(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の工程からなる組み合わせ変異による硫黄原子を含まない酵素蛋白質の製造方法。（１）硫黄原子を含むアミノ酸（含硫アミノ酸）の配列上の位置がＡｉ（ｉ＝１〜ｎ）である、ｎ個の含硫アミノ酸を含む全長ｍ個のアミノ酸よりなる酵素蛋白質をコードするＤＮＡ配列のＬ−メチオニンをコードする開始コドンを、Ｌ−メチオニン−Ｌ−アラニン、Ｌ−メチオニン−Ｌ−セリン又はＬ−メチオニン−Ｌ−プロリンのコドンで置換した変異体遺伝子を作成し、これを宿主細胞で発現して得られた変異体酵素蛋白質の酵素活性を測定し、最も活性が高いものを選び得られる置換変異体をＡ１／ＭＡ１とする；
（２）その他の部位のＡｉ（ｉ＝２〜ｎ）の含硫アミノ酸をコードするコドンをＬ−アラニン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−プロリン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−バリン、Ｌ−チロシン、及びＬ−トリプトファンからなる群から選択される他のアミノ酸をコードするコドンで置換した変異遺伝子を作成し、これを宿主細胞で発現して得られた変異体酵素蛋白質の酵素活性を測定し、酵素活性を示すｐ個の変異体酵素蛋白質を選び得られる置換変異体をＡｉ／Ｂｉｊ（ｊ＝１〜ｐ）とする；
（３）置換変異体のうち活性の高いものから最大３個の置換変異体Ａｉ／Ｂｉ１、Ａｉ／Ｂｉ２及びＡｉ／Ｂｉ３を選択するが、ここで置換変異体はＡｉ／Ｂｉ１＞Ａｉ／Ｂｉ２＞Ａｉ／Ｂｉ３＞・・＞Ａｉ／Ｂｉｐの順に活性が小さくなるものとする；
（４）全ての部位Ａｉ（ｉ＝２〜ｎ）の含硫アミノ酸について、（２）、（３）と同様にして活性を有する置換変異体を選択し、それらの変異体とＡ１／ＭＡ１の変異体を全て組み合わせた最大３×（ｎ−１）個の変異体を作成し、それらの酵素活性を測定して元の酵素蛋白質と同等以上の活性を有する変異体酵素蛋白質を作成する。
【請求項２】
次の工程からなる段階的変異による硫黄原子を含まない酵素蛋白質の製造方法。
（１）硫黄原子を含むアミノ酸（含硫アミノ酸）の配列上の位置がＡｉ（ｉ＝１〜ｎ）である、ｎ個の含硫アミノ酸を含む全長ｍ個のアミノ酸よりなる酵素蛋白質をコードするＤＮＡ配列のＬ−メチオニンをコードする開始コドンを、Ｌ−メチオニン−Ｌ−アラニン、Ｌ−メチオニン−Ｌ−セリン又はＬ−メチオニン−Ｌ−プロリンのコドンで置換した変異体遺伝子を作成し、これを宿主細胞で発現して得られた変異体酵素蛋白質の酵素活性を測定し、最も活性が高いものを選び得られる置換変異体をＡ１／ＭＡ１とする；
（２）Ａ１／ＭＡ１変異体のＡ２の含硫アミノ酸をコードするコドンをＬ−アラニン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−プロリン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−バリン、Ｌ−チロシン、及びＬ−トリプトファンからなる群から選択される他のアミノ酸をコードするコドンで置換した変異遺伝子を作成し、これを宿主細胞で発現して得られた２重変異体酵素蛋白質の酵素活性を測定し、活性の高いものから最大３個の２重変異体を選ぶ；
（３）得られた２重変異体のそれぞれのＡ３の含硫アミノ酸をコードするコドンをＬ−アラニン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−プロリン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−バリン、Ｌ−チロシン、及びＬ−トリプトファンからなる群から選択される他のアミノ酸をコードするコドンで置換した変異遺伝子を作成し、これを宿主細胞で発現して得られた３重変異体酵素蛋白質の酵素活性を測定し、活性の高いものから最大３個の３重変異体を選ぶ；
（４）以下同様に、ｎ重変異体を作成し、ここでnは４以上であり置換したアミノ酸の数を表し、最後のｎ重変異体の酵素活性を調べ、元の酵素の活性と同等以上の活性を有する変異体酵素蛋白質を作成する。
【請求項３】
段階的に変異する部位の順番が、Ａ１、Ａ２、・・・、Ａｎの順列組み合わせの種類（ｎ！通り）のうちどれか一つであることを特徴とする請求項２に記載の段階的変異による硫黄原子を含まない酵素蛋白質の製造方法。
【請求項４】
含硫アミノ酸の配列上の位置がＡｉ（ｉ＝１〜ｎ）である、ｎ個の含硫アミノ酸を含む全長ｍ個のアミノ酸よりなる酵素蛋白質において、ｋ個の部位に関しては請求項１に記載の方法を行い、ここでｋはｎより小さい自然数であり、残りのｎ−ｋ個の部位に関しては請求項２に記載の方法を行うことを特徴とする硫黄原子を含まない酵素蛋白質の製造方法。
【請求項５】
Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−プロリン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−バリン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−システイン、及びＬ−メチオニンの２０種類のＬ−アミノ酸残基から構成される酵素蛋白質のすべてのＬ−システイン及びＬ−メチオニン残基をＬ−アラニン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−プロリン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−バリン、Ｌ−チロシン、及びＬ−トリプトファンの１８種類のＬ−アミノ酸残基のいずれかに置換した、元の酵素蛋白質の活性を保持し耐酸化性を有する、請求項１〜４のいずれかに記載の方法で製造した硫黄原子を含まない酵素蛋白質であって、ジヒドロ葉酸還元酵素活性を保持し耐酸化性を有することを特徴とする硫黄原子を含まない酵素蛋白質。
【請求項６】
Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−プロリン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−バリン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−システイン、及びＬ−メチオニンの２０種類のＬ−アミノ酸残基から構成される酵素蛋白質のすべてのＬ−システイン及びＬ−メチオニン残基をＬ−アラニン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−プロリン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−バリン、Ｌ−チロシン、及びＬ−トリプトファンの１８種類のＬ−アミノ酸残基のいずれかに置換した、元の酵素蛋白質の活性を保持し耐酸化性を有する、請求項１〜４のいずれかに記載の方法で製造した硫黄原子を含まない酵素蛋白質であって、キシラナーゼの活性を保持し耐酸化性を有することを特徴とする硫黄原子を含まない酵素蛋白質。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、硫黄原子を含まない酵素蛋白質に関する。
背景技術
酵素は、その基質特異性が非常に高いためバイオセンサー等の分析機器開発、バイオリアクターなどのファインケミカル産業、また、特定汚染物質の分解除去など利用が試みられ、また期待されている。
近年の質量分析装置の発達により、蛋白質の質量分析ができるようになってきた。蛋白質の質量数を質量分析により求めると、蛋白質として高度に精製された蛋白質でもアミノ酸配列から予想される質量数以外の質量数を示すものの混在が見いだされる様になってきた。例えば、Ｌ−システインを含まないジヒドロ葉酸還元酵素を用いて詳しく調べたところ、質量数変化は、質量数１６を単位とするものであり、メチオニンの酸化がその主な原因である。
酵素の利用を考える場合、酸化による蛋白質の変質は大きな障害となる。例えば、多くのバイオセンサーは電極反応を利用するが、その際過酸化水素等の酸化物が電極反応により生成し、これは酵素を酸化しセンサー全体の劣化を早めたり、信頼性を失わせたりする可能性が考えられるからである。また、長期間溶液中で酵素を利用する場合も水溶液中の酸素による酸化を防ぐことは困難もしくはコスト的に問題となるであろう。
蛋白質を構成する原子は、水素（Ｈ）、炭素（Ｃ）、窒素（Ｎ）、酸素（Ｏ）、及び硫黄（Ｓ）の５種類である。このうち、硫黄原子は他の原子に比べて電子価特性等反応性の強い原子である。
生物が作る蛋白質は、遺伝子であるＤＮＡ中にトリプレットコドンで暗号化されているＬ−アラニン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−プロリン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−バリン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−システイン、及びＬ−メチオニンの２０種類のＬ−アミノ酸残基から構成される。このうち、含硫アミノ酸は、Ｌ−システイン及びＬ−メチオニンである。
Ｌ−システインの硫黄原子は、チオール（−ＳＨ）基として存在する。チオール基は非常に反応性が高く、酸素、過酸化水素により容易に酸化されて、ジスルフィドさらにスルフィン酸を生成する。
Ｌ−メチオニンの硫黄原子は、チオエーテル（−Ｓ−ＣＨ３）基として存在する。チオエーテル基は、チオール基ほど反応性は強くないが、過酸化水素により容易に酸化されてメチオニンスルフォキシドが生成する。
このことは、Ｌ−システイン及びＬ−メチオニン、即ち含硫アミノ酸を含まない酵素は、抗酸化特性を有することを示唆している。
Ｌ−システイン及びＬ−メチオニンに対応するコドンは、ＴＧＴとＴＧＣ（Ｌ−システイン）及びＡＴＧ（Ｌ−メチオニン）の３種類である。一方、硫黄を含まないその他１８種のＬ−アミノ酸に対応するコドンは、５８種類である。従って、平均すると蛋白質は、２０アミノ酸に１個の割合（３／６１）で、Ｌ−システインもしくはＬ−メチオニンを含むことになる。このことは、１００アミノ酸以上で構成される蛋白質は、非常に高い確率でＬ−システインもしくはＬ−メチオニンを含んでいることを意味する。実際、これまで報告された蛋白質のうちで触媒機能を有する酵素を調べてみると、Ｌ−システイン及びＬ−メチオニンを全く含まないものは見あたらない。
即ち、生物が作る酵素は全て含硫アミノ酸を含んでいるのである。
ところが、近年の遺伝子操作を背景とする蛋白質変異の結果は、少なくとも一箇所の変異であれば、元の酵素機能を失わせることなく含硫アミノ酸を他のアミノ酸に置換することが可能であることを明らかにしてきている。ただ、本発明が完成された以前においては、全ての含硫アミノ酸を他のアミノ酸に置換した酵素が元の機能と同等の活性を示すか否かに関しては明らかとなっていなかった。むしろ、酵素活性の発現には、含硫アミノ酸の存在が必須であるとの考え方が支配的であった。
このことから、次の相反する２つ可能性が考えられる。
第１の可能性は、生物がその生命維持に必要とするために必要な非常に高い酵素活性を発現するためには、含硫アミノ酸の存在が必須である。
第２の可能性は、非常に高い酵素活性を発現するためには、含硫アミノ酸の存在は必ずしも必要としないが、生命の起源の過程においてたまたま硫黄原子含んだ形で蛋白質を利用し且つ遺伝子のコード形態を確立させたため、生物が作る酵素はコドン使用頻度の割合に対応して含硫アミノ酸を含んでいる。従って、全ての含硫アミノ酸を他のアミノ酸に置換し、生物が作る含硫アミノ酸を含む酵素と同等の機能を有する酵素を作ることが可能である。
もし、第２の可能性が正しければ、生物由来の含硫アミノ酸を含む酵素の全ての含硫アミノ酸を他のアミノ酸に置換することにより、抗酸化特性を有する酵素を製造する一般的な方法を開発できることになる。
発明の開示
本発明者らは、鋭意研究を重ね、生物由来の含硫アミノ酸を含む酵素の全ての含硫アミノ酸を他のアミノ酸に置換しても、元の酵素と同程度もしくはそれ以上の酵素活性を示す酵素が製造できることを実証するとともに、生物由来の野性型酵素から含硫アミノ酸を含まない酵素への変異戦略を確立し、本発明を完成させるに至った。
なお、本発明における野性型酵素とは、生物由来の酵素の他に、生物由来の酵素に人工的に変異させて得られた酵素を含むものとする。
すなわち、本発明は、野性型酵素の活性を保持するとともに、過酸化水素等の酸化に対する抗酸化特性を有する酵素蛋白質、及びその製造方法を提供することを目的とするものである。
本発明では、上記目的を達成するために、次のような構成を採る。
１．Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−プロリン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−バリン、Ｌ−チロシン、及びＬ−トリプトファンの１８種類のＬ−アミノ酸残基から構成される硫黄原子を含まない酵素蛋白質。
２．Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−プロリン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−バリン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−システイン、及びＬ−メチオニンの２０種類のＬ−アミノ酸残基から構成される酵素蛋白質のＬ−システイン及びＬ−メチオニン残基をＬ−アラニン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−プロリン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−バリン、Ｌ−チロシン、及びＬ−トリプトファンの１８種類のＬ−アミノ酸残基に置換した、元の酵素蛋白質の活性を保持し耐酸化性を有する上記１．の硫黄原子を含まない酵素蛋白質。
３．アミノ酸置換が合成ＤＮＡを使用した部位特異的変異法により行われたものである上記２．の硫黄原子を含まない酵素蛋白質。
４．酵素活性が酸化還元活性、もしくは加水分解活性の機能を有することを特徴とする上記１．〜３．いずれかの硫黄原子を含まない酵素蛋白質。
５．ジヒドロ葉酸還元酵素活性を保持し耐酸化性を有することを特徴とする上記１．〜４．いずれかの硫黄原子を含まない酵素蛋白質。
６．キシラナーゼの活性を保持し耐酸化性を有することを特徴とする上記１．〜４．いずれかの硫黄原子を含まない酵素蛋白質。
７．次の工程からなる組み合わせ変異による硫黄原子を含まない酵素蛋白質の製造方法。
（１）硫黄原子を含むアミノ酸（含硫アミノ酸）の配列上の位置がＡｉ（ｉ＝１〜ｎ）である、ｎ個の含硫アミノ酸を含む全長ｍ個のアミノ酸よりなる酵素蛋白質をコードするＤＮＡ配列のＬ−メチオニンをコードする開始コドンを、Ｌ−メチオニン−Ｌ−アラニン、Ｌ−メチオニン−Ｌ−セリン又はＬ−メチオニン−Ｌ−プロリンのコドンで置換した変異体遺伝子を作成し、これを宿主細胞で発現して得られた変異体酵素蛋白質の酵素活性を測定し、最も活性が高いものを選び得られる置換変異体をＡ１／ＭＡ１とする；
（２）その他の部位のＡｉ（ｉ＝２〜ｎ）の含硫アミノ酸をコードするコドンを１．に記載される１８種類の他のアミノ酸（以下、当該アミノ酸を「含硫アミノ酸以外の他のアミノ酸」という）をコードするコドンで置換した変異遺伝子を作成し、これを宿主細胞で発現して得られた変異体酵素蛋白質の酵素活性を測定し、酵素活性を示すｐ個の変異体酵素蛋白質を選び得られる置換変異体をＡｉ／Ｂｉｊ（ｊ＝１〜ｐ）とする；
（３）置換変異体のうち活性の高いものから最大３個の置換変異体Ａｉ／Ｂｉ１、Ａｉ／Ｂｉ２及びＡｉ／Ｂｉ３を選択するが、ここで置換変異体はＡｉ／Ｂｉ１＞Ａｉ／Ｂｉ２＞Ａｉ／Ｂｉ３＞・・＞Ａｉ／Ｂｉｐの順に活性が小さくなるものとする；
（４）全ての部位Ａｉ（ｉ＝２〜ｎ）の含硫アミノ酸について、（２）、（３）と同様にして活性を有する置換変異体を選択し、それらの変異体とＡ１／ＭＡ１の変異体を全て組み合わせた最大３×（ｎ−１）個の変異体を作成し、それらの酵素活性を測定して元の酵素蛋白質と同等以上の活性を有する変異体酵素蛋白質を作成する。
８．次の工程からなる段階的変異による硫黄原子を含まない酵素蛋白質の製造方法。
（１）硫黄原子を含むアミノ酸（含硫アミノ酸）の配列上の位置がＡｉ（ｉ＝１〜ｎ）である、ｎ個の含硫アミノ酸を含む全長ｍ個のアミノ酸よりなる酵素蛋白質をコードするＤＮＡ配列のＬ−メチオニンをコードする開始コドンを、Ｌ−メチオニン−Ｌ−アラニン、Ｌ−メチオニン−Ｌ−セリン又はＬ−メチオニン−Ｌ−プロリンのコドンで置換した変異体遺伝子を作成し、これを宿主細胞で発現して得られた変異体酵素蛋白質の酵素活性を測定し、最も活性が高いものを選び得られる置換変異体をＡ１／ＭＡ１とする；
（２）Ａ１／ＭＡ１変異体のＡ２の含硫アミノ酸をコードするコドンを前記「含硫アミノ酸以外の他のアミノ酸」をコードするコドンで置換した変異遺伝子を作成し、これを宿主細胞で発現して得られた２重変異体酵素蛋白質の酵素活性を測定し、活性の高いものから最大３個の３重変異体を選ぶ；
（３）得られた２重変異体のそれぞれのＡ３の含硫アミノ酸をコードするコドンを前記「含硫アミノ酸以外の他のアミノ酸」をコードするコドンで置換した変異遺伝子を作成し、これを宿主細胞で発現して得られた３重変異体酵素蛋白質の酵素活性を測定し、活性の高いものから最大３個の３重変異体を選ぶ；
（４）以下同様に、４重、・・、ｎ重変異体を作成し、最後のｎ重変異体の酵素活性を調べ、元の酵素の活性と同等以上の活性を有する変異体酵素蛋白質を作成する。
９．段階的に変異する部位の順番が、Ａ１、Ａ２、・・・、Ａｎの順列組み合わせの種類（ｎ！通り）のうちどれか一つであることを特徴とする上記８．の段階的変異による硫黄原子を含まない酵素蛋白質の製造方法。
１０．含硫アミノ酸の配列上の位置がＡｉ（ｉ＝１〜ｎ）である、ｎ個の含硫アミノ酸を含む全長ｍ個のアミノ酸よりなる酵素蛋白質において、ｋ個の部位に関しては上記７．の方法を行い、残りのｎ−ｋ個の部位に関しては上記９．の方法を行うことを特徴とする硫黄原子を含まない酵素蛋白質の製造方法。
本発明において、元の蛋白質の活性を保持するとは、野性型酵素の１０％以上の活性、好ましくは５０％以上の活性、特に好ましくは１００％以上の活性を有し、元の酵素蛋白質と同様の用途に使用できることを意味する。
次に、本発明において目的とする酵素蛋白質を得る第１の方法の手順について説明する。
全長ｍ個のアミノ酸よりなる野性型酵素において含硫アミノ酸がｎ個あるとする。その各々のアミノ酸配列上の位置を、Ａｉ（ｉ＝１〜ｎ）とする。
蛋白質の開始コドンに由来するアミノ酸は、Ｌ−メチオニンである。
アミノ末端のＬ−メチオニンを含まないようにするためには、宿主細胞が有するメチオニルアミノペプチダーゼ（ｍｅｔｈｉｏｎｙｌ−ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）の反応特異性に従い、メチオニンをアミノ末端から脱離させることができる。
例えば、宿主として大腸菌を用いた場合、アミノ末端をＬ−メチオニン−Ｌ−アラニン、Ｌ−メチオニン−Ｌ−セリン、もしくはＬ−メチオニン−Ｌ−プロリンのいずれかにすることにより、末端のＬ−メチオニンが脱離した形で発現させることができる。従って、まず第一に、酵素のアミン末端の変異として、Ｌ−メチオニン−Ｌ−アラニン、Ｌ−メチオニン−Ｌ−セリン、もしくはＬ−メチオニン−Ｌ−プロリンのコドンを有する変異体遺伝子を作製し、これを宿主で発現させ、得られた変異体の活性を測定し、最も活性が高いものを選ぶことにより、アミノ末端がメチオニンでない変異酵素を作製できる。
この様にして得られる変異を、Ａ１／ＭＡ１と表す。
その他の部位のＡｉ（ｉ＝２〜ｎ）の含硫アミノ酸に関して、含硫アミノ酸をコードするコドンを前記「含硫アミノ酸以外の他のアミノ酸」（最大１８種類）をコードするコドンで置換した変異遺伝子を作成し、これを宿主細胞で発現して得られた２重変異体酵素蛋白質の酵素活性を調べる。
酵素蛋白質中の特定の部位でのアミノ酸置換は、合成ＤＮＡを用いた部位特異的変異法により行うことができる。
部位特異的変異法としては、ＺｏｌｌｅｒとＳｍｉｔｈらの方法（Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１００，ｐ．４６８）及びその改良方法、本実施例で用いているＰＣＲを利用した方法などの他多く方法が公知である。本発明においては、目的の含硫アミノ酸部位でのアミノ酸置換できる変異方法であればどのような方法でも適用可能であり、目的を達成することができる。従って、変異体の作製方法によって本発明は制限を受けない。
Ａｉの含硫アミノ酸の置換変異体を作製し、その活性を調べると、野性型酵素と同等もしくはそれ以上の活性を示す変異体がｐ個見いだされる。そのアミノ酸を、Ｂｉｊ（ｊ＝１、〜ｐ）とする。ただし、Ａｉ／Ｂｉｊ置換変異体の活性を高いものから並べるものとする。即ち、Ａｉ／Ｂｉ１＞Ａｉ／Ｂｉ２＞Ａｉ／Ｂｉ３＞  ・・  ＞Ａｉ／Ｂｉｐの順に変異体の活性が小さくなるものとする。
Ａｉ／Ｂｉｊ置換変異のうち、活性の高いものから最大３個の置換変異、即ち、Ａｉ／Ｂｉ１、Ａｉ／Ｂｉ２、及びＡｉ／Ｂｉ３を選ぶ。
全てのｉ（ｉ＝２〜ｎ）について同じように選び、それらの変異とＡ１／ＭＡ１の変異を全て組み合わせた最大３ｘ（ｎ−１）個の変異体を作製し、３ｘ（ｎ−１）個の変異体の活性を調べ、野性型酵素の活性と同等もしくは優れたものを選ぶ。
このようにして得られる変異酵素は、含硫アミノ酸を含まないことが明らかである。
また、このようにして作製される野性型酵素と同等もしくはそれ以上の活性を示す含硫アミノ酸を含まない酵素は、過酸化水素などの処理により酸化を受けにくいという特徴を有する全く新規な酵素である。
以上第１の方法を、ここでは「組み合わせ変異による含硫アミノ酸を含まない酵素の作製方法」と呼ぶ。
また、本発明の野性型酵素と同等もしくはそれ以上の活性を示す含硫アミノ酸を含まない酵素は、次に示す第２の方法によっても作製することができる。
前記第１の方法に従いＡ１／ＭＡ１変異体を作製する。
次に、同様にＡ１／ＭＡ１変異体のＡ２の含硫アミノ酸を含硫アミノ酸以外の他のアミノ酸（最大１８種）に置換した２重変異体（最大１８種）をそれぞれ作製し、その酵素活性を調べる。
２重変異体の活性を調べると、野性型と同等もしくはそれ以上の活性を示す変異体が見いだされる。２重変異のうち活性の高いものから最大３個の２重変異体を選ぶ。
次に、得られた２重変異体のそれぞれのＡ３の含硫アミノ酸を含硫アミノ酸以外の他のアミノ酸（最大１８種）に置換した３重変異体をそれぞれ作製し（最大、３ｘ１８＝５４種）、その酵素活性を調べる。
３重変異体の活性を調べると、野性型と同等もしくはそれ以上の活性を示す変異体が見いだされる。
以下同様に、４重、・・、ｎ重変異体を作製する。最後のｎ重変異体が、目的の含硫アミノ酸を含まない酵素である。
なお、説明の都合で、変異する部位の順番を、Ａ１、Ａ２，・・、Ａｎとしたが、変異の順番は、順列組み合わせの種類（ｎ！通り）のうちどれか一つを適当に選ぶものとする。
以上第２の方法を、ここでは「段階的変異による含硫アミノ酸を含まない酵素の作製方法」と呼ぶ。
「段階的変異による含硫アミノ酸を含まない酵素の作製方法」においては、最大〔４（Ａ１）＋１８（Ａ２）＋５４ｘ（ｎ−２）（Ａ３〜Ａｎ）〕の変異体を調べることになる。
また、本発明の野性型酵素と同等もしくはそれ以上の活性を示す含硫アミノ酸を含まない酵素は、「組み合わせ変異による含硫アミノ酸を含まない酵素の作製方法」と「段階的変異による含硫アミノ酸を含まない酵素の作製方法」を部分的に組み合わせた方法（ここでは「組み合わせ変異と段階的変異との組み合わせによる含硫アミノ酸を含まない酵素の作製方法」と呼ぶ）を用いても作製できることは自明であろう。
本発明の硫黄原子を含まない酵素蛋白質の作製のためには、対象とする野性型酵素のアミノ酸配列及び塩基配列の情報が有れば十分である。例えば、塩基配列の情報に従いＰＣＲプライマーを合成し、野性型酵素を生産する細胞のＤＮＡもしくはｃＤＮＡもしくは組み換えプラスミドＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法により野性型酵素をコードするＤＮＡを合成することできる。また、塩基配列を元に化学合成によっても野性型酵素をコードするＤＮＡを作製することができる。このようにして得られた野性型酵素をコードするＤＮＡに、本発明に示される方法に従って変異を施すことにより本発明を行うことができる。従って、本発明は野性型酵素の遺伝子によって制限を受けない。
本発明の実施例においては、酸化還元酵素の代表例として、大腸菌由来のジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲと略す）のシステインフリー変異体（ＡＳ−ＤＨＦＲと略す）を出発物質として、ＡＳ−ＤＨＦＲ中に５個含まれるメチオニンを他のアミノ酸に置き換えて、２個のシステイン残基及び５個のメチオニン残基を含む野性型ＤＨＦＲの酵素活性を遥かに凌ぐ高活性型の含硫アミノ酸を含まないＤＨＦＲの作製を示している。また、加水分解酵素の代表例として、枯草菌由来のキシラナーゼに含まれる２個のメチオニンを他のアミノ酸に置き換えて、野性型酵素と同等の活性を示す含硫アミノ酸を含まないキシラナーゼの作製を示している。
また、配列表配列番号１に、ＡＳ−ＤＨＦＲのアミノ酸配列を、配列表配列番号２に、制限酵素ＢａｍＨＩで切り出し可能で且つ大腸菌の適当なベクターのＢａｍＨＩ部位に導入することにより大腸菌で高発現可能な遺伝子配列を、配列表配列番号３に枯草菌由来のキシラナーゼのアミノ酸配列を、配列表配列番号４に枯草菌由来のキシラナーゼをコードするＤＮＡ配列をそれぞれ示している。
配列表配列番号２のＤＮＡは、本発明者らが報告した配列（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｖｏｌ．１１７，ｐ．４８０−４８８（１９９５）に記載）を持つ組み換えプラスミドｐＴＺＤＨＦＲ２０を鋳型として、例えば、５’−ｇｇａｔｃｃｔｔｇａｃａａｔｔａｇｔｔａａｃｔａｔ−３’と５’−ｇｇａｔｃｃｔｔａａｃｇａｃｇｃｔｃｇａｇｇａｔｔｔ−３’の２つのプライマーＤＮＡを用いてＰＣＲ法を用いて作製できる。また、配列番号２の配列に基づいて化学合成法によっても作製できる。
配列表配列番号４のＤＮＡは、枯草菌の染色体ＤＮＡから、例えば、５’−ｇｃｔａｇｃａｃａｇ  ａｃｔａｃｔｇｇｃａａａａｔ−３’と５’−ｔｔａｃｃａｔａｃｇｇｔａａｃａｔｔｃｇａｃｇ−３’に示すプライマーＤＮＡを用いてＰＣＲ法を用いて作製できる。本発明では、枯草菌の染色体ＤＮＡとして、シグマ社が販売している染色体ＤＮＡ（製品番号Ｄ４０４１）を用いて分離したものを用いている。また、配列番号４の配列に基づいて化学合成法によっても作製できる。
ＡＳ−ＤＨＦＲは１５９個のアミノ酸より構成されるが、このうち１、１６、２０、４２、及び９２番目のアミノ酸がメチオニンである。これらのメチオニンを他のアミノ酸に置換した酵素を作製する方法として、実施例においては「組み合わせ変異と段階的変異との組み合わせによる含硫アミノ酸を含まない酵素の作製方法」を用いた方法を示している。
表１〜５は、ＡＳ−ＤＨＦＲの１、１６、２０、４２及び９２番目のメチオニンを他のアミノ酸に置換した変異体の酵素活性を示す表であり、そして、表６はＡＳ−ＤＨＦＲの４２番目及び９２番目のメチオニンを他のアミノ酸で置換した変異体の酵素活性、
表７はＡＳ−ＤＨＦＲの１６番目及び２０番目のメチオニンを他のアミノ酸で置換した変異体の酵素活性を示す表である。
１番目のメチオニンに関しては、前記の方法に従い、３種類の変異体を作製したところ、メチオニン−アラニンが最適なものとして選ばれた。（表１参照）この変異体を、ＡＳ−ＤＨＦＲ−Ａ１と名付けた。
ＡＳ−ＤＨＦＲの１６、２０、４２、及び９２番目のメチオニンに関しては、それぞれメチオニンのコドンであるＡＴＧをＮＮＹ（ＮはＡ，Ｔ，Ｇ，Ｃの塩基を表し、Ｙは、Ｔ，Ｃの塩基を表す。）に変えた配列を有するプライマーを用いてランダム塩基置換変異体を作製し、得られた変異体の塩基配列と酵素活性を測定した。その結果、１６番目のアミノ酸として好適なものとして、アラニン、フェニルアラニン、アスパラギンが、２０番目のアミノ酸として好適なものとして、イソロイシン、ロイシン、バリンが、４２番目のアミノ酸として好適なものとして、バリンとチロシンが、９２番目のアミノ酸として好適なものとして、フェニルアラニンとイソロイシンがそれぞれ示された。（表２〜５参照）
次に、４２番目のアミノ酸として好適なアミノ酸であるバリンとチロシンと、９２番目のアミノ酸として好適アミノ酸であるフェニルアラニンとイソロイシンとを組み合わせることにより、ＡＳ−ＤＨＦＲ−Ａ１の４２及び９２番目のアミノ酸置換変異体を作製し、得られた変異体の塩基配列と酵素活性を測定した結果、４２番目がチロシンで９２番目がフェニルアラニンの組合わせが最も高い活性を示した（野性型酵素の約３倍）。この変異体を、ＡＳ−ＤＨＦＲ−Ａ１−Ｍ４２Ｙ−Ｍ９２Ｆと名付けた。（表６参照）
次に、１６番目のアミノ酸として好適なアミノ酸であるアラニン、フェニルアラニン、アスパラギンと、２０番目のアミノ酸として好適アミノ酸であるイソロイシン、ロイシン、バリンとを組み合わせることにより、ＡＳ−ＤＨＦＲ−Ａ１−Ｍ４２Ｙ−Ｍ９２Ｆの１６及び２０番目のアミノ酸置換変異体を作製し、得られた変異体の塩基配列と酵素活性を測定した。その結果、表７に示す様に、野性型酵素の活性を越える変異体酵素が得られた。その中でも、１６番目がアスパラギンで２０番目がロイシンの組み合わせが最も高い活性を示した（野性型酵素の約１２倍）。この変異体を、ＡＮＬＹＦと名付けた（ＡＳ−ＤＨＦＲのＭ１ＭＡ、Ｍ１６Ｎ、Ｍ２０Ｌ、Ｍ４２Ｙ、Ｍ９２Ｆの各メチオニン部位の変異の一文字表記にちなんだ。以下、同様の表記を用いた）。
ＡＮＬＹＦ以外にも、野性型酵素より高い活性を示す硫黄原子を含まない変異体として、ＡＦＬＹＦ、ＡＦＩＹＦ、ＡＮＩＹＦ、ＡＦＶＹＦ、ＡＮＶＹＦなど計９個の変異体が得られた。
この結果は、硫黄原子を含まない酵素蛋白質として多くの可能性が有ることを示している。少なくとも本発明の方法に従って野性型酵素配列を変換していくことにより、野性型酵素より高い活性を示す硫黄原子を含まない酵素に到達できる。このように、本発明の有効性が証明された。
キシラナーゼは、１８５アミノ酸より構成されるが、このうち１５８及び１６９番目のアミノ酸がメチオニンである。これらのメチオニンを他のアミノ酸に置換した酵素を作製する方法として、実施例においては「段階的変異による含硫アミノ酸を含まない酵素の作製方法」を用いた方法を示している。
具体的には、上記ＡＮＬＹＦのカルボキシ末端とキシラナーゼのアミノ末端をＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙの配列でつないだ融合蛋白質（これをＮＬ−キシラナーゼと名付けた）を作製した。ＮＬ−キシラナーゼＡＮＬＹＦ部分及びリンカー部分にはメチオニン及びシステインのいずれも含まれない。ＡＮＬＹＦと融合させることによりＮＬ−キシラナーゼ変異体融合遺伝子が導入された形質転換株をトリメトプリム耐性で選択できること及びキシラナーゼの活性とＤＨＦＲ活性とを測定し、［キシラナーゼの活性］／［ＤＨＦＲ活性］の値を計算することにより、ＮＬ−キシラナーゼ変異体の蛋白質量を測定しなくてもキシラナーゼ変異体の活性と野性型キシラナーゼの活性を比較できるという特徴を有する。
ＮＬ−キシラナーゼのキシラナーゼ部分の１５８番目のメチオニンのコドンであるａｔｇをｎｎｙ（ｎはａ，ｃ，ｇ，ｔの塩基を表し、ｙは、ｔ，ｃの塩基を表す。）に変えた配列を有するプライマーを用いてランダム塩基置換変異体を作製し、得られた変異体の塩基配列と酵素活性を測定した結果、ロイシンに置換した変異体が野性型の１２７％の活性を示した。この変異体を、ＮＬ−キシラナーゼ（Ｍ１５８Ｌ）と名付けた。
次に、ＮＬ−キシラナーゼ（Ｍ１５８Ｌ）のキシラナーゼ部分の１６８番目のメチオニンのコドンであるａｔｇをｎｎｙ（ｎはａ，ｃ，ｇ，ｔの塩基を表し、ｙは、ｔ，ｃの塩基を表す。）に変えた配列を有するプライマーを用いてランダム塩基置換変異体を作製し、得られた変異体の塩基配列と酵素活性を測定した。その結果、イソロイシンに置換した変異体が野性型の１５１％の活性を示した。この変異体を、ＮＬ−キシラナーゼ（Ｍ１５８Ｌ，Ｍ１６９Ｉ）と名付けた。
得られたＮＬ−キシラナーゼ（Ｍ１５８Ｌ，Ｍ１６９Ｉ）のＤＨＦＲ部分、リンカー部分、及びキシラナーゼのいずれの部分にも、含硫アミノ酸であるシステイン及びメチオニンを含まない。それにも係わらず、ＤＨＦＲおよびキシラナーゼのそれぞれの酵素活性は、それぞれ対応する野性型酵素よりも高い活性を示した。
ＤＨＦＲは、ニコチンアミド補酵素を要求する酸化還元反応を触媒するいわゆる酸化還元酵素であり、キシラナーゼは、高分子多糖を加水分解反応を触媒するいわゆる加水分解酵素である。本発明において示す２例の実施例が示すことは、酸化還元反応と加水分解反応という全く異なった反応を触媒する酵素において、含硫アミノ酸を全く含まないようにしてしても、生物進化において生じた野性型酵素を越える活性を有する酵素が作れることである。このことから、野性型酵素に含まれる含硫アミノ酸の全てを他のアミノ酸に置換した蛋白質の中には、野性型酵素の活性を越えるもしくは同等の活性を示すものが存在するものと考えられる。本発明は、そのような含硫アミノ酸を全く含まない酵素に至る確実な方法を提供するものである。従って、本発明が、本明細書に記載の含硫アミノ酸を全く含まない酵素の作製方法によって作製可能な含硫アミノ酸を全く含まない全ての酵素を含むことは、自明である。
本発明のジヒドロ葉酸還元酵素は、次の反応式１で表される
（反応式１）
ジヒドロ葉酸  ＋  ＮＡＤＰＨ  −〉  テトラヒドロ葉酸  ＋  ＮＡＤＰ＋を触媒する。（上記反応式において、「−〉」は矢印を意味する、以下同様）
ジヒドロ葉酸還元酵素の活性は、反応に伴う基質の減少を、３４０ｎｍの吸光度の減少で追跡することができる。本発明において、酵素反応液の組成を、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）、０．１ｍＭ  ＮＡＤＰＨ、０．０５ｍＭ  ジヒドロ葉酸、１２ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、及び適当量の酵素とし、酵素反応液１ｍｌを分光光度計用のキュベットにとり、酵素液を加えることにより反応を開始し、３４０ｎｍの吸光度の１分間あたりの変化量を測定し、この量を持って活性の指標とした。
本発明のキシラナーゼは、次の反応式２で表される
（反応式２）
キシラン  ＋  ｎＨ２Ｏ  −〉  ｍキシロースオリゴマー
を触媒する。
キシラナーゼの活性は、生成するオリゴキシロースの還元末端に由来する還元力の増加をネルソンソモギ法により測定することによって行うことができる。本発明において、酵素反応液の組成を、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、２ｍｇ／ｍｌオート麦由来のキシラン、及び適当量の酵素とし、酵素反応液０．２５ｍｌを試験管にとり、酵素液を加えることにより反応を開始し、１０分間反応を行い、０．２５ｍｌの銅−アルカリ試薬を加えた後、沸騰水中で１０分間保持し、その後室温に冷却した後砒素−モリブデン酸試薬０．２５ｍｌを加え、着色させる。着色の強さを５００ｎｍの吸光度により測定し、対照試料の吸光度との差を求め、酵素活性の指標とした。
酵素活性の測定方法としては、種々の方法が開発され利用されていることは公知の事実であり、目的とする酵素の活性測定法によって本発明が制限を受けないことは明白である。
本発明によって製造された、硫黄原子を含まないジヒドロ葉酸還元酵素及びジヒドロ葉酸還元酵素−キシラナーゼ融合蛋白質は、過酸化水素により容易に酸化されるシステイン及びメチオニンを配列に含まないため、０．１Ｍの高濃度の過酸化水素水を用いて処理しても酸化されることは無く、酸化に対する抵抗性が著しく増大した。ジヒドロ葉酸還元酵素及びジヒドロ葉酸還元酵素−キシラナーゼ融合蛋白質いずれにおいても、硫黄原子を含む酵素の場合、０．１Ｍの過酸化水素水で処理することにより、全ての硫黄分子が酸化され、このことにより酵素活性が約１０分の１以下に低下する。このように抗酸化性を高めることにより酵素の形質の安定性に寄与できることが実証されている。
発明を実施するための最良の形態
以下に、実施例により本発明を説明するが、これらの具体例は本発明を限定するものではない。
なお、本実施例における、ＰＣＲ法によるＤＮＡの増幅反応、制限酵素によるＤＮＡの切断反応、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼ、大腸菌への形質転換によるＤＮＡの結合反応は、市販のＰＣＲキット、制限酵素、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼ、及び大腸菌コンピテントセルに添付している標準プロトコールに従って行った。
［実施例１］  硫黄原子を含まないジヒドロ葉酸還元酵素の作製
硫黄原子を含むジヒドロ葉酸還元酵素として本実施例においては、ＡＳ−ＤＨＦＲを用いている。ＡＳ−ＤＨＦＲの酵素活性安定性などの性質は、野性型酵素とほぼ一致している。（Ｍ．Ｉｗａｋｕｒａ，Ｂ．Ｅ．Ｊｏｎｅｓ，Ｊ．Ｌｕｏ，＆  Ｃ．Ｒ．Ｍａｔｔｈｅｗｓ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１１７，４８０−４８８（１９９５）に記載）
ＡＳ−ＤＨＦＲのアミノ酸配列及びその遺伝子の塩基配列をそれぞれ配列表配列番号１及び配列表配列番号２に示す。
ＡＳ−ＤＨＦＲの遺伝子は「ｐＴＺＤＨＦＲ２０」と名付けられたプラスミドに組み込まれている（Ｍ．Ｉｗａｋｕｒａ，Ｂ．Ｅ．Ｊｏｎｅｓ，Ｊ．Ｌｕｏ，＆  Ｃ．Ｒ．Ｍａｔｔｈｅｗｓ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１１７，４８０−４８８（１９９５）に記載）。
２本の化学合成プライマーＤＮＡ：
５’−ｇｇｇｇａｔｃｃｔｃｔｔｇａｃａａｔｔａｇｔｔａａｃｔａｔｔｔｇｔｔａｔａａｔｇｔａｔｔｃ−３’及び
５’−ｇｇｇｇａｔｃｃｃｔｔａｔｇｃａｃａｇｃｃａｃｃｇｃｃａｃｃａｃｇａｃｇｃｔｃｇａｇｇａｔｔｔｃｇ−３’
を用いることにより、ｐＴＺＤＨＦＲ２０を鋳型として、ＰＣＲ法により増幅することにより、制限酵素ＢａｍＨＩで切り出すことができ、且つＡＳ−ＤＨＦＲを発現できる遺伝子配列を作製した（これを、ＤＮＡ１とする）。
ＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ配列を鋳型として、１番目のアミノ酸であるメチオニンをＬ−メチオニン−Ｌ−アラニン、Ｌ−メチオニン−Ｌ−セリン、もしくはＬ−メチオニン−Ｌ−プロリンに変異する遺伝子の作製を行った。そのため、２本の化学合成プライマーＤＮＡ：
５’−ｇｇｇｇａｔｃｃｔｃｔｔｇａｃａａｔｔａｇｔｔａａｃｔａｔｔｔｇｔｔａｔａａｔｇｔａｔｔｃ−３’及び
５’−ｃｇｃａａｔｃａｇａｃｔｇａｔｎｇｎｃａｔｇｇａａｇｔｔｃｃｔｃｃｔｔｔｔｃｃｇｇａｔｔ−３’
（ただし、ｎはａ，ｃ，ｇ，ｔの塩基を表わす。）を用いてＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ（これをＤＮＡ２とする。）と２本の化学合成プライマーＤＮＡ：
５’−ｇｇａｇｇａａｃｔｔｃｃａｔｇｎｃｎａｔｃａｇｔｃｔｇａｔｔｇｃｇｇｃｇｃｔａｇｃｇｇｔａｇａｔ−３’
（ただし、ｎはａ，ｃ，ｇ，ｔの塩基を表わす。）及び
５’−ｇｇｇｇａｔｃｃｃｔｔａｔｇｃａｃａｇｃｃａｃｃｇｃｃａｃｃａｃｇａｃｇｃｔｃｇａｇｇａｔｔｔｃｇ−３’
を用いてＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ（これをＤＮＡ３とする。）を作製し、次に、ＤＮＡ２とＤＮＡ３を同量混合したのち、２本の化学合成プライマーＤＮＡ：
５’−ｇｇｇｇａｔｃｃｔｃｔｔｇａｃａａｔｔａｇｔｔａａｃｔａｔｔｔｇｔｔａｔａａｔｇｔａｔｔｃ−３’及び
５’−ｇｇｇｇａｔｃｃｃｔｔａｔｇｃａｃａｇｃｃａｃｃｇｃｃａｃｃａｃｇａｃｇｃｔｃｇａｇｇａｔｔｔｃｇ−３’
を用いてＰＣＲ法により増幅して得られたＤＮＡ（これをＤＮＡ４とする。）を作製した。
ＤＮＡ４をＢａｍＨＩで切断した後、市販のプラスミドベクターｐＵＣ１９をＢａｍＨＩで切断したものとを合わせ、両者をＴ４−ＤＮＡリガーゼで結合し、組み換えプラスミドを作製した。得られた組み換えプラスミドを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、寒天培地１（１ｌあたり５ｇの食塩、５ｇの酵母エキス、８ｇのトリプトン、１００ｍｇのアンピシリンナトリウム、５０ｍｇトリメトプリム、及び１５ｇの寒天を含んでいる）で生育する変異株を選択した。寒天培地１で形成したコロニー１５個について、プラスミドを分離し、その塩基配列を決定することにより、１番目のアミノ酸であるメチオニンをＬ−メチオニン−Ｌ−アラニン、Ｌ−メチオニン−Ｌ−セリン、もしくはＬ−メチオニン−Ｌ−プロリンに変異した遺伝子が組み込まれた形質転換株を分離した。分離した形質転換株それぞれを培地１（１ｌあたり５ｇの食塩、５ｇの酵母エキス、８ｇのトリプトン、及び１００ｍｇのアンピシリンナトリウムを含んでいる）で３７度で一晩培養し、６６０ｎｍの吸光度が１に合わせ、その培養液１ｍｌから菌体を収集し、０．２ｍｌの１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、音波破砕後、遠心分離によって得られた上清についてそのＤＨＦＲ酵素活性を調べた。その結果を表１に示す。
以下の表において、ＤＨＦＲ活性は野生型酵素の活性を１００％として、％で表示したものである。
0004534030.tif 000002
この結果、１番目のアミノ酸の変異としてＬ−メチオニン−Ｌ−アラニンが適していることが示された（この変異体をＡＳ−ＤＨＦＲ−Ａ１と称する。また、ＡＳ−ＤＨＦＲ−Ａ１の遺伝子を組み込んだ組み換えプラスミドを、ｐＡＳ−ＤＨＦＲ−Ａ１と称する）。また、ＡＳ−ＤＨＦＲ−Ａ１を高度に精製して、アミノ末端の配列を調べたところ、９９％以上がアラニンであり、遺伝子配列上の開始コドンに由来するメチオニンは、大腸菌を用いて発現する際に、メチオニルアミノペプチダーゼ（ｍｅｔｈｉｏｎｙｌ−ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）によりほぼ完全に切除されたことが示された。
ＡＳ−ＤＨＦＲの１６、２０、４２、及び９２番目のメチオニンに関しては、それぞれメチオニンのコドンであるａｔｇをｎｎｙ（ｎはａ，ｃ，ｇ，ｔの塩基を表し、ｒはａ，ｇの塩基を、ｙはｃ，ｔの塩基を表す。）に変えた配列を有するプライマーを用いてランダム塩基置換変異体を作製し、得られた変異体の塩基配列と酵素活性を測定した。
１６番目のメチオニンの変異体の作製には、ＤＮＡ１を鋳型として、２本の化学合成プライマーＤＮＡ：
５’−ｇｇｇｇａｔｃｃｔｃｔｔｇａｃａａｔｔａｇｔｔａａｃｔａｔｔｔｇｔｔａｔａａｔｇｔａｔｔｃ−３’と
５’−ｇｇｃａｔｇｇｃｇｔｔｔｔｃｒｎｎｇｃｃｇａｔａａｃｇｃｇａｔｃｔａｃｃｇｃｔａ−３’
を用いてＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ（これをＤＮＡ５とする。）と２本の化学合成プライマーＤＮＡ：
５’−ｇａｔｃｇｃｇｔｔａｔｃｇｇｃｎｎｙｇａａａａｃｇｃｃａｔｇｃｃａｔｇｇａａｃ−３’及び
５’−ｇｇｇｇａｔｃｃｃｔｔａｔｇｃａｃａｇｃｃａｃｃｇｃｃａｃｃａｃｇａｃｇｃｔｃｇａｇｇａｔｔｔｃｇ−３’
を用いてＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ（これをＤＮＡ６とする。）を作製し、次に、ＤＮＡ５とＤＮＡ６を同量混合したのち、２本の化学合成プライマーＤＮＡ：
５’−ｇｇｇｇａｔｃｃｔｃｔｔｇａｃａａｔｔａｇｔｔａａｃｔａｔｔｔｇｔｔａｔａａｔｇｔａｔｔｃ−３’及び
５’−ｇｇｇｇａｔｃｃｃｔｔａｔｇｃａｃａｇｃｃａｃｃｇｃｃａｃｃａｃｇａｃｇｃｔｃｇａｇｇａｔｔｔｃｇ−３’
を用いてＰＣＲ法により増幅して得られたＤＮＡ（これをＤＮＡ７とする。）を作製した。ＤＮＡ７をＢａｍＨＩで切断した後、前記と同様にして寒天培地１に生育するコロニーを調べ、その結果を表２に示した。
0004534030.tif 000003
0004534030.tif 000004
この結果から、１６番目のアミノ酸として好適なものとして、アラニン、フェニルアラニン、アスパラギンが、示された。
２０番目のメチオニンの変異体の作製には、ＤＮＡ１を鋳型として、２本の化学合成プライマーＤＮＡ：
５’−ｇｇｇｇａｔｃｃｔｃｔｔｇａｃａａｔｔａｇｔｔａａｃｔａｔｔｔｇｔｔａｔａａｔｇｔａｔｔｃ−３’と
５’−ａｇｇｃａｇｇｔｔｃｃａｔｇｇｒｎｎｇｇｃｇｔｔｔｔｃｃａｔｇｃｃｇａｔａａｃ−３’
を用いてＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ（これをＤＮＡ８とする。）と２本の化学合成プライマーＤＮＡ：
５’−ｇｇｃａｔｇｇａａａａｃｇｃｃｎｎｙｃｃａｔｇｇａａｃｃｔｇｃｃｔｇｃｃｇａｔｃ−３’及び
５’−ｇｇｇｇａｔｃｃｃｔｔａｔｇｃａｃａｇｃｃａｃｃｇｃｃａｃｃａｃｇａｃｇｃｔｃｇａｇｇａｔｔｔｃｇ−３’
を用いてＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ（これをＤＮＡ９とする。）を作製し、次に、ＤＮＡ８とＤＮＡ９を同量混合したのち、２本の化学合成プライマーＤＮＡ：
５’−ｇｇｇｇａｔｃｃｔｃｔｔｇａｃａａｔｔａｇｔｔａａｃｔａｔｔｔｇｔｔａｔａａｔｇｔａｔｔｃ−３’及び
５’−ｇｇｇｇａｔｃｃｃｔｔａｔｇｃａｃａｇｃｃａｃｃｇｃｃａｃｃａｃｇａｃｇｃｔｃｇａｇｇａｔｔｔｃｇ−３’
を用いてＰＣＲ法により増幅して得られたＤＮＡ（これをＤＮＡ１０とする。）を作製した。ＤＮＡ１０をＢａｍＨＩで切断した後、前記と同様にして寒天培地１に生育するコロニーを調べ、その結果を表３に示した。
0004534030.tif 000005
この結果から、２０番目のアミノ酸として好適なものとして、イソロイシン、ロイシン、バリンが示された。
４２番目のメチオニンの変異体の作製には、ＤＮＡ１を鋳型として、２本の化学合成プライマーＤＮＡ：
５’−ｇｇｇｇａｔｃｃｔｃｔｔｇａｃａａｔｔａｇｔｔａａｃｔａｔｔｔｇｔｔａｔａａｔｇｔａｔｔｃ−３’と
５’−ｃｃａｇｇｔａｔｇｇｃｇｃｃｃｒｎｎａａｔｃａｃｇｇｇｔｔｔａｔｔｔａａｇｇｔｇ−３’
を用いてＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ（これをＤＮＡ１１とする。）と２本の化学合成プライマーＤＮＡ：
５’−ａａｔａａａｃｃｃｇｔｇａｔｔｎｎｙｇｇｇｃｇｃｃａｔａｃｃｔｇｇｇａａｔｃａａ−３’及び
５’−ｇｇｇｇａｔｃｃｃｔｔａｔｇｃａｃａｇｃｃａｃｃｇｃｃａｃｃａｃｇａｃｇｃｔｃｇａｇｇａｔｔｔｃｇ−３’
を用いてＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ（これをＤＮＡ１２とする。）を作製し、次に、ＤＮＡ１１とＤＮＡ１２を同量混合したのち、２本の化学合成プライマーＤＮＡ：５’−ｇｇｇｇａｔｃｃｔｃｔｔｇａｃａａｔｔａｇｔｔａａｃｔａｔｔｔｇｔｔａｔａａｔｇｔａｔｔｃ−３’及び
５’−ｇｇｇｇａｔｃｃｃｔｔａｔｇｃａｃａｇｃｃａｃｃｇｃｃａｃｃａｃｇａｃｇｃｔｃｇａｇｇａｔｔｔｃｇ−３’
を用いてＰＣＲ法により増幅して得られたＤＮＡ（これをＤＮＡ１３とする。）を作製した。ＤＮＡ１３をＢａｍＨＩで切断した後、前記と同様にして寒天培地１に生育するコロニーを調べ、その結果を表４に示した。
0004534030.tif 000006
この結果から、４２番目のアミノ酸として好適なものとして、バリンとチロシンが示された。
９２番目のメチオニンの変異体の作製には、ＤＮＡ１を鋳型として、２本の化学合成プライマーＤＮＡ：
５’−ｇｇｇｇａｔｃｃｔｃｔｔｇａｃａａｔｔａｇｔｔａａｃｔａｔｔｔｇｔｔａｔａａｔｇｔａｔｔｃ−３’と
５’−ｔｃｃｇｃｃｇｃｃａａｔｃａｃｒｎｎｇａｔｔｔｃｔｇｇｔａｃｇｔｃａｃｃｔｇｃｇ−３’
を用いてＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ（これをＤＮＡ１４とする。）と２本の化学合成プライマーＤＮＡ：
５’−ｇａｃｇｔａｃｃａｇａａａｔｃｎｎｙｇｔｇａｔｔｇｇｃｇｇｃｇｇａｃｇｃｇｔｔｔ−３’及び
５’−ｇｇｇｇａｔｃｃｃｔｔａｔｇｃａｃａｇｃｃａｃｃｇｃｃａｃｃａｃｇａｃｇｃｔｃｇａｇｇａｔｔｔｃｇ−３’
を用いてＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ（これをＤＮＡ１５とする。）を作製し、次に、ＤＮＡ１４とＤＮＡ１５を同量混合したのち、２本の化学合成プライマーＤＮＡ：５’−ｇｇｇｇａｔｃｃｔｃｔｔｇａｃａａｔｔａｇｔｔａａｃｔａｔｔｔｇｔｔａｔａａｔｇｔａｔｔｃ−３’及び
５’−ｇｇｇｇａｔｃｃｃｔｔａｔｇｃａｃａｇｃｃａｃｃｇｃｃａｃｃａｃｇａｃｇｃｔｃｇａｇｇａｔｔｔｃｇ−３’
を用いてＰＣＲ法により増幅して得られたＤＮＡ（これをＤＮＡ１６とする。）を作製した。ＤＮＡ１６をＢａｍＨＩで切断した後、前記と同様にして寒天培地１に生育するコロニーを調べ、その結果を表５に示した。
0004534030.tif 000007
この結果から、９２番目のアミノ酸として好適なものとして、フェニルアラニンとイソロイシンが示された。
次に、ＡＳ−ＤＨＦＲ−Ａ１の４２番目のアミノ酸として好適なアミノ酸であるバリンとチロシンと、９２番目のアミノ酸として好適アミノ酸であるフェニルアラニンとイソロイシンとを組み合わせることにより、ＡＳ−ＤＨＦＲ−Ａ１の４２及び９２番目のアミノ酸置換変異体を作製し、得られた変異体の塩基配列と酵素活性を測定した。
ｐＡＳ−ＤＨＦＲ−Ａ１を鋳型として、２本の化学合成プライマーＤＮＡ：
５’−ｇｇｇｇａｔｃｃｔｃｔｔｇａｃａａｔｔａｇｔｔａａｃｔａｔｔｔｇｔｔａｔａａｔｇｔａｔｔｃ−３’と
５’−ｃｃａｇｇｔａｔｇｇｃｇｃｃｃｒｗｍａａｔｃａｃｇｇｇｔｔｔａｔｔｔａａｇｇｔｇ−３’
（ｒはａとｇの塩基を、ｗはａとｔの塩基を、ｍはａとｃの塩基を表す、以下同様）を用いてＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ（これをＤＮＡ１７とする。）と２本の化学合成プライマーＤＮＡ：
５’−ａａｔａａａｃｃｃｇｔｇａｔｔｋｗｙｇｇｇｃｇｃｃａｔａｃｃｔｇｇｇａａｔｃａａ−３’
（ｋはｇとｔの塩基を、ｗはａとｔの塩基を、ｙはｃとｔの塩基を表す、以下同様）及び
５’−ｇｇｇｇａｔｃｃｃｔｔａｔｇｃａｃａｇｃｃａｃｃｇｃｃａｃｃａｃｇａｃｇｃｔｃｇａｇｇａｔｔｔｃｇ−３’
を用いてＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ（これをＤＮＡ１８とする。）を作製し、次に、ＤＮＡ１７とＤＮＡ１８を同量混合したのち、２本の化学合成プライマーＤＮＡ：
５’−ｇｇｇｇａｔｃｃｔｃｔｔｇａｃａａｔｔａｇｔｔａａｃｔａｔｔｔｇｔｔａｔａａｔｇｔａｔｔｃ−３’及び
５’−ｇｇｇｇａｔｃｃｃｔｔａｔｇｃａｃａｇｃｃａｃｃｇｃｃａｃｃａｃｇａｃｇｃｔｃｇａｇｇａｔｔｔｃｇ−３’
を用いてＰＣＲ法により増幅して得られたＤＮＡ（これをＤＮＡ１９とする。）を作製した。
得られたＤＮＡ１９を鋳型として、２本の化学合成プライマーＤＮＡ：
５’−ｇｇｇｇａｔｃｃｔｃｔｔｇａｃａａｔｔａｇｔｔａａｃｔａｔｔｔｇｔｔａｔａａｔｇｔａｔｔｃ−３’と
５−ｔｃｃｇｃｃｇｃｃａａｔｃａｃｒａｗｇａｔｔｔｃｔｇｇｔａｃｇｔｃａｃｃｔｇｃｇ−３’
を用いてＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ（これをＤＮＡ２０とする。）と２本の化学合成プライマーＤＮＡ：
５’−ｇａｃｇｔａｃｃａｇａａａｔｃｗｔｙｇｔｇａｔｔｇｇｃｇｇｃｇｇａｃｇｃｇｔｔｔ−３’及び
５’−ｇｇｇｇａｔｃｃｃｔｔａｔｇｃａｃａｇｃｃａｃｃｇｃｃａｃｃａｃｇａｃｇｃｔｃｇａｇｇａｔｔｔｃｇ−３’
を用いてＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ（これをＤＮＡ２１とする。）を作製し、次に、ＤＮＡ２０とＤＮＡ２１を同量混合したのち、２本の化学合成プライマーＤＮＡ：５’−ｇｇｇｇａｔｃｃｔｃｔｔｇａｃａａｔｔａｇｔｔａａｃｔａｔｔｔｇｔｔａｔａａｔｇｔａｔｔｃ−３’及び
５’−ｇｇｇｇａｔｃｃｃｔｔａｔｇｃａｃａｇｃｃａｃｃｇｃｃａｃｃａｃｇａｃｇｃｔｃｇａｇｇａｔｔｔｃｇ−３’
を用いてＰＣＲ法により増幅して得られたＤＮＡ（これをＤＮＡ２２とする。）を作製した。
ＤＮＡ２２をＢａｍＨＩで切断した後、前記と同様にして寒天培地１に生育するコロニーを調べ、その結果を表６に示した。
0004534030.tif 000008
この結果、４２番目がチロシンで９２番目がフェニルアラニンの組み合わせが最も高い活性を示した（野性型酵素の約３倍以上）。この変異体を、ＡＳ−ＤＨＦＲ−Ａ１−Ｍ４２Ｙ−Ｍ９２Ｆと称する。また、ＡＳ−ＤＨＦＲ−Ａ１−Ｍ４２Ｙ−Ｍ９２Ｆの遺伝子を組み込んだ組み換えプラスミドを、ｐＡＳ−ＤＨＦＲ−Ａ１−Ｍ４２Ｙ−Ｍ９２Ｆと名付けた。
ＡＳ−ＤＨＦＲ−Ａ１−Ｍ４２Ｙ−Ｍ９２Ｆの１６番目のアミノ酸として好適なアミノ酸であるアラニン、フェニルアラニン、アスパラギンと、２０番目のアミノ酸として好適アミノ酸であるイソロイシン、ロイシン、バリンとを組み合わせることにより、ＡＳ−ＤＨＦＲ−Ａ１−Ｍ４２Ｙ−Ｍ９２Ｆの１６及び２０番目のアミノ酸置換変異体を作製し、得られた変異体の塩基配列と酵素活性を測定した。
ｐＡＳ−ＤＨＦＲ−Ａ１−Ｍ４２Ｙ−Ｍ９２Ｆを鋳型として、３本の化学合成プライマーＤＮＡ：５’−ｇｇｇｇａｔｃｃｔｃｔｔｇａｃａａｔｔａｇｔｔａａｃｔａｔｔｔｇｔｔａｔａａｔｇｔａｔｔｃ−３’と
５’−−ａｇｇｃａｇｇｔｔｃｃａｃｇｇｒｋｗｇｇｃｇｔｔｔｔｃｒｙｔｇｃｃｇａｔａａｃｇｃｇａｔｃｔａｃｃｇ−３’と
５’−ａｇｇｃａｇｇｔｔｃｃａｃｇｇｒｋｗｇｇｃｇｔｔｔｔｃｔｇｃｇｃｃｇａｔａａｃｇｃｇａｔｃｔａｃｃｇ−３’
を用いてＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ（これをＤＮＡ２３とする。）と３本の化学合成プライマーＤＮＡ：
５’−ｇａｔｃｇｃｇｔｔａｔｃｇｇｃａｒｙｇａａａａｃｇｃｃｗｍｙｃｃｇｔｇｇａａｃｃｔｇｃｃｔｇｃｃｇａ−３’と
５’−ｇａｔｃｇｃｇｔｔａｔｃｇｇｃｇｃａｇａａａａｃｇｃｃｗｍｙｃｃｇｔｇｇａａｃｃｔｇｃｃｔｇｃｃｇａ−３’と
５’−ｇｇｇｇａｔｃｃｃｔｔａｔｇｃａｃａｇｃｃａｃｃｇｃｃａｃｃａｃｇａｃｇｃｔｃｇａｇｇａｔｔｔｃｇ−３’
を用いてＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ（これをＤＮＡ２４とする。）を作製し、次に、ＤＮＡ２３とＤＮＡ２４を同量混合したのち、２本の化学合成プライマーＤＮＡ：５’−ｇｇｇｇａｔｃｃｔｃｔｔｇａｃａａｔｔａｇｔｔａａｃｔａｔｔｔｇｔｔａｔａａｔｇｔａｔｔｃ−３’及び
５’−ｇｇｇｇａｔｃｃｃｔｔａｔｇｃａｃａｇｃｃａｃｃｇｃｃａｃｃａｃｇａｃｇｃｔｃｇａｇｇａｔｔｔｃｇ−３’
を用いてＰＣＲ法により増幅して得られたＤＮＡ（これをＤＮＡ２５とする。）を作製した。
ＤＮＡ２５をＢａｍＨＩで切断した後、前記と同様にして寒天培地１に生育するコロニーを調べ、その結果を表７に示した。
0004534030.tif 000009
0004534030.tif 000010
この結果、１６番目がアスパラギンで２０番目がロイシンの組み合わせが最も高い活性を示した（野性型酵素の約１０倍）。この変異体を、ＡＮＬＹＦと称する。また、ＡＮＬＹＦの遺伝子を組み込んだ組み換えプラスミドを、ｐＡＮＬＹＦと名付けた。その他の８個の変異体も野性型酵素を越える活性を示した。この結果は、硫黄原子を含まない酵素蛋白質として多くの可能性が有ることを示している。
配列表配列番号５に、ＡＮＬＹＦのアミノ酸配列を、配列表配列番号６に、制限酵素ＢａｍＨＩで切り出し可能で且つ適当なベクターのＢａｍＨＩ部位に導入することにより大腸菌で高発現可能なＡＮＬＹＦ遺伝子配列をそれぞれ示している。
ｐＡＮＬＹＦを含む大腸菌を、３リッターの培地（１５ｇの食塩、１５ｇの酵母エキス、２４ｇのトリプトン、３０ｍｇのアンピシリンナトリウムを含んでいる）で、３７度で一晩培養し、湿重量約１０ｇの菌体を得た。この菌体の無細胞抽出液に、ストレプトマイシン硫酸処理、硫安分画、メソトレキセートアフィニティクロマトグラフィー及びＤＥＡＥトヨパールクロマトグラフィーの精製操作を施すことにより、均一にまで蛋白質を精製し、約１００ｍｇの均一なＡＮＬＹＦが得られた。アミノ末端分析を行ったところ、ＡＮＬＹＦのアミノ末端の配列は、Ｌ−アラニン−Ｌ−イソロイシン−Ｌ−セリン−Ｌ−ロイシン−Ｌ−イソロイシン−であり、開始コドンに由来するＬ−メチオニンが取り除かれた配列をしていた。精製して得られた１ｍｇのＡＮＬＹＦを０．１Ｍの過酸化水素水含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で室温で一晩放置し、その分子量を調べたところ、処理していないＡＮＬＹＦの分子量と全く同じ値、１７，９０５（計算値１７，９０３）を示した。また、酵素活性も全く変化しなかった。一方、同様の処理をＡＳ−ＤＨＦＲにしたところ、過酸化水素水処理前の分子量が１７，９５４（計算値１７，９５０）、過酸化水素水処理後の分子量が１８，０３４であり、全てのメチオニンがメチオニンスルホオキサイドに酸化されたことが示された。また、全てのメチオニンが酸化されることによりＡＳ−ＤＨＦＲの酵素活性が約５分の１に低下した。このように、硫黄原子を含まなくすることにより、抗酸化性が付与されたことが示された。
［実施例２］  硫黄原子を含まないジヒドロ葉酸還元酵素−キシラナーゼ融合酵素の作製
ジヒドロ葉酸還元酵素とキシラナーゼの融合遺伝子の作製のために、ジヒドロ葉酸還元酵素の遺伝子部分として配列表配列番号６の配列の１から５６０番目の配列を用い、キシラナーゼ遺伝子部分として、枯草菌の染色体ＤＮＡとして、シグマ社が販売している染色体ＤＮＡ（製品番号Ｄ４０４１）を鋳型として、２本の化学合成プライマーＤＮＡ：
５’−ｇｃｔａｇｃａｃａｇ  ａｃｔａｃｔｇｇｃａａａａｔ−３’と
５’−ｔｔａｃｃａｔａｃｇｇｔａａｃａｔｔｃｇａｃｇ−３’
を用いてＰＣＲ法により増幅して得られたＤＮＡ（これをＤＮＡ２６とする。）を作製し、これをＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙのコドンに対応する塩基配列で結合した融合遺伝子を作製した。  まず、ｐＮＡＬＹＦを鋳型とし、２本の化学合成プライマーＤＮＡ：
５’−ｇｇｇｇａｔｃｃｔｃｔｔｇａｃａａｔｔａｇｔｔａａｃｔａｔｔｔｇｔｔａｔａａｔｇｔａｔｔｃ−３’及び
５’−ｇｃｃｇｃｃａｃｃａｃｃｃｇａｇｃｃａｃｃｇｃｃａｃｃａｃｇａｃｇｃｔｃｇａｇｇａｔｔｔｃｇａａｃｇａａｔａ−３’
を用いてＰＣＲ法により増幅して得られたＤＮＡ（これをＤＮＡ２７とする。）を作製した。次に、ＤＮＡ２６を鋳型とし、２本の化学合成プライマーＤＮＡ：５’−ｇｇｔｇｇｃｇｇｔｇｇｃｔｃｇｇｇｔｇｇｔｇｇｃｇｇｃｇｃｔａｇｃａｃａｇａｃｔａｃｔｇｇｃａａａａｔｔｇｇａｃｔｇａｔ−３’及び
５’−ｇｇｇｇａｔｃｃｔｔａｃｃａｔａｃｇｇｔａａｃａｔｔｃｇａｃｇａｇｃｃａｃｔａｃｔｔｔｇａ−３’
を用いてＰＣＲ法により増幅して得られたＤＮＡ（これをＤＮＡ２８とする。）を作製した。ＤＮＡ２７とＤＮＡ２８を同量混合したのち、２本の化学合成プライマーＤＮＡ：５’−ｇｇｇｇａｔｃｃｔｃｔｔｇａｃａａｔｔａｇｔｔａａｃｔａｔｔｔｇｔｔａｔａａｔｇｔａｔｔｃ−３’及び
５’−ｇｇｇｇａｔｃｃｔｔａｃｃａｔａｃｇｇｔａａｃａｔｔｃｇａｃｇａｇｃｃａｃｔａｃｔｔｔｇａ−３’
を用いてＰＣＲ法により増幅して得られたＤＮＡ（これをＤＮＡ２９とする。）を作製した。
ＤＮＡ２９をＢａｍＨＩで切断した後、前記と同様にして寒天培地１に生育するコロニーを１０個取り、組み換えプラスミドを分離し、プラスミドに組み込んだ部分の塩基配列を調べ、目的の配列が組み込まれた組み換えプラスミドを分離し、これをｐＮＬＸＹＬ−ｗｔと名付けた。
配列表配列番号７に、ジヒドロ葉酸還元酵素−キシラナーゼ融合酵素のアミノ酸配列を、配列表配列番号８に、制限酵素ＢａｍＨＩで切り出し可能で且つ適当なベクターのＢａｍＨＩ部位に導入することにより大腸菌で高発現可能なジヒドロ葉酸還元酵素−キシラナーゼ融合酵素遺伝子配列をそれぞれ示している。配列表配列番号７の配列中１から１５９番目の配列がジヒドロ葉酸還元酵素（ＡＮＬＹＦ変異体）の部分で、１６０から１６８番目の配列がジヒドロ葉酸還元酵素とキシラナーゼを無理なくつなぐためのリンカー配列であり、１６９から３５３番目の配列が野性型キシラナーゼの配列である。
キシラナーゼは、１８５アミノ酸より構成されるが、このうち１５８及び１６９番目のアミノ酸がメチオニンである。従って、ジヒドロ葉酸還元酵素−キシラナーゼ融合酵素においては、３２６番目と３３７番目の配列がメチオニンである。このジヒドロ葉酸還元酵素−キシラナーゼ融合酵素においてこれ以外に含硫アミノ酸は存在しない。
ジヒドロ葉酸還元酵素−キシラナーゼ融合酵素の３２６番目のメチオニンの変異体の作製には、ｐＮＬＸＹＬ−ｗｔを鋳型として、２本の化学合成プライマーＤＮＡ：
５’−ｇｇｇｇａｔｃｃｔｃｔｔｇａｃａａｔｔａｇｔｔａａｃｔａｔｔｔｇｔｔａｔａａｔｇｔａｔｔｃ−３’と
５’−ｇａｃｔｔｇｇｔａａｇｃｃｃａａｔｔａｃｔｇｃｃｃａｇａｔｔｇｎｎｔｃｃａｔｇｇｃｔｃｔｔｃｃａｔｇｃｇｔｔ−３’
を用いてＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ（これをＤＮＡ３０とする。）を作製した。ＤＮＡ３０を鋳型として、２本の化学合成プライマーＤＮＡ：
５’−ｇｇｇｇａｔｃｃｔｃｔｔｇａｃａａｔｔａｇｔｔａａｃｔａｔｔｔｇｔｔａｔａａｔｇｔａｔｔｃ−３’と
５’−ａｃｔｔｔｇａｔａｔｃｃｔｔｃｔｇｔｃｇｃｃａｔｇａｃｔｔｇｇｔａａｇｃｃｃａａｔｔａｃｔｇｃｃｃａｇａｔｔ−３’
を用いてＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ（これをＤＮＡ３１とする）を作製した。更に、ＤＮＡ３１を鋳型として、２本の化学合成プライマーＤＮＡ：
５’−ｇｇｇｇａｔｃｃｔｃｔｔｇａｃａａｔｔａｇｔｔａａｃｔａｔｔｔｇｔｔａｔａａｔｇｔａｔｔｃ−３’と
５’−ｇｇｇｇｇｇａｔｃｃｔｔａｃｃａｔａｃｇｇｔａａｃａｔｔｃｇａｃｇａｇｃｃａｃｔａｃｔｔｔｇａｔａｔｃｃｔｔｃｔｇｔｃｇｃ−３’を用いてＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ（これをＤＮＡ３２とする）を作製した。ＤＮＡ３２をＢａｍＨＩで切断した後、前記と同様にして寒天培地１に生育するコロニーを調べた。また、各変異体のキシラナーゼ活性も同時に調べた。
測定したキシラナーゼとジヒドロ葉酸還元酵素の活性から、［キシラナーゼの活性］／［ＤＨＦＲ活性］の値を計算し、ｐＮＬＸＹＬ−ｗｔを保有する菌体が示す［キシラナーゼの活性］／［ＤＨＦＲ活性］の値（これを野性型酵素の活性とする）と比較した。その結果を表８に示す。以下の表において、［キシラナーゼの活性］／［ＤＨＦＲ活性］は野生型酵素の活性を１００％として、％で表示したものである。
0004534030.tif 000011
この結果から、３２６番目のアミノ酸として好適なものとして、ロイシンが示された。
この変異体を、ＮＬ−キシラナーゼ（Ｍ１５８Ｌ）と名付けた。また、ＮＬ−キシラナーゼ（Ｍ１５８Ｌ）の遺伝子を組み込んだ組み換えプラスミドを、ｐＮＬＸＹＬ−Ｍ１５８Ｌと名付けた。
ＮＬ−キシラナーゼ（Ｍ１５８Ｌ）の３３７番目のメチオニンの変異体の作製には、ｐＮＬＸＹＬ−Ｍ１５８Ｌを鋳型として、２本の化学合成プライマーＤＮＡ：
５’−ｇｇｇｇａｔｃｃｔｃｔｔｇａｃａａｔｔａｇｔｔａａｃｔａｔｔｔｇｔｔａｔａａｔｇｔａｔｔｃ−３’と
５’−ａｃｔｔｔｇａｔａｔｃｃｔｔｃｔｇｔｃｇｃｇｎｎｇａｃｔｔｇｇｔａａｇｃｃｃａａｔｔａｃｔｇｃｃｃａｇａｔｔ−３’
を用いてＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ（これをＤＮＡ３３とする。）を作製した。ＤＮＡ３３を鋳型として、２本の化学合成プライマーＤＮＡ：
５’−ｇｇｇｇａｔｃｃｔｃｔｔｇａｃａａｔｔａｇｔｔａａｃｔａｔｔｔｇｔｔａｔａａｔｇｔａｔｔｃ−３’と
５’−ｇｇｇｇｇｇａｔｃｃｔｔａｃｃａｔａｃｇｇｔａａｃａｔｔｃｇａｃｇａｇｃｃａｃｔａｃｔｔｔｇａｔａｔｃｃｔｔｃｔｇｔｃｇｃ−３’を用いてＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ（これをＤＮＡ３４とする。）を作製した。ＤＮＡ３４をＢａｍＨＩで切断した後、前記と同様にして寒天培地１に生育するコロニーを調べた。また、各変異体のキシラナーゼ活性も同時に調べた。その結果を表９に示す。
0004534030.tif 000012
この結果から、３２６番目のアミノ酸として好適なものとして、イソロイシンが示された。
この変異体を、ＮＬ−キシラナーゼ（Ｍ１５８Ｌ，Ｍ１６９Ｉ）と名付けた。また、ＮＬ−キシラナーゼ（Ｍ１５８Ｌ，Ｍ１６９Ｉ）の遺伝子を組み込んだ組み換えプラスミドを、ｐＮＬＸＹＬ−ＬＩと名付けた。
配列表配列番号９に、ＮＬ−キシラナーゼ（Ｍ１５８Ｌ，Ｍ１６９Ｉ）を、配列表配列番号１０に、制限酵素ＢａｍＨＩで切り出し可能で且つ適当なベクターのＢａｍＨＩ部位に導入することにより大腸菌で高発現可能なＮＬ−キシラナーゼ（Ｍ１５８Ｌ，Ｍ１６９Ｉ）をそれぞれ示している。
ｐＮＬＸＹＬ−ＬＩを含む大腸菌を、３リッターの培地（１５ｇの食塩、１５ｇの酵母エキス、２４ｇのトリプトン、３０ｍｇのアンピシリンナトリウムを含んでいる）で、３７度で一晩培養し、湿重量約１０ｇの菌体を得た。この菌体の無細胞抽出液に、ストレプトマイシン硫酸処理、硫安分画、メソトレキセートアフィニティクロマトグラフィー及びＤＥＡＥトヨパールクロマトグラフィーの精製操作を施すことにより、均一にまで蛋白質を精製し、約３０ｍｇの均一なＮＬ−キシラナーゼ（Ｍ１５８Ｌ，Ｍ１６９Ｉ）が得られた。アミノ末端分析を行ったところ、ＮＬ−キシラナーゼ（Ｍ１５８Ｌ，Ｍ１６９Ｉ）のアミノ末端の配列は、Ｌ−アラニン−Ｌ−イソロイシン−Ｌ−セリン−Ｌ−ロイシン−Ｌ−イソロイシン−−であり、開始コドンに由来するＬ−メチオニンが取り除かれた配列をしていた。精製して得られた１ｍｇのＮＬ−キシラナーゼ（Ｍ１５８Ｌ，Ｍ１６９Ｉ）を０．１Ｍの過酸化水素水含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で室温で一晩放置し、その分子量を調べたところ、処理していないＮＬ−キシラナーゼ（Ｍ１５８Ｌ，Ｍ１６９Ｉ）の分子量と全く同じ値、３８，７７５（計算値３８，７７３）、を示した。また、酵素活性も全く変化しなかった。一方、同様の処理を変異処理する前のジヒドロ葉酸還元酵素−キシラナーゼ融合酵素に対して行ったところ、過酸化水素水処理前の分子量が３８，８１３（計算値３８，８０９）、過酸化水素水処理後の分子量が３８，８４５であり、全てのメチオニンがメチオニンスルホオキサイドに酸化されたことが示された。また、全てのメチオニンが酸化されることによりキシラナーゼの酵素活性が約３分の１に低下した。このように、硫黄原子を含まなくすることにより、抗酸化性が付与されたことが示された。
産業上の利用可能性
本発明によれば、野生型酵素の活性を保持するとともに、過酸化水素等による酸化に対して耐性を有し、化学的に安定な酵素蛋白質、及びその製造方法が提供される。本発明の酵素蛋白質は、性状が安定していることから、バイオセンサー、バイオリアクター等の用途に幅広く使用することが可能なものであり、実用的価値の高いものである。
【配列表】
0004534030.tif 000013
0004534030.tif 000014
0004534030.tif 000015
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