(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列が配列番号37または配列番号43で示されるポリペプチドからなる薬物送達構築物。
【請求項２】
請求項１に記載の薬物送達構築物からなるニューロンの軸索成長阻害の抑制、軸索成長促進、神経損傷治療、脳卒中に関係する虚血損傷治療、または緑内障治療のための薬剤。
【請求項３】
請求項１に規定されるポリペプチドを調製するための方法であって、
−細胞内でポリペプチドの発現をもたらす条件の下に宿主細胞を培養すること、および
−精製ステップによってポリペプチドを回収することを含む方法。
【請求項４】
薬剤組成物の製造のための、請求項１に記載の薬物送達構築物の使用。
【請求項５】
ニューロンの軸索成長の阻害を抑制する薬物、軸索成長を促進するための薬物、神経損傷を治療する薬物または緑内障を治療する薬物の製造のための、請求項１に記載の薬物送達構築物の使用。
【請求項６】
薬剤として許容可能な担体および有効量の請求項１に記載の薬物送達構築物を含む薬剤組成物。
【請求項７】
生物学的接着剤をさらに含む、請求項６に記載の薬剤組成物。
【請求項８】
フィブリンをさらに含む、請求項６に記載の薬剤組成物。
【請求項９】
配列番号36または配列番号42のポリヌクレオチド配列からなる、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項９に記載の単離されたポリヌクレオチドで形質転換された細胞。
【請求項１１】
配列番号37または配列番号43で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば、C3(下記参照)(すなわち、C3様タンパク質、C3キメラタンパク質)を含むコンジュゲートまたは融合型タンパク質(ポリペプチド)に関する。以下では、特に軸索の再生および神経保護を促進するための使用に関連して本発明の融合型タンパク質を論ずるが、他の状況において融合タンパク質を利用できることは理解されるであろう。
【０００２】
特に、本発明は、哺乳類の神経系修復(例えば、中枢神経系(CNS)病変部位または末梢神経系(PNS)病変部位の修復)、軸索再生および軸索発芽、神経突起成長ならびに神経変性および虚血性損傷からの保護の分野に関する。
【０００３】
RhoファミリーGTPアーゼは、軸索の成長および再生を調節している。ボツリヌス菌のC3エキソトランスフェラーゼ(以下単にC3という)によるRhoの不活性化は、損傷した軸索の再生および発芽を刺激することができる。C3は、ボツリヌス菌から精製された毒素である(Saito他、1995年、FEBS Lett、371:105〜109頁;Wilde他、2000年、J.Biol.Chem.、275:16478頁)。ボツリヌス菌に由来するC3ファミリーの化合物は、ADPリボシル化によってRhoを不活性化し、Rhoの効果または機能のアンタゴニスト(Rhoアンタゴニスト)としての機能を果たす。
【０００４】
特に、本発明は、神経系における損傷を修復し、虚血性細胞死を防ぎ、Rhoの不活性化が必要とされる様々な疾患を治療するため、C3タンパク質(例えば、C3それ自身またはC3様トランスフェラーゼなどの他の活性類似体-下記参照)または他のRhoアンタゴニストを細胞内に送達する手段に関する。この送達手段は、キメラ(すなわち、コンジュゲート)C3様Rhoアンタゴニストという形をとってもよい。これらのコンジュゲートアンタゴニストは、C3化合物(単独)を上回る顕著な改善を提供する。なぜなら、コンジュゲートアンタゴニストは阻害性基質上の軸索成長の刺激に関して、組み換えC3単独に比べて3から4桁強力であるためである。これらのRhoアンタゴニストの例は、細胞膜の透過を容易にし(すなわち、アンタゴニストの細胞取り込みを促進し)、成長阻害性基質上の成長を刺激するためニューロンに投与された場合に用量反応を改善し、Rhoを不活性化するために作製される組み換えタンパク質として製造されている。これらのコンジュゲートRhoアンタゴニストの例をC3APL、C3APLT、C3APS、C3-TL、C3-TS、C3Basic1、C3Basic2およびC3Basic3の意味と関連して以下に記載する。
【背景技術】
【０００５】
脊髄の外傷性損傷は永久的な機能障害をもたらす。脊髄損傷に伴う大部分の欠陥は、中枢神経系(CNS)において損傷を受けた軸索の損失によって生じる。同様に、脳卒中、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)痴呆、プリオン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、多発性硬化症および緑内障などのCNSの他の疾患は、軸索損失および退縮と関係している。これらの疾患すべてに共通しているのは、それらの標的との軸索連絡の喪失、および細胞死である。感染または病変した神経集団からの軸索の成長を刺激する能力は、失われた神経機能の回復を改善すると思われ、細胞死からの保護は、損傷の範囲を制限することができる。例えば、白質脳卒中後には、たとえニューロンの細胞体が生きていても軸索が損傷を受けて失われ、灰白質における脳卒中は、多くのニューロンおよび非ニューロン(グリア)細胞を死に至らしめる。損傷した軸索からの発芽を誘発するのに有効な治療は、あるタイプの脳卒中を治療するのにも同様に有効である(Boston life science、2000年9月6日、プレスリリース)。神経保護剤は、脳卒中後の損傷を制限できる可能性のある化合物として試験されることが多い。成長促進と神経保護を共に示す化合物は、脳卒中および神経変性疾患の治療にとって特に優れた候補である。同様に、以下の考察は、Rhoアンタゴニストなどを外傷性の損傷を受けた中枢系に送達することに関するものであるが、本発明は、脳卒中、多発性硬化症、HIV痴呆、パーキンソン病、アルツハイマー病、プリオン病、またはCNS環境において軸索が損傷を受けたCNSの他の疾患などの未知の原因による損傷にも適用することができる。また、Rhoは、癌および転移(Clark他、2000年、Nature、406:532〜535頁)、および高血圧症(Uehata他、1997年、Nature、389:990頁)の治療にとっても重要な標的であり、RhoAは、心保護の役割を有していると報告されている(Lee他、FASEB J.、15:1886〜1884頁)。したがって、新たなC3様タンパク質は、Rho活性の阻害を必要とする様々な疾患に有用であることが期待される。
【０００６】
(切断)軸索、すなわち神経病変の再生を刺激する薬剤として様々なRhoアンタゴニストを用いることが提案されてきた。カナダ特許出願番号2,304,981(McKerracher他)および2,300,878(Strittmatter)を参照。これらの特許出願文書は、軸索の再生に使用するための例えばC3、キメラC3タンパク質などの知られているRhoアンタゴニスト(以下参照)ならびに知られているtrans-4-アミノ(アルキル)-1-ピリジルカルバモイルシクロヘキサンの中から選択される物質(同様に以下参照)またはRhoキナーゼ阻害剤の使用を提案している。C3は、ADPリボシル化によってRhoを阻害し、細胞にはほとんど無毒である(DillonおよびFeig、1995年、Methods in Enzymology:Small GTPase and their regulators Part.B.、256:174〜184頁)。
【０００７】
以下の考察は、一般的にCNSにおける修復に関係しまたは対象とするが、本明細書に記載の技法は、癌、転移、高血圧症、心疾患、発作、糖尿病性神経障害および脳卒中、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症(ALS)などの神経変性障害を含むがこれらに限定されない多くの他の疾患における使用まで広げることができる。Rhoアンタゴニストによる治療は、末梢神経の軸索成長の速度を高め、それによって手術後、例えば切断された肢の再付着後の末梢神経の修復に有効と思われる。また、我々の融合化合物(タンパク質)による治療は、それらの軸索成長促進作用のおかげで様々な末梢神経障害の治療に有効であることが期待される。
【０００８】
前述のように、脊髄の外傷性損傷は永久的な機能障害をもたらす。基質に結合した成長阻害性タンパク質は軸索成長を妨害するため、成体哺乳類のCNSでは軸索再生が起こらない。栄養因子などの多くの化合物は、ニューロン分化を亢進し、組織培養において軸索成長を刺激する。しかしながら、成長および分化を亢進する大部分の因子は、阻害性基質上で軸索の再生成長を促進することができない。組織培養において軸索成長を刺激することが知られている化合物が、CNSにおける軸索再生での治療的使用の可能性を最も正確に反映していることを立証するためには、ある化合物が成長阻害性基質上の軸索成長を可能にすることができることの立証が細胞培養試験に含まれていることが重要である。組織培養において許容性基質上で成長を刺激する栄養因子および分化因子の例は、神経成長因子(NGF)および脳由来成長因子などのニューロトロフィンである。しかしながら、NGFは、阻害性基質上の成長を促進せず(Lehmann他、1999年、19:7537〜7547頁)、in vivoにおいて軸索再生を促進する際にも有効ではなかった。脳由来神経栄養因子(BDNF)は、やはりin vivoにおける再生を促進するのに有効ではない(Mansour-Robaey他、J. Neurosci.、1994年、91:1632〜1636頁)。BDNFは、成長阻害性基質上の神経突起成長を促進しない(Lehmann他、同上)。
【０００９】
軸索再生を促進するためにRhoおよびRhoキナーゼが関わる細胞内シグナル伝達機構を標的とすることが提案されてきた(例えば、前述のカナダ特許出願番号2,304,981(McKerracher他)を参照)。Rhoの不活性化が成長阻害性基質上の軸索成長を促進することを立証するため、エフェクタードメインのADPリボシル化によってRhoを不活性化するタンパク質である組み換えC3が用いられた。このようなC3タンパク質は再生を効率的に促進することができるが、このようなC3タンパク質は細胞中にたやすく透過せず、したがってそれを有効にするためには高用量を投与しなければならないことが指摘されている。
【００１０】
機能回復を促進するのに必要な高用量の組み換えC3は、再生を促進するためのin vivoにおけるC3の使用に実際的な制約または限界をもたらす(Lehmann他、1999年、J. Neurosci.、19:7537〜7547頁;Morii、NおよびNarumiya、S、1995年、Methods in Enzymology、256巻パートB、196〜206頁)。組織培養試験では、例えば、阻害性基質上で成長を誘発するために用いることができるC3の最低量は25ug/mlであることが決定された(Lehmann他、1999年、J. Neurosci.、19:7537〜7547頁;Morii、NおよびNarumiya、S、1995年、Methods in Enzymology、256巻パートB、196〜206頁)。細胞を摩砕しない場合には、この用量でさえ無効である。損傷したマウス脊髄またはラット視神経には20gのマウスに対してC3を少なくとも40μg投与する必要があると推定されている(McKerracher、カナダ特許出願番号2,325,842)。ラットおよびマウスの実験に用いた体重あたりのスケールアップした等価用量で成人のヒトを治療するのに必要と思われる用量を計算すると、損傷したヒト脊髄には120mg/kgのC3(すなわち、単独)を投与する必要があると思われる。必要とされる大量の組み換えC3タンパク質は、大規模なタンパク質精製および費用のため製造に重大な問題を引き起こす。また、最低有効用量に大量のタンパク質が必要なため、試験することができる用量範囲も制限される。
【００１１】
損傷したCNSにおける修復を促進するためのC3の使用に関する別の関連する制限は、生細胞の原形質膜を容易に透過しないことである。生物学的作用を試験するためにC3が投与された組織培養試験では、細胞中に直接微量注入されるか(RidleyおよびHall、1992年、Cell、70:389〜399頁)、原形質膜を破壊するために細胞を摩砕して投与されている(Lehmann他、1999年、J. Neurosci.、19:7537〜7547頁;JinおよびStrittmatter、1997年、J. Neurosci.、17:6256〜6263頁)。In vivoにおける軸索損傷の場合には、損傷した軸索が環境から物質を容易に取り込むため、C3タンパク質は細胞に入ることができるようである。しかしながら、本発明のC3様タンパク質は、周囲の無損傷のニューロンにも作用して同じように新たに接続するのを助け、それによって回復を促進するようである。不完全脊髄損傷後には、脊髄回路を含む皮質レベルおよび皮質下レベルによる運動系の柔軟性が存在する(Raineteau、O.およびSchwab、M.E.、2001年、Nat Rev Neurosci、2:263〜73頁)。この柔軟性は、側枝の軸索発芽または樹状発芽およびシナプスの強化または弱化によるものと考えられる。さらに、予備の数本の腹外側繊維が歩行運動動作の著しい差に姿を変えることが分かったが、それは、これらの繊維が、脊髄の中枢パターン発生器による歩行運動パターンの開始および制御に重要なためである(Brustein、E.およびRossignol、S.、1998年、J Neurophysiol、80:1245〜67頁)。脊髄損傷後に予備の側枝皮質性脊髄繊維の再組織化が起こり、これが機能回復に寄与することは十分に立証されている(Weidner他、2001年、Proc. Natl. Acad. Sci. 98:3513〜3518頁)。再組織化および予備繊維の発芽の過程は、無損傷のニューロンに入ることができるC3様タンパク質による治療によって亢進されると思われる。このことは、機能回復を助けることが知られている軸索および樹状リモデリングの自発的柔軟性を亢進すると思われる。
【００１２】
受容体媒介性機構によって取り込むことができる組み換えタンパク質を製造するために、in vitroにおけるC3を送達する他の方法が行われている(Boquet、P.他、1995年、Meth. Enzymol.、256:297〜306頁)。この方法の欠点は、処理を必要とする細胞が必要な受容体を発現しなければならないことである。最後に、C21N-C3融合毒素と一緒にC2II結合タンパク質を組織培養培地に添加することは、受容体媒介性エンドサイトーシスによるC3の取り込みを可能にする(Barthe他、1998年、Infection and Immunity 66:1364頁)。この系の欠点は、細胞中のC3の多くが膜分画内に拘束されることである。さらに重要なことに、輸送を起こさせるには2種類の異なるタンパク質を別々に添加しなければならず(Wahl他、2000年、J. Cell Biol. 149:263頁)、この系をin vivoにおける疾患の治療に適用することを困難にしている。
【非特許文献１】Saito他、1995年、FEBS Lett、371:105〜109頁
【非特許文献２】Wilde他、2000年、J.Biol.Chem.、275:16478頁
【非特許文献３】Boston life science、2000年9月6日、プレスリリース
【非特許文献４】Clark他、2000年、Nature、406:532〜535頁
【非特許文献５】Uehata他、1997年、Nature、389:990頁
【非特許文献６】Lee他、FASEB J.、15:1886〜1884頁
【特許文献１】カナダ特許出願番号2,304,981(McKerracher他)
【特許文献２】カナダ特許出願番号2,300,878(Strittmatter)
【非特許文献７】DillonおよびFeig、1995年、Methods in Enzymology: Small GTPase and their regulators Part.B.、256:174〜184頁
【非特許文献８】Lehmann他、1999年、J.Neurosci.、19:7537〜7547頁
【非特許文献９】Mansour-Robaey他、J.Neurosci.、1994年、91:1632〜1636頁
【非特許文献１０】Morii、NおよびNarumiya、S、1995年、Methods in Enzymology、256巻)パートB、196〜206頁
【特許文献３】McKerracher、カナダ特許出願番号2,325,842
【非特許文献１１】RidleyおよびHall、1992年、Cell、70:389〜399頁
【非特許文献１２】JinおよびStrittmatter、1997年、J.Neurosci.、17:6256〜6263頁
【非特許文献１３】Raineteau、O.およびSchwab、M.E.、2001年、Nat Rev Neurosci、2:263〜73頁
【非特許文献１４】Brustein、E.およびRossignol、S.、1998年、J Neurophysiol、80:1245〜67頁
【非特許文献１５】Weidner他、2001年、Proc. Natl. Acad. Sci. 98:3513〜3518頁
【非特許文献１６】Boquet、P.他、1995年、Meth.Enzymol.、256:297〜306頁
【非特許文献１７】Barthe他、1998年、Infection and Immunity、66:1364頁
【非特許文献１８】Wahl他、2000年、J. Cell Biol. 149:263頁
【非特許文献１９】Wilde他、2001年、J.Biol.Chem.、276:9537〜9542頁
【非特許文献２０】Protein-structure and molecular proterties、第2版、T.E.Creighton、W.H.Freeman and Company、New-York、1993年
【非特許文献２１】Smith、T.F.およびWaterman、M.S.、1981年、Ad. Appl. Math.、2:482〜489頁
【非特許文献２２】Needleman、S.B.およびWunsch、C.D.、1970年、J.Mol.Biol.、48:443〜453頁
【非特許文献２３】J.Perbal、A Practical Guide to Molecular Cloning、John Wiley and Sons、1984年
【非特許文献２４】J.Sambrook他、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1989年
【非特許文献２５】T.A.Brown(編集者)、Essential Molecular Biology: A Practical Approach、第1および2巻、IRL Press、1991年
【非特許文献２６】D,M.GloverおよびB.D.Hames(編集者)、DNA Cloning: A Practical Approach、第1〜4巻、IRL Press、1995および1996年
【非特許文献２７】F.M.Ausubel他(編集者)、Current Protocols in Molecular Biology、Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience(1988年、現在までのすべてのアップデートを含む)
【非特許文献２８】Hitomi、他、2000年、67:1929〜39頁
【非特許文献２９】Trapp他、2001年、Mol.Cell.Neurosci.、17:883〜84頁
【非特許文献３０】Morissette、他、2000年、278:H1769〜74頁
【非特許文献３１】Kawamata、他、1998年、18:7402〜10頁
【非特許文献３２】Amano、他、1996年、271:648〜50頁
【非特許文献３３】Watanabe、他、1996年、271:645〜8頁
【非特許文献３４】Honjo、他、2001年、42:137〜44頁
【非特許文献３５】Rao、他、2001年、42:1029〜1037頁
【非特許文献３６】Sahai、他、1999年、9:136〜45頁
【非特許文献３７】Takamura、他、2001年、33:577〜81頁
【非特許文献３８】Imamura他、2000年、91:811〜6頁
【非特許文献３９】Chitaley、他、2001年、3:139〜144頁
【非特許文献４０】Somlyo、1997年、389:908〜911頁
【非特許文献４１】Nakahara、他、2000年、389:103〜6頁
【非特許文献４２】Ishizaki、他、2000年、57:976〜83頁
【非特許文献４３】Miyata、他、2000年、20:2351〜8頁
【非特許文献４４】Robertson、他、2000年、131:5〜9頁
【非特許文献４５】Chitaley、他、2001年、7:119〜22頁
【非特許文献４６】Lee他、2001年、FASEB J.、15:1886〜1894頁
【非特許文献４７】Greene AおよびTischler、A S、1976年、PNAS、73:2424頁
【非特許文献４８】KimuraおよびSchubert、1992年、Journal of Cell Biology、116:777〜783頁
【非特許文献４９】Keino-Masu、他、1996年、Cell、87:175〜185頁
【非特許文献５０】Matsui、他、1996年、EMBO J.、15:2208〜2216頁
【非特許文献５１】Matsui、他、1998年、J.Cell Biol.、140:647〜657頁
【非特許文献５２】Ishizaki、1997年、FEBS Lett.、404:118〜124頁
【非特許文献５３】Han他、2001年、J.Mol.Biol.、305:95頁
【非特許文献５４】Janknecht他、1981年、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、88:8972頁
【非特許文献５５】DiekmannおよびHall、1995年、Methods in Enzymology、第256巻、パートB、207〜215
【非特許文献５６】Rojas、1998年、16:370〜375頁
【非特許文献５７】Vives、1997年、272:16010〜16017頁
【非特許文献５８】Wender他、2000年、PNAS、24:13003〜13008頁
【非特許文献５９】Derossi、1996年、271:18188〜18193頁
【特許文献４】カナダ特許文書番号2,301,157
【特許文献５】米国特許5,652,122
【特許文献６】米国特許5,670,617
【特許文献７】米国特許5,674,980
【特許文献８】米国特許5,747,641
【特許文献９】米国特許5,804,604
【特許文献１０】PCT国際出願番号WO99/11809
【非特許文献６０】Frankel A.D.他、1988年、Cell、55:1189〜1193頁
【非特許文献６１】Aullo、他、1993年、12:921〜31頁
【非特許文献６２】Fawell、1994年、91:664〜668頁
【特許文献１１】米国特許番号6,080,724
【非特許文献６３】Bloch-Gallego、1993年、120:485〜492頁
【非特許文献６４】Schwarze、他、1999年、285:1569〜72頁
【非特許文献６５】Royas他、1998年、Nature Biotech.、16:370〜375頁
【非特許文献６６】Pecheur、J.Sainte-Marie、A.Bienvenue、D.Hoekstra、1999年、J.Membrane Biol.、167:1〜17頁
【非特許文献６７】David、他、1995年、42:594〜602頁
【非特許文献６８】Cai、他、1999年、22:89〜101頁
【非特許文献６９】Schnell、他、1994年、367:170〜173頁
【非特許文献７０】SchnellおよびSchwab、1990年、343:269〜272頁
【非特許文献７１】Huang、1999年、24:639〜647頁
【非特許文献７２】Derossi、1994年、269:10444〜10450頁
【非特許文献７３】Maizel、1999年、126:3183〜3190頁
【非特許文献７４】Basso、1995年、12:1〜21頁
【非特許文献７５】NortonおよびPoduslo、1973年、21:749〜757頁
【非特許文献７６】Studier他、1990年、Meth. Enzymol.、185:60〜89頁。Gene Expression Technology。D.V.Goeddel、編
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明によれば、治療的活性剤を含むコンジュゲート、薬物送達構築物、または融合タンパク質が提供され、活性剤は細胞壁膜を超えて送達され、コンジュゲートまたは融合タンパク質は、1つまたは複数の活性剤部分(すなわち、活性剤領域)の他に少なくとも1つまたは複数の輸送サブドメインまたは部分(すなわち、輸送剤領域)を含む。より具体的には、本明細書に記載するように、本明細書によれば、治療的活性剤が軸索(または樹状突起、または神経突起)成長(例えば、再生)を促進することができる(促進するための)コンジュゲートまたは融合タンパク質、すなわちコンジュゲートRhoアンタゴニストの形態のコンジュゲートまたは融合タンパク質が提供される。
【００１４】
その1態様によれば、本発明は、少なくとも1つの輸送剤領域および活性剤領域と自然に関係しない活性剤領域を含む[例えば、中枢神経系(CNS)病変部位または末梢神経系(PNS)病変部位におけるニューロンの軸索成長の阻害を抑制することができる(抑制するための)]薬物送達構築物またはコンジュゲートであって、輸送剤領域は、哺乳類(すなわち、ヒトまたは動物)組織または細胞中への活性剤領域の取り込みを促進することができ(すなわち、容易にし)、活性剤領域は、in vivoにおいて(哺乳類(例えば、ヒトまたは動物)において)、またはin vitroにおいて(細胞培養において)例えば成長阻害性基質上の軸索成長(例えば、再生)を促進することができる(すなわち、能力または可能性を有する)活性治療剤領域であり、それらの誘導体または同族体(すなわち、薬剤として許容可能なそれらの化学的等価体-薬剤として許容可能な誘導体または同族体)が含まれる薬物送達構築物またはコンジュゲートを提供する。
【００１５】
本発明によれば、活性剤領域は、ADPリボシルトランスフェラーゼC3領域であってもよい。本発明によれば、ADPリボシルトランスフェラーゼC3は、ボツリヌス菌由来のADPリボシルトランスフェラーゼ(例えば、ADPリボシルトランスフェラーゼC3)および全C3コード領域、またはADPリボシルトランスフェラーゼ活性を保持するC3コード領域の一部(断片)のみ、またはADPリボシルトランスフェラーゼ活性を保持するC3の類似体(誘導体)、またはRhoを効率的に不活性化することができる十分なC3コード領域が含まれる組み換えADPリボシルトランスフェラーゼ(例えば、ADPリボシルトランスフェラーゼC3)からなる群から選択することができる。また、活性剤は、Rhoに作用する他の知られているADPリボシルトランスフェラーゼから選択することができる(Wilde他、2000年、J.Biol.Chem.、275:16478〜16483頁; Wilde他、2001年、J.Biol.Chem.、276:9537〜9542頁)。
【００１６】
別の態様によれば、本発明は、(例えば、ペプチド結合または不安定な結合(すなわち、内部標的細胞環境中で容易に切断可能な、または化学的変化を受けやすい結合)によって)活性カーゴ部分と共有結合的に連結された輸送ポリペプチド部分(例えば、塩基性アミノ酸、例えばアルギニン、リジン、ヒスチジン、アスパラギン、グルタミンに富む)からなる薬物コンジュゲートであって、輸送ポリペプチド部分は、哺乳類(例えば、ヒトまたは動物)組織または細胞中への活性カーゴ部分(例えば、HIV(例えば、HIV-1)Tatタンパク質の輸送サブドメイン、ホメオタンパク質輸送配列(輸送ホメオタンパク質とも呼ばれる)(例えば、アンテナペディアのホメオドメイン)、ヒスチジンタグ(長さが4個から30個までのヒスチジン反復)またはそれらの変形誘導体もしくは同族体(すなわち、薬剤として許容可能なそれらの化学的等価体))の[受容体非依存性過程による]取り込みを促進することができる、または促進する能力を有し、活性カーゴ部分は、in vivoにおいて(哺乳類(例えば、ヒトまたは動物)において)、あるいはin vitroにおいて(細胞培養において)軸索成長(例えば、再生、発芽)または神経保護(細胞死の予防)を促進することができる(すなわち、能力または可能性を有する)(すなわち、促進するための)活性治療部分である薬物コンジュゲートを提供する。
【００１７】
本発明によれば、輸送ポリペプチド部分は、配列番号48、例えば配列番号46、配列番号47などのHIV(例えば、HIV-1)Tatタンパク質の輸送サブドメイン、例えば配列番号44、配列番号45などのアンテナペディアのホメオドメイン、ヒスチジンタグならびにそれらの機能性誘導体および類似体(例えば配列番号21、配列番号26、配列番号31)[すなわち、ポリアミン、または塩基性アミノ酸に富む任意のランダム配列の付加により]-[すなわち、薬剤として許容可能なそれらの化学的等価体]からなる群から選択することができ、活性カーゴ部分は、in vivoにおいて(哺乳類(例えば、ヒトまたは動物)において)、あるいはin vitroにおいて(細胞培養において)軸索成長(例えば、再生、発芽)または神経保護(細胞死の予防)を促進することができる(すなわち、能力または可能性を有する)(すなわち、促進するための)C3タンパク質からなる群から選択される。
【００１８】
本発明によれば、C3タンパク質は、ADPリボシルトランスフェラーゼC3およびADPリボシルトランスフェラーゼC3類似体からなる群から選択することができる。本発明によれば、ADPリボシルトランスフェラーゼは、ボツリヌス菌に由来するADPリボシルトランスフェラーゼ(例えば、ADPリボシルトランスフェラーゼC3)および組み換えADPリボシルトランスフェラーゼ(例えば、組み換えADPリボシルトランスフェラーゼC3)からなる群から選択することができる。ADPリボシルトランスフェラーゼは、黄色ブドウ球菌に由来するADPリボシルトランスフェラーゼ(Wilde他、2001年、J.Biol.Chem.、276:9537〜9542頁)などのC3様活性を有するタンパク質であってもよい。ADPリボシルトランスフェラーゼは、クロストリジウムリモスム(limosum)、およびセレウス菌に由来するトランスフェラーゼなどのRhoA、RhoBおよび/またはRhoCを不活性化するために作用するその他のトランスフェラーゼであってもよい(Wilde他、2000年、J.Biol.Chem.、275:16478〜16483頁)。本発明によれば、輸送ポリペプチド部分は、本明細書に記載の活性な隣接アミノ酸配列を含むことができる。
【００１９】
追加態様によれば、本発明は、カルボキシ末端活性カーゴ部分およびアミノ末端輸送部分からなる[例えば、中枢神経系(CNS)病変部位または末梢神経系(PNS)病変部位におけるニューロンの軸索成長の阻害を抑制することができる(抑制するための)]融合タンパク質(ポリペプチド)であって、アミノ末端輸送部分は、HIV(例えば、HIV-1)Tatタンパク質の輸送サブドメイン、ホメオタンパク質輸送配列(輸送ホメオタンパク質とも呼ばれる)(例えば、アンテナペディアのホメオドメイン)、ヒスチジンタグならびにそれらの機能性誘導体および類似体(すなわち、薬剤として許容可能なそれらの化学的等価体)からなる群から選択され、活性カーゴ部分はC3タンパク質からなる融合タンパク質を提供する。
【００２０】
特に、本発明は、カルボキシ末端活性カーゴ部分およびアミノ末端輸送部分からなる[例えば、中枢神経系(CNS)病変部位または末梢神経系(PNS)病変部位におけるニューロンの軸索成長の阻害を抑制することができる(抑制するための)]融合タンパク質(ポリペプチド)であって、アミノ末端輸送部分は、アンテナペディアのホメオドメインからなり、活性カーゴ部分はC3タンパク質(すなわち、本明細書に記載のように)からなる融合タンパク質を提供する。
【００２１】
特に、本発明は、カルボキシ末端活性カーゴ部分およびアミノ末端輸送部分からなる[例えば、中枢神経系(CNS)病変部位または末梢神経系(PNS)病変部位におけるニューロンの軸索成長の阻害を抑制することができる(抑制するための)]融合タンパク質(ポリペプチド)であって、アミノ末端輸送部分は、HIV(例えば、HIV-1)Tatタンパク質の輸送サブドメインからなり、活性カーゴ部分はC3タンパク質(すなわち、本明細書に記載のように)からなる融合タンパク質を提供する。
【００２２】
本発明によれば、C3タンパク質は、ADPリボシルトランスフェラーゼC3およびADPリボシルトランスフェラーゼC3類似体からなる群から選択することができる。本発明によれば、ADPリボシルトランスフェラーゼC3は、ボツリヌス菌に由来するADPリボシルトランスフェラーゼ(例えば、ADPリボシルトランスフェラーゼC3)および組み換えADPリボシルトランスフェラーゼ(例えば、組み換えADPリボシルトランスフェラーゼC3)からなる群から選択することができる。
【００２３】
追加態様によれば、本発明は、アミノ末端活性カーゴ部分およびカルボキシ末端輸送部分からなる[例えば、中枢神経系(CNS)病変部位または末梢神経系(PNS)病変部位におけるニューロンの軸索成長の阻害を抑制することができる(抑制するための)]融合タンパク質(ポリペプチド)であって、カルボキシ末端輸送部分は、HIV Tatタンパク質の輸送サブドメイン、ホメオタンパク質輸送配列(輸送ホメオタンパク質とも呼ばれる)(例えば、アンテナペディアのホメオドメイン)、ヒスチジンタグならびにそれらの機能性誘導体および類似体(すなわち、薬剤として許容可能なそれらの化学的等価体)からなる群から選択され、活性カーゴ部分はC3タンパク質からなる融合タンパク質を提供する。
【００２４】
特に、本発明は、アミノ末端活性カーゴ部分およびカルボキシ末端輸送部分からなる(例えば、中枢神経系(CNS)病変部位または末梢神経系(PNS)病変部位におけるニューロンの軸索成長の阻害を抑制することができる(抑制するための))融合タンパク質(ポリペプチド)であって、カルボキシ末端輸送部分は、アンテナペディアのホメオドメインからなり、活性カーゴ部分はC3タンパク質(すなわち、本明細書に記載のように)からなる融合タンパク質を提供する。
【００２５】
特に、本発明は、アミノ末端活性カーゴ部分およびカルボキシ末端輸送部分からなる(例えば、中枢神経系(CNS)病変部位または末梢神経系(PNS)病変部位におけるニューロンの軸索成長の阻害を抑制することができる(抑制するための))融合タンパク質(ポリペプチド)であって、カルボキシ末端輸送部分は、HIV Tatタンパク質の輸送サブドメインからなり、活性カーゴ部分はC3タンパク質(すなわち、本明細書に記載のように)からなる融合タンパク質を提供する。
【００２６】
本発明によれば、C3タンパク質は、ADPリボシルトランスフェラーゼC3およびADPリボシルトランスフェラーゼC3類似体からなる群から選択することができる。本発明によれば、ADPリボシルトランスフェラーゼC3は、ボツリヌス菌に由来するADPリボシルトランスフェラーゼC3および組み換えADPリボシルトランスフェラーゼC3からなる群から選択することができる。
【００２７】
他の態様では、本発明は、ニューロンの軸索成長の阻害を抑制するための、本明細書に記載の薬物送達構築体、本明細書に記載の薬物コンジュゲートおよび(例えば、薬剤として許容可能なそれらの化学的等価体を含む)本明細書に記載の融合タンパク質(ポリペプチド)からなる群から選択されるメンバーの使用を提供する。
【００２８】
他の態様では、本発明は、(例えば、ニューロンの軸索成長の阻害を抑制するための)薬剤組成物であって、薬剤として許容可能な希釈剤または担体、および本明細書に記載の薬物送達構築体、本明細書に記載の薬物コンジュゲートおよび(例えば、薬剤として許容可能なそれらの化学的等価体を含む)本明細書に記載の融合タンパク質(ポリペプチド)からなる群から選択される有効量の活性メンバーを含む薬剤組成物に関する。
【００２９】
さらに、本発明は、(例えば、ニューロンの軸索成長の阻害を抑制するための)薬剤組成物の製造のための、本明細書に記載の薬物送達構築体、本明細書に記載の薬物コンジュゲートおよび(例えば、薬剤として許容可能なそれらの化学的等価体を含む)本明細書に記載の融合タンパク質(ポリペプチド)からなる群から選択されるメンバーの使用を提供する。
【００３０】
また、本発明は、上記で定義した薬物送達構築体、コンジュゲートまたは融合タンパク質(ポリペプチド)を調製するための方法であって、
-細胞内で薬物送達構築体、コンジュゲートまたは融合タンパク質(ポリペプチド)の発現をもたらす条件の下に宿主細胞(細菌または真核生物の)を培養すること(また、薬物送達構築体、コンジュゲートまたは融合タンパク質(ポリペプチド)は、例えば、家畜の乳における組み換えタンパク質の生成などのように、動物において生産するために発現させることができる)および、
精製ステップによって薬物送達構築体、コンジュゲートまたは融合タンパク質(ポリペプチド)を回収することを含む方法に関する。
【００３１】
薬物送達構築体、コンジュゲートまたは融合タンパク質(ポリペプチド)の精製は、親和性方法、イオン交換クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、疎水性またはタンパク質精製に通常用いられるその他の精製技法によって行うことができる。精製ステップは、非変性条件で行われることが好ましい。一方、変性ステップが必要な場合には、当技術分野で知られている技法を用いてタンパク質を変性することができる。
【００３２】
また、本発明は、哺乳類細胞における薬物送達構築体、コンジュゲートまたは融合タンパク質(ポリペプチド)の発現に関し、シグナル配列と共に使用された場合に、細胞外環境中への融合タンパク質の発現および分泌を可能にするはずである。発現の他の系(酵母細胞、細菌細胞、昆虫細胞など)は、本明細書に記載の本発明の薬物送達構築体、コンジュゲートまたは融合タンパク質(ポリペプチド)を発現(生産)するのに適している。
【００３３】
特に、本発明は、C3APL(配列番号4)、C3APLT(配列番号37)、C3APS(配列番号6)、C3-TL(配列番号14)、C3-TS(配列番号18)、C3Basic1(配列番号25)、C3Basic2(配列番号30)、C3Basic3(配列番号35)、配列番号20、および配列番号43および薬剤として許容可能なそれらの化学的等価体からなる群から選択される融合タンパク質(ポリペプチド)を提供する。
【００３４】
追加態様によれば、本発明は、C3APL(配列番号4)、C3APLT(配列番号37)、C3APS(配列番号6)、C3-TL(配列番号14)、C3-TS(配列番号18)、C3Basic1(配列番号25)、C3Basic2(配列番号30)、C3Basic3(配列番号35)、配列番号20、および配列番号43および薬剤として許容可能なそれらの化学的等価体からなる群から選択されるポリペプチドを含む薬剤組成物を提供する。
【００３５】
本発明によれば、薬剤組成物は、例えば、フィブリン(例えば、フィブリングルー)などの生物学的接着剤をさらに含むことができる。
【００３６】
他の態様では、本発明は、少なくとも1つ(1つまたは複数)の輸送剤領域および活性剤領域を含み、前記活性剤領域は、ADPリボシルトランスフェラーゼC3およびADPリボシルトランスフェラーゼC3類似体から選択されるポリペプチド、および薬剤として許容可能な担体を含む薬剤組成物を提供する。
【００３７】
本発明によれば、輸送剤領域は、前記ポリペプチドのカルボキシ末端にあってもよく、活性剤領域は、前記ポリペプチドのアミノ末端にあってもよい。
【００３８】
本発明によれば、薬剤組成物は、例えば、フィブリン(例えば、フィブリングルー)などの生物学的接着剤をさらに含むことができる。
【００３９】
追加態様では、本発明は、少なくとも1つ(1つまたは複数)の輸送剤領域および活性剤領域を含み、前記活性剤領域は、ADPリボシルトランスフェラーゼC3およびADPリボシルトランスフェラーゼC3類似体から選択されるポリペプチド(輸送剤領域は、細胞中への(細胞内部または細胞膜中)活性剤領域の取り込みを促進することができる)を提供する。
【００４０】
追加態様では、本発明は、カルボキシ末端活性剤部分およびアミノ末端輸送部分領域(輸送剤領域は、細胞中への(細胞内部または細胞膜中)活性剤領域の取り込みを促進することができる)からなり、前記カルボキシ末端活性剤部分は、ADPリボシルトランスフェラーゼC3およびそのADPリボシルトランスフェラーゼC3類似体から選択することができるポリペプチドを提供する。
【００４１】
本発明によれば、カルボキシ末端輸送部分領域は、塩基性アミノ酸に富む領域およびプロリンに富む領域からなる群から選択することができる。
【００４２】
他の態様では、本発明は、アミノ末端活性剤部分およびカルボキシ末端輸送部分領域からなり、前記アミノ末端活性剤部分は、ADPリボシルトランスフェラーゼC3およびそのADPリボシルトランスフェラーゼC3類似体から選択することができるポリペプチドに関する。
【００４３】
本発明によれば、カルボキシ末端輸送部分領域は、塩基性アミノ酸に富む領域およびプロリンに富む領域からなる群から選択することができる。
【００４４】
さらに他の態様では、本発明は、(1、2、3個またはそれ以上の輸送剤領域を含む)少なくとも1つの輸送剤領域および活性剤領域からなり、前記活性剤領域は、ADPリボシルトランスフェラーゼC3およびADPリボシルトランスフェラーゼC3類似体から選択され、前記輸送剤領域は、前記活性剤領域と共有結合的に連結されているコンジュゲートに関する。
【００４５】
本発明によれば、輸送剤領域は、活性剤領域(本発明のC3様タンパク質およびその類似体)と架橋(例えば、化学的に架橋、紫外により架橋)することができる。
【００４６】
本発明によれば、組み換えDNA技術(例えば、スペーサーDNA配列(複数クローニング部位、リンカー)または発現してもC3様タンパク質の活性を妨害しないと思われるその他のDNA配列を含む、または含まないADPリボシルトランスフェラーゼC3またはADPリボシルトランスフェラーゼC3類似体のDNA配列と共にフレーム中で輸送剤領域のDNA配列をクローニングする)によって輸送剤領域をADPリボシルトランスフェラーゼC3およびADPリボシルトランスフェラーゼC3類似体と融合することができる。
【００４７】
追加態様では、本発明は、薬剤組成物の製造のための、C3APL(配列番号4)、C3APLT(配列番号37)、C3APS(配列番号6)、C3-TL(配列番号14)、C3-TS(配列番号18)、C3Basic1(配列番号25)、C3Basic2(配列番号30)、C3Basic3(配列番号35)、配列番号20、および配列番号43からなる群から選択されるポリペプチドの使用に関する。
【００４８】
他の態様では、本発明は、薬剤組成物の製造のため、または軸索成長を促進するため(促進することのため)もしくは神経損傷(例えば、外傷性神経損傷に起因する神経損傷または疾患による神経損傷)を治療することのため(治療において)、または細胞アポトーシス(CNSにおける虚血後などの細胞死)を予防すること(軽減すること、阻害すること(部分的または完全に))のため、またはニューロンの軸索成長の阻害を抑制すること(軽減すること)のため、または脳卒中に関係する虚血性障害の治療のため、またはRho活性を抑制すること(軽減すること)のため、または損傷した軸索を再生して(損傷した軸索がそれらの機能を部分的もしくは完全に回復するのを助ける)ため、または哺乳類(例えば、ヒト、動物)において、ニューロンが他の(周囲の)細胞(ニューロン細胞)と新たに連絡する(軸索、樹状突起、神経突起を発達する)のを助ける(助けることの)ための、少なくとも1つ(1つまたは複数の)輸送剤領域および活性剤領域を含むポリペプチドであって、前記活性剤領域は、ADPリボシルトランスフェラーゼC3およびADPリボシルトランスフェラーゼC3類似体からなる群から選択されるポリペプチドの使用に関する。
【００４９】
本発明によれば、輸送剤領域は、ポリペプチド(すなわち、タンパク質)のアミノ末端にあってもよく、ADPリボシルトランスフェラーゼC3またはADPリボシルトランスフェラーゼC3類似体は、ポリペプチド(すなわち、タンパク質)のカルボキシ末端にあってもよい。
【００５０】
本発明によれば、輸送剤領域は、ポリペプチド(すなわち、タンパク質)のカルボキシ末端にあってもよく、ADPリボシルトランスフェラーゼC3またはADPリボシルトランスフェラーゼC3類似体は、ポリペプチド(すなわち、タンパク質)のアミノ末端にあってもよい。
【００５１】
他の態様では、本発明は、(例えば、哺乳類(例えば、ヒト、動物)において)ニューロンの軸索成長の阻害を抑制する(ための)方法であって、薬物送達構築物、薬物コンジュゲート、融合タンパク質および(例えば、薬剤として許容可能なその化学的等価体を含む)ポリペプチド(前記ポリペプチドは、少なくとも1つの(1つまたは複数の)輸送剤領域およびADPリボシルトランスフェラーゼC3およびADPリボシルトランスフェラーゼC3類似体からなる群から選択される活性剤領域を含む)からなる群から選択されるメンバーを、前記阻害を相殺するのに有効な量で(患者の)中枢神経系(CNS)病変部位または末梢神経系(PNS)病変部位において(に対し)(直接)投与すること(例えば、送達すること)を含む方法を提供する。このような投与は、糖尿病性神経障害などの多種多様な末梢神経障害の治療に有用であると思われる。
【００５２】
例えば、本発明は、外傷性軸索損傷がない場合であっても、CNSにおける修復および/または修復の促進または成長の促進のために、組織または細胞中への取り込みを促進するため、C3コード配列に付加されたアミノ酸の塩基性ストレッチ(例えば、塩基性アミノ酸に富む領域)またはプロリンに富む領域を有するC3酵素を含む組み換えRhoアンタゴニストを提供する。塩基性アミノ酸に富む領域およびプロリンに富む領域の例は、以下に示してある。
【００５３】
他の態様では、本発明は、(例えば、哺乳類(例えば、ヒト、動物)において)軸索成長を促進する(ための)方法であって、少なくとも1つの輸送剤領域およびADPリボシルトランスフェラーゼC3およびADPリボシルトランスフェラーゼC3類似体からなる群から選択される活性剤領域を含むポリペプチドまたはコンジュゲートを、前記成長を促進するのに有効な量で、中枢神経系(CNS)病変部位または末梢神経系(PNS)病変部位において直接送達することを含む方法を提供する。
【００５４】
他の態様では、本発明は、(例えば、哺乳類(例えば、ヒト、動物)において)神経損傷を治療する(ための)方法であって、少なくとも1つの輸送剤領域およびADPリボシルトランスフェラーゼC3およびADPリボシルトランスフェラーゼC3類似体からなる群から選択される活性剤領域を含むポリペプチドまたはコンジュゲートを、中枢神経系(CNS)病変部位または末梢神経系(PNS)病変部位において(に対し)直接送達することを含む方法を提供する。
【００５５】
さらに追加態様では、本発明は、(例えば、哺乳類(例えば、ヒト、動物)において)細胞アポトーシスを予防する(ための)方法であって、少なくとも1つの輸送剤領域およびADPリボシルトランスフェラーゼC3およびADPリボシルトランスフェラーゼC3類似体からなる群から選択される活性剤領域を含むポリペプチドまたはコンジュゲートを、中枢神経系(CNS)病変部位または末梢神経系(PNS)病変部位において直接送達することを含む方法を提供する。
【００５６】
別の態様では、本発明は、(例えば、哺乳類(例えば、ヒト、動物)において)脳卒中に関係する虚血性損傷を治療する(ための)方法であって、少なくとも1つの輸送剤領域およびADPリボシルトランスフェラーゼC3およびADPリボシルトランスフェラーゼC3類似体からなる群から選択される活性剤領域を含むポリペプチドまたはコンジュゲートを、中枢神経系(CNS)病変部位において(前記哺乳類に)直接送達することを含む方法を提供する。
【００５７】
別の態様では、本発明は、Rho活性を抑制する(ための)方法であって、少なくとも1つの輸送剤領域およびADPリボシルトランスフェラーゼC3およびADPリボシルトランスフェラーゼC3類似体からなる群から選択される活性剤領域を含むポリペプチドまたはコンジュゲートを、前記活性を抑制するのに有効な量で、中枢神経系(CNS)または末梢神経系(PNS)病変部位病変部位において直接送達することを含む方法を提供する。
【００５８】
追加態様によれば、本発明は、(例えば、哺乳類(例えば、ヒト、動物)において)損傷した軸索を再生する(ための)方法であって、少なくとも1つの輸送剤領域およびADPリボシルトランスフェラーゼC3およびADPリボシルトランスフェラーゼC3類似体からなる群から選択される活性剤領域を含むポリペプチドまたはコンジュゲートを、前記損傷軸索を再生するのに有効な量で、(例えば、哺乳類における)中枢神経系(CNS)病変部位または末梢神経系(PNS)病変部位において直接送達することを含む方法を提供する。
【００５９】
他の態様によれば、本発明は、ニューロンが他の(周囲の)細胞(ニューロン細胞)と新たな結合を作る(軸索、樹状突起、神経突起を発達する)のを助ける(ための)方法であって、少なくとも1つの輸送剤領域およびADPリボシルトランスフェラーゼC3およびADPリボシルトランスフェラーゼC3類似体からなる群から選択される活性剤領域を含むポリペプチドまたはコンジュゲートを、中枢神経系(CNS)病変部位または末梢神経系(PNS)病変部位において直接送達することを含む方法を提供する。
【００６０】
追加態様では、本発明は、少なくとも1つ(1つまたは複数の)輸送剤領域および活性剤領域を含むポリペプチドを調製する(ための)方法であって、前記輸送剤領域は、配列番号21、配列番号26、配列番号31、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48およびそれらの類似体からなる群から選択することができ、前記活性剤領域は、ADPリボシルトランスフェラーゼC3およびADPリボシルトランスフェラーゼC3類似体からなる群から選択することができ、前記方法は、
-細胞内でポリペプチドの発現をもたらす条件の下に宿主細胞を培養すること、および
-精製ステップによってポリペプチドを回収することを含む方法を提供する。
【００６１】
本発明によれば、ポリペプチドの精製は、親和性方法、イオン交換クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、疎水性またはタンパク質精製に通常用いられるその他の精製技法によって行うことができる。精製ステップは、非変性条件で行われることが好ましい。一方、変性ステップが必要な場合には、当技術分野で知られている技法を用いてタンパク質を変性することができる。
【００６２】
別の態様では、本発明は、塩基性アミノ酸に富む領域および活性剤領域からなるポリペプチドであって、前記の塩基性に富む領域からのアミノ酸は、ヒスチジン、アスパラギン、グルタミン、リジンおよびアルギニンからなる群から選択されるアミノ酸を含み、活性剤領域は、ADPリボシルトランスフェラーゼC3であるポリペプチドを提供する。
【００６３】
さらに別の態様では、本発明は、ニューロンの軸索成長の阻害を抑制するための薬物(または薬剤組成物)の製造のための、少なくとも1つの輸送剤領域および活性剤領域を含むポリペプチド(前記活性剤領域は、ADPリボシルトランスフェラーゼC3およびADPリボシルトランスフェラーゼC3類似体から選択される)の使用に関する。
【００６４】
本発明によれば、ポリペプチドは、C3APL(配列番号4)、C3APLT(配列番号37)、C3APS(配列番号6)、C3-TL(配列番号14)、C3-TS(配列番号18)、C3Basic1(配列番号25)、C3Basic2(配列番号30)、C3Basic3(配列番号35)、配列番号20および配列番号43からなる群から選択することができる。
【００６５】
他の態様では、本発明は、軸索成長を促進するための薬物(または薬剤組成物)の製造のための、少なくとも1つの輸送剤領域および活性剤領域を含むポリペプチド(前記活性剤領域は、ADPリボシルトランスフェラーゼC3およびADPリボシルトランスフェラーゼC3類似体から選択される)の使用に関する。
【００６６】
本発明によれば、ポリペプチドは、C3APL(配列番号4)、C3APLT(配列番号37)、C3APS(配列番号6)、C3-TL(配列番号14)、C3-TS(配列番号18)、C3Basic1(配列番号25)、C3Basic2(配列番号30)、C3Basic3(配列番号35)、配列番号20および配列番号43からなる群から選択することができる。
【００６７】
さらに他の態様では、本発明は、(例えば、哺乳類(例えば、ヒト、動物)における)神経損傷を治療するための薬物(または薬剤組成物)の製造のための、少なくとも1つの輸送剤領域および活性剤領域を含むポリペプチド(前記活性剤領域は、ADPリボシルトランスフェラーゼC3およびADPリボシルトランスフェラーゼC3類似体から選択される)の使用に関する。
【００６８】
本発明によれば、ポリペプチドは、C3APL(配列番号4)、C3APLT(配列番号37)、C3APS(配列番号6)、C3-TL(配列番号14)、C3-TS(配列番号18)、C3Basic1(配列番号25)、C3Basic2(配列番号30)、C3Basic3(配列番号35)、配列番号20および配列番号43からなる群から選択することができる。
【００６９】
本発明によれば、本明細書に記載の輸送剤領域は、塩基性アミノ酸に富む領域(塩基性アミノ酸(例えば、アルギニン、リジン、ヒスチジン、グルタミン、および/またはアスパラギン)を含む領域)およびプロリンに富む領域(例えば、プロリンを含む領域)からなる群から選択することができる。
【００７０】
本発明によれば、本明細書に記載の塩基性アミノ酸に富む領域は、配列番号48、HIV Tatタンパク質のサブドメイン(例えば、配列番号46、配列番号47、または輸送配列としての機能を果たすと思われるTatのその他のドメイン)、アンテナペディアのホメオドメイン(例えば、配列番号44、配列番号45、または輸送配列としての機能を果たすと思われるアンテナペディアのその他のドメイン)、ホメオタンパク質輸送配列、ヒスチジンタグ、およびそれらの類似体(例えば、配列番号21、配列番号26、配列番号31)からなる群から選択することができる。
【００７１】
本発明によれば、本明細書に記載の塩基性アミノ酸領域は、配列番号21(Basic1)、配列番号26(Basic2)、配列番号31(Basic3)、配列番号44(APL)、配列番号45(APS)、配列番号46(TL)、配列番号47(TS)、およびそれらの類似体からなる群から選択することができる。
【００７２】
本発明によれば、本明細書に記載のプロリンに富む領域は、配列番号48(APLT)およびその類似体からなる群から選択することができる。
【００７３】
別の態様では、本発明は、配列番号3、配列番号5、配列番号13、配列番号17、配列番号19、配列番号24、配列番号29、配列番号34、配列番号36および配列番号42からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列(例えば、好適な(DNA)主鎖(例えば、プラスミド、ウイルスベクター)をさらに有する(または場合によっては有さない)本明細書に開示のポリヌクレオチド配列)を少なくとも含む単離ポリヌクレオチドを提供する。
【００７４】
さらに別の態様では、本発明は、配列番号3、配列番号5、配列番号13、配列番号17、配列番号19、配列番号24、配列番号29、配列番号34、配列番号36および配列番号42からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列(例えば、好適な(DNA)主鎖(例えば、プラスミド、ウイルスベクター)をさらに有する(または場合によっては有さない)本明細書に開示のポリヌクレオチド配列)を少なくとも含む単離ポリヌクレオチドにより形質転換された(形質移入された、形質導入された、感染した、電気穿孔された、微量注入されたなどの)細胞を提供する。
【００７５】
他の態様では、本発明は、輸送部分と併せてカーゴ部分からなる送達剤であって、輸送部分は、配列番号48およびその類似体からなる群から選択される送達剤を提供する。配列番号48およびその類似体は、細胞膜の透過を促進する輸送部分としての役割を果たす。配列番号48またはそのいくつかの類似体に連結した(例えば、接続した)任意のカーゴ部分(例えば、タンパク質、化学物質)も本発明に包含される。例えば、配列番号48およびその類似体は、抗癌剤、治療剤、アポトーシス剤、抗アポトーシス剤、リポータータンパク質、抗体、抗体断片、色素、プローブ、マーカーなどと融合させることができる。
【００７６】
本発明によれば、カーゴ部分は、輸送部分依存性細胞内送達後に生物活性を保持することができる。生物活性には、例えば、生物学的特性(例えば、酵素活性)ならびにその免疫学的特性が含まれる。カーゴ部分は、例えば、その内部移行後に細胞を死に至らしめるなどの細胞に対する直接の生物学的作用を有し、または、間接的な生物学的作用を有し、例えば、カーゴ部分は、それ自体は不活性であるが、修飾(例えば、切断、リン酸化など)後もしくは第二の分子が細胞の内部に導入された場合に活性となるプロドラッグであってもよい。また、カーゴ部分は、標識分子(例えば、化学物質、タンパク質)およびイメージング分子などの生物学的に不活性な(すなわち、イナートな)化合物であってもよい。
【００７７】
本発明によれば、送達剤は、カーゴ部分であるアミノ末端を有する、および輸送部分であるカルボキシ末端を有する融合タンパク質であってもよい。
【００７８】
本発明によれば、カーゴ部分は、分析用分子(例えば、組織培養実験で使用される分子、マーカー、プローブ、色素、リポータータンパク質)、治療用分子(例えば、毒素、薬物、プロドラッグ)、予防用分子および診断用分子(すなわち、in vivoおよびin vitroにおいて特定の病状、代謝、他の分子の検出で使用される分子)からなる群から選択することができる。分析用分子、治療用分子、予防用分子および診断用分子の例には、タンパク質(例えば、酵素(例えば、ヌクレアーゼ、プロテアーゼ、キナーゼなど)、サイトカイン、ケモカイン、抗原、抗体、抗体断片、西洋わさびペルオキシダーゼなどのリポータータンパク質、ベータ-ガラクトシダーゼ、蛍光性タンパク質(例えば、緑色蛍光性タンパク質))、核酸、多糖、色素、同位元素(例えば、放射性同位元素)、マーカー、プローブ、および他のタイプの化学物質が含まれる。本発明の輸送ポリペプチドは、化学的架橋または遺伝的融合によってカーゴ分子と有利に接続することができる。
【００７９】
本発明によれば、カーゴ部分は、ADPリボシルトランスフェラーゼC3およびそのADPリボシルトランスフェラーゼC3類似体からなる群から選択することができる。
【００８０】
追加態様では、本発明は、配列番号48およびその類似体で示されるポリペプチドに関する。
【００８１】
さらに追加の態様では、本発明は、配列番号48およびその類似体で示されるポリペプチドであって、前記ポリペプチドおよび類似体は、分析用分子、治療用分子、予防用分子、および診断用分子からなる群から選択されるカーゴ剤の細胞内送達のための輸送剤としての役割を果たすことができるポリペプチドを提供する。
【００８２】
本発明によれば、カーゴ剤は、ADPリボシルトランスフェラーゼC3およびそのADPリボシルトランスフェラーゼC3類似体からなる群から選択することができる。
【００８３】
細胞膜を超えるカーゴ部分の輸送(細胞内送達)は、配列番号48およびその類似体に連結された(例えば、遺伝学的に融合された、化学的に架橋されたなど)場合に促進する(増加させる)ことができる。したがって、本発明の1目的は、カーゴ部分の細胞内送達のための方法であって、カーゴ部分および輸送部分を含む送達剤に細胞を曝露することを含み、前記輸送部分は、配列番号48およびその類似体からなる群から選択され、前記輸送部分は、送達剤が細胞内部に(すなわち、細胞膜を超えて)送達されるのを可能にする方法を提供することである。細胞膜を超えて送達することができるカーゴ部分の例は、ADPリボシルトランスフェラーゼC3およびその類似体である。カーゴ部分の他の例については本明細書に述べられている。また、本方法は、細胞による送達剤の取り込みを可能にするのに十分な方法(例えば、濃度)で標的細胞の周囲においてカーゴ部分および輸送部分(配列番号48およびその類似体)を含む送達剤を与えることも含む。例えば、in vitro(例えば、細胞培養)における送達の場合には、(薬剤として許容可能な担体、希釈剤、賦形剤などの中の)送達剤を、接着細胞(すなわち、細胞系または一次細胞)の細胞外環境(例えば、細胞培養培地)または懸濁液中の細胞に直接添加することができる。あるいは、送達剤と接触させる前に、細胞を採取し濃縮することができる。細胞内送達は、例えば、免疫蛍光、免疫組織化学などの当技術分野で知られている技法により、またはカーゴ部分の固有の特性(例えば、その酵素活性)によりモニターすることができる。
【００８４】
In vivoにおける送達は、例えば、カーゴ部分の生物学的作用(例えば、傷ついた組織の回復、治癒など)を促進するのに十分な量で、本発明の(薬剤として許容可能な担体、希釈剤、賦形剤、フィブリンゲルなどの中の)送達剤で組織、神経損傷部位、開放創などを曝露すること(すなわち、接触させること)によって行うことができる。さらに、in vivoにおける送達は、任意の好適な手段を用い、経口および鼻腔膜を含む粘膜における筋肉内(IM)、皮下(SC)、皮内(ID)、静脈内(IV)または腹腔内(IP)経路を介する注入などの当技術分野で知られている他の方法によって行うことができる。あるいは、哺乳類から細胞を単離し、同一個体において、または適合する個体において再注入する前に本発明の送達剤でex-vivoにおいて(例えば、遺伝子療法技法において)処理(曝露)することができる。
【００８５】
本明細書で使用する用語「Rhoアンタゴニスト」には、C3キメラタンパク質を含む(知られている)C3、およびRho様アンタゴニストが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００８６】
用語「C3タンパク質」は、ボツリヌス菌から単離されたADPリボシルトランスフェラーゼC3または組み換えADPリボシルトランスフェラーゼを指す。
【００８７】
本明細書で使用する用語「C3様タンパク質」、「ADPリボシルトランスフェラーゼC3様タンパク質」、「ADPリボシルトランスフェラーゼC3類似体」、「C3様トランスフェラーゼ」または「C3キメラタンパク質」は、ADPリボシルトランスフェラーゼC3と類似した(例えば、同じ、実質的に類似した)生物活性を有する任意のタンパク質(ポリペプチド)を指す。このようなC3様タンパク質の例には、例えば、C3APL、C3APLT、C3APS、C3-TL、C3-TS、C3Basic1、C3Basic2およびC3Basic3ならびに配列番号20で定義されるタンパク質が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００８８】
用語「神経損傷部位」は、外傷性神経損傷または疾患による神経損傷の部位を指す。神経損傷部位は、単一神経(例えば、坐骨神経)または多くの神経(例えば、脊髄の損傷領域)の神経路であってもよい。神経損傷部位は、中枢神経系もしくは末梢神経系または修復を必要とする任意の領域にあってもよい。神経損傷部位は、脳卒中による損傷の結果として形成することがある。神経損傷部位は、手術、脳腫瘍摘出または癌性病変後の治療の結果として脳にあってもよい。神経損傷部位は、脳卒中、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、糖尿病またはその他のタイプの神経変性疾患に起因することがある。
【００８９】
用語「カーゴ」は、輸送部分以外の(1)細胞(例えば、細胞分画)に入ることが本質的に不可能である、または(2)有用な速度で細胞(例えば、細胞分画)に入ることが本質的に不可能である分子を指す。本明細書で使用する用語「カーゴ」は、分子それ自体、すなわちコンジュゲーション前の分子、あるいは輸送ポリペプチド-カーゴコンジュゲートのカーゴ部分を指す。「カーゴ」の例には、小分子ならびにポリペプチド、核酸(ポリヌクレオチド)、多糖および化学物質などの巨大分子が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００９０】
本明細書で使用する用語「送達剤」は、カーゴ部分および輸送部分を含む薬剤に関する。カーゴ部分の例は上記に記載し、例えば、ADPリボシルトランスフェラーゼC3およびADPリボシルトランスフェラーゼC3類似体が含まれる。輸送部分の例は、例えば、配列番号48およびその類似体を含む。
【００９１】
一般的に、「ポリヌクレオチド」は、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを指し、非修飾RNAもしくはDNA、または修飾RNAもしくはDNAであってもよい。「ポリヌクレオチド」には、一本鎖および二本鎖DNA、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるDNA、一本鎖および二本鎖RNA、ならびに一本鎖および二本鎖領域の混合物であるRNA、一本鎖または、より典型的には二本鎖もしくは一本鎖および二本鎖領域の混合物であってもよいDNAおよびRNAを含むハイブリッド分子が含まれるが、これらに限定されるものではない。さらに、「ポリヌクレオチド」は、RNAもしくはDNAまたはRNAとDNAを共に含む三本鎖領域を指す。また、用語ポリヌクレオチドには、安定性のため、または他の理由で修飾された主鎖を有する1つまたは複数の修飾塩基およびDNAまたはRNAを含むDNAまたはRNAが含まれる。「修飾された」塩基には、例えば、トリチル化された塩基およびイノシンなどの異常な塩基が含まれる。DNAおよびRNAに対して様々な修飾が行われてきた。したがって、「ポリヌクレオチド」は、通常天然に見いだされる化学的、酵素的または代謝的に修飾された形態のポリヌクレオチドならびにウイルスおよび細胞に特徴的な化学的形態のDNAおよびRNAを包含する。「ポリヌクレオチド」には、線状分子および末端閉鎖分子が含まれるが、これらに限定されるものではない。また、「ポリヌクレオチド」は、多くの場合オリゴヌクレオチドと呼ばれる比較的短いポリヌクレオチドも包含する。
【００９２】
「ポリペプチド」は、ペプチド結合または修飾ペプチド結合(すなわち、ペプチドアイソスター)によってお互いと結合した2個以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質を指す。「ポリペプチド」は、一般にペプチドと呼ばれる短鎖、オリゴペプチドすなわちオリゴマーと一般的にタンパク質と呼ばれる長鎖を共に指す。前述のように、ポリペプチドは、20個の遺伝子がコードされたアミノ酸以外のアミノ酸を含むことができる。
【００９３】
本明細書で使用する用語「類似体」は、変異体、変種、キメラ体、融合体、欠失体、付加体および所与のポリペプチドに関した作製された他のタイプの修飾体を指す。用語「類似体」は、同族体、誘導体および化学的等価体または生物学的等価体の同義語である。
【００９４】
本明細書で使用する用語「相同な」配列は、C3APL、C3APLT、C3APS、C3-TL、C3-TS、C3Basic1、C3Basic2およびC3Basic3のDNA配列またはポリペプチド配列から誘導されるヌクレオチドまたはアミノ酸を指す。
【００９５】
本明細書で使用する用語「非相同な」配列は、非相同なポリペプチドのDNA配列またはアミノ酸配列を指し、C3APL、C3APLT、C3APS、C3-TL、C3-TS、C3Basic1、C3Basic2およびC3Basic3の配列以外の配列が含まれる。
【００９６】
本明細書で使用する用語「塩基性アミノ酸に富む領域」は、高含有量のアルギニン、ヒスチジン、アスパラギン、グルタミン、リジン(Lys)などの塩基性アミノ酸を有するタンパク質の領域を指す。「塩基性アミノ酸に富む領域」は、例えば、15%以上(100%まで)の塩基性アミノ酸を有することがある。場合によっては、「塩基性アミノ酸に富む領域」は、15%未満の塩基性アミノ酸を有し、依然として輸送剤領域として機能することがある。塩基性アミノ酸に富む領域は、30%以上(100%まで)の塩基性アミノ酸を有することがより好ましい。
【００９７】
本明細書で使用する用語「プロリンに富む領域」は、その配列中に5%以上(100%まで)のプロリンを有するタンパク質の領域を指す。場合によっては、「プロリンに富む領域」は、5%と15%の間のプロリンを有することがある。さらに、「プロリンに富む領域」は、天然に存在するタンパク質(例えば、ヒトゲノムによってコードされるタンパク質)において一般に観察されるより多くのプロリンを含有するタンパク質の領域を指す。本発明の「プロリンに富む領域」は、輸送剤領域として機能する。
【００９８】
本明細書で使用する用語「ニューロンが他の細胞と新たな結合を作るのを助けるため」または「ニューロンが新たな細胞結合を作るのを助けること」は、細胞(例えば、ニューロン)または組織を本発明の薬物送達構築物、コンジュゲート、融合タンパク質、ポリペプチドまたは薬剤組成物で処理すると、例えば、新たな樹状突起、新たな軸索または新たな神経突起(すなわち、細胞発芽)を成長(発達)させ、またはすでに存在する樹状突起、軸索または神経突起(すなわち、細胞発芽)をさらに成長させることができることを意味する。
【００９９】
本明細書で使用する用語「ベクター」は、異種DNAまたはRNA断片が挿入され、次いで異種DNAまたはRNA分子の発現または増幅のために宿主細胞中に伝播される自己複製DNAまたはRNA分子を指す。用語「ベクター」は、DNA配列をある生物体から別の生物体に移動するのに用いることができるプラスミド(例えば、線形化したまたはしていない)を含むが、これらに限定されるものではない。
【０１００】
用語「薬剤として許容可能な担体」または「アジュバント」および「生理学的に許容可能な媒体」などは、本発明の化合物と一緒に患者に投与することができる許容可能な担体またはアジュバントを指していると理解すべきである。さらに、本明細書で使用する「薬剤として許容可能な担体」または「薬剤担体」は当技術分野で知られており、0.01-0.1M、好ましくは0.05Mリン酸緩衝液または0.8%食塩水が含まれるが、これらに限定されるものではない。さらに、このような薬剤として許容可能な担体は、水性または非水溶液、懸濁液、および乳濁液であってもよい。非水溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルである。水性担体には、水、アルコール性/水溶液、乳濁液または懸濁液が含まれ、食塩水および緩衝媒質が含まれる。非経口媒体には、塩化ナトリウム溶液、リンゲルブドウ糖、ブドウ糖および塩化ナトリウム、乳酸加リンゲルまたは不揮発性油が含まれる。静脈内媒体には、リンゲルブドウ糖をベースとするような体液および栄養補給剤、電解質補給剤などが含まれる。例えば、抗菌薬、抗酸化剤、コレーティング剤、不活性ガスなどの保存剤および他の添加剤も存在することができる。
【０１０１】
本明細書で使用する「薬剤組成物」は、薬剤として許容可能な希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバントおよび/または担体と合わせた治療有効量(投与量)の薬剤を意味する。本明細書で使用する「治療有効量」は、所与の条件および投与計画に関して治療効果を提供する量を指す。このような組成物は、液体または凍結乾燥され、さもなければ乾燥製剤であり、様々な緩衝液含有量(例えば、Tris-HCl、酢酸塩、リン酸塩)、pHおよびイオン強度の希釈剤、表面への吸収を予防するためのアルブミンまたはゼラチンなどの添加剤、界面活性剤(例えば、Tween20、Tween80、Pluronic F68、胆汁酸塩)が含まれる。可溶化剤(例えば、グリセロール、ポリエチレングリセロール)、抗酸化剤(例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム)、保存剤(例えば、チメロサール、ベンジルアルコール、パラベン)、充填物質または張力改変剤(例えば、乳糖、マンニトール)、ポリエチレングリコールなどのポリマーとタンパク質との共有結合、金属イオンとの複合体形成、またはポリ乳酸、ポリグリコール酸、ヒドロゲルなどのポリマー化合物の粒子状調製物中もしくは粒子調製物上、リポソーム、マイクロエマルジョン、ミセル、単層もしくは多層小胞、赤血球ゴースト、もしくはスフェロプラスト上への材料の組み込み。このような組成物は、物理的状態、溶解度、安定性、in vivoにおける放出速度、およびin vivoにおけるクリアランス速度に影響を及ぼすはずである。制御放出組成物または徐放性組成物には、親油性デポー(例えば、脂肪酸、ワックス、油)中の製剤が含まれる。また、本発明は、ポリマー(例えば、ポロキサマーまたはポロキサミン)でコーティングされた粒子状組成物も包含する。本発明の組成物の他の実施形態は、非経口、経肺、経鼻および経口経路を含む様々な投与経路のために、粒子状剤型の保護コーティング、プロテアーゼ阻害剤または浸透エンハンサーを組み入れる。一実施形態では、薬剤組成物を非経口、傍癌(paracancerally)、経粘膜、経皮、筋肉内、静脈内、皮内、皮下、腹腔内、脳室内、頭蓋内、腫瘍内で、より好ましくは、中枢神経系(CNS)病変部位または末梢神経系(PNS)病変部位に直接投与する。
【０１０２】
さらに、用語「薬剤有効量」または「治療有効量」は、例えば、神経損傷を有する患者を治療する際に有効な量(投与量)を指す。また、本明細書では、「薬剤有効量」は、1投与量または任意の用量もしくは経路で服用される、または単独もしくは他の治療剤と組み合わせて服用される望ましい治療効果が得られる量として解釈できると理解すべきである。本発明の場合には、「薬剤有効量」は、例えば、ニューロンの軸索成長の阻害を(例えば、部分的または完全に)抑制する、軸索成長を促進する、細胞アポトーシスを予防する、Rho活性を抑制する、損傷した軸索の再生を助けることができる、またはニューロンが他の細胞と新たな結合を作るのを助けることができる本発明のADPリボシルトランスフェラーゼC3またはADPリボシルトランスフェラーゼC3類似体(例えば、融合タンパク質)の量として理解することができる。
【０１０３】
理解されるように、本発明のポリペプチド、例えば、活性剤領域(例えば、ADPリボシルトランスフェラーゼC3またはADPリボシルトランスフェラーゼC3類似体)または輸送剤領域(例えば、HIV Tatタンパク質のサブドメイン、またはアンテナペディアのホメオドメイン)およびポリペプチドまたは断片の生物活性に有害な影響を及ぼさないそれらの断片に対して多くの修飾を行うことができる。本発明のポリペプチドは、例えば、翻訳後プロセシングなどの自然過程により、または当技術分野で知られている化学的修飾技法により修飾されたアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。修飾は、ポリペプチド主鎖を含むポリペプチド、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシ末端においてどこに起きてもよい。同じタイプの修飾は、所与のポリペプチドにおけるいくつかの部位において同程度または様々な程度で存在することができる。また、所与のポリペプチドは、多くのタイプの修飾を含むことができる。ポリペプチドは、ユビキチン結合の結果として枝分かれしていてもよく、枝分かれの有無に関係なく環状であってもよい。環状、枝分かれおよび枝分かれ環状ポリペプチドは、翻訳後の自然過程に起因するか、合成法によって製造することができる。修飾は、例えば、アセチル化、アシル化、アセトアミドメチル(acetomidomethyl) (Acm)基の付加、ADPリボシル化、アミド化、フィアビン(fiavin)との共有結合、ヘム部分との共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体との共有結合、脂質または脂質誘導体との共有結合、ホスファチジルイノシトールとの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合の架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、ガンマ-カルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化(selenoylation)、硫酸化、アルギニル化などのタンパク質に対するアミノ酸の転移RNA媒介性付加およびユビキチン結合を含むが、これらに限定されるものではない(参考のため、Protein-structure and molecular proterties、第2版、T.E.Creighton、W.H.Freeman and Company、New-York、1993年を参照)。
【０１０４】
他のタイプのポリペプチド修飾は、そのような変化がポリペプチドの全体的な生物活性を実質的に変化させないポリペプチド配列における、例えば、アミノ酸挿入(すなわち、付加)、欠失および保存的あるいは非保存的(例えば、D-アミノ酸、デスアミノ酸(desamino acid))な置換(すなわち、置き換え)を含むことができる。本発明のポリペプチドは、例えば、生物学的に活性な変異体、変種、断片、キメラ、および類似体を含む。断片は、1つまたは複数のアミノ酸の切断を有するアミノ酸配列を包含し、切断は、アミノ末端(N末端)、カルボキシ末端(C末端)、またはタンパク質の内部によって生じることができる。本発明の類似体は、1つまたは複数のアミノ酸の挿入または置換を含む。変種、変異体、断片、キメラ、および類似体は、例えば、ニューロンの軸索成長を促進すること、ニューロンの軸索成長の阻害を抑制すること、神経突起成長を促進すること、アポトーシスを阻害すること、神経損傷を治療すること、損傷した軸索を再生することおよび/またはRhoアンタゴニストとしての役割を果たすことを含むが(本実施例に限定されない)本発明のポリペプチドの生物学的特性を有することができる。
【０１０５】
例示されているように(実施例13:逆Tat配列)、場合によっては、特定のポリペプチドにおけるアミノ酸の順序は重要ではない。本明細書に記載の輸送剤領域に関しては、たとえアミノ酸が本来の(自然に見いだされるような)順序(配列)でないとしても、この領域の輸送機能を保存することができる。
【０１０６】
置換の例は、保存的である(すなわち、ある残基が同じ一般タイプの別の残基によって置き換えられる)置換であってもよい。理解されるように、天然に存在するアミノ酸は、酸性、塩基性、中性および極性、または中性および非極性と細分類することができる。さらに、コードされるアミノ酸のうち3個は芳香族である。本発明のポリペプチドと異なるコードされたポリペプチドが、置き換えられているアミノ酸と同じグループからのアミノ酸で置換されたコドンを含むことは有用である可能性がある。したがって、場合によっては、塩基性アミノ酸であるLys、ArgおよびHisは交換可能であり、酸性アミノ酸であるAspおよびGluは交換可能であり、中性の極性アミノ酸であるSer、Thr、Cys、Gln、およびAsnは交換可能であり、非極性脂肪族アミノ酸であるGly、Ala、Val、Ile、およびLeuは交換可能であるが、大きさの点からGlyおよびAlaはより近縁関係にあり、Val、Ile、およびLeuはお互いにより近縁関係にあり、芳香族アミノ酸であるPhe、TrpおよびTyrは交換可能である。
【０１０７】
さらに、ポリペプチドを合成的に製造する場合には、DNAによって天然にはコードされないアミノ酸による置換を行うことができることに注目すべきである。例えば、代わりに使える残基には、nが2〜6である式NH2(CH2)nCOOHのオメガアミノ酸が含まれる。これらは、サルコシン、t-ブチルアラニン、t-ブチルグリシン、N-メチルイソロイシン、およびノルロイシンのような中性の非極性アミノ酸である。フェニルグリシンをTrp、TyrまたはPheの代わりに使うことができる。シトルリンおよびメチオニンスルホキシドは中性の非極性であり、システイン酸は酸性であり、オルニチンは塩基性である。プロリンはヒドロキシプロリンで置換され、特性を付与するコンホメーションを保持することができる。
【０１０８】
変異体または変種は、置換変異誘発によって生成され、本発明のポリペプチドの生物活性を保持することは当技術分野で知られている。これらの変種は、タンパク質分子中に除去された少なくとも1つのアミノ酸およびその場所に挿入された異なる残基を有する(知られている分子生物学技法を用いてDNA配列中の1つまたは複数のヌクレオチドを異なるヌクレオチドに変え、対応するメッセンジャーRNAのポリペプチドへの翻訳により異なるアミノ酸を与える)。例えば、置換変異誘発に関して興味のある1部位には、活性部位、または免疫学的部位であると確認された部位が含まれるが、これらに限定されるものではない。興味深い他の部位は、例えば、様々な種から得られた特定の残基が一致している部位である。これらの位置は、生物活性にとって重要なことがある。「保存的置換」として確認された置換の例を表1に示す。このような置換が望ましくない変化をもたらす場合には、表1において「例示的置換」と呼ぶ、またはアミノ酸に関して本明細書にさらに記載する他のタイプの置換を導入し、生成物をスクリーニングする。
【０１０９】
場合によっては、アミノ酸の置換、挿入、または欠失によってポリペプチドの生物活性を修飾することに興味が持たれる。例えば、ポリペプチドの修飾は、ポリペプチドの生物活性の向上をもたらし、その毒性を変調し、バイオアベイラビリティまたは安定性の変化をもたらし、その免疫学的活性または免疫学的同一性を変調することができる。機能または免疫学的同一性における実質的な修飾は、(a)置換の領域におけるポリペプチド主鎖の構造、例えばシートコンホメーションまたはラセンコンホメーションのような構造、(b)標的部位における分子の電荷または疎水性、または(c)側鎖の大きさを維持することに対する影響が著しく異なる置換を選択することによって行われる。天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいてグループに分けられる。
(1)疎水性:ノルロイシン、メチオニン(Met)、アラニン(Ala)、バリン(Val)、ロイシン(Leu)、イソロイシン(Ile)
(2)中性親水性:システイン(Cys)、セリン(Ser)、スレオニン(Thr)
(3)酸性:アスパラギン酸(Asp)、グルタミン酸(Glu)
(4)塩基性:アルパラギン(Asn)、グルタミン(Gln)、ヒスチジン(His)、リジン(Lys)、アルギニン(Arg)
(5)鎖の配向性に影響する残基:グリシン(Gly)、プロリン(Pro);および
(6)芳香族:トリプトファン(Trp)、チロシン(Tyr)、フェニルアラニン(Phe)
【０１１０】
非保存的置換は、これらの種類のうち1つのメンバーを別のメンバーで交換する必要がある。
【０１１１】
【表１】
0004489353.tif 000002
【０１１２】
アミノ酸配列挿入(例えば、付加)には、長さが1残基から100以上の残基を含むポリペプチドまでに及ぶアミノおよび/またはカルボキシ末端融合ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。他の挿入変種には、同種またはキメラを生成する異種ポリペプチドへのタンパク質のNまたはC末端の融合が含まれる。キメラポリペプチド(すなわち、キメラ、ポリペプチド類似体)は、同種または異種配列に融合された本発明のポリペプチドの配列を含む。前記同種または異種配列は、本発明のポリペプチドでキメラを生成した場合に1つまたは複数の生物学的または免疫学的特性を保持する配列を包含する。
【０１１３】
異種融合によって生成する他のタイプのキメラには、本発明の2つ以上のポリペプチドの反復によって生成する新たなポリペプチドが含まれる。反復数は、例えば、2から50単位(すなわち、反復)であってもよい。場合によっては、50を超える多くの反復を含むあらたなポリペプチドを得ることが有用なことがある。例えば、C3APL、C3APLT、C3APS、C3-TL、C3-TS、C3Basic1、C3Basic2およびC3Basic3などのポリペプチドを、(架橋技法または組み換えDNA技術技法を用い)それら自身と(例えば、C3APLTと融合したC3APLT)あるいは本発明の別のポリペプチドと(例えば、C3APLと融合したC3APLT)融合することが有用であることもある。
【０１１４】
さらに、例えば、HIV Tatタンパク質のサブドメイン、およびアンテナペディアのホメオドメインなどの輸送剤は、ADPリボシルトランスフェラーゼC3またはADPリボシルトランスフェラーゼC3類似体を含むポリペプチド中で2回以上繰り返すことができる。輸送剤領域は、ADPリボシルトランスフェラーゼC3またはADPリボシルトランスフェラーゼC3類似体のアミノ末端領域あるいはそのカルボキシ末端領域のどちらか一方、または両領域にあってもよい。輸送剤領域の反復は、望ましい細胞によるADPリボシルトランスフェラーゼC3またはADPリボシルトランスフェラーゼC3類似体の取り込みに影響を及ぼす(例えば、増加させる)ことがある。
【０１１５】
異種融合には、本発明のポリペプチドの異種ポリペプチドとの融合により製造される新たなポリペプチドが含まれる。このようなポリペプチドには、細菌ポリペプチド(例えば、ベータラクタマーゼ、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ、または大腸菌trp遺伝子座によりコードされる酵素)、酵母タンパク質、ウイルスタンパク質、ファージタンパク質、ウシ血清アルブミン、走化性ポリペプチド、免疫グロブリン定常領域(または他の免疫グロブリン領域)、アルブミン、またはフェリチンが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１１６】
他のタイプのポリペプチド修飾には、アミノ酸配列欠失(例えば、切断)が含まれる。これらは、一般には約1から30残基であり、約1から10残基がより好ましく、典型的には約1から5残基である。
【０１１７】
変異体、変種および類似体タンパク質
変異体ポリペプチドは、1つまたは複数の変異を有し、変異は、アミノ酸残基の欠失(例えば、切断)、挿入(例えば、付加)、または置換である。変異体は、天然に存在する(すなわち、自然源から精製または単離される)、または合成(例えば、コード化DNAに対し部位特異的変異誘発を行うことにより、または化学合成などの他の合成法によって製造される)による。したがって、本発明のポリペプチドは、天然に存在するか、あるいは組み換え(すなわち、組み換えDNA技法から調製される)であることは明らかである。
【０１１８】
当業者に知られている方法(例えば、Smith、T.F.およびWaterman、M.S.、1981年、Ad. Appl. Math.、2:482〜489頁、またはNeedleman、S.B.およびWunsch、C.D.、1970年、J.Mol.Biol.、48:443〜453頁により記載の方法)により測定したときに、本発明のポリペプチド、例えばC3APL、C3APLT、C3APS、C3-TL、C3-TS、C3Basic1、C3Basic2およびC3Basic3と少なくとも50%一致するタンパク質は本発明に含まれ、本発明のタンパク質と少なくとも70%または80%、より好ましくは90%一致するタンパク質も本発明に含まれる。これは、一般的に少なくとも5個、好ましくは少なくとも20個の隣接アミノ酸の領域にわたる。
【０１１９】
本明細書で使用する用語「変種」は、それぞれの基準ポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは異なるが本質的特性を保持しているポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。典型的なポリヌクレオチドの変種は、別の基準ポリヌクレオチドとはヌクレオチド配列が異なる。変種のヌクレオチド配列の変化は、基準ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変化させることもあれば変化させないこともある。ヌクレオチド変化は、本明細書に記載のように、基準配列によってコードされるポリペプチドにおいてアミノ酸の置換、付加、欠失、融合および切断をもたらすことがある。典型的なポリペプチドの変種は、別の基準ポリペプチドとはアミノ酸配列が異なる。一般には、基準ポリペプチドおよび変種の配列が全体として極めて類似し、多くの領域で一致するように差異を制限する。変種および基準ポリペプチドは、1つまたは複数の置換、付加、欠失、またはそれらの任意の組合せによりアミノ酸が異なる。置換または挿入されたアミノ酸残基は、遺伝コードによってコードされる残基であることもあればそうでないこともある。変種ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、対立遺伝子変種のように天然に存在することがあり、または天然に存在することが知られていない変種であってもよい。天然に存在しない変種のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、変異誘発技法または直接合成によって製造することができる。
【０１２０】
アミノ酸配列変種は、適切なヌクレオチド変化をDNA中に導入することにより、または望ましいポリペプチドのin vitroにおける合成によって調製することができる。このような変種には、例えば、アミノ酸配列内の残基の欠失、挿入、または置換が含まれる。欠失、挿入および置換を組み合わせて最終構築物に到達することができるが、ただし、最終タンパク質生成物は、望ましい生物活性、または特徴を有しているものとする。また、アミノ酸変化は、グリコシル化部位の数または位置を変化させること、膜固着特性を変化させること、挿入すること、欠失させることもしくは元のタンパク質の膜貫通配列に影響を及ぼすことによって細胞内位置を変化させること、またはタンパク質分解切断に対する感受性を変えることなどの翻訳後過程を変化させることがある。
【０１２１】
特に断りのない限り、本発明で利用される組み換えDNA技法は、当業者に知られている標準手順である。このような技法の例は、J.Perbal、A Practical Guide to Molecular Cloning、John Wiley and Sons、1984年、J.Sambrook他、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1989年、T.A.Brown(編集者)、Essential Molecular Biology: A Practical Approach、第1および2巻、IRL Press、1991年、D,M.GloverおよびB.D.Hames(編集者)、DNA Cloning: A Practical Approach、第1〜4巻、IRL Press、1995および1996年、およびF.M.Ausubel他(編集者)、Current Protocols in Molecular Biology、Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience(1988年、現在までのすべてのアップデートを含む)などの文献中で説明されており、参照により本明細書に組み込む。
【０１２２】
本明細書では、本発明の特定の特徴(例えば、アミノ酸グループ、温度、圧力、時間など)に関して「範囲」または「物質グループ」が記載されている場合には、本発明は、その中のどの部分的範囲またはサブグループについても各々のおよびあらゆる具体的メンバーならびに組合せと関連し、それらを本明細書中に明示的に組み入れていると理解すべきである。したがって、任意の特定された範囲またはグループは、範囲またはグループの各々およびあらゆるメンバーを個別に、ならびにその中に包含される各々およびあらゆる可能な部分的範囲またはサブグループを参照する簡単な方法として理解するべきであり、その中の任意の部分的範囲またはサブグループに関しても同様である。したがって、例えば、
-50個までの塩基単位を含む配列に関しては、各々およびあらゆる個別単位、ならびに単位の部分的範囲を本明細書に具体的に組み込むことと理解すべきであり、
-反応時間に関しては、1分以上の時間は、各々およびあらゆる個別時間、ならびに、例えば、1分、3から15分、1分から20時間、1から3時間、16時間、3時間から20時間などの1分以上の部分的範囲を具体的に組み込むことと理解すべきであり、
-ポリペプチドに関しては、特定の配列を含み、そのアミノ末端またはそのカルボキシ末端において少なくとも1つのアミノ酸の付加を有するポリペプチド類似体は、例えば、1、2、3、10、18、40などの各々およびあらゆる個別の可能性を具体的に組み込むことと理解すべきであり、
-ポリペプチドに関しては、特定のアミノ酸配列と一致する少なくとも90%のアミノ酸配列を有するポリペプチド類似体は、例えば、特定のアミノ酸配列と一致する90%、90.5%、91%、93.7%、97%、99%などのアミノ酸配列を有するポリペプチド類似体などの各々およびあらゆる個別の可能性(100%は除く)を具体的に組み込むことと理解すべきであり、
-ポリペプチドに関しては、特定のアミノ酸配列と一致する少なくとも70%のアミノ酸配列を有するポリペプチド類似体は、例えば、特定のアミノ酸配列と一致する70%、72.3%、73%、88.6%、98%などのアミノ酸配列を有するポリペプチド類似体などの各々およびあらゆる個別の可能性(100%は除く)を具体的に組み込むことと理解すべきであり、
-ポリペプチドに関しては、特定のアミノ酸配列と一致する少なくとも50%のアミノ酸配列を有するポリペプチド類似体は、例えば、特定のアミノ酸配列と一致する50%、54%、66.7%、70.2%、84%、93%などのアミノ酸配列を有するポリペプチド類似体などの各々およびあらゆる個別の可能性(100%は除く)を具体的に組み込むことと理解すべきであり、
-ポリペプチドに関しては、少なくとも1つの輸送剤領域を含むポリペプチドは、例えば、1、2、5、10個の輸送剤領域を有するポリペプチドなどの各々およびあらゆる個別の可能性を具体的に組み込むことと理解すべきであり、
-低圧、濃度、要素などの他のパラメータに関しても同様である。
【０１２３】
また、「g」または「gm」はグラム重量単位を指し、「C」または「℃」は、摂氏温度単位を指すと理解すべきである。
【０１２４】
【表２】
0004489353.tif 000003
【０１２５】
【表３】
0004489353.tif 000004
【０１２６】
特に、本発明は、C3タンパク質のカルボキシ末端に付加された追加のアミノ酸を有するC3様タンパク質を提供する。このようなタンパク質の例は以下の通りである。
【０１２７】
C3APL:(C3アンテナペディア-ロング)C3 cDNAをコードする配列の3'末端にアンテナペディア転写因子からの配列をアニールすることによって作製。アンテナペディアのホメオドメインを含む60個のアミノ酸の長いアンテナペディア配列を用いた。
【０１２８】
C3APLT:(C3アンテナペディア-切断型)C3 cDNAをコードする配列の3'末端にアンテナペディア転写因子からの配列をアニールすることによって作製。フレームシフト変異を含むこのクローンは、良好な輸送活性を有するプロリンに富む輸送ペプチドを与える。この配列は、切断型で、すなわちC3APLより短い。
【０１２９】
C3APS:膜貫通輸送特性を有するアンテナペディアの短い11のアミノ酸配列をC3のカルボキシ末端に融合してC3APSを作製した。
【０１３０】
C3-TL:C3タンパク質のカルボキシ末端にTatのアミノ酸27〜72を融合することによって作製されたC3 Tat-ロング。
【０１３１】
C3-TS:C3タンパク質のカルボキシ末端にアミノ酸YGRKRRQRRRを融合することによって作製されたC3 Tat-ショート。
【０１３２】
C3Basic1:C3のC末端に付加されたランダムな塩基性荷電配列。
【０１３３】
C3Basic2:C3のC末端に付加されたランダムな塩基性荷電配列。
【０１３４】
C3Basic3:C3タンパク質にTatのアミノ酸の逆配列RRQRRKKRを融合することによって作製されたC3 Tat-ショート。
【０１３５】
本発明のコンジュゲートまたは融合タンパク質(C3様タンパク質)Rhoアンタゴニストは、脊髄損傷後のCNSにおける修復を刺激するのに有効であることが分かった。脳卒中後の修復にRhoシグナル伝達経路が重要であるため、新たなRhoアンタゴニスト(新たなキメラC3)の細胞透過性の増加は、脳卒中および神経変性疾患の犠牲者の治療を直ちに可能にするであろう(Hitomi、他、2000年、67:1929〜39頁、Trapp他、2001年、Mol.Cell.Neurosci.、17:883〜84頁)。接着性送達システムにおけるRhoアンタゴニストによる治療を用い、PNSにおける軸索成長速度を高めることができるであろう。また、今や、文献中の証拠は、PKNを活性化し、次いでタウおよび神経フィラメントをリン酸化する能力がからむアルツハイマー病の形成とRhoシグナル伝達を結び付けている(Morissette、他、2000年、278:H1769〜74頁、Kawamata、他、1998年、18:7402〜10頁、Amano、他、1996年、271:648〜50頁、Watanabe、他、1996年、271:645〜8頁)。したがって、Rhoアンタゴニストは、アルツハイマー病の治療に有用であることが期待される。新たなキメラC3薬物は、容易に拡散することができるはずであり、したがって神経変性である疾患の修復を促進することができる。その例には、脳卒中、外傷性脳損傷、パーキンソン病、アルツハイマー病およびALSが含まれるが、これらに限定されるものではない。さらに、Rhoシグナル伝達アンタゴニストが他の疾患の治療に有効であることが今や十分に確立されている。これらには、緑内障などの眼疾患(Honjo、他、2001年、42:137〜44頁、Rao、他、2001年、42:1029〜1037頁)、癌細胞移動および転移(Sahai、他、1999年、9:136〜45頁、Takamura、他、2001年、33:577〜81頁、Imamura他、2000年、91:811〜6頁)が含まれるが、これらに限定されるものではない。平滑筋の弛緩に対するRhoシグナル伝達経路の効果は十分に確立されている。このことは、高血圧症(Chitaley、他、2001年、3:139〜144頁、Somlyo、1997年、389:908〜911頁、Uehata、他、1997年、389:990〜994頁)、喘息(Nakahara、他、2000年、389:103〜6頁、Ishizaki、他、2000年、57:976〜83頁)、および血管疾患(Miyata、他、2000年、20:2351〜8頁、Robertson、他、2000年、131:5〜9頁)ならびにペニス勃起機能障害(Chitaley、他、2001年、7:119〜22頁)の治療にRhoシグナル伝達アンタゴニストが有効であるという確認につながった。また、Rhoは、心保護タンパク質としても重要である(Lee他、2001年、FASEB J.、15:1886〜1894頁)。
【０１３６】
Rho GTPアーゼには、タンパク質のRho、RacおよびCdc42ファミリーのメンバーが含まれる。我々の発明は、RhoクラスのRhoファミリーメンバーに関する。Rhoタンパク質は、様々な遺伝子によってコードされる様々な変種からなる。例えば、PC-12細胞は、RhoA、RhoBおよびRhoCを発現する(Lehman他、1999年、同上);PC-12細胞:クロム親和細胞系(Greene AおよびTischler、A S、1976年、PNAS、73:2424頁)。細胞内部でRhoタンパク質を不活性化するのにC3ファミリータイプのRhoアンタゴニストが有効なのは、すべての形のRho(例えば、RhoA、RhoBなど)を不活性化するためである。対照的に、病変した細胞中へのドミナントネガティブなRhoAファミリーメンバーの導入などの遺伝子治療技法は、RhoAファミリーメンバーに特異的なメンバーを不活性化するに過ぎない。
【０１３７】
組み換えC3タンパク質、またはリボシル化活性を保持するC3タンパク質も我々の送達系において有効であり、本発明に包含される。さらに、Rhoキナーゼはよく知られている活性Rhoの標的であり、Rhoキナーゼを不活性化することは、少なくとも本発明にかかわる生物活性である神経突起または軸索成長(KimuraおよびSchubert、1992年、Journal of Cell Biology、116:777〜783頁、Keino-Masu、他、1996年、Cell、87:175〜185頁、Matsui、他、1996年、EMBO J.、15:2208〜2216頁、Matsui、他、1998年、J.Cell Biol.、140:647〜657頁、Ishizaki、1997年、FEBS Lett.、404:118〜124頁)の点ではRhoを不活性化することと同じ効果を有する。
【０１３８】
本発明のC3ポリペプチドには、C3の生物学的に活性な断片および類似体が含まれる。断片は、1つまたは複数のアミノ酸の切断を有し、その切断がアミノ末端、カルボキシ末端、またはタンパク質の内部に由来することがあるアミノ酸配列を包含する。C3のGlu(173)を含む断片は本発明に含まれる(Saito他、1995年、FEBS Lett.、371:105頁)。本発明の類似体は、1つまたは複数のアミノ酸の挿入または置換を含む。断片および類似体は、RhoのAsn(11)上でRho GTPアーゼを不活性化することができるC3の生物学的特性を有するはずである。また、異種アミノ酸配列と融合されたC3アミノ酸配列を含むキメラポリペプチドも本発明に包含される。前記異種配列は、C3とキメラを形成する場合にC3の1つまたは複数の生物学的または免疫学的特性を保持する配列を包含する。C3タンパク質またはC3キメラタンパク質をコードする核酸で形質転換または形質移入された宿主細胞も本発明に包含される。C3の少なくとも1つの生物学的特性を有するポリペプチドを産生する任意の宿主細胞を用いることができる。具体例には、細菌、酵母、植物、昆虫または哺乳類の細胞が含まれる。さらに、トランスジェニック動物でC3タンパク質を産生することができる。形質転換または形質移入された宿主細胞およびトランスジェニック動物は、当業者が日常的に利用可能な材料および方法を用いて入手される。宿主細胞は、リーダー配列およびC末端膜アンカー配列(下記参照)を含むC3タンパク質の完全長遺伝子を有する核酸配列を含み、あるいは、リーダー配列およびC末端膜アンカー配列のうち1つまたは双方を欠く核酸配列を含むことができる。さらに、C3の生物活性を保持することができるポリペプチドをコードする核酸断片、変種および類似体は、宿主発現系に常在することができる。
【０１３９】
C3は、26kDAタンパク質として産生される。完全長C3タンパク質は、RhoAのアスパラギン41をADPリボシル化することによってRhoを不活性化する(Han他、2001年、J.Mol.Biol.、305:95頁)。Rhoをリボシル化する能力を保持する切断型、伸長型もしくは改変型C3タンパク質またはC3由来ペプチドは本発明に含まれ、融合タンパク質を製造するのに用いることができる。C3の結晶構造が決定され、リボシル化活性に影響を及ぼすことなく変えることができるC3タンパク質の要素に関する識見が得られている(Han他、2001年、J.Mol.Biol.、305:95頁)。
【０１４０】
組み換えタンパク質であるRhoアンタゴニストは、当技術分野に存在する方法に従って製造することができる。本発明のタンパク質は、細菌細胞抽出物から、または組み換え技法を使用することにより調製することができる。一般に、本発明によるC3タンパク質は、好適な発現媒体においてC3をコードするDNA断片のすべてまたは部分による宿主細胞の形質転換(形質移入、形質導入、または感染)によって産生することができる。好適な発現媒体には、プラスミド、ウイルス粒子、およびファージが含まれる。昆虫細胞の場合には、バキュロウイルスの発現ベクターが適している。全発現媒体、またはその一部を宿主細胞ゲノム中に組み込むことができる。環境によっては、誘導性発現ベクターを用いることが望ましい。
【０１４１】
分子生物学の分野における当業者は、組み換えタンパク質を提供するために多種多様ないかなる発現系も使用できることを理解しているはずである。使用される正確な宿主細胞は本発明にとって重要ではない。C3およびC3様タンパク質は、原核生物宿主(例えば、大腸菌または枯草菌)または真核生物宿主(例えば、サッカロミセス属またはピキア属;哺乳類細胞、例えば、COS、NIH 3T3、CHO、BHK、293、またはHeLa細胞;または昆虫細胞)において産生することができる。
【０１４２】
また、タンパク質およびポリペプチドは、植物細胞によっても産生することができる。植物細胞の場合には、ウイルス発現ベクター(例えば、カリフラワーモザイクウイルスおよびタバコモザイクウイルス)およびプラスミド発現ベクター(例えば、Tiプラスミド)が適している。このような細胞は、多種多様なソースから入手可能である(例えば、American Type Culture Collection、Rockland、Md.)。形質転換および形質移入の方法ならびに発現媒体の選択は、選択された宿主系によって異なる。
【０１４３】
発現媒体を抱く宿主細胞は、選ばれた遺伝子の活性化、選ばれた遺伝子の抑制、形質転換体の選択、または選ばれた遺伝子の増幅の必要性に適合した慣用の栄養培地中で培養することができる。発現系の1つは、pMAMneo発現ベクターで形質転換したマウス3T3線維芽細胞宿主細胞である(Clontech、Palo Alto、Calif.)。pMAMneoは、デキサメタゾン誘導性MMTV-LTRプロモーターに連結されたRSV-LTRエンハンサー、哺乳類系における複製を可能にする複製のSV40源、選択可能ネオマイシン遺伝子、ならびにSV40スプライシングおよびポリアデニル化部位を提供する。C3またはC3様タンパク質をコードするDNAは、発現を可能にするように設計された配向性でpMAMneoベクター中に挿入される。組み換えC3またはC3様タンパク質は、後述のように単離される。pMAMneo発現媒体と併せて使用することができる他の好ましい宿主細胞には、COS細胞およびCHO細胞が含まれる(ATCC Accession No.はそれぞれCRL1650およびCCL61)。
【０１４４】
C3ポリペプチドは、融合タンパク質として産生することができる。例えば、発現ベクターを用いてlacZ融合タンパク質を作製することができる。pGEXベクターを用い、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)を含む融合タンパク質として異種ポリペプチドを発現することができる。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン-アガロースビーズへの吸着と、続く遊離グルタチオン存在下の溶離によって溶解した細胞から容易に精製することができる。pGEXベクターは、クローン化標的遺伝子産物をGST部分から遊離させることができるように、トロンビンまたは第Xa因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計される。融合タンパク質を製造するための別の戦略は、Hisタグ系を用いることである。
【０１４５】
昆虫細胞発現系では、ヨトウガ(Spodoptera frugiperda)細胞中で成長するキンウワバ(Autographa californica)核多角体病ウイルス(AcNPV)をベクターとして用い、異種遺伝子を発現させる。C3コード配列をウイルスの非必須領域(例えば、ポリヘドリン遺伝子)中に個別にクローニングし、AcNPVプロモーター、例えば、ポリヘドリンプロモーターの制御下に置くことができる。C3またはC3様タンパク質(ポリペプチド)をコードする遺伝子の挿入に成功すると、ポリヘドリン遺伝子が不活性化され、非閉塞組み換えウイルス(すなわち、ポリヘドリン遺伝子によってコードされるタンパク性外被を欠くウイルス)が生じるはずである。次いで、これらの組み換えウイルスを用い、ヨトウガ細胞に感染させ、挿入遺伝子を発現させる(組み換えMAGタンパク質を製造する例についてはLehmann他を参照)。
【０１４６】
哺乳類宿主細胞では、多くのウイルスベースの発現系を利用することができる。発現ベクターとしてアデノウイルスを使用する場合には、アデノウイルスの転写/翻訳制御複合体、例えば、遅発性プロモーターおよび3つの部分からなるリーダー配列にC3核酸配列をライゲーションすることができる。次いで、in vitroまたはin vivo組み換えにより、このキメラ遺伝子をアデノウイルスゲノム中に挿入することができる。ウイルスゲノムの非必須領域(例えば、領域E1またはE3)中への挿入の結果、感染宿主において生存能力があり、C3遺伝子産物を発現することができる組み換えウイルスが得られるはずである。
【０１４７】
また、挿入された核酸配列の効率的翻訳に特異的な開始シグナルが必要なこともある。これらのシグナルには、ATG開始コドンおよび隣接配列が含まれる。それ自身の開始コドンおよび隣接配列を含む全天然C3遺伝子またはcDNAが適切な発現ベクターに挿入される場合には、追加の翻訳制御シグナルは一切必要ではない。他の場合には、おそらくATG開始コドンを含む外因性翻訳制御シグナルを提供しなければならない。さらに、開始コドンは、望ましいコード配列のリーディングフレームと位相があって、全挿入断片の翻訳を保証しなければならない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然および合成といった様々な起源であってもよい。発現の効率は、適切な転写エンハンサー要素、転写ターミネーターを含めることによって向上させることができる。
【０１４８】
さらに、挿入配列の発現を変調し、または特異的な望ましい方法で遺伝子産物を修飾および加工する宿主細胞を選ぶことができる。このようなタンパク質産物の修飾(例えば、グリコシル化)および加工(例えば、切断)は、タンパク質の機能にとって重要なことがある。異なる宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセシングおよび修飾に関して特徴的かつ特異的な機構を有する。発現される異種タンパク質の正しい修飾およびプロセシングを保証するために、適切な細胞系または宿主系を選ぶことができる。この目的では、一次転写物の適切なプロセシング、グリコシル化、および遺伝子産物のリン酸化のための細胞の仕組みを有する真核生物宿主細胞を用いることができる。このような哺乳類宿主細胞には、CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3、WI38、および特に脈絡叢細胞系が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１４９】
あるいは、安定に形質移入された哺乳類宿主細胞によってC3タンパク質を生産することができる。哺乳類細胞の安定な形質移入に適している多くのベクターが一般に公開されており、このような細胞系を作製する方法も公的に利用可能である。1例では、ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)遺伝子が含まれる発現ベクター中にC3タンパク質をコードするcDNAをクローニングすることができる。プラスミドおよび、したがって、C3またはC3様タンパク質をコードする遺伝子の宿主細胞染色体中への組み込みは、細胞培養培地に0.01〜300μMメトトレキサートを含めることによって選択される(Ausubel他、同上、に記載のように)。この優性選択は、大部分の細胞タイプで行うことができる。組み換えタンパク質発現は、形質移入された遺伝子のDHFR媒介性増幅によって増加させることができる。遺伝子増幅を有する細胞系を選択するための方法は、当技術分野で知られている。一般的に、このような方法は、徐々に増加する濃度のメトトレキサートを含有する培地における拡張培養を含む。この目的でよく使用されるDHFR含有発現ベクターには、pCVSEII-DHFRおよびpAdD26SV(A)が含まれる。前述の宿主細胞または、好ましくはDHFR欠損CHO細胞系(例えば、CHO DHFR細胞、ATCC Accession No. CRL9096)は、安定に形質移入された細胞系のDHFR選択またはDHFR媒介性遺伝子増幅にとって好ましい宿主細胞である。
【０１５０】
単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を含むがこれらに限定されない他の多くの選択システムを用いることができ、それぞれtk、hgprt、またはaprt細胞で用いることができる。さらに、ミコフェノール酸に対する耐性を付与するgpt、アミノグリコシドG-418に対する耐性を付与するneo、およびハイグロマイシンに対する耐性を付与するhygroを使用することができる。
【０１５１】
あるいは、発現されている融合タンパク質に特異的な抗体を利用することにより、いかなる融合タンパク質も容易に精製することができる。例えば、Janknecht他、1981年、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、88:8972頁に記載の系は、ヒト細胞系で発現された非変性融合タンパク質の容易な精製を可能にする。この系では、遺伝子のオープンリーディングフレームが、6個のヒスチジン残基からなるアミノ末端タグと翻訳的に融合するように、当該遺伝子をワクシニア組み換えプラスミド中にサブクローニングする。組み換えワクシニアウイルスに感染した細胞からの抽出物をNi2+ニトリロ酢酸(nitriloacetic acid)-アガロースカラム上に充填し、イミダゾール含有緩衝液によりヒスチジンタグ付きタンパク質を選択的に溶離する。
【０１５２】
あるいは、C3、C3様タンパク質またはその部分(断片)を、免疫グロブリンFcドメインと融合させることができる。このような融合タンパク質は、プロテインAカラムを用いて容易に精製することができる。
【０１５３】
Rhoアンタゴニストの活性を試験するため、組織培養バイオアッセイ系を用いた。このバイオアッセイを用い、脊髄損傷、脳卒中または神経変性疾患において軸索再生を促進する際に有効なRhoアンタゴニストの活性を明らかにする。
【０１５４】
ニューロンは、阻害性ミエリン基質上で神経突起を伸ばさない。ニューロンが組織培養で阻害性基質上に置かれている場合には丸いままである。有効なRhoアンタゴニストが添加された場合に、ニューロンは、ミエリン基質上で神経突起を伸ばすことができる。Rhoアンタゴニストを添加してニューロンが神経突起を伸ばすまでにかかる時間は、ラミニンまたはポリリジンなどの成長が許容される基質上にニューロンが置かれていた場合と同様であり、細胞培養中で典型的には1から2日である。その結果は、視覚的に記録することができる。必要な場合は、神経突起成長の定量的評価を行うことができる。このことは、a)ニューロンをミエリン基質上で平板培養し、未処理のままにする対照培養液、b)ポリリジン上で平板培養されたニューロンなどの陽性対照培養液またはc)様々な濃度の試験アンタゴニストで培養液を処理することで神経突起の長さを測定するものである。
【０１５５】
組織培養においてC3を試験するのに最良の濃度は25〜50ug/mlであることが分かっている(Lehmann他、1999年、J. Neurosci.、19:7537〜7547頁; JinおよびStrittmatter、1997年、J. Neurosci.、17:6256〜6263頁)。したがって、神経突起の成長を刺激するために使用される成長因子に比べると、高濃度のこのRhoアンタゴニストが必要である。神経成長因子(NGF)などの成長因子は、組織培養において1〜100ng/mlの濃度で使用される。しかしながら、成長因子はミエリンによる成長阻害に打ち勝つことができない。我々の組織培養実験は、すべて網膜神経節細胞の成長因子BDNF、またはPC-12細胞のNGFの存在下で行われる。成長因子がin vivoにおいて試験された場合には、ug/ml範囲の可能な最高濃度が典型的には用いられる。また、持続性送達のためにポンプを用いてCNSに加えることも多い(例えば、Ramer他、同上)。In vivo実験の場合、凍結した1mg/ml溶液として保存されたC3とあわせて可能な最高濃度を用いた。
【０１５６】
RhoアンタゴニストC3は、37℃で少なくとも24時間は安定である。C3の安定性は、以下の実験により組織培養において試験した。C3を組織培養培地で希釈し、インキュベーター中に37℃で24時間放置し、次いで試験細胞タイプとして網膜神経節細胞を用いる前述のバイオアッセイ系に加えた。これらの細胞は、37℃で24時間保存したC3で処理した場合に阻害性基質上で神経突起を伸ばすことができた。したがって、最低の安定性は24時間である。これは、アミノ酸組成に基づく安定性予測と一致している(以下の配列データを参照)。
【０１５７】
以下の方法のうち1つで、ある化合物がRhoアンタゴニストであると確認することができる。
a)上記のように成長阻害性基質上で細胞を培養し、Rhoアンタゴニスト候補に曝露する。
b)ステップa)の細胞をホモジナイズし、プルダウンアッセイを行う。このアッセイは、GST-RhotektinのGTP結合Rhoとの結合能に基づいている。組み換えGST-rhotekitinまたはGST rhotektin結合ドメイン(GST-RBD)を、a)と同様に培養した細胞から作製した細胞ホモジネートに加える。阻害性基質はRhoを活性化し、この活性化RhoはGST-RBDによってプルダウンされることが分かっている。RhoアンタゴニストはRhoの活性化を妨害するはずであり、したがって、上記のa)に記載したように細胞を培養した場合に、有効なRhoアンタゴニストはRhoの検出を妨害するはずである。
c)このプルダウンアッセイの代替法は、(DiekmannおよびHall、1995年、Methods in Enzymology、第256巻、パートB、207〜215頁)に記載のように、活性化RhoをプルダウンするアッセイにおけるおとりとしてGTPアーゼ活性化タンパク質Rho-GAPを用いるものである。
【０１５８】
ある化合物がRhoアンタゴニストであることを確認するための別の方法は、以下の通りである。生細胞に加えられた場合、エフェクタードメインのADPリボシル化によってRhoを不活性化するアンタゴニストは、Rhoにおける分子量シフトを検出することによって識別することができる(Lehmann他、1999年、同上)。分子量シフトは、Rhoアンタゴニストによる細胞の処理後、細胞をホモジナイズし、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動によって細胞ホモジネート中のタンパク質を分離することによって検出することができる。タンパク質をニトロセルロース紙に移し、ウエスタンブロット技法によってRho特異的抗体でRhoを検出する。
【０１５９】
化合物がRhoキナーゼアンタゴニストであることを確認するための別の方法は、以下の通りである。
a)形質移入により、mycエピトープタグ、またはGSTタグもしくは任意の好適なタグを付けられた組み換えRhoキナーゼをHeLa細胞または別の好適な細胞タイプ中で発現させる。
b)特異的タグ(例えば、mycタグまたはGSTタグ)を対象とする抗体を用いる免疫沈降により、細胞ホモジネートからキナーゼを精製する。
c)b)から回収した免疫沈降物を、Rhoキナーゼ阻害剤の存在下または非存在下で基質としての[32P]ATPおよび2型ヒストンと共にインキュベートする。Rhoキナーゼ阻害剤活性の非存在下では、Rhoキナーゼはヒストンをリン酸化した。Rhoキナーゼ阻害剤活性の存在下では、Rhoキナーゼのリン酸化活性(すなわち、ヒストンのリン酸化)は妨害され、このようにして化合物がRhoキナーゼアンタゴニストであると識別される。
【０１６０】
次に、本発明のコンジュゲートの輸送面を考えると、タンパク質を細胞中に透過させる輸送配列を付加するための知られている方法を利用できる。その例には、膜転位置配列(Rojas、1998年、16:370〜375頁)、Tat媒介性タンパク質送達(Vives、1997年、272:16010〜16017頁)、ポリアルギン(polyargine)配列(Wender他、2000年、PNAS 24:13003〜13008頁)およびアンテナペディア(Derossi、1996年、271:18188〜18193頁)が含まれる。知られている輸送剤、部分、サブドメインなどの例は、例えば、カナダ特許文書番号2,301,157(アンテナペディアのホメオドメインを含むコンジュゲート)ならびに米国特許5,652,122、5,670,617、5,674,980、5,747,641、および5,804,604(Tat HIVタンパク質(以下Tat HIVタンパク質を単にTatと呼ぶことがある)のアミノ酸配列を含むコンジュゲート)に示され、これらの特許文書の各々の全内容を参照により本明細書に組み込む。
【０１６１】
アンテナペディアホメオドメインの3番目のアルファヘリックスの16個のアミノ酸領域は、タンパク質(融合タンパク質として製造された)が細胞膜を通過することを可能にすることが分かっている(参照により本明細書に組み込む、PCT国際出願番号WO99/11809およびカナダ出願番号2,301,157(Crisanti他))。本発明では、我々は、C3を含み、融合タンパク質のカルボキシ末端に位置するアンテナペディアホメオドメイン配列を有する融合タンパク質を作製した。これらの融合タンパク質の(例えば、軸索成長を促進する)生物活性は、ニューロンなどの一次哺乳類細胞上で立証した。同様に、HIV Tatタンパク質は、細胞膜を通過できることが分かっている(Frankel A.D.他、Cell、55:1189頁)。本発明で、我々は、HIV Tatのアミノ酸27から72に及ぶ配列を用い、生物学的に活性なC3タンパク質のTat媒介性送達がニューロン細胞において、より具体的には一次ニューロン細胞において可能であることを示した。
【０１６２】
C3タンパク質および類似体のHIV Tatおよびアンテナペディア媒介性輸送の他に、本明細書では新たな輸送配列(すなわち、輸送ポリペプチド部分、輸送剤領域など)を提示する。
【０１６３】
ADPリボシラーゼ(ribosylase)の機能を試験または改善するために、いくつかの受容体媒介性輸送戦略が用いられてきた。これらの方法には融合C2およびC3配列(Wilde、他、2001年、276:9537〜9542頁)およびジフテリア毒素受容体による受容体媒介性輸送の使用(Aullo、他、1993年、12:921〜31頁;Boquet、P.他、1995年、Meth.Enzymol.、256:297〜306頁)が含まれる。これらの方法がC3の効力を劇的に高めることは立証されていない。さらに、これらのタンパク質は、受容体媒介性輸送を必要とする。このことは、細胞は受容体を発現しなければならず、輸送を著しく改善するのに十分な量の受容体を発現しなければならないことを意味する。さらに、エンドサイトーシスによってC3が細胞に入る場合には、C3は膜分画内に閉じこめられ、したがってその大部分はRhoの不活性化に利用されないことになる。ジフテリア毒素の場合には、すべての細胞が適切な受容体を発現するとは限らず、その可能な使用を限定している。これらのいずれについても臨床的重要性が試験されたり示されていない。また、C2/C3融合タンパク質が作られ、C3の有効性が試験および改善されてきた。この場合、受容体媒介性エンドサイトーシスによるC3の取り込みを可能にするC2-C3融合毒素に加えて、組織培養培地へのC2II結合タンパク質の添加が必要である(Barthe、他、1998年、Infection and Immunity、66:1364頁)。この系の欠点は、細胞中のC3の多くが膜分画内に拘束されてしまうことである。さらに重要なことに、輸送を起こさせるには2種類の異なるタンパク質を別々に添加しなければならず(Wahl他、2000年、J. Cell Biol. 149:263頁)、この系をin vivoにおける疾患の治療に適用することを困難にしている。さらに、C3またはC3類似体(C3様タンパク質)によりRhoを不活性化するどの方法も、組織培養における成長阻害に打ち勝つ、またはin vivoにおけるCNS損傷後の回復を促進するのに十分であるとは立証されていない。
【０１６４】
本発明に従って使用することができる1戦略は、受容体依存性機構によって原形質膜を超えてタンパク質を輸送することができるアンテナペディアホメオドメインを開発することである(Derossi、1996年、271:18188〜18193頁)。代替戦術は、Tat媒介性送達を開発することである(Vives、1997年、272:16010〜16017頁、Fawell、1994年、91:664〜668頁、Frankel、1988年、55:1189〜1193頁)。
【０１６５】
アンテナペディア戦略は、ニューロン中へのタンパク質移行に用いられてきた(Derossi、1996年、271:18188〜18193頁)。例えば、アンテナペディアは、技法の有効性を立証するため、ビオチン標識ペプチドを輸送するために用いられてきた。米国特許番号6,080,724(この特許の全内容を参照により本明細書に組み込む)。アンテナペディアは、in vitroにおけるニューロンの成長および枝分かれを亢進する(Bloch-Gallego、1993年、120:485〜492頁)。ホメオタンパク質は、体組織化の発達を調節する転写因子であり、アンテナペディアは、ショウジョウバエのホメオタンパク質である。一方、Tatは、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)に由来する調節タンパク質である。Tatは、核内に見いだされる極めて塩基性のタンパク質であり、細胞中にリポーター遺伝子を輸送することができる。さらに、Tatと結合したタンパク質は、腹腔内注入後に細胞を貫通することができ、血液脳関門を通過して脳内の細胞に入ることさえできる(Schwarze、他、1999年、285:1569〜72頁)。
【０１６６】
他の状況で試験されてきた(すなわち、リポーター配列の使用によって働くことを示すため)他の輸送配列が知られている。輸送ペプチドの1つである12量体、AAVLLPVLLAAPはプロリンに富んでいる。これは、GST-MTS融合タンパク質として作られ、カポジFGFシグナル配列のh領域に由来する(Royas他、1998年、Nature Biotech.、16:370〜375頁)。別の例は、精子ファーティリン(fertilin)アルファペプチド、HPIQIAAFLARIPPISSIGTCILKである(これは、Pecheur、J.Sainte-Marie、A.Bienvenue、D.Hoekstra、1999年、J.Membrane Biol.、167:1〜17頁に概説されている)。しかしながら、精子ファーティリンアルファの推定上の融合タンパク質は、リポソームの存在下で高いアルファヘリックス含量を示すため、プロリン(Pro)残基のアルファヘリックス構造を壊す傾向は一般規則ではないことに注意しなければならない。しかしながら、ファーティリンの効率的融合特性には、Pro-Pro配列が必要である。我々が試験したC3APLT融合タンパク質は、有効な輸送ペプチドを作製するために2個のプロリンを有するという要件にあてはまる。したがって、有効な輸送体としての役割を果たし、ヘリックス構造を壊す傾向を有するプロリンに富む配列およびランダム配列も、C3に融合させた場合に有効であると思われる。
【０１６７】
阻害性基質上の軸索成長、損傷後の軸索再生、または脳もしくは精髄中の軸索再生との関係において、これらの輸送配列を用いる方法は一切考案されていない。特に、アンテナペディアの成長亢進能が、ラミニンでコーティングされたカバーガラス上に置かれたニューロンについて試験されたことに注目すべきである。ラミニンは、軸索成長を支援し成長阻害を無効にする(David、他、1995年、42:594〜602頁)ことから、再生の効力を試験するのには好適な基質ではない。このような都合のよい組織培養条件の下で軸索成長を促進する物質に関してはこの20年間にわたる膨大な文献が存在するが、それらのどの文献も、脊髄損傷の治療における臨床的進歩にはつながっていない。アンテナペディアの効果は、成長因子と類似した役割を果たすことが分かった。成長因子は、CNSの成長阻害性基質による成長阻害を克服しない(Lehmann、他、1999年、19:7537〜7547頁、Cai、他、1999年、22:89〜101頁)。In vivoにおいて投与される成長因子は、再生を支援せず、発芽を支援するに過ぎない(Schnell、他、1994年、367:170〜173頁)。
【０１６８】
輸送配列は、C3タンパク質のN末端(アミノ末端)配列に付加することができる。あるいは、輸送配列は、C3タンパク質のC末端(カルボキシ末端)配列に付加することができる。C末端はすでにかなりの塩基性であるため、輸送特性をさらに増強するはずである。このことは、その塩基性荷電およびプロリンに富む配列とは別の、C3APLTが活性を示す理由の1つのようである。
【０１６９】
新たなキメラC3を用い、脊髄損傷を治療して機能修復を促進することができる。我々は、C3APLTとC3APSが共に、ミエリンおよび混合コンドロイチン硫酸プロテオグリカンを含む複雑な阻害性基質上の成長阻害に打ち勝つことができることを立証した。さらに、我々は、C3APLTが、成体マウスにおいて損傷した脊髄への投与後に機能回復を促進することができることを立証する。新たなキメラタンパク質を用い、軸索再生を促進し、CNS損傷後の瘢痕を軽減することができる。瘢痕は神経再生の障害である。
【０１７０】
新たなキメラC3の利点は、損傷と治療の間に著しい遅れがあっても損傷した軸索を治療する能力である。また、新たな組み換えタンパク質は、慢性損傷の治療にも有用である。また、キメラC3を用い、病気に冒されたニューロン集団へのRhoアンタゴニストの透過が有効な治療にとって必要とされるアルツハイマー病およびパーキンソン病などの神経変性疾患を治療することができる。また、このキメラC3(融合タンパク質)は、脳卒中および外傷性脳損傷の治療にも有益であろう。さらに、多くの証拠が、癌細胞移動の治療における有効性を示唆している。また、Rhoアンタゴニストは、血管疾患、高血圧症、喘息、およびペニス機能障害などの平滑筋が関与する疾患の治療にも有用である。
【０１７１】
脊髄損傷の治療の場合には、本発明のコンジュゲートRhoアンタゴニストを細胞移植と併用することができる。シュワン細胞、成長因子を発現するように修飾された線維芽細胞、胎児脊髄移植、マクロファージ、胚性または成人幹細胞、および嗅覚被膜膠細胞(olfactory ensheathing glia)を含むが、それらに限定されない多くの様々な細胞移植が、再生および修復を促進する能力について広範囲に試験されてきた。C3融合タンパク質は、ニューロトロフィン、アポトーシス阻害剤、または細胞死を予防する他の薬剤と併用することができる。C3融合タンパク質は、L1、ラミニン、および軸索成長を促進する人工的成長マトリックスなどの細胞接着分子と併用することができる。また、本発明のキメラC3構築物を、成長阻害性タンパク質基質を遮断する抗体と併用し、軸索成長を促進することができる。このような抗体法の例は、IN-1もしくは関連抗体の使用(SchnellおよびSchwab、1990年、343:269〜272頁)または治療的ワクチン手法の使用(Huang、1999年、24:639〜647頁)による。
【０１７２】
本発明の実施形態例を示す図面である。
【０１７３】
図1を参照すると、PC-12細胞は、阻害性ミエリン基質上で平板培養した(0)。0.00025〜50ug/mlの濃度で組織培養培地に添加された非修飾C3は、無処置対照(灰色の棒)を上回って神経突起成長を有意に改善することはなかった。C3は、スクレープローディング後のミエリン基質上で平板培養された細胞の神経突起成長を刺激する際に有効であるに過ぎなかった(黒の棒)。この図は、組織培養培地に受動的に添加された場合に、細胞内への透過が制限されるか、一切ないことを示している。技法については下記の実施例4を参照されたい。
【０１７４】
図2を参照すると、この図は、C3APLTおよびC3APSがRhoをADPリボシル化するという実証を提供する。無処置細胞(レーン1)、およびC3APLT(レーン2)またはC3APS(レーン3)で処置された細胞におけるRhoAを示すウエスタンブロット。RhoがC3によってADPリボシル化された場合には、レーン2および3に見られるように分子量シフトを受ける(Lehmann他、同上)。技法については下記の実施例4を参照されたい。
【０１７５】
図3を参照すると、この図は、C3APLTによる処理後の細胞内活性を示す。新たな融合C3が細胞中に侵入することの検出。ミエリン上で平板培養されC3(A)またはC3APLT(B)で処理されたPC-12細胞の抗C3抗体による免疫細胞化学。C3が細胞中に侵入しないため、Aにおける細胞(図3A)は免疫反応性ではない。Bにおける細胞(図3B)は、免疫反応性であり、ミエリン基質上で神経突起を伸ばすことができる。技法については下記の実施例4を参照されたい。
【０１７６】
図4に移ると、この図は、C3-アンテナペディア融合タンパク質が阻害性基質上の成長を促進することを示している。神経突起を伸ばすニューロンの割合を各処理についてカウントした。用量反応実験は、ミエリン(0)上で平板培養された対照PC-12細胞に比べ、C3APLTおよびC3APSは、細胞1個当たりの神経突起成長をより促進することを示している。PC-12細胞はミエリン上で平板培養し、非修飾C3と共にスクレープローディングする(C3 50)、未処理のままにおく(0)、または様々な濃度のC3APLTで処理した。25ug/mlにおいて使用されたC3に比べ、C3APSは、0.0025ug/ml、すなわち10,000倍以下の用量で細胞の神経突起成長を刺激する効果を発揮する。技法については下記の実施例4を参照されたい。
【０１７７】
図5は、細胞が阻害性基質上で平板培養された場合に、C3APLTおよびC3APSが長い神経突起の成長をもたらすことを示す用量反応実験を示している。神経突起の長さを各処理について測定した。PC-12細胞はミエリン上で平板培養し、非修飾C3と共にスクレープローディングする(C3 50)、未処理のままにおく(0)、または様々な濃度のC3APLTで処理した。25ug/mlにおいて使用されたC3に比べ、C3APSは、0.0025ug/ml、すなわち10,000倍以下の用量で細胞のより長い神経突起成長を刺激する効果を発揮する。技法については下記の実施例4を参照されたい。
【０１７８】
示すように、図6は、C3APLTによる処理後に阻害性基質上で成長する一次ニューロンを示している。ラット網膜神経節細胞をミエリン基質上で平板培養し、様々な濃度のC3APLTで処理した。0.025以上の濃度は、より長い神経突起を有意に促進した。この用量は、ミエリン上で成長を促進するために必要なC3の濃度の1000分の1以下である。
【０１７９】
図7を参照すると、この図は、用量反応実験において成体マウスをC3APLTで治療した後の行動回復を示している。マウスには、脊髄の背部片側切断を行い、未治療(切除)のままにする、フィブリン単独(フィブリン)で治療する、またはフィブリンおよびug/マウスで示される指示濃度のC3APLTで治療した。各ポイントは1匹の動物を表す。BBBスコア(詳細は実施例6を参照)は治療の24時間後に評価した。C3APLTで治療した動物は、未治療の動物に比べて行動回復に有意な改善を示した。有効用量の0.5μgは、使用された非修飾C3に比べて100分の1以下である(カナダ特許出願2,325,842で示された以前の実験を参照)。実施例6を参照されたい。
【０１８０】
図8を参照すると、この図は、C3-Tatキメラタンパク質による軸索成長の促進を示している。用量反応実験は、C3-TSおよびC3-TLが、ミエリン上で平板培養された対照PC-12細胞に比べて細胞当たりの神経成長をより促進することを示している。PC-12細胞は、ミエリン上で平板培養し、非修飾C3と共にスクレープローディングする(スクレープロード)、未処理のままにおく(ミエリン)、または様々な濃度のC3-TS(灰色の棒)もしくはC3-TL(黒い棒)で処理した。25ug/mlにおいて使用されたC3に比べ、C3-TLは、0.0025ug/ml、すなわちC3の10,000倍以下の用量で細胞の神経突起成長を刺激する効果を発揮する。
【０１８１】
図9Aおよび9Bを参照すると、これらの図は、損傷した脊髄における軸索再生、すなわち、C3APLTによる治療後の解剖学的再生を示している。コムギ胚芽凝集素にコンジュゲートされた西洋ワサビペルオキシダーゼ(WGA-HRP)による順行的標識後の脊髄の切片。A)背部白質中への切断軸索の発芽。矢印は、病変の遠位で再生する軸索を示す。B)病変部位から3mmの同一切片。矢印は、再生する軸索を示す。
【０１８２】
図10を参照すると、この図は、C3-APLTが脊髄損傷後の細胞死からニューロンを守ったことを示している。病変部位(病変)における病変(頭側)から2mm頭側または病変部位(尾側)から2mm尾側のTUNEL標識(実施例16を参照)後に、アポトーシスを起こした(瀕死の)細胞をカウントした。棒は、対照として脊髄損傷後にフィブリンのみ(白い棒)、または1μgのフィブリンに溶かしたC3APLT(黒い棒)で治療した4匹の動物からのTunel陽性細胞の平均カウントを示す。C3APLTによる治療は、Tunel標識細胞(瀕死の細胞)数が著しく減少することを示している。また、非損傷脊髄サンプルも処理し、これらの脊髄は、予想した通りTunel標識を示さなかった。
【０１８３】
図11を参照すると、この図は、迅速なバイオアッセイの一部として、細胞をプラスチック上で平板培養した場合に、未処置細胞に比べてC3APLTおよびC3Basic3が迅速な神経突起成長を促進することを示している(実施例4を参照)。
【０１８４】
図12Aおよび12Bを参照すると、阻害性基質上で神経突起成長を促進するC3様キメラタンパク質の能力をさらに支援するため、我々は、阻害性基質上で平板培養された一次培養液のC3APLT処理に対する反応を調べた。精製網膜神経節細胞(RGC)をミエリン、またはCSPG基質上で平板培養し、様々な濃度のC3APLTで処理した。RGC切開中は、細胞の機械的操作の量を制限しようとして十分な注意をしたが、単離プロトコルは、細胞を解離し分離するためにいくらかの摩砕を行うことを必要とする。RGCが阻害性基質上で平板培養された場合には、ミエリン上で平板培養されたPC-12細胞と類似した丸い外観を維持した。C3APLTによるRGCの処理は、神経突起成長を促進し、ミエリンとCSPG基質上で神経節の長さをいずれも増加させた。他のPC-12実験で有効であることが分かった広範囲な濃度とは対照的に、0.025ug/mlから50ug/mlというより狭い範囲のC3APLT処理が神経突起成長を促進し、ミエリン上の神経突起の長さを増加させた。CSPG基質上で平板培養されたRGCの場合には、0.0025ug/mlから50ug/mlの有効濃度範囲が観察された。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１８５】
C3APL、C3APLT、およびC3APSの作製方法
C3APLは、C3をコードするcDNA(DillonおよびFeig、1995年、256:174〜184頁)を、アンテナペディアホメオドメインをコードするcDNA(Bloch-Gallego、1993年、120:485〜492頁)とライゲーションすることによって作製されたタンパク質に与えられた名前である。DNAの3'末端における終止コドンは、プライマー(オリゴヌクレオチド)5'GAATTCTTTAGGATTGATAGCTGTGCC3'(配列番号1)および5'GGTGGCGACCATCCTCCAAAA3'(配列番号2)を用いるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によってEcoR I部位で置き換えた。PCR産物をpSTBlue-1ベクター(Novage、市)中にサブクローニングし、次いでBamH IおよびNot I制限部位を用いてpGEX-4Tベクター中にクローニングした。このベクターをpGEX-4T/C3と呼んだ。pGEX-4T/C3におけるC3の3'末端に付加するのに用いたアンテナペディア配列は、pET-3aベクター(Bloch-Gallego、1993年、120:485〜492頁、Derossi、1994年、269:10444〜10450頁)からPCRによって作製し、pSTBlue-1平滑末端ベクター中にサブクローニングし、次いで制限部位EcoR IおよびSal Iを用いてpGEX-4T/C3中にクローニングし、pGEX-4T/C3APLを作製した。フレームシフト変異を有する別のクローン(C3APLT)を選択し、タンパク質を作製して試験した。変異にもかかわらず培養液が陽性であった場合には、変異を確認するために別の会社により再度クローンの配列決定を行い、このクローンをC3APLTと呼んだ。C3APLTの配列を確認するため、両鎖からのコード配列を配列決定した。このクローンの配列を実施例16および17に示す(C3APLTのヌクレオチド配列;配列番号42、C3APLTのアミノ酸配列;配列番号43)。
【０１８６】
アンテナペディアのより短い種類(pGEX-4T/C3APS)も作製した。このキメラ配列は、短いアンテナペディアペプチドをコードするオリゴヌクレオチド(Maizel、1999年、126:3183〜3190頁)を、EcoR IおよびSal Iで切断したpGEX-4T/C3ベクター中にライゲーションすることによって作製した。組み換えC3APLTおよびC3APS cDNAを細菌中へ別々に形質転換し、組み換えタンパク質が産生された後に超音波処理によって細菌のホモジネートを取得し、遠心分離法によってホモジネートから不要物を取り除いた。透明溶解液にグルタチオン-アガロースビーズ(Sigma)を加え、回転円板上に2〜3時間置き、次いでよく洗浄した。組み換えタンパク質からグルタチオンSトランスフェラーゼ配列を除去するためにトロンビン20U(単位)を加え、4℃で一夜回転板上にビーズを放置した。トロンビンによる切断後、空の20mlカラム中にビーズを充填し、PBS(リン酸緩衝食塩水)でタンパク質を溶離した。組み換えタンパク質を含有するアリコートをプールし、p-アミノベンズアミジンアガロースビーズ(Sigma)100μlを加え、4℃で45分間混ぜたままにしてトロンビンを除去し、次いで遠心分離によりビーズから組み換えタンパク質を単離した。サンプルの純度は、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)によって決定し、PC-12細胞による生物活性バイオアッセイを行った(Lehmann他、同上を参照)。
【０１８７】
生物活性キメラタンパク質を作製するための他の可能な方法には、陰イオン交換クロマトグラフィが含まれる。この場合、GSTタグは不要であり、取り外すことができる。次いで、実施例16に示すように、pETなどの高発現細菌ベクター中にクローニングすることができる。
【０１８８】
Rhoアンタゴニストは組み換えタンパク質であり、当技術分野に存在する方法に従って製造することができる。本発明のタンパク質は、細菌の細胞抽出物から、または好適な発現媒体におけるアンテナペディア由来輸送配列を有しC3をコードするDNA断片のすべてまたは一部による宿主細胞の形質転換、形質移入、形質導入、または感染による組み換え技法を用いることによって調製することができる。分子生物学の分野における当業者は、組み換えタンパク質を提供するために多種多様ないかなる発現系も使用できることを理解しているはずである。使用される正確な宿主細胞は本発明にとって重要ではない。
【０１８９】
いかなる融合タンパク質も、親和性精製技法またはより慣用的なカラムクロマトグラフィを利用することにより容易に精製することができる。親和性技法には、GST(グルタチオン-S-トランスフェラーゼ)、発現されている融合タンパク質に特異的な抗体の使用、またはヒスチジンタグが含まれるが、これらに限定されるものではない。あるいは、組み換えタンパク質を、免疫グロブリンFcドメインと融合させることができる。このような融合タンパク質は、プロテインAカラムを用いて容易に精製することができる。前述のアンタゴニストの小分子模倣体も本発明に包含されることを意図している。
【０１９０】
C3APLT、C3APS、C3-TLおよびC3-TSの生物活性の試験
C3APLT、C3APS、C3-TLおよびC3-TSの有効性を試験するため、成長阻害性基質上で培養されたニューロンの細胞系であるPC-12細胞を用いて多くの実験を行った(Lehmann他、同上参照)。PC-12細胞は、前述のミエリン基質上で平板培養した(Lehmann他、同上参照)。摩砕せずに、様々な濃度でC3、C3APLT、C3APS、C3-TLまたはC3-TSを加えた(用いた濃度については図4、5および8を参照されたい)。この方法で受動的に培地に添加されたC3は、成長阻害性基質における神経突起成長を促進できなかったが、それはC3が細胞に入り活性であるためには細胞を摩砕しなければならないためである(図1)。C3APLTとC3APSは共に、RhoをADPリボシル化し、RhoAの分子量にシフトをもたらした(図2)。C3APLTとC3APSは共に、神経突起成長を促進し、培地に受動的に添加された後でニューロンに入った(図3、図4および5)。0.25ng/ml、2.5ng/ml、25ng/ml、250ng/mlならびに2.5μg/mlおよび25μg/mlの濃度を試験した用量反応実験から、C3APLTおよびC3APSがC3の10,000分の1以下の用量でニューロンが神経突起を分化するのを助けたことが分かった(図4)。0.25ng/ml、2.5ng/ml、25ng/ml、250ng/mlならびに2.5μg/mlおよび25μg/mlの濃度を試験した用量反応実験から、0.0025ug/mlの最低濃度で添加された場合にもC3APLTは長い神経突起成長を促進できることが分かった(図5)。C3APLTおよびC3APSのこれらの濃度2.5ng/mlおよび25ng/mlは、C3で必要な用量のそれぞれ10,000分の1および1,000分の1以下に相当する。さらに、最高試験濃度の50ug/mlでは、これら2つの新たなRhoアンタゴニストは、PC-12細胞に対して毒性作用を示さず、成長阻害性基質上で神経突起成長を促進することができた。
【０１９１】
また、C3-TLおよびC3-TSも0.25ng/ml、2.5ng/ml、25ng/ml、250ng/mlならびに2.5μg/mlおよび25μg/mlの濃度で試験し、C3よりも著しく低い用量でミエリン基質上の神経突起成長を促進できることが分かった(図8)。C3Basic3は、高速成長アッセイにおいて50ug/mlで試験した(図11)。
【０１９２】
一次ニューロンからの成長を促進するC3APLTおよびC3APSの能力を検証するため、一次網膜培養液を調製し、実施例5に関して記載するようにミエリン基質上で平板培養した。C3APLTまたはC3APSで処理しないと細胞は丸いままで、神経突起を伸ばすことができなかった。C3APLTまたはC3APSで処理した場合には、網膜ニューロンは、阻害性ミエリン基質上で長い神経突起を伸ばすことができた(図6)。
【０１９３】
次に、グリア性瘢痕において見いだされる成長阻害性タンパク質のタイプに関連する異なるタイプの成長阻害性基質上の成長を促進するC3APLTおよびC3APSの能力を試験した。コンドロイチン硫酸プロテオグリカン(Chemicon)の混合物でチャンバースライドをコーティングし、次いで網膜ニューロンを平板培養した(図12に示す結果)。ニューロンは、プロテオグリカン基質上で神経突起を伸ばすことができなかったが、C3APLTまたはC3APSで処理すると長い神経突起を伸ばした。これらの試験は、C3APLTおよびC3APSを用い、CNSにおける損傷後の修復を妨げる主要な阻害性基質であるミエリン上およびプロテオグリカン上で神経突起成長を促進することができることを示している。
【０１９４】
脊髄損傷後の再生および機能回復を促進するC3APLTの能力の試験
C3APLTが脊髄損傷後の修復を促進するかどうかを試験するため、完全な成体マウスを用いた(実施例6に関して記載のように)。背部片側切断をT8(胸椎レベル8)において行い、前述のようにマウスをフィブリングルー中の様々な量(図7)のC3APLTで処理した(McKerracher、米国特許継続中(デリバリーパテント))。以前から知られているC3の実験では、視神経における解剖学的再生を促進するためには40〜50μgが必要であることが分かった(Lehmann他、同上)。我々は、1μgから50μgの様々な用量(図7を参照)のC3APLTを試験し、BBBスケール(Basso、1995年、12:1〜21頁)に従い行動回復について動物を評価した。
【０１９５】
手術およびC3APLTの投与の翌日に行動試験を開始した。大きさが約4'×3'のゴムマットからなるオープンフィールド環境中に動物を置いた。動物をランダムに動くままにして動物の動きをビデオテープにとった。各試験について回復の初期における足首、膝および股関節を動かす能力について2人の観察者が動物を採点した。以前に、マウスのC3治療が、治療の24時間後に観察可能な機能回復をもたらすことが示されていた。C3APLTで治療したマウスでは、早ければ脊髄損傷の24時間後に機能回復を観察することができた(図7)。無処置マウスは、平均して0のBBBスケールによる機能回復スコアを示したが、C3で処置したマウスは歩行ができ、平均8のBBBスコアを有している(図7)。より高濃度の50ugにおいては、C3APLTで処置したマウスの約50%が24時間以内に死亡した。しかしながら、生き残ったマウスは、良好な機能回復を示した。これらの結果は、C3APLTが脊髄損傷後の初期に機能回復を効率よく促進し、C3よりもかなり低用量で有効であること立証している。しかしながら、高濃度では、C3APLTは毒性を示すように見えるため、臨床使用については注意深く行うことが必要である。
【０１９６】
ビデオテープの質的観察は、C3APLTで処置された動物のみが30日の処置後に回復の後期に到達することを示していた。一般的に、無処置対照動物は、回復の初期を越えることはなかった。これらの結果は、C3APLTの投与が、無処置、損傷単独、またはフィブリン接着剤単独に比べると脊髄損傷後の長期の機能回復を改善したことを示している。
【０１９７】
初期の回復が神経保護によるものかどうかを試験するため、製造者の使用説明書(Roche Diagnostic)に従うTunel標識によって脊髄切片のアポトーシスについて調べた。C3APLTは、病変部位において観察される瀕死の細胞数を減少させることができた。したがって、C3APLTは、脳卒中後などの虚血を治療するための有効な神経保護剤のはずである。
【実施例１】
【０１９８】
C3APLのDNAおよびタンパク質配列の詳細
C3APLのヌクレオチド配列。
長い種類のアンテナペディア輸送配列が神経突起成長を亢進できることが報告されている(Bloch-Gallego、E.、LeRoux、I.、Joliot、A.H.、Volovitch、M.、Henderson、C.E.、Prochiants、A.、1993年、J.Cell Biol.、120:485頁)。したがって、この配列は、神経突起成長を亢進することが予想される。以下に示す配列の場合、開始部位はプラスミドのGST配列中にある(図示せず)。GST配列を含むベクターは市販されていることから、開始を含む全GST配列は配列決定しなかった。GST配列からC3コンジュゲートを遊離するトロンビン切断部位に対して3'に位置する配列のみを決定することが望まれた。GST配列は、トロンビンで切断される。
APL輸送配列(配列番号44)は以下の通りである。
「配列表１」
0004489353.tif 000005
C3APLのヌクレオチド配列(配列番号3)
「配列表２」
0004489353.tif 000006
C3APLのアミノ酸配列(配列番号4)
「配列表３」
0004489353.tif 000007
C3APLの物理的特性
分子量34098.03ダルトン
295個のアミノ酸
48個の強塩基性(+)アミノ酸(K、R)
28個の強酸性(-)アミノ酸(D、E)
89個の疎水性アミノ酸(A、I、L、F、W、V)
94個の極性アミノ酸(N、C、Q、S、T、Y)
9.847等電点
20.524  PH7.0における電荷
Davis, Botstein, Roth融解温度79.48℃
【実施例２】
【０１９９】
C3APSのDNAおよびタンパク質配列の詳細
C3APSのヌクレオチド配列(配列番号5)。開始部位は、本明細書で図示しないプラスミドのGST配列中にある。
「配列表４」
0004489353.tif 000008
APS輸送配列(配列番号45)は以下の通りである。
「配列表５」
0004489353.tif 000009
C3APSのアミノ酸配列(配列番号6)
「配列表６」
0004489353.tif 000010
C3APSの物理的特性
分子量29088.22ダルトン
257個のアミノ酸
38個の強塩基性(+)アミノ酸(K、R)
23個の強酸性(-)アミノ酸(D、E)
79個の疎水性アミノ酸(A、I、L、F、W、V)
83個の極性アミノ酸(N、C、Q、S、T、Y)
9.745等電点
15.211  PH7.0における電荷
Davis, Botstein, Roth融解温度78.34℃
【実施例３】
【０２００】
C3APLTおよびC3APSタンパク質の作製方法
C3APL(アミノ酸配列:配列番号4)およびC3APS(アミノ酸配列:配列番号37)は、以下の方法でC3トランスフェラーゼの機能性ドメインとアンテナペディアと呼ばれる転写因子のホメオボックス領域(Bloch-Gallego、1993年、120:485〜492頁)をライゲーションすることによって作製されたcDNAによってコードされるタンパク質に与えられた名前である。プラスミドベクターpGEX-2T中にクローニングされた、C3をコードするcDNA(DillonおよびFeig、1995年、256:174〜184頁)をキメラタンパク質のC3部分として用いた。DNAの3'末端における終止コドンは、プライマー5'GAATTCTTTAGGATTGATAGCTGTGCC3'(配列番号1)および5'GGTGGCGACCATCCTCCAAAA3'(配列番号2)を用いるポリメラーゼ連鎖反応によってEcoR I部位で置き換えた。PCR産物をpSTBlue-1ベクター(Novage、市)中にサブクローニングし、次いでBamH IおよびNot I制限部位を用いてpGEX-4Tベクター中にクローニングした。このベクターをpGEX-4T/C3と呼んだ。pGEX-4Tベクターは、親和性精製で用いるための5'グルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)配列を有している。pGEX-4T/C3におけるC3の3'末端に付加するのに用いたアンテナペディア配列は、pET-3aベクター(Bloch-Gallego、1993年、120:485〜492頁、Derossi、1994年、269:10444〜10450頁)からPCRによって作製した。用いるプライマーは、5'GAATCCCGCAAACGCGCAAGGCAG3'(配列番号7)および5'TCAGTTCTCCTTCTTCCACTTCATGCG3'(配列番号2)とした。反応から得られたPCR産物をpSTBlue-1平滑末端ベクター中にサブクローニングし、次いで制限部位EcoR IおよびSal Iを用いてpGEX-4T/C3中にクローニングし、pGEX-4T/C3APLおよびC3APLTを作製した。プロリンに富む輸送領域部分をもたらすフレームシフト変異の存在についてC3APLTを選択した。
【０２０１】
アンテナペディアのより短い種類(pGEX-4T/C3AP-short)(C3APSのアミノ酸配列:配列番号6)も作製した。このキメラ配列は、短いアンテナペディアペプチドをコードするオリゴヌクレオチド(Maizel、1999年、126:3183〜3190頁)を、EcoR IおよびSal Iで切断したpGEX-4T/C3ベクター中にライゲーションすることによって作製した。pGEX-4T/C3AP-shortの場合、作製するオリゴの配列は、5'AATTCCGCCAGATCAAGATTTGGTTCCAGAATCGTCGCATGAAGTGGAAGAAGG3'(配列番号9)および5'GGCGGTCTAGTTCTAAACCAAGCTCTTAGCAGCGTAGTTCACCTTCTTCCAGCT3'(配列番号10)とした。同量のオリゴヌクレオチドを混ぜ、72℃で5分間加熱し、次いで室温に15分間放置することにより2つの鎖をアニールした。オリゴヌクレオチドをpGEX-4T/C3ベクター中にライゲーションし、クローンを採取して分析した。
【０２０２】
組み換えC3APLT(配列番号37)およびC3APS(配列番号6)を調製するため、対応するcDNA(pGEX-4T/C3APLTおよびpGEX-4T/C3AP-short)を含むプラスミドを細菌、XL-1 blue コンピテント大腸菌中に形質転換した。振盪培養器中、37℃および300rpmで1時間、アンピシリン50ug/ml(BMC-Roche)を含むL-ブロス(10g/L Bacto-Tryptone、5g/L酵母エキス、10g/L NaCl)中で細菌を培養した。イソプロピルβ-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)、(Gibco)を最終濃度0.5mMまで加え、組み換えタンパク質の産生を誘導し、37℃および250rpmでさらに6時間培養を行った。250ml遠心分離ボトルで7000rpmにおいて4℃で6分間遠心分離することによって細菌ペレットが得られた。各ペレットを緩衝液A(50mM Tris、pH7.5、50mM NaCl、5mM MgCl2、1mM DTT)プラス1mM PMSF 10ml中に再懸濁した。再懸濁したすべてのペレットをプールし、氷上の100mlプラスチックビーカーに移した。プールしたサンプルにPMSFを含む残りの緩衝液Aを加えた。Branson Sonifier450プローブ超音波処理器を用い、6×20秒、細菌サンプルを超音波処理した。超音波処理の間の1分間、細菌とプローブを共に氷上で冷却した。超音波処理物をSorvall SS-34ローターで16,000rpmにおいて4℃で12分間遠心分離して上清を清澄にした。上清を新たなSS-34管に移し、12,000rpmにおいて4℃で12分間再回転させた。透明溶解液にグルタチオン-アガロースビーズ(Sigma)を20mlまで加え、2〜3時間回転板上に置いた。ビーズは、緩衝液B(緩衝液A、NaClは150mM、PSMFはなし)で4回、次いで緩衝液C(緩衝液B+2.5mM CaCl2)で2回洗浄した。最後の洗浄は、ビーズが密なスラリを作るまで流した。組み換えタンパク質からグルタチオンSトランスフェラーゼ配列を除去するためにトロンビン(ウシ、プラスミノーゲン非含有、Calbiochem)20Uを加え、4℃で一夜回転板上にビーズを放置した。トロンビンによる切断後、空の20mlカラム中にビーズを充填した。、PBSによる溶離によって約20の1mlの分量を集めた。各アリコートのサンプル0.5ulをニトロセルロースにスポットし、アミドブラックで染色してタンパク質ピークを決定した。融合タンパク質を含有するアリコートをプールし、p-アミノベンズアミジンアガロースビーズ(Sigma)100μlを加え、4℃で45分間混ぜたままにした。この最終ステップにより組み換えタンパク質サンプルからトロンビンを除去した。組み換えタンパク質を遠心分離してビーズを除去し、次いでcentriprep-10濃縮器(Amicon)を用いて濃縮した。濃縮組み換えタンパク質をPD-10カラム(Pharmacia、セファデックスG-25Mを含有)で脱塩し、10個の0.5mlの分量を集めた。これらのサンプルについてドットブロットを行い、タンパク質ピークを決定し、適切なアリコートをプールし、濾過滅菌し、-80℃で保存した。タンパク質アッセイ(DCアッセイ、Biorad)を用いて組み換えタンパク質の濃度を決定した。サンプルの純度は、SDS-PAGEによって決定し、PC-12細胞による生物活性バイオアッセイを行った。
【実施例４】
【０２０３】
組織培養におけるC3APLTおよびC3APSの有効性の試験
成長阻害に打ち勝つC3APLTおよびC3APSの能力を試験するため、成長阻害性基質であるミエリン上でPC-12細胞を平板培養した。ミエリンは、ウシの脳から精製した(NortonおよびPoduslo、1973年、21:749〜757頁)。他の実験では、購入したタンパク質組成物(Chemicon)からコンドロイチン硫酸プロテオグリカン(CSPG)基質を作製した。カバーガラスまたは96ウエルプレートのウエルをコーティングする前に、ポリ-L-リジン(0.025μg/ml)(Sigma、St.Louis、MO)でコーティングし、水で洗浄して乾燥させた。-80℃において1mg/ml溶液として保存したミエリンを37℃で解凍し、ボルテックスした。8ウエルのチャンバーLab-Tekスライド(Nuc、Naperville、IL)中8ug/ウエルでミエリンを平板培養した。ミエリン溶液は、無菌組織培養フード中で一夜乾燥させた。翌朝、リン酸緩衝食塩水で基質を静かに洗浄し、次いで培地中の細胞を基質に加えた。PC-12細胞(Lehmann他、1999年)は、10%ウマ血清(HS)および5%ウシ胎児血清(FBS)を含むDMEM中で培養した。使用する2日前に50ng/mlの神経成長因子(NGF)によりPC-12細胞を分化させた。細胞を初回刺激した後、培養皿にトリプシン5mlを加えて細胞を引き離し、細胞をペレット化して、1%HSおよび神経成長因子50ng/mlを含むDMEM2ml中に再懸濁した。次いで、約5000から7000個の細胞を、ミエリンでコーティングした8ウエルのチャンバーLab-Tekスライド(Nuc、Naperville、IL)上で平板培養した。試験基質上に37℃で3〜4時間細胞を置き、細胞を定着させた。細胞を破壊しないように注意しながら吸引によって始めの培地を注意深く除去し、1%HS、NGF 50ng/mlおよび望ましい用量に応じた様々な量のC3、C3APLT、またはC3APSを含むDMEMで置き換えた。2日後、細胞を固定した(4%パラホルムアルデヒドおよび0.5%グルタルアルデヒド)。非修飾C3による対照実験については、NGFで初回刺激したPC-12細胞をトリプシン処理して培養皿から引き離し、細胞をスクレープローディング緩衝液(114mM KCL、15mM NaCl、5.5mM MgCl2、および10mM Tris-HCl)で1回洗浄し、次いでC3 25または50μg/mlの存在下でゴム冠ポリスマンによりスクレーピング緩衝液0.5ml中に削り取った。細胞をペレット化し、平板培養の前にDMEM 2ml、1%HSおよび50ng/ml神経成長因子中に再懸濁した。各処置について少なくとも4実験を分析した。各ウエルについて、Zeiss Axiovert顕微鏡を用い20倍の対物レンズで12枚の画像を集めた。各画像について、神経突起のある細胞と無い細胞数をカウントし、神経突起の長さを測定した。ミエリンは濃厚相(phase dense)であることから、ミエリン基質上で平板培養された細胞を分析の前に抗βIIIチューブリンで免疫染色した。神経突起成長の定性分析には、Northern Eclipseソフトウェア(Empix Imaging、Mississauga、Ontario、Canada)を用いた。データ分析および統計にはMicrosoft Excelを用いた。
【０２０４】
迅速バイオアッセイの場合には、前述のように組織培養で化合物を試験したが、ただし阻害性基質上ではなく組織培養プラスチック上で細胞を平板培養した。これらの実験ではプレートを固定し、細胞の平板培養から5時間後に神経突起をカウントした。試験化合物(C3APLTおよびC3Basic3)は、処置なしに平板培養された細胞よりも組織培養プラスチック上の迅速な成長を促進することができた(図11)。
【０２０５】
C3、C3APLT、およびC3APSによるADPリボシル化を調べるため、前述のように化合物をPC-12細胞培養液に加えた。遠心分離によって細胞を採取し、細胞ホモジネートを調製し、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動によってタンパク質を分離した。次いで、タンパク質をニトロセルロースに移し、抗RhoA抗体(Santa Cruz)でウエスタンブロットを探索した。
【実施例５】
【０２０６】
複数の成長阻害性タンパク質の阻害を乗り越えるC3APLTおよびC3APSの能力の試験
実施例4に記載のようにミエリン基質を作製し、組織培養チャンバースライド上で平板培養した。P1からP3のラットの子を断頭し、頭をエタノールで洗浄し、眼を摘出してHanks緩衝食塩溶液(HBSS、Gibcoから)と共にペトリ皿に入れた。角膜に穴を開けて、水晶体を取り出し、網膜をひねり出した。典型的には、1調製物当たり4枚の網膜を用いた。網膜を15mlの管に移し、容積を7mlにした。解離酵素およびパパイン7mlをさらに加えた。解離酵素溶液は以下のように作製した。DLシステイン30mgを15mlの管に加え(Sigma DLシステイン塩酸塩)、HBSS70ml、10mg.mlウシ血清アルブミン280ulを加えて溶液を混ぜ、0.3N NaOHでpHを7に調整した。解離溶液を濾過滅菌し、7mlの分量として冷凍保存し、使用前に1ml当たりパパイン(Worthington)12.5単位を加えた。網膜に解離溶液を加えた後、ロッキングトレイ上で37℃において30分間管をインキュベートした。次いで、網膜を軽く摩砕し、遠心分離してHBSSで洗浄した。C3APLTまたはC3APSの存在下、または非存在下に、HBSSを成長培地(DMEM(Gibco)、10%ウシ胎児血清、および50mg/ml脳由来神経栄養因子(BDNF)ビタミン、ペニシリン-ストレプトマイシン)で置き換えた。上記の実施例4に記載のように調製したチャンバースライド中の試験基質、ミエリンまたはCSPG上で細胞を平板培養した。定量分析は上記実施例4に記載のように完了した。成長する網膜神経節細胞(RGC)を検出する抗βIIIチューブリンによる蛍光顕微鏡によってニューロンを可視化した。結果を図6に示す。
【実施例６】
【０２０７】
C3APLTによる損傷マウス脊髄の治療および処置マウスにおける運動機能の回復の測定
成体Balb-cマウスを0.6ml/kg hypnorm、2.5mg/kgジアゼパムおよび35mg/kgケタミンで麻酔した。この用量により、全操作に十分な約30分の麻酔が得られる。微小骨鉗子(microrongeurs)(Fine Science Tools)による椎骨および棘突起(spinus process)の除去によって胸部脊柱の一部を露出させた。次いで、背部に脊髄病変を作製し、よく切れるハサミで中心管を過ぎるまで広げ、よく切れるナイフで病変を再切断した。この病変は、すべての対照動物を下半身不随にする。脊椎傍筋肉を再吸収可能な縫合によって閉じ、皮膚を2.0絹縫合によって閉じた。手術後、動物が回復するまで、通常2〜3日は8〜10時間毎に膀胱を手で空にした。近づきやすいように食餌はケージ内に置き、手術後に水に近づきやすいようにスポンジ-水を用いた。また、始めの3日間は、8〜12時間毎にブプレノルフィン(0.05〜0.1mg/kg)の皮下注射を動物に行った。体重が15〜20%減少した動物はすべて致死せしめた。
【０２０８】
Rhoアンタゴニスト(C3またはC3様タンパク質)は、フィブリンをベースにした組織接着送達系(McKerracher、カナダ特許出願番号2,325,842)によって病変の部位へ局所的に送達した。組み換えC3APLTは、CaCl2の存在下でフィブリノーゲンおよびトロンビンと混ぜた。フィブリノーゲンはトロンビンによって切断され、得られるフィブリン単量体は三次元マトリックス中に重合する。我々は、損傷した脊髄に置かれて約10秒以内に重合するフィブリン接着剤の一部としてC3APLTを加えた。我々は、病変の作製後に、脊髄病変部位にC3APLTを塗布して試験した。対照については、フィブリン接着剤のみを注入するか、脊髄を切除してそれ以上処置しなかった。行動試験についてはBBB採点法を用い、オープンフィールド環境における歩行運動を調べた(Basso、1995年、12:1〜21頁)。結果を図7に示す。環境は、大きさが約4'×3'のゴムマットとし、動物をマット上に置いて約4分間ビデオテープにとった。テープにとっている間は腓骨領域を刺激したり動物に過度に触れたりしないように注意した。ビデオテープをデジタル化し、二人の観察者により観察してBBBスコアを割り当てた。マウス用に改変したBBBスコアは以下の通りである。
スコアの説明
1  観察可能な後肢(HL)の動きなし。
2  1または2関節のわずかな動き。
3  1関節の広範囲な動きおよび/または他の1関節のわずかな動き。
4  2関節の広範囲な動き。
5  HLの3関節すべてのわずかな動き。
6  2関節のわずかな動きおよび3番目の関節の広範囲な動き。
7  2関節の広範囲な動きおよび3番目の関節のわずかな動き。
8  HLの3関節すべての広範囲な動き、歩行するが体重を支えられず。
9  3関節すべての広範囲な動き、体重を支えての歩行。
10  体重を支えての頻回から一貫した背面足踏み(dorsal stepping)。
11  体重を支えての頻回な足底足踏み(plantar stepping)。
12  体重を支えての一貫した足底足踏み、協調無し。
13  一貫して体重を支えての一貫した足底足踏み、時々のFL-HL協調。
14  一貫して体重を支えての一貫した足底足踏み、頻回のFL-HL協調。
15  一貫して体重を支えての一貫した足底足踏み、一貫したFL-HL協調;歩行運動中の支配的な足の位置は内側もしくは外側に回転し、または時々の背面足踏みを伴う一貫したFL-HL協調。
16  一貫して体重を支えての一貫した足底足踏み、一貫したFL-HL協調;支配的な足の位置は身体と並行である;頻回から一貫したつま先を引きずり、またはつま先折れ(curled toes)、胴体の不安定性。
17  一貫して体重を支えての一貫した足底足踏み、一貫したFL-HL協調;支配的な足の位置は身体と平行であり、つま先の引きずりなし、またはつま先折れ、ある程度の胴体不安定性。
18  一貫して体重を支えての一貫した足底足踏み、一貫したFL-HL協調;支配的な足の位置は身体と並行であり、つま先の引きずりなし、および歩行運動における一貫した安定性。
【実施例７】
【０２０９】
C3APLTによる損傷したマウス脊髄の治療および解剖学的回復の評価
実施例6について記載したように脊髄損傷を受け、対照としてまたはC3APLTで治療されたマウスを、瘢痕への形態学的変化および軸索再生について評価した。軸索再生を検討するため、順行性標識によって皮質脊髄軸索を識別した。順行性標識試験の場合には、上記のように動物を麻酔し、運動皮質を覆う頭蓋を切除した。細いガラスのマイクロピペッター(直径約100um)により、コムギ胚芽凝集素(2%)にコンジュゲートされた西洋ワサビペルオキシダーゼ2〜4ulを大脳皮質に注入すると、マーカーは神経細胞によって取り込まれ、脊髄中に広がる軸索中へ順行的に輸送される。順行性トレーサーの注入後、頭蓋を元に戻し、皮膚を5〜0絹縫合により閉じる。48時間後に抱水クロラール(4.9mg/10g)で動物を致死せしめ、固定液としてのリン酸緩衝液に溶かした4%パラホルムアルデヒドを灌流した。脊髄を摘出し、ショ糖で凍結保護し、クリオスタット切片を組織学的検査用のスライド上に置いた。
【実施例８】
【０２１０】
C3-TLのDNAおよびタンパク質配列の詳細。
C3APLのヌクレオチド配列
Tatコード配列は、全HIV-1 Tatコード配列を含むプラスミドSVCMV-TAT(Universite de MontrealのDr. Eric Cohenから入手)のポリメラーゼ連鎖反応より取得した。Tatタンパク質の輸送配列を単離するため、PCRを用いた。使用した第一プライマー(5'GAATCCAAGCACCAGGAAGTCAGCC3'(配列番号11))および第二プライマー(5'ACCAGCCACCACCTTCTGATA3'(配列番号12))は、HIV Tatタンパク質のアミノ酸27〜72に対応していた。検証および精製し、PCR産物をpSTBlue-1平滑末端ベクター中にサブクローニングした。次いで、Tatタンパク質のこの輸送セグメントを、制限部位EcoR IおよびSac Iを用いてC3の3'末端においてpGEX-4T/C3中にクローニングした。新たなC3-Tat融合タンパク質をC3-TLと呼んだ。組み換えタンパク質は、実施例3に記載のように作製した。
C3-TLのDNA配列(配列番号13)
「配列表７」
0004489353.tif 000011
TL輸送ペプチド配列自体は以下の通りである:(配列番号46)
「配列表８」
0004489353.tif 000012
C3-TLのタンパク質配列(配列番号14)
「配列表９」
0004489353.tif 000013
分子量32721.40ダルトン
291個のアミノ酸
43個の強塩基性(+)アミノ酸(K、R)
21個の強酸性(-)アミノ酸(D、E)
82個の疎水性アミノ酸(A、I、L、F、W、V)
104個の極性アミノ酸(N、C、Q、S、T、Y)
9.688等電点
22.655  PH7.0における電荷
翻訳された塩基の総数は876個である
%A=37.44  [328]
%G=17.58  [154]
%T=28.31  [248]
%C=16.67  [146]
【実施例９】
【０２１１】
C3-TSのDNAおよびタンパク質配列の詳細。
より短いTat構築物も作製した(C3-TS)。より短いC3 Tat融合タンパク質を作製するため、以下のオリゴヌクレオチドは、5'AATTCTATGGTCGTAAAAAACGTCGTCAACGTCGTCGTG3'(配列番号15)および5'GATACCAGCATTTTTTGCAGCAGTTGCAGCAGCACAGCT3'(配列番号16)とした。同量のオリゴヌクレオチドを混ぜ、72℃で5分間加熱し、次いで室温に15分間オリゴヌクレオチド溶液を放置することにより2本のオリゴヌクレオチド鎖をアニールした。オリゴヌクレオチドをC3の3'末端においてpGEX-4T/C3ベクター中にライゲーションした。構築物を配列決定した。すべてのプラスミドをXL-1 blueコンピテント細胞中に形質転換した。組み換えタンパク質は、実施例3に記載のように作製した。
C3-TSのヌクレオチド配列(配列番号17)
「配列表１０」
0004489353.tif 000014
TS輸送ペプチド配列自体は以下の通りである:(配列番号47)
「配列表１１」
0004489353.tif 000015
C3-TSのタンパク質配列(配列番号18)
「配列表１２」
0004489353.tif 000016
分子量26866.62ダルトン
238個のアミノ酸
36個の強塩基性(+)アミノ酸(K、R)
21個の強酸性(-)アミノ酸(D、E)
71個の疎水性アミノ酸(A、I、L、F、W、V)
78個の極性アミノ酸(N、C、Q、S、T、Y)
9.802等電点
15.212  PH7.0における電荷
翻訳された塩基の総数は717個である
%A=38.91  [279]
%G=17.43  [125]
%T=28.45  [204]
%C=15.20  [109]
【実施例１０】
【０２１２】
以下の実施例は、翻訳されたタンパク質の有効性に影響を及ぼすことなくコード配列を修飾することができる方法を示している。この実施例は、活性に影響を及ぼさないと考えられるC3Basic3への修飾を示している。配列には、本明細書に示すように開始部位を含む全GST配列が含まれ、この開始配列は酵素的に除去されないと思われる。また、本実施例に示す輸送配列は、クローニング戦略の相違による活性配列周囲のアミノ酸組成の変化を有し、Hisタグは省略されている。しかしながら、活性領域は、RRKQRRKRRである。この配列はC3Basic3に含まれ、以下の配列における活性輸送配列である。また、この活性領域の後のタンパク質のC末端領域は、C3Basic3とは異なることに注目されたい。これは、クローニング戦略を変えたためであり、制限部位は異なり、したがって輸送配列には非必須なアミノ酸3'末端が移植されてタンパク質に含まれる。
核酸配列:(配列番号19)
1413塩基対
一本鎖
線状配列
「配列表１３」
0004489353.tif 000017
アミノ酸配列:(配列番号20)
479個のアミノ酸
線状、一本鎖
「配列表１４」
0004489353.tif 000018
分子量53813.02ダルトン
470個のアミノ酸
68個の強塩基性(+)アミノ酸(K、R)
55個の強酸性(-)アミノ酸(D、E)
149個の疎水性アミノ酸(A、I、L、F、W、V)
121個の極性アミノ酸(N、C、Q、S、T、Y)
9.137等電点
14.106  PH7.0における電荷
翻訳された塩基の総数は1413個である
%A=34.61  [489]
%G=19.75  [279]
%T=29.51  [417]
%C=15.99  [226]
%不明=0.14  [2]
%A+T=64.12  [906]
%C+G=35.74  [505]
Davis, Botstein, Roth融解温度79.20℃
【実施例１１】
【０２１３】
CNSにおける修復を刺激するのに有効と思われる追加のキメラC3タンパク質
以下の配列を、C3またはその酵素活性を保持する切断型C3のアミノ末端またはカルボキシ末端に付加することができると考えられる。
1)(Wender他、2000年、97:13003〜13008頁)に記載のポリアルギニンの配列。これらは、6から9個以上のアルギニンであってもよい。
2)ポリリジンの配列
3)ポリヒスチジンの配列
4)アルギニンおよびリジンの混合配列。
5)付加された配列が輸送特性を保持する非塩基性アミノ酸ストレッチを含むアミノ酸の塩基性ストレッチ。
6)少なくとも50%の塩基性アミノ酸を含む5〜15個のアミノ酸の配列。
7)少なくとも30%の塩基性アミノ酸を含む15〜30個のアミノ酸より長い配列。
8)少なくとも18%の塩基性アミノ酸を含む50個のアミノ酸より長い配列。
9)シクロヘキシル側鎖、他の側鎖、様々なアルキルスペーサーの付加によるなど、アミノ酸が化学的に修飾されている上記のいずれか。
10)有効な輸送体としての役割を果たすためのヘリックス構造を壊す傾向を有するプロリン残基を有する配列。
【実施例１２】
【０２１４】
CNSにおける修復を刺激するのに有効と思われる追加のキメラC3タンパク質
C3Basic1:ランダムに設計された塩基性尾部と融合したC3
C3Basic2:ランダムに設計された塩基性尾部と融合したC3
C3Basic3:逆Tat配列と融合したC3
我々は、膜輸送特性を有するキメラC3をコードする以下のDNAを設計した。このタンパク質はC3Basic1と命名されている。この配列は、ランダム塩基配列と融合したC3について設計した。以下に示すタンパク質をコードする構築物を作製した。
「配列表１５」
0004489353.tif 000019
この構築物は、以下に示す2つのオリゴヌクレオチドを合成し、それらを一緒にアニールし、付加されたヒスチジンタグを有するpGEX-4T/C3ベクター中にライゲーションすることによって作製した。
「配列表１６」
0004489353.tif 000020
C3Basic1のDNA配列:(配列番号24)
「配列表１７」
0004489353.tif 000021
C3Basic1のたんぱく質配列:(配列番号25)
「配列表１８」
0004489353.tif 000022
分子量29897.03ダルトン
263個のアミノ酸
44個の強塩基性(+)アミノ酸(K、R)
23個の強酸性(-)アミノ酸(D、E)
75個の疎水性アミノ酸(A、I、L、F、W、V)
79個の極性アミノ酸(N、C、Q、S、T、Y)
10.024等電点
22.209  PH7.0における電荷
Davis, Botstein, Roth融解温度78.56℃
【実施例１３】
【０２１５】
CNSにおける修復を刺激するのに有効と思われる追加のキメラC3タンパク質。
我々は、膜輸送特性を有するキメラC3をコードする以下のDNAを設計した。このタンパク質はC3Basic2と命名されている。この配列は、ランダム塩基配列と融合したC3について設計した。以下に示すタンパク質をコードする構築物を作製した。
「配列表１９」
0004489353.tif 000023
この構築物は、以下に示す2つのオリゴヌクレオチドを合成し、それらを一緒にアニールし、付加されたヒスチジンタグを有するpGEX-4T/C3ベクター中にライゲーションすることによって作製した。
「配列表２０」
0004489353.tif 000024
C3Basic2のDNA配列:(配列番号29)
「配列表２１」
0004489353.tif 000025
C3Basic2のたんぱく質配列:(配列番号30)
「配列表２２」
0004489353.tif 000026
分子量29572.61ダルトン
260個のアミノ酸
42個の強塩基性(+)アミノ酸(K、R)
23個の強酸性(-)アミノ酸(D、E)
74個の疎水性アミノ酸(A、I、L、F、W、V)
80個の極性アミノ酸(N、C、Q、S、T、Y)
9.956等電点
20.210  PH7.0における電荷
Davis, Botstein, Roth融解温度78.45℃
【実施例１４】
【０２１６】
CNSにおける修復を刺激するのに有効と思われる追加のキメラC3タンパク質。
我々は、膜輸送特性を有するキメラC3をコードする以下のDNAを設計した。このタンパク質はC3Basic3と命名されている。この配列は、逆Tat配列と融合したC3について設計した。以下に示すタンパク質をコードする構築物を作製した。
「配列表２３」
0004489353.tif 000027
この構築物は、以下に示す2つのオリゴヌクレオチドを合成し、それらを一緒にアニールし、付加されたヒスチジンタグを有するpGEX-4T/C3ベクター中にライゲーションし、次いでpGEX-4T/C3中でサブクローニングすることによって作製した。
「配列表２４」
0004489353.tif 000028
C3Basic3のDNA配列:(配列番号34)
「配列表２５」
0004489353.tif 000029
C3Basic3のたんぱく質配列:(配列番号35)
「配列表２６」
0004489353.tif 000030
分子量29441.47ダルトン
260個のアミノ酸
39個の強塩基性(+)アミノ酸(K、R)
23個の強酸性(-)アミノ酸(D、E)
76個の疎水性アミノ酸(A、I、L、F、W、V)
80個の極性アミノ酸(N、C、Q、S、T、Y)
9.833等電点
17.211  PH7.0における電荷
Davis, Botstein, Roth融解温度78.29℃
【実施例１５】
【０２１７】
C3APLTの配列
pGEX中へのC3APLのサブクローニングから選択されたクローンの1つは、予想した大きさではないが良好な生物活性を有するタンパク質をコードした。このクローンは、切断につながるフレームシフト変異を有し、このクローンはC3APLTと呼ばれた。このクローンを再び配列決定し、クロマトグラムを分析して配列を確認した。C3APLTの配列を確認するため、pGEX-4T/C3APLTの両鎖からのコード配列を、完全長クローンの二重鎖配列決定によって配列決定した(BioS&T、Montreal、Quebec)。
C3APLTのDNA配列は以下の通りである(配列番号36)。
「配列表２７」
0004489353.tif 000031
APLT輸送ペプチド配列自体は以下の通りである(配列番号48)。
「配列表２８」
0004489353.tif 000032
C3APLTのタンパク質配列は以下のとおりである(配列番号37)。
「配列表２９」
0004489353.tif 000033
分子量27574.42ダルトン
248個のアミノ酸
33個の強塩基性(+)アミノ酸(K、R)
21個の強酸性(-)アミノ酸(D、E)
76個の疎水性アミノ酸(A、I、L、F、W、V)
80個の極性アミノ酸(N、C、Q、S、T、Y)
9.636等電点
12.379  PH7.0における電荷
【実施例１６】
【０２１８】
pETにおけるC3APLTのサブクローニングおよび配列
C3は、pGEX系列とpET系列ベクターの双方により大腸菌中で安定に発現されることが報告されている(例えば、DillonおよびFeig、1995年、Meth. Enzymol. 256:174〜184頁、Small GTPases and their Regulators. Part.B. Rho Family. W.E.Balch、C.J.Der、およびA.Hall、編; Lehmann他、1999年、同上; Han他、2001年、J.Mol.Biol.、395:95〜107頁)。融合タンパク質は、合成および試験のためには、pGEXベクター中で十分に発現された。しかしながら、大規模な産生のためには、産生されるタンパク質の大きさを増加させる親和性タグなしに組み換えタンパク質を合成することがより効率的である。また、自動FPLCシステムを用いる親和性クロマトグラフィによって大規模にタンパク質を合成することがより経済的である。ポリメラーゼ連鎖反応を用い、pET T7ポリメラーゼをベースとする大腸菌発現系(Studier他、1990年、Meth. Enzymol.、185:60〜89頁。Gene Expression Technology。D.V.Goeddel、編により概説されている)に組み換え構築物C3APLTを移動した。同様のPCR手法は、輸送配列を有する融合タンパク質系列のC3をベースとする構築物における他のものにも適している。pET3aベクターDNAは、McGill UniversityのDr.Jerry Pelletierより入手した。PCRプライマーは、Invtrogenから入手した。上流(5')プライマーは、5'-GGATCTGGTTCCGCGTCATATGTCTAGAGTCGACCTG-3(37b)(配列番号38)とした。下線は、pGEX4T-C3APLT中のBamHI部位と置き換えるためにプライマー中に導入されたNde I部位である。下流プライマーは、5'-CGCGGATCCATTAGTTCTCCTTCTTCCACTTC-3'(32b)(配列番号39)とした。このプライマーは、pGEX4T-C3APLTの有意鎖DNAに2つの変化を導入し、pGEX4T-C3APLTからのEcoRI部位をBamH I部位(下線部分)で置き換え、TGA終止コドンを強力な終止配列TAAT(相補的プライマー中のイタリック体を使用したATTA配列)で置き換えている。pGEX4T-C3APLTと比較すると、pET3a-C3APLTの予想N末端配列は、Gly-Ser-SerではなくMet-Serであり、1つのセリンが失われGlyがMetで置換されている。C3APLTのC末端におけるアミノ酸配列は変化していなかった。
【０２１９】
標的C3APLT遺伝子は、製造者によって推奨されている緩衝液、DNAおよびデオキシリボヌクレオチド濃度によるPfuポリメラーゼ(Invitrogen/Canadian Life Technologies)を用いて増幅した。PCRは以下の通り行った。95℃で5分間、94℃で2分間を10サイクルと、続いて56℃で2分間、次いで70℃で2分間の延長、次いで94℃で2分間を30サイクルと、続いて70℃。完了した反応物は4℃で保存した。QIAEXIIキット(Qiagen)を用い、DNAバンドを含むアガロースゲルを精製した。精製したPCR産物DNAおよびベクターを、製造者の使用説明書に従ってBamH IおよびNde I(どちらもNew England BioLabsから入手)で消化した。消化生成物をアガロースゲル電気泳動によって無関係なDNAから分離し、QIAEXIIキットで精製した。挿入断片およびベクターDNAを、製造者(New England BioLabs)により提供された指示に従ってT4 DNAリガーゼと共に16℃で一夜インキュベートした。コンピテント大腸菌(DH5α、Invitrogen/Canadian Life Technologiesから入手)をライゲーション混合物で形質転換した。
【０２２０】
DNAは、Qiagenプラスミド中型キットを用いて精製したコロニーから調製し、全挿入断片および接合配列は、フォワードプライマー5'AAATTAATACGACTCACTATAGGG3'(24塩基)(配列番号40)および逆T7ターミネーター配列決定プライマー5'GCTAGTTATTGCTCAGCGG3'(19塩基)(配列番号41)による完全長クローンの二本鎖配列決定法(BioS&T、Montreal、Quebec)により検証した。pET中のC3APLT cDNAの配列を配列番号42に示す。アミノ酸配列は、ID NO.:43に示す。
【実施例１７】
【０２２１】
配列の修飾
実施例1、2、8、9、10、11、12および13、15および16で得られたいずれの配列もC3酵素活性および効果的な輸送配列を保持するように修飾することができた。例えば、クローニングで使用された制限部位の翻訳に相当する配列の3'末端におけるDNAによってコードされるアミノ酸は、活性に影響を及ぼすことなく除去することができる。アミノ末端アミノ酸の一部も、活性に影響を及ぼすことなく除去することができる。融合タンパク質のC3部分の生物活性に必要な最低量の配列は不明であるが、知られている技法によって容易に決定できるであろう。例えば、C3をコードするcDNAの5'末端をだんだんと除去し、得られるタンパク質を作製して生物活性を試験する。同様に、3'末端をだんだんと除去し、断片の生物活性を試験する。次に、中央領域を試験する断片をC3活性の保持について試験する。したがって、タンパク質のC3部分は、活性に必要なだけのアミノ酸が含まれるように切断することができる。あるいは、C3のコード領域において変異を行わせ、得られるタンパク質の活性を試験する。輸送配列は、1つまたは複数のアミノ酸を付加もしくは除去し、または輸送ペプチドを完全に変えるが、我々の組織培養バイオアッセイ(実施例4)におけるC3と比較した有効量の点で輸送特性を保持するように修飾することができる。新たな輸送配列を生物活性について試験し、実施例4に記載のようにニューロンを平板培養し、阻害性基質上でそれらを試験することによってC3活性の効率を改善することができる。
【０２２２】
前述のように、阻害性基質上で成長を誘導するために用いることができる最低量のC3は25ug/mlであることが組織培養試験で決定されている(Lehmann他、1999年、J. Neurosci.、19:7537〜7547頁;Morii、NおよびNarumiya、S、1995年、Methods in Enzymology、256巻パートB、196〜206頁)。細胞を摩砕しない場合には、この用量でさえ無効である(図1)。本発明との関連で、例えば、損傷したマウス脊髄またはラット視神経には20gのマウスに対してC3を少なくとも40μg投与する必要があると判断されている(McKerracher、カナダ特許出願番号2,325,842)。ラットおよびマウスの実験に用いた体重あたりのスケールアップした等価用量で成人のヒトを治療するのに必要と思われる用量を計算すると、損傷したヒト脊髄には120mg/kgのC3(すなわち、単独)を投与する必要があろう。必要とされる大量の組み換えC3タンパク質は、大規模なタンパク質精製および費用のため製造に重大な問題を引き起こす。また、最低有効用量に大量のタンパク質が必要なため、試験することができる用量範囲も制限される。
【０２２３】
本発明の融合タンパク質は、ミエリン基質上で神経突起成長を促進する際にC3(すなわち、単独)よりもはるかに有効である。例えば、C3APLTおよびC3APSの濃度は、C3の場合に必要な濃度の10,000分の1および1,000分の1未満であり、毒作用(例えば、PC-12細胞に対し)を示すことなく匹敵する(同様の)効果を持って用いることができる。また、C3-TLおよびC3-TSは、C3より著しく低い用量でミエリン基質上の神経突起成長を促進することができる。また、in vivoにおける結果は、マウスにおける脊髄損傷後の再生および機能回復を促進するには低用量の融合タンパク質が必要であることを示している。したがって、本発明の融合タンパク質は、製造コストおよび治療に必要な用量の双方においてC3を上回る有意な改善および利点を示す。
【図面の簡単な説明】
【０２２４】
【図１】摩砕あり、および摩砕無しの正常C3の用量反応を示す図である。
【図２】PC-12細胞に化合物を受動的に添加した後のC3ではなくC3APLTおよびC3APSによるADPリボシル化を示す図である。
【図３Ａ】C3APLTが細胞を貫通することを示す図である。
【図３Ｂ】図3Aに比べてより低レベルの、C3による細胞貫通を示す図である。
【図４】低用量におけるC3APLTおよびC3APSの有効性を示す図である。
【図５】低用量におけるC3APLTおよびC3APSの有効性を示す図である。
【図６】一次ニューロンの軸索再生を刺激するC3APLTの有効性を示す図である。
【図７】脊髄損傷後の機能回復を促進するC3APLTの有効性を示す図である。
【図８】C3-Tat(C3-TLおよびC3-TS)キメラとして成長を亢進するTat輸送配列の有効性を示す図である。
【図９】脊髄損傷およびC3APLTによる処置後の軸索再生を示す図である。
【図１０】脊髄損傷後の細胞死を予防し、それによって神経保護性であることを示すC3APLTの有効性を示す図である。
【図１１】神経突起成長を促進するC3APLTおよびC3Basic3の比較を示す図である。
【図１２】C3APLTが、阻害性ミエリンまたはCSPG基質上で平板培養された網膜ニューロンからの神経突起成長を促進することを示す図である。ミエリン(黒い棒)またはCSPG(点付きの棒)基質上で平板培養され、C3-05で処理された網膜ニューロン。図12Aは、細胞1個の直径より長い神経突起を有する細胞の割合を示し(神経突起成長)、図12Bは、細胞1個につき最も長い神経突起の長さを示す(神経突起長)。
【図１】
0004489353.tif 000034
【図２】
0004489353.tif 000035
【図３Ａ】
0004489353.tif 000036
【図３Ｂ】
0004489353.tif 000037
【図４】
0004489353.tif 000038
【図５】
0004489353.tif 000039
【図６】
0004489353.tif 000040
【図７】
0004489353.tif 000041
【図８】
0004489353.tif 000042
【図９Ａ】
0004489353.tif 000043
【図９Ｂ】
0004489353.tif 000044
【図１０】
0004489353.tif 000045
【図１１】
0004489353.tif 000046
【図１２】
0004489353.tif 000047
【配列表】
0004489353000001.app