(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８０７８を有する動物細胞。
【請求項２】
ＨＩＶ−１感染価の測定のために使用する、請求項１に記載の動物細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、HIV-1感染により分泌型レポータータンパク質を発現することができる動物細胞、より詳細には、HIV-1感染価の測定のために使用できる、HIV-1感染により分泌型レポータータンパク質を発現することができる動物細胞に関する。
【０００２】
【従来の技術】
1996年E.Bergerらにより、HIV-1の標的細胞への侵入過程には細胞側の主要ウイルスレセプターであるCD4分子以外に、T細胞指向性HIV-1はCXCR4を、マクロファージ指向性HIV-1はCCR5をコレセプターとして用いることが明らかにされ、それ以来、HIV-1の指向性およびウイルス侵入過程の解明が進んできた(Feng, Y. et al., HIV-1 entry cofactor: Functional cDNA cloning of a seven-transmembrane, G-protein-coupled receptor. Science 272: 872-877, 1996; Alkhatib, G. et al., CC-CCR5, a RANTES, MIP-1alpha, MIP-1beta receptor as a fusion cofactor for macrophage-tropic HIV-1. Science 272: 1955 - 1958, 1996; Choe, H. et al.,  The beta-chemokine receptor CCR3 and CCR5 facillitate infection by primary HIV-1 isolates. Cell 85: 1135-1148, 1996; Debg, H. et al., Identification of a major co-receptor for primary isolates of HIV-1. Nature 381: 661 - 666, 1996; 及びDRagic, T. et al., HIV-1 entry into CD4+ cells is mediated by the chemokine receptor CC-CCR5.Nature 381: 667 - 673, 1996)。HIV-1感染の測定系としては主として、HIV-1の構造蛋白であるgag蛋白p24のELISAによる測定系と、逆転写酵素の活性測定に基づく測定系が用いられてきたが、これらはウイルスの感染価そのものを反映した定量系ではない。
【０００３】
現在用いられる感染価測定系としては、Emermanらにより開発されたCD4発現HeLa細胞  (HeLa CD4/LTR-bGal; 通称MAGI 細胞)を用いた測定系が知られている(Kimpton, J. et al., Detection of replication-competent and pseudotyped human immunodeficiency virus with a sensitive cell line on the basis  of activation of an integrated beta-galactosidase gene. J.Virol. 66: 2232-2239, 1992)。この細胞株はHIV-1のLTR下流にSV40の核移行シグナルを付け加えたβ-ガラクトシダーゼを入れた発現ユニットを組み込んであり、感染したHIV-1が発現する転写活性因子であるTat蛋白により強力に駆動されるHIV-1 Promoter LTRによりβ-ガラクトシダーゼ酵素が感染細胞核内で発現することを利用した測定系である。この細胞は、in situにHIV-1感染多核細胞を計数できることからMultiple nuclear Activation of Galactosidase Indicator cell Assay (MAGI Assay)と呼ばれ、数多くの実験系に応用されてきた。しかしながら、MAGI 細胞の親株HeLa細胞は構成的にCXCR4を発現しているのでT細胞指向性HIV-1の感染価は測定することができるが、CCR5は発現していないことからマクロファージ指向性HIV-1をはじめとする多くの臨床分離株には応用しえないという問題点があった。
【０００４】
そこで、MAGI 細胞にCCR5発現能を付与させることを目的として、Elongation Factor 1αのプロモーター下流にCCR5を組み込み、Blasticidine により選択できる発現ベクターpEFBOSbsrCCR5を構築し、これをMAGI細胞にトランスフェクションし、Blasticidine選択後、限界希釈することによりCCR5発現MAGI細胞(MAGIC-5 : MAGI-CCR5)が樹立された（巽  正志、小島朝人：HIV-1感染価測定に適したCCR5発現HeLa/CD4-LTR-beta-Gal細胞の樹立と応用について  第10回日本エイズ学会総会、1997年12月、熊本、Tatsumi,M. and Kojima,A.: Establishment of HeLa/CD4-LTR-bGal expressing CCR5 suitable for infectivity assay of T- and M-tropic HIV-1 and its application to clinical isolation and cloning of virus. The XIIth International Congress of AIDS, Geneve, Switzerland, June, 1998）。この細胞株はT細胞指向性HIV-1のみならずマクロファージ指向性HIV-1 の感染価をも計数しえることが判明し、MAGI細胞と異なり疑陽性を大幅に減じたクローンを選択できた。
【０００５】
このMAGIC-5細胞株を用いたHIV-1感染価測定、ウイルスクローニング、臨床検体からのウイルス分離および感染性分子クローン樹立については、
巽  正志、小島朝人：HIV-1感染価測定に適したCCR5発現HeLa/CD4-LTR-beta Gal細胞の樹立と応用について  第10回日本エイズ学会総会、1997年12月、熊本；
Tatsumi,M. and Kojima,A.: Establishment of HeLa/CD4-LTR-bGal expressing CCR5 suitable for infectivity assay of T- and M-tropic HIV-1 and its application to clinical isolation and cloning of virus. The XIIth International Congress of AIDS, Geneve, Switzerland, June, 1998；
巽  正志    MAGIC-5A細胞による感染性HIV-1 分子クローンの確立  第13回日本エイズ学会  1998年12月  横浜；
Tatsumi, M. Efficient molecular cloning of infectious HIV-1 subtype C by MAGIC-5 virus cloning and long PCR. The XIthe International Congress of Virology, Sydney, Australia, August, 1999；並びに
蜂谷敦子、相沢佐織、田中真理、高橋由紀子、平林義弘、井田 節子、巽  正志、岡  慎一  CCR5発現Hela/CD4-LTR-beta Gal細胞(MAGIC5 clone 1-10)を用いた抗HIV薬耐性検査に関する検討  第13回日本エイズ学会  1999年12月  東京；
に報告されている。この細胞株はHIV-1 の感染価測定という基本的基盤をなすことから多くのHIV-1 研究領域に応用されうる可能性が想定された。現在、既に薬剤耐性Phenotype Assayおよび抗HIV薬剤スクリーニングなどに応用されてきている。
【０００６】
一般に用いられているHIV-1 gag蛋白p24のELISAによる測定もしくは逆転写酵素の活性測定に基づくものに比較して迅速簡便かつ経済的であるものの、この細胞株によるHIV感染価測定は顕微鏡下におけるX-galにより青染した細胞核の計数による測定であったため、多検体の迅速処理には適していなかった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は上記した従来技術の問題点を解消することを解決すべき課題とした。即ち、本発明は、HIV-1ウイルスの感染価自体を測定するのに適した細胞であって、T細胞指向性HIV-1のみならずマクロファージ指向性HIV-1を含む多くの臨床分離株に適用でき、かつ迅速簡便かつ経済的であり、多検体の迅速処理を可能とする細胞を提供することを解決すべき課題とした。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、種々の酵素活性基質が入手しやすく、測定感度も高く、測定手技の簡略化が可能なレポータータンパク質として分泌型アルカリホスファターゼを選定し、HIV感染により培養上澄中に分泌されるアルカリホスファターゼ(SEAP)をレポーター遺伝子として組み込んだインジケーター細胞の樹立を試みた。そして、この樹立した細胞株のHIV感受性をp-Nitrophenol phosphateを基質とした比色反応、MUPを基質とした蛍光発光(Clonetech)及びCSPDを基質とした化学発光測定系(Toyobo Co. Ltd)で、MAGIC-5細胞のBlue Cell Countと比較検討した結果、この細胞株はHIV-1感受性においてMAGIC-5と高い相関を示した。またこの細胞株は、末梢血リンパ球培養で分離された広範囲のHIV-1に感受性を示し、そのウイルスのTropismにかかわらず検出可能であり、検出感度も十分に高いことが判明した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
【０００９】
即ち、本発明によれば、HIV-1感染により分泌型レポータータンパク質を発現することができる、動物細胞が提供される。
好ましくは本発明の動物細胞は、HIV-1ウイルスレセプターCD4とHIV-1ウイルスコレセプターとを有する。
好ましくは本発明の動物細胞は、HIV-1ウイルスコレセプターとしてCXCR4及び／又はCCR5を有し、さらに好ましくはHIV-1ウイルスコレセプターとしてCXCR4及びCCR5の両方を有する。
【００１０】
好ましくは、分泌型レポータータンパク質は比色反応、蛍光発光または化学発光の何れか1種以上の測定系で検出できるタンパク質であり、より好ましくは、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ又はペルオキシダーゼである。
【００１１】
好ましくは本発明の動物細胞は、HIV-1 LTR配列の下流に分泌レポータータンパク質をコードする遺伝子を有する発現ベクターを動物細胞に形質転換することにより得られる。
好ましくは本発明の動物細胞は、哺乳類動物細胞に由来する細胞であり、より好ましくは、ヒトＨｅｌａ細胞又はヒトＨＯＳ細胞に由来する細胞である。
特に好ましい本発明の動物細胞は、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８０７８を有する動物細胞である。
【００１２】
本発明の動物細胞は、ＨＩＶ−１感染価の測定のために使用することができる。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明の動物細胞は、HIV-1感染により分泌型レポータータンパク質を発現することができることを特徴とする。
本発明の動物細胞はHIV-1が感染することができる細胞であれば、その種類は特には限定されない。
通常、HIV-1の感染には、HIV-1ウイルスレセプターCD4が必要とされることから、本発明の動物細胞は、HIV-1ウイルスレセプターCD4を有していることが好ましい。また、本明細書中で上記した通り、HIV-1の標的細胞への侵入過程には細胞側の主要ウイルスレセプターであるCD4分子以外に、T細胞指向性HIV-1はCXCR4を、マクロファージ指向性HIV-1はCCR5をコレセプターとして用いていることから、本発明の動物細胞もこれらのコレセプターを有していることが好ましい。広範なHIV-1の感染価を分析することを目的とする場合には、CXCR4及びCCR5の両方を発現している動物細胞を使用することが好ましい。
【００１４】
これらのHIV-1ウイルスレセプターCD4とHIV-1ウイルスコレセプターは出発となる動物細胞がもともと保持し、かつ発現している場合にはそれらをそのまま利用すればよい。また、出発となる細胞がこれらを発現していない場合には、好適な発現ベクターに上記レセプターまたはコレセプターをコードする遺伝子を組み込んだ組み換え発現ベクターを出発動物細胞に導入することにより、当該レセプターまたはコレセプターを当該動物細胞中に発現させることができる。
【００１５】
本発明の動物細胞を樹立するために用いることができる出発細胞の種類は特に限定はされないが、好ましくは哺乳類（例えば、ヒトまたはサルなどの霊長類や、マウス、ラット又はハムスターなどのげっ歯類など）の動物細胞であり、より具体的には、ヒト由来Ｈｅｌａ細胞又はヒト由来ＨＯＳ細胞などが挙げられる。
【００１６】
目的のレセプター又はコレセプターを発現している細胞を選択するための手法としては、当該レセプター又はコレセプターを含む組み換え発現ベクター中に抗生物質耐性遺伝子を当該レセプター又はコレセプターと一緒に発現され得るように組み込んでおき、当該抗生物質を含む培地中で培養することにより、目的のレセプター又はコレセプターを発現する細胞を選択することができる。また、目的の細胞を一つの細胞に由来する単一の細胞としてクローニングするための手法としては限界希釈法を挙げることができる。
【００１７】
例えば、構成的にCXCR4を発現しているHeLa細胞は出発細胞として使用する場合には、このHeLa細胞に抗生物質耐性遺伝子（例えば、ネオマイシン（Neo）耐性遺伝子）を乗せたマウスレトロウイルスベクターを形質転換してCD4を発現させ、所望によりLTR-βGal発現ユニットをハイグロマイシン（Hygromycin）耐性遺伝子ととも形質転換し、生育細胞を選択する。さらに、CD4発現増強のためのCD4発現とPuromycin耐性を形質転換体に付与する発現ベクター、並びにCCR5発現とBlastocitidine耐性を形質転換体に付与する発現ベクターを上記細胞に形質転換し、限界希釈法により目的とする細胞をクローニングする。この操作でクローニングされる目的細胞は、G418, Hygromycin, PuromycinおよびBlastcitidinの合計４種の選択薬剤に対して耐性を有している。
【００１８】
本発明の動物細胞は、HIV-1感染により分泌型レポータータンパク質を発現することができることを特徴とする。本発明の動物細胞はHIV-1感染により分泌型レポータータンパク質を発現し、発現した分泌型レポータータンパク質は細胞該に分泌され、培養液中に放出される。本発明の動物細胞を含む培養系にHIV-1を含む試料を添加し、その培養液を採取し、該培養液中に分泌されたレポータータンパク質を適当な方法で検出又は分析することにより、試料中のHIV-1の感染価を測定することができる。
【００１９】
培養液中に分泌されたレポータータンパク質の検出方法は特に限定されないが、例えば、比色反応、蛍光発光または化学発光などにより検出する方法が挙げられる。分泌レポータータンパク質の種類は特に限定されないが、種々の酵素活性基質が入手しやすく、測定感度が高く、測定手技の簡略化が可能なものが好ましく、例えば、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ又はペルオキシダーゼなどが挙げられ、この中でもアルカリホスファターゼが特に好ましい。
【００２０】
本発明によるHIV-1感染により分泌型レポータータンパク質を発現する動物細胞を作成するための好ましい方法の一つとしては、HIV-1 LTR配列の下流に分泌レポータータンパク質をコードする遺伝子を有する発現ベクターを動物細胞に形質転換する方法が挙げられる。上記方法で用いる発現ベクターには、所望の細胞の選択のための薬剤耐性遺伝子が含まれていることが好ましい。
【００２１】
例えば、本明細書中で上記したようなG418, Hygromycin, PuromycinおよびBlastcitidinの合計４種の選択薬剤に対して耐性を有し、CXCR4、CD4およびCCR5を発現する細胞に対して、分泌レポータータンパク質をコードする遺伝子を有する発現ベクターを形質転換することにより、本発明の動物細胞を作成することができる。この場合、分泌レポータータンパク質をコードする遺伝子を有する発現ベクター中に組み込むことができる薬剤耐性遺伝子としては、上記４種の薬剤耐性遺伝子以外であればよく、例えば、Zeocin耐性遺伝子などが挙げれる。
【００２２】
より具体的には、分泌レポータータンパク質をコードする遺伝子を有する発現ベクターを、HIV-1ウイルスレセプターCD4とHIV-1ウイルスコレセプターとを有する細胞にトランスフェクションし、薬剤で選択し、生存コロニーを得ることができる。これらを増殖させたクローン細胞をマイクロプレートに２重に播き、一方はHIV-1を感染させ、他方は非感染対照とする。感染2日後、培養上清を採取し、65℃で15分間処理して内在性アルカリホスファターゼとHIVの不活化する。培養上清に分泌されたSEAPは例えば、p-Nitrophenol phosphateを基質とした比色反応で測定し選別することができる。HIV 非感染ではSEAP活性が低く、HIV感染により高いSEAP活性を示すクローンを選別することにより目的の細胞を樹立することができる。
上記した方法で樹立することができる細胞の一例としては、受託番号ＦＥＲＭＰ−１８０７８を有する細胞が挙げられる。
【００２３】
本発明の動物細胞の培養方法、培養条件は細胞の種類、性質などに応じて適宜選択することができる。例えば、HeLa 細胞に由来する細胞株の場合には、抗生物質（例えば、Kanamycin等）を含み、5% FCSを添加したDulbecco's Modified Minimum Essential Medium (High glucose; Gibco)中で37℃で5%ＣＯ2で培養することができる。
【００２４】
本発明の動物細胞は、HIV-1感染価の測定のために使用することができる。具体的には、本発明の動物細胞をマイクロプレートに接種し、HIV-1を含む試料を培地で段階的に希釈し、各穴に添加する。適当な培養条件（例えば、温度３７℃で５％ＣＯ2）で一定時間インキュベートした後、各穴の上清を回収し、内在性レポータータンパク質とHIVの不活化のために６５℃で１５分間加熱する。この上清を用いて常法に従って、レポータータンパク質のアッセイを行なうことができる。レポータータンパク質がアルカリホスファターゼの場合には、例えば、p-ニトロフェノールホスフェートを基質とした比色反応、MUPを基質とした蛍光発光、及びCSPDを基質とした化学発光測定系などを利用することができる。
【００２５】
さらに本発明の動物細胞は、ＨＩＶの薬剤耐性試験に利用することができる。現在利用可能な抗ＨＩＶ薬としては、逆転写酵素阻害剤とプロテアーゼ阻害剤が挙げられるが、本発明の動物細胞はこれら抗ＨＩＶ薬に対するＨＩＶの薬剤耐性を調べるのに有用である。
【００２６】
具体的には、本発明の動物細胞をマイクロプレートに接種し、HIV-1を含む試料を培地で段階的に希釈し、各穴に添加する。さらに適当な希釈系列の抗ＨＩＶ薬を添加し、適当な培養条件（例えば、温度３７℃で５％ＣＯ2）で一定時間インキュベートした後、各穴の上清を回収する。以下HIV-1感染価の測定の場合と同様にして、レポータータンパク質をアッセイすることにより、抗ＨＩＶ薬に対するＨＩＶの薬剤耐性を調べることができる。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されることはない。
【００２７】
【実施例】
１．方法
全てのHeLa 細胞由来細胞株は、抗生剤として50μg/mlのKanamycinを含み、5% FCSを添加したDulbecco's Modified Minimum Essential Medium (High glucose; Gibco)で37℃で5%ＣＯ2で培養した。
既に本発明者が樹立したCCR5発現MAGI細胞株MAGIC-5Aは、元来の親株HeLa細胞にNeo耐性遺伝子を乗せたマウスレトロウイルスベクターによりCD4を発現し、LTR-βGal発現ユニットはHygromycin耐性遺伝子とともに乗せて選択されFACS(Fluorescent Activated Cell Sorter)で選別された細胞株であるMAGI細胞株にさらにCD4発現増強のため発現ベクターpEFBOSpacCD4（CD4発現とPuromycin耐性をTransformant に与える）, CCR5発現のため発現ベクターpEFBOSbsr（CCR5発現とBlastocitidine耐性をTransformantに与える）により形質転換され限界希釈法によりクローニングされ樹立した細胞株で、G418, Hygromycin, PuromycinおよびBlastcitidinの合計４種の選択薬剤に耐性になっていた。
【００２８】
HIV-1 subtype B由来の LTRの下流にpSEAP2-Basic (Clontech) からTranscriptional Blockerとともにレポーター遺伝子として分泌型アルカリホスファターゼ(SEAP)を組み込み、さらに新たな選択遺伝子としてZeocin耐性遺伝子を載せた発現ベクターを構築した（図１）。この発現ベクターをMAGIC-5A細胞株にトランスフェクション後、Zeocinで選択培養し生残したコロニー165個を得た。これらの増殖させたクローン細胞を96穴マイクロプレートに２重に播き、一方はHIV-1を感染させ一方は非感染対照とした。感染2日後培養上澄100μl採取し、内在性アルカリホスファターゼとHIVの不活化のため65℃で15分間処理し測定まで−20℃で保存した。検体中の分泌されたSEAPはL-Homoarginineを内在性アルカリホスファターゼ阻害剤として添加したｐ−ニトロフェノールホスフェートを基質とした比色反応で測定し選別した(Berger J.  et al., Secreted placental alkaline phosphatase: a powerull new quantitative indicator of gene expression in eukaryotic cells. Gene 66: 1-10, 1988)。HIV 非感染ではSEAP活性が低く、HIV感染により高いSEAP活性を示すクローンを選別し、選択薬剤非存在下での連続２回の限界希釈法によりMAGIC-5/SEAP clone 3-1-1を樹立した。
【００２９】
この樹立した細胞株のHIV感受性を、以下の方法により、p-Nitrophenol phosphateを基質とした比色反応、MUPを基質とした蛍光発光(Clonetech)及びCSPDを基質とした化学発光測定系(Toyobo Co. Ltd)で、既にデータが蓄積されているMAGIC-5細胞のBlue Cell Countと比較検討した。
【００３０】
（化学発光アッセイの方法）
100万細胞のMAGIC-5/SEAPインジケーター細胞を感染前日に９６穴マイクロプレートの各穴に接種した。R５マクロファージ指向性HIV-1、Indie-C1(104bcc/ml)またはＸ４Ｔ細胞株指向性HIV-1 NL432（２×１０4bcc/ml）を培地で段階的に希釈し、各穴に添加し、３７℃で５％ＣＯ2でインキュベートした。48時間のインキュベーション後、各穴の上清を回収し、６５℃で１５分間加熱し、Reporter Assay Kit-SEAP-（東洋紡）を用いて取扱説明書に従って化学発光アッセイを行なった。
【００３１】
（比色アッセイの方法）
100万細胞のMAGIC-5/SEAPインジケーター細胞を感染前日に９６穴マイクロプレートの各穴に接種した。R５マクロファージ指向性HIV-1、Indie-C1(106bcc/ml)またはＸ４Ｔ細胞株指向性HIV-1 NL432（２×１０6bcc/ml）を培地で段階的に希釈し、各穴に添加し、３７℃で５％ＣＯ2でインキュベートした。HIV-1 NL432（１×１０6bcc/ml）も、開始濃度１ｍＭで段階的に希釈したＲＴ阻害剤ＡＺＴの存在下でインキュベートした。48時間のインキュベーション後、各穴の上清を回収し、６５℃で１５分間加熱し、Cullen, B.R. and Malim,M.M. Methods in Enzymology 216: 362-368, 1992の方法に従って比色アッセイを行なった。
【００３２】
２．結果
200μg/ml のZeocin存在下の選択培養で総計162個の生残コロニーが得られた。しかしながら生残した殆どのコロニーはHIV感染の有無にかかわらず高いSEAPを分泌していた。2個の数少ないコロニーから、HIV非感染ではBackgroud 程度のSEAPしか検出せず、HIV感染により多量のSEAPを分泌する細胞群から２度にわたる限界希釈法で安定したHIV-1感受性を示したクローンMAGIC-5/SEAP 3-1-1 を樹立した。
MAGIC-5/SEAP 3-1-1は、ＦＥＲＭ  Ｐ−１８０７８として、平成１２年１０月１６日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所、日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号305-8566）に寄託されている。
【００３３】
MAGIC-5/SEAPに対するHIV-1の化学発光アッセイの結果を図２に、MAGIC-5/SEAPに対するHIV-1の比色アッセイの結果を図３にそれぞれ示す。
MAGIC-5/SEAPはHIV-1感受性においてMAGIC-5Aと高い相関を示した。またこの細胞株は現在まで調べた限り、末梢血リンパ球培養で分離されたHIV-1全てに感受性を示し、そのウイルスのTropismにかかわらず検出可能であった。また検出感度について感染性分子クローンであるX4 HIV-1 NL432とR5 HIV-1 Indie-C1を用いた実験では、10000個のMAGIC-5/SEAP細胞に10 bcu (Blue Cell Unit; MAGIC-5A 細胞で予め感染価を測定してTiter を合わせてある)のHIV-1感染2日後の培養上澄中に化学発光基質では有意なSEAP活性が検出される程鋭敏であった。またこの細胞株ではその感染価測定のためMAGIC-5A のX-Gal染色のように固定染色の必要がないため、培養を継続でき、MAGIC-5A 細胞はHIV-1の増殖が可能であるため、培養を継続することによりさらに低い力価のHIV-1 の検出も可能である。この測定系は培養上澄に反応基質を添加するだけで迅速簡便で、さらに高感度にて広い範囲のHIV感染を検出することが可能であった。またMAGIC-5/SEAP細胞株は、親株のMAGIC-5Aと同様感染した細胞の核が青染することを利用して、分離ウイルスの感染価をBlue cell countのみならず、一個当たりのウイルス感染により産生されたTat 分子により転写発現されるSEAP の化学発光量として表現でき、分離ウイルスのTat蛋白の転写活性の比較も可能であると考えられた。
【００３４】
３．考察
本発明では、HIV-1 感染価測定細胞として有用性が認められているMAGIC-5A細胞にさらに感染したHIV-1のTat蛋白で培養上澄中に分泌されるSEAPをReporter として組み込んだMAGIC-5/SEAP細胞株を樹立した。この細胞株樹立の過程で、SEAP発現ユニットを組み込んだMAGIC-5A細胞で選択薬剤Zeocin耐性のコロニー細胞群の殆どが、HIV-1非感染にもかかわらず、無視できない程バックグラウンドより有意に高いSEAP活性をその培養上澄に分泌することが判明した。このことはHIV-1 LTRが弱いながらもBasalなプロモーター活性を示すことと、組み込まれたHeLa細胞のゲノムの近傍に有意なトランスな転写活性を促進する領域があることを示している。当初Transcriptional Blocker (TB) をLTR下流に組み込んでいないSEAPの発現ユニットをMAGIC-5Aに組み込んだZeocin耐性コロニーの細胞群はTBを組み込んだ発現ユニットの細胞群より高いバックグラウンド 値を示したことからも（データは示さず）、感度のよいレポーター遺伝子を用いた場合、感染価測定に実際に使用に耐える細胞株を得る確率は高くないことが考えられた。
【００３５】
本発明のMAGIC-5/SEAP細胞株は、親株MAGIC-5A細胞株の長所を全て備えている。すなわち現在一般的にHIV-1分離とその増殖および感染過程の測定に用いられているPBMCの培養による方法は、ウイルス分離に数週間にわたる培養を必要とするが、MAGIC-5A およびMAGIC-5/SEAPでは患者検体試料中に含まれる感染性のウイルス量によるが、104コピー/ml 以上の検体から2日から7日でウイルス分離が可能であり、PBMC法のようにドナーによる分離率のばらつきが認められない利点がある。さらに多くのHIV-1ウイルスでは増殖によりSyncytium形成により分離の確認がPBMC培養に比較して容易であり、MAGI細胞との共用により分離したHIV-1 のCoreceptor Usageが推定でき、さらにp24 gaga ELISA法やRT 測定などより迅速簡便なX-Gal染色あるいはSEAP活性の測定により感染の確定ができる。さらにMAGIC-5A細胞と同様にHIV-1 以外のPrimate LentivirusであるHIV-2 およびSIVの感染価も測定できる広いスペクトルを有する細胞株であることも判明した。
【００３６】
今回のHIV-1感染測定細胞株MAGIC-5Aの改変を試みるに当たって、新たなレポータータンパク質としてSEAPを選定した根拠は以下の通りである。
（１）  SEAPは細胞外の培養上澄中に分泌されるため、通常の高感度なレポーターアッセイに用いられるルシフェラーゼのように細胞溶解操作が不要であり、試料調製が容易であるのみならず、細胞を無傷のままでSEAPの発現、即ちHIV-1感染の経時的な変化を連続して同一培養で追跡できること。
（２）  SEAPは胎盤性アルカリホスファターゼ由来で、多くの細胞が産生する内在性アルカリホスファターゼよりも熱安定性が高く、試薬に対する感受性にも違いがあることから、SEAPの活性を選択的に測定できること。
【００３７】
（３）  SEAPの基質として比色反応、蛍光反応、化学発光反応と、それぞれ研究室に装備されている機器に応じて選択の柔軟性があること。
（４）  特に検出感度の観点からはSEAP の化学発光による検出は、現在もっとも鋭敏であるとされるLuciferaseに優とも劣らない感度を示し、約10fg の極微量のSEAP が検出可能でなおかつ定量性においてその直線性は5桁までの広い測定レンジをもつこと。
【００３８】
特にMAGIC-5A 細胞株によるたった一個の感染性HIV-1 検出の鋭敏性を備え、さらに単に培養上澄に酵素基質を添加するのみで感染価が測定できる操作の簡便性は、96穴マイクロプレートとLiminometerを用いることにより多検体を迅速簡易に測定できることから、容易に測定過程のロボット化が期待でき、薬剤耐性試験あるいは抗HIV薬剤スクリーニング試験等の様々なHIV-1感染測定系においてHigh Throughputな測定系の構築に応用が期待できる基盤技術を提供するものと考えられる。
【００３９】
【発明の効果】
本発明により、HIV-1ウイルスの感染価自体を測定するのに適した細胞であって、T細胞指向性HIV-1のみならずマクロファージ指向性HIV-1を含む多くの臨床分離株に適用でき、かつ迅速簡便かつ経済的であり、多検体の迅速処理を可能とする細胞が提供されることになった。
【図面の簡単な説明】
【図１】図1は、HIV-1subtype B 由来の LTRの下流にpSEAP2-Basic (Clontech) からTranscriptional BlockerとともにReporter Geneとして分泌型アルカリホスファターゼ(SEAP)を組み込み、さらに新たな選択遺伝子としてZeocin耐性遺伝子を載せた発現ベクターｐＨＩＶ−ＬＴＲｂｌｅｏＳＥＡＰの構造を示す図である。プラスミドの大きさは５６１８ｂｐである。
【図２】図２は、MAGIC-5/SEAPに対するHIV-1の化学発光アッセイの結果を示す図である。
【図３】図３は、MAGIC-5/SEAPに対するHIV-1の比色アッセイの結果を示す図である。
【図１】
0004461211.tif 000002
【図２】
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【図３】
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