(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板を備えた細胞電気生理センサ用チップであって、
前記基板は、その上面から下面までを貫く貫通孔を有し、
この貫通孔の内壁と前記基板の表面とは湾曲面で繋がっている、細胞電気生理センサ用チップ。
【請求項２】
前記基板上には酸化物層を有する、請求項１に記載の細胞電気生理センサ用チップ。
【請求項３】
前記貫通孔の内壁は、この貫通孔の内側へ湾曲する曲面で形成され、
前記貫通孔の内径は、この貫通孔の内部から前記貫通孔の開口部に向けて徐々に大きくなるように形成された、請求項１に記載の細胞電気生理センサ用チップ。
【請求項４】
前記貫通孔の内径は、この貫通孔の深さ方向における中心点で最小となり、
この中心点から前記貫通孔の開口部に向けて徐々に大きくなるように形成された、請求項１に記載の細胞電気生理センサ用チップ。
【請求項５】
前記貫通孔の開口部の表面および内壁は、二乗平均粗さＲｑ＝１．０ｎｍ以下とした、請求項１に記載の細胞電気生理センサ用チップ。
【請求項６】
前記貫通孔の開口部外周は、外方に向けて滑らかに盛り上がる隆起部を有する、請求項１に記載の細胞電気生理センサ用チップ。
【請求項７】
前記貫通孔の開口部外周は、外方に向けて滑らかに盛り上がる隆起部を有し、
前記基板上において、前記隆起部の最外周から前記貫通孔の開口部の中心までの距離が、検体となる細胞の半径より短い、請求項１に記載の細胞電気生理センサ用チップ。
【請求項８】
基板の表面は、絶縁層で被覆されている、請求項１に記載の細胞電気生理センサ用チップ。
【請求項９】
基板の表面は、酸化シリコン、窒化シリコン、またはそれらの混合物からなる絶縁層で被覆されている、請求項１に記載の細胞電気生理センサ用チップ。
【請求項１０】
前記基板はシリコンからなる、請求項１に記載の細胞電気生理センサ用チップ。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか一つに記載の細胞電気生理センサ用チップと、
前記細胞電気生理センサ用チップの基板の上方および下方にそれぞれ配置された電極槽と、
これらの電極槽に入れられる液体と電気的に接続される電極とを備えた、細胞電気生理センサ。
【請求項１２】
基板を備えた細胞電気生理センサ用チップであって、
前記基板は、この基板の第一の面に形成された凹部と、
この凹部から前記基板の第一の面と対向する第二の面に向けて形成された貫通孔とを有し、
前記基板の第一の面と前記凹部の内壁、この凹部の内壁と前記貫通孔の内壁、およびこの貫通孔の内壁と前記基板の第二の面とは、それぞれ湾曲面で繋がっている、細胞電気生理センサ用チップ。
【請求項１３】
前記凹部は、前記貫通孔開口部を中心に外方へ広がり、前記基板の第一の面と繋がる湾曲面で形成されている、請求項１２に記載の細胞電気生理センサ用チップ。
【請求項１４】
前記凹部は半球形状である、請求項１２に記載の細胞電気生理センサ用チップ。
【請求項１５】
前記凹部は円錐形状である、請求項１２に記載の細胞電気生理センサ用チップ。
【請求項１６】
前記基板の第二の面には酸化物層を有する、請求項１２に記載の細胞電気生理センサ用チップ。
【請求項１７】
前記貫通孔の内壁は、この貫通孔の内側へ湾曲する曲面で形成され、
前記貫通孔の内径は、この貫通孔の内部から前記貫通孔の開口部に向けて徐々に大きくなるように形成された、請求項１２に記載の細胞電気生理センサ用チップ。
【請求項１８】
前記貫通孔の内径は、この貫通孔の深さ方向における中心点で最小となり、
この中心点から前記貫通孔の開口部に向けて徐々に大きくなるように形成された、請求項１２に記載の細胞電気生理センサ用チップ。
【請求項１９】
前記貫通孔の開口部の表面および内壁と、前記凹部の内壁は、二乗平均粗さＲｑ＝１．０ｎｍ以下とした、請求項１２に記載の細胞電気生理センサ用チップ。
【請求項２０】
前記貫通孔の開口部外周は、外方に向けて滑らかに盛り上がる隆起部を有する、請求項１２に記載の細胞電気生理センサ用チップ。
【請求項２１】
前記貫通孔の開口部外周は、外方に向けて滑らかに盛り上がる隆起部を有し、
前記基板上において、前記隆起部の最外周から前記貫通孔の開口部の中心までの距離が、検体となる細胞の半径より短い、請求項１２に記載の細胞電気生理センサ用チップ。
【請求項２２】
基板の表面は絶縁層で被覆されている、請求項１２に記載の細胞電気生理センサ用チップ。
【請求項２３】
基板の表面は、酸化シリコン、窒化シリコン、またはそれらの混合物からなる絶縁層で被覆されている、請求項１２に記載の細胞電気生理センサ用チップ。
【請求項２４】
前記基板はシリコンからなる、請求項１２に記載の細胞電気生理センサ用チップ。
【請求項２５】
請求項１２から２４のいずれか一つに記載の細胞電気生理センサ用チップと、
前記細胞電気生理センサ用チップの基板の上方および下方にそれぞれ配置された電極槽と、
これらの電極槽に入れられる液体と電気的に接続される電極とを備えた、細胞電気生理センサ。
【請求項２６】
基板の上面からドライエッチングによって貫通孔を形成するステップと、
この基板を減圧した希ガスまたは水素ガスまたは窒素ガス雰囲気下で加熱するステップと、
前記基板の上面および下面から前記貫通孔の内側へ湾曲した曲面を形成するステップを有する、細胞電気生理センサ用チップの製造方法。
【請求項２７】
前記基板としてシリコンを用い、
この基板を加熱するステップにおいて、
前記希ガスまたは水素ガスまたは窒素ガス雰囲気の圧力を２７ｋＰａ以下とし、
加熱温度を、１０００℃以上で、シリコンの融点以下とする、請求項２６に記載の細胞電気生理センサ用チップの製造方法。
【請求項２８】
基板の上面からドライエッチングによって貫通孔を形成するステップと、
前記基板の両面から気相法による成膜を行うステップと、
前記基板の上面および下面から前記貫通孔の内側へ湾曲した曲面を形成するステップを有する、細胞電気生理センサ用チップの製造方法。
【請求項２９】
ドライエッチングによって基板の第一の面に凹部を形成するステップと、
次にドライエッチングによってこの凹部から前記基板の第二の面までを貫く貫通孔を形成するステップと、
その後減圧した希ガスまたは水素ガスまたは窒素ガス雰囲気下で前記基板を加熱するステップと、
この基板の第一の面から前記凹部開口部の内壁までと、この凹部の内壁から前記貫通孔開口部の内壁までと、この貫通孔の内壁から前記基板の第二の面までとに、湾曲した曲面を形成するステップを有する、細胞電気生理センサ用チップの製造方法。
【請求項３０】
前記基板としてシリコンを用い、
この基板を加熱するステップにおいて、
前記希ガスまたは水素ガスまたは窒素ガス雰囲気の圧力を２７ｋＰａ以下とし、
加熱温度を１０００℃以上でシリコンの融点以下とする、請求項２９に記載の細胞電気生理センサ用チップの製造方法。
【請求項３１】
ドライエッチングによって基板の第一の面に凹部を形成するステップと、
次にドライエッチングによってこの凹部から前記基板の第二の面までを貫く貫通孔を形成するステップと、
その後前記基板の第一の面および第二の面の両側から気相法による成膜を行うステップと、
減圧した希ガスまたは水素ガスまたは窒素ガス雰囲気下で前記基板を加熱するステップと、
この基板の第一の面から前記凹部開口部の内壁までと、この凹部の内壁から前記貫通孔開口部の内壁までと、この貫通孔の内壁から前記基板の第二の面までとに、湾曲した曲面を形成するステップを有する、細胞電気生理センサ用チップの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の電気生理的活動の測定に用いられる細胞電気生理センサに用いるチップとこれを用いた細胞電気生理センサおよび細胞電気生理センサ用チップの製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、細胞膜に存在するイオンチャネルを電気生理学的に測定する方法として、微細加工技術を利用した基板型プローブが注目されている。これは、従来のマイクロピペットのように、個々の細胞にマイクロピペットを挿入するという熟練作業を必要とせず、高スループットの自動化システムに適している。
【０００３】
例えば、図２６に示すように、従来の開示された細胞電気生理センサ１（基板型プローブ）は、基板２と、基板２の上方に配置した電極槽３とを備えている。そして、基板２は、この基板２の上面から下面まで貫通する貫通孔５を有している。
【０００４】
また、電極槽３の内部には第一電極６を配置し、貫通孔５の内部には第二電極７を配置している。さらに、この第二電極７は配線８を経て信号検出部（図示せず）に連結されている。
【０００５】
前記細胞電気生理センサ１の動作方法について以下に説明する。
【０００６】
まず、電極槽３の内部に電解液９および被検体細胞１０が注入され、この被検体細胞１０が貫通孔５の開口部４にトラップ（捕捉）され、保持される。
【０００７】
そして、測定の際には被検体細胞１０は貫通孔５の下方から吸引ポンプなどで吸引され、開口部４に密着した状態で保持される。すなわち、この貫通孔５がマイクロピペットにおける先端穴と同様の役割を果たしている。そして被検体細胞１０のイオンチャネルの機能性や薬理反応などは、第一電極６と第二電極７との間における反応前後の電圧、あるいは電流を測定し、細胞内外の電位差を求めることによって分析している（例えば、特許文献１参照）。
【０００８】
しかしながら、従来の細胞電気生理センサ１においては、貫通孔５に出入りする電解液９の流れが悪く、被検体細胞１０の捕捉率が悪いという問題があった。
【０００９】
それは、貫通孔５は非常に微細なため、電極槽３と貫通孔５との界面で流路の急速な断面積の変化が生じ、流体の抵抗損失が増大するためであった。そしてその結果、被検体細胞１０を的確に吸引することが出来ず、捕捉率が低下してしまうものであった。
【特許文献１】国際公開第０２／０５５６５３号パンフレット
【発明の開示】
【００１０】
本発明は、貫通孔に出入りする電解液を流れやすくし、被検体細胞の捕捉率を向上させるものである。
【００１１】
そのために本発明は、基板の上面から下面までを貫く貫通孔を有し、この貫通孔の内壁と基板の表面とは、湾曲面で繋がっているものとした。
【００１２】
これにより本発明は、貫通孔に出入りする電解液を流れやすくし、被検体細胞の捕捉率を向上させることができる。
【００１３】
それは、貫通孔の開口部を基板表面と滑らかに繋がる湾曲面で形成にしたことによって、電極槽から貫通孔の内部にかけての流路の断面積の変化が緩慢となり、流体の抵抗損失が低減されるためである。そしてその結果、貫通孔に出入りする電解液が流れやすくなり、被検体細胞を的確に吸引し、捕捉率を向上させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
（実施の形態１）
以下、本発明の実施の形態１における細胞電気生理センサについて、図面を参照しながら説明する。図１は実施の形態１における細胞電気生理センサの断面図であり、図２はそれに用いる基板の断面図であり、図３は細胞電気生理センサの動作を示す要部拡大断面図であり、図４は基板の斜視図である。
【００１５】
なお、以下に説明する各実施の形態において、上方向とは図１に記載の矢印Ｘ方向を言うものとする。
【００１６】
図１に示すように、本実施の形態１における細胞電気生理センサ１１は、基板１２を備えたチップ３６と、基板１２の上方に配置した第一電極槽１３と、この第一電極槽１３の内部であって、基板１２の上面に配置した第一電極１４と、基板１２の下方に配置した第二電極槽１５と、この第二電極槽１５の内部であって基板１２の下面に配置した第二電極１６とを備えており、基板１２は上面から下面に向けて形成された貫通孔１７を有している。
【００１７】
そして、図１の点線で囲った部分Ｙを拡大した図が図２であり、この図２に示すように、開口部１７Ａ、１７Ｂは、基板１２の上面および下面から貫通孔１７の内側に向かって湾曲し、貫通孔１７の内部へと繋がる滑らかな曲面で形成されている。
【００１８】
また貫通孔１７の内壁は、この貫通孔１７の内側へ湾曲し、且つこの貫通孔１７の深さ方向における略中心点で突出する滑らかな曲面で形成されている。
【００１９】
すなわち、この貫通孔１７の口径は、貫通孔１７の深さ方向における中心点あるいは略中心点で最小内径となり、開口部１７Ａ、１７Ｂに向けて徐々に大きくなっている。
【００２０】
また、本実施の形態では、開口部１７Ａ、１７Ｂの外周は、基板１２表面において滑らかに盛り上がる隆起部１８Ａ、１８Ｂを有している。そして図３の断面図に示すように、この隆起部１８Ａは、前記基板１２の上において、隆起部１８Ａの最外周から開口部１７Ａの中心までの距離ｒ１が、被検体細胞１９の半径より短いものとした。
【００２１】
なお、本実施の形態では、開口部１７Ａ、１７Ｂ、貫通孔１７の内壁、および隆起部１８Ａ、１８Ｂの各表面形状は、二乗平均粗さＲｑ＝１．０ｎｍ以下の滑らかさである。この二乗平均粗さＲｑは、表面粗さの分布を測定した際の、平均値から測定値までの偏差の二乗を平均した値の平方根で定義される。また、被検体細胞１９の半径とは、被検体細胞１９を生理食塩水に含浸させ、細胞内外の浸透圧が平衡となった状態での計測値を用いた。
【００２２】
なお、チップ３６の基板１２としてシリコン基板１２を用い、図４に示すように、この基板１２には複数の貫通孔１７を形成している。この貫通孔１７内部の最小内径は３μｍとした。
【００２３】
なお、貫通孔１７の内径は測定する細胞の大きさ、形状、性質によって決定することができる。例えば、被検体細胞１９の大きさが５〜５０μｍ程度の場合に、被検体細胞１９と開口部１７Ａとの密着性を高めるため、貫通孔１７の最小内径を３μｍ以下とすることが望ましい。また貫通孔１７の深さは１５μｍ以下とした。
【００２４】
次に、本発明の細胞電気生理センサ１１の動作について説明する。
【００２５】
まず図３に示すように、第一電極槽１３に被検体細胞１９を含んだ第一電解液２０（細胞外液）を満たし、第二電極槽１５には第二電解液２１（細胞内液）を満たしておく。そして基板１２の上面から加圧するか、下面を減圧することによって、被検体細胞１９と第一電解液２０とを貫通孔１７へ引き込む。すると、被検体細胞１９は貫通孔１７を塞ぐように保持される。
【００２６】
そして、本実施の形態１では、被検体細胞１９として哺乳類筋細胞を用い、第一電解液２０にはＫ＋イオンが１５５ｍＭ程度、Ｎａ＋イオンが１２ｍＭ程度、Ｃｌ−イオンが４．２ｍＭ程度添加された電解液を用い、第二電解液２１には、Ｋ＋イオンが４ｍＭ程度、Ｎａ＋イオンが１４５ｍＭ程度、Ｃｌ−イオンが１２３ｍＭ程度添加された電解液を用いた。なお、第一電解液２０と第二電解液２１とは同組成のものを用いることもできる。
【００２７】
次に、基板１２の下面側から吸引するか、もしくは基板１２下方から薬剤（例えばナイスタチン）を投入することにより、被検体細胞１９に微細小孔を形成する。
【００２８】
その後、被検体細胞１９への刺激となりうる行為を基板１２の上方から施す。この刺激の種類としては、例えば化学薬品、毒物などの化学的な刺激に加え、機械的変位、光、熱、電気、電磁波などの物理的な刺激なども含む。
【００２９】
そして、被検体細胞１９がこれらの刺激に対して活発に反応する場合、例えば被検体細胞１９は細胞膜が保有するチャネルを通じて各種イオンを放出あるいは吸収する。これにより、細胞内外の電位勾配が変化するため、図１に示す第一電極１４と第二電極１６によってその変化を検出し、細胞の薬理反応などを検討することができる。
【００３０】
次に、本発明の実施の形態１における細胞電気生理センサ１１の製造方法について図面を用いて説明する。図５〜図９は細胞電気生理センサ１１の基板１２の製造方法を説明するための断面図、図１０は同斜視図である。
【００３１】
まず、図５に示すように、シリコンからなる基板１２の上面にレジストマスク２２を形成する。このとき、所望する貫通孔１７の断面と略同形状のマスクホール２３をパターニングしておく。
【００３２】
次に、基板１２をエッチングして貫通孔（図２の１７）を形成していく。このときのエッチング方法としては、高精度な微細加工が可能なドライエッチングが望ましい。そしてドライエッチングを行う場合、アスペクト比の高い貫通孔１７を形成するために、エッチングを促進するガス（以下エッチングガスという）とエッチングを抑制するガス（以下抑制ガスという）とを交互に用いる。
【００３３】
本実施の形態１では、エッチングガスとしてＳＦ６、抑制ガスとしてＣ４Ｆ８を用いた。
【００３４】
このドライエッチング工程について以下に詳述する。
【００３５】
まず、図６Ａの基板１２の上方において、外部コイルの誘導結合法によりプラズマを生成し、ここへエッチングガスとしてＳＦ６を導入するとＦラジカルを生成し、Ｆラジカルが基板１２と反応して基板１２は化学的にエッチングされる。
【００３６】
この時、基板１２に高周波を印加すると、基板１２にはマイナスのバイアス電圧が発生する。すると、エッチングガスに含まれるプラスイオン（ＳＦ５＋）が基板１２に向かって垂直に衝突し、このイオン衝撃によって基板１２が物理的にエッチングされる。
【００３７】
その結果、図６Ｂに示すように、ドライエッチングは基板１２の垂直方向（下方）に進むことになる。
【００３８】
一方、抑制ガスＣ４Ｆ８を用いる際には、基板１２に高周波を加えないでおく。そうすることによって、基板１２にはバイアス電圧は全く発生しない。
【００３９】
従って、抑制ガスＣ４Ｆ８に含まれるＣＦ＋は、偏向を受けることなく、基板１２のドライエッチング穴の壁面に付着し、均一な膜を形成する。
【００４０】
そして、このＣＦ＋の膜は、保護膜となってエッチングを抑制する。ここで、この保護膜は貫通孔１７の壁面部分だけでなく底面にも形成されるが、底面に形成された保護膜は、壁面に形成された保護膜に比較して、前記イオン衝撃により容易に除去されるため、エッチングは下方に進むことになる。ただし底面の保護膜が除去された部分の下方は、エッチングが下方向だけでなく横方向へも等方的に進行するため、図６Ｃのように貫通孔１７の壁面は、凹凸が形成されている。
【００４１】
そして、前記のようにエッチングガスと抑制ガスとを交互に用いることによって、図６Ｄのように、電解液の流れ方向に垂直な凹凸を有する貫通孔１７が形成される。そして貫通孔１７の内壁と、基板１２表面との境界は鋭い角部となっている。
【００４２】
図７はこの貫通孔１７の凹凸を省略した基板１２の断面図である。なお、エッチングガスとしてはその他にＣＦ４、抑制ガスとしてはその他にＣＨＦ３を用いることもできる。
【００４３】
その後、図８に示すようにレジストマスク２２を除去し、この基板１２を減圧した希ガス、または水素ガスまたは窒素ガス雰囲気下において、１０００℃以上で加熱（アニール）する。
【００４４】
すると、図９に示すように開口部１７Ａ、１７Ｂと基板１２表面との角部が丸みを帯びていく。
【００４５】
また、例えば加熱温度を上げたり加熱条件を延長したりすることによって、角部が丸くなるだけでなく、図２に示したように貫通孔１７の開口部１７Ａ、１７Ｂの周辺には、基板１２の表面上において滑らかに盛り上がる隆起部１８Ａ、１８Ｂが形成される。
【００４６】
これらの現象は、シリコン原子の表面自己拡散現象により説明することができる。
【００４７】
すなわち、表面原子の化学ポテンシャルは、物質の表面曲率に比例することが知られており、この効果はＧｉｂｂｓ−Ｔｈｏｍｓｏｎ効果と呼ばれる。
【００４８】
本効果によると、図８に示した状態では、貫通孔１７の開口部１７Ａ、１７Ｂと基板１２の表面との境界には明確な角部を有することから、開口部１７Ａ、１７Ｂの周辺の各シリコン原子は化学ポテンシャルが高い状態で存在している。
【００４９】
従って、この状態でシリコン原子が表面拡散するのに十分なエネルギーを与えた場合、化学ポテンシャルの勾配が低くなる方へ表面自己拡散現象が誘発され、その結果、図９に示したように貫通孔１７の開口部１７Ａ、１７Ｂと基板１２の表面との境界は、丸みを帯びた滑らかな湾曲面で繋がることになる。
【００５０】
また、この表面自己拡散反応が進むと、図２に示したように貫通孔１７の開口部１７Ａ、１７Ｂの周辺には基板１２の表面において、滑らかに盛り上がる隆起部１８Ａ、１８Ｂが形成される。この原因としては、湾曲面の曲率は小さい方が安定であるためであり、基板１２の表面から貫通孔１７にかけて、全体ができるだけ緩やかなカーブを描くように拡散が進行するためと考えられる。
【００５１】
このとき、ガスとしてヘリウム、ネオン、アルゴン、クリプトン、キセノン、水素、窒素のいずれか一つ、またはこれらの混合物を用いることができる。なお、実験により、特に水素を用いた際には、その圧力に応じて拡散速度を大きく変動させ得ることが分かっており、高精度に拡散を制御できるといった生産面での効果が得られる。なお、不活性ガス雰囲気の圧力は、２７ｋＰａ以下に制御されることが望ましい。このことにより、所望の形状を高速で実現することが可能となる。
【００５２】
また、基板１２にシリコンを用いた場合、シリコンの表面自己拡散現象を引き起こすエネルギーを得るために、１０００℃以上でアニールする必要がある。
【００５３】
なお、このような表面自己拡散現象は、アニール条件（不活性ガスの種類やアニール温度）を変更すれば、ＳｉＯ２などのシリコン以外の材料でも見られ、これらの材料を基板１２の材料として用いることもできる。
【００５４】
また、加熱（アニール）を用いない方法として、基板１２の上面、下面から順次、例えば化学気相析出法（ＣＶＤ法）などによって、シリコンまたはシリコン以外の材料を成膜することで同様の形状が得られる。このような手法を用いた際には、シリコン以外の様々な材料を選択することが可能であり、細胞と基板１２の相性を考慮した構成とすることができる。
【００５５】
本実施の形態１における細胞電気生理センサの効果を以下に説明する。
【００５６】
本実施の形態１における細胞電気生理センサ１１は、貫通孔１７に出入りする電解液（第一電解液２０および第二電解液２１）を流れやすくし、被検体細胞１９の捕捉率を向上させることができる。この理由を以下に説明する。
【００５７】
すなわち、流路の断面積が急激に変化すると、渦が発生したり、逆流したりして流体の抵抗損失が大きくなり、電解液（第一電解液２０および第二電解液２１）の流れが阻害される。
【００５８】
一方、本発明は、貫通孔１７の開口部１７Ａ、１７Ｂおよび貫通孔１７の内壁が、上述のように基板１２の表面から貫通孔１７の内部に向けて、貫通孔１７の内側に湾曲する滑らかな曲面で構成されている。これによって、第一電極槽１３から貫通孔１７の内部へ、さらにこの貫通孔１７の内部から第二電極槽１５へと、流路の断面積変化を緩慢にすることができ、流体の抵抗損失が低減されるのである。そしてその結果、貫通孔に出入りする電解液（第一電解液２０および第二電解液２１）が流れやすくなり、被検体細胞１９を的確に吸引し、開口部１７Ａへの捕捉率を向上させることができるのである。
【００５９】
また、貫通孔１７の開口部１７Ａ、１７Ｂおよび貫通孔１７の内壁を二乗平均粗さＲｑ＝１．０ｎｍ以下の平滑な面としたため、電解液（第一電解液２０および第二電解液２１）の摩擦抵抗が低減され、さらに流れやすくすることができる。
【００６０】
また、貫通孔１７の内部の気泡を低減することによって、細胞電気生理センサ１１の測定誤差を抑制することができる。
【００６１】
すなわち、従来は微細な貫通孔１７を形成すると、この貫通孔１７の内壁に凹凸ができるため、貫通孔１７の内部に気泡が発生しやすく、この気泡によって抵抗値が変動し、測定誤差を招来していた。またこの気泡が貫通孔１７を完全に塞いでしまうと、第一電極槽１３と第二電極槽１５とが完全に絶縁されてしまい、測定が実質不可能になっていた。
【００６２】
一方、本実施の形態１では、アニール処理によってこの凹凸を取り除き、二乗平均粗さＲｑ＝１．０ｎｍ以下の平滑な面としたため、気泡の発生を抑制することができる。また、僅かに発生した気泡も、電解液（第一電解液２０および第二電解液２１）の円滑な流れに伴って移動させ、除去することができる。
【００６３】
さらに、前記貫通孔１７の内壁は、貫通孔１７の内側へ湾曲し、貫通孔１７の略中心点で突出する曲面で構成されており、貫通孔１７の内径は貫通孔１７の中心点から貫通孔１７の開口部１７Ａ、１７Ｂに向かって徐々に大きくなる構造をしている。
【００６４】
よって、貫通孔１７の中心点で流速が最大となり、その水圧で気泡を押し流すことができる。ここで気泡は貫通孔１７の内部へ行くほど除去し難いことから、この構造は気泡低減を実現する為に非常に有用である。
【００６５】
また、基板１２の下面における貫通孔１７の開口部１７Ｂの周辺に隆起部１８Ｂを形成したことによって、測定誤差を低減することができる。この要因としては、貫通孔１７から押し流した気泡が基板１２の下面に付着すると、抵抗成分の増大により測定誤差を招来するが、隆起部１８Ｂを設けることによって、気泡を隆起部１８Ｂの斜面に沿って第二電極槽１５へと放出することができるためと考えられる。
【００６６】
さらに、開口部１７Ａの湾曲面に沿って被検体細胞が捕捉されるため、被検体細胞１９と貫通孔１７の開口部１７Ａとの密着性を高めるとともに、その密着状態を維持しやすくなり、細胞電気生理センサ１１の測定精度を向上させることができる。
【００６７】
それは、貫通孔１７の開口部１７Ａが二乗平均粗さＲｑ＝１．０ｎｍ以下の平滑な面で形成されていることと、基板１２の上面において同じく二乗平均粗さＲｑ＝１．０ｎｍ以下の滑らかな隆起部１８Ａを有することに由来する。
【００６８】
このような表面形状によって、被検体細胞１９と貫通孔１７の開口部１７Ａとの密着性が増大し、高いシール性を得ることができる。そして前記隆起部１８Ａによって被検体細胞１９と開口部１７Ａとの接触面積を増大させることができる。さらに隆起部１８Ａの最外周から前記貫通孔１７の開口部１７Ａの中心までの距離ｒ１を、被検体細胞１９の半径より短くすることによって、この開口部１７Ａと被検体細胞１９との接触面積をより増大させることができる。
【００６９】
そしてその結果、的確に被検体細胞１９を開口部１７Ａに密着保持することができ、細胞電気生理センサ１１の測定精度を向上させることができる。
【００７０】
なお、本実施の形態１では基板１２の上面に隆起部１８Ａ、下面に隆起部１８Ｂを形成したが、図９の断面図および図１０の斜視図に示すように、隆起部１８Ａおよび１８Ｂのいずれをも形成しない場合でも、開口部１７Ａ、１７Ｂを基板１２表面と繋がる湾曲面で形成したことにより、電解液が流れやすくなり、また気泡の存在を低減し、さらに細胞と貫通孔１７の開口部１７Ａとの密着性を向上させる効果を有する。
【００７１】
（実施の形態２）
以下、本発明の実施の形態２における細胞電気生理センサについて、図面を参照しながら説明する。図１１は実施の形態２における細胞電気生理センサ用チップの基板の断面図である。
【００７２】
本実施の形態２における細胞電気生理センサに用いる基板１２の構成は、図１１に示すように基板１２の両面と貫通孔１７の内壁表面を絶縁層２４で被覆したものである。
【００７３】
このような構成とすることにより、被検体細胞１９を貫通孔１７の開口部１７Ａに密着保持した際、第一電極槽１３と第二電極槽１５とを、被検体細胞１９を通る経路を除いて電気的に確実に絶縁することができる。
【００７４】
また、絶縁層２４として酸化シリコン、窒化シリコンのような親水性の高い材料を用いた場合、被検体細胞１９も水酸基を含んだ親水性の表面を有していることから、この被検体細胞１９を開口部１７Ａに高い密着性をもって保持することができる。
【００７５】
さらに、電解液（第一電解液２０及び第二電解液２１）との接触する部分の親水性が高まることにより、気泡の発生を効果的に抑制することが可能となる。
【００７６】
また、基板１２としてシリコン基板１２を用いた際には、前述の酸化シリコンや窒化シリコンからなる絶縁層２４を、酸化処理および窒化処理により容易に作製でき、生産性向上の効果も同時に得られる。
【００７７】
（実施の形態３）
本実施の形態３と実施の形態１との違いは、図１２のチップ３６の断面図に示すように、予め基板１２の片面に酸化物層２５となる酸化シリコン層を積層している点である。
【００７８】
すなわち本実施の形態３では、図１３に示すように、酸化物層２５をシリコン層２６で挟んだブロック２７に、孔のあいたレジストマスク２８を形成し、図１４に示すように、基板１２となるシリコン層２６側からドライエッチングにより貫通孔１７を形成する。図１３、図１４において、二層のシリコン層２６のうちの上側のシリコン層２６が、図１２に示す基板１２となる。
【００７９】
この時、シリコン層２６より酸化物層２５（酸化シリコン）の方がエッチングレートが小さいため、シリコン層２６をエッチングしていくと、酸化物層２５でエッチングがストップし、貫通孔１７の深さおよび基板１２（図１２の基板１２）の厚みを高精度に管理することができる。
【００８０】
次に、ドライエッチングによって、酸化物層２５の貫通孔１７と対応する位置にホール３０（図１２のホール３０）を形成する。酸化物層２５のエッチングに適したガスとしては、ＣＦ４などがある。
【００８１】
そしてその後、図１５に示すように、シリコン層２６にレジストマスク２９を形成し、シリコン層２６をエッチングする。
【００８２】
そして、最後に希ガスや窒素ガス、水素ガス雰囲気下で基板１２を加熱するか、あるいは基板１２の両面から気相法によって成膜することにより、図１２のチップ３６が形成される。
【００８３】
なお、この酸化物層２５は、基板１２の上面、すなわち、被検体細胞を捕捉する側の面に配置してもよく、基板１２の下面に配置してもよい。特に基板１２下方から流体を吸引しやすくしたい場合は、基板１２の上面に酸化物層２５を配置すればよく、特に基板１２の上方において流れやすくしたい場合は基板１２の下面に酸化物層２５を配置すればよい。
【００８４】
さらに、図１６に示すように、基板１２の一面であって、酸化物層２５が形成されていない側の面および貫通孔１７内壁に、絶縁層３１を形成すれば、基板１２の上方および下方間の電気的絶縁性を向上させることができる。
【００８５】
また図１７に示すように、隆起部１８を形成してもよい。
【００８６】
その他の実施の形態と同様の構成および効果については説明を省略する。
【００８７】
（実施の形態４）
図１８に示すように、本実施の形態４の細胞電気生理センサ１１に用いる基板１２は、基板１２の上面（第一の面）に形成された凹部３２と、凹部３２から基板１２の下面（第二の面）までを貫く貫通孔１７を有する。
【００８８】
この貫通孔１７の開口部１７Ａ、１７Ｂは、滑らかな曲面で形成されており、基板１２の上面と凹部３２の内壁、この凹部３２の内壁と貫通孔１７の内壁、およびこの貫通孔１７の内壁と基板１２の下面とは、それぞれ湾曲面で繋がっている。ここで本実施の形態４では、貫通孔１７の開口部１７Ａ、１７Ｂの表面および内壁と、凹部３２の内壁は、二乗平均粗さＲｑ＝１．０ｎｍ以下とした。
【００８９】
また、本実施の形態４では、凹部３２は貫通孔１７の開口部１７Ａを中心に外方へ広がり、基板１２の上面と繋がる湾曲面で形成されており、凹部３２の最深部から貫通孔１７が形成されているものである。
【００９０】
なお本実施の形態では、凹部３２の形状を、半球形状あるいは略半球形状とした。このように半球形状あるいは略半球形状とすることで、被検体細胞が真球である場合に、細胞を歪ませることなく保持しやすくなる。また被検体細胞が５〜５０μｍ程度の大きさの場合には、凹部３２の開口部３２Ａの直径は約３０μｍが望ましい。
【００９１】
次に、本実施の形態における細胞電気生理センサ１１の製造方法について説明する。
【００９２】
まず、図１９に示すように、シリコンからなる基板１２の上面にレジストマスク３３を形成する。このとき、所望する貫通孔１７の断面と略同形状のマスクホール３４をパターニングしておく。
【００９３】
次に、図２０に示すように、基板１２をエッチングすることで凹部３２を形成する。このときのエッチング方法としては、高精度な微細加工が可能なドライエッチングが望ましい。このとき用いるエッチングガスとして、ＳＦ６、ＣＦ４、ＮＦ３、ＸｅＦ２、またはこれらの混合ガスのいずれかを用いることができる。これらはシリコンのエッチングを深さ方向だけでなく、水平方向へのエッチングも促進する作用があるため、基板１２を半球形状の碗型に高精度にエッチングすることができる。また、本実施の形態４においては、エッチングを促進するガスに、Ｎ２、Ａｒ、ＨｅまたはＨ２などのキャリアガスを混合して用いた。
【００９４】
その後、図２１に示すように、前述のレジストマスク３３を配置した状態で、凹部３２の底面から基板１２の下面までを垂直方向に貫く貫通孔１７を形成する。
【００９５】
なお、このときには実施の形態１と同様に、エッチングガスと抑制ガスを交互に用いたドライエッチング処理を行う。
【００９６】
最後にレジストマスク３３を除去し、この基板１２を実施の形態１と同様に、減圧した不活性ガス雰囲気下において、１０００℃以上で加熱すると、本実施の形態４の滑らかな曲線を有した基板１２（図１８）を作製することができる。
【００９７】
また、加熱（アニール）を用いない場合には、実施の形態１と同様に、気相法による成膜によっても同様の形状を作製することができる。
【００９８】
以下、本実施の形態４における効果を説明する。
【００９９】
本実施の形態４では、図１８に示すように、基板１２の上面と凹部３２の内壁、この凹部３２の内壁と貫通孔１７の内壁、およびこの貫通孔１７の内壁と基板１２の下面とは、それぞれ湾曲面で繋がっている。これにより、流路の急速な断面積変化が抑制され、流体の抵抗損失が低減し、貫通孔１７に出入りする電解液２０、２１（図３に示す）が流れやすくなり、結果として被検体細胞の捕捉率が向上し、細胞電気生理センサ１１の測定精度が高まる。
【０１００】
また本実施の形態４では、貫通孔１７の開口部１７Ａ、１７Ｂの表面および内壁と、凹部３２の内壁とを、二乗平均粗さＲｑ＝１．０ｎｍ以下の非常に滑らかな状態としたことにより、流体の抵抗損失はさらに低減され、また気泡の発生も低減でき、被検体細胞の捕捉率が向上する。
【０１０１】
また、基板１２の上面に凹部３２を形成することで、被検体細胞１９を捕捉しやすくなり、さらに捕捉した被検体細胞１９を維持しやすくなる。
【０１０２】
また、貫通孔１７の開口部１７Ａと被検体細胞１９との接触面積が増えるため、貫通孔１７の開口部１７Ａと被検体細胞１９との密着性が向上する。
【０１０３】
さらに本実施の形態４では、貫通孔１７が凹部３２の最深部に形成されているため、凹部３２に捕捉された被検体細胞１９を貫通孔１７の開口部１７Ａにアライメントしやすくなる。そしてその結果、被検体細胞の捕捉率が向上する。
【０１０４】
なお、本実施の形態４では、凹部３２は半球形状としたが、図２２に示すように、凹部３２は円錐形状あるいは略円錐形状としてもよい。このように凹部３２を円錐形状あるいは略円錐形状とすれば、凹部３２の傾斜が急になり、被検体細胞が粘着性細胞である場合でも、凹部３２の途中で粘着することなく貫通孔１７へ到達する確率を高めることができる。
【０１０５】
さらに、図１８に示す基板１２の表面と、凹部３２および貫通孔１７の内壁とに絶縁層（図示せず）を形成すれば、基板１２上下間の電気的絶縁性を向上させることができる。
【０１０６】
また、あらかじめ基板１２の下面（第二の面）に酸化物層（図示せず）を積層してもよい。これにより基板１２の厚みを高精度に管理できる。なお、この場合、基板１２の上面と、凹部３２および貫通孔１７の内壁とに絶縁層（図示せず）を形成してもよい。
【０１０７】
また、貫通孔１７の開口部１７Ａ、１７Ｂの外周に、外方にむけて隆起する隆起部（図示せず）を形成してもよい。これにより被検体細胞１９と開口部１７Ａとの接触面積が増えるとともに、貫通孔１７の開口部１７Ｂに留まる気泡を低減することができる。
【０１０８】
また、図２３に示すように、基板１２の上面により多数の凹部３２を形成し、隣接する凹部３２の内壁を互いに交差するものとしてもよい。これにより基板１２の上面において、凹部３２を形成している領域には平面部が殆どなくなり、交差部３５に被検体細胞が接触した場合でも、付着することなく、重力によりいずれかの凹部３２に傾き、その内壁に沿って凹部３２の中心にアライメントされる。
【０１０９】
また交差部３５もアニール処理等によって、平滑な湾曲面とすることにより、接触した被検体細胞を傷つけることなく貫通孔１７の開口部１７Ａへと導くことが可能となる。
【０１１０】
また、図２３において、隣接する貫通孔１７の中心点間距離を、被検体細胞の平均直径の２倍より短くすることによって、一つの凹部３２の中に複数の細胞がトラップされるのを防ぐことができる。
【０１１１】
また、図２３において、隣接する貫通孔１７の中心点間距離を、被検体細胞の平均直径より長くすることにより、一つの凹部３２に保持された被検体細胞同士の接触を低減することができる。そしてその結果、細胞電気生理センサ１１の測定精度を向上させることが出来る。
【０１１２】
本実施の形態４において、その他の実施の形態と同様の構成および効果については説明を省略する。
【０１１３】
（実施の形態５）
本実施の形態５は、図２４に示すように、実施の形態４の基板を上下反転させたものである。
【０１１４】
すなわち、本実施の形態５の細胞電気生理センサ１１に用いる基板１２は、基板１２の下面に形成された凹部３２と、凹部３２から基板１２の上面までを貫く貫通孔１７を有する。
【０１１５】
この貫通孔１７の開口部１７Ｃ、１７Ｄは、滑らかな曲面で形成されており、基板１２の下面と凹部３２の内壁、この凹部３２の内壁と貫通孔１７の内壁、およびこの貫通孔１７の内壁と基板１２の上面とは、それぞれ湾曲面で繋がっている。
【０１１６】
ここで本実施の形態５では、貫通孔１７の開口部１７Ｃ、１７Ｄの表面および内壁と、凹部３２の内壁は、二乗平均粗さＲｑ＝１．０ｎｍ以下とした。
【０１１７】
また、本実施の形態５では、凹部３２は貫通孔１７の開口部１７Ｄを中心に外方へ広がり、基板１２の下面と繋がる湾曲面で形成されており、凹部３２の最深部から貫通孔１７が形成されているものである。
【０１１８】
本実施の形態５では、貫通孔１７から凹部３２、凹部３２から基板１２下方の第二電極槽（図１の１５）へと段階的に流路の断面積が変化するため、流体の抵抗損失が小さくなる。さらに基板１２の下面と凹部３２の内壁、この凹部３２の内壁と貫通孔１７の内壁、およびこの貫通孔１７の内壁と基板１２の上面とは、それぞれ平滑な湾曲面で繋がっていることから、流体抵抗をより低減できる。
【０１１９】
また本実施の形態５では、基板１２の下方に凹部３２を形成しているため、基板１２の下方から第二電解液２１（図１の第二電解液２１）を吸引しやすくなり、被検体細胞１９と貫通孔１７の開口部１７Ｃとの密着性を向上させることができる。さらに、基板１２の下方に凹部３２を形成したことにより、基板１２の下方から注入する薬剤（ナイスタチンなど）が貫通孔１７へと回り込みやすくなる。
【０１２０】
さらに、基板１２の表面と、凹部３２および貫通孔１７の内壁とに絶縁層（図示せず）を形成すれば、図１に示す第一電極槽１３と第二電極槽１５との間の電気的絶縁性を向上させることができる。
【０１２１】
また、図２５に示すように、あらかじめ基板１２の上面に酸化物層２５を積層してもよい。これにより基板１２の厚みを高精度に管理できる。なお、この場合、基板１２の下面と、凹部３２および貫通孔１７の内壁とに絶縁層（図示せず）を形成してもよい。
【０１２２】
また、貫通孔１７の開口部１７Ｃ、１７Ｄの外周に、外方にむけて隆起する隆起部１８を形成してもよい。貫通孔１７の上方に隆起部１８を形成すれば、被検体細胞１９が開口部１７Ｃに捕捉しやすくなり、また被検体細胞１９と開口部１７Ｃとの接触面積が増える。また貫通孔１７の下方に隆起部１８を形成すれば、開口部１７Ｄに留まる気泡を低減することができる。
【０１２３】
本実施の形態５において、その他の実施の形態と同様の構成および効果については説明を省略する。
【産業上の利用可能性】
【０１２４】
以上のように、本発明にかかる細胞電気生理センサは、細胞を的確に吸引し、貫通孔の開口部に精度高く捕捉・保持することができるため、高精度かつ高効率な測定が求められる医療・バイオ分野において有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１】本発明の一実施の形態における細胞電気生理センサの断面図
【図２】本発明の一実施の形態における基板の断面図（図１のＹ部分）
【図３】本発明の一実施の形態における細胞電気生理センサの動作を示す要部拡大断面図
【図４】本発明の一実施の形態における基板の斜視図
【図５】本発明の一実施の形態における基板の製造工程を示す断面図
【図６Ａ】本発明の一実施の形態における基板の要部断面図
【図６Ｂ】同要部断面図
【図６Ｃ】同要部断面図
【図６Ｄ】同要部断面図
【図７】本発明の一実施の形態における基板の製造工程を示す断面図
【図８】同基板の製造工程を示す断面図
【図９】同基板の製造工程を示す断面図
【図１０】本発明の一実施の形態における基板の斜視図
【図１１】本発明の一実施の形態における基板の断面図
【図１２】本発明の一実施の形態におけるチップの断面図
【図１３】本発明の一実施の形態におけるチップの製造工程を示す断面図
【図１４】同チップの製造工程を示す断面図
【図１５】同チップの製造工程を示す断面図
【図１６】本発明の一実施の形態における基板の断面図
【図１７】同断面図
【図１８】同断面図
【図１９】本発明の一実施の形態における基板の製造工程を示す断面図
【図２０】同基板の製造工程を示す断面図
【図２１】同基板の製造工程を示す断面図
【図２２】本発明の一実施の形態における基板の断面図
【図２３】同断面図
【図２４】同断面図
【図２５】同断面図
【図２６】従来の細胞電気生理センサの断面図
【符号の説明】
【０１２６】
１１    細胞電気生理センサ
１２    基板
１３    第一電極槽
１４    第一電極
１５    第二電極槽
１６    第二電極
１７    貫通孔
１７Ａ，１７Ｂ，１７Ｃ，１７Ｄ    開口部
１８，１８Ａ，１８Ｂ    隆起部
１９    被検体細胞
２０    第一電解液
２１    第二電解液
２２    レジストマスク
２３    マスクホール
２４    絶縁層
２５    酸化物層
２６    シリコン層
２７    ブロック
２８    レジストマスク
２９    レジストマスク
３０    ホール
３１    絶縁層
３２    凹部
３２Ａ    開口部
３３    レジストマスク
３４    マスクホール
３５    交差部
３６    チップ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
0004596009.tif 000006
【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
0004596009.tif 000008
【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
0004596009.tif 000014
【図１１】
0004596009.tif 000015
【図１２】
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【図１３】
0004596009.tif 000017
【図１４】
0004596009.tif 000018
【図１５】
0004596009.tif 000019
【図１６】
0004596009.tif 000020
【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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