(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で示される配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するズブチリシンの免疫原性を減少させる方法であって、配列番号２、配列番号９０、配列番号１５、配列番号３０、及び配列番号４０からなる群より選択される少なくとも１の前記ズブチリシンのＴ細胞エピトープを修飾することによる、前記方法。
【請求項２】
前記ズブチリシンが、配列番号１で示される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ズブチリシンが、配列番号１で示される配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
（ａ）前記ズブチリシンをコードする遺伝子を得る工程、
（ｂ）前記遺伝子のＤＮＡ配列を修飾する工程、
（ｃ）修飾されたズブチリシンをコードする前記修飾されたＤＮＡ配列を発現ベクターにクローニングする工程、
（ｄ）前記発現ベクターで宿主細胞を形質転換する工程、及び
（ｅ）前記修飾されたズブチリシンを発現する工程
を含む、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記ズブチリシンが、少なくとも１の前記エピトープにおける、１以上のアミノ酸の置換により修飾される、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記ズブチリシンが、少なくとも１の前記エピトープにおける、１以上のアミノ酸の欠失により修飾される、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記ズブチリシンが、少なくとも１の前記エピトープへの、アミノ酸の付加により修飾される、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記修飾されたズブチリシンが、バチルス属の生物内で発現される、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
配列番号１で示される配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する修飾ズブチリシンであって、配列番号２、配列番号９０、配列番号１５、配列番号３０、及び配列番号４０からなる群より選択されたアミノ酸配列を含む少なくとも１のエピトープにおいて少なくとも１の変異を含み、それにより、前記修飾ズブチリシンにより生じる免疫原生反応が、野生型ズブチリシンにより生じる前記免疫原生反応より少ない、前記修飾ズブチリシ。
【請求項１０】
前記ズブチリシンが、配列番号１で示される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項９に記載の修飾ズブチリシン。
【請求項１１】
少なくとも１の前記エピトープが、１以上のアミノ酸の置換により修飾される、請求項９に記載の修飾ズブチリシン。
【請求項１２】
少なくとも１の前記エピトープが、１以上のアミノ酸の欠失により修飾される、請求項９に記載の修飾ズブチリシン。
【請求項１３】
少なくとも１の前記エピトープが、アミノ酸の付加により修飾される、請求項９に記載の修飾ズブチリシン。
【請求項１４】
バチルス属の生物内で発現される、請求項９に記載の修飾ズブチリシン。
【請求項１５】
請求項９に記載の修飾ズブチリシンをコードする単離核酸。
【請求項１６】
請求項１５に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項１７】
請求項１６に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項１８】
洗浄組成物、パーソナルケア組成物及びヘルスケア組成物からなる群より選択される組成物であって、請求項９に記載の修飾ズブチリシンを含む組成物。
【請求項１９】
配列番号２、配列番号９０、配列番号１５、配列番号３０、又は配列番号４０からなる配列を有するペプチド。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明はズブチリシン・カールスバーグタンパク質におけるＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを同定する方法を提供する。本発明は、野生型ズブチリシン・カールスバーグタンパク質（Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）内に組込まれた場合、ヒトにおいて変化した免疫原性反応、好ましくは低免疫原性反応を生じる変性ペプチドを生成する方法も提供する。特に、本発明ＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）酵素の免疫原性を減少させるために適した方法及び組成物を含む手段を提供する。
【０００２】
発明の背景
工業的、医薬的及び商業的用途に用いられるタンパク質の普及及び重要性は増加してきている。しかしながら、これによりこれらのタンパク質に対する多く個体への感作を生じ、広範囲にわたってこれらのタンパク質に対するアレルギー反応の発生が生じている。例えば、いくつかのプロテアーゼは特定個体の超過敏反応に関連する。結果として、プロテアーゼの工業的（例えば、洗濯用洗剤、化粧品、織物処理等）有用性及び改善されたプロテアーゼ（例えば、一般的な洗剤条件下でより効果的にシミを除去する変異体ズブチリシン・カールスバーグ酵素）を提供しようとする分野で行われる広範囲の研究にも関わらず、工業上のプロテアーゼの使用は問題を含むものであった。
【０００３】
これらの問題を軽減するために多くの研究が行われてきた。プロテアーゼ使用の免疫原性の潜在性を減少させるために追及された方法は改善された生成プロセスを含み、粉塵及び／または空中に浮遊するプロテアーゼを運ぶ噴霧器の作業場濃度を制御及び最小限にすることにより潜在的な接触を減少させ、プロテアーゼ生成物から生じる塵または。噴霧の量を減少させる造粒プロセスを改善し、及び最終生成物における潜在的なアレルギー／免疫原性汚染物質のレベルを減少させるために再生プロセスを改善させることを含む。しかしながら、プロテアーゼ自身のアレルギー性／免疫原性を減少させる努力は比較的うまくいっていなかった。あるいは、過敏症の個体の免疫グロブリン（ＩｇＥ）により認識されるプロテアーゼのエピトープをマスクするための努力（ＰＣＴ公報ＷＯ９２／１０７５５；ＷＯ９４／１０１９１；ＷＯ９６／１７９２９；ＷＯ９９／４９０５６及びＷＯ０１／０７５７８を参照）または問題のあるプロテアーゼにポリマーまたはペプチド／タンパク質を付着させることにより抗原決定基の性質を増大または変化させるための努力が行われてきた。
【０００４】
いくつかの研究により特定タンパク質のアレルギー性／免疫原性を減少し、いくつかの個体にアレルギー反応を引き起こすエピトープを同定する方法が提供されてきたが、これらのエピトープを同定するために使用される分析は通常、以前に抗原に曝露された人々の血清中のＩｇＥ及びＩｇＧの測定を含む。しかしながら、Ｉｇ反応が開始されると、感作は既に発生している。従って、高められた免疫反応を生じるタンパク質を同定する必要性及び減少された免疫反応を生じるタンパク質を生成する必要性がある。
【０００５】
発明の概要
本発明はズブチリシン・カールスバーグタンパク質においてＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを同定する方法を提供する。本発明は、野生型ズブチリシン・カールスバーグタンパク質（Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）内に組込まれた場合、ヒトにおいて変化した免疫原性反応、好ましくは低免疫原性反応を生じる変性ペプチドを生成する方法も提供する。特に、本発明ＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）酵素の免疫原性を減少させるために適した方法及び組成物を含む手段を提供する。本発明は、野生型ズブチリシン・カールスバーグタンパク質配列に組込まれた場合、もはやＣＤ４＋Ｔ細胞反応を開始することができず、または少なくともアレルギー反応が減少した変性ペプチドを生成する方法も提供する。特に、本発明は野生型ズブチリシン・カールスバーグの免疫原性を減少するために適した方法及び組成物を含む手段を提供する。
【０００６】
１の実施態様において、本発明はＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）酵素のＴ細胞エピトープを提供する。これらのエピトープはここで説明する種々の配列で提供され（図２及び３を参照）、限定されないが、ペプチド番号５（配列番号６）、ペプチド番号２６（配列番号２７）、ペプチド番号３７（配列番号３８）、ペプチド番号５０（配列番号５１）、ペプチド番号５１（配列番号５２）、及びペプチド番号７９（配列番号８０）などがある。他の実施態様において、本発明はＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）酵素内の置換に適した同定エピトープの変性配列を提供する。
【０００７】
さらに別の実施態様において、本発明はＴ細胞エピトープ及びＴ細胞非エピトープを同定するための分析システムを提供し、限定されないが、分化樹状細胞とヒトＣＤ４＋及び／またはＣＤ８＋Ｔ細胞及び目的のペプチド（例えば、ＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）酵素由来ペプチド）とを混合する工程を有する方法を含む。より具体的には、免疫反応が減少した目的ペプチドを提供し、Ｔ細胞エピトープが認識され、以下の工程を含む：（ａ）１の血液源から樹状細胞溶液及びＣＤ４＋及び／またはＣＤ８＋Ｔ細胞溶液を得る工程；（ｂ）樹状細胞の分化を促進させる工程；（ｃ）分化樹状細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞及び／またはＣＤ８＋Ｔ細胞の溶液と目的ペプチド（例えば、ＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）の少なくとも一部を含むペプチド）を混合する工程；及び（ｄ）工程（ｃ）のＴ細胞の増殖を測定する工程。（例えば、ＷＯ９９／５３０３８；及びＳｔｒｉｃｋｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，２３：６５４−６６０［２０００］を参照）。
【０００８】
本発明の他の実施態様において、ＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）酵素の全部または一部に対応する一連のペプチドオリゴマーを提供する。例えば、ペプチドライブラリーはＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）酵素の全部または関連部分をカバーして生成される。１の側面において、ペプチドを生成する方法はペプチドライブラリー中に重複を導入することであり、例えば、ＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）酵素分子全体に対応する代表的ペプチドが作成されるまで、ＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）酵素のアミノ酸配列１−１５に対応する第１のペプチド、ＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）酵素のアミノ酸配列４−１８に対応する第２のペプチド、ＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）酵素のアミノ酸配列７−２１に対応する第３のペプチド、ＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）酵素のアミノ酸配列１０−２４に対応する第４のペプチド等を生成する。ここに提供する分析において個々に各ペプチドを分析することにより、Ｔ細胞により認識されるエピトープの位置を正確に同定することが可能である。上述の例において、その隣接部分に比べて１の特定ペプチドの反応が大きいと、３アミノ酸内に対するエピトープアンカー領域の同定が促進される。これらのエピトープの位置決定後、各エピトープ内の１以上のアミノ酸を変性させることが可能である。修飾エピトープはそれから野生型ズブチリシン・カールスバーグタンパク質の基幹内に再組込みできる。特に好ましい実施態様において、最終的な修飾ズブチリシン・カールスバーグタンパク質は最初の野生型タンパク質により生成されるものと比較して異なるＴ細胞反応を生じ、好ましくは減少したＴ細胞反応を生じる。さらに、本発明は、最初から望ましい低Ｔ細胞エピトープ潜在性を有し、その天然型で使用できるタンパク質を同定する方法を提供する。
【０００９】
当業界に公知の種々のｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ分析は本発明に従う修飾タンパク質の免疫反応の減少を確かめるために使用できる。ｉｎ  ｖｉｖｏ分析は、限定されないが、ＨＬＡクラスＩＩ反応及びより具体的にはＨＬＡ−ＤＲ３／ＤＱ２マウスＴ細胞反応を含む。適当なｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析は限定されないが、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）分析を含む（Ｈｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６３：６２７５−６２８２［１９９９］；Ｓｏｎｄｅｒｓｔｒｕｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，１７２：３３５−３４３［１９９９］；Ｔａｎｅｊａ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，１６９：６７−７９［１９９９］；Ｔａｕｒｏｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１６９：２０９−２２３［１９９９］；Ｃｏｓｇｒｏｖｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  ６６：１０５１−１０６６［１９９１］；及びＧｒｕｓｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９０：３９１３−３９１７［１９９３］を参照）。
【００１０】
本発明はさらに免疫原性が減少した修飾ズブチリシン・カールスバーグ組成物を提供する。特に、本発明はＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）酵素に対する免疫反応を減少させるここに記載したエピトープを含むＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）酵素組成物を提供する。
【００１１】
本発明は、細菌性ズブチリシンの少なくとも１のＴ細胞エピトープを同定する方法も提供し、以下の工程を含む：（ｉ）１の血液源から樹状細胞溶液及びナイーブＣＤ４＋及び／またはＣＤ８＋Ｔ細胞の溶液を得る工程；（ｉｉ）分化樹状細胞溶液を生成するために樹状細胞を分化させる工程；（ｉｉｉ）分化樹状細胞及びナイーブナイーブＣＤ４＋及び／またはＣＤ８＋Ｔ細胞の溶液とズブチリシン・カールスバーグのペプチド断片を混合する工程；及び（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）のＴ細胞の増殖を測定する工程。いくつかの好ましい実施態様において、細菌性ズブチリシン・カールスバーグはバチルス属のメンバー由来である。特に好ましい実施態様において、バチルスはＢ．ズブチリス、Ｂ．リケニホルミス、Ｂ．レンタス、Ｂ．ブレビス、Ｂ．ステロサーモフィラス、Ｂ．アルカロフィラス（ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アミロリケファシエンス、Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ、Ｂ．ハロデュランス、Ｂ．メガテリウム、Ｂ．コアグランス、Ｂ．サーキュランス、Ｂ．レンタス及びＢ．チューリンゲンシスからなる群より選択される。別の好ましい実施態様において、細菌性ズブチリシン・カールスバーグは配列番号１に示される配列の少なくとも一部を含む。
【００１２】
本発明のさらに細菌性ズブチリシン・カールスバーグの免疫原性を減少させる方法を提供し、以下の工程を含む：（ａ）（ｉ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏで少なくとも１のサイトカインに曝露することにより分化された接着性単球由来樹状細胞とＴ細胞エピトープを含む少なくとも１のペプチドを接触させることにより、及び（ｉｉ）樹状細胞及びペプチドとナイーブＴ細胞を接触させることにより、タンパク質中の少なくとも１のＴ細胞エピトープを同定する工程であって、ここで、ナイーブＴ細胞は接着性単球由来樹状細胞と同じ供給源から得たものであり、それによりＴ細胞増殖はペプチドに反応する；及び（ｂ）Ｔ細胞エピトープを中性化するためにズブチリシン・カールスバーグを修飾し、変異体タンパク質を生成する工程であって、変異体タンパク質がナイーブＴ細胞より少ないまたは実質的に等しい基準増殖を誘発するようにする。いくつかの好ましい実施態様において、細菌性ズブチリシン・カールスバーグはバチルス属のメンバー由来である。特に好ましい実施態様において、バチルスはバチルスはＢ．ズブチリス、Ｂ．リケニホルミス、Ｂ．レンタス、Ｂ．ブレビス、Ｂ．ステロサーモフィラス、Ｂ．アルカロフィラス（ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アミロリケファシエンス、Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ、Ｂ．ハロデュランス、Ｂ．メガテリウム、Ｂ．コアグランス、Ｂ．サーキュランス、Ｂ．レンタス及びＢ．チューリンゲンシスからなる群より選択される。別の好ましい実施態様において、細菌性ズブチリシン・カールスバーグは配列番号１に示される配列の少なくとも一部を含む。いくつかの実施態様において、細菌性ズブチリシン・カールスバーグのエピトープは、細菌性ズブチリシンの相同体に類似の配列を有するＴ細胞エピトープのアミノ酸配列を置換することにより修飾され、置換は実質的にＴ細胞エピトープに属する主要な３次構造を擬態する。別の実施態様において、細菌性ズブチリシン・カールスバーグは、配列番号２、配列番号９０、配列番号１５、配列番号３０、及び配列番号４０からなる群より選択される少なくとも１のエピトープを改変させることにより修飾される。さらに別の実施態様において、エピトープは少なくとも１のエピトープに対応する残基のアミノ酸配列を置換することにより修飾される。さらに別の実施態様において、エピトープは少なくとも１のエピトープに対応する残基のアミノ酸配列を欠失することにより修飾される。他の実施態様において、エピトープは少なくとも１のエピトープにアミノ酸を付加することにより修飾される。
【００１３】
本発明は変性ズブチリシン・カールスバーグ酵素も提供する（すなわち、変異体ズブチリシン・カールスバーグ酵素）。いくつかの好ましい実施態様において、これらの変異体ズブチリシン・カールスバーグ酵素は、配列番号２、配列番号９０、配列番号１５、配列番号３０、及び配列番号４０からなる群より選択されたアミノ酸配列を含む少なくとも１のエピトープにおいて少なくとも１の変異を含む。実際に、本発明は多数の変異体ズブチリシン・カールスバーグ酵素を提供する。特に好ましい実施態様において、これらの変異体
酵素は野生型ズブチリシン・カールスバーグ酵素と比較して減少した免疫原性／アレルギー性を示す。これらの変異体酵素は、パーソナル／消費者ケア用品から工業的生産及び使用にわたる多数の製品及び方法に使用できる。
【００１４】
発明の説明
本発明はズブチリシン・カールスバーグタンパク質においてＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを同定する方法を提供する。本発明は、野生型ズブチリシン・カールスバーグタンパク質（Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）内に組込まれた場合、ヒトにおいて変化した免疫原性反応、好ましくは低免疫原性反応を生じる変性ペプチドを生成する方法も提供する。特に、本発明ＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）酵素の免疫原性を減少させるために適した方法及び組成物を含む手段を提供する。本発明は、野生型ズブチリシン・カールスバーグタンパク質配列に組込まれた場合、もはやＣＤ４＋Ｔ細胞反応を開始することができず、または少なくともアレルギー反応が減少した変性ペプチドを生成する方法も提供する。特に、本発明は野生型ズブチリシン・カールスバーグの免疫原性を減少するために適した方法及び組成物を含む手段を提供する。
【００１５】
定義
別段に定めない限り、ここで用いる全ての技術及び科学用語は本発明が属する技術の当業者により通常理解される意味と同じ意味を有する。例えば、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ａｎｄ  Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９４）；及びＨａｌｅ  ａｎｄ  Ｍａｒｈａｍ，Ｔｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈａｒｐｅｒ  Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，ＮＹ（１９９１）は当業者にとってここで用いる用語の多くの一般的な辞書となるものである。ここに記載した方法及び物質に類似または同等のものは本発明の実施に用いることができるが、好ましい方法及び物質についてここに記載する。従って、下記に定義される用語は本明細書の全体を参照することによりさらに詳細に説明される。また、文脈で明らかに示さない限り、ここで用いる単数形は複数のものも含むものとする。
【００１６】
ここで用いる“バチルス属”は当業界に公知の全てのメンバーを含み、限定されないが、Ｂ．ズブチリス、Ｂ．リケニホルミス、Ｂ．レンタス、Ｂ．ブレビス、Ｂ．ステロサーモフィラス、Ｂ．アルカロフィラス（ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アミロリケファシエンス、Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ、Ｂ．ハロデュランス、Ｂ．メガテリウム、Ｂ．コアグランス、Ｂ．サーキュランス、Ｂ．レンタス及びＢ．チューリンゲンシスを含む。バチルス属は分類上再編成を受け続けることは当然認識されることである。従って、当該属は再分類された種を含むものとし、限定されないが、今は“ゲオバチルス・ステロサーモフィラス”の名前であるＢ．ステロサーモフィラスなどの生物を含む。酸素の存在下、耐性内生胞子の生成はバチルス属の決定的な特徴と考えられるが、この特徴は最近命名されたＡｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｍｐｈｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｎｅｕｒｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｆｉｌｏｂａｃｈｉｌｌｕｓ、Ｇｒａｃｉｌｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｈａｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓａｌｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｕｒｅｉｂａｃｉｌｌｕｓ、及びＶｉｒｇｉｂａｃｉｌｌｕｓにも適用する。
【００１７】
ここで用いる“野生型ズブチリシン・カールスバーグ（Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ）”の語は、ｉ）公知のズブチリシン・カールスバーグタンパク質、例えば、Ｎｏｖｏから市販のＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）酵素（配列番号１）；ジェネンコーから市販のＭＡＸＡＴＡＳＥ（登録商標）酵素；及びＫａｌｉ−Ｃｈｅｍｉｅから市販のＯＰＴＩＭＡＳＥ（登録商標）酵素など；ｉｉ）ＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）に類似の触媒活性を有し、配列番号１に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％のアミノ酸配列同一性を有し、好ましくは配列番号１に少なくとも９０％アミノ酸配列同一性を有するズブチリシン・カールスバーグタンパク質；及びｉｉｉ）ズブチリシン・カールスバーグタンパク質の変異体を含む。
【００１８】
ここで用いる“ＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）”の語はセリンプロテアーゼ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ００７８０を有するバチルス・リケニフォルミス由来のズブチリシン・カールスバーグをいう。合計タンパク質は３７９のアミノ酸残基を有する。プレタンパク質は１０５アミノ酸残基を含み、及び成熟タンパク質は２７４アミノ酸残基を含む（図１、配列番号１を参照、Ｊａｃｏｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１３：８９１３−８９２６［１９８５］、及びＳｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４３：２１８４−２１９１［１９６８］も参照）。
【００１９】
ここで用いる“修飾野生型ズブチリシン・カールスバーグ”、“修飾ＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）”及び“修飾変異体”とは野生型ズブチリシン・カールスバーグ及び特にＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）の少なくとも１の有意なＴ細胞エピトープが変性されているタンパク質をいう。
【００２０】
ここで用いる“野生型”及び“天然”タンパク質は天然に見つかるタンパク質をいう。“野生型配列”及び“野生型遺伝子”の語はここでは交換可能に用いられ、宿主細胞に天然、または自然に生じる配列をいう。いくつかの実施態様において、野生型配列はタンパク質工学プロジェクトの開始点である目的配列をいう。天然（すなわち、前駆体）タンパク質をエンコードする遺伝子は当業界に公知の一般的な方法に従って得ることができる。当該方法は通常、目的タンパク質の領域をエンコードする推定上の配列を有する標識プローブを合成し、タンパク質を発現する生物からゲノムライブラリーを調製し、及び当該プローブに対してハイブリダイゼーションすることにより目的遺伝子のライブラリーをスクリーニングすることを含む。陽性ハイブリダイズクローンをそれから位置付けて、配列を決定する。
【００２１】
“組換え体”、“組換えズブチリシン”及び“組換えプロテアーゼ”とはタンパク質、ズブチリシンまたはプロテアーゼをエンコードするＤＮＡ配列を天然アミノ酸配列中に１以上のアミノ酸の置換、欠失または挿入をエンコードする変異体（または変性体）ＤＮＡ配列を生成するために修飾した、タンパク質、ズブチリシンまたはプロテアーゼをいう。当該修飾を生じるための適当な方法、及びここに記載の方法と組み合わされる方法は、限定されないが、ここに引用するものとする米国特許第４，７６０，０２５号（ＵＳ  ＲＥ３４，６０６）、米国特許第５，２０４，０１５号、及び米国特許第５，１８５，２５８号に記載される方法がある。
【００２２】
“非ヒトズブチリシン”及びそれらのエンコードするＤＮＡ配列は多くの原核及び真核生物から得られる。原核生物の適当な例としては、グラム陰性細菌（例えば、大腸菌及びシュードモナス種）及びグラム陽性細菌（例えば、マイクロコッカス種及びバチルス種）などがある。ズブチリシン及びそれらの遺伝子を得ることができる真核生物の例としては、サッカロマイセス・セレヴィシエ及びアスペルギルス種などの真菌がある。
【００２３】
ここで用いる“サンプル”の語はその最も広い意味で用いる。しかしながら、好ましい実施態様において、該語は分析、同定、修飾及び／またはその他のペプチドと比較されるペプチド（例えば、ペプセット内の、目的のタンパク質の配列を含むペプチド）を含むサンプル（例えば、アリコート）に関して用いる。従って、ほとんどの場合、該語は目的のタンパク質またはペプチドを含む材料に関して用いる。
【００２４】
ここで用いる“バックグラウンドレベル”及び“バックグラウンド反応”とは試験タンパク質のデータセットにおける所定のペプチドに対する平均反応者比率をいう。この値は試験したドナー全員に関して編集して、セット内の反応者比率を平均することにより決定される。例として、３％のバックグラウンド比率は１００人のドナーについて試験した場合、データセット内のペプチドに関して３つの陽性（２．９５以上のＳＩ）反応が平均してあるであろうことを示す。
【００２５】
ここで用いる、“抗原提示細胞（ＡＰＣ）”とは、その表面に抗原を提示し、抗原がＴ細胞の表面上の受容体により認識されるようにする免疫系の細胞をいう。抗原提示細胞は、限定されないが、樹状細胞、相互連結細胞、活性化Ｂ細胞及びマクロファージを含む。
【００２６】
ここで用いる、“Ｔリンパ球”及び“Ｔ細胞”とは、Ｔ細胞前駆体（再配列されていないＴ細胞受容体遺伝子を有するＴｈｙ１陽性細胞など）由来のＴリンパ球系統から成熟Ｔ細胞（すなわち、ＣＤ４またはＣＤ８シングルポジティブ、表面ＴＣＲ陽性細胞）内の細胞を包含する。
【００２７】
ここで用いる“ＣＤ４＋Ｔ細胞”及び“ＣＤ４  Ｔ細胞”とは、ヘルパーＴ細胞をいい、一方“ＣＤ８＋Ｔ細胞”及び“ＣＤ８  Ｔ細胞”とは細胞障害性Ｔ細胞をいう。
【００２８】
ここで用いる“Ｔ細胞増殖”とは、抗原の有無に関わらず、抗原提示細胞を用いたＴ細胞培養時に生成されたＴ細胞の数をいう。
【００２９】
ここで用いる“基準Ｔ細胞増殖”とは、ペプチドまたはタンパク質抗原が存在しない中で、抗原提示細胞に曝露された個体反応において通常見られるＴ細胞増殖の程度をいう。本目的において、基準Ｔ細胞増殖レベルは抗原の不存在下、抗原提示細胞に反応したＴ細胞増殖として各個人に関して各サンプルに基づき測定される。
【００３０】
ここで用いる“Ｔ細胞エピトープ”とは、抗原を含むペプチド（すなわち、免疫原）に対する免疫反応の開始においてＴ細胞受容体により認識される、ペプチドまたはタンパク質の特徴をいう。本発明を特定のメカニズムに限定する趣旨ではないが、Ｔ細胞によるＴ細胞エピトープの認識はＴ細胞が、抗原提示細胞上で発現するクラスＩまたはクラスＩＩ  ＭＨＣ（すなわち、ＨＬＡ）分子に結合する抗原のペプチド断片を認識するメカニズムによるものと一般的に考えられている（例えば、Ｍｏｅｌｌｅｒ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，９８：１８７［１９８７］を参照）。
【００３１】
ここで用いる、“変化したＴ細胞エピトープ”とは、前駆体ペプチドまたは目的ペプチドとは異なり、目的の変異体ペプチドがヒトまたはその他の動物において異なる免疫反応を生じるエピトープアミノ酸配列をいう。変化した免疫反応は変化した免疫原性及び／またはアレルギー性を含むと考える（すなわち、増加または減少した全体的な免疫反応）。いくつかの実施態様において、変化したＴ細胞エピトープは同定エピトープ内の残基から選択されたアミノ酸の置換及び／または欠失を含む。別の実施態様において、変化したＴ細胞エピトープはエピトープ内に１以上の残基の付加を含む。
【００３２】
ここで用いる、“弱有意性Ｔ細胞エピトープ”とは試験ドナープール内の反応がバックグラウンド反応率よりも大きいが、バックグラウンド率の３倍よりも低いエピトープをいう。
【００３３】
ここで用いる、“Ｂリンパ球”及び“Ｂ細胞”とは、プレ細胞（ｌｇ重鎖遺伝子を配列し始めるＢ２２０＋細胞）などのＢ細胞前駆体由来のＢ細胞系列から成熟Ｂ細胞及び形質細胞内の細胞を包含する。
【００３４】
ここで用いる“Ｂ細胞増殖”とは、抗原の存在の有無に関わらず、抗原提示細胞を用いたＢ細胞の培養時に生成されたＢ細胞の数をいう。
【００３５】
ここで用いる“基準Ｂ細胞増殖”とは、ペプチドまたはタンパク質抗原が存在しない中で、抗原提示細胞に曝露された個体反応において通常見られるＢ細胞増殖の程度をいう。本目的において、基準Ｂ細胞増殖レベルは抗原の不存在下、Ｂ細胞増殖として各個人に関して各サンプルに基づき測定される。
【００３６】
ここで用いる“Ｂ細胞エピトープ”とは、抗原を含むペプチド（すなわち、免疫原）に対する免疫反応においてＢ細胞受容体により認識される、ペプチドまたはタンパク質の特徴をいう。
【００３７】
ここで用いる、“変化したＢ細胞エピトープ”とは、前駆体ペプチドまたは目的ペプチドとは異なり、目的の変異体ペプチドがヒトまたはその他の動物において異なる（すなわち、変化した）免疫反応を生じるエピトープアミノ酸配列をいう。変化した免疫反応は変化した免疫原性及び／またはアレルギー性を含むと考える（すなわち、増加または減少した全体的な免疫反応）。いくつかの実施態様において、変化したＢ細胞エピトープは同定エピトープ内の残基から選択されたアミノ酸の置換及び／または欠失を含む。別の実施態様において、変化したＢ細胞エピトープはエピトープ内に１以上の残基の付加を含む。
【００３８】
ここで用いる、“有意なエピトープ”とは試験ドナープール内の反応率がバックグラウンド反応率の約３倍以上であるエピトープ（すなわち、Ｔ細胞またはＢ細胞エピトープ）をいう。
【００３９】
ここで用いる“変化した免疫反応”とは、増加または減少した免疫反応をいう。タンパク質及びペプチドは、それらが引き起こすＴ細胞及び／またはＢ細胞反応が母体（例えば、前駆体）タンパク質またはペプチド（例えば、目的のタンパク質）により引き起こされたものより大きい場合、“増加した免疫反応”を示す。この高い反応の最終結果は変異体タンパク質またはペプチドに対する直接の増加した抗体反応である。タンパク質及びペプチドはそれらが引き起こすＴ細胞及び／またはＢ細胞反応が母体（例えば、前駆体）タンパク質またはペプチドにより引き起こされたものより少ない場合、“減少した免疫反応”を示す。好ましい実施態様において、この低い反応の最終結果は変異体タンパク質またはペプチドに対する直接の減少した抗体反応である。いくつかの好ましい実施態様において、母体タンパク質は野生型タンパク質またはペプチドである。
【００４０】
ここで用いる、“ｉｎ  ｖｉｖｏでの免疫原性の減少”とは、生きた生物内で（例えば、生きた動物を用いることが必要）少なくとも部分的に起こる分析により測定して免疫反応の減少示すことをいう。典型的な“ｉｎ  ｖｉｖｏ”分析はマウスモデルにおける変性免疫反応の測定などである。
【００４１】
ここで用いる、“ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの免疫原性の減少”とは、生きた生物の外側の人口的な環境内（すなわち、生きた動物の使用は必要でない）で起こる分析により測定して免疫反応の減少示すことをいう。典型的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析は目的ペプチドに対するヒト末梢血単核細胞による増殖反応の試験などである。
【００４２】
ここで用いる、“目的タンパク質”とは、分析、同定及び／または修飾されるタンパク質（例えば、プロテアーゼ）をいう。天然及び組換えタンパク質は本発明で使用できる。実際、本発明はヒト（またはその他の動物）の免疫反応を特徴付ける及び／または調節するために望ましいタンパク質を用いることができる。いくつかの実施態様において、ホルモン、サイトカイン、抗体、酵素、構造タンパク質及び結合タンパク質などのタンパク質が本発明で使用できる。いくつかの実施態様において、ホルモンは、限定されないが、インスリン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、スロモポエチン（Ｔｈｒｏｍｏｐｏｉｅｔｉｎ）（ＴＰＯ）及び黄体形成ホルモン（ＬＨ）などが本発明で使用できる。さらに別の実施態様において、サイトカインは限定されないが、インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−α及びＩＦＮ−β）、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１〜ＩＬ−１５）、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦ−α及びＴＮＦ−β）、及びＧＭ−ＣＳＦなどが本発明で使用できる。さらに別の実施態様において、抗体（すなわち、免疫グロブリン）は、限定されないが、ヒト及びヒト化抗体、任意のクラスの抗体由来断片（例えば、一本鎖抗体）などが本発明で使用できる。さらに別の実施態様において、構造タンパク質、限定されないが、食物アレルゲン（例えば、Ｂｅｒ  ｅ１［ブラジルナッツアレルゲン］及びＡｒａ  Ｈ１［ピーナッツアレルゲン］）などが本発明で使用できる。別の実施態様において、タンパク質は工業的及び／または薬剤酵素である。いくつかの実施態様において、酵素の好ましいクラスは、限定されないが、プロテアーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、エステラーゼ、アミラーゼ、フェノールオキシダーゼ、オキシダーゼ、パーミアーゼ、プルラナーゼ、イソメラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ラクタマーゼ及びレダクターゼなどがある。
【００４３】
ここで用いる“タンパク質”とは、アミノ酸からなり、当業者によりタンパク質として認識される任意の組成物をいう。“タンパク質”、“ペプチド”及びポリペプチドの語はここでは交換可能に用いられる。アミノ酸は完全な名称（例えば、アラニン）または一般に認められる１文字（例えば、Ａ）、または３文字（例えば、ａｌａ）省略形で言及される。ペプチドはタンパク質の一部であり、当業者であれば本文中の該語の使用は当然理解する。“タンパク質”の語は成熟型タンパク質及びプロ及びプレプロ型の関連タンパク質を包含する。プレプロ型のタンパク質は、タンパク質のアミノ末端に作動可能に連結するプロ配列、及びプロ配列のアミノ末端に作動可能に連結する“プレ”または“シグナル”配列を有する成熟型のタンパク質を含む。好ましい実施態様において、タンパク質はプロテアーゼである。いくつかの特に好ましい実施態様において、プロテアーゼはズブチリシンであり、一方、別の特に好ましい実施態様において、プロテアーゼはズブチリシン・カールスバーグである。
【００４４】
ここで用いる“野生型”及び“天然”タンパク質は天然に見られるタンパク質である。“野生型配列”及び“野生型遺伝子”の語はここで交換可能に用いられ、宿主細胞において天然または元からある配列をいう。いくつかの実施態様において、野生型配列はタンパク質工学プロジェクトの出発点である目的の配列をいう。
【００４５】
ここで用いる“プロテアーゼ”とは天然プロテアーゼ及び組換えプロテアーゼをいう。プロテアーゼは一般的に、タンパク質またはペプチドのペプチド結合を切断する働きを有するカルボニルヒドロラーゼである。天然プロテアーゼは、限定されないが、α−アミノアシルペプチドヒドロラーゼ、ペプチジルアミノ酸ヒドロラーゼ、アシルアミノヒドロラーゼ、セリンカルボキシペプチダーゼ、メタロカルボキシペプチダーゼ、チオールプロテイナーゼ、カルボキシルプロテイナーゼ及びメタロプロテイナーゼなどの例を含む。セリン、メタロ、チオール及び酸プロテアーゼはエンド及びエキソプロテアーゼもまた含まれる。実際、いくつかの好ましい実施態様において、キモトリプシン及びズブチリシンなどのセリンプロテアーゼは使用できる。これらのセリンプロテアーゼの両方は、アスパラギン酸、ヒスチジン及びセリンを含む触媒の三点セットを有する。ズブチリシンプロテアーゼにおいて、カルボキシ末端から読むこれらのアミノ酸の相対オーダーはアスパラギン酸−ヒスチジン−セリンであり、一方、キモトリプシンプロテアーゼにおいて、カルボキシ末端から読むこれらのアミノ酸の相対オーダーはヒスチジン−アルパラギン酸−セリンである。ズブチリシンは通常、細菌、真菌または酵母源から得られるが、ここで用いる“ズブチリシン”とは、上に定義したズブチリシンプロテアーゼの触媒三点セットを有するセリンプロテアーゼをいう。さらに、ヒトズブチリシンはズブチリシン触媒活性を有するヒト起源のタンパク質であり、例えば、ヒト由来プロテアーゼのケキシンファミリーである。ズブチリシンは当業界に公知であり、例えば、バチルス・アミロリケファシエンスズブチリシン（ＢＰＮ’）、バチルス・レンタスズブチリシン、バチルス・ズブチリスズブチリシン、バチルス・リケニフォルミスズブチリシン（例えば、米国特許第４，７６０，０２５号（ＲＥ３４，６０６）、米国特許第５，２０４，０１５号、米国特許第５，１８５，２５８号、ＥＰ０  ３２８  ２９９、及びＷＯ８９／０６２７９を参照）。本発明のいくつかの好ましい実施態様において、該語はズブチリシンに関して用い、一方、特に好ましい実施態様において、該語はＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）酵素をいう。
【００４６】
ここで用いる“タンパク質”とは、アミノ酸からなり、当業者によりタンパク質として認識される任意の組成物をいう。“タンパク質”、“ペプチド”及びポリペプチドの語はここでは交換可能に用いられる。ペプチドはタンパク質の一部であり、当業者であれば本文中の該語の使用は当然理解する。“タンパク質”の語は成熟型タンパク質及びプロ及びプレプロ型の関連タンパク質を包含する。プレプロ型のタンパク質は、タンパク質のアミノ末端に作動可能に連結するプロ配列、及びプロ配列のアミノ末端に作動可能に連結する“プレ”または“シグナル”配列を有する成熟型のタンパク質を含む。ここで用いる、機能的に類似のタンパク質は“関連タンパク質”と考える。いくつかの実施態様において、これらのタンパク質は異なる属及び／または種に由来し（例えば、Ｂ．ズブチリスズブチリシン及びＢ．レンタスズブチリシン）、生物分類間の違いを含む（例えば、細菌性ズブチリシン及び真菌ズブチリシン）。別の実施態様において、関連タンパク質は同じ種から得られる。実際に、本発明はいかなる供給源由来の関連タンパク質にも限定するものではない。
【００４７】
ここで用いる、“誘導体”の語は、前駆体タンパク質（例えば、天然プロテアーゼ）に１以上のアミノ酸をＣ及び／またはＮ末端に付加、１以上のアミノ酸をアミノ酸配列中の１以上の異なる部位で置換、及び／またはタンパク質の末端またはアミノ酸配列中の１以上の部位で１以上のアミノ酸が欠失、及び／またはアミノ酸配列中の１以上の部位で１以上のアミノ酸を挿入することにより得られたタンパク質（例えば、プロテアーゼ）をいう。プロテアーゼ誘導体の調製は好ましくは、天然タンパク質をエンコードするＤＮＡ配列を修飾し、ＤＮＡ配列を適当な宿主に形質転換、及び修飾ＤＮＡ配列を発現させて誘導体プロテアーゼを形成させることにより達成される。
【００４８】
関連（及び誘導体）タンパク質の１の種類としては “変異体タンパク質”がある。好ましい実施態様において、変異体タンパク質は親タンパク質と異なり、お互い少数のアミノ酸残基が異なる。アミノ酸残基の違いの数は１以上であり、好ましくは、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０以上のアミノ酸残基である。１の好ましい実施態様において、変異体間の異なるアミノ酸の数は１〜１０である。特に好ましい実施態様において、関連タンパク質及び特に変異体タンパク質は少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％アミノ酸配列同一性を含む。さらに、ここで用いる関連タンパク質または変異体タンパク質は顕著な領域の数が他の関連タンパク質または親タンパク質とは異なるタンパク質をいう。例えば、いくつかの実施態様において、変異体タンパク質は、親タンパク質とは異なる１、２、３、４、５または１０の対応する顕著な領域を有する。１の実施態様において、変異体の顕著な対応領域はバックグランドレベルの免疫反応しか生じない。
【００４９】
ここで用いる“対応する”とはタンパク質またはペプチドの列挙した位置での残基または他のタンパク質またはペプチドの列挙した残基に類似、相同または同等である残基をいう。
【００５０】
ここで用いる“対応領域”とは通常、関連タンパク質または親タンパク質内の類似位置をいう。
【００５１】
ここで用いる、“類似配列”とは、目的タンパク質と類似の機能、三次構造及び／または保存残基を与えるタンパク質内の配列をいう。特に好ましい実施態様において、類似配列はエピトープの、またはその近くの配列を含む。例えば、αへリックスまたはβシート構造を含むエピトープ領域において、類似配列内の置換アミノ酸は好ましくは同じ特異構造を維持する。該語は核酸配列及びアミノ酸配列についてもいう。
【００５２】
ここで用いる“相同タンパク質”とは、目的タンパク質（例えば、プロテアーゼ）と類似の触媒作用、構造、抗原性及び／または免疫反応を有するタンパク質（例えば、プロテアーゼ）をいう。目的の相同体及びタンパク質（例えば、プロテアーゼ）は必ずしも進化に関連することは意図されない。従って、該語は異なる種から得られた同じ機能的タンパク質を包含するものである。いくつかの好ましい実施態様において、目的タンパク質に類似の三次及び／または一次構造を有する相同体を同定することは、相同体と類似断片を有する目的タンパク質におけるエピトープの置換が変化による破壊を減少させるので、望ましい。従って、ほとんどの場合において、相同体に近いタンパク質はエピトープ置換の最も望ましい供給源となる。もしくは、所定のタンパク質のヒト類似体に目を向けることは有益である。
【００５３】
好ましい実施態様において、ここで用いる“相同体”とはＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）酵素と類似の触媒作用、構造及び／または用途を有する酵素を意味する。いくつかの好ましい実施態様において、本発明のＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）酵素相同体は野生型ＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）酵素に実質的に類似の三次及び／または一次構造を有する。有意なＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）酵素エピトープは相同性酵素を類似断片と置換できる。このタイプの置換は親ズブチリシンの変化が破壊するのを減少できる。ほとんどの場合において、厳密に相同なタンパク質はエピトープ置換の最も望ましい供給源となる。
【００５４】
ここで用いる“相同性遺伝子”とは、異なるが通常関連する種由来の少なくとも遺伝子の対をいい、お互い対応し、お互い同一または非常に類似したものとなっている。該語は種形成（すなわち、新しい種の発達）により分離された遺伝子（例えば、オーソロガス遺伝子）及び遺伝子重複により分離された遺伝子（例えば、）を包含する。
【００５５】
ここで用いる“オーソログ”及び“オーソロガス遺伝子”とは、種形成により共通の祖先の遺伝子（すなわち、相同性遺伝子）から進化した、異なる種における遺伝子をいう。通常、オーソログは進化の過程において同じ機能を保有する。オーソログの同定は新しく配列決定されたゲノムの遺伝子機能について信頼性のある予測を行うために使用できる。
【００５６】
ここで用いる、“パラログ”及び“パラロガス遺伝子”とはゲノム内の重複により関連する遺伝子をいう。オーソログは進化の過程において同じ機能を保有するが、パラログは、同じ機能が元々の遺伝子に関連することが多くても、新しい機能を発展させる。パラログ遺伝子の例としては、限定されないが、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ及びトロンビンをエンコードする遺伝子などがあり、これらは全てセリンプロテイナーゼであり、同じ種内で一緒に起こる。
【００５７】
配列間の相同性の程度は当業界に公知の適当な方法を用いて決定できる（例えば、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，２：４８２［１９８１］；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３［１９７０］；Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４［１９８８］；Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，マディソン，ウィスコンシン州）のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡなどのプログラム；及びＤｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１２：３８７−３９５［１９８４］を参照）。
【００５８】
例えば、ＰＩＬＥＵＰは配列相同性レベルを決定するのに有用なプログラムである。ＰＩＬＥＵＰは、進行性、対合アラインメントを用いて関連配列のグループから複数の配列アラインメントを作成する。また、当該アラインメントを作成するために用いる集積性関係を示す系図をプロットできる。ＰＩＬＥＵＰはＦｅｎｇとＤｏｏｌｉｔｔｌｅの進行性アラインメント法の簡略化を用いる（Ｆｅｎｇ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．，３５：３５１−３６０［１９８７］）。当該方法はＨｉｇｇｉｎｓとＳｈａｒｐにより説明された方法と類似している（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３［１９８９］）。有用なＰＩＬＥＵＰパラメーターは、初期設定ギャップウェイト３．００、初期設定ギャップ長さウェイト０．１０及び加重ウェイトギャップを含む。有用なアルゴリズムの他の例としては、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．により説明されるＢＬＡＳＴアルゴリズムである（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０、［１９９０］；及びＫａｒｌｉｎ  ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５７８７［１９９３］）。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムはＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラムである（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２６６：４６０−４８０［１９９６］を参照）。パラメーター“Ｗ”、“Ｔ”及び“Ｘ”はアラインメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは初期設定として、語長（Ｗ）が１１、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５［１９８９］を参照）アラインメント（Ｂ）として５０、期待値（Ｅ）として１０、Ｍ’５、Ｎ’−４及び両ストランドの比較を用いる
【００５９】
ここで用いる“核酸配列同一性比率（％）”とは、当該配列のヌクレオチド残基と同一である、候補配列におけるヌクレオチド残基の比率として定義される。
【００６０】
ここで用いる“ハイブリダイゼーション”の語は核酸ストランドが塩基対合により相補的ストランドに結合するプロセスをいい、当業界に公知である。
【００６１】
ここで用いる“最大ストリンジェンシー”とは、約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍより５℃低い）で通常起こるハイブリダイゼーションのレベルをいい、“高ストリンジェンシー”はＴｍより約５℃〜１０℃低く、“中ストリンジェンシー”はＴｍより約１０℃〜２０℃低く、及び“低ストリンジェンシー”はＴｍより約２０℃〜２５℃低い。当業者に理解されるように、最大ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは同一のポリヌクレオチド配列を同定または検出するために使用でき、中または低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションはポリヌクレオチド配列相同体を同定または検出するために使用できる。
【００６２】
２つの核酸またはポリペプチドに関する語句“実質的に類似”及び“実質的に同一”は、一般的にポリヌクレオチドまたはポリペプチドが参照（すなわち、野生型）配列と比較して、少なくとも７５％配列同一性、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは９５％、最も好ましくは９７％、時には９８％及び９９％程度の配列同一性を有する配列を含むことを意味する。配列同一性は標準パラメーターを用いてＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ及びＣＬＵＳＴＡＬなどの公知のプログラムを使用して決定できる（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０［１９９０］；Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５［１９８９］；Ｋａｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：５８７３［１９９３］；及びＨｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ７３：２３７−２４４［１９８８］を参照）。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは全米バイオテクノロジー情報センターより公共に入手可能である。また、データベースはＦＡＳＴＡを用いて調査できる（Ｐｅａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４−２４４８［１９８８］）。
【００６３】
いくつかの実施態様において、“同等残基” とは、前駆体タンパク質（すなわち目的タンパク質）の三次構造レベルで相同性を決定することにより定義され、その三次構造はＸ線結晶学により決定される。同等残基は前駆体タンパク質及びその他のタンパク質の特定アミノ酸残基の２以上の主鎖原子の原子座標が配列後０．１３ｎｍ及び好ましくは０．１ｎｍ内であるものとして定義される。配列はベストモデルに合わせ、タンパク質の非水素タンパク質原子の原子座標が最大重複を与えるようにランク付けした後に達成される。ほとんどの実施態様において、ベストモデルは、利用可能な最高解像度での実験回折データに関して最も低いＲ因子を与える結晶モデルである。
【００６４】
いくつかの実施態様において、修飾は好ましくは前駆体酵素のアミノ酸配列をエンコードする“前駆体ＤＮＡ配列”に対して行うが、前駆体タンパク質を操作することにより行うことができる。保存されていない残基の場合、１以上のアミノ酸の置換は天然に見られる配列に一致しないアミノ酸配列を有する変異体を生成する置換に限定される。保存残基の場合、当該置換は天然配列を生じないはずである。本発明により提供される誘導体はさらにプロテアーゼの特徴を変化させる化学修飾を含む。
【００６５】
いくつかの好ましい実施態様において、タンパク質遺伝子は適当な発現プラスミド内に連結される。クローンタンパク質遺伝子はそれから宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトしてタンパク質遺伝子を発現するために用いる。このプラスミドは、プラスミド複製に必要な公知の要素を含むという意味で宿主において複製し、またはプラスミドは宿主染色体中に統合するために設計される。必須要素が効率的な遺伝子発現のために提供される（例えば、目的遺伝子に作動可能に連結するプロモーター）。いくつかの実施態様において、これらの必須要素は、認識される場合（すなわち、宿主により転写される場合）該遺伝子自身の相同性プロモーター、外来性の転写ターミネーター（真核宿主細胞のポリアデニル化領域）として供給され、またはタンパク質遺伝子の内生ターミネーター領域により供給される。いくつかの実施態様において、抗菌剤含有培地中での成長により、プラスミド感染宿主細胞の連続培養持続を可能とする抗生物質耐性遺伝子などの選択遺伝子も含む。
【００６６】
本発明は言及した特定の微生物株由来のものに等しい変化した免疫原性を有するプロテアーゼを包含する。“同等”であるとは、中から高ストリンジェンシー条件下で図１に示すいずれかの配列を有するポリヌクレオチドにハイブリダイズでき、依然としてヒトＴ細胞に対する変化した免疫反応を維持できるポリヌクレオチドによりプロテアーゼがエンコードされることを意味する。“同等”であるとは、プロテアーゼが少なくとも５５％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７、または少なくとも９９％同一性をエピトープ配列及び当該エピトープを有する変異体プロテアーゼ（すなわち、修飾されたアミノ酸配列を有する）に対して含むことを意味する。
【００６７】
ここで用いる、“ハイブリッドプロテアーゼ”及び“融合プロテアーゼ”の語は、少なくとも２の異なるまたは“母体”タンパク質から設計されたタンパク質をいう。好ましい実施態様において、これらの母体タンパク質は他方の相同体である。例えば、いくつかの実施態様において、好ましいハイブリッドプロテアーゼまたは融合タンパク質はタンパク質のＮ末端及びタンパク質相同体のＣ末端を含む。いくつかの好ましい実施態様において、２つの末端は完全長活性タンパク質に対応して組み合わされる。別の好ましい実施態様において、相同体は実質的に類似だが同一ではないＴ細胞エピトープを共有する。従って、１の実施態様において、本発明はＣ末端に１以上のＴ細胞エピトープを有する目的プロテアーゼを提供するが、Ｃ末端はより作用の弱いＴ細胞エピトープを有する相同体のＣ末端で置換されており、またはＣ末端にＴ細胞エピトープを持たない、またはほとんど持たない。従って、相同体間のＴ細胞エピトープを同定できれば、異なる免疫原性反応を生じる種々の変異体が形成できることが当業者であれば理解される。さらに、内部及び１以上の相同体が本発明の変異体を生成するために使用できることが理解される。
【００６８】
本発明の変異体はタンパク質変異体の成熟型、及び当該タンパク質変異体のプロ及びプレプロ型を含む。プレプロ型は、タンパク質変異体の発現、分泌及び成熟を促進するので好ましい構造である。
【００６９】
ここで用いる、“プロ配列”とは、除去された場合、タンパク質の“成熟”型が生じる、タンパク質の成熟型のＮ末端部分に結合するアミノ酸配列をいう。多くのタンパク質分解酵素は翻訳プロ酵素生成物として自然に見られ、翻訳後処理がない場合、この状態で発現する。プロテアーゼ変異体などの生成タンパク質変異体の好ましいプロ配列はバチルス・リケニフォルミスズブチリシンカールスバーグの推定上のプロ配列であるが、その他のプロ配列は本発明で使用できる。
【００７０】
ここで用いる“シグナル配列”及び“プレ配列”とは、タンパク質のＮ末端部分、またはプロタンパク質のＮ末端部分に結合するアミノ酸配列をいい、タンパク質の成熟またはプロ型の分泌に関連し得るものである。シグナル配列のこの定義は機能的なものであり、天然条件下でタンパク質の分泌実施に関連する、タンパク質遺伝子のＮ末端部分によりエンコードされるそれら全てのアミノ酸配列を含むものとする。本発明はそのような配列を利用し、ここに記載するタンパク質変異体の分泌をもたらす。
【００７１】
ここで使用する、タンパク質変異体の“プレプロ”型はタンパク質のアミノ末端に作動可能に連結するプロ配列、及びプロ配列のアミノ末端に作動可能に連結する“プレ”または“シグナル”配列を有するタンパク質の成熟型からなる。
【００７２】
ここで用いる“調節要素”の語は、核酸配列の発現のいくつかの側面を制御する遺伝要素をいう。例えば、プロモーターは作動可能に連結したコドン領域の転写の開始を促進する調節要素である。他の調節要素はスプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル、及び終結シグナルなどがある。
【００７３】
ここで用いる“発現ベクター”とは、適当な宿主においてＤＮＡ発現をもたらすことができる適当な制御配列に作動可能に連結したＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築体をいう。当該制御配列は転写をもたらすプロモーター、当該転写を制御する任意のオペレーター配列、適当なｍＲＮＡリボソーム結合部位をエンコードする配列及び転写及び翻訳の終了を制御する配列を含む。ベクターはプラスミド、ファージ粒子、または簡単な潜在的ゲノム挿入である。いったん適当な宿主内に形質転換されると、ベクターは複製し、宿主ゲノムと独立して機能し、または場合によってはそれ自身のゲノム中に統合される。本明細書において、“プラスミド”及び“ベクター”は、プラスミドが現在最も一般的に使用されているベクターの形態であるので、交換可能に用いる場合もある。しかしながら、本発明は同等の機能を有し、当業界に公知な、またはこれから公知になるその他の発現ベクターの形態も含むものとする。
【００７４】
ここで用いる、“宿主細胞”とは通常、当業界に公知の方法で、酵素的に活性なエンドプロテアーゼを分泌できなくするように好ましく操作された原核または真核宿主である（例えば、米国特許第４，７６０，０２５号（ＲＥ３４，６０６）を参照）。タンパク質を発現するために好ましい宿主細胞は酵素的に活性な中性タンパク質中に不足しているバチルス株ＢＧ２０３６及びアルカリ性プロテアーゼ（ズブチリシン）である。株ＢＧ２０３６の構築は米国特許第５，２６４，３６６号に詳細に説明されている。タンパク質を発現するためのその他の宿主細胞はバチルス・ズブチリスＩ１６８（米国特許第４，７６０，０２５号８ＲＥ３４，６０６及び米国特許第５，２６４，３６６号に記載）、及び適当なバチルス株を含み、Ｂ．リケニフォルミス、Ｂ．レンタス、及びその他のバチルス種等に含まれるものなどである。
【００７５】
宿主細胞は当業界に公知の組換えＤＮＡ技術を用いて構築したベクターを用いて形質転換またはトランスフェクトする。形質転換宿主細胞はタンパク質変異体をエンコードするベクターの複製または所望のタンパク質変異体の発現が可能である。タンパク質変異体のプレまたはプレプロ型をエンコードするベクターの場合、当該変異体は、発現した場合、宿主細胞から宿主細胞培地中に通常分泌される。
【００７６】
核酸配列を細胞中に挿入する内容に関して“導入する”の語は形質転換、形質導入またはトランスフェクションを意味する。形質転換の意味はプロトプラスト形質転換、塩化カルシウム沈殿、エレクトロポレーション、ｎａｋｅｄ  ＤＮＡ及びその他当業界に公知のものを含む（Ｃｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｃｏｈｅｎ（１９７９）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１６８：１１１−１１５；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）Ａｐｐｌ．ａｎｄ  Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５１：６３４；及びＦｅｒｒａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．による総論（１９８９）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５７−７２頁、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｅｄ．Ｃ．Ｈａｒｗｏｏｄ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎを参照）。
【００７７】
プロテアーゼに関する実施態様において、変異体プロテアーゼ活性は種々の市販基質（限定されないが、カゼイン、ケラチン、エラスチン及びコラーゲンなど）を用いてプロテアーゼ相互作用を調べることにより測定及び目的プロテアーゼと比較できる。実際に、プロテアーゼ活性は当業界に公知の適当な方法により測定できる。プロテアーゼ活性を測定する典型的な例としては、限定されないが、スクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐａｒａニトロアニリド（ＳＡＡＰＦｐＮＡ）（引用）分析、及び２，４，６−トリニトロベンゼンスルホネートナトリウム塩（ＴＮＢＳ）分析などがある。ＳＡＡＰＦｐＮＡ分析において、プロテアーゼはペプチドとｐ−ニトロアニリン間の結合を切断して、４０５ｎｍに可視黄色吸収を生じる。ＴＮＢＳ呈色反応法において、該分析は基質から遊離アミノ基を含むポリペプチドへの酵素加水分解を測定する。これらのアミノ基はＴＮＢＳと反応して黄色複合体を形成する。従って、反応して色が深くなるほど、より多くの活性が測定される。黄色は当業界に公知の種々の分析器または分光光度計により測定できる。
【００７８】
変異体プロテアーゼのその他の特性は当業界に公知の方法により測定できる。典型的な特性は、限定されないが、熱安定性、アルカリ安定性、及び種々の基質における特定プロテアーゼの安定性または緩衝溶液または生成物形成などである。
【００７９】
ここに記載する酵素安定性分析手順と組み合わせた場合、ランダム変異により得られる変異体は酵素活性を維持しながら増加または減少したアルカリまたは熱安定性を示すものを同定できる。
【００８０】
アルカリ安定性は公知の手順により、またはここに記載の方法により測定できる。アルカリ安定性の実質的な変化は、前駆体タンパク質と比較した場合、変異体の酵素活性半減期が少なくとも約５％以上の増加または減少（ほとんどの実施態様において、好ましくは増加）することにより証明される。
【００８１】
熱安定性は公知の手順により、またはここに記載の方法により測定できる。熱安定性の実質的な変化は前駆体タンパク質と比較して比較的高温及び中性ｐＨに曝露された場合、変異体の触媒活性の半減期が約５％以上増加または減少（ほとんどの実施態様において、好ましくは増加）することにより証明される。
【００８２】
ここで用いる、“パーソナルケア製品”とは、髪、肌、頭皮、歯の洗浄に用いる製品を意味し、限定されないが、シャンプー、ボディーローション、シャワー用ジェル、局所用保湿剤、歯磨き粉、及び／またはその他の局所用洗剤などがある。いくつかの特に好ましい実施態様において、これらの製品はヒトが利用するものであり、一方、他の実施態様において、これらの製品はヒト以外の動物にも使用できる（例えば、獣医用途）。
【００８３】
ここで用いる“スキンケア組成物”とは、肌を洗浄及び／または保湿するための局所用途に用いる製品を意味する。当該組成物は、限定されないが、保湿体用洗浄剤、シャワー用ジェル、ボディーローション、保湿顔用クリーム、メイク落とし及びローションなどがある。
【００８４】
ここで用いる“洗浄組成物”は、布、皿、コンタクトレンズ、その他の固体基質、髪（シャンプー）、肌（石けん及びクリーム）、歯（マウスウォッシュ、歯磨き粉）等の基質から望ましくない成分を除去するために用いることができる組成物である。
【００８５】
ここで用いる“洗浄組成物物質”の語は特定タイプの望ましい洗浄組成物及び製品の形態（例えば、液体、顆粒、スプレー組成物）に関して選択する液体、固体、または気体物質をいい、当該物質は該組成物に使用されるプロテアーゼ酵素と適合するものでもある。洗浄組成物物質の特定の選択は表面、洗浄する品目または布、及び使用時の洗浄状態に関する（例えば、洗浄洗剤使用により）組成物の望ましい形態を考慮することにより容易に行える。
【００８６】
ここで用いる“硬い表面（ｈａｒｄ  ｓｕｒｆａｃｅ）用洗浄組成物”の語は床、壁、浴室タイル等の硬い表面を洗浄するための洗剤組成物をいう。当該組成物は限定されないが、固体、液体、エマルジョン等などの形態で提供される。
【００８７】
ここで用いる“食器洗い組成物”とは、皿を洗浄するための全ての形態の組成物をいい、限定されないが、顆粒及び液体形状を含む。
【００８８】
ここで用いる“布洗浄組成物”とは、布を洗浄するための全ての形態の洗剤組成物をいい、限定されないが、顆粒、液体及びバー状形態を含む。ここで用いる“布”とは任意の繊維材料をいう。
【００８９】
ここで用いる“適合する（ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）”とは、洗浄組成物物質が、プロテアーゼが通常の使用状態で望むとおりの有効でなくなる程度までプロテアーゼ酵素のタンパク質分解活性を減少させないことを意味する。具体的な洗浄組成物物質については以下に詳細を説明する。
【００９０】
ここで用いる“プロテアーゼ酵素の有効量”とは、特定用途（パーソナルケア製品、洗浄組成物等）において必要な酵素活性を達成するために必要なプロテアーゼ酵素（例えば、ズブチリシンカールスバーグ）の量をいう。当該有効量は当業者により容易に確認され、使用する特定酵素、洗浄用途、洗浄組成物の特定組成、及び液体または乾燥（例えば、顆粒、バー状）組成物のどちらが良いか等の多くの要素に基づくものである。
【００９１】
ここで用いる“非布洗浄組成物”とは硬い表面用洗浄組成物、食器洗い組成物、口内洗浄組成物、入れ歯洗浄組成物、及びパーソナル洗浄組成物を含む。
【００９２】
ここで用いる“口内洗浄組成物”とは、歯磨剤、練歯磨き、歯磨きジェル、歯磨き粉、マウスウォッシュ、マウススプレー、マウスジェル、チューイングガム、薬用キャンディー、香料袋（ｓａｃｈｅｔｓ）、タブレット、バイオジェル、病気予防ペースト、歯の治療溶液等をいう。
【００９３】
ここで用いる“薬学的に許容できる”とは、薬剤、薬品、及び／または不活性成分を意味し、該語の記載は、ヒト及びその他の動物の組織に接触して使用するために適しており、過度の毒性、不適合性、不安定性、刺激、アレルギー反応等がなく、妥当な利益／危険度比と釣り合いのとれたものをいう。
【００９４】
本発明のタンパク質変異体の多くは種々の洗剤組成物を形成するのに有用である。多数の公知の化合物は本発明のタンパク質変異体を含む組成物において有用な適した界面活性剤である。これらは非イオン性、陰イオン性、陽イオン性、または両性イオン洗剤を含む（例えば、米国特許第４，４０４，１２８号、及び米国特許第４，２６１，８６８号を参照）。適当な洗剤処方は米国特許第５，２０４，０１５号に記載されている。当業者は洗浄組成物として使用できる別の処方についてよく知っている。一般的な洗浄組成物に加えて、本発明のタンパク質変異体は天然または野生型タンパク質を使用する任意の目的において使用できることが当業者であれば容易に理解できる。従って、これらの変異体は、例えば、バーまたは液体石けん用途、食器用処方、表面洗浄用途、コンタクトレンズ洗浄溶液または製品、ペプチド加水分解、廃棄物処理、織物用途、融合切断酵素としてタンパク質製品等に使用できる。実際に、本発明の変異体はいかなる特定の使用にも限定されるものではない。例えば、本発明の変異体は減少したアレルギー性／免疫原性に加えて、高められた洗剤組成物性能を含む（前駆体と比較して）。ここで用いる、洗剤の高められた性能とは、標準洗浄サイクル後の通常評価により測定して、特定酵素に敏感なシミ（例えば、草または血液）の洗浄が増加したものとして定義される。
【００９５】
タンパク質、特に本発明のプロテアーゼは、約０．０１〜約５重量％（好ましくは０．１重量％〜０．５重量％）のレベルでｐＨが６．５〜１２．０の公知の粉末及び液体洗剤中に処方できる。いくつかの実施態様において、これらの洗剤洗浄組成物はさらに、プロテアーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、リパーゼまたはエンドグリコシダーゼなどの酵素及びビルダー及び安定剤を含む。
【００９６】
従来の洗浄組成物にタンパク質を添加することによりいかなる特別な用途限定も生じない。言い換えれば、当該洗剤に適した温度及びｐＨは、ｐＨが上述の範囲内であり、温度が記載したタンパク質の変性温度以下である限り、本発明の組成物にも適している。さらに、本発明のタンパク質は洗剤なしで洗浄組成物に使用することができ、単独またはビルダー及び安定剤との組み合わせで使用できる。
【００９７】
１の実施態様において、本発明は本発明の変異体タンパク質を含む織物処理用組成物を提供する。当該組成物は絹またはウールの処理に使用できる（例えば、米国再発行特許第２１６，０３４号、欧州特許第１３４，２６７号、米国特許第４，５３３，３５９号、及び欧州特許第３４４，２５９号を参照）。これらの変異体は、当業界に公知の方法を用いてタンパク質分解活性及びこれらの用途に関するそれらの安定性に関してスクリーニングできる。
【００９８】
上述の通り、本発明のタンパク質は、その前駆体ＤＮＡによりエンコードされる天然タンパク質と比較した場合、変化した免疫反応（例えば、抗原性及び／または免疫原性）を示す。いくつかの好ましい実施態様において、当該タンパク質（例えば、プロテアーゼ）は減少したアレルギー性／免疫原性を示す。当業者は本発明のプロテアーゼの使用はタンパク質の免疫特性について大部分が決定されるであろうことを容易に理解する。例えば、減少した免疫反応を示すプロテアーゼは洗浄組成物において使用できる。ここに記載する１以上のプロテアーゼ変異体の有効量はタンパク性シミ除去が必要な種々の表面を洗浄するために有用な組成物に使用できる。当該洗浄組成物は、硬い表面を洗浄するための洗剤組成物、布を洗浄する洗剤組成物、食器洗い用組成物、口内洗浄組成物、及び入れ歯洗浄組成物を含む。
【００９９】
減少したアレルギー性／免疫原性を有する１以上の関連及び／または変異体タンパク質の有効量で、本発明の方法に従いランク付けされたものは、爪及び髪などの角質材料に適当される種々の組成物において使用でき、限定されないが、ヘアスプレー組成物、ヘアシャンプー及び／またはコンディショニング組成物、育毛調節用途組成物及び脂漏症、皮膚炎及び／またはフケを処理する目的で髪及び頭皮に適用される組成物として有用なものがある。
【０１００】
ここに記載する１以上のプロテアーゼ変異体の有効量は肌または髪への局所用途に適した組成物に含んで使用できる。これらの組成物はクリーム、ローション、ジェル等の形態となることができ、水溶液組成物として処方でき、または水性連続相中に１以上の油相を含むエマルジョンとして処方できる。
【０１０１】
さらに、減少したアレルギー性／免疫原性を有する関連及び／または変異体タンパク質はその他の用途で使用でき、医薬用途、ドラッグデリバリー用途及びその他のヘルスケア用途などがある。
【０１０２】
スキンケア活性
いくつかの実施態様において、本発明により提供される組成物は約０．１重量％〜約２０重量％、好ましくは約１重量％〜約１０重量％、より好ましくは約２重量％〜約８重量％のレベルでスキンケア活性を含む。ここで使用する適当なスキンケア活性の非限定的な例として、ビタミンＢ３成分、パンテノール、ビタミンＥ、ビタミンＥ酢酸、レチノール、レチニルプロピオネート、レチニルパルミテート、レチノイン酸、ビタミンＣ、テオブロミン、α−ヒドロキシ酸、ファルネソール、フィタントリオール、サリチル酸、パルミチル  ペプタペプチド−３及びこれらの混合物などがある。
【０１０３】
Ｂ３化合物
ここで用いる“ビタミンＢ３化合物”とは以下の式を有する化合物を意味する：
【数１】
0004597528.tif 000002
【０１０４】
ここでＲは−ＣＯＮＨ２（すなわち、ナイアシンアミド）、−ＣＯＯＨ（すなわち、ニコチン酸）または−ＣＨ２ＯＨ（すなわち、ニコチニルアルコール）、それらの誘導体及び前述のいずれかの塩である。前述のビタミンＢ３化合物の典型的な誘導体としては、ニコチン酸エステルを含み、ニコチン酸の非血管拡張エステル、ニコチニルアミノ酸、カルボン酸のニコチニルアルコールエステル、ニコチン酸Ｎ−オキシド及びナイアシンアミドＮ−オキシドなどがある。
【０１０５】
ニコチン酸の適当なエステルとしては、Ｃ１−Ｃ２２のニコチン酸エステル、好ましくはＣ１−Ｃ１６、より好ましくはＣ１−Ｃ６アルコールがある。アルコールは好ましくは、直鎖または分岐鎖、環式または非環式、飽和または不飽和（芳香族を含む）及び置換または非置換のアルコールである。当該エステルは好ましくは非血管拡張性である。ここで用いる、“非血管拡張性”とは、対象組成物を肌に適用後、当該エステルが通常、目に見える炎症反応を生じないということを意味する（すなわち、通常の集団の大部分が目に見える炎症反応を経験しないが、当該化合物は裸眼では確認できない血管拡張を生じ得る）。ニコチン酸の非血管拡張性エステルはトコフェロールニコチネート及びイノシトールヘキサニコチネートを含み、トコフェロールニコチネートが好ましい。ビタミンＢ３化合物のより完全な説明はＷＯ９８／２２０８５にある。好ましいＢ３化合物はナイアシンアミド及びトコロフェロールニコチネートである。
【０１０６】
レチノイド
他の適当なスキンケア活性はレチノイドである。ここで用いる、“レチノイド”は、肌においてビタミンＡの生物学的活性を有するビタミンＡまたはレチノイド様化合物の天然及び／または合成類似体の全て、及びこれらの化合物の幾何異性体及び立体異性体を含む。レチノイドがここに記載の組成物に含まれる場合、通常は約０．００５％〜約２％、より好ましくは０．０１％〜約２％レチノイドを含む。レチノールは好ましくは約０．０１％〜約０．１５％の量で用い、レチノールエステルは好ましくは約０．０１％〜約２％（例えば、約１％）の量で用いる。
【０１０７】
レチノイドは好ましくはレチノール、レチノールエステル（例えば、レチノールのＣ２−Ｃ２２アルキルエステル、レチニルパルミテート、レチニルアセテート、レチニルプロピオネートがある）、レチナール及び／またはレチノイン酸（全てのトランスレチノイン酸及び／または１３−シス−レチノイン酸）であり、より好ましくはレチノイン酸以外のレチノイドである。これらの化合物は当業界に公知であり、多数の供給元から入手可能である（例えば、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（セントルイス、ミズーリ州）、及びＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ（インディアナポリス、インディアナ州）。好ましいレチノイドは、レチノール、レチニルパルミテート、レチニルアセテート、レチニルプロピオネート、レチナール、レチノイン酸及びこれらの組み合わせを含む。より好ましいレチノイドはレチノール、レチノイン酸プロピオネート、レチノイン酸及びレチニルパルミテートが含まれる。レチノイドは実質的に純度の材料として含むことができ、または天然源（例えば、植物）から適当な物理的及び／または化学的単離により得られた抽出物として含むことができる。
【０１０８】
キャリア
本発明の組成物は安全で有効量の皮膚科学的に許容できるキャリアであって、必須物質及び任意のその他の物質が肌または髪に適当な濃度で運ばれることを可能にするために組込む範囲で肌及び／または髪への局所用途に適したものを使用できることがさらに考えられる。従って、当該キャリアは、選択した標的上に適当な濃度で確実に均一塗布または分布できるように必須成分の希釈剤、分散剤、溶媒等として作用する。
【０１０９】
本発明で利用されるキャリアの種類は当該組成物に望ましい製品形態のタイプに依存する。本発明はいかなる特定形態のキャリアにも限定されるものではないが、最も一般的には、固体、半固体または液体である。適当なキャリアは液体または半固体であり、クリーム、ローション、ジェル、スティック、軟膏、ペースト及びムース状などである。好ましくは、キャリアはローション、クリームまたはジェルの形態であり、より好ましくは粒子が沈殿するのを防ぐために十分な濃さまたは収量を有する。キャリアはそれ自身が不活性であり、またはそれ自身が皮膚科学的利点を有する。キャリアは直接肌及び／または髪に適当してもよく、または織布または不織布繊維または布を通して適当してもよい。また、パッチ、マスクまたはラップの形態であってもよい。また、エアゾール化または肌及び／または髪上にスプレーしてもよい。キャリアはここに記載した必須成分と物理的及び化学的に適合性を有するものでもあり、過度に安定性、効率またはその他の本発明の組成物に関する使用利点を損なうものであるべきでない。
【０１１０】
好ましいキャリアは皮膚科学的に許容できる、親水性希釈剤を含む。適当な親水性希釈剤は、水、Ｃ１−Ｃ４一価アルコール及び低分子量グリコール及びポリオールなどの有機親水性希釈剤が挙げられ、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール（例えば、分子量２００〜６００）、ポリプロピレングリコール（例えば、分子量４２５〜２０２５）、グリセロール、ブチレングリコール、１，２，４−ブタントリオール、ソルビトールエステル、１，２，６−ヒキサメトリオール（ｈｅｘａｍｅｔｒｉｏｌ）、エタノール、イソプロパノール、ソルビトールエステル、エトキシル化エーテル、プロポキシル化エーテル及びこれらの組み合わせなどを含む。希釈剤は好ましくは液体である。水は好ましい希釈剤である。組成物は好ましくは少なくとも約２０％の親水性希釈剤を含む。
【０１１１】
適当なキャリアは親水性相、特に水相及び疎水性相（脂質、油または油性物質）を含むエマルジョンも含む。当業界に公知であるように、親水性相は疎水性相中に分散し、または反対に、組成物成分に応じて、それぞれ親水性または疎水性の分散及び連続相を形成する。エマルジョン技術において、公知の語“分散相”とは、相が連続相に囲まれて、懸濁した小さい粒子または小滴として存在することを意味する。分散相は内部または不連続相としても公知である。エマルジョンは水中油型エマルジョンまたは油中水型エマルジョンであり、または含むことができ（例えば、三相またはその他の複数相エマルジョン）、シリコーン中水型エマルジョンなどである。水中油型エマルジョンは通常約１％〜約６０％（好ましくは約１％〜約３０％）の所望の疎水性相及び約１％〜約９９％（好ましくは約４０％〜約９０％）の連続親水性相を含み、油中水型エマルジョンは通常、約１〜約９８％（好ましくは約４０％〜約９０％）の所望の親水性相及び約１％〜約５０％（好ましくは約１％〜約３０％）の連続疎水性相を含む。
【０１１２】
保湿剤
いくつかの実施態様において、本発明の組成物は好ましくは約０．０１％〜約２０％、より好ましくは約０．１％〜約１５％及び特に好ましくは約０．５％〜約１０％のレベルで存在する保湿剤を含む。好ましい保湿剤は、限定されないが、多価アルコール、尿素、ＤまたはＤＬパンテノール、パントテン酸カルシウム、ロイヤルゼリー、パンテチン、パントテイン、パンテニルエチルエーテル、パンガミン酸、ピリドキシン、パントイルラクトース・ビタミンＢ複合体、ヘキサン−１，２，６−トリオール、グアニジンまたはその誘導体及びこれらの混合物から選択される化合物を含む。
【０１１３】
ここで使用するために適当な多価アルコールは、ポリアルキレングリコール、及びより好ましくはアルキレンポリオール及びそれらの誘導体を含み、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコール及びこれらの誘導体、ソルビトール、ヒドロキシプロピルソルビトール、エリトリトール、トレイトール、ペンタエリトリトール、キシリトール、グルシトール、マンニトール、ヘキシレングリコール、ブチレングリコール（例えば、１，３−ブチレングリコール）、ヘキサントリオール（例えば、１，２，６−ヘキサントリオール）、トリメチロールプロパン、ネオペンチルグリコール、グリセリン、エトキシル化グリセリン、プロパン−１，３ジオール、プロポキシル化グリセリン及びこれらの混合物などがある。上述の多価アルコールのアルコキシル化誘導体に本発明での使用に適している。本発明の好ましい多価アルコールはグリセリン、ブチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ヘキサントリオール、エトキシル化グリセリン及びプロポキシル化グリセリン、及びこれらの混合物から選択される。
【０１１４】
本発明で有用な適した保湿剤はナトリウム２−ピロリドン−５−カルボキシレート（ＮａＰＣＡ）、グアニジン、グリコール酸及びグリコール酸塩（例えば、アンモニウム及び第４アルキルアンモニウム）、乳酸及び乳酸塩（例えば、アンモニウム及び第４アルキルアンモニウム）、種々の形態のアロエベラ（例えば、アロエベラジェル）、ヒアルロン酸及びその誘導体（例えば、ヒアルロン酸ナトリウムなどの塩誘導体）、ラクトアミドモノエタノールアミン、アセトアミドモノエタノールアミン、尿素、パンテノール及びその誘導体及びこれらの混合物である。
【０１１５】
保湿剤の少なくとも一部（組成物の約５重量％以下）は微粒子架橋疎水性アクリル酸塩またはメタクリル酸塩コポリマーとの混合物の形態で組込むことができ、それ自身、好ましくは約０．１〜約１０％の量で存在し、水または分散相に加えることができる。このコポリマーは特に、効果的な保湿利点を与えるのを助けつつ、光沢を減少させ、油分を制御するのに有用であり、ここに引用するＷＯ９６／０３９６４にさらに詳細が記載されている。
【０１１６】
皮膚軟化剤
いくつかの実施態様において、本発明の水中油型エマルジョンの実施態様は約１％〜約２０％、好ましくは約１．５％〜約１５％、より好ましくは約０．１％〜約８％及びさらにより好ましくは約０．５％〜約５％の皮膚科学的に許容される皮膚軟化剤を含む。皮膚軟化剤は皮膚を円滑にする傾向があり、滑らかさ及び柔軟性を増加させ、乾燥を防止または軽減し、及び／または肌を保護する傾向がある。皮膚軟化剤は通常、水と不混和性であり、高分子量の油性またはワックス性物質及び皮膚軟化剤は局所用組成物に粘着特性を与えることができる。多種多様の適当な皮膚軟化剤が公知であり、本発明で使用できる。例えば、Ｓａｇａｒｉｎ，Ｃｏｓｍｅｔｉｃｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，第２版、Ｖｏｌ．１、第３２〜４３頁（１９７２）は皮膚軟化剤としての使用に適した物質の多数の例を含む。さらに、ＷＯ００／２４３７２で議論されている全ての皮膚軟化剤は本発明の使用に適したものと考えられるが、好ましい例についてさらに以下に詳細を概説する：
ｉ）約７〜約４０炭素原子を有する直鎖及び分岐鎖炭化水素、例えばドデカン、スクアラン、コレステロール、水素化ポリイソブチレン、イソヘキサデカン、イソエイコサン、イソオクタヘキサコンタン、イソヘキサペンタコンタヘクタン、及びＣ７−Ｃ４０分岐鎖炭化水素であるＣ７−Ｃ４０イソパラフィン。本発明の使用に適した分岐鎖炭化水素はイソペンタコンタオクタクタン、流動パラフィン及びこれらの混合物から選択される。Ｐｅｒｍｅｔｈｙｌ（登録商標）の商標で販売されており、Ｐｒｅｓｐｅｒｓｅ  Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ  Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ，Ｎ．Ｊ．から市販の分岐鎖脂肪族炭化水素は本発明の使用に適している。
ｉｉ）Ｃ１−Ｃ３０カルボン酸、Ｃ１２−Ｃ１５安息香酸アルキル及びＣ２−Ｃ３０ジカルボン酸のＣ１−Ｃ３０アルコールエステル、例えば、イソノナン酸イソノニル、ネオペンタン酸イソステアリル、オクタン酸イソデシル、イソノナン酸イソデシル、イソノナン酸トリデシル、オクタン酸ミリスチル、ペラルゴン酸オクチル、イソノナン酸オクチル、ミリスチン酸ミリスチル、ネオペンタン酸ミリスチル、オクタン酸ミリスチル、ミリスチン酸イソプロピル、プロピオン酸ミリスチル、ステアリン酸イソプロピル、イソステアリン酸イソプロピル、イソステアリン酸メチル、ベヘン酸ベヘニル、マレイン酸ジオクチル、アジピン酸ジイソプロピル及びジリノール酸ジイソプロピル及びこれらの混合物。
ｉｉｉ）糖類及び関連物質のＣ１−Ｃ３０モノ−及びポリ−エステル。これらのエステルは糖またはポリオール部分及び１以上のカルボン酸部分から得られる。構成酸及び糖に応じて、これらのエステルは室温で液体または固体である。例としては、テトラオレイン酸グルコース、オレイン酸のガラクトーステトラエステル、テトラオレイン酸ソルビトール、テトラオレイン酸スクロース、ペンタオレイン酸スクロース、ヘキサオレイン酸スクロース、ヘプタオレイン酸スクロース、オクタオレイン酸スクロース、ソルビトールヘキサエステルがあり、カルボン酸エステル部分はモル比が１：２のパルミトレイン酸とアラキジン酸及びスクロースのオクタエステル（ｏｃｔａｅｓｔｅｒ）であり、エステル化カルボン酸部分はモル比が１：３：４のラウリン酸、リノレン酸及びベヘン酸である。その他の物質は綿実油またはスクロースの大豆油脂肪酸エステルを含む。当該物質のその他の例としては、ＷＯ９６／１６６３６に記載されている。特に好ましい物質はＩＮＣＬの名前のスクロースポリコットンシーデート（ｐｏｌｙｃｏｔｔｏｎｓｅｅｄａｔｅ）により公知である。
ｉｖ）植物油及び水素化植物油。植物油及び水素化植物油の例としては、ベニバナ油、ココナッツ油、綿実油、メンハーデン油、パーム核油、ヤシ油、ピーナッツ油、大豆油、菜種油、リンシード油、ぬか油、松根油、ゴマ油、ヒマワリ油、前述の供給源から部分及び完全に水素化された油、及びこれらの混合物が挙げられる。
ｖ）溶性またはコロイド性−溶性保湿剤。例としては、ヒアルロン酸及びでんぷんグラフトポリアクリル酸ナトリウム、例えばＣｅｌａｎｅｓｅ  Ｓｕｐｅｒａｂｓｏｒｂｅｎｔ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｐｏｒｔｓｍｉｔｈ，ＶＡから市販のＳａｎｗｅｔ（登録商標）ＩＭ−１０００、ＩＭ−１５００及びＩＭ−２５００があり、米国特許第４，０７６，６６３号に記載されている。
【０１１７】
本発明で使用する好ましい皮膚軟化剤はイソヘキサデカン、イソオクタコンタン、流動パラフィン、イソノナン酸イソノニル、オクタン酸イソデシル、イソノナン酸イソデシル、イソノナン酸トリデシル、オクタン酸ミリスチル、イソノナン酸オクチル、ミリスチン酸ミリスチル、イソステアリン酸メチル、イソステアリン酸イソプロピル、Ｃ１２〜Ｃ１５安息香酸アルキル及びこれらの混合物である。本発明で使用する特に好ましい皮膚軟化剤はイソヘキサデカン、イソノナン酸イソノニル、イソステアリン酸メチル、イソステアリン酸イソプロピル、流動パラフィンまたはこれらの混合物である。
【０１１８】
乳化剤／界面活性剤
いくつかの実施態様において、本発明の組成物は乳化剤及び／または界面活性剤を含み、通常は連続水相内の分散相が分散及び懸濁するのを助ける。界面活性剤は製品が肌洗浄を目的とするものである場合も有用である。以下、便宜上、乳化剤は“界面活性剤”の語に含むものとする。従って、“界面活性剤”とは乳化剤として用いるか、肌洗浄などその他の界面活性目的であるかに関わらず、表面活性剤をいう。公知または従来の界面活性剤は、選択した物質が組成物の必須成分と化学的及び物理的に適合性であり、所望の性質を与える場合、本発明の組成物に使用できる。適当な界面活性剤は非シリコーン由来物質及びその混合物を含む。ＷＯ００／２４３７２に説明されている全ての界面活性剤は本発明での使用に適していると考えられる。
【０１１９】
いくつかの実施態様において、本発明の組成物は約０．０５〜約１５％の界面活性剤または界面活性剤の混合物を含む。選択した正確な界面活性剤または界面活性剤混合物は組成物のｐＨ及び存在するその他の成分に依存する。
【０１２０】
本発明で有用な非イオン性界面活性剤は、糖またはでんぷんポリマー（すなわち、グリコシド）を含む長鎖アルコール（例えば、Ｃ８−Ｃ３０アルコール）の縮合生成物として広く定義できるものである。その他の有用な非イオン性界面活性剤は脂肪酸を含むアルキレンオキシド（すなわち、脂肪酸のアルキレンオキシドエステル）の縮合生成物を含む。これらの物質は一般式ＲＣＯ（Ｘ）ｎＯＨを有し、ＲはＣ１０−Ｃ３０アルキル基、Ｘが−ＯＣＨ２ＣＨ２−（すなわち、エチレングリコールまたはオキシドから得られる）または−ＯＣＨ２ＣＨＣＨ３−（すなわち、プロピレングリコールまたはオキシドから得られる）、及びｎが約６〜約２００の整数である。その他の非イオン性界面活性剤は２モルの脂肪酸を含むアルキレンオキシドの縮合生成物（すなわち、脂肪酸のアルキレンオキシドジエステル）である。これらの物質は一般式ＲＣＯ（Ｘ）ｎＯＯＣＲを有し、ＲはＣ１０−３０アルキル基、Ｘは−ＯＣＨ２ＣＨ２−（すなわち、エチレングリコールまたはオキシドから得られる）または−ＯＣＨ２ＣＨＣＨ３−（すなわち、プロピレングリコールまたはオキシドから得られる）、及びｎが約６〜約１００の整数である。ここで使用する乳化剤は最も好ましくは、ソルビタン脂肪酸エステル及びスクロース脂肪酸エステルの混合物に基づく脂肪酸エステルブレンドであり、特にステアリン酸ソルビタンとスクロースココエートのブレンドである。これは商標名Ａｒｌａｔｏｎｅ２１２１でＩＣＩから市販されている。さらに適した例として、セテアリルアルコール、セテアリルグルコシドの混合物が挙げられ、例えば、商標名Ｍｏｎｔａｎｏｖ６８でＳｅｐｐｉｃから市販及びＥｍｕｌｇａｄｅ  ＰＬ６８／５０でＨｅｎｋｅｌから市販のものがある。
【０１２１】
いくつかの実施態様において、本発明で有用な親水性界面活性剤は代わりにまたはさらに、当業界に公知の多種多様の陽イオン性、陰イオン性、両性イオン及び両性界面活性剤を含む（例えば、米国特許第５，０１１，６８１号、米国特許第４，４２１，７６９号及び米国特許第３，７５５，５６０号を参照）。多種多様の陰イオン性界面活性剤も本発明の組成物において使用できる（例えば、米国特許第３，９２９，６７８号を参照）。典型的な陰イオン性界面活性剤はイセチオン酸アルキル（例えば、Ｃ１２−Ｃ３０）、アルキル及びアルキルエーテルサルフェート及びこれらの塩、アルキル及びアルキルエーテルホスフェート及びこれらの塩、アルキルメチルタウリン酸（例えば、Ｃ１２−Ｃ３０）及び脂肪酸の石けん（例えば、ナトリウムまたはカリウム塩などのアルカリ金属塩）を含む。
【０１２２】
両性及び両性イオン界面活性剤も本発明の組成物で使用できる。本発明の組成物で使用できる両性及び両性イオン界面活性剤の例として、脂肪族第２及び第３アミンの誘導体として広く説明されるものがあり、ここで脂肪族ラジカルは直鎖または分岐鎖であり、脂肪族置換基の一つは約８〜約２２の炭素原子（好ましくはＣ８〜Ｃ１８）を含み、１つは陰イオン水可溶化基（ａｎｉｏｎｉｃ  ｗａｔｅｒ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｚｉｎｇ  ｇｒｏｕｐ）（例えば、カルボキシ、スルホネート、ホスフェート、またはホスホネート）を含む。例としては、アルキルイミノ酢酸、イミノジアルカノエート及びアミノアルカノエート、イミダゾリニウム及びアンモニウム誘導体が挙げられる。その他の適当な両性及び両性イオン界面活性剤はベタイン、サルテイン（ｓｕｌｔａｉｎｅ）、ヒドロキシサルテイン、及び分岐及び非分岐アルカノイルサルコシン及びこれらの混合物からなる群より選択されるものを含む。
【０１２３】
いくつかの実施態様において、本発明のエマルジョンは乳化剤または界面活性剤を含んだシリコーンをさらに含む。多種多様なシリコーン乳化剤が本発明で使用できる。これらのシリコーンエマルジョンは通常有機的に修飾したオルガノポリシロキサンであり、当業者にはシリコーン界面活性剤としても公知である。有用なシリコーン乳化剤はジメチコンコポリマーなどがある。これらの物質は、酸化ポリエチレン鎖、酸化ポリプロピレン鎖、これらの鎖の混合物及び酸化エチレン及び酸化プロピレンの両方から得られる部分を含むポリエーテル鎖などのポリエーテル側鎖を含むように修飾されたポリジメチルシロキサンである。その他の例としては、アルキル修飾ジメチコンコポリマー（すなわち、Ｃ２−Ｃ３０ペンダント側鎖を含む化合物）を含む。さらに別の有用なジメチコンコポリマーは種々の陽イオン、陰イオン、両性及び両性イオンペンダント部分を有する物質を含む。
【０１２４】
ポリマー増粘剤
いくつかの実施態様において、本発明の組成物は少なくとも１のポリマー増粘剤（ｔｈｉｃｋｅｎｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）を含む。本発明で有用なポリマー増粘剤の数平均分子量は好ましくは２０，０００以上、より好ましくは５０，０００以上及び特に１００，０００以上である。いくつかの実施態様において、本発明の組成物は組成物の約０．０１重量％〜約１０重量％、好ましくは約０．１重量％〜約８重量％及び最も好ましくは約０．５重量％〜約５重量％のポリマー増粘剤またはこれらの混合物を含む。
【０１２５】
本発明で使用する好ましいポリマー増粘剤は非イオン性増粘剤及び陰イオン性増粘剤またはこれらの混合物を含む。適当な非イオン性増粘剤はポリアクリルアミドポリマー、架橋ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、多糖類、天然または合成ゴム、ポリビニルピロリドン、及びポリビニルアルコールを含む。適当な非イオン性増粘剤はアクリル酸／アクリル酸エチルコポリマー、カルボキシビニルポリマー及びアルキルビニルエーテル及び無水マレイン酸の架橋コポリマーを含む。本発明の使用に特に好ましい増粘剤は、ポリアクリルアミド及びイソパラフィン及びＳｅｐｉｇｅｌ３０５の商標名でＳｅｐｐｉｃ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから市販のラウレス−７及びアクリル酸／アクリル酸エチルコポリマー及びＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）樹脂の商標名でＢ．Ｆ．Ｇｏｏｄｒｉｃｈ  Ｃｏｍｐａｎｙから市販のカルボキシビニルポリマーまたはこれらの混合物などの非イオン性ポリアクリルアミドポリマーである。いくつかの実施態様において、適当なＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）樹脂は疎水的に修飾する。別の適当な樹脂はＷＯ９８／２２０８５に記載されている。これらの樹脂の混合物は本発明で使用できると考えられる。
【０１２６】
シリコーン油
いくつかの実施態様において、本発明は少なくとも１のシリコーン油相を含む。シリコーン油相は通常、組成物の約０．１％〜約２０％、好ましくは約０．５〜約１０％、より好ましくは約０．５％〜約５％を含む。各シリコーン油相は好ましくは１以上のシリコーン成分を含む。
【０１２７】
いくつかの実施態様において、シリコーン成分は流動体であり、直鎖、分岐鎖及び環式シリコーンを含む。本発明で有用な適当なシリコーン流動体はポリアルキルシロキサン流動体、ポリアリールシロキサン流動体、環式及び線状ポリアルキルシロキサン、ポリアルコキシル化シリコーン、アミノ及び第４アンモニウム変性シリコーン、ポリアルキルアリールシロキサンまたはポリエーテルシロキサンコポリマー及びこれらの混合物を含むシリコーンを含む。シリコーン流動体は揮発性または不揮発性である。シリコーン流動体は通常、重量平均分子量が約２００，０００以下である。適当なシリコーン流動体は分子量が約１００，０００以下、好ましくは約５０，０００以下、最も好ましくは約１０，０００以下である。好ましくはシリコーン流動体は重量平均分子量が約１００〜約５０，０００及び好ましくは約２００〜約４０，０００のシリコーン流動体から選択される。通常、シリコーン流動体の粘度は２５℃で、約０．６５〜約６００，０００ｍｍ２ｓ−１であり、好ましくは約０．６５〜約１０，０００ｍｍ２ｓ−１である。粘度は、Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｅ  Ｔｅｓｔ  Ｍｅｔｈｏｄ  ＣＴＭ０００４に記載のガラス毛細管粘度計手段により測定できる。本発明で使用できる適当なポリジメチルシロキサンは、例えばＧｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  ＣｏｍｐａｎｙからＳＦ及びＶｉｓｃａｓｉｌ（登録商標）シリーズとして市販及びＤｏｗ  ＣｏｒｎｉｎｇからＤｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ  ２００シリーズとして市販のものがある。２５℃で約０．６５〜３０，０００ｍｍ２．ｓ−１の粘度を有する、本質的に不揮発性ポリアルキルアリールシロキサン（例えば、ポリメチルフェニルシロキサン）も有用である。これらのシロキサンは例えば、Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  ＣｏｍｐａｎｙからＳＦ１０７５メチルフェニル流動体として、またはＤｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇから５５６コスメティックグレード流動体として市販されている。本発明での使用に適した環式ポリジメチルシロキサンは約３〜約７（ＣＨ３）２ＳｉＯ部分を組込んだ環状構造を有するものである。
【０１２８】
シリコーンゴムも本発明で使用できる。ここで“シリコーンゴム”の語は、約２００，０００以上及び好ましくは約２００，０００〜約４，０００，０００の重量平均分子量を有する高分子量シリコーンを意味する。本発明は不揮発性ポリアルキル及びポリアリールシロキサンゴムを含む。好ましい実施態様において、シリコーン油相はシリコーンゴムまたはシリコーンゴムを含むシリコーンの混合物を含む。通常、シリコーンゴムは２５℃で約１，０００，０００ｍｍ２ｓ−１以上の粘度を有する。シリコーンゴムは当業界に公知のジメチコン（例えば、米国特許第４，１５２，４１６号を参照）、及びＧｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃシリコーンゴム製品データシートＳＥ３０、ＳＥ３３、ＳＥ５４及びＳＥ７６に記載のシリコーンゴムを含む。シリコーンゴムの具体的な例として、ポリジメチルシロキサン、（ポリジメチルシロキサン）−（メチルビニルシロキサン）コポリマー、ポリ（ジメチルシロキサン）（ジフェニル）（メチルビニルシロキサン）コポリマー及びこれらの混合物を含む。本発明に使用する好ましいシリコーンゴムは、約２００，０００〜約４，０００，０００の分子量を有するシリコーンゴムであり、ジメチコノール、ジメチコンコポリオール、ジメチコン、及びこれらの混合物から選択される。
【０１２９】
ここでシリコーン相は好ましくはシリコーンゴム−流動体ブレンドの一部として組成物中に組込まれたシリコーンゴムを含む。シリコーンゴムがシリコーンゴム−流動体ブレンドの一部として組込まれた場合、シリコーンゴムは、シリコーンゴム−流動体ブレンドの好ましくは約５重量％〜約４０重量％、特に約１０重量％〜約２０重量％を構成する。本発明の適当なシリコーンゴム−流動体ブレンドは特に以下からなる混合物である：
（ｉ）ジメチコノール、フルオロシリコーン及びジメチコン及びこれらの混合物から選択された約２００，０００〜約４，０００，０００の分子量を有するシリコーン；及び
（ｉｉ）シリコーン流動体のキャリアであって、当該キャリアの粘度は約０．６５ｍｍ２ｓ−１〜約１００ｍｍ２ｓ−１である。
【０１３０】
ここで、ｉ）対ｉｉ）の比は約１０：９０〜約２０：８０であり、ここでシリコーンゴムベースの成分の最終的な粘度は約１００ｍｍ２ｓ−１〜約１００，０００ｍｍ２ｓ−１であり、好ましくは５００ｍｍ２ｓ−１〜約１０，０００ｍｍ２ｓ−１である。
【０１３１】
さらに、本発明のシリコーン油相での使用に適したシリコーン成分は架橋ポリオルガノシロキサンポリマーであり、任意で流動キャリア中に分散させる。通常、架橋ポリオルガノシロキサンポリマーはそのキャリア（もしあれば）と一緒に用い、組成物の０．１％〜約２０％、好ましくは約０．５％〜約１０％、より好ましくは約０．５〜約５％を含む。当該ポリマーは架橋剤により架橋されたポリオルガノシロキサンポリマーを含む。適当な架橋剤はＷＯ９８／２２０８５に記載されたものを含む。本発明の使用に適したポリオルガノシロキサンポリマーの例としては、メチルビニルジメチコン、メチルビニルジフェニルジメチコン、及びメチルビニルフェニルメチルジフェニルジメチコンがある。
【０１３２】
本発明のシリコーン油相の使用に適した別のシリコーン成分の分類としては、少なくとも１のポリジオルガノシロキサン断片及び少なくとも１のポリオキシアルキレン断片を含むポリジオルガノシロキサン−ポリオキシアルキレンコポリマーを含む。適当なポリジオルガノシロキサン断片及びこれらのコポリマーはＷＯ９８／２２０８５に記載のものを含む。適当なポリジオルガノシロキサン−ポリアルキレンコポリマーはＢｅｌｓｉｌ（登録商標）の商標名でＷａｃｋｅｒ−Ｃｈｅｍｉｅ  ＢｍｂＨ，Ｍｕｎｉｃｈから及びＡｂｉｌ（登録商標）でＴｈ．Ｇｏｌｄｓｃｈｍｉｄｔ  Ｌｔｄ．，イングランドから市販されており、例えば、Ｂｅｌｓｉｌ（登録商標）６０３１及びＡｂｉｌ（登録商標）Ｂ８８１８３である。本発明の使用に特に好ましいコポリマー流動体ブレンドはＣＴＦＡ表記ジメチコン／ジメチコンコポリオールを有するＤｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＤＣ３２２５Ｃを含む。
【０１３３】
サンスクリーン
さらに別の実施態様において、本発明は有機サンスクリーンを含んだ組成物を提供する。いくつかの実施態様において、適当なサンスクリーンはＵＶＡ吸収特性及び／またはＵＶＢ吸収特性を含む。サンスクリーン活性の正確な量は組成物に望ましい太陽光線保護指数（すなわち、“ＳＰＦ”）及び望ましいＵＶ保護レベルに応じて変化する。本発明の組成物は好ましくはＳＰＦが少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５である。ＳＰＦは紅斑に対するサンスクリーンの光保護指数に一般的に用いられる。ＳＰＦは保護した肌に生じる紅斑が最小限となるように必要とされる紫外線エネルギーの、同じ個体における保護されていない肌に同じ最小限の紅斑を生じるために必要な紫外線エネルギーに対する比として定義される（Ｆｅｄ．Ｒｅｇ．，４３，Ｎｏ．１６６、３８２０６−３８２６９頁、１９７８年８月２５日を参照）。使用するサンスクリーンの量は一般的には約２％〜約２０％、より一般的には約４％〜１４％である。適当なサンスクリーンは、限定されないが、Ｗｅｎｎｉｎｇｅｒ  ａｎｄ  ＭｃＥｗｅｎ（編集）、ＣＴＦＡ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，第７版、第２巻、１６７２頁（コスメティック、トイレタリー、アンド  フレグランス・アソシエーション，Ｉｎｃ．，ワシントン、Ｄ．Ｃ．、１９７７）に記載されているものがある。
【０１３４】
いくつかの実施態様において、本発明の組成物は約３２０ｎｍ〜約４００ｎｍの波長を有するＵＶ線を吸収するＵＶＡ吸収サンスクリーン活性剤を含む。適当なＵＶＡ吸収サンスクリーン活性剤はジベンゾイルメタン誘導体、アントラニル酸メチル及びホモメチル、１−Ｎ−アセチルアントラニレート及びこれらの混合物などのアントラニル酸誘導体から選択される。ジベンゾイルメタンスンスクリーン活性剤の例は米国特許第４，３８７，０８９号及びＬｏｗｅ  ａｎｄ  Ｓｈａａｔｈ（編集）、Ｓｕｎｓｃｒｅｅｎｓ：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ａｓｐｅｃｔｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ（１９９０）に記載されている。ＵＶＡ吸収サンスクリーン活性剤は好ましくは広域スペクトラムＵＶＡ保護を与えるような量で、独立して、または組成物に存在できる他のＵＶ保護活性剤と組み合わせて存在する。
【０１３５】
適当なＵＶＡサンスクリーン活性剤はジベンゾイルメタンサンスクリーン活性剤及びそれらの誘導体である。限定されないが、２−メチルジベンゾイルメタン、４−メチルジベンゾイルメタン、４−イソプロピルジベンゾイルメタン、４−ｔｅｒｔ−ブチルジベンゾイルメタン、２，４−ジメチルジベンゾイルベタン、２，５−ジメチルジベンゾイルベタン、４，４’−ジイソプロピルベンゾイルメタン、４−（１，１−ジメチルエチル）−４’−メトキシジベン−ゾイルメタン、２−メチルー５−イソプロピル−４’−メトキシジベンゾイルメタン、２−メチル−５−ｔｅｒｔ−ブチル−４’−メトキシ−ジベンゾイルメタン、２，４−ジメチル−４’−メトキシジベンゾイルメタン、２，６−ジメチル−４’−ｔｅｒｔ−ブチル−４’メトキシジベンゾイルメタン及びこれらの混合物から選択したものが挙げられる。好ましくはジベンゾイルサンスクリーン活性剤は、４−（１，１−ジメチルエチル）−４’−メトキシジベンゾイルメタン、４−イソプロピルジベンゾイルメタン及びこれらの混合物から選択されたものを含む。好ましいサンスクリーン活性剤は４−（１，１−ジメチルエチル）−４’−メトキシジベンゾイルメタンである。
【０１３６】
サンスクリーン活性剤４−（１，１−ジメチルエチル）−４’−メトキシジベンゾイルメタンは、ブチルメトキシジベンゾイルメタンまたはアボベンゾン（Ａｖｏｂｅｎｚｏｎｅ）としても知られ、ＰＡＲＳＯＬ（登録商標）１７８９の商標名でＧｉｖａｕｄａｎ  Ｒｏｕｒｅ（インターナショナル）Ｓ．Ａ．（Ｂａｓｅｌ，スイス）から、及びＥＵＳＯＬＥＸ（登録商標）９０２０でＭｅｒｃｋ＆Ｃｏ．，Ｉｎｃ（Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ，ＮＪ）から市販されている。サンスクリーン４−イソプロピルジベンゾイルメタンは、イソプロピルジベンゾイルメタンとしても知られ、ＥＵＳＯＬＥＸ（登録商標）８０２０の商標名でＭｅｒｃｋから市販されている。
【０１３７】
さらに別の実施態様において、本発明の組成物は約２９０ｎｍ〜約３２０ｎｍの波長を有するＵＶ線を吸収するＵＶＢサンスクリーン活性剤を含む。当該組成物は、独立して、または組成物に存在できるその他のＵＶ保護活性剤と組み合わせて安全で効果的にＵＶＢ保護を与える量のＵＶＢサンスクリーン活性成分を含む。いくつかの実施態様において、当該組成物はＵＶＢ吸収有機サンスクリーンの約０．１重量％〜約１６重量％、より好ましくは約０．１重量％〜約１２重量％、及び最も好ましくは約０．５重量％〜約８重量％を含む。
【０１３８】
種々のＵＶＢサンスクリーン活性剤は本発明での使用に適している。当該有機サンスクリーン活性剤の非限定的例としては、米国特許第５，０８７，３７２号、米国特許第５，０７３，３７１号、米国特許第５，０７３，３７２号及びＳｇａｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｓｍｅｔｉｃｓ  Ｓｃｉｅｎｅｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，チャプターＶＩＩＩ、１８９頁、以下参照に記載されているものを含む。別の有用なサンスクリーンは米国特許第４，９３７，３７０号及び米国特許第４，９９９，１８６号に記載されているものを含む。好ましいＵＶＢサンスクリーン活性剤は、２−エチルへキシル−２−シアノ−３，２−エチルヘキシルＮ，Ｎ−ジメチル−ｐ−アミノ安息香酸、ｐ−アミノ安息香酸、オキシベンゾン、サリチル酸ホモメンチル、サリチル酸オクチル、４，４’−メトキシ−ｔ−ブチルジベンゾイルメタン、４−イソプロピルジベンゾイルメタン、３−ベンジリデンカンフル、３−（４−メチルベンジリデン）カンフル、３−ジフェニルアクリレート（オクトクリレンと呼ぶ）、２−フェニル−ベンズイミダゾール−５−スルホン酸（ＰＢＳＡ）、桂皮酸及びそれらの誘導体、例えば、２−エチルヘキシル−ｐ−メトキシ桂皮酸及びオクチル−ｐ−メトキシ桂皮酸、ＴＥＡサリチル酸、オクチルジメチチルＰＡＢＡ、カンフル誘導体及びそれらの誘導体及びこれらの混合物から選択される。好ましい有機サンスクリーン活性剤は２−メチルへキシル−２−シアノ−３，３−ジフェニルアクリレート（オクトクリレンと呼ぶ）、２−フェニル−ベンズイミダゾール−５−スルホン酸（ＰＢＳＡ）、オクチル−ｐ−メトキシ桂皮酸及びこれらの混合物である。酸性サンスクリーンの塩及び酸中和形態も本発明で有用である。
【０１３９】
本発明のいくつかの実施態様において、組成物はさらに、ＵＶ線への曝露上、光分解を防止し、それによりＵＶＡ保護効果を維持するために、ＵＶＡサンスクリーンを安定化させるのに有用な物質を含む。多種多様な化合物がこれら安定化特性を与えるものとして言及されている。これらの化合物はＵＶＡサンスクリーン及び組成物全体の両方を補完するように選択することが考えられる。適当な安定化剤としては、限定されないが、米国特許第５，９７２，３１６号、第５，９６８，４８５号、第５，９３５，５５６号、第５，８２７，５０８号及びＷＯ００／０６１１０に記載されているものを含む。本発明で使用するための安定化剤の好ましい例としては、２−エチルヘキシル−２−シアノ−３，３−ジフェニルアクリレート（オクトクリレンと呼ぶ）、エチル−２−シアノ−３，３−ジフェニルアクリレート、２−エチルヘキシル−３，３−ジフェニルアクリレート、エチル−３，３−ビス（４−メトキシフェニル）アクリレート、及びこれらの混合物を含む。２−エチルヘキシル−２−シアノ−３，３−ジフェニルアクリレートは最も好ましい。
【０１４０】
いくつかの実施態様において、肌を改善するために本発明に有用な組成物のいずれかに物質を添加し、特に高められた耐性を有するこれらの組成物は水により洗い落とされるか、こすり落とされる。当該利点を与える好ましい物質はエチレン及びアクリル酸のコポリマーである（米国特許第４，６６３，１５７号を参照）。
【０１４１】
有機サンスクリーンに加えて、いくつかの実施態様において、本発明の組成物はさらに無機物理的サンブロックを含む。適当な物理的サンブロックの非限定的な例は、ＣＴＦＡ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ、第６版、１９９５、１０２６−２８頁及び１１０３頁、及びＳａｙｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｓｏｃ．Ｃｏｓｍｅｔ．Ｃｈｅｍ．，４１：１０３−１０９（１９９０）に記載されている。好ましい無機物理的サンブロックは酸化亜鉛及び二酸化チタン及びこれらの混合物を含む。
【０１４２】
物理的サンブロックは、使用される場合、本組成物が皮膚上で透けて見えるような（すなわち、白くない）量で存在し、好ましくは約５％以下である。二酸化チタニウムを使用する場合、アナターゼ、ルチルまたはアモルファス構造を有することができる。物理的サンブロック粒子（例えば、二酸化チタニウム及び酸化亜鉛）は種々の物質で被覆または非被覆でき、限定されないが、アミノ酸、アルミニウム化合物、例えばアルミナ、ステアリン酸アルミニウム、ラウリン酸アルミニウム等、カルボン酸及びその塩、卵ステアリン酸及びその塩、レシチンなどのリン脂質、有機シリコーン化合物、シリカ及びケイ酸塩などの無機シリコーン化合物及びこれらの混合物を含む。好ましい二酸化チタニウムはＴａｙｃａ（日本）から市販されており、ＭＴミクロイオン化シリーズ（例えば、ＭＴ１００ＳＡＳ）でＴｒｉ−Ｋインダストリーズ（Ｅｍｅｒｓｏｎ，ＮＪ）により流通されている。いくつかの実施態様において、本発明の組成物は、無機サンスクリーンの約０．１重量％〜約１０重量％を含み、より好ましくは約０．１重量％〜約４重量％、及び最も好ましくは約０．５重量％〜約２．５重量％を含む。
【０１４３】
抗菌及び抗真菌作用剤
いくつかの実施態様において、本発明の組成物は抗菌及び／または抗真菌作用剤を含む。本発明に有用な抗菌及び抗真菌作用剤の非限定的な例は、限定されないが、β−ラクタム剤、キノロン剤、シプロフロキサシン、ノルフロキサシン、テトラサイクリン、エリスロマイシン、アミカシン、２，４，４’−トリクロロ−２’−ヒドロキシジフェニルエーテル、３，４，４’−トリクロロバニリド（ｔｒｉｃｈｌｏｒｏｂａｎｉｌｉｄｅ）、フェノキシエタノール、フェノキシプロパノール、フェノキシイソプロパノール、ドキシサイクリン、カプレオマイシン、クロルヘキシジン、クロルテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、クリンダマイシン、エタンブトール、ヘキサミジン、イセチオン酸塩、メトロニダゾール、ペンタミジン、ゲンタマイシン、カナマイシン、リネオマイシン（ｌｉｎｅｏｍｙｃｉｎ）、メタサイクリン、メテンアミン、ミノサイクリン、ネオマイシン、ネチルミシン、パロモマイシン、ストレプトマイシン、トブラマイシン、ミコナゾール、塩酸テトラサイクリン、亜鉛エリスロマイシン、エリスロマイシン・エストレート、ステアリン酸エリスロマイシン、硫酸アミカシン、塩酸ドキシサイクリン、硫酸カプレオマイシン、グルコン酸クロルヘキシジン、塩酸クロルヘキシジン、塩酸クロルテトラサイクリン、塩酸オキシテトラサイクリン、塩酸クリンダマイシン、塩酸エタンブトール、塩酸メトロニダゾール、塩酸ペンタミジン、硫酸ゲンタマイシン、硫酸カナマイシン、塩酸リネオマイシン（ｌｉｎｅｏｍｙｃｉｎ）、塩酸メタサイクリン、馬尿酸メテナミン、マンデル酸メテナミン、塩酸ミノサイクリン、硫酸ネオマイシン、硫酸ネチルミシン、硫酸パロモマイシン、硫酸ストレプトマイシン、硫酸トブラマイシン、塩酸ミコナゾール、塩酸アマンファジン（ａｍａｎｆａｄｉｎｅ）、硫酸アマンファジン、ｏｃｔｏｐｉｒｏｘ、パラクロロメタ（ｐａｒａｃｈｌｏｒｏｍｅｔａ）キシレノール、ナイスタチン、トルナフテート、クロトリマゾール、塩化セチルピリジニウム（ＣＰＣ）、ピロクトン・オラミン、硫化セレン、ケトコナゾール、トリクロカーボン、トリクロサン、亜鉛パイリシオン、イトラコナゾール、アジアティック酸、ヒノキチオール、ｍｉｐｉｒｏｃｉｎ、塩化ｃｌｉｎａｃｙｃｉｎ、過酸化ベンゾイル、過酸化ベンジル、ミノサイクリン、フェノキシイソプロパノール、及びこれらの混合物及び欧州特許第０  ６８０  ７４５に記載されているものを含む。
【０１４４】
その他の任意の成分
いくつかの実施態様において、中和剤、香料及び着色料などの種々の任意の成分が本発明の組成物で使用できる。製品が肌の柔軟性／円滑性を高める追加成分は好ましい。さらに、製品の風合いにマイナスの影響を与えないような成分は好ましい。従って、コラーゲン及びエラスチンなどの高レベルのタンパク質は本発明に有用な組成物に通常、好ましいものではない。
【０１４５】
また、いくつかの実施態様において、本発明の組成物は約０．０１％〜約１０％、好ましくは約０．１％〜約５％のパンテノール保湿剤も含む。好ましい実施態様において、パンテノール保湿剤はＤ−パンテノール（［Ｒ］−２，４−ジヒドロキシ−Ｎ−［３−ヒドロキシプロピル］−３，３−ジメチルブタマイド）、ＤＬ−パンテノール、パントテン酸カルシウム、ロイヤルゼリー、パンテチン、パントテイン、パンテニルエチルエーテル、パンガミン酸、ピリドキシン及びパントイルラクトースから選択される。
【０１４６】
本発明で親水性ゲル化剤を含む酸性基を中和するのに適した中和剤は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、モノエタノールアミン、トリエタノールアミン、アミノメチルプロパノール、ｔｒｉｓ−バッファー及びトリエタノールアミンを含む。
【０１４７】
その他の任意の物質としては、角質溶解薬、好ましくは約０．１％〜約５％のレベルの例えば、Ｇｅｒｍａｌｌ  １１５などの水溶性または可溶性保存料、ヒドロキシ安息香酸のメチル、エチル、プロピル及びブチルエステル、ベンジルアルコール、商標名Ｇｌｙｄａｎｔ  ＰｌｕｓでＬｏｎｚａから市販のＤＭＤＭヒダントイン・ヨードプロパニルブチルカーバネート、ＥＤＴＡ、Ｅｕｘｙｌ（登録商標）Ｋ４００、Ｂｒｏｍｏｐｏｌ（２−ブロモ−２−ニトロプロパン−１，３−ジオール）及びフェノキシプロパノール、Ｉｒｇａｓａｎ（登録商標）及びフェノキシエタノールなどの抗菌剤（好ましくは０．１％〜約５％のレベル）；ヒアルロン酸などの溶性またはコロイド性溶性保湿剤、及びセラニーズ（Ｃｅｌａｎｅｓｅ）Ｓｕｐｅｒａｂｓｏｒｂｅｎｔ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｐｏｒｔｓｍｉｔｈ，ＶＡから市販の、及び米国特許第４，０７６，６６３号記載のＳａｎｗｅｔ（登録商標）ＩＭ−１０００、ＩＭ−１５００及びＩＭ−２５００などのでんぷんグラフトポリアクリル酸ナトリウム；ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ及びその誘導体などのビタミン及びフィタントリオールなどのそれらの構成単位及びビタミンＫ及び脂肪族アルコールドデカトリエノールなどのそれらの成分；α及びβヒドロキシ酸；アロエベラ；スフィンゴシン及びフィトスフィンゴシン、コレステロール；肌美白剤；Ｎ−アセチルシステイン；着色剤；トリクロサン及びトリクロロカーボンとしても公知のＴＣＣ／ＴＣＳなどの抗菌剤；香料及び香料可溶化剤などがある。αヒドロキシ酸の例としては、グリコール酸、乳酸、リンゴ酸、クエン酸、グリコール酸アンモニウムと併用したグリコール酸、α−ヒドロキシエタン酸、α−ヒドロキシオクタン酸、α−ヒロドキシカプリル酸、ヒドロキシカプリル酸、混合フルーツ酸、トリ−αヒドロキシフルーツ酸、トリプルフルーツ酸、サトウキビ抽出物、架橋脂肪酸α  ｎｕｔｒｉｕｍにおける１−αヒドロキシ酸及びグリコマーを含むαヒドロキシ及び植物を含む。αヒドロキシ酸の好ましい例はグリコール酸及び乳酸である。αヒドロキシ酸は１０％以下のレベルで用いるのが好ましい。
【０１４８】
いくつかの実施態様において、抗炎症剤の本発明の組成物に安全かつ効果的な量で添加され、好ましくは組成物の約０．１％〜約５％、より好ましくは約０．１％〜約２％である。抗炎症剤は本発明の肌の風合い利点を高める（例えば、当該物質は肌の色合いまたは色をより均一にし、期待に沿うように寄与する）。本組成物に使用される抗炎症剤の正確な量は当該物質は効力がかなり異なるので、使用する特定の抗炎症剤に応じて変わる。
【０１４９】
さらに別の実施態様において、本発明の組成物はさらに酸化防止剤／ラジカルスカベンジャーを含む。酸化防止剤／ラジカルスカベンジャーは、角質層の落屑または質感変化の増加を引き起こすＵＶ線に対する保護、及び肌ダメージを引き起こすその他の環境要因に対する保護を与えるために特に有用である。本組成物の約０．１％〜約１０％、より好ましくは約１％〜約５％が適した量である。酸化防止剤／ラジカルスカベンジャーはアスコルビン酸（ビタミンＣ）及びその塩などの化合物を含む。
【０１５０】
本発明のいくつかの実施態様においてキレート剤を含有させることは、過度の落屑または皮膚質感変化に寄与し得るＵＶ線に対する保護及び肌ダメージを引起しうるその他の環境要因に対する保護を与えるために特に有用である。本組成物の約０．０１％〜約１％、より好ましくは約０．０５％〜約０．５％が適した量である。本発明で有用な典型的なキレートは米国特許第５，４８７，８８４号に記載されている。本発明の組成物に有用な好ましいキレート剤はエチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）、フリルジオキシム及びそれらの誘導体を含む。
【０１５１】
さらに別の実施態様において、本発明の組成物は美白剤（ｓｋｉｎ  ｌｉｇｈｔｅｎｉｇ  ａｇｅｎｔ）を含む。使用される場合、組成物は約０．１％〜約１０％、より好ましくは約０．２％〜約５％、さらに好ましくは約０．５％〜約２％の美白剤を含む。適当な美白剤は当業界に公知であり、コジック酸、アルブチン、アスコルビン酸及びそれらの誘導体（例えば、アスコルビン酸リン酸マグネシウム）を含む。本発明での使用に適した別の美白剤は、それぞれここに引用するＷＯ９５／３４２８０及びＷＯ９５／２３７８０に記載されたものも含む。トリクロサン及びトリクロロカーボンとしても公知のＴＣＣ／ＴＣＳなどの抗菌剤も本発明の組成物において有用である。
【０１５２】
その他の任意の物質としては顔料を含み、水溶性である場合、油相成分の合計レベルに寄与し、かつ含まれる。本発明の組成物での使用に適した顔料は有機及び／または無機である。“顔料”の語には低色またマット表面処理剤などの光沢を有する物質、及び光散乱剤も含まれる。好ましくは、本発明の組成物は屈折指数約１．３〜約１．７を有する粒子材料を含み、当該粒子材料は組成物中に分散され、約２〜約３０μｍの粒子サイズ中央値を有する。好ましくは、本発明で有用な微粒子は比較的狭い分布を有し、粒子の５０％以上は各々の中央値の側面が３μｍ内となることを意味する。また、粒子の５０％以上、好ましくは６０％以上及びさらに好ましくは７０％以上が各々の中央値の規定したサイズ範囲となることが好ましい。適当な粒子材料は有機またはオルガノシリコーンを含み、好ましくはオルガノシリコーンポリマーを含む。好ましい粒子は流動、固体、物質である。“固体”とは粒子が空洞でないことを意味する。空洞粒子中心の空洞は屈折指数に悪影響を有し、従って、肌または組成物上の粒子の視覚上の影響を有し得る。適当な有機粒子物質は上述の、ポリメチルシルセスキオキサン、ポリアミド、ポリテン（ポリエチレン）、ポリアクリロニトリル、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリスチレン、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）及びポリ（ビニリデンクロリド）から作られるものを含む。前述物質のモノマー由来コポリマーも使用できる。無機物質はシリカ及び窒化ホウ素を含む。本発明に有用な市販の微粒子物質の代表的な例としては、中央粒子サイズが約４．５μｍであるＴｏｓｐｅａｒｌ（登録商標）１４５及びエチレン／アクリル酸コポリマーの中央粒子サイズが約１０μｍであるＥＡ−２０９（登録商標）（Ｋｏｂｏ）、商標名Ｏｒｇａｓｏｌ２００２でＥｌｆ  Ａｔｏｃｈｅｍ、フランスから市販のＮｙｌｏｎ−１２、またはこれらの混合物である。
【０１５３】
適当な顔料のさらなる例としては、二酸化チタニウム、前もって分散させた二酸化チタニウム（Ｋｏｂｏ）（例えば、Ｋｏｂｏ  ＧＷＬ７５ＣＡＰ）、酸化鉄、アシグルタミン酸酸化鉄、群青、Ｄ＆Ｃ染料、カルミン、及びこれらの混合物を含む。組成物の種類に応じて、顔料の混合物を使用することも多い。保湿、肌触り、肌の風合い及びエマルジョン適合性の観点から本発明で使用する好ましい顔料は処理済顔料である。顔料はアミノ酸、シリコーン、レシチン及びエステル油などの化合物を用いて処理できる。
【０１５４】
好ましくは、本発明の組成物のｐＨは約６．１〜約１０．０の範囲であり、ここで最終生成物のｐＨは酸性、塩基性または緩衝塩を必要に応じて加えることにより調節する。
【０１５５】
組成物の調製
本発明の組成物は当業界に公知の標準技術により調製する。通常、水相及び／または油相は別々に調製し、分割した類似相の物質を任意の順番で加える。最終生成物がエマルジョンである場合、２つの相はそれから勢いよくかき混ぜながら混合する。高揮発性の処方中の成分、または高温で加水分解しやすい成分は、該当する場合、乳化後、処理の最後の方で穏やかにかき混ぜながら加えることができる。
【０１５６】
減少したアレルギー性／免疫原性を有するプロテアーゼも織物処理に用いることができる。“織物処理”とは織物や、布または衣類に織る、フェルトまたは編み込むことができる個々の糸または繊維を所望の特性を生じるように処理する方法を含む。当該所望の特性の例としては、“ストーン・ウォッシング”、けば取り、脱毛、糊抜き、軟化及び当業界に公知のその他の織物処理がある。
【０１５７】
本発明の１の実施態様において、ここで同定されるエピトープは免疫反応を誘導するために用いる（例えば、当該エピトープの１つまたは２つを含むプロテアーゼに対する抗体を生じることが望ましい場合）。当該抗体は、１または２のこれらの領域またはそれらと相同性が高い領域を含むその他のプロテアーゼのスクリーニングに使用できる。従って、本発明は１または２の以下の配列を含むプロテアーゼを提供する：バチルス・アミロリケファシエンスズブチリシンの（ｉ）残基７０−８４及び／または（ｉｉ）残基１０９−１２３。本発明は単離中性エピトープ、組換えタンパク質、または合成ペプチド発現特異エピトープ領域を利用する免疫学的検定において具現化でき、これらまたは高相同性領域を含むタンパク質に対する個人の感作を評価する。
【０１５８】
他の実施態様において、本発明のエピトープ断片は当該断片に結合及び提示できるＭＨＣ分子を有する抗原提示細胞の検出に用いる。例えば、エピトープ断片は検出ラベルを含むことができる（例えば、放射性ラベル）。標識化断片はそれから、目的細胞を用いて培養し、そして標識断片を結合（または提示）する細胞を検出する。
【０１５９】
発明の詳細な説明
本発明はズブチリシン・カールスバーグタンパク質においてＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを同定する方法を提供する。本発明は、野生型ズブチリシン・カールスバーグタンパク質（Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）内に組込まれた場合、ヒトにおいて変化した免疫原性反応、好ましくは低免疫原性反応を生じる変性ペプチドを生成する方法も提供する。特に、本発明ＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）酵素の免疫原性を減少させるために適した方法及び組成物を含む手段を提供する。本発明は、野生型ズブチリシン・カールスバーグタンパク質配列に組込まれた場合、もはやＣＤ４＋Ｔ細胞反応を開始することができず、または少なくともアレルギー反応が減少した変性ペプチドを生成する方法も提供する。特に、本発明は野生型ズブチリシン・カールスバーグの免疫原性を減少するために適した方法及び組成物を含む手段を提供する。
【０１６０】
１の実施態様において、本発明はＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）酵素のＴ細胞エピトープを提供する。これらのエピトープはここで説明する種々の配列で提供され（図２及び３を参照）、限定されないが、ペプチド番号１（配列番号２）、ペプチド番号７（配列番号８７）、ペプチド番号１４（配列番号１５）、ペプチド番号２９（配列番号３０）、ペプチド番号３９（配列番号４０）などがある。他の実施態様において、本発明はＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）酵素内の置換に適した同定エピトープの変性配列を提供する。
【０１６１】
本発明は野生型ズブチリシン・カールスバーグタンパク質におけるＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを同定する方法を提供する。本発明はさらに、もはやＣＤ４＋Ｔ細胞反応を開始できないペプチドを生成する方法を提供する。特に、本発明はＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）酵素の免疫原性を減少させるために適した方法及び組成物を含む手段を提供する。
【０１６２】
タンパク質に対する抗体の開発は活性化抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上で提示されるタンパク質由来のペプチド断片から始める一連の事象を必要とする。ペプチドは抗原提示細胞の表面上の特異タンパク質に関連し、すなわち、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）（ヒトにおいて、ＭＨＣは“ヒト白血球抗原”（ＨＬＡ）システムという）におけるタンパク質に関連する。結合ペプチドは第２の細胞型、Ｔ細胞と相互作用できる。具体的には、Ｔ細胞はその表面上でＣＤ４タンパク質を発現することにより認識されるサブタイプである（すなわち、ＣＤ４＋Ｔ細胞）。相互作用がうまくいった場合、特異ＣＤ４＋Ｔ細胞は成長及び分割（すなわち、増殖）し、抗体生成細胞（すなわち、Ｂ細胞）と相互作用できるようになる。その相互作用がうまくいくと、Ｂ細胞は増殖し、元来のタンパク質に特異的な抗体の生成の中心となる。従って、抗体の最終的な生成は１のペプチド配列（すなわち、エピトープ）に特異なＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化の開始に応じたものとなる。ここに記載した組成物及び方法を用いることにより、野生型ズブチリシン・カールスバーグタンパク質などの標的タンパク質由来のどのペプチドが特定のＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を開始できるかを予測できるようになる。
【０１６３】
本発明のいくつかの好ましい実施態様において、ズブチリシン・カールスバーグタンパク質は以下を含む：ｉ）ＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）酵素（配列番号１）；ｉｉ）ＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）酵素と類似の触媒活性を有し、配列番号１と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％アミノ酸配列同一性を有し、好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９７％アミノ酸配列同一性を有する、ズブチリシン・カールスバーグタンパク質；及びｉｉｉ）ズブチリシン・カールスバーグタンパク質の変異体。
【０１６４】
ズブチリシンは通常、ペプチド結合を切断する働きを有するセリンプロテアーゼ（一般的に細菌及び真菌性）である。ズブチリシンのアミノ酸配列は全体的に相同ではないが、ズブチリシンは同じまたは類似のタンパク質分解活性を示し、セリンプロテアーゼ、キモトリプシンの関連分類からそれらを区別する触媒三点セットを有する共通のアミノ酸配列を有する。触媒三点セットは、アミノからカルボキシ末端へ読んで、アスパラギン酸−ヒスチジン−セリンである。本発明の野生型ズブチリシン・カールスバーグタンパク質及びその修飾タンパク質はこの触媒三点セットを有する。
【０１６５】
P００７８０及び図１（配列番号１）に示すように、ＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）酵素と類似の触媒活性を有するズブチリシン・カールスバーグタンパク質はバチルス・リケニフォルミスから得られるズブチリシン・カールスバーグタンパク質を含み、限定されないが、ＥＭＢＬアクセッションコードＸ９１２６２、ＥＭＢＬアクセッションコードＸ９１２６１及びＥＭＢＬアクセッションコードＸ９１２６０を有するズブチリシンがある。これらのズブチリシンの触媒ドメインはＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）酵素と９０％以上のアミノ酸配列同一性を有する。好ましい実施態様において、これらの野生型ズブチリシン・カールスバーグタンパク質は、同定された有意な配列番号１のＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）酵素エピトープと共通した少なくとも１及び好ましくは１〜６の有意なエピトープを有する。
【０１６６】
本発明のいくつかの実施態様において、ズブチリシン・カールスバーグタンパク質の変異体は天然（例えば、バチルス・リケニフォルミス株から得たもの）であり、一方、他の実施態様において、それらは遺伝子組換え変異体（例えば、組換えタンパク質）である。これらの変異体は１以上のアミノ酸残基の変異を含む組換えタンパク質を含み、変異アミノ酸残基は有意なエピトープ以外の位置に見られる。例えば、いくつかの実施態様において、変異体は配列番号１の位置１−１５、１９−３３、４０−５４、８５−９９及び１１５−１２９に対応する位置のアミノ酸残基に１以上の変異を含む。他の実施態様において、変異体は配列番号１の位置１−１５、１９−３３、４０−５４、８５−９９及び１１５−１２９に対応する位置のアミノ酸残基に２以上のアミノ酸変異を含む。さらに別の実施態様において、変異体は配列番号１の位置１−１５、１９−３３、４０−５４、８５−９９及び１１５−１２９に対応する位置のアミノ酸残基に２〜１０または２〜６のアミノ酸変異を含む。いくつかの実施態様において、変異はアミノ酸またはアミノ酸配列の置換、欠失及び／または挿入を含み、変異は酵素の変性表現型を生じる。例えば、いくつかの実施態様において、変異は高められた酵素活性、高められた熱安定性、増加したアルカリ安定性及び／または所望の特性を生じる。
【０１６７】
修飾野生型ズブチリシン・カールスバーグタンパク質を生じる１以上の有意エピトープに対する変異または修飾で、修飾ＡＬＣＡＬＡＳＥまたは修飾変異体ズブチリシン・カールスバーグを含むものは、以下のものを含むことができる、ａ）エピトープ中の１以上のアミノ酸の置換、欠失または挿入によるエピトープの修飾、またはｂ）相同タンパク質由来の類似配列を置換することによるエピトープの修飾であって、類似配列はＴ細胞認識に起因して親野生型ズブチリシン・カールスバーグよりも少ない免疫反応を生じる。
【０１６８】
本発明のいくつかの実施態様において、有意エピトープは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、及び１５程度のエピトープ中のアミノ酸残基の置換、欠失及び／または挿入により修飾される。例えば、１の好ましい実施態様において、ペプチド番号３９（配列番号４０）であって、配列番号１の位置１１５−１２９に対応するアミノ酸残基を変異させる。変異アミノ酸配列は位置１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８及び／または１２９のうち１以上の置換を含む。他の実施態様において、変異ペプチドは１１５−１２９の位置の２以上の置換を含む。他の好ましい実施態様において、ペプチド番号７（配列番号８；配列番号１の位置１９−３３のアミノ酸残基に対応）を変異させる。これらの実施態様において、変異アミノ酸配列は１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、及び／または３３（例えば、位置１９−３３）の１以上の位置の置換を含む。置換は異なるアミノ酸で野生型アミノ酸残基を置換することにより行う。いくつかの好ましい実施態様において、置換は中性Ｌ−アミノ酸の１つを用いるのが好ましい（すなわち、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ及びＶａｌ）。さらに別の実施態様において、変異ペプチドはペプチド番号７であり、配列番号１の位置１９−３３に対応する１以上のアミノ酸残基の欠失を含む。さらに別の実施態様において、変異ペプチドはペプチド７及び８に対応し、配列ＱＧＦＫＧＡＮＶＫＶＡＶＬＤＴＧＩＱ（配列番号９０）を有する。従って、目的エピトープにおいて、変異体ズブチリシン・カールスバーグタンパク質に減少した免疫原性を与える種々の修飾がされる。
【０１６９】
本発明のさらに別の実施態様において、修飾野生型ズブチリシン・カールスバーグタンパク質は相同プロテアーゼ由来の類似エピトープ断片の置換を含み、類似エピトープ断片は、野生型母体で置換されたエピトープ比較して減少した免疫反応（例えば、減少したＴ細胞反応）を生じる。例えば、いくつかの実施態様において、ペプチド番号７（すなわち、配列番号１の位置１９−３３に対応する）はＢ．アミロリケファシエンス由来のズブチリシンＢＰＮ’またはＢ．ズブチリス由来のズブチリシン１６８などの他の相同ズブチリシンから得た類似断片と置換し、ここで類似断片は有意エピトープではない。いくつかの実施態様において、相同プロテアーゼは原核生物から得られ、一方他の実施態様において、真核生物から得られる。適当な原核生物の例としては、限定されないが、大腸菌及びシュードモナス種などのグラム陰性細菌、及びミクロコッカス種及びバチルス種などのグラム陽性細菌を含む。
【０１７０】
いくつかの実施態様において、野生型ズブチリシン・カールスバーグタンパク質のエピトープは当業界に公知の方法により修飾される（例えば、Ｚｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１０：６４８７−６５００［１９８２］；及びＹｕｃｋｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ（編集）、Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，［１９９１］、２７−４８頁を参照）。上述の通り、これらの修飾はアミノ酸残基欠失、置換及び／または挿入を含む。例えば、１以上のアミノ酸残基は部位特異アミノ酸置換により修飾される。実際に、市販の変異誘発キットはこれらの変異体タンパク質の生成に使用できる。
【０１７１】
いくつかの実施態様において、置換、挿入及び／または欠失に関して同定されたアミノ酸残基は保存残基であり、一方、他の実施態様においてはそうでない。保存残基でない残基に関する好ましい実施態様において、１以上のアミノ酸置換は天然に見られるアミノ酸配列に対応しないアミノ酸配列を含む修飾ペプチドを生成する置換に制限される。保存残基の場合、当該置換は天然配列を生じない。
【０１７２】
カセット式変異誘発も本発明の修飾タンパク質の構築を促進するために本発明に使用できる。この方法に従い、タンパク質をエンコードする天然遺伝子が得られ、全体または一部が配列決定される。そして、当該配列はエンコードされるタンパク質において１以上のアミノ酸の変異（例えば、欠失、挿入または置換）を作ることが望ましい点に関してスキャンする。この点のフランキング配列は、発現した場合種々の変異体をエンコードするオリゴヌクレオチドプールを用いて当該遺伝子の短断片を置換する制限酵素認識部位の存在に関して評価する。当該制限酵素認識部位は好ましくは遺伝子断片の置換を促進するために当該タンパク質遺伝子内に固有のものである。しかしながら、当該タンパク質遺伝子内で過度に冗長でない任意の制限酵素認識部位が、制限酵素消化により生成した当該遺伝子断片が適当な配列に再構築できるのであれば、適宜、本発明で使用できる。制限酵素認識部位が選択した点から都合のよい距離内（例えば、１０〜１５ヌクレオチド）の位置に存在しない場合、当該部位は遺伝子内のヌクレオチドを置換することにより生じ、リーディングフレームまたはエンコードされるアミノ酸のいずれも最終構築物において変化しないようにする。いくつかの実施態様において、配列を変化させて所望の配列に合わせるための遺伝子の変異は一般的な公知の方法に従い、Ｍ１３プライマー伸長により達成される。適当なフランキング領域の位置を示し、２つの都合の良い制限酵素認識部位配列に達するために必要な変化を評価する課題は遺伝子コードの冗長性、遺伝子の制限酵素マップ及び多数の異なる制限酵素により通常行われる。都合の良いフランキング制限酵素認識部位が利用可能である場合、上述の方法は制限酵素認識部位を含まないフランキング領域と一緒にのみ使用することが必要であることに留意する。しかしながら、本発明はこれらの方法に限定するものではなく、その他の適当な当業界に公知の方法が本発明に使用できる。
【０１７３】
いくつかの実施態様において、ＤＮＡ（天然または組換え体）をいったんクローンすると、変異すべき位置の側面にある制限酵素認識部位は同族源の制限酵素を用いて消化し、多数の末端相補的オリゴヌクレオチドカセットを遺伝子内に連結させる。突然変異誘発は、全てのオリゴヌクレオチドは同じ制限酵素認識部位を有するように合成でき、制限酵素認識部位を作成するために合成リンカーは必要でないので、この方法により単純化される。
【０１７４】
変性エピトープを含むペプチドを本発明の分析法において分析する場合、好ましくは野生型ズブチリシンを含むペプチドよりも少ないＴ細胞増殖を生じる。より好ましくは、変性した場合、当該エピトープはサンプルの基準Ｔ細胞増殖の３倍少ない、好ましくは基準Ｔ細胞増殖よりも２倍少ない、及び最も好ましくは基準Ｔ細胞増殖よりも少ないまたは実質的に等しいＴ細胞増殖を生じる。
【０１７５】
いくつかの実施態様において、野生型ズブチリシン・カールスバーグタンパク質及びそれらの修飾タンパク質は当業界に公知の方法に従いタンパク質分解活性に関してスクリーニングする。当該方法は、限定されないが、ｐＮＡ分析及びジメチルカゼイン（ＤＭＣ）分析法を含む（Ｒｏｔｈｇｅｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ  Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，６５：８０６［１９８８］）。
【０１７６】
組換えＤＮＡ技術の適用は、タンパク質またはペプチドをエンコードするＤＮＡ配列を変化させることにより、タンパク質またはペプチド（すなわち、目的タンパク質またはペプチド）配列の素早い操作の手助けをする。修飾ＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）酵素などの修飾ズブチリシン・カールスバーグタンパク質をコードする遺伝子へのこの方法の適用によりエピトープ配列の変化が容易になり、もはやＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化させることができなくなる。好ましい実施態様において、これらの変化はヒトの抗体結合（Ｂａｂ）及び／または中和抗体（Ｎａｂ）反応を生じるズブチリシン・カールスバーグの傾向を減少させる。従って、特に好ましい実施態様において、本発明はＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）酵素タンパク質配列におけるＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを同定する組成物及び方法を提供し、及びもはやＣＤ４＋Ｔ細胞反応を開始できないペプチドの生成は、組換えＤＮＡ技術によりＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）酵素に組込まれた場合、抗体の生成を開始するＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）酵素の機能を減少させるものと考えられる。
【０１７７】
従って、特定の実施態様において、修飾野生型ズブチリシン・カールスバーグ（特に修飾ＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）酵素）をエンコードするＤＮＡ配列は宿主細胞内で複製可能な発現ベクターにより宿主細胞中に導入される。当業者であれば、バチルス宿主細胞などの宿主細胞への使用に適したベクターを良く知っている（例えば、Ｈａｒｗｏｏｄ  ａｎｄ  Ｃｕｔｔｉｎｇ（編集）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，（１９９０）、９２頁を参照）。形質転換技術はＣｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｃｏｈｅｎ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６８：１１−１１５［１９７９］；及びＳｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．ａｎｄ  Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５１：６３４［１９８６］にさらに説明されている。いくつかの実施態様において、ＤＮＡ配列は発現ベクター内に挿入せず、宿主細胞に直接導入される。当該方法は当業界に公知であり、限定されないが、塩化カルシウム沈殿、エレクトロポレーション、ｎａｋｅｄ  ＤＮＡなどがある。
【０１７８】
いくつかの実施態様において、本発明の修飾野生型ズブチリシン・カールスバーグタンパク質はさらに単離及び／または精製される。これは当業界に公知の分離技術により達成され、限定されないが、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、疎水性分離、沈殿、ろ過、精密ろ過、ゲル・エレクトロフォレーシス、及びその他の適した方法が含まれる。別の実施態様において、タンパク質をいったん単離及び／または精製すると、さらなる構成成分を目的組成物を得るために修飾タンパク質に加える。
【０１７９】
ＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）酵素などのズブチリシン・カールスバーグタンパク質の多数の用途が存在し、限定されないが、液体及び粉末洗剤、織物処理製剤、従来の洗浄組成物及びパーソナルケア組成物が含まれる。本発明の修飾エピトープを含むズブチリシンはＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）酵素が使用できる任意の目的において使用できることは当然に理解されることである。
【０１８０】
実験
以下の実施例は本発明の特定の好ましい実施態様及び側面を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるものではない。
【０１８１】
以下の実験的記載において、以下の省略形は、ｅｑ（同等物）、Ｍ（モル濃度）、μＭ（マイクロモル濃度）、Ｎ（通常）、ｍｏｌ（モル）、ｍｍｏｌ（ミリモル）、μｍｏｌ（マイクロモル）、ｎｍｏｌ（ナノモル）、ｇ（グラム）、ｍｇ（ミリグラム）、ｋｇ（キログラム）、μｇ（マイクログラム）、Ｌ（リットル）、ｍｌ（ミリリットル）、μｌ（マイクロリットル）、ｃｍ（センチメートル）、ｍｍ（ミリメートル）、μｍ（マイクロメートル）、ｎｍ（ナノメートル）、℃（摂氏温度）、ｈ（時間）、ｍｉｎ（分）、ｓｅｃ（秒）、ｍｓｅｃ（ミリ秒）、ｘｇ（時間比重（ｔｉｍｅｓ  ｇｒａｖｉｔｙ）、Ｃｉ（Ｃｕｒｉｅｓ）、ＯＤ（光学密度）、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ダルベッコリン酸緩衝液）（ＤＰＢＳ）、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ−［２−エタンスルホン酸］）、ＨＢＳ（ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水）、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｔｒｉｓ［ヒドロキシメチル］アミノメタン−塩酸塩）、クレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）（ＤＮＡポリメラーゼＩ大（Ｋｌｅｎｏｗ）断片）、ｒｐｍ（１分当たりの回転数）、ＥＧＴＡ（エチレングリコール−ｂｉｓ（β−アミノエチルエーテル）Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラ酢酸）、ＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラ酢酸）、ＡＴＣＣ（米国菌培養収集所、ロックビル、メリーランド州）、Ｃｅｄａｒ  Ｌａｎｅ（Ｃｅｄａｒ  Ｌａｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，オンタリオ、カナダ）、Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、グランドアイランド、ＮＹ）、Ｓｉｇｍａ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ミズーリ州）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ニュージャージー）、プロクター＆ギャンブル（プロクター  アンド  ギャンブル、シンシナティ、ＯＨ）、ジェネンコー（ジェネンコー・インターナショナル、パロ  アルト、カリフォルニア）、Ｅｎｄｏｇｅｎ（Ｅｎｄｏｇｅｎ、ウォバーン、マサチューセッツ）、Ｃｅｄａｒｌａｎｅ（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ、トロント、カナダ）、Ｄｙｎａｌ（Ｄｙｎａｌ、ノルウェー）、Ｎｏｖｏ（Ｎｏｖｏ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ａ／Ｓ、コペンハーゲン、デンマーク）、Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、ルイビル、テキサス）、ＴｒｉＬｕｃ  Ｂｅｔａ（ＴｒｉＬｕｃ  Ｂｅｔａ、Ｗａｌｌａｃ、フィンランド）、ＤｕＰｏｎｔ／ＮＥＮ（ＤｕＰｏｎｔ／ＮＥＮ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ボストン、マサチューセッツ）、ＴｏｍＴｅｃ（ハムデン、コネチカット）及びＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ラ・ホーヤ、カリフォルニア）である。
【０１８２】
実施例１
ヒトＴ細胞を用いるＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）におけるペプチドＴ細胞エピトープを同定するための分析システムに用いる細胞調製
新しいヒト末梢血細胞をＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）酵素への曝露状態が未知の９２人のヒトから収集した。これらの細胞を実施例３に記載するように、ＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）における抗原エピトープを決定するために試験した。末梢血単核細胞（２４時間以下、室温で保存）を以下の通り調製して使用した：１単位の全血由来の約３０ｍｌの軟膜調製物溶液を５０ｍｌのダルベッコリン酸緩衝液（ＤＰＢＳ）に加え、２つの管に分割した。当該サンプルを１２．５ｍｌの室温リンフォプレップ（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ）密度分離培地（Ｎｙｃｏｍｅｄ；密度１．０７７ｇ／ｍｌ）下に置いた。当該管を６００×重力（ｇ）で３０分間遠心分離した。２つの相の接合部分を回収、プールし、ＤＰＢＳで洗浄した。最終的な溶液の細胞密度を当業界に公知の血球計算板により測定した。存続性を当業界に公知のトリパンブルー排除により測定した。
【０１８３】
得られた溶液から、分化樹状細胞培養物を密度が７５ｍｌの培養フラスコの溶液当たり１０８細胞である末梢血単核細胞サンプルから以下の通り調製した：
（１）５０ｍｌの血清フリーＡＩＭ  Ｖ培地（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を１：１００希釈β−メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を用いて捕捉した。フラスコを２時間、３７℃で、５％ＣＯ２中に倒して、フラスコ壁に単球を付着させた；
（２）単球細胞の樹状細胞への分化を以下の通り行った：非付着細胞を除去し、得られた付着細胞（単球）を３０ｍｌのＡＩＭ  Ｖ、８００単位／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ（Ｅｎｄｏｇｅｎ）及び５００単位／ｍｌのＩＬ−４（Ｅｎｄｏｇｅｎ）と混合し；得られた混合物を５日間、３７℃で５％ＣＯ２中で培養した。培養の５日後、サイトカインＴＮＦα（Ｅｎｄｏｇｅｎ）を０．２単位／ｍｌに加え、及びサイトカインＩＬ−１α（Ｅｎｄｏｇｅｎ）を最終濃度５０単位／ｍｌに加え、当該混合物を３７℃、５％ＣＯ２中で、もう２日間培養した。
（３）７日目に、マイトマイシンＣを１００ｍＭ  ＥＤＴＡ含有リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中、濃度５０マイクログラム／ｍｌまで加え、分化中の樹状細胞培養物の成長を止めた。当該溶液を６０分間、３７℃、５％ＣＯ２中で培養した。樹状細胞を穏やかにフラスコを湯出しすることにより、プラスティック表面から除去した。樹状細胞をそれから、５分間、６００×ｇで遠心分離し、ＤＰＢＳで洗浄し、上述の通り計算した。
（４）調製した樹状細胞を、１００マイクロリットル合計体積のＡＩＭ  Ｖ培地中、ウェル当たり２×１０４細胞／ウェル濃度で９６−ウェル丸底プレート内に置いた。
【０１８４】
ＣＤ４＋Ｔ細胞は、Ｄｙｎａｌ  ＣＤ４＋Ｔ細胞エンリッチメントキット（Ｄｙｎａｌ）により提供される試薬を用いて、樹状細胞を調製するために用いる末梢血細胞サンプルの凍結アリコートから調製した。得られたＣＤ４＋Ｔ細胞溶液を遠心分離し、ＡＩＭ  Ｖ培地中で再懸濁させ、当該細胞密度を当業界に公知の方法を用いて測定した。ＣＤ４＋Ｔ細胞懸濁液をそれから、ＡＩＭ  Ｖ培地中で２×１０６細胞／ｍｌに再懸濁させ、９６ウェルプレートの効率的な操作を容易にする。
【０１８５】
実施例２
分析システムに用いるＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）におけるＴ細胞エピトープの同定
実施例３に記載の分析に用いるペプチドをＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）酵素の完全長アミノ酸配列（配列番号１）に基づいて調製し、ＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）の全体配列を含む１５マーを合成的に調製した。連続ペプチドは１２アミノ酸が重複した。合計８８のペプチド（配列番号２〜８９）を作成し、その配列を図２に示す。  
ペプチド抗原を２ｍｇ／ｍｌのＤＭＳＯ原液として調製した。まず、０．５マイクロリットルの原液を分化樹状細胞を前もって加えた９６ウェルプレートの各ウェル中に入れた。そして、上述の通り調製した１００マイクロリットルの希釈ＣＤ４＋Ｔ細胞溶液を各ウェルに加えた。有用な対照は希釈ＤＭＳＯを含まないもの、及び破傷風トキソイド溶性対照を含む。
【０１８６】
２０マイクロリットル合計体積で各ウェルの最終濃度は以下の通りである：
２×１０４  ＣＤ４＋  Ｔ細胞
２×１０５  樹状細胞  （Ｒ：Ｓが１０：１）
５μＭ  ペプチド
実施例３
ヒトＴ細胞を用いるＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）酵素におけるペプチドＴ細胞エピトープを同定する分析
いったん分析試薬（すなわち、細胞、ペプチド等）を調製し、９６ウェルプレート中に分配すると、当該分析が行われた。対照は樹状細胞とＣＤ４＋  Ｔ細胞だけ（ＤＭＳＯキャリアを含む）を含み、及び約５Ｌｆ／ｍＬで破傷風トキソイド（Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔ，フィラデルフィア、ペンシルベニア州）を含む。
【０１８７】
培養物を５日間、３７℃、５％ＣＯ２中で培養した。トリチウム化チミジン（ＮＥＮ）を０．５マイクロＣｉ／ウェルで加えた。培養物を集菌し、Ｗａｌｌａｃ  ＴｒｉＢｅｔａ  シンチレーション検出システムを用いて次の日に混合のため評価した。
【０１８８】
全ての試験は少なくとも２回行った。記録した試験の全ては、抗原破傷風トキソイドに対して堅調な陽性対照反応を示した。反応は各実験内で平均し、それから基準反応に対して標準化した。陽性事象（すなわち、増殖反応）は、当該反応が基準反応の少なくとも２．９５倍の場合、記録した。
【０１８９】
ＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）酵素から調製したペプチドに対する免疫反応（すなわち、Ｔ細胞増殖）は９２人のドナーに関して集計し、図３に示した。６つの有意なエピトープを同定した。特に関心のあるものとして同定されたペプチドは、図２及び３に示すようにペプチド１、７及び８、１４、２９及び３９を含む。これらのペプチドは以下の配列に対応する。
【表１】
0004597528.tif 000003
【０１９０】
このペプチドセットに対する全体的な反応のバックグラウンド率は、試験したドナーについて２．３５±２．５６％であった。上の表において、ペプチド７〜８は１８アミノ酸の連続配列である（ペプチド番号７、３つの固有アミノ酸はペプチド番号８に寄与させる）。このペプチド７と８の組み合せは両ペプチドに関して観測された反応が優れていたので組み合わせた。
【０１９１】
実施例４
変異体ペプチドの分析
ペプチド番号７及び２９はさらなる分析のために選択する。変性ペプチドのセットはペプチド番号７及びペプチド番号２９の配列に基づいて構築し、ここでアミノ酸残基は親配列から修飾する。これはＭｉｍｏｓｔｏｐｅｓ（サンディエゴ）などの製造供給元により達成できる。アラニンスキャンを各ペプチドについて行う（例えば、Ｈｅｒｒｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８４：５５５−５６１［１９９５］；及び）Ｍａｉｌｌｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３２：１０７３−１０８０［１９９５］を参照）。当該分析は実施例３に説明の通り行い、ドナーサンプルのセット上の変性ペプチドを利用する。増殖性反応を照合する。
【０１９２】
１の実施態様において、変性ペプチドは、少なくとも１及び好ましくは３つ全ての以下の基準に合致する場合、低アレルギー性タンパク質分子（すなわち、本発明に従う修飾ズブチリシンタンパク質）を作成するのに有用であると考えられる：（１）親ペプチドに約２．９２以上の刺激指数（ＳＩ）で反応するドナー全員が約１．０以下のＳＩで変性ペプチドに反応する；（２）親ペプチドに弱くしか反応しない（ＳＩが約１．０以上だが、約２．９５以下である）ドナー全員が約１．０以下のＳＩで変性ペプチドに反応する；及び（３）親ペプチドに対して反応しないドナー全員が変性ペプチドに対しても反応しない。ＳＩは対照ペプチドと比較した、ペプチドのＴ細胞増殖性反応の指標である。ＳＩは各ペプチド、各ドナーに関して計算する。
【０１９３】
実施例５
エピトープペプチド番号とＨＬＡの関連
上述の分析試験ラウンドにおける試験ドナー全員のＨＬＡ−ＤＲ及びＤＱ発現は市販のＰＣＲベースのＨＬＡ割出しキット（Ｂｉｏ−Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）を用いて評価する。いくつかの実施態様において、ペプチド番号に対する反応者と非反応者間の個々のＨＬＡ−ＤＲ及びＤＱ抗原の表現型頻度を自由度１でカイ二乗分析を用いて試験する。ペプチド番号に対応するエピトープに対して反応する増加または減少可能性は問題のＨＬＡ抗原が反応及び非反応ドナーサンプルの両方に存在し、対応エピトープがＨＬＡ関連エピトープであると考えられるときに計算する。
【０１９４】
エピトープ関連ＨＬＡ対立遺伝子を発現する反応者及び非反応者における個々のペプチドに対する増殖反応の大きさも分析できる。“ペプチドに対する個々の反応者”とは２．９５以上の刺激指数により定義される。ＨＬＡ対立遺伝子に関連するエピトープを発現するドナーの増殖性反応は関連対立遺伝子を発現しないペプチド反応者よりも高いと考えられる。
【０１９５】
上述より、本発明はＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）などの野生型ズブチリシン・カールスバーグにおけるＴ細胞エピトープを同定する方法及び組成物を提供することが明らかである。いったん抗原エピトープを同定すると、エピトープを所望により修飾し、修飾エピトープのペプチド配列は野生型ズブチリシン・カールスバーグ内に組込み、修飾配列がもはやＣＤ４＋Ｔ細胞反応を開始できないようにし、ここでＣＤ４＋Ｔ細胞反応は野生型母体と比較して著しく減少している。特に、本発明はＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）の免疫原性を減少させるために適した方法及び組成物を含む手段を提供する。
【０１９６】
実施例６
突然変異体ズブチリシンによるジメチルカゼイン（“ＤＭＣ”）の加水分解
本発明に記載した方法により単離及び精製された、突然変異体ズブチリシンを市販合成基質、ジメチルカゼイン（Ｓｉｇｍａ  Ｃ−９８０１）を加水分解する能力について分析する。５ｍｇ／ｍｌ  ＤＭＣ基質溶液を適当な緩衝液中で調製する（５ｍｇ／ｍｌ  ＤＭＣ、０．００５％（ｗ／ｗ）Ｔｗｅｅｎ  ８０（登録商標）（ポリオキシエチレン・ソルビタンモノ−オレアート、Ｓｉｇｍａ  Ｐ−１７５４）。適当なＤＭＣ基質緩衝液を調製する（例えば、ｐＨ５．５の５０ｍＭ  酢酸ナトリウム；ｐＨ６．５の５０ｍＭ  Ｎ−ｔｒｉｓ（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（“ＴＥＳ”）；ｐＨ７．５の５０ｍＭ  ピペラジン−Ｎ−Ｎ’−ｂｉｓ−２−エタンスルホン酸（“ＰＩＰＥＳ”）；及びｐＨ８．５の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ）。試験を始めるために、２００μｌの所望のｐＨ基質をマイクロタイタープレート（例えば、９６ウェルプレート）のウェル中に入れ、酵素添加前に２０分間、３７℃で前もって培養する。２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸塩（“ＴＮＢＳ”）呈色反応法をＳｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ２５０分光光度計における活性を測定するために用いる。この分析は遊離アミノ基を含むペプチド内のＤＭＣの酵素的加水分解を測定する。これらのアミノ基は２，４，６−トリニトロ−ベンゼンスルホン酸と反応して黄色複合体を形成する。
【０１９７】
従って、反応の色が濃いほど、より多くの活性が測定される。ＴＮＢＳ検出分析は３７℃、２時間の培養後、上澄み上で行うことができる。１ｍｇ／ｍｌのＴＮＢＳ溶液は、１０００ｍｌ中で加熱により溶解させた、２．４ｇ  ＮａＯＨ、４５．４ｇ  Ｎａ２Ｂ４）７・１０Ｈ２Ｏを含む溶液中で調製する。この溶液から、６０μｌを９６ウェルマイクロタイタープレート内に分割する。そして、上述の１０μｌの培養酵素溶液を各ウェルに加え、室温で２０分間混合する。それから、２０μｌのＮａＨ２ＰＯ４溶液（２０００ｍｌ中、７０．４ｇ  ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ及び１．２ｇ  Ｎａ２ＳＯ３）をウェル中で１分間混合し、反応を停止させ、Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ２５０  分光光度計における４０５ｎｍの吸収を測定する。ブランク（同じＴＮＢＳ溶液だが、酵素を含まない）も調製し、試験する。加水分解は以下の式により、種々の酵素濃度（０、２．５、５、７．５及び１０ｐｐｍ）で測定する：
吸収４０５（酵素溶液）  −  吸収４０５（酵素なし）
公知の突然変異体由来ズブチリシン（例えば、特性付けられた変異ズブチリシン）と比較した当該基質を加水分解する突然変異体の能力はこの方法で測定できる。
【０１９８】
実施例７
変異体ズブチリシン・カールスバーグ酵素によるコラーゲン、エラスチン及びケラチンの加水分解
上述の方法により単離及び精製した突然変異体ズブチリシン・カールスバーグ酵素は、例えば、ウシコラーゲン（Ｓｉｇｍａ  Ｃ−９８７９）、ウシエラスチン（Ｓｉｇｍａ  Ｅ−１６２５）及び／またはウシケラチン（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ９０２１１１）などの市販基質を加水分解する能力について分析されることが多い。５ｍｇ／ｍｌの基質溶液を調製する（０．００５％  Ｔｗｅｅｎ  ８０（登録商標）中）。各基質を当業界に公知の適当なｐＨで調製する（例えば、ｐＨ５．５、６．５、７．５及び８．５）。試験のため、１．５ｍｌの各基質を３７℃で２４ウェルＣｏｓｔａｒプレート内に移す。プレートは酵素を添加する前に３７℃、２０分で前もって培養する。上述のＴＮＢＳ検出分析を３７℃で２時間培養した後に上澄みについて行う。
【０１９９】
これらの分析は当該基質を加水分解するために、公知の突然変異体由来のズブチリシンに対する突然変異体の比較能力を示すのに使用できると考えられる。ほとんどの場合、突然変異酵素は、お互い及び野生型酵素と比較して、種々のｐＨ、及び種々の酵素濃度で通常、コラーゲン、エラスチン及びケラチン基質の顕著な加水分解を示すことが考えられる。
【０２００】
実施例８
ピペラジン−Ｎ−Ｎ’−ビス−２−エタンスルホン酸（“ＰＩＰＥＳ”）緩衝液における変異体タンパク質の熱安定性
これらの実験では、ＰＩＰＥＳ中のタンパク質（例えば、ズブチリシン・カールスバーグ）変異体の熱安定性について測定する。通常、これらの測定はストラタジーン・ロボサイクラー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｒｏｂｏｃｙｃｌｅｒ）のタイプのＰＣＲサーモサイクラーを用いて行う。５．０ｐｐｍ酵素、５．０ｐｐｍ酵素（例えば、目的変異体及び対照変異酵素）の安定性は５つの時点（例えば、５、１０、２０、４０及び６０分）、ｐＨ６．５で各温度について試験する。例えば、サンプルは４２〜５６℃の範囲で２度毎及び４２℃〜５６℃の温度でその他の各温度で、ＰＣＲサーモサイクラー勾配（ｇｒａｄｉｅｎｔ）において試験する。これらの実験では、５０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ緩衝液を調製する（５０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ、０．００５％  Ｔｗｅｅｎ８０（登録商標）。通常、ｐＨは６．５に調節する。しかしながら、本発明は特定の方法に限定されるものではなく、酵素の熱安定性を測定するための種々の方法が当業界に公知である。
【０２０１】
サンプルは標準スクシニル−ａｌａ−ａｌａ−パラ−ニトロアニリド（“ＳＡＡＰＦｐＮＡ”）分析（例えば、Ｄｅｌｍａｒ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，９４：３１６−３２０［１９７９］；及びＡｃｈｔｓｔｅｔｔｅｒ，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２０７：４４５−５４［１９８１］を参照）を用いて、ｐＨ６．５及び２５℃で分析する。サンプルを約３００ミリＯＤ／分まで希釈する。熱安定性は通常、以下の通り測定して酵素半減期（分）として表す：  Ｈ．Ｌ．＝２／傾き、ここで傾きは各温度についてのｖ時間率の曲線の傾きである。
【０２０２】
これらの方法を用いることにより、突然変異体の安定性は対照変異酵素及び／または野生型酵素に関して容易に比較できる。
【０２０３】
実施例９
Ｎ−ｔｒｉｓ（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（“ＴＥＳ”）におけるズブチリシン・カールスバーグ変異体の熱安定性
これらの実験では、ＴＥＳ中の変異体の安定性を測定する。上述の通り、５．０ｐｐｍ酵素（例えば、目的変異体及び対照）を各温度について、ｐＨ６．５、５つの時点（例えば、５、１０、２０、４０及び６０分）で試験する。例えば、サンプルをＰＣＲサーモサイクラー勾配において、４２〜５６℃の範囲で２℃毎に試験し、４２℃〜５６℃の温度でその他の各温度で試験する。ＴＥＳ緩衝液は５０ｍＭ  ＴＥＳ（Ｓｉｇｍａ  Ｔ１３７５）、０．００５％  Ｔｗｅｅｎ８０（登録商標）を混合することにより調製する。通常、ｐＨは６．５に調節する。
【０２０４】
変異体の熱安定性は、当業界に公知のスクシニル−ａｌａ−ａｌａ−ｐｒｏ−ｐｈｅ−パラ−ニトロアニリド（“ＡＡＰＦｐＮＡ”）を用いて、測定して、余剰変異体の活性として測定でき、Ｓｉｇｍａ番号Ｓ−７３８８（ｍｏｌ．ｗｔ．６２４．６ｇ／モル）（例えば、Ｄｅｌｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，９４：３１６−３２０［１９７９］；及びＡｃｈｔｓｔｅｔｔｅｒ，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２０７：４４５−４５４［１９８１］を参照）などの試薬を用いてｐＨ６．５、２５℃の温度で試験できる。反応において形成される（黄）ｐ−ニトロンアニリド（ｐＮＡ）は４１０ｎｍ：ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ２５０分光光度計を用いてεＭ＝８，４８０Ｍ−１．ｃｍ−１、（）で分光光度法で測定し、サンプルは約３００ｍＯＤ／分に希釈される。熱安定性は上述の通り酵素半減期（分）として表す。上述に示したように、これらの実験は変異体酵素調製物と対照変異酵素及び／または野生型酵素の安定性を比較するための手段を提供する。
【０２０５】
実施例１０
ボディウォッシュ溶液及びその他のパーソナルケア製品におけるズブチリシン・カールスバーグ変異体の安定性
種々のズブチリシン・カールスバーグ変異体の安定性を以下の手順を用いて測定した。
【０２０６】
溶液安定性の測定方法
これらの実験では、ズブチリシン・カールスバーグ及び突然変異体を少なくとも２つの研究において試験し、第１の研究は４５℃で３０分間試験し、第２の研究は５０℃で３０分間試験する。これらの試験に関して、５０／５０（ｗ／ｗ）ボディウォッシュ溶液を市販のボディウォッシュ（例えば、商標名ＺＥＳＴ（登録商標）でプロクター＆ギャンブルから市販のボディウォッシュ）と脱イオン水を混合することにより調製する。緩衝液ブレンドのｐＨは約６．８である。
【０２０７】
試験する酵素は希釈し、５０ｗ／ｗ％ボディウォッシュ：脱イオン水溶液中の最終的な濃度が、１０μｌの酵素／ボディウォッシュ溶液をＳＡＡＰＦｐＮＡ分析終点法を用いて分析した場合、０．５〜１．０のＯＤ405変化を生じるようにする。いったん希釈物の量を確認すると、２００μｌの希釈混合物を９６ウェルマイクロタイタープレートウェル中に加える。プレートは密封して、第１の研究について４０℃の水槽中及び第２の研究について５０℃の水槽中に置く。プレートは所望の時間後（例えば、３０または４０分）後に水槽から取り除き、１０μｌのサンプルを終点法により分析する。活性持続率は最終活性を最初の活性で割り、１００倍して計算する。
【０２０８】
いくつかの実施態様において、前述の実施例の分析により測定した特定残基を含む変異体は増加した量の酵素活性持続を示し、従って、対照よりも大きな熱安定性を有する。例えば、５０℃で、いくつかの変異体化合物はより大きな活性持続率を有し、一方、安定化残基変異体を有さない対照変異体酵素及び／または野生型酵素はより低い活性持続率を有する。いくつかの実施態様において、全ての酵素は５０℃のボディウォッシュの存在下で高められた安定性を有するが、異なる安定性変異体を含む対照の突然変異体酵素−［エピトープ変異体］はさらに優れた安定性を有する。
【０２０９】
実際に、減少した免疫原性を有する本発明の変異体ズブチリシン・カールスバーグ酵素が使用できる多数の用途が存在する。洗剤及びその他の洗浄調製物に加えて、減少した免疫原性を有する変異体ズブチリシン・カールスバーグ酵素はパーソナルケア製品にも使用できる。以下の表は試験での使用に適した種々の製品の組成を提供する。これらの表において、“微量成分”の語はｐＨ調整剤、保存料、粘度調整剤及び香料を包含する。これらの表において特に示さない限り、量はおおよその重量％を表し（製造元が提供する通り）、有効数字を示すものではない。
【表２】
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【０２１０】
0004597528.tif 000005
【０２１１】
0004597528.tif 000006
【０２１２】
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【０２１３】
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【０２１４】
実施例１１
洗浄組成物
上述の組成物に加え、本発明は特定の性質を有する洗浄組成物を開発する手段を提供する。実際に、本発明は修飾プロテアーゼ（例えば、ズブチリシン・カールスバーグ）を含む種々の洗浄組成物を提供する。特に好ましい実施態様において、効果的な量の１以上の上述のプロテアーゼ酵素はタンパク性のシミ除去が必要な種々の表面を洗浄するのに有用な組成物に含まれる。当該洗浄組成物は硬い表面を洗浄する洗剤組成物、繊維を洗浄する洗剤組成物；食器洗剤組成物；口内洗浄組成物；及び入れ歯洗浄用組成物を含む。これらの組成物は特定の使用目的に適した形態で提供される。好ましくは、本発明の洗浄組成物は約０．０００１％〜約１０％の１以上、より好ましくは約０．００１％〜約１％、及びさらに好ましくは約０．００１％〜約０．１％のプロテアーゼ酵素を含む。プロテアーゼ酵素が使用できる種々の洗浄組成物のいくつかの例としては下記にさらに詳細に説明する。ここで使用する全ての割合、比率、及び比は別に定めない限り重量によるものとする。
【０２１５】
Ａ．  硬い表面、皿及び繊維用の洗浄組成物
本発明のプロテアーゼ酵素（例えば、変異体ズブチリシン・カールスバーグ酵素）は高い泡立ち及び／または不溶性基質の優れた除去が望まれる洗剤組成物において使用できる。従って、本発明のプロテアーゼ酵素は硬い表面用洗浄剤、食器洗い用組成物、織物洗浄組成物等の十分な処方を提供するために種々の従来の成分を用いて使用できる。これらの組成物は特定用途に許容される形態（例えば、液体、顆粒、バー等）での使用に適している。さらに、これらの組成物は界面活性剤の３０重量％〜６０重量％程度を含む市販の“濃縮”洗剤での使用にも適している。
【０２１６】
いくつかの実施態様において、洗浄組成物は種々の陰イオン、非イオン、両性イオン等の界面活性剤を含む。当該界面活性剤は通常、組成物の約０．１％〜約６０％、好ましくは約１％〜約３５％のレベルで存在する。適当な界面活性剤は、限定されないが、従来のＣ１１−Ｃ１８アルキルベンゼンスルホネート及び第１級及びランダムアルキルアルホネート、Ｃ１０−Ｃ１８第２級（２，３）アルキルスルホネート、式ＣＨ３（ＣＨ２）ｘ（ＣＨＯＳＯ３）．ｓｕｐ．−Ｍ．ｓｕｐ．＋）ＣＨ３及びＣＨ３（ＣＨ２）ｙ（ＣＨＯＳＯ３．ｓｕｐ．−Ｍ．ｓｕｐ．＋）ＣＨ２ＣＨ３を含み、ここでｘ及び（ｙ＋１）は少なくとも約７、好ましくは少なくとも約９の整数であり、及びＭは水可溶化カチオン、特にナトリウム、Ｃ１０−Ｃ１８アルキルアルコキシ硫酸（特にＥＯ１−７エトキシ硫酸）、Ｃ１０−Ｃ１８アルキルアルコキシカルボキシレート（特にＥＯ１−７エトキシカルボキシレート）、Ｃ１０−Ｃ１８アルキルポリグリコシド、及びそれらの対応する硫酸ポリグリコシド、Ｃ１２−Ｃ１８αスルホン酸脂肪酸エステル、Ｃ１２−Ｃ１８アルキル及びアルキルフェノールアルコキシレート（特にエトキシレート及び混合エトキシ／プロポキシ）、Ｃ１２−Ｃ１８ベタイン及びスルホベタイン（“ｓｕｌｔａｉｎｅ”）、Ｃ１０−Ｃ１８酸化アミン、Ｃ８−Ｃ２４サルコシン（特にオレオイルサルコシン）等である。さらに、前述の酸化アミン及び／またはベタインまたはｓｕｌｔａｉｎｅと組み合わせての当該界面活性剤の使用も好ましく、設計者の要望に応じる。その他の従来の有用な界面活性剤も当業界に公知であり、限定されないが、Ｃ１０−Ｃ１８Ｎ−メチルグルカミドなどの特に有用な界面活性剤を含む（米国特許第５，１９４，６３９号を参照）。
【０２１７】
いくつかの実施態様において、本発明の組成物は酸化エチレンと疎水性部分の縮合物である陰イオン性界面活性剤の分類メンバーを含み、５〜１７、好ましくは６〜１４、より好ましくは７〜１４の範囲の平均親水性−親油性比率（ＨＬＢ）を有する界面活性剤を提供する。疎水性（親油性）部分は脂肪族または芳香族であり、任意の特定疎水性基と縮合したポリオキシエチレン基の長さは親水性と疎水性成分の所望比率を有する水溶性化合物を生じるために容易に調節できる。特に好ましくは３〜８モルの酸化エチレンをアルコール１モル当たりに含むＣ９−Ｃ１５第１級アルコールエトキシレート（または混合エトキシ／プロポキシ）であり、特に好ましくは６〜８モルの酸化エチレンをアルコール１モル当たりに含むＣ１４−Ｃ１５第１級アルコール、３５モルの酸化エチレンをアルコール１モル当たりに含むＣ１２−Ｃ１５第１級アルコール及びこれらの混合物である。
【０２１８】
洗剤洗浄組成物に有用なその他の種々の成分は本発明の組成物に使用でき、その他の活性成分、キャリア、可溶化剤、加工助剤、染料または顔料、液体製剤のための溶剤等を含む。泡立ちを追加するために、Ｃ１０−Ｃ１６アルキルアミドなどの泡立ち促進剤を組成物に混合でき、通常約１％〜約１０％のレベルである。Ｃ１０−Ｃ１４モノエタノール及びジエタノールアミドは当該泡立ち促進剤の一般的な分類を示す。上述の酸化アミン、ベタイン及びｓｕｌｔａｉｎｅｓなどの界面活性剤を補助する高い泡立ちを有する当該泡立ち促進剤の使用も有益である。所望により、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４等などの溶性マグネシウム塩は追加の泡立ちを与えるために通常、約０．１％〜約２％のレベルで添加できる。
【０２１９】
本発明の液体洗剤組成物は通常、水及びその他の溶媒をキャリアとして含む。低分子量第１級または第２級アルコール（例えば、メタノール、エタノール、プロパノール及びイソプロパノール）は適している。一価アルコールは界面活性剤を可溶化するために好ましいが、約２〜約６炭素原子及び約２〜約６ヒドロキシ基などを含むポリオール（例えば、１，３−プロパンジオール、エチレングリコール、グリセリン及び１，２−プロパンジオール）も本発明の洗剤に使用できる。いくつかの実施態様において、組成物は約９０％または約１０％〜約５０％の当該キャリアを含む。
【０２２０】
本発明の洗剤組成物は好ましくは水洗浄での使用中、洗浄水が約６．８〜約１１．０のｐＨを有するように処方するのが好ましい。従って、最終的な製品はこの範囲で一般的に処方される。推奨使用レベルでｐＨを制御する技術は緩衝液、アルカリ、酸等の使用を含み、当業界に公知である。
【０２２１】
本発明の硬い表面用洗剤組成物及び繊維洗浄組成物を設計する場合、設計者は約５重量％〜約５０重量％のレベルで種々のビルダーを使用するかもしれない。一般的なビルダーは１〜１０ミクロンゼオライト、ポリカルボキシレート、例えば、クエン酸及びオキシジスクシネート、層状ケイ酸塩、ホスフェート等を含む。その他の従来のビルダーは当業界に公知であり、本発明の組成物に含めるために適している。
【０２２２】
同様に、設計者は種々の他の酵素を使用することが考えられ、例えば、セルラーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、パーオキシダーゼ、及びプロテアーゼなどがあり、当該組成物中、通常約０．００１重量％〜約１重量％のレベルである。種々の洗剤及び繊維ケア酵素は洗濯洗剤業界で公知であり、本発明の組成物に含めるために適している。
【０２２３】
種々の漂白成分、例えば、過炭酸ナトリウム、過ホウ酸塩等も本発明の組成物で使用できる。これらの漂白成分は通常約１重量％〜約１５重量％のレベルで存在する。所望により、当該組成物は漂白活性剤も含むことができ、例えば、テトラアセチルエチレンジアミン、ノナノイルオキシベンゼンスルホネート等があり、当業界に公知である。当該化合物の使用レベルは通常、約１重量％〜約１０重量％である。
【０２２４】
種々の土汚れ離型剤、特に陰イオン性オリゴエステル型、種々のキレート剤、特にアミノホスホネート及びエチレンジアミンジスクシネート、種々の粘土汚れ離型剤、特にエトキシル化テトラエチレンペントアミン、種々の分散剤、特にポリアクリル酸及びポリアスパラギン酸塩、種々の漂白剤、特に陰イオン性漂白剤、種々の転染阻害剤、例えば、ポリビニルピロリドン、種々の泡立ち抑制剤、特にシリコーン及び第２級アルコール、種々の繊維軟化剤、特にスメクタイト粘土及び粘土ｆｌｏｃｕｌａｔｉｎｇポリマー（例えば、ポリ（オキシエチレン））等は全て本発明の組成物に使用でき、最も一般的には約１重量％〜約３５重量％のレベルである。
【０２２５】
酵素安定化剤も本発明の洗浄組成物に使用できる。当該酵素安定化剤は限定されないが、プロピレングリコール（好ましくは約１％〜約１０％）、ギ酸ナトリウム（好ましくは約０．１％〜約１％）及びギ酸カルシウム（好ましくは約０．１％〜約１％）を含む。
【０２２６】
１．硬い表面用洗浄組成物
好ましい実施態様において、本発明の硬い表面用洗浄組成物は効果的な量の１以上のプロテアーゼ酵素（例えば、変異体ズブチリシン・カールスバーグ酵素）を含み、好ましくは組成物の約０．０００１重量％〜約１０重量％、より好ましくは約０．００１重量％〜約５重量％、さらにより好ましくは約０．００１重量％〜約１重量％の活性プロテアーゼ酵素を含む。１以上のプロテアーゼ酵素を含むことに加え、当該硬い表面用洗浄組成物は通常、界面活性剤及び水溶性金属イオン封鎖ビルダーを含む。しかしながら、スプレー窓拭き用洗剤などのある特殊化製品において、界面活性剤は、ガラス表面上に薄膜／縞むらを生じ得るので使用しない場合もある。
【０２２７】
界面活性剤成分は、存在する場合、本発明の組成物の０．１％程度で含むことができるが、一般的には組成物は約０．２５％〜約１０％、より好ましくは約１％〜約５％の界面活性剤を含む。
【０２２８】
一般的には組成物は約０．５％〜約５０％の洗浄ビルダーを含み、好ましくは約１％〜約１０％を含む。好ましくは、ｐＨは約８〜１２の範囲である。水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウムまたは塩酸などの従来のｐＨ調節剤は調節が必要な場合用いることができる。
【０２２９】
いくつかの実施態様において、少なくとも１の溶媒が組成物中に含まれる。有用な溶媒は限定されないが、ジエチレングリコールモノヘキシルエーテル、ジエチレングリコールモノブチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル、エチレングリコールモノヘキシルエーテル、プロピレングリコールモノブチルエーテル、ジプロピレングリコールモノブチルーエーテルなどのグリコールエーテル及び２，２，４−トリメチル−１，３−ペンタンジオール及び２−エチル−１，３−ヘキサンジオールなどのジオールを含む。使用する場合、当該溶媒は通常、約０．５％〜約１５％、好ましくは約３％〜約１１％のレベルで存在する。
【０２３０】
さらに、イソプロパノールまたはエタノールなどの高揮発性溶媒は、表面へ組成物を“そのままの濃度で”適用した後に当該表面を流さない場合、表面から組成物のより速い蒸発を促進するために本発明の組成物で使用できる。使用する場合、揮発性溶媒は通常、組成物において約２％〜約１２％のレベルで存在する。
【０２３１】
本発明の硬い表面用洗浄組成物の実施態様は以下の非限定的な例により説明する。以下の例において、実施例中の“プロテアーゼ＃”の言及は０．１０、０．２０、０．１０、０．０５、０．０３及び０．０２パーセントのプロテアーゼ変異体に反応する減少した免疫原性を有する本発明の組成物に有用な変異体に対するものである。
【表３】
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【０２３２】
上述の実施例のいくつかの実施態様において、本発明に有用な他のプロテアーゼ（例えば、変異体ズブチリシン・カールスバーグ酵素）は実質的に類似の結果で置き換えられる。さらに、上述の実施例のいくつかの実施態様において、本発明に有用な減少した免疫原性プロテアーゼの組み合わせ（例えば、変異体ズブチリシン・カールスバーグ酵素）は上述の処方において実質的に類似の結果で置き換えられる。
【０２３３】
以下の表は硬い表面用洗浄及びカビ取りに適したサンプル組成物を提供する。当該製品組成物は通常、約ｐＨ７である。
【表４】
0004597528.tif 000010
【０２３４】
これらの実施例で、本発明で有用なプロテアーゼ酵素（例えば、変異体ズブチリシン・カールスバーグ酵素）の任意の組み合わせは実質的に類似の結果で置き換えられる。
【０２３５】
２．食器洗い用組成物
本発明の別の実施態様において、１以上のプロテアーゼ酵素（例えば、変異ズブチリシン・カールスバーグ酵素）を含む食器洗い用組成物を提供する。本発明の好ましい食器洗い用組成物の実施態様を以下に示す。プロテアーゼは０．５、０．４、０．１、０．０５、０．０３及び０．０２パーセントで含まれる。これらの組成物では、製品ｐＨは７に調節する。
【表５】
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【０２３６】
上述の実施例のいくつかの実施態様において、本発明に有用なプロテアーゼ（例えば、変異体ズブチリシン・カールスバーグ酵素）は上述の処方で置換され、実質的に類似の結果を有する。さらに、上述の実施例のいくつかの実施態様において、本発明で有用なプロテアーゼ酵素の組み合わせ（例えば、変異体ズブチリシン・カールスバーグ酵素）は、とりわけ、上述の処方で置換され、実質的に類似の結果を有する。
【表６】
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【０２３７】
上述の処方において、本発明で有用な減少された免疫原性プロテアーゼ（例えば、変異体ズブチリシン・カールスバーグ酵素）はそこで置換され、実質的に類似の結果を有する。また、上述の処方において、ここに挙げる本発明で有用なプロテアーゼの組み合わせ（例えば、変異体ズブチリシン・カールスバーグ酵素）は実質的に類似の結果を有して置換できる。
【０２３８】
３．織物洗浄組成物
本発明はさらに、１以上のプロテアーゼ酵素（例えば、変異体ズブチリシン・カールスバーグ酵素）を含む織物洗浄組成物を提供する。
【０２３９】
ａ．顆粒織物洗浄
本発明の顆粒織物洗浄組成物は効果的な量の１以上のプロテアーゼ酵素（例えば、変異体ズブチリシン・カールスバーグ酵素）を含み、好ましくは組成物の約０．００１重量％〜約１０重量％、より好ましくは約０．００５重量％〜約５重量％、より好ましくは約０．０１重量％〜約１重量％の活性プロテアーゼ酵素を含む。１以上のプロテアーゼ酵素に加えて、顆粒織物洗浄組成物は通常、少なくとも１の界面活性剤、１以上のビルダー及び場合によっては、漂白剤を含む。本発明の顆粒織物洗浄組成物の実施態様は以下の実施例により説明する。
【表７】
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【０２４０】
上述の処方において、本発明で有用な減少された免疫原性プロテアーゼ（例えば、変異体ズブチリシン・カールスバーグ酵素）はそこで置換され、実質的に類似の結果を有する。また、上述の処方において、ここに挙げる本発明で有用なプロテアーゼの組み合わせ（例えば、変異体ズブチリシン・カールスバーグ酵素）は実質的に類似の結果を有して置換できる。
【表８】
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【０２４１】
上述の処方において、本発明で有用な減少された免疫原性プロテアーゼ（例えば、変異体ズブチリシン・カールスバーグ酵素）はそこで置換され、実質的に類似の結果を有する。また、上述の処方において、ここに挙げる本発明で有用なプロテアーゼの組み合わせ（例えば、変異体ズブチリシン・カールスバーグ酵素）は実質的に類似の結果を有して置換できる。
【表９】
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【０２４２】
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【０２４３】
別の実施態様において、以下のような凝集顆粒織物洗浄組成物を提供する。成分は重量％に関して与える。組成物１：硫酸アルキル（８．０）、アルキルエトキシ硫酸（２．０）、３及び７回エトキシル化したＣ２５とＣ４５アルコールの混合物（６．０）、ポリヒドロキシ脂肪酸アミド（２．５）、ゼオライト（１７．０）、層状ケイ酸塩／クエン酸塩（１６．０）、炭酸塩（７．０）、マレイン酸アクリル酸コポリマー（５．０）、土汚れ除去ポリマー（０．４）、カルボキシメチルセルロース（０．４）、ポリ（４−ビニルピロリジン）−Ｎ−オキシド（０．１）、ビニルイミダゾール及びビニルピロリドンのコポリマー（０．１）、ＰＥＧ−２０００（０．２）、プロテアーゼ＃（４％プリル）（０．５）、リパーゼ（０．２）、セルラーゼ（０．２）、テトラセチルエチレンジアミン（６．０）、過炭酸塩（２２．０）、エチレンジアミン２琥珀酸（０．３）、泡立ち抑制剤（３．５）、２ナトリウム−４，４’−ｂｉｓ（２−モルホリノ−４−アニリノ−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−２，２’−ジスルホン酸（０．２５）、２ナトリウム−４，４’−ｂｉｓ（２−スルホスチリル）ビフェニル（０．０５）及び水、香料及び微量成分の組み合わせ（１００まで調整）。
【０２４４】
別の顆粒織物洗浄組成物において、以下の成分を提供する。成分は重量％に関する。組成物２：直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩（７．６）、Ｃ１６−Ｃ１８硫酸アルキル（１．３）、７回エトキシル化したＣ１４−Ｃ１５アルコール（４．０）、ｃｏｃｏ−アルキル−ジメチルヒドロキシエチル塩化アンモニウム（１．４）、分散剤（０．０７）、シリコーン流動体（０．８）、クエン酸３ナトリウム（５．０）、ゼオライト４Ａ（１５．０）、マレイン酸アクリル酸コポリマー（４．０）、ジエチレントリアミンペンタメチレンホスホン酸（０．４）、過ホウ酸塩（１５．０）、テトラアセチルエチレンジアミン（５．０）、スメクタイト粘土（１０．０）、ポリ（オキシエチレン）（分子量３００，０００）（０．３）、プロテアーゼ＃（４％プリル）（０．４）、リパーゼ（０．２）、アミラーゼ（０．３）、セルラーゼ（０．２）、ケイ酸ナトリウム（３．０）、炭酸ナトリウム（１０．０）、カルボキシメチルセルロース（０．２）、漂白剤（０．２）及び香料及び微量成分の混合物（１００まで調整）。
【０２４５】
さらに別の顆粒織物洗浄組成物において、以下の成分を提供する。成分は重量％に関する。組成物２：直鎖アルキルベンゼン（６．９２）、タローアルキル硫酸（２．０５）、７回エトキシル化したＣ１４−Ｃ１５アルコール（４．４）、３回エトキシル化したＣ１２−Ｃ１５アルキルエトキシ硫酸（０．１６）、ゼオライト（２０．２）、クエン酸塩（５．５）、炭酸塩（１５．４）、ケイ酸塩（３．０）、マレイン酸アクリル酸コポリマー（４．０）、カルボキシメチルセルラーゼ（０．３１）、土汚れ除去ポリマー（０．３０）、プロテアーゼ＃（４％プリル）（０．２）、リパーゼ（０．３６）、セルラーゼ（０．１３）、過ホウ酸テトラヒドレート（１１．６４）、過ホウ酸モノヒドレート（８．７）、テトラアセチルエチレンジアミン（５．０）、ジエチレントラミンペンタメチルホスホン酸（０．３８）、硫酸マグネシウム（０．４０）、漂白剤（０．１９）、香料、シリコーン及び泡立ち抑制剤の混合物（０．８５）及び微量成分（１００まで調整）。
【０２４６】
上述の処方において、本発明で有用な減少された免疫原性プロテアーゼ（例えば、変異体ズブチリシン・カールスバーグ酵素）はそこで置換され、実質的に類似の結果を有する。また、上述の処方において、ここに挙げる本発明で有用なプロテアーゼの組み合わせ（例えば、変異体ズブチリシン・カールスバーグ酵素）は実質的に類似の結果を有して置換できる。
【０２４７】
ｂ．液体織物洗浄組成物
本発明の液体織物洗浄組成物は効果的な量の１以上プロテアーゼ酵素（例えば、変異体ズブチリシン・カールスバーグ酵素）を含み、好ましくは組成物の約０．０００１重量％〜約１０重量％、より好ましくは約０．００１重量％〜約１重量％、及び最も好ましくは約０．００１重量％〜約０．１重量％を含む。当該液体織物洗浄組成物は通常、さらに陰イオン性界面活性剤、脂肪酸、水溶性洗剤ビルダー及び水を含む。本発明の液体織物洗浄組成物の実施態様は以下の例により説明する。
【表１０】
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【０２４８】
上述の処方において、本発明で有用な減少された免疫原性プロテアーゼ（例えば、変異体ズブチリシン・カールスバーグ酵素）はそこで置換され、実質的に類似の結果を有する。また、上述の処方において、ここに挙げる本発明で有用なプロテアーゼの組み合わせ（例えば、変異体ズブチリシン・カールスバーグ酵素）は実質的に類似の結果を有して置換できる。
【表１１】
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【０２４９】
上述の処方において、本発明で有用な減少された免疫原性プロテアーゼ（例えば、変異体ズブチリシン・カールスバーグ酵素）はそこで置換され、実質的に類似の結果を有する。また、上述の処方において、ここに挙げる本発明で有用なプロテアーゼの組み合わせ（例えば、変異体ズブチリシン・カールスバーグ酵素）は実質的に類似の結果を有して置換できる。
【０２５０】
ｃ．バー状織物洗浄組成物
本発明のバー状織物洗浄組成物は汚れた織物を手洗いするのに適しており、効果的な量の１以上プロテアーゼ酵素（例えば、変異体ズブチリシン・カールスバーグ酵素）を含み、好ましくは組成物の約０．００１重量％〜約１０重量％、より好ましくは約０．０１重量％〜約１重量％を含む。本発明のバー状織物洗浄組成物の実施態様は以下の例により説明する。
【表１２】
0004597528.tif 000019
【０２５１】
本発明のバー状織物洗浄組成物は汚れた織物を手洗いするのに適しており、効果的な量の１以上プロテアーゼ酵素（例えば、変異体ズブチリシン・カールスバーグ酵素）を含み、好ましくは組成物の約０．００１重量％〜約１０重量％、より好ましくは約０．０１重量％〜約１重量％を含む。本発明のバー状織物洗浄組成物の実施態様は以下の例により説明する。
【０２５２】
Ｂ．他の洗浄組成物
上述の硬い表面用洗浄、食器洗い用及び織物洗浄組成物に加え、１以上のプロテアーゼ酵素（例えば、変異体ズブチリシン・カールスバーグ酵素）は不溶性基質を加水分解することが望ましい種々のその他の洗浄組成物の成分として使用できる。当該他の洗浄組成物は、限定されないが、口内洗浄組成物、入れ歯洗浄組成物、及びコンタクトレンズ洗浄組成物、並びにその他のパーソナルケア洗浄組成物を含む。
【０２５３】
１．口内洗浄組成物
本発明の他の実施態様において、薬学的に許容できる量の１以上のプロテアーゼ酵素（変異体ズブチリシン・カールスバーグ酵素）は歯または入れ歯からタンパク性のシミを除去するのに有用な組成物に含まれる。好ましくは、本発明の口内洗浄組成物は組成物の約０．０００１重量％〜約２０重量％の１以上のプロテアーゼ酵素、より好ましくは約０．００１重量％〜約１０重量％、さらにより好ましくは約０．０１重量％〜約５重量％及び薬学的に許容できるキャリアを含む。通常、口内洗浄組成物の口内洗浄成分の薬学的に許容できる口内洗浄キャリア成分は組成物の約５０重量％〜約９９．９９重量％、好ましくは約６５重量％〜約９９．９９重量％、より好ましくは約６５重量％〜約９９重量％を含む。
【０２５４】
薬学的に許容できる口内洗浄キャリア成分及び方法の口内洗浄組成物に含むことができる任意の成分は当業界に公知である。多種多様な組成物の種類、キャリア成分及び口内洗浄組成物に有用な任意の成分が米国特許第５，０９６，７００号、米国特許第５，０２８，４１４号、及び米国特許第５，０２８，４１５号に記載されており、その全てをここに引用するものとする。本発明の口内洗浄組成物の実施態様は以下の例により説明する。
【表１３】
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【０２５５】
上述の処方において、本発明で有用な減少された免疫原性プロテアーゼ（例えば、変異体ズブチリシン・カールスバーグ酵素）はそこで置換され、実質的に類似の結果を有する。また、上述の処方において、ここに挙げる本発明で有用なプロテアーゼの組み合わせ（例えば、変異体ズブチリシン・カールスバーグ酵素）は実質的に類似の結果を有して置換できる。
【表１４】
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【０２５６】
上述の処方において、本発明で有用な減少された免疫原性プロテアーゼ（例えば、変異体ズブチリシン・カールスバーグ酵素）はそこで置換され、実質的に類似の結果を有する。また、上述の処方において、ここに挙げる本発明で有用なプロテアーゼの組み合わせ（例えば、変異体ズブチリシン・カールスバーグ酵素）は実質的に類似の結果を有して置換できる。
【表１５】
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【０２５７】
上述の処方において、本発明で有用な減少された免疫原性プロテアーゼ（例えば、変異体ズブチリシン・カールスバーグ酵素）はそこで置換され、実質的に類似の結果を有する。また、上述の処方において、ここに挙げる本発明で有用なプロテアーゼの組み合わせ（例えば、変異体ズブチリシン・カールスバーグ酵素）は実質的に類似の結果を有して置換できる。
【表１６】
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【０２５８】
上述の処方において、本発明で有用な減少された免疫原性プロテアーゼ（例えば、変異体ズブチリシン・カールスバーグ酵素）はそこで置換され、実質的に類似の結果を有する。また、上述の処方において、ここに挙げる本発明で有用なプロテアーゼの組み合わせ（例えば、変異体ズブチリシン・カールスバーグ酵素）は実質的に類似の結果を有して置換できる。
【０２５９】
２．入れ歯洗浄組成物
さらに別の実施態様において、本発明は１以上のプロテアーゼ酵素（例えば、変異体ズブチリシン・カールスバーグ酵素）を含む口腔の外側の入れ歯を洗浄するための種々の入れ歯組成物を提供する。当該入れ歯洗浄組成物は効果的な量で１以上のプロテアーゼ酵素（例えば、変異体ズブチリシン・カールスバーグ酵素）を含み、好ましくは組成物の約０．０００１重量％〜約５０重量％の１以上のプロテアーゼ酵素、より好ましくは約０．００１重量％〜約３５重量％、さらにより好ましくは約０．０１重量％〜約２０重量％及び入れ歯洗浄キャリアを含む。発泡錠など種々の入れ歯洗浄組成物形態は当業界に公知であり（例えば、ここに引用する米国特許第５，０５５，３０５号を参照）、通常は１以上のプロテアーゼ酵素を入れ歯からタンパク性シミを除去するために含めるのが好ましい。本発明の入れ歯洗浄組成物の実施態様は以下の例により説明する。
【表１７】
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【０２６０】
上述の処方において、本発明で有用な減少された免疫原性プロテアーゼ（例えば、変異体ズブチリシン・カールスバーグ酵素）はそこで置換され、実質的に類似の結果を有する。また、上述の処方において、ここに挙げる本発明で有用なプロテアーゼの組み合わせ（例えば、変異体ズブチリシン・カールスバーグ酵素）は実質的に類似の結果を有して置換できる。
【０２６１】
３．パーソナル洗浄組成物
本発明の別の実施態様において、肌を洗浄するためのパーソナル洗浄組成物は１以上のプロテアーゼ酵素（例えば、変異体ズブチリシン・カールスバーグ酵素）を含む。当該組成物は通常、組成物の約０．００１重量％〜約５重量％プロテアーゼ酵素（例えば、変異体ズブチリシン・カールスバーグ酵素）を含み、好ましくは約０．００５重量％〜約２重量％、及び最も好ましくは約０．１重量％〜約０．８重量％を含む。ここに記載のプロテアーゼ酵素を含むことができる好ましいパーソナル洗浄組成物は限定されないが、米国特許出願第０８／１２１，６２３号及び第０８／１２１，６２４号に記載のものを含む。種々の組成物が本発明で考えられるが、石けん成分を含む１の液体パーソナル洗浄組成物は以下を含む（重量％）：石けん（ＫまたはＮａ）（１５．００）、３０％ラウレート、３０％ミリステート、２５％パルミテート、１５％ステアレート、脂肪酸（上述の比）（４．５０）、Ｎａラウリルサルコシネート（６．００）、ナトリウムラウレス−３硫酸（０．６６）、コカミドプロピルベタイン（１．３３）、グリセリン（１５．００）、プロピレングリコール（９．００）、ポリクオタニウム１０（０．８０）、エチレングリコールジステアレート（ＥＤＴＡ）（１．５０），プロピルパラベン（０．１０）、メチルパラベン（０．２０）、プロテアーゼ＃（０．１０）、ＫＯＨまたはＮａＯＨ（ｐＨを調節する必要がある場合）、硫酸カルシウム（３）、酢酸（３）及び水（１００に調整）。
【０２６２】
他の実施態様において、パーソナル洗浄バーが本発明により提供される。本発明により種々の組成物が考えられるが、石けん成分を含む１のバー状パーソナル洗浄組成物は以下を含む（重量％）：ココイルイソチオン酸ナトリウム（４７．２０）、セテアリル硫酸ナトリウム（９．１４）、パラフィン（９．０５）、ナトリウム石けん（ｉｎ  ｓｉｔｕ）（３．６７）、イセチオン酸ナトリウム（５．５１）、塩化ナトリウム（０．４５）、二酸化チタニウム（０．４）、３ナトリウムＥＤＴＡ（０．１）、エチドロン酸３ナトリウム（０．１）、香料（１．２０）、Ｎａ２ＳＯ４（０．８７）、プロテアーゼ＃（０．１０）及び水及び微量成分の混合物（１００に調整）。
【０２６３】
上述の処方において、本発明で有用な減少された免疫原性プロテアーゼ（例えば、変異体ズブチリシン・カールスバーグ酵素）はそこで置換され、実質的に類似の結果を有する。また、上述の処方において、ここに挙げる本発明で有用なプロテアーゼの組み合わせ（例えば、変異体ズブチリシン・カールスバーグ酵素）は実質的に類似の結果を有して置換できる。
【０２６４】
実施例１２
洗浄性能試験
本発明組成物で有用な変異体の洗浄性能を当業界に公知の適当な手段により評価できる。ＥＭＰＡ１１６（綿上の血液／ミルク／カーボンブラック）布見本（Ｔｅｓｔｆａｂｒｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ，Ｎ．Ｊ．０７０３０）からのシミ除去を測定する１の適当な方法をこの実施例で説明する。
【０２６５】
６つのＥＭＰＡ１１６見本を３回４１／２インチに切断し、端をピンクにし、１５ｇｐｇ硬度（Ｃａ＋＋：Ｍｇ＋＋：：3：1：：：ｗ：ｗ）、１０００ｍｌの水、７ｇの洗剤及び必要に応じて酵素を含むＭｏｄｅｌ  ７２４３Ｓ  Ｔｅｒｇ−Ｔｏｍｅｔｅｒ（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｈｏｂｏｋｅｎ、Ｎ．Ｊ．）の各ポット内に入れる。洗剤基礎はｍｆｋ  Ｔｅｓｔｇｅｗｅｂｅ  ＧｍｂＨ（Ｋｒｅｆｅｌｄ，ドイツ）からのＷＦＫ１洗剤であり、以下の成分を含む（最終製剤の％）：ゼオライトＡ（２５％）、硫酸ナトリウム（２５％）、ソーダ灰（１０％）、直鎖アルキルベンゼンスルホネート（８．８％）、アルコールエトキシレート（７−８ＥＯ）（４．５％）、ナトリウム石けん（３％）、及びケイ酸ナトリウム（ＳｉＯ２：Ｎａ２Ｏ：：３．３：１）（３％）。
【０２６６】
この基礎洗剤に以下の追加ができる（最終製剤の％）：過ホウ酸ナトリウムモノヒドレート（１３％）、コポリマー（Ｓｏｋａｌａｎ  ＣＰ５）（４％）、ＴＡＥＤ（Ｍｙｋｏｎ  ＡＴＣ  Ｇｒｅｅｎ）（３％）、酵素（０．５％）及び漂白剤（Ｔｉｎｏｐａｌ  ＡＭＳ−ＧＸ）（０．２％）。
【０２６７】
過ホウ酸ナトリウムモノヒドレートは種々の市販元から得ることができ、デグサ社（Ｄｅｇｕｓｓａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ），Ｒｉｄｇｅｆｉｅｌｄ−Ｐａｒｋなどがある。Ｓｏｋａｌａｎ  ＣＰ５はＢＡＳＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．から得られる。Ｍｙｋｏｎ  ＡＴＣ  Ｇｒｅｅｎ（ＴＡＥＤ、テトラアセチルエチレンジアミン）はＷａｒａｉｃｋ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｌｉｍｉｔｅｄ，イングランドから得られる。Ｔ  ｉｎｏｐａｌ  ＡＭＳ  ＧＸはＣｉｂａ−Ｇｅｉｇｙ  Ｃｏｒｐｏｒｔｉｏｎ、Ｇｒｅｅｎｓｂｏｒｏ，Ｎ．Ｃ．から得られる。
【０２６８】
１の適した試験方法において、６つのＥＭＰＡ  １１６見本を酵素を用いて洗剤中で３０分間、６０℃で洗浄し、１０００ｍｌの水の中で５分毎に２回ゆすぐ。酵素は標準曲線に関して最終濃度０．０５〜１ｐｐｍで加え、通常の分析に関して０．２５ｐｐｍで加える。見本は乾燥及び圧縮し、見本からの反射率をミノルタＣｈｒｏｍａ  Ｍｅｔｅｒ、モデルＣＲ−２００（ミノルタ・コーポレーション、Ｒａｍｓｅｙ，ＮＪ）のＬ＊ａ＊ｂ＊スケールについてＬ値を用いて測定する。いくつかの実施態様において、試験酵素の性能はＢ．アミロリケファシエンス（ＢＰＮ’）プロテアーゼの性能の比率として記録し、Ｂ．アミロリケファシエンス（ＢＰＮ’）プロテアーゼ量を同じシミ除去性能が必要な変異体プロテアーゼ（変異体ズブチリシン・カールスバーグ酵素）量で割って１００倍することにより計算する。
【０２６９】
実施例１３
液体洗剤製剤中の変異体ズブチリシン・カールスバーグ安定性
この実施例は液体洗剤製剤中での不活性化に対するプロテアーゼ（例えば、変異体ズブチリシン・カールスバーグ酵素）安定性をバチルス・アミロリケファシエンスズブチリシン及びその変異体酵素と比較する方法を提供する。他の方法が本発明で使用できるので、本発明はこの方法に限定されるものではない。
【０２７０】
この方法において、研究用の洗剤製剤は市販の洗濯用洗剤である（例えば、Ｔｉｄｅ（登録商標）Ｕｌｔｒａ液体洗濯用洗剤（プロクター＆ギャンブル））。いくつかの実施態様において、ｉｎ  ｓｉｔｕプロテアーゼを不活性化させるために洗剤製剤の熱処理が必要である。これは９６℃で４．５時間の間、洗剤を培養することにより達成される。２０グラム／リットル酵素の範囲の試験用Ｂ．アミロリケファシエンスズブチリシン及び変異体（例えば、変異体ズブチリシン・カールスバーグ酵素）の濃縮調製物は、室温で最終濃度が洗剤製剤中、０．３グラム／リットル酵素になるように熱処理した洗剤にそれから加える。プロテアーゼを加えた熱処理洗剤はそれから５０℃で水槽中で培養する。アリコートを０、２４、４６、７６及び１１２時間の間隔で培養管から取り除き、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中に、ｐＨ８．６、２５℃で溶解させた１．２ｍＭの合成ペプチド基質ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ｐｈｅ−ｐ−ニトロアニリドを含む１ｃｍキュベットに加えることにより酵素活性を分析する。初期線状反応速度は時間の関数として４１０ｎｍで反応生成物ｐ−ニトロアニリンの吸収を観測することにより分光光度法に従う。好ましい実施態様において、好ましい変異体は天然Ｂ．アミロリケファシエンス酵素よりも不活性化に対して著しく大きい安定性が観測される。２つの酵素に関する洗濯用洗剤製剤における不活性化の推測半減期は特定の試験条件下で測定する。
【０２７１】
上述の明細書中の全ての文献及び特許はここに引用するものとする。本発明で説明した方法及びシステムの種々の修正及び変形は本発明の範囲及び概念を逸脱することなく当業者に明らかである。本発明は特定の好ましい実施態様と関連して説明したが、本発明は当該特定の実施態様に過度に限定されるべきでないことは当然のことである。実際に、本発明を実施するために分子生物学、免疫学、処方設計及び／また関連分野の当業者に明らかな種々の形態の変更は本発明の範囲内であるとする。
【図面の簡単な説明】
【０２７２】
【図１】図１は、ＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）酵素に見られるズブチリシン・カールスバーグの成熟タンパク質配列である（配列番号１）。この図において、成熟ポリペプチドは位置１０６で始まり、下線残基により示される（ＡＱＴＶＰ）。
【図２】図２は配列番号１の配列に基づいて合成された、ペプチドのそれぞれ配列番号２−８９に対応する、ペプチド番号１−８８のアミノ酸配列である。
【図３】図２に示すペプチドの分析結果である。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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