(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）バチルス属菌株から得られるポリ−γ−グルタミン酸合成酵素複合体をコードする遺伝子であるｐｇｓＢＣＡ、ｐｇｓＣＡ及びｐｇｓＡからなる群から選択される少なくとも一種 の遺伝子及び、（ii）前記（i）の遺伝子の下流末端に連結されたヒト・パピローマウイルスの抗原タンパク質遺伝子を含むワクチン製造用ベクター。
【請求項２】
前記抗原タンパク質遺伝子はヒト・パピローマウイルスの カプシドＨＰＶ Ｌ１およびＨＰＶ Ｌ２からなる群より選択されるいずれか１つまたは２つの遺伝子であることを特徴とする、請求項１に記載のワクチン製造用ベクター。
【請求項３】
前記抗原タンパク質遺伝子はヒト・パピローマウイルスの 腫瘍誘発抗原タンパク質であるＨＰＶ Ｅ６およびＨＰＶ Ｅ７からなる群より選択されるいずれか１つまたは２つの遺伝子であることを特徴とする、請求項１に記載のワクチン製造用ベクター。
【請求項４】
前記ポリ−γ−グルタミン酸合成酵素複合体をコードする遺伝子ｐｇｓＡ を含むことを特徴とする、請求項１に記載のワクチン製造用ベクター。
【請求項５】
請求項１に記載のワクチン製造用ベクターにより形質転換 されたグラム陰性微生物。
【請求項６】
前記微生物は大腸菌、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ウシ型結核菌(Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ)および赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）からなる群より選択されることを特徴とする、請求項５に記載の微生物。
【請求項７】
請求項１に記載のワクチン製造用ベクターにより形質転換されたグラム陽性微生物。
【請求項８】
前記微生物はバチルス、ラクトバチルス、ラクトコッカ ス、スタフィロコッカス、リステリア、モノサイトゲネスおよびストレプトコッカスからなる群より選択されることを特徴とする、請求項７に記載の微生物。
【請求項９】
前記ヒト・パピローマウイルスの抗原タンパク質遺 伝子がＨＰＶ  Ｅ７抗原タンパク質の遺伝子であることを特徴とする請求項５又は請求項７記載の微生物であってＨＰＶ  Ｅ７抗原タンパク質が細胞表面に発現した微生物を有効成分として含む、ＨＰＶ  Ｅ７発現粘膜腫瘍の治療用または予防用ワクチンであって、前記ワクチンは経口用または食用として投与できること を特徴とするＨＰＶ  Ｅ７発現粘膜腫瘍の治療用または予防用ワクチン。
【請求項１０】
前記ヒト・パピローマウイルスの抗原タンパク質遺伝子がＨＰＶ  Ｅ７抗原タンパク質の遺伝子で あることを特徴とする請求項５又は請求項７記載の微生物であってＨＰＶ  Ｅ７抗原タンパク質が細胞表面に発現した微生物を有効成分として含む、ＨＰＶ  Ｅ７発現粘膜腫瘍の治療用または予防用ワクチンであって、前記ワクチンは皮下または腹腔に注射できることを 特徴とするＨＰＶ  Ｅ７発現粘膜腫瘍の治療用または予防用ワクチン。
【請求項１１】
前記バチルス属菌株から得られるポリ−γ−グルタミン酸合成酵素複合体をコードする遺伝子がｐｇｓＡ遺伝子であって、前記ヒト・パピローマウイルスの抗原タンパク質遺伝子がＨＰＶ Ｌ１抗原タンパク質の遺伝子であることを特徴とする請求項１記載のワクチン製 造用ベクター。
【請求項１２】
前記バチルス属菌株から得られるポリ−γ−グルタミン酸合成酵素複合体をコードする遺伝子がｐｇｓＢＣＡ遺伝子であって、前記ヒト・パピローマウイルスの抗原タンパク質遺伝子がＨＰＶ Ｅ７抗原タンパク質の遺伝子であることを特徴とする請求項１記載のワクチン製 造用ベクター。
【請求項１３】
請求項１１に記載のワクチン製造用ベクターにより形質転換された微生物。
【請求項１４】
請求項１２に記載のワクチン製造用ベクターにより形質転換された微生物。
【請求項１５】
前記微生物はラクトバチルス（Ｌａｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）またはサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）が宿主細胞として利用されていることを特徴とする請求項１３に記載の微生物。
【請求項１６】
前記微生物はラクトバチルス （Ｌａｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）またはサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）が宿主細胞として利用されていることを特徴とする請求項１４に記載の微生物。
【請求項１７】
請求項１１に記載のワクチン製造用ベクターにより形質転換された大 腸菌ＫＣＴＣ１０３４９ＢＰ。
【請求項１８】
請求項１２に記載のワクチン製造用ベクターにより形質転換された大腸菌ＫＣＴＣ１０５２０ＢＰ。
【請求項１９】
ＨＰＶ  Ｅ７抗原タンパク質が細胞表面に発現した請求項１６に記載の 微生物を有効成分として含むＨＰＶ  Ｅ７発現粘膜腫瘍の治療用または予防用ワクチンであって、前記ワクチンは経口用または食用として投与できることを特徴とするＨＰＶ  Ｅ７発現粘膜腫瘍の治療用または予防用ワクチン。
【請求項２０】
ＨＰＶ  Ｅ７抗原タンパク質が細胞表面に発現した請求項１６に記 載の微生物を有効成分として含む、ＨＰＶ  Ｅ７発現粘膜腫瘍の治療用または予防用ワクチンであって、前記ワクチンは皮下または腹腔に注射できることを特徴と するＨＰＶ   Ｅ７発現粘膜腫瘍の治療用または予防用ワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、パピローマウイルスの表面抗原に対するワクチンを発現させるベクター、前記ベクターによって形質転換された微生物、および前記形質転換された微生物またはその抽出精製物を用いたワクチンに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
微生物の細胞表面に所望のタンパク質を付着させ発現させる技術を細胞表面発現（ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｄｉｓｐｌａｙ）技術という。タンパク質の分泌メカニズムとして分子生物学的情報を利用しての応用方も解明されている。この細胞表面発現技術は、バクテリアや酵母などの微生物の表面タンパク質を表面発現母体（ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｃｈｏｒｉｎｇ  ｍｏｔｉｆ）として使用して外来タンパク質を表面に発現させる技術であって、組み換え生ワクチンの生産、ペプチド／抗体ライブラリー製造およびスクリーニング、全細胞アブソルベント、全細胞生物転換触媒などの様々な応用範囲を有する技術である。すなわち、細胞表面に発現した外来タンパク質の多様性が高ければそれだけ応用範囲が広くなる。したがって本技術の産業的利用の可能性は甚大であると言える。
【０００３】
細胞表面発現技術を成功させるためには表面発現母体が最も重要な要素となる。より効果的に外来タンパク質を細胞表面に発現させ得る母体を選定することがこの技術の核心となる。
【０００４】
したがって、次のような性質を有する表面発現母体を選定しなければならない。第一に、 外来タンパク質を細胞表面まで送り出すために、外来タンパク質の細胞内膜通過を助ける分泌信号があること、第２に、細胞外膜表面に外来タンパク質が確実に付着するように手伝う標的信号があること、第３に、細胞表面に多量に発現しても細胞成長にはほとんど影響を及ぼさないこと、第４に、タンパク質の大きさに関係なく外来タンパク質の３次元的な構造変化なしに安定的に発現されることである。しかし、上記条件を全て満たす表面発現母体は未だに開発されておらず、現在までは上記各短所を補う程度の水準である。
【０００５】
今まで知られていて使用される表面発現母体としては、細胞外膜タンパク質、リポタンパク質（ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）、分泌タンパク質（ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、鞭毛タンパク質のような表面器官タンパク質などの４種に大別される。グラム陰性菌の場合、ＬａｍＢ、ＰｈｏＥ［Ｃｈａｒｂｉｔ  ｅｔ  ａｌ.，Ｊ.Ｉｍｍｕｎｏｌ.，１３９：１６５８−１６６４（１９８７）；Ａｇｔｅｒｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ.，Ｖａｃｃｉｎｅ，８：８５−９１（１９９０）］、ＯｍｐＡなどのような細胞外膜に存在するタンパク質を主に用いており、リポタンパク質であるＴｒａＴ［Ｆｅｌｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ.，Ｊ.Ｍｏｌ.Ｂｉｏｌ.，２２２：３０１−３１０（１９９１）］，ペプチドグリカン関連リポプロテイン（ＰＡＬ）［Ｆｕｃｈｓ  ｅｔ  ａｌ.，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：１３６９−１３７２（１９９１）］そしてＬｐｐ［Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  ｅｔ  ａｌ.，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，４８９：２７１３−２７１７（１９９２）］なども用いられ、ＦｉｍＡやｔｙｐｅ  １  ｆｉｍｂｒｉａｅのＦｉｍＨ ａｄｈｅｓｉｎ のようなｆｉｍｂｒｉａｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ［Ｈｅｄｅｇａｒｄ  ｅｔ  ａｌ.，Ｇｅｎｅ，８５：１１５−１２４（１９８９）］、ＰａｐＡ ｐｉｌｕ  ｓｕｂｕｎｉｔのようなピリープロテインなどを細胞表面発現母体として用いての外来タンパク質の発現が試みられてきた。この他、氷核活性タンパク質（ｉｃｅ  ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）［Ｊｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ.，Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１６：５７６−５６０（１９９８），Ｊｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ.，Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ，２２（５）：３４８−３５４（１９９８），Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ.，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１８：６４５−６４８（２０００）］、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａのｐｕｌｌｕｌａｎａｓｅ［Ｋｏｒｎａｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｌ.，４：１１０１−１１０９（１９９０）］、ＮｅｉｓｓｅｒｉａのＩｇＡ ｐｒｏｔｅａｓｅ［Ｋｌａｕｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ.，ＥＭＢＯ Ｌ.，９：１９９１−１９９９（１９９０）］などが表面発現母体となることが報告されている。グラム陽性菌に関しては、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ来由のプロテインＡを表面発現母体として用いてマラリア抗原を効果的に発現させたことや、乳酸菌の表面外皮タンパク質が表面発現したことが知られている。したがって、グラム陽性菌の表面タンパク質は細胞表面タンパク質となることが明らかにされた。
【０００６】
本発明者らは、バチルス属菌株来由のポリ−γ−グルタミン酸の合成複合体遺伝子（ｐｇｓＢＣＡ）を新たな表面発現母体としての活用の可能性をすることに対し、鋭意研究したところ、ｐｇｓＢＣＡ遺伝子を用いて外来タンパク質を微生物の表面に効果的に発現させる新たなベクター、および微生物の表面に外来タンパク質を多量に発現させる方法を開発した（韓国特許出願番号第１０−２００１−４８３７３）。
【０００７】
上述の各表面発現母体を用いて病原体の抗原または抗原決定基を遺伝工学的な方法を利用して大量生産の可能な細菌で安定的に発現させようとする研究が数多く行われている。特に、非病原性の細菌表面に外来免疫源を発現させて生きている状態で経口投与する場合、従来の弱毒化された病原性細菌やウイルスを用いたワクチンに比べてより持続的で強力な免疫反応を誘導できると報告されている。細菌の各表面構造物は表面発現した外来タンパク質の抗原性（ａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙ）を増加させるアジュバント(ａｄｊｕｖａｎｔ)作用をするためであり、生きている菌により誘発される体内の免疫反応によるものとして知られている。このような表面発現システムを用いた非病原性細菌の組み換え生ワクチンの開発は注目すべきものである。
【０００８】
ヒト・パピローマウイルス（Ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａ  ｖｉｒｕｓ，以下ＨＰＶと称する。）による感染は、世界的に全体の大人のうちの５０％以上を占めていると推定されており、パピローマウイルスのうち、特にＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１およびＨＰＶ４５の４種は、子宮頸部癌（ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ）の原因の８０％以上を占めることが確認された［Ｌｏｗｒｙ，Ｄ.Ｒ.，Ｋｉｒｎｂａｕｅｒ，Ｒ.，Ｓｃｈｉｌｌｅｒ  Ｊ.Ｔ.，（１９９４）Ｐｒｏｃ.Ｎａｌｔ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.９１，２４３６−２４４０］。パピローマウイルスは非常に種特異的な小型のＤＮＡ腫瘍ウイルスであって、人間、牛、兎、羊などの哺乳動物に感染し、皮膚や粘膜でイボや乳頭腫を誘発するパポバウイルス科（Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ ）の一種である［Ｐｆｉｓｔｅｒ，Ｈ.（１９８７）Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ.４８，１１３−１４７］。その中でもヒト・パピローマウイルスは約７０余種のタイプが知られており、その中で約２０余種のタイプが口腔や生殖器官の皮膚粘膜で腫瘍を誘発するが、特に、ＨＰＶ１６とＨＰＶ１８とのタイプは、女性癌の大部分を占める子宮頸部癌を誘発すると報告されている［Ｚｕｒ  Ｈａｕｓｅｎ  Ｈ，（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，８：１４７−１５０］。
【０００９】
世界的に子宮頸部癌は、女性にとっては乳房癌に次いで発生頻度の高い癌であって、世界保健機関（Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，  ＷＨＯ）によれば、毎年全世界で５０万人以上の子宮頸部癌患者が発生し、毎年３０万人以上が子宮頸部癌によって死亡している。特に、開発途上国では、女性の死亡の主原因となっている（Ｐｉｓａｎｉ，Ｐ.，Ｐａｒｋｉｎ，Ｄ.Ｍ.，Ｆｅｒｌａｙ，Ｊ.（１９９３）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ ５５：８９１−９０３）。ＩＡＲＣの統計によれば、特に慢性感染者が先進国に比べて格段に多い開発途上国においてパピローマウイルス感染を根絶するための長期的で最も効果的な方法は、パピローマウイルス予防ワクチンを投与することとして報告された。
【００１０】
ある種のウイルスに対するワクチンを開発するためには、適当な動物培養システムを備えなければならず、これを用いてウイルス粒子を大量に生産、精製すべきである。しかし、ＨＰＶは最終的に分化が終わった上皮細胞（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ）でのみ、ウイルス粒子（ビリオン）を形成するため、試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）または生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）でウイルス粒子を大量に生産しにくいという問題点があり、研究に必要なウイルス粒子の十分な生産はもとより、子宮頸部癌に対する予防用または治療用ワクチンを実用化することが難しかった。子宮頸部癌に係るワクチン開発の方法として、予防ワクチン（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）と治療ワクチン（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）との２つの形態に焦点が当てられている。予防ワクチンは、ＨＰＶ Ｌ１／L２抗原タンパク質によって強力な中和抗体（ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）が生成されるようにすることで宿主がＨＰＶに感染することを阻止し、既に感染したとしてもそれ以上疾病が進展しないようにすることを目的とする。一方、治療ワクチンは、ＨＰＶ Ｅ６／Ｅ７を対象とし、特異的な細胞性免疫を誘導し、既に形成された病斑や悪性腫瘍を退化させることを目的とする。
【００１１】
人間の上皮細胞に感染するヒト・パピローマウイルスは、去る２０余年間の研究結果によれば、種々の遺伝子型（ｇｅｎｏｔｙｐｅ）が存在し、様々な良性および悪性腫瘍の原因に関わっている。かかる様々なＨＰＶに対する実験結果および発見は、ＨＰＶワクチンの開発を促進するようになった。パピローマウイルス以外に、他のウイルスに比べてＨＰＶの免疫誘導能が比較的に良いという特徴のため、いくつかのＨＰＶワクチン候補物質のうちＨＰＶ類似粒子（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｖｉｒｕｓ  ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅ）は、動物モデルおよび人間を対象としたワクチン效能実験において非常に楽観的な結果を示した［Ｋｏｕｔｓｋｙ，Ｌ.Ａ.，Ａｕｌｔ，Ｋ.Ａ.，Ｗｈｅｅｌｅｒ，Ｃ.Ｍ.，Ｂｒｏｗｎ，Ｄ.Ｒ.，Ｂａｒｒ，Ｅ.，Ａｌｖａｒｅｚ，Ｆ.Ｂ.，Ｃｈｉａｃｃｈｉｅｒｉｎｉ  ，Ｌ.Ｍ.，Ｊａｎｓｅｎ，  Ｋ.Ｕ.（２００２）Ｎ.Ｅｎｇｌ.Ｊ.ｏｆ Ｍｅｄ ３４７（２１）：１６４５−１６５１］。すなわち、ＨＰＶ感染が癌を誘導する最も核心的な原因であるということが近年確証されて以来、世界的に多くの科学者らがＨＰＶの研究に興味をもって参加するようになり、ＨＰＶワクチンの開発に拍車がかかった。現在、世界的に開発されているＨＰＶワクチンとしては、ＨＰＶタンパク質（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＨＰＶ類似粒子（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｖｉｒｕｓ  ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅ）、ＨＰＶ ＤＮＡなどを用いた製品が挙げられる。
【００１２】
バクテリア、酵母、動物細胞などにおいて、ＨＰＶ構成体の一部を組み換え技術にて生産された組み換えタンパク質と、直接主要エピトープ部位を合成した合成ペプチドとをワクチンとして使用しようとする研究が進められてきた。組み換えタンパク質は、一般に広く使用されている生産方法であるバクテリア、酵母、バキュロウイルス（ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）、組み換えワクチン用ウイルス（ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ）などのシステムを用いて生産しており、これらの方法によってＨＰＶの組み換えタンパク質を生産する研究と、一部生産された組み換えタンパク質を用いて血清内ＨＰＶに対する抗体形成能および細胞性免疫誘導能などを検証する研究とが行われている。しかし、動物および昆虫細胞を用いたウイルスシステムの場合、培養過程での汚染および精製過程での難しさなどの問題点がある。また、合成ペプチドの合成を通じる場合を含み全体としてコストが高いという短所があり、パピローマウイルス感染患者が主に低開発国家に集中しているという現実から商業的な制約が伴う。
【００１３】
組み換え生ウイルスワクチン（Ｌｉｖｅ   ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ）としてＨＰＶ Ｌ１ウイルス類似粒子（ ｖｉｒｕｓ  ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅ ：以下ＶＬＰという。）を乳腺細胞培養を通じて生産する方法が知られており［Ｈａｇｅｎｓｅｅ，Ｍ.Ｅ.，Ｙａｅｇａｓｈｉ，Ｎ.，Ｇａｌｌｏｗａｔ，Ｄ.Ａ.（１９９３）Ｊ． Ｖｉｒｏｌ  ６７：３１５−３２２］、ＶＬＰはマウスモデルにおいて、中和抗体を誘導産生するという報告がある［Ｓｃｈｉｌｌｅｒ，Ｊ.Ｔ.，Ｌｏｗｒｙ，Ｄ.Ｒ.（１９９６）Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ.７，３７３−３８２］。治療ワクチンは子宮頸部癌で発現する唯一のＨＰＶタンパク質であるＥ６とＥ７を用いて開発されてきた［Ｂｕｂｅｎｉｋ  Ｊ．（２００２）Ｎｅｏｐｌａｓｍａ ４９：２８５−２８９］。ＨＰＶのＥ６／Ｅ７タンパク質は、ＨＰＶに感染した細胞の癌化に係る癌特異抗原であるため、子宮頸部癌の免疫治療のターゲットとしてＥ６／Ｅ７タンパク質を用いた治療ワクチンの研究が続けて進行されてきた。実際、微生物システムで合成されたＨＰＶ Ｅ６／Ｅ７タンパク質を腫瘍細胞が注入されたマウスに投与したとき腫瘍形成が阻害もしくは遅延されるという報告がある［Ｇａｏ，Ｌ.，Ｃｈａｉｎ，Ｂ.，Ｓｉｎｃｌａｉｒ，Ｃ.（１９９４）Ｊ.Ｇｅｎ Ｖｉｏｌ，７５：１５７−１６４，Ｍｅｎｅｇｕｚｚｉ，Ｇ.，Ｃｅｒｎ，Ｃ.，Ｋｉｅｎｙ，Ｍ.Ｐ.（１９９１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１８１：６２−６９］。しかし、他の場合と同様に、生ウイルスワクチンを用いる場合、過多なウイルス複製による問題点が誘発され得るので、実際には、研究レベルに止まる場合が多く、商業化までは長年の期間と相当な臨床実験が要されるという短所がある。このような短所を克服するために、ウイルスの複製能が阻害もしくは欠乏したウイルスベクターの開発に関する研究も行われているが、まだ商業化されていない［Ｍｏｓｓ，Ｂ.（１９９６）Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ ９３，１１３４１−１１３４８］。
【００１４】
一方、バクテリアベクターを用いたワクチン開発の研究も活発に進行されつつあり、弱化したサルモネラ菌（ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）から合成されたＨＰＶ １６ ＶＬＰがマウスの粘膜や全身で抗原特異的な抗体生成を誘導するという報告もある［Ｄｅｎｉｓ，Ｎａｒｄｅｌｉ−ｈａｅｆｌｉｇｅｒ.，Ｒｉｃｈａｒｄ，Ｂ.，Ｓ.Ｒｏｄｅｎ.（１９９７）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６５：３３２８−３３３６］。合成ペプチドを用いたワクチンは免疫反応を誘導するのに必要なエピトープのみを合成して接種（ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ）させるものであって、既にＨＰＶ １６ Ｅ６／Ｅ７に対する細胞性免疫反応（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ；ＣＴＬ）を起こすエピトープが究明されている［Ｒｅｓｓｉｎｇ，Ｍ.Ｅ.，Ｓｅｔｔｅ，Ａ.，Ｂｒａｎｄｔ，Ｒ.Ｍ.（１９９５）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ １５４：５９３４−５９４３］。
【００１５】
このような試みのほか、植物からウイルス抗原を産生するために、トマトやじゃがいもなどの野菜類を用いてその形質転換体の野菜類そのものを経口用ワクチンまたは食物ワクチンとして使用しようとする研究が進行中である。代表的な例として肝炎ウイルス表面抗原粒子（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｐａｒｔｉｃｌｅ ）［Ｔｈａｖａｌａ，Ｙ.Ｆ.ａｎｄ Ｃ.Ｊ.Ａｒｔｚｅｎ.（１９９５）Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ ９２：３３５８−３３６１］、およびパピローマウイルスのカプシドＬ１およびＬ２タンパク質（韓国特許出願番号第１０−２０００−０００７０２２）が挙げられる。しかし、植物を用いたシステムの場合、発現されるＨＰＶ Ｌ１タンパク質の量が少なく精製過程に問題があり、同じく商業的な制約が伴うという問題がある。
【００１６】
したがって、ヒト・パピローマウイルスの感染者が主に低開発国家に集中している点を勘案すれば、パピローマウイルス来由の口腔または生殖器官の皮膚粘膜の腫瘍に対する予防と治療のために、より経済的で安定的にヒト・パピローマウイルス抗原を作製する方法の開発が切望される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
前述の技術的問題点を解決するために、本発明は、微生物の表面発現システムを用いてＨＰＶ抗原を製造できるベクター、および前記ベクターによって形質転換された微生物を提供することを目的とする。
【００１８】
また、本発明は、ＨＰＶ抗原が表面に発現した前記形質転換された微生物、前記微生物から粗抽出されたＨＰＶ抗原、または前記微生物から精製されたＨＰＶ抗原を有効成分とする粘膜腫瘍治療・予防用ワクチンを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
上記目的を達成するために、本発明は、ポリ−γ−グルタミン酸合成酵素複合体をコードする遺伝子であるｐｇｓＢ、ｐｇｓＣおよびｐｇｓＡのうちのいずれか１つまたは２つ以上と、ヒト・パピローマウイルスの表面抗原タンパク質遺伝子を含むワクチン製造用表面発現ベクターを提供するものである。
【００２０】
本発明において、前記遺伝子ｐｇｓＢ、ｐｇｓＣ、ｐｇｓＡはそれぞれ配列１、配列２、配列３と記載された塩基配列を持つ。
【００２１】
本発明において、前記表面抗原タンパク質遺伝子としてはＨＰＶ表面構成体タンパク質を暗号化する遺伝子であればいずれも使用可能である。例えば、ヒト・パピローマウイルスのカプシドであるＨＰＶ Ｌ１またはＨＰＶ Ｌ２抗原タンパク質遺伝子を単独で用いることもできれば、２つ以上を複合的に用いることもできる。しかし、ＨＰＶの主要カプシドであるＬ１抗原タンパク質の遺伝子を用いるのがより望ましい。
【００２２】
また、本発明において、前記腫瘍関連抗原タンパク質遺伝子としてはＨＰＶの腫瘍関連タンパク質を暗号化する遺伝子であればいずれも使用でき、ヒト・パピローマウイルスの腫瘍関連抗原タンパク質であるＨＰＶ Ｅ６またはＨＰＶ Ｅ７抗原タンパク質遺伝子を単独で用いることもできれば、２つ以上を複合的に用いることもできる。また、Ｅ６およびＥ７の腫瘍誘発に係る遺伝子を変形して発現させた抗原も使用可能である。しかし、ＨＰＶの主要腫瘍関連抗原タンパク質であるＥ７抗原タンパク質の遺伝子を用いるのがより望ましい。
【００２３】
また、本発明では、前記ポリ−γ−グルタミン酸合成酵素複合体をコードする遺伝子にはｐｇｓＡが含まれることが好ましい。
【００２４】
本発明はまた、前記ワクチン製造用ベクターで形質転換された微生物に関するものである。
【００２５】
本発明においてがは、生体適用の際に毒性がなく、弱毒化された（attenuated）微生物であればいずれも使用可能である。例えば、グラム陰性菌としては、大膓菌、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａ）、ウシ型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ）、赤痢菌などを、グラム陽性菌としては、バチルス、ラクトバチルス、ラクトコッカス、スタフィロコッカス、リステリア・モノサイトゲネスおよびストレプトコッカスなどを適宜選択することができる。
【００２６】
本発明はまた、前記抗原タンパク質が表面に発現した微生物そのもの及び、前記微生物を破壊してメンブレイン成分を粗抽出物質、前記微生物から精製した抗原タンパク質を有効成分として含む各種の粘膜腫瘍治療・予防用ワクチンを提供するものである。すなわち、本発明に係るワクチンは、ＨＰＶによって誘発される、口腔や生殖器官などの粘膜に発生した腫瘍、特に女性子宮頸部癌の治療・予防薬として用いることができる。
【００２７】
本発明に係るワクチンは、経口用または食用として摂取可能であり、皮下または腹腔に注射可能で、更に生殖器の洗浄液としても使用可能である。女性生殖器に直接適用する場合は、女性生殖器に棲息する有用菌、例えば乳酸菌を宿主とすることが好ましく、このようにすることは当業者にとっては非常に容易なことであろう。
【００２８】
また、本発明に係るワクチンはスプレー方式による鼻腔への適用も可能である。
【００２９】
ＨＰＶの感染は粘膜組織表面（ｍｕｃｏｓａｌ  ｓｕｒｆａｃｅ）に発生することが多いので、粘膜免疫による感染の防御は非常に重要である。ＨＰＶの抗原を表面に発現する微生物は粘膜での抗体形成（ｍｕｃｏｓａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を更に効果的に誘導できるという長所があり、前記形質転換された微生物そのものを用いた経口用ワクチンが非経口用（ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ）ワクチンに比べてＨＰＶの防御により高い効果が期待される。
【００３０】
具体的には、本発明は、バチルス属菌株由来のポリ−γ−グルタミン酸合成複合体の遺伝子のうちｐｇｓＡを含み、ｐｇｓＡのＣ末端にＨＰＶ Ｌ１のＮ末端を連結し、ＨＰＶ Ｌ１を融合タンパク質の形態でグラム陰性菌およびグラム陽性菌の表面に発現させることのできるワクチン用表面発現形質転換ベクター［ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＨＰＶ Ｌ１（図１参照）］、およびこれによって形質転換された微生物を提供するものである。前記ワクチン製造用ベクターで形質転換された大腸菌は別に寄託した（ＫＣＴＣ １０３４９ＢＰ）。
【００３１】
また、本発明は、バチルス属菌株由来のポリ−γ−グルタミン酸合成複合体の遺伝子のうちｐｇｓＢＣＡを含み、ｐｇｓＡのＣ末端にＨＰＶ Ｅ７のＮ末端を連結し、ＨＰＶ Ｅ７を融合タンパク質の形態でグラム陰性菌およびグラム陽性菌の表面に発現させることのできるワクチン用表面発現形質転換ベクター［ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＢＣＡ−ＨＰＶ Ｅ７（図５参照）］、およびこれによって形質転換された微生物を提供するものである。前記ワクチン製造用ベクターで形質転換された大腸菌は別に寄託した（ＫＣＴＣ １０５２０ＢＰ）。
【発明の効果】
【００３２】
本発明者らは、バチルス属菌株来由のポリ−γ−グルタミン酸の合成遺伝子（ｐｇｓＢＣＡ）を用いてヒト・パピローマウイルスのカプシドＬ１タンパク質を微生物の表面に、特に経口投与可能な乳酸菌表面およびワクチン菌株であるサルモネラ菌株の表面に效果的に発現させる方法、およびその用途を開発し、この組み換え菌株はＨＰＶの予防および治療のためのワクチンなどの開発に使用可能である。特に、ＨＰＶの抗体誘導のための抗原の大量生産が不可能であるのに対し、本発明のＨＰＶ抗原を発現する組み換え菌株を低コストで大量増殖させ経口用ワクチンとして直接あるいは膣部位に直接適用可能な経済性のあるワクチンとして用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
以下、本発明を実施例によって更に詳しく説明する。但し、これらの実施例は本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に局限されないことは、当業界で通常の知識を有する者にとっては自明なことであろう。
【００３４】
特に、下記実施例では、ＨＰＶ １６ Ｌ１抗原タンパク質遺伝子を適用したが、他のＨＰＶのタイプストレイン（ｔｙｐｅ  ｓｔｒａｉｎ）のＬ１およびＬ２など、ＨＰＶのカプシドであるいずれかの抗原タンパク質遺伝子を、単独または２つ以上を複合的に用いることもできる。また、下記実施例では、ＨＰＶ ｔｙｐｅ１６の主要癌誘発関連抗原タンパク質であるＥ７遺伝子を適用したが、他のＨＰＶのタイプストレインの癌誘発抗原タンパク質遺伝子を単独または複合的に用いることもできる。
【００３５】
また、下記実施例ではバチルス・サブチルス清麹醤（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｖａｒ．ｃｈｕｎｇｋｏｏｋｊａｎｇ, ＫＣＴＣ ０６９７ＢＰ）からポリ−γ−グルタミン酸合成に関与する細胞外膜タンパク質の遺伝子ｐｇｓＢＣＡを獲得して用いたが、遺伝子はポリ−γ−グルタミン酸を産生する全てのバチルス属菌株からｐｇｓＢＣＡを獲得して製造されたベクター、またはこのベクターを用いた形質転換微生物なども本発明の範囲に含まれる。例えば、バチルス・サブチルス清麹醤に存在するｐｇｓＢＣＡ遺伝子の塩基配列と８０％以上の相同性を有する他の菌株来由のｐｇｓＢＣＡ遺伝子を用いてワクチン用ベクターを製造すること及び、これを用いることも本発明の範囲に含まれる。
【００３６】
また、下記実施例および間接実施例に示すように、遺伝子ｐｇｓＢＣＡの全部または一部のみを用いてワクチン用ベクターを製造することも本発明の範囲に含まれる。
【００３７】
また、下記実施例では、前記ベクターに対する宿主として、グラム陰性菌であるチフス菌とグラム陽性菌であるラクトバチルスのみを用いたが、これらの細菌のほか、如何なるグラム陽性菌またはグラム陽性菌も本発明に係る方法で形質転換させれば同様の結果が得られるという事実も当業者にとっては自明なことであろう。
【００３８】
また、下記実施例では、ワクチン用ベクターで形質転換された微生物そのものを生ワクチンとして生体に適用した例のみが提示されている。しかし、ワクチン関連技術分野の知識上、前記微生物から抽出された発現タンパク質（すなわち、ＨＰＶ抗原タンパク質）または精製された発現タンパク質を生体に適用しても同一または類似の結果が得られることは当然であろう。
＜実施例１＞表面発現形質転換ベクター（ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ：ＨＰＶ Ｌ１）の製造
【００３９】
バチルス属菌株から由来のポリ−γ−グルタミン酸合成に関与する細胞外膜タンパク質の遺伝子（ｐｇｓＢＣＡ）のうちｐｇｓＡを用いてグラム陰性微生物およびグラム陽性微生物を宿主としてヒト・パピローマウイルスｔｙｐｅ１６（以下、パピローマウイルスをＨＰＶという。）の主要カプシドタンパク質Ｌ１を表面発現できる形質転換ベクター（ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＨＰＶ Ｌ１）を製造した。
【００４０】
まず、グラム陰性微生物を宿主とする表面発現ベクターｐＧＮＡ（韓国特許出願第１０−２００１−４８３７３号の出願人から提供される。）にＨＰＶのＬ１をコードする遺伝子を導入するために、ｐＵＣ１９にクローニングされている約１.５ｋｂのヒト・パピローマウイルス遺伝子を鋳型として用い、ＨＰＶ Ｌ１をコードする遺伝子配列４（５-ｃｇｃ ｇｇａｔｃｃ ｔｃｔ ｃｔｔ ｔｇｇ ｃｔｇ ｃｃｔ ａｇ−３）および配列５（５-ｇｇａ ａａｇｃｔｔ ｔｔａ ｔｔａ ｃａｇ ｃｔｔ ａｃｇ ｔｔｔ ｔｔｔ ｇ-３）の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）を行った。この結果、増幅された遺伝子部位の大きさは１５１８ｂｐであった。
【００４１】
前記プライマー配列４および配列５には表面発現ベクターｐＧＮＡに存在する制限酵素ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩとの認識部位が存在するように構成した。前記増幅されたＨＰＶ Ｌ１抗原遺伝子を制限酵素ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩとで切断し、予め用意した表面発現ベクターｐＧＮＡのポリ−γ−グルタミン酸合成に関与する細胞外膜タンパク質の遺伝子ｐｇｓＡのＣ末端部位に翻訳コドンを合わせて連結し、形質転換ベクターｐＧＮＡ-ＨＰＶ Ｌ１を製造した。
【００４２】
製造された形質転換ベクターｐＧＮＡ−ＨＰＶ Ｌ１からＨＣＥプローモータ、ｐｇｓＡ、そしてＨＰＶ Ｌ１を含む切片を得るために、ｐＧＮＡ−ＨＰＶ Ｌ１を制限酵素であるＮｈｅＩとＳｃａＩとで切断して切片を用意し、グラム陽性の汎用ベクターであるｐＡＴ１９のマルチクローニングサイト内の制限酵素であるＸｂａＩとＳｍａＩ部位とでその切片を連結し、形質転換ベクター［ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＨＰＶ Ｌ１（図１）］を製造した。
【００４３】
本表面発現ベクターで大腸菌を形質転換させ、ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＨＰＶ Ｌ１を含む大腸菌を韓国生命工学研究院遺伝子銀行（ＫＣＴＣ，韓国大田広域市儒城区魚隠洞５２番地）に受託番号ＫＣＴＣ １０３４９ＢＰにてブダペスト条約に基づく国際寄託をした。
＜実施例２＞ｐｇｓＡと融合したＨＰＶ Ｌ１の表面発現
【００４４】
前記表面発現ベクター（ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＨＰＶ Ｌ１）を用いてグラム陰性菌であるチフス菌（Ｔｙ２１ａ）を形質転換させた後、チフス菌（Ｔｙ２１ａ）においてのｐｇｓＡと融合したＨＰＶ Ｌ１抗原のタンパク質発現を調べ、グラム陽性菌であるラクトバチルスを形質転換させた後、ラクトバチルス内のｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＨＰＶ Ｌ１プラスミドの存在を確認し、ｐｇｓＡと融合したＨＰＶ Ｌ１抗原のタンパク質発現を調べた（図２参照）。
【００４５】
ポリ−γ−グルタミン酸を合成する遺伝子ｐｇｓＡのＣ末端と融合したＨＰＶ Ｌ１抗原の細菌発現は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびＨＰＶ Ｌ１に対する特異抗体を用いたウエスタンブロッティング（ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）を行って確認した。
【００４６】
具体的には、ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＨＰＶ Ｌ１に形質転換されたチフス菌（Ｔｙ２１ａ）を抗生剤のエリスロマイシン１００ｍｇ／Ｌの添加された５０ｍｌのＬＢ培地（酵母エキス５ｇ／Ｌ，トリプトン１０ｇ／Ｌ，食塩５ｇ／Ｌ，ｐＨ７.０）を含む５００ｍｌフラスコで増殖させることで、表面発現を誘導した。これとは別に、ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＨＰＶ Ｌ１に形質転換されたラクトバチルスカゼイをＭＲＳ培地（Ｌａｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ＭＲＳ，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｓｐａｒｋｓ，ＵＳＡ）上で３７℃で静置培養・増殖させることで、表面発現を誘導した。
【００４７】
発現が誘導されたチフス菌（Ｔｙ２１ａ）およびラクトバチルスカゼイを同じ細胞濃度から得たタンパク質で変性させて試料を用意し、これをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した後、分画された各タンパク質をＰＶＤＦ（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｌｉｄｅｎｅ−ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）メンブレインに移した。各タンパク質が移されたＰＶＤＦメンブレインをブロッキング緩衝溶液（５０ｍＭトリス塩酸，５％スキムミルク，ｐＨ８.０）で１時間振ってブロッキングさせた後、ＨＰＶ Ｌ１に対するマウス来由のモノクローナル一次抗体をブロッキング緩衝溶液に１０００倍希釈し、１２時間反応させた。反応の終わったメンブレインは緩衝溶液で洗浄し、ビオチンの接合したマウスに対する２次抗体をブロッキング緩衝溶液に１０００倍希釈し、４時間反応させた。反応の終わったメンブレインは緩衝溶液で洗浄し、アビジン−ビオチン試薬を１時間反応させて再び洗浄した。洗浄されたメンブレインに基質と発色試薬としてＨ２Ｏ２およびＤＡＢ溶液を添加して発色させ、ＨＰＶ Ｌ１に対する特異抗体と前記融合タンパク質と間の特異的な結合を確認した（図２）。
【００４８】
図２のＡにおいて、レーン１は形質転換されていない宿主細胞であるチフス菌（Ｔｙ２１ａ）を示し、レーン２およびレーン３は形質転換されたｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＨＰＶ Ｌ１／チフス菌（Ｔｙ２１ａ）を示す。なお、図２のＢにおいて、レーン１は形質転換されていないラクトバチルスカゼイを示し、レーン２は形質転換されたｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＨＰＶ Ｌ１／ラクトバチルスカゼイを示す。同図に示すように、ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＨＰＶ Ｌ１プラスミドによって約９７.４ｋＤａの融合タンパク質バンドを確認することができた。ｐｇｓＡが約４１.８ｋＤａで、Ｌ１タンパク質が約５５.６ｋＤａであるので、上記の９７.４ｋＤａを示すバンドは、ｐｇｓＡとＬ１タンパク質とが融合した融合タンパク質であることが分かる。
＜実施例３＞ＨＰＶ Ｌ１抗原を表面発現するラクトバチルスの免疫反応誘導能調査
【００４９】
前記表面発現形質転換ベクター（ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＨＰＶ Ｌ１）でグラム陽性菌であるラクトバチルスカゼイを形質転換させ、実施例２と同様の方法で前記抗原をラクトバチルスカゼイにおいて表面発現を誘導した後、ポリ−γ−グルタミン酸合成に関与する細胞外膜タンパク質ｐｇｓＡと融合したＨＰＶ１６のＬ１抗原の抗原性を調べた。
【００５０】
具体的に、本発明の表面発現形質転換ベクターｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＨＰＶ Ｌ１でラクトバチルスカゼイを形質転換させ、それぞれ同じ細菌濃度になるように獲得した細胞を緩衝溶液（ＰＢＳ ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ７.４）で数回洗浄し、ＨＰＶ１６のＬ１抗原が表面発現したラクトバチルスおよび形質転換されていないラクトバチルス（それぞれ５×１０１０菌）を、４〜６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスの口腔に第１週および第２週に１日おきに３回、そして２週間後に更に、同じく１日おきに３回投与した。対照群としては、酵母で発現して得たＨＰＶ１６のＬ１ ＶＬＰ（ｖｉｒｕｓ  ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅ）を１日おきに ２回静脈投与したマウスを用いた。
【００５１】
経口投与および静脈投与後、２週間おきにマウスを犠牲にしてそれぞれの１マウス群の血清を採って血清内のＨＰＶ１６のＬ１抗原に対するＩｇＧ抗体価、および２マウスの内臓、気管支、肺そして膣を採ってその内部を洗浄した浮遊液内でのＨＰＶ１６のＬ１抗原に対するＩｇＡ抗体価をＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）で抗原に対する抗体価を測定した（図３ａ，図３ｂ）。ＨＰＶ１６のＬ１抗原に対するＩｇＧおよびＩｇＡ抗体価を測定するためのＥＬＩＳＡ方法では、酵母で発現させて得たＨＰＶ１６のＬ１ ＶＬＰ（ｖｉｒｕｓ  ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅ）を抗原として使用し、ＩｇＧ抗体価測定のためには、ホースラディッシュ・過酸化酵素コンジュゲート（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）抗マウスＩｇＧを、そしてＩｇＡ抗体価測定のためには、ホースラディッシュ・ 過酸化酵素コンジュゲート抗マウスＩｇＡを使用した。
【００５２】
0004549858.tif 000002
【００５３】
その結果、図３ａに示すように、ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＨＰＶ Ｌ１で形質転換させたラクトバチルスカゼイを投与したＢＡＬＢ／ｃマウス群の血清希釈液において、ヒトＨＰＶのＬ１抗原に対するＩｇＧ抗体が、対照群であるＢＡＬＢ／ｃマウスのそれより格段に高く現れることを確認し、ＨＰＶ１６のＬ１ ＶＬＰを静脈投与した群に比べても、比較できるような抗体価の上昇を確認した。
【００５４】
また、図３ｂに示すように、ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＨＰＶ Ｌ１で形質転換させたラクトバチルスカゼイを投与したＢＡＬＢ／ｃマウス群の内臓、気管支、肺、そして膣内部などを洗浄した浮遊液内でのＨＰＶ１６のＬ１抗原に対するＩｇＡ抗体が、対照群とＨＰＶ１６のＬ１ ＶＬＰを静脈投与したＢＡＬＢ／ｃマウス群とも比較できるような抗体価の上昇を確認した。特に、内臓浮遊液内のＨＰＶ１６のＬ１抗原に対するＩｇＡ抗体価の差がより大きく現れた。
【００５５】
したがって、本発明に係る形質転換微生物は、全身的免疫誘導の指標であるＨＰＶに対するＩｇＧ抗体および局所免疫である粘膜免疫誘導の指標であるＨＰＶに対するＩｇＡ抗体を形成することが確認され、これらの形質転換微生物が生ワクチンとして活用可能であることが分かった。
＜実施例４＞ＨＰＶ Ｌ１抗原を表面発現するラクトバチルスで免疫された動物からの脾臓細胞の細胞融解活性
【００５６】
ＨＰＶ Ｌ１抗原を表面発現するラクトバチルスで免疫が確認されたマウスにおいて発生する免疫反応の中で細胞媒介性免疫反応が同様の過程を通じて誘導されるか否かを確認するために、免疫された動物から脾臓の細胞を分離して細胞毒性リンパ球（ＣＴＬ）の活性を測定した。
【００５７】
具体的には、免疫化されていないＢａｌｂ／ｃマウスの脾臓細胞と１０μｇの合成ＨＰＶ１６のＬ１ペプチドとを３７℃で３時間インキュベートし、４０００ｒａｄで照射して刺激細胞（ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ）を用意する。
【００５８】
前記実施例３でのＨＰＶ Ｌ１抗原を表面発現するラクトバチルスで免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウスから脾臓細胞を分離し、合成ペプチドをローディングした刺激細胞と混合して６日間培養し、効果細胞（ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｅｌｌ）を用意する。この際、刺激細胞と効果細胞との割合は２：１にする。６日目に更に刺激を与える。アッセイの前日、標的細胞として使用される細胞に１０μｇの合成ＨＰＶ１６のＬ１ペプチドを入れてインキュベートする。アッセイの当日に、ペプチドローディングされた標的細胞に１００ｕＣｉ／１０６ｃｅｌｌの５１ＣｒＯ４を入れて２時間インキュベートした後、洗浄する。用意された効果細胞を９６ウエルに５０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの標的細胞と１：１００ないし１：２５までの割合で分注する。標的細胞と効果細胞とを混合した後、３７℃で４時間インキュベートする。４時間後、上清液を集めて５１ＣｒＯ４のリリース（ｒｅｌｅａｓｅ）を測定する。１％ｔｒｉｔｏｎＸ-１００と標的細胞とを混合した時を最大リリース、メジアー（ｍｅｄｉａ）と標的細胞とを混合した時を自然リリース（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｒｅｌｅａｓｅ ）とし、以下の計算式によって特異的分解（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｌｙｓｉｓ）を換算する。
［ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｌｙｓｉｓ ＝１００×（ｅｘｐｅｒｉｍｍｅｎｔａｌ ｃｐｍ− ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｃｐｍ）／ｍａｘｉｍｕｍ ｃｐｍ ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｃｐｍ ］
【００５９】
換算された細胞融解活性の結果を図４に示した。
【００６０】
その結果、同図に示すように、ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＨＰＶ Ｌ１で形質転換させたラクトバチルスカゼイを投与したＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓細胞での特異的な細胞融解の割合が、形質転換されていないラクトバチルスを投与したＢＡＬＢ／ｃマウスのそれより高く現れることが確認された。
【００６１】
したがって、本発明に係るＨＰＶ１６のＬ１抗原を表面発現させたラクトバチルスによって誘導された免疫は、経口ワクチンとしての主要効果である細胞毒性リンパ球（ＣＴＬ）を活性化させるような特異性を現わす細胞媒介性免疫反応であることが確認された。
＜実施例５＞表面発現形質転換ベクター（ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＢＣＡ：ＨＰＶ Ｅ７）の製造
【００６２】
バチルス属菌株由来のポリ−γ−グルタミン酸合成に関与する細胞外膜タンパク質の遺伝子（ｐｇｓＢＣＡ）のうち、ｐｇｓＢＣＡを用いてグラム陰性微生物およびグラム陽性微生物を宿主としてＨＰＶ ｔｙｐｅ１６の主要癌誘発関連抗原タンパク質Ｅ７を表面発現させることのできる形質転換ベクター（ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＢＣＡ−Ｅ７）を製造した。
【００６３】
まず、グラム陰性微生物を宿主とする表面発現ベクターｐＧＮＢＣＡ（韓国特許出願第１０−２００１−４８３７３号の出願人から提供される。）にＨＰＶ１６のＥ７をコードする遺伝子を導入するために、ｐＵＣ１９にクローニングされている約３２４ｂｐのヒト・パピローマウイルスｔｙｐｅ１６のＥ７遺伝子を鋳型として使用し、ＨＰＶ１６ Ｅ７をコードする遺伝子配列６（５-ｃｇｃ ｇｇａ ｔｃｃ ｃｃａ ｇｇａ ｇｇｔ ａｔｇ ｃａｔ-３）および配列７（５-ｇｇａ ａａｇ ｃｔｔ ｔｔａ ｔｇｇ ｔｔｔ ｃｔｇ ａｇａ ａｃａ ｇａ-３）の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）を行った。この結果、増幅された遺伝子部位の大きさは３２４ｂｐであった。
【００６４】
前記プライマー配列６およびプライマー配列７には表面発現ベクターｐＧＮＢＣＡに存在する制限酵素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩの認識部位が存在するように構成した。前記増幅されたＨＰＶ Ｌ１抗原遺伝子を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、予め用意された表面発現ベクターｐＧＮＢＣＡのポリ−γ−グルタミン酸合成に関与する細胞外膜タンパク質の遺伝子ｐｇｓＡのＣ末端部位に翻訳コドンを合わせて連結し、形質転換ベクターｐＧＮＢＣＡ−ＨＰＶ Ｅ７を製造した。
【００６５】
製造された形質転換ベクターｐＧＮＢＣＡ−ＨＰＶ Ｅ７からＨＣＥプローモータ、ｐｇｓＢＣＡ、およびＨＰＶ Ｌ１を含む切片を得るために、ｐＧＮＢＣＡ−ＨＰＶ Ｅ７を制限酵素であるＮｈｅＩとＳｃａＩとで切断して切片を用意し、グラム陽性の汎用ベクターであるｐＡＴ１９のマルチクローニングサイト内の制限酵素であるＸｂａＩとＳｍａＩ部位とでその切片を連結し、形質転換ベクター［ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＢＣＡ−ＨＰＶ Ｅ７（図５）］を製造した。
【００６６】
本表面発現ベクターで大腸菌を形質転換させ、ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＢＣＡ−ＨＰＶ Ｅ７を含む大腸菌を、韓国生命工学研究院遺伝子銀行（ＫＣＴＣ，大田広域市儒城区魚隠洞５２番地所在）に受託番号ＫＣＴＣ １０５２０ＢＰにてブダペスト条約に基づく国際寄託をした。
＜実施例６＞ｐｇｓＡと融合したＨＰＶ Ｅ７の表面発現
【００６７】
前記表面発現ベクター（ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＢＣＡ−ＨＰＶ Ｅ７）でグラム陽性菌であるラクトバチルスを形質転換させた後、ラクトバチルス内のｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＢＣＡ−ＨＰＶ Ｅ７プラスミドの存在を確認し、ｐｇｓＡと融合したＨＰＶ Ｅ７抗原のタンパク質発現を調べた（図６参照）。
【００６８】
このために、前記発現ベクターでラクトバチルスを形質転換させ、実施例２と同様の過程で発現を誘導した後、ポリ−γ−グルタミン酸を合成する遺伝子ｐｇｓＡのＣ末端と融合したＨＰＶ Ｅ７抗原タンパク質のラクトバチルスの発現をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、およびｐｇｓＡ（図６のＡ）とＨＰＶ Ｅ７（図６のＢ）に対する特異抗体を用いたウエスタンブロッティングを行って確認した（図６）。図６において、レーン１は形質転換されていないラクトバチルスカゼイを示し、レーン２およびレーン３は形質転換されたｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＢＣＡ−ＨＰＶ Ｅ７／ラクトバチルスカゼイを示す。
【００６９】
同図に示すように、ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＢＣＡ−ＨＰＶ Ｅ７プラスミドによって約６０.８ｋＤａの融合タンパク質バンドが確認された。ｐｇｓＡが約４１.８ｋＤａで、典型的なＨＰＶ１６のＥ７抗原タンパク質が約１９ｋＤａであるので、前記６０.８ｋＤａを示すバンドはｐｇｓＡとＨＰＶ１６のＥ７抗原タンパク質とが融合した融合タンパク質であることが分かった。
＜実施例７＞ＨＰＶ Ｅ７抗原を表面発現するラクトバチルスで免疫された動物への腫瘍細胞チャレンジ
【００７０】
前記表面発現形質転換ベクター（ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＢＣＡ−ＨＰＶ Ｅ７）でグラム陽性菌であるラクトバチルスカゼイを形質転換させ、実施例２と同様の方法で前記抗原をラクトバチルスカゼイにおいて表面発現を誘導した後、ポリ−γ−グルタミン酸合成に関与する細胞外膜タンパク質ｐｇｓＡと融合したＨＰＶ１６のＥ７抗原の免疫化による腫瘍増殖抑制效果を調べた。
【００７１】
具体的には、本発明の表面発現形質転換ベクター（ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＢＣＡ−ＨＰＶ Ｅ７）で形質転換させたラクトバチルスカゼイ、および形質転換されていないラクトバチルスをそれぞれ実施例３のように処理し、５×１０１０菌を４〜６週齢のＣ５７／ＢＬ／６マウスの口腔に第１週および第２週に１日おきに３回、そして２週間後に更に、同じく１日おきに３回投与した。
【００７２】
最後に投与した後、ＨＰＶのＥ７を発現する腫瘍細胞ＴＣ−１細胞株（１×１０４／５０μｌ）をマウスの左わき腹に皮下注射することで、チャレンジした。
【００７３】
ＨＰＶのＥ７発現腫瘍細胞を発現させるＴＣ−１腫瘍細胞株は、先行文献［Ｌｉｎ ｅｔ  ａｌ.，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ.５６：２１−２６（１９９６）］に記載のように、ＨＰＶ１６のＥ６およびＥ７遺伝子と、活性化されたヒト・ｃ−Ｈａ−ｒａｓ遺伝子とで免疫・形質転換させることで、Ｃ５７／ＢＬ／６マウスの一次肺細胞から誘導されたものである。
【００７４】
腫瘍チャレンジ２週間後から腫瘍の大きさを測定した。腫瘍の大きさは、２日おきに週３回測定し、最長の長さと最短の長さとを測定し、それらを掛け算して表示した。腫瘍チャレンジの後、腫瘍の大きさを測定した結果は図７に示した。
【００７５】
図７に示すように、ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＢＣＡ−Ｅ７で形質転換させたラクトバチルスカゼイを投与したＣ５７／ＢＬ／６マウスでチャレンジした腫瘍細胞の増殖が形質転換されていないラクトバチルスを投与したＣ５７／ＢＬ／６マウスの場合に比べて著しく抑制された。
【００７６】
したがって、本発明に係るＨＰＶ１６のＥ７抗原を表面発現させたラクトバチルスによって誘導された免疫は、腫瘍細胞でチャレンジしたマウスの腫瘍細胞の増殖を抑制することが確認された。
＜間接実施例＞ｐｇｓＢ、ｐｇｓＣ、およびｐｇｓＡの組み合わせが挿入されたワクチン用ベクターの作製およびそれを用いた外来タンパク質表面発現実験
【００７７】
ポリ−γ−グルタミン酸合成酵素複合体をコードする遺伝子ｐｇｓＢ、ｐｇｓＣ、およびｐｇｓＡのうちのいずれか一つまたは２つ以上と、外来タンパク質をコードする遺伝子が含まれた表面発現ベクターとの製造が可能であり、これらのベクターで微生物を形質転換させることで、外来タンパク質が微生物の表面に発現することを確認した。
【００７８】
これにより、ポリ−γ−グルタミン酸合成酵素複合体をコードする遺伝子ｐｇｓＢ、ｐｇｓＣ、およびｐｇｓＡのうちのいずれか１つまたは２つ以上を含むワクチン用ベクター及び、本発明に係るＨＰＶ抗原タンパク質をコードする遺伝子を含むワクチン用ベクターを製造できることが間接的に確認された。
【００７９】
間接実施例において、プラスミドｐＧＮＢＣＡ、ｐＧＮＣＡは、それぞれ本発明でのプラスミドｐＧＮｐｇｓＢＣＡ、ｐＧＮｐｇｓＣＡと等しいものである。
＜間接実施例１＞表面発現形質転換ベクターｐＧＮＢＣＡ−ＨＢ１６８の製造およびＳ抗原の中和抗体形成抗原基の表面発現
【００８０】
バチルス属菌株由来のポリ−γ−グルタミン酸合成に関与する細胞外膜タンパク質の遺伝子（ｐｇｓＢＣＡ）を用い、グラム陰性微生物を宿主としてＢ型肝炎ウイルスＳ抗原の中和抗体形成抗原基を表面発現できる形質転換ベクターｐＧＮＢＣＡ−ＨＢ１６８を製造した。
【００８１】
グラム陰性微生物を宿主とする表面発現ベクターｐＧＮＢＣＡにＢ型肝炎ウイルスＳ抗原遺伝子を導入するために、汎用クローニングベクターであるｐＵＣ８にクローニングされている約１.４ｋｂのＢ型肝炎ウイルス遺伝子を鋳型として使用し、配列８（５-ｃｔｇｇｇａ ｔｃｃ ｃａａ ｇｇｔ ａｔｇ ｔｔｇ ｃｃｃ ｇｔｔ ｔｇ-３）および配列９（５-ｔｇａ ａｇｃ ｔｔａ ｔｔａ ｇｇａ ｃｇａ ｔｇｇ ｇａｔ ｇｇｇ ａａｔ-３）の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたポリメラーゼ連鎖反応を行ってＳ抗原遺伝子を増幅させた。このとき、増幅された遺伝子部位の大きさは１６８ｂｐであった。
【００８２】
前記配列８および配列９のプライマーは、表面発現ベクターｐＧＮＢＣＡに存在する制限酵素ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩとの認識部位が存在するように構成した。前記増幅されたＢ型肝炎ウイルスＳ抗原遺伝子を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、予め用意された表面発現ベクターｐＧＮＢＣＡのポリ−γ−グルタミン酸合成に関与する細胞外膜タンパク質の遺伝子のＣ末端部位に翻訳コドンを合わせて連結した。このようにして形質転換ベクターｐＧＮＢＣＡ−ＨＢ１６８を製造した（図８参照）。
【００８３】
前記表面発現ベクターｐＧＮＢＣＡ−ＨＢ１６８を用いて大腸菌でのＢ型肝炎ウイルスＳ抗原の中和抗体形成抗原基の表面発現を調べた。
【００８４】
実施例２で製造された発現ベクターで大腸菌を形質転換させた後、抗生剤のアンピシリン１００ｍｇ／Ｌの添加された５０ｍｌのＬＢ培地（酵母エキス５ｇ／Ｌ，トリプトン１０ｇ／Ｌ，食塩５ｇ／Ｌ，ｐＨ７.０）を含む５００ｍｌフラスコで増殖させることで、表面発現を誘導した。
【００８５】
ポリ−γ−グルタミン酸を合成する遺伝子のＣ末端と融合したＳ抗原の中和抗体形成抗原基の細菌発現は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびＳ抗原に対する抗体を用いたウエスタンブロッティングを行って確認した。具体的には、同じ細胞濃度より得たタンパク質を変性させて試料を用意し、これをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した後、分画された各タンパク質をＰＶＤＦメンブレインに移した。各タンパク質の移されたＰＶＤＦメンブレインをブロッキング緩衝溶液（５０ｍＭトリス塩酸，５％スキムミルク，ｐＨ８.０）で１時間振ってブロッキングさせた後、Ｓ抗原に対するヒツジ来由のポリクローナル一次抗体をブロッキング緩衝溶液で１０００倍希釈し、１２時間反応させた。反応の終わったメンブレインを緩衝溶液で洗浄し、ビオチンの接合されたヒツジに対する２次抗体をブロッキング緩衝溶液で１０００倍希釈し、４時間反応させた。反応の終わったメンブレインを緩衝溶液で洗浄し、アビジン−ビオチン試薬を１時間反応させ、再び洗浄した。洗浄されたメンブレインに基質と、発色試薬としてＨ２Ｏ２およびＤＡＢ溶液を添加して発色させ、Ｓ抗原に対する特異抗体と前記融合タンパク質と間の特異的な結合を確認した（図９のＡ）。図９において、レーン１は形質転換されていない宿主細胞であるＪＭ１０９を示し、レーン２は形質転換されたｐＧＮＢＣＡ−ＨＢ１６８／ＪＭ１０９を示す。同図に示すように、ｐＧＮＢＣＡ−ＨＢ１６８プラスミドによって約４８ｋＤａの融合タンパク質バンドを確認することができた。
【００８６】
また、Ｓ抗原の中和抗体形成抗原基が大腸菌の表面に位置し発現されることを直接確認するために、外幕分画法で発現を誘導させた大腸菌の可溶性成分、内膜、外膜などを分離した後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびＳ抗原に対する抗体を用いたウエスタンブロッティングを行って確認した。具体的には、上記方法で融合タンパク質の表面発現が誘導された大腸菌を、形質転換されていない大腸菌と同じ細胞濃度となるように獲得し、細胞を緩衝溶液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ７.４）で数回洗浄した後、１０μｇ／ｍｌリゾチーム、１ｍＭ ＰＭＳＦ、および１ｍＭ ＥＤＴＡが含有された緩衝溶液で浮遊させ、４℃で１０分間反応させた後、ＤＮａsｅ（０.５ｍｇ／ｍｌ）とＲＮａｓｅ（０.５ｍｇ／ｍｌ）とを加えた後、超音波処理で細胞を破壊した後、無傷の大膓菌と細胞残屑が４℃で２０分間の遠心分離（１０,０００ｇ）によって分離され、分離された大腸菌の細胞残屑が４℃で２時間の遠心分離（１５,０００ｇ）によって大腸菌のペリプラズムと細胞質とのタンパク質を含む分画を得ることができた。得られたペレットを１％サルコシル（Ｎ-ｌａｕｒｙｌ ｓａｒｃｏｓｉｎａｔｅ，ｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ）を含む緩衝溶液（ＰＢＳ，ｐＨ７.４）で浮遊させた後、４℃で２時間の遠心分離（１５,０００ｇ）によって上清液は大腸菌の内膜、ペレットは大腸菌の外膜のタンパク質からその分画を得た後、それぞれの分画をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびＳ抗原に対する抗体を用いたウエスタンブロッティングを行ってそれぞれの大膓菌分画中のＳ抗原の中和抗体形成抗原基が外膜に位置することを確認した（図９ａ；大膓菌メンブレイン分画ウエスタンブロッティングの結果）。図９において、レーン１は形質転換されていないＪＭ１０９を、レーン２は形質転換されたｐＧＮＢＣＡ−ＨＢ１６８／ＪＭ１０９の全細胞を、レーン３は形質転換されたｐＧＮＢＣＡ−ＨＢ１６８／ＪＭ１０９の可溶性分画を、レーン４は形質転換されたｐＧＮＢＣＡ−ＨＢ１６８／ＪＭ１０９の内膜分画を、レーン５は形質転換されたｐＧＮＢＣＡ−ＨＢ１６８／ＪＭ１０９の外膜分画をそれぞれ示す。
【００８７】
Ｓ抗原の中和抗体形成抗原基が、ポリ−γ−グルタミン酸合成タンパク質のＣ末端によって大腸菌の表面に発現されることを、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ， Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｅｒ）で確認した。
【００８８】
免疫蛍光（Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）染色のために、発現を誘導させた大腸著菌を同じ細胞濃度となるように獲得し、細胞を緩衝溶液（ＰＢＳ ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ７.４）で数回洗浄した後、１％ウシ血清アルブミンを含む緩衝溶液１ｍｌに浮遊させ、Ｓ抗原に対するヒツジ来由のポリクローナル一次抗体を１０００倍希釈し、４℃で１２時間反応させた。反応の終わった各細胞を緩衝溶液で数回洗浄し、１％ウシ血清アルブミンを含む緩衝溶液１ｍｌに浮遊させた後、ビオチンが結合されている２次抗体を１０００倍希釈し、４℃で３時間反応させた。更に、反応の終わった細胞は緩衝溶液で数回洗浄し、１％ウシ血清アルブミンが入っている緩衝溶液０.１ｍｌに浮遊させた後、ビオチンに特異的なストレプトアビジン−Ｒ−フィコエリスリン染色試薬を１０００倍希釈して結合させた。
【００８９】
反応の終わった大腸菌を数回洗浄してＦＡＣＳで測定した結果、形質転換されていない大腸菌と比較されるＳ抗原の中和抗体形成抗原基タンパク質が表面に発現することを確認した（図９のＢ）。同図において、白色は形質転換されていないＪＭ１０９を示し、黒色は形質転換されたｐＧＮＢＣＡ−ＨＢ１６８／ＪＭ１０９から来由したものを示す。なお、同図に示すように、形質転換されていない大腸菌ではＳ抗原中和抗体形成基が発現されなかったが、表面発現ベクターによって形質転換された大膓菌ではＳ抗原中和抗体形成基の表面発現が明らかに確認された。
＜間接実施例２＞表面発現形質転換ベクターｐＧＮＣＡ−ＨＢ１６８の作製およびＢ型肝炎ウイルスＳ抗原の中和抗体形成抗原基の表面発現
【００９０】
バチルス属菌株由来のポリ−γ−グルタミン酸合成に関与する細胞外膜タンパク質の遺伝子（ｐｇｓＢＣＡ）のうち、ｐｇｓＣとｐｇｓＡとを用いたグラム陰性微生物を宿主とする表面発現ベクターを製造した。
【００９１】
ポリ−γ−グルタミン酸合成に関与する細胞外膜タンパク質のうち、ｐｇｓＣとｐｇｓＡとのＮ末端およびＣ末端を暗号化する遺伝子を得るために、前記全染色体を鋳型として用い、Ｎ末端には配列１０（５-ｇｃａ ｃａｔ ａｔｇ ｔｔｃ ｇｇａ ｔｃａ ｇａｔ ｔｔａ ｔａｃ ａｔｃ-３）、Ｃ末端には配列１１（５-ｃｔｃ ｇｇａ ｔｃｃ ｔｔｔ ａｇａ ｔｔｔ ｔａｇ ｔｔｔ ｇｔｃ ａｃｔ-３）の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたポリメラーゼ連鎖反応を行った。
【００９２】
Ｎ末端に対するプライマーである配列には、発現ベクターｐＨＣＥ１９Ｔ（ＩＩ）に存在する制限酵素ＮｄｅＩの認識部位が存在するように構成した。このとき、増幅された遺伝子部位は、ポリ−γ−グルタミン酸合成に関与する細胞外膜タンパク質遺伝子であるｐｇｓＣのＮ末端部位からｐｇｓＡのＣ末端部位までの約１.６ｋｂの大きさの部位であった。
【００９３】
ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅された遺伝子を、制限酵素ＮｄｅＩとＢａｍＨＩとで切断し、既にＮｄｅＩとＢａｍＨＩとで切断された常時的な高発現ベクターであるｐＨＣＥ１９Ｔ（ＩＩ）に挿入し、ポリ−γ−グルタミン酸合成に関与する細胞外膜タンパク質の遺伝子に終止コドンがなく新たな制限酵素認識部位の添加された新規の約５.３ｋｂの大きさのベクターを製造し、これをｐＧＮＣＡと命名した。
【００９４】
ポリ−γ−グルタミン酸合成に関与する細胞外膜タンパク質の遺伝子（ｐｇｓＢＣＡ）のうち、ｐｇｓＣとｐｇｓＡとを用い、グラム陰性微生物を宿主としてＢ型肝炎ウイルスＳ抗原の中和抗体形成抗原基を表面発現することのできる形質転換ベクターｐＧＮＣＡ−ＨＢ１６８を、上記実施例２と同様の方法で製造した。このようにして製造した形質転換ベクターｐＧＮＣＡ−ＨＢ１６８を図１０に示した。
【００９５】
前記表面発現ベクターｐＧＮＣＡ−ＨＢ１６８を用い、大膓菌でのＢ型肝炎ウイルスＳ抗原の中和抗体形成抗原基の発現を調べた。
【００９６】
このために、前記発現ベクターで大膓菌を形質転換させ、上記実施例３と同様の過程で発現を誘導した後、細胞外膜タンパク質ｐｇｓＣＡと融合したＳ抗原の中和抗体抗原基が大腸菌で発現することを、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびＳ抗原に対する抗体を用いたウエスタンブロッティングを行って確認した。
【００９７】
図１１において、レーン１は形質転換されない宿主細胞であるＪＭ１０９を示し、レーン２は形質転換されたｐＧＮＣＡ−ＨＢ１６８／ＪＭ１０９を示す。同図に示すように、ｐＧＮＣＡ−ＨＢ１６８プラスミドによって約４８ｋＤａの融合タンパク質バンドを確認することができた。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】本発明に係るグラム陰性およびグラム陽性微生物を宿主細胞とする表面発現形質転換ベクター（ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＨＰＶ Ｌ１）の遺伝子地図である。
【図２】ＡおよびＢは、本発明の表面発現形質転換ベクター（ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＨＰＶ Ｌ１）で形質転換させたサルモネラ菌株および乳酸菌株内において、ｐｇｓＡと融合したＨＰＶ Ｌ１抗原の融合タンパク質発現の様子を、特異抗体でウエスタンブロッティングした写真である。
【図３−ａ】本発明の表面発現形質転換ベクター（ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＨＰＶ Ｌ１）で形質転換させたラクトバチルスカゼイ菌株において、抗原基の表面発現が確認された一定量の菌を口腔に一定期間投与したマウスの血清内ＨＰＶ Ｌ１抗原基に対するＩｇＧ抗体価の結果を示したグラフである。
【図３−ｂ】本発明の表面発現形質転換ベクター（ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＨＰＶ Ｌ１）で形質転換されたラクトバチルスカゼイ菌株において、抗原基の表面発現が確認された一定量の菌を一定期間口腔に投与したマウスの小腸、気管支、肺および膣洗浄液内のＨＰＶ Ｌ１抗原基に対するＩｇＡ抗体価の結果を示したグラフである。
【図４】本発明の表面発現形質転換ベクター（ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＨＰＶ Ｌ１）で形質転換させたラクトバチルスカゼイ菌株において、抗原基の表面発現が確認された一定量の菌を一定期間口腔に投与した後、マウスの脾臓細胞の細胞毒性Ｔリンパ球の細胞融解活性の結果を示したグラフである。
【図５】本発明に係るグラム陰性およびグラム陽性微生物を宿主とする表面発現形質転換ベクター（ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＢＣＡ−ＨＰＶ Ｅ７）の遺伝子地図である。
【図６】本発明の表面発現形質転換ベクター（ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＢＣＡ−ＨＰＶ Ｅ７）で形質転換させた乳酸菌株内において、ｐｇｓＡと融合したＨＰＶ Ｅ７抗原の融合タンパク質発現の様子を、特異抗体でウエスタンブロッティングした写真である。
【図７】本発明の表面発現形質転換ベクター（ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＢＣＡ−ＨＰＶ Ｅ７）で形質転換させたラクトバチルスカゼイ菌株における抗原基の表面発現が確認された一定量の菌を一定期間口腔に投与した後、マウスに腫瘍細胞をチャレンジして経時による腫瘍増殖率を測定した結果を示したグラフである。
【図８】本発明に係る間接実施例において、表面発現ベクターｐＧＮＢＣＡおよび形質転換ベクターｐＧＮＢＣＡ−ＨＢ１６８の遺伝子地図である。
【図９−ａ】本発明に係る間接実施例において、表面発現形質転換ベクターｐＧＮＢＣＡ−ＨＢ１６８で形質転換させたグラム陰性微生物におけるＢ型肝炎ウイルスの表面抗原基タンパク質の表面発現を示すウエスタンブロッティング写真およびＦＡＣＳによる測定結果グラフである。
【図９−ｂ】本発明に係る間接実施例において、表面発現形質転換ベクターｐＧＮＢＣＡ−ＨＢ１６８で形質転換させたグラム陰性微生物におけるＢ型肝炎ウイルスの表面抗原基タンパク質の表面発現を示すウエスタンブロッティング写真およびＦＡＣＳによる測定結果グラフである。
【図１０】本発明に係る間接実施例において、表面発現ベクターｐＧＮＣＡおよび形質転換ベクターｐＧＮＣＡ−ＨＢ１６８の遺伝子地図である。
【図１１】図１１ａおよび図１１ｂは、本発明に係る間接実施例において、表面発現形質転換ベクター（ｐＧＮＣＡ−ＨＢ１６８：Ａ２，ｐＧＮＡ−ＨＢ１６８：Ａ３、およびｐＧＮＨＢ−Ａ：Ａ４）で形質転換させたグラム陰性微生物におけるＢ型肝炎ウイルスの表面抗原基タンパク質の表面発現を示すウエスタンブロッティング写真およびＦＡＣＳによる測定結果グラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３−ａ】
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【図３−ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【配列表】
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