(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ほぼ全ての真菌の１８ＳｒＲＮＡ遺伝子に共通する遺伝子領域を特異的に遺伝子増幅できる特定のプライマーセットＦｕｎｇｉ〜Ｆｕｎｇｉ７のうちいずれか１つ以上を用いて遺伝子増幅することで、予め真菌に対するその遺伝子増幅領域のＴｍ値を取得し、
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌のＳｐａ遺伝子及びｍｅｃＡ遺伝子をそれぞれ特異的に遺伝子増幅できる特定のプライマーセット（ｓｐａまたはｓｐａ２）及び（ｍｅｃＡまたはｍｅｃＡ２）を用いて遺伝子増幅することで予めＳｐａ遺伝子及びｍｅｃＡ遺伝子のその増幅領域のＴｍ値を取得し、
細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のうち、ほぼ全ての細菌に共通する塩基配列領域を含む約９０〜４００の塩基からなる特定の遺伝子領域であって、特定のプライマーセットＢａｃ．１〜Ｂａｃ．１１のうち、第１，第２，第３の３つ以上のプライマーセットを用いて遺伝子増幅することで、予め既知の細菌に対する前記特定の遺伝子領域の各Ｔｍ値の組合せを取得し、
前記真菌、Ｓｐａ遺伝子、ｍｅｃＡ遺伝子、既知の細菌に対する各Ｔｍ値をデータベース化し、
前記データベース化に用いた特定のプライマーセットを用いて同定対象となる未知の微生物のＤＮＡに対して遺伝子増幅を試み、陽性を示した特定の遺伝子領域のＴｍ値の組合せから未知の微生物が細菌であることが疑わしい場合に、
前記第１のプライマーセットを用いて得られたＴｍ値に基づいてその測定値及び測定機器の誤差範囲に含まれると推定される既知の細菌の群をデータベースから選び出し、当該選び出された既知の細菌の群の中から前記第２、第３プライマーセットを用いて順次得られた各Ｔｍ値の測定値に基づいて、当該測定機器の誤差範囲に含まれるものを順次絞り込むことで当該未知の微生物を同定することを特徴とする感染症起因菌の同定方法。
【請求項２】
ほぼ全ての細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子に共通する遺伝子領域を特異的に遺伝子増幅できる特定のプライマーセットＢａｃ．１〜Ｂａｃ．１１のうちいずれか１つ以上を用いて遺伝子増幅することで、予め細菌に対するその遺伝子増幅領域のＴｍ値を取得し、
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌のＳｐａ遺伝子及びｍｅｃＡ遺伝子をそれぞれ特異的に遺伝子増幅できる特定のプライマーセット（ｓｐａまたはｓｐａ２）及び（ｍｅｃＡまたはｍｅｃＡ２）を用いて遺伝子増幅することで予めＳｐａ遺伝子及びｍｅｃＡ遺伝子のその増幅領域のＴｍ値を取得し、
真菌の１８ＳｒＲＮＡ遺伝子のうち、ほぼ全ての真菌に共通する塩基配列領域を含む約９０〜４００の塩基からなる特定の遺伝子領域であって、特定のプライマーセットＦｕｎｇｉ〜Ｆｕｎｇｉ７のうち第１，第２，第３の３つ以上のプライマーセットを用いて遺伝子増幅することで、予め既知の真菌に対する前記特定の遺伝子領域の各Ｔｍ値の組合せを取得し、
前記細菌、Ｓｐａ遺伝子、ｍｅｃＡ遺伝子、既知の真菌に対する各Ｔｍ値をデータベース化し、
前記データベース化に用いた特定のプライマーセットを用いて同定対象となる未知の微生物のＤＮＡに対して遺伝子増幅を試み、陽性を示した特定の遺伝子領域のＴｍ値の組合せから未知の微生物が真菌であることが疑わしい場合に、
前記第１のプライマーセットを用いて得られたＴｍ値に基づいてその測定値及び測定機器の誤差範囲に含まれると推定される既知の真菌の群をデータベースから選び出し、当該選び出された既知の真菌の群の中から前記第２、第３プライマーセットを用いて順次得られた各Ｔｍ値の測定値に基づいて、当該測定機器の誤差範囲に含まれるものを順次絞り込むことで当該未知の微生物を同定することを特徴とする感染症起因菌の同定方法。
【請求項３】
標準コントロールとして、前記データベース化に用いた細菌又は真菌のうちの一のプライマーセットにて標準株の標準Ｔｍ値を毎回測定し、
当該標準Ｔｍ値にて測定機器誤差を補正することを特徴とする請求項１又は２のいずれかに記載の感染症起因菌の同定方法。
【請求項４】
同定対象となる未知の微生物のＤＮＡに対して前記細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３ヶ所以上又は真菌の１８ＳｒＲＮＡ遺伝子の３ヶ所以上の前記データベース化に用いたそれぞれのプライマーセットにてＴｍ値を取得し、取得した各Ｔｍ値間の差の組合せを利用して同定することで、測定誤差の影響を低減したことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の感染症起因菌の同定方法。
【請求項５】
遺伝子増幅をＰＣＲ法で行い、Ｔｍ値を吸光度測定法により取得することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の感染症起因菌の同定方法。
【請求項６】
遺伝子増幅及びＴｍ値の取得をリアルタイムＰＣＲ法で行うことを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の感染症起因菌の同定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、感染症、特に敗血症の早期治療実現のため、起因菌を迅速に検出・同定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
敗血症は重篤な全身感染症で、確定診断には血液中の起因微生物の検出・同定が必須である。
近年、癌治療や臓器移植など医療の高度化に伴い、敗血症発症のリスクの高い重症患者が増えている。
また、院内感染の観点からメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）をはじめとする多剤耐性菌が敗血症の起因菌となることも多く、適切な抗菌薬を選択し患者を救命するためには、血液中の起因菌を可能な限り迅速に検出・同定することが臨床上重要である。
しかし現在の細菌学的検出法では、血液培養ボトルの提出から細菌の同定までに少なくとも１８時間はかかるため、結果が判明するまでの間は経験に基づく治療（ｅｍｐｉｒｉｃ  ｔｈｅｒａｐｙ）を施行せざるを得なく、盲目的に抗菌薬の選択を余儀なくされていることが臨床的現状である。
その結果、広域スペクトルの抗菌薬使用による多剤耐性菌の出現や、不適切な抗菌薬選択により敗血症患者を救命できない事態が生じている。
一方、敗血症起因菌ＤＮＡの痕跡をＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）により増幅し、増幅された起因菌ＤＮＡを、経験的に想定した菌に標的を定めた菌種固有のヌクレオチドプローブとハイブリッド形成させ、起因菌を検出・同定する試みがなされた（特許文献１）。
さらに、検出・同定の迅速性を求めて、リアルタイムＰＣＲによる技術が開発されている（非特許文献１）。【０００３】
【特許文献１】特開平６−９０７９９号公報
【非特許文献１】生物試料分析，Ｖｏｌ．２８，Ｎｏ５．（２００５），４００−４０４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
非特許文献１の敗血症検査法は、ハイブリダイゼーションプローブを用いたリアルタイムＰＣＲを基本原理としている。
しかし、該方法では、菌種それぞれに特異的なハイブリダイゼーションプローブを作製する必要があり、数多くの起因菌を同定するためには際限なくハイブリダイゼーションプローブを用意しなければならない。
つまり、検出する菌種の数は用意するプローブの数に依存するため、広範な菌種の同定は現実的に不可能である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、最近接塩基法の「融解温度（ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：Ｔｍ値）は塩基配列で決まる」という理論的根拠を元に、菌種毎のＴｍ値の違いを起因菌同定に応用することについて鋭意研究した結果、本発明を完成するに至った。
本発明は、微生物のＤＮＡを抽出し、これを鋳型として、特定のプライマーセットを使用してＰＣＲなどで遺伝子増幅を行い、次いで、微生物に特異的な融解温度（Ｔｍ値）の組合せ、或いは各Ｔｍ値間の差を解析することにより起因菌の検出・同定を迅速に行う方法である。
ここで、Ｔｍ値の測定には一般的教科書に示されている従来の吸光度測定方法を用いることもでき、近年開発されたリアルタイムＰＣＲ法を用いて、遺伝子増幅及びＴｍ値を取得してもよい。
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）細菌の１６ＳｒＲＮＡは、ほぼ全ての細菌に共通の塩基配列領域（２０〜４０塩基）を７〜８ヶ所もつことが知られている。
その全て或いは一部の箇所にフォワードとリバースのプライマーをそれぞれ設定することにより、１〜７つの遺伝子増幅領域を作製する。
（２）遺伝子増幅領域は、約１５０〜２００塩基であり、プライマーを設定した共通保存領域以外は、それぞれの細菌に固有の塩基配列を持つ。
従って、Ｔｍ値も塩基配列の違いを反映して固有の値を示し、細菌毎に１〜７種類の特徴的なＴｍ値を持つことが推定される。
それ故、細菌の種類に応じた１〜７つのＴｍ値を調べ、データベース化する。
このデータベースを利用して未知の細菌を同定することができる。
（３）さらに、真菌に固有のプライマーを１〜６つ、ＭＲＳＡ同定の為のＳｐａ、ｍｅｃＡのプライマーを併用することで、未知の起因菌に対し、細菌感染とその種類（ＭＲＳＡ含む）、或いは真菌感染とその種類を同定出来る。
（４）非特異的な遺伝子産物が生じ、目的のＴｍ値に近い値を示す場合、擬陽性のリスクが生じる。
そのような場合、遺伝子増幅後の増幅産物をアガロース・ゲルに流してバンドの大きさを確認することで、結果を二重にチェックすることが出来る。
すなわち、従来の遺伝子増幅による検出法で二重チェックするシステムを採用することで検査精度の向上が図れる。
（５）遺伝子増幅方法としてリアルタイムＰＣＲを採用した場合、その定量性を利用して、菌量を治療前後で相対定量することで、治療効果のモニタリングの向上を図ることが出来る。
（６）リアルタイムＰＣＲ機器には、ヒートブロックで温度制御するブロック型と、空気を介して温度制御するエアバス型の２種類あるが、試行回毎にヒートブロック型で±０．１〜０．３℃（メーカーで異なる）、エアバス型で±０．４のＴｍ値測定誤差が生じる（同じ試行回ではサンプル間誤差は±０．２℃程）。
この測定誤差で菌種同定が妨げられないように、同じ試行回の各Ｔｍ値間の差異パターンを判定に利用する方法を採用することが好ましい。
【０００６】
本発明に使用されるプライマー以下のとおりである。
＜組み合わせグループ１＞
全ての細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子に共通な配列部位から５カ所を選び、フォワードプライマーとリバースプライマーを設定する。
具体的には以下のプライマーの塩基配列の全部または一部を含むプライマー、（Ｂ１）大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子（配列番号１）の８０９番目から９０５番目に相当する９７塩基のＤＮＡを増幅するプライマーセット（ｂａｃｔｅｒｉａ  ｐｒｉｍｅｒ  １：Ｂａｃ．１）。
配列番号２．ＧＡＴＴＡＧＡＴＡＣＣＣＴＧＧＴＡＧＴＣＣＡＣＧ  （２４ｍｅｒ）フォワード
配列番号３．ＣＣＣＧＴＣＡＡＴＴＣＣＴＴＴＧＡＧＴＴＴ  （２１ｍｅｒ）  リバース
（Ｂ２）大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の９２７番目から１０９２番目に相当する１６６塩基のＤＮＡを増幅するプライマーセット（ｂａｃｔｅｒｉａ  ｐｒｉｍｅｒ  ２：Ｂａｃ．２）。
配列番号４．ＡＡＡＣＴＣＡＡＡＧＧＡＡＴＴＧＡＣＧＧＧ  （２１ｍｅｒ）フォワード
配列番号５．ＣＧＣＴＣＧＴＴＧＣＧＧＧＡＣ  （１５ｍｅｒ）  リバース
（Ｂ３）大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の１１０８番目から１２１８番目に相当する１１１塩基のＤＮＡを増幅するプライマーセット（ｂａｃｔｅｒｉａ  ｐｒｉｍｅｒ  ３：Ｂａｃ．３）。
配列番号６．ＧＴＣＣＣＧＣＡＡＣＧＡＧＣＧ  （１５ｍｅｒ）フォワード
配列番号７．ＡＴＴＧＴＡＧＣＡＣＧＴＧＴＧＴＡＧＣＣＣ  （２１ｍｅｒ）  リバース
（Ｂ４）大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の１２４０番目から１３６９番目に相当する１３０塩基のＤＮＡを増幅するプライマーセット（ｂａｃｔｅｒｉａ  ｐｒｉｍｅｒ  ４：Ｂａｃ．４）。
配列番号８．ＧＧＧＣＴＡＣＡＣＡＣＧＴＧＣＴＡＣＡＡＴ  （２１ｍｅｒ）フォワード
配列番号９．ＣＣＧＧＧＡＡＣＧＴＡＴＴＣＡＣＣ  （１７ｍｅｒ）  リバース【０００７】
全ての真菌の１８ＳｒＲＮＡ遺伝子に共通な配列部位を選び１組の由来するフォワードプライマーとリバースプライマーを設定する。
具体的には以下のプライマーの塩基配列の全部または一部を含むプライマー、
（Ｆ１）真菌の１８ＳｒＲＮＡ遺伝子のプライマーセット（ｆｕｎｇｉ  ｐｒｉｍｅｒ：Ｆｕｎｇｉ）
配列番号１０．ＧＡＡＴＧＡＧＴＡＣＡＡＴＧＴＡＡＡＴＡＣＣＴＴＡＡＣＧ  （２８ｍｅｒ）  フォワード
配列番号１１．ＴＡＡＣＴＧＣＡＡＣＡＡＣＴＴＴＡＡＴＡＴＡＣＧＣ  （２５ｍｅｒ）  リバース【０００８】
ＭＲＳＡのＳｐａ遺伝子およびｍｅｃＡ遺伝子のプライマーは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  Ｐｒｏｂｅ  Ｄｅｓｉｇｎ  ２  ソフトウェアを用い、最もスコアが高いプライマーデザインを選定する。
具体的には、
（Ｍ１）ＭＲＳＡのＳｐａ遺伝子のプライマーセット（ｓｐａ  ｐｒｉｍｅｒ：ｓｐａ）。
配列番号１２．ＴＧＡＡＣＧＡＡＧＡＡＣＡＡＣＧＣＡＡＴ  （２０ｍｅｒ）フォワード
配列番号１３．ＴＴＴＧＣＴＣＡＣＴＧＡＡＧＧＡＴＣＧＴＣ  （２１ｍｅｒ）  リバース
（Ｍ２）ＭＲＳＡのｍｅｃＡ遺伝子のプライマーセット（ｍｅｃＡ  ｐｒｉｍｅｒ：ｍｅｃＡ）
配列番号１４．ＡＴＴＡＴＡＡＡＧＣＡＡＴＣＧＣＴＡＡＡＧＡＡＣＴＡＡＧＴＡ  （３０ｍｅｒ）  フォワード
配列番号１５．ＣＣＡＡＴＡＡＣＴＧＣＡＴＣＡＴＣＴＴＴＡＴＡＧＣＣ  （２６ｍｅｒ）  リバース【０００９】
＜組み合わせグループ２＞
全ての細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子に共通な配列部位から１０カ所を選び、フォワードプライマーとリバースプライマーを設定する。
具体的には以下のプライマーの塩基配列の全部または一部を含むプライマー、
（Ｂ５）大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の８番目から３４５番目に相当する３３８塩基のＤＮＡを増幅するプライマーセット（ｂａｃｔｅｒｉａ  ｐｒｉｍｅｒ  ５：Ｂａｃ．５）。
配列番号１７．ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＡＴＧＧＣＴＣＡＧ  （２０ｍｅｒ）フォワード
配列番号１８．ＣＧＴＡＧＧＡＧＴＣＴＧＧＡＣＣＧＴ  （１８ｍｅｒ）  リバース
（Ｂ６）大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３３６番目から５３４番目に相当する１９９塩基のＤＮＡを増幅するプライマーセット（ｂａｃｔｅｒｉａ  ｐｒｉｍｅｒ  ６：Ｂａｃ．６）。
配列番号１９．ＧＡＣＴＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡ  （１７ｍｅｒ）フォワード
配列番号２０．ＴＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧ  （１７ｍｅｒ）  リバース
（Ｂ７）大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の５１９番目から８０５番目に相当する２８７塩基のＤＮＡを増幅するプライマーセット（ｂａｃｔｅｒｉａ  ｐｒｉｍｅｒ  ７：Ｂａｃ．７）。
配列番号２１．ＡＧＣＡＧＣＣＧＣＧＧＴＡＡＴＡ  （１６ｍｅｒ）フォワード
配列番号２２．ＧＧＡＣＴＡＣＣＡＧＧＧＴＡＴＣＴＡＡＴＣＣＴ  （２３ｍｅｒ）  リバース
（Ｂ８）大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の７８０番目から９６０番目に相当する１８１塩基のＤＮＡを増幅するプライマーセット（ｂａｃｔｅｒｉａ  ｐｒｉｍｅｒ  ８：Ｂａｃ．８）。
配列番号２３．ＡＡＣＡＧＧＡＴＴＡＧＡＴＡＣＣＣＴＧＧＴＡＧ  （２３ｍｅｒ）フォワード
配列番号２４．ＡＡＴＴＡＡＡＣＣＡＣＡＴＧＣＴＣＣＡＣＣ  （２１ｍｅｒ）  リバース
（Ｂ９）大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の９５１番目から１０７０番目に相当する１２０塩基のＤＮＡを増幅するプライマーセット（ｂａｃｔｅｒｉａ  ｐｒｉｍｅｒ  ９：Ｂａｃ．９）。
配列番号２５．ＴＧＧＴＴＴＡＡＴＴＣＧＡＴＧＣＡＡＣＧＣ  （２１ｍｅｒ）フォワード
配列番号２６．ＧＡＧＣＴＧＡＣＧＡＣＡＧＣＣＡＴ  （１７ｍｅｒ）  リバース
（Ｂ１０）大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の１０８４番目から１１９２番目に相当する１０９塩基のＤＮＡを増幅するプライマーセット（ｂａｃｔｅｒｉａ  ｐｒｉｍｅｒ  １０：Ｂａｃ．１０）。
配列番号２７．ＴＴＧＧＧＴＴＡＡＧＴＣＣＣＧＣ  （１６ｍｅｒ）フォワード
配列番号２８．ＣＧＴＣＡＴＣＣＣＣＡＣＣＴＴＣ  （１６ｍｅｒ）  リバース
（Ｂ１１）大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の１２２０番目から１３８５番目に相当する１６６塩基のＤＮＡを増幅するプライマーセット（ｂａｃｔｅｒｉａ  ｐｒｉｍｅｒ  １１：Ｂａｃ．１１）。
配列番号２９．ＧＧＣＴＡＣＡＣＡＣＧＴＧＣＴＡＣＡＡＴ  （２０ｍｅｒ）フォワード
配列番号３０．ＣＣＧＧＧＡＡＣＧＴＡＴＴＣＡＣＣ  （１７ｍｅｒ）  リバース【００１０】
真菌の１８ＳｒＲＮＡ遺伝子に共通な配列部位から７ヶ所を選び、フォワードプライマーとリバースプライマーを設定する。
具体的には以下のプライマーの塩基配列の全部または一部を含むプライマー、
（Ｆ２）カンジダ菌（Ｃ．  Ａｌｂｉｃａｎｓ）の１８ＳｒＲＮＡ遺伝子（配列番号１６）の１４９番目から４０７番目に相当する２５９塩基のＤＮＡを増幅するプライマーセット（ｆｕｎｇｉ  ｐｒｉｍｅｒ  ２：Ｆｕｎｇｉ  ２）
配列番号３１．ＧＴＧＧＴＡＡＴＴＣＴＡＧＡＧＣＴＡＡＴＡＣＡＴＧＣ  （２６ｍｅｒ）  フォワード
配列番号３２．ＧＧＴＡＧＣＣＧＴＴＴＣＴＣＡＧＧ  （１７ｍｅｒ）  リバース
（Ｆ３）カンジダ菌（Ｃ．  Ａｌｂｉｃａｎｓ）の１８ＳｒＲＮＡ遺伝子の３９０番目から５５１番目に相当する１６２塩基のＤＮＡを増幅するプライマーセット（ｆｕｎｇｉ  ｐｒｉｍｅｒ  ３：Ｆｕｎｇｉ  ３）
配列番号３３．ＧＣＣＴＧＡＧＡＡＡＣＧＧＣＴＡＣＣＡ  （１９ｍｅｒ）  フォワード
配列番号３４．ＣＣＴＣＣＡＡＴＴＧＴＴＣＣＴＣＧＴＴＡＡＧ  （２２ｍｅｒ）  リバース
（Ｆ４）カンジダ菌（Ｃ．  Ａｌｂｉｃａｎｓ）の１８ＳｒＲＮＡ遺伝子の５３１番目から７６２番目に相当する２３２塩基のＤＮＡを増幅するプライマーセット（ｆｕｎｇｉ  ｐｒｉｍｅｒ  ４：Ｆｕｎｇｉ  ４）
配列番号３５．ＴＴＡＡＣＧＡＧＧＡＡＣＡＡＴＴＧＧＡＧＧＧ  （２２ｍｅｒ）  フォワード
配列番号３６．ＧＣＣＴＧＣＴＴＴＧＡＡＣＡＣＴＣＴＡＡＴＴＴ  （２３ｍｅｒ）  リバース
（Ｆ５）カンジダ菌（Ｃ．  Ａｌｂｉｃａｎｓ）の１８ＳｒＲＮＡ遺伝子の９８９番目から１１３４番目に相当する１４６塩基のＤＮＡを増幅するプライマーセット（ｆｕｎｇｉ  ｐｒｉｍｅｒ  ５：Ｆｕｎｇｉ  ５）
配列番号３７．ＡＴＡＣＣＧＴＣＧＴＡＧＴＣＴＴＡＡＣＣＡ  （２１ｍｅｒ）  フォワード
配列番号３８．ＧＴＣＡＡＴＴＣＣＴＴＴＡＡＧＴＴＴＣＡＧＣＣＴ  （２４ｍｅｒ）  リバース
（Ｆ６）カンジダ菌（Ｃ．  Ａｌｂｉｃａｎｓ）の１８ＳｒＲＮＡ遺伝子の１２６０番目から１４２８番目に相当する１６９塩基のＤＮＡを増幅するプライマーセット（ｆｕｎｇｉ  ｐｒｉｍｅｒ  ６：Ｆｕｎｇｉ  ６）
配列番号３９．ＣＡＴＧＧＣＣＧＴＴＣＴＴＡＧＴＴＧＧ  （１９ｍｅｒ）  フォワード
配列番号４０．ＧＧＧＣＡＴＣＡＣＡＧＡＣＣＴＧＴＴ  （１８ｍｅｒ）  リバース
（Ｆ７）カンジダ菌（Ｃ．  Ａｌｂｉｃａｎｓ）の１８ＳｒＲＮＡ遺伝子の１４１４番目から１６３０番目に相当する２１７塩基のＤＮＡを増幅するプライマーセット（ｆｕｎｇｉ  ｐｒｉｍｅｒ  ７：Ｆｕｎｇｉ  ７）
配列番号４１．ＡＧＧＴＣＴＧＴＧＡＴＧＣＣＣＴＴＡＧ  （１９ｍｅｒ）  フォワード
配列番号４２．ＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣＡＡＡ  （１７ｍｅｒ）  リバース【００１１】
ＭＲＳＡのＳｐａ遺伝子およびｍｅｃＡ遺伝子のプライマーは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  Ｐｒｏｂｅ  Ｄｅｓｉｇｎ  ２  ソフトウェアを用い、最もスコアが高いプライマーデザインを選定する。
具体的には、
（Ｍ３）ＭＲＳＡのＳｐａ遺伝子のプライマーセット（ｓｐａ  ｐｒｉｍｅｒ  ２：ｓｐａ２）。
配列番号４３．ＴＡＡＡＣＧＡＴＧＣＴＣＡＡＧＣＡＣＣＡＡ  （２１ｍｅｒ）フォワード
配列番号４４．ＧＧＴＴＴＡＡＣＧＡＣＡＴＧＴＡＣＴＣＣＧ  （２１ｍｅｒ）  リバース
（Ｍ４）ＭＲＳＡのｍｅｃＡ遺伝子のプライマーセット（ｍｅｃＡ  ｐｒｉｍｅｒ  ２：ｍｅｃＡ２）
配列番号４５．ＣＡＡＡＣＴＡＣＧＧＴＡＡＣＡＴＴＧＡＴＣＧＣ  （２３ｍｅｒ）  フォワード
配列番号４６．ＡＴＧＴＡＴＧＣＴＴＴＧＧＴＣＴＴＴＣＴＧＣ  （２２ｍｅｒ）  リバース【００１２】
本発明の遺伝子増幅の方法として、ＰＣＲ法が好ましく、さらにリアルタイムＰＣＲ法が好ましい。
本発明に使用されるリアルタイムＰＣＲは、二本鎖ＤＮＡに結合することで蛍光を発する試薬（インターカレーター）をＰＣＲ反応系に加えるインターカレーター法である。
インターカレーターとして、エジチジウムブロマイド、サイバー・グリーンＩ（ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ）などが挙げられる。
好ましいインターカレーターは、サイバー・グリーンＩである。
尚、本発明で使用するプライマーは全てのバクテリアＤＮＡに反応する為、使用すべきサイバー・グリーンＩは、組換えホスト由来のバクテリアＤＮＡ混入を最小限に抑えた高純度のサイバーグリーンＩを使用すべきである。【００１３】
本発明において、Ｔｍ値とは、ＰＣＲ産物の５０％がその相補鎖と解離する時の温度である。
また、最近接塩基法によるＴｍ値計算式の「Ｔｍ値は塩基配列で決まる」という理論的根拠を元に、菌種ごとの塩基配列の違いをＴｍ値の違いとして起因菌同定に応用することができる。
従って、「Ｔｍ値から測定誤差の影響を排除する」ことが正確に同定する上で最も重要となる。このため、以下の方法で測定誤差の影響を排除する。
先ず、Ｔｍ値は緩衝液の組成などが異なる実験条件下では変化するため、塩化マグネシウム濃度の固定されたサイバー・グリーンＩを反応用緩衝液として使用することで、反応液の組成による測定誤差を生じないようにする。
次に、リアルタイムＰＣＲ機器自体が試行回毎に測定誤差を生じるため、コントロールとしての標準Ｔｍ値を設定すると共に、同じ試行回での各Ｔｍ値間の差異パターンを判定に利用する。【００１４】
本発明において、測定機器の試行間誤差を補正する目的で、基準Ｔｍ値を使用することができる。
具体的には、テンプレートとして一定濃度の大腸菌標準株のＤＮＡを用い、細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の一領域を増幅する１つのプライマーセットを使用して毎回Ｔｍ値を測定し、試行回毎のＴｍ値のズレを補正する。
すなわち、同じテンプレートに同じプライマーの組み合わせであれば、理論的には毎回同じＴｍ値となる。
しかし、実際に得られたＴｍ測定値がズレた場合、それは試行間誤差となるので、そのズレ分だけ補正を行えばよい。【００１５】
本発明の方法の手順は以下のとおりである。
（１）微生物のＤＮＡを抽出する。
（２）抽出した未知の微生物ＤＮＡに対し、以下の細菌、ＭＲＳＡ、および真菌のプライマーセットを用いて遺伝子増幅後、それぞれのＴｍ値を一時に測定し、細菌、ＭＲＳＡ、および真菌のＴｍ値の組合せを得る。
（３）真菌であるか否か。
［上記（２）のＴｍ値の組合せの中で、全ての真菌の１８ＳｒＲＮＡ遺伝子の一領域〜複数領域を増幅できるプライマーセットを用いて得た真菌に特異的なＴｍ値を先ず解析することで、真菌であるか否か、或いは真菌の種類を判定する。］
（４）ＭＲＳＡであるか否か。
［上記（２）のＴｍ値の組合せの中で、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）のＳｐａ遺伝子およびｍｅｃＡ遺伝子を特異的に増幅するプライマーセットを用いて得たＭＲＳＡに固有の遺伝子増幅を解析することで、ＭＲＳＡであるか否かを判定する。］
（５）どの細菌であるか絞り込む
［上記（２）のＴｍ値の組合せの中で、全ての細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の複数領域を増幅できるプライマーセットを用いて得た細菌に特異的なＴｍ値を解析することで、細菌の種類を同定する。］
細菌の絞り込みは、具体的には、細菌のＴｍ値の一つに注目して（場合によっては、標準Ｔｍ値で先ず補正する）、そのＴｍ値に値の近い菌種に範囲を狭め、順次Ｔｍ値の差を取って絞り込む、または、直接、標準Ｔｍ値を含む、各Ｔｍ値間の差をとって、その差の組み合わせをフィンガープリントとして同定する。
また、起因菌が細菌か、真菌か、あるいはＭＲＳＡであるかを迅速、簡便に同定する方法としては、Ｔｍ値を利用しなくても未知の微生物ＤＮＡを抽出し、これを鋳型として、［１］真菌の１８ＳｒＲＮＡ遺伝子の全ての真菌に共通、且つ真菌特異的に検出するプライマー１つ、［２］メチシリン耐性黄色ブドウ球菌のＳｐａ遺伝子およびｍｅｃＡ遺伝子を特異的に検出するプライマー各々１つずつ、［３］細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の全ての細菌に共通、且つ細菌特異的に検出するプライマー１つ、の計４つのプライマーでＰＣＲを行い、アガロース・ゲルに電気泳動して目的サイズのバンドを確認する方法がある。
【発明の効果】
【００１６】
（１）４〜１８個、好ましくは４〜１６個のプライマーセットを元にリアルタイムＰＣＲなどの遺伝子増幅を実施し、得られるＴｍ値をデータベースと照合することにより、抗菌薬選択に必要な起因菌の菌種同定が出来る。
（２）血液検体の場合、ＤＮＡ抽出からＴｍ値の解析、そして同定までに要する時間は約２時間であり、迅速診断が可能となる。
（３）ＤＮＡを抽出する血液検体の量を一定とした場合、菌量の相対量を定量でき、抗菌薬投与後の治療効果のモニタリングが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】アガロース・ゲル上の泳動バンドを示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明を実施例および試験例によってより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
以下の実施例では、細菌のプライマー７つ（ｂａｃｔｅｒｉａ  ｐｒｉｍｅｒ  ５〜１１）、ＭＲＳＡのＳｐａ、ｍｅｃＡ遺伝子のプライマーそれぞれ１つずつ（ｓｐａ  ｐｒｉｍｅｒ  ２，  ｍｅｃＡ  ｐｒｉｍｅｒ  ２）、そして真菌のプライマー１つ（Ｆｕｎｇｉ  ｐｒｉｍｅｒ  ５）、標準Ｔｍ値測定用プライマー１つ（ｂａｃｔｅｒｉａ  ｐｒｉｍｅｒ  ３）の計１１のプライマーで実施した。
［実験材料とＤＮＡ抽出］
使用菌株は、２００４年４月１日から２００５年３月３１日までの１年間に、富山大学附属病院検査部細菌検査室に提出された１３２３検体中陽性となった１６０株（保存菌株）を使用した。
通常の分離培養法は、全自動血液培養検査装置バクテアラート（Ｂａｃｔ／Ａｌｅｒｔ：日本ビオメリュー）を用いて培養した。
使用ボトルは専用のＳＡ培養ボトル（好気性菌用）、ＳＮ培養ボトル（嫌気性菌用）、ＰＦ培養ボトル（重篤な小児疾患病原菌検出用）を組み合わせた。分離同定は、定法に従った。
ＤＮＡの抽出は、保存菌株をミュラー・ヒントン（Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ）寒天培地（日本ベクトン・ディッキンソン）、羊血液寒天培地（日水製薬）およびサブロー寒天培地（日本ベクトン・ディッキンソン）で分離培養後、その１コロニーを滅菌生食水１ｍｌの入ったマイクロチュ−ブに浮遊させ、１２，０００  ｒｐｍで２分間遠心し上清を捨て菌のペレットを残し、次に、インスタジーンマトリクス（Ｉｎｓｔａ  Ｇｅｎｅ  Ｍａｔｒｉｘ：日本バイオ・ラッド  ラボラトリーズ）を２００μｌ加え、５６℃で１５〜３０分間加温する。
その後、マイクロチュ−ブを激しくボルテックスして、１００℃のヒ−トブロックで８分間ボイルする。
最後に、１２，０００  ｒｐｍで２分間遠心しその上清をＤＮＡ抽出液とした。【００１９】
［リアルタイムＰＣＲ法］
リアルタイムＰＣＲ機器としてライトサイクラー１．５（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ１．５：ロシュ・ダイアグノスティックス）を使用した。
リアルタイムＰＣＲ用試薬は、パワーサイバーグリーンＰＣＲマスターミックス（Ｐｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ：アプライド・バイオシステムズ）を用いた。
ＰＣＲの成分構成は、ゲノムＤＮＡテンプレート量２μｌ、ＰＣＲプライマー  １０倍濃縮  ２μｌ（最終濃度は２５０ｎΜ）、リアルタイムＰＣＲ用試薬２倍濃縮  １０μｌ、ＢＳＡ（５００μｇ／ｍｌ）２μｌ、超純水  ４μｌで、計２０μｌの系で行った。
リアルタイムＰＣＲのプログラム設定を表１に示す。
なお、伸長反応時間は、３００塩基長までの増幅を可能にする最短時間である１２秒に設定した。
表１にリアルタイム ＰＣＲのプログラム設定を示す。
【表１】
0004590573.tif 000002
【００２０】
［融解曲線分析によるＴｍ値のデータ解析］
リアルタイムＰＣＲを施行後の、Ｔｍ値の解析は、先ず、定量曲線をチェックし、それぞれのプライマーが量的に立ち上がっているかどうかを確認した。
他のプライマーの立ち上がりサイクル数に比較し、極端にサイクル数の低い立ち上がりはプライマーが掛かっていないと判断した。
次に、融解曲線の形状をチェックした。
急激にＰＣＲ産物が一本鎖に解離し始める”崖”の形状（急激なＦ１値の低下所見）が確認できなければ、そのＴｍ値は採用しなかった。
上記２項目を確認した後、Ｔｍ値を融解ピーク曲線（ｍｅｌｔｉｎｇ  ｐｅａｋ）の”山”から計算した。【００２１】
［プライマーの検出感度］
各プライマーの検出感度を事前に測定した。結果を表２に示した。
【表２】
0004590573.tif 000003
検出感度を評価するため、菌株から取り出したゲノムＤＮＡを順次希釈し、リアルタイムＰＣＲにて検出の有無を確認した。
それぞれのプライマーの検出感度には差が生じたが、システムとして評価するには検出感度の最も低いプライマー（ｂａｃｔｅｒｉａ  ｐｒｉｍｅｒ  ５，  １０  と  ｍｅｃＡ  ｐｒｉｍｅｒ  ２）を基準に決め、システムとしての感度をゲノムＤＮＡ  １ｎｇ／μｌと設定した。【００２２】
［起因菌Ｔｍ値データベースの作成］
未知の敗血症起因菌を同定するシステムを構築するために、先ず頻度の高い起因菌に関するＴｍ値データベースの作成を行った。
データベースに登録する起因菌を決定するため、富山大学医学部附属病院検査部にて２００４年４月１日から２００５年３月３１日までの１年間、血液培養検査で陽性となった有効株１６０株についての検出菌頻度を調べ、計３４種の起因菌についてデータベースを作成した（表３〜７）。
表はグラム陽性・陰性、球菌・桿菌に分けて分類し、検出頻度の高い順に並べたものである。
この表では、菌からＴｍ値を探すツールとして利用できる。尚、大腸菌標準株ＤＮＡとｂａｃ．７プライマーの組合せで得られるコントロールＴｍ値は８４．４３度とした。
表において、
（  ）中のＴｍ値は、検出される可能性も、されない可能性もあることを示す。
（−）とＴｍ値との併記は、検出されないか、或いは検出された場合のＴｍ値を示す。
“−”は、検出されないことを示す。【００２３】
グラム陽性球菌を表３に示す。
【表３】
0004590573.tif 000004
【００２４】
グラム陽性桿菌を表４に示す。
【表４】
0004590573.tif 000005
【００２５】
グラム陰性球菌を表５に示す。
【表５】
0004590573.tif 000006
【００２６】
グラム陰性桿菌を表６に示す。
【表６】
0004590573.tif 000007
【００２７】
真菌を表７に示す。
【表７】
0004590573.tif 000008
【００２８】
［起因菌同定早見表の作成］
未知の敗血症起因菌を解析した場合、得られるデータは１つのコントロールＴｍ値と、１０のＰＣＲ増幅産物Ｔｍ値の組合せであるが、表３〜７のデータベースではＴｍ値から起因菌を同定するには不便である。
従ってＴｍ値から起因菌を容易に同定するために、起因菌同定早見表を作成した（表８）。【００２９】
【表８】
0004590573.tif 000009
＊コントロールＴｍ値＝８４．４３℃
カッコ  （  ）中のＴｍ値は、検出される可能性も、されない可能性もあることを示す。
（−）とＴｍ値との併記は、検出されないか、或いは検出された場合のＴｍ値を示す。
“−”は、検出されないことを示す。
各Ｔｍ値に下記した数値は、左隣のＴｍ値に比較した、大小の差を示す。【００３０】
表は左の項目から順にチェックするものとする。横の並びは先ず、Ｆｕｎｇｉ  ｐｒｉｍｅｒが陽性となる真菌を見極めの最優先事項として最上段に並べた。
次にｓｐａが陽性となる菌が少ないことを考慮して、２番目の優先次項においた。
優先順位の最後にはｍｅｃＡをおいたが、この理由はメチシリン耐性遺伝子の有無は同一菌種でも異なるからである。
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓや他のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種の一部はｍｅｃＡを持つ可能性があるが、陰性であった場合の同定が煩雑にならないよう、敢えて優先順位の最後においた。上記の優先次項を除いた同定法については、ｂａｃｔｅｒｉａ  ｐｒｉｍｅｒ  ７種によるＴｍ値の組合せを解析する。
そこで先ず、最初のプライマー（ｂａｃ．５）ではＴｍ値の高い方から順に並べることにした。
このように並べることで、容易な検索が可能となった。
さらに、早見表のｂａｃｔｅｒｉａのＴｍ値に差異のパターンが分かるよう、差異の数値を下記した。左隣のＴｍ値に対する変動幅の大小間系を±の数値で表わした。これにより、リアルタイムＰＣＲ機器自体の試行回毎の測定誤差に影響されること無く、ｂａｃｔｅｒｉａ  の７つのＴｍ値の差異パターンにより判別することが可能となる。【００３１】
［ブラインドテストによる検証］
［試験１］
本発明システムを評価するため、菌名を隠して本発明の１１のプライマーセットでリアルタイムＰＣＲを行い、Ｔｍ値の組合せをデータベースと照合し、菌種の同定を試みた。
得られたＴｍ値の組合せを表９に示す。【００３２】
【表９】
0004590573.tif 000010
【００３３】
Ｆｕｎｇｉ５，  ｓｐａ２，  ｍｅｃＡ２  はそれぞれ陰性であり、ｂａｃｔｅｒｉａ  ｐｒｉｍｅｒのみでＰＣＲ産物のＴｍ値が得られた。
コントロールＴｍ値が８４．０２を示したので、本来の値である８４．４３から−０．４１全体に施行間誤差を生じていると判断し、Ｂａｃ．５のＴｍ値に＋０．４１加えて補正を行った。
するとｂａｃ．５のＴｍ値が８４．５８であったので、機器の施行内誤差±０．２℃を考慮し、起因菌早見表の８４．７８〜８４．２８の部分に注目した（表１０のＢａｃ．５の列）。
次にＢａｃ．６がＢａｃ．５と比較してＴｍ値差が−２．１２℃なので、施行内誤差±０．２℃を考慮して−１．９２〜−２．３２の範囲の差に注目すると、３つの候補、すなわちＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ，  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ，  Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍが残る結果となった。
次にＢａｃ．７へのＴｍ値差は＋１．０４なので、＋１．２４〜＋０．８４の範囲に注目するとＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのみに絞られた。
その後のｂａｃ．８，  ９，  １０，  １１へのＴｍ値差は全てＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのデータベース値と合致し、結果もＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａで正解であった。
計１２回のブラインドテストを行った結果、全ての同定に正解を得ることが出来た。【００３４】
【表１０】
0004590573.tif 000011
【００３５】
［Ｔｍ値を利用しない簡便な代替方法について］
本発明のプライマーを使用して、リアルタイムＰＣＲ等のＴｍ値測定機器を使うことなく、起因菌が細菌か、真菌か、ＭＲＳＡか、の簡便・迅速同定が可能となる。
具体的には、一般のＰＣＲ用サーマルサイクラーを用い、本発明のバクテリアプライマー１つ、真菌プライマー１つ、ｓｐａ，  ｍｅｃＡプライマーそれぞれ１つずつの計４種類のプライマーで未知の起因菌ＤＮＡをテンプレートとしたＰＣＲを行い、増幅産物をアガロース・ゲルで泳動する。その結果、既存のサイズのバンドが確認されれば、細菌、真菌、ＭＲＳＡいずれかの感染を区別出来ることになる（図１）。
その結果、リアルタイムＰＣＲの様な機器の無い施設においても、簡便・迅速に細菌・真菌・ＭＲＳＡ感染の区別を行うことが出来、早期の適切な抗菌薬の選択に役立つ。
尚、本発明で使用するバクテリアプライマーは全てのバクテリアＤＮＡに反応する為、使用すべきＤＮＡポリメラーゼは、組換えホスト由来のバクテリアＤＮＡ混入を最小限に抑えた高純度のポリメラーゼを使用すべきである。【００３６】
簡便な代替方法を用いて確認された、アガロース・ゲル上の泳動バンドを図１に示す。
使用したプライマー；ｂａｃ．６，  ｆｕｎｇｉ．５，  ｓｐａ，  ｍｅｃＡ，  の計４つ。
使用したＤＮＡポリメラーゼ；ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，  ＬＤ  （アプライド・バイオシステムズ）
【産業上の利用分野】
【００３７】
本発明の方法により、感染症起因菌、とりわけ敗血症の起因菌を迅速に検出・同定することができ、敗血症の迅速診断法が実現する。
即ち、本発明により起因菌を２時間以内に同定するシステム構築が可能となるため、敗血症早期に最適な抗菌薬選択が可能となる。
また、抗菌薬投与後の治療効果のモニタリングも可能となる。
【図１】
0004590573.tif 000012
【配列表】
0004590573000001.app