督機関によって認可された、或いは米国薬局方又は他の一般的に認められた薬局方に、動物、そして更に特にヒトに対する使用が記載されていること意味する。“担体”の用語は、治療剤がこれらと共に投与される、希釈剤、アジュバント、賦形剤、又はベヒクルを指す。このような医薬的な担体は、滅菌液体、例えば水、及び石油、動物、植物又は合成起源のもの例えばピーナツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油等を含む油であることができる。医薬組成物が静脈から投与される場合、水が好ましい担体である。生理食塩水溶液及びブドウ糖水溶液並びにグリセリン溶液も、特に注射用溶液のための液体担体として更に使用することができる。適当な医薬的賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、白亜（ｃｈａｌｋ）、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセリン、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセリン、プロピレン、グリコール、水、エタノール、ソルビトール、トレハロース等を含む。組成物は、所望する場合、更に少量の湿潤剤又は乳化剤、或いはｐＨ緩衝剤を含むことができる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳液、錠剤、丸薬、カプセル、粉剤、継続放出製剤等の形態をとることができる。組成物は、トリグリセリドのような伝統的な結合剤及び担体と共に、座薬として処方することができる。経口用製剤は、標準的な担体、例えば医薬級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム、等を含むことができる。適当な医薬的担体の例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ”中に記載されている。このような組成物は、治療的に有効な量の治療剤を、好ましくは精製された形で適当な量の担体と共に含み、患者に対する適切な投与の形態を提供する。
【００１８】
本発明の活性剤は、中性即ち塩の形で処方することができる。医薬的に受容可能な塩は、遊離アミノ基と共に形成されたもの、例えば塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸等から誘導されたもの、及び遊離カルボキシル基と共に形成されたもの、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等から誘導されたものを含む。
【００１９】
特定の疾患及び状態の治療に効果的な本発明の治療剤の量は、疾患及び状態の特質に依存するであろうし、そして標準的な臨床技術によって決定することができる。更に、最適な投与量の範囲を確認することを援助するために、所望によりｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを使用することができる。処方に使用される正確な投与量は、更に投与経路及び疾病又は疾患の重大さに依存するであろうし、そして開業医の判断及びそれぞれの患者の状況によって決定されなければならない。
【００２０】
本発明によれば、標的化するレトロ反転されたペプチドは、更に抗体を発生する免疫原として使用して、このような免疫原を免疫特異的に結合することができる。このような抗体は、制限されるものではないが、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単一鎖、Ｆａｂ断片、及びＦａｂ発現ライブラリーを含む。
【００２１】
これらの抗体は、定位及び本発明の標的化するレトロ反転されたペプチドの局在及び活性に関係する方法、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与後のこれらのペプチドの画像化（例えば治療効果のモニター）、適当な生理学的試料中のその濃度の測定、診断法、等のために使用することができる。例えば、標的化するレトロ反転されたペプチドのドメインに特異的な抗体又は抗体の断片、例えばダンシル基又はペプチドに導入されたある種の他のエピトープは、１）ナノ粒子又は他の基質上のペプチドの存在の確認；２）ナノ粒子上のペプチドの量の定量；３）適当な生理学的試料中のペプチドの濃度の測定；４）組織試料の免疫組織学の実行；５）ｉｎ  ｖｉｖｏ投与後のペプチドの画像化；６）免疫アフィニティーカラムを使用した混合物からのペプチドの精製；７）ナノ粒子の表面のペプチドの結合又は固定；又は８）活性剤を含む粒子又は活性剤そのもののいずれかに、更に標識が付けられた場合、粒子／活性剤及び標的化するレトロ反転されたペプチドの両者の最終結果を追跡して、これらが分離するか否か、及び／又は何処で分離するかを決定することに使用することができる。上記７）の使用は、抗体（又は抗体の断片）を、薬物を充填されたナノ粒子又は他の基質の表面に結合し、そして次いでこの複合物をペプチドと共にインキュベートすることを考慮している。この方法は、ペプチドをある固定した方向付けで結合することになり、ペプチドが完全に活性であるような方法で抗体に結合したペプチドを含む粒子が得られる。更に、標的化するレトロ反転されたペプチドのドメインに特異的な抗体又は抗体の断片は、９）ナノ若しくはミクロ粒子の表面上のペプチドの存在箇所（ｌｏｃａｔｉｏｎ）又は局在を、証明又は確認或いは確定するための共焦点顕微鏡画像技術又は他の画像技術に使用することができ、１０）同様に更に蛍光剤を付加されたナノ若しくはミクロ粒子の表面上のペプチドの存在箇所又は局在を、証明又は確認或いは確定するための共焦点顕微鏡画像技術又は他の画像技術に使用することができ、１１）ミクロトーム又は他の適当な技術で半分にスライスされたペプチドで被覆されたナノ粒子又はミクロ粒子の場合、抗体は、ナノ粒子又はミクロ粒子の表面及びナノ粒子又はミクロ粒子の表面下の内部基質間のペプチドの相対的分布を確定又は定量するために、共焦点顕微鏡画像技術又は他の定量的画像技術のような適当な定量的技術に使用することができ、１２）ナノ粒子若しくはミクロ粒子の表面上の、ＴＲＭＡ又はフルオラセン（ｆｌｕｏｒａｓｃｅｎｅ）のような蛍光剤で付加されたペプチドの存在箇所を、証明又は確認或いは確定するための共焦点顕微鏡画像技術又は他の画像技術に使用することができ、１３）ペプチドのどのエピトープ又はドメインが抗体による同定の原因であるのかを確定するために使用することができ；環状又は鎖中のジスルフィド結合若しくは他の鎖中結合を含む誘導体のようなペプチド誘導体も、更にペプチドのどのドメイン又はエピトープが抗体による認識の原因であるかの確定のためのマッピング研究に使用することができ；１４）標的の受容体に結合する原因であるエピトープ又はドメインが、ジスルフィド結合若しくは他の鎖中結合によって近接してお��、そしてこのドメインが更に抗体との結合の原因であるペプチド誘導体の場合、抗体は、エピトープ又はドメインが、抗体に暴露されているか又は結合に利用可能であるか否かを決定するために、ペプチド又は誘導体がナノ粒子、ミクロ粒子又は他の基質の表面上に被覆されている場合、使用することができ；１５）ペプチドのエピトープ又はドメインがヒトの胃腸管中の標的受容体或いはＣａｃｏ−２細胞又は極性化されたＣａｃｏ−２細胞のようなモデル上皮細胞上の標的受容体に結合する場合であって、そしてこのペプチドのエピトープ又はドメインが、更に抗体による結合の原因である場合、抗体は、ペプチドのその標的受容体部位への結合を競合させる競合研究に使用することができ；そして１６）ペプチドのエピトープ又はドメインがヒトの胃腸中の標的受容体或いはＣａｃｏ−２細胞又は極性化されたＣａｃｏ−２細胞のようなモデル上皮細胞上の標的受容体に結合する場合であって、そしてこのペプチドのエピトープ又はドメインが、更に抗体による結合の原因である場合、抗体は、ナノ粒子又はミクロ粒子がペプチドで被覆され、そしてこれが細胞結合研究及び／又は受容体結合研究に使用される競合研究に使用することができる。
【００２２】
標的化するレトロ反転されたペプチドのドメインに特異的なアブチド（ａｂｔｉｄｅ）（即ち抗原結合ペプチド）、例えばダンシル基又はペプチドに導入されたある種の他のエピトープは、抗体に対して上記で明確にしたと同様な目的に使用することができる。
【００２３】
本発明のレトロ反転されたペプチドは、当該技術分野において既知の方法によって調製することができる。例えば、簡単には、固相ペプチド合成は、Ｃ−末端アミノ酸のカルボキシル基と樹脂とのカップリング及びその後のＮ−アルファ保護アミノ酸の付加からなる。保護基は当該技術分野において既知のいかなるものであってもよい。それぞれの新しいアミノ酸を成長する鎖に付加する前に、鎖に付加したその前のアミノ酸の保護基は除去される。アミノ酸の適当な樹脂とのカップリングは、Ｒｉｖｉｅｒ等によって米国特許第４，２４４，９４６号に記載されている。このような固相合成は、例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，１９６４，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９；Ｖａｌｅ等、１９８１，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１３：１３９４−１３９７；Ｍａｒｋｉ等、１９８１，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：３１７８並びに米国特許第４，３０５，８７２号及び４，３１６，８９１号によって記載されている。好ましい側面において、自動化ペプチド合成機が使用される。
【００２４】
制限するものではないが、例として、ペプチドは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．（“ＡＢＩ”）モデル４３１Ａ自動ペプチド合成機によって、ＡＢＩによって提供された“Ｆａｓｔｍｏｃ”合成プロトコルを使用して、ヘキサフルオロリン酸２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム（“ＨＢＴＵ”）（Ｒ．Ｋｎｏｒｒ等、１９８９，Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．，３０：１９２７）をカップリング剤として使用して、合成することができる。合成は、０．２５ｍｍｏｌの商業的に入手可能な４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−（９−フルオレニル−エトキシカルボニル）−アミノメチル）−フェノキシポリスチレン樹脂（“Ｒｉｎｋ樹脂”Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈから入手）（Ｈ．Ｒｉｎｋ，１９８７，Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．２８：３７８７）で行うことができる。Ｆｍｏｃアミノ酸（１ｍｍｏｌ）をＦａｓｔｍｏｃプロトコルに従ってカップリングさせる。次の側鎖保護Ｆｍｏｃアミノ酸誘導体を使用する：ＦｍｏｃＡｒｇ（Ｐｍｃ）ＯＨ；ＦｍｏｃＡｓｎ（Ｍｂｈ）ＯＨ；ＦｍｏｃＡｓｐ（tＢｕ）ＯＨ；ＦｍｏｃＣｙｓ（Ａｃｍ）ＯＨ；ＦｍｏｃＧｌｕ（tＢｕ）ＯＨ；ＦｍｏｃＧｌｎ（Ｍｂｈ）ＯＨ；ＦｍｏｃＨｉｓ（Ｔｒ）ＯＨ；ＦｍｏｃＬｙｓ（Ｂｏｃ）ＯＨ；ＦｍｏｃＳｅｒ（tＢｕ）ＯＨ；ＦｍｏｃＴｈｒ（tＢｕ）ＯＨ；ＦｍｏｃＴｙｒ（tＢｕ）ＯＨ。［略語：Ａｃｍ、アセトアミドメチル；Ｂｏｃ、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル；tＢｕ、ｔｅｒｔ−ブチル；Ｆｍｏｃ、９−フルオレニルメトキシカルボニル；Ｍｂｈ、４，４’−ジメトキシベンズヒドリル；Ｐｍｃ、２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル；Ｔｒ、トリチル］。
【００２５】
合成は、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）を溶媒として使用して、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解したＨＢＴＵで行われる。Ｆｍｏｃ基の脱保護は、ＮＭＰ中の約２０％のピペリジンを使用して行われる。それぞれの合成の終了時に存在するペプチドの量を、紫外分光分析によって分析する。乾燥したペプチド樹脂の試料（約３−１０ｍｇ）を秤量し、次いでＤＭＡ（１０ｍｌ）中の２０％ピペリジンを加える。３０分間の超音波処理後、ジベンゾフルベン−ピペリジン付加物（Ｎ−末端Ｆｍｏｃ基の切断により形成される）のＵＶ（紫外）吸光度を３０１ｎｍで記録する。ペプチド置換（ｍｍｏｌ  ｇ-1）は、等式：
置換＝［（Ａ×ｖ）／（７８００×ｗ）］×１０００
によって計算することができて、式中、Ａは、３１０ｎｍでの吸光度、ｖは、ＤＭＡ中の２０％ピペリジンの体積（ｍｌ）、７８００は、ジベンゾフルベン−ピペリジン付加物の吸光係数（ｍｏｌ-1ｄｍ3ｃｍ-1）、そしてｗは、ペプチド樹脂試料の重量（ｍｇ）である。
【００２６】
最後に、Ｎ−末端のＦｍｏｃ基は、ＤＭＡ中の２０％ピペリジンを使用して切断され、次いで無水酢酸及びＤＭＡ中のピリジンを使用してアセチル化される。ペプチド樹脂は、ＤＭＡ、ＣＨ2Ｃｌ2及び最終的にジエチルエーテルで完全に洗浄される。
【００２７】
制限するものではないが、例として、切断及び脱保護は、次のように行うことができる：空気乾燥されたペプチド樹脂を、硫化エチルメチル（ＥｔＳＭｅ）、エタンジチオール（ＥＤＴ）、及びチオアニソール（ＰｈＳＭｅ）で約２０分間処理してから、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の９５％水溶液を加える。全体積約５０ｍｌのこれらの試薬を、ペプチド樹脂１グラム当たり使用する。次の比を使用する：ＴＦＡ：ＥｔＳＭｅ：ＥＤＴ：ＰｈＳＭｅ（１０：０．５：０．５：０．５）。混合物をＮ2雰囲気下の室温で３時間撹拌する。混合物を濾過し、そして樹脂をＴＦＡ（２×３ｍｌ）で洗浄する。混合した濾液を真空中で蒸発し、そして無水ジエチルエーテルを黄色／橙色の残留物に加える。得られた白色の沈殿物を濾過により分離する。各種の切断方法に関しては、Ｋｉｎｇ等、１９９０，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．３６：２５５−２６６を参照されたい。
【００２８】
合成されたペプチドの精製は、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、及びサイジングカラムクロマトグラフィー、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ））、遠心、溶解度の差、又は他のいかなる標準的な技術を含む、標準的な方法によって行うことができる。
【００２９】
本発明のペプチドは、当該技術分野において公知の方法によって、他の分子（例えば、本発明の各種の態様によって、検知可能な標識、固体基質への吸着を促進する分子、又は毒素）に結合させることができる。このような方法は、同種二官能基性及び異種二官能基性架橋分子の使用を含む。
【００３０】
同種二官能基性分子は、同一の少なくとも二つの反応性官能基を有する。同種二官能基性分子の反応性官能基は、例えばアルデヒド基及び活性なエステル基を含む。アルデヒド基を有する同種二官能基性分子は、例えばグルタルアルデヒド及びスベルアルデヒドを含む。グルタルアルデヒドの架橋剤としての使用は、Ｐｏｚｎａｎｓｋｙ等、１９８４，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２３：１３０４−１３０６によって開示された。
【００３１】
少なくとも二つの活性エステル単位を有する同種二官能基性分子は、ジカルボン酸及びＮ−ヒドロキシスクシンイミドのエステルを含む。このようなＮ−スクシンイミジルエステルのいくつかの例は、スベリン酸ジスクシンイミジル及びジチオ−ビス−（プロピオン酸スクシンイミジル）、並びにこれらの可溶性ビス−スルホン酸及びこれらのナトリウム及びカリウム塩のようなビス−スルホン酸塩を含む。これらの同種二官能基性試薬は、Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓから入手可能である。
【００３２】
異種二官能基性分子は、少なくとも二つの異なった反応基を有する。反応性ジスルフィド結合を含む、異種二官能基性試薬のいくつかの例は、３−（２−ピリジル−ジチオ）プロピオン酸Ｎ−スクシンイミジル（Ｃａｒｌｓｓｏｎ等、１９７８，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．１７３：７２３−７３７）、Ｓ−４−スクシンイミジルオキシカルボニル−アルファ−メチルベンジルチオ硫酸ナトリウム及び４−スクシンイミジルオキシカルボニル−アルファ−メチル−（２−ピリジルジチオ）トルエンを含む。３−（２−ピリジル−ジチオ）プロピオン酸Ｎ−スクシンイミジルが好ましい。チオール基と反応する二重結合を有する反応基を含む、異種二官能基性試薬のいくつかの例は、４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸スクシンイミジル及びｍ−マレイミド安息香酸スクシンイミジルを含む。
【００３３】
他の異種二官能基性分子は、３−（マレイミド）プロピオン酸スクシンイミジル、４−（ｐ−マレイミド−フェニル）酪酸スルホスクシンイミジル、４−（Ｎ−マレイミドメチル−シクロヘキサン）−１−カルボン酸スルホスクシンイミジル、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステルを含む。ｍ−マレイミド安息香酸スクシンイミジルのスルホン酸ナトリウム塩が好ましい。先に記載した異種二官能基性試薬及びそのスルホン酸塩の多くは、Ｐｉｅｒｃｅから入手可能である。
【００３４】
これらの並びに他の多官能基性試薬をいかに製造し、そしていかに使用するかに関する更なる情報は、以下の刊行物又は当該技術分野において入手可能な他の刊行物から得ることができる：Ｃａｒｌｓｓｏｎ等、１９７８，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１７３：７２３−７３７；Ｃｕｍｂｅｒ等、１９８５，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １１２：２０７−２２４；Ｊｕｅ等、１９７８，Ｂｉｏｃｈｅｍ  １７：５３９９−５４０５；Ｓｕｎ等、１９７４，Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３：２３３４−２３４０；Ｂｌａｔｔｌｅｒ等、１９８５，Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４：１５１７−１５２；Ｌｉｕ等、１９７９，Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８：６９０−６９７；Ｙｏｕｌｅ及びＮｅｖｉｌｌｅ、１９８０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：５４８３−５４８６；Ｌｅｒｎｅｒ等、１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：３４０３−３４０７；Ｊｕｎｇ及びＭｏｒｏｉ、１９８３，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ７６１：１６２；Ｃａｕｌｆｉｅｌｄ等、１９８４，Ｂｉｏｃｈｅｍ．８１：７７７２−７７７６；Ｓｔａｒｏｓ、１９８２，Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１：３９５０−３９５５；Ｙｏｓｈｉｔａｋｅ等、１９７９，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０１：３９５−３９９；Ｙｏｓｈｉｔａｋｅ等、１９８２，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９２：１４１３−１４２４；Ｐｉｌｃｈ及びＣｚｅｃｈ、１９７９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５４：３３７５−３３８１；Ｎｏｖｉｃｋ等、１９８７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：８４８３−８４８７；Ｌｏｍａｎｔ及びＦａｉｒｂａｎｋｓ、１９７６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１０４：２４３−２６１；Ｈａｍａｄａ及びＴｓｕｒｕｏ、１９８７，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６０：４８３−４８８；Ｈａｓｈｉｄａ等、１９８４，Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．６：５６−６３。
【００３５】
更に、架橋の方法は、Ｍｅａｎｓ及びＦｅｅｎｅｙ、１９９０，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１：２−１２によって報告されている。
標的化するレトロ反転されたペプチドの合成及び特徴付け
先に引用したＷＯ９８／５１３２５に記載されている方法と同様に、合成ダンシル化ペプチドを、Ｇｅｎｏｓｙｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＫ及びＡｎａｓｐｅｃ  Ｉｎｃ．，ＵＳＡで製造した。特徴付け項目は、外観、溶解度、ＨＰＬＣ及び質量分析を含んでいた（最小純度＞９５％）。表１は、特定のＧＩＴ標的剤を参照して合成されたレトロ反転されたペプチド及び本来のＧＩＴ標的剤それ自体の両者の一次配列を示す。
【００３６】
【表１】
0004566406.tif 000002
【００３７】
ＥＬＩＳＡによるダンシル化ペプチドのＣａｃｏ−２細胞膜画分への結合の分析
先に引用したＷＯ９８／５１３２５に記載されている方法と同様に、Ｃａｃｏ−２細胞膜（Ｐ１００）及び細胞質ゾル（Ｓ１００）の画分を、Ｋｉｎｓｅｌｌａ，Ｂ．Ｔ．，Ｏ’Ｍａｈｏｎｙ，Ｄ．Ｊ．及びＧ．Ａ．ＦｉｔｚＧｅｒａｌｄ，１９９４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９（４７）：２９９１４−２９９１９に記載されている方法の改変を使用して調製した。コンフルエントのＣａｃｏ−２細胞単層（７５ｃｍ2フラスコ中で３７℃及び５％ＣＯ2で１週間まで成長した）を、ダルベッコＰＢＳ（ＤＰＢＳ）で２回洗浄し、そして、１０ｍＭのＥＤＴＡ−ＤＰＢＳで処理した後、細胞を１０００ｒｐｍの遠心により回収した。細胞をＤＰＢＳで３回洗浄し、そして最終の細胞のペレットを、３体積の氷冷ＨＥＤ緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．６７）、１ｍＭのＥＧＴＡ、０．５ｍＭのジチオトレイトール、１ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ））に再懸濁した。細胞を氷の上で５分間膨潤させてから、３０秒間ホモジナイズした。ホモジネートを４０，０００ｒｐｍで４５分間４℃で遠心した。上清（Ｓ１００）を除去し、そしてペレット（Ｐ１００）をＨＥＤＧ緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．６７）、１ｍＭのＥＧＴＡ、０．５ｍＭのジチオトレイトール、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセリン、１ｍＭのＰＭＳＦ）に再懸濁した。タンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ．Ｍ．，１９７６，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２：２４８−２５４）を使用して測定した。
【００３８】
ペプチドの膜（Ｐ１００）への結合は、ペプチドに組み込まれたダンシル分子の検出によって評価した。Ｃｏｓｔａｒ９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、Ｐ１００画分（０．０５ＭのＮａＨＣＯ3（ｐＨ９．６）中の１００μｇ／ｍｌ；１００μｌ／ウェル）で４℃で一晩コートした。プレートを２％のＭａｒｖｅｌ−ＤＰＢＳで室温で１時間ブロックし、そして１％のＤＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中で３回洗浄した。ペプチド（２％のＭａｒｖｅｌ−ＤＰＢＳ中の２００μｇ／ｍｌ）を、プレート上で連続的に希釈し、そして室温で１時間インキュベートした。プレートを５回洗浄し、そしてダンシル化ペプチドを、ｉ）マウスの抗ダンシル抗血清（Ｃｙｔｏｇｅｎ  ＤＢ３−２２６．３；２％のＭａｒｖｅｌ−ＤＰＢＳ中の１：１３４０希釈）又はｉｉ）ウサギの抗ダンシル抗血清（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＬＡＪＤ−１１９；１：１０００希釈）を使用して室温で１時間検出した。プレートを３回洗浄してから、ｉ）ヤギ抗マウスＩｇＧλ：ＨＰＲ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０６０−０５；２％のＭａｒｖｅｌ−ＤＰＢＳ中の１：１０，０００希釈）又はｉｉ）抗ウサギＩｇＧ  ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ  Ａ−０５４５、１：８，０００）と共に室温で１時間インキュベートした。３回の洗浄後、反応物を、Ｋ  Ｂｌｕｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ及びＲｅｄ  Ｓｔｏｐ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（それぞれＮｅｏｇｅｎ  Ｃｏ．３００１７６＆３０１４７５）を使用して、６５０ｎｍで可視化した。
【００３９】
ＺＥｌａｎ０２１即ちＨＡＸ４２［Ｋ（ｄｎｓ）−ＳＤＨＡＬＧＴＮＬＲＳＤＮＡＫＥＰＧＤＹＮＣＣＧＮＧＮＳＴＧＲＫＶＦＮＲＲＲＰＳＡＩＰＴ］の全長に、信号／雑音比のデータから決定された一定のペプチド濃度における、Ｐ１００に対する結合に対して１．００という任意の値を与えた。表２は、ＨＡＸ４２関連のペプチドＺＥｌａｎ０２１、ＺＥｌａｎ０９１及びＺＥｌａｎ１４６によるＰ１００アッセイの結果を示す。アッセイ番号１は、２０μｇ／ｍｌにおけるものであり；２及び３は５０μｇ／ｍｌであり；そして４ないし８は２５μｇ／ｍｌである。レトロ反転型ＺＥｌａｎ１４６の結果は、ＨＡＸ４２断片ＺＥｌａｎ０９１と比較して妥当な結合を示し、そしてＧＩＴ標的剤の活性は、これがレトロ反転型に転換されても排除されないことを示した。
【００４０】
【表２】
0004566406.tif 000003
【００４１】
ＫD値、即ちＣａｃｏ−２のＰ１００画分に対する最大結合の半分に達するために必要なペプチドの濃度を、ＺＥｌａｎ０２１即ちＨＡＸ４２［Ｋ（ｄｎｓ）−ＳＤＨＡＬＧＴＮＬＲＳＤＮＡＫＥＰＧＤＹＮＣＣＧＮＧＮＳＴＧＲＫＶＦＮＲＲＲＰＳＡＩＰＴ］の全長、ＨＡＸ４２の断片ＺＥｌａｎ０９１、及びこの断片のレトロ反転型ＺＥｌａｎ１４６、並びにＺＥｌａｎ０１８即ちＰＡＸ２［Ｋ（ｄｎｓ）−ＳＴＰＰＳＲＥＡＹＳＲＰＹＳＶＤＳＤＳＤＴＮＡＫＨＳＳＨＮＲＲＬＲＴＲＳＲＰＮＧ］の全長、ＰＡＸ２の断片ＺＥｌａｎ１２９、及びこの断片のレトロ反転型ＺＥｌａｎ１４４について、表３に示す。
【００４２】
【表３】
0004566406.tif 000004
【００４３】
ペプチドで被覆されたインスリン充填ＰＬＧＡ粒子の製造及び分析
インスリンを充填されたＰＬＧＡ粒子を、先に引用したＷＯ９８／５１３２５に記載されているコアセルベーション法によって、本発明によるレトロ反転されたペプチド又はＧＩＴ標的剤で被覆する。特に、活性剤を含む固体粒子は、ポリマーから形成され、そして約１０ｎｍないし約５００μｍ、最も好ましくは５０ないし８００ｎｍの粒子の大きさを有する。更に、粒子は、以下に概略記載されるような、及び先に引用したＷＯ９８／５１３２５に記載されているような多くの方法を使用して粒子中に組み込まれた標的化するレトロ反転されたペプチドを含む。
【００４４】
以下に示した一般的方法の、有機相（Ｂ）のポリマーは、可溶性、透過性、非透過性、生分解可能又は胃保持性であってもよい。ポリマーは、ポリマー又は共重合体の混合物からなることができ、そして天然又は合成のポリマーであることができる。代表的な生分解可能なポリマーは、制限するものではないが、ポリグリコリド；ポリラクチド；ＤＬ、Ｌ及びＤ型を含むポリ（ラクチド−コ−グリコリド）；コポリオキサラート；ポリカプロラクトン；ポリエステルアミド；ポリオルトエステル；ポリアンヒドリド；ポリアルキルシアノアクリラート；ポリヒドロキシブチラート；ポリウレタン；アルブミン；カゼイン；シトサン誘導体；ゼラチン；アカシア；セルロース；ポリサッカリド；アルギン酸；ポリペプチド；等、これらの共重合体、これらの混合物並びにこれらの立体異性体を含む。代表的な合成ポリマーは、アルキルセルロース；ヒドロキシアルキルセルロース；セルロースエーテル；セルロースエステル；ニトロセルロース；アクリル酸及びメタクリル酸のポリマー並びにこれらのエステル；デキストラン；ポリアミド；ポリカーボナート；ポリアルキレン；ポリアルキレングリコール；ポリアルキレンオキシド；ポリアルキレンテレフタラート；ポリビニルアルコール；ポリビニルエーテル；ポリビニルエステル；ポリハロゲン化ビニル；ポリビニルピロリドン；ポリシロキサン及びポリウレタン並びにこれらの共重合体を含む。
【００４５】
典型的には、粒子は、以下の一般的な方法を使用して形成される：
ポリマー、表面活性剤、表面安定若しくは改良剤又は塩、或いは界面活性剤、好ましくは５０−１００％の加水分解％及び５００−５００，０００の範囲の分子量、最も好ましくは８０−１００％の加水分解及び１０，０００−１５０，０００の分子量を持つ、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）又は誘導体の水溶液（Ａ）を、容器に導入する。混合物（Ａ）を低い剪断力下で１０−２０００ｒｐｍ、好ましくは１００−６００ｒｐｍで撹拌する。この溶液のｐＨ及び／又はイオン強度は、塩、緩衝液又は他の改良剤を使用して改変することができる。この溶液の粘度は、ポリマー、塩又は他の粘度向上若しくは改良剤を使用して改変することができる。
【００４６】
標的リガンドを含む、ポリマー、好ましくはポリ（ラクチド−コ−グリコリド）、ポリラクチド、ポリグリコリド又はこれらの組み合わせ或いはこれらのポリマーのいかなる鏡像異性体又は共有結合複合体を、水混和性の有機溶媒に溶解して、有機相（Ｂ）を形成する。最も好ましくは、アセトン及びエタノールの組み合わせを、使用するポリマーによるが、０：１００のアセトン：エタノールないし１００：０のアセトン：エタノールの比の範囲で使用する。
【００４７】
付加的なポリマー、ペプチド、糖、塩、天然／生物学的ポリマー又は他の薬剤を、有機相（Ｂ）に更に加えて、得られる粒子産物の物理的及び化学的特性を改良することができる。
【００４８】
薬剤又は生理活性物質を、水性相（Ａ）又は有機相（Ｂ）のいずれかに導入することができる。標的化するレトロ転換されたペプチド又はＧＩＴ標的剤も、更に水性相（Ａ）又は有機相（Ｂ）のいずれかに、この時点で導入することができる。
【００４９】
有機相（Ｂ）を、撹拌された水性相（Ａ）に連続した速さで加える。溶媒を、好ましくは温度を周囲より上昇する及び／又は真空ポンプを使用することによって蒸発する。粒子は、このとき懸濁液（Ｃ）として存在する。標的化するレトロ転換されたペプチド又はＧＩＴ標的剤を、撹拌された懸濁液中にこの時点で導入することができる。
【００５０】
ポリマー、ペプチド、糖、塩、天然／生物学的ポリマー又は他の薬剤の第２の層を、先に形成された粒子の核にこの段階で、いかなる適当な方法によっても沈積することができる。
【００５１】
次いで粒子（Ｄ）を、標準的なコロイド分離技術を使用して、好ましくは高“ｇ”力の遠心、濾過、十字流濾過、ゲル透過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー又は電荷分離技術によって、懸濁液（Ｃ）から分離する。上清を捨て、そして粒子（Ｄ）を、洗浄溶液（Ｅ）、好ましくは水、塩溶液、緩衝液又は有機溶媒に再懸濁する。粒子（Ｄ）を、先に記載したと同様な方法で洗浄液から分離し、そして通常２回再洗浄する。標的リガンドは、最初、中間及び／又は最後の洗浄段階で洗浄溶液（Ｅ）に溶解してもよく、そして粒子（Ｄ）の洗浄に使用することができる。
【００５２】
次いで粒子は、乾燥してもよい。次いで粒子は更に加工、例えば錠剤化、カプセル化又は噴霧乾燥することができる。
上記で形成した粒子の放出特性は、使用及び／又は所望の処方によって、即時から制御又は遅延放出まで変化させることができる。
【００５３】
薬物の充填は、０−９０重量／重量％の範囲であることができる。標的化するレトロ転換されたペプチド又はＧＩＴ標的剤の充填は、０−９０重量／重量％に範囲であることができる。
【００５４】
インスリンを充填されたＰＬＧＡ（ＲＧ５０４Ｈ）ナノ粒子を、次の標的リガンドについて、先に示したように製造した：ＨＡＸ４２の全長（ＺＥｌａｎ０２１）、ＰＡＸ２の全長（ＺＥｌａｎ０１８）、ＨＡＸ４２断片のＺＥｌａｎ０９１、ＰＡＸ２断片のＺＥｌａｎ１２９、ＨＡＸ４２断片のレトロ反転ペプチドＺＥｌａｎ１４６及びＰＡＸ２断片のレトロ反転ペプチドＺＥｌａｎ１４４。ウシインスリンの効力（ＨＰＬＣ）及びペプチド充填（ダンシル蛍光）を評価してから、オープンループモデルを使用したＷｉｓｔａｒラットのインスリン運搬を分析した。表４は、ＰＬＧＡ粒子のインスリン効力及び標的化するペプチドの充填を示す。
【００５５】
【表４】
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【００５６】
動物における研究
各種の標的化するレトロ転換されたペプチドの、経口インスリンの生物学的利用能のｉｎ  ｖｉｖｏの評価を、オープンループ研究を使用して行い、先に記載した（表４）ナノ粒子を含む試験溶液を、先に引用したＷＯ９８／５１３２５に記載されているプロトコールと同様に、Ｗｉｓｔａｒラットの回腸に直接注射した。要約すれば、Ｗｉｓｔａｒラット（３００−３５０ｇ）を４時間絶食させ、そして試験溶液の投与の１５ないし２０分前に、ケタミン溶液［０．５２５ｍｌのケタミン（１００ｍｇ／ｍｌ）及び０．８７５ｍｌのアセトプロマジンマレイン酸塩−ＢＰ  ＡＣＰ（２ｍｇ／ｍｌ）］を筋内投与することによって麻酔をかけた。次いでラットに、幽門の２−３ｃｍ下の十二指腸内に試験溶液（注射体積：１．５ｍｌ  ＰＢＳ）を注射した。インスリン（速効性ウシ；２８．１ｉｕ／ｍｇ）を、合計３００ｉｕのインスリンとなるように先に記載したように粒子中に組み込んだ（約２１０ｍｇの粒子）。ラットの血液グルコース値を、Ｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒ（商標）（Ｂａｙｅｒ；０．１ないし３３．３ｍ／ｍｏｌ／Ｌ）を使用して測定し；血漿インスリン値は、Ｐｈａｄｅｓｅｐｈ  ＲＩＡキット（商標）（Ｕｐｊｏｈｎ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ；３ないし２４０μＵ／ｍｌ−二系列分析）を使用して測定した。全身系及び門脈血液を試料として採取した。
【００５７】
研究グループは、表４に示した以下のペプチドで被覆された粒子を含む試験溶液を受けたラットを含んでいた。対照グループは：１）ＰＢＳ対照（１．５ｍｌ）オープンループ；２）インスリン溶液（１ｉｕ／０．２ｍｌ）皮下；３）ペプチドを含まないインスリン粒子、を含んでいた。
【００５８】
表５は、投与された経口投与量の、インスリンの参照皮下投与量と比較した生物学的利用能の％で表記された、先に記載したインスリンを充填したナノ粒子（表面は標的化するレトロ反転されたペプチド又はＧＩＴ標的剤で改変されている）のインスリンの生物学的利用能を示す。図１及び図２は、対照（ＰＢＳ）；ＺＥｌａｎ０２１で被覆したインスリンを含む粒子、ＺＥｌａｎ０１８で被覆したインスリンを含む粒子、ＺＥｌａｎ０９１で被覆したインスリンを含む粒子、ＺＥｌａｎ１２９で被覆したインスリンを含む粒子及び本発明によるＺＥｌａｎ１４４で被覆したインスリンを含む粒子（インスリン充填３００ｉｕ）の腸管投与に続く、（１）全身系血液グルコース濃度及び（２）インスリン濃度を示す。
【００５９】
【表５】
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【００６０】
本発明は、本明細書中に記載された特定の態様の範囲に制限されるものではない。実際に、本明細書中に記載されているものに加えて、本発明の各種の改変は、前記の説明及び付属する図から、当業者にとって明白となるであろう。このような改変は、本発明の特許請求の範囲に入ることを意図している。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、対照（ＰＢＳ）；ＺＥｌａｎ０２１で被覆したインスリンを含む粒子、ＺＥｌａｎ０１８で被覆したインスリンを含む粒子、ＺＥｌａｎ０９１で被覆したインスリンを含む粒子、ＺＥｌａｎ１２９で被覆したインスリンを含む粒子及び本発明によるＺＥｌａｎ１４４で被覆したインスリンを含む粒子（インスリン３００ｉｕを充填している）の腸管投与に続く全身系血液のグルコース濃度を示す；そして
【図２】  図２は、対照、ＺＥｌａｎ０２１で被覆したインスリンを含む粒子、ＺＥｌａｎ０１８で被覆したインスリンを含む粒子、ＺＥｌａｎ０９１で被覆したインスリンを含む粒子、ＺＥｌａｎ１２９で被覆したインスリンを含む粒子及び本発明によるＺＥｌａｎ１４４で被覆したインスリンを含む粒子（インスリン３００ｉｕを充填している）の腸管投与に続く全身系のインスリン濃度を示す。
【図１】
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【図２】
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