(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定患者の血清、分泌物及び排泄物で、下記の合成ペプチドのいずれかに対する抗体よりなる群から選択される1種以上の抗体を用いた免疫化学系により膵臓エラスターゼ（イソ酵素）の総含量を決定することを特徴とする膵機能障害を検出する方法。
NH2-A-V-K-E-G-P-E-Q-V-I-P-I-N-COOH
NH2-Y-T-N-G-P-L-P-D-K-L-Q-Q-A-R-COOH
NH2-R-S-G-C-N-G-D-S-G-G-P-L-N-COOH
NH2-G-P-L-N-C-P-T-E-D-G-G-W-Q-COOH
NH2-G-T-E-A-G-R-N-S-W-P-S-Q-I-COOH
NH2-H-N-L-S-Q-N-D-G-T-E-Q-Y-V-COOH
NH2-W-G-K-T-K-T-N-G-Q-L-A-COOH
NH2-V-S-S-R-G-C-N-V-S-R-K-P-T-COOH
NH2-G-G-E-E-A-R-P-N-S-W-P-W-Q-COOH
【請求項２】
抗体はモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
膵臓エラスターゼはエラスターゼ1、2及び3である、請求項1又は2記載の方法。
【請求項４】
抗体はペプチドA-V-K-E-G-P-E-Q-V-I-P-I-Nに対する抗体である、請求項1〜3のいずれか1項記載の方法。
【請求項５】
抗体はペプチドY-T-N-G-P-L-P-D-K-L-Q-Q-A-Rに対する抗体である、請求項1〜3のいずれか1項記載の方法。
【請求項６】
抗体はペプチドR-S-G-C-N-G-D-S-G-G-P-L-Nに対する抗体である、請求項1〜3のいずれか1項記載の方法。
【請求項７】
抗体はペプチドG-P-L-N-C-P-T-E-D-G-G-W-Qに対する抗体である、請求項1〜3のいずれか1項記載の方法。
【請求項８】
抗体を単独で又は組合わせて免疫化学的検出系に使用することを特徴とする請求項4〜7のいずれか1項記載の方法。
【請求項９】
請求項1〜8のいずれか1項記載の抗体の１種以上を含む、糞便又は体液を使用する膵疾患の検出及び経過検査のための免疫学的テストキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は膵機能障害認識のための診断方法に関する。応用分野は医療及び製薬業界である。
【０００２】
膵機能障害は種々の疾患の結果として起こることがあり、その診断にはとりわけ確実な根拠を有する機能基準を特定しなければならない。最も多い膵疾患は慢性再発性及び急性の膵炎である。
【０００３】
慢性膵炎は、健全な膵臓組織が次第に変質する硬化過程を呈する、緩慢な進行性疾患である。臨床的苦痛症状（腹痛、脂肪便、体重減少）、腺の典型的な形態学的変異（石灰化、拡張し不規則に限局された膵管）及び進行性の外分泌性及び内分泌性機能障害（消化不良、糖尿病）が特徴である。慢性膵炎は西欧で毎年住民10万人当り6ないし8件の新規発病率がある。アルコール消費が増えているため、慢性膵炎の診断が下されることがますます多くなっている。
【０００４】
種々の機能基準に基づき、臨床的、形態学的所見を基礎づけることができる。分泌−セルリン又は分泌−コレシストキニン試験は極めて敏感な分析法であるが、患者の負担が大きく、所要時間が長い。間接試験法にはLundh、NBT−PABA及びパンクレオアウリル試験がある。血清中のトリプシン又は糞便中のキモトリプシンの決定もある程度の実際的意義を有する。これらの間接試験法はすべて特異性不足という欠点がある。
【０００５】
エラスターゼ1の定量は、利用可能なすべての間接機能試験の中で最高の感受性と特異性を有する試験である（C.Lｏser：Therapie & Erfolg[治療と成果]1997年；１:411−413）。この試験は近年、外分泌性膵機能診断の標準として日常の医療業務に普及している。この試験の基礎は、エラスターゼ１に対するポリクロナール抗体（エラスターゼ１−RIA［放射線免疫検定法］、Abbott）又はモノ及び／又はポリクロナール抗エラスターゼ１抗体である。これらの抗体はアミノ酸配列Thr-Met-Val-Ala-Gly-Gly-Asp-Ile-Arg又はその免疫学的活性部分ペプチドを含む抗原による免疫感作で得られる（欧州特許第0547059号）。
【０００６】
膵臓エラスターゼはタンパク分解性消化酵素である。膵臓診断の慣用のパラメータ（例えば糞便中のキモトリプシン活性）と比較して、定量的エラスターゼ決定は決定的な利点がある。この酵素は膵臓だけで生成され、腸通過時に格別安定である。即ちエラスターゼ濃度は膵臓の分泌能力を反映している。
【０００７】
他の外分泌性パラメータの場合には優れているにかかわらず、在来のエラスターゼ１−ELISAでは、かなりの濃度で存在するのに検出されない場合が非常に多い。
【０００８】
そこで本発明の目的は、膵臓エラスターゼの検出に基づく膵機能障害認識のための一層敏感な方法を開発することである。
【０００９】
在来のELISAでエラスターゼ1に反応しなかった糞便試料を系統的に研究し、電気泳動的分離によりエラスターゼを含む試料を調製することができた。さらに配列決定によって、このタンパク質は明らかに市販の試験抗体で認識されない幾つかのイソ酵素であることが判明した。この酵素に対して明瞭な遺伝的多形性があることは明らかであり、それが専門文献で膵臓エラスターゼ1、2及び3の説明にも反映している。また独自の研究によって、少なくとも2つのイソ酵素が同時に現われることを証明することができた。またこれらのエラスターゼは濃度に応じて、膵障害に対してエラスターゼ1と同様に振舞うことを示すことができた。
【００１０】
膵臓エラスターゼ1だけの特異的検出による公知の解決策と対照的に、現在知られているのは膵臓エラスターゼ1、2及び３であるが、なるべくすべてのイソ形膵臓エラスターゼの検出によって、意外なことに膵機能に関する情報を決定的に改善できることが判明した。そこで本発明は常法による抗エラスターゼ抗体の調製方法ではあるが、使用する特異的抗原が単独で又は組合せとして、すべての公知のエラスターゼ−イソ酵素又はそのフラグメント又は交差反応的合成配列を代表することを特徴とする方法に関する。
【００１１】
フラグメントはペプチド合成によって得ることが好ましい。その場合アミノ酸配列を予め構造分析的方法によって全配列から導き出し、又はタンパク質配列決定に従って決定する。ペプチドは単独ですでに抗体の誘導を生じさせるが、本発明に基づきこのペプチドを慣用の担体物質、例えばヘモシアニンに結合しておくと好都合であることが判明した。本発明に係るペプチドによって、モノクロナール及びポリクロナール抗体を作ることが可能である。
【００１２】
本発明に係るポリクロナール抗ペプチド抗体の調製のために、試験動物、例えばイエウサギ、モルモット、ヤギ、ニワトリ又は魚類を、定法によりペプチドで免疫感作する。モノクロナール抗体を調製するには、周知のようにペプチドを使用して特異的Ｂ細胞を誘導する。Ｂ細胞を骨髄腫細胞と融合させてハイブリッド細胞を生成する。特異的モノクロナール抗体を分泌する細胞系で、公知のクローニング法によりこのハイブリッド細胞を培養する。本発明に係るモノ又はポリクロナール抗体は、使用する特異的エピトープ又はすべての公知のエラスターゼ−イソ酵素とだけ反応する。
【００１３】
ペプチドA-V-K-E-G-P-E-Q-V-I-P-I-N、Y-T-N-G-P-L-P-D-K-L-Q-Q-A-R、R-S-G-C-N-G-D-S-G-G-P-L-N、G-P-L-N-C-P-T-E-D-G-G-W-Q、G-T-E-A-G-R-N-S-W-P-S-Q-I、H-N-L-S-Q-N-D-G-T-E-Q-Y-V、W-G-K-T-K-T-N-G-Q-L-A、V-S-S-R-G-C-N-V-S-R-K-P-T、G-G-E-E-A-R-P-N-S-W-P-W-Q、S-S-S-R-T-Y-R-V-G-L-G-R-H-N、K-D-W-N-S-N-Q-I-S-K-G-N-D、G-P-L-N-C-Q-A-S-D-G-R-W、G-A-L-P-D-D-L-K-Q-G-R-L、S-L-Q-Y-E-K-S-G-S-F-Y、F-G-C-N-T-R-R-K-P-T-V-F-Tに対する抗体はイソ形膵臓エラスターゼと極めて特異的に反応し、他の糞便成分と非特異的に反応することはない旨を証明できた。
【００１４】
本発明のもう一つの主題は、体液及び糞便中のすべての公知エラスターゼ−イソ酵素の検出と定量のため、本発明に係るエラスターゼ抗体を使用することである。従って本発明はまた膵機能障害認識のための補助手段としての、この臓器の機能状態を確認するための検出系、とりわけ免疫化学的検出系に関する。そのために特異的抗体をすべての適当な担体に公知の結合法により吸着的又は化学的に結合することができる。担体として膜又は粒子が適している。交差反応性エピトープ抗体又は異なるエピトープ抗体の組合せを使用する本発明に係るサンドイッチELISAにより、糞便及び血清又は血漿中の膵臓エラスターゼを迅速かつ特異的に検出し、定量できる。
【００１５】
本発明に係るサンドイッチELISAは、腹痛及び外分泌性膵不全の際の膵臓の関与を診断し、排除するために利用される。
【００１６】
膵障害の確実な診断を下すのに、エラスターゼ1の検出ですでに十分な場合もある。この場合は本発明方法は次のように行なわれる。
【００１７】
ヒト・エラスターゼ1のDNA配列（特開昭62-276号）からアミノ酸配列を求めた。慣用のタンパク質構造プログラムを使用して、潜在的エピトープ構造を有する複数のアミノ酸配列を同定することができた。ペプチドA-V-K-E-G-P-E-Q-V-I-P-I-N、Y-T-N-G-P-L-P-D-K-L-Q-Q-A-R、R-S-G-C-N-G-D-S-G-G-P-L-N及びG-P-L-N-C-P-T-E-D-G-G-W-Qに対する抗体は極めて特異的にエラスターゼ1と結合し、他の糞便成分とは非特異的に反応しないことを証明することができた。
【００１８】
本発明は常法による抗エラスターゼ抗体の調製方法において、使用する特異的抗原を予めアミノ酸配列から構造分析して設定し、化学的に合成したことを特徴とする方法に関する。本発明に基づきこの合成ペプチドの一部を抗体の調製のために使用することも可能である。ペプチドは単独で抗体の誘導を生じさせるが、このペプチドを慣用の担体物質例えばヘモシアニンに結合させると好都合であることが判明した。本発明に係るペプチドによりモノクロナール抗体もポリクロナール抗体も生成することが可能である。
【００１９】
本発明に係るポリクロナール抗ペプチド抗体の調製のために、試験動物例えばイエウサギ、モルモット、ヤギ、ニワトリ又は魚類を定法によりペプチドで免疫感作する。モノクロナール抗体を調製するには、ペプチドを周知のように特異的Ｂ細胞の誘導のために使用する。特異的Ｂ細胞は骨髄腫細胞と融合してハイブリッド細胞を生成する。特異的モノクロナール抗体を分泌する細胞系で、このハイブリッド細胞を公知のクローニング法により培養する。本発明に係るモノ又はポリクロナール抗体は、使用する特異的エピトープ又は成熟エラスターゼ1とだけ反応する。
【００２０】
本発明のもう一つの主題は、体液及び糞便中のエラスターゼ1の検出と定量のため、本発明に係るエラスターゼ１−エピトープ特異的抗体を使用することである。従って本発明は膵機能障害認識のための補助手段としての、この臓器の機能状態確認のための免疫化学的検出系にも関する。そのために特異的抗体をすべての適当な担体に公知の結合法により吸着的又は化学的に結合することができる。担体として膜又は粒子が適している。各々2種類の異なるエピトープ抗体を使用する本発明に係るサンドイッチELISAによって、糞便及び血清又は血漿中の特異的エラスターゼ１が迅速かつ特異的に検出され、定量される。
【００２１】
実施例1−成熟ヒト・エラスターゼ1の特定の部分に向けられた特異的抗ペプチド抗体の調製
メリフィールド法による固相合成で、アミノ酸配列NH2-A-V-K-E-G-P-E-Q-V-I-P-I-N-COOH、NH2-Y-T-N-G-P-L-P-D-K-L-Q-Q-A-R-COOH、NH2-R-S-G-C-N-G-D-S-G-G-P-L-N-COOH及びNH2-G-P-L-N-C-P-T-E-D-G-G-W-Q-COOHを有するペプチドを合成する。ペプチドを公知の方法でツタノハガイのヘモシアニン（KLH）に結合する(1mg ペプチド／mg KLH)。フロイントアジュバントを添加して、このコンジュゲート300μgずつをイエウサギ又はニワトリの免疫感作のために使用する。ワクチン注射3回の後に動物から血液を抜く。血清を得た後、抗血清の特異性をELISAで検定する。そのために遊離ペプチドをマイクロタイタープレートのキャビティの表面に吸着させる。抗血清を有するキャビティを温置した後、これをよく洗浄する。抗イエウサギ又は抗ニワトリPODコンジュゲートを使用して、常法により抗原抗体反応を検出する。どの抗血清も同種のペプチドとだけ反応する。
【００２２】
実施例2−本発明に係る抗体の特異性確認
エラスターゼ１特異性をウエスタンブロッテングで検出することができる。そのために糞便から粗精製又は高純度精製したエラスターゼ1がポリアクリルアミドゲル電気泳動により分子量に応じて随伴不純物から分離される。「半乾式ブロッティング(Semidry-blotting)」装置によりゲルのタンパク質ゾーンをニトロセルロースに転写する。再懸濁した乾燥脱脂乳で膜の空いた結合部位を飽和した後、膜を1:500に希釈した抗ペプチド抗血清とともに温置する。非特異的に結合したすべての抗体を除去するために、膜を激しく洗浄した後、ホスファターゼで標識した抗イエウサギ抗体を有する膜を温置する。洗浄の後に膜に残る特異的に結合した二次抗体を、基質の添加で可視化する。これにより、使用した試料でエラスターゼだけが検出されたことが示される。
【００２３】
実施例３−本発明に係る抗体を使用する、糞便中のエラスターゼ1のELISAによる分析
血清試料又は糞便試料中のエラスターゼ１を、サンドイッチ法に基づく固相酵素免疫検定法で分析する。エラスターゼ1のエピトープに向けられたポリクロナール抗体を炭酸塩／重炭酸塩緩衝液混合物（pH9.6）に溶解し、マイクロタイタープレートのウェルに入れる。4℃で12時間にわたり温置した後、PBS（リン酸塩緩衝塩水）で洗浄して未結合の抗体を除去する。担体材料のまだ空いている結合部位を、エタノールアミン及びトゥイーン（Tween）20を含むPBS緩衝液で蔽う。遮断は室温で90分にわたって行なう。洗浄の後、PBSで希釈された血清又は糞便試料をピペットでウェルに入れる。室温で60分の温置を洗浄で終了する。ビオチン接合特異的ポリクロナール抗体の二次エラスターゼ1を、一次抗体に結合したエラスターゼに加える。
【００２４】
30分の温置と洗浄処理の後に、ビオチンで標識した抗体をペルオキシダーゼ接合ストレプトアビジンで検出する。最後の洗浄段階で未結合のストレプトアビジンを除去する。続いてペルオキシダーゼのための基質としてTMB（トリメドキシム）を加え、所定の時間の後にHClの添加により呈色反応を停止する。光学密度の変化を測定する。呈色反応の強さは試料のエラスターゼ1濃度に比例する。
【００２５】
実施例４−イソ形膵臓エラスターゼの特定の部分に向けられた特異的抗ペプチド抗体の調製
メリフィールド法固相合成で、アミノ酸配列A-V-K-E-G-P-E-Q-V-I-P-I-N、Y-T-N-G-P-L-P-D-K-L-Q-Q-A-R、R-S-G-C-N-G-D-S-G-G-P-L-N、G-P-L-N-C-P-T-E-D-G-G-W-Q、G-T-E-A-G-R-N-S-W-P-S-Q-I、H-N-L-S-Q-N-D-G-T-E-Q-Y-V、W-G-K-T-K-T-N-G-Q-L-A、V-S-S-R-G-C-N-V-S-R-K-P-T、G-G-E-E-A-R-P-N-S-W-P-W-Q、S-S-S-R-T-Y-R-V-G-L-G-R-H-N、K-D-W-N-S-N-Q-I-S-K-G-N-D、G-P-L-N-C-Q-A-S-D-G-R-W、G-A-L-P-D-D-L-K-Q-G-R-L、S-L-Q-Y-E-K-S-G-S-F-Y、F-G-C-N-T-R-R-K-P-T-V-F-Tを有するペプチドを合成する。このペプチドを公知の方法でツタノハガイのヘモシアニン（KLH）に結合する（１mgペプチド／mgKLH）。フロイントアジュバントを添加して、このコンジュゲート300μｌずつをイエウサギ又はニワトリの免疫感作のために使用する。ワクチン注射3回の後に動物の血液を抜く。抗体を得た後（タンパク質Ａ-酸又は分別沈降で精製）、その特異性をELISAで検定する。そのために遊離ペプチドをマイクロタイタープレートのキャビティに吸着する。同種又は異種の抗体を有するキャビティを温置した後、これをよく洗浄する。抗イエウサギ又は抗ニワトリPODコンジュゲート及び基質としてのTMBを使用して、常法により抗原抗体反応を検出する。抗体はいずれも同種のペプチドとだけ反応する。
【００２６】
実施例５−本発明に係る抗体の特異性の検出
種々のイソ形膵臓エラスターゼに対する抗体の特異性を、ウエスタンブロッティングで検出することができる。そのために糞便及び膵液から粗精製及び高純度精製したエラスターゼ試料を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によりその分子量に応じて随伴不純物から分離する。「半乾式」（semi-dry）ブロッティング装置によりタンパク質ゾーンをゲルからニトロセルロースヘ転写する。膜の空いた結合部位を再懸濁した乾燥脱脂乳で飽和した後、予め希釈した当該の抗ペプチド抗体の単味又は種々の組合せを有する膜を温置する。非特異的に結合したすべての抗体を除去するために膜を激しく洗浄した後、ホスファターゼで標識した、事前に決定した濃度のアルカリ性抗イエウサギ抗体を有する膜を温置する。洗浄の後に膜に残る特異的二次抗体を基質の添加で可視化する。その際単一の抗体又は抗体混合物を有するすべての試料でエラスターゼを検出できることが判明したが、必ずしもすべてのイソ形抗体が検出される訳でない。
【００２７】
実施例６−本発明に係る抗体を使用する糞便及び血清中の膵臓エラスターゼの分析
血清、血漿又は糞便中のエラスターゼを、サンドイッチ法に基づく固相ELISAで分析する。そのために単一の本発明抗体又は複数の本発明抗体の適当な混合物を炭酸塩／重炭酸塩緩衝液混合物(pH9.6)に溶解し、マイクロタイタープレートのウェルに入れる。4℃で温置の後、PBSで洗浄して未結合の抗体を除去する。担体材料のまだ空いている結合部位をエタノールアミン／トゥイーン20−PBS緩衝液で蔽う。遮断は室温で90分間行なう。洗浄の後、PBSで希釈された血清又は糞便試料をピペットでウェルに入れる。室温で60分の温置を洗浄で終了する。検出抗体として、ビオチンを接合した単一の本発明抗体又は複数の本発明抗体の適当な混合物を使用する。30分の温置と洗浄処理の後に、ビオチン標識した抗体をペルオキシダーゼ接合ストレプトアビジンで検出する。最後の洗浄段階で未結合のストレプトアビジンを除去する。続いて基質としてのTMBによりペルオキシダーゼ濃度を決定する。酵素反応の終了のためにHClを添加した後、光学密度の変化を測定する。呈色反応の強さは試料中のエラスターゼ濃度に比例する。