(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板表面中または基板表面上に形成された囲まれた微小チャンネルを含むサンプル検出デバイスであって、該微小チャンネルは入口ポートおよび出口ポートを有し、該入口ポートおよび該出口ポートは該微小チャンネルの端部を含み、該微小チャンネルは反応部位を含み、該部位は、以下：
（ａ）該微小チャンネル中の該基板の表面の少なくとも一部上に化学吸着または物理吸着した有機薄膜；および
（ｂ）該有機薄膜上に固定化した生物学的部分、ここで、該生物学的部分は、該サンプルの成分と相互作用することができる、
を備える、前記デバイス。
【請求項２】
前記微小チャンネルが前記基板表面上にある、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
前記微小チャンネルが、基板材料と化学的に異なる壁を含む、請求項２に記載のデバイス。
【請求項４】
前記微小チャンネルが、半透明又は透明のカバーを含む、請求項１に記載のデバイス。
【請求項５】
前記カバーが検出装置の一部を形成する、請求項４に記載のデバイス。
【請求項６】
前記微小チャンネルが、５ナノリットル〜３００ナノリットルの容量を有する、請求項１に記載のデバイス。
【請求項７】
前記微小チャンネルが、１０ナノリットル〜５０ナノリットルの容量を有する、請求項１に記載のデバイス。
【請求項８】
前記微小チャンネルが、１０μｍ〜５００μｍの深さを有する、請求項１に記載のデバイス。
【請求項９】
前記微小チャンネルが、５０μｍ〜２００μｍの深さを有する、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１０】
前記微小チャンネルが、１０μｍ〜５００μｍの幅を有する、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１１】
前記微小チャンネルが、５０μｍ〜２００μｍの幅を有する、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１２】
複数の囲まれた微小チャンネルを含み、前記反応部位の各々が、前記有機薄膜を有さない前記基板の領域によって、互いに分離している、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１３】
複数の並行な囲まれた微小チャンネルを含み、前記反応部位の各々が、前記有機薄膜を有さない前記基板の領域によって、互いに分離している、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１４】
少なくとも２個の並行微小チャンネル反応部位を含む、請求項１３に記載のデバイス。
【請求項１５】
少なくとも１０個の並行微小チャンネル反応部位を含む、請求項１３に記載のデバイス。
【請求項１６】
少なくとも１００個の並行微小チャンネル反応部位を含む、請求項１３に記載のデバイス。
【請求項１７】
１００〜５００個の並行微小チャンネルを含む、請求項１３に記載のデバイス。
【請求項１８】
前記微小チャンネルが、１０μｍ〜５ｍｍの距離に分離する、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項１９】
１ｃｍ2あたり２〜５００個の並行微小チャンネルを含む、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項２０】
前記生物学的部分がタンパク質である、請求項１に記載のデバイス。
【請求項２１】
前記生物学的部分が抗体である、請求項１に記載のデバイス。
【請求項２２】
少なくとも１０個の異なる固定された生物学的部分を含む、請求項１に記載のデバイス。
【請求項２３】
少なくとも１００個の異なる固定された生物学的部分を含む、請求項１に記載のデバイス。
【請求項２４】
請求項１〜２３のいずれか１項に記載のデバイスを用いて、固定生物学的部分を、液体サンプル内に含まれる成分と相互作用するその能力についてスクリーニングする方法。
【請求項２５】
前記微小チャンネルが、前記基板表面中にある、請求項１に記載のデバイス。
【請求項２６】
少なくとも１０個の異なるタンパク質を含む、請求項２２に記載のデバイス。
【請求項２７】
少なくとも１００個の異なるタンパク質を含む、請求項２３に記載のデバイス。
【請求項２８】
前記タンパク質が、同一タンパク質ファミリーの少なくとも１０個の異なるメンバーを含む、請求項２６に記載のデバイス。
【請求項２９】
前記タンパク質が、同一タンパク質ファミリーの少なくとも１００個の異なるメンバーを含む、請求項２６に記載のデバイス。
【請求項３０】
前記タンパク質ファミリーが、レセプターファミリー、リガンドファミリー、酵素ファミリー、又は転写因子ファミリーである、請求項２８または２９に記載デバイス。
【請求項３１】
前記タンパク質が、増殖因子レセプター、カテコールアミンレセプター、アミノ酸誘導体レセプター、サイトカインレセプター、レクチン、ホルモンレセプター、神経伝達物質レセプター、または細胞外マトリクスレセプターである、請求項３０に記載のデバイス。
【請求項３２】
前記タンパク質が、サイトカインまたはセルピンである、請求項３０に記載のデバイス。
【請求項３３】
前記タンパク質が、ステロイドホルモンレセプター、熱ショック転写因子、亜鉛フィンガータンパク質、ロイシンジッパータンパク質、ホメオドメインタンパク質、ＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ合成因子、ＤＮＡ修復因子、またはＤＮＡ組換え因子である、請求項３０に記載のデバイス。
【請求項３４】
前記タンパク質が、プロテアーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ＧＴＰａｓｅ、またはヒドロラーゼである、請求項３０に記載のデバイス。
【請求項３５】
前記タンパク質が、キナーゼである、請求項３４に記載のデバイス。
【請求項３６】
前記タンパク質が、同一タンパク質の改変体である、請求項２６または２７に記載のデバイス。
【請求項３７】
前記タンパク質が、組換え融合タンパク質である、請求項２６または２７に記載のデバイス。
【請求項３８】
前記組換え融合タンパク質が、パラレルプロセッシングを用いて製造される、請求項３７に記載のデバイス。
【請求項３９】
前記組換え融合タンパク質が、酵母細胞、バキュロウイルス系、または哺乳動物細胞を用いて製造される、請求項３７に記載のデバイス。
【請求項４０】
前記タンパク質が、少なくとも１０個のアポトーシス関連因子を含む、請求項２６または２７に記載のデバイス。
【請求項４１】
前記タンパク質が、親和性タグによって前記有機薄膜に固定される、請求項２６または２７に記載のデバイス。
【請求項４２】
前記親和性タグが、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、アビジン、またはストレプトアビジンである、請求項４１に記載のデバイス。
【請求項４３】
前記タンパク質がインビトロで合成される、請求項２６または２７に記載のデバイス。
【請求項４４】
前記有機薄膜が、ヒドロゲルを含む、請求項１に記載のデバイス。
【請求項４５】
前記ヒドロゲルが、デキストランを含む、請求項４４に記載のデバイス。
【請求項４６】
前記反応部位が、前記生物学的部分と前記成分との相互作用を直接的または間接的に検出することができる検出器を更に含む、請求項１〜２３および２５〜４５のいずれか１項に記載のデバイス。
【発明の詳細な説明】
（発明の背景）
（ａ）発明の分野）
本発明は、一般に、複数の生体分子−被分析物相互作用の並行化インビトロスクリーニングのための微小デバイスおよびそのデバイスを使用する方法に関する。より具体的には、本発明は、薬物の開発、機能的プロテオミクスおよび臨床診断のためのデバイスの使用に関する。
【０００１】
（ｂ）関連する技術の記載）
非常に多数の新規の薬物標的が、現在、ゲノミクス、バイオインフォマティクス、遺伝学、および高スループット生化学の組み合わせを使用して同定されている。ゲノミクスは、遺伝的組成および生物の遺伝子の活性についての情報を提供する。バイオインフォマティクスは、コンピュータアルゴリズムを使用して、ＤＮＡおよびタンパク質の構造パターンを認識および予測し、関連する遺伝子およびタンパク質のファミリーを規定する。これらのアプローチの組み合わせから得られる情報は、薬物標的（通常、タンパク質）の数を、大量に増加させることが予測される。
【０００２】
可能性のある薬物としてスクリーニングするために利用可能な化合物の数は、コンビナトリアルケミストリー（迅速な並行化かつ自動化した合成を介する大多数の有機化合物の産生）の最近の進歩に起因して、劇的に増加している。生成されるコンビナトリアルライブラリーにおいて産生される化合物は、伝統的な手動の手段によって調製される化合物、天然の産物の抽出物、または大規模な製薬企業の歴史的な化合物のファイル中の化合物よりも、数で非常に勝っている。
【０００３】
新規の薬物標的の迅速な増加、および化合物の多量なライブラリーが利用可能であることの両方は、スクリーニングプロセスを改善する新規の技術に対する莫大な要求をもたらす。この必要性への取り組みを試みる現在の技術的アプローチとしては、マルチウェル−プレートをベースとするスクリーニング系、細胞をベースとするスクリーニング系、微小流体（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）をベースとするスクリーニング系、および固相合成された薬物成分に対する可溶性標的のスクリーニングが挙げられる。
【０００４】
自動化マルチウェルフォーマットは、開発された最良の高スループットスクリーニング系である。自動化９６ウェルプレートをベースとするスクリーニング系は、最も広範に使用される。プレートをベースとするスクリーニング系の現在のトレンドは、さらに反応ウェルの容量を減少し、それによってプレートあたりのウェルの密度を増加することである（プレートあたり９６ウェル〜３８４ウェルおよび１５３６ウェル）。反応容量の減少は、スループットの増加を生じ、生物試薬の費用を劇的に減少し、そして自動制御によって操作される必要のあるプレートの数を減少する。
【０００５】
しかし、プレートあたりのウェルの数の増加が、高スループット効率に望ましいが、ウェル形式での１マイクロリットル未満の容量の使用は、エバポレーション、調製時間、タンパク質の不活性化、およびアッセイの適合についての顕著な問題を生じる。タンパク質は、反応チャンバー表面の物理的特性および化学的特性に対して非常に敏感である。タンパク質は、液体／固体および液体／気体界面において、変性し易い。１マイクロリットル未満の容量への、アッセイの小型化は、容量に対する表面の比を実質的に増加する。（１マイクロリットルから１０ナノリットルへの容量の変化は、表面比率を４６０％にまで増加し、増加したタンパク質不活化をもたらす。）さらに、マイクロリットル容量未満の溶液は、空気と接触すると、迅速に、数秒から数分内にエバポレートする。従って、開放系において微小容量を維持することは、非常に困難である。
【０００６】
他のタイプの高スループットアッセイ（例えば、小型化された、細胞をベースとするアッセイ）もまた、開発されている。小型化された、細胞をベースとするアッセイは、そのインビボの性質に起因して、優れた質と正確なスクリーニングデータを生じる可能性を有する。しかし、薬物化合物と、所望の標的以外のタンパク質との相互作用は、擬陽性の結果を高い確率でもたらす、このアプローチに関連する重大な問題である。
【０００７】
液体中でのインビトロ反応を測定する、微小流体をベースとするスクリーニング系は、１０〜数百マイクロリットルの幅のチャンネルを利用する。微小ポンプ、電気浸透流、一体型バルブおよび混合デバイスは、チャンネルネットワークを通る液体の移動を制御する。微小流体ネットワークは、大きな表面−容量比率に起因して、エバポレートを防ぐが、顕著なタンパク質変性をもたらす。生体分子スクリーニングにおける微小流体ネットワークの首尾よい使用は、まだ示されていない。
【０００８】
固相合成された薬物成分に対する可溶性標的の薬物スクリーニングは、その本来の性質として、限定されている。固体状態の有機合成に必要な表面は、化学的に多様であり、そしてしばしばタンパク質の不活性化または非特異的結合を生じ、高い割合の擬陽性結果をもたらす。さらに、薬物化合物の化学的多様性は、界面で化合物を生成するために使用されるコンビナトリアル合成アプローチによって制限される。このアプローチの別の主な不利な点は、固定化薬物候補物に対する、可溶性標的タンパク質の結合部位の限定された接近可能性より生じる。
【０００９】
微小化ＤＮＡチップ技術が開発され（例えば、米国特許第５，４１２，０８７号、同第５，４４５，９３４号、および同第５，７４４，３０５号を参照のこと）、そして現在、核酸ハイブリダイゼーションアッセイのために利用されている。しかし、ＤＮＡバイオチップ技術は、タンパク質アッセイに移転可能ではない。なぜなら、ＤＮＡバイオチップについて使用される化学および材料は、タンパク質を用いる使用には、容易に移転可能ではないからである。核酸は、活性を失うことなく、１００℃までの温度に耐え、乾燥され得、そして再水和され得、そしてその活性を維持しながら、ガラスのような物質によって支持される有機付着層に、直接結合し得る。対照的に、タンパク質は、水和されたままで、周囲温度に維持維持されなければならず、そして支持物質の物理的特性および化学的特性に対して、非常に感受性である。従って、液体−固体界面でタンパク質の活性を維持することは、核酸について使用される戦略とは全く異なる固定化戦略を必要とする。さらに、界面でのタンパク質の適切な配向は、相互作用する分子に対するその活性部位の接近可能性を確実にするために所望される。非接近可能抗体に対する接近可能抗体の比が、チップの微小化および造作サイズが減少するにつれ、ますます関連するようになる。
【００１０】
可能性のある薬物リードを同定するための、標的に対する化合物の高スループットスクリーニングを達成するゴールに加え、研究者はまた、薬物発見プロセスの初期に、高度に特異的なリード化合物を同定し得る必要がある。タンパク質ファミリーの多数のメンバー、または多型タンパク質の形態の並行した分析（複数標的のスクリーニング）は、高度に特異的なリード化合物の迅速な同定を可能にする。構造的ファミリー内のタンパク質は、類似の結合部位および触媒機構を共有する。しばしば、ファミリーの１つのメンバーの活性を効果的に妨げる化合物は、同一のファミリーの他のメンバーも妨げる。標準的な技術を使用して、そのようなさらなる相互作用を発見することは、時間と費用において多大なる努力を必要とし、結果として単純にはなされない。
【００１１】
しかし、薬物と、関連するタンパク質との交差反応性は、患者における低い効力の原因となり得、または副作用の原因でさえあり得る。例えば、ＡＩＤＳの主要な処置であるＡＺＴは、ウイルスポリメラーゼをブロックするばかりでなく、ヒトポリメラーゼもまたブロックし、有害な副作用を生じる。密接に関連するタンパク質との交差反応性はまた、非ステロイド性の抗炎症薬物（ＮＳＡＩＤ）およびアスピリンでも、問題である。これらの薬物は、シクロオキシゲナーゼ−２（疼痛および炎症を促進する酵素）を阻害する。しかし、これら同一の薬物は、関連する酵素であるシクロオキシゲナーゼ−１（胃の内壁および腎臓の健康を維持する原因である）もまた強力に阻害し、胃の痛みを含む一般的な副作用をもたらす。
【００１２】
複数のタンパク質相互作用の微小化された、並行スクリーニングはまた、高スループット薬物スクリーニングの他に、多数の適用のために有用であり、そして必要である。例えば、新規に発見されたタンパク質の機能は、既知のタンパク質ファミリーの、多数の可能性のあるリガンドまたは可能性のある基質を用いる並行形式において効果的にアッセイされ得る。抗体のようなタンパク質に対する被分析物の結合による複数の被分析物の分析を可能にする微小化診断デバイスもまた、所望される。
【００１３】
上記の理由により、複数の生体分子相互作用、特にタンパク質と被分析物または他のタンパク質との相互作用の、並行したインビトロでのスクリーニングのための、微小化デバイスおよびそのデバイスを使用する方法が必要である。
【００１４】
（発明の要旨）
本発明は、複数の生体分子相互作用、特にタンパク質と被分析物または他のタンパク質との相互作用の、並行したインビトロでのスクリーニングについての必要性を満たす、デバイスおよびそのデバイスを使用する方法に関する。
【００１５】
本発明の１つの実施態様は、液体サンプルの成分を分析するためのデバイスを提供する。このデバイスは、複数の非隣接反応部位を含む。反応部位の各々は、基板、その基板の表面の部分に、化学吸着または物理吸着した有機薄膜、およびその有機薄膜上に固定化した生物学的部分を包含し、ここで、その反応部位の各々は、その液体サンプルの成分と独立して反応し得、そしてその有機薄膜を有さない基板の領域によって、お互いに分離する。
【００１６】
このデバイスの特定の好ましい実施態様において、本発明のデバイスにおける反応部位の各々が、そのデバイスにおける他の反応部位の微小チャンネルに並行に向けられた微小チャンネル中にあり、ここで、この微小チャンネルが、その基板中またはその基板上に微小製作される。
【００１７】
本発明の代替的な実施態様は、基板、その基板中またはその基板上に微小製作された複数の並行微小チャンネル、および生物学的部分が液体サンプルの成分と相互作用し得る様式において並行微小チャンネルの少なくとも１つの中に固定化された生物学的部分を備える、液体サンプルの成分の分析のためのデバイスを提供する。好ましい実施態様において、生物学的部分は、タンパク質である。
【００１８】
本発明のデバイスを使用する方法もまた、本発明によって提供される。１つの実施態様において、本発明は、複数の生物学的部分を、液体サンプルの成分と相互作用するその能力について、並行してスクリーニングする方法を提供する。この方法は、液体サンプルを本発明のデバイスの反応部位に送達する第１の工程を包含し、ここで、異なる生物学的部分の各々が、デバイスの異なる反応部位に固定化され、各反応部位における固定化された生物学的部分と成分との相互作用を、直接的または間接的のいずれかで検出する。アッセイされる相互作用は、結合相互作用、触媒、または脂質二重層を通る膜タンパク質によるトランスロケーションであり得る。
【００１９】
本発明の代替的な実施態様において、本発明のデバイスを使用して、複数の成分（各々が別々の液体サンプル中にある）を、生物学的部分と相互作用するその能力についてスクリーニングする。この実施態様の方法は、異なる液体サンプルの各々を、本発明のデバイスの別々の反応部位に送達する第１の工程を包含し、ここで、このデバイスの別々の反応部位の各々は、固定化された生物学的部分を含む。次の工程は、各反応部位で固定化された生物学的部分と、その反応部位に送達された成分との相互作用について、直接的または間接的のいずれかで、検出する工程を包含する。再度、アッセイされる相互作用は、結合相互作用、触媒、または脂質二重層を通る膜タンパク質によるトランスロケーションであり得る。
【００２０】
本発明の別の実施態様において、類似の方法を使用して、複数の被分析物の存在または量について（並行して）、液体サンプルをスクリーニングする。この方法は、診断における可能性のある適用を有する。この方法は、液体サンプルを本発明のデバイスの複数の反応部位に送達する工程を包含し、ここで反応部位の各々が、その複数の被分析物の１つと、反応するか、結合するか、そうでなければ相互作用するかのいずれかであり得る固定化された生物学的部分を含む。この方法はまた、被分析物と、各反応部位の固定化された生物学的部分との相互作用を検出する最終工程を包含する。
【００２１】
本発明の別の実施態様において、デバイスを使用して、複数の結合候補物を、生物学的部分に結合するその能力についてもまた、並行してスクリーニングし得る。この実施態様の方法において、試験をされる異なる液体サンプル（各々が異なる結合候補物を含む）（または結合候補物の異なる混合物）が、本発明のデバイスの別々の反応部位に送達され、ここで、別々の反応部位の各々が、固定化された生物学的部分を含有する。この方法の次の工程は、結合候補物の存在または量について、直接的または間接的のいずれかで検出する工程を包含する。
【００２２】
本発明はまた、共通のリガンドに対する結合か、または共通の基質に対する反応性のいずれかに基づき、複数のタンパク質の各々が特定のタンパク質ファミリーに属するか否かについて並行して決定する方法を提供する。これらの方法は、既知のタンパク質ファミリーのリガンドまたは基質を含む液体サンプルを、本発明のデバイスの反応部位（各々がアッセイされる異なるタンパク質の１つを含む）に送達する工程、次に、そのタンパク質ファミリーに特徴的な既知のリガンドとの結合または反応について、直接的または間接的のいずれかで検出する工程を包含する。
【００２３】
（発明の詳細な説明）
本発明によって、薬物開発、プロテオミクス、および臨床診断にとって有用な種々のデバイスおよび方法が提供される。
【００２４】
（（ａ）定義）
用語「生物学的部分」および「生体分子」は、互換可能に使用され、そして各々は、生理学的機能を有するか、または有することが疑われるかのいずれかの、任意の実体をいう。この生物学的部分は、単一の分子であっても、高分子複合体であってもよい。生物学的部分の一例は、ポリヌクレオチドである。好ましい生物学的部分は、タンパク質である。タンパク質は、任意の細胞内タンパク質または細胞外タンパク質であり得、任意の膜タンパク質または分泌タンパク質を含む。他の可能な生物学的部分としては、酵素のインヒビターとして作用し得る低分子化合物、または他の生体分子に結合し得る低分子化合物を含む。例えば、生物学的部分は、必要に応じて、タンパク質捕獲剤であり得る。
【００２５】
用語「ポリヌクレオチド」とは、１本鎖または２本鎖形態のいずれかにおける、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを意味し、そして他に限定しなければ、天然に生じるヌクレオチドと同様の様式において機能し得る、天然のヌクレオチドの公知のアナログを含む。ポリヌクレオチドは、天然の供給源から得られ得るか、または酵素合成または化学合成によってインビトロまたはインビボで産生され得る。本明細書において、核酸、ポリヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチドは、区別されない。好ましくは、ポリヌクレオチドは、少なくとも１６ヌクレオチドを含有する。
【００２６】
「タンパク質」とは、ペプチド結合でお互いに連結したアミノ酸残基のポリマーを意味する。本明細書において使用する場合、この用語は、任意のサイズ、構造、または機能の、タンパク質、ポリペプチド、およびペプチドをいう。しかし、代表的には、タンパク質は、少なくとも約６アミノ酸長である。好ましくは、タンパク質が短いペプチドの場合、少なくとも約１０アミノ酸残基長である。タンパク質は、天然に生じるか、組換えか、または合成であるか、あるいはこれらの任意の組み合わせである。タンパク質はまた、天然に存在するタンパク質またはペプチドの単なるフラグメントでもあり得る。タンパク質は、単一の分子であっても、複数の分子の複合体であってもよい。用語タンパク質は、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然に生じるアミノ酸の人工の化学アナログである、アミノ酸ポリマーにも適用され得る。１つ以上のアミノ酸残基が「非天然」アミノ酸であり、任意の天然のアミノ酸に対応しないアミノ酸ポリマーもまた、本明細書において、用語「タンパク質」の使用によって包含される。
【００２７】
「タンパク質のフラグメント」とは、別のタンパク質の部分であるタンパク質を意味する。例えば、タンパク質のフラグメントは、培養細胞から単離された全長タンパク質の消化を行うことによって得られるポリペプチドであり得る。タンパク質のフラグメントは、代表的には少なくとも６アミノ酸を含む。より代表的には、フラグメントは、少なくとも１０アミノ酸を含む。好ましくは、フラグメントは、少なくとも１６アミノ酸を含む。
【００２８】
用語「抗体」とは、天然の、あるいは全体的または部分的に合成的に産生された免疫グロブリンを意味する。特異的結合能を保持するその全ての誘導体もまた、この用語に含まれる。この用語はまた、免疫グロブリンの結合ドメインに相同か、または高度に相同な結合ドメインを有する任意のタンパク質を含む（キメラ抗体およびヒト化抗体を含む）。これらのタンパク質は、天然の供給源に由来し得るか、あるいは全体的または部分的に合成的に産生され得る。抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であり得る。抗体は、任意の免疫グロブリンクラスのメンバーであり得、任意のヒトのクラス（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥ）を含む。しかし、ＩｇＧクラスの誘導体が本発明において好ましい。
【００２９】
用語「抗体フラグメント」とは、全長未満の抗体の任意の誘導体をいう。好ましくは、抗体フラグメントは、少なくとも、全長抗体の特異的結合能力の重要な部分を保持する。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄｓＦｖダイアボディー、およびＦｄフラグメントが挙げられるがこれらに限定されない。抗体フラグメントは、任意の手段によって産生され得る。例えば、抗体フラグメントは、酵素的または化学的に、インタクトな抗体のフラグメント化によって産生され得るか、あるいは部分抗体配列をコードする遺伝子より組換え的に産生され得る。あるいは、抗体フラグメントは、全体的にまたは部分的に合成的に産生され得る。抗体フラグメントは、必要に応じて、単鎖抗体フラグメントであり得る。あるいは、フラグメントは、例えば、ジスルフィド結合によってともに連結される複数の鎖を含み得る。フラグメントはまた、必要に応じて、複数の分子の複合体であり得る。機能的な抗体フラグメントは、代表的には、少なくとも約５０アミノ酸を含み、より代表的には少なくとも、約２００アミノ酸を含む。
【００３０】
単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は、ポリペプチドリンカーによってお互いに共有結合される可変軽鎖（ＶL）および可変重鎖（ＶH）のみからなる組換え抗体フラグメントである。ＶLまたはＶHのいずれかが、ＮＨ2末端ドメインであり得る。ポリペプチドリンカーは、２つの可変ドメインが重篤な立体障害をともなわずに架橋される限り、長さおよび組成が変化し得る。代表的には、リンカーは、もっぱらグリシン残基およびセリン残基のストレッチ（可溶性のために、いくつかのグルタミン酸残基およびリジン残基が点在する）からなる。
【００３１】
「ダイアボディー」はダイマーのｓｃＦｖである。ダイアボディーの成分は、代表的には、ほとんどのｓｃＦｖよりも短いペプチドリンカーを有し、そしてダイマーとしての会合についての優先性を示す。
【００３２】
「Ｆｖ」フラグメントは、非共有的相互作用によってともに保持される、１つのＶHドメイン１つのＶLドメインからなる抗体フラグメントである。用語「ｄｓＦｖ」は、本明細書において使用され、ＶH−ＶL対を安定化させるために操作された分子間ジスルフィド結合を有するＦｖをいう。
【００３３】
「Ｆ（ａｂ’）2」フラグメントは、酵素ペプシンを用いてｐＨ４．０〜４．５で消化されることにより免疫グロブリン（代表的にはＩｇＧ）から得られる抗体フラグメントと実質的に等価な抗体フラグメントである。このフラグメントは、組換え的に産生され得る。
【００３４】
「Ｆａｂ’」フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）2フラグメント中のジスルフィド架橋、または２つの重鎖種を結合する架橋を還元することにより得られる抗体フラグメントと実質的に等価な抗体フラグメントである。Ｆａｂ’フラグメントは、組換え的に産生され得る。
【００３５】
「Ｆａｂ」フラグメントは、酵素パパインを用いて免疫グロブリン（代表的にはＩｇＧ）の消化から得られる抗体フラグメントと実質的に等価な抗体フラグメントである。Ｆａｂフラグメントは、組換え的に産生され得る。Ｆａｂフラグメントの重鎖セグメントは、Ｆｄ部分である。
【００３６】
用語「タンパク質捕獲剤」とは、それ自体にタンパク質を結合し得る分子または複数分子の複合体を意味する。タンパク質捕獲剤は、好ましくは、実質的に特異的な様式においてその結合パートナーと結合する。約１０-6未満の解離定数（ＫD）を有するタンパク質捕獲剤が、好ましい。抗体または抗体フラグメントは、タンパク質捕獲剤として高度に適切である。抗原もまたタンパク質捕獲剤として作用し得る。なぜなら、抗体に結合し得るからである。タンパク質リガンドに結合するレセプターは、可能性のあるタンパク質捕獲剤の別の例である。タンパク質捕獲剤は、非共有結合相互作用を介してその結合パートナーと相互作用のみをする薬剤に限定されないことが理解される。タンパク質捕獲剤はまた、必要に応じて、それが結合するタンパク質と共有結合的に付着されるようになり得る。例えば、タンパク質捕獲剤は、結合後に、その結合パートナーと光架橋され得る。
【００３７】
用語「結合パートナー」とは、特定のタンパク質捕獲剤によって、好ましくは実質的に特異的な様式において、結合されるタンパク質を意味する。いくつかの場合、結合パートナーは、タンパク質捕獲剤であるタンパク質によって、インビボにおいて通常結合されるタンパク質であり得る。しかし、他の実施態様において、結合パートナーは、タンパク質捕獲剤が選択された（インビトロまたはインビボ選択を通して）か、または惹起された（抗体の場合）、タンパク質またはペプチドであり得る。結合パートナーは、１つより多いタンパク質捕獲剤によって共有され得る。例えば、種々のポリクローナル抗体によって結合される結合パートナーは、多数の異なるエピトープを有し得る。１つのタンパク質捕獲剤はまた、多数の結合パートナーに結合し得る（例えば、結合パートナーが同一のエピトープを共有する場合）。
【００３８】
「タンパク質結合に適切な条件」とは、溶液中で、タンパク質捕獲剤とその結合パートナーとの間で結合が生じるのを可能にする条件（塩濃度、ｐＨ、界面活性剤、タンパク質濃度、温度などに関する）を意味する。好ましくは、この条件は、顕著な量の非特異的タンパク質結合が生じるほどは、寛大ではない。
【００３９】
「体液」は、生物または生物の組織から、抽出、排出、または分泌された任意の液体の物質であり得る。必ずしも細胞を含む必要はない。本発明に関連する体液としては、全血、血清、尿、血漿、脳髄液、涙、滑液、および羊水が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４０】
用語「基板」とは、本発明のデバイスの、バルクの、基礎をなし、そして中心となる物質である。
【００４１】
用語「マイクロマシン加工」および「微小製作」の両方は、微小構造（ミリメートル未満のスケールの造作サイズを有する構造）の生成において有用な、任意の多数の技術をいう。そのような技術としては、レーザー切除、電着、物理的および化学的蒸着、フォトリソグラフィー、および湿式化学エッチングおよびドライエッチングが挙げられるがこれらに限定されない。注入成形およびＬＩＧＡ（Ｘ線リソグラフィー、電着、および成形）のような関連する技術もまた挙げられる。これらの技術のほとんどは、半導体、マイクロエレクトロニクス、およびマイクロエレクトロメカニカルシステム（ＭＥＭＳ）における使用のために最初は、開発されたが、本発明にも同様に適用可能である。
【００４２】
用語「コーティング」とは、基板の表面上に形成されるか、または基板の「表面」に適用される、天然または合成のいずれかの層を意味する。例えば、シリコンのような基板の空気への曝露は、曝露された表面の酸化を生じる。シリコンから作製される基板の場合、酸化シリコンコーティングが、空気へ曝露される際に、表面に形成される。他の場合において、コーティングは、基板由来ではなく、機械的、物理的、電気的、または化学的手段を介して表面に配置され得る。このタイプのコーティングの例は、シリコン基板またはポリマー基板に適用される金属コーティングか、あるいはシリコン基板に適用される窒化シリコンコーティングである。コーティングは、任意の厚さであり得るが、代表的には、コーティングは、基板の厚みよりも薄い厚さを有する。
【００４３】
「中間層」は、第１のコーティングと基板との間に位置するさらなるコーティングまたは層である。複数の中間層が、必要に応じて、ともに使用され得る。代表的な中間層の主な目的は、第１のコーティングと基板との間の付着を助けることである。１つのそのような例は、シリコンまたはガラス表面に金コーティングを付着するのを助ける、チタンまたはクロム中間層の使用である。しかし、中間層の他の可能性のある機能もまた、予想される。例えば、いくつかの中間層は、デバイスの検出系において、役割を担い得る（例えば、ナノ伝導性基板とナノ伝導性コーティングとの間の半導体または金属層）。
【００４４】
「有機薄膜」は、基板に適用されるか、または基板上のコーティング（存在する場合）に適用される有機分子の薄層である。代表的に、有機薄膜は、約２０ｎｍ未満の厚さである。必要に応じて、有機薄膜は、約１０ｎｍ未満の厚さであり得る。有機薄膜は、無秩序であっても、整列されていてもよい。例えば、有機薄膜は、アモルファス（例えば、化学吸着されたポリマーまたはスピン塗布（ｓｐｉｎ−ｃｏａｔｅｄ）されたポリマー）であり得るか、または高度に組織化され得る（例えば、ラングミュアー・ブロジェット膜または自己組織化単層）。有機薄膜は、不均一であっても、均一であってもよい。単層である有機薄膜が、好ましい。脂質二重層または単層が、好ましい有機薄膜である。必要に応じて、有機薄膜は、有機薄膜の１つより多い形態の組み合わせを含み得る。例えば、有機薄膜は、自己組織化単層の上表部に脂質二重層を含み得る。ヒドロゲルもまた、有機薄膜を構成し得る。有機薄膜は、代表的には、その表面に曝露された官能基（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ）を有し、任意の多数の方法において、基板の表面状態または基板上のコーティングを増強するために作用する。例えば、有機薄膜の曝露された官能基は、代表的に、デバイスへの生物学的部分の結合または共有結合的固定化において有用である。あるいは、有機薄膜は、表面に対する生体分子および他の被分析物の非特異的結合を減少する官能基（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））を有し得る。他の曝露された官能基は、薄膜を、基板表面またはコーティングに繋ぎ止める作用をする。有機薄膜の特定の官能基はまた、表面とともに使用される特定の検出技術を可能にするために設計され得る。あるいは、有機薄膜は、デバイス上に固定化された生物学的部分の不活化が、基板表面または基板表面上のコーティングとの接触の際に生じることを防ぐ目的に役立ち得る。
【００４５】
「単層」は、単分子厚の有機薄膜である。単層は、不規則であっても、整列されていてもよい。単層は、必要に応じて、ポリマー性化合物（例えば、ポリ非イオン性ポリマー、ポリイオン性ポリマー、またはブロックコポリマー）であり得る。例えば、単層は、ポリリジンのようなポリ（アミノ酸）から構成され得る。しかし、自己組織化単層である単層が最も好ましい。自己組織化単層の一方の面は、代表的には、基板表面上または基板上のコーティング（存在する場合）に、化学吸着または物理吸着した有機分子の末端の化学的官能基から構成される。単層の適切な官能基の例としては、負に荷電した表面での使用のためのポリ−Ｌ−リジンの陽に荷電したアミノ基、および金表面での使用のためのチオールが挙げられる。代表的には、自己組織化単層の他の面は曝露され、そして任意の数の化学的官能基（末端基）を有し得る。好ましくは、自己組織化単層の分子は、高度に整列されている。
【００４６】
「自己組織化単層」は、分子の自発的な組織化によって生成される単層である。自己組織化単層は、整列されていれも、無秩序でも、短い範囲から長い範囲の整列を示してもよい。
【００４７】
「親和性タグ」は、有機薄膜の曝露された官能基上に生物学的部分を直接的または間接的に固定化し得る官能部分である。好ましくは、親和性タグは、部位特異的固定化を可能にし、従って、有機薄膜上への生物学的部分の配向を増強する。いくつかの場合、親和性タグは、単純な化学的官能基であり得る。他の可能性としては、アミノ酸、ポリ（アミノ酸）タグ、または全長タンパク質が挙げられる。さらに他の可能性としては、糖質および核酸が挙げられる。例えば、親和性タグは、有機薄膜上で官能基として作用する別のポリヌクレオチドか、またはアダプターとして作用する別のポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドであり得る。親和性タグはまた、合成化学部分であり得る。各部位の有機薄膜が脂質二重層または単層を含むならば、膜のアンカーは、適切な親和性タグである。親和性タグは、生物学的部分に、共有結合しても、非共有結合してもよい。例えば、親和性タグがタンパク質である生物学的部分に共有結合する場合、化学的結合を介して付着し得るか、または融合タンパク質であり得る。親和性タグはまた、切断可能な連結を介して生物学的部分に付着し得る。あるいは、親和性タグは、生物学的部分と直接接触しなくてもよい。そのかわり、親和性タグは、アダプターによって生物学的部分から分離され得る。親和性タグは、非共有的相互作用を介してか、または共有連結を介してかのいずれかで、生物学的部分を有機薄膜に固定化し得る。
【００４８】
本発明の目的のために、「アダプター」は、親和性タグを、デバイスの固定化された生物学的部分に連結する任意の実体である。アダプターは、親和性タグおよび生物学的部分の両方に非共有結合的に付着した別個分子であってもよいが、必ずしもそうである必要はない。そのかわり、アダプターは、親和性タグまたは生物学的部分あるいはその両方に共有結合し得る（例えば、化学結合を介してか、または融合タンパク質として）。全長タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドのようなタンパク質が、代表的なアダプターである。他の可能なアダプターとしては、糖質および核酸が挙げられる。
【００４９】
用語「融合タンパク質」とは、その天然の状態において代表的には結合していないが、ペプチド結合を介してそれぞれのアミノ末端およびカルボキシ末端によって結合し、単一の連続するポリペプチドを形成する、２つ以上のポリペプチドから構成されるタンパク質をいう。２つ以上のポリペプチド成分が、ペプチドリンカー／スペーサーを介して、直接的または間接的に結合され得ることが理解される。
【００５０】
用語「通常の生理条件」とは、生きている生物または細胞の内部において典型的な条件を意味する。いくつかの生物（単数または複数）は、極端な条件を提供することが認識されるが、生物内および細胞内の環境は、通常ｐＨ７付近（すなわち、ｐＨ６．５〜ｐＨ７．５）で変化し、主要な溶媒として水を含み、そして０℃を超えて、５０℃未満の温度で存在する。種々の塩濃度は、器官、生物、細胞、または参照として使用される細胞成分に依存することが理解される。
【００５１】
「プロテオミクス（ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ）」とは、プロテオーム（ｐｒｏｔｅｏｍｅ）またはプロテオームのいくつかの画分のいずれかの特徴付けまたは研究を意味する。「プロテオーム」は、細胞または細胞の集団の細胞内タンパク質、および細胞または細胞の集団によって分泌されるタンパク質全体の集合である。この特徴付けとして最も代表的には、細胞によって発現されたタンパク質の存在（通常は量）の測定を含む。タンパク質の機能、構造的特徴付け（例えば、翻訳後修飾）、および細胞内局在もまた、研究され得る。「機能的プロテオミクス」とは、細胞または細胞の集団のタンパク質発現産物の、機能的特徴、活性レベル、および構造的特徴の研究をいう。
【００５２】
（（ｂ）本発明のデバイス）
１つの局面において、本発明は、液体サンプルの成分を分析するためのデバイスを提供する。このデバイスは、複数の非隣接の反応部位を含み、この各々は、以下を含む：基板；基板の表面の一部分に、化学吸着または物理吸着した有機薄膜；および有機薄膜上に固定化した生物学的部分。ここで、この部位の各々は、液体サンプルの成分と独立して反応し得、そして有機薄膜を有さない基板の領域によって、お互いに分離される。
【００５３】
好ましい実施態様において、デバイスは、少なくとも約１０個の反応部位を含有する。特に好ましい実施態様において、デバイスは、少なくとも約１００個の反応部位を含有する。
【００５４】
本発明の好ましい実施態様において、デバイスは、マイクロマシン加工されたデバイスまたは微小製作されたデバイスを含む。このデバイスは、必要に応じて、ミリメーターからセンチメーターのスケールの大きさの微小デバイスである。
【００５５】
本発明の好ましい実施態様において、デバイスの反応部位の各々が、デバイスにおける他の反応部位の微小チャンネルに並行に向けられた微小チャンネル中にある。そのようなデバイスの微小チャンネルは、必要に応じて、デバイスの基板中または基板上に微小製作されているか、またはマイクロマシン加工されている。反応部位は、必要に応じて、微小チャンネルの内部表面全体を覆うか、あるいは、微小チャンネルの内部表面の一部のみを覆う。
【００５６】
別の実施態様において、本発明は、基板、基板中または基板上に微小製作された、複数の並行微小チャンネル、および並行微小チャンネルの少なくとも１つの中に固定化された生物学的部分を含む液体サンプルの成分を分析するためのデバイスであって、ここで生物学的部分が該液体サンプルの成分と相互作用し得る、デバイスを提供する。好ましくは、多数の並行微小チャンネルは、固定化された生物学的部分を含む。各微小チャンネルの固定化された生物学的部分が微小チャンネルの内部表面の少なくとも一部の上で有機薄膜に固定化されることもまた、好ましい。
【００５７】
図１は、バルク基板材料中に製作された、微小チャンネル１のアレイを示す、本発明の１つの実施態様を説明する。特定の示されたデバイスにおいて、４８個の並行微小チャンネル１が、基板３中に微小製作されている。ガラスカバー２は、微小チャンネルアレイの一部を覆う。
【００５８】
本発明の１つの実施態様において、デバイスは、少なくとも２個の並行微小チャンネル反応部位を含む。本発明の別の実施態様において、デバイスは、少なくとも１０個の並行微小チャンネル反応部位を含む。本発明の好ましい実施態様において、デバイスは、少なくとも１００個の並行微小チャンネル反応部位を含む。特定の好ましい実施態様において、デバイスは、約１００個〜約５００個の並行微小チャンネルを含む。微小チャンネルは、代表的には、約１０μｍ〜約５ｍｍでお互いに離れる。デバイスは、必要に応じて、基板１ｃｍ2あたり約２個〜約５００個の並行微小チャンネルを含み得る。
【００５９】
微小チャンネルの大きさは、変化し得る。しかし、好ましい実施態様において、この大きさは、微小の液体サンプル容量のみを必要とするように、十分小さい。本発明のデバイスの各微小チャンネルの幅および深さは、代表的には、約１０μｍと約５００μｍとの間である。デバイスの好ましい実施態様において、各微小チャンネルの幅および深さは、約５０と２００μｍとの間である。各微小チャンネルの長さは、約１から約２０ｍｍ長である。好ましい実施態様において、各微小チャンネルの長さは、約２から約８ｍｍ長である。任意のチャンネルの横断面幾何学（台形、長方形、Ｖ型、半円など）が、デバイスにおいて使用され得る。幾何学は、当該分野において公知のように、微小チャンネルを作製するために使用される微小製作プロセスまたはマイクロマシン加工プロセスのタイプによって決定される。台形または長方形の横断面幾何学は、微小チャンネルにとって好ましい。なぜなら、これらは、標準的な蛍光検出方法と容易に適応するからである。
【００６０】
多数の異なる材料が、本発明のデバイスの基板として使用され得る。基板は、有機または無機、生物学的または非生物学的、あるいはこれらの材料の任意の組み合わせであり得る。基板は、必要に応じて、透明または半透明であり得る。マイクロマシン加工または微小製作のために適切な基板が、好ましい。本発明の基板は、必要に応じて、シリコン、シリカ、石英、ガラス、孔径の制御された多孔質ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）、炭素、アルミナ、チタニア、酸化タンタル、ゲルマニウム、窒化シリコン、ゼオライト、およびガリウムヒ素からなる群から選択される物質を含み得る。金、プラチナ、アルミニウム、銅、チタン、およびその合金のような多くの金属もまた、基板のための選択肢である。さらに、多くのセラミクスおよびポリマーがまた、基板として使用され得る。基板として使用され得るポリマーとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ポリスチレン；ポリ（テトラ）フルオロエチレン（ＰＴＦＥ）；ポリビビニリデンジフルオリド；ポリカーボネート；ポリメチルメタクリレート；ポリビニルエチレン；ポリエチレンイミン；ポリ（エーテルエーテル）ケトン；ポリオキシメチレン（ＰＯＭ）；ポリビニルフェノール；ポリラクチド；ポリメタクリルイミド（ＰＭＩ）；ポリアルケンスルホン（ＰＡＳ）；ポリプロピレン；ポリエチレン；ポリヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）；ポリジメチルシロキサン；ポリアクリルアミド；ポリイミド；およびブロックコポリマー。デバイスのための好ましい基板としては、シリコン、シリカ、ガラス、およびポリマーが挙げられる。基板はまた、上記の基板材料の任意の組み合わせであり得る。
【００６１】
複数の反応部位（例えば、微小チャンネルの並行アレイ）を生成するために、第１に、基板材料を洗浄し、溶媒の汚染、ほこり、または有機残留物のような混入物を取り除く必要がある。種々の洗浄手順を、基板材料および混入物の起源に依存して使用し得る。これらとしては、湿式浸漬（ｗｅｔ  ｉｍｍｅｒｓｉｏｎ）プロセス（例えば、ＲＣＡ１＋２、「ピラニア（ｐｙｒａｎｈａ）」、溶媒）、乾燥気相洗浄（ｄｒｙ  ｖａｐｏｒ  ｐｈａｓｅ  ｃｌｅａｎｉｎｇ）、熱処理、プラズマ放電またはグロー放電技術、研磨化合物を用いて磨く、短波長光曝露、超音波攪拌および超臨界流体での処理が挙げられる。
【００６２】
次に、チャンネルは、以下のいずれかによって基板表面上に形成され得る（１）バルクマイクロマシン加工、（２）犠牲マイクロマシン加工、（３）ＬＩＧＡ（高アスペクト比メッキ）または（４）他の技術、あるいはこれらの任意の組み合わせ。そのような技術は、半導体およびマイクロエレクトロニクス工業の分野で周知であり、そして例えば、Ｇｈａｎｄｉ、ＶＬＳＩ  Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ、Ｗｉｌｅｙ（１９８３）およびＳｚｅ、ＶＬＳＩ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第２版、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ（１９８８）；ＷｏｌｆおよびＴａｕｂｅ、Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＶＬＳＩ  Ｅｒａ、第１巻、Ｌａｔｔｉｃｅ  Ｐｒｅｓｓ（１９８６）、およびＭａｄｏｕ、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（１９９７）に記載される。
【００６３】
バルクマイクロマシン加工において、基板の大部分が取り除かれ、微小チャンネルの最終的な大きさを含む長方形またはＶ型の溝を形成する。このプロセスは、通常、標準的なフォトリソグラフィー技術（レジスト材料のスピンコーティング、リソグラフィーマスクを通しての照射、その後の湿式化学現像ならびにディスカム（ｄｅｓｃｕｍｍｉｎｇ）およびポストベーキングのような処理後の工程を含む）によって行われる。次に、生じるレジストのパターンを、バルク材料のその後の湿式エッチングまたはドライエッチングのためのエッチレジスト材料として使用して、所望の形状構造を形成する。代表的なレジスト材料としては、陽性および陰性有機レジスト（例えば、Ｋｏｄａｋ７４７、ＰＲ１０２）、無機材料（例えば、ポリシリコン、窒化シリコン）および生物学的エッチレジスト（例えば、ラングミュアー・ブロジェット膜およびＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃｌａｄａｒｉｕｓのＳ層のような２次元タンパク質結晶）が挙げられる。基板およびレジストストリッピングへのパターンの転写は、湿式化学エッチング技術およびドライエッチング技術（プラズマエッチング、反応性イオンエッチング、スパッタリング、イオンビームに補助された化学エッチング、および反応性イオンビームエッチングを含む）を介して生じる。
【００６４】
本発明の１つの実施態様において、例えば、フォトレジストを洗浄した４インチＳｉ（１１０）ウェーハ上にスピン塗布し得る。次に、フォトマスクを通しての、フォトレジストへの紫外光曝露は、フォトレジストにおけるチャンネルのパターンを生じ、下層にあるシリコンのストリップのパターンを曝露する。次に、湿式化学エッチング技術を、シリコン中にチャンネルパターンをエッチングするために適用し得る。次に、チタンの薄層を、表面にコートし得る。次に、金の薄層を、熱エバポレーションまたは電子ビームエバポレーションを用いて、表面にコートする。標準的なレジストストリッピングが続く。（あるいは、ストリップレジストの後に、金コーティングを行い得る）。
【００６５】
図２は、バルクマイクロマシン加工によって製作された微小チャンネルアレイの１例の横断面図を示す。基板３の中の微小チャンネル１を、カバーガラス２で覆う。微小チャンネルの底面では、基板３の表面を、中間層６によって分離されたコーティング５で覆う。
【００６６】
犠牲マイクロマシン加工において、基板は、実質的には処理しないままである。他の材料の種々の厚みの層が、蒸着、プラズマ増強化学蒸着（ＰＥＣＶＤ）またはスピンコーティングによって構築され、そして次のプロセシング工程によって、選択的に後ろに残されるか、または取り除かれる。従って、生じるチャンネル壁は、チャンネルの底部とは化学的に異なり、そしてレジスト材料は、微小デバイスの一部として残る。犠牲マイクロマシン加工のための代表的なレジスト材料は、直線の側壁を有する高アスペクト比造作の形成を可能にする、窒化シリコン（Ｓｉ3Ｎ4）、ポリシリコン、熱成長酸化シリコン、およびＳＵ−８のような有機レジストおよびポリイミドである。
【００６７】
図３は、犠牲マイクロマシン加工によって製作された微小チャンネルアレイの１例の横断面図を示す。微小チャンネル１は、フォトレジスト４からなる壁、ならびにコーティング５および中間層６によって覆われる基板３を備える床を備える。カバーガラス２は、微小チャンネル１を覆う。
【００６８】
高アスペクト比メッキまたはＬＩＧＡにおいて、三次元金属構造を、Ｘ線レジストで覆われた材料上への高エネルギーＸ線照射曝露によって作製する。引き続いての電着およびレジストの除去は、精密プラスチック注入成形のために使用され得る金属構造を生じる。これらの注入成形されたプラスチック部分は、最終的な微小デバイスとして、またはロストモールド（ｌｏｓｔ  ｍｏｌｄ）のいずれかとして使用され得る。ＬＩＧＡプロセスは、Ｂｅｃｋｅｒら、Ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  （１９８６）４：３５〜５６およびＢｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｅｎ（１９８２）６９：５２０〜５２３によって記載されている。
【００６９】
微小チャンネルアレイ製作のための代替的な技術としては、集束イオンビーム（ＦＩＢ）ミリング、静電破壊機械加工（ＥＤＭ）、超音波ドリリング、レーザーアブレーション（米国特許第５，５７１，４１０号）、機械的ミリングおよび熱成形技術が挙げられる。当業者は、微小作製またはマイクロマシン加工技術における多くの改変を使用して、本発明のデバイスを構築し得ることを理解する。
【００７０】
１つの実施態様において、透明または半透明なカバーが、アノード性結合または付着性コーティングを介して、基板に付着され、入口および出口ポートを有する微小チャンネルアレイを生じる。好ましい実施態様において、微小チャンネルカバーは、ガラス、特にパイレックスまたは石英ガラスである。代替的な実施態様において、透明でも半透明でもないカバーが、基板に結合され得るか、そうでなければ、付着され得、微小チャンネルを囲み得る。他の実施態様において、カバーは、チャンネル内に固定化された生物学的部分と被分析物との間の相互作用をモニターする検出系の一部であり得る。あるいは、ポリマー性のカバーが、他の手段（例えば、圧力をともなう熱の適用によってか、または溶媒ベースの結合を介する）によって、ポリマー性基板チャンネルアレイに付着され得る。
【００７１】
覆われた微小チャンネルアレイの１つの特定の実施態様を、図１において説明する。このデバイスにおいて、透明なカバーガラス２は、アレイの並行化微小チャンネルの各々の長さの、全てではないにしてもほとんどを覆う。この特定の実施態様において、微小チャンネルは、基板の端まで完全には広がらないので、チャンネルの長さの不完全な覆いが、微小チャンネルの各々について、入口および出口のポートを提供する。
【００７２】
微小チャンネルアレイに対するカバーの付着は、反応部位上の有機薄膜の形成に先立ち得る。この場合には、有機薄膜の成分を含む溶液（代表的には有機溶媒）を、一体型微小キャピラリーおよび適切な入口／出口ポートを有する、微細作製された分配系を介して、チャンネルの内部に適用し得る。あるいは、有機薄膜を、微小チャンネルを囲む前に微小チャンネル中に沈着し得る。これらの実施態様のために、単層のような有機薄膜を、必要に応じて、単純な浸漬を介してか、またはミクロ接触プリンティング（ＰＣＴ公報ＷＯ９６／２９６２９を参照のこと）を介して、内部の微小チャンネル表面に転写し得る。もっとも好ましい実施態様において、全ての微小チャンネル中の有機薄膜は、同一である。そのような場合、微小チャンネルアレイの単純な浸漬、または薄膜成分を含有する同一の液体と全ての微小チャンネル内部のインキュベーションで十分である。
【００７３】
各囲まれた微小チャンネルの容量は、必要に応じて、約５ナノリットルから約３００ナノリットルであり得る。好ましい実施態様において、本発明のデバイスの囲まれた微小チャンネルの容量は、１０と５０ナノリットルとの間である。
【００７４】
流体の容量は、当業者に公知の多数の標準的手段によって、各微小チャンネルを通して移動し得る。微小流体デバイスを通して流体を移動させるため、およびマイクロタイタープレート中での混合のために必要とされる精巧な手段は、本発明の微小チャンネルアレイには必要ではない。キャピラリー技術を用いて一般に使用される単純な液体交換技術で十分である。例えば、流体は、標準的なポンプを使用して、チャンネルを通して移動され得る。あるいは、電気浸透のような、微小チャンネルを通しての流体移動のより精巧な方法が、使用され得る（例えば、米国特許第４，９０８，１１２号を参照のこと）。
【００７５】
本発明の１つの実施態様において、バルク−ローディング分配デバイスを使用して、同一の流体を、一度にデバイスの微小チャンネルの全てにロードし得る。あるいは、一体型微小キャピラリー分配デバイスは、ガラスまたは他の基板から微小製作され得、デバイスの各微小チャンネルに別々に流体をロードし得る。
【００７６】
次に、微小チャンネルの形成後、側面、底面または微小チャンネルのカバーまたはこれらの任意の部分またはその組み合わせが、さらに化学的に改変され、所望の生物反応特性および生体適合特性を達成し得る。
【００７７】
デバイスの反応部位は、必要に応じて、基板とその有機薄膜との間のコーティングをさらに含み得る。このコーティングは、基板上に形成され得るか、または基板上に適用され得るかのいずれかである。基板は、薄膜技術をベースとする、例えば、物理蒸着（ＰＶＤ）、熱プロセシング、またはプラズマ増強化学蒸着（ＰＥＣＶＤ）を使用することによるコーティングを用いて改変され得る。あるいは、プラズマ曝露を使用して、直接活性化するか、または基板を改変して、コーティングを作製し得る。例えば、プラズマエッチング手順を使用して、ポリマー性表面（すなわち、ヒドロキシル、カルボン酸、アルデヒドなどのような極性官能基を曝露するポリスチレンまたはポリエチレン）を酸化し得る。
【００７８】
コーティングは、必要に応じて、金属膜である。可能な金属膜としては、アルミニウム、クロム、チタン、タンタル、ニッケル、ステンレス鋼、亜鉛、鉛、鉄、銅、マグネシウム、マンガン、カドミウム、タングステン、コバルト、ならびにそれらの合金および酸化物が挙げられる。好ましい実施態様において、金属膜は、貴金属膜である。コーティングのために使用され得る貴金属としては、金、プラチナ、銀および銅が挙げられるがこれらに限定されない。特に好ましい実施態様において、コーティングは、金または金合金を含む。電子ビームエバポレーションを使用して、基板の表面上に金の薄いコーティングを提供し得る。好ましい実施態様において、金属膜は、約５０ｎｍから約５００ｎｍの厚さである。別の実施態様において、金属膜は、約１ｎｍから約１μｍの厚さである。
【００７９】
代替的な実施態様において、コーティングは、シリコン、酸化シリコン、チタニア、酸化タンタル、窒化シリコン、水素化シリコン、酸化スズインジウム、酸化マグネシウム、アルミナ、ガラス、ヒドロキシル化表面、およびポリマーからなる群から選択される組成を含む。
【００８０】
もし反応部位が、基板と有機薄膜との間のコーティングを含むならば、コーティングは有機薄膜上の適切な官能基が利用可能である材料から構成されなければならないことが理解される。もしそのようなコーティングが存在しないならば、基板は有機薄膜上の適切な官能基が利用可能である材料から構成されなければならないことが理解される。
【００８１】
多くのコーティングが少なくとも１つの付着層、またはコーティングと基板との間のメディエーターの追加を必要とすることが予想される。例えば、チタンまたはクロムの層は、シリコンウェーハと金コーティングとの間に望ましくあり得る。代替的な実施態様において、Ｅｐｏ−ｔｅｋ３７７（登録商標）、Ｅｐｏ−ｔｅｋ３０１−２（登録商標）（Ｅｐｏｘｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）のようなエポキシ接着剤が、基板へのコーティングの付着を助けるために好ましくあり得る。付着層に如何なる材料が使用されるべきかの決定は、一旦、基板およびコーティングの両方について材料が選択されると、当業者にとって自明である。他の実施態様において、さらなる付着メディエーターまたは中間層が、デバイスの光学特性（例えば、検出目的のための導波路において）の改善のために必要であり得る。
【００８２】
基板上へのコーティングの沈着または形成（そのようなコーティングが所望される場合）は、基板上への有機薄膜の形成前に生じなければならない。
【００８３】
デバイスの反応部位の有機薄膜は、基板自体の上か、または基板を覆うコーティングの上のいずれかに、層を形成する。生物学的部分が固定化される有機薄膜は、好ましくは、約２０ｎｍ未満の厚さである。本発明のいくつかの実施態様において、各部位の有機薄膜は、約１０ｎｍ未満の厚さであり得る。
【００８４】
種々の異なる有機薄膜が、本発明の使用のために適切である。有機薄膜の形成方法としては、表面からのインサイチュでの成長、物理吸着による沈着、スピンコーティング、化学吸着、自己組織化、またはプラズマが開始する気相からの重合が挙げられる。例えば、デキストランのような材料から構成されるヒドロゲルは、デバイスの部位上の適切な有機薄膜として作用し得る。本発明の１つの好ましい実施態様において、有機薄膜は、脂質二重層または脂質単層である。別の好ましい実施態様において、デバイスの各部位の有機薄膜は、単層である。負に荷電した基板またはコーティング上に吸着されたポリアルギニンまたはポリリジンの単層は、有機薄膜の１つの選択肢である。別の選択肢は、つなぎとめられたポリマー鎖の無秩序な単層である。特定の好ましい実施態様において、有機薄膜は、自己組織化単層である。ポリリジンの単層は、有機薄膜についての１つの選択肢である。この有機薄膜は、最も好ましくは、式Ｘ−Ｒ−Ｙ（ここで、Ｒは、スペーサーであり、Ｘは、Ｒを表面に結合させる官能基であり、そしてＹは、タンパク質を単層に結合させるための官能基である）の分子を含む自己組織化単層である。代替的な好ましい実施態様において、自己組織化単層は式（Ｘ）aＲ（Ｙ）bの分子から構成され、ここで、ａおよびｂは、独立して少なくとも１に等しい整数であり、Ｘ、Ｒ、およびＹは以前に定義したとおりである。代替的な好ましい実施態様において、有機薄膜は、式Ｘ−Ｒ−Ｙの分子の自己組織化単層の表面に固定化された脂質二重層の組み合わせのような有機薄膜の組み合わせを含む。別の例として、ポリリジンの単層もまた、必要に応じて、式Ｘ−Ｒ−Ｙの分子の自己組織化単層と組み合わせられ得る（米国特許第５，６２９，２１３号を参照のこと）。
【００８５】
種々の化学的部分が、本発明のデバイスにおいて、式Ｘ−Ｒ−Ｙの単層分子として機能し得る。しかし、３つの主要なクラスの単層形成が、好ましくは使用され、デバイスの反応部位上に高密度の反応性オメガ官能部分を曝露する：（ｉ）ヒドロキシル化および非ヒドロキシル化表面上のアルキルシロキサン単層（「シラン」）（例えば、米国特許第５，４０５，７６６号、ＰＣＴ公報ＷＯ９６／３８７２６、米国特許第５，４１２，０８７号および米国特許第５，６８８，６４２号に教示されるように）；（ｉｉ）貴金属（好ましくはＡｕ（ＩＩＩ））上のアルキルチオール／ジアルキルジスルフィド単層（例えば、Ａｌｌａｒａら、米国特許第４，６９０，７１５号；Ｂａｍｄａｄら、米国特許第５，６２０，８５０号；Ｗａｇｎｅｒら、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ、１９９６、７０：２０５２〜２０６６に記載されるように）；ならびに（ｉｉｉ）酸化物を含まない不動態化シリコン上のアルキル単層形成（例えば、Ｌｉｎｆｏｒｄら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９９５、１１７：３１４５〜３１５５、Ｗａｇｎｅｒら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９７、１１９：１８９〜２０１、米国特許第５，４２９，７０８号に教示されるように）。しかし、当業者は、基板、コーティングおよび親和性タグの選択に主に依存して、多くの可能な部分がＸ、Ｒ、および／またはＹの代わりとなり得ることを理解する。単層の多くの例が、Ｕｌｍａｎ、Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｕｌｔｒａｔｈｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｆｉｌｍｓ：Ｆｒｏｍ  Ｌａｎｇｍｕｉｒ−Ｂｌｏｄｇｅｔｔ  ｔｏ  Ｓｅｌｆ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  ｐｒｅｓｓ（１９９１）に記載される。
【００８６】
１つの実施態様において、単層は、式（Ｘ）aＲ（Ｙ）bの分子を含み、ここで、ａおよびｂは、独立して、１と約２００との間に等しい整数である。好ましい実施態様において、ａおよびｂは、独立して、１と約８０との間に等しい整数である。より好ましい実施態様において、ａおよびｂは、独立して、１または２に等しい整数である。最も好ましい実施態様において、ａおよびｂは、両方とも１に等しい（式Ｘ−Ｒ−Ｙの分子）。
【００８７】
本発明のデバイスの部位が、式（Ｘ）aＲ（Ｙ）bの分子の自己組織化単層を含むならば、Ｒは、必要に応じて、約１から約４００の炭素長の直鎖状または分岐炭化水素鎖を含む。炭化水素鎖は、アルキル基、アリール基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アルカリール（ａｌｋａｒｙｌ）基、アラルキル基、またはこれらの任意の組み合わせを含み得る。もしａとｂの両方が１に等しければ、Ｒは、代表的には約３から約３０炭素長のアルキル鎖である。好ましい実施態様において、ａとｂの両方が１に等しければ、Ｒは、約８から約２２炭素長のアルキル鎖であり、必要に応じて、直鎖アルカンである。しかし、代替的な実施態様において、Ｒが容易に約２から約４００炭素長の直鎖状または分岐炭水化物鎖を含み得、そして少なくとも１つのヘテロ原子によって中断されることもまた意図される。中断するヘテロ基としては、−Ｏ−、−ＣＯＮＨ−、−ＣＯＮＨＣＯ−、−ＮＨ−、−ＣＳＮＨ−、−ＣＯ−、−ＣＳ−、−Ｓ−、−ＳＯ−、−（ＯＣＨ2ＣＨ2）ｎ−（ここでｎ＝１〜２０）、−（ＣＦ2）n−（ここでｎ＝１〜２２）などが挙げられ得る。あるいは、Ｒの１つ以上の水素部分が、ジュウテリウムによって置換され得る。代替的な、より好ましくない実施態様において、Ｒは、約４００炭素長を超え得る。
【００８８】
Ｘは、基板表面上（または、存在する場合はコーティング）に単層の化学吸着または物理吸着をもたらす任意の基として選択され得る。例えば、基板またはコーティングが金属または金属合金の場合、少なくとも単層への取り込み前のＸは、好ましくは対称または非対称の、ジスルフィド、スルフィド、ジセレニド、セレニド、チオール、イソニトリル、セレノール（ｓｅｌｅｎｏｌ）、三価のリン化合物、イソチオシアネート、イソシアネート、キサンタネート、チオカルバメート、ホスフィン、アミン、チオ酸、およびジチオ酸である。この実施態様は、基板（または、使用される場合はコーティング）が、金、銀またはプラチナのような貴金属の場合は、特に好ましい。
【００８９】
デバイスの基板が、シリコン、酸化シリコン、酸化スズインジウム、酸化マグネシウム、アルミナ、石英、ガラスまたはシリカのような材料ならば、本発明の１つの実施態様のデバイスは、この単層への取り込み前に、モノハロシラン、ジハロシラン、トリハロシラン、トリアルコキシシラン、ジアルコキシシラン、またはモノアルコキシシランであるＸを含む。これらのシランの中で、トリクロロシランおよびトリアルコキシシランが、特に好ましい。
【００９０】
本発明の好ましい実施態様において、基板は、シリコン、二酸化シリコン、酸化スズインジウム、アルミナ、ガラスおよびチタニアからなる群から選択され；そして、その単層中への取り込み前に、Ｘが、モノハロシラン、ジハロシラン、トリハロシラン、トリクロロシラン、トリアルコキシシラン、ジアルコキシシラン、モノアルコキシシラン、カルボン酸、およびリン酸からなる群から選択される。
【００９１】
本発明の別の好ましい実施態様において、デバイスの基板は、シリコンであり、Ｘはオレフィンである。
【００９２】
なお別の好ましい実施態様において、コーティング（コーティングが存在しない場合は、基板）は、チタニアまたは酸化タンタルであり、そしてＸは、リン酸である。
【００９３】
他の実施態様において、基板表面（または基板表面上のコーティング）は、酸化チタン、酸化タンタル、酸化スズインジウム、酸化マグネシウム、またはアルミナのような金属から構成され、ここで、Ｘは、カルボン酸またはアルキルリン酸である。あるいは、デバイスの基板表面（または基板表面上のコーティング）が銅であるならば、Ｘは、必要に応じて、ヒドロキサム酸であり得る。
【００９４】
本発明において使用される基板が、ポリマーであるならば、多くの場合において、銅コーティングのような基板上のコーティングが、デバイスに含まれる。次に、コーティングのための適切な官能基Ｘを、このデバイスにおける使用のために選択する。ポリマー基板を含む代替的な実施態様において、ポリマーの表面は、プラズマ修飾され、単層形成のために所望の表面の官能基を曝露し得る。例えば、ＥＰ  ７８０４２３は、プラズマで曝露された表面上にアルケンＸ官能基を有する単層分子の使用を記載する。ポリマーから構成される本発明のデバイスのなお別の可能性は、単層が形成されるポリマーの表面が適切に官能化された前駆体分子の共重合に起因して官能化されるということである。
【００９５】
別の可能性は、単層への取り込み前に、Ｘがフリーラジカル生成部分であり得るということである。この官能基は、単層が形成される表面が水素化されたシリコン表面である場合、特に適切である。可能なフリーラジカル生成部分としては、ジアシルペルオキシド、ペルオキシド、アゾ化合物であるが、これらに限定されない。あるいは、Ｘを用いる反応が、紫外線、赤外線、可視光線、またはマイクロ波照射によって達成される場合、非置換型アルケン、アルキン、シアノ化合物、およびイソニトリル化合物のような不飽和部分がＸについて使用され得る。
【００９６】
代替的な実施態様において、単層への取り込み前に、Ｘは、ヒドロキシル基、カルボキシル基、ビニル基、スルホニル基、ホスホリル基、水素化シリコン基、またはアミノ基であり得る。
【００９７】
単層の成分Ｙは、単層上への生物学的部分の結合の原因である。本発明の好ましい実施態様において、Ｙ基は、生物学的部分（またはその親和性タグ）に対して高度に反応性（活性化）であるか、またはそのような活性化形態に容易に変換されるかのいずれかである。好ましい実施態様において、Ｙと生物学的部分との結合は、生物学的部分の生物学的活性に有害でない通常の生理学的条件下で容易に生じる。官能基Ｙは、生物学的部分（または存在する場合、その親和性タグ）と、共有結合または非共有結合のいずれかを形成し得る。好ましい実施態様において、官能基Ｙは、生物学的部分、またはその親和性タグとの共有結合を形成する。生物学的部分（親和性タグを有するかまたは有さない）のＹへの付着の後、Ｙの化学的性質が変化し得ることが理解される。生物学的部分への付着の際に、Ｙは、有機薄膜から除去すらされ得る。
【００９８】
本発明の１つの実施態様において、Ｙは、生物学的部分への付着の前に、インサイチュで活性化される官能基である。このタイプの官能基の可能性としては、ヒドロキシル基、カルボキシル基、アミノ基、アルデヒド基、カルボニル基、メチル基、メチレン基、アルケン基、アルキン基、カーボネート基、ヨウ化アリール基、またはビニル基のような単純な部分が挙げられるがこれらに限定されない。これらの単純な官能基の活性化の適切な様式は、当業者に公知である。あるいは、Ｙは、生物学的部分を捕獲するのに十分に活性化される前に、光活性化を必要とする官能基を含み得る。
【００９９】
本発明のデバイスの特定の好ましい実施態様において、Ｙは、単層形成と適合性の高度に反応性の官能部分であり、そして生物学的部分またはその親和性タグとの反応前にインサイチュでの活性化を必要としない。Ｙについてのそのような可能性としては、マレイミド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｗａｇｎｅｒら、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ、１９９６、７０：２０５２〜２０６６）、ニトリロトリ酢酸（米国特許第５，６２０，８５０号）、活性化ヒドロキシル、ハロアセチル、ブロモアセチル、ヨードアセチル、活性化カルボキシル、ヒドラジド、エポキシ、アジリジン、スルホニルクロライド、トリフルオロメチルジアジリジン、ピリジルジスルフィド、Ｎ−アシル−イミダゾール、イミダゾールカルバメート、ビニルスルホン、スクシンイミジルカーボネート、アリールアジド、無水物、ジアゾアセテート、ベンゾフェノン、イソチオシアネート、イソシアネート、イミドエステル、フルオロベンゼン、およびビオチンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１００】
図４は、基板３上の単層の一例を示す。この例において基板３は、ガラスを含む。この単層は、チオ反応性である、なぜなら、マレイミジル官能基Ｙを有するからである。
【０１０１】
図５は、シリコンである基板３上の単層の別の例を示す。しかし、この場合、金薄膜コーティング５は、基板３の表面を覆う。この実施態様において、チタン付着中間層６もまた使用され、コーティング５を基板３に付着させる。この単層は、アミノ反応性である。なぜなら、これは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル官能基Ｙを有するからである。
【０１０２】
代替的な実施態様において、Ｙは、単純な官能部分から選択される。可能なＹ官能基としては、−ＯＨ、−ＮＨ2、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＲ、−ＲＳＲ、−ＰＯ4-3、−ＯＳＯ3-2、−ＳＯ3-、−ＣＯＯ−、−ＳＯＯ−、−ＣＯＮＲ2、−ＣＮ、−ＮＲ2などが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１０３】
本発明の単層分子は、必要に応じて、ある程度表面上で組織化し得る。すなわち、単層は、基板（またはコーティング）表面への、式Ｘ−Ｒ−Ｙの分子の化学吸着または物理吸着によって構築されることが必ずしも必要ではない。そのかわり、１つの実施態様において、Ｘは、まず、単独で基板（またはコーティング）表面へ化学吸着または物理吸着され得る。次に、ＲまたはＲの個々の成分のみでさえもが、適切な化学反応を介して、Ｘに付着し得る。表面に既に固定化されたＸ部分へのスペーサーＲの添加の完了の際に、Ｙは、適切な共有結合を介して単層分子の末端に付着し得る。
【０１０４】
所定の反応部位で、全ての単層分子が同一である必要はない。いくつかは、混合した単層からなり得る。例えば、個々の反応部位の単層は、必要に応じて、少なくとも２つの異なるＸ−Ｒ−Ｙ分子を含み得る。この第２のＸ−Ｒ−Ｙ分子は、同一かまたは異なる生物学的部分を固定化し得る。さらに、反応部位の多くの単層分子Ｘ−Ｒ−Ｙは、任意の生物学的部分を付着し損なってもよい。
【０１０５】
本発明の別の代替物として、個々の反応部位の単層は、式Ｘ−Ｒ−Ｖ（Ｒは、スペーサーであり、Ｘは、Ｒを表面に結合させる官能基であり、Ｖは、生体分子の非特異的結合に抵抗する部分である）である第２の有機分子を含み得る。当業者は、Ｖの可能性がデバイスのその部位について選択された生物学的部分の性質に応じて変化することを認識する。例えば、デバイスの固定化された生物学的部分がタンパク質を含む場合、非特異的タンパク質結合に抵抗性の官能基Ｖが使用される。Ｖの性質は、使用されるタンパク質および溶液のタイプに、いくぶん依存する。例えば、Ｖは、ヒドロキシル部分、糖類部分、またはオリゴ／ポリエチレングリコール部分を含み得る（ＥＰ公報７８０４２３）。
【０１０６】
本発明のデバイスのなおさらなる代替物として、デバイスは、式Ｘ−Ｒ−Ｖ（Ｒは、スペーサーであり、Ｘは、Ｒを表面に結合させる官能基であり、Ｖは、生体分子の非特異的結合に抵抗する部分である）の分子の単層を含む、任意の生物学的部分を有さない少なくとも１つの非反応部位をさらに含み得る。この実施態様において、非反応部位は、式Ｘ−Ｒ−Ｙの分子の単層を含まない。
【０１０７】
単層分子の性質にかかわらず、いくつかの場合、単層の分子間に架橋を提供することが所望され得る。一般に、このことは、単層にさらなる安定性をもたらす。そのような単層の架橋方法は、当業者に公知である（Ｕｌｌｍａｎ、Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｕｌｔｒａｔｈｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｆｉｌｍｓ：Ｆｒｏｍ  Ｌａｎｇｍｕｉｒ−Ｂｌｏｄｇｅｔｔ  ｔｏ  Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１）を参照のこと）。
【０１０８】
基板への生物学的部分の結合の促進に加え、有機薄膜を有する基板の官能化もまた、他の理由のために所望される。多くの生物学的部分および特にタンパク質は、表面界面において、その生物学的活性の破壊を受けやすい。タンパク質は、固体／液体界面において、変性および所望されない非特異的結合の両方をしやすい。低分子リガンドのような他の生物学的部分は、基板表面界面においてさほど問題のある相互作用を有さないかもしれないが、アッセイにおいて、低分子への生物学的結合パートナー（おそらくタンパク質）の接近の際に、不活化の問題が、非常に関係してくる。高度に整列された有機単層が、基板またはコーティングの表面を効果的に「一面に覆い」得、表面との接触から生物学的部分を保護し得る。これらの高度に整列された自己組織化単層が、本発明において好ましい。さらに、スペーサーＲは、固定化された生物学的部分と表面との間の距離を作る。
【０１０９】
本発明のデバイスの反応部位上の有機薄膜の形成後に、生物学的部分を単層に固定化する。固定化する生物学的部分を含む溶液を、一体型の微小キャピラリーおよび入口／出口ポートを有する微小製作されたアダプター系を用いて溶液を分配することにより、生体反応性である、有機薄膜で覆われた微小デバイスの部位に曝露し得る。そのような分配機構は、例えば、デバイスの反応部位が、覆われた並行マイクロチャンネル中にある場合、適切である。あるいは、生物学的部分は、当該分野において周知であり、市販すらされているキャピラリー分配系ベースのアレイヤー（ａｒｒａｙｅｒ）の１つを用いることにより、デバイスの覆われていない部位に移され得る。これらの分配系は、好ましくは、自動化され、そしてコンピュータに補助される。自動化キャピラリー系を含むマイクロアレイヤーの例についての記載および組み立て指示書は、ｈｔｔｐ：／／ｃｍｇｍ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｐｂｒｏｗｎ／ａｒｒａｙ．ｈｔｍｌおよびｈｔｔｐ：／／ｃｍｇｍ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｐｂｒｏｗｎ／ｍｇｕｉｄｅ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌにおいて、インターネットで見出され得る。他のプリンティング技術の使用もまた、予想される。単層に生物学的部分を付着した後、未反応のＹ官能基は、好ましくは、デバイスの使用前にクエンチされる。
【０１１０】
本発明の代替的な実施態様において、デバイスの反応部位は、微小チャンネル内に含まれない。例えば、そのかわりに、本発明のデバイスの反応部位は、同時係属の米国特許出願「Ａｒｒａｙｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｃａｐｔｕｒｅ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｕｓｅ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」、１９９９年７月１４日出願、識別番号２４４０６−０００６、発明者Ｐｅｔｅｒ  Ｗａｇｎｅｒ、Ｓｔｅｆｆｅｎ  Ｎｏｃｋ、Ｄａｎａ  Ａｕｌｔ−Ｒｉｃｈｅ、およびＣｈｒｉｓｔｉａｎ  Ｉｔｉｎ、ならびに「Ａｒｒａｙｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｕｓｅ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」、１９９９年７月１４日出願、識別番号（ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）２４４０６−０００４  Ｐ１、発明者Ｐｅｔｅｒ  Ｗａｇｎｅｒ、Ｄａｎａ  Ａｕｌｔ−Ｒｉｃｈｅ、Ｓｔｅｆｆｅｎ  Ｎｏｃｋ、およびＣｈｒｉｓｔｉａｎ  Ｉｔｉｎ（この両方が、その全体が本明細書において参考として援用される）に記載されるいくつかのような反応部位のアレイを形成し得る。
【０１１１】
（（ｃ）親和性タグおよび生物学的部分の固定化）
好ましい実施態様において、デバイスの反応部位は、有機薄膜上への生物学的部分の固定化を増強する親和性タグをさらに含む。生物学的部分を固定化する親和性タグの使用は、いくつかの利点を代表的に提供する。有機薄膜が上記のＸ−Ｒ−Ｙ単層の場合、親和性タグは、有機薄膜上のＹのような官能基との生物学的部分の増強した結合または反応をもたらし得る。この増強効果は、速度論的か、または熱力学的のいずれかであり得る。デバイスの反応部位において使用される親和性タグ／薄膜の組み合わせは、好ましくは、生物学的部分の安定性または機能に不都合な、激しい反応条件を必要としない様式において、生物学的部分の固定化を可能にする。ほとんどの実施態様において、水溶液の生物学的緩衝液中での有機薄膜への固定化が理想的である。
【０１１２】
親和性タグはまた、好ましくは、生物学的部分の指定された部位または位置に特異的な有機薄膜の固定化（部位特異的固定化）を提供する。このことを生じるために、生物学的部分に対する親和性タグの付着は、部位特異的でなければならない。部位特異的固定化は、固定化された生物学的部分の活性部位または結合部位（例えば、抗体の抗原結合部位）が、溶液中のリガンドに接近可能のままであることを確実にすることを助ける。親和性タグを介する固定化の他の利点は、複数の異なる生物学的部分について、共通の固定化戦略が使用されることを可能にするということである。
【０１１３】
親和性タグは、生物学的部分に対して、必要に応じて直接的に、共有結合または非共有結合のいずれかで付着する。しかし、代替的な実施態様において、親和性タグは、生物学的部分に共有結合または非共有結合のいずれかで付着するアダプターに対して、共有結合または非共有結合のいずれかで付着する。
【０１１４】
好ましい実施態様において、親和性タグは、少なくとも１つのアミノ酸を含む。親和性タグは、有機薄膜の官能基と反応性の少なくとも２つのアミノ酸を含むポリペプチドであり得る。あるいは、親和性タグは、有機薄膜と反応性の単一のアミノ酸であり得る。有機薄膜と反応し得る可能なアミノ酸の例としては、システイン、リジン、ヒスチジン、アルギニン、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、トリプトファン、セリン、スレオニン、およびグルタミンが挙げられる。固定化される反応部位の生物学的部分が、タンパク質ならば、ポリペプチドまたはアミノ酸の親和性タグが、好ましくは、生物学的部分を有する融合タンパク質として発現される。アミノ酸親和性タグは、有機薄膜の官能基（例えば、自己組織化単層分子のＹ官能基）と相互作用し得る単一のアミノ酸または一連のアミノ酸のいずれかを提供する。アミノ酸親和性タグは、組換えタンパク質に容易に導入され得、単層のＹ官能基または代替的な有機薄膜上の官能基への共有結合による配向性固定化を促進する。
【０１１５】
親和性タグは、必要に応じて、ポリ（アミノ酸）タグを含み得る。ポリ（アミノ酸）タグは、単一のアミノ酸の約２〜約１００残基（必要に応じて他のアミノ酸によって中断される）を含むポリペプチドである。例えば、親和性タグは、ポリ−システイン、ポリリジン、ポリ−アルギニン、またはポリ−ヒスチジンを含み得る。アミノ酸タグは、好ましくは、２〜２０残基の単一のアミノ酸（例えば、ヒスチジン、リジン、アルギニン、システイン、グルタミン、チロシン）、またはこれらの任意の組み合わせから構成される。好ましい実施態様に従って、１〜２０アミノ酸のアミノ酸タグは、少なくとも、チオエーテル結合のための１〜１０個のシステインを含むか；またはアミド結合のための１〜１０個のリジン；または隣接したジカルボニル基と結合するための１〜１０個のアルギニン、を含む。当業者は、適切な親和性タグと、有機薄膜上の所定の官能基とを、容易に対にし得る。
【０１１６】
アミノ酸タグの位置は、生物学的部分の活性部位または結合部位が、リガンド相互作用のために接近可能な位置のままである限り、タンパク質である反応部位の生物学的部分のアミノ末端またはカルボキシ末端、あるいは、その間のどこかに存在し得る。選択されたタンパク質に適合性の場合、タンパク質精製のために導入された親和性タグが、好ましくは、組換えタンパク質のＣ末端に位置し、タンパク質精製の間に全長タンパク質のみが単離されることを確実にする。例えば、インタクトな抗体が、反応部位において使用されるならば、抗体における親和性タグの付着点は、好ましくは、抗体のエフェクター（Ｆｃ）領域のＣ末端に位置する。ｓｃＦｖが反応部位で使用されるならば、親和性タグの付着点はまた、好ましくは、その分子のＣ末端に位置する。
【０１１７】
親和性タグはまた、１つ以上の非天然アミノ酸を含み得る。非天然アミノ酸は、終止コドン（すなわち、アンバー）を認識するサプレッサーｔＲＮＡを使用して導入され得る（Ｎｏｒｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８９、２４４：１８２〜１８８；Ｅｌｌｍａｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍ．、１９９１、２０２：３０１〜３３６；Ｃｌｏａｄら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、１９９６、３：１０３３〜１０３８）。ｔＲＮＡは、化学的にアミノアシル化されて、特定のカップリング化学（すなわち、ケトン修飾、光反応性基）との使用のための化学的に改変された（「非天然」）アミノ酸を含む。
【０１１８】
代替的な実施態様において、親和性タグは、限定されないがグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、抗体、アビジン、またはストレプトアビジンのようなインタクトなタンパク質を含み得る。
【０１１９】
当該分野において公知の他のタンパク質結合体化技術および固定化技術が、生物学的部分に親和性タグを付着する目的のために適応され得る。例えば、デバイスの代替的な実施態様において、親和性タグは、目的の生物学的部分に化学的に結合した、有機生物結合体であり得る。ビオチンまたは抗原は、生物学的部分に、化学的に架橋され得る。あるいは、チオールまたはアミンのような単純な官能部分を、デバイスの反応部位上に固定化される生物学的部分の表面に付着する化学的架橋剤が、使用され得る。あるいは、当業者に公知のタンパク質合成技術またはタンパク質連結技術を使用して、親和性タグを、タンパク質である生物学的部分に付着し得る。例えば、インテイン（ｉｎｔｅｉｎ）媒介性タンパク質連結を、必要に応じて使用して、親和性タグを生物学的部分に付着し得る（Ｍａｔｈｙｓら、Ｇｅｎｅ  ２３１：１〜１３、１９９９；Ｅｖａｎｓら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ７：２２５６〜２２６４、１９９８）。
【０１２０】
本発明の代替的な実施態様において、各反応部位の有機薄膜は、少なくとも部分的に、脂質単層または二重層を含み、そして親和性タグは、膜アンカーを含む。必要に応じて、脂質単層または二重層は、自己組織化単層上に固定化される。
【０１２１】
図６は、基板３上の単層７上に固定化された生物学的部分１０を示す。親和性タグ８は、生物学的部分１０を単層７に連結する。単層７は、基板３の表面から中間層６によって分離されたコーティング５の上に形成される。
【０１２２】
図７は、微小チャンネルアレイデバイスの１つの実施態様の、生体分子コーティングされた微小チャンネルの横断面図を示す。微小チャンネル１は、カバーガラス２で覆われる。微小チャンネルの壁は、第１に中間層６、次にコーティング５、次に有機単層７、そして最後に親和性タグ８を介して生物学的部分１０でコーティングされた基板３から構成される。
【０１２３】
本発明の代替的な実施態様において、有機薄膜上に生物学的部分を固定化するために、親和性タグを用いない。そのかわりに、生物学的部分自体に本来備わっているアミノ酸、ヌクレオチド、または他の部分（例えば、糖質部分）を使用して、タンパク質を、有機薄膜の反応基につなぎとめる。好ましい実施態様において、生物学的部分上の固定化部位の位置に関して、固定化は、部位特異的である。例えば、抗体のペプシン消化、その後の１価Ｆａｂ’フラグメントの間のジスルフィドの選択的還元によって生成されるＦａｂ’フラグメントの重鎖部分のＣ末端領域上のスルフヒドリル基を、親和性タグとして使用し得る。あるいは、インタクトな抗体のＦｃ部分の糖質部分を、温和な条件下で、単層上のヒドラジド活性化Ｙ基との反応を介する単層上への抗体の固定化に適切なアルデヒド基まで酸化し得る。親和性タグを全く使用しないタンパク質の固定化の例は、Ｗａｇｎｅｒら、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．、７０：２０５２〜２０６６、１９９６に見出され得る。
【０１２４】
（（ｄ）アダプター）
本発明のデバイスの別の実施態様は、親和性タグを、固定化された生物学的部分に連結するアダプターを含む。アダプターの使用によってもたらされる、基板（またはコーティング）表面からのタンパク質のさらなる間隔は、特に有利である。なぜなら、いくつかの生物学的部分（例えば、タンパク質）は、表面の不活化をしやすいことが公知であるからである。必要に応じて、アダプターは、いくつかのさらなる利点もまたもたらし得る。例えば、アダプターは、親和性タグへの生物学的部分の付着の促進を助け得る。別の実施態様において、アダプターは、本デバイスとの特定の検出技術の使用を促進するのを助け得る。当業者は、所定の親和性タグについて適切なアダプターを選択し得る。例えば、もし親和性タグがストレプトアビジンならば、アダプターは、固定化されるタンパク質と化学的に結合したビオチン分子であり得る。
【０１２５】
好ましい実施態様において、アダプターは、タンパク質である。好ましい実施態様において、親和性タグ、アダプター、および生物学的部分はともに、融合タンパク質を構成する。そのような融合タンパク質は、標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して、容易に発現され得る。タンパク質であるアダプターは、目的のタンパク質の溶解度を増加し、そして基板またはコーティングの表面と目的のタンパク質との間の距離を増加するために、特に有用である。タンパク質であるアダプターの使用はまた、デバイスへの固定化前の、親和性結合によるタンパク質の調製スケールでの精製工程を促進することにおいて、非常に有用であり得る。タンパク質である可能なアダプターの例としては、グルタチオン−Ｓ−トランフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質、キチン結合タンパク質、チオレドキシン、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）が挙げられる。ＧＦＰはまた、表面結合の定量化のために使用され得る。デバイスの反応部位上に固定化された生物学的部分が、抗体またはＦｃ領域を含む抗体フラグメントであるならば、アダプターは、必要に応じて、プロテインＧ、プロテインＡ、または組換えプロテインＧ／Ａ（プロテインＡ由来の４つのＦｃ結合ドメインおよびプロテインＧ由来の２つのＦｃ結合ドメインを含む、Ｂａｃｉｌｌｕｓの非病原性形態から分泌される遺伝子融合産物）であり得る。
【０１２６】
図８は、親和性タグ８およびアダプター分子９の両方を介する、単層７上に固定化された生物学的部分１０を示す。単層７は、基板３上のコーティング５上に形成されている。中間層６はまた、コーティング５と基板３との間に使用される。
【０１２７】
（（ｅ）固定化された生物学的部分およびその調製）
本発明の１つの実施態様において、１つの反応部位の生物学的部分は、同一のデバイス上の第２の反応部位の生物学的部分と異なる。好ましい実施態様において、デバイスは、少なくとも１０の異なる固定化された生物学的部分を含む。特に好ましい実施態様において、デバイスは、少なくとも１００の異なる固定化された生物学的部分を含む。
【０１２８】
好ましい実施態様において、本発明のデバイスの部位に固定化された生物学的部分は、タンパク質である。タンパク質は、本発明の好ましい生物学的部分であるが、そのかわりに、固定化された生物学的部分は、必要に応じて、ポリヌクレオチド、ペプチド核酸、ホルモン、抗原、エピトープ、または生理学的機能を有するか、もしくは有することが疑われる任意の低有機分子を含み得る。
【０１２９】
本発明の別の実施態様において、１つの反応部位の生物学的部分は、別の反応部位の生物学的部分とは異なるが、２つの生物学的部分は、関連する。好ましい実施態様において、生物学的部分は、同一のタンパク質ファミリーのメンバーである。異なる生物学的部分は、機能的に関連し得るか、または機能的に関連することが少しは疑われ得る。しかし、別の実施態様において、生物学的部分の機能は、完全には既知ではなくてもよい。これらの場合において、異なる生物学的部分は、構造または配列において類似性を共有し得るか、あるいは構造または配列において類似性を共有することが疑われ得るかのいずれかである。１つの実施態様において、異なる固定化された生物学的部分は、同一のタンパク質ファミリーの異なるメンバーの単なるフラグメントであり得る。別の実施態様において、生物学的部分は、公知のアイソザイムであり得る。
【０１３０】
タンパク質ファミリーの例としては、レセプターファミリー（例：増殖因子レセプター、カテコールアミンレセプター、アミノ酸誘導体レセプター、サイトカインレセプター、レクチン）、リガンドファミリー（例：サイトカイン、セルピン）、酵素ファミリー（例：プロテアーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ｒａｓ様ＧＴＰａｓｅ、ヒドロラーゼ）、および転写因子（例：ステロイドホルモンレセプター、熱ショック転写因子、亜鉛フィンガータンパク質、ロイシンジッパータンパク質、ホメオドメインタンパク質）が挙げられるがこれらに限定されない。１つの実施態様において、異なる固定化タンパク質は、全て、ＨＩＶプロテアーゼまたはＣ型肝炎（ＨＣＶ）プロテアーゼである。本発明の他の実施態様において、本発明のデバイスの反応部位上の固定化タンパク質は、全て、ホルモンレセプター、神経伝達物質レセプター、細胞外マトリクスレセプター、抗体、ＤＮＡ結合タンパク質、細胞内シグナル伝達モジュレーターおよびエフェクター、アポトーシス関連因子、ＤＮＡ合成因子、ＤＮＡ修復因子、ＤＮＡ組換え因子、または細胞表面抗原である。
【０１３１】
代替的な好ましい実施態様において、本発明のデバイスの部位の生物学的部分は、タンパク質捕獲剤である。別の好ましい実施態様において、デバイスの反応部位または微小チャンネルの生物学的部分は、全て、抗体または抗体フラグメントである。
【０１３２】
本発明のデバイスの代替的な実施態様において、デバイス上の異なる反応部位の生物学的部分は、お互いに同一である。
【０１３３】
デバイス上に固定化された生物学的部分は、当業者に公知の任意の種々の手段によって、産生され得る。
【０１３４】
本発明のデバイスの部位に対する固定化のための調製において、タンパク質である生物学的部分は、必要に応じて、インビボまたはインビトロのいずれかにおいて、組換えＤＮＡより発現され得る。デバイス上に固定化されるタンパク質のｃＤＮＡは、発現ベクター（多くの例が市販されている）中にクローニングされ、そして発現に適切な生物の細胞中に導入される。広範囲の宿主細胞および発現系を使用して、デバイス上に固定化されるタンパク質を産生し得る。タンパク質のインビボ発現のために、ｃＤＮＡを市販の発現ベクター（例えば、Ｑｉａｇｅｎ、Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）中にクローニングし、そして発現に適切な生物中に導入し得る。インビボ発現は、細菌（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、植物（例えば、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）、下等真核生物（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、または高等真核生物（例えば、バキュロウイルス感染昆虫細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞）において、行われ得る。インビトロ発現のために、ＰＣＲ増幅されたＤＮＡ配列を、組み合わせたインビトロ転写／翻訳系（例えば、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ発現株（好ましくは、プロテアーゼ欠損株）由来のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｓ３０ライセート；コムギ胚ライセート；網状赤血球ライセート（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐａｎｖｅｒａ））において、直接使用する。最適な発現のための生物の選択は、所望される翻訳後修飾（すなわち、グリコシル化、脂質修飾）の程度に依存する。当業者は、固定化されるタンパク質および所望される適用に最も適切な宿主細胞のタイプを、容易に選択し得る。
【０１３５】
アミノ酸親和性タグおよびアダプタータンパク質配列をコードするＤＮＡ配列を、目的の遺伝子が、インフレームで、親和性タグおよびアダプターをコードするＤＮＡ配列の５’または３’のいずれかにクローニングされ得るように、発現ベクター中に操作する。
【０１３６】
発現されるタンパク質を、市販の樹脂を使用して、親和性クロマトグラフィーによって精製する。
【０１３７】
好ましくは、関連するタンパク質のファミリーの産生は、クローニングからタンパク質発現およびタンパク質精製までの並行したプロセスを含む。目的のタンパク質についてのｃＤＮＡを、テンプレートとしてｃＤＮＡライブラリーまたはＥＳＴ（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔａｇ）クローンを使用するＰＣＲによって増幅する。次に、上記の任意のインビトロまたはインビボ発現系を、デバイス上に固定化されるタンパク質の発現に使用し得る。
【０１３８】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉベースのタンパク質発現は、一般に、活性のために広範な翻訳後修飾を必要としない可溶性タンパク質のためのえり抜きの方法である。膜タンパク質の細胞外ドメインまたは細胞内ドメインは、発現および精製のためにタンパク質アダプターに融合される。
【０１３９】
全体のアプローチは、９６ウェルアッセイプレートを使用して行われ得る。ＰＣＲ反応を、標準の条件化で行う。オリゴヌクレオチドプライマーは、発現ベクターへの容易なクローニングのために、独特の制限部位を含む。あるいは、ＴＡクローニング系（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用し得る。発現ベクターは、親和性タグおよびタンパク質アダプターのための配列を含む。ＰＣＲ産物を発現ベクター（誘導性プロモーターの下）中に連結し、適切なコンピテントＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株中に、カルシウム依存性形質転換によって導入する（株として含まれるもの：ＸＬ−１  ｂｌｕｅ、ＢＬ２１、ＳＧ１３００９（ｌｏｎ−））。形質転換されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ細胞を、プレーティングし、個々のコロニーを９６アレイブロックに移す。培養物を中期対数期まで増殖させ、発現のために誘導し、そして細胞を遠心分離によって収集する。細胞をリゾチウムを含む溶液に再懸濁し、そして迅速な凍結／融解サイクルまたは超音波処理によって膜を破壊する。細胞の破片を遠心分離によって取り除き、上清を９６チューブアレイに移す。適切な親和性マトリクスを添加し、目的のタンパク質を結合させ、そして非特異的に結合したタンパク質を１２〜９６ピンの吸上げデバイスおよび遠心分離を使用する洗浄工程の繰り返しによって取り除く。あるいは、磁気親和性ビーズおよび濾過デバイスを使用し得る（Ｑｉａｇｅｎ）。タンパク質を溶出し、そして新たな９６ウェルアレイに移す。タンパク質濃度を決定し、そして各タンパク質のアリコートを、ニトロセルロースフィルター上にスポットし、親和性タグに対して指向する抗体を使用するウェスタン分析によって確認する。各サンプルの精製を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色または質量分析計によって評価する。タンパク質を素早く凍結し、そして−８０℃で保存する。
【０１４０】
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、タンパク質のコアのグリコシル化および脂質修飾を可能にする。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉについての上記のアプローチを、形質転換および細胞溶解についてのわずかな改変を用いて使用し得る。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの形質転換は、酢酸リチウムにより、そして細胞溶解は、細胞壁のリティカーゼ（ｌｙｔｉｃａｓｅ）消化とその後の凍結−融解、超音波処理によるか、またはガラスビーズ抽出によるかのいずれかである。翻訳後修飾の改変は、異なる酵母株によって得られ得る（すなわち、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）。
【０１４１】
バキュロウイルス系または哺乳動物細胞の利点は、得られ得る豊富な翻訳後修飾である。バキュロ系は、ウイルスのクローニング、高力価ストックを得ることおよび液体昆虫細胞懸濁液の感染を必要とする（細胞は、ＳＦ９、ＳＦ２１である）。哺乳動物細胞ベースの発現は、トランスフェクションおよび細胞株のクローニングを必要とする。可溶性タンパク質は、培地から収集されるが、細胞内タンパク質または膜結合タンパク質は、細胞の溶解（界面活性剤の可溶化、凍結−融解のいずれか）を必要とする。次に、タンパク質は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉについて記載されたものと類似の手順で精製され得る。
【０１４２】
インビトロ翻訳のためのえり抜きの系は、プロテアーゼ欠損およびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ過剰発現株より得られるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉライセートである。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉライセートは、効果的なタンパク質発現（３０〜５０μｇ／ｍｌライセート）を提供する。全体のプロセスを、９６ウェルアレイにおいて行う。目的の遺伝子を、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターおよび結合部位、ならびに親和性タグをコードする配列を含有する遺伝子特異的配列を含むオリゴヌクレオチドを使用するＰＣＲによって増幅する。あるいは、ＰＣＲによって、アダプタータンパク質を、目的の遺伝子に融合し得る。増幅されたＤＮＡを、短時間の分析のために、予めのクローニングをせずに、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉライセート中で直接、転写および翻訳し得る。次に、タンパク質を、親和性マトリクスへの結合によって単離し、そして上記のようにプロセスする。
【０１４３】
使用され得る代替的な系としては、コムギ胚抽出物および網状赤血球抽出物が挙げられる。膜タンパク質のインビトロ合成および／または翻訳後修飾タンパク質は、ミクロソームと組み合わせた網状赤血球ライセートを必要とする。
【０１４４】
本発明の１つの好ましい実施態様において、デバイスの部位に固定化されたタンパク質は、抗体である。必要に応じて、固定化されたタンパク質は、モノクローナル抗体であり得る。特定のタンパク質標的に対するモノクローナル抗体の産生は、標準的なハイブリドーマ技術を使用して、慣用的である。実際に、大多数のモノクローナル抗体が、市販されている。
【０１４５】
細胞融合によって産生されるか、または連続した細胞株から産生される抗体または抗体フラグメントを得るための代替物として、抗体部分が、バクテリオファージ中で発現され得る。そのような抗体ファージディスプレイ技術は、当業者にとって周知である。バクテリオファージ発現系は、重鎖配列および軽鎖配列のランダムな組み合わせを可能にし、それによって、所望の抗原に対して選択され得る抗体配列のライブラリーを作製する。発現系は、バクテリオファージλベースまたはより好ましくは、繊維状ファージベースであり得る。バクテリオファージ発現系を使用して、Ｆａｂフラグメント、ＶH−ＶL対を安定化するために操作された分子間ジスルフィド結合を有するＦｖ（ｄｓＦｖ）、ｓｃＦｖ、またはダイアボディーフラグメントを発現し得る。
【０１４６】
ファージディスプレイライブラリーの抗体遺伝子は、免疫前のドナー由来であり得る。例えば、ファージディスプレイライブラリーは、タンパク質の混合物（例えば、ヒトＴ細胞のライセート）で以前に免疫されたマウスの脾臓より調製されたディスプレイライブラリーであり得る。免疫は、必要に応じて、特定の一組のタンパク質（例えば、ヒトＴ細胞において見出されるタンパク質）に対して反応性な、より多数の組換え抗体を含むようにライブラリーを片寄らせるために使用され得る。あるいは、ライブラリー抗体は、天然または合成ライブラリー由来であり得る。天然ライブラリーは、外来の抗原と接触していないマウスの脾臓から構築されている。合成ライブラリーにおいて、抗体配列の部分（代表的には相補性決定領域（ＣＤＲ）ループ）が、変異誘発またはランダム化されている。
【０１４７】
ファージディスプレイ方法は、抗体遺伝子ライブラリーの、ファージゲノム中への、ファージコートタンパク質の１つをコードする遺伝子（ｐＩＩＩ、ｐＶＩ、またはｐＶＩＩＩ）との融合物としてのバッチクローニングを含む。ｐＩＩＩファージタンパク質遺伝子が、好ましい。融合産物が発現される場合、融合産物は、成熟ファージコートに組み込まれる。結果として、抗体は、ファージ表面に融合物としてディスプレイされ、そして結合のために利用可能であり、従って、標的タンパク質における選択のために利用可能である。一旦、ファージ粒子が標的タンパク質に対する所望の親和性を有する抗体−コートタンパク質融合物を有するとして選択されると、ディスプレイされた抗体に対応するファージ粒子内の遺伝物質を、増幅および配列決定し得るか、またはそうでなければ分析し得る。
【０１４８】
好ましい実施態様において、ファージミドを、ファージディスプレイ手順において、発現ベクターとして使用する。ファージミドは、適切なクローニング部位を有する遺伝子ＩＩＩおよびファージパッケージングシグナルを保有し、そして宿主複製起点およびファージ複製起点の両方を含む、小さなプラスミドベクターである。遺伝子ＩＩＩ融合物は、ファージミドによってコードされている唯一のファージ遺伝子であるので、ファージミドは、完全なファージを産生し得ない。生存可能なファージは、ファージミドを含む細胞に、欠損した複製起点を有するヘルパーファージを感染させることにより、産生され得る。全てのヘルパーファージタンパク質および遺伝子ＩＩＩ−ｒＡｂ融合物を含むハイブリッドファージが生じる。生じたファージは、ファージミドＤＮＡのみを含む。
【０１４９】
本発明の好ましい実施態様において、本発明のデバイスのための抗体フラグメントを調製するファージディスプレイ方法において使用される組換え抗体が、ファージミドベクター上のバクテリオファージ遺伝子ＩＩＩタンパク質との遺伝子融合物として発現される。例えば、単鎖Ｆｖフラグメントをコードする抗体の可変領域を、ファージミド上の遺伝子ＩＩＩタンパク質のアミノ末端と融合し得る。あるいは、抗体フラグメント配列を、最初の２つのＮ末端ドメインを欠く短縮型ｐＩＩＩ配列のアミノ末端と融合し得る。抗体−ｐＩＩＩ融合物をコードするファージミドＤＮＡは、好ましくは、全てのファージ構造タンパク質を供給するヘルパーファージ（例えば、Ｍ１３ＫＯ７またはＶＣＳ−Ｍ１３）を使用して、ファージ粒子中にパッケージングされる。
【０１５０】
Ｆａｂフラグメントをファージ上にディスプレイするために、軽鎖または重鎖（Ｆｄ）のいずれかが、そのＣ末端を介してｐＩＩＩと融合する。パートナーの鎖を、ｐＩＩＩと融合せずに発現し、その結果、両方の鎖が、インタクトなＦａｂフラグメントを形成するように会合し得る。
【０１５１】
標的タンパク質に結合しないファージ粒子から、標的タンパク質に結合するファージ粒子を分離する任意の選択方法を、使用し得る。選択方法はまた、選択されたファージの回収を可能にしなければならない。最も代表的には、ファージ粒子を、固定化された標的タンパク質において、選択する。当業者に公知であるいくつかのファージ選択の戦略としては、以下が挙げられる：固定化抗原でのパニング；特異的溶出を使用する、固定化抗原でのパニング；ビオチン化抗原の使用、次にストレプトアビジン樹脂、またはストレプトアビジンでコートした磁気ビーズにおける選択；親和性精製；ウェスタンブロットでの選択（未知の抗原または精製することが困難な抗原について特に有用である）；インビボ選択；および草分け的な選択。選択されたファージ粒子が選択の回の間で増幅される場合、選択の複数の反復する回が、必要に応じて、行われ得る。
【０１５２】
溶出技術は、選択された選択プロセスに依存して変化するが、代表的な溶出技術としては、以下の溶液の１つを用いる洗浄が挙げられる：ＨＣｌまたはグリシン緩衝液；トリエチルアミンのような塩基性溶液；カオトロピック剤；イオン強度を増加する溶液；またはビオチンがジスルフィド結合によって抗原に結合する場合はＤＴＴ。溶出の他のタイプの方法としては、抗体と遺伝子ＩＩＩとの間に操作されたプロテアーゼ部位の酵素的切断、または過剰の抗原または抗原に対する過剰の抗体を用いる結合の競合が挙げられる。
【０１５３】
タンパク質がファージミドベクターまたは代わりのベクター中へ取り込まれるのに適切なサイズであり、そしてバクテリオファージコートタンパク質との融合物として発現する限り、本発明のデバイスの調製において、抗体フラグメントについて使用されるものと類似のファージディスプレイ法を、本発明のデバイス上に固定化する他のタンパク質について使用し得る。非抗体ライブラリーを使用するファージディスプレイ技術は、代表的には、可変領域を支持する宿主の足場構造タンパク質のあるタイプを利用する。例えば、β−シートタンパク質、α−へリックスハンドル（ｈａｎｄｌｅ）タンパク質、および他の高度に束縛されたタンパク質構造が、宿主の足場として使用されている。
【０１５４】
代替的なディスプレイベクターもまた使用して、デバイスの部位に固定化されたタンパク質を産生し得る。ポリソーム（安定なタンパク質−リボソーム−ｍＲＮＡ複合体）を使用して、組換え抗体フラグメントまたは他のタンパク質のためのディスプレイビヒクルとして、生バクテリオファージの替わりとして使用し得る（ＨａｎｅｓおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｍ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４：４９３７〜４９４２、１９９７）。ポリソームは、新たに合成されそして正確に折り畳まれたタンパク質の、リボソームからの発光を妨げることにより形成される。ポリソームライブラリーの選択は、抗体フラグメントまたはポリソームにおいてディスプレイされる他のタンパク質の、標的タンパク質に対する結合に基づく。次に、ディスプレイされたタンパク質をコードするｍＲＮＡ、または所望の親和性を有する抗体を、単離する。より大きなライブラリーは、ファージディスプレイよりも、ポリソームディスプレイを用いて、使用され得る。
【０１５５】
（（ｅ）デバイスの使用）
本発明のデバイスの使用方法が、本発明の他の局面によって提供される。本発明のデバイスは、高スループット薬物スクリーニングのような薬物開発における使用のために、特に適切である。他の使用としては、医学的診断およびバイオセンサーが挙げられる。本発明のデバイスはまた、機能的プロテオミクスのために有用である。各々の場合において、複数の生物学的部分または薬物候補または被分析物を、可能性のある生物学的相互作用について、並行してスクリーニングし得る。
【０１５６】
本発明の１つの局面において、複数の異なる生物学的部分を、液体サンプルの成分と相互作用するその能力について並行してスクリーニングする方法が提供される。この方法は、液体サンプルを本発明のデバイスの１つの反応部位（異なる生物学的部分の各々がデバイスの異なる部位に固定化されている）に送達する工程、次に、その成分と、各反応部位において固定化された生物学的部分との相互作用を検出する工程を包含する。好ましい実施態様において、反応部位の各々は、デバイスの他の反応部位の微小チャンネルに、並行して向けられた微小チャンネル中にあり、ここで、この微小チャンネルが、基板中または基板上に微小作製される。
【０１５７】
本発明のデバイスは、酵素の触媒反応、結合事象のアッセイに適切であり、または膜タンパク質による脂質二重層を通過する移動のアッセイにさえも適切である。本発明が指向する可能な相互作用としては、抗体／抗原、抗体／ハプテン、酵素／基質、キャリアタンパク質／基質、レクチン／糖質、レセプター／ホルモン、レセプター／エフェクター、タンパク質／ＤＮＡ、タンパク質／ＲＮＡ、核酸の相補鎖、リプレッサー／インデューサーなどが挙げられるが、これらに限定されない。アッセイされる相互作用は、可能性のある薬物候補と複数の可能性のある薬物標的との間であり得る。例えば、合成有機化合物を、固定化されたレセプターのファミリーに対するインヒビターとして作用するその能力について試験し得る。このデバイスはまた、一般的なタンパク質−タンパク質相互作用についてのアッセイのために非常に適切である
本発明の１つの実施態様は、液体サンプルの成分と反応するその能力について、複数の生物学的部分を並行してスクリーニングする方法を提供し、この方法は、液体サンプルを本発明のデバイスの反応部位に送達する工程を包含し、ここで、異なる生物学的部分の各々が、デバイスの異なる反応部位に固定化され、各反応部位に固定化された生物学的部分とその成分との反応産物の形成を、直接的または間接的のいずれかで検出する。
【０１５８】
本発明の別の実施態様は、複数の生物学的部分を、液体サンプルの成分と結合するその能力について、並行してスクリーニングするための方法を提供する。この方法は、以下の工程を包含する：液体サンプルを、本発明のデバイスの反応部位に送達する工程であって、ここで異なる生物学的部分の各々が、デバイスの異なる反応部位に固定化される、工程；必要に応じて、反応部位の洗浄が、サンプルの非結合成分または非特異的結合成分を、反応部位から取り除く；および各反応部位で保持されたこの成分の存在または量を、直接的または間接的のいずれかで検出する工程。
【０１５９】
複数の生物学的部分を、液体サンプルの成分に結合するその能力についてスクリーニングするための代替的な方法は、第１に生物学的部分の既知のリガンドを、液体サンプルに添加する工程、次に、本発明のデバイスの反応部位に液体サンプルを送達する工程を包含し、ここで、異なる生物学的部分の各々が、デバイスの異なる部位に固定化される。必要に応じての次の工程として、既知のリガンドおよび成分（またはサンプル由来の別の成分）の非結合分子または非特異的結合分子をデバイスの反応部位から溶出するために、反応部位を、公知のリガンドまたは成分のいずれかを含まない液体で洗浄し得る。この方法の最終工程は、各反応部位に保持された既知のリガンドの存在または量を検出する工程、および各反応部位での既知のリガンドの保持を、成分が存在しない同一の反応部位での既知のリガンドの保持と比較する工程を包含する。
【０１６０】
広範な検出方法が、本発明に適用可能である。所望される場合、検出は、定量的または定性的のいずれかであり得る。本発明のデバイスは、光学的検出法（例えば、可視光範囲または赤外光範囲の吸収、化学発光、および蛍光（寿命時間、偏光、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ））とインターフェースで連結され得る。さらに、光導波路（ＰＣＴ公開ＷＯ９６／２６４３２および米国特許第５，６７７，１９６号）、表面プラズモン共鳴、表面荷電センサー、および表面力センサーに基づくような他の様式の検出が、本発明の多くの実施態様と適合可能である。あるいは、Ｂｒｅｗｓｔｅｒ角顕微鏡（Ｂｒｅｗｓｔｅｒ  ａｎｇｌｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）（Ｓｃｈａａｆら、Ｌａｎｇｍｕｉｒ、３：１１３１〜１１３５（１９８７））および楕円偏光法（米国特許第５，１４１，３１１号および同５，１１６，１２１号；Ｋｉｍ、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、２２：２６８２〜２６８５（１９８４））を、本発明のデバイスと組み合わせて使用し得る。クリスタルクォーツマイクロバランスおよび脱着過程（例えば、米国特許第５，７１９，０６０号を参照のこと）は、本発明のデバイスの少なくともいくつかの実施態様に適切な、なお他の代替的な検出手段を提供する。本発明のいくつかのデバイスおよび種々の非標識検出原理に適合可能な光学バイオセンサーシステムの例（表面プラズモン共鳴、全反射蛍光（ｔｏｔａｌ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）（ＴＩＲＦ）、Ｂｒｅｗｓｔｅｒ角顕微鏡（Ｂｒｅｗｓｔｅｒ  ａｎｇｌｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）、光導波路光モード（ｌｉｇｈｔｍｏｄｅ）分光法（ＯＷＬＳ）、表面電荷測定、および楕円偏光法を含む）が、米国特許第５，３１３，２６４号に見出され得る。
【０１６１】
図９は、微小チャンネルアレイの固定化された生物学的部分と、被分析物との相互作用をモニターするために使用され得る蛍光検出ユニットの１つのタイプの模式図を示す。図示された検出ユニットにおいて、微小チャンネルアレイデバイス２１は、ベースプレート２０の上に位置する。１００Ｗの水銀アーク灯２５からの光は、励起フィルター２４を通って、ビームスプリッター２３上に向けられる。次に、光は、レンズ２２（例えば、Ｍｉｃｒｏ  Ｎｉｋｋｏｒ  ５５ｍｍ  １：２：８レンズ）を通って、デバイス２１の微小チャンネルに向けられる。デバイスからの蛍光発光光は、レンズ２２およびビームスプリッター２３を通って、戻る。発光フィルター２６をも通過した後、発光光は、冷却されたＣＣＤカメラ２７（例えば、Ｓｌｏｗｓｃａｎ  ＴＥ／ＣＣＤ−１０２４ＳＦ＆ＳＢ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ））によって受け取られる。このカメラは、作動可能にＣＰＵ２８と連結され、次に、ＶＣＲ２９およびモニター３０と作動可能に連結される。
【０１６２】
薬物候補の特異性を試験するために、タンパク質ファミリーの複数のメンバーとの相互作用を測定する。タンパク質ファミリーのメンバーを、微小チャンネル中に別々に固定化する。次に、タンパク質活性（例えば、結合、触媒変換、または脂質二重層を通過するリガンドの移動）を妨げる薬物候補の能力を、測定する。
【０１６３】
別の実施例において、タンパク質結合事象を妨げる薬物候補の能力を試験するために、薬物候補、および化学的に結合した蛍光部分によって標識される、タンパク質ファミリーのメンバーの既知のリガンドを、デバイスの各微小チャンネル中の液体サンプル中に送達する。短時間のインキュベーションの後、微小チャンネルを薬物候補およびリガンドの両方を含まない液体で流す。次に、微小チャンネルの各々に残った蛍光リガンドの量（およびその微小チャンネルのタンパク質分子に結合したと推定される蛍光リガンドの量）を、透明または半透明のカバーまたは基板のいずれかを通して、反応部位への光学的アクセスを有する蛍光検出器／蛍光定量器を使用することにより、検出し得る。
【０１６４】
薬物候補がリガンドの触媒的変換を妨げる能力を試験するために、薬物候補およびリガンドを、液体サンプル中の微小チャンネル中へ送達し、そして色素生産特性または蛍光特性を、透明または半透明のカバーまたは基板のいずれかを通して、反応部位への光学的アクセスを有する光学検出器／光学定量器を使用することにより検出し得る。
【０１６５】
より一般的には、本発明は、薬物候補がタンパク質ファミリーの複数のメンバーとその基質との反応を阻害する能力をスクリーニングする方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：液体サンプル中で薬物候補と基質を組み合わせる工程；液体サンプルを、本発明のデバイスの反応部位に送達する工程であって、ここで、タンパク質ファミリーの異なるメンバーの各々が、異なる反応部位に固定化される、工程；そして直接的または間接的のいずれかで、各反応部位での産物形成の阻害を検出する工程。
【０１６６】
薬物候補が脂質二重層を通過するリガンドの移動を妨げる能力を試験するために、薬物候補およびリガンドを、液体サンプル中で、各微小チャンネルへ送達する。短時間のインキュベーションの後、微小チャンネルを、リガンドを含まない液体で流し、そして脂質二重層を通るリガンドの通過の任意の阻害を、蛍光、吸収または電気的な荷電の変化を測定することによって決定する。
【０１６７】
本発明の代替的な実施態様において、本発明のデバイスを使用して、各々が別々の液体サンプル中にある複数の成分を、生物学的部分と相互作用するその能力について、スクリーニングする。この実施態様の方法は、第１に、異なる液体サンプルの各々を、本発明のデバイスの別々の反応部位に送達する工程であって、ここで、デバイスの別々の反応部位がそれぞれ、固定化された生物学的部分を含む工程、を包含する。次の工程は、直接的または間接的のいずれかで、各反応部位において固定化された生物学的部分と、その反応部位に送達された成分との相互作用を検出する工程を包含する。好ましくは、反応部位の各々は、デバイスの他の反応部位の微小チャンネルに対して、並行に向けられた微小チャンネル中にあり、ここで、この微小チャンネルは、基板中または基板上に微小作製される。上記のように、本方法によってアッセイされる相互作用は、生物学的部分について通常観察される任意のタイプの相互作用（酵素の触媒反応、結合事象または、膜タンパク質による、脂質二重層を通過する移動）であり得る。
【０１６８】
本発明の１つの実施態様は、複数の異なるタンパク質を、特定のタンパク質と相互作用するその能力について、並行してスクリーニングする方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：各々が少なくとも１つの異なるタンパク質を含有する異なる液体サンプルを、本発明のデバイスの別々の反応部位に送達する工程であって、ここで特定のタンパク質が、別々の反応部位の各々に固定化される、工程；および各反応部位における、特定のタンパク質と異なるタンパク質との相互作用を、直接的または間接的のいずれかで検出する工程。
【０１６９】
本発明の代替的な実施態様は、複数の薬物候補を、酵素とその基質との反応を阻害するその能力について、並行してスクリーニングする方法を提供する。この方法は、第１に、酵素基質を複数の液体サンプルに添加する工程を包含し、ここで液体サンプルの各々が少なくとも１つの目的の薬物候補を含む。次に、液体サンプルの各々を、本発明のデバイスの反応部位（好ましくは微小チャンネルアレイ）に送達する。この実施態様において、デバイスの各反応部位が、固定化された酵素を特徴付ける。最後に、各反応部位での産物形成の阻害（液体中の薬物候補の存在に起因する）をモニターする。
【０１７０】
本発明の別の局面は、複数の結合候補物を、生物学的部分に結合するそれらの能力について、並行してスクリーニングするための方法を提供する。この方法は、第１に、各々が少なくとも１つの結合候補物を含有する異なる液体サンプルを、本発明のデバイスの反応部位に送達する工程であって、ここで別々の反応部位の各々が、固定化された生物学的部位を含む、工程を包含する。必要に応じての次の工程は、非結合の結合候補物または非特異的結合した結合候補物を溶出するための、結合候補物を含まない液体を用いる反応部位の洗浄工程、および各反応部位で保持されたその結合候補物の存在または量を、直接的または間接的に検出する工程を包含する。
【０１７１】
本発明によってまた提供される、複数の結合候補物を生物学的部分に結合するそれらの能力について並行してスクリーニングするための代替的な方法は、以下を包含する：生物学的部分の既知のリガンドを、複数の液体サンプルに添加する工程であって、液体サンプルの各々が、少なくとも１つの結合候補物を含む、工程；本発明のデバイスの反応部位の各々に異なる液体サンプルを送達する工程であって、ここで、デバイスの別々の反応部位の各々が、固定化された生物学的部分を含む、工程；必要に応じて、反応部位の各々から非結合の分子を溶出するために、既知のリガンドも結合候補物も含まない液体でその反応部位を洗浄する工程；各反応部位で保持された既知のリガンドの存在を検出する工程；および、結合候補物の存在下の既知のリガンドの保持を、結合候補物が存在しない場合の既知のリガンドの保持と比較する工程。
【０１７２】
本発明はまた、複数の異なるタンパク質をその基質と対形成させる方法を提供する。この方法において、既知の酵素ファミリーの基質を含有する液体サンプルを、第１に、本発明のデバイスの反応部位に送達する工程であって、ここでデバイスの反応部位の各々が、その部位に固定化された異なるタンパク質を含有する。次に、任意の適切な検出手段を使用して、各反応部位において、基質とタンパク質との反応によって形成された産物の存在を、直接的または間接的に検出し得る。本方法は、機能が未知である多数のタンパク質の機能の同定のために有用である。
【０１７３】
本発明の別の局面において、複数の異なるタンパク質をそれらのリガンドと対形成させる方法が提供される。この方法は、既知のタンパク質のファミリーのリガンドを含む液体サンプルを、本発明のデバイスの反応部位に送達する工程であって、ここで、デバイスの各反応部位は、異なる固定化タンパク質を含む、工程；必要に応じて、デバイスの反応部位から非結合のリガンドを取り除くために、リガンドを含まない液体でその反応部位を洗浄する工程；および、各反応部位で保持されたリガンドの存在または量を、直接的または間接的のいずれかで検出する工程、を包含する。この方法は、未知の機能のタンパク質が、どのタンパク質ファミリーに属し得るのか同定するために有用である。
【０１７４】
本発明のなお別の実施態様は、液体サンプル中で、複数の被分析物の存在を検出する方法を提供する。この方法の工程は、液体サンプルを、本発明のデバイスの反応部位に送達する工程であって、ここで少なくとも１つの被分析物と反応する生物学的部分が、反応部位の各々に固定化される工程、および各反応部位における、被分析物と固定化生物学的部分との相互作用を検出する工程、を包含する。
【０１７５】
液体サンプル中で、複数の被分析物の存在を検出する別の方法は、以下の工程を包含する：液体サンプルを、本発明のデバイスの反応部位に送達する工程であって、ここで少なくとも１つの被分析物と結合する生物学的部分が、反応部位の各々に固定化される工程；必要に応じて、各反応部位から非結合の被分析物または非特異的結合の被分析物を取り除くために、被分析物を含まない液体でその反応部位を洗浄する工程；および各反応部位において保持された被分析物の存在または量を、直接的または間接的のいずれかで検出する工程。
【０１７６】
複数の被分析物の並行した検出方法は、種々の診断での使用に適用可能である。被分析物は、必要に応じて、その存在または量が生物における疾患状態の指標である、体液中のまたは細胞抽出物中の化合物であり得る。１つの例において、被分析物の起源は、生物に感染する病原体であり得る。あるいは、被分析物は、生物中の細胞または細胞集団の発現産物であり得る。そのような方法は、生物の組織における腫瘍または他の疾患状態の評価に有用であり得る。
【０１７７】
（（ｃ）実施例）
以下の特定の実施例は、本発明を説明することを意図されるが、特許請求の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【０１７８】
（実施例１．バルクマイクロマシン加工による、微小チャンネルアレイの作製）
好ましい実施態様において、微小チャンネルアレイは、標準的なマイクロステレオリソグラフィー（ｍｉｃｒｏｓｔｅｒｅｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ）を介して、デバイス材料中に作製される（バルクマイクロマシン加工）。代替的な技術としては、表面−マイクロマシン加工およびＬＩＧＡ（注入成形）が挙げられる。通常、コンピュータで補助された設計パターン（最終的なチャンネルの幾何学を反映する）を、標準的な技術を使用してフォトマスクに転写し、次に、これを使用して、フォトレジストでコートされたシリコンウェーハ上にこのパターンを転写する。
【０１７９】
代表的な例において、側面の大きさが５０×１５ｍｍであるデバイス（「チップ」）は、２５０μｍの間隔で隔たれた、一連の１００の並行チャンネルを含む。各チャンネルは、５ｍｍ長であり、そして１００×１００μｍの横断面を有する。チャンネル容量は、５０ｎｌである。４’’の直径のＳｉ（１００）ウェーハ（Ｖｉｒｇｉｎｉａ  Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ）。Ｓｉ（１００）ウェーハを、まず濃Ｈ2ＳＯ4：３０％  Ｈ2Ｏ2の３：１混合液で洗浄し（９０℃、１０分）、脱イオン水（１８ＭΩｃｍ）でリンスし、最後に１％のＨＦ水溶液で不動態化し、１５０℃で３０分間表面を焼く。ウェーハを陽性のフォトレジストとしてのポリメチルメタクリレートＰＭＭＡでスピン塗布した後、２５分間９０℃で前焼き（ｐｒｅｂａｋｅ）し、Ｋａｒｌ  Ｓｕｓｓコンタクトプリンターを使用して露光し、標準的なプロトコールに従って現像する。次に、ウェーハを乾燥して、１１０℃で２５分間、後焼き（ｐｏｓｔｂａｋｅ）する。ディープシリコンリアクティブイオンエッチング法（ＲＩＥ）を使用して、バルク材料中にチャンネル造作を異等方性ドライエッチングし、シリコン中に高アスペクト比の垂直サイドウオール造作を生じる（エッチング速度２．５μｍ／分）。次の工程において、ウェーハを、２０ｎｍ厚のチタン層で下塗りし、次に２００ｎｍ厚の金層を下塗りし、両方の層を電子ビームエバポレーション（５Å／秒）を用いて沈着する。レジストのストリッピング（アセトン）および短時間のプラズマ処理の後、低温場アシストガラス−シリコン結合形成を使用して、５０μｍの薄いカバーガラス（ｐｙｒｅｘ７７４０）でデバイスを覆い、そしてシールし、入口および出口を有する多チャンネルのアレイを生じる。次に、金コートしたチャンネル壁を、さらに化学的に修飾し、所望の生物反応特性および生体適合特性を達成し得る（下記の実施例３を参照のこと）。
【０１８０】
これらの手順のさらなる詳述は、以下の参考文献において見出され得る：Ｍａｄｏｕ、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（１９９７）；ＷｏｌｆおよびＴａｕｂｅｒ、Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＶＬＳＩ  Ｅｒａ、第１巻：Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｌａｔｔｉｃｅ  Ｐｒｅｓｓ、（１９８６）；ならびにＴｈｏｍｓｏｎら、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｉｃｒｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、（１９９４）。
【０１８１】
（実施例２．犠牲マイクロマシン加工による微小チャンネルアレイの作製）
犠牲マイクロマシン加工において、バルク材料は、実質的に処理されないままである。他の材料の種々の厚みの層を、物理的蒸着（ＰＶＤ）、プラズマ増強化学蒸着（ＰＥＣＶＤ）またはスピン塗布のいずれかによって構築し、そして選択的に、後に残すか、またはその後のプロセス工程によって除去する。従って、生じるチャンネル壁は、チャンネルの底部とは化学的に異なり、そしてレジスト材料が微小デバイスの一部として残る。犠牲マイクロマシン加工のための代表的なレジスト材料は、窒化シリコン（Ｓｉ3Ｎ4）、ポリシリコン、熱成長酸化シリコンならびにエポキシベースのＳＵ−８およびポリイミドのような有機レジストであり、直線状の側壁を有する高アスペクト比の造作の形成を可能とする。
【０１８２】
代表的な例において、側面の大きさが５０×１５ｍｍであるデバイス（「チップ」）は、２５０μｍの間隔で隔たれた、一連の１００の並行チャンネルを含む。各チャンネルは、５ｍｍ長であり、そして１００×１００μｍの横断面を有する。チャンネル容量は、５０ｎｌである。４’’の直径のＳｉ（１００）ウェーハ（Ｖｉｒｇｉｎｉａ  Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ）。Ｓｉ（１００）ウェーハを、まず濃Ｈ2ＳＯ4：３０％  Ｈ2Ｏ2の３：１混合液で洗浄し（９０℃、１０分）、脱イオン水（１８ＭΩｃｍ）でリンスし、最後に１％のＨＦ水溶液で不動態化し、１５０℃で３０分間表面を焼く。ＥＰＯＮ  ＳＵ−８を用いるウェーハのスピン塗布は、上記の実施例１と類似の露光される１００μｍ厚の膜を生じ、プロピレングリコール−モノメチルエーテルアセテート（ＰＧＭＥＡ）溶液中で現像し、高アスペクト比の垂直側壁を有する多チャンネル構造を生じる。金属膜の沈着（２０ｎｍ  Ｔｉ、２００ｎｍ  Ａｕ）を、上記の実施例１に記載のように行う。このデバイスを、５０μｍの薄い接着性カバーガラスで覆う。次に、金コートしたチャンネル壁を、さらに化学的修飾して、所望の生物反応特性および生体適合特性を達成し得る（下記の実施例３を参照のこと）。
【０１８３】
犠牲マイクロマシン加工プロセスさらなる詳述は、Ｌｏｒｅｎｚら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ＭＭＥ’９６（Ｍｉｃｒｏ  Ｍｅｃｈａｎｉｃｓ  Ｅｕｒｏｐｅ）、Ｂａｒｃｅｌｏｎａ、Ｓｐａｉｎ、１９９６年１０月、３２〜３５頁において見い出され得る。
【０１８４】
（実施例３．アミノ反応性単層分子の合成（Ｗａｇｎｅｒら、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．１９９６、７０：２０５２〜２０６６に概説される手順に従う））
（一般）
1Ｈ−および13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを、Ｂｒｕｋｅｒ器械において記録する（１００〜４００ＭＨｚ）。化学シフト（δ）を、内部標準（（ＣＨ3）4Ｓｉ、δ＝０．００（1Ｈ−および13Ｃ−ＮＭＲ））に対する相対的なｐｐｍにおいてレポートする。ＦＡＢ−質量スペクトルを、ＶＧ−ＳＡＢＳＥＱ器械（Ｃｓ+、２０ｋｅＶ）で記録する。透過赤外線スペクトルを、ＦＴＩＲ  Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  １６００シリーズ器械において、ＫＢｒの散乱として得る。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を、予めコートしたシリカゲル６０  Ｆ２５４プレート（ＭＥＲＣＫ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ＦＲＧ）上で行い、そしてＮＨ3気相下で、Ｃｌ2／トルイジン、ＰｄＣｌ2およびＵＶ検出を用いて、検出を行う。中圧液体クロマトグラフィー（ＭＰＬＣ）を、Ｍｅｒｃｋからのシリカゲル６０（粒子サイズ１５〜４０μｍ）を充填したＢｕｅｃｈｉカラム（４６０×３６ｍｍ；ＢＵＥＣＨＩ、Ｆｌａｗｉｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、Ｌａｂｏｍａｔｉｃ  ＭＤ−８０（ＬＡＢＯＭＡＴＩＣ  ＩＮＳＴＲ．ＡＧ、Ａｌｌｓｃｈｗｉｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）において行う。
【０１８５】
（１１，１１’−ジチオビス（スクシンイミジルウンデカノエート）（ＤＳＵ）の合成）
チオ硫酸ナトリウム（５５．３ｇ、３５０ｍｍｏｌ）を、５０％  １，４−ジオキサン水溶液中の１１−ブロモ−ウンデカン酸（９２．８ｇ、３５０ｍｍｏｌ）の懸濁液（１０００ｍｌ）に添加する。この混合液を、中間体ブンテ（Ｂｕｎｔｅ）塩までの反応が完了するまで（透明な溶液）、還流中（９０℃）で２時間加熱する。対応するジスルフィドまでの酸化を、溶液が黄色から茶色を保ち続けるまで、ヨウ素の一部を添加することによりインサイチュで行う。ヨウ素の残りを、１５％のピロ亜硫酸ナトリウム水溶液で、再滴定する。ロータリーエバポレーションによる１，４−ジオキサンの除去の後、クリーム状の懸濁液を、濾過して、産物１１，１１’−ジチオビス（ウンデカン酸）を生じる。エチル酢酸／ＴＨＦからの再結晶化によって、白色固体を提供する
【０１８６】
【化１】
0004489949.tif 000002
【０１８７】
ＴＨＦ（５０ｍｌ）中の１１，１１’−ジチオビス（ウンデカン酸）（１．０ｇ、２．３ｍｍｏｌ）の溶液に対して、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（０．５７５ｇ、５ｍｍｏｌ）、次にＤＣＣ（１．０３ｇ、５ｍｍｏｌ）を０℃で添加する。反応混合液を２３℃まで暖め、そして室温で３６時間攪拌した後、ジシクロヘキシルウレア（ＤＣＵ）を濾過する。減圧下での溶媒の除去、そしてアセトン／ヘキサンからの再結晶化によって、１１，１１’−ジチオビス（スクシンイミジルウンデカノエート）を白色固体として生成する。シリカゲルおよびエチル酢酸とヘキサンの２：１の混合液を使用する中圧液体クロマトグラフィー（９バール）によって、最終精製を達成する。有機相を濃縮し、真空中で乾燥して、１１，１１’−ジチオビス（スクシンイミジルウンデカノエート）を得る。
【０１８８】
【化２】
0004489949.tif 000003
【０１８９】
（実施例４．金上でのアミノ反応性単層の形成（Ｗａｇｎｅｒら、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．１９９６、７０：２０５２〜２０６６の手順に従う））
１１，１１’−ジチオビス（スクシンイミジルウンデカノエート）（ＤＳＵ）ベースの単層を、クロロホルム中の１ｍＭのＤＳＵ溶液中に室温で１時間浸漬することにより、実施例１および２に記載される微小デバイスのＡｕ（ＩＩＩ）表面に沈着させる。１０容量の溶媒でリンスした後、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドが末端をなす単層を、窒素蒸気下で乾燥し、直ちにタンパク質固定化のために使用する。
【０１９０】
（実施例５．ＨＩＶプロテアーゼ改変体の発現および精製）
ＨＩＶプロテアーゼ（Ｇｅｎｅｂａｎｋ  ＨＩＶＨＸＢ２ＣＧ）は、ＨＩＶの生活環の必須の成分であり、抗ウイルス治療の主要な標的である。ＨＩＶプロテアーゼは、ｇａｇおよびｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子産物を、機能的タンパク質にタンパク質分解性プロセシングするために必要とされる。ＨＩＶプロテアーゼの阻害は、感染性のウイルス子孫の産生を妨げ、従って、さらなる感染の回を妨げる。ＨＩＶプロテアーゼは、アスパラギン酸プロテアーゼのファミリーに属し、そして２つの９９アミノ酸長のサブユニットの接触面に形成される活性部位を有する対称のホモダイマーである。活性部位のコア残基は、保存された３ペプチドモチーフからなる（Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ）（Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９０、２４８：３５８）。ＨＩＶプロテアーゼの耐性改変体は、現在使用される全てのインヒビターに対して生じている。個々にまたは組み合わせで耐性を生じる最も関係のある変異は：Ｌ１０Ｒ、Ｄ３０Ｎ、Ｍ４６Ｉ、Ｌ６３Ｐ、Ａ７１Ｖ、Ｖ８２Ｆ（Ｋａｐｌａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９４、９１：５５９７；Ｈｏら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９４、６８：２０１６；Ｃｏｎｄｒａら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９５、３７４：５６９；Ｓｃｈｏｃｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９６、２７１：３１９５７；ＫｏｒａｎｔおよびＲｉｚｚｏ、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．、１９９７、４２１：２７９）である。プロテアーゼ活性を保持するさらなる変異が、系統立てて生成されている（Ｌｏｅｂら、Ｎａｔｕｒｅ、１９８９、３４０：３９７）。
【０１９１】
変異型プロテアーゼは、ＰＣＲ変異誘発によって生成され（Ｗｅｉｎｅｒら、Ｇｅｎｅ、１９９４、１５１：１１９）、そして２つのアプローチを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉにおいて発現されている：（ｉ）Ｎ−末端ヒスチジンタグ（Ｈ6；Ｈｏｃｈｕｌｉら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９８８、６：１３２１）とその後に続く第Ｘａ因子切断部位を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ発現ベクター中へ、変異型プロテアーゼｃＤＮＡおよび野生型プロテアーゼｃＤＮＡをクローニングし、一方、ＨＩＶプロテアーゼの終止コドンを、リジンタグ（Ｋ6）とその後に続く終止コドンをコードする配列で置換する。生じる融合タンパク質を、ＷｏｎｄｒａｋおよびＬｏｕｉｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９６、３５：１２９５７に記載されるように封入体から精製し、そしてＷｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９８、３７：４５１８に記載されるように、ヒスチジンタグを第Ｘａ因子によって除去する；あるいは（ｉｉ）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ発現ベクター中へ、変異型プロテアーゼｃＤＮＡおよび野生型プロテアーゼｃＤＮＡをクローニングし、ＨＩＶプロテアーゼ、３個のグリシンのリンカー、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）およびリジンタグの融合物（ＨＩＶ−ＧＳＴ−Ｋ6）を作製する。ＨＩＶプロテアーゼのカルボキシ末端の自己プロセシング部位Ｆ*Ｐを、Ｆ*Ｉに変えて、融合タンパク質の自己切断を防ぐ（Ｌｏｕｉｓら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９９１、１９９：３６１）。生じるタンパク質ＨＩＶ−ＧＳＴ−Ｋ6を、グルタチオンアガロースビーズでの標準的なクロマトグラフィーによって、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉライセートから精製し、そしてアミンを含まない緩衝液中（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）で、−８０℃で保存する。
【０１９２】
（実施例６．アミノ反応性単層上への融合タンパク質の固定化）
ＨＩＶ−ＧＳＴ−Ｋ6形態のＨＩＶプロテアーゼ改変体およびＧＳＴ−Ｋ6を、微小チャンネルデバイスのアミノ反応性単層表面に固定化する（上記の実施例４を参照のこと）。ＨＩＶ−ＧＳＴ−Ｋ6およびＧＳＴ−Ｋ6を、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）中に１μｇ／ｍｌの濃度に希釈する。第１に、５０μｌのタンパク質を含まない緩衝液を、チャンネルを通して移し、単層表面を水和する。５分間のインキュベーションの後、１０μｌの対応するタンパク質溶液を、チャンネルを通して流し、タンパク質含有溶液での完全な置換を保証する。室温での３０分後に、固定化は完了する。チャンネルを５０μｌの固定化緩衝液でリンスし、そして分析に供する。各微小チャンネルは、異なるＨＩＶ−ＧＳＴ−Ｋ6改変体またはコントロール（ＧＳＴ−Ｋ6）を、ディスプレイする。１８ＭΩｃｍの抵抗の超純粋水を、全ての水性緩衝液について、一般に使用する（Ｂａｒｎｓｔｅａｄ  Ｎａｎｏｐｕｒｅ（登録商標）システムを通過して精製する）。
【０１９３】
（実施例７．微小チャンネル内でのプロテアーゼ活性アッセイ）
ＨＩＶプロテアーゼは、少なくとも７ペプチドの基質を必要とする（Ｍｏｏｒｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１９８９、１５９：４２０）。異なるＨＩＶ改変体の活性を分析するために、分子内蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に基づく連続的アッセイを使用する。ウイルスｇａｇタンパク質のｐ１７−ｐ２４切断部位（Ｓｋａｌｋａ、Ｃｅｌｌ、１９８９、５６：９１１）に対応するペプチド基質を、エネルギー移動対の添加により修飾する（Ｇｅｏｇｈｅｇａｎら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、１９９０、２６２：１１９）：Ｄｎｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ（Ｄｎｓ−ＳＳＱＮＹＰＩＶＷ）において、Ｄｎｓ（ダンシル）およびＴｒｐ基が、それぞれＮ末端およびＣ末端伸長である（Ｇｅｏｇｈｅｇａｎら）。Ｔｒｐの励起は２９０ｎｍ、およびＤｎｓの発光は５７５ｎｍ。Ｔｙｒ−Ｐｒｏ結合でのペプチドの切断は、Ｄｎｓの発光を減少し、３６０ｎｍでのＴｒｐの発光を増加する。修飾された７ペプチドＤｎｓ−ＳＳＱＮＹＰＩＶＷを記載されたように調製し（Ｇｅｏｇｈｅｇａｎら）、アミノ酸分析、核磁気共鳴および質量分析法によって分析する。純度を、Ｖｙｄａｃ  Ｃ−４カラムおよび０．１％  ＴＦＡ中のアセトニトリル勾配を使用するＨＰＬＣ分析によって調べる。上記の全てのＨＩＶ改変体の活性を試験するために、固定化ＨＩＶ改変体を有する各微小チャンネル（実施例６を参照のこと）を、５０ｍＭ  酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５、１３％  グリセロール、１０ｍＭ  ＤＴＴ中の２０μＭのＤｎｓ−ＳＳＱＮＹＰＩＶＷで満たす。固定化タンパク質に対する基質の添加は、蛍光発光スペクトルの、経時的な強度変化をもたらす。３６０ｎｍのＴｒｐ発光ピークは、その初期の強度の約２．５倍まで、漸次的に増加するが、その一方、Ｄｎｓ基の発光バンド（５７５ｎｍ）は、強度が低下する。この強度変化は、ＨＩＶ改変体の活性形態を含有する全てのチャンネルにおいて観察される。バックグラウンド蛍光変化のコントロールとして、ＧＳＴ−Ｋ6融合タンパク質を、並行して測定する。
【０１９４】
ＨＩＶ改変体によるタンパク質分解の特異性を試験するために、競合アッセイを行い得る。１つのアッセイにおいて、薬物としてのその可能性について試験されるＤｎｓ−ＳＳＱＮＹＰＩＶＷおよび小有機分子を、５０ｍＭ  酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５、１３％  グリセロール、１０ｍＭ  ＤＴＴ溶液中で、各チャンネルに送達する。広範囲のＨＩＶプロテアーゼ改変体についてインヒビターとして作用する有機分子は、多数の微小チャンネル中のプロテアーゼとペプチド基質との反応に付随する、Ｔｒｐ発光ピークの増加およびＤｎｓ発光バンド減少を小さくする。他方、さほど所望されない薬物候補は、選択された微小チャンネル内のみにおいて、ＨＩＶプロテアーゼとペプチド基質との反応を阻害する（または全く阻害しない）。
【０１９５】
プロテアーゼインヒビターであるシクイナビル（Ｓｅｑｕｉｎａｖｉｒ）（Ｒｏｃｈｅ）、リトナビル（Ｒｉｔｏｎａｖｉｒ）（Ａｂｂｏｔ）またはインディナビル（Ｉｎｄｉｎａｖｉｒ）（Ｍｅｒｃｋ）もまた、反応緩衝液に添加して、阻害の特異性のための陽性コントロールとして使用し得る。シクイナビルは、Ｇ４８ＶまたはＬ９０Ｍ変異のいずれかを含むＨＩＶ改変体以外の全てのＨＩＶ改変体を阻害する。対照的に、リトナビルは、Ｍ４６Ｉ、Ｌ６３Ｐ、Ａ７１Ｖ、Ｖ８２ＦおよびＩ８４Ｖ改変体の活性をブロックし得ない。インディナビルは、Ａ７１Ｖ改変体が影響されない以外は、リトナビルと類似の阻害パターンを有する。さらに、インディナビルは、Ｌ１０Ｒ  ＨＩＶプロテアーゼ改変体の活性を減少し得ない。
【０１９６】
これらの実験は、ＨＩＶ改変体微小チャンネルデバイスをどのように使用して、ＨＩＶプロテアーゼ活性に対する小有機分子の阻害的影響を試験し得るかを、実証する。
【０１９７】
上記の明細書において引用された全ての文献は、本明細書において参考として援用される。本発明の種々の変更および変形は、本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく、当業者に明らかである。本発明は、特定の好ましい実施態様と関連して記載されているが、特許請求の範囲に記載される本発明は、そのような特定の実施態様に不当に限定されるべきではないことが、理解されるべきである。実際、当業者に明らかである、本発明を行うために記載された様式の種々の変更が、特許請求の範囲内にあることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、カバーを付けた微小チャンネルアレイデバイスの平面図を示す。
【図２】  図２は、バルクマイクロマシン加工によって製作された、カバーを付けた微小チャンネルアレイの断面図を示す。
【図３】  図３は、犠牲マイクロマシン加工によって製作された、カバーを付けた微小チャンネルアレイの断面図を示す。
【図４】  図４は、基板上のチオール反応性単層を示す。
【図５】  図５は、コートされた基板上のアミノ反応性単層を示す。
【図６】  図６は、親和性タグを介して、単層でコートされた基板上に固定化された生物学的部分を示す。
【図７】  図７は、微小チャンネルアレイデバイス中の生体分子でコートされた微小チャンネルの断面図を示す。
【図８】  図８は、親和性タグおよびアダプター分子を介して、単層でコートされた基板上に固定化された生物学的部分を示す。
【図９】  図９は、微小チャンネルアレイの固定化された生物学的部分と、被分析物との相互作用をモニターするために使用され得る、蛍光検出ユニットの模式図を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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