(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２で示される、ヒトＩｇＧ抗体に結合することを特徴とするポリペプチド。
【請求項２】
配列番号３で示される、ヒトＩｇＧ抗体に結合することを特徴とするポリペプチド。
【請求項３】
配列番号４で示される、ヒトＩｇＧ抗体に結合することを特徴とするポリペプチド。
【請求項４】
配列番号２〜４のいずれかで示されるポリペプチドに対して９５％以上の配列相同性を有するポリペプチドであって、ヒトＩｇＧ抗体に結合することを特徴とするポリペプチド。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端もしくはアミノ酸側鎖に１〜１０個のアミノ酸残基が共有結合したポリペプチドであって、ヒトＩｇＧ抗体に結合することを特徴とするポリペプチド。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載のポリペプチドを１ドメイン単位として、該ドメイン単位２〜１０個を共有結合にて融合させたポリペプチドであって、ヒトＩｇＧ抗体に結合することを特徴とする融合ポリペプチド。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載のポリペプチドを水不溶性担体に固定化したことを特徴とする、ヒトＩｇＧ抗体またはＩｇＧ抗体誘導体の吸着材料。
【請求項８】
請求項７に記載の吸着材料を用いることを特徴とする、ヒトＩｇＧ抗体またはＩｇＧ抗体誘導体を分離精製する方法。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれかに記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれかに記載のポリペプチドを含む融合蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項１１】
請求項９または１０に記載のＤＮＡを有するベクター。
【請求項１２】
請求項１１に記載のベクターにより形質転換された形質転換細胞。
【請求項１３】
請求項１２に記載の形質転換細胞を用いた、請求項１〜６のいずれかに記載のポリペプチドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトＩｇＧ抗体と結合する新規なポリペプチドに関する。また、本発明は、該ポリペプチドを担持させた吸着材料に関する。また、本発明は、該吸着材料を用いたヒトＩｇＧ抗体およびＩｇＧ抗体誘導体を分離精製する方法に関する。また、本発明は、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、このＤＮＡを有するベクター、このベクターで形質転換された形質転換細胞、該ポリペプチドの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロテインＡは、細菌スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）より見出されたプロテインＡ蛋白質（以下、ＳｐＡ蛋白質と称する）であり、ヒトＩｇＧ抗体と結合する性質を持つ。プロテインＡ様物質（以下、ＳｐＡ様物質と称する）は、ＳｐＡ蛋白質を断片化したポリペプチド、ＳｐＡ蛋白質の変異体、該ポリペプチドの変異体、およびそれらを化学修飾した物質を含むものである。
【０００３】
ヒトＩｇＧ抗体およびＩｇＧ抗体誘導体を分離精製する方法として、ＳｐＡ様物質を担持させた吸着剤を用いたアフィニティ・カラム・クロマトグラフィ精製法が知られている（特許文献１（プロテインＡ様物質の遺伝子及び該遺伝子含有微生物）、特許文献２（アフィニティ分離の方法及びそれに用いるリガンド））。該方法により分離精製されたヒトＩｇＧ抗体およびＩｇＧ抗体誘導体は、医薬品、分析試薬あるいは研究用試薬として、産業利用されている。
【０００４】
ＳｐＡ様物質がヒトＩｇＧ抗体と結合した複合体分子の立体構造は明らかにされており、ＳｐＡ様物質分子の一部分である２つのα−ヘリックス構造部分とヒトＩｇＧ抗体分子のＦｃ鎖構造部分とが特異的に結合することが知られている（非特許文献１）。ヒトＩｇＧ抗体分子のＦｃ鎖構造部分は、種々知られているＩｇＧ抗体サブクラスの間でアミノ酸配列の差が少ない部分である。そのため、Ｆｃ鎖構造部分を特異的に認識するＳｐＡ様物質は、さまざまなサブクラスを持つＩｇＧ抗体を吸着、分離精製するためのリガンド分子として、優れた汎用性を持つ。
【０００５】
産業上の利用性をさらに高めるべく、野生型ＳｐＡ蛋白質のアミノ酸配列にさまざまな変異を加えた、ＩｇＧ抗体のＦｃ鎖構造部分を特異的に認識する種々のＳｐＡ様物質が知られている（特許文献２、非特許文献２〜４）。しかしながら、公知のＳｐＡ様物質は野生型ＳｐＡ蛋白質のアミノ酸配列を変異させることによって誘導されたポリペプチドのみである。野生型ＳｐＡ蛋白質以外の蛋白質から誘導され、かつヒトＩｇＧ抗体のＦｃ鎖構造部分と特異的に結合する性質を有するポリペプチドは知られていない。
【特許文献１】特開昭５９−１１３８９０号公報
【特許文献２】特表２００２−５２７１０７号公報
【非特許文献１】Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ、Ｊ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９８１年、２０巻、２３６１−２３７０頁
【非特許文献２】Ｂｒａｉｓｔｅｄ、Ａ．Ｃ．＆  Ｗｅｌｌｓ、Ｊ．Ａ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９６年、９３巻、５６８８−５６９２頁
【非特許文献３】Ｌｉ、Ｒ．ｅｔ．ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１９９７年、１６巻、１９０−１９５頁
【非特許文献４】Ｌｉｎｈｕｌｔ、Ｍ．ｅｔ．ａｌ．、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、２００４年、５５巻、４０７−４１６頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、野生型ＳｐＡ蛋白質以外の蛋白質から誘導され、かつヒトＩｇＧ抗体と特異的に結合する性質を有する、プロテインＡ様の新規なポリペプチドを提供する。さらに本発明は、該ポリペプチドを吸着リガンドとして用いることを特徴とするＩｇＧ抗体吸着剤、ならびに該吸着剤を用いてＩｇＧ抗体を分離除去または分離精製する方法を提供する。さらに本発明は該ポリペプチドを形質転換細胞を用いて生産する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく、蛋白質工学的手法および遺伝子工学的手法を用いて、数多くのポリペプチドを分子設計し、形質転換細胞から取得し、該ポリペプチドの物性を比較検討することにより、本発明を完成させるに至った。すなわち本発明は、配列番号１で示されるポリペプチドのアミノ酸残基部位、Ａｌａ−３、Ｍｅｔ−７、Ｈｉｓ−８、Ｓｅｒ−９、Ａｒｇ−１１、Ｌｅｕ−１２、Ｇｌｕ−１５、Ａｌａ−２５、Ｖａｌ−２８、Ｓｅｒ−３２において単数または複数のアミノ酸を置換、挿入もしくは欠失またはそれらを組み合わせることにより得られたポリペプチドであって、ヒトＩｇＧ抗体に結合することを特徴とするポリペプチドに関する。さらに本発明は、配列番号２、３または４で示される、ヒトＩｇＧ抗体に結合することを特徴とするポリペプチドに関する。さらに本発明は、配列番号１〜４のいずれかで示されるポリペプチドに対して７０％以上の配列相同性を有するポリペプチドであって、ヒトＩｇＧ抗体に結合することを特徴とするポリペプチドに関する。さらに本発明は、前記いずれかのポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端もしくはアミノ酸側鎖に１〜１０個のアミノ酸残基が共有結合したポリペプチドであって、ヒトＩｇＧ抗体に結合することを特徴とするポリペプチドに関する。さらに本発明は、配列番号１〜４のいずれかで示されるポリペプチド配列単位（１ドメイン単位）を１個以上１０個以下だけ含むポリペプチド（好適には、前記ドメイン単位２〜１０個を共有結合にて融合させたポリペプチド）であって、ヒトＩｇＧ抗体に結合することを特徴とする融合ポリペプチドに関する。さらに本発明は、該ポリペプチドを水不溶性担体に固定化したことを特徴とするヒトＩｇＧ抗体吸着材料、および該吸着材料を用いることを特徴とするヒトＩｇＧ抗体を分離精製する方法に関する。さらに本発明は該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを有するベクター、該ベクターにより形質転換された形質転換細胞、および該形質転換細胞を用いた前記ポリペプチドの製造方法に関する。
【０００８】
本発明のその他の特徴およびそれらの利点は、以下の実施形態および図面によって明らかにされる。
【発明の効果】
【０００９】
本発明は、野生型ＳｐＡ蛋白質あるいはその断片ペプチドとはアミノ酸配列上の相同性が異なり、それが故に野生型ＳｐＡ蛋白質あるいはその断片ペプチドとは種々の物理的ないし化学的物性が異なる、ヒトＩｇＧ抗体と特異的に結合する性質を有する新規なポリペプチドを提供する。本発明のポリペプチドを水不溶性担体に固定化した吸着材料を用いることにより、ヒトＩｇＧ抗体または種々のＩｇＧ抗体誘導体を分離精製することが可能となる。また本発明の形質転換細胞を用いることにより、本発明のポリペプチドを製造することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、実施形態を用いて本発明を詳細に説明する。
【００１１】
本明細書において、アミノ酸、ペプチド、タンパク質は下記に示すＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会（ＣＢＮ）で採用された略号を用いて表される。また、特に明示しない限りペプチド及びタンパク質のアミノ酸残基の配列は、左端から右端にかけてＮ末端からＣ末端となるように、またＮ末端が１番になるように表される。
Ａ＝Ａｌａ＝アラニン、Ｃ＝Ｃｙｓ＝システイン、
Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸、Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸、
Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン、Ｇ＝Ｇｌｙ＝グリシン、
Ｈ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン、Ｉ＝Ｉｌｅ＝イソロイシン、
Ｋ＝Ｌｙｓ＝リシン、Ｌ＝Ｌｅｕ＝ロイシン、
Ｍ＝Ｍｅｔ＝メチオニン、Ｎ＝Ａｓｎ＝アスパラギン、
Ｐ＝Ｐｒｏ＝プロリン、Ｑ＝Ｇｌｎ＝グルタミン、
Ｒ＝Ａｒｇ＝アルギニン、Ｓ＝Ｓｅｒ＝セリン、
Ｔ＝Ｔｈｒ＝スレオニン、Ｖ＝Ｖａｌ＝バリン、
Ｗ＝Ｔｒｐ＝トリプトファン、Ｙ＝Ｔｙｒ＝チロシン、
Ｂ＝Ａｓｘ＝ＡｓｐまたはＡｓｎ、Ｚ＝Ｇｌｘ＝ＧｌｕまたはＧｌｎ、
Ｘ＝Ｘａａ＝任意のアミノ酸。
【００１２】
本明細書において、「変異体」とは、ポリペプチドのアミノ酸配列に含まれるアミノ酸が少なくとも１つ以上置換、付加、もしくは欠失、または修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをいう。
【００１３】
本明細書において、「ドメイン」とは、蛋白質およびポリペプチドの高次構造上の単位であり、数十から数百のアミノ酸残基配列から構成され、なんらかの物理化学的または生物化学的な機能を発現するに十分なアミノ酸高分子の単位をいう。
【００１４】
本明細書において、「ＩｇＧ抗体誘導体」とは、ヒトＩｇＧ抗体、ヒトＩｇＧ抗体のＦｃ鎖部分と他生物種ＩｇＧ抗体のＦａｂ鎖部分とを融合させたキメラＩｇＧ抗体、ヒトＩｇＧ抗体のいくつかのＣドメイン部分と他生物種ＩｇＧ抗体のいくつかのＶドメイン部分とを融合させたキメラＩｇＧ抗体、ヒトＩｇＧ抗体のＣＤＲ部分を除いた残余の部分と他生物種ＩｇＧ抗体のＣＤＲ部分とを融合させたヒト型化ＩｇＧ抗体、およびそれらに化学的修飾を加えた蛋白質であって、Ｆｃドメイン部分を保持する蛋白質をいう。
【００１５】
１．アミノ酸の変異
以下、所望の変異体もしくはポリペプチドを取得するための、タンパク質のアミノ酸の変異について説明する。アミノ酸の置換などを実施する方法は、化学合成、または遺伝子工学を利用する技術においてアミノ酸をコードするＤＮＡ配列のコドンを変化させることを含むが、これらに限定されない。
【００１６】
本発明者らは、野生型ＳｐＡ蛋白質以外の蛋白質から誘導され、かつヒトＩｇＧ抗体のＦｃ鎖構造部分と特異的に結合する性質を有する新規なポリペプチドの設計を、立体構造のデータを利用した種々の検討およびモデリングによる分析により実施した。これらの設計作業の結果として、ヒトＩｇＧ抗体またはＩｇＧ抗体誘導体に結合し得る種々のポリペプチドを考案した。考案したポリペプチドを遺伝子工学的手法により数多く取得し、それらポリペプチドの特徴を種々の科学的手法を用いて解析したところ、いくつかのポリペプチドにヒトＩｇＧ抗体と結合する性質を見出した。
【００１７】
２．ヒトＩｇＧ抗体結合能を有するポリペプチドの取得
前記設計による考案および実施形態を具体的に以下に示す。配列番号１で示されるポリペプチドは、ウイルス被覆蛋白質の一種であり、その立体構造情報は公開データベースであるプロテイン・データ・バンク（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ）に、コード番号１Ｒ４Ｇとして登録公開されている。ＳｐＡ蛋白質ＺドメインとＩｇＧ抗体Ｆｃドメインとの複合体立体構造情報は、同データベースにコード番号１ＦＣ２として登録公開されている。
【００１８】
配列番号１で示されるポリペプチドは５８残基であり、α−ヘリックス３個からなる高次構造を持つ。一方、上記ＳｐＡ蛋白質Ｚドメインは４０残基からなるポリペプチドであり、配列番号１で示されるポリペプチドとアミノ酸残基数が異なるものの、α−ヘリックス３個からなる高次構造を持つ。それら２種のポリペプチド間の配列相同性を、後述するプログラムＢＬＡＳＴにより計算したところ、該ポリペプチド間には相同性は見られない（相同性１％未満）という結果となった。すなわち、ＳｐＡ蛋白質Ｚドメインと配列番号１で示されるポリペプチドは全く異なる配列を持つと考えられた。前記した立体構造情報を種々比較検討することにより、配列番号１で示されるポリペプチドに上記ＩｇＧ抗体Ｆｃ部分との結合能を付与すべく、ポリペプチド変異体の分子設計を行った。分子設計により考案された種々のポリペプチドを遺伝子工学的手法により取得し、いくつかのポリペプチドにヒトＩｇＧ抗体と結合する性質を見出した。すなわち、配列番号１で示されるポリペプチドのアミノ酸残基部位、Ａｌａ−３、Ｍｅｔ−７、Ｈｉｓ−８、Ｓｅｒ−９、Ａｒｇ−１１、Ｌｅｕ−１２、Ｇｌｕ−１５、Ａｌａ−２５、Ｖａｌ−２８、Ｓｅｒ−３２において単数または複数のアミノ酸を置換することにより、ヒトＩｇＧ抗体またはＩｇＧ抗体誘導体のＦｃ部分に結合しうるポリペプチドを得ることができる。上記「複数のアミノ酸」の数は特に限定されないが、２個、３個、４個、５個、好ましくは６個以上である。その他の実施形態として、上記したアミノ酸の置換に限らず、配列番号１で示されるポリペプチドのアミノ酸残基部位、Ａｌａ−３、Ｍｅｔ−７、Ｈｉｓ−８、Ｓｅｒ−９、Ａｒｇ−１１、Ｌｅｕ−１２、Ｇｌｕ−１５、Ａｌａ−２５、Ｖａｌ−２８、Ｓｅｒ−３２のいずれかの部位について、単数または複数のアミノ酸を、挿入もしくは欠失、または、それらいずれかの部位において、アミノ酸の置換、挿入、欠失を組合わせてもよい。
【００１９】
さらに、より好ましい実施形態としては、配列番号２、３、４で示されるポリペプチドが挙げられる。別の実施形態としては、配列番号１〜４のいずれかで示されるポリペプチドに対して７０％以上（好ましくは、８０％以上、より好ましくは９０％以上）の配列相同性を有するポリペプチドが挙げられる。配列番号１〜４で示されるポリペプチドに対して十分な配列相同性を有するポリペプチドに関しても、本発明によるヒトＩｇＧ抗体およびＩｇＧ抗体誘導体への結合能を示すことが期待できるためである。配列相同性は、プログラムＦＡＳＴＡ（Ｐｅｒａｓｏｎ  Ｗ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、４６、２４−３６（１９９７））やＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５、３３８９−３４０２（１９９７））を用いたアミノ酸配列相同性解析により、決定することができる。
【００２０】
３．リンカー
本発明の別の実施形態としては、それらのポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端もしくはアミノ酸側鎖に１〜１０個のアミノ酸残基が共有結合したポリペプチドであって、それら付与したアミノ酸残基が該ポリペプチド間のリンカーとして、あるいは担持材料（担体）とのリンカーとして利用できるポリペプチドが挙げられる。好ましくは、ポリペプチド間のリンカーとしてはＩｇＧ抗体との相互作用が少ないＧｌｙ、Ａｌａ等が挙げられ、担体とのリンカーとしてはチオール基を持つＣｙｓ、アミノ基を持つＬｙｓ、カルボキシル基を持つＧｌｕ、Ａｓｐ等が挙げられ、さらにそれらのアミノ酸残基を複数個利用することもできる。
【００２１】
４．融合ポリペプチド
さらに別の実施形態としては、それらのポリペプチド単位２〜１０個を共有結合にて融合させ、ヒトＩｇＧ抗体およびＩｇＧ抗体誘導体への結合能を高めた融合ポリペプチドが挙げられる。好ましくは、本発明のポリペプチド単位２〜５個および前記した各種のリンカー部分を含む融合ポリペプチドが挙げられる。
【００２２】
５．ヒトＩｇＧ抗体等の吸着材料
また本発明の一つの実施態様としては、上記方法で得られたポリペプチドを水不溶性担体に固定化したことを特徴とする、ヒトＩｇＧ抗体の吸着材料、またはＩｇＧ抗体誘導体の吸着材料を提供しうる。さらに、その吸着材料を用いることを特徴とする、ヒトＩｇＧ抗体を分離生成する方法、またはＩｇＧ抗体誘導体を分離精製する方法を提供しうる。
【００２３】
本発明に用いる水不溶性担体としては、ガラスビーズ、シリカゲルなどの無機担体、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレンなどの合成高分子や、結晶性セルロース、架橋セルロース、架橋アガロース、架橋デキストランなどの多糖類からなる有機担体、さらにはこれらの組み合わせによって得られる有機−有機、有機−無機などの複合担体などが挙げられる。市販品としては、多孔質セルロースゲルであるＧＣＬ２０００、アリルデキストランとメチレンビスアクリルアミドを共有結合で架橋したＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１０００、アクリレート系の担体であるＴｏｙｏｐｅａｒｌ、アガロース系の架橋担体であるＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ４Ｂ、エポキシ基で活性化されたポリメタクリルアミドであるオイパーギット  Ｃ２５０Ｌ等を例示することができる。ただし、本発明における水不溶性担体は、例示したこれらの担体、活性化担体のみに限定されるものではない。また、本発明に用いる水不溶性担体は、本吸着材料の使用目的および方法からみて、表面積が大きいことが望ましく、適当な大きさの細孔を多数有する多孔質であることが好ましい。担体の形態としては、ビーズ状、繊維状、膜状（中空糸を含む）など何れも可能であり、任意の形態を選ぶことができる。
【００２４】
本発明のポリペプチドを前記担体への固定化する方法は特に限定されるものではないが、一般に蛋白質やペプチドを担体に固定化する場合に採用される方法を例示する。担体を臭化シアン、エピクロロヒドリン、ジグリシジルエーテル、トシルクロライド、トレシルクロライド、ヒドラジンなどと反応させて担体を活性化あるいは担体表面に反応性官能基を導入し、リガンドとして固定化する化合物と反応、固定化する方法、また、担体とリガンドとして固定化する化合物が存在する系にカルボジイミドのような縮合試薬、または、グルタルアルデヒドのように分子中に複数の官能基を持つ試薬を加えて縮合、架橋することによる固定化方法が挙げられる。
【００２５】
６．ヒトＩｇＧ抗体等の精製法
本発明のポリペプチド結合担体を吸着材料として、ヒトＩｇＧ抗体またはＩｇＧ抗体誘導体をアフィニティ・カラム・クロマトグラフィ精製法により分離精製することが可能となる。本発明の一実施形態としての精製法は、ＳｐＡ様物質を担持させた吸着材料を用いたアフィニティ・カラム・クロマトグラフィ精製法に準じる手順（特許文献２に記載の手法に基づいて当業者が実施可能な手順）により達成することができる。すなわち、ヒトＩｇＧ抗体またはＩｇＧ抗体誘導体を含有する緩衝液を中性となるように調整した後、該溶液を本発明の吸着材料を充填したアフィニティ・カラムに通過させ、ヒトＩｇＧ抗体またはＩｇＧ抗体誘導体を吸着させる。次いで、アフィニティ・カラムに純粋な緩衝液を適量通過させ、カラム内部を洗浄する。この時点では所望のヒトＩｇＧ抗体またはＩｇＧ抗体誘導体はカラム内の本発明の吸着材料に吸着されている。次いで、適切なｐＨに調整した酸性もしくはアルカリ性の純粋な緩衝液をカラムに通過させ、所望のヒトＩｇＧ抗体またはＩｇＧ抗体誘導体を溶出することにより、高純度な精製が達成される。本発明の吸着材料を充填したアフィニティ・カラムは、強酸性もしくは強アルカリ性の純粋な緩衝液を通過させて洗浄することにより、再利用が可能である。
【００２６】
７．ヌクレオチド配列、融合蛋白質等
さらに本発明の一つの実施態様としては、前記方法により得られたポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、そのヌクレオチド配列を一つ又はそれ以上有する組み換えＤＮＡ、またはその組み換えＤＮＡがプラスミド又はファージである組み換えＤＮＡ、またはその組み換えＤＮＡを少なくとも一つ含有する微生物または細胞を得ることができる。
【００２７】
また、本発明のポリペプチドは、該ポリペプチドと細胞での蛋白質発現を補助する作用のある公知の蛋白質との融合蛋白質として取得することができる。すなわち、本発明のポリペプチドと該蛋白質との融合蛋白質をコードする組換えＤＮＡを少なくとも一つ含有する微生物または細胞を得ることができる。該蛋白質の例としては、マルトース結合蛋白質（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）等が挙げられるが、それらの蛋白質に限定されるものではない。
【００２８】
８．変異の導入方法
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを改変するための部位特異的な変異の導入は、以下のように、当業者に周知の組換えＤＮＡ技術、ＰＣＲ法等を用いて行うことができる。すなわち、組換えＤＮＡ技術による変異の導入は、例えば、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子中において、変異導入を希望する目的の部位の両側に適当な制限酵素認識配列が存在する場合に、それら制限酵素認識配列部分を前記制限酵素で切断し、変異導入を希望する部位を含む領域を除去した後、化学合成等によって目的の部位のみに変異導入したＤＮＡ断片を挿入するカセット変異法によって行うことができる。また、ＰＣＲによる部位特異的変異の導入は、例えば、ポリペプチドをコードする二本鎖プラスミドを鋳型として、＋および−鎖に相補的な変異を含む２種の合成オリゴプライマーを用いてＰＣＲを行うダブルプライマー法により、行うことができる。
【００２９】
９．ベクター・形質展開細胞・ポリペプチドの製造方法
本発明のベクターは、前述したポリペプチドをコードする遺伝子を適当なベクターに連結もしくは挿入することにより得ることができ、遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で自律複製可能なものであれば特に限定されず、プラスミドＤＮＡやファージＤＮＡをベクターとして用いることができる。例えば、大腸菌を宿主として用いる場合には、ｐＢＲ３２２（株式会社ニッポンジーン）、ｐＵＣ１８（タカラバイオ株式会社）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（株式会社ニッポンジーン）等のプラスミドＤＮＡ、ＥＭＢＬ３（ストラタジーン・ジャパン株式会社）、Ｍ１３（タカラバイオ株式会社）、λｇｔ１１（株式会社ニッポンジーン）等のファージＤＮＡ等を、酵母を宿主として用いる場合は、ＹＥｐ１３（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ））、ＹＣｐ５０（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ））等を、植物細胞を宿主として用いる場合には、ｐＢＩ１２１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）、ｐＢＩ１０１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）等を、動物細胞を宿主として用いる場合は、ｐｃＤＮＡＩ（インビトロジェン株式会社）、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（インビトロジェン株式会社）等をベクターとして用いることができる。
【００３０】
本発明の形質転換細胞は、宿主となる細胞へ本発明の組み換えベクターを導入することにより得ることができる。細菌への組換え体ＤＮＡの導入方法としては、例えばカルシウムイオンを用いる方法やエレクトロポレーション法等が挙げられる。酵母への組換え体ＤＮＡの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。植物細胞への組換え体ＤＮＡの導入方法としては、アグロバクテリウム感染法、パーティクルガン法、ポリエチレングリコール法等が挙げられる。動物細胞への組換え体ＤＮＡの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法等が挙げられる。
【００３１】
本発明のポリペプチドは、前記した形質転換細胞を培地で培養し、培養物（培養菌体または培養上清）中に本発明のポリペプチドを生成蓄積させ、該培養物から所望のポリペプチドを採取することにより製造することができる。また、本発明のポリペプチドは、前記した形質転換細胞を培地で培養し、培養物（培養菌体または培養上清）中に本発明のポリペプチドを含む融合蛋白質を生成蓄積させ、該培養物から該融合蛋白質を採取し、該融合蛋白質を適切なプロテアーゼによって切断し、所望のポリペプチドを採取することにより製造することができる。
【００３２】
本発明の形質転換細胞を培地で培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。大腸菌等の細菌を宿主として得られた形質転換細胞を培養する培地としては、完全培地又は合成培地、例えばＬＢ培地、Ｍ９培地等が挙げられる。また、培養温度は２０〜４０℃で好気的に６〜２４時間培養することにより本発明のポリペプチドを菌体内に蓄積させ、回収する。
【００３３】
本発明のポリペプチドの精製は、前述した培養法により得られる培養物を遠心して回収し（細胞についてはソニケーター等にて破砕する）、アフィニティークロマトグラフィー、陽イオンまたは陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等を単独でまたは適宜組み合わせることによって行うことができる。得られた精製物質が目的のポリペプチドであることの確認は、通常の方法、例えばＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、Ｎ末端アミノ酸配列分析、ウエスタンブロッティング等により行うことができる。
【実施例】
【００３４】
以下に、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００３５】
（実施例１）
配列番号２をコードする遺伝子
以下の実施例１〜７では、ウイルス被覆蛋白質の一種である上記配列番号１で示されるポリペプチドに対してヒトＩｇＧ抗体のＦｃ部分またはＩｇＧ抗体誘導体のＦｃ部分への結合能を付与したポリペプチドの例示として、配列番号２、３、４で示される各ポリペプチドの取得方法について説明する。
【００３６】
以下の配列番号５〜８のＤＮＡは、後述するように、上記配列番号２およびそのＣ末端側にＨｉｓが６個連続する配列をコードする遺伝子のクローニングのために設計した。配列番号２のポリペプチドは、配列番号１で示されるポリペプチドのアミノ酸残基部位中、Ａｌａ−３がＰｈｅ、Ａｒｇ−１１がＰｈｅ、Ｌｅｕ−１２がＴｙｒ、Ｇｌｕ−１５がＬｅｕ、Ａｌａ−２５がＡｓｎ、Ｖａｌ−２８がＩｌｅ、にそれぞれ置換された変異体である。
【００３７】
配列番号５および６に記載の合成遺伝子３００ピコモルを混合し、オーバーラップＰＣＲ反応を行った。ポリメラーゼにはＴａｋａｒａ社製ｐｙｒｏｂｅｓｔを用い、添付のバッファーとｄＮＴＰを用いた。反応液量は０．０５ｍｌとした。反応条件は９６℃５分１回、９６℃２分・５５℃３０秒・７２℃３０秒のサイクルを１０回とした。約１００ｂｐのＤＮＡをアガロース電気泳動より切り出し、制限酵素ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩにより切断した。
【００３８】
同様に、配列番号７および８に記載の合成遺伝子３００ピコモルを混合し、同様にオーバーラップＰＣＲ反応を行った。約１２０ｂｐのＤＮＡをアガロース電気泳動より切り出し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩにより切断した。
【００３９】
アマシャムファルマシア社製プラスミドベクターｐＧＥＸ−２Ｔのマルチクーニングサイト中のＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩサイトに、オーバーラップＰＣＲ反応により得た上記２種の遺伝子をサブクローニングした。なお、プラスミドベクターｐＧＥＸ−２Ｔに挿入された遺伝子が、オーバーラップＰＣＲ反応により得た２種のＤＮＡがＨｉｎｄＩＩＩ切断サイトで結合したときに、配列番号２およびそのＣ末端側にＨｉｓが６個連続する配列をコードするように、配列番号５、６、７、８の遺伝子を設計した。また全ての制限酵素はＴａｋａｒａ社製である。前記操作により作成したプラスミドベクターｐＧＥＸ−２Ｔは配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子を含んでいる。配列番号１５は該遺伝子のＤＮＡ配列を示す。前記操作により作成された配列番号２をコードする遺伝子を含むｐＧＥＸ−２Ｔを用いて、大腸菌ＤＨ５α細胞（Ｔａｋａｒａ社製）の形質転換を行い、定法によってプラスミドＤＮＡを増幅および抽出した。
【００４０】
（実施例２）
配列番号３をコードする遺伝子
実施例１で得た、配列番号２をコードする遺伝子を含むｐＧＥＸ−２Ｔを鋳型として、配列番号９および１０のプライマーを用い、クイックチェンジ法で配列番号２のアミノ酸配列においてＨｉｓ−８がＧｌｎに変換された変異体をコードする遺伝子を作成した。
【００４１】
クイックチェンジ法はＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社のプロトコルに従った。前記操作により作成したプラスミドベクターｐＧＥＸ−２Ｔは配列番号３に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子を含んでいる。配列番号１６は該遺伝子のＤＮＡ配列を示す。
【００４２】
実施例１と同様に、前記操作により作成された配列番号３をコードする遺伝子を含むｐＧＥＸ−２Ｔを用いて大腸菌ＤＨ５α細胞の形質転換を行い、定法によってプラスミドＤＮＡを増幅および抽出した。
【００４３】
（実施例３）
配列番号４をコードする遺伝子
実施例２で得た、配列番号３をコードする遺伝子を含むｐＧＥＸ−２Ｔを鋳型として、配列番号１１および１２のプライマーを用い、クイックチェンジ法で配列番号３のアミノ酸配列においてＭｅｔ−７がＧｌｎ、およびＳｅｒ−９がＡｓｎに変換された変異体をコードする遺伝子を作成し、さらに該遺伝子を鋳型として、配列番号１３および１４のプライマーを用い、クイックチェンジ法で前記変異体のアミノ酸配列においてＳｅｒ−３２がＬｙｓに変換された変異体、すなわち配列番号４をコードする遺伝子を作成した。
【００４４】
前記操作により作成したプラスミドベクターｐＧＥＸ−２Ｔは配列番号４に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子を含んでいる。配列番号１７は該遺伝子のＤＮＡ配列を示す。
【００４５】
実施例１と同様に、前記操作により作成された配列番号４をコードする遺伝子を含むｐＧＥＸ−２Ｔを用いて大腸菌ＤＨ５α細胞の形質転換を行い、定法によってプラスミドＤＮＡを増幅および抽出した。
【００４６】
（実施例４）
遺伝子の配列確認
実施例１〜３で作成した変異体遺伝子全てについて、ＤＮＡ塩基配列確認をＰＥＲＩＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ  ＡＰＰＬＩＥＤ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ社製のＤＮＡシークエンサー３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて行った。
【００４７】
（実施例５）
遺伝子の発現
得られた上記の配列番号２，３または４のアミノ酸配列をコードする遺伝子のいずれかを含むｐＧＥＸ−２Ｔを導入したＤＨ５α細胞をそれぞれ、アンピシリンを含むＬＢ培地にて終夜培養した。本培養液１０ｍＬを２×ＹＴ培地（１Ｌ、アンピシリン含有）に接種し、３７℃にて２時間培養した。その後、培養温度を２５℃に下げ、下げてからおよそ１時間後に、終濃度０．１ｍＭになるようＩＰＴＧ（イソプロピル１‐チオ‐β‐Ｄ‐ガラクトシド）を添加し、２５℃にて８時間培養した。培養終了後、遠心にて集菌し、ＰＭＳＦ（１ｍＭ）、ＥＤＴＡ（０．５ｍＭ）、ＤＴＴ（１ｍＭ）を含むＰＢＳ緩衝液２５ｍＬに再懸濁した。超音波破砕にて細胞を破砕し、遠心分離して上清画分と不溶性画分に分画した。ｐＧＥＸ−２Ｔベクターマルチクローニングサイトに遺伝子を導入すると、ＧＳＴがＮ末端に付与した融合蛋白質として発現される。それぞれの画分をＳＤＳ電気泳動にて分析したところ、上清画分すべてに、分子量３万５千の位置にＩＰＴＧにより誘導されたと考えられる蛋白質発現を認めた。
【００４８】
（実施例６）
ＧＳＴ融合蛋白質でのポリペプチドの精製
実施例５において、ＩＰＴＧにより誘導されたと考えられる各蛋白質は、Ｎ末端側にＧＳＴが付与し、さらにＣ末端側にＨｉｓが６個続いた配列が付与された形で発現される。上記のそれぞれの上清画分をアマシャムファルマシア社製Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラムに添加し、ＰＢＳ緩衝液にてカラムを洗浄、続いて溶出用緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２０ｍＭ  Ｇｌｕｔａｈｉｏｎｅ、ｐＨ  ８．０）にて目的ＧＳＴ融合蛋白質を溶出、分取した。これらの溶出画分を、アマシャムファルマシア社製Ｎｉ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラムに添加し、洗浄用緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、ｐＨ７．４）にてカラムを洗浄、続いて、溶出用緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２００ｍＭ  Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、ｐＨ７．４）にて、目的ＧＳＴ融合蛋白質を溶出、分取した。これらの溶出画分のそれぞれを、ＰＢＳ緩衝液にて透析し、ＳＤＳ電気泳動にて分析したところ、目的のＧＳＴ融合蛋白質が高純度（９５％以上）で存在することを確認した。
【００４９】
（実施例７）
ポリペプチドの精製
ｐＧＥＸ−２Ｔベクターマルチクローニングサイトに遺伝子を導入すると、ＴｈｒｏｍｂｉｎプロテアーゼでＧＳＴを切断することが可能な部位も導入される。上記の各ＧＳＴ融合蛋白質溶液のそれぞれに、アマシャムファルマシア社製Ｔｈｒｏｍｂｉｎを、ＧＳＴ融合蛋白質１ｍｇあたり１０Ｕｎｉｔ添加し、室温にて１８時間インキュベートした。これらの溶液をアマシャムファルマシア社製Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラムに添加し、素通り画分を回収した。これらの溶出画分のそれぞれを、アマシャムファルマシア社製Ｎｉ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラムに添加し、洗浄用緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、ｐＨ７．４）にてカラムを洗浄、続いて、溶出緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２００ｍＭ  Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、ｐＨ７．４）にて、目的ＧＳＴ融合蛋白質を溶出、分取した。これらの溶出画分を、ＰＢＳ緩衝液にて透析し、トリシン‐ＳＤＳ電気泳動にて分析したところ、分子量７千５百の位置に目的のポリペプチドと考えられるバンドを確認した。
【００５０】
（実施例８）
ＢＩＡＣＯＲＥによるヒトＩｇＧ抗体への結合能の検討
表面プラズモン共鳴（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）を利用したバイオセンサーＢｉａｃｏｒｅ３０００（ビアコア社製）を用いて、取得した各ポリペプチドのヒトＩｇＧ抗体への結合を検討した。ヒトＩｇＧ抗体をビアコア社製ＣＭ４チップに固定し、ＧＳＴ融合ポリペプチドをチップ上に流す実験系を試みた。リガンドの固定化は、カップリング剤としてＮ−ｅｔｈｙｌ−Ｎ−（３−ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ（ＥＤＣ）およびＮ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ（ＮＨＳ）を用い、およびブロッキング剤としてＥｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅを用いてアミンカップリング法で行った。シグマ社製ヒトＩｇＧ抗体をＰＢＳ緩衝液にて１０ｍｇ／ｍＬになるよう溶解し、さらに１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ  ５．０）にて１０００倍希釈した溶液を用いて、ビアコア社プロトコルに従ってヒトＩｇＧ抗体を固定化した。また、シグマ社製ヒト血清アルブミンをＰＢＳ緩衝液にて１０ｍｇ／ｍＬになるよう溶解し、さらに１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ  ５．０）にて１０００倍希釈した溶液を用いて、ビアコア社プロトコルに従ってヒト血清アルブミンを別のフローセルに固定化し、リファレンス・セルとした。測定時のランニング緩衝液およびＧＳＴ融合ポリペプチドの希釈液として、ＰＢＳ緩衝液に終濃度０．００５％となるようＰ−２０（ビアコア社製）を加えた緩衝液を用いた。取得した各種ＧＳＴ融合ポリペプチドを１０μＭになるよう調製し、流速２０μＬ／分で２分間添加した後、２分間にわたって測定物の解離を観察した。測定は２５℃で行った。結合反応曲線を解析するソフトＢＩＡ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ(ビアコア社製)を用いて、結合反応曲線から結合速度定数Ｋａｓｓ、並びに解離速度定数Ｋｄｉｓｓを算出し、これから各種ＧＳＴ融合ポリペプチドとヒトＩｇＧ抗体の結合反応における解離定数ＫD（Ｍ）を算出した。解離定数ＫDは、ＫD＝Ｋｄｉｓｓ／Ｋａｓｓで計算される。
【００５１】
各種ＧＳＴ融合ポリペプチドとヒトＩｇＧ抗体との間の、ＢＩＡＣＯＲＥ測定における結合反応曲線を図１に示した。図１において、図上方より順に、配列番号４、配列番号３、および配列番号２それぞれのＧＳＴ融合ポリペプチドが示す結合反応曲線を示した。図１において、縦軸は本発明のポリペプチドを担持したセルの測定値からリファレンス・セルの測定値を差し引いた値としてのレゾナンスユニット、横軸は時間を示した。
【００５２】
結合反応曲線の解析により得られたヒトＩｇＧ抗体との解離定数はそれぞれ、配列番号２のＧＳＴ融合ポリペプチドが１．７６×１０-5Ｍ、配列番号３のＧＳＴ融合ポリペプチドが２．３５×１０-5Ｍ、配列番号４のＧＳＴ融合ポリペプチドが１．７７×１０-6Ｍであった。ＧＳＴ蛋白質にはヒトＩｇＧ抗体と結合する活性は見られなかった（図示せず）。これらの結果から、配列番号２〜４で示されるポリペプチドには、ヒトＩｇＧ抗体と結合する活性があることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図１は、各種ＧＳＴ融合ポリペプチドとＩｇＧの結合反応曲線を示すグラフである。
【図１】
0004481260.tif 000002
【配列表】
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