(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｓｓａＶ遺伝子の発現を阻害する弱毒化変異、およびアロ（ａｒｏ）Ｃ遺伝子の発現を阻害する弱毒化変異を有するサルモネラ微生物。
【請求項２】
前記微生物がさらに異種抗原または治療タンパクを含む、請求項１記載の微生物。
【請求項３】
前記抗原がＡ型、Ｂ型またはＣ型肝炎抗原である、請求項２記載の微生物。
【請求項４】
前記微生物がサルモネラ・チフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）Ｔｙ２である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項５】
細菌性またはウイルス性感染症の予防または治療に使用する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の微生物、およびアジュバントおよび生理学的に許容され得る希釈剤を含むワクチン組成物。
【請求項７】
単用量単位において１０７〜１０１０ＣＦＵからなる、請求項６記載の組成物。
【請求項８】
１０８〜１０９ＣＦＵを含む、請求項７記載の組成物。
【請求項９】
全身性細菌感染症治療のための静脈内投与用薬物の製造における、請求項１〜４のいずれか１項に記載の微生物の使用。
【請求項１０】
全身性細菌感染症治療のための経口投与用薬物の製造における、請求項１〜４のいずれか１項に記載の微生物の使用。
【請求項１１】
腸チフス治療のための請求項９または請求項１０記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は細菌性またはウイルス性感染症の予防または治療のための、ワクチン組成物に使用され得る弱毒化微生物に関する。
【０００２】
（背景技術）
生弱毒化微生物は非常に有効なワクチンであり、このようなワクチンにより誘発された免疫応答はしばしば、非複製免疫原よりもより大きく、かつ、より長い耐性を有することが知られている。その理由の１つとしては、生弱毒化種は宿主の中で小規模の感染症を起こし、天然の感染症の初期状態をを模倣するのであろう。さらに、死菌調製物と違って、生ワクチンはマクロファージなどの抗原提示細胞内において複製する能力と結びつくであろう潜在的細胞仲介応答を誘発することが可能である。
【０００３】
動物やヒトのサルモネラ症の阻止において、安全で有効なワクチンとして弱毒化サルモネラ(Salmonella) 生ワクチンを使用する長い歴史が存在している。事実、スイス・セーラム・バクシーン・インスティテュート(Swiss Serum Vaccine Institute)が生産する弱毒化経口腸チフス生ワクチン、Ｔｙ２１ａ（Vivotif）が腸チフス熱の阻止において非常に成功したワクチンであることが証明され、米国およびヨーロッパを含む多くの国で実施許諾されている。
【０００４】
しかしながら、この種の弱毒化は化学的変異技術を使用して行われ、この株を弱毒化することの基礎は、完全には理解されていない。それゆえ、このワクチンは用量の回数（目下、４回）および各用量にて与えられるべき生有機体の数から見て理想的でない。
【０００５】
近年の分子生物学技術は、サルモネラの病原性についての知識の増加とともに、生物体のインビボ(in vivo)での成長および生存において必須である数種の遺伝子が同定されてきている。これは弱毒化のための新規な遺伝子標的を提供し、病原性に関与することが知られている、ある遺伝子中に所定の非復帰変異を導入して、ワクチン種が将来、「合理的に」弱毒化され得るとの考えにつながる。これは特に、免疫原性および投与されるべき用量回数の面において、改良ワクチンの開発を促すであろう。
【０００６】
サルモネラの弱毒化株で現在公知であるものも多いが、ヒトに使用するための潜在的なワクチン候補としては、適しているものがほとんどない。これは一部には、サルモネラ微生物が反応性になるという可能性と、ワクチンの免疫原性のバランスをとる必要があるからであろう。
【０００７】
適当なワクチン候補となるであろう弱毒化のために、適当な標的を選択することは明瞭でなく、容易に予め特定することはできない。適当なワクチンとしての弱毒化株の適性には多くの因子が影響を与え、かつ、適当な株を同定するために多くの研究が行われている。例えば、ワクチン候補として試験された多くの弱毒化株は、患者にワクシネミア(vaccinemia)や腫瘍を引き起こしてしまう。
【０００８】
したがって、微生物種が反応型へ戻る可能性を低下させた、高度な免疫原性を有するワクチンであって、かつ限られた副作用しかない良好な安全性を示すワクチンの開発が望まれている。
【０００９】
（発明の開示）
本発明は、サルモネラ微生物中へ導入した２つの特異的弱毒化変異が、高度な免疫原性示し反応型へ戻るリスクの低い微生物を生産できることを見出したことに基づく。得られたワクチン株は良好な副作用プロファイルを示す。
【００１０】
第１変異はサルモネラ病原性アイランド２（Ｓｐｉ２）の領域内に含まれ、第２変異は栄養要求性変異（auxotrophic mutation）、すなわち、生合成経路で要求されるタンパクをコードする遺伝子の発現を阻害する変異である。
【００１１】
本発明の第１態様では、サルモネラ微生物は、Ｓｐｉ２病原性アイランド内に位置するアパレイタス遺伝子の発現を阻害する弱毒化変異と、これと独立な栄養要求性変異を有する。好ましい弱毒化変異はアパレイタス遺伝子ssaＶ内に存在し、そして、好ましい栄養要求性変異は、アロ(aro)Ｃ内に存在する。
【００１２】
この微生物は、好ましくは、さらに１つまたはそれ以上の異種抗原または治療タンパク、例えば、病原性大腸菌、赤痢菌、Ａ型、Ｂ型またはＣ型肝炎、単純ヘルペスウイルスおよびヒトパピローマウイルスの抗原を含む。したがって、この微生物はサルモネラ以外の感染症に対しても免疫性を与える送達担体として働くであろう。
【００１３】
サルモネラ微生物は細菌性またはウイルス性感染症の治療、例えば、腸チフスの治療における静脈内または経口投与用の薬物の製造に使用してもよい。
【００１４】
本発明の弱毒化サルモネラ微生物は、驚いたことに、全身性免疫のみならず粘膜性を刺激するワクチンを生成する。さらに、この微生物はモデル動物において脾臓膿瘍を生じないが、単一変異を有する変異体ではこれを生じる。これは本明細書に記載する二重変異体特有の利点である。
【００１５】
（発明を実施するための最良の形態）
本発明の微生物およびワクチン組成物は、公知技術により調製される。
特別なサルモネラ微生物の選択および適当な変異の選択は、不当な実験を要することなく、当業者によって行い得る。好ましい微生物は、サルモネラ・チフィムリウム（ネズミチフス菌）である。
【００１６】
第１変異は、サルモネラ病原性アイランド２の領域内に位置するアパレイタス遺伝子中に導入してもよい。この領域はWO-9617951に記載されている。
サルモネラ病原性アイランド２（Ｓｐｉ２）は、サルモネラ染色体上に位置する２つの古典的な病原性アイランドのうちの１つである。Ｓｐｉ２はＳｐｉ２コード病原性関連タンパク（いわゆるエフェクタータンパク）をサルモネラ菌の外側へ、かつ、マクロファージなどの標的宿主細胞中へ潜在的に、かつ直接に輸送することに関与するIII型分泌システムをコードする数種の遺伝子を含む。Ｓｐｉ２（アパレイタス遺伝子）の一部は、III型システムの分泌アパレイタスをコードする。Ｓｐｉ２はマウスのサルモネラの病原性および毒性には絶対的に必須であり、これは世界中のいくつかの違ったグループによって今や実証された知見である。Ｓ．チフィムリウムＳｐｉ２変異体は経口、静脈内および腹膜内投与によって免疫されたマウスにおいて大いに弱毒化される。
【００１７】
Ｓｐｉ２内に位置するアパレイタス遺伝子は、現在十分にその特性が明らかになっている。例えば、ヘンゼル(Hensel)ら、モレキュラー  マイクロバイオロジー（Molecular Microbiology）(1997); 24(1):155-167参照すること。本発明に使用するに適した遺伝子としては、ssaＶ、ssaＪ、ssaＫ、ssaＬ、ssaＭ、ssaＯ、ssaＰ、ssaＱ、ssaＲ、ssaＳ、ssaＴ、ssaＵおよびssaＨ遺伝子が挙げられる。
Ｓｐｉ２領域内の変異は、必ずしも、機能を阻害する遺伝子内に存在する必要はない。例えば、上流制御領域内の変異もまた、遺伝子発現を阻害し、弱毒化となる。遺伝子間領域にある変異もまた、遺伝子機能の破壊に充分である。
本発明の好ましい態様では、アパレイタス遺伝子はssaＶである。別な好ましい態様では、変異はssaＪとssaＫの間の遺伝子間領域に存在する。
【００１８】
第２変異は、生合成経路において必須である遺伝子を阻害するから、「栄養要求性変異」と呼ばれる。この生合成経路はサルモネラに存在するものであり、哺乳動物には存在しない。したがって、この変異体は治療患者に見られる代謝産物に依存せず、変異の影響を回避する。栄養要求性変異に好適な遺伝子としては、全てのアロ(aro)遺伝子、例えば、アロＡ、アロＣ、アロＤおよびアロＥが挙げられる。
本発明の好ましい態様では、ワクチン組成物はssaＶおよびアロ(aro)Ｃ中に弱毒化変異を有するサルモネラ微生物を含む。
【００１９】
変異はいかなる公知技術を使用して、微生物中に導入してもよい。好ましくは、変異は遺伝子の阻害が核酸の切除によって生じる欠失変異である。または、変異は核酸の挿入または点変異によって導入してもよい。特異的領域中へ変異を導入する方法は当業者には明白である。
【００２０】
２つの変異に加えて、サルモネラ微生物はまた、異種抗原を含んでいてもよい。したがって、弱毒化微生物は、細菌性またはウイルス性感染症に対する抗原を投与するための送達担体として働くことができる。この方法における用途に適した抗原は、当業者には明白であり、下記のものが挙げられる。
病原性大腸菌抗原、すなわち、ＥＴＥＣ、
Ａ型、Ｂ型およびＣ型肝炎抗原、
ライム(Lime)病抗原、
コレラ菌抗原、
ヘリコバクター抗原、
単純ヘルペスウイルス抗原、
ヒトパピローマウイルス抗原。
【００２１】
このシステムはまた、患者、例えば肝炎に感染した患者の治療のために、治療タンパク、例えばサイトカインを送達する潜在性も有する。ワクチン組成物を使用する異種抗原または治療タンパクの送達方法は、当業者には明白であろう。
【００２２】
本発明の微生物を使用して作られたワクチンは、ヒト患者の感染症治療および家畜感染症の治療への応用を有する。
二重変異は、安全なワクチン候補を提供するために微生物を弱毒化する有効な手段をもたらす。
このワクチン組成物は、免疫システムが損なわれた患者ですら有効な防御をもたらし、重要なことには、脾臓膿瘍を発症するリスクが低い。脾臓膿瘍は単一変異に基づくワクチンを使用して確認されたため、本発明組成物は患者へ実質的な利益をもたらすであろう。
【００２３】
ワクチン組成物を調合するには、変異体微生物を好適な薬学的に許容されるアジュバント、希釈剤または賦形剤とともに組成物中に混合する。好適な調合剤は当業者には明白であろう。この調合剤はいかなる好適な投与手段においても利用される。好ましい投与は経口または静脈内経路を経由するものであり、ワクチンは生弱毒化サルモネラ微生物である。この調合剤に存在することが要求される微生物の数は、当業者によって決定され、かつ、最適化され得る。しかしながら、一般には患者には１つの用量単位で１０7〜１０10ＣＦＵ、好ましくは約１０8〜１０9ＣＦＵを投与してもよい。
【００２４】
（実施例）
下記実施例は本発明を更に詳しく説明する。
実施例１
本実施例は、ヒト経口腸チフスワクチンとして活性を有するＺＨ９と命名される変異体種の調製について述べる。この種は、元来、腸チフスの症例から単離された病原性Ｓ．チフィ(typhi)種Ｔｙ２から誘導される。この誘導種はピュール(pur)Ａおよびアロ(aro)Ａ内の所定の変異を有する。
【００２５】
ＺＨ９構築のためのＴｙ２
Ｓ．チフィ(typhi)Ｔｙ２は、元々、１９１６年に腸チフス熱の患者から単離され、全ての実施権を与えられた腸チフスワクチンの誘導に使用されている。この種はコリンデール（Colindale）のＰＨＬＳナショナルカルチャーコレクションから入手した。これは、ＮＣＴＣ番号が８３８５である凍結乾燥培養物として得た。
【００２６】
Ｓ．チフィＴｙ２からのＳ．チフィアロ(aro)Ｃ遺伝子のクローニング
Ｓ．チフィＴｙ２は、ルリア・ベルタニ（Luria Bertani）（ＬＢ）培養液中で一夜、保存および成長させて回収した。この細胞を採取し、全細胞性ＤＮＡを調製した。Ｓ．チフィＴｙ２ＤＮＡのＤＮＡ断片は、制限酵素Sau3Aを使用する部分開裂によって生成し、得られた断片はBamHI開裂ｐＨＣ７９と結合して、宿主として大腸菌ＨＵ８３５を使用するＳ．チフィＴｙ２ＤＮＡのコスミドライブラリーを形成した。Ｓ．チフィＤＮＡからアロＣをコードするＤＮＡを単離するために、このコスミドライブラリーが使用されて、アロＣ遺伝子中に変異を有し、かつ、成長のためには芳香族化合物に依存する大腸菌ＡＢ２８４９に形質導入した。形質導入混合物は芳香族化合物を欠く最低培地上に載置し、３７℃でインキュベートした。単離コロニー数は一夜、インキュベーションした後に観測した。これらの細菌はおそらく、無傷アロＣ遺伝子を有するコスミドクローンによるＡＢ２８４９のアロＣ変異補完の結果として生じたのであろう。これらの種の１つから得たコスミドＤＮＡを精製した。このコスミドから得た５．２ｋｂのHindIII断片はｐＵＣ１８中へクローン化し、ＡＢ２８４９においてアロＣ欠失を補完することができるプラスミドｐＴＡＣ２を生じ、これがＳ．チフィアロＣ遺伝子を含むことを証明する。
【００２７】
クローン化Ｓ．チフィＴｙ２アロＣの所定欠失の生成
所定の６００ｂｐ欠失はＰＣＲを使用してクローン化アロＣ遺伝子内で作られた。ＰＣＲに使用したオリゴヌクレオチドプライマーは、Ｓ．チフィアロＣ遺伝子（Acc.M27715）の公表されたＤＮＡ配列を使用して設計した。アロＣ遺伝子へのＤＮＡ５’は、配列番号３および配列番号１のプライマーを使用してｐＴＡＣから増幅した。配列番号３はベクターＤＮＡにアニールし、配列番号１はアロＣの５’領域にアニールする。アロＣ遺伝子へのＤＮＡ３’は、配列番号４および配列番号２のプライマーを使用して増幅した。配列番号４はベクターＤＮＡにアニールし、配列番号２はアロＣの３’領域にアニールする。得られたＰＣＲ産物は、クローニングを容易にするために、５’末端中へ挿入されたXbaI部位を有していた。この断片はベクターｐＵＣ１８中へクローン化された。ｐＭＩＡＣ２３と命名された最終プラスミド構築物は、４．８ｋｂHindIII断片において、アロＣの所定欠失（５４４〜１１４３位）を含む。このHindIII断片は、ｐＵＣ１８のHindIII部位に挿入される。アロ(aro)Ｃ欠失の部位には、１つのXbaI部位が存在する。
【００２８】
Ｓ．チフィＴｙ２ゲノム中へのアロＣ変異の導入
自己不活性化プラスミドｐＣＶＤ４４２（ドネンバーグ(Donnenberg)とケイパー(Kaper)、Infection and Immunity, 1991; 59:4310-4317）が、Ｓ．チフィＴｙ２のゲノム中へアロＣ欠失を導入するベクターとして使用された。アロＣ欠失を含む４．８ｋｂHindIII断片は、ｐＭＩＡＣ２３から単離し、ストラタジーン(Stratagne)ＤＮＡポリッシングキットを使用して平滑末端にした。プラスミドｐＣＶＤ４４２はSmaIによる消化によって線状化し、アルカリホスファターゼで処理し、平滑末端断片と結合した。必要とする構築物は単離されてｐＹＣＶＣ２１と表示された。
【００２９】
ｐＹＣＶＣ２１は標準的電気穿孔プロトコールを使用して、Ｓ．チフィＴｙ２中へ導入した。このプラスミドはプラスミド上の同質領域とゲノムとの間での組換え後にＴｙ２ゲノム中へ集積することができて、アンピシリン耐性形質転換体を生じた。これらの形質転換体は元の野生型アロＣと欠失アロＣ遺伝子の双方のコピーを含んでいた。アンピシリンが存在しないで、これらの種を成長させると、ｐＣＶＤ４４２ＤＮＡ配列とアロＣ遺伝子の１つのコピー、野生型コピーか欠失コピーのいずれかの損失となる第２の組換え技術が生じることとなる。この第２組換え技術を引き起したＳ．チフィＴｙ２細菌は、５％ショ糖の存在下に成長することができるアンピシリン耐性誘導体として同定された（ｐＣＶＤは発現した場合、ショ糖感受性遺伝子型となるsacＢ遺伝子を有する）。欠失アロＣ遺伝子のみを保持する種は、最初、芳香族化合物の補充がない場合、最低培地プレート上で成長できない種として同定された。アロ遺伝子型はＰＣＲ分析を使用して確認した。配列番号５および配列番号６を有するプライマーから、野生型アロＣの９９４ｂｐおよび欠失アロＣ遺伝子の４００ｂｐからなる産物を得た。得られたＰＣＲ産物の配列分析から、ＤＴＹ６、ＤＴＹ７、ＤＴＹ８、ＤＴＹ９およびＤＴＹ１０と命名された５つの単離物中に必要な欠失が存在することを確認した。これらの種は長期間保存のために−７０℃でマイクロバンクのバイアル中に貯蔵した。ＤＴＹ８種がさらなる処置のために選択された。
【００３０】
Ｓ．チフィアロ変異体ＤＴＹ８中へのssaＶ変異の導入
Ｓ．チフィのssaＶ領域を含む７．５ｋｂPstI断片をＰＣＲを使用して全ＤＮＡ調製物から増幅し、ベクターｐＣＲ２．１（Invitrogen）中へクローン化した。配列番号７および配列番号８を有する、使用したＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーは、Ｓ．チフィムリウムＳＰ１２配列として設計された。得られたプラスミド構築物はｐＴＹＳＶ２１として表わされた。
【００３１】
ssaＶ遺伝子の欠失を有するプラスミド構築物は、逆配向ＰＣＲを使用してｐＴＹＳＶ２１から誘導した。ssaＶオープンリーディングフレームの５’領域（配列番号９）および３’領域（配列番号１０）にアニールするプライマーは、Ｓ．チフィムリウムＳｐｉ２配列として表わされる。AvrII制限酵素部位が各プライマーの５’領域中へ導入され、XbaI部位が配列番号１０中に導入された。XbaI部位はssaＶ変異のための標識として働くから、制限酵素分析によって容易に検出され得る。得られたＰＣＲ産物はAvrIIによる消化に付して、骨格プラスミド分子をアガロースゲル電気泳動後に精製した。AvrII粘着末端での得られた断片の再循環が、必要とする欠失構築物ｐＹＤＳＶ１を生じた。ｐＹＤＳＶ１がssaＶオープンリーディングフレーム内に所定の１８９４ｂｐ欠失を有する５．５ｋｂPstI断片を含む。
【００３２】
自己不活性化プラスミドｐＣＶＤ４４２はＳ．チフィＴｙ２アロ変異体ＤＴＹ８のゲノム中へssaＶ欠失を導入するベクターとして使用した。ssaＶ欠失を含む５．５ｋｂPstI断片をｐＹＤＳＶ１から単離し、クレノー(Klenow)ＤＮＡポリメラーゼによる処理によって末端を平滑とした。プラスミドｐＣＶＤ４４２をSmaIによる消化によって線状化し、アルカリホスファターゼで処理し、平滑末端断片へ結合した。必要とする構築物が単離されて、ｐＶＤＳＶ２１４と命名された。
【００３３】
ｐＹＤＳＶ２１４は電気穿孔法を使用してＳ．チフィＤＴＹ８中へ挿入した。アンピシリン耐性形質転換体を選択し、次いで、アンピシリン不存在下に成長させて、ｐＣＶＤ４４２ＤＮＡ配列とssaＶ遺伝子の１つのコピー、すなわち野生型コピーまたは欠失コピーのいずれかを欠くことができた。この第２組換え技術を行った種は、アンピシリン感受性ショ糖抵抗性コロニーとして同定された。欠失ssaＶ遺伝子のみを保持する種は、ＰＣＲ分析法を使用して同定した。配列番号１１および配列番号１２を有するプライマーは野生型ssaＶ遺伝子では２４８５ｂｐおよび欠失ssaＶ遺伝子では５９１ｂｐの産物を生じた。得られたＰＣＲ産物の配列分析から、５つの個々の単離体、ＺＨ２、ＺＨ４、ＺＨ６、ＺＨ７およびＺＨ９では必要な欠失の存在が確認された。ＺＨ９種はＣＧＭＰマスターセルバンク製造のために選択した。
【００３４】
実施例２
本実施例はヒト胃腸炎に対するワクチン活性を有するＷＴ０５として表わされるＳ．チフィムリウム変異体種の調製について述べる。この種は公知ヒト病原性Ｓ．チフムリウム種ＴＭＬから誘導される。
【００３５】
ＷＴ０５構築のためのＴＭＬ
ＴＭＬは元々、胃腸炎を患う患者から単離され、バーミンガム大学のジョン・スティーブン(John Steven)博士の研究室で同定された。これはウェルカム・リサーチ・ラボラトリーズ(Wellcome Research Laboratories)で凍結乾燥され、培養番号、ＢＲＤ５１９が与えられた。この培養物をバーミンガム大学から入手した。
【００３６】
クローン化Ｓ．チフィムリウムssaＶ遺伝子の所定欠失の生成
プラスミド（プラスミド７−２、シー(Shea)ら、ＰＮＡＳ、1996;93:2593-2597）は、ｐＵＣ１８のPstI部位中へＳ．チフィムリウムＬＴ２から単離した７．５ｋｂPstI断片をクローン化して生成した。ssaＶはこの断片の中心に位置していた。  ssaＶＯＲＦの所定欠失を含むプラスミド構築物は、逆配向ＰＣＲを使用してプラスミド７−２から誘導した。ssaＶオープンリーディングフレームの５’領域（配列番号１３）および３’領域（配列番号１４）にアニールするプライマーは、Ｓ．チフィムリウムＳｐｉ２配列として設計された。AvrII制限酵素部位は各プライマーの５’領域中へ挿入され、XbaI部位が配列番号１４中に挿入された。XbaI部位はssaＶ変異のための標識(tag)として働くから、これは制限酵素分析によって簡単に検出され得る。得られたＰＣＲ産物はAvrIIによる消化に付され、バックグランドプラスミド分子がアガロース電気泳動後に精製された。AvrII粘着末端での得られた断片の再循環から、ｐＭＤＳＶ１として表わされる必要な欠失構築物を生じた。ｐＭＤＳＶ１は、ssaＶオープンリーディングフレーム内に所定の１８９４ｋｂ欠失を有する５．５ｋｂPstI断片を含み、AvrIIおよびXbaI制限酵素部位は欠失の部位に存在する。
【００３７】
自己不活性化プラスミドｐＣＶＤ４４２はＳ．チフィムリウムＴＭＬのゲノム中にssaＶ欠失を誘導するベクターとして使用した。ssaＶ欠失を含む５．５ｋｂPstI断片はｐＭＤＳＶ１から単離し、クレノー(Klenow)ＤＮＡポリメラーゼによる処理によって末端を平滑化した。プラスミドｐＣＶＤ４４２はSmaIによる消化によって線状化し、アルカリホスファターゼで処理し、平滑末端断片に結合した。必要な構築物を単離し、ｐＭＤＳＶ２２と命名した。
【００３８】
ｐＭＤＳＶ２２は接合を使用して、Ｓ．チフィムリウムＴＭＬ中へ導入した。この目的では、構築物は大腸菌Ｓ１７−１λｐｉｒ種中へ形質転換した。接合は、標準的手法に従って行った。プラスミドｐＭＤＳＶ２２はプラスミドの同質領域とゲノムとの間での組換え後にＴＭＬゲノム中に組込まれ、アンピリシン耐性接合完了体を生じた。ｍｄｓｖ−ＷＴ２として表わされる接合完了体がさらなる処置のために選択された。この接合完了体は元の野生型ssaＶ遺伝子と欠失ssaＶ遺伝子の双方のコピーを含む。これはアンピシリンの不存在下に成長させて、ｐＣＶＤ４４２ＤＮＡ配列とssaＶ遺伝子の１つのコピー、すなわち野生型コピーまたは欠失コピーのいずれかの損失となる第２組換え技術を生じることができる。この第２組換え技術を行った単離体は、５％ショ糖の存在下に成長することができるアンピシリン感受性誘導体として同定した（ｐＣＶＤ４４２は発現した際にショ糖感受性遺伝子型となるsacＢ遺伝子を担持する）。欠失ssaＶ遺伝子のみを保持する種は、ＰＣＲ分析法を使用して同定した。配列番号１５および配列番号１６を有するプライマーは、野生型ssaＶ遺伝子では２４８５ｂｐおよび欠失ssaＶ遺伝子では５９１ｂｐの産物を生じた。得られたＰＣＲ産物の配列分析から、必要とする欠失が４つの個々の単離体、ＺＨ２０、ＺＨ２３、ＺＨ２５およびＺＨ２６に存在することが確認された。これらの種は長期保存のために、ＬＢプラス１５％グルセロール中に−８０℃で貯蔵された。ＺＨ２６種がさらなる処置のために選択された。
【００３９】
Ｓ．チフィムリウムＴＭＬからのＳ．チフィムリウムアロＣ遺伝子のクローニング
ゲノムＤＮＡはＳ．チフィムリウムＴＭＬから単離し、HindIIIで開裂した。大きさが５〜６ｋｂであるHindIII断片は精製して、HindIII開裂pBluescriptへ結合した。結合混合物を使用して、大腸菌アロＣ変異体、ＡＢ２８４９を形質転換し、この種を補足する能力によってＳ．チフィムリウムアロＣ遺伝子を含むクローンを選択した。１つのクローン、ｐＤＡＣ１の分析は、これが５．２ｋｂHindIII断片を含むことを示した。
【００４０】
所定の６００ｂｐ欠失はＰＣＲを使用してクローン化アロ遺伝子内に作った。オリゴヌクレオチドプライマーはＳ．チフィアロＣ遺伝子(Acc.M27715)の公表されているＤＮＡ配列を使用して設計した。アロＣ遺伝子のＤＮＡ５’は、配列番号１９および配列番号１７を有するプライマーを使用して、ｐＤＡＣ１から増幅した。配列番号１９はベクターＤＮＡにアニールし、配列番号１７はアロＣの５’領域にアニールする。アロＣ遺伝子へのＤＮＡ３’は、配列番号２０および配列番号１８を有するプライマーを使用して増幅した。配列番号２０はベクターＤＮＡにアニールし、配列番号１８はアロＣの３’領域にアニールする。得られたＰＣＲ産物はクローニングを容易にする５’末端に挿入されたXbaI部位を有していた。この断片はベクターｐＵＣ１８中にクローン化された。最終プラスミド構築物ｐＭＩＡＣ８は、４．８ｋｂHindIII断片にアロＣの所定の欠失（Acc.M27715の５４４〜１１４３位）を含む。HindIII断片はｐＵＣ１８のHindIII部位に挿入された。１つのXbaI部位が欠失部位に存在する。
【００４１】
Ｓ．チフィムリウムssaＶ変異体ＺＨ２６中へのアロＣ変異の導入
自己不活性化プラスミドｐＣＶＤ４４２は、Ｓ．チフィムリウムＴＭＬのゲノム中へアロ欠失を導入するベクターとして使用した。アロ(aro)Ｃ欠失を含む４．８ｋｂHindIII断片はｐＭＩＡＣ８から単離し、ストラタジーン(Stratagene)ＤＮＡポリッシングキット（Part No.200409）を使用して平滑末端にした。プラスミドｐＣＶＤ４４２はSmaIを使用する消化によって線状化し、アルカリホスファターゼで処理し、平滑末端断片と結合した。必要とする構築物を単離して、ｐＭＣＶＣ１６と命名した。ｐＭＣＶＣ１６は電気穿孔法によってＳ．チフィムリウムＺＨ２６中へ導入した。アンピシリン耐性形質転換体を選択して、アンピシリン不存在下に成長させて、ｐＣＶＤＣ４４２ＤＮＡ配列とアロＣ遺伝子の１つのコピー、すなわち野生型コピーまたは欠失コピーのいずれかの損失を生じさせた。第２組換え技術を行った種は、５％ショ糖の存在下に成長することができるアンピシリン感受性誘導体として同定した。欠失アロＣ遺伝子のみを保持する種は、最初、芳香族化合物の補充がなくては最低培地プレート上で成長することができない種として同定した。アロＣ遺伝子型はＰＣＲ分析法を使用して確認した。配列番号２１および配列番号２２を有するプライマーは、野生型アロＣ遺伝子では９９４ｂｐおよび欠失アロＣ遺伝子では４００ｂｐの産物を生じた。得られたＰＣＲ産物の配列分析から、ＷＴ０５、ＷＴ０９、ＷＴ１０およびＷＴ１２と命名された４つの個々の単離物中に必要な欠失が存在すること確認した。ＷＴ０５種がＣＧＭＰマスターセルバンクの製造のために選択された。
【００４２】
実施例３
下記構築物が動物モデルで二重変異ワクチンを試験するために調製された。マウスに感染させる種として、１つおよび２つの変異が存在するＳ．チフィムリウムＳＬ１３４４を使用した。
Ｓ．チフィムリウム１２０２３ｓからのssaＶ::ａｐｈ（非極性）変異は、ＳＬ１３４４へＰ２２形質導入して１つのＳｐｉ２変異体を生じた。
アロＣ欠失／ｐＣＶＤ４４２自己不活性化ベクターｐＭＣＶＣ１６はＳ．チフィムリウムＬＢ５０１０中へ電気穿孔し、部分二倍体を得た。アロＣ欠失部分二倍体は、次いでＬＢ５０１０部分二倍体からＳＬ１３４４部分二倍体へＰ２２形質導入した。ＳＬ１３４４部分二倍体は、次いでショ糖選択法を使用して分離し、１つのアロＣ変異体を得た。
二重変異体はＬＢ５０１０からＳＬ１３４４ssaＶ::ａｐｈ中へのアロＣ欠失部分二倍体のＰ２２形質導入によって生成した。プラスミド配列は、種３を残す部分二倍体、ＳＬ１３４４ssaＶ::ａｐｈバックグランド中のアロＣ欠失変異から分析した。
【００４３】
所定アロＣ／ssaＶサルモネラ(Salmonella)変異体における前臨床薬効学的研究  アロＣ、ssaＶまたは両変異の組み合わせにおける所定変異を有するサルモネラ(Salmonella)変異体（ＳＬ１３４４種）は、弱毒化、生物体の残留性および野生型種による感染に対して免疫する能力を判断するために、ＢＡＬＢ／Ｃマウスにて広範囲に評価された。
【００４４】
実施例４
静脈内経路から免疫された動物
保護研究
ＬＢ培地中で一夜成長させ、投与のために生理食塩水に再懸濁したＳＬ１３４４アロＣ、ＳＬ１３４４ssaＶ、およびＳＬ１３４４アロＣ：ssaＶの１０5〜１０6個の生物体を使用して、１０匹のＢＡＬＢ／Ｃマウス群を静脈内から免疫した。マウスは６週間後に静脈内から投与した１０5個の野生型生物体に感染させた。静脈内から投与したこの野生型種の１０個の生物体は、マウスを死亡させるには十分である。
【００４５】
単一アロＣまたはssaＶ変異体を与えられた全てのマウスは、どのような用量にて感染された後にも一致して防御されて、実験中、健康に生存して、いかなる病気の徴候も示さなかった。二重変異体についても１０6個の微生物の免疫を受けた動物の９０％が一致して防御された。これらの動物のうち、１匹は感染後、８日目に死亡した。低用量にて免疫された動物については、たった１匹のマウスのみが感染後も生存していた。
この実験は、サルモネラssaＶ変異体、単独またはアロＣ変異と組み合わせる免疫が野生型サルモネラ種による感染に対してマウスを免疫するであろうことを示す。
【００４６】
種の持続性
マウス群に上記した３種のサルモネラ変異体の生物体１０6個を与えた。４匹のマウスを１４日までの異なった時点で死亡させて、肝臓および脾臓の生物体計数を行った。その数が各器官で生物体約５×１０5個となる１０日目まで、３種の変異体すべての数を比較した。１４日目に単一変異体と二重変異体との間に差異が示され、肝臓および脾臓において二重変異体生物体の数に対数的減少があった。
単一変異体とアロＣ／ssaＶ二重変異体との間の他の重要な差異は、二重変異体では実験中、肝臓腫瘍が存在しなかったことである。しかしながら、単一変異体で感染したマウスは１０日目と１４日目に肝臓腫瘍を発症していた。これは重要な発見であり、ワクチン調製評価においてこの変異体の組み合せの使用を強く支持する。
【００４７】
免疫原性
上記免疫されたマウスを失血させて、ＥＬＩＳＡを使用してサルモネラ全細胞に対する抗体価を測定した。３種全ては高い免疫原性であり、サルモネラに対するＩｇＧを循環する高い抗体価を誘発した。
【００４８】
実施例５
経口経路から免疫された動物
種の持続性
３種のサルモネラ変異体それぞれ５×１０9個の生物体で経口免疫したマウス群を周期的間隔をおいて死亡させて、肝臓および脾臓の生物体数を計数した。肝臓および脾臓の単一アロ変異体および単一ssaＶ変異体の数は、約２１日まではそれぞれ１０3および１０2であった。その後、その数は低下した。アロ(aro)Ｃ:ssaＶ二重変異体を投与されたマウスでは、生物体は経口免疫後、肝臓および脾臓で実質的に検出されなかった。
【００４９】
サルモネラ・チフィムリウムＴＭＬアロＣ／ssaＶ（ＷＴ０５）でワクチン摂取されたＡ−Ｊマウスの経口免疫および静脈内感染
この実験の目的は、ityrマウスのワクチン経口摂取および静脈内感染モデルにおける５×１０9個のアロＣ／ssaＶ  Ｓ．チフィムリウム(typhimurium)ＴＭＬ変異体の防御効果を確認することであった。このモデルは、これらの動物がitysバックグランドよりも感受性が低いことにおいて、サルモネラに対するヒトの応答により近いものである。
０．２ｍｌＰＢＳ容量中のＳ．チフィムリウムＴＭＬアロＣ／ssaＶ５×１０9個を６〜８週齢Ａ−Ｊマウス１０匹中に栄養管から経口摂取させた。２匹のマウスはこの時点でＰＢＳのみを与えられ、コントロール動物とした。８週間経過後、２つの免疫群に１０7個の野生型Ｓ．チフィムリウムＴＭＬを静脈内感染させた。マウスをポスト感染３０日間に観察した。
全ての動物は、野生型感染に対して一致して防御した（１００％残存、１０／１０動物生存）。ＰＢＳのみを与えられ、次いで野生型Ｓ．チフィムリウムＴＭＬに感染させたマウスはポスト感染６日目に死亡した。
ityrバックグランドでは、二重Ｓ．チフィムリウムアロＣ／ssaＶは用量５×１０9個を経口投与されたマウスを防御するようである。これは、ityrマウスが感染の感受性においてヒトサルモネラ症のより良いモデルであることから、ヒトでは重要であろう。
マウスの肝臓および脾臓における二重変異体の持続性を評価するための研究も実施した。二重変異体は約２１日目まで低濃度で持続することが見出された。２８日目までにこの変異体種はなくなっていた。
【００５０】
実施例６
ヒト臨床試験
１８名の健康なボランティアをオープンラベル非偽薬制御研究のために募集した。適当なスクリーニング後に３名のボランティアそれぞれは、単一経口用量が１０7、１０8または１０9ＣＦＵのいずれかであるＳ．チフィ(ＺＨ９またはＳ．チフィムリウムＷＴ０５を投与された。上記のように調製された微生物は、胃酸を中和するために最終容量１００ｍｌの２％（w/v）重炭酸ナトリウム溶液中で適当な用量濃度まで再懸濁した。この液体懸濁液はボランティアに経口から投与された。次いで、ボランティアを７２時間隔離し、次いで安全性および免疫原性のために免疫投与を追加して行った。
【００５１】
ワクチン摂取に関連した反応性や他の副作用について、ボランティアを観察、身体的試験によって、および日誌カードから評価した。さらに、血液、糞便および尿培養物を集めてワクシネミア(vaccinaemia)、ワクチン株の持続性および分解性について評価した。さらなる安全性データは標準的手法を用いて、血液中のＣ−反応性タンパク（ＣＲＰ）および肝機能酵素（ＡＬＴ）の濃度、全白血球細胞（ＷＢＣ）数および赤血球沈降速度（ＥＳＲ）を測定した。これらのパラメータは７日まで毎日採取した血液で測定し、次いで２８日までは１週間毎に測定した。
【００５２】
粘膜性および全身性免疫応答の分析
血液および唾液試料を免疫前に採取し、次いで免疫後、７、１４、２１日目に採取した。唾液および血清はＥＬＩＳＡによる分析まで−７０℃で凍結した。腹膜血液単核細胞を採取し、ＥＬＩＳＰＯＴ法を使用して、抗体分泌細胞（ＡＳＣ）の存在について分析した。
Ｓ．チフィＺＨ９およびＳ．チフィムリウムＷＴ０５の双方をボランティア全員に充分与えた。３回用量の各濃度でもいずれのボランティアに重大な副作用が現れず、また血液および尿培養物は試験したすべての時点でワクチン摂取を受けた者全てにおいて陰性のままであった。すなわち、Ｓ．チフィＺＨ９およびＳ．チフィムリウムＷＴ０５の双方による免疫はワクシネミア(vaccinaemia)の効果がない。これらの種のいずれかを与えられたボランティアはいずれも下痢または持続性高熱を発症せず、さらにワクチン種の安全性を示した。７日目を越えて持続性排泄またはワクシネミア(vaccinaemia)は、Ｓ．チフィＺＨ９の３回用量群またはＳ．チフィムリウムＷＴ０５の低用量（１０7個）のいずれにおいても観察されなかった。
【００５３】
Ｓ．チフィＺＨ９により誘発された粘膜性および全身性免疫応答
単一低用量（１×１０7ＣＦＵ）であるＳ．チフィＺＨ９の経口免疫は、免疫後、７日目に検出された３名のワクチン摂取者のうち２名において、Ｓ．チフィ特異的ＩｇＡ分泌ＡＳＣが刺激されていた。１４日目および２１日目の続いての試験では、ＩｇＡＡＳＣはなおも検出可能であったが、より低濃度では検出されず、また、２８日目には消失していた。ほとんど全てのワクチン摂取者では、ＡＳＣ数は７日目に最高であった。驚くべきことに、高用量（１０8ＣＦＵ）のＳ．チフィＺＨ９は３名のワクチン摂取者のうち１名のみにおいて低ＩｇＡＡＳＣ応答を示した。最高用量（１×１０9ＣＦＵ）摂取は３名のボランティアのうち２名においてＩｇＡＡＳＣが刺激された。
【００５４】
サルモネラ特異的血清抗体応答
単一低用量（１×１０7ＣＦＵ）であるＳ．チフィＺＨ９による経口免疫では、７、１４、２１および２８日目に試験した際には（ワクチン摂取者の２／３においてＩｇＡ−ＡＳＣを生成したにもかかわらず）、Ｓ．チフィＬＰＳ−特異的血清ＩｇＧを誘発できなかった。同様に、たった１／３名が非常に低濃度の鞭毛特異的ＩｇＧを産生した。しかしながら、１０8ＣＦＵの摂取は３名のボランティア全員においてＬＰＳおよび鞭毛特異的ＩｇＧの高濃度産生となった。Ｓ．チフィＬＰＳ特異的および鞭毛特異的ＩｇＧの濃度増加は、ワクチン摂取後、７日目に早くも検出され、１４日目に増加し、２８日目には高いままであった。最高用量１０9ＣＦＵもまた、３名のワクチン摂取者のうち２名において、ＬＰＳ−および鞭毛特異的ＩｇＧを刺激し、７日目と１４日目においてそれぞれ検出可能であった。
【００５５】
結論
本研究は、新規な経口腸チフスワクチン種の成分として、ssaＶ変異の利用を証明する。アロ変異だけを有するＳ．チフィ株は、所与の用量でワクシネミア(vaccinaemia)を生じたであろう。したがって、ssaＶ変異はこの初期調合剤を使用してワクシネミア(vaccinaemia)を消滅させることによって、アロ変異のみにさらなる安全性をもたらす。
【００５６】
充分に許容されていることを証明するとともに、ＺＨ９もまた、所与の３種の用量濃度全てで免疫原性であることが証明された。血清抗体を刺激することに関して、中間（１０8ＣＦＵ）および最高（１０9ＣＦＵ）用量は、１０8ＣＦＵを投与されたワクチン摂取者３／３および１０9ＣＦＵを投与されたワクチン摂取者２／３では非常に免疫原性であり、Ｓ．チフィＬＰＳおよび鞭毛特異的血清ＩｇＧの双方の高い力価を誘発することを証明した。これらの応答は、経口ワクチン摂取によって血清抗体を誘発することが一般的には難しいから、非常に有望である。
【００５７】
Ｓ．チフィ特異的血清抗体応答発生とともに、ＺＨ９もまた、腸粘膜で免疫刺激を表示するＩｇＡＡＳＣを初回抗原刺激した。ボランティア５／９全員が、用量依存性でないＳ．チフィＬＰＳ−特異的ＩｇＡ分泌細胞（ＡＳＣ）応答を誘発した。
【００５８】
ＷＴ０５もまた、充分に許容され、ワクシネミア(vaccinaemia)が検出されなかった。興味あることに、ボランティアのいずれにも下痢や胃腸炎の徴候が検出されなかった。マウスへ与えたＳ．チフィムリウムの単一アロまたはＳＰＩ２変異をもつ変異体ＴＭＬ種を使用して得た先のデータは、二重アロＣ／ssaＶ変異がヒトにおいてある局所的腸効果、例えば、下痢や腹痛を生じるであろうことを示唆していた。これらの事象がないことは、さらにアロとＳＰＩ２変異の組み合せの有用性を支持している。
【００５９】
実施例７
異種抗原担体
ssaＶ:アロ(aro)Ｃ二重変異体種が外来抗原を発現および輸送することを証明するために、ＷＴ０５を大腸菌熱不安定性エンテロトキシンＢサブユニット（ＬＴ−Ｂ）の遺伝子を発現するプラスミド（ｐＢＲＤ０２６）にて形質転換した。
ＢＡＬＢ／Ｃマウス（ｎ＝１０／群）を、１０9ＣＦＵ（２００ｍｌＰＢＳ中）のｐＢＲＤ０２６発現ＷＴ０５またはＷＴ０５ベクター種（コントロール）を０日および２８日に経口免疫した。比較のために（および陽性コントロールとして）、１群のマウス（ｎ＝５）を０日および２８日に１０μｇの精製ＬＴ（Sigma）にて経口免疫した。陰性コントロールマウス（ｎ＝５）を０日および２８日に２００μｌＰＢＳで経口免疫した。マウスを２１、２８、３５日目に尾静脈から、４２日目に心臓に穿刺して失血させ、血清と腸洗浄液（４２日目のみ）を採取し、−２０℃で貯蔵した。
【００６０】
ＷＴ０５／ＬＴ−Ｂで免疫されたマウスのうち１匹を除いて全てが、単一経口用量後、２８日目にＬＴ−特異的ＩｇＧ（力価3,000〜50,000）を誘発した。ＷＴ０５またはＰＢＳで経口免疫されたコントロールマウスのいずれもＬＴ−特異的ＩｇＧを誘発しなかった。単一用量の精製ＬＴでの経口免疫は、より高い力価のＬＴ−特異的抗体（力価6,000〜＞50,000）を誘発した。ＬＴ−Ｂ特異的血清ＩｇＧのアイソタイプが試験されたとき、ｐＢＲＤ０２６発現ＷＴ０５種は、ほとんどもっぱらＬＴ−特異的ＩｇＧ２ａを誘発し、ＴＨ１−型免疫応答に対する偏向を示した。反対に、精製ＬＴ（Sigma）で免疫されたマウスはほとんどもっぱらＬＴ−特異的ＩｇＧ１を誘発し、ＴＨ２−型応答を示した。したがって、アロ(aro)Ｃ／ssaＶ種内にＬＴ−Ｂを発現させることは、大きな免疫変調を促進する。サルモネラ(Salmonella)アロ(aro)Ｃ／ssaＶ種により発生するＴＨ−１偏向応答は、ＴＨ１−型応答が防御的である病原性生物体からの抗原が発現する際に、重要となるであろう。
【配列表】
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