(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
固体担体と、該固体担体に一端で固定化された２本鎖ＤＮＡとからなり、該２本鎖ＤＮＡは、クラスＩＩ−Ｓ制限酵素の認識配列と、標的とする転写調節因子の認識配列と、前記クラスＩＩ−Ｓ制限酵素の切断部位と、蛍光標識された配列とが他の配列を介するか、介せずに前記固体担体側から、この順序で直列に、連結された（但し、該転写調節因子の認識配列は、該クラスＩＩ−Ｓ制限酵素の切断部位に存在してもよい）構造体を含むことを特徴とする転写調節因子とＤＮＡの結合を検出するための蛍光プローブ。
【請求項２】
クラスＩＩ−Ｓ制限酵素の認識配列がＦｏｋＩの認識配列であることを特徴とする、請求項１に記載の転写調節因子とＤＮＡの結合を検出するための蛍光プローブ。
【請求項３】
固体担体が磁気ビーズであることを特徴とする、請求項１に記載の転写調節因子とＤＮＡの結合を検出するための蛍光プローブ。
【請求項４】
２本鎖ＤＮＡがビオチン・アビジン結合によって固体担体に固定化されていることを特徴とする、請求項１に記載の転写調節因子とＤＮＡの結合を検出するための蛍光プローブ。
【請求項５】
転写調節因子とＤＮＡの結合を検出する方法であって、
前記転写調節因子を含む試料に、転写調節因子とＤＮＡの結合を検出するための蛍光プローブを添加し、ここで前記蛍光プローブは、固体担体と、該固体担体に一端で固定化された２本鎖ＤＮＡとからなり、該２本鎖ＤＮＡはクラスＩＩ−Ｓ制限酵素の認識配列と、前記転写調節因子の認識配列と、前記クラスＩＩ−Ｓ制限酵素の切断部位と、蛍光標識された配列とが他の配列を介するか、介せずにこの順序で直列に、連結された（但し、該転写調節因子の認識配列は、該クラスＩＩ−Ｓ制限酵素の切断部位に存在してもよい）構造体を含む第１の工程と、
前記第１の工程で得られた混合液を、前記転写調節因子が、前記転写調節因子とＤＮＡの結合を検出するための蛍光プローブに結合するのに充分な時間、反応させる第２の工程と、
前記第２の工程で得られた反応混合液に、クラスＩＩ−Ｓ制限酵素を添加する第３の工程と、
前記クラスＩＩ−Ｓ制限酵素の作用により前記蛍光プローブが切断されて、該蛍光プローブから蛍光標識が遊離するか否かを該蛍光標識の蛍光を測定することにより判定する第４の工程と、
前記第４の工程の判定結果に基づいて、前記転写調節因子が、前記転写調節因子とＤＮＡの結合を検出するための蛍光プローブに結合したか否かを決定する第５の工程と
を含むことを特徴とする、前記転写調節因子とＤＮＡの結合を検出する方法。
【請求項６】
クラスＩＩ−Ｓ制限酵素がＦｏｋＩであることを特徴とする、請求項５に記載の転写調節因子とＤＮＡの結合を検出する方法。
【請求項７】
第５の工程で、転写調節因子が、転写調節因子とＤＮＡの結合を検出するための蛍光プローブに結合したと決定された場合、さらに該結合の強度を評価する工程を含むことを特徴とする、請求項５に記載の転写調節因子とＤＮＡの結合を検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、転写調節制御因子とＤＮＡの結合の検出に関する。さらに詳しくは、本発明は転写調節制御因子とＤＮＡ（遺伝子の転写調節領域）の結合を検出するための蛍光プローブおよびそれを用いて、該ＤＮＡ結合を検出する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
転写調節因子は、プロモーターの上流または下流のＤＮＡと結合し、遺伝子の転写を調節する。例えば、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの調節因子としては、ＮＦ−κ、ＮＦ−ＩＬ６、ＣＲＥＢ、ＣＢＰ、ＡＰＩ等が知られている。転写調節因子と遺伝子の転写調節領域の結合（以下、ＤＮＡ結合ともいう）を検出、さらに評価する簡便な方法が確立されれば、転写調節因子のＤＮＡ親和性を測定できるのみならず、特定の遺伝子に対する転写調節因子の阻害剤（アンタゴニスト）、或いはアゴニストをスクリーニングするのに有用である。すなわち、候補薬剤の存在下、ＤＮＡ結合がいかなる影響を受けるかを調べることができる。結合が阻害されれば、候補薬剤の阻害活性が、その遺伝子発現を抑える医薬品として利用できる可能性がある。なお、ガン関連遺伝子の多くは転写調節因子であることから、当該方法は、ガン診断および制ガン剤開発において有用である。
【０００３】
このような転写調節因子とＤＮＡの結合を検出する方法として、Ｓｋｏｗｒｏｎらは、「アキレス・ヒール開裂（Ａｃｈｉｌｌｅｓ’ ｈｅｅｌ ｃｌｅａｖａｇｅ）」とよばれる手法を提案した。Ｐ．Ｍ．Ｓｋｏｗｒｏｎら、Ｇｅｎｅ，１７０（１９９６）１−８を参照。この方法の概要は、次のとおりである。すなわち、プラスミドに制限酵素ＦｏｋＩの認識配列とＤＮＡ結合タンパク質（転写調節因子ＧＣＮ４）の認識配列とを部分的に重複させて、直列に配置し、ＤＮＡ結合タンパク質を加える。この混合液にさらに、ＦｏｋＩの認識配列を特異的にメチル化する酵素（ＦｏｋＩメチル化酵素）を加える。このメチル化酵素は、ＦｏｋＩの認識配列を特異的にメチル化することによって、ＦｏｋＩが制限酵素として該配列を認識し、切断するのを阻害する。ＤＮＡ結合タンパク質がプラスミドに結合しているとき、該ＤＮＡ結合タンパク質の立体障害のためにＦｏｋＩメチル化酵素はＦｏｋＩの認識配列に接近することが阻まれ、該ＦｏｋＩの認識配列はメチル化を受けない。一方、ＤＮＡ結合タンパク質がプラスミドに結合していないとき、このような立体障害が存在しないので、ＦｏｋＩの認識配列はメチル化される。そこで、ＦｏｋＩ処理を行うと、前者ではＦｏｋＩによるプラスミドの切断が起こるが、後者では切断が起こらない。従って、両者の酵素処理液から、プラスミドを回収して、ゲル電気泳動し、各々のＤＮＡ鎖長を比較すると、ＤＮＡ結合タンパク質がプラスミドに結合するか否かを判定できることになる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、アキレス・ヒール開裂法には様々な問題点が内在する。それらを列挙すると、下記のとおりである。
（１）基質として、プラスミドを使用するので、ＤＮＡ結合タンパク質が認識しうる配列が、挿入された配列以外に、プラスミドＤＮＡ中に存在する可能性が高く、したがって該挿入配列以外の部位にＤＮＡ結合タンパク質が結合することがある。
（２）ＦｏｋＩが認識配列を切断するかどうかをみるのに、メチル化酵素の反応を介して行うので、操作が煩雑になる。しかも、ＤＮＡ結合タンパク質の結合しなかったＦｏｋＩ認識配列をメチル化酵素が１００％メチル化するとは限らないため、結合試験における評価が難しくなる。
（３）ＦｏｋＩ以外の制限酵素を使用する場合、その酵素のメチル化酵素が必要となり、該メチル化酵素が知られていないか、または入手できないとき、この方法は適用できない。
（４）ゲル電気泳動を用いて制限酵素によるＤＮＡの切断を検出するので、判定に時間がかかり、高速処理に不適当である。また、比較的多量のサンプル量を各検体、或いは各試験に対して用意する必要がある。
【０００５】
以上のようなアキレス・ヒール開裂法の問題点に鑑み、転写調節因子とＤＮＡの結合を検出する迅速、かつ簡便な方法が望まれる。従って、本発明は、アキレス・ヒール開裂法の問題点を解決し、迅速、かつ簡便にＤＮＡ結合を検出する方法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題について、鋭意検討した結果、クラスＩＩ−Ｓ制限酵素の特性を利用した、転写調節因子とＤＮＡの結合を検出するための蛍光プローブを作成し、さらにこれを用いると、前記ＤＮＡ結合が蛍光測定によって容易に検出可能であることを見出した。
【０００７】
すなわち、本発明は、固体担体と、該固体担体に一端で固定化された２本鎖ＤＮＡとからなり、該２本鎖ＤＮＡはクラスＩＩ−Ｓ制限酵素の認識配列と、標的とする転写調節因子の認識配列と、前記クラスＩＩ−Ｓ制限酵素の切断部位と、蛍光標識された配列とが他の配列を介するか、介せずに前記固体担体側から、この順序で直列に、連結された（但し、該転写調節因子の認識配列は、該クラスＩＩ−Ｓ制限酵素の切断部位に存在してもよい）構造体を含むことを特徴とする転写調節因子とＤＮＡの結合を検出するための蛍光プローブを提供する。
【０００８】
前記転写調節因子とＤＮＡの結合を検出するための蛍光プローブにおいて、好ましくは、クラスＩＩ−Ｓ制限酵素の認識配列がＦｏｋＩの認識配列である。
【０００９】
また、転写調節因子とＤＮＡの結合を検出するための蛍光プローブにおいて、好ましくは、固体担体が磁気ビーズである。
【００１０】
また、前記転写調節因子とＤＮＡの結合を検出するための蛍光プローブにおいて、好ましくは、２本鎖ＤＮＡがビオチン・アビジン結合によって固体担体に固定化されている。
【００１１】
また、本発明は、転写調節因子とＤＮＡの結合を検出する方法であって、
前記転写調節因子を含む試料に、転写調節因子とＤＮＡの結合を検出するための蛍光プローブを添加し、ここで前記蛍光プローブは、固体担体と、該固体担体に一端で固定化された２本鎖ＤＮＡとからなり、該２本鎖ＤＮＡはクラスＩＩ−Ｓ制限酵素の認識配列と、前記転写調節因子の認識配列と、前記クラスＩＩ−Ｓ制限酵素の切断部位と、蛍光標識された配列とが他の配列を介するか、介せずに前記固体担体側から、この順序で直列に、連結された（但し、該転写調節因子の認識配列は、該クラスＩＩ−Ｓ制限酵素の切断部位に存在してもよい）構造体を含む第１の工程と、
前記第１の工程で得られた混合物を、前記転写調節因子が、前記転写調節因子とＤＮＡの結合を検出するための蛍光プローブに結合するのに充分な時間、反応させる第２の工程と、
前記第２の工程で得られた反応混合液に、クラスＩＩ−Ｓ制限酵素を添加する第３の工程と、
前記クラスＩＩ−Ｓ制限酵素の作用により前記蛍光プローブが切断されて、該蛍光プローブから蛍光標識が遊離するか否かを該蛍光標識の蛍光を測定することにより判定する第４の工程と、
前記第４の工程の判定結果に基づいて、前記転写調節因子が、前記転写調節因子とＤＮＡの結合を検出するための蛍光プローブに結合したか否かを決定する第５の工程と
を含むことを特徴とする、前記転写調節因子とＤＮＡの結合を検出する方法を提供する。
【００１２】
前記転写調節因子とＤＮＡの結合を検出する方法において、好ましくは、クラスＩＩ−Ｓ制限酵素がＦｏｋＩである。
【００１３】
前記転写調節因子とＤＮＡの結合を検出する方法において、第５の工程で、転写調節因子が、前記転写調節因子とＤＮＡの結合を検出するための蛍光プローブに結合したと決定された場合、さらに該結合の強度を評価する工程を含むことを特徴とする。
【００１４】
以下、本発明を好適な実施の形態に従って、詳細に説明する。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明の第１の側面に従えば、固体担体と、該固体担体に一端で固定化された２本鎖ＤＮＡとからなり、該２本鎖ＤＮＡは、クラスＩＩ−Ｓ制限酵素の認識配列と、標的とする転写調節因子の認識配列と、前記クラスＩＩ−Ｓ制限酵素の切断部位と、蛍光標識された配列とが他の配列を介するか、介せずに前記固体担体側から、この順序で直列に、連結された（但し、該転写調節因子の認識配列は、該クラスＩＩ−Ｓ制限酵素の切断部位に存在してもよい）構造体を含むことを特徴とする転写調節因子とＤＮＡの結合を検出するための蛍光プローブが提供される。この蛍光プローブ（以下、本発明の蛍光プローブという）の好適な実施の形態として、その具体例を模式的に図１に示す。図を参照しながら、以下、本発明の蛍光プローブ１を構成する各要素について説明する。
【００１６】
まず、図１中、２は固体担体を表わし、これに２本鎖ＤＮＡ３がその一端で固定化される。固体担体２は、固体の支持体であれば、その材質は特に限定されない。例えば、ポリプロピレン、ポリアクリレート、ガラス等が挙げられる。また、その形状についても、特に限定はなく、タイタープレート内壁、ＤＮＡアレイ、ビーズ等が挙げられる。しかし、固定化操作およびその後の洗浄操作での簡便性を考慮して、磁気ビーズが本発明では、特に好適である。このような固体担体２に２本鎖ＤＮＡ３を固定化する。固定化反応については、ビオチン／アビジン（またはストレプトアビジン）結合を利用するのが好ましいが、他の結合方法、例えば共有結合（アルデヒド基とアミン基間でのイミノ結合の形成等）を介する方法を使用してもよい。
【００１７】
本発明で使用するクラスＩＩ−Ｓ制限酵素は、基質の認識配列（４〜７ｂｐ）に結合するが、その部位を切断せずに外側の切断部位（１〜２０ｂｐ下流）を切断する制限酵素である。代表的なものとして、ＢｂｖＩ、ＢｃｅｆＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＥｃｉＩ、Ｅｃｏ５７Ｉ、ＦｏｋＩ、ＧｓｕＩ、ＨｐｈＩ、ＭｂｏＩＩ、ＲｌｅＡＩ、Ｔｔｈ１１１Ｉ等が挙げられるが、本発明では、特にＦｏｋＩが好適に用いられる。ＦｏｋＩは、ＧＧＡＴＧ配列を認識し、その下流９／１３位を切断する。従って、前記認識配列とその切断部位との間の配列は、そのままに残される。図１では、ＦｏｋＩの認識配列、すなわちＧＧＡＴＧとその相補的配列との２本鎖ＤＮＡ部分はＳｆｏｋＩで示される。
【００１８】
本発明に係る２本鎖ＤＮＡにおいて、転写調節因子の認識配列は、前記制限酵素の認識配列と切断部位との間、もしくは切断部位上に介在するように配置される。図１の２本鎖ＤＮＡ３では、転写調節因子の認識配列はＳｒで表わされ、ＦｏｋＩの認識配列ＳｆｏｋＩと後述する蛍光標識された配列Ｓｐに挟まれて存在する。図中、転写調節因子（ＦｏｋＩ）の切断部位は、上下の矢印で表示された箇所である。
【００１９】
前記転写調節因子の認識配列は、本発明で用いられる（標的とする）転写調節因子が結合する配列であり、転写調節因子が与えられれば、自ずと決まってくる。また、前記転写調節因子については、特に制限はなく、既述したＮＦ−κ、ＮＦ−ＩＬ６、ＣＲＥＢ、ＣＢＰ、ＡＰＩ等が挙げられ、その中から所望のものを選択する。図１のＳｒとしては、ＡＰＩの認識配列が例示されている。
【００２０】
蛍光標識された配列は、該配列のいずれかの位置が蛍光標識されているものであればよく、その塩基長および含まれる塩基の種類については特に制限はない。また、蛍光標識の位置も同様に制限はないが、２本鎖ＤＮＡの末端（３'−末端または５'−末端のいずれかであるが、固体担体と反対側）であることが好ましい。蛍光標識に用いられる蛍光色素は、ローダミンまたはフルオレセイン等、蛍光標識の常法で用いられる公知の色素である。図１では、Ｓｐとして蛍光標識された配列が例示されているが、この特定の配列の開示は、単に例示の目的のためだけである。また、図中、蛍光標識は、模式的に「★印」で示されている。
【００２１】
これら前記の配列、すなわちクラスＩＩ−Ｓ制限酵素の認識配列（ＳｆｏｋＩ）と、転写調節因子の認識配列（Ｓｒ）と、前記クラスＩＩ−Ｓ制限酵素の切断部位と、蛍光標識された配列（Ｓｐ）とが直列に、連結されて本発明に係る２本鎖ＤＮＡ３を構成する。ここで、それぞれの配列または部位間は、他の配列を介するか、介せずに固体担体２側からこの順序で直列に、連結されている。特に、本発明を実施するにあたり、前記転写調節因子の認識配列が前記クラスＩＩ−Ｓ制限酵素の切断部位に出来るだけ接近して配置されている（含んでいてもよい）必要があり、そのため必要ならば、任意の塩基対からなる他の配列を該転写調節因子の認識配列の上流側に連結する。クラスＩＩ−Ｓ制限酵素の認識配列も好ましくは、任意の塩基対からなる他の配列を介して固定担体に固定化される。例えば、図１ではクラスＩＩ−Ｓ制限酵素の認識配列ＳｆｏｋＩと固定担体２との間には、数塩基対からなる配列が介在する。さらに、ＳｆｏｋＩとＳｒ、およびＳｒとＳｐとの間にも、数塩基対からなる配列が介在する。これらの介在配列は、該クラスＩＩ−Ｓ制限酵素の認識配列、および前記転写調節因子の認識配列と一致しない配列とする。
【００２２】
本発明の蛍光プローブを作製するには、公知のオリゴヌクレオチド合成方法が採用される。まず、そのＤＮＡ結合を検出すべき標的転写調節因子が特定されれば、該転写調節因子との適当な組み合わせをつくるクラスＩＩ−Ｓ制限酵素を選択する。この組み合わせに基づいて、前記該転写調節因子の認識配列およびクラスＩＩ−Ｓ制限酵素の認識配列が決定される。さらに、適当な塩基長の蛍光標識された配列を選択する。それらに加えて、所望ならば、1つまたは複数の前記介在する配列を適宜、選択する。このようにして、本発明に係る２本鎖ＤＮＡを構成する上記すべての要素についての塩基情報が明らかになれば、当業者は容易に、該２本鎖ＤＮＡの１本鎖ＤＮＡ部分を設計できる。前記１本鎖ＤＮＡ部分の合成は、常法に従い、ＤＮＡ自動合成機を用いて実施する。さらに、この１本鎖ＤＮＡの５’−末端に固定担体への固定化に必要な、結合基（例えば、前述のビオチン）を付加する。一方、前記１本鎖ＤＮＡの３’−末端部分にハイブリダイズする適当な長さのオリゴヌクレオチドを合成する。１本鎖ＤＮＡを鋳型とし、前記オリゴヌクレオチドをプライマーとして、ＤＮＡポリメラーゼを用いて２本鎖ＤＮＡを合成する。これら一連の操作は、当業者には公知である。なお、２本鎖ＤＮＡの鎖長は、必須のすべての配列および要素を収容できる長さであれば、特に制限はない。
【００２３】
２本鎖ＤＮＡ３を合成後、その末端を固体担体２に固定化すると、本発明の蛍光プローブ１が得られる。図１に示す本発明の好適な実施例に従うなら、固定担体２は、固定化のために、例えばアビジン（またはストレプトアビジン）で予めコートされている。
【００２４】
本発明の第２の側面に従えば、上記の蛍光プローブを用いて、転写調節因子とＤＮＡの結合を検出する方法が提供される（以下、本発明のＤＮＡ結合検出方法ともいう）。この検出方法は、要約すると、（１）転写調節因子を含む試料に本発明の蛍光プローブを添加する第１の工程と、（２）第１の工程で得られた混合液を、転写調節因子が、蛍光プローブに結合するのに充分な時間、反応させる第２の工程と、（３）第２の工程で得られた反応混合液に、クラスＩＩ−Ｓ制限酵素を添加する第３の工程と、（４）クラスＩＩ−Ｓ制限酵素の作用により蛍光プローブが切断されて、該蛍光プローブから蛍光標識が遊離するか否かを該蛍光標識の蛍光を測定することにより判定する第４の工程と、（５）第４の工程の判定結果に基づいて、前記転写調節因子が、本発明の蛍光プローブに結合したか否かを決定する第５の工程とを含む。
【００２５】
まず、上記第１の工程は、標的とする転写調節因子を含むか、または含むと疑われる試料溶液を用意することから始まり、ここで「試料」とは、その後の工程（すなわち、処理操作）に悪影響及ぼさない限り、その濃度、形態等については、特に制限はない。好適な試料として、生体試料（臨床検体および細胞診検体）が挙げられる。次に、試料を本発明の蛍光プローブに添加する。この工程では、逆に本発明の蛍光プローブを試料に添加してもよい。蛍光プローブの形態についても特に、限定はないが溶液状態であることが好ましい。
【００２６】
上記第２の工程では、第１の工程で得られた混合液を、適当な、ＤＮＡ結合反応可能な条件で反応させる。反応条件は、標的とする転写調節因子によって異なるが、通常、室温で約１５分間〜１時間程度、反応させればよい。次いで、上記第３の工程で、選択されたクラスＩＩ−Ｓ制限酵素を添加する。添加後、本発明の蛍光プローブが前記制限酵素と相互作用するのに充分な時間、両者を接触させる。
【００２７】
上記第３の工程で、前記クラスＩＩ−Ｓ制限酵素の作用により、蛍光プローブから蛍光標識が遊離するか否かを判定する。この判定は、該蛍光標識の蛍光を測定することによって行われる。詳しくは、前記第２の工程で、本発明の蛍光プローブ中の標的とする転写調節因子の認識配列に、転写調節因子が結合する場合（試料に標的転写調節因子が存在する場合にもあたる）と、蛍光プローブ中の標的転写調節因子の認識配列に転写調節因子が結合しない場合（試料に標的転写調節因子が存在しない場合、或いは存在しても該結合を阻害する要素および要因がある場合にもあたる）の二通りがある。それぞれの場合について、反応機構および反応の結果を模式的に説明したものが図２である。前者の場合を図中、左側（ａ）に示し、後者の場合を右側（ｂ）に示す。まず、本発明の蛍光プローブにおいて、転写調節因子の認識配列に転写調節因子が結合している（転写調節因子の結合がある）とき、クラスＩＩ−Ｓ制限酵素（例えば、ＦｏｋＩ）がその認識配列（ＳｆｏｋＩ）に結合しても、該転写調節因子による認識配列（Ｓｒ）への結合による立体的な障害のために、制限酵素がその切断部位に接近できないか、接近しにくくなる。この場合、制限酵素が前記切断部位（すなわち、２本鎖ＤＮＡ）を切断できず、従って、蛍光標識は２本鎖ＤＮＡに標識されたままである。結果として、蛍光プローブから蛍光標識が遊離することはない。図２（ａ）中、５は転写調節因子の分子を、６はＦｏｋＩを表わす。その他ＳｆｏｋＩおよびＳｒについては、図１と同じ意味で使用する。
【００２８】
一方、本発明の蛍光プローブにおいて、転写調節因子の認識配列に転写調節因子が結合していないとき、ＦｏｋＩがその認識配列に結合すると、前記のような立体的な障害がないので、その切断部位に自由に接近できる。この場合、制限酵素による通常の切断がみられ、２本鎖ＤＮＡが切断部位で切断されることになる。従って、蛍光標識４は２本鎖ＤＮＡ３から開裂され、結果として、蛍光プローブから蛍光標識が遊離する。
【００２９】
本発明のＤＮＡ結合検出方法を実施するとき、蛍光プローブから遊離した蛍光標識は、反応溶液中に存在するので、固体担体の蛍光プローブから上澄み液として容易に分離され、そのまま該溶液の蛍光測定を行うことによって、遊離した蛍光標識が存在するか否か判定できる。
【００３０】
次の第５の工程において、上記の判定結果に基づいて、例えば、図２（ａ）に示されるような場合、転写調節因子と蛍光プローブとの結合があり、と決定される。逆に、図２（ｂ）に示されるような場合、転写調節因子の蛍光プローブへの結合がなし、と決定される。「結合があり」と決定された場合、本発明のＤＮＡ結合検出方法にさらに該ＤＮＡ結合の強度を評価する工程を第５の工程に続いて含めることができる。この目的で、例えば、スキャッチャードプロット（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ  ｐｌｏｔ）解析を用いて、特定の転写調節因子と本発明の蛍光プローブ間の親和性をさらに調べることも可能となる。このような実施の形態は、実施例３に記載されている。
【００３１】
また、別の実施の形態として、特定の転写調節因子のアンタゴニスト、またはアゴニストの可能性のある薬剤の存在下、本発明のＤＮＡ結合検出方法を行い、前記「結合の有無」を決定し、或いはさらにその結合の強度を評価することも可能である。具体的には、上記第１の工程で、試験薬剤を試料に加えて、本発明の結合検出方法に含まれる各工程を実施すればよい。この方法は、前記アンタゴニスト、またはアゴニストのスクリーニングとして、有用である。
【００３２】
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって制限されるものではない。
【００３３】
【実施例】
（実施例１）  蛍光プローブの作製
１．１  １本鎖ＤＮＡ部分の合成
蛍光プローブの２本鎖ＤＮＡを構成する１本鎖ＤＮＡ部分として、下記のビオチン化オリゴヌクレオチドを合成した。
0004398062.tif 000002
（配列表の配列番号１に記載）
前記式中、下線部を付した配列部分は、それぞれＳｆｏｋＩ（ｆｏｋＩの認識配列）、Ｓｒ（転写調節因子ＡＰ１の認識配列）、Ｓｐ（下記の蛍光標識されたプライマーに相補的な配列）を表わし、ＦｏｋＩの１本鎖ＤＮＡ上での切断部位は、５’末端から１８位のＣと１９位のＡの間である。
【００３４】
さらに、次の工程で使用する蛍光標識された配列として下記のオリゴヌクレオチドを合成した。
(fluorescein)-5'-CTAAGTGCAG-3'
（配列表の配列番号３に記載）
前記２つのオリゴヌクレオチドの合成は、ＤＮＡ自動合成機（アプライド・バイオシステム社製 392 DNA/RNA Synthesizer）を用いて、常法に従い、行った。
【００３５】
１．２  ２本鎖ＤＮＡの合成
１．１で合成した１本鎖ＤＮＡ部分を鋳型として、また蛍光標識された配列をプライマー（ＦＡＭプライマー）として用い、２本鎖ＤＮＡの合成を行った。ポリメラーゼ反応には、下記の組成を有する反応溶液を使用した。
２本鎖ＤＮＡ（鋳型）  ２５ｐｍｏｌ／μｌ               １μｌ
ＦＡＭプライマー      ２５ｐｍｏｌ／μｌ               １μｌ
５ＸＴ７Sequenase Buffer                              １０μｌ
ｄＮＴＰ mixture                                        １μｌ
滅菌水                                                ３６μｌ
全液量                                                ４９μｌ
まず、反応溶液を６５℃で２分間、熱変性処理し、次いで室温で１０分間アニールした。その後、反応溶液に５倍希釈したＴ７Sequenase（USB社製）１μｌを加え、３７℃で１時間、保ち２本鎖ＤＮＡを合成した。
【００３６】
１．３  ２本鎖ＤＮＡの固定化
本実施例では、固体担体として、表面をアビジンでコートした磁気ビーズ（DynabeadsM280）を使用した。１．２で合成した２本鎖ＤＮＡを含む溶液に２５μｌのDynabeadsM280を加え、室温で１０分間、振蘯し、DynabeadsM280に２本鎖ＤＮＡを固定化した。得られた混合物に２倍希釈のbinding and washing bufferをさらに７５μｌ加えて、振蘯した。この混合物から、２本鎖ＤＮＡを固定化した磁気ビーズを磁性粒子濃縮ユニット（ＭＰＣ）を使用して回収した。ここで、反応液を捨て、新たに１５０μｌのbinding and washing bufferを加えて、同様に振蘯して、２回洗浄をおこなった。次いで、滅菌水で、また同様に２回洗浄をおこなった。洗浄終了後、磁気ビーズを２５μｌの滅菌水に分散して、蛍光プローブ調製液である磁気ビーズ分散液を得た。
【００３７】
（実施例２）  転写調節因子の蛍光プローブへの結合検出
２．１  転写調節因子の結合化
本実施例では、転写調節因子としてＡＰ１（ｒｈ−ｊｕｎ）(Promega社製)を使用した。１．３で得られた磁気ビーズ分散液から結合試験用の基液を調製し、これに以下の組成を有するＡＰ１溶液を添加して、ＡＰ１を含む結合反応溶液を調製した。また、前記基液は、そのままＡＰ１を含まない反応溶液（対照溶液）として結合試験に使用した。それぞれの溶液の組成を下記に示す。
ＡＰ１溶液
ＡＰ１ １０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＣＯＯＨ ｐＨ７．５中        １０μｌ
ｐｏｌｙ（ｄＩ−ｄＣ）［注］ ０．１ｍｇ／ｍｌ           １μｌ
全液量                                                １１μｌ
［注］(アマシャム・ファルマシアバイオテク社製)
結合試験用の基液（対照でもある）
２本鎖ＤＮＡ固定化ビーズ                              ２５μｌ
１０ＸＦｏｋＩ緩衝液                                    ５μｌ
０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ                                  ５μｌ
ｐｏｌｙ（ｄＩ−ｄＣ）    ０．１ｍｇ／ｍｌ              ４μｌ
全液量                                                ３９μｌ
ここで、上記１０ＸＦｏｋＩ緩衝液は、５０ｍＭ ＫＣＯＯＨ、１０ｍＭ ＭｇＣＯＯＨ、１ｍＭ ＤＴＴ、および２０ｍＭ ＴｒｉｓＣＯＯＨ／ｐＨ７．９からなる。
【００３８】
上記ＡＰ１溶液［poly(dI-dC)で非特異的結合を抑制］に結合試験用の基液を加えて、室温で、３０分間、振蘯した。混合物を室温で、１０分間さらに放置した。この処理によりＡＰ１とＡＰ１認識配列との結合反応が平衡化する。
【００３９】
２．２  制限酵素処理
２．１で得られたＡＰ１を含む結合反応溶液にＦｏｋＩ（０．５μｌ，１ｕ／μｌ）を添加して、３７℃で３０分間、振蘯し、さらに１０分間放置した。放置後、上澄み液を採取し、蛍光を測定した。蛍光測定は、以下のように実施した。
【００４０】
すなわち、ＦｏｋＩ処理後、磁気ビーズをＭＰＣユニットで凝集させ、ガラスキャピラリー(Drummond Science Co.製Microcap 50)に毛管現象を利用して上澄みを充填した。この上澄み液を充填したキャピラリーを倒立蛍光顕微鏡（Olympus社製LX70,対物レンズUplanFl 10x)のステージに置き、透過光像により焦点を合わせた後、ＣＣＤカメラと画像解析装置(浜松ホトニクス社製C2400-77、Argus50)を用いて蛍光像を撮影した。この蛍光像の中央に100x100の窓を切って、その領域内で積算された光子数を蛍光強度とした。また、蛍光強度から分子数への換算が必要な場合は、濃度が既知である蛍光標識プライマーＤＮＡを希釈し、同様の手順で測定することにより、蛍光強度から蛍光分子モル濃度への換算を行った。
【００４１】
対照溶液にＦｏｋＩ（０．５μｌ，１ｕ／μｌ）を添加し、全く同様に、蛍光測定を実施した。
【００４２】
蛍光測定の結果、後者の上澄み液（ＡＰ１を含まない系）では、蛍光標識からの強い蛍光が確認されたが、前者の上澄み液（ＡＰ１を含む系）では、弱い蛍光しか確認されなかった。このように、ＡＰＩの存在、非存在下における制限酵素処理後の上澄み液から得られる蛍光に有意差が認められた。この結果からＡＰ１を含む結合反応溶液では、ＦｏｋＩによって２本鎖ＤＮＡがほとんど切断されず、蛍光標識（すなわち、蛍光標識を含む配列）の溶液中への遊離が少なかったことが分かる。一方、ＡＰ１を含まない対照溶液では、ＦｏｋＩによって２本鎖ＤＮＡが切断され、蛍光標識が溶液中に遊離したことが分かる。
【００４３】
さらに、制限酵素との反応時間を検討する目的で、ＦｏｋＩとの処理時間を変化させて、得られる上澄み液の蛍光強度を測定し、比較した。
【００４４】
実験および蛍光測定条件は、処理時間を、０、１、３、１０、３０（上記）、６０分間と設定した以外は、上記のとおりであった。結果を図３に示す。図中、ＡＰ１（-）−ＡＰ１（+）は、ＡＰ１を添加した溶液と対照溶液との蛍光強度の差であり、ＡＰ１によるＦｏｋＩ酵素活性阻害（見かけ）を表わす。図３の結果は、上述したＡＰ１の存在による、蛍光の有意差を明瞭に示し、３０分もしくは６０分の処理時間が、選択した処理時間のなかでは、至適であることが分かった。
【００４５】
（実施例３）  転写調節因子の特異的結合および非特異的結合試験
本実施例でも、転写調節因子としてＡＰ１（ｒｈ−ｊｕｎ）を使用して、その認識配列への特異的結合、および認識配列を含まない他の配列への非特異的結合を比較検討した。実施例１で作製したＡＰ１の認識配列を含む固定化２本鎖ＤＮＡ（ここで、テンプレートＡＰ１という）を使用し、ＡＰ１の濃度を変化させて実施例２に記載した結合試験を繰り返した。比較対照として、ＡＰ１の認識配列を含む１３塩基対の配列において、それに対応する部分がランダムである、不特定の１３塩基対の配列を含む固定化２本鎖ＤＮＡ（ここで、テンプレートＮ１３という）を使用し、ＡＰ１の濃度を変化させて実施例２に記載した結合試験を繰り返した。テンプレートＮ１３の塩基配列を配列表の配列番号４に示す。これらの結合試験の結果をプロットしたものが図４である。測定された上澄み液の蛍光強度は、ＡＰ１の各プレートへの結合量に反比例する。図中、テンプレートＡＰ１に結合したＡＰ１の総結合量は、ＡＰ１の特異的および非特異的結合の合計であり、一方、テンプレートＮ１３に結合したＡＰ１の結合量は、ＡＰ１の非特異的結合量に対応する。
【００４６】
図４に示されたデータを基に、さらに演算を施し、ＡＰ１の特異的結合量（相対）を求めて、ＡＰ１の濃度に対してプロットしたものが図５である。
【００４７】
図５の結果に基づいて、スキャッチャードプロット（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ  ｐｌｏｔ）解析を行った結果を図６に示す。プロットの勾配からＫｄ値は、約１０ｎＭと算出され、文献に報告されているゲルシフト方法［Glenn J. Foulds and Felicia A. Etzkorn (1998) Nucleic Acids Res.,26, 4304-4305］から得られたＡＰ１のＫｄ値（３５ｎＭ±４ｎＭ）と近い数値であった。また、プロットの勾配が直線であることから、結合部位はただひとつであると確認された。
【００４８】
【発明の効果】
本発明の蛍光プローブは、固体担体と、該固体担体に一端で固定化された、標的とする転写調節因子の認識配列を含む２本鎖ＤＮＡとからなるので、アキレス・ヒール開裂法の問題点をすべて解消する。特に、転写調節因子とＤＮＡの結合を比較的容易に平衡化しうるので、結合検出の評価の信頼性が高くなる。
【００４９】
また、本発明の蛍光プローブにおいて固定担体として、磁気ビーズを用いるとＤＮＡ結合検出の際、洗浄等の操作工程が非常に簡便になる。
【００５０】
本発明のＤＮＡ結合検出方法は、メチル化酵素を使用していないので、工程が簡略化され、しかも結合の検出がメチル化酵素と転写調節因子との競合阻害によらず、そのためＤＮＡ結合がより直接的に検出できる。
【００５１】
本発明のＤＮＡ結合検出方法は、検出反応の結果、遊離する蛍光標識からの蛍光を測定することによって行うので、検出手法が簡便であり、結合そのものの検出のみならず、結合の強度（親和性）も定量的に評価できる。
【００５２】
本発明のＤＮＡ結合検出方法は、癌細胞が産生する転写調節因子を識別できるので、試料細胞が癌細胞であるか、正常細胞であるかの検定に用いることもできる。
【００５３】
【配列表】
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0004398062.tif 000004
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の蛍光プローブの一例を構成的に示す図である。図中、ＳｆｏｋＩは、ＦｏｋＩの認識配列ＧＧＡＴＧを表わし、Ｓｒは、転写調節因子ＡＰ１の認識配列を表わし、Ｓｐは蛍光標識された配列を表わす。
【図２】本発明のＤＮＡ結合検出方法を段階毎に、かつ模式的に示した説明図である。図中、（ａ）は標的とする転写調節因子の結合のある場合、（ｂ）は標的とする転写調節因子の結合のない場合を示す。
【図３】制限酵素ＦｏｋＩとの処理時間の最適化を図る試験の結果をプロットしたグラフである。図中、縦軸は蛍光強度（任意単位）、横軸はＦｏｋＩとの処理時間を表わす。また、ＡＰ１（+）は、ＡＰＩを添加した系を、ＡＰ１（-）は、ＡＰＩを添加しなかった系（対照）を表わし、ＡＰ１（-）−ＡＰ１（+）は、ＡＰ１によるＦｏｋＩ酵素活性阻害（見かけ）に対応する。
【図４】本発明のＤＮＡ結合検出方法を応用して、転写調節因子ＡＰ１とテンプレートの結合を評価した結果をプロットしたグラフである。図中、縦軸は蛍光強度（任意単位）、横軸はＡＰ１の濃度を表わす。「◇」はテンプレートＡＰ１を用いた試験の結果の表示であり、ＡＰ１の総結合量に対応し、「□」はテンプレートＮ１３を用いた試験の結果の表示であり、ＡＰ１の非特異的結合量に対応する。
【図５】転写調節因子ＡＰ１のテンプレートに対する特異的結合量とＡＰ１の濃度の関係を示すプロットである。図中、縦軸は蛍光強度（任意単位）、横軸はＡＰ１の濃度を表わす。
【図６】スキャッチャードプロットである。図中、縦軸は結合ＡＰ１と遊離ＡＰ１との比、横軸は結合ＡＰ１の濃度を表わす
【符号の説明】
１・・・蛍光プローブ、２・・・固体担体、３・・・２本鎖ＤＮＡ、４・・・蛍光標識、５・・・転写調節因子、６・・・制限酵素ＦｏｋＩ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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