(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中に存在するミコバクテリウム種のリファンピシン（および／またはリファブチン）耐性を検出するための方法であって、下記工程：
（i）必要ならば、試料中に存在するポリ核酸を遊離、単離、あるいは濃縮し；
（ii）必要ならば、少なくとも１つの適当なプライマーのペアーを用いてｒｐｏＢ遺伝子の重要部分を増幅し；
（iii）適当なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で、工程（i）または（ii）のポリ核酸を、野生型のプローブのセットとハイブリダイゼーションさせ；
ここに該プローブは表２に示される
Ｓ１                （配列番号：１）、
Ｓ１１              （配列番号：２）、
Ｓ２                （配列番号：３）、
Ｓ３                （配列番号：４）、
Ｓ３３              （配列番号：５）、
Ｓ４                （配列番号：６）、
Ｓ４４              （配列番号：７）、
Ｓ４４４            （配列番号：４３）、
Ｓ４４４４          （配列番号：８）、
Ｓ５                （配列番号：９）、
Ｓ５５              （配列番号：１０）、
Ｓ５５５            （配列番号：３９）、
Ｓ５５５５          （配列番号：４０）、
Ｓ５５Ｃ            （配列番号：４４）、および
Ｓ５５Ｍ            （配列番号：４５）
からなる群より選択されるＳ−プローブであり；
該セットは図１に示すｒｐｏＢ遺伝子の完全な変異領域と重複しており；
（iv）工程（iii）で得られたハイブリッドを検出し；
（v）工程（iv）で得られた異なるハイブリダイゼーションシグナルから試料中に存在するミコバクテリウム種のリファンピシン感応性（耐性対感受性）を推定する、
からなる方法。
【請求項２】
野生型プローブの該セットが、５以上の野生型プローブからなる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
工程（iii）の野生型プローブのセットが、エム・ツベルクローシス、エム・パラツベルクローシス、エム・アビウム、エム・スクロフラセウム、エム・カンサイイ、エム・イントラセルラレ（およびＭＡＣ−株）、またはエム・レプラエに対する少なくとも１つの特異的プローブとさらに組み合わされている、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
エム・ツベルクローシスに対する種特異的プローブが、
ＭＴ−ＰＯＬ−１    （配列番号：２３）、
ＭＴ−ＰＯＬ−２    （配列番号：２４）、
ＭＴ−ＰＯＬ−３    （配列番号：２５）、
ＭＴ−ＰＯＬ−４    （配列番号：２６）および
ＭＴ−ＰＯＬ−５    （配列番号：２７）、
からなる群から選択される、請求項３記載の方法。
【請求項５】
エム・パラツベルクローシスに対する種特異的プローブが、
ＭＰ−ＰＯＬ−１    （配列番号：２８）、および／または
エム・パラツベルクローシスのｒｐｏＢ遺伝子の重要部分の配列（配列番号：３５）由来のいずれかのエム・パラツベルクローシス特異的プローブ、
からなる群から選択される、請求項３記載の方法。
【請求項６】
エム・アビウムに対する種特異的プローブが、
ＭＡ−ＰＯＬ−１    （配列番号：２９）、および／または
エム・アビウムのｒｐｏＢ遺伝子の重要部分の配列（配列番号：３６）由来のいずれかのエム・アビウム特異的プローブ、
からなる群から選択される、請求項３記載の方法。
【請求項７】
エム・スクロフラセウムに対する種特異的プローブが、
ＭＳ−ＰＯＬ−１    （配列番号３８）、および／または
エム・スクロフラセウムのｒｐｏＢ遺伝子の重要部分の配列（配列番号：３７）由来のいずれかのエム・スクロフラセウム特異的プローブ、
からなる群から選択される、請求項３記載の方法。
【請求項８】
エム・カンサイイに対する種特異的プローブが、
ＭＫ−ＰＯＬ−１    （配列番号５５）、および／または
エム・カンサイイのｒｐｏＢ遺伝子の重要部分の配列（配列番号：５６）由来のいずれかのエム・カンサイイ特異的プローブ、
からなる群から選択される、請求項３記載の方法。
【請求項９】
エム・イントラセルラレ（およびＭＡＣ−株）に対する種特異的プローブが、
ＭＩ−ＰＯＬ−１    （配列番号６８）、および／または
ＭＡＣ−株のｒｐｏＢ遺伝子の重要部分の配列（配列番号：６９）由来のいずれかのＭＡＣ−株特異的プローブ、
からなる群から選択される、請求項３記載の方法。
【請求項１０】
エム・レプラエに対する種特異的プローブが、
ＭＬ−ＰＯＬ−１    （配列番号５７）、
である、請求項３記載の方法。
【請求項１１】
工程（iii）の野生型プローブの該セットが、少なくとも１つのｒｐｏＢサイレント変異プローブとさらに組み合わされている、請求項１ないし１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
工程（iii）の野生型プローブの該セットが、少なくとも１つのｒｐｏＢ変異プローブとさらに組み合わされている、請求項１ないし１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
ミコバクテリウム種がエム・ツベルクローシスである、請求項１ないし１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
野生型プローブの該セットが、
Ｓ１１              （配列番号：２）、
Ｓ２                （配列番号：３）、
Ｓ３３              （配列番号：５）、
Ｓ４４４４          （配列番号：８）、
Ｓ５５              （配列番号：１０）、および
Ｓ５５５５          （配列番号：４０）、
からなる群から選択される、少なくとも１つの（Ｓ−）プローブを含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
野生型プローブの該セットが、少なくとも１つの下記（Ｓ−）プローブ：
Ｓ４４４４          （配列番号：８）、および
Ｓ５５またはＳ５５５５      （配列番号：１０）または（配列番号：４０）、
を含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
野生型プローブの該セットが、下記（Ｓ−）プローブ：
Ｓ１１              （配列番号：２）、
Ｓ２                （配列番号：３）、
Ｓ３３              （配列番号：５）、
Ｓ４４４４          （配列番号：８）、および
Ｓ５５またはＳ５５５５      （配列番号：１０）または（配列番号：４０）、
全てからなる、請求項１３記載の方法。
【請求項１７】
工程（iii）の野生型プローブの該セットが、少なくとも１つのｒｐｏＢサイレント変異プローブとさらに組み合わされている、請求項１３ないし１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
ｒｐｏＢサイレント変異プローブが、
ＳＩＬ−１          （配列番号：１３）、
である、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
工程（iii）の野生型プローブの該セットが、少なくとも１つのｒｐｏＢ変異プローブとさらに組み合わされている、請求項１３ないし１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
ｒｐｏＢ変異プローブ、またはＲ−プローブが、
Ｒ１                （配列番号：４６）、
Ｒ２                （配列番号：１４）、
Ｒ２Ｂ              （配列番号：４７）、
Ｒ２Ｃ              （配列番号：４８）、
Ｒ３                （配列番号：４９）、
Ｒ４Ａ              （配列番号：１５）、
Ｒ４４Ａ            （配列番号：１６）、
Ｒ４４４Ａ          （配列番号：１７）、
Ｒ４Ｂ              （配列番号：１８）、
Ｒ４４Ｂ            （配列番号：１９）、
Ｒ４４４Ｂ          （配列番号：２０）、
Ｒ４Ｃ              （配列番号：５０）、
Ｒ４Ｄ              （配列番号：５１）、
Ｒ４Ｅ              （配列番号：５２）、
Ｒ５                （配列番号：２１）、
Ｒ５５              （配列番号：２２）、
Ｒ５Ｂ              （配列番号：５３）、および
Ｒ５Ｃ              （配列番号：５４）、
からなる群から選択される、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
Ｒ−プローブが、
Ｒ２                （配列番号：１４）、
Ｒ４４４Ａ          （配列番号：１７）、
Ｒ４４４Ｂ          （配列番号：２０）、および
Ｒ５５              （配列番号：２２）、
からなる群から選択される、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
下記の新たなｒｐｏＢ遺伝子変異：
−ｒｐｏＢ遺伝子のコドン５１６における変異を表し、アミノ酸ＤからＧへの変化を生じている、Ｄ５１６Ｇ、
−ｒｐｏＢ遺伝子のコドン５２６における変異を表し、アミノ酸ＨからＣへの変化を生じるている、Ｈ５２６Ｃ、
−ｒｐｏＢ遺伝子のコドン５２６における変異を表し、アミノ酸ＨからＴへの変化を生じている、Ｈ５２６Ｔ、
−ｒｐｏＢ遺伝子のコドン５２９における変異を表し、アミノ酸ＲからＱへの変化を生じている、Ｒ５２９Ｑ、
を特異的に検出するか、あるいは増幅するように設計されたプローブまたはプライマーのセットを用いる、請求項１３ないし２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
ミコバクテリウム種が、エム・レプラエである、請求項１ないし１０のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
工程（iii）の野生型プローブの該セットが、
ＭＬ−Ｓ１          （配列番号：５８）、
ＭＬ−Ｓ２          （配列番号：５９）、
ＭＬ−Ｓ３          （配列番号：６０）、
ＭＬ−Ｓ４          （配列番号：６１）、
ＭＬ−Ｓ５          （配列番号：６２）、および
ＭＬ−Ｓ６          （配列番号：６３）、
からなる群から選択される、少なくとも１つの（Ｓ−）プローブを含む、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
プローブが固体支持体に固定化されている、請求項１から２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
ミコバクテリウム種のリファンピシン（および／またはリファブチン）耐性の検出のための野生型プローブのセットであって、該プローブは表２に示される
Ｓ１                （配列番号：１）、
Ｓ１１              （配列番号：２）、
Ｓ２                （配列番号：３）、
Ｓ３                （配列番号：４）、
Ｓ３３              （配列番号：５）、
Ｓ４                （配列番号：６）、
Ｓ４４              （配列番号：７）、
Ｓ４４４            （配列番号：４３）、
Ｓ４４４４          （配列番号：８）、
Ｓ５                （配列番号：９）、
Ｓ５５              （配列番号：１０）、
Ｓ５５５            （配列番号：３９）、
Ｓ５５５５          （配列番号：４０）、
Ｓ５５Ｃ            （配列番号：４４）、および
Ｓ５５Ｍ            （配列番号：４５）
からなる群より選択されるＳ−プローブであることを特徴とし、該セットが図１に示すｒｐｏＢ遺伝子の完全な変異領域と重複していることを特徴とする、野生型プローブのセット。
【請求項２７】
該セットが、５以上の野生型プローブを含む、請求項２６記載の野生型プローブのセット。
【請求項２８】
ＭＬ−Ｓ１          （配列番号：５８）、
ＭＬ−Ｓ２          （配列番号：５９）、
ＭＬ−Ｓ３          （配列番号：６０）、
ＭＬ−Ｓ４          （配列番号：６１）、
ＭＬ−Ｓ５          （配列番号：６２）、および
ＭＬ−Ｓ６          （配列番号：６３）
からなる群から選択される、少なくとも１つの野生型プローブを含む、リファンピシン（および／またはリファブチン）耐性の検出のための、請求項２６または２７記載の野生型プローブのセット。
【請求項２９】
請求項２６ないし２８のいずれかにおいて定義された野生型プローブのいずれかのセットを含む、組成物。
【請求項３０】
試料中に存在するミコバクテリウム種のリファンピシン（および／またはリファブチン）耐性を検出するためのキットであって、下記成分：
（i）適当な場合には、試料中に存在するポリ核酸を遊離、単離、あるいは濃縮するための手段；
（ii）適当な場合には、ｒｐｏＢ遺伝子の増幅のためのプライマーのセット；
（iii）可能には固体支持体に固定化されている、請求項２６または２７のいずれかにおいて定義された野生型プローブの少なくとも１つのセット；
（iv）ハイブリダイゼーションバッファー、または該バッファーを製造するのに必要な成分；
（v）洗浄溶液、または該溶液を製造するのに必要な成分；
（vi）適当な場合には、上記ハイブリダイゼーションから得られたハイブリッドを検出する手段、
を含む、キット。
【請求項３１】
工程（iii）の野生型プローブのセットが、請求項２６において定義されたセットからなる、エム・ツベルクローシスのリファンピシン（および／またはリファブチン）耐性の検出のための、請求項３０に記載のキット。
【請求項３２】
工程（iii）の野生型プローブのセットが、請求項２８において定義されたセットからなる、エム・レプラエのリファンピシン（および／またはリファブチン）耐性の検出のための、請求項３０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
本発明は、薬剤耐性ミコバクテリアの分野に関する
本発明は、プローブ、プライマー、および生物学的試料中のミコバクテリアの核酸の検出のための方法ならびにそれらからなるキットに関する。
最も臨床的に重要なミコバクテリウム（Mycobacterium）種、詳細にはミコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis）の同定は、６週間までを必要としうる培養工程のため、退屈な仕事であり時間がかかる。疾病が生命を脅かし、非常に感染性があるかもしれないので、ミコバクテリウム感染の迅速な診断は非常に重要である。ごく最近になって、培養の必要なくミコバクテリウム種を検出し同定するためのいくつかの方法−すべてが１つまたは別の増幅プロセスを用いる−が開発された（Claridgeら、１９９３年）。これらの方法の大部分は評価途中であり、ルーチンでの適用における利益は問題となったままである。そのうえ、これらの方法は、なお培養に依存しているミコバクテリウムの薬剤耐性の検出という問題を解決するものではない。
ツベルクローシスにおける多剤耐性の頻度が着実に増加しているので（Culliton、１９９２年）、エム・ツベルクローシス（M.tuberclosis）の早期診断および主な結核菌抑制剤に対する耐性の認識は、治療および伝染病復活の最適な抑制にとり必須である。
エム・ツベルクローシス感染の治療み用いられる抗生物質は主にイソニアジドおよびリファンピシンであり、別々にあるいは両方を混合して投与される。時折、ピラジンアミド、エタンブトールおよびストレプトマイシンが用いられる。（フルオロ）キノロンのような他のクラスの抗生物質は、将来の好ましい結核菌抑制剤であるかもしれない。
さらに大部分の多剤耐性ミコバクテリアはリファンピシンに対する感受性を失ったので、リファンピシン耐性は多剤耐性結核菌に関する有効なマーカーであると考えられる。この理由により、リファンピシン耐性の検出が特に重要であるかもしれない。
試験されたエム・ツベルクローシス株の大部分については、リファンピシン（およびリファブチンのようなアナログ）に対する耐性の原因となる機構が調べられている。リファンピシン（およびアナログ）は、ＲＮＡポリメラーゼのβ−サブユニットと相互作用することによりこの酵素をブロックする。Telentiら（１９９３年ａ）は、エム・ツベルクローシスのＲＮＡポリメラーゼのβ−サブユニットに限られた領域での変異はリファンピシン作用に対するＲＮＡポリメラーゼの不感受性を生じることを見いだした。この領域はｒｐｏＢ遺伝子における２３個のコドンの並びに限られる。該著者らは、リファンピシン耐性を引き起こす１７個のアミノ酸の変化を記載している（Telentiら、１９９３年ｂ）。これらのアミノ酸変化は、６７個のヌクレオチドまたは２３個のアミノ酸のコドンの並びにそれぞれ分散している１５個のヌクレオチドまたは８個のアミノ酸のコドンにおける点突然変異または欠失により引き起こされる。
Telentiら（１９９３年ａおよびｂ）は、リファンピシン耐性の原因となる関連変異に関するスクリーニングのためのＰＣＲ−ＳＳＣＰ法を記載した（ＳＳＣＰは１本鎖コンホーメーションの多型性をいう）。放射活性または蛍光マーカーのいずれかを用いることによりＳＳＣＰ分析を行うことができる。後者の場合、精巧で高価は装置（自動ＤＮＡ配列決定装置）が必要である。記載されたＳＳＣＰ法は特異性および感度に関する他の限界も有しており、その限界により日常的な使用が妨げられうる。有意な細菌負荷（顕微鏡スコア：＞９０個／視野）が顕微鏡で観察される場合には、標本を直接十分に分析できるだけであり、粗ＤＮＡ試料について結果の解釈を複雑にする鎖分離人工物が観察されうる。
Kaperら、（１９９４年）は、リファンピシン耐性に関する２３個の異なったｒｐｏＢ対立遺伝子を記載している。Telemtiら（１９９３年ａ）により記載された変異のほかに、いくつかの新たな変異ｒｐｏＢ対立遺伝子が記載されている。しかしながら、最も頻繁に生じる対立遺伝子は以前記載されたものと同じものである。
エム・レプラエ（M.leprae）においては、リファンピシン耐性に関する分子の基礎が
0004558105.tif 000002
およびCole（１９９３年）により記載されている。ここでも、エム・レプラエのＲＮＡポリメラーゼのベータサブユニットをコードしているｒｐｏＢ遺伝子における変異により耐性が生じていた。限られた数の耐性エム・レプラエ株（９種類）が分析されただけであり、その大部分において（９種類のうち８種類）耐性はＳｅｒ−４２５残基に影響する変異によるものであった。
エム・ツベルクローシスおよびエム・レプラエ以外の臨床的に重要なミコバクテリアは、しばしば、変化するとしても本質的なリファンピシン耐性を示す。かかる場合は、ヒト病原菌であるエム・アビウム（M.avium）およびエム・イントラセルラレ（M.intracellulare）の場合であって、それらに対しては限られた治療選択肢が用いられるだけである。Guerreroら、（１９９４年）は、異なるエム・アビウムおよびエム・イントラセルラレ単離体のｒｐｏＢ遺伝子配列をエム・ツベルクローシスのそれと比較した。ヌクレオチドレベルで相違が存在したが、リファンピシン感受性のエム・ツベルクローシスについては全アミノ酸同一性が見いだされた。これらの知見は、耐性についての別の機構、おそらくは障壁透過性がエム・アビウムおよびエム・イントラセルラレに適用されることを示唆するものである。
逆ハイブリダイゼーションアッセイのごときハイブリダイゼーション法を用いて点突然変異または小規模な欠失の特異的検出をうまく行うことができる。しかしながら、ｒｐｏＢ遺伝子の重要な部分において観察された複雑さにより簡単なプローブの開発は可能ではない。さらに説明するように、精巧な装置の必要なく迅速かつ便利な方法で、すべてではないとしても大部分の変異の検出可能にする特別なアプローチを設計することが本発明の１つの目的であった。
イソニアジド（ＩＮＨ）に対する耐性の機構は、リファンピシンについての耐性機構よりもかなり複雑である。少なくとも２つの遺伝子産物がＩＮＨ耐性に関与している。第１に、ＩＮＨを活性分子に変換すると考えられているカタラーゼ−ペルオキシダーゼがある。ゆえに、ｋａｔＧ遺伝子の欠陥または欠失によってカタラーゼ−ペルオキシダーゼを産生しない株はもはやＩＮＨに感受性がない（Zhangら、１９９２年；Stoeckleら、１９９３年）。この意味からすると、ＩＮＨ耐性とカタラーゼ活性との間の関連はすでに１９５０年代に記録されていた（Middlebrook、１９５４年ａおよびｂ；Youatt、１９６９年）。
関与している第２の分子はｉｎｈＡ遺伝子産物であり、それはミコール酸生合成において役割を果たしていると考えられている。活性化されたＩＮＨ分子はこの産物と直接的または間接的に相互作用し、おそらくは正常なミコール酸生合成を妨げると仮定される。この仮説は、野生型ｉｎｈＡ遺伝子の過剰発現またはｉｎｈＡ遺伝子産物における特別なアミノ酸変化（Ｓ９４Ａ）がＩＮＨ耐性を付与しているという最近の観察結果（Banerjeeら、１９９４年）に基づくものである。
手短にかついくぶん簡単に言えば、ある種のエム・ツベルクローシス株においてＩＮＨ耐性は以下のことにより媒介されている可能性がある：
−  カタラーゼ−ペルオキシダーゼ活性の消失
−  ｉｎｈＡ蛋白におけるある種のアミノ酸変化の存在
−  野生型ｉｎｈＡ蛋白の発現レベル。
さらに、ＩＮＨおよび関連薬剤に対する耐性の付与に他の機構が関与しているかもしれない。ＩＮＨ耐性機構の全体的なスペクトルにおけるこれらの要因の重要性はまだ評価されていない。本発明は、利用可能なｋａｔＧ遺伝子（ＥＭＢＬＸ６８０８１番）およびエム・ツベルクローシスのｉｎｈＡ遺伝子（ＥＭＢＬＵ０２４９２番）から信頼できるＤＮＡプローブが開発されうる場合には、ＤＮＡプローブ法を手段とすることができる。次いで、これらのプローブ試験物を生物学的試料における薬剤耐性の検出に適用することができる。
ストレプトマイシンおよび（フルオロ）キノロンに対する耐性の検出に、リファンピシンに関するものと同じアプローチを用いることができる。１またはそれ以上の遺伝子の限定された領域における点突然変異により、これらの抗生物質に対する耐性も誘導される。ジャイレース遺伝子における点突然変異は（フルオロ）キノロン（ＥＭＢＬ  Ｌ２７５１２番）に対する耐性を付与する。ストレプトマイシン耐性は、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子またはリボゾーム蛋白Ｓ１２の遺伝子（ｒｐｓＬ）のいずれかにおける変異に関係している（Finkenら、１９９３年；DouglasおよびSteyn、１９９３年；Nairら、１９９３年）。
ｋａｔＧ、ｒｐｏＢおよびｒｐｓＬ遺伝子におけるヌクレオチド変化による耐性は、国際出願ＷＯ９３／２２４５４に記載されている。エム・ツベルクローシスにおける異なる遺伝子のそれぞれに関して、可能性のある多くの変異のうちのただ１つのみが詳細に記載されていた（ｋａｔＧについてはＲ４６１Ｌ、ｒｐｏＢについてはＳ４２５Ｌ（Telentiらおよび本発明により記載されたＳ５３１Ｌと同じ）、およびｒｐｓＬについてはＫ４２Ｒ）。
生物学的試料中に存在するミコバクテリウム種の抗生物質耐性の決定のための迅速かつ信頼できる検出方法を提供することが本発明の目的である。
より詳細には、生物学的試料中の存在するエム・ツベルクローシスのリファンピシン（および／またはリファンブチン）に対する耐性の決定のための迅速かつ信頼できる検出方法を提供することが本発明の目的である。
また、抗生物質耐性スペクトルのモニタリングに直接関連した、生物学的試料中のミコバクテリウム種の検出および同定を可能にする方法を提供することが本発明の目的である。
より詳細には、リファンピシン（および／またはリファンブチン）耐性の検出に直接関連した、生物学的試料中のミコバクテリウム・ツベルクローシスの存在を検出する方法を提供することが本発明の目的である。
より詳細には、リファンピシン（および／またはリファンブチン）耐性の検出に直接関連した、生物学的試料中のミコバクテリウム・レプラエの存在を検出する方法を提供することが本発明の目的である。
さらに、野生型配列と１またはそれ以上の薬剤に対する耐性を付与する変異配列とを識別しうる特別なプローブを選択することが本発明の目的である。
より詳細には、野生型配列とリファンピシン（および／またはリファンブチン）に対する耐性を付与する変異配列とを識別しうる特別なプローブを選択することが本発明の目的である。
より詳細には、野生型配列とリファンピシン（および／またはリファンブチン）に対する耐性を付与する変異配列とを識別しうる特別なプローブのセットであって、同一のハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で用いられる特別なプローブのセットを選択することが本発明の目的である。
さらにそのうえ、野生型配列とリファンピシン（および／またはリファンブチン）に対する耐性を付与する変異配列とを識別しうる選択プローブのセットを、生物学的試料中に存在するミコバクテリウム種を同定しうる選択プローブの別のセットと組み合わせることが本発明の目的であり、そのことにより同じハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下ですべてのプローブが使用可能となる。
対象とする抗生物質耐性の特徴を決定する遺伝子フラグメントの増幅を可能にするプライマーを選択することが本発明の目的である。
より詳細には、リファンピシン（およびアナログ）に対する耐性を決定するｒｐｏＢ遺伝子フラグメントの増幅を可能にするプライマーを選択することが本発明の目的である。
本発明のもう１つの目的は、できれば関連するミコバクテリウム種の同定を含めた、ミコバクテリアにおける抗生物質耐性の検出のためのキットを提供することである。
本発明のすべての目的は、以下の特別な具体例に応じたものである。
本発明の好ましいプローブの選択は、固体支持体片上に平行線状に固定化されたオリゴヌクレオチドプローブを用いる逆ハイブリダイゼーションアッセイ（reverse hybridization assay）であるライン・プローブ・アッセイ（Line Probe Assay（LiPA））原理に基づく（Stuyverら、１９９３年；国際出願ＷＯ９４／１２６７０）。このアプローチは、迅速かつ簡単に行えるので、特に有利である。逆ハイブリダイゼーションフォーマット、そしてより詳細にはＬｉＰＡアプローチは、特に、調査すべき重要な情報を得るためにはプローブの組み合わせの使用が好ましいかまたは不可避である場合に、他のＤＮＡ法またはハイブリダイゼーションフォーマットと比較すると多くの実用的な利点を有する。
しかしながら、本発明においてさらに説明される選択プローブのいずれかを用いる他のいかなるタイプのハイブリダイゼーションアッセイまたはフォーマットであっても本発明に包含されることが理解されよう。
逆ハイブリダイゼーションアプローチは、プローブを固体支持体に固定化し、標的ＤＮＡを標識して形成されたハイブリッドの検出を可能にすることを包含する。
以下の定義は、本発明において使用される用語および表現を説明するのに役立つ。
これらの試料中の標的物質は、ＤＮＡまたはＲＮＡ、例えばゲノムＤＮＡまたはメッセンジャーＲＮＡまたはそれらの増幅されたバージョンのいずれであってもよい。これらの分子をポリ核酸ともいう。
用語「プローブ」は、検出すべき標的配列に相補的な配列を有する１本鎖の配列特異的オリゴヌクレオチドをいう。
本明細書の用語「相補的」は、１本鎖プローブ配列が１本鎖標的の配列に正確に相補的であることを意味し、該標的は、検出すべき変異が存在する配列として定義される。本願は単一塩基対のミスマッチの検出を必要とするので、原理的には正確に相補的な配列のハイブリダイゼーションのみを可能にする非常に厳密な条件がハイブリダイゼーションのために必要である。しかしながら、プローブの長さの変更が可能であり（下記参照）、プローブの中央部分がそのハイブリダイゼーション特性に必要であるので、標的配列に対するプローブ配列の可能な逸脱がプローブの頭および尾のほうでは可能であることに注意すべきである。しかしながら、逸脱が正確に相補的なプローブと同等なハイブリダイゼーション特性を生じるかどうかをチェックするために、当業者の知識から考えられるこれらの逸脱を常に実験的に評価すべきである。
好ましくは、プローブは約５ないし５０ヌクレオチドの長さであり、より好ましくは、約１０ないし２５ヌクレオチドである。本発明に使用するヌクレオチドはリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、およびノシンまたはハイブリダイゼーション特性を変化させない修飾基を有するヌクレオチドのごとき修飾ヌクレオチドであってよい。本発明においては、プローブ配列を５’から３’末端への１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドとして表す。以下に記載するプローブのいずれかをそれ自体として、あるいはそれらの相補的形態として、あるいはそれらのＲＮＡ形態（ＴがＵに置換されている）用いることができることは当業者に明らかである。
対応ヌクレオチド配列を含むインサートを含んでいる組み換えプラスミドのクローニングによって本発明プローブを製造することができる。必要な場合には、適当なヌクレアーゼを用いてクローン化プラスミドから対応ヌクレアーゼ配列を開裂し、それらを、例えば、分子量による濾過により回収する。本発明プローブを化学的に、例えば、慣用的なホスホトリエステル法により合成することもできる。
用語「固体支持体」とは、オリゴヌクレオチドプローブを結合させることのできるすべての物質をいうことができるが、オリゴヌクレオチドプローブがそのハイブリダイゼーション特性を保持し、さらに、ハイブリダイゼーションのバックグラウンドレベルが低いままであることが条件となる。通常には、固体物質はマイクロタイタープレート、膜（例えば、ナイロンまたはニトロセルロース）または微小球（ビーズ）であろう。膜または固定に適用する前に、核酸プローブを修飾して固定を容易にし、あるいはハイブリダイゼーション効率を改善することが慣用的である。かかる修飾は、ホモポリマーテイリング、脂肪族基、ＮＨ2基、ＳＨ基、カルボキシル基のごとき別の反応性基との結合、またはビオチン、ハプテンもしくは蛋白との結合を包含する。
用語「標識」は、標識核酸の使用をいう。Saikiら、（１９８８年）またはBejら、（１９９０年）により説明されているような増幅のポリメラーゼ工程の間に取り込まれる標識ヌクレオチドを用いることにより標識を行ってもよく、あるいは標識プライマー、または当業者に知られた他のいずれかの方法によって標識を行ってもよい。標識の性質は同位体（32Ｐ、35Ｓ等）であってもよく、あるいは非同位体（ビオチン、ジゴキシゲニン等）であってもよい。
用語「プライマー」は、コピーすべき核酸鎖に相補的なプライマー伸長生成物の合成の開始点として作用しうる１本鎖オリゴヌクレオチド配列をいう。プライマーの長さおよび配列は、伸長生成物の合成を開始しうるようなものでなくてはならない。好ましくは、プライマーは約５〜５０ヌクレオチドの長さであり、個々の長さおよび配列は、必要なＤＮＡまたはＲＮＡ標的の複雑さ、ならびに温度およびイオン強度のごときプライマー使用条件に依存する。
正しい増幅を保証するには増幅プライマーは対応鋳型配列と正確にマッチする必要はないという事実は、文献（Kwokら、１９９０年）に十分に開示されている。
用いられる増幅方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：Saikiら、１９８８年）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ：Landgrenら、１９８８年；WuおよびWallace、１９８９年；Barany、１９９１年）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ：Guatelliら、１９９０年；Compton、１９９１年）、転写に基づく増幅系（ＴＡＳ：Kwohら、１９８９年）、鎖置換増幅（ＳＤＡ：Duck、１９９０年；Walkerら、１９９２年）またはＱβレプリカーゼによる増幅（Lizardiら、１９８８年；Lomeliら、１９８９年）もしくは当該分野で知られている他のいずれかの核酸分子増幅方法のいずれであってもよい。
プライマーまたはプローブとして用いられるオリゴヌクレオチドは、ホスホロチエート（Matsukuraら、１９８７年）、アルキルホスホロチエート（Millerら、１９７９年）またはペプチド核酸（Nielsenら、１９９１年；Nielsenら、１９９３年）であってもよく、あるいは挿入剤（intercalating agents）（Asselineら、１９８４年）を含んでいてもよい。
本発明の元のＤＮＡ配列中に導入される大部分の他の変更または修飾として、これらの変更は、必要な特異性および感度を得るためにオリゴヌクレオチドが用いられるべき条件に関する改変を必要とするであろう。
ハイブリダイゼーション動力学、ハイブリッド形成の可逆性、オリゴヌクレオチド分子の生物学的安定性等のごとき特性に積極的に影響を及ぼすために、これらの修飾の導入は有利であるかもしれない。
「試料」は、感染したヒト（または動物）から直接的に、あるいは培養（豊富化）後のいずれかから得られるいずれの生物学的物質であってもよい。生物学的物質は、例えば、すべての種類の喀出物、気管支洗浄物、血液、皮膚組織、生検材料、リンパ球血液培養物、コロニー、液体培養物、土壌、糞試料、尿等であってよい。
同一のハイブリダイゼーション条件下での最適な実行を達成してプローブをセットにして同時ハイブリダイゼーションに使用できるように本発明プローブを設計する。このことにより、これらのプローブの有用性が非常に高まり、時間および労力の有意な節約になる。明らかに、他のハイブリダイゼーション条件が好ましい場合には、それらの先端部において多くのヌクレオチドの付加または欠失を行うことにより、すべてのプローブを適宜適合させるべきである。これらの随伴する適合は必然的に同じ結果を生じること、すなわち、個々のプローブはやはり特異的に一定の標的にハイブリダイゼーションするということが理解されるはずである。ＮＡＳＢＡ系のように、増幅された物質が性質上ＲＮＡであってＤＮＡでない場合には、かかる適合は必要であろう。
所望特性を有するプローブの設計には、当業者に知られた以下の有用なガイドラインを適用することができる。
本明細書記載のごときハイブリダイゼーション反応の程度および特異性は多くの要因により影響を受けるので、その標的に完全に相補的であるか否かにかかわらず、それらの要因の１つまたはそれ以上の取り扱いによって個々のプローブの正確な感度および特異性が決定されるであろう。本明細書においてさらに説明する種々のアッセイ条件の重要性および影響は当業者に知られている。
第１に、アッセイ条件に適合するように［プローブ：標的］核酸ハイブリッドの安定性を選択すべきである。長いＡＴに富む配列を避けることにより、Ｇ：Ｃ塩基対でハイブリッドを終結することにより、および適当なＴｍを有するプローブを設計することにより、このことを行ってもよい。長さおよび％ＧＣが最終アッセイが行われる温度よりも約２〜１０℃高くなるようにプローブの開始点および終点を選択すべきである。さらなる水素結合のためにＧ−Ｃ塩基対はＡ−Ｔ塩基対と比較して高い熱安定性を示すので、プローブの塩基組成は重要である。かくして、高いＧ−Ｃ含量の相補的ヌクレオチドを含むハイブリダイゼーションは比較的高温において安定であろう。
プローブの設計の際には、プローブが用いられるイオン強度およびインキュベーション温度のごとき条件も考慮すべきである。反応混合物のイオン強度が増加するにつれハイブリダイゼーションが増加し、イオン強度の増加とともにハイブリッドの熱安定性が向上することが知られている。一方、水素結合を妨げるホルムアミド、尿素、ＤＭＳＯおよびアルコールのごとき化学試薬はハイブリダイゼーションの厳密性を増大させるであろう。かかる試薬による水素結合の不安定化はＴｍを非常に低下させうる。一般的には、約１０〜５０塩基の長さの合成オリゴヌクレオチドプローブに関する最適ハイブリダイゼーションは、生じる２本鎖の融解温度よりも約５℃低い温度で起こる。最適温度以下の温度でのインキュベーションはミスマッチの塩基配列のハイブリダイゼーションを可能にし、それゆえ、特異性が低下しうる。
高い厳密性の条件下でのみハイブリダイゼーションするプローブを有することが望ましい。高い厳密性の条件下では、高度に相補的な核酸ハイブリッドのみが形成するであろう：すなわち、十分な相補性を有しないハイブリッドは形成しないであろう。したがって、アッセイ条件の厳密性は、ハイブリッドを生じる２個の核酸鎖間に必要とされる相補性の量を決定する。標的とともに形成されるハイブリッドと非標的核酸との間の安定性の相違が最大となるように厳密性の程度を選択する。本発明の場合、単一の塩基対の変化を検出する必要があり、非常に高い厳密性の条件が必要である。
第２に、［プローブ：非標的］核酸ハイブリッドの安定性を最小にするようにプローブの位置決めをすべきである。非標的生物に対して完全な相補性のある部分の長さを最小にすることにより、非標的配列に対して相同性のあるＧＣに富む領域を避けることにより、および可能な限り多くの不安定化ミスマッチをまたぐようにプローブの位置決めをすることにより、このことを行ってもよい。配列が特異的なタイプの生物のみを検出するのに有用であるかどうかは、［プローブ：標的］ハイブリッドと［プローブ：非標的］ハイブリッドとの間の熱安定性の相違に大きく依存する。プローブの設計において、これらのＴｍ値の相違はできるだけ大きくすべきである（例えば、少なくとも２℃、好ましくは５℃）。
標的核酸配列の長さ、したがって、プローブ配列の長さも重要である。いくつかの場合、位置および長さを変えて、特定の領域から数個の配列が存在することもあり、そのことにより所望のハイブリダイゼーション特性を有するプローブが得られるであろう。他の場合には、１の配列が、単一塩基のみが異なるもう１つの配列よりも有意に良いものであるかもしれない。完全には相補的でない核酸がハイブリダイゼーションすることは可能であるが、完全に相補的な塩基配列の最大長は、通常、主としてハイブリッドの安定性を決定するであろう。異なる長さおよび塩基組成のオリゴヌクレオチドプローブを用いてもよいが、本発明の好ましいオリゴヌクレオチドプローブは約５ないし５０（より詳細には１０〜２５）塩基の長さであり、標的核酸配列に完全に相補的な配列の十分な伸長部分を有する。
第３に、ハイブリダイゼーションを阻害する強力な内部構造を形成することが知られている標的ＤＮＡまたはＲＮＡにおける領域は好ましくない。同様に、非常に自己相補的なプローブも避けるべきである。上で説明したように、ハイブリダイゼーションは、水素結合した２本鎖を形成する２個の１本鎖の相補的核酸の結合である。２つの鎖の一方が全体的にあるいは部分的にハイブリッドに包含される場合には新たなハイブリッドの形成に関与しにくくなるであろうと考えられる。十分な自己相補性がある場合には、あるタイプのプローブ分子中で分子内および分子間ハイブリッドが形成されうる。注意深いプローブの設計によってかかる構造を避けることができる。対象配列の実質的な部分が１本鎖であるようにプローブを設計することにより、稀であって広範囲のハイブリダイゼーションを非常に増加させてもよい。このタイプの相互作用を検索するためにコンピュータープログラムが使用可能である。しかしながら、ある場合においては、このタイプの相互作用を避けることは不可能であるかもしれない。
本発明は、その最も一般的な形態において、可能には含まれているミコバクテリウム種の同定と連動して、試料中に存在するミコバクテリウム種の抗生物質耐性スペクトルを検出するための方法であって、下記工程：
（i）必要ならば、試料中に存在するポリ核酸を遊離、単離、あるいは濃縮し；
（ii）必要ならば、少なくとも１つの適当なプライマーのペアーを用いて該試料中に存在する抗生物質耐性遺伝子の重要部分を増幅し；
（iii）適当なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で、工程（i）または（ii）のポリ核酸を、表２に掲載する少なくとも１つのｒｐｏＢ遺伝子プローブとハイブリダイゼーションさせ、
（iv）工程（iii）で得られたハイブリッドを検出し；
（v）工程（iv）で得られた異なるハイブリダイゼーションシグナルからミコバクテリウムの抗生物質耐性を、そして可能には含まれているミコバクテリウム種を推定する
からなる方法を提供する。
抗生物質耐性遺伝子の重要部分とは、上記リファンピシン、イソニアジド、ストレプトマイシンおよび（フルオロ）キノロンに対する耐性を生じさせる変異を有するｒｐｏＢ、ｋａｔＧ、ｉｎｈＡ、１６Ｓ  ｒＲＮＡ、ｒｐｓＬおよびジャイレース遺伝子をいう。
本発明の好ましい具体例によれば、同一のハイブリダイゼーションおよび洗浄条件に用いた場合に所望の結果を示すように慎重に設計されたプローブのセットを用いて工程（iii）を行う。
より詳細には、本発明は、生物学的試料に存在するエム・ツベルクローシスのリファンピシン（および／またはリファブチン）耐性の検出方法であって、下記工程：
（ｉ）必要ならば、試料中に存在するポリ核酸を遊離、単離、あるいは濃縮し；
（ii）必要ならば、少なくとも１つの適当なプライマーのペアーを用いて該ポリ核酸に存在するｒｐｏＢ遺伝子の重要部分を増幅し；
（iii）適当なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で、工程（i）または（ii）のポリ核酸を、ｒｐｏＢ野生型プローブの選択されたセットであって下記プローブ（表２参照）：
0004558105.tif 000003
のうち少なくとも１つからなるセットとハイブリダイゼーションさせ；
（iv）工程（iii）で得られたハイブリッドを検出し；
（v）工程（iv）で得られた異なるハイブリダイゼーションシグナルから試料に存在するエム・ツベルクローシスのリファンピシン感応性（耐性対感受性）を推定する
からなる方法を提供する。
用語「感応性」は、インビトロ培養法により決定される、薬剤、より詳細には、リファンピシン（および／またはリファブチン）に対する耐性または感受性のいずれかであるエム・ツベルクローシス株の表現型の特性をいう。リファンピシン耐性は、Ｓ−プローブの少なくとも１つとハイブリダイゼーションしないことによって示される。
標準的なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、例えば、３ＸＳＳＣ（セイライン、クエン酸ナトリウム）、２０％脱イオンＦＡ（ホルマリン）、５０℃である。他の溶液（ＳＳＰＥ（セイライン、リン酸ナトリウム、ＥＤＴＡ）、ＴＭＡＣｌ（テトラメチルアンモニウムクロリド））および温度を用いることもできるが、プローブの特異性および感度が維持されることが条件である。必要ならば、長さまたは配列についてプローブをわずかに変更して、与えられた環境で必要とされる特異性および感度を維持しなければならない。本発明プローブを用い、１．４ＸＳＳＣ、０．０７％ＳＤＳ、６２℃に条件を変更することにより、標準的条件で得られるハイブリダイゼーション結果と同じハイブリダイゼーション結果が得られ、プローブの配列または長さを適合させる必要はない。
下記プライマーペアーのリストから適当なプライマーペアーを選択することができる。
より好ましい具体例において、上記工程（i）または（ii）からのポリ核酸を、一緒になってｒｐｏＢ遺伝子の「変異領域」をカバーする少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１７種の上記Ｓ−プローブ、好ましくは５または６種のＳ−プローブとハイブリダイゼーションさせる。
用語「変異領域」は、すべてではないとしても、リファンピシン耐性の原因となる大部分の変異が存在しているｒｐｏＢ遺伝子配列中の領域を意味する。この変異領域を図１に示す。
より好ましい具体例において、上記工程（i）または（ii）からのポリ核酸を、ｒｐｏＢ野生型プローブの選択されたセットであって、下記プローブ（表２参照）：
0004558105.tif 000004
のうち少なくとも１種、好ましくはすべてからなるセットとハイブリダイゼーションさせる。
もう１つの特別な具体例において、上記Ｓ−プローブのセットまたはそれらのうちの少なくとも１種を、ＳＩＬ−プローブのうちの１種またはそれ以上と組み合わせて、ｒｐｏＢ遺伝子中のサイレント変異を検出することができる。好ましいＳＩＬ−プローブはＳＩＬ−１（配列番号：１３、表２参照）である。
本発明のもう１つの具体例において、Ｓ−プローブおよびできればＳＩＬ−プローブのセットを、少なくとも１種のＲ−プローブと組み合わせて、リファンピシリン耐性に関連した特異的変異を検出することができる。
Ｒ−プローブを下記プローブ群（表２参照）：
0004558105.tif 000005
から選択する。
好ましくは、Ｓ−プローブおよびできればＳＩＬ−プローブのセットを、少なくとも２、３、４、５、６、またはそれ以上のＲ−プローブと組み合わせることができる。
より好ましくは、Ｓ−プローブおよびできればＳＩＬ−プローブのセットを、下記の限定されたプローブ群：
0004558105.tif 000006
からの少なくとも１種のＲ−プローブと組み合わせる。
ＳおよびＲプローブを組み合わせる場合、Ｓプローブの１種とハイブリダイゼーションしないことによって、およびできれば対応Ｒ−プローブとの陽性ハイブリダイゼーションシグナルによってリファンピシン耐性が示される。
例えば、特定の位置の領域（例えば、表５参照）において、あるいは特異的な環境（例えば、やや近接したコミュニティー）において、いくつかの変異は他の変異よりも頻発するので、Ｓおよび／またはＲプローブの選択されたセットを用いて特異的な変異についてのみスクリーニングすることが適当であるかもしれない。このことにより、より単純な試験を行うことができ、該試験は一定の環境下での必要性を満たすであろう。Telentiら、（１９９３年ａおよびｂ）によれば、彼の刊行物に記載された大部分の変異は比較的まれ（３％またはそれ未満）なものであり、主な変異はＳ５３１Ｌ（５１．６％）、Ｈ５２６Ｙ（１２．５％）、Ｄ５１６Ｖ（９．４％）およびＨ５２６Ｄ（７．８％）である。
本発明の特別な具体例において、２種または３種のＳ−プローブの選択されたセットを用いる。プローブのそれぞれのセットは：
0004558105.tif 000007
あるいは
0004558105.tif 000008
である。
この限定されたＳ−プローブのセットを用いて、これらのプローブの少なくとも１種とのハイブリダイゼーションシグナルが存在しないことによって、大部分のリファンピシン耐性の場合を検出することができる。
本発明のもう１つの具体例において、少なくとも１種のＲプローブを用いるが、できれば２種または３種のＳプローブの選択されたセットとともに用いる。Ｒプローブは下記プローブのリスト：
0004558105.tif 000009
から選択される。
この場合、Ｒ−プローブの１種との陽性ハイブリダイゼーションシグナルおよび／または対応Ｓ−プローブとのハイブリダイゼーションの不存在から、リファンピシン耐性表現型の原因となっている特異的変異を推定することができる。
本発明のもう１つの具体例において、上記Ｓ、ＳＩＬまたはＲプローブを、エム・ツベルクローシスに関する少なくとも１つの種特異的プローブと組み合わせて、ミコバクテリウム・ツベルクローシスの同定とリファンピシン耐性の検出を同時に行ってもよく、該種特異的プローブは以下のプローブ群（表２参照）：
0004558105.tif 000010
から選択される。
最も好ましくは、種特異的エム・ツベルクローシスのプローブは：
0004558105.tif 000011
である。
本発明のさらにもう１つの具体例において、上記Ｓ、ＳＩＬ、ＲまたはＭＴ−ＰＯＬプローブを、それぞれ、ＭＰ−ＰＯＬ−１（配列番号：２８）、ＭＡ−ＰＯＬ−１（配列番号：２９）、ＭＳ−ＰＯＬ−１（配列番号：３８）、ＭＫ−ＰＯＬ−１（配列番号：５５）、ＭＩ−ＰＯＬ−１（配列番号：６８）およびＭＬ−ＰＯＬ−１（配列番号：５７）（表２Ｂ参照）である、エム・パラツベルクローシス（M.paratuberculosis）、エム・アビウム（M.avium）、エム・スクロフラセウム（M.scrophlaceum）、エム・カンサイイ（M.kansaii）、エム・イントラセルラレ（M.intracellulare）（およびＭＡＣ−株）またはエム・レプラエ（M.leprae）に対する少なくとも１つの種特異的プローブ、または図５、６、７、８ならびに１１に示すエム・パラツベルクローシス（配列番号：３５）、エム・アビウム（配列番号：３６）、エム・スクロフラセウム（配列番号：３７）、エム・カンサイイ（配列番号：５６）もしくはＭＡＣ−株（配列番号：６９）のｒｐｏＢ遺伝子の重要部分の配列に由来するいずれかの種特異的プローブと組み合わせることができる。図５〜８および１１に示す配列は新規であることに注意すべきである。エム・イントラセルラレおよびエム・レプラエのｒｐｏＢ遺伝子フラグメントの配列は、他人（Guerreroら、１９９４年；HonoreおよびCole、１９９３年）によって記載されている。
用語「ＭＡＣ−株」は、ミコバクテリア分類学の当業者に知られた「エム・アビウム複合」株を意味する。しかしながら、このどちらかといえば異成分からなるＭＡＣ−株の群は、遺伝子型的にはエム・イントラセルラレ類似の株からなっている。また、このことは、単離体ＩＴＧ９２６の場合にもあてはまり、そのｒｐｏＢ配列を図１１に示す。それゆえ、配列番号：６９由来のＭＬ−ＰＯＬ−１プローブおよび公表されているエム・イントラセルラレのｒｐｏＢ配列は、エム・イントラセルラレおよびいくつかのＭＡＣ株に対して同時に特異的である。
種特異的プローブを包含する上記プローブのすべてはｒｐｏＢ遺伝子配列、より詳細には増幅されたｒｐｏＢ遺伝子フラグメント配列に含まれることを強調すべきである。そのうえ、さらに実施例にて説明するように、上記プローブを「好ましいもの」として設計して、同一のハイブリダイゼーションおよび洗浄条件においてそれらがすべて同時に使用できるようにする。これら２つの判断基準は、単一の増幅およびハイブリダイゼーション工程は、リファンピシン耐性の検出および含まれているミコバクテリウム種の同定について十分なものであることを意味する。
好ましい具体例において、一例として、エム・ツベルクローシスおよびそのリファンピシン耐性を検出するための方法であって、下記工程：
（i）必要ならば、試料中に存在するポリ核酸を遊離、単離または濃縮し；
（ii）必要ならば、少なくとも１つの適当なプライマーのペアーを用いてｒｐｏＢ遺伝子の重要部分を増幅し；
（iii）適当なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で、工程（i）または（ii）のポリ核酸を下記プローブ：
ＭＴ−ＰＯＬ−１
Ｓ１１
Ｓ２
Ｓ３３
Ｓ４４４４
Ｓ５５またはＳ５５５５
Ｒ２
Ｒ４４４Ａ
Ｒ４４４Ｂ
Ｒ５５
のセットとハイブリダイゼーションさせ；
（iv）工程（iii）で得られたハイブリッドを検出し；
（v）工程（iv）で得られた異なるハイブリダイゼーションシグナルから、エム・ツベルクローシスの存在およびそのリファンピシンに対する感受性を推定する
からなる方法が開示される。
ミコバクテリウムの生物および／またはそれらの耐性パターンをオリゴヌクレオチドプローブの選択されたセットを用いて検出するためには、当該分野で知られたすべてのハイブリダイゼーション法を用いることができる（慣用的なドットブロット、サザンブロット、サンドイッチ等）。
しかしながら、多数のプローブが関与している場合に迅速かつ簡単な結果を得るためには、逆ハイブリダイゼーションフォーマットが最も便利であるかもしれない。
好ましい具体例において、プローブの選択されたセットを固体支持体上に固定化する。もう１つの好ましい具体例において、プローブの選択されたセットを膜片に線状に固定化する。該プローブを固体支持体上に別々に固定化してもよく、あるいは線形でない位置に混合物として固定化してもよい。
上記好ましい方法の特別かつ使用者に好意的な具体例はＬｉＰＡ法であり、上記プローブのセットは、さらに実施例で説明するように膜上に平行線状に固定化される。
上記Ｒ−プローブは、すでに先行技術（Telentiら、１９９３年ａおよび１９９３年ｂ）において記載されている変異を検出する。しかしながら、さらに実施例において説明するように、他人によってまだ記載されていない、エム・ツベルクローシスにおけるリファンピシン耐性に関連した４つの新たな変異が本発明により開示される。本発明Ｓ−プローブを用いて、新たな変異ならびに当該分野ですでに記載されている変異を検出することができる。ｒｐｏＢ遺伝子における完全な変異領域をカバーするＳ−プローブのセットを用いるというユニークな考えは、すべてではないにしてもリファンピシン耐性の原因となっているｒｐｏＢ遺伝子における大部分の変異を検出することを可能にし、さらに現在まで記載されていなかった変異でさえも検出可能とする。
４種の新たなｒｐｏＢ変異（Ｄ５１６Ｇ、Ｈ５２６Ｃ、Ｈ５２６ＴおよびＲ５２９Ｑ）を表１においてアステリスクでマークしてある。一例として、ｒｐｏＢ変異体対立遺伝子Ｈ５２６Ｃの配列を図２（配列番号：３４）に示す。
また、本発明は、これらの新たなｒｐｏＢ変異を特異的に検出し、あるいは特異的に増幅するように設計されたプローブまたはプライマーセット、および該プライマーセットまたはプローブを用いる方法またはキットを提供する。
もう１つの具体例において、さらに本発明は、生物学的試料に存在するエム・レプラエのリファンピシン（および／またはリファブチン）耐性の検出方法であって、下記工程：
（i）必要ならば、試料中に存在するポリ核酸を遊離、単離または濃縮し；
（ii）必要ならば、少なくとも１つの適当なプライマーのペアーを用いてｒｐｏＢ遺伝子の重要部分を増幅し；
（iii）適当なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で、工程（i）または（ii）のポリ核酸をｒｐｏＢ野生型プローブの選択されたセットであって下記プローブ（表２参照）：
0004558105.tif 000012
のうちの少なくとも１つからなるセットとハイブリダイゼーションさせ；
（iv）工程（iii）で得られたハイブリッドを検出し；
（v）工程（iv）で得られた異なるハイブリダイゼーションシグナルから、試料中に存在するエム・レプラエのリファンピシン感受性（耐性とは逆の感受性）を推定する
からなる方法を提供する。
少なくとも１種のＭＬ−Ｓ−プローブとハイブリダイゼーションしないことにより、リファンピシン耐性が示される。
本発明のもう１つの具体例において、上記ＭＬ−Ｓプローブを、エム・レプラエに対する種特異的プローブＭＬ−ＰＯＬ−１と組み合わせて、エム・レプラエの同定とリファンピシン耐性の検出を同時に行ってもよい。該種特異的プローブを配列番号：５７に示す。
上記ＭＬ−ＳプローブおよびＭＬ−ＰＯＬ−１プローブはすべて、エム・レプラエの増幅された同一のｒｐｏＢ遺伝子フラグメント中に含まれており、同一のハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で使用できるように設計されたものである。
さらに本発明は、上記プローブのいずれか、ならびにこれらのプローブの少なくとも１つからなる組成物を提供する。
また、本発明は、エム・ツベルクローシスのｒｐｏＢ遺伝子の変異領域の増幅を可能にするプライマーのセットを提供する。プライマーのセットを下記のセットの群：
0004558105.tif 000013
（Ｐ１およびＰ５）もしくは（Ｐ３およびＰ４）もしくは（Ｐ７およびＰ８）と組み合わされたＰ２およびＰ６
から選択することができる。
もっとも好ましくは、プライマーのセットは以下のものである：
0004558105.tif 000014
さらに本発明は、一般的にマイコバクテリアにおける、すなわち、少なくともエム・ツベルクローシス、エム・アビウム、エム・パラツベルクローシス、エム・イントラセルラレ・エム・レプラエ、エム・スクロフラセウムにおけるｒｐｏＢ遺伝子の変異領域の増幅を可能にするプライマーのセットを提供する。例えば、エム・ツベルクローシス以外のミコバクテリアの存在が疑わしい試料、およびより一般的な検出方法を有することが望ましい場合に、これらの一般的プライマーを用いることができる。プライマーのセットは、下記セット：
0004558105.tif 000015
から選択される５’−プライマー、および下記セット：
0004558105.tif 000016
から選択される３’−プライマーからなる。
これらのプライマーの配列を表２Ｂに示す。
プライマーを選択された標識（例えば、ビオチン）で標識してもよい。プライマーに基づく標的増幅系、好ましくは、実施例に示すＰＣＲ増幅を用いてもよい。単一ラウンドまたはネスティッドＰＣＲ（nested PCR）を用いてもよい。
また、本発明は、可能には含まれているミコバクテリア種の同定と連動して、生物学的試料に存在するミコバクテリアの抗生物質耐性スペクトルを推定するためのキットであって、下記成分：
（i）適当な場合には、試料中に存在するポリ核酸を遊離、単離または濃縮するための手段；
（ii）適当な場合には、少なくとも１つの上記プライマーのセット；
（iii）可能には固体支持体に固定されている少なくとも１つの上記プローブ、
（iv）ハイブリダイゼーションバッファー、または該バッファーを製造するのに必要な成分；
（v）洗浄溶液、または該溶液を製造するのに必要な成分；
（vi）適当な場合には、上記ハイブリダイゼーションから得られたハイブリッドを検出する手段
からなるキットを提供する。
用語「ハイブリダイゼーションバッファー」は、プローブと試料中に存在するポリ核酸との間、または適当な厳密な条件下で増幅された生成物との間でハイブリダイゼーション反応が起こることを可能にするバッファーを意味する。
用語「洗浄溶液」は、適当な厳密な条件下で形成されるハイブリッドの洗浄を可能にする溶液を意味する。
より詳細には、本発明は、エム・ツベルクローシスおよびそのリファンピシン耐性を同時に検出するための上記キットを提供する。
もう１つの特別な場合において、本発明は、エム・レプラエおよびそのリファンピシン耐性を同時に検出するための上記キットを提供する。
表の説明
表１は、リファンピシン耐性エム・ツベルクローシス単離体のｒｐｏＢ遺伝子フラグメントにおけるヌクレオチドおよびアミノ酸の変化（Telentiら（１９９３年ａおよびｂ）、Kapurら１９９４年、および本発明により記載されている）をまとめたものである。図１と同様にコドンに番号を付す。本発明による新たな変異をアステリスク（＊）で示す。
表２は、ｒｐｏＢ遺伝子から選択されるプライマーおよびプローブの配列を掲載する。
２Ａ：エム・ツベルクローシス
２Ｂ：他のミコバクテリウム種
表３は、プローブＭＴ−ＰＯＬ−１と異なるミコバクテリウム種ならびに非ミコバクテリウム種由来のＤＮＡとで得られたハイブリダイゼーション結果を示す。
表４は、配列決定されたいくつかのエム・ツベルクローシス単離体についてＬｉＰＡを用いて得られたいくつかの代表的な結果、および異なるＬｉＰＡパターンの解釈を示す。
表５は、異なる地域のエム・ツベルクローシスにおける異なるｒｐｏＢ変異の発生を示す。略号：Ｂｅｌ＝ベルギー、Ｂｅｎｇｌａ＝バングラデシュ、Ｂｕｒ−Ｆａ＝ブルキナ・ファソ、Ｂｕｒｕ＝ブルンジ、Ｃａｎ＝カナダ、Ｃｈｉ＝チリ、Ｃｏｌ＝コロンビア、Ｅｇｙ＝エジプト、Ｇｕｉ＝ギアナ、Ｈｏｎ＝ホンジュラス、Ｐａｋ＝パキスタン、Ｒｗａ＝ルワンダ、Ｔｎｕ＝チュニジア。
表６は、エム・ツベルクローシスに関する培養におけるリファンピシン耐性の決定とＬｉＰＡの結果との比較を示す。Ｓ＝感受性、Ｒ＝耐性。
図面の説明
図１は、それぞれ、ｒｐｏＢ遺伝子および野生型（すなわち、耐性でない）ミコバクテリウム・ツベルクローシス株（ＩＴＧ９０８１）のＲＮＡポリメラーゼのβ−サブユニットの変異領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。コドン（アミノ酸）番号はTelentiら（１９９３年ａ）と同じである。耐性誘導変化に関与しているヌクレオチドまたはアミノ酸に下線を付す。観察された変異をボックスに入れてある。横向きのバーはいくつかのオリゴヌクレオチドプローブの位置を示す（１つのグループにつき１つのプローブを示す）。
図２は、新たに記載されたエム・ツベルクローシス株ＩＴＧ９００３のｒｐｏＢ変異体対立遺伝子の部分ヌクレオチド配列（配列番号：３４）を示す。
図３は、異なる濃度で膜片に適用されたプローブＳ４４およびＳ４４４４を用いてＬｉＰＡ片上に得られた結果を示す。標的物質として、エム・ツベルクローシス株ＩＴＧ８８７２およびＩＴＧ９０８１の核酸標品を用いた。
図４は、ラインプローブアッセイ配置（Line probe assay conformation）でのプローブＳ４４およびＳ４４４４の品質を比較したものである。片ＡおよびＢ上のプローブは、Ｓ４４およびＳ４４４４を除いては同じである。エム・ツベルクローシス株ＩＴＧ８８７２由来の増幅材料を用いてハイブリダイゼーションを行った。
図５は、エム・パラツベルクローシス株３１６Ｆの推定ｒｐｏＢ遺伝子の部分ヌクレオチド配列（配列番号：３５）を示す。
図６は、エム・アビウム株ＩＴＧ５８８７の推定ｒｐｏＢ遺伝子の部分ヌクレオチド配列（配列番号：３６）を示す。
図７は、エム・スクロフラセウム株ＩＴＧ４９７９の推定ｒｐｏＢ遺伝子の部分ヌクレオチド配列（配列番号：３７）を示す。
図８は、エム・カンサイイ株ＩＴＧ４９８７の推定ｒｐｏＢ遺伝子の部分ヌクレオチド配列（配列番号：５６）を示す。
図９は、エム・ツベルクローシスにおけるいくつかのｒｐｏＢの変異およびそれらの対応するＬｉＰＡパターンを示す。変異の命名法は表１と同じ。ＬｉＰＡパターンの命名法は以下のとおり：
ｗｔ＝すべてのＳ−プローブとハイブリダイゼーション陽性であり、すべてのＲ−プローブとハイブリダイゼーション陰性；
ΔＳ１−５＝それぞれのＳ−プローブとハイブリダイゼーションせず；
Ｒ２、４Ａ、４Ｂ、５＝それぞれのＲ−プローブとハイブリダイゼーション陽性であり、対応するＳ−プローブとハイブリダイゼーションしない；
Ｃ＝陽性対照線：試験を正しく行う場合に陽性となるべきもの；
Ｍｔｂ＝ＭＴ−ＰＯＬ−プローブ；
各群の１個のプローブのみを述べるが、それは全群を表す：例えば、Ｓ５は、Ｓ５、Ｓ５５、Ｓ５５５、Ｓ５５５５、Ｓ５５Ｃ、Ｓ５５Ｍを表す。
図１０は、ＬｉＰＡにより分析されたリファンピシン耐性エム・ツベルクローシス株において出現した異なる変異の頻度を示す。命名法は図９と同じ。
「Ｍｉｘ」は、株の混合物が試料中に存在したことを意味する。「Ｄｏｕｂｌｅ」は、１つの株に２つの変異が存在することを意味する。
図１１は、ＭＡＣ株ＩＴＧ９２６の推定ｒｐｏＢ遺伝子の部分ヌクレオチド配列（配列番号：６９）を示す。
実施例１：エム・ツベルクローシスにおけるｒｐｏＢ遺伝子フラグメントの増幅
ミコバクテリウム単離体（培養または体液もしくは組織中のもの）から核酸抽出後、２μｌの抽出物を用い、５’−プライマー（Ｐ１（配列番号：３０）、Ｐ２、Ｐ３（配列番号：３１）およびＰ７（配列番号：４１））と３’−プライマー（Ｐ４（配列番号：３２）、Ｐ５（配列番号：３３）、Ｐ６およびＰ８（配列番号：４２））との１またはそれ以上の組み合わせを用いることによりｒｐｏＢ遺伝子の重要部分を増幅した。
これらのプライマーの配列は表２に示されており、Ｐ１、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５、Ｐ７およびＰ８は本発明により記載される新たなプライマー配列であり、Ｐ２およびＰ６は以前に記載されている（Telentiら、１９９３年ａ）。
これらのプライマーを選択した標識（例えば、ビオチン）で標識してもよい。異なるプライマーに基づく標的増幅系を用いてもよい。ＰＣＲを用いる増幅には、以下に記載する条件を用いる。プライマーＰ１およびＰ５単一ラウンドの増幅は、４５秒／９４℃、４５秒／５８℃、４５秒／７２℃の３５サイクルを包含していた。ネスティッドＰＣＲ（nested PCR）が好ましい場合には、第２ラウンドにおいてプライマーＰ３およびＰ４を用い、１μｌの第１ラウンド生成物から、２５サイクル（４５秒／９４℃、６０秒／６８℃）を行った。
Ｐ３およびＰ４を単一ラウンドのＰＣＲに用いる場合には、下記サイクリングプロトコールを用いた：１分／９５℃、１分／５５℃、１分／７２℃を３０サイクル。同じサイクリングプロトコールをプライマーのセットＰ２／Ｐ６に用いた。
通常には、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、２．２ｍＭ  ＭｇＣｌ2、２００μｌの各ｄＮＴＰ、０．０１％ゼラチンおよび１ＵのＴａｑポリメラーゼを含有する全体積５０μｌ中でＰＣＲを行った。
プライマー濃度は１０ないし２５ｐｍｏｌ／反応の範囲であった。
プライマーＰ３／Ｐ４のセットはハイブリダイゼーション後にＰ２／Ｐ６のプライマーセットよりも有意に強いシグナルを生じたので、当該第１のプライマーセットを以後すべてのハイブリダイゼーション実験に使用した。プライマーＰ２／Ｐ６のセットを配列分析に使用した。Ｐ２およびＰ６を外側のプアイマーとして用いＰ３およびＰ４内側の（ビオチン化）セットとして用いるネスティッドＰＣＲを、臨床試料（喀出物および生検材料）における直接検出に用いた。
アガロースゲル電気泳動によりモニターされる増幅生成物の長さは下記のごとし：
プライマーセットＰ１／Ｐ５：３７９塩基対
プライマーセットＰ３／Ｐ４：２５７塩基対
プライマーセットＰ２／Ｐ６：４１１塩基対
プライマーセットＰ７／Ｐ８：３３９塩基対
実施例２：エム・ツベルクローシス株由来のｒｐｏＢ遺伝子フラグメントの配列決定
リファンピシン耐性または感受性であることが知られているミコバクテリウム単離体から抽出したＤＮＡを、プライマーＰ２／Ｐ６のセット（そのうちＰ６は５’末端がビオチン化されていた）を用いて増幅した。ストレプトアビジン被覆ビーズおよびTaq Dye Deoxy Terminator/Cycle Sequencingキットを用いてＡＢＩ３７３Ａ  ＤＮＡシークエンサー（Applied Biosystems,Foster City,CA,USA）により製造者が推奨したようにして１本鎖ＰＣＲ生成物の直接配列決定を行った。配列決定に用いたプライマーは、増幅に用いたもの（Ｐ２またはＰ６）以外の同じものであった。
予想したように、配列決定されたすべての感受性（＝培養において感受性であり、感受性のＬｉＰＡパターンを示す）株（７株）は野生型配列（変異せず）を生じた。大部分の耐性株において、変異を確認することができた。これらの変異の大部分は以前記載されていたものであった（Telentiら、１９９３年ａ、１９９３年ｂ、Kapurら、１９９４年）。しかしながら、４つの新たな変異が本発明に記載されている：Ｄ５１６Ｇ、Ｈ５２６Ｃ、Ｈ５２６ＴおよびＲ５２９Ｑ（表１の（＊）参照）。対立遺伝子変異体Ｈ５２６Ｃ（単離体ＩＴＧ９００３）の増幅されたｒｐｏＢフラグメントの全配列を図２（配列番号：３４）に一例として示す。
少数の株（１８０株中３株、表６参照）は、培養においてはリファンピシン耐性であったが、野生型ＬｉＰＡパターンを示した。配列決定後、これらの単離体はすべて野生型ｒｐｏＢ遺伝子配列を示し、ハイブリダイゼーションの結果が確認された。それゆえ、これらの単離体についてはリファンピシン耐性についての別の分子機構を適用することができる。
実施例３：ライン・プローブ・アッセイ（LiPA）片の開発
ライン・プローブ・アッセイの原理およびプロトコールは、少数の例外はあるが似前に記載されている（Stuyverら、１９９３年）。ビオチン化ｄＵＴＰを組み入れるかわりに、ビオチン化プライマーを用い、ハイブリダイゼーションおよび厳密な洗浄を５０℃において３ｘＳＳＣ／２０％脱イオンホルムアミド中で行った。
リファンピシン耐性を生じるｒｐｏＢ遺伝子における変異は、主に、６７個のヌクレオチド（２３個のアミノ酸のコドン）にわたる小さな領域に位置している。この領域に均等に散在している少なくとも１７個のヌクレオチドが少なくとも２８個のアミノ酸の変化を生じる変異に関与している。かかるヌクレオチド変化の複雑性は、単一のハイブリダイゼーション工程におけるこれらすべてのの変化の検出についての問題を提起する。原理的には、１つの変異部位につき１つの野生型プローブが必要であり、１つのヌクレオチド変化につき特定の変異を特異的に検出する１つの変異プローブが必要となろう。それゆえ、ハイブリダイゼーション試験には約３５種の配列特異的オリゴヌクレオチドが必要であり、この試験の製造および使用を複雑にし、結果的にこの試験を商業的により魅力のないものとする。
それゆえ、１つ以上の多型性部位にまたがっており、重要な完全領域（図１参照）と重複している野生型（Ｓ−）プローブを注意深く選択することにより、特別なアプローチを開発した。そのようにすることにより、少なくとも１０種の野生型プローブのセットを全部で５種または６種のプローブに減らすことができた。これらのプローブを実験的に慎重に調節して、ｒｐｏＢ変異領域における耐性の原因となる各変異の存在が、同じハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下における標的とこれらのプローブの少なくとも１つとの間における明確に検出可能なハイブリッド安定性の低下を生じるようにした。
このプローブの組み合わせを用いて記載されたすべての重要な変異を検出できるので、リファンピシン耐性をミコバクテリウム・ツベルクローシス単離体においてモニターすることができる。このプローブのセットは所望でない変異、例えば、ＩＴＧ９００３株における位置５２６におけるＴＧＣの変異の存在を検出することができる。
野生型プローブの選択パネルに対する変異（Ｒ−）プローブの添加は厳密に見ると時代遅れであるが、科学的な目的には、正確な点突然変異の存在を検出することは有益であるかもしれない。それゆえ、最も頻繁に起こる変異に対応しており、一緒になってすべての変異の場合の７０％以上を明確に同定することのできる４つの変異プローブ（Ｒ２、Ｒ４Ａ、Ｒ４Ｂ、Ｒ５）を設計した（図１０参照）。さらなる変異プローブ（例えば、Ｒ１、Ｒ２Ｂ、Ｒ２Ｃ、Ｒ３、Ｒ４Ｃ、Ｒ４Ｄ、Ｒ４Ｅ、Ｒ５Ｂ、Ｒ５Ｃ）をこの４つのプローブのセットに付加して大部分の臨床的に重要な耐性のケースを明確に同定することができる。混合感染を取り扱うものでない場合には変異プローブの出現は不可避的に野生型プローブの消失を引き起こすので、これらのプローブの付加はアッセイの信頼性をも付加する。いくつかの場合、存在可能な異なる変異の間を識別することは臨床的に重要であるかもしれない。例えば、位置５１６のアミノ酸において、この状況が生じるかもしれない。その位置において正常（野生型）アミノ酸（アスパラギン酸）が存在するならば、バリンまたはチロシンへの変化、すなわち、リファンピシンに対する高レベルの耐性または中レベルの耐性が誘導される。しかしながら、公表されていないデータは、リファブチンに対する感受性が維持されることを示すようである。それゆえ、この変異を有する株による感染については、リファンピシンが有効でない場合にリファブチンがなお有効であろう。同じことがコドン５１１にも言えるかもしれないが、われわれの知識では、これらはリファンピシンとリファブチンの効果が異なりうる唯一の変異部位であり、通常は、リファンピシン耐性株はリファブチンにも耐性である。
ＬｉＰＡ片を開発してエム・ツベクローシスにおけるリファンピシン（および／またはリファブチン）耐性を生じる変異の存在を検出するために、全部で３６種のオリゴヌクレオチドプローブを合成し、逆ハイブリダイゼーション試験において評価した。これらのプローブの配列を表２Ａ（野生型および変異プローブ）に示す。試験した第１のプローブのセットは：Ｓ１１、Ｓ３３、Ｓ４４、Ｓ４４４４、Ｓ５５５５、Ｒ４４Ａ、Ｒ４４４Ａ、Ｒ４４Ｂ、Ｒ４４４Ｂ、Ｒ５５であった。プローブの全パネルから、同じ実験条件下で特異性および感度に関して最適の特徴を示すプローブを、さらなる使用のために選択した。
一緒になって対象とする全ｒｐｏＢ領域を覆う野生型配列を有する好ましいプローブは：Ｓ１１、Ｓ２、Ｓ３３、Ｓ４４４４およびＳ５５またはＳ５５５５（表２参照）である。これらのＳ−プローブのいずれかとのハイブリダイゼーションシグナルの消失により耐性が検出されるであろう。
好ましい変異プローブ（Ｒ−プローブ）は：Ｒ２、Ｒ４４４Ａ、Ｒ４４４ＢおよびＲ５５（表２参照）である。いくつかの耐性の場合、Ｓ−プローブとのハイブリダイゼーションシグナルの消失に対応するＲ−プローブとの陽性ハイブリダイゼーションシグナルが伴うことがありうる。
一例として、いくつかのｒｐｏＢ変異およびそれらの対応ＬｉＰＡパターンを図９に示す。
同じグループからのプローブ（例えば、Ｓ４、Ｓ４４、Ｓ４４４およびＳ４４４４）は互いにわずかに異なるだけであるが、それらのハイブリダイゼーション特性はかなり異なる。一例として、プローブＳ４４およびＳ４４４４の標的領域における野生型配列をともに示す２種のエム・ツベルクローシス株（ＩＴＧ８８７２およびＩＴＧ９０８１）から得たＰＣＲ生成物を用いるプローブＳ４４およびＳ４４４４の品質を比較する実験において、このことが説明される。両プローブ間の相違を以下に示す：
0004558105.tif 000017
知られている遺伝子配列（Telentiら、１９９３年ａ）からの理論的基礎に基づいてプローブＳ４４を選択した。理論的には、このプローブは、ＣＡＣコドンにおけるミスマッチを識別するために最良のプローブであろう。なぜなら、このコドンはプローブの中央部分にあるからである。しかしながら、一般的法則とは対照的に、プローブＳ４４４４の品質が有意により良いものであることがわかった（下記実験において説明）。
異なる量（２．４、１．２および０．６ｐｍｏｌ／片）の両方のプローブをニトロセルロース片に適用した。片の固定およびブロッキング後、上記のごとくプローブをビオチン化ＰＣＲフラグメント（ＩＴＧ８８７２およびＩＴＧ９０８１株由来）とハイブリダイゼーションさせた。結果を図３に示す。
使用したハイブリダイゼーション条件下で（３ｘＳＳＣ、２０％脱イオンホルムアミド、５０℃）、プローブＳ４４を用いて得られたシグナルは非常に弱い。一方、プローブＳ４４４４は非常に強力で信頼できるシグナルを生じる。結果的に、ＬｉＰＡ片における使用については、プローブＳ４４４４がＳ４４よりも好ましい。この劇的な効果を両プローブの長さの違いのせいにすることはできないだけでなく、その位置も重要であるように思われる。最も可能性があることには、プローブの標的領域の２次構造がハイブリダイゼーション特性に非常に影響するのであろう。
図４において、もう１つの実験結果を示すが、該実験においては両プローブの品質が他のプローブとの関係において比較される。ＩＴＧ８８７２株から得られた増幅生成物を用いて両方の片ＡおよびＢを同様に処理する。片ＡがプローブＳ４４（０．６ｐｍｏｌ）を含み、片ＢがＳ４４４４（０．１ｐｍｏｌ）を含み、片に適用するプローブの順番が異なる以外は、両方の片はほとんど同じである。両方の場合に標的とプローブとの間には完璧な合致が存在し、両方の場合に陽性の結果が得られたであろうが、片ＡにおいてはプローブＳ４４は陰性であるり、片ＢにおいてはプローブＳ４４４４は明確に陽性である。
これらの結果は、特に、逆ハイブリダイゼーションフォーマットの固定条件におけるプローブの設計は単純でなく、プローブを逆ハイブリダイゼーションフォーマットに使用する前にプローブを慎重に評価しなくてはならないことを明確に示す。
一般的には、我々は、知られている遺伝子配列による理論的基礎に基づいて適当なプローブがいつも簡単に誘導されるとは限らないと述べることができる。
本発明において試験された単離体において検出されないとしても、サイレント変異の存在は、株が感受性であっても片上に耐性パターン（１の野生型プローブがない）を生じうる。現在まで、ただ１つのサイレント置換が記載されている（コドン５２８において、ＣＧＣ→ＣＧＴ：Telentiら、１９９３年ａ）。この変異はプローブＳ−４４４４とのハイブリッドの不安定化を生じるであろう。しかしながら、サイレント変異に特異的なプローブ（プローブＳＩＬ−１，表２）を片に添加することによって、このサイレント変異を変異を誘導する耐性から識別することができ、観察されたパターンの誤解が防止されるであろう。そのうえ、ＳＩＬ−プローブを、対応Ｓ−プローブ以外の同じ位置において片に適用することができる（混合プローブ）。そのようにすることにより、サイレント変異の結果としてハイブリダイゼーションシグナルの消失は観察されない。
リファンピシン耐性を付与する挿入変異である５１４ｉｎｓＦおよび５１４ｉｎｓＦＭ（図１参照）を検出するために、２つの新たな野生型プローブＳ６およびＳ６６（配列を表２に示す）を設計した。これらの挿入変異を有する株から得られた核酸とのハイブリダイゼーションにより、Ｓ６およびＳ６６とのハイブリダイゼーションシグナルが消失した（表１参照）。
Ｒ２、Ｒ４Ａ、Ｒ４ＢおよびＲ５のセットにより検出された変異よりも多くの変異を陽性として同定するために、同じハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で用いるＬｉＰＡ片に付加されうる多くのさらなるＲ−プローブを設計した。上記Ｒ−プローブと一緒になって、さらなるＲ−プローブ（Ｒ１、Ｒ２Ｂ、Ｒ２Ｃ、Ｒ３、Ｒ４Ｃ、Ｒ４Ｄ、Ｒ４Ｅ、Ｒ５Ｂ、Ｒ５Ｃ）は、本願において試験した株のコレクションに最も頻繁に出現する変異の陽性の同定を可能にする。
実施例４：エム・ツベルクローシス複合体に特異的なプローブ
エム・ツベルクローシスにおける病因の検出に直接連動した、リファンピシン耐性を引き起こす変異の同時検出を可能にするためにライン・プローブ・アッセイを開発した。
エム・ツベルクローシスの存在および薬剤耐性を引き起こす遺伝子または変異の存在または不存在を同時に検出できることは極めて有利であるので、目的は、同定されるべき重要な耐性マーカーの少なくとも１つと同じＰＣＲフラグメントに含まれているエム・ツベルクローシスのプローブを開発することであった。それゆえ、エム・ツベルクローシスでない単離体のｒｐｏＢ遺伝子を配列決定した。これらの生物は：エム・パラツベルクローシス３１６Ｆ、エム・アビウムＩＴＧ５８８７、エム・スクロフラセウムＩＴＧ４９７９およびエム・カンサイイＩＴＧ４９８７であった。対応ｒｐｏＢ遺伝子フラグメントの配列を図５から８にそれぞれ示す。さらに、エム・レプラエおよびエム・イントラセルラレのｒｐｏＢ遺伝子の配列は文献から知られていた
0004558105.tif 000018
これらの配列とエム・ツベルクローシスのｒｐｏＢ遺伝子との比較により、エム・ツベルクローシスに対して潜在的に特異的なプローブの開発が可能と思われるｒｐｏＢ遺伝子フラグメント中の特異的領域（耐性の原因となっている領域の外側）の輪郭を描くことが可能となった。下記配列：
0004558105.tif 000019
を有する当該領域由来のオリゴヌクレオチドプローブ（ＭＴ−ＰＯＬ−１という）を、ＬｉＰＡ片上でのハイブリダイゼーションにより、その感度および特異性についてさらに評価した。結果を表３にまとめる。表３に掲載した４種のエム・ツベルクローシスのほかに、５２１個のさらなるエム・ツベルクローシスの臨床単離体を試験した。すべての単離体は陽性のハイブリダイゼーションシグナルを生じた。明らかに、エム・ボビス（M.bovis）株も該プローブとハイブリダイゼーションしたが、この目的もためにエム・ツベルクローシスをエム・ボビスから識別することは臨床的に重要でない。実際、本願全体において、用語「エム・ツベルクローシス」を「エム・ツベルクローシス複合体」と置き換えることができ、結果の有意さに影響することなく、エム・ツベルクローシスｓ．ｓ、エム・ボビス、エム・アフリカヌム（M.africanum）およびエム・ミクロチ（M.microti）をいう。
実施例１に記載したプライマーのセットを用いて、いくつかの他のミコバクテリウム種および気道に存在しうる遺伝学的に関連のない微生物のＤＮＡとともにＰＣＲ生成物を得てもよいが、これらの細菌は選択されたＭＴ−ＰＯＬ−１プローブとハイブリダイゼーションを示さなかった。結論として、我々は、選択されたプローブはエム・ツベルクローシス複合体に非常に特異的であり、エム・ツベルクローシスに対して１００％感度があるといえる。ＭＴ−ＰＯＬ−２、ＭＴ−ＰＯＬ−３、ＭＴ−ＰＯＬ−４およびＭＴ−ＰＯＬ−５のごときこの領域由来の他のプローブ（表２参照）も、エム・ツベルクローシス複合体株の特異的検出に有用でありうる。
同様にして、以下のプローブ：ＭＡ−ＰＯＬ−１、ＭＰ−ＰＯＬ−１、ＭＳ−ＰＯＬ−１、ＭＫ−ＰＯＬ−１、ＭＩ−ＰＯＬ−１およびＭＬ−ＰＯＬ−１（表２Ｂ参照）をそれぞれ用いてエム・アビウム、エム・パラツベルクローシス、エム・スクロフラセウム、エム・カンサイイ、エム・イントラセルラレおよびエム・レプラエ株を互いに、そして他のミコバクテリアから識別することができる。
実施例５：エム・ツベルクローシスに関するＬｉＰＡ片の評価
以下のプローブ：ＭＴ−ＰＯＬ−１、Ｓ１１、Ｓ２、Ｓ３３、Ｓ４４４４、Ｓ５５５５、Ｒ２、Ｒ４４４Ａ、Ｒ４４４Ｂ、Ｒ５５を有するＬｉＰＡ片を調製した（陽性対照線のほかに）。
これらの片を、重要なｒｐｏＢ遺伝子配列が決定されたエム・ツベルクローシス株由来のＰＣＲ生成物とハイブリダイゼーションさせた。
いくつかの代表的な結果を表４にまとめる。
ハイブリダイゼーションの結果は配列決定の結果と完全に対応し、使用プローブは単一のミスマッチのレベルで識別可能であることが示される。野生型プローブ（Ｓ−プローブ）のうちの１つの不存在により、あるいは対応変異プローブ（Ｒ−プローブ）の存在を伴う野生型プローブに不存在により、スクリーニングされた各変異を検出することができた。後者の場合、存在する正確な変異はハイブリダイゼーション結果から得ることができる。しかしながら、スクリーニングされた各変異が耐性を付与するので、リファンピシン耐性株を取り扱うのか否かを決定するためには存在する正確な変異についての知識は必要ない。感受性株、すなわち、ｒｐｏＢ遺伝子の重要部分に変異を有していない株はすべてのＳ−プローブについて陽性の反応を示すが、すべてのＲ−プローブスコアは陰性である（＝ｗｔパターン）。
実施例６：臨床試料中のエム・ツベルクローシス株およびリファンピシン耐性の直接検出
エム・ツベルクローシスに関する培養においてすべて陽性であり、−２０℃に保存された、異なる地域から得た６８個の臨床試料（１３個および３５個の痰試料はそれぞれベルギーおよびルワンダから、２０個のリンパ節生検材料はブルンジから）を分析した。増幅のための試料の調製は、De Beenhouwerら（投稿中）により改変されたBoomら（１９９０年）の手順によった。ｒｐｏＢ遺伝子の重要領域に対するネスティッドＰＣＲ法を、ビオチン化内部プライマー（Ｐ３およびＰ４）を用いて行った。サーマルサイクリングの後、増幅された生成物をＬｉＰＡ片とともにインキュベーションした。Canettiら（１９６３年）の比例法を用いる
0004558105.tif 000020
に基づいてリファンピシン耐性を決定した。耐性株について、７Ｈ１０寒天（Heifets、１９８８年）上でリファンピシンのＭＩＣ（最小阻害濃度）を決定した。
顕微鏡により、Ziehl-Neeisen染色で、２０個（２９．４％）の試料が陰性であり、１５個（２２．１％）が弱い陽性（アメリカ胸部協会のスケールによれば＋１またはそれ未満）であり、３３個（４８．５％）が強い陽性（≧＋２）であった。
ＬｉＰＡにより、４９個の標本においてリファンピシン感受性が検出され（エム・ツベルクローシスのみ、および野生型プローブ陽性）、１９個の標本において耐性が検出された（エム・ツベルクローシスプローブ陽性、野生型プローブの１つが消失、結局は変異プローブの１つ陽性）。インビトロでのリファンピシン感受性試験により、３つの例外があったがこれらの結果が確認された。すべての感受性株については、感受性プローブのパターンが観察され、可能性のあるサイレント変異はこのシリーズにおいては検出されないことが示された。耐性パターンを示すすべての株は、慣用的方法により、耐性であることがわかった。３つの標本（ルワンダからの３人の多剤耐性患者由来のもの）については、ＰＣＲ−ＬｉＰＡにより感受性のパターンが観察されたが、培養により耐性が明らかとなった（７Ｈ１０上でＭＩＣ＞２μｇ／ｍｌ）。これらの株のｒｐｏＢ領域の配列決定により野生型遺伝子配列が確認され、おそらく、これらのケースにおいては別のリファンピシン耐性機構またはｒｐｏＢ遺伝子の別の部分における変異が示唆された。ネスティッドＰＣＲ系により、２０個のZiehl-Neeisen陰性標本を含む、培養における陽性試験標本すべてについて陽性の結果が生じたことも注目に値する。培養において陰性である臨床的に結核の疑いのあるケースから得られた１７個のあいまいに陰性の痰標本を包含する別の実験（データ示さず）においては、ＬｉＰＡ系では全くシグナルを得られず、最も可能性の高いことには感染がエム・ツベルクローシスによって引き起こされたものではないことが示された。
引き続いて行った実験において、異なる地域からの大規模な臨床標本のコレクションをＬｉＰＡにおいて試験した。結果を表５に示す。見いだされた１３７個の耐性株のうち、非常に大多数がＲ−プローブ（Ｒ２、Ｒ４Ａ、Ｒ４Ｂ、Ｒ５）により示される変異の１つによるものとすることができた。興味深いことに、いくつかの変異は、他の国と比較すると、いくつかの国においてより頻発するように思える（例えば、チュニジアおよびエジプトにおいてＲ４Ｂ（＝Ｈ５２６Ｄ）、ルワンダにおいてＲ５（Ｓ５３１Ｌ））。結局、このことは異なる国に関する異なる試験フォーマットにつながる。
本願においてＬｉＰＡにより分析された全部で２１３個のリファンピシン耐性株について、１５１個（７１％）が変異Ｓ５３１Ｌ、Ｈ５２６Ｄ、Ｄ５１６ＶまたはＨ５２６Ｙによるものとすることができ、よって、それぞれプローブＲ５、Ｒ４Ｂ、Ｒ２およびＲ４Ａとの陽性シグナルによって検出された（図１０参照）。
培養およびＬｉＰＡの両方により分析された全部で１８０株につき、正確な同定（感受性／耐性）を１６４株（＝９１．１％）において行った（表６参照）。３つの耐性株において、ＬｉＰＡの結果および配列決定により野生型ｒｐｏＢ遺伝子フラグメントが示され、そのことは、リファンピシン耐性に関する機構はｒｐｏＢ遺伝子の調べられた部分における変異によるものとすることができないということを示す。
分析された１８０株中３０株はＬｉＰＡにおいて耐性であったが、培養においては感受性であるように見えた。しかしながら、これら１３株のうちの２株は、伝統的な
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培地のかわりに合成７Ｈ１１培地で再培養後、とにかくリファンピシン耐性に変化した。いままで公表されていないこの知見は、慣用的な
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培地はミコバクテリアの抗生物質間受精の決定には推奨されないことを示す（おそらく、
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培地の調製に用いる市販の卵中の痕跡量の抗生物質の存在による）。それゆえ、培養を７Ｈ１１のような合成培地で行う場合には、ＬｉＰＡにおいては耐性であるが培養においては感受性である矛盾した株のパーセンテージ（この場合１３／１８０＝７．２％）はずっと低く、おそらく０％と予想できる。
興味深いことに、本願において試験された大部分のリファンピシン耐性単離体は、さらにイソニアジド耐性であり、よって多剤耐性であった（多剤耐性の定義＝少なくともイソニアジドおよびリファンピシンに耐性）。よって、リファンピシン耐性を多剤耐性の可能性のあるマーカーと考えることができ、それゆえ、上記ＬｉＰＡ試験は多剤耐性結核菌の対照のための重要な道具でありうる。
結論として、上記方法は、前培養を行わずに、臨床標本中における直接的なエム・ツベルクローシスの正しい同定およびリファンピシン耐性の同時検出を可能にするものである。該方法は、２４時間以内に、臨床標本中における直接的なリファンピシン耐性の容易な検出を可能にする。
実施例７：エム・レプラエにおけるリファンピシン耐性の検出
上記検出方法を、リファンピシン耐性の検出に連動した、生物学的試料に存在するエム・レプラエの検出にも適用することもできる。エム・レプラエのｒｐｏＢ遺伝子配列は、以前に
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およびCole（１９９３年）に記載されていた。それらは、エム・レプラエにおけるリファンピシン耐性の原因となる限られた数の変異が同定されただけであった。エム・ツベルクローシスと同様に、他の多くの変異がエム・レプラエにおけるリファンピシン耐性を引き起こしうるものであり、これらの変異の大部分が、むしろ、本願で先に述べた「変異領域」に対応したｒｐｏＢ遺伝子の限られた領域に局在化しているであろうと合理的に考えることができる。
それゆえ、エム・レプラエのｒｐｏＢ遺伝子における推定上の変異領域にまたがっている野生型プローブのセット：
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を選択する（表２Ｂ参照）。
これらのＭＬ−Ｓプローブの少なくとも１つとのハイブリダイゼーションの不存在によってリファンピシン耐性が示される。これらの変異配列がまだ特定されていないとしても、このＭＬ−Ｓプローブのセットは、この領域におけるリファンピシン耐性を引き起こす変異を検出するであろう。
上記ＭＬ−Ｓプローブを、それらすべてが同じハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で用いることのできるように、注意深く設計した。同じことが、ＭＬ−Ｓプローブが一緒になってエム・レプラエおよびリファンピシン耐性の同時検出を可能にすることのできる種特異的ＭＬ−ＰＯＬ−１プローブについてもいえる。
この実施例において述べたすべてのプローブはエム・レプラエの同じｒｐｏＢ遺伝子に含まれており、ＭＧＰＲＯ−１もしくはＭＧＰＲＯ−２（５’プライマー）およびＭＧＰＲＯ−３もしくはＭＧＰＲＯ−４（３’プライマー）から選択されるプライマーのセットを用いるＰＣＲにより得ることができる。
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文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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