(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲノム内に組み込まれた機能性ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子を保有する両種指向性レトロウイルスパッケージング細胞株ＤＳＭＡＣＣ２２３５であって、その遺伝子ｇａｇ及びｐｏｌの発現が、ｅｎｖ遺伝子の発現とは無関係に制御され、そしてその細胞株のゲノムが１又は２個の機能的に活性なｅｎｖ遺伝子を保有する前記細胞株。
【請求項２】
２個の組込みｅｎｖ及び１個の組込みｇａｇ／ｐｏｌを有する、請求項１に記載のパッケージング細胞株。
【請求項３】
レトロウイルスベクターをパッケージングした際に、少なくとも２×１０6〜１０7コロニー形成単位／ｍｌ細胞培養上清である力価を達成する、請求項１又は２に記載のパッケージング細胞株。
【請求項４】
両種指向性レトロウイルスパッケージング細胞株ＤＳＭＡＣＣ２２３５を生産するための方法であって、選択遺伝子を保有するｅｎｖヘルパープラスミドと、選択遺伝子を保有するｇａｇ／ｐｏｌヘルパープラスミドとを真核細胞にトランスフェクションし、その選択遺伝子に基づいてトランスフェクションされた細胞を同定し、そして単離し、そして１又は２個の機能的に活性なｅｎｖ遺伝子を有する前記細胞を選択することを含んでなる前記方法。
【請求項５】
レトロウイルスベクターを生産するための方法であって、そのウイルスに対して異種の１又は複数の遺伝子を保有するが、機能的に活性なレトロウイルスの構造遺伝子を保有しないベクターゲノムによって、請求項１〜３のいずれかに記載のパッケージング細胞株をトランスフェクションし、その細胞株を培養し、そしてその培養上清からレトロウイルスベクターを単離することを含んでなる前記方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、両種指向性(amphotropic)レトロウイルスのパッケージング細胞株、その生産方法、及びその使用、特にインビトロ及びインビボでの遺伝子治療のための使用に関する。前記パッケージング細胞株によって生産されたレトロウイルスベクターを用いることにより、高いウイルス力価を達成できる。
【０００２】
レトロウイルスベクターは、哺乳動物及び人間の細胞に外来遺伝子を導入するために広く用いられている。しかし安全上の理由から、その様なレトロウイルスは、もはや複製能を有するべきではない。従って、機能的なパッケージング配列を保有しないために野生型ウイルスを生産することができないレトロウイルスベクターを生産するために、パッケージング細胞株を用いる。その様なパッケージング細胞株が知られていて、報告されている：Ψ2(Mann et al., Cell 33 (1983) 153-156), Ψ-Am(Cone and Mulligan, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81 (1994) 6349-6353), PA12(Miller et al., Mol.Cell Biol. 5 (1985) 431-437), GP+E-86(Markowitz et al., J.Virol. 62 (1988) 1120-1124), PA317(Miller and Buttimore, Mol.Cell Biol. 6 (1986) 2895-2902)及びGP+env Am12(Markowitz et al., Virology 167 (1988) 400-406)。Handbuch der molekularen Medizin, Vol.1, Ed. D. Ganten and K. Ruckpaul, Springer Publishers, Heidelberg 1997, R. Ruger, chapter 2.1, 197-241も参照すること。
【０００３】
しかし、GP+env Am12(以下ではAm12と称する)以外の全ての前記パッケージング細胞株は、ある程度野生型ウイルスを形成する(Bosselman  et al., Mol.Cell Biol. 7 (1987) 1797-1804)。対照的にAm12は、ウイルスのgag及びpolの機能が１つのプラスミドにより、そしてenvがもう１つのプラスミドにより導入されていて、安全なパッケージング細胞株である。従ってこれらの機能は、パッケージング細胞のゲノム上の異なる位置に組み込まれる。Am12から野生型ウイルスを形成するためには、元の完全なゲノムを再生する３つの組換えが起きる必要がある。これは明かにほぼ不可能であり、これまでも観察されていない。
【０００４】
パッケージング細胞株内で相同組換えによって引き起こされる問題を回避するために、例えば、異なるプロモーターによってgag/pol及びenvを発現させる試み(Meyers et al., Arch.Virol. 119 (1991) 257-264; Dougherty et al., J.Virol. 63 (1989) 3209-3212)、そして脾臓壊死ウイルス(SNV)に基づいたパッケージング細胞株を用いる試み(Martinez and Dornburg, Virolory 208 (1995) 234-241)も為された。
【０００５】
しかしこれらの既知のパッケージング細胞株の欠点は、この様にして生産されたレトロウイルスベクターのベクターウイルス力価が非常に低く、102から最大で106コロニー形成単位(CFU)/ml細胞培養上清の範囲にあることである。
【０００６】
本発明の目的は、導入効率の高いベクターウイルスを生産することができるレトロウイルス用の安全なパッケージング細胞株を提供することである。
本発明は、ゲノム内に組み込まれた形で機能性gag、pol及びenv遺伝子を有する両種指向性レトロウイルスパッケージング細胞株であって、その遺伝子gag及びpolの発現が、env遺伝子の発現とは無関係に制御され、そしてその細胞株のゲノムが１又は２個の機能的に活性なenv遺伝子を有する前記細胞株に関する。
【０００７】
本発明の別の対象は、レトロウイルスベクターを生産するための方法であり、この方法は、当ウイルスに対して異種である１又は複数の遺伝子を有するが、機能的に活性なレトロウイルスの構造遺伝子を有さないベクターウイルス(ベクターゲノム)によって、本発明の両種指向性レトロウイルスパッケージング細胞株をトランスフェクションし、その細胞株を培養し、そしてその培養上清からレトロウイルスベクターを単離することに依る。
【０００８】
本発明の更に別の対象は、両種指向性レトロウイルスパッケージング細胞株を生産するための方法であり、この方法は、選択遺伝子を有するenvヘルパープラスミドと、選択遺伝子を有するgag/polヘルパープラスミドとを真核細胞にトランスフェクションし、その選択遺伝子に基づいてトランスフェクションされた細胞を同定し、そして単離し、そして１又は２個の機能的に活性なenv遺伝子を有する前記細胞を選択することに依る。
本発明の更に別の対象は、本発明の方法によって生産された複製不能なレトロウイルスベクターウイルスである。
【０００９】
パッケージング細胞株のゲノム内に組み込まれたenv遺伝子の数は、前記の通り生産された当ベクターウイルスの導入効率に対して決定的な影響を与えることが判明した。このことは全く驚くべきことである。なぜならMartinez and Dornburg, Virology 208 (1995) 234-241から、パッケージング細胞株におけるenvの発現程度は、その導入効率に影響しないだろうことが知られているからである。Martinez and Dornburgによって調べられたパッケージング細胞は、env発現に関して、env発現を調節する配列のプロモーター強度に関してのみ異なっている。
【００１０】
好ましい態様では、本発明のパッケージング細胞株は、２個の組込みenv遺伝子及び１個の組込みgag/pol遺伝子を有する。本発明に依れば、当パッケージング細胞株を用いることによって、レトロウイルスベクターの力価として2x106〜107又は、好ましくは少なくとも107のコロニー形成単位/ml細胞培養上清を達成し、そして／又は、好ましくは、遠心法によって３日後に測定した場合にMOLT-4細胞(ATCC CRL 1582)において少なくとも50％の導入効率を達成する。
【００１１】
gag/pol遺伝子とenv遺伝子との独立した発現の調節は、通常、gag/polとenvとの間に少なくとも１つの発現調節配列及び／又は停止シグナルを配置することによって達成される。
【００１２】
当パッケージング細胞のための出発細胞株は、例えば3T3, D17である。適当な出発ベクターは、例えばMLV, MoMuLVに基づく。この様な適当なパッケージング細胞株と出発ベクターが当業者に周知であり、例えばR. Ruger (1997) Handbuch der molekularen Medizinに記載されている。
【００１３】
本発明のパッケージング細胞として、特に細胞株HSR BM01が好ましい。この細胞株は、ブタペスト条約に従って1995年9月12日にBoehringer Mannheim GmbHによって、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Mascheroder Weg 1b, 38124 BraunschweigにNo. DSM ACC 2235として寄託された。
【００１４】
本発明の更に別の対象は、本発明の両種指向性レトロウイルスパッケージング細胞株を生産するための方法である。
分断ゲノムから成る両種指向性レトロウイルスパッケージング細胞株を、例えばMarkowiz et al., Virology 167 (1988) 400-406に記載の通りに生産することができる。このために、いわゆるｆヘルパー配列(gag, pol及びenv)をコードする２つのプラスミドを用いる。
【００１５】
本発明の細胞を選択するために、組込みenv及び組込みgag/pol遺伝子の数を決定する必要がある。これを都合良く実行するために、gag/pol配列又はenv配列内を切断しない制限酵素によってゲノムDNAを消化し、そしてgag/pol又はenvに特異的な配列を有する断片の数を決定する。
【００１６】
本発明を更に下記の実施例及び文献によって明らかにする。記載した方法は例であり、これは修飾した後でも本発明に含まれる。
【００１７】
実施例１
ヘルパープラスミドの構築
gag/polヘルパープラスミドの構築
１つのヘルパープラスミドは、モロニーマウス白血病ウイルス(MoMULV)のウイルス構造遺伝子gag/polを、例えばMoMULVの5'LTRの支配下に保持する。これらの構造遺伝子gag/polを、前記5'LTRと共に、MoMULVのプロウイルスDNAから制限消化によって得ることができる。この方法では、安全上の理由から、いわゆるパッケージング配列Ψを失活させることが重要である。これは、例えば、制限消化を利用して欠損を導入することによって達成できる。更に当ヘルパープラスミド上に選択性マーカー、例えばgpt遺伝子を有することも有益である。前記遺伝子の産物によって選択薬剤ミコフェノール酸への耐性が付与される。ミコフェノール酸耐性に基づいて、希望するプラスミド(gag/polヘルパープラスミド)を取り込んだ細胞株の迅速な選択が可能となる。対応するヘルパープラスミドを、例えばMarkowitz et al., J.Virol. 62 (1988) 1120-1124の記載通りに構築することができる。
【００１８】
envヘルパープラスミドの構築
もう１つのヘルパープラスミドは、両種指向性マウス白血病ウイルス株4070A (Chattopadhyay et al., J.Virol. 39 (1981) 777-791)のウイルス構造遺伝子envを、例えばMoMULVの5'LTRの支配下に保持する。このために、4070AのプロウイルスDNAから、env遺伝子及び3'スプライス受容部位を有する断片を単離する。この断片を、MoMULVの5'LTR及び5'スプライス供与部位を有するプラスミドに挿入する。対応するヘルパープラスミドを、Markowitz et al., Virolory 167 (1988) 400-406の記載通りに構築することができる。
【００１９】
実施例２
ヘルパー構成体の導入
gag/polヘルパープラスミドの導入
最初に例えば、NIH3T3細胞(ATCC No. CRL1658)をgag/polヘルパープラスミドによってトランスフェクションする。これは、例えばエレクトロポレーション法によって実行できる。gpt遺伝子が当gag/polプラスミド上に存在するので、トランスフェクションされた細胞を、適当な選択培地によって単離できる。適当な選択培地は、例えば、ヒポキサンチン(15μg/ml)、キサンチン(250μg/ml)及びミコフェノール酸(25μg/ml)を含む(HXM培地)。次に耐性株を、例えばMarkowitz et al., J.Virol. 62 (1988) 1120-1124の記載通りに、逆転写酵素(RT)の発現に関して調べることができる。発現が特に高い株を、次のenvヘルパープラスミドのトランスフェクションのために選択する。
【００２０】
envヘルパープラスミドの導入
次にgag/polプラスミドがトランスフェクションされた、RT活性の高いミコフェノール酸耐性株に、例えばエレクトロポレーション法によって、envヘルパープラスミドをトランスフェクションすることができる。確実にトランスフェクションされた細胞を簡単に同定するために、例えば、当ヘルパープラスミドと共に、耐性遺伝子を有する別のプラスミドを同時にトランスフェクションすることが有益である。この様なプラスミドは、例えば、ハイグロマイシン耐性を付与するプラスミド、例えばプラスミドpRSHhyg (Murphy, A.J. (1987) doctoral tesis, Columbia University, USA)でよい。例えばハイグロマイシンB 200μg/mlを含んだ適当な選択培地によって、確実にトランスフェクションされた株を簡単に選択できる。次にハイグロマイシン耐性株のenv発現を、例えばMarkowitz et al., Virolory 167 (1988) 400-406の記載通りに、抗env抗血清を用いた放射性免疫沈降法によって調べることができる。
【００２１】
実施例３
両種指向性レトロウイルスパッケージング細胞株の選択
ゲノム内に組み込まれたenvヘルパープラスミドのコピー数を、パッケージング細胞株の亜株を選択するためのパラメーターとして選択した。Martinez and Dornburg, Virology 208 (1995) 234-241には、gag/polの場合とは対照的に、より高いenvの発現は当ウイルスの力価に影響しないこと、そしてgag/pol発現がより高い株の力価は、実際の感染効率と相関するが、env発現がより高い株ではそうではないことが報告された。このことを基にして、gag/pol対envの遺伝子産物比率が、パッケージング細胞の効率にとって非常に重要であり、そしておそらく、envの発現がより低いパッケージング細胞は、導入効率がより高いウイルス上清を生産し得るという仮説を立てた。
【００２２】
組込みenv数の決定
調査した各株のゲノム内に組み込まれたenvヘルパープラスミドのコピー数を、制限消化とサザンブロット分析によって決定した。このために、種々の亜株からゲノムDNAを単離し、そして制限酵素、例えばPstIによって消化した。この酵素は、env配列を切断せず、且つ当プラスミドの全配列中１個所のみを切断する。各制限断片を生じるための対応する２番目の各切断部位は、ゲノム上にランダムに存在するので、これによって組込みenvの数を決定することができる。
【００２３】
切断したDNAをアガロースゲルで分離し、毛細管現象を利用してナイロン膜上に転写した。env特異的な配列を有する断片を、env特異的なジゴキシゲニン標識DNAプローブによって検出した。種々の数の組込みenvを有する亜株を見出した。例えば、制限酵素PstIによって切断した後に得られたバンドは、パッケージング細胞株GP+env Am12の場合、17.5kb, 13.3kb及び3.4kbであり、パッケージング細胞株HSR BM01の場合、13.3kb及び3.4kbであった。
【００２４】
実施例４
種々の数の組込みenvを有するウイルス生産細胞株の生産
ウイルス生産細胞株(生産株)を生産するために、２つ(HSR BM01)又は３つ(GP+env Am12)の組込みenvを有する各亜株に、レトロウイルス構成体pL1をトランスフェクションした。構成体pL1は、細胞質ドメインを欠失させたヒト低親和性神経成長因子受容体の短縮型(hΔLNGFR; WO95/06723と同様に作成した)をコードするDNAを、ウイルス5'LTRの支配下に保持する。hΔLNGFRのcDNAの遺伝子産物である膜タンパク質を、hΔLNGFR特異的モノクローナル抗体(mAb)によって検出できる。免疫蛍光法及びフローサイトメトリーによって、HSR BM01及びGP+env
Am12からウイルス生産株(各々HSRBM-L1及び株C11-C4)を単離した。
【００２５】
種々の数の組込みenvを有するウイルス生産細胞の上清の力価の決定
２つの株HSRBM-L1又はC11-C4から得たウイルス粒子を含む上清を用いて、指標細胞(NIH/3T3, ATCC No.CRL1658)に形質導入を行った。抗hΔLNGFRモノクローナル抗体を用いた細胞化学法によって、hΔLNGFRをコードするレトロウイルスのコロニー形成単位数(力価)を決定することができる。パッケージング細胞GP+env Am12に基づく生産株C11-C4(3envコピー)の上清の力価は、6.3x105コロニー形成単位であり、一方HSR BM01に基づく生産株HSRBM-L1(2envコピー)の上清の力価は1.25x107であった。
【００２６】
実施例５
同一のレトロウイルスベクターを含む２種類の生産細胞株の上清による種々の細胞株への形質導入
細胞株Jurkat, MOLT4, Raji及びK562を、RPMI/10%FCS中で標準的な培養条件下で培養し、そして細胞密度3-9x105細胞/mlにて形質導入を行う。同一のレトロウイルスベクターを保有する種々の生産細胞株を、DMEM/10%FCS中で標準的な培養条件下で培養する。この細胞を1x104細胞/cm2にまく。３日後に上清を捨てて、新しい培地を加える。24時間後に上清を集める。この上清を0.22μmフィルターに通して濾過する。種々の上清の力価を決定し、同量に同数のウイルス粒子が含まれる様に調整する。レトロウイルス上清の力価を、標的細胞としてNIH3T3を用いて免疫染色による滴定によって決定した。
【００２７】
形質導入
方法１：
5x105細胞を、レトロウイルス上清１ml中に再縣濁する。形質導入を24ウエルプレート上で行う。遠心(1000g, 30℃,90分)後に当細胞を洗浄し、そして新しい細胞培養液１ml中に再縣濁する。当細胞を一晩インキュベーションし、そして新しい培養液１mlを加える。形質導入後３日目に当細胞を集めて、FITC標識抗LNGFR抗体によって染色する。フローサイトメトリーによって、LNGFRを発現する細胞の割合を決定する。この方法では、ヨウ化プロピジウムの染色分析によって死細胞を排除する。フローサイトメトリー分析をFACScan装置で行う。
【００２８】
方法２：
方法２は、方法１に従って、ただし遠心せずに行った。細胞を37℃で２時間レトロウイルス上清とインキュベーションする。
表１は、方法１による形質導入後３日目の種々の細胞株のLNGFR発現を示す。
表２は、方法２による形質導入後３日目の種々の細胞株のLNGFR発現を示す。
【００２９】
0004571307.tif 000002
【００３０】
0004571307.tif 000003
【００３１】
参考文献
Bosselman  et al., Mol.Cell Biol. 7 (1987) 1797-1804
Chattopadhyay et al., J.Virol. 39 (1981) 777-791
Cone and Mulligan, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81 (1994) 6349-6353
Dougherty et al., J.Virol. 63 (1989) 3209-3212
Handbuch der molekularen Medizin, Volume I, Ed. D. Ganten and K. Ruckpaul, Springer Verlag Heidelberg 1997, R. Ruger, Chapter 2.1, 197-241
Mann et al., Cell 33 (1983) 153-156
Markowitz et al., J.Virol. 62 (1988) 1120-1124
Markowitz et al., Virolory 167 (1988) 400-406
Martinez and Dornburg, Virology 208 (1995) 234-241
Meyers et al., Arch.Virol. 119 (1991) 257-264
Miller and Buttimore, Mol.Cell Biol. 6 (1986) 2895-2902
Miller et al., Mol.Cell Biol. 5 (1985) 431-437
Murphy, A.J. (1987) Doctoral Tesis, Columbia University, USA