(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
0004481504.tif 000008
の化合物またはその医薬上許容される塩。
【請求項２】
請求項１記載の化合物と医薬上許容される担体とを含んでなる医薬組成物。
【請求項３】
請求項１記載の化合物、抗腫瘍薬および医薬上許容される担体を含んでなる医薬組成物。
【請求項４】
抗腫瘍薬がトポテカンである請求項３記載の医薬組成物。
【請求項５】
抗腫瘍薬がシスプラチンである請求項３記載の医薬組成物。
【請求項６】
式（ＩＩ）：
【化２】
0004481504.tif 000009
の化合物またはその医薬上許容される塩。
【請求項７】
式（ＩＩＩ）：
【化３】
0004481504.tif 000010
の化合物を、２−（５，６，７，８−テトラヒドロ−１，８−ナフチリジン−２−イル）−１−エタノールと、アゾジカルボン酸ジイソプロピルとトリフェニルホスフィン間に形成される複合体により媒介される反応において反応させ、続いて水性塩基を用いてエステル加水分解することを含む請求項１において定義した式（Ｉ）の化合物を調製する方法。
【請求項８】
医薬として用いられる請求項１記載の化合物。
【請求項９】
αｖβ３レセプターの拮抗作用が必要とされる疾患を治療するための医薬の製造における請求項１に定義した式（Ｉ）の化合物の使用。
【請求項１０】
αｖβ５レセプターの拮抗作用が必要とされる疾患を治療するための医薬の製造における請求項１において定義した式（Ｉ）の化合物の使用。
【請求項１１】
骨粗鬆症を治療するための医薬の製造における請求項１において定義した式（Ｉ）の化合物の使用。
【請求項１２】
血管新生を抑制するための医薬の製造における請求項１において定義した式（Ｉ）の化合物の使用。
【請求項１３】
腫瘍増殖または腫瘍転移を抑制するための医薬の製造における請求項１において定義した式（Ｉ）の化合物の使用。
【請求項１４】
アテローム性動脈硬化症または再発狭窄症を抑制するための医薬の製造における請求項１において定義した式（Ｉ）の化合物の使用。
【請求項１５】
炎症を治療するための医薬の製造における請求項１において定義した式（Ｉ）の化合物の使用。
【請求項１６】
腫瘍増殖を抑制するための医薬の製造における、請求項１において定義した式（Ｉ）の化合物と抗腫瘍薬の使用。
【請求項１７】
抗腫瘍薬がトポテカンである請求項１６記載の使用。
【請求項１８】
抗腫瘍薬がシスプラチンである請求項１６記載の使用。
【請求項１９】
骨粗鬆症を治療するための医薬の製造における請求項１において定義した式（Ｉ）の化合物と骨吸収の抑制剤の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、ビトロネクチンレセプターを抑制し、炎症、癌および心血管障害、たとえばアテローム性動脈硬化症および再発狭窄症、ならびに骨吸収が要因である疾患、たとえば骨粗鬆症の治療に有用である医薬上活性な化合物に関する。
【０００２】
（背景技術）
インテグリンは、さまざまな細胞上で発現された貫膜糖タンパクである細胞接着レセプターのスーパーファミリーである。これらの細胞表面接着レセプターはｇｐＩＩｂ／ＩＩＩａ（フィブリノゲンレセプター）およびαｖβ３（ビトロネクチンレセプター）を包含する。フィブリノゲンレセプターｇｐＩＩｂ／ＩＩＩａは血小板表面上に発現され、血小板凝集および出血している創傷部位での止血凝塊の形成を媒介する。Ｐｈｉｌｉｐら、Ｂｌｏｏｄ．、１９８８、７１、８３１。ビトロネクチンレセプターαｖβ３は、内皮、平滑筋、破骨細胞、および腫瘍細胞を包含する多くの細胞上で発現され、したがってさまざまな機能を有する。破骨細胞膜上で発現されたαｖβ３レセプターは骨吸収プロセスの重要な段階である骨マトリックスへの破骨細胞の接着を媒介する。Ｒｏｓｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９８７、２６２、７７０３。過度の骨吸収により特徴づけられる疾患は骨粗鬆症である。ヒト大動脈平滑筋細胞上で発現されたαｖβ３レセプターはその新生脈管内膜中への移動を媒介し、経皮冠血管形成後に再発狭窄症に至る。Ｂｒｏｗｎら、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｒｅｓ．、１９９４、２８：１８１５。加えて、Ｂｒｏｏｋｓら、Ｃｅｌｌ、１９９４、７９、１１５７は、αｖβ３拮抗物質が脈管形成血管のアポトーシスを誘発することにより腫瘍退縮を促進できることを示した。したがって、ビトロネクチンレセプターをブロックする薬剤は、骨粗鬆症、再発狭窄症および癌などの疾患の治療において有用である。
【０００３】
ビトロネクチンレセプターは、αｖβ１、αｖβ３およびαｖβ５と表される３つの異なるインテグリンを意味することが知られている。Ｈｏｒｔｏｎら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈｏｌ．、１９９０、７１、７４１。αｖβ１はフィブロネクチンおよびビトロネクチンと結合する。αｖβ３は、フィブリン、フィブリノゲンラミニン、トロンボスポンジン、ビトロネクチン、ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄファクター、オステオポンチンおよび骨シアロプロテインＩを含むさまざまなリガンドと結合する。αｖβ５はビトロネクチンと結合する。ビトロネクチンレセプターαｖβ５は、微小血管内皮細胞を含むさまざまなセルタイプの細胞接着に関与し（Ｄａｖｉｓら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９３、５１、２０６）、その血管形成における役割は確認されている。Ｂｒｏｏｋｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９４、２６４、５６９。このインテグリンは、ヒトの創傷肉芽組織における血管上で発現されるが、正常な皮膚においては発現されない。
【０００４】
ビトロネクチンレセプターは、トリペプチドＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（またはＲＧＤ）モチーフを含む骨マトリックスタンパクと結合することが知られているしたがって、Ｈｏｒｔｏｎら、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．１９９１、１９５、３６８は、ＲＧＤ−含有ペプチドおよび抗ビトロネクチンレセプター抗体（２３Ｃ６）は破骨細胞による象牙質吸収および細胞の拡散を抑制することを開示している。加えて、Ｓａｔｏら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９０、１１１、１７１３は、エキスタチン（ＲＧＤ配列を含むヘビ毒ペプチド）は組織培養における骨吸収の有効な抑制物質であり、破骨細胞の骨への付着を抑制することを開示している。
【０００５】
ある種の化合物が、αｖβ３およびαｖβ５レセプターの有効な抑制物質であることが見いだされている。特に、このような化合物は、フィブリノゲンレセプターよりもビトロネクチンレセプターのより有効な抑制物質であることが見いだされている。
【０００６】
（発明の開示）
本発明は、ビトロネクチンレセプターを抑制する薬理活性を有し、炎症、癌ならびに心血管障害、たとえばアテローム性動脈硬化症および再発狭窄症、ならびに骨吸収が要因である疾患、たとえば骨粗鬆症の治療に有用である以下に記載する式（Ｉ）の化合物を含む。
本発明はさらに、式（Ｉ）の化合物と医薬担体とを含んでなる医薬組成物である。
本発明はさらに、ビトロネクチンレセプターにより媒介される疾患の治療法である。一態様において、本発明の化合物はアテローム性動脈硬化症、再発狭窄症、炎症、癌および骨吸収が要因である疾患、例えば骨粗鬆症の治療に有用である。
【０００７】
（発明を実施するための最良の形態）
本発明は、フィブリノゲンレセプターよりもビトロネクチンレセプターのより有効な抑制物質である新規化合物を含む。新規化合物は、ジベンゾシクロヘプテン殻を含み、ジベンゾシクロヘプテンの芳香族６員環の１つの環上に窒素含有置換基が存在し、ジベンゾシクロヘプテンの７員環上に酸性部分を含む脂肪族置換基が存在する。ジベンゾシクロヘプテン環系は、６および７員環の置換基側鎖がビトロネクチンレセプターと有利に相互作用できるように配列されると考えられている。最短の分子内経路による約１２から１４の共有結合が、ジベンゾシクロヘプテンの７員環の脂肪族置換基上の酸性基とジベンゾシクロヘプテンの芳香族６員環の１つ環上の窒素含有置換基間に存在するのが好ましい。
【０００８】
本発明は、式（Ｉ）：
【化４】
0004481504.tif 000002
の化合物またはその医薬上許容される塩を含む。
式（Ｉ）の化合物は、ビトロネクチンおよび他のＲＧＤ−含有ペプチドのビトロネクチンレセプターに対する結合を抑制する。破骨細胞上のビトロネクチンレセプターの抑制は、破骨細胞による骨吸収を抑制し、骨吸収が病因に関連する疾患、たとえば骨粗鬆症および骨関節炎の治療において有用である。
【０００９】
別の態様において、本発明は、オステオカルシン放出を起こす式（Ｉ）の化合物を投与することを含む骨形成を刺激する方法である。向上した骨産生は、骨折の治癒および骨折の予防など、鉱化骨量が欠乏しているかまたは骨のリモデリングが望ましい疾患において明らかな利点がある。骨構造の損失につながる疾患および代謝障害にはこの治療が有利である。たとえば、上皮小体機能亢進症、パジェット病、悪性の高カルシウム血症、骨転移により生じる溶骨性病変、固定または性ホルモン欠乏による骨損失、ベーチェット病、骨軟化症、骨化過剰症、および大理石骨病などは、本発明の化合物を投与することが有利である。
【００１０】
加えて、本発明の化合物は、多くの異なるタイプの細胞上のビトロネクチンレセプターを抑制するので、前記化合物は、炎症性疾患、例えば慢性関節リウマチおよび乾癬など、ならびに心血管疾患、たとえばアテローム性動脈硬化症および再発狭窄症の治療において有用である。本発明の式（Ｉ）の化合物は、これに限定されないが、血栓塞栓障害、喘息、アレルギー、成人呼吸困難症候群、対宿主移植片疾患、臓器移植拒絶反応、敗血症性ショック、湿疹、接触性皮膚炎、炎症性腸疾患、および他の自己免疫疾患を含む他の疾患を治療または予防するのに有用である。本発明の化合物は、傷の治癒にも有用である。
【００１１】
本発明の化合物は、血管形成障害の予防も含めた治療にも有用である。本明細書において用いられる血管形成障害なる用語は、異常な新血管形成を含む状態を包含する。新しい血管の増殖が疾患の病因であるかまたは一因である場合には、血管形成の抑制により疾患の有害な影響が減少する。このような疾患の例は、糖尿病性網膜症である。有害な組織の増殖を維持するために新しい血管の増殖が必要である場合、血管形成の抑制は、組織への血液の供給を減少させ、それにより血液供給の需要に基づく組織塊の減少に寄与する。例としては、腫瘍が増殖するために新生血管形成が連続して必要とされる腫瘍の増殖および固体腫瘍転移の確立が挙げられる。したがって、本発明の化合物は腫瘍組織の血管形成を抑制し、これにより腫瘍転移および腫瘍増殖を防止する。
【００１２】
したがって、本発明の方法に従って、本発明の化合物を用いて血管形成を抑制することにより疾患の症状を改善することができ、場合によっては疾患を治癒することができる。
本発明の化合物の別の治療標的は、新生血管形成により特徴づけられる眼疾患である。このような眼疾患としては、角膜新生血管障害、たとえば角膜移植、ヘルペス性角膜炎、梅毒性角膜炎、翼状片およびコンタクトレンズの使用に関連する新生血管パンヌスが挙げられる。別の眼疾患としてはさらに、加齢による黄斑変性、推定眼ヒストプラスマ症、未熟児網膜症および血管新生性緑内障が挙げられる。
【００１３】
本発明はさらに、式（Ｉ）の化合物と抗腫瘍薬、たとえばトポテカンおよびシスプラチンを段階的または物理的に組み合わせて投与することからなる腫瘍増殖を抑制する方法を提供する。
本発明の新規化合物は、（Ｓ）−１０，１１−ジヒドロ−３−［２−（５，６，７，８−テトラヒドロ−１，８−ナフチリジン−２−イル）−１−エトキシ］−５Ｈ−ジベンゾ［ａ，ｄ］シクロヘプテン−１０−酢酸またはその医薬上許容される塩である。
本発明によると、式（Ｉ）の化合物の（Ｓ）構造が好ましい。
【００１４】
本発明の化合物のプロドラッグも本発明に含まれる。プロドラッグは、インビボで式（Ｉ）の活性な親化合物を放出する共有結合した任意の担体と考えられる。したがって、本発明の別の態様は、式（Ｉ）の化合物の調製における中間体でもある式（ＩＩ）：
【化５】
0004481504.tif 000003
の新規プロドラッグまたはその医薬上許容される塩である。
ペプチドおよび化学分野で通常用いられる略号および記号を本明細書において本発明の化合物を説明するのに用いる。一般に、アミノ酸略号はＥｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１５８、９（１９８４）に記載されているようなＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法に関する合同会議に従う。
【００１５】
本明細書において用いられるＣ１−６アルキルは、１ないし６個の炭素原子を有する所望により置換されていてもよいアルキル基であり、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチルおよびへキシルならびにその単純な脂肪族異性体を包含する。
任意のＣ１−６アルキルは所望によりＲｘ基で置換されていてもよく、この置換基は安定な構造が得られるような任意の炭素原子上にあり、通常の合成技術により得ることができる。Ｒｘの適当な基は、Ｃ１−４アルキル、ＯＲ”、ＳＲ”、Ｃ１−４アルキルスルホニル、Ｃ１−４アルキルスルホキシル、−ＣＮ、Ｎ（Ｒ”）２、ＣＨ２Ｎ（Ｒ”）２、−ＮＯ２、−ＣＦ３、−ＣＯ２Ｒ”、−ＣＯＮ（Ｒ”）２、−ＣＯＲ”、−ＮＲ”Ｃ（Ｏ）Ｒ”、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、またはＣＦ３Ｓ（Ｏ）ｒ−である（ここに、ｒは０、１または２であり、Ｒ”はＨまたはＣ１−６アルキルである）。
【００１６】
いくつかのラジカル基は本明細書においては略号で表す。ｔ−Ｂｕはターシャリーブチルラジカルであり、Ｂｏｃはｔ−ブチルオキシカルボニルラジカルであり、Ｆｍｏｃはフルオレニルメトキシカルボニルラジカルであり、Ｐｈはフェニルラジカルであり、Ｃｂｚはベンジルオキシカルボニルラジカルであり、Ｂｎはベンジルラジカルであり、Ｍｅはメチルであり、Ｅｔはエチルであり、Ａｃはアセチルであり、ＡｌｋはＣ１−４アルキルであり、Ｎｐｈは１−または２−ナフチルであり、ｃＨｅｘはシクロヘキシルである。Ｔｅｔは５−テトラゾリルである。
【００１７】
本明細書において、いくつかの試薬は略記する。ＤＣＣはジシクロヘキシルカルボジイミドであり、ＤＭＡＰはジメチルアミノピリジンであり、ＤＩＥＡはジイソプロピルエチルアミンであり、ＥＤＣは１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩である。ＨＯＢｔは１−ヒドロキシベンゾトリアゾールであり、ＴＨＦはテトラヒドロフランであり、ＤＩＥＡはジイソプロピルエチルアミンであり、ＤＥＡＤはアゾジカルボン酸ジエチルであり、ＰＰｈ３はトリフェニルホスフィンであり、ＤＩＡＤはアゾジカルボン酸ジイソプロピルであり、ＤＭＥはジメトキシエタンであり、ＤＭＦはジメチルホルムアミドであり、ＮＢＳはＮ−ブロモスクシンイミドであり、Ｐｄ／Ｃは炭素上パラジウム触媒であり、ＰＰＡはポリリン酸であり、ＤＰＰＡはジフェニルホスホリルアジドであり、ＢＯＰはベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェートであり、ＨＦはフッ化水素酸であり、ＴＥＡはトリエチルアミンであり、ＴＦＡはトリフルオロ酢酸であり、ＰＣＣはクロロクロム酸ピリジニウムである。
【００１８】
式（Ｉ）の化合物は、Ｂｏｎｄｉｎｅｌｌら、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９７／０１５４０（国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９６／１１１０８）１９９７年１月１６日公開（出典明示により本発明の一部とする）に記載されている方法により調製できる。
加えて、式（Ｉ）の化合物は以下に詳細に記載するようなスキームに記載されている方法と類似した方法により調製される。
【００１９】
【化６】
0004481504.tif 000004
スキームＩは式（Ｉ）の化合物の調製において有用な中間体の調製を詳細に説明する。
【化７】
0004481504.tif 000005
スキームＩＩも式（Ｉ）の化合物の調製において有用な中間体の調製を詳細に説明する。
【００２０】
【化８】
0004481504.tif 000006
(a)EtOAc/LiHMDS、THF;(b)H2、10% Pd/C、濃HCl、AcOH;(c)EtSH、AlCl3、CH2Cl2;(d)2-(5,6,7,8-テトラヒドロ-1,8-ナフチリジン-2-イル)-1-エタノール、アゾジカルボン酸ジイソプロピル、(Ph)3P;(e)1.0N LiOH、EtOH;HCl
スキームＩＩＩは式（Ｉ）の化合物の調製の詳細を説明する。ＩＩＩ−１（スキームＩ−３の化合物）の、酢酸エチルを適当なアミド塩基、たとえばリチウムジイソプロピルアミド（ＬＤＡ）またはリチウムビス（トリメチルシリル）アミド（ＬｉＨＭＤＳ）と接触させることにより得ることができる酢酸エチルのエノレートとのアルドールタイプの反応における反応により、ＩＩＩ−２を得る。ＴＨＦはアルドール反応に最適の溶媒である場合が多いが、種々の添加剤、たとえばＨＭＰＡまたはＴＭＥＤＡの存在下でＴＨＦを用いることが多い。ＩＩＩ−３（スキームＩＩ−６の化合物）を得るためのＩＩＩ−２の還元は、ＨＣｌなどの鉱酸の存在下で、酢酸などの適当な溶媒中、適当な触媒上、例えば活性炭上金属パラジウム（Ｐｄ／Ｃ）上水添分解により達成できる。別法として、この還元は、ＩＩＩ−２を、ＯｒｆａｎｏｐｏｕｌｏｓおよびＳｍｏｎｏｕの一般法（Ｓｙｎｔｈ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９８８、８３３）により、三フッ化ホウ素エーテラートの存在下でトリエチルシランで処理することにより行うことができる。ＩＩＩ−４を得るためのＩＩＩ−３のメチルエーテルの除去は、例えばＣＨ２Ｃｌ２などの不活性溶媒中ＢＢｒ３などを用いて行うことができるか、または不活性溶媒、好ましくはＣＨ２Ｃｌ２中エタンチオールおよびＡｌＣｌ３との反応により行うことができる。メチルエーテルを除去するための他の有用な方法は、Ｇｒｅｅｎｅ、“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ出版）に記載されている。スキーム３の化合物４（ＩＩＩ−４）を２−（５，６，７，８−テトラヒドロ−１，８−ナフチリジン−２−イル）−１−エタノールと反応させて、ＩＩＩ−５を得る。反応は、アゾジカルボン酸ジイソプロピルとトリフェニルホスフィン間に形成される複合体により媒介され、非プロトン性溶媒、例えばＴＨＦ、ＣＨ２Ｃｌ２、またはＤＭＦ中で行われる。ＩＩＩ−５のエチルエステルを、水性塩基、たとえば水性ＴＨＦ中ＬｉＯＨあるいは水性メタノールまたはエタノール中ＮａＯＨを用いて加水分解し、中間体カルボン酸塩を適当な酸、たとえばＴＦＡまたはＨＣｌで酸性にして、カルボン酸ＩＩＩ−６を得る。別法として、中間体カルボン酸塩を所望により単離するか、または遊離カルボン酸のカルボン酸塩を当業者に一般的な方法により調製することができる。
【００２１】
【化９】
0004481504.tif 000007
(a)PhOH、Cu、K2CO3;(b)硫黄、モルホリン;(c)KOH、H2O、i-PrOH;(d)SOCl2、ベンゼン;(e)AlCl3、CH2Cl2;(f)EtOAc、LiN(TMS)2、TMEDA、THF;(g)Et3SiH、BF3・OEt2、CH2Cl2;(h)H2、Pd/C、EtOH;(i)BBr3、CH2Cl2
商業的に入手可能な２−フルオロ−４−メトキシアセトフェノン（ＩＶ−１）はアルコール、例えばフェノールと金属銅および適当な塩基、例えばＫ２ＣＯ３の存在下で反応して、ジアリルエーテルＩＶ−２を得る。硫黄および適当な第一または第二アミン、好ましくはモルホリンでＨａｒｒｉｓの一般法（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９８２、２５、８５５）に従って処理すると、ＩＶ−２が古典的なＷｉｌｌｇｅｒｏｄｔ−Ｋｉｎｄｌｅｒ反応においてＩＶ−３に変換される。このようにして得られたチオアミドを加水分解して、アルカリ金属水酸化物、適当にはＫＯＨとの、水性アルコール性溶媒、例えば水性ＭｅＯＨ、ＥｔＯＨ、またはｉ−ＰｒＯＨ中での反応により、対応するカルボン酸ＩＶ−４を得る。当業者に一般的な条件に従ってＳＯＣｌ２または塩化オキサリルのいずれかとの反応によりカルボン酸ＩＶ−４を対応する酸塩化物に変換する。この酸塩化物を不活性溶媒、たとえばＣＨ２Ｃｌ２またはＣＳ２中、適当なフリーデル−クラフツ触媒、たとえばＡｌＣｌ３またはＳｎＣｌ４で処理して、環状ケトンＩＶ−５を得る。別法として、酸ＩＶ−４を酸性条件下、例えばポリリン酸を用いて直接ケトンＩＶ−５に変換できる。酢酸エチルから適当なアミド塩基、例えばリチウムジイソプロピルアミド（ＬＤＡ）またはリチウムビス（トリメチルシリル）アミド（ＬｉＨＭＤＳ）と接触させることにより得られる酢酸エチルのエノレートとのアルドール型反応におけるＩＶ−５の反応により、ＩＶ−６を得る。ＴＨＦはアルドール反応に最適の溶媒であることが多いが、例えばＨＭＰＡまたはＴＭＥＤＡなどの種々の添加剤の存在下でのＴＨＦがしばしば用いられる。ＩＶ−６をＩＶ−７に還元することは、ＯｒｐｈａｎｏｐｏｕｌｏｓおよびＳｍｏｎｕの一般法（Ｓｙｎｔｈ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９８８、８３３）により三フッ化ホウ素エーテラートの存在下でトリエチルシランでＩＶ−６を処理することにより行うことができる。アルコールの除去により得られる任意のオレフィン系副生成物を、適当な溶媒、例えばＭｅＯＨまたはＥｔＯＨ中、適当な触媒上、たとえば活性炭上金属パラジウム（Ｐｄ／Ｃ）上で水素添加することにより還元する。別法として、ＩＶ−６をＩＶ−７に還元することは、ＨＣｌなどの鉱酸の存在下での水添分解により行うことができる。典型的には、この反応はＰｄ／Ｃにより触媒され、酢酸中で行うのが最適である。ＩＶ−７のメチルエーテルを除去してＩＶ−８を得ることは、たとえばＣＨ２Ｃｌ２などの不活性溶媒中、ＢＢｒ３を用いるか、または不活性溶媒、好ましくはＣＨ２Ｃｌ２中、エタンチオールとＡｌＣｌ３との反応により行うことができる。メチルエーテルを除去するための他の有用な方法は、Ｇｒｅｅｎｅ、“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ出版）に記載されている。ＩＶ−８はその後、スキームＩＩＩに概要を示した手順に従って式（Ｉ）の化合物に変換される。
【００２２】
化合物の酸付加塩は適当な溶媒中、標準的方法で、親化合物および過剰の酸、たとえば塩酸、臭化水素酸、フッ化水素酸、硫酸、リン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、マレイン酸、琥珀酸またはメタンスルホン酸から調製される。特定の化合物は、許容できる内部塩または双性イオンを形成する。カチオン塩は、親化合物を適当なカチオンを含む過剰のアルカリ性試薬、例えば水酸化物、炭酸塩またはアルコキシド；あるいは適当な有機アミンで処理することにより調製される。Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃａ＋＋、Ｍｇ＋＋、およびＮＨ４＋などのカチオンは、医薬上許容される塩において存在するカチオンの例である。
【００２３】
本発明はさらに、式（Ｉ）の化合物と医薬上許容される担体とを含んでなる医薬組成物も提供する。したがって、式（Ｉ）の化合物は、医薬の製造において用いることができる。本明細書においてすでに記載したようにして調製される式（Ｉ）の化合物の医薬組成物は、非経口投与される溶液または凍結乾燥粉末として処方できる。粉末は使用前に適当な希釈剤または医薬上許容される担体を添加することにより復元できる。液体処方は、緩衝液、等張液、水溶液であってもよい。適当な希釈剤の例は、標準等張塩溶液、標準５％水中デキストロースまたは緩衝酢酸ナトリウムまたはアンモニウム溶液である。このような処方は、非経口投与に特に適しているが、経口投与するために用いることもでき、あるいは計量器付吸入器または吸入用ネブライザーに入れることもできる。賦形剤、例えば、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、ヒドロキシセルロース、アカシア、ポリエチレングリコール、マンニトール、塩化ナトリウムまたはクエン酸ナトリウムを添加するのが望ましい。
【００２４】
別法として、これらの化合物は、カプセル化、打錠、または経口投与用エマルジョンまたはシロップに調製することができる。組成物を改良するかまたは安定化させるために、あるいは組成物の調製を容易にするために、医薬上許容される固体または液体担体を添加することができる。固体担体としては、デンプン、ラクトース、硫酸カルシウム二水和物、白陶土、ステアリン酸マグネシウムまたはステアリン酸、タルク、ペクチン、アカシア、寒天またはゼラチンが挙げられる。液体担体としては、シロップ、ピーナッツ油、オリーブ油、食塩水および水があげられる。担体はさらに、徐放性物質、たとえば、グリセリルモノステアレートまたはグリセリルジステアレートを単独またはワックスと共に含むことができる。固体担体の量は変わるが、好ましくは投与単位あたり約２０ｍｇないし約１ｇである。医薬製剤は、錠剤形については粉砕、混合、造粒、必要ならば打錠；あるいはハードゼラチンカプセル形については、粉砕、混合および充填を含む一般的な調剤技術にしたがって調製される。液体担体を用いる場合、製剤はシロップ、エリキシル、エマルジョンあるいは水性または非水性懸濁液の形態にされる。このような液体処方は、直接ｐ．ｏ．で投与することもできるし、ソフトゼラチンカプセル中に充填することもできる。
【００２５】
経直腸投与するために、本発明の化合物は、カカオ脂、グリセリン、ゼラチンまたはポリエチレングリコールなどの賦形剤と組み合わせ、坐剤に成形することもできる。
本明細書に記載する化合物は、ビトロネクチンレセプターの拮抗物質であり、その根底にある病因がビトロネクチンレセプターと相互作用するリガンドまたは細胞にある疾患を治療するのに有用である。例えば、これらの化合物は、骨マトリックスの損失が病因である疾患の治療に有用である。したがって、本発明の化合物は、骨粗鬆症、上皮小体機能亢進症、パジェット病、悪性の高カルシウム血症、骨転移により生じる溶骨性病変、固定または性ホルモン欠乏による骨損失などの治療に有用である。本発明の化合物は、抗腫瘍剤、抗血管形成剤、抗炎症剤および抗転移剤として有用性を有し、アテローム性動脈硬化症および再発狭窄症の治療において有用であると考えられている。
【００２６】
化合物は、骨吸収、または他のこのような適応症を抑制するのに十分な薬剤濃度で、患者に経口または非経口投与される。該化合物を含有する医薬組成物は、患者の状態にあった方法で、約０．１から約５０ｍｇ／ｋｇの間の経口用量で投与される。好ましくは、経口用量は約０．５ないし約２０ｍ／ｋｇである。短期療法については、非経口投与が好ましい。ペプチドの５％水中デキストロース中または通常の塩溶液中静脈内注入、あるいは適当な賦形剤を含む同様の処方がもっとも有効であるが、筋肉内濃縮塊注射も有用である。典型的には、非経口用量は、約０．０１ないし約１００ｍｇ／ｋｇであり；好ましくは０．１から２０ｍｇ／ｋｇの間である。化合物は毎日１ないし４回、合計一日量が約０．４ないし約４００ｍｇ／ｋｇ／日になるような量で投与される。正確な量および化合物を投与する方法は、治療効果を得るために必要な濃度と薬剤の血中レベルを比較することにより当業者により容易に決定される。
【００２７】
本発明はさらに、骨粗鬆症の治療法または骨量損失の抑制法であり、式（Ｉ）の化合物と他の骨吸収抑制剤、例えばビスホスホネート（すなわち、アレンドロネート）、ホルモン置換療法、抗エストロゲン剤、またはカルシトニンと段階的に、または物理的に組み合わせて投与することを含む方法を提供する。加えて、本発明は、本発明の化合物と、骨損失の防止および／または骨の増加において有用な同化促進剤、例えば、骨形態形成タンパク質、イプロフラボンを用いた治療法を提供する。
【００２８】
加えて、本発明は、式（Ｉ）の化合物と抗腫瘍薬を段階的にあるいは物理的に組み合わせて投与することを含む腫瘍増殖を抑制する方法を提供する。トポテカン、イリノテカンおよび９−アミノカンプトテシンなどのカンプトシン類似物クラスの化合物、およびシスプラチン、オルマプラチンおよびテトラプラチンなどの白金配位錯体は公知の抗腫瘍薬である。カンプトテシン類似体クラスの化合物は、米国特許第５００４７５８号、第４６０４４６３号、第４４７３６９２号、第４５４５８８０号、第４３４２７７６号、第４５１３１３８号、第４３９９２７６号、欧州特許出願公開番号０４１８０９９号および００８８６４２号、Ｗａｎｉら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、１９８６、２９、２３５８、Ｗａｎｉら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、１９８０、２３、５５４、Ｗａｎｉら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、１９８７、３０、１７７４、およびＮｉｔｔａら、Ｐｒｏｃ．１４ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｇｒ．  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ．、１９８５、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｓｅｃｔｉｏｎ  １、２８（すべての刊行物はそれぞれ出典明示により本発明の一部とする）に記載されている。白金配位錯体、シスプラチンは、Ｐｌａｔｉｎｏｌという商品名でＢｒｉｓｔｏｌ  Ｍｙｅｒｓ−Ｓｑｕｉｂｂ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能である。シスプラチンの有用な処方は、米国特許第５５６２９２５号および第４３１０５１５号（それぞれの全開示は出典明示により本発明の一部とする）に記載されている。
【００２９】
式（Ｉ）の化合物と抗腫瘍薬を段階的または物理的に組み合わせて投与することを含む腫瘍の増殖を抑制する方法において、白金配位化合物、たとえばシスプラチンは、ゆっくりとした静脈内注入を用いて投与することができる。好ましい担体は、マンニトールを含有するデキストロース／塩溶液である。白金配位化合物の投与計画は、治療法により体表面積１平方メートルあたり約１ないし約５００ｍｇ（ｍｇ／ｍ２）を基準とする。白金配位化合物の注入は、毎週１ないし２回投与でき、週ごとの治療を数回繰り返すことができる。非経口投与においてカンプトテシン類似体クラスの化合物を用いて、一般に用いられる治療法は、連続して約５日間一日あたり体表面積１平方メートルあたり約０．１ないし約３００．０ｍｇである。トポテカンについて用いられる治療法は、連続約５日間、一日あたり体表面積１平方メートルあたり約１．０ないし約２．０ｍｇであるのが最も好ましい。好ましくは、治療は、約７日に少なくとも１回ないし約２８日間隔で繰り返される。
【００３０】
医薬組成物は、式（Ｉ）の化合物と抗腫瘍薬の両者を同じ容器内に処方することができるが、異なる容器中の処方が好ましい。両薬剤が液体形態で提供される場合、これらは同時投与または直列の注入／注射システムに含むことができる。式（Ｉ）の化合物および抗腫瘍剤を同じまたは異なる回数簡便に投与するために、箱、カートンまたは他の容器、別個のビン、バッグ、バイアルまたは他の容器などの、それぞれが前記のような非経口投与される有効量の式（Ｉ）の化合物と、前記のような非経口投与される有効量の抗腫瘍薬を含む単一の容器中のキットが調製される。このようなキットは、例えば両薬剤を別個の容器または同一の容器中に含むことができ（所望により凍結乾燥されたプラグとして）、また復元用溶液の容器を含むことができる。これの変形は、復元用溶液と、凍結乾燥したプラグを１つの容器の２つのチャンバー中に含み、使用前に混合することができる。このような配列で、抗腫瘍薬と本発明の化合物を別々に、２つの容器に包装することができ、また一緒に凍結乾燥して粉末にし、１つの容器中に提供することもできる。
【００３１】
両薬剤が液体形態で提供される場合、これらは同時投与用または直列の注入／注射システム中に含むことができる。例えば、式（Ｉ）の化合物は、ｉ．ｖ．注射可能な形態、またはチューブで第二の注入バッグ中の抗腫瘍薬と一列に連結された注入バッグにすることができる。このようなシステムを用いて、患者は式（Ｉ）の化合物の初期濃縮塊タイプの注射または注入を受け、続いて抗腫瘍剤の注入を受けることができる。
化合物をいくつかの生物学的検定のうちの１つで試験して、薬理学的効果を得るのに必要な化合物の濃度を決定することができる。
【００３２】
ビトロネクチン結合の抑制
αｖβ３に対する固相［３Ｈ］−ＳＫ＆Ｆ−１０７２６０結合：緩衝液Ｔ（２ｍＭ  ＣａＣｌ２および１％オクチルグルコシドを含有）中ヒト胎盤またはヒト血小板αｖβ３（０．１−０．３ｍｇ／ｍＬ）を、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＭｎＣｌ２、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２（緩衝液Ａ）および０．０５％  ＮａＮ３を含有する緩衝液Ｔで希釈し、その後直ちに９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ）に各ウェルあたり０．１ｍＬで添加した。０．１−０．２μｇのαｖβ３を各ウェルごとに添加した。プレートを４℃で一夜インキュベートした。実験時に、ウェルを１回緩衝液Ａで洗浄し、同じ緩衝液中０．１ｍＬの３．５％ウシ血清アルブミンと共に室温で１時間インキュベートした。インキュベーション後、ウェルを完全に吸引し、０．２ｍＬの緩衝液Ａで２回洗浄した。
【００３３】
化合物を１００％ＤＭＳＯ中に溶解させて、２ｍＭストック溶液を得、これを結合緩衝液（１５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＭｎＣｌ２、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２で希釈し、最終化合物濃度を１００μＭとした。この溶液を次に所望の最終化合物濃度まで希釈する。種々の濃度の非標識拮抗物質（０．００１−１００μＭ）をウェルに三重複試験で添加し、続いて５．０ｎＭの［３Ｈ］−ＳＫ＆Ｆ−１０７２６０（６５−８６Ｃｉ／ミリモル）を添加した。
【００３４】
プレートを一時間室温でインキュベートした。インキュベーション後、ウェルを完全に吸引し、０．２ｍＬの氷冷緩衝液Ａで一回ウェルからウェルへのやり方で洗浄した。レセプターを０．１ｍＬの１％ＳＤＳで可溶化し、結合［３Ｈ］−ＳＫ＆Ｆ−１０７２６０を、ベックマンＬＳ液体シンチレーションカウンター中３ｍＬ  Ｒｅａｄｙ  Ｓａｆｅを添加して液体シンチレーションカウンティングにより定量し、効率４０％であった。［３Ｈ］−ＳＫ＆Ｆ−１０７２６０の非特異性結合を２μＭ  ＳＫ＆Ｆ−１０７２６０の存在下で測定し、一貫して全放射性リガンドインプットの１％未満であった。ＩＣ５０（［３Ｈ］−ＳＫ＆Ｆ−１０７２６０の結合を５０％抑制する拮抗物質の濃度）を、ＬＵＮＤＯＮ−２プログラムを変更した非直線、最小二乗曲線適合法により決定した。Ｋｉ（拮抗物質の解離定数）を、式：Ｋｉ＝ＩＣ５０／（１＋Ｌ／Ｋｄ）（ここに、ＬおよびＫｄはそれぞれ［３Ｈ］−ＳＫ＆Ｆ−１０７２６０の濃度および解離定数である）にしたがって計算した。
本発明の化合物は、ＳＫ＆Ｆ−１０７２６０に対するビトロネクチン結合をＫｉ＝約１．７ナノモルで抑制する。
【００３５】
本発明の化合物をさらに、欧州特許番号ＥＰ５２８５８７に開示されているピット形成検定などの骨形成の抑制を評価するために当該分野で標準的なインビトロおよびインビボ骨吸収検定について試験し、この試験はまたＷｒｏｎｓｋｉら、Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  １９９１、補遺１、６９−７４に記載されているようにラット破骨細胞のかわりにヒト破骨細胞、または卵巣摘出されたラットモデルを用いて行うこともできる。
【００３６】
血管平滑筋細胞移動検定
ラットまたはヒト大動脈平滑筋細胞を用いた。細胞移動をＴｒａｎｓｗｅｌｌ細胞培養チャンバー中で、８ｕｍの孔を有するポリカーボネート膜（Ｃｏｓｔａｒ）を用いてモニターした。フィルターの下部表面をビトロネクチンでコートした。細胞を２．５−５．０×１０６細胞／ｍＬの濃度で０．２％ウシ血清アルブミンを補足したＤＭＥＭ中に懸濁させ、種々の濃度の試験化合物で２０分間２０℃で予備処理した。溶媒単独を対照として用いた。０．２ｍＬの細胞懸濁液をチャンバーの上部コンパートメントに入れた。下部コンパートメントは、０．２％ウシ血清アルブミンを補足した０．６ｍＬのＤＭＥＭを含んでいた。インキュベーションを３７℃、９５％空気／５％ＣＯ２の大気中２４時間行った。インキュベーション後、フィルターの上部表面上の移動しなかった細胞を、静かに掻き取ることにより除去した。フィルターを次にメタノール中に固定し、１０％Ｇｉｅｍｓａ染料で染色した。ａ）フィルターの下部表面に移動した細胞の数を数えるか、またはｂ）１０％酢酸で染色された細胞を抽出し、続いて６００ｎＭでの吸光度を測定することによるかのいずれかで移動を測定した。
【００３７】
甲状腺副甲状腺切除したラットモデル
各実験群は、５−６匹の成熟オススプラグ−ドーリーラット（体重２５０−４００ｇ）からなる。ラットを使用の７日前に甲状腺副甲状腺切除する（販売業者による、Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍ）。すべてのラットに置換量のチロキシンを３日ごとに投与する。ラットが受容したら、循環するイオン化カルシウムレベルを、尾静脈穿刺によりヘパリン化チューブ中に抜き取った直後に全血において測定する。イオン化Ｃａレベル（Ｃｉｂａ−Ｃｏｒｎｉｎｇ６３４型ｐＨ分析器で測定）が１．２ｍＭ／Ｌより少ないラットは包含される。各ラットに、それぞれ試験物質を送達するため、および血液サンプリングのための埋め込んだ静脈および動脈カテーテルを装着する。ラットを次に無カルシウム食餌と脱イオン水を与える。ベースラインＣａレベルを測定し、各ラットに、対照ビヒクルまたはヒト甲状腺ホルモン１−３４ペプチド（ｈＰＴＨ１−３４、塩溶液／０．１％ウシ血清アルブミン中１．２５ｕｇ／ｋｇ／時の用量、Ｂａｃｈｅｍ、Ｃａ）またはｈＰＴＨ１−３４と試験物質の混合物のいずれかを、外部シリンジポンプを用いて静脈カテーテルから連続静脈内注入により投与する。各ラットのカルシウム血反応を６−８時間の注入期間中２時間間隔で測定する。
【００３８】
ヒト破骨細胞吸収および接着検定
ピット吸収および接着検定は、破骨細胞腫組織由来の正常ヒト破骨細胞を用いて開発され、標準化された。検定１はレーザー共焦点顕微鏡により破骨細胞ピット体積を測定するために開発された。検定２はより高いスループットスクリーンとして開発され、コラーゲンフラグメント（吸収中に放出される）を競合的ＥＬＩＳＡにより測定する。
【００３９】
検定１（レーザー共焦点顕微鏡を使用）
・ヒト破骨細胞腫由来の細胞懸濁液のアリコートを、液体窒素貯蔵器から取り出し、急速に３７℃で暖め、遠心分離（１０００ｒｐｍ、４℃で５分）によりＲＰＭＩ−１６４０培地中１回洗浄する。
・培地を吸引し、ネズミ抗−ＨＬＡ−ＤＲ抗体で置換し、次にＲＰＭＩ−１６４０培地中１：３に希釈する。懸濁液を氷上で３０分間インキュベートし、頻繁に混合する。
・細胞を冷ＲＰＭＩ−１６４０で２回洗浄し、続いて遠心分離（１０００ｒｐｍ、４℃で５分）し、細胞を滅菌１５ｍｌ遠心管に移す。単核細胞の数を改良Ｎｅｕｂａｕｅｒカウンティングチャンバー中で数える。
・ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｄｙｎａｌ、Ｇｒｅａｔ  Ｎｅｃｋ、ＮＹ）でコートした十分な磁気ビーズ（５／単核細胞）をその保存ビンから取り出し、５ｍｌの新鮮な培地中に移す（これにより有害なアジド保存料を洗い流す）。ビーズをマグネット上に固定することにより培地を除去し、新鮮な培地と交換する。
・ビーズを細胞と混合し、懸濁液を氷上３０分間インキュベートする。懸濁液を頻繁に混合する。
・ビーズコートした細胞をマグネット上に固定し、残りの細胞（破骨細胞豊富なフラクション）を滅菌５０ｍｌ遠心管中にデカントする。
・新鮮な培地をビーズコートした細胞に添加してトラップされた破骨細胞を除去する。この洗浄プロセスを１０回繰り返す。ビーズコートされた細胞を捨てる。
・生存細胞を標識するためにフルオレセイン二酢酸塩を用いて生存可能な破骨細胞をカウンティングチャンバー中で測定する。大内径の使い捨てプラスチック製パスツールピペットを用いてサンプルをチャンバーに添加する。
・破骨細胞を遠心分離によりペレット化し、密度を調節して、１０％ウシ胎仔血清および１．７ｇ／リットルの炭酸水素ナトリウムを補足したＥＭＥＭ培地中適当な数にする（破骨細胞の数は、腫瘍によりさまざまである）。
・細胞懸濁液の３ｍｌアリコート（化合物処理ごとに）を１５ｍｌ遠心管中にデカントする。細胞を遠心分離によりペレット化する。
・各管に、３ｍｌの適当な化合物処理を加える（ＥＭＥＭ培地中５０ｕＭに希釈）。適当なビヒクル対照、陽性対照（１００ｕｇ／ｍｌに希釈した抗ビトロネクチンレセプターネズミモノクローナル抗体［８７ＭＥＭ１］）およびイソタイプ対照（ＩｇＧ２ａ、１００ｕｇ／ｍｌに希釈）も組み入れる。サンプルを３７℃で３０分間インキュベートする。
・細胞の０．５ｍｌアリコートを４８−ウェルプレート中滅菌象牙質薄片上に接種し、３７℃で２時間インキュベートする。各処理を四重複試験においてスクリーンする。
・薄片を温ＰＢＳ（６−ウェルプレート中１０ｍｌ／ウェル）を６回交換して洗浄し、処理化合物または対照サンプルを含む新鮮な培地中に移す。サンプルを３７℃で４８時間インキュベートする。
酒石酸抵抗性酸ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）法（破骨細胞系の細胞の選択的染色）
・付着した破骨細胞を含む骨薄片をリン酸塩緩衝塩溶液中で洗浄し、２％グルタルアルデヒド中（０．２Ｍカコジル酸ナトリウム中）に５分間固定する。
・これを水中で洗浄し、４分間、ＴＲＡＰ緩衝液中、３７℃でインキュベートする（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中に溶解させ、０．２５Ｍクエン酸塩緩衝液（ｐＨ４．５）と混合した、１０ｍＭ酒石酸ナトリウムを含有する０．５ｍｇ／ｍｌナフトールＡＳ−ＢＩリン酸塩）。
・冷水中で洗浄した後、薄片を、１ｍｇ／ｍｌファーストレッドガーネットを含む冷酢酸塩緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ６．２）中に浸漬し、４℃で４分インキュベートする。
・過剰の緩衝液を吸引し、薄片を水中で洗浄した後に風乾する。
・ＴＲＡＰ陽性破骨細胞（赤煉瓦色／紫色沈殿）を明視野顕微鏡により数え、超音波処理により象牙質表面から除去する。
・Ｎｉｋｏｎ／Ｌａｓｅｒｔｅｃ  ＩＬＭ２１Ｗ共焦点顕微鏡を用いてピット体積を測定する。
【００４０】
検定２（ＥＬＩＳＡ表示を使用）
検定１の初めの９工程において記載したように化合物をスクリーンするためにヒト破骨細胞を濃縮し、調製する。明らかにするために、これらの工程を以下に繰り返し記載する。
・ヒト破骨細胞腫由来の細胞懸濁液のアリコートを、液体窒素貯蔵器から取り出し、急速に３７℃で暖め、遠心分離（１０００ｒｐｍ、４℃で５分）によりＲＰＭＩ−１６４０培地中１回洗浄する。
・培地を吸引し、ネズミ抗−ＨＬＡ−ＤＲ抗体で置換し、次にＲＰＭＩ−１６４０培地で１：３に希釈する。懸濁液を氷上で３０分間インキュベートし、頻繁に混合する。
・細胞を冷ＲＰＭＩ−１６４０で２回洗浄し、続いて遠心分離（１０００ｒｐｍ、４℃で５分）し、細胞を滅菌１５ｍｌ遠心管に移す。単核細胞の数を改良Ｎｅｕｂａｕｅｒカウンティングチャンバー中で数える。
・ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｄｙｎａｌ、Ｇｒｅａｔ  Ｎｅｃｋ、ＮＹ）でコートした十分な磁気ビーズ（５／単核細胞）をその保存ビンから取り出し、５ｍｌの新鮮な培地中に移す（これにより有害なアジド保存料を洗い流す）。ビーズをマグネット上に固定することにより培地を除去し、新鮮な培地と置換する。
・ビーズを細胞と混合し、懸濁液を氷上３０分間インキュベートする。懸濁液を頻繁に混合する。
・ビーズコートした細胞をマグネット上に固定し、残りの細胞（破骨細胞豊富なフラクション）を滅菌５０ｍｌ遠心管中にデカントする。
・新鮮な培地をビーズコートした細胞に添加してトラップされた破骨細胞を除去する。この洗浄プロセスを１０回繰り返す。ビーズコートされた細胞を捨てる。
・生存細胞を標識するためにフルオレセイン二酢酸塩を用いて生存可能な破骨細胞をカウンティングチャンバー中で測定する。大内径の使い捨てプラスチックパスツールピペットを用いてサンプルをチャンバーに添加する。
・破骨細胞を遠心分離によりペレット化し、密度を調節して、１０％ウシ胎仔血清および１．７ｇ／リットルの炭酸水素ナトリウムを補足したＥＭＥＭ培地中適当な数にする（破骨細胞の数は、腫瘍によりさまざまである）。
検定１に記載した方法に対して、化合物を４回分でスクリーンして、以下に概要を記載するようにしてＩＣ５０を得る：
・破骨細胞調製物を３０分間３７℃で試験化合物（４回分）または対照と共にプレインキュベートする。
・これらを次に、４８ウェル組織培養プレートのウェル中のウシ皮質骨薄片上に接種し、さらに２時間３７℃でインキュベートする。
・骨薄片を温リン酸塩緩衝塩溶液（ＰＢＳ）を６回交換して洗浄して、非接着細胞を除去し、新鮮な化合物または対照を含む４８ウェルプレートのウェルに戻す。
・組織培養プレートを４８時間３７℃でインキュベートする。
・各ウェルからの上清を各試験管中に吸引し、吸収プロセス中に放出されるＩ型コラーゲンのｃ−テロペプチドを検出する競合的ＥＬＩＳＡにおいてスクリーンする。これは、Ｉ型コラーゲンのａ１−鎖のカルボキシ末端テロペプチド中に存在する８−アミノ酸配列（Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）と特異的に反応するウサギ抗体を含む商業的に入手可能なＥＬＩＳＡ（Ｏｓｔｅｏｍｅｔｅｒ、デンマーク）である。結果を、ビヒクル対照と比較した吸収の抑制率（％）で表す。
【００４１】
ヒト破骨細胞接着試験
ヒト破骨細胞を増殖させ、検定１の初めの９工程においてすでに記載したようにして化合物スクリーニングのために調製する。明らかにするために、これらの工程を以下に繰り返し記載する。
【００４２】
・ヒト破骨細胞腫由来の細胞懸濁液のアリコートを、液体窒素保管所から取り出し、急速に３７℃で暖め、遠心分離（１０００ｒｐｍ、４℃で５分）によりＲＰＭＩ−１６４０培地中１回洗浄する。
・培地を吸引し、ネズミ抗−ＨＬＡ−ＤＲ抗体で置換し、次にＲＰＭＩ−１６４０培地中１：３に希釈する。懸濁液を氷上で３０分間インキュベートし、頻繁に混合する。
・細胞を冷ＲＰＭＩ−１６４０で２回洗浄し、続いて遠心分離（１０００ｒｐｍ、４℃で５分）し、細胞を滅菌１５ｍｌ遠心管に移す。単核細胞の数を改良Ｎｅｕｂａｕｅｒカウンティングチャンバー中で数える。
・ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｄｙｎａｌ、Ｇｒｅａｔ  Ｎｅｃｋ、ＮＹ）でコートした十分な磁気ビーズ（５／単核細胞）をその保存ビンから取り出し、５ｍｌの新鮮な培地中に移す（これにより有害なアジド保存料を洗い流す）。ビーズをマグネット上に固定することにより培地を除去し、新鮮な培地と置換する。
・ビーズを細胞と混合し、懸濁液を氷上３０分間インキュベートする。懸濁液を頻繁に混合する。
・ビーズコートした細胞をマグネット上に固定し、残りの細胞（破骨細胞豊富なフラクション）を滅菌５０ｍｌ遠心管中にデカントする。
・新鮮な培地をビーズコートした細胞に添加してトラップされた破骨細胞を除去する。この洗浄プロセスを１０回繰り返す。ビーズコートされた細胞を捨てる。
・生存細胞を標識するためにフルオレセイン二酢酸塩を用いて生存破骨細胞をカウンティングチャンバー中で測定する。大内径の使い捨てプラスチックパスツールピペットを用いてサンプルをチャンバーに添加する。
・破骨細胞を遠心分離によりペレット化し、密度を調節して、１０％ウシ胎仔血清および１．７ｇ／リットルの炭酸水素ナトリウムを補足したＥＭＥＭ培地中適当な数にする（破骨細胞の数は、腫瘍によりさまざまである）。
・破骨細胞腫由来の破骨細胞を化合物（４回分）または対照と共に３７℃で３０分間プレインキュベートする。
・細胞を次にオステオポンチンでコートしたスライド（ヒトまたはラットオステオポンチン、２．５ｕｇ／ｍｌ）上に接種し、２時間３７℃でインキュベートする。
・リン酸塩緩衝塩溶液中でスライドを激しく洗浄することにより非接着細胞を除去し、スライド上に残存する細胞をアセトン中に固定する。
・破骨細胞を、このフェノタイプの細胞の選択的マーカーである酒石酸抵抗性酸ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）について染色し（工程１５〜１７を参照のこと）、光学顕微鏡により数える。結果をビヒクル対照と比較した接着の抑制率（％）で表す。
【００４３】
細胞接着検定
細胞および細胞培養物
ヒト胚腎臓細胞（ＨＥＫ２９３細胞）をＡＴＣＣから入手した（カタログ番号ＣＲＬ１５７３）。細胞を、Ｅａｒｌ塩、１０％ウシ胎仔血清、１％グルタミンおよび１％ペニシリン−ストレプトマイシンを含有するＥａｒｌの最小基本培地（ＥＭＥＭ）中で増殖させた。
【００４４】
構築およびトランスフェクション
αｖサブユニットの３．２ＫＢ  ＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩフラグメントおよびβ３サブユニットの２．４ｋｂＸｂａＩ−ＸｈｏＩフラグメントを、ＣＭＶプロモーターおよびＧ４１８選択マーカーを含有するＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＶクローニングサイト中に平滑末端結紮により挿入した。安定な発現のために、８０×１０６ＨＥＫ２９３細胞を、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒを用いてαｖ＋β３構築物（各サブユニットのＤＮＡ２０μｇ）で電気形質転換し（Ｈｅｎｓｌｅｙら、１９４４）、１００ｍｍプレート中にプレートした（５×１０５細胞／プレート）。４８時間後、増殖培地を４５０μｇ／ｍＬのＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｇ４１８スルフェート、ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）で補足した。コロニーが分析できるほど大きくなるまで細胞を選択培地中に維持した。
【００４５】
トランスフェクトされた細胞の免疫細胞化学分析
ＨＥＫ２９３形質転換体がビトロネクチンレセプターを発現したがどうかを確認するために、細胞を遠心分離によりガラス製顕微鏡スライド上に固定し、アセトン中２分間室温で固定し、風乾した。２３Ｃ６、αｖβ３複合体に対して特異的なモノクローナル抗体との特異的反応性を、標準的間接的免疫蛍光法を用いて証明した。
【００４６】
細胞接着研究
コーニング９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを０．１ｍＬのヒトビトロネクチン（ＲＰＭＩ培地中０．２μｇ／ｍＬ）で４℃で一夜プレコートした。実験時に、プレートを１回ＲＰＭＩ培地で洗浄し、ＲＰＭＩ培地中３．５％ＢＳＡで１時間室温でブロックした。トランスフェクトした２９３細胞を、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４および０．１％ＢＳＡで補足したＲＰＭＩ８培地中に０．５×１０６細胞／ｍＬの密度で再懸濁させた。０．１ｍＬの細胞懸濁液を各ウェルに添加し、種々のαｖβ３拮抗物質の存在下または非存在下で１時間３７℃でインキュベートした。インキュベーション後、０．０２５ｍＬの１０％ホルムアルデヒド溶液（ｐＨ７．４）を添加し、細胞を室温で１０分間固定した。プレートを３回０．２ｍＬのＲＰＭＩ培地で洗浄し、接着細胞を０．１ｍＬの０．５％トルイジンブルーで２０分間室温で染色した。脱イオン水でよく洗浄することにより過剰の染料を除去した。細胞中に組み入れられたトルイジンブルーを、０．１ｍＬの５０％エタノールを含有する５０ｍＬ  ＨＣｌを添加することにより溶出させる。細胞接着を、マイクロタイタープレートリーダー（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ  Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ＭＣ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、ＶＡ）で６００ｎｍの光学密度で定量化した。
【００４７】
固相αｖβ５結合検定：
ビトロネクチンレセプターαｖβ５をヒト胎盤から精製した。レセプター調製物を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＭｎＣｌ２、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２（緩衝液Ａ）で希釈し、直ちに９６−ウェルＥＬＩＳＡプレートに各ウェルあたり０．ｍｌで添加した。０．１〜０．２μｇのαｖβ５をウェルごとに添加した。プレートを一夜４℃でインキュベートした。実験時に、ウェルを緩衝液Ａで１回洗浄し、同じ緩衝液中０．１ｍｌの３．５％ウシ血清アルブミンとともに１時間室温でインキュベートした。インキュベーション後、ウェルを完全に吸引し、０．２ｍｌの緩衝液Ａで２回洗浄した。
【００４８】
［３Ｈ］−ＳＫ＆Ｆ−１０７２６０競合検定において、種々の濃度の未標識拮抗物質（０．００１〜１００μＭ）をウェルに添加し、続いて５．０ｎＭの［３Ｈ］−ＳＫ＆Ｆ−１０７２６０を添加した。プレートを１時間室温でインキューベートした。インキュベーション後、ウェルを完全に吸引し、０．２ｍｌの氷冷緩衝液Ａでウェルからウェルへのやり方で洗浄した。レセプターを０．１ｍｌの１％ＳＤＳで可溶化し、結合［３Ｈ］−ＳＫ＆Ｆ−１０７２６０を、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＬＳ６８００液体シンチレーションカウンターで３ｍｌのＲｅａｄｙ  Ｓａｆｅを添加して液体シンチレーションカウンティングにより定量した（効率４０％）。［３Ｈ］−ＳＫ＆Ｆ−１０７２６０の非特異的結合を、２μＭの［３Ｈ］−ＳＫ＆Ｆ−１０７２６０の存在下で定量し、一貫して全放射性リガンドインプットの１％未満であった。ＩＣ５０（［３Ｈ］−ＳＫ＆Ｆ−１０７２６０の結合を５０％抑制する拮抗物質の濃度）を、ＬＵＮＤＯＮ−２プログラムを変更した非直線最小二乗曲線適合ルーチンにより決定した。Ｋｉ（拮抗物質の解離定数）を、ＣｈｅｎｇおよびＰｒｕｓｏｆｆ式：Ｋｉ＝ＩＣ５０／（１＋Ｌ／Ｋｄ）（ここに、ＬおよびＫｄはそれぞれ［３Ｈ］−ＳＫ＆Ｆ−１０７２６０の濃度および解離定数である）にしたがって計算した。
【００４９】
ＲＧＤ−媒介ＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａ結合の抑制
ＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａの精製
１０単位の古い、洗浄したヒト血小板（赤十字より入手）を、３％オクチルグルコシド、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２中、４℃で２時間穏やかに撹拌することにより溶解させた。溶菌液を１０００００ｇで１時間遠心分離した。得られた上清を、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、１％オクチルグルコシド（緩衝液Ａ）で予備平衡化した５ｍＬのレンズ豆レクチンセファロース４Ｂカラム（Ｅ．Ｙ．Ｌａｂｓ）にかけた。２時間インキュベートした後、カラムを５０ｍＬの冷緩衝液Ａで洗浄した。レクチン保持ＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａを１０％デキストロースを含有する緩衝液Ａで溶出させた。すべての手順は４℃で行った。得られたＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａの純度は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によると＞９５％であった。
【００５０】
リポソーム中のＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａの取り込み
ホルファチジルセリン（７０％）とホスファチジルコリン（３０％）の混合物（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）を窒素気流下ガラス製試験管の壁面に乾燥させる。精製されたＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａを最終濃度０．５ｍｇ／ｍＬに希釈し、タンパク質：リン脂質の比１：３（ｗ：ｗ）でリン脂質と混合した。混合物を再懸濁させ、バスソニケーターで５分間音波処理した。混合物を次に一夜１２０００〜１４０００分子量カットオフ透析管を用いて１０００倍過剰の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２（２回交換）に対して一夜透析した。ＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａ含有リポソームを１２０００ｇで１５分間遠心分離し、透析緩衝液中最終タンパク質濃度約１ｍｇ／ｍｌで再懸濁させた。リポソームを−７０℃で必要になるまで保存した。
【００５１】
ＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａに対する競合結合
フィブリノゲンレセプター（ＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａ）に対する結合を、ＲＧＤタイプリガンドとして［３Ｈ］−ＳＫ＆Ｆ−１０７２６０を用いた間接的競合結合法により試験した。結合試験は、９６−ウェルフィルトレーションアセンブリー（Ｍｉｌｌｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）中で０．２２ｕｍ親水性ｄｕｒａｐｏｒｅ膜を用いて行った。ウェルを０．２ｍＬの１０μｇ／ｍＬのポリリシン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｕｉｓ、ＭＯ）で室温で１時間プレコートして非特異的結合をブロックした。種々の濃度の未標識ベンズアゼピンをウェルに四重複試験で添加した。［３Ｈ］−ＳＫ＆Ｆ−１０７２６０を各ウェルに最終濃度４．５ｎＭで添加し、続いて１μｇの精製した血小板ＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａ含有リポソームを添加した。混合物を１時間室温でインキュベートした。ＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａ結合［３Ｈ］−ＳＫ＆Ｆ−１０７２６０を未結合からＭｉｌｌｉｐｏｒｅフィルトレーションマニフォールドを用いた濾過により分離し、続いて氷冷緩衝液で洗浄した（２回、それぞれ０．２ｍＬ）。フィルター上に残存する結合放射能をＢｅｃｋｍａｎ液体シンチレーションカウンター（ＬＳ６８００型）で１．５ｍＬ  Ｒｅａｄｙ  Ｓｏｌｖｅ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ）中で計数した（効率４０％）。非特異性結合を２μＭ未標識ＳＫ＆Ｆ−１０７２６０の存在下で測定し、一貫してサンプルに添加された全放射能の０．１４％未満であった。すべてのデータは四重複測定値の平均である。
【００５２】
競合結合データを非直線最小二乗曲線適合法により分析した。この方法により、拮抗物質のＩＣ５０（［３Ｈ］−ＳＫ＆Ｆ−１０７２６０の特異的結合を平衡状態で５０％抑制する拮抗物質濃度）が得られる。ＩＣ５０は、ＣｈｅｎｇおよびＰｒｕｓｏｆｆ式：Ｋｉ＝ＩＣ５０／（１＋Ｌ／Ｋｄ）（ここに、Ｌは競合的結合試験において用いられる［３Ｈ］−ＳＫ＆Ｆ−１０７２６０の濃度（４．５ｎＭ）であり、ＫｄはＳｃａｔｃｈａｒｄ分析により測定すると４．５ｎＭである［３Ｈ］−ＳＫ＆Ｆ−１０７２６０の解離定数である）に基づく拮抗物質の平衡解離定数（Ｋｉ）に関連する。
【００５３】
式（Ｉ）の化合物の単独または抗腫瘍薬との組み合わせにおける有効性をいくつかの移植可能なマウス腫瘍モデルを用いて測定することができる。これらのモデルの詳細については米国特許第５００４７５８号および第５６３３０１６号を参照のこと。
以下の実施例は本発明の範囲を制限するためのものではなく、本発明の化合物の調製法および使用法を説明するためのものである。多くの他の例は当業者には容易に明らかである。
【００５４】
実施例
一般則
プロトン核磁気共鳴（１Ｈ  ＮＭＲ）スペクトルを３００ＭＨｚで記録し、化学シフトは内標トリメチルシラン（ＴＭＳ）からダウンフィールドｐｐｍ（δ）で記録する。ＮＭＲデータについての略号は以下の通りである：ｓ＝シングレット、ｄ＝ダブレット、ｔ＝トリプレット、ｑ＝カルテット、ｍ＝マルチプレット、ｄｄ＝ダブレットのダブレット、ｄｔ＝トリプレットのダブレット、ａｐｐ＝明確、ｂｒ＝ブロード。Ｊはヘルツで測定されたＮＭＲカップリング定数を示す。ＣＤＣｌ３は重クロロホルム、ＤＭＳＯ−ｄ６は六重水素化ジメチルスルホキシド、ＣＤ３ＯＤは四重水素化メタノールである。質量スペクトルは、エレクトロスプレー（ＥＳ）イオン化技術を用いて得た。元素分析は、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ、ＮＪにより行われた。融点は、Ｔｈｏｍａｓ−Ｈｏｏｖｅｒ融点装置で測定し、未補正である。すべての温度は摂氏度で記載する。Ａｎａｌｔｅｃｈ  Ｓｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ  ＧＦおよびよびＥ．Ｍｅｒｃｋ  Ｓｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ６０Ｆ−２５４薄層プレートを薄層クロマトグラフィーに用いた。フラッシュクロマトグラフィーは、Ｅ．Ｍｅｒｃｋ  Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ  ６０（２３０−４００メッシュ）シリカゲル上で行った。分析および分取ＨＰＬＣをベックマンクロマトグラフ上で行った。ＯＤＳはオクタデシルシリル誘導化シリカゲルクロマトグラフィー支持体である。ＹＭＣ  ＯＤＳ−ＡＱはＯＤＳクロマトグラフィー支持体であり、ＹＭＣ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．（京都、日本）の登録商標である。ＰＲＰ−１はポリマー（スチレンジビニルベンゼン）クロマトグラフィー支持体であり、Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｃｏ．、（リーノ、ネバダ）の登録商標である。セライトは、酸洗浄した珪藻土シリカからなる濾過助剤であり、Ｍａｎｖｉｌｌｅ  Ｃｏｒｐ．（デンバー、コロラド）の登録商標である。
【００５５】
調製１
２−（５，６，７，８−テトラヒドロ−１，８−ナフチリジン−２−イル）−１−エタノールの調製
ａ）２−メチル−８−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，８−ナフチリジン
２−メチル−１，８−ナフチリジン（Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（Ｃ）１９６６、３１５；５．１３ｇ、３５．５８ミリモル）、１０％  Ｐｄ／Ｃ（１．１４ｇ、１．０７ミリモル）、および無水ＥｔＯＨ（７０ｍＬ）の混合物を３回の真空排気／Ｈ２パージサイクルにより脱酸素化し、その後Ｈ２バルーン下で激しく撹拌した。１８．５時間後、混合物をセライトを通して濾過し、フィルターパッドを連続して無水ＥｔＯＨおよびＥｔＯＡｃで洗浄した。濾液を濃縮乾固させ、残渣をＥｔＯＡｃから再濃縮して、灰白色固体（５．２５ｇ）が残る。
前記物質（５．２５ｇ）、ジ炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（１５．５３ｇ、７１．１６ミリモル）、およびＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）の溶液をｒｏｔａｖａｐで濃縮して溶媒を除去し、油状残渣を５５−６０℃に設定した浴中Ｎ２下で加熱した。４５時間後、反応を室温に冷却し、残渣をシリカゲル上フラッシュクロマトグラフィーにかけた（４０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）。標記化合物（４．９０ｇ、５５％）を淡黄色固体として得た：１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ７．２７（ｄ、Ｊ＝７．６Ｈｚ、１Ｈ）、６．８１（ｄ、Ｊ＝７．６Ｈｚ、１Ｈ）、３．６９−３．７９（ｍ、２Ｈ）、２．６５−２．７５（ｍ、２Ｈ）、２．４８（ｓ、３Ｈ）、１．８３−１．９８（ｍ、２Ｈ）、１．５２（ｓ、９Ｈ）；ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｅ２４９（Ｍ＋Ｈ）＋
【００５６】
ｂ）［８−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，８−ナフチリジン−２−イル］酢酸エチル
ジイソプロピルアミン（７．２４ｍＬ、５５．３ミリモル）の乾燥ＴＨＦ（５０ｍＬ）中溶液に、ｎ−ＢｕＬｉ（ヘキサン中２．５Ｍ、２２ｍＬ、５５．３ミリモル）を０℃で滴下した。１５分後、この溶液を、２−メチル−８−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，８−ナフチリジン（４．９ｇ、１９．７ミリモル）および炭酸ジエチル（８．８６ｍＬ、７３．０ミリモル）の乾燥ＴＨＦ（５０ｍＬ）中溶液に−７８℃で滴下した。３０分後、混合物を飽和ＮＨ４Ｃｌ（１００ｍＬ）で急冷し、室温に暖め、ＥｔＯＡｃで抽出した（３×２００ｍＬ）。合した有機抽出物をＭｇＳＯ４上で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲル上クロマトグラフィー（４０％ＥｔＯＨ／ヘキサン）にかけて、淡黄色油状の標記化合物（５．７２ｇ、９１％）を得た：ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｅ  ３２１（Ｍ＋Ｈ）＋
【００５７】
ｃ）２−（５，６，７，８−テトラヒドロ−１，８−ナフチリジン−２−イル）−１−エタノール
室温の［８−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，８−ナフチリジン−２−イル］酢酸エチル（５．７２ｇ、１７．８５ミリモル）の乾燥ＴＨＦ（８０ｍＬ）中溶液にＬｉＢＨ４（ＴＨＦ中２．０Ｍ、１０．７ｍＬ、２１．４２ミリモル）を添加し、得られた混合物を還流温度に加熱した。１８時間後、混合物を０℃に冷却し、Ｈ２Ｏ（１００ｍ）で慎重に急冷した。１０分後、混合物をＥｔＯＡｃで抽出した（３×１００ｍＬ）。合した有機抽出物をＭｇＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。
前記残渣（４．９ｇ）をＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）中に溶解させた。これにジオキサン中４Ｎ  ＨＣｌ（２０ｍＬ）を一度に室温で添加した。４後、混合物を減圧下で濃縮した。残渣を１．０Ｎ  ＮａＯＨと飽和ＮａＣｌの１：１混合物（１００ｍＬ）中に溶かし、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した（３×１００ｍＬ）。合した有機抽出物をＭｇＳＯ４上で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲル上クロマトグラフィー（１：１  ＥｔＯＡｃ／ＣＨＣｌ３中１０％ＭｅＯＨ）にかけて、黄色固体の標記化合物（２．０９ｇ、６６％）を得た：ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｅ  １７９（Ｍ＋Ｈ）＋
【００５８】
調製２
（±）−１０，１１−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−５Ｈ−ジベンゾ［ａ，ｄ］シクロヘプテン−１０−酢酸エチルの調製
ａ）６−メトキシ−１−フェニリデン
アルゴン雰囲気下、常温で、３．０ＭフェニルマグネシウムブロミドのＥｔ２Ｏ中溶液（６８０ｍＬ、２．０４モル）を撹拌しながらＥｔ２Ｏ（７００ｍＬ）で希釈し、６−メトキシ−１−インダノン（２７７ｇ、１．７１モル）のＴＨＦ（１４００ｍＬ）中溶液を１時間かけて滴下した。反応混合物を常温で２時間撹拌し、撹拌しながらＮＨ４Ｃｌ（２．８Ｌ）中に注いだ。Ｈ２Ｏ（１．４Ｌ）を添加し、有機層を分離した。水性相をＥｔ２Ｏで抽出し（２×１Ｌ）、合した有機抽出物を濃縮して、褐色油状の粗６−メトキシ−１−フェニル−１−インダノール（４４５ｇ）を得た。この油状物をトルエン（２．５Ｌ）中に溶解させ、ｐ−トルエンスルホン酸一水和物（１２．３ｇ、０．０６５ミリモル）を添加した。溶液を撹拌し、凝縮器付ディーンスタークトラップを用いて還流温度で１６時間加熱した。Ｈ２Ｏの収集量は２時間後に最少で、合計２８ｍＬであった。溶液を冷却し、連続して５％水性Ｎａ２ＣＯ３（１Ｌ）およびＨ２Ｏ（２×１Ｌ）で抽出した。有機層を濃縮して、暗褐色油状物（４００ｇ）を得た。この油状物を真空下で蒸留して、黄色油状の標記化合物（２９８．２ｇ、７９％）を得た：沸点１５２−１９０℃／２．０  Ｔｏｒｒ  ＴＬＣ（１０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）Ｒｆ０．７５。
【００５９】
ｂ）２−ベンゾイル−４−メトキシフェニル酢酸
アセトン（４．２Ｌ）を１０℃に冷却し、６−メトキシ−１−フェニリデン（２７１ｇ、１．２２モル）のアセトン（１．８Ｌ）中溶液を１．５時間かけてジョーンズ試薬（１．８Ｌ、ＣｒＯ３（４７０ｇ、４．７０モル）、Ｈ２Ｏ（１Ｌ）、および濃Ｈ２ＳＯ４（４０５ｍＬ）から調製）と同時に添加した。４％水性ＯｓＯ４（１５３ｍＬ）を得られた混合物に２回に分けて添加し、１回目は添加の開始時に、２回目は添加の中間点で反応混合物の温度を１５℃より低く保ちながら添加した。添加後、反応混合物を２２℃に暖め、１．５時間撹拌し、この間、穏やかな発熱反応により温度が２８℃に上昇した。反応混合物を２０℃より低く冷却し、イソプロパノール（１Ｌ）をはじめは滴下し、初期発熱が減少した後は急速に添加した。この時期中、撹拌が困難になった。イソプロパノールの添加中、温度は３２℃に達した。Ｈ２Ｏ（２Ｌ）を添加し、混合物を分液漏斗に移した。追加のＨ２Ｏを添加して、沈殿したクロモ酸を溶解させ、混合物をＣＨ２Ｃｌ２（２Ｌ）で抽出した。有機層（上層）を分離し、水性相をＣＨ２Ｃｌ２で抽出した（２×１Ｌ）。合したＣＨ２Ｃｌ２抽出物を連続してＨ２Ｏ（２Ｌ）および飽和食塩水（２Ｌ）で洗浄し、次に濃縮して、湿潤灰色固体（４１６ｇ）を得た。これを、アセトンおよびＥｔＯＡｃの混合物で磨砕し、濾過し、乾燥して、灰白色固体の標記化合物（２２５．４ｇ、７１％）を得た：融点１５８−１５９℃。
【００６０】
ｃ）２−ベンジル−４−メトキシフェニル酢酸
２−ベンゾイル−４−メトキシフェニル酢酸（２１５．５ｇ、０．８０モル）を二等分し、それぞれを２．５Ｌ耐圧ビン中氷酢酸（１．５Ｌ）中に溶解させた。５％Ｐｄ／Ｃ（１０ｇ、０．００４８モル）をそれぞれに添加し、各混合物を水素雰囲気下Ｐａｒｒ装置で常温で振盪した。２．５時間後、混合物を濾過して触媒を除去し、フィルターパッドをＥｔＯＡｃで洗浄した。合した濾液を濃縮して、濃黄色油状の標記化合物（２１５ｇ、定量的）を得、これを静置すると結晶化した：１Ｈ  ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ７．０５−７．３５（ｍ、６Ｈ）、６．７７（ｄｄ、Ｊ＝８．３、２．７Ｈｚ、１Ｈ）、６．７１（ｄ、Ｊ＝２．７Ｈｚ、１Ｈ）、４．００（ｓ、２Ｈ）、３．７６（ｓ、３Ｈ）、３．５４（ｓ、２Ｈ）。
【００６１】
ｄ）１０，１１−ジヒドロ−３−メトキシ−５Ｈ−ジベンゾ［ａ，ｄ］シクロヘプテン−１０−オン
２−ベンジル−４−メトキシフェニル酢酸（２０４．６ｇ（０．８０モル）の純粋な物質を含む２１５ｇの粗物質）のＣＨ２Ｃｌ２（１Ｌ）中溶液をアルゴン雰囲気下、常温で撹拌し、ＤＭＦ（１ｍＬ）を添加し、続いて塩化オキサリル（４００ｍＬ、４．５９モル）を添加した。塩化オキサリルを１時間かけて添加し、激しい気体の発生を抑制するためにはじめは滴下した。溶液を１６時間常温で撹拌し、次に濃縮して、黄色液体の粗酸塩化物（２０７．７ｇ、０．７５６モル、９５％）を得た。この液体をＣＨ２Ｃｌ２中に溶解させて全体積を５００ｍＬにし、溶液およびＡｌＣｌ３（１００．８ｇ、０．７５６モル）を同時に１時間かけてＣＨ２Ｃｌ２（３．７Ｌ）にアルゴン雰囲気下、常温で撹拌しながら添加した。温度は添加完了時で２８℃であった。反応混合物を常温で１６時間撹拌し、この間に固体が沈殿した。Ｈ２Ｏ（１Ｌ）を、初めは滴下して３０分かけて添加した。混合物を分離し、有機相を連続してＨ２Ｏ（１Ｌ）および５％水性ＮａＨＣＯ３（１Ｌ）で洗浄した。ＣＨ２Ｃｌ２溶液を濃縮して、黄色固体（１７５．３ｇ）を得た。ＥｔＯＡｃ／ヘキサンから再結晶して、標記化合物（１２８ｇ、７１％）を得た：融点１０７−１０９℃。
【００６２】
ｅ）（±）−１０，１１−ジヒドロ−１０−ヒドロキシ−３−メトキシ−５Ｈ−ジベンゾ［ａ，ｄ］シクロヘプテン−１０−酢酸エチル
リチウムビス（トリメチルシリル）アミドのヘキサン中１．０Ｍ溶液（１２８２ｍＬ、１．２８２モル）をＴＨＦ（４．０Ｌ）に−７０℃、アルゴン雰囲気下で添加し、その後ＥｔＯＡｃ（１４６ｍＬ、１．４９モル）を２０分かけて滴下した。反応混合物を１５分間撹拌し、次に、Ｎ，Ｎ、Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（３７８ｍＬ、２．５モル）を２０分かけて添加した。反応混合物を１０分間撹拌し、次に１０，１１−ジヒドロ−３−メトキシ−５Ｈ−ジベンゾ［ａ，ｄ］シクロヘプテン−１０−オン（１１９．２ｇ、０．５０モル）の無水ＴＨＦ（１．２６Ｌ）中溶液を４０分かけて滴下した。これらすべての添加中、温度を−６５℃より低く維持した。反応混合物を−６５℃ないし−７０℃で２０分間撹拌し、飽和水性ＮＨ４Ｃｌ（６．２Ｌ）中に激しく撹拌しながら注いだ。有機層を分離し、水性相をＥｔＯＡｃで抽出した（２×１Ｌ）。合した有機抽出物をＨ２Ｏで洗浄し（２×１Ｌ）、濃縮して、淡褐色油状物（１７５ｇ）を得た。薄層クロマトグラフィー（２０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）は、主Ｒｆ０．５（所望の生成物）および副Ｒｆ０．７（回収されたケトン）を示した。粗生成物をシリカゲル（２ｋｇ、１０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）上クロマトグラフィーにかけて、黄色油状の標記化合物（１０１ｇ、６１％）を得た：１Ｈ  ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ７．６３（ｄ、Ｊ＝７．７Ｈｚ、１Ｈ）、７．００−７．３０（ｍ、４Ｈ）、６．８０（ｄ、Ｊ＝２．６Ｈｚ、１Ｈ）、６．６９（ｄｄ、Ｊ＝８．２、２．６Ｈｚ、１Ｈ）、３．９５−４．３５（ｍ、２Ｈ）、４．０７（ｓ、２Ｈ）、３．７６（ｓ、３Ｈ）、３．６８（ｓ、１Ｈ）、３．６４（ｄ、Ｊ＝１４．２Ｈｚ、１Ｈ）、３．３５（ｄ、Ｊ＝１４．２Ｈｚ、１Ｈ）、２．７９（ｄ、Ｊ＝１６．０Ｈｚ、１Ｈ）、２．６６（ｄ、Ｊ＝１６．０Ｈｚ、１Ｈ）、１．２２（ｔ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、３Ｈ）。
【００６３】
ｆ）（±）−１０，１１−ジヒドロ−３−メトキシ−５Ｈ−ジベンゾ［ａ，ｄ］シクロヘプテン−１０−酢酸エチル
（±）−１０，１１−ジヒドロ−１０−ヒドロキシ−３−メトキシ−５Ｈ−ジベンゾ［ａ，ｄ］シクロヘプテン−１０−酢酸エチル（１０１ｇ、０．３１モル）を氷酢酸（１．８Ｌ）中に溶解させ、１２Ｎ  ＨＣｌ（２８．５ｍＬ、０．３４モル）を添加した。５％Ｐｄ／Ｃ（２０ｇ、０．００９４モル）を含む２．５Ｌ耐圧ビン中に混合物を入れ、得られた混合物を３５℃で水素雰囲気下、ジャケットヒーターを備えたＰａｒｒ水素化装置で振盪した。１８時間後、反応を常温に冷却し、濾過により触媒を除去した。濾液を濃縮して淡黄色油状物（８５．１ｇ）を得た。これをシリカゲル上クロマトグラフィー（２ｋｇ、５％から１０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンを用いた段階的勾配）にかけて、油状の標記化合物（６９．１ｇ、７２％）を得た：１Ｈ  ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ７．０５−７．２２（ｍ、４Ｈ）、７．０１（ｄ、Ｊ＝８．２Ｈｚ、１Ｈ）、６．７６（ｄ、Ｊ＝２．７Ｈｚ、１Ｈ）、６．６７（ｄｄ、Ｊ＝８．２、２．７Ｈｚ、１Ｈ）、４．３０（ｄ、Ｊ＝１５．０Ｈｚ、１Ｈ）、４．１１−４．２５（ｍ、２Ｈ）、３．８５（ｄ、Ｊ＝１５．０Ｈｚ、１Ｈ）、３．７０−３．９０（ｍ、１Ｈ）、３．７７（ｓ、３Ｈ）、３．３１（ｄｄ、Ｊ＝１５．０、４．１Ｈｚ、１Ｈ）、２．９３（ｄｄ、Ｊ＝１５．０、９．２Ｈｚ、１Ｈ）、２．６４（ｄｄ、Ｊ＝１５．６，５．０Ｈｚ、１Ｈ）、２．５２（ｄｄ、Ｊ＝１５．６、９．３Ｈｚ、１Ｈ）、１．２７（ｔ、Ｊ＝７．１Ｈｚ、３Ｈ）。
【００６４】
ｇ）（±）−１０，１１−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−５Ｈ−ジベンゾ［ａ，ｄ］シクロヘプテン−１０−酢酸エチル
（±）−１０，１１−ジヒドロ−３−メトキシ−５Ｈ−ジベンゾ［ａ，ｄ］シクロヘプテン−１０−酢酸エチル（８．５ｇ、０．０２７モル）のＣＨ２Ｃｌ２（１５０ｍＬ）中溶液をアルゴン雰囲気下で撹拌しながら−１０℃に冷却した。エタンチオール（１０．７ｍＬ、０．１４４モル）を添加し、続いてＡｌＣｌ３（２０．６ｇ、０．１５４モル）を２回に分けて１５分かけて添加した。添加後、発熱により温度が０℃に上昇し、水浴を用いて温度が２５℃に上昇した。反応混合物を２５から３０℃で２．２５時間撹拌し、この時点で氷−Ｈ２Ｏ中に注いだ。有機層を分離し、メタノール（１００ｍＬ）を添加し、混合物をＣＨ２Ｃｌ２で抽出した（２×５０ｍＬ）。合したＣＨ２Ｃｌ２抽出物をＨ２Ｏ（２５０ｍＬ）で洗浄し、濃縮して粘稠性油状物（８．６ｇ）を得た。これをＥｔ２Ｏ（１５０ｍＬ）中に溶かし、エーテルを沸騰させて除去し、ヘキサンと置換した。所望のフェノールをまず油状物として分離し、これを常温で撹拌すると結晶化した。２回の固体の収穫を合わせて、標記化合物（７．１ｇ、８９％）を得た：融点１１０−１１２℃。
【００６５】
調製３
（±）−１０，１１−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−５Ｈ−ジベンゾ［ａ，ｄ］シクロヘプテン−１０−酢酸エチルのエナンチオマーのＨＰＬＣ分離
ａ）（Ｒ）−（＋）−１０，１１−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−５Ｈ−ジベンゾ［ａ，ｄ］シクロヘプテン−１０−酢酸エチルおよび（Ｓ）−（−）−１０，１１−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−５Ｈ−ジベンゾ［ａ，ｄ］シクロヘプテン−１０−酢酸エチル
（±）−１０，１１−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−５Ｈ−ジベンゾ［ａ，ｄ］シクロヘプテン−１０−酢酸エチルを以下の条件を用いてそのエナンチオマーに分割した：Ｄａｉｃｅｌ  Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ  ＯＪカラム（２１．２×２５０ｍｍ）、ヘキサン移動相中２０％エタノール、流量１５ｍＬ／分、ｕｖ検出２５４ｎｍ、１４０ｍｇ注入；（Ｓ）−（−）−１０，１１−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−５Ｈ−ジベンゾ［ａ，ｄ］シクロヘプテン−１０−酢酸エチルについてのｔＲ＝１０．４分；（Ｒ）−（＋）−１０，１１−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−５Ｈ−ジベンゾ［ａ，ｄ］シクロヘプテン−１０−酢酸エチルについてのｔＲ＝１３．１分。
【００６６】
調製４
１０，１１−ジヒドロ−３−メトキシ−５Ｈ−ジベンゾ［ａ，ｄ］シクロヘプテン−１０−オンの調製
ａ）２−ベンジル−４−メトキシフェニル酢酸
Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９８１、２４、９９８の方法により調製した２−ベンゾイル−４−メトキシフェニル酢酸（１３．０ｇ、０．０４８モル）の氷酢酸（６００ｍＬ）中溶液をアルゴン雰囲気下、４．３ｇの１０％Ｐｄ／Ｃで処理し、５０ｐｓｉで１７時間水素化した。混合物をセライトを用いて濾過し、濾液を濃縮し、トルエンおよび塩化メチレンから再濃縮して、１４．２ｇの標記化合物を得た：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ３．５２（ｓ、２Ｈ）、３．７５（ｓ、３Ｈ）、４．０（ｓ、３Ｈ）、６．７（ｍ、２Ｈ）、７．１５（ｍ、６Ｈ）。
【００６７】
ｂ）１０，１１−ジヒドロ−３−メトキシ−５Ｈ−ジベンゾ［ａ，ｄ］シクロヘプテン−１０−オン
２−ベンジル−４−メトキシフェニル酢酸（１４．２ｇ、０．０５５モル）のベンゼン（１２０ｍＬ）および塩化チオニル（２８ｍＬ）中溶液を１時間還流させ、濃縮した。酸塩化物を乾燥塩化メチレン（４０ｍＬ）中に溶解させ、溶液をアルゴン雰囲気下、ＡｌＣｌ３（１４．７ｇ、０．１１モル）の塩化メチレン（６００ｍＬ）中溶液に滴下した。反応物をアルゴン雰囲気下で２．５時間室温で撹拌し、氷−水（２００ｍＬ）で急冷した。層を分離し、有機相を連続して１０％ＮａＯＨ溶液、水、および希ＨＣｌで洗浄した。得られた溶液をエーテル（２００ｍＬ）で希釈し、ＭｇＳＯ４上で乾燥し、濃縮した。固体残渣をエーテル／ヘキサン（１：１）で磨砕し、９．３５ｇの標記化合物を濾過により集めた：融点１０５−１０６℃；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ３．７２（ｓ、３Ｈ）、４．１（ｓ、２Ｈ）、４．２（ｓ、２Ｈ）、６．７（ｄ、１Ｈ）、６．８２（ｓ、１Ｈ）、７．３０（ｍ、４Ｈ）、８．１（ｄ、１Ｈ）。
【００６８】
調製５
（±）−１０，１１−ジヒドロ−３−メトキシ−５Ｈ−ジベンゾ［ａ，ｄ］シクロヘプテン−１０−酢酸エチルの調製
ａ）（±）３−（３−メトキシフェニル）インデン酢酸エチル
Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９８１、２４、９９８の方法により調製した３−（３−メトキシフェニル）インデン（４ｇ、１８ミリモル）の０℃のＴＨＦ（１５ｍＬ）中冷溶液に、ＬｉＮ（ＴＭＳ）２（２０ｍＬ、ＴＨＦ中１Ｍ）を５分かけて滴下した。得られた溶液を、ブロモ酢酸エチル（３．３４ｇ、２０ミリモル）のＴＨＦ（１５ｍＬ）中溶液に−７８℃で３０分かけて滴下した。２．５時間後、混合物を飽和塩化アンモニウム溶液で急冷し、層を分離した。有機層をＭｇＳＯ４上で乾燥し、濃縮して粗生成物を得、これをカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２／２−４％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）により精製して、標記化合物（１．１ｇ）を得た：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ１．３０（ｔ、３Ｈ）、２．５０（ｍ、１Ｈ）、２．８５（ｍ、１Ｈ）、３．８５（ｓ、３Ｈ）、４．０（ｍ、１Ｈ）、４．２０（ｑ、２Ｈ）、６．６（ｓ、１Ｈ）、６．９（ｍ、１Ｈ）、７．２（ｓ、１Ｈ）、７．３５（ｍ、６Ｈ）
【００６９】
ｂ）（±）３−［（３−メトキシベンゾイル）］フェニル琥珀酸エチル
（±）３−（３−メトキシフェニル）インデン酢酸エチル（１．１ｇ、３．６ミリモル）のアセトン（３０ｍＬ）中溶液を四酸化オスミウムの４％水性溶液（０．５ｍＬ）で処理し、続いて追加の１．２Ｍジョーンズ試薬（５ｍＬ、６ミリモル）を文献の手順（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９３、５８、４７４５）にしたがって滴下した。一夜室温で撹拌した後、暗色反応混合物をイソプロパノール（２．５ｍＬ）、続いて亜硫酸水素ナトリウム（０．９ｇ）および水（３０ｍＬ）で急冷した。生成物を酢酸エチルで抽出し、食塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥し、濃縮して、固体残渣を得た。１：１エーテル／ヘキサンで磨砕して、０．７６ｇの標記化合物を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ１．１８（ｔ、３Ｈ）、２．９０（ｍ、１Ｈ）、３．３（ｍ、１Ｈ）、３．９２（ｓ、３Ｈ）、４．１（ｑ、２Ｈ）、４．４（ｍ、１Ｈ）、４．４（ｄ、１Ｈ）、７．２５（ｍ、２Ｈ）、７．５（ｍ、６Ｈ）。
【００７０】
ｃ）（±）３−［（３−メトキシベンジル）］フェニル琥珀酸エチル
（±）３−［（３−メトキシベンゾイル）］フェニル琥珀酸エチル（０．７６ｇ、２．１ミリモル）および１０％Ｐｄ／Ｃ（０．６ｇ）の氷酢酸（３５ｍＬ）中混合物を５０ｐｓｉで１７時間水素添加した。混合物をセライトを用いて濾過し、フィルターパッドを酢酸で洗浄した。濾液を濃縮し、トルエンおよび塩化メチレンから再濃縮して、０．６５ｇの標記化合物を得た：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ１．２０（ｔ、３Ｈ）、２．２０（ｍ、１Ｈ）、３．０（ｍ、１Ｈ）、３．７４（ｓ、３Ｈ）、４．１（ｑ、２Ｈ）、４．１８（ｑ、２Ｈ）、４．４（ｄ、１Ｈ）、６．２（ｍ、２Ｈ）、７．２２（ｍ、６Ｈ）。
【００７１】
ｄ）（±）−１０，１１−ジヒドロ−３−メトキシ−１１−オキソ−５Ｈ−ジベンゾ［ａ，ｄ］シクロヘプテン−１０−酢酸エチル
磁気攪拌機で撹拌した（±）３−［（３−メトキシベンジル）］フェニル琥珀酸エチル（０．６５ｇ、１．９ミリモル）の乾燥塩化メチレン（１０ｍＬ）中溶液に、ＤＭＦ（０．２ｍＬ）および塩化オキサリル（０．２ｍＬ、２．２８ミリモル）を添加した。１．５時間後、溶液を塩化アルミニウム（０．６ｇ、４．５ミリモル）の乾燥塩化メチレン（１５ｍＬ）中懸濁液に滴下した。混合物を２時間後氷水で急冷し、層を分離し、水性層を塩化メチレンで抽出した。合した有機層をＭｇＳＯ４上で乾燥し、濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２／２−４％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）により精製して、標記化合物（０．３ｇ）を得た：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ１．２８（ｔ、３Ｈ）、２．８８（ｍ、１Ｈ）、３．５５（ｍ、１Ｈ）、３．８４（ｓ、３Ｈ）、３．８８（ｄ、１Ｈ）、４．１８（ｑ、２Ｈ）、４．８５（ｄ、１Ｈ）、４．９５（ｍ、１Ｈ）、５．８（ｍ、２Ｈ）７．２２（ｍ、４Ｈ）、８．１（ｓ、１Ｈ）。
【００７２】
ｅ）（±）−１０，１１−ジヒドロ−３−メトキシ−５Ｈ−ジベンゾ［ａ，ｄ］シクロヘプテン−１０−酢酸エチル
（±）−１０，１１−ジヒドロ−３−メトキシ−１１−オキソ−５Ｈ−ジベンゾ［ａ，ｄ］シクロヘプテン−１０−酢酸エチル（０．３ｇ、０．９３ミリモル）および１０％Ｐｄ／Ｃ（０．３ｇ）の氷酢酸（２５ｍＬ）中混合物を５０ｐｓｉで１８時間水素添加した。セライトを用いて混合物を濾過し、酢酸で洗浄した。濾液を濃縮し、トルエンおよび塩化メチレンから再濃縮して、０．２５ｇの標記化合物を得た：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ１．２８（ｔ、３Ｈ）、２．６０（ｍ、２Ｈ）、２．９０（ｍ、１Ｈ）、３．３０（ｍ、１Ｈ）、３．８０（ｓ、３Ｈ）、３．８５（ｄ、１Ｈ）、４．１８（ｑ、２Ｈ）、４．３０（ｄ、１Ｈ）、６．７０（ｍ、２Ｈ）、７．０（ｄ、１Ｈ）、７．２２（ｍ、４Ｈ）
【００７３】
以下の実施例は本発明の生物学的に活性な化合物を前記調製において記載したような中間体化合物から調製する方法を説明する。
実施例１
（Ｓ）−１０，１１−ジヒドロ−３−［２−（５，６，７，８−テトラヒドロ−１，８−ナフチリジン−２−イル）−１−エトキシ］−５Ｈ−ジベンゾ［ａ，ｄ］シクロヘプテン−１０−酢酸の調製
ａ）（Ｓ）−１０，１１−ジヒドロ−３−［２−（５，６，７，８−テトラヒドロ−１，８−ナフチリジン−２−イル）−１−エトキシ］−５Ｈ−ジベンゾ［ａ，ｄ］シクロヘプテン−１０−酢酸エチル
（Ｓ）−１０，１１−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−５Ｈ−ジベンゾ［ａ，ｄ］シクロヘプテン−１０−酢酸エチル（２００ｍｇ、０．６７ミリモル）、２−（５，６，７，８−テトラヒドロ−１，８−ナフチリジン−２−イル）−１−エタノール（２４１ｍｇ、１．３５ミリモル）、およびＰＰｈ３（３５４ｍｇ、１．３５ミリモル）の乾燥ＴＨＦ（５ｍＬ）中溶液に、アゾジカルボン酸ジイソプロピル（０．２７ｍＬ、１．３５ミリモル）を０℃で添加した。浴を暖めて混合物を室温に暖めた。１８時間後、混合物を減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲル上クロマトグラフィーにかけて（１：４．５ヘキサン／Ｅｔ２Ｏ）、透明油状の標記化合物（９４ｍｇ、３１％）を得た：ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｅ４５７（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００７４】
ｂ）（Ｓ）−１０，１１−ジヒドロ−３−［２−（５，６，７，８−テトラヒドロ−１，８−ナフチリジン−２−イル）−１−エトキシ］−５Ｈ−ジベンゾ［ａ，ｄ］シクロヘプタン−１０−酢酸
（Ｓ）−１０，１１−ジヒドロ−３−［２−（５，６，７，８−テトラヒドロ−１，８−ナフチリジン−２−イル）−１−エトキシ］−５Ｈ−ジベンゾ［ａ，ｄ］シクロヘプテン−１０−酢酸エチル（１３１ｍｇ、０．２９ミリモル）のＴＨＦ／Ｈ２Ｏ（２ｍＬ）中溶液に、１．０Ｎ  ＬｉＯＨ（０．４３ｍＬ、０．４３ミリモル）を添加し、混合物を５０℃に加熱した。１８時間後、混合物を室温に冷却し、Ｅｔ２Ｏで洗浄した（２×２ｍＬ）。水性層を１０％ＨＣｌを用いてｐＨ６に酸性化した。得られた乳白色溶液をＣ−１８結合−溶出カラム（勾配溶出：溶離液として、Ｈ２Ｏ、続いて２０％ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ、次にＣＨ３Ｃｌ）に通した。生成物を含むフラクションを減圧下で濃縮して、白色粉末の標記化合物（３０ｍｇ、２４％）を得た：ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｅ  ４２９（Ｍ＋Ｈ）＋。元素分析  Ｃ２７Ｈ２８Ｎ２Ｏ３・０．９５ＨＣｌとしての計算値：Ｃ＝７０．０２；Ｈ＝６．３０；Ｎ＝６．０５。測定値：Ｃ＝７０．０１；Ｈ＝６．３３；Ｎ＝５．７１。
【００７５】
実施例２
非経口投与単位組成物
２０ｍｇの実施例１の化合物を滅菌乾燥粉末として含む製剤を以下のようにして調製した：２０ｍｇの化合物を１５ｍｌの蒸留水中に溶解させる。溶液を滅菌条件下で２５ｍＬマルチドースアンプル中に濾過し、凍結乾燥する。静脈内または筋肉内注射のために、２０ｍＬの５％水中デキストロース（Ｄ５Ｗ）を添加することにより粉末を復元する。投与量を注射体積により決める。計量した単位剤型を他の体積の注射用Ｄ５Ｗに添加するか、または静脈内点滴注入または他の注射−注入システム用ボトルまたはバッグ中など、計量した用量を別の薬剤分配メカニズムに添加することにより続いて希釈する。
【００７６】
実施例３
経口投与単位組成物
５０ｍｇの実施例１の化合物を７５ｍｇのラクトースおよび５ｍｇのステアリン酸マグネシウムと混合し、粉砕することにより、経口投与用カプセルを調製する。得られた粉末をスクリーンし、ハードゼラチンカプセル中に充填する。
実施例４
経口投与単位組成物
２０ｍｇのシュークロース、１５０ｍｇの硫酸カルシウム二水和物および実施例１の化合物を１０％のゼラチン溶液と混合し、造粒することにより経口投与用錠剤を調製する。湿潤顆粒をスクリーンし、乾燥し、１０ｍｇのデンプン、５ｍｇのタルクおよび３ｍｇのステアリン酸と混合し、打錠する。
【００７７】
前記記載事項は本発明の調製法および使用法を完全に開示する。しかしながら、本発明は前記した特定の具体例に制限されず、請求項の範囲内のあるあらゆる修正も包含する。本明細書において記載した種々の雑誌、特許および他の刊行物は現在の技術水準を含み、これらは出典明示により本発明の一部とする。