(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の性質：
ａ）旬平均気温６℃、その旬の最低気温−１℃以下で、最低気温−１５℃以上において、緑葉を保ち、通年にわたってアントシアニンを実質的に含有せず；
ｂ）土表面に密着して障害物のない生長条件で、伸びているほふく茎の主枝先端の未成熟な節間を除いた節間長が、在来鳥取コウライを１．０としたとき、０．９〜０．６であり；
ｃ）土表面に密着して障害物のない生長条件で、伸びているほふく茎において、少なくとも主枝先端より２０節以上に相当する主枝長を基準として主枝から生じる側枝合計長を測定し、主枝長と側枝合計長の比が、在来鳥取コウライに比し１．２倍以上であり；
ｄ）２８±３℃、旬間積算日照時間５０時間以下においても、ほふく茎を伸長する
ことを特徴とするコウシュンシバ。
【請求項２】
交配、変異、細胞融合または遺伝子導入により請求項１に記載のコウシュンシバを親株として作出される、請求項１に記載の特徴を継承するスズメガヤ亜科植物。
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、従来の交配、細胞融合、遺伝子導入等に依らず、単一のコウシュンシバ（学名：Ｚｏｙｓｉａ ｍａｔｒｅｌｌａ：一般名：コウライシバ）系統（親株）に、遺伝的変異を加えることにより、新たに作出された、従来のコウシュンシバの特徴を維持しつつ全く新しい形質を加えた新規なコウシュンシバ品種に属する植物に関する。即ち冬期、従来のコウシュンシバが緑色を失う期間においても同条件下で緑色を保つ新規なコウシュンシバに関する。また本発明は、冬期に緑色を保つと共に、通常の栽培条件においてアントシアニンを実質的に生じないコウシュンシバ、ほふく茎密度が高いコウシュンシバ、高温、低日照下でもほふく茎を伸長させるコウシュンシバ、矮性であるコウシュンシバ、並びに本発明のコウシュンシバが有する新たに発明された、従来のコウシュンシバ系統にない遺伝形質を利用して開発されたスズメガヤ亜科植物に関する。
発明の背景
本発明でいうコウシュンシバとは、栄養生長によるほふく性を有するＺｏｙｓｉａ ｍａｔｒｅｌｌａであって、葉幅が１．０〜３．５ｍｍで、Ｚｏｙｓｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ、Ｚｏｙｓｉａ ｔｅｎｕｉｆｏｌｉａ、Ｃｙｎｏｄｏｎ ｄａｃｔｙｌｏｎ等の他種との人工的交配による種間雑種系統を含まない（福岡壽夫著、浅野義人、青木孝一編「芝草と品種」ソフトサイエンス社  平成１０年６月１５日発行、第１２２〜１２３頁参照）。
コウシュンシバ（学名：Ｚｏｙｓｉａ ｍａｔｒｅｌｌａ、一般名：コウライシバ）は、美観、土壌被覆力、管理の容易さ、擦り切れ耐性、水ストレス耐性、生長力、ほふく性など多くの特徴を有し、広範な用途で、グラウンドカバーとして多用されている。
しかしながら、コウシュンシバは冬期の葉枯れ、強い頂芽優先生長、アントシアニンによる美観の阻害、日照不足時や山間・木陰での生長の鈍化などいわゆる耐陰性が弱く、また強い生長性に基づく夏期刈り込み頻度の増大等の欠点を有しており、この為市場ニーズを満足できないばかりか、用途上の限定もある。
即ち、美観を重視する用途、たとえば、スポーツターフ、公園・工場緑地・施設外構などの広場、屋上断熱緑化、庭園などにおいては、冬期の葉枯れは著しくコウシュンシバの価値を損ね、「一年中緑のコウシュンシバ」は多くの用途で永く夢とされ、極めて強い市場ニーズが存在している。
コウシュンシバやバーミューダグラス（Ｃｙｎｏｄｏｎ ｄａｃｔｙｌｏｎ）の冬期の葉枯れをカバーするために、多くのスポーツターフ等ではオーバーシード法（冬期の緑葉を保つため、初秋にコウライ芝地やバーミューダグラス芝地の上に寒地型芝である洋芝を重ね播きし、春に洋芝を枯死せしめてコウシュンシバやバーミューダグラスを再萌芽させる方法）、枯れ葉着色法（コウシュンシバの枯れ葉を緑色の顔・染料で着色する方法）が実施されているほどである。しかし、これらの方法は、毎年の経費投資を要し、著しいコスト高を招き、ゴルフ場等スポーツターフでは適用されることもあるが、その他の多くの分野では、実際的には実施困難であり、又オーバーシード法ではコウシュンシバそのものが年々弱ってしまうという欠点がある。
また、省エネルギー、炭酸ガスの固定などに有効とされている屋上断熱緑化の分野でも、コウシュンシバの冬期の葉枯れは致命的な欠点とされている。
さらに、コウシュンシバやバーミューダグラスの冬期の葉枯れは、踏圧等による、いわゆる擦り切れによる裸地化を起こしやすく、また、従来のコウシュンシバでは冬雑草及び春季萌芽雑草が発生しやすく、これらによる芝地荒廃も進みやすく、欠点の一つとされている。
また上記のようなオーバーシード法や枯れ葉着色法のような物理的方法のほかに、スズメガヤ亜科芝の冬期の葉枯れ期間の短縮は次のようにして行われてきた。
（イ）鉄剤の散布：鉄の吸収により葉緑素の合成が促進され植物体の緑度が増加する。
（ロ）窒素肥料の散布：この方法は初冬の緑色維持には有効であるが、逆に春の萌芽を遅延させることになり、冬期の葉枯れ期間はさほど短縮できず、好ましい方法ではない。
（ハ）５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）の散布：葉緑素を増加させる効果が報告されている（「５−アミノレブリン酸の微生物生産と芝草への応用」堀田康司、田中徹、渡辺圭太郎、竹内安智、近内誠登「芝草研究」大会誌  第２７号  １９９８年第１３８〜１３９頁）。
（ニ）育種学的方法：Ｚｏｙｓｉａ ｍａｔｒｅｌｌａとＺｏｙｓｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ等を交配するなどして冬期の葉枯れの問題の解決が試みられている。更に世界各地の系統収集・選抜により、冬期の葉枯れの少ない系統を選抜するなど、遺伝的形質のより好ましい品種系統を得ようとの試みも為されている。（例えば福岡壽夫著、浅野義人、青木孝一編「芝草と品種」第３章３−２、第１２６〜１３０頁ソフトサイエンス社）。しかしながら前者Ｚｏｙｓｉａ ｍａｔｒｅｌｌａと他の種との交配の場合、コウシュンシバの特徴を保持しにくく、得られた品種はＺｏｙｓｉａ ｍａｔｒｅｌｌａに比して、例えば葉幅が広く、美観上劣り、冬期の葉枯れも十分には解決されていない。一方後者の系統収集による方法においても、未だ冬期に十分な緑色を保つコウシュンシバは見出されていない。
発明の開示
本発明は旬平均気温６℃、その旬の最低気温−１℃以下で、最低気温−１５℃以上において、緑葉を保ち、通年にわたってアントシアニンを実質的に含有しないことを特徴とするコウシュンシバに関する。
更に、本発明は土表面に密着して障害物のない生長条件で、伸びているほふく茎の主枝先端の未成熟な節間を除いた節間長が、在来鳥取コウライ（鳥取県芝生産組合：日本国鳥取県東伯郡東伯町大字徳万５５８−１の生産販売するコウシュンシバの代表的系統）を１．０としたとき、０．９〜０．６であることを特徴とする前記のコウシュンシバに関する。
更に、本発明は、土表面に密着して障害物のない生長条件で、伸びているほふく茎において、本発明品の少なくとも主枝先端より２０節以上に相当する主枝長を基準として主枝から生じる側枝合計長を測定し、主枝長と側枝合計長の比が、在来鳥取コウライ芝に比し１．２倍以上であることを特徴とする前記それぞれのコウシュンシバに関する。
また、本発明は、２８±３℃、旬間積算日照時間５０時間以下においても、ほふく茎を伸長することを特徴とする前記それぞれのコウジュンシバに関する。
更に、本発明は、交配、変異、細胞融合または遺伝子導入により上記いずれかのコウシュンシバを親株として作出される、上記いずれかに記載の特徴を継承するスズメガヤ亜科植物にも関する。
本発明の新規なコウシュンシバは、親株（在来鳥取コウライ）やノシバ（Ｚｏｙｓｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ）等に比して、著しく側枝伸長性が高く、このため、ほふく茎密度が高まり、重層網目状マットが早期に形成されやすく、実用上のメリットが著しく増大する。
前記重層網目状マットの形成は、
▲１▼コウシュンシバは実用上種子繁殖が難しい（栄養繁殖）ため、生産圃場において、毎年上層を１〜２ｃｍはぎ取って収穫し、マットの残った部分から再増殖して翌年再び収穫できる方法をとっており、生産性の向上に関係する、
▲２▼擦り切れにくい、
▲３▼上層部が削り取られても（例えば、ゴルフ場デボット）再生が早い、
▲４▼スポーツターフにおいては、緩衝性が高まる、
▲５▼耐乾燥性向上（保水力、吸水力、貯蔵水分）、
▲６▼法面、河川敷等に必須の被覆力が大幅に向上し、従って、表土層の保護に寄与、
▲７▼緻密で美しい芝面が得られる、
▲８▼緻密なターフの形成により雑草を抑制できる、
などのメリットを有するものである。
また従来のコウシュンシバは茎部においては、年間を通じ、アントシアニンを生成、発色し、日平均気温が概ね１０℃以下では、わずかに残った生葉においてもアントシアニンが生成、発色し、赤紫色、濃緑紫色ないし黒紫色を呈し、美しい緑の景観を著しく損なうものであった。しかしながら本発明はコウシュンシバで初めて、アントシアニンを実質的に含まない品種であり、以上の課題を解決している。
ゴルフ場のフェアウエーなど高品質の芝面を確保するためには、高温生長期には、週２−３回程度の刈り込みを必要とし、刈り込み回数を少なくするために生長抑制剤をわざわざ散布するところもあるほどである。この場合管理コストの著しい上昇をも招いている。本発明のコウシュンシバはこれらについても改善が見られるものである。
さらに従来のコウシュンシバは山間、樹林陰、構造物などによって直達日射時間が短縮されるような状況においては、生長に十分な温度であっても、ほふく茎の伸長が抑制され、芝面が荒れるという問題があった。
本発明のコウシュンシバは高温、低日照時においても著しい改善が見られ、実施例３の「冬期温室におけるＴＫ−ＸＧ１の生長」で顕著に示されるように、日照時間が短くても、生長に必要な温度条件が確保されれば、ほふく茎の伸長は顕著に見られ、従来のコウシュンシバの問題を解決することができた。
本発明は、冬期に緑葉を保つと共に、アントシアニンを通年にわたり実質的に含有しない新規なコウシュンシバ、矮性であるコウシュンシバ、ほふく茎密度が高いコウシュンシバ、高温、低日照下でもほふく茎を伸長させるコウシュンシバ及び本発明により新たに開発されたコウシュンシバを用い、その遺伝形質を導入したスズメガヤ亜科植物を提供することを目的とする。
本発明において「冬期」とは、本発明の出発材料である在来のコウシュンシバが、一般実用的な露地栽培利用条件において、緑葉を減じて被覆域総体として褐変ないし枯草色化して見える低温期間を指し、例えば海水化学工業株式会社の研究圃場においては、１月上旬には在来鳥取コウライは葉枯れを生じ被覆域全体として枯草色化した。
実験を行った１９９９年１月上旬の旬平均気温は６．６℃、最低気温−０．８℃であった。同研究圃場における１９９８年１２月中旬〜１９９９年３月上旬の気象状況を表１に示す。
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年により気温の変動パターンが異なることを考慮すると、旬平均気温が６℃前後、旬最低気温が−１℃以下となる条件を冬期と規定した。また、圃場実験では、下限温度の評価ができなかったため、実施例３、図１２で示す如くハードニング試験を実施し、下限温度は−１５℃であることがわかった。
また、「緑葉を保つ」とは、在来のコウシュンシバのごとく、冬期において褐色ないし枯草色化したり、わずかに残る生葉においても赤紫色、濃紫緑色ないし黒紫色化したりすることなく、緑色ないし黄緑色を保ち、これを被覆域総体として見ても明瞭に、緑地と認めうる状況を保つことを意味する。
本発明において「通年にわたり」とは、在来のコウシュンシバが、茎、葉及び穂で季節に応じてそれぞれにアントシアニンを含有・発色し、赤紫色、濃緑紫色ないし黒紫色となる時期及び地方においても、本発明の品種は、年間を通じ、茎、葉及び穂が緑色ないし黄緑色を維持することを意味し、「実質的に含有しない」とは、地上部において目視によって赤紫色、濃緑紫色ないし黒紫色の発色が認められないのみならず、後述の実施例に示すように、在来のコウシュンシバがアントシアニンを含有発色する季節及び各部位での分析の結果によっても皆無（検出できない）ないし痕跡程度にしか、アントシアニンが含有されていないことを意味する。
本発明において「主枝先端の未成熟な節間」とは、茎頂を含む主枝先端部において節間が生長途上にある部分をいう。
本発明において「親株」とは交配、変異、細胞融合または遺伝子導入の際に、出発材料として用いる株を意味する。
実施例５に示すように、本発明のコウシュンシバＴＫ−ＸＧ１は、高温、低日照下においても、ほふく茎生長が続く。これは、例えば気温２８±３℃、旬間積算日照時間５０時間以下においても、ほふく茎を伸展することを意味する。一般に、コウシュンシバにおいては、気節、天候及び障害物等により日照時間が短くなるとほふく茎の生長が抑制または停止し、このため芝面の荒廃、退化が生じる。或いは、直達日射が障害物によって遮られ、生長には十分な温度があるにも関わらず、ほふく茎が十分には伸長しないため、年々、芝面が退化し、消失していく。本発明品によればこれらの問題を改善することができる。
前述のように芝植物において、冬期の緑色度を高める目的で、耕種的方法が行われ、休眠期間の短縮を目的に交配が試みられてきた。しかしながらこれらの方法によって得られた結果は市場のニーズを満足させるものとはなっていない。
従来のコウシュンシバは、栽培地域や品種系統によってその程度はまちまちであるが、いずれにせよ冬期の葉枯れを起こして褐変し、わずかに生きている部分も葉緑素が減少し、かつアントシアニンを大量に蓄積するので黒紫色になってしまう。よって冬期の緑度を向上させるためには、生葉の増加や、葉緑素の分解を抑制し、かつアントシアニンの生成を抑制することが必要であると同時に、霜により生葉が凍結しやすかったり、著しいクロロシス（クロロフィルの分解）を起こしたりしないことが必要で、また、低温での生長停滞期において耐擦り切れ性が高いことが望ましいが、従来の手法によって得られたコウシュンシバでは本発明が目的とする特性はまだ得られていない。本発明では従来のコウシュンシバに冬期に緑葉を保つような遺伝的変異を加え、更にアントシアニン蓄積をしないようにするような遺伝的変異を加えた他、請求項２ないし４に示す親株にない全く新しい遺伝形質を発現する遺伝的変異を持つ系統を作出することに成功した。
本発明のコウシュンシバは以上のように明確な変異を母材に加えたものであり、細胞変異、紫外線照射、Ｘ線照射等の変異方法の組合せ及び、苗条原基様体の形成及び利用、変異処理細胞の選抜方法を含む一連の独自技術体系は目的に応じて方向性をもった変異株を作出しようとするプロセスであって、葉幅か細く、霜による凍結葉枯れがない等のコウシュンシバの特徴を残しつつ、▲１▼コウシュンシバとして低温常緑性、▲２▼実質的にアントシアニンを含有しない、▲３▼節間長が短いこと、▲４▼側枝生長性が高いこと、▲５▼高温、低日照下でほふく茎生長が続くこと、という全く新しい遺伝形質を創出したものであり、自然交雑、人工交配、細胞融合、遺伝子導入、野生系統の選抜等の従来の手法に依らずに作出されたものである。また、これらの遺伝形質は固定されており、他の品種系統から移転・導入した遺伝形質ではなく全く新しいコウシュンシバの遺伝形質である。従って本発明品種を用いて再度変異を加えたり、他の遺伝子を導入したり、或いは交配等の従来の各種手法によりこの品種を用いてこの品種の持つ新しい遺伝形質を導入した、本発明の特徴を有するスズメガヤ亜科植物は、この発明の範囲に含まれるものである。
発明の詳細な説明
上記のように従来の技術、即ち従来のコウシュンシバ品種・系統の有する各種の課題を解決するために本発明においては従来のコウシュンシバに意図的に変異を加え、固定された新しい遺伝形質を有せしめることに成功した。その作出方法等について以下に述べる。
作出方法
コウシュンシバの完熟種子の胚組織、未熟種子の胚組織、頂芽の生長点、腋芽の生長点、茎頂組織のいずれかをアルコールや塩素系の殺菌剤により殺菌した後に、細胞組織を採取し、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸やインドール酢酸などの植物生長調節物質を添加したムラシゲ・スクーグ培地などに植床し、無菌状態で暗条件もしくは明条件により、前記培地を静置あるいは振動を与えて培養することで苗条原基様体を得（特開平６−１０６４２７号公報参照）、この苗条原基様体に、紫外線、軟Ｘ線、ガンマ線などの高エネルギー線を照射または突然変異物質による浸漬処理により、遺伝子の変異を誘発させ、さらに、これを前記ムラシゲ・スクーグ培地などに植床して培養を継続し、次にこれを低温感受性の差により選抜し、さらに植物生長調節物質を含まないムラシゲ・スクーグ培地などに植床すると、植物体に再生し苗へと育てることができる。この苗を育成する。馴化は極めてスムーズに進行する。
前記苗条原基様体は、表層構造を有したドームを形成し、表層構造を形成しないカルスとは異なるものである。また、この苗条原基様体は、苗条原基様体を得た条件で培養を続けることによって集塊を形成し、更に、これを植物生長調節物質を含まない前記固体培地に植床して培養を続けることにより、植物体へと再生できるものである。
また、突然変異誘発物質による浸漬処理とは、液体培地や緩衝液等に突然変異誘発物質を添加溶解して、前記苗条原基様体を浸漬させて突然変異を誘発するものである。その変異を誘発する突然変異誘発物質には、５−ブロモ−２’−デオキシウリジン、エチルメタンサルホネート（ＥＭＳ）、エチレンイミン（ＥＩ）、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、Ｎ−ニトロソ−Ｎ’−メチル−ウレア（ＭＮＨ）、ジエチル硫酸、１，２−エポキシブタン、２，３−エポキシプロピオニックアルデヒド、８−アザグアニン、５−ブロモウラシル、アクリジンオレンジ、ＩＣＲ−１０、アクリフラビン等が用いられる。
実施例１
苗条原基様体の作成
コウシュンシバの代表系統である、前記鳥取県芝生産組合が生産販売する、在来鳥取コウライの茎頂組織が含まれるほふく茎の頂芽を採取し、７０％（Ｖ／Ｖ）のエタノール水溶液で手早くすすぎ、続いて１％（Ｖ／Ｖ）次亜塩素酸ソーダ水溶液中で１５分間ゆっくり振盪しつつ殺菌し、滅菌水で充分水洗した後、無菌室で無菌操作により、この茎頂組織を無菌状態の容器中の固体培地に植え付けた。その固体培地としては、ムラシゲ・スクーグ培地１０００ｍｌに蔗糖３０ｇと寒天７ｇとを加えた基本培地に、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸を２ｍｇ添加し、ｐＨを５．８に調整したものを用いた。続いて２５℃、暗条件下で培養した。培養開始後、約２週間で誘導体としての苗条原基様体を含むカルス塊を得た。苗条原基様体部分を切り出し、同様の方法で継代培養し、純粋な苗条原基様体の集塊を得た。
照射による変異処理
直径９０ｍｍのプラスチックシャーレに、蔗糖３％、寒天０．８％の植物生長調節物質を含まないムラシゲ・スクーグ培地２０ｍｌを用いて平板を作った。直径２−３ｍｍの前記苗条原基様細胞集塊を平板当たり約２００個置床し、石英円盤にて蓋をしてテープで封をした。これらの操作は、無菌室での無菌操作により行った。Ｘ線照射装置としてはオーミック株式会社製照射用軟Ｘ線発生装置Ｍｏｄｅｌ  ＯＭ−１００Ｒを用いた。紫外線源としては、波長２５４ｎｍ、紫外線強度１７８０μｗ／ｃｍ２のアトー株式会社製ＨＰ−３０Ｃを用いた。Ｘ線照射強度は６０ＫＶｐ、４ｍＡ，被照射体までの距離５００ｍｍ、Ａｌフィルター０．５ｍｍを使用し、２５時間の照射を行った。装置の一部を改良し、Ｘ線照射箱内に紫外線源を設置し、被照射体より４５ｃｍの距離から、同時に紫外線の照射を行った。一度に６枚の平板を照射処理し、これを１９９５年１０月２日から１０月２０日にかけて、１０回繰り返した。
苗  化
照射処理の終了した平板は２８℃の暗条件下に２日間静置した。続いて、低温培養による選抜を行った。苗条原基様体を、内径８０ｍｍ高さ１２０ｍｍのガラスビン内に作った蔗糖３％、寒天０．８％の植物生長調節物質を含まないムラシゲ・スクーグ平板上に移し、明期１０，０００ルクス１５℃１６時間、暗期１０℃８時間の周期で３ヶ月間培養した。
以上の低温培養によって緑化した苗条原基様体とアントシアニンを蓄積した赤紫色の苗条原基様体が得られた。緑化した苗条原基様体を選別し、内径８０ｍｍ，高さ１２０ｍｍの広口ビン内に作った同じ組成の寒天培地上に移し、２８℃、４，５００〜５，０００ルクスで培養することにより、苗条を生じさせ発根させて苗に育てた。
照射処理した１２，８００個の苗条原基様細胞集塊のうち緑化したものが６，０１７個であり、これから約３００株の植物体が１９９６年３月末までに再生した。
目的とする個体の選抜
以上の操作で得られた苗は、培土組成が真砂土：バーミキュライト：ピートモス（ラメックス社製）２：１：１を含む３号鉢に植え付け、屋外で生長させた。この用土は肥料を含んでいないが、追肥として、１００ｇ当たり窒素５ｇ・リン酸１０ｇ・カリ５ｇを含む液肥（家庭園芸専用肥料：ハイポネックス５−１０−１０  （株）ハイポネックス  ジャパン社）を１０００倍に希釈して、鉢当たり５０ｍｌを１週間ごとに与えた。また、１００ｇ当たり窒素６ｇ・リン酸３８ｇ・カリ６ｇ・マグネシウム１８ｇを含むく溶性緩効性肥料（グリーンマップＩＩ、Ｍ：日本合同肥料株式会社製）を１９９６年９月１２日に鉢当たり１ｇを与えた。灌水は定着までの６ヶ月間、雨天を除き毎日行った。馴化は特別の処置無しに非常に順調に進んだ。除草剤、殺菌剤、殺虫剤の散布は行わなかった。露地栽培は日本国山口県防府市大字浜方５３５番地の海水化学工業株式会社研究用圃場内で行い、冬期の緑葉維持性、生育性、春期の緑化の早晩を調査した。
茎の色の調査は１９９６年５月１６日、８月１０日、１２月２日に目視によって赤紫色色素形成の有無を観察することによって行った。５月１６日にはまだほふく茎は形成されておらず直立茎の色を記録した。その後の２回の調査ではほふく茎の色を記録した。
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第１回の調査で直立茎の色が緑色であるものが６株あったが、これ以後の調査では１株だけが直立茎・ほふく茎ともに赤紫色色素を生じなかった。
冬期の葉の緑色の程度を１９９６年１２月２日から目視で観察し、５段階の基準で評価した。
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葉全体が緑色であるもの・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・５
葉身全体が緑色で、赤紫色、黄色化していない生葉と、
葉身全体が緑色を失い、枯葉となったものが混じっている・・・・・４
葉先の１−２ｍｍが赤紫色化、黄色化したものが混じっている・・・３
葉身の基部だけに緑色が残っているもの・・・・・・・・・・・・・２
株全体に緑色が認められないもの・・・・・・・・・・・・・・・・１
以上の屋外における冬期の選抜で２月１４日においても茎葉に赤紫色色素を生じず、緑葉の程度が段階４である株を、この時点での系統番号４２−２８９とした。
形質の評価
このようにして得られた４２−２８９株は系統名をＴＫ−ＸＧ１と変更して、１９９６年１０月２２日に３基のプランターに移し、温室内で育成し、翌１９９７年６月３０日まで増殖及び観察を行った。１９９７年９月からは、対照７品種と共に圃場に移植し、それぞれ一辺２．０ｍの区画の密植区１ヶ所と個体植区２ヶ所での特性評価を行った。圃場の土壌成分は真砂土と砂を７：３の比で混合したものに、硬質発泡珪藻土焼成粒（イソライト：イソライト工業株式会社製）１００ｋｇ／ｍ３、く溶性緩効性肥料１．５ｋｇ／ｍ３、特殊発酵肥料（マザーソイル：湖東工業株式会社製）１０ｋｇ／ｍ３を混合した。密植区には１苗が５節よりなるほふく茎を１５ｃｍ間隔で８１本植え付けた。個体植区には１苗が５節より成るほふく茎を中央に１本ずつ植えた。施肥量は窒素・リン酸・カリがそれぞれ年間２０ｇ／ｍ２になるように、２月から１１月までの１０ヶ月間に毎月一回均等に散布した。
密植区において、１９９９年２月までに調査した形質を表４に示す。低温期の緑葉維持に関しては、ＴＫ−ＸＧ１が１９９６年５月から１９９９年１１月迄の期間中、緑葉を維持したのに対して、在来鳥取コウライは１１月中旬よりアントシアニンの発色による紅葉化が見られ、１２月下旬には殆どの葉が枯死し、わずかに残った生葉も、濃緑紫色ないし、黒紫色となり、外見上の緑色を失った。また比較に用いたメイヤー、エメラルド、在来ノシバ（Ｚｏｙｓｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ）のいずれも１２月中旬よりアントシアニンによる紫色を発色し、１２月末にはほとんどの葉が枯死状態となった。この発明の当初目標の一つであるアントシアニンを生じないという特徴は目視による観察で明らかであり、又以下に述べるように分析によっても証明されている。又その他の特徴についても安定した形質であることを確認した。
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在来鳥取コウライが赤紫色の穂を有するのに比し、ＴＫ−ＸＧ１は赤紫色を含まない黄緑色の穂を形成する。
調査期間中の海水化学工業の研究圃場の気温を表５に示す。
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アントシアニンについて高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による確認
在来鳥取コウライとＴＫ−ＸＧ１の葉身とほふく茎を別々に採取し、ほふく茎はさらに節の部分を切り落とし節間だけとし、アントシアニン分析用の試料として用いた。精秤の後海砂を加えて磨砕し、抽出溶媒として０．１％塩酸メタノール３０ｍｌを加えて一昼夜放置した。抽出液をＮｏ．２濾紙で濾過し、更に抽出溶媒を加えて５０ｍｌとした。ＨＰＬＣ（Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：高速液体クロマトグラフィー）による測定の場合は、メンブレンフィルター（０．４５μｍ）により濾過したものを用いた。溶出溶媒として、４％燐酸水溶液（Ａ液）とアセトニトリル（Ｂ液）を用いた。カラム平衡化はＡ液９０％、Ｂ液１０％で行い、１０μｌのサンプルを加えると同時に、Ｂ液の割合を直線的に増加させ、４０分後にＡ液７０％Ｂ液３０％となるようにした。送液量は１ｍｌ／分、カラム温度４０℃、カラムはＮＡＫＡＲＡＩ、ＣＯＳＭＯＳｉｌ、ＯＤＳ−Ｃ１８を用いた。検出は５３０ｎｍの吸光度を測定することで行った。
色素骨格の分子種を調べる目的で、抽出液に塩酸を加えて酸性とし、１００℃で６０分加熱し、加水分解により糖鎖を取り除き、ＨＰＬＣによる分析を行った。溶出溶媒はＡ液８３％Ｂ液１７％の一定濃度とした。
１９９７年１１月１０日に在来鳥取コウライのほふく茎の抽出物をＨＰＬＣで分析したところ１６．９３０分と２０．７５０分に主要な２つのピークがあった（図１−９７１１１０）。
アントシアニン分子のアグリコンを同定するためにサンプルを加水分解して、ＨＰＬＣ分析を行うと、６．９５０分の位置に一本の主ピークが現れ、１３．２１７分に小さなピークが出た（図２）。
標準物質の保持時間から、主ピークはシアニジン、小さなピークはペオニジンと考えられ、図１−９７１１１０の主要な２つのピークはどちらもシアニジンを骨格としそれぞれ異なった糖鎖を持つアントシアニンであることが分かった。
１９９７年１１月から１９９８年２月まで、防府市大字浜方５３５番地の圃場に植え付けられている在来鳥取コウライを毎月サンプリングして分析を行った（図１）。
その結果先に述べたように１１月のサンプルでは１６．９３０分と２０．７５０分にピークがみられるが、この１６．９３０分のピークは次第に減少し、１２月末には小さなピークになる。代わりに１月末の測定では２８．０５２分が主ピークの一つとなり、この状態は２月末にも維持されている。１１月の２０．７５０分のもう一つの主ピークは、高さは別として測定期間を通じて維持されている。在来鳥取コウライのほふく茎は一年を通じて赤色をしているが、その分子組成は一定ではなく季節の移り変わりとともに変化していることがわかった。
在来鳥取コウライの葉は夏期は緑色をしており、１１月末の分析でもほとんどアントシアニンを検出しない（図３）。しかしながら紅葉した葉においては、２月のほふく茎で見られる２０．７９５分と２８．０２７分のアントシアニンを主成分とする、ほふく茎のアントシアニン組成と良く似た組成を示すようになる。
在来鳥取コウライ（Ｚｏｙｓｉａ ｍａｔｒｅｌｌａ）のほふく茎に生じるアントシアニン組成は気温又は日照の変化にともなって変化し、初冬に最も強く色素を蓄積するが、やがて寒期に葉とほふく茎に生じるアントシアニン組成へと変化する。この冬期のアントシアニン組成は、暖かくなるに従って葉のアントシアニンが消滅し、ほふく茎では暖かい時期のアントシアニン組成へと変わる。在来鳥取コウライのアントシアニン組成は、この様な一年を通じたサイクルを持っている。
本発明に関わるＴＫ−ＸＧ１の葉は１９９７年１１月から１９９８年２月までの測定ではいかなるアントシアニンも生じない（図４）。ほふく茎においては１１月２５日に１６．９０８と２０．７９２の２つのピークが痕跡程度に検出され、１月２２日に１７．２２５、２０．７２５、２８．０７５、２月２６日には２０．７２５、２７．８４０が痕跡程度に検出されたにすぎなかった（図５）。
以上から在来鳥取コウライは冬期には葉に赤色の色素であるアントシアニンを蓄積するが、新品種ＴＫ−ＸＧ１は冬期においても葉にアントシアニンを蓄積することはない。また、ほふく茎に生じるアントシアニンは痕跡程度であり、実質的にアントシアニンを含まないとみなせる。外観的にもＴＫ−ＸＧ１はいずれの部位、時期にもアントシアニンによる発色を認められなかった。
アントシアニン分子構造の決定
以上のようにＴＫ−ＸＧ１にはコウシュンシバに特徴的に現れるアントシアニン分子のうち１７分と２０分の分子を痕跡程度にもつのみで、相対的に実質的にアントシアニンを含有しない系となっていることが大きな特徴である。これらアントシアニンの分子構造を明確にする目的で、在来鳥取コウライを用いて、コウシュンシバのアントシアニンの構造の決定をおこなった。
分子構造の決定はコクロマトグラフィー（Ｃｏ−ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）の方法で行い、その結果、コウシュンシバの主要なアントシアニンは１０分：Ｃｙａｎｉｄｉｎ３−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ（Ｃｙ３Ｇ），１７分：Ｃｙａｎｉｄｉｎ３−ｍａｌｏｎｙｌｇｌｕｃｏｓｉｄｅ（Ｃｙ３ＭＧ），２０分：Ｃｙａｎｉｄｉｎ３−ｄｉｍａｌｏｎｙｌｇｌｕｃｏｓｉｄｅ（Ｃｙ３ＤＭＧ），２８分：Ｃｙａｎｉｄｉｎ３−ｐｏｌｙｍａｌｏｎｙｌｇｌｕｃｏｓｉｄｅ（Ｃｙ３ＰＭＧ）であることが分かった。
冬期の葉緑素濃度
ＴＫ−ＸＧ１と母材とした在来鳥取コウライの葉緑素濃度の１９９７年９月〜１９９８年３月までの変化を測定した（表６参照）。
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葉緑素は、葉身から８０％アセトンにより抽出し、６４５ｎｍと６６３ｎｍの吸光度を測定し、アーノンの式を用いて算出した（Ａｒｎｏｎ，１９４９，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２４，１−１５）。在来鳥取コウライは冬期には冬枯れしていて、生きている葉は１％以下であった。試料として、枯死した葉を除いて生葉だけを選別して用いたので、在来鳥取コウライに関しては目視による、全面に冬枯れした状態としか見えない感覚的な値よりも高い値が出ているが、それでもＴＫ−ＸＧ１よりも冬期の葉緑素量は有意に少ない。
ＲＡＰＤ法によるＴＫ−ＸＧ１のＤＮＡ解析
ＴＫ−ＸＧ１の品種間差を明確にする目的で、ＲＡＰＤ（Ｒａｎｄａｍ  Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  ＤＮＡ）法による解析を行った（図６−１０参照）。ＴＫ−ＸＧ１及び、対照として用いた、在来鳥取コウライ、ウインターフィールド（日本登録品種、Ｚｏｙｓｉａ ｍａｔｒｅｌｌａ）、ウインターカーペット（日本登録品種、Ｚｏｙｓｉａ ｍａｔｒｅｌｌａ）、ビクトール（プレシャスグリーンともいう。米国植物特許、Ｚｏｙｓｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ）、みやこ（日本登録品種、Ｚｏｙｓｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ×Ｚｏｙｓｉａ ｍａｔｒｅｌｌａまたはＺｏｙｓｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ）、メイヤー（米国品種登録品種、Ｚｏｙｓｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ）、エメラルド（米国品種登録品種、Ｚｏｙｓｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ×Ｚｏｙｓｉａ ｔｅｎｕｉｆｏｌｉａ）、及びエルトロ（米国植物特許、Ｚｏｙｓｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ）の９品種は海水化学工業株式会社研究用圃場で同じ条件で栽培されているもので、同じ日に同量の葉を採取し、ＣＴＡＢ（Ｃｅｔｙｌｔｒｉｍｅ  ｔｈｙｌ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）法によってＤＮＡを抽出した。これを鋳型とし、下に配列を示すプライマーを用いてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）反応を行った。反応条件は増幅前の熱変性９４℃２分、増幅サイクルの熱変性９４度３０秒、アニーリング３４℃３０秒、伸長６８℃２分。以上を１サイクルとして、４５サイクルの反応を行わせ、最終伸長６８℃５分とした。電気泳動には２％のアガロースゲルを用いた。データとして示した各写真のプライマーは次に塩基配列を示す４種類である。
プライマーＡ：  ＴＴＣＣＧＴＡＡＴＣＡＣ・・・・・・・（図６）
プライマーＢ：  ＡＧＡＧＧＴＧＴＡＡＡＴ・・・・・・・（図７）
プライマーＣ：  ＴＴＧＣＡＴＡＡＴＣＧＴ・・・・・・・（図８）
プライマーＤ：  ＣＣＴＴＧＧＡＡＣＴＣＧ・・・・・・・（図９）
ＴＫ−ＸＧ１及び在来鳥取コウライとその他の対照品種は、例えば、Ａ、Ｂ、Ｃのプライマーを用いたＰＣＲ増幅産物の電気泳動像を比較することによって区別することが可能である（図６、７、８を参照）。また在来鳥取コウライはＤプライマーによる増幅で１，３３０ｂｐのバンドを生じるが、ＴＫ−ＸＧ１にはこれがないことから、この両品種を区別することが可能である（図９を参照）。
図６〜９のＰＣＲ増幅に用いたプライマーの塩基配列は本文に示した。図６、７、８の各レーンはレーン１）及び１１）は２５０ｂｐ間隔の分子量マーカーで、図中矢印のバンドが１０００ｂｐである。以下、レーン２）ＴＫ−ＸＧ１、３）在来鳥取コウライ、４）ウィンターカーペット、５）ウィンターフィールド、６）ビクトール、７）みやこ、８）マイヤー、９）エメラルド、１０）エルトロである。図９のレーン１）及び４）は分子量マーカー、レーン２）がＴＫ−ＸＧ１、レーン３）が在来鳥取コウライである。
ＡＦＬＰ法によるＴＫ−ＸＧ１のＤＮＡ解析
ＴＫ−ＸＧ１の品種間差を明確にする目的で、ＡＦＬＰ（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法による解析を行った。海水化学工業株式会社研究用圃場で栽培されているＴＫ−ＸＧ１の葉を採取し、ＣＴＡＢ（Ｃｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）法によりＤＮＡを抽出した。このＤＮＡを２種類の制限酵素Ｅｃｏ  ＲＩ（６塩基を認識する酵素）とＭｓｅ  Ｉ（４塩基を認識する酵素）で切断した後、２本鎖アダプターをＤＮＡ断片の両端に結合させ、はじめにＰｒｅｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ：Ｐｒｅｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を行い、プレセレクティブプライマーを用いて制限酵素サイトの下流にさらに１塩基を付け、制限酵素断片の中で合致する塩基を持つ塩基だけを選択的に増幅させた。反応条件は増幅前の熱変性７２℃２分を１サイクル、増幅サイクルの熱変性９４℃２０秒、アニーリング５６℃３０秒、伸長７２℃２分を２０サイクル行った。ＰＣＲ反応産物の確認のための電気泳動には１．２％のアガロースゲルを用いた。次に蛍光色素標識されたセレクティブプライマーを用いてＳｅｃｏｎｄ  ＰＣＲ（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）反応を行った。反応条件は表７に示したＳｅｃｏｎｄ  ＰＣＲ反応産物とｌｏａｄｉｎｇ  ｄｙｅ及びＲＯＸ５００Ｓｉｚｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄを混合し、泳動用サンプルとした。ＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３７７  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）を用い、６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分画した後（図１０）、解析ソフトウェア（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  Ｇｅｎｅ  Ｓｃａｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）を用い、検出されたシグナルをエレクトロフェログラム上で解析した（図１１ａ〜図１１ｉ）。なお、実験は３反復行った。
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多芽体による大量培養による固定性の確認
ＴＫ−ＸＧ１の生長点をＮＡＡ０．０２ｍｇ／ｌとＢＡ０．２ｍｇ／ｌを含むムラシゲ・スクーグ培地で培養すると多芽体が得られる（特開平７−３１３００８）。多芽体は芽の集合体であるが、この１体の多芽体を同じ条件で大型の容器で培養すると、２ヶ月間で約１００体の多芽体に増殖する。この多芽体を発根させて苗化することにより、約１万本の苗を得ることができる。これを圃場に移して、生育させた結果、ＴＫ−ＸＧ１の形質に変化を生じたものは出現しなかった。つまり１頂芽を１万個体に増殖させても形質は安定しており、また１９９７年９月以来の圃場増殖においても形質は安定しており、少なくとも、栄養繁殖を行う限り、以上に述べる有用な形質は保存される。
以上のように、本発明者は「冬期において緑葉を保つコウシュン芝」の作出を計画し、それを実現する方法として、カルス生成を通じ再生可能で分化段階の高い苗条原基様体培養細胞を作出し、それに例えば紫外線、軟Ｘ線を照射することで必要な変異を導入し、かつ、特殊な細胞選抜法を考案して緑化細胞を選抜するという方法を採用し実行した結果、当初目的とした芝の新品種を得た。
実施例２
中国地区寒冷地におけるＴＫ−ＸＧ１の緑葉維持観察
１９９８年１１月下旬〜１９９９年３月上旬迄の期間中、広島県立大学試験圃場（日本国広島県庄原市七塚原５６２番地）においてＴＫ−ＸＧ１及び在来鳥取コウライの評価試験を実施した。この期間中、ＴＫ−ＸＧ１は明瞭に緑色を保持したが、在来鳥取コウライは１２月中旬には、紅葉及び葉枯れを生じ、緑色を保持できなかった（表８）。
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全体的に緑の生葉・・・・・・・・・・・・・・・・・・５
緑色が低下し、葉の一部分が葉枯れ状態となっている・・４
部分的に紅葉化ないし赤紫色・・・・・・・・・・・・・３
全体的に紅葉化ないし赤紫色・・・・・・・・・・・・・２
枯葉・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・１
この期間における同試験圃場の気象状況を表９に示す。
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実施例３
ハードニング試験
人工気象器（日本医化器械製作所製  ＬＨ−２００ＲＤＺ）内において、４±２℃、光量５０，０００ルクス、ワグネルポットに定着させたＴＫ−ＸＧ１及び在来鳥取コウライを１ヶ月間育成した後、フリーザー（ＳＡＮＹＯ製  ＭＤＦ−２９３ＡＴ）内で低温耐性試験を行った。生葉約５０ｍｇを採取し、重量を測定し、アルミ箔で包み、−１５℃、−１０℃に設定したフリーザーにそれぞれ０、１．５、３、６、９時間冷凍させた後、取り出し蒸留水２０ｍｌに浸漬し冷蔵庫（５℃）に２４時間放置し、導電率計（ＹＯＫＯＧＡＷＡ製  Ｍｏｄｅｌ  ＳＣ８２パーソナルＳＣメーター）を用いて、電気伝導度（ＥＣ：Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）を測定し、低温処理開始前の在来鳥取コウライ、ＴＫ−ＸＧ１それぞれのＥＣを１．０として、それぞれの経時変化率を見ることにより凍結による細胞の破壊程度を評価した。−１０℃低温処理時にはＴＫ−ＸＧ１と在来鳥取コウライは共に、細胞の破壊はほとんど起こらないが、−１５℃低温処理時にはどちらも細胞破壊によるＥＣの上昇が観測された（図１２）。しかし、在来鳥取コウライに比べ、ＴＫ−ＸＧ１は低温処理時間３時間までのＥＣの傾きが緩やかで、凍結による細胞破壊が起こりにくいことが示唆された。
実施例４
ＴＫ−ＸＧ１の生長試験
真砂土と砂を７：３の比で混合したものに、硬質発泡珪藻土焼成粒１００ｋｇ／ｍ３、く溶性緩効性肥料１．５ｋｇ／ｍ３、特殊発酵肥料１０ｋｇ／ｍ３の混合物からなる土壌（山口県防府市大字浜方５３５番地  海水化学工業株式会社内  研究圃場）を用い、一辺２．０ｍの区画中央に、５節を含むほふく茎を１９９７年９月１７〜１８日に植えこみ、毎月１回の頻度で、窒素：リン酸：カリウム＝１０：１０：１０質量％の化成肥料（スターマイン：日東エフシー株式会社製）１２．５ｇ／ｍ２を与え、生育せしめた。１９９８年１０月１９日時点での全体写真を図１３ａ（ＴＫ−ＸＧ１）、図１３ｂ（在来鳥取コウライ）に示す。その代表的な部分の拡大写真を図１４ａ（ＴＫ−ＸＧ１）、図１５ｂ（在来鳥取コウライ）に示し、これらからほふく茎の伸展状況を線図にしたものを図１５ａ（ＴＫ−ＸＧ１）、図１５ｂ（在来鳥取コウライ）に示す。同様にして生育せしめた８種類の代表的なほふく茎先端４３．０の比較写真の一例を図１６に示す。
芝草は節間長やほふく茎の生長の仕方は生長条件に左右される。例えば、地表面から遊離して伸びるほふく茎では節間長は短くなりがちで、また、側枝の生長も抑制される場合が多い。更に、ほふく茎が重なり合ったり何らかの物理的障害物があったりすると生長が抑制される。また、日照が遮られた陰では徒長することが多い。このため、正確な比較を行うためには、土表面に密着して、障害物のない生長条件で同一条件下で伸びているほふく茎を採取し、比較する必要がある。ほふく茎の先端部は茎頂部を含むＴＫ−ＸＧ１  ２０節（４３．０ｃｍ）と同じ長さのほふく茎を採取した。図１６をもとに実測した節間距離及びほふく茎の伸長状況を表１０及び表１１に示す。本実施例の場合、図１６に示す如く、未成熟で、伸長を続けている節間は１０ｃｍ程度の範囲であり、この範囲を除き、測定した。
ＴＫ−ＸＧ１は親株（変異操作の出発材料）である在来鳥取コウライに比し、全体的な伸展性はほぼ同じであったが（図１３ａ、１３ｂ参照）、節間距離が短く、側枝生長性が明瞭に大きいため、被覆部（密生状態になっている部分）の面積が顕著に大きかった（図１４−ａ、−ｂないし図１５ａ、１５ｂ参照）。節間距離が短く、側枝生長が大きいことは、被覆速度を速め、緻密な被覆面を形成すると共に、ＴＫ−ＸＧ１の強いほふく性（土地に密着して伸長する性質）の故にほふく茎の地下での重なりが増し、土壌面の保護力が増すと共に、スパイク傷などの芝層表面の損傷に対しても回復が早く、また弾力性に富む優れたターフ層を形成することができ、実用的にも、在来コウシュンシバ（Ｚｏｙｓｉａ ｍａｔｒｅｌｌａ）及び他のスズメガヤ亜科の芝に比して非常に高い価値を提供することができる。
なお、データ処理に当たっては、異常値を排除するため各々の品種の節間長の実測値の最大値と最小値各１を除いた残りの数値を用いた。植物は、環境条件、土壌形態及び施肥方法に対する品種間の感受性が異なることを考慮すると、ＴＫ−ＸＧ１の在来鳥取コウライ及びメイヤーに対する節間長の比は、これらを１．０にしたとき、０．９〜０．６の範囲にあり、有意に矮性であった。在来鳥取コウライ及び、メイヤーはスズメガヤ亜科の芝の代表的品種であるとともに、本実施例で節間計測値データ数が多く、データ処理上より正確な基準となることから両品種を比較対象とした。因みに、スズメガヤ亜科の芝は生育条件により節間の生長が異なることがあるため、比較評価にあたっては本実施例に準拠して行うことが望ましいが、少なくとも土表面に密着して障害物なしに伸びる条件下でほふく茎を比較する必要がある。また、茎頂部の損傷なく生長を続けているほふく茎を選ぶ必要がある。また、主枝先端近くの節間は主枝の生長・伸展に伴い、次第に長くなり、成熟にしたがって節間の伸長を止める。従って、先端近くの未成熟な先端を除いて比較する必要がある。本実施例の場合、図１６に示す如く未成熟で、伸長を続けている節間は１０ｃｍ程度であり、この部分を除いて節間長を計測した。主枝先端近くまで側枝が追随して密生域ができる方が実用上望ましい。なお、表４に示すように、親株である在来鳥取コウライに比し、葉幅も狭く、葉長もわずかに短くなっている。
また、主枝長と側枝合計長の比は、在来鳥取コウライに比し、１．２〜１．４倍、メイヤーに対し１．４〜１．８倍の範囲にあった。
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実施例５
冬期温室におけるＴＫ−ＸＧ１の生長
１９９７年１０月３０日に在来鳥取コウライとＴＫ−ＸＧ１のほふく茎を５節ずつに切り、１本ずつを、それぞれ１０個の３号鉢に植えた。土壌は実施例１と同様にし、く溶性緩効性肥料を１鉢あたり１ｇ与えた。翌１０月３１日から山口県農業試験場（日本国山口県山口市大内御堀１４１９）内ガラス温室に移し、２８±３℃（最低気温２５℃、温風噴き出し口温度３１℃）で生育させた。翌１９９８年１月２２日に観察した。この時点において、在来鳥取コウライからはほふく茎の伸長は実質的に見られなかったが、ＴＫ−ＸＧ１の全ての鉢からは複数の旺盛なほふく茎の伸長が見られた（図１７及び表１３参照）。しかしながら、在来鳥取コウライの１０鉢の内１鉢から１ｃｍ未満の新たなほふく茎の伸長が１本のみ見られたことから、このわずかなほふく茎の伸長は本期間中の最長日照時間帯に起こっており、このため本期間中の旬間積算日照時間の内、最大の旬間を除外し、なおかつ有効数字１桁に切り下げて、旬間積算日照時間以下を５０時間以下とした。
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ほふく茎の長さ１ｃｍ以上のものについて計測した。
ＮＤ：１ｃｍ以上のほふく茎は存在しなかった。
実施例６
ＴＫ−ＸＧ１の発明形質を継承した交配品種の作出
本発明のＴＫ−ＸＧ１の新形質が、スズメガヤ亜科植物で交配によって継承・移転されうろことを確認するため、みやこ（ジャパン・ターフ株式会社、ノシバ系品種）との交配を行い、派生品種の作出を試みた。
その結果、少なくともＴＫ−ＸＧ１との交配対象としたみやこが、同一条件において、ほふく茎にアントシアニンによる濃い赤紫色を示したのに対し、ＴＫ−ＸＧ１の特異形質の一つであるアントシアニンを実質的に蓄積しない黄緑色のほふく茎を有する新たな品種が作出された。以下に作出の過程と作出された新たな人工交配品種の特性の一部を示す。
みやこを母、ＴＫ−ＸＧ１を父として交配を行った。交配方法については、「植物生産農学実験マニュアル」（日向康吉、羽柴輝良編、ソフトサイエンス社１９９５年発行、第２６３〜２６８頁）に準拠した。
交配後は温室内で生育・完熟させ、４０日後に種子を採取した。採取した種子の発芽率を向上させる目的で３ヵ月間室内にて保存した後、アルコール選抜法を用いて稔実種子と不稔種子を選抜した。選抜された沈下種子９８粒を用い、発芽率を高めるために０．５％ＮａＯＨ処理を施した（平吉功、松村正幸、岩田悦行著「有用野草の播種増殖」岐阜大学農学部研究報告  第２８号  １９６９年発行、第２３９〜２５１頁参照）。
０．５％ＮａＯＨ処理後の９８粒の種子を吸水したろ紙を敷いたシャーレ上にてし、人工気象器で３５℃、８．５００ルクスの条件の下、発芽実験を開始した。
９８粒中で発芽した種子は２３粒であり、発芽後５日目の発芽苗をオートクレーブ滅菌したイネ用培土（宇部興産製  くみあい宇部培土特２号、１ｋｇ当たり、窒素、リン酸各０．２ｇ、カリ０．３３ｇ含有）の入ったプラスチックポットに移植した。
発芽した２３粒の内で生育した１８株を育苗ポットに移植した。培土の組成については、海砂：硬質発泡珪藻土焼成粒：ピートモス：木質堆肥（バーク）を６：２：１：１の割合で混合したものに、く溶性緩効性肥料濃度が１．５ｋｇ／ｍ３になるように混合した培土の入った育苗ポットに移し、水をかけて２８℃±３℃の温室で育苗した。１８苗を同一区画に置き、結実した１２５粒の種子を採取し、同様の方法で保存、選抜及び発芽させた結果、１９本の苗が得られた。この内、ほふく茎に赤紫色が発色せず、アントシアニンを含まない株が１株得られた。１９９９年１１月２２日に得られた株の苗の葉幅、節間長、ほふく茎の太さを測定した。ほふく茎に赤紫色が発色しなかった株の数値について表１４に示す。
なお、染色体基本数が一致する植物同士では遠縁交雑等を含めて交配種の作出が可能であることは知られているが（例えば、前掲「芝草と品種」第１２６〜１３０頁参照）、本実施例によって、ＴＫ−ＸＧ１の発明遺伝形質を継承した交配品種開発は可能であることが判明した。
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本発明の新品種の多様な形質がそれぞれ独立に出現したのか、あるいはある単独の遺伝子の変異がこのような多様な表現形を示すのかは明確ではないが、一般的には変異方法から推定すると本発明品種の有するコウシュンシバの全く新たな複数の形質は、複数ヶ所の変異による独立した形質と考える方が自然と考えられる。また、それぞれの新形質は親株に見られない形質で、そのいずれもが独立に新規性を有し、且つ実用上の有用性を有している。これらの各々の遺伝形質を交配等の品種作出法により利用することで新たな実用性のある派生品種を作出する事が出来、前述の５つの本発明品の遺伝形質を利用することができる。
栽培上の注意点等
本発明のＴＫ−ＸＧ１は、生産圃場において、在来鳥取コウライと同様な手法で栽培することが出来る。この際、在来鳥取コウライより生長性が高いため、生育状況を観察しながら多目の施肥を行うことが望ましい。その他、多芽体による増殖も可能である。更に、実用に当たっては生産圃場同様、在来鳥取コウライと同様の方法で容易に栽培可能である。さらに本発明のＴＫ−ＸＧ１の使用用途の要請に合ったそれぞれの特徴を強調することも肥培管理によって可能である。
本発明の１実施様体であるＴＫ−ＸＧ１は海水化学工業株式会社の研究圃場（山口県防府市大字浜方５３５番地）に維持されており、日本国特許法施行規則第２７条の３の規定に準じて、本発明品の確認のための試料の分譲を保証するものである。
【図面の簡単な説明】
図１は在来鳥取コウライのほふく茎におけるＨＰＬＣによるアントシアニンの変化を示し、上から順に１９９７年１１月１０日、１９９７年１１月２５日、１９９７年１２月２３日、１９９８年１月２２日、１９９８年２月２６日のものである。
図２は上図は在来鳥取コウライのアントシアニン加水分解物のＨＰＬＣによる分析であって、下図は標準物質を同じ条件で分析したものである。
図３は在来鳥取コウライの葉身におけるアントシアニン組成の変化を示し、上から順に１９９７年１１月２５日、１９９７年１２月２３日、１９９８年１月２２日、１９９８年２月２６日のものである。
図４はＴＫ−ＸＧ１の葉身におけるアントシアニン組成の変化を示し、上から順に１９９７年１１月２５日、１９９７年１２月２３日、１９９８年１月２２日、１９９８年２月２６日のものである。
図５はＴＫ−ＸＧ１の葉身におけるアントシアニン組成の変化を示し、上から順に１９９７年１１月２５日、１９９７年１２月２３日、１９９８年１月２２日、１９９８年２月２６日のものである。
図６はプライマーＡを用いたＲＡＰＤ法による品種の識別のためのゲル電気泳動像図である。
図７はプライマーＢを用いたＲＡＰＤ法による品種の識別のためのゲル電気泳動像図である。
図８はプライマーＣを用いたＲＡＰＤ法による品種の識別のためのゲル電気泳動像図である。
図９はプライマーＤを用いたＲＡＰＤ法による品種の識別のためのゲル電気泳動像図である。
図１０は９組み合わせのプライマーを用いたＡＦＬＰ法によるＴＫ−ＸＧ１のゲル電気泳動像図である。
図１１ａ〜図１１ｉは９組み合わせのプライマーを用いたＡＦＬＰ法によるＴＫ−ＸＧ１のゲル電気泳動後、解析ソフトウェアを用いて検出されたシグナルを解析したエレクトロフェログラム図である。
図１２はＴＫ−ＸＧ１と在来鳥取コウライをそれぞれ０、１．５、３、６、９時間、−１５℃で低温処理したときのＥＣの折れ線グラフである。−１５℃低温処理前の電気伝導度（ＥＣ）を１としたときの低温処理によるＥＣの変化率（ＥＣの増加は凍結による細胞破壊によりもたらされる）を表す。
図１３はほふく茎５節を植え込んだ圃場の写真であって、図１３ａはＴＫ−ＸＧ１のものであって、図１３ｂは在来鳥取コウライのものである。
図１４は図１３の一部拡大写真であって、図１４ａは図１３ａの、そして、図１４ｂは図１３ｂの拡大写真である。
図１５はほふく茎の伸展状況の線図であって、図１５ａは図１４ａから作成し、図１５ｂは図１４ｂから作成したものである。図中の斜線部は被覆が完了した密生域である。ＴＫ−ＸＧ１では側枝生長性が高いため、密生域を形成しつつ、ほふく茎の伸長が行われている。
図１６は代表的な８系統のほふく茎先端４３．０ｃｍの比較線図である。
上から順に
Ａ）ＴＫ−ＸＧ１
Ｂ）在来鳥取コウライ
Ｃ）ウィンターカーペット
Ｄ）ウィンターフィールド
Ｅ）ビクトール
Ｆ）みやこ
Ｇ）メイヤー
Ｈ）エメラルドのほふく茎先端を示す。
図１７は冬期温室のおけるＴＫ−ＸＧ１と在来鳥取コウライのほふく茎の伸長を示した写真である（表１０参照）。在来鳥取コウライからはほふく茎の伸長は見られないが、ＴＫ−ＸＧ１の全ての鉢からは旺盛なほふく茎の伸長が見られる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１１ｃ】
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【図１１ｄ】
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【図１１ｅ】
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【図１１ｆ】
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【図１１ｇ】
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【図１１ｈ】
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【図１１ｉ】
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【図１２】
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【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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【図１５ａ】
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【図１５ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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