(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫原性フラビウイルス抗原の転写単位を含む核酸分子であって、ここで、該転写単位は、宿主細胞に取り込まれた後に、該宿主細胞に該免疫原性抗原の合成を指向し；
該免疫原性フラビウイルス抗原は、Ｍタンパク質およびＥタンパク質の両方であり；
該転写単位がＫ−ｐｒ−Ｍ−Ｅの構造を有する、核酸分子であって、
ここでＫは、ＧＣＣＧＣＣＧＣＣからなるコンセンサスＫｏｚａｋリボソーム結合配列であり；
ｐｒ−Ｍは、プレＭ配列を含むＭタンパク質をコードする配列であり；
Ｅは、Ｅタンパク質をコードする配列である、
核酸分子。
【請求項２】
前記フラビウイルスが、黄熱病ウイルス、デング熱１型ウイルス、デング熱２型ウイルス、デング熱３型ウイルス、デング熱４型ウイルス、および日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）からなる群より選択される、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
ＤＮＡ分子である、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項４】
前記転写単位が、適切に配置された制御配列をさらに含み、この結果、該制御配列がＭ抗原およびＥ抗原の発現を作動可能に制御する、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項５】
前記制御配列が、サイトメガロウイルス最初期プロモーターである、請求項４に記載の核酸分子。
【請求項６】
前記転写単位が、ポリＡターミネーターをさらに含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項７】
免疫原性フラビウイルス抗原の転写単位を含む核酸分子を保持する宿主細胞であって、ここで、該転写単位は、該宿主細胞に該免疫原性抗原の合成を指向し；
該免疫原性フラビウイルス抗原は、Ｍタンパク質およびＥタンパク質の両方であり；
該転写単位がＫ−ｐｒ−Ｍ−Ｅの構造を有する、宿主細胞であって、
ここでＫは、ＧＣＣＧＣＣＧＣＣからなるコンセンサスＫｏｚａｋリボソーム結合配列であり；
ｐｒ−Ｍは、プレＭ配列を含むＭタンパク質をコードする配列であり；
Ｅは、Ｅタンパク質をコードする配列である、
宿主細胞。
【請求項８】
前記フラビウイルスが、黄熱病ウイルス、デング熱１型ウイルス、デング熱２型ウイルス、デング熱３型ウイルス、デング熱４型ウイルス、およびＪＥＶからなる群より選択される、請求項７に記載の宿主細胞。
【請求項９】
フラビウイルスの免疫原性抗原の転写単位を含む核酸分子を含む、該フラビウイルスに対して被験体をワクチン接種するための組成物であって、ここで、該転写単位は、該被験体の体内の細胞に取り込まれた後、該細胞に該免疫原性抗原の合成を指向し、かつここで、該組成物はさらに薬学的に受容可能なキャリアを含み；
該フラビウイルスの該免疫原性抗原は、Ｍタンパク質およびＥタンパク質の両方であり；
該転写単位がＫ−ｐｒ−Ｍ−Ｅの構造を有する、組成物であって、
ここでＫは、ＧＣＣＧＣＣＧＣＣからなるコンセンサスＫｏｚａｋリボソーム結合配列であり；
ｐｒ−Ｍは、プレＭ配列を含むＭタンパク質をコードする配列であり；
Ｅは、Ｅタンパク質をコードする配列である、
組成物。
【請求項１０】
前記フラビウイルスが、黄熱病ウイルス、デング熱１型ウイルス、デング熱２型ウイルス、デング熱３型ウイルス、デング熱４型ウイルス、およびＪＥＶからなる群より選択される、請求項９に記載のワクチン接種組成物。
【請求項１１】
前記核酸分子がＤＮＡ分子である、請求項９に記載のワクチン接種組成物。
【請求項１２】
前記転写単位が、適切に配置された制御配列をさらに含み、この結果、前記核酸が前記被験体の前記細胞に導入された場合、該制御配列がＭ抗原およびＥ抗原の発現を作動可能に制御する、請求項９に記載のワクチン接種組成物。
【請求項１３】
前記制御配列が、サイトメガロウイルス最初期プロモーターである、請求項１２に記載のワクチン接種組成物。
【請求項１４】
前記転写単位が、ポリＡターミネーターをさらに含む、請求項９に記載のワクチン接種組成物。
【請求項１５】
フラビウイルスによる感染に対して被験体を免疫するための組成物であって、免疫原性フラビウイルス抗原の転写単位を含む核酸分子を含む、ワクチン接種組成物であり、ここで、該転写単位は、該被験体の体内の細胞に取り込まれた後、該細胞に該免疫原性抗原の合成を指向し、かつここで、該組成物はさらに薬学的に受容可能なキャリアを含み；
該免疫原性フラビウイルス抗原は、Ｍタンパク質およびＥタンパク質の両方であり；
該転写単位がＫ−ｐｒ−Ｍ−Ｅの構造を有する、組成物であって、
ここでＫは、ＧＣＣＧＣＣＧＣＣからなるコンセンサスＫｏｚａｋリボソーム結合配列であり；
ｐｒ−Ｍは、プレＭ配列を含むＭタンパク質をコードする配列であり；
Ｅは、Ｅタンパク質をコードする配列である、
、組成物。
【請求項１６】
前記フラビウイルスが、黄熱病ウイルス、デング熱１型ウイルス、デング熱２型ウイルス、デング熱３型ウイルス、デング熱４型ウイルス、およびＪＥＶからなる群より選択される、請求項１５に記載の被験体を免疫化するための組成物。
【請求項１７】
前記ワクチン接種組成物が単回用量で被験体に投与するに適切に処方される、請求項１５に記載の被験体を免疫化するための組成物。
【請求項１８】
非経口経路での投与のための組成物である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１９】
前記核酸分子がＤＮＡ分子である、請求項１５に記載の被験体を免疫するための組成物。
【請求項２０】
前記転写単位が、適切に配置された制御配列をさらに含み、この結果、該制御配列がＭ抗原およびＥ抗原の発現を作動可能に制御する、請求項１５に記載の被験体を免疫するための組成物。
【請求項２１】
前記制御配列が、サイトメガロウイルス最初期プロモーターである、請求項２０に記載の被験体を免疫するための組成物。
【請求項２２】
前記転写単位が、ポリＡターミネーターをさらに含む、請求項１５に記載の被験体を免疫するための組成物。
【請求項２３】
前記フラビウイルスが、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ脳炎ウイルスである、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項２４】
前記フラビウイルスが、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ脳炎ウイルスである、請求項７に記載の核酸前駆体を保持する宿主細胞。
【請求項２５】
前記フラビウイルスが、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ脳炎ウイルスである、請求項９に記載のワクチン接種組成物。
【請求項２６】
前記フラビウイルスが、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ脳炎ウイルスである、請求項１５に記載のフラビウイルスによる感染に対して被験体を免疫するための組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、フラビウイルスに対する新規なワクチンに関する。特に、このワクチンは、フラビウイルス（例えば、日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ））の構造タンパク質の遺伝子を含む組換え核酸である。これらのワクチンは、インビボで投与された場合、ウイルスタンパク質抗原の生合成のための転写単位として機能する。
【０００２】
（発明の背景）
フラビウイルスは、フラビウイルス属のメンバーであり、これは、フラビウイルス科内に分類される。フラビウイルスは、ヒトおよび他の哺乳動物に対して非常に病原性である。ヒトに疾患を与えるフラビウイルスとしては、黄熱病ウイルス、ＪＥＶ、デング熱ウイルス（４つの血清型、デング熱−１、デング熱−２、デング熱−３およびデング熱−４を含む）、ダニ媒介脳炎ウイルス、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ脳炎ウイルス（ＳＬＥＶ）などが挙げられる。全体で、約７０種が現在同定されている（Ｋｕｎｏら、Ｊ．ｏｆ  Ｖｉｒｏｌ．７２：７３−８３（１９９８））。
【０００３】
フラビウイルスは、一般に以下の３つの構造タンパク質を含む：Ｍ、マトリックスまたは膜タンパク質；Ｅ、エンベロープタンパク質；およびＣ、カプシドタンパク質（Ｍｏｎａｔｈ、「Ｖｉｒｏｌｏｇｙ」（Ｆｉｅｌｄｓ編）、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９０，７６３−８１４頁：ＨｅｉｎｚおよびＲｏｅｈｒｉｇ、「Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｖｉｒｕｓｅｓ  ＩＩ：Ｔｈｅ  Ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  Ｓｅｒｏｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ」（ｖａｎ  ＲｅｇｅｎｍｏｒｔｅｌおよびＮｅｕｒａｔｈ編）、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９９０、２８９−３０５頁）。Ｍは、約７〜８ｋＤａの分子量（ＭＷ）を有し；そしてＥは約５５〜６０ｋＤａのＭＷを有する。Ｍは、ｐｒＭと呼ばれる、より大きな前駆体として合成される。ｐｒＭのさらなる部分は、成熟ビリオンの分泌前に、宿主細胞中でプロセシングされＭを形成する。ＭおよびＥは、フラビウイルス粒子の膜またはエンベロープ中に見出され、そしてウイルスの重要な免疫原性成分を構成すると長く考えられてきた。
【０００４】
フラビウイルスは、ＲＮＡウイルスであり、その一本鎖ＲＮＡは、種々の種の間で、約１０ｋｂの長さを有する。Ｃタンパク質（そのＭＷは、１２〜１４ｋＤａである）は、ＲＮＡと複合体化して、ヌクレオカプシド複合体を形成する。いくつかの非構造タンパク質もまた、ＲＮＡゲノム中にコードされ；これらは、ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４ＢおよびＮＳ５と呼ばれる。ゲノムは、ポリタンパク質として宿主細胞内で翻訳され、次いで、翻訳と同時に、または翻訳後にウイルス特異的プロテアーゼまたは宿主特異的プロテアーゼによって個々の遺伝子産物にプロセシングされる（図１）。
【０００５】
米国特許第５，４９４，６７１号に要約されるように、いくつかのフラビウイルスのゲノムのヌクレオチド配列は、公知である。ＪＥＶヌクレオチド配列は、Ｓｕｍｉｙｏｓｈｉら（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １６１：４９７−５１０（１９８７））およびＨａｓｈｉｍｏｔｏら（Ｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅｓ  １，３０５−３１７（１９８８））によって提供される。ＪＥＶの毒性株ＳＡ−１４および中華人民共和国でワクチンとして使用される弱毒化株ＳＡ−１４−１４−２のヌクレオチド配列は、Ｎｉｔａｙａｐｈａｎらの研究において比較されている（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７７：５４１−５５２（１９９０））。
【０００６】
他のフラビウイルス種の構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列もまた公知である。多くの場合において、完全ゲノムの配列が報告されている。利用可能な配列としては、デング熱１型ウイルス（Ｍａｓｏｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １６１：２６２−２６７（１９８７））。デング熱２型ウイルス（Ｄｅｕｂｅｌら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １５５：３６５−３７７（１９８６）；Ｇｒｕｅｎｂｅｒｇら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６９，１３９１−１３９８（１９８８）；Ｈａｈｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １６２，１６７−１８０（１９８８））、デング熱３型ウイルス（Ｏｓａｔｉｍｉら、Ｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅｓ  ２：９−１０８（１９８８））、デング熱４型ウイルス（Ｍａｃｋｏｗら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １５９：２１７−２２８（１９８７）；Ｚｈａｏら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １５５，７７−８８（１９８６））、および黄熱病ウイルス（ＹＦＶ）（Ｒｉｃｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９，７２６−７３３（１９８５））が挙げられる。
【０００７】
ＪＥＶを含む、多くのフラビウイルスは、蚊によってヒトおよび他の宿主動物に伝播される。従って、これらは、広範な領域にわたって発生し、そしてこれらの伝播は、容易に妨害または防御されない。ＪＥＶは、成体および小児に感染し、そして熱帯および亜熱帯アジア地域において、幼児、小児、および高齢者の間で高い死亡率を引き起こす（Ｔｓａｉら、「Ｖａｃｃｉｎｅｓ」（Ｐｌｏｔｋｉｎ編）Ｗ．Ｂ．Ｓａｎｄｅｒｓ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ，１９９４、６７１−７１３頁）。生存者の間では、感染後に持続する、脳炎の症状に関連する、深刻な神経学上の結果が存在する。この地域の先進国（例えば、日本、中国、および韓国）において、不活性化ＪＥＶのワクチンの使用によって、ＪＥＶは非常に制御されている。にもかかわらず、この地域の他の国々においては、ＪＥＶは依然流行している。
【０００８】
デング熱ウイルスもまた、蚊媒介性であり、熱帯および亜熱帯気候の地域で全体的に生じる。症状としては、熱、発疹、重篤な頭痛および関節痛が挙げられるが、デング熱からの死亡率は低い。デング熱ウイルスの蔓延は、非常に頻繁に、そして広範であるため、この疾患は主要な公衆衛生上の問題である。にもかかわらず、デング熱に対して予防するための安全かつ効果的なワクチンは、数十年の努力にもかかわらず、利用可能でない。従って、デング熱に対するワクチンの強い必要性が存在する。
【０００９】
黄熱病は、南アメリカおよびサハラ砂漠以南のアフリカの熱帯地域で流行し、そして蚊によって伝播される。感染によって、黄疸を伴う、熱、悪寒、重篤な頭痛および他の痛み、食欲不振、悪心および嘔吐が生じる。生きたウイルスワクチンである１７Ｄ（ニワトリ胚において増殖される）は、安全かつ効果的であると考えられる。にもかかわらず、穏やかな症状およびウイルス血症のその付随的発生を伴う生きたウイルスを投与の必要性を回避するワクチンの必要性が残存する。
【００１０】
ＪＥＶに対する使用のために利用可能なワクチンとして、ホルマリン処理のような方法によって不活性化された生きたウイルス、および弱毒化ウイルスが挙げられる（Ｔｓａｉら）。全体的にウイルスワクチンは、効果的であるが、特定の問題および／または不利益を有する。ウイルスは、マウス脳または哺乳動物細胞を宿主として使用する細胞培養物中で培養される。このような培養方法は、煩雑であり、かつ高価である。さらに、ワクチンレシピエントにおける意図および所望しないアレルギー応答を潜在的に導く、宿主細胞（すなわち、脳または他の宿主）由来の抗原の最終ワクチン産物内への取り込みの付随性の危険性が存在する。ワクチン生産に関与する労働者の間での不注意な感染の危険性もまた存在する。最後に、ウイルスが、十分または完全に不活性化あるいは弱毒化され得ず、従って、ワクチンが実際に疾患を引き起こし得る危険性が存在する。
【００１１】
２つのフラビウイルス間のキメラである組換えフラビウイルスは、ＷＯ９３／０６２１４に開示される。このキメラは、ある「型」または血清型のデング熱ウイルスあるいはフラビウイルス由来の非構造タンパク質と、異なる「型」または血清型のデング熱ウイルスあるいは別のフラビウイルス由来の構造タンパク質とを融合している構築物である。第２のフラビウイルスは、ＪＥＶであり得る。
【００１２】
最近、いくつかの組換えサブユニットおよびウイルスワクチンが考案されている。米国特許第４，８１０，４９２号は、ワクチンにおける抗原としての使用のためにＪＥＶのＥ糖タンパク質の産生を記載する。対応するＤＮＡが、Ｅ．ｃｏｌｉ、酵母のような適切な宿主細胞、またはより高等な生物の細胞培養で抗原タンパク質を発現するために、発現系中にクローン化されている。米国特許第５，２２９，２９３号は、ＪＥＶ  Ｅタンパク質遺伝子を保持する組換えバキュロウイルスを開示する。このウイルスは、このＥタンパク質が、ワクチンとしての使用のために産生および回収されるように、培養中の昆虫細胞を感染するために用いられる。
【００１３】
米国特許第５，０２１，３４７号は、そのゲノム中にＪＥＶ  Ｅタンパク質遺伝子が取り込まれた組換えワクシニアウイルスを開示する。生きた組換えワクチンウイルスは、ＪＥＶに対して免疫化するためのワクチンとして用いられる。このウイルスが、デング熱２型、デング熱４型、およびＪＥＶのＥタンパク質のＣ末端短縮型の遺伝子を取り込んだ組換えワクシニアウイルスおよび組換えバキュロウイルスは、米国特許第５，４９４，６７１号に開示されている。米国特許第５，５１４，３７５号は、ｐｒＭからＮＳ２Ｂまで延びるＪＥＶオープンリーディングフレームの部分を発現する種々の組換えワクシニアウイルスを開示する。これらのポックスウイルスは、プロセッシクングされたＭタンパク質およびＥタンパク質を含む細胞外粒子の形成を誘導した。これらのＪＥＶタンパク質をコードする２つの組換え体は、マウスにおいて、高力価の中和抗体および赤血球凝集素阻害抗体、および保護免疫を産生した。これらの効果の程度は、１回のみの後よりも２回の免疫化処理の後で大きかった。ＪＥＶタンパク質ＭおよびＥタンパク質の遺伝子を含む組換えワクシニアウイルスは、マウスに投与されたとき、保護免疫を与えた（Ｋｏｎｉｓｈｉら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １８０：４０１〜４１０（１９９１））。ＪＥＶからのｐｒＭおよびＥの遺伝子を保持する組換えワクシニアウイルスで感染したＨｅＬａ細胞は、サブウイルス（ｓｕｂｖｉｒａｌ）粒子を産生することが示された（Ｋｏｈｉｓｈｉら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １８８：７１４〜７２０（１９９２））。Ｄｍｉｔｒｉｅｖらは、ダニ媒介脳炎ウイルスからの構造タンパク質および特定の非構造的タンパク質をコードする組換えワクシニアウイルスを用いるマウスの免疫化を報告する（Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４４：９７〜１０３（１９９６））。
【００１４】
組換えウイルスベクターがまた、デング熱のためのウイルスワクチンとして供するために調製された。Ｚｈａｏら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１、４０１９〜４０２２（１９８７））は、デング熱４型からの構造タンパク質およびＮＳ１を保持する組換えワクシニアウイルスを調製し、そしてこの組換え体で哺乳動物細胞を感染した後発現を達成した。同様の発現が、標的昆虫細胞を感染する組換えバキュロウイルスを用いて得られた（Ｚｈａｎｇら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２、３０２７〜３０３１（１９８８））。Ｂｒａｙら（Ｊ．Ｖｉｏｒｌ．６３、２８５３〜２８５６（１９８９））はまた、デング熱脳炎発症のために抗原投与されるとき、マウスに対して保護免疫を与えるＥタンパク質遺伝子を基にした組換えワクシニアデング熱ワクチンを報告する。Ｆａｌｇｏｕｔら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ６３、１８５２〜１８６０（１９８９））およびＦａｌｇｏｕｔら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４、４３５６〜４３６３（１９９０）は、同様の結果を報告する。Ｚｈａｎｇら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ６２、３０２７〜３０３１（１９８８））は、デング熱ＥおよびＮＳ１タンパク質をコードする組換えバキュロウイルスが同様に、抗原投与されるとき、デング熱脳炎に対してマウスを保護し得ることを示した。構造遺伝子および非構造遺伝子が、組換えウイルスワクチン中に取り込まれるその他の組み合わせは、有意な免疫を産生しない（Ｂｒａｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３、２８５３〜２８５６（１９８９））。また、サルは、Ｅタンパク質を発現する組換えバキュロウイルスで免疫されたとき、デング熱ウイルス抗原投与に対する完全保護免疫を発生しなかった（Ｌａｉら（１９９０）１１９〜１２４頁、Ｆ．Ｂｒｏｗｎ、Ｒ．Ｍ．Ｃｈａｎｃｏｃｋ、Ｈ．Ｓ．ＧｉｎｓｂｅｒｇおよびＲ．Ｌｅｒｎｅｒ（編）「Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ９０：Ｍｏｄｅｒｎ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｎｅｗ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ＡＩＤＳ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）。
【００１５】
組換えＤＮＡ調製物を用いる免疫化が、離乳マウスをモデルとして用い、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ脳炎ウイルス（ＳＬＥＶ）およびデング熱２ウイルスについて報告されている（Ｐｈｉｌｌｐｏｔｔｓら、Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１４１：７４３〜７４９（１９９６）；Ｋｏｃｈｅｌら、Ｖａｃｃｉｎｅ  １５：５４７〜５５２（１９９７））。ＳＬＥＶのｐｒＭおよびＥ遺伝子をコードするプラスミドＤＮＡは、ＤＮＡ免疫化の単一または２回用量でのＳＬＥＶ抗原投与に対して部分的保護を提供した。これらの実験では、コントロールマウスは、約２５％の生存を示し、そしてＤＮＡ免疫化マウスでは保護抗体は検出されなかった（Ｐｈｉｌｌｐｏｔｔｓら）。ｐｒＭを含む組換えデング熱２プラスミドＤＮＡの３回の皮内注射を受けたマウスでは、１００％が抗デング熱２中和抗体を発生し、そして対応するＥ遺伝子を受けたマウスの９２％が同様に中和抗体を発生した（Ｋｏｃｈｅｌら）。２回用量スケジュールを用いる抗原投与実験は、しかし、致死的なデング熱２ウイルス抗原投与に対してマウスを保護しなかった。
【００１６】
ＪＥＶに対する免疫化のために現在まで開発されたワクチンは、それらの使用にともなう多くの欠点および問題を有している。不活性化ウイルスワクチンはコスト高であり、そして調製が不便である。さらに、それは、このウイルスの調製に用いた宿主のタンパク質に由来するアレルギー反応のリスクを持っている。さらに、それは、それらの生産に雇われる労働者にかなりのリスクを提示する。候補の弱毒化ＪＥＶワクチンは、臨床試験を受けたが、１９９６年の時点では、中華人民共和国の外では広く承認は見出されていない（Ｈｅｎｎｅｓｓｙら、Ｌａｎｃｅｔ  ３４７：１５８３〜１５８６（１９９６））。ＪＥＶゲノムの特定のタンパク質のみの生合成発現に基づく組換えワクチンは、高い抗体力価を誘導しないようであり、そして、全ウイルス調製物のように、場合によっては、宿主生物からの抗原に対する、またはワクシニアウイルスベクターに対する有害なアレルギー反応のリスクを持つ。同様の問題がＹＦＶに対するワクチンの調製にともなう。デング熱に対するワクチン開発は、より進行しておらず、そしてこのようなウイルスを基礎にするか、まは組換えタンパク質を基礎にするワクチンは、まさに暗示されたような問題と同様の問題に直面する。
【００１７】
したがって、調製することが安価で、それらの製造に関与する労働者にリスクをほとんど提示せず、不純物または外来の免疫原性成分に起因する有害な免疫学的反応のリスクが最小であり、そして中和抗体および保護免疫を惹起することに高度に有効である、黄熱病、デング熱、ＪＥＶおよびＳＬＥＶのようなフラビウイルスに対するワクチンの必要性が存在する。さらに、必要な免疫する用量の数を最小にする、ＪＥＶおよび関連するフラビウイルスに対するワクチンの必要性が存在する。
【００１８】
（発明の要旨）
本発明は、免疫原性フラビウイルス抗原の転写単位（ＴＵ）を含む核酸分子を提供する。このＴＵは、細胞内に取りこまれた後、この抗原を合成するように宿主細胞を指向させる。本発明の重要な局面では、このフラビウイルスは、黄熱病ウイルス（ＹＦＶ）、デング熱１型ウイルス、デング熱２型ウイルス、デング熱３型ウイルス、デング熱４型ウイルス、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ脳炎ウイルス（ＳＬＥＶ）、または日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）のいずれかである。本発明の重要な実施態様では、この抗原は、フラビウイルスＭタンパク質、Ｅタンパク質、またはその両方であり得る。特に、このＴＵがＭタンパク質およびＥタンパク質の両方のためであるとき、宿主細胞は、Ｍ抗原およびＥ抗原を含むサブウイルス粒子を分泌する。本発明のさらなる重要な局面は、この核酸はＤＮＡ分子である。さらに重要な実施態様では、この核酸ＴＵは、これがＭ抗原およびＥ抗原の発現を作動可能に制御するように適切に配置される制御配列を含む；この制御配列は、有利には、サイトメガロウイルス前初期プロモーターであり得る。さらなる実施態様では、この転写単位はまた、ポリＡターミネーターを含む。
【００１９】
本発明は、宿主細胞を免疫原性抗原を合成するように指向させる免疫原性フラビウイルス抗原の転写単位を含む核酸分子を持つ宿主細胞をさらに提供する。このフラビウイルスは、ＹＦＶ、デング熱１型ウイルス、デング熱２型ウイルス、デング熱３型ウイルス、デング熱４型ウイルス、ＳＬＥＶ、またはＪＥＶであり得る。重要な実施態様では、この抗原は、Ｍタンパク質、Ｅタンパク質、またはＭタンパク質およびＥタンパク質の両方であり得る；後者の場合、細胞は、Ｍ抗原およびＥ抗原を含むサブウイルス粒子を分泌する。
【００２０】
さらに、本発明は、フラビウイルスに対して被験体をワクチン接種するための組成物を提供し、この組成物は、免疫原性フラビウイルス抗原の転写単位を含む核酸分子を含む。この転写単位は、被験体の身体内の細胞を、その中に取り込まれた後、免疫原性抗原を合成するように指向させる。この組成物は、薬学的に受容可能なキャリアをさらに包含する。重要な実施態様では、このフラビウイルスは、黄熱病ウイルス、デング熱１型ウイルス、デング熱２型ウイルス、デング熱３型ウイルス、デング熱４型ウイルス、ＳＬＥＶ、またはＪＥＶであり得る。さらに、この抗原は、Ｍタンパク質、Ｅタンパク質、またはＭタンパク質およびＥタンパク質の両方であり得；後者の場合には、細胞は、フラビウイルスＭ抗原およびＥ抗原を含むサブウイルス粒子を分泌する。重要な実施態様では、核酸分子はＤＮＡ分子である。さらなる重要な実施態様では、転写単位は、それが、この核酸が被験体の細胞中に導入されるときＭ抗原およびＥ抗原の発現を作動可能に制御するように、適切に配置された制御配列をさらに含む；有利には、この制御配列はサイトメガロウイルス前初期プロモーターである。なおさらなる実施態様では、転写単位はまた、ポリＡターミネーターを含む。
【００２１】
本発明は、なお、さらに、フラビウイルスによる感染に対して被験体を免疫化する方法を提供する。この方法は、被験体に、免疫原性フラビウイルス抗原の転写単位を含む核酸分子を含むワクチン接種組成物の有効量を投与する工程を包含する。この転写単位は、被験体の身体内の細胞により取り込まれた後、この細胞が免疫原性抗原を合成するように指向させる。この組成物は、薬学的に受容可能なキャリアをさらに含む。この方法の重要な実施態様では、フラビウイルスは、黄熱病ウイルス、デング熱１型ウイルス、デング熱２型ウイルス、デング熱３型ウイルス、デング熱４型ウイルス、ＳＬＥＶ、またはＪＥＶであり得る。この方法のなおその他の重要な局面では、抗原は、Ｍタンパク質、Ｅタンパク質、またはＭタンパク質およびＥタンパク質の両方であり得る。抗原が、Ｍタンパク質およびＥタンパク質の両方であるとき、被験体の身体内の細胞は、その中に核酸を取り込んだ後、フラビウイルスＭ抗原およびＥ抗原を含むサブウイルス粒子を分泌する。さらに、この方法の重要な実施態様では、このワクチン化組成物は、単回用量で被験体に投与され、そして非経口的経路を経由して投与される。この方法のなおさらなる局面では、この核酸はＤＮＡ分子である。この方法のなおさらなる実施態様では、この転写単位は、これが、Ｍ抗原およびＥ抗原の発現を作動可能に制御するように適切に配置された制御配列をさらに含む；この実施態様の重要な局面では、この制御配列は、サイトメガロウイルス前初期プロモーターである。さらに、この転写単位は、ポリＡターミネーターをさらに含み得る。
【００２２】
本発明のこれらの局面および実施態様は、その別の属性および利点の基礎である。完全ゲノムを包含する配列よりむしろフラビウイルスゲノムの部分のみを含む核酸構築物であることにより、この核酸ＴＵ含有ワクチンは完全に生育不能である。したがって、それは、その製造に関与するものに対し、そしてこのワクチンを受ける被験体のいずれにもフラビウイルスによる感染の危険を引き起こさない。この核酸ワクチンは、調製することおよび投与することが容易であり、そして使用の前の貯蔵に対して安定である。予期せぬことに、本発明の核酸ワクチンは、単回用量のみの投与後、哺乳動物において保護免疫を付与することにおいて本質的に１００％成功することが見出された。さらなる予期せぬ結果は、この核酸ＴＵが、ミルクを通じてその子孫に移行され得る雌の哺乳動物においてフラビウイルスに対する免疫を発生し得ることである。理論によって制限されることを望むことなく、本発明者らは、保護免疫を与えることにおける核酸の成功の可能な機構は、このワクチンが投与される被験体の細胞のような、核酸を保有する宿主細胞が、フラビウイルスのＭ抗原およびＥ抗原を含む細胞下粒子を産生することであると考える。これらの粒子は、病原性フラビウイルスその自身の免疫原性属性を緊密に模倣し得る。
【００２３】
（発明の詳細な説明）
本発明は、Ｍタンパク質抗原およびＥタンパク質抗原のような、フラビウイルス抗原タンパク質をコードする核酸転写単位を包含する。この核酸は、この核酸が適切な宿主細胞により取り込まれるとき、特にこの宿主細胞が被験体の細胞であるとき、Ｍタンパク質抗原およびＥタンパク質抗原を発現するように機能する。本発明はまた、その活性因子が、核酸転写単位（ＴＵ）であるワクチンを包含する。本発明は、培養宿主細胞がそれらの中に核酸ＴＵを含むとき、培養宿主細胞をさらに包含する。さらに本発明は、被験体に、核酸ＴＵ分子を含む有効量のワクチンを投与することによって、フラビウイルス感染に対して被験体を免疫化する方法を包含する。
【００２４】
本明細書で用いる「核酸転写単位」または「核酸転写単位分子」は、１つ以上の特定の遺伝子をコードする核酸に関する。このＴＵは、適切な宿主細胞中に導入された後、この核酸は、特定の遺伝子（単数または複数）によりコードされる１つ以上の特定の遺伝子産物の生合成を誘導するという生物学的活性を有する。この遺伝子産物（単数または複数）は、このＴＵに化学的に関係しない、タンパク質のようなその他の生物学的高分子である。この核酸ＴＵは、細胞がその細胞成分を採用し、その遺伝子（単数または複数）がこのＴＵ中に含まれる特定の遺伝子産物（単数または複数）を産生するように細胞を誘導する。任意の核酸がＴＵとして供され得るが、好適な実施態様では、このＴＵは、プラスミドまたは類似のベクターであるＤＮＡであり、ここで、このプラスミドまたはベクターは、マーカー遺伝子のコード配列またはこのＴＵの実験および生合成を促進するその他の配列構築物をさらに包含する。
【００２５】
本明細書で用いる「制御配列」は、核酸ＴＵ内に取り込まれる調節ヌクレオチド配列であり、宿主細胞の適切な細胞成分と相互作用し、そしてこのＴＵによりコードされる遺伝子産物の増大したか、または活性化された生合成を導く。したがって、適切な制御配列は、それとともに、宿主細胞の成分が相互作用する能力を有するものであり、遺伝子産物の刺激された合成が起こる。特定の遺伝子に関して、核酸中で作動可能に配置されるとき、制御配列は、この特定遺伝子の発現を効果的に制御する。
【００２６】
本明細書中で使用される用語「プロモーター」は、制御配列として作用する核酸ＴＵにおけるヌクレオチド配列である。
【００２７】
本明細書中で使用される用語「ターミネーター」は、成熟ｍＲＮＡの３’末端でポリアデニル化を誘導するように作用する伸長したヌクレオチド配列である。ターミネーター配列は、特定のコード配列の後ろ、またはそのコード配列の下流に見出される。
【００２８】
本明細書中で使用される用語「宿主細胞」は、１つ以上の産物をコードする核酸ＴＵを有するか、またはこのようなＴＵが導入される原核生物細胞または真核生物細胞である。従って、宿主細胞は、外来または異種の物質（ＴＵ）を有し、これは、成分としてそこに天然には見出されないか、または固有ではない。適切な宿主細胞は、ＴＵの導入の結果としての遺伝子産物の生合成の能力を有する細胞である。特に、適切な宿主細胞は、制御配列に、そしてターミネーター配列（あるとすれば）に応答する細胞である。これらの配列は、ＴＵ内に含まれ得る。本発明の重要な実施態様において、宿主細胞は、哺乳動物細胞である。本発明の特定の重要な実施態様において、宿主細胞は、ヒトまたは非ヒト被験体の身体に天然に存在する細胞であり、ＴＵは、これらの身体にワクチンの成分として投与される。あるいは、分析目的において、診断適用において、または証明目的のために、哺乳動物細胞は、インビトロで培養されたヒトまたは非ヒト細胞であり得る。
【００２９】
本明細書中で使用される特定の病原体に対して特異的な「ワクチン」または「被験体にワクチン接種するための組成物」は、被験体に投与される場合に、被験体において免疫原性応答を導く調製物に関する。本明細書中で使用される「免疫原性」応答は、病原体に対する防御免疫を被験体に付与する応答である。理論に拘束されることは望まないが、免疫原性応答は、中和抗体の生成から、または免疫系の細胞傷害性細胞から、またはその両方から生じ得る。本明細書中で使用される「免疫原性抗原」は、被験体に導入される場合、または本発明の場合においては、宿主もしくは被験体の細胞内で合成される場合に免疫原性応答を導く抗原である。本明細書中で使用されるワクチンまたはワクチン接種組成物の「有効量」は、被験体に投与された場合に、防御免疫を被験体に付与するに十分な量である。歴史的には、ワクチンは、病原体を含む１つ以上の特定の分子成分もしくは構造（特に、その表面）を活性な素因として含むと理解されてきた。このような構造は、病原性生物において一般に見出される表面成分（例えば、タンパク質）、複合糖質、および／または複合脂質を含み得る。
【００３０】
しかし、本明細書中で記載されるように、用語「ワクチン」または「被験体にワクチン接種するための組成物」は、前述の段落でまとめられた従来の意味を拡大することが強調される。本明細書中で使用されるこれらの用語はまた、本発明の核酸ＴＵ分子またはＴＵを含む組成物に関する。このＴＵは、被験体の細胞内でＴＵによりコードされた１つ以上の特定化された遺伝子産物の生合成を誘導する。ここで、この遺伝子産物は、特定化された病原体の抗原性タンパク質である。次いで、生合成抗原は、免疫原として作用する。既に述べられたように、ＴＵ（従ってワクチン）は、特定化された免疫原性抗原に対して特定化された遺伝子を有する任意の核酸であり得る。本発明の特定の好ましい実施態様において、ワクチンであるＴＵは、ＤＮＡである。このＴＵは、分子生物学、細胞生物学、およびウイルス免疫学の分野の当業者の便宜のためにさらなる遺伝子もしくは特定の配列を組み込むプラスミドまたはベクターであり得る（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９；ならびに「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８７（季刊誌）を参照のこと、これらは、本明細書中に参考として援用される）。
【００３１】
本発明の核酸ＴＵ分子は、核酸または核酸誘導体を示す。そのヌクレオチド配列は、フラビウイルス（例えば、ＪＥＶ、デング熱ウイルス、黄熱病ウイルスおよびセントルイス脳炎ウイルス）の抗原性タンパク質に関連した特定の遺伝子産物をコードする。任意の核酸は、ＴＵとして作用し得るが、重要な実施態様においては、ＴＵはＤＮＡである。あるいは、核酸はＲＮＡ分子であり得る。それらはまた、ＤＮＡもしくはＲＮＡのいくつかの誘導体のうちの任意の１つであり得る。その骨格であるリン酸ジエステル結合は、薬剤としてＴＵの安定性を増大させるために化学的に改変されている。このように想定された改変としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ホスホロチオエート誘導体またはホスホネート誘導体；誘導体のこれらおよび他の例は、核酸化学分野の当業者に周知である。
【００３２】
ＪＥＶは、そのゲノムが特徴づけられ、かつ配列決定されている（図１および２を参照のこと）ＲＮＡウイルスである。Ｍ構造遺伝子の遺伝子は、細胞内に翻訳されるプレＭ配列（ｐｒＭ）を含む。この配列は、ＪＥＶ粒子のアセンブリを細胞内で可能にする。次いで、このプレＭ配列は、遺伝子産物から切断されて、分泌前に成熟Ｍタンパク質を含むウイルス粒子を得る。関連するフラビウイルス（例えば、ＹＦＶ、デング熱ウイルス、およびＳＬＥＶ）は、同様のゲノム構造および機能を有する（例えば、図６および７を参照のこと）。
【００３３】
本発明のフラビウイルスＭおよびＥタンパク質の重要なＴＵは、ＤＮＡである。前述の段落における議論に従って、このＤＮＡは、同様に、プレＭ配列を含むＭの遺伝子をコードする；このＲＮＡはまた、Ｅタンパク質の遺伝子もまたコードする。このようにして、意図された遺伝子産物は、宿主細胞内でサブウイルス（ｓｕｂｖｉｒｕｓ）粒子を形成することを可能にする。次いで、宿主細胞は、完全なビリオンに関して生じるのと同様な様式で、プレＭ配列を切断し得る。
【００３４】
インビボでのワクチンとして有効に機能するために、抗原をコードする配列の翻訳を増強または促進するという効果を有する制御配列を、核酸ＴＵ内に含むことは有利である。このようなプロモーターの使用は、分子生物学、細胞生物学、およびウイルス免疫学の分野の当業者には周知である「（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９；ならびに「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８７（季刊誌）を参照のこと）。核酸ＴＵは、哺乳動物宿主においてワクチンとして使用されることが意図されるため、使用されるプロモーターは、好ましくは、哺乳動物細胞において効率的に作動するプロモーターである。このようなプロモーターは、翻訳が促進される遺伝子に関して、このプロモーターがこのような翻訳を作動可能に促進し得る位置に配置される。本発明の重要な実施態様において、このプロモーターは、サイトメガロウイルス初期プロモーターである。さらに、本発明のさらに好ましい実施態様において、ＴＵ核酸において、遺伝子の後にターミネーター配列が続く（Ｓａｍｂｒｏｏｋら）。本発明の特定の実施態様は、原核生物宿主細胞および真核生物宿主細胞の両方に関する。多くのプロモーター配列は、原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞のいずれかにおいて有用であることは公知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋらを参照のこと）。
【００３５】
本発明の核酸ＴＵの調製は、分子生物学の分野の当業者に周知の方法により容易に達成される。関連する手順は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、１９８９、ならびに「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８７（季刊誌）に記載される。フラビウイルスＲＮＡ分子は、例えば、フラビウイルス属および他の群のウイルスにもまた精通したウイルス学者に広く知られた方法により生存ウイルスのサンプルから単離され得る。ＪＥＶで使用される方法は、Ｋｕｎｏら（１９９０）に要約されている。逆転写酵素を使用して、ｃＤＮＡ合成のためのテンプレートとしてＲＮＡを使用する。ｃＤＮＡからプレＭ〜Ｅ遺伝子を含むフラグメント（図２を参照のこと）は、このようなフラグメントを提供するためにｃＤＮＡを適切に切断することが公知である制限ヌクレアーゼで消化することにより得られ得る。ＪＥＶの制限酵素消化の例は、例えば、Ｎｉｔａｙａｐｈａｎら（１９９０）およびＫｏｎｉｓｈｉら（１９９１）に提供される。プロモーター（例えば、サイトメガロウイルスプロモーター）およびポリアデニル化シグナルの組み込みは、同様に分子生物学および組換えＤＮＡ工学の当業者に周知である。所望の遺伝子および制御配列を含むＴＵを有する核酸分子が調製される場合、これは、核酸フラグメントを増幅する方法により多量に得られ得る。このような方法は、分子生物学および組換えＤＮＡ工学の当業者に広く公知である。これらの方法の例としては、細胞（例えば、原核生物細胞）において培養すること、および培養を完了した後にプラスミドを採取すること、ならびにポリメラーゼ連鎖反応を使用する方法による核酸フラグメントの増幅による複製のための、核酸フラグメントのプラスミドへの組み込みが挙げられる。これらの例は、ＴＵを含む核酸が得られ得る方法を制限することを意図しない。
【００３６】
本発明のＴＵ含有核酸分子は、分子生物学およびウイルス免疫学の分野の当業者に周知の多くの方法において適切な宿主細胞へ導入され得る。例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：宿主細胞により取り込まれるプラスミドまたは類似の核酸ベクターへの組み込み、またはリポソームのような小胞脂質構造（特に、カチオン性脂質を含むリポソーム）中へのカプセル化、またはエンドサイトーシスによって宿主細胞に取り込まれる粒子への吸着。
【００３７】
一般に、宿主細胞は、核酸ＴＵを有する原核生物細胞または真核生物細胞であるか、またはそこに、このようなＴＵ分子は導入される。本発明のＴＵは、コードされたＥおよびＭ抗原の細胞内生合成を誘導する。適切な宿主細胞は、核酸の導入の結果として遺伝子産物の生合成の能力を有する細胞である。本発明の特定の実施態様において、適切な宿主細胞は、ＴＵ内に含まれ得る制御配列およびターミネーター配列（あるとすれば）に応答する宿主細胞である。この様式で応答するために、このような宿主細胞は、制御配列およびターミネーターと相互作用し、そして機能の、それぞれ促進および終結を行うように作用する成分をその内部に含む。宿主細胞がインビトロで培養される場合、この宿主細胞は、原核生物であってもよいし、単細胞の真核生物細胞であってもよく、哺乳動物細胞であってもよい。本発明の特定の実施態様において、宿主細胞は哺乳動物細胞である。これらの場合において、合成されたＥタンパク質遺伝子産物およびＭタンパク質遺伝子産物は、分析適用において、もしくは診断適用において、または証明目的のための使用が利用可能である。
【００３８】
好都合な環境において、宿主細胞が培養哺乳動物細胞であるような場合、Ｅ抗原およびＭ抗原は、サブウイルス粒子の形態で分泌される。これらは、表面微細構造形態および免疫原性特性が生存ウイルスと似たＥタンパク質およびＭタンパク質の凝集物である。しかし、本発明の核酸ＴＵはフラビウイルスゲノムの残りに含まれないため、取り込まれるキャプシドはなく、そして最も重要なことには、感染性ウイルスＲＮＡがない。
【００３９】
本発明の別の重要な実施態様において、この宿主細胞は、被験体の天然の細胞成分である。この被験体に対して、ＴＵはワクチンとして投与される。そのように投与された場合、核酸ＴＵは、被験体の細胞により取り込まれ、このことによってこれらの細胞は本明細書中で記載されるように宿主細胞になると理解される。被験体の細胞は、任意のプロモーター配列およびターミネーター（存在するとすれば）に応答する能力を有する。いずれの場合においても、ＴＵ核酸は、フラビウイルスのＥ遺伝子産物およびＭ遺伝子産物を合成するように被験体の細胞を誘導する。理論的考察により拘束されることは望まないが、インビトロで培養された哺乳動物宿主細胞で生じたことが見出されさえすれば、被験体の宿主細胞は、Ｍ抗原およびＥ抗原からなるサブウイルス粒子をインビボで生成すると考えられる。このよなサブウイルス粒子は、次いで、インビボで免疫原として作用し、被験体の免疫系を刺激して、被験体に防御免疫を付与する免疫学的応答を生成すると考えられる。再び、理論により制限されることは望まないが、得られる防御免疫は、体液性免疫または細胞性免疫のいずれかを介して（すなわち、それぞれ、ＭＨＣクラスＩＩ拘束機構またはＭＨＣクラスＩ拘束機構のいずれかを介するか、あるいはその両方によるか）であり得る。
【００４０】
本発明に従って、被験体は、被験体にＭ抗原およびＥ抗原の遺伝子をコードする核酸ＴＵの有効量を投与することにより、フラビウイルス（例えば、ＪＥＶ、ＹＦＶ、デング熱ウイルス、およびＳＬＥＶ）による感染に対して免疫され得る。この核酸は、被験体の細胞に組み込まれた後に、フラビウイルスのＭ抗原およびＥ抗原の合成を導く。
【００４１】
核酸ＴＵを被験体に投与するために、この核酸ＴＵは、薬学的に受容可能なキャリアもまた含む組成物に組み込まれる。このようなキャリアは、薬学の当業者に周知である。それらとしては、注射用水、および一般的な生理学的緩衝液が挙げられる（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）。それらはまた、薬学分野および免疫学分野の当業者に公知であるように、小胞またはリポソーム構造（特にカチオン性脂質を含むもの）を含み得る。
【００４２】
有効量のワクチン接種組成物は、被験体に投与される場合、被験体に防御免疫を付与する量であることが、ウイルス免疫学分野の当業者により容易に決定される。このような決定を行うために、当業者は、ワクチンを投与した被験体の血液中に存在する、フラビウイルスのＭ特異的抗体およびＥ特異的抗体ならびに／またはフラビウイルスのＭ特異的細胞傷害性Ｔリンパ球およびＥ特異的細胞傷害性Ｔリンパ球を誘導する能力を評価し得る。さらに、生ＪＥＶでのチャレンジにより実験動物に付与された防御免疫のレベルを決定し得る。このようなチャレンジ実験は、ウイルス免疫学の当業者に周知である。一般に、ＪＥＶ、ＹＦＶ、デング熱ウイルス、またはＳＬＥＶによる感染に対して被験体を免疫するために、本発明に従って、そしてこのような方法において使用される核酸ＴＵが、全体のサイズが異なり得ることを認識して、約０．１μｇ／ｋｇ体重〜約５０μｇ／ｋｇ体重の範囲にわたる用量が使用され得る。
【００４３】
ＤＮＡである本発明のＴＵが、単一の有効用量のＴＵのみの投与の後に、約１００％の有効性レベルで防御免疫を付与することが見出されたことは予測外であった。このことは、１回以上の追加免疫ワクチン接種をしばしば必要とし、かつ有効性ほぼ１００％まで防御免疫を付与し得ない従来のワクチンを使用して行った多くの免疫方法（上記）とは対照的であった。
【００４４】
この防御免疫がワクチン接種した雌性被験体からこの被験体の子孫に移行し得ることが見出されたことはさらに予測外であった。新生仔マウスの有意な割合は、それらの母親が本発明のＴＵ  ＤＮＡを使用してワクチン接種した後のウイルスチャレンジに対して防御されることを示した。理論に制限されることは望まないが、種々の病原体に対して特異的な中和抗体が母乳に存在することに起因して、新生仔哺乳動物に受動免疫が付与され得ることは公知である。新生仔で見出されたＪＥＶに対する防御免疫がこのようにして新生仔に移行した可能性がある。
【００４５】
本発明の特定の実施態様は、以下の実施例において記載される。これらの例は、本明細書中で開示されるように本発明の範囲を限定することは意図されない。
【００４６】
（実施例）
本発明の核酸ＴＵ分子を調製し、そしてこれを発現することに関して、分子生物学および組換えＤＮＡ技術を利用する一般的な方法は、例えば、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８７（季刊誌）ならびに「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９に記載される。
【００４７】
（実施例１．ＪＥＶ  ｐｒＭ抗原およびＥ抗原をコードする転写単位を含む組換えプラスミドの調製）  ゲノムＲＮＡを、ＱＩＡａｍｐTMウイルスＲＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒｉｔａ，ＣＡ）を使用してマウス脳から増殖させた１５０μＬのＪＥＶ株ＳＡ  １４ウイルス種から抽出した。ＲＮＡ（シリカ膜に吸着させた）を８０μＬの、ヌクレアーゼを含まない水に溶出し、そしてＪＥＶ  ｐｒＭ遺伝子コード配列およびＥ遺伝子コード配列の増幅のためのテンプレートとして使用した。プライマー配列をＮｉｔａｙａｐｈａｎら（１９８０）の研究から得た。ゲノムヌクレオチド領域３８９〜２４７８を含む単一のｃＤＮＡフラグメントを、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により増幅した。制限部位ＫｐｎＩおよびＸｂａＩ、コンセンサスＫｏｚａｋリボソーム結合配列、ならびに翻訳開始部位を、アンプリフィアー（ａｍｐｌｉｆｉｅｒ）１４ＤＶ３８９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）によりｃＤＮＡの５’末端に操作した。インフレームの翻訳終結コドン、次いで、ＮｏｔＩ制限部位を、アンプリフィアーｃ１４ＤＶ２４５３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）によりｃＤＮＡの３’末端に導入した（図２を参照のこと）。ワンチューブ（ｏｎｅ−ｔｕｂｅ）ＲＴ−ＰＣＲを、Ｔｉｔａｎ  ＲＴ−ＰＣＲキット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を使用して行った。１０μＬのウイルスＲＮＡを、１μＬの１４ＤＶ３８９（５０μＭ）および１μＬのｃ１４ＤＶ２４５３（５０μＭ）ならびに１８μＬのヌクレアーゼを含まない水を混合し、そしてこの混合物を８５℃で５分間加熱し、次いで、４℃に冷却した。７５μＬの反応混合物［２０μＬ  ５×緩衝液、２μＬのｄＮＴＰ混合物（それぞれ１０ｍＭ）、５μＬのジチオスレイトール（０．１ｍＭ）、０．５μＬのＲＮａｓｉｎTM（４０Ｕ／μＬ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、２μＬのポリメラーゼ混合物、および４５．５μＬのヌクレアーゼを含まない水］を添加し、そしてＲＴ−ＰＣＲを以下のとおり行った：１サイクル（５０℃で３０分、９４℃で３分、５０℃で３０秒、６８℃で２．５分）、９サイクル（９４℃で３０秒、５０℃で３０秒、６８℃で２．５分）、２０サイクル（９４℃で３０秒、５０℃で３０秒、最初のサイクルにおいて６８℃で２．５分（この後、１サイクル毎に５秒ずつ増加させる））、そして６８℃で１５分の最後の伸長。ＲＴ−ＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋTMＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）により精製し、そして５０μＬの１ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５で溶出した。
【００４８】
すべてのベクターの構築および分析を、標準的な技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）を用いて行った。ＫｐｎＩおよびＮｏｔＩヌクレアーゼを用いて消化したＲＴ−ＰＣＲ増幅されたｃＤＮＡを、真核生物発現プラスミドベクター（ｐＣＤＮＡ３、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）のＫｐｎＩ−ＮｏｔＩ部位に挿入した。エレクトロポレーションにコンピテントなＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を、エレクトロポレーション（Ｇｅｎｅ  ＰｕｌｓｅｒTM、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）によって形質転換し、そして１００μｇ／ｍＬのカルベニシリン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含むＬＢ寒天プレート上にプレーティングした。クローンを拾い上げ、そして１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含む３ｍＬのＬＢブロス中に接種した。プラスミドＤＮＡを、１４時間培養物から、ＱＩＡｐｒｅｐTMＳｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して抽出した。自動化ＤＮＡ配列決定を、推奨されるように（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）実行した。ｃＤＮＡの両方の鎖を配列決定し、そしてもともとのＳＡ１４株についての配列（Ｎｉｔａｙａｐｈａｎら、１９９０）と同一であることを示した。
【００４９】
プラスミドｐＣＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）の、ｆｌ  ｏｒｉ、ＳＶ４０  ｏｒｉ、ネオマイシン耐性遺伝子、およびＳＶ４０ポリ（Ａ）エレメントを含むヌクレオチド（ｎｔ）１２８９〜ｎｔ３４５５までのフラグメントを、ＰｖｕＩＩ消化により欠失させ、次いで連結してｐＣＢａｍｐプラスミドを生成した。ｐＣＢａｍｐのＮｃｏＩ／ＫｐｎＩ部位にキメライントロン挿入を含むベクターｐＣＩＢａｍｐを、ＮｏｔＩおよびＫｐｎＩを用いる消化によってｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）からのイントロン配列を切り出すことによって構築した。生じる５６６ｂｐフラグメントを、ＮｏｔＩ−ＫｐｎＩを用いて消化してその２８９ｂｐフラグメントを置き換えることによってｐＣＢａｍｐにクローニングした。図３は、プラスミドｐＣＤＡ３、プラスミドｐＣＢａｍｐおよびプラスミドｐＣＩＢａｍｐの間の関係を表す。
【００５０】
これらのプラスミドから、ＪＥＶ  ｐｒＭタンパク質およびＥタンパク質をコードする転写単位を含むプラスミドを調製した。ｐＣＤＮＡ３ベクター由来の組換えプラスミドｐＣＤＪＥ２−７のＪＥＶ  ｐｒＭコード領域およびＥコード領域を含むｃＤＮＡフラグメントを、ＮｏｔＩおよびＫｐｎＩまたはＸｂａＩを用いる消化によって切り出し、そしてｐＣＢａｍｐ、ｐＣＩＢａｍｐ、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）もしくはｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）のＫｐｎＩ−ＮｏｔＩ部位、またはｐＲｃ／ＲＳＶ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）のＳｐｅＩ−ＮｏｔＩ部位にクローニングして、それぞれｐＣＢＪＥ１−１４、ｐＣＩＢＪＥＳ１４、ｐＣＥＪＥ、ｐＲＥＦＥ、およびｐＲＣＪＥを作製した。各々のプラスミドのクローン由来のｃＤＮＡの両方の鎖を配列決定し、そして正しいヌクレオチド配列を有する組換えクローンを同定した。哺乳動物細胞のインビトロ形質転換またはマウス免疫実験における使用のためのプラスミドＤＮＡを、ＥｎｄｏＦｒｅｅTMＰｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。
【００５１】
（実施例２：種々の組換えプラスミドによって発現されるＪＥＶ  ｐｒＭタンパク質およびＥタンパク質の間接的免疫蛍光抗体アッセイを用いる評価）  種々の組換え発現プラスミドによるＪＥＶ特異的遺伝子産物の発現を、間接的免疫蛍光抗体アッセイ（ＩＦＡ）によって、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、およびＳＶ−Ｔ２（それぞれ、ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ  ＭＤ；１６５０−ＣＲＬ、１６５１−ＣＲＬ、および１６３．１−ＣＣＬ）の、一過性にトランスフェクトされた細胞株において評価した。ＳＶ−Ｔ２細胞株をさらなる試験から除外した。なぜなら、予備的な結果が、形質転換されたＳＶ−Ｔ２細胞の１〜２％のみがＪＥＶ抗原陽性であることを示したからである。形質転換のために、細胞を、１５０ｃｍ2培養フラスコ中で７５％コンフルエンスまで増殖させ、トリプシン処理し、そして４℃でリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁させて、最終細胞数を１ｍＬあたり５×１０6にした。１０μｇのプラスミドＤＮＡを、１５０Ｖ、９６０μＦ、および１００Ω抵抗に設定したＢｉｏＲａｄ  Ｇｅｎｅ  ＰｕｌｓｅTM（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて、３００μＬの細胞懸濁物中にエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの５分後、細胞を２５ｍＬの新鮮な培地で希釈し、そして７５ｃｍ2フラスコ中に播種した。形質転換の４８時間後、培地を細胞から取り除き、そしてその細胞をトリプシン処理し、そして３％正常ヤギ血清を有する５ｍＬ  ＰＢＳ中に再懸濁した。１０μＬのアリコートをスライド上にスポットし、風乾し、そして−２０℃で２０分間アセトンを用いて固定した。ＩＦＡを、プラスミドで形質転換しアセトン固定した細胞を用いて、フルオレセインイソチオシアネート結合体化ヤギ抗マウス免疫グロブリンＧ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）およびＪＥＶ  ＨＩＡＦを使用して行った。
【００５２】
ＪＥＶ  ｐｒＭタンパク質およびＥタンパク質の発現に対する種々のプロモーターおよびポリ（Ａ）エレメントの影響を決定するために、ＣＯＳ−１細胞株およびＣＯＳ−７細胞株を、等量のｐＣＤＪＥ２−７プラスミドＤＮＡ、ｐＣＥＪＥプラスミドＤＮＡ、ｐＲＥＪＥプラスミドＤＮＡ、またはｐＲＣＪＥプラスミドＤＮＡによって一過性に形質転換した。ＪＥＶ抗原は、４つすべての組換えプラスミドによって形質転換した両方の細胞株において発現され、従ってＣＭＶまたはＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）のプロモーターおよびＢＧＨまたはＳＶ４０のポリ（Ａ）エレメントが機能的に活性であることが確認された。しかし、ＩＦＡ陽性細胞の数およびＩＦＡ強度によってそれぞれ決定されるような、形質転換された細胞のパーセンテージおよび発現されたＪＥＶ抗原のレベルは、種々のプラスミドの間で大きく異なっていた（表１を参照のこと）。ｐＣＤＪＥ２−７、ｐＣＢＪＥ１−１４、およびｐＣＩＢＪＥＳ１４によって形質転換された著しく高いパーセンテージのＣＯＳ−１細胞は、ＪＥＶ抗原を発現し、そしてその発現されたタンパク質のレベルは、ＪＥＶ感染細胞に匹敵した。他方、ｐＣＥＪＥベクター、ｐＲＥＪＥベクター、またはｐＲＣＪＥベクターを用いてトランスフェクトされた細胞は、低いパーセンテージの抗原発現細胞、ならびに低い強度の蛍光を有した。このことは、抗原の弱い発現を示す。
【００５３】
ｐＣＤＪＥ２−７によって増強されたＪＥＶタンパク質発現がＳＶ−４０によってコードされる真核生物の複製起点によって影響を受けたか否かを確認するために、プラスミドｐＣＢＪＥ１−１４が構築され、その結果、ｐＣＤＪＥ２−７由来のｆｌ  ｏｒｉ、ＳＶ４０  ｏｒｉ、ネオマイシン耐性遺伝子、およびＳＶ４０ポリ（Ａ）エレメントを含む２１６６ｂｐのフラグメントが欠失された。次いで、キメライントロンをｐＣＢＪＥ１−１４に挿入して、ｐＣＩＢＪＥＳ１４を生成した。このｐＣＩＢＪＥＳ１４プラスミドを、ＪＥＶタンパク質の発現がイントロン配列によって増強され得るか否かを決定するために使用した。形質転換後、ｐＣＢＪＥ１−１４ベクターおよびｐＣＩＢＪＥＳ１４ベクターの両方を保有する細胞は、ｐＣＤＪＥ２−７を用いて観察されたのと同様のレベルのＪＥＶ抗原を発現した（表１を参照のこと）。この結果は、組換えベクターによるＪＥＶ  ｐｒＭ抗原およびＥ抗原の発現は、転写調節エレメントによってのみ影響を受けることを示す。真核生物の複製起点もイントロン配列もいずれも、使用された細胞においてＪＥＶ抗原発現を増強しなかった。ＣＭＶプロモーターおよびＢＧＨポリ（Ａ）を含むベクター（図３を参照のこと）を、さらなる分析のために選択した。
【００５４】
【表１】
0004489943.tif 000002
（実施例３：インビトロで形質転換された、ＪＥＶ特異的遺伝子産物を構成的に発現する安定な細胞株の選択）  先の実施例において記載されたように、ＣＯＳ−１細胞を、１０μｇのｐＣＤＪＥ２−７  ＤＮＡを用いて、エレクトロポレーションによって形質転換した。非選択培養培地中での２４時間のインキュベーション後、細胞をネオマイシン（０．５ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）を用いて処理した。２〜３週間後に見えるようになったネオマイシン耐性コロニーを、ネオマイシン含有培地中での限界希釈によってクローニングした。ベクターにコードされるＪＥＶ遺伝子産物の発現を、最初にＪＥＶ  ＨＩＡＦを用いるＩＦＡによってスクリーニングした。１つのＪＥＶ−ＩＦＡ陽性クローン（ＪＥ−４Ｂ）および１つの陰性クローン（ＪＥ−５Ａ）をさらなる分析のために選択し、そして２００μｇ／ｍＬのネオマイシンを含有する培地中で維持した。
【００５５】
ＪＥ−４Ｂクローンによって発現されるＪＥＶ  Ｅタンパク質の確実性を、ＪＥＶ  Ｅ特異的マウスモノクローナル抗体（Ｍａｂ）（Ｋｉｍｕｒａ−Ｋｕｒｏｄａら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４５、１２４−１３２（１９８３）；Ｋｉｍｕｒａ−Ｋｕｒｏｄａら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６７、２６６３−２６７２（１９８６）；Ｚｈａｎｇら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．２９、１３３−１３８（１９８９）；およびＲｏｅｈｒｉｇら、Ｖｉｒｏｌ．１２８、１１８−１２６（１９８３））のパネルを使用するＩＦＡによるエピトープマッピングによって実証した。ＪＥＶ  ＨＩＡＦおよび正常マウス血清を、陽性抗体コントロールおよび陰性抗体コントロールとしてそれぞれ使用した。４つのＪＥＶ特異的Ｍａｂ、６つのフラビウイルス亜群特異的Ｍａｂ、および２つのフラビウイルス群反応性Ｍａｂが、４ＢクローンまたはＪＥＶ感染ＣＯＳ−１細胞と同様に反応した（表２を参照のこと）。
【００５６】
【表２】
0004489943.tif 000003
（実施例４：ＪＥ−４Ｂ  ＣＯＳ−１細胞株によって分泌されるサブウイルス粒子の抗原性特性および免疫学的検出）
（ａ．サブウイルス粒子の調製）  ＪＥ−４Ｂ  ＣＯＳ−１細胞を、２００μｇ／ｍＬのネオマイシンを含む培地中で増殖させ、そして維持した。培養した培地を、慣用的に収集し、そして４℃で保存し、そして週に２回補充し、そしてその細胞を７〜１０日毎に１：５に分割した。培養培地を、Ｓｏｒｖａｌｌ  Ｆ１６／２５０ローター中にて４℃で、１０，０００ｒｐｍで３０分間の遠心分離により清澄化し、そしてさらにＳｏｒｖａｌｌ  ＴＨ６４１ローター中にて、４℃で、５％ショ糖クッション（ｗ／ｗ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ７．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ（ＴＮ緩衝液）を用いて調製した）を通して３９，０００ｒｐｍで４時間遠心分離した。細胞内粒子を含むペレットを、ＴＮ緩衝液中で再懸濁し、そして４℃で保存した。あるいは、７％または１０％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ−８０００を、清澄化した培養培地に添加した。この混合物を４℃で少なくとも２時間攪拌し、そして沈殿した粒子を１０，０００ｒｐｍ、３０分間の遠心分離によって収集した。沈殿をＴＮ緩衝液中に再懸濁し、そして４℃で保存した。サブウイルス粒子を、ＴＮ中の５〜２５％連続ショ糖勾配中の、４℃における３８，０００ｒｐｍ、９０分間の速度レートゾーン遠心分離（ｒａｔｅ  ｚｏｎａｌ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）によって、ペレット化した調製物およびＰＥＧ沈殿させた調製物の両方から精製した。１ｍＬの画分を、勾配の上端から収集し、抗原捕捉ＥＬＩＳＡ（以下を参照のこと）によって試験し、そして陽性画分をＴＮ中の２５〜５０％ショ糖勾配にロードした。これを、４℃で３５，０００ｒｐｍの平衡密度遠心分離で一晩遠心分離した。平衡勾配からの０．９ｍＬの画分を、下端から収集した。これらを抗原捕捉ＥＬＩＳＡによって試験し、そしてｐＨ  ６．６における赤血球凝集（ＨＡ）活性について評価した。各画分の１００μＬのアリコートを正確に秤量し、その密度を決定した。ＥＬＩＳＡ陽性画分をプールし、そして４℃、３９，０００ｒｐｍ、３〜４時間でペレット化し、そしてそのペレットをＴＮ緩衝液中に再懸濁した。抗原捕捉ＥＬＩＳＡおよびＨＡ力価を、ペレット化したサンプルで決定した。ＪＥＶ感染ＣＯＳ−１細胞上清もまた、上記に詳述されるような同様の精製プロトコルに供し、そして勾配分析についての陽性コントロールとして使用した。ＪＥビリオンをまた、グリセロール／酒石酸平衡勾配中の沈降によって、感染５〜６日後の感染したＣ６／３６細胞から精製した。
【００５７】
（ｂ．サブウイルス粒子のウェスタンブロット）  サブウイルス粒子の勾配精製したサンプルを、電気泳動サンプル緩衝液と混合し、そしてＬａｅｍｍｌｉ（Ｎａｔｕｒｅ  ２７７、６８０−６８５（１９７０））によって記載されるように、ドデシル硫酸ナトリウムを含む１０または１２．５％ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）上で泳動した。タンパク質をニトロセルロース膜に転写し、そしてポリクローナルＪＥＶ  ＨＩＡＦ、フラビウイルス交叉反応性抗Ｅ  Ｍａｂ  ４Ｇ２（Ｈｅｎｃｈａｌら、Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．３１、８３０−８３６（１９８２））、またはマウス抗ｐｒＭペプチド超免疫血清（ＪＭ０１、Ｃｈｉｕｅｈら、未公開結果）を用いて免疫化学的に検出した。図４は、ＪＥＶに感染したＣ６／３６細胞およびＪＥ−４Ｂ  ＣＯＳ−１細胞によって産生されるＭタンパク質とＥタンパク質との比較を示す。Ｅタンパク質に対するいくつかの非特異的な反応性が、正常マウス腹水およびＪｍｏｌ抗ペプチド血清中で観察された。ＭおよびＥに対してサイズが同一であるタンパク質は、サブウイルス粒子中で分泌され、そしてＥ特異的Ｍａｂ  ４Ｇ２およびｐｒＭ特異的ＪＭ０１抗血清によってそれぞれ検出され得る。
【００５８】
（ｃ．培養培地中のＪＥＶサブウイルス粒子の密度勾配検出）  ＥＬＩＳＡのために、抗原捕捉抗体（４Ｇ２）を、０．１Ｍ  炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ  ９．６中で希釈し、９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ  ＩＩ、Ｄｙｎａｔｅｃｈ、Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ、ＶＡ）を、４℃で一晩のインキュベーションによりコートするために使用した。ＰＢＳ中の３％正常ヤギ血清を用いてブロッキングした後、２倍連続希釈サンプルを、４Ｇ２コートしたプレートに添加し、そして３７℃で１．５時間インキュベートした。捕捉された抗原を、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体化６Ｂ６Ｃ−１  Ｍａｇによって検出し、そして３７℃で１時間インキュベートした。次いで、固相における酵素活性をＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）−ＥＬＩＳＡ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を用いて検出した。
【００５９】
ＪＥ−４Ｂ細胞の１５×１５０ｃｍ2フラスコからの細胞培養培地の約５００ｍＬを、細胞を播種してから４日後に収集した。ＰＥＧ沈殿させたサブウイルス粒子を、２ｍＬのＴＮ緩衝液、ｐＨ  ７．５中に再懸濁し、この再懸濁したペレットの０．７ｍＬアリコートを、５〜２５％ショ糖勾配にロードした。サブウイルス粒子を破壊するＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を、別の０．７ｍＬのアリコートに、０．１％の最終濃度で添加し、そしてこれを０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むＴＮ緩衝液中で調製した５〜２５％ショ糖勾配にロードした。明確な不透明なバンドが、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む勾配の上端から約２．５ｃｍで観察されたが、界面活性剤を含まない勾配中では観察されなかった。画分（１ｍＬ）を各勾配の上端から下端まで収集し、そして抗原捕捉ＥＬＩＳＡによって分析した（図５）。抗原は画分４〜６中で検出された。このことは、サブウイルス粒子に特徴的な比較的迅速な沈降を示す。ＪＥ−４Ｂ培養培地からのＰＥＧ沈殿物のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００による処理により、ＥＬＩＳＡ反応性の物質の位置が、勾配の上端に移動した。このように、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００による処理は、ゆっくりと沈降する分子のみを産生する。同様な知見は、Ｋｏｎｉｓｈｉら、１９９２（Ｖｉｒｏｌ．１８８：７１４−７２０）によって報告された。これらの結果は、ｐｒＭ／ＭおよびＥを含む迅速に沈降するサブウイルス粒子は、界面活性剤処理によって破壊され得ることを示す。
【００６０】
ＨＡ活性を、ＣｌａｒｋおよびＣａｓａｌｓの方法（Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．７：５６１−５７３（１９５８））によって、６．１〜７．０のｐＨ範囲で測定した。ＪＥ−４Ｂ細胞によって分泌されるサブウイルス粒子およびＪＥＶに感染したＣＯＳ−１細胞によって産生されるビリオン粒子は、６．６であると決定された最適ｐＨを有する同様のＨＡプロフィールを有した。
【００６１】
（実施例５：本発明のｐＣＤＪＥ２−７核酸ワクチンおよび市販のＪＥＶワクチンでワクチン接種したマウスにおける免疫応答の比較）５匹の３週齢の雌性ＩＣＲ非近交系マウスの群に、１００μＬのｄＨ2Ｏ中のｐＣＤＪＥ２−７プラスミドの１００μｇを用いて、左および右四頭筋に筋肉内注射するか、またはＪＥ−ＶＡＸ（阪大微生物病研究所で製造され、そしてＣｏｎｎｎａｕｇｈｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓｗｉｆｔｗａｔｅｒ、ＰＡにより販売される）の皮下投与（ヒトへの投与量の１／５である）を行った。関連しないタンパク質をコードしそして発現するプラスミドｐＣＤＮＡ３／ＣＡＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、陰性のワクチン接種コントロールとして用いた。ｐＣＤＪＥ２−７でワクチン接種したマウスの１つの群を除いて、全ての動物を、３週間後、さらなる用量のプラスミドまたはＪＥ−ＶＡＸで、追加免疫（ブースト）した。マウスを、接種後、３、６、９、２３、４０および６０週で後眼窩洞から採血した。ＪＥＶ抗体力価を、精製ＪＥＶに対する酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により、またはプラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）（Ｒｏｅｈｒｉｎｇら、Ｖｉｒｏｌ．１７１  ４９〜６０（１９８９）ならびにＨｕｎｔおよびＣａｌｉｓｈｅｒ、Ａｍｅｒ  Ｊ  Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．２８：７４０〜７４９（１９７９））により決定した。
【００６２】
ｐＣＤＪＥ２−７核酸ワクチンおよびＪＥ−ＶＡＸは、マウスのすべての３つの群において第１のワクチン接種後３週間で１００％のセロコンバージョンを提供した（表３）。ＪＥＶのＥＬＩＳＡおよびＰＲＮＴ抗体力価は、免疫後それぞれ６週および９週で最高レベルに達した。１用量のＤＮＡワクチンを投与されたマウスは、２用量を投与されたマウスと類似の抗体応答を有した。匹敵するＥＬＩＳＡ抗体力価は、ＤＮＡワクチン接種群において６０週まで維持され、その後実験を終了した。しかし、ＪＥ−ＶＡＸ群における４匹のマウスの１匹のみが接種後６０週でＪＥＶ抗体陽性であった。ｐＣＤＮＡ３／ＣＡＴコントロール群は、どんな測定可能なＪＥＶ抗体も有さなかった。これらの結果は、ＪＥＶ特異的核酸ワクチンの単回用量が、市販のＦＤＡ承認のＪＥ−ＶＡＸワクチンよりも、マウスにおいてＪＥＶ抗体を維持することにおいてより効果的であることを実証する。
【００６３】
【表３】
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（実施例６：異なる年齢での、ワクチン接種の効力についての、本発明の種々の核酸ワクチン構築物および市販のＪＥＶワクチンの比較）類似のレベルのＪＥＶタンパク質をｐＣＤＪＥ２−７  ｐＣＢＪＥ１−１４またはｐＣＩＢＪＥＳ１４のいずれかにより形質転換したＣＯＳ−１細胞により発現させた。これらの核酸構築物によるＪＥＶ抗体誘導を、ワクチン接種で２つの異なる年齢でＪＥ−ＶＡＸ市販ワクチンと比較した。３日（雌性、雄性とも混在）または３週齢（雌性）のＩＣＲ非近交系マウス（１群あたり１０匹）を５０または１００μｇのプラスミドＤＮＡを用いて筋肉内に、またはヒトへの投与量の１／１０または１／５であるＪＥ−ＶＡＸの用量を用いて皮下にワクチン接種した。血清標本を免疫後３および７週で収集し、そして抗原として精製されたＪＥＶを用いてＥＬＩＳＡにより１：１６００希釈で試験した。結果を表４に示す。
【００６４】
プラスミドｐＣＢＪＥ１−１４は、最高程度のセロコンバージョン（すなわち、１：１６００より大きい抗体力価）を提供した。これは、ワクチン接種の両方の年齢で８０〜１００％を達成する。ｐＣＤＪＥ２−７またはｐＣＩＢＪＥＳ１４の投与は、３日齢のマウスをワクチン接種した場合、７週で中度のセロコンバージョン（それぞれについて６０％）を提供したが、ワクチン接種の３週後に測定した場合はより弱いセロコンバージョン（それぞれ４０％および１０％）を提供した。しかし、これらのプラスミドを３週齢で投与した場合、９０％または１００％のセロコンバージョンをワクチン接種後３週および７週の両方で獲得した。対照的に、市販のワクチンであるＪＥ−ＶＡＸは、３日齢で投与された場合、セロコンバージョンを付与せず、そして３週齢で投与された場合、１００％であった。このようにＪＥＶ  ｐｒＭおよびＥについてのＴＵの核酸は、市販のワクチンの非常に高用量より良好なセロコンバージョンの程度、そして若年およびより成熟した動物の両方において予想外に高いセロコンバージョンを提供した。
【００６５】
【表４】
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（実施例７．本発明の核酸ワクチンにより付与される防御的免疫）  実施例６由来の３日齢のワクチン接種群を、マウス順応性ＪＥＶ株ＳＡ１４の５０，０００ｐｆｕ／１００μＬの腹腔内注射により、ワクチン接種の７週後チャレンジし、そして３週間観察した。種々の核酸ＴＵ含有ワクチン構築物を投与した群において、２１日目まで１００％の防御を達成した（表５）。対照的にＪＥ−ＶＡＸワクチン接種マウスの６０％およびｐＣＤＮＡ３／ＣＡＴワクチン接種陰性コントロールの７０％は、２１日のウイルスチャレンジに生存しなかった。これらの結果は、本発明のこの核酸ＴＵが、予想外に、ワクチン接種されたマウスに効果的な防御を付与したことを示唆する。これは、本発明の核酸ワクチンの、ヒトの幼児期ワクチンとしての使用の可能性を示唆する。対照的に、現在用いられる不活化ヒトワクチンであるＪＥ−ＶＡＸは、若年の動物においては効果的でないようである。
【００６６】
【表５】
0004489943.tif 000006
（実施例８：母性抗体力価に相関する胎仔マウスの受動的防御）  ３週齢の雌性ＩＣＲマウスを、ｐＣＤＪＥ２−７プラスミドＤＮＡ（１００μｇ／１００μＬ）から２日間空けて１用量または２用量のいずれかでワクチン接種するか、またはヒトの１／５の用量であるＪＥ−ＶＡＸの２用量でワクチン接種した。陰性コントロール群には、ｐＣＤＮＡ−３／ＣＡＴプラスミドの１００μｇ／１００μＬの２用量を投与した。母性抗体による受動防御を、実験の雌性マウスと非免疫の雄性マウスとの交配（初めのワクチン接種後９週または第２のワクチン接種後６週で生じた）から得られる仔において評価した。仔を、マウス適合ＳＡ１４ウイルスの５，０００ｐｆｕ／１００μＬの腹腔内投与により、生後３〜１５日でチャレンジし、そして３週間毎日観察した（表６を参照）。生存率は、母性中和抗体力価と相関した。１：８０のＰＲＮＴを有する母により授乳された仔の１００％がウイルス感染に対して生存したが、コントロールの母からの仔は全く生存しなかった（表６）。それぞれ、１：２０および１：４０のＰＲＮＴ力価を有する母により授乳された、より齢上の仔において、４５％および７５％の部分的防御を観察した。生存率はまた、仔が免疫母体から授乳された時間の長さと相関した。ちょうど示されるように、１３〜１５日齢の仔は高い生存率を有した。しかし、３〜４日齢の仔は、母体が１：２０または１：４０のＰＲＮＴ力価を有した場合、ウイルスチャレンジに対して全く生存しなかった。このように母性抗体は、子孫に部分的防御免疫〜完全防御免疫を提供する。さらに、ＪＥＶ抗体を、ＥＬＩＳＡにより、チャレンジ後の仔の血清の９７％（２９／３０）において検出した。
【００６７】
【表６】
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（実施例９：黄熱病ウイルス（ＹＦＶ）またはセントルイス脳炎ウイルス（ＳＬＥＶ）のｐｒＭおよびＥタンパク質のコード配列を含む組換えプラスミドの調製）  ｐＣＤＪＥ２−７組換えプラスミド構築に類似の戦略を用いて、ＹＦＶおよびＳＬＥＶの組換えプラスミドを調製した。ゲノムＲＮＡを、Ｑ１ＡａｍｐTMＶｉｒａｌ  ＲＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒｉｔａ、ＣＡ）を用いて、１５０μＬのＹＦＶ株ＴＲＩ−７８８３７９またはＳＬＥ株７８Ｖ−６５０７ウイルス種から抽出した。このウイルスＲＮＡを、ＹＦＶまたはＳＬＥＶ  ｐｒＭおよびＥ遺伝子コード領域の増幅のための鋳型として用いた。増幅されたＹＦＶおよびＳＬＥＶ  ＤＮＡ産物のプライマー配列および構造をそれぞれ、図６および７に示す。ＲＴ−ＰＣＲで増幅したｃＤＮＡ（ＫｐｎＩおよびＮｏｔＩ酵素で消化された）を真核生物の発現プラスミドベクター、ｐＣＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＫｐｎＩ−ＮｏｔＩ部位に挿入した。ｃＤＮＡの両方の鎖を配列決定し、そしてＹＦＶ株ＴＲＩ−７８８３７９またはＳＬＥＶ株７８Ｖ−６５０７（未公表；Ｃｈａｎｇ，１９９８）由来の配列に対する同一性を確認した。組換えプラスミドｐＣＤＹＦ２およびｐＣＤＳＬＥ４−３（それぞれ、ＹＥＶまたはＳＬＥＶのｐｒＭおよびＥのコーディング領域のヌクレオチド配列を含んだ）を、ＥｎｄｏＦｒｅｅTMＰｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製し、そしてインビトロ形質転換またはマウス免疫に用いた。
【００６８】
ＹＦＶまたはＳＬＥＶ特異的抗原を、それぞれ、ｐＣＤＹＦ２またはｐＣＤＳＬＥ４−３により形質転換されたＣＯＳ−１細胞において発現した（図８）。発現されたタンパク質のレベルは、ＹＦＶ感染ＣＯＳ−１細胞コントロールまたはＳＬＥＶ感染ＣＯＳ−１細胞コントロールと類似であった。ＪＥＶモデルと同様に、ウイルス抗原の遺伝子を保有するベクターにより形質転換された、ＹＦＶまたはＳＬＥＶ抗原性タンパク質を構成的に発現する、ＣＯＳ−１細胞株を得た。ＹＦＶまたはＳＬＥＶ  Ｅ特異的Ｍａｂのパネルを用いるＩＦＡによるエピトープマッピングは、真正のＥタンパク質がｐＣＤＹＦ２かまたはｐＣＤＳＬＥ４−３により形質転換されたＣＯＳ−１細胞により発現されたことを示した。予備研究は、３週齢の雌性ＩＣＲマウスの１００％が、脱イオン水中の１００μｇ／１００μＬのｐＣＤＳＬＥ４−３プラスミドの単回用量での筋肉内接種後、セロコンバージョンされたことを示した。
【００６９】
（実施例１０：デング２型構造タンパク質のコード配列を含むプラスミドの調製）  ＪＥＶについて実行された手順（実施例１を参照のこと）と同様の手順に従って、デング２型抗原の核酸ＴＵを含むベクターを調製する。
【００７０】
ｐｒＭからＥへのデング２型遺伝子領域を含むプラスミドを構築する。デング２型のｐｒＭおよびＥの遺伝子（Ｄｅｕｂｅｌら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １５５：３６５〜３７７（１９８６）；Ｇｒｕｅｎｂｅｒｇら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６９：１３０１〜１３９８（１９８８）；Ｈａｈｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １６２：１６７〜１８０（１９８８））をｐＣＤＮＡ３のようなプラスミドに連結させ、次いで、切除し、そしてｐＣＢａｍｐ、ｐＣＥＰ４、ｐＲＥＰ４、またはｐＲｃ／ＲＳＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡにより供給）のようなベクターにクローニングし、発現可能にした。必要に応じて、ｃＤＮＡ配列にコードされるデング２型ウイルス特異的配列は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような手順を用いて増幅され得る。あるいは、ウイルスＲＮＡが遺伝子領域の供給源である場合、ＤＮＡ配列は逆転写酵素ＰＣＲ手順により増幅され得る。５’末端で開始コドンおよび３’末端で終止コドンを含むＤＮＡフラグメントを、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期（ＩＥ）プロモーター、開始コドンおよびターミネーターがデング２型ウイルス配列に作動可能に連結されるような方法で、適切な制限ヌクレアーゼ特異的部位で発現ベクターにクローニングする。
【００７１】
（実施例１１：デング２型ＤＮＡワクチンを用いるマウスのワクチン接種）  実施例１０において調製されたｐｒＭ〜Ｅの遺伝子領域をコードするデング２型核ＴＵワクチンを、注射用水または緩衝化生理食塩水のような適切な薬学的キャリアに懸濁し、そして離乳マウスの群に筋肉内注射する。コントロール群には、デング２型特異的遺伝子を欠失する同等のプラスミド調製物を投与する。デング２型特異的抗体の生成および／またはデング２型特異的な免疫系の細胞傷害性細胞を以後、固定した間隔（例えば、毎週の間隔）で評価する。核酸ＴＵワクチンの投与後約２〜４ヶ月で、マウスをデング２型ウイルスでチャレンジする。ウイルス血症のレベルを、以後、適切な間隔（例えば、２日ごと）に評価する。母性抗体による受動的防御を図８に示すように評価する。
【図面の簡単な説明】
【図１】  フラビウイルスポリプロテインプロセッシングの概略図である。中央の水平領域は、ウイルスゲノムの概略図を提供する。直線は、５’および３’非翻訳領域を示し、そして箱で囲った領域は、構造タンパク質（左および上）および非構造タンパク質（右および下）のオープンリーディングフレームを示す。宿主細胞シグナラーゼによる切断は、構造領域および非構造領域を分離するＥタンパク質Ｃ末端におけるトランスローケーションと同時に起こる。ズブチラーゼ様細胞酵素であるフリン（ｆｕｒｉｎ）が、ｐｒＭ切断の原因であり得る。ウイルスポリプロテインの潜在的な膜貫通ドメインが斜線領域により示される。
【図２】  ＪＥＶゲノムのマップ（上）、ｐｒＭ−Ｅタンパク質コード領域（下）の発現のための転写単位を構築するために逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で用いたオリゴヌクレオチドのＤＮＡ配列（中）を示す図である。ウイルスポリプロテインの潜在的な膜貫通ドメインが斜線領域により示される。
【図３】  プラスミドベクターｐＣＤＮＡ３、ｐＣＢａｍｐ、およびｐＣＩＢａｍｐ、およびそれらの間の関係を示す概略図である。これらのプラスミドは、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター／エンハンサーエレメント、ＢＧＨｐ（Ａ）（ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列）、Ｅ．ｃｏｌｉにおける選択および維持のためのアンピシリン耐性遺伝子およびＣｏｌＥ１複製起点を含む。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞中の一本鎖レスキューのためのｆ１複製起点、ＳＶ４０複製起点（ＳＶ４０  ＯＲＩ）、ネオマシン耐性コード領域、およびＳＶ４０ｐ（Ａ）配列をｐＣＤＮＡ３から欠失し、ｐＣＢａｍｐを生成した。イントロン配列を、ｐＣＢａｍｐのＮｃｏＩ−ＫｐｎＩ部位中に挿入し、プラスミドｐＣＩＢａｍｐを生成した。ＣＭＶプロモーター／エンハンサーのＴＡＴＡボックスと、ＢＧＨｐ（Ａ）との間に位置する、フラビウイルス構造タンパク質遺伝子の挿入のための多重クローニング部位を示す。
【図４】  ＪＥ−４Ｂ  ＣＯＳ−１培養液からのスクロース勾配精製サブウイルス粒子のＳＤＳ−ＰＡＧＥ−イムノブロット分析を示す図である（４Ｂ、各ペアの右のレーン）。ＪＥＶ感染Ｃ６／３６細胞培養からの密度勾配精製ＪＥビリオンをポジティブコントロールとして用いた（ＪＥＶ、各ペアの左レーン）。ＪＥ  ＨＩＡＦ（超免疫腹水（ａｓｃｅｔｉｃ））；４Ｇ２、抗Ｅモノクローナル抗体；ＪＭ０１、抗Ｍモノクローナル抗体；ＮＭＡＦ（正常マウス腹水）。
【図５】  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００処理ありまたはなしで、ＪＥ−４Ｂ細胞培養培地のＰＥＧ沈殿物から調製された比率ゾーンスクロース勾配分析におけるＥ抗原のプロフィールを示す図である。
【図６】  黄熱病ウイルス（ＹＦＶ）ゲノム（上）のマップ、およびＹＦＶ  ｐｒＭ−Ｅタンパク質コード領域（下）の発現のための転写単位を構築するための逆転写酵素−ＰＣＲに用いたオリゴヌクレオチドのＤＮＡ配列（中）を示す図である。ウイルスポリプロテインの潜在的な膜貫通ドメインが斜線領域により示される。
【図７】  Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ脳炎ウイルス（ＳＬＥＶ）ゲノムのマップ（上）、およびＳＬＥＶ  ｐｒＭ−Ｅタンパク質コード領域（下）の発現のための転写単位を構築するための逆転写酵素−ＰＣＲに用いたオリゴヌクレオチドのＤＮＡ配列（中）を示す図である。ウイルスポリプロテインの潜在的な膜貫通ドメインが斜線領域により示される。
【図８】  ＹＦＶまたはＳＬＥＶ  ＨＩＡＦのいずれかを用いる間接免疫蛍光抗体アッセイ（ＩＦＡ）により検出されたＹＦまたはＳＬＥウイルスタンパク質の写真を示す。ウイルスタンパク質ｐｒＭおよびＥは、それぞれ、ｐＣＤＹＦ２またはｐＣＤＳＬＥ４−３により形質転換されたＣＯＳ−１細胞中で発現された。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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