(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリエチレングリコールで修飾されたヘモグロビン、および希釈剤を含む水性無細胞組成物であって、前記ポリエチレングリコール修飾ヘモグロビンの分子サイズが四量体ヘモグロビンの1.7倍を超え、前記組成物中のヘモグロビン濃度が5.5/dlより低く、前記希釈剤が200,000ダルトン〜400,000ダルトンの平均分子量を有するペンタスターチを含む、前記組成物。
【請求項２】
前記水性組成物の前記粘度が2.5〜４cPである、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
前記ポリエチレングリコール修飾ヘモグロビンが、動物ヘモグロビン、ヒトヘモグロビン、および組換えヘモグロビンよりなる群から選択されるヘモグロビンを含んでいる、請求項１〜２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４】
ポリエチレングリコールが分子量5000Daのポリエチレングリコールである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
哺乳動物の組織へ酸素を送達するための医薬の製造における、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
本発明は、契約P01 HL48018により認められた米国国立衛生研究所（National Institues of Health, NIH）による政府の支持によりなされた。アメリカ合衆国政府は、本発明において一定の権利を有する。
発明の分野
本発明は、一般的には血液製剤に関し、さらに詳しくは酸素運搬性および非酸素運搬性血漿増量剤の混合物およびその使用に関する。
発明の背景
Ａ．循環系とヘモグロビンの性質
血液は、組織に栄養物質を供給し、排泄のために組織から廃棄生成物を除去するための手段である。血液は、赤血球（RBC）、白血球（WBC）、および血小板が懸濁された血漿からなる。赤血球は血液中の細胞の約99％を構成し、その主要な機能は組織への酸素の輸送と組織からの二酸化炭素の除去である。
心臓の左心室は、ポンプで血液を循環系の動脈と細動脈に送る。次に血液は毛細管に入り、ここで栄養物質と細胞の廃棄生成物の大部分の交換が起きる。（例えば、A. C. Guyton, 人体生理学と病気のメカニズム（Human Physiology And Mechanisms Of Disease）（第３版；W. B. Saunders Co., Philadelphia, PA）、pp. 228-229[1982]を参照）。次に血液は細静脈および静脈を通過して心臓の右心房に戻る。心臓に戻る血液は心臓から出る血液に比較して酸素が不足しているが、安静時のヒトでは、戻る血液はまだ元々の酸素含量の約75％を有する。
赤血球の可逆的な酸素化機能（すなわち、酸素の供給と二酸化炭素の除去）はタンパク質であるヘモグロビンにより行われる。哺乳動物では、ヘモグロビンは約68,000の分子量を有し、約６％のヘムと94％のグロビンからなる。その本来の型では、赤血球は２対のサブユニットを有し（すなわち、これは４量体である）、各サブユニットはヘム基とグロビンポリペプチド鎖とを含む。水溶液中では、ヘモグロビンは４量体型（分子量68,000）と２量体型（分子量34,000）の間で平衡しており、赤血球の外では２量体は早期に腎臓から排泄される（血漿半減期は約２〜４時間である）。ヘモグロビンとともに赤血球はストロマ（赤血球膜）を有し、これはタンパク質、コレステロール、およびリン脂質を含む。
Ｂ．外来性血液製剤
病院や他の環境における血液製剤の需要のために、代用血液や血漿増量剤の開発を目指した広範な研究が行われている。代用血液は、組織に酸素を運搬し供給することができる血液製剤である。代用血液には多くの用途があり、例えば手術時や急性の出血後に失われた血液の補充、外傷後の蘇生操作がある。血漿増量剤は、血管系に投与される血液製剤であるが、典型的には酸素を運搬することができない。血漿増量剤は例えば、火傷により失われた血漿の補充のために、容量欠乏ショックの治療や血液希釈の治療（例えば、正常血液量の維持や血液粘度を下げるために）に使用される。基本的には血液製剤は、これらの目的や血液銀行の血液が患者に投与される任意の目的のために使用することができる。（例えば、Bonsonらの米国特許第4,001,401号、およびMorrisらの米国特許第4,061,736号を参照されたい。これらは参照により本明細書に組み入れる）。
現在のヒト血液の供給にはいくつかの限界があり、これらは外来性の血液製剤の使用により解決することができる。例えば、安全で有効な代用血液が広く利用できれば、血液銀行の（同種異系の）血液の必要性が低下するであろう。さらにこのような代用血液は、外傷後に交差適合試験（血液の場合は必要である）を考慮する必要なく蘇生溶液をすぐ注入することができ、このため虚血性組織に酸素を供給する貴重な時間を無駄にしないですむ。同様に代用血液は手術前に患者に投与することができ、患者から自己由来の血液を取り出し、これを必要な場合は手術後に戻すことができるであろう。すなわち外来性血液製剤の使用は、非自己の（同種異系の）血液に患者が暴露されることを防ぐのみでなく、自己または同種異系の（血液銀行の、交差適合試験した）血液を最適な使用のために保存する。
Ｃ．現在の代用血液の限界
代用血液（「酸素運搬性血漿増量剤」と呼ばれることもある）を生産するための試みは、いまのところ有効性の小さい製剤しか製造できず、その製造は面倒かつ高価である。このような製剤を製造するためのコストは非常に高いことがしばしばあり、このためこれらの製剤を特に最も必要とする市場（例えば、生まれつつある第３世界）での広範な使用を妨害している。
これまで開発された代用血液は種々の文献に総説がある（例えば、Winslow, Robert M., ”ヘモグロビンベースの代用赤血球（Hemoglobin-based Red Cell Substitutes）”、Johns Hopkins University Press, Baltimore[1992]を参照されたい）。これらは３つに分類される：ｉ）パーフルオロカーボンベースの乳剤、ii）リポソームにカプセル化されたヘモグロビン、およびiii）修飾無細胞ヘモグロビン。修飾無細胞ヘモグロビンを含む製剤が最も有望であると考えられるが、後述するようにいずれも完全に満足できるものではない。パーフルオロ化学物質ベースの組成物は、キレート物質として酸素を結合するのでなくこれを溶解する。生物系で使用するために、パーフルオロ化学物質は脂質、典型的には卵黄リン脂質で乳化しなければならない。パーフルオロカーボン乳剤の製造は安価であるが、臨床的に許容される容量で有効となるのに充分な酸素を運搬できない。逆にリポソームにカプセル化されたヘモグロビンが有効であることが証明されているが、広く使用されるにはあまりにもコストが高い（例えば、前述のWinslowを参照されたい）。今日臨床治験中のほとんどの代用血液製剤は、修飾ヘモグロビンに基づく。これらの製剤はしばしばヘモグロビンベースの酸素運搬体（HBOC）と呼ばれ、一般に化学修飾ヘモグロビンの均一な水溶液であり、本質的に他の赤血球残渣（ストロマ）を含まない。ストロマのないヒトヘモグロビンはHBOCを調製するための最も一般的な原料であるが、他のヘモグロビン源も使用されてきた。例えばヘモグロビンは、動物の血液（例えば、ウシヘモグロビン）、または細菌もしくは酵母、あるいは所望のヘモグロビン産物を産生するように分子的に変化させたトランスジェニック動物から得られるかまたは誘導される（一般的には、前述のWinslowを参照されたい）。
化学的修飾は一般的に、循環中のヘモグロビンの存在が非修飾ヘモグロビンと比較して延長されるようにかつその酸素結合性が血液と同等であるように、ヘモグロビンを修飾するための、分子内架橋および／またはオリゴマー化の１つである。分子内架橋は４量体ヘモグロビン単位のサブユニットを化学的に結合し、既に記載したように早期に排出されてしまう２量体の形成を防ぐ（例えば、Rauschらの米国特許第5,296,465号を参照されたい。これは参照により本明細書に組み入れる）。
HBOC製剤を製造するためのコストが高いために、その販売が大幅に制限されてきた。さらに本発明者は、既知のHBOCが過剰量の酸素を毛細管ではなく細動脈壁の組織に放出する傾向があることを見いだした。このためHBOCにより毛細管の周りの組織に供給するのに利用できる酸素が不充分になる。これは、HBOCへの酸素の初期の添加が比較的高い（たとえ天然の赤血球が通常有する濃度より高くても）のにもかかわらず起きる。
必要とされるのは、比較的安価に製造でき、かつ充分量の酸素を組織に供給する血液製剤である。
発明の概要
本発明は、酸素運搬成分と非酸素運搬成分の混合物を含む組成物、およびその使用方法に関する。本組成物は、従来の代用血液の制限された酸素供給特性を克服し、従って低用量で使用できる。これらは、現在入手できる代用血液よりも安全かつ有効な代用物である。
本発明は、酸素運搬体と従来の血漿増量剤のような非酸素運搬成分とを組合わせることにより、該運搬体の酸素供給能を改善する手段を企図する。好適な実施形態において、酸素運搬体（すなわち、酸素運搬成分）はヘモグロビンベースの酸素運搬体である。ヘモグロビンは未変性（修飾されていない）であり、次に化学反応、例えば、架橋、重合、もしくは他の化学基の付加（すなわち、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレン、または他の付加物）により修飾されるか、またはヘモグロビンは、組み換え体でもリポソームにカプセル化されていてもよい。非酸素運搬性血漿増量剤は、コロイド浸透圧（oncotic pressure）を有する赤血球の一時的代用物として使用される任意の物質である（例えば、ヘタスターチもしくはペンタスターチのようなデンプン、デキストラン−70もしくはデキストラン−90のようなデキストラン、アルブミン、または他の任意のコロイド性静脈用溶液）。
さらに詳しくは、本発明の組成物は以下の性質の１つまたはそれ以上を有する：ｉ）血液の少なくとも半分の粘度、ii）血漿より大きいコロイド浸透圧、iii）血液より大きいかまたはこれと等しいヘモグロビン酸素親和性（すなわち、等しいかまたはより小さいP50）、およびiv）血液より小さい酸素容量。本発明は、本組成物の使用法については限定されない。本発明の組成物について種々の用途が考えられ、例えば出血の治療または血液希釈での使用があるが、これらに限定されない。
特定の非酸素運搬性血漿増量剤が何年も使用（例えば、血液希釈のために）されており、投与後のその生理学的作用はよく特性づけされている。すでに研究者達は、酸素運搬性血液製剤（例えば、HBOCのような代用血液）の投与により、同様の分子量を有する非酸素運搬性希釈剤物質（例えば、デキストラン、分子量70,000、アルブミンおよびデンプン）の投与後に観察されるものと類似の、生理的心血管応答が引き起こされることを想定していた。さらに代用血液の分野の研究者達は、他のいくつかの重要な仮説をもって研究している。さらに詳しくは本発明以前に、代用血液は血液より小さい粘度、赤血球と同様であるか等しいかまたはそれより小さい酸素親和性、最小のコロイド性浸透圧、およびできるたけ高いヘモグロビン濃度を有するべきであると考えられてきた。後に詳述するように、本発明の組成物と方法はこれらの仮定のいくつかの直感的な考えに対抗する。
本発明は、酸素運搬成分と非酸素運搬成分を含有し、血漿より高いコロイド浸透圧と血液の少なくとも半分の粘度を有する血液製剤溶液を企図する。ある実施形態において血液製剤溶液はさらに、血液に等しいかまたはこれより大きい酸素親和性を有する。他の実施形態において血液製剤溶液は、血液より小さい酸素容量をさらに有する。特定の実施形態において、酸素運搬成分はポリエチレングリコール修飾ヘモグロビンである。さらにある実施形態において、非酸素運搬成分はコロイドデンプンである。非酸素運搬成分がコロイドデンプンである場合、これはある実施形態において約200,000ダルトン〜約400,000ダルトンの平均分子量を有する。特定の実施形態においてコロイドデンプンはペンタスターチである。
本発明また、a）ポリエチレングリコール修飾ヘモグロビンを含んでなる酸素運搬成分と、b）約200,000ダルトン〜約400,000ダルトンの平均分子量を有するコロイドデンプンを含んでなる非酸素運搬成分とを含む、血液製剤溶液をも企図する。ある実施形態において、ポリエチレングリコール修飾ヘモグロビンは、動物ヘモグロビン、ヒトヘモグロビン、および組換えヘモグロビンよりなる群から選択されるヘモグロビンを含む。特定の実施形態においてコロイドデンプンは、約225,000〜約300,000ダルトンの平均分子量を有し、別の実施形態においてコロイドデンプンはペンタスターチである。さらに別の実施形態においてペンタスターチは、血液製剤溶液の約20〜約80容量％を構成し、他の実施形態においてペンタスターチは血液製剤の約40〜約60容量％を構成する。さらに、特定の実施形態において、血液製剤溶液は、約２センチポアズから約4.5センチポアズの粘度を有する。
本発明はまた、哺乳動物の組織への酸素供給を増強する方法であって、a）酸素運搬成分と非酸素運搬成分を含み、血漿より高いコロイド浸透圧と血液の少なくとも半分の粘度を有する血液製剤溶液を提供し、そしてb）この血液製剤溶液を哺乳動物に投与し、これにより哺乳動物の組織への酸素供給を増強することを含んでなる上記方法を企図する。ある実施形態において、血液製剤溶液はさらに血液と等しいかまたはこれより大きい酸素親和性を有し、別の実施形態においては血液製剤溶液はさらに、血液より小さい酸素容量を有する。ある実施形態において、酸素運搬成分はポリエチレングリコール修飾ヘモグロビンである。特定の実施形態において非酸素運搬成分はコロイドデンプンであり、ある実施形態においてコロイドデンプンは約200,000ダルトン〜約400,000ダルトンの平均分子量を有する。さらに別の実施形態において、コロイドデンプンはペンタスターチである。
さらに本発明は、哺乳動物の組織への酸素供給を増強する方法であって、a）ｉ）ポリエチレングリコール修飾ヘモグロビンを含んでなる酸素運搬成分と、ii）約200,000ダルトン〜約350,000ダルトンの平均分子量を有するコロイドデンプンを含む非酸素運搬成分とを含んでなる血液製剤溶液を提供し、b）この血液製剤溶液を哺乳動物に投与し、これにより哺乳動物の組織への酸素供給を増強することを含んでなる上記方法を企図する。
ある実施形態においてポリエチレングリコール修飾ヘモグロビンは、動物ヘモグロビン、ヒトヘモグロビン、および組換えヘモグロビンよりなる群から選択されるヘモグロビンを含む。他の実施形態においてコロイドデンプンは、約200,000ダルトン〜約400,000ダルトンの平均分子量を有する。さらに別の実施形態において、コロイドデンプンはペンタスターチである。特定の実施形態においてペンタスターチは、血液製剤の約20〜約80容量％を構成する。
ある実施形態において血液製剤溶液は、約２センチポアズ〜約4.5センチポアズの粘度を有する。最後に他の実施形態において、哺乳動物はヒトである。
本発明はまた、ヘモグロビンを含む水性無細胞組成物であって、ヘモグロビンが0.1〜4.0g/dlの濃度で存在し、該水性組成物が2.5cPより大きい粘度を有する上記組成物を提供する。ある好適な実施形態において、水性組成物の粘度は2.5〜４cPである。すなわち本発明は、約2.5cPより大きい粘度に限定されない。確かに、本発明は粘度が６cPまたはそれ以上である組成物を包含することを企図する。さらに本発明は、ヘモグロビン濃度が0.1g/dl未満であるかまたは４g/dlより大きい組成物を包含するが、特定の好適な実施形態においてヘモグロビン濃度は0.1〜４g/dlである。さらにある実施形態において、組成物のＫ*は、同じヘモグロビン濃度で測定したときの赤血球懸濁液のＫ*とほぼ等しいかまたは同様である。
この組成物の別の実施形態において、ヘモグロビンは赤血球と比較して分子状酸素に対して親和性が上昇している。本発明は、ヒトを含む任意の哺乳動物での使用に適した組成物を提供する。すなわちある実施形態において、本組成物のヘモグロビンは哺乳動物の赤血球に比較して親和性が上昇しているが、他の実施形態において赤血球は、は虫類、鳥類または他の動物由来であることが企図される。最も好適な実施形態において、この比較で使用される赤血球はヒトの赤血球である。好適な実施形態において、組成物は28mmHg未満のP50を有する。別の好適な実施形態において、P50は約１であり、他の実施形態においてそれは１〜1.5の範囲であり、さらなる実施形態においてそれは約10である。しかし本発明は特定のP50値に限定されず、ある実施形態ではP50は28mmHgより大きい。
他の実施形態において本組成物は、タンパク質、糖タンパク質、多糖および他のコロイドよりなる群から選択される希釈剤をさらに含む。これらの実施形態は特定の希釈剤に限定されない。すなわち希釈剤は、アルブミン、他のコロイド、または他の非酸素運搬成分の溶液を包含することを企図する。好適な実施形態において希釈剤は多糖を含む。他の好適な実施形態において多糖はデンプンを含む。特に好適な実施形態においてデンプンはペンタスターチを含む。
他の実施形態において本組成物内のヘモグロビンは表面修飾されている。これらの実施形態は特定のタイプの表面修飾に限定されない。好適な実施形態において表面修飾は、種々の鎖長および電荷を有するポリアルキレンオキシド基の使用を含む。好適な実施形態において、ヘモグロビンは、種々の鎖長および電荷を有するポリエチレングリコールで表面修飾される。表面修飾は特定のタイプまたは単一のタイプの修飾に限定されない。組成物のヘモグロビンに対して複数のタイプの表面修飾が施されることが企図される。
本発明はまた、表面修飾ヘモグロビンを含む水性無細胞組成物であって、表面修飾ヘモグロビンが0.1〜4.0g/dlの濃度で存在し、該水性組成物が2.5cPより大きい粘度を有する上記組成物を提供する。前記したように、ある好適な実施形態において、水性組成物の粘度は2.5〜４cPである。すなわち本発明は、約2.5cPより大きい粘度に限定されない。確かに本発明は、粘度が６cPまたはそれ以上である組成物を包含することが企図される。さらなる実施形態において、ヘモグロビン濃度は0.1g/dl未満であるかまたは４g/dlより大きいが、特定の好適な実施形態においてヘモグロビン濃度は0.1〜４g/dlである。ある実施形態において、組成物のＫ*は、同じヘモグロビン濃度で測定したときの赤血球懸濁液のＫ*とほぼ等しいかまたは同様である。
本組成物の好適な実施形態において、ヘモグロビンは赤血球と比較して分子状酸素に対する親和性が上昇している。前記したようにこれらの実施形態は、ヒトを含む任意の動物での使用に適している。すなわちある実施形態において、ヘモグロビンは哺乳動物の赤血球に比較して親和性が上昇しているが、他の実施形態では赤血球は、は虫類、鳥類、または他の任意の動物由来であることが企図される。最も好適な実施形態において、この比較で使用される赤血球はヒトの赤血球である。他の好適な実施形態において、組成物は28mmHg未満のP50を有する。別の好適な実施形態において、P50は約１であり、他の実施形態においてはこれは１〜1.5の範囲であり、さらに別の実施形態においては、これは約10である。しかし本発明は、特定のP50値に限定されず、ある実施形態ではP50は28mmHgより大きい。
さらに他の実施形態において本発明は、タンパク質、糖タンパク質、多糖、および他のコロイドよりなる群から選択される希釈剤をさらに含む組成物を提供する。これらの実施形態は特定の希釈剤に限定されない。すなわち希釈剤は、アルブミン、他のコロイド、または他の非酸素運搬成分を包含することを企図する。好適な実施形態において希釈剤は多糖を含む。別の好適な実施形態において多糖はデンプンを含む。特に好適な実施形態においてデンプンはペンタスターチを含む。これらの実施形態において、本発明は特定のタイプの表面修飾に限定されない。好適な実施形態において、表面修飾は種々の鎖長および電荷のポリアルキレンオキシドの使用を含む。好適な実施形態において、ヘモグロビンは、種々の鎖長および電荷のポリエチレングリコールで表面修飾されている。
本発明はさらに、ヘモグロビンと希釈剤の混合物を含む水性無細胞組成物であって、ヘモグロビンが0.1〜４g/dlの濃度で存在し、希釈剤が、タンパク質、糖タンパク質、多糖、および他のコロイドよりなる群から選択され、該水性組成物が少なくとも2.5cPの粘度を有する上記組成物を提供する。前記したようにある好適な実施形態において、水性組成物の粘度は2.5〜４cPである。すなわちこれらの実施形態は、約2.5cPより大きい粘度に限定されない。確かに本発明は、粘度が６cPまたはそれ以上である組成物を包含することが企図される。さらにある実施形態において希釈剤は多糖を含み、好適な実施形態において希釈剤はデンプンを含み、特に好適な実施形態において希釈剤はペンタスターチを含む。さらに本発明は、ヘモグロビン濃度が0.1g/dl未満であるかまたは４g/dlより大きい組成物を包含するが、特に好適な実施形態において、ヘモグロビン濃度は0.1〜４g/dlである。ある実施形態において、組成物のＫ*は、同じヘモグロビン濃度で測定したときの赤血球懸濁液のＫ*とほぼ等しいかまたは同様である。
ある実施形態において組成物は、赤血球と比較して分子状酸素に対する親和性が上昇しているヘモグロビンを含む。本発明は、ヒトを含む任意の動物での使用に適した組成物を提供する。すなわちある実施形態においてヘモグロビンは、哺乳動物の赤血球と比較して親和性が上昇しているが、他の実施形態において赤血球は、は虫類、鳥類、または他の任意の動物由来であることが企図される。最も好適な実施形態において、この比較で使用される赤血球はヒト赤血球である。好適な実施形態において、組成物は28mmHg未満のP50を有する。別の好適な実施形態においてP50は約１であり、他の実施形態ではこれは１〜1.5の範囲であり、さらに別の実施形態においてこれは約10である。しかし本発明は特定のP50値に限定されず、ある実施形態ではP50は28mmHgより大きい。
前記したようにこれらの実施形態はまた、表面修飾されたヘモグロビンを含んでもよい。本発明は特定のタイプの表面修飾に限定されない。好適な実施形態において表面修飾は、種々の鎖長および電荷を有するポリアルキレンオキシド基の使用を含む。好適な実施形態において、ヘモグロビンは種々の鎖長および電荷を有するポリエチレングリコールで表面修飾されている。
本発明はまた、動物と、ヘモグロビンを含む水性無細胞組成物（ここで、ヘモグロビンは0.1〜4.0g/dlの濃度で存在し、該水性組成物は2.5cPより大きい粘度を有する）とを提供し、該水性組成物を該動物に投与すること、を含んでなる方法をも提供する。好適な実施形態において、動物は哺乳動物であり、特に好適な実施形態において動物はヒトである。ある実施形態においてヒトは、疾患、病理、不全症、または異常の症状を患っている。ある実施形態においてヒトは、血液量減少ショック症状、低酸素症、慢性肺疾患、虚血、発作、外傷、血液希釈、心臓麻痺、癌、貧血、鎌状赤血球貧血、敗血症ショック、または播種性血管内凝固よりなる群から選択される疾患の症状を有する。しかし本発明の方法は、特定の疾患、症状、病理、不全症、または異常を緩和するための水性組成物の投与に限定されない。むしろ本方法は、本方法が適切な任意かつすべての応用を包含する。
前記したように本発明の方法は、ヘモグロビンを含む水性無細胞組成物であって、ヘモグロビンが0.1〜4.0g/dlの濃度で存在し、水性組成物が2.5cPより大きい粘度を有する上記組成物を包含する。ある好適な実施形態において、水性組成物の粘度は2.5〜４cPである。すなわち本発明は、約2.5cPより大きい粘度に限定されない。確かに、本発明は粘度が６cPまたはそれ以上である組成物を包含することを企図する。さらに本発明は、ヘモグロビン濃度が0.1g/dl未満であるかまたは４g/dlより大きい組成物を包含するが、特定の好適な実施形態においてヘモグロビン濃度は0.1〜４g/lである。ある実施形態において、組成物のＫ*は、同じヘモグロビン濃度で測定したときの赤血球懸濁液のＫ*とほとんど等しいかまたは同様である。
別の実施形態において組成物は、赤血球と比較して分子状酸素に対して親和性が上昇しているヘモグロビンを含む。さらにこれらの実施形態は、ヒトを含む任意の哺乳動物での使用に適する。すなわちある実施形態において、ヘモグロビンは哺乳動物の赤血球に比較して親和性が上昇しているが、他の実施形態において赤血球は、は虫類、鳥類または他の動物由来であることが企図される。最も好適な実施形態において、この比較で使用される赤血球はヒトの赤血球である。好適な実施形態において、組成物は28mmHg未満のP50を有する。別の好適な実施形態において、P50は約１であり、他の実施形態においてそれは１〜1.5の範囲であり、さらに別の実施形態においてそれは約10である。しかし本発明は特定のP50値に限定されず、ある実施形態ではP50は28mmHgより大きい。
他の実施形態において本組成物は、タンパク質、糖タンパク質、多糖、および他のコロイドよりなる群から選択される希釈剤をさらに含む。本発明は特定の希釈剤に限定されない。すなわち希釈剤は、アルブミン、他のコロイド、または他の非酸素運搬成分の溶液を包含することを企図する。好適な実施形態において希釈剤は多糖を含む。他の好適な実施形態において多糖はデンプンを含む。特に好適な実施形態においてデンプンはペンタスターチを含む。
さらに別の実施形態において本組成物内のヘモグロビンは表面修飾されている。本発明は特定のタイプの表面修飾に限定されない。好適な実施形態において表面修飾は、種々の鎖長および電荷を有するポリアルキレンオキシド基の使用を含む。好適な実施形態において、ヘモグロビンは種々の鎖長および電荷を有するポリエチレングリコールで表面修飾されている。
本発明はまた、動物の臓器と、ヘモグロビンを含む水性無細胞組成物（ここで、ヘモグロビンは0.1〜4.0g/dlの濃度で存在し、該水性組成物は2.5cPより大きい粘度を有する）を提供する工程と；該水性組成物で該臓器を潅流する工程とを含む方法を提供する。好適な実施形態において、動物は哺乳動物であり、特に好適な実施形態において動物はヒトである。しかし本方法はヒトまたは哺乳動物に限定されない。好適な実施形態において臓器は、腎臓、肝臓、脾臓、心臓、膵臓、肺、および筋肉よりなる群から選択されるが、本発明の方法はこれらの臓器に限定されず、本発明の水溶液により任意の臓器が潅流され得る。
本方法のある好適な実施形態において水性組成物の粘度は2.5〜４cPである。すなわち本発明は約2.5cPより大きい粘度に限定されない。確かに、本発明は粘度が６cPまたはそれ以上である組成物を包含することを企図する。さらに本発明は、ヘモグロビン濃度が0.1g/dl未満であるかまたは４g/dlより大きい組成物を包含するが、特定の好適な実施形態においてヘモグロビン濃度は0.1〜４g/dlである。ある実施形態において、組成物のＫ*は、同じヘモグロビン濃度で測定したときの赤血球懸濁液のＫ*とほとんど等しいかまたは同様である。
これらの実施形態はまた、赤血球と比較して分子状酸素に対して親和性が上昇しているヘモグロビンを含む組成物を提供する。前記したようにこれらの実施形態は、ヒトを含む任意の哺乳動物での使用に適している。すなわちある実施形態において、ヘモグロビンは哺乳動物の赤血球に比較して親和性が上昇しているが、他の実施形態において赤血球は、は虫類、鳥類または他の動物由来であることが企図される。最も好適な実施形態において、この比較で使用される赤血球はヒトの赤血球である。好適な実施形態において、組成物は28mmHg未満のP50を有する。別の好適な実施形態において、P50は約１であり、他の実施形態においてそれは１〜1.5の範囲であり、さらなる実施形態においてそれは約10である。しかし本発明は特定のP50値に限定されず、ある実施形態ではP50は28mmHgより大きい。
他の実施形態において本組成物は、タンパク質、糖タンパク質、多糖、および他のコロイドよりなる群から選択される希釈剤をさらに含む。本発明は特定の希釈剤に限定されない。すなわち希釈剤は、アルブミン、他のコロイド、または他の非酸素運搬成分の溶液を包含することを企図する。好適な実施形態において希釈剤は多糖を含む。他の好適な実施形態において多糖はデンプンを含む。特に好適な実施形態においてデンプンはペンタスターチを含む。
さらに別の実施形態において本組成物内のヘモグロビンは表面修飾されている。本発明は特定のタイプの表面修飾に限定されない。好適な実施形態において表面修飾は、種々の鎖長および電荷を有するポリアルキレンオキシド基の使用を含む。好適な実施形態においてヘモグロビンは、種々の鎖長および電荷を有するポリエチレングリコールで表面修飾されている。
本発明は特定のコロイド浸透圧に限定されない。確かに、本発明の組成物はある範囲のコロイド浸透圧を包含する。ある実施形態において、コロイド浸透圧の範囲は70〜80mmHgであり、最も好適な実施形態においてコロイド浸透圧は約90mmHgである。しかし他の実施形態においては、コロイド浸透圧は60mmHgと低いこともある。さらに本発明は、低張、高張、および等張を包含する。本明細書において「高張性」という用語は、25mmHgより大きい任意のコロイド浸透圧を包含するが、好適な実施形態においては20〜60mmHgのコロイド浸透圧を有する溶液が提供される。本発明の方法のある実施形態において、投与のために選択された組成物は、動物の特定のニーズに合うように作られている。本発明は、種々の臨床的および獣医的用途を満足するように、組成物を作成するための手段を提供する。
図１９は、種々のヘモグロビン調製物のヘモグロビン濃度と粘度を示すグラフである。このグラフ内の四角（すなわち、約2.5〜４cPおよび0.1〜４g/dlのヘモグロビン）は、本発明の最も好適な組成物の性質を示す。記載されるように、基準を満たす唯一のヘモグロビン溶液は、本発明の方法に従って作製された”Hemospan”溶液である。このグラフ中の他の試料は、血液、ＰＥＧ−Ｈｂ（Enzon）、ＰＨＰ（Apex）とαα-ヘモグロビン（US Army）を含む。さらに後で詳述されるように、本発明の組成物の特性は、未知の予期されない利点を多く提供する。
本発明はさらにi）リガンドが結合したヘモグロビン、ii）ヘモグロビンを処理するための手段、およびiii）ヘモグロビンの表面を装飾する手段を提供すること；リガンドが結合したヘモグロビンを、リガンドが結合していないヘモグロビンよりも分子状酸素に対して強い親和性を有する、処理したヘモグロビンが産生されるような条件下で処理手段で処理すること；および、処理したヘモグロビンを表面装飾手段で装飾すること、を含んでなる方法を提供する。
本方法のある実施形態において処理するための手段は、架橋手段と重合手段よりなる群から選択される。別の実施形態において工程（ｃ）の表面装飾は、処理したヘモグロビンをポリアルキレンオキシドと反応させることを含んでなる。
本発明はまた、i）リガンドが結合したヘモグロビン、ii）架橋手段および重合手段よりなる群から選択される、ヘモグロビンを処理するための手段、およびiii）ヘモグロビンの表面を装飾する手段を提供すること；リガンドが結合したヘモグロビンを、リガンドが結合していないヘモグロビンよりも分子状酸素に対して強い親和性を有する、処理したヘモグロビンが産生されるような条件下で処理手段で処理すること；および、処理したヘモグロビンを表面装飾手段で装飾すること、を含んでなる方法を提供する。本方法のある実施形態において工程（ｃ）の表面装飾は、処理したヘモグロビンをポリアルキレンオキシドと反応させることを含んでなる。
本発明はまた、i）ヘモグロビン、ii）ヘモグロビンを酵素的に処理するための手段（例えば、カルボキシペプチダーゼのような酵素）、およびiii）ヘモグロビンの表面を装飾する手段を提供すること；リガンドが結合したヘモグロビンを、赤血球中のヘモグロビンよりも分子状酸素に対して強い親和性を有する、酵素的に処理したヘモグロビンが産生されるような条件下で酵素的処理手段で処理すること；および、酵素的に処理したヘモグロビンを表面装飾手段で装飾すること、を含んでなる方法を提供する。
定義
以下の開示内容に示す本発明をより理解し易くするために、いくつかの用語を以下に定義する。
用語「血液より低い酸素容量」とは、本発明の血液製剤溶液の酸素容量を血液のそれと比較した時、血液製剤溶液の酸素容量がより低いことを意味する。本発明の血液製剤溶液の酸素容量が、血液のそれよりある特定の量だけ低くなければならないということではない。１グラムのヘモグロビンは1.34mlの酸素に結合するため、酸素容量は一般にヘモグロビン濃度から計算される。すなわちヘモグロビン濃度（g/dl）に係数1.34を掛けると、酸素容量（ml/dl）が得られる。本発明はヘモグロビン濃度を測定するための適当な市販の装置（例えば、B-Hemoglobin Photometer（Hemocue, Inc.））の使用を意図している。同様に酸素容量は、例えば燃料電池装置（例えば、Lex-O2-Con; Lexington Instruments）を使用して、ヘモグロビンまたは血液の試料から放出される酸素の量から計算することができる。
用語「血液と等しいかまたはそれより高い酸素親和性」とは、本発明の血液製剤溶液の酸素親和性を血液のそれと比較した時、血液製剤溶液の酸素親和性がより高いことを意味する。本発明の血液製剤溶液の酸素容量は、血液のそれよりある特定の量だけ高くなければならないということでなはい。全血（および赤血球やヘモグロビンのような全血の成分）の酸素親和性は、当該分野で公知の種々の方法により測定することができる（例えば、VandegriffとShrager、Methods in Enzymology（Everseら、編）232:460[1994]を参照されたい）。好適な実施形態において酸素親和性は、市販のHEMOX▲Ｒ▼ Analyzer（TCS Medical Products）を使用して定量してもよい（例えば、Winslowら、J. Biol. Chem., 252（7）:2331-37[1977]を参照されたい）。
用語「血漿より高いコロイド浸透圧」とは、本発明の血液製剤溶液のコロイド浸透圧を血漿のそれと比較した時、血液製剤溶液のコロイド浸透圧がより高いことを意味する。本発明の血液製剤溶液のコロイド浸透圧は、血液のそれよりある特定の量だけ高くなければならないということではない。コロイド浸透圧は任意の適当な技術により測定でき、好適な実施形態においてコロイド浸透圧はColloid Osmometer（Wesco model 4420）を使用して測定される。
用語「血液の少なくとも半分の粘度」とは、本発明の血液製剤溶液の粘度を血液のそれと比較した時、血液製剤溶液の粘度が血液の少なくとも50％であることを意味し、さらに粘度は血液のそれより高くてもよい。好ましくは粘度は、標準的な技術を使用して毛管粘度計で37℃で測定される（Reinhartら、L. Lab. Clin. Med. 104:921-31[1984]を参照されたい）。さらに粘度は他の方法（例えば、Brookfieldから販売されているような回転コーンアンドプレート（cone-and-plate）粘度計）を使用して測定することができる。血液の粘度は約４センチポアズである。すなわち血液値の少なくとも半分は、少なくとも約２センチポアズに相当する。
用語「血液製剤」とは、体の循環系に導入することができ、組織に酸素を運搬し供給することができる製剤を広く意味する。用語「血液製剤」は、通常の製剤、例えば、液体を含有する製剤および／または体の循環系を通常通過する細胞成分（例えば、血小板混合物、血清、および血漿があるが、これらに限定されない）などを含有する製剤を含むが、本発明の好適な血液製剤は「血液製剤混合物」である。本明細書において血液製剤混合物は、非酸素運搬成分と酸素運搬成分を含む。
用語「酸素運搬成分」とは、体の循環系で酸素を運搬することができ、その酸素の少なくとも１部を組織に供給することができる物質を広く意味する。好適な実施形態において、酸素運搬成分は未変性のヘモグロビンまたは修飾ヘモグロビンである。本明細書において用語「ヘモグロビン」とは、酸素を運搬することができる赤血球中に通常見られる呼吸系タンパク質を意味する。修飾ヘモグロビンは、例えば、架橋、重合、または化学基（例えば、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレン、または他の付加物）の添加のような化学反応により修飾されるヘモグロビンを含むが、これらに限定されない。同様に修飾ヘモグロビンはリポソームにカプセル化されたヘモグロビンを含む。
本発明は、ヘモグロビンの供給源によって限定されるものではない。例えばヘモグロビンは動物およびヒトから誘導することができ、ヘモグロビンの好適な供給源はウシとヒトである。さらにヘモグロビンは、他の方法（組換え技術を含む）により産生してもよい。本発明の最も好適な酸素運搬成分は、「ポリエチレングリコール修飾ヘモグロビン」である。
用語「ポリエチレングリコール修飾ヘモグロビン」とは、ポリエチレングリコール（α−ヒドロ−ω−ヒドロキシポリ−（オキシ−１，２−エタンジイル）と会合するように修飾されているヘモグロビンを意味し、一般に修飾は、ヘモグロビンへのポリエチレングリコール（PEG）の共有結合を包含する。ＰＥＧは、一般化学式H（OCH2CH2）nOH（式中、ｎは４より大きいかまたはこれと等しい）の液体および固体ポリマーである。ＰＥＧ製剤は通常、平均分子量に対応する数字が付いている。例えばPEG-200は分子量200を有し、分子量の範囲は190〜210である。PEGは多くの製剤として市販されている（例えば、Carbowax、Poly-G、およびSolbase）。
用語「非酸素運搬成分」とは、例えば喪失された赤血球の一時的補充のために投与することができる血漿増量剤のような物質を広く意味する。本発明の好適な実施形態において、非酸素運搬成分はコロイド浸透圧（コロイド浸透圧は、例えば血漿の液体が毛細管から漏れて間質液に入ることを防ぐ）を有するコロイド（すなわち、気体、液体、または固体媒体中に分散された微細な状態の分子を含有する物質）である。コロイドの例には、ヘタスターチ、ペンタスターチ、デキストラン-70、デキストラン-90、およびアルブミンがある。
本発明の好適なコロイドは、ヘタスターチおよびペンタスターチのようなデンプンを含む。ペンタスターチ（ヒドロキシエチルデンプン）は、本発明の好適なコロイドデンプンである。ペンタスターチは、ほとんど全てアミロペクチンからなるデンプンより誘導される人工コロイドである。そのモル置換は0.45（すなわち、100グルコース単位ごとに45ヒドロキシエチル基がある）であり、ヒドロキシエチル基は、主にグルコース単位のC-2（および、あまり頻繁ではないがC-3とC-6）でエーテル結合により結合している。ペンタスターチの重合グルコース単位は、一般的に1-4結合（および、あまり頻繁ではないが1-6結合）により結合しているが、分岐の程度は約1:20（すなわち、20個のグルコース単量体単位ごとに１つの分岐がある）である。ペンタスターチの重量平均分子量は約250,000であり、約150,000〜350,000の範囲である。特に明記しない場合は、「平均分子量」とは重量平均分子量を意味する。ペンタスターチは10％溶液（すなわち、10g/100ml）として市販されている（例えば、DuPont Merck）。特に明記しない場合は、ペンタスターチを有する血液製剤溶液（および他の非酸素運搬成分ならびに酸素運搬成分）について言及する場合は、容量を基準とする。
用語「哺乳動物の組織への酸素供給の増強」とは、液体を導入しない時より多くの酸素を組織へ供給する、循環系に導入される液体（例えば、血液製剤）の能力を意味する。例えば、患者が急性の出血後にかなりの血液を喪失すれば、血液を介する組織への酸素の輸送が低下する。この患者に血液製剤を投与すると、患者自身の血液が酸素を供給する能力を補充することができる。
用語「混合物」とは、個々の性質を失うような反応が起きることなく、２つまたはそれ以上の物質が混在することを意味する。用語「溶液」とは液体混合物を意味する。用語「水溶液」」とは、ある程度の水を含有する溶液を意味する。多くの例において水は、固体物質を含有する溶液を作製するためにこれらの物質の希釈剤として作用する。他の例では固体物質は、単に水溶液中で運搬されるのみである（すなわち、これらはその中に溶解していない）。水溶液という用語はまた、１つまたはそれ以上の他の液体物質が水と組合わさって多成分溶液を形成することも意味する。
用語「約」とは、実際の値が記載の値のある範囲にあることを意味する。一般に実際の値は、記載値の10％（プラスまたはマイナス）の間である。
図面の説明
図１Ａ〜Ｂは、動脈中の全血（図１Ａ）とヘモグロビン系酸素運搬体（図１Ｂ）の流れを示す断面概略図である。
図２は、デキストラン血液希釈と生理食塩水血液希釈によるヘマトクリットの低下の関数として、微小循環の流速をプロットしたものを示す。
図３は、HemoLink▲Ｒ▼（▼）、ペンタスターチ（▲）、およびHemoLink▲Ｒ▼＋ペンタスターチの50/50（容量／容量）混合物（▽）で交換輸血（矢印）をする前およびその最中のラットの平均動脈血圧のグラフを示す。
図４は、HemoLink▲Ｒ▼（▼）、ペンタスターチ（▲）、およびHemoLink▲Ｒ▼＋ペンタスターチの50/50（容量／容量）混合物（▽）で交換輸血をした後で60％の血液容量の出血中の、ラットの平均動脈血圧のグラフを示す。
図５は、ペンタスターチ（▲）、αα-Hb（■）、PEG-Hb（●）、ペンタスターチ＋αα-Hb（□）、およびペンタスターチ＋PEG-Hb（○）で交換輸血をした後で60％出血を開始させたラットの生存を示す。
図６Ａ〜Ｄは、対照ラット（◆）と、ペンタスターチ（▲）、αα-Hb（■）、PEG-Hb（●）、ペンタスターチ＋αα-Hb（□）、およびペンタスターチ＋PEG-Hb（○）で交換輸血をした後で60％出血の開始後のラットの酸−塩基状態のグラフを示す。図６ＡはPaO2を、図６ＢはPaCO2を、図６Ｃは動脈ｐＨを、そして図６Ｄは塩基過剰を示す。
図７は、対照ラット（◆）と、ペンタスターチ（▲）、αα-Hb（■）、PEG-Hb（●）、ペンタスターチ＋αα-Hb（□）、およびペンタスターチ＋PEG-Hb（○）で交換輸血をした後で60％出血を開始させたラットの乳酸産生のグラフを示す。
図８Ａは、対照ラット（◆）と、ペンタスターチ（▲）、PEG-Hb（●）、およびペンタスターチ＋PEG-Hb（○）で30分前に交換輸血をした後で０分目に60％出血開始させたラットの平均動脈血圧を示す。
図８Ｂは、対照ラット（◆）と、ペンタスターチ（▲、Ｂ点）、αα-Hb（■、Ｂ点）、およびペンタスターチ＋αα-Hb（□、Ａ点）で交換輸血をした後で60％出血を開始させた（Ｃ点）ラットの平均動脈血圧を示す。
図９は、対照ラット（◆）と、ペンタスターチ（▲）、αα-Hb（■）、PEG-Hb（●）、およびペンタスターチ＋PEG-Hb（○）で交換輸血をした後で０分目に60％出血を開始させたラットの心搏出量を示す。
図10は、対照ラット（◆）と、ペンタスターチ（▲）、αα-Hb（■）、PEG-Hb（●）、およびペンタスターチ＋PEG-Hb（○）で交換輸血をした後で０分目に60％出血を開始させたラットの全身血管抵抗を示す。
図11は、ペンタスターチ（▲）、αα-Hb（■）、およびペンタスターチ＋αα-Hb（□）で交換輸血をした後で60％出血を開始させた動物の生存を示す。
図12は、ヘタスターチ（×）、HemoLink▲Ｒ▼（▼）、HemoLink▲Ｒ▼＋ペンタスターチ（▽）、およびヘタスターチ＋HemoLink▲Ｒ▼（◇）で交換輸血をした後で60％出血を開始させた動物の生存を示す。
図13は、Kroghシリンダーの図を示す。
図14は、毛細管系の概略図を示す。
図15は、赤血球、A0ヘモグロビン、αα-ヘモグロビン、およびPEG-Hbの、排出PO2を滞留時間と比較したグラフである。
図16は、赤血球、A0ヘモグロビン、αα-ヘモグロビン、およびPEG-Hbの、飽和を滞留時間と比較したグラフである。
図17は、赤血球、A0ヘモグロビン、αα-ヘモグロビン、およびPEG-Hbの、Ｋ*を滞留時間と比較したグラフである。
図18は、A0ヘモグロビン、αα-ヘモグロビン、およびPEG-HbのMAPの経時変化を示すグラフである。
図19は、種々のヘモグロビン溶液のヘモグロビン濃度と粘度を示すグラフである。
発明の説明
本発明は、一般的には血液製剤に関し、さらに詳しくは酸素運搬成分と非酸素運搬成分の混合物を含む組成物、およびその使用方法に関する。本発明の組成物と方法により、ヘモグロビン系酸素運搬体の酸素供給能が改良される。一般に本発明の組成物は、以下の性質の１つまたはそれ以上を示す：ｉ）血液の少なくとも半分の粘度、ii）血漿より高いコロイド浸透圧、iii）血液より高いかまたはこれに等しいヘモグロビン酸素親和性（すなわち、P50は血液と等しいかまたはこれより低い）、およびiv）血液より低い酸素容量。組織の酸素添加の点でHBOCが運搬する酸素がより効率的に利用されるためには、本発明の組成物は、実質的に低下したヘモグロビン含量を有し、一般により安価に製剤化できる。
本発明の説明は、Ｉ）酸素供給と消費の性質、II）ヘモグロビン系酸素運搬体の促進拡散と設計、III）本発明の臨床的および他の応用、IV）本発明の血液製剤の酸素運搬成分、Ｖ）本発明の血液製剤の非酸素運搬成分、およびVI）血液製剤組成物、に分けられる。各節を以下に順番に説明する。
Ｉ．酸素供給と消費の性質
本発明の組成物と方法を使用するのに酸素供給と消費の基礎的機序の理解は必要ないが、これらの推定機序の一部に関する基礎的知識は、以下の説明を理解する助けとなるであろう。前記したように毛細管は組織への酸素の主要な運搬体であると一般的に考えられているが、休止中の組織に関して現在の知見は、細動脈と毛細管の酸素放出はほぼ同等であることを示す。すなわち動脈系におけるヘモグロビンは、酸素含量の約３分の１を細動脈ネットワークに供給し、３分の１を毛細管に供給し、残りは静脈系を介して微小循環に出て行く。動脈自身は酸素利用の部位を構成する（例えば、動脈壁は、血管抵抗に対して収縮して血流を制御するのにエネルギーを必要とする）。すなわち動脈壁は通常、血液からの酸素拡散のための重要な部位である。しかし現在の酸素供給組成物（例えば、HBOC）はあまりにも多くの酸素含量を動脈系で放出するため、毛細管潅流において自己制御的低下を誘導する。
血管壁による酸素消費速度（すなわち、機械的作業に必要な酸素と生化学的合成に必要な酸素の組合せ）は、血管壁での勾配を測定することにより決定することができる。現在の技術は、50ミクロンのオーダーの直径で、血管中の酸素分圧の正確な測定を可能にする。測定された勾配は、測定領域での組織による酸素の利用速度に正比例する。このような測定は、血管壁がベースラインの酸素利用を有し、炎症と収縮で上昇し、弛緩により低下することを示す。
血管壁勾配は組織酸素付加に反比例する。血管収縮は酸素勾配（組織代謝）を上昇させ、血管拡張は勾配を低下させる。勾配が大きいことは血管壁がより多くの酸素を使用することを示し、組織が利用できる酸素がより少ないことを示す。同じ現象が、微小循環中に存在すると考えられる。
本発明は、従来の酸素運搬溶液（例えば、HBOC）の投与により血中PO2が上昇するが（これは、例えば血液希釈により得られる）、変化した血流特性とその結果の循環液体の血液酸素運搬能の見かけ上有効な結果は、重要な欠点を有していることを示す。すなわち酸素を運搬するヘモグロビンが、赤血球中に含有されている場合と異なって血管中に均等に分布している時、酸素供給に影響を与える異なるセットのファクターが作用する。本発明は、すなわち酸素運搬成分（例えば、修飾ヘモグロビン）と非酸素運搬成分（例えば、デキストランやペンタスターチのような非タンパク質性コロイド）の水溶液を提供かつ使用して、これらの欠点を緩和する手段を提供する。特に本発明の組成物は、通常のHBOCよりはるかに少ないコストで製造でき、粘度の上昇した代用血液を与えることができる。
図１Ａは、流路の周りに壁（2）を有する細動脈の断面を概略で示す。壁はまた、筋肉（1）に囲まれる。前記したように通常の全血は、基本的に赤血球（3）と血漿（4）とからなる。血液により運搬される実質的にすべて（約97％）の酸素は、ヘモグロビンに会合して赤血球（3）の内部にあり、酸素の約３％のみが血漿成分中にある。
従って動脈壁（2）が利用できる酸素は、赤血球の表面積と赤血球膜を介する酸素の拡散速度および周囲のかき乱されていない血漿により制限される。動脈壁は、赤血球間の間隔と赤血球から壁への平均拡散距離に比例する量の酸素を受け取る。
比較のために図１Ｂは、全血と混合したHBOC（5）で動脈を潅流した時の酸素供給の略図を示す。この場合、酸素に直接結合するHBOCの成分はHBOC（5）中に均一に分布しており、酸素は動脈壁（2）の全表面部分に拡散するのに利用できる。すなわち動脈壁（2）への酸素の利用可能性は大幅に上昇しており、有効に動脈系のPO2の上昇を引き起こす。本発明は正確な機序の理解を必要としないが、組織のPO2を維持するために、動脈壁と筋肉の反応（例えば、エネルギー消費性血管収縮作用の結果としての血管の細胞成分の代謝の増加）が起きると考えられ、これは、細動脈の酸素分圧を一定に維持するための動脈壁の酸素分圧の大きな勾配の確立により証明される。その結果、動脈壁で血液−HBOC混合物からの酸素の過剰の喪失があり、同時に組織への毛細管供給に利用できる酸素が不足する。
本発明を実施するのに基礎的機序の正確な理解は必要ないが、本発明は、HBOCが動脈壁でそれが運搬する酸素を過剰に放出し、このため動脈壁が過剰の酸素と反応し毛細管での酸素不足を引き起こすという発見に基づく。上記したように研究者達は以前、代用血液（例えば、HBOC）の投与により、同様の分子量を有する非酸素運搬性の希釈物質の投与で観察されるものと似た生理的心血管応答が起きるはずであると仮定した。しかしHBOCは、非酸素運搬性血漿増量剤でみられるようなものとは異なる生理反応を引き起こすことが観察されている。組成物に固有の酸素供給能の維持を伴う（すなわち、血液代替組成物はそれ自身が酸素運搬体であるため）赤血球の希釈は、循環系の酸素の分布を変化させ、細動脈セグメントにおけるPO2を上昇させる。さらに後述するように、これは動脈壁の裏側の筋肉の反応から過剰の酸素利用性につながると考えられる。これに対して本発明の組成物は、毛細管周囲の組織への酸素供給を上昇させる。
前記考察で示したように、血液製剤の適切性は、その全身的作用の分析、かつ循環液体の改変された輸送と併せて、そのような作用が如何に微小循環機能に影響を与えるか、により決定される。
II. ヘモグロビン系酸素運搬体の促進拡散と設計
血管収縮は、安全で有効な赤血球代用物の開発において最も複雑な問題である。動物やヒトに注入されると多くのヘモグロビン系溶液は、重大な高血圧、血管抵抗の上昇、および酸素輸送の低下を引き起こす。この現象は、臨床的使用のモデル（Hessら、J. Appl. Physiol., 74:1769-78[1993]、Keipertら、Transfusion 33:701-8[1993]）およびヒト（Kasperら、Biochem., 31:7551-9[1992]）で体循環および肺循環で観察されている。
血管活性は通常、ヘモグロビンが血管内皮由来拡張因子である酸化窒素と結合する結合活性（avidity）に由来する。しかしモデルヘモグロビンのNO親和性は、ラットの平均動脈血圧に対する作用と相関せず（Rohlfsら、R. M. Winslowら（編）、Advances in Blood Substitutes. Industrial Opportunities and Medical Challenges, Birkhauser, Boston[1997], pp. 298-327[1997]）、HbO2の拡散によるO2の過剰供給またはHbNOの拡散によるNOの除去は、さらなる（排他的ではないが）役割も果たすことが可能である。
赤血球と比較して無細胞ヘモグロビンによるO2の取り込み速度と放出速度の上昇が予測され（例えば、Homer, Microvasc. Res., 22:308-23[1981]；FederspielとPopel、Microvase. Res., 32:164-189[1986]を参照されたい）、in vitroで証明されている（Pageら、R. M. Winslowら（編）、Blood Substitutes: New Challenges、Birkhauser, Boston[1996], pp. 132-145）。しかし無細胞ヘモグロビンによるin vivoでのO2拡散による輸送の上昇を証明する試みはうまくいっていない（Biro, Can. J. Physiol. Pharmacol., 69:1656-1662[1991]；Hoganら、Adv. Exp. Med. Biol., 361:375-378[1994]；およびHoganら、J. Appl. Physiol., 361:2470-5[1992]を参照されたい）。本発明を構成し利用するためには機序の理解は必要ではないが、本発明の開発中に、人工毛細管での測定により無細胞ヘモグロビンは確かに周りの媒体へのO2の利用可能性を上昇させることが測定され、証明された。
正常な血液では、O2は単純拡散により赤血球から血管壁に移動する。血漿間隙中にヘモグロビンが存在する時、O2はまたHbO2としてヘモグロビンに結合して移動する。この第２のプロセスは「促進拡散」と呼ばれる。本発明の開発中に、この促進拡散を調節する無細胞ヘモグロビンの性質が確認された。この知見を使用して、促進拡散の低下による赤血球の拡散性O2輸送と類似の拡散性O2輸送を示すヘモグロビンを調製した。これらの例の分子は動物で血管収縮を引き起こさないことも確認された。驚くべきことに、血管活性を避けかつ赤血球代用物として成功させるために、粘度の上昇、O2親和性の上昇（P50の低下）と分子サイズの増大が無細胞ヘモグロビンにとって重要な性質であることが見いだされた。
さらに本発明は、酸素親和性、粘度および分子サイズに関してヘモグロビン系代用血液の最適な性質に関する教示と、人工毛細管に基づく装置によるそのような生成物を評価するための方法を提供する。この方法は、代用血液がin vivoの気体輸送のモデルとして毛細管膜を横切ってO2（または他の任意の気体、例えばCO2、NO、もしくはCO）を輸送する代用血液の能力の定量的測定を可能にする。
Ａ．促進拡散
本発明の開発中に予想外に、細動脈は特にA2/A3レベルで多量のO2を消費することが示された。これは、微小循環の局所でO2濃度を測定する方法により決定された（TorresとIntaglietta、Am. J. Physiol., 265:H1434-H1438[1993]）。これらの結果は、これらの細動脈が驚異的な代謝活性が可能であることを示す。これらの細動脈の神経支配は特に密であり（Saltzmanら、Microvasc. Res., 44:263-273[1992]）、これらが下流の毛細管血流を制御することを示唆する。これらの結果に基づき、これらの細動脈に利用可能なO2を増やすことは、毛細血管床へのO2の供給を制御する機序（自己制御）を保証する強力な刺激となることが予測された。本発明を使用するのにこれらの事象の基礎となる正確な生化学的機序の理解は必須ではないが、これらにはO2-またはNO-感受性経路が介在し、血漿間隙中で「代用血液」として遊離のヘモグロビンが存在することは、その正確な促進拡散の能力のため、これらの機序を保証するものと予測される。
２つの経路（O2およびHbO2拡散）による血液中のO2の輸送は、数学的に表現することができる。血管壁へのO2の輸送（フラックス、-J）は、遊離（O2）および化学結合した酸素（HbO2）の拡散の総和である：
0004583510.tif 000002
（式中、DO2とDHbO2は、それぞれO2と無細胞HbO2の拡散定数であり、αは血漿中のO2の溶解度であり、ΔPO2は容器の内と外でのO2の分圧の差であり、ΔYは容器の中心からその壁までのヘモグロビン飽和の勾配であり、そして[Hb]Tは総無細胞ヘモグロビン濃度である）。DO2とDHbO2は静止溶液で実験的に測定されている（表１）。拡散の差ΔXは、２つの分子O2とHbO2について同じであると考えられる。表１で引用された文献は、Wittenberg, Physiol. Rev., 50（4）:559-636[1970]、およびBouwer, Biochim. Biophys. Acta 1338:127-136[1977]である。
0004583510.tif 000003
表１は、DHbO2がDO2の約1/20であることを示す。しかし血漿中のO2の溶解度は低く（α＝1.2074μＭ/Torr）、DO2は比較的高いため、血漿ヘモグロビン濃度が100TorrのPO2でわずかに３mM（4.83g/dl）である時、遊離O2とHbO2について拡散と濃度の積（式１中の分子）はほとんど等しい。すなわち血漿ヘモグロビンは溶存O2と同程度のO2に寄与し、赤血球から利用できるO2の量を有効に倍にしている。これらの関係を定量的に表２に示す。
0004583510.tif 000004
血漿HbO2による促進拡散を最小にするための方策を開発するために、そこに寄与する生物物理的性質を分析することが必要であった。水はHbO2よりはるかに小さいため、DHBO2は、以下のStokes-Einstein式により規定されるように、粘度と分子半径の関数である：
0004583510.tif 000005
（式中、ｋはボルツマン定数であり、ηsolutionは溶液の粘度であり、そしてｒHbO2はヘモグロビン分子（HbO2）の半径である）。分子酸素について分子半径（rO2）は水のそれとほぼ同様であり、Stokes-Einstein式は以下のようになる：
0004583510.tif 000006
すなわちHbO2と溶存O2の両方について、その拡散性は巨大分子溶液の粘度に反比例する。無細胞ヘモグロビンについて、DHbO2はヘモグロビンの分子サイズ（式２のｒHbO2）に反比例するという点で、ヘモグロビン分子サイズは追加の係数である。すなわち、この解析は、無細胞ヘモグロビンによる促進拡散を低下または排除するための２つの可能な方策が、分子の半径を上げることと溶液の粘度を上げることであることを予測させる。
式１をさらに解析すると、この機序を無効にするための追加の方策が理解される。HbO2が拡散する勾配は[Hb]TΔYであり、HbO2が拡散しなければならない距離は、（ΔXHbO2）である。所定のPO2における量ΔYは、そのPO2における酸素平衡曲線の傾きであり、曲線の形（ヘモグロビン分子の性質）とその位置（すなわち、P50）に依存する。
要約すると、Kroghシリンダー（図１を参照）の円筒形断面で輸送される総O2は、以下のように記載される：
0004583510.tif 000007
この式で、ｒは毛細管の半径であり、Ｒは流速である。式は、総O2輸送に対するHbO2拡散の寄与を示す。この型のO2輸送式は、HbO2拡散の寄与が４つの変数（拡散定数（DHbO2）、ヘモグロビン濃度（[Hb]T）、毛細管の中心と端の飽和の差（ΔY）、およびHbO2の拡散距離（ΔXHbO2））に依存するという点で興味深い性質を有する。
式４は多くの方策を明らかにし、これらは独立に使用してまたは併用してO2フラックス（ΔO2T）を調節する。これらの方策は、ΔO2Tが：
（1）式２と３に従ってDO2とDHbO2の変化を介して、溶液粘度（η）と反比例する、
（2）式２に従ってDHbO2の変化を介して、分子サイズ（ｒHbO2）と反比例する、
（3）[Hb]Tに正比例する、および
（4）ΔYに正比例する（ΔYは、O2親和性および／またはO2結合の協同作用を変化させることにより変化させることができる）
であるように、ΔO2Tと変更可能な溶液の性質の関係により規定される。
すなわち無細胞ヘモグロビン系酸素運搬体のΔO2Tに及ぼす促進拡散の作用を最小にするために、赤血球の値に基づく所定のΔO2Tは、上記方策を独立に使用してまたは併用することにより達成される。例えばΔO2Tは：
（1）−  ηの上昇、
−  ｒHbO2の上昇、
−  [Hb]Tの低下、または
−  O2親和性および／または協同作用を介してΔYを調整、
することにより独立に単一のパラメータを変化させる、
（2）定量的にΔO2Tが所望の範囲内にあるように上記性質の任意の組合せを変化させる、ことにより所望の範囲内に低下させることができる。
Ｂ．無細胞ヘモグロビンの評価
酸素の促進拡散に関する無細胞ヘモグロビンの評価、従って細動脈中の自己調節性血管活性を生み出す可能性は、Kroghシリンダー（容器の理想化されたセグメント）に基づく（図13）。酸素平衡曲線の形と位置の詳細な解析を通して、この感受性のある領域へ供給される酸素の量は、拡散、ヘモグロビン濃度、およびP50の関数として解析される。
１．人工毛細管システム
人工毛細管システムを図14に示す。毛細管は、直径（57μm）とほぼ同じ大きさの壁厚を有するポリジメチルシロキサン（例えば、Silastic、Point Medical Corporation、Crown Point、IN）である。ガラス毛細管は、２μlピペット（例えば、Drummond Scientific、Broomall、PA）である。ガラスとシリコン接合部は、シリコンシーラント（例えば、RTV 60、General Electric）で密閉する。毛細管の典型的な長さの100mmでは、in vivo時間と同程度の滞留時間になる（すなわち、0.37秒−1.5）。
注入シリンジポンプ（例えば、KD Scientific、Boston、MA）は、短い低透過性Tygon管により、入口酸素フローセルに連結する。Clark型酸素電極（例えば、Instech、Plymouth Meeting、PA）を使用して、システムを監視する。データ収集は、血液ガス分析装置（ABL-5、Radiometer）による流出液の分析により行う。フローセルからの出口は、別の短いTygon管に連結し、次にこれを、マイクロ管連結器（例えば、Cole-Palmer、Niles、IL）を使用してシリコン毛細管ユニットのガラス毛細管に固定する。人工毛細管は、透明アクリルプラスチック製の気密交換チャンバーに入れる。正確な温度制御を確保するために、バイメタル温度プローブ（例えば、YSI 700、Yellow Springs、OH）を流体の流れの入口点および出口点近くに取り付け、37℃で一定に保つ。
回収セルは、シリコンシーラントとポリプロピレンのマイクロ嵌合（Cole-Palmer）の使用により人工毛細管ユニットの末端に直接かみ合わせる。回収セルは、穴をあけたT型チャネル（0.75mmの直径）を有する固体アクリルである。第１のチャネルは、流量計としてはたらく較正した測定管によって分岐させる。システム条件を監視するために、定期的に流量計を酸素電極と置き換えることができる。第２の流動チャネルは、回収セルの後ろに向けられ、ここで気密隔壁が出口を密閉する。Hamilton気密シリンジ（Hamilton Co.、Reno、NV）はこの隔壁を貫通して、シリンジポンプが毛細管中の流速よりも低い速度で流体を取り出すのにつれて試料を回収する。この装置全体は、フィン加熱器の使用により温度を37℃に維持したアクリル容器に封入する。
２．人工毛細管実験プロトコール
平衡化した試料は、圧力計から、注入ポンプに据え付けたHamilton気密シリンジ中に吸引する。所望の滞留時間を達成するために、システム中の一定の流れを確立する。空気に似せて、試験溶液を20％ O2、残りのN2で平衡化する。毛細管のチャンバー外側を、100％ N2で充填する。チャンバー中のガスの容量が10秒毎に交換されるように、入口ガスは、37℃水浴と流量計を経由して一定の流速を維持する。酸素電極により、毛細管外ガス区画を監視する。
毛細管からの流出液を第２のHamilton気密シリンジに回収して、血液ガス分析装置（例えば、ABL-5、Radiometer、West lake、OH）に注入する。各滞留時間で３つの試料のうちで最小のものをとる。流動条件を変更し、新しいセットの試料を試験する。３種の流速（10、20および40μl/分）により、それぞれ1.56、0.75および0.39秒の毛細管の滞留時間となる。
３．人工毛細管データの数理解析
毛細管に沿う距離の各セグメント（dx、図13）について、溶液中に存在する総O2は、
0004583510.tif 000008
[式中、αは、血漿中のO2の溶解度係数（1.2074μM/Torr）（Winslow et al., J. Biol. Chem., 252（7）:2331-2337[1977]）であり、Yは、ヘモグロビン飽和度であり、そして[Hb]Tは、総ヘモグロビン濃度である]である。セグメントdxで毛細管から出てくるO2の量は、
0004583510.tif 000009
[式中、K*は、式１に与えられた拡散定数およびO2の拡散勾配の長さからなる集中拡散パラメーターであり、ΔPO2はPO2勾配（N2が外側ガスである場合は、本質的に内部PO2）であり、ｒは、毛細管の半径であり、そしてRは、流速である]である。総O2はΔO2により減少している。この点で、問題のヘモグロビンに関する既知パラメーターを用いるAdairの式を使用して、式（5）により新しいO2Tを与えるPO2とYの組合せを経験的に見いだす。本プロセスは、毛細管の末端に達するまで反復し、そして最終PO2は、実験で実際に測定した値に合わせる。FORTRANプログラムを使用して、dxの有限要素においてこの解析を行った。実験は、以下の実験の節に記載するように、これらの方法と装置を使用して行った（実施例16を参照のこと）。
Ｃ．ヘモグロビンの可能な修飾
現在開発中のいかなる製剤も、血液の全ての機能を代替することはできない。代わりに、これらの血液製剤溶液は、供給できる総酸素を増大させる能力によって他の血漿増量剤と区別される。これらには２つの一般型がある：溶存酸素を増大させるもの（すなわち、パーフルオロカーボン）とヘモグロビンに化学結合した酸素を運ぶもの（ヘモグロビン系のO2担体）。この２つの型の間には顕著な差があり、これらはO2を根本的に異なる方法で輸送する。
ヘモグロビンは、４つのポリペプチドサブユニット（2αおよび2β鎖）から構成される。各々の一つ同士が強固に結合して半分の分子（αβ２量体）を形成し、そして２つの２量体がゆるく結合して完全な機能を有する分子（α2β2４量体）を形成する。αβ２量体の間の界面は、O2が可逆的に結合すると滑って離れ、２つの構造（それぞれ完全に脱酸素化した構造（T、緊張）に対応するものと、完全に酸素化した構造（R、弛緩）に対応するもの）を形成する。これら２つの配座は、O2に対する非常に異なる親和性を有するため、O2分子が順次結合し、デオキシからオキシへの移行が起こり、O2に対する親和性が増大する。この親和性の変化は、「協同作用」と呼ばれ、Hill係数のnにより表される（図13）。
αβ２量体の間のゆるい界面は、ヘモグロビン系代用血液には決定的に重要である。この解離反応の平衡定数は、HbO2では10-6Mであり、これはヘモグロビン濃度が低下するほど、２量体分子の相対割合は増大することを意味する。これらの２量体は、腎臓の糸球体において非常に迅速かつ効率的に濾過される。穏やかな溶血が起きる時に存在する２量体を除去するための機序は、200mg/dlまでの濃度において遊離ヘモグロビンを除去することができるハプトグロビン結合を含む。この閾値を超えると、ヘモグロビンの腎クリアランスは非常に高くなり、かつ腎毒性が生じ得る。
ヘモグロビンの多くの化学修飾が考案されてきた（表３を参照のこと）。これらの修飾の目的は、４量体−２量体解離を防止すること、酸素親和性を調節すること、および血管保持時間を延長することである。これらは、ヘモグロビンの表面、その内腔、およびアミノ末端の幾つかの反応性部位を利用する。研究者にとって最も有用な修飾の1つ（αα−ヘモグロビン、DCLHb▲Ｒ▼、HemAssist▲Ｒ▼）は、試薬DBBFによってデオキシヘモグロビンのリシン99残基の間に単架橋を組み込むことである（Walder et al., J.Mol.Biol., 141:195-216[1980]）。この単一調節は、直ちにαβ２量体を結合させ、無細胞分子のO2親和性を無傷のヒト赤血球の親和性程度まで低下させる。架橋が酸素化ヘモグロビンにより行われると、内腔の大きさはβ82リシンの間で反応が起きるのに充分な程度まで変化する。この場合、最終架橋産物は、デオキシ架橋産物よりもはるかに高いO2親和性を有する。この物質はまた容易に製造することができるが、そのO2親和性は、従来は生理学的または臨床的に利用するには高すぎると考えられていたため、まだ充分に研究されていない。
0004583510.tif 000010
0004583510.tif 000011
0004583510.tif 000012
別のユニークな種類の架橋剤のトリメシン酸誘導体では、２点または３点反応が起こる（Kluger et al., Biochem., 31:7551-7559[1992]）。初期の報告では、これらにより生成した修飾ヘモグロビンが安定であると考えられ、かつこの反応が高度の特異性を有すると考えられた。
この64,000kD分子量ヘモグロビンの変型は、架橋が遺伝子的に行われる、遺伝子操作で作製した「rHb1.1」（Looker et al., Nature 356:258-260[1992]）である。この場合、転写された時に、一方のα鎖がもう一方と隣接している単一遺伝子産物（ジアルファペプチド）が生じるように、２α鎖遺伝子が大腸菌（E.coli）ゲノムに導入される。すなわち本生成物は64,000kDの分子量を有しており、２量体に解離しない。その生理学的性質はαα−ヘモグロビンと類似している。
他の架橋剤は、2,3-DPGの類似体であり、このような架橋剤の基本型であるNFPLPは、β鎖の間の2,3-DPG「ポケット」内に結合して、２量体化の防止とO2親和性の低下という二重効果を有する。この生成物は、広範に研究されてきた（Bleeker et al., Biomater. Artific. Cells Immobil. Biotechnol., 20:747-750[1992]）が、残念なことに架橋剤自体を合成するのが困難であり、実用上スケールアップは達成されていない。
結合ヘモグロビンは、その表面にある種の修飾分子が結合したヘモグロビンである（例えば、Nho et al., Biomat. Artif. Cells Immobil. Biotechnol., 20:511-524[1992]を参照されたい）。修飾基は、ポリエチレングリコール（PEG）、ポリオキシエチレン（POE）、またはデキストランを含む。これらの生成物は、修飾基の数と大きさに依存して分子量を増大させるが、製造は比較的容易である。分子サイズが増大すると、タンパク質分子の周囲の水和殻も増大し、POEとPEGの場合には、そのため無細胞環境での他の分子とのヘモグロビンの反応を制限することもある。
最後に、非特異的試薬は、任意のヘモグロビンの表面上の44位ε−アミノリシン基または４アミノ末端基と反応しうる。このような二官能性試薬は、グルタルアルデヒドとo−ラフィノースがあり、そして現在臨床治験中の少なくとも３つの製品において使用されている。修飾反応は、化学的に明確に理解されているが、反応の程度はしばしば制御が難しく、そしてある範囲の分子量の生成物が生じる（Marini et al., Biopolymers 29:871-882[1990]）。
本発明は、重大な問題を抱える現在のヘモグロビン系代用赤血球を改善する方法を提供する。一般に、ヘモグロビンと多官能架橋剤との重合により、またはPEG、デキストラン、または他のデンプン、炭水化物、またはタンパク質のようなポリマーへの表面結合により、分子サイズ増大させることができる。PEGまたはその類似体への結合により、粘性を増大させることができる。ペンタスターチ、デキストラン、炭水化物またはタンパク質のような、それ自体が粘性の高粘性物質との調合により、溶液の粘性を増大させることができる。最後に、Ｒ配座状態のヘモグロビンの分子内架橋により、酸素親和性を増大させることができる。これは、O2、COまたはＲ配座に有利な他のリガンドのような環境にヘモグロビンを置くことにより達成することができる。無細胞酸素担体として使用される修飾ヘモグロビンの製造に対する具体的な変化の例は、下記を含む。
1.    αα-ヘモグロビン
このヘモグロビンは、最初は米国陸軍により研究用のモデル化合物として設計され、バクスター・ヘルスケア（Baxter Healthcare）により製造され手術直後の、またある外傷患者におけるヒト血液の代替物として試験されている。米国陸軍およびバクスターは双方とも、この製剤が血圧および血管抵抗に顕著な上昇をもたらすことを報告し、前臨床動物試験では、これらの望ましくない特性がヘモグロビン溶液の投与からもたらされる利点のいずれもが消去されることを示している（例えばHessら，J. Appl. Physiol., 74:1769-1778[1993]を参照）。
このように処方した場合、αα-Hbは粘度が低く（およそ1cP、剪断速度160S-1、37℃）、およそ10g/dlで高い[Hb]を有し、四量体ヘモグロビンと同じ分子サイズであり、しかも血液と同じかまたはそれより低い酸素親和性を有する。本発明は、ペンタスターチまたはいずれかの高粘度コロイドでの処方により粘度が増強されたαα-ヘモグロビンを提供する。事実、粘度および分子サイズはPEGでの表面結合、または他のいずれかの好適な表面修飾法によって上昇させることができる。さらに、この組成物はより低い[Hb]で処方することもできる。加えて、その酸素親和性は、（例えば、COまたはO2配位の）高親和性配座状態にあるヘモグロビン出発物質とともにDBBFを用いる架橋化学を行うことにより高めることができる。
このように、本発明は、例えば配位（例えばCOまたはO2）状態にあるヘモグロビンを架橋することにより、かつPEGまたはその分子半径および粘度を大きくする他の物質との表面修飾によりその分子サイズを大きくすることにより、そのP50を小さくすることでこの組成物を改良する方法を提供する。αα-ヘモグロビン溶液におけるO2の拡散はペンタスターチ中の処方により低くすることが可能であった。
2.rHb1.1
組換えヘモグロビン（例えば、OptroTM, Somatogen）は、種々の宿主（例えば細菌）を用いて作製し得る。現在入手可能な組換えヘモグロビンは、主に融合α鎖とその酸素親和性を低くする突然変異（Presbyterian）の導入からなっている。本発明は、例えばPresbyterian突然変異を除去することにより、またはその酸素親和性を高めるもしくは協同性を低くする他の突然変異を導入ことにより、さらにはPEGもしくはその分子半径および粘度を大きくする他の物質との表面修飾によって分子サイズを大きくすることにより、そのP50を低くことでこの製剤を改良する方法を提供する。OptroTM溶液におけるO2の拡散はペンタスターチ中の処方により低くすることが可能であった。
このように処方した場合、rHb1.1は粘度が低く、四量体ヘモグロビンと同じ分子サイズで、血液と同じまたはそれより低い酸素親和性を有する。本発明は、ペンタスターチまたはいずれかの高粘度コロイドでの処方によりrHb1.1の粘度を高める方法を提供する。さらに、その粘度および分子サイズは、PEGでの表面結合または他のいずれかの好適な表面修飾法を用いる表面結合によって大きくすることができる。さらに、それは低い[Hb]で処方することもできる。
3.PHP（ピリドキシル化ヘモグロビンポリオキシエチレン）
PHP（ピリドキシル化ヘモグロビンポリオキシエチレン；例えばApex Bioscience）。このヘモグロビンはヒト供給源由来のものであり、リン酸ピリドキサル（PLP）と反応させてそのP50を高め、さらにポリエチレングリコールの形態で表面改良されている。本発明は、PLP反応を除去し、配位（例えばCOまたはO2）状態を架橋し、かつ分子当たりのPEG鎖数を増やすか、または個々のPEG鎖を長くするかのいずれかによりPEGによる表面修飾をさらに拡張することによってこの製剤を改良する方法を提供する。PHP溶液におけるO2拡散はペンタスターチ中の処方により低くすることが可能であった。
このように処方した場合、PHPはおよそ2cP（本明細書に記載の条件下）という中間的な粘度を有し、およそ8g/dlで高い[Hb]を有し、その分子サイズはヘモグロビン四量体より2倍をわずかに上回るほど大きく、酸素親和性は血液よりもわずかに大きい。本発明は、ペンタスターチまたはいずれかの高粘度コロイドでの処方によりこの製剤の粘度を高める方法を提供する。その粘度および分子サイズは、分子当たりのPEG鎖数を増やすことによるか、または個々のPEG鎖を長くすることによるかのいずれかでPEGでの表面修飾をさらに拡張することによって大きくすることができる。それはまた、より低い[Hb]で処方することもできるし、かつ／またはヘモグロビン修飾反応中にPLPを除去することによりその酸素親和性を高めることもできる。
4.HemoLinkTM
HemoLinkTM（Hemosol社）は、極めて高いP50を有するヒト由来のヘモグロビン製剤であり、多官能価架橋剤o-ラフィノースで重合している。本発明は、配位（例えばCOまたはO2）タンパク質を架橋することにより、さらには分子半径および粘性を大きくすることによりこの製剤を改良する方法を提供する。これはPEG誘導体のいずれかとの表面修飾、多糖またはその分子サイズを大きくするであろう他の重合体との結合により達成できた。HemoLinkTM溶液におけるO2の拡散はペンタスターチ中の処方により低くすることが可能であった。
このように処方した場合、HemoLinkは粘性が低く（発明者らの測定条件下ではおよそ1.4cP）、およそ10g/dlで高い[Hb]を有し、その分子サイズは四量体ヘモグロビンの約1.7倍と大きく、血液に匹敵する低い酸素親和性を有する。本発明は、ペンタスターチまたはいずれかの高粘度コロイドでの処方によりその粘度を高める方法を提供する。その粘度および分子サイズは、PEGでの表面結合または他の表面修飾法を用いる表面結合により大きくすることができる。さらに、それはより低い[Hb]で処方することもできる。その酸素親和性は（例えば、COまたはO2配位の）高親和性配座状態にあるヘモグロビン出発物質とともにo-ラフィノースを用いる重合化学を行うことにより高めることができる。
5.HemoPureTM
HemoPureTM（Bio-Pure）は中程度に高いP50を有するウシ由来ヘモグロビン製剤であり、二官能価架橋剤グルタルアルデヒドで重合している。本発明は配位（例えばCOまたはO2）タンパク質を架橋することにより、さらにはその分子半径および粘度を大きくすることによりこの製剤を改良する方法を提供する。これはPEG誘導体のいずれかでの表面修飾、または多糖もしくはその分子サイズを大きくするであろう他の重合体との結合により達成できた。HemoPureTM溶液におけるO2の拡散はペンタスターチ中の処方により低くすることが可能であった。
6.PolyhemeTM
PolyhemeTM（Northfield Laboratories）はPLPとの反応のため中程度に高いP50を有するヒト由来ヘモグロビン製剤であり、二官能価架橋剤グルタルアルデヒドで重合している。本発明は配位（例えばCOまたはO2）タンパク質を架橋し、PLPを除去し、かつその分子半径および粘度を大きくすることによりこの製剤を改良する方法を提供する。これはPEG誘導体のいずれかでの表面修飾、または多糖もしくはその分子サイズを大きくするであろう他の重合体との結合により達成できた。PolyhemeTM溶液におけるO2の拡散はペンタスターチ中の処方により低くすることが可能であった。
このように処方した場合、Polyhemeはおよそ10g/dlで高い[Hb]を有し、その分子サイズは重合することで四量体ヘモグロビンより大きく、その酸素親和性はPLPとの反応により低下している。本発明は、ペンタスターチまたはいずれかの高粘度コロイドでの処方によりその粘度を高める方法を提供する。その粘度および分子サイズは、PEGでの表面結合または他の表面修飾法を用いる表面結合により大きくすることができる。それはまた、より低い[Hb]で処方することもできる。その酸素親和性は、PLPの不在下、（例えば、COまたはO2配位の）高親和性配座状態にあるヘモグロビン出発物質とともにグルタルアルデヒドを用いる重合化学を行うことにより高めることができる。
7.PEG-Hb
市販のPEG-Hb組成物（例えば、Enzon）を本発明を用いてその濃度を低くすることにより、またペンタスターチ中に処方することにより改良してもよい。Enzonのヘモグロビンは、直鎖5000MWポリエチレングリコール（PEG）との結合により改良されたウシヘモグロビンからなる。ポリアルキレンオキシド（PAO）とは、PEGを含む分子のグループに対する一般名称である。PAOのヘモグロビンへの結合は、PAOとリシン残基のε-アミノ基との間の共有結合の形成により達成される。Enzonのヘモグロビンは、ヘモグロビン四量体につき10ないし12個のPAO鎖と結合している。37℃、160S-1の剪断速度で測定した場合、EnzonのPEG-Hbの5g/dl溶液は3.39cPの粘度を示す。
このように処方した場合、PEG-Hbは5.5g/dlの[Hb]でおよそ3.5cPの粘度（本明細書に記載の条件下で）を有し、その分子サイズは四量体ヘモグロビンの4倍と大きく、血液よりも高い酸素親和性を有する。本発明は、ペンタスターチまたはいずれかの高粘度コロイド中の処方により、より低い[Hb]でこの製剤の粘度を高める方法を提供する。さらに、その粘度および分子サイズは、分子当たりのPEG鎖数を増やすか、または個々のPEG鎖を長くすることのいずれかにより、PEGでの表面修飾をさらに拡張することで大きくすることができる。それはまた、より低い[Hb]で処方することもできる。
ヘモグロビン溶液の単位濃度当たりの粘度（η，cP）単位を高めるさらなる方法には、限定されるものではないが以下のものがある。
1.  ヘモグロビン四量体についての5000MW PAOへの結合部位の数の増加
ヒトヘモグロビンは44個のリシン残基（各鎖につき11個）を含んでいる。これにより、4個のN末端アミノ基と組み合わせれば、アミノ基の修飾に関して記載された化学を用い理論的に可能なPAOの共有結合部位は48となる。PAOをシステイン残基のスルフィドリル基に共有結合させる付加化学が記載されている（Acharya′s米国特許第5,585,484号を参照；なお、これは参照により本明細書に組み入れる）。Hb四量体につき6個のシステイン残基が存在（すなわち各α鎖上に1個、そして各β鎖上に2個）するので、理論的に可能な結合数は54まで増える。さらに好適な結合化学の使用を含むPAO修飾が意図され、これにはセリン、トレオニン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、アルギニンおよびヒスチジン残基への結合が含まれる。またカルボン酸基への結合を可能とする化学は、アスパラギン酸およびグルタミン酸残基、ならびにヘモグロビンのC末端カルボキシ基へのPAO結合を可能にし得ると考えられる。
四量体当たりの結合部位の数が十分大きければ、低分子量（すなわち、MW<5000）のPAO分子はなお、本明細書に記載の修飾を用いずにEnzonの製剤以上に高い単位濃度当たり粘度を達成するものと考えられる。
2.  共有PAO結合数を維持し、かつ各PAO部分のサイズを大きくする
PAO基が四量体につき10ないし12部位に結合した分子量のより高い（すなわち、MW>5000）状況においては、単位ヘモグロビン濃度当たり粘度が高いと考えられる。これはより長いかつ／または分枝したPAO鎖を含有する分子からなるPAO出発物質を用いることにより達成できる。
PAO単位の分子サイズが十分に大きければ、四量体上のより少ない部位数（すなわち、<10）を改良し、なおEnzonの製剤以上に高い単位濃度当たり粘度を達成することが可能であると考えられる。
IV.   本発明の血液製剤の酸素運搬成分
本発明の好ましい実施形態では、酸素運搬成分は天然または修飾ヘモグロビン（例えば、HBOC）である。修飾ヘモグロビンは化学反応（例えば、架橋または重合）により、または付加物（例えば、ポリエチレンブリコール、ポリオキシエチレン）の付加により修飾されている。さらに、本発明の酸素運搬成分は組換えにより製造したヘモグロビンまたはリポソーム中に封入したヘモグロビン製剤であってよい。本発明はまた、ヘモグロビンまたは修飾ヘモグロビンを包含しない他の酸素送達手段の使用も意図する。
本発明は酸素運搬成分のいずれの使用も意図するが、好ましい酸素運搬成分としては、二量体への解離を防ぐために分子内架橋されたヒトまたは動物（例えば、ウシ）ヘモグロビンの溶液が包含される。所望により、本発明の酸素運搬成分はオリゴマー化して約750,000ダルトンまで、好ましくは約500,000ダルトンまでの分子量のオリゴマーとしてもよい。ヘモグロビン製剤は遺伝子工学により製造され、組換え工程もまた好ましい酸素運搬成分の範囲内にある。
本発明の好ましい酸素運搬成分はストロマフリーで、かつ内毒素フリーであるべきである。好ましい酸素運搬成分の代表例は、Hsiaに対する米国特許第4,857,636号；Walderに対する同第4,600,531号；Morrisらに対する同第4,061,736号；Mazurに対する同第3,925,344号；Tyeに対する同第4,529,719号；Scannonに対する同第4,473,496号；Bocciらに対する同第4,584,130号；Klugerらに対する同第5,250,665号；Hoffmanらに対する同第5,028,588号；ならびにSehgalらに対する同第4,826,811号および第5,194,590号をはじめとする米国特許のいくつかに開示されており、各々の内容は参照により本明細書に組み入れる。さらに好ましい実施形態では、酸素運搬成分は、ポリエチレングリコール（PEG）もしくはポリオキシエチレン（POE）との反応により改良された、架橋した、もしくは架橋していないヒト、組換え型、または動物ヘモグロビンを含んでなる。
組織へ酸素を送達する溶液の能力は、複合静脈酸素張力（mixed venous oygen tension）を上昇させ且つ酸素抽出比（oxygen extraction ratio）を低下させる、組織における酸素張力の直接測定を含む、研究者に慣例的に用いられているいくつかの方法で求めることができる。
V.    本発明の血液製剤の非酸素運搬成分
前記のように、本発明は酸素運搬成分と非酸素運搬成分とを含んでなる混合物を考案する。本発明の非酸素運搬成分は、コロイド浸透圧を有するPBC類（例えばデキストラン-70、デキストラン-90、ヘスパン、ペンタスターチ、ヘタスターチ、アルブミンまたは他のいすれかの静脈内コロイド溶液）の一時的置換に使用されるいずれの物質であってもよい。
血液量不足および他の症状の治療用の非酸素運搬血漿増量製品が市販されており、代表的な製品としては、限定されるものではないがPentaspanTM（DuPont Merck, Fresenius）、HespanTM（0.9%注射用塩化ナトリウム中6%ヘタスターチ;DuPont Merck）、およびMacrodexTM（注射用水5%デキストロース中6%デキストラン70、または0.9%注射用塩化ナトリウム中6%デキストラン70; Pharmacia）が挙げられる。臨床用（例えば、血液希釈または救急蘇生）として入手可能な非酸素運搬液は、晶質溶液（すなわち塩溶液）およびコロイド溶液の大別できる。本発明の好ましい実施形態では、コロイド溶液は混合物の非酸素運搬成分を含んでなる。
本発明の１つの好ましい実施形態では、酸素運搬成分（例えば、HBOC）及び不活性な非タンパク質性コロイドを含んでなる非酸素運搬成分の双方を含有する処方および組成物（水溶液）の使用により、先行技術の製剤の関する問題が解決される。このような組成物の単独または併用により、２つの効果が得られる。第１には、コロイド浸透圧および血漿張力は維持されつつ、組成物の酸素運搬能が低下するということである。得られるコロイド希釈酸素運搬成分は単位用量当たり酸素運搬成分単独より少ない酸素送達コロイド粒子を有し、ゆえに動脈壁に与えられる酸素が少ない。すなわち、酸素送達は全血のそれにより近くなり、その結果、本発明の組み合わせはRBC類により達成されるものにより近い様式でその酸素量を送達、分配することが可能となる。
第２には、非タンパク質性コロイドの種類および量の好ましい選択により（以下に考察）、酸素運搬成分-コロイド組成物の粘度を高める、好ましくは全血のそれに近くすることができるということである。これはまた、動脈壁反応を低くするまたは打ち消すものと思われる。本発明を実施するために、この作用のメカニズムを理解する必要はないが、それはi）ヘモグロビン減少の結果として酸素送達が低下し、且つii）血管壁での剪断応力が高まる（その結果、プロスタサイクリンなどの内在性血管拡張物質の放出が増加する）ためであると確信される。
本発明の組成物に使用するための非タンパク質性コロイドの好適な例としては、デキストランおよび製薬上許容されるその誘導体、デンプンおよび製薬上許容されるその誘導体、ならびにポリビニルピロリドン（PVP）が挙げられる。好適な非タンパク質性コロイドのうちペンタスターチが特に好ましい。実際に、好適な非タンパク質性コロイドとしては、血液希釈剤としてこれまで首尾よく使用されてきた実質上すべての非タンパク質性コロイド物質が含まれる。許容される候補は水溶性であり、コロイド浸透（oncotic）圧を示し、生物学的に不活性であり、他の点で製薬上許容されるものでなければならない。これらの物質（例えば、デキストランおよびヘタスターチのようなコロイド性非タンパク質コロイド）のコストは、重量／重量を基にするとヘモグロビンやHBOC類よりも非常に低い。
III.   本発明の臨床およびその他の適用
本発明は救急治療室から手術台、ならびに軍の闘争および獣医学的適用の範囲にわたる多くの状況での使用を見出すものである。この用途の広さは、所望に応じて保存でき且つ治療しようとする患者との適合性を調べるために交差試験や他の実験室試験の必要がないという、本発明の最適な組成物によるものである。本発明に関するヘモグロビンの化学的および遺伝学的修飾に関する詳細にわたる研究により、今、これまでには考えられなかった効果の高い様式で、物理学的、生理学的特性のいずれの好ましい密接な組み合わせを有する分子も設計することが可能となる。
A. 臨床適用
種々の臨床適用は、下記表4中に提供される赤血球代替物の特性と適合している。この表では、T1/2とは半減期をさす。
0004583510.tif 000013
高いコロイド浸透圧活性（COP）は、短期、即時の血液量不足によるショックからの蘇生における用途を見出すものと考えられる。高張生理食塩水／デキストラン（HSD）の有用性は動物研究で示されている（Kramerら，Surgery, 100（2）:239-47[1986]）。コロイド浸透圧活性（COP）は極めて迅速に血管容積を拡張させ、おそらくこれはO2の迅速な回復能と結びついて急激な血液損失後の患者および組織の十分に良好な救済につながり得ると考えられる。しかしながら、本発明の組成物および方法が以下のものを含む用途を、出す多くの状況がある。
血液希釈．  この臨床適用では、患者は外科手術を受け、いくらかの容量の血液が除かれ、代替物で置換される。目的は予防であり、ある平衡失調を矯正することではない。血液に極めて近い働きをする溶液が必要である。わずかに高いCOPが外科手術の血液損失に予測において血液容量と心拍出量を増加させるので望ましい。代替液ははヘモグロビンを基にしているので、助長された拡散を克服するためには低いP50が好ましい。粘度も同じ理由で高めるべきであり、同種異型血液ユニットを用いる外科術後輸血の必要性をなくすまたは少なくするためにはT1/2を延長すべきである。外科手術（自家移植）に先立って採取されたものは十分でなくともよい。血液希釈用溶液は心肺のバイバスで使用されるものと同様の特性を有するであろ。
外傷．  外傷において、患者は全血を失っている。この血液損失に応答して、間質および細胞間隙から体液が移動し、損失容量に置き換わろうとする。この過程で、ヘマトクリットおよび粘度は降下し、血管収縮が起こり、優先順位の低い器官から血液が流れる。これらには例えば皮膚や消化管が含まれ、一方、腎臓、心臓および脳への血液流は可能な限り長く保守される。ここでの外傷的血液置換の目的は、第１に可能な限り迅速に損失容量を置き換えることである。ゆえに、高いCOPが望ましい。代替液はヘモグロビンを基にしているので、助長された拡散を克服するためには低P50が好ましい。同じ理由で粘度も高めるべきである。
敗血性ショック．  不可抗的な敗血症において、大量輸血療法や血管収縮薬での治療にもかかわらず高血圧になる患者があり得る。このような場合、血圧を低下させるメカニズムは一酸化窒素（NO）の過剰生産である。従ってヘモグロビンは、ヘモグロビンがNOと結合する結合活性のために、これらの患者の治療のために理想的な薬剤に近い。一般に、NO結合親和性は、O2結合親和性と相等しく、従ってこの適用に使用するのため薬剤は極めて高いO2親和性（低P50）を有しているはずである。患者はしばしば過剰に輸血されるので、必須ではないが高COPが望ましく、高粘度は自己調整的血管収縮を低下させると考えられる。これらの患者には連続注入が使用できるので、T1/2は顕著に長い必要はないが、中程度に長くあるべきである。
虚血（例えば、発作）．  虚血とは組織が酸素に「飢えた」状態をいう。これは通常、例えば心臓発作または脳血管発作の場合の血流の制限に起因するものである。酸素に飢えた組織は壊死して「梗塞部」と呼ばれる小さな斑点となる。ここでの血液置換療法の目的は、血流を増加させること、および毛細血管床への酸素送達を促進することであると考えられる。ゆえに、毛細血管床をより良好に灌流するためにはより低い粘度の液体であることが好ましい。これは、血液容量が維持される、または拡張する場合にしか行えず、従って、高COPが望ましい。ほとんどの状況の心臓発作では、組織の損傷は急性であり、従って治療は数時間が必要とされるだけである。このように、T1/2は他の適用ほど重要ではない。
癌．  放射線感受性（または化学療法に対する感受性）を高めるため、目的は腫瘍の低酸素核にできる限り多くの酸素を送達することである。腫瘍の微小循環は、毛細管の内皮ライニングを欠き、正常な血管作用が起こらないので他の組織の微小循環とは異なっている。従って、低粘度の溶液を提供できるはずである。P50が非常に低いと、それが腫瘍の低酸素核に達する前に組織に、たとえあるにしても組織には少量の酸素しか供給されないはずである。言い換えれば、発明者らは可能ならば非常に低いPO2で酸素を供給したいと考えている。血漿T1/2は、繰り返し用量の照射または化学療法を投じることができるよう、極力長くすることが可能である。
慢性貧血．  このような患者は失った赤血球を再生できないか、あるいは正常な（または加速された）破壊を伴って生産を維持することができない。このような状況では、輸血置換はできる限り天然の赤血球のように挙動することが望まれる。従って促進された拡散は酸素親和性および粘度を高めることにより克服すべきである。この適用では、患者は自信では損失または代謝されたヘモグロビンを置換できないので、他のいずれよりもさらにT1/2が極めて重要となる。
鎌状赤血球貧血．  これは、赤血球の回転率が極めて高い独特の臨床例であり、罹患者の赤血球における鎌状赤血球化の過程はPO2の関数である。すなわち、PO2が低くなるほど、鎌状赤血球化速度が速くなる。鎌状赤血球化はまた、赤血球密度および粘度の関数であり、次にはヘマトクリットに強く依存する。鎌状赤血球発症における理想的な溶液は鎌状化した赤血球に酸素を送達するものであろう。従って、低いものよりもむしろ高いP50を使用することが好ましく、そうすれば鎌状化した赤血球に有利となるよう酸素の正味の輸送がなされる。これを行うためには、可能ないずれかの方法で拡散を止め、赤血球細胞に酸素を送り込むという潜在的優位性のいずれもを相殺することができる血管作用を低下させる必要があろう。同時に、溶液が良好な流動特性を有することが好ましい。従って、血管収縮が阻害されている、または少なくとも引き起こされていない間、赤血球に酸素が送り込まれるよう、P50と粘度との間のバランスがとられていなければならないであろう。
心臓麻痺．  特定の心臓手術法においては、心臓を適当な電解溶液によって停止させ、患者の体温を低下させる。体温の低下は、おそらくは通常のいずれかの生理学的条件の下で酸素が供給されない点まで劇的にP50を低下させる。従って、この目的のための溶液のP50は他の適用に解するものよりさらに高い可能性がある。粘度もまた温度に依存し、患者の特異な症状の下でin vivoにおける粘度が血液に近いように適当に調節されるであろう。
低酸素症．  高地居住者や世界クラスの陸上競技者、および極限状態にある兵士において、肺における空気からの酸素の抽出が全体の酸素輸送の制限となる。酸素輸送のこの態様は、おそらく組織に酸素を供給する溶液の能力よりもより重要であろう。この場合、より低いP50が有利であろうと考えられ、協同性は最大になるはずである。血管作用は望ましくないと考えられ、従って粘度が引き上げられよう。このような溶液のCOPは引き上げる必要はないと考えられ、血漿T1/2はできる限り長くあるべきである。
器官灌流．  ここでの主要な目的は、灌水の酸素含量を高めることである。この流体は流動しないので、酸素運搬および供給のパラメーターは他の症状におけるほど重要ではない。従ってほぼ完全な抽出が可能である。溶液には外部の酸素供給装置で酸素供給できるので、P50は相対的に、標準であってもよいし、または高くともよい。
細胞培養．  この必要条件は、細胞およびそれらの濃度により酸素の消費速度がより速い可能性があることを除いては、器官灌流のものとほとんど同じである。
造血．  ここではヘモグロビンはヘム及び鉄の供給源として機能し、新たなヘモグロビンへと再合成される。従って、ヘモグロビンは単球-マクロファージ系へ取り込まれ、次いで赤血球の代謝および成熟のために利用可能なその成分を作り出すような方法で壊されなければならい。COP、P50および粘度の特性は血液希釈溶液と同様であり得る。T1/2は、代謝が十分である限り、比較的短くてもよい。
酸素輸送の分野の多くの研究者は、組織への酸素供給を最大にするには修飾ヘモグロビンの酸素親和性は、低いかまたは少なくとも赤血球のそれとは有意には異ならないべきであると仮定している。本発明の開発中、このコンセプトには根拠がないことが判明した。重篤な低酸素症では、極端な高度にいる登山家で実証されているように、肺の酸素拡散は肺胞における酸素の取り込みの制限となり得る（Winslowら，[1984]）。この場合、酸素親和性の低下よりもむしろ上昇が、動脈中の酸素飽和を高めるので有利である。高地におけるデータに基づけば、このポイントはおよそ標高6,000メーターに、または約40トルのPaO2に達する。推定によれば、拡散性の肺の酸素の取り込みに厳格な制限を有する海水面患者（sea level patients）はまた高まったヘモグロビンの酸素親和性から有利であり得ると結論付けられ得る。肺の毛細管PO2が40トル（またはそれより低い）の最大値に達すれば、酸素平衡曲線を左へ移動させれば、増加した赤血球量およびそれゆえの粘度の負担をかけることなく飽和は高まり、結果として輸血として酸素含量を増加させたのと同じことになる。
一般に、血漿保持時間はできる限り長くあるべきである。しかしながら、おそらく特異的組織（例えば、腫瘍、心筋、潰瘍、鎌状赤血球症）に対する酸素送達に関しては、この特性はそれほど重要ではないと考えられる。さらに、ヘモグロビン溶液を与えることの理由が赤血球生成を刺激することであれば、保持時間が短いことが望まれると考えられる。
本発明は粘度、コロイド浸透圧、酸素親和性およびヘモグロビン濃度の特性が記載のように至適化されれば、ヘモグロビンは付加成分とともに処方され、血液の補助的機能を果たし得ることを示すデータを提供する。かかる組成物を必要とする患者に利益を与えるため、例えば、凝固因子（例えば、因子VIII、IXおよび／またはII）、免疫グロブリン、抗酸化剤、鉄キレート剤、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、炭酸アンヒドラーゼ、および他の酵素をヘモグロビン溶液と混合してもよい。同様に、細胞毒、抗生物質もしくは他の薬剤などの薬物をこの溶液に加えるか、またはヘモグロビンもしくは他の重合体などの成分と化学的に結合させてもよい。
さらに、最終的な製剤はいずれの望ましい電解液および塩組成物で処方してもい。それは最終製剤として液体状で、凍結、もしくは凍結乾燥させて保存することができ、またはヘモグロビン成分自身を続いていずれかの溶液で再構成することもできる。このような再構成媒体は限定されるものではないが、例えば、生理食塩水、リンゲルの乳酸塩、アルブミン溶液またはプラズマライト（PlasmaLyte）であり得る。最終製品はガラスまたはプラスチックなどのいずれの生体適合性容器でも保存できる。
B.  獣医学的適用
本発明は、限定されるものではないが、ヒトに使用するためのものである。簡単に前記した臨床適用に加え、本発明は獣医学的領域における有用性を見出す。本発明の組成物は家畜（livestock）およびペット（例えば、イヌ、ネコ、トリ、爬虫類）などの家畜（domestic animals）、ならびに水族館、動物園、海洋大水族館および動物を飼う他の施設中の動物で使用され得る。例えば、ヒトでは、本発明の組成物は、外傷、溶血性貧血などのための血液損失により傷ついた家畜および野生動物の救急治療に使用され得る。例えば、ウマ伝染性貧血、ネコ伝染性貧血、化学物質による溶血性貧血および他の自然の病原体、細菌感染、因子IV切断、脾機能亢進および巨脾症、家禽における出血症候群、発育不全性貧血（hypoplastic anemia）、再生不能性貧血（aplastic anemia）、突発性免疫溶血症状、鉄欠乏、自己免疫溶血性貧血、微細血管障害性溶血、寄生などにおける本発明の実施形態を考える。特に、本発明は、希少種および／または新種の動物のための血液供与者を見つけるのが困難な領域における使用を見出す。
VI. 血液製剤組成物
本発明の組成物に含まれる酸素運搬成分と非酸素運搬成分（例えば、コロイド血漿拡張剤）との相対比率は、広範囲にわたって変化させることができる。もちろん、相対比率はある程度まで非酸素運搬血漿拡張剤として使用されるコロイドの分子量のような特定成分の性質に依存する。しかしながら、本発明は非酸素運搬成分としてのコロイドの使用に限定されない。
本発明の好ましい実施形態では、非酸素運搬成分（例えば、非タンパク質様コロイド）の血液希釈効果が優先され、すなわち酸素運搬成分の全酸素運搬能力が希釈によって減少する結果、動脈壁での過剰な酸素放出による逆の効果が緩和される。かかる実施形態において、かなりの経済的な利益が、好ましくは各成分の少なくとも20重量%、さらに好ましくは各成分の少なくとも25重量%を含む組成物から得られる。最も好ましい組成物は、（2つの組み合わせの100重量部当たり）約30ないし約70部の酸素運搬成分（例えば、HOBC）、相当する約70ないし約30部の非酸素運搬成分（例えば、不活性コロイド）を含んでなる。
好ましい実施形態において、本発明の血液置換組成物の粘度は正常な血液のそれに近い。従って、粘度を増加させることを主要目的として組成物を使用することを望む場合には、高分子量コロイドを酸素運搬成分の100重量部当たり約1ないし約20重量部の量で使用することが好ましい。
本発明の他の好ましい実施形態において、組成物の増加した粘度（すなわち、全血のそれに近づく値まで）は主要な効果である。これらの組成物において、組成物の粘度が十分に高い結果、動脈壁における剪断応力は動脈壁で利用可能なたくさんの酸素の効果を打ち消すために内因性の血管拡張剤を放出するに十分である。かかる実施形態において、非酸素運搬成分（例えば、非タンパク質様コロイド）は酸素運搬成分よりもかなり高い分子量を有するべきであるが、過剰な粘度を避けるためにはより少ない量で使用するべきである。分子量300,000〜750,000のポリビニルピロリドン（PVP）を酸素運搬成分100重量部当たり約1ないし約20重量部の量で使用することは、これらの実施形態において特に適切である。同様に、高分子量のデンプン（例えば、約200,000〜750,000の分子量）はまた、これらの実施形態において好ましい。酸素運搬成分、すなわち、ある粘性を有するコロイド溶液を生ずるように選択した量は、全血と比較して（1の値を割り当てると）約0.5ないし約1.2である。
本発明のある実施形態において、前記の効果の双方が利用される。すなわち、非酸素運搬成分（例えば、非タンパク質様不活性コロイド血漿拡張剤）の量および型を、溶液の単位容積が運搬する酸素の量を減少させ、正常な全血のそれに近いレベルまでその粘度を増加させるように選択する。この目的のために、酸素運搬成分の分子量よりも高分子量のPVPおよびデンプンが、粘度を増加させ、運搬する酸素の量を減少させ、および溶液の価格を下げるために十分な量で用いられる。本発明での使用においては、特に、約200,000ないし約600,000の分子量を有するPVPおよびデンプンを酸素運搬成分100重量部当たり約5ないし約50重量部の不活性コロイドの量で使用することが考えられる。
いくつかの実施形態において、本発明は、水溶液組成物において酸素運搬成分と非酸素運搬成分（例えば、不活性コロイド血漿拡張剤）とを組み合わせた濃度が、通常その成分の1つを同じ目的のために単独で用いる場合に通常使用されるものと同一の範囲である（すなわち、溶液10リットル当たり約5ないし約15グラムの組み合わせた物）ことを意図する。
本発明の組成物は、現在の血液代替物に関する以下の改良点を提供する。i）患者がさらされるヘモグロビンの濃度を少なくし、それによって血液製剤の毒性および価格を下げること、ii）現在用いられている代用血液よりも効果的に血管容積を拡張するコロイド浸透圧、iii）毛細血管の血流を維持する最適の粘度、iv）動脈壁への酸素の過剰供給を減少させる最適の酸素親和性、およびv）最適の酸素運搬能力。これらの改良点のすべてが無細胞酸素担体としての血液製剤の有効性を増加させる。
いくつかの先行技術の参照が、ヘモグロビン溶液と非酸素運搬血漿拡張剤との混合の可能性について議論している。例えば、Morrisらの米国特許第4,061,736号およびBonsonらの米国特許第4,001,401号は、ヘモグロビンの類似体および製薬上許容される担体を含んでなる医薬組成物を記載しており、担体としては、例えばポリマー血漿代替物（例えば、ポリエチレンオキシド）が挙げられ得る。同様に、Bonaventuraらの米国特許第5,349,054号は、ポリマー血漿代替物（例えば、ポリビニルピロリドン）と混合できるヘモブロビン類似体を含んでなる医薬組成物を記載している。しかしながら、先行技術は特定の組成を記載してはいないし、血液代替物の有効性の改良およびそれらの溶液の毒性の減少に関する本発明の技術も記載していない。
いくつかの好ましい実施形態の説明
概して言えば、i）高いコロイド浸透圧、酸素親和性および粘度を有する酸素運搬成分（例えば、HBOC）、ならびにii）類似のコロイド浸透圧および粘度を有する非酸素運搬成分を含んでなる組成物は、最適の血液製剤を提供する。本発明の最も好ましい実施形態において、混合物の酸素運搬成分はポリエチレングリコールで修飾したヘモグロビンを含んでなり、非酸素運搬成分はペンタスターチを含んでなる。
実施例の節でさらに詳細に記載するが、現在ポリエチレングリコールで修飾したヘモグロビン製剤は2つ市販されている。第1の製剤、ピリドキサルヘモグロビンポリオキシエチレン（PHP）は、Apex Bioscienceから入手できるヒト由来の製剤である。第2の製剤、PEG-Hbは、Enzon社から入手できるウシ由来の製剤である。ほとんどの実験操作はPEG-Hbを用いて行われたが、この2つのPEG修飾ヘモグロビン製剤は定性的に同一の結果を与えた。本発明の好ましい酸素運搬成分がPEG-HbおよびPHPに限定されるものでなく、実際にポリエチレングリコールと関係あるどのヘモグロビン製剤も本発明の最も好ましい混合物との使用を意図するものとして理解されるべきである。
本発明の最も好ましい非酸素運搬成分であるペンタスターチは、DuPont Merck（PentaspanTM）ならびに他の供給源から市販されている。それはヒドロキシエチルスターチを含んでなり、約250,000ダルトンの分子量を有する。他のスターチ（例えば、ヘタスターチ）と比較してそれがより低い分子量を有しており、ヒドロキシエチル置換の程度がより低いために、それはより高いコロイド浸透圧および循環においてより速い酵素分解を示す。実施例の節でさらに詳細に記載するが、ヘタスターチのような異なる非酸素運搬成分でのPEG-Hbの希釈は、その結果生じる血液製剤の粘度およびコロイド浸透圧を下げ、生じる混合物の酸素容量を減少させる。対照的に、PEG修飾ヘモグロビンとペンタスターチとの組み合わせから生ずる混合物は粘度およびコロイド浸透圧の値がPEG-Hb単独のものと非常に近く、他の混合物（実施例の節を参照のこと）と比較して動物の残存期間および生理学的パラメーターの増大を導くことがわかっている。
ポリエチレングリコール修飾ヘモグロビンとペンタスターチとの好ましい混合物は、各成分の少なくとも20重量%、さらに好ましくは各成分の少なくとも25重量%を含む。最も好ましい組成物は、（2つの組み合わせの100重量部当たり）約30ないし約70部の酸素運搬成分であるPEG修飾ヘモグロビン、及び、対応する約70ないし約30部の非酸素運搬成分であるペンタスターチを含んでなる。
以下に表す実験結果は、PEG-Hbとペンタスターチとの混合物がPEG-Hb単独の溶液と同様にふるまうことを示す。たとえ動物が曝されるヘモグロビン濃度および用いられるヘモグロビン製剤の量が混合物の半分よりも少なかったとしてもこのことは真実であり、患者に投与するヘモグロビンの濃度を下げるという利点を与え、それによって価格および可能な逆効果の双方を軽減する。
前記で指摘したように、本発明の組成物および方法は、現在貯蔵血液を患者に投与しているどの状態においても用いることができる。例えば、外科手術の間にまたは外傷性損傷によって血液を喪失した患者に組成物を投与することができる。本発明の組成物は、ヒト免疫不全性ウイルスおよび肝炎ウイルスのような起こり得る伝染性病原体にさらされた患者を救うという利点がある。
実験
以下の実施例により本発明のある好ましい実施形態および態様を説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
以下に示す実験では、次の省略記号を用いる：eq（等量）；M（モル）；mM（ミリモル）；μM（マイクロモル）；g（グラム）；mg（ミリグラム）；μg（マイクログラム）；kg（キログラム）；L（リットル）；mL（ミリリットル）；dL（デシリットル）；μL（マイクロリットル）；cm（センチメートル）；mm（ミリメートル）；μm（マイクロメートル）；nm（ナノメートル）；min.（分）；ｓおよびsec.（秒）；b.w.（体重）；i.p.（腹腔内のまたは腹腔内に）；Da（ダルトン）；dP/dt（経時的な圧力変化）；IU（国際単位）；Hg（水銀）；Hz（ヘルツ）；MHz（メガヘルツ）；COP（コロイド浸透圧）；CRBCv（毛細管赤血球速度）；FCD（機能毛細管密度）；FDA（米国食品医薬品局; United States Food and Drug Administration）; Hb（ヘモグロビン）；MAP（平均動脈血圧）；Pb（パラジウム）；PEG（ポリエチレングリコール）；PEGHb（ポリエチレングリコールとの結合により修飾したウシヘモグロビン）；sat.（飽和）；semおよびs.e.m.（平均の標準誤差）；TM（トリメシン酸）；Abbott（Abbott Laboratories, Chicago, 1L）; Beckman（Beckman Instruments, Fullerton, CA）; Bectron（NJ）; Dupont（Dupont Pharmaceuticals, Wilmington, DE）; EG&G Electro Optics（Salem, MA）; Enzon, Inc.（Piscataway, NJ）; Fresenius（Walnut Creek, CA）; Hemocue, Inc.（Mission Viejo, CA）; Hemosol Inc.（Etobicoke, ON, Canada）; IPM（IPM, inc., San Diego, CA）; Lexington Instruments（Waltham, MA）; Pharmacia（Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ）; Porphyrin Products, Inc.（Logan, UT）; Sharp（Japan）; Sony（Japan）; TCS Medical Products（Hintingdon Valley, PA）; Tektronix（Tektronix Inc., Beaverton, OR）; Wescor（Logan, UT）。特に断らない限り、次の実施例では、以下の一般的な方法を用いた。
動物モデルおよび調製
試験（実施例16に記載のものは除く）は、40ないし50gの体重の10匹のシリアンゴールデンハムスターで行った。次いで記載の手術手法（参照、例えばH.D. Papenfussら，“A transparent access chamber for the rat dorsal skin fold.”Microvasc. Res. 18:311-318[1979]; H. Kergerら，“Systemic and subcutaneous microvascular oxygen tension in conscious Syrian golden hamsters.”Am. J. Physiol., 267（Heart. Circ. Physiol. 37）: H802-810[1995]）を用い、それぞれの動物で「ハムスターウィンドウ調製物」を作製した。簡潔に言えば、皮膚および筋肉組織の２層で構成される、それぞれの動物の背部皮膚褶襞にペントバルビタール麻酔（50mg/kg b.w., i.p., Membutal（登録商標），Abbott）をかけ、15mmの円形開口部をもつ2つのチタンフレームをはめ込み、手術により取り付けた。皮膚筋肉層を注意深く皮下組織から切り離し、薄い単分子層の筋肉および１層のインタクトな皮膚が残るまで取り除いた。
その後、1つのフレームで固定したカバーガラスを露出した組織上に乗せ、微小血管系の生体内観察をした。第2フレームを開け、インタクトな皮膚を露出させた。PE10カテーテルを頚静脈および頚動脈中に移植した。カテーテルを皮下で頚部腹部側から背部側へ通し、チャンバー基部で皮膚から体外に露出させた。ヘパリン含有食塩水（40IU/mL）0.005ないし0.01mLで移植先端を毎日洗い流してカテーテルの開通を確実にした。チャンバー移植の少なくとも2日後、従って手術後の外傷性傷害が緩和された状態で、覚醒し、麻酔をしていないハムスターの微小血管観察を行った。これらの研究の間、呼吸を妨げることなく動物の動きを最小にするためにウィンドウチャンバーが突出した管に動物を入れた。
ウィンドウチャンバーの顕微鏡検査が次の基準：i）出血および／または浮腫の徴候がない；ii）全身的平均血圧が約80mmHg以上；iii）心拍数が320拍／分以上（Beckman recorder, R611, Spectramed transducer P23XL）；iv）全身的ヘマトクリットが約45%以上（Readacrit（登録商標）centrifuge, Bectron）；およびv）固定化白血球および細静脈内皮接触を有して流れる白血球の数が対照の時点における総通過白血球の10%以下、を満たす場合、調製物は試験に適当であるとみなされた。
特に指示されない限り、以後記載する試験はハムスターウィンドウ調製物でのみ行った。このモデルは、麻酔なしに長時間（すなわち数日間）の微小循環観察が可能であるため選択した；先に行われた微小血管の研究から、麻酔をかけた動物から得たデータは覚醒状態の代わりとならないことが示された。ハムスターウィンドウ調製物はまた、代表的なデータを得るために環境から単離された状態で観察される組織を提供する。
生体内鏡検法
25x SW 0.60 n.a.浸水型対物レンズを有する生体内顕微鏡（Leitz, Ortholux II）を用い、顕微鏡観察を行った。調製物は、10x接眼レンズを用い、全光学倍率250xで視覚的に観察した。透視画像のコントラストの増強を、ヘモグロビンの最大吸収バンドで光を選択的に通過させる青色フィルター（420nm）を用いて行い、赤血球は他のグレーの背景に対して黒い物体として現われた。コンデンサーの前に熱フィルターを光路に置いた。
鏡像は2種の異なるカメラ、ビデオカセットレコーダー（Sharp XA-2500S）およびモニターの最終全倍率が650xであるモニター（Sony, PVM 1271Q）で構成される閉回路ビデオ装置で調べた。
毛細管赤血球速度
毛細管赤血球速度（CRBCv）は、速度自動記録（tracing）コレレーター（IPM, モデル102B）を装備したビデオ併用（dual）ウィンドウ技術を用いて測定した。観察期間にわたり平均速度を得るため、それぞれの毛細管のCRBCvを20秒間測定した。すべての測定は同一の毛細管で行った。血流がありながら、次の時点で停止するそれら毛細管は、血流のない時点で0値をとる統計量には含めなかった。；これはそれらの組織灌流指数への影響は、それらの機能的毛細管密度（FOD）、すなわちRBCが通過していることが観察される単位面積における毛細管数への影響によって説明されるためである。1視野のすべての毛細管が同一焦点平面（focal plane）にあるわけではないため、CRBCvを１観察視野につき1ないし2血管（動物当たり10ないし12）で測定した。
細動脈および細静脈径
細動脈および細静脈径を、画像剪断モニター（IPM,モデル907）を用い、ビデオ再生間の各時点で測定した。
微小循環におけるpO2の測定
データ収集の前に、予めアルブミンと結合したパラジウム（Pd）-コプロポルフィリン（Porphyrin Products, Inc.）をそれぞれの動物にゆっくりと静脈内注射をした。用いた濃度は、30mg/kg体重であった。pO2の測定の間、崩壊定数10マイクロ秒を有するキセノンストロボアーク（EG&G Electro Optics）を選択領域に30Hzでフラッシュした。強い照明により引き起こされる可能性のある組織損傷を避けるため、pO2測定の間だけ外部照射を用いた。外部照射領域からの燐光放射は光電子増倍管（EMI, 9855B）で捕獲される前に、調節スリットを通過し、長波長帯（long band）通過フィルター（630nmで遮断する）を通る。スリットサイズは、通常15x100μm（実際の顕微鏡視野に比較して）にしておき、それを必ず血管の縦方向に沿って置いた。
間質測定を行う場合、スリットを最も近傍の血管に平行に、様々な間隔で置いた。光電子増倍管からのシグナルをデジタルオシロスコープ（Tektronix, 2430）へ送信した。オシロスコープは平均200ないし500曲線であり、1つの滑らかな曲線を0.5MHzの速度でデジタル化（分解能10ビット）し、後の解析に備えた。それぞれの曲線は特殊アナログ演算処理装置でpO2算出の処理を行った。
一般試験プロトコール
特に断らない限り、以下の実施例では、下記の一般的な交換輸血手法を用いた。ウィンドウ調製物のチャンバーウィンドウを第1日に移植した。そのチャンバーを第3日に封入基準に応じて検査し、満足すべきものであれば、頚動脈および頚静脈カテーテルを移植した。動物を全身的および微小血管封入基準に応じて第５日に検査し、満足すべきものであれば、交換試験を開始した。
それぞれの試験がそれ自体の対照となり、すべてのデータは試験開始時の動物の状態に相対的なものである。血液交換前を対照として、ビデオ顕微鏡的測定、全身的ヘマトクリット、心拍数、血中ガス（pO2、pH、pCO2）および血中ヘモグロビン含量（この測定はヘモリンク（登録商標）／デキストランを使用する試験で開始し、以後実施される試験で継続した）を調べた。対照の顕微鏡測定には、毛細管流速ならびに細動脈および細静脈径を含めた。微小血管pO2測定は、毒性のために1つの時点でのみ行うことができるため、対照では行わなかった。対照のマクロおよびミクロ的データ収集は1時間かかった。
対照の測定値を収集した後、最初の交換を開始した。目標は元の血液量の40%を取り除き、100μL/分の速度で置換血液と置き換えることであった（この手法の継続時間は10ないし20分であった）。この手法の最後、および10分間の平衡化および安定化期間の後、前記のミクロおよびマクロ的測定を行った（この手法の継続時間は1時間であった）。
次いで前記の手法を用い、元の体積の30%の抽出を目標とした2回目の交換を開始した。ミクロおよびマクロ的測定を行い、これが最終交換である場合には、動物をpO2測定用顕微鏡に移した。動物にポルフィリン化合物を注射し、細動脈、細静脈および組織で脈管内および脈管外のpO2測定を行った（この手法の継続時間は1時間であった）。
最終ヘマトクリットの目標が20%の範囲内にある場合、次いで3回目の交換を行い、2回目の交換の間、微小血管pO2の測定は行わなかった。3回目の交換の後、ミクロおよびマクロ的測定を行い、動物をpO2測定用顕微鏡に移した。
統計的解析
それぞれのグループで得られたデータを解析し、グループ内で観察された変化が統計的に有意であるか否かを決定した。それぞれのグループの結果は、独立した試験から得られる各々の時点のデータを処理して得られる。標準化した平均にマン・ホイットニー非パラメーター試験（Mann-Whitney non-parametric test）を用い、パラメーターの変化が対照と有意に異なるか否かを評価した。結果は中央値および四分位数間領域に関して得られる。変化はP＜0.05が統計的に有意であると考えた。
以下の実施例は以下の節：I）微小循環試験；およびII）臨床モデル試験に分けられる。
1．微小循環試験
実施例1
コロイドおよび食塩水による血液希釈間の血流およびヘマトクリット
この実施例の試験は、血液希釈の結果としてのヘマトクリットの減少の血流速度に対する影響の決定を目的としたものである。この実施例の試験はデキストラン70および食塩水を用いハムスターで実施した。
前記の一般的試験手法（例えば、一般的試験プロトコールおよび毛細管赤血球速度）を行った。図2はデキストランによる血液希釈および食塩水による血液希釈によるヘマトクリット減少の関数としての微小循環の流速プロットを表す。下記の記号を図2で用いる。：i）デキストラン血液希釈：。＝腸間膜；□＝皮膚；＋＝筋肉；およびii）食塩水血液希釈：○＝皮膚褶襞。その結果は、微小循環血管内の血液速度により立証されるように、血液が希釈されるにつれて血流が増加することを示す。この増加は、ヘマトクリットの減少に１次元的に関連し、循環における粘性喪失の大部分が、油液粘性およびヘマトクリット間の関係が一次元的である微小循環内で生じるという事実を反映している。
これまでの研究の多くは、循環機能および血流を維持しながら、RBC数を元の総数の25%（すなわち、元のRBC量の75%の損失）まで減少し得ることを示していた。大部分のヘモグロビンフリー溶液（例えば、HBOC）は、非常に低いヘマトクリットにおいてヘマトクリットの減少による血流の一次元的増加を示さず、これは酸素非運搬希釈剤により明示される。これらの結果から、先に言及し、さらに詳細を後に記載した動脈壁反応のようなヘモグロビンフリー溶液の場合に別の工程が存在することが示される。
実施例2
デキストラン70およびヘモリンク（登録商標）血液希釈間のpO2分配
この実施例の試験は、上記の燐光崩壊（decay）法による微小循環での血液希釈のpO2への影響の決定を目的としたものである。
デキストラン70血液希釈
pO2の測定は、50μm細動脈およびそれら細動脈周辺組織で行った。その結果は次のようであった：細動脈pO2（pO2.A）=53mmHg；組織pO2（pO2.T）=21mmHg。次いで下記の公式を用い、i）細動脈および組織間、およびii）中枢動脈および組織間の酸素分圧の低減の差を表すKA*定数を算出できる：
KA*=In[（pO2.A-pO2.T）/（pO2.a-pO2.T）]
（式中、pO2は中枢動脈の酸素分圧である。pO2.a=100mmHgと仮定すると、KA*=In[（53-21）/（100-21）]=-0.90となる。）
表5はデキストラン70による血液希釈で、これまでに（本発明者らが）得た種々のヘマトクリット（α）レベルのpO2値を説明する。対流拡散モデルから測定値の理論値との比較が可能である。血液粘度（γ）の変化は直接測定しなかったが、微小循環の血流速度変化から推定した；相対粘度（γ）は全血液の粘度（γ=1.0）に関連する。酸素運搬量は、ヘマトクリットに正比例すると想定した（すなわち、血漿により運搬される酸素を無視する）。表5はデキストラン70血液希釈後の測定および理論pO2.A値を要約する。対応するγ/α比によりKA*が増加するというモデル結果を用い、血液希釈各レベルの推定値を得た。
0004583510.tif 000014
表5に示された結果から、元のヘマトクリット総数の60%（すなわち、元のRBC量の40%の損失）までの減少、または（RBC中）ヘモグロビン濃度9%では、通常組織での酸素付加を変化させないことが示される。これは自己調節性応答および組織酸素付加の見地から当然そうあるべきである。このモデルから、ヘマトクリットが正常値の40%および20%まで減少するにつれて細動脈の血液pO2が有意に低くなるであろうことが推定される。しかしながら、データが示すように、40%の減少ではこの自体は生じず、細動脈はpO2の維持を目的とする十分に強い自己調節性応答を引き出すことが示される。ヘマトクリットのさらなる減少により、組織pO2の顕著な減少が生じる。さらに、過度の血液希釈における壁勾配は低く、より低い細動脈酸素分圧に応じるために必要な血管拡張を反映する。
ヘモリンク（登録商標）による血液希釈
ヘモリンク（登録商標）での血液希釈を上記のデキストラン70についての方法と同様の方法で行った。その結果を表6に示す。
0004583510.tif 000015
表6の結果から、血液希釈のすべてのレベルでヘモリンク（登録商標）が細動脈pO2を維持したことが示される。動物は元のRBC量の20%までの血液希釈に耐え、これはデキストラン血液希釈では見られなかった。本発明を実施するためにメカニズムの理解は必要とされないが、細動脈pO2の維持は血流を約25%まで減少させる血管収縮作用によると考えられる。これはi）増加した血管壁勾配（血管収縮の徴候）；ii）細動脈血管収縮；およびiii）ヘモリンク（登録商標）でのRBC量希釈のいずれの所与のレベルにおいてもより高いγ値であることから明示される、デキストラン70血液希釈で得られるものより低い粘性作用による流量増加、により明示される。
ヘモリンク（登録商標）を用いた希釈が、コロイドから生じる粘性作用に従い、血流のみを増加させるとした場合、50μm細動脈のレベルにおけるpO2値を得ることが予測され理論上の推定により算出すると、これは約60mmHg（ヘマトクリット=0.4）であろう。値がほぼ同一である理由の理解は、本発明の実践には必要でないが、理論数値および測定数値間の差は、一種の動脈壁反応の存在を示す。この結果から25%のオーダーで減少した血流を説明する血管収縮作用があることが示唆され、これは6%のオーダーでの血管径の減少によるものであろう。得られたデータから、細動脈径がヘマトクリット0.4では対照の93%まで、ヘマトクリット0.2では対照の88%まで減少することが示される。この血管収縮レベルは、ヘマトクリット0.4における圧力の増加（しかしより多量の交換レベルの対照とは異ならない）からも明白である。
ヘモリンク（登録商標）で得られた結果から、10%から40%までのヘマトクリットの等容性減少の後、組織の酸素付加（50μm細動脈および組織の同一のレベルまでのpO2に関して）は標準条件にあるそれらのレベルに維持されることが示される。本発明を実施するために、この作用についての方法論の厳密な理解は必要とされないが、認められた血圧および血管壁勾配のわずかな上昇および機能的毛細管密度の減少は自己調節現象（すなわち、低下した血液粘度により潜在的過剰酸素運搬能が存在する中で、50μm細動脈のpO2を一定に維持することを目的とした現象）の直接的な結果であろう。
本発明の血液置換処方の効果の影響
本実施例の結果から、ヘモリンク（登録商標）は本処方で過度の酸素を供給すること、および得られた血液混合液の粘度が低すぎることが示される。酸素運搬能を維持するために不活性コロイドでの血液希釈は低い血液粘度に依存するが、得られた心拍出量の増加はすべての場合において、所望の効果ではない可能性がある。それゆえ、本発明のいくつかの実施形態において、ヘモリンク（登録商標）および他の酸素運搬成分、特にHBOCを不活性コロイドを含有する溶液に配合する。この方法で、コロイド浸透圧および血漿貯留（retention）を維持しながら、粘度の上昇を達成するか、および／または酸素運搬能を低減させる。
実施例3
50%ヘモリンク（登録商標）/50%デキストラン70での血液希釈によりもたらされる組織酸素付加
この実施例の試験は、ヘモリンク（登録商標）およびデキストラン70混合液投与後の組織酸素付加の妥当性の決定を目的としたものである。
50%ヘモリンク（登録商標）および50%デキストラン70の混合液を調製し、基底レベルの60%ないし40%のヘマトクリットレベルで組織酸素付加を決定した。得られた混合液のヘモグロビン濃度は吸光分光分析により直接測定した。さらに、RBC数およびヘモリンク（登録商標）量は血液サンプルで直接測定した。4匹の動物で試験を開始したが、2匹の動物のみが試験実施に含まれるすべての基準を満たした；2匹の動物についての結果を表7に示す。
0004583510.tif 000016
表7のデータをヘモリンク（登録商標）単独使用で得られたもの（表6参照）と比較した場合、pO2.T値は非常に類似している（ヘマトクリット=0.4で15mmHgに対して17mmHg）；これらの値は許容範囲である。それゆえ、希釈混合液がヘモリンク（登録商標）単独で運搬される単位重量当りの酸素量の半分だけ運搬するという事実にもかかわらず、希釈混合液およびヘモリンク（登録商標）単独の双方で適当な組織酸素付加が得られる。
実施例4
ヘマトクリット0.4におけるヘモリンク（登録商票）、デキストラン70およびヘモリンク（登録商標）/デキストラン70での組織酸素付加
この実施例の試験は、ヘマトクリット0.4におけるヘモリンク（登録商標）、デキストラン70、およびヘモリンク（登録商標）/デキストラン70（50%/50%）による組織酸素付加の決定および比較を目的としたものである。これらの試験は先の実施例で述べられたものに基づいて構成する。
前記の組成物の投与後、組織酸素付加の効率を細動脈および細静脈pO2、ヘモグロビンの酸素飽和率（％）、毛細管流速（1/γ）、および固有酸素運搬能（α）についての情報から算出した。これらのパラメーターは上記のように決定し、微小循環による酸素抽出を以後に述べる方法により決定した。その結果を表8に示す（該当する場合には相対的数値を示す）。
0004583510.tif 000017
表8の酸素抽出についてのデータは、血管壁でのpO2勾配の測定により得られる。この値は、血液=1に標準化した酸素運搬能の値と合わせて、組織酸素付加の所与のレベルの動脈血管および組織間で失われた酸素の相対量を示す。正常（すなわち、希釈しない血液）の場合、数値は32%である。血液をデキストラン70で希釈する場合、数値は9%（すなわち、40%の22%）であり；血液をヘモリンク（登録商標）で希釈する場合、数値は40%（すなわち、80%の50%）であり；血液をヘモリンク（登録商標）/デキストラン70混合液で希釈する場合、数値は14%（すなわち、54%の26%）である。
この結果から、デキストラン/ヘモリンク（登録商標）混合液は組織への酸素の送達においてヘモリンク（登録商標）単独よりかなり効率的であることが示される。混合液は動脈から毛細管への移動での酸素の損失がヘモリンク（登録商標）単独よりかなり少ないため、混合液は酸素付加目的での組織に有用な酸素の保有がより多い。それゆえ、酸素非運搬成分および酸素運搬成分を含んでなる本発明の組成物は、組織により多くの酸素の保有をもたらす；この結果はさらに、意外な本組成物の有利点を示す。
実施例5
ヘマトクリット0.4におけるヘモリンク（登録商標）およびヘモリンク（登録商標）/デキストラン70での壁勾配
前記の実施例のいくつかは、i）動脈、静脈および組織の酸素分圧、およびii）ヘマトクリット0.4におけるヘモリンク（登録商標）およびヘマトクリット0.4における50:50デキストラン/ヘモリンク（登録商標）での標準血液（対照）の血圧を決定する「覚醒ハムスター」モデルの使用を目的としたものである。本実施例は、これらの組成物のそれぞれを用いる壁勾配の決定を目的とするものである。
前記に示されるように、血管壁勾配は組織の酸素付加に反比例する。この実施例では、壁勾配を先の研究のpO2測定から得た。その「血圧」のデータは対照に相対的な平均動脈血圧を示す。結果を表9に示す。
0004583510.tif 000018
表9のデータから、測定パラメーターについて比較した場合、ヘモリンク（登録商標）/デキストラン組成物は事実上ヘモリンク（登録商標）単独と同等であることが示される。さらにこの実施例の結果から、前記の実施例と合わせて、ヘモリンク（登録商標）（および、外挿により、他のHBOC）を用いて単独で得られる所望の血液置換物の特性が本発明の組成物（すなわち、酸素非運搬成分と組合わせた酸素運搬成分の溶液を含んでなる組成物）でも得ることができることが示される。
実施例6
ヘマトクリット12−13%における微小循環パラメーター
この実施例の試験では、前記の手法を用い、数種の異なる組成物の投与後の様々な微小循環パラメーターを評価する。
6種の異なる組成物：1）対照（すなわち標準血液）；2）デキストラン70単独；3）ヘモリンク（登録商標）単独；4）ヘモリンク（登録商標）33%/デキストラン66%（容量）；5）ヘモリンク（登録商標）50%/デキストラン50%；および6）L-Name（L-ニトロシル-アルギニン-モノメチル-エーテル；例えばSigma社から市販品を入手可能である）を別個の試験でハムスターに投与した。試験3）ないし5）では3回の交換灌流の後、対照の約12%のヘマトクリットとした。デキストラン単独の試験（試験番号3）では、動物がこの組成物での3回の希釈に耐えないため、2回の血液希釈（すなわち、2回の交換灌流）を行った。L-name組成物は動物に注入した（すなわち、血液希釈のために投与しなかった）。
得られたデータを表10に示す。表10において、PaO2=動脈PO2；Grad（A）=細動脈/組織勾配；およびGrad（V）=細静脈./組織PO2勾配である。血管収縮に関するデータは、対照（試験番号1）に対する相対値である。
表10のデータから、ヘモグロビンに基づく酸素担体（HBOC）ヘモリンク（登録商標）での血液希釈は組織PO2を約20から5mmHgに低下させたことが示される。これは、細動脈/組織PO2勾配の約17から28mmHgまでの上昇に伴って起こり、この生成物によって生じることが予め解明している血管収縮と一致する。ヘモリンク（登録商標）を酸素非運搬血漿増量用デキストランと混合した場合、組織PO2はヘモリンク（登録商標）/デキストランの33%および50%混合液でそれぞれ13および17mmHgまで増大した。しかしながら、ヘモリンク（登録商標）/デキストラン組成物での試験では、ヘモグロビンによりなおも生じる血管収縮の結果、細動脈/組織PO2勾配は高いままである。
これらの試験から、前記実施例のいくつかの結果と合わせ、ヘモグロビンの細胞外の場所によりO2の利用性が増大するならば、細動脈レベルで自己調節性血管収縮を妨げるために次の1以上の補償作用：i）粘性の増大、ii）O2運搬能の低下、またはiii）O2親和性の増大が起こらなければならないことが示される。
0004583510.tif 000019
実施例７
ヘモリンク（登録商標）およびポリビニルピロリドンを含む組成物の使用
本実施例の試験は、粘性の上昇が細動脈レベルにおける自己調節性血管収縮を阻害するという証拠を提供する。本実施例の微小血管実験は、ヘモリンク（登録商標）および、分子量750,000ダルトンのポリビニルピロリドン（PVP）を含む組成物を用いて行った。
i）ヘモリンク（登録商標）、ii）50:50ヘモリンク（登録商標）：分子量70,000のデキストラン（容積比）およびiii）100:4ヘモリンク（登録商標）：分子量750,000のPVP（容積比）の水溶液を、それぞれ全溶質濃度が10g/100mlとなるよう調製した。この組成物を、前記の「覚醒ハムスター」モデルにおいて試験した。PVPは、血漿膨張剤として実験的に用いられ、またヒトにおいても同じ目的で使用されてきた；その主要な特性は、血漿血液粘性の増大である。PVPの使用により、溶液の粘性が推定値約15センチポアズ（全血の粘性と実質的に等価）まで実質的に増大する。
動物の血液とそれぞれの組成物を、最終ヘマトクリットが対照の0.20（すなわち、もとのRBC量の20%）となるよう、または有効ヘマトクリットが約10%となるよう等容性交換した。前記の方法により、動脈圧、壁勾配、血圧および組織酸素の測定を行った。その結果を、以下の表11に示す。
表11の結果から、他の２つの組成物と比較して、ヘモリンク（登録商標）：PVP組成物の粘性上昇によって、血管壁の勾配を有意に低下させ、より多くの酸素を組織が利用できるようにすることが示される。この増大した粘性は、血管系の拡張を引き起こし、微小循環における酸素の分配を正常化する。本発明を実施するために、その基礎となるメカニズムの理解は要求されないが、組成物の粘性増大による血管拡張のメカニズムは２倍になると考えられている。まず、低ヘモグロビンによる血液の酸素送達の減少は、他の不活性非タンパク質コロイドを含む、前記の酸素運搬組成物においても認められる、類似の自己調節作用を引き起こす。第二に、血管壁において増大する剪断応力が、プロスタサイクリンのような内因性血管拡張物質の放出を増大させる。
これに加えて、ヘモリンク（登録商標）／PVP混合物のO2容量はヘモリンク（登録商標）単独の場合よりも低く、その粘性がより高いにもかかわらず、細動脈／組織PO2勾配は減少し、組織PO2は5ないし16mmHgに増加する。これらの結果は、従前に言及した理論的記述と一致する。しかしながら、ヘモリンク（登録商標）とPVPの混合物を血液代替物質として開発するのは適当ではなく、また、機能的毛細血管密度は所望とされるより低いと考えられている。
0004583510.tif 000020
II．臨床モデル実験
実施例８
臨床条件下におけるペンタスターチ、ヘモリンク（登録商標）、およびそれらの混合物の使用
この実施例は、雄Sprague-Dawleyラットを用いた、苛酷なストレス条件下でのin vivo実験に関する。本実施例の実験は、本発明の組成物の臨床使用（例えば、オペレーティングシアター（operating theater）環境下での）に関する情報を提供する。
交換輸血
実験開始24時間前に、動物に器械をつけ、すべての実験は覚醒状態にて行った。一本のカテーテルを大腿動脈に挿入し、もう一本を大腿静脈に挿入した。実験用ケージ中に動物を拘束した。まず、動物の血液の約50%を除去し、試験組成物と置換する交換輸血を行った；評価した試験組成物は、ペンタスターチ、ヘモリンク（登録商標）、およびヘモリンク（登録商標）／ペンタスターチ混合物（50:50容積比）であった。血液の回収と、試験組成物のうちのひとつの注入を0.5ml/分で同時に行うために蠕動性ポンプを使用した。交換時間は、ラットの標準血液容積65ml血液／kg体重に基づいて、推定全血液容積の50%の交換が達成されるように計算した。
交換中の平均動脈血圧
交換輸血が進行している際に、当該技術分野の標準的な方法により、カテーテルを通して平均動脈圧を測定した。図3は、交換輸血前および輸血中（図3中に矢印で示されている）の動脈血圧をグラフで示したものである。図3において、（▼）はヘモリンク（登録商標）、（▲）はペンタスターチ、および（▽）はヘモリンク（登録商標）＋ペンタスターチの混合物を表す。前記の統計分析を行ったところ、ヘモリンク（登録商標）単独と、ヘモリンク（登録商標）／ペンタスターチ組成物の間に有意な差は認められなかった。
出血時の生理的状態
前記の実施例に記載されたものと類似の、60%出血法を動物に施した。より明確には、前記の65ml/kgの推定を用いて、全血液量の60%を計算した。次いで、Hannonらにより開発された方法（「固定容量の出血後、高張食塩水デキストランにより蘇生した意識のあるブタの血液および酸−塩基の状態」、Circulatory Shock 32:19-29[1990]）と類似の簡易化指数法（simplified exponential protocol））により、計算した血液量を除去した。10分間の出血の開始時に、0.5ml／分の速度で稼動するシリンジポンプを用いて動脈側から血液を除去した。全血液量の60%が60分以上かけて除去されるよう、それぞれの回収時間を計算した。
カテーテルを通して平均動脈血圧を測定し、図４にそのデータをグラフで示した；図4で、各組成物を表す記号は図3で説明したものと同じである。ヘモリンク（登録商標）／ペンタスターチ組成物を輸血された動物において、最初は急激に低下した血圧がより高い血圧になると出血し始めることは注目すべきである。ヘモリンク（登録商標）／ペンタスターチ組成物およびヘモリンク（登録商標）単独の双方では、最初の50分、血圧は良く維持された。
前記の出血試験は、比較的苛酷な試験モデルを説明している。交換輸血をしていなくても、動物の約50%のみしか、60%出血の開始から120分を越えて生存できず、試験溶液を輸血されたものでは、生存した動物はずっと少なかった（データは示していない）。
心拍数（平均動脈圧測定の、圧力トレースから測定）およびpH、pCO2、pO2、乳酸蓄積および塩基過剰（血液の標準分析により測定）を含むその他の測定も、出血時間中に測定した。ヘモリンク（登録商標）を輸血された動物および、ヘモリンク（登録商標）／ペンタスターチ組成物を輸血された動物の結果（データは示していない）は、以下の例外を除いて実質的に等価であった。ヘモリンク（登録商標）／ペンタスターチ組成物の方が乳酸蓄積が多く、この組成物の酸素運搬量が少ないという事実を反映している。乳酸蓄積は、組織の酸素付加状態を直接的に反映する。すなわち、組織が十分な酸素を供給されない時に乳酸が蓄積する。
本実施例の実験の所見から、酸素運搬成分および酸素非運搬成分の混合物は、酸素運搬成分のみで達成された結果と比べて、優れてはいないにしても類似した結果であることが示される。
実施例9
ペンタスターチ、修飾ヘモグロビンおよびそれらの混合物の、臨床条件下における使用
本実施例の実験は、2つの酸素運搬成分、ポリエチレングリコールとの結合により修飾されたウシヘモグロビン（PEGHbまたはPEG）、およびαα-Hbを、単独で、および酸素非運搬成分である血漿膨張剤ペンタスターチ（ペンタスパン（登録商標）；DuPont）との組み合わせで評価した。
組成物の特性
表12において、本実施例で使用されたいくつかの組成物の特性を比較する。PEGHb＋ペンタスターチ組成物およびαα-Hb＋ペンタスターチ組成物は、それぞれの組成物を容積比で50%含んでなる。表12に示したとおり、PEGHbおよびペンタスターチは共に高コロイド浸透圧（COP）値を示し、双方とも血液の粘性にほぼ近い粘性を有する（使用した測定系において、水および精製ヘモグロビンは1センチポアズの粘性を有する）。
0004583510.tif 000021
交換輸血
覚醒ラットにおいて、前記の実施例に記載された方法を用いて50%の等容性交換輸血を行った。表13は、いくつかの組成物について、交換輸血が血液量、ヘマトクリット、総ヘモグロビンおよび血漿ヘモグロビンに及ぼす影響（±sem）を示している。
0004583510.tif 000022
表13に関して言えば、実験群のヘマトクリットおよびヘモグロビン濃度の減少は、PEGHb、ペンタスパン（登録商標）、そしてPEGHb＋ペンタスパン（登録商標）投与動物において、交換法が血漿容積の有意な膨張につながったことを示している。
出血時の生理的状態
次いで、ラットは1時間以上にわたる60%出血に供された；実施例8に記載されている、約50%の動物を致死させることが知られているこのプロトコールを実行した。
図5ないし10において、以下の名称を適用した：ペンタスターチ（▲）、αα-Hb（■）、PEG-Hb（●）、ペンタスターチ＋αα-Hb（□）、ペンタスターチ＋PEG-Hb（○）、および対照動物（◆）。図5は、出血開始後2時間を超える動物生存を表す。図5のデータにより示されているように、ペンタスターチ単独による血液希釈は、有意な生存率の低下を導き、一方、PEGHb単独またはPEGHb＋ペンタスターチによる血液希釈ではすべて生存した；αα-Hbを含んでなる組成物による血液希釈後の生存率は、PEGHbを含有する組成物のそれよりも非常に低かった。
図6A-Dは、対照ラット（◆）および、60%出血開始後に以下の交換輸血を受けた動物の酸-塩基状態をグラフで表している；ペンタスターチ（▲）、αα-Hb（■）、PEG-Hb（●）、ペンタスターチ＋αα-Hb（□）、ペンタスターチ＋PEG-Hb（○）。図6AはPaO2、図6BはPaCO2、図6Cは動脈pH、図6Dは塩基過剰を表す。
図6AないしDは、出血の開始から2時間以上にわたって測定された動物の酸-塩基状態を示している。より明確には、図6AはPaO2、図6BはPaCO2、図6Cは動脈pH、そして図6Dは塩基過剰を表す。図6AないしCに示されているように、PEGHbまたはPEGHb＋ペンタスターチ動物のいずれにおいても、ペンタスターチ動物と比較して有意な呼吸性アルカローシスは認められなかった。さらに、PEGHbまたはPEGHb＋ペンタスターチ動物のいずれにおいても、出血時間の終了時においてさえ、有意なアシドーシスは認められなかった。PEGHbおよびPEGHb＋ペンタスターチ動物のいずれにおいても、酸塩基状態は完全に保持されていた（図6D）。さらに、αα-Hbを含んでなる組成物は、PEGHb＋ペンタスターチ動物またはペンタスターチ動物と同様の成果を示すことはできなかった。
図7は、各組成物の投与後の乳酸の生成を示す。図7に示されているように、出血時の乳酸の生成はαα-Hb動物（単独およびペンタスターチとの組み合わせ）およびペンタスターチ動物において、他の群より有意に多かった。注目すべきは、PEGHb＋ペンタスターチ動物において総ヘモグロビン濃度およびヘマトクリットが有意に低かったにもかかわらず、対照動物（予め交換輸血していない）およびPEGHb＋ペンタスターチ動物の乳酸上昇が、ほぼ等しく最小であったことである（表13を参照）。
図8Aは、対照ラット（◆）および−60分にペンタスターチ（▲）、PEG-Hb（●）およびペンタスパン＋PEG-Hb（○）の交換輸血をした後に、0分において60%出血を開始した後のラットの平均動脈血圧を表している。図8Aのデータが示すように、交換輸血中（すなわち60ないし0分）においては、いずれの群の血圧も上昇しなかったが、出血中（すなわち、0ないし120分）に、対照群およびペンタスターチ動物において有意な血圧の下降が認められた。PEGHbおよびPEGHb＋ペンタスターチ組成物双方は、低血圧から動物を「保護」した。
図8Bは、対照ラット（◆）ならびに、ペンタスターチ（▲、B点）、αα-Hb（■、B点）、およびペンタスターチ＋αα-Hb（□、A点）の交換輸血をした後に、60%出血を開始した（C点）後のラットを表す。図8で説明したように、対照動物およびペンタスターチ動物は、ペンタスターチ＋αα-Hb動物よりも、平均動脈圧の維持範囲が広かった。
図9と図10は、相対心拍出量と、全身血管抵抗をそれぞれ表す。心拍出量は、単位時間中に心臓によって汲み出された血液量を表す（例えばリットル／分）；相対心拍出量とは、対照時間（-30分）と比較した3つの実験群の心拍出量を表す。図9に表されているように、PEGHb群とPEGHb＋ペンタスターチ群の心拍出量は、他の群に比べて高かった。図10は、PEGHb動物とPEGHb＋ペンタスターチ動物の全身血管抵抗が、他の動物に比べて低く維持されていることを示している。
前記の結果は、PEGHb＋ペンタスターチ混合物が、αα-Hbを含んでなる組成物よりも優れていることを示す。これに加えて、PEGHb＋ペンタスターチ混合物は、PEGHb組成物単独と類似の成果を示す。このことは、混合物の場合、動物が曝露されるヘモグロビン濃度と、使用されるヘモグロビン製剤の量が1/2と少ないにもかかわらず真実であり、患者に投与するヘモグロビン濃度を減らし、このことにより経費と可能性のある副作用を減じるという利益を提供する。なぜ混合物が効果的なのかという正確な理解は、本発明を実施するためには要求されないが、PEGHb＋ペンタスターチの有用性は、前記の4つの特性、すなわちコロイド浸透圧、粘性、酸素親和性および低酸素容量のすべてを保持している結果であると考えられる。実際、この結果はi）高コロイド浸透圧性、酸素親和性と粘性を有する酸素運搬成分（例えばHBOC）、およびii）類似のコロイド浸透圧と粘性を有する非酸素運搬血漿膨張剤からなる組成物が、最も好ましい血液製剤となることを示している。
実施例10
修飾ヘモグロビン、非酸素運搬成分およびそれらの組成物の生存データ
この実施例は、いくつかの修飾ヘモグロビン製剤（すなわち酸素運搬成分）、非酸素運搬成分ならびに、酸素運搬成分および非酸素運搬成分からなる数種類の混合物を用いる動物の生存に向けられる。
実験計画
一般に、実施例10ないし15の実験は実施例8に記載された方法で行った。要するに、血液希釈の24時間前に、麻酔下で雄Sprague-Dawleyラットに機器を取り付けた。機器の取付は、大腿動脈および大腿静脈へのカニューレーション、および、その後の24時間に、動物がケージ中を自由に歩き回れるようにカテーテルを体外に取り付けることからなる。本実験はすべて、全身運動を制限するために緩やかに拘束した覚醒動物において行った。ひとつの大腿動脈の動脈圧を継続的にモニターした。その後、0.5ml/分の速度で推定血液量（60ml/kg）の50%を試験物質と交換した。これは、回収と注入が同時に同じ速度で行えるように蠕動ポンプを用いて行った。
交換輸血後に出血を開始させた；出血容積が、元の血液容積の60%となるよう計算した。60分後には出血が完了するよう、単純指数法（simple exponential protocol）を用いて血液を除去した。明確には、総計60分のうちの各10分間の始めに、時間を減少させるために抜き取りポンプを0.5ml/分の速度で運転した。
動物の生存
表14は、本実験において使用されたすべての物質を要約してある。表14では、「DBBF」の設計とは、α鎖間で架橋結合したヒトヘモグロビン（「αα-Hb」）を表す；これは米国陸軍において製造され、提供された。ポリエチレングリコールで修飾された2つのヘモグロビン製剤を試験した。PHPヘモグロビンは、Apex Bioscience製のヒト由来製剤であり、PEGHbはEnzon Inc.製の、牛由来の製剤である。2つのPEG-修飾ヘモグロビン製剤（PHPおよびPEGHb）は、質的には同じ結果を示した。今後記載される本実験ではPEGHbを使用するが、本発明により、PEG-修飾ヘモグロビンおよび、制限されるものではないがPHPを含んでなる製剤を包含する非酸素運搬成分からなるその他の製剤が期待される。
0004583510.tif 000023
有効な代用血液製剤のための主要な基準の1つは、高められた生存であり、表15は、動物生存のいくつかの指標を示す。特に、表15は、死に至るまでの平均時間を示し、「最初の死」を示す欄は、出血の開始後、最初の動物の死までに経過した時間（分）を示し、「生存％」を示す欄は、50％の動物が死んだときに経過した時間（分）を示す。
表15を参照すると、表15の混合血液製剤（すなわち、Pentaspan（商標）＋HemoLink（商標）；ヘタスターチ（hetastarch）＋HemoLink（商標）；Pentaspan（商標）＋PEGHb；およびPentaspan（商標）＋DBBF）は全て、酸素運搬成分50％（容量）および非酸素運搬成分50％を含んでいた。これらのデータから、変性ヘモグロビンは全て（これらの特性に関係なく）、ポリエチレングリコール（PEG）との結合によって変性されたヘモグロビンだけを除いて、対照またはPentaspan（商標）と比較して生存の減少を示すことが分かる。実際、PEGHbと非酸素運搬成分との混合物を用いた実験では、動物のほとんどが、出血後、１時間の観察期間の後もなお生存していた。
表15に示すように、混合血液製剤のうち、Pentaspan（商標）＋PEGHbのみが対照と同じか、対照よりも良好であった（対照動物は、交換輸血を受けなかった）。さらに、Pentaspan（商標）＋PEGHbは、生存において、PEGHbとほぼ同様に有効であった。このことは、総ヘモグロビンがPentaspan（商標）＋PEGHbの動物ではより少なく、また、血漿ヘモグロビンがほんの約１g/dlであるという事実を考えると、驚くべきことである。他の混合血液製剤を用いた動物生存データは、対照動物よりもかなり小さかった。
0004583510.tif 000024
上記したように、ペンタスターチ（例えば、Pentaspan（商標））およびPEGHbを含む血液製剤は、粘度、コロイド浸透圧、酸素親和性および酸素容量を最適にする。表14に挙げた製剤のうち、PEGHbのみがこれらの特性の全てを有する。PEGHbを、種々の非酸素運搬成分（例えば、血漿増量剤ヘタスターチ）で希釈すると、得られた血液製剤の粘度およびコロイド浸透圧は低下し、酸素親和性は変化ないが、酸素容量は減少するであろう。これに対して、PEG変性したヘモグロビンとペンタスターチとの組み合わせから得られる混合物の粘度およびコロイド浸透圧の値は、PEGHbのみの場合と非常に近い。
以下の実施例では、いくつかの異なる血液製剤混合物および溶液を比較し、各組の実験から得られた生理学的データをまとめる。データは、好ましい代用血液製剤が、上記特性（すなわち、コロイド浸透圧、粘度、酸素親和性および酸素含量）のたとえ全部でなくてもそのほとんどを受け入れていることを示す。
実施例11
従来の血漿増量剤
本実施例では、特に、２個の従来の血漿増量剤（すなわち、非酸素運搬成分、ヘタスターチ（HS）およびペンタスターチ（PS）（表14参照））を用いた、交換輸血および出血後の動物の生存および生理学的データを比較する。実験は、実施例10に記載したように行われた。
製剤の特徴
ヘタスターチはFreseniusから市販されており、ペンタスターチはDuPont Merckから商業的に得られた。どちらの製剤も、ヒドロキシエチルスターチを含むが、ペンタスターチは低分子量（250,000Da対480,000Da）である。これは、ヒドロキシエチル置換度がより低い（0.70と比較して0.45）ことの結果である。この違いにより、ペンタスターチのコロイド浸透圧はより高く、循環での酵素分解はより速い。このより高いコロイド浸透圧のため、ペンタスターチは、より大きい血漿増量力を有する。
動物の生存
２つの群の試験動物（ペンタスターチおよびヘタスターチ）および対照動物の全体的な動物生存を上記表15に示す。データは、血流力学、酸素輸送よび酸−塩基データと一致する。すなわち、ペンタスターチ動物における生存は、ヘタスターチ動物よりもかなり長いが、どちらも対照よりは短い。
ヘマトクリットおよびヘモグロビン
表16、17および18は、各々、ヘマトクリット、総ヘモグロビンおよび血漿ヘモグロビンを示す。表16〜18において、「ｎ」＝実験における動物の数、「ND」＝測定しなかった、「ET後」＝交換輸血直後、および「60分」＝60分の出血後である。
0004583510.tif 000025
0004583510.tif 000026
0004583510.tif 000027
表16のデータは、交換輸血後のヘマトクリットにより測定したとき、ペンタスターチおよびヘタスターチの両方が同じ程度に血液希釈することを示している。しかし、ヘタスターチ動物におけるヘマトクリットは、60％の出血後のペンタスターチ動物よりもかなり低かった。同様に、表17は、総ヘモグロビンが血液希釈後の両群の動物において同じであったが、ヘタスターチ動物の出血後のヘモグロビンはかなり低かったことを示す。
血流力学
対照と比較して、ペンタスターチおよびヘタスターチによる血液希釈群は共に、出血開始後、血圧が非常に急激に低下した（データは示していない）。回復は、ペンタスターチ動物の方が早く、ヘタスターチ群よりも良好に維持されたが、最初の40分の出血後の血圧は、対照よりもかなり低かった。
ヘタスターチおよびペンタスターチの両群は、体積低下に応答して心拍数を増加させたが、ヘタスターチ群での増加は、ペンタスターチまたは対照群におけるよりも急激であった（データは示していない）。本発明の実施では、この影響を理解する必要はないが、それは恐らく、高張性のペンタスターチによる交換後に予想される、より有意な血漿体積膨張によるものである。両方の試験群の血圧は、出血中、対照よりもすばやく上昇した。これは恐らく、交換輸血された動物におけるヘモグロビンおよびヘマトクリットがかなり低かったからである。
パラメーターdP/dtは、パルス圧曲線の正の最大の傾きを表す。このパラメーターは、心収縮の開始に比例し、したがって、心臓の強さ、または筋変力作用を表す。対照動物では、dP/dtは、心臓がその出力を高めようとするので、出血の開始後に増加した。dP/dt値は、３群全てにおいて増加したが、ヘタスターチ群では、ペンタスターチ群および対照と比較して早かった（データは示していない）。ペンタスターチ群におけるdP/dtの増加は、実際、対照と非常に似ていた。これは、ペンタスターチ動物の血漿体積膨張が有益であることを示唆している。
換気
換気は、PO2およびPCO2測定値によって示される。PO2の増加およびPCO2の減少（データは示していない）は、ペンタスターチ動物と比較してヘタスターチ動物の方が著しいが、共に、対照より有意であった。これは、出血中の酸素運搬における、ヘタスターチ＞ペンタスターチ＞対照の順での歩み寄りを表している。本発明の実施では、メカニズムの理解は必要ではないが、それは恐らく、両方のスターチ製剤が、対照と比較して、ヘモグロビンをかなり低下させるということであり、これは、なぜ両者が対照よりも多く動物を刺激するように見えるかということを説明している。しかし、ペンタスターチおよびヘタスターチのうち、ペンタスターチの方が出血へのより良好な代償を与える。これは恐らく、血漿膨張力がより良好であるからである。
酸−塩基バランスおよび乳酸
ｐＨおよび塩基過剰に関して、出血中の最も有意な歩み寄りは、ｐＨおよび塩基過剰において劇的な低下を示すヘタスターチ動物に見られる（データは示していない）。ペンタスターチ動物は、対照と比較してわずかに多くの歩み寄りが見られた。対照が実際に、60％の出血に対してかなり十分代償しているように見えたことは注目すべきである。特に、PCO2は低下し、塩基過剰はよりマイナスになったが、動物は、ｐＨを本質的に一定に維持することができた。
乳酸は、組織の酸素化の正確な指標である。ヘタスターチ動物における乳酸の蓄積は、ペンタスターチ動物中よりもかなり多く、両群は、対照よりも多くの乳酸を蓄積した（データは示していない）。注目すべきことに、対照での乳酸レベルは安定状態にあった。これは、産生および排泄の速度が等しいことを示唆しており、出血への適正な代償の別の指標である。
この実施例の結果は、利用される交換輸血／出血モデルにおいて、対照動物の全てが出血開始の約130分後までに死亡したことを示している。すなわち、酸素輸送系での混乱は、測定された変数に反映された。結果は、ペンタスターチまたはヘタスターチのどちらも循環する血液の体積の半分の損失を代償することはできなかった。しかし、２つの血漿増量剤を比較すると、ペンタスターチの方がヘタスターチよりも明らかに優れていることが分かる。この発見の原理は、発明の実施には必要ないが、それは、ペンタスターチのより高いコロイド浸透圧によると考えられる。すなわち、ヘタスターチ群と比較して、ペンタスターチ動物では、より有意な血漿体積膨張が得られる。
実施例12
ペンタスターチとDBBFとの血液製剤混合物
本実施例では、ペンタスターチおよびDBBF（αα−Hb）の血液製剤混合物（50：50）による、交換輸血および出血後の動物の生存および生理学的データを比較する。実験は、実施例10に記載したように行われた。
動物の生存
対照動物、ペンタスターチ（PS）のみの動物、DBBF（αα−ヘモグロビン）のみの動物およびペンタスターチ＋αα−Hb混合物を投与した動物の動物生存を図11に示す。図11を参照すると、（▲）はペンタスターチを表し、（■）はαα−Hbを表し、（□）はペンタスターチ＋αα−Hbを表す。図11に示されるように、αα−Hb動物の生存は、対照またはペンタスターチ動物よりもかなり悪く、αα−Hbおよびペンタスターチの50/50混合物はさらに悪い。また、生存とヘマトクリット（前記表16を参照）またはヘモグロビン（前記表17を参照）との間には明らかな関係はなく、従って、生存は、血液において運ばれる酸素の直線関数であるとは思われないことも記しておくべきである。
平均動脈圧
平均動脈圧は、PS/αα−Hb動物およびαα−Hb動物において上昇した（データは示していない）。さらに、ヘモグロビン用量は、PS/αα−Hb動物では半分であったが、血圧上昇の大きさは同じであった。すなわち、PSの存在が、ヘモグロビンによって誘発される約20mmHgの高血圧を弱めなかった。しかし、出血開始後の血圧の低下は、PS/αα−Hb動物の場合が、他の３群のいずれの場合よりも急激であった。回復は幾分早かった。これは恐らく、ペンタスターチの存在により得られる血漿膨張による。にもかかわらず、血血圧が最後に低下し始めると、それは非常に速く低下し、動物は急に死亡した。すなわち、αα−Hbヘモグロビンの存在から生じる血圧の上昇は、何らの利点も与えないように見え、PSの存在はこの影響を減じるものではない。
心拍数
対照動物では、心拍数は出血の開始後、徐々に増加した（データは示していない）。本発明は、この効果の根元的な機構を理解する必要はないが、それは恐らく、脈管内体積の低下による。この解釈は、より低いヘモグロビン濃度にもかかわらず、心拍数を同程度に上昇させなかったペンタスターチ動物に見られるいくらか低い心拍数応答にって支持される（データは示していない）。異なるパターンの心拍数応答が、αα−Hb動物に認められた。特に、交換輸血開始後直ちに心拍数の低下があり、次いで、出血開始後、徐々に上昇した（データは示していない）。低下は、体積の変化によって説明することはできない。なぜならば、血漿体積の縮小が心拍数を上昇させることは予想されるが、低下は予想されないからである。恐らくこれは、心筋層に対する直接の変時的影響である。注目すべきことは、この抑制効果が、αα−Hbをペンタスターチで希釈する場合は減少するということである（データは示していない）。PS/αα−Hb動物は、出血の開始後、心拍数の鋭い増加を示し、急激に約500/分に達した。この値は、後まで他の群では達成されなかった。すなわち、PS/αα−Hb混合物は、αα−Hbのみよりも有利であるようには見えなかった。
dP/dt
先に記載したように、dP/dtは、パルス圧曲線の正の最大の傾きである。このパラメーターは、心収縮の開始に比例し、したがって、心臓の強さ、または筋変力作用を表す。対照動物では、dP/dtは、出血の開始後に増加した（データは示していない）。ペンタスターチ動物は同じパターンを示したが、応答の大きさはより小さかった。これは恐らく、出血開始時にこれらの動物の血管容積が対照と比較して幾分増加したからである。αα−Hb動物は、dP/dtを決して増加させなかった（データは示していない）。事実、その値は、出血の開始後、急激に低下した。これは、正常な代償機構の1つが乱れていることを示唆する。PS/αα−Hb動物では、コロイド的に活性なペンタスターチの存在によりαα−Hb動物よりも幾分大きい血管容積を有することが予想されたが、同じ観察がなされた。
換気
貧血または低酸素症のために酸素輸送が低下すると、正常な生理学的応答は過換気を行うことである。過換気の結果、PCO2が低下する。これは、肺によるCO2の除去が換気の直接の機能であるからである。肺によって交換されている気体の分体積がより大きいため、相互効果によりPO2は再び増加する。対照動物では、出血の開始後にPCO2が低下した（データは示していない）。比べると、ペンタスターチ動物もPCO2を低下させた（データは示していない）が、その効果はより長い時間持続し、より顕著であるように見えた。これはたぶん、対照と比較して、ペンタスターチ動物でのヘモグロビン濃度が低い結果である。（表17を参照）。PCO2の低下は、αα−Hb動物においてかなり大きく、PS/αα−Hb動物ではさらに大きかった。αα−Hb動物とPS/αα−Hb動物との比較は興味深い。というのは、前者は総ヘモグロビン濃度がより高いが、血液体積はより低いからである。すなわち、PSのαα−Hbへの添加は動物に何らの利益も与えず、実際、より大きな過換気を誘発したように思われる。
PO2の変化は、PCO2応答の鏡像である。PO2の最大の増加（およびPCO2の低下）は、αα−HbおよびPS/αα−Hb動物で見られ、一方、対照およびペンタスターチ動物はPCO2の増加が最小であった（データは示していない）。すなわち、データは、低下された酸素運搬が過換気を招き、過換気の度合は全体の生存と相関するという考えと一致する。
酸−塩基状態
出血が進み、組織への酸素の運搬に障害が生じるようになると、乳酸が産生され、ｐＨが低下する。対照動物の場合、ｐＨは出血の進行と共にほぼ一定に維持された。代償の度合の別の指標は、塩基過剰である。これは、40TorrのPCO2の存在下で血漿のｐＨを7.4に戻すのに必要とされる塩基の量として定義される。対照およびPS動物の場合、塩基過剰は、ベースラインからあまり変わらなかった（データは示していない）。これに対して、αα−Hbおよび特にPS/αα−Hbは、ｐＨの著しい低下を生じた。これは、鋭い過換気によって代償されず（データは示していない）、その結果、塩基過剰の急激な低下（すなわち、「塩基不足」結果）を生じた。通常の臨床基準により、−10mEq/l以下の塩基過剰は、出血ショックからの回復の悪さを示す。
最後に、乳酸は、組織への酸素の不充分な運搬の度合の直接的な尺度である（すなわち、「酸素負債」）。乳酸の蓄積は、αα−HbおよびPS/αα−Hb動物の両方において非常に有意であり、後者は前者よりも急に上昇する（データは示していない）。また、対照およびペンタスターチ動物では、乳酸の上昇がかなり緩やかであり、それはその後、安定状態に達するように見え、動物の代償機構（心臓出力の増加、換気）が血液の欠損を補うように見えたことも興味深い。しかし、αα−HbおよびPS/αα−Hb動物では共に乳酸の直線的上昇が続き、これは、進行性の制御されない組織アシドーシスを示した。
上記した結果は、αα−Hbを酸素運搬成分として含む血液製剤混合物の使用が、或る血漿ヘモグロビンを提供するとしても、対照またはペンタスターチで血液希釈した動物のいずれよりも出血に関して動物をより無防備な状態にしたことを示している。αα−Hbへのペンタスターチの添加は、αα−Hbの有害な影響を代償するものではなく、事実、酸素運搬、アシドーシスおよび全体的な生存を悪化させた。
実施例13
HemoLink（商標）／ペンタスターチおよびHemoLink（商標）／ヘタスターチの血液製剤混合物
実施例８は、ペンタスターチ、HemoLink（商標）およびそれらの混合物の効果を比較したものである。本実施例では、HemoLink（商標）／ペンタスターチの混合物をHemoLink（商標）と別の非酸素運搬成分ヘタスターチとの混合物と比較する。本実施例の実験は、実施例10の記載と同様に行われ、特に交換輸血および出血後の動物の生存および生理学的データを比較する。
先に記載したように、HemoLink（商標）（Hemosol）は、約128,000Daの平均分子量を有する重合されたヒトヘモグロビンである。HemoLink（商標）は重合された物質であるため、最終物質には多数の分子サイズが存在する。単独で試験したとき、HemoLink（商標）による血液希釈はペンタスターチと同じようには作用しなかった。そして、動物は、対照またはペンタスターチ群よりも早く死亡した（例えば、実施例８を参照）。ペンタスターチとPEGHbとの混合物による驚くべき好ましい結果を鑑みて、本実施例では、HemoLink（商標）と非酸素運搬成分（ヘタスターチまたはペンタスターチ）との混合物（50/50）を含む追加の実験を行った。
動物の生存
図12に示すように、HemoLink（商標）のみによる交換輸血は、60％の出血からの生存を低下させた。特に、図12は、ヘタスターチ（×）、HemoLink（商標）（▼）、HemoLink（商標）＋ペンタスターチ（▽）およびヘタスターチ＋HemoLink（商標）（◇）による交換輸血後および60％出血の開始後の動物の生存を示す。
HemoLink（商標）動物での交換輸血後のヘマトクリット（前記表16）は、対照のの約半分であり、ペンタスターチ、DBBF（αα−Hb）またはPS/DBBF動物よりわずかに低かった。しかし、血漿ヘモグロビンは、これらの他の群よりHemoLink（商標）動物の方がわずかに高かった（前記表16）。図12は、HemoLink（商標）とペンタスターチまたはヘタスターチとの組み合わせが、対照動物ほど有効でなかった（短時間の生存による測定）ことを示す。しかし、実施例12に記載したDBBFおよびペンタスターチを用いた状況とは対照的に、HemoLink（商標）のペンタスターチまたはヘタスターチによる希釈は、生存を悪化させなかった。
平均動脈圧
HemoLink（商標）による交換輸血は、平均動脈血圧をわずかに上げたが（データは示していない）、DBBF（αα−Hb）ほど有意ではなかった（実施例12）。動脈出血が始まると、全４群（すなわち、HemoLink（商標）のみ、HemoLink（商標）／ペンタスターチ、HemoLink（商標）／ヘタスターチおよび対照）の動物の血圧は急激に低下した（データは示していない）。血圧の最初の低下度は、対照の110〜80mmHg、HemoLink（商標）／ペンタスターチ動物の120〜90mmHgおよびHemoLink（商標）のみの動物の120〜80mmHgと比較して、HemoLink（商標）／ヘタスターチ群において最高であった（120〜50mmHg）。すなわち、血圧の低下および全体的な生存によって判断すると、HemoLink（商標）／ヘタスターチ動物、HemoLink（商標）およびHemoLink（商標）／ペンタスターチ動物は（その順序で）全て、対照よりも劣るように見えた。にもかかわらず、HemoLink（商標）／ヘタスターチおよびHemoLink（商標）／ペンタスターチ動物の全体的な生存は相違せず（前記表15）、HemoLink（商標）のみの動物よりもほんの少しばかり良好であった。
心拍数
HemoLink（商標）およびHemoLink（商標）／ペンタスパン動物は共に、出血に応答して心拍数を上げたが、その上昇は、対照よりも早くかつ急であった（データは示していない）。これは、対照と比較して、交換輸血された動物では心臓血管の安定性がより小さいことを示す。驚くべきことに、HemoLink（商標）／ヘタスターチ動物は、出血開始後に心拍数を急激に低下させた。この急激な応答は、他の群と比較して、これらの動物では歩み寄りが激しいことを示していると考えられる。
dP/dt
dP/dtの増加は、対照と比較して、交換輸血後のHemoLink（商標）動物において認められた（データは示していない）。これは、交換がそれだけで、心臓血管系に不安定性を与えたことを示している。ペンタスターチ／HemoLink（商標）動物のdP/dtの増加は、たとえあったとしても少しであった。ところが、ヘタスターチ／HemoLink（商標）動物の応答は著しく、出血開始後に急に増加し、ほぼ2000mmHg/秒の最高値に達した後、急に低下し、動物は激しく歩み寄るようになり、死亡した（データは示していない）。
換気および酸塩基状態
3つの実験群の各々で認められたPO2の増加およびPCO2の低下は対照値よりも大きかったが、それらの群の間に差異をつけることはできない（データは示していない）。
全ての実験群は、出血中のｐＨが対照群よりも低い。酸−塩基の乱れは、塩基過剰においてより明確に示された。３つの全ての実験群が、出血開始後に急激に始まって、激しくアシドーシスになる（負の塩基過剰）からである。最後に、乳酸の増加は３つの全ての実験群において非常に有意であり、それにより激しいアシドーシスの存在が再度確認される（データは示していない）。
HemoLink（商標）は、対照またはペンタスターチのみと同じようには作用しないことが先に示された。さらに、HemoLink（商標）のみおよびヘタスターチのみは、同等に作用したが、ペンタスターチのみと同様の保護を与えるものではなかった。本実施例に示したように、HemoLink（商標）をペンタスターチまたはヘタスターチのいずれかと混合するとによるHemoLink（商標）の性能を改善する試みは、結果を改善するもではなかった。
実施例14
TMヘモグロビン／ペンタスターチの血液製剤混合物
本実施例では、特に、ペンタスターチとTMヘモグロビンとの血液製剤混合物（50/50）を用いた交換輸血および出血後の動物の生存および生理学的データを比較する。トリメシン酸（TM）を使用してヘモグロビンを架橋する。実験は、実施例10に記載したように行われた。
動物の生存
TMヘモグロビン（Hemosol）は、分子量約64,000Daのヒトヘモグロビン由来の物質である。酸素親和性は比較的低い（P50は約35Torr）。TMヘモグロビンのみを使用する研究は、DBBF（αα−Hb）のみを用いたものと有意な差はなかった（実施例１２を参照）。TMヘモグロビンのみまたはペンタスターチとの組み合わせを受けた動物は全て、出血開始後60分以内に死亡した（1匹の動物のみは、TMヘモグロビンとペンタスターチとの混合物を使用して試験し、出血開始後60分に死亡した）。
平均動脈圧、心拍数およびdP/dt
交換輸血の結果、TMヘモグロビン／ペンタスターチを使用して試験した１匹の動物の平均動脈血圧は中位に上昇した。出血開始後の血圧は急激に低下したが、その後、かなりすばやく回復した。しかし、出血が進行するにつれ、平均動脈圧が再び低下し始めると、動物は非常に突然死亡した（データは示していない）。
TMヘモグロビンまたはTMヘモグロビン／ペンタスターチ混合物を用いた交換輸血後の心拍数はわずかに低下した。約20分の遅れの後、出血中の心拍数は両群で上昇した。
dP/dtに関しては、他のヘモグロビン製剤の多くとは対照的に、TMヘモグロビン／ペンタスターチまたはTMヘモグロビンのみは、dP/dtの増加を招かなかった。むしろ、安定した低下が、出血の開始後に始まった（データは示していない）。
換気および酸−塩基状態
先の実施例で示したように、PO2およびPCO2は鏡像で変化する。これは過換気を意味し、出血が進行するにつれて、酸素輸送の低下を伴う。両方の実験群で認められたPO2の増加およびPCO2の低下は、対照値よりも大きかった（それらの群の間に差異をつけることはできない；データは示していない）。
動脈ｐＨ酸および塩基に関して、両方の実験群は、出血の間、対照群よりも低いｐＨを示した。塩基過剰の測定は、両方の実験群が、出血開始後急激に始まるアシドーシス（負の塩基過剰）に激しくなったことを示した（データは示していない）。最後に、乳酸の増加は、両方の実験群で非常に有意であった（データは示していない）。これは、激しいアシドーシスの存在を再び確信させるものである。
前記したように（表15を参照）、TMヘモグロビンは、対照またはペンタスターチと同じようには作用しなかった。TMヘモグロビンおよびペンタスターチ／TMヘモグロビンは同等に作用したが、ペンタスターチのみと同じような保護を与えるものではなかった。本実施例に示したように、TMヘモグロビンをペンタスターチと混合するとによるTMヘモグロビンの性能を改善する試みは、結果を改善するもではなかった。TMヘモグロビンのO2親和性は、研究された他のヘモグロビン誘導体と比較して低く、上記で報告した結果は、この低い親和性が、他の物理的特性は同じである他の架橋されたヘモグロビン（例えば、DBBF）に対して優位性を与えなかったことを示している。
実施例15
変性ヘモグロビン
上記したように、ポリエチレングリコール変性ウシヘモグロビンとペンタスターチとの混合物は、他の非酸素運搬成分を含む混合物と比較して、動物の生存を増加させる。これらの結果が混合物によるのか、ウシヘモグロビン自体によるのかを調べるために、精製されたウシヘモグロビンを評価する実験を行った。さらに、高い酸素親和性を有する物質であるβ82ヘモグロビンを用いた実験を行い、この物質のみが、本発明と共に使用されるものである酸素運搬成分および非酸素運搬成分の混合物より優れているかどうかを調べた。先の実施例と同様に、本実施例の実験では特に、実施例10に記載された実験プロトコルを使用して、交換輸血および出血後の動物の生存および生理学的データを比較する。
ウシヘモグロビン
簡単に述べると、動物をウシヘモグロビンで交換輸血したとき、平均動脈血圧は一時的に増加しただけで、その後は安定して低下した（データは示していない）。出血が始まると、平均動脈圧は急に低下し、動物は出血開始の約30分後に死亡した（データは示していない）。
この動物の心拍数は、出血が開始したときはあまり上昇しなかったが、最後の、動物が死亡する２，３分前には、緩やかな増加があった。dP/dtは、対照と比較して一定のままであった。対照では、このパラメーターは常に、出血に応答して上昇した。最後に、ｐＨおよび酸−塩基状態に関しては、動物は、PO2の増加およびPCO2の低下によって示されるように、激しく過換気した。したがって、ｐＨおよび塩基過剰は非常に急激に低下し、乳酸は鋭く上昇した（データは示していない）。
β82ヘモグロビン
β82ヘモグロビン（Hemosol）は、β鎖の間で架橋されたヒトヘモグロビンの誘導体である（DBBF［αα−Hb］とは対照的）。この物質は、高い酸素親和性を有するが、粘度およびコロイド浸透圧は低い。
動物をβ82ヘモグロビンを用いて交換輸血すると、血圧の上昇は非常に一時的であったが、著しかった。上昇の大きさは、αα−Hbの場合に見られた大きさとほぼ同じであったが、平均動脈圧は、注入前のレベルに急激に戻った（データは示していない）。出血が始まると、血圧は急激に低下し、動物は約70分で死亡した。すなわち、全体的な生存は、αα−Hbヘモグロビンより良好ではなく、対照またはペンタスターチ動物より低かった。
交換後または出血後の心拍数はあまり上昇しなかったし、dP/dtもあまり上昇しなかった。動物は著しい過換気を示した（PO2の増加およびPCO2の低下）。ｐＨ、塩基過剰の急激な低下および乳酸の増加により、激しいアシドーシスが示された（データは示していない）。
すなわち、本実施例の変性ヘモグロビン物質を用いた実験は、ペンタスパンおよびPEGHbの混合物を使用して得られた結果より優位な結果をもたらさなかった。
実施例16
種々のヘモグロビン溶液の評価
本実施例では、３つのヘモグロビン溶液を評価した（表19を参照）。すなわち、１）精製したヒトヘモグロビンA0（Hb-A0）；２）αα−ヘモグロビン、ビス（3,5−ジブロモサリシル）フマレートで架橋されたヒトヘモグロビン；３）PEG−ヘモグロビン、ポリチレングリコールで表面変性されたウシヘモグロビンである。PEG単位の分子量は5,000Daである。
ヒト赤血球を、健康なボランティアから取り出してヘパリン抗凝固剤に入れ、静かに遠心分離することにより0.9％のNaClで３回洗浄し、0.1Mのビス−トリスCl緩衝液、pH7.4に再懸濁した。全溶液および赤血球懸濁物のヘモグロビン濃度は約3mMであった（ヘム）。メトヘモグロビンは常に、総ヘモグロビンの2〜4％未満であった。試験溶液を、トノメーター（例えば、モデル2000、Instrumentation Laboratories, Lexington, MA）を使用して、適切な気体濃度および37℃と平衡させた。ヒト血清アルブミン（HAS）は、市販品を購入した。
使用した試験法としては下記プロトコルが挙げられ、それらの結果を表19に示す。本実施例は、試験製剤の種々の特徴を調べるための方法を提供するが、本発明は、これらの特定のプロトコルに限定されるものではない。実際、当業者であれば、これらの測定を行うのに適切な別の方法を知っている。
酸素平衡結合曲線：
無細胞ヘモグロビン−酸素平衡曲線は、ダイオードアレイ分光測定をオキシヘモグロビン溶液の酵素的脱酸素化と組合せることにより測定した（Vandegriffら., Anal. Biochem., 256:107-116[1998]）。プロトカテク酸（PCA）/プロトカテク酸3,4-ジオキシゲナーゼ（PCD）酵素系は生産物に変換されたPCA１モルにつき１モルのＯ2を消費する。
反応は、0.1Mビス−トリスプロパン（Sigma）、0.1M Cl-および1mM EDTAを用いpH7.4および37℃で実施した。ヘモグロビンサンプルを少量のカタラーゼ（例えば0.2-0.5μM）を含有する空気-平衡化し温度-平衡化したバッファー中およそ60μM（ヘムで）の濃度となるまで希釈した。最終的なヘモグロビン濃度は523nmでの吸光係数により測定した（ε523＝7.12-1mM）。基質（PCA）は１mMの濃度で添加した。この反応溶液のある量を用いて反応セルを完全に満たし、酵素の添加前に存在する全てのガス相を排除した。栓中に埋めこまれたＯリングによって挿入されたミクロ-酸素電極（Microelectrodes, Inc., Londonderry, NH）を備えた気密性のテフロン栓を用いてキュベットを密封した。電極をMilton Roy 3000ダイオードアレイ分光光度計（SLM Instruments, Inc., Urbana, IL）の光線通路のすぐ上の位置まで溶液中に浸漬した。温度は反応セルホルダー内のPeltierコントローラーを用いて制御し、そして溶液は反応セルホルダー中の攪拌モーターにより回転されるミクロ攪拌バーを用いて混合した。脱酸素化反応は酵素（PCD）の添加（0.05-0.1単位/ml）により開始した。
酵素的脱酸素化の間のヘモグロビンのスペクトル変化は480から650nmの可視範囲で約0.35nm毎に測定した。PO2のポーラログラフィー測定はClark型の酸素電極を用いて測定したが、これは酸素濃度の変化に比例した電圧変化を生ずる。電極は、100%空気電圧を測定するために空気を吹き込むか、またはゼロ点を設定するために純粋なN2を吹き込んだ水中に浸漬することにより毎日較正した。ヘモグロビン脱飽和反応の間中、O2電極からの電圧を10Hzのサンプリング率で収集した。
スペクトルデータおよびO2電極電圧データをMATLABテクニカルコンピューティングプログラム（The Mathworks, Natick, MA）を用いる分析用のファイルに変換した。O2電極からの出力電圧を気圧および実験温度での水蒸気圧に基づきmmHgに変換した。平均PO2値を、各スペクトルの収集時間に相当する各５秒間隔の50個のデータポイントから計算した。
スペクトルマトリックスを多重成分分解アルゴリズムを用いて分析した。このプログラムは評価中の測定されたスペクトルから結合した各基本スペクトル（オキシ−、デオキシ−、およびメトヘモグロビン）のフラクションを戻す。フラクション飽和はオキシヘモグロビンとデオキシヘモグロビンの合計に対するオキシヘモグロビンの比率として計算した。Adair定数a1-a4に適合する値は均一な秤量を伴う最小二乗分析により測定された。P50についての値およびHill係数は適合されたAdair定数（すなわち、表19に示される値）から計算した。
赤血球懸濁液の酸素平衡曲線はHemox-Analyzer▲Ｒ▼（TCS Medical Products, Huntingdon Valley, PA）を用いるガス交換方法によりpH7.4および37℃で測定した。
COP
COPは30,000分子量カットオフメンブランを備えたWescor4420コロイド浸透圧計（Logan, Utah）を用いて測定した。この浸透圧計は、製造者により推奨されるとおり各ヘモグロビンサンプルの測定に先立ち、5%アルブミンを用いて較正した。測定は20-23℃の範囲の室温で実施した。表19に示す値はヘモグロビン濃度5g/dlの場合のものである。
粘度
粘度測定は毛細管粘度計（Reinhardt, 1984）を用いて実施する。この装置は、毛細管半径（r）としての流れ（flow）（Q）、毛細管に沿った圧力変化（dP/dx）および粘度（η）を規定するHagen-Poiseuille法則をその操作原理として用いる。
Ｑ＝（πｒ4dP）/（8ηdx）
この数式は２つの成分、剪断応力（Lは毛細管の長さ）および剪断速度に分けられ、ここで剪断応力および剪断速度は次のとおりである。
剪断応力＝（r/2ΔL）ΔP
剪断速度＝（4/πr3）Ｑ
粘度η＝剪断応力／剪断速度
毛細管の形状に基づいて、ΔPとＱ以外のすべてのパラメーターが知られていた。従って、これらは測定される２つの変数であった。流体はシリンジポンプ（Harvard Apparatus, model 975, S. Natick, Ma）に入れ、流れを開始した。示差圧力変換器（Validyne Engineering, model MP-45-14, Northridge, CA）を内径508μMを有する10cmのガラス毛細管チューブ（Vitro Dynamics, Rockway, NJ.）の末端にＴバルブによって連結した。流体がそのチューブを通して流されると、変換器はそれぞれのＴバルブポイントで圧力を感知した。変換器は出力が２つのＴバルブポイントの間のΔPとなるように配置した。シグナルは増幅され（Validyne model CD12）そしてストリップチャートに記録した。
流れ（Ｑ）は目盛りをつけた流れチューブの使用により測定した。粘度はΔPおよびＱから計算した。毛細管粘度計は静的および動的の両方で較正し、一方圧力変換器は食塩水のヘッド圧を用いて静的に較正した。動的較正は水を用いてなされた。溶液を37℃まで加熱しそして粘度計内に置いた。実施例での測定は160s-1の剪断速度を使用した。表19に報告する値はヘモグロビン濃度5g/dlの場合の測定値を示す。
0004583510.tif 000028
人工毛細管実験
出口PO2値対滞留時間を図15に示す。任意の特定の流量で、最低の出口PO2値はHb-A0について見られ、つづいてPEG-Hb, αα-Hbそして最大の出口PO2値を有するRBCsの順番である。人工毛細管における最終的なヘモグロビン飽和（図６）は表19に示されるAdair定数から計算した。PEG-Hbはすべての流量での時間にわたり最小の脱飽和を示した。これはRBCプロフィルと密接に平行した。Hb−Ａ0およびαα-Hbのいずれもずっと大きい脱飽和度を示した。
出口PO2が実験値と等しくなるまで、限定された元素分析は塊状の拡散パラメーターK*についての値を調整する。滞留時間の函数としてのK*の最終的な適合値を図17に示す。PEG-HbおよびRBCsは900-1200μM/分/トルという同様のK*値を生ずる。Hb-A0およびαα-HbのK*値は、無細胞溶液に関する内腔抵抗が存在しないゆえに、RBCsのそれより高い。この効果は、最速流量ではRBCsと等しいK*値を有し最も遅い流量ではRBCsよりわずかに高いK*値を有する無細胞PEG-Hb溶液中においては打ち消される。これはPEG-Hb溶液の少なくとも２つの物理的特性、すなわち（1）その分子サイズが比較的大きいゆえにテトラマー溶液に比較して比較的粘度が高いこと；および（2）その高いＯ2親和性、によるものである（前記等式２を参照されたい）。
動物実験
雄のスプレーグ−ドーリー系ラット（210-350g, Charles River Labs）を、ケタミン（ketamine）（71mg/ml）、アセプロマジン（acepromazine）（2.85mg/ml）およびキシラジン（xylazine）（2.85mg/ml）の混合物250μｌを用いて麻酔した。動脈血を迅速に採れるように大腿部動脈を介して腹部大動脈内にポリエチレンカテーテル（PE-50）を入れた。第２のカテーテルは血圧を監視するために反対側の大腿部動脈中に入れ、そして第３のカテーテルは試験物質を注入するために大腿部静脈の一方に入れた。カテーテルは皮下的に通し、尻尾から体外に出し、そして約100μLの生理食塩水を流した。動物をこの処置から回収し、実験に使用するに先立ちそれらのケージの中で24時間おいた。一方の大腿部動脈カテーテルを栓によって圧力変換器（UFI model 1050, Morro, CA）に連結し、そして動脈圧をMP100WSWデータ収集システム（BIOPAC Systems, Inc., Goleta, CA）を用い100Hzで連続的にサンプル採取した。データは後続のオフライン分析にかけるためにデジタル形態で保存した。
交換輸血の前および間中の平均動脈圧を図18に示す。そのK*値が赤血球のそれと実質的に同じであるPEG-ヘモグロビン以外はすべての溶液が有意な血管活性を示した（図17参照）。
これらの実験で得られたデータに基づけば、無細胞酸素担体による拡散促進ゆえの酸素の供給過剰の結果として自己調節が起こることが意図される。送達されたＯ2量は最大の血管活性を示す溶液について最大となるはずである。ラットの50%交換輸血のインビボ実験では、平均動脈圧の増大が概算された拡散定数K*とおおざっぱに一致するという点でこの理論と合致する。従って、K*は有効な赤血球代替物の特性を最適化するのに使用すべき重要なパラメーターであると思われる。
実施例１７
他のヘモグロビン調製物
この実施例においては、さらなるヘモグロビン調製物を説明する。これらの調製物は、高酸素親和性、高腫瘍圧および相対的に高い粘度（例えば、少なくとも血液のそれの半分）なる望ましい特性を有する血液代替物を提供すべく修飾できる。
Ａ．ヒトヘモグロビンＡ0の調製
この実験においては、ChristensenらのヒトヘモグロビンＡ0を調製する（Christensenら., J. Biochem. Biophys. Meth. 17:143-154[1988]）。
古くなった、充填した細胞の１単位を500mlプラスチック遠心ビン中滅菌0.9%食塩水で３回洗浄する。洗浄溶液および軟膜を吸い出して除去する。この充填した細胞を2.5容量の蒸留水と混合し、20,000×ｇで１時間遠心する。上清を取り出してカラム中の混合床イオン交換樹脂（Bio-Rex RG501-X8, Bio-Rad, Richmond. CA）に通す。等イオン流出液を0.22μmのフィルター（Millipore Millistack 40. Bedford, MA）に通して滅菌容器中に入れる。
大量の方の支質（stroma）不含ヘモグロビンについて：充填した細胞の８単位を前記したようにして洗浄し、冷下で一夜溶血を起こす。溶解物を600mlのトランスファーパック（Fenwal 4B2024, Deerfield, IL）中に移し、そして3500×ｇで６時間遠心する。次に上清ヘモグロビン溶液のおよそ1/3を血漿抽出器で取り出し、導電率が約15μmhosとなるまで混合床樹脂に通す。この操作は樹脂１Kgを必要とし、これを最も好都合に３つのカラムに充填する。この溶液を再びトランスファーパックに入れそして3500×ｇで４時間遠心する。上清を0.22μm使い捨てフィルターユニット（Millipore Millistack MSG05CHZ）を通して濾過し、そして濾液を滅菌トランスファーパックに集め、クロマトグラフィー用に４℃で保存する。長期保存は、まとめて−80℃で凍結することにより最も良く達成される。
10-20gのヘモグロビンを含有する支質不含ヘモグロビン溶液を0.05M Tris-HCl（pH8.5）を用いて平衡化する。これは通常、透析によるかまたかバッファー交換およびゲル排除カラムによりなされうる。しかしながら、これら溶液は等イオン性であるので、これらを同量のpH8.5の0.1M Tris-HClを用いてただ希釈することがより好都合である。クロマトグラフィーは調製用HPLC（Waters Delta-Prep 3000）を用いて実施される。サンプル（約250-500ml, 4-10g/dl）を、QMA-Acell（Waters）を予め充填し、1-2リットルのバッファーＡ（0.05M Tris-HCl,pH8.5）を用い、毎分80mlの流量で予め平衡化したステンレス鋼カラムにアプライする。クロマトグラムは同じ流量での予備（バッファーＢ）としての0.05M Tris-HCl,pH6.5の直線勾配を用いて展開させる。バッファーＢの10%から90%までpH変化は直線的で、この間にすべてのヘモグロビン種が溶離される。分離は50分間で完結し、この時点で流出バッファーのpHは7.2である。サンプルの完全な溶離を確実にするためにバッファーＢをさらに10分間流し、そしてカラムを後続の分離の準備のために１リットルのバッファーＡを用いて再平衡化する。一つのカラムで20ｇまでを処理することが可能である。しかしながら、これは過荷重であると思われる。カラムは0.1M NaCl中の0.1M Tris-HCl, pH7.4の１リットルを用い毎日パージする。放置の際これを70%エタノールで平衡化する。
調製用セル（2.1mm通路長）を用いるピーク検出は510nmおよび／または600nmにてなされる。後者の波長は、比較的高い濃度に対しおよびメトヘモグロビンによるシグナルを増幅するために必要である。前縁でのメトヘモグロビンの回収および後縁での少量のヘモグロビン成分の混入を回避するためにHb−Ａ0の主要フラクションを回収する。フラクションは氷バケツ中の２リットル容トランスファーパック中に回収し、そしてTM10メンブラン（10,000Daカットオフ）フィルターを備えた滅菌２リットル容Amicon濃縮器（Model 2000B, Danvers, MA）に無菌的に移し、そして容量を４℃で溶出液容量の約10%まで減少させる。
Ｂ．Ｐ50を低下させるための架橋反応
この実験では、それらのＰ50低下能について種々の架橋法を試験する。一つの実験においては、ビス（3,5-ジブロモサリチル）フマレート（DBBF）およびビス（3,5-ジブロモサリチル）スクシネート（DBBS）（β82−β82）を生成させるためにWalderら（Walderら. Biochem., 18:4265-4270[1979]）の方法が使用される。ヒトヘモグロビンの化学的修飾はpH7.2の、0.05Mリン酸ナトリウム中または0.05M Bistris-HCl中の、無細胞オキシヘモグロビンの6g/dl溶液中で実施される。インキュベーションは水浴シェーカー中37℃で２時間である。反応はグリシンを用いて急冷させることにより終結させる。
もう一つの実験は、Ｒ状態のヘモグロビンをグリコアルデヒドと架橋させるManningおよびManningの方法（Manning and Manning, Biochem., 27:6640-6644[1988]）である。この実験においては、ヘモグロビン濃度をpH7.3の50mMリン酸カリウムバッファー中45から360μMまで変化させた。HbCOが使用される。グリコールアルデヒドを最終濃度50mMとなるまで添加する。架橋は室温で4.5時間実施し、そして次にヘモグロビン誘導体を50mM Tris-アセテートpH7.3で充分に透析する。
さらにもう一つの実験では、Manningの方法（Manningら., PNAS 88:3329-3333[1991]）に従いヘモグロビンを架橋させるのにジイソチオシアナトベンゼンスルホネート（DIBS）を使用する。ヘモグロビン溶液（脱酸素化状態で200μM、通常3-5μM）を10倍モル過剰の架橋剤DIBSで処理する。この溶液を0.1Mリン酸カリウムpH7.2中25℃で15分間インキュベートする。グリシルグリシンを30倍モル過剰に添加することにより反応を終結させる。次にさらに15分間インキュベーションする。溶液を、後続のクロマトグラフィー工程で使用するバッファーで４℃で透析する。架橋したヘモグロビン（合計200-250mg）をWhatman DE-52カラム（2×30cm）にかけ、pH8.3からpH6.3の50mM Tris-アセテートの直線勾配で溶離する（それぞれ500ml）。最も付着性の高い成分を取り除くには、カラムをさらにpH6.3バッファー500mlで溶離する。カラムからのヘモグロビンの回収率は80-95%である。調製用目的には、架橋ヘモグロビンを混合床樹脂に通す。
もう一つの実験では、ヘモグロビンをトリメソイル（trimesoyl）トリス（メチルホスフェート）（β82−β82）と架橋させるのにKlugerらの方法（Klugerら., Biochem., 31:7551-7559[1992]）を使用する。この実験においては、ヘモグロビンの化学的修飾は、ヘモグロビンテトラマーが最終濃度１mM HbとなるまでpH7.2の0.1Mビストリス-HClバッファーで希釈した溶血物を用いてなされる。架橋試薬の最終濃度は0.1Mバッファー中２mMである。この研究の初期段階では、反応物は35℃で2-3時間保持され、ヘモグロビンはCO形態である。収率を改善しすべてのウイルス性汚染物を破壊するために、反応を60℃で実施する。試薬は60℃のヘモグロビン溶液中に室温で30-60分にわたって注入され、合計反応時間は３時間に達する。試薬および低分子量副生物を次にセファデックスG-25カラムを用いるゲル濾過により除去する。
さらに他の実験においては、ジカルボン酸ビス（メチルホスフェート）（フマリル＆イソフタリル）（β82−β82）がJonesらの方法（Jonesら., Biochem., 32:215-223[1993]）に従い使用される。ヘモグロビンの化学的修飾は、pH7.2の0.1Mビストリス-HClバッファーを用いて１mM Hb（テトラマー）まで希釈した溶血物および２mMと５mMの間の架橋剤を使用してなされる。反応温度は35℃または60℃のいずれかであり、反応時間は2-3時間である。これより温度が高い場合は、架橋剤は1/2ないし２時間にわたり注入することにより徐々に添加される。反応は一酸化炭素形態のヘモグロビン（HbCO）を用いて操作される。架橋剤はセファデックスG-25を通してゲル濾過することにより除去される。
Ｃ．ヘモグロビン・コンジュゲート
この実験セットにおいては、ヘモグロビン・コンジュゲートを種々の方法を用いて生成させる。
１．ポリオキシエチレンに結合（conjugate）したヘモグロビン
初めに、1.0M二塩基性ホスフェート（Na2HPO4）および1.0Mビカーボネート（NaHCO3）を含有する溶液１mlを9g/dlヘモグロビン溶液10mlに４℃で穏やかにかきまぜながら添加する。次に、この溶液に分子量5000Daのメトキシプロピル（エチレングリコール）プロピオン酸のN-ヒドロキシスクシンイミジルエステル（M-SPA-5000, Shearwater Polymers, Huntsville, AL）１ｇを攪拌を継続しながら２分間かかって加える。温度およびpHを反応の間中監視する。活性化ポリオキシエチレンの添加により、溶液pHの低下が引き起こされる。pHを8.5-9.5の範囲内に維持するために約10mg量の固形炭酸ナトリウム（Na2CO3）を混合物に加える。４時間後、反応混合物を30,000MW透析バッグ（Spectra/Por, Spectrum Medical Industries, Houston, TX）に移し、そして0.1Mリン酸バッファーpH7.4で充分に透析する。
２．ポリオキシエチレンに結合したヘモグロビン
この実験においては、LeonardおよびDellacherieの方法（Leonard and Dellacherie, Biochim. Biophys. Acta 791:219-225[1984]）が用いられる。
活性化されたポリエチレングリコールであるモノメトキシポリオキシエチレンスクシンイミジルエステル（MPSE）, MW=5000Da,を支質不含オキシヘモグロビンと反応させる。10g/dlヘモグロビン溶液1.5mlを0.1Mリン酸バッファー、水、または0.1M NaCl溶液の２mlに加える。必要な場合は、少量の0.1M NaOHまたは0.1M HClの添加によりpHを所望の値（5.7-7.8）に調整する。次にMPSEを加える（ヘモグロビンテトラマー１モル当たりMPSE 20-30モル）。反応混合物を６℃で２時間攪拌し、そして次に0.05Mリン酸バッファー（pH7.2）中のAcA 44 Ultrogel上６℃でのゲル透過クロマトグラフィーにより分析する（直線状フラクション化範囲10,000-130,000;排除限界200,000）。遊離ヘモグロビンピークがゲル透過クロマトグラムから消失した場合に反応は完結したと見なされる。
３．ヘモグロビン−ポリエチレングリコール・コンジュゲート
この実験においては、Zalipskyらの方法（Zalipskyら., In Polymeric Drugs and Drug Delivery Systems（Dumm, R.L. and Ottenbrite, R.M.,編）pp 91-100, American Chemical Society, Washington, DC 91-100[1991]）が用いられる。
Ａ．0.1Mリン酸ナトリウムバッファーpH7.8（60ml）中のウシ・オキシヘモグロビン（0.1g, 約1.5×10-6モル）の攪拌溶液にメトキシポリ（エチレングリコール）−Ｎ−スクシンイミジルカーボネート（SC-PEG），MW 2,000-6,000Da（1g, 約0.2ミリモル）を加える。水酸化ナトリウム（0.5N）を使用してpH7.8に30分間保持する。過剰の遊離のPEGは50mMリン酸緩衝食塩水を用いる透析濾過により除去する。
Ｂ．0.1MナトリウムボレートバッファーpH9.2中のウシ・オキシヘモグロビン（0.1g, 約1.5×10-6モル）の攪拌溶液にメトキシポリ（エチレングリコール）−Ｎ−スクシンイミジルカーボネート（SC-PEG），MW 2,000-6,000Da（1g, 約0.2ミリモル）を加える。30分間pH9.2に保持するために水酸化ナトリウム（0.5N）を使用する。過剰の遊離のPEGは50mMリン酸緩衝食塩水を用いる透析濾過により除去される。
４．ヘモグロビン−ポリエチレングリコール・コンジュゲート
この実験では、ヘモグロビン−ポリエチレングリコール・コンジュゲートを生成させるためにXueおよびWongの方法（Xue and Wong, Meth. Enz., 231:308-323[1994]）を使用する。
初めに、PEG:ビス（スクシンイミジルスクシネート）の活性化を行う。PEG（200g, 0.059モル, 平均MW3400;日本油脂,日本,東京）をジメチルホルムアミド200ml中に100℃で溶解させ、無水コハク酸15g（0.15モル）を加える。この混合物を100℃で３時間攪拌する。ジメチルホルムアミド溶液を室温に冷却しそしてエチルエーテル１リットル中に注ぐ。生成するコハク酸のPEGエステルをガラスフィルターを通して濾過しエチルエーテルで洗浄する。次にこのエステルを真空条件下40℃で乾燥させる。生成物の重量は約197g（収率93%）である。
PEG上のスクシニル基を活性化するために、コハク酸のPEGエステル197g（0.055モル）をジメチルホルムアミド200ml中に溶解させ、次にＮ−ヒドロキシスクシンイミド13g（0.11モル）およびジシクロヘキシルカルボジイミド23g（0.22モル）を加える。この溶液を30℃で一夜激しく攪拌する。ジシクロヘキシル尿素の沈殿を濾過しそして濾液をエチルエーテル１リットル中に注ぐ。形成されたポリエチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）を単離し、エチルエーテルで繰り返し洗浄し、そして真空条件下40℃で乾燥させる。生成物の重量は約196gであり、PEGからの収率87%を表している。
ポリエチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）の純度およびイミジル化の度合いは標準物質として（0ppm）テトラメチルシランおよび溶媒としてクロロホルム-d1を使用する核磁気共鳴により概算できる。同様の操作はモノメトキシポリエチレングリコールの親電子的活性化にも使用できる。
次に、この活性化されたPEGを４℃で以下の操作を実施してヘモグロビンに結合する。初めに、0.1Mリン酸ナトリウムpH7.4中の0.25mM Hb溶液100mlにポリエチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）0.95g（0.25ミリモル）を加え、反応を１時間継続する。この溶液をAmicon XM100メンブランでの限外濾過により濃縮する。次に電解質溶液を加えそして濃縮操作を反復する。この濃縮操作を３回反復することにより、未反応のPEGおよび他の低分子量化合物を除去する。
PEG-Hb中のPEGとコハク酸との間のエステル結合（これは加水分解に対して不安定である）を利用することによりPEG-Hbを安定化させる。PEGとHbとの間の結合の安定性を増大させる１つの方法は、ポリエチレン部分と末端カルボキシルとの間の不安定なエステル結合を、金属触媒の使用によりPEGの両末端アルコール基をカルボキシル基に酸化して−カルボキシメチル−ω−カルボキシメトキシルポリオキシエチレンを生成させ、これを活性化してPEGの場合のようにピリドキサール化Hbに結合させることにより除去することである。得られるコンジュゲートは「安定化ヘモグロビン」と称する。
加えて、モノメトキシポリオキシエチレン−ヘモグロビンを生成させる。PEGは２つの末端に２個のヒドロキシル基を有する。もしこれらをHbと反応しうる官能基に誘導体化させた場合は、同じポリマー上の２つの反応基の存在により架橋反応が可能となる。かかる架橋形成はモノメトキシポリオキシエチレン（MPOE）の場合におけるように２つの末端の一方を遮断することにより停止される。
MPOEを生成させるには、Aldrich（Milwaukee, WI）製のMW 5000のMPOE 80g（４ミリモル）をテトラヒドロフラン（300ml）中に溶解させ、そして窒素下、室温で３時間ナフタレンナトリウムで処理する。次にBrCH2COOC2H5（1.4ml, 12ミリモル）を攪拌下に滴下する。反応４時間後、得られたエチルエステルをエーテルで沈殿させ、乾燥し、水中に溶解させ、そして0.1N NaOHを用い55℃で24時間けん化してMPOE−カルボン酸（MPOE-O-CH2COOH）を生成させる。次にこの溶液を1N HClを用いてpH2.5に酸性化し、そしてポリマーをクロロホルムにとる。数回水洗後、有機層をMgSO4で乾燥し木炭で処理する。MPOE−カルボン酸を乾燥エーテルで沈殿させ、濾過しそして減圧乾燥させる。この操作を反復して電位差計滴定すると、固定されたCOOHの量について一定した値が得られる。
MPOE−カルボン酸（５ｇ，１ミリモル）を乾燥酢酸エチル（60ml）中に溶解させそしてＮ−ヒドロキシスクシンイミド（0.15g, 1.25ミリモル）およびジシクロヘキシルカルボジイミド（0.26g, 1.25ミリモル）により30℃で15時間活性化する。ジシクロヘキシル尿素を濾去しそして乾燥エーテルで沈殿させたポリマーをクロロホルムにとりこの溶液からエーテルを０℃で滴加することにより結晶化させる。スクシンイミジル基の分光測定による分析で一定した値が得られるまでこの操作を数回反復する。
ヘモグロビンへのカップリングは、10g/dlのヘモグロビン溶液1.5mlを0.1Mリン酸バッファーpH5.8の２mlで希釈しそしてMPOE−カルボン酸スクシンイミジルエステル300mgを攪拌下に加えることにより５℃で実施される。この反応混合物を６℃で２時間攪拌し、そして0.05Mリン酸バッファー（pH7.2）中のUltrogel AcA 34（直線状フラクション化範囲はMW20,000-350,000;排除限界750,000）上６℃でのゲル透過クロマトグラフィーにより分析する。
５．ヘモグロビン−デキストラン・コンジュゲート
この実験においては、ヘモグロビン−デキストラン・コンジュゲートはKueおよびWongの種々の方法（Xue and Wong, Meth. Enz., 231:308-323[1994]）に従い生成される。
アルキル化による合成
この方法においては、デキストラン（Dx）を初めに臭化シアンおよびジアミノエタンを用いて誘導体化させて遊離のアミノ基を含有させ、これをブロモアセチルブロマイドでアシル化する。ブロモアセチル官能基が次にHb上のβ93システインのスルフヒドリルをアルキル化する。
Dx＋CNBR＋ジアミノエタン→アミノエチル−Dx
アミノエチル−Dx＋ブロモアセチルブロマイド→Dx-NHCOCH2Br
Dx-NHCOCH2Br＋HS-Hb→Dx-NHCOCH2-S-Hb
代表的な調製においては、臭化シアン1.5gをアセトニトリル15ml中に溶解させ、そして水375ml中のデキストラン（MW 20,000）10g中に添加する。1M NaOHの添加によりpHを10.8に５分間保持する。次に濃HClを用いてpHを約2.0-2.5に低下させる。１分間攪拌後、ジアミノエタン15mlを、pHが9.5を超えるのを阻止するのに充分なHClと共に添加する。最終的なpHは9.5に調整する。４℃で一夜放置後、この混合物をMillipore（Marlborough, MA）Pellicon透析器を用い蒸留水で完全に透析し、凍結乾燥する。こうして得られたアミノエチル−Dxを0.1Mリン酸ナトリウムpH7.0の250ml中に溶解させ、ブロモアセチルブロマイド15mlを、微細に引っ張った毛細管先端を有するパストゥールピペットを通して加え、２時間にわたり激しく攪拌する。全体にわたり、pHはpH安定装置の使用および1M NaOHの添加により7.0に維持する。次に、この混合物を蒸留水で完全に透析し、凍結乾燥してDx-NHCOCH2Br（Br−デキストラン）約７ｇを得る。Br−デキストランの臭素含量は臭素原子あたりグルコース残基9-11個の範囲である。
デキストランにヘモグロビンを結合させるには、Br−デキストラン3.3gを0.1M重炭酸ナトリウムpH9.5中の6g/dlヘモグロビン溶液100ml中に溶解させる。カップリング反応は４℃で一定して混合しながら進行せしめる。Dx-NHCOCH2-S-Hb（Dx-Hb）の収率を測定するには、反応混合物0.1mlを0.05Mリン酸バッファーpH7.5で平衡化したセファデックスG-75カラムにかけ、そして同じバッファーを用いて毎時40mlの流量で溶離する。溶出フラクションのヘモグロビン含量は415nmでの吸光度により測定され、比較的速やかに移動するDx-Hbピークとよりゆっくりと移動するHbピークとの比率はこれらピークの下の面積により得た。２日後、Dx-Hbコンジュゲートの形成は実質的に完結する。
ジアルデヒドによる合成
過ヨウ素酸ナトリウムの12%水溶液10mlをデキストランの10%水溶液100ml中に加え、この混合物を４℃で暗所に一夜放置する。この混合物が褐色に変わりそして次にもう一度無色となるまで重亜硫酸ナトリウムの3%溶液を加える。この混合物を蒸留水で透析してデキストランジアルデヒド溶液を得る。次にこれを0.3M重炭酸ナトリウムバッファーpH9.5中の３g/dl支質不含ヘモグロビンの２容量中に加え、デキストランへのヘモグロビンのカップリングを４℃で一夜進行せしめる。形成されたDx-Hb複合体はセファデックスG-75カラム上のクロマトグラフィーにより未結合ヘモグロビンから分離する。
Dx−ジアルデヒドへのHbのカップリングはpH依存性である。もしカップリングを0.6Mホウ酸ナトリウムバッファー１ml中にDx−ジアルデヒド100mgを溶解させそして10g/dlのHb 1.8mlと６℃で混合することにより実施すると、pH＜9.6では多くの不安定なイミン結合が形成され、そしてコンジュゲートは100,000以上にも及ぶ高い分子量を有する。PHが高い程、主要な生成物は低い分子量範囲（70,000＞MW＞100,000）を有し、そして恐らくDxとHbの1:1複合体からなり、このものはより高い分子量形態物にゆっくりとしか変換しない。もしこのコンジュゲートをpH9.8で形成させ、1mM NaOH中に溶解した過剰のNaBH4（最初のアルデヒド１モルあたり２モル）を用いてpH7.2で30分間還元した場合、ヘモグロビンのα鎖のみがDxにより修飾されたことが判明する。Dx−ジアルデヒドへのHbのカップリングもまた、pHが高いほど、より迅速に進行し、pH10での完結には１時間以下しか必要とせず、またpH9.7では１時間半しか必要としないが、pH9.5では６時間そしてpH9.1では23時間を要する。pH9.75で調製した場合、Dx-Hbの酸素P50はコンジュゲートは、NaBH4還元に先立ち１時間で形成せしめられる場合は10.1mmHgであり、４時間で形成せしめられる場合は9.5mmHgであり、そして18時間で形成せしめられる場合は8.1である。
６．SF-DXおよびP-Dxへのヘモグロビン結合
この実験においては、ヘモグロビンをSF-DXおよびP-Dxと結合させる。デキストラン−スルフェート（SF-DX）およびデキストラン−ホスフェート（P-Dx）（MW 40,000）を過ヨウ素酸ナトリウムで処理してジアルデヒド誘導体を生成させ、次にこれをヘモグロビン上のアミノ基に結合させ、そしてDx−ジアルデヒドからのDx-Hbの合成において前記したようにしてホウ水素化ナトリウムで還元することによりさらに安定化させる。
７．デキストラン−ベンゼンヘキサカルボキシレート（Dx-BHC）へのヘモグロビン結合
この実験においては、ヘモグロビンをデキストラン−ベンゼンヘキサカルボキシレート（Dx-BHC）と結合させる。デキストラン5gを25%水性Zn（BF4）2の7.5mlおよび水５ml中に溶解させることによりアミノプロピル-Dxを調製する（35）。エピクロロヒドリン（25ml）を激しく攪拌しながら添加する。混合物は80℃で３時間そして次に室温で一夜反応せしめる。この溶液をアセトン中に滴下しながら注ぐことによりポリマーを沈殿させ、濾過し、そして減圧乾燥させる。生成するデキストラン誘導体は構造Dx-O-CH2CH（OH）CH2Clを有する。この生成物（3% Clを含有する4.1g）は水中への溶解ならびにアセトンおよびメタノールによる沈殿を反復することにより精製する。続いて化合物をH2O 60mlおよび14M水性アンモニア20ml中に溶解させることにより塩素原子をアミノ基で置き換える。この溶液を室温で20時間攪拌しそして次にメタノール１リットル中に滴下する。生成するアミノプロピル−Dx（デキストランの3-アミノ-2-ヒドロキシプロピルエーテル）の沈殿を濾過し、アセトンで洗い、減圧乾燥する。この段階での収量は約3.5gである。
縮合剤として1-（3-ジメチルアミノプロピル）-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（EDCI）を使用することによりベンゼンヘキサカルボン酸をアミノプロピル−Dxに結合させてDx-BHCを形成させる。ベンゼンヘキサカルボン酸は６個のカルボン酸基を有するので、アミノプロピル−Dx上のアミノ基との反応でもなお５個までのカルボン酸基が残る。これらの一つは、縮合剤として水溶性EDCIをさらに使用して、Hb上のアミノ基に連結させることができる。
８．ヒドロキシエチルデンプン−ヘモグロビン・コンジュゲート
この実験においては、ヒドロキシエチルデンプン−ヘモグロビン・コンジュゲートを生成させるのにXueおよびWongの方法（Xue and Wong, Meth. Enz., 231:308-323[1994]）が用いられる。
ヘモグロビンへの結合用に調製するには、ヒドロキシエチルデンプン（Hs）を初めにアミノエチル-Hsに変換する。代表的な調製においては、臭化シアン1.5gをアセトニトリル15ml中に溶解させ、そして2%Hs溶液の500ml中に加える。この溶液のpHは1M NaOH溶液の添加により10.8に5-10分間維持する。次にpHを濃HClを用いて2.0-2.5に低下させ、そしてpHが9.5を超えるのを阻止するためのさらなるHClと共にジアミノエタン10mlを加える。最終的なpHを9.5に調整し、そして溶液を４℃で一夜放置し次に脱イオン水で透析する。Hsに対する臭化シアン／ジアミノエタンの比率は変化させることができ、出発ポリマー中のグルコース残基の7-20%が置換されたアミノエチル-Hsの合成が可能である。
アルデヒド置換されたHsはアミノエチル-Hsをグルタルアルデヒドと反応させることにより調製される。代表的な反応においては、アミノエチル-Hsの透析溶液500mlを重炭酸ナトリウム2gで処理して、Hsが2%そして重炭酸塩が約0.05Mの溶液を得る。次にこの溶液に50%グルタルアルデヒド溶液５mlを加え、これを室温で２時間攪拌した後で透析する。
ヘモグロビンは凍結乾燥された固体として一酸化炭素下で使用される。これを脱酸素化脱イオン化水を使用して４℃でアルゴン下で再構成して、１mlあたりHb約2.5gを含有する溶液となす。代表的な反応では、アルデヒド置換Hsの透析された溶液500mlを重炭酸ナトリウムで処理して、Hsがおよそ2%そして重炭酸塩が0.1Mの溶液500mlを得、ヘモグロビン溶液（25ml）を加え、そして反応物を室温で４時間攪拌し、この後のセファデックスG-150でのゲル濾過によって、未修飾ヘモグロビンは何ら残っていないことが示される。次にこの溶液にホウ水素化ナトリウム（1.0g）を加え、これを室温でさらに２時間攪拌する。どんな微量の未修飾ヘモグロビンも除去できるように100,000分子量カットオフカートリッジを備えたAmicon（Danvers, MA）限外濾過ユニットを用いてHs-Hbを透析する。溶液にグルコース（10g）を加えた後凍結乾燥し、一酸化炭素下で４℃で保存する。
９．ヒドロキシエチルデンプン−ヘモグロビン・コンジュゲートの代替製造法
この実験においては、ヒドロキシエチルデンプン−ヘモグロビン・コンジュゲートを生成させるのに、XueおよびWongにより記載されたもう一つの方法（Xue and Wong, Meth. Enz., 231:308-323[1994]）を用いた。
ヒドロキシエチルデンプン−ヘモグロビン（Hs-Hb）コンジュゲートはHs-ジアルデヒドから次のようにして合成できる。0.03当量のHsを水250ml中に溶解させ、そして過ヨウ素酸ナトリウム0.028モルで５℃で12時間暗所で処理する。この溶液をイオンがなくなるまで透析する。酸化率（％）は熱量計を用いて測定できる。重炭酸ナトリウムの添加によりこの溶液をpH8.0に緩衝し、５℃に冷却し、そして一酸化炭素ヘモグロビン5gで処理する。反応は室温で18時間進行せしめるか、またはゲル濾過によりヘモグロビンの完全な修飾が示されるまで進行せしめる。この溶液を1%炭酸アンモニウムで透析しそしてグルコースの存在下で凍結乾燥する。
10．ヘモグロビン−イヌリン・コンジュゲート
この実験においては、ヘモグロビン−イヌリン・コンジュゲートを生成させるのに、XueおよびWongにより記載された方法（Xue and Wong, Meth. Enz., 231:308-323[1994]）が用いられる。
イヌリン−ヘモグロビン（In-Hb）コンジュゲートを合成するには、まずイヌリンをN,N-ジメチルホルムアミド中の無水コハク酸と100℃で２時間反応させることによりスクシニル化する。続いて、このスクシニル化イヌリンを、N,N-ジメチルホルムアミド中で縮合剤としてジシクロヘキシルカルボジイミドを用いて室温で一夜N-ヒドロキシスクシンイミドに連結させる。ヘモグロビンを0.1MトリスバッファーpH7.0中のN-ヒドロキシスクシンイミド活性化イヌリンの10倍モル過剰と４℃で１時間反応せしめてIn-Hbとなし、これを未反応のイヌリンおよび他の低分子量化合物が除去されるまでAmicon PM30メンブランフィルターを用いて精製する。
無水コハク酸／イヌリン比を制御することにより、イヌリン上のN-ヒドロキシスクシンイミド活性化スクシニル基の数を様々に変化させることができる。低密度のかかる基は82,000MWのIn-Hbコンジュゲートを生ずるが、一方高密度では約300,000MW以上までの範囲の架橋In-Hbを生成する。
11．ヘモグロビン−イヌリン・コンジュゲートを生成させるための代替法
この実験においては、ヘモグロビン−イヌリン・コンジュゲートを生成させるのに、Iwasakiらの方法（Iwasakiら., Biochem. Biophys. Res. Comm., 113:513-518[1983]）が用いられる。
イヌリンのN-ヒドロキシスクシンイミジルエステルを0.1Ｍトリスバッファー（pH7.0）中のオキシヘモグロビンと４℃で１時間反応させる。この反応混合物をTSK G3000 SWカラムを備えたJASCO Trirotor HPLC装置を用いて分析した。修飾されたヘモグロビン溶液は未反応のイヌリンおよび他の低分子量化合物がもはや検出されなくなるまでAmicon PM30メンブランフィルターを用いて精製した。
12．ヘモグロビン−ポリビニルピロリドン・コンジュゲート
この実験においては、ヘモグロビン−ポリビニルピロリドン・コンジュゲートを生成させるのにXueおよびWongの方法（Xue and Wong, Meth. Enz., 231:308-323[1994]）を用いた。
活性化PVPの合成
初めに、ポリビニルピロリドン（PVP）（MW 25,000-35,000）50gを0.25N NaOHの１リットル中に溶解させ、オートクレーブ内、窒素下で140℃で42時間加熱して部分加水分解させる。次にこれを濃HClを用いてpH５に調整し、Amicon UM10メンブランで限外濾過して塩を除去する。ベンゼンとの共沸蒸留により水を除去し、そして加水分解の度合いを第２級アミノ基の滴定により測定する。これらのアミノ基を封鎖するために、部分加水分解PVP 50ｇをジクロロメタン／ジメチルホルムアミド（1:1）300ml中に溶解させ、無水酢酸の0.5Mと混合する。これを室温で１時間放置し、４時間還流させる。約100mlとなるまで真空排気し、溶液をエチルエーエル中に強く攪拌しながら滴下する。アセチル化PVP沈殿を濾過し、エーテルで洗い、五酸化リンで恒量となるまで減圧乾燥する。
そのカルボキシル基を活性化するために、ジクロロメタン／ジメチルホルムアミド（1:1）500ml中に溶解したアセチル化PVP 50ｇを、N-ヒドロキシスクシンイミド15.47gと、続いてジクロロメタン50ml中のジシクロヘキシルカルボジイミド27.75gの溶液と０℃で混合する。この溶液を０℃で14時間攪拌し次に遠心してジシクロヘキシル尿素を除去する。上清溶液（約300ml）を冷エーテル５リットル中に強く攪拌しながら滴下する。白色沈殿を濾過し、エーテルで繰り返し洗い、そして冷下で五酸化リンで乾燥する。
活性化PVPへのヘモグロビンの結合
ヘモグロビン（27g）を5%炭酸ナトリウム１リットル中に溶解させ、活性化PVP 40gを用いて攪拌下４℃で24時間処理する。この調製物を凍結乾燥し、蒸留水300ml中に再溶解させる。20倍量透析濾過後、これを再び凍結乾燥する。
上記から、本発明が酸素担持性および酸素非担持性血漿増量剤（expander）の混合物を含んでなる最適な血液代替組成物およびその使用方法を提供することは明らかとなろう。これら組成物および方法により、現在利用可能な組成物よりも効果的で比較的安価な生成物の製造が可能となる。
上記明細書に述べられたすべての刊行物および特許は引用により本明細書中に組み込まれる。本発明の範囲および精神を逸脱することなく本発明の記載された方法およびシステムの種々の改変および変更は当業者にとって明らかであろう。本発明は特定の好ましい実施形態に関連して記載されているが、特許請求された本発明はかかる特定の実施形態に不当に限定されるべきでないことは理解されるべきである。事実、血液学、外科科学、輸血医学、移植、または任意の関連分野に習熟する者には明白な、本発明を実施するために記載された様式の種々の改変は下記請求の範囲の範囲内にあるとするものである。
【図１】
0004583510.tif 000029
【図２】
0004583510.tif 000030
【図３】
0004583510.tif 000031
【図４】
0004583510.tif 000032
【図５】
0004583510.tif 000033
【図６ａ】
0004583510.tif 000034
【図６ｂ】
0004583510.tif 000035
【図６ｃ】
0004583510.tif 000036
【図６ｄ】
0004583510.tif 000037
【図７】
0004583510.tif 000038
【図８ａ】
0004583510.tif 000039
【図８ｂ】
0004583510.tif 000040
【図９】
0004583510.tif 000041
【図１０】
0004583510.tif 000042
【図１１】
0004583510.tif 000043
【図１２】
0004583510.tif 000044
【図１３】
0004583510.tif 000045
【図１４】
0004583510.tif 000046
【図１５】
0004583510.tif 000047
【図１６】
0004583510.tif 000048
【図１７】
0004583510.tif 000049
【図１８】
0004583510.tif 000050
【図１９】
0004583510.tif 000051