(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マンゴスチン（Garcinia mangostana L.）の植物体、あるいはその溶媒抽出物からなり、ゼラチナーゼ群、ストロムライシン群のいずれかの群に属する、細菌由来でないマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰｓ）の活性を阻害する、ＭＭＰｓ活性阻害剤。
【請求項２】
エラスチン分解抑制剤である、請求項１記載のＭＭＰｓ活性阻害剤。
【請求項３】
ラミニン分解抑制剤である、請求項１記載のＭＭＰｓ活性阻害剤。
【請求項４】
基底膜分解抑制剤である、請求項１記載のＭＭＰｓ活性阻害剤。
【請求項５】
プロテオグリカン分解抑制剤である、請求項１記載のＭＭＰｓ活性阻害剤。
【請求項６】
ゼラチナーゼ群、ストロムライシン群のいずれかの群に属する、細菌由来でないマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰｓ）の活性を阻害するＭＭＰｓ活性阻害剤の製造のための、マンゴスチン（Garcinia mangostana L.）の植物体、あるいはその溶媒抽出物の使用。
【請求項７】
ＭＭＰｓ活性阻害剤がエラスチン分解抑制剤である、請求項６記載の使用。
【請求項８】
ＭＭＰｓ活性阻害剤がラミニン分解抑制剤である、請求項６記載の使用。
【請求項９】
ＭＭＰｓ活性阻害剤が基底膜分解抑制剤である、請求項６記載の使用。
【請求項１０】
ＭＭＰｓ活性阻害剤がプロテオグリカン分解抑制剤である、請求項６記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、特定の植物あるいはその溶媒抽出物を含有するマトリックスメタロプロテアーゼ活性阻害剤に関する。さらに詳しくは、皮膚の老化に大きな影響を与える特定のマトリックスメタロプロテアーゼ（MMPs：Matrix metalloproteinases）の活性に対して優れた拮抗作用を有し、皮膚の老化を効果的に予防・防止・改善することのできるＭＭＰｓ活性阻害剤に関する。本発明は、基礎化粧品をはじめ、メイクアップ化粧品、頭髪用化粧品、浴剤などに好適に使用し得るものである。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
ヒトの皮膚は表皮、真皮、皮下組織の３層に大別され、表皮と真皮は基底膜を介して接している。
【０００３】
基底膜では、基底細胞が耐えず分裂を繰り返し、この分裂した基底細胞が順次上方に押し上げられ、表皮の最上層にある角質層を形成している。角質層は美容上の肌の性質とも関わりが極めて深いことから、基底膜の肌への影響もまた大きい。基底膜は細胞外マトリックス（後述）の一種とされ、タイプIVコラーゲン、プロテオグリカン、ラミニン、フィブロネクチン等を含む。
【０００４】
真皮は結合組織からなり、細胞外空間はおもに、細胞外マトリックス（ECM: extracellular matrix）と呼ばれる巨大分子の網目構造によって満たされている。細胞外マトリックス（ＥＣＭ）は、繊維性タンパク質（コラーゲン、エラスチン等）や、細胞接着性タンパク質（グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ラミニン等）からなり、こうした構造により、真皮は皮膚の弾力、張りなどに大きく影響している。
【０００５】
従来、皮膚の老化に伴う変化、すなわちしわ、くすみ、きめの消失、弾力性の低下等に、紫外線や更年期にみられる女性ホルモンの低下などが大きく関与していることが知られている。これらの変化をミクロ的にみれば、真皮でのコラーゲン、エラスチン等の細胞外マトリックス成分（ＥＣＭ）の減少・変性、さらには基底膜損傷や表皮肥厚が起こっている。
【０００６】
近年研究が進み、これらの変化を誘導する因子として、特にマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰｓ）の関与が指摘されている。ＭＭＰｓは、細胞外マトリックスタンパク質を主要な基質とする一群のプロテアーゼの総称名である。ＭＭＰｓには多くの種類が知られており、構造的、機能的特徴に共通点を有してはいるものの、それぞれの基質タンパク質が異なっている（宮崎香、他、「生化学」、68巻12号、pp.1791-1807(1996)）。
【０００７】
ＭＭＰｓは、その構造および機能の面から、通常、ゼラチナーゼ群、ストロムライシン群、コラゲナーゼ群、およびその他（マトリライシン等）に分類されている。
【０００８】
ゼラチナーゼ群には、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９等が含まれる。これらＭＭＰ−２、９は、基底膜成分であるタイプIVコラーゲンやラミニン、真皮マトリックス成分のエラスチン等を分解する酵素として知られている。
【０００９】
ストロムライシン群には、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−１０等が含まれる。これらＭＭＰ−３、１０は、基底膜成分であるプロテオグリカンや、タイプIVコラーゲン、ラミニン、その他フィブロネクチン等を分解する酵素として知られている。
【００１０】
コラゲナーゼ群には、ＭＭＰ−１（間質コラゲナーゼ）、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−１３等が含まれる。中でもＭＭＰ−１は、真皮マトリックスの主な構成成分であるタイプＩ、IIIコラーゲンや、基底膜成分であるプロテオグリカン等を分解する酵素として知られている。ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−１３もタイプIコラーゲン等の分解作用を有する。
【００１１】
さらに、これら各酵素は、その発現が紫外線の照射により大きく増加し、紫外線による細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の減少変性の原因の１つとなり、皮膚のしわの形成等の大きな要因の１つであると考えられている（V. Koivukangas et al., "Acta Derm Venereol"(Stockh), 74, 279-282(1994); Gary J. Fisher et al., "Nature", 379(25),335(1996); Gary J. Fisher et al., "The New England Journal of Medicine", 337(20), 1419(1997)）。また紫外線の照射以外にも、更年期時の女性ホルモンの急激な減少・欠乏が引き金となり、皮膚中のＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９の増加が生じ、紫外線照射の場合と同様に、皮膚のしわ、たるみ等の発生要因となっていることが明らかとなった（特願２００１−５０８３９明細書、 N. Ochiai et al., "Jpn. J. Dermatol.", 111(3), 532(Abs.)(2001)）。このようにＭＭＰｓ活性の阻害は、種々の細胞外マトリックスを保護し、皮膚の老化を防ぐ上で極めて重要である。
【００１２】
従来の抗老化薬剤には、繊維芽細胞を活性化し、コラーゲンの産生量を増加させる機序をもったものは多く認められるが、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に対する各々のＭＭＰｓの活性阻害に着目したものは限られている（特開２００１−１３９４６６公報、特開２００１−１７２１５７公報、特開２００１−１９２３１６公報、特開２００１−１９２３１７公報）。
【００１３】
したがって本発明は、皮膚の老化と密接に関係するＭＭＰｓの活性を確実に阻害することができ、皮膚の老化の予防・防止や改善作用に優れ、かつ安全性の高いＭＭＰｓ活性阻害剤を提供することを目的とする。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため、広く種々の物質についてそれぞれのＭＭＰｓ活性阻害作用を検討した結果、特定の植物あるいはその抽出液中に優れたＭＭＰｓ活性阻害作用があることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１５】
すなわち本発明は、マンゴスチン（Garcinia mangostana L.）の植物体、あるいはその溶媒抽出物からなり、ゼラチナーゼ群、ストロムライシン群のいずれかの群に属する、細菌由来でないマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰｓ）の活性を阻害する、ＭＭＰｓ活性阻害剤に関する。
また本発明は、上記のＭＭＰｓ活性阻害剤の製造のための、マンゴスチンの植物体、あるいはその溶媒抽出物の使用に関する。
【００１６】
また本発明は、エラスチン分解抑制剤、ラミニン分解抑制剤、基底膜分解抑制剤、プロテオグリカン分解抑制剤のいずれかである、上記ＭＭＰｓ活性阻害剤に関する。
【００１９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳述する。
【００２４】
マンゴスチン（Garcinia mangostana L.）は、オトギリソウ科（Guttiferae（Hypericaceae））フクギ属（Garcinia）に属する植物種である。熱帯地域で栽培される常緑果樹で、果皮部分はタンニンと黄色色素（マンゴスチン）を含む。乾燥樹皮も黒色染料となる。
【００３４】
マンゴスチンは、種々の薬理活性が知られているが、ＭＭＰｓ活性阻害作用を有することは今まで知られておらず、今回、本発明者らが初めて見出したものである。
【００３５】
本発明に用いるマンゴスチンは、生のままでも乾燥したものでも使用することができるが、使用性、製剤化等の点から乾燥粉末あるいは溶媒抽出物として用いることが好ましい。
【００３６】
マンゴスチンの使用部位としては、葉、枝、花、根、果実、果皮、種子、樹皮など、植物体の任意の部位を用いることができるが、特には果皮または皮を用いるのが好ましいが、他の部位を用いることもできる。
【００５１】
マンゴスチンの植物体の抽出物は常法により得ることができ、例えば、マンゴスチンの植物体を抽出溶媒とともに浸漬または加熱還流した後、濾過して濃縮して得ることができる。抽出溶媒としては、通常抽出に用いられる溶媒であれば任意に用いることができ、例えば、水、メタノール、エタノール、プロピレングリコール、1，３−ブチレングリコール、グリセリン等のアルコール類、含水アルコール類、クロロホルム、ジクロルエタン、四塩化炭素、アセトン、酢酸エチル、ヘキサン等の有機溶媒等を、それぞれ単独あるいは組み合わせて用いることができる。上記溶媒で抽出して得た抽出液をそのまま、あるいは濃縮したエキスを吸着法、例えばイオン交換樹脂を用いて不純物を除去したものや、ポーラスポリマー（例えばアンバーライトＸＡＤ−２）のカラムにて吸着させた後、メタノールまたはエタノールで溶出し、濃縮したものも使用することができる。また分配法、例えば水／酢酸エチルで抽出した抽出物等も用いられる。
【００５２】
マンゴスチンの植物体あるいはその抽出物は、安全性が高く、優れたＭＭＰｓ活性阻害作用を有し、優れた抗老化作用、特に抗皮膚老化作用を有する。
【００５３】
本発明では特に、マンゴスチン（G. mangostana）の植物体、あるいはその溶媒抽出物は、ゼラチナーゼ群、ストロムライシン群、コラゲナーゼ群のいずれの群に属するＭＭＰｓに対しても優れたＭＭＰｓ拮抗作用、活性阻害作用を有する。
【００５４】
ゼラチナーゼ群に属するＭＭＰｓの活性阻害剤としては、エラスチン分解抑制剤、ラミニン分解抑制剤、および基底膜分解抑制剤としての適用が例示的に挙げられる。
【００５５】
ストロムライシン群に属するＭＭＰｓの活性阻害剤としては、プロテオグリカン分解抑制剤、ラミニン分解抑制剤としての適用が例示的に挙げられる。
【００５７】
コラゲナーゼ群に属するＭＭＰｓの活性阻害剤としては、コラーゲン分解抑制剤としての適用が例示的に挙げられる。
【００５８】
また、本発明の上記いずれのＭＭＰｓ活性阻害剤にあっても、しわの予防・防止と改善を目的とした抗しわ剤としても適用が可能である。
【００５９】
なお、本発明において「ＭＭＰｓ活性阻害剤」は、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰｓ）活性に対し拮抗作用を有する製剤を広く意味する。
【００６０】
本発明のマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤は、抗老化用化粧料・皮膚外用剤等として用いることを好適とし、その場合、マンゴスチンの植物体あるいはその抽出物の配合量は、組成物全量中、乾燥質量（固形分質量）として０．０００１〜２０質量％が好ましく、特には０．０００１〜１０質量％である。０．０００１質量％未満では本願発明効果が十分に発揮され難く、一方、２０質量％を超えて配合してもさほど大きな効果の向上は認められず、また製剤化が難しくなるので好ましくない。
【００６１】
本発明のＭＭＰｓ活性阻害剤を、例えば抗老化用化粧料に用いる場合、上記必須成分以外に、本発明の効果を損わない範囲内で、通常化粧品や医薬品等の外用剤に用いられる成分、例えば、美白剤、保湿剤、酸化防止剤、油性成分、紫外線吸収剤、界面活性剤、増粘剤、アルコール類、粉末成分、色剤、水性成分、水、各種皮膚栄養剤等を必要に応じて適宜配合することができる。
【００６２】
さらに、エデト酸二ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ポリリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム、グルコン酸等の金属封鎖剤、カフェイン、タンニン、ベラパミル、トラネキサム酸およびその誘導体、甘草抽出物、グラブリジン、カリンの果実の熱水抽出物、各種生薬、酢酸トコフェロール、グリチルリチン酸およびその誘導体またはその塩等の薬剤、ビタミンＣ、アスコルビン酸リン酸マグネシウム、アスコルビン酸グルコシド、アルブチン、コウジ酸等の他の美白剤、グルコース、フルクトース、マンノース、ショ糖、トレハロース等の糖類、レチノイン酸、レチノール、酢酸レチノール、パルミチン酸レチノール等のビタミンＡ誘導体類なども適宜配合することができる。
【００６３】
本発明は、その剤型が特に限定されるものでなく、溶液系、可溶化系、乳化系、粉末分散系、水−油二層系、水−油−粉末三層系、軟膏、ゲル、エアゾール等、任意の剤型が適用される。
【００６４】
またその使用形態も任意であり、例えば化粧水、乳液、クリーム、パック等のフェーシャル化粧料やファンデーションの他、メーキャップ化粧料、毛髪用化粧料、芳香化粧料、浴用剤等に用いることができるが、これら例示に限定されるものでないことはもちろんである。
【００６５】
【実施例】
次に、実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例によってなんら限定されるものではない。
【００６６】
実施例に先立ち、本発明に用いられる各植物抽出物のＭＭＰ−９、ＭＭＰ−３およびＭＭＰ−１活性阻害効果について、試験方法と評価方法について説明する。
【００６７】
［試験方法および評価方法］
１．試料の調製
【００６８】
（１）植物抽出物
表１に示すように、各植物をそれぞれ室温で１週間メタノールに浸漬し、抽出液を得た。この抽出液を濃縮して各植物抽出物（メタノール抽出物）を得た。
【００６９】
【表１】
0004577868.tif 000002
【００７０】
上記植物抽出物をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に濃度２質量％となるよう溶解して、植物抽出物含有溶液とした。
【００７１】
この植物抽出物含有溶液をそれぞれ、測定用緩衝液（０．４Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ2を含むｐＨ７．４の０．１Ｍトリス）で希釈して、表２〜５に示すように濃度を調整し、これを試料溶液として用い、以下の実験を行った。
【００７２】
２．ＭＭＰｓ活性阻害効果試験
（１）ＭＭＰ−９活性阻害率
ゼラチナーゼ群に属する酵素としてＭＭＰ−９を用いて、その活性阻害率を測定した。測定は以下のように行った。
【００７３】
すなわち、０．２質量％ゼラチンを含むＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（１０％Ｔ）を作製し、全レーンにヒト細胞由来のＭＭＰ−９溶液を一定量アプライし、電気泳動を行った。泳動後のゲルを２．５質量％「TritonX−100」で洗浄し、さらにインキュベーション用緩衝液（０．０１ｍＭ  ＺｎＳＯ4、５ｍＭ  ＣａＣｌ2を含むｐＨ８．０の５０ｍＭトリス）で十分にＳＤＳを除いた。ゲルを短冊状に切断し、各切断ゲルを、試料を所定濃度添加したインキュベーション用緩衝液に浸して、３７℃で一晩インキュベートした。
【００７４】
インキュベーション後、ゲルをクマッシーブリリアントブルー染色し、脱色後に現れるバンドの太さをイメージアナライザー（バイオラド社製「Fluor-S Multi Imager」）で定量化した。
【００７５】
そして、植物抽出物を含まない反応系（コントロール。ＤＭＳＯ）でのバンドの値に対する、植物抽出物を含んだ系（上記試料溶液）でのバンドの減少値を求め、ＭＭＰ−９活性阻害率（％）を算出した。結果を表２〜３に示す。
また参考例として、ＭＭＰｓ活性阻害作用がよく知られている物質であるエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）についても、上記と同様の試験を行った。結果を併せて表３に示す。
【００７６】
（２）ＭＭＰ−１、３
測定にはヤガイ製のストロメリシン−１、I型コラゲナーゼの測定キットを用いた。ＭＭＰとしてヒト細胞由来の各酵素を用いた。すなわち、ストロムライシン群に属する酵素としてＭＭＰ−３を、コラゲナーゼ群に属する酵素としてＭＭＰ−１を、それぞれ用いた（いずれもヤガイ製）。
【００７７】
上記試料溶液５０μｌと一定量の酵素（０．４単位／ｍｌ）を含んだ酵素溶液１００μｌ、そして蛍光標識基質溶液（１ｍｇ／ｍｌ）５０μｌを合わせ、一定時間（２〜４時間）、４２℃でインキュベートした後、エタノール溶液を添加して酵素反応停止後、遠心分離により未反応の基質を沈殿させ、上清に残った分解した基質の蛍光強度を測定し、基質の分解率を求めた。
【００７８】
そして、植物抽出物を含まない反応系（コントロール。ＤＭＳＯ）での基質分解率に対する、植物抽出物を含んだ系（上記試料溶液）での分解率の割合より、植物抽出物の各酵素活性阻害率を求めた。結果を表４、５に示す。
【００７９】
また参考例として、ＭＭＰｓ活性阻害作用がよく知られている物質であるエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）についても、上記と同様の試験を行った。結果を併せて表４、５に示す。
【００８０】
【表２】
0004577868.tif 000003
【００８２】
【表４】
0004577868.tif 000004
【００８３】
【表５】
0004577868.tif 000005
【００８４】
表２〜５（ただし表３は欠番とする）から明らかなように、本発明に用いられるマンゴスチン抽出物のＭＭＰ−９、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−１活性阻害効果は、ＥＤＴＡのＭＭＰ−９、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−１活性阻害効果に比べ極めて優れたものであった。したがって、これらの植物あるいはその抽出物を用いて、しわ、たるみなどの皮膚の老化を効果的に予防・防止・改善することができる。
【００８５】
以下に、さらに本発明の処方例を実施例２、４、８、１０（実施例１、３、５〜７、９は欠番とする）として挙げる。
【００８７】
0004577868.tif 000006
（１３）に（８）を加え、加熱して７０℃に保つ（水相）。一方、（１）〜（７）、（９）〜（１２）を混合し、加熱融解して７０℃に保つ（油相）。水相に油相を加え予備乳化を行い、ホモミキサーで均一に乳化した後、よくかき混ぜながら３０℃まで冷却する。
【００８９】
0004577868.tif 000007
少量の（１３）に（８）を溶解する（Ａ相）。一方、残りの（１３）に（６）、（７）を加え、加熱溶解して７０℃に保つ（水相）。（１）〜（５）、（９）〜（１２）を混合し、加熱融解して７０℃に保つ（油相）。水相に油相を加え、予備乳化を行い、Ａ相を加えホモミキサーで均一に乳化し、乳化後よくかき混ぜながら３０℃まで冷却する。
【００９３】
0004577868.tif 000008
Ａ相、Ｂ相、Ｃ相をそれぞれ均一に溶解し、Ａ相にＢ相を加えて可溶化する。
次いでこれをＣ相に加えた後、容器に充填する。
【００９５】
0004577868.tif 000009
水相を加熱攪拌後、十分に混合粉砕した粉体部を添加してホモミキサー処理する。さらに加熱混合した油相を加えてホモミキサー処理した後、攪拌しながら香料を添加し、室温まで冷却する。
【０１０６】
上記実施例２、４、８、１０の化粧料はいずれもＭＭＰｓ活性阻害作用に優れる。
【０１０７】
【発明の効果】
以上に説明したように、本発明のＭＭＰｓ活性阻害剤は、優れたＭＭＰｓ活性阻害効果を有し、皮膚の老化に深く関係する皮膚細胞外マトリックス成分（例えば、エラスチン、ラミニン、プロテオグリカン、基底膜成分、コラーゲン等）の分解を防止して、繊維を保持し、皮膚の老化を予防・防止・改善し、弾力のある、しわやたるみのない、若々しい肌の状態を維持することができる。