(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の焦点で蛍光パラメータを測定することにより試料の特性を分析する方法であって、
試料の複数光子励起に適切である光子密度及び波長を平行一次レーザビームに与える工程と、
偏光プリズムの集合（５０３）により、フォーカシング光学部品（５０７）の光学軸に対して異なる伝播角度で伝播するように、入射する平行一次レーザビームを少なくとも２つの偏向された平行二次レーザビームに分割する工程と、
これら分割された少なくとも２つの偏向された平行二次レーザビームを、ミラーアレイ（５０４）によって、前記フォーカシング光学部品（５０７）に向ける工程と、
前記試料の少なくとも２つの体積要素に、前記フォーカシング光学部品（５０７）を用いて前記少なくとも２つの二次レーザビームを夫々焦点合わせさせる工程と、
検出装置（５１０）を用いて前記少なくとも２つの体積要素から発せられる光を検出する工程と、
分析される前記特性を取得するために前記検出された光を評価する工程と、
を具備する方法。
【請求項２】
前記少なくとも２つの二次レーザビームは、異なる波長と、同一の輝度と、同一のビームプロファイルとの少なくとも１つを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも２つの二次レーザビームに分割する前記偏光プリズムの集合（５０３）は、ウォラストンプリズムの集合である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ミラーアレイ（５０４）のミラーは、前記少なくとも２つの二次レーザビームの前記伝播角度を夫々調整するために選択的に傾けられる請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記フォーカシング光学部品（５０７）は、共焦点フォーカシング光学部品であり、前記検出する工程は、前記フォーカシング光学部品（５０７）、及びビームスプリッタ（５０５）を用いて、前記少なくとも２つの体積要素（１０８、７０８）を前記検出装置（５１０）の対応する検出器上に投射することを有する請求項１乃至４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記検出する工程と評価する工程とは、前記検出装置内の検出された光子の流れを経時的に信号ストリームに変形すること、及び／又は異なる時点で前記体積要素から、及び異なる検出器（５１０）から収集される信号を前記試料についての情報に変換する、及び／又は結合することを有する請求項１乃至５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
複数の焦点で蛍光パラメータを測定することにより試料の特性を分析するための装置であって、
試料の複数光子励起に適切である光子密度及び波長を有する平行一次レーザビームを発生させるための光源と、
前記一次レーザビームを少なくとも２つの二次レーザビームに分割する分割装置（５０３）と、
前記試料の少なくとも２つの体積要素に前記少なくとも２つの二次レーザビームの焦点を夫々合わせるための前記フォーカシング光学部品（５０７）と、
前記体積要素から発せられる光を検出し、分析される前記少なくとも１つの特性を取得するために前記検出された光を評価するための検出装置と、
を具備する装置において、
前記分割装置（５０３）は、前記一次レーザビームを、前記フォーカシング光学部品に対して異なる伝播角度を夫々有する少なくとも２つの二次レーザビームに分割するための偏光プリズムの集合（５０３）を有し、
少なくとも２つのミラーを有するミラーアレイ（５０４）が、前記二次ビームを前記プリズムの集合からフォーカシング光学部品に向けるために、前記分割装置（５０３）と前記フォーカシング光学部品（５０７）との間に設けられている、
ことを特徴とする、装置。
【請求項８】
前記プリズムの集合（５０３）は、ウォラストンプリズムの集合を有する請求項７に記載の装置。
【請求項９】
前記ミラーアレイ（５０４）の前記ミラーの夫々は、前記少なくとも２つの二次レーザビームの前記伝播角度を夫々調整するために可動である請求項７に記載の装置。
【請求項１０】
請求項１乃至６のいずれか１項に記載の方法を使用して、
複数の試料を平行分析と、
複数の試料を高スループットスクリーニングと、
時間分解及び空間分解された蛍光分光を測定と、
蛍光相関分光法と、
蛍光一致測定、及び／又は、
蛍光変動測定と、のいずれかを果たす方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料量中の平行な、焦点を共有する複数の体積要素内でレーザ誘起蛍光を検出し、検出された蛍光光子の流れから、前記試料について、特に生化学組成、物理特性、化学特性及び分光特性、あるいは生化学試料又は生体試料の構造についての時間分解マルチパラメータ情報を抽出する方法及び装置に関する。本発明の方法は、特に、高分解能生化学運動力学を測定するため、及び高スループットスクリーニング応用例のために適している。
【背景技術】
【０００２】
一般的にライフサイエンスにおいて、及び特にバイオテクノロジーにおいては、細胞の表面又は内部で、あるいは植物又は動物の組織から採取された試験片において水溶液、複雑な生化学混合物などの様々な試料フォーマットでの化学的、生化学的、及び生物学的なパラメータの正確で高速且つ効率的な分析を可能とするバイオアナリティカル方法に対する広範囲なニーズが存在する。
【０００３】
バイオアナリティカル方法の全般的なタスクとは、非常に高い空間及び時間分解能を持つその化学組成に関して生体試料又は生化学的な試料の特徴付けを行うことである。理想的には、これらの方法によりアドレス指定可能な小さな体積要素の化学組成及びそれらの経時的な変化のリアルタイム分析が可能になる。このような体積要素の規模は生体内作用の微細構造の範囲内、つまり細胞の大きさ及びこれ未満になければならない。前記時間分解能はほぼ生体内作用程度、つまり、マイクロ秒以下の範囲でなければならない。生体内作用は多くの場合単一分子に依存するか、あるいは単一分子によりトリガされるため、感度は単一分子レベルまで下げられなければならない。さらに（蛋白質などの）生体分子の個体群は、単一分子分析から分かるように明らかに極めて異質であり、この本質的な異質性は生体内作用の調整にとって極めて重要であると考えられる。
【０００４】
蛍光の使用は、多くの理由からこのようなバイオアナリティカル方法にとって並外れてよく適している。第１に、蛍光は誘起される。したがって、重要な分子を選択的に励起し、それにより様々な分子間で弁別し、背景を抑制することができるようになる。第２に、蛍光は単一分子の特性である。つまり単一分子は励起し、検出できる単一光子を相応して発することができる。したがって、蛍光は単一分子レベルの感度で測定できる。第３に、蛍光パラメータは蛍光を受ける分子の性質の特性である。吸収される光子の波長、励起状態の存続期間、発せられた光子の波長、及び発せられた光子の偏光角は全て蛍光分子の化学構造の特性である。これらの及びそれ以上のパラメータは様々な生体分子を検出、弁別するために全て利用できる。第４に、蛍光は高速である。蛍光状態の存続期間は通常ほぼピコ秒からナノ秒程度である。したがって、ほぼマイクロ秒からミリ秒程度の運動学を分解できる。第５に、蛍光は非破壊且つ非侵襲性であり、試験片の固定を必要としない。したがって、蛍光は生きている細胞の中で、あるいは穏やかな条件下での組織内で容易に分析できる。
【０００５】
蛍光の測定に基づく多くのバイオアナリティカル方法が既知である。高い空間分解能を有するために、蛍光分析はやや初期に共焦点セットアップと組み合わされた。バイオテクノロジーの共焦点セットアップにおける蛍光分析の応用は、Ｅｉｇｅｎ及びＲｉｇｌｅｒ（ＰＮＡＳ  １９９４年、９１（１３）：５７４０）によって広範囲に立証された。Ｅｉｇｅｎ及びＲｉｇｌｅｒは、特に、変動する蛍光エミッション信号の間の相関を記録し、それによって分子拡散現象及び分子輸送現象の分析を可能にする蛍光相関分光法を説明した。著者らはこの技法を、リガンドの、これのレセプタへのバインディングなどの分子サイズ及び生体分子相互作用の測定に使用した。さらに、著者らは、感度を高め、検出限度をさらに引き下げるために、これらの分析を電場の単一分子を閉じ込めるための装置と結合した。これらの測定では、分子は特定の蛍光団で標識され、１０−１５Ｍ以下の濃度で監視できるであろう。
【０００６】
このセットアップ及び他のセットアップの問題は、とりわけ空間分解能が制限されていること、非常に高いデータ品質を獲得するための同程度に長い記録時間、複数の蛍光団を励起するための２つ以上のレーザビームをオーバレイする要件、及び軸方向での開放体積要素を制限するためにピンホールを整列させることの難しさである。
【０００７】
複数光子（ｍｕｌｔｉ−ｐｈｏｔｏｎ）励起は、体積要素の規模をさらに下げるため、及びピンホールを必要とせずに体積要素を明確に制限するために使用されてきた。高解像度顕微鏡法と組み合わされた２光子励起の原則はＤｅｎｋらによって説明された（サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２４８（１９９０年）７３−７６）。複数光子励起は、特に微細な焦点での分子変動に基づいた生体試料及び方法との使用のためにいくつかの多大な優位点を有している。２光子励起はその非線形性質のために顕微鏡対物レンズの焦点領域に厳しく制限されている。この結果は非常に高いコントラスト、非常に高い空間分解能、及び検出体積を限定するために空間的なフィルタリング要素（「ピンホール」）を使用する必要がないことであり、位置合わせ手順を容易にする。さらに、生体分子又はマーカ分子の光破壊及び光ブリーチングなどの問題は縮小される。光破壊及び類似した影響は、多くの場合、偽の結果又は誤解された結果につながる。
【０００８】
２光子励起の使用のための特定のセットアップが国際公開第０２／０８７３２号に説明されている。スペクトル的に異なる蛍光エミッションを有する、異なる蛍光色素でマーキングされた試料アナリストは、２光子励起による１つのレーザ波長で照射される。前記蛍光エミッションは２つの別個の検出装置によって検出される。２光子励起を使用することにより、両方の色素の励起体積のアイデンティティが保証され、両方の検出経路の中に測定体積を制限するためのピンホールの使用が回避される。しかしながら、このセットアップは、交差相関分析及び／又は共焦蛍光一致分析に制限され、空間的な情報は明らかにしない。
【０００９】
より高い精度、より高い試料スループット及び加えて各試料についての空間的な情報の分析は、これら単一焦点共焦点蛍光分析セットアップを平行にするときに達成できる。これは、好ましくは複数焦点のセットアップを使用して行うことができる。
【００１０】
多数の体積要素の中で蛍光を検出する蛍光定量分析のための改善されたセットアップが説明された。米国特許第５，８１５，２６２号は、複数のプローブ体積の中で平行なレーザ誘起２光子蛍光相関分光法を実施するための装置及び方法を説明している。このセットアップでは、レーザビームは一連の試料体積を通して顕微鏡対物レンズを介して連続的に焦点が合わされる。つまり１つの試料体積を通過する光は、次の試料の中に再び焦点を結ばれる。蛍光は、試料ごとにレンズ、フィルタ及び光電子倍増管を備える光デバイスの平行な配列によって検出される。セットアップは、焦点ごとに高品質の光学部品を必要とするため複雑である。さらに、励起輝度は、試料及び連続配列に沿った光学学部品における光学損失のために試料ごとに減少する。これが、異なる試料から結果として生じる蛍光信号を比較するときの制限につながる。さらにセットアップは様々な試料で焦点を生成する。したがって、セットアップは試料からの空間的情報を明らかにしない。
【００１１】
国際公開第０１／４０７６９号は、各試料内で生じる多数の焦点における共焦点セットアップで蛍光を測定するためのセットアップを説明する。技術的なセットアップは、多数の光ファイバ、ビーム分割装置及びフォーカシング光学部品を使用する。レーザビーム又は励起に使用される他の光は、多数の光ファイバを通して誘導される。ファイバの出力は、代わりに多数の二次ファイバの中に励起光の焦点を合わせるフォーカシング光学部品に、ダイクロイックミラーを介して向けられる。ファイバの前記二次集合の出力は、多数の焦点を生じさせる試料の中に別のフォーカシング光学部品によって焦点を合わせられる。焦点の中の分子からの結果として生じる蛍光は、次に同じ光学部品によって前記二次ファイバの中に収集される。次にダイクロイックミラーを通過した後、蛍光は、少なくとも１つの検出器装置の上に蛍光の光を最後に向ける第３の多数のファイバの中に焦点を合わせられる。分子変動に基づいた測定に必須である、試料内の回折が制限された高品質焦点、及び限定された検出体積を達成するために、光励起経路内の全てのファイバがモノモードファイバでなければならない。位置合わせ手順が非常に時間を要するという事実に加えて、光のモノモードファイバの中への結合は輝度の重大な損失を受ける。これが検出された蛍光だけではなく励起光の主な原因となり、励起された分子ごとに検出されるエミッション光子数の大幅な削減につながる。加えて、ファイバにより、２光子励起に必要であるｆｓ個のレーザパルスのかなりのパルス広がりが引き起こされるため、これにより前記セットアップは複数光子励起と相容れなくなる。しかしながら、複数焦点セットアップで１光子励起を使用すると、焦点領域を越えた励起のための焦点間の深刻な漏話につながり、さらに信号の品質が低下する。
【００１２】
要約すれば、これまで説明された全ての従来のセットアップは、その空間的分解能及び時間的分解能、それらの信号品質、それらの記録速度、したがってそれらの試料スループット、複雑で変化する試料行列に対するそれらのロバストネス、ならびに再調整及び位置合わせのためのそれらの技術的な安定性及び要件という点で制限されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって、本発明の根底にある技術的な問題は、試料の蛍光パラメータを分析する改善された方法を提供することである。本発明の特定の目的とは、特に高い空間的分解能及び時間的分解能の、高い試料スループットを持ち、複雑で変化する試料行列に対する高いロバストネスを持ち、前記光セットアップを位置合わせする際に高い光学安定性及びより少ない労力の、生体試料又は生化学試料を分析するための方法を提供することである。前記セットアップは、多岐に亘る蛍光分子及び最大の蛍光読み出しパラメータに対して幅広く適用可能でなければならない。本発明の別の目的とは、試料の蛍光パラメータを分析するための改善された装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
これらの目的は、それぞれ請求項１又は１２に記載の特徴を持つ方法及び装置で解決される。本発明の好ましい実施形態及び応用例は、従属クレームに特徴付けられている。
【００１５】
本発明の第１の態様に従って、多数の焦点において蛍光パラメータ（又は一般的には、光と試料の間の相互作用のパラメータ）を測定することによって試料の特性を分析するための方法は、分割装置をもって平行一次（つまり第１の）レーザビームを少なくとも２つの平行二次レーザビームに分割し、前記二次（つまり第２の）レーザビームを、それらがフォーカシング光学部品の光学軸に対して異なる伝播角度で伝播するように偏向する工程と、前記二次レーザビームを、前記フォーカシング光学部品をもって前記試料の少なくとも２つの体積要素の中に焦点を合わせる工程と、検出装置をもって前記体積要素から発せられる光を検出する工程と、分析される前記特性を取得するための前記検出済み光を評価する工程とを有する。本発明の第２の態様に従って、複数の焦点において蛍光パラメータを測定することによって試料の特性を分析するための装置は、前記平行一次レーザビームを生成するための光源と、前記分割装置が前記二次レーザビームを、それぞれが前記フォーカシング光学部品の光学軸に対して異なる伝播角度を有する平行したレーザビームとして形成するために配置されている平らな屈折面又は反射面を含む、前記一次レーザビームを少なくとも２つの二次レーザビームに分割するための分割装置と、前記試料内の少なくとも２つの体積要素の中に前記二次レーザビームの焦点を合わせるためのフォーカシング光学部品と、体積要素から発せられる光を検出するため、及び分析される特性を得るために検出された光を評価するための検出装置とを備える。これらの手段の組み合わせにより、試料内の焦点は、特に高い精度及び改善された均質性をもって生成できる。前記励起光を平行ビームに分割することには、光学セットアップにおける光学歪みを回避するという特定の優位点がある。
【００１６】
特に、本発明は、各試料の複数の体積要素の中で、レーザ誘起複数光子励起蛍光を、高い空間分解能及び時間分解能をもって同時に測定することによって、高速の試料の特徴付けを可能にする方法及び装置に向けられている。この複数焦点セットアップの主要な利点とは、分子蛍光パラメータの決定が、連続する代わりに同時に実行できるという点である。したがって、測定時間は大幅に短縮できる。加えて、複数の分子パラメータを試料内で同時に分析し、リアルタイムで比較することができる。前記方法は、蛍光変動分析を実行するために特に適している。蛍光変動分析とは、蛍光信号の変動を評価することによって試料特性を決定する分析である。このような評価は、好ましくは運動量分析によって行われる。したがって、前記方法は、蛍光存続期間、蛍光異方性、蛍光エネルギー伝達、蛍光移動性、及び多数の焦点でのそれらの組み合わせのような分子パラメータの決定を可能にする。前記セットアップは、回折が制限された光学品質を明らかにし、前記同じ試料内での前記焦点間の漏話を受けない。さらに、前記セットアップは、好ましくは前記励起波長を調整し、任意の位置合わせ手順又は光学構成要素の変更を必要とすることなく同時に重要な全ての蛍光分子を励起することによって、広範囲の蛍光分子と互換性がある。さらに、前記セットアップは、幅広い波長範囲で波長について焦点体積要素の間で均一な輝度分布を実現する。
【００１７】
複数光子励起応用例の場合、本発明の前記方法は以下の工程を備える。
【００１８】
（ａ）複数光子励起に適している輝度及び波長の前記第１のレーザビームを生成する工程と、
（ｂ）前記第１のレーザビームから均一な輝度を持つ複数の２つ以上の第２のレーザビームを生成する工程と、
（ｃ）前記複数の２つ以上の第２のレーザビームを異なる角度で、前記フォーカシング光学部品を形成する顕微鏡対物レンズの後部開口の中に結合し、それにより前記試料体積の中で複数の２つ以上の照射された体積要素を生成する工程と、
（ｄ）前記同じ顕微鏡対物レンズ及びビームスプリッタによって前記複数の２つ以上の体積要素を複数の２つ以上の検出装置上に投射する工程と、
（ｅ）各検出装置内の検出された光子の前記流れを、信号ストリームの中に経時的に変形する工程と、
（ｆ）様々な時点で前記複数の体積要素から、及び様々な検出装置から収集される信号を前記試料体積内の前記試料についての情報に変換する、及び／又は結合する工程。
【００１９】
複数光子励起応用例のための装置は、特に以下の構成要素を備える。
【００２０】
−複数光子励起に適切である第１のレーザビームを生成するための光源と、
−好ましくは均一の輝度の２つ以上の第２のレーザビームに、前記第１のレーザビームを分割するための光学構成要素の配列と、
−様々な角度での前記第２のレーザビームを、顕微鏡対物レンズの前記後部開口の中に結合するための光学構成要素の配列と、
−顕微鏡対物レンズと、
−前記励起放射線から蛍光光子を分離するためのビームスプリッタと、
−各体積要素を、要すれば光ファイバを介して検出装置の上に投射するためのフォーカシング光学部品と、
−数が二次レーザビームの数に等しい、又は二次レーザビームの多数の数である２つ以上の検出装置と、
−検出された光子を信号ストリームに変換するため、及び異なる時点での異なる堆積要素からの前記信号の組み合わせ及び相関を計算するための信号処理装置。
【００２１】
本発明に従って、複数の体積要素は、前記同じ試料体積内の複数の焦点スポットによって画定される。前記複数焦点セットアップは、光デバイスの本発明の配列により実行される。
【００２２】
本発明の好ましい実施形態において、技術的なセットアップは、ミラーアレイを使用してレーザビームを複数の個々のビームに分割することにある。本発明の別の好ましい実施形態では、複数焦点アレイは、プリズムの配列によって、前記１つのレーザビームを異なる角度の個々のビームに分割することにより生成される。本発明の特に好ましい実施形態では、前記複数焦点セットアップは、プリズムの配列及びミラーのアレイの組み合わせによって生成される。
【００２３】
本発明の追加の詳細、優位点及び好ましい特徴は、添付図面に関して以下に説明される。図面は、詳しい説明に補足して本発明をさらに説明するために提供されるが、いかなる点においても本発明を制限するように閉鎖的（ｏｂｓｔｒｕｅｄ）ではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明の枠組みの中で、以下の用語及び定義が使用される。
【００２５】
「粒子ごとのカウント」とは、持続的に再励起される単一蛍光分子により発せられ、光学セットアップ内の全ての光学損失を考慮に入れて検出装置により検出される、毎秒の平均光子数である。
【００２６】
用語「体積要素」は、その寸法が焦点を共有する光学部品の本発明による使用によって画定される試料体積内で抽出された体積を指す。「体積要素」は試料体積内でのユニットであり、そこで試料は本発明により生じる第２のレーザビームで照射される。変動分析はこのような体積要素における信号変動を評価する。
【００２７】
「共焦点」セットアップは、光学励起検出経路が１つの単一のレンズ又は顕微鏡対物レンズを通して向けられ、それによってこのレンズ又は顕微鏡対物レンズの焦点を光学励起及び光学検出経路について同一とする光学構成要素の配列により定義される。これにより、直径が１μｍ未満のようにより小さい体積要素でも、試料内の励起体積及び検出体積が、それらの２つの体積を空間的にオーバレイするための位置合わせを必要とせずに同一となることが保証される。
【００２８】
「照度」は、光学セットアップ内の全ての損失を考慮して、最終的に体積要素を照射している電磁放射の輝度である。
【００２９】
本発明は、各試料の中の複数の体積要素内で、レーザ誘起複数光子励起蛍光を高い空間的分解能及び時間的分解能で同時に測定することにより、試料の高速の特徴付けを可能にする方法及び装置を目的としている。検出された蛍光光子は、それぞれの検出された光子の発生元である体積要素の場所、各検出された光子のエネルギー及び偏光角、各検出された光子の励起状態の存続期間、及び追加のパラメータについての情報を伝播する信号ストリームに変換される。信号ストリームは、分析される試料の構造及び／又は組成、及びこれらのパラメータの時間的な展開についての情報を明らかにするためにリアルタイムで評価される。
【００３０】
本発明の実施形態、特に試料の複数光子励起のために適応されている方法は、図１に概略で描かれている。したがって、複数光子励起に適切である光子密度及び波長を有する第１のレーザビーム１０１が発生される。ビーム分割装置１０２を用いて、この第１のレーザビームは、複数の２つ以上の平行した第２のレーザビーム１０３に分離され、第２のレーザビームの間で輝度は均一に分散されている。次に、異なる角度のレーザビーム１０６を生じさせるために、多数の第２のレーザビームの方向が偏向装置１０４によって修正される。ビームスプリッタ１０５を介して、これらのレーザビームは、次に顕微鏡の対物レンズ１０７の後部開口の中に結合され、それにより試料体積中に多数の２つ以上の照射された体積要素１０８を生成する。体積要素のそれぞれでの光子密度は、複数光子励起に必要とされるのと同程度に高く設定され、体積要素内に常駐する、あるいは体積要素を通過する蛍光団はその蛍光状態に励起される。次に体積要素は、フォーカシング光学部品１０９を介して、信号処理装置１１１と共に、光子の時間分解検出、前記利用されている体積要素のどれかに対するそれらの割り当て、及び光子エネルギーに関するそれらの特徴付け、励起状態の持続期間、偏光角及び追加の特性を可能にする検出器集合１１０に投射される。信号処理装置１１１を用いて、この情報は、分析される試料の構造及び組成及びこれらのパラメータの時間的な展開についての情報を明らかにするためにさらに処理される。したがって、前記方法は、リガンド−レセプタバインディング、酵素反応動力学又は類似した動力学などの化学反応又は生化学反応を測定するために特に適している。さらに、前記方法は分子輸送プロセスを測定するために特に適している。
【００３１】
共焦蛍光分析において複数光子励起を使用すると、単一光子励起に優るいくつかの利点が提供される。第１に、複数光子励起は、その非線形性質のために焦点領域に厳密に制限されている。その結果、１つの試料の中の様々な焦点の間の、いわゆる問題のある「漏話（クロストーク）」が排除される。励起は、焦点体積の外部ではごくわずかであるため、異なった隣接する励起体積及び検出体積の焦点外背景からの蛍光による干渉は存在しない。したがって、重要なパラメータ粒子ごとのカウントは、それが通常１光子励起を使用するときであるため、多焦点セットアップで危うくされない。複数光子励起は、１光子セットアップが検出体積をさらに限定するために、必要に応じて各焦点ごとの個々のピンホールの使用及び時間を要する位置合わせも回避する。利用される検出器の大きな検出領域と共に、複数光子励起は位置合わせの非常に高い安全性を可能にする。
【００３２】
複数光子励起の別の重要な優位点は、それらの１光子吸収スペクトルで大幅に異なる複数の蛍光分子を同時に励起する可能性に関する。それらの２光子断面スペクトルが共通調整可能レーザの範囲内でかなりの振幅を有するため、複数光子励起は全ての共通する蛍光色素及び蛍光蛋白質を励起できる。励起された蛍光分子のエミッションスペクトルが極めて異なっていたとしても、それらの２光子断面スペクトルは著しくオーバレイするため、通常１つの２光子励起波長を検出できる。さらに結果的に、時間を要する位置合わせのプロセスによって様々なレーザの励起体積をオーバレイする必要はない。複数光子励起の別の優位点は、一般的には、異なる蛍光分子を使用するときに、フィルタ又はダイクロイックミラーを変更すること、及びシステムの以後の時間を要する再位置合わせが要求されることが、重要ではないという点である。一般的には、赤外線励振源の光子が、蛍光分子により発せられる蛍光光子の波長がある可視範囲内の光子だけを検出すると仮定される検出器に当たるのを妨げるために、１つのフィルタ及び１つのダイクロイックミラーのセットが使用できる。
【００３３】
複数光子励起の別の優位点は、球体に近い励起輪郭の形状に対して、結果的に高品質の焦点が生じることである。この結果は、分子明度などの焦点体積要素の形状に強く依存する、読み出されたパラメータについても、励起及び検出体積の生成のための光学部品が、それは通常単一光子励起のケースで必要とされるため、時間を要する手順では変更される必要はないという点である。
【００３４】
妥当な複数光子励起を達成するために、高いピーク電力の電磁場が必要とされる。本発明の方法に従って、これは第１のレーザビーム１０１のための光源としてパルス化されたレーザの光源を利用することにより達成される。好ましくは、１００ＭＨｚの範囲の反復率及び１００から３００フェムト秒の範囲のパルス持続期間を有する高反復フェムト秒パルス化レーザが使用される。これらのレーザ光源は、共焦点セットアップの光学部品における分散影響のためである場合があるパルス広がりに依然として鈍感でありながらも、非常に高いピーク電力を提供する。１００ＭＨｚの範囲の高反復率は、１０ｎｓという対応する期間が０．５から５ｎｓの範囲内にあるこれらの分子の大部分の緩和時間を十分に超えるため、蛍光分子の以後の励起の最大速度を可能にする。しかしながら、分析が、通常０．５ｎｓより短い存続期間を有する分子の状態、例えばｐｓ又はｆｓタイムスケールでの典型的な存続期間の状態に基づいている場合、励起パルスの１００ＭＨｚより大幅に高い反復率さえ好ましい。したがって、本発明は好ましくは近赤外の、例えばチタン−サファイアｆｓ−光源における線形に偏光された超短レーザパルスを提供する波長調整可能な光源を利用する。赤外線領域内での光の使用は２光子励起を介した最も一般的な蛍光分子の励起のために有利である。フェムト秒パルスの使用での追加の優位点は、ピコ秒（例えば蛍光存続期間）タイムスケール及びフェムト秒タイムスケール（例えば蛍光分子の振動再分配）での動力学を同時に測定する可能性である。励起は、円形及び／又は線形に偏光されたレーザ光によっても実行できる。
【００３５】
任意の検出された光子について、励起状態の持続期間の測定を可能にするためにパルス化レーザ光源も、本発明のセットアップで利用される。信号処理装置によって、検出装置から時間分解された信号が、２光子励起イベントと対応する傾向光子のエミッションの間の距離についての情報を抽出するためにパルス化レーザ光源からのトリガ信号と結合される。
【００３６】
本発明の方法に従って、適切なレーザ光源により生成される平行レーザビームは、好ましくは高品質顕微鏡対物レンズの後部開口のサイズ又はその倍数まで広げられ、次に光学構成要素１０２の集合によって、最終的には本発明の光学デバイスの配列によって試料体積内の多数の焦点に誘導される多数の二次個別ビーム１０３に分離又は分割される。
【００３７】
本発明に従って、二次レーザビームは、波長が広範囲で調整されるにしても同一の輝度を有する。ビームの輝度は、測定可能な差異が複数のビームの輝度の平均の５から１０％より少ないときに同一と見なされる。波長範囲は、それが少なくとも１００から２００ｎｍをカバーするときに幅広いと見なされる。
【００３８】
ビームは、次に、全ての二次ビームが顕微鏡対物レンズ１０７の後部開口内でオーバレイするように光学構成要素１０４の集合により偏向され、それぞれがわずかに異なる角度のレーザビーム１０６で前記対物レンズに入射する。次に複数の非平行であるが、平行にされたレーザビームが、さらに長い波長励起光とさらに短い波長エミッション光子を区別できるビームスプリッタ１０５によって反射される。したがって、前記ビームスプリッタ１０５は、通常ダイクロイックミラーであるが、偏光立方体、輝度ビームスプリッタ、又は類似する光学構成要素であってもよい。
【００３９】
試料内の多数の回折制限された励起スポットは、高品質顕微鏡対物レンズ１０７を使用して生成される。本発明に従って、試料１０８内の個々の焦点の位置は、前記顕微鏡対物レンズの後部開口に入る個々のビームの入射角によって決定される。焦点のサイズは通常１μｍ未満の範囲内であるが、おそらく大幅に小さい又は大きいことがある。位置及び焦点間の距離は、本発明の光学デバイスの配列によって所望されるように調整できる。通常、焦点間距離は好ましくは約５から５０μｍであり、さらに好ましくは１０μｍから２０μｍであるが、各焦点の直径の一部分からフォーカシング光学部品の限度までの範囲となる場合がある。典型的な高品質顕微鏡対物レンズを使用するとき、この限度は３００μｍから１０００μｍである。また焦点の数は制限されず、完全に光学構成要素１０２に依存している。実施形態に応じて、焦点の数は光学構成要素１０２の数に比例するか、あるいは２ｎ以下ほど高く、ここではｎは光学構成要素１０２の数である。
【００４０】
好ましくは、焦点の数は２から１００００であり、さらに好ましくは２から１０００であり、最も好ましくは２から１００である。
【００４１】
体積要素内に常駐する、あるいは体積要素のどれかを通過するときに励起される分子により発せられる蛍光光子は、同じ顕微鏡対物レンズ１０７によって収集される。前述されたようにビームスプリッタ１０５の性質のため、蛍光光子はビームスプリッタ１０５を通過し、検出装置１１０上に再度焦点を結ばれる。この検出装置は複数の検出領域を備える。これらの検出領域は、例えばフォトダイオード、特にＡＰＤなどの個々の検出器の敏感な領域、あるいはＣＣＤチップ又は類似した検出装置などの検出アレイの敏感な領域の区画となる場合がある。
【００４２】
好ましくは、検出装置１１０は、検出装置の敏感な領域に当たる単一光子を検出するほど十分な感度を提供しなければならない。光子が検出装置の敏感な領域で検出されるたびに、光子の発生元の体積要素のアドレス、光子の波長及び／又は偏光角、及び追加のパラメータに対応する信号が、信号処理装置１１１によって抽出される。
【００４３】
本発明の方法は、以下の実施形態の１つによって実現できる。第１の実施形態（実施形態Ａ、図２）では、異なる入射角を有する平行ビームの生成が平らなミラーの配列によって達成される。このケースでは、光源２０１から発生された平行レーザビームは、ビームエキスパンダ２０２によって平らなミラーの完全な配列のサイズまで広げられてから、ビーム整形要素２０３によって変調される。前記ミラーの傾斜角度は、代わりに個々のミラーによって個々の平行ビームを顕微鏡対物レンズの後部開口に向けるために個別に調整できる。本発明に従って、試料内の対応する焦点の正確な位置は、ミラーの傾斜角度によって決定できる。したがって、後述される検出経路内での正確な焦点位置も、ミラーの傾斜角度によって決定できる。本発明に従って、これは検出経路内の検出器又は検出器ファイバ２１０の個別の位置合わせを回避する。これによって、非常に有利な方法でシステムの初期の位置合わせが容易になる。個々のビームのビームプロファイルはいわゆる「フラットトップ」形状に非常に近く、ビームの波面は非常に平らであるため、このようにして作成される焦点の光学品質は非常に高い。
【００４４】
本発明の好ましい実施形態（実施形態Ａ１、図３）では、典型的なレーザ光源のガウス輝度プロファイルは、各焦点の均一な励起輝度を達成するために傾斜濃度フィルタを使用して変更される。傾斜濃度フィルタは、光学的濃度の中心対称性の逆ガウスプロファイルを有する。したがって、最大光学的濃度は、レーザビームの最大輝度が発生するフィルタの中心にある。しかしながら、この点での光学的濃度は、依然として光の大部分が通過できるほど濃いに過ぎない。同様に、ビームの輝度は、フィルタの光学的濃度が減少するにつれ、その中心から減少していく。その結果、発生元のガウスプロファイルの中心領域において、フィルタ後の輝度プロファイルはフラットである。この領域はミラーの配列を均一に照射するために使用される。
【００４５】
本発明の第２の好ましい実施形態（実施形態Ａ２、図３）では、回折ビームシェーパーは、各焦点における均一な励起輝度を達成するためにビーム整形要素として使用される。回折ビームシェーパーは回折要素の特殊なケースである（工業用及び商業用応用例のための回折光学部品（Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｖｅ  Ｏｐｔｉｃｓ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ａｎｄ  Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、Ａｋａｄｅｍｉｅ  Ｖｅｒｌａｇ、ベルリン１９９７年、Ｔｕｒｕｎｅｎ及びＷｙｒｏｗｓｋｉ、編集）。レンズ及びミラーと異なり、回折要素の機能は散乱及び干渉に基づいている。回折要素は通常薄い平らな基板である。前記構成要素の片側には細かな溝構造がある。回折光学部品は、その波動性を利用して光を整形する。回折ビームシェーパーを使用することの、傾斜濃度フィルタを使用することに優る優位点とは、レーザ輝度の損失がないという点である。当業者に既知である回折ビームシェーパーは、既知の特性を備えるビームから任意の所望される回折パターンを生じさせるために、干渉の影響を使用している。本発明のこの実施形態のために使用される好ましい回折パターンは、入信ビームからいわゆる「フラットトップ」パターンを生じさせ、はっきりとした特徴は均一な矩形輝度プロファイルである。したがって、それぞれのミラーは均一に照射できる。
【００４６】
本発明の追加の実施形態（実施態様Ｂ）では、複数焦点アレイはプリズムによって生成される。図４は、本実施形態の好ましい技術的なセットアップを概略して示す。光源４０１により提供されるレーザビームは、高品質顕微鏡対物レンズ４０７の後部開口のサイズまで拡大され、次にプリズム４０３の集合に誘導される。偏光プリズムを使用することにより、レーザビームは、絶対的に同一の高品質ビームプロファイル及びエネルギーであるが、異なる伝播角度の多数のビームに分割される。好ましくは、１つのレーザビームを異なる角度の複数の単一ビームに分割することは、ウォラストンプリズムの集合で達成される。本発明に従って、入射ビームの偏光がプリズムの２つの出射ビームの２つの直交偏光に対して４５°傾けられるときに、偏光にも関わらず同一である直交偏光角の２つのビームに線形偏光のレーザビームを分離することにある、プリズムの本質的な特徴が使用される。本発明に従って、ｎ個のプリズムは、代替偏光の２ｎの同一ビームの生成のための４５°である主要軸の代替相対角度のアレイで配列できる。これは、使用されたプリズム数ｎの線形増加だけで、急上昇する数の同一ビームの生成を可能にする。好ましい実施形態では、これらの出射ビームは、通常１°未満のわずかに異なる伝播角度を有するにすぎない。したがって、本実施形態では、ウォラストンプリズムの集合は、組み合わせられたビーム分割１０２と偏向装置１０４としての役割を果たす。
【００４７】
特に好ましい実施形態（実施形態Ｂ１）では、ウォラストンプリズムは、菱形形状の焦点アレイを達成するように配列される。４つのウォラストンプリズムを用いたこのような配列の例は、図６に示されている。第１のウォラストンプリズムは、ビームが、元の偏光から＋４５°及び−４５°逸脱する直交線形偏光の２つの新しいビームに分割されるように（傾斜角度４５°）拡大された線形偏光レーザビームに向かって向けられる。これは、２つの新しいビームについて、再び前記２つのビームを４つの新しいビームに分割する第２のウォラストンプリズムを用いて繰り返される。次のウォラストンプリズムは再び前記４つのビームを８つのビームに分割するが、今回はビームの伝播ベクトルの分割角度は、ビームベクトルの再結合を回避するために前記第１のウォラストンプリズムと第２のウォラストンプリズムの分割角度の量の半分である。本発明に従って、同じ品質及びエネルギー、及び別のエネルギーの十分に分離されたビームを生じさせるために、プリズムアセンブリの相対的な向き及び分割角度の複数の可能性がある。
【００４８】
次に、アレイの出射ビームは、例えば顕微鏡対物レンズの後部開口などのフォーカシング光学部品に向かって向けられ、それらの異なる入射角に従って試料内の様々な場所にある同一の高品質焦点スポットを生じさせる。ウォラストンプリズムを使用すると、角度が通常１°未満であるため、入射ビームの中心の、対物レンズの後部開口の中心からの逸脱は極めて小さく、焦点の質及び均一性を危うくしない。
【００４９】
追加の特に好ましい実施形態（実施形態Ｃ）では、複数焦点アレイが、プリズム及び平らなミラーの技術的なセットアップの組み合わせによって生成される。この実施形態の好ましい技術的なセットアップは図５に概略して示される。ここでは、プリズム５０３のアレイの出射ビームがミラーアレイ５０４のミラーに当たり、次にミラーアレイの中の個々のミラーを傾斜することにより向けられる。好ましくは、ウォラストンプリズムはビーム分割プリズム５０３として使用される。このセットアップは、欠点なしで両方の個々のセットアップの優位点を結合する。特に好ましい実施形態Ｂの対物レンズの後部開口の中心からの、プリズムの入射ビームの中心の小さな逸脱は、全てのビームが正確に対物レンズの後部開口で結合されるようにミラーを傾けることによって補償できる。また、試料内の同一の焦点は、個々のミラーを傾けることによって所望されるように配置できる。したがって、この実施形態では、プリズム５０３の集合は、ビーム分割装置１０２として機能し、ミラーアレイ５０４は偏向装置１０４として機能する。ウォラストンプリズムの特性のために、このようなセットアップでは、ビーム整形要素は必要とされない。
【００５０】
本発明に従って、検出装置１１０は、多数の体積要素のそれぞれから発生する単一光子の時間分解検出を可能にする方法で配列される。試料内の焦点で蛍光分子により発せられる蛍光の光は顕微鏡対物レンズによって収集され、本発明のセットアップによって生じる入射励起ビームと同じ伝播角度の小さな偏差を持つ出射ビームを、後部開口で生じさせる。それらは、最新の共焦点技法から既知のダイクロイックミラー１０５を通過し、顕微鏡対物レンズの特性あるいは当業者に既知の追加の焦点レンズに応じた位置で焦点を結ばれる。焦点の位置で、少なくとも１つの検出器が、発せられた蛍光の光の輝度又は単一光子を検出するために設置され、好ましい実施形態では、１つの検出器が個々の焦点の全ての蛍光を検出する。特にこの種の好ましい実施形態では、検出器は単一光子カウントが可能であり、１ｎｓ未満の高時間分解能を有する。この特に好ましい実施形態では、前記１つの検出器は個々の焦点に関連付けられた特徴的な様々な到着時間を特定することによって様々な焦点から生じる光子を区別することができる。別の好ましい実施形態では、個々の焦点の蛍光は検出器のアレイで検出される。この種の１つの好ましい実施形態は、同時に１０００×１０００個を超える焦点を検出、分解できる高感度ＣＣＤ（電荷結合素子）である。この種の別の好ましい実施形態は、試料内で生じる個々の焦点の焦点が結ばれた蛍光の位置に置かれた個々の検出器を有し、１ｎｓより良く単一光子の到着時間を分解できる光電子増倍管又はアバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）のアレイである。別の好ましい実施形態は、個々の検出器内で収集された蛍光の光を誘導するファイバの開裂された、あるいは研摩されたファイバ端部のアレイである。
【００５１】
本発明の方法では、信号処理装置１１１は、分析される各試料の構造及び組成、ならびに高速及び高分解能でのこれらのパラメータの時間的な展開についての情報を抽出するために利用される。これは、複数の信号処理モジュールの組み合わせによって実現される。前述されたように、検出装置のそれぞれの個々の検出器は、この検出器に当たる光子のストリームに相当する電子パルスの時間分解ストリームを生成する。前記検出器からのこれらの単一の光子カウント信号は、２つの電子装置に分割される。１つの装置は標準電子ＯＲゲートである。ＯＲゲートの出力は個々の焦点のために全ての検出器によって生成される全ての電子パルスの時間分解された合計である。他の装置はバイナリデコーダである。前記バイナリデコーダの出力は、電子パルスが生成されたときに光子が検出された検出器のアドレスである。両方の出力ともが、電子パルスとレーザトリガ信号の間の距離を計算するｐｓ時間分析器に接続される。この種の装置において単一カウントイベントの検出に関係する不感時間はないため、この電子評価は最高で数ＧＨｚまでの光子カウントバーストレートを評価することができ、３００ｐｓより優れた時間分解能で同時に２００を超える検出器からのカウントを評価できる。したがって、蛍光存続期間の個々の評価又は非常に多数の焦点で測定される光子到着時間が、この方法によるｐｓ時間分解能で可能になる。また、分子変動に基づいた他の全ての共焦方法、及び蛍光に基づいた他の方法は、この装置を用いて個別に焦点ごとに評価できる。また、光子の個々の到着時間は他の測定可能なパラメータ、又は個々の光子のためのそれらの組み合わせに結合できる。複数の焦点及び高速電子獲得は、試料の構造についての情報の抽出も可能にする。
【００５２】
（実験の項）
（例１）
第１の実験では、共焦蛍光一致分析が、本発明の方法の高精度を立証するために使用される。この例の特定のセットアップは図７に示されている。ビームスプリッタ７１３は、蛍光の光を均等に両方の一致チャネルに分割するために使用された。テトラメチルローダミン（ＴＭＲ）溶液が、焦点あたり２０個及び１００個の粒子という濃度で使用された。２光子励起は８３０ｎｍという波長で行われた。測定はそれぞれ１０００ｍｓ、５００ｍｓ、３００ｍｓ、２００ｍｓ、１００ｍｓ及び５０ｍｓで実行された。図示されているのは、１２の焦点に同時に比較される１つの焦点を使用して獲得される比較結果である（図８を参照）。標準偏差は３回の測定から求められ、エラーバーとして示されている。プロットは多焦点セットアップが、同じ標準偏差を維持する一方で焦点の量に比例する係数で測定時間の削減を可能にすることを明確に証明している。多焦点セットアップを使用する１００ｍｓ測定の標準偏差は、１つの焦点を使用する１０００ｍｓ測定の標準偏差よりも優れている。特に非常に短い時間で、統計的な変動が働き始めるとき、結果は多焦点セットアップではるかに正確である。測定は、単一焦点セットアップが受け入れがたく高い統計的なエラーを示す、１００ｍｓより短い測定時間で十分に実行できる。
【００５３】
多焦点セットアップが、同じ標準偏差を維持しつつ、焦点の量に比例する係数で測定時間の削減を可能にすることが明確に理解できる。
【００５４】
（例２）
類似した複数光子を用い、８個の焦点、平均粒子数、及びＣＰＰを備える多焦点セットアップが表１に示されている。再び、８３０ｎｍという励起波長と組み合わされたテトラメチルローダミンが使用された。この表から分かるように、得られた結果は高い均一性を示している。約２０という測定されたＣＰＰは、利用されているＡＰＤ検出器で取得可能な飽和値に近い。この値は色素をフォトブリーチングから保護する揺れ止めを使用するときにさらに上昇することがある。したがって、ＣＰＰ値は、１光子励起で取得可能な値に非常に近い約５０ＣＰＰである。
【表１】
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【００５５】
（例３）
変動分析のための２光子励起を用いて取得される、さらに低いＣＰＰの影響を解明するために、１光子励起を使用する測定が２光子励起を使用する同じ測定と比較された。自由なＴＭＲ色素及びＴＭＲ標識蛋白質ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の拡散時間が測定され、両方の励起オプションについてｚ係数が計算された。１光子励起の場合、励起波長は５４３ｎｍであり、励起電力は約１００μＷであった。２光子励起の場合、励起波長は８４０ｎｍであり、励起電力は約２００ｆｓのパルス幅で約３０ｍＷ、及び９０ＭＨｚの反復レートであった。全ての測定で、測定された粒子番号は焦点あたり５粒子に調整された。ｚ係数は、ｚ＝１−（３σＴＭＲＢＳＡ＋３σＴＭＲ）／（ＸＴＭＲＢＳＡ−ＸＴＭＲ）として計算された。ここでは、ＸＴＭＲＢＳＡ及びＸＴＭＲは、それぞれＴＲＭ標識ＢＳＡとＴＭＲを含んだ試料のＦＣＳ実験で測定された適合拡散時間の１００回の測定の平均値を示している。σＴＭＲＢＳＡ及びσＴＭＲは、対応する平均値の標準偏差である。結果は表２に示されている。前記ｚ係数は２つのアッセイ端点を区別するための生化学アッセイの適性の基準である。０．５を超えるｚ係数のアッセイは、通常十分な分解能を有すると見なされる。表２から分かるように、１つの焦点で２光子励起を使用するアッセイは、１つの焦点で１光子励起を使用するよりわずかに悪く機能するにすぎない。しかしながら、１焦点、１光子測定のｚ係数は、多焦点（１２）２光子セットアップの同じ測定より著しく悪化している。多焦点多光子測定のｚ係数は、生体分子パラメータを決定するためのこの検出技法の実現可能性を示している。これらの結果はさらに図９に描かれている。
【表２】
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【００５６】
（例４）
図１０は、多焦点セットアップを用いて測定されるＴＭＲの存続期間分析を示す。最短の測定時間でさえ、曲線の質は非常に高い。達成された計器反応時間は、これらの実験で使用されたＡＰＤの時間分解能に近い５００ｐｓより低い。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】複数の焦点で画定される、同じ試料体積内の複数の体積要素の中の蛍光パラメータを測定することを可能にする方法及び装置を備える本発明を概略して描く図である。
【図２】複数焦点アレイの生成がミラーアレイにより実現される本発明の実施形態Ａを概略して描く図である。
【図３】ビーム成形要素の使用を示し、実施形態Ａ１は傾斜ＮＤフィルタを使用し、実施形態Ａ２は回折型ビームシェーパーを使用する図である。
【図４】複数焦点アレイの生成をウォラストンプリズムの集合により実現する、本発明の実施形態Ｂを概略して描く図である。
【図５】複数焦点アレイの生成をウォラストンプリズム及びミラーアレイの組み合わせで実現する、本発明の実施形態Ｃを概略して描く図である。
【図６】４つのウォラストンプリズムの本発明による適用で生成される焦点のパターンを示す図である。
【図７】蛍光の光を均等に２つの一致チャネルの上に分割するために使用される追加のビームスプリッタを備える特定のセットアップを描く図である。
【図８】一致値及び蛍光輝度を均等に２つのチャネルの上に分割するビームスプリッタを使用するテトラメチルローダミン（ＴＭＲ）溶液の標準偏差の測定を示し、示されているのは１２焦点セットアップと異なる測定時間での１焦点セットアップでの同じ測定の比較を示す図である。
【図９】ＴＭＲ標識ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と比較されるＴＭＲの拡散時間の１焦点１光子測定のｚ係数の、複数焦点２光子セットアップにおける同じ測定との比較を示す図である。
【図１０】本発明の複数焦点セットアップで測定されるＴＭＲの蛍光存続期間分析を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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