(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検物質と接触させることにより、受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片がオリゴマーを形成するか否かを調べることによって、該受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片のオリゴマー化を促進する物質をスクリーニングする方法であって、該受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片の少なくともひとつが放射性同位元素で標識化され、他の少なくともひとつがシンチラントを含む固相に結合されており、ならびに、該オリゴマー形成により誘起されるシンチレーションシグナルを測定することを含む、前記方法。
【請求項２】
無細胞環境下で、受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片を被検物質と接触させる請求項１記載の方法。
【請求項３】
シンチラントを含む固相に結合されている受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片がシンチラントを含むビーズの表面にコーティングされている請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
放射性同位元素で標識化されている受容体またはそのペプチド断片と、シンチラントを含むビーズの表面にコーティングされている受容体またはそのペプチド断片とを含む水溶液に被検物質を添加し、誘起されるシンチレーションシグナルを測定することにより、該受容体またはそのペプチド断片がオリゴマーを形成したか否かを調べる請求項３記載の方法。
【請求項５】
受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片のオリゴマーが固相表面上に形成される請求項１記載の方法。
【請求項６】
受容体がサイトカイン受容体である請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
サイトカイン受容体が、造血因子受容体、リンホカイン受容体、増殖因子受容体および分化抑制因子受容体からなる群より選択される請求項６記載の方法。
【請求項８】
サイトカイン受容体が、エリスロポエチン（ＥＰＯ）受容体、トロンボポエチン（ＴＰＯ）受容体、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）受容体、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）受容体、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）受容体、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体、インターロイキン−１（ＩＬ−１）受容体、インターロイキン−２（ＩＬ−２）受容体、インターロイキン−３（ＩＬ−３）受容体、インターロイキン−４（ＩＬ−４）受容体、インターロイキン−５（ＩＬ−５）受容体、インターロイキン−６（ＩＬ−６）受容体、インターロイキン−７（ＩＬ−７）受容体、インターロイキン−９（ＩＬ−９）受容体、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）受容体、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）受容体、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）受容体、インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）受容体、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）受容体、インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）受容体、インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）受容体、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）受容体、成長ホルモン（ＧＨ）受容体、インスリン受容体、血液幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）受容体、血管上皮増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）受容体、神経成長因子（ＮＧＦ）受容体、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）受容体、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）受容体、トランスフォーミング増殖−β（ＴＧＦ−β）受容体、白血球遊走阻止因子（ＬＩＦ）受容体、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）受容体、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）受容体およびＮｏｔｃｈファミリー受容体からなる群より選択される請求項６記載の方法。
【請求項９】
受容体タンパク質分子がサイトカイン受容体サブユニットである請求項６記載の方法。
【請求項１０】
受容体タンパク質分子のペプチド断片がその受容体の可溶性領域を含むものである請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
受容体タンパク質分子のペプチド断片がその受容体の細胞外領域を含むものである請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
受容体タンパク質分子のペプチド断片が少なくともその受容体のリガンド結合部位を含むものである請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
オリゴマーがホモオリゴマーである請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
オリゴマーがヘテロオリゴマーである請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
オリゴマーがダイマーである請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
スクリーニングされる物質が、既知の生理活性物質の新規な代替物である請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
１２５Ｉで標識されているエリスロポエチン受容体またはそのペプチド断片と、シンチラントを含むイットリウムシリケートビーズまたはポリビニルトルエンビーズの表面にコーティングされているエリスロポエチン受容体またはそのペプチド断片とを含む水溶液に被検物質を添加し、誘起されるシンチレーションシグナルを測定することにより、該エリスロポエチン受容体またはそのペプチド断片がダイマーを形成したか否かを調べることを含む、エリスロポエチン受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片の二量体化を促進する物質をスクリーニングする方法。
【請求項１８】
受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片のオリゴマー化を促進する物質による受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片のオリゴマー形成が、被検物質との接触により、阻害されるか否かを調べることによって、該受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片のオリゴマー化を阻害する物質をスクリーニングする方法であって、該受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片の少なくともひとつが放射性同位元素で標識化され、他の少なくともひとつがシンチラントを含む固相に結合されており、ならびに、該オリゴマー形成により誘起されるシンチレーションシグナルを測定することを含む、前記方法。
【請求項１９】
オリゴマー化促進物質が生理活性を有するものである請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片のオリゴマー化を阻害する物質が、前記オリゴマー化促進物質の生理活性を抑制する作用を有するものである請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
オリゴマー化促進物質がエリスロポエチンであり、受容体がエリスロポエチン受容体である請求項１８記載の方法。
【請求項２２】
受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片、および緩衝液を含む、その受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片のオリゴマー化を促進する物質をスクリーニングするための検査キットであって、該受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片が放射性同位元素で標識化されたものと、シンチラントを含む固相に結合されたものとからなる、前記検査キット。
【請求項２３】
受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片がエリスロポエチン受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片であり、緩衝液がリン酸緩衝生理食塩水である請求項２２記載の検査キット。
【請求項２４】
受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片のオリゴマー化を促進する物質、受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片、および緩衝液を含む、その受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片のオリゴマー化を阻害する物質をスクリーニングするための検査キットであって、該受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片が放射性同位元素で標識化されたものと、シンチラントを含む固相に結合されたものとからなる、前記検査キット。
【請求項２５】
受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片のオリゴマー化を促進する物質がエリスロポエチンであり、受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片がエリスロポエチン受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片であり、緩衝液がリン酸緩衝生理食塩水である請求項２４記載の検査キット。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、受容体タンパク質分子のオリゴマー化を促進する物質のスクリーニング方法、より詳細には、受容体タンパク質分子のオリゴマー形成を指標とした生理活性物質のスクリーニング方法に関する。
背景技術
エリスロポエチンや成長ホルモンといった生理活性因子は、標的細胞側の細胞膜に発現している特異的受容体に結合して、分化・増殖等のシグナルを伝えている。１９９０年、吉村らはＥＰＯ受容体の細胞外ドメインに存在するＡｒｇ（１２９）をＣｙｓに置換すると、ＥＰＯ非存在下でも増殖シグナルが伝わることを報告し、ＥＰＯ受容体の細胞外ドメインがジスルフィド結合により多量体化することがシグナル伝達に重要であることを示唆した（Ｎａｔｕｒｅ，３４８：６４７−６４９，（１９９０））。更に、成長ホルモンと成長ホルモン受容体の結合様式をＸ線構造解析で検討した結果、Ｉ分子の成長ホルモンに２分子の受容体が結合していることが明らかとなり（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２２２（４）：８６５−８６８，（１９９１））、生理活性因子からのシグナル伝達経路のファーストステップは受容体の多量体形成である可能性が高まった。
１９９６年にＹＸＣＸＸＧＰＸＴＷＸＣＸＰ（Ｘはどの様なアミノ酸でも良い）の１４アミノ酸をコア構造とするＥＰＯ受容体結合ペプチドがＥＰＯ機能を代替しうることが報告され（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７３：４５８−４６３，（１９９６））、このペプチドとＥＰＯ受容体の結晶構造解析から、ペプチドの二量体がＥＰＯ受容体の二量体化を促していることが明らかとなった（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７３：４６４−４７１，（１９９６））。
さらに、ＥＰＯ受容体細胞外ドメインに対する抗体がＥＰＯ機能を代替することも明らかとなり、この抗体を一価（Ｆａｂ）にするとＥＰＯ受容体への結合能を保持しつつもシグナル伝達能を失うことから、二価の結合によるＥＰＯ受容体の二量体形成が必要と考えられている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１（４０）：２４６９１−２４６９７，（１９９６））。
この様な受容体の多量体形成を引き金とするシグナル伝達経路は、ＥＰＯや成長ホルモンに限った現象ではなく、インターフェロンや顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）などの生理活性因子でも共通に認められる現象である。トロンボポエチンに関しても受容体の多量体化を介して機能を代替しうるペプチドが発見されている（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７６：１６９６−１６９９，（１９９７））。
カニングハムらは、成長ホルモン受容体とリガンドの三要素複合体形成を検出するリガンドの作用薬及び拮抗薬の選択方法を示している（特願平５−５０００７０号）。しかしながら、本法は蛍光プローブ標識によるホモクエンチング量を分光蛍光計を用いて測定しており、大量の被検物質を測定するスクリーニングには適していなかった。
本発明の目的は、受容体多量体形成を指標とした生理活性因子代替物スクリーニング方法を提供することである。
発明の開示
本発明者らは、被検物質との接触により、受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片がオリゴマーを形成するか否かを簡便に調べることができるスクリーニング系を確立して、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、被検物質と接触させることにより、受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片がオリゴマーを形成するか否かを調べることによって、その受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片のオリゴマー化を促進する物質なスクリーニングする方法を提供する。受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片と被検物質との接触は無細胞環境下で行うとよい。
上記の方法においては、受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片のオリゴマー形成により誘起される信号を測定することにより、該受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片がオリゴマーを形成したか否かを調べることができる。信号は、シンチレーションシグナル、化学発光シグナル、蛍光シグナル、吸光シグナル、電離線シグナル、核磁気共鳴シグナルおよび表面プラズモン共鴫シグナルからなる群より選択することができる。このような信号を測定する方法としては、ＳＰＡ法、ＲＩＡ法、表面プラズモン共鳴、核磁気共鳴、酵素免疫沈降測定法、ゲル濾過クロマトグラフィーなどを挙げることができる。受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片の少なくともひとつは標識化されているとよい。標識は、放射性同位元素、蛍光体、酵素、ビオチン、アビジン、シンチラントおよびそれらの組み合わせからなる群より選択することができる。例えば、ＳＰＡ法でオリゴマー形成の有無を調べるためには、受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片の少なくともひとつが放射性同位元素で標識化され、他の少なくともひとつがシンチラントを含むビーズの表面にコーティングされているとよい。この場合、放射性同位元素で標識化されている受容体またはそのペプチド断片と、シンチラントを含むビーズの表面にコーティングされている受容体またはそのペプチド断片とを含む水溶液に被検物質を添加し、誘起されるシンチレーションシグナルを測定することにより、該受容体またはそのペプチド断片がオリゴマーを形成したか否かを調べることができる。ビーズ表面にコーティングする受容体とシンチラントを含むビーズ（ＳＰＡビーズ）の混合比は、取扱説明書に従い適当に決めればよい。
受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片のオリゴマーは溶液中に形成されてもよいし、固相表面上に形成されてもよい。核磁気共鳴またはゲル濾過クロマトグラフィーを利用して、オリゴマー形成の有無を調べる場合には、通常、オリゴマーは溶液中に形成されるとよい。ＳＰＡ法、ＲＩＡ法、表面プラズモン共鳴または酵素免疫沈降測定法を利用して、オリゴマー形成の有無を調べる場合には、通常、オリゴマーは固相表面上に形成されるとよい。
受容体はサイトカイン受容体であるとよく、サイトカイン受容体は、造血因子受容体、リンホカイン受容体、増殖因子受容体および分化抑制因子受容体からなる群より選択することができ、より具体的には、エリスロポエチン（ＥＰＯ）受容体、トロンボポエチン（ＴＰＯ）受容体、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）受容体、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）受容体、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）受容体、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体、インターロイキン−１（ＩＬ−１）受容体、インターロイキン−２（ＩＬ−２）受容体、インターロイキン−３（ＩＬ−３）受容体、インターロイキン−４（ＩＬ−４）受容体、インターロイキン−５（ＩＬ−５）受容体、インターロイキン−６（ＩＬ−６）受容体、インターロイキン−７（ＩＬ−７）受容体、インターロイキン−９（ＩＬ−９）受容体、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）受容体、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）受容体、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）受容体、インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）受容体、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）受容体、インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）受容体、インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）受容体、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）受容体、成長ホルモン（ＧＨ）受容体、インスリン受容体、血液幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）受容体、血管上皮増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）受容体、神経成長因子（ＮＧＦ）受容体、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）受容体、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）受容体、トランスフォーミング増殖−β（ＴＧＦ−β）受容体、白血球遊走阻止因子（ＬＩＦ）受容体、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）受容体、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）受容体およびＮｏｔｃｈファミリー受容体からなる群より選択することができる。
受容体タンパク質分子は、サイトカイン受容体サブユニットであってもよい。例えば、ＩＬ−３受容体、ＩＬ−５受容体、ＧＭ−ＣＳＦ受容体はαサブユニットとβサブユニットから構成され、βサブユニットは共通であることが知られている。また、ＩＬ−６受容体、ＬＩＦ受容体、ＩＬ−１１受容体は、αサブユニットとｇｐ１３０サブユニットから構成され、ｇｐ１３０サブユニットが共通であることが知られている。また、ＣＮＴＦ受容体、ＯＳＭ受容体では、αサブユニット、ＬＩＦ受容体αサブユニットとｇｐ１３０サブユニットの３量体から構成されている。また、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−４受容体、ＩＬ−７受容体、ＩＬ−９受容体、ＩＬ−１５受容体は、αサブユニット、βサブユニット、γサブユニットから構成され、γサブユニットは共通であることが知られている。
受容体タンパク質分子のペプチド断片は、少なくともその受容体のリガンド結合部位を含むものであるとよい。受容体タンパク質分子のリガンド結合部位は細胞外領域あるいは可溶性領域に存在する。
受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片が形成しうるオリゴマーは、ホモオリゴマーであっても、ヘテロオリゴマーであってもよいし、ダイマー、トリマー、テトラマー、などのいずれのオリゴマーであってもよい。例えば、エリスロポエチン受容体、トロンボポエチン受容体、Ｇ−ＣＳＦ受容体、ＳＣＦ受容体、ＥＧＦ受容体などは、ホモダイマーを形成し、ＩＬ−６受容体、ＬＩＦ受容体、ＩＬ−１１受容体はヘテロダイマーを形成し、ＩＬ−２受容体、ＣＮＴＦ受容体、ＯＳＭ受容体はヘテロトリマーを形成することが知られている。
スクリーニングされる物質は、既知の生理活性物質の新規な代替物であってもよい。既知の生理活性物質としては、エリスロポエチン、インターフェロン、Ｇ−ＣＳＦ、成長ホルモン、トロンボポエチン、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、などを挙げることができる。
上記方法のひとつの態様においては、１２５Ｉで標識されているエリスロポエチン受容体またはそのペプチド断片と、シンチラントを含むイットリウムシリケートビーズまたはポリビニルトルエンビーズの表面にコーティングされているエリスロポエチン受容体またはそのペプチド断片とを含む水溶液に被検物質を添加し、誘起されるシンチレーションシグナルを測定することにより、該エリスロポエチン受容体またはそのペプチド断片がダイマーを形成したか否かを調べて、エリスロポエチン受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片の二量体化を促進する物質をスクリーニングすることができる。
本発明は、上記の方法により見いだされた受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片のオリゴマー化を促進する物質も提供する。このオリゴマー化促進物質は、既知の生理活性物質の新規な代替物となりうるものであり、サイトカイン受容体アゴニスト、特に、エリスロポエチン受容体アゴニストであってもよく、赤血球形成を刺激する作用を有するかもしれない。
本発明は、上記の方法により見いだされた受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片のオリゴマー化を促進する物質を含む医薬組成物も提供する。その態様として、腎性貧血治療剤などが挙げられる。本発明の医薬組成物は、治療上有効量の上記オリゴマー化促進物質とともに、適当な希釈剤、防腐剤、可溶化剤、乳化剤、担体などを含有してもよい。ここで、「治療上有効量」という用語は、指定の条件および投与法に対して治療効果を奏する量をいうものとする。本発明の医薬組成物は、液体、粉体、保護被膜で被覆された形態のいずれであってもよく、非経口、経口、経肺、経鼻などを含めた種々の投与経路で投与されうる。投与経路、投与量、投与時間、投与間隔などの投与計画は、有効成分である上記オリゴマー化促進物質とその剤型の特性、患者の年齢と病状などを考慮して、適宜決定することができる。
また、本発明は、受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片のオリゴマー化を促進する物質による受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片のオリゴマー形成が、被検物質との接触により、阻害されるか否かを調べることによって、その受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片のオリゴマー化を阻害する物質をスクリーニングする方法を提供する。オリゴマー化促進物質は生理活性を有するものであってもよい。受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片のオリゴマー化を阻害する物質は、前記オリゴマー化促進物質の生理活性を抑制する作用を有するものであってもよい。例えば、オリゴマー化促進物質がエリスロポエチンであり、受容体がエリスロポエチン受容体であるとよい。
本発明は、また、上記の方法により見いだされた受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片のオリゴマー化を阻害する物質も提供する。このオリゴマー化阻害物質は、既知の生理活性物質のインヒビターとなりうるものであり、サイトカイン受容体アンタゴニスト、特に、エリスロポエチン受容体アンタゴニストであってもよく、エリスロポエチンの赤血球形成刺激作用を阻害できるかもしれない。
本発明は、上記の方法により見いだされた受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片のオリゴマー化を阻害する物質を含む医薬組成物も提供する。その態様として、ＥＰＯ量が増加することによって生じる疾患の治療剤を挙げることができる。本発明の医薬組成物は、治療上有効量の上記オリゴマー化阻害物質とともに、適当な希釈剤、防腐剤、可溶化剤、乳化剤、担体などを含有してもよい。本発明の医薬組成物は、液体、粉体、保護被膜で被覆された形態のいずれであってもよく、非経口、経口、経肺、経鼻などを含めた種々の投与経路で投与されうる。投与経路、投与量、投与時間、投与間隔などの投与計画は、有効成分である上記オリゴマー化阻害物質とその剤型の特性、患者の年齢と病状などを考慮して、適宜決定することができる。
さらに、本発明は、受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片、および緩衝液を含む、その受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片のオリゴマー化を促進する物質をスクリーニングするための検査キットを提供する。例えば、受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片がエリスロポエチン受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片であり、緩衝液がリン酸緩衝生理食塩水であってもよい。
さらにまた、本発明は、受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片のオリゴマー化を促進する物質、受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片、および緩衝液を含む、その受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片のオリゴマー化を阻害する物質をスクリーニングするための検査キットを提供する。例えば、受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片のオリゴマー化を促進する物質がエリスロポエチンであり、受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片がエリスロポエチン受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片であり、緩衝液がリン酸緩衝生理食塩水であってもよい。
以下、本発明を詳細に説明する。
まず、受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片を用意する。受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片は、受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片を含む膜画分であってもよいが、好ましくは、細胞から単離・精製されたものであるとよく、より好ましくは、組換え法などにより作製されたものであるとよい。受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片を得る方法の一例を以下に記載する。
膜画分を用いる場合、目的とする受容体蛋白質分子を発現している細胞をＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００等の界面活性剤を含む緩衝液で可溶化し、リガンドまたは抗受容体抗体を固相化したアフィニティークロマトグラフィー等で受容体蛋白質分子を精製すればよい。
受容体蛋白質分子のリガンド結合部位の構造が明らかな場合には、その部分のペプチド断片を合成して使用することができる。
遺伝子組換え法により受容体蛋白質分子またはそのペプチド断片を得るには、ＰＣＲ法やｃＤＮＡライブラリーを用いて受容体蛋白質分子の全長またはリガンド結合部位を含む細胞外領域をコードするｃＤＮＡをクローニングし、適当な発現ベクターに組み込んだ後、Ｅ．ｃｏｌｉやＣＨＯ細胞等の宿主を用いて発現させればよい。精製を容易にする目的で目的とする蛋白質をコードする遺伝子の上流または下流にＭＢＰ，ＧＳＴ，ＦＬＡＧ等のタグをコードする遺伝子を連結することもできる。
受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片のオリゴマーをＲＩＡ法、酵素免疫沈降測定法などで検出するためには、予め、受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片を標識化しておく。
次いで、受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片を被検物質と接触させて、オリゴマー形成の有無を調べる。その具体的方法は以下のとおりである。
本発明の一態様では、受容体の結合をシンチレーションによって測定することができる。シンチレーションは同位体元素で標識された受容体から発せられる放射線が、複合体を形成したもう一方の受容体に結合した発光物質（シンチラント）に衝突して発する光を光電子倍増管やフォトダイオードなどで電圧パルスに変えて測定することかできる。発光物質としてはＮａＩ，ＣｓＩ，ＺｎＳなどの結晶または粉末、アントラセン、ナフタリンなどの結晶が好適に用いられる。また、Ａｍｅｒｓｈａｍ社によって開発された（Ｂｏｔｈｗｏｒｔｈ  Ｎ，ａｎｄ  Ｔｏｗｅｒｓ  Ｐ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ，３４１，１６７−１６８）シンチレーション近接アッセイ技術（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（ＳＰＡ）を用いることができる。シンチレーション近接アッセイでは、シンチラントを含むイットリウムシリケートまたはポリビニルトルエンビーズ（ＳＰＡビーズ）に同位体元素が結合または近接すると、放射同位体のエネルギーがＳＰＡビーズに吸収され光に変換される。例えば、ＳＰＡビーズを一方の受容体に結合させ、さらに放射性同位体を結合させたもう一方の受容体を溶液中に共存させる。ここに被検物質を加え、被検物質の介在によって生じる複合体の形成により誘起される光を検出することが可能である。ＳＰＡビーズと受容体との結合にはアビジン、ビオチンをもちいることができる。放射性同位体としては３Ｈ，１４Ｃ，３２Ｐ，４５Ｃａ，１２５Ｉをもちいることができる。また、ＳＰＡビーズの他にシンチラントをプレートの底面に含むマイクロタイタープレートを用いることもできる。例えば、標識をしていない一方の受容体をプレートの底面に固定し、ここへ放射性同位体で標識された受容体と被検物質を加える。被検物質を介して受容体の複合体が形成されると、プレート底面に放射性同位体で標識された受容体が留まり、プレート底面に含有されたシンチラントに放射性同位体のエネルギーが吸収されて光が発せられる。光量の増加により複合体の検出が可能である。ＳＰＡビーズを用いる方法は、結合、非結合の分離操作を必要とせず、簡便な方法である点で、大量の被検物質の活性を測定するスクリーニングに特に好適である。
本発明の別の態様では、ＢＩＡＣＯＲＥと呼ばれる表面プラズモン共鳴センサー（フェルマシアバイオテク社により開発、実用化された）により受容体の複合体形成を検出することができる。ＢＩＡＣＯＲＥの基本構造は、光源とプリズム、ディテクターとマイクロ流路からなる。カセット式のセンサーチップ上に一方の受容体を固定化し、もう一方の受容体をセンサーチップ上にインジェクションする。インジェクトされた受容体は一定の流速でセンサーチップ上に供給され、固定化された受容体中に拡散する。固定化された受容体とインジェクトされた受容体が結合して複合体を形成すれば、インジェクションされた受容体がセンサーチップ上に留まり、センサーチップ上の蛋白質で構成される体積が増加する。この体積の増加を光学的にプラズモン共鳴シグナルとして検出することができる。例えば、被検物質と受容体を同時にインジェクションした際のプラズモン共鳴シグナルの増加を検出し、被検物質を共存させることによって誘起されたプラズモン共鳴シグナルの増加により、被検物質の活性を検出することができる。
本発明のさらに別の態様では、核磁気共鳴（ＮＭＲ：Ｎｕｃｌｅａｒ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）を用いて複合体の形成を検出することが可能である。ＮＭＲはエネルギーの小さな電磁波を用いる方法であり、わずかなエネルギー変化でも感度よく検出することができる点で好ましい。例えば、２種の受容体を１ｍＭ程度の濃度で溶媒に溶かし、核磁気共鳴シグナルを測定する。ついで、被検物質を加え、再度核磁気共鳴シグナルを測定し、シグナルの移動を測定することで複合体を検出することができる。
本発明のさらなる別の態様では、酵素免疫沈降測定法（ＥＬＩＳＡ：Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）を用いることができる。例えば、９６穴プレートに一方の受容体を固定し、適当な溶媒下、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、またはアルカリフォスファターゼ等の酵素を結合させたもう一方の受容体と被検物質を加え反応させる。洗浄後、発色試薬を加え、好適な波長における吸光度を測定する。吸光度の増大により複合体の形成を検出することができる。酵素としてルシフェラーゼを結合させ、発光試薬により化学発光量により検出することも可能である。また、放射性同位元素または蛍光物質で標識した受容体を、酵素を結合した受容体の代わりに用いて、残存する電離線量または蛍光量を測定することにより検出することも可能である。
本発明のまた別の態様では、ゲル濾過クロマトグラフィーを用いることができる。適当な条件で反応した２種の受容体と被検物質をゲル濾過クロマトグラフィにふす。複合体の形成は、吸光度ピーク保持時間の移動により検出することができる。
受容体タンパク質またはそのペプチド断片のオリゴマー化を阻害する物質をスクリーニングするには、以下のようにすればよい。
受容体タンパク質またはそのペプチド断片のオリゴマー化を促進する物質と、被検物質とを共存させてシグナルの変化を検出することによりスクリーニングすることができる。
例えば、１２５Ｉで標識されているエリスロポエチン受容体またはそのペプチド断片と、シンチラントを含むイットリウムシリケートビーズまたはポリビニルトルエンビーズの表面にコーティングされているエリスロポエチン受容体またはそのペプチド断片とを含む水溶液に、受容体タンパク質またはそのペプチド断片のオリゴマー化を促進する物質と被検物質を添加し、誘起されるシンチレーションシグナルを測定することにより阻害する物質を検出することができる。
本発明の検査キットの一態様においては、キットを構成する要素が、各々あるいは組み合わせてあるいはひとまとめにして、バイアル，チューブなどのような容器に包含されていてもよく、さらに、それらの容器はひとまとめにして納めるための区画化された担持手段に納められていてもよい。このキットにおいては、受容体タンパク質分子またはそのペプチド断片、およびそのオリゴマー化を促進する物質が凍結乾燥された状態であるとよい。これらの要素は、検査キットの使用時に、緩衝液に添加されて、検査に供されるとよい。
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願特願平１０−１０２３２５号の明細書および図面に記載される内容を包含する。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は説明のためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
〔実施例１〕ＥＰＯレセプター遺伝子のクローニング
１）ＥＰＯレセプターｃＤＮＡ配列をもとにＰＣＲのための２組計４個のプライマーを設計した。即ち、第１回目のＰＣＲ用として、５’側にＥＲＯ−１（５’−ＧＣＡＧＣＴＧＣＴＧＡＣＣＣＡＧＣＴＧＴ−３’）（配列番号１）および３’側ＥＲＯ−２（５’−ＡＡＧＴＣＴＴＧＡＧＴＣＴＧＣＡＣＴＧＧ−３’）（配列番号２）を作製した。クローニングの正確性を高めるための第２回目のＰＣＲ用としてＥＲＯ−１，ＥＲＯ−２の内側の５’側にＥＲＩ−１（５’−ＴＴＴＧＡＡＴＴＣＴＧＴＡＴＣＡＴＧＧＡＣＣＡＣＣＴＣＧＧ−３’）（配列番号３）および３’側にＥＲＩ−２（５’−ＴＴＴＡＡＧＣＴＴＧＡＴＣＣＣＴＧＡＴＣＡＴＣＴＧＣＡＧＣ−３’）（配列番号４）を作製した。ＥＲＩ−１，ＥＲＩ−２には後にサブクローニングを容易にするため、ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩサイトをそれぞれ付与した。
２）ＥＰＯレセプター高発現細胞株（ＡＳ−Ｅ２）約１×１０８個より、ＡＧＰＣ法の改変法（フェノール処理とクロロホルム処理を追加）にてｔｏｔａｌ  ＲＮＡ（１．２３ｍｇ）を抽出した。ｔｏｔａｌ  ＲＮＡの全量から、ｏｌｉｇｏ  ｄＴ−ｌａｔｅｘ  ｂｅａｄｓを使ってｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ（７．８ｕｇ）を精製した。ｍＲＮＡの純度を電気泳動で確認した後、１ｕｇのｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡからＡｍｅｒｓｈａｍ  ｃＤＮＡ合成キットを用いて逆転写反応を行った。この反応液（２０ｕｌ）のうち２ｕｌを、ＬＡ  Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ  ＬＡ  ＰＣＲ  ｋｉｔ  ｖｅｒ２）を用いたＰＣＲを行った。ＰＣＲプライマーは、ＥＲＯ−１，ＥＲＯ−２およびＥＲＩ−１，ＥＲＩ−２を用いた。ＰＣＲサイクルは、９４℃、２ｍｉｎ−−−（９８℃、２０ｓｅｃ／６０℃、９０ｓｅｃ／７２℃、３ｍｉｎ）×３０ｃｙｃｌｅ−−−７２℃、１０ｍｉｎで行った。このＲＴ−ＰＣＲ反応液の一部を、電気泳動にて増幅フラグメントのサイズの確認を行った。
３）ＡＳ−Ｅ２細胞ｍＲＮＡより合成した１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを鋳型として、上記の方法にてＬＡ  Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ）を用いて独立に６反応のＰＣＲを行った。このＰＣＲにはプライマーとしてＥＲＩ−１，ＥＲＩ−２を用いた。増幅した各ＰＣＲフラグメントをｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）にサブクローニングした後、それぞれより１個ずつのクローンを選択し、プラスミドを調製した。それぞれの６クローンのプラスミド、およびＰＣＲフラグメント（Ｄｉｒｅｃｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）について解析を行った。
４）２箇所の塩基置換を含むＥＰＯ−Ｒ  ｃＤＮＡプラスミドよりＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩによりｃＤＮＡインサートを切り出したのち、ｐＵＣ１１９ベクターのＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩサイトに挿入した。このプラスミドをＢｓｓＨＩＩおよびＢａｌＩにて消化後、ベクターを含むフラグメントを得た（フラグメント１）。一方、３）で作製した６つのＥＰＯ−Ｒ  ｃＤＮＡのＢｓｓＨＩＩ部位よりＢａｌＩ部位までの領域が変異を含まない正常塩基配列を確認したクローンよりＢｓｓＨＩＩ部位よりＢａｌＩ部位までの領域を切り出した（フラグメント２）。フラグメント１とフラグメント２をライゲーションして得たクローンのなかで、塩基配列を解析しフラグメント２が正しく挿入されたクローン（ｐＵＣ１１９−ＥＰＯＲ−Ｌ２）を単離した。ｐＵＣ１１９−ＥＰＯＲ−Ｌ２より、ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩによりｃＤＮＡインサートを切り出したのち、ｐＢＬＳＩＩ  ＳＫ（＋）ベクターのＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩサイトに挿入したクローンを得た（ｐＥＰＯＲ−Ｌ２／ＳＫ）。
〔実施例２〕可溶性ＥＰＯレセプターの発現系構築
１）可溶型ヒトＥＰＯ受容体遺伝子を構築するため、ｐＥＰＯＲ−ＳＫを鋳型に用いて以下に示すプライマー１および２によりＰＣＲを行った。
プライマー１：５’−ＴＴＴＴＡＡＧＡＡＴＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＣＡＣＣＴＣＧＧＧＧＣＧＴ−３’（配列番号５）
プライマー２：５’−ＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＴＴＡＴＣＧＴＣＡＴＣＧＴＣＴＴＴＧＴＡＧＴＣＧＣＴＡＧＧＣＧＴＣＡＧＣＡＧＣＧＡＣＡ−３’（配列番号６）
プライマー３：５’−ＴＧＡＡＴＴＣＡＧＴＧＴＧＴＧＣＴＧＡＧＣＡＡＣＣＴ−３’（配列番号７）
プライマー４：５’−ＧＧＧＡＴＣＣＧＣＴＴＴＧＣＴＣＴＣＧＡＡＣＴＴ−３’（配列番号８）
５０μｌの反応溶液には１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．３、５０ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、２．５ＵのＥｘ．Ｔａｑ（宝酒造）、０．２５ｍＭのｄＮＴＰ、０．２μＭのプライマー１及び２、１８０ｎｇのｐＥＰＯＲ−ＳＫを含み、１５μｌのＣｈｉｌｌＯｕｔ１４（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．）を重相し、４８０型サーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）にて９６℃で１分、６０℃で１分、７２℃で２分のサイクルを３０サイクル反応させた後、７２度で１０分間保温した。得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）にて精製し、エタノール沈澱後、８μｌのＴＥに溶解した。１μｌのＢｕｆｆｅｒ  Ｈ（ｘ１０、宝酒造）を添加後ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩをそれぞれ０．５μｌ（１０Ｕ）添加して３７℃で２時間消化した。消化物を１％アガロースゲル電気泳動を行って、約７００ｂｐのバンドを切りだし、ゲルエクストラクションキット（Ｑｉａｇｅｎ）により抽出精製し、エタノール沈澱後、５μｌのＴＥに溶解した。同様にＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化したｐＵＣ１９（１μｇ、宝酒造）をエタノール沈澱後、１０μｌのＴＥに溶解した。切り出したバンドおよびｐＵＣ１９それぞれ２および１μｌに、蒸留水４μｌおよび２μｌのｘ５  Ｔ４  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ  Ｂｕｆｆｅｒ、１μｌのＴ４ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ（ライフテックオリエンタル）を混合し、１６℃、２時間反応させた後、氷上で融解した大腸菌ＪＭ１０９株コンピテントセル（宝酒造）に混和して氷上３０分間静置し、４２℃で１分間保温した後氷上に２分３０秒静置し、５００μｌのＳＯＣ培地（ライフテックオリエンタル）を添加して３７℃で保温した。このうち２００μｌをＬＢＡ−Ａｍｐプレートに播種して３７℃で一晩静置し、形成されたコロニーのうち６個を３ｍｌのＬＢ−ＡｍｐおよびＬＢＡ−Ａｍｐプレートにストリークして３７℃で培養し、さらに蒸留水に懸濁して上記条件でコロニーＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動にて解析し、すべてのクローンでＥＰＯ受容体遺伝子の挿入を確認した。ＬＢ−Ａｍｐにて培養した培養液から２０００ｒｐｍ、１５分間の遠心（日立、０５ＰＲ２２）により大腸菌を回収し、ＱＩＡｐｒｅｐ−ｓｐｉｎｐｌａｓｍｉｄ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）によりプラスミドを１００μｌのＴＥに回収した。プラスミド溶液をサイクルシークエンシングキット（パーキンエルマー）、プライマー１、２、３、４、Ｍ１３（−２１）（パーキンエルマー）またはＭ１３ＲＶ（宝酒造）を用いて、ＡＢＩ３７３Ａ型ＤＮＡシークエンサー（パーキンエルマー）にてサイクルシークエンス法にて塩基配列を決定した。目的とする可溶型ＥＰＯ受容体の配列をもつクローンのプラスミド溶液を上記条件でＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ消化して抽出精製し、同様に消化、抽出精製したｐＣＨＯ１と連結し、大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセルを上記条件で形質転換し、同様にプラスミド溶液を調製し、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩにて消化してアガロースゲル電気泳動により解析し、それぞれ目的の可溶型ＥＰＯ受容体遺伝子の挿入された可溶型ヒトＥＰＯ受容体発現プラスミドｐＣＨＯ／ＥｐｏＲ２を得た。
２）次に可溶型ヒトＥＰＯ受容体を発現するＣＨＯ細胞株の調製を行った。
３０μｌのｐＣＨＯ／ＥｐｏＲ２プラスミド溶液と４μｌのＢｕｆｆｅｒ  Ｋ（ｘ１０、宝酒造）、４μｌの１％ＢＳＡ溶液、２μｌのＰｖｕＩを混和して３７℃で一晩静置し、５０μｌのＴＥおよび１００μｌのＴＥ飽和フェノールを混和後１４０００ｒｐｍで１分間（トミー精工、ＭＲＸ−１５０）遠心し水相を回収し、１００μｌのクロロホルムを添加混合後、１４０００ｒｐｍで１分間（トミー精工、ＭＲＸ−１５０）遠心し水相を回収し、エタノール沈澱を行った。２０μｌの滅菌ＴＥに溶解し、２６０ｎｍの吸光度を測定して濃度を計算した。１０μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔ  ＡＭＩＮＥ（ライフテックオリエンタル）および３μｇのＰｖｕＩ消化プラスミド溶液をそれぞれ０．３ｍｌのα−ＭＥＭに懸濁した後混和し、室温で３０分間静置した。２５Ｔフラスコ（ベクトンディッキンソン）に７０％コンフルエントに培養したＣＨＯ細胞をα−ＭＥＭにて洗浄後、２．４ｍｌのα−ＭＥＭを添加し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔ  ＡＭＩＮＥ−プラスミド混合液を添加して３７℃、５％ＣＯ２下で８時間培養した。上清を捨て、５ｍｌの１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）を含むα−ＭＥＭにて一晩培養した後、上清を捨て５ｍｌの１０％ＦＣＳを含むα−ＭＥＭ（核酸不合、選択培地）にて培養を開始した。２から４日間隔で選択培地を交換し、増殖細胞を７５Ｔフラスコにて１度継代培養を行った後、ｗｅｌｌあたり０．１個となるように希釈して５枚の９６−１／２穴プレート（コーニング）に限界希釈を行った。２週間後に倒立顕微鏡下で各ｗｅｌｌを観察して８９個のクローンの増殖を確認した。ダルベッコＰＢＳにて洗浄後、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液にて細胞を回収し、２４穴プレートにて培養を行い、コンフルエントに培養し、培地を交換して４日間培養して培養上清を得た。可溶型ＥＰＯ受容体を抗ＦＬＡＢ  Ｍ２抗体を一次抗体に用いたウエスタンブロット法にて確認し、可溶型ＥＰＯ受容体発現クローンｃ１６５を得た。ｃ１６５を２０ｎＭ  ＭＴＸを含む選択培地で培養し、限界希釈を行って、３６クローンを得た。培養上清を調製して可溶型ＥＰＯ受容体を抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体または抗ＥＰＯ受容体抗体（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を一次抗体に用いたウエスタンブロット法にて確認し、可溶型ＥＰＯ受容体発現ＣＨＯ細胞株ＥｐｏＲ／ＣＨＯ  ｃ１６５−１９を得た。
〔実施例３〕可溶性ＥＰＯレセプターの精製
ｓＥｐｏＲ発現ＣＨＯ細胞の培養上清をフィルター（ポアサイズ５μｍフジフィルム社製）で濾過し、更にＳＡＲＴＯＰＵＲＥ  ＰＰフィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社製）、ＳＡＲＴＯＢＲＡＮ  Ｐフィルター（ポアサイズ０．４５＋０．２μｍ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を通して細胞片等を除去した。
濾液にビストリス塩酸緩衝液（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓを水に溶解し、ＨＣｌでｐＨ６．０に調製した溶液）を２０ｍＭになるよう添加し、２０ｍＭビストリス塩酸緩衝液ｐＨ６．０で平衡化したＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ベットボリューム５００ｍｌ）カラムに流速４〜５ｍｌ／分で吸着させた。同カラムを２０ｍＭビストリス塩酸緩衝液ｐＨ６．０で洗浄して非吸着蛋白質を除去した後、０．５Ｍ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭビストリス塩酸緩衝液ｐＨ６．０で溶出し（流速５〜６ｍｌ／分）、得られた画分にトリス塩酸緩衝液（Ｔｒｉｓを水に溶解し、ＨＣｌでｐＨ７．３に調製した溶液）を５０ｍＭになるように添加して、ＴＢＳ（宝酒造社製）溶液で平衡化した抗ＦＬＡＧ  Ｍ２アフィニティー（ベットボリューム１０ｍｌ、イーストマンコダック社製）カラムに吸着させた（流速１ｍｌ／分）。
抗ＦＬＡＧ  Ｍ２アフィニティーカラムへの吸着蛋白質を０．１Ｍのグリシン塩酸緩衝液ｐＨ３．５で溶出し、１Ｍトリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０を約１／１０量添加してｐＨを中性付近に戻して、Ｖｙｄａｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ４（Ｖｙｄａｃ社製）による逆相系高速液体クロマトグラフィーに供した。すなわち、２０％アセトニトリルを含む０．１％トリフルオロ酢酸溶液で平衡化したＶｙｄａｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ４カラムに吸着させ、６０分間でアセトニトリル濃度を８０％まで直線的に増加させて溶出した。当該高速液体クロマトグラフィーによる溶出結果は単一ピークを呈したことから、当該標品を精製ｓＥｐｏＲとした。
〔実施例４〕可溶性ＥＰＯレセプターのビオチン標識
実施例３で得られた精製ｓＥｐｏＲを０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液ｐＨ８．６に溶媒置換した。すなわち、真空遠心濃縮機で乾燥後に０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液ｐＨ８．６に溶解するか、あるいは、０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液ｐＨ８．６で平衡化したＦａｓｔ  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇカラム（ファルマシア社製）を用いて溶媒置換を行った。
ビオチン化試薬（アマシャム社製）を標識対象の蛋白質１ｍｇ当たり４０μｌ添加し、攪拌しながら室温で１時間標識を行った。反応液中の未反応試薬を、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ溶液で平衡化したバイオゲルＰ−６カラム（バイオラッド社製）で除去し、得られた蛋白質画分をビオチン標識ｓＥｐｏＲとした。
〔実施例５〕可溶性ＥＰＯレセプターの１２５Ｉ標識
実施例３で得られた精製ｓＥｐｏＲを０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液ｐＨ８．６に溶媒置換した。すなわち、真空遠心濃縮機で乾燥後に０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液ｐＨ８．６に溶解するか、あるいは、０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液ｐＨ８．６で平衡化したＦａｓｔ  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇカラム（ファルマシア社製）を用いて溶媒置換を行った。
１２５Ｉ  Ｂｏｌｔｏｎ  ａｎｄ  Ｈｕｎｔｅｒ試薬（アマシャム社製）の入ったバイアルに窒素ガスを吹き付けて溶媒を蒸発させ、同バイアルにｓＥｐｏＲ溶液（約１ｍｇ／ｍｌ）を１５μｌ添加した。５分毎に攪拌しながら氷中で３０分間反応を行った後、０．２Ｍグリシンを含む０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液ｐＨ８．６を５００μｌ加えて更に５分間氷中で反応を行った。
反応液中の未反応試薬を、０．２５％ゼラチンを含む０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．２で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（ファルマシア社製）で除去し、得られた蛋白質画分を１２５Ｉ標識ｓＥｐｏＲとした。
〔実施例６〕ＳＰＡビーズによるＥＰＯレセプター二量体形成の検出
１００μｌの測定用緩衝液（組成：０．１％ＢＳＡ、５ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ＰＢＳ（−））中に５０μｇのストレプトアビジン結合ＳＰＡビーズ（アマシャム社製）、ビオチン化ｓＥｐｏＲ、約１５００００ｃｐｍの１２５Ｉ標識ｓＥｐｏＲが含まれる溶液を調製した。この溶液中に以下に示す構造のＥＰＯレセプター結合性ペプチドの二量体（ＳＣＩＥＮＣＥ，２７３：４５８−４６３，（１９９６）、ＢＬＯＯＤ，８８（１０）：５４２ａ，（１９９６）、ＳＣＩＥＮＣＥ，２７６：１６９６−１６９９，（１９９７）を参考に株式会社ペプチド研究所に依頼して合成）を添加して室温で１２時間反応を行った後、マイクロベータ（ファルマシア社製）で測定した。
ＥＰＯレセプター結合性ペプチドの二量体の構造
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その結果、ＥＭＰ１二量体の濃度に依存したＳＰＡビーズからのシグナルが得られ、ＥＰＯレセプターの二量体化が検出された（図１）。
産業上の利用可能性
受容体多量体形成を指標とした生理活性因子代替物スクリーニング方法が提供された。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、ＳＰＡビーズによるＥＰＯレセプター二量体の検出結果を示す。横軸はＥＭＰ１二量体のモル濃度、縦軸は発光量のカウントを示す。
【図１】
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