(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト免疫不全ウイルス−１（ＨＩＶ−１）タンパク質ｐ２４およびヒト免疫不全ウイルス−２（ＨＩＶ−２）タンパク質ｐ２６の共有エピトープに結合するモノクローナル抗体であって、該モノクローナル抗体はＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号ＰＴＡ−２８０９なるハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体。
【請求項２】
ヒト免疫不全ウイルス−１タンパク質ｐ２４およびヒト免疫不全ウイルス−２タンパク質ｐ２６の共有エピトープに結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株であって、該細胞株が、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号ＰＴＡ−２８０９であるハイブリドーマ細胞株。
【請求項３】
ＨＩＶ−１  ｐ２４抗原およびＨＩＶ−２  ｐ２６抗原よりなる群から選ばれる１以上の抗原の、該１以上の抗原を含有する疑いのある試験サンプル中における存在を検出するための方法であって、
（ａ）該試験サンプルを、請求項１に記載されたモノクローナル抗体と、抗体／抗原複合体の形成に十分な時間にわたり及び条件下で接触させ、
（ｂ）該複合体を検出する工程を含んでなり、
該複合体の存在が、該試験サンプル中のＨＩＶ−１  ｐ２４抗原およびＨＩＶ−２  ｐ２６抗原よりなる群から選ばれる少なくとも１つの抗原の存在を示すことを特徴とする前記方法。
【請求項４】
工程（ａ）のモノクローナル抗体が標識されている、請求項３記載の方法。
【請求項５】
工程（ｂ）が以下の工程（ｉ）及び（ｉｉ）を含む請求項３に記載の方法、
（ｉ）工程（ａ）で生じた抗体／抗原複合体に、検出可能なシグナルを生成しうるシグナル生成化合物に結合した抗体を含むコンジュゲートを、該コンジュゲートが該結合抗原に結合するのを可能にするのに十分な時間にわたり及び条件下で加え、
（ｉｉ）該シグナル生成化合物により生成されたシグナルを検出することにより、該試験サンプル中に存在しうる抗原の存在を検出する工程を含んでなり、
該シグナルの存在が、該試験サンプル中のＨＩＶ−１  ｐ２４抗原およびＨＩＶ−２  ｐ２６抗原よりなる群から選ばれる少なくとも１つの抗原の存在を示すことを特徴とする前記方法。
【請求項６】
工程（ｉ）の抗体が、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号ＰＴＡ−２８０６、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号ＰＴＡ−２８０８、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号ＰＴＡ−２８１０及びＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号ＰＴＡ−２８０７よりなる群から選ばれるハイブリドーマ細胞株によって産生される抗体である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む請求項３に記載の方法、
（ａ）１）固体支持体に結合した請求項１に記載のモノクローナル抗体、２）該試験サンプル、および３）シグナル生成化合物が結合しているＨＩＶ−１抗原およびＨＩＶ−２抗原に結合する抗体を含む指示試薬を接触させて、混合物を形成させ、
（ｂ）該混合物を、抗体／抗原／抗体複合体の形成に十分な時間にわたり及び条件下でインキュベートし、
（ｃ）該シグナル生成化合物により生成された測定可能なシグナルの存在を検出する工程を含んでなり、
該シグナルの存在が、ＨＩＶ−１  ｐ２４抗原およびＨＩＶ−２  ｐ２６抗原よりなる群から選ばれる該試験サンプル中の１以上の抗原の存在を示すことを特徴とする前記方法。
【請求項８】
工程（ａ）の指示試薬の抗体が、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号ＰＴＡ−２８０６、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号ＰＴＡ−２８０８、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号ＰＴＡ−２８１０及びＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号ＰＴＡ−２８０７よりなる群から選ばれるハイブリドーマ細胞株によって産生される抗体である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
試験サンプル中のＨＩＶ−１  ｐ２４抗原およびＨＩＶ−２  ｐ２６抗原よりなる群から選ばれる１以上の抗原の存在を測定するためのキットであって、（ａ）請求項１に記載のモノクローナル抗体と、（ｂ）検出可能なシグナルを生成しうるシグナル生成化合物に結合した抗体を含むコンジュゲートとを含んでなる前記キット。
【請求項１０】
工程（ｂ）の抗体が、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号ＰＴＡ−２８０６、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号ＰＴＡ−２８０８、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号ＰＴＡ−２８１０及びＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号ＰＴＡ−２８０７よりなる群から選ばれるハイブリドーマ細胞株によって産生される抗体である、請求項９記載のキット。
【請求項１１】
請求項１に記載のモノクローナル抗体を含んでなる診断試薬。
【請求項１２】
１）ＨＩＶ−１抗体およびＨＩＶ−２抗体よりなる群から選ばれる１以上の抗体、ならびに２）ＨＩＶ−１  ｐ２４抗原およびＨＩＶ−２  ｐ２６抗原よりなる群から選ばれる１以上の抗原を、該抗体の１以上および該抗原の１以上を含有する疑いのある試験サンプル中で検出する方法であって、
ａ）該試験サンプルを、ＨＩＶ−１抗体に結合する少なくとも１つのＨＩＶ−１抗原と、ＨＩＶ−１抗原／ＨＩＶ−１抗体複合体の形成に十分な時間にわたり及び条件下で接触させ、
ｂ）該試験サンプル中のＨＩＶ−１抗体の存在を示す、該ＨＩＶ−１抗原／ＨＩＶ−１抗体複合体を検出し、
ｃ）該試験サンプルを、ＨＩＶ−２抗体に結合する少なくとも１つのＨＩＶ−２抗原と、ＨＩＶ−２抗原／ＨＩＶ−２抗体複合体の形成に十分な時間にわたり及び条件下で接触させ、
ｄ）該試験サンプル中のＨＩＶ−２抗体の存在を示す、該ＨＩＶ−２抗原／ＨＩＶ−２抗体複合体を検出し、
ｅ）該試験サンプルを、請求項１に記載されたモノクローナル抗体と、抗体／抗原複合体の形成に十分な時間にわたり及び条件下で接触させ、及び
ｆ）該試験サンプル中のＨＩＶ−１  ｐ２４抗原およびＨＩＶ−２  ｐ２６抗原よりなる群から選ばれる少なくとも１つの抗原の存在を示す該複合体を検出する工程を含んでなる前記方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって、
工程ｂ）が、
（ｉ）生じたＨＩＶ−１抗原／ＨＩＶ−１抗体複合体に、検出可能なシグナルを生成しうるシグナル生成化合物に結合した抗原を含むコンジュゲートを、該コンジュゲートが該結合抗体に結合するのを可能にするのに十分な時間にわたり及び条件下で加え、及び
（ｉｉ）該シグナル生成化合物により生成された該試験サンプル中のＨＩＶ−１抗体の存在を示すシグナルを検出することにより、該試験サンプル中に存在しうるＨＩＶ−１抗体を検出する工程を含み、
工程ｄ）が、
（ｉ）生じたＨＩＶ−２抗原／ＨＩＶ−２抗体複合体に検出可能なシグナルを生成しうるシグナル生成化合物に結合した抗原を含むコンジュゲートを、該コンジュゲートが該結合抗体に結合するのを可能にするのに十分な時間にわたり及び条件下で加え、及び
（ｉｉ）該シグナル生成化合物により生成された、該試験サンプル中のＨＩＶ−２抗体の存在を示すシグナルを検出することにより、該試験サンプル中に存在しうるＨＩＶ−２抗体を検出する工程を含み、
工程ｆ）が、
（ｉ）生じた抗体／抗原複合体に、検出可能なシグナルを生成しうるシグナル生成化合物に結合した抗体を含むコンジュゲートを、該コンジュゲートが該結合抗原に結合するのを可能にするのに十分な時間にわたり及び条件下で加え、
（ｉｉ）該シグナル生成化合物により生成された、該試験サンプル中のＨＩＶ−１  ｐ２４抗原およびＨＩＶ−２  ｐ２６抗原よりなる群から選ばれる少なくとも１つの抗原の存在を示すシグナルを検出することにより、該試験サンプル中に存在しうる抗原の存在を検出する工程を含んでなる前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の検出において使用しうる新規モノクローナル抗体に関する。これらの抗体は、並外れて高い感度、著しく広い範囲の特異性を示し、新規共有非交差反応性エピトープに結合する。特に、本発明のモノクローナル抗体は、患者のサンプル中のＨＩＶ−１抗原およびＨＩＶ−２コア抗原を検出するために使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
後天性免疫不全症候群（エイズ（ＡＩＤＳ））は、ＨＩＶ感染個体から性的接触により又はＨＩＶに汚染された血液もしくは血液製剤への曝露により伝染する不治の感染症である。ＨＩＶ−１は、以前はヒトＴ細胞リンパ球向性ウイルス３型（ＨＴＬＶ  ＩＩＩ）、リンパ節疾患随伴ウイルス（ＬＡＶ）およびエイズ関連レトロウイルス（ＡＲＶ）と呼ばれていたウイルスを含む。ＨＩＶは、形態学的特徴、ゲノムおよびヌクレオチド配列に基づけば細胞変性レトロウイルスの一群（すなわち、レンチウイルス属）に関連したレトロウイルスである（Ｇｏｎｄａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  （１９８５）２７７：１７７−１７９；Ｓｔｅｐｈａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  （１９８６）２３１：５８９−５９４；Ｋｏｒｂｅｒ，Ｂ．（編）ら，Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ＡＩＤＳ．Ａ  Ｃｏｍｐｉｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  ａｎｄ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ，Ｎｅｗ  Ｍｅｘｉｃｏ）発行；総説としては、Ｓｃｈｏｃｈｅｔｍａｎ，Ｇ．およびＧｅｏｒｇｅ，Ｊ．Ｒ．，（１９９４）ＡＩＤＳ  Ｔｅｓｔｉｎｇ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）。ＨＩＶは、いくつかの構造タンパク質を含有する包膜ウイルスである。特に重要なのは、該ウイルスのコアが、ｐｏｌ前駆体およびｇａｇ前駆体（Ｐｒ５５ｇａｇ）へと切断される高度にプロセシングされたｇａｇ−ｐｏｌポリタンパク質前駆体（Ｐｒ１８０ｇａｇ−ｐｏｌ）からの切断産物の縮合により形成されることである。ついでコア前駆体Ｐｒ５５ｇａｇは、ｐ１７（ミリスチル化ｇａｇタンパク質）、ｐ２４（主要構造タンパク質）、ｐ７（核酸結合タンパク質）およびｐ９（プロリンリッチタンパク質）へと切断される。該エンベロープは、エンベロープポリタンパク質前駆体ｇｐ１６０の切断産物である２つの構造タンパク質ｇｐ１２０（エンベロープ糖タンパク質）およびｇｐ４１（膜貫通タンパク質）を含有する。
【０００３】
ＨＩＶ感染の最も一般的なマーカーは、ウイルス構造タンパク質に対する抗体（Ｄａｗｓｏｎら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．（１９８８）１５７：１４９−１５５；Ｍｏｎｔａｇｎｉｅｒら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  （１９８５）１４４：２８３−２８９；Ｂａｒｉｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  （１９８５）２２８：１０９４−１０９６；Ｓｃｈｕｌｚ，Ｔ．Ｆ．ら，Ｌａｎｃｅｔ  （１９８６）２：１１１−１１２；Ｓａｒｎｇａｄｈａｒａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  （１９８４）２２４：５０６−５０８；Ａｌｌａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  （１９８５）２２８：１０９１−１０９３）、および検出可能なウイルスコア抗原の形態のウイルス血症（抗原血症）（Ｋｅｓｓｌｅｒら，ＪＡＭＡ  （１９８７）２５８：１１９６−１１９９；Ｐｈａｉｒ，ＪＡＭＡ  （１９８７）２５８：ｐ１２１８；Ａｌｌａｉｎら，Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ  （１９８６）ｉｉ：１２３３−１２３６；Ｋｅｎｎｙら，Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ  （１９８７）１（８５３２）：５６５−５６６；Ｗａｌｌら，Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ  （１９８７）１（８５３２）：ｐ５６６；Ｓｔｕｔｅ，Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ  （１９８７）１（８５３２）：ｐ５６６；Ｇｏｕｄｓｍｉｔら，Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ  （１９８６）ｉｉ：１７７−１８０；ｖｏｎＳｙｄｏｗら，Ｂｒｉｔ．Ｍｅｄ．Ｊ．（１９８８）２９６：２３８−２４０；Ｂｏｗｅｎら，Ａｎｎ．ｏｆ  Ｉｎｔ．Ｍｅｄ．（１９８８）１０８：４６−４８）または検出可能なウイルス核酸（Ｍｅｌｌｏｒｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  （１９９６）２７２：１１６７−１１７０；Ｓａａｇら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．（１９９６）２：６２５−６２９；Ｍｕｌｄｅｒら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９４）３２：２９２−３００；Ｚｈａｎｇら，ＡＩＤＳ  （１９９１）５（６）：６７５−６８１；Ｓｉｍｍｏｎｄｓら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  （１９９０）６４（２）：８６４−８７２）である。例えば、米国においては、抗体または抗原を検出するための試験による血液および血液製剤のスクリーニングが要求される（Ｆｅｄｅｒａｌ  Ｆｏｏｄ，Ｄｒｕｇ，ａｎｄ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ａｃｔ，２１  Ｕ．Ｓ．Ｃ．§§３０１以下参照，Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ａｃｔ  ４２  Ｕ．Ｓ．Ｃ．§§２１以下参照）。最近、ＨＩＶ血清転換ウィンドウの最大減少を得るためにために、核酸試験が実施されている（ｗｗｗ．ｆｄａ．ｇｏｖ）。さらなる具体例として、核酸試験の欧州における実施に加えて、欧州諸国は、抗体および抗原を同時に検出する試験を評価し使用することを開始している（Ｌｙら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２０００）３８（６）：２４５９−２４６１；Ｇｕｒｔｌｅｒら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  （１９８８）７５：２７−３８；Ｗｅｂｅｒら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  （１９９８）３６（８）：２２３５−２２３９；Ｃｏｕｒｏｕｃｅ’ら，Ｌａ  Ｇａｚａｔｔｅ  ｄｅ  ｌａ  Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  （１９９９）Ｎ１５５−Ｍａｒｓ−Ａｖｒｉｌ，Ｖａｎ  Ｂｉｎｓｂｅｒｇｅｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  （１９９９）８２：７７−８４）。抗体および抗原の検出を組合せた血清学的アッセイは、抗体のみを検出するアッセイよ���優れた血清転換感度を示す。なぜなら、抗体より前に出現する抗原の検出は血清転換ウィンドウを減少させるからである。初期形態のＨＩＶ組合せアッセイは、Ｇａｌｌａｒｄａら，１９９２，ＷＯ９３／２１３４６，Ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＨＩＶ  Ａｎｔｉｇｅｎ  ａｎｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙに記載されている。
【０００４】
ＨＩＶ感染後数週間以内に、個体は、一般には、広範なウイルス血症および急性症状により特定される臨床期に入る。この期間中、血清転換の前に、血清または血漿試料においてＨＩＶ  ｐ２４コア抗原が一時的に検出されうる（抗原血症）（Ｄｅｖａｒｅら  （１９９０）Ｉｎ，Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｖｉｒｕｓ：Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ  ｉｎ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｊ．Ｌ．Ｍｅｌｎｉｃｋ（編），Ｂａｓｅｌ，Ｋａｒｇｅｒ，ｖｏｌ  １８：１０５−１２１；Ｋｅｓｓｌｅｒら，ＪＡＭＡ  （１９８７  ２５８：１１９６−１１９９；Ｐｈａｉｒ，Ｊ．Ｐ．，ＪＡＭＡ  （１９８７）２５８：ｐ１２１８；Ａｌｌａｉｎら．Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ  （１９８６）ｉｉ：１２３３−１２３６；Ｋｅｎｎｙら，Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ  （１９８７）１（８５３２）：５６５−５６６；Ｗａｌｌら，Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ  （１９８７）１（８５３２）：５６６；Ｓｔｕｔｅ，Ｒ．，Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ  （１９８７）１（８５３２）：５６６；Ｇｏｕｄｓｍｉｔら，Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ  （１９８６）ｉｉ：１７７−１８０；ｖｏｎＳｙｄｏｗら，Ｂｒｉｔ．Ｍｅｄ．Ｊ．（１９８８）２９６：２３８−２４０；Ｂｏｗｅｎら，Ａｎｎ．ｏｆ  Ｉｎｔ．Ｍｅｄ．（１９８８）１０８：４６−４８）。血清転換後、該コアタンパク質は、循環中の免疫複合体内の抗体により拘束されるらしく、コアタンパク質の検出を困難にし、免疫複合体破壊技術を要する（Ｓｃｈｕｐｂａｃｈら，ＡＩＤＳ  （１９９６）１０：１０８５−１０９０；Ｋａｇｅｙａｍａら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  （１９８８）２２：１２５−１３１；Ｍａｔｈｉｅｓｅｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  （１９８８）２２：１４３−１４８；Ｓｔｅｉｎｄｌら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  （１９９８）２１７：１４３−１５１；Ｅｕｌｅｒら，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８５）５９：２６７−２７５；Ｇｕｐｔａら，Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．（１９８４）３１０：１５３０−１５３１；Ｇｒｉｆｆｉｔｈら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９５）３３：１３４８−１３５０）。該初期ウイルス血症期の後および該疾患の残りの期間を通じて、該ウイルスは一般には定常状態レベルを確立する（Ｃｏｆｆｉｎ，Ｊ．Ｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  （１９９５）２６７：４８３−４８９に概説されている）。
【０００５】
ＨＩＶ−１  Ｏ群、ＨＩＶ−１  Ｍ群およびＨＩＶ−２の分離体からのコアタンパク質は抗原性において類似している。なぜなら、それらはアミノ酸配列の相同性領域を共有しているからである。１つの群または型のコアタンパク質に対して惹起されたヒト（またはマウス）免疫ポリクローナル血清（すなわち、免疫グロブリン）は、異なる群または型のコアタンパク質に対して交差反応する（Ｃｌａｖｅｌら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  （１９８６）２３３；３４３−３４６；Ｇｕｙａｄｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ  （１９８７）３２６：６６２−６６９；Ｂａｒｉｎら，Ｌａｎｃｅｔ  （１９８５）２：１３８７−１３８９；Ｋａｎｋｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  （１９８６）２３２：２３８−２４３；Ｋａｎｋｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  （１９８７）２３６：８２７−８３１；Ｃｌａｖｅｌら，Ｎａｔｕｒｅ  （１９８６）３２４：６９１−６９５；Ｈｕｎｔら，ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  （１９９７）１３：９９５−１００５；Ｇｕｒｔｌｅｒら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  （１９９５）５１：１７７−１８４；Ｍａｕｃｌｅｒｅ，Ｐ．ＡＩＤＳ  （１９９７）１１：４４５−４５３）。しかし、ヒト（またはマウス）免疫ポリクローナル血清とは対照的に、１つのＨＩＶ群または型のコアタンパク質に対して産生または惹起されたマウスまたはヒトモノクローナル抗体は、異なるＨＩＶ群または型のコアタンパク質に対して反応しうる（Ｍｅｈｔａら，米国特許第５，１７３，３９９号；Ｂｕｔｍａｎら，米国特許第５，２１０，１８１号；Ｂｕｔｍａｎら，米国特許第５，５１４，５４１号）または反応し得ない（Ｍｅｈｔａら，米国特許第５，１７３，３９９号；Ｂｕｔｍａｎら，米国特許第５，２１０，１８１号；Ｂｕｔｍａｎら，米国特許第５，５１４，５４１号）。しかし、しばしば、マウスモノクローナル抗体の交差反応性も共有反応性も（Ｔｉｊｓｓｅｎ，１９９３  Ｉｎ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｒ．Ｈ．ＢｕｒｄｏｎおよびＰ．Ｈ．ｖａｎ  Ｋｎｉｐｐｅｎｂｅｒｇ編，ｖｏｌ．１５．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）考慮も教示もされていない（Ｋｏｒｔｒｉｇｈｔら，米国特許第４，８８８，２９０号；Ｋｏｒｔｒｉｇｈｔら，米国特許第４，８８６，７４２号）。ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２コアタンパク質が同時に検出された際には（Ｂｕｔｍａｎら，米国特許第５，２１０，１８１号；Ｂｕｔｍａｎ，米国特許第５，５１４，５４１号）、少なくとも３つのモノクローナル抗体の組合せが必要であったうえ、ＨＩＶ−１コアタンパク質に対する得られた定量的感度は、ＨＩＶ−２コアタンパク質に対するものより遥かに大きかった。このことは、該モノクローナル抗体が交差反応性エピトープを同定し、共有エピトープを同定しなかったことを示している。典型的には、モノクローナル抗体は、免疫抗原（エピトープ）または共有エピトープに対する親和性より低い親和性を交差反応性抗原（エピトープ）に対して示し（Ｋａｒｕｓｈ，Ｆ．（１９７８）Ｉｎ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｒ．Ａ．Ｇｏｏｄ，Ｓ．Ｂ．Ｄａｙ編，５：８５���１１６．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ／Ｌｏｎｄｏｎ：Ｐｌｅｎｕｍ；Ｍａｒｉｕｚｚａら，Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．（１９８７）１６：１３９−１５９；Ｔｉｊｓｓｅｎ，（１９９３）Ｉｎ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｒ．Ｈ．ＢｕｒｄｏｎおよびＰ．Ｈ．ｖａｎ  Ｋｎｉｐｐｅｎｂｅｒｇ編，Ｖｏｌ．１５．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）、該交差反応性抗原に対しては、感度が低い。
【０００６】
共有エピトープは、特に関連しているが異なる配列のタンパク質中では容易には同定されない。エピトープ中の単一のアミノ酸変化は、そのエピトープへのモノクローナル抗体の結合を阻止または修飾しうる（Ｍａｒｉｕｚｚａら，Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．（１９８７）１６：１３９−１５９）。また、タンパク質中では、該エピトープ以外の部位におけるアミノ酸の変化（または相違）は、タンパク質のフォールディング（折りたたみ）の変化により該エピトープを変化させて（Ｍａｒｉｕｚｚａら，Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．（１９８７）１６：１３９−１５９；Ｌａｖｅｒら，Ｃｅｌｌ  （１９９０）６１：５５３−５５６）、該エピトープへの抗体の結合を改変しうる。この点において、ＨＩＶ−１  Ｍ群、ＨＩＶ−１  Ｏ群およびＨＩＶ−２のコアタンパク質は関連しているが同一ではなく（Ｋｏｒｂｅｒ，前掲）、ＨＩＶコアタンパク質間には交差反応性エピトープが存在することは公知だが、共有エピトープが存在することは確認も教示もされていない。
【０００７】
多数の科学文献が可変性のメカニズムに関する説明を与えようと努めているが（Ｍｅｙｅｒｈａｎｓら，Ｃｅｌｌ  （１９８９）５８：９０１−９１０；Ｗａｉｎ−Ｈｏｂｓｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９２）１７６：１８１−１９３；Ｈｏｌｌａｎｄら，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｏｒｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９２）１７６：１−２０；Ｇａｏ，Ｆ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  （１９９９）３９７：４３６−４４１；Ｓｈａｒｐら，Ｂｉｏｌ．Ｂｕｌｌ．（１９９９）１９６：３３８−３４２；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ  （１９９５）３７４：１２４−１２６；Ｚｈｕ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９５）６９：１３２４−１３２７）、ＨＩＶの広範な遺伝的（したがって抗原性）可変性は予測されていない。ＨＩＶの遺伝的（したがって抗原性）可変性の決定は、後にＨＩＶの核酸およびアミノ酸配列の変異に基づく系統学的分類につながった多数の実験的観察に基づいているに過ぎない（Ｋｏｒｂｅｒ，前掲）。同様に、ＨＩＶ（コア）タンパク質間の共有エピトープを予測することはできない。なぜなら、（ａ）まず、コアタンパク質配列が発見されなければならず、（ｂ）発見されたら、遺伝的変異が、共有エピトープの同定に更なる複雑性および不確実さを与え、（ｃ）交差反応性エピトープを共有エピトープから区別するためには、エピトープの発見および特徴づけが要求されるからである。ＨＩＶ−１  Ｍ群、ＨＩＶ−１  Ｏ群およびＨＩＶ−２間の共有エピトープは、１９９４年にＨＩＶ−１  Ｏ群が発見されて初めて決定された（Ｇｕｒｔｌｅｒら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９４）６８：１５８１−１５８５；Ｈａｅｓｅｖｅｌｄｅら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９４）６８：１５８６−１５９６；Ｃｈａｒｎｅａｕら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  （１９９４）２０５：２４７−２５３）。
【０００８】
可変性ＨＩＶコアタンパク質の同等の定量的検出のためのモノクローナル抗体の親和性の役割は一般的には教示されていない（Ｍｅｈｔａら，米国特許第５，１７３，３９９号；Ｇａｌｌａｒｄａら，ＷＯ９３／２１３４６；Ｚｏｌｌａ−Ｐａｚｎｅｒら，米国特許第５，７３１，１８９号；Ｍｅｓｔａｎら，ＥＰ  ０５１９８６６Ａ１；Ｂｕｔｍａｎら，米国特許第５，２１０，１８１号；Ｂｕｔｍａｎら，米国特許第５，５１４，５４１号；Ｋｏｒｔｒｉｇｈｔら，米国特許第４，８８８，２９０号；Ｋｏｒｔｒｉｇｈｔら，米国特許第４，８８６，７４２号）。タンパク質抗原に対して惹起されたモノクローナル抗体の平均親和性は４．５×１０７ｍｏｌ−１である（Ｍａｒｉｕｚｚａら，Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．（１９８７）１６：１３９−１５９；Ｋａｒｕｓｈ，Ｆ．（１９７８）Ｉｎ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｒ．Ａ．Ｇｏｏｄ，Ｓ．Ｂ．Ｄａｙ編，５：８５−１１６．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ／Ｌｏｎｄｏｎ：Ｐｌｅｎｕｍ）。さらに、共有エピトープに対するモノクローナル抗体を得る可能性を高めるための免疫方法は教示されていない。
【０００９】
モノクローナル抗体の予測不可能な２つの特徴（すなわち、親和性および共有反応性）を組合せることによってのみ、関連しているが同一ではない同等量のＨＩＶコアタンパク質を検出するために使用しうるモノクローナル抗体を得ることを理論的に予想することが可能である。モノクローナル抗体の単なる交差反応性は、ＨＩＶコアタンパク質の同等な定量的検出を達成するには不十分であると考えられる。それよりむしろ、所望の結果を得るためには共有反応性と高い親和性との組合せが要求される。関連コアタンパク質に対するモノクローナル抗体の親和性は、免疫コアタンパク質で測定されたものより実質的に低い。その場合、該エピトープは、十中八九、交差反応性であり、該交差反応性エピトープに対する該抗体の親和性は、診断的に関連した（すなわち、２５ｐｇ  ｐ２４／ｍｌ血清または血漿、Ｃｏｕｒｏｕｃｅら，Ｌａ  Ｇａｚｅｔｔｅ  ｄｅ  ｌａ  Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ（１９９９）Ｎ  １５５−Ｍａｒｓ−Ａｖｒｉｌ）濃度の該交差反応性コアタンパク質の検出のための該抗体の利用を著しく制限する。
【００１０】
現在のところ、ＨＩＶ−１  Ｍ群、ＨＩＶ−１  Ｏ群およびＨＩＶ−２コアタンパク質の同等の定量的検出を達成するために２つのモノクローナル抗体のみを使用するイムノアッセイの公知の記載はない。したがって、そのようなイムノアッセイは、明らかに、望ましい。ポリクローナル血清（免疫グロブリン）と組合された２以上のモノクローナル抗体は、ＨＩＶ−１コアタンパク質を又は同時にＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２コアタンパク質を検出するためのイムノアッセイの基礎となる（Ｍｅｈｔａら，米国特許第５，１７３，３９９号；Ｂｕｔｍａｎら，米国特許第５，２１０，１８１号；Ｂｕｔｍａｎら，米国特許第５，５１４，５４１号；Ｋｏｒｔｒｉｇｈｔら，米国特許第４，８８８，２９０号；Ｋｏｒｔｒｉｇｈｔら，米国特許第４，８８６，７４２号；Ｇａｌｌａｒｄａら，ＷＯ９３／２１３４６）。したがって、前記を考慮すると、先行文献は、（ａ）ＨＩＶ−１  Ｍ群およびＨＩＶ−２コアタンパク質の同等の定量的検出のための２つのモノクローナル抗体に限定されたイムノアッセイを記載も教示もしておらず、（ｂ）ＨＩＶ−１  Ｍ群、ＨＩＶ−１  Ｏ群およびＨＩＶ−２コアタンパク質の同等の定量的検出のための２つのモノクローナル抗体に限定されたイムノアッセイを記載も教示もしておらず、（ｃ）ＨＩＶ−１  Ｍ、Ｏ群およびＨＩＶコアタンパク質の非同等検出を招く交差反応性抗原を認識するモノクローナル親和性障壁を克服するための方法を教示しておらず、（ｄ）ＨＩＶ−１  Ｍ群、ＨＩＶ−２  Ｏ群およびＨＩＶ−２からの診断的に関連した及び同等の量の非同一コアタンパク質を検出するための方法および手段としての、共有エピトープに対する高親和性モノクローナル抗体を教示していない。
【００１１】
本明細書に言及されているすべての米国特許、特許出願および刊行物の全体を、参照により本明細書に組み入れることとする。
【発明の開示】
【００１２】
（発明の概要）
本発明は、モノクローナル抗体、ならびに血清、血漿または他の体液中の後天性免疫不全症候群（エイズ）の原因因子であるヒト免疫不全ウイルス１型（ＭおよびＯ群）および２型の検出においてこれらの抗体を使用する方法に関する。特に、本発明は、同等量のＨＩＶ−１コアタンパク質（ｐ２４）およびＨＩＶ−２コアタンパク質（ｐ２６）を検出するために、非交差反応性共有エピトープを同定する適合性で高親和性の特有のマウスモノクローナル抗体を使用する診断方法を含む。また、そのような抗体は、ＨＩＶ抗原を検出するアッセイにおいて及びＨＩＶ抗原とＨＩＶ抗体とを同時に検出する組合せアッセイにおいて使用することができる。本発明の好ましい実施形態においては、ＨＩＶ−１  Ｍ群、ＨＩＶ−１  Ｏ群およびＨＩＶ−２からの同等量のコアタンパク質を検出するためには、２つの相補的な高親和性で広特異的なマウスモノクローナル抗体が必要である。
【００１３】
本発明のモノクローナル抗体は、診断に関連したフェムトモル量のＨＩＶコアタンパク質を検出するのに十分な高い親和性（Ｋｅｑ値）を有するが、それらは、ＨＩＶ−１  Ｍ群、ＨＩＶ−１  Ｏ群およびＨＩＶ−２からの関連しているが同一でない同等量のコアタンパク質の検出のための広い特異性（すなわち、共有反応性）をも有する。
【００１４】
特に、本発明は、ヒト免疫不全ウイルス−１  ＯおよびＭ群タンパク質ｐ２４ならびにヒト免疫不全ウイルス−２タンパク質ｐ２６に特異的に結合するモノクローナル抗体を含む。これらのモノクローナル抗体は、例えば、１２０Ａ−２７０、１１５Ｂ−１５１、１０３−３５０、１１５Ｂ−３０３、１１７−２８９および１０８−３９４である。本発明はまた、これらの抗体を産生するハイブリドーマを含む。
【００１５】
さらに、本発明はまた、ＨＩＶ−１抗原およびＨＩＶ−２抗原よりなる群から選ばれる１以上の抗原の、該抗原の１以上を含有する疑いのある試験サンプル中の存在を検出するための方法を含む。該方法は、ａ）該試験サンプルを、ヒト免疫不全ウイルス−１タンパク質ｐ２４およびヒト免疫不全ウイルス−２タンパク質ｐ２６上の共有エピトープに特異的に結合する少なくとも１つのモノクローナル抗体（例えば、１２０Ａ−２７０）と、抗体／抗原複合体の形成に十分な時間にわたり及び条件下で接触させ、ｂ）該複合体を検出する工程を含んでなり、該複合体の存在が、該試験サンプル中のＨＩＶ−１抗原およびＨＩＶ−２抗原よりなる群から選ばれる少なくとも１つの抗原の存在を示すことを特徴とする。工程（ａ）のモノクローナル抗体は、例えば、本明細書に記載のモノクローナル抗体の任意のものでありうる。それは標識されていても標識されていなくてもよい。好ましくは、１つのモノクローナル抗体のみを、該試験サンプルと接触させる。
【００１６】
本発明はまた、ＨＩＶ−１抗原およびＨＩＶ−２抗原よりなる群から選ばれる１以上の抗原の、該抗原の１以上を含有する疑いのある試験サンプル中の存在を同時に検出するための方法を含む。該方法は、ａ）該試験サンプルを、ヒト免疫不全ウイルス−１タンパク質２４およびヒト免疫不全ウイルス−２タンパク質ｐ２６に特異的に結合する少なくとも１つのモノクローナル抗体と、抗体／抗原複合体の形成に十分な時間にわたり及び条件下で接触させ、ｂ）生じた抗体／抗原複合体にコンジュゲート（共役体）を、該コンジュゲートが該結合抗原に結合するのを可能にするのに十分な時間にわたり及び条件下で加え（ここで、該コンジュゲートは、検出可能なシグナルを生成しうるシグナル生成化合物に結合した抗体を含む）、ｃ）該シグナル生成化合物により生成されたシグナルを検出することにより、該試験サンプル中に存在しうる抗原の存在を検出する工程を含んでなり、該シグナルの存在が、該試験サンプル中のＨＩＶ−１抗原およびＨＩＶ−２抗原よりなる群から選ばれる少なくとも１つの抗原の存在を示すことを特徴とする。工程（ａ）の少なくとも１つのモノクローナル抗体は、例えば、１２０Ａ−２７０、１１５Ｂ−１５１、１１７−２８９、１０３−３５０、１０８−３９４または１１５Ｂ−３０３でありうる。好ましくは、１つのモノクローナル抗体、特に１２０Ａ−２７０を使用する。該コンジュゲートの工程（ｂ）の抗体は、例えば、１２０Ａ−２７０、１１５Ｂ−１５１、１１７−２８９、１０３−３５０、１０８−３９４または１１５Ｂ−３０３であることが可能であり、好ましくは、１１５Ｂ−１５１である。好ましくは、モノクローナル抗体１２０Ａ−２７０（または１１７−２８９）およびモノクローナル抗体１１５Ｂ−１５１は、１２０Ａ−２７０（または１１７−２８９）が該固相上に存在するか該コンジュゲート中に存在するか又は１１５Ｂ−１５１が固相上に存在するか該コンジュゲート中に存在するかにかかわらず、ペアとして使用する。
【００１７】
さらに、本発明はまた、ＨＩＶ−１抗原およびＨＩＶ−２抗原よりなる群から選ばれる１以上の抗原の、これらの抗原の１以上を含有する疑いのある試験サンプル中の存在を検出するための方法を含む。該方法は、（ａ）１）固体支持体に結合した、ＨＩＶ−１  ｐ２４抗原およびＨＩＶ−２  ｐ２６抗原に特異的に結合する少なくとも１つのモノクローナル抗体、２）該試験サンプル、および３）シグナル生成化合物が結合しているＨＩＶ−１抗原およびＨＩＶ−２抗原に特異的に結合する抗体を含む指示試薬を同時に接触させて、混合物を形成させ、（ｂ）該混合物を、抗体／抗原／抗体複合体の形成に十分な時間にわたり及び条件下でインキュベートし、（ｃ）該シグナル生成化合物により生成された測定可能なシグナルの存在を検出する工程を含んでなり、該シグナルの存在が、該試験サンプル中のＨＩＶ−１抗原およびＨＩＶ−２抗原よりなる群から選ばれる１以上の抗原の存在を示すことを特徴とする。工程（ａ）の少なくとも１つのモノクローナル抗体は、例えば、１２０Ａ−２７０、１１５Ｂ−１５１、１１７−２８９、１０８−３９４、１１５Ｂ−３０３または１０３−３５０であることが可能であり、好ましくは、１２０Ａ−２７０である。工程（ｂ）のコンジュゲートの抗体は、例えば、１２０Ａ−２７０、１１５Ｂ−１５１、１１７−２８９、１０８−３９４、１１５Ｂ−３０３または１０３−３５０であることが可能であり、好ましくは、１１５Ｂ−１５１である。この場合も、本発明の任意の１以上のモノクローナル抗体は該固相上で、本発明の任意の他のモノクローナル抗体（該コンジュゲートまたは液相中）と共に使用されうることに注目することが重要である。モノクローナル抗体の或るペアが好ましいが、該固相上に１つのモノクローナル抗体のみを存在させるのが好ましい。
【００１８】
本発明はまた、試験サンプル中のＨＩＶ−１抗原およびＨＩＶ−２抗原よりなる群から選ばれる１以上の抗原の存在を測定するためのキットであって、ａ）ヒト免疫不全ウイルス−１タンパク質ｐ２４およびヒト免疫不全ウイルス−２タンパク質ｐ２６に特異的に結合する少なくとも１つのモノクローナル抗体と、（ｂ）検出可能なシグナルを生成しうるシグナル生成化合物に結合した抗体を含むコンジュゲートとを含んでなるキットを含む。工程（ａ）の少なくとも１つのモノクローナル抗体は、例えば、１２０Ａ−２７０、１１５Ｂ−１５１、１１７−２８９、１０８−３９４、１１５Ｂ−３０３または１０３−３５０であることが可能であり、好ましくは、１２０Ａ−２７０である。工程（ｂ）の抗体は、例えば、１２０Ａ−２７０、１１５Ｂ−１５１、１１７−２８９、１０８−３９４、１１５Ｂ−３０３または１０３−３５０であることが可能であり、好ましくは、１１５Ｂ−１５１である。
【００１９】
本発明はまた、１２０Ａ−２７０、１１５Ｂ−１５１、１１７−２８９、１０３−３５０、１０８−３９４および１１５Ｂ−３０３よりなる群から選ばれる少なくとも１つのモノクローナル抗体を含んでなる診断試薬を含む。
【００２０】
また、本発明は、配列番号１〜６に示すアミノ酸配列を有する単離されたエピトープまたはペプチドを含む。
【００２１】
本発明はまた、患者のサンプル中のＨＩＶ−１および／またはＨＩＶ−２に対する抗体および抗原の両方を同時に検出する方法を含む。１つのそのような方法は、１）ＨＩＶ−１抗体およびＨＩＶ−２抗体よりなる群から選ばれる１以上の抗体、ならびに２）ＨＩＶ−１抗原およびＨＩＶ−２抗原よりなる群から選ばれる１以上の抗原を、該抗体の１以上および該抗原の１以上を含有する疑いのある試験サンプル中で検出することを含み、ａ）該試験サンプルを、ＨＩＶ−１抗体に結合する少なくとも１つのＨＩＶ−１抗原と、ＨＩＶ−１抗原／ＨＩＶ−１抗体複合体の形成に十分な時間にわたり及び条件下で接触させ、ｂ）該ＨＩＶ−１抗原／ＨＩＶ−１抗体複合体を検出し（該複合体の存在は、該試験サンプル中のＨＩＶ−１抗体の存在を示す）、ｃ）該試験サンプルを、ＨＩＶ−２抗体に結合する少なくとも１つのＨＩＶ−２抗原と、ＨＩＶ−２抗原／ＨＩＶ−２抗体複合体の形成に十分な時間にわたり及び条件下で接触させ、ｄ）該ＨＩＶ−２抗原／ＨＩＶ−２抗体複合体を検出し（該複合体の存在は、該試験サンプル中のＨＩＶ−２抗体の存在を示す）、ｅ）該試験サンプルを、ヒト免疫不全ウイルス−１タンパク質ｐ２４およびヒト免疫不全ウイルス−２タンパク質ｐ２６に特異的に結合する少なくとも１つのモノクローナル抗体と、抗体／抗原複合体の形成に十分な時間にわたり及び条件下で接触させ、ｆ）該複合体を検出する（該複合体の存在は、該試験サンプル中のＨＩＶ−１抗原およびＨＩＶ−２抗原よりなる群から選ばれる少なくとも１つの抗原の存在を示す）工程を含んでなる。この場合も、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２抗原検出（例えば、１２０Ａ−２７０および１１５Ｂ−１５１）に関してモノクローナル抗体の或るペアを使用することが好ましい。
【００２２】
本発明に含まれるもう１つの方法は、１）ＨＩＶ−１抗体およびＨＩＶ−２抗体よりなる群から選ばれる１以上の抗体、ならびに２）ＨＩＶ−１抗原およびＨＩＶ−２抗原よりなる群から選ばれる１以上の抗原を、該抗体の１以上および該抗原の１以上を含有する疑いのある試験サンプル中で検出することを含み、ａ）該試験サンプルを、ＨＩＶ−１抗体に結合する少なくとも１つのＨＩＶ−１抗原と、ＨＩＶ−１抗原／ＨＩＶ−１抗体複合体の形成に十分な時間にわたり及び条件下で接触させ、ｂ）生じたＨＩＶ−１抗原／ＨＩＶ−１抗体複合体にコンジュゲート（共役体）を、該コンジュゲートが該結合抗体に結合するのを可能にするのに十分な時間にわたり及び条件下で加え（ここで、該コンジュゲートは、検出可能なシグナルを生成しうるシグナル生成化合物に結合した抗原を含む）、ｃ）該シグナル生成化合物により生成されたシグナルを検出することにより、該試験サンプル中に存在しうるＨＩＶ−１抗体を検出し（該シグナルの存在は、該試験サンプル中のＨＩＶ−１抗体の存在を示す）、ｄ）該試験サンプルを、ＨＩＶ−２抗体に結合する少なくとも１つのＨＩＶ−２抗原と、ＨＩＶ−２抗原／ＨＩＶ−２抗体複合体の形成に十分な時間にわたり及び条件下で接触させ、ｅ）生じたＨＩＶ−２抗原／ＨＩＶ−２抗体複合体にコンジュゲート（共役体）を、該コンジュゲートが該結合抗体に結合するのを可能にするのに十分な時間にわたり及び条件下で加え（ここで、該コンジュゲートは、検出可能なシグナルを生成しうるシグナル生成化合物に結合した抗原を含む）、ｆ）該シグナル生成化合物により生成されたシグナルを検出することにより、該試験サンプル中に存在しうるＨＩＶ−２抗体を検出し（該シグナルの存在は、該試験サンプル中のＨＩＶ−２抗体の存在を示す）、ｇ）該試験サンプルを、ヒト免疫不全ウイルス−１タンパク質２４およびヒト免疫不全ウイルス−２タンパク質ｐ２６に特異的に結合する少なくとも１つのモノクローナル抗体と、抗体／抗原複合体の形成に十分な時間にわたり及び条件下で接触させ、ｈ）生じた抗原／抗体複合体にコンジュゲート（共役体）を、該コンジュゲートが該結合抗原に結合するのを可能にするのに十分な時間にわたり及び条件下で加え（ここで、該コンジュゲートは、検出可能なシグナルを生成しうるシグナル生成化合物に結合した抗体を含む）、ｉ）該シグナル生成化合物により生成されたシグナルを検出することにより、該サンプル中に存在しうる抗原の存在を検出する（該シグナルの存在は、該試験サンプル中のＨＩＶ−１抗原およびＨＩＶ−２抗原よりなる群から選ばれる少なくとも１つの抗原の存在を示す）工程を含んでなる。この場合も、該アッセイにおいて使用しうるモノクローナル抗体の好ましいペアは前記のとおりであるが、他のペアを使用することも可能である。
【００２３】
（発明の詳細な記載）
本発明は、ＨＩＶ−１タンパク質ｐ２４およびＨＩＶ−２タンパク質ｐ２６に対する新規モノクローナル抗体、これらのモノクローナル抗体を使用するための方法、ならびにこれらの抗体を含有するキットに関する。より詳しくは、本発明は、本発明において１２０Ａ−２７０（例えば、クローン１０８）、１１５Ｂ−１５１（例えば、クローン４２３）および１１７−２８９（例えば、クローン５５５）と称されるモノクローナル抗体に関する。また、本発明は、本発明において１０３−３５０（例えば、クローン４７４）、１０８−３９４（例えば、クローン４７０）および１１５Ｂ−３０３（例えば、クローン６２０）と称されるモノクローナル抗体を含む。
【００２４】
本発明は、前記のモノクローナル抗体を含むだけでなく、これらの抗体を産生する新規ハイブリドーマ細胞株をも含む。より詳しくは、細胞株  はモノクローナル抗体１２０Ａ−２７０を産生し、細胞株ＰＴＡ−２８０９はモノクローナル抗体１１５Ｂ−１５１を産生し、細胞株ＰＴＡ−２８０６はモノクローナル抗体１１７−２８９を産生し、細胞株ＰＴＡ−２８０８はモノクローナル抗体１０３−３５０を産生し、細胞株ＰＴＡ−２８０７はモノクローナル抗体１０８−３９４を産生し、細胞株ＰＴＡ−２８１０はモノクローナル抗体１１５Ｂ−３０３を産生する。モノクローナル抗体１２０Ａ−２７０を産生する細胞株以外の抗体産生細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ  ２０１１０にブダペスト条約の条項に基づき２０００年１２月１３日付けで寄託されており、前記のＡＴＣＣ番号が付与されている。
【００２５】
本発明のモノクローナル抗体またはそのフラグメントは、ＨＩＶ−１（ＭおよびＯ群）およびＨＩＶ−２の同時検出のためのイムノアッセイにおいて使用することができる（本発明の目的においては、「フラグメント」は、結合特性に関して完全抗体と機能的に同様に反応するモノクローナル抗体のサブユニットと定義される）。特に、イムノアッセイ（例えば、サンドイッチアッセイ）においてモノクローナル抗体１２０Ａ−２７０および１１５Ｂ−１５１またはモノクローナル抗体１１７−２８９および１１５Ｂ−１５１を組合せて使用する場合には、少なくとも、患者のサンプル中のＨＩＶ−１  ＭおよびＯ群のサブタイプＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＯからのコア抗原（ｐ２４）ならびにＨＩＶ−２コア抗原（ｐ２６）を検出することが可能である。実際のところ、前記のモノクローナル抗体の組合せを用いて、２５ピコグラム未満（すなわち、ピコグラムコア抗原／ｍｌ血清または血漿）の量のＨＩＶ−１  ｐ２４抗原およびＨＩＶ−２  ｐ２６抗原を検出することができる。したがって、本発明のモノクローナル抗体は高い感度および広い特異性を有する。特に、これらの抗体の特有の特性は、それらが、ほぼ同等の親和性（すなわち、同等の定量的感度）を有する関連しているが同一ではないコア抗原を認識するというものであり、このことは、それらが、典型的な予想される交差反応性エピトープを認識して交差反応性を示すのではなく、予想不可能な共有エピトープを認識して共有反応性を示すことを示している（本発明の目的においては、「交差反応性」は、異なる抗原上の構造的に異なる決定基への抗体の結合性と定義される。交差反応性エピトープ（すなわち、抗原）に対する抗体親和性は、免疫原性エピトープ（すなわち、抗原）または共有エピトープに対するものより低い。「共有反応性」は、異なる抗原上の構造的に同一の決定基への抗体の結合性と定義される。共有エピトープに対する抗体親和性は、免疫原性エピトープ（すなわち、免疫原）に対する親和性と同等である）。また、モノクローナル抗体のペアが適合性であること、すなわち、該ペアの各モノクローナル抗体が、該コアタンパク質上の異なるエピトープまたは抗原決定基にマッピングされることに注目すべきである。該ペアの一方の抗体の結合は、該ペアの他方の抗体の結合を妨げない。
【００２６】
本発明の１つの実施形態（好ましい実施形態）においては、モノクローナル抗体１２０Ａ−２７０またはそのフラグメントを固相（例えば、微粒子、マイクロタイターウェル、ビーズなど）上にコーティングするが、１１５Ｂ−１５１もしくは１１７−２８９またはそのフラグメントを使用することも可能である。ついで該試験サンプルを該モノクローナル抗体またはそのフラグメントと接触させると、該患者サンプル中にｐ２４抗原またはｐ２６抗原が存在すれば、抗体／抗原複合体が第１混合物として形成される（例えば、該患者がＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２の両方を有する場合には、モノクローナル抗体／ｐ２４抗原複合体およびモノクローナル抗体／ｐ２６抗原複合体の両方が形成されうる）。ついで、（ｂ）シグナル生成化合物に結合した（ａ）プローブ抗体、例えばモノクローナル抗体１１５Ｂ−１５１（これは、１２０−２７０が結合するエピトープとは異なるそれに適合性のエピトープに結合する）を含むコンジュゲートを加える。すると抗体／抗原／抗体プローブ複合体が第２混合物として形成される。ついで、生成したシグナルの存在を検出しそれにより該抗体／抗原／抗体プローブ複合体の存在を検出することにより、ＨＩＶ−１および／またはＨＩＶ−２抗原を検出する。生成したシグナルは該サンプル中の抗原の量に比例するため、該試験サンプル中の抗原の量も計算することが可能である。
【００２７】
形成された複合体を検出するもう１つの方法は、シグナル生成化合物に結合した第３抗体を含むコンジュゲートを使用するものである。特に、前記の抗体／抗原／抗体複合体が形成されたら（すなわち、後者の抗体は未標識の第２抗体である）、溶液中の該「第２」未標識抗体に結合するコンジュゲートを加えることが可能である。該コンジュゲートは、例えば、検出可能なシグナルを生成しうるシグナル生成化合物に結合した結合第２抗体（例えば、抗１１５Ｂ−１５１抗体、または該プローブ抗体に対する抗体）に結合しうる抗原または抗抗体を含みうる。したがって該シグナルの検出は、該サンプル中の該複合体、したがって該抗原の存在を示す。生成したシグナルは、実際に、該サンプル中に存在する抗原の量に比例する（例えば、米国特許第６，０１５，６６２号を参照されたい）。該アッセイの設計は、使用する抗体の親和性および特異性、得られる結果の精度、簡便さ、固相の性質などに左右される（種々の抗原アッセイ形態の考察には、米国特許第５，１０４，７９０号を参照されたい）。
【００２８】
また、該イムノアッセイにおいて使用した初期捕捉抗体は、該固相に共有結合または非共有結合（例えば、イオン結合、疎水結合など）されうることに注目すべきである。共有結合のための連結剤は当技術分野で公知であり、固相の一部であることが可能であり、あるいはコーティングの前にそれに誘導体化されうる。イムノアッセイにおいて使用する固相の具体例としては、多孔性および非多孔性物質、ラテックス粒子、磁気粒子、微粒子、ビーズ、膜、マイクロタイタープレートおよびプラスチックチューブが挙げられる。所望により、固相物質、および該コンジュゲート中の抗原または抗体を標識する方法の選択は、所望のアッセイ形態の性能特性に応じて決定される。
【００２９】
前記のとおり、該コンジュゲート（または指示試薬）は、シグナル生成化合物または標識に結合した抗体（または、該アッセイに応じて恐らくは抗抗体）を含む。このシグナル生成化合物または「標識」はそれ自体が検出可能であるか、または１以上の追加的化合物と反応して検出可能な産物を生成しうる。シグナル生成化合物の具体例には、色素原、放射性同位体（例えば、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３２Ｐ、３Ｈ、３５Ｓおよび１４Ｃ）、化学発光性化合物（例えば、アクリジニウム）、粒子（可視性または蛍光性）、核酸、錯化剤または触媒、例えば酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、βガラクトシダーゼおよびリボヌクレアーゼ）が含まれる。酵素（例えば、アルカリホスファターゼまたはホースラディッシュペルオキシダーゼ）を使用する場合には、色素原、蛍光原または発光原基質の添加は検出可能なシグナルの生成をもたらす。他の検出系、例えば、時間分解蛍光、内部反射蛍光、増幅（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応）およびラマン分光も有用である。
【００３０】
該モノクローナル抗体が使用されうるもう１つのタイプのアッセイは、１）１つのモノクローナル抗体（固体支持体に結合しているもの）、２）該試験サンプル、および３）シグナル生成化合物が結合しているモノクローナル抗体またはそのフラグメント（例えば、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２抗原に特異的に結合する１１５Ｂ−１５１）を含む指示試薬を同時に接触させて、混合物を形成させる。ついで該混合物を、抗体／抗原／抗体複合体の形成に十分な時間にわたり及び条件下でインキュベートする。該試験サンプル中に存在し該固相上に捕捉されたＨＩＶ−１および／またはＨＩＶ−２抗原の存在は、実際にそれらが存在する場合には、該シグナル生成化合物により生成された測定可能なシグナルを検出することにより測定される。該試験サンプル中に存在する抗原の量は、生成したシグナルに比例する。このアッセイまたは前記のアッセイにおいては、本発明のモノクローナル抗体は、捕捉相として又は溶液中の指示試薬の一部として（すなわち、該試薬は抗体およびシグナル生成化合物を含む）使用することができる。そのような診断方法（前記および後記のものを含む）は当技術分野においてよく知られている（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌｓ．ＩおよびＩＩ，１９７９および１９８１，ＬｅｆｋｏｖｉｔｓおよびＰｅｒｎｉｓ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，１９８２，Ｋｅｎｎｅｔｔら編，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；ならびにＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９７８，Ｗｅｉｒ編，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯを参照されたい）。
【００３１】
本発明のモノクローナル抗体は、好ましくは、単一捕捉抗体として単独で、あるいは単一プローブおよび／または共役抗体として単独で使用しうることに注目すべきである。しかし、それらは前記アッセイにおいてペア（２つ組）またはトリオ（３つ組）で使用することも可能である。さらに、本発明のモノクローナル抗体（およびそのフラグメント）の組合せを、本発明のモノクローナル抗体のエピトープ特異性以外のＨＩＶ−１および／またはＨＩＶ−２のエピトープに対する特異性を有する他のモノクローナル抗体と共に使用することができる。したがって、該モノクローナル抗体は、ＨＩＶ−１および／またはＨＩＶ−２抗体の混合物または「カクテル」中の成分として作用しうる。したがって、例えば、このカクテルは、ＨＩＶ−１のｐ２４およびＨＩＶ−２のｐ２６を検出する本発明のモノクローナル抗体（例えば、１２０Ａ−２７０）、ならびに膜貫通タンパク質または細胞外糖タンパク質中のＨＩＶエンベロープ抗原決定基を検出するモノクローナル抗体を含みうる。このように、１以上のウイルス（例えば、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２）の種々のタンパク質からの幾つかの抗原決定基を同時に検出することが可能である。
【００３２】
また、本発明のモノクローナル抗体は、１）抗原、例えば前記のもの（例えば、ｐ２４およびｐ２６）および２）ＨＩＶに対する抗体（例えば、エンベロープ抗原（例えば、ＨＩＶ−１  ＭおよびＯ群ｇｐ４１ならびにＨＩＶ−２  ｇｐ３６）の使用による）を検出する組合せアッセイにおいて使用しうることに注目すべきである。本発明のモノクローナル抗体を使用する任意のそのような組合せアッセイが本発明の範囲内に含まれるとみなされる。
【００３３】
前記イムノアッセイにより試験されうる生物学的流体の具体例には、血漿、血清、脳脊髄液、唾液、涙、鼻洗浄液、または組織および細胞の水性抽出物が含まれる。該試験サンプルはまた、不活性化全ウイルスまたは部分精製もしくは組換えｐ２４もしくはｐ２６抗原を含みうる。
【００３４】
前記モノクローナル抗体は、適当に標識された場合には、組換え的に誘導されたＨＩＶ−１  ｐ２４およびＨＩＶ−２  ｐ２６への結合に関する血清サンプル中のＨＩＶ−１および−２コア抗体に対する競合プローブとして使用しうることに注目すべきである。
【００３５】
また、本発明のモノクローナル抗体またはそのフラグメントは、各モノクローナル抗体の適当な標識と共に固定細胞または固定組織を使用する検出系において使用することができる。特に、該組織サンプルを、本発明のモノクローナル抗体の１つに結合したシグナル生成化合物を含むコンジュゲートと接触させて、混合物を形成させる。ついで該混合物を、抗原／抗体複合体の形成に十分な時間にわたり及び条件下でインキュベートする。該サンプル中に存在する抗原の存在を、生成したシグナルを検出することにより測定する。また、ＨＩＶ−１  ｐ２４抗原およびＨＩＶ−２  ｐ２６抗原を例えば親和性クロマトグラフィーにより精製するために、該抗体を使用することができる。
【００３６】
さらに、本発明の抗体をマトリックスに結合させ、例えば細胞培養または生物学的組織（例えば、血液および肝臓）からの特定のＨＩＶ−１および／またはＨＩＶ−２抗原の親和性精製のために使用することができる。例えば、該モノクローナル抗体を基質または支持体に結合させ、あるいは基質または支持体上に固定化することができる。ついで、該ＨＩＶ抗原決定基を含有する溶液を該固定化抗体に、該抗体とｐ２４およびｐ２６決定基を含有するポリペプチドとの免疫複合体の形成に適した時間にわたり及び条件下で接触させる。未結合物質を該結合免疫複合体から分離する。ついで該複合体または抗原断片を該支持体から分離する。
【００３７】
本発明のモノクローナル抗体の１以上、好ましくは、前記で示唆されるペアが、キットの形態における使用に特に適している。該キットは、バイアルまたはボトルのような１以上の容器を含むことが可能であり、各容器は、モノクローナル抗体のペアまたはモノクローナル抗体のカクテルを含有しうる。これらのキットはまた、該アッセイを実施するために必要な他の試薬（例えば、洗浄液、加工および指示試薬）のバイアルまたは容器を含有しうる。
【００３８】
さらに、本発明はまた、本発明のモノクローナル抗体の１以上と、ＨＩＶ感染個体に投与されうる医薬上許容されるアジュバント（例えば、フロイントアジュバント）とを含むワクチンを含む（すなわち、受動免疫）。さらに、本発明のモノクローナル抗体は、未感染ハイリスク個体（例えば、医療従事者）への投与に予防的に働きうる。
【００３９】
本発明のモノクローナル抗体はまた、ＨＩＶタンパク質ｐ２４およびｐ２６のエピトープマッピングのための研究手段として働きうることにも注目すべきである。さらに、本発明のモノクローナル抗体は、抗原決定基の標的化領域を含有するＨＩＶ臨床分離体のタンパク質およびタンパク質前駆体に結合するだけでなく、該抗体は、該抗原決定基を含有する組換えタンパク質および該タンパク質の合成類似体にも結合することに注目すべきである。したがって、例えば、本発明のモノクローナル抗体は、ＨＩＶ−１のｐ２４およびＨＩＶ−２のｐ２６の組換えタンパク質および合成類似体が関わる結合実験において使用することができる。
【００４０】
また、未標識の本発明の抗体を凝集アッセイにおいて使用することが可能であり、あるいは、免疫グロブリンに特異的な抗体のような該モノクローナル抗体と反応性である標識抗体と組合せて使用することが可能である。
【００４１】
本発明はまた、ＨＩＶ−１および／またはＨＩＶ−２に感染した哺乳動物を治療するための方法であって、すぐ後に説明する医薬組成物の形態の本発明のモノクローナル抗体の１以上の有効量を、そのような治療を要する哺乳動物に投与することを含んでなる前記方法を含む。医薬的に有効な量（有効量）は、該医薬組成物中に含まれている場合に、ＨＩＶの複製を抑制して後天性免疫不全症候群（エイズ）を治療するのに有効である該化合物の任意の量であって、該対象に毒性となる量より低い量を意味する。
【００４２】
また、本発明は、本発明のモノクローナル抗体の１以上と医薬上許容される担体とを含んでなる医薬組成物を含む。医薬担体は、１以上のモノクローナル抗体を患者に運搬するのに適した任意の適合性で無毒性の物質である。例えば、滅菌水、アルコール、脂肪、ろう及び不活性固体を担体として使用することができる。また、該組成物は、ｐ２４および／またはｐ２６以外のＨＩＶのタンパク質または糖タンパク質に結合するモノクローナル抗体を含有しうる。さらに、該医薬組成物は、単独で又は他の抗レトロウイルス剤（Ｍｉｔｓｕｙａら，Ｎａｔｕｒｅ  ３２５：７７３−７７８（１９８７）を参照されたい）と共に投与することができる。本発明の医薬組成物は、経口的または非経口的（すなわち、皮下、筋肉内または静脈内）に投与することができる。
【００４３】
さらに、本発明のモノクローナル抗体の１以上は、例えば治療用の又はアッセイ対照もしくは校正体としてのキメラ抗体を得るために使用しうることに注目すべきである。
【００４４】
表５に記載のデータから明らかに示されるとおり、本発明のモノクローナル抗体のすべてはＨＩＶ−１のｐ２４およびＨＩＶ−２のｐ２６の両方に結合するため、例えば、該モノクローナル抗体の任意の１以上は、前記の診断アッセイ、キット、組成物および方法において使用することができる。明らかに、最強の結合特異性および能力（ｐ２４およびｐ２６に対して）を有するものが好ましい。
【００４５】
本発明は、以下の非限定的な実施例により例示されうる。
【実施例１】
【００４６】
免疫原の選択
該免疫方法は、ＨＩＶ−１  Ｏ群およびＨＩＶ−１  Ｍ群抗原（これは、ＨＩＶ−１の両群のコア抗原中の両方の共有エピトープの認識へと免疫応答を導くためのものである）を含むものであった。動物宿主において抗ＨＩＶ−１  ｐ２４応答を生成させるために、３つの異なるＨＩＶ−１免疫原を種々の組合せで使用した。Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬ）で製造された２つのＨＩＶ−１  Ｍ群抗原は変性全ウイルス溶解物から誘導されたものであり、一方、天然ＨＩＶ−１  Ｍ群ｐ２４（ｐ２４Ｍ）タンパク質は該ウイルス溶解物から精製されたものである。
【００４７】
該第３免疫原は、ＨＩＶ−１  Ｏ群分離体ＨＡＭ１１２のｇａｇ遺伝子から誘導された組換えｐ２４抗原（ｒｐ２４−Ｏ）であった。ＨＡＭ１１２からのｐ２４遺伝子をラムダＰＬベクター中にクローニングし、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現させた。該組換え抗原の構築、大規模化および精製は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で製造された組換えタンパク質に関する公開されている方法（Ｓｅｅｔｈａｒａｍ，Ｒ．およびＳｈａｒｍａ，Ｓ．Ｋ．（編），１９９１．‘Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ’，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ．）に従い行った。公開されている結果に対する該アミノ酸配列の照合は該産物の完全性を証明した（Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈａｅｓｅｖｅｌｄｅら，１９９４．Ｇｅｎｏｍｉｃ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａ  ｈｉｇｈｌｙ  ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ  Ａｆｒｉｃａｎ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｉｓｏｌａｔｅ．Ｊ．Ｖｉｒｏ．６８：１５８６）。
【実施例２】
【００４８】
マウスの免疫
ハイブリドーマの発生に関して選択したモデル動物は、３つの系統のマウス、すなわち、Ｃａｆ１、ＲＢｆ／ｄｎおよびＢＡＬＢ／ｃであった。該マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅ）から購入した６〜８週齢の雌であった。高親和性を有するＨＩＶ−１  ｐ２４モノクローナル抗体を産生させるために、２つの異なる免疫方法を用いた。ｒｐ２４−Ｏまたはｐ２４−Ｍまたはｒｐ２４Ｏとｐ２４Ｍとの両方の混合物で皮下（ｓ．ｃ．）または筋肉内（ｉ．ｍ．）に２回免疫したマウスから、抗ｐ２４モノクローナル抗体（Ｍａｂ）１０３−３５０−４７４、１０８−３９４−４７０、１１５Ｂ−３０３−６２０、１１５Ｂ−１５１−４２３および１１７−２８９−５５５を分泌するハイブリドーマが産生された。該マウスを、親和性成熟のために４〜１２ヶ月間休養させ、融合の３日前に免疫原で脾臓内（ｉ．ｓ．）で追加免疫した。腹腔内（ｉ．ｐ．）投与と皮下投与とを交互に行って低用量の精製天然ｐ２４−Ｍで毎週、６回にわたり高度免疫化したＢＡＬＢ／ｃマウスからは、１２０Ａ−２７０−１０８が産生された。
【００４９】
該免疫方法を以下に詳しく説明する。
【００５０】
ハイブリドーマ１０３−３５０−４７４は細胞融合体＃１０３から製造した。第１日に、０．２ｍｌのフロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）中の１０ｕｇのｒｐ２４Ｏ抗原をＣＡＦ１マウス＃１５５５に皮下投与した。第５６日に、０．２ｍｌの不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）中の１０ｕｇのｒｐ２４Ｏ抗原を該マウスに筋肉内（ｉ．ｍ．）投与した。第７４日に、間接酵素結合イムノアッセイ（ＥＩＡ）による抗ＨＩＶ−１抗体力価の評価のために該マウスから採血した。第１８６日に、正常食塩水中の２５ｕｇのＨＩＶ−１  Ｍ群ウイルスライセートで該マウスをｉ．ｓ．で追加免疫した。
【００５１】
ハイブリドーマ１０８−３９４−４７０は細胞融合体＃１０８から製造した。第１日に、０．２ｍｌのＣＦＡ中の１０ｕｇのｒｐ２４−Ｏ抗原をＣＡＦ１マウス＃１５５６にｓ．ｃ．投与した。第５６日に、０．２ｍｌのＩＦＡ中の１０ｕｇのｒｐ２４Ｏ抗原を該マウスにｉ．ｍ．投与した。第７４日に、間接ＥＩＡによる抗ＨＩＶ−１抗体力価の評価のために該マウスから採血した。第２７０日に、正常食塩水中の４５ｕｇの精製天然ＨＩＶ−１  Ｍ群ｐ２４で該マウスをｉ．ｓ．で追加免疫した。
【００５２】
ハイブリドーマ１１５Ｂ−１５１−４２３および１１５Ｂ−３０３−６２０は細胞融合体＃１１５Ｂから製造した。第１日に、０．２ｍｌのＣＦＡ中の１０ｕｇのｒｐ２４Ｏ抗原をＣＡＦ１マウス＃１５６３にｓ．ｃ．投与した。第２１０日に、０．２ｍｌのＩＦＡ中の１０ｕｇのｒｐ２４Ｏと１０ｕｇのｐ２４Ｍとの混合物を該マウスにｓ．ｃ．投与した。第２３５日に、間接ＥＩＡによる抗ＨＩＶ−１抗体力価の評価のために該マウスから採血した。第３７５日に、正常食塩水中の１０ｕｇのｒｐ２４Ｏと１０ｕｇのｐ２４Ｍとの混合物で該マウスをｉ．ｓ．で追加免疫した。
【００５３】
ハイブリドーマ１１７−２８９−５５５は細胞融合体＃１１７から製造した。第１日に、０．２ｍｌのＣＦＡ中の１０ｕｇのｒｐ２４Ｏ抗原をＲＢｆ／ｄｎマウス＃１５４５にｓ．ｃ．投与した。第５６日に、０．２ｍｌのＩＦＡ中の１０ｕｇのｒｐ２４Ｏの混合物を該マウスにｉ．ｍ．投与した。第７４日に、間接ＥＩＡによる抗ＨＩＶ−１抗体力価の評価のために該マウスから採血した。第３９２日に、正常食塩水中の４５ｕｇのｒｐ２４Ｏと精製天然ｐ２４Ｍとの混合物で該マウスをｉ．ｓ．で追加免疫した。
【００５４】
ハイブリドーマ１２０Ａ−２７０−１０８は、１０ｕｇの精製天然ｐ２４Ｍ抗原と４ｕｇのエス・ティフィムリウム（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）抽出物（ＲＩＢＩ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ＲｉＢｉ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｃｈｅｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｍｏｎｔａｎａ）とを含有する０．２ｍｌの免疫原を第１日にｉ．ｐ．で、第７日にｓ．ｃ．で及び第１４日にｉ．ｐ．で投与した高度免疫化ＢＡＬＢ／ｃマウス＃７の細胞融合体＃１２０Ａから製造した。第２１日に、間接ＥＩＡによる抗ＨＩＶ−１  ｐ２４抗体力価の評価のために該マウスから採血した。第２８、３５および４２日に、それぞれｓ．ｃ．、ｉ．ｐ．およびｓ．ｃ．で０．２ｍｌのＲＩＢＩアジュバント中の５ｕｇの精製天然ｐ２４Ｍ抗原を該マウスに投与した。第４９日に、間接ＥＩＡによる抗ＨＩＶ−１抗体力価の評価のために該マウスから再度採血した。第７７日（融合の３日前）に、正常食塩水中の５０ｕｇの精製天然ｐ２４Ｍ抗原で該マウスをｉ．ｓ．で追加免疫した。
【実施例３】
【００５５】
免疫マウスの抗ｐ２４抗体力価の評価
間接結合および直接サンドイッチ酵素結合イムノアッセイ（ＥＩＡ）を用いて、該免疫マウスからの抗ＨＩＶ−１抗体力価を評価した（直接サンドイッチＥＩＡは、高親和性抗体のみを検出するために一定量のコア抗原で行った）。ナイーブまたは免疫マウスからの血清を、５％  ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と保存剤としての０．０３％  アジ化ナトリウムとを含有する１０ｍＭ  リン酸ナトリウムバッファー（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）中で系列希釈した。詳細なアッセイ方法は後記で説明する。該免疫マウスからの抗ｐ２４抗体力価の評価を、該間接結合ＥＩＡからのものは表１ａに、該直接サンドイッチＥＩＡからのものは表１ｂに示す。
【００５６】
【表１】
0004489351.tif 000002
【００５７】
該直接結合ＥＩＡの場合には、簡単に説明すると、該希釈血清を、ＰＢＳ中の１００ｕｌの３ｕｇ／ｍｌ  ｐ２４Ｍ（すなわち、Ｍ群からのｐ２４）またはｒｐ２４Ｏ（すなわち、群からの組換えｐ２４）抗原またはｐ２４Ｍとｒｐ２４Ｏとの混合物で直接的にコーティングされたマイクロタイターウェルと反応させ、ＰＢＳ中の２％  ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロッキングした。マイクロタイタープレートシェーカー（Ｌａｂ−Ｌｉｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｍｅｌｒｏｓｅ，ＩＬ）上、室温（ＲＴ）で１時間インキュベートした後、マイクロタイタープレート洗浄器（Ｓｋａｎｗａｓｈ，Ｓｋａｔｒｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）を使用して該プレートを蒸留水で３回洗浄した。１００ｕｌの０．２ｕｇ／ｍｌのヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）（ＫＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）コンジュゲート（共役体）を該プレートの各ウェルに加えた。室温で３０分間インキュベートした後、該プレートを３回洗浄した（前記のとおり）。酵素基質ｏ−フェニレンジアミン：２ＨＣｌ（ＯＰＤ）溶液を各ウェルに加えて、暗所中、室温で５分間にわたり呈色反応を進行させた。各ウェルに１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を加えることにより、該反応を停止させた。該プレートを、マイクロタイタープレートリーダー（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ  ｍｕｌｔｉｗｅｌｌ  ＥＩＡ  ｒｅａｄｅｒ，ＩＣＮ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）中、Ａ４９０ｎｍで測定した。
【００５８】
該間接サンドイッチＥＩＡの場合には、マイクロタイターウェルを１００ｕｌ／ウェルのＰＢＳ中の１０ｕｇ／ｍｌのヤギ抗マウスＩｇＧ＋Ｍ抗体（ＫＰＬ）で２〜８℃で一晩にわたりコーティングした。該プレートを、プレート洗浄器（Ｓｋａｎｗａｓｈ，Ｓｋａｔｒｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）を使用して蒸留水で３回洗浄し、ＰＢＳ中の２％  ＢＳＡで室温で３０分間ブロッキングした。培養液の１００ｕｌ部分を該ウェルに加え、該プレートを、プレートシェーカー上、室温で１時間インキュベートした。培養液中に分泌した抗ｐ２４抗体を、固相上にコーティングされたヤギ抗マウスＩｇＧ＋Ｍにより捕捉した。洗浄後、１００ｐｇ／ｍｌのＨＩＶ−１ウイルスライセートの１００ｕｌ部分を各ウェルに加え、該プレートを、プレートシェーカー上、室温で１時間インキュベートした。洗浄後、０．５ｕｇ／ｍｌのウサギ抗ｐ２４抗体の１００ｕｌ部分を各ウェルに加え、該プレートを、プレートシェーカー上、室温で１時間インキュベートした。洗浄後、０．２ｕｇ／ｍｌのヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰＯ（ＫＰＬ）の１００ｕｌを各ウェルに加え、該プレートを室温で３０分間インキュベートした。最終洗浄後、色素原ＯＰＤを前記のとおりに加えた。
【実施例４】
【００５９】
細胞融合
融合前の追加抗原刺激の３日後、マウスを屠察にし、それらの脾臓を単個細胞にまで破壊した。該単個細胞浮遊液を０．８３％  ＮＨ４Ｃｌで処理して、赤血球を除去し、ついでＳＰ２／０：脾臓細胞の比が１０：１となるようＳＰ２／０細胞と混合した。該混合細胞を遠心分離し、無血清培地で１回洗浄し、ついで再び遠心分離した。該上清を該細胞ペレットから除去した。融合誘導因子ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を使用して、免疫脾臓細胞と骨髄腫細胞系ＳＰ２／０（ＨＰＲＴ  ｎｅｇ．）とのハイブリッドを形成させた［ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６：４９４，総説は、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｈｕｒｒｅｌｌ編（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８２０］。簡単に説明すると、脾臓細胞とＳＰ２／０細胞との融合は、該ペレットを、無血清イスコエ（Ｉｓｃｏｅ）変法ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）中の４０％  ＰＥＧ（Ｍ．Ｗ．１４５０，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）に２分間さらすことにより達成された。２０ｍｌの無血清ＩＭＤＭを５分間にわたり加えることにより、該ＰＥＧおよび細胞浮遊液をゆっくり希釈し、ついで遠心分離により該細胞を集めた。該上清をデカントし、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン）と共に２０％  ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，Ｕｔａｈ）を含有する３０ｍｌのＩＭＤＭと交換して、ハイブリドーマを選択した。１匹の未免疫ＢＡＬＢ／ｃマウスからの脾臓細胞も支持細胞層として加えた。該細胞を３個の９６ウェル組織培養プレート中で０．１ｍｌ／ウェルでプレーティングした。３日後、更に０．１ｍｌのＨＡＴ培地を各ウェルに加えた。その後、１週間間隔で、該培地の半分を、ＨＡＴと共に２０％  ウシ胎仔血清を含有するＩＭＤＭと交換し、ハイブリッドを更に７〜１４日間にわたり増殖させた。
【００６０】
該ハイブリッドのいくつかは、ＳＰ２／０細胞と融合した、ＨＩＶ−１に対する抗体を産生する脾臓細胞から構成されていた。簡単に説明すると、該融合誘導因子は脾臓細胞とＳＰ２／０細胞膜との融合を促進して、両方の細胞の核を含有するヘテロカリオンを形成した。最終的には、異なる核が融合して、同調有糸分裂能を有する単一の核を生成した。該融合細胞が分裂するにつれて、各核の染色体を失うことにより該ハイブリッドは安定化する。該融合細胞を複数の９６ウェルプレート中に１０５〜１０６細胞／ウェルでプレーティングした。ＳＰ２／０：脾臓細胞融合から形成したハイブリッド細胞は、ＨＡＴ培地中で培養することにより選択的に増殖した。すべての未融合ＳＰ２／０またはＳＰ２／０：ＳＰ２／０融合細胞はアミノプテリンにより増殖が妨げられ、未融合脾臓細胞または脾臓：脾臓融合細胞は培養内で死滅した。脾臓細胞：ＳＰ２／０ハイブリッドのみが該ＨＡＴ培地中で増殖することとなる。
【実施例５】
【００６１】
ｐ２４モノクローナル抗体のスクリーニング、クローニングおよび特定
１０〜１４日後、ハイブリドーマ細胞増殖を含有するウェルからの培養液を、ＨＩＶ−１  ｐ２４に対する抗体に関してスクリーニングした。間接ＥＩＡを用いて、細胞融合体＃１０３、＃１０８、＃１１５Ｂおよび＃１１７からの培養液をスクリーニングした。また、高親和性を有する抗ＨＩＶコアタンパク質モノクローナル抗体を選択するために、直接サンドイッチＥＩＡアッセイを用いて、融合体＃１１５Ｂおよび１２０Ａのクローニングならびに細胞融合体＃１２０Ａからの潜在的に有用なクローンをスクリーニングした。直接ＥＩＡおよび間接ＥＩＡは共に、実施例２の抗血清力価評価の節に記載されている。本出願に記載のハイブリドーマからの一次スクリーニングデータを表２ａおよび２ｂに示す。
【００６２】
【表２】
0004489351.tif 000003
【００６３】
該一次スクリーニングＥＩＡにおいて強力な陽性シグナルを示すハイブリドーマを、細胞増殖のために２４ウェルプレート中に移した。抗ｐ２４抗体の存在に関して、培養液を再びアッセイした。限界希釈によるクローニングのために、Ｔ２５フラスコ中、抗ｐ２４陽性ハイブリッドを更に増殖させた。各増殖ハイブリッドを９６ウェルプレート中で１０５〜１０６の希釈度でプレーティングし、１０〜２１日間増殖させた。限界希釈からの培養液を抗ｐ２４抗体の存在に関してアッセイした。ハイブリドーマの命名法は、３個の数字を使用する番号付けの系に基づくものであり、第１の数字は融合の番号であり、第２の数字は親ハイブリッドの番号であり、第３の数字はサブクローンの番号である。各９６ウェル組織培養プレートは連続的に１〜９６に番号付けされている。例えば、ハイブリドーマ＃１０３−３５０−４７４は第１０３の融合に由来する。該親ハイブリッドは、それがウェル＃５０中の第３の融合プレートに由来するため、＃３５０である。該サブクローンは、それがウェル＃７４の第４のクローニングプレートに由来するため、＃４７４である。該クローンは、Ｊ．Ｗ．Ｇｏｄｉｎｇ  ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，１９８３）に概説されているガイドラインを使用して限界希釈により得た。本出願に記載のハイブリドーマに関する一次クローニングデータを表３ａおよび３ｂに示す。
【００６４】
【表３】
0004489351.tif 000004
【００６５】
抗ｐ２４  ＭａｂのイソタイプをＳＢＡ  Ｃｌｏｎｏｔｙｐｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）で決定した。簡単に説明すると、マイクロタイターウェルプレートをヤギ抗マウスＩｇＧ＋Ｍ抗体（ＫＰＬ）の１００ｕｌ部分で２〜８℃で１８〜２４時間にわたりコーティングした。該ウェルを洗浄し、ＰＢＳ中の２％  ＢＳＡで室温で３０分間ブロッキングした。洗浄後、培養液の１００ｕｌ部分を該ウェルに加え、該プレートを、プレートシェーカー上、室温で２時間インキュベートした。洗浄後、ウサギ抗マウスイソタイプ特異的抗体の１００ｕｌ部分を該ウェルに加え、プレートシェーカー上、室温で１時間インキュベートした。洗浄後、１００ｕｌのヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰＯ（ＫＰＬ）を該ウェルに加え、プレートシェーカー上、室温で更に３０分間インキュベートした。最終洗浄後、色素原ＯＰＤを前記のとおりに加えた。Ｍａｂ  １０３−３５０−４７４、１０８−３９４−４７０、１１５Ｂ−１５１−４２３、１１５Ｂ−３０３−６２０、１１７−２８９−５５５および１２０Ａ−２７０−１０８のイソタイプを表４に要約する。
【００６６】
【表４】
0004489351.tif 000005
【００６７】
ＨＩＶ−１／２抗原に対するＭａｂの特異的反応性を、前節に記載のとおりの直接サンドイッチＥＩＡにおいて試験した。結果を表５に要約する。
【００６８】
【表５】
0004489351.tif 000006
【００６９】
表５に示した結果を考慮すると、本発明のモノクローナル抗体のすべてはＨＩＶ−１／２  ｐ２４／ｐ２６抗原と反応する（ＨＩＶ−１  Ｏ群およびＨＩＶ−２  ＮＩＨ−Ｚウイルス溶解物はＡＢＩ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）から購入した）。
【実施例６】
【００７０】
抗体の製造および精製
更なる特徴づけ及び試験のために大量のＭａｂを製造するために、抗ｐ２４ハイブリドーマ細胞系をＴ２５０フラスコ中で更に増殖させ、無血清培地Ｈ−ＳＦＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）に切り換えた。該ハイブリドーマ細胞系がＨ−ＳＦＭに適応したら、それを大規模抗体製造用のローラーボトル（回転びん）中に播いた。培養液を該ローラーボトルから回収し、濾過系により濃縮した。該ローラーボトル由来抗体を、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）からのプロテインＡカラム上で精製した。
【実施例７】
【００７１】
抗ｐ２４モノクローナル抗体の親和性測定
精製された抗ｐ２４  Ｍａｂ  １０３−３５０−４７４、１０８−２９４−４７０、１１５Ｂ−３０３−６２０、１１５Ｂ−１５１−４２３、１１７−２８９−５５５および１２０Ａ−２７０−１０８の親和性を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に基づくＢＩＡｃｏｒｅイムノセンサー（ｉｍｍｕｎｏｓｅｎｓｏｒ）装置（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）により測定した。簡単に説明すると、ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ）抗体を、ＥＤＡＣ化学によりアミノセンサーチップに共有結合させた。各マウスＩｇＧモノクローナル抗体を該センサーチップ中に注入し、該固定化ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体により捕捉させた。未結合マウスモノクローナル抗体を該チップから洗い落とした。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）シグナルのベースライン測定値を各モノクローナル抗体に関して記録した。精製されたＨＩＶ−１  ｐ２４タンパク質を該センサーチップ中に注入し抗ｐ２４モノクローナル抗体と反応させると、ＳＰＲシグナルは増加し始めた。結合曲線の傾きは各モノクローナル抗体の会合定数に比例した。結合が達成された後、洗浄工程を導入した。抗ｐ２４モノクローナル抗体からのｐ２４の解離速度はＳＰＲシグナルの減少に比例した。測定の各サイクルの後、次の測定のために抗ｐ２４モノクローナル抗体を該センサーチップから除去するために、ＨＣｌバッファーを該センサーチップ中に適用した。オン・レイト（ｏｎ−ｒａｔｅ）およびオフ・レイト（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）ＳＰＲシグナルに基づき、各モノクローナル抗体の会合（Ｋａ）、解離（Ｋｄ）および相対親和性（Ｋ）定数を求めた。データを表６に要約する。
【００７２】
【表６】
0004489351.tif 000007
【実施例８】
【００７３】
ｐ２４モノクローナル抗体のエピトープマッピング
マウスモノクローナル抗体により認識されるＨＩＶ−１  ｐ２４上のエピトープを、２組の１３個のｐ２４合成ペプチドを使用して同定した（図１ａ）。共有エピトープに特有でありうるラセン構造（インビボ）の選択非遮断領域を提示するために、ペプチドの設計はｐ２４抗原の三次元構造（Ｇｉｔｔｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７３：２３１（１９９６）；Ｇａｍｂｌｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７８：８４９（１９９７））に基づくものであった。これらのペプチドは該コアタンパク質上の全てのラセン領域（Ａ〜Ｊ）を網羅した。モノクローナル抗体をＭ群（クレードＢ）およびＯ群（Ｈａｍ１１２）ペプチドの両方に対して反応させた。ペプチドを、ＨＩＶ−１  Ｍ群クレードＢ  ｐ２４を表すＭ１〜Ｍ１３、またはＨＩＶ−１  Ｏ群（Ｈａｍ１１２分離体）ｐ２４を表すＯ１〜Ｏ１３と命名した。各ペプチドはまた、マレイミド修飾キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）と反応して未共役ペプチドの他に２通りのＫＬＨ共役ペプチドを形成する追加的なシステインをそのＣ末端に含有していた。ＫＬＨ共役ペプチドは、エピトープの提示および認識（モノクローナル結合）に必須でありうるコンホメーション構造を安定化しそれをとるのを補助するために作製した。ＫＬＨ共役ペプチドは、Ｍ群ペプチドに関してはＫＭ１〜ＫＭ１３と、Ｏ群ペプチドに関してはＫＯ１〜ＫＯ１３と命名した。
【００７４】
合成ペプチドの組へのモノクローナル抗体（Ｍａｂ）の結合は間接ＥＬＩＳＡアッセイにより測定した。簡単に説明すると、遊離またはＫＬＨ共役合成ペプチドをマイクロタイタープレートのウェル上にコーティングした。該ペプチドコート化ウェルを、約１ｕｇ／ｍｌの濃度に調製したＭａｂと共にインキュベートした。結合Ｍａｂを酵素またはアクリジニウム標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体により検出した。代表的なデータを図２ａおよびｂに示す。Ｍａｂ  １０３−３５０−４７４、１１１７−２８９−５５５、１１５Ｂ−３０３−６２０および１２０Ａ−２７０−１０８により認識されるエピトープが以下のとおりに同定された。
【００７５】
モノクローナル抗体１０３−３５０−４７４は、ｐ２４のヘリックスＤ領域に対応するＫＬＨ共役Ｍ群およびＯ群ペプチド＃４（ＫＭ４／ＫＯ４）に特異的に結合した。該エピトープは、見掛け二次コンホメーション要件を有する直鎖状である。１０３−３５０−４７４が遊離（未共役）ペプチドに対して反応した場合には、一貫した結合はほとんど又は全く検出されなかった。一方、二次コンホメーションペプチド構造を促すためにペプチドを担体タンパク質（ＫＬＨ）に共役させると、１０３−３５０−４７４は、一貫して、ＫＭ４／ＫＯ４ペプチドに対して強力（高いＳ／Ｎ）な結合を示した。該エピトープが直鎖状であると考えられるのは、該抗体は小さな合成ペプチドに結合するが最適なエピトープは特異的な二次ラセン構造を要しうるからである。したがって、該エピトープは、最も広義には、アミノ酸６３−８９を含むと定められ、最も狭義には、アミノ酸６３−８０を要すると推定され、これはヘリックスＤ領域にマッピングされる。さらに、ＭおよびＯ  ｐ２４間の該抗体の交差反応性は、ヘリックスＤにおける最大配列相同性を有するｐ２４領域が、十中八九、該エピトープの形成に関与していることを示している。太字で示した残基が、十中八九、該エピトープの形成の鍵となるが、隣接アミノ酸が関与する又は隣接アミノ酸を要する二次構造の可能性も排除できない。
【００７６】
【化１】
0004489351.tif 000008
【００７７】
モノクローナル抗体１１７−２８９−５５５は、主要相同性領域（ＭＨＲ）の一部であるヘリックスＨ領域に対応するＭ群およびＯ群Ｍ１０／０１０ペプチドの両方に特異的に結合した。該抗体は遊離（未共役）Ｍ１０／Ｏ１０ペプチドに容易に結合するため、該エピトープは直鎖状であると考えられる。Ｍ群およびＯ群  ｐ２４の両方への結合が予想される。太字で示した残基が該エピトープの形成の鍵となるらしい。
【００７８】
【化２】
0004489351.tif 000009
【００７９】
モノクローナル抗体１１５Ｂ−３０３−６２０は、ｐ２４のヘリックスＪ〜Ｋ領域に対応するＭ１２およびＯ１２ペプチドに特異的に結合した。該エピトープは、Ｍ１２／Ｏ１２の遊離（未共役）ペプチドに対する強力（高いＳ／Ｎ）な結合に基づけば、直鎖状であると考えられる。太字で示した残基が該エピトープの形成の鍵となると考えられるが、隣接アミノ酸が関与する又は隣接アミノ酸を要する二次構造の可能性も排除できない。
【００８０】
【化３】
0004489351.tif 000010
【００８１】
モノクローナル抗体１２０Ａ−２７０−１０８は、モノクローナル抗体１１７−２８９−５５５の場合と同様に、ｐ２４のヘリックスＨおよびＭＨＲ領域にマッピングされた。しかし、１２０Ａ−２７０−１０８は、１１７−２８９−５５５により認識されるエピトープとは異なるエピトープを認識する。１１７−２８９−５５５と１２０Ａ−２７０−１０８との有意な相違は、１２０Ａ−２７０−１０８がＫＬＨ共役Ｍ１０ペプチドに中等度でしか結合しなかったことである。１２０Ａ−２７０−１０８を遊離（未共役）ペプチドに対して反応させた場合には、結合は全く検出されなかった。したがって、１２０Ａ−２７０−１０８の最適エピトープは特異的な二次または三次構造を要する。さらに、１１７−２８９−１０８と１２０Ａ−２７０−１０８とは、異なる適合性群に属する。なぜなら、それらは、お互いからの阻害も競合もなくコアタンパク質に同時に結合するからである（以下の表７を参照されたい）。
【００８２】
【表７】
0004489351.tif 000011
【００８３】
また、Ｍａｂ  １０３−３５０または１０８−３９４とペアになってサンドイッチを形成する１１７−２８９とは異なり、１２０Ａ−２７０はいずれのＭａｂともサンドイッチを形成し得ないことが、該適合性研究から示された（表７）。該適合性データは、１２０Ａ−２７０により認識されるエピトープが、１１７−２８９により認識されるエピトープとは別物であり異なることを明らかに示した。Ｍａｂ  １２０Ａ−２７０は、十中八九、部分的にはアミノ酸１５１−１７６により形成されるコンホメーションエピトープを認識する。
【００８４】
２つのＭａｂ  １１５Ｂ−１５１および１０８−３９４は遊離合成ペプチドには結合せず、１１５Ｂ−１５１は１つのＫＬＨ共役ペプチドに弱く結合した（図２Ｂ）。合成ペプチドに結合しなかったことでは、これらのＭａｂがコア抗原上のコンホメーションエピトープを認識することを示した。コンホメーションエピトープは、ｐ２４抗原の三次または四次フォールディングにより一緒になる連続的なアミノ酸により形成される。三次または四次構造依存性コンホメーションエピトープは、一般には、小さな合成ペプチドによっては模擬され得ない。
【００８５】
該１１５Ｂ−１５１および１０８−３９４により認識されるコンホメーションエピトープを位置決定するために、１組の大きな重複ｐ２４ポリペプチドを使用した。重複ｐ２４ポリペプチドを、ｐ２４ヌクレオチド配列の特有の部分を保持するプラスミド（欠失クローン）から大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で発現させた（ｒタンパク質）。６個の欠失クローンの２組を、ｐ２４の構造に基づき設計した。ｐ２４ポリペプチドへのモノクローナル抗体の特異的結合を、ウエスタンブロット法を用いて測定した。簡単に説明すると、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の抽出物中の発現された（組換え）ｐ２４ポリペプチドをＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、ニトロセルロースメンブレンにトランスファーした。電気泳動により分離されたタンパク質を含有するメンブレンをｐ２４  Ｍａｂ（〜５ｕｇ／ｍｌの濃度）と反応させ、結合モノクローナル抗体を酵素標識ヤギ抗マウスＩｇＧにより検出した。図４は、Ｍａｂ  １１５Ｂ−１５１および１０８−３９４のウエスタンブロットの結果を例示する。
【００８６】
モノクローナル抗体１１５Ｂ−１５１は、Ｍ群ポリペプチドＦ（１−１７２）およびＧ（１３７−２３１）ならびにＯ群ポリペプチドＮ（１−１７３）およびＯ（１３８−２３２）に特異的に結合した。ＦおよびＧおよびＮおよびＯ間の重複領域（アミノ酸１３７−１７２）が、１１５Ｂ−１５１により認識されるエピトープに寄与している可能性がある。このデータは、アミノ酸１３７−１７２を含有するＫＬＨ共役合成ペプチドＫＭ１０およびＫＯ１０に対する１１５Ｂ−１５１の弱いが一貫した結合により裏付けられた（図２Ｂ）。（ａ）１１５Ｂ−１５１は、該エピトープが特異的な二次または三次コンホメーション状態にあることを要したらしいこと、（ｂ）それは、ｐ２４とサンドイッチを形成するのに１１７−２８９／１２０Ａ−２７０と適合性であったこと（表７）、および（ｃ）ヘリックスＡに対するモノクローナル抗体は１１５Ｂ−１５１とは不適合性であり強く競合したが、１１７−２８９とは適合性であったことから、Ｍａｂ  １１５Ｂ−１５１は１１７−２８９および１２０Ａ−２７０とは異なっていた。ＫＬＨ共役ペプチドに対する弱い結合に加えて、ヘリックスＡに対するモノクローナル抗体が１１５Ｂ−１５１と強く競合したことは、１１５Ｂ−１５１により認識される最適エピトープが、ヘリックスＨ内で同定された最小直鎖状エピトープに加えてヘリックスＡの一部を含むことを示している可能性がある。
【００８７】
モノクローナル１０８−３９４は、Ｍ／Ｏ  ｐ２４の最初の１７２／１７３アミノ酸内で形成されるコンホメーションエピトープにマッピングされた。該エピトープは非直鎖状である。なぜなら、ＨＩＶ−１  ＭおよびＯ合成ペプチド（遊離体、または担体タンパク質ＫＬＨとの共役体）は１０８−３９４と無反応性であったからである。また、１０８−３９４は、Ｍ／Ｏ  ｐ２４に由来するポリペプチドのうちの最大のもの（Ｆ  １−１７２／Ｎ  １−１７３）としか反応しなかった。ＭポリペプチドＣ（１−６５）、Ｅ（１−１３０）およびＩ（６０−１５０）、ならびにポリペプチドＬ（１−６５）、Ｍ（１−１３１）およびＱ（６０−１５１）は、ポリペプチドＦ（１−１７２）およびＮ（１−１７３）中で見出されるのと同じ配列の大きなセグメントを含有するが、１０８−３９４により認識されるエピトープは、それらの短いポリペプチドからは形成されなかったらしい。これらのデータは、少なくとも最初の１７２／１７３アミノ酸を含むｐ２４の主要部分により形成されるコンホメーションエピトープに符合する。
【００８８】
合成ペプチドおよびｐ２４欠失クローンを使用するエピトープマッピングからのデータ、ならびにｐ２４サンドイッチ適合性研究からのデータに基づき、ｐ２４抗原の三次元構造上の６個のｍＡｂのエピトープ地図を図５に例示する。該ｐ２４分子の構造は、２つのドメイン、すなわち、Ｎ末端ドメイン（アミノ酸１−１５１）およびＣ末端ドメイン（アミノ酸１５１−２３１）により表される。無傷ｐ２４分子の構造は未だ決定されていないため、それらの２つのドメイン間の厳密な構造的関係は完全には特徴づけられていない。
【００８９】
以下のとおりに、６個のｍＡｂがｐ２４抗原にマッピングされた（図５）。
【００９０】
モノクローナル抗体１０３−３５０−４７４は、ＨＩＶ−１  ＭおよびＯ  ｐ２４のヘリックスＤ領域中に位置する直鎖状エピトープに結合する。該エピトープは、最も広義には、該ｐ２４抗原のＭ群およびＯ群のアミノ酸６３−８９を含むと定められ、最も狭義には、アミノ酸６３−８０を含むと推定される。
【００９１】
モノクローナル抗体１１７−２８９−５５５は、ｐ２４のＭＨＲ／ヘリックスＨ領域中に位置する直鎖状エピトープに結合する。該エピトープは、最も広義には、ｐ２４抗原のアミノ酸１５１−１７２（Ｍ）／１５２−１７３（Ｏ）を含むと定められ、最も狭義には、アミノ酸１６２−１７２（Ｍ）／１６３−１７３（Ｏ）を含むと定められる。
【００９２】
モノクローナル抗体１１５Ｂ−３０３−６２０は、ｐ２４抗原のヘリックスＪ〜Ｋ領域中に位置する直鎖状エピトープに結合する。該エピトープは、該ｐ２４抗原のアミノ酸１９８−２１７（Ｍ）／１９９−２１８（Ｏ）を含むと定められる。
【００９３】
モノクローナル抗体１１５Ｂ−１５１−４２３は、ｐ２４のヘリックスＡおよびＭＨＲ／ヘリックスＨ領域の結合部付近に十中八九は存在するコンホメーションエピトープに結合する。
【００９４】
モノクローナル抗体１０８−３９４−４７０は、ｐ２４のＮ末端ドメイン（アミノ酸１−１５１）内に形成されるコンホメーションエピトープに結合する。該コンホメーションエピトープはヘリックスＤおよびヘリックスＡの結合部付近に存在すると推定される。
【００９５】
モノクローナル抗体１２０Ａ−２７０−１０８は、ｐ２４のヘリックスＤ、ヘリックスＡおよびＭＨＲ／ヘリックスＨ領域の結合部付近に存在すると推定されるコンホメーションエピトープに結合する。
【実施例９】
【００９６】
モノクローナル抗体でコーティングされた微粒子の製造
１％  固体のカルボキシ修飾ラテックス（ＣＭＬ）微粒子（Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｆｉｓｈｅｒｓ，ＩＮから入手）を、スケール５の高に設定された（Ｒｏｔｏ−Ｔｏｒｑｕｅ，Ｃｏｌｅ  Ｐａｒｍｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｖｅｒｎｏｎ  Ｈｉｌｌｓ，ＩＬ）上、カルボジイミドＥＤＣ［Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯからの１−エチル−３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩］により、５０ｍＭ  ＭＥＳ［２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸］バッファー（ｐＨ６．１）中、ＥＤＣ：カルボキシル基＝１０：１のモル比で室温で５分間にわたり活性化した。エンド・オーバー・エンド・ローテーター上、抗コアＭａｂをＥＤＣ前活性化ＣＭＬ微粒子に、１％  固体微粒子の１ｍｌ当たり２００ｕｇの抗体の比率で、室温で４時間にわたり加えた。十字流（ｃｒｏｓｓｆｌｏｗ）シリンジ膜（孔径０．２ｕｍおよび表面積１２ｃｍ２、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ，Ｌａｇｕｎａ  Ｈｉｌｌｓ，ＣＡから入手）と共にＡｂｂｏｔｔダイアフィルトレーション系（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬ）を使用して、遊離反応物を洗い落とした。Ｍａｂコート化微粒子に、１０ｍＭ  ＰＢＳおよび５％  ＢＳＡ、０．０３％  アジ化ナトリウムを含有するバッファーをローテーター上で室温で１時間にわたり上塗り（オーバーコーティング）した。Ｍａｂコート化ＣＭＬ微粒子を、４５℃のオーブンインキュベーター中で２０時間にわたり熱ストレスに付し、ついでＡｂｂｏｔｔ  Ｐｒｉｓｍ  Ｓｔａｎｄ−ａｌｏｎｅ装置（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬ）により試験した。
【実施例１０】
【００９７】
アクリジニウム標識抗体コンジュゲートの製造
ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の抗ＨＩＶコアＭａｂをアクリジニウム−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＡＣＲ−ＮＨＳ）活性エステルと、エンド・オーバー・エンド・ローテーター（Ｃｏｌｅ  Ｐａｒｍｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｖｅｒｎｏｎ  Ｈｉｌｌｓ，ＩＬ）上、Ｍａｂ：ＡＣＲ−ＮＨＳ＝１：１５のモル比で室温で１０分間反応させた。１％  ＣＨＡＰＳを含有するＰＢＳ（ｐＨ６．３）中で予め平衡化されたＧ−２５セファデックスカラム（１５ｃｍ×１．５ｃｍ）により、ＡＣＲ標識Ｍａｂコンジュゲートを遊離反応体から分離した。ＡＣＲ標識Ｍａｂの溶出ピークを、分光光度計（Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＵＶ−２１０１ＰＣ）を使用して２８０ｎｍでの以下の吸光度によりモニターした。ＡＣＲ標識ｍＡｂタンパク質の濃度＝（ＯＤ２８０ｍｍ−０．２４７×ＯＤ３７０ｍｍ）／１．３８。ＡＣＲ／ｍＡｂのモル比（率）＝［ＯＤ３７０ｍｍ／（ＯＤ２８０ｍｍ−０．２４７×ＯＤ３７０ｍｍ）］×１５。
【実施例１１】
【００９８】
プリズムイムノアッセイ法および調製
抗ｐ２４  ｍＡｂ−微粒子（濃縮ストック）をｕＰａｒｔｉｃｌｅ希釈剤（５％  子ウシ血清、７．５％  スクロース、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０および０．１％  プロクリン（ｐｒｏｃｌｉｎ）を含有する１０ｍＭ  ＰＢＳ，ｐＨ６．５）中で希釈した。抗ｐ２４  ｍＡｂ−ＡＣＲコンジュゲートをコンジュゲート希釈剤（４０ｍＭ  ＥＤＴＡ、５％  子ウシ血清、０．５％  Ｔｒｉｔｏｎおよび０．１％  プロクリンを含有する１０ｍＭ  ＰＢＳ，ｐＨ６．３）中で希釈した。２つの洗浄バッファーを該アッセイにおいて使用した。トランスファー洗浄バッファーは、２５ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ５．７）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、４％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１％  Ｔｗｅｅｎ２０、０．００１％  ＰＥＧ、０．１％  プロクリンおよび０．００１％  消泡剤を含有していた。コンジュゲート洗浄バッファーは、１０ｍＭ  ＣＡＰＳ（ｐＨ９．９）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．１％  プロクリンおよび０．００１％  消泡剤を含有していた。ＨＩＶ−１  ｐ２４−Ｍ、ｒｐ２４−Ｏ、ＨＩＶ−２  ｒｐ２６およびＨＩＶ−２ウイルスライセートをＨＩＶ−１／２陰性ヒト血漿中で希釈した。また、陰性対照として正常ヒト血漿を使用した。
アッセイ方法：
簡単に説明すると、該装置を始動させる前に、すべての試薬を室温に加温した。トランスファー洗浄バッファー、コンジュゲート洗浄バッファー、抗ｐ２４  ｍＡｂ−ＡＣＲコンジュゲートおよび活性化剤を適当な試薬ラインに接続した。該試薬を２回予備注入し、該試薬ライン中に捕捉されている空泡があればそれを叩き出した。１００ｕｌのサンプルおよび５０ｕｌの試料希釈剤（２５ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ６．５）、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．４％  Ｔｗｅｅｎ２０、２０ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．１％  プロクリン）をサンプルトレイのチャンネルＡおよびＢ反応ウェルに手動で加えた。該トレイを該装置上にローディングし、該アッセイ工程中に該チャンネルを介して絶えず移動させた。該サンプルトレイが該微粒子ステーションに移動した際に、５０ｕｌの抗ｐ２４  ｍＡｂコート化微粒子を各反応ウェルに加えた。該アッセイ工程の残りは、該装置により自動的に行った。該装置のチャンネル温度は３７℃に維持した。３７℃で１８分間のインキュベーションの後、該サンプルトレイを該トランスファー洗浄ステーションに移動させた。サンプルとｕＰｒｔｉｃｌｅｓとの混合物をトランスファーバッファーによりガラス繊維マトリックス上にフラッシュし、トランスファーバッファーで２回洗浄した。５０ｕｌの抗ｐ２４  ｍＡｂ−ＡＣＲコンジュゲートを該ガラス繊維マトリックス上に加えた。２０分間のインキュベーションの後、該サンプルトレイを該コンジュゲート洗浄ステーションに移動させた。未結合コンジュゲートをコンジュゲート洗浄バッファーにより洗い落とした。該コンジュゲート洗浄の後、該サンプルトレイを該活性化剤ステーションに移動させた。５０ｕｌの活性化剤（過酸化水素と水酸化ナトリウムとの混合物）を該マトリックスに適用した。化学発光シグナルを光電子増倍管検出器により測定した。
【実施例１２】
【００９９】
２つのモノクローナル抗体を使用するＨＩＶコアタンパク質（抗原）の同等検出
高親和性モノクローナル抗体の適合性ペアを使用して、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐｒｉｓｍ独立型（ｓｔａｎｄａｌｏｎｅ）装置（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬ）上での２工程化学発光「サンドイッチ」イムノアッセイの実施において、同等な定量的コア抗原感度が示された。１２０Ａ−２７０−１０８でコーティングされた微粒子（０．０６６％  固体）を６０ｎｇ／ｍｌの１１５Ｂ−１５１−４２３−ＡＣＲコンジュゲートと組合せることにより、ＨＩＶ−１  Ｍ群、ＨＩＶ−１  Ｏ群およびＨＩＶ−２コアタンパク質の同等な検出が達成された。ＨＩＶ−１  Ｍ群ｐ２４の検出下限は０．３ｐｇ／ｍｌ（図６）、ＨＩＶ−１  Ｏ群ｒｐ２４については０．３ｐｇ／ｍｌ（図７）、およびＨＩＶ−２  ｒｐ２６については１．０ｐｇ／ｍｌ（図８）と推定された。ＨＩＶ−１とＨＩＶ−２との間では定量的感度における僅かな相違（３．３倍）が検出されたに過ぎなかった。関連しているが同一ではない３つのコア抗原間の同等の感度は、これらのモノクローナル抗体の異常に高いＫｅｑが共有エピトープに対するものであり交差反応性エピトープに対するものではないことを強く示している。コア抗原（ＨＩＶ−１  Ｍ、ＯおよびＨＩＶ−２）に対するこれらのＭａｂの親和性はほぼ等しいはずである。なぜなら、全３個のコア抗原に対する結合速度論はほぼ同等であるからである。一般に、Ｍａｂが交差反応性エピトープと反応するとＫｅｑは減少する。これは、定量的感度が、交差反応性抗原に対しては、天然（免疫原）抗原に対する場合より顕著に低いことにより示される。さらに、この場合に関連しているＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２コアタンパク質の定量の間の僅かな相違は、該研究のために該タンパク質を定量するために用いた方法および（該方法に基づく誤差）に、より関連している可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１Ａ】図１ａは、ＨＩＶ−１  Ｍ群およびＨＩＶ−１  Ｏ群からのｐ２４のアミノ酸配列アライメントを例示する。Ｍ群  ｐ２４の構造から決定された構造的特徴（例えば、ヘリックス（ｈｅｌｉｘ）Ａ〜Ｊ）が該配列アライメントの上に示されている。マッピング研究のための合成Ｍ群およびＯ群ｐ２４ペプチドは、それぞれＭまたはＯ群の配列および番号付けに従い設計し標識した。
【図１Ｂ】図１ｂは、ＨＩＶ−１  Ｍ群、ＨＩＶ−１  Ｏ群からのｐ２４およびＨＩＶ−２  ｐ２６のアミノ酸配列アライメントを例示する。
【図２Ａ−１】図２Ａ−１は、ｐ２４合成ペプチドへのモノクローナル抗体１０３−３５０、１１７−２８９，１１５−３０３、１２０Ａ−２７０および１１５Ｂ−１５１の結合を例示する。
【図２Ａ−２】図２Ａ−２は、ｐ２４合成ペプチドへのモノクローナル抗体１０３−３５０、１１７−２８９，１１５−３０３、１２０Ａ−２７０および１１５Ｂ−１５１の結合を例示する。
【図２Ａ−３】図２Ａ−３は、ｐ２４合成ペプチドへのモノクローナル抗体１０３−３５０、１１７−２８９，１１５−３０３、１２０Ａ−２７０および１１５Ｂ−１５１の結合を例示する。
【図２Ａ−４】図２Ａ−４は、ｐ２４合成ペプチドへのモノクローナル抗体１０３−３５０、１１７−２８９，１１５−３０３、１２０Ａ−２７０および１１５Ｂ−１５１の結合を例示する。
【図２Ｂ−１】図２Ｂ−１は、ｐ２４合成ペプチドへのモノクローナル抗体１０３−３５０、１１７−２８９，１１５−３０３、１２０Ａ−２７０および１１５Ｂ−１５１の結合を例示する。
【図２Ｂ−２】図２Ｂ−２は、ｐ２４合成ペプチドへのモノクローナル抗体１０３−３５０、１１７−２８９，１１５−３０３、１２０Ａ−２７０および１１５Ｂ−１５１の結合を例示する。
【図２Ｂ−３】図２Ｂ−３は、ｐ２４合成ペプチドへのモノクローナル抗体１０３−３５０、１１７−２８９，１１５−３０３、１２０Ａ−２７０および１１５Ｂ−１５１の結合を例示する。
【図２Ｂ−４】図２Ｂ−４は、ｐ２４合成ペプチドへのモノクローナル抗体１０３−３５０、１１７−２８９，１１５−３０３、１２０Ａ−２７０および１１５Ｂ−１５１の結合を例示する。
【図２Ｂ−５】図２Ｂ−５は、ｐ２４合成ペプチドへのモノクローナル抗体１０３−３５０、１１７−２８９，１１５−３０３、１２０Ａ−２７０および１１５Ｂ−１５１の結合を例示する。
【図３】図３は、ＨＩＶ−１  ＭおよびＯ群のｐ２４から誘導された欠失クローンの位置を例示する。
【図４Ａ】図４Ａは、ｐ２４の領域へのモノクローナル抗体１１５Ｂ−１５１および１０８−３９４の結合をマッピングするために使用したウエスタンブロットの結果を例示する。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ｐ２４の領域へのモノクローナル抗体１１５Ｂ−１５１および１０８−３９４の結合をマッピングするために使用したウエスタンブロットの結果を例示する。
【図５】図５は、ｐ２４モノクローナル抗体により認識されるＨＩＶ−１  ｐ２４エピトープを要約する。
【図６】図６は、固相上で１２０Ａ−２７０を及び液相中で１１５Ｂ−１５１を使用して得られたＨＩＶ−１  Ｍ群ｐ２４の定量的感度を例示する。
【図７】図７は、固相上で１２０Ａ−２７０を及び液相中で１１５Ｂ−１５１を使用して得られたＨＩＶ−１  Ｏ群ｐ２４の定量的感度を例示する。
【図８】図７は、固相上で１２０Ａ−２７０を及び液相中で１１５Ｂ−１５１を使用して得られたＨＩＶ−２  ｐ２６の定量的感度を例示する。
【配列表】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ−１】
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【図２Ａ−２】
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【図２Ａ−３】
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【図２Ａ−４】
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【図２Ｂ−１】
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【図２Ｂ−２】
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【図２Ｂ−３】
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【図２Ｂ−４】
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【図２Ｂ−５】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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