(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
E.maxima ARI-73/97（NM 98/02796）、E.acervulina ARI-77/97（NM 98/02794）、E.tenella ARI-11/98（NM 98/02795）、E.necatrix MCK01（NM 98/02797）及びE.necatrix ARI-MEDNEC3 +8（NM 98/02118）から選択されたEimeriaの３〜５種類のワクチン株またはその抗原を、獣医学的に許容されるキャリヤまたは賦形剤とともに含むワクチン。ただし、前記株または抗原はワクチン接種した鳥に防御的免疫応答を誘発させる能力をもつもので、カッコ内の数字はブタペスト条約に基づくオーストラリア政府分析研究所に寄託した寄託番号を示す。
【請求項２】
さらに少なくとも１種類の追加の弱毒Eimeria株を含む請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
E.maxima ARI-73/97、E.acervulina ARI-77/97、E.tenella ARI-11/98、およびE.necatrix MCK01とE.necatrix ARI-MEDNEC3 +8のいずれかまたは両方を含む請求項１に記載のワクチン。
【請求項４】
E.brunetti、E.mitis、E.praecox、E.maxima、E.acervulina、E.necatrixまたはE.tenellaの１種類以上のワクチン株を含む請求項１に記載のワクチン。
【請求項５】
他の家禽疾病に対するワクチンを含む請求項１記載のワクチン。
【請求項６】
マレック病、マイコプラズマ、またはサルモネラ感染症の１以上に有効なワクチン成分を含む請求項５に記載のワクチン。
【請求項７】
前記菌株が胞子形成オーシストまたはスポロシストの全体および／または断片の形である請求項１に記載のワクチン。
【請求項８】
１用量当たり１５〜５００の胞子形成オーシストを含む請求項１に記載のワクチン。
【請求項９】
E.maxima ARI-73/97（NM 98/02796）、E.acervulina ARI-77/97（NM 98/02794）、E.tenella ARI-11/98（NM 98/02795）、E.necatrix MCK01（NM 98/02797）及びE.necatrix ARI-MEDNEC3 +8（NM 98/02118）から選択されたアイメリア株またはその株の抗原。ただし、前記株または抗原はワクチン接種した鳥に防御的免疫応答を誘発させる能力をもつもので、カッコ内の数字はブタペスト条約に基づくオーストラリア政府分析研究所に寄託した寄託番号を示す。
【請求項１０】
オーシストまたは胞子形成オーシストである請求項９に記載のアイメリア株。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ワクチン用アイメリア属（Eimeria）株、ならびに同株を含むワクチンに関する。
コクシジウム症は世界中で実施されている大規模家禽産業において大きな経済的重要性を持つ疾病である。病原体は原生動物の寄生虫であるアイメリアである。
鶏では７種類の異なるアイメリア属、すなわち、E.maxima、E.acervulina、E.necatrix、E.tenella、E.mitis、E.praecox、および E.brunetti が同定されている。これらすべての種が、ある特定の国や地域に存在するというわけではない。E.maxima、E.acervulina、E.necatrix および E.tenella がアイメリア属の一般的な種である。
【０００２】
アイメリアは複雑なライフサイクルを示すが、その詳細は、たとえば家禽類コクシジウム症：診断およびテスト法［Poultry Coccidiosis：Diagonostic and testing procedures］、第２版、ファイザー社［Pfizer Inc.］に記載されている。要約すれば、胞子を形成した（感染性の）コクシジウム接合子嚢（オーシスト oocysts）が摂取されると、種虫が放出されて無性及び有性のサイクルが始まり、何千もの新しいオーシストが生まれ、それらが糞便中に排泄される。これらのオーシストはその後すぐに胞子を形成し、それらは他の鳥類に感染性を持つものとなる。１個の胞子形成オーシストが何万もの子孫を作ることになる。アイメリアは上皮細胞を破壊することにより消化管に病変部を作り、あるいは腸管粘膜や粘膜下組織に外傷を作り、その中で成長および増殖する。
【０００３】
アイメリアのさまざまな種（球虫目と呼ぶこともある）は、オーシストの顕微鏡的特徴（大きさ、形、長さ、巾）、オーシストが好む消化管内の場所、作り出された病変部の特性、検出潜伏器(propatent period)、胞子形成回数と生殖指数、ＤＮＡテストおよび種間の交差防御性(cross protection)の欠如により同定することができる。したがって特定の種による感染は、これらの１以上の特徴をベースとして一般的な精度で同定することができる。
コクシジウム症の臨床的な兆候としては、粘液状または血便状または脱水状などの下痢がある。これらの症状には通常、羽の乱れ、貧血、脱力、体重減少、頭や首の収縮、傾眠を伴う。産卵鶏におけるコクシジウム症の場合は通常、産卵数の低下があらわれる。非常に毒性の強い菌株による鶏の死亡率は非常に高い。
【０００４】
１９９７年の数字では約２００億羽の鳥類が世界中で毎年飼養されている。このように大量の羽数でのコクシジウム症の抑制は、通常全体的には有効である抗コクシジウム剤により行われている。しかし、意外なことではないが、化学治療薬に耐性を示すアイメリア株の数が増え、薬剤耐性が問題となっている。薬剤耐性を示し、強力な毒性を持つアイメリア株の出現は家禽産業を破滅させる可能性がある。
ワクチン接種によるコクシジウム症抑制の可能性は長年にわたって関心を持たれてきたが、大きな成功は見ていない。遺伝子工学的に作り出した、またはサブユニットのワクチン類は今まで成功していない（シャーリー［Shirley］、1992、Br.Vet. J. 、148:479)。コクシジウムの弱毒化した株からのオーシストを含む生ワクチン（パラコックス［Paracox］、ピットマン−ムーア［Pitman-Moore］）が英国で使用されている（ファーレント［Farrent］、1992、Poultry World、4:11）。
【０００５】
上記のパラコックス生ワクチンは、さまざまなアイメリア種の早熟系をベースにしたものである。アイメリア早熟種は、野生株よりも早く宿主中で体内ライフサイクルを完了する集団である。この選択の方法については、ジェファーズ［Jeffers］（1975、J.Parasitol.61, 1083-1090）による最初の記述がある。感染中に産生される最初のオーシストを鶏中で連続的に継代培養することにより、短縮されたライフサイクルと、おそらくはいくらか減弱された毒性を特徴とする寄生虫が生まれる。早熟種に関わる問題は、毒性アイメリア種に対する防御ができないこと、そうした株を使用したワクチンを製造することができないほど増殖能力が弱いこと、ならびに減毒および感染力の維持に関連する安定性である。たとえば、 シャーリー［Shirley］とベラッティ［Bellatti］（1988,Re. Vet. Sci.,44:25-28)は、悪性の異種株の攻撃に十分に防御されない早熟種 E.maxima について記述している。
【０００６】
本発明者らは驚くことに、E.maxima、E.acervulina、E.tenella、E.necatrix のワクチン株を作り出したが、これらはそれぞれの種からの有毒株に対して強い防御作用を持ち、ワクチン製造を可能とする速度で増殖し、かつ安定なものである。
オーストラリアは地理的に外国のコクシジウム疾病から隔離されているため、本明細書に記述したワクチンおよびワクチン株は特有なものであり、したがって前記早熟アイメリア株とは明確に区別されるものである。
本発明の第１の視点では、E.maxima ARI-73/97、E.acervulina ARI-77/97、E.tenella ARI-11/98、E.necatrix MCK01 および／または E.necatrix ARI-MEDNEC3+8 の１以上の株、または前記１以上の株の抗原を、獣医学的に許容されるキャリヤまたは賦形剤と合わせて含むワクチンが提供される。
【０００７】
本発明に係るワクチンは、上記の株に加えてその他のアイメリア種も含むものとすることもできる。たとえば、そうした付加的な種としては E.brunetti、E.mitis、および／または E.praecox および／または１以上のその他 E.maxima、E.acervulina、E.necatrix および／または E.tenella のワクチン株であってもよい。そうした付加的な株は本発明の株ほど有用ではないが、それでもスペクトルの広いワクチン組成物の中では有利な成分となることがある。本発明に係るワクチンはまた、少なくとも１種類の付加的な弱毒化していない株を含ませることもできる。たとえば、ワクチンの１つの実施態様として、E.maxima ARI-73/97、E.acervulina ARI-77/97 、E.tenella ARI-11/98 および／または E.necatrix MCK01、および／または E.necatrix ARI-MEDNEC３+8 と、任意に E.brunetti、E.mitis、E.mivati、および／または E.praecox、から選ばれる１以上の株を含む多価ワクチンとすることができる。好ましいワクチンは、E.maxima ARI-73/97、E.acervulina ARI-77/97、E.tenella ARI-11/98 および／または E.necatrix MCK01、および／または E.necatrix ARI-MEDNEC３+8 から選ばれる３〜５種類のワクチン株を含むものとすることができる。
【０００８】
ワクチン能力を有する本発明の付加的な株は、鳥類を E.maxima ARI-73/97、E.acervulina ARI-77/97、E.tenella ARI-11/98 および／または E.necatrix MCK01 の１以上の株で免疫し、感作した鳥類をフィールド隔離集団(field isolates)から得た候補株で曝露する(challenge) ことによって調製することができる。免疫した鳥に多量のオーシストを産生するこれらの株は、ワクチンがこれらに交差防御性がない（稀にしかない事象）ことによって、鳥の中で連続的継代培養に供して、毒性株に強い防御作用とワクチン生産が可能な増殖速度とを有し、安定で抗コクシジウム剤に感受性のある本発明の株を作らせる。
【０００９】
本発明のワクチン中の微生物は、ワクチン接種した鳥に防御的免疫応答を誘発させる能力を持つ胞子形成オーシストまたはスポロシスト、あるいはそれらの抗原の全体および／または断片の形とする。便宜上オーシストという用語は、胞子形成オーシスト、またはオーシストと胞子形成オーシストの混合物を意味するものとする。オーシストは当分野で周知の方法、たとえばジェンセン［Jensen］ら、(1976)、The Journal of Parasitology 2、195-198、および199-202 の方法に基づいて胞子形成させる。胞子形成オーシストまたはスポロシストは、経口、点眼、点鼻、または非経口経路で鳥類に対して感染性である。抗原は通常、タンパク質またはペプチドあるいはそれらの断片（たとえば、５〜５０アミノ酸のような５つ以上のアミノ酸を含むもの）である。炭水化物、脂質、糖脂質などで抗原を含むものでもよい。抗原は通常、微生物の種虫段階で取り出される。抗原はリコンビナントＤＮＡ技術、タンパク質精製および当分野で周知のその他の技法を含む標準的手法により作ることができる。
【００１０】
獣医学的に許容されるキャリヤとしては、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水などの緩衝生理食塩水、またはその他生理学的に適切な媒体などである。キャリヤとしては、生理学的に好適なゲル、ゼラチン、ヒドロゾル、セルロースまたは多糖ガムなどの１以上の懸濁剤、増粘剤または防腐剤を含む。賦形剤としては、ビタミン類、抗生物質および抗菌剤（殺ウイルス剤、殺菌剤および／または防黴剤）、界面活性剤などである。一例としては、ストレプトマイシン、リノマイシン、アンホテリシン、ホルムアルデヒド、鶏胆汁、次亜塩素酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、牛胎児血清および塩酸システインの１以上を含むものである。
【００１１】
ワクチンは１以上のアイメリア株を含み、また１ｍｌ当たり約５０〜５０，０００以上の胞子形成オーシストを含むものとすることができる。ワクチン中の各アイメリア種のそれぞれの数は、本発明による株では通常同数である。しかしながら、例えば E.brunetti のような本発明の株ではなく、付加的な株を用いる場合は、本発明の株と比較して防御反応が弱いため、比例的に大量の微生物を使用する。ワクチンの例として、眼または経口投与用のものは、１ワクチン用量に１５〜５００の胞子形成オーシストを含むものとすることができる。
【００１２】
本発明に係るワクチンは、他の家禽疾病に有効な他のワクチン成分を含んでもよい。例としては、マレック病用ワクチン、鶏痘、マイコプラズマおよびサルモネラワクチン類などである。したがって本発明の別の視点では、上記のようにマレック病、マイコプラズマまたはサルモネラ感染症の１以上に対するワクチン成分を含むワクチンが提供される。
【００１３】
本発明のワクチンは、ひな鳥や成鳥類に対してin ovo（たとえば、孵化１８−２０日の卵）で投与することができる。投与経路は、経口、涙管を経由しての眼内、またはその他周知のワクチン投与法とすることができる。一例としては、適当な媒体中に入れたワクチンを１群の鳥にスプレー投与したり、餌にスプレーしたり、点眼薬として投与したり、飲用水中に入れたり、調合飼料の一部として、あるいはペックゲル（ゼラチン・マトリクス中に入れた胞子形成オーシストなど）中に混ぜて投与することができる。
【００１４】
本発明の別の視点では、E.maxima ARI-73/97、E.acervulina ARI-77/97、E.tenella ARI-11/98、E.necatrix MCK01、および／または E.necatrix ARI-MEDNEC３+8 のグループから選ばれるワクチン・アイメリア株に関する。好ましくは、これらの株はオーシストおよび／または胞子形成オーシストの形で提供される。
【００１５】
本発明に係るアイメリア株は、ブタペスト条約の寄託機関であるオーストラリア政府分析研究所（Australian Government Analytical Laboratories : AGAL、オーストラリア ２０７３、ニューサウスウェールズ州、ピンブル、スアキン通り １）に、１９９８年３月１７日に寄託した E.necatrix ARI-MEDNEC３+8以外は、１９９９年３月３０日に寄託した。詳細は下記の通りである。
【００１６】
株                              寄託番号
E.maxima ARI-73/97                  NM 98/02796
E.acervulina ARI-77/97              NM 98/02794
E.necatrix MCK01                    NM 98/02797
E.necatrix ARI-MEDNEC3+8            NM 99/02118
E.tenella ARI-11/98                 NM 98/02795
【００１７】
本発明に係るアイメリア株は、実験されたことのない感染していない家禽類（すなわち、アイメリア感染に曝されていないもの）の継代など、当分野の標準的手法により繁殖させることができる。各株は感染していない家禽類で繁殖させ、オーシストを回収し、任意に胞子形成させ、次にキャリヤおよび／または賦形剤と混ぜ合わせる。アイメリア株は標準的手法により卵中で繁殖させ、オーシストを卵から回収することもできる。アイメリア株は通常、従来手法により卵中で成長および増殖させることができる。
本発明のアイメリア株のオーシストおよび／またはスポロシストは、たとえば当業界で周知のM.W.シャーリー［Shirley］、Biotechnology Guidelines on Techniques in Coccidiosis Research、97頁-（1995）、ISBN 92-827-4970-3 の方法のように、液体窒素中で凍結（低温保存）して貯蔵することができる。一例として、タンパク質濃縮媒体中に懸濁させたスポロシストをジメチルスルホキシドまたはグリセリンの存在下、たとえば１から１０％ｗ／ｗで液体窒素中で凍結させることができる。
【００１８】
次に本発明を以下の非制限的実施例により説明する。
実施例１
種々の病原性を持った大量のアイメリア隔離集団(isolate)をクイーンズランドの非商業（バックヤード）鶏群から採集した。これらの隔離集団は通常アイメリア種の混合物であるが、ほとんどの場合、単一のアイメリア種が主要な病原性微生物であった。隔離集団は顕微鏡分析により、E.maxima、E.acervulina、E.tenellaおよび／または E.necatrix のそれぞれ種に分別した。各種の株からの単一のオーシストを、通常約１ｍｌといった容量の媒体に入れたものを用いて、個々の非アイメリア感染鳥を感染させた。これらの鳥の糞便のオーシストを、塩浮上技法（M.W.シャーリー［Shirley］、Biotechnology Guidelines on Techniques in Coccidiosis Research、1-25頁-（1995）ISBN 92-827-4970-3）を用いてモニターし、オーシストを回収した。
アイメリアに感染してない個々の鳥を最大２０００の精製オーシスト菌により感染させ、それらを増殖させた。これらの鳥を安楽死させ、腸管病変部に繁殖している種が前述の基準を用いて感染させたものと一致することを確認した。
【００１９】
株の弱毒化
連続継代培養により早く増殖するものを選択して株を弱毒化した。要約すれば、鳥を１０００−５０００の寄生虫で感染させてモニターし、最初に死亡した寄生虫を個別に回収した。このプロセスを何度も（５〜３０回程度）繰り返し、早く出現する寄生虫を段階的に選別した。これは鶏の腸内におけるそれらの増殖と病変部を作る能力の減衰と一致した。多くの隔離集団において早熟株は産生されず、それらの株は極度に病原性であり、遅い繁殖速度を示し、薬剤耐性、および／または不安定であった。これらの株は廃棄した。残りの株で同じ種からの異種株に対する曝露に対する防御性を調べると、多くの株はワクチン開発には欠くことのできないアイメリア種中での交差防御は示さなかった。この作業から意外にもE.maxima、E.acervulina、E.tenella 及びE.necatrix種からアイメリアの４種類のワクチン株を産生することができた。これらはすべてそれぞれの種からの毒性株に対して強い防御性を有し、ワクチン生産を可能とする速度で増殖し、コクシジウム薬剤に非耐性、かつ安定なものであった。これらの株は、E.maxima ARI-73/97、E.acervulina ARI-77/97、E.tenella ARI-11/98、E.necatrix ARI-MEDNEC３+8 および E.necatrix MCK01 と命名された。
【００２０】
オーシストは以下のようにして胞子形成させた。すなわち、オーシストを含む糞便を二クロム酸カリウム溶液中に入れた。二クロム酸塩は静菌剤の働きをした。溶液に空気を吹き込んで泡立てた。このプロセスは３０℃のインキュベータ中で行った。胞子形成のプロセスは、最低倍率１００倍の光学顕微鏡によりオーシストの変化を観察することにより確認した。胞子形成時間は、種に応じて１８〜３０時間であった。胞子形成後の懸濁液を、ワクチン調製または貯蔵のために冷蔵庫に入れた。
糞便と二クロム酸塩が１００ｍｌ以下しかない場合は、５０ｍｌの糞便懸濁液を大きなペトリ皿に入れ、３０℃のインキュベータに入れた。混合物への酸素の拡散と胞子形成が確実に起きるように十分な表面積と最低の深さとした。
これらの株は、オーシストを媒体中に浸積（適当な容器中）して液体窒素中に入れるなどして低温保存した。
【００２１】
実施例２
実施例１で作ったそれぞれの株、それら株の２ないし４種類の組み合わせを含むワクチン、ならびに実施例１の株と他の株を組み合わせたものを含むワクチンを使用して一連の実験を行った。これらのワクチンはすべて、異種アイメリア菌による感染ならびにアイメリア感染処理に対して優れた防御を示した。
実験では、 E.maxima ARI-73/97 と E. acervulina ARI-77/97 のスポロシストを、ワクチン中で Medichick の E. necatrix 株および Darryl の E. tenella 株と混ぜあわせた。鳥には１ｍｌの生理食塩水中で混ぜ合わせたそれぞれの株の２５０の胞子形成オーシストを含むワクチンを接種した。
鳥は金網ケージ中の固形床上で２１日間飼養し、排泄されたオーシストによる再感染を助長させた。餌と水は試験中好きなだけ与えた。
すべての鳥は曝露時に、個々に体重を測定し、羽クリッピングによりマークした。ワクチン接種した鳥群と感受性の高い陽性の対照鳥群はそれぞれ、Ingham の E.tenella と E.necatrix のアイメリア株、ならびに Medichick 株（E.maxima と E.acervulina）の６０００の異種株胞子形成オーシスト、または６０００の同種株オーシストに曝露した。異なる処理をした群の鳥と感染していない対照群の鳥の１２日後の体重増加と疾病率を比較した。結果を表１に示す。処理の効果の統計有意差を求めるために、この試験に適切なＡＮＯＶＡモデル（変動解析）を利用した。
【００２２】
【表１】
0004549530.tif 000002
【００２３】
表１に示されているように、すべてのワクチン接種群は異種または同種株で試験した場合に非接種の鳥よりも著しく大きな体重増加を示した。ワクチン接種した鳥では、未処理の鳥と比べて、アイメリア感染の臨床症状は見られなかった。
【００２４】
実施例３
１ワクチン用量当たり、E.maxima ARI-73/97 を１５オーシスト、E.acervulina ARI-77/97 を２５オーシスト、E.tenella ARI-11/98 を２５オーシスト、ならびに E.necatrix MCK01 を１５オーシスト含むワクチンを調製した。このワクチンを、免疫処理した鳥の体重と免疫刺激性を対照の非ワクチン接種鳥と比較する実験に使用した。テストした全四群の鳥のうち、第一群は点眼によるワクチン、第二群は餌による経口投与、第三群は飲用水による経口投与、そして第四群は対照群とした。鳥は固形床のオリの中に入れ、餌と水を無制限で与え、ランプにより光と熱を供給して飼養した。
１日齢または６日齢でワクチン接種した鳥のすべての群はワクチン接種後、非ワクチン接種対照群と比べて同様の成長率を示した。これはこのワクチンが成長率に影響を及ぼさないことを示しており、その有用性を裏付けている。鳥はワクチンに使用したオーシストの１０倍の数のアイメリア株に免疫テストした。
ワクチンを接種せずに曝露した鳥は著しく高いオーシスト産生を示し、これはそれらの鳥の中でのアイメリア感染の広がりを示すものである。ワクチン接種した鳥で、産生されるオーシストの数が著しく減ったことは防御的免疫応答があることを示している。
ワクチンを接種しなかった群では曝露後に成長率の低下を示したが、ワクチンを接種した鳥では体重増加が継続した。これもまた防御免疫応答を示すものである。
【００２５】
実施例４
前記株の胞子形成オーシストを含むワクチン組成物を、ｐＨ７．４で０．１％ホルムアルデヒドを含むダルベッコＡリン酸緩衝化生理食塩水（オクソイド・ラボラトリーズ［Oxoid Laboratories］、オーストラリア、メルボルン、ハイデルバーグ）中に胞子形成オーシストを懸濁させて調製した。E.maxima ARI-73/97、E.acervulina ARI-77/97、E.tenella ARI-11/98、および E.necatrix ARI-MEDNEC3+8、および／または E.necatrix MCK01 各株の同数の胞子形成オーシストを使用した。
経口投与用のワクチンは、１用量当たり９０のオーシストを含むものを、１ｍｌ当たり５００用量含む。
眼球投与用のワクチンは、１用量当たり１０８のオーシストを含むものを、１ｍｌ当たり４０用量含む。
【００２６】
本明細書全体を通して、文脈が別の解釈を必要としない限り、“含む（comprise）”という用語、あるいは“含む（comprises）”または“含んでいる（comprising）”といった変形、あるいは“含む（includes）”という用語またはそれらの変形は、記述した成分または数字または成分や数字のグループを含むことを示唆するものと理解し、その他の成分または数字または成分や数字のグループを除外するものではないものとする。この点において、請求項の範囲を解釈するにおいては、請求項のいずれかに１以上の特性を付加したクレームとしても、その中に本発明の請求している基本的な特性が含まれることから、そうしたクレームも本発明の範疇に属するものとする。