(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
内部に集積的に形成された１以上のチャネルを持つ基板と、
基板の外表面の１以上の出口と外部の分析及び／又は収集システムの１の入口との間の間隙を移動する液滴、スプレイまたは流体の流れによって前記１以上のチャネル内を移動する微少量の液体試料を前記基板を離れて移送するように、１以上の出口が構成された、前記基板の外表面の１以上の出口を終点とする前記１以上のチャネルと、
前記微少量の液体試料を受けるための前記基板の前記１以上の出口に近いが前記１以上の出口とは分離して配置された前記入口を有する前記外部の分析及び／又は収集システムからなることを特徴とする微量液体処理システム。
【請求項２】
前記１以上のチャネルは、前記１以上の主平面を横断することを特徴とする請求項１の微量液体処理システム。
【請求項３】
前記基板は、前記基板の単一の主平面に含まれた複数のチャネルを備えることを特徴とする請求項１の微量液体処理システム。
【請求項４】
前記基板は、複数の平行な前記主平面を備え、それぞれが複数の前記チャネルを含んでいることを特徴とする請求項３の微量液体処理システム。
【請求項５】
前記１以上の出口の少なくとも１つは、前記１以上のチャネルの１つを通る第２の平行な主平面とは異なる前記基板の第１の主平面に配設されていることを特徴とする請求項１の微量液体処理システム。
【請求項６】
前記基板は、光学グレード材料であることを特徴とする請求項１の微量液体処理システム。
【請求項７】
前記基板は、非導電性材料であることを特徴とする請求項１の微量液体処理システム。
【請求項８】
前記基板は、導電性材料であることを特徴とする請求項１の微量液体処理システム。
【請求項９】
くぼみが、隣接する出口間の前記外表面内で仕切られることを特徴とする請求項１の微量液体処理システム。
【請求項１０】
前記基板の前記外表面がぬれていない表面であることを特徴とする請求項１の微量液体処理システム。
【請求項１１】
２以上の前記出口からなり、前記２つの出口間の前記基板の表面の一部がくぼんでいることを特徴とする請求項１の微量液体処理システム。
【請求項１２】
前記１以上の出口が前記１以上のチャネルの先をとがらすことにより形成されることを特徴とする請求項１の微量液体処理システム。
【請求項１３】
前記基板中の２以上のチャネルからなり、２つの前記チャネルが１以上の出口の１つで終わることを特徴とする請求項１の微量液体処理システム。
【請求項１４】
前記１以上のチャネル中に試料を送入する手段から更になることを特徴とする請求項１の微量液体処理システム。
【請求項１５】
前記１以上のチャネルに隣接する前記基板の領域は、微量液体試料における試料の化学構造解析または微小調整または分析操作を行うために、および前記１以上のチャネル中に前記領域から液体試料を移送するために適用されることを特徴とする請求項１の微量液体処理システム。
【請求項１６】
前記基板が、前記基板に取り付け、前記１以上のチャネル中に液体を移送するために適合する貯蔵器または入口を更に備えることを特徴とする請求項１の微量液体処理システム。
【請求項１７】
前記基板が、液体試料を導くために内部に集積的に形成された１以上の第１チャネル、および追加の流体を導くための１以上の第２のチャネルを備えることを特徴とする請求項１の微量液体処理システム。
【請求項１８】
前記１以上の第２チャネルが、共通出口で１以上の前記第１チャネルに収斂することを特徴とする請求項１７の微量液体処理システム。
【請求項１９】
前記１以上の出口が前記基板に集積的に作られたことを特徴とする請求項１の微量液体処理システム。
【請求項２０】
前記１以上の出口が前記基板とは別個に作られ、前記チャネルの終端に取り付けられたことを特徴とする請求項１の微量液体処理システム。
【請求項２１】
前記外部の分析および／または収集システムが外部の質量分析システムであることを特徴とする請求項１の微量液体処理システム。
【請求項２２】
前記基板を離れる微量の液体試料の前記移送がエレクトロスプレイ・イオン化によることを特徴とする請求項１の微量液体処理システム。
【請求項２３】
前記外部の分析および／または収集システムは１以上の収集システムであることを特徴とする請求項１の微量液体処理システム。
【請求項２４】
前記１以上の出口の周囲の前記基板の表面の一部が、前記１以上の出口から出る前記液体試料による表面のぬれを防止するための材料で被われることを特徴とする請求項１の微量液体処理システム。
【請求項２５】
前記基板が表面がぬれない材料であることを特徴とする請求項１の微量液体処理システム。
【請求項２６】
前記出口が金属被覆されていることを特徴とする請求項１の微量液体処理システム。
【請求項２７】
前記１以上のチャネルの１つの内部表面が前記基板とは異なる材料で被覆されていることを特徴とする請求項１の微量液体処理システム。
【請求項２８】
基板を備え、前記基板には１以上のチャネルが集積化され、前記１以上のチャネルは前記基板の外表面の１以上の出口を終点としている微量液体処理システムを提供し、前記微量液体処理システムが、入口を有する外部の分析及び／又は収集システムを更に備えるステップと、
前記基板内の前記１以上のチャネルの１つに液体試料を供給するステップと、
前記チャネル内で前記液体試料を前記１以上の出口の一つの方向に移動させるステップと、
前記チャネルの前記１以上の出口を通して前記基板から前記液体試料を吐出させ、そして前記基板を離れて液滴、スプレイまたは流体の流れによって前記液体試料を移送させ、前記１以上の出口と前記外部の分析及び／又は収集システムの入口との間の間隙を前記液体試料を移動させ、前記入口が前記１以上の出口に近いが前記１以上の出口とは分離するように配置されるステップと、
を備えることを特徴とする微少量の液体を処理するための方法。
【請求項２９】
前記外部の分析および／または収集システムが質量分析器であり、また前記液体試料がエレクトロスプレイ・イオン化により前記質量分析器に移送させることを特徴とする請求項２８の方法。
【請求項３０】
前記液体試料が、空気圧または超音波噴霧化により前記外部の分析および／または収集システムへの移送をさせることを特徴とする請求項２８の方法。
【請求項３１】
前記外部の分析および／または収集システムが質量分析器であり、また前記液体が化学イオン化により前記質量分析器に移送させることを特徴とする請求項２８の方法。
【請求項３２】
前記液体試料が、マトリクス支援レーザー脱離イオン化によって前記外部の分析および／または収集システムへの移送をさせることを特徴とする請求項２８の方法。
【請求項３３】
前記外部の分析および／または収集システムがレーザー誘起蛍光による検出用であることを特徴とする請求項２８の方法。
【請求項３４】
前記液体を前記基板から吐出させる前記ステップにおいて、前記微量液体処理システムが前記外部の分析および／または収集システムとの関係において固定されていることを特徴とする請求項２８の方法。
【請求項３５】
前記液体を前記基板から吐出させる前記ステップにおいて、前記微量液体処理システムが前記外部の分析および／または収集システムとの関係において移動することを特徴とする請求項２８の方法。
【請求項３６】
前記液体を前記基板から出すことを生じる前記ステップに先行して、前記液体試料または前記液体試料の成分が前記チャネル内で検出されることを特徴とする請求項２８の方法。
【請求項３７】
前記基板が更に液体試料を前記試料の成分に分離するためのデバイスを備え、前記方法が更に前記試料を前記試料の成分に分離するステップからなることを特徴とする請求項２８の方法。
【請求項３８】
液体試料を前記試料の成分に分離するための前記デバイスが、前記基板内に集積されていることを特徴とする請求項３７の方法。
【請求項３９】
液体試料を前記試料の成分に分離するための前記デバイスが、前記基板に取り外し可能に結合されていることを特徴とする請求項３７の方法。
【請求項４０】
前記１以上のチャネルの前記１つは液体試料を前記試料の成分に分離するための前記デバイスからなることを特徴とする請求項３７の方法。
【請求項４１】
前記基板が試料の温浸を生じさせるためのデバイスを更に備え、前記方法が前記試料を温浸するステップから更になることを特徴とする請求項２８の方法。
【請求項４２】
前記基板が試料を脱塩するためのデバイスを更に備え、前記方法が前記試料を脱塩するステップから更になることを特徴とする請求項２８の方法。
【請求項４３】
前記基板が試料を予備濃縮するためのデバイスを更に備え、前記方法が前記試料を予備濃縮するためのステップから更になることを特徴とする請求項２８の方法。
【請求項４４】
前記基板が試料に親和力結合するためのデバイスを更に備え、前記方法が前記試料を親和力結合するステップから更になることを特徴とする請求項２８の方法。
【請求項４５】
前記基板が試料をサイズ排除クロマトグラフィーするためのデバイスから更になり、前記方法が前記試料をサイズ排除クロマトグラフィーするステップから更になることを特徴とする請求項２８の方法。
【請求項４６】
前記基板が液体試料を導入するために内部に集積的に形成された１以上の第１のチャネルと追加流体を導入するための１以上の第２のチャネルを有することを特徴とする請求項２８の方法。
【請求項４７】
前記基板内において、前記１以上の第２チャネルが共通出口で１以上の前記第１チャネルに収斂することを特徴とする請求項４６の方法。
【請求項４８】
前記基板中の前記１以上の第２チャネルが前記微少量の液体試料に加えられた追加の流体を導き、前記追加の流体がシース流体として機能することを特徴とする請求項４６の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
この発明は、微量流体処理システムに関し、特に微小デバイス内に組み込まれたその様なシステムに関する。
発明の背景
微細組立技術における近年の発展は、生化学的分析用の微小な小型ツールを小さなデバイス内に集積化することを可能にしている。完全な化学処理システム、例えば反応チャンバ、分離用毛細柱およびそれらに関連した電極貯蔵器は、ある種の検出器と同様に、例えばガラスまたは融合シリカの微小チップ上に合体させることができる。その様な、”チップ上の研究室”は、原則として、微小量の材料の効果的な利用または操作を可能とする。意図した処理が導入された後に、処理された化合物は、更なる分析操作を遂行するために都合の良い空間的に集中した形態のチップ上で利用可能になる。試料成分の体積はナノリットルのオーダーであるため、連続する操作は好ましくは同じデバイス内で遂行されるべきである（例えば、Effenhauser et al., Anal. Chem. 67:2284-2287, 1995を参照のこと）。この強制は、しかしながら、質量分析器のようなある種の強力な分析器具の効果的な利用をそれほど許容しない。
発明の要約
この発明は、ナノリットルまたは他の微少量の流体試料を、微細組立チップのような微小デバイスの空間的に集中した環境から、”オフチップ”の分析または収集デバイスに向けて、試料体積を増加させることなく効果的に移送することを許容する微量流体処理システムを指向している。この発明の流体処理システムは、１以上の毛細柱の形態のチャネルとして本体または基板内に組み立てられる。前記基板は、シリカやポリマープラスチックのような適切な非導電性材料、またはステンレススチールや貴金属のような適切な導電性材料、またはシリコンのような半導体材料から製造される。この発明の微小デバイスは、適用された試料に対する連続したまたは同時の分析または収集をオフチップで行うために、前記１以上のチャネルの端部に整合した１以上の出口を有する。この出口は、例えば、エレクトロスプレイ質量分析法による分析（ＥＳＩ／ＭＳ）のために、大気圧−化学イオン化質量分析法による分析（ＡＰＣＩ／ＭＳ）のために、マトリクス支援レーザ脱離イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ／ＭＳ）のために、核磁気共鳴分析（ＮＭＲ）のために、圧搾空気式または超音波式に支援されたスプレイ試料処理のために、電気化学、導電性、またはレーザ誘起蛍光のオフチップ検出システムに移送するために、あるいは例えば収集毛細柱内または収集膜上の特殊な破片の収集のために、試料を移送するように構成される。試料の移送は、小滴、スプレイ（噴霧）または流れ、あるいは望まれるときは、移送された試料を受ける器具またはデバイスにとって都合の良い手法で行われる。移送される流体は、液体または気体の形態をとる。
微小デバイスの前記チャネルは、流体試料に対する連続したまたは同時の処理を許容するためのどのような形態でも良い。この発明の１つの実施例では、前記チャネルは空間的に離れた形態に配列され、各チャネルはそれぞれの試料の導入部と出口を有する独立した微小分析システムを代表する。他の実施例では、微小デバイスの前記チャネルは、環状パターンに配列され、全てのチャネルは、前記微小デバイスの１つの表面に集積的に形成された１つの出口に集中している。出口は、この出口を介して分析用の試料を受け取る質量分析器や膜のような外部デバイスとのインターフェースとして適用される。
いかなる実施例においても、各チャネルは電気接点を有し、それにより電気回路の経路がチャネルに沿って形成されるようになっている。例えば１つの電気接点はチャネルの入り口側に設けられ、そして他の１つの電気接点は出口側に設けられる。変形された配置では、チャネルの出口より外側の外部接点によって電気回路が完成される。例えば、１つのチャネルの出口が質量分析器用のエレクトロスプレイ源として使用されている場合、質量分析器のサンプリング孔は、対向電極として機能する。電気回路をチップ上の各チャネルに順番に切り換えることにより、複数の分析用試料はチップから外部に移送される。分析が終了すると、このチップは廃棄される。かくして、この発明はブラッシングのような操作を軽減し、また質量分析器やその他の分析および／または収集用のデバイスの効果的な使用を提供する時の動作過程の試料の繰り越し問題をなくすことができる。
試料は、この発明の微小デバイス上のチャネル内に種々の方法によって導入され得る。例えば、圧力、動電学的注入、または他の技術、および電流および／または圧力降下が、チャネルに沿って試料成分を移動させるために適用される。チャネルは、例えば質量分析器への流体移送用だけに機能するか、あるいはチャネルは、種々の試料操作、例えば毛細柱式電気泳動（ＣＥ）またはポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）のような微小準備または分析的操作用の環境として、あるいは、いかなるタイプの試料化学の遂行のためにも機能する。チャネルは、予備濃縮または試料の濃厚化を遂行したり、または脱塩のようなその他の処理段階のための膜やパッキング材料によって満たされる。更に、例えばチャネルの壁面に共有結合したり、あるいはチャネル内で自由である酵素によって、試料成分のその他の修正が可能である。パッキング材料は、チャネルの壁面に結合したり、あるいは磁気粒子のような他の成分を含むことができる。この磁気粒子は、磁界が適用されたときにパッキング材料をその場所に保持するためのものである。磁気粒子はまた、外部磁界を使用することにより、流体をチャネルの内側に効果的に混合させるために使用され得る。パッキング材料をその場所に保持するために、微小機械フィルタまたは他の静止構造も使用できる。その代わりに、静止構造が微小機械化されたり、鋳造されたり、またはパッキング材料の代用をする高い表面領域を提供するために、チャネルの表面に形成されたりしても良い。試料を供給する他の方法は、ハイブリッド微小機械化システムとして小型化された複数の試料ホルダをチャネルの入り口部分に取り付けることである。
試料は、チャネル内の短い開始ゾーンへ導入されたり、チャネル全体を完全に満たすことができる。チャネルの小領域だけを試料で満たすことは、電気泳動やクロマトグラフィのような試料成分のオンチップ分離が実行される場合には都合がよい。チャネル全体を試料で満たすことは、質量分析法による構造分析のために試料注入／エレクトロスプレイイオン化のような試料の長い流れを、オフチップ分析が要求する場合に有利である。
多くの場合に、液体流は、試料内のアナライト（analyte）を、特定のチャネル内に、またはチャネルの長さ方向に沿って、または出口を経由してチャネルから送り出すように、輸送することを要求される。それ故、要求される流体移送を支援するために、この発明の微小デバイスの内部にまたは関連してポンピングデバイスが使用される。例えば、試料液体の移動を果たす熱膨張を起こすために加熱素子が使用されるか、あるいは微小な気泡を生成するために加熱素子が使用される。後者の場合、気泡の膨張がチャネル内の試料の移動を生起させる。他の選択枝には、オンチップの電気分解によって生成された１もしくは複数の気体の圧力によるポンピングが含まれる。流れはまた、チャネルに沿った圧力降下により、またはチャネル内側の電気浸透によって生成される。
試料がチャネルの端部に移動すると、それらはこの発明の微小デバイスの外部において、種々の技術による検出や分析に供される。これらの技術には、質量分析、核磁気共鳴、レーザ誘起蛍光、紫外線検出、電気化学的検出などが含まれる。各チャネルの端部は、試料体積の移送を助長するように構成されたチップを備える。質量分析が解析の方法である場合、各チャネルの端部には、微小エレクトロスプレイによって質量分析器のサンプリング孔内にイオンを移送することを許容するエレクトロスプレイ出口即ちチップが、微細組立技術によって形成される。他の出口の構成は、気圧または超音波で支援されたスプレイによる試料移送用に使用される。更に、移送される試料が、液体キャリアによってチャネルに輸送された溶解した気体である場合、出口は、スプレイ移送用に液体キャリアを加熱して試料を気相に復帰させる様に構成される。チャネルの出口側端部は、エレクトロスプレイ・チップとして機能する構成および／または大きさにする。あるいは、そのチップが、チャネルの延長部として、またはチャネルへの付属物として形成される。基板の端部表面は、隣接する出口の間で凹みをつけ、汚染転移（クロス汚染）を最小にする。あるいは、基板は、湿らない材料で製造され、または化学的に湿らないように修正され、これにより外部に出て行く液体自身がエレクトロスプレイを提供できるようにする。必要であれば、微小デバイスは、移動可能なステージの上に搭載され、それにより各出口が順番に質量分析器またはその他の有用なデバイスのサンプリング孔に対し正確に配列されるようにする。
この発明は、シース（sheath）流体（例えば、液体または気体）において、または要求される分析のタイプとチャネルから出て行く試料のサイズに依存するシースレス（sheathless）・モードにおいて使用できる。シースレス構成では、出口はチャネルの端部に形成される。シース液体が要求される場合（例えば、エレクトロスプレイに先行して、またはシース液体を経由して電気的接続を提供することに先行して、液体、化学物質および／または標準液を追加するために）、出口は２つのチャネルの集中点において形成され、そして１つは試料を供給し、他の１つはシース液体を供給する。カチオン・モードおよびアニオン・モードの双方におけるアナライトの選択的分析は、電界の極性の迅速な切り換えによって容易に実行される。
異なるサイズのチャネルが同じ微小デバイス上で使用され得る。例えば、大きなチャネルは浄化操作に使用され、小さいチャネルは処理操作に使用される。更に、試料または試料の成分の化学処理、分割、分離または検出のような他の操作が、チャネルへの試料導入に先行して、デバイスの他の領域で実行される。かくして、更なる分析や収集のために試料やその成分をチップ外部に移送することに先行して、この発明のデバイス内で開始試料およびその成分の双方について試料化学を遂行し、または微小予備準備および分析操作を導入することが可能になる。加えて、試料の検出が、例えばオフチップ分析と検出用の相補的制御情報を提供できるファイバ光学的検出システムによって、またはレーザ誘起蛍光、伝導性および／または電気化学的検出器のような他の好適な検出器によって微小デバイス自体の上で遂行され得る。
この発明の微小デバイスの好適な組立方法は、それ自体当業者には良く知られたものであり、例えば、フォトリソグラフィおよびエッチング技術、レーザ加工、ステロリソグラフィのような多層組立技術、そしてスタンピング、封止（モールディング）または鋳造技術を含んでいる。
チャネルは、円筒形状、台形形状、その他の断面形状であり得る。チャネルのパターンは、単一平面において直線的または曲線線形である。更に、微小デバイスは、独立した接続されていないチャネルの複数のそのような層を含んでいる。この代わりに、個別のチャネルは、希望する入り口から希望する出口に向けて試料を移送することを可能にするために、２以上の平面の間に延びることができる。チャネルはまた、そのような移送を可能にするために、いかなる必要な長さにもなり得る。その最も基本的なものでは、チャネルは１つの入り口と１つの出口とを結合する単なる直線状のスリットである。
緩衝液貯蔵器、反応チャンバ、試料貯蔵器、および検出セルもまた、個別のチャネルに沿って組み立てられる。より複雑な構造は、積層（スタッキング）により、さもなければ２以上の微細組立デバイスの結合（アッセンブリング）により製造される。加えて、試料貯蔵器のような個別の器具ブロック、前処理または分離チャネル、および出口は、別々に微細加工され、そしてエレクトロニクスのハイブリッド集積回路を形成するのと概ね同じ手法に従って、１つの完成したシステムに組み込まれる。微細組立技術は精密であり、選択されたチャネルと出口の形状、寸法に関して高度な再現性を有する。
この発明の微量流体処理システムは、質量分析器のような強力な分析デバイスを、現在可能であることに比べて、より一層効果的に使用することを可能にする。加えて、この発明のシステムは、数多くの試料を自動分析するために好適なコスト効率に優れた廃棄可能なデバイスとして製造され得る。この微小加工のアプローチを使用することにより、質量分析法による高度のスループットが可能になる。加えて、少ない体積および量の試料の処理が促進され、そして貴重な試料と試薬の消費が低減される。適用には、スクリーニングや診断方法のように特に高度のスループットと汚染転移の最小化が要求される研究室の分析方法、および新鮮なコラムが各操作毎に要求される薬動学（ファーマコキネティックス）のような同様の他の分析方法が含まれる。
この発明の他の特徴と利点は、以下に示すこの発明の好ましい実施例の説明から、および請求の範囲から明らかにされる。
【図面の簡単な説明】
図１ａは、この発明の微量流体処理システムの一実施例の平面図である。この図では、試料移送に関連するチャネルは単一平面内で平行に配列されている。
図１ｂは、追加的なウエル延長部を示した、この発明の実施例の断面図である。
図１ｃは、付加された試料／電極ブロックを示した、この発明の実施例の断面図である。
図１ｄは、試料移送用の結合されていないチャネルの複数の層を示した、この発明の実施例の断面図である。
図１ｅは、複数平面構成のチャネルを示した、この発明の実施例の断面図である。
図２ａは、この発明の微量流体処理システムの他の実施例の平面図である。この図では、試料移送に関連するチャネルは環状に配列され、共通出口内に集中している。
図２ｂ−２ｄは、図２ａに描かれた出口の３つの異なる実施例の側面図である。
図３は、チップ中央の孔の縁部上の分離した出口に各チャネルが終結する試料移送チャネルの環状配置の他の例を示す。
図４は、この発明の他の実施例におけるチャネル配置の平面図である。この図では、出口はスプレイ部分として構成され、シース液体と共に、オフチップ試料操作用の気圧式スプレイまたはエレクトロスプレイの何れにも使用される。
図５は、複数のチャネルが１つの出口に集中した、この発明の他の実施例のチャネル配置の平面図である。
図６ａは、質量分析器に対するエレクトロスプレイ・インターフェースとして使用される図１ａの微小デバイスを模式的に示す構成図である。
図６ｂは、図６ａで指示された部分の拡大図である。
図７ａおよび７ｂは、図１ａの微小デバイスの、同じ幅および深さの２つの選択されたチャネルから０．０１ｍｇ／ｍｌのミオグロビン（２００ｎｌ／ｍｉｎ）を注入したときのエレクトロスプレイ質量スペクトルを示す。
図８ａ−８ｄは、微小デバイスの異なるチャネルからメタノール／水／酢酸（７５／２５／０．１）中に異なる試料を注入したときのエレクトロスプレイの質量スペクトルを示す。図８ａの試料は０．１ｍｇ／ｍｌのミオグロビン、図８ｂの試料は０．１ｍｇ／ｍｌのエンドルフィン、図８ｃの試料は０．１ｍｇ／ｍｌのヒト成長ホルモン、図８ｄの試料は０．１ｍｇ／ｍｌのユビクイチン（ubiquitin）である。
図９は、メタノール／水／酢酸（７５／２５／０．１）中の０．００１ｍｇ／ｍｌのミオグロビンをＥＳＩ／ＭＳ検出した時のエレクトロスプレイ質量スペクトルを示す。
図１０は、図１ａの微小デバイスからメタノール／水／酢酸（７５／２５／０．１）中に、０．０５ｍｇ／ｍｌのヒト成長ホルモンと０．０５ｍｇ／ｍｌのユビクイチンの混合物を注入したときの、前記デバイスを使用することによる検出限界の研究中に得られたエレクトロスプレイ質量スペクトルを示す。
図１１ａは、圧力を加えるシリンジ内のメタノール／水／酢酸（７５／２５／０．１）と共に、水溶液から０．０５ｍｇ／ｍｌのヒト成長ホルモンを注入したときのエレクトロスプレイ質量スペクトルを示す。
図１１ｂは、メタノール／水／酢酸（７５／２５／０．１）の溶液から直接０．０５ｍｇ／ｍｌのヒト成長ホルモンを注入したときのエレクトロスプレイ質量スペクトルを示す。
図１２ａのパートｉおよびｉｉは、ｐＨ８．２のトリス２０ｍＭ中に３０μＭのメリチンを含み、メリチン／トリプシン比率＝３００／ｌ（ｗ／ｗ）である場合の、オンチップでのメリチンのトリプチック温浸の、２つの異なる時点におけるエレクトロスプレイ質量スペクトルを示す。
図１２ｂのパートｉおよびｉｉは、ｐＨ８．２の２０ｍＭ中に２μＭのカゼインを含み、カゼイン／トリプシン比率＝６０／ｌ（ｗ／ｗ）である場合の、オンチップおよびオフチップでのカゼインのトリプチック温浸のエレクトロスプレイ質量スペクトルを示す。
図１３は、６０％のアセトニトリルと４０％のＨ2Ｏ中の短いＤＮＡ破片（２０ｍｅｒ）のエレクトロスプレイ質量スペクトルを示す。
発明の詳細な説明
この発明の微小デバイスは、オフチップでのみ利用可能な強力な分析および／または収集システムを伴う、微小反応および分離システムの集積化を可能とする。この発明の一実施例が図１ａおよび１ｂに示されている。この実施例は、一連のチャネルまたは溝を有する微小チップ基板または本体を含んでいる。これら一連のチャネルまたは溝は、ガラス本体またはチップの平坦な１つの表面に、それらに関連した試料入り口および緩衝液貯蔵器に沿って平行に配列されるように組み立てられたものである。出口は、前記チップの縁部上の、それらに対応するチャネルの端部に組み立てられる。前記チップの溝部は、チャネルを包囲するカバー板で覆われる。
図１ａを参照すると、チップ（１０）は、関連するカバー板は図示されていないが、微小チップ基板（１１）の表面を全て同じ幅および深さにエッチングした９個の平行なチャネル（１２）を有している。チャネルは、チャネル配列を最適化するために、３つの異なる長さに形成されている。各チャネル（１２）は、例えばチャネルを通して試料を注入するために、１つのチャネル内の試料に添加される異なる溶液を操作するために、そしてまた電気泳動緩衝液貯蔵器として使用するために、チャネルへのアクセスを許容する３つのウエル（１３，１４，１５）に結合されている。各ウエルは、直径１ｍｍ、深さ０．５ｍｍ、容積０．４μＬを有する。各ウエル（１３および１５）は、溝またはチャネル（１２ａ）によって、対応するチャネルに結合されている。プラスチック製の微小チューブ（図示せず）は、前記カバーの上に、且つ前記ウエルに関連して、ウエルの容積を例えば１０μＬに増加するために取り付けられる。図１ｂを参照すると、試料は、チップが試料導入の間配置される供給チューブまたはシリンジの様な便利な手段によって、カバー板（１３ｃ）の追加的なウエル延長部（１３ａ）および試料入り口（１３ｂ）を通してウエル（１３）内に導入される。
再び図１ａを参照すると、各チャネルの端部で微小チップ基板の縁部にある出口（１６）は、出口からエレクトロスプレイされる溶液を分離するために、２つの出口（１６）の間の微小チップ基板の外部表面領域（１８）上の湿らない皮膜、例えばポリジメチルシロキサンジオールを使用することにより、エレクトロスプレイ出口として機能する。図示の例では、チャネルは相互に６ｍｍ離れて配置されている。変形例として、出口を分離し、チャネル相互間の汚染転移を最小化するために、凹み（２０）が、隣接する出口（１６）間の微小チップ基板の外部表面に切り込みを入れることにより形成され得る。
図１ｃに示すこの発明の実施例では、試料／電極ブロックが、微小チップ本体に取り付けられる別体の素子として提供される。図１ｃを参照すると、本体（１１）は、前記本体の１側面に沿って配置された試料／電極ブロック（３０）を備えている。このブロック（３０）は、供給チャネル（３３）を経由して対応するチャネル（１２）の入り口の端部に接続される試料入り口（３１）を備えている。電極（３２）がブロック（３０）によって支持されている。この電極は、高電圧電力を接続するために、供給チャネル（３３）内に位置する一端と、前記ブロックの外部に位置する他端とを有する。この実施例では、内部で試料の前処理を行うために、供給チャネル（３３）はパッキング材料（３４）を含んでいる。図示のチャネル（１２）は、外部の収集または分析デバイスへ移送するための液体試料をスプレイする出口チップを形成するために、テーパ付き端部（３５）を備える。
ある種の適用のために、微小デバイス基板は、独立してチャネルには結合していない複数の層を含むように組み立てられる。図１ｄを参照すると、この発明の実施例の断面図が、図１ａに示したこの発明の実施例による単一平面内において、それぞれが複数のチャネルを表す独立したチャネル（１２ｂ），（１２ｃ）および（１２ｄ）を示している。チャネル（１２ｂ），（１２ｃ）および（１２ｄ）を含む複数の平面は、基板ブロック１１ａ内に１つの層が他の層の上に重なって積層された層を有する。各層の各チャネルは、図示のように、出口（１６ｂ），（１６ｃ）および（１６ｄ）で表されるそれ自身の出口にそれぞれ終結している。この実施例は、複数の試料のスクリーニングを高いスループットで行うためには、特に有用である。
上述した実施例では、チャネルは、概ね前記基板または本体の単一平面内に並んでいる。このチャネルはまた、図１ｅに示すような２以上の平面の間に延びることもできる。図示するように、チャネル（１２ｅ）は第１の上側平面から第２の下側平面に向けて延び、そして微小チップ基板（１１）の縁部の出口（１６ｅ）に終結している。一般的に、チャネルは、意図したチャネルのパッキング濃度と微小チップデバイスの関連する成分を許容するために、基板または本体（１１）の範囲内でどのような構成をとることもでき、またどのような都合の良い経路に追従することもできる。
２つの与えられたチャネル間の距離は、汚染転移を最小化することに加え、要求されるチャネルの濃度に依存し、また関連する化学物質に依存して、選択される。低いチャネル濃度が要求される場合、個々のチャネル間（および個々の出口間）の距離は、数ミリメータになり得る。この場合は、デバイス全体は、オフチップ（微小デバイス外）の分析器に対し各出口を精密に位置決めするために、移動ステージ上に搭載される。高いチャネル濃度が要求される場合は、チャネルおよびそれに関連する出口相互間は、接近する（数１０ミクロンだけ離れる）。この場合、移動ステージは必要ない。
この発明は、環状またはスポーク状に配列されたチャネルを伴うように実現することもできる。図２ａを参照すると、本体（４０）内に、毛細柱チャネル（４２）の配列が環状またはスポーク状配置として提供されている。チャネル（４２）の内側端部は、共通出口（４６）に直面している。チャネルの入り口端部は、図示するように、試料入り口（５６）と緩衝液貯蔵器（５２）に結合している。一般的には金薄膜の電極が、基板（４１）上に形成されるか、または基板（４１）に固着される。各電極は、対応する緩衝液貯蔵器の内部に位置した一端と、外部電源へ接続するためにアクセスできる他端とを備える。試料入り口（５６）と緩衝液貯蔵器（５２）は、液体を供給するために、または関連した部分および／またはチューブが基板の表面に向けて、またはそこから外側に延長して供給装置と結合するために、アクセスすることができる。出口は、種々の構成をとり得る。図２ｂを参照すると、基板のチャネルを囲むカバー板（４３）から外側に延長されたエレクトロスプレイチップ（４８）に結合された出口が図示されている。このチップは、一般的には１〜６０マイクロメータの出口孔を有する。図２ｃの実施例では、出口（４６）は電界放射チップ（５０）の配列に結合している。このチップは、それぞれ直径約１〜１０マイクロメータの出口孔を有する。更に変形した出口の構成が図２ｄに示されている。この例では、ノズル孔が、出口（４６）に隣接したカバー板（４３）中の凹部（４９）内に形成されている。このノズル孔の直径は、約１〜５０マイクロメータである。
図３に示される異なる実施例では、チャネル（６２）は規則正しく離れて環状に配列されるように、基板（６１）内に配置されている。チャネル（６２）の外側端部は、対応する貯蔵器（６９）に結合している。各貯蔵器（６９）に対しては、上述した実施例のように、電極が設けられている。前記チャネルのそれぞれは、個々の出口（６６）に向けてテーパ付けされた内側端部を備える。個々の出口の全ては、基板（６１）内の前記配列の中心部の単一のホール（６８）を通してアクセスできる。それぞれのチャネルは、意図する能力と操作要求に適合するために、１以上の試料貯蔵器と１以上の緩衝液貯蔵器を有する。
図４は、試料分離／注入チャネル（７２）とシース（試薬）液体チャネル（７３）の対を備えた実施例を示している。各対は出口（７６）に集まっている。出口は、シース液体または気体と共に使用されるスプレイ部である。気圧式スプレイでもエレクトロスプレイでも、オフチップ試料分析または収集用に適用できる。シース・モードにおける試料のエレクトロスプレイ移送のために、高電圧電源（７８）が試料貯蔵器（７４）とシース貯蔵器（７５）の両電極（７９）の間に接続される。この代わりに、貯蔵器（７４）または（７５）の電極と、出口（７６）に隣接する質量分析器の入り口部における電極との間に、電圧を印加することもできる。第１の配置では、出口（７６）におけるエレクトロスプレイ電位は、合計印加電圧と両チャネル（７２）および（７３）の抵抗値の関数である。第２の配置では、出口（７６）におけるエレクトロスプレイ電位は、試料貯蔵器に印加された電圧に直接比例する。出口はまた、それらの電位を能動的に制御するための電極を含んでいてもよい。
シース液体流は、試料チャネル内の流れに対する前述したと同様の方法によって、制御され得る。シース液体の成分は、希望する適用に依存する。シース液体は、例えばエレクトロスプレイ溶液のｐＨを制御するように、水／揮発性酸（または塩基）の有機溶液を含むことができる。シース液体はまた、マトリクス支援レーザ脱離および連続飛翔時間（ＴＯＦ）型質量分析器での分析のために、適切なマトリックス（例えば、ジヒドロベンゾニック酸、シナピニック酸）の溶液を含むことができる。エレクトロスプレイおよび気圧支援式スプレイの双方が、この場合には使用できる。レーザおよび／またはマトリクス支援レーザ脱離イオン化は、例えば膜やステンレススチール等の外部支持体上の微小デバイスから溶液の析出が生じた後に成し遂げられる。
図５は、複数の入り口（８４）と、１つの出口（８６）に集まる複数のチャネル（８２）を備えた実施例を示している。図５には、その様な２つの配列が示されている。各チャネル（８２）には、オフチップ分析を改善するために、例えば校正用の標準液、液体シース流体、または化学試薬を含む異なる複数の流体が供給され得る。各チャネル内の流れは、圧力制御される。あるいは調整された電流分配器（８８）が、チャネル内の電気泳動および電気浸透の精密制御のために使用される。
上述したように、この発明の微小チップデバイスは試料を質量分析器に移送するためのエレクトロスプレイ・インターフェース（ＥＳＩ／ＭＳ）として使用され得る。図６ａを参照すると、質量分析器での検出用試料注入効率を増加するために、図１ａの微小チップ（１０）が３次元ステージ（２１）上に搭載されている。このステージは、図６ｂに示すように、質量分析器（２３）の試料孔（２２）に対するチャネル出口（１６）の精密な位置決めを可能とする。チャネル（１２）に接続された１つのウエル（１４）は、電気泳動用の緩衝液貯蔵器として使用されている。他の１つのウエル（１３）は、試料入力用に使用される。第３の利用可能なウエル（１５）は、閉鎖され、この実施例では使用されない。試料注入実験が行われるとき、ウエルは、例えばプラスチック製のストッパによって気密にされ、チャネル内の流体試料を対応するチャネル出口に向けて移送するように圧力が加えられる。
低電流、高電圧の電源（２４）は、対応するチャネル内の試料をエレクトロスプレイ移送するために、緩衝液貯蔵器ウエル（１４）に挿入された電極（２５）を介して各チャネル（１２）へ順番に電圧を印加する。高電圧電源（２４）はグランド（２６）に接地される。また質量分析器の第２のグランド（２７）がある。前記電圧の大部分は、エレクトロスプレイ出口（１６）と質量分析器の試料孔（２２）との間の間隙に印加される。かくして、試料のエレクトロスプレイ移送が生起する。微小チップの９個のチャネルからの流体試料のエレクトロスプレイ移送は、シーケンシャルなモードで遂行される。１つのチャネルが試料分析器へ試料を注入している間は、他のチャネルは試料の準備に使用される。各試料分析器での分析の後に、次のチャネルがステージ（２１）によって移動され、試料孔に位置決めされる。位置決めは、３次元ステージの位置を手で調整することによって手動式に実行され得る。または、ステージをステッパモータで移動させることによって、自動式に行うこともできる。一例として、最良の信号が得られるまで電圧を増加させることによって最適な電圧を決定し、その電圧は再調整することなく次のチャネルに使用される。出口と試料分析器の試料孔との間の距離は、厳密なものではなく、ミリメータ以下から数１０ミリメータの範囲内にあれば良い。
以下の実験例は、この発明の利点を示すために呈示されたものである。
実験例Ｉ
異なる複数のチャネルから同じ試料を注入する
異なる複数のチャネルの能力を調査するために、図１ａに示したこの発明の微小デバイスの実施例を使用して、０．０１ｍｇ／ｍｌのミオグロビン試料が同じ断面を有する２つの選択されたチャネルから注入された。図７ａおよび７ｂに示すように、記録されたエレクトロスプレイの質量スペクトルの感度は、この２つのチャネルに関して極めて近似している。このことは、この発明の微小デバイスの準備に使用された微細加工技術が、再製造可能なチャネルを生成していることを意味している。実験によって決定されたミオグロビンの分子量は１６，９６３であった。これは、実際の分子量１６，９５０と比較した場合に、０．０２％の精度限界を示している。スペクトル間の僅かな違いは、タンパク質の分析にとって一般的なことである。
実験例II
高スループットの分析を導入するために
異なる複数のチャネルから異なる複数の試料を注入する
この発明の微小チップが、シーケンシャルな分析用の質量分析器に対するエレクトロスプレイ・インターフェースとして使用できることを検証するために、４つの異なる試料がシーケンシャルに処理された。各試料（７５／２５／０．１のメタノール／水／酢酸中の）は、図１ａに示した微小デバイス上の異なるチャネルからスプレイされた。４つの分析された実験例に対応するスペクトルが、図８ａ−８ｄに呈示されている。各試料に対し実験により決定された分子量（ＭＷｅｘｐ）、実際の分子量（ＭＷａｃｔ）および精度限界は次の通りである。
図８ａ：０．１ｍｇ／ｍｌのミオグロビン、ＭＷｅｘｐ＝１６，９５３、
ＭＷａｃｔ＝１６，９５０、精度限界＝０．０２％
図８ｂ：０．１ｍｇ／ｍｌのエンドルフィン、ＭＷｅｘｐ＝３４３８．３、
ＭＷａｃｔ＝３４３８、精度限界＝０．０１％
図８ｃ：０．１ｍｇ／ｍｌのヒト成長ホルモン、ＭＷｅｘｐ＝２２，１２０、
ＭＷａｃｔ＝２２，１２４、精度限界＝０．０２％
図８ｄ：０．１ｍｇ／ｍｌのユビクイチン、ＭＷｅｘｐ＝８５６５、
ＭＷａｃｔ＝８５５７、精度限界＝０．０９％
各分析は、システムがシーケンシャル分析モードで動作しているときに、数分以内で行われた。生化学試料の分析に対して非常に高いスループットである。この操作手法は１つのチャネルが試料の分析に使用されている期間に、試料準備が他のチャネルで導入され得ることを意味している。このモードでは、質量分析器の利用効率は、従来に比べて高いものとなり得る。図１ａに示されたものと同様のデザインで、この発明の微小デバイスは、質量分析器の分析スループットを増加するために、２０チャネルも備えるように組み立てることがきる。更に、図１ｄに示したような、３次元配列のチャネルを有する微小デバイスは、より高いスループットの可能性さえ生じさせる。
実験例III
検出限界の研究
図９は、メタノール／水／酢酸（７５／２５／０．１）中の０．００１ｍｇ／ｍｌのミオグロビン溶液を２００ｎｌ／ｍｉｎで、微小デバイスの出口から質量分析器の試料孔に直接スプレイすることによって得られた、ミオグロビンのエレクトロスプレイ質量スペクトルを示している。この実験例の信号対雑音比は１０：１よりも良好であり、検出限界が１０-8Ｍよりも良好であることを示している。エレクトロスプレイ電圧は４．４ｋＶであった。
実験例IV
試料混合物のエレクトロスプレイ
図１０は、０．０５ｍｇ／ｍｌのヒト成長ホルモンと０．０５ｍｇ／ｍｌのユビクイチンの、メタノール／水／酢酸（７５／２５／０．１）中の混合物を、幅６０μｍおよび深さ２５μｍに微小加工されたチップのチャネルから２００ｎｌ／ｍｉｎの流率でスプレイした場合の質量スペクトルを示している。エレクトロスプレイ電圧（４．３ｋＶ）は、チップの注入側から印加された。個々の試料成分に対応して多重に荷電されたイオンの分離したエンベロープが、スペクトル中で観測される。各試料成分の確実な分子量計算は、これらのデータから可能であり、そして実験的に決定されたＭＷ値は、各試料が分離したチャネルから分析された時の実験例ＩＩの場合と同じであった。この実験は、複雑な混合物が微小デバイス内で部分的にまたは試料成分にさえ分離することなしに、分析され得ることを示している。質量分析器は、分離器具として機能する。分離された実験では、ＭＳ／ＭＳ操作は、個々のイオンの構造を推論するために使用できる。
実験例Ｖ
水溶液中の試料の分析
図１１ａは、シリンジ内のメタノール／水／酢酸（７５／２５／０．１）に圧力を加えて０．０５ｍｇ／ｍｌのヒト成長ホルモンの水溶液を注入した場合のエレクトロスプレイ質量スペクトルを示している。図１１ｂは、メタノール／水／酢酸（７５／２５／０．１）の溶液から直接０．０５ｍｇ／ｍｌのヒト成長ホルモン溶液を注入した場合のエレクトロスプレイ質量スペクトルを示している。この実験例は、いかなる有機溶媒も先行的に添加することなしに、水性試料を直接オフチップ（微小デバイスの外部で）エレクトロスプレイすることが、メタノールを供給された試料から得られるスペクトル（図１１ｂ）に比べて、高品質のスペクトル（図１１ａ）を提供できること、および試料が完全に水性であっても、あるいはメタノールを供給された環境にあっても、実験的に決定された同じ分子量の値２２，１２０が得られることを示している。標準的なエレクトロスプレイ・インターフェースを使用したこの実験では、試料は一般的には有機添加物と共に供給される。しかしながら、有機添加物に耐性のない生化学的試料に対しては、水溶液の直接スプレイが、分析を実行する上で最良のアプローチとなる。
実験例VI
ペプチドおよびタンパク質のオンチップ温浸
図１２ａを参照すると、ｐＨ８．２のトリス緩衝液２０ｍＭ中に、メリチン／トリプシン比率＝３００／１（ｗ／ｗ）でメリチンのオンチップ温浸が導入されている。メリチンの濃度は４０μＭであった。エレクトロスプレイ質量スペクトル（ｉ）は１０分間の温浸によるものであり、またスペクトル（ｉｉ）は１時間の温浸によるものである。２つの温浸時間の後に、同じ試料破片が検出されたが、異なるレベルであった。例えば、１つの生成イオンの温浸を表すピーク番号２が経時的に増加したのに対し、１つの分子イオンを表すピーク番号５は長い温浸期間の後に減少した。
図１２ｂは、２μＭのカゼインのオンチップ温浸とオフチップ温浸との比較を示している。反応条件は、カゼイン／トリプシン＝６０であることを除いて、図１２ａの実験で使用されたものと同様である。２つのスペクトルは実質的に同一のパターンを示している。これらの結果は、この発明の微量流体処理システムが、ペプチドとタンパク質の温浸運動の研究に使用できることを検証し、またオンチップおよびオフチップ温浸が全く同様の破片を生成することを示している。オンチップ温浸の成功はまた、エレクトロスプレイ試料分析用の試料をチップ上に予備的に準備することが実現可能であることを示し、また試料処理工程を簡略化し、分析スループットを増加させることになる。
実験例VI
モデルＤＮＡ試料の分析
この発明の潜在能力を種々の試料の分析に利用するために、短いＤＮＡ破片（２０ｍｅｒ）が、いかなる前処理もすること無しに、エレクトロスプレイ質量スペクトル分析器で分析された。結果として得られたスペクトルが図１３に示されている。計算された分子量６１５５と比較すると、実験で測定された分子量は６１６４．３、精度は０．０１５％以内である。ＤＮＡ試料は、試料の気化を促進するための６０％のアセトニトリルと４０％のＨ2Ｏ溶液によって、スプレイされた。上述したＤＮＡ分子量の決定精度の高さから、この発明がＤＮＡの突然変異をスクリーンするために分析できることが期待される。
この発明は、好ましい実施例を伴って説明されてきたが、前述の明細書を読んだ後に、当業者は、ここで述べた構成および手法に対する種々の変形、均等物の創生、およびその他の変更を行うことが可能となる。それ故、特許により与えられる保護の範囲は、添付した請求の範囲とその等価物によってのみ制限されることが意図されている。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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