(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトバチルス・カゼイＹＩＴ９０２９株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１３６６）を有効成分として含有する尿路感染症予防治療剤。
【請求項２】
ラクトバチルス・カゼイＹＩＴ９０２９株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１３６６）が、生菌として含有されている請求項１記載の尿路感染症予防治療剤。
【請求項３】
尿路感染症が、複雑性尿路感染症である請求項１又は請求項２記載の尿路感染症予防治療剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、尿路内における感染症、特に複雑性尿路感染症の予防および治療に用いられる尿路感染症予防治療剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
尿路細菌感染症とは尿路への細菌の付着と増殖によって生じる慢性的な感染症である。尿路感染症は、尿路に明らかな基礎疾患や異常が見出せない単純性尿路感染症と尿路に基礎疾患があり、これが誘因となって感染が生じる複雑性尿路感染症に分類される。尿路感染症の原因菌は、1950年頃までスタフィロコッカス（Staphylococcus）属が主要であった。しかし、近年臨床での抗生物質の蔓延により、グラム陽性菌の症例が減少し、現在ではエスケリッチア・コリ（ Escherichia coli ）（以下E.coli）による症例が大部分となっている。また、シュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）、カンジダアルビカンス（Candida albicans ）等の日和見感染原因菌（薬剤耐性菌）による症例も増加している。
【０００３】
尿路感染症における原因菌の感染動態は、管腔性（尿路上行性）と内因性（血行性）とに分けられ、その大部分は尿路上行性である。原因菌が外尿道口に付着した場合、１．細菌自身の力で尿道壁を伝わって上がる、２．排尿最後に起こる尿道膀胱逆流に乗じる、３．尿道の摩擦作用による、等によって膀胱へ到達する。そこで、菌は膀胱上皮ムチン層や上皮細胞に付着し増殖して尿管、腎盂へと感染が増悪していく。しかし健常人であれば、原因菌が外尿道口に付着し、さらに膀胱へ上行して上皮に接着しても、１．膀胱上皮ムチン層や赤血球凝集塊、２．感染細胞、３．原因菌を貪食した多核白血球、４．尿中微量物質（ファイブロネクチン等のレセプター物質、IgA等）により被膜された状態で排尿により体外に排除される。
【０００４】
したがって、尿路感染症の生じる患者では、感染の前提因子として上記の排除機構が欠落した基礎疾患ないし病態が認められている。 これには全身的要因である代謝性疾患、先天性免疫不全、免疫抑制剤の投与、放射線照射と局所的要因である尿路（腎盂尿管移行部、尿管膀胱移行部、膀胱頸部、尿道）狭窄、結石、外傷、カテーテル、腫瘍等が挙げられる。特に後者の局所的要因が、原因菌の感染を助長している場合が多いものと考えられる。
【０００５】
尿路感染症の動物モデルとしては、カテーテル操作によりマウス膀胱内に経尿道的にE. coliを注入するモデルが報告されている。しかし尿路が正常な状態の動物に E. coliを感染させる方法は、 臨床で問題視されている宿主の基礎的疾患よりもむしろ原因菌の病原性が起因となって感染が成立しているモデルと考えられ、このようなモデルでは、急性尿路感染症に対しては、モデルとして利用できるものの、複雑性（慢性）尿路感染症に対する評価モデルとしては利用できない。
【０００６】
このため、複雑性（慢性）尿路感染症に対する効果を評価できる方法が望まれており、また、これにより複雑性（慢性）尿路感染症予防治療に有効な手段を見出すことが望まれている。
【０００７】
尿路感染症に対しては、一般に抗生物質の投与等が行われているが、抗生物質の使用は、目的とする病原菌に対して、良好な除菌効果を発揮するが、一方で供した抗生剤に対して耐性な菌による二次感染の生じる可能性が危惧される。
【０００８】
一方、最近では、尿路感染症に対する乳酸菌の効果も報告されている。例えば、Hilton, E., Rindos, P and Isenberg, H.D. (1995). Lactobacillus GG vaginal Suppositories and Vaginitis. J. Clin. Microbiol. 33, 1443. および Bruce, A.W and Reid, G. (1988). Intravaginal Instillation of lactobacilli for Prevention of Recurrent Urinary Tract Infection. Can. J. Microbiol. 34, 339-343.では、臨床において、乳酸菌を膣内に注入することにより尿路感染症を防御する試みが報告されている。さらに Reid, G., Chan, R.C.Y., Bruce, A.W and Costerton, J.W. (1985). Prevention of Urinary Tract Infection in Rats with an Indigenous Lactobacillus casei strain. Can. J. Microbiol. 34, 339-343.では、動物モデルにおいて、乳酸菌を膀胱内に注入することにより、尿路感染症を防御できたと報告している。
しかしながら、これは、1.尿路局所の基礎的疾患を模した複雑性尿路感染症実験モデルを用いていない、2.感染防御効果に関する詳細なデータが示されていない、3.他の乳酸菌と効果の比較がされていないものである。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
このような現状において、より安全で治療効果の高い尿路感染症、特に複雑性尿路感染症の予防治療剤を開発することが望まれていた。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、マウス膀胱内を化学処理することにより、慢性的な尿路局所の感染症を誘導することで精度の高い尿路感染マウスによる評価方法を確立し、この方法を用いて各種乳酸菌について研究を進めたところ、ラクトバチルス・カゼイ、特にラクトバチルス・カゼイYIT9029株が優れた尿路感染症、特に複雑性尿路感染症に対する予防治療効果を有し、また安全性及び回収性にも優れていることを見出し、本発明を完成した。
【００１１】
即ち、本発明の請求項１に係る発明は、ラクトバチルス・カゼイYIT9029株を有効成分として含有する尿路感染症予防治療剤に係るものである。
【００１３】
また、本発明の請求項２に係る発明は、ラクトバチルス・カゼイが、生菌として含有されている請求項１記載の尿路感染症予防治療剤に係るものである。
【００１４】
更に、本発明の請求項３に係る発明は、尿路感染症が、複雑性尿路感染症である請求項１又は請求項２記載の尿路感染症予防治療剤に係るものである。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明の尿路感染症予防治療剤の有効成分として含有されるラクトバチルス・カゼイは、ラクトバチルス属の乳酸桿菌の一種である。本発明では、ラクトバチルス・カゼイに分類される各種の株が有効に利用できるが、特にラクトバチルス・カゼイYIT9029株（FERM BP-1366）を用いることで特に優れた尿路感染症予防治療効果を得ることができる。
【００１６】
本発明の尿路感染症予防治療剤は、有効成分として前記ラクトバチルス・カゼイを含有させることが必要であるが、それ以外の成分を含有することを妨げるものではなく、各種の医療助剤等を添加しても良い。
また、前記ラクトバチルス・カゼイは、生菌、死菌いずれの状態で含有させても良いが、生菌の状態で含有させることが望ましい。
【００１７】
本発明の尿路感染症予防治療剤を医薬として使用する場合の投与量は、投与法、患者の年齢、体重、容態によって異なるが、成人患者に対して１日あたり、１００ｍｇ〜１０ｇ程度を患部に直接または経口で投与とすることができる。
【００１８】
【実施例】
慢性尿路感染症モデルの作成
動物：マウス C3H/HeN（SLC）SPFの雌 8週齢を一群につき 6匹用いた。飼育は MF 飼料と水の自由摂取で行った。
感染菌液の調製：名古屋大学 泌尿器科より分与された尿路感染症の患者の尿分離株であるE．coli YU株を感染菌として用いた。この菌株が膀胱上皮細胞への接着、あるいは尿路感染への関与が報告されている Type I-fimbriae、および P-fimbriaeを有していることをあらかじめ確認した。E. coli を トリプトース液体培地（Difco）にて 37℃、14時間振盪培養した。培養菌体を滅菌生理食塩水で 4℃、3,500 rpm、5分間、3回遠心洗浄後、5.0×107（Colony Formation Units/ml、以下 CFU/ml）に調製した（以下 E. coli菌液）。
【００１９】
尿路感染症モデルの作製：ネンブタール麻酔下のマウスの膀胱内へ経尿道的に静脈内留置用カテーテル（BECTON DICKINSON）を挿入後、0.1N-HCl（和光純薬）を 100μｌ注入した。次いで 45秒後に 0.1N-KOH（和光純薬）を 100μｌ注入した後、直ちに PBS pH 7.2を 200μｌ注入して膀胱内を洗浄した。洗浄して24時間後に、上記の E. coli菌液を膀胱内に 20μｌ注入した。
【００２０】
試験例１（乳酸桿菌前添加）
乳酸桿菌の投与菌液の調製：ラクトバチルス・カゼイ YIT9029株（以下YIT9029株）、ラクトバチルス・ファーメンタム YIT0159（以下YIT0159株）、あるいは ラクトバチルス・プランタラム YIT0102（以下YIT0102株）をMRS液体培地（Difco）にて37℃、48時間炭酸ガス培養した。培養菌体を滅菌生理食塩水で 4℃、3,500 rpm、5分間、3回遠心洗浄した後、5.0×109 CFU/mlに調製した。さらに 5.0×1010、あるいは 5.0×108（CFU/ml）の投与菌液を調製した。
【００２１】
動物モデルによる防御効果の測定：化学処理を行って 15分後に乳酸桿菌の菌液を膀胱内に 20μｌ注入した。注入して24時間後に E. coli菌液を膀胱内に 20μｌ注入し、その後 15分、1、3および 7日目に解剖を行い、膀胱および腎臓を無菌的に採取して、５mlの滅菌生理食塩水に浮遊させた。テフロンホモジナイザーにて攪拌破砕した各臓器浮遊液中の E. coliと乳酸桿菌の菌数について、それぞれ DHLおよび MRS平板寒天培地（Difco）を用いて確認した。
結果を図１、図２及び図３に示す。
【００２２】
図１の結果、膀胱において、対照群では感染後 1日目から 7日目にかけて E.coliによる慢性感染が生じた。これに対して YIT9029投与群では、対照群に比較して感染１、４、および７日目に感染菌数がそれぞれ 1/100、1/100、および 1/1000だった。また腎臓においても、対照群に比較して YIT9029株投与群では感染菌数が 1/10以下だった。このことから YIT9029株の膀胱内注入は、 E. coliの慢性尿路感染症に対して有意な感染防御効果を有することが確認された。
【００２３】
図２の結果、YIT9029株投与群では、対照群に比較して感染菌数が 1/100であり、有意な感染防御効果が認められた。一方、YIT0159株投与群にも感染菌数の減少は認められたが有意な効果ではなかった。また、YIT0102株投与群では全く感染菌数の減少は認められなかった。このことから乳酸桿菌の防御効果には菌株（菌種）間で差が認められ、特に YIT9029株で防御効果の強いことが確認された。
【００２４】
図３の結果、108、および109（CFU/mouse）の YIT9029株を投与した群では、感染 4日目に感染菌数が対照群の 1/1000になり、有意な感染防御効果が認められたが、107 投与群では防御効果が弱まった。一方、YIT0159投与群では、いずれの菌数を投与した場合も感染菌数の減少はわずかであり、有意な防御効果は認められなかった。 YIT9029株の防御効果は投与菌数が影響することが確認された。以上図１、図２及び図３の結果より、ラクトバチルス・カゼイ YIT9029株を投与した系には、明らかな感染防御効果が認められた。
【００２５】
試験例２
化学処理を行って 15分後に YIT9029株菌液を膀胱内に 20μｌ注入した。注入して24時間後に 尿路感染症の患者の尿分離株である E. coli YU株（Type I-fimbriae/P-fimbriae；＋/＋）およびSK株（＋/−）、あるいはウサギ糞便分離株（−/−）の菌液を膀胱内に 20μｌ注入した。注入後 4日目に解剖を行い、膀胱中の E. coliと YIT9029株の菌数について、それぞれ DHLおよび LLV平板寒天培地を用いて確認した。
結果を表１に示す。
【００２６】
【表１】
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【００２７】
感染 1日目に対照群では、膀胱から検出された E.coli YU株、SK株、およびウサギ糞便分離株の感染菌数は、それぞれ 106（CFU/Bladder）、105、および 105であった。これに対して YIT9029株投与群では、いずれの感染菌に対しても感染菌数が 1/100以下であった。尿路への接着に関与している線毛の有無に関わらず、いずれの感染菌に対しても有意な感染防御効果が認められた。感染菌間で乳酸桿菌の回収菌数に差は認められなかった。ラクトバチルス・カゼイ YIT9029株を投与した系では、病原性の異なる種々の大腸菌に対し、優れた感染防御効果が認められた。
【００２８】
試験例３（乳酸桿菌後添加）
化学処理を行って 24時間後に E. coli菌液を膀胱内に 20μｌ注入した。注入 24時間後に YIT9029株菌液を 1日 1回、計 11回膀胱内に 20μｌ注入した。 E. coliを感染後 12日目に解剖を行い、膀胱、および腎臓中の E. coliと YIT9029株の菌数について、それぞれ DHLおよび LLV平板寒天培地を用いて確認した。
結果を表２に示す。
【００２９】
【表２】
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【００３０】
対照群では膀胱において、7例中 6例で感染菌が検出され、検出された個体の感染菌数は 106（CFU/Bladder）レベルだった。これに対して YIT9029株投与群では 8例中 2例にのみ感染菌が検出され、菌数も 104レベルだった。尿路感染後にラクトバチルス・カゼイ YIT9029株を膀胱内に注入した場合、明らかな治療効果が認められた。
【００３１】
試験例４（尿中白血球数及び尿中 Myeloperoxidase (MPO)活性への影響）
化学処理を行って 15分後に YIT9029株菌液を膀胱内に 20μｌ注入した。注入して24時間後に E. coli YU株の菌液を膀胱内に 20μｌ注入した。注入後 1、4および 7日目に尿を採取し、血球計算板を用いて尿中の白血球数を測定した。また、採取した尿 100μｌと抽出緩衝液（Hexadecyltrimethylammonium bromide, 10 g/l; KH2PO4, 6.82 g/l; pH 6.0）の 100 mlを混和後、氷中で10分間超音波処理した。次いで凍結融解を２回行った後、4℃、15,000 rpm、10分間遠心分離した上清の 50μｌと反応液（O-dianisidine dihydrochloride, 167 mg/l; KH2PO4, 6.82 g/l; Hydrogen peroxide, 40μｌ/l; pH 6.0）の 150μｌを混和後、25℃、5分間反応させた。その後、50μｌの 1N HClを添加して反応を終了させた後、405 nmの吸光度を測定した。尿試料中のMPO活性は、既知の酵素活性を示すMPO溶液の吸光度変化から導いた。
結果を図４に示す。
【００３２】
化学処理のみでは尿中の白血球数の増加は認められなかった。 E. coli感染後１日目に、対照群では白血球数の著しい増加が認められたのに対して、 YIT9029株投与群では白血球の増加は僅かだった。感染4〜7日目に対照群の白血球数は高く維持されたのに対して、YIT9029株投与群の白血球数は減少した。
【００３３】
化学処理のみでは尿中の MPO活性は上昇しなかった。 E. coli感染後1日目に、対照群ではMPO活性の上昇が認められたのに対して、 YIT9029株投与群では MPO活性の上昇は僅かだった。感染4〜7日目に対照群の MPO活性は高く維持されたのに対して、YIT9029株投与群のMPO活性に変化は認められなかった。
このことからラクトバチルス・カゼイ YIT9029株を膀胱内に注入した場合、E. coliの感染によって生じる尿中白血球の増加、および MPO活性の上昇が抑制されることが確認された。
【００３４】
【発明の効果】
本発明のラクトバチルス・カゼイを有効成分として含有する尿路感染症予防治療剤によれば、尿路感染症に対し、優れた予防効果及び治療効果を得ることができる。また、本発明の尿路感染症予防治療剤の有効成分であるラクトバチルス・カゼイは、乳酸菌飲料等に用いられている菌株であるので安全性に全く問題のないものである。
更に、本発明のラクトバチルス・カゼイ、特にラクトバチルス・カゼイYIT9029株は、抗生剤との併用により、薬剤耐性菌による尿路感染症に対しても優れた治療効果が期待できるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】カゼイ YIT9029株が慢性尿路感染症に対して感染防御効果を示す図
【図２】カゼイ YIT9029株と他の乳酸桿菌の感染防御効果の比較を示す図
【図３】カゼイ YIT9029株の投与菌数が感染防御効果に与える影響を示す図
【図４】カゼイ YIT9029株の投与が尿中白血球数およびMPO活性に与える影響を示す図
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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