(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次のアミノ酸配列：
ＮＱＱＲＬＮＳＷＧＣＫＧＲＩＩＣＹＴＳＡＲＷＨ，
ＥＱＱＲＬＮＳＷＧＣＫＧＲＩＩＣＹＴＳＡＲＷＨ，
ＧＲＥＴＬＭＱＤＱＱＲＬＮＳＷＧＣＫＧＲＩＩＣＹＴＳＡＲＷＨ，
ＸＱＱＲＬＮＳＷＧＣＫＧＲＩＩＣＹＴＳＡＲＷＨ，
ＥＴＬＭＱＸＱＱＲＬＮＳＷＧＣＫＧＲＩＩＣＹＴＳＡＲＷＨ，および
ＲＡＲＬＱＡＬＥＴＬＭＱＮＱＱＲＬＮＳＷＧＣＫＧＲＩＩＣＹＴＳＡＲＷＨ,
から成る群より選ばれたアミノ酸配列を含んで成るペプチドであって、ここでＸがＬ−アスパラギン以外の任意の天然アミノ酸、又は非天然アミノ酸を表すペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドが抗原性である、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
前記ペプチドが抗ＨＩＶ  Ｏ群抗体と結合する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
請求項１に記載のペプチドに対して惹起された抗体。
【請求項５】
前記ペプチドが組換え化学法または合成化学法により製造される、請求項１に記載のペプチド。
【請求項６】
請求項１に記載のペプチドをコードする核酸配列。
【請求項７】
請求項６に記載の核酸配列を含有する発現ベクター。
【請求項８】
請求項７に記載の発現ベクターを含有する宿主細胞。
【請求項９】
組換え宿主細胞中でのペプチドの発現方法であって、(a) 請求項７に記載の発現ベクターを適当な宿主細胞中に導入する段階、および(b) 前記発現ベクターからの前記ペプチドの発現を可能にする条件下で、段階(a) の宿主細胞を培養する段階を含んで成る方法。
【請求項１０】
試験キットであって、
ＮＱＱＲＬＮＳＷＧＣＫＧＲＩＩＣＹＴＳＡＲＷＨ，
ＥＱＱＲＬＮＳＷＧＣＫＧＲＩＩＣＹＴＳＡＲＷＨ，
ＧＲＥＴＬＭＱＤＱＱＲＬＮＳＷＧＣＫＧＲＩＩＣＹＴＳＡＲＷＨ，
ＸＱＱＲＬＮＳＷＧＣＫＧＲＩＩＣＹＴＳＡＲＷＨ，
ＥＴＬＭＱＸＱＱＲＬＮＳＷＧＣＫＧＲＩＩＣＹＴＳＡＲＷＨ，および
ＲＡＲＬＱＡＬＥＴＬＭＱＮＱＱＲＬＮＳＷＧＣＫＧＲＩＩＣＹＴＳＡＲＷＨ，
から成る群より選ばれた１もしくは複数のペプチドであって、ここでＸがＬ−アスパラギン以外の任意の天然アミノ酸、又は非天然アミノ酸を表すペプチド、および前記ペプチドに結合する抗体
を含んで成る試験キット。
【請求項１１】
試験管内診断アッセイ方法であって、
ＮＱＱＲＬＮＳＷＧＣＫＧＲＩＩＣＹＴＳＡＲＷＨ，
ＥＱＱＲＬＮＳＷＧＣＫＧＲＩＩＣＹＴＳＡＲＷＨ，
ＧＲＥＴＬＭＱＤＱＱＲＬＮＳＷＧＣＫＧＲＩＩＣＹＴＳＡＲＷＨ，
ＸＱＱＲＬＮＳＷＧＣＫＧＲＩＩＣＹＴＳＡＲＷＨ，
ＥＴＬＭＱＸＱＱＲＬＮＳＷＧＣＫＧＲＩＩＣＹＴＳＡＲＷＨ，および
ＲＡＲＬＱＡＬＥＴＬＭＱＮＱＱＲＬＮＳＷＧＣＫＧＲＩＩＣＹＴＳＡＲＷＨ，
から成る群より選ばれた１もしくは複数のペプチドであって、ここでＸがＬ−アスパラギン以外の任意の天然アミノ酸、又は非天然アミノ酸を表すペプチドと試料とを接触させ、そして前記ペプチドと抗体との間の結合を測定することを含んで成る試験管内診断アッセイ方法。
【請求項１２】
試験管内診断アッセイ方法であって、請求項１のペプチドに対して惹起せしめた１または複数の抗体と試料とを接触させ、そして前記抗体と抗原との間の結合を測定することを含んで成る方法。
【請求項１３】
組換えＭ群gp41タンパク質を含んで成るモザイクであって、ここでＭ群免疫優性領域が１または複数のＯ様免疫優性配列により置き換えられているモザイクであり、ここで該Ｏ様免疫優性配列が、
ＮＱＱＲＬＮＳＷＧＣＫＧＲＩＩＣＹＴＳＡＲＷＨ，
ＥＱＱＲＬＮＳＷＧＣＫＧＲＩＩＣＹＴＳＡＲＷＨ，
ＧＲＥＴＬＭＱＤＱＱＲＬＮＳＷＧＣＫＧＲＩＩＣＹＴＳＡＲＷＨ，
ＸＱＱＲＬＮＳＷＧＣＫＧＲＩＩＣＹＴＳＡＲＷＨ，
ＥＴＬＭＱＸＱＱＲＬＮＳＷＧＣＫＧＲＩＩＣＹＴＳＡＲＷＨ，および
ＲＡＲＬＱＡＬＥＴＬＭＱＮＱＱＲＬＮＳＷＧＣＫＧＲＩＩＣＹＴＳＡＲＷＨ，
から成る群より選ばれ、ここでＸがＬ−アスパラギン以外の任意の天然アミノ酸、又は非天然アミノ酸を表す、モザイク。
【請求項１４】
Ｍ群免疫優性領域が１または複数のＯ様免疫優性配列により置き換えられている組換えＭ群gp41タンパク質を含んで成るモザイクであって、
【化１】
0004481404.tif 000039
および
【化２】
0004481404.tif 000040
から成る群より選ばれるモザイク。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ペプチド、それらの調製および使用に関する。各ペプチドは、ＨＩＶ−１のＯ群のgp41エンベロープタンパク質の免疫優性（immunodominant）領域に相当する配列を有する。この配列は、それが任意の既知の天然に存在するＯ群変異体には一致しないことにより特徴づけられる。
【０００２】
【従来の技術】
後天性免疫不全症候群（AIDS）として知られるようになった病気を引き起こす原因である主な病因物質は、レンチウイルス属に属する非形質転換レトロウイルスである (1)。ヒト免疫不全ウイルスＩ型 (ＨＩＶ−１) と呼ばれるこのウイルスは、現在広く散在しており、それが世界中の健康や生産性に対して重大な驚異となっている。事実上全ての工業先進国に加えて多くの発展途上国が、汚染された血液や血液製剤の使用を通したこのウイルスの更なる伝染戦と病気の蔓延を防ぐために献血の試験を強制している。同様な病気を引き起こすことができ、関連しているが遺伝的には別々であり、あまり広範囲に散在しておらず、且つ病理学的には侵略性が低いウイルスが1986年に報告されており、このウイルスはＨＩＶ−２と呼ばれる (2)。ＨＩＶ−２は主として西アフリカに見られ、ＨＩＶ−１よりは広く散在していないけれども、多くの国がこのウイルスに対する抗体についても同様に献血のスクリーニングを要求している。ＨＩＶ−１はヨーロッパ特許第178 978 号公報に開示されており、ＨＩＶ−２はヨーロッパ特許第0 239 425 号公報に開示されている。
【０００３】
ヒト免疫不全ウイルスに特有である１つの特徴は、それらが配列可変性であることである。全てのＨＩＶのゲノムが逆転写酵素をコードしている。ウイルスが宿主細胞ＤＮＡ中への組込みに先立ってそのＲＮＡゲノムを二本鎖ＤＮＡ相当物へと変換するのに必要とするこの酵素は、ウイルス複製にとって不可欠である。多くのポリメラーゼとは異なり、このMg2+依存性酵素は、通常はプルーフリーディング機能を果たす３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を欠いている。結果として、この酵素は誤りがちな（error-prone ）傾向を有する。ＨＩＶに感染したいずれの個体の中にも、多数の該ウイルスの天然の配列変異体が観察され得るが、その全てが生存可能であるわけではない。この観察は、準種（quasi-species ）という疑念を引き起こした。準種という語は、その全てが密接に関連しており天然に存在する配列変異体の１集団として個体に感染するＨＩＶの特定の株を記載するのに用いられる (3)。
【０００４】
感染個体に見つかる天然の配列変異体に加えて、世界中から集められたＨＩＶ−１株の系統分析から、それらの株が配列の類似性に基づいて少なくとも９つの型（Ａ〜Ｉ）に分類できることが証明された (4)。型間の相違は、一人の感染した人の中での個々のウイルス変異体間に観察される相違、または同じ型に属する別の変異体間の相違よりも大きい。それらのＨＩＶ−１型の地理的分布は大きく異なっており、ある型は特定の地理的領域で流行しているが別の領域では稀であるかまたは存在しない。集約すると、それらのＨＩＶ−１型は１つの群を形成していると考えられ、その群は一般にＭ群（Ｍ＝major ）と称される。
【０００５】
1987年に、一般に遭遇するＨＩＶ株とは容易に免疫学的に識別できるＨＩＶ−１の高度に分岐した変異体が単離された (5)。この変異体はヨーロッパ特許第0 345 375 号公報、米国特許第5,304,466 号および米国特許第5,567,603 号明細書に記載されている。このウイルス (ANT70)は、抗原上はＨＩＶ−２よりもＨＩＶ−１参考株に類似していたが、それにもかかわらず明らかに大きく異なっていた。その後、完全なプロウイルスの配列が決定された (6)。このウイルスのゲノム構成はこの分離株がＨＩＶ−１であることを確証し、その配列と多数の他の参考株の配列との比較はこのウイルスが高度に分岐していることを示し、系統分析はこの分離株をＨＩＶ系統樹のそれ自体ユニークな枝に配置した。
【０００６】
1991年に、第二の高度に分岐したＨＩＶ−１株（MVP5180 ）が単離されそして記載された (7)。この分離株はヨーロッパ特許第0 591 914 号公報に開示されており、これはANT70 と系統的に集団（クラスター）を形成していることがわかった。それらの２つの分離株間の遺伝的距離は、Ｍ群に属するウイルス型間の距離とほぼ同じくらい大きかった。これらの２つの分離株は一緒にＨＩＶ−１分離株の新しい群を限定した。それらの分離株は従来のＨＩＶ−１分離株の通常の集団の外側に集団化しているので、それらは一般にＯ群（Ｏ＝outlier ）と称される新しい群を構成する。
【０００７】
1992年に、フランスでＯ群の株に感染した三番目の人が確認された (8)。免疫学的に重要なウイルス env遺伝子の配列が決定され、WO 96/12809 に記載された。続いて、フランスで数人の追加のＯ群感染患者が確認され、それらの分離株のウイルス envタンパク質の部分配列も決定された。それらの配列はPCT/FR96/00294に記載された。入手可能な全ての配列の分析は、それらがＯ群に相当する系統樹の枝において一緒に集団を形成することを示した。Ｍ群とは異なり、Ｏ群内の個別的なウイルス型の存在についての証拠はほとんどないようである。フランスのＶＡＵ分離株を除いて、Ｏ群分離株の事実上全てが今日まで西〜中央アフリカへの関連性を共有している。アフリカのこの地域では、ＨＩＶ−１感染の全症例の５％〜８％がＯ群変異体により引き起こされると見積もられているが、しかしこの比率は特定の地理的領域に強く依存している（10, 11）。
【０００８】
Ｍ群株とＯ群株との間には病理学または病気進行の面から有意な相違はないように見えるが、血清試験に使用する抗原がＭ群株からのみ誘導される場合には、Ｏ群感染に応答して生産される抗体の検出は信頼できないことがある（12, 13）。Ｏ群抗原に対して生産される抗体はしばしば対応するＭ群抗原と交差反応するだろうが、抗Ｏ群抗体に対する感受性は、その試験にＯ群抗原を取り入れることにより大きく改善することができる。
【０００９】
ＨＩＶ−１の群および型の存在は十分に確立されているけれども、ＨＩＶ−１Ｍ群の特定の型に便利に割り当てることのできない、確認される分離株が増加してきている。配列分析を通して、それらの分離株は２以上の異なる型に属するウイルス間の組換えの産物であることを証明することができる。ある場合には、「モザイク」ゲノムをもたらす複雑な組換え現象が起こったに違いない。１人の患者に複数の型が共存することが示され、そして１人の患者にＯ群株と共に多数のＭ群型が共存することが示されている（14, 15）。また、Ｍ群株とＯ群株のゲノムは非常に高度に保存される領域を共有しているので、おそらくそれらのウイルス間でも同様に理に適った組換えが起こり得るだろう。
【００１０】
ＨＩＶ感染に応答して生産される抗体の検出用に好ましい抗原は、ウイルスエンベロープタンパク質の膜貫通部分である。gp41と呼ばれるこのタンパク質は、感染細胞中で細胞性プロテアーゼによりgp160 前駆体から開裂される。このタンパク質は、ウイルスが新しい宿主細胞と融合しそして宿主細胞中に侵入するために必要とするウイルス融合ペプチドをＮ末端に含む。それは表面エンベロープ糖タンパク質 gp120のためのアンカーも提供する。gp120 は、感受性細胞の表面上に存在するCD4 とウイルスのコレセプターを認識する働きをする。しかしながら、gp120 とgp41の間の相互作用は非共有結合であり従って幾らか不安定である。gp41タンパク質は、それ自体で疎水性膜貫通領域によってウイルスまたは細胞膜に固定される。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
このタンパク質の詳細な三次元構造はほとんど知られていない。このタンパク質の細胞外領域に関する限定量の構造情報がBrookhaven Protein Data Baseから入手可能である。しかしながら、gp41の免疫学的に最も重要な領域の情報は欠けており、これは多分、非常に移動性であるので鏡映を生成できないためであろう。この免疫学的に重要な領域に相当するウイルスgp41アミノ酸配列の比較は、恐らくジスルフィド結合で安定化された堅固なループの最上部にある部分において、非常に高度に保存されたアミノ酸の存在を明らかにする。このことは、それらのアミノ酸が不可欠な構造的および機能的役割を果たしていることを示唆する。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明は、ペプチド、それらの調製および使用に関する。各ペプチドはＨＩＶ−１のＯ群 gp41 エンベロープタンパク質の免疫優性領域に相当する配列を有する。それらの配列は、天然に存在する既知のＯ群変異体のいずれにも一致しないことにより特徴づけられる。
【００１３】
別の面では、本発明は抗原性である前記ペプチドに関する。好ましくは、それは抗ＨＩＶ−１  Ｏ群抗体と結合する。
更に別の面では、本発明は、ＨＩＶ−１のＯ群感染に応答して生産される抗体の検出のための前記ペプチドの使用に関する。
【００１４】
更に別の面では、本発明は、前記ペプチドまたはその類似体を含んで成る、ＨＩＶ−１のＯ群抗体の存在を検出するための組成物およびキットに関する。
更に別の面では、抗ＨＩＶ−１  Ｏ群抗体、前記ペプチドを使ったそれらの生産、並びにＨＩＶ−１抗原およびＨＩＶ−１感染の検出におけるそれらの使用に関する。
【００１５】
本明細書中で「ペプチド147 」と称する好ましいペプチドは、下記のアミノ酸配列を有する：
ＮＱＱＲＬＮＳＷＧＣＫＧＲＩＩＣＹＴＳＡＲＷＨ
（アミノ末端が配列の左端である）。このペプチドは、その使用を促進するような性質を付与するために、一方の末端のところで化学的に修飾されてもよく（16）、例えばＮ末端アセチル化、ビオチン化、または固相もしくは担体に前記ペプチドを固定するのに使われる官能基と前記ペプチドとの間に物理的距離を提供するためのスペーサーアームの付加を行ってもよい。
【００１６】
ペプチド147 の他に、ペプチド147 のアミノ酸配列の幾つかの変異体も有用であることがわかった。
ペプチド147 に関連する好ましいペプチドは下記の配列を有する：
ＸＱＱＲＬＮＳＷＧＣＫＧＲＩＩＣＹＴＳＡＲＷＨ
ここで、ＸはＬ−アスパラギン以外の任意の天然アミノ酸または非天然アミノ酸（即ち20種類の認識される天然アミノ酸に含まれないもの）であってもよいが、天然に存在してもよくまたは人為的デザインによるものであってもよい。
【００１７】
ペプチド147 に関連する別のペプチドは次のアミノ酸配列を有する：
ＥＴＬＭＱＸＱＱＲＬＮＳＷＧＣＫＧＲＩＩＣＹＴＳＡＲＷＨ
ここでＸはＬ−アスパラギン以外の任意の天然アミノ酸または非天然アミノ酸を表す。
【００１８】
前記の好ましいペプチドはいずれも、その使用を促進するような性質を付与するために、それらのアミノ末端またはカルボキシ末端のところで化学的に修飾されてもよく、例えばＮ末端アセチル化、ビオチン化、または固相もしくは担体に前記ペプチドを固定するのに使われる官能基と前記ペプチドとの間に物理的距離を提供するためのスペーサーアームの付加を行うことができる。
【００１９】
本発明は更にモザイクの調製にも関する。モザイクは、Ｍ群免疫優性領域がＯ様免疫優性配列により置き換えられている組換えＭ群gp41タンパク質である。免疫優性領域の下流に位置するα−ヘリックス抗原性領域も、それが抗Ｏ群抗体により認識される可能性を増加させるように変更したが、該タンパク質のヘリックス間相互作用および構造的安定化に必要なアミノ酸は保持した。従って、得られた組換え体は、人工的に作製された天然に存在しないＭ群／Ｏ群ハイブリッドである。
【００２０】
別の面では、本発明は、ＨＩＶ−１のＯ群感染に応答して生産される抗体の検出のための前記組換えタンパク質の使用に関する。
別の面では、本発明は、抗ＨＩＶ−１  Ｏ群抗体を優先的に結合する前記組換えタンパク質に関する。
【００２１】
更に別の面では、本発明は、前記組換えタンパク質を含んで成る、ＨＩＶ−１のＯ群抗体の存在を測定するための組成物およびキットに関する。
更に別の面では、本発明は、抗ＨＩＶ−１  Ｏ群抗体、前記組換えタンパク質を使ったそれらの生産、並びにＨＩＶ−１抗原およびＨＩＶ−１感染の検出のためのそれらの使用に関する。
【００２２】
好ましいＯ群置換配列は下記のものである：
i)  ＲＡＲＬＱＡＬＥＴＬＭＱＮＱＱＲＬＮＳＷＧＣＫＧＲＩＩＣＹＴＳＡＲＷＨ，および
ii) ＤＱＱＶＮＮＶＳＳＩＩＹＤＫＩＬＥＡＱＤＱＱＥＥＮＶＲＥＬＬＥＬＤ
（ここでアミノ末端は配列の左端である）。
【００２３】
組換えタンパク質は、その使用を促進するような性質を付与するために、いずれかの末端のところで化学的に修飾されてもよく、例えばＮ末端アセチル化、ビオチン化、または固相もしくは担体に前記ペプチドを固定するのに使われる官能基と前記ペプチドとの間に物理的距離を提供するためのスペーサーアームの付加を行うことができる。
【００２４】
別の面では、本発明は、前記ペプチドまたは前記組換えタンパク質および別の抗ＨＩＶ−１型抗体に向けられた１または複数の抗原、を含んで成る組成物およびキットに関する。
更に別の面では、本発明は、別のＨＩＶ−１型抗体に向けられた１または複数の抗原と組み合わせて、前記ペプチドまたは前記組換えタンパク質を使ってＨＩＶ−１感染を検出する方法に関する。
【００２５】
【発明の実施態様】
本明細書中で用いる「試料」という語は、着目の分析物を含有すると思われる任意の物質を指す。試料は生物学的液体、例えば全血または全血成分、例えば赤血球、白血球、血小板、血清および血漿、腹水、尿、脳脊髄液、並びに着目の分析物を含み得る他の体内成分であることができる。
【００２６】
本明細書中で用いる「抗体」はモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であることができ、そして例えばヒト、ラット、マウス、ウサギ、ウマ、ヒツジをはじめとする任意の種起源の抗体であるか、またはキメラ抗体であることができる。抗体は組換えモノクローナル抗体または化学的に作製された抗体であることができる。M. Walker 他, Molec. Immunol. 26, 403-11 (1989) ; 米国特許第4,474,893 号；米国特許第4,816,567 号および米国特許第4,676,980 号明細書を参照のこと。
【００２７】
本明細書中で用いる「抗原」は、適当な動物体組織との接触の結果として、感染に対する感受性および／または耐性の状態を誘導する任意の物質を指す。「抗原性」とは、免疫原性であるかまたは抗原の性質（非限定的に抗原を結合する抗体の生成を含む）を有することを意味する。抗原はタンパク質、オリゴペプチドまたはポリペプチドであり、そして合成方法の他に組換え技術を使って調製することができる。
【００２８】
本発明の目的上、遺伝暗号は縮重であるために１つの特定アミノ酸をコードするのに複数のコドンを用いることができ、従って、アミノ酸配列は１組の類似のＤＮＡオリゴヌクレオチドのいずれかによりコードすることができる。
【００２９】
更に、特定アミノ酸をコードする様々なコドンには相当量の重複性があることが知られている。従って本発明は、同一アミノ酸の最終的翻訳をコードする別のコドンを含むＤＮＡ配列にも向けられる。本発明の目的上、１または複数の置換されたコドンを有する配列は縮重変異体として定義される。本発明の範囲内には、発現されるタンパク質の最終的な物理的特性を実質上変更しないＤＮＡ配列中または翻訳タンパク質中のいずれかの突然変異も含まれる。例えば、バリンからロイシンへの置換、アルギニンからリジンへの置換、またはアスパラギンからグルタミンへの置換はペプチドの機能性の変更を引き起こさないであろう。
【００３０】
本明細書中で用いる時、ペプチドの「機能的誘導体」とは、本発明のペプチドの生物性に実質的に類似している生物活性を有する化合物である。「機能的誘導体」という語は、ペプチドの「断片」、「変異体」、「縮重変異体」、「類似体」および「相同体」または「化学的誘導体」を含むものである。「断片」という語はペプチドの任意の部分配列を指す。「変異体」という語は、完全なモザイクもしくはペプチド分子のいずれかまたはそれらの断片に対して構造上および機能上実質的に類似している分子を指す。従って、ある分子とモザイクまたはペプチド分子の両者が実質的に類似した構造を有する場合、またはその２つの分子が類似した生物学的活性を有する場合、その分子はモザイクまたはペプチドに「実質的に類似」している。従って、２つの分子が実質的に類似した活性を有するならば、一方の分子の構造が他方の分子中に認められなくても、または２つの分子のアミノ酸配列が同一でなくても、それらは変異体であると見なされる。「類似体」という語は、完全なモザイクもしくはペプチドのいずれかにまたはそれらの断片に機能の面で実質的に類似している分子を言う。
【００３１】
組換え宿主細胞中でのペプチドの発現後、数種類のペプチド精製方法が利用可能であり且つ使用に好適である。例えば、塩分別、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイト吸着クロマトグラフィーおよび疎水的相互作用クロマトグラフィーの個々の適用または様々な組合せの適用により、細胞溶解物と抽出物から、または順化培地から、ペプチドを精製することができる。加えて、全長ペプチドまたは断片に特異的なモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を使って調製された免疫アフィニティークロマトグラフィーを使って、組換えペプチドをその他の細胞タンパク質から分離することができる。
【００３２】
下記に実施例を与える。この実施例は例示のためであり本発明を限定するものではない。
【００３３】
【実施例】
実施例１
配列。どのアミノ酸がＯ群株に特徴的であるかを決定するために、できるだけ多くの異なる分離株からのgp41配列（完全なものと部分的なもの）を収集しそして整列させた。それらの配列の多くが科学文献から入手可能であったが、その他のものは本発明者らの研究室で決定した。比較に用いる配列は次の源より得られた。免疫原性であることが知られているgp41の領域および特定の診断的価値を有する領域に注意を集中させた。
【００３４】
【表１】
0004481404.tif 000002
【００３５】
ウイルスアミノ酸配列を、gp41の免疫優性領域を含有する33アミノ酸断片に短縮し、MEGALIGNプログラム（DNAStar)を使って整列させた。整列を図１に示す。
【００３６】
各アミノ酸位置の上の欄の棒の高さは、各位置のアミノ酸がどれくらい高度に保存されているかをグラフ的に示す。着目の領域中の33個の位置のうち、18アミノ酸が全ての株において完全に保存されている。低度に保存されているその他の15の位置では、それらの位置に見つかるアミノ酸の綿密な調査は、しばしば或る特徴を有するアミノ酸に優先性があることを示す。例えば、９位と25位では、疎水性側鎖を有するアミノ酸が強く優先される。21位ではリジンが、そして23位では正電荷を有するアミノ酸に強い優先性が認められる。
【００３７】
免疫優先領域は、主として表３に示される領域中の11〜33位アミノ酸に位置することが知られているので、１つのアミノ酸を天然株においても見つかる各位置に組み込んだペプチド配列を誘導した。しかしながら、得られる配列はユニークであり、且つ既知のＯ群ウイルスのいずれのものとも一致しない。この配列は元のANT70 分離株のものと約63％同一である。
【００３８】
このペプチド（ペプチド 147）のアミノ酸配列は次の通りである：
ＮＱＱＲＬＮＳＷＧＣＫＧＲＩＩＣＹＴＳＡＲＷＨ
【００３９】
下記に示すアミノ酸整列は、この配列と元のANT70 分離株の配列との類似性と相違性を示す：
ANT70           ＮＱＱＬＬＳＬＷＧＣＫＧＫＬＶＣＹＴＳＶＫＷＮ
ペプチド 147    ＮＱＱＲＬＮＳＷＧＣＫＧＲＩＩＣＹＴＳＡＲＷＨ
【００４０】
ペプチド合成。ペプチド合成は、開裂後にＣ末端アミドを有するペプチドを生成させるために修飾されたRinkリンカーを有する、市販のポリスチレン：ジビニルベンゼン架橋樹脂上で９−フルオレニルメトキシカルボニル（Fmoc）化学を使って行った。保護アミノ酸は、等モル量のＮ−〔（ジメチルアミノ）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾロ〔４，５−ｂ〕ピリジン−１−イルメチレン〕−Ｎ−メチルメタナミニウムヘキサフルオロリン酸Ｎ−オキシド（HATU）と１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアール（HOAt）、および２倍モル過剰量のＮ−メチルピロリドン(NMP) 中のＮ−メチルモルホリン(NMM) を使ってその場で活性化した。樹脂の負荷容量に関して４倍過剰量の活性アミノ酸を使用した。グルタミン、アスパラギン、システインおよびヒスチジンにはトリチル(Trt) 側鎖保護基を使用した。セリン、スレオニンおよびチロシンのヒドロキシル機能はｔ−ブチル (tBu)基で保護し、リジンの側鎖はｔ−ブチルオキシカルボニル (tBoc) 基で保護し、そしてアルギニンの側鎖には２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル(Pmc) 基を使用した。その他の全てのアミノ酸は側鎖保護を用いずにカップリングせしめた。
【００４１】
サイクルの初めのFmoc基の除去は、NMP 中の２％ピリジンと２％１，８−ジアザビシクロ〔５．４．０〕ウンデカ−７−エンの混合物を用いて、樹脂に結合したペプチドを処理することによって行った。
【００４２】
試験のための固相へのペプチドの結合を促進するために、アミノ末端にビオチン残基を有するペプチドを合成した。ビオチンを付ける前にこのペプチドのＮ末端に２個のグリシン残基を付加して、それをスペーサーアームとして使った。ビオチンは、等モル量のＯ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（TBTU）と２倍モル過剰量のNMM を使って、それのカルボキシル基のその場での活性化により結合させた。ビオチンは、活性化前に30％ジメチルスルホキシド（DMSO），70％ NMP中に溶かした。
【００４３】
樹脂に結合したペプチドの開裂は、該ペプチドをトリフルオロ酢酸、フェノール、チオアニソール、エタンジオールおよび水（82.5：５：５：2.5 ：５）の混合物（Ｋ試薬）で処理することにより行った。開裂後、ペプチドを含む開裂混合物を濾過により回収し、ロータリーエバポレーター中で体積を減らした。次いでメチル−ｔ−ブチルエーテルを添加してペプチドを沈澱させた。沈澱した粗製ペプチドを濾過により集め、真空乾燥し、そして逆相HPLCにより精製した。所望の生成物を含有する画分を電子衝撃質量分析法により同定し、凍結乾燥し、そして４℃で乾燥保存した。
【００４４】
実施例２
ＨＩＶ−１のＯ群血清によるペプチドの血清学的認識。感染個体からのヒト血清中に存在する抗ＨＩＶ−１  Ｏ群抗体により認識される能力についてペプチド147 を評価した。全てのＯ群試料は、Ｏ特異的プライマーを使ったウイルスgp41配列の逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）増幅によりＨＩＶ−１のＯ群について陽性であると確認された。得られたＰＣＲ生成物の素性をＤＮＡ配列決定により更に確認した。
【００４５】
抗体結合を証明するのに好ましい方法はエンザイムリンクドイムノソルベントアッセイ(ELISA) である。この技術は、固相に抗原を結合させ、試験しようとする液体を、抗原がコーティングされた固相と接触させ、未結合の材料を洗い流し、次いで酵素標識した第二抗体を用いて結合抗体を検出することを含んで成る。酵素の存在は色素生成または蛍光生成基質を使って検出する。
【００４６】
ビオチン化ペプチド147 を評価するために、マイクロタイタープレートのウエルを、50 mM 炭酸塩緩衝液 pH 9.6 中の１μg/mlの濃度のストレプトアビジン（200 μl ／ウエル）でコーティングした。余分な未結合のストレプトアビジンをリン酸塩緩衝化食塩水(PBS) での数回の洗浄により除去した。ビオチン化ペプチド147 を最少量の純粋なDMSO中に溶かし、次いでPBS 中に0.5 μg/mlの濃度にまで希釈した。各ウエルに200 μl のペプチド溶液を添加し、ペプチドをストレプトアビジンに結合させた。未結合のペプチドをPBS での洗浄により除去した後、ＨＩＶ−１のＯ群に感染した患者から得た血清試料をプレートのウエル中に添加した。適当なインキュベーション期間の後、PBS での洗浄により未結合の物質を除去した。各ウエルに抗IgＧ：西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP) 接合体の希釈液を添加し、37℃で30分間インキュベートした。十分な洗浄により未結合の物質を除去した。Ｏ−フェニレンジアミン(OPD) とH2O2を含有する基質溶液を各ウエルに添加し、そして遮光下でプレートを更にインキュベートした。室温で30分間のインキュベーション期間の後、50μl の4 N H2SO4 の添加により反応を終わらせ、そして各ウエルの吸光度を492 nmで読み取った。
最初に未希釈（10μl ）の血清試料を使ってペプチド147 を試験した。結果を表２に示す。試料の測定値は光学濃度（ＯＤ）で与えられる。
【００４７】
【表２】
0004481404.tif 000003
【００４８】
試料ODS007ａおよびｂは同じ個体から連続採血した血液である。陰性対照試料は未感染の血液提供者からのものである。それらの結果は、ＨＩＶ−１のＯ群感染に応答して生産された抗体がペプチド147 を認識できることを示す。
【００４９】
ペプチド147 抗原を使ったELISA の感度を評価するために、ペプチド147 を使って系列希釈したＯ群血清のパネルを試験した。ストレプトアビジンでコーティングしたプレートを調製し、そこに上記と同様にペプチド147 を添加し、そして希釈パネルを使って試験した。更に、ペプチド147 の性能を純種のＯ群配列のものと比較するために、DUR 変異体の配列に相当する第二のペプチドを合成した（ペプチド 146）。それらのペプチドはgp41の同一領域を正確にカバーしており、それらを並行試験した。結果を表３に示す。
【００５０】
【表３】
0004481404.tif 000004
【００５１】
これらの結果は、高倍率に希釈した試料を使った場合でも、ペプチド147 がＯ群gp41免疫優性領域に対する抗体を結合することができる適切な抗原であることを証明する。多数のパネルを用いてもペプチド147 の性能は純種のＯ群配列のものと同等であるかまたは有意に優れていた。
【００５２】
別の純種のＯ群配列に対してペプチド 147の性能を比較するために、ANT70 配列に相当するペプチドを合成した（ペプチド80）。ペプチド147 と80を同じ濃度で溶解し、系列希釈し、そしてストレプトアビジンをコーティングしたウエルに結合させた。血清試料 ODS007b（表３参照）の１：60希釈液を全てのウエルに添加し、インキュベートした。洗浄後、抗ヒトIgＧ−ＨＲＰ接合体を添加し、インキュベートし、そしてウエルを徹底的に再洗浄した。この場合、ルミノールと過酸塩から成る化学発光基質を使った。蛍光計を使って発光を定量した。結果を表４に示し、そして図２にグラフとして示す。
【００５３】
【表４】
0004481404.tif 000005
【００５４】
上記結果は、ペプチド147 のアミノ酸配列がＨＩＶ−１のＯ群に対する抗体の検出能について、天然分離株のものと同等であることを証明する。
【００５５】
実施例３
ペプチド147 の変異体の抗体認識。次の２つのペプチドを合成した。
ペプチド147-4 ：
ＥＱＱＲＬＮＳＷＧＣＫＧＲＩＩＣＹＴＳＡＲＷＨ
ペプチド147-5 ：
ＧＲＥＴＬＭＱＤＱＱＲＬＮＳＷＧＣＫＧＲＩＩＣＹＴＳＡＲＷＨ
【００５６】
ペプチド147-5 には、スペーサーとして機能するＮ末端グリシンを付加し、そして水性緩衝液中のペプチドの溶解度を高めるために２位にアルギニンを付加した。上記の両ペプチドを抗体捕捉法によりＨＩＶ−１のＯ群血清試料によって認識される能力について評価した。一般に、そのようなアッセイでは、ペプチドを固相に結合せしめ、そして固相に結合したペプチドに試料中に存在する二価抗体が結合する。続いて、西洋ワサビペルオキシダーゼに接合した問題のペプチドから成る接合体を使って、結合した抗体を検出する。次いで、ペプチド−ＨＲＰ接合体が、固相結合ペプチドに結合した抗体に結合する。そのような接合体を調製するのに適した方法は科学文献中に容易に見つけることができ、また当業者に周知である。
【００５７】
ペプチド147-4 かペプチド147-5 のいずれかによりマイクロウエルプレートを予備コーティングした。次いで血清試料の希釈液を添加して37℃で１時間インキュベートした後、プレートを十分に洗浄した。次いで、ＨＲＰに接合させたペプチド147-4 かペプチド147-5 のいずれかの１：100 希釈液を添加し、37℃で更に１時間インキュベートした。このインキュベーション後、プレートを再度徹底的に洗浄した。ＨＲＰの基質（Ｏ−フェニレンジアミン）とH2O2の添加によって、結合した接合体の存在を検出した。ペプチド147-4 と147-5 の抗体認識を下の表５に示す。
【００５８】
【表５】
0004481404.tif 000006
【００５９】
両ペプチドを、感染個体からのヒト血清試料中に存在する抗ＨＩＶ−１  Ｏ群抗体により認識される能力について評価した。Ｏ群血清は全て、Ｏ特異的プライマを使ったウイルスgp41配列の逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）増幅により、ＨＩＶ−１のＯ群について陽性であると確認された。ＤＮＡ配列決定によりＰＣＲ生成物の素性を更に確かめた。
【００６０】
上の表に与えられた結果は、血清試料を高倍率に希釈した場合であっても、指摘のペプチド147 配列変異体が、ＨＩＶ−１  Ｏ群感染に応答して生産される抗体の存在を検出するのに適することを証明する。上記結果は、より長鎖のペプチドの使用が短鎖の変異体よりも幾分高いシグナルをもたらすことも示す。
【００６１】
ペプチド147 の基本的アミノ酸配列に変異を導入し且つＨＩＶ−１のＯ群による感染に応答して生産される抗体を検出する能力を保持することが可能である。
【００６２】
実施例４
抗体検出要の組換え抗原のデザイン。多くの場合、大きなタンパク質は、生来のタンパク質中のポリペプチド鎖の遠隔領域の並置により構築される不連続エピトープを提供できるので、短鎖ペプチドよりも抗体検出の機能がしばしば優れている。組換えタンパク質を使用することの別の利点として、タンパク質の精製もしくは固相への結合を容易にするために、またはタンパク質に別の望ましい特性を付与するために、実際の抗原に無関係のタンパク質特異的配列中に組み込むことができる点が挙げられる。
【００６３】
Ｍ群ＨＩＶ−１Ｂ型ＭＮ分離株の配列を、抗Ｏ群抗体の検出のために望ましい特性を有する新規抗体をデザインする際の出発点として利用した。env 遺伝子産物は855 アミノ酸の長さを有するポリペプチドである。gp160 前駆体の開裂はアミノ酸513 と514 の間で起こり、成熟ウイルス粒子中に見つかるエンベロープタンパク質gp120 とgp41を与える。抗体検出用に特に注目されるのは、図３に示されるgp41の外表領域（ectodomain）である。
【００６４】
新規組換えタンパク質のデザインは、溶液中でその本来の構造を再生する能力を本質的に妨害するタンパク質の生成を避けるためにあらゆる入手可能な構造情報を考慮に入れるべきである。構造１ＡＩＫと１ＥＮＶはBrookhaven Protein Database から入手し、そしてプログラム Rasmol とSwissModelを使って調査した。それらの結晶構造は、渦巻き状コイルを形成する相互作用している２つのヘリックス（らせん）の存在を示す。１ＥＮＶ構造中にはそれらの２つのヘリックスを連結する（且つ免疫優性領域を包含する）配列は存在せず、このことは、ループの最上部の免疫原性領域を含んで成る相互連結領域が非常に移動性であるため鏡映を作れないことを意味する。結晶学データがあるヘリックスを図３に示す。各ヘリックスのＮ末端およびＣ末端限界線は、結晶学データが入手できる限界であり、それらは必ずしも生来のgp41タンパク質中に存在するヘリックスの真の限界線ではない。
【００６５】
図３に示す「下降」ヘリックスの中に含まれる配列のＯ群血清に対する潜在的重要性が証明されており、WO 95/32293 に記載されている。ＭＮ配列中のどのアミノ酸を変異させてはならないかを決定するために、入手可能な三次元構造を調査し、多分２つのヘリックス間の相互作用を安定化するのに関与しているようであるアミノ酸を同定した。次の近接な接触点が同定された：
Ｇ548 →Ｎ657
Ｑ551 →Ｑ653
Ｑ552 →Ｑ654
Ａ562 →Ｉ643
Ｈ565 →Ｙ639
Ｌ569 →Ｉ636
Ｗ572 →Ｗ632
Ｗ572 →Ｗ629
【００６６】
Los Alamos National Laboratoryに保存されたＨＩＶ配列データベース中の入手可能な配列の調査は、上記アミノ酸の多数が高度に保存されていることを明らかにした。存在するとしても、突然変異はしばしば類似した特徴を有しており、例えば疎水性側鎖または水素結合に関与する能力を持つ側鎖を有している。下降ヘリックスの領域（アミノ酸633 〜665 ）中のＭＮ分離株の配列を整列させ、そして配列情報が入手できる全てのＯ群株のものと比較した。この整列を図４に示す。
【００６７】
図４は、Ｂ型配列とＯ群配列との間であっても、この領域中のどのアミノ酸が保存されているかも示す。この配列比較は、Ｍ群株とＰ群株の間に高度の構造相同性があることを非常に強く示唆する。
【００６８】
Ｏ群に典型的な配列に到達するために、Ｏ群配列のみを考察した。各位置に見つかるアミノ酸の評価の後に選択した配列は次のものである：
ＤＱＱＶＮＮＶＳＳＩＩＹＤＫＩＬＥＡＱＤＱＱＥＥＮＶＲＥＬＬＥＬＤ
この配列は、対応するANT70 配列と57.6％の同一性を有する。
【００６９】
更に、ペプチド147 Ｏ群様免疫優性領域をＮ末端方向に延長した。この長い免疫優性領域は下記配列を有する：
ＲＡＲＬＱＡＬＥＴＬＭＱＮＱＱＲＬＮＳＷＧＣＫＧＲＩＩＣＹＴＳＡＲＷＨ
Ｎ末端延長部分を有するこの新規配列は、元のANT70 株と68.6％の同一性を有する。
【００７０】
当業者は、感染患者に認められる抗体を検出するために本明細書中に記載のペプチドまたはその誘導体を使って、または感染患者に認められる抗原を検出するために上記ペプチドに対して惹起せしめた抗体を使って、診断試験を開発することができる。
【００７１】
実施例５
「モザイク」Ｍ群／Ｏ群組換え抗原の作製。gp41の構造的特徴を考慮に入れ、そしてペプチド147 の中に含まれる配列が抗Ｏ群抗体の検出に適当であることを理解して、モザイク組換え体の作製を行った。目的は、出発点としてＭＮ gp41 配列を使用しそして上記の２つのＯ群領域を交換し、それにより免疫上重要な領域のための担体としてＢ型ＭＮ配列を使ってＯ群抗原を作製することである。
【００７２】
そのような組換え体の作製手順を図５〜７に示す。全ての重要な制限酵素開裂部位と共に、重複する合成オリゴペプチドを使った段階的再構成と免疫優性領域の交換が図解される。
使用するプライマーの配列を図８に示す。
【００７３】
ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）融合タンパク質として２つの構成物を作製した。どちらの構成物も全長gp41分子を示さないが、２つのうちの長い方（DHFR-hENV-NH）は、Ｎ末端融合ペプチドを除く本質的に全部のgp41外表領域を含む。構成物DHFR-hES-MH は長い融合タンパク質の先端が切り取られた変異体である。それらの融合タンパク質のアミノ酸配列を図６のａとｂに示す。
【００７４】
分析を促進するためにmyc 遺伝子に由来するＣ末端配列を付加し、そして精製を容易にするためにhis6末尾配列を付加した。全ての非ＨＩＶ配列がボックス中に示されている。Ｏ群様配列には下線が引かれている。この組換え体のＨＩＶ部分の他の全配列はＭ群由来である。
【００７５】
両タンパク質の発現をエシェリキア・コリ（Escherichia coli）中で試みた。端が切り取られた構成物 DHFR-hES-MHを用いた場合に最大の発現レベルが観察され、そして発現された組換えタンパク質は封入体として観察された。細胞を溶解させ、周知の方法により封入体を収穫した。次いでドデシル硫酸ナトリウム(SDS) とジチオスレイトールでの処理によりタンパク質を可溶化し、そしてSDS の存在下でのポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。期待通りの分子サイズを有する１本のバンドが観察され、粗製抗原調製物中の全タンパク質の約90％を占めると見積もられた。
【００７６】
実施例６
Ｏ群抗体検出についてのＭ群／Ｏ群「モザイク」構成物の性能。上述の通り発現させたタンパク質を、評価のためにマイクロタイタープレートのウエル中に0.5 μg/mlの濃度でコーティングした。タンパク質のコーティング後、プラスチック上に残っている全ての結合部位をウシ血清アルブミンによりブロックした。次いでＯ群血清の希釈液を、組換え抗原を認識する能力について試験した。ＨＲＰ標識マウス抗ヒトIgＧ接合体とのインキュベーションにより、結合した抗体を検出し、次いでＯＰＤとH2O2の添加により結合した接合体を検出した。結果を表６に示す。
【００７７】
【表６】
0004481404.tif 000007
【００７８】
それらの抗原は適度に大きい数のＨＩＶ−１Ｏ群配列を考慮に入れることにより誘導したため、新規配列は天然に存在するであろうＯ群変異体のスペクトルをより良好に象徴すると考えられ、従って抗Ｏ群抗体の検出についてより広い特異性を有することができる。実験結果は、それらの抗原がＨＩＶ−１のＯ群感染に応答して生産される抗体の検出について天然のウイルス配列と同等に機能し、より良好に機能する場合もあることを示す。
【００７９】
「モザイク」組換え体の使用は、所望の抗原決定基を表示するが、イムノアッセイにおいて使用されるペプチドよりも固相への直接コーティングにより一層容易に結合できるという利点を提供する。更に、ペプチドに比較して長さが増加されそしてより構造がより安定化されるために、組換え体はより一層正確な測定を与える。
本明細書中に言及される全ての資料は参考として本明細書中に組み込まれる。従って、本発明は、特許請求の範囲内に入る全ての変更を包含すると理解すべきである。
【００８０】
【表７】
0004481404.tif 000008
【配列表】
0004481404.tif 000009
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＨＩＶ−１  Ｏ群の免疫優性領域アミノ酸配列の整列を示す。
【図２】図２は、ＨＩＶ−１  Ｏ群の試料によるペプチド147 およびペプチド80の認識を示す。
【図３】図３は、gp41の外表領域を示す（ＭＮ分離株）。
【図４】図４は、下降ヘリックスの領域中のＭＮ（Ｂ型）およびＯ群gp41配列の整列を示す。
【図５】図５は、重複する合成オリゴヌクレオチドを使った免疫優性領域の段階的再構成と置換を示す。
【図６】図６は、重複する合成オリゴヌクレオチドを使った免疫優性領域の段階的再構成と置換を示す。
【図７】図７は、重複する合成オリゴヌクレオチドを使った免疫優性領域の段階的再構成と置換を示す。
【図８】図８は、図３において使用したプライマーのヌクレオチド配列を示す。
【図９】図９は、DHFR-hENV-MHのアミノ酸配列を示す。
【図１０】図１０は、DHFR-hES-MH のアミノ酸配列を示す。
【図１】
0004481404.tif 000041
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
0004481404.tif 000047
【図８】
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【図９】
0004481404.tif 000049
【図１０】
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