(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された植物クチクラ膜を媒質入りの容器に浮かべ、膜上に被検化合物溶液を添付し、媒質中に透過した化合物を定量分析することを特徴とする化合物の植物クチクラ膜透過量及び／または透過速度測定方法。
【請求項２】
媒質が水または緩衝液である請求項１に記載の測定方法。
【請求項３】
被検化合物が農薬活性成分である請求項１乃至２のいずれかに記載の測定方法。
【請求項４】
酵素溶液に植物葉から切り取った切片を浮かべて処理することにより単離した植物クチクラ膜を用いることを特徴とする請求項1記載の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、化合物の植物クチクラ膜透過量及び／または透過速度測定方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
殺菌剤、殺虫剤、殺ダニ剤、除草剤、植物成長調節剤等の農薬は、乳剤、水和剤、顆粒水和剤、フロアブル剤等の剤型に製剤化され、これを水で希釈して、目的とする作物や雑草に噴霧散布機で散布して使用することがほとんどである。これらの農薬のうち、浸透性のある殺菌剤、殺虫剤、あるいは多くの除草剤、植物成長調節剤等のように植物組織内に浸透・移行して効力を発揮する農薬においては、噴霧散布機で散布された農薬が植物体表面に付着した後、クチクラ層を透過して葉内組織に移行することが効果発現上重要である。
このような農薬の葉表面から内部への浸透移行量の測定手段として従来より行われている方法は、（１）散布処理後、経時的に葉を切り取って葉面を溶剤等で洗浄、あるいはセルロースアセテート等のフィルムを利用してクチクラ膜を剥離した後、葉肉組織に存在する農薬量を測定する方法、（２）化学的、酵素的または物理的に単離したクチクラ膜をドナー溶液セルとレシーバー溶液セルの間に挟み込み、レシーバー溶液に透過する農薬量を経時的に測定する方法、（３）単離したクチクラ膜をプランシェット等に挟み、これを寒天ゲルカラム上面におき、クチクラ膜表面に存在する農薬の寒天ゲルへの透過量を、上記プランシェットを経時的に寒天ゲルの新規な表面に移動させて測定する方法、（４）農薬等の植物体内への移行量測定装置として、ドナー溶液／単離葉面クチクラ膜／高分子ゲル体ディスク／レシーバー溶液から構成する測定装置を使用する方法（実開平６−７２６３５）等がある。
【０００３】
しかしながら、（１）の方法では葉表面を溶剤等で洗浄またはフィルム等で剥離し、その残りを葉内に浸透したものと仮定する方法であるため、溶剤の種類によっては本来葉内に存在する農薬を抽出してしまったり、あるいはアジュバント等によって葉表面に固着した農薬を十分に抽出することができない場合があり、実際の農薬の分布状態と整合性があるとは言い難い。（２）の方法は医薬の分野で皮膚からの薬剤の浸透性評価に一般的に使用される方法であるが、ドナーセル、レシーバーセル共に溶液状態での測定であるため、溶液状態で散布された農薬が葉表面に液滴状態で付着し、それが徐々に乾燥する状態とはかけ離れているといわざるを得ない。（３）の方法では操作、取り扱いが相当に難しく、測定作業に熟練を必要とし、再現性に難点があるなどの問題点がある。（４）の方法は（１）、（２）、（３）の方法の欠点が克服され実験装置としては申し分ない。しかしながら、レシーバー溶液の量が多いため、ラジオアイソトープによって標識した農薬を扱う場合は問題ないが、非標識の農薬を通常の分析機器であるＧＣやＨＰＬＣ等で分析する場合には濃度が薄くなるため、添付する水滴中の農薬の濃度を実場面とはかけ離れた高濃度にしたり、サンプリングした溶液の濃縮操作が必要となる等の問題点がある。市販されている農薬であれば、ラジオアイソトープによって標識した農薬を購入することは可能であるが、これらの農薬は高額であったり、農薬製造メーカーでなければ入手困難な農薬も多い。また、開発中の農薬等に関してはラジオアイソトープで標識したものは存在しない。さらにこの装置の製造にコストがかかること、単離したクチクラ膜を高分子ゲル体ディスク上にのせること等の実験準備に熟練の技を必要とする等の根本的な問題点もある。
【０００４】
酵素溶液に植物葉から切り取った切片を浮かべて処理することにより植物クチクラ膜を単離する方法は、例えば、Schonherr,J. & Riederer,M.,Plant Cell Environ.,9(1986)やKloppenburg,D.J. & Hall,J.C., Weed Research,30(1990)等に記載されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、アイソトープで標識されていない化合物を使用して、簡便な方法で化合物のクチクラ膜の透過性を測定する方法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、単離された植物クチクラ膜を用いた化合物の植物クチクラ膜透過量及び／または透過速度測定方法であり、詳しくは、酵素溶液に植物葉から切り取った切片を浮かべて処理することにより単離した植物クチクラ膜を媒質入りの容器に浮かべ、ここに化合物の溶液を添付し、媒質中に透過した化合物を定量分析することを特徴とする化合物の植物クチクラ膜透過量及び／または透過速度測定方法である。
【０００７】
即ち、１．単離された植物クチクラ膜を媒質入りの容器に浮かべ、そこに被検化合物溶液を添付し、媒質中に透過した化合物を定量分析することを特徴とする化合物の植物クチクラ膜透過量及び／または透過速度測定方法であり、
２、媒質が水または緩衝液である１に記載の方法であり、
３、被検化合物が農薬活性成分である１乃至２のいずれかに記載の方法であり、
４、酵素溶液に植物葉から切り取った切片を浮かべて処理することにより単離した植物クチクラ膜を用いることを特徴とする1乃至３のいずれかに記載の方法である。
【０００８】
本発明に使用できる植物葉は作物、雑草、イネ科植物、広葉植物等の植物の種類または、生育ステージに限定されるものではなく、切り取った切片が水に浮かぶものであればいかなる種類の植物葉でも使用できる。例えば、オオムギ、コムギ、トウモロコシ、イネ、ダイズ、インゲン、ピーマン、ナス、トマト、ジャガイモ、サツマイモ等の野菜類、ミカン、リンゴ、ナシ、モモ等の果樹類、エノコログサ、メヒシバ、イチビ、イヌビユ、アカザ、オナモミ、アサガオ等の雑草類が挙げられる。また、水に浮かせて処理できる部位であれば、植物のどの部位でも利用することができ、特に葉に限定されることはない。例えば、花弁、がく、茎等である。
【０００９】
本発明で植物クチクラ膜を単離するために使用される酵素は、市販の粉末状のセルラーゼとペクチナーゼを任意の割合で混合し、これらを適正なｐＨに調整した緩衝液に溶解して溶液状態で使用する。任意の割合とは酵素の反応速度、温度とコストの関係で選択される割合であり、高濃度にすれば反応時間は短くて済むが、コストがかかる。好ましくは０．５〜１０％（Ｗ／Ｗ）の濃度であり、さらに好ましくは１〜５％（Ｗ／Ｗ）の濃度である。また、セルラーゼとペクチナーゼの混合割合はペクチナーゼの割合が多い方が好ましく、セルラーゼ：ペクチナーゼ＝１：２〜１：４が好ましい。適正なｐＨとは酵素が反応して植物組織を分解するための最適ｐＨのことであり、ｐＨ４〜８の範囲が好ましく、さらに好ましくはｐＨ５〜７の範囲である。
【００１０】
クチクラ膜単離作業の効率化のため、あるいは上述の酵素処理だけではクチクラ膜がきれいに単離できない場合、上述の酵素処理に酸処理を併用することができる。酸処理とは、酵素処理した植物葉の切片を塩化亜鉛を高濃度に溶解した濃厚な無機酸溶液に浮かべることにより、植物組織を完全に分解してクチクラ膜だけを単離する処理方法である。ここで使用する無機酸は植物組織を分解するものであれば特に限定されない。例えば、塩酸、硫酸、硝酸等であるが、作業性、後処理の点から塩酸を使用するのが好ましい。また、これら無機酸に溶解する塩化亜鉛の量はできる限り高濃度であることが好ましく、３０〜７０％（Ｗ／Ｗ）さらに好ましくは５０〜６０％である。
【００１１】
このようにして溶液上に浮かべた状態で単離したクチクラ膜は、化合物の植物クチクラ膜透過量及び／または透過速度を測定するのに使用する場合も引き続き溶液上に浮かべた状態で使用される。即ち、単離したクチクラ膜を媒質入りの容器に浮かべ、ここに被検化合物の溶液を添付し、媒質中に透過した化合物を定量分析する。
【００１２】
被検化合物としては、液体か、固体か、あるいは有機化合物か、無機化合物か、また単一化合物か、混合物か等によって限定されるものではなく、透過した化合物が容器内の媒質中に溶解し、それを何らかの分析手段で定量することが可能であれば何でも用いることができる。例えば、農薬、肥料、界面活性剤、鉱物油、植物油等である。農薬の種類についても特に限定はなく、殺菌剤、殺虫剤、殺ダニ剤、除草剤、植物成長調節剤等なんら制限はない。
【００１３】
媒質は、単離クチクラ膜が浮かんだ状態を保てるものなら特に限定されることはないが、クチクラ膜を透過した化合物が媒質中に溶解した場合の安定性等を考慮するとｐＨが７．０付近で不純物が少ない蒸留水や脱イオン水が好ましい。しかしながら、化合物によって酸やアルカリ水溶液中でイオン化したり、不安定となるものがある。また、植物の種類によっては細胞内が酸性やアルカリ性を示すものがあり、実際の透過を再現するためには媒質のｐＨを調整した方がよい場合がある。このような場合は適正なｐＨに調整した緩衝液を媒質としても何ら問題はない。
【００１４】
媒質中の浮かべたクチクラ膜に添付する被検化合物または混合物の溶液として、実際の農薬散布において使用される水和剤、乳剤、フロアブル剤、顆粒水和剤、ＥＷ剤等の散布用の農薬製剤品を使用濃度に合わせて水で希釈した溶液が使用できるが、ここに欧米等で茎葉処理除草剤等の効力増強剤として使用されるアジュバントを混合してもなんら差し支えない。また、開発中の化合物で製剤化されていない化合物の場合、化合物をアセトン、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ等の水溶性の溶剤に溶解し、ツイーン、トリトン等の界面活性剤と水を加えて混合することによる簡易乳剤や、乳鉢中で細かくすりつぶした化合物にリグニンスルホン酸ソーダ、アルキルベンゼンスルホン酸ソーダ等の粉末状の界面活性剤と微紛化した鉱物質担体等を混合することによる簡易水和剤等の使用も可能である。
【００１５】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明の内容をさらに具体的に示すが、本発明は特にこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１
【００１６】
[水和剤の調製]
１−エチル−５−ヒドロキシ−４−［４−メタンスルホニル−２−メチル−３−（３−メチル−１，２−イソオキサゾール−５−イル）ベンゾイルピラゾール（ＷＯ９７／４１１１８記載の除草剤有効成分：以下化合物Ａ）25部、リグニンスルホン酸Na６部、アルキルナフタレンスルホン酸Na６部、鉱物質担体及び有機質担体43部を良く混合した後、ウルマックスTM[ジェット粉砕機（日曹エンジニアリング（株）製]で粉砕して含量２５％の水和剤を調製した。
【００１７】
[植物葉クチクラ膜の単離]
コムギ、デントコーン、ダイズの葉の太い葉脈がない部分を直径１ｃｍのコルクボーラーを使用してリーフディスクを切り取り、これらをMASEROZIME R-10（ヤクルト薬品製）２％とCELLULAZE "ONOZUKA" R-10（ヤクルト薬品製）１％を溶解したｐH5.6の酢酸―酢酸Na緩衝液（50mM）に浮かべ、室温（２０〜２５℃）で５日間静置した。次に下部組織が分離のため、さらに塩化亜鉛58.8%(W/V)を溶解した濃塩酸に２時間浮かべ、下部組織を分解して除き、蒸留水で洗浄後に試験に使用した。
【００１８】
[薬液調製]
化合物Ａの投下量がヘクタール当たり２００リットルの散布量に対して５０ｇとなるように、先に調製した水和剤をニューコール２５（ソルビタンモノオレエート；日本乳化剤（株））の１％水溶液で希釈して薬液調製を行った。
【００１９】
[薬液処理]
蒸留水５ｍｌを入れた直径５cmの容器に、先に単離した植物葉クチクラ膜を２枚浮かべ、ここに調製した薬液をマイクロシリンジで５μLずつ添付し、温度２５℃、相対湿度５０％に調整された室内に静置した。薬液添付後30分、２時間、４時間、８時間、２４時間後に容器内の蒸留水をすべてサンプリングし、新たに５mlの蒸留水を添加した。サンプリング液は冷蔵庫に保存し、２４時間後のサンプリング終了後にまとめてＨＰＬＣで定量分析した。また２４時間後のサンプリング終了後、クチクラ膜上に残った薬剤も同時にＨＰＬＣでの定量分析を行った。結果を表１、図１に示す。
【００２０】
【表１】
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実施例２
【００２１】
[植物葉クチクラ膜の単離]
実施例１と同様の方法で単離したコムギ葉クチクラ膜を使用した。
【００２２】
[薬剤調製]
アトラジン47.5%水和剤[ゲザプリムTM（トモノアグリカ（株））]を薬剤の透過量がヘクタール当たり２００リットルの散布量に対して５００ｇとなるように蒸留水、またはDASH（植物油と界面活性剤の混合物）を１％となるように蒸留水で調製した溶液で希釈して薬液を調製した。
【００２３】
[薬液処理]
蒸留水5mlを入れた直径５cmの容器に、先に単離した各種植物葉クチクラ膜を２枚浮かべ、ここに調製した薬液をマイクロシリンジで５μLずつ添付し、室温２５℃、相対湿度５０％に調整された室内に静置した。薬液添付後30分、２時間、４時間、８時間、２４時間後に容器内の蒸留水をすべてサンプリングし、新たに５mlの蒸留水を添加した。サンプリング液は冷蔵庫に保存し、２４時間後のサンプリング終了後にまとめてＨＰＬＣで定量分析した。また２４時間後のサンプリング終了後、クチクラ膜上に残った薬剤も同時にＨＰＬＣでの定量分析を行った。結果を表２、図２に示した。
【００２４】
【表２】
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【００２５】
【発明の効果】
実施例１、２は本発明の評価方法を使って化合物Ａ及びアトラジンの植物葉クチクラ膜への透過性をラジオアイソトープ化合物を使用せずに評価した結果を示すものである。実施例はすべて３連で行ったが大きなバラツキはなく、本評価法の再現性も実証された。
本発明の測定方法を使用することにより、ラジオアイソトープで標識された化合物や特別な実験機器、実験器具を使用することなく、目的とする化合物の目的とする植物葉内への透過量、透過速度を短時間で再現性よく測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】化合物Ａの初期添付量に対する透過割合の経時変化を示すグラフ
【図２】アトラジンの初期添付量に対する透過割合の経時変化を示すグラフ
【図１】
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【図２】
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