(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の液体搬送管と、
前記第１の液体搬送管に液体を供給し送液するための第１の送液手段と、
前記第１の液体搬送管の液体流出口にエアーギャップを介して液体流入口が配置された第２の液体搬送管と、
前記第２の液体搬送管の前記液体流入口から液体を吸引し前記第２の液体搬送管内を搬送するための第２の送液手段とを有し、
前記第１の送液手段によって前記第１の液体搬送管内を流れる液体の送液速度Ｖ１と、前記第２の送液手段によって前記第２の液体搬送管内を流れる液体の搬送速度Ｖ２との関係はＶ１＜Ｖ２であり、
前記第１の液体搬送管の液体流出口から流出して前記エアーギャップに生成された液滴が前記第２の液体搬送管の液体流入口から吸引され、前記第２の液体搬送管内を空気と液体の断続流体として搬送されることを特徴とする液滴生成搬送装置。
【請求項２】
請求項１記載の液滴生成搬送装置において、前記第１の液体搬送管の液体流出口と前記第２の液体搬送管の液体流入口は、同軸上に対向するように配置されていることを特徴とする液滴生成搬送装置。
【請求項３】
請求項１記載の液滴生成搬送装置において、前記第１の液体搬送管と第２の液体搬送管はそれぞれ同一平面上に複数本並べられ、前記第１の液体搬送管と第２の液体搬送管の各々は一対一で対応していることを特徴とする液滴生成搬送装置。
【請求項４】
請求項３記載の液滴生成搬送装置において、前記第１の液体搬送管と第２の液体搬送管は、前記平面と垂直な方向に複数層配置されていることを特徴とする液滴生成搬送装置。
【請求項５】
請求項１記載の液滴生成搬送装置において、前記エアーギャップは２ｍｍ以下であることを特徴とする液滴生成搬送装置。
【請求項６】
請求項１記載の液滴生成搬送装置において、１つの液体流出口と複数の液体流入口が前記エアーギャップの中心から等距離に位置するように１本の前記第１の液体搬送管と複数の前記第２の液体搬送管が放射状に配置され、前記第１の液体搬送管から流出して前記エアーギャップに生成された液滴を吸引する前記第２の液体搬送管を選択する手段を有することを特徴とする液滴生成搬送装置。
【請求項７】
請求項１記載の液滴生成搬送装置において、前記第１の液体搬送管に供給される液体は、水、緩衝液、生体分子試料、又はオイルであることを特徴とする液滴生成搬送装置。
【請求項８】
請求項１記載の液滴生成搬送装置において、前記第１の液体搬送管に空気を導入し送液されている液体を空気によって区切る手段と、前記第１の液体搬送管に空気を導入するタイミングを制御する手段と、前記第２の液体搬送管に断続的に供給される一定ヴォリュームを有する一定数の液区画を当該第２の液体搬送管の前記液体流入口と反対側の開放端から流出させる微量分注手段を有すること特徴とする液滴生成搬送装置。
【請求項９】
請求項１記載の液滴生成搬送装置において、前記エアーギャップの間隔を制御することにより前記液滴のヴォリュームを制御することを特徴とする液滴生成搬送装置。
【請求項１０】
第１の液体搬送管と、
前記第１の液体搬送管に液体を供給し送液するための第１の送液手段と、
前記第１の液体搬送管の液体流出口にエアーギャップを介して液体流入口が配置された第２の液体搬送管と、
前記第２の液体搬送管の前記液体流入口から液体を吸引し前記第２の液体搬送管内を搬送するための第２の送液手段と、
粒子を収容する粒子収容部と、
先端に前記粒子収容部内に収容された粒子を捕捉して移動することのできる粒子捕捉ノズルと、
前記粒子捕捉ノズル内の圧力を制御する圧力制御手段と、
前記粒子捕捉ノズルの先端を前記粒子収容部と前記エアーギャップの間に移動させる粒子捕捉ノズル移動手段とを有し、
前記第１の送液手段によって前記第１の液体搬送管内を流れる液体の送液速度Ｖ１と、前記第２の送液手段によって前記第２の液体搬送管内を流れる液体の搬送速度Ｖ２との関係はＶ１＜Ｖ２であり、
前記第１の液体搬送管の液体流出口から流出して前記エアーギャップに生成された液滴は前記第２の液体搬送管の液体流入口から吸引され、前記第２の液体搬送管内を空気と液体の断続流体として搬送され、
前記粒子収容部から前記粒子捕捉ノズルの先端に吸引捕捉された１個の粒子を、前記粒子捕捉ノズル移動手段によって前記エアーギャップに生成された液滴の位置に移動し、前記圧力制御手段による圧力制御によって前記粒子捕捉ノズルから遊離させ、前記液滴に内包させて前記第２の液体搬送管内に搬送することを特徴とする粒子操作装置。
【請求項１１】
請求項１０記載の粒子操作装置において、生体プローブが固定化されていることを特徴とする粒子操作装置。
【請求項１２】
請求項１０記載の粒子操作装置において、前記微粒子捕捉ノズルの数は、前記第１の液体搬送管の数と同数、もしくはそれより少ないことを特徴とする粒子操作装置。
【請求項１３】
請求項１０記載の粒子操作装置において、複数の粒子収納部を有し各粒子収納部にそれぞれ生体プローブ固定化粒子が収納された粒子収納プレートを有し、前記複数の粒子収納部に収納された生体プローブ固定化粒子を定められた順序で前記第２の液体搬送管へ搬送して、前記第２の液体搬送管内あるいは前記第２の液体粒子搬送管に接続された粒子配列容器内にプローブアレイを作製することを特徴とする粒子操作装置。
【請求項１４】
請求項１３記載の粒子操作装置において、前記第２の液体搬送管内あるいは前記粒子配列容器の内径は、前記生体プローブ固定化粒子の直径より大きく、前記直径の２倍未満であることを特徴とする粒子操作装置。
【請求項１５】
請求項１３記載の粒子操作装置において、前記粒子収納プレートを保持して移動するステージを有し、前記粒子捕捉ノズル移動手段は前記粒子捕捉ノズルを上下方向に移動させ、前記ステージは前記粒子収納プレートを水平方向に移動させることを特徴とする粒子操作装置。
【請求項１６】
請求項１０記載の粒子操作装置において、１つの液体流出口と複数の液体流入口が前記エアーギャップの中心から等距離に位置するように１本の前記第１の液体搬送管と複数の前記第２の液体搬送管が放射状に配置され、前記第１の液体搬送管から流出して前記エアーギャップに生成された液滴を吸引する前記第２の液体搬送管を選択する手段を有することを特徴とする粒子操作装置。
【請求項１７】
第１の液体搬送管と、
前記第１の液体搬送管に液体を供給し送液するための第１の送液手段と、
前記第１の液体搬送管の液体流出口にエアーギャップを介して液体流入口が配置された第２の液体搬送管と、
前記第２の液体搬送管の前記液体流入口から液体を吸引し前記第２の液体搬送管内を搬送するための第２の送液手段と、
液体サンプルを添加する微量分注手段とを有し、
前記第１の送液手段によって前記第１の液体搬送管内を流れる液体の送液速度Ｖ１と、前記第２の送液手段によって前記第２の液体搬送管内を流れる液体の搬送速度Ｖ２との関係はＶ１＜Ｖ２であり、
前記第１の液体搬送管の液体流出口から流出して前記エアーギャップに生成された液滴が前記第２の液体搬送管の液体流入口から吸引され、前記第２の液体搬送管内を空気と液体の断続流体として搬送され、
前記微量分注手段は、前記エアーギャップに生成された液滴中に液体試料を添加することを特徴とする微量液体搬送装置。
【請求項１８】
請求項１７記載の液体搬送装置において、前記第１の液体搬送管に供給される液体は前記液体試料と不混和であることを特徴とする微量液体搬送装置。
【請求項１９】
第１の液体搬送管に液体を送液する工程と、
前記第１の液体搬送管の開口端部の液体流出口に液滴を生成させる工程と、
第２の液体搬送管の開口端部の液体流入口から前記液滴を吸引する工程とを有し、
前記第１の液体搬送管内を流れる液体の送液速度Ｖ１と前記第２の液体搬送管内を流れる液体の送液速度Ｖ２の関係をＶ１＜Ｖ２とすることにより、前記第２の液体搬送管の開口端部の液体流入口に到達した液滴を前記第２の液体搬送管内へ空気と液体の断続流体として搬送することを特徴とする液滴生成搬送方法。
【請求項２０】
請求項１９記載の液滴生成搬送方法において、前記第１の液体搬送管の開口端部の液体流出口と前記第２の液体搬送管の開口端部の液体流入口との間のエアーギャップの間隔を調整することにより前記液滴のヴォリュームを制御することを特徴とする液滴生成搬送方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液滴の生成とその搬送技術、また、液滴を用いた粒子や微量液体試料等の被搬送物の操作技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゲノム計画の進展とともにＤＮＡやタンパク質レベルで生体を理解し、病気の検査や生命現象を理解しようとする動きが活発化してきた。生命現象の理解や遺伝子の働きを調べるには遺伝子の発現状況を調べることが有効である。この遺伝子の発現状況を調べるのに有力な方法として、スライドガラス等の固体表面上に数多くのＤＮＡプローブやタンパク質プローブを種類毎に区分けして固定したプローブアレイ、いわゆるＤＮＡチップ、プロテインチップが用いられてきている。チップを作る方法としては、光化学反応と半導体工業で広く使用されるリソグラフィーを用いて、区画された多数のセルに設計された配列のオリゴマーを１塩基ずつ合成していく方法（Science 251, 767-773 (1991)）、及び複数種類のプローブを各区画に１つ１つ植え込んでいく方法（Science 270, 467-470 (1995); Nat. Biotechnol. 18, 438-441 (2000)）がある。【０００３】
チップの作製にあたっては、何れの方法も１枚１枚のアレイ毎に、ＤＮＡプローブやタンパク質プローブを固定するか、ＤＮＡプローブに特化すれば、オリゴマーを１塩基ずつ合成する必要があり、製作に手間と時間がかかり、コスト高になる。また、プローブを固体表面に液滴として載せるのが一般的であるが、区画ごとにばらつきが出る、プローブ種の組み合わせの変更が容易でない、使用者が容易に操作できない、等の問題がある。【０００４】
以上の課題を解決するために、粒子にＤＮＡプローブやタンパク質プローブを固定したものを用意し、これら複数種類の粒子を集めたプローブアレイ、すなわち粒子アレイが提案されている（Clinical Chemistry 43, 1749-1756 (1997); Nucleic Acids Research 30, e87 (2002)；米国特許第6,023,540号明細書）。粒子を用いたプローブアレイの利点は、溶液中の化学反応を利用したプローブ固定方法が利用できるため、粒子毎にプローブ密度にばらつきのないプローブアレイを作製することができることである。【０００５】
ＤＮＡチップ、プロテインチップでは、オリゴマー作製位置もしくは各プローブのスポット位置によりプローブ種を識別する方法をとっているが、プローブ固定化粒子を用いたプローブアレイでは、プローブ毎に色分けした粒子を用いる方法（Clinical Chemistry 43, 1749-1756 (1997); 米国特許第6,023,540号明細書）、又はキャピラリ内やマイクロ流路チップ内に、並べる順序でプローブ種を識別する方法（Nucleic Acids Research 30, e87 (2002)、特許第3593525号、特開2005-17224号公報）をとっている。【０００６】
従来のＤＮＡチップ、プロテインチップでは、計測試料中に含まれる複数種類の定量解析に、半日から一日の時間を費やして、チップ上に固定したオリゴマー又はＤＮＡプローブ、タンパク質プローブと反応させる。一方、キャピラリ内に粒子を並べたプローブアレイ（Nucleic Acids Research 30, e87 (2002)）、即ち粒子アレイでは、計測試料をキャピラリ内に強制的に流す。粒子アレイは、従来法と比較して遺伝子検査時間を短縮できる可能性が高いため、比較的大規模な臨床検査センターでの使用だけでなく、病院や、現場での簡易計測、いわゆるPoint of Care Testing (POCT)に使用できる計測技術である。例えば、緊急な診断が要求される感染症、細菌検査等での病原微生物ゲノムの自己に存在しない外来遺伝子の迅速な検出手段として使用することが期待できる。【０００７】
キャピラリ内に並べる順序でプローブ種を識別する方法（Nucleic Acids Research 30, e87 (2002)）をとる粒子アレイの実用化にあたっては、任意のプローブ固定化粒子を検査用途に合わせて選択し、思い通りに配列する方法を確立することが必須であり、幾つかの方法が提案された。例えば、粒子を１個ずつ制御しながら液体の流れを利用してキャピラリ内に流し込む方法（特開平11-243997号公報）や、粒子が１つしか入らない微細な穴が設けられたシート上に、溶媒とともに導入された複数の粒子の中から１つの粒子だけを保持して、保持したままシートをキャピラリあるいは平板に設けた溝の位置まで移動して並べていく方法（特開2000-346842号公報）がある。しかしながら、これらの方法は、気泡の影響で粒子をうまく取り込めない場合が多く、確実性や操作性に問題があった。【０００８】
そこで、同一プローブが固定された複数の粒子が溶液とともにストックされた容器の中から、粒子捕捉ノズルを用いて、粒子捕捉ノズルの先端吸引部に1個だけ捕捉して操作する方法が提案された（特許第3593525号、特開2005-17224号公報、Analytical Chemistry 75, 3250-3255 (2003)）。この方法により、意図した順番に粒子を配列することができるようになった。
【特許文献１】米国特許第6,023,540号明細書
【特許文献２】特開平11-243997号公報
【特許文献３】特開2000-346842号公報
【特許文献４】特許第3593525号
【特許文献５】特開2005-17224号公報
【非特許文献１】Science 251, 767-773 (1991)
【非特許文献２】Science 270, 467-470 (1995)
【非特許文献３】Nat. Biotechnol. 18, 438-441 (2000)
【非特許文献４】Clinical Chemistry 43, 1749-1756 (1997)
【非特許文献５】Nucleic Acids Research 30, e87 (2002)
【非特許文献６】Analytical Chemistry 75, 3250-3255 (2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
粒子捕捉ノズルを用いた粒子捕捉法では、捕捉した粒子を粒子捕捉ノズル先端から遊離し、キャピラリ内やマイクロ流路チップ内に導入していくことで粒子アレイを作製する。粒子の導入には、これまで空気の流れや水流を使用していたが、連続流体では、遊離した粒子がその流れに追従しない場合があり、キャピラリの入口付近や、マイクロ流路チップの入口付近に、粒子が長い時間停滞する現象が見られる。この現象は粒子アレイを作製する上で、スループットが低くなるだけでなく、粒子が配列されているかどうかを逐次確認する検出手段を備えなければ、粒子の配列順序に誤りが生じてしまうという問題が生じる。特に、キャピラリ内や流路内に配列した粒子の数に比例して、上述の問題の頻度が高くなることがわかってきている。これは、粒子の配列個数に比例してキャピラリ内や流路内の流路抵抗は大きくなるため、粒子の配列数に伴って粒子を引き込むのに必要な力が小さくなるからである。【００１０】
本発明は、上述した課題について、解決する手段と方法を提供することを目的とする。また、粒子のみならず、液体試料を含めた被搬送物を、効率よく搬送または分取する装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明では、キャピラリの入口、またはマイクロ流路チップの入口で液滴を生成し、粒子捕捉ノズルの先端から遊離した粒子を該液滴に内包して、キャピラリ内やマイクロ流路チップ内へ粒子を導入する。一旦、粒子が液滴に内包されると、気液界面の表面張力により、液滴から外へ放出されにくくなるため、粒子は安定に液滴と一緒に搬送される。【００１２】
まず、液滴生成搬送手段について説明する。液体を搬送する管（液体搬送管）を２本以上用意する。簡単のため、ここでは２本のみ用意したシステムについて説明する。以下、２本の液体搬送管を各々第１の液体搬送管、第２の液体搬送管と記述する。第１の液体搬送管の一端を、液体容器に挿入し、圧力送液ポンプを用いて、容器内の液体を吸水し、送液速度Ｖ１で、第１の液体搬送管の他端へ向かって送液する。他端は、大気開放になっており、第１の液体搬送管内を通過した液体は他端から一定速度で流出する。流出時の初期段階では、液体は表面張力により球状の滴（液滴）を形成する。一方、第２の液体搬送管は、その一端を吸引ポンプに繋げておき、送液速度をＶ２で液体搬送管内を陰圧にしておく。第２の液体搬送管の他端は、液体が接触することで、液体を吸水し、第２の液体搬送管内を搬送できる。【００１３】
第１の液体搬送管他端の液体流出口と第２の液体搬送管他端の液体流入口を近づけると、液体流出口から流出した液滴が重力落下の影響を受けずに液体流入口に到達する距離であれば、第１の液体搬送管から第２の液体搬送管へと液体を移し、搬送することができる。以下、液体流出口と液体流入口の間隔をエアーギャップと記述する。ここで、送液速度、Ｖ１、Ｖ２に注目し、Ｖ１＜Ｖ２の関係を維持すると、第２の液体搬送管に吸引された液滴はエアーギャップ部で引きちぎられることになる。これにより、第１の液体搬送管から供給されてきた連続流体は、エアーギャップ部で液滴を生成し、第２の液体搬送管内では、液体と気体（空気）の断続流を形成することになる。【００１４】
次に、粒子捕捉手段について説明する。粒子捕捉手段は、複数の粒子の入った溶液を収納する粒子収納容器と、先端に粒子を捕捉する細長い粒子捕捉ノズルと、粒子捕捉ノズルに連結した吸引機と加圧機、粒子捕捉ノズルの先端部を容器中の溶液に挿入し、引き上げるためのアクチュエータとを有する。粒子捕捉ノズルの先端に開口する孔は粒子の直径より小さい。生体分子プローブを表面に固定した粒子が複数入った溶液中に、先端に粒子の直径より小さい孔が開口している粒子捕捉ノズルを挿入し、粒子捕捉ノズルの先端に吸引力を作用させる。こうして、先端に１個の粒子を吸引保持した粒子捕捉ノズルを容器の溶液から引き出し、粒子捕捉ノズルの先端に吸引保持している粒子に圧力をかけて遊離する。【００１５】
本発明による粒子操作装置は、先に説明した液滴生成搬送手段と粒子補足手段を具備した形態であり、具体的には、第１の液体搬送管とその管に液体を供給する第１の送液手段と、第２の液体搬送管と液体を吸引搬送する第２の送液手段と、複数の粒子が入った溶液を収納する複数の容器を保持するステージとそのステージを移動させるアクチュエータ、先端に前記粒子の直径より小さい孔が開口した粒子捕捉ノズルと、粒子捕捉ノズルを駆動するアクチュエータ、粒子捕捉ノズルの先端に正又は負の圧力を発生させる吸引加圧手段と、これらをコントロールする制御部を備えている。【００１６】
粒子捕捉ノズルは、第１の液体搬送管と第２の液体搬送管の間のエアーギャップ内を、第１の液体搬送管と第２の液体搬送管に接触しないように移動する位置関係を有している。粒子捕捉ノズルが移動する方向の延長上にある粒子ストック容器から粒子を、吸引機の駆動により粒子捕捉ノズルの先端に捕捉し、エアーギャップ部まで、ノズル先端を移動させ、その後、エアーギャップに形成されている液滴へ、加圧機の駆動により粒子捕捉ノズル先端に捕捉されている粒子を遊離する。遊離された粒子は、液滴に接触することで内包され、第２の液体搬送管内へと搬送される。【００１７】
第２の液体搬送管を、粒子アレイ容器として用いるキャピラリやマイクロ流路チップに置き換えることで、液滴に内包された粒子を確実にキャピラリ内や流路内へ誘導でき、粒子アレイを作製することができる。この方法は、気液界面の表面張力を利用した方法であるため、粒子を流し込む流速に依存せず、粒子を運び込むことができる。【００１８】
また、粒子捕捉手段を液体試料の微量分注手段に置き換え、液滴生成搬送手段で供給する液体に液体試料と不混和なものを使用することで、微量液体サンプルの搬送、分取等への応用も可能である。さらに、液滴生成搬送手段を単体として用いた場合、第１の液体搬送管と第２の液体搬送管で形成されるエアーギャップの間隔を制御することで液滴のヴォリュームを制御できる特徴を持つ微量分注機としても活用できる。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、生体分子を固定した粒子を確実に１個ずつ粒子アレイ容器内へ導入、配列でき、異なる粒子を複数個並べた粒子アレイを、低い製造コストで高効率に作製することができる。また、本発明の装置を用いて、液体試料の微量分取が可能なため、粒子のみならず液体を含む被搬送物を簡便に操作できるようになる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明の液滴生成法、断続流体搬送法を示す模式図。
【図２】本発明による液体搬送の原理を示す模式図。
【図３】第２の液体搬送管に２μＬの液区画を１０個生成した結果を示す模式図。
【図４】エアーギャップ部に生成する液滴の大きさを制御する方法の例を示す模式図。
【図５】本発明の応用例としての微量分注装置を示す模式図。
【図６】本発明の粒子操作装置を示す模式図。
【図７（Ａ）】目的とする収納部へ粒子捕捉ノズルを挿入する直前の状態を示す模式図。
【図７（Ｂ）】内部を負圧にした粒子捕捉ノズルを収納部に挿入した状態を示す模式図。
【図７（Ｃ）】粒子捕捉ノズル先端に粒子を１個だけ保持している状態を示す模式図。
【図７（Ｄ）】液滴へ粒子を遊離する直前の状態を示す模式図。
【図７（Ｅ）】液滴へ粒子を遊離した状態を示す模式図。
【図７（Ｆ）】液滴に内包された粒子を第２の液滴搬送管へ搬送する様子を示す模式図。
【図７（Ｇ）】液区画に内包された粒子を搬送する状態を示す模式図。
【図８】粒子アレイ容器としてマイクロ流路チップを用いた本発明の粒子操作装置の模式図。
【図９】粒子操作手段を並列化した本発明の装置形態の一例を示す模式図。
【図１０】粒子操作手段を並列化した本発明の装置形態の一例を示す模式図。
【図１１】５本の第２の液体搬送管に粒子を並べている様子を示す模式図。
【図１２】第２の液体搬送管を並列化した本発明の装置形態の一例を示す模式図。
【図１３】第２の液体搬送管を並列化した本発明の装置形態の一例を示す模式図。
【図１４（Ａ）】第１の液体搬送管と第２の液体搬送管を放射状に並べた形態を示す模式図。
【図１４（Ｂ）】液滴に内包した粒子を第２の液体搬送管に導入する状態を示す模式図。
【図１４（Ｃ）】液滴に内包した粒子を第２の液体搬送管に導入する状態を示す模式図。
【図１４（Ｄ）】複数の第２の液体搬送管に粒子アレイを作製している状態を示す模式図。
【図１５】粒子の調製法及び粒子収納プレートの構成例の説明図。
【図１６】粒子を配列したｍ本の粒子アレイ容器の断面模式図。
【図１７（Ａ）】粒子アレイを用いたハイブリダイゼーション実験の形態を示す模式図。
【図１７（Ｂ）】ハイブリダイゼーション後に蛍光検出する様子を示す模式図。
【図１８（Ａ）】オイルが第１の液体搬送管を流れる様子を示す模式図。
【図１８（Ｂ）】オイル液滴の生成の様子を示す模式図。
【図１８（Ｃ）】分注ノズルから吐出した微量液体をオイル滴に内包する様子を示す模式図。
【図１８（Ｄ）】微量液体を内包したオイル滴が第２の液体搬送管へ移動する瞬間の様子を示す模式図。
【図１８（Ｅ）】液区画に内包された粒子を搬送する状態を示す模式図。
【図１９】本発明の微量液体操作装置の一例を示す模式図。
【符号の説明】
【００２１】
１  液体容器
２  第１の送液ポンプ
３  第１の液体搬送管
４  第２の液体搬送管
５  液体収集容器
６  吸引ポンプ
７  純水
８  三方バルブ
９  液体流出口
１０  液体流入口
１１  エアーギャップ
１２  液滴
１３  液区画
１４  空気区画
１５  第２の送液ポンプ
１６  スライドガラス平板
１７  分取液滴
１８  第１の板状部材
１９  収納部
２０  粒子収納プレート
２１  プレート設置治具
２２  第１の電動アクチュエータ
２３  第２の電動アクチュエータ
２４  第２の板状部材
２５  粒子捕捉ノズル
２６  粒子捕捉ノズル設置治具
２７  第３の電動アクチュエータ
２８  電磁三方バルブ
２９  粒子吸引用ポンプ
３０  粒子遊離用加圧ポンプ
３１  第３の液体搬送管
３２  第１のソケット
３３  制御装置（コンピュータ）
３４  溶液
３５  粒子
３６  マイクロ流路チップ
３７  第２の液体搬送管
３８  第２の液体搬送管
３９  粒子容器
４０  プローブ固定化粒子
４１  粒子アレイ容器
４２  第２のソケット
４３  配列１を有する一本鎖DNAプローブ
４４  配列２を有する一本鎖DNAプローブ
４５  配列３を有する一本鎖ターゲットDNA
４６  配列４を有する一本鎖ターゲットDNA
４７  ２０ｍMリン酸バッファー
４８  蛍光顕微鏡
４９  Cy３の蛍光
５０  TexasRedの蛍光
５１  オイル滴
５２  液体分注ノズル
５３  微量液滴
５４  検出セル用液体搬送管
５５  光源
５６  検出器
５７  試料液滴
５８  試薬液滴
５９  混合液
６０  バルブ
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、図面を参照して本発明の実施の形態を説明する。
【実施例１】
【００２３】
本実施例では、本発明の液滴生成法と断続流体搬送法を、純水を用いた実験をもとに説明する。【００２４】
図１は、本発明の液滴生成法、断続流体搬送法の実験系を示す概略模式図である。本実験系は、液体容器１、第１の送液ポンプ２、第１の液体搬送管３、第２の液体搬送管４、液体収集容器５、吸引ポンプ６で構成されている。液体容器１には、純水７をストックしている。また、液体容器1と第１の送液ポンプ２の間には、三方バルブ８が挿入されている。ここでは、第１の送液ポンプ２にはペリスタポンプを、吸引ポンプ６にはアスピレータを用いている。しかし、ペリスタポンプの代わりにダイヤフラムポンプ、アスピレータの代わりにペリスタポンプ、ダイヤフラムポンプ、ロータリーポンプ、油回転ポンプ等を使用しても良い。【００２５】
第１の液体搬送管３の開口端付近と第２の液体搬送管４の開口端付近は、ｙ軸の同一軸上にあり、各々の開口端は対向している。第１の液体搬送管３の開口端を液体流出口９、第２の液体搬送管の開口端を液体流入口１０と以下記述する。液体流出口９と液体流入口１０の間隔であるエアーギャップ１１は、０.０ｍｍから２．０ｍｍまでの間で可変である。【００２６】
第１の液体搬送管３と第２の液体搬送管４の内径は、０.０１ｍｍから１ｍｍ程度が好適である。後述するが、エアーギャップ１１中に生成する液滴のヴォリュームを小さくしたい場合や液滴のヴォリューム再現性を重視する場合、さらにヴォリューム可変レンジを大きく取りたい場合には、小さい内径で肉薄な管を使用する方が良い。本実施例では、内径０.５ｍｍ、外径１ｍｍの管を使用している。【００２７】
純水７は、第１の送液ポンプ２を用いて、第１の液体搬送管３に供給され、一定速度Ｖ１で送る。一方、第２の液体搬送管４内は、アスピレータの吸引ポンプ６により１気圧程度減圧させる。このときの流速Ｖ２＝２０μＬ/sec.であった。本実施例では、Ｖ１を０．１μL/sec.から２０μL/sec.の範囲で変化させた。【００２８】
図２（Ａ）〜図２（Ｆ）は、図１の実験系を用いた液体搬送の原理を示した模式図である。ここでの条件は、Ｖ１＝５μＬ/sec.、Ｖ２＝２０μＬ/sec.、エアーギャップ１．５ｍｍである。図２（Ａ）に示すように第１の液体搬送管３内を送られてきた純水７は、図２（Ｂ）のように液体流出口９を経てエアーギャップ１１に到達し、図２（Ｃ）のようにエアーギャップ１１中に液滴１２が生成される。球状に膨らんだ液滴１２は、図２（Ｄ）に示すように第２の液体搬送管４の液体流入口１０に到達すると、図２（Ｅ）に示すように第２の液体搬送管４内に引き込まれる。Ｖ１＜Ｖ２であるため、第１の液体搬送管３の液体流出口９付近の流速と、第２の液体搬送管４の液体流入口１０付近の流速との間に大きな速度勾配が生じる。液滴１２は表面張力により球形を保とうとする力が働くため、液滴生成開始位置である液体流出口９付近には最も大きな速度勾配が生じる。これにより、液の流れの向きと垂直な方向にせん断力が生じる。このため、図２（Ｅ）に示すように、液滴は液区画１３として引きちぎられる。その後、図２（Ｆ）に示すように、空気と純水７の断続流体となって、第２の液体搬送管４の中を流れていくことが確認できる。Ｖ１＜２０μＬ/sec.の条件下では、図２と同様の結果が得られ、流速に比例して、液滴生成速度は早くなる。液滴１２の大きさは、エアーギャップ１１の距離で制御されるため、ほぼ一定量の液区画１３が第２の液体搬送管４内で生成される。【００２９】
図３は、図１の実験系を用いて、三方バルブ８をあるタイミングで切り替えて、空気区画１４を第１の液体搬送管３に強制的に挿入した一例を示す模式図である。ここでの条件は、Ｖ１＝５μＬ/sec.、Ｖ２＝２０μＬ/sec.、エアーギャップ１１は１．５ｍｍである。空気区画１４をタイミング制御して挿入することにより、図２で述べた純水７の液区画１３の液量を一定にできるだけでなく、液区画１３の数を制御できるようになる。図３は、約２０μＬ分の純水７を第１の送液ポンプ２で吸い上げた後、三方バルブ８を空気側に切り替えた例で、２μＬの液区画１３が、１０個生成された結果を示す模式図である。【００３０】
図４は、液滴１２の大きさを制御し、液区画１３の液体ヴォリュームを制御する方法の一例を示す模式図である。エアーギャップ１１の間隔を制御することにより、液滴１２の球径、つまり、分取したい液滴１２、液区画１３のヴォリュームを任意に変えることができる。図４（Ａ）ではエアーギャップ１１間隔を１ｍｍとし、４μＬの液滴をエアーギャップ１１に生成した状態を示している。図４（Ａ）のエアーギャップ１１の間隔を半分にしたのが図４（Ｂ）である。エアーギャップを半分にすることで、０．５μＬに、つまり、図４（Ａ）と比較して、２の３乗分の１の液量の液滴１２をエアーギャップ１１部に生成することができる。純水７や緩衝液の液滴１２の場合、２ｍｍ以下では、強い表面張力は重力の影響を受けずに真球となるため、精度良く、一定量の分取が可能である。これにより、第２の液体搬送管４内へ、予め目的とした正確な液量の液区画１３を操作できる。一方、エアーギャップが２ｍｍを越えると、重力の影響を受け、液滴１２は真球とならず、重力方向へ垂れ下がった歪な球体となる。歪な球体は、振動や、空気の流れに敏感になるため、液滴１２の形状、すなわち、ヴォリュームが再現しにくくなる。最悪のケースでは、液滴１２は、第２の液体搬送管４の液体流入口１０に到達できず、落下してしまう。このように、２ｍｍを超えると分取量にばらつきが生じてしまうため、真球構造が保たれる２ｍｍ以下にエアーギャップ１１を設定するのが好適である。他の液体、血清等の生体試料や、オイルでは、エアーギャップ１１の距離を０．５ｍｍ以下で制御するのが好適である。【００３１】
先に述べたように、内径の小さい管を使用することで、分取する液体ヴォリュームの再現性が向上する。液体流出口９付近の速度勾配により受ける力が大きくなる、言い換えれば、弱い力でも液体を切断できるようになるため、液滴１２が引きちぎられる場所が確度よく再現する。また、送られてくる液体の断面積が小さいため、液体分取の微量化において好適である。ただし、管の断面に液体が吸着して、液が広がらないようにするために、外径の小さい、肉薄な管を使用した方が良い。肉厚な管を使用する場合には、管の断面を撥水処理しておく。内径０．０１ｍｍの第１の液体搬送管３と第２の液体搬送管４を使用した場合で、５００ｐＬ〜５μＬの範囲で良好に液体を分取できる。【００３２】
図５は、図１〜図４で説明した液滴生成搬送手段を微量分注に応用した一例を示す模式図である。第２の液体搬送管４内を陰圧にするためのポンプとして、吸引ポンプ６の代わりにペリスタポンプやダイヤフラムポンプ等の第２の送液ポンプ１５を使用する。また、エアーギャップ部を囲むチャンバを用意し、チャンバ内を加圧状態にしても送液ポンプとして使用できる。これらの代替ポンプを使用することで、分取した液区画１３を、反応容器やスライドガラス平板１６、さらに、メンブレン上に滴下できるようになる。図５では、スライドガラス平板１６に滴下している状態を示している。ＤＮＡプローブやタンパク質プローブを用意し、スライドガラス平板１６の位置をアクチュエータで制御しながら液区画１３として第２の液体搬送管４を通過した分取液滴１７を滴下していくことで、ＤＮＡチップやプロテインチップを作製できる。【００３３】
以上、図１〜図５で説明した本実施例の手段および方法は、マイクロタイタープレートへの微量分注機や、ＤＮＡチップ、プロテインチップの微量スポッター、さらに、たんぱく質のマトリックス支援レーザ脱離イオン化法−質量分析システムの前処理スライドへのスポッターとして使用できる。
【実施例２】
【００３４】
本実施例では、粒子操作装置およびその方法について説明する。ここでは、第２の液体搬送管４内に粒子アレイを作製する方法を取り上げる。粒子径は一定で、粒子表面に生体分子プローブを固定したものを複数種類用意し、それらを予め定めた順列で第２の液体搬送管４内に一列に配列する例を、装置構成図と動作原理を用いて説明する。【００３５】
図６は、本発明の粒子操作装置の一例を示す模式図である。第１の板状部材１８の上には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質等の生体分子と結合する生体プローブを固定した粒子を複数の収納部１９に保持した粒子収納プレート２０とプレート設置治具２１が、第１の電動アクチュエータ２２、第２の電動アクチュエータ２３を介して設置されている。【００３６】
図６では、簡単のために、ｘ方向に５個、ｙ方向に８個で合計５×８＝４０個の収納部１９を有する粒子収納プレート２０を設置した例を示しているが、粒子収納プレート２０としては、９６（８×１２）穴マイクロタイタープレートや３８４（１６×２４）穴マイクロタイタープレートが好適である。粒子収納プレート２０の位置は、ｘ方向に移動可能な第１の電動アクチュエータ２２とｙ方向に移動可能な第２の電動アクチュエータ２３により制御される。プレート設置治具２１には、振幅と振動周波数を任意に制御できる振動発生機が備わっている。【００３７】
第２の板状部材２４には、先端部に粒子を１個だけ吸引して保持できる内径を持つ粒子捕捉ノズル２５と粒子捕捉ノズル設置治具２６が、第３の電動アクチュエータ２７を介して固定されている。【００３８】
粒子捕捉ノズル２５が先端部に粒子を１つだけ吸引して保持するためには、粒子の直径をＲとする時、粒子捕捉ノズル２５の内径ＩＤは、ＩＤ≪Ｒなる関係を満たせば良く、粒子捕捉ノズル２５の外径をＯＤとする時、ＯＤは、Ｒ≦ＯＤ＜２Ｒなる関係を満たせばよい。粒子の直径が１００μｍの時、内径５０μｍ、外径１００μｍもしくは１５０μｍのガラス製又はステンレス製のキャピラリを粒子捕捉ノズル２５として用いるのが妥当である。ただし、１０μｍ程度の小さい粒子を扱う場合、使用する粒子捕捉ノズル２５の外径が２倍を超える場合が多い。このとき、先述したプレート設置治具２１の振動発生機を使用する。その際、周波数２０Ｈｚ以上、振幅０．１ｍｍ以上の振動を図のｘ軸方向、ｙ軸方向に付加すると良い。【００３９】
粒子捕捉ノズル２５の一端は、電磁三方バルブ２８を介して、粒子吸引用ポンプ２９と粒子遊離用加圧ポンプ３０に繋がっている。第１の送液ポンプ２、第１の液体搬送管３、第２の液体搬送管４、吸引ポンプ６は、図１で説明したものと同様である。第１の送液ポンプ２は、図示しない液体容器１にストックされた純水を第１の液体搬送管３に送液する。【００４０】
図１で説明した液体生成搬送手段の構成と異なり、第２の液体搬送管４は、第３の液体搬送管３１と第１のソケット３２を介して接続されており、第３の液体搬送管３１が吸引ポンプ６に繋がっている。第１のソケット３２は、第２の液体搬送管４と一体で取扱える部材であり、第２の液体搬送管４の内径よりも小さく、扱う粒子の直径よりもやや小さい１辺を有する四角形の孔を有しているのが望ましい。さらに、断面形状上に凹凸がある方が好ましい。これにより、粒子が、第１のソケット３２にはまり込むことがなくなり、流路抵抗を低くすることができる。また、この第１のソケット３２を、第２の液体搬送管４と第３の液体搬送管３１との間に挿入することにより、粒子は、第２の液体搬送管４内部に保持できる。【００４１】
第２の液体搬送管４は、粒子の直径をＲとする時、第２の液体搬送管４の内径ＩＤは、Ｒ＜ＩＤ＜２Ｒなる関係を満たしているものを用いる必要がある。例えば、粒子の直径Ｒが０．１ｍｍであるときは、第２の液体搬送管４の内径ＩＤは、０．１５ｍｍ程度でよく、例えば、内径０．１５ｍｍ外径０．３８ｍｍの市販のガラスキャピラリを使用するのが一般的である。ここで、第２の液体搬送管４にガラス材を使用する理由は、粒子アレイを用いたアッセイの蛍光計測時に、広い波長範囲に渡って、最も自家蛍光が小さいからである。もちろん、用途によって材料を変えても良い。例えば、生物発光や化学発光を利用した計測では、透明なプラスティック製チューブを用いてもかまわない。粒子アレイを用いたアッセイの蛍光計測については、実施例５で説明する。【００４２】
図６に示す全システムにおける駆動部である第１の電動アクチュエータ２２、第２の電動アクチュエータ２３、第３の電動アクチュエータ２７、電磁式三方弁２８、粒子吸引用ポンプ２９、粒子遊離用加圧ポンプ３０、第１の送液ポンプ２、吸引ポンプ６、プレート設置治具２１の振動発生機は、制御装置（コンピュータ）３３により総括的に制御される。【００４３】
図７（Ａ）〜図７（Ｇ）は、本発明の図６の粒子操作装置を用いて、収納部１９に溶液３４とともに収納された複数の粒子から１個の粒子３５を捕捉する工程を示す断面模式図である。ここでの条件は、Ｖ１＝５μＬ/sec.、Ｖ２＝２０μＬ/sec.、エアーギャップ１ｍｍ、粒子３５の直径は１００μｍ、粒子捕捉ノズル２５の内径は５０μｍ、外径は１００μｍである。また、第１の液体搬送管３、第２の液体搬送管４の内径は１５０μｍ、外径は５００μｍである。なお、溶液３４は純水である。もちろん、溶液３４は、純水、緩衝液、アルコールなどでも良い。粒子収納プレート２０には、ここでは、説明を簡単にするため振動は印加しない。【００４４】
図７（Ａ）は、目的とする粒子３５を保持している収納部１９の開口部が粒子捕捉ノズル２５の開口部とｚ方向で対向する位置にくるように、第１の電動アクチュエータ２２と第２の電動アクチュエータ２３で粒子収納プレート２０を移動させた状態を示している。まさに、目的とする収納部１９へ粒子捕捉ノズル２５が挿入されるところである。このとき、粒子捕捉ノズル２５と粒子吸引用ポンプ２９が連結するように、電磁式三方弁２８を駆動し、粒子捕捉ノズル２５の先端を負圧状態にする。【００４５】
図７（Ｂ）は、第３の電動アクチュエータ２７の制御により、粒子捕捉ノズル設置治具２６がｚ方向に下降し、内部を負圧にした粒子捕捉ノズル２５の下端が収納部１９の内部に挿入された状態を示している。挿入した状態では、粒子捕捉ノズル２５の先端面が、収納部１９の底に接する程度が良い。これは、粒子３５の収納量が少ない場合に、粒子捕捉ノズル２５の先端が粒子３５と接触できず、捕捉効率が低下するからである。このとき、粒子収納プレート２０を振とうさせると、粒子捕捉ノズルによる粒子の捕捉効率が向上する。【００４６】
液滴生成法、液体搬送法は、図２で説明したとおりである。もちろん、粒子捕捉ノズル２５が第１の液体搬送管３と第２の液体搬送管４の間を移動するときに、タイミングよく図３で説明した空気区画１４を入れても良いが、粒子捕捉ノズル２５が形成される液滴に対して十分に小さい場合は、空気区画１４を挿入する必要はない。液滴１２の直径をＲ０、粒子捕捉ノズル２５の外径をＲ１としたときに、Ｒ０/Ｒ１≧５の条件を満たしている場合には、粒子捕捉ノズル２５は、液滴１２の第２の液体搬送管４への到達を妨げないからである。一方、Ｒ０/Ｒ１＜５の条件を満たしている場合では、粒子捕捉ノズル２５が第２の液体搬送管４への到達を妨害するため、空気区画１４を挿入する必要がある。本説明では簡単のために、液滴を連続で生成している場合での粒子操作を示した。【００４７】
図７（Ｃ）は、収納部１９の溶液３４から、粒子捕捉ノズル２５の先端を完全に大気中へ抜き出した状態を示している。このとき、粒子捕捉ノズル２５の先端には、粒子３５が１個だけ保持されている。図７（Ｂ）から図７（Ｃ）の工程の間では、図示していないが、以下説明する物理現象が起こっている。【００４８】
図７（Ｂ）から粒子捕捉ノズル２５を図７（Ｃ）の位置まで移動させる間、溶液３４中では、粒子捕捉ノズル２５と粒子３５の間では液架橋構造や静電気が生じ、余分な粒子３５が粒子捕捉ノズル２５の外壁に吸着する。ただし、溶液３４と大気の間の気液界面に働く表面張力により、余分な粒子３５は、溶液３４中へと削ぎ落とされるため、粒子捕捉ノズル２５が大気中に露出した時には、粒子３５は、吸引で保持されている粒子捕捉ノズル２５の開口部に１個のみ保持される。【００４９】
図７（Ｄ）、（Ｅ）は、捕捉した粒子３５をエアーギャップ１１中に生成した液滴へ遊離する瞬間を示す模式図である。図７（Ｄ）の状態では、粒子捕捉ノズル２５は吸引状態のままであることから、液滴１２の純水７は、ノズル内へも粒子吸引用ポンプに向かって一部流れている。図７（Ｅ）で、電磁式三方弁２８を切り替えると、粒子捕捉ノズル２５は粒子遊離用加圧ポンプ３０へと繋がり、粒子捕捉ノズル２５内部は大気開放の状態となる。これにより、粒子３５は液滴１２内へ遊離する。大気開放は、制御装置（コンピュータ）３３を用いて液滴の生成間隔と同期させる。同期させるための検出手段として、画像センサや、ラインセンサを用いるのが良い。液滴を直接観察しながら、制御装置３３に信号を送って、大気開放させるようにする。または、第２の液体搬送管内４を流れる液区画の間隔をモニタリングして、規則性を読み取り、そのデータを制御装置３３に送って、タイミングよく大気開放するようにしても良い。また、粒子遊離用加圧ポンプ３０による加圧は、大気開放のためであって、粒子３５を圧力で飛ばすわけではない。従って、粒子捕捉ノズル２５と粒子遊離用吸引ポンプ３０間の配管の長さと、配管の内径を考慮して、加える圧力と圧力印加時間を予め設定しておく必要がある。【００５０】
図７（Ｆ）と図７（Ｇ）は、液滴１２に内包された粒子３５が、第２の液体搬送管４へ搬送される様子を示す模式図である。内包された粒子３５は、液滴１２の表面張力と内圧により外へ放出されることなく、安定に第２の液体搬送管内４へ導入される。図７（Ｇ）は、第２の液体搬送管４内を粒子３５が、液区画１３と共に搬送されている様子を示している。【００５１】
図７（Ａ）〜図７（Ｇ）で説明した動作工程により、確実に、粒子３５を１個ずつ操作し、第２の液体搬送管４内へ導入することができる。本工程を粒子収納プレート２０の収納部１９ごとに１個ずつ粒子３５を操作していくことで、粒子アレイを作製できる。３８４穴マイクロタイタープレートを用いれば、３８４種類の多項目検査用粒子アレイを作製できる。【００５２】
図８は、第２の液体搬送管４となる粒子アレイ容器をマイクロ流路チップ３６に置き換えた一例を示している。これにより、マイクロ流路チップ３６内にも図７の方法で、粒子アレイを作製できる。マイクロ流路チップ３６の詳細は図示していないが、一般的に、ウェットエッチング等により表面に粒子配置流路をパターニングした石英ガラスやパイレックス（登録商標）製のスライドガラスあるいはＰＤＭＳからなる基板に、加工していないスライドガラスを密着させ、接着することにより作製したものを言う。粒子配置流路は、粒子が１個だけ通過できる断面積を有し、第３の液体搬送管３１側の配置流路末端領域には、粒子が流出しないようにするための堰が設けられている。堰と粒子配置流路の流路壁の間には、流路を閉塞しないように隙間が設けられている。
【実施例３】
【００５３】
図９と図１０は、図６、図７で説明した粒子操作手段を並列化した装置形態を示す２つの例である。【００５４】
図９は、５本の粒子捕捉ノズル２５を粒子捕捉ノズル設置治具２６に設置している。粒子捕捉ノズル２５は、ｘ−ｚ平面に平行で、ｘ軸方向にある一定の間隔で並んでいる。また、これらの開口部は全てｚ軸方向で同位置にある。また、第１の液体搬送管３と第２の液体搬送管４も各々５本設置している。第１の液体搬送管３と第２の液体搬送管４は、ｘ−ｙ平面に平行で、ｘ軸方向にある一定の間隔で並んでいる。また、これらの開口部は全てｙ軸方向で同位置にある。５本の粒子捕捉ノズル２５と５本の第１の液体搬送管３と５本の第２の液体搬送管４は、各々が、同一のｙ−ｚ平面上に存在するように設置してある。５本の粒子捕捉ノズル２５の中心軸の延長上に、エアーギャップ１１と粒子収納プレート２０上の５つの収納部１９の開口部の位置がそれぞれ対応している。【００５５】
図１１は、ｘ−ｙ平面上に５本並べた第２の液体搬送管４内に粒子３５が並んでいく様子を示している模式図である。まさに、８個目の粒子３５が液区画１３に内包されながら、導入されるところである。このように、図９の粒子操作手段並列化により、８種類の粒子３５を配列した粒子アレイを第２の液体搬送管４内に５本同時に作製することが可能となる。本実施例では、簡単のため、５×８の収納部を持つ粒子収納プレート２０で説明しているが、実際には、粒子収納プレート２０に３８４穴タイタープレートを使用し、粒子捕捉ノズル２５、第１の液体搬送管３、第２の液体搬送管４を各１６本用意する。これにより、２４種類の粒子３５を配列した粒子アレイを１６本同時に作製できるようになる。もちろん、２５種類以上のたくさんの異種粒子を第２の液体搬送管４内に並べたい場合、粒子収納プレート２０を第２の電動アクチュエータ２３上に複数枚、設置すれば良い。【００５６】
図１０は、第１の液体搬送管３と第２の液体搬送管４をさらに複数本、まとめてｎ層配置した一例である。図は、簡単のためｚ軸方向に３層積み上げた構造を示しているが、空間が許すかぎり、多くの層を積み上げることが可能である。例えば、粒子収納プレート２０に３８４穴タイタープレートを使用し、粒子捕捉ノズル２５を１６本使用することにより、ユーザは一回のセッティングで、１６×ｎ本の粒子アレイを自動で作製できるようになる。
【実施例４】
【００５７】
図１２と図１３は、図６、図７で説明した粒子操作装置において、一本の粒子捕捉ノズル２５と一本の第１の液体搬送管３に対して、粒子アレイとして使用する第２の液体搬送管４を並列化した装置形態を示す２つの例である。【００５８】
図１２の説明を簡単にするため、第１の液体搬送管３と３本の第２の液体搬送管４を９０°間隔で並べたｘ−ｙ同一平面で切り取った断面図を図１４（Ａ）〜図１４（Ｄ）に示す。第１の液体搬送管３と第２の液体搬送管４の外径、さらにエアーギャップ１１距離にも関係するが、これらの搬送管は１５°刻みの間隔で、最大２４本まで設置可能である。もちろん、規則的に均等な間隔でこれらを並べる必要はない。【００５９】
図１４（Ｂ）は、液滴に内包された粒子３５を第２の液体搬送管３７に導入している状態を示している。一方、図１４（Ｃ）は、液滴に内包された粒子３５を第２の液体搬送管３８に導入している様子を示している。図１４（Ｂ）と図１４（Ｃ）のような粒子の分取制御は、第２の液体搬送管４に連結された吸引ポンプ６の制御により変更できる。これらの制御は、タイミングコントロール機能を有する専用のソフトウェアをもとに制御装置（コンピュータ）３３で行う。具体的には、図１４（Ｂ）では、第２の液体搬送管３７のみが陰圧状態であり、図１４（Ｃ）では、第２の液体搬送管３８のみが陰圧状態になっており、その時、他の第２の液体搬送管４は、図１２に示したバルブ６０を独立に制御して閉回路を形成することにより、吸引ポンプ６による陰圧化を遮断している。図１４（Ｄ）は、第２の液体搬送管３７から反時計周りに順番に粒子アレイを作製している様子を示す模式図である。【００６０】
図１２と図１４で説明した装置形態の特徴は、粒子収納プレート２０の収納部１９内の全ての粒子３５を第２の液体搬送管４内に配列できることである。例えば、粒子収納プレート２０に３８４穴タイタープレートを使用し、第１の液体搬送管３を一本、第２の液体搬送管４を各２３本用意する。これにより、３８４種類の粒子３５を配列した粒子アレイを２３本同時に作製できるようになる。もちろん、３８５種類以上の異種粒子を並べたい場合には、粒子収納プレート２０を第２の電動アクチュエータ２３上に複数枚、設置すれば良い。【００６１】
図１３は、第１の液体搬送管３と第２の液体搬送管４をさらに複数本、まとめてｚ軸方向にｎ層配置した一例である。図は、簡単のためにｚ軸方向に２層積み上げた構造を示しているが、空間が許すかぎり、さらに多くの層を積み上げることが可能である。これにより、ユーザは一回のセッティングのみで、２３×ｎ本の粒子アレイを自動で作製できるようになる。
【実施例５】
【００６２】
本実施例では、図９の装置を用いた、ＤＮＡの検出を目的とした粒子アレイの作製と、作製した粒子アレイを用いた反応実験と蛍光検出実験の一例を示す。【００６３】
まず、図１５を用いて、表面に生体分子を固定した粒子の調製方法について説明する。ｍ×ｎ個の収納部１９を有する粒子収納プレート２０と、粒子群と、粒子３５を修飾する複数種のＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質等の生体分子プローブとを用意する。用意する粒子収納プレート２０上の収納部１９は、ｘ方向に第１の中心間隔で等間隔に配置されており、ｘ方向と直交するｙ方向に第２の間隔で等間隔に配置されている。収納部１９は円形の上部開口を持ち、ｚ方向に平行な中心軸を持ち、底部を持つ円柱、又は円錐の穴の形状をしている。このような複数の収納部１９を有する粒子収納プレート２０としては、市販の９６穴マイクロチタープレートや３８４穴マイクロタイタープレートを用いることができる。粒子３５のサイズは、ガラス製の粒子捕捉ノズル２５に用いる場合、好適には直径１０μｍ以上の球状のものを使用するのが好ましい。【００６４】
粒子容器３９から、薬さじを用いて粒子収納プレート２０の各収納部１９に、数ｍｇ単位で用意した粒子３５を分配し、収納部１９の１列を単位として、又は各収納部１９に、異なる種類のプローブを導入して、全ての粒子表面にプローブを固定させる。これにより、収納部１９の位置によりプローブの種類が対応づけられたプローブＤＮＡ固定化粒子４０を複数種保持した粒子収納プレート２０を用意できる。【００６５】
本例では、ｎ種類の生体分子プローブを用意し、第１列のｍ個の収納部にはＮｏ.１の生体分子プローブを、第２列のｍ個の収納部にはＮｏ.２の生体分子プローブを、‥‥、第ｎ列のｍ個の収納部にはＮｏ.ｎの生体分子プローブを導入して、各収納部１９に収納された粒子３５にプローブを固定した。粒子収納プレート２０は、粒子３５に固定したプローブがＤＮＡ等の化学的に比較的安定な生体分子の場合、一度作製した粒子収納プレート２０をデシケータ内で保存、もしくは冷蔵庫で保存できるため、作り置きが可能である。各収納部１９に純水等の溶液を導入した粒子収納プレート２０は、図９の粒子配列装置のプレート設置治具２１に設置され、図７で説明した動作工程により粒子アレイを作製する。【００６６】
図１６は、本実施例により、ｍ×ｎ個の収納部１９を持った粒子収納プレート２０を用いて得られるｍ本の粒子アレイ容器４１の例を模式的に示した断面図である。粒子アレイ容器４１とは、第２の液体搬送管４のことである。この段階では、粒子アレイ容器４１内に導入した粒子３５がこぼれ出さず、且つ、整然と配列された状態を保つように、粒子アレイ容器４１の内径を外径とする中空の細管を持つ第２のソケット４２を開放端側に挿入する。これにより、第１のソケット３２と第２のソケット４２で、粒子アレイを挟みこんで粒子の移動を阻止できる。【００６７】
次に、粒子を用いたＤＮＡプローブアレイで、ハイブリダイズさせる使用例を図１７（Ａ）、図１７（Ｂ）を参照して説明する。【００６８】
まず、粒子収納プレート２０に３８４穴マイクロタイタープレートを使用し、図９の粒子操作装置を用いて、２４種類のＤＮＡ固定化粒子を順番に配列し、１６本の粒子アレイ容器４１内に粒子アレイを同時作製した。【００６９】
図１７（Ａ）、図１７（Ｂ）では、塩基配列の異なる２４種類の５’−チオール基修飾した１８ベースの合成オリゴヌクレオチドの２４種類のプローブＤＮＡのうち、配列１を有する一本鎖ＤＮＡプローブ４３を固定した粒子及び配列２を有する一本鎖ＤＮＡプローブ４４を固定した粒子をそれぞれ有する粒子アレイ容器４１に、配列１に相補的なＣｙ３標識した配列３を有する一本鎖ターゲットＤＮＡ４５及び配列２に相補的な配列４を有するTexasRed標識した一本鎖ターゲットＤＮＡ４６を含む試料を流して、プローブＤＮＡにターゲットＤＮＡが意図のとおりに結合するかどうかを検証した。【００７０】
（配列１）5’-thiol-ATCTGACT・・・GCTCCTC-3’
（配列２）5’-thiol-CTACCTGC・・・CTGGACG-3’
（配列３）5’-Cy3-GAGGAGCC・・・GTCAGAT-3’
（配列４）5’-TexasRed-CGTCCAGG・・・CAGGTAG-3’
一本鎖ターゲットＤＮＡ４５と一本鎖ターゲットＤＮＡ４６をそれぞれ１μＭの濃度で含んだ２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）溶液４７を、図１７（Ａ）に示すように、ＤＮＡプローブアレイが作製されている粒子アレイ容器４１内に流し、４５℃でハイブリダイゼーション反応を行った。送液は、シリンジポンプを用いて行った。反応後、ハイブリダイゼーション反応に寄与しなかった残留ターゲットＤＮＡを２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）溶液４７と純水で順に洗浄し乾燥させた。その後、水銀ランプを光源とし、Ｃｙ３とTexasRedの発光波長を中心としたＣｙ３用ロングパスフィルターとTexasRed用ロングパスフィルターを順に用いて、粒子アレイ容器４１内の各粒子を蛍光顕微鏡４８により観察した。【００７１】
その結果、図１７（Ｂ）に示す通り、並んだ粒子のうち、所定の粒子がＣｙ３の蛍光４９を、さらに他の所定の粒子がTexasRedの蛍光５０をそれぞれ発しているのを観察した。このことは、一本鎖ＤＮＡプローブ４３に対して一本鎖ターゲットＤＮＡ４５が、一本鎖ＤＮＡプローブ４４に対して一本鎖ターゲットＤＮＡ４６が確実にハイブリダイズしたことを示しており、この粒子操作装置により、任意の順列で、プローブに影響を与えず、粒子アレイ容器４１内にＤＮＡプローブアレイを作製できることを確認した。
【実施例６】
【００７２】
血液や血清等の試料中に含まれる成分量を検出する分析装置として、ハロゲンランプ等からの白色光を試料と試薬との混合液である反応液に照射し、反応液を透過してきた光を回折格子で分光して必要な波長成分を取り出し、その吸光度を割り出すことで目的の成分量を測定する分光分析技術があるが、近年、試薬コスト削減のため、微量化のニーズが高まってきている。本実施例では、被搬送物に微量液体を用いた例について説明する。【００７３】
図１８（Ａ）から図１８（Ｅ）は、オイル滴５１中に微量液体５２を内包して、搬送する様子を示す模式図である。図１８（Ａ）は、まさに、第１の液体搬送管３からオイル滴５１が形成される直前を示している。図１８（Ｂ）は、第１の液体搬送管３の液体流出口９からオイルが流出し、オイル滴５１がエアーギャップ１１に生成されたところである。図１８（Ｃ）は、オイル滴５１内に向かって、液体分注ノズル５２から吐出した微量液体５３が、オイル滴５１に内包される様子を示している。図１８（Ｄ）から図１８（Ｅ）に示すように、内包された微量液体５３はオイル滴５１内に保持されたまま、第２の液体搬送管４内に運搬される。【００７４】
液体分注ノズル５２からの微量液体５３の吐出タイミングは、制御装置（コンピュータ）３３を用いてオイル滴５１の生成と同期させる。同期させるための検出手段として、画像センサや、ラインセンサを用いるのが良い。オイル滴５１を直接観察しながら、制御装置３３に信号を送って、微量液体５３を吐出させるようにする。または、第２の液体搬送管４内を流れるオイル区画の間隔をモニタリングして、規則性を読み取り、そのデータを制御装置３３に送って、タイミングよく微量液体５３の吐出するようにしても良い。【００７５】
図１９は、本発明の微量液体操作装置の一例を示す模式図である。図では、２箇所にエアーギャップ１１を挿入した例であり、液体容器１から搬送してきたオイル滴５１中に、試料液滴５７と試薬液滴５８をエアーギャップ１１部で供給することができる。第１の液体搬送管３、第２の液体搬送管４、検出セル用液体搬送管５４には、第１の送液ポンプ２、第２の送液ポンプ１５、第３の送液ポンプが備え付けてあり、液区画を保持しながら搬送できるようになっている。各管の流速条件は、Ｖ１＜Ｖ２≦Ｖ３であり、これらの制御にはペリスタポンプを使用するのが簡便である。【００７６】
検出セル用液体搬送管の一部の検出領域には、光源５５と検出器５６が設けられており、オイル滴５１内で混合された試料液滴５７と試薬液滴５８の混合液５９の吸光度を測定する。ここでは、簡単のため、分光器や集光レンズは図から省略している。本実施例でオイル滴５１を使用した理由は、搬送管中でのコンタミネーションや、連続計測の際のクロスオーバーを防ぐためである。オイルを使用することで、試料や試薬が搬送管の壁に吸着することを防ぐことができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７（Ａ）】
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【図７（Ｂ）】
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【図７（Ｃ）】
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【図７（Ｄ）】
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【図７（Ｅ）】
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【図７（Ｆ）】
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【図７（Ｇ）】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４（Ａ）】
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【図１４（Ｂ）】
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【図１４（Ｃ）】
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【図１４（Ｄ）】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７（Ａ）】
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【図１７（Ｂ）】
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【図１８（Ａ）】
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【図１８（Ｂ）】
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【図１８（Ｃ）】
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【図１８（Ｄ）】
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【図１８（Ｅ）】
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【図１９】
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