(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２以上のポリクローナル抗体試薬を含む免疫測定キットの製造方法であって、当該ポリクローナル抗体試薬は、互いに抗原上の異なるエピトープを優先的に認識するように選択されることを特徴とし、また当該ポリクローナル抗体はモルモットを免疫動物として得られ、該方法は；
（イ）少なくとも２以上の免疫されたモルモットから各々の抗血清を得；
（ロ）該モルモットを免疫した抗原に対する特定のモノクローナル抗体と該抗血清との間でのエピトープの競合を検査し；
（ハ）該モノクローナル抗体とエピトープの競合を示す抗血清からキャプチャー側または検出側のポリクローナル抗体試薬を調製し；そして
（ニ）該モノクローナル抗体とエピトープの競合を示さない抗血清から他方のポリクローナル抗体試薬を調製することを特徴とする、
前記キットの製造方法。
【請求項２】
上記特定のモノクローナル抗体と抗血清の間でのエピトープの競合の検査が；
（イ）一定濃度の抗原と抗血清の混合溶液を調製し；
（ロ）該溶液内で抗原抗体結合体を形成させ；
（ハ）次いで、該混合溶液を、上記特定のモノクローナル抗体の固相化体に添加し；そして、
（ニ）該固相化モノクローナル抗体と特異的に結合した（ロ）の抗原抗体結合体の量を測定することを特徴とする、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記一定濃度の抗原と混合される抗血清の濃度を段階的に希釈して上記抗原抗体結合体量を測定することを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ポリクローナル抗体試薬の少なくとも１つが抗体分子の酵素消化体から調製される、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
上記酵素消化体が抗体分子のＦ（ａｂ’）２フラグメントである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
測定対象がインスリンである、請求項１乃至５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
免疫測定キットであって、
（イ）測定対象である抗原に対する１のモノクローナル抗体との間でエピトープの競合を示す第１のポリクローナル抗体試薬と、
（ロ）該抗原に結合し、該モノクローナル抗体との間でエピトープの競合を示さない第２のポリクローナル抗体試薬とを含み、
ここで、当該ポリクローナル抗体はモルモットを免疫動物として得られる、
前記キット。
【請求項８】
サンドイッチアッセイのための請求項７に記載の免疫測定キットであって、上記第１のポリクローナル抗体試薬がキャプチャー側または検出側であり、上記第２のポリクローナル抗体試薬がその他方の側である、前記キット。
【請求項９】
上記ポリクローナル抗体試薬の少なくとも一方が抗体分子のＦ（ａｂ’）２フラグメントから調製される、請求項７または８に記載のキット。
【請求項１０】
測定対象がインスリンである、請求項７乃至９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１１】
上記インスリンが実験動物由来である、請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
上記実験動物がマウス、ラット及びハムスターからなる群から選択される、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
試料中のインスリンを１ｐｇ/ｍｌの感度で検出可能な請求項１０乃至１２のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本願発明は、高い感度を有する免疫測定試薬及びキット並びにその製造方法に関し、特に、インスリンを高感度に測定する免疫測定試薬及びキット並びにその製造方法に関する。
【０００２】
【従来技術】
インスリンは血糖降下作用をもつホルモンとして広く知られており、その血中濃度を測定することは糖尿病の診断や病態の把握に不可欠である。
【０００３】
このようなヒト血中インスリン濃度の測定は、当初、放射性同位元素を用いるラジオイムノアッセイで行われてきたが、後に酵素免疫測定法が確立され、これもインスリンの測定に応用されるようになってきており、したがって、当該免疫測定キットとしてはラジオイムノアッセイや酵素免疫測定法を利用したキットが臨床診断薬キット等の目的で市販されている。
【０００４】
しかしながら、上記いずれのキットも、測定試料として数十マイクロリットルから百マイクロリットル程度の試料を必要とし、測定感度は数百ｐｇ／ｍｌ程度に過ぎない。
【０００５】
一方、近年、糖尿病研究が盛んになるにつれて、実験動物でのインスリン測定の必要性も増大してきている。
【０００６】
このような実験動物でのインスリン測定においても、従来はヒトインスリン測定試薬が用いられ、その抗体の交差反応性を利用して実験動物のインスリンが測定されてきた。しかしながら、標準品としてヒトインスリンを用いることで動物インスリン濃度の真の値が得られないという問題があったことから、実験動物専用の測定試薬が期待されるようになった。
【０００７】
このため、ラットインスリン測定用ラジオイムノアッセイ法が最初に開発され、米国Ｌｉｎｃｏ  Ｒｅｓｅａｃｈ社、英国  Ａｍｅｒｓｈａｍ社、米国Ｉｎｋｓｔａｒ社等から市販されるに至った。これらのキットには、標準品としてラットインスリンが添付されており、ヒトインスリンを標準物質として用いることによるトラブルは回避されるようになった。
【０００８】
しかし、そのようなキットでは、依然、用いる試料の容量がヒトインスリン測定キットと同じ約１００マイクロリットル程度であり、また、後の実験に支障をきたさないように一匹の動物から得ることのできる血液の量にも限界があるため、実験には必然的に多数の動物を使う必要が生じた。とりわけ、体重がラットの十分の一程度のマウスを用いる実験においては、一つのデータを取るために複数のマウスを犠牲にする必要があり、後の実験が不可能となる場合さえあった。
【０００９】
上記の問題を解決するために、従来の測定試薬と同程度の感度を有し、且つ微量の試料でも測定可能な方法が開発された。当該測定試薬は、本件出願人の他、株式会社シバヤギやスウェーデンのＭｅｒｃｏｄｉａ社からも販売されている。
【００１０】
しかしながら、たとえ微量試料で測定可能な上記の試薬であっても、それが従来の測定試薬と同程度の感度では測定に不十分な場合がある。例えば、ストレプトゾトシン処理ラットやマウスに代表されるＩ型糖尿病のモデル等が示すような、低濃度の血中インスリンを測定する場合等には、より高い測定感度が要求される。この場合、従来の測定試薬を用いつつ、逆に、比較的大量の血清を試料とすれば、当該血清中に含まれている多量の抗原抗体反応阻害物質により反応系が影響され、その影響を無視できなくなる。したがって、上記のような低濃度の血中インスリン測定等に際しても有効な、極めて高い感度を有する免疫測定試薬の開発が望まれていた。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本願発明は、従来の免疫測定試薬に比べて、極めて高い測定感度を有する免疫測定試薬及びキットを提供することを課題とする。
【００１２】
殊に、糖尿病の治療や研究においては血中インスリンの濃度を測定することが必須であり、Ｉ型糖尿病患者やストレプトゾトシン処理動物等の血中インスリン濃度をも測定できる試薬が求められている。とりわけ、実験用小動物の血中インスリン濃度を測定するにはヒトインスリン測定に用いられるような１００マイクロリットルの試料を用いるのではなく、できるだけ小容量の試料で測定できる極めて高い感度の測定系が必要とされている。
【００１３】
したがって、本願の免疫測定試薬及びキットは、インスリンの濃度を測定する際に有利に使用され得る。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
上記のとおり、本願発明は、従来の免疫測定試薬に比べて、極めて高い測定感度を有する免疫測定試薬及びキットを提供することを課題とする。
【００１５】
ここで、インスリンを例にとれば、現在市販されているインスリン測定試薬やインスリン測定診断薬の多くには、その特異性を高めるためにマウスを用いて作製された「モノクローナル抗体」が使用されている。
【００１６】
ところが、これらのモノクローナル抗体は、その特異性にも拘らず、一般的に抗原（インスリン）に対する親和性がポリクローナル抗体に比べて低く、そのため当該モノクローナル抗体を用いたインスリン測定法の感度には自ずと一定の限界があった。
【００１７】
すなわち、モノクローナル抗体は単一分子であるが故に、その特異性も高いことが利点ではあるが、その抗原に対する親和性もまた単一である。一般に、モノクローナル抗体の結合定数は１０８程度、高くても１０９が限度であり、１０１０程度の非常に高い結合定数を持つモノクローナル抗体を分離するのは容易ではない。
【００１８】
これとは対照的に、ポリクローナル抗体は複数の抗体分子の混合物であり、したがって、それが認識する抗原上のエピトープは単一ではないが、その親和性もまた単一ではなく、適当な方法で免疫された抗血清の中には１０１０程度の非常に高い結合定数を持つ抗体も含まれる場合がある。とすれば、これらの高い結合定数を有する抗体をポリクローナル抗体としてそのまま測定に利用することにより、当該測定系の感度を上げ得ることが期待される。
【００１９】
ところが、上記のとおり、ポリクローナル抗体には親和性が高い抗体分子が含まれるという利点がある反面、それが抗原分子上の異なるエピトープを認識する抗体分子の集合体であるという欠点も有している。しかも、各免疫動物毎に血中に含まれる抗体分子の比率や量、抗原分子に対する親和性が異なるため、同じ性質を持つ抗血清を安定的に得るには同じ条件で免疫した動物の抗血清を少なくとも数十匹分、理想的には数百匹分をプールし、そこからポリクローナル抗体を調製しなければならないという欠点を有するものであった。したがって、その高い親和性にも拘らず、ポリクローナル抗体の免疫測定法への使用は、近年、一般的ではなかった。
【００２０】
しかしながら、本発明者らは、インスリン測定系の開発を進める過程で、驚くべきことに、インスリン免疫したモルモットの抗血清に含まれる抗体群（ポリクローナル抗体）が優先的に認識するエピトープは免疫モルモット個体毎に異なり、極端な例ではその特異性がモノクローナル抗体に近い場合があることを見いだした。
【００２１】
更に、本発明者らは、上記のモノクローナル抗体に似た反応性（特異性）を有するという性質と、インスリンに対して非常に高い親和性を持つことの二つの条件を併せ持つポリクローナル抗体を利用することにより、インスリンの測定感度を上昇させる得ることを想到した。
【００２２】
すなわち、インスリン分子上の、互いに異なるエピトープを優先的に認識する２以上の高親和性ポリクローナル抗体を選択して組み合わせることにより、従来用いられてきた測定試薬より高感度な測定系を組み立てることに成功した。したがって、本願発明の第１は、
（１）少なくとも２以上のポリクローナル抗体試薬を含む免疫測定キットの製造方法であって、当該ポリクローナル抗体試薬は、互いに抗原上の異なるエピトープを優先的に認識するように選択されることを特徴とする、前記キットの製造方法である。
【００２３】
より詳細には、モノクローナル抗体に匹敵する特異性を有し、且つモノクローナル抗体に比べて高い親和性を有する幾つかのポリクローナル抗体を個々の免疫動物の抗血清から得た場合でも、それらを単に任意に組み合わせて、キャプチャー側（固定化抗体側）及び検出側（標識抗体側）の各試薬に用いたのでは、当該ポリクローナル抗体試薬間でエピトープの競合が起って、折角の検出感度が損なわれてしまう場合がある。例えば、キャプチャー側と検出側のポリクローナル抗体試薬が同一のエピトープを優先的に認識したのでは、キャプチャー側のポリクローナル抗体試薬が優先的に認識するべきエピトープが、先に検出側のポリクローナル抗体試薬に優先的に認識されてしまい、当該エピトープが検出側の抗体試薬によって前もって塞がれてもはやキャプチャー側と結合し得なくなり、そのことでサンドイッチアッセイの検出感度が低下する惧れがあるのである。
【００２４】
これに対し、本願のように、キャプチャー側と検出側が優先的に認識するエピトープが異なったものとなるように夫々を選択して組み合わせれば、上記のようなエピトープの競合が起こらず、したがって、互いのポリクローナル抗体が有するモノクローナル抗体に比べた高い親和性が損われることがなく、結果として高い感度を達成することが可能なのである。
【００２５】
更に、このような選択及び組み合わせは、均質で安定的な免疫測定キットの供給をも可能にするのである。
【００２６】
従来のように、均質なポリクローナル抗体を得る目的で複数の免疫動物からの抗血清を一旦プールし、そこからポリクローナル抗体を得て免疫測定キットの試薬として使用すると、個々のポリクローナル抗体が有する有利な特徴であるモノクローナル抗体に似た高い特異性と、抗原に対する高い親和性が希釈及び／または相殺されて、ポリクローナル抗体を使用する本願の利点が失われてしまう結果となる。
【００２７】
これに対し、本願のようにポリクローナル抗体を選択すれば、均質で安定的なキットを与えるように各ポリクローナル抗体を簡便に組み合わせることができ、抗血清をプールする必要がなくなるのである。
【００２８】
さて、以上の観点からすれば、本願の免疫測定キットの製造方法においては各免疫動物から得られる抗血清に含まれるポリクローナル抗体のエピトープに対する特異性を迅速に判別することが更に望ましい。したがって、本願発明の第２は、
（２）上記（１）に記載の免疫測定キットの製造方法であって、該方法は；
（イ）少なくとも２以上の免疫動物から各々の抗血清を得；
（ロ）該免疫動物を免疫した抗原に対する特定のモノクローナル抗体と該抗血清との間でのエピトープの競合を検査し；
（ハ）該モノクローナル抗体とエピトープの競合を示す抗血清からキャプチャー側または検出側のポリクローナル抗体試薬を調製し；そして
（ニ）該モノクローナル抗体とエピトープの競合を示さない抗血清から他方のポリクローナル抗体試薬を調製することを特徴とする、
前記キットの製造方法である。
【００２９】
上記の構成によれば、特定のモノクローナル抗体は単一のエピトープを認識するので、当該モノクローナル抗体とのエピトープの競合を指標にすることで、ポリクローナル抗体同士のエピトープの競合も迅速に特徴付けることが可能である。すなわち、特定のモノクローナル抗体との間でエピトープの競合を示す抗血清は、そこに含まれる抗体群（ポリクローナル抗体）が当該エピトープ若しくはその近傍を優先的に認識していると考えられる。一方、モノクローナル抗体との間でエピトープの競合が起こらなければ、その抗血清は当該エピトープとは別の、離れたエピトープを優先的に認識する抗体群（ポリクローナル抗体）を含むと判別できるのである。
【００３０】
なお、上記の判別は、特定のポリクローナルを固相化して、サンドイッチアッセイ法の原理を利用して行うのが更に簡便である。したがって、本願発明の第３は、
（３）上記特定のモノクローナル抗体と抗血清の間でのエピトープの競合の検査が；
（イ）一定濃度の抗原と抗血清の混合溶液を調製し；
（ロ）該溶液内で抗原抗体結合体を形成させ；
（ハ）次いで、該混合溶液を、上記特定のモノクローナル抗体の固相化体に添加し；そして、
（ニ）該固相化モノクローナル抗体と特異的に結合した（ロ）の抗原抗体結合体の量を測定することを特徴とする、
上記（２）に記載の方法である。
【００３１】
上記において、固相化モノクローナル抗体と特異的に結合した抗原抗体結合体の量の測定は、抗血清に含まれる抗体分子に特異的に反応する酵素標識抗体を用いて、「固相化モノクローナル抗体」−「抗原」−「抗血清由来の抗体分子」−「酵素標識抗体」の４分子結合体を形成させることで容易に測定できる。例えば、抗原がマウスインスリンであり、免疫動物がモルモットである場合は、「固相化マウスインスリンモノクローナル抗体」−「マウスインスリン」−「モルモット由来の抗インスリン抗体（ＩｇＧ）」−「抗モルモットＩｇＧ抗体（酵素標識付き）」である。酵素標識抗体の固相支持体への結合量が少ないことは、固相化モノクローナル抗体と抗血清に含まれる抗体群（ポリクローナル抗体）との間にエピトープ競合があったことを示し、逆に当該結合量が多いことは、エピトープの競合が少なかったことを示す。
【００３２】
なお、抗原と抗血清との混合による上記抗原抗体結合体の形成は、固相化モノクローナル抗体との接触（添加）と同時に行われてもよい。
【００３３】
更に、上記サンドイッチアッセイにおいては、検査する抗血清を段階的に希釈してその用量依存性を調べることが、エピトープの競合の判別において有利である。したがって、本願発明の第４は、
（４）上記一定濃度の抗原と混合される抗血清の濃度を段階的に希釈して上記抗原抗体結合体量を測定することを特徴とする、上記（３）に記載の方法である。
【００３４】
なお、本願発明に用いることのできるポリクローナル抗体試薬は、ポリクローナル抗体自身のほか、そのいかなる反応性のフラグメント、例えばポリクローナル抗体の酵素消化体をも含み得る。好適な酵素消化体は、抗体分子をペプシンで消化したＦ（ａｂ’）２フラグメントであり、そのようなフラグメントの使用は高感度測定では必須とされるバックグラウンドの低減に有効である。したがって、本願発明の第５及び第６は、
（５）ポリクローナル抗体試薬の少なくとも１つが抗体分子の酵素消化体から調製される、上記（１）乃至（４）のいずれかに記載の方法であり、
（６）上記酵素消化体が抗体分子のＦ（ａｂ’）２フラグメントである、上記（５）に記載の方法である。
【００３５】
本願発明の方法は、抗原の分子量が約５０００以下のような場合に特に有効である。そのような抗原では、固体に認識されるエピトープの数がそれほど多くないため、任意のポリクローナル抗体の組み合わせの結果生じるポリクローナル抗体試薬間でエピトープの競合が起こりやすいからであり、そのような場合に本願のような特定のポリクローナル抗体どうしの組み合わせが有効になるのである。
【００３６】
抗原がインスリンである場合が特に有利である。したがって、本願発明の第７は、
（７）測定対象がインスリンである、上記（１）乃至（６）のいずれかに記載の方法である。
【００３７】
また、ポリクローナル抗体の生産性の観点等から、抗原がインスリンであるときは免疫動物としてモルモットを用いることが有利である。したがって、本願発明の第８は、
（８）ポリクローナル抗体がモルモットを免疫動物として得られる、上記（１）乃至（７）のいずれかに記載の方法である。
【００３８】
更に本願は、上記のような、エピトープの競合を起こさないポリクローナル抗体の組み合わせ、特に、抗原に対する１のモノクローナル抗体との間でエピトープの競合を示すようなポリクローナル抗体と、競合を示さないようなポリクローナル抗体を組み合わせた免疫測定キットにも関する。したがって、本願発明の第９乃至１５は、
（９）測定対象である抗原に対する１のモノクローナル抗体との間でエピトープの競合を示す第１のポリクローナル抗体試薬と、該モノクローナル抗体との間でエピトープの競合を示さない第２のポリクローナル抗体試薬を含む免疫測定キット、
（１０）サンドイッチアッセイのための上記（９）の免疫測定キットであって、上記第１のポリクローナル抗体試薬がキャプチャー側または検出側であり、上記第２のポリクローナル抗体試薬がその他方の側である前記キット、
（１１）上記ポリクローナル抗体試薬の少なくとも一方が抗体分子のＦ（ａｂ’）２フラグメントから調製される、上記（９）または（１０）に記載のキット、
（１２）測定対象がインスリンである、上記（９）乃至（１１）のいずれかに記載のキット、
（１３）上記インスリンが実験動物由来である、上記（１２）に記載のキット、
（１４）上記実験動物がマウス、ラット及びハムスターからなる群から選択される、上記（１３）に記載のキットであり、また、
（１５）ポリクローナル抗体がモルモットを免疫動物として得られる、上記（９）乃至（１４）のいずれかに記載のキットである。
【００３９】
上記のようなキットを用いれば、インスリンを５ｐｇ/ｍｌの感度で検出可能である。したがって、本願発明の第１６は、
（１６）試料中のインスリンを１ｐｇ/ｍｌの感度で検出可能な上記（１２）乃至（１５）のいずれかに記載のキットである。
【００４０】
【発明の実施の形態】
本願発明に用いるポリクローナル抗体は、測定対象である抗原で免疫した実験動物からの抗血清を使用して調製する。抗原の調製、免疫動物への投与及び当該動物からの抗血清の採取は当業者にとって周知のいずれのプロトコールをも使用することができ、そのようなプロトコールの最適化も当業者にとって容易であろう。
【００４１】
免疫動物としては、ヒツジ、ウサギ、サル等も用いられ得るが、モルモットを用いるのが特に有利である。
【００４２】
当該免疫動物からの抗血清は、例えば、アジュバントと共に抗原を免疫動物に皮下注射し、当該皮下投与を適当な間隔（例えば２週間）で所定の回数（例えば４回）繰り返し、最終免疫後に全血を採集して、これを分離することで得ることができる。そのような方法は、例えば、「ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳＩＮ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ、第２.４章（発行元：Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ,Ｉｎｃ．,Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）」等に記載されている。
【００４３】
次いで、本願発明によれば、複数の免疫動物から得られた個々の抗血清は、その抗原に対する親和性と、モノクローナル抗体に似た反応性、すなわち、優先的に特定のエピトープを認識するという性質の２つの観点から分別され選択される。
【００４４】
ここで、インスリンに対する親和性については、例えば、免疫測定用のマイクロプレートやビーズに固相化したインスリンとの反応の強さを測定することで容易に判定できる。
【００４５】
次いで、エピトープの認識に関する特異性は以下の方法に準じて判定することが可能である。
【００４６】
すなわち、インスリンを例にとれば、まず、インスリン分子上の１のエピトープを認識するマウスモノクローナル抗体を免疫測定用のマイクロプレートやビーズに固相化（コート）する。次いで、そこに、一定濃度のインスリンと、濃度を変えたモルモット抗インスリン（ポリクローナル）抗体溶液またはモルモット抗インスリン血清を同時に加えて固相と反応させる。固相を洗浄後、モルモットＩｇＧに特異的に反応する酵素標識抗体を加えて更に反応させ、次いで固相を再度洗浄後、酵素基質を加えて酵素反応を行わせる。
【００４７】
コートされたマウスモノクローナル抗体と同一、或いはその近傍のエピトープを認識する抗体群が多く含まれるようなモルモットポリクローナル抗体溶液や抗血清は、該エピトープ或いはその近傍部位と結合し、それにより、コートされたモノクローナル抗体と当該エピトープとが更に結合するのを阻害する（エピトープの競合が起こる）。その結果、酵素標識抗体（抗モルモットＩｇＧ抗体）が固相化モノクローナル抗体と結合する量が減少し、酵素反応が弱くなる。
【００４８】
一方、コートされたモノクローナル抗体の認識するエピトープとは別の、離れたところにあるエピトープを認識する抗体群が多く含まれるポリクローナル抗体溶液や抗血清は、コートされたモノクローナル抗体とインスリンが結合することを阻害しないために（エピトープが競合しないために）酵素反応が強くなる。従って、このような方法により、異なるエピトープを認識する抗体溶液や抗血清を分別することができるのである。
【００４９】
上記ようにしてインスリンに対する親和性と、モノクローナル抗体とのエピトープの競合とを判別することにより、モノクローナル抗体より高い親和性を持ち、且つ、モノクローナル抗体と類似の反応性（特異性）を持つポリクローナル抗体を選び出すことができる。
【００５０】
そして、このようにして選び出された複数の抗血清からＩｇＧ画分または特異（ポリクローナル）抗体を精製し、そのままでキャプチャー側のポリクローナル抗体試薬として使用することができ、また、酵素標識すれば検出側のポリクローナル抗体試薬として用いることができる。
【００５１】
そのような、ＩｇＧ画分等の精製や酵素標識の方法は当業者にとって周知のいかなる方法も用いることができ、例えば、夫々、「ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ、第２.７章（発行元：Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ,Ｉｎｃ．,Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）」記載の方法や、「Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  ＳｔａｉｎｉｎｇＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  （Ｅｌｓｅｖｉｅｒ/Ｎｏｒｔｈ  Ｈｏｌｌａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、２１５〜２２４頁（１９７８年））」、「化学と生物、第１２巻、６２６〜６３１頁（１９７４年）」、「Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、ｖｏｌ．８（Ｓｕｐｐｌ.７）、４３〜５５頁（１９７８年）」記載の方法を利用することができる。
【００５２】
酵素標識に用いる酵素にも特に制限はなく、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼやアルカリ性フォスファターゼ等の酵素が有利に使用される。西洋ワサビペルオキシダーゼを使用する場合は、当該酵素の基質として３,３',５,５'−テトラメチルベンチジンがキットに含まれてよく、アルカリ性フォスファターゼを使用する場合は、基質としてｐ−ニトロフェニル燐酸がキットに含まれ得る。
【００５３】
更に、本願発明のポリクローナル抗体試薬には、上記のようなＩｇＧ画分または特異抗体の他、特異抗体を酵素消化して得られるような、該抗体の反応性フラグメントを用いることもできる。特に、該フラグメントが、特異抗体をペプシンで消化して得られるＦ（ａｂ’）２フラグメントである場合が有利である。当該Ｆ（ａｂ’）２等の酵素消化フラグメントは、「ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ、第２.７章（発行元：Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ,Ｉｎｃ．,Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）」記載の方法に準じて容易に調製可能である。
【００５４】
上記のように調製されたポリクローナル抗体試薬は、キャプチャー側と検出側でエピトープの競合が起こらないように組み合わされて最終的に免疫測定キットとなるのである。
【００５５】
本願発明のキットの測定対象としては蛋白質、ペプチド等があげられる。したがって、本願発明のキットは、例えば、インスリン、カルシトニン、Ｃ−ペプチド、レプチン、ベータ２−ミクログロブリン、レチノール結合タンパク、アルファ１−ミクログロブリン、アルファ−フェトプロテイン、癌胎児性抗原、トロポニン−Ｉ、クルカゴン様ペプチド、インスリン様ペプチド、腫瘍増殖因子、繊維芽細胞増殖因子、血小板成長因子、上皮増殖因子等の測定に用いられ得るがこれに限定されない。特に、分子量が５０００以下の蛋白質の測定に関し本願のキットは好適に用いられる。測定対象としての抗原がインスリン、とくにマウス、ラットやハムスター由来のインスリンである場合が一層好ましい。その場合、インスリンの超高感度測定系を作製することができる。
【００５６】
以下に、本願発明を実施例により詳細に説明するが、本願発明は当該実施例により何等限定されるものではないことは言うまでもない。
【００５７】
【実施例】
実施例１
インスリンを１０ｍＭ塩酸に対して２ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した後、０．４Ｍの炭酸水素ナトリウムで２倍に希釈し、フロイントの完全アジュバントで水中油型エマルジョンを作製して、２０匹のモルモットに一匹あたり皮下２０箇所において０．０５ｍｌづつ注射し、免疫した。
【００５８】
二週間の間隔をあけて４回の免疫を繰り返し、最終免疫後２週間目に全採血した。
【００５９】
分離した抗血清を、インスリンを固相化した免疫測定用のマイクロプレートを用いてインスリンとの反応性を調べたところ、２０匹から得られた個々の抗血清の全てが１００万倍の希釈でも吸光度が１．０以上あり、インスリンに対する結合活性（親和性）は免疫測定に用いるには十分なものであった。
【００６０】
実施例２
実施例１で作製した抗血清に含まれる抗体群（ポリクローナル抗体）と抗インスリンモノクローナル抗体との間でエピトープの競合を調べた。
【００６１】
測定結果は表１に示す。
【００６２】
【表１】
0004590117.tif 000002
このデータより１６番と１７番の抗血清がコート抗体として用いたモノクローナル抗体とほぼ同じエピトープを、１番と２０番の抗血清がコートに用いたモノクローナル抗体と異なるエピトープを認識する抗体を多く含むことが明らかとなった。すなわち、１６番及び１７番では、希釈倍率が低い（すなわち、濃度が高い）抗血清において吸光度の顕著な低下が観察され、これはコートしたモノクローナル抗体とのエピトープの競合によるものと考えられる。一方、１番及び２０番ではそのような吸光度の低下は観察されず、これはエピトープの競合がないことを示す。
【００６３】
実施例３
実施例２において、インスリン分子上での認識するエピトープが異なることが明らかとなった抗血清１番と１６番より、特異抗体（ポリクローナル抗体）をインスリン固相化カラムを通じて精製した。
【００６４】
９６穴の免疫測定用のマイクロプレートを用い、１番より精製した特異抗体（ポリクローナル抗体）を２μｌ／ｍｌの濃度で１００μｌづつウェルに分注し、室温で２時間静置してコートし、その後２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  ｐＨ７．４／１５０ｍＭ  ＮａＣｌで溶解した０．１％ＢＳＡを２００μｌづつウェルに分注してブロッキングを行った。
【００６５】
１６番より精製した特異抗体を０．２Ｍ  炭酸水素ナトリウムに対して透析し、同重量の活性化ペルオキシダーゼと混合して酵素標識抗体を得た。
【００６６】
抗体固相化マイクロプレートに９５μｌのインスリン除去ラット血清を分注し、次いで０ｐｇ／ｍｌから５,０００ｐｇ／ｍｌの標準インスリン希釈系列５μｌを分注し、室温で一時間反応させた。次いで、ウェルを洗浄後、ペルオキシダーゼ標識抗体を加え、室温で１時間反応させた。
【００６７】
ウェルを洗浄後、１００μｌの酵素基質液（ＴＭＢ溶液）を加えて３０分間酵素反応を行い、１規定の硫酸を加えて酵素反応を止めた後、４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【００６８】
その結果を図１Ａ及びＢに示す。
【００６９】
この結果より、本発明の測定試薬で１００μｌの試料を用いると１ｐｇ／ｍｌの濃度までインスリンが測定できることが示された。
【００７０】
実施例４
実施例３で得られた特異抗体をペプシンで酵素消化してＦ（ａｂ’）２を作製し、この１ｍｇと活性化ペルオキシダーゼ０．７ｍｇと混合し、酵素標識Ｆ（ａｂ’）２得た。
【００７１】
この酵素標識Ｆ（ａｂ’）２を実施例３で用いたペルオキシダーゼ標識抗体の代わりに用いてインスリンを測定した結果を図２に示す。
【００７２】
この結果より１００μｌの試料を用いると上記実施例３よりも０ｐｇ／ｍｌの時の吸光度が下がり、より安定したデータが得られるようになった。
【００７３】
実施例５
実施例３に示した方法でラット血清を試料としてインスリン濃度を測定した。
【００７４】
同じラット血清の量を変えて測定した結果を図３に示す。
この結果より本発明の測定試薬を用いるとラットの血清量５μｌから１００μｌまで良好な直線性が得られ、１００μｌの血清試料を用いてもインスリンが測定できることが示された（図１Ｂの標準曲線参照）。
【００７５】
実施例６
実施例４と同様にマウス血清を試料としてインスリン濃度を測定した結果を図４に示す。
【００７６】
この結果より本発明の測定試薬を用いるとマウスの血清量５μｌから１００μｌまで良好な直線性が得られ、１００μｌの血清試料を用いてもインスリンが測定できることが示された。
【００７７】
実施例７
実施例５と同様にマウス血清及びマウス全血を試料としてインスリン濃度を測定した結果を図５に示す。
【００７８】
この結果より本発明の測定試薬を用いるとマウスの全血を用いてもインスリン濃度を測定することができることが示された。
【００７９】
実施例８
実施例３の方法に準じて、ヒトインスリン標準用液１００μｌを用い、ヒトインスリンの測定も行った。その結果を図６に示す。
【００８０】
この結果から、１００μｌのサンプル量においてもヒトインスリンを１ｐｇ／ｍｌの感度で測定可能なことが示された。
【００８１】
【効果】
抗原分子上の異なるエピトープを優先的に認識するような２以上の高親和性抗体群（ポリクローナル抗体）を選択し、これらを組み合わせて使用するという本願発明の構成により、従来用いられてきた測定試薬より高感度な免疫測定キットが提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】図１Ａは、本願のキットによるラットインスリン（０〜５ｎｇ/ｍｌ）の測定結果を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、本願のキットによるラットインスリン（０〜２０ｎｇ/ｍｌ）の測定結果を示す。
【図２】図２は、ポリクローナル抗体試薬としてＦ（ａｂ’）２フラグメントを使用した場合の本願のキットによるラットインスリンの測定結果を示す。
【図３】図３は、本願のキットによるラット血清中のインスリン濃度の測定結果を示す。
【図４】図４は、本願のキットによるマウス血清中のインスリン濃度の測定結果を示す。
【図５】図５は、本願のキットによるマウス血清及びマウス全血中のインスリン濃度の測定結果を示す。
【図６】図６は、本願のキットによるヒトインスリンの測定結果（サンプル量１００μｌ）を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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