(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リシン様毒素のA鎖、リシン様毒素のB鎖およびAとB鎖を結合する異種リンカーアミノ酸配列をコードし、異種リンカー配列が癌関連プロテアーゼ、ウイルスプロテアーゼ、菌プロテアーゼおよび寄生虫プロテアーゼからなる群から選択される疾患特異的プロテアーゼの切断認識部位を含む、ヌクレオチド配列を有する精製および単離核酸。
【請求項２】
A鎖がリシンA鎖、アブリン毒素A鎖、ジフテリア毒素A鎖またはシュードモナスエキソトキシンのドメインII/IIIである、請求項１記載の単離核酸。
【請求項３】
A鎖がボルケンシン毒素A鎖、コレラ毒素A鎖、モデシン毒素A鎖またはシガ毒素A鎖である、請求項１記載の単離核酸。
【請求項４】
B鎖がリシンB鎖、アブリン毒素B鎖、ジフテリア毒素B鎖またはシュードモナスエキソトキシンのドメインIである、請求項１記載の単離核酸。
【請求項５】
B鎖がボルケンシン毒素B鎖、コレラ毒素B鎖、モデシン毒素B鎖またはシガ毒素B鎖である、請求項１記載の単離核酸。
【請求項６】
切断認識部位が、カテプシンB、エプスタイン−バールウイルス特異的プロテアーゼ、マトリックスメタロプロテイナーゼ、カテプシンＬ、カテプシンＤ、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター、組織型プラスミノーゲンアクチベーター、ヒト前立腺特異的抗原、カリクレイン、好中球エラスターゼおよびカルパインからなる群から選択される癌関連プロテアーゼにより認識される、請求項１から５のいずれかに記載の単離核酸。
【請求項７】
切断認識部位が、熱帯熱マラリア原虫プロテアーゼである寄生虫プロテアーゼにより認識される、請求項１から５のいずれかに記載の単離核酸。
【請求項８】
切断認識部位が、ヒトサイトメガロウイルス、ヒトヘルペスウイルス、水痘−帯状疱疹ウイルス、A型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルスおよび感染性喉頭気管炎ウイルスからなる群から選択されるウイルスプロテアーゼにより認識される、請求項１から５のいずれかに記載の単離核酸。
【請求項９】
切断認識部位が、カンジダ酸プロテアーゼである菌プロテアーゼにより認識される、請求項１から５のいずれかに記載の単離核酸。
【請求項１０】
配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39、配列番号48、配列番号50、配列番号52、配列番号54、配列番号74、配列番号77、配列番号80、配列番号83、配列番号86、配列番号89、配列番号92、配列番号95、配列番号98、配列番号101、配列番号104、配列番号107、配列番号110、配列番号113、配列番号116、配列番号119、配列番号122または配列番号125に従ったヌクレオチド配列を有する、請求項１記載の単離核酸。
【請求項１１】
配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号86、配列番号89、配列番号92、配列番号95、配列番号98、配列番号101、配列番号104、配列番号107、配列番号110、配列番号113、配列番号116、配列番号119、配列番号122または配列番号125に従ったヌクレオチド配列を有する、請求項６記載の単離核酸。
【請求項１２】
A鎖がリシンA鎖であり、B鎖がリシンB鎖であり、異種リンカーがマトリックスメタロプロテイナーゼの切断認識部位を含む、請求項６記載の単離核酸。
【請求項１３】
異種リンカーがマトリックスメタロプロテイナーゼ９の切断認識部位を含む、請求項１２記載の単離核酸。
【請求項１４】
A鎖がリシンA鎖であり、B鎖がリシンB鎖であり、異種リンカーがヒト前立腺特異的抗原の切断認識部位を含む、請求項６記載の単離核酸。
【請求項１５】
配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19または配列番号21に従ったヌクレオチド配列を有する、請求項７記載の単離核酸。
【請求項１６】
配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39、配列番号48、配列番号52、配列番号74、配列番号77、配列番号80または配列番号83に従ったヌクレオチド配列を有する、請求項８記載の単離核酸。
【請求項１７】
A鎖がリシンA鎖であり、B鎖がリシンB鎖であり、異種リンカーがC型肝炎ウイルスの切断認識部位を含む、請求項８記載の単離核酸。
【請求項１８】
配列番号50または配列番号54に従ったヌクレオチド配列を有する、請求項９記載の単離核酸。
【請求項１９】
リシン様毒素からの切断されたA鎖を含む、請求項１から１８のいずれかに記載の単離核酸。
【請求項２０】
リシンA鎖の切断されたA鎖を含む、請求項１９記載の単離核酸。
【請求項２１】
リシン様毒素からの切断されたB鎖を含む、請求項１から２０のいずれかに記載の単離核酸。
【請求項２２】
リシンB鎖の切断されたB鎖を含む、請求項２１記載の単離核酸。
【請求項２３】
請求項１から２２のいずれかに記載の核酸を包含するプラスミド。
【請求項２４】
請求項１から２２のいずれかに記載の核酸を包含するバキュロウイルストランスファーベクター。
【請求項２５】
リシン様毒素のA鎖、リシン様毒素のB鎖およびAとB鎖を結合する異種リンカーアミノ酸配列を含み、リンカー配列が癌関連プロテアーゼ、ウイルスプロテアーゼ、菌プロテアーゼおよび寄生虫プロテアーゼからなる群から選択される疾患特異的プロテアーゼの切断認識部位を含む、組換えタンパク質。
【請求項２６】
A鎖がリシンA鎖、アブリン毒素A鎖、ジフテリア毒素A鎖またはシュードモナスエキソトキシンのドメインII/IIIである、請求項２５記載の組換えタンパク質。
【請求項２７】
A鎖がボルケンシン毒素A鎖、コレラ毒素A鎖、モデシン毒素A鎖またはシガ毒素A鎖である、請求項２５記載の組換えタンパク質。
【請求項２８】
B鎖がリシンB鎖、アブリン毒素B鎖、ジフテリア毒素B鎖またはシュードモナスエキソトキシンのドメインIである、請求項２５記載の組換えタンパク質。
【請求項２９】
B鎖がボルケンシン毒素B鎖、コレラ毒素B鎖、モデシン毒素B鎖またはシガ毒素B鎖である、請求項２５記載の組換えタンパク質。
【請求項３０】
切断認識部位が、カテプシンB、エプスタイン−バールウイルス特異的プロテアーゼ、マトリックスメタロプロテイナーゼ、カテプシンL、カテプシンD、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター、組織型プラスミノーゲンアクチベーター、ヒト前立腺特異的抗原、カリクレイン、好中球エラスターゼおよびカルパインからなる群から選択される癌関連プロテアーゼにより認識される、請求項２５から２９のいずれかに記載の組換えタンパク質。
【請求項３１】
切断認識部位が、熱帯熱マラリア原虫プロテアーゼである寄生虫プロテアーゼにより認識される、請求項２５から２９のいずれかに記載の組換えタンパク質。
【請求項３２】
切断認識部位が、ヒトサイトメガロウイルス、ヒトヘルペスウイルス、水痘−帯状疱疹ウイルス、A型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルスおよび感染性喉頭気管炎ウイルスからなる群から選択されるウイルスプロテアーゼにより認識される、請求項２５から２９のいずれかに記載の組換えタンパク質。
【請求項３３】
切断認識部位が、カンジダ酸プロテアーゼである菌プロテアーゼにより認識される、請求項２５から２９のいずれかに記載の組換えタンパク質。
【請求項３４】
配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号75、配列番号78、配列番号81、配列番号84、配列番号87、配列番号90、配列番号93、配列番号96、配列番号99、配列番号102、配列番号105、配列番号108、配列番号111、配列番号114、配列番号117、配列番号120、配列番号123または配列番号126に従ったリンカーアミノ酸配列を有する、請求項２５記載の組換えタンパク質。
【請求項３５】
配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号86、配列番号89、配列番号92、配列番号95、配列番号98、配列番号101、配列番号104、配列番号107、配列番号110、配列番号113、配列番号116、配列番号119、配列番号122または配列番号125に従ったヌクレオチド配列によってコードされる、請求項３０記載の組換えタンパク質。
【請求項３６】
A鎖がリシンA鎖であり、B鎖がリシンB鎖であり、異種リンカーがマトリックスメタロプロテイナーゼの切断認識部位を含む、請求項３０記載の組換えタンパク質。
【請求項３７】
異種リンカーがマトリックスメタロプロテイナーゼ９の切断認識部位を含む、請求項３６記載の組換えタンパク質。
【請求項３８】
A鎖がリシンA鎖であり、B鎖がリシンB鎖であり、異種リンカーがヒト前立腺特異的抗原の切断認識部位を含む、請求項３０記載の組換えタンパク質。
【請求項３９】
配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19または配列番号21に従ったヌクレオチド配列によってコードされる、請求項３１記載の組換えタンパク質。
【請求項４０】
配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39、配列番号48、配列番号52、配列番号74、配列番号77、配列番号80または配列番号83に従ったヌクレオチド配列によってコードされる、請求項３２記載の組換えタンパク質。
【請求項４１】
A鎖がリシンA鎖であり、B鎖がリシンB鎖であり、異種リンカーがC型肝炎ウイルスの切断認識部位を含む、請求項３２記載の組換えタンパク質。
【請求項４２】
配列番号50または配列番号54に従ったヌクレオチド配列によってコードされる、請求項３３記載の組換えタンパク質。
【請求項４３】
リシン様毒素からの切断されたA鎖を含む、請求項２５から４２のいずれかに記載の組換えタンパク質。
【請求項４４】
リシンA鎖の切断されたA鎖を含む、請求項４３記載の組換えタンパク質。
【請求項４５】
リシン様毒素からの切断されたB鎖を含む、請求項２５から４４のいずれかに記載の組換えタンパク質。
【請求項４６】
リシンB鎖の切断されたB鎖を含む、請求項４５記載の組換えタンパク質。
【請求項４７】
インビトロで、疾患に特異的なプロテアーゼに関連する細胞である、疾患に罹患している細胞を阻害または破壊する方法であって、以下の段階を含む方法：
（a）リシン様毒素のA鎖、リシン様毒素のB鎖およびAとB鎖を結合する異種リンカーアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有し、リンカー配列が、癌関連プロテアーゼ、ウイルスプロテアーゼ、菌プロテアーゼおよび寄生虫プロテアーゼからなる群から選択される疾患特異的プロテアーゼの切断認識部位を含む、精製および単離核酸を調製する；
（b）該核酸を宿主細胞に導入し、宿主細胞で核酸を発現させ、リシン様毒素のA鎖、リシン様毒素のB鎖およびリンカーアミノ酸配列を含む組換えタンパク質を得る；
（c）該タンパク質を医薬的に許容される担体、希釈剤または賦形剤に懸濁させる、そして
（d）細胞と該組換えタンパク質を接触させる。
【請求項４８】
疾患が、癌の一であるかまたは、菌、ウイルスまたは寄生虫に感染した細胞である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
インビトロで、疾患に特異的なプロテアーゼに関連する細胞である、疾患に罹患している細胞を阻害または破壊する方法であって、細胞と、請求項２５から４６のいずれかに記載の組換えタンパク質とを接触させる段階を含む方法。
【請求項５０】
疾患を処置するための医薬の製造のための、請求項２５から４６のいずれかに記載の組換えタンパク質の使用。
【請求項５１】
疾患を処置するための医薬の製造のための、請求項１から２２のいずれかに記載の核酸分子の使用。
【請求項５２】
癌であるかまたは菌、ウイルスまたは寄生虫に感染している哺乳類の処置のための医薬の製造のための、リンカー配列が癌、菌、ウイルスまたは寄生虫プロテアーゼの切断認識部位を含む請求項２５から４６のいずれかに記載の組換えタンパク質の使用。
【請求項５３】
癌、菌感染、ウイルス感染または寄生虫感染の哺乳類を処置するための医薬の製造法であって、以下の段階を含む方法：
（a）リシン様毒素のA鎖、リシン様毒素のB鎖およびAとB鎖を結合する異種リンカーアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有し、リンカー配列が癌関連プロテアーゼ、ウイルスプロテアーゼ、菌プロテアーゼまたは寄生虫プロテアーゼの切断認識部位を含む、精製および単離核酸を調製する；
（b）該核酸を宿主細胞に導入し、宿主細胞で核酸を発現させ、リシン様毒素のA鎖、リシン様毒素のB鎖およびリンカーアミノ酸配列を含む組換えタンパク質を得る；
（c）タンパク質を医薬的に許容される担体、希釈剤または賦形剤に懸濁させる。
【請求項５４】
請求項２５から４６のいずれかに記載の組換えタンパク質および医薬的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む、動物の癌または菌、ウイルスまたは寄生虫感染を処置するための医薬組成物。
【請求項５５】
請求項１から２２のいずれかに記載の核酸分子および医薬的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む、動物の癌または菌、ウイルスまたは寄生虫感染を処置するための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、癌、ウイルス、寄生虫および菌感染に対する治療剤として有用なタンパク質に関する。該タンパク質は、疾患関連病原体または細胞に特異的なプロテアーゼによって特異的に切断されて活性化される、リンカー配列によって結合したリシン様毒素をもつＡ鎖およびＢ鎖を含む。
背景技術
細菌および植物は、１、２または数個のポリペプチドまたはサブユニットからなる細胞毒性タンパク質を産生することが知られている。単一のサブユニットをもつこのようなタンパク質は、大雑把には、Ｉ型タンパク質として分類される。多数の２個のサブユニット構造を含む細胞毒はＩＩ型タンパク質と呼ばれている（Saelinger, C.B.の「細菌毒の輸送」（Saelinger, C.B.編）１−１３（ＣＲＣプレス・インク、ボカレイトン、フロリダ、１９９０））。一つのサブユニット、Ａ鎖は毒性活性をもち、第２のサブユニット、Ｂ鎖は細胞表面に結合して標的細胞内へ毒素が侵入するのを媒介する。このような毒素のサブセットは、タンパク質の生合成を阻害することによって標的細胞を殺す。たとえば、ジフテリア毒素またはシュードモナスエキソトキシンといったような細菌毒素は、延長因子２を不活性化することによってタンパク質の合成を阻害する。リシン、アブリンといったような植物毒素および細菌毒素シガ毒素は、リボソームを直接不活性化することによってタンパク質の合成を阻害する（Olsnes,S.およびPhil, A.の「毒素およびウイルスの分子的活動」（Cohen,P.およびvanHeyringen,S.編）５１−１０５、エルセビア・バイオメディカル。プレス、アムステルダム、１９８２）。
Ricinus communis（ひまし油をとる植物）の種子から得られるリシンは、植物毒素の中で最も強力な毒素である。一本のＡ鎖が、一分間に１５００個のリボソームを不活性化することができると評価されている。したがって、一個の細胞を殺すには、一個のリシン分子で十分なのである（Olsnes,S.およびPhil, A.の「毒素およびウイルスの分子的活動」（Cohen,P.およびvanHeyringen,S.編）５１−１０５、エルセビア・バイオメディカル。プレス、アムステルダム、１９８２）。リシン毒素は、ジスルフィド結合によって結合している、それぞれ分子量３０６２５Ｄａおよび３１４３１ＤａのＡ鎖およびＢ鎖からなるグリコシル化されたヘテロダイマーである。リシンのＡ鎖はＮ−グリコシダーゼ活性をもち、真核細胞のリボソームの２８Ｓ  ｒＲＮＡの特異的アデニン残基の除去を触媒する（Endo,Y.およびTsurugi,K.J.のBiol.Chem.２６２：８１２８（１９８７））。リシンのＢ鎖は、それ自体には毒性はないが、真核細胞の表面のガラクトース残基に結合し、毒素分子の受容体媒介性エンドサイトーシスを刺激することによってＡ鎖の毒性を促進する（SimmonsらのBiol.Chem.２６１：７９１２（１９８６））。Ａ鎖およびＢ鎖からなる毒素分子が、クラスリン依存性または非依存性メカニズムを介して細胞内へ侵入するとすぐに、細胞内のポテンシャルが非常に低下し、活性のあるＡ鎖が放出され、そのタンパク質合成阻害効果および細胞毒性が誘発される（Emmanuel,F.らのAnal.Biochem.１７３：１３４−１４１（１９８８）；Blum,J.S.らのJ.Biol.Chem.２６６：２２０９１−２２０９５（１９９１）；Fiani,M.L.らのArch.Bioshem.Biophys.３０７：２２５−２３０（１９３３））。実験的な証拠から、エンドソーム内で活性化された毒素（リシン、シガ毒素など）は、Ａ鎖が細胞質内へトランスロケーションされてその作用を誘発される前に、老化輸送によってトランスゴルジネットワークを通って小胞体へ侵入することが示唆される’（Sandvig,K.およびvan Deurs,B.のFEBS Lett.３４６：９９−１０２（１９９４））。
タンパク質毒素は、最初、不活性な先駆体として産生される。リシンは最初、３５アミノ酸Ｎ−末端プレ配列およびＡ鎖とＢ鎖の間の１２アミノ酸リンカーをもつシングルポリペプチド（プレプロリシン）として産生される。該プレ配列は、リシン先駆体が小胞体へトランスロケーションする間に除去される（Lord,J.M.のEur.J.Biochem.１４６：４１１−４１６（１９８５））。次いで、プロリシンは、プロテインボディと呼ばれる特別の細胞小器官内へトランスロケーションされ、植物プロテアーゼがＡ鎖とＢ鎖の間のリンカー領域で該タンパク質を切断する（Lord,J.M.のFASAB Journal８：２０１−２０８（１９９４））。しかし、二つの鎖は、鎖内ジスルフィド結合（Ａ鎖のシステイン２５９がＢ鎖のシステイン４に結合）によって依然として共有的に結合したままであり、成熟ジスルフィドリンクしたリシンが植物細胞内のプロテインボディ内に貯蔵される。Ａ鎖はプロリシンにおいて不活性であり（O’Hare,M.らのFEBS Lett.２７３：２００−２０４（１９９０））、ジスルフィド結合した成熟リシンにおいては不活性であるRichardson,P.T.らのFEBS Lett.２５５：１５−２０（１９８９））。唐胡麻のリボソームはそれ自体、リシンのＡ鎖による不活性化の影響を受けやすいが、Ｂ鎖の認識を許容する細胞表面ガラクトースがないのでＡ鎖は細胞内へ再侵入することができない。Ａ鎖の放出および標的細胞の細胞質内での活性化の正確なメカニズムはわかっていない（Lord,J.M.のFASAB Journal８：２０１−２０８（１９９４））。しかし、活性化が行なわれるためには、Ａ鎖とＢ鎖の間のジスルフィド結合が弱められ、それによってサブユニット間の結合が破壊されなければならないことはわかっている。
ジフテリア毒素は、Corynebacterium diphtheriaeによって産生される、分子量５８ｋＤの５３５アミノ酸のポリペプチドである（Greenfield,L.らのProc.Natl.Acad.Sci.USA８０：６８５３−６８５７（１９８３）；Pastan,I.らのAnnu.Rev.Biochem.６１：３３１−３５４（１９９２）；Collier,R.J.およびKandel,J.のJ.Biol.Chem.２４６：１４９６−１５０３（１９７１））。それは２つの機能ドメインからなる一本鎖ポリペプチドとして分泌される。プロリシンと同様に、Ｎ−末端ドメイン（Ａ鎖）が毒性部位を持ち、Ｃ−末端ドメイン（Ｂ鎖）が細胞に結合することができ、毒素のエンドサイトーシスを促進する。逆に、ジフテリア毒素の細胞毒性のメカニズムは、ＥＦ−２のＡＤＰ−リボシル化およびそれによるタンパク質合成の遮断ならびに細胞死の誘導に基づいている。ジフテリア毒素の２つの機能ドメインはアルギニンリッチペプチド配列ならびにジスルフィド結合によって結合している。ジフテリア毒素が細胞に侵入するとただちに、トリプシン様酵素によってアルギニンリッチペプチドリンカーが切断され、ジスルフィド結合（Ｃｙｓ１８６−２０１）が弱くなる。続いて、上記リシンで述べた経路と実質的に同様に細胞毒ドメインが細胞質ゾルにトランスロケーションされ、リボソーム阻害および細胞毒性が誘発される。
シュードモナスエキソトキシンもまたPseudomonas aeruginosaによって分泌される６６ｋＤの一本鎖毒素タンパク質であり、ジフテリア毒素と同様のメカニズムの細胞毒性をもつ（Pastan,I.らAnnu.Rev.Biochem.６１：３３１−３５４（１９９２）；Ogata,M.らのJ.Biol.Chem.２６７：２５３９６−２５４０１（１９９２）；Vagli,M.L.らのInfect.Immunol.１６：３５３−３６１（１９７７））。シュードモナスエキソトキシンは３つの結合した機能ドメインからなる。第１のドメインＩａ（１−２５２アミノ酸）は細胞結合および毒素エンドサイトーシスに関与し、第２のドメインＩＩ（アミノ酸２５３−３６４）は、細胞質内粒子からの毒素トランスロケーションに関与し、第３のドメインＩＩＩ（アミノ酸４００−６１３）は、タンパク質合成阻害および細胞毒性に関与する。シュードモナスエキソトキシンが細胞に侵入すると、細胞質ない粒子における第２のドメインのポリペプチド配列のタンパク質分解的切断（Ａｒｇ２７９の近傍）およびジスルフィド結合（Ｃｙｓ２６５−２８７）の衰弱の両方によって、細胞毒性ドメインの放出が誘発される。シュードモナスエキソトキシンにおける毒素トランスロケーションドメインが構造的に別のものであること以外は、細胞毒性への全経路は本質的に、ジフテリア毒素のものと類似している。
細胞毒性および細胞結合／毒性トランスロケーションに対する別の機能ドメインをもつ他の毒素として、アブリン、モデシンおよびボルケンシンがある（Sandvig,K.らのBiochem.Soc.Trans.２１：７０７−７１１（１９９３））。シガ毒素およびコレラ毒素などの幾つかの毒素もまた、受容体結合およびエンドサイトーシスに関与する複数のポリペプチド鎖をもつ。
リシン遺伝子は、クローニングされ、配列決定されており、Ａ鎖およびＢ鎖のＸ線結晶構造は、（Ruteber,E.らのProteins１０：２４０−２５０（１９９１）；Halling,K.らのNucleic Acids Res.１３：８０１９（１９８５））に記載されている。同様に、ジフテリア毒素およびシュードモナスエキソトキシンの遺伝子もまたクローニングされ、配列決定されており、毒素タンパク質の三次元構造は解明され、（Columblatti,M.らのJ.Biol.Chem.２６１：３０３０−３０３５（１９８６）；Gray,G.L.らのProc.Acad.Sci.USA８１：２６４５−２６４９（１９８４）；Greenfield,L.らのProc.Acad.Sci.USA８０：６８５３−６８５７（１９８３）；Collier,R.J.らのJ.Biol.Chem.２５７：５２８３−５２８５（１９８２））に記載されている。
哺乳類レトロウイルス、特に後天性免疫不全症候群（エイズ）を阻害する細菌および植物毒素の能力が研究されている。シュードモナスエキソトキシンＡおよびジフテリア毒素のサブユニットＡといったような細菌毒素；リシンなどの二本鎖リボソーム阻害性タンパク質およびトリコサンチンおよびアメリカヤマゴボウ抗ウイルス性タンパク質などの一本鎖リボソーム阻害性タンパク質が、ＨＩＶ感染細胞の排除に使用されている（OlsonらのAIDS Res.and Human Retroviruses７：１０２５−１０３０（１９９１））。作用の特異性の欠如とともに、この様な毒素の哺乳類細胞に対する毒性の強さは、イムノトキシンなどの毒素を配合する医薬の発達に対する主要な問題を提起する。
それらの強い毒性ゆえに、感染または腫瘍細胞または組織を特異的に破壊または阻害するための治療剤としてリシンベースのイムノトキシンを作製することに興味がもたれている（VitettaらのScience２３８：１０９８−１１０４（１９８７））。イムノトキシンは、モノクローナル抗体または成長因子などの特異的細胞結合成分と毒素の複合体であり、２つのタンパク質成分は共有的に結合している。一般に、これらの成分は化学的にカップリングしている。しかし、結合はペプチド結合であってもジスルフィド結合であってもよい。抗体は、特異的抗原を提示している細胞タイプに毒素を導き、それによって天然の毒素では不可能であった特異的作用が提供される。イムノトキシンは完全なリシン分子（すなわち、両方の鎖を含む）およびリシンのＡ鎖単独の両方において作製されている（SpoonerらのMol.Immunol.３１：１１７−１２５（１９９４））。
リシンダイマーを用いて作製されたイムノトキシン（ＩＴ−Ｒｓ）は、Ａ鎖単独を用いて作製されたもの（ＩＴ−Ａｓ）よりも強力な毒素である。強化されたＩＴ−Ｒｓの毒性は、標的細胞の細胞表面への結合および細胞質ゾル内コンパートメントへのＡ鎖のトランスロケーションというＢ鎖の２つの役割を演じると考えられる（VitettaらのScience２３８：１０９８−１１０４（１９８７）；VitettaおよびThorpeのSeminars in Cell Biology２：４７−５８（１９９１））。しかし、これらの複合体におけるＢ鎖の存在は、非標的細胞へのイムノトキシンの侵入も促進する。Ｂ鎖はほとんどの細胞に存在するＮ−結合炭水化物に関連するガラクトースに非特異的に結合するので、少量のＢ鎖でさえも、細胞結合成分の特異性を損ねる。ＩＴ−ＡｓはＩＴ−Ｒｓよりも特異的であり、安全である。しかし、Ｂ鎖がないと、Ａ鎖の毒性が非常に小さくなってしまう。ＩＴ−ＲｓとくらべてＩＴ−Ａｓはその毒性の低さゆえに、患者に対し、大量投与しなければならない。大量投与は、患者において、しばしば免疫応答および中和抗体の産生を引き起こす（VitettaらのScience２３８：１０９８−１１０４（１９８７）。Ａ鎖が複合体から標的細胞の細胞質へ放出されないので、ＩＴ−ＡｓおよびＩＴ−Ｒｓの両方ともが毒性の低下という問題点をもつことになる。
多数のイムノトキシンが、腫瘍細胞表面の抗原および免疫系の細胞を認識するように設計されている（PastanらのAnnals New York Academy of Sciences７５８：３４５−３５３（１９９５））。このようなイムノトキシンの使用における主たる問題点は、抗体成分がそのメカニズムのみを標的化し、標的抗原がしばしば非標的細胞に見られることである（VitettaらのImmunology１４：２５２−２５９（１９９３）。また、適当な特異的細胞結合成分の作製にも問題がある。たとえば、標的細胞に対して特異的な抗原は、入手可能ではなく、多くの潜在的標的細胞および感染生物は免疫認識を避けるためにその抗原的構成をすばやく変更することができる。リシンなどの毒性の高いタンパク質では、イムノトキシンの特異性の欠如がそれらの癌および感染性疾患の治療剤としての有用性を厳しく制限する。
毒素の細胞毒性成分および細胞結合成分の間の分子内プロテアーゼ切断部位を挿入することにより、天然の毒素が活性化される経路を模倣することができる。欧州特許出願第４６６６２２２号には、Ｘａ因子、トロンビンまたはコラゲナーゼといったような細胞外血液酵素で切断する事により,活性体に変換されうるトウモロコシ誘導プロタンパク質の使用が記載されている。Garred,O.らJ.Biol.Chem.２７０：１０８１７−１０８２１（１９９５）には、細胞毒性Ａ鎖と細胞結合Ｂユニットのペンタマー（pentamer）の間のトリプシン感受性結合を切断することによる、シガ毒素を活性化するための遍在性カルシウム依存セリンプロテアーゼ、フリンの使用が記載されている。WestbyらのBioconjugate Chem.３：３７５−３８１（１９９２）には、特異的細胞結合成分およびリンカー配列内のＸａ因子に特異的なプロテアーゼ感受性切断部位をもつプロリシンを有する融合タンパク質が記載されている。O’Hare,M.らのFEBS Lett.２７３：２００−２０４（１９９０）にも、トリプシン感受性切断部位で結合したＲＴＡとスタフィロコッカスタンパク質Ａの組換え融合タンパク質が記載されている。これらのアプローチに用いた細胞外プロテアーゼの遍在性という性質を考慮すると、毒素先駆体またはイムノトキシンのこのような人工的活性化は、細胞毒素活性化のためのメカニズムを与えることはなく、標的特異性および細胞結合成分に対する逆免疫反応という問題点が残る事になる
結合鎖と毒性鎖を結合するタンパク質上の分子内プロテアーゼ切断部位の挿入というアプローチのバリエーションのひとつにおいて、Leppla,S.H.らのBacterial Protein Toxins zbl.bakt.suppl.２４：４３１−４４２（１９９４）は、Bacillus anthracisによって産生される保護抗原（ＰＡ）天然の切断部位を特別のプロテアーゼを含む細胞によって認識される切断部位と置換することを示唆している。ＰＡは、認識し、結合し、それによって、Bacillus anthracisによって産生される致死因子（ＬＦ）および浮腫毒素（ＥＴ）のインターナリゼーションを補佐する。しかし、このアプローチは、修飾されたＰＡが特異的プロテアーゼによって活性化されうる細胞内にすべて局在化しているＬＦ、あるいはＥＴおよびＰＡの入手可能性に完全に依存している。このアプローチは、細胞内毒素活性化のメカニズムを付与せず、標的細胞へのインターナリゼーションのために十分な量の毒素を保証するという問題点が現れる。
Panchel,R.G.らのNature Biotechnology１４：８５２−８５７（１９９６）には、細胞外腫瘍関連プロテアーゼによるスタフィロコッカス誘導ポア形成毒素、α−ヘモリシンのインビトロ活性化が記載されている。該プロテアーゼによるα−ヘモリシンの人工的活性化が報告されたが、標的細胞の破壊におけるα−ヘモリシンの実際の活性および実用性は実証されなかった。
ヘモリシンは、タンパク質の合成を阻害しないが、３ｋＤまでの分子を漏出させることにより、生きている細胞のイオンバランスを妨害するチャンネルとして作用するヘプタマー膜貫通ポアである。α−ヘモリシン活性化ドメインは標的細胞の外側に位置していると思われる（細胞外プロテアーゼによる活性化より）。開示されたヘモリシン先駆体におけるトリガーメカニズムは、２つの別の機能ドメインの細胞内タンパク質分解的切断を含んでいない。また、α−ヘモリシン活性化に用いたプロテアーゼは、細胞外プロテアーゼから遍在的に分泌され、毒素活性化は、疾患細胞の近くにおける活性化に制限されない。このような広範囲の毒素の活性化からは、標的特異性は得られず、全身的毒性により、療剤としてのα−ヘモリシン毒素の有用性が制限されることになる。
悪性度、ウイルス感染および寄生虫感染に特異的に関連する種々のプロテアーゼが同定され、記載されている。たとえば、カテプシンは、セリン、システインまたはアスパラギン酸エンドペプチダーゼおよびエキソペプチダーゼのファミリーであり、癌の転移において第１の役割を演じることに関与している（Schwarts,M.K.のClin.Chim.Acta.２３７：６７−７８（１９９５）；Spiess,E.らのJ.Histochem.Cystochem.４２：９１７−９２９（１９９４）；Scarborough,P.E.らのProtein Sci.２：２６４−２７６（１９９３）；Sloane,B.F.らのProc.Natl.Acad.Sci.USA８３：２４８３−２４８７（１９８６）；Mikkelsen,T.らのJ.Neurosurge８３：２８５−２９０（１９９５）。マトリックスメタロプロテイナーゼ類（ＭＭＰ類またはマトリクシン類）は、コラゲナーゼ、マトリリシン、ストロメリシン、ゲラチナーゼおよびマクロファージエラスターゼからなる亜鉛依存性プロテイナーゼである（Krane,S.M.のAnn.N.Y.Acad.Sci.７３２：１−１０（１９９４）；Woessner,J.F.のAnn.N.Y.Acad.Sci.７３２：１１−２１（１９９４）；Carvalho,K.らのBiochem.Biophys.Res.Comm.１９１：１７２−１７９（１９９３）；Nakano,A.らのJ.of Neurosurge,８３：２９８−３０７（１９９５）；Peng,K-WらのHuman Gene Therapy８：７２９−７３８（１９９７）；More,D.H.らのGynaecologic Oncology６５：７８−８２（１９９７））。これらのプロテアーゼは病理学的アマトリクシンリモデリングに関与している。正常な生理学的条件下では、マトリクシン活性の制御は、遺伝子発現レベルで生み出されている。酵素活性もまたメタロプロテイナーゼの組織インヒビター（ＴＩＭＰ）によってストリンジェントリーにコントロールされている（Murphy,G.らのAnn.N.Y.Acad.Sci.７３２：３１−４１（１９９４））。ＭＭＰ遺伝子の発現が、炎症性疾患（リューマチ性関節炎）および悪性度において活性化されることが報告されている。
マラリアでは、寄生虫セリンおよびアスパラギン酸プロテアーゼが、Plasmodium寄生虫の宿主赤血球への侵入および赤血球内マラリアによるヘモグロビン異化作用に関与している（O’Dea,K.P.らのMol.Biochem.Parasitol.７２：１１１−１１９（１９９５）；Blackman,M.J.らのMol.Biochem.Parasitol.６２：１０３−１１４（１９９３）；Cooper,J.A.らのMol.Biochem.Parasitol.５６：１５１−１６０（１９９２）；Goldberg,D.E.らのJ.Exp.Med.１７３：９６１−９６９（１９９１））。Schistosoma mansoniもまた病原性寄生虫であり、住血吸虫病を引き起こす。エラスチン分解性プロテイナーゼは、この特別な寄生虫の発病性に特に関与している（McKerrow,J.H.らのJ.Biol.Chem.２６０：３７０３−３７０７（１９８５））。
Welch,A.R.らのProc.Natl.Acad.Sci.USA８８：１０７９７−１０８００（１９９１）には、ヒトサイトメガロウイルス、ヒトヘルペスウイルス、エプスタイン−バールウイルス、水痘−帯状疱疹ウイルスＩおよび感染性喉頭気管炎ウイルスに特に関連する一連のウイルスプロテアーゼが記載されている。これらのプロテアーゼは、類似した基質特異性をもち、カプシド組立ておよびウイルス成熟の際に構造改変を行うウイルス骨格タンパク質において不可欠な役割を演じる。また、ヒトＴ細胞白血球ウイルス（Blaha,I.らのFEBS Lett.３０９：３８９−３９３（１９９２）；Pettit,S.C.らのJ.Biol.Chem.２６６：１４５３９−１４５４７（１９９１））、肝炎ウイルス（Hirowatari,Y.らのAnal.Biochem.２２５：１１３−１２０（１９９５）；Hirowatari,Y.らのArch.Virol.１３３：３４９−３５６（１９９３）；Jewell,D.A.らのBiochemistry３１：７８６２−７８６９（１９９２））、ポリオウイルス（Weidner,J.R.らのArch.Biochem.Biophys.２８６：４０２−４０８（１９９１））およびヒトライノウイルス（Long,A.C.らのFEBS Lett.２５８：７５−７８（１９８９））において、同様の機能をもつ他のウイルスプロテアーゼがそれぞれ立証されている。
カンジダ属イーストは、エイズ患者における大部分の日和見感染の原因となる二相性の菌である（Holmberg,K.およびMyer,R.のScand.J. Infect.Dis.１８：１７９−１９２（１９８６））。アスパラギン酸プロテアーゼは、Candida albican、Candida tropicalisおよびCandida parapsilosisなどのカンジダ属のおびただしい伝染性の強い菌株に特に関連性があり（Abad-Zapatero,C.らのProtein Sci.５：６４０−６５２（１９９６）；Cutfield,S.M.らのBiochemistry３５：３９８−４１０（１９８５）；Ruchel,R.らのZentralbl.Bakteriol.Mikrobiol Hyg.I Abt.Orig.A.２５５：５３７−５４８（１９８３）；Remold,H.らのBiochim.Biophys.Acta１６７：３９９−４０６（１９６８））、これらの酵素の濃度は、その菌株の致死性と関連している（Schreiber,B.らのDiagn.Microbiol.Infect.Dis.３：１−５（１９８５））。
発明の簡単な説明
本発明は、疾患細胞に対して特異的に毒性があるが、特定の細胞結合成分における作用の特異性の面で依存性がない、新規な組換え毒性タンパク質に関する。本発明の組換えタンパク質は、合成リンカーによってＢ鎖に結合するリシン様毒素をもつＡ鎖を有し、特定の疾患に罹っている細胞または組織に局在するプロテアーゼによって特異的に切断されて毒性Ａ鎖を放出することによって疾患細胞または組織を選択的に阻害または破壊する。本明細書で用いる語句「疾患細胞」とは、癌に冒されている細胞または菌、レトロウイルスなどのウイルスまたは寄生虫に感染した細胞を包含する。
本発明の組換え毒性タンパク質を用いる毒素ターゲッティングは、多くのＤＮＡウイルスが免疫的破壊を逃れるために宿主細胞の輸送メカニズムを利用するという事実を利用するものである。これは、宿主の小胞体から細胞質へのＩ型主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子のレトログレードトランスロケーションを増強することによって達成される（Bonifacino,J.S.のNature３８４：４０５−４０６（１９９６）；Wiertz,E.J.らのNature３８４：４３２−４３８（１９９６））。ウイルスによる疾患細胞内のレトログレード輸送を促進すると、本発明の組換え毒性タンパク質のトランスサイトーシスおよび細胞毒性を増強することができ、それによって非特異的細胞毒性が低減化され、生産物の総合的安全性を改良される。
本発明の組換え毒性タンパク質は、Ｔ細胞およびＢ細胞リンパ球増殖疾患、卵巣癌、膵臓癌、頭部および頚部癌、扁平上皮癌、胃腸癌、胸部癌、前立腺癌、非小細胞癌といったような種々の形態の癌、マラリアおよびサイトメガロウイルス、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、ヒトライノウイルス、感染性喉頭気管炎ウイルス、ポリオウイルスまたは水痘−帯状疱疹ウイルスの感染に関連した多様なウイルス性疾患状態などの疾患の治療に用いる。
ひとつの態様において、本発明は、リシン様毒素をもつＡ鎖、リシン様毒素をもつＢ鎖およびＡ鎖とＢ鎖を結合する異種リンカーアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列をもつ、精製および単離された核酸を提供する。リンカー配列は、リシン様毒素の天然のリンカー配列ではなく、疾患特異的プロテアーゼに対する切断認識部位を含む合成非相同リンカー配列である。Ａ鎖および／またはＢ鎖はリシンのものである。
本発明のひとつの具体例において、切断認識部位は癌関連性プロテアーゼに対する切断認識部位である。特定の具体例において、リンカーアミノ酸配列は、カテプシンによって切断されるＳＬＬＫＳＲＭＶＰＮＦＮまたはＳＬＬＩＡＲＲＭＰＮＦＮ；エプスタイン−バールウイルスプロテアーゼによって切断されるＳＫＬＶＱＡＳＡＳＧＶＮまたはＳＳＹＬＫＡＳＤＡＰＤＮ；ＭＭＰ−３（ストロメリシン）によって切断されるＲＰＫＰＱＱＦＦＧＬＭＮ；ＭＭＰ−７（マトリリシン）によって切断されるＳＬＲＰＬＡＬＷＲＳＦＮ；ＭＭＰ−９によって切断されるＳＰＱＧＩＡＧＱＲＮＦＮ；サーモリシン様ＭＭＰによって切断されるＤＶＤＥＲＤＶＲＧＦＡＳＦＬ；マトリックスメタロプロテイナーゼ２（ＭＭＰ−２）によって切断されるＳＬＰＬＧＬＷＡＰＮＦＮ；カテプシンＬによって切断されるＳＬＬＩＦＲＳＷＡＮＦＮ；カテプシンＤによって切断されるＳＧＶＶＩＡＴＶＩＶＩＴ；マトリックスメタロプロテイナーゼ１（ＭＭＰ−１）によって切断されるＳＬＧＰＱＧＩＷＧＱＦＮ；ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーターによって切断されるＫＫＳＰＧＲＶＶＧＧＳＶ；膜型１マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＴ−ＭＭＰ）によって切断されるＰＱＧＬＬＧＡＰＧＩＬＧ；ストロメリシン３（またはＭＭＰ−１１）、サーモリシン、フィブロブラストコラゲナーゼおよびストロメリシン１によって切断されるＨＧＰＥＧＬＲＶＧＦＹＥＳＤＶＭＧＲＧＨＡＲＬＶＨＶＥＥＰＨＴ；マトリックスメタロプロテイナーゼ１３（コラゲナーゼ３）によって切断されるＧＰＱＧＬＡＧＱＲＧＩＶ；組織型プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）によって切断されるＧＧＳＧＱＲＧＲＫＡＬＥ；ヒト前立腺特異的抗原によって切断されるＳＬＳＡＬＬＳＳＤＩＦＮ；カリクレイン（ｈＫ３）によって切断されるＳＬＰＲＦＫＩＩＧＧＦＮ；好中球エラスターゼによって切断されるＳＬＬＧＩＡＶＰＧＮＦＮ；およびカルパイン（カルシウム活性化中性プロテアーゼ）によって切断されるＦＦＫＮＩＶＴＰＲＴＰＰである。
それぞれのリンカー配列を結合したリシンＡ鎖およびＢ鎖の核酸配列を図２Ｄ，３５Ｃ，３Ｄ，４Ｄ，５Ｄ，６Ｄ，１６Ｄ，１７Ｄ，３４Ｃ，３６Ｃ，３７Ｃ，３８Ｃ，３９Ｃ，４０Ｃ，４１Ｃ，４２Ｃ，４３Ｃ，４４Ｃ，４５Ｃ，４６Ｃおよび４７Ｃに示す。
他の具体例において、切断認識部位は、マラリア寄生虫、Plasmodium falciparumに関連するプロテアーゼに対する切断認識部位である。別の具体例において、リンカーアミノ酸配列は、ＱＶＶＱＬＱＮＹＤＥＥＤ；ＬＰＩＦＧＥＳＥＤＮＤＥ；ＱＶＶＴＧＥＡＩＳＶＴＭ；ＡＬＥＲＴＦＬＳＦＰＴＮまたはＫＦＰＱＤＭＬＮＩＳＱＨＱを含む。それぞれのリンカー配列を結合したリシンＡ鎖およびＢ鎖のヌクレオチド配列を図７Ｄ，８Ｄ，９Ｄ，１０Ｄおよび１１Ｄに示す。
他の具体例において、切断認識部位は、ウイルスプロテアーゼに対する切断認識部位である。配列Ｙ−Ｘ−Ｔ−Ａ−Ｚ（ここで、Ｘはバリンまたはロイシン、Ｙは極性アミノ酸およびＺはセリン、アスパラギンまたはバリンである）を含むリンカー配列が好ましい。特定の具体例において、リンカーアミノ酸配列は、ヒトサイトメガロウイルスプロテアーゼによって切断されるＳＧＶＶＮＡＳＣＲＬＡＮまたはＳＳＹＶＫＡＳＶＳＰＥＮ；１型単純ヘルペスウイルスプロテアーゼによって切断されるＳＡＬＶＮＡＳＳＡＨＶＮまたはＳＴＹＬＱＡＳＥＫＦＫＮ；ヒトヘルペスウイルスプロテアーゼによって切断されるＳＳＩＬＮＡＳＶＰＮＦＮ；水痘−帯状疱疹ウイルスプロテアーゼによって切断されるＳＱＤＶＮＡＶＥＡＳＳＮまたはＳＶＹＬＱＡＳＴＧＹＧＮ；または感染性喉頭気管炎ウイルスプロテアーゼによって切断されるＳＫＹＱＡＮＥＶＩＴＮを含む。それぞれのリンカー配列を結合したリシンＡ鎖およびＢ鎖のヌクレオチド配列を図１２Ｄ，１３Ｄ，１４Ｄ，１５Ｄ，１８Ｄ，１９Ｄ，２０Ｄおよび２２Ｄに示す。
別の具体例において、切断認識部位はＡ型肝炎ウイルスプロテアーゼに対する切断認識部位である。特定の具体例において、リンカーアミノ酸配列は、Ａ型肝炎ウイルスによって切断されるＳＥＬＲＴＱＳＦＳＮＷＮまたはＳＥＬＷＳＱＧＩＤＤＤＮを含む。それぞれのリンカー配列を結合したリシンＡ鎖およびＢ鎖のヌクレオチド配列を図２３Ｄまたは２４Ｄに示す。
別の具体例において、切断認識部位はＣ型肝炎ウイルスプロテアーゼに対する切断認識部位である。定の具体例において、リンカーアミノ酸配列は、Ｃ型肝炎ウイルスによって切断されるＤＬＥＶＶＴＳＴＷＶＦＮ、ＤＥＭＥＥＣＡＳＨＬＦＮ、ＥＤＶＶＣＣＳＭＳＹＦＮまたはＫＧＷＲＬＬＡＰＩＴＡＹを含む。それぞれのリンカー配列を結合したリシンＡ鎖およびＢ鎖のヌクレオチド配列を図３０Ｃ，３１Ｃ，３２Ｃおよび３３Ｃに示す。
別の具体例において、切断認識部位はカンジダ属菌プロテアーゼに対する切断認識部位である。定の具体例において、リンカーアミノ酸配列は、Candida asparticプロテアーゼによって切断されるＳＫＰＡＫＦＦＲＬＮＦＮ、ＳＫＰＩＥＦＦＲＬＮＦＮまたはＳＫＰＡＥＦＦＡＬＮＦＮを含む。それぞれのリンカー配列を結合したリシンＡ鎖およびＢ鎖のヌクレオチド配列を図２５Ｄに示す。
本発明はまた、本発明の核酸を組み込んだプラスミドを提供する。ひとつの具体例において、プラスミドは、図２Ａ，３Ａ，４Ａ，５Ａ，６Ａ，７Ａ，８Ａ，９Ａ，１０Ａ，１１Ａ，１２Ａ，１３Ａ，１４Ａ，１５Ａ，１６Ａ，１７Ａ，１８Ａ，１９Ａ，２０Ａ，２１Ａ，２２Ａ，２３Ａ，２４Ａまたは２５Ａに示す制限酵素地図をもつ。
他の具体例において、本発明は本発明の核酸を組み込んだバキュロウイルストランスファーベクターを提供する。特定の具体例において、本発明は、図１に示すＤＮＡ配列をもつバキュロウイルストランスファーベクターを提供する。
別の具体例において、本発明は、本発明の核酸を組み込んだバキュロウイルストランスファーベクターを提供する。特定の具体例において、本発明は、２Ｃ，３Ｃ，４Ｃ，５Ｃ，６Ｃ，７Ｃ，８Ｃ，９Ｃ，１０Ｃ，１１Ｃ，１２Ｃ，１３Ｃ，１４Ｃ，１５Ｃ，１６Ｃ，１７Ｃ，１８Ｃ，１９Ｃ，２０Ｃ，２１Ｃ，２２Ｃ，２３Ｃ，２４Ｃ，２５Ｃ，３０Ａ，３１Ａ，３２Ａ，３３Ａ，３４Ａ，３５Ａ，３６Ａ，３７Ａ，３８Ａ，３９Ａ，４０Ａ，４１Ａ，４２Ａ，４３Ａ，４４Ａ，４５Ａ，４６Ａまたは４７Ａに示す制限酵素地図もしくは図１に示すＤＮＡ配列をもつバキュロウイルストランスファーベクターを提供する。
別の態様において、本発明は、リシン様毒素をもつＡ鎖、リシン様毒素をもつＢ鎖およびＡ鎖とＢ鎖を結合する異種リンカーアミノ酸配列を含む組換えタンパク質であって、該リンカー配列が疾患特異的プロテアーゼ（癌、ウイルス、寄生虫または菌プロテアーゼなど）に対する切断認識部位を含むタンパク質を提供する。Ａ鎖および／またはＢ鎖はリシンのものである。ひとつの具体例において、切断認識部位は、前述した癌、ウイルスまたは寄生虫プロテアーゼに対する切断認識部位である。特定の具体例において、癌は、Ｔ細胞またはＢ細胞リンパ球増殖疾患である。他の特定の具体例において、ウイルスは、ヒトサイトメガロウイルス、エプスタイン−バールウイルス、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、ヒトライノウイルス、感染性喉頭気管炎ウイルス、ポリオウイルス、または水痘−帯状疱疹ウイルスＩである。別の特定の具体例において、寄生虫は、熱帯熱マラリア原虫である。
さらに別の態様において、本発明は、本発明の組換えタンパク質および医薬的に許容しうる担体、希釈剤または賦形剤を含む、哺乳類におけるカンジダ属などの菌感染の治療用医薬組成物を提供する。
さらに別の態様において、本発明は、それぞれ疾患特異的プロテアーゼを有する、癌またはウイルス、菌もしくは寄生虫感染などの疾患に冒された細胞を阻害または破壊する方法であって、疾患特異的プロテアーゼに対する切断認識部位を含む異種リンカー配列をもつ本発明組換えタンパク質を作製するステップおよび組換えタンパク質を細胞に投与するステップを特徴とする方法を提供する。ひとつの具体例において、癌は、Ｔ細胞およびＢ細胞リンパ球増殖疾患、卵巣癌、膵臓癌、頭部および頚部癌、扁平上皮癌、胃腸癌、胸部癌、前立腺癌、非小細胞癌である。他の具体例において、ウイルスは、ヒトサイトメガロウイルス、エプスタイン−バールウイルス、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、ヒトライノウイルス、感染性喉頭気管炎ウイルス、ポリオウイルス、または水痘−帯状疱疹ウイルスＩである。別の具体例において、寄生虫は、熱帯熱マラリア原虫である。
本発明はまた、有効量の１種または２種以上の本発明組換えタンパク質を投与することにより、それぞれ疾患特異的プロテアーゼを有する、癌またはウイルス、菌もしくは寄生虫感染などの疾患に細胞が冒されている哺乳類を治療する方法を提供する。
さらに、本発明は、それぞれ疾患特異的プロテアーゼをもつ癌またはウイルス、菌もしくは寄生虫感染疾患（ここで、疾患に冒されている細胞は疾患特異的プロテアーゼと関連する）に罹患している哺乳類を治療するための医薬組成物を製造する方法であって、リシン様毒素をもつＡ鎖、リシン様毒素をもつＢ鎖およびＡ鎖とＢ鎖を結合する異種リンカーアミノ酸配列（ここで、リンカー配列は疾患特異的プロテアーゼに対する切断認識配列を含む）をコードするヌクレオチド配列をもつ、精製および単離された核酸を作製するステップ；核酸を宿主細胞へ導入するステップ；宿主細胞内で核酸を発現させて、リシン様毒素をもつＡ鎖、リシン様毒素をもつＢ鎖およびＡ鎖とＢ鎖を結合する異種リンカーアミノ酸配列（ここで、リンカー配列は疾患特異的プロテアーゼに対する切断認識配列を含む）を含む組換えタンパク質を得るステップ；次いで、タンパク質を医薬的に許容しうる担体、希釈剤または賦形剤に懸濁するステップを特徴とする方法を提供する。
ひとつの具体例において、本発明は、それぞれ疾患特異的プロテアーゼをもつ癌またはウイルス、菌もしくは寄生虫感染疾患（ここで、疾患に冒されている細胞は疾患特異的プロテアーゼと関連する）に罹患している哺乳類を治療するための医薬組成物を製造する方法であって、プロテアーゼに対する切断認識部位を同定するステップ；リシン様毒素をもつＡ鎖、リシン様毒素をもつＢ鎖およびＡ鎖とＢ鎖を結合する異種リンカーアミノ酸配列（ここで、リンカー配列は疾患特異的プロテアーゼに対する切断認識配列を含む）を含む組換えタンパク質を作製するステップ；次いで、タンパク質を医薬的に許容しうる担体、希釈剤または賦形剤に懸濁するステップを特徴とする方法を提供する。
さらに別の態様において、本発明は、それぞれ疾患特異的プロテアーゼをもつ癌またはウイルス、菌もしくは寄生虫感染疾患（ここで、疾患に冒されている細胞は疾患特異的プロテアーゼと関連する）に罹患している哺乳類を治療するための、本発明組換えタンパク質および医薬的に許容しうる担体、希釈剤または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
本発明の組成物の他の特徴および利点は、以下に詳述する記載からさらに明らかになろう。しかし、該詳述する記載および本発明の好ましい具体例を示す特定の実施例は説明の目的でのみ示すものであり、本発明の範囲に属する種々の変更および改変は、この詳細な記載から当業者には明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
図面を参照することにより、本発明をさらに理解することができる。
図１は、バキュロウイルストランスファーベクターｐＶＬ１３９３のＤＮＡ配列である。
図２Ａは、ｐＡＰ−２１３構築物を作製するために用いたクローニング方策の概要である。
図２Ｂは、ｐＡＰ−２１３のカテプシンＢリンカー領域のヌクレオチド配列である。
図２Ｃは、カテプシンＢリンカー変異体のバキュロウイルストランスファーベクターへのサブクローニングである。
図２Ｄは、リシンおよびカテプシンＢリンカーを含むｐＡＰ−２１４インサートのＤＮＡ配列である。
図３Ａは、ｐＡＰ−２１５構築物を作製するために用いたクローニング方策の概要である。
図３Ｂは、ｐＡＰ−２１５のＭＭＰ−３リンカー領域のヌクレオチド配列である。
図３Ｃは、ＭＭＰ−３リンカー変異体のバキュロウイルストランスファーベクターへのサブクローニングである。
図３Ｄは、リシンおよびＭＭＰ−３リンカーを含むｐＡＰ−２１６インサートのＤＮＡ配列である。
図４Ａは、ｐＡＰ−２１７構築物を作製するために用いたクローニング方策の概要である。
図４Ｂは、ｐＡＰ−２１７のＭＭＰ−７リンカー領域のヌクレオチド配列である。
図４Ｃは、ＭＭＰ−７リンカー変異体のバキュロウイルストランスファーベクターへのサブクローニングである。
図４Ｄは、リシンおよびＭＭＰ−７リンカーを含むｐＡＰ−２１８インサートのＤＮＡ配列である。
図５Ａは、ｐＡＰ−２１９構築物を作製するために用いたクローニング方策の概要である。
図５Ｂは、ｐＡＰ−２１９のＭＭＰ−９リンカー領域のヌクレオチド配列である。
図５Ｃは、ＭＭＰ−９リンカー変異体のバキュロウイルストランスファーベクターへのサブクローニングである。
図５Ｄは、リシンおよびＭＭＰ−９リンカーを含むｐＡＰ−２２０インサートのＤＮＡ配列である。
図６Ａは、ｐＡＰ−２２１構築物を作製するために用いたクローニング方策の概要である。
図６Ｂは、ｐＡＰ−２２１のサーモリシン様ＭＭＰリンカー領域のヌクレオチド配列である。
図６Ｃは、サーモリシン様ＭＭＰリンカー変異体のバキュロウイルストランスファーベクターへのサブクローニングである。
図６Ｄは、リシンおよびサーモリシン様ＭＭＰリンカーを含むｐＡＰ−２２２インサートのＤＮＡ配列である。
図７Ａは、ｐＡＰ−２２３構築物を作製するために用いたクローニング方策の概要である。
図７Ｂは、ｐＡＰ−２２３の熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）Ａリンカー領域のヌクレオチド配列である。
図７Ｃは、熱帯熱マラリア原虫Ａリンカー変異体のバキュロウイルストランスファーベクターへのサブクローニングである。
図７Ｄは、リシンおよび熱帯熱マラリア原虫Ａリンカーを含むｐＡＰ−２２４インサートのＤＮＡ配列である。
図８Ａは、ｐＡＰ−２２５構築物を作製するために用いたクローニング方策の概要である。
図８Ｂは、ｐＡＰ−２２５の熱帯熱マラリア原虫Ｂリンカー領域のヌクレオチド配列である。
図８Ｃは、熱帯熱マラリア原虫Ｂリンカー変異体のバキュロウイルストランスファーベクターへのサブクローニングである。
図８Ｄは、リシンおよび熱帯熱マラリア原虫Ｂリンカーを含むｐＡＰ−２２６インサートのＤＮＡ配列である。
図９Ａは、ｐＡＰ−２２７構築物を作製するために用いたクローニング方策の概要である。
図９Ｂは、ｐＡＰ−２２７の熱帯熱マラリア原虫Ｃリンカー領域のヌクレオチド配列である。
図９Ｃは、熱帯熱マラリア原虫Ｃリンカー変異体のバキュロウイルストランスファーベクターへのサブクローニングである。
図９Ｄは、リシンおよび熱帯熱マラリア原虫Ｃリンカーを含むｐＡＰ−２２８インサートのＤＮＡ配列である。
図１０Ａは、ｐＡＰ−２２９構築物を作製するために用いたクローニング方策の概要である。
図１０Ｂは、ｐＡＰ−２２９の熱帯熱マラリア原虫Ｄリンカー領域のヌクレオチド配列である。
図１０Ｃは、熱帯熱マラリア原虫Ｄリンカー変異体のバキュロウイルストランスファーベクターへのサブクローニングである。
図１０Ｄは、リシンおよび熱帯熱マラリア原虫Ｄリンカーを含むｐＡＰ−２３０インサートのＤＮＡ配列である。
図１１Ａは、ｐＡＰ−２３１構築物を作製するために用いたクローニング方策の概要である。
図１１Ｂは、ｐＡＰ−２３１の熱帯熱マラリア原虫Ｅリンカー領域のヌクレオチド配列である。
図１１Ｃは、熱帯熱マラリア原虫Ｅリンカー変異体のバキュロウイルストランスファーベクターへのサブクローニングである。
図１１Ｄは、リシンおよび熱帯熱マラリア原虫Ｅリンカーを含むｐＡＰ−２３２インサートのＤＮＡ配列である。
図１２Ａは、ｐＡＰ−２３３構築物を作製するために用いたクローニング方策の概要である。
図１２Ｂは、ｐＡＰ−２３３のＨＳＶ−Ａリンカー領域のヌクレオチド配列である。
図１２Ｃは、ＨＳＶ−Ａリンカー変異体のバキュロウイルストランスファーベクターへのサブクローニングである。
図１２Ｄは、リシンおよびＨＳＶ−Ａリンカーを含むｐＡＰ−２３４インサートのＤＮＡ配列である。
図１３Ａは、ｐＡＰ−２３５構築物を作製するために用いたクローニング方策の概要である。
図１３Ｂは、ｐＡＰ−２３５のＨＳＶ−Ｂリンカー領域のヌクレオチド配列である。
図１３Ｃは、ＨＳＶ−Ｂリンカー変異体のバキュロウイルストランスファーベクターへのサブクローニングである。
図１３Ｄは、リシンおよびＨＳＶ−Ｂリンカーを含むｐＡＰ−２３６インサートのＤＮＡ配列である。
図１４Ａは、ｐＡＰ−２３７構築物を作製するために用いたクローニング方策の概要である。
図１４Ｂは、ｐＡＰ−２３７のＶＺＶ−Ａリンカー領域のヌクレオチド配列である。
図１４Ｃは、ＶＺＶ−Ａリンカー変異体のバキュロウイルストランスファーベクターへのサブクローニングである。
図１４Ｄは、リシンおよびＶＺＶ−Ａリンカーを含むｐＡＰ−２３８インサートのＤＮＡ配列である。
図１５Ａは、ｐＡＰ−２３９構築物を作製するために用いたクローニング方策の概要である。
図１５Ｂは、ｐＡＰ−２３９のＶＺＶ−Ｂリンカー領域のヌクレオチド配列である。
図１５Ｃは、ＶＺＶ−Ｂリンカー変異体のバキュロウイルストランスファーベクターへのサブクローニングである。
図１５Ｄは、リシンおよびＶＺＶ−Ｂリンカーを含むｐＡＰ−２４０インサートのＤＮＡ配列である。
図１６Ａは、ｐＡＰ−２４１構築物を作製するために用いたクローニング方策の概要である。
図１６Ｂは、ｐＡＰ−２４１のＥＢＶ−Ａリンカー領域のヌクレオチド配列である。
図１６Ｃは、ＥＢＶ−Ａリンカー変異体のバキュロウイルストランスファーベクターへのサブクローニングである。
図１６Ｄは、リシンおよびＥＢＶ−Ａリンカーを含むｐＡＰ−２４２インサートのＤＮＡ配列である。
図１７Ａは、ｐＡＰ−２４３構築物を作製するために用いたクローニング方策の概要である。
図１７Ｂは、ｐＡＰ−２４３のＥＢＶ−Ｂリンカー領域のヌクレオチド配列である。
図１７Ｃは、ＥＢＶ−Ｂリンカー変異体のバキュロウイルストランスファーベクターへのサブクローニングである。
図１７Ｄは、リシンおよびＥＢＶ−Ｂリンカーを含むｐＡＰ−２４４インサートのＤＮＡ配列である。
図１８Ａは、ｐＡＰ−２４５構築物を作製するために用いたクローニング方策の概要である。
図１８Ｂは、ｐＡＰ−２４５のＣＭＶ−Ａリンカー領域のヌクレオチド配列である。
図１８Ｃは、ＣＭＶ−Ａリンカー変異体のバキュロウイルストランスファーベクターへのサブクローニングである。
図１８Ｄは、リシンおよびＣＭＶ−Ａリンカーを含むｐＡＰ−２４６インサートのＤＮＡ配列である。
図１９Ａは、ｐＡＰ−２４７構築物を作製するために用いたクローニング方策の概要である。
図１９Ｂは、ｐＡＰ−２４７のＣＭＶ−Ｂリンカー領域のヌクレオチド配列である。
図１９Ｃは、ＣＭＶ−Ｂリンカー変異体のバキュロウイルストランスファーベクターへのサブクローニングである。
図１９Ｄは、リシンおよびＣＭＶ−Ｂリンカーを含むｐＡＰ−２４８インサートのＤＮＡ配列である。
図２０Ａは、ｐＡＰ−２４９構築物を作製するために用いたクローニング方策の概要である。
図２０Ｂは、ｐＡＰ−２４９のＨＨＶ−６リンカー領域のヌクレオチド配列である。
図２０Ｃは、ＨＨＶ−６リンカー変異体のバキュロウイルストランスファーベクターへのサブクローニングである。
図２０Ｄは、リシンおよびＨＨＶ−６リンカーを含むｐＡＰ−２５０インサートのＤＮＡ配列である。
図２１は、野生型リシンリンカーおよびｐＡＰ−２１３からｐＡＰ−２２０、ｐＡＰ−２４１からｐＡＰ−２４４に含まれる癌プロテアーゼ感受性アミノ酸リンカーのアミノ酸配列である。
図２２Ａは、ｐＡＰ−２５３構築物を作製するために用いたクローニング方策の概要である。
図２２Ｂは、ｐＡＰ−２５３のＩＬＶリンカー領域のヌクレオチド配列である。
図２２Ｃは、ＩＬＶリンカー変異体のバキュロウイルストランスファーベクターへのサブクローニングである。
図２２Ｄは、リシンおよびＩＬＶリンカーを含むｐＡＰ−２５４インサートのＤＮＡ配列である。
図２３Ａは、ｐＡＰ−２５７構築物を作製するために用いたクローニング方策の概要である。
図２３Ｂは、ｐＡＰ−２５７のＨＡＶ−Ａリンカー領域のヌクレオチド配列である。
図２３Ｃは、ＨＡＶ−Ａリンカー変異体のバキュロウイルストランスファーベクターへのサブクローニングである。
図２３Ｄは、リシンおよびＨＡＶ−Ａリンカーを含むｐＡＰ−２５８インサートのＤＮＡ配列である。
図２４Ａは、ｐＡＰ−２５５構築物を作製するために用いたクローニング方策の概要である。
図２４Ｂは、ｐＡＰ−２５５のＨＡＶ−Ｂリンカー領域のヌクレオチド配列である。
図２４Ｃは、ＨＡＶ−Ｂリンカー変異体のバキュロウイルストランスファーベクターへのサブクローニングである。
図２４Ｄは、リシンおよびＨＡＶ−Ｂリンカーを含むｐＡＰ−２５６インサートのＤＮＡ配列である。
図２５Ａは、ｐＡＰ−２５９構築物を作製するために用いたクローニング方策の概要である。
図２５Ｂは、ｐＡＰ−２５９のＣＡＮリンカー領域のヌクレオチド配列である。
図２５Ｃは、ＣＡＮリンカー変異体のバキュロウイルストランスファーベクターへのサブクローニングである。
図２５Ｄは、リシンおよびＣＡＮリンカーを含むｐＡＰ−２６０インサートのＤＮＡ配列である。
図２６は、野生型リシンリンカーおよびｐＡＰ−２２３からｐＡＰ−２３２に含まれる熱帯熱マラリア原虫プロテアーゼ感受性アミノ酸リンカーのアミノ酸配列である。
図２７は、野生型リシンリンカーおよびｐＡＰ−２３３からｐＡＰ−２４０、ｐＡＰ−２４５、ｐＡＰ−２４８、ｐＡＰ−２５３からｐＡＰ−２５８に含まれるウイルスプロテアーゼ感受性アミノ酸リンカーのアミノ酸配列である。
図２８は、野生型リシンリンカーおよびｐＡＰ−２５９からｐＡＰ−２６４に含まれるカンジダアスパラギン（aspartic）プロテアーゼ感受性アミノ酸リンカーのアミノ酸配列である。
図２９は、リシン様毒素変異体遺伝子を含むバキュロウイルストランスファーベクターを提供する別の突然変異誘発およびサブクローニング方策である。
図３０Ａは、ｐＡＰ−２６２構築物を作製するために用いたクローニング方策の概要である。
図３０Ｂは、ｐＡＰ−２６２のＨＣＶ−Ａリンカー領域のヌクレオチド配列である。
図３０Ｃは、ｐＡＰ−２６２インサートのＤＮＡ配列である。
図３０Ｄは、ＨＣＶ−Ａの突然変異体プレプロリシンリンカー領域と野生型のアミノ酸配列の比較。
図３１Ａは、ｐＡＰ−２６４構築物を作製するために用いたクローニング方策の概要である。
図３１Ｂは、ｐＡＰ−２６４のＨＣＶ−Ｂリンカー領域のヌクレオチド配列である。
図３１Ｃは、ｐＡＰ−２６４インサートのＤＮＡ配列である。
図３１Ｄは、ＨＣＶ−Ｂの突然変異体プレプロリシンリンカー領域と野生型のアミノ酸配列の比較。
図３２Ａは、ｐＡＰ−２６６構築物を作製するために用いたクローニング方策の概要である。
図３２Ｂは、ｐＡＰ−２６６のＨＣＶ−Ｃリンカー領域のヌクレオチド配列である。
図３２Ｃは、ｐＡＰ−２６６インサートのＤＮＡ配列である。
図３２Ｄは、ＨＣＶ−Ｃの突然変異体プレプロリシンリンカー領域と野生型のアミノ酸配列の比較。
図３３Ａは、ｐＡＰ−２６８構築物を作製するために用いたクローニング方策の概要である。
図３３Ｂは、ｐＡＰ−２６８のＨＣＶ−Ｄリンカー領域のヌクレオチド配列である。
図３３Ｃは、ｐＡＰ−２６８インサートのＤＮＡ配列である。
図３３Ｄは、ＨＣＶ−Ｄの突然変異体プレプロリシンリンカー領域と野生型のアミノ酸配列の比較。
図３４Ａは、ｐＡＰ−２７０構築物を作製するために用いたクローニング方策の概要である。
図３４Ｂは、ｐＡＰ−２７０のＭＭＰ−２リンカー領域のヌクレオチド配列である。
図３４Ｃは、ｐＡＰ−２７０インサートのＤＮＡ配列である。
図３４Ｄは、ＭＭＰ−２の突然変異体プレプロリシンリンカー領域と野生型のアミノ酸配列の比較。
図３５Ａは、ｐＡＰ−２７２構築物を作製するために用いたクローニング方策の概要である。
図３５Ｂは、ｐＡＰ−２７２のカテプシンＢ（サイト２）リンカー領域のヌクレオチド配列である。
図３５Ｃは、ｐＡＰ−２７２インサートのＤＮＡ配列である。
図３５Ｄは、カテプシンＢ（サイト２）の突然変異体プレプロリシンリンカー領域と野生型のアミノ酸配列の比較。
図３６Ａは、ｐＡＰ−２７４構築物を作製するために用いたクローニング方策の概要である。
図３６Ｂは、ｐＡＰ−２７４のカテプシンＬリンカー領域のヌクレオチド配列である。
図３６Ｃは、ｐＡＰ−２７４インサートのＤＮＡ配列である。
図３６Ｄは、カテプシンＬの突然変異体プレプロリシンリンカー領域と野生型のアミノ酸配列の比較。
図３７Ａは、ｐＡＰ−２７６構築物を作製するために用いたクローニング方策の概要である。
図３７Ｂは、ｐＡＰ−２７６のカテプシンＤリンカー領域のヌクレオチド配列である。
図３７Ｃは、ｐＡＰ−２７６インサートのＤＮＡ配列である。
図３７Ｄは、カテプシンＤの突然変異体プレプロリシンリンカー領域と野生型のアミノ酸配列の比較。
図３８Ａは、ｐＡＰ−２７８構築物を作製するために用いたクローニング方策の概要である。
図３８Ｂは、ｐＡＰ−２７８のＭＭＰ−１リンカー領域のヌクレオチド配列である。
図３８Ｃは、ｐＡＰ−２７８インサートのＤＮＡ配列である。
図３８Ｄは、ＭＭＰ−１の突然変異体プレプロリシンリンカー領域と野生型のアミノ酸配列の比較。
図３９Ａは、ｐＡＰ−２８０構築物を作製するために用いたクローニング方策の概要である。
図３９Ｂは、ｐＡＰ−２８０のウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーターリンカー領域のヌクレオチド配列である。
図３９Ｃは、ｐＡＰ−２８０インサートのＤＮＡ配列である。
図３９Ｄは、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーターの突然変異体プレプロリシンリンカー領域と野生型のアミノ酸配列の比較。
図４０Ａは、ｐＡＰ−２８２構築物を作製するために用いたクローニング方策の概要である。
図４０Ｂは、ｐＡＰ−２８２のＭＴ−ＭＭＰリンカー領域のヌクレオチド配列である。
図４０Ｃは、ｐＡＰ−２８２インサートのＤＮＡ配列である。
図４０Ｄは、ＭＴ−ＭＭＰの突然変異体プレプロリシンリンカー領域と野生型のアミノ酸配列の比較。
図４１Ａは、ｐＡＰ−２８４構築物を作製するために用いたクローニング方策の概要である。
図４１Ｂは、ｐＡＰ−２８４のＭＭＰ−１１リンカー領域のヌクレオチド配列である。
図４１Ｃは、ｐＡＰ−２８４インサートのＤＮＡ配列である。
図４１Ｄは、ＭＭＰ−１１の突然変異体プレプロリシンリンカー領域と野生型のアミノ酸配列の比較。
図４２Ａは、ｐＡＰ−２８６構築物を作製するために用いたクローニング方策の概要である。
図４２Ｂは、ｐＡＰ−２８６のＭＭＰ−１３リンカー領域のヌクレオチド配列である。
図４２Ｃは、ｐＡＰ−２８６インサートのＤＮＡ配列である。
図４２Ｄは、ＭＭＰ−１３の突然変異体プレプロリシンリンカー領域と野生型のアミノ酸配列の比較。
図４３Ａは、ｐＡＰ−２８８構築物を作製するために用いたクローニング方策の概要である。
図４３Ｂは、ｐＡＰ−２８８の組織型プラスミノーゲンアクチベーターリンカー領域のヌクレオチド配列である。
図４３Ｃは、ｐＡＰ−２８８インサートのＤＮＡ配列である。
図４３Ｄは、組織型プラスミノーゲンアクチベーターの突然変異体プレプロリシンリンカー領域と野生型のアミノ酸配列の比較。
図４４Ａは、ｐＡＰ−２９０構築物を作製するために用いたクローニング方策の概要である。
図４４Ｂは、ｐＡＰ−２９０のヒト前立腺特異的抗原リンカー領域のヌクレオチド配列である。
図４４Ｃは、ｐＡＰ−２９０インサートのＤＮＡ配列である。
図４４Ｄは、ヒト前立腺特異的抗原の突然変異体プレプロリシンリンカー領域と野生型のアミノ酸配列の比較。
図４５Ａは、ｐＡＰ−２９２構築物を作製するために用いたクローニング方策の概要である。
図４５Ｂは、ｐＡＰ−２９２のカリクレインリンカー領域のヌクレオチド配列である。
図４５Ｃは、ｐＡＰ−２９２インサートのＤＮＡ配列である。
図４５Ｄは、カリクレインの突然変異体プレプロリシンリンカー領域と野生型のアミノ酸配列の比較。
図４６Ａは、ｐＡＰ−２９４構築物を作製するために用いたクローニング方策の概要である。
図４６Ｂは、ｐＡＰ−２９４の好中球エラスターゼリンカー領域のヌクレオチド配列である。
図４６Ｃは、ｐＡＰ−２９４インサートのＤＮＡ配列である。
図４６Ｄは、好中球エラスターゼの突然変異体プレプロリシンリンカー領域と野生型のアミノ酸配列の比較。
図４７Ａは、ｐＡＰ−２９６構築物を作製するために用いたクローニング方策の概要である。
図４７Ｂは、ｐＡＰ−２９６のカルパインリンカー領域のヌクレオチド配列である。
図４７Ｃは、ｐＡＰ−２９６インサートのＤＮＡ配列である。
図４７Ｄは、カルパインの突然変異体プレプロリシンリンカー領域と野生型のアミノ酸配列の比較。
図４８は、カテプシンＢによるｐＰＡ−２１４の切断を示すブロットである。
図４９は、ＭＭＰ−９によるｐＰＡ−２２０の切断を示すブロットである。
図５０は、ｐＰＡ−２１４の活性化を示すブロットである。
図５１は、ｐＰＡ−２２０の活性化を示すブロットである。
図５２は、ＨＣＭＶによるｐＰＡ−２４８の切断を示すブロットである。
図５３は、ｐＰＡ−２４８の活性化を示すブロットである。
図５４は、ＨＡＶによるｐＰＡ−２５６の切断を示すブロットである。
図５５は、ｐＰＡ−２５６の活性化を示すブロットである。
図５６は、非消化ｐＡＰ−２１４およびカテプシンで消化されたｐＡＰ−２１４のＣＯＳ−１細胞に対する毒性を示す半対数グラフである。
図５７は、ＣＯＳ−１細胞における、ＭＭＰ−９で切断されたｐＡＰ−２２０の毒性と新たに解凍したｐＡＰ―２２０およびリシンの毒性の比較を示す半対数グラフである。
図５８は、ＭＭＰ−２によるｐＰＡ−２７０の切断を示すブロットである。
図５９は、ｐＰＡ−２７０の活性化を示すブロットである。
図６０は、ｔ−ＰＡによるｐＰＡ−２８８の切断を示すブロットである。
図６１は、ｐＰＡ−２８８の活性化を示すブロットである。
図６２は、好中球エラスターゼによるｐＰＡ−２９４の切断を示すブロットである。
図６３は、ｐＰＡ−２９４の活性化を示すブロットである。
図６４は、カルパインによるｐＰＡ−２９６の切断を示すブロットである。
図６５は、ｐＰＡ−２９６の活性化を示すブロットである。
図６６は、ＭＭＰ−２によるｐＰＡ−２２２の切断を示すブロットである。
図６７は、ｐＰＡ−２２２の活性化を示すブロットである。
発明の詳細な説明
本発明の核酸分子
これまでに述べたように、本発明は、リシン様毒素をもつＡ鎖、リシン様毒素をもつＢ鎖およびＡ鎖とＢ鎖を結合する異種リンカーアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列をもつ、精製および単離された核酸に関する。異種リンカー配列は、疾患特異的プロテアーゼ（ウイルスプロテアーゼ、寄生虫プロテアーゼ、癌関連プロテアーゼまたは菌プロテアーゼなど）に対する切断認識部位を含む。
本明細書で用いる語句“単離および精製された”とは、組換えＤＮＡ技術によって作製された場合には、細胞物質または培養培地を、化学的に合成された場合には、その先駆体あるいは他の化学物質を実質的に含まない核酸を意味する。
“単離および精製された”核酸は、該核酸が誘導された配列において、天然には、その核酸の隣にある配列（すなわち、核酸の５’および３’末端に位置する配列）もまた実質的に含まない。“核酸”は、ＤＮＡおよびＲＮＡを意味し、二本鎖または一本鎖のいずれもが含まれる。
“リンカー配列”とは、Ａ鎖がその毒性効果を発揮する（たとえば、触媒的に真核細胞のリボソームの翻訳を阻害する）のを不可能にするために、Ａ鎖とＢ鎖を結合している残基を含む本発明の核酸分子によってコードされる内部アミノ酸配列を意味する。異種とは、リンカー配列が、リシン様毒素またはその先駆体のＡ鎖またはＢ鎖に本来備わっている配列ではないことを意味する。しかし、リンカー配列はリシン様毒素のリンカー配列と同様の長さであることが好ましく、Ｂ鎖の細胞結合および細胞質内への輸送という役割を妨害すべきではない。リンカー配列を切断するとＡ鎖は活性化し、毒性を発揮するようになる。
Ａ鎖とＢ鎖の間の配列（リンカー領域）のみが異なる一連の変異体を作製するために、プレプロリシンｃＤＮＡクローンにおいて部位特異的突然変異誘発を行うことにより、本発明の核酸分子をクローン化する。プレプロリシン遺伝子の５’および３’末端の最末端に対応するオリゴヌクレオチドを合成し、遺伝子のＰＣＲ増幅に用いる。プレプロリシンのｃＤＮＡ（Lambらの，Eur. J. Biochem.１４５：２６６−２７０（１９８５））を用いて、数個のオリゴヌクレオチドプライマーが、プレプロリシンのオープンリーディングフレームの出発および停止コドンの隣になるように設計する。
リシン−９９またはリシン−１０９の上流およびリシン１７２９Ｃプライマーの下流を用い、VentＤＮＡポリメラーゼ（ニュー・イングランド・バイオラブズ）で標準的操作によってプレプロリシンｃＤＮＡを増幅する（SambrookらのMolecular Cloning：A Laboratory Manual、第２版（コールド・スプリング・ハーバー・プレス、１９８９））。次いで、プレプロリシンｃＤＮＡをコードする精製したＰＣＲフラグメントをＥｃｏＲＩ消化したｐBluescriptＩＩＳＫプラスミド（ストラタジーン）にライゲートし、コンピテントＸＬ１−ブルー細胞（ストラタジーン）の形質転換に用いる。推定のプレプロリシン遺伝子を含むクローニングしたＰＣＲ産物を完全ｃＤＮＡクローンのＤＮＡ配列で確認する。配列決定に用いたオリゴヌクレオチドプライマーの配列および位置を表１に示す。
Ａ鎖とＢ鎖の間の配列（リンカー領域）のみが異なる一連の変異体を作製するために、プレプロリシンｃＤＮＡクローンに部位特異的突然変異誘発を行う。野生型プレプロリシンリンカー領域を、図２１，２６，２７，２８および図３０−４７のＤに示す種々の疾患特異的プロテアーゼによって切断された異種リンカー配列で置き換える。これらの図に示したリンカー配列に、後記の配列番号を付与する。
変異体のリンカー領域は、癌、ウイルス、寄生虫または菌などに関連する疾患特異的プロテアーゼに対する切断認識配列をコードする。疾患特異的プロテアーゼ感受性リンカー変異体の作製に用いる突然変異誘発およびクローニングの方策の概略を図２−２０のＡおよび図２２―２５のＡに示す。最初のステップには、１セットの突然変異誘発プライマーを２つのフランキングプライマー、リシン−９９Ｅｃｏまたはリシン−１０９Ｅｃｏおよびリシン１７２９Ｃ ＰｓｔＩと組み合わせて用いるＤＮＡ増幅が含まれる。制限酵素切断ＰＣＲフラグメント（ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで切断）をゲル精製し、次いでｐBluescriptＳＫとライゲートする。ライゲーション反応を用いて、コンピテントＸＬ１−ブルー細胞（ストラタジーン）の形質転換を行う。プラスミドミニプレップＤＮＡの制限酵素切断によって組換えプラスミドを同定し、ＤＮＡ配列決定によって突然変異リンカー配列を確認する。この方策を実行して作製されたヌクレオチド配列およびアミノ酸配列に関し、以下の配列番号を付与する。
配列番号１は、バキュロウイルストランスファーベクターｐＶＬ１３９３の配列に用いる。
配列番号２は、ｐＡＰ−２１３のカテプシンＢリンカー領域のヌクレオチド配列である。
配列番号３は、ｐＡＰ−２１４のカテプシンＢリンカー領域のヌクレオチド配列である。
配列番号４は、ｐＡＰ−２１５のカテプシンＢリンカー領域のヌクレオチド配列である。
配列番号５は、リシンおよびＭＭＰ−３リンカーを含むｐＡＰ−２１６インサートのＤＮＡ配列である。
配列番号６は、ｐＡＰ−２１７のＭＭＰ−７リンカー領域のヌクレオチド配列である。
配列番号７は、リシンおよびＭＭＰ−７リンカーを含むｐＡＰ−２１８インサートのＤＮＡ配列である。
配列番号８は、ｐＡＰ−２１９のＭＭＰ−９リンカー領域のヌクレオチド配列である。
配列番号９は、リシンおよびＭＭＰ−９リンカーを含むｐＡＰ−２２０インサートのＤＮＡ配列である。
配列番号１０は、ｐＡＰ−２２１のサーモリシン様ＭＭＰリンカー領域のヌクレオチド配列である。
配列番号１１は、リシンおよびサーモリシン様ＭＭＰリンカーを含むｐＡＰ−２２２インサートのＤＮＡ配列である。
配列番号１２は、ｐＡＰ−２２３の熱帯熱マラリア原虫Ａリンカー領域のヌクレオチド配列である。
配列番号１３は、リシンおよび熱帯熱マラリア原虫Ａリンカーを含むｐＡＰ−２２４インサートのＤＮＡ配列である。
配列番号１４は、ｐＡＰ−２２５の熱帯熱マラリア原虫Ｂリンカー領域のヌクレオチド配列である。
配列番号１５は、リシンおよび熱帯熱マラリア原虫Ｂリンカーを含むｐＡＰ−２２６インサートのＤＮＡ配列である。
配列番号１６は、ｐＡＰ−２２７の熱帯熱マラリア原虫Ｃリンカー領域のヌクレオチド配列である。
配列番号１７は、リシンおよび熱帯熱マラリア原虫Ｃリンカーを含むｐＡＰ−２２８インサートのＤＮＡ配列である。
配列番号１８は、ｐＡＰ−２２９の熱帯熱マラリア原虫Ｄリンカー領域のヌクレオチド配列である。
配列番号１９は、リシンおよび熱帯熱マラリア原虫Ｄリンカーを含むｐＡＰ−２３０インサートのＤＮＡ配列である。
配列番号２０は、ｐＡＰ−２３１の熱帯熱マラリア原虫Ｅリンカー領域のヌクレオチド配列である。
配列番号２１は、リシンおよび熱帯熱マラリア原虫Ｅリンカーを含むｐＡＰ−２３２インサートのＤＮＡ配列である。
配列番号２２は、ｐＡＰ−２３３のＨＳＶ−Ａリンカー領域のヌクレオチド配列である。
配列番号２３は、リシンおよびＨＳＶ−Ａリンカーを含むｐＡＰ−２３４インサートのＤＮＡ配列である。
配列番号２４は、ｐＡＰ−２３５のＨＳＶ−Ｂリンカー領域のヌクレオチド配列である。
配列番号２５は、リシンおよびＨＳＶ−Ｂリンカーを含むｐＡＰ−２３６インサートのＤＮＡ配列である。
配列番号２６は、ｐＡＰ−２３７のＶＺＶ−Ａリンカー領域のヌクレオチド配列である。
配列番号２７は、リシンおよびＶＺＶ−Ａリンカーを含むｐＡＰ−２３８インサートのＤＮＡ配列である。
配列番号２８は、ｐＡＰ−２３９のＶＺＶ−Ｂリンカー領域のヌクレオチド配列である。
配列番号２９は、リシンおよびＶＺＶ−Ｂリンカーを含むｐＡＰ−２４０インサートのＤＮＡ配列である。
配列番号３０は、ｐＡＰ−２４１のＥＢＶ−Ａリンカー領域のヌクレオチド配列である。
配列番号３１は、リシンおよびＥＢＶ−Ａリンカーを含むｐＡＰ−２４２インサートのＤＮＡ配列である。
配列番号３２は、ｐＡＰ−２４３のＥＢＶ−Ｂリンカー領域のヌクレオチド配列である。
配列番号３３は、リシンおよびＥＢＶ−Ｂリンカーを含むｐＡＰ−２４４インサートのＤＮＡ配列である。
配列番号３４は、ｐＡＰ−２４５のＣＭＶ−Ａリンカー領域のヌクレオチド配列である。
配列番号３５は、リシンおよびＣＭＶ−Ａリンカーを含むｐＡＰ−２４６インサートのＤＮＡ配列である。
配列番号３６は、ｐＡＰ−２４７のＣＭＶ−Ｂリンカー領域のヌクレオチド配列である。
配列番号３７は、リシンおよびＣＭＶ−Ｂリンカーを含むｐＡＰ−２４８インサートのＤＮＡ配列である。
配列番号３８は、ｐＡＰ−２４９のＨＨＶ−６リンカー領域のヌクレオチド配列である。
配列番号３９は、リシンおよびＨＨＶ−６リンカーを含むｐＡＰ−２５０インサートのＤＮＡ配列である。
以下のｐＡＰタンパク質に含まれる癌プロテアーゼ感受性アミノ酸リンカーのアミノ酸配列の配列番号は、ｐＡＰ−２１３およびｐＡＰ−２１４（配列番号４０）；ｐＡＰ−２１５およびｐＡＰ−２１６（配列番号４１）；ｐＡＰ−２１７およびｐＡＰ−２１８（配列番号４２）；ｐＡＰ−２１９およびｐＡＰ−２２０（配列番号４３）；およびｐＡＰ−２２１およびｐＡＰ−２２２（配列番号４４）である。
癌プロテアーゼ感受性リンカーのアミノ酸配列の配列番号は、ｐＡＰ−２４１およびｐＡＰ−２４２（配列番号４５）；およびｐＡＰ−２４３およびｐＡＰ−２４４（配列番号４６）である。
配列番号４７は、ｐＡＰ−２５３のＩＬＶリンカー領域のヌクレオチド配列である。
配列番号４８は、リシンおよびＩＬＶ−６リンカーを含むｐＡＰ−２５４インサートのＤＮＡ配列である。
配列番号４９は、ｐＡＰ−２５７のＨＡＶ−Ａリンカー領域のヌクレオチド配列である。
配列番号５０は、リシンおよびＨＡＶ−Ａリンカーを含むｐＡＰ−２５８インサートのＤＮＡ配列である。
配列番号５１は、ｐＡＰ−２５５のＨＡＶ−Ｂリンカー領域のヌクレオチド配列である。
配列番号５２は、リシンおよびＨＡＶ−Ｂリンカーを含むｐＡＰ−２５６インサートのＤＮＡ配列である。
配列番号５３は、ｐＡＰ−２５９のＣＡＮリンカー領域のヌクレオチド配列である。
配列番号５４は、リシンおよびＣＡＮリンカーを含むｐＡＰ−２６０インサートのＤＮＡ配列である。
熱帯熱マラリア原虫プロテアーゼ感受性リンカーのアミノ酸配列の配列番号は、ｐＡＰ−２２３およびｐＡＰ−２２４（配列番号５５）；ｐＡＰ−２２５およびｐＡＰ−２２６（配列番号５６）；ｐＡＰ−２２７およびｐＡＰ−２２８（配列番号５７）；ｐＡＰ−２２９およびｐＡＰ−２３０（配列番号５８）；およびｐＡＰ−２３１およびｐＡＰ−２３２（配列番号５９）である（図２６参照）。
ウイルスプロテアーゼ感受性リンカーのアミノ酸配列の配列番号は、ｐＡＰ−２３３およびｐＡＰ−２３４（配列番６０）；ｐＡＰ−２３５およびｐＡＰ−２３６（配列番号６１）；およびｐＡＰ−２４９およびｐＡＰ−２５０（配列番号６２）である（図２７参照）。
ウイルスプロテアーゼ感受性リンカーのアミノ酸配列の配列番号は、ｐＡＰ−２４５およびｐＡＰ−２４６（配列番６３）；およびｐＡＰ−２４７およびｐＡＰ−２４８（配列番号６４）である（図２７参照）。
ウイルスプロテアーゼ感受性リンカーのアミノ酸配列の配列番号は、ｐＡＰ−２３７およびｐＡＰ−２３８（配列番６５）；ｐＡＰ−２３９およびｐＡＰ−２４０（配列番号６６）；ｐＡＰ−２５３およびｐＡＰ−２５４（配列番号６７）；ｐＡＰ−２５５およびｐＡＰ−２５６（配列番号６８）；およびｐＡＰ−２５７およびｐＡＰ−２５８（配列番号６９）である（図２７参照）。
カンジダアスパラギン（aspartic）プロテアーゼ感受性リンカーのアミノ酸配列の配列番号は、ｐＡＰ−２５９およびｐＡＰ−２６０（配列番７０）；ｐＡＰ−２６１およびｐＡＰ−２６２（配列番号７１）；およびｐＡＰ−２６３およびｐＡＰ−２６４（配列番号７２）である。
疾患特異的プロテアーゼ感受性リンカー変異体の作製に用いる突然変異誘発およびクローニングの別の方策の概略を図２９に示す。最初のステップには、１セットの突然変異誘発プライマーを２つのフランキングプライマー、リシン−９９Ｅｃｏおよびリシン１７２９Ｃ Ｐｓｔと組み合わせて用いるＤＮＡ増幅が含まれる。制限酵素切断ＰＣＲフラグメント（ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩ）をゲル精製する。この方法で作製したプレプロリシン変異体をＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで切断したバキュロウイルストランスファーベクターに直接サブクローニングすることができ、ｐBluescriptＳＫおよびｐＳＢ２を含む中間のライゲーションステップを回避する。疾患特異的プロテアーゼ感受性リンカー変異体を作製するのに用いたクローニング方策の概略を図３０−４７のＡに示す。この方策を実行して作製されたヌクレオチド配列およびアミノ酸配列に関し、以下の配列番号を付与する。
配列番号７３は、ｐＡＰ−２６２のＨＣＶ−Ａリンカー領域のヌクレオチド配列である。
配列番号７４は、ｐＡＰ−２６２インサートのＤＮＡ配列である。
配列番号７５は、ｐＡＰ−２６２、ＨＣＶ−Ａ突然変異プレプロリシンリンカー領域のアミノ酸配列である。
配列番号７６は、ｐＡＰ−２６４のＨＣＶ−Ｂリンカー領域のヌクレオチド配列である。
配列番号７７は、ｐＡＰ−２６４インサートのＤＮＡ配列である。
配列番号７８は、ｐＡＰ−２６４、ＨＣＶ−Ｂ突然変異プレプロリシンリンカー領域のアミノ酸配列である。
配列番号７９は、ｐＡＰ−２６６のＨＣＶ−Ｃリンカー領域のヌクレオチド配列である。
配列番号８０は、ｐＡＰ−２６６インサートのＤＮＡ配列である。
配列番号８１は、ｐＡＰ−２６６、ＨＣＶ−Ｃ突然変異プレプロリシンリンカー領域のアミノ酸配列である。
配列番号８２は、ｐＡＰ−２６８のＨＣＶ−Ｄリンカー領域のヌクレオチド配列である。
配列番号８３は、ｐＡＰ−２６８インサートのＤＮＡ配列である。
配列番号８４は、ｐＡＰ−２６８、ＨＣＶ−Ｄ突然変異プレプロリシンリンカー領域のアミノ酸配列である。
配列番号８５は、ｐＡＰ−２７０のＭＭＰ−２リンカー領域のヌクレオチド配列である。
配列番号８６は、ｐＡＰ−２７０インサートのＤＮＡ配列である。
配列番号８７は、ｐＡＰ−２７０、ＭＭＰ−２突然変異プレプロリシンリンカー領域のアミノ酸配列である。
配列番号８８は、ｐＡＰ−２７２のカテプシンＢ（サイト２）リンカー領域のヌクレオチド配列である。
配列番号８９は、ｐＡＰ−２７２インサートのＤＮＡ配列である。
配列番号９０は、ｐＡＰ−２７２、カテプシンＬ突然変異プレプロリシンリンカー領域のアミノ酸配列である。
配列番号９１は、ｐＡＰ−２７４のカテプシンＬリンカー領域のヌクレオチド配列である。
配列番号９２は、ｐＡＰ−２７４インサートのＤＮＡ配列である。
配列番号９３は、ｐＡＰ−２７４、カテプシンＬ突然変異プレプロリシンリンカー領域のアミノ酸配列である。
配列番号９４は、ｐＡＰ−２７６のカテプシンＤリンカー領域のヌクレオチド配列である。
配列番号９５は、ｐＡＰ−２７６インサートのＤＮＡ配列である。
配列番号９６は、ｐＡＰ−２７６、カテプシンＤ突然変異プレプロリシンリンカー領域のアミノ酸配列である。
配列番号９７は、ｐＡＰ−２７８のＭＭＰ−１リンカー領域のヌクレオチド配列である。
配列番号９８は、ｐＡＰ−２７８インサートのＤＮＡ配列である。
配列番号９９は、ｐＡＰ−２７８、ＭＭＰ−１突然変異プレプロリシンリンカー領域のアミノ酸配列である。
配列番号１００は、ｐＡＰ−２８０のウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーターリンカー領域のヌクレオチド配列である。
配列番号１０１は、ｐＡＰ−２８０インサートのＤＮＡ配列である。
配列番号１０２は、ｐＡＰ−２８０、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター突然変異プレプロリシンリンカー領域のアミノ酸配列である。
配列番号１０３は、ｐＡＰ−２８２のＭＴ−ＭＭＰリンカー領域のヌクレオチド配列である。
配列番号１０４は、ｐＡＰ−２８２インサートのＤＮＡ配列である。
配列番号１０５は、ｐＡＰ−２８２、ＭＴ−ＭＭＰ突然変異プレプロリシンリンカー領域のアミノ酸配列である。
配列番号１０６は、ｐＡＰ−２８４のＭＭＰ−１１リンカー領域のヌクレオチド配列である。
配列番号１０７は、ｐＡＰ−２８４インサートのＤＮＡ配列である。
配列番号１０８は、ｐＡＰ−２８４、ＭＭＰ−１１突然変異プレプロリシンリンカー領域のアミノ酸配列である。
配列番号１０９は、ｐＡＰ−２８６のＭＭＰ−１３リンカー領域のヌクレオチド配列である。
配列番号１１０は、ｐＡＰ−２８６インサートのＤＮＡ配列である。
配列番号１１１は、ｐＡＰ−２８６、ＭＭＰ−１３突然変異プレプロリシンリンカー領域のアミノ酸配列である。
配列番号１１２は、ｐＡＰ−２８８の組織型プラスミノーゲンアクチベーターリンカー領域のヌクレオチド配列である。
配列番号１１３は、ｐＡＰ−２８８インサートのＤＮＡ配列である。
配列番号１１４は、ｐＡＰ−２８８、組織型プラスミノーゲンアクチベーター突然変異プレプロリシンリンカー領域のアミノ酸配列である。
配列番号１１５は、ｐＡＰ−２９０のヒト前立腺特異的抗原リンカー領域のヌクレオチド配列である。
配列番号１１６は、ｐＡＰ−２９０インサートのＤＮＡ配列である。
配列番号１１７は、ｐＡＰ−２９０、ヒト前立腺特異的抗原突然変異プレプロリシンリンカー領域のアミノ酸配列である。
配列番号１１８は、ｐＡＰ−２９２のカリクレインリンカー領域のヌクレオチド配列である。
配列番号１１９は、ｐＡＰ−２９２インサートのＤＮＡ配列である。
配列番号１２０は、ｐＡＰ−２９２、カリクレイン突然変異プレプロリシンリンカー領域のアミノ酸配列である。
配列番号１２１は、ｐＡＰ−２９４の好中球エラスターゼリンカー領域のヌクレオチド配列である。
配列番号１２２は、ｐＡＰ−２９４インサートのＤＮＡ配列である。
配列番号１２３は、ｐＡＰ−２９４、好中球エラスターゼ突然変異プレプロリシンリンカー領域のアミノ酸配列である。
配列番号１２４は、ｐＡＰ−２９６のカルパインリンカー領域のヌクレオチド配列である。
配列番号１２５は、ｐＡＰ−２９６のインサートのＤＮＡ配列である。
配列番号１２６は、ｐＡＰ−２９６、カルパイン突然変異プレプロリシンリンカー領域のアミノ酸配列である。
配列番号１２７は、野生型リンカー領域のアミノ酸配列である。
本発明の核酸分子は、リシン様毒素をもつＡ鎖、リシン様毒素をもつＢ鎖およびＡ鎖とＢ鎖を結合する異種リンカーアミノ酸配列をコードする配列をもつ。該核酸は、発現して、リシン様毒素をもつＡ鎖、リシン様毒素をもつＢ鎖およびＡ鎖とＢ鎖を結合する、疾患特異的プロテアーゼに対する切断認識部位を含む異種リンカーアミノ酸配列組換えタンパク質を提供する。
Ａ鎖および／またはＢ鎖はリシンのものである。リシン遺伝子はクローニングされ、配列決定され、さらにＡ鎖およびＢ鎖のＸ線結晶構造が公開されている（Rutenber, E.,らのProteins １０：２４０−２５０（１９９１）；WestonらのMol. Biol.２４４：４１０−４２２（１９９４）；LambおよびLord, Eur. J. Biochem.１４：２６５（１９８５）；Halling, K.,らのNucleic Acids Res.１３：８０１９（１９８５））。本発明は、リシン様タンパク質のＡ鎖およびＢ鎖の切断片、リシン用タンパク質のＡ鎖およびＢ鎖の類似体および相同体およびその切断片（すなわち、リシン様タンパク質）をコードする核酸分子を包含する。さらに、本発明のｃＤＮＡに対応するｍＲＮＡの別のスプライシングによって生じる、本発明の核酸分子の変異体は、本発明に包含される。
本発明の他の態様は、高ストリンジェント条件下で、リシン様タンパク質のＡ鎖および／またはＢ鎖をコードする核酸配列にハイブリダイズする核酸配列を提供する。ＤＮＡのハイブリダイゼーションを促進する適当なストリンジェント条件は、当業者には公知であるか、もしくはCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y.（１９８９）,6.3.1 6.3.6.において見出すことができる。たとえば、約４５℃、６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、次いで５０℃、２．０×ＳＳＣの洗液を採用する。ストリンジェンシーは、洗浄ステップで用いる条件に基づいて選択する。例として、洗浄ステップにおける塩濃度は、５０℃、約０．２×ＳＳＣという高いストリンジェンシーから選ぶことができる。さらに、洗浄ステップにおける温度は約６５℃という高いストリンジェンシー条件をとることができる。
核酸分子は、リシン様毒素のＡ鎖および／またはＢ鎖を含む。リシン様毒素のクローニング方法は、当業界で公知であり、たとえば、ＥＰ４６６２２２に記載されている。リシンまたはリシン様Ａ鎖およびＢ鎖をコードする配列は、選択的ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリー内のコーディング領域の増幅用の退行性プライマーまたはプローブのセットを用い、コーディング領域の選択的増幅によって得ることができる。リシンまたはリシン様毒素のＡ鎖およびＢ鎖の核酸配列から適当なプライマーを選んでもよい。ＰＣＲに用いる核酸配列から合成オリゴヌクレオチドプライマーを設計することもできる。たとえば米国特許５１０１０２５およびＥＰ４６６２２２に記載されているように、高度に保存されたリシン様タンパク質の配列コーディング領域から適当なプライマーを選んでもよい。
核酸配列は、これらのオリゴヌクレオチドプライマーおよび標準的ＰＣＲ増幅技術を用いてｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡから増幅することができる。このように増幅された核酸は、適当なベクターにクローニングしてＤＮＡ配列分析によって特徴付けることができる。たとえば、Chirgwinらのthe guanidinium-thiocyanate extraction procedure,  Biochemistry １８,５２９４−５２９９（１９７９）などの種々の技術によって、総細胞ｍＲＮＡを単離することにより、ｍＲＮＡからｃＤＮＡを作製することができる。次いで、逆転写酵素（たとえば、ギブコ／ＢＲＬ、ベセスダ、ＭＤから入手しうるMoloneyＭＬＶ逆転写酵素またはセイカガク・アメリカ・インク、セントピーターズバーグ、ＦＬから入手しうるＡＭＶ）を用いてｃＤＮＡをｍＲＮＡから合成することができる。上記方法を用いて、公知のリシン様タンパク質を産生する植物、細菌または菌（好ましくは植物）からコーディング配列を得てもよく、また未知のリシン様タンパク質をコードする遺伝子の存在をスクリーニングしてもよい。
特異的プロテアーゼに対する切断認識部位を含む配列は、組換えタンパク質によって標的化すべき疾患または病原に基づいて選ぶ。切断認識部位は、癌、ウイルス、または寄生虫プロテアーゼに対する切断認識部位をコードすることがわかっている配列から選択する。切断認識部位をコードする配列は、該当するプロテアーゼによる切断の容易さについて、配列の発現産物をテストすることによって同定する。
ウイルス、菌、寄生虫または癌関連プロテアーゼに対する切断認識部位を含む配列は、組換えタンパク質によって標的化すべきレトロウイルスに基づいて選択する。切断認識部位は、ウイルス、菌、寄生虫または癌関連プロテアーゼに対する切断認識部位をコードすることがわかっている配列から選択する。切断認識部位をコードする配列は、ウイルス、菌、寄生虫または癌関連プロテアーゼによる切断の容易さについて、配列の発現産物をテストすることによって同定する。推測される切断認識部位を含むポリペプチドをプロテアーゼとともにインキュベートするが、切断産物の量は測定されている（Dilannit,１９９０，J. Biol. Chem.２８５：１７３４５−１７３５４（１９９０））。
プロテアーゼは、当業界で公知の方法で作製することができ、推測される切断認識部位をテストするのに用いる。
ひとつの具体例において、主要関連カテプシンＢの作製、その基質および酵素活性アッセイ方法がSloane,B.F.らの（Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８３：２４８３−２４８７（１９８６）），Schwartz, M.K.（Clin. Chim. Acta ２３７：６７−７８（１９９５）），and Panchal, R.G.ら（Nature Biotechnol.１４：８５２−８５６（１９９６））に記載されている。エプスタイン−バールウイルスプロテアーゼの作製、その基質および酵素活性アッセイ方法がWelch,A.R.の（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.８８：１０７９２−１０７９６（１９９１））に記載されている。
他の具体例において、熱帯熱マラリア原虫プロテアーゼの作製、その基質および酵素活性アッセイ方法が、Goldberg, D.E.らの（J. Exp. Med.１７３：９６１−９６９（１９９１）），Cooper & Bujard（Mol. Biochem. parasitol.５６：１５１−１６０（１９９２）），Nwagwu, M.らの（Exp. parasitol.７５：３９９−４１４（１９９２）），Rosenthal, P.J.らの（J. Clin. Invest.９１：１０５２−１０５６（１９９３）），Blackman, M.J.らの（Mol. Biochem. Parasitol.６２：１０３−１１４（１９９５））に記載されている。
他の具体例において、ヒトサイトメガロウイルス、ヒトヘルペスウイルス、水痘−帯状疱疹ウイルスおよび感染性喉頭気管炎ウイルスのプロテアーゼの作製について、Liu F. & Roizman, B.（J. Virol.６５：５１４９−５１５６（１９９１））and Welch, A.R.（Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８８：１０７９２−１０７９６（１９９１））に記載されている。さらに、それぞれの基質および酵素活性アッセイ方法もまた記載されている。
他の具体例において、Ａ型肝炎ウイルスプロテアーゼの作製、その基質および酵素活性アッセイ方法が、Jewell, D.A.らの（Biochemistry ３１：７８６２−７８６９（１９９２））に記載されている。ポリオウイルスプロテアーゼの作製、その基質および酵素活性アッセイ方法が、Weidner, J.R.らの（Arch.Biochem.Biophys.２８６：４０２−４０８（１９９１））に記載されている。ヒトライノウイルスプロテアーゼの作製、その基質および酵素活性アッセイ方法が、Long, A.C.らの（FEBS Lett.２５８：７５−７８（１９８９））に記載されている。
本発明の他の具体例において、特に、カンジダ・アルビカン（Candida albican）、カンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）およびカンジダ・パラプシロシス（Candida parapsilosis）などのカンジダ属といった多数の毒性の強い菌株関連アスパラギンプロイナーゼを含む、カンジダ属酵母関連プロテアーゼの作製、その基質および酵素活性アッセイ方法が企図されている（Arad-Zapatero, C.らのProtein Sci.５：６４０−６５２（１９９６）；Cutfield, S.M.らのBiochemistry ３５：３９８−４１０（１９９５）；Ruchel, RらのZentralbl. Bakteriol. Mikrobiol Hyg. I Abt. Orig. A.２５５：５３７−５４８（１９８３）；Remold, H.らのBiochim. Biophys. Acta １６７：３９９−４０６（１９６８））。
本発明の核酸分子は、部位特異的突然変異誘発によって製造することができる。たとえば、疾患特異的プロテアーゼの切断部位を、プロリシン様毒素の同種リンカー配列の部位特異的突然変異誘発によって作製する。リンカー配列をコードする、プロリシン様遺伝子をクローニングする方法はＥＰ４６６２２２に記載されている。部位特異的突然変異誘発は、突然変異誘発プライマーとフランキングプライマーを組み合わせたＤＮＡ増幅によって遂行される。突然変異誘発プライマーを用いる適当な操作を図１−４、図１３−１６、図１８−３６、図３８−４１および図５０−６７のＡおよびＢに示す。
本発明の核酸分子は融合タンパク質もコードする。疾患特異的プロテアーゼに対する切断認識部位を含む異種リンカー配列は、ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーからクローニングするかまたはこのような切断部位の公知の配列に基づいて化学的に合成する。次いで、融合タンパク質として発現させるために、異種リンカー配列をフレーム内でリシン様毒素のＡ鎖およびＢ鎖をコードする配列とともに融合させる。融合タンパク質をコードする核酸分子は、同じリシン様毒素由来のＡ鎖およびＢ鎖をコードする配列を含んでもよいし、あるいはコードされたＡ鎖およびＢ鎖が異なる毒素であってもよい。たとえば、Ａ鎖をリシンから誘導し、Ｂ鎖をアブリンから誘導してもよい。共有結合のための慣例のカップリング剤を用いて、Ａ鎖とＢ鎖およびリンカー配列の化学的複合によってタンパク質を作製してもよい。
ＲＮＡである、本発明の単離および精製された核酸分子は、Ａ鎖およびＢ鎖ならびにリンカーをコードするｃＤＮＡを、ｃＤＮＡが転写されて本発明のタンパク質をコードするＲＮＡ分子を産生し得る適当なベクター内へクローニングすることによって単離することができる。たとえば、ベクター内のバクテリオファージプロモーター（Ｔ７プロモーター）の下流でクローニングし、ｃＤＮＡをインビトロにてトランスクリプトし、得られるＲＮＡを標準的技術によって単離することができる。
本発明の組換えタンパク質
これまでに記載したように、本発明は、疾患特異的プロテアーゼに対する切断認識部位を含む異種リンカー配列によって結合した、リシン様毒素をもつＡ鎖とＢ鎖を含む新規な組換えタンパク質を提供する。本発明の組換えタンパク質の利点は、標的プロテアーゼによるリンカーの特異的切断によってＡ鎖がＢ鎖から放出されるまでは非毒性であることである。
したがって、該タンパク質は、標的感染細胞への特異的な細胞結合成分がなくとも、特定の標的癌細胞またはウイルスもしくは寄生虫に感染した細胞に対して用いることができる。さらなる利点は、疾患特異的プロテアーゼが、異種リンカーを細胞内で切断することにより、毒性のＡ鎖が癌細胞または感染細胞の細胞質へ直接放出されることである。結果として、該細胞は特異的に標的化され、非感染正常細胞は活性化した遊離のＡ鎖に直接さらされることはない。
リシンは、真核細胞内でタンパク質の合成を遮断する、植物由来リボソーム阻害タンパク質である。リシン毒素は、それぞれ分子量３０２６５Ｄａおよび３１４３１ＤａのＡ鎖およびＢ鎖をもつグリコシル化ヘテロダイマーである。リシンのＡ鎖は、Ｎ−グリコシダーゼ活性を有し、真核細胞リボソームの２８Ｓ  ｒＲＮＡの特定のアデニン残基の切除を触媒する（Endo, Y; &Tsurugi, K. J. Biol. Chem.２６２：８１２８（１９８７））。リシンのＢ鎖は、それ自体毒性はないが、真核細胞の表面に存在するガラクトース残基に結合して毒素分子の受容体媒介性エンドサイトーシスを刺激することによってＡ鎖の毒性を促進する（SimmonsらのBiol. Chem.２６１：７９１２（１９８６））。
すべてのタンパク質毒素は最初は不活性な先駆体として産生される。リシンは最初、３５アミノ酸のＮ−末端プレ配列およびＡ鎖とＢ鎖の間の１２アミノ酸のリンカーを含む一本のポリペプチド（プレプロリシン）である。該プレ配列は、リシン先駆体が小胞体内へトランスロケーションされる間に除去される（Lord, J.M., Eur. J. Biochem.１４６：４０３−４０９（１９８５）and Lord, J.M.,Eur.J.Biochem.１４６：４１１−４１６（１９８５））。次いで、プロリシンはプロテインボディと呼ばれる特別の小器官内へトランスロケーションされ、そこで植物プロテアーゼがタンパク質をＡ鎖とＢ鎖の間のリンカー領域で切断する（Lord, J.MらのFASAB Journal ８：２０１−２０８（１９９４））。しかし、二つの鎖は、鎖内ジスルフィド結合（Ａ鎖のシステイン２５９がＢ鎖のシステイン４に結合）によって依然として共有的に結合したままであり、成熟ジスルフィドリンクしたリシンが植物細胞内のプロテインボディ内に貯蔵される。Ａ鎖はプロリシンにおいて不活性であり（O’Hare,M.らのFEBS Lett.２７３：２００−２０４（１９９０））、ジスルフィド結合した成熟リシンにおいては不活性であるRichardson,P.T.らのFEBS Lett.２５５：１５−２０（１９８９））。唐胡麻のリボソームはそれ自体、リシンのＡ鎖による不活性化の影響を受けやすいが、Ｂ鎖の認識を許容する細胞表面ガラクトースがないのでＡ鎖は細胞内へ再侵入することができない。
リシン様タンパク質には、これらに限定されるものではないが、Ａ鎖とＢ鎖を有し、リボソームを不活性化し、タンパク質の合成を阻害する細菌毒素、菌毒素および植物毒素が含まれる。Ａ鎖は毒素の薬理効果をもたらす活性なポリペプチドサブユニットである。ほとんどの場合、Ａ鎖の活性成分は酵素である。Ｂ鎖は毒素を細胞の表面に結合させるように働き、Ａ鎖が細胞質内へ侵入するのを促進すると考えられる。成熟毒素においてＡ鎖とＢ鎖は、ジスルフィド結合で結合している。構造がリシンと非常によく似ている毒素は、ひとつのＡ鎖とひとつのＢ鎖をもつ植物毒素である。このような毒素には、トウアズキ（Abrus precatorius）の種子から単離されるアブリンが含まれる。
リシン様細菌タンパク質としては、コリネバクテリウム・ジフテリアエによって産生されるジフテリア毒素、シュードモナス・エンテロトキシンＡおよびコレラ毒素が挙げられる。リシン様毒素という用語には、Ａ鎖のみをもつ毒素も含まれることを意図している。本発明の組換えタンパク質には、こういった毒素のＡ鎖と他のの毒素のＢ鎖を複合させて、組換えタンパク質として発現したものも含まれる。Ａ鎖のみをもつ植物毒素としては、トリコサンチン、ＭＭＣおよびアメリカヤマゴボウ抗ウイルス性タンパク質、ジアンチン３０、ジアンチン３２、クロチンＩＩ、および小麦胚芽インヒビターが挙げられる。Ａ鎖のみをもつ菌毒素としては、α−サルシン、レストリクトシン、ミトギリン、エノマイシン、フェノマイシンが挙げられる。Ａ鎖のみをもつ細菌毒素としては、シゲラ・ジスエンテンテリアエ由来の毒素およびシガ様毒素が挙げられる。組換えトリコサンチンおよびそのコーディング配列が、ＵＳ特許５１０１０２５および５１２８４６０に開示されている。
完全なＡ鎖またはＢ鎖をもつリシン様毒素に加えて、本発明の組換えタンパク質には、その毒性効果を現わすのに必要なＡ鎖の一部のみを有するものが含まれる。Ａ鎖の最初の３０個のアミノ酸を取ると毒性活性を保有する切断されたＡ鎖が得られる。切断されたリシンまたはリシン様Ａ鎖は、切断された遺伝子の発現またはタンパク質分解的減成（ナガラーゼなど）によって作製することができる（FunmatsuらのJap. J. med. Sci. Biol.２３：２６４−２６７（１９７０））。同様に、本発明の組換えタンパク質には、ガラクトース認識、細胞結合および細胞質内への輸送に必要なＢ鎖の一部のみをもつものも含まれる。切断されたＢ鎖は、ＥＰ１４５１１１などに記載されている。Ａ鎖とＢ鎖は、グリコシル化されても、されなくてもよい。グリコシル化されたＡ鎖とＢ鎖は、グリコシル化を行う能力をもつ適当な宿主細胞内で発現させることにより得ることができる。非グリコシル化鎖は、非グリコシル化宿主細胞内で発現させるか、糖質部分を除去もしくは破壊処理することにより、得ることができる。
本発明のタンパク質を組換えＤＮＡ法を用いて作製する。したがって、本発明の核酸分子を、公知の方法で、タンパク質が効率よく発現する適当な発現ベクター内へ組み込む。可能な発現ベクターとしては、コスミド、プラスミドまたはウイルス（複製欠陥レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルスなど）が挙げられるが、使用する宿主細胞に適合するウイルスであれば、これらに限定されるものではない。発現ベクターが“宿主細胞の形質転換に適する”とは、発現ベクターが本発明の核酸分子および、宿主細胞に基づいて選択した、発現に用いた該核酸分子に作動可能に結合する調節配列を含むことを意味する。作動可能に結合するとは、核酸を発現させうるような作法で、核酸分子が調節配列に結合することを意味することを意図している。
したがって、本発明には、本発明の核酸分子またはそのフラグメントおよび挿入されたタンパク質配列の転写ならびに翻訳必要な調節配列を含む本発明の発現ベクターも含まれる。
適当な調節配列は、細菌、菌、ウイルス、哺乳類または昆虫遺伝子といったような種々の源から誘導することができる（たとえば、Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology １８５，Academic Press, San Diego, CA（１９９０）に記載の調節配列を参照せよ）。適当な調節配列は、以下に記載するように、選んだ宿主細胞に応じて選択するが、当業者には容易に行い得ることである。このような調節配列として、転写プロモーターおよびエンハンサーまたはＲＮＡポリメラーゼ結合配列、リボソーム結合配列、転写開始シグナルが挙げられる。さらに、選んだ宿主細胞および採用したベクターに応じて、複製起点、さらなるＤＮＡ制限部位、エンハンサーおよび転写誘導力を付与する配列といったような他の配列を発現ベクターに組み込むことができる。必要な調節配列は、もとのＡ鎖とＢ鎖および／またはそのフランキング領域によって補給されてもよい。
本発明の組換え発現ベクターは、本発明の組換え分子で形質転換されるかまたはトランスフェクトされた宿主細胞の選択を促進する選択可能なマーカー遺伝子を含んでもよい。選択可能なマーカー遺伝子として、たとえば、Ｇ４１８およびハイグロマイシンといったようなタンパク質をコードする、特定の薬物に対する耐性を付与する遺伝子、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスファーゼ、ファイヤーフライルシフェラーゼ、または免疫グロブリン、好ましくはＩｇＧのＦｃ部位といったようなその一部をコードする遺伝子が挙げられる。選択可能なマーカー遺伝子の転写は、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスファーゼ、ファイヤーフライルシフェラーゼなどの選択可能なマーカータンパク質の濃度の変化によってモニターする。選択可能なマーカー遺伝子がネオマイシン耐性などの抗生物質耐性を付与するタンパク質をコードするならば、形質転換体細胞は、Ｇ４１８を選択することができる。選択可能なマーカー遺伝子を組み込まれた細胞は生き残るが、他の細胞は死ぬ。これによって、本発明の組換え発現ベクターの視覚化およびアッセイが可能になり、特に、発現および表現型における突然変異の効果を測定することが可能になる。選択可能なマーカーを対象の核酸から別のベクターへ導入することもできる。
組換え発現ベクターは、組換えタンパク質の発現；組換えタンパク質の溶解度；およびアフィニティー精製においてリガンドとして作用することによる標的組換えタンパク質の精製における補助；を増加させる融合部分をコードする遺伝子を含んでもよい。たとえば、タンパク質分解的切断部位を標的組換えタンパク質に加えて、組換えタンパク質を融合部分から分離させて融合タンパク質を精製することができる。代表的な融合発現ベクターとしては、組換えタンパク質に対し、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはタンパク質Ａをそれぞれ融合する、ｐＧＥＸ（アムラッド・コーポレイション、メルボルン、オーストラリア）、ｐＭＡＬ（ニュー・イングランド・バイオラブズ、ベバリー、ＭＡ）およびｐＲＩＴ５（ファルマシア、ピスカタウェイ、ＮＪ）が挙げられる。
組換え発現ベクターを宿主細胞に導入して宿主細胞の形質転換体を作製することができる。“宿主細胞形質転換体”とは、本発明の組換え発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた原核細胞および真核細胞を含むことを意図するものである。“形質転換された”、”トランスフェクトされた”、“形質転換”および“トランスフェクション”とは、当業界で公知の多くの可能な技術のひとつによって、核酸（ベクターなど）を細胞内へ導入することを含むことを意図している。原核細胞は、たとえば電気穿孔または塩化カルシウム媒介形質転換によって形質転換することができる。核酸は、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈法、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクチン、電気穿孔またはマイクロインジェクションなどの慣例の技術を介して哺乳類細胞内へ導入することができる。細胞を形質転換およびトランスフェクションする適当な方法は、Sambrookらの（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press（１９８９））およびその他の実験室テキストにおいて見出すことができる。
適当な宿主細胞には、広範囲の種類の原核細胞および真核細胞が含まれる。たとえば、本発明のタンパク質を大腸菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルスを用いて）、酵母細胞または哺乳類細胞内で発現させることができる。他の適当な宿主細胞はGoeddelのGene Expression Technology: Methods in Enzymology １８５，Academic Press, San Diego, CA（１９９１）に見出すことができる。
特に、本発明を行うのに適した細菌宿主細胞は、大腸菌、B.subtilis、Salmonella typhimurium、およびシュードモナス属、ストレプトマイセス属およびスタフィロコッカス属に属する種々の菌、ならびに当業者に公知のその他の多数の細菌である。適当な細菌発現ベクターとして、宿主細胞内で機能するプロモーター１個または２個以上の選択可能な表現型マーカーおよび細菌複製起点を含むのが好ましい。代表的なプロモーターは、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトースプロモーター系（ChangらのNature ２７５：６１５（１９７８））、ｔｒｐプロモーター（Nichols and Yanofsky, Meth in Enzymology １０１：１５５，（１９８３）およびｔａｃプロモーター（RussellらのGene２０：２３１，（１９８２））である。代表的な選択可能なマーカーは、カナマイシンまたはアンピシリン耐性遺伝子などの種々の抗生物質耐性マーカーである。適当な発現ベクターとしては、これらに限定されるものではないが、ラムダ誘導体などのバクテリオファージまたはｐＢＲ３２２（BolivarらのGene ２：９Ｓ，（１９７７））、ｐＵＣプラスミドｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９（Messing Meth in Enzymology １０１：２０−７７，１９８３and Vieira and Messing, Gene １９：２５９−２６８（１９８２）を参照）およびｐＮＨ８Ａ,ｐＮＨ１６ａ,ｐＮＨ１８ａおよびBluescript Ｍ１３（Stratagene, La Jolla, Calif.）などのプラスミドが挙げられる。使用しうる代表的な融合発現ベクターは、前述したｐＧＥＸ（アムラッド・コーポレイション、メルボルン、オーストラリア）、ｐＭＡＬ（ニュー・イングランド・バイオラブズ、ベバリー、ＭＡ）およびｐＲＩＴ５（ファルマシア、ピスカタウェイ、ＮＪ）である。誘導可能な非融合発現ベクターとして、ｐＴｒｃ（AmannらのGene ６９：３０１−３１５（１９８８））およびｐＥＴ１１ｄ（StudierらのGene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calofornia,６０−８９（１９９０））が挙げられる。
本発明を行うのに適した酵母および菌宿主細胞として、これらに限定されるものではないが、Saccharomyces cerevisae、ピシア属またはクルイベロマイセス属および種々のアスペルギルス属のものが挙げられる。酵母Ｓ．セレビシアエにおける発現ベクターは、ｐＹｅｐＳｅｃ１（BaldariらのEmbo J.６：２２９−２３４（１９８７）），ｐＭＦａ（Kurjan and Herskowitz, Cell ３０：９３３−９４３（１９８２）），ｐＪＲＹ８８（SchultzらのGene ５４：１１３−１２３（１９８７））およびｐＹＥＳ２（Invitrogen Corporation, San Diego, CA）などである。酵母および菌の形質転換のプロトコルは、当業者には公知である（HinnenらのProc. Natl. Acad. Sci. USA ７５：１９２９（１９７８）；ItohらのJ. Bacteriology １５３：１６３（１９８３）およびCullenらの（Bio/Technology ５：３６９（１９８７）を参照せよ）。
本発明を行うのに適した哺乳類細胞として、ＣＯＳ（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５０または１６５１）、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ６２８１）、ＣＨＯ（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ６１）、Ｈｅｌａ（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ２）、２９６（ＡＴＣＣ番号１５７３）およびＮＳ−１が挙げられる。哺乳類細胞での発現に適した発現ベクターは、一般に、プロモーター（ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス４０などから誘導されたもの）ならびに他の転写および翻訳コントロール配列を含む。哺乳類における発現ベクターには、ｐＣＤＭ８などがある（Seed, B., Nature ３２９：８４０（１９８７））and pMT2PC（KaufmanらのEMBO J.６：１８７−１９５（１９８７））。
本明細書で提供する技術により、プロモーター、ターミネーターおよび植物、トリおよび昆虫細胞へ発現ベクターを導入する方法もまた、容易に実行できる。たとえば、ひとつの具体例において、本発明のタンパク質を植物細胞から発現させることができる（アグロバクテリウム・リゾゲネス・ベクターの使用について論じているSinkarらのJ. Biosci（Bangalore）１１：４７−５８（１９８７）を参照せよ；ｐＡＳ２０２２、ｐＡＳ２０２３およびｐＡＳ２０２４などの植物細胞における発現ベクターについて記載している、Zambryski Genetic Engineering, Principles and Methods, Hollaender and Setlow（eds.）, Vol. VI, pp.２５３−２７８,Plenum Press, New York（１９８４）も参照せよ）。
本発明を行うのに適した昆虫細胞として、Bombyx、TrichoplisiaまたはSpodotera種由来の細胞および細胞系が挙げられる。培養した昆虫細胞（ＳＦ９細胞）においてタンパク質を発現させるのに適したバキュロウイルスベクターとして、ｐＡＣシリーズ（SmithらのMol. Cell. Biol.３：２１５６−２１６５（１９８３））およびｐＶＬシリーズ（Lucklow, V.A., and Summers, MD., Virology １７０：３１−３９（１９８９））が挙げられる。本発明の組換えタンパク質の発現に適したいくつかのバキュロウイルス−昆虫細胞発現系がＰＣＴ／ＵＳ／０２４４２に記載されている。
別法として、本発明のタンパク質は、ラット、ウサギ、ヒツジおよびブタなどの非トランスジェニック動物において発現させることもできる（HammerらのNature ３１５：６８０−６８３（１９８５）；PalmiterらのScience ２２２：８０９−８１４（１９８３）；BrinsterらのProc. Natl. Acad. Sci. USA ８２：４４３８−４４４２（１９８５）；Palmiter and Brinster Cell ４１：３４３−３４５（１９８５）およびU.S. Patent No.４，７３６，８６６）。
本発明のタンパク質は、固相合成法（Merrifield, J. Am. Chem. Assoc.８５：２１４９−２１５４（１９６４））またはホモジニアス溶液合成法（Houbenweyl, Methods of Organic Chemistry, ed. E. Wansch, Vol.１５ I and II, Thieme, Stuttgart（１９８７））などの化学の分野で公知の技術を用いる化学合成によって作製してもよい。
本発明はまた、疾患特異的プロテアーゼに対する切断認識部位を含む異種リンカー配列によって結合した、リシン様毒素をもつＡ鎖とＢ鎖を含むタンパク質を提供する。このようなタンパク質は、化学合成、または天然の植物、菌または細菌源から単離および精製されたＡ鎖とＢ鎖およびリンカー配列の複合などの組換え法以外の方法でも作製することができる。このようなＡ鎖およびＢ鎖は天然のリシン様毒素のグリコシル化パターンをもつように作製することができる。
タンパク質などの他の分子と複合した本発明のタンパク質のＮ−末端またはＣ−末端融合タンパク質は、組換え技術やフュージングによって作製することができる。得られる融合タンパク質には、選ばれたタンパク質または前記のマーカータンパク質に融合した本発明タンパク質が含まれる。本発明組換えタンパク質は、公知の技術によって他のタンパク質と複合してもよい。たとえば、ＷＯ９０／１０４５７に記載のヘテロバイファンクショナルチオール−含有リンカー、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ−プロピオネート）またはＮ−スクシンイミジル−５−チオアセテートを用いて本発明タンパク質とカップリングさせてもよい。融合または複合タンパク質の作製に用いるタンパク質として、免疫グロブリン、ホルモン、成長因子、レクチン、インスリン、低密度リポタンパク質、グルカゴン、エンドフリン、トランスフェリン、ボンベシン、アシアログリコプロテイン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ヘマグルチニン（ＨＡ）および切断されたｍｙｃなどの細胞結合タンパク質が挙げられる。
本発明核酸分子およびタンパク質の用途
本発明タンパク質を用いて、特異的プロテアーゼ、すなわち、癌細胞またはウイルス、菌または寄生虫に感染した細胞などの疾患に特異的なプロテアーゼ（これらはすべて疾患特異的という語句に含まれる）に関連する、疾患または感染した細胞を特異的に阻害または破壊することができる。細胞結合成分を必要とすることなく該細胞に特異性をもつことが本発明組換えタンパク質の利点である。該組換えタンパク質のリシン様Ｂ鎖は、細胞表面にあるガラクトース部位を認識し、該タンパク質が疾患細胞に結合し、細胞質内へ放出されるのを確実にする。該タンパク質が非感染細胞の内部へ侵入しても、疾患特異的プロテアーゼがないので異種リンカーの切断は起こらず、Ａ鎖はＢ鎖に結合して不活性のままである。逆に、タンパク質が疾患細胞内へ侵入すると、疾患特異的プロテアーゼがリンカーの切断認識部位を切断し、毒性のＡ鎖が放出される。
本発明組換えタンパク質の特異性は、リンカーの切断認識部位に特異的であると考えられる、疾患特異的プロテアーゼで該タンパク質を処理し、切断産物をアッセイすることにより、テストすることができる。疾患特異的プロテアーゼは、癌細胞または感染細胞から単離するか、あるいはDarketらの（J. Biol. Chem.２５４：２３０７−２３１２（１９８８））の記載などにしたがって、組換え技術で作製することができる。切断産物は、たとえば、大きさ、抗原性または活性に基づいて同定する。ブローム・モザイク・ウイルスのｍＲＮＡなどを用いて、切断産物を細胞ライセート内でのインビトロ翻訳アッセイに付すことによって、組換えタンパク質の毒性を研究する。切断産物の毒性はリボソーム不活性化アッセイを用いて測定することができる（WestbyらのBioconjugate Chem.３：３７７−３８２（１９９２））。タンパク質合成における切断産物の影響は、リボソーム源として赤血球溶解液調製品、ｍＲＮＡテンプレートおよびアミノ酸などの種々の必須コファクターなどからなる、部分的に定義された細胞フリー系を用いるインビトロ翻訳などの標準的アッセイで測定することができる。混合物中に放射標識したアミノ酸を用いると、遊離アミノ酸先駆体のトリクロロ酢酸沈殿可能タンパク質への取りこみを定量することができる。ウサギ赤血球溶解液が慣例的に用いられる（O’Hare, FEBS Lett.２７３：２００−２０４（１９９０））。
癌細胞やウイルスまたは寄生虫に感染した細胞を選択的に阻害または破壊する、本発明の組換えタンパク質の能力は、動物癌細胞系または対象となるウイルスもしくは寄生虫に感染した細胞を用いてインビトロで容易に試験することができる。本発明の組換えタンパク質の選択的阻害効果を、たとえば、感染哺乳類細胞におけるウイルス抗原の発現の選択的阻害、疾患細胞におけるｍＲＮＡの翻訳およびタンパク質合成の選択的阻害、または癌細胞または感染細胞における細胞増殖の選択的阻害を明らかにすることにより、測定することができる。
毒性もまた、細胞の生存能力に基づいて測定することができ、たとえば、組換えタンパク質に曝露された感染および非感染細胞培養物の生存能力を比較する。細胞の生存能力は、トリパンブルー排除アッセイなどの公知の技術によって評価する。
他の実施例において、多数のモデルを用いて癌関連マトリックスメタロプロテイナーゼに対する切断認識部位を含む異種リンカー配列を有する組換えタンパク質の細胞毒性をテストする。Thompson, E.W.らの（Breast Canser Res. Treatment ３１：３５７−３７０（１９９４））には、細胞外マトリックスの腫瘍細胞媒介タンパク質分解および再構成基底膜の腫瘍細胞浸潤（コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、マトリゲルまたはゼラチン）を測定することによる胸部癌細胞の浸潤性を決定するためのモデルが記載されている。他の応用しうる癌細胞モデルとして、培養卵巣アデノカルシノーマ細胞（Young, T.N.らのGynecol. Oncol.６２：８９−９９（１９９６）；Moore, D.H.らのGynecol. Oncol.６５：７８−８２（１９９７））、ヒト小胞チロイド癌細胞（Demeure, M.J.らのWorld J. Surg.１６：７７０−７７６（１９９２））、ヒト黒色腫（Ａ−２０５８）および線維肉腫（ＨＴ−１０８０）細胞系（Mackay,A.R.らのLab.Invest.７０：７８１−７８３（１９９４））、および肺鱗細胞系（ＫＳ−２４）ならびにアデノカルシノーマ（ＳＢ−３）細胞系（Spiess, E.らのJ. Histochem. Cytochem.４２：９１７−９２９（１９９４））が挙げられる。無胸腺ヌードマウスにおける腫瘍の移植および腫瘍成長ならびに転移の測定を含むインビボテストシステムも記載されている（Thompson, E. W.らのBreast Canser Res. Treatment ３１：３５７−３７０（１９９４）；Shi, Y.E.らのCanser Res.５３：１４０９−１４１５（１９９３））。
さらに、他のモデルを用いて、ヒトグリオームにおける癌関連カテプシンＢプロテアーゼに対する切断認識部位を含む異種リンカー配列を有する組換えタンパク質の細胞毒性ををテストすることができる（Mikkelsen, T.らのJ. Neurosurge,８３：２８５−２９０（１９９５））。
同様に、マラリアプロテアーゼに対する切断認識部位を含む異種リンカー配列を有する組換えタンパク質の細胞毒性を、成熟相メロゾイト寄生虫に感染したヒト赤血球を用いて形質胞体浸潤アッセイを行うことによりテストすることができる（McPherson,R.A.らの（Mol. Biochem. parasitol.６２：２３３−２４２（１９９３））。別法として、人肝パレンチマル細胞のインビトロ培養を用いて、シゾント感染能および形質胞体メロゾイト生成を評価することができる。
ウイルス感染および複製モデルに関しては、インビトロで培養しうる、ウイルス複製を維持する能力をもつ適当な動物細胞を宿主として用いることができる。次いで、感染および非感染培養物に対する組換えタンパク質の毒性を比較する。本発明組換えタンパク質のウイルス抗原の発現を阻害する能力は、該タンパク質のウイルス複製を阻害する能力の重要なインジケーターである。これらの抗原の濃度を、抗原に対する特異性を有する標識抗体を用いるアッセイで測定する。ウイルス抗原発現の阻害は、ウイルス複製の阻害と相関関係がある（ＵＳ特許４８６９９０３）。［３Ｈ］ロイシンといったような標識アミノ酸の使用など、公知の技術にて測定を行い、標的細胞におけるタンパク質の合成の減少に基づいて、毒性も評価することができる（O’HareらのFEBS Lett.２７３：２００−２０４（１９９０））。感染細胞を放射標識チミジンで処理し、細胞ＤＮＡへの放射活性標識の組み込みを細胞増殖の測定指標とする。細胞死または細胞溶解に基づいて毒性も測定することができ、たとえば、組換えタンパク質に曝露した感染および非感染細胞培養物の生存率を比較する。細胞生存率は、トリパンブルー排除アッセイなどの公知の技術で評価する。疾患細胞に対する本発明タンパク質の第１の特異性は、リンカーの切断認識部位の特異的切断によって媒介されるが、特異的細胞結合成分を必要に応じて本発明タンパク質に複合させてもよい。このような細胞結合成分を本発明タンパク質との融合タンパク質として発現させるか、または該細胞結合成分を本発明タンパク質成分と物理的または化学的にカップリングさせる。適当な細胞結合成分として、癌、ウイルスまたは寄生虫タンパク質に対する抗体が挙げられる。
細胞表面タンパク質に対する特異性を有する抗体を慣例の方法で作製する。哺乳類（マウス、ハムスターまたはウサギなど）を、哺乳類に抗体応答を引き出す、免疫原体のペプチドで免疫感作することができる。ペプチドに免疫原性を付与する技術は、担体への複合などがあり、その他のものも当業界で公知である。たとえば、アジュバントの存在下でペプチドを投与する。免疫感作の進行は、血漿または血清中の抗体の検出によってモニターすることができる。標準的ＥＬＩＳＡまたは他のイムノアッセイ操作を、抗原としての免疫原に対して用い、抗体の濃度を評価することができる。免疫感作後、抗血清が得られ、要すれば、該抗血清からポリクローナル抗体を単離することができる。
モノクローナル抗体を産生するために、抗体産生細胞（リンパ球）を免疫感作した動物から採取し、標準的体細胞融合操作により骨髄腫細胞と融合させて、これらの細胞を不死化し、ハイブリドーマ細胞を得る。このような技術は当業界で公知であり（ハイブリドーマ技術は、最初、KohlerおよびMilstein（Nature ２５６：４９５−４９７（１９７５））によって発展した）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術などの他の技術（KozborらのImmunol. Today ４：７２（１９８３））、ヒトモノクローナル抗体を産生するＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（ColeらのMonoclonal Antibodies in Cancer Therapy Allen R., Bliss, Inc., pages ７７−９６（１９８５））および組み合わせ抗体ライブラリーのスクリーニング（HuseらのScience ２４６：１２７５（１９８９））なども同様である。ハイブリドーマ細胞を免疫化学的にスクリーニングして、ペプチドと特異的に反応する抗体を産生し、該モノクローナル抗体を単離することができる。
本明細書において“抗体”は、それらも細胞表面成分と特異的に反応する、抗体フラグメントを含む。抗体は、慣例の技術を用いてフラグメント化することができ、前記と同じ作法で実用性のあるフラグメントをスクリーニングすることができる。たとえば、抗体をペプシンで処理することにより、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを作製することができる。得られるＦ（ａｂ’）２フラグメントを、ジスルフィド結合橋を弱めるように処理して、Ｆａｂ’フラグメントを作製する。
キメラ抗体誘導体、すなわち非ヒト可変領域およびヒト定常領域を組み合わせている抗体分子もまた本発明に含まれる。キメラ抗体分子は、たとえば、マウス、ラットまたは他の種の抗体由来の抗原結合ドメインとヒト定常領域を含むことができる。慣例の方法を用いて、細胞表面抗原を認識する免疫グロブリン可変領域を含むキメラ抗体を作製する（MorrisonらのProc. Natl. Acad.Sci. U.S.A.８１：６８５１（１９８５）；TakedaらのNature ３１４：４５２（１９８５），CabillyらのU.S.Patent No.４８１６５６７；BossらのU.S. Patent No.４８１６３９７；TanaguchiらのE.P. Patent No.１７１４９６；European patent No.１７３４９４，United Kingdom Patent No. GB ２１７７０９６Ｂ）を参照せよ）。キメラ抗体は、対応する非キメラ抗体よりも、ヒトにおいて免疫原性が弱いと予想される。
細胞表面成分に対して特異的に活性のあるモノクローナル抗体またはキメラ抗体を、ヒト定常領域キメラを産生することによって、さらにヒト化することができる。該キメラにおいては可変領域、特に抗原結合ドメインの保存されたフレームワーク領域は、ヒト由来であり、超可変領域のみが非ヒト由来である。このような免疫グロブリン分子は、公知の技術で製造することができる（たとえば、TengらのProc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,８０：７３０８−７３１２（１９８３）；KozborらのImmunology Today ４：７２７９（１９８３）；OlssonらのMeth. Enzymol.,９２：３−１６（１９８２），and PCT Publication WO ９２／０６１９３ or EP ２３９４００）。ヒト化抗体は、市販されているものもある（スコッチゲン・リミテッド、２ホリーロード、ツウィッケンハム、ミドルセックス、イギリス）。
細胞表面成分に対して活性のある特異的抗体または抗体フラグメントもまた、細胞表面成分をもつ細菌に発現した免疫グロブリン遺伝子をコードする発現ライブラリーまたはその一部をスクリーニングすることにより作製することができる。たとえば、完全Ｆａｂフラグメント、ＶＨ領域およびＦＶ領域を、ファージ発現ライブラリーを用いて、細菌内で発現させることができる（WardらのNature ３４１：５４４−５４６（１９８９）；HuseらのScience ２４６：１２７５−１２８１（１９８９）；and McCaffertyらのNature ３４８：５５２−５５４（１９９０）を参照せよ）。別法として、たとえば、Genpharmによって開発されたモデルであるＳＣＩＤ−ｈｕマウスを用いて、抗体またはそのフラグメントを産生することができる。
本発明のタンパク質は、インビボ投与に適した生体適合性の剤形で患者に投与するための医薬組成物に配合することができる。“インビボ投与に適した生体適合性の剤形”とは、物質が、治療的効果がいかなる毒性効果にもまさるような、剤形であることを意味する。物質は、ヒトおよび動物などの生命体に投与される。本発明化合物の治療上有効量の投与とは、所望の結果に到達するのに必要な、１投与あたりの有効量、回数および投与期間として定義される。たとえば、治療上有効量の物質は、個々の患者の疾患の状態、年齢、性別および体重、ならびに所望の応答を個々の患者に誘発する抗体の能力などの多くのファクターによって変化する。投与処方筆は最適治療応答が得られるように調整する。たとえば、１日あたり数回の分割投与で投与するかまたは治療情況の緊急性に応じて減少させる。
本発明の核酸分子は、インビボ投与に適した生体適合性の剤形で患者に投与するための医薬組成物に配合することができる。“インビボ投与に適した生体適合性の剤形”とは、物質が、治療的効果がいかなる毒性効果にもまさるような、剤形であることを意味する。物質は、ヒトおよび動物などの生命体に投与される。本発明化合物の治療上有効量の投与とは、所望の結果に到達するのに必要な、１投与あたりの有効量、回数および投与期間として定義される。たとえば、治療上有効量の物質は、個々の患者の疾患の状態、年齢、性別および体重、ならびに所望の応答を個々の患者に誘発する抗体の能力などの多くのファクターによって変化する。投与処方箋は最適治療応答が得られるように調整する。たとえば、１日あたり数回の分割投与で投与するかまたは治療情況の緊急性に応じて減少させる。
該有効物質は、注射（皮下、静脈内、筋肉内など）、経口投与、吸入、経皮投与（局所投与用クリーム剤または軟膏剤など）または座剤などの簡便な作法で投与することができる。投与経路に応じて、酵素、酸およびその他の化合物を不活性化する天然条件作用から保護するための素材で有効物質を化合物をコートする。
組成物は、有効量の有効物質が医薬的に許容しうるビヒクルとの混合物として、患者に投与しうる医薬的に許容しうる組成物の製造用の本質的に公知の方法で製造することができる。適当なビヒクルが、Remington’s Pharmaceutical Science（Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mark Publishing Company, Easton, Pa., USA １９８５）などに記載されている。これに基づいて、組成物には、１種または２種以上の医薬的に許容しうるビヒクルまたは希釈剤と混合され、適当なｐＨで生理液と浸透圧が同じ緩衝液に混合された有効物質の溶液が含まれる。
医薬組成物は、哺乳類（好ましくはヒト）を含む動物の癌またはウイルスもしくは寄生虫感染の治療方法に用いることができる。該組成物生物は、Ｂ細胞リンパ球増殖疾患、（黒色腫）、単核細胞症、巨細胞封入体疾患、マラリア、疱疹、帯状疱疹、肝炎、ポリオ脊髄炎または感染性咽喉気管炎の患者の治療に特に有用であることが予想される。投与される組換えタンパク質の投与量およびタイプは、ヒト患者において容易にモニターしうる種々のファクターに依存している。このような、ファクターとしては、悪性新生物の病因および重篤度（程度および段階）、マラリア感染の段階（赤血球段階対赤外段階など）または患者の組織または循環液中のウイルスに関連する抗原の濃度が挙げられる。
上述したように、本発明の新規組換え毒性タンパク質および核酸分子は、細胞が、組換え毒性タンパク質のリンカー領域を切断しうる特異的プロテアーゼを含む、癌または感染細胞の治療に有用である。当業者であれば、一旦疾患関連プロテアーゼが同定されれば、多くの異なる組換え毒性タンパク質を作製することができる。たとえば、本発明の新規組換え毒性タンパク質および核酸分子は、ＣＮＳ腫瘍の治療に用いることができる。Mullerら（１９９３）には、ＣＮＳ腫瘍に罹った患者の大脳脊髄液中のインスリン型成長因子結合タンパク質３（ＩＧＦＢＰ−３）プロテアーゼが記載されている。Cohenら（１９９２）は、ＩＧＦＢＰ−３プロテアーゼ中の前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）を主張している。上記ｐＡＰ２９０構築物は、ＰＳＡの基質である。Conoverら（１９９４）は、カテプシンＤがＩＧＦＢＰ−３プロテアーゼであると主張している。ｐＡＰ２７６は、カテプシンＤの基質である。本発明の特定の用途の他の例は、カテプシンＤを産生することがわかっているヒトグリオームの治療である（Mikkelsen, T.らのJ. Neurosurge,８３：２８５−２９０（１９９５））。ｐＡＰ２１４および２７２は、カテプシンＢの基質である。
さらに、本発明の新規タンパク質および核酸分子は、嚢胞性線維症の治療に使用することができる。Hansenら（１９９５）には、過剰の非阻害好中球エラスターゼ（ＮＥ）を有する好中球優位性慢性炎症により、どのようにＣＦ経路が特徴付けられるのかが記載されている。ＣＦ喀痰中のＮＥ濃度は、正常喀痰中に見られる濃度の３５０倍である。ｐＡＰ２９４は好中球エラスターゼの基質である。
また、本発明の新規タンパク質および核酸分子は、多発性硬化症の治療に用いることができる。Bever Jr.ら（１９９４）は、多発性硬化症に見られる脱ミエリン化におけるカテプシンＢ（血液原性起源の炎症細胞からかもしれない）について言及している。ｐＡＰ２１４および２７２はカテプシンＢの基質である。
“動物”は、哺乳類を含む動物界のすべての構成員を意味する。ヒトが好ましい。
以下の非制限的実施例において本発明を説明する。
実施例
実施例1
疾患特異的プロテアーゼにより活性化されるプロリシン変異体のクローニングおよび発現
全RNAの単離
プレプロリシン遺伝子を、トウゴマ植物の新葉からクローン化した。全メッセンジャーRNAを確立された方法に従って単離し（Sambrook et al., Molecular Cloning: A Lab Manual（Cold Spring Harbour Press, Cold Spring Harbour, （1989））、逆転写酵素を使用してcDNAを産生した。
cDNA合成：
プレプロリシン遺伝子の5’および3’末端に対応するオリゴヌクレオチドを合成し、遺伝子のPCR増幅に使用した。プレプロリシンのcDNAの配列を使用して（Lamb et al., Eur. J. Biochem, 145:266-270, 1985）、数個のオリゴヌクレオチドプライマーを、プレプロリシンオープンリーディングフレームの開始および停止コドンを備えるように設計した。オリゴヌクレオチドを、Applied Biosystems Model 392 DNA/RNA Synthesizerを使用して合成した。第1鎖cDNA合成は、オリゴヌクレオチドRicin1729C（表1）を使用して準備した。3種の微生物の全RNAを、製造者のプロトコールに従って、Superscript II Reverse Transcriptase（BRL）を使用したcDNAのオリゴRicin1729C準備合成の鋳型として使用した。
DNA増幅およびクローニング
第1鎖cDNA合成反応を、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によるDNA増幅の鋳型として使用した。プレプロリシンcDNAを、上流プライマーRicin-99および下流プライマーRicin1729Cと、Vent DNAポリメラーゼ（New England Biolabs）を使用して、標準法を使用して増幅した（Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition,（Cold Spring Harbpr Laboratory Press, 1989））。増幅は、Biometraサーマルサークラー（TRIO-Thermalcycler）で、以下のサイクリングパラメーターを使用して行った：変性95℃、1分、アニーリング52℃、1分および伸長72℃、2分（33サイクル）、続いて最終伸長サイクル72℃、10分。1846bp増幅生産物をアガロースゲル（Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition,（Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989））に分画し、製造者のプロトコールに従って、Qiaex樹脂（Qiagen）を使用してDNAをゲル切片から精製した。プレプロリシンcDNAをコードする精製PCRフラグメントを、次いで、Eco RV-消化pBluescript II SKプラスミド（Stratagene）にライゲートし（Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition,（Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989））、コンピテントXL1-Blue細胞（Stratagene）の形質転換に使用した。陽性クローンを精製プラスミドDNAの制限消化により確認した。プラスミドDNAを、Qiaprep Spin Plasmid Miniprep Kit（Qiagen）を使用して抽出した。
DNA配列決定
推定されるプレプロリシン遺伝子を含むクローン化PCR生産物を、完全cDNAクローン（pAP-144）のDNA配列決定により確認した。配列決定は、Applied Biosystems 373A Automated DNA Sequencerを使用して行い、Sequenaseキット（USB）を使用したSanger法により二本鎖ジデオキシ配列決定により確認した。配列決定に使用したオリゴヌクレオチドプライマーは下記の通りである：Ricin267、Ricin486、Ricin725、Ricin937、Ricin1151、Ricin1399、Ricin1627、T3プライマー（5’AATTAACCCTCACTAAAGGG−3’）（配列番号128）およびT7プライマー（5’GTAATACGACTCACTATAGGGC−3）（配列番号129）。配列データは、PC Geneソフトウェアパッケージ（intelligenetics）を使用して編集および分析した。オリゴヌクレオチドプライマーの配列および位置を表1に示す。表1に示すオリゴヌクレオチドプライマーは、以下のID番号を使用する：
Ricin-109は、本明細書で配列番号130と呼ぶ；
Ricin-99Ecoは、本明細書で配列番号131と呼ぶ；
Ricin267は、本明細書で配列番号132と呼ぶ；
Ricin486は、本明細書で配列番号133と呼ぶ；
Ricin725は、本明細書で配列番号134と呼ぶ；
Ricin937は、本明細書で配列番号135と呼ぶ；
Ricin1151は、本明細書で配列番号136と呼ぶ；
Ricin1399は、本明細書で配列番号137と呼ぶ；
Ricin1627は、本明細書で配列番号138と呼ぶ；
Ricin1729Cは、本明細書で配列番号139と呼ぶ；そして
Ricin1729C Xbaは、本明細書で配列番号140と呼ぶ。
リンカー変異体の製造およびクローニング
EcoRIで切断したpAP144を、Ricin109-Ecoオリゴヌクレオチド（Ricin-109Ecoプライマー：5−GGAGGAATCCGGAGATGAAACCGGGAGGAAATACTATTGTAAT−3（配列番号141））およびリンカーの5’側半分のための変異誘発プライマーならびにRicin1729PstIプライマー（Ricin1729-PstI：5−GTAGGCGCTGCAGATAACTTGCTGTCCTTTCAG−3（配列番号142））およびリンカーの3’側半分のための変異誘発プライマーを用いたPCR対の標的に使用した。PCRに使用したサイクリング条件は、98℃、2分：98℃、1分、52℃、1分、72℃、1分15秒（30サイクル）；72℃、1分；4℃浸漬であった。次いで、PCR生産物をEcoRIおよびPstIで各々消化し、アガロースゲルで電気泳動し、バンドをグラスウールスピンカラムを介して精製した。PCR生産物ペア（新リンカーの半分に対応する）およびEcoRIおよびPstIで消化したpVL1393の3種のライゲーションを行った。組換えクローンを、プラスミドミニプレップDNAの制限消化により同定し、変化したリンカーをDNA配列決定により確認した。クローニング概念に関して、図45参照。組換えクローンを、ミニプレップDNAの制限消化により同定し、変化したリンカーをDNA配列決定により確認した。全ての変化したリンカー変異体が、直接pVL13932ベクターにクローン化されるため、奇数番号pAPはもはや必要ないか製造しないことを注意する。
組換えバキュロウイルスの単離
昆虫細胞S. frugiperda（Sf9）およびTricoplusia ni（Tn368およびBTI-TN-581-4（High Five））を、10％全ウシ血清を添加したEX-CELL  405培地に維持した（Summers et al., A Manual of Methods of Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures,（Texas Agricultural Experiment Station, 1987））。組換えpVL1393  DNAの2マイクログラムをBaculoGosd  AcNPV  DNA（Pharmingen）0.5マイクログラムと共に、製造者の指示に従って（Gruenwald et al., Baculovirus Expression Vector System: Procedures and Methods Manual, 2nd Edition,（San Diego, CA, 1993））、2×106個のTn368細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション後5日に、培地を遠心し、上清を限界希釈アッセイでTn368細胞に関して試験した（Summers et al., A Manual of Methods of Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures,（Texas Agricultural Experiment Station, 1987））。上清中の組換えウイルスを、次いで、Tn368細胞を、感染効率（moi）0.1で感染することにより増幅させ、続いて3から5日に上清を回収した。合計3ラウンドの増幅を、確立された方法に従って各組換え体で行った（Summers et al., A Manual of Methods of Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures,（Texas Agricultural Experiment Station, 1987およびGruenwald et al., Baculovirus Expression Vector System: Procedures and Methods Manual, 2nd Edition,（San Diego, CA, 1993））。
変異プロリシンの発現
組換えバキュロウイルスを、スピナフラスコ中、25mM  α−ラクトース添加EX-CELL  405培地（JRH Biosciences）で9のmoiで1×107  Tn368またはsf9細胞を感染するのに使用した。変異プロリシン含有培地上清を、感染後3から4日に回収した。
実施例2
プロリシン変異体の回収および親和性カラム精製
タンパク質サンプルを、トランスフェクション3日後に回収した。細胞を培地を8288g、10分、GS3（Sorvall）遠心ローターを使用して遠心して除去した。上清を、更にSLA-1500ローター（Sorvall）を使用して、４５分、25400gで遠心することにより浄化した。プロテアーゼ阻害剤フェニルメチルスルホニルフルオリド（Sigma）を、最終濃度1mMでゆっくり添加した。更に、サンプルをラクトースを20mM（発現培地に含まれていた先のラクトースを含まない）の濃度に添加することにより調製した。サンプルを、Prep/Scale-Tff Cartridge（2.5ft、10K再生セルロース（Millipore））およびMasterflexポンプを使用して、700mLまで濃縮した。次いで、サンプルを1×カラム緩衝液（50mM  Tris、100mM  NaCl、0.02％  NaN3、pH7.5）中で2日間、透析試験管（10K MWCO、32mmフラットワイズ（Spectra/Por））を使用して透析した。続いて、サンプルをSLA-1500ローター（Sorvall）を使用して、45分、25400gで遠心することにより浄化した。
遠心に続いて、サンプルを脱気し、4℃で、20mLのa−Lactose Agarose Resin（Sigma）を含むXK26/20（Pharmacia）カラム（Pharmacia蠕動ポンプに接続、Pharmacia Single-path Monitor UV-1 Control and Optical Units, and Bromma LKB 2210 2-Channel Recorder）に付した。カラムを3時間、1×カラム緩衝液で洗浄した。プロリシン変異体の溶出を、再びベースラインが保たれるまで、緩衝液（1×カラム緩衝液（0.1％  NaN3）、100mM  ラクトース）で溶出することにより行った。サンプルを、YM10 76mm膜を備えたAmicon 8050濃縮器（Amicon）を使用して、アルゴンガスをチャンバーの加圧に使用して濃縮した。更にサンプルを、製造者の仕様書に従って、Centricon 10（Millipore）濃縮器で濃縮した。
ゲル濾過クロマトグラフィーによる変異体pAP−タンパク質の精製
プロリシン変異体を加工物質から発酵中に精製するために、タンパク質を、100mMラクトースおよび0.1％β−メルカプトエタノール（βME）含有50mM  Tris、100mM  NaCl、pH7.5で平衡化した直列に接続されたSUPERDEX 75（16/60）カラムおよびSUPERDEX 200（16/60）カラム（Pharmacia）に付した。カラムの流速は0.15mL／分であり、フラクションは25分毎に回収した。UV（280nm）追跡を、精製pAP−タンパク質のおよその位置の決定に使用し、このようにしてウエスタン分析のためのサンプルを決定した。
カラムフラクションのウエスタン分析
SUPERDEXカラム（Pharmacia）から溶出したフラクションを、標準ウェスタンブロッティング法を使用して、純度を分析した。各フラクション由来の10μLのアリコート1×サンプル緩衝液（62.6mM  Tris−Cl、pH6.8、4.4％βME、2％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、5％グリセロース（全てSigmaから）および0.002％ブロモフェノールブルー（Biorad））中で5分沸騰させた。変性サンプルを12％Tris−Glycine Gels（Biorad）に、50ngのRCA60（Sigma）および5μLの万華鏡前染色標準（kaleidoscope prestained standards）（Biorad）と共に流した。電気泳動を90分、100Vで25mM  Tris−Cl、pH8.3、0.1％SDSおよび192mMグリシン中、BioRad Mini Protean IIセル（Biorad）を使用して行った。
電気泳動に続いて、ゲルを数分伝達緩衝液（48mM Tris、39mMグリシン、0.0375％  SDSおよび20％メタノール）で平衡化した。PVDF Biorad膜を1分、100％メタノールに予浸し、ddH2Oおよび2分転移緩衝液で濯いだ。ワットマン紙を短く転移緩衝液に浸した。ワットマン紙5片、膜、ゲルおよび更に5片のワットマン紙をPharmacia Novablot転移装置（Pharmacia）の底カソード（アノード）に配置した。転移は1時間、一定電流（2mA／cm2）であった。
電位を膜上の予備染色標準の出現の調査により確認した。膜の非特異的部位を、ブロットを30分、1×リン酸緩衝食塩水（1×PBS；137mM  NaCl、2.7mM  KCl、8mM  Na2HPO4、1.5mM  KH2PO4、pH7.4）と5％スキムミルク粉末（Carnation）でインキュベートすることによりブロックした。一次抗体（ウサギα−リシン、Sigma）を、0.1％トゥイン20（Sigma）および2.5％スキムミルク含有1×PBSで1：3000に希釈し、オービタル・シェーカー（VWR）で45分、ブロットとインキュベートした。非特異的結合一次抗体を、ブロットを10分、0.2％トゥイン20含有1×PBSで洗浄することにより除去した。これを4回繰り返した。二次抗体ロバ抗ウサギ（Amesham）を、ブロットと一次抗体と同じ条件下でインキュベートした。過剰の二次抗体を上記のように洗浄した。ブロットを、ECL Western Blotting検出試薬で、製造者の指示に従って現像した。ブロットをMedtecのFull Speed Blue Film（Medtee）またはAmershamのECL Hyperfilm（Amersham）に1秒から5分曝した。フィルムをKODAK Automatic Developerで現像した。
プロリシン変異体のレクチン結合能の決定
Immulon2プレート（VDVR）をアシアロフェツイン10μg／mLの100μl／ウェルでコートし、一晩4℃で放置した。プレートを3×300μl／ウェルのddH2Oで、自動プレート洗浄器（BioRad）を使用して洗浄した。プレートを1時間、37℃で、300μL／ウェルの1％卵白アルブミン含有PBSの添加によりブロックした。プレートを上記のように洗浄した。プロリシン変異体pAP−タンパク質を、1×Baculo中の種々の希釈でプレートに加えた。1−10ngのRCA60（Sigma）の標準曲線をまた包含させた。プレートを1h、37℃でインキュベートした。プレートを上記のように洗浄した。抗−リシンモノクローナル抗体（Sigma）を、0.5％卵白アルブミンおよび0.1％トゥイン20含有1×PBSで1：3000に希釈し、100μL／ウェルで添加し、1h、37℃でインキュベートした。プレートを上記のように洗浄した。ロバ−抗ウサギポリクローナル抗体を、0.5％卵白アルブミン、0.1％トゥイン20含有1×PBSで1：3000に希釈し、100μL／ウェルで添加し、1h、37℃でインキュベートした。プレートを上記のように最後の洗浄をした。基質をプレートに100μL／ウェル（1mg／ml  o−フェニレンジアミン（Sigma）、1μL／ml  H2O2）を添加し、25μLの停止溶液（20％H2SO4）を添加して、吸光度（A490nm−A630nm）をSPECTRA MAX 340プレートリーダー（Molecular Devices）を使用して読んだ。
ウサギ網状赤血球を使用したpAP−タンパク質活性の測定
リシンサンプルを還元のために調製した。
A）  RCA60＝3,500ng／μLのRCA60＋997μL  1×Endo緩衝液（25mM  Tris、25mM  KCl、5mM  MgCl2、pH7.6）
還元＝95μLの10ng／μL＋5μL  β−メルカプトエタノール
B）  リシン変異体
還元＝40μL変異体＋2μL  β−メルカプトエタノール
リシン標準および変異体を30分、室温でインキュベートした。
リシン−ウサギ網状赤血球溶解物反応
必要な数の0.5mL試験管を標識した。（各サンプル2本の試験管、＋および−アニリン）。各サンプルの試験管に20μLの1×endo緩衝液を添加し、30μLの緩衝液をコントロールに添加した。サンプル試験管に、10μLの10ng／μL  Ricinまたは10μLの変異体を添加した。最後に、30μLのウサギ網状赤血球溶解物を全試験管に添加した。サンプルを、30分、30℃でサーマル・ブロックを使用してインキュベートした。サンプルをエッペンドルフ試験管から除去し、中身を1mLのTRIZOL（Gibco）含有1.5mL試験管に添加した。サンプルを15分、室温でインキュベートした。インキュベーション後、200μLのクロロホルムを添加し、サンプルをボルテックス処理し、12,000gで15分、4℃で回転させた。サンプル由来の最上水性相を除去し、中身を500μLのイソプロパノール含有1mL試験管に添加した。サンプルを15分、室温でインキュベートし、次いで12,000で15分、4℃で遠心した。上清を除去し、ペレットを1mLの70％エタノールで洗浄した。12,000g、5分、4℃での遠心により、RNAが沈殿した。全てのしかし約20μLの上清を除去し、空気乾燥させた。他のサンプル（＋アニリンサンプル）由来のペレットを20μLのDEPC処理ddH2Oに溶解した。1Mアニリン（蒸留）の80μLのアリコートを2.8M酢酸と共に、これらのRNAサンプルに添加し、新しい0.5mL試験管に移した。サンプルを暗所で3分、60℃でインキュベートした。RNAを、100μLの95％エタノールおよび5μLの3M酢酸ナトリウム、pH  5.2を各試験管に添加し、12,000gで30分、4℃で遠心することにより沈殿させた。ペレットを1mL  70％エタノールで洗浄し、再び12,000g、5分、4℃で遠心し、RNAを沈殿させた。上清を除去し、空気乾燥した。これらのペレットを10μLの0.1×E緩衝液に溶解させた。全てのサンプルに、10μLのホルムアミドローディング色素を添加した。RNAはしご（8μLのはしご＋8μLのローディング色素）をまた包含させた。サンプルを2分、70℃でサーマルブロックでインキュベートした。電気泳動を、0.1×E緩衝液＋0.2％SDS中の1.2％アガロース、50％ホルムアミドゲルを使用して行った。ゲルを90分、75ワットで流した。RNAを、ゲルを、流動用緩衝液中の1μg／μL臭化エチジウムで45分染色した。ゲルを302nm  UVボックスで試験し、ゲル考証システムを使用して撮影し、コンピューターディスクに保存した。
結果：
タンパク質発現収率
アリコートを回収／精製の各中断で取り、試験した。官能的リシン変異体の収率をELISAによって測定した。感染T. ni細胞の2400mL予備試験の典型的結果を下に示す：
0004566290.tif 000002
収率：  1058／6000＝17.6％
pAP−タンパク質の精製およびカラムフラクションのウェスタン分析
部分的に精製したpAP−タンパク質を、直列に接続したSuperdex 75および200（16/60）カラムに付し、汚染された非特異的加工pAP−タンパク質を除去した。溶出フラクションを、上記のようにウェスタン分析で試験し、最も純粋なタンパク質を含むフラクションを貯蔵し、濃縮し、カラムに再び付した。変異体を合計3回カラムに付した。最終精製pAP−タンパク質は、1％以下の加工変異体を含んだ。
精製pAP−タンパク質を、特定のプロテアーゼによる切断への感受性およびプロリシン変異体A鎖の活性化を試験した（タンパク質合成の阻害）。典型的に、pAP−タンパク質を一定時間プロテアーゼ有りおよび無しでインキュベートし、次いで電気泳動し、ブロットした。切断pAPは、還元（SDS-PAGE）条件下で二つの30kDaタンパク質（Bが僅かに大きい）として流れる。リンカー領域を含む非加工pAP−タンパク質は、60kDaで流れる。
特異的プロテアーゼによるpAP−タンパク質変異体の活性化
プロテアーゼ処理pAP−タンパク質の活性化は、May et al.（EMBO Journal. 8, 301-8, 1989）の方法に基く。中間リンカーの切断によるリシンA鎖の活性化は、28Sまたは26S  rRNAのアデノシン4325残基の触媒的脱プリンをもたらす。この脱プリンにより、分子は、修飾部位のいずれかの側のホスホジエステル結合の、アニリンによるアミン−触媒加水分解に感受性となる。結果は、診断的390塩基バンドである。このように、網状赤血球リボソームを生化学的に精製したリシンA鎖とインキュベートし、単離rRNAのアニリン処理により特徴的RNAフラグメントを放出する（May, M. J. et al. Embo. Journal, 8:301-308の302-303（1989））。アッセイが、特定の変異リンカー配列を含む無傷単位から切断されたリシンA鎖の活性化の測定を可能にするのがこの根拠である。
実施例3
プロリシン変異体のインビトロプロテアーゼ消化：
親和性精製プロリシン変異体を個々の疾患特異的プロテアーゼで処理し、リンカーの領域特異的切断を確認した。リシン様毒素変異体を、100mMラクトース含有プロテアーゼ消化緩衝液（50mM  NaCl、50mM  Na−酢酸、pH5.5、1mMジチオスレイトール）中のラクトース−アガロースマトリックスから溶出する。プロリシン基質を、次いで、37℃で60分、疾患特異的プロテアーゼとインキュベートする。リシンAおよびB鎖を含む切断生産物を、SDS/PAGE（Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd. ed., Cold Spring Harbor Press, 1989）、続いて抗−リシン抗体（Sigma）を使用してウェスタンブロットを使用して同定する。
カテプシンBは、MedcorまたはCalbiochemから得られ得る。マトリックスメタロプロテイナーゼを、実質的に、Lark, M. W. et al.（Proceedings of the 4th International Conference of the Imflammation Research Association Abstract 145（1988））およびWelch, A. R. et al.（Arch. Biochem. Biophys. 324:59-64（1995））に記載のように製造し得る。カンジダ酸プロテアーゼを、実質的にRemold, H. H. et al.（Biochim. Biophys. Acta 167:399-406（1968））、Ray, T. L. and Payne, C. D.（Infect. Immunol. 58:508-514（1990））およびFusek, M. et al.（FEBS Lett. 327:108-112（1993））に記載のように製造し得る。Ａ型肝炎プロテアーゼを、Jwewll, D. A. et al.（Biochemistry 31:7862-7869（1992））記載のように製造し得る。プラスモジウムプロテアーゼを、Goldberg, D. E. et al.（J. Exp. Med. 173:961-969（1991））およびCooper, J. A. and Bujard, H.（Mol. Biochem. Parasitol. 56:151-160（1992））に記載のように製造し得る。
インビトロ細胞毒性アッセイ：
ヒト卵巣癌細胞（例えば、MA148）を96ウェル平底プレートに蒔き、リシン様毒素変異体またはコントロール培地に37℃で16時間曝す。癌細胞の生存率を、［35S］メチオニン取りこみの測定により決定し、これは毒素変異体で処理したウェルが、コントロール培地でのものより有意に低い。
インビトロ癌生育阻害アッセイ：
ヒト乳癌（例えばMCF-7）細胞を10％ウシ胎児血清を含む適当な培地に維持する。細胞を生育させ、回収し、続いて卵巣切除した無胸腺ヌードマウスに皮下的に注射する。腫瘍サイズを、一定間隔で、カリパスを使用した二つの直角測定を測定することにより決定する。マトリックスメタロプロテイナーゼ−感受性リンカーを含むリシン様毒素変異体を投与された動物において、腫瘍サイズおよび腫瘍生育速度は、コントロールグループ動物より低い。
インビトロ腫瘍転移アッセイ：
転移実験を、実質的にHonn, K. V. et al.（Biochem. Pharmacol. 34:235-241（1985））に記載のように行う。生存可能B16aメラノーマ腫瘍細胞を調製し、同系マウスの左腋窩領域に皮下的に注射する。腫瘍転移の程度を4週間後に測定する。肺を動物から除去し、Bouinの溶液に固定し、肉眼的肺転移を解剖顕微鏡を使用して計数する。一般に治療的介入なしに、105の生存可能腫瘍細胞の注射は、約40−50の肺転移を形成する。カテプシンB感受性リンカーを含むプロリシン変異体で処理した動物の転移の数は、有意に低い。
実施例4
癌プロテアーゼカテプシンBまたはMMP-9によるプロリシン変異体のインビトロプロテアーゼ消化
癌プロテアーゼによるプロリシン消化の一般的プロトコールは実施例2および3に記載する。
カテプシンBプロリシン変異体のインビトロプロテアーゼ消化
親和性精製変異プロリシンを、個々の疾患特異的プロテアーゼで処理し、リンカー領域の特異的切断を確認する。プロリシン基質をカテプシンBプロテアーゼ緩衝液（50mM酢酸ナトリウム、2mM  EDTA、0.05％トリトン）で40℃で消化する。2時間および一晩（16時間）の消化反応を、100ngのプロリシン基質ならびに100および618ngのカテプシンBプロテアーゼを反応当り使用して行う（CALBIOCHEM, USA）。プロリシンの切断生産物（リシンAおよびB鎖）を、SDS/PAGE（Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory Manual, 2nd. ed., Cold Spring Harbor Press, 1989）を使用して同定し、続いて抗−リシン抗体（Sigma）を使用してウェスタンブロット分析する。
MMP-9プロリシン変異体のインビトロプロテアーゼ消化
親和性精製変異プロリシンを、個々の疾患特異的プロテアーゼで処理して、リンカー領域における特異的切断を確認する。プロリシン基質を1×カラム緩衝液（100mM  NaCl、50mM  Tris、pH7.5）で37℃で消化する。2時間および一晩（16時間）の消化反応を、50ngのMMP-9プロリシン基質ならびに20および200ngのMMP-9プロテアーゼを反応当り使用して設定する（CALBIOCHEM, USA）。プロリシンの切断生産物（リシンAおよびB鎖）を、SDS/PAGE（Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory Manual, 2nd. ed., Cold Spring Harbor Press, 1989）を使用して同定し、続いて抗−リシン抗体（Sigma）を使用してウェスタンブロット分析する。
リシン鎖のウェスタン分析のプロトコールは、実施例2に記載する。
結果
図48および49は、それぞれカテプシンB（pAP214）およびMMP-9（pAP220）によるプロテアーゼ−感受性リンカーの切断を示すウェスタンブロットを説明する。プロテアーゼ消化無しで、プロリシン変異体は約60kDaで単一バンドとして見える（図48のレーンBおよび図49のレーンA）。野性型リシンA鎖およびリシンB鎖は、約30kDaの二つの異なるバンドとして見える（図48のレーンAおよび図49のレーンE）。プロリシン切断の増加した程度は、プロリシン濃度の増加により明らかに見ることができる（図48のCおよびDならびに図49のレーンB−C）。
実施例5
対応するプロテアーゼによる種々のプロリシン変異体のインビトロプロテアーゼ消化
対応するプロテアーゼによるプロリシン消化の一般的プロトコールは、実施例2および3に記載してあり、下記の消化と関連して考慮すべきである。
マトリックスメタロプロテイナーゼ2（MMP-2）によるpAP-222タンパク質の切断
親和性精製変異プロリシンを個々の疾患特異的プロテアーゼで処理し、リンカー領域における特異的切断を確認する。
pAP-222タンパク質サンプル（1.0μg）をMMP-2プロテアーゼ（1.0μg）で一晩37℃で消化した。消化反応の総量は21.5μlであり、反応サンプルの0.250μgをタンパク質ゲルに充填した。MMP-2プロテアーゼはCalbiochem-Novabiochem Corporation, USAから購入した。
ヒトサイトメガロウイルス（HCMV）プロテアーゼによるpAP-248タンパク質の切断
親和性精製変異プロリシンを、個々の疾患特異的プロテアーゼで処理し、リンカー領域における特異的切断を確認する。
pAP-248タンパク質サンプル（1.19μg）を、HCMVプロテアーゼ（1.13μg）で一晩、37℃で消化した。消化の総量は10.5μlであり、0.279μgの反応サンプルをタンパク質ゲルに充填した。HCMVはBACHEM Bioscience Inc., USAから購入した。
A型肝炎ウイルス3C（HAV3C）プロテアーゼによるpAP-256タンパク質の切断
親和性精製変異プロリシンを、個々の疾患特異的プロテアーゼで処理し、リンカー領域における特異的切断を確認する。
pAP-256タンパク質サンプル（1.26μg）を、HAV3Cプロテアーゼ（5μg）で一晩、37℃で消化した。消化の総量は12.5μlであり、0.302μgの反応サンプルをタンパク質ゲルに充填した。HAC3Aプロテアーゼは、Bates Collage, Main, USAのG. Lawson博士からの贈り物であった。
マトリックスメタロプロテイナーゼ2（MMP-2）によるpAP-270タンパク質の切断
親和性精製変異プロリシンを、個々の疾患特異的プロテアーゼで処理し、リンカー領域における特異的切断を確認する。
pAP-270タンパク質サンプル（0.120μg）を、MMP-2プロテアーゼ（0.25μg）で一晩、37℃で消化した。消化の総量は22.5μlであり、0.106μgの反応サンプルをタンパク質ゲルに充填した。MMP-2プロテアーゼは、Calbiochem-Novabiochem Corporation, USAから購入した。
tPAプラスミノーゲン組織アクティベーターによるpAP-288タンパク質の切断
親和性精製変異プロリシンを、個々の疾患特異的プロテアーゼで処理し、リンカー領域における特異的切断を確認する。pAP-288タンパク質サンプル（1.65μg）を、t-PAプロテアーゼ（0.5μg）で一晩、37℃で消化した。消化の総量は55μlであり、0.6μgの反応サンプルをタンパク質ゲルに充填した。t-PAプロテアーゼは、Sigma Chemical Co., USAから購入した。
ヒト好中球エラスターゼによるpAP-294タンパク質の切断
親和性精製変異プロリシンを、個々の疾患特異的プロテアーゼで処理し、リンカー領域における特異的切断を確認する。
pAP-256タンパク質サンプル（0.6μg）を、エラスターゼプロテアーゼ（5μg）で1時間、25℃で消化した。消化の総量は52.5μlであり、0.171μgの反応サンプルをタンパク質ゲルに充填した。ヒト好中球エラスターゼプロテアーゼは、Cedarlane Laboratories Limited, Canadaから購入した。
カルパインによるpAP-296タンパク質の切断
親和性精製変異プロリシンを、個々の疾患特異的プロテアーゼで処理し、リンカー領域における特異的切断を確認する。pAP-296タンパク質サンプル（2.05μg）を、カルパインプロテアーゼ（10μg）で一晩、37℃で消化した。消化の総量は35μlであり、0.761μgの反応サンプルをタンパク質ゲルに充填した。カルパインプロテアーゼは、Sigma Chemical Co., USAから購入した。
結果
図52、54、58および66（MMP-2）、60、64および62は、HCMV、HAV3C、MMP-2、t-PA、カルパインおよびヒト好中球エラスターゼそれぞれによるリンカーのプロテアーゼの切断を示す。プロテアーゼ消化なしで、プロリシン変異体は約60kDaの単一バンドとして見える（図52に関してはレーンA；図54のレーンB；図58のレーンA；図60のレーンB；および図62のレーンC；図64のレーンBおよび図66のレーンB）。野性型リシン鎖AおよびBは、約30kDaの二つのバンドとして見られ（例えば、図52のレーンCおよびD）、プロリシン切断は各々のプロテアーゼにより消化されているタンパク質に関連して30kDaの出現により明らかに観察される（例えば、図52のレーンB；図54のレーンC；または図58のレーンB参照）。
実施例6
インビトロ翻訳アッセイ（癌プロテアーゼカテプシンBまたはMMP-9による活性化）
癌プロテアーゼ−活性化プロリシンの細胞毒性を試験するためのウサギ網状赤血球融解物反応の一般的プロトコールは、簡単に実施例3に、詳細に実施例2に記載する。
結果
May et al.（EMBO J. 8:301-3087, 1989）に基いたpAP214およびpAP220プロリシン変異体のカテプシンBおよびMMP-9による活性化は、それぞれ図50および51に説明する。390塩基対生産物の出現（陽性コントロール）は、図50のレーンFおよび図51のレーンGに観察される。この390塩基対生産物は、陰性コントロールレーンでは無い。カテプシンまたはMMP-9活性化なしで、pAP214変異体（図50のレーンHからL）またはpAP220変異体（図51のレーンAからE）のN-グリコシダーゼ活性は観察されないか最少であった。pAP214変異体およびpAP220変異体をカテプシンまたはMMP-9でそれぞれ活性化したとき、390塩基対生産物の出現が濃度依存的方法で見られた（図50のレーンAからEおよび図51のレーンHからL）。本実験シリーズは、癌関連プロテアーゼによる十分なそして選択的なプロリシン変異体の活性化を証明する。
実施例7
ウサギ網状赤血球融解物反応の一般的プロトコールは、簡単に実施例3に、詳細に実施例2に記載し、その全て下記の記載と合う。
消化および非消化リシン変異体によるウサギ網状赤血球28SリボソームRNAの脱プリン
先に疾患特異的プロテアーゼで消化した親和性精製変異プロリシン変異体を、5％2−メルカプトエタノールで還元し、次いで1×ENDO緩衝液（25mM  Tris  pH7.6、25mM  KCl、5mM  MgCl2）で100ng、14.2ng、2.0ng、291pgおよび41.7pgに希釈し、ウサギ網状赤血球融解物、未処理（Promega）と、30分、30℃でインキュベートした。消化と非消化プロリシン変異体を比較するために、消化緩衝液（特異的消化プロトコールに従う）中のプロリシンを、消化サンプルと同じ方法で処理した。陽性および陰性コントロールにおいて、10ngリシンA鎖および1×ENDO緩衝液を、連続して、ウサギ網状赤血球、未処理と30分、30℃でインキュベートした。
rRNAのアニリン切断およびゲル分画
全RNAを、次いで、網状赤血球融解物翻訳混合物から、Trizol試薬（Gibco-BRL）で、製造者の指示に従って抽出する。RNAを、80μlの1Mアニリン（蒸留）と、2.8M酢酸と3分、60℃で暗所でインキュベートした。エタノール沈殿RNAサンプルを、20μlの50％ホルムアミド、0.1×E緩衝液（3.6mM Tris、3mM NaH2PO4、0.2mM EDTA）および0.05％キシレンシアノールに溶解した。この10μlを70℃で2分加熱し、1.2％アガロース、0.1％E緩衝液および50％ホルムアミドゲルにRNA流動緩衝液（0.1×E緩衝液、0.2％SDS）とともに充填し、電気泳動した。
結果
pAP-248プロリシン変異体のHCMVによる；pAP-256のHAV3Cプロテアーゼによる；pAP-270のMMP-2プロテアーゼによる；pAP-288のt-PAによる；pAP-294のヒト好中球エラスターゼによる；pAP-296のカルパインによる；およびpAP-222のMMP-2による活性化を、図52、55、59、61、63、65および67にそれぞれ記載する。390塩基対生産物の出現（コントロールの付着）が図53、55、61、63、65および67のレーンLに見られる。390塩基対生産物は、図59のレーンAに見られる（MMP-2によるpAP-270の活性化）。この390塩基対生産物は、陰性コントロールレーンでは無い。特異的プロテアーゼ活性化なしで、消化していないプロリシン変異体のみを含むレーンで活性が見られないか最少である（図53、55、61、63、65および67のレーンA、B、C、DおよびE参照）。同じ観察が、図59のpAP-270に関連して成されるが、非消化レーンはH、I、J、KおよびLとして見られる。変異体をその各々のプロテアーゼで活性化したとき、390塩基対生産物の出現が、プロリシン濃度依存的方法で見られる（図53、55、61、63、65および67のレーンH、I、J、KおよびLおよび図59のレーンA、B、C、DおよびE参照）。本実験シリーズは、選択的対応プロテアーゼによる十分なそして選択的な同定プロリシン変異体の活性化を証明する。
実施例8
COS-1細胞系におけるリシンおよびリシン変異体の細胞毒性の実験法
細胞調製
1×PBS（0.137M  NaCl、2.68mM  KCl、8.10mM  Na2HPO4、1.47mM  KH2PO4）での洗浄後、対数増殖相の細胞をプレートから1×トリプシン／EDTA（Gibco/BRL）で除去した。細胞を1100rpmで3分遠心し、10％FBSおよび1×pen/strep含有ダルベッコ修飾イーグル培地に再懸濁し、次いで、血球計数器を使用して計数した。それらを5×104細胞・ml-1に調節した。100μl／ウェルの細胞を、Falcon96ウェル組織培養プレートのウェル2B−2Gからウェル9B−9Gに添加した。別の96ウェル組織培養プレートをリシンまたはリシン変異体の各サンプルで使用した。プレートを37℃で5％CO2と24時間インキュベートした。
毒素調製
リシンおよびリシン変異体を、0.22μmフィルター（Millipore）を使用して滅菌濾過した。滅菌サンプルの量を次いでA280により定量し、BCA測定（Pierce）により確認した。プロテアーゼでインビトロで消化した変異体に関して、消化を各プロテアーゼの消化法に記載のように行った。次いで、消化物を1000ng・ml-1希釈に希釈し、滅菌濾過した。pAp214の細胞毒性データにおけるリシンおよび非消化pAP214を、同じ方法で、しかしカテプシンB処理無しで処理した。リシンおよびリシン変異体を、以下の濃度に連続的に希釈した：10％FBSおよび1×pen/strep含有培地で1000ng・ml-1、100ng・ml-1、10ng・ml-1、1ng・ml-1、0.1ng・ml-1、0.01ng・ml-1、0.001ng・ml-1。
プレートへの毒素または変異体の適用
カラム2から9を標識した：連続的にコントロール、1000ng・ml-1、100ng・ml-1、10ng・ml-1、1ng・ml-1、0.1ng・ml-1、0.01ng・ml-1、0.001ng・ml-1。培地を全サンプルウェルから、多チャンネルピペットで除去した。変異体および毒素の各プレートに関して、50μlの培地をウェル2Bから2Gにコントロールとして添加し、50μlの各サンプル希釈を対応するカラムに添加した。pAP220＋MMP-9データに関して、プレートを1時間、37℃で5％CO2とインキュベートし、次いで1回洗浄し、培地を変え、次いで48時間、37℃で5％CO2とインキュベートした。pAP214＋カテプシンBデータに関して、毒素をプレートに残し、24時間、37℃で5％CO2とインキュベートし、次いでウェルに50μlの毒素含有培地を添加し、更に24時間、37℃で、5％CO2とインキュベートした。
サンプル適用
培地（および／または毒素）の全量を各ウェルから多チャンネルピペットで除去し、100μlの基質混合物に変えた（Promega Cell Titer 96 Aqueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay Kit）。プレートを37℃で5％CO2と2から4時間インキュベートし、続いて、Spectramax340  96ウェルプレートリーダーで490nmで読んだ。IC50値をGRAFITソフトウェアプログラムを使用して計算した。
結果
COS-1細胞とインキュベートしたpAP-214およびカテプシンBでの実験において、pAP-214単独とインキュベートした細胞が、細胞死にpAP-214が無関係であることを見ることができる（図56参照）。しかし、カテプシンBで消化したpAP-214の細胞毒性は、COS-1細胞でリシンコントロールと同様に行動する。これはまた図56に説明する。同様に、非消化pAP-220の細胞毒性は、COS-1細胞とインキュベートしたとき、MMP-9で消化したpAP-220とインキュベートしたCOS-1細胞で観察される細胞毒性より低い。実際、結果は、消化pAP-220の毒性が、リシンのものより大きいことを示す（図57参照）。
実施例9
種々の組織培養細胞系におけるリシンおよびリシン変異体の細胞毒性の試験法
細胞増殖
1×PBS（1.37M  NaCl、26.8mM  KCl、81mM  Na2HPO4、14.7mM  KH2PO4）で洗浄後、対数増殖相の細胞を10％FBSおよび1×トリプシン/EDTA含有培地（Gibco/BRL）から除去する。細胞を、1100rpmで3分遠心し、１×pen/strep含有培地に再懸濁し（試験する細胞系に依存して使用した培地）、次いで血球計数器を使用して計数した。それらを5×104細胞／ml-1に調節した（速い成長細胞系は、2×104細胞／ml-1に調節した）。100μl／ウェルの細胞を、Falcon96ウェル組織培養プレートのウェル2B−2Gからウェル9B−9Gに添加した。別の96ウェル組織培養プレートをリシンまたはリシン変異体の各サンプルで使用した。プレートを37℃で5％CO2と24時間インキュベートした。
毒素調製
リシンおよびリシン変異体を、0.22μmフィルター（Millipore）を使用して滅菌濾過した。滅菌サンプルの量を次いでA280により定量し、BCA測定（Pierce）により確認した。リシンおよびリシン変異体を、以下の濃度に連続的に希釈した：10％FBSおよび1×pen/strep含有培地で3000ng・ml-1、300ng・ml-1、30ng・ml-1、3ng・ml-1、0.3ng・ml-1、0.03ng・ml-1、0.003ng・ml-1。
プレートへの毒素または変異体の適用
カラム2から9を標識した：連続的にコントロール、0.001ng・ml-1、0.01ng・ml-1、0.1ng・ml-1、1ng・ml-1、10ng・ml-1、100ng・ml-1、1000ng・ml-1。変異体および毒素の各プレートに関して、50μlの培地をウェル2Bから2Gにコントロールとして添加し、50μlの各サンプル希釈を、細胞100μl／ウェルを含む対応するカラムに添加した（即ち、50μlの3000ng・ml-1希釈をカラム9のB−Gに添加、1000ng・ml-1で標識）。プレートを、24時間、37℃で、5％CO2とインキュベートした。
サンプルの適用
140μl量を各ウェルから多チャンネルピペットで除去し、100μlの基質混合物に変えた（Promega Cell Titer 96 Aqueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay Kit）。プレートを37℃で5％CO2と2から4時間インキュベートし、続いて、Spectramax340  96ウェルプレートリーダーで490nmで読んだ。IC50値をGRAFITソフトウェアプログラムを使用して計算した。
結果
表2に関して、細胞の生存がプロリシン変異体および細胞タイプにより産生される細胞特異的プロテアーゼに相関していることを見ることができる。例えば、HT1080細胞系において、pAP-214およびpAP-220の両方が同じレベルの細胞毒性を達成するために、リシンの2−1／2倍の量のみを必要とする。一方、pAP-224は、同じレベルの細胞死を達成するために、リシンの193倍の量を必要とする。同様に、カテプシンDの発現が見られるところの細胞において、pAP-214および220が、リシンよりも細胞死をもたらすことにより有効であり、pAP-224よりも有効であることを見ることができる。本実験で使用した種々の細胞タイプの詳細に関しては、下に概説する。
COS-1（ミドリザル腎臓細胞）
これは、確立された類人猿細胞CV-1から調製したSV40形質転換細胞系である（参考文献：Gluzman, Y.（1975）Cell, 23, 175-182）（ATCC CRL 1650）。
HT-1080ヒト線維肉腫
（ATCC CCL 121）本細胞系は、活性MMP-9を組織培養で産生することが示された。参考文献：Moore et al.（1997）Gynecologic Oncology 65, 83-88。
9Lラット神経膠芽細胞腫
神経膠芽細胞腫は、一般にカテプシンB発現に関する。カテプシンB発現のレベルが、悪性の進行の程度に対応し、即ち、低グレード神経膠腫および正常脳組織で、神経膠芽細胞腫では、未分化星状細胞腫よりも最大レベルである。9L細胞系は、B. C. Cancer AgencyのWilliam Jia博士から提供された。参考文献：Mikkelsen et al.（Aug. 1995）Journal of Neurosurgery 83（2）, 285-290。Nakano et al.（1995）J. of Neurosurgery 83（2）, 298-307。
MCF-7ヒト乳癌細胞系（上皮系）
（ATCC CRL 1555）エストロゲン非存在下で、カテプシンBは製造細胞に関して上昇を示さない。エストロゲンによりカテプシンDの産生を誘導できる。MMP-9細胞の製造は未知である。
好ましい態様により本発明の原則を説明し、記載したが、当業者は、本発明が、このような原則から逸脱することなく、計画や詳細を修飾できることを認識する。我々は、以下の請求の範囲の範囲に入る全ての修飾を請求する。
本明細書に引用の全ての刊行物、特許および特許出願は、個々の刊行物、特許または特許出願を、具体的におよび個々に、引用してその全体を包含させると示したのと同じ程度に、引用して本明細書にその全体を包含させる。
本明細書に記載のある引用文献に関する完全な引証
Bever Jr., C. T., Panitch, H.S., and Johnson, K.P.（1994）Neurology 44（4）, 745-8. Increased cathepsin B activity in peripheral blood mononuclear cells of multiple sclerosis patients.
Cohen, P., Graves, H.C., Peehl, D.M., Kamarei, M., Giudice, L.C., and Rosenfeld, R.G.（1992）Journal of Clinal Endocrinology and Metabolism 75,（4）, 1046-53. Prostate-specific antigen（PSA）is an insulin-like growth factor binding protein-3 protease found in seminal plasma.
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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0004566290.tif 000065
【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
0004566290.tif 000069
0004566290.tif 000070
【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
0004566290.tif 000072
【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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0004566290.tif 000080
【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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0004566290.tif 000095
【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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0004566290.tif 000100
【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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0004566290.tif 000105
【図２１】
0004566290.tif 000106
【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２２Ｄ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２４Ｄ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２５Ｄ】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３０Ｃ】
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【図３０Ｄ】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３１Ｃ】
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【図３１Ｄ】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３２Ｃ】
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0004566290.tif 000146
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【図３２Ｄ】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３３Ｃ】
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【図３３Ｄ】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３４Ｃ】
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【図３４Ｄ】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３５Ｃ】
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【図３５Ｄ】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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【図３６Ｃ】
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【図３６Ｄ】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３７Ｃ】
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【図３７Ｄ】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
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【図３８Ｃ】
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0004566290.tif 000182
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【図３８Ｄ】
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【図３９Ａ】
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【図３９Ｂ】
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【図３９Ｃ】
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0004566290.tif 000188
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【図３９Ｄ】
0004566290.tif 000190
【図４０Ａ】
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【図４０Ｂ】
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【図４０Ｃ】
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【図４０Ｄ】
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【図４１Ａ】
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【図４１Ｂ】
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【図４１Ｃ】
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0004566290.tif 000200
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【図４１Ｄ】
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【図４２Ａ】
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【図４２Ｂ】
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【図４２Ｃ】
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【図４２Ｄ】
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【図４３Ａ】
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【図４３Ｂ】
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【図４３Ｃ】
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【図４３Ｄ】
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【図４４Ａ】
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【図４４Ｂ】
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【図４４Ｃ】
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【図４４Ｄ】
0004566290.tif 000220
【図４５Ａ】
0004566290.tif 000221
【図４５Ｂ】
0004566290.tif 000222
【図４５Ｃ】
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0004566290.tif 000224
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【図４５Ｄ】
0004566290.tif 000226
【図４６Ａ】
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【図４６Ｂ】
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【図４６Ｃ】
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0004566290.tif 000230
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【図４６Ｄ】
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【図４７Ａ】
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【図４７Ｂ】
0004566290.tif 000234
【図４７Ｃ】
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【図４７Ｄ】
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【図４８】
0004566290.tif 000239
【図４９】
0004566290.tif 000240
【図５０】
0004566290.tif 000241
【図５１】
0004566290.tif 000242
【図５２】
0004566290.tif 000243
【図５３】
0004566290.tif 000244
【図５４】
0004566290.tif 000245
【図５５】
0004566290.tif 000246
【図５６】
0004566290.tif 000247
【図５７】
0004566290.tif 000248
【図５８】
0004566290.tif 000249
【図５９】
0004566290.tif 000250
【図６０】
0004566290.tif 000251
【図６１】
0004566290.tif 000252
【図６２】
0004566290.tif 000253
【図６３】
0004566290.tif 000254
【図６４】
0004566290.tif 000255
【図６５】
0004566290.tif 000256
【図６６】
0004566290.tif 000257
【図６７】
0004566290.tif 000258