(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記配列：
（ＮＨ3−ＫＩＲＲＬＫＱＫＮＡＲＬＫ（βＡ）3）2−Ｋ
を有する繊維造形性ペプチド。
【請求項２】
下記配列：
Ｅ−（（βＡ）3ＥＩＡＡＬＥＹＥＩＡＡＬＥＱ−ＣＯＯＨ）2
を有する繊維造形性ペプチド。
【請求項３】
屈曲、波状、分裂および分岐状タンパク質繊維を含み、請求項１または２に記載の繊維造形性ペプチドを含むタンパク質構造体。
【請求項４】
請求項１または２に記載の複数の繊維造形性ペプチドおよび複数の自己集合性ペプチドを含むタンパク質構造体であって、第１の自己集合性ペプチドモノマーおよび第２の自己集合性ペプチドモノマーが、非線状タンパク質構造体を形成するように自己集合し、屈曲、波状、分裂および分岐状タンパク質繊維を含むタンパク質構造体。
【請求項５】
繊維造形性ペプチド：第１の自己集合性ペプチド：第２の自己集合性ペプチドの比が、１×１０-6：１：１〜１０：１：１である、請求項４に記載のタンパク質構造体。
【請求項６】
マトリックス、グリッド、足場構造体、フィルターまたは網目構造体である、請求項４に記載のタンパク質構造体。
【請求項７】
前記複数の自己集合性ペプチドは、
配列：
ＮＨ3−ＫＩＡＡＬＫＱＫＩＡＳＬＫＱＥＩＤＡＬＥＹＥＮＤＡＬＥＱ−ＣＯＯＨを有するペプチドおよび
配列：
ＮＨ3−ＫＩＲＲＬＫＱＫＮＡＲＬＫＱＥＩＡＡＬＥＹＥＩＡＡＬＥＱ−ＣＯＯＨを有するペプチド
を含む、請求項４〜６のいずれか１項に記載のタンパク質構造体。
【請求項８】
請求項１または２に記載の複数の繊維造形性ペプチドおよび複数の自己集合性ペプチドを、前記ペプチドが会合して、タンパク質構造体を形成するような条件下で混合することを含む、請求項４〜７のいずれか１項に記載のタンパク質構造体を生産する方法。
【請求項９】
請求項１または２に記載の複数の繊維造形性ペプチドおよび複数の自己集合性ペプチドを含み、第１の自己集合性ペプチドモノマーおよび第２の自己集合性ペプチドモノマーは、会合して、タンパク質構造体を形成する、請求項４〜７のいずれか１項に記載のタンパク質構造体を生産するためのキット。
【請求項１０】
生体液の精製における請求項３〜７のいずれか１項に記載のタンパク質構造体の使用。
【請求項１１】
細胞および組織工学用に細胞を集合させるための請求項３〜７のいずれか１項に記載のタンパク質構造体の使用。
【請求項１２】
表面工学的処置における請求項３〜７のいずれか１項に記載のタンパク質構造体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質構造を形成するように自己集合性ペプチドと相互作用することが可能である繊維造形性ペプチド（fiber-shaping（FiSh）peptide）に関する。本発明はまた、本発明の繊維造形性ペプチドを用いて、タンパク質構造を形成する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物における集合構造体は、各種用途のための新たな物質を開発するに当たってのヒントになる(Holmes, Trends Biotechnol., 20, 16-21, 2002およびYeates et al., Curr. Opin. Struct. Biol., 12, 464-470, 2002)。しかしながら、天然の生体物質を生産および操作する際の、ならびにそれらをデノボで設計する際の困難さが足かせになり、この潜在力の実現化は難しい。近年、本発明者等は、２つの短い合成ポリペプチド（本明細書中で平坦化（dubbed）自己集合性ペプチド（またストレートとも称される））を含む自己集合系について記載しており、該２つの短い合成ポリペプチドは、組み合わさって伸長繊維を形成する（国際特許出願ＷＯ０１／２１６４６およびPandya et al., Biochemistry, 39,
8728-8734, 2000を参照）。ＷＯ０１／２１６４６に記載される繊維は、直径約５０ｎｍであり、数十〜数百ミクロンにわたって分岐することなくまっすぐに伸長する。繊維形態に影響を及ぼすことおよび繊維形態を制御することが望ましい。
【０００３】
以前に本発明者等は、ＤＮＡの構築（assembly）に関しては十分な証明がなされている付着末端支配型の分子集合の概念を、ペプチドに応用した。これが、自己集合性ペプチド繊維（ＳＡＦ）系の概念へとつながった（Pandya et al., Biochemistry, 39, 8728-8734, 2000)。この系は、デノボ設計の２つの短ペプチド（ＳＡＦ−ｐ１およびＳＡＦ−ｐ２）を含む。ＳＡＦ−ｐ１およびＳＡＦ−ｐ２配列は、平行へテロ二量体コイルドコイル、すなわちロイシンジッパーに関して認められている設計原理に基づいた(Harbury et al.,
Science, 262, 1401-1407, 1993; O'Shea et al., Curr. Biol., 3, 658-667, 1993; Woolfson et al., Prot. Sci., 4, 1596-1607, 1995; Ciani et al., J. Biol. Chem., 277, 10150-10155, 2002)。しかしながら、ＳＡＦペプチドは、それぞれ２つの別個の領域またはサブユニット：それぞれＳＡＦ−ｐ１中ではＡおよびＢ、ならびにＳＡＦ−ｐ２中ではＣおよびＤ（ここで、ＡはＤに相補的であり、ＢはＣに相補的である）を用いて設計された。したがって、図１ａに表すように、２つのペプチドを同時に会合させることにより、付着末端同士の会合したヘテロ二量体が導かれ、それらがさらに会合して繊維を構成するはずである（図１ｂ参照）。これらの設計の特徴は、分光法、Ｘ線繊維回折および顕微鏡検査法を組み合わせて用いて実験的に確認されたが、興味深いことに、繊維は本来予想していたよりも太かった。例えば、ＳＡＦペプチドは水中で混合して短時間成熟させると、何ミクロンにもわたって伸長する直径４０〜５０ｎｍの線状構造を生産することが、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）法により明らかとなった（図２ａ）。稀に繊維が曲がった幾つかの例もあるが、それらを除き、非線状または分岐状構造に関する徴候は見られなかった。より最近では、本発明者等は、ＳＡＦ−ｐ２の再設計によりＳＡＦ−ｐ２ａを作製した。ＳＡＦ−ｐ２ａは、より効率よくＳＡＦ−ｐ１と結合し、元の設計と比較して有意に改善された安定性および内部秩序を有する繊維を生産する。それ以外の点については、十分に伸長した繊維の外観には変化は認められなかった。
【０００４】
米国特許ＵＳ−Ａ−５，２２９，４９０号および国際特許出願ＷＯ９２／１８５２８は、分岐状ペプチドに関するが、該分岐状ペプチドは、自己集合性ペプチドと相互作用してタンパク質構造を形成することはない。分岐状ポリペプチドは、抗原の提示に使用される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
合理的設計により繊維サイズおよび形態を変更することは、非常に興味深いことである。例えば、特定の目的に合わせて繊維を調製でき、かつ／または、パターン化された表面または成長中の細胞培養に応じた繊維の集合体を製造できる、等である。１つの可能性は、ストレートなＳＡＦ構成単位（自己集合性ペプチド）と相補的で、かつそれと会合するが、規則的な反復線状構造に対して不連続点を挿入する特殊なペプチド（本明細書中では繊維造形性ペプチドと称される）を導入することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、ハブおよびそれぞれが一方の末端でハブに結合された複数のペプチドモノマー単位を含む繊維造形性ペプチドであって、少なくとも２個のペプチドモノマー単位の遊離末端はＮ末端またはＣ末端であり、それら少なくとも２個のペプチドモノマー単位はそれぞれ、自己集合性ペプチドのサブユニットと相互作用して重複ねじれ（overlapping staggered）構造を形成することができる繊維造形性ペプチドを提供する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の繊維造形性ペプチドにより、自己集合性ペプチドを含むタンパク質繊維の形態を変化させることができる。特に、繊維造形性ペプチドは、タンパク質繊維中に分岐、分割、屈曲およびねじれを組み込むことが可能である。タンパク質繊維中においてかかる形態的変化を組み込むことが可能であるため、マトリックス、フィルター、網目構造、グリッド、足場構造等を含む一般的な集合構造体のような各種タンパク質構造を生成することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
上述のように、本発明の繊維造形性ペプチドは、ペプチドモノマー単位が結合されるハブを含む。ペプチドモノマー単位は、ハブに共有結合される。ハブは、少なくとも２個の誘導体化可能部位を有し（したがって、少なくとも２個のペプチドモノマー単位を結合することが可能である）、かつ少なくとも２個のペプチドモノマー単位が自己集合性ペプチドのサブユニットと相互作用して重複ねじれ構造を形成するのを妨げなければどのような分子であっても良い。ハブは、３個以上のペプチドモノマー単位の結合および／または１個またはそれ以上の活性分子の結合を可能にする３個以上の誘導体化可能な部位を有することがさらに好ましい。ハブは、３個または４個の誘導体化可能な基を有することが特に好ましい。
【０００９】
好ましい実施形態では、繊維造形性ペプチドは、ハブに結合される１個またはそれ以上の活性分子を含む。活性分子は、少なくとも２個のペプチドモノマー単位が自己集合性ペプチドのサブユニットと相互作用し重複ねじれ構造を形成するのを妨げない限り、望ましい機能を有する任意の分子であり得る。適切な活性分子としては、抗体分子（すなわち、モノクローナル抗体またはそれらの機能性部分（Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）2断片および単鎖Ｆｖ断片を含む））、受容体、リガンド、酵素、抗原、標識、金属イオンまたは核酸分子が挙げられる。特に好ましい実施形態では、活性分子はビオチンである。ビオチン分子は、ストレプトアビジンを結合するのに使用することができる。ストレプトアビジンは、遊離していても、あるいは標識または他の活性分子のような望ましい分子に結合されていてもよい。活性分子は、溶液から所望の物質を結合するに使用できる。例えば、抗体分子は、相当する抗原を結合するに使用することができる。あるいは、受容体は、相当するリガンドを結合するに使用できる。活性分子が核酸である場合、転写因子、またはさらには相補的な核酸を結合するに使用され得る。活性分子がＲＧＤベースのペプチドであることが特に好ましい。ＲＧＤペプチドは、溶液から細胞を単離するに使用できる。
【００１０】
ハブは、好ましくは１個またはそれ以上のアミノ酸、より好ましくは１個〜６個のアミノ酸、最も好ましくは１個のアミノ酸である。好ましい実施形態では、ハブはリシンである。ハブがリシンである場合、２個のペプチドモノマー単位を、それらのＣ末端を介してアミノ基に結合することが可能である。さらなるペプチドモノマー単位または活性分子を、カルボン酸基に結合させることができる。
【００１１】
さらに好ましい実施形態では、ハブは、グルタミン酸である。ハブがグルタミン酸である場合、２個のペプチドモノマー単位を、それらのＮ末端を介してカルボン酸基に結合することが可能である。さらなるペプチドモノマー単位または活性分子を、アミノ基に結合させることができる。
【００１２】
好ましくは、ペプチドモノマー単位および機能性分子は、可撓性リンカーによりハブに連結される。可撓性リンカーは、適切なリンカーであればどのようなものでも良い。好ましくは、可撓性リンカーは、グリシン、セリン、アラニンおよびβ−アラニンのようなアミノ酸から構成される。可撓性リンカーは、２〜１０残基、より好ましくは約３〜５残基を含むポリ−β−アラニンペプチドであることが特に好ましい。可撓性リンカーは、ペプチドモノマー単位と自己集合性ペプチドとの相互作用を容易にし、かつ任意の機能性分子がそれらの機能を発揮するのを可能にする。
【００１３】
本明細書中で使用する場合、「ペプチドモノマー単位」という用語は、自己集合性ペプチドのサブユニットと相互作用することができるペプチドを指す。換言すると、ペプチドモノマー単位は、自己集合性ペプチドのサブユニットに相補的である。繊維造形性ペプチドのペプチドモノマー単位は、自己集合性ペプチドと相互作用して重複ねじれ構造を形成し、続いてＷＯ０１／２１６４６号に記載されるような、かつ図１に示すようなタンパク質構造へと自己集合する。自己集合性ペプチドのサブユニットは、ペプチドモノマー単位と特異的に相互作用する領域である。一般に、サブユニットは自己集合性ペプチドの一方の末端であり、その結果、相互作用すると重複ねじれ構造が形成される。好ましくは、繊維造形性ペプチドのペプチドモノマー単位および自己集合性ペプチドは、７残基および／または１１残基反復モチーフを含む。また、ペプチドモノマー単位の少なくとも１個は、繊維造形性ペプチドと自己集合性ペプチドがねじれ平行（staggered parallel）へテロ二量体を形成するのを促進するように、自己集合性ペプチドのサブユニット中の残基に相補的であるアミノ酸残基を含むことが好ましい。ペプチドモノマー単位中のアミノ酸残基は、自己集合性ペプチドのサブユニット中の相補的アミノ酸と対を形成することができる任意の残基であり得る。好ましくは、相補的アミノ酸は、アスパラギン、アルギニンまたはリシンの対である。また、相補的アミノ酸は、ペプチド上の界面部位に存在することが好ましい。好ましくは、相補的アミノ酸は、ペプチドモノマー単位上の、および自己集合性ペプチドのサブユニット中の７残基または１１残基反復モチーフ内の「a」位置に存在する。
【００１４】
本発明の繊維造形性ペプチドは、３個以上のペプチドモノマー単位を含んでもよい。繊維造形性ペプチドは、２個〜１０個のペプチドモノマー単位、より好ましくは２個〜５個のペプチドモノマー単位、最も好ましくは２個のペプチドモノマー単位を含むことが好ましい。上述のように、繊維造形性ペプチド中のペプチドモノマー単位の数は、ハブ上の誘導体化可能な基の数に依存する。
【００１５】
上述のように、ペプチドモノマー単位の少なくとも２個は、遊離Ｎ末端または遊離Ｃ末端のいずれかを有さなくてはならない。繊維造形性ペプチドを、同一種の遊離末端（すなわち、ともにＣ末端またはともにＮ末端）を持つ２個のペプチドモノマー単位を含むように確実に設計することで、２個の自己集合性ペプチドは強制的に一点に収束され、自己集合性ペプチドにより形成されるタンパク質構造が不連続性を持つようになる（図１ｃおよ
び図１ｄを参照）。
【００１６】
本明細書中で使用する場合、「自己集合性ペプチド」という用語は、他の自己集合性ペプチドと相互作用して、実質的に線状の構造、好ましくはストレートなタンパク質繊維を形成することができるペプチドを指す。自己集合性ペプチドは、好ましくは同方向かつ連続的に会合する。適切な自己集合性ペプチドは、ＷＯ０１／２１６４６号に記載されている。好ましくは、自己集合性ペプチドは、７残基または１１残基反復モチーフを含み、ここで異なる自己集合性ペプチド上の相補的アミノ酸残基の対は、自己集合性ペプチドがねじれ平行へテロ二量体コイルドコイルを形成するのを促進する。相補的アミノ酸残基は、対を形成することができる任意の残基であり得る。好ましくは、相補的アミノ酸は、アスパラギン、アルギニンまたはリシンの対である。また、相補的アミノ酸は、ペプチド上の界面部位にあることが好ましい。好ましくは、相補的アミノ酸は、自己集合性ペプチド中の７残基または１１残基反復モチーフ内の「a」位置に存在する。
【００１７】
自己集合性ペプチドは、配列ＮＨ3−ＫＩＡＡＬＫＱＫＩＡＳＬＫＱＥＩＤＡＬＥＹＥＮＤＡＬＥＱ−ＣＯＯＨ（ＳＡＦ−ｐ１）または配列ＮＨ3−ＫＩＲＲＬＫＱＫＮＡＲＬＫＱＥＩＡＡＬＥＹＥＩＡＡＬＥＱ−ＣＯＯＨ（ＳＡＦ−ｐ２ａ）を有することが特に好ましい。
【００１８】
本発明はまた、配列ＮＨ3−ＫＩＲＲＬＫＱＫＮＡＲＬＫＱＥＩＡＡＬＥＹＥＩＡＡＬＥＱ−ＣＯＯＨ（ＳＡＦ−ｐ２ａ）を有する自己集合性ペプチドを提供する。
【００１９】
アミノ酸の標準的な一文字表記が、本願で提供される配列において使用される。
【００２０】
「突出ねじれ構造」という用語は、２個のペプチドが集合して突出末端を持つヘテロ二量体を形成する構造において、ヘテロ二量体内でそれらの突出末端が相互作用しないものを指す。
【００２１】
繊維造形性ペプチドおよび自己集合性ペプチドを含む本発明のペプチドは、好ましくは１５〜１００アミノ酸長、より好ましくは２０〜５０アミノ酸長、最も好ましくは約３０アミノ酸長である。ペプチドは、天然アミノ酸、合成アミノ酸、および天然アミノ酸の改変物を含むことができる。
【００２２】
本明細書中で使用する場合「繊維」という用語は、突出末端を通じて相互作用する重複ねじれ構造から構築されるタンパク質構造を指す。多数の繊維が、横方向に相互作用してもよく、それにより、より厚い繊維を形成する。この用語は、ヘテロ二量体コイルドコイル構造を指すことが特に好ましい。
【００２３】
本明細書中で使用する場合「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸、合成アミノ酸、および天然アミノ酸の改変物を指す。
【００２４】
本発明の好ましい実施形態では、本発明の繊維造形性ペプチドは、
下記式：
（ＮＨ3−ｇ（ａｂｃｄｅｆｇ）q ａｂｃｄｅ−（Ｘ）m）n−Ｙ−（（Ｘ）m−Ｚ）p
（Ｉ）
または
（Ｚ−（Ｘ）m）p−Ｙ−（（Ｘ）m−ｇ（ａｂｃｄｅｆｇ）q ａｂｃｄｅｆ−ＣＯＯＨ）n                                                                    （ＩＩ）
（式中、ａｂｃｄｅｆｇは、７残基反復モチーフであり、
Ｘは、可撓性リンカーであり、
Ｙは、ハブであり、
Ｚは、機能性分子であり、
qは、１〜１５であり、
mは、０または３であり、
nは、２〜１０であり、
pは、０〜４である）
を有する。
【００２５】
本発明の特に好ましい実施形態では、本発明の繊維造形性ペプチドは、
下記式：
（ＮＨ3−ｇ（ａｂｃｄｅｆｇ）q ａｂｃｄｅ−（Ｘ）m）n−Ｙ−（（Ｘ）m−Ｚ）p
（Ｉ）
または
（Ｚ−（Ｘ）m）p−Ｙ−（（Ｘ）m−ｇ（ａｂｃｄｅｆｇ）q ａｂｃｄｅｆ−ＣＯＯＨ）n                                                                    （ＩＩ）
（式中、ａｂｃｄｅｆｇは、７残基反復モチーフであり、
Ｘは、可撓性リンカーであり、
Ｙは、ハブであり、
Ｚは、機能性分子であり、
qは、１〜１５であり、
mは、０または１であり、
nは、２〜１０であり、
pは、０〜４である）
を有する。
【００２６】
好ましくは、Ｘは、上述のような可撓性リンカーである。
【００２７】
好ましくは、Ｙは、式（Ｉ）においてリシンである。
【００２８】
好ましくは、Ｙは、式（ＩＩ）においてグルタミン酸である。
【００２９】
好ましくは、qは、１〜５である。
【００３０】
好ましくは、nは、２である。
【００３１】
本発明はまた、
下記配列：
（ＮＨ3−ＫＩＲＲＬＫＱＫＮＡＲＬＫ（βＡ）3）2−Ｋ
を有する繊維造形性ペプチドを提供する。
【００３２】
本発明はまた、
下記配列：
Ｅ−（（βＡ）3ＥＩＡＡＬＥＹＥＩＡＡＬＥＱ−ＣＯＯＨ）2
を有する繊維造形性ペプチドを提供する。
【００３３】
上記配列中で使用される場合のβＡは、β−アラニンを表す。
【００３４】
本発明はまた、本発明の繊維造形性ペプチドを含むタンパク質構造を提供する。
【００３５】
好ましくは、タンパク質構造は、本発明による複数の繊維造形性ペプチド、および上述
により定義されるような自己集合して線状タンパク質構造を形成することができる複数の自己集合性ペプチドを含み、ここで、繊維造形性ペプチドおよび自己集合性ペプチドは、自己集合してタンパク質構造を形成する。
【００３６】
当業者に明らかであるように、タンパク質構造を形成するためには、自己集合性ペプチドは複数種、すなわち実際に相互作用して線状構造を形成する第１の自己集合ペプチドのセットおよび第２の自己集合ペプチドのセットを含む。好ましくは、本発明のタンパク質構造中における繊維造形性ペプチド：第１の自己集合ペプチド：第２の自己集合ペプチドの比は、約１×１０-6：１：１〜１０：１：１、より好ましくは約１×１０-4：１：１〜２：１：１である。
【００３７】
「タンパク質構造」という用語は、ヘリックスおよびβ鎖のような二次タンパク質構造の任意の組合せを指す。タンパク質構造は、１個またはそれ以上のタンパク質繊維であるか、またはそれらを含むことが特に好ましく、ここでタンパク質繊維は上述により定義される通りである。
【００３８】
好ましくは、本発明のタンパク質構造は屈曲および波状繊維を含む。
【００３９】
好ましくは、本発明のタンパク質構造は分裂および分岐状繊維を含む。
【００４０】
本発明はまた、本発明の複数の繊維造形性ペプチドおよび複数の自己集合性ペプチドを、該ペプチドの会合によってタンパク質構造が形成されるような条件下で混合することを含む、本発明のタンパク質構造を生産する方法を提供する。
【００４１】
ペプチドを混合することによりタンパク質構造を形成するのに適した条件は、特にＷＯ０１／２１６４６号に付与される情報を鑑みて、当業者に明らかであろう。
【００４２】
本発明はまた、本発明のタンパク質構造を生産するためのキットであって、本発明の複数の繊維造形性ペプチドおよび複数の自己集合性ペプチドを含み、該複数の繊維造形性ペプチドおよび複数の自己集合性ペプチドは、会合してタンパク質構造を形成することができるキットを提供する。
【００４３】
タンパク質構造における繊維造形性ペプチドの量を制御することにより、タンパク質構造の形態を変化させることができる。したがって、生成されるタンパク質構造に対して幾つかの制御を行うことが可能である。特に、タンパク質繊維は、グリッド、足場構造、フィルター、網目構造およびマトリックスのような２次元および３次元構築物を形成するように配列させることができる。かかるタンパク質構造は、血液のような生体液の精製、または細胞工学および組織工学を目的とした細胞の構築のような複数の用途で使用することができる。タンパク質構造は、表面工学にも使用できる（Zhang et al., Biomaterials, 16, 1385-1393, 1995を参照）。
【００４４】
さらに、繊維造形性ペプチドには機能性分子を含ませることができるため、タンパク質構造に機能を付与することができる。例えば、機能性分子が所望の構成成分または混入物を特異的に結合できる場合、そのマトリックスは、所望の構成成分を単離するための、あるいは混入物を除去するための親和性マトリックスとして使用することができる。例えば、血液サンプルからウイルスを除去する場合では、標的混入物用のバインダー（例えば、ウイルスのコートタンパク質に対して天然の親和性、または工学的に改変された親和性を有するペプチドあるいはタンパク質）が、繊維造形性ペプチドに結合される機能性分子である。その後、マトリックスは、軽い遠心分離により任意の結合された混入物と一緒に血液から除去することができる。
【００４５】
本願のタンパク質構造は、以下のものを含む複数の他の用途を有する：
ｉ．Ｘ線結晶学用の生体分子の結晶化の核となる組織化網目構造の調製、
ｉｉ．組織の工学的使用における細胞成長を促進するためのタンパク質構造の使用、
ｉｉｉ．ナノスケール分子ふるいおよび他のデバイスの構築、
ｉｖ．各種機能性分子用に支持体として使用することができるナノスケール分子グリッド／足場構造の調製、
ｖ．機能化されたタンパク質構造は、例えば、触媒、生体液および他の研究用溶液の親和性に基づくふるいわけ／精製、内因性分子および補因子の動員による組織修復および組織工学全般の促進に使用できる。
【００４６】
本発明の繊維造形性ペプチドは、１個またはそれ以上の機能性分子から構成されていれば良いが、追加の機能性分子は、標準的なカップリング技法を用いて任意の適切な部位で本発明のタンパク質構造に結合させることができる。
【００４７】
ここで、本発明を、ほんの一実施例として添付した図面を参照しながら記述する。
【実施例】
【００４８】
材料および方法
ペプチド合成
ペプチドは、標準的な固相Ｆｍｏｃ化学を用いて合成し、ＲＰ−ＨＰＬＣで精製して、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析で確認した。
【００４９】
繊維の構築
繊維のサンプルはすべて、Pandya et al., 2000（上述）に記載する技法に従って、指定量のＦｉＳｈペプチドを用いて、ＳＡＦ−ｐ１およびＳＡＦ−ｐ２ａ（それぞれ濃度１００μＭ）により調製し、２２℃で一晩インキュベートした。
【００５０】
電子顕微鏡
Pandya et al., 2000（上述）にすでに記載されているように、繊維懸濁液を炭素グリッド上で乾燥させ、電子顕微鏡観察用に酢酸ウラニルで染色した。
【００５１】
金粒子の捕集
ストレプトアビジンナノ金複合体（コロイド状金ナノ粒子（５または１０ｎｍ）で標識したストレプトアビジン）は、SIGMAから入手した。ビオチン化Ｆｍｏｃリシンを含むペプチド合成試薬はすべて、Merck Biosciences(Novabiochem)から購入した。ペプチドは、上述のように標準的なＦｍｏｃ化学を用いて、Ｐｉｏｎｅｅｒペプチド合成システムで合成した。
【００５２】
ストレプトアビジンナノ金複合体（ＳＮＣ）を、バックグラウンドを最低限に抑えるため、０．０５％  ＴＷＥＥＮ２０を含有する１０ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ７）を希釈用緩衝液として２〜１０倍に希釈した。希釈した複合体を室温に３０分間放置し、この低グリセロール含有量と平衡化させた。最適濃度は、インキュベーション時間３０〜４５分で経験的に（SIGMAによる推奨手順に従って）Ａ520＝０．２５であると決定した。
【００５３】
繊維サンプルは、上述のように調製した（但し、ビオチン化Ｆｍｏｃリシンを用いて、ペプチドにビオチンを組み込んだ）。側鎖（ε）アミノ基を結合したビオチンを有する市販のＦｍｏｃ−リシンを用いて、ストレートなペプチドおよび繊維造形性ペプチドの両方にビオチンを導入した。ストレートなペプチドについては、標準的な線状合成を用いた。ビオチンを組み込んでいる繊維造形性ペプチドは、リシン二量体ハブ、すなわちＬｙｓ−
Ｌｙｓ（ビオチン）を用いて作出した。第１のリシンは、２個のペプチドアームを結合、伸長させるハブとして働いた。このリシンのαおよびεアミノ基を用いて、ペプチド合成を開始した。第１のリシンのαカルボキシ基を、ビオチンを含有する第２のリシンにカップリングさせた。続いて指定量（２μＬ）のＳＮＣを繊維調製物に添加した。幾つかの適用においては、ＳＮＣによる繊維表面のより良好な被覆率を達成するために、より大きい容量（最大２０μＬ）またはより高い濃度（最大２倍希釈）のいずれかを使用した。
【００５４】
インキュベーション後、ペプチド溶液の８μＬ滴をカーボン被覆した銅試験片グリッド(Agar Scientific Ltd)に塗布して、濾紙で乾燥させた後、標準的なＭＯＰＳ緩衝液で２〜３回（それぞれ３〜５分）洗浄して、非特異的に結合しているＳＮＣを除去した。グリッドを、電子顕微鏡用に、濾過した０．５％酢酸ウラニル水で２０℃にて染色した。
【００５５】
本明細書中に記載する新規タンパク質構造は、Pandya et al., 2000（上述）に記載される技法に従って、ＳＡＦ−ｐ２ａ配列に基づいた繊維造形性ペプチドの存在下でＳＡＦ−ｐ１およびＳＡＦ−ｐ２ａを組み合わせることにより作製された。
【００５６】
本発明は、２種の新規ペプチドであるＣＣNNおよびＤＤCCを用いた一実施例のみに基づき実証される。ここで、ＣＣNNおよびＤＤCCはそれぞれ、屈曲／波および分裂／分岐をＳＡＦ繊維に導入する。
【００５７】
ＣＣNNおよびＤＤCCペプチドに関する設計原理を、図１ｃおよび図１ｄに図示する。ペプチドは、ＳＡＦ−ｐ２ａ配列に基づいた（図１ａ）。例えば、ＣＣNNでは、ＳＡＦ−ｐ２ａのＮ末端「Ｃ」サブユニットは、尾−尾様式で二つ組にされる。すなわち、Ｃ配列の２つのコピー（したがって、「ＣＣ」という表現）は、それらのＣ末端を介して、構築物の末端でＮ末端が遊離状態のまま連結される（したがって、「ＮＮ」という上付き文字）。これは、単一の二官能性ハブ、すなわち固相ペプチド合成樹脂にそのカルボキシ末端で結合されたＬ−リシンの２つのアミノ基から２つのＣサブユニットを同時に合成することにより達成された。リシンとの結合部位により高い可撓性を付与するために、Ｃ配列の合成に先だって、３個のβ−アラニンモノマーをリシンのアミノ基に付加した。図１ｃで示すように、これにより、ＣＣNNがＳＡＦ−ｐ１の２つのコピーと相互作用することが可能になるはずである。しかしながら、この相互作用は、自己集合性ペプチド（ストレート）のＳＡＦ−ｐ２ａおよびＳＡＦ−ｐ１について元々規定された相互作用とは全く異なる。これらの会合は、平行かつ連続的であり（図１ａおよび図ｂ）、線状かつ潜在的には無限長の構築物をもたらす(Pandya et al., Biochemistry, 39, 8728-8734, 2000)。対比して、ＣＣNNの付加は、２つの隣接しているＳＡＦ−ｐ１ペプチドを収束させることを目的としている。β−アラニンリンカーを含む理由は、どのような不連続性が生じた場合にも対応して２個のＳＡＦ−ｐ１ペプチドからの効率的な原繊維形成を可能にするためである（図１ｃ）。同様の原理がＤＤCC設計でも使用されるが、但し、ＳＡＦ−ｐ２ａのＤサブユニットの２つのコピーは、それらのＮ末端を介して、ハブとして用いられるＬ−グルタミン酸に連結される（図１ｄ）。同様に、３個のβ−アラニン残基を用いて、Ｄペプチド配列それぞれをハブから離して結合させた。ＣおよびＤユニットの配列には微妙な違いがあり（図１ａ）、以下に論述するように、ＳＡＦ集合体において異なる形態的変化をもたらした。
【００５８】
ＣＣNNをＳＡＦ−ｐ１／ＳＡＦ−ｐ２ａの新鮮混合物に添加した場合、設計の通り、得られた成熟繊維はストレートではなく、屈曲しているか、または波状であった（図２ｂ、図２ｃおよび図２ｄ）。出発混合物におけるＣＣNNの比を変えることにより、繊維単位長当たりの屈曲数が変化した（図３ａ）。しかしながら、これは、繊維の完全性を犠牲にして成り立つ。すなわち、より多くのＣＣNNを包含することにより、形成される繊維長が減少した（図３ｂ）。幾つかの線状繊維が観察されたが、これらは稀であり、その数はＣＣ
NNの量を増加させるのに伴って急速に減少した。
【００５９】
これらの観察結果はＣＣNNＦｉＳｈペプチドの設計と一致するが、それらの屈曲した繊維が非常に硬質に見えることは、おそらく驚くべきことである。上述のような、繊維が厚さを増すという現象は、繊維を安定化し、その結果として屈曲を制限すると考えられる。これを試験するために、本発明者等は、ＣＣNNを入れずに元のＳＡＦ−ｐ１：ＳＡＦ−ｐ２設計のサンプルを調製した。元のＳＡＦペプチドおよび再設計したＳＡＦペプチドならびにＦｉＳｈペプチドのコイルドコイルの界面は変更されず、したがって相互の親和性が保たれていたことに留意されたい。ＳＡＦ−ｐ２の配列は、ＫＩＲＡＬＫＡＫＮＡＨＬＬＫＱＥＩＡＡＬＥＱＥＩＡＡＬＥＱであり、ＳＡＦ−ｐ２ａとは４つの残基が異なる。ＳＡＦ−ｐ２とＳＡＦ−ｐ１とを会合させた場合、再設計したＳＡＦ−ｐ１：ＳＡＦ−ｐ２ａ繊維のおよそ２／３倍の直径で、より熱安定性の低い繊維が得られる（A.M. Smith & D.N. Woolfson、結果は公表されていない）。サンプルは、ＳＡＦ−ｐ１およびＳＡＦ−ｐ２を、ＣＣNN存在下、あるいは非存在下（ペプチドの濃度は、それぞれ、１００μＭであった）、５℃にて１時間インキュベートした後、電子顕微鏡用の標準的な前処理を行った。ＣＣNNが存在しない場合では、ＳＡＦ−ｐ１＋ＳＡＦ−ｐ２は、線状の伸長繊維を生じた（図４ａ）が、ＦｉＳｈペプチドを用いた場合では、多数の屈曲が見られた（図４ｂ）。ＳＡＦ−ｐ１：ＳＡＦ−ｐ２バックグラウンドにおける屈曲の程度および頻度は、ＳＡＦ−ｐ１＋ＳＡＦ−ｐ２ａで観察されるものよりも大きかった。このことは、ＳＡＦの可撓性が屈曲において役割を果たすことを示唆している。すなわち、より薄く安定性の低いＳＡＦ−ｐ１：ＳＡＦ−ｐ２繊維は、より多くの屈曲を含有する。これと一致して、再設計したＳＡＦ−ｐ１：ＳＡＦ−ｐ２ａバックグラウンドにおけるＦｉＳｈペプチドに関して観察される繊維の短縮（図３ｂ）は、元のＳＡＦ−ｐ１：ＳＡＦ−ｐ２バックグラウンドではより低頻度で認められた（図４）。
【００６０】
興味深いことに、ＳＡＦ−ｐ１／ＳＡＦ−ｐ２ａの新鮮混合物にＤＤCCを加える場合、成熟繊維は２つの異なる形態を持つ。即ち、少量のＦｉＳｈペプチドを用いる場合（ＤＤCC：ＳＡＦ−ｐ１：ＳＡＦ−ｐ２が１０-4：１：１）、繊維はＣＣNNで観察されるように屈曲した。しかしながら、ＤＤCCの比が増加するにつれ（最大１：１：１）、屈曲はあまり観察されなくなり、代わって、繊維は分裂または分岐する傾向にあった（図２ｅおよび図２ｆ、ならびに図３ａ）。
【００６１】
２つのＦｉＳｈペプチドの挙動の差は、ＣおよびＤサブユニットの異なる配列に起因するにちがいない（図１ａ）。元のＳＡＦ設計では、ＳＡＦ−ｐ２のＣサブユニットはＳＡＦ−ｐ１のＢサブユニットとパートナーになるように作製された。これは、具体的には、各々のペプチドにおける重要な界面部位に、相補的なアスパラギン残基を含ませることによってなされる(Pandya et al., Biochemistry, 39, 8728-8734, 2000)。この特徴は、ＳＡＦ−ｐ２ａ設計でも同様に維持された。これは、いわゆるネガティブ設計原理であり(Beasley et al., J. Biol. Chem., 277, 10150-10155, 2002)、すなわち、ある一定の構造の構築を導き、かつ考え得る他産物の生成を防ぐために取り入れられた特徴である。ＳＡＦの場合では、アスパラギン残基は、平行へテロ二量体形成を確実にするために含まれ（Harbury et al., Science, 262, 1401-1407, 1993, O'Shea et al., Curr. Biol., 3, 658-667, 1993, woolfson et al., Prot. Sci., 4, 1596-1607, 1995, O'Shea et al., Science, 254, 539-44, 1991, Lumb et al., Biochemistry, 34, 8642-8648, 1995、およびGonzalez et al., Nature Struct. Biol., 3, 1011-1018, 1996）、２つのペプチドの会合部位を補正し、その結果原繊維形成を促進する(Pandya et al., Biochemistry, 38, 8728-8734, 2000)。アスパラギンの包含は、ロイシン−ジッパーペプチドにおいて二量体および会合部位の特異性を増大させるが、これによって概して安定性は犠牲になる（Harbury et al., Science, 262, 1401-1407, 1993, Lumb et al., Biochemistry, 34, 8642-8648,
1995、およびGonzalez et al., Nature Struct. Biol., 3, 1011-1018, 1996）。ＣＣNN
ペプチドは２つのかかるアスパラギンを有し、ＤＤCCは有さない。したがって、本発明者等は、ＤＤCCが、より強力なロイシン−ジッパー相互作用を形成し、かつ標準的なＳＡＦペプチドと潜在的により無差別的に相互作用し、さらにこれは、幾つかの繊維における分裂および／または肥厚した外観をもたらすと考える（図２ｅおよび図２ｆ）。換言すると、ＣＣNNは、それが行う相互作用においてより選択的である。これは、Ａ：Ｄ相互作用と比較してＢ：Ｃ相互作用において推定されるより低い安定性と併せて、より数少なく、かつより容易に修正できる欠陥（分裂や肥厚）につながる。
【００６２】
図１のスキームに従って、ＳＡＦ−ｐ２ａのＣおよびＤのサブユニットの１６個の考え得る組合せが存在する。本発明者等は、これらのうちの２つ、すなわちＣＤNCおよびＣＣNCを対照ペプチドとして合成した。ＣＤNCは、単にＣサブユニットとＤサブユニットとの間にスペーサーが挿入されたＳＡＦ−ｐ２ａ配列であり、ＣＣNCでは、Ｃの２つの連続コピーが、スペーサーにより分離されており、両方の場合で、スペーサーは、３つのβ−アラニン残基、中心ε−アミノヘキサン酸残基（ＣＣNNおよびＤＤCCで使用されるＬ−リシンおよびＬ−グルタミン酸ハブに代わる置換基として）、続いてさらなる３つのβ−アラニン残基を含んでいた。ＣＤNCもＣＣNCも、ＣＣNNおよびＤＤCCに関して観察されるような成熟繊維の屈曲、波状、分裂または分岐は引き起こさなかった。しかしながら、１０-2：１：１（対照：ＳＡＦ−ｐ１：ＳＡＦ−ｐ２ａ）以上の比で、ＣＤNCおよびＣＣNCはともに、繊維集合を完全に阻害した。より少量の対照ペプチドを有する混合物は、繊維を生じたが、これらは、短く（２０ｍｍ未満）かつ稀であった（ＦｉＳｈペプチドＣＣNNおよびＤＤCCを含有する混合物における場合よりも５００倍少ない）。換言すると、ＣＤNCおよびＣＣNCは、原繊維形成における終結因子として作用した。
【００６３】
要約すると、本発明者等は、元来専ら線状かつ未分岐構造を形成するように設計された自己集合繊維の形状を変更させるための実験データを提示した。繊維造形性（ＦｉＳｈ）ペプチドを、ＦｉＳｈペプチド無添加では線状構築物を形成するはずのペプチドの混合物に添加した。試験した２つのＦｉＳｈペプチドは、繊維形態に異なる影響を及ぼした：一方は、繊維を屈曲させたのに対して、他方は、繊維を分裂または分岐させた。ＦｉＳｈペプチド：標準物質ペプチドの比が、観察される屈曲および分岐の数を決定した。
【００６４】
繊維形態を変化させる能力を用いて、周囲環境からの信号に応答する生体物質の開発が可能になる。かかる信号が、ある表面上のパターンとして提示されるかもしれない。これは、タンパク質アレイ技術に利用できるタンパク質により機能化された表面、および新規なタンパク質に基づく診断用デバイスまたはセンサーデバイスの開発につながるかも知れない。別の可能性は、細胞および組織工学における足場構造として使用され得る網目構造の構築である。この場合では、自己集合繊維は、細胞成長に応答し、その結果細胞成長を支持するように誘導され得る。
【００６５】
上述のように、ＦｉＳｈペプチドは、他の機能性分子を含んでもよい。このようにして、ＦｉＳｈペプチドを用いて、生理活性ペプチド、タンパク質および小分子を、集合繊維に捕集することができる。例えば、付加部分はペプチド抗原であってもよく、これは、いったん繊維に組み込まれれば、繊維表面に特異的抗体をプルダウンする（すなわち、捕集する）のに用いることができる。あるいは、機能性分子が核酸配列である場合、核酸配列と相互作用する転写因子が単離され得る。これらの観点で、ＦｉＳｈペプチドは、官能基を結合できる中心点とみなされるべきである。
【００６６】
上述のように、標準的なビオチン／ストレプトアビジン化学を用いて、１０ｎｍの金粒子を、本発明のストレートな繊維および屈曲繊維の両方に捕集した。特に、ビオチンは、合成段階で自己集合性ペプチドに組み込み、金粒子はストレプトアビジンでコーティングした。金粒子は、ストレートな繊維上では無作為に分布する（図５〜図７を参照）が、屈
曲繊維のハブでは特異的に捕集されること（図８参照）がわかった。
【００６７】
ストレートな繊維では、７残基の「ｆ」位でのアミノ酸の１つをビオチンで誘導体化した。屈曲繊維では、ハブをビオチンで誘導体化した。本発明の屈曲繊維内の特定の部位に、金粒子のような機能性分子を特異的に捕集できることは好都合である。
【００６８】
上述に引用した文書はすべて、参照により本明細書に援用される。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】自己集合性繊維（ＳＡＦ）ペプチドおよび繊維造形性（ＦｉＳｈ）ペプチドに関する設計原理ならびに配列を示す図である。ａ．それぞれ２つのブロックに分けて示した標準的なＳＡＦペプチド配列：ＳＡＦ−ｐ１に関してＡおよびＢ、ＳＡＦ−ｐ２ａに関してＣおよびＤ。ａおよびｂ．ブロックＡは、Ｄに相補的であり、Ｂは、Ｃに相補的である。これは、付着末端二量体を導き、それらはさらに会合して繊維を形成する。集合体の会合部位の精度は、アスタリスクで強調した重要なアスパラギン残基により部分的に保たれる。ｃおよびｄ．それぞれＦｉＳｈペプチドＣＣNNおよびＤＤCCの設計により導入される不連続性。ｂ、ｃおよびｄでは、ポリペプチド鎖の方向（Ｎ末端からＣ末端へ）は、矢印で示す。これは、ＦｉＳｈペプチドの名称に関連する。例えば、ＣＣNNは、ＳＡＦ−ｐ２ａのブロックＣの２つのコピーを有し、それらはＣ末端により連結され、その構築物の両末端に遊離のＮ末端を有するため、そのように呼ばれる。ＦｉＳｈペプチドは、リンカーが可撓性β−アラニン残基を含有するため、ストレートというよりは屈曲して示される。
【図２】ＳＡＦおよびＳＡＦ−ＦｉＳｈ系から形成される繊維の酢酸ウラニル染色したＴＥＭ画像を示す図である。ａ，ＳＡＦ−ｐ１およびＳＡＦ−ｐ２ａを１：１の比で混合することにより形成されるストレートな繊維。ｂ〜ｄ，ＣＣNNＦｉＳｈペプチドをＳＡＦ−ｐ１／ＳＡＦ−２ａの新鮮混合物に１：１：１（ｂ）、０．１：１：１（ｃ）および＜０．１：１：１（ｄ）（ＦｉＳｈ：ＳＡＦ−ｐ１：ＳＡＦ−ｐ２ａ）の比で添加することにより形成される屈曲繊維ならびに波状繊維。ｅおよびｆ，ＤＤCCＦｉＳｈペプチドを新鮮なＳＡＦ−ｐ１／ＳＡＦ−２ａ混合物に０．０１：１：１の比で添加することにより形成される分裂繊維ならびに分岐状（ｆでは四角形で囲んである）繊維。
【図３】自己集合性繊維に導入される形態的変化の分析結果を示す図である。ａは、繊維１０μｍ長当たりの特徴（屈曲または分裂）の平均数を示す。ｂは、ＦｉＳｈ対ＳＡＦペプチドの比の関数として、成熟繊維の平均長を示す。ＣＣNNを含有する繊維に関するデータ点は丸で示す一方で、ＤＤCCを含有する繊維に関するデータ点は四角で示す。パネルａでは、ＤＤCCにより生産される屈曲および分裂の数は、それぞれ実線および破線で区別している。分析：付与した数は、８０〜１００個の繊維に関して測定した平均値である。ａでの測定に対する標準偏差は、ＣＣNNを含有する繊維に関して２．６（０．０１：１：１に関して）および０．２（＜０．０１：１：１に関して）であり、ＤＤCCを含有する分裂繊維に関して０．４（０．０１：１：１に関して）および０．１（＜０．０１：１：１に関して）であり、屈曲繊維に関して０．４（０．０１：１：１に関して）および０．１（＞０．０１：１：１に関して）であった。ｂでの測定に対する標準偏差は、両方のＦｉＳｈペプチドからのデータに関して５．６μｍ（０．０１：１：１に関して）および１．６μｍ（＞０．０１：１：１に関して）であった。
【図４】ＣＣNN非存在下（ａ）、およびＣＣNN存在下（ｂ）での元のＳＡＦ−ｐ１：ＳＡＦ−ｐ２をベースとする繊維の透過型電子顕微鏡画像を示す図である。
【図５】自己集合性ペプチドに組み込まれたビオチンにより、ストレプトアビジンを介して繊維に捕集された金ペプチドを有する、ストレートなペプチド繊維マトリックスの透過型電子顕微鏡画像を示す図である。
【図６】自己集合性ペプチドに組み込まれたビオチンにより、ストレプトアビジンを介して繊維に捕集された金ペプチドを有する、単一のストレートなペプチド繊維の透過型電子顕微鏡画像を示す図である。
【図７】自己集合性ペプチドに組み込まれたビオチンにより、ストレプトアビジンを介して繊維に捕集された金ペプチドを有する、単一のストレートなペプチド繊維の高倍率透過型電子顕微鏡画像を示す図である。
【図８】ペプチドのハブ部位で特異的に捕集された金粒子を有する屈曲ペプチド繊維の透過型電子顕微鏡画像を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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