(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンドヌクレアーゼ切断サイトＮｃｏＩおよびＸｈｏＩの間にｎｅｆ欠失を有する組み換えＨＩＶ−１分子クローンに感染した細胞から調製された、単離精製されたＨＩＶ−１ｎｅｆ欠失ウィルス粒子が製薬的に許容しうる媒体に懸濁された懸濁液であって、ＨＩＶ−１感染した患者のＣＤ４+リンパ球数を増加または回復させる機能をもつ、ヒト免疫不全ウイルスのタイプ１（ＨＩＶ−１）に感染した患者を治療するための治療懸濁液。
【請求項２】
前記懸濁液が、さらに、ＨＩＶ−１ウィルスに感染した患者の前記ＨＩＶ−１ウィルス負荷を低減する請求項１に記載の懸濁液。
【請求項３】
前記懸濁液が、さらに、細胞障害性Ｔリンパ球の正常な活性化経路を回復する請求項１に記載の懸濁液。
【請求項４】
エンドヌクレアーゼ切断サイトＮｃｏＩおよびＸｈｏＩの間にnef欠失を有する組換えＨＩＶ−１分子クローンに感染した細胞から調製された、
単離精製されたＨＩＶ−１ｎｅｆ欠失ウィルス粒子が製薬的に許容しうる媒体に懸濁された懸濁液であって、
ＨＩＶ−１感染予防のためのワクチン。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は生きたままの遺伝的に変化したＨＩＶウイルスワクチンを用いるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の治療と予防に関する。
背景技術
本発明者が知る限り、治療や予防のために同様な発明を用いた先行技術はない。
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）は後天的免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の第一の病因となる病原体である。ＨＩＶは、ウイルスの様々な種や、また同一の患者における異なった時に同一のウイルスの種により示される、生物学的表現型の広い多様性に帰結する高い遺伝的多様性を示す。複製動力学的、血清中和に対する感受性、抗ウイルス剤耐性、細胞毒性の誘導、および宿主特異性の幅における表現型が異った種が見つかった。２つの主たるサブタイプＨＩＶ−１とＨＩＶ−２は非常に近縁のＲＮＡレトロウイルスであるヒトおよび非ヒトの霊長類のレンチウイルスのグループの構成員である。
ＨＩＶによる感染は様々なカリニ肺炎（ＰＣＰ）のような日和見感染やカポジ肉腫（ＫＳ）のような腫瘍を許す犠牲を作る細胞性免疫系の進行していく低下に到る。免疫系の破壊の機構は細胞性免疫が適切に機能するための道具であるＣＤ４+ＴHELPERリンパ球におけるＨＩＶの細胞病理学上の効果であることが知られている。
ＡＩＤＳとＨＩＶ感染はまず米国や欧州において同性愛の男性、静脈注射による薬物使用者、および血友病患者を巻き込んだ。しかし、異性間の感染がアフリカ（特にルワンダ、ブルンジ、ザイールおよびケニヤ）、ブラジル、インド、ミャンマー、およびタイでは普通になり、流行してきた。世界保健機構（ＷＨＯ）によれば、世界中で１千万人以上がＨＩＶに感染していると見積もられる。利用できるデータはこれらの感染した人のほとんど全員が効果的な治療がないために死ぬであろうことを示す。
Ｂリンパ球に媒介される体液性抗体応答は通常、膜タンパク質ｇｐ１２０，ｇｐ４１、ならびにｇａｇタンパク質ｐ２４、ｐ１７およびｐ１５に対して感染した人で高い抗体力価で感染した人で強い。不幸にも、これは継続し容赦のない感染と感染の細胞から細胞への伝達により進行する疾患、多分ＩＬ−２（インターロイキン２）信号伝達の阻害による細胞障害性Ｔリンパ球の阻害からのいかなる防御も提供しない。米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）は最近初期段階の結果に失望して、ＨＩＶの様々なウイルスタンパク質由来のワクチンのフェイズＩＩＩとフェイズＩＶの治験をやめた。同様に、ＨＩＶに対する細胞性の応答は最初、細胞障害性（キラー）Ｔリンパ球（ＣＴＬ）のために増殖に強い。不幸にも、これはウイルスがＣＴＬ認識から逃げることを可能にするｇａｇＣＴＬエピトープの遺伝的多様性のせいで感染後すぐに低下してしまう。（フィリップ  アール  イー等；ネーチャー３４５：４５３、１９９１）
ウイルス核酸配列に作用するジドブジンのような様々な薬剤もＨＩＶ感染の治療のために認可されてきた。これらが初期の段階にとても有望そうだと思われたが、これらに対する耐性の発達により大きな失望と挫折を生んだ。
他の様々なアプローチが求められた。ジョナス  サーク博士はネーチャーの論評において、病気が進行する際に、ｇｐ４１に対する抗体とウイルス中和抗体の力価は一定だが、細胞毒性（ＡＤＣＣ）に依存する抗体と逆転写酵素に対する抗体の存在と相関する抗ｐ２４抗体の濃度は減少することを指摘した。彼は発症したＨＩＶ感染患者の、発症していないＨＩＶ感染患者から得た血清での治療を提言した。彼は更にＨＩＶに感染した患者に投与されたＨＩＶ免疫原は予防的に働くと仮説をたてた。（サーク  ジェー；血清反応陽性の個体を免役することによるＡＩＤＳのコントロールに対する予見：ネーチャー  ３２７：４７４−４７６、１９８７）
弱毒化された生ウイルスと死んだビリオンに仮説を立てられていたが、ヒトのＨＩＶ感染の予防と治療のいずれにも有意義な方法でこれらを試みた研究者は未だいない。
ＳＩＶ（シミアン免疫不全ウイルス）はミドリザル、マカークザル，スーティー−マンガビーザル、アカゲザル、およびチンパンジーに作用する多様な種を有する霊長類のレンチウイルスである。サルにおけるＳＩＶ感染は霊長類のレンチウイルスの生理学的、病理学的研究に広く用いられてきた。相対的な感染力が決定されたＳＩＶの人工的に生み出した変異体でサルを感染させてみることにより膨大な研究がなされてきた。これらの研究の多くはウイルス生活環の生理機能におけるｎｅｆ遺伝子の役割に焦点をあてた。ｎｅｆ遺伝子は今までに配列が決定された全ての霊長類のレンチウイスルに存在する。該遺伝子はｅｎｖ遺伝子の中からまたはその３’末端のすぐ後ろからはじまる、オープンリーディングフレームからなり、３’末端の長い繰り返し配列のＵ３部分と重なる。該遺伝子はあらかじめＦ，３’−ｏｒｆまたはＢ−ｏｒｆと命名された。それは、感染した個体でｎｅｆ遺伝子産物に対する抗体により決定されたとおり、インビボで発現される。ルリア等は少なくともあるｎｅｆ遺伝子産物は活性化試薬ＰＭＡ，ＰＨＡおよび／またはＣＤ３、ＴＣＲまたはＣＤ２に対する抗体により誘導されるリンパ球様細胞におけるＩＬ−２（インターロイキン２）ｍＲＮＡの誘導を阻害することを示した（ルリア  Ｓ、チャンバー  Ｉ、バーグ  Ｐ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８：５３２６  １９９１）。ケスラー等はインビボにおけるオープンフォーム（ｏｐｅｎ  ｆｏｒｍｓ）に対してｎｅｆでの終止コドンの点突然変異の速い回復を発見し、ｎｅｆの開いた、多分機能型に対する選択圧（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ）を示した。（ケスラー  ＨＷ等；Ｃｅｌｌ，６５：６５１，１９９１）さらにｎｅｆがアカゲザルにおける活発なウイルスの複製、正常なウイルスの荷重（ｌｏａｄ）の維持、および疾患の誘導に対して必要であることが明らかにされた。野生型ウイルスを感染させられた全ての動物はＡＩＤＳを発症し、死んだのに対して、ｎｅｆ欠失変異体を接種された動物は少なくとも３年は発病しなかった。ｎｅｆの欠失はウイルスの複製を増やしたことが示されたが、ｎｅｆ欠失に対する応答はインビボとインビトロで異なっているという仮説がたてられた。（ギブズ  ＪＳおよびデスロザイアー  ＲＣ「ヒトレトロウイルス」カレン  ＢＲ編集、オックスフォード大学出版、ニューヨーク，１９９３）
本発明の第一の目的は、それゆえ、残ったオープンリーディングフレーム、特にｔａｔ，ｏｌ，ｇａｇ，ｅｎｖ，およびｖｐｒを保存しつつｎｅｆ遺伝子の実質的な部分が欠失させるような組み換え技術を用いてＨＩＶウイルスクローンを生産することである。
本発明の別の目的はＨＩＶに感染した患者にこのｎｅｆ遺伝子欠失組み換えウイルスを注入し、以下の１つかそれ以上の方法により治療を提供することである。
ａ）ＨＩＶ抗原提示細胞を認識させることにより、Ｂリンパ球や細胞障害性（キラー）Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を活性化するＴHELPER細胞での正常なＩＬ２およびＩＦＮγを生産させる、
ｂ）細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を介する野生型ＨＩＶに対する細胞性免疫応答を、継続的に活性化し、刺激し、維持する、
ｃ）および、潜在的宿主に対して野生型ＨＩＶと競合させ、野生型ＨＩＶがｇｐ１２０、ｇｐ４１、およびｇａｇタンパク質に対する体液性抗体にさらされる可能性を高める。
本発明の第二の目的はＨＩＶのタンパク質のいずれかを発現している細胞に特異的で、ほぼ永久な長期にわたるＣＴＬの記憶幹細胞を生む細胞障害性Ｔリンパ球の系統を提供することにより本発明の対象であるｎｅｆ欠失変異体での処置により売春婦のような危険性の高い個体の予防免疫を提供する。野生型のＨＩＶによる感染は、これらの個体において、速やかに、効率的に、効果的に処理される。
発明の開示
ｎｅｆオープンリーディングフレームが欠失したＨＩＶ−１ELI単離物の組み換えクローンがＮｃｏＩとＸｈｏＩサイトでのエンドヌクレアーゼによる切断と、開放端のオリゴヌクレオチドによるエンドフィリングによりプラスミドベクターから構築された。得られたプラスミドＤＮＡはスクリーニングされ、ＤＥＡＥデキストランを使ってＨｕＴ７８細胞株へトランスフェクションされた。ＨＩＶウイルスの増殖はｇｐ４１、ｐ２４，ｐ１７、およびｐ１５のタンパク質の観察、逆転写酵素活性の観察、およびビリオンの電子顕微鏡による同定により確認された。ウイルス粒子は培地上清から分離され、使用するまで液体窒素で凍結された。ＨＩＶ感染治療のために、ＨＩＶ感染とＣＤ４−ＣＤ８細胞数の確認を含む基本的な診断処置、アレルギー反応に対する皮膚テストと告知に基づく同意の後で、およそ２００，０００，０００ウイルス粒子が静脈注射された。この後でほぼ１ヶ月でＣＤ４の数が観察され、さらに追加抗原刺激の２００，０００，０００ウイルス粒子が静脈注射された。この後、１ヶ月ごとのＣＤ４の数の観察が１年に渡って続けられた。本発明によれば、患者は６−９ヶ月で、正常のＣＤ４の数を回復し、１年間で免疫系を回復することが期待される。危険性が高い集団における野生型ＨＩＶの感染の予防のためには、およそ１，０００，０００ウイルス粒子が皮下注射され、過敏（アナフィラキシー）反応のような不都合な効果がないことを確認するために十分な時間患者が観察される。この集団における免疫は血清変換により確認され、野生型ＨＩＶ感染はＥＬＩＳＡを用いてｎｅｆ遺伝子産物に対する抗体を検出することにより診断される。
発明を実施するための最良の形態
ヒトリンパ球様細胞株であるＨｕＴ７８細胞はＡＴＣＣ（ロックビル、メリーランド）から得られ、１０％加熱（５６°Ｆ、３０分）ウシ血清（シグマ化学会社、セントルイス、ミズーリ）と１０％インターロイキン２−Ｔ細胞増殖因子（メロイ研究所、スプリングフィールド、バージニア）を含むダルベコの修飾イーグル培地（ギブコ、グランドアイランド、ニューヨーク）で増殖された。細胞はプラスチック製の組織培養皿（ファルコン）で増殖され、ＥＤＴＡを含むトリプシン（ギブコ、グランドアイランド、ニューヨーク）を使って移された。この細胞株はＨＩＶ−１ELI株に感染したＡＩＤＳ患者から得られた末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に接種された。ＰＭＢＣはまずフィコールジアトリゾエート（密度１．０７７−１．０８０ｇ／ｍｌ，２０℃）（ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジー、アップサラ、スウェーデン）で単一バンドに分離して調製した。ＰＢＭＣはＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄して、５日間、１μｇ／ｍｌの植物凝集素（シグマ化学、セントルイス、ミズーリ）で刺激され、先に培養物にいれた植物凝集素を洗って除いた。分子クローニング技術は、マニアチス  Ｔ，フィッチ  ＥＦ等（モルキュラークローニング、ラボラトリーマニュアル、コールドスプリングハーバーラボラトリー、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク）に記載のとおり、使用された。感染された細胞株の全細胞ＤＮＡから得られたＨＩＶ−１ELIの非切断（ｎｏｎｃｕｔｔｅｒ）制限エンドヌクレアーゼ（ニューイングランド  バイオラボ、ビバリー、メリーランド）を使って、細胞のフランキング配列がある統合されたプロウイルスＤＮＡがバクテリオファージＪ１（プロメガバイオテク、マジソン、ウィスコンシン）のＸｂａＩサイトにクローンされ、組み換えファージクローンλＨＸＥＬＩが得られた。ベクターＳＰ６５ｇｐｔはプラスミドｐＳＶ２ｇｐｔのＢａｍＨＩ−ＰｖｕＩＩ断片をＳＰ６５のＢａｍＨＩ−ＰｖｕＩＩサイト（プロメガバイオテク、マジソン、ウィスコンシン）に結合して構築された。λＨＸＥＬＩクローンの１２．５キロベース（ｋｂ）ＨｐａＩ−ＸｂａＩ断片がＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片で平滑末端にされ、同様にベクターＳＰ６５ｇｐｔの平滑末端化されたＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩサイトにクローンされた。得られたクローンＨＸＥＬＩｇｐｔはＨＩＶ−１ELIとキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）配列を同じ転写方向に持っている。プラスミドベクターを持つプロウイルスはＮｃｏＩ（ベーリンガーマンハイムバイオケミストリー、マンハイム、ドイツ）とＸｈｏＩ（ニューイングランドバイオラボ、ビバリー、マサチューセッツ）制限エンドヌクレアーゼで消化して、続いてバイオサーチサイクロン合成機、逆転写酵素、およびｄＮＴＰで構築されたオリゴヌクレオチドで末端を埋めて、続いて平滑末端を結合した。プラスミドはｎｅｆ欠失を含むＨＸＥＬＩｇｐｔの派生物に対して０．８％アガロースゲル（シグマ化学、セントルイス、ミズーリ）による電気泳動でスクリーニングした。欠失の正確な位置はＤＮＡポリメラーゼの鎖延長終結阻害剤−正常なデオキシヌクレオシド三リン酸の２’，３’−ジデオキシおよびアラビヌクレオシド類���体（ｄｄＣＴＰはコラボレイティブリサーチＩｎｃ．、ワルサム、マサチューセッツから購入し、ａｒａＡＴＰとａｒａＣＴＰはＰ−ＬバイオケミカルＩｎｃ．，ミルウォーキー、ウィスコンシンから購入）を使って、サンガー  Ｆ，ニコルソン  Ｓ等（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  ｏｆ  Ｓｃｉ  ７４：５４６３−５４６７、１９７７）に記載のとおり、ＤＮＡ配列決定により確定された。ヘテロ二重鎖ＤＮＡはエタノール沈殿に供され、滅菌水に再懸濁された。ＤＮＡの厳密な希釈が最終的な容量が８０μｌ（ｍｉｃＬ）になるように行なわれた。それぞれのＤＮＡサンプルに対してオートクレーブによる滅菌の後で２ｍｇ／ｍｌの濃度でファルマシアから購入したＤＥＡＥデキストラン２０μｌと２倍に濃縮された無血清ダルベコ修飾イーグル培地（ギブコ、グランドアイランド、ニューヨーク）１００μｌが添加された。上記ＨｕＴ７８細胞が確実に対数増殖させるためにトランスフェクションに２４時間先立って新鮮なプレートに移された。これらの増殖細胞はトリスで緩衝されたｐＨ７．２の等張生理食塩水（シグマ化学、セントルイス、ミズーリ）中のＥＤＴＡを含んだ０．１％トリプシン（ギブコ、グランドアイランド、ニューヨーク）でプレートから取り除かれ、上記のとおり加熱してトリプシンを不活性化したウシ血清を含む新鮮なダルベコ修飾イーグル培地と混ぜて、カルターカウンター（Ｃｕｌｔｅｒ  ｃｏｕｎｔｅｒ）で細胞数が数えられた。６×１０5個の細胞が１２ｍｍ×７５ｍｍの透明なプラスチックチューブ（ファルコン＃２０５８）に入った血清を含む２ｍｌダルベコ修飾イーグル培地に添加された。チューブは５０００ｒｐｍで１分間遠心された。培地はアスピレーターにつけたピペットを用いて注意深く取り除かれた。ＤＮＡの希釈物の１００μｌサンプルがそれぞれのチューブに添加された。チューブは穏やかに振とうされ１時間の間３７℃のＣＯ2インキュベーターに移された。ラックは１５分毎に穏やかに振とうされた。インキュベーションの最後に、上記のとおり加熱したウシ血清を含む新鮮なダルベコ修飾イーグル培地２ｍｌがそれぞれのチューブに加えられ、チューブが振とうされ、遠心され、培地は上記のとおり吸引除去された。次いで細胞は、上記のとおり加熱したウシ血清を含む２ｍｌの新鮮なダルベコ修飾イーグル培地に再懸濁され、３７℃５％ＣＯ2インキュベーターで保温された。培養物はＨＩＶ−１ｇａｇとｅｎｖの産物ｐ１７，ｐ２４，およびｇｐ４１、逆転写酵素活性、および既に当業者には公知である電子顕微鏡で見えるビリオンの存在を観察された。培養物のウイルスを含む上清が、１ｍｌあたり２００，０００，０００ビリオン粒子を含むように、ミリポアフィルター（フィルターサイズ０．４５μｍ、ミリポアコーポレーション、ベッドフォード、マサチューセッツ）で濾過され、滅菌したバイアルに入れられた。滅菌したバイアルは液体窒素中で保存された。
実施例
＜実施例１＞
両者ともインドで売春婦をしている２人のボランティア（Ｓ１およびＳ２）は１９８９年にＨＩＶ陽性になった。それから、両者は下痢で体重が減少し、カンジダとＣＭＶに感染して状態が悪化していた。彼らのＣＤ４の数はそれぞれ３２７と２５８であった。家族や友人はＨＩＶ感染のため彼らを見捨て、ほとんど支援する構造はなかった。詳細な告知に基づく同意、および本発明の使用を含むあらゆる危険の綿密な説明の後に、彼らにＨＩＶの状態を確認するための生理的な、確認のためのウエスタンブロットテスト、ＣＤ４−ＣＤ８細胞数の基準線、ウイルス懸濁液に対する感受性を調べる皮膚テストを行ない、両者はおよそ２００，０００，０００ウイルス粒子を含んだ組み換えウイルス懸濁液を静脈内に投与された。患者は独立した施設に隔離され、すべての彼らとの個人的な接触には伝染病予防措置を用いた。患者のＣＤ４の数は最初の注射の１カ月後記録され、彼らは同じ量の２回目の静脈注射を受けた。彼らのＣＤ４の数は追加抗原刺激の４−６週後、再度記録された。患者は、最初の注射のおよそ４−６週後で体重が増加し始めて、ＣＤ４の数も下記の表に示すとおり増加した。かれらはそれぞれ３および４．５月で無症状状態になった。
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＜実施例２＞
ヒトの免疫系を移植した１００匹のＳＣＩＤ（重度関連免疫不全症候群（Ｓｅｖｅｒ  Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）マウスを５０匹づつコントロールと実験グループに分けた。実験グループは好ましい態様の対象であるｎｅｆ欠失ウイルスの１００万ビリオンを静脈注射で感染させた。この注射から１ヶ月後両方のグループは野生型のＨＩＶ−１ビリオンと感染したリンパ球で感染させられた。感染の１ヶ月後、それぞれのグループから１０匹のマウスが犠牲にされ、それらのリンパ様組織が調べられた。コントロールグループにおいて病理学的実験により小胞の樹状突起細胞の深刻な減少、著しいシンシチウムの形成、平均ＣＤ４の３８．６％が減少した末梢血が明らかにされた。実験グループでは最小の病理学的変化とＣＤ４細胞数の顕著な減少が起こっていないことが明らかにされた。さらに２ヶ月経過した後、コントロールの動物の５８％が野生型ＨＩＶ−１感染により生じた免疫不全の結果として死に、一方実験グループの動物には免疫不全の結果として死んだものはいなかった。この観察は統計的に重要である（ｐ＜．００１）。実験グループから選ばれた２０匹は上記のとおり再度野生型ＨＩＶ−１で感染させたが、また病理学的応答はなかった。
本発明の対象である組み換えウイルスは病原性がなく、上記のとおり野生型ＨＩＶのＣＤ４細胞障害性効果に由来する免疫を付与し、以下の方法が野生型ＨＩＶ感染する危険性が高い人における予防に対して確立される。：
１．細心な生理学的実験とＨＩＶ感染に関しての教育。
２．組み換えｎｅｆ欠失ＨＩＶウイルスを用いた予防の危険性と告知に基づく同意の獲得の詳細な議論。議論は標準テストからでは野生型ＨＩＶ感染の診断が不可能であること、ｎｅｆタンパク質に対する抗体を検出する特別なＥＬＩＳＡを行なうことの必要性を含む。
３．０．５ｍｌに懸濁したおよそ１，０００，０００ウイルス粒子が皮下投与される。
４．対象者はアナフィラキシー反応のような不都合な反応がないことを確認するために十分な時間観察される。
５．血清変換（ｓｅｒｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）で組み換えウイルスに対する免疫反応の成功が観察される。
上述の記載と実施例は単に具体的にするためになされ、修飾や変更は本発明の意図と目的からはずれるものではないことは明らかである。
結論、効果および目的
組み変えレトロウイルスの１つの潜在的な用途だけが記載されているが、本発明の主題は多くのさらに達成するものを含んでいる。該主題はＨＴＬＶウイルスによりおこる白血病のような他のレトロウイルス感染症の予防と治療に広く用いうる。この主題が用いうる既に発見されている他の病原性レトロウイルスがあるかもしれない。本発明が遺伝子欠損の位置と程度および／または欠失部位の広がりを変えて修飾されうることは確実にありえる。本発明の上述の好ましい態様の記載に別の方法を用いて同様な遺伝子欠失を生じることも実施可能である。