(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のDNA。
（ａ）配列番号：４または６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA。
（ｂ）配列番号：３または５に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA。
（ｃ）配列番号：４または６に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、肝臓癌組織または肺癌組織において発現するが、正常肝臓組織または正常肺組織では発現しないタンパク質をコードするDNA。
（ｄ）配列番号：３または５に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、肝臓癌組織または肺癌組織において発現するが、正常肝臓組織または正常肺組織では発現しないタンパク質をコードするDNA。
【請求項２】
請求項１に記載のDNAが挿入されたベクター。
【請求項３】
請求項１に記載のDNAまたは請求項２に記載のベクターを保持する形質転換細胞。
【請求項４】
請求項１に記載のDNAによりコードされるタンパク質またはペプチド。
【請求項５】
請求項３に記載の形質転換細胞を培養し、該形質転換細胞またはその培養上清から発現させたタンパク質を回収する工程を含む、請求項４に記載のタンパク質またはペプチドの製造方法。
【請求項６】
請求項４に記載のタンパク質に対する抗体。
【請求項７】
請求項４に記載のタンパク質に結合する化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）該タンパク質またはその部分ペプチドに被検試料を接触させる工程、
（ｂ）該タンパク質またはその部分ペプチドと被検試料との結合活性を検出する工程、
（ｃ）該タンパク質またはその部分ペプチドに結合する活性を有する化合物を選択する工程、を含む方法。
【請求項８】
請求項１に記載のDNAの発現を抑制または促進する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）該DNAを発現する細胞に被検試料を接触させる工程、
（ｂ）該細胞内における該DNAの発現を検出する工程、および
（ｃ）被検試料を細胞に接触させない場合（対照）と比較して、該DNAの発現を減少または増加させる化合物を選択する工程、を含む方法。
【請求項９】
生体から採取した試料における下記（ａ）または（ｂ）に記載のDNAの発現を検出又は測定する工程を含む、癌細胞の検出方法：
（ａ）配列番号：４または６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA；および
（ｂ）配列番号：３または５に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA。
【請求項１０】
生体から採取した試料に下記（ａ）または（ｂ）に記載のDNAによりコードされるタンパク質に対する抗体を接触させる工程、および該抗体と該試料との結合活性を検出又は測定する工程を含む、癌細胞の検出方法：
（ａ）配列番号：４または６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA；および
（ｂ）配列番号：３または５に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、胎児組織や腫瘍細胞で発現が活性化している胎児性遺伝子がコードするタンパク質に関する。本発明のタンパク質は、例えば、癌に対する医薬品開発の標的分子として利用しうる。
背量技術
胎児組織には、活発に増殖を行っている未分化細胞、高度に活性化されている細胞、また新生血管内皮細胞等が多く含まれている。胎児組織におけるこれらは厳密な制御下にあり、個体の成熟に応じて抑制されていくわけだが、制御を受けるかどうかという点をのぞけば、これは固形腫瘍における状態に非常に類似した現象であるといえる。従って、胎児組織に特異的に発現している遺伝子（ｆｅｔａｌｇｅｎｅ／胎児性遺伝子）の一部は、異常増殖性や、不死化、浸潤、転移、血管新生といった固形腫瘍に特徴的な現象に関与する遺伝子である可能性が存在する。また癌以外の疾病についても、正常な生体では抑制されている胎児性遺伝子が、異常に活性化されることにより起こるものが存在することが推測される。よって、胎児性遺伝子を単離し、それらを解析することによって、癌をはじめとする様々な疾病に関与する遺伝子を探索でき得ると考えられる。さらに、その遺伝子をターゲットにした薬剤等を設計することにより、新たな作用機序による医薬品の開発が可能であると考えられる。
癌化に関与していることが推測される胎児性遺伝子として、ｓｕｒｖｉｖｉｎ（Ｎａｔ  Ｍｅｄ，３，９１７−９２１，１９９７）、ａｕｒｏｒａキナーゼ（ＥＭＢＯ  Ｊ，１７，３０５２−３０６５，１９９８）、ＬＹＡＲ（Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ，７，７３５−７４８，１９９３）といった遺伝子が最近報告されている。いずれも大腸癌や白血病細胞などにおいてその発現が活性化されており、癌化に対して重要な寄与をしているものと考えられている。実際その生理的機能として、ｓｕｒｖｉｖｉｎはアポトーシス阻害活性を持つことが、またａｕｒｏｒａキナーゼは細胞周期の調節に関与していることが示されており、いずれも癌細胞にとってその機能獲得が有利に働いていると予想される。
発明の開示
本発明は、胎児組織に特異的あるいはより強く発現している新規なタンパク質および該タンパク質をコードする遺伝子、並びにそれらの製造および用途を提供する。
これまでに癌化に関連する遺伝子を単離する方法として、癌細胞と正常細胞を直接比較し発現量の異なる遺伝子を同定するという戦略は数多く試みられてきている。しかしこの様な方法には、癌細胞の特徴の一つである遺伝子発現制御の乱れにより癌化には直接関係ない多数の遺伝子がノイズとなって単離されてしまい、重要な遺伝子の単離には至らないという問題があった。そこで、本発明者らは、まず生理的な必要性から生理的に発現が制御されている遺伝子を選び出し、それが癌という非生理的な状態において再活性化されていないかを探るという戦略を立てた。これに基づき、生理的な必要性から生理的に発現が制御されている遺伝子として胎児組織に特異的に発現する遺伝子に着目し、その単離および解析を行った。
具体的には、まず、サプレッションサブトラクティブハイブリダイゼーション法により、胎児肝臓由来ｃＤＮＡをテスター、成体肝臓由来ｃＤＮＡをドライバーとしたサブトラクションを行い、胎児肝臓に特異的あるいはより強く発現している胎児性遺伝子の探索を行った。その結果、複数の遺伝子を単離するに至った。次いで、これら胎児組織特異的に発現する遺伝子について癌細胞における発現を検討した。その結果、大腸癌や肝臓癌などの癌細胞において発現が活性化されている新規遺伝子「ｆｌｓ３５３」および「ｆｌｓ４８５」を同定することに成功した。これらの全長ｃＤＮＡのクローニングを行いその構造を決定したところ、これらがコードするタンパク質のアミノ酸配列にはいくつかの特徴的なドメイン構造は存在するものの、特に有意なホモロジーを示すタンパク質はデータベース中に見いだされなかった。本発明者らは、さらに詳細にこれら遺伝子の発現の組織特異性の検討を行った結果、これら遺伝子は種々の癌細胞において発現し、また、正常組織においては、胎児組織をはじめとする未分化な細胞や活発に分化増殖する細胞が多く含まれていると考えられる組織に特異的に発現していることを見出した。
これらの事実から、新規な胎児性遺伝子である「ｆｌｓ３５３」および「ｆｌｓ４８５」が、細胞の癌化に関与していることが予想された。従って、これら胎児性遺伝子の発現阻害剤は抗癌剤となりうることが期待されるほか、本発明の胎児性遺伝子および該遺伝子がコードするタンパク質は、腫瘍に対する医薬品開発のためのツールとして利用することが可能である。
本発明は、癌化への関連が予想される新規胎児性遺伝子「ｆｌｓ３５３」および「ｆｌｓ４８５」、ならびにそれらがコードするタンパク質、並びにそれらの製造及び用途に関し、より具体的には、
１．  下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡ、
（ａ）配列番号：２、４、または６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｂ）配列番号：１、３、または５に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ。
（ｃ）配列番号：２、４、または６に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、配列番号：２、４、または６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｄ）配列番号：１、３、または５に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号：２、４、または６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするするＤＮＡ。
２．配列番号：２、４、または６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の部分ペプチドをコードするＤＮＡ、
３．  （１）または（２）に記載のＤＮＡが挿入されたベクター、
４．  （１）若しくは（２）に記載のＤＮＡまたは（３）に記載のベクターを保持する形質転換細胞、
５．  （１）または（２）に記載のＤＮＡによりコードされるタンパク質またはペプチド、
６．  （４）に記載の形質転換細胞を培養し、該形質転換細胞またはその培養上清から発現させたタンパク質を回収する工程を含む、（５）に記載のタンパク質またはペプチドの製造方法、
７．  （５）に記載のタンパク質に対する抗体、
８．  配列番号：１、３、または５に記載の塩基配列からなるＤＮＡまたはその相補鎖とハイブリダイズし、少なくとも１５塩基の鎖長を有するヌクレオチド、
９．  （５）に記載のタンパク質に結合する化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）該タンパク質またはその部分ペプチドに被検試料を接触させる工程、
（ｂ）該タンパク質またはその部分ペプチドと被検試料との結合活性を検出する工程、
（ｃ）該タンパク質またはその部分ペプチドに結合する活性を有する化合物を選択する工程、を含む方法、
１０．  （９）に記載の方法により単離されうる、（５）に記載のタンパク質に結合する化合物、
１１．  （１）に記載のＤＮＡの発現を抑制または促進する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）該ＤＮＡを発現する細胞に被検試料を接触させる工程、
（ｂ）該細胞内における該ＤＮＡの発現を検出する工程、および
（ｃ）被検試料を細胞に接触させない場合（対照）と比較して、該ＤＮＡの発現を減少または増加させる化合物を選択する工程、を含む方法、
１２．  （１）に記載のＤＮＡの発現を抑制または促進する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）（１）に記載のＤＮＡの発現制御領域の下流に機能的に結合されたレポーター遺伝子を含むベクターが導入された細胞を提供する工程、
（ｂ）該細胞に被検試料を接触させる工程、
（ｃ）該細胞内におけるレポーター活性を検出する工程、および
（ｄ）被検試料を細胞に接触させない場合（対照）と比較して、該レポーター活性を減少または増加させる化合物を選択する工程、を含む方法、
１３．  （１１）または（１２）に記載の方法により単離しうる、（１）に記載のＤＮＡの発現を抑制または促進する化合物、
を提供するものである。
本発明は、胎児組織および腫瘍細胞で発現が活性化している新規なタンパク質「ｆｌｓ３５３」および「ｆｌｓ４８５」に関する。本発明に含まれる、新規ヒト胎児性遺伝子「ｆｌｓ３５３」のｃＤＮＡの塩基配列を配列番号：１に、また、２種類の新規ヒト胎児性遺伝子「ｆｌｓ４８５」のｃＤＮＡの塩基配列を、それぞれ配列番号：３（ｆｌｓ４８５  Ｌ）および５（ｆｌｓ４８５  Ｓ）に、これらのｃＤＮＡによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：２（ｆｌｓ３５３）、４（ｆｌｓ４８５  Ｌ）および６（ｆｌｓ４８５  Ｓ）に示す。
正常組織においてこれらの遺伝子は、胎児組織をはじめとする未分化な細胞や、活発に分化増殖する細胞が多く含まれていると考えられる組織に特異的に発現していた。また、癌細胞における発現を調べたところ、大腸癌や肝臓癌などの癌細胞において発現が活性化されていることが判明した。
胎児性遺伝子としては、ｓｕｒｖｉｖｉｎ、ａｕｒｏｒａキナーゼ、およびＬＹＡＲが、いずれも癌化に関与していることが推測されおり、それらの遺伝子の正常組織における発現は、胎児性組織、特に胎児肝臓に高く、また成体組織においては、精巣や胸腺といった活発な増殖を行っている未分化な細胞が多く存在する組織に高いがそれ以外の組織においては基本的に発現がほとんどみられないといったパターンを示すことが報告されている（Ｎａｔ  Ｍｅｄ，３，９１７−９２１，１９９７、ＥＭＢＯ  Ｊ，１７，３０５２−３０６５，１９９８、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ，７，７３５−７４８，１９９３）。これは本発明の胎児性遺伝子にほぼ共通した発現パターンであり、細胞の増殖に対する必要性からその共通性が生じていることが推測される。
癌細胞がそのような自己の増殖に有利に働く遺伝子を再び活性化させる機構については不明であるが、ａｕｒｏｒａキナーゼの場合は癌細胞において遺伝子重複が高頻度で起こっていることが示されており、これが遺伝子発現活性化の重要な原因であると予想される。これらの事実から、本発明の胎児性遺伝子も、遺伝子重複による活性化あるいはまたＤＮＡのメチル化などにより、細胞の癌化に関与している可能性が考えられる。
従って、本発明の胎児性遺伝子や該遺伝子がコードするタンパク質は、細胞分化や細胞増殖を制御する因子の精製やクローニングのためのツールとしての他、腫瘍などの疾患の治療薬や予防薬の候補化合物のスクリーニングなどの標的として好適に利用しうる。また、「ｆｌｓ３５３」および／または「ｆｌｓ４８５」遺伝子には、各種腫瘍などにおける遺伝子治療などの治療への応用も考えられる。
本発明は、また、ヒト「ｆｌｓ３５３」または「ｆｌｓ４８５」タンパク質と機能的に同等なタンパク質を包含する。このようなタンパク質には、例えば、ヒト「ｆｌｓ３５３」または「ｆｌｓ４８５」タンパク質に対応する他の生物のホモログタンパク質やヒト「ｆｌｓ３５３」または「ｆｌｓ４８５」タンパク質の変異体が含まれる。
本発明において「機能的に同等」とは、対象となるタンパク質が癌に関連した機能を有することを指す。癌に関連した機能を有するか否かは、例えば、癌細胞株、胎児性組織、その他活発な増殖を行う細胞を含む組織での高い発現特性により特徴付けることができる。
あるタンパク質と機能的に同等なタンパク質を調製するための、当業者によく知られた方法としては、タンパク質に変異を導入する方法が知られている。例えば、当業者であれば、部位特異的変異誘発法（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｅ  １５２，２７１−２７５、Ｚｏｌｌｅｒ，ＭＪ，ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００，４６８−５００、Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２，９４４１−９４５６、Ｋｒａｍｅｒ  Ｗ，ａｎｄ  Ｆｒｉｔｚ  ＨＪ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４，３５０−３６７、Ｋｕｎｋｅｌ，ＴＡ（１９８５）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．８２，４８８−４９２、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８８）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．８５，２７６３−２７６６）などを用いて、ヒト「ｆｌｓ３５３」または「ｆｌｓ４８５」タンパク質のアミノ酸に適宜変異を導入することによりヒト「ｆｌｓ３５３」または「ｆｌｓ４８５」タンパク質と機能的に同等なタンパク質を調製することができる。また、アミノ酸の変異は自然界においても生じうる。このように、ヒト「ｆｌｓ３５３」または「ｆｌｓ４８５」タンパク質のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が異なるアミノ酸配列を有し、ヒト「ｆｌｓ３５３」または「ｆｌｓ４８５」タンパク質と機能的に同等なタンパク質もまた本発明のタンパク質に含まれる。このような変異体において、変異するアミノ酸数は、通常、１０アミノ酸以内であり、好ましくは、５アミノ酸以内であり、さらに好ましくは、３アミノ酸以内であると考えられる。
あるアミノ酸配列に対する１又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するタンパク質がその生物学的活性を維持することはすでに知られている（Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８４）８１，５６６２−５６６６、Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．＆  Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８２）１０，６４８７−６５００、Ｗａｎｇ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２４，１４３１−１４３３、Ｄａｌｂａｄｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８２）７９，６４０９−６４１３）。
また、変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ、Ｍ）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ離（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。
ヒト「ｆｌｓ３５３」または「ｆｌｓ４８５」タンパク質のアミノ酸配列（配列番号：２、４、または６）に１又は複数個のアミノ酸残基が付加されたタンパク質としては、例えば、ヒト「ｆｌｓ３５３」または「ｆｌｓ４８５」タンパク質を含む融合タンパク質が挙げられる。融合タンパク質は、ヒト「ｆｌｓ３５３」または「ｆｌｓ４８５」タンパク質と他のペプチド又はタンパク質とが融合したものであり、本発明に含まれる。融合タンパク質を作製する方法は、本発明のヒト「ｆｌｓ３５３」または「ｆｌｓ４８５」タンパク質をコードするＤＮＡと他のペプチド又はタンパク質をコードするＤＮＡをフレームが一致するように連結してこれを発現ベクターに導入し、宿主で発現させればよく、当業者に公知の手法を用いることができる。本発明のタンパク質との融合に付される他のペプチド又はタンパク質としては、特に限定されない。
本発明のタンパク質との融合に付される他のペプチドとしては、例えば、ＦＬＡＧ（Ｈｏｐｐ，Ｔ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８８）６，１２０４−１２１０）、６個のＨｉｓ（ヒスチジン）残基からなる６×Ｈｉｓ、１０×Ｈｉｓ、インフルエンザ凝集素（ＨＡ）、ヒトｃ−ｍｙｃの断片、ＶＳＶ−ＧＰの断片、ｐ１８ＨＩＶの断片、Ｔ７−ｔａｇ、ＨＳＶ−ｔａｇ、Ｅ−ｔａｇ、ＳＶ４０Ｔ抗原の断片、ｌｃｋ  ｔａｇ、α−ｔｕｂｕｌｉｎの断片、Ｂ−ｔａｇ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃの断片等の公知のペプチドを使用することができる。また、本発明のタンパク質との融合に付される他のタンパク質としては、例えば、ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）、ＨＡ（インフルエンザ凝集素）、イムノグロブリン定常領域、β−ガラクトシダーゼ、ＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）等が挙げられる。
市販されているこれらペプチドまたはタンパク質をコードするＤＮＡを本発明のタンパク質をコードするＤＮＡと融合させ、これにより調製された融合ＤＮＡを発現させることにより、融合タンパク質を調製することができる。
また、あるタンパク質と機能的に同等なタンパク質を調製する当業者によく知られた他の方法としては、ハイブリダイゼーション技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．，９．４７−９．５８，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．ｐｒｅｓｓ，１９８９）を利用する方法が挙げられる。即ち、当業者であれば、ヒト「ｆｌｓ３５３」または「ｆｌｓ４８５」タンパク質をコードするＤＮＡ配列（配列番号：１、３、または５）もしくはその一部を基に、これと相同性の高いＤＮＡを単離して、該ＤＮＡからヒト「ｆｌｓ３５３」または「ｆｌｓ４８５」タンパク質と機能的に同等なタンパク質を単離することも通常行いうることである。このように、ヒト「ｆｌｓ３５３」または「ｆｌｓ４８５」タンパク質をコードするＤＮＡもしくはその一部からなるＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡがコードするタンパク質であって、ヒト「ｆｌｓ３５３」または「ｆｌｓ４８５」タンパク質と機能的に同等なタンパク質もまた本発明のタンパク質に含まれる。このようなタンパク質としては、例えば、ヒト以外の哺乳動物のホモログ（例えば、サル、ラット、マウス、ウサギ、ウシの遺伝子がコードするタンパク質）が挙げられる。ヒト「ｆｌｓ３５３」または「ｆｌｓ４８５」タンパク質をコードするＤＮＡと相同性の高いｃＤＮＡを、動物から単離する場合、特に胎児組織、特に胎児の肝臓や腎臓を用いることが好ましいと考えられる。
ヒト「ｆｌｓ３５３」または「ｆｌｓ４８５」タンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするＤＮＡを単離するためのハイブリダイゼーションの条件としては、当業者であれば適宜選択することができる。一例を示せば、以下の如くである。即ち、「ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ」（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を用い、５５℃で３０分以上プレハイブリダイゼーションを行った後、標識したプローブを添加し、３７℃から５５℃で１時間以上保温することによりハイブリダイゼーションを行う。その後、２ｘＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中、室温で２０分の洗浄を３回、次いで、１ｘＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中、３７℃で２０分の洗浄を１回行う。
より好ましい条件（よりストリンジェントな条件）としては、「ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ」（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を用い、６０℃で３０分以上プレハイブリダイゼーションを行った後、標識したプローブを添加し、６０℃で１時間以上保温することによりハイブリダイゼーションを行う。その後、２ｘＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中、室温で２０分の洗浄を３回、次いで、１ｘＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中、５０℃で２０分の洗浄を２回行う。
さらに好ましい条件（さらにストリンジェントな条件）としては、「ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ」（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を用い、６８℃で３０分以上プレハイブリダイゼーションを行った後、標識したプローブを添加し、６８℃で１時間以上保温することによりハイブリダイゼーションを行う。その後、２ｘＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中、室温で２０分の洗浄を３回、次いで、０．１ｘＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中、５０℃で２０分の洗浄を２回行う。
但し、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。また、ハイブリダイゼーションにかえて、ヒト「ｆｌｓ３５３」または「ｆｌｓ４８５」タンパク質をコードするＤＮＡ（配列番号：１、３、または５）の配列情報を基に合成したプライマーを用いる遺伝子増幅法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を利用して単離することも可能である。
これらハイブリダイゼーション技術または遺伝子増幅技術により単離されるＤＮＡがコードするヒト「ｆｌｓ３５３」または「ｆｌｓ４８５」タンパク質と機能的に同等なタンパク質は、通常、ヒト「ｆｌｓ３５３」または「ｆｌｓ４８５」タンパク質とアミノ酸配列において高い相同性を有する。高い相同性とは、通常、６０％以上の相同性、好ましくは７０％以上の相同性、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を指す。タンパク質の相同性を決定するには、文献（Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８３）８０，７２６−７３０）に記載のアルゴリズムにしたがえばよい。
本発明のタンパク質は、後述するそれを産生する細胞や宿主あるいは精製方法により、アミノ酸配列、分子量、等電点又は糖鎖の有無や形態などが異なり得る。しかしながら、得られたタンパク質が、本発明のヒト「ｆｌｓ３５３」または「ｆｌｓ４８５」タンパク質（配列番号：２，４，または６）と同等の機能を有している限り、本発明に含まれる。
本発明のタンパク質は、当業者に公知の方法により、組み換えタンパク質として、また天然のタンパク質として調製することが可能である。組み換えタンパク質であれば、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ（例えば配列番号：１、３、または５に記載の塩基配列を有するＤＮＡ）を、適当な発現ベクターに組み込み、これを適当な宿主細胞に導入して得た形質転換体を回収し、抽出物を得た後、イオン交換、逆相、ゲル濾過などのクロマトグラフィー、あるいは本発明のタンパク質に対する抗体をカラムに固定したアフィニティークロマトグラフィーにかけることにより、または、さらにこれらのカラムを複数組み合わせることにより精製し、調製することが可能である。
また、本発明のタンパク質をグルタチオンＳトランスフェラーゼタンパク質との融合タンパク質として、あるいはヒスチジンを複数付加させた組み換えタンパク質として宿主細胞（例えば、動物細胞や大腸菌など）内で発現させた場合には、発現させた組み換えタンパク質はグルタチオンカラムあるいはニッケルカラムを用いて精製することができる。
融合タンパク質の精製後、必要に応じて融合タンパク質のうち目的のタンパク質以外の領域を、トロンビンまたはファクターＸａなどにより切断し、除去することも可能である。天然のタンパク質であれば、当業者に周知の方法、例えば、本発明のタンパク質を発現している組織や細胞の抽出物に対し、後述するヒト「ｆｌｓ３５３」または「ｆｌｓ４８５」タンパク質に結合する抗体が結合したアフィニティーカラムを作用させて精製することにより単離することができる。抗体はポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。
本発明は、また、本発明のタンパク質の部分ペプチドを包含する。本発明のタンパク質に特異的なアミノ酸配列からなる部分ペプチドは、少なくとも７アミノ酸、好ましくは８アミノ酸以上、さらに好ましくは９アミノ酸以上のアミノ酸配列からなる。該部分ペプチドは、例えば、本発明のタンパク質に対する抗体の作製、本発明のタンパク質に結合する化合物のスクリーニングや、本発明のタンパク質の促進剤や阻害剤のスクリーニングに利用し得る。
本発明の部分ペプチドは、遺伝子工学的手法、公知のペプチド合成法、あるいは本発明のタンパク質を適切なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチド合成法としては、たとえば固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。
また、本発明は、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡに関する。本発明のＤＮＡは、上述したような本発明のタンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏやｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける生産に利用される他、例えば、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の異常に起因する疾患の遺伝子治療などへの応用も考えられる。本発明のＤＮＡは、本発明のタンパク質をコードしうるものであれば、いかなる形態でもよい。即ち、ｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡであるか、ゲノムＤＮＡであるか、化学合成ＤＮＡであるかなどを問わない。また、本発明のタンパク質をコードしうる限り、遺伝暗号の縮重に基づく任意の塩基配列を有するＤＮＡが含まれる。
本発明のＤＮＡは、当業者に公知の方法により調製することができる。例えば、本発明のタンパク質を発現している細胞よりｃＤＮＡライブラリーを作製し、本発明のＤＮＡの配列（例えば、配列番号：１、３、または５）の一部をプローブにしてハイブリダイゼーションを行うことにより調製できる。ｃＤＮＡライブラリーは、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載の方法により調製してもよいし、市販のＤＮＡライブラリーを用いてもよい。また、本発明のタンパク質を発現している細胞よりＲＮＡを調製し、本発明のＤＮＡの配列（例えば、配列番号：１、３、または５）に基づいてオリゴＤＮＡを合成し、これをプライマーとして用いてＰＣＲ反応を行い、本発明のタンパク質をコードするｃＤＮＡを増幅させることにより調製することも可能である。
また、得られたｃＤＮＡの塩基配列を決定することにより、それがコードする翻訳領域を決定でき、本発明のタンパク質のアミノ酸配列を得ることができる。また、得られたｃＤＮＡをプローブとしてゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、ゲノムＤＮＡを単離することができる。
具体的には、次のようにすればよい。まず、本発明のタンパク質を発現する細胞、組織、臓器（例えば、胎児の肝臓や腎臓、癌細胞株など）から、ｍＲＮＡを単離する。ｍＲＮＡの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７９）１８，５２９４−５２９９）、ＡＧＰＣ法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．ａｎｄ  Ｓａｃｃｈｉ，Ｎ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８７）１６２，１５６−１５９）等により全ＲＮＡを調製し、ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等を使用して全ＲＮＡからｍＲＮＡを精製する。また、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いることによりｍＲＮＡを直接調製することもできる。
得られたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡの合成は、ＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（生化学工業）等を用いて行うこともできる。また、本明細書に記載されたプライマー等を用いて、５’−Ａｍｐｌｉ  ＦＩＮＤＥＲ  ＲＡＣＥ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）およびポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＰＣＲ）を用いた５’−ＲＡＣＥ法（Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８）８５，８９９８−９００２；Ｂｅｌｙａｖｓｋｙ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８９）１７，２９１９−２９３２）にしたがい、ｃＤＮＡの合成および増幅を行うことができる。
得られたＰＣＲ産物から目的とするＤＮＡ断片を調製し、ベクターＤＮＡと連結する。さらに、これより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。目的とするＤＮＡの塩基配列は、公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法により確認することができる。
また、本発明のＤＮＡにおいては、発現に使用する宿主のコドン使用頻度を考慮して、より発現効率の高い塩基配列を設計することができる（Ｇｒａｎｔｈａｍ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｅｌｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８１）９，ｐ４３−ｐ７４）。また、本発明のＤＮＡは、市販のキットや公知の方法によって改変することができる。改変としては、例えば、制限酵素による消化、合成オリゴヌクレオチドや適当なＤＮＡフラグメントの挿入、リンカーの付加、開始コドン（ＡＴＧ）及び／又は終止コドン（ＴＡＡ、ＴＧＡ、又はＴＡＧ）の挿入等が挙げられる。
本発明のＤＮＡは、具体的には、配列番号：１の塩基配列において４７２位の塩基Ａから２７１２位の塩基ＣからなるＤＮＡ、配列番号：３の塩基配列において２４７位の塩基Ａから１３０５位の塩基ＧからなるＤＮＡ、および配列番号：５の塩基配列において２５４位の塩基Ａから１１５９位の塩基ＧからなるＤＮＡ、を包含する。
本発明のＤＮＡはまた、配列番号：１、３、または５に示す塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであり、且つ上記本発明のタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするＤＮＡを含む。
ストリンジェントな条件としては、当業者であれば適宜選択することができるが、例えば低ストリンジェントな条件が挙げられる。またより好ましくは、高ストリンジェントな条件が挙げられる。これらの条件は、前記の通りである。上記のハイブリダイズするＤＮＡは、好ましくはｃＤＮＡまたは染色体ＤＮＡである。
また、本発明は、本発明のＤＮＡが挿入されたベクターに関する。本発明のベクターとしては、宿主細胞内において本発明のＤＮＡを保持したり、本発明のタンパク質を発現させるために有用である。
ベクターとしては、例えば、大腸菌を宿主とする場合には、ベクターを大腸菌（例えば、ＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、ＸＬ１Ｂｌｕｅ）などで大量に増幅させ大量調製するために、大腸菌で増幅されるための「ｏｒｉ」をもち、さらに形質転換された大腸菌の選抜遺伝子（例えば、なんらかの薬剤（アンピシリンやテトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフェニコール）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すれば特に制限はない。ベクターの例としては、Ｍ１３系ベクター、ｐＵＣ系ベクター、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔなどが挙げられる。また、ｃＤＮＡのサブクローニング、切り出しを目的とした場合、上記ベクターの他に、例えば、ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＤＩＲＥＣＴ、ｐＴ７などが挙げられる。本発明のタンパク質を生産する目的においてベクターを使用する場合には、特に、発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、例えば、大腸菌での発現を目的とした場合は、ベクターが大腸菌で増幅されるような上記特徴を持つほかに、宿主をＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、ＸＬ１−Ｂｌｕｅなどの大腸菌とした場合においては、大腸菌で効率よく発現できるようなプロモーター、例えば、ｌａｃＺプロモーター（Ｗａｒｄら，Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３４１，５４４−５４６；ＦＡＳＥＢ  Ｊ．（１９９２）６，２４２２−２４２７）、ａｒａＢプロモーター（Ｂｅｔｔｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４０，１０４１−１０４３）、またはＴ７プロモーターなどを持っていることが不可欠である。このようなベクターとしては、上記ベクターの他にｐＧＥＸ−５Ｘ−１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、「ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ  ｓｙｓｔｅｍ」（Ｑｉａｇｅｎ社製）、ｐＥＧＦＰ、またはｐＥＴ（この場合、宿主はＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現しているＢＬ２１が好ましい）などが挙げられる。
また、ベクターには、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列が含まれていてもよい。タンパク質分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、ｐｅ１Ｂシグナル配列（Ｌｅｉ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８７）１６９，４３７９）を使用すればよい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法を用いて行うことができる。
大腸菌以外にも、例えば、本発明のタンパク質を製造するために、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）や、ｐＥＧＦ−ＢＯＳ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１９９０，１８（１７），ｐ５３２２）、ｐＥＦ、ｐＣＤＭ８）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Ｂａｃ−ｔｏ−ＢＡＣ  ｂａｃｕｌｏｖａｉｒｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ」（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）、ｐＢａｃＰＡＫ８）、植物由来の発現ベクター（例えばｐＭＨ１、ｐＭＨ２）、動物ウィルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＨＳＶ、ｐＭＶ、ｐＡｄｅｘＬｃｗ）、レトロウィルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＺＩｐｎｅｏ）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Ｐｉｃｈｉａ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔ」（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＮＶ１１、ＳＰ−Ｑ０１）、枯草菌由来の発現ベクター（例えば、ｐＰＬ６０８、ｐＫＴＨ５０）が挙げられる。
ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えばＳＶ４０プロモーター（Ｍｕｌｌｉｇａｎら，Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１０８）、ＭＭＬＶ−ＬＴＲプロモーター、ＥＦ１αプロモーター（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９０）１８，５３２２）、ＣＭＶプロモーターなどを持っていることが不可欠であり、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子（例えば、薬剤（ネオマイシン、Ｇ４１８など）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すればさらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、ｐＭＡＭ、ｐＤＲ２、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＯＰＲＳＶ、ｐＯＰ１３などが挙げられる。
さらに、遺伝子を安定的に発現させ、かつ、細胞内での遺伝子のコピー数の増幅を目的とする場合には、核酸合成経路を欠損したＣＨＯ細胞にそれを相補するＤＨＦＲ遺伝子を有するベクター（例えば、ｐＣＨＯＩなど）を導入し、メトトレキセート（ＭＴＸ）により増幅させる方法が挙げられ、また、遺伝子の一過性の発現を目的とする場合には、ＳＶ４０  Ｔ抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つＣＯＳ細胞を用いてＳＶ４０の複製機転を持つベクター（ｐｃＤなど）で形質転換する方法が挙げられる。
一方、動物の生体内で本発明のＤＮＡを発現させる方法としては、本発明のＤＮＡを適当なベクターに組み込み、レトロウィルス法、リポソーム法、カチオニックリポソーム法、アデノウィルス法などにより生体内に導入する方法などが挙げられる。これにより、本発明の「ｆｌｓ３５３」または「ｆｌｓ４８５」遺伝子の変異に起因する疾患に対する遺伝子治療を行うことが可能である。用いられるベクターとしては、例えば、アデノウィルスベクター（例えばｐＡｄｅｘｌｃｗ）やレトロウィルスベクター（例えばｐＺＩＰｎｅｏ）などが挙げられるが、これらに制限されない。ベクターへの本発明のＤＮＡの挿入などの一般的な遺伝子操作は、常法に従って行うことが可能である（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，５．６１−５．６３）。生体内への投与は、ｅｘ  ｖｉｖｏ法であっても、ｉｎ  ｖｉｖｏ法であってもよい。
また、本発明は、本発明のベクターが導入された宿主細胞に関する。本発明のベクターが導入される宿主細胞としては特に制限はなく、例えば、大腸菌や種々の動物細胞などを用いることが可能である。本発明の宿主細胞は、例えば、本発明のタンパク質の製造や発現のための産生糸として使用することができる。タンパク質製造のための産生糸は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの産生系がある。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの産生糸としては、真核細胞を使用する産生糸や原核細胞を使用する産生糸が挙げられる。
真核細胞を使用する場合、例えば、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を宿主に用いることができる。動物細胞としては、哺乳類細胞、例えば、ＣＨＯ（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９５）１０８，９４５）、ＣＯＳ、３Ｔ３、ミエローマ、ＢＨＫ（ｂａｂｙ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｋｉｄｎｅｙ）、ＨｅＬａ、Ｖｅｒｏ、両生類細胞、例えばアフリカツメガエル卵母細胞（Ｖａｌｌｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９１，３５８−３４０）、あるいは昆虫細胞、例えば、ｓｆ９、ｓｆ２１、Ｔｎ５が知られている。ＣＨＯ細胞としては、特に、ＤＨＦＲ遺伝子を欠損したＣＨＯ細胞であるｄｈｆｒ−ＣＨＯ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８０）７７，４２１６−４２２０）やＣＨＯ  Ｋ−１（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９６８）６０，１２７５）を好適に使用することができる。動物細胞において、大量発現を目的とする場合には特にＣＨＯ細胞が好ましい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、カチオニックリボソームＤＯＴＡＰ（ベーリンガーマンハイム社製）を用いた方法、エレクトロポーレーション法、リポフェクションなどの方法で行うことが可能である。
植物細胞としては、例えば、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）由来の細胞がタンパク質生産系として知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、糸状菌、例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、例えば、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）が知られている。
原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生糸がある。細菌細胞としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、例えば、ＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１等が挙げられ、その他、枯草菌が知られている。
これらの細胞を目的とするＤＮＡにより形質転換し、形質転換された細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することによりタンパク質が得られる。培養は、公知の方法に従い行うことができる。例えば、動物細胞の培養液として、例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＩＭＤＭを使用することができる。その際、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできるし、無血清培養してもよい。培養時のｐＨは、約６〜８であるのが好ましい。培養は、通常、約３０〜４０℃で約１５〜２００時間行い、必要に応じて培地の交換、通気、攪拌を加える。
一方、ｉｎ  ｖｉｖｏでタンパク質を産化させる系としては、例えば、動物を使用する産生糸や植物を使用する産生糸が挙げられる。これらの動物又は植物に目的とするＤＮＡを導入し、動物又は植物の体内でタンパク質を産化させ、回収する。本発明における「宿主」とは、これらの動物、植物を包含する。
動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生糸がある。哺乳類動物としては、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ウシを用いることができる（Ｖｉｃｋｉ  Ｇｌａｓｅｒ，ＳＰＥＣＴＲＵＭ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９３）。また、哺乳類動物を用いる場合、トランスジェニック動物を用いることができる。
例えば、目的とするＤＮＡを、ヤギβカゼインのような乳汁中に固有に産生されるタンパク質をコードする遺伝子との融合遺伝子として調製する。次いで、この融合遺伝子を含むＤＮＡ断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ移植する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ又はその子孫が産生する乳汁から、目的のタンパク質を得ることができる。トランスジェニックヤギから産生されるタンパク質を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ｅｂｅｒｔ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９４）１２，６９９−７０２）。
また、昆虫としては、例えばカイコを用いることができる。カイコを用いる場合、目的のタンパク質をコードするＤＮＡを挿入したバキュロウィルスをカイコに感染させることにより、このカイコの体液から目的のタンパク質を得ることができる（Ｓｕｓｕｍｕ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１５，５９２−５９４）。
さらに、植物を使用する場合、例えばタバコを用いることができる。タバコを用いる場合、目的とするタンパク質をコードするＤＮＡを植物発現用ベクター、例えばｐＭＯＮ  ５３０に挿入し、このベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えば、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）に感染させ、本タバコの葉より所望のポリペプチドを得ることができる（Ｊｕｌｉａｎ  Ｋ．−Ｃ．Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）２４，１３１−１３８）。
これにより得られた本発明のタンパク質は、宿主細胞内または細胞外（培地など）から単離し、実質的に純粋で均一なタンパク質として精製することができる。タンパク質の分離、精製は、通常のタンパク質の精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせればタンパク質を分離、精製することができる。
クロマトグラフィーとしては、例えばアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｄａｎｉｅｌ  Ｒ．Ｍａｒｓｈａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６）。これらのクロマトグラフィーは、液相クロマトグラフィー、例えばＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。本発明は、これらの精製方法を用い、高度に精製されたタンパク質も包含する。
なお、タンパク質を精製前又は精製後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり部分的にペプチドを除去することもできる。タンパク質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グルコシダーゼなどが用いられる。
また、本発明は、本発明のタンパク質と結合する抗体に関する。本発明の抗体の形態には、特に制限はなく、ポリクローナル抗体の他、モノクローナル抗体も含まれる。また、ウサギなどの免疫動物に本発明のタンパク質を免疫して得た抗血清、すべてのクラスのポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、さらにヒト抗体や遺伝子組み換えによるヒト型化抗体も含まれる。
抗体取得の感作抗原として使用される本発明のタンパク質は、その由来となる動物種に制限されないが哺乳動物、例えばヒト、マウス又はラット由来のタンパク質が好ましく、特にヒト由来のタンパク質が好ましい。ヒト由来のタンパク質は、本明細書に開示される遺伝子配列又はアミノ酸配列を用いて得ることができる。
本発明において、感作抗原として使用されるタンパク質は、完全なタンパク質であってもよいし、また、タンパク質の部分ペプチドであってもよい。タンパク質の部分ペプチドとしては、例えば、タンパク質のアミノ基（Ｎ）末端断片やカルボキシ（Ｃ）末端断片が挙げられる。本明細書で述べる「抗体」とはタンパク質の全長又は断片に反応する抗体を意味する。
本発明のタンパク質又はその断片をコードする遺伝子を公知の発現ベクター系に挿入し、該ベクターで本明細書で述べた宿主細胞を形質転換させ、該宿主細胞内外から目的のタンパク質又はその断片を公知の方法で得て、これらを感作抗原として用いればよい。また、タンパク質を発現する細胞又はその溶解物あるいは化学的に合成した本発明のタンパク質を感作抗原として使用してもよい。
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的には、げっ歯目、ウサギ目、霊長目の動物が使用される。
げっ歯目の動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター等が使用される。ウサギ目の動物としては、例えば、ウサギが使用される。霊長目の動物としては、例えば、サルが使用される。サルとしては、狭鼻下目のサル（旧世界ザル）、例えば、カニクイザル、アカゲザル、マントヒヒ、チンパンジー等が使用される。
感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。一般的方法としては、感作抗原を哺乳動物の腹腔内又は皮下に注射する。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものに対し、所望により通常のアジュバント、例えば、フロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に投与する。さらに、その後、フロイント不完全アジュバントに適量混合した感作抗原を、４〜２１日毎に数回投与することが好ましい。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することができる。このように免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを常法により確認する。
ここで、本発明のタンパク質に対するポリクローナル抗体を得るには、血清中の所望の抗体レベルが上昇したことを確認した後、抗原を感作した哺乳動物の血液を取り出す。この血液から公知の方法により血清を分離する。ポリクローナル抗体としては、ポリクローナル抗体を含む血清を使用してもよいし、必要に応じこの血清からポリクローナル抗体を含む画分をさらに単離して、これを使用してもよい。例えば、本発明のタンパク質をカップリングさせたアフィニティーカラムを用いて、本発明のタンパク質のみを認識する画分を得て、さらにこの画分をプロテインＡあるいはプロテインＧカラムを利用して精製することにより、免疫グロブリンＧあるいはＭを調製することができる。
モノクローナル抗体を得るには、上記抗原を感作した哺乳動物の血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞を取り出し、細胞融合に付せばよい。この際、細胞融合に使用される好ましい免疫細胞として、特に脾細胞が挙げられる。前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としては、好ましくは哺乳動物のミエローマ細胞、より好ましくは、薬剤による融合細胞選別のための特性を獲得したミエローマ細胞が挙げられる。
前記免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合は基本的には公知の方法、例えば、ミルステインらの方法（Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８１）７３，３−４６）等に準じて行うことができる。
細胞融合により得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えば、ＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。当該ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間、通常、数日〜数週間継続して行う。次いで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよびクローニングを行う。
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球、例えばＥＢウィルスに感染したヒトリンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏでタンパク質、タンパク質発現細胞又はその溶解物で感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞、例えばＵ２６６と融合させ、タンパク質への結合活性を有する所望のヒト抗体を産生するハイブリドーマを得ることもできる（特開昭６３−１７６８８号公報）。
次いで、得られたハイブリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウスより腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロテインＡ、プロテインＧカラム、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー、本発明のタンパク質をカップリングしたアフィニティーカラムなどにより精製することで調製することが可能である。本発明の抗体は、本発明のタンパク質の精製、検出に用いられる他、本発明のタンパク質のアゴニストやアンタゴニストの候補になる。また、この抗体を本発明のタンパク質が関与する疾患の抗体治療へ応用することも考えられる。得られた抗体を人体に投与する目的（抗体治療）で使用する場合には、免疫原性を低下させるため、ヒト抗体やヒト型抗体が好ましい。
例えば、ヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジェニック動物に抗原となるタンパク質、タンパク質発現細胞又はその溶解物を免疫して抗体産生細胞を取得し、これをミエローマ細胞と融合させたハイブリドーマを用いてタンパク質に対するヒト抗体を取得することができる（国際公開番号ＷＯ９２−０３９１８、ＷＯ９３−２２２７、ＷＯ９４−０２６０２、ＷＯ９４−２５５８５、ＷＯ９６−３３７３５およびＷＯ９６−３４０９６参照）。
ハイブリドーマを用いて抗体を産生する以外に、抗体を産生する感作リンパ球等の免疫細胞を癌遺伝子（ｏｎｃｏｇｅｎｅ）により不死化させた細胞を用いてもよい。
このように得られたモノクローナル抗体はまた、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型抗体として得ることができる（例えば、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，Ｃ．Ａ．Ｋ．ａｎｄ  Ｌａｒｒｉｃｋ，Ｊ．Ｗ．，ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ  ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ  ｂｙ  ＭＡＣＭＩＬＬＡＮ  ＰＵＢＬＩＳＨＥＲＳ  ＬＴＤ，１９９０参照）。組換え型抗体は、それをコードするＤＮＡをハイブリドーマ又は抗体を産生する感作リンパ球等の免疫細胞からクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させる。本発明は、この組換え型抗体を包含する。
さらに、本発明の抗体は、本発明のタンパク質に結合する限り、その抗体断片や抗体修飾物であってよい。例えば、抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ′）２、Ｆｖ又はＨ鎖とＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８）８５，５８７９−５８８３）が挙げられる。具体的には、抗体を酵素、例えば、パパイン、ペプシンで処理し抗体断片を生成させるか、又は、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させる（例えば、Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１５２，２９６８−２９７６；Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．ａｎｄ  Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ａ．Ｈ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８９）１７８，４７６−４９６；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．ａｎｄ  Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８９）１７８，４９７−５１５；Ｌａｍｏｙｉ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８６）１２１，６５２−６６３；Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８６）１２１，６６３−６６９；Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，Ｂ．Ｗ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９１）９，１３２−１３７参照）。
抗体修飾物として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる。本発明の「抗体」にはこれらの抗体修飾物も包含される。このような抗体修飾物を得るには、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。これらの方法はこの分野において既に確立されている。
また、本発明の抗体は、公知の技術を使用して非ヒト抗体由来の可変領域とヒト抗体由来の定常領域からなるキメラ抗体又は非ヒト抗体由来のＣＤＲ（相補性決定領域）とヒト抗体由来のＦＲ（フレームワーク領域）及び定常領域からなるヒト型化抗体として得ることができる。
前記のように得られた抗体は、均一にまで精製することができる。本発明で使用される抗体の分離、精製は通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよい。例えば、アフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜選択、組み合わせれば、抗体を分離、精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）が、これらに限定されるものではない。
アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムが挙げられる。例えば、プロテインＡカラムを用いたカラムとして、Ｈｙｐｅｒ  Ｄ，ＰＯＲＯＳ，Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等が挙げられる。
アフィニティークロマトグラフィー以外のクロマトグラフィーとしては、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｄａｎｉｅｌ  Ｒ．Ｍａｒｓｈａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６）。これらのクロマトグラフィーはＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。
また、本発明の抗体の抗原結合活性を測定する方法として、例えば、吸光度の測定、酵素結合免疫吸着検定法（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ；ＥＬＩＳＡ）、ＥＩＡ（酵素免疫測定法）、ＲＩＡ（放射免疫測定法）あるいは蛍光抗体法を用いることができる。ＥＬＩＳＡを用いる場合、本発明の抗体を固相化したプレートに本発明のタンパク質を添加し、次いで目的の抗体を含む試料、例えば、抗体産生細胞の培養上清や精製抗体を加える。酵素、例えば、アルカリフォスファターゼ等で標識した抗体を認識する二次抗体を添加し、プレートをインキュベーションし、次いで洗浄した後、ｐ−ニトロフェニル燐酸などの酵素基質を加えて吸光度を測定することで抗原結合活性を評価することができる。タンパク質としてタンパク質の断片、例えばそのＣ末端からなる断片あるいはＮ末端からなる断片を使用してもよい。本発明の抗体の活性評価には、ＢＩＡｃｏｒｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）を使用することができる。
これらの手法を用いることにより、本発明の抗体と試料中に含まれる本発明のタンパク質が含まれると予想される試料とを接触せしめ、該抗体と該タンパク質との免疫複合体を検出又は測定することからなる、本発明のタンパク質の検出又は測定方法を実施することができる。
本発明のタンパク質の検出又は測定方法は、タンパク質を特異的に検出又は測定することができるため、タンパク質を用いた種々の実験等に有用である。
本発明はまた、ヒト「ｆｌｓ３５３」または「ｆｌｓ４８５」タンパク質をコードするＤＮＡ（配列番号：１、３、または５）またはその相補鎖とハイブリダイズし、少なくとも１５塩基の鎖長を有するヌクレオチドに関する。本発明のヌクレオチドは、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡに特異的にハイブリダイズするヌクレオチドである。ここで「特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、他のタンパク質をコードするＤＮＡとのクロスハイブリダイゼーションが有意に生じないことを意味する。このようなヌクレオチドには、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ又はその相補鎖と特異的にハイブリダイズし得るプローブやプライマー、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドやリボザイム等）が含まれる。また、このようなヌクレオチドは、ＤＮＡチップの作製に利用することも考えられる。
本発明は、例えば、配列番号：１、３、または５のいずれか一つに示される塩基配列中のいずれかの箇所にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは配列番号：１、３、または５のいずれか一つに示される塩基配列中の連続する少なくとも１５個以上のヌクレオチドに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。さらに好ましくは、前記連続する少なくとも１５個以上のヌクレオチドが翻訳開始コドンを含む、前記のアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、それらの誘導体や修飾体を使用することができる。このような修飾体として、例えばメチルホスホネート型又はエチルホスホネート型のような低級アルキルホスホネート修飾体、ホスホロチオエート修飾体又はホスホロアミデート修飾体等が挙げられる。
ここでいう「アンチセンスオリゴヌクレオチド」とは、ＤＮＡ又はｍＲＮＡの所定の領域を構成するヌクレオチドに対応するヌクレオチドが全て相補的であるもののみならず、ＤＮＡまたはｍＲＮＡとオリゴヌクレオチドとが配列番号：１、３、または５に示される塩基配列に特異的にハイブリダイズできる限り、１又は複数個のヌクレオチドのミスマッチが存在していてもよい。
このようなヌクレオチドは、少なくとも１５個の連続したヌクレオチド配列領域で、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％以上の塩基配列上の相同性を有する。相同性を決定するためのアルゴリズムは本明細書に記載したものを使用すればよい。このようなヌクレオチドは、後述の実施例に記載するように本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを検出若しくは単離するためのプローブとして、又は増幅するためのプライマーとして有用である。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は、本発明のタンパク質の産生細胞に作用して、該タンパク質をコードするＤＮＡ又はｍＲＮＡに結合することにより、その転写又は翻訳を阻害したり、ｍＲＮＡの分解を促進したりして、本発明のタンパク質の発現を抑制することにより、結果的に本発明のタンパク質の作用を抑制する効果を有する。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は、それらに対して不活性な適当な基剤と混和して塗布剤、パップ剤等の外用剤とすることができる。
また、必要に応じて、賦形剤、等張化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐剤、無痛化剤等を加えて錠剤、散財、顆粒剤、カプセル剤、リポソームカプセル剤、注射剤、液剤、点鼻剤など、さらに凍結乾燥剤とすることができる。これらは常法にしたがって調製することができる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は患者の患部に直接適用するか、又は血管内に投与するなどして結果的に患部に到達し得るように患者に適用する。さらには、持続性、膜透過性を高めるアンチセンス封入素材を用いることもできる。例えば、リポソーム、ポリ−Ｌ−リジン、リピッド、コレステロール、リポフェクチン又はこれらの誘導体が挙げられる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体の投与量は、患者の状態に応じて適宜調整し、好ましい量を用いることができる。例えば、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１〜５０ｍｇ／ｋｇの範囲で投与することができる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは本発明のタンパク質の発現を阻害し、従って本発明のタンパク質の生物学的活性を抑制することにおいて有用である。また、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する発現阻害剤は、本発明のタンパク質の生物学的活性を抑制することが可能である点で有用である。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、抗癌の目的に用いることが考えられる。
また、本発明は、本発明のタンパク質を利用する、本発明のタンパク質に結合する化合物のスクリーニング方法に関する。このスクリーニング方法は、（ａ）本発明のタンパク質またはその部分ペプチドに被検試料を接触させる工程、（ｂ）本発明のタンパク質またはその部分ペプチドと被検試料との結合活性を検出する工程、（ｃ）本発明のタンパク質またはその部分ペプチドに結合する化合物を選択する工程、を含む。
スクリーニングに用いられる本発明のタンパク質は組換えタンパク質であっても、天然由来のタンパク質であってもよい。また部分ペプチドであってもよい。被検試料としては特に制限はなく、例えば、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、精製若しくは粗精製タンパク質、ペプチド、非ペプチド性化合物、合成低分子化合物、天然化合物が挙げられる。被検試料を接触させる本発明のタンパク質は、例えば、精製したタンパク質として、可溶型タンパク質として、担体に結合させた形態として、また、他のタンパク質との融合タンパク質として、被検試料に接触させることができる。
本発明のタンパク質を用いて、例えば該タンパク質に結合するタンパク質をスクリーニングする方法としては、当業者に公知の多くの方法を用いることが可能である。このようなスクリーニングは、例えば、免疫沈降法により行うことができる。具体的には、以下のように行うことができる。本発明のタンパク質をコードする遺伝子を、ｐＳＶ２ｎｅｏ，ｐｃＤＮＡ  Ｉ，ｐＣＤ８などの外来遺伝子発現用のベクターに挿入することで動物細胞などで当該遺伝子を発現させる。発現に用いるプロモーターとしてはＳＶ４０  ｅａｒｌｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｒｉｇｂｙ  Ｉｎ  Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ（ｅｄ．），Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．３．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，ｐ．８３−１４１（１９８２）），ＥＦ−１  α  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（ＫｉｍらＧｅｎｅ  ９１，ｐ．２１７−２２３（１９９０）），ＣＡＧ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｎｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  １０８，ｐ．１９３−２００（１９９１）），ＲＳＶ  ＬＴＲ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｃｕｌｌｅｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １５２，ｐ．６８４−７０４（１９８７），ＳＲ  α  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｔａｋｅｂｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８，ｐ．４６６（１９８８）），ＣＭＶ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｓｅｅｄ  ａｎｄ  Ａｒｕｆｆｏ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４，ｐ．３３６５−３３６９（１９８７）），ＳＶ４０  ｌａｔｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｇｈｅｙｓｅｎ  ａｎｄ  Ｆｉｅｒｓ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１，ｐ．３８５−３９４（１９８２）），Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｌａｔｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｋａｕｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９，ｐ．９４６（１９８９）），ＨＳＶ  ＴＫ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ等の一般的に使用できるプロモーターであれば何を用いてもよい。動物細胞に遺伝子を導入することで外来遺伝子を発現させるためには、エレクトロポレーション法（Ｃｈｕ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１５，１３１１−１３２６（１９８７））、リン酸カルシウム法（Ｃｈｅｎ，Ｃ  ａｎｄ  Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７，２７４５−２７５２（１９８７））、ＤＥＡＥデキストラン法（Ｌｏｐａｔａ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２，５７０７−５７１７（１９８４）；Ｓｕｓｓｍａｎ，Ｄ．Ｊ．ａｎｄ  Ｍｉｌｍａｎ，Ｇ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４，１６４２−１６４３（１９８５））、リポフェクチン法（Ｄｅｒｉｊａｒｄ，Ｂ．Ｃｅｌｌ  ７，１０２５−１０３７（１９９４）；Ｌａｍｂ，Ｂ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ５，２２−３０（１９９３）；Ｒａｂｉｎｄｒａｎ，Ｓ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９，２３０−２３４（１９９３））等の方法があるが、いずれの方法によってもよい。特異性の明らかとなっているモノクローナル抗体の認識部位（エピトープ）を本発明のタンパク質のＮ末またはＣ末に導入することにより、モノクローナル抗体の認識部位を有する融合タンパク質として本発明のタンパク質を発現させることができる。用いるエピトープー抗体系としては市販されているものを利用することができる（実験医学  １３，８５−９０（１９９５））。マルチクローニングサイトを介して、β−ガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などとの融合タンパク質を発現することができるベクターが市販されている。
融合タンパク質にすることにより本発明のタンパク質の性質をできるだけ変化させないようにするために数個から十数個のアミノ酸からなる小さなエピトープ部分のみを導入して、融合タンパク質を調製する方法も報告されている。例えば、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ−ｔａｇ）、インフルエンザ疑集素ＨＡ、ヒトｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓウィルス糖タンパク質（ＶＳＶ−ＧＰ）、Ｔ７  ｇｅｎｅ１０タンパク質（Ｔ７−ｔａｇ）、ヒト単純ヘルペスウィルス糖タンパク質（ＨＳＶ−ｔａｇ）、Ｅ−ｔａｇ（モノクローナルファージ上のエピトープ）などのエピトープとそれを認識するモノクローナル抗体を、本発明のタンパク質に結合するタンパク質のスクリーニングのためのエピトープ−抗体系として利用できる（実験医学１３，８５−９０（１９９５））。
免疫沈降においては、これらの抗体を、適当な界面活性剤を利用して調製した細胞溶解液に添加することにより免疫複合体を形成させる。この免疫複合体は本発明のタンパク質、それと結合能を有するタンパク質、および抗体からなる。上記エピトープに対する抗体を用いる以外に、本発明のタンパク質に対する抗体を利用して免疫沈降を行うことも可能である。本発明のタンパク質に対する抗体は、例えば、本発明のタンパク質をコードする遺伝子を適当な大腸菌発現ベクターに導入して大腸菌内で発現させ、発現させたタンパク質を精製し、これをウサギやマウス、ラット、ヤギ、ニワトリなどに免疫することで調製することができる。また、合成した本発明のタンパク質の部分ペプチドを上記の動物に免疫することによって調製することもできる。
免疫複合体は、例えば、抗体がマウスＩｇＧ抗体であれば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＳｅｐｈａｒｏｓｅやＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いて沈降させることができる。また、本発明のタンパク質を、例えば、ＧＳＴなどのエピトープとの融合タンパク質として調製した場合には、グルタチオン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ  などのこれらエピトープに特異的に結合する物質を利用して、本発明のタンパク質の抗体を利用した場合と同様に、免疫複合体を形成させることができる。
免疫沈降の一般的な方法については、例えば、文献（Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ｄ．：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｐｐ．５１１−５５２，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８））記載の方法に従って、または準じて行えばよい。
免疫沈降されたタンパク質の解析にはＳＤＳ−ＰＡＧＥが一般的であり、適当な濃度のゲルを用いることでタンパク質の分子量により結合していたタンパク質を解析することができる。また、この際、一般的には本発明のタンパク質に結合したタンパク質は、クマシー染色や銀染色といったタンパク質の通常の染色法では検出することは困難であるので、放射性同位元素である３５Ｓ−メチオニンや３５Ｓ−システインを含んだ培養液で細胞を培養し、該細胞内のタンパク質を標識して、これを検出することで検出感度を向上させることができる。タンパク質の分子量が判明すれば直接ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルから目的のタンパク質を精製し、その配列を決定することもできる。
また、本発明のタンパク質を用いて、該タンパク質に結合するタンパク質を単離する方法としては、例えば、ウエストウエスタンブロッティング法（Ｓｋｏｌｎｉｋ，Ｅ．Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９９１）６５，８３−９０）を用いて行うことができる。すなわち、本発明のタンパク質と結合する結合タンパク質を発現していることが予想される細胞、組織、臓器（例えば、胎児の肝臓や腎臓、癌細胞株など）よりファージベクター（λｇｔ１１，ＺＡＰなど）を用いたｃＤＮＡライブラリーを作製し、これをＬＢ−アガロース上で発現させフィルターに発現させたタンパク質を固定し、精製して標識した本発明のタンパク質と上記フィルターとを反応させ、本発明のタンパク質と結合したタンパク質を発現するプラークを標識により検出すればよい。本発明のタンパク質を標識する方法としては、ビオチンとアビジンの結合性を利用する方法、本発明のタンパク質又は本発明のタンパク質に融合したペプチド又はポリペプチド（例えばＧＳＴなど）に特異的に結合する抗体を利用する方法、ラジオアイソトープを利用する方法又は蛍光を利用する方法等が挙げられる。
また、本発明のスクリーニング方法の他の態様としては、細胞を用いた２−ハイブリッドシステム（Ｆｉｅｌｄｓ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｓｔｅｒｎｇｌａｎｚ，Ｒ．，Ｔｒｅｎｄｓ．Ｇｅｎｅｔ．（１９９４）１０，２８６−２９２）を用いて行う方法が挙げられる。
本発明のタンパク質をＳＲＦ  ＤＮＡ結合領域またはＧＡＬ４  ＤＮＡ結合領域と融合させて酵母細胞の中で発現させ、本発明のタンパク質と結合するタンパク質を発現していることが予想される細胞より、ＶＰ１６またはＧＡＬ４転写活性化領域と融合する形で発現するようなｃＤＮＡライブラリーを作製し、これを上記酵母細胞に導入し、検出された陽性クローンからライブラリー由来ｃＤＮＡを単離して大腸菌に導入して発現させる（酵母細胞内で本発明のタンパク質と結合するタンパク質が発現すると、両者の結合によりレポーター遺伝子が活性化され、陽性のクローンが確認できる）「ｔｗｏハイブリッドシステム」（「ＭＡＴＣＨＭＡＲＫＥＲ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ」，「Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ」，「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  Ｏｎｅ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ」（いずれもＣｌｏｎｔｅｃｈ社製）、「ＨｙｂｒｉＺＡＰ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ」（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、文献「Ｄａｌｔｏｎ  Ｓ，ａｎｄ  Ｔｒｅｉｓｍａｎ  Ｒ（１９９２）Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＳＡＰ−１，ａｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｒｕｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｓｅｒｕｍ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｃ−ｆｏｓ  ｓｅｒｕｍ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ．Ｃｅｌｌ  ６８，５９７−６１２」）を利用して、本発明のタンパク質に結合するタンパク質またはその遺伝子を調製することも可能である。
レポーター遺伝子としては、ＨＩＳ３遺伝子の他、Ａｄｅ２遺伝子、ＬａｃＺ遺伝子、ＣＡＴ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子等を用いることができる。
本発明のタンパク質と結合するタンパク質のスクリーニングは、アフィニティクロマトグラフィーを用いて行うこともできる。例えば、本発明のタンパク質をアフィニティーカラムの担体に固定し、ここに本発明のタンパク質と結合するタンパク質を発現していることが予想される被検試料を適用する。この場合の被検試料としては、例えば細胞抽出物、細胞溶解物等が挙げられる。被検試料を適用した後、カラムを洗浄し、本発明のタンパク質に結合したタンパク質を調製することができる。
得られたタンパク質は、そのアミノ酸配列を分析し、それを基にオリゴＤＮＡを合成し、該ＤＮＡをプローブとしてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、該タンパク質をコードするＤＮＡを得ることができる。
本発明において、結合した化合物を検出又は測定する手段として表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーを使用することもできる。表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーは本発明のタンパク質と被検化合物との間の相互作用を微量のタンパク質を用いてかつ標識することなく、表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムに観察することが可能である（例えばＢＩＡｃｏｒｅ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）。したがって、ＢＩＡｃｏｒｅ等のバイオセンサーを用いることにより本発明のタンパク質と被検化合物との結合を評価することが可能である。
また、タンパク質に限らず、本発明のタンパク質に結合する化合物（アゴニスト、およびアンタゴニストを含む）を単離する方法としては、例えば、固定した本発明のタンパク質に、合成化合物、天然物バンク、もしくはランダムファージペプチドディスプレイライブラリーを作用させ、本発明のタンパク質に結合する分子をスクリーニングする方法や、コンビナトリアルケミストリー技術によるハイスループットを用いたスクリーニング方法（Ｗｒｉｇｈｔｏｎ  ＮＣ；Ｆａｒｒｅｌｌ  ＦＸ；Ｃｈａｎｇ  Ｒ；Ｋａｓｈｙａｐ  ＡＫ；Ｂａｒｂｏｎｅ  ＦＰ；Ｍｕｌｃａｈｙ  ＬＳ；Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＤＬ；Ｂａｒｒｅｔｔ  ＲＷ；Ｊｏｌｌｉｆｆｅ  ＬＫ；Ｄｏｗｅｒ  ＷＪ．，Ｓｍａｌｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｓ  ｐｏｔｅｎｔ  ｍｉｍｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＵＮＩＴＥＤ  ＳＴＡＴＥＳ）Ｊｕｌ  ２６  １９９６，２７３  ｐ４５８−６４、Ｖｅｒｄｉｎｅ  ＧＬ．，Ｔｈｅ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｎａｔｕｒｅ．Ｎａｔｕｒｅ（ＥＮＧＬＡＮＤ）Ｎｏｖ  ７  １９９６，３８４  ｐ１１−１３、Ｈｏｇａｎ  ＪＣ  Ｊｒ．，Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｎａｔｕｒｅ（ＥＮＧＬＡＮＤ）Ｎｏｖ  ７  １９９６，３８４  ｐ１７−９）が当業者に公知である。
スクリーニングにより単離され得る化合物は、本発明のタンパク質の機能異常などに起因する疾患や腫瘍などの予防や治療において、本発明のタンパク質の活性を促進または阻害するための薬剤の候補となる。本発明のスクリーニング方法を用いて得られる、本発明のタンパク質に結合する活性を有する化合物の構造の一部を、付加、欠失及び／又は置換により変換される物質も、本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物に含まれる。
また、本発明のタンパク質をコードする遺伝子またはその発現制御領域を利用して、生体内においてこれら遺伝子の発現（転写および翻訳を含む）を抑制または促進しうる化合物をスクリーニングすることも考えられる。このスクリーニングは、例えば、癌の治療薬や予防薬の候補化合物のスクリーニングとして利用しうる。
このスクリーニングは、（ａ）本発明の遺伝子を発現する細胞に被検試料を接触させる工程、（ｂ）該細胞内における本発明の遺伝子の発現を検出する工程、および（ｃ）被検試料を細胞に接触させない場合（対照）と比較して、本発明の遺伝子の発現を減少または増加させる化合物を選択する工程、を含む方法により実施しうる。
例えば、ｆｌｓ３５３、またはｆｌｓ４８５遺伝子を発現している適当な細胞株（Ｈｅｌａ  Ｓ３、Ｈｅｐ  Ｇ２など）を被検試料と共に培養し、これらの遺伝子の発現（転写および翻訳を含む）をノーザン解析やＲＴ−ＰＣＲ法などのｍＲＮＡを検出する方法、あるいはウェスタンブロッティングなどのタンパク質を検出する方法、またはこれらを改良した方法により検出し、被検試料を添加しない場合と比較して、これらの遺伝子の発現を増加あるいは低下させる化合物を選択することにより、目的の化合物スクリーニングすることができる。
また、本発明の遺伝子の発現制御領域の活性化または不活性化を指標とする方法によって、生体内において本発明の遺伝子の発現を抑制または促進しうる化合物をスクリーニングすることも考えられる。このスクリーニングは、（ａ）本発明の遺伝子の発現制御領域の下流に機能的に結合されたレポーター遺伝子を含むベクターが導入された細胞を提供する工程、（ｂ）該細胞に被検試料を接触させる工程、（ｃ）該細胞内におけるレポーター活性を検出する工程、および（ｄ）被検試料を細胞に接触させない場合（対照）と比較して、該レポーター活性を減少または増加させる化合物を選択する工程、を含む方法により実施しうる。
ここで「機能的に結合された」とは、発現制御領域の活性化に応答して、その下流に結合されたレポーター遺伝子が発現しうるように、発現制御領域とレポーター遺伝子が結合していることを指す。
例えば、配列番号：１、３または５に記載の塩基配列若しくはその一部をプローブとしたゲノムＤＮＡライブラリーのスクリーニングにより、本発明の遺伝子の発現制御領域（プロモーター、エンハンサーなど）をクローニングし、これを適当なレポーター遺伝子（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子など）の上流に挿入した発現ベクターを作製し、これを哺乳動物細胞に導入する。次いで、被検試料を該細胞株に接触させ、レポーター活性を検出し、被検試料を接触させない細胞におけるレポーター活性と比較して、レポーター活性を増加または減少させる化合物を選択することにより、生体内において本発明の遺伝子の発現を抑制あるいは促進しうつ化合物をスクリーニングすることができる。このスクリーニングは、本発明の遺伝子の発現を、レポーター活性を指標として検出するため、上記したノーザン解析などの直接的な検出と比較して、簡便であるという特徴を有する。
これらスクリーニングにより単離された、本発明の遺伝子の発現を促進または抑制する化合物は、該遺伝子の発現異常に起因する種々の疾患に対する医薬品の候補となる。特に、癌などの疾患を予防または治療する薬剤としての利用が期待される。なお、上記のスクリーニング方法を用いて得られる、本発明の遺伝子の発現を促進または抑制する化合物の構造の一部を、付加、欠失及び／又は置換により変換される物質も、本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物に含まれる。
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物をヒトや哺乳動物、例えばマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、サル、マントヒヒ、チンパンジーの医薬として使用する場合には、単離された化合物自体を直接患者に投与する以外に、公知の製剤学的方法により製剤化して投与を行うことも可能である。例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤として経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤に混和することができる添加剤としては、例えばゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸のような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖又はサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油又はチェリーのような香味剤が用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記の材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０と併用してもよい。
油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。
患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射などのほか、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、または経口的に当業者に公知の方法により行いうる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。また、該化合物がＤＮＡによりコードされうるものであれば、該ＤＮＡを遺伝子治療用ベクターに組込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。投与量、投与方法は、患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。
例えば、本発明のタンパク質と結合する化合物や本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物の投与量は、症状により差異はあるが、経口投与の場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり約０．１から１００ｍｇ、好ましくは約１．０から５０ｍｇ、より好ましくは約１．０から２０ｍｇである。
非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法によっても異なるが、例えば注射剤の形では通常成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり約０．０１から３０ｍｇ、好ましくは約０．１から２０ｍｇ、より好ましくは約０．１から１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
［実施例１］  胎児性遺伝子（ｆｅｔａｌ  ｇｅｎｅ）サブトラクトライブラリーの作製
サブレッションサブトラクティブハイブリダイゼーション法により、胎児肝臓由来ｃＤＮＡをテスター、成体肝臓由来ｃＤＮＡをドライバーとしたサブトラクションを行い、胎児肝臓に特異的、あるいはより強く発現している胎児性遺伝子（ｆｅｔａｌ  ｇｅｎｅ）からなるサブトラクトライブラリーを作製した。
サブトラクションライブラリーはＰＣＲ−ＳｅｌｅｃｔＴＭ  ｃＤＮＡ  Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を用い、Ｌｕｄａ  Ｄｉａｔｃｈｅｎｋｏらの方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９３，６０２５−６０３０，１９９６）に基本的に従って作製した。
まずヒト胎児肝臓由来ｐｏｌｙＡ＋  ＲＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）及びヒト成体肝臓由来ｐｏｌｙＡ＋  ＲＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）よりＭＭＬＶ逆転写酵素を用いた標準的な方法で二本鎖ｃＤＮＡを合成した。つぎにＴ４  ＤＮＡポリメラーゼによりこのｃＤＮＡ末端を平滑化し、さらにＲｓａＩにより切断した。胎児肝臓由来ｃＤＮＡ（テスター）の一部を２分割し、アダプター１とアダプター２をそれぞれ別々にライゲートした。これにそれぞれ１２０倍量の成体肝臓由来ｃＤＮＡ（ドライバー）を加え、熱変性を行ったあと６８℃で８時間の１次ハイブリダイゼーションを行った。つぎにこれを熱変性せずに混合し、さらに熱変性した過剰量のドライバーを加え６８℃で約１６時間の２次ハイブリダイゼーションを行った。これを希釈用バッファーにて希釈し、７５℃で７分インキュベートし、アダプターの短い方の鎖を取り除いたものをＰＣＲの鋳型として用いた。アダプターに対応するプライマーであるＰＣＲプライマー１、２を用いたＰＣＲを行うことにより、両端に異なるアダプターを持ったｃＤＮＡ（サブトラクトされたｃＤＮＡ）のみを選択的に増幅した（サプレッションＰＣＲ）。これの一部を鋳型とし、ＰＣＲプライマー１、２のさらに内側に位置するプライマーであるＮｅｓｔｅｄ  ＰＣＲプライマー１と２を用いたＰＣＲを行うことにより、さらに選択性を増した生成物を得た。この生成物をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製し、ｐＴ７Ｂｌｕｅ−Ｔベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にＴＡクローニング法によりクローニングし、サブトラクションライブラリーとした。
アダプター１および２、プライマー１および２、Ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲプライマー１および２を表１に示す。
0004590107.tif 000002
［実施例２］胎児性遺伝子ＥＳＴの構築
実施例１で作製したライブラリーより抽出したクローンをランダムにシークエンスすることにより、胎児性遺伝子からなるＥＳＴを構築した。
シークエンシングは、アルカリＳＤＳ法によって調製したプラスミドＤＮＡ、またはコロニーＰＣＲなどのＰＣＲ産物を鋳型とし、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｗｉｔｈ  ＡｍｐｌｙＴａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，ＦＳ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いたサイクルシー・クエンシング法により行い、ＡＢＩ  ３７７  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒにより解読した。
コロニーＰＣＲは、ベクタープライマーであるＭ１３  Ｐ４−２２プライマー（５’ＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ  ３’／配列番号：１５）及びＭ１３  Ｐ５−２２プライマー（５’ＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ  ３’／配列番号：１６）を含むＰＣＲ反応溶液の中に、組み換え体を持つコロニーを直接懸濁することにより行った。ＰＣＲ反応後、増幅されたインサートＤＮＡから、ゲル濾過法などにより未反応のプライマー、ヌクレオチド等を除き、シークエンシングの鋳型として用いた。
［実施例３］  ＲＴ−ＰＣＲアッセイ
シークエンシングによるＥＳＴ構築の結果、配列が新規である８４種類のＥＳＴに対してそれぞれ特異的なプライマーセットを作製し、ＲＴ−ＰＣＲ法によって各遺伝子の発現を、胎児の肝臓、腎臓、肺、脳、及び成体の肝臓、腎臓、肺、脳、骨髄、精巣について調べるスクリーニングを行った。
ｐｏｌｙＡ＋  ＲＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）あるいは全ＲＮＡより、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴＴＭ  ＩＩ  ＲＮａｓｅ  Ｈ−  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を用いた標準的な方法により１本鎖ｃＤＮＡを合成し、その一部をＲＴ−ＰＣＲアッセイの鋳型として用いた。ＰＣＲは基本的に以下の条件で行った。
反応液組成
ＴａＫａＲａ  Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ）  ０．２４μｌ
ＴａｑＳｔａｒｔＴＭ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）  ０．２４μｌ
１０ｘＰＣＲバッファー（ＴａＫａＲａ）３μｌ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（ＴａＫａＲａ）２．４μｌ
２０μＭプライマー  各０．６μｌ
鋳型ＤＮＡ  ６μｌ
／全量  ３０μｌ
反応条件
９４℃、２分→（９４℃、３０秒→５０℃〜６０℃、１分→７２℃、１分）  ｘ２８〜３５サイクル→７２℃、３分
より胎児性組織に特異的な発現パターを示した６３個のクローンを選択し、次に大腸癌臨床サンプル、および各種癌細胞株における発現を調べていった。その結果、癌細胞において発現が活性化されている胎児性遺伝子として「ｆｌｓ３５３」および「ｆｌｓ４８５」が選択された。
なお、ＲＴ−ＰＣＲにおける「ｆｌｓ３５３」、「ｆｌｓ４８５」、および対照として用いたＧ３ＰＤＨを増幅するために用いたプライマー対を表２に示す。
0004590107.tif 000003
［実施例４］ｆｌｓ３５３全長ｃＤＮＡのクローニング
ｆｌｓ３５３オリジナルクローンをプローブとし、ヒト胎児肝臓由来５’−ｓｔｒｅｔｃｈ  ｐｌｕｓ  ｃＤＮＡライブラリー（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）をプラークハイブリダイゼーション法によりスクリーニングした。約５ｘ１０５個のプラークをスクリーニングしたところ数個の陽性クローンが得られた。これらクローンのインサートをＰＣＲによって増幅し直接シークエンシングすることにより配列を決定した。得られた配列を用いてパブリックデータベースをサーチすることにより、ｆｌｓ３５３の３’側に一致するＥＳＴをいくつか見いだした。これらのＥＳＴの配列からＦＬＳ３５３  Ｅ２プライマー（５’ＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＴＧＧＴＧＡＧＧＴＴＴＴＣＴ  ３’／配列番号：２３）およびＦＬＳ３５３  Ｒ１プライマー（５’ＣＡＡＴＣＡＣＣＧＴＣＣＣＣＡＡＧＴＣＡＣＣＡＧ  ３’／配列番号：２４）を作製し、ヒト胎児肝臓由来ｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによってｆｌｓ３５３遺伝子の３’側断片を増幅した。増幅断片をｐＴ７ＢｌｕｅＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にサブクローニングし、複数のサブクローンをシークエンシングすることによりｆｌｓ３５３遺伝子のストップコドンを含む３’側断片の配列を決定した。また、ｆｌｓ３５３遺伝子の５’側は５’ＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ）法によってクローニングした。ヒト胎児肝臓由来ＭａｒａｔｈｏｎＴＭ  Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を鋳型とし、ＦＬＳ３５３  Ｓ１プライマーとＡＰ１プライマー（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を用いたＰＣＲによりｆｌｓ３５３遺伝子の５’側断片（約１．３ｋｂｐ）を増幅し、ｐＴ７ＢｌｕｅＴベクターにサブクローニングした。複数のサブクローンをシークエンシングし、開始コドンを含む５’側の配列を決定した。
全コーディング領域を含むｃＤＮＡは、ＦＬＳ３５３  ＷＮ１プライマー（５’ＡＧＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＧＧＴＡＴＧＣＡＧＡＧＡＡＧＡＧＧＡＣＡＧＡＡ  ３’／配列番号：２５）およびＦＬＳ３５３  ＷＮ２プライマー（５’ＡＧＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＡＡＧＧＧＧＴＧＡＡＡＧＡＧＡＡＧＡＴＴＧＣ  ３’／配列番号：２６）を用いたＰＣＲにより、胎児肝臓由来ｃＤＮＡなどから増幅した。
［実施例５］  ｆｌｓ４８５全長ｃＤＮＡのクローニング
ヒト精巣ｃＤＮＡライブラリー（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を通常の方法でプレートに蒔き、ナイロンメンブラン（Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ＋）へ写し取った。このメンブレンを約２００プラークを含むと考えられる断片に切り分け、メンブラン上のファージをラムダ希釈バッファー（ＳＭ）中へ抽出した。このようにして得たｃＤＮＡプールを鋳型とし、上記ＦＬＳ４８５  Ｓ１プライマー及び、ＦＬＳ４８５  Ａ１プライマーによるＰＣＲでスクリーニングを行うことにより陽性クローンを含むプールを同定した。このプールを鋳型とし、上記ＦＬＳ４８５  Ａ１プライマーとライブラリー（λｇｔ１０ベクター）のベクタープライマーであるＧＴ１０  Ｓ１プライマー（５’ＣＴＴＴＴＧＡＧＣＡＡＧＴＴＣＡＧＣＣＴ  ３’／配列番号：２７）によるＰＣＲでこの陽性クローンの断片（約８００ｂｐ）を増幅した。シークエンスを確認した後、この断片をプローブとし、ヒト胎児肝臓由来５’−ｓｔｒｅｔｃｈ  ｐｌｕｓ  ｃＤＮＡライブラリー（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）をプラークハイブリダイゼーション法によりスクリーニングした。約１０６個のプラークをスクリーニングしたところ、８個の陽性クローンが得られた。これらクローンのインサートをＰＣＲによって増幅し直接シークエンシングすることにより配列を決定した。こうして得られた配列をもとにＦＬＳ４８５  Ａ４プライマー（５’ＴＴＧＡＡＡＴＧＴＣＣＡＣＴＣＧＣＴＴＡＴＣＣＴ  ３’／配列番号：２８）を作製し、５’ＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ）法により５’側断片のクローニングを行った。ヒト胎児肝臓由来ＭａｒａｔｈｏｎＴＭ  Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を鋳型とし、ＦＬＳ４８５  Ａ４プライマーとＡＰ１プライマー（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を用いたＰＣＲによりｆｌｓ４８５遺伝子の５’側断片（約６００ｈｐ）を増幅した。増幅断片をｐＴ７ＢｌｕｅＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にサブクローニングし、複数のサブクローンをシークエンシングすることにより開始コドンを含む５’側の配列を決定した。
全コーディング領域を含むｃＤＮＡは、表３に記載の５’側センスプライマーと３’側アンチセンスプライマーの組み合わせを用いたＰＣＲによりヒト胎児肝臓ｃＤＮＡなどから増幅しクローニングした。
0004590107.tif 000004
［実施例６］  ｆｌｓ３５３についての解析
＜６−１＞正常組織における発現分
ｆｌｓ３５３の正常組織における発現分布をノーザン解析によって調べた。ｆｌｓ３５３のオリジナルクローンをＲｅａｄｙ−ｔｏ  Ｇｏ  ＤＮＡ  ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ｂｅａｄｓ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いたランダムプライマー法により［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰでラベルし、プローブとして用いた。Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｏｒｔｈｅｒｎ（ＭＴＮ）Ｂｌｏｔ−Ｈｕｍａｎ，Ｈｕｍａｎ  ＩＩ，Ｈｕｍａｎ  ＩＩＩ，Ｈｕｍａｎ  Ｆｅｔａｌ  ＩＩ，Ｈｕｍａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を用い、ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）中で、メーカー推奨の方法に従い、６８℃でハイブリダイゼーションを行った。最終的な洗浄は、０．１  Ｘ  ＳＳＣ，０．１％  ＳＤＳ、５０℃で行った。
その結果を図１に示す。ｆｌｓ３５３は胎児の肝臓、腎臓、肺、脳に強い発現がみられるが、それぞれ対応する成体の臓器においてはほとんど発現はみられなかった。他の成体の臓器においては胸腺と精巣に比較的強い発現がみられるが、それ以外は非常に弱い発現がみられるのみであった。
＜６−２＞癌細胞株における発現
まず癌細胞株における発現を上記と同様のノーザンハイブリダイゼーションにより解析したところ、調べた８つの癌細胞株のうち７つの株においてｆｌｓ３５３の強い発現が観察された（図１）。次に大腸癌臨床サンプルにおける発現をＲＴ−ＰＣＲにより調べた（図２、３）。その結果、１２種類のサンプルのうち１０種の腫瘍においてｆｌｓ３５３遺伝子の発現が認められた。これらのうち６種については同一の患者から採取した正常組織における発現も同時に調べたが、ほとんど発現はみられず、大腸組織細胞が癌化することによりｆｌｓ３５３の発現が活性化されていることが示唆された。
＜６−３＞臨床癌サンプルにおける発現
臨床肝臓癌サンプル及び臨床肺癌サンプルにおけるｆｌｓ３５３の発現をノーザン解析により調べた（図１０、１１）。その結果、癌組織においてその発現が活性化されていることが明らかとなった。これらの結果から、ｆｌｓ３５３遺伝子は様々な癌種において発現が活性化され、それらの癌の進展に関与していることが示唆された。
＜６−４＞構造解析
プラークハイブリダイゼーション法によるｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、およびＲＡＣＥ法などによってｆｌｓ３５３遺伝子の全コーディング領域をカバーするｃＤＮＡをクローニングし配列を決定した。その結果、ｆｌｓ３５３は７４７アミノ酸からなるタンパク質をコードしていることが明らかとなった（図４および５）。決定されたｆｌｓ３５３  ｃＤＮＡの塩基配列を配列番号：１に、また、コードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：２に示す。このアミノ酸配列を用いデータベースの検索を行ったが、有意な相同性を示すタンパク質は見いだされなかった。構造の特徴としては、ＡＴＰ／ＧＴＰ結合コンセンサス配列（５２−５９、［Ａｌａ／Ｇｌｙ］−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−［Ｓｅｒ／Ｔｈｒ］、Ｘａａは任意のアミノ酸を表す）を有することと、塩基性アミノ酸であるリジンの比率が多く（１３．２％）、塩基性のタンパク質であると予想される点（計算上の等電点ｐＩ＝９．６２）が挙げられるが、タンパク質の機能を予測できる様なモチーフ等は見あたらなかった。
［実施例７］  ｆｌｓ４８５についての解析
＜７−１＞正常組織における発現分
ｆｌｓ４８５の正常組織における発現をノーザン解析により調べた（図６）。ノーザン解析は、ｆｌｓ４８５のオリジナルクローンをプローブに用い、上記ｆｌｓ３５３と同様に行った。
その結果、ｆｌｓ４８５は胎児の肝臓、腎臓、および成体の精巣、小腸といった、未分化な細胞を多く含み、活発な細胞の分化や増殖が行われている臓器に非常に選択性が高く発現している遺伝子であることが明らかとなった。
＜７−２＞腫瘍細胞株における発現
培養細胞における発現をＲＴ−ＰＣＲ解析により検討したところ、ｆｌｓ４８５の発現は正常細胞である初代培養肺繊維芽細胞には見られないものの、いくつかの肝臓癌由来細胞株−ＨｅｐＧ２，ＨｕＨ７，ＰＬＣ／ＰＲＦ５（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ）には存在することが明らかとなった（図７）。肝臓癌由来細胞株におけるｆｌｓ４８５発現のパターンは、肝臓癌腫瘍マーカーであるαフェトプロテインの発現のパターンとよく一致しており、成体における癌細胞の性質をよりよく反映する細胞株にｆｌｓ４８５の発現は相関していると考えられた。成体の正常肝臓にはノーザンレベルにおいてもより高感度なＲＴ−ＰＣＲのレベルにおいても、全くｆｌｓ４８５の発現は認められなかった。このことから、肝臓細胞の癌化に伴いｆｌｓ４８５の発現が活性化されていることが示唆された。
また、データベース検索によりパブリックデータベースにｆｌｓ４８５由来であると考えられるＥＳＴが４つ登録されていることを見いだした。それらのうち３つは大腸癌細胞由来である（ＡＡ３０８８１４、ＡＡ３０５１５９−大腸腺腫細胞株Ｃａｃｏ２由来、ＡＡ６２２９６４−大腸癌ＲＥＲ＋由来）。このことから、ある種の大腸癌においてもｆｌｓ４８５の発現が活性化していることが示唆された。
＜７−３＞臨床癌サンプルにおける発現
臨床肝臓癌サンプル及び臨床肺癌サンプルにおけるｆｌｓ４８５の発現をノーザン解析により調べた（図１０、１１）。その結果、癌組織においてその発現が活性化されていることが明らかとなった。これらの結果から、ｆｌｓ４８５遺伝子は様々な癌種において発現が活性化され、それらの癌の進展に関与していることが示唆された。
＜７−４＞構造解析
全コーディング領域をカバーするｃＤＮＡのクローニングを行ったところ、ｆｌｓ４８５は３５３アミノ酸からなるタンパクをコードし得る遺伝子であることが明らかとなった（図８）。決定されたｆｌｓ４８５全長ｃＤＮＡの塩基配列を配列番号：３に、また、コードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：４に示す。このアミノ酸配列は、以下にあげる特徴を有していた。
▲１▼中央部にＣ４タイプ様のＺｉｎｃフィンガードメインと考えられる配列が存在する。このドメインは、Ｃｙｓ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｃｙｓ−Ｘａａ−Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｇｌｙからなる配列を２回、ついでＣｙｓ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｃｙｓ−Ｘａａ−Ｇｌｙからなる配列を１回というユニットを２回繰り返す形となっている。
▲２▼Ｃ末端の配列はＣｙｓ−Ａａａ−Ａａａ−Ｘａａボックスのコンセンサス配列に当てはまる。（Ａａａは主に脂肪族のアミノ酸を表す。）このモチーフはｒａｓをはじめとするＧプロテインなどによく見られ、Ｃｙｓが脂質により修飾されることにより、細胞膜内側へ局在する機構に必要なモチーフであるとされている。この他の細胞内局在化シグナルは見あたらない。
▲３▼さらにＣ末端の配列は、最近明らかとなったＰＤＺ（ＤＨＲ）ドメインと呼ばれる特徴的なドメイン構造に結合するとされる（Ｓｅｐ／Ｔｈｒ）−Ｘａａ−Ｖａｌモチーフにも当てはまる。この結合様式は、家族性ポリポーシスの原因遺伝子であるＡＰＣとショウジョウバエの癌抑制遺伝子ＤＬＧのヒトホモローグとの結合等に見られ、細胞内でのシグナル伝達における重要かつ基本的な結合様式であると認識されつつある。
▲４▼全体的に親水性であり、膜貫通領域、分泌シグナルなどは見られない。
ホモロジーサーチを行ったところ、ｚｉｎｃフィンガー様ドメインの部分で、いくつかのタンパク質と類似性が見られるものの、有意な相同性を持つと考えられるタンパク質はデータベース中には見いだされなかった。
ｚｉｎｃフィンガードメインは多数の転写調節因子中によく見られる構造ドメインであるが、ｆｌｓ４８５のｚｉｎｃフィンガー様ドメインはそのような典型的な転写調節因子タイプのものとは異なっており、またｆｌｓ４８５アミノ酸配列中には核移行シグナルと考えられる配列も見出だされなかった。
また、ＰＣＲによる解析から、ｆｌｓ４８５のｍＲＮＡは、５’側に存在する１４６ｂｐからなる配列を含む形と（ｆｌｓ４８５  Ｌ／配列番号：３）それをスキップする形（ｆｌｓ４８５  Ｓ／配列番号：５）の２種類が存在することが判明した（図９）。この領域は推定されるコーディング領域のＮ末端に相当しており、ｆｌｓ４８５  Ｌは、ｆｌｓ４８５  Ｓよりも５１アミノ酸長いタンパク質をコードし得ることになる（ｆｌｓ４８５  Ｌタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：４に、ｆｌｓ４８５  Ｓタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：６に示す）。さらにノーザン解析からは、精巣には他の組織に見られるものより長い転写産物が存在することが判明した。しかしＰＣＲによる解析から、この転写産物は他の組織と同じコーディング領域を持つことが示され、これは３’非翻訳領域（ＵＴＲ）における長さの相違（ポリＡ添加サイトの違いである可能性がある）に由来するものであると考えられた。
産業上の利用の可能性
本発明により、胎児組織に特異的、あるいはより強く発現している新規なタンパク質および該タンパク質をコードする遺伝子が提供された。該遺伝子は、腫瘍細胞で強く発現しており、細胞の癌化に関与していることが予想される。従って、本発明の胎児性遺伝子の発現阻害剤は抗癌剤となりうることが期待される。また、本発明の胎児性遺伝子および該遺伝子がコードするタンパク貿は、細胞増殖性や、不死化、浸潤、転移、血管新生などに関与する新たな因子の精製やクローニング、さらには生体内の発現調節異常により本発明の遺伝子発現が異常に活性化されることにより起こる様々な疾病に対する医薬品開発のためのツールとして利用することが可能である。本発明の遺伝子をターゲットにした薬剤等を設計することにより、新たな作用機序による医薬品の開発が可能であると考えられる。
【配列表】
0004590107.tif 000005
0004590107.tif 000006
0004590107.tif 000007
0004590107.tif 000008
0004590107.tif 000009
0004590107.tif 000010
0004590107.tif 000011
0004590107.tif 000012
0004590107.tif 000013
0004590107.tif 000014
0004590107.tif 000015
0004590107.tif 000016
0004590107.tif 000017
0004590107.tif 000018
0004590107.tif 000019
0004590107.tif 000020
0004590107.tif 000021
0004590107.tif 000022
0004590107.tif 000023
0004590107.tif 000024
0004590107.tif 000025
0004590107.tif 000026
0004590107.tif 000027
0004590107.tif 000028
0004590107.tif 000029
0004590107.tif 000030
0004590107.tif 000031
0004590107.tif 000032
0004590107.tif 000033
0004590107.tif 000034
0004590107.tif 000035
0004590107.tif 000036
0004590107.tif 000037
0004590107.tif 000038
0004590107.tif 000039
0004590107.tif 000040
0004590107.tif 000041
0004590107.tif 000042
0004590107.tif 000043
0004590107.tif 000044
0004590107.tif 000045
0004590107.tif 000046
0004590107.tif 000047
【図面の簡単な説明】
図１は、ｆｌｓ３５３の発現をノーザン解析によって調べた結果を示す写真である。
図２は、大腸菌臨床サンプルにおけるｆｌｓ３５３の発現を示す写真である。ＲＴ−ＰＣＲによる解析の結果を示す。図３に続く。
図３は、図２の続きの写真である。
図４は、ｆｌｓ３５３の塩基配列と予想されるアミノ酸配列を示す図である。ＡＴＰ／ＧＴＰ結合部位のコンセンサス配列に合致するアミノ酸を実線で囲って示した。図５に続く。
図５は、図４の続きである。
図６は、ｆｌｓ４８５の発現をノーザン解析によって調べた結果を示す写真である。
図７は、各種培養細胞におけるｆｌｓ４８５およびαフェトプロテインの発現を示す写真である。ＲＴ−ＰＣＲによる解析の結果を示す。
図８は、ｆｌｓ４８５の塩基配列と予想されるアミノ酸配列を示す図である。ｆｌｓ４８５Ｓにおいては下線で示した領域が存在せず、○で囲ったメチオニン（Ｍ）が開始コドンとして用いられていると予想される。実線の四角で囲って示した配列はＣｙｓ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｃｙｓ−Ｘａａ−Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｇｌｙからなる配列に合致するアミノ酸配列であり、点線の四角で囲って示した配列はＣｙｓ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｃｙｓ−Ｘａａ−Ｇｌｙからなる配列に合致するアミノ酸配列である。
図９は、ｆｌｓ４８５の全コーディング領域を挟むプライマーセットを用いたＲＴ−ＰＣＲの結果を示す写真である。ヒト胎児肝臓由来ｃＤＮＡを鋳型として用いた。上の模式図において斜め線で示したボックスはｆｌｓ４８５のコーディング領域を表す。
図１０は、臨床肝臓癌サンプルにおけるｆｌｓ３５３、ｆｌｓ４８５およびαフェトプロテインの発現をノーザン解析により調べた結果を示す写真である。
図１１は、臨床肺癌サンプルにおけるｆｌｓ３５３およびｆｌｓ４８５の発現をノーザン解析により調べた結果を示す写真である。
【図１】
0004590107.tif 000048
【図２】
0004590107.tif 000049
【図３】
0004590107.tif 000050
【図４】
0004590107.tif 000051
【図５】
0004590107.tif 000052
【図６】
0004590107.tif 000053
【図７】
0004590107.tif 000054
【図８】
0004590107.tif 000055
【図９】
0004590107.tif 000056
【図１０】
0004590107.tif 000057
【図１１】
0004590107.tif 000058