(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プローブポリヌクレオチドが固定化された担体を用いてポリヌクレオチド試料を分析する方法において該担体を再生する方法であって、
ターゲットポリヌクレオチドがプローブポリヌクレオチドにハイブリダイズした担体に、保湿剤を含む水性分散液を塗布する工程、および
該担体を洗浄する工程
を含み、前記保湿剤がゲル化剤および糖質からなる群から選択される少なくとも１種を含む、前記方法。
【請求項２】
担体上に固定化されたプローブポリヌクレオチドにハイブリダイズしたターゲットポリヌクレオチドを除去する方法であって、
ターゲットポリヌクレオチドがプローブポリヌクレオチドにハイブリダイズした担体に、保湿剤を含む水性分散液を塗布する工程、および
該担体を洗浄する工程
を含み、前記保湿剤がゲル化剤および糖質からなる群から選択される少なくとも１種を含む、前記方法。
【請求項３】
プローブポリヌクレオチドが固定化された担体を用いてポリヌクレオチド試料を分析する方法であって、
ａ）担体に固定化されたプローブポリヌクレオチドに、ポリヌクレオチド試料を接触させてポリヌクレオチド試料に含まれるターゲットポリヌクレオチドをプローブポリヌクレオチドにハイブリダイズさせる工程、
ｂ）未反応のポリヌクレオチドを除去する工程、
ｃ）保湿剤を含む水性分散液を担体に塗布する工程、および
ｄ）ハイブリダイゼーションに基づくシグナルを測定する工程
を含み、前記保湿剤がゲル化剤および糖質からなる群から選択される少なくとも１種を含む、前記方法。
【請求項４】
請求項３に記載のｄ）の工程の後に担体を洗浄することにより、担体を再生する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プローブポリヌクレオチドが固定化された担体の再生方法、ならびにそのための試薬およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
多種多様な生物の遺伝子構造を明らかにするのみならず、その遺伝子機能をゲノムスケールで解明しようとする試みが行われつつあり、遺伝子機能を効率的に解析するための技術開発も急速に進んでいる。マイクロアレイは、スライドガラス等の基板にＤＮＡなどのポリヌクレオチドを所定の領域毎に多数整列固定させた高密度のアレイであり、核酸の塩基配列の決定、並びに遺伝子の発現、変異、多型性などの同時解析に非常に有用である。このマイクロアレイを用いた遺伝子情報の解析は、創薬研究、疾病の診断や予防法の開発などに極めて有用であるため、マイクロアレイの作製技術および得られたデータの解析システムにより一層の開発が望まれている。
【０００３】
マイクロアレイを用いた検出に際しては、まず担体表面に高密度に整列したプローブポリヌクレオチドに対して、放射性同位体や蛍光色素で標識したポリヌクレオチド試料をハイブリダイズさせる。このとき、ターゲットポリヌクレオチド試料中の、プローブポリヌクレオチドと相補的な塩基配列をもつ分子は、プローブポリヌクレオチドと相補的にハイブリダイズする。次いで、このハイブリダイズしているターゲットポリヌクレオチド分子上の標識に由来するシグナルを測定し、ハイブリダイズされたプローブポリヌクレオチドを同定する。具体的には、ＲＩや蛍光イメージスキャナーでマイクロアレイ上の放射線強度または蛍光強度を測定し、そして得られた画像データを解析処理する。従って、マイクロアレイによれば、数千〜数万個の分子を同時にハイブリダイズさせて検出することができ、微量の試料で短時間のうちに大量の遺伝子情報を得ることができる。
【０００４】
マイクロアレイにおいてプローブポリヌクレオチドを高密度かつ強固に固定化するため、例えば、担体表面に、ポリヌクレオチドと共有結合を形成する活性エステル基等の反応活性基を導入して、プローブポリヌクレオチドを共有結合を介して固定化させること（特許文献１〜３参照）などが報告されている。
【０００５】
マイクロアレイは高価であることから、ターゲットポリヌクレオチドをハイブリダイズさせて分析した後、ハイブリダイズしたポリヌクレオチドを除去して再生し、再利用することが望まれる。しかし、プローブポリヌクレオチドに一度ハイブリダイズしたポリヌクレオチドを完全に除去することは困難であり、従ってマイクロアレイの再利用は実質的に不可能であった。
【０００６】
【特許文献１】ＷＯ ００／２２１０８
【特許文献２】ＷＯ ０１／７５４４７
【特許文献３】ＷＯ ０２／１２８９１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、プローブポリヌクレオチドが固定化された担体を分析に使用した後、プローブポリヌクレオチドにハイブリダイズしたターゲットポリヌクレオチドを除去して、再生する手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題を解決するために検討を行った結果、プローブポリヌクレオチドが固定化された担体にポリヌクレオチド試料を接触させてターゲットポリヌクレオチドをハイブリダイズさせ、未反応のポリヌクレオチドを除去した後、保湿剤、好ましくはゲル化剤および糖質からなる群から選択される少なくとも１種を含む水性分散液を担体に塗布することにより、その後の担体洗浄工程においてターゲットポリヌクレオチドが効率的に除去されることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）プローブポリヌクレオチドが固定化された担体を用いてポリヌクレオチド試料を分析する方法において該担体を再生する方法であって、
ターゲットポリヌクレオチドがプローブポリヌクレオチドにハイブリダイズした担体に、保湿剤を含む水性分散液を塗布する工程、および
該担体を洗浄する工程
を含む、前記方法。
（２）保湿剤がゲル化剤および糖質からなる群から選択される少なくとも１種である、（１）記載の方法。
（３）担体上に固定化されたプローブポリヌクレオチドにハイブリダイズしたターゲットポリヌクレオチドを除去する方法であって、
ターゲットポリヌクレオチドがプローブポリヌクレオチドにハイブリダイズした担体に、保湿剤を含む水性分散液を塗布する工程、および
該担体を洗浄する工程を含む、前記方法。
（４）保湿剤がゲル化剤および糖質からなる群から選択される少なくとも１種である、（３）記載の方法。
【００１０】
（５）プローブポリヌクレオチドが固定化された担体を用いてポリヌクレオチド試料を分析する方法であって、
ａ）担体に固定化されたプローブポリヌクレオチドに、ポリヌクレオチド試料を接触させてポリヌクレオチド試料に含まれるターゲットポリヌクレオチドをプローブポリヌクレオチドにハイブリダイズさせる工程、
ｂ）未反応のポリヌクレオチドを除去する工程、
ｃ）保湿剤を含む水性分散液を担体に塗布する工程、および
ｄ）ハイブリダイゼーションに基づくシグナルを測定する工程
を含む前記方法。
（６）保湿剤がゲル化剤および糖質からなる群から選択される少なくとも１種である、（５）記載の方法。
（７）（５）または（６）に記載のｄ）の工程の後に担体を洗浄することにより、担体を再生する方法。
（８）プローブポリヌクレオチドが固定化された担体を用いてポリヌクレオチド試料を分析する方法において担体の再生を促進するための試薬であって、保湿剤を含む水性分散液からなる前記試薬。
（９）保湿剤がゲル化剤および糖質からなる群から選択される少なくとも１種である、（８）記載の試薬。
（１０）担体に固定化されたプローブポリヌクレオチドにポリヌクレオチド試料を接触させ、ポリヌクレオチド試料に含まれるターゲットポリヌクレオチドをプローブポリヌクレオチドにハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーションに基づくシグナルを測定することによりポリヌクレオチド試料を分析するためのキットであって、（８）または（９）に記載の試薬を含む前記キット。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、プローブポリヌクレオチドが固定化された担体を用いて分析を行った後、該担体を再生して再利用することが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
一実施形態において本発明は、プローブポリヌクレオチドが固定化された担体を用いてポリヌクレオチド試料を分析する方法において該担体を再生する方法であって、
ターゲットポリヌクレオチドがプローブポリヌクレオチドにハイブリダイズした担体を、保湿剤、好ましくはゲル化剤および糖質からなる群から選択される少なくとも１種を含む水性分散液を塗布する工程、および該担体を洗浄する工程を含む、前記方法に関する。
【００１３】
本発明において担体、すなわちプローブポリヌクレオチドが固定化された担体を再生するとは、担体上に固定化されたプローブポリヌクレオチドにハイブリダイズしたターゲットポリヌクレオチドを除去することをさす。これにより担体を再度分析に使用することができる。
【００１４】
従って一実施形態において、本発明は、担体上に固定化されたプローブポリヌクレオチドにハイブリダイズしたターゲットポリヌクレオチドを除去する方法であって、
ターゲットポリヌクレオチドがプローブポリヌクレオチドにハイブリダイズした担体を、保湿剤、好ましくはゲル化剤および糖質からなる群から選択される少なくとも１種を含む水性分散液を塗布する工程、および該担体を洗浄する工程を含む、前記方法に関する。
【００１５】
換言すれば本発明は、担体上に固定化されたプローブポリヌクレオチドにハイブリダイズしたターゲットポリヌクレオチドの除去を促進する方法であって、
ターゲットポリヌクレオチドがプローブポリヌクレオチドにハイブリダイズした担体を、保湿剤、好ましくはゲル化剤および糖質からなる群から選択される少なくとも１種を含む水性分散液を塗布する工程を含む、前記方法に関する。
【００１６】
本明細書においてポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチドも包含され、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む核酸、ならびに核酸誘導体も包含される。ＤＮＡには、一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡが包含される。核酸誘導体の例としては、リン酸ジエステル部位を修飾した人工核酸；フラノース部位のグリコシル結合やヒドロキシル基を修飾した人工核酸；核酸塩基部位を修飾した人工核酸；および糖・リン酸骨格以外の構造を利用した人工核酸などが挙げられ、より具体的には、リン酸部位の酸素原子を硫黄原子で置換したホスホロチオエート型、ホスホロジチオエート型、ホスホロジアミデート型、メチルホスホネート型またはメチルホスホノチオエート型の人工核酸；フラノース環上の置換基修飾型、糖環骨格が１炭素増炭したピラノース型、または多環式糖骨格型の人工核酸；ピリミジンＣ−５位修飾塩基型、プリンＣ−７位修飾塩基型、または環拡張修飾塩基型の人工核酸などが挙げられる。ならびにそれらに標識が付加されたもの、また、担体に固定化するために反応性の官能基が付加されたものも包含される。
【００１７】
本明細書においてプローブポリヌクレオチドは、当技術分野で通常用いられる意味を有し、目的遺伝子を検出するために用いられるポリヌクレオチドであって、目的遺伝子に対応するポリヌクレオチドまたはその断片と特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドをさす。プローブポリヌクレオチドとしては、通常、合成オリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ、それらの断片、ならびにそれらを変性させたもの（例えば、一本鎖を二本鎖に変性させたもの）等が用いられる。プローブポリヌクレオチドは、通常２０〜５０００塩基長、好ましくは２０〜１５００塩基長を有する。
【００１８】
本明細書においてターゲットポリヌクレオチドは、当技術分野で通常用いられる意味を有し、検出対象であるポリヌクレオチドをさす。ターゲットは標的と称される場合もある。通常、プローブにハイブリダイズさせる被検試料由来のポリヌクレオチドおよびそれを基にして酵素的に合成されたポリヌクレオチド、具体的には、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ａＲＮＡ、それらの断片、ならびにそれらを変性させたもの等が用いられる。
【００１９】
ハイブリダイズまたはハイブリダイゼーションは、当技術分野で通常用いられる意味を有し、相補的な配列を持つポリヌクレオチド同士、例えば、一本鎖のＤＮＡ同士、一本鎖のＲＮＡ同士、または一本鎖のＤＮＡと一本鎖のＲＮＡが適切な条件下で二本鎖を形成することをいう。
【００２０】
プローブポリヌクレオチドが固定化された担体を用いてポリヌクレオチド試料を分析する方法は、当技術分野で慣用の分析方法をさし、通常、以下の工程によって実施される：
担体に固定化されたプローブポリヌクレオチドに、ポリヌクレオチド試料を接触させてポリヌクレオチド試料に含まれるターゲットポリヌクレオチドをプローブポリヌクレオチドにハイブリダイズさせる工程、未反応のポリヌクレオチドを除去する工程、ハイブリダイゼーションに基づくシグナルを測定する工程。
【００２１】
ポリヌクレオチド試料は、担体上に固定化されたプローブポリヌクレオチドにハイブリダイズするターゲットポリヌクレオチドを含みうる試料であれば特に制限されない。例えば、血液、血清、尿、涙、細胞、器官、組織、骨、骨髄、リンパ、リンパ節、滑液組織、軟骨細胞、滑液マクロファージ、内皮細胞、皮膚、これらの抽出物および破砕物、ならびに培養細胞、胚細胞、幹細胞、動物細胞抽出物、植物抽出物、原核細胞抽出物および真核単細胞抽出物等の生物学的試料が挙げられる。ポリヌクレオチド試料には、上記の生物学的試料に由来する試料、例えば、特定の核酸が増幅された試料等も包含される。通常、ポリヌクレオチド試料として、含まれるポリヌクレオチドが標識されたものを用いることにより、ハイブリダイゼーションを検出する。上記生物学的試料およびこれに由来する試料を、ＳＳＣ（saline-sodium citrate）などの水性媒体に溶解または分散することにより、ポリヌクレオチド試料（以下、ハイブリダイゼーション溶液と称する場合もある）を調製することができる。
【００２２】
ハイブリダイゼーションに基づくシグナルを測定するとは、換言すれば、プローブポリヌクレオチドとターゲットポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを示すシグナル、通常、標識に基づくシグナルを測定することをさし、得られるシグナルおよびその強度は、検出方法、標識方法や標識の種類によって異なる。
【００２３】
標識方法や標識の種類は、プローブポリヌクレオチドとターゲットポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを検出できるものであれば特に制限されず、当技術分野で公知である。例えば、ターゲットポリヌクレオチドを合成または増幅する際に放射能標識や蛍光標識などの標識を共有結合させた基質（主にＵＴＰ）を取り込ませ、その標識によって、ハイブリダイゼーションを検出することができる。標識としては、当技術分野で通常用いられるもの、例えば、放射能標識、蛍光標識、化学ルミネッサー、ルミネッサーおよび感光剤等を使用することもできる。蛍光標識としては、Ｃｙ３およびＣｙ５などのＣｙＤｙｅ、ＦＩＴＣ、ＲＩＴＣ、ローダミン、テキサスレッド、ＴＥＴ、ＴＡＭＲＡ、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＲＯＸなどが挙げられ、放射能標識としては、α−３２Ｐ、γ−３２Ｐ、３５Ｓなどが挙げられる。さらに、酵素、酵素断片、酵素阻害剤、抗体、触媒等を結合させてもよい。
【００２４】
例えば、標識として蛍光標識を用いた場合は、蛍光シグナルを好適な検出器により検出する。検出器としては、例えば蛍光レーザー顕微鏡、冷却ＣＣＤカメラおよびコンピュータを連結した蛍光スキャニング装置が用いられ、担体上の蛍光強度を自動的に測定することができる。ＣＣＤカメラの代わりに共焦点型または非焦点型のレーザーを用いてもよい。これにより、画像データが得られる。得られたデータから、担体上に固定化されたプローブポリヌクレオチドに対して相補性を有するターゲットポリヌクレオチドを同定することができ、これに基づいて遺伝子発現プロファイルを作成したり、ポリヌクレオチド試料の塩基配列を決定することもできる。
【００２５】
ターゲットポリヌクレオチドのプローブポリヌクレオチドへのハイブリダイゼーションは、プローブポリヌクレオチドを固定化した担体上に、上記ポリヌクレオチド試料をスポッティングした後インキュベートすることにより実施できる。例えば、スポッティングは、９６穴または３８４穴等のプラスチックプレートに試料を分注し、スポット装置を用いて滴下することにより実施できる。インキュベーションは、室温〜１００℃の範囲の温度で、１〜２４時間の範囲の時間で実施することが好ましい。
【００２６】
ハイブリダイゼーション終了後、未反応のポリヌクレオチドを除去することが好ましい。例えば、界面活性剤の溶液と緩衝液との混合溶液を用いて洗浄を行い、未反応のポリヌクレオチドを除去することができる。界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いることが好ましい。緩衝液としては、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液、またはグッド緩衝液等を用いることができるが、クエン酸緩衝液を用いることが好ましい。
【００２７】
本発明の担体の再生方法は、上記のような分析方法において、ターゲットポリヌクレオチドがプローブポリヌクレオチドにハイブリダイズした担体に、保湿剤、好ましくはゲル化剤および糖質からなる群から選択される少なくとも１種を含む水性分散液を塗布する工程を含むことを特徴とする。上記工程は、ハイブリダイゼーション反応後に実施する。好ましくは、ハイブリダイゼーション終了後、未反応のポリヌクレオチドを除去した後、シグナルを測定する前に実施するのが好ましい。
【００２８】
本発明者らは、保湿剤の少なくとも１種、好ましくはゲル化剤および糖質からなる群から選択される少なくとも１種を含む水性分散液を担体に塗布することにより、分析終了後の担体の再生工程において、プローブポリヌクレオチドにハイブリダイズしたターゲットポリヌクレオチドの除去が促進されることを見出した。従って上記水性分散液は、プローブポリヌクレオチドが固定化された担体を用いてポリヌクレオチド試料を分析する方法において担体の再生を促進するための試薬として使用できる。
【００２９】
上記水性分散液は、水を主成分とする溶媒に保湿剤の少なくとも１種、好ましくはゲル化剤および糖質からなる群から選択される少なくとも１種を分散または溶解することにより調製しうる。本発明において、水性分散液には水溶液も含まれる。溶媒として、水を７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上含むものを用いる。溶媒として、好ましくは純水、より好ましくは超純水を用いる。本発明の水性分散液は、保湿剤を飽和濃度以下で使用する。
【００３０】
本明細書において保湿剤は、ある物質もしくは組織に対して、接触、浸透または結合することなどにより、物質もしくは組織に対して水分を与える効果を有する物質、または水分を保持する効果を有する物質と定義され、ゲル化剤および糖質が包含される。具体的には、グリセリン、キシリトール（キシリット）、ジグリセリン 、ジプロピレングリコール（ＤＰＧ）、ソルビトール（ソルビット）、ＤＬ−ピロリドンカルボン酸ナトリウム、３−メチル−１，３−ブタンジオール、１、３−ブチレングリコール（１、３ＢＧ）、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール（カーボワックス）、ポリグリセリンなどの多価アルコール、混合異性化糖、アミノ酸、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−アスパラキン酸ナトリウム、ＤＬ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−リジン塩酸塩、Ｌ−グリシン（アミノ酢酸）、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン酸ナトリウム、γ−アミノ酪酸（ピぺリジン酸）、Ｌ−スレオニン、Ｌ−セリン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−バリン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−ヒスチジン塩酸塩、Ｌ−ヒドロキシプロリン（Ｌ−オキシプロリン）、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−メチオニン、ＤＬ−ピロリドンカルボン酸（ＰＣＡ）、ＤＬ−ピロリドンカルボン酸ナトリウム液（ＰＣＡソーダ）、乳酸、乳酸ナトリウム（液）、尿素、尿酸、酸性ムコ多糖類、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸ナトリウム、コンドロイチン硫酸ナトリウム、グルクロン酸、コラーゲン、可溶性コラーゲン（水溶性コラーゲン）、コラーゲン加水分解物（加水分解コラーゲン）、加水分解コラーゲン液、加水分解コラーゲン末、加水分解コラーゲンエチル、加水分解コラーゲンヘキサデシル、コラーゲンアミノ酸、アテロコラーゲン、ゼラチン、加水分解ゼラチン末、エラスチン、水溶性エラスチン、加水分解エラスチン（エラスチン加水分解物）、細胞間脂質、スフィンゴ脂質（セラミド）、ケラチン、加水分解ケラチン、ケラチンアミノ酸、核酸、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、グアノシン、グアニン、リン酸、ＡＴＰ（アデノシン三リン酸）、リン酸リボフラビンナトリウム、リン脂質、レシチンなどの生体系保湿成分、アルブミン（乾燥脱糖卵白）、血清アルブミン、脱脂粉乳、ホエ一（乳清、乳酸菌発酵液）、乳糖、カゼイン、牛乳糖たんぱく、ラクトフェリン、加水分解シルク、シルクアミノ酸、シルク抽出液、シルクパウダー、セリシン、加水分解コンキオリン液（真珠たんぱく描出液）、コンキオリンパウダー、キチン、キトサン、グルコサミン（キトサミン）、ローヤルゼリー、ハチミツ、ブドウ糖（グルコース）、大豆たんぱく質、大豆たんぱく加水分解物、大豆リン脂質（大豆レシチン）、大豆リゾリン脂質（リゾレシチン）、卵黄レシチン（卵黄リン脂質）、納豆エキス（大豆発酵代謝液）、アルファヒドロキシ酸（ＡＨＡ）、グリコール酸、リンゴ酸、海藻エキス、褐藻エキス、含硫ケイ酸アルミニウム（マリンクレイ）、塩化マグネシウム、マリンコラーゲン、酵母エキス、乾燥酵母、プルラン、サルファキニン、トレハロースなど動植物性成分からなる保湿成分があげられる。
【００３１】
本明細書においてゲル化剤は、１０〜９０℃程度で固体から液体への相変化が、その物質自体もしくはその物質と溶媒の混合物において認められる物質であれば特に制限されない。ゲル化剤は通常その物質自体もしくはその物質と溶媒の混合物において保湿効果を有する。具体的には、ゼラチン、コラーゲン、寒天、カラギーナン、ペクチン、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、マンナン、コンニャク、コンニャクマンナン、グルコマンナン、キトサン、キサンタンガム、タマリンド種子多糖類、ジェランガム、カラヤガム、アカシアガム、プルラン、カードラン、キシログルカン、グアーガム、アラビアガム、ローカストビーンガム、カルボキシメチルセルロース多価金属塩、ＤＰＰＣ（Dipalmitoyl phosphatidylcholine）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（ε−カプロラクトン）などが挙げられる。ゲル化剤は、単一で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。例えばゲル化剤がゼラチンであれば、本発明の水性分散液は、０．０５％（Ｗ／Ｖ）以上３．０％（Ｗ／Ｖ）以下、好ましくは０．５％（Ｗ／Ｖ）以上２．０％（Ｗ／Ｖ）以下、より好ましくは１．０％（Ｗ／Ｖ）以上１．５％（Ｗ／Ｖ）以下のゲル化剤を含む。
【００３２】
本明細書において糖質には、単糖、オリゴ糖（二糖、三糖および四糖など）および多糖、ならびにこれらの還元誘導体（糖アルコール、デオキシ糖、グリカール）、アルキル化誘導体（アルキル化糖）、硫酸化誘導体（硫酸化糖）、酸化誘導体（アルドン酸、ウロン酸、アルダル酸など）および脱水誘導体(グリコセエン、アンヒドロ糖など）が包含される。糖質は通常その物質自体もしくはその物質と溶媒の混合物において保湿効果を有する。糖質としては、好ましくは水溶性のものを用いる。また、室温で緩徐に溶媒中に溶解する性質を有するものが好ましい。糖質の具体例としては、グルコース、ガラクトース、マンノース、アラビノース、リボース、フルクトース、キシロース、ソルボースなどの単糖、α,α-トレハロース(トレハロース)、アルキル化トレハロース、硫酸化トレハロース、β,β-トレハロース (イソトレハロース) 、α,β-トレハロース (ネオトレハロース) 、トレハロサミン、コウジビオース、ニゲロース、マルトース、マルチトール、マルツロース、イソマルトース、イソマルツロース(パラチノース)、ソホロース、ラミナラビオース、セロビオース、ゲンチオビオース、ガラクトスクロース、ラクトース、ラクトサミン、ラクトースジアミン、ラクトビオン酸、ラクチトール、ラクツロース、メリビオース、ネオラクトース、プリメベロース、ルチノース、シラビオース、スクラロース、スクロース(サッカロース)、ツラノース、ビシアノース、セロトリオース、カコトリオース、ゲンチアノース、イソマルトトリオース、イソパノース、マルトトリオース、マンニノトリオース、メレジトース、パノース、プランテオース、ラフィノース、ソラトリオース、ウンベリフェロース、リコテトラオース、マルトテトラオース、スタキオース、マルトペンタオース、ベルバスコース、マルトヘキサオース、α-シクロデキストリン(α-ＣＤ)、β-シクロデキストリン(β-ＣＤ)、γ-シクロデキストリン(γ-ＣＤ)、δ-シクロデキストリン(シクロマルトノナオース)などのオリゴ糖およびそれらの誘導体、澱粉加水分解物およびデキストランなどの多糖、ならびにエチレングリコール、ジエチレングリコール、ポリエチレングリコール、ジプロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、グリセリン、ジグリセリン、ポリグリセリン、１，３―ブチレングリコール、エリトリトール、ペンチトール、ヘキシトール、キシリトール、ソルビトールおよびマンニトールなどの糖アルコールなどが挙げられる。糖質は、単一で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。例えば糖質がトレハロースであれば、本発明の水性分散液は、０．１％（Ｗ／Ｖ）以上３０％（Ｗ／Ｖ）以下、好ましくは１．０％（Ｗ／Ｖ）以上２５％（Ｗ／Ｖ）以下、より好ましくは５％（Ｗ／Ｖ）以上２０％（Ｗ／Ｖ）以下の糖質を含む。
【００３３】
本発明の水性分散液は、保湿剤の１種、好ましくはゲル化剤と糖質のうちのいずれか１つを含んでいてもよいし、複数のものを含んでいてもよい。本発明において水性分散液は、保湿剤以外の成分、例えば、緩衝剤や界面活性剤などを適宜含んでいてもよい。
【００３４】
上記水性分散液を担体に塗布する方法は、プローブポリヌクレオチドが固定化された表面の全体に水性分散液を塗布できる方法であれば特に制限されない。例えば、担体を水性分散液に浸漬することにより塗布してもよい。その場合、浸漬した後、担体を遠心処理に付すことにより、水性分散液を担体表面に均一に塗布することができる。水性分散液を担体表面に滴下または噴霧することにより塗布してもよい。
【００３５】
上記水性分散液を担体に塗布する方法は、プローブポリヌクレオチドが固定化された表面の全体に水性分散液を塗布できる方法で、担体表面に水分を保持させる方法であれば特に制限されない。
【００３６】
上記水性分散液を塗布した担体についてハイブリダイゼーションに基づくシグナルを測定してポリヌクレオチド試料を分析した後、担体を洗浄することにより、担体を再生すること、すなわちプローブポリヌクレオチドにハイブリダイズしたポリヌクレオチドを除去することができる。この洗浄工程における条件は、使用した水性分散液の種類に基づき、適宜設定することができる。通常、水性洗浄液を用いて洗浄を行う。水性洗浄液は、水を主成分とする洗浄液をさし、界面活性剤や緩衝剤などを含んでいてもよい。水性洗浄液として、好ましくは超純水を用いる。具体的には、沸点以下、好ましくは３０℃以上１００℃以下、より好ましくは６０℃以上１００℃以下の水性洗浄液を用いることで洗浄することができる。
【００３７】
洗浄時間は、ハイブリダイゼーションに基づくシグナルを測定する工程により、適宜、設定することができる。また、ハイブリダイゼーションに基づくシグナルは通常、標識に基づくシグナルを測定することをさし、シグナルを測定する工程は、プローブポリヌクレオチドとターゲットポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを検出できるものであれば特に制限されない。
【００３８】
換言すれば本発明はまた、プローブポリヌクレオチドが固定化された担体を用いてポリヌクレオチド試料を分析する方法であって、
ａ）担体に固定化されたプローブポリヌクレオチドに、ポリヌクレオチド試料を接触させてポリヌクレオチド試料に含まれるターゲットポリヌクレオチドをプローブポリヌクレオチドにハイブリダイズさせる工程、
ｂ）未反応のポリヌクレオチドを除去する工程、
ｃ）保湿剤の少なくとも１種、好ましくはゲル化剤および糖質からなる群から選択される少なくとも１種を含む水性分散液を担体に塗布する工程、および
ｄ）ハイブリダイゼーションに基づくシグナルを測定する工程
を含む前記方法に関する。ポリヌクレオチド試料を分析する方法においてｃ）の工程を実施することにより、分析後に洗浄することにより担体を容易に再生することができる。
【００３９】
プローブポリヌクレオチドを固定化するための担体としては、当技術分野で通常用いられるものを使用でき、その形状や材料は特に制限されない。例えば、マイクロアレイ等の平板状のもの、ビーズ等の粒子状のもの、および糸状のものが挙げられるが、好ましくはマイクロアレイ等の平板状のものを用いる。材料としては、例えば、例えば、金、銀、銅、アルミニウム、タングステン、モリブデン、クロム、白金、チタン、ニッケル等の金属；ステンレス、ハステロイ、インコネル、モネル、ジュラルミン等の合金；上記金属とセラミックスとの積層体；シリコン；ガラス、石英ガラス、溶融石英、合成石英、アルミナ、サファイア、セラミクス、フォルステライトおよび感光性ガラス等のガラス材料；プラスチック（例えば、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ＡＢＳ樹脂(Acrylonitrile Butadiene Styrene 樹脂)、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂）が挙げられる。
【００４０】
本発明においては、担体として、基板上にポリヌクレオチドを静電的に引き寄せるための静電層、およびポリヌクレオチドと共有結合しうる官能基を有するものが好ましく用いられる。ここで基板の材料としては、特に制限されないが、上記の材料が挙げられる。基板の形状およびサイズは特に限定されないが、形状としては、平板状、糸状、球状、多角形状、粉末状などが挙げられ、サイズは、平板状のものを用いる場合、通常は、幅０．１〜１００ｍｍ、長さ０．１〜１００ｍｍ、厚み０．０１〜１０ｍｍ程度である。
【００４１】
基板には、表面処理を施してもよい。表面処理には、合成ダイヤモンド、高圧合成ダイヤモンド、天然ダイヤモンド、軟ダイヤモンド（例えば、ダイヤモンドライクカーボン）、アモルファスカーボン、炭素系物質（例えば、グラファイト、フラーレン、カーボンナノチューブ）のいずれか、それらの混合物、またはそれらを積層させたものを用いることが好ましい。また、炭化ハフニウム、炭化ニオブ、炭化珪素、炭化タンタル、炭化トリウム、炭化チタン、炭化ウラン、炭化タングステン、炭化ジルコニウム、炭化モリブデン、炭化クロム、炭化バナジウム等の炭化物を用いてもよい。ここで、軟ダイヤモンドとは、いわゆるダイヤモンドライクカーボン（ＤＬＣ：Diamond Like Carbon）等の、ダイヤモンドとカーボンとの混合体である不完全ダイヤモンド構造体を総称し、その混合割合は、特に限定されない。表面処理層の厚みは、１ｎｍ〜１００μｍであることが好ましい。
【００４２】
表面処理された基板の一例としては、スライドガラスに軟ダイヤモンドを製膜した基板が挙げられる。このような基板は、ダイヤモンドライクカーボンが、水素ガス０〜９９体積％、残りメタンガス１００〜１体積％を含んだ混合ガス中で、イオン化蒸着法により作成したものであることが好ましい。
【００４３】
基板の表面処理層の形成は、公知の方法、例えば、マイクロ波プラズマＣＶＤ(Chemical Vapor Deposit)法、ＥＣＲＣＶＤ(Electric Cyclotron Resonance Chemical Vapor Deposit)法、ＩＣＰ(Inductive Coupled Plasma)法、直流スパッタリング法、ＥＣＲ(Electric Cyclotron Resonance)スパッタリング法、イオンプレーティング法、アークイオンプレーティング法、ＥＢ(Electron Beam)蒸着法、抵抗加熱蒸着法、イオン化蒸着法、アーク蒸着法、レーザ蒸着法などにより行うことができる。
【００４４】
本発明の担体には、ポリヌクレオチドを静電的に引き寄せるために静電層が設けられていることが好ましい。静電層としては、ポリヌクレオチドを静電的に引き寄せ、ポリヌクレオチドの固定化量を向上させるものであれば、特に制限はないが、例えば、アミノ基含有化合物など正荷電を有する化合物を用いて形成することができる。
【００４５】
前記アミノ基含有化合物としては、非置換のアミノ基（−ＮＨ２）、または炭素数１〜６のアルキル基等で一置換されたアミノ基（−ＮＨＲ；Ｒは置換基）を有する化合物、例えばエチレンジアミン、ヘキサメチレンジアミン、ｎ−プロピルアミン、モノメチルアミン、ジメチルアミン、モノエチルアミン、ジエチルアミン、アリルアミン、アミノアゾベンゼン、アミノアルコール（例えば、エタノールアミン）、アクリノール、アミノ安息香酸、アミノアントラキノン、アミノ酸（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、プロリン、シスチン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、アニリン、またはこれらの重合体（例えば、ポリアリルアミン、ポリリシン）や共重合体；４,４’,４”-トリアミノトリフェニルメタン、トリアムテレン、スペルミジン、スペルミン、プトレシンなどのポリアミン（多価アミン）が挙げられる。
【００４６】
静電層は、基板または表面処理層と共有結合させずに形成してもよく、基板または表面処理層と共有結合させて形成してもよい。
【００４７】
静電層を基板または表面処理層と共有結合させずに形成する場合には、例えば、表面処理層を製膜する際に前記アミノ基含有化合物を製膜装置内に導入することによって、アミノ基を含有する炭素系皮膜を製膜する。製膜装置内に導入する化合物として、アンモニアガスを用いてもよい。また、表面処理層は、密着層を形成した後にアミノ基を含有する皮膜を形成するといった、複層であってもよく、この場合もアンモニアガスを含んだ雰囲気で行ってもよい。
【００４８】
また、静電層を基板または表面処理層と共有結合させずに形成する場合には、静電層と基板または表面処理層との親和性、即ち密着性を高める点で、基板上に、前記の非置換または一置換されたアミノ基を有する化合物および炭素化合物を蒸着させた後、ポリヌクレオチドと共有結合しうる官能基を導入することが好ましい。ここで用いる炭素化合物としては、気体として供給することができれば特に制限はないが、例えば常温で気体であるメタン、エタン、プロパンが好ましい。蒸着の方法としては、イオン化蒸着法が好ましく、イオン化蒸着法の条件としては、作動圧が０．１〜５０Ｐａ、そして加速電圧が２００〜１０００Ｖの範囲であることが好ましい。
【００４９】
静電層を基板または表面処理層と共有結合させて形成する場合には、例えば、基板または表面処理層を施した基板に、塩素ガス中で紫外線照射して表面を塩素化し、次いで前記アミノ基含有化合物のうち、例えば、ポリアリルアミン、ポリリシン、４,４',４''-トリアミノトリフェニルメタン、トリアムテレン等の多価アミンを反応させて、基板と結合していない側の末端にアミノ基を導入することにより、静電層を形成することができる。基板表面を塩素化した後、アンモニアガス中でＵＶ照射することにより、アミノ基を導入してもよい。
【００５０】
また、静電層が施された基板にポリヌクレオチドと共有結合しうる官能基を導入する反応（例えば、ジカルボン酸または多価カルボン酸を用いるカルボキシル基の導入）を溶液中で行う場合には、基板を、前記の非置換または一置換されたアミノ基を有する化合物を含有する溶液中に浸漬した後、ポリヌクレオチドと共有結合しうる官能基を導入することが好ましい。前記溶液の溶媒としては、例えば水、Ｎ−メチルピロリドン、エタノールが挙げられる。
【００５１】
静電層が施された基板に、ジカルボン酸または多価カルボン酸を用いてカルボキシル基を導入する場合には、予めＮ−ヒドロキシスクシンイミドおよび／またはカルボジイミド類で活性化させたり、あるいは、反応をＮ−ヒドロキシスクシンイミドおよび／またはカルボジイミド類の存在下に行うことが好ましい。
【００５２】
基板を、非置換または一置換されたアミノ基を有する化合物を含有する溶液中に浸漬することにより、静電層を形成する場合に、アミノ基含有化合物としてポリアリルアミンを用いると、基板との密着性に優れ、ポリヌクレオチドの固定化量がより向上する。
【００５３】
静電層の厚みは、１ｎｍ〜５００μｍであることが好ましい。
前記のようにして、静電層を施した基板表面には、ポリヌクレオチドと共有結合しうる官能基を導入するため、化学修飾を施すことが好ましい。
【００５４】
前記官能基としては、例えばカルボキシル基、活性エステル基、ハロホルミル基、水酸基、シアノ基、ニトロ基、チオール基、アミノ基が挙げられる。
【００５５】
官能基としてカルボキシル基を導入するために用いられる化合物としては、例えば、式：Ｘ−Ｒ１−ＣＯＯＨ（式中、Ｘはハロゲン原子、Ｒ１は炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示されるハロカルボン酸、例えばクロロ酢酸、フルオロ酢酸、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、２−クロロプロピオン酸、３−クロロプロピオン酸、３−クロロアクリル酸、４−クロロ安息香酸；式：ＨＯＯＣ−Ｒ２−ＣＯＯＨ（式中、Ｒ２は単結合または炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示されるジカルボン酸、例えばシュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸；ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、トリメリット酸、ブタンテトラカルボン酸などの多価カルボン酸；式：Ｒ３−ＣＯ−Ｒ４−ＣＯＯＨ（式中、Ｒ３は水素原子または炭素数１〜１２の２価の炭化水素基、Ｒ４は炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示されるケト酸またはアルデヒド酸；式：Ｘ−ＯＣ−Ｒ５−ＣＯＯＨ（式中、Ｘはハロゲン原子、Ｒ５は単結合または炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示されるジカルボン酸のモノハライド、例えばコハク酸モノクロリド、マロン酸モノクロリド；無水フタル酸、無水コハク酸、無水シュウ酸、無水マレイン酸、無水ブタンテトラカルボン酸などの酸無水物が挙げられる。
【００５６】
活性エステル基は、エステル基のアルコール側に酸性度の高い電子求引性基を有して求核反応を活性化するエステル群、すなわち反応活性の高いエステル基を意味するものとして、各種の化学合成、たとえば高分子化学、ペプチド合成等の分野で慣用されているものである。
【００５７】
実際的には、エステル基のアルコール側に、電子求引性の基を有し、アルキルエステルよりも活性化されたエステル基である。さらに具体的には、フェノールエステル類、チオフェノールエステル類、Ｎ−ヒドロキシアミンエステル類、シアノメチルエステル、複素環ヒドロキシ化合物のエステル類等がアルキルエステル等に比べてはるかに高い活性を有する活性エステル基として知られている。活性エステル基としては、具体的にはｐ−ニトロフェニル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基、コハク酸イミド基、フタル酸イミド基、５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド基等が挙げられる。
【００５８】
例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基は、前記のようにして導入されたカルボキシル基に、シアナミドやカルボジイミド（例えば、１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド）などの脱水縮合剤とＮ−ヒドロキシスクシンイミドなどの化合物を反応させることにより生成することができる。
【００５９】
官能基としてハロホルミル基を導入するために用いられる化合物としては、例えば、式：Ｘ−ＯＣ−Ｒ６−ＣＯ−Ｘ（式中、Ｘはハロゲン原子、Ｒ６は単結合または炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示されるジカルボン酸のジハライド、例えばコハク酸クロリド、マロン酸クロリドが挙げられる。
【００６０】
官能基として水酸基を導入するために用いられる化合物としては、例えば、式：ＨＯ−Ｒ７−ＣＯＯＨ（式中、Ｒ７は炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示されるヒドロキシ酸またはフェノール酸が挙げられる。
【００６１】
官能基としてアミノ基を導入するために用いられる化合物としては、例えばアミノ酸が挙げられる。
【００６２】
前記の化合物は、そのカルボキシル基が静電層のアミノ基と縮合してアミド結合を形成する。
【００６３】
前記の化合物のうち、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、トリメリット酸、ブタンテトラカルボン酸などの多価カルボン酸は親水性を向上させるために使用することもできる。
【００６４】
上記の工程において、アミノ基含有化合物による処理、官能基導入処理、活性エステル化処理は、数回繰り返して行うことが好ましい。
【００６５】
プローブポリヌクレオチドを、適当な溶媒に溶解または分散して、担体上にスポッティングすることにより、ポリヌクレオチドを担体に固定化することができる。例えば、プローブポリヌクレオチドを含む溶液を、９６穴または３８４穴等のプラスチックプレートに分注し、分注した溶液をスポット装置等を用いて担体上に滴下してスポッティングを行う。スポット装置としては、ピン方式、インクジェット方式、毛細管によるキャピラリ方式などを利用したスポット装置を用いることができる。
【００６６】
本発明はまた、担体に固定化されたプローブポリヌクレオチドにポリヌクレオチド試料を接触させ、ポリヌクレオチド試料に含まれるターゲットポリヌクレオチドをプローブポリヌクレオチドにハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーションに基づくシグナルを測定することによりポリヌクレオチド試料を分析するためのキットであって、ゲル化剤および糖質からなる群から選択される少なくとも１種を含む水性分散液からなる担体の再生を促進するための試薬を含む前記キットに関する。当該キットは、公知のポリヌクレオチド試料を分析するためのキットに加えて、担体の再生を促進するための試薬を含むことを特徴とする。本発明のキットは、上記担体の再生を促進するための試薬を含むことを除き、公知公用のキットに用いられている各要素によって構成することができる。例えば、ポリヌクレオチドを分解または断片化するための酵素、緩衝液、マトリックス溶媒、洗浄バッファー、試料希釈液、反応停止液、標準物質等を含みうる。更に本発明のキットには、アッセイ方法を説明するためのインストラクションマニュアルを組み合せることもできる。
【実施例】
【００６７】
実施例１  蛍光ラベル化ｃＤＮＡ（ターゲットポリヌクレオチド）の調製
蛍光ラベル化ｃＤＮＡの調製にはアマシャムバイオサイエンス社製のＣｙＳｃｒｉｂｅ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  Ｋｉｔを用いた。
【００６８】
予め７０℃、４２℃、３７℃のヒートブロック、もしくは恒温器を準備し、ｍＲＮＡ試料および各試薬類を溶かし氷上に準備した。次にｍＲＮＡ試料を含め、以下の系を組んだ。この系は以後のハイブリダイゼーションを３回実施するのに充分な量であった。
【００６９】
【表１】
0004524392.tif 000002
【００７０】
上記反応系を組んだ後、７０℃にて５分間保温し、室温に移し１０分間放置した。この反応液にさらに以下のように試薬を添加し、反応系を組んだ。また以後の操作はできる限り遮光条件下で行なった。
【００７１】
【表２】
0004524392.tif 000003
【００７２】
上記反応系を組んだ後、４２℃にて９０分間保温し逆転写反応により蛍光ラベル化ｃＤＮＡを合成した。次に２．５Ｍ  ＮａＯＨを２μｌ添加し、３７℃で１５分間保温することで未反応ｍＲＮＡを分解した。次に２Ｍ  ＨＥＰＥＳを１０μｌ添加することで中和し、蛍光ラベル化ｃＤＮＡ溶液を得た。
【００７３】
次にアマシャムバイオサイエンス社製のＣｙＳｃｒｉｂｅ  ＧＦＸ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて、蛍光ラベル化ｃＤＮＡを精製した。コレクションチューブにＧＦＸスピンカラムをセットし、ＧＦＸスピンカラム内にＣａｐｔｕｒｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ５００μｌを添加し、蛍光ラベル化ｃＤＮＡ溶液をさらに添加し、ピペッティングにより混和した。１３，０００ｒｐｍにて３０秒間遠心し、コレクションチューブ内の濾液を廃棄した。同じコレクションチューブにＧＦＸスピンカラムを再度セットし、Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ  ６００μｌを添加した。１３，０００ｒｐｍにて３０秒間遠心し、コレクションチューブ内の濾液を廃棄した。上記洗浄過程をさらに２回繰り返した。同じコレクションチューブにＧＦＸスピンカラムを再度セットし、１３，０００ｒｐｍにて１０秒間遠心し、カラムに付着したＷａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒを完全に除去した。新しい１．５ｍｌ容マイクロチューブにＧＦＸスピンカラムをセットし、予め６５℃に保温しておいたＥｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ  ２２μｌをフィルターの中央部に添加し、１０分間放置した。１３，０００ｒｐｍにて１分間遠心し、マイクロチューブ内に濾液を回収した。上記溶出過程をさらに２回繰り返し、同じマイクロチューブ内に回収した。上記操作により合計６６μｌの蛍光ラベル化ｃＤＮＡ溶液を得た。得られた蛍光ラベル化ｃＤＮＡ溶液を２２μｌずつ新しいマイクロチューブに分注し、スピードバック等で乾固し、−２０℃、暗所にて保存した。
【００７４】
実施例２  マイクロアレイ（プローブポリヌクレオチド固定化担体）の製造
２５ｍｍ（幅）×７５ｍｍ（長さ）×１ｍｍ（厚み）のスライドガラスを、ポリアリルアミン水溶液（０．１ｇ／ｌ）に浸漬することにより、静電層を形成した。その後、静電層のアミノ基に、多価カルボン酸としてのポリアクリル酸を、０．１Ｍの１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミドの存在下で縮合した。そして、０．１Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ６）３００ｍｌに０．１Ｍの１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド・塩酸塩と２０ｍＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミドを溶解した活性化液中に３０分間浸漬することによって活性化することにより、ガラス基板の表面に静電層およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド基を有する担体を製造した。
【００７５】
得られた担体に、上記で得られた蛍光ラベル化ｃＤＮＡに対応するプローブポリヌクレオチドをそれぞれスポッティングすることにより、担体上にプローブポリヌクレオチドが固定化されたマイクロアレイを得た。
【００７６】
実施例３  ゼラチンを用いた再生方法
（１）マイクロアレイの前処理
実施例２で製造したマイクロアレイを２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳに浸漬し、室温で１５分放置した。その後、マイクロアレイをあらかじめ９０℃に加温しておいた２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳに浸漬し５分間加熱後、超純水でリンスし、３００ｒｐｍにて３分間遠心しマクロアレイ表面の水分を除去した。
【００７７】
（２）ハイブリダイゼーション
乾固した蛍光ラベル化ｃＤＮＡに１８μｌの５×ＳＳＣ／０．５％ＳＤＳの溶液を加えハイブリダイゼーション溶液を調製した。前処理を施したマイクロアレイをハイブリダイゼーションカセット（ＡｒｒａｙＩｔ）にセットし、スポット位置に合うように２４×２４ｍｍのギャップ付きカバーグラスを載せ、ハイブリダイゼーション溶液を毛管現象により流し込んだ。カセット内の窪みに各々３０μｌの精製水とガラス上のカバーグラスと離れた位置２点に各々５μｌの３×ＳＳＣを滴下しハイブリダイゼーション中の乾燥を防いだ。６０℃にて１６時間ハイブリダイゼーションを行った。
【００７８】
（３）洗浄（未反応のポリヌクレオチドの除去）
マイクロアレイを２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳに浸漬してカバーグラスを洗い落とし、２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳで１５分間洗浄した。これを２×ＳＳＣで洗浄し、３００ｒｐｍにて３分間遠心しマクロアレイ表面の水分を除去した。コントロール実験は、この段階で下記（５）と同様に蛍光強度を測定した（図１ａ）。
【００７９】
（４）ゼラチンコーティング
このマイクロアレイをあらかじめ５０〜６０℃に加温して溶解しておいた０．２×ＳＳＣ／１ｍＭ  ＥＤＴＡ／１．５％（Ｗ／Ｖ）ゼラチンに浸漬し、ただちに３００ｒｐｍにて３分間遠心を行い、室温で遮光して放置し、ゼラチンをゲル化した。ゼラチンは、新田ゼラチン（株）社製「ゼラチン２１」を使用した。
【００８０】
（５）蛍光の測定および蛍光強度の数値化
このマイクロアレイ上のスポットにハイブリダイズした蛍光ラベル化ｃＤＮＡの蛍光をマイクロアレイスキャナーＧｅｎｅＴＡＣ  ＵＣ−４（Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社製）で測定した。蛍光強度の数値化は、ＳｃａｎＡｌｙｚｅ  ｖｅｒ．２．５を使用した（図１ｂ）。
【００８１】
（６）担体の再生
５０ｍＬ容のファルコンチューブに入れた超純水（約５０ｍＬ）を沸騰湯浴上で加熱したものをあらかじめ準備した。蛍光強度を測定したマイクロアレイをこの沸騰湯浴上で加熱しておいた超純水に浸漬し、１５分間洗浄した。この操作を計４回繰り返してマイクロアレイ上のスポットにハイブリダイズした蛍光ラベル化ｃＤＮＡを除去した。すなわち、超純水による加熱洗浄過程は、累計６０分実施した。その後、マイクロアレイを３００ｒｐｍにて３分間遠心し、マクロアレイ表面の水分を除去し、（５）と同様に蛍光をマイクロアレイスキャナーで測定した（図２）。
【００８２】
８つのスポット、すなわちグリッド１のROW4 COL6、ROW4 COL7、ROW5 COL4、ROW5 COL5、ならびにグリッド２のROW4 COL6、ROW4 COL7、ROW5 COL4、ROW5 COL5（図７参照）について、ゼラチンコーティングを行った場合および行わなかった場合（コントロール）で、１回目のハイブリダイゼーションおよび１回目の再生後の蛍光強度を測定した結果を以下の表３および図１ｃに示す。
【００８３】
【表３】
0004524392.tif 000004
【００８４】
（７）ゼラチンコーティングを行ったマイクロアレイについて、上記（１）〜（３）の工程を繰り返し、再生後の２回目のハイブリダイゼーションを行い、蛍光をマイクロアレイスキャナーで測定した（図３ａ）。再度担体の再生（６）を実施し、蛍光をマイクロアレイスキャナーで測定した（図３ｂ）。
【００８５】
結果：
（６）の再生工程の後、ゼラチンコーティングを行わなかった担体についてはハイブリダイズした蛍光ラベル化ｃＤＮＡの残存がみられるのに対し（図２ａ）、ゼラチンコーティングを行った担体については、ハイブリダイズした蛍光ラベル化ｃＤＮＡがほぼ完全に除去されたことがわかる（図２ｂ）。さらに、再生工程の後、蛍光ラベル化ｃＤＮＡが、担体上のプローブポリヌクレオチドに再度ハイブリダイズすること（図３ａ）、さらに再度再生できることも示された（図３ｂ）。従って、本発明により、プローブポリヌクレオチド固定化担体を再生し、再利用できることが示された。
【００８６】
実施例４  トレハロースを用いた再生方法
（１）マイクロアレイの前処理
実施例２で製造したマイクロアレイを２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳに浸漬し、室温で１５分放置した。その後、マイクロアレイをあらかじめ９０℃に加温しておいた２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳに浸漬し５分間加熱後、超純水でリンスし、３００ｒｐｍにて３分間遠心しマクロアレイ表面の水分を除去した。
【００８７】
（２）ハイブリダイゼーション
乾固した蛍光ラベル化ｃＤＮＡに１８μｌの５×ＳＳＣ／０．５％ＳＤＳの溶液を加えハイブリダイゼーション溶液を調製した。前処理を施したマイクロアレイをハイブリダイゼーションカセット（ＡｒｒａｙＩｔ）にセットし、スポット位置に合うように２４×２４ｍｍのギャップ付きカバーグラスを載せ、ハイブリダイゼーション溶液を毛管現象により流し込んだ。カセット内の窪みに各々３０μｌの精製水とガラス上のカバーグラスと離れた位置２点に各々５μｌの３×ＳＳＣを滴下しハイブリダイゼーション中の乾燥を防いだ。６０℃にて１６時間ハイブリダイゼーションを行った。
【００８８】
（３）洗浄（未反応のポリヌクレオチドの除去）
マイクロアレイを２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳに浸漬してカバーグラスを洗い落とし、２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳで１５分間洗浄した。これを２×ＳＳＣで洗浄し、３００ｒｐｍにて３分間遠心しマクロアレイ表面の水分を除去した。コントロール実験は、この段階で下記（５）と同様に蛍光強度を測定した（図４ａ）。
【００８９】
（４）トレハロースコーティング
このマイクロアレイを２×ＳＳＣ／２０％（Ｗ／Ｖ）トレハロース溶液に浸漬し、ただちに３００ｒｐｍにて３分間遠心を行い、室温で遮光して放置した。トレハロースは、Ｓｉｇｍａ社製Ｄ−（＋）−Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ  ｄｅｈｙｄｒａｔｅ（Ｔ９５３１）：α−Ｄ−グルコピラノシル−α−Ｄ−グルコピラノシドを使用した。
【００９０】
（５）蛍光の測定および蛍光強度の数値化
このマイクロアレイ上のスポットにハイブリダイズした蛍光ラベル化ｃＤＮＡの蛍光をマイクロアレイスキャナー  ＧｅｎｅＴＡＣ  ＵＣ−４（Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社製）で測定した。蛍光強度の数値化は、ＳｃａｎＡｌｙｚｅ  ｖｅｒ．２．５を使用した（図４ｂ）。
【００９１】
（６）担体の再生
５０ｍＬ容のファルコンチューブに入れた超純水（約５０ｍＬ）を沸騰湯浴上で加熱したものをあらかじめ準備した。蛍光強度を測定したマイクロアレイをこの沸騰湯浴上で加熱しておいた超純水に浸漬し、１５分間洗浄した。この操作を計４回繰り返してマイクロアレイ上のスポットにハイブリダイズした蛍光ラベル化ｃＤＮＡを除去した。すなわち、超純水による加熱洗浄過程は、累計６０分実施した。その後、マイクロアレイを３００ｒｐｍにて３分間遠心し、マイクロアレイ表面の水分を除去し、（５）と同様に蛍光をマイクロアレイスキャナーで測定した（図５）。
【００９２】
赤線で囲った８つのスポット、すなわちグリッド１のROW4 COL6、ROW4 COL7、ROW5 COL4、ROW5 COL5、ならびにグリッド２のROW4 COL6、ROW4 COL7、ROW5 COL4、ROW5 COL5、（図７参照）について、トレハロースコーティングを行った場合および行わなかった場合（コントロール）で、１回目のハイブリダイゼーションおよび１回目の再生後の蛍光強度を測定した結果を以下の表４および図４ｃに示す。
【００９３】
【表４】
0004524392.tif 000005
【００９４】
（７）トレハロースコーティングを行ったマイクロアレイについて、上記（１）〜（５）の工程を繰り返し、再生後の２回目のハイブリダイゼーションを行い、蛍光をマイクロアレイスキャナーで測定した（図６ａ）。再度担体の再生（６）を実施し（２回目の再生においては１５分間の洗浄を１回のみ実施した）、蛍光をマイクロアレイスキャナーで測定した（図６ｂ）。
【００９５】
結果：
（６）の再生工程の後、トレハロースコーティングを行わなかった担体についてはハイブリダイズした蛍光ラベル化ｃＤＮＡの残存がみられるのに対し（図５ａ）、トレハロースコーティングを行った担体については、ハイブリダイズした蛍光ラベル化ｃＤＮＡがほぼ完全に除去されたことがわかる（図５ｂ）。さらに、再生工程の後、蛍光ラベル化ｃＤＮＡが、担体上のプローブポリヌクレオチドに再度ハイブリダイズすること（図６ａ）、さらに再度再生できること（図６ｂ）も示された。従って、本発明により、プローブポリヌクレオチド固定化担体を再生し、再利用できることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】ゼラチンコーティングを行った担体（ｂ）と行わなかった担体（ａ）について１回目のハイブリダイゼーション後に測定した蛍光画像を示す。また、蛍光強度の測定結果を示す（ｃ）。
【図２】ゼラチンコーティングを行った担体（ｂ）と行わなかった担体（ａ）について１回目の再生処理後に測定した蛍光画像を示す。
【図３】ゼラチンコーティングを行った担体について、２回目のハイブリダイゼーション後（ａ）および２回目の再生処理後（ｂ）に測定した蛍光画像を示す。
【図４】トレハロースコーティングを行った担体（ｂ）と行わなかった担体（ａ）について１回目のハイブリダイゼーション後に測定した蛍光画像を示す。また、蛍光強度の測定結果を示す（ｃ）。
【図５】トレハロースコーティングを行った担体（ｂ）と行わなかった担体（ａ）について１回目の再生処理後に測定した蛍光画像を示す。
【図６】トレハロースコーティングを行った担体について、２回目のハイブリダイゼーション後（ａ）および２回目の再生処理後（ｂ）に測定した蛍光画像を示す。
【図７】プローブポリヌクレオチドを固定化した担体におけるスポット位置を示す。グリッド１とグリッド２のスポット位置は同じである。なお、グリッド１および２とも、ROW1 COL6およびROW1 COL7は、Cy3オリゴヌクレオチドを固定化した対照スポットである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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