(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アスペルギウス族（Aspergillus）を種特異的に同定するための単離された核酸プローブであって、該プローブが、Aspergillus flavus（配列番号１）、Aspergillus fumigatus（配列番号２）、Aspergillus niger（配列番号３）、Aspergillus terreus（配列番号４）およびAspergillus nidulans（配列番号５）のうちのいずれか一つの内部転写スペーサー２の核酸配列またはその相補的配列に選択的にハイブリダイズする、プローブ。
【請求項２】
配列番号１に記載のAspergillus flavus核酸またはその相補的配列に選択的にハイブリダイズし得る、請求項１に記載の単離された核酸プローブ。
【請求項３】
配列番号２に記載のAspergillus fumigatus核酸またはその相補的配列に選択的にハイブリダイズし得る、請求項１に記載の単離された核酸プローブ。
【請求項４】
配列番号３に記載のAspergillus niger核酸またはその相補的配列に選択的にハイブリダイズし得る、請求項１に記載の単離された核酸プローブ。
【請求項５】
配列番号４に記載のAspergillus terreus核酸またはその相補的配列に選択的にハイブリダイズし得る、請求項１に記載の単離された核酸プローブ。
【請求項６】
配列番号５に記載のAspergillus nidulans核酸またはその相補的配列に選択的にハイブリダイズし得る、請求項１に記載の単離された核酸プローブ。
【請求項７】
サンプルにおいて、Aspergillus flavus（配列番号１）、Aspergillus fumigatus（配列番号２）、Aspergillus niger（配列番号３）、Aspergillus terreus（配列番号４）またはAspergillus nidulans（配列番号５）の種を検出する方法であって、該サンプルと、配列番号１〜５のうちのいずれか一つの内部転写スペーサー２の核酸配列またはその相補的配列に選択的にハイブリダイズし得る核酸プローブとを組み合わせる工程を包含し、該核酸プローブのサンプルとのハイブリダイゼーションの存在が、該サンプル中のアスペルギウス属（Aspergillus）の種の検出を示す、方法。
【請求項８】
前記プローブが、配列番号１に記載のAspergillus flavus核酸またはその相補的配列に選択的にハイブリダイズし得る、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記プローブが、配列番号２に記載のAspergillus fumigatus核酸またはその相補的配列に選択的にハイブリダイズし得る、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記プローブが、配列番号３に記載のAspergillus niger核酸またはその相補的配列に選択的にハイブリダイズし得る、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記プローブが、配列番号４に記載のAspergillus terreus核酸またはその相補的配列に選択的にハイブリダイズし得る、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記プローブが、配列番号５に記載のAspergillus nidulans核酸またはその相補的配列に選択的にハイブリダイズし得る、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
配列番号３０または３１のヌクレオチド配列からなる、請求項１に記載のAspergillus flavusを同定するためのプローブ。
【請求項１４】
配列番号３２のヌクレオチド配列からなる、請求項１に記載のAspergillus fumigatusを同定するためのプローブ。
【請求項１５】
配列番号３３のヌクレオチド配列からなる、請求項１に記載のAspergillus nigerを同定するためのプローブ。
【請求項１６】
配列番号３４のヌクレオチド配列からなる、請求項１に記載のAspergillus terreusを同定するためのプローブ。
【請求項１７】
配列番号３５のヌクレオチド配列からなる、請求項１に記載のAspergillus nidulansを同定するためのプローブ。
【請求項１８】
プローブが配列番号３０または３１のヌクレオチド配列である、請求項７に記載のAspergillus flavusを検出するための方法。
【請求項１９】
プローブが配列番号３２のヌクレオチド配列である、請求項７に記載のAspergillus fumigatusを検出するための方法。
【請求項２０】
プローブが配列番号３３のヌクレオチド配列である、請求項７に記載のAspergillus nigerを検出するための方法。
【請求項２１】
プローブが配列番号３４のヌクレオチド配列である、請求項７に記載のAspergillus terreusを検出するための方法。
【請求項２２】
プローブが配列番号３５のヌクレオチド配列である、請求項７に記載のAspergillus nidulansを検出するための方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、合衆国政府の機関である、the Centers for Disease Control Mycotic Diseases Laboratoriesにおいて成された。
技術分野
本出願は、一般的に診断微生物学の分野に関する。詳細には、本発明は、Aspergillus、Fusarium、Mucor、Penicillium、Rhizopus、Rhizomucor、Absidia、Cunninghamella、Pseudallescheria boydii（Scedosporium apiospermum）およびSporothrix種の種特異的な検出に関する。
発明の背景
近年、血液学的悪性疾患に対する化学療法および器官移植レシピエントに対する高用量コルチコステロイド処置は、AIDSの流布と共に、免疫無防備状態の患者の数を非常に増加した（１、12、14、43）。環境中に見出され、そして低ビルレンスであると考えられている腐生性糸状菌（例えば、Aspergillus、RhizopusおよびMecor種）が、今や、免疫無防備状態宿主で数の増加している感染症の原因である（17、20、43）。さらに、これらの感染症はしばしば、免疫無防備状態の患者において、劇症および急性致死性である（７、11、12、20、44）。罹患率および死亡率は非常に高い；例えば、aspergillosisは約90％の死亡率を有する（８、11）。
問題を複雑にすることに、診断は困難であり、そしてしばしば、症状は特殊なものではない（18、27、29、42、44）。抗体に基づく試験は、免疫無防備状態の患者の弱まったまたは可変的な免疫応答に起因して、信頼できるものであり得ない（２、９、18、46）。今までに開発された抗原検出試験は所望の感度にはおよばない範囲にあった（２、９、38）。放射線検査証拠は非特異的および非決定的であり得るが（５、29、36）、診断におけるいくらかの進歩はコンピューター化断層撮影法の出現と共に成されてきた（40）。しかし、最終的な診断は、さらにポジティブな血液または組織培養物あるいは組織病理学的な確認のいずれかを必要とする（３、21）。追加される複雑な問題は、生体組織検査材料を得るために必要な侵襲性手順は、しばしば、血小板減少性患者集団には推奨されていない、ということである（37、41）。
血液、肺または嗅脳室性組織の培養がポジティブである場合でさえ、糸状菌の形態学的および生化学的同定は適切な増殖および胞子形成が生じるために数日を必要とし得、これにより標的化した薬物治療を遅らせる。いくつかの異型単離物は決して胞子形成し得ず、これによりさらにより同定を困難にし得る（23）。組織病理学が組織生体組織検査切片上で行われる場合、組織中の種々の糸状菌の形態形成学的類似性により区別は困難となる（16）。交差反応（cross-reactive）エピトープ（これは得られる抗体反応を弱くし得る）が吸収されない限り、組織病理学的組織切片の蛍光抗体染色は特異的ではない（14、19）。治療的選択は変化して（７、41、44）、適切な標的化治療の完成が至急必要とされる、迅速および特異的に糸状菌を同定する試験を作成する。早期および正確な診断および処置は罹患率を減少させ、そして患者が生存する機会を増加し得る（6、27、39）。さらに、少なくとも種のレベルまでの糸状菌の同定は疫学的に有用である（24、31、43、47）。
PCRに基づく検出方法（これは感染を迅速に感度良く診断する手段の見込みがある）が、Candida種（13、15、30）およびいくつかの他の真菌（特にAspergillus種）（31、33、45）由来のDNAの同定に使用されてきた。しかし、これらの試験のほとんどは単に属特異的（28、38）であるか、または単一コピーの遺伝子の検出のみに関する（４、35）。他のものは、試験の感度を増加するように多重遺伝子コピー遺伝子を検出するプローブを設計してきているが（31、33）、そのようにする場合は試験の特異性を失っている。なぜならばそれらは高度に保存された遺伝子を使用しており、これは１つかまたはいくつかの種を検出するが、また、ヒト、真菌またはウイルス性DNAに対してさえ交差反応性を有し、このことは悩みのもとである（25、31、33）。
それゆえ、本発明の目的は、臨床的および実験的な設定において、Aspergillusおよび他の糸状菌種を検出および区別するための、改善された材料および方法を提供することである。
発明の要旨
本発明は、Aspergillus、Fusarium、Mucor、Penicillium、Rhizopus、Rhizomucor、Absidia、Cunninghamella、Pseudallescheria（Scedosporium）およびSporothrix種を検出するための核酸に関する。独特な内部転写スペーサー２コード領域は、５個の異なるAspergillus種（A.flavus、A.fumigatus、A.niger、A.terreusおよびA.nidulans）に特異的なプローブの開発を可能にする。それによって、本発明は、被験体におけるAspergillus感染の種特異的な検出および診断のための方法を提供する。さらに、３つのFusarium、４つのMucor、２つのPenicillium、５つのRhizopusおよび１つのRhizomucor種に対する種プローブ、ならびにAbsidia corymbifera、Cunninghamella elegans、Pseudallescheria boydii（Scedosporium apiospermum）およびSporothrix schenckiiに対するプローブが開発されている。Aspergillus、FusariumおよびMucor種に対する属プローブもまた、開発されている。
本開示の実施態様の以下の詳細な説明および添付の請求の範囲の再検討の後、本発明のこれらおよび他の目的、特徴および利点が明らかになる。
発明の詳細な説明
本発明は、糸状菌種を、互いに、および他の医学的に重要な真菌から区別する、簡単で、迅速および有用な方法を提供する。本発明は、宿主サンプルから真菌DNAを単離する迅速、簡単および有用な方法を可能にし、そして疾患の診断のために種特異的プローブおよび属特異的プローブを適用する方法を可能にする。最終的に、これらのプローブは、宿主組織および微生物の形態学が無傷のままであるように、インサイチュハイブリダイゼーションまたはインサイチュPCR診断に使用され得る。
本発明は５つのAspergillus、３つのFusarium、４つのMucor、２つのPenicillium、５つのRhizopusおよび１つのRhizomucor種に特異的な領域を含む核酸ならびにAbsidia corymbifera、Cunninghamella elegans、Pseudallescheria boydii（Scedosporium apiospremum）およびSporothrix schenckiiのプローブを提供する。これらの核酸は上述の糸状菌のゲノムのリボソームデオキシリボ核酸（rDNA）の内部転写スペーサー２（「ITS2」）領域由来である。ITS2領域は5.8S rDNA領域と28S rDNA領域との間に配置される。
詳細には、本発明は以下に記載されるもの由来の核酸を提供する：
0004425354.tif 000002
これらの配列はAspergillus、Fusarium、Mucor、RhizopusおよびPenicilliumのそれぞれの種を同定ならびに区別するために使用され得、そしてこれらの種を互いから、ならびにAbsidia corymbifera、Cunninghamella elegans、Pseudallescheria boydii（Scedosporium apiospermum）およびSporothix schenkiiから同定および区別するために使用され得る。
さらに、本発明はGenBank核酸配列由来（Penicillium marneffeiおよびFusarium oxysporumのみについて）、または上記の核酸配列由来（これは以下の種特異的な識別名として使用され得る：
0004425354.tif 000003
）由来の単離された核酸プローブを提供する。このようなプローブは、Aspergillus、Fusarium、Mucor、Rhizopus（またはRhizomucor）、Penicillumの種、あるいはAbsidia corymbifera、Cunninghamella elegans、Pseudallescheria boydii（Scedosporium apiospermum）およびSporothrix schenkii由来の核酸を含むサンプルと選択的にハイブリダイズするために使用され得る。これらの真菌は、真菌DNAのポリメラーゼ連鎖反応またはリガーゼ連鎖反応増幅、ならびに増幅されたDNAの、例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼおよび比色基質で標識された抗ジゴキシゲニン抗体と反応する、ジゴキシゲニンで標識されたDNAプローブでの特異的プロービングの後に検出され得る。日常的に、さらなるプローブは、配列番号１〜29（これらは個々の種に特異的である）に示される配列由来であり得る。それゆえ、配列番号30〜57に示されるプローブは、単に種特異的なプローブ（これらは配列番号１〜29由来であり得る）の例として提供される。
Aspergillus（配列番号５８）、Fusarium（配列番号５９）およびMucor（配列番号６０）種に対する属プローブもまた、上記に列挙されるそれらのそれぞれの種のすべてのメンバーを同定するために開発され、ならびに上記に列挙されるすべての種特異的および属プローブをそれらの検出のために捕獲するために全真菌ビオチン化プローブ（配列番号６１）が開発された。
「単離された」は、少なくとも、それとともに天然に存在するいくつかの成分を含まない核酸を意味する。「選択的」または「選択的に」は、Aspergillus、Fusarium、Mucor、Penicillium、RizopusまたはRhizomucor属または種、あるいはAbsidia corymbifera、Cunninghamella elegans、Pseudallescheria boydii（Scedosporium apiospermum）、またはSporothrix schenckii種、の適切な決定を妨害する他の核酸とハイブリダイズしない配列を意味する。
ハイブリダイズする核酸は、それがハイブリダイズする核酸のセグメントと少なくとも７０％の相補性を有するべきである。核酸を記載するため本明細書で用いられるように、用語「選択的にハイブリダイズする」は、しばしばランダムにハイブリダイズする核酸を排除し、そしてそれ故「特異的にハイブリダイズする」と同じ意味をもつ。本発明の選択的にハイブリダイズする核酸は、それがハイブリダイズする配列のセグメントと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、および９９％の相補性を有し得る。
本発明は、本明細書に詳細に提供されるようなＤＮＡの相補的鎖、または反対鎖に選択的にハイブリダイズする配列、プローブおよびプライマーを予期する。核酸との特異的なハイブリダイゼーションは、機能的な種特異的または属特異的ハイブリダイゼーション能力が維持される限り、核酸における小さな改変または置換とともに生じ得る。「プローブ」は、それらの検出または増幅用の相補的核酸配列との選択的ハイブリダイゼーションのためのプローブまたはプライマーとして用いられ得る核酸配列を意味し、このプローブは、長さが、約５から１００ヌクレオチド、または、好ましくは約１０から５０ヌクレオチド、または最も好ましくは約１８ヌクレオチドで変化し得る。本発明は、種特異的核酸と、ストリンジェントな条件下で選択的にハイブリダイズし、そして目的の配列と相補的な少なくとも５ヌクレオチドを有するべきてある単離された核酸を提供する。Maniatis（26）を一般に参照のこと。
プライマーとして用いられる場合、本発明は、所望の領域を増幅するために異なる領域とハイブリダイズする少なくとも２つの核酸を含む組成物を提供する。プローブまたはプライマーの長さに依存して、標的領域は、７０％の相補的塩基と完全な相補性との間の範囲であり得、かつストリンジェントな条件下でなおハイブリダイズし得る。例えば、Aseprgillusの存在を診断する目的には、ハイブリダイズする核酸（プローブまたはプライマー）とそれがハイブリダイズする配列（例えば試料からのAspergillus ＤＮＡ）との間の相補性の程度は、少なくとも他の酵母および糸状菌からの核酸とのハイブリダイゼーションを区別するに十分である。本発明は、列挙された配列中の各糸状菌に特有の核酸の例を提供し、その結果ストリンジェントな条件下、非選択的にハイブリダイズする核酸から選択的にハイブリダイズする核酸を区別するために必要な相補性の程度が、各核酸について明瞭に決定され得る。
あるいは、核酸プローブは、上記に列挙された真菌の１つより多いの種において存在するヌクレオチド配列と相同性を有するように設計され得る。このような核酸プローブは、Aspergillus（配列番号５８）、Fusarium（配列番号５９）、およびMucor（配列番号６０）ならびに列挙されたすべての真菌（配列番号６１）について列挙された属プローブのような一群の種を選択的に同定するために用いられ得る。さらに、本発明は、核酸を用いて、他の糸状菌およびCandida種のような酵母から概して列挙された糸状菌を鑑別し得ることを提供する。このような測定は臨床的に重要である。なぜなら、これらの感染に対する治療は異なるからである。
本発明はさらに、核酸を用いて、列挙された糸状菌、またはその特定の種の存在を検出および同定する方法を提供する。この方法は、糸状菌を含むと疑われる試料を得る工程を包含する。この試料は、個体から採取され得るか（例えば、血液、唾液、肺洗浄液、膣粘膜、組織など）、または環境から採取され得る。次いで糸状菌の細胞は、溶解され、そしてＤＮＡを抽出しかつ沈澱させ得る。好ましくは、ＤＮＡは、糸状菌ｒＤＮＡの内部転写スペーサー領域１８Ｓ、５．８Ｓおよび２８Ｓ領域由来のユニバーサルプライマーを用いて増幅される。このようなユニバーサルプライマーの例は、以下にＩＴＳ１（配列番号６２）、ＩＴＳ３（配列番号６３）、ＩＴＳ４（配列番号６４）として示される。糸状菌ＤＮＡの検出は、増幅されたＤＮＡを、このＤＮＡと選択的にハイブリダイズする種特異的プローブとハイブリダイズすることにより達成される。ハイブリダイゼーションの検出は、糸状菌の特定の属（属プローブについて）または種（種プローブについて）の存在の指標である。
好ましくは、核酸（例えばプローブまたはプライマー）ハイブリダイゼーションの検出は、検出可能部分の使用により容易にされ得る。例えば、種特異的または属プローブが、ジゴキシゲニンで標識され得、そして配列番号６１に記載のような全真菌プローブがビオチンで標識され得、そしてストレプトアビジン被覆マイクロタイタープレートアッセイで用いられ得る。その他の検出可能部分は、例えば、放射能標識、酵素標識、および蛍光標識を含む。
本発明は、試料中の特定の糸状菌の種および属の検出のために用いられ得る１つ以上の種特異的プローブを含むキットをさらに意図する。このようなキットはまた、試料にプローブをハイブリダイズし、そして結合したプローブを検出するための適切な試薬を備え得る。本発明は、以下の非制限的な実施例によりさらに実証され得る。
実施例
この実施例では、ユニバーサルな真菌特異的プライマー、およびアンプリコン検出のための単純迅速ＥＩＡを基礎にしたフォーマットを利用するＰＣＲアッセイを用いた。
糸状菌ＤＮＡの抽出
機械的破壊方法を用いて糸状菌種からＤＮＡを得、そして先に記載（13）の酵素的破壊方法を用いて酵母からＤＮＡを得た。糸状菌は、Sabouraudデキストロース寒天スラント（ＢＢＬ、Becton Dickinsonの部門、Cockeysville、ＭＤ）において、３５℃で４〜５日増殖させた。次いで２つのスラントを、５mlの0.01Ｍのリン酸カリウム緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を各スラントの表面上に激しくピペッティングすることにより洗浄し、そして洗浄液を２５０ｍｌのSabouraudデキストロースブロス（ＢＢＬ）を含む500mlのErlenmeyerフラスコに移した。次いで、フラスコをロータリーシェーカー（140rpm）において、周囲温度で４〜５日間インキュベートした。次いで、増殖物を、２Ｌのサイドアームフラスコに取り付けた滅菌Buchner濾斗中に置かれた滅菌Whatman＃１濾紙を通す真空濾過により回収した。得られた細胞マットを、濾過装置上で滅菌蒸留水を用いて３回洗浄し、ゴムポリスマンを用いて穏やかに掻き取ることにより濾紙から取り出し、そして滅菌Petriプレート中に置き、次いでパラフィルムでシールし、そして使用するまで−２０℃で凍結した。
使用直前に、凍結細胞マットのサイズで等しく４等分した一部分を、取り出し、そして冷乳鉢（直径６インチ）中に置いた。液体窒素を添加してマットを覆い、次いで乳棒で粉末にすりつぶした。粉砕の間にマットの凍結を保つために必要に応じてさらなる液体窒素を添加した。
次いでＤＮＡを、プロテイナーゼＫおよびＲＮａｓｅ処理、複数回のフェノール抽出、およびエタノール沈澱を用いて従来手段（26）によって精製した。
ＰＣＲ増幅
真菌特異的なユニバーサルプライマーペアＩＴＳ３（5’-ＧＣＡ ＴＣＧ ＡＴＧ ＡＡＧ ＡＡＣ ＧＣＡ ＧＣ-3’）（配列番号６３）およびＩＴＳ４（5’-ＴＣＣ ＴＣＣ ＧＣＴ ＴＡＴ ＴＧＡ ＴＡＴ ＧＣ-3’）（配列番号６４）を用いて、先に記載のように（13、34）、各種について、５．８Ｓ ｒＤＮＡ領域の一部分、全ＩＴＳ２領域、および２８Ｓ ｒＤＮＡ領域の一部分を増幅した。ＤＮＡ配列決定には、このプライマーペアを、そしてまた真菌特異的ユニバーサルプライマーペアＩＴＳ１（5’-ＴＣＣ ＧＴＡ ＧＧＴ ＧＡＡ ＣＣＴ ＧＣＧ Ｇ-3’）（配列番号６２）および１８Ｓ ｒＤＮＡ領域の一部分全５．８Ｓ領域、全ＩＴＳ１およびＩＴＳ２領域、ならびに２８Ｓ ｒＤＮＡ領域の一部分を増幅するためのＩＴＳ４、を用いた。
ゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅には、ＤＮＡ試薬キット（TaKaRa Biomedicals、Shiga、Japan）を用いた。ＰＣＲは、２μlの試験試料を用いて、１０μlの１０×Ｅｘ Ｔａｑ緩衝液、８μl中の各２．５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＴＴＰ、０．２μＭの各プライマー、ならびに０．５ＵのＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼからなる１００μlの全ＰＣＲ反応容量中で実施した。３０サイクルの増幅を、９５℃５分間におけるＤＮＡの初期変性後、Ｐｅｒｋｉｎ-Ｅｌｍｅｒ９６００サーマルサイクラー（Emeryville、CA）中で実施した。各サイクルは、９５℃における３０秒間の変性工程、５８℃における３０秒間のアニーリング工程、および７２℃における１分間の伸長工程からなった。７２℃における５分間の最終伸長工程を最終サイクル後に行った。増幅後、使用するまで試料を−２０℃で貯蔵した。
0004425354.tif 000004
ＤＮＡ配列決定
初期ＤＮＡ増幅を上記のように実施した。初期ＰＣＲ反応の水相を、QIAquick Spin Columns（Quiagen、Chatsworth、CA）を用いて精製した。ＤＮＡを、各カラムから、５０μlの熱滅菌Ｔｒｉｓ-ＥＤＴＡ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を用いて溶出した。
精製ＤＮＡを、色素ターミネーターサイクル配列決定キット（ABI PRISM、Perkin Elmer、Foster City、CA）を用いて標識した。１つの混合物をプライマーの各々について作成し、その結果、配列決定は、前方向および逆方向の両方で行うことができた。反応容量（２０μl）は、９．５μlのTerminator Premix、２μl（１ng）のＤＮＡテンプレート、１μlのプライマー（３．２ｐｍｏｌ）および７．５μlの熱滅菌蒸留Ｈ2Ｏを含んだ。次いで混合液を、予備加熱した（９６℃）Perkin Elmer 9600サーマルサイクラー中に置き、９６℃１０秒、５０℃５秒、６０℃４分の２５サイクルを行った。次いでＰＣＲ産物を、配列決定の前に、CentriSepスピンカラム（Princeton Separations、Adelphia、NJ）を用いて精製した。次いでＤＮＡを真空乾燥し、６μlのホルムアミド-ＥＤＴＡ（５μlの脱イオン化ホルムアミド＋１μlの５０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に再懸濁し、そして９０℃で２分間変性した後、自動化キャピラリーＤＮＡシークエンサー（ABI Systems、Model 373、Bethesda、MD）を用いて配列決定した。
配列決定結果は以下の通りであった：
Aspergillus flavus ５．８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子、部分配列、内部転写スペーサー２、完全配列、および２８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子、部分配列。
0004425354.tif 000005
Aspergillus fumigatus ５．８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子、部分配列、内部転写スペーサー２、完全配列、および２８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子、部分配列。
0004425354.tif 000006
Aspergillus niger ５．８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子、部分配列、内部転写スペーサー２、完全配列、および２８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子、部分配列。
0004425354.tif 000007
Aspergillus terreus ５．８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子、部分配列、内部転写スペーサー２、完全配列、および２８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子、部分配列。
0004425354.tif 000008
Aspergillus nidulans ５．８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子、部分配列、内部転写スペーサー２、完全配列、および２８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子、部分配列。
0004425354.tif 000009
Fusarium solani（ATCC 62877株）内部転写スペーサー２および隣接領域。
0004425354.tif 000010
Fusarium moniliforme（ATCC 38519株）内部転写スペーサー２および隣接領域。
0004425354.tif 000011
Mucor rouxii（ATCC 24905株）内部転写スペーサー２および隣接領域。
0004425354.tif 000012
Mucor racemosus（ATCC 22365株）内部転写スペーサー２および隣接領域。
0004425354.tif 000013
Mucor plumbeus（ATCC 4740株）内部転写スペーサー２および隣接領域。
0004425354.tif 000014
Mucor indicus（ATCC 4857株）内部転写スペーサー２および隣接領域。
0004425354.tif 000015
Mucor circinelloides f．circinelloides（ATCC 1209B株）内部転写スペーサー２および隣接領域。
0004425354.tif 000016
Rhizopus oryzae（ATCC 34965株）内部転写スペーサー２および隣接領域。
0004425354.tif 000017
Rhizopus oryzae（ATCC 11886株）内部転写スペーサー２および隣接領域。
0004425354.tif 000018
Rhizopus microsporus（ATCC 14056株）内部転写スペーサー２および隣接領域。
0004425354.tif 000019
Rhizopus microsporus（ATCC 12276株）内部転写スペーサー２および隣接領域。
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Rhizopus circinans（ATCC 34106株）内部転写スペーサー２および隣接領域。
0004425354.tif 000021
Rhizopus circinans（ATCC 34101株）内部転写スペーサー２および隣接領域。
0004425354.tif 000022
Rhizous stolonifer（ATCC 14037株および6227A株）内部転写スペーサー２および隣接領域。
0004425354.tif 000023
Rhizomucor pusillus（ATCC 36606株）内部転写スペーサー２および隣接領域。
0004425354.tif 000024
Absidia corymbifera（ATCC 46774株）内部転写スペーサー２および隣接領域。
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Absidia corymbifera（ATCC 46773株）内部転写スペーサー２および隣接領域。
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Cunninghamella elegans（ATCC 42113株）内部転写スペーサー２および隣接領域。
0004425354.tif 000027
Pseudallescheria boydii（ATCC 44328株）内部転写スペーサー２および隣接領域（Scedosporium apiospermumの完全世代（teleomorph））。
0004425354.tif 000028
Pseudallescheria boydii（ATCC 36282株）内部転写スペーサー２および隣接領域（Scedosporium apiospermumの完全世代）。
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Scedosporium apiospermum（ATCC 64215株）内部転写スペーサー２および隣接領域。
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Scedosporium apiospermum（ATCC 46173株）内部転写スペーサー２および隣接領域。
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Penicillium notatum（ATCC 10108株）内部転写スペーサー２および隣接領域。
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Sporothrix schenckii（ATCC 14284株）内部転写スペーサー２および隣接領域。
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夾雑予防
FujitaおよびKwok（13、22）のガイドラインに従って、PCRサンプルの可能性のある夾雑を避けるための予防を行った。PCRアッセイに用いる全ての緩衝液および滅菌水をオートクレーブし、そして新鮮なPCR試薬を使用前に等分した。PCRアッセイの調製およびPCR産物の分析に使用するために研究室領域を物理的に分離し、そして噴霧耐性（aerosol-resistant）ピペットチップを使用して噴霧によるサンプルの交叉夾雑の可能性を減少させた。PCRアッセイの間、プライマーまたはDNAテンプレートのいずれかを含まないコントロールを含む、適切なネガティブコントロールを各試験の実施に含めた。
アガロースゲル電気泳動
ゲル電気泳動をTBE緩衝液（0.1M Tris，0.09Mホウ酸、1mM EDTA、pH8.4）中で、80Vで1〜2時間、１％（w/vol）アガロース（International Technologies，New Haven，CT）および１％（w/vol）NuSieveアガー（FMC Bioproducts，Rockland，ME）からなるゲルを使用して行った。ゲルを0.5μgエチジウムブロマイド（EtBr）/1ml蒸留水で10分間染色し、次いで３つの連続洗浄を10分間、各々蒸留水H2Oで洗浄した。
PCR産物の検出のためのマイクロタイタープレート酵素イムノアッセイ
アンプリコンを、ジゴキシゲニンで標識化した種特異的かつ属プローブ、およびビオチンで標識した全ての糸状の真菌プローブを使用して、ストレプトアビジンコートしたマイクロタイタープレートフォーマットにおいて検出した（13,34）。10μlのPCR産物を各1.5mlのエッペンドルフチューブに添加した。次いで、一本鎖DNAを、チューブを95℃5分間加熱し、そして氷上で即座に冷却することにおよって調製した。各50ng/mlの全-Aspergillusビオチン化プローブおよび種特異的ジゴキシゲニン標識化プローブで補充した１mlのハイブリダイゼーション溶液[20mM Hepes、2mM EDTA、および0.15%（vol/vol）Tween 20含有4×SSC（クエン酸ナトリウム生理食塩水緩衝液、0.6M NaCl、0.06クエン酸三ナトリウム、pH7.0）]の2/10を、変性したPCR産物を含む各チューブに添加した。チューブを転倒攪拌し、そして37℃での水浴中に配置してプローブをPCR産物DNAにアニールさせた。1時間後、100μlの各サンプルを、市販の調整されたストレプトアビジンコートマイクロタイタープレート（Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN）の二連のウェルに添加した。プレートを、マイクロタイタープレートシェーカー（CLTI，Middletown，NYからDynatechに製造された）を使用して、周辺温度で1時間、振盪しながらインキュベートした。プレートを、0.05％Tween 20を含む0.01Mリン酸カリウム緩衝化生理食塩水（PBST）（pH7.2）で、6回洗浄した。次いで各ウェルに、ハイブリダイゼーション緩衝液で1：1000に希釈した100μlの西洋ワサビペルオキシダーゼ結合化抗ジゴキシゲニンFabフラグメント（Boehringer Mannheim）を添加した。30分間の周辺温度での振盪しながらのインキュベーション後、プレートをPBSTで6回洗浄した。１容量の3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジンペルオキシダーゼ基質（Kirkegaard and Perry Laboratories，Inc.，Gaithersberg，MD）と１容量のペルオキシダーゼ溶液（Kirkegaard and Perry Laboratories）との混合物の100μlを各ウェルに添加し、そしてプレートを周辺温度で10分間、発色のために配置した。各ウェルのA650nmをマイクロタイタープレートリーダーで測定した（UV Max，Molecular Devices，Inc.，Menlo Park，CA）。DNAは入っていないが滅菌H2Oで置換した試薬ブランクの吸光値を、各試験サンプルから減じた。
統計学的分析
Studentのｔ検定を使用して、サンプル平均間の差異を決定した。平均を、平均プラス平均からの標準誤差または平均マイナス平均からの標準誤差として表した。差異を、P<0.05の場合に有意であると考えた。
以下のプローブを使用して、各種を検出および区別した。
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Aspergillus fumigatus（配列番号32）、A．flavus（配列番号31）、A．niger（配列番号33）、A．terreus（配列番号34）、およびA．nidulans（配列番号35）のrDNAのITS2領域に対する種特異的プローブは、各それぞれの種を正確に同定し（P<0.001）、そしてRhizopus、Mucor、Fusarium、Penicillium、またはCandida種とは偽陽性反応を示さなかった。A．flavusプローブはまた、A．flavus群に属するA．oryzaeを認識した。同定時間を従来の方法の平均5日から8時間に減らした。
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Fusarium oxysporum，F．solani、およびF．moniliformeについてのrDNAのITS2領域に対する種特異的プローブは、各それぞれの種を正確に同定し（P<0.001）そしてBlastomyces、Apophysomyces、Candida、Aspergillus、Mucor、Penecillium、Rhizopus、Rhizomucor、Absidia、Cunninghamella、Pseudallescheria、Sporothrix、またはNeosartoryaとの偽陽性反応はなかった。表４における空欄は、０プローブ反応性を示す。
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種々の他の接合菌（zygomyce）に対する種特異的プローブを表５に示し、これは、各種の正確な同定および偽陽性のないことを示す。例外は、M．circinelloidesプローブがM．rouxii DNAにハイブリダイズし、そしてM．plumbeusプローブがM．racemosus DNAにハイブリダイズしたことである。しかし、M．rouxiiプローブはM．circinelloides DNAにハイブリダイズせず、そしてM．racemosusプローブもまたM．plumbeus DNAにハイブリダイズしなかった。従って、除去工程によって、各種は正確に同定され得る。表５における空欄は、０プローブ反応性を示す。
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種々の他の真菌に対する種特異的プローブを表６に示し、これは、各種の正確な同定および偽陽性のないことを示す。表６における空欄は、０プローブ反応性を示す。
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本明細書中に記載された全ての参考文献は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
参考文献
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