(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者に投与するための90Yによってキレーター結合抗体または抗体断片を放射ラベルするための方法であって、
(i)MX-DTPA、フェニル-DTPA、ベンジル-DTPA、CHX-DTPA、DOTAおよびその誘導体から成る群から選択される二官能価キレーターに結合した抗体または抗体断片を、90Yまたはその塩を非クエン酸バッファー中に含んだ溶液と混合して、pHが3.0から6.0の間である混合液を作ること；および
(ii) 90Yラベルされた抗体または抗体断片が、該放射ラベルされた抗体または抗体断片を、取り込まれなかった90Yから分離するためのさらなる精製をせずに患者に直接投与されてもいいような、95％を超える放射取り込み、少なくとも5 mCi/mgの特異的活性、および少なくとも50％の結合特異性を有して該放射ラベルされた抗体または抗体断片が作製されるような、25℃から43℃の間である温度条件下で、前記混合液を8分未満の時間インキュベートすること、
を含む方法。
【請求項２】
前記十分なインキュベーション時間が2分から5分の間である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記キレーターがMX-DTPAである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記許容可能なバッファーが酢酸バッファーである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記バッファーが10から1000 mMの酢酸ナトリウム濃度である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記許容可能なバッファーが穏和な放射線防護剤を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記穏和な放射線防護剤がアスコルビン酸塩である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記抗体断片がFab、F(ab’)2およびFv断片から成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
キレーターと抗体または抗体断片の比が11/2から1の間である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記結合特異性が少なくとも70％である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗体および抗体断片が少なくとも10 mCi/mgの特異的活性でラベルされる、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗体および抗体断片が少なくとも15 mCi/mgの特異的活性でラベルされる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗体および抗体断片が5から20 mCi/mgの間の特異的活性でラベルされる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗体および抗体断片が特異的にCD20に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗体が2B8である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記キレーターがMX-DTPAである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記十分なインキュベーション時間が2分から8分の間である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗体および抗体断片が5から40 mCi/mgの間の特異的活性でラベルされる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
96％を超える放射取り込みのレベルが達成される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
99.5％までの放射取り込みのレベルが達成される、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、治療用放射性同位体でタンパク質およびペプチドを放射ラベルするためのキット、および方法であって、これらの放射ラベルされたタンパク質がさらに精製をする必要なく直接患者に投与してもよいようなキット、および方法に関する。このようなキットおよび方法は、特にイットリウム−90（90Y）でタンパク質およびペプチドをラベルするために適用可能である。さらに放射ラベルされたタンパク質を精製する必要がないように放射ラベルプロトコルを最適化することによって、本発明は、イットリウムラベルされた薬剤をこれらの薬剤が病院または外来患者の設備において容易に調製されかつ投薬されるように、使用者にわかりやすい形態としてどのように提供するか、という残されていた問題を解決することにより当業者が長い間探索していた要求を満たした。
【０００２】
【技術背景】
本明細書内の全ての刊行物および特許出願は、個々のそれぞれの刊行物または特許出願が本質的におよび個別に参照文献によって援用されることを指示したような同じ範囲で、本明細書によって援用される。
【０００３】
放射ラベルされたタンパク質、特に抗体は、診断および治療薬となり得る可能性があるとして長年評価を受けてきた。このような試薬は、癌治療薬として特に有用であると考えられているので、現在研究者は、腫瘍特異的抗体および同族のリガンド、またはこのような抗原と結合する抗体の同定を開始している。飛程が短く、高エネルギーかつ豊富な粒子放射を有する放射性同位体と結合して放射ラベルされた、腫瘍特異的抗原に特異的に結合するリガンドまたは抗体を投与することによって、腫瘍細胞に直接致死量の放射線を送達する能力を有する。
【０００４】
特定アイソトープの粒子飛程によって、特定の細胞タイプをターゲティングするために、その安定性に基づいて、ラベルを選択すればよい。たとえば、ガンマエミッターは、一般に治療目的（すなわち、腫瘍を可視化するためであり、一般に致死薬としては効果がない）で使用される。逆に、アルファおよびベータエミッションは、細胞殺傷効果を果たすために使用されるであろう。アルファエミッターは、それらがよく透過することができる血液産生疾患または血管腫瘍に対して特に有用である；ある場合では、一粒子エミッターが細胞を殺すには十分な効果があるかもしれないが、一般にアルファエミッターは、細胞表面に正確に配置されなければならない。逆に、ベータエミッター、すなわち90Yは、一般に、より長いエミッション範囲を有しているので、それらは特により巨大な、より局在化した疾患に適している。
【０００５】
イットリウム−90−ラベルされた抗体およびペプチドは、特に臨床治療プロトコルにおいて有望な結果を示した（Thomas et al., 1995. Gamma-interferon adminisiration after 90Y radiolabeled antibody therapy: survival and hematopoietic toxicity studies. Int. J. Radiat. Oncol.Biol. Phys. 31: 529-534; DeNardo et al. 1995. Yttrium-90/Indium-111 DOTA peptide chimeric L6: pharmacokinetics, dosimetry and initinal therapeutic studies in patients with breast cancer., J. Nucl. Med. 36:97P）。このような結合体は、通常はタンパク質または抗体を二官能価のキレーターと結合することによって作製され、次に二官能価キレーターを介してタンパク質構築物と放射ラベルを結合する。たとえば、本明細書の参照文献に援用された出願中の08/475,813、28/475,815、および08/478，967には、B細胞リンパ腫および腫瘍細胞をターゲティングおよび絶滅するための、放射ラベルされた治療用抗体が記載されている。抗ヒトCD−20マウスモノクローナル抗体、Y2B、二官能価キレーターであるMX−DTPAを介して結合された90Yを含むY2B8結合体が、特に開示されている。
【０００６】
キレーターおよびキレーター結合体に関する特許が、当業者に既知である。たとえば、GansowのU.S.特許番号4、831，175には、多置換されたジエチレントリアミンペンタアセチック酸キレーター、および同じものを含むタンパク質結合体、並びにその調製方法が指示されている。GansowのU.S.特許番号5,099,069、5,246,692、5,286,850、および5,124,471も、多置換されたDTPAキレーターに関する。Kozak らが記載したように、MX−DTPAを含むDTPAキレート試薬のいくつかが、イットリウム−モノクローナル抗体による放射免疫治療に適していることが示された（1989. Nature of the cifunctional chelating agent used for radioimmunotheray with yttrium-90 monoclonal antibodies: Critical factors in determining in vivo survival and rogan toxicity. cancer Res. 49:2639-2644）。これらの参照文献は、その全体が本明細書に援用される。
【０００７】
イットリウム−90は、いくつかの理由により、特に放射免疫療法および放射ペプチド療法に適している。90Yの半減期である64時間は、腫瘍に抗体を蓄積させるためには充分長く、かつたとえばガンマ線照射を全く持たない高エネルギー(E max2.27MeV)の純粋なベータエミッターである131Iとは異なっている。その粒子エミッションの飛程は100〜1000の細胞直径である。これは、外来患者に投与することが可能とされる貫通性放射線量としては十分に小さい量である。さらに、細胞殺傷には、ラベルされた抗体のインターナリゼーションが必要とされず、および電離放射線の局所的なエミッションは、標的抗原を欠失しているであろう隣接する腫瘍細胞にも致命的となるはずである。
【０００８】
しかし、イットリウムラベルされた抗体において認知されている利用性、およびいくつかのイットリウムラベルされた治療による有望な臨床結果にも関わらず、放射ラベルすること、および単一部位に投与することは、どちらも本質的に困難であるために、多くの患者はこれらの治療法が提供するであろう恩恵を受けていない。この重大な問題は、アルファおよびベータエミッティング放射性同位体によってその場で試薬をラベルすることが可能なキット、および製品がほとんど完全に役に立たないことが明らかである。これらは、他の点においては、このような技術を商業的に適用可能であることを示すであろう。
【０００９】
放射ラベル、およびその後に破壊性のアイソトープでラベルされた治療薬を投与するためのキットを提供する際の問題は、このような治療薬が患者に投薬される前に、骨および他の標的でない組織に蓄積するであろうフリーの放射性同位体を患者に暴露しないように、結合しなかったラベルを除去するために多数の精製工程が必要とされる、当業者に長い間存在する確信であることが明らかである。イットリウムで抗体をラベルするために現在利用可能なこれらのキットでさえ、投与するための治療薬を準備する前に複雑な精製工程を必要とすることが明らかである。
【００１０】
たとえば、現在Antisomaは、、モノクローナル抗体HMFG1（Theragyn（R））を90Yでラベルして、卵巣癌と診断された患者に投与後にするためのキットを提供している。フェーズI-IIに拡張された研究において、この治療法が従来の外科手術および化学療法を追従するものとして、特に患者に対して有益であろうことが示された（Hird et al., 1993. Ajuvant therapy of ovarian cancer with radioactive monoclonal antibody. Br. J. Cancer 68: 403-406）。さらに、Anitisomaのラベル方法は、未結合のラベルをSephadex G50のゲル濾過によって除去する必要がある。これは、Theragyn（R）ラベルキットが商業的な成功を収める際に重大な妨害となり、並びにこの治療法が、全ての子宮癌患者（この治療法の恩恵が役に立つ患者）に対して容易に利用可能とするための障害となる。
【００１１】
医者が迅速に、効率的に、かつ安全に投与することが可能な簡便化された方法が提供されない限り、現在このような試薬は投与前にカラムによる精製が必要であるという事実は、このような技術から恩恵を受けるであろう全ての患者に対する利用の可能性を主に妨害物であったし、かつあり続けるであろう。たとえば、外来患者設定の医者は、薬剤をその患者に投与する前に、HPLCまたはゲル濾過クロマトグラフィーによって薬剤を精製するための時間または設備を持っていない。これは、薬剤の生産と医者への即時の送達が同時にするための場所として、さらなる設備が入手可能でなければならないことを意味する。これは、治療費を劇的に増大し、かつある場合には、治療を受けるために患者がかなり遠くに旅をする必要があるだろう。あるいは、前記薬剤は、施設外でラベルすることができるであろう。これには治療薬を、事前に調製すること、および少なくとも短期間保存する必要があるだろう。これは、保存時の放射性の崩壊を介した放射性同位体強度の減少に影響するだけでなく、放射性同位体に過剰に暴露されることによってタンパク質の構造の完全性に重大な損傷を引き起こす。
【００１２】
たとえば、90Yおよび同様の放射性同位体の放射線分解性が、多くの報告で議論されている（すなわちSalako et al., 1998. Effects of radiolysisi on yttrium-90-labeled Lym-1 antibody preparations. J. Nucl. Med.39:667-670; Chakrabarti et al. 1996. Prevention of radiolysis of monoclonal antibody during labeling .J. Nucl. Med. 37:1384-1388）。 Chakrabartiらが述べているように、90Yなどの放射性核種は、ラベル工程の際に、並びに保存の際に、抗体に大量の放射線を送達する。話によれば、腫瘍細胞の選択的なターゲッティングが無視され、かつ有意な毒性レベルに標的でない組織を暴露することが可能抗体の損傷の原因が、放射線によって引き起こされた。
【００１３】
放射線による損傷の機構は、フリーラジカルの発生に起因される（Pizzarello. 1975. Direct and indirect action. In: Pizzarello and Witcofski, eds. Basic Radiation Biology, 2nd ed. Philadeophia: Lea and Febger, pp. 20-29）。しかし、Salakoらが述べたように、2.2MeVのエネルギーにおいて、90Yからエミットされるベータ粒子は、抗体のジスルフィド結合を含むほとんどの化学結合を容易に破壊することができるであろう（Skoog. 1985. Principles of Instrumental Analysis, 3rd edition. San Francisco: Saunders）。従って、ラベルされたタンパク質が、90Yなどの破壊的放射性同位体にさらされる時間が短いほど、タンパク質が標的抗原と相互作用するために必要な構造の完全性、および結合の特異性を、投与されてから標的部位に到達するときまで維持している確率が高いであろう。
【００１４】
90Yの放射線分解性は、長年当業者には既知であり、およびこれらの治療を商業的に使用する際に、90Yに存在する問題を解決するために、多くのことが試みられた。たとえば、Salakoら、およびChakrabartiらの両者は、抗体の損傷を減少させる方法として、90Yでラベルされた抗体のプレパレーションにおける放射線保護材の使用を評価した。特に、Salakoらは、ヒト血清アルブミンが、90Yでラベルされた抗体の免疫活性を72時間まで維持可能にすることを報告した。しかし、Sadakoのプレパレーションによって示された特異的活性は、むしろ低かった（2mCi/mlより少ない）。さらに、Salako またはChakrabartiは、抗体をラベルした後に必要な多数の精製工程に先立つ、いずれの努力も報告していない。Salakoらは、45分から1時間ラベルして、次に分子ふるいクロマトグラフィーによって前記抗体を精製するが、一方Chakrabartiは、3時間近くラベルして、ゲル濾過クロマトグラフィーで精製している。これらの方法はいずれも、90Yラベルされた治療薬を外来患者の設備に持ってくるための手段とはならないであろう。
【００１５】
ChinolおよびHnatowichは、彼ら自身の発生器で作製した90Yを使用して、1-3mCi/mgの範囲の特異的活性をもつ90Yでラベルされたタンパク質において、90％の放射化学純度をラベル後に精製することなく得ることができた（1987. Generator^produced yttrium-90 for radioimmunotherapy. J.Nucl. Med.28(9): 1465-1470）。しかし、前記著者は、95％より低い純度を有するプレパレーションを患者に投与することを特に反対し、HPLCが重要、かつ「おそらく必須」の工程であろうことを示差した。
【００１６】
HPLCおよび他のタイプの精製法が、外来患者および病院の設備から削除されているに違いないと認識した者は、高いレベルでラベルの取り込みがなされ、許容可能な抗体安定性のレベルを維持するように、90Yを十分にラベルするプロトコルの開発には成功しなかった。高レベルの放射取り込みが一貫して成し遂げられなければ、このラベルが試薬から精製されていなければ、患者は許容できないレベルの、結合していないフリーな放射ラベルに暴露されるであろう。さらにもう一度、抗体構造の完全性が、該抗体が標的に対する特異性を失うように損傷されると、このような試薬は、その同族のリガンドと特異的に結合できないであろう。
【００１７】
Matherおよびその同僚たちは、ラベルした後の精製を避けられるような方法によって、腫瘍特異的抗体を90Yでラベルする目的のために着手した（1989. Labeling monoclonal antibodies with yttrium-90. Eur. J. Nucl. Med. 15: 307-312）。しかし、Matherは、ゆるい特異的活性（1mCi/mg）の場合にのみ、高効率のラベル（95％以上）が得られることを発見した。さらに、Matherらは、それらの抗体プレパレーションが、数時間後に（放射線により）破壊の徴候を示したことを報告している。これは、Matherらが、この分野の他の多くの者が行うように、それらのラベル反応を一時間以上行ったためであろう。
【００１８】
たとえば、さらなる精製工程を行わずに、111Inなどの破壊性の低い試薬でタンパク質をラベルするために提案された方法がある。Richardsonらは、診断に使用するためのキットの構成を容易にする目的で、このような111Inで抗体をラベルするための方法を提案する（Richardson et al. 1987. Optimization and batvh production of DTPA-labeled antibody kits for routine use in 111In immunoscintography. Nucl. Med. Comm. 8:347-356）。しかし、Richardsonらが提案したラベル法は、一時間以上行われ、放射線分解すらない111Inにおいては実施できるかもしれないが、Matherらが報告した困難性によって証明されたように、90Yでは受け入れられるとは思われない。
【００１９】
これは、我々に驚きと本発明の予想外の利点をもたらす。これは、タンパク質を90Yで放射ラベルする方法において、他の当業者によって認識されていない貴重な洞察を提供する。驚くべきことに、本発明者らは、他の者が純粋な試薬を得るために必須であると長い間考えていたHPLC、または他の精製工程、およびそれらの試薬の特異的活性を増加するために他の者が採用した長時間のインキュベーションが、90Yでラベルされた試薬を調製する方法に対して有害であることを発見した。このような時間包括的な方法は、放射線分解によるタンパク質の損傷を増加するだけであり、低い特異性および放射ラベルされたタンパク質を注入するための準備がなされる時までのタンパク質分解の割合が増加される。驚くべきことに、本発明は90Yによる効率的なラベルは、二分から五分ほどで行うことができ、実際に、反応時間が八分越えて増加しただけでさえ、このようなラベルはその効率が損なわれる。
【００２０】
今では、本発明の方法によって、90Yによるラベルが二分ほどで成し遂げられるかもしれないという事実により、病院および外来患者の設備においてイットリウムを放射ラベルするキットを適用性についての分野における現在の懐疑が完全に解決されるであろう。従って、本発明のキットは、おそらく多くの癌患者および医者によって認知されている長く切実な要求、並びに商業的な適用性、およびタンパク質を基にした、放射ラベルされた癌治療薬の利用可能性に関する長く切実な要求を最終的に満たすであろう。
【００２１】
【発明の概要】
本発明は、患者に投与するための治療用放射性同位元素によってキレーター結合タンパク質またはペプチドを放射ラベルするための方法、およびキットに関する。本発明の方法は、本質的に、
（i）キレーター結合タンパク質またはペプチドを放射性同位体またはその塩を含む溶液と混合すること、および
（ii）放射ラベルされた抗体が、さらなる生成をせずに患者に直接投与してもよいような、十分な純度、すなわち放射取り込みのレベル、特異的活性、および結合特異性を有する放射ラベルされたタンパク質またはペプチドが得られるようなよい条件下で、混合液を十分な時間インキュベートすること、
を含む方法である。
【００２２】
本発明のキットは、本質的に、
（i）キレーター結合タンパク質またはペプチドをバッファー中に含むバイアルと、
（ii）放射ラベルされた抗体を安定化し、かつ患者に投与するための調合バッファーを含むバイアルと、および
（iii）放射ラベル法を実施するための説明書であって、放射ラベルされたタンパク質またはペプチドが、前記説明書で推薦するようなよい条件下で放射性同位体またはその塩に暴露されたときに、前記放射ラベルされた抗体を調合バッファー中に適切な濃度に希釈して、かつさらなる精製をせずに患者に直接投与されてもよいような、十分な純度、特異的活性、および結合特異性を有する放射ラベルされたタンパク質またはペプチドが得られる説明書、
を含むキットである。
【００２３】
【発明の詳細な記載】
別に定義していなければ、ここで使用された全ての技術的および化学的用語は、本発明が属する分野の当業者によって、通常理解されるものと同じ意味を持つ。本明細書に記載されたものと同様の、または同等の方法および物は、本発明の実行またはテストにおいて使用することができ、好ましい方法および物が記載されている。
【００２４】
患者に投与するための治療用放射性同位元素で、キレーター結合タンパク質またはペプチドを放射ラベルするための方法であって、
（i）キレーター結合タンパク質またはペプチドを放射性同位体またはその塩を含む溶液と混合することと、
（ii）放射ラベルされた抗体が、さらなる生成をせずに患者に直接投与してもよいような、十分な純度、すなわち放射取り込みのレベル、特異的活性、および結合特異性を有する放射ラベルされたタンパク質またはペプチドが得られるようなよい条件下で、十分な時間混合液をインキュベートすること、
を含む方法を、本発明は包含する。「さらなる精製」には、HPLC、ゲル濾過、その他のタイプのカラムクロマトグラフィー、およびフリーまたは結合した未結合の放射ラベルを除去する目的で使用されるその他の分離技術を含む。
【００２５】
本発明の方法は、一般に放射線分解性であることにより、タンパク質の構造の完全性に対して危険な可能性のある治療用の放射性同位体に対して、特に適用可能である。このような治療用放射性同位体は、一般にアルファおよびベータエミッターから成る群から選択される。好ましい治療用の放射性核種には、203Pb、212Pb、212Bi、109Pd、64Cu、90Y、77Br、211、A、97Ru、105Rh、195Auおよび、177Luを含む。治療上の利用性を有するその他の放射性核種は、本明細書の参照文献に援用されたU.S.特許5,541,287に記載されている。特に好ましい放射性核種は、90Y、64Cu、131I、186Re、および188Reなどの強力なベータ線エミッターである。これらは分子内崩壊を引き起こすであろう。「治療用」放射性同位体は、一般に細胞毒性作用を有するベータおよびガンマエミッターなどの放射性同位体を指し、このような放射性同位体が診断目的としても使用されるであろう範囲までをいう。これらのアイソトープの放射線分解性が開示された方法およびキットに最適となるので、このような目的により、本発明の範囲からこれらのアイソトープは除かれない。
【００２６】
本発明の方法は、タンパク質またはペプチドをラベルするために、特に標的特異性のために、構造の完全性を維持しなければならないものに使用してもよい。好ましいタンパク質は、腫瘍特異的な、または腫瘍に関連した抗原を認識する抗体、またはFab、（Fab）2およびFv断片などの抗体断片である。好ましいペプチドはソマトスタチン、血管作用性小腸ペプチド（VIP）、物質P、および細胞受容体と結合する他のペプチドを含む。このようなペプチド、およびこのようなペプチドのキレーター結合誘導体は、本明細書の参照文献に援用されたU.S.特許番号5、830，431に開示されている。
【００２７】
本発明の方法において述べられた「十分なインキュベーション時間」は、前記試薬が、さらなる精製を必要とせずに患者に直接投与されてもいいような十分な放射取り込み、および放射化学純度がなされる際に許容可能な時間の範囲である。十分な放射取り込み、および純度は、一般に少なくとも95％であると当業者に認識されているが、ラベルの毒性によって変更してもよい。十分であると見なされる放射取り込みの範囲が、要求されたレベルの効率における機能であることも、当業者には明らかなはずである。90Y、および特に本発明の90Yでラベルされた抗体において、このような十分な時間は、一般に約8分より少なく、およびより好ましくは約2〜約5分でよく、キレーター結合タンパク質がラベルされるときにキレーターとタンパク質が敏感に反応するモル比が与えられる。
【００２８】
特定のタンパク質をラベルするために必要である最適な時間は、タンパク質、特定の放射ラベル、および使用された特定の複合体によって異なるかもしれないことが、当業者には明らかなはずである。放射ラベルのために当てられる時間を最適化するときの基礎となる因子は、ラベルされる試薬におけるキレーターとタンパク質の比である。たとえば、治療上有用なレベルの取り込みがなされるには、キレーターとタンパク質の比が十分高くなくてはならないが（すなわち95％）、タンパク質の構造の完全性、または免疫反応性が損なわれるほど高すぎてはならない。これには、ある場合には低いレベルの結合キレーターで、かつ長い時間ラベルをする一定のバランスをとる工程が必要である。
【００２９】
たとえば、本発明者らは、望ましいレベルの純度に90Yでラベルするには、キレーターとしてMX−DTPAを使用して5分の条件で、かつキレーターと抗体のモル比が約11/2〜1のときにのみなされるであろうことを発見した。キレーターと抗体の比は、実際に増加させることができるが、望ましいレベルの放射取り込みおよび特異的活性は、短時間のラベル後に得られるので、このような必要はなかった。この発見が与えられると、キレーターとタンパク質の濃度などのパラメータは、他のタンパク質およびペプチドに対する当業者の経験的方法によって、治療用ラベルの選択、キレーターの選択、キレーター結合のために利用可能な部位の数、放射線分解に対するタンパク質の感受性、所望される効率のレベルなどに依存して、容易に測定することができる。
【００３０】
対象のタンパク質および放射性同位体の両方と結合することができる限り、本発明の方法においていずれの二官能価キレーターが使用されてもよい。好ましいキレーターは、MX−DTPA、フェニルーDTPA、ベンジル−DTPA、CHX−DTPA、DOTAおよびその誘導体から成る群から選択される。特に好ましいキレーターは、MX−DTPAである。
【００３１】
本発明の方法において述べられたように、「よい条件」には、許容可能な温度、pH、およびバッファーの条件を含む。阻害的、またはラベル反応に不利益となる反応条件を選択すべきでないことが、当業者には明らかなはずである。Lewisらは、免疫複合体を放射ラベルするときに考慮されるべき反応条件を議論している。これは、本明細書の参照文献に援用される（1994.A facile, water-soluble method for modification of protein with DOTA. Use of elevated temperature and optimized pH to achieve high specific activity and high chelate stability in radiolabeled immunoconjugate. Bioconjugate Chem. 5: 565-576）。
【００３２】
前記反応において、許容可能な温度は、ラベルされるタンパク質によって変更してもよいが、一般的な範囲は約25℃〜約43℃である。Lewisらは、放射ラベル反応の温度を25℃〜43℃に増加すると、放射金属の取り込み効率、および調査したDOTAの放射複合体の安定化速度が、どちらも増加することを発見した。
【００３３】
許容可能なpHは、使用される放射ラベルに依存して、相当に変更してもよい。異なった各種でラベルに対して推薦されるpHは、一般に当業者に知られており、放射性同位体によって、それに応じて選択されればよい。たとえば、90Yにおいて許容可能なpHは、約3から6であるが、より好ましくは約4.2である。
【００３４】
許容可能なバッファーも、特定のラベルに依存して変更されるであろう。たとえば、Lewisらおよび他の者は、クエン酸が存在すると90Yによるラベル反応が阻害されることを発見した。従って、放射ラベルに90Yが選択された場合、クエン酸バッファーは適していないであろう。90Yでラベルする場合、好ましいバッファーは、酢酸バッファー、およびより好ましくは、約10〜約1000mMの間の濃度の酢酸ナトリウムバッファーである。
【００３５】
ラベル反応を阻害しないか、またはさもなくば不利な影響を与えないならば、反応バッファー中に穏和な（有害でない）放射線防護剤が含まれていてもよい。Chakrabartiによれば、アスコルビン酸は、このような、ラベル反応に影響を与えない放射線防護剤の一つである。しかし、ヒト血清アルブミンをラベル反応に使用する場合、ラベル工程に影響を及ぼす金属が存在するので、注意すべきである。
【００３６】
本発明は、特に放射線分解性のアイソロープでタンパク質を放射ラベルすることに関しているので、結合特異性と特異的活性の間には、当業者が本発明を実施する場合に遭遇する一定のバランスがあるかもしれない。たとえば、特異的活性が非常に高い（すなわち、5mCi/mg以上、好ましくは10mCi/mg以上、およびより好ましくは15mCi/mg以上）場合、望まれる結合特異性を有するタンパク質構築物は、腫瘍領域において十分な殺傷能力を有するであろう。しかし、全体としてその免疫反応性を保持する集団のタンパク質では、放射ラベルの放射線分解のために低い特異的活性を有する集団よりも低いかもしれない。当業者は、望まれる特異的活性のレベルに依存して、一定のレベルの免疫反応性が損なわれる選択をしてもよい。
【００３７】
たとえば、本発明者は、90Yで抗体が約15mCi/mgの特異的活性でラベルされたときに、結合特異性、またはタンパク質の免疫反応性は、一般に少なくとも約70％であることを発見した。この場合、抗体の感受性、および使用した放射性同位体の放射線分解の性質に依存して変更してもよく、および高レベルの免疫反応性、または特異的活性が望まれるならば、熟練した専門家によって操作されてもよい。本発明者らは、90Yで約20mCi/mgまでの特異的活性が得られた。治療に適用するためには、少なくとも50％の結合活性が望ましい。
【００３８】
所望であれば、ラベルした後のパーセント結合親和性、および複合体の免疫反応性を評価するために使用されてもよい結合アッセイが、これと共に同時に認められ、かつ提出された出願中の09/    および09/    に開示されている。本発明のラベル方法の後に、さらなる精製を必要とされないが、患者の健康を危険にさらさないように、放射取り込みのレベルを確認するためのTLCに基づいたアッセイは、常に実施されるべきである。このようなアッセイは、約3-4分で行うことができ、かつ放射線治療薬の安定性、または効率に有意な影響を与えないはずである。
【００３９】
また、本発明には、患者に投与するための治療用放射性同位元素で、キレーター結合タンパク質またはペプチドを放射ラベルするためのキットであって、
本発明のキットは、本質的に、
（i）バッファー中にキレーター結合タンパク質またはペプチドを含むバイアルと、
（ii）放射ラベルされた抗体を安定化し、かつ患者に投与するための調合バッファーを含むバイアルと、および
（iii）放射ラベル法を実施するための説明書であって、放射ラベルされたタンパク質またはペプチドが、前記説明書で推薦するようなよい条件下で放射性同位体またはその塩に暴露されたときに、前記放射ラベルされた抗体を調合バッファー中に適切な濃度に希釈して、かつさらなる精製をせずに患者に直接投与されてもよいような、十分な純度、特異的活性、および結合特異性を有する放射ラベルされたタンパク質またはペプチドが得られる説明書、
を含むキットが包含される。前記キレーター結合タンパク質またはペプチドは、凍結乾燥された形態で供給されてもよい。
【００４０】
本発明のキットが本明細書に記載の方法を実施するために設計されたことを理解すべきであり、従って、その目的に使用してもよい。従って、本発明を読むときに、キットの説明書が上記方法に基づいているであろうこと、並び本キットに関して考えたときに、上記の取り組まれた問題が同じ関連性および意味を有することは、関係する者には明らかなはずである。さらに、本開示を読む際に、全体として他のキット態様が、本発明に包含されることは明らかなはずである。これらは、上記のような放射ラベルのpHを合わせるための酢酸バッファーなどの組成物を含むであろう。
【００４１】
特に有利な本キットの組成物は、放射線分解の効果に対して安定化するため、および放射ラベルされた抗体を患者に投与するための調合バッファーである。前記調合バッファーは、ラベルされた抗体を希釈するため、および投与バッファーの両方として役に立つ薬学的に許容可能なキャリアである。薬学的に許容可能な希釈剤は、治療用または診断用の抗体を投与するために使用してもよいが、本発明の調合バッファーは、特に放射ラベルされた抗体に適している。
【００４２】
たとえば、本発明の調合バッファーは、ヒト血清アルブミン（HAS）またはアスコルビン酸などの、イットリウムおよびその他の強力な放射性核種による放射線分解を最小にする放射線防護剤を含む。その他の放射線防護剤が当業者に既知であり、本発明の調合バッファーとして使用することもできるであろう。すなわち、フリーラジカルスカベンジャー（フェノール、亜硫酸塩、グルタチオン、システイン、ゲンチシン酸、ニコチン酸、パルミチン酸アスコルビル、HOP(:O)H2、グリセロール、ホルムアルデヒドスルホキシル酸ナトリウム、Na2S2O5、Na2S2O3、およびSO2など）である。
【００４３】
また、本発明の調合バッファーは、過剰量の未結合キレーターを含む。未結合キレーターを含む目的は、このキレーターが患者内で非タンパクが質結合した放射ラベルのいずれにもスカベンジャーとして、かつ放射ラベルを排出することによって「向骨性」アイソトープ、すなわち90Yの患者の骨による取り込みを減少するために役に立つことである。たとえば、キットの抗体がDTPAキレーターと結合された場合、過剰のDTPAまたは他のキレーターのいずれかが、調合バッファー中に含まれていてもよい。また、前記調合バッファーは、好ましくは全用量が反応バイアルに移されるような量で提供される。上で論じたように、これは、正確な量を測定して移さなくてもよいので、使用時の容易さおよび再現性を増大させる結果となる。
【００４４】
好ましい調合バッファーは、リン酸バッファー、または生理食塩水、ヒト血清アルブミン、およびDTPAを含む。前記ヒト血清アルブミンは、好ましくは約5〜25％（w/v）の間の濃度、およびより好ましくは約7.5％（w/v）の濃度である。前記DTPAの濃度は、このましくは約1mMである。アスコルビン酸塩は、ヒト血清アルブミンの代わりとして使用してもよく、かつ一般的には約1〜100mg/mlの濃度で使用される。しかし、患者の安全を損なわないように、より広範囲の濃度で使用されてもよい。
【００４５】
前記キットは、購入者の好みによって、他の代わりの態様として供給されてもよい。たとえば、前記キットは、さらにラベル反応および調合バッファーの希釈の両方が行われるであろう滅菌反応バイアルを含む。廃棄物を減らすために、放射ラベルのpHを合わせるためのバッファーが、実際の反応バイアル内に供給されるといった、さらなる態様が想像される。前もってラベルキットを注文して、その後で別に、投与直前に放射性同位体を注文することもあり得るであろうが、さらに放射性同位体のバイアルを含むキットも考えられる。第二のタンパク質もしくはペプチドのバイアルを含むキットも考えられ、放射ラベル産物の結合親和性を評価する際のコントロールとして、またはある場合には、放射ラベルされたタンパク質もしくはペプチドと治療法を組み合わせて使用するために、いずれかとして貢献する。
【００４６】
【好ましい態様の詳細な記載】
再発したB細胞リンパ腫を治療するための臨床試験において、90Yでラベルされた抗CD20マウスモノクローナル抗体（Y2B8）が、現在評価されている。前記2B8抗体は、ヒトCD20を認識するマウス抗体である。最近、この抗体のキメラバージョン（RITUXAN（R））が、非ホジキンリンパ腫の治療のためのFDAの認可を受けた。本明細書によって参照文献に援用されたU.S.特許出願番号08/475,813には、治療的療法と組み合わせてイットリウムラベルされたマウスモノクローナル抗体と共にRITUXAN（R）を経時的に投与した開示がある。RITUXAN（R）を投与した後の、イットリウムラベルされた抗CD20抗体の投与は、（A）抗CD20キメラ抗体によって除去されずに残っている全ての末梢血B細胞を除去するため；（b）リンパ節からB細胞の除去を開始するため；または（c）その他の組織からB細胞の除去を開始するためには十分であった。
【００４７】
従って、非ホジキンリンパ腫の治療に対する抗CD20抗体の効果が改良され、かつ放射活性に対するリンパ球の感受性が既知となったので、このような治療抗体が、キット形態として商業的に利用可能になることは非常に有用となるであろう。これにより、臨床の設備内で、放射ラベルによる修飾が容易になされ、および患者に直接投与されるであろう。
【００４８】
2B8抗体を放射ラベルするキットは、好ましくは4つの構成要素を含む：
1.）2mg/mlの2B8−MX−DTPAの低金属の通常の生理食塩水、
2.）放射性同位体溶液をラベルに最適なpHに合わせるために使用される50mM酢酸ナトリウム、
3.）調合バッファー（7.5％（w/v）ヒト血清アルブミン、および1mMDTPAを含む、1×PBS、pH7.4）、および随意に
4.）空の10mLガラスバイアル（反応バイアル）（「10mL」の反応バイアルは実際に不自由なく保持され、かつ技術的には、やや「10mL」より大きい）。全ての構成要素は、滅菌されおよびピロゲンフリーであることがテストされている。
【００４９】
この節では、この放射性同位体ラベルキットのバリデーション（使用が単純かつ容易で、並びに≧95％の放射取り込みの放射ラベルされ、および抗原陽性細胞との結合が許容可能に保持された抗体を産生する）を要約する。結合および放射線取り込みに影響を及ぼす実験パラメーターの評価も行なった。
【００５０】
【実施例】
実施例1.  2B8を90Yでラベルするための放射ラベルキットおよび方法
A. 放射ラベルキットの試薬。
【００５１】
1. 2B8-MX-DTPA、IDEC；Lot＃082395RM2、
2. 50mM 酢酸ナトリウム、低金属、IDEL；Lot＃082395RM3、
3. 調合バッファー（7.5％（w/v）ヒト血清アルブミン、および1mMDTPA、を含む、1×PBS、pH7.4）、IDEC。Lot＃082395RM1、
4. 反応バイアル、10mL、IDEC、
B. 材料および装置。
【００５２】
1. Biotex Tec-Control Radioincorporation Kit, Cat.#151-770、
2. 手袋：パウダーフリー、
3. 滅菌ポリプロピレン注射器、
4. 滅菌注射針、
5. ふた付きの小さなチューブ；1.5ｍｌ、
C. 方法。
【００５３】
1. 放射ラベルキットを使用したY2B8の調製
キットの試薬を調製し、かつ中隔ガラスバイアルを満たした。タイプIのホウケイ酸バイアル（2または10ml）を注入用滅菌水（WFI）でリンスして、使用前にオートクレーブした。試薬を手作業で満たして、Class 100の部屋において圧着し、かつUSP法を使用して発熱性および無菌性をテストした。
【００５４】
補助試薬：
1. イットリウム-[90]：塩化物塩、キャリアフリー、HCl溶液。
【００５５】
予防措置
1.全ての工程は無菌的技術を使用して行うべきである。
2.放射ラベルキットの構成物は、使用前に室温にしておくべきである。
【００５６】
放射ラベルプロトコル
1. 反応バイアルに添加する90YCL3の量は、以下のように見積もった
a. 放射ラベル時の放射活性濃度：
C0＝キャリブレーション時の放射活性濃度（製造者の証明書の分析法を参照）、
Δt＝変化時間（正の数はキャリブレーション後、負の数はキャリブレーション前）、
ラベル時の放射活性濃度＝C0/e0.0108（Δt）。
【００５７】
b. 反応バイアルに添加する90YCL3の量
45mCi/ラベル時の放射化性濃度＝反応バイアルに添加した量。
【００５８】
2. 反応バイアルに添加する50mM酢酸ナトリウムの量は、以下のように見積もった：
a.0.040M HCl(Amersham)中の90YCL3には:
90YCL3（工程1b）の量×（0.8）＝添加する酢酸ナトリウムの量、
b.0.050M HCl(Nordion)中の90YCL3には:
90YCL3（工程1b）の量×（1.0）＝添加する酢酸ナトリウムの量、
3. 中隔のある反応バイアルおよび酢酸ナトリウムのバイアルは、アルコールで拭いた。1ccのシリンジを使用して、見積もった量（工程1aまたは1b）の50mM酢酸ナトリウム（工程2）を、反応バイアルに移した。前記バイアルを数回反転して混合した。
【００５９】
4. 90YCL3源のバイアルの中隔をアルコールで拭いた。前記針とバイアルを滅菌した0.2μmフィルターに装着した。1ccのシリンジを反転して使用し、必要量（工程1b）の90YCL3を、反応バイアルに移した。前記バイアルを数回反転して混合した。
【００６０】
5. 2B8−MX−DTPAのバイアルの中隔をアルコールで拭いた。3ccのシリンジを使用して、1.5mlの2B8−MX−DTPAを反応バイアルに移した。前記バイアルを数回反転して混合した。
【００６１】
6. 前記反応混合液の全量は、添加したY-90塩化物の量（工程4）と、添加した50mM酢酸ナトリウムの量（工程3）と、添加した2B8−MX−DTPAの量（工程5）を加えて見積もった。
【００６２】
7. 最終的に10mLの量にするために、反応バイアルに添加する調合バッファーの量は、10から工程6で見積もった全反応液の量を引いて見積もった。
【００６３】
8. 調合バッファーのバイアルをアルコールで拭いて、前記バイアルをベントした。調合バッファーの粘性による針を使用して、反応バイアルを0.2μmの注射器フィルターに装着した。適切なゲージの針を装着した10ccの滅菌シリンジを使用して、工程7で見積もった量の調合バッファーを反応バイアルに移した。ベント針を反応バイアルから除去して、前記バイアルを数回反転して混合した（最終産物）。前記バイアルは、「放射活性アッセイ」を行う前に少なくとも5分インキュベートした。溶液の色は琥珀色であり、前記反応バイアルが満たされていることによって調合バッファーが添加されたことを確認する。
【００６４】
9. 最終産物のバイアルの全放射活性を、90Yを測定するための適切な装置セットを使用して測定した。
【００６５】
10. 最終産物は、直ちに2℃から8℃にし、患者への投与が必要になるまで保存した。
【００６６】
2. 放射取り込みアッセイ
％放射取り込みは、以下のプロトコルに従ってBiodex Tec-Control Radiochromatographic Kitを使用して、瞬間薄層クロマトグラフィー（ITLC）によって測定した。
【００６７】
補助材料および装置：
1. 90Yで放射ラベルされた2B8−MX−DTPA、
2. 放射活性なTLCストリップを計測するチューブ、
3. はさみ、
4. 滅菌シリンジ；1cc、
5. 滅菌針；26G、
6. ガンマカウンターまたはシンチレーションカウンター、
7. ピペッター。、
手順
1. Biodex 操作マニュアルの全体を最初に読むべきである。
2. それぞれの放射ラベルされたサンプルを三つずつ、キットの説明書に従ってテストした；バイアルあたり一ストリップを展開した。
3. クロマトグラフィーストリップに放射ラベルされたサンプルをスポットするために、ピペッターで開始線に1μlをスポットした。あるいは、1ccの滅菌シリンジに装着した26Gの針から分取した小さい一滴をスポットしてもよい。前記抗体は開始点に残ったままであり、かつ取り込まれていない90Y-DTPAは、溶媒の先端に移動する。
4. 適切なカウンター、すなわち90Yにはシンチレーションカウンターを使用して、バックグランドを修正し、それぞれの画分の活性を測定した。
5. 放射ラベルされた抗体の割合の見積もりは、Biodex装置に従った。
3. 結合アッセイ
補助試薬
1.  90Y2B8−MX−DTPA
2. 凍結乾燥した細胞
ヒト細胞株sb（CD20陽性）およびHSP（CD20陰性）は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから得て、2％グルタミンを補った10％ウシ胎児血清を含むRPMI―1640を使用して、T-フラスコ内で培養した。培養液は、37℃および5％CO2で維持した。細胞は、一般に1：2にわけて、0.5-2.5×106細胞/mlおよび生存率が＞80％で収集した。細胞濃度は、血球計算版を使用して測定し、および生存率はトリパンブルー排除法によって測定した。
0.5-2×106細胞/mlの細胞濃度の細胞は、周囲温度で遠心することによって回収し、かつ1×HBSSで二回洗浄した。ペレット細胞を1％（w/v）ウシ血清アルブミン（BSA）をおよび10％（w/v）マンニトール（凍結乾燥バッファー）を含む1×HBSSに、l50×106細胞/mlとして再懸濁し、Oリングガスケットの1.5mlのポリプロピレンマイクロフージチューブに0.5mlを分配して、-70度に保存し、および30-60ミリトールで一晩凍結乾燥した。凍結乾燥した細胞のチューブは、乾燥させて2-8℃で保存し、かつアッセイには滅菌水で元に戻した；マイクロフージチューブ内の凍結乾燥した細胞のチューブは乾燥して保存した。
【００６８】
3. 洗浄のための滅菌水、または注入のための滅菌水。
4. 希釈バッファー（1％ウシ血清アルブミン（BSA）および0.02％アジ化ナトリウムを含む1×PBS、pH7.2-7.4）。
【００６９】
方法
放射ラベルされた抗体サンプルの調製
1. 2℃〜8℃に保存された放射ラベルされた抗体を得た。
2. 10μl量をP20で取り除き、990μlの希釈バッファー（1：100希釈）を含む、1.5mlのマクロフージチューブに添加した。チップをリンスして、チューブを軽くボルテックスした。
3. 50mlのふた付きの滅菌ポリプロピレンチューブを手に入れて、10mlの希釈バッファーを10mlの血清ピペットを使用してチューブに入れた。
4. 1：100希釈チューブから35μl量をp200で取り除き、10mlの希釈バッファーを含むコニカルチューブに添加した。よく混合した。
凍結乾燥細胞の調製
1. 凍結乾燥されたSB細胞のチューブを三つ用意した。
2. 0.5ml量のSWFIをそれぞれのチューブに添加して、単一の細胞懸濁液が得られるまでチューブをボルテックスした。
3. 空のマイクロフージチューブを三つ用意した；0.5mlの希釈バッファーを三つのチューブに添加して、細胞を含まないコントロールを提示した。
【００７０】
アッセイプロトコル
1. 0.5ml量の希釈した 90Y2B8−MX−DTPAをそれぞれのチューブに添加した。
2. ふたが確かに閉められたことを確認した後、前記チューブをミキサー上に45分間立てておいた。
3. 周囲温度で45分間培養した後、前記細胞を5分間遠心してペレットにした。
4. 0.8ml量の上清をシンチレーションバイアルに移した。
5. シンチレーションカクテルをそれぞれのバイアルに添加した。
6. 隔バイアルの放射活性の量を、バックグランドを修正したシンチレーションカウンターを使用して測定した。
【００７１】
D.結果
それぞれの放射性同位体について異なったロットを使用して、確認実験を数回行うことによって、Y2B8の放射ラベルプロトコルの再現性および困難さを評価した。5人の操作者によって、6個の確認ロットをそれぞれのY2B8で調製した。これらのロットを以下のように命名し、以下の設備で行った：
＃1：IDEC医薬、
＃2：IDEC医薬、
＃3：IDEC医薬、
＃4：MD Anderson Health Center、
＃5：Mayo Clnic、
＃6：City of Hope、
これらの隔確認ロットに対してテストした結果を表1に要約した。
【００７２】
【表１】
0004558947.tif 000002
調製した6個の確認ロットについて、結合が得られた割合は、78.6％〜87.0％の範囲であり、平均が82.3％ある。Y2B8の放射線取り込み値の平均は、98.8％（96.3％〜99.5％の範囲）である。全体として、これらの結果からは、放射性同位体ラベルキット法によるY2B8の調製の再現性、および困難性が確認され、全体として、この放射ラベルキットを使用して調製されたY2B8は、臨床設定における使用に適していることを示している。
【００７３】
例2.  反応パラメーターの初期評価〜pHおよび反応時間
様々なpHおよび反応時間の条件下でラベル反応を行った後、初期段階の速度実験を行って、90Yラベルされた抗体の放射取り込み、および結合を評価した。pH3.9から4.7の範囲で、5分間インキュベートして放射ラベル反応をした場合、＞80％がCD20陽性細胞との結合を維持したままで、＞96％の放射取り込みであった（表2）。pH2.9から4.6の範囲で、3、5、および10分間インキュベートした場合にも同様の結果が得られた（表3）。
【００７４】
【表２】
0004558947.tif 000003
【００７５】
【表３】
0004558947.tif 000004
Y2B8プレパレーションの免疫反応性は、Lindmo et alの方法を使用して測定した。新たに回収したCD20陽性SB細胞の量を増やして、抗原過剰の条件下で、固定した量のY2B8とインキュベートした。逆数プロットによる結合データの解析では、一回の調製の後に、Y2B8の免疫反応性は72.2％を示した（図1）。
【００７６】
例3.  さらなる反応パラメーターの評価
I  導入
この節において記載された実験は、Y2B8放射ラベルキットを使用して調製したY2B8の結合について、プロトコールのずれに対する影響を調査した。放射ラベルされた抗体の結合は、放射ラベルの工程におけるいくつかのパラメータの影響を受けるであろう（表4）。
【００７７】
【表４】
0004558947.tif 000005
放射ラベルプロトコルに由来する以下のずれは、結合に対して最も負の影響を有するであろうものとして同定され、かつ含んでいた：
1.）より少ない量の酢酸ナトリウムの添加、
2.）過剰量の塩化物溶液の添加、
3.）より少ない量の2B8−MX−DTPAの添加、および、
4.）最大反応時間を上回るインキュベーション、
である。これらのずれの影響は、別々に、または同時に評価した。
【００７８】
別々に評価した場合、8分間インキュベートしたときでさえ、上記項目の1−3における20％量のずれでは、IDEC−Y2B8が、臨床試験において結合のために確立された放出規格に合格する結果となった。
【００７９】
三つの量全てのずれを同時に起こした研究において、月曜日ラベルプロトコル（放射線分解が最大の可能性がある）を使用して調製され、および8分間（通常より60％長い）培養した用量の場合にのみ、臨床放出規格よりわずかに下であった（＜3％）。逆に、金曜日ラベルプロトコルを使用して調整された用量では、4種のパラメーターの全てにおいて（上記1−4）ずれの累積的効果にも関わらず、許容可能な結合結果を維持した。全てのずれにおいて別々および同時起こる場合、放射取り込みが、臨床放出規格の95％より上であった。
【００８０】
II. パラメータの選択
我々は、必要とされる試薬量の20％のずれ、または通常使用される最大6分の反応時間の30％過剰までの許容が、放射薬学で使用されるプロトコルからの最大限可能なすれを示すと判断した。本研究において、我々は、IDEC−Y2B8の結合に対するこれらのずれの影響を評価した。我々は評価した条件が、週の全体にわたる用量調製の極限値を示すことを立証するために、「月曜日」および「金曜日」ラベルをシミュレートした。全てのずれが単一の用量調製に生じた場合の結合に対する組合わせの効果、および90Yの放射取り込みに対する、これらのずれの影響を評価した。
【００８１】
「月曜日」および「金曜日」ラベルは、次の考えを反映している。90Y塩化物溶液が短い半減期（64h）を有するので、使用した放射性同位体の量は、用量を調製した週のうちの日にちに依存する。このような理由により、月曜日に用量調製した反応量はより少なく、その結果90Yの濃度がより高くなり、おそらくより強い放射線分解を生じる。従って、我々は、月曜日および金曜日ラベル法をシミュレートして、週の全体において用量調製の極限値を示すことを立証した。
【００８２】
III.  材料および方法
A. 試薬
1. 0.05M HCl中の90YCl；Pacific Northwest National Laboratory, reagent grade; P.O.#08016,08118、
2. Ultrex HAL; J.T. Baker, Product#6900, Lot#J22539、
3. 洗浄用の滅菌水；Baxter, Part#2F7114, Lot#G926092、
4. 希釈バッファー；10mM PBSを含むpH7.4、1％BSA；Sigma, Part#P-3688, Lot#076H8913、
5. IDEC Supplied Radiolabeling kit;IDEC Part#130018, Lot#0129、以下のものを含む：
a.)2B8−MX−DTPA；IDECPart#129017, Lot#0165、
b.)50mM 酢酸ナトリウム；IDEL Part#121017, Lot＃0209A、
c.)調合バッファー；IDEC Part#120015, Lot#0202、
d.)反応バイアル；IDEC Part#122015, Lot#0218、
6. 凍結乾燥SB細胞、IDEC Part#127, Lot#127-001F、
B. 材料および装置。
【００８３】
1.ピペッター（20，200、および1000gL）、
2. ボルテックス、
3. 金属フリーピペットチップ（Biorad; metal-free）、
4. ガンマカウンター（Isodata, Model#20-10）、
5. ガラスチューブ（12×75mm）、
6. ポリプロピレンチューブ(Costar; 15mL および50mL conical, 滅菌)、
7. Tec-Control Radiochromatographic Kit（BioDex；Cat＃151-770）、
8. マイクロ遠心機（Savant）、
9. ポリプロピレンマイクロフージチューブ、金属フリー（Biorad;Cat#223-9780）。
【００８４】
C. 方法
1. Y2B8の調製
一般的に、 90Yラベルされた2B8−MX−DTPAは、以下に記載した変更により修飾された、上記の小スケールバージョンの放射ラベルキットプロトコルを使用して調製した。放射ラベルは、保存濃度が84mCi/mLまたは29.8mCi/mLの濃度の90Y塩化物を使用して行い、それぞれ月曜日または金曜日用量のプレパレーションをシミュレートした（水曜日キャリブレーションである50mCi/mLを基にして）。濃縮された90Y塩化物溶液は、50mM HCl(Ultrex, high-purity)を使用して、「金属フリー」のプラスチックマイクロフージチューブ内で希釈した。Ultrex(high-purity)HClを洗浄用の滅菌水（SWFI）で50mMに希釈した。放射ラベル反応は、「金属フリー」のプラスチックマイクロフージチューブ、15mlのコニカルチューブ、またはY2B8放射ラベルキットにより提供された10mLのガラス中隔反応バイアル内で行った。
【００８５】
a. 小スケールラベルから全スケール用量の調整
0、3、10、および40mCiの放射ラベル反応は、月曜日用量プレパレーションをシミュレートする反応条件を使用して行った。各反応の試薬量をmLsとして表5に抄録した。
【００８６】
【表５】
0004558947.tif 000006
5分間インキュベートした後、20μlサンプルを除去して、調合バッファーで最終抗体濃度を0.21mg/mLに希釈して、アッセイするまで2-8℃に保存した。このレポートに記載された以下の全ての実験において、コントロールとして1mCi反応液を使用したので、結合値を1mCi反応液に標準化した。報告された値は、コントロールの結合値により各反応の結合値を割ることによって1mCiコントロールサンプルとして標準化し、割合として表示した。
【００８７】
b. 添加した酢酸ナトリウムの量に対する影響
月曜日ラベルにおいて、10mCiの90Y塩化物（0.119mL）と0.114mLの50mM酢酸ナトリウムを混合した。この50mM酢酸ナトリウムの量は、IDEC−Y2B8の臨床において用量を調整するために通常使用されるバッファーの量よりも20％少ない。結合した抗体（2B8−MX−DTPA）を添加して（0.333ml）、前記サンプルを混合して、次に周囲温度でインキュベートした。放射ラベル溶液の特異的活性は18.9mCi/mg抗体であった。2分の時点で、0.020mLを除去して、調合バッファーで0.24mg/mLに調合して、2-8℃に保存した。8分後、放射ラベル溶液の残りを0.24mg/mLに調合して、2-8℃に保存した。金曜日ラベルをシミュレートするために、0.336mlの90Y塩化物、0.323mLの酢酸ナトリウム、および0.333mlの2B8−MX−DTPAを使用して、前記プロトコルを繰り返した。両研究において、上記の「標準」条件を使用して、1mCiコントロース反応を行った（5分反応）。
【００８８】
c.添加した90Y塩化物の量に対する影響
月曜日ラベルにおいて、12mCiの90Y塩化物（0.143mL）を0.143mLの50mM酢酸ナトリウムと混合した。この90Yの量は、一般的にY2B8を用量調整するために通常使用される90Yの量よりも20％多い。結合した抗体を添加して、前記サンプル溶液を混合して、次に周囲温度でインキュベートした。最終的な放射ラベル溶液の特的活性は22.5mCi/mg抗体であった。2分の時点で、0.020mLを除去して、調合バッファーで0.24mg/mLに調合して、2-8℃に保存した。8分後、放射ラベル溶液の残りを0.24mg/mLに調合して、2-8℃に保存した。金曜日ラベルも同様に、0.403mlの90Y塩化物、0.403mLの酢酸ナトリウム、および0.333mlの2B8−MX−DTPAを使用して実施した（特異的活性は22.5mCi/mg抗体であった）。両研究において、上記の「標準」条件を使用して、1mCiコントロース反応を行った（5分反応）。
【００８９】
d.抗体結合体の量を少なく添加したときの影響
月曜日ラベルにおいて、10mCiの90Y塩化物（0.119mL）と0.143mLの50mM酢酸ナトリウムを混合した。通常使用される抗体の量よりも20％少ない結合した抗体を添加して（0.267ml）、前記サンプルを混合して、次に周囲温度でインキュベートした。2および8分の時点で、0.020mLを除去して、調合バッファーで最終抗体濃度を0.24mg/mLに調合して、アッセイまで2-8℃に保存した。金曜日ラベルも同様に、0.336mlの90Y塩化物、0.403mLの酢酸ナトリウム、および0.27mlの結合体を使用して、実施した。両研究において、上記の「標準」条件を使用して、1mCiコントロース反応を行った（5分反応）。
【００９０】
e.試薬のずれを組み合わせたときの影響
月曜日または金曜日ラベルプロトコルにおいて、酢酸ナトリウム、90Y塩化物、および結合体の量を20％すらしたときの影響を同時に評価した。月曜日ラベルにおいて、12mCiの90Y塩化物（0.143mL）を0.113mLの50mM酢酸ナトリウム、20％多い量を示す90Y塩化物、通常使用される酢酸ナトリウムの20％少ない量と混合した。通常使用される抗体よりも20％少ない量を示す2B8−MX−DTPAを添加して、前記サンプル溶液を混合して、その後周囲温度でインキュベートした。2、4、6および8分の時点で、0.020mLを除去して、調合バッファーで最終抗体濃度を0.24mg/mLに調合して、アッセイまで2-8℃に保存した。金曜日ラベルも同様に、0.403mlの90Y塩化物、0.387mLの酢酸ナトリウム、および0.267mlの結合体を使用して実施した；40μLのサンプルを示した時間に除去して、調合バッファーで調合した。両研究において、上記の「標準」条件を使用して、1mCiコントロース反応を行った（5分反応）。
【００９１】
2.  放射取り込みの測定
上記アッセイに従って、Biodex（Tec-Control Radiochromatographic Kit）によって製造された商業的に利用可能なキットを使用して、結合体と結合した放射活性の量を測定した。一般的なマイクロピペッターを使用して、0.5-1μlのサンプルを複製ストリップに注ぎ、かつBiotex instruction incertによって展開した。Isodataガンマカウンターを100-1000KeVのウィンドーで使用して、ガラスチューブ内でストリップの半分の放射活性を計測した。放射ラベルの取り込みは、上部および底部の半分の両方から求めた全活性から前記ストリップの上部半分の放射活性の量をわけることによって評価した。この値は、パーセントとして、かつ測定した平均値を示した。
【００９２】
3.結合の測定
上記プロトコルに従って、サンプルのCD20陽性細胞に対する結合％を解析した。しかし、ネガティブコントロールであるHSB細胞のサンプルは、これらの実験には含まれておらず、およびSB細胞はマイクロフージチューブの代わりに5mlバイアル内で凍結乾燥した。
【００９３】
本質的に、最終的に調合した全てのY2B8サンプルは、希釈バッファー（10.0μlの抗体+990μLバッファー）で1：100に希釈した。次に前記抗体は、50mLポリプロピレンチューブ内の10mlの希釈バッファーに、30μLの1：100希釈液を添加することによって8ng/mLの範囲の濃度に再び希釈した。
【００９４】
6から7個の凍結乾燥細胞のバイアルをSWFIで元に戻して、50mLコニカルチューブにプールした。再構成された細胞（0.5mL）を三本の1.5mLマイクロフージチューブ内に三等分して、サンプルあたり三本をテストした。希釈バッファー（0.5mL）を三本の空のマイクロフージチューブに添加した。希釈した抗体（0.5mL）をそれぞれのチューブに添加して、しっかりとふたをして、周囲温度で45分間、エンドオーバーエンドで混合してインキュベートした。インキュベーションした後、「6」（4000×ｇ）にセットしたSavant マイクロ遠心機を使用して、5分間遠心することによって細胞をペレットとした。エネルギーウィンドーを100-1000KeVにセットしたIsodata ガンマカウンターを使用して放射活性を測定するために、前記サンプルの上清（0.75mL）を12×75mmのガラスチューブに移した。
【００９５】
細胞に結合した放射活性（B）は、添加した全放射活性から未結合（上清）の放射活性を引くことによって見積もった。全放射活性は、細胞のないチューブの放射活性を計測することによって測定した。結合％は、結合した放射活性を全パーセントとして示すことによって見積もった。
【００９６】
結合を評価するために使用する凍結乾燥された細胞間のロットのばらつき効果を最小にするために、「標準的」ラベル条件を使用して調製された1mCiのY2B8コントロールによって結合値を標準化した。この節の始めの方に述べたように、各セットの実験に対してコントロールサンプルを調製した。
【００９７】
D.結果
1.全スケールでの用量のプレパレーションを予測するための小スケールラベル  小スケール放射ラベル反応から、全スケール（40mCi）用量のプレパレーションが予測されることを確認するために、上述の放射ラベルプロトコルを使用して、1、3、10、および40mCiのY2B8用量を調製した。これらの結果を表6に示し、および反応混合液のスケールを1ｍCi〜40mCiに増加しても、結合、または放射取り込みに対して不利な影響がないことが示される。
【００９８】
【表６】
0004558947.tif 000007
2.酢酸ナトリウムの量を少なく添加した場合の影響
20％少ない量の酢酸ナトリウムを使用して、かつインキュベーション時間を60％のばしてY2B8を調製した場合、以下の「標準的」ラベル条件で調製された放射ラベルと比較して、実質的な結合が保持された（以下の表7）。ラベル反応が月曜日ラベル条件を使用して実施された場合でさえ、コントロール結合の＞89％が保持された。同様の結果が、金曜日用量のプレパレーションからも得られた。このようなずれは、用量を調製した日にちにかかわらず、放射取り込みに影響を与えなかった。
【００９９】
3.90Y塩化物の量を過剰に添加した場合の影響
20％過剰量の90Y塩化物を使用して、インキュベーション時間を通常使用されるものよりも60％長くすることと組み合わせて、Y2B8を調製した場合、以下の「標準的」ラベル条件によって調製された放射ラベルと比較した場合の、実質的な結合が保持された（以下の表7）。ラベル反応を8分間増加した場合、月曜日または金曜日用量プレパレーションのいずれにおいても、コントロールと比較して、結合は＞90％のままであった。20％多い量の90Y塩化物を添加しても、用量を調製した日にちにかかわらず、放射取り込みに影響を与えなかった。
【０１００】
4.抗体結合体の量を少なく添加した場合の影響
20％少ない量の結合体（2B8−MX−DTPA）を使用して、かつインキュベーション時間を60％のばしてY2B8を調製した場合、以下の「標準的」ラベル条件で調製された放射ラベルと比較して、結合は有意な影響を受けなかった（以下の表7）。20％少ない量の結合体を添加しても、用量を調製した日にちにかかわらず、放射取り込みに影響を与えなかった。
【０１０１】
【表７】
0004558947.tif 000008
5.試薬のずれと組み合わせた場合の影響
四種のずれの全てを同時に起こしたプロトコルを使用してY2B8を調製した場合、「標準的」ラベル条件で調製された放射ラベル抗体と比較して、結合はいまだ実質的に維持された（以下の表8）。月曜日プレパレーションを通常使用される最大の6分よりも30％長くインキュベートした場合でさえ、まだ結合が＞83％であった。用量を調製した日にちにかかわらず、8分間インキュベートした後でさえ、放射取り込みは、これらの累積したずれによる影響を受けなかった。
【０１０２】
【表８】
0004558947.tif 000009
V．考察
オペレーターに暴露される放射線を減らすために、全スケール用量の調製の代わりに、より少ないラベル反応を評価した。従って、我々は、本研究において評価された1mCおよび10mCiラベルにより、全スケールの40mCiのプレパレーションを予測されることを立証した。この結果は、1mC〜40mCiの範囲以上において、結合および放射線取り込みに有意差がないことを示した。
【０１０３】
我々は、酢酸ナトリウム、90Y塩化物、および結合した抗体の20％量の誤差が、放射ラベルプロトコルにおけるずれの極限値である可能性を示していると判断した。さらに、8分間（通常より3分長い）の培養が有意なプロトコルのずれであると見なされる。一般に、90Y塩化物の半減期が短いために、放射性同位体の量は用量調製する日に依存して変更されるであろう。従って、本研究において記載された実験は、用量調製をし得る全範囲を提示するために、90Y塩化物を月曜日および金曜日それぞれの両方の濃度において使用して行った。
【０１０４】
20％少ない量の酢酸ナトリウム、かつ8分間のインキュベーションを使用して調製されたY2B8の用量は、標準的ラベル条件と比較して、有意な結合が保持された（＞89％）。同様の結果が、月曜日または金曜日用量プレパレーションから得られた。月曜日または金曜日のいずれにおいても、20％多い量の90Y塩化物を添加して、かつ8分までインキュベーションすることにより、標準的ラベル条件と比較して結合が減少された。しかし、結合は、上記の標準化された放射規格の＞90％のままであった。結合は金曜日用量プレパレーションの方がわずかによかった。放射取り込みは、90Y塩化物の量の増加によって有意な影響を受けなかった。
【０１０５】
全ての量のずれを同時に起こした場合の影響を評価するために、月曜日または金曜日用量で調製して、2、4、6，および8分のインキュベーション時間を比較した。8分のインキュベーション時間を使用してY2B8が月曜日に調製された場合にのみ、標準化された規格にわずかに結合が合わなかった（標準化された放射規格である86.3％と比較して83.2％）。
【０１０６】
それぞれの引例は、本明細書の参照文献によって援用される。
【図面の簡単な説明】
【図１】A）SB細胞を洗浄して、希釈バッファー（1％ウシ血清アルブミン（BSA）を含む1×PBS、pH7.2-7.4。2B8−MX−DTPA lot#0165A.を使用して調製した2ng/mlのY2B8で3時間インキュベートして、細胞の濃度を増加した）で90×106細胞/mlに懸濁した場合の図。B）細胞濃度対結合した放射活性/総放射活性（B/AT）の二重逆数プロットを示す図。免疫応答性を1/y-intercept×100として推定した。免疫反応性、および相関関数（R）値は、それぞれ77.2％、および0.999であった。
【図１】
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