(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたDNA分子によりコード化されたポリペプチドを含んでいる免疫原性組成物であって、該DNA分子は下記からなる群から選択されるＤＮＡ配列を含んでいる免疫原性組成物：
(i)配列番号41により表わされるＤＮＡ配列；
(ii)(i)で定義されたDNA配列に対し、縮重であるDNA配列。
【請求項２】
請求項１に記載の免疫原性組成物であって、前記ポリペプチドが配列番号209で表される配列を有する免疫原性組成物。
【請求項３】
請求項1または2に記載の免疫原性組成物であって、前記組成物が更に担体および／またはアジュバントを含む免疫原性組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
本発明は、抗原性ポリペプチド、典型的には病原性の微生物（microbes）により発現されるオプソニン抗原（opsonic antigens）を同定するための方法；前記抗原を具備しているワクチン；および前記抗原性ポリペプチドに対する治療用の抗体に関する。
【０００２】
微生物は、多くの致死的な又は衰弱させる疾患を生じさせ、世界中の多くの人々に影響する。現在の微生物をコントロールする方法には、抗微生物剤(抗生物質)および消毒剤（disinfectants）の使用が含まれる。
これらは問題があることが実証されており、その理由はこれらの薬剤は顕著な選択圧を発生させることにより耐性微生物を誕生させるからであり、その微生物は抗微生物剤の効果を回避することができる。例えば、最近トリクロサン（triclosan；家庭用および産業用の環境で使用される多くの消毒剤に添加される薬剤）に耐性となった微生物が発見されている。
【０００３】
論証される大きな問題は、多くの重篤な病原性を有する微生物の抗生物質耐性株の進化である。
【０００４】
例えば、（この例に限定されないが）、世界中で薬剤耐性の結核(TB)に感染した５億人の人々が存在していると推測されている（世界保健機関1998の推定)。過去において、ＴＢを治療するための抗生物質の使用は、単一の薬物（例えば、エチオナミド)の投与に頼っており、これらの薬物は相対的に高頻度の耐性を促進させた。この理由から、現在は薬物の併用により結核の治療がなされている。しかしながら、少なくとも１つの薬物に耐性な株により発症した場合の致死率は、なお50%に近づいている（治療された場合でさえ）。結核菌（Mycobacterium tuberculosis；ＴＢの原因菌）は、緩徐に成長する細菌であり、殺傷するには長期間を要する。従って、効果的な薬物併用のために、ＴＢを有する人物は少なくとも６ヶ月間の薬物併用を毎日摂取しなければならない。従って、患者は毎日２以上のピルを頻繁に摂取しなければならず、この治療には比較的長い治療期間における管理された規定量（a regimented dosage）の摂取が必要とされる。多くの患者は断続的に医薬（medications）を摂取し、それゆえ療法のフルコースを終了せずM. tuberculosis感染が完全に根絶されない。また、ＴＢとHIV感染との関連性は強く、したがってＴＢの成立は免疫抑制（immunosuppression）と強い関連性がある。
【０００５】
ＴＢに対するワクチン接種は、多年にわたり有効である。BCG（bacillus calmette-guerin)ワクチン接種は、世界中で長い間広く使用されている、なぜならＴＢに潜在的に感染する可能性のある多くの人々をワクチン接種するための安全で安価な手段だからである。BCGは、Mycobacterium bovisの生きた、弱毒化株に由来するものである。しかしながら、感染性形態のＴＢにおけるワクチン接種の効果は最小であり、それゆえＢＣＧは疾病の全体的なコントロールに若干は寄与してきた。
【０００６】
抗生物質に対する耐性を進展させてきた病原性生物の更なる例は、Staphylococcus aureusである。S. aureusは、正常な健常人の約20〜40%の鼻部の上皮性のライニングに通常生息する細菌であり、普段は害を生じることなく人々の皮膚上にも見つけられる。しかしながら、特定の環境（特に皮膚が障害された場合）において、この菌は感染を成立させることができる。このことは病院（患者が外科的処置および／または免疫抑制薬薬物で治療される病院）において特別な問題である。これらの患者は、彼等が受けている治療のせいで、S.aureusの感染により攻撃され易い。S. aureusの耐性株は最近数年で発生してきた。メチシリン耐性株が蔓延しており、それらの耐性株の多くは他のいくつかの抗生物質にも耐性である。現在、S.aureusに対する効果的なワクチン接種の処置（procedure）は存在しない。ＵＳにおいて、S.aureus感染は、各年あたり２百万人の入院感染患者（hospitalised infections）の１３％の患者の原因である。これは260,000の人々がS.aureusに感染していることを表わしており、そのうちの60-80,000が死亡する。
【０００７】
従って、S.aureusは、敗血症（septicaemia）、心内膜炎（endocarditis）、関節炎（arthritis）および毒素ショック（toxic  shock）を含む広範囲の生命を脅かす疾患を生じる可能性のある主要なヒトの病原体である。この能力は、生物の汎用性（versatility）及びその細菌のビルレンスに関連する成分の蓄積（arsenal）により決定される。病原性は多因子性であり、如何なる成分も特定の感染の原因となるとは示されていない〔Projan, S. J. & Novick, R. P. (1997) in The Staphylococci in Human Disease (Crossley, K. B. & Archer, G. L. , eds. ) pp. 55-81を参照〕。
【０００８】
感染の開始時に及びその進行にしたがい、生物体の要求および環境は変化し、これはS.aureusが産生するビルレンス決定因子における対応する変化を正確に反映するものである。感染の開始時に、病原体にとって宿主組織に接着することは重要であり、それゆえ多くの細胞表面関連付着タンパク質のレパートリーが産生される。これらにはコラーゲン-、フィブリノーゲン-およびフィブロネクチン-結合タンパク質が含まれる。また、病原体は宿主の防御機構を因子を産生することにより回避する能力を有しており、この因子は食作用を減少させる又は循環している抗体により認識される細胞の能力に干渉するものである。
【０００９】
しばしば感染の病巣は、膿瘍（abscess）として進展し、そして生物体数が増加する。S.aureusは、自身の細胞密度を定員検知ペプチド（a quorum sensing peptide）の産生によりモニターする能力を有している。前記ペプチドの蓄積（前記細胞の飢餓を開始させることにより誘発される生理的な変化と関連して）は、ビルレンス決定因子を産生するスイッチを付着因子から侵入および組織浸透に関与する成分へと切り替える。これらは、広範囲の溶血素（hemolysins）、プロテアーゼおよび他の分解酵素（degradative enzymes）を含む。
【００１０】
任意の感染プロセスの間に、ビルレンス決定因子（S.aureusにより産生される）が、環境の及び生理学的な刺激に応答して産生される。これらの刺激は、体内のニッチェ（niche）に依存し、そして感染の進行にしたがって変化する。インビボでの状態については僅かなことしか知られていなく、いくつかの成分はこの環境でのみ産生されると思われる。それ故、これらは、潜在的なワクチン成分であり、従来技術によっては発見されなかった。
【００１１】
最近の医学の歴史において最も重要な発展の１つはワクチンの開発であり、これは広範囲の病原性生物に対する予防的な防御を提供する。多くのワクチンは、不活化又は弱毒化された病原体により産生され、個体に注射される。免疫された個体は、液性(抗体)および細胞性(細胞溶解性Ｔ細胞、CTL's)応答の両方を発生させることにより応答する。例えば、肝炎ワクチンは、ウイルスを熱不活性化すること及びクロスリンキング剤（例えば、ホルムアルデヒド）で処理することにより作出される。ワクチンとして有用な弱毒化病原体の例は、ポリオワクチンに代表される、生きた病原体を弱毒化することにより産生されるワクチンである。
【００１２】
しかしながら、特定の疾患に対するワクチンにおいて弱毒化した生物体を使用することは、症状の病理学および弱毒化の性質に関する知識の欠如から問題がある。特定のウイルス性の因子にとって、これは特に問題である。なぜならウイルス（特にレトロウイルス）は、エラーを生じる傾向がある複製サイクルを有しており、結果的に様々な変異を該ウイルスが具備する遺伝子に生じるからである。この現象により、以前はワクチンとして使用されてきた抗原性決定因子に変化を生じさせることが可能である。
不活化または弱毒化された病原体の使用の代替となる手段は、病原体エピトープ（このエピトープに対して免疫システムが特に感受性である）を同定することである。この点において、多くの病原性毒素（病原性生物により感染の間に産生された）はワクチンの開発において特に有用であり、このワクチンは個体を特定の病原性生物から防御する。
【００１３】
いわゆるサブユニットワクチン（免疫原が特定の病原菌により発現される蛋白質もしくは複合体の断片またはサブユニットであるワクチン)の開発は、重要な医学的研究の焦点となっている。サブユニットワクチンの開発に有用な候補分子を同定することは明らかに必要な事項であり、この理由は特に最近は病原性生物を制御するための従来の化学療法的アプローチが抗生物質耐性の発生により阻まれているからである。多くの方法が開発され、潜在的な抗原性ポリペプチド（ワクチンとして使用できる）が同定されている。かかる方法の１つが本明細書中に開示されている。
腫瘍細胞が多くの腫瘍細胞特異的抗原を産生すること、そのうちのいくつかが腫瘍細胞表面に提示されることは以前から知られている。免疫系はこれらの抗原を異物として認識し、これによって自己抗原（いわゆる自己抗体または自己の抗血清）に対する抗体の産生を生じる。
【００１４】
かかる技術の１つは、リコンビナント発現クローニングによる抗原の血清学的な同定（Serological identification of antigens by recombinant Expression Cloning）であり、この技術はSEREXと略称される。
【００１５】
この技術の典型例では、腫瘍組織からのRNAの抽出、次に分離された全RNAからのmRNAの選択的濃縮を含む。前記mRNAは、ウイルスの逆転写酵素を用いてcDNAへと逆転写される。このように合成したcDNAを、発現ベクターにサブクローンし、そして適切な細菌株へと導入する。形質転換した細菌を適切な栄養寒天上にプレートし、適切な成長条件下でサブクローンされたDNAを細菌細胞中の発現ベクターから発現させる。その細胞をファージに基づいた発現ベクター（例えば、λファージまたはファージミドに基づくベクター）を使用することにより、彼等の溶菌サイクルが作用する細胞溶解を介して自然に溶解させる。放出されたポリペプチドは、適切な膜支持体（即ち、ニトロセルロース、ナイロン）に転写され、腫瘍組織が最初に分離された患者の自己の抗血清に対して暴露された。免疫スクリーニングの方法論により、患者から選択された腫瘍組織において過剰発現される又は不適切に発現される遺伝子の同定が可能である。
【００１６】
我々は、このテクニックを使用して感染の間に病原性生物により発現される抗原性ポリペプチドを同定した。感染の間に産生された自己血清を使用して、ゲノムDNAから作出した発現ライブラリをスクリーンし、抗原を同定およびクローン化する。
【００１７】
最も広い側面において、本発明は病原性微生物による感染の間に発現された抗原性ポリペプチドの同定およびワクチン接種におけるそれらの使用に関する。
【００１８】
本発明の第一側面によると、病原性生物により発現されるオプソニン抗原（opsonic antigens）を同定するための方法が提供され、該方法は以下を具備する、即ち：
(i)病原性生物の遺伝子または部分的な遺伝子配列をコード化している核酸ライブラリを提供することと；
(ii)前記ライブラリを宿主細胞へと形質転換することと／トランスフェクションすることと；
(iii)前記の形質転換された／トランスフェクションされた遺伝子または部分的な遺伝子配列の発現を促進（conducive）する条件を提供することと；
(iv)前記の遺伝子／部分的な遺伝子配列により発現される抗原を前記病原性生物を感染させた（又は該生物を感染させていた）動物に由来する自己抗血清（autologous antisera）と接触させることと；
(v)前記自己抗血清と結合している前記抗原または部分的な抗原性ポリペプチドをコード化している核酸を精製することと；
(vi)前記DNA分子によりコード化されたポリペプチドのオプソニン活性（opsonic activity）を検査することと、を具備する。
【００１９】
本発明の好適な方法において、前記ライブラリは病原性生物のゲノムDNAを具備する。
【００２０】
理想的には前記病原性生物は、細菌に属する生物である。
【００２１】
より好ましくは更に前記の細菌に属する生物体は以下から選択される：
Staphylococcus aureus；Staphylococcus epidermidis；Enterococcus faecalis；Mycobacterium tuberculsis；StreptococcusグループB；Streptoccocus pneumoniae；Helicobacter pylori；Neisseria gonorrhea；StreptococcusグループA；Borrelia burgdorferi；Coccidiodes immitis；Histoplasma sapsulatum、Neisseria meningitidisタイプＢ；Shigella flexneri；Escherichia coli；Haemophilus influenzae。
【００２２】
好ましくは更に前記病原性生物は、属  Staphylococcus spp.の生物である。理想的には生物体は、Staphylococcus  aureusまたはStaphylococcus  epidermidisである。
【００２３】
本発明の更に好適な態様において、前記核酸ライブラリはλライブラリ、理想的にはλ発現ライブラリである。
【００２４】
本発明の第二側面によると、DNA配列を具備している核酸分子が提供され、該配列は以下から選択される：
(i)本明細書の表７または表９に開示されるDNA配列により表わされるDNA配列；
(ii)病原性生物により発現されるポリペプチドをコード化する上記(i)で特定された配列とハイブリダイズするDNA配列；並びに
(iii)(i)および(ii)において定義されたDNA配列に対し、遺伝コードの結果として縮重であるDNA配列。
【００２５】
本発明の更になお更なる好適な態様において、前記核酸分子はゲノムDNA（genomic DNA）である。
【００２６】
本発明の好適な態様において、単離された核酸分子が提供され、該核酸分子は厳密なハイブリダイゼーション条件下で本明細書に開示される配列とアニールする。
【００２７】
厳密なハイブリダイゼーション／洗浄条件は、当該技術において公知である。例えば、核酸ハイブリッドは、O.1xSSC、0.1%  SDSにおいて60℃で洗浄した後に安定である。至適なハイブリダイゼーション条件を、核酸の配列が既知の場合に計算できることは当該技術において公知である。例えば、ハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーションに供試する核酸のＧＣ含量により決定することができる。Sambrook et al (1989) Molecular Cloning; A Laboratory Approachを参照のこと。特定の相同性を有する核酸分子間のハイブリダイゼーションを達成するために必要な厳密性条件を計算するための共通式（common formula）は：
【００２８】
Tm=81.5℃+16.6  Log[Na+]+0.41[%G+C]-0.63(%ホルムアミド)。
【００２９】
本発明の第三側面によると、本発明の方法により同定された少なくとも１つのポリペプチドが提供される。
【００３０】
本発明の好適な態様において、前記ポリペプチドは、本発明の既述の任意の側面または態様による生物の感染病原性（infective pathogenicity）と関連する。
【００３１】
より好ましくは更に前記ポリペプチドは、表８または表１０において表わされるアミノ酸配列の少なくとも１つ又はその部分である。
【００３２】
本発明の別の好適な態様において、前記ポリペプチドは非蛋白質抗原（例えば、ポリ多糖抗原）を具備する。
【００３３】
本発明の第四側面により核酸分子が提供される。該核酸分子は、前記核酸分子によりコードされたポリペプチドの組換え型の発現を促進させることに適合したベクターの部分である、との特徴を具備する分子である。
【００３４】
本発明の好適な態様において、前記ベクターは原核生物の遺伝子発現に適合した発現ベクターである。或いは、前記発現ベクターは真核生物の遺伝子発現に適合したものである。
【００３５】
典型的には、前記の適合には、限定されない例示として、細胞特異的な発現を媒介する転写制御配列（プロモーター配列）の供給（provision）が含まれる。これらのプロモーター配列は、細胞特異的な、誘導性の又は構成的な（constitutive）ものであってもよい。
【００３６】
プロモーターは当該技術において認識される用語であり、明確には以下の特徴を含む用語である（この特徴は例示の目的でのみ提供され、限定されるものではない）。エンハンサーエレメントはシス作用性核酸配列であり、たいていは遺伝子の転写開始点の5'に認められる(エンハンサーは遺伝子配列の3'においても見つけられ、またイントロン配列においてさえも局在し得る、それゆえに位置に非依存的である)。エンハンサーが機能して該エンハンサーがリンクする遺伝子の転写の割合を増加させる。エンハンサー活性はトランス作用性の転写因子(ポリペプチド)に応答性であり、該因子はエンハンサーエレメントに特異的に結合することが示されている。転写因子の結合／活性（Eukaryotic Transcription Factors, by David S Latchman, Academic Press Ltd, San Diegoを参照）は、多くの環境的な合図〔例示の目的であり、限定されるものではないが、該合図には中間代謝物（例えば、グルコース、脂質）、環境的なエフェクタ（例えば、光、熱）が含まれる〕に応答性である。
【００３７】
またプロモーターエレメントは、いわゆるＴＡＴＡボックスおよびＲＮＡポリメラーゼ開始選択(RIS)配列（転写開始の部位を選択する機能を有する）を含む。
また、これらの配列は、特にＲＮＡポリメラーゼによる転写開始選択を促進する機能を有するポリペプチドと結合する。
【００３８】
また、適合には選択可能なマーカーおよび自律増殖配列の供給が含まれ、この両者は前記ベクターの保持性（真核細胞または原核生物宿主のどちらにおいても）を促進させる。自律的に保持されるベクターは、エピソームベクター（episomal vector）と称される。
【００３９】
ベクターがコード化する遺伝子の発現を促進する適合化には、転写終結（termination）／ポリアデニル化配列の供給が含まれる。これには内部リボソーム侵入部位(IRES)の供給も含まれ、この部位はバイシストロン性またはマルチシストロン性の発現カセットに配置されるベクターコード化遺伝子の発現を最大化する機能を有する。
【００４０】
これらの適合は、当該技術分野において公知である。一般的な発現ベクターの構築および組換えＤＮＡ技術に関して、かなりの量の公開された文献が存在する。Sambrook et al (1989) Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, NY and references therein; Marston, F (1987) DNA Cloning Techniques: A Practical Approach Vol in IRL Press, Oxford UK ; DNA Cloning: F M Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994)を参照。
【００４１】
本発明のなお更なる側面によると、本発明の任意の既述の側面または態様によるポリペプチドの産生のための方法が提供され、該方法は下記：
(i)本発明のベクターで形質転換された／トランスフェクトされた細胞を提供することと；
(ii)前記細胞を前記ポリペプチドの製造を助長（conducive）する条件下で成長させることと；および
(iii)前記ポリペプチドを前記細胞から又はその成長環境から精製することと、を含む。
【００４２】
本発明の好適な方法において、前記ベクターは前記ポリペプチドの精製を促進するための分泌シグナルをコードし、従って、前記組換え型のポリペプチドは該分泌シグナルと共に提供される。
【００４３】
本発明の第五側面によると、本発明のベクターで形質転換もしくはトランスフェクトされた細胞または細胞株が提供される。
【００４４】
本発明の好適な態様において、前記細胞は原核細胞である。
或いは、前記細胞は真核細胞であって、その細胞は：真菌、昆虫、両生類；哺乳類；植物から選択される。
【００４５】
本発明のなお更なる側面によると、本発明による少なくとも１つの抗原または抗原性ポリペプチドを含むワクチンが提供される。
【００４６】
理想的には（Ideally）、前記ワクチンは更に担体および／またはアジュバントを含む。
【００４７】
アジュバントおよび担体の用語は、下記の様式で解釈される。ある種のポリペプチドまたはペプチド抗原は、B-細胞エピトープを含むが、Ｔ細胞エピトープを含まない。
免疫応答を、ポリペプチド／ペプチドにＴ細胞エピトープを包含（inclusion）させることにより又はポリペプチド／ペプチドを免疫原性の担体タンパク質（例えば、キーホールリンペットヘモシアニンまたはテタヌストキソイド）（複数のＴ細胞エピトープを具備している）へ抱合（conjugation）させることにより非常に増強させることが可能である。抱合体は、抗原提示細胞により取り込まれ、プロセスされ、そしてヒト白血球抗原(HLA's)クラスＩＩ分子によって提示される。これにより、担体に由来するエピトープに特異的なＴ細胞により与えられるＴ細胞ヘルプをＢ細胞（オリジナルの抗原性ポリペプチド／ペプチドに特異的である）に対して許容させる。これにより、抗体産生、分泌およびアイソタイプスイッチの増加を生じさせることが可能である。
【００４８】
アジュバントは物質（substance）または処置（procedure）であって、抗原に対する特異的な免疫応答を免疫細胞の活性を調節することにより補強する。アジュバントの例には（例示のみの目的で）、共刺激分子に対して作用性（agonistic）の抗体、フロイントアジュバント、ムラミルジペプチド、リポソームが含まれる。アジュバントは、従って免疫調節物質（immunomodulator）である。担体は免疫原性の分子であり、第二の分子と組み合わせた場合に後者に対する免疫応答を補強する。
【００４９】
本発明の更なる側面において、動物を病原性微生物に対して免疫する方法が提供され、該方法は前記動物に少なくとも１つの、本発明のポリペプチド（若しくはその部分）または本発明のワクチンを投与することを含む。
【００５０】
本発明の好適な方法において、前記動物はヒトである。
【００５１】
好ましくはワクチン（又は抗原性ポリペプチド）は、直接的な注射（静脈内、筋肉内、皮下のいずれか）により投与できる。更になお、ワクチンまたは抗原性ポリペプチドは経口的に接種されてもよい。
【００５２】
好ましくは前記ワクチンは、細菌の種Staphylococcus aureusに対するものである。
【００５３】
ワクチンは、細菌の種Staphylococcus epidermidisに対するものであってもよい。
【００５４】
ワクチンまたは抗原性ポリペプチドは、ヒト以外の動物（限定される例示ではないが、例えば、ファミリーペット、家畜、ウマ）の症状の予防又は軽減に効果的であることは明白であろう。
【００５５】
本発明の更なる側面によると、抗体、または少なくともその効果的な結合部分が提供され、これらは少なくとも１つの本発明による抗原または抗原性ポリペプチドに結合する。
【００５６】
本発明の好適な態様において、前記抗体はポリクローナルまたはモノクローナル抗体であって、この抗体は前記ポリペプチドに特異的なものである。
【００５７】
或いは、前記抗体はキメラ抗体であり、該抗体は前記抗体の可変領域をヒト抗体の不変または定常領域と共に含有させる組換え技術によって作出される。
【００５８】
本発明の別の態様において、前記抗体は組換え技術によりヒト化された抗体であり、該抗体は前記抗体の相補性決定領域をヒト抗体の定常(C)領域および可変性(V)領域におけるフレームワーク領域の双方と連結させた抗体である。
【００５９】
好ましくは前記抗体はマーカーと共に提供され、該マーカーには従来の標識またはタグ（例えば、放射性および／または蛍光および／またはエピトープの標識或いはタグ）が含まれる。
【００６０】
好ましくは前記ポリペプチドに対する前記ヒト化モノクローナル抗体は、原核生物もしくは真核生物の細胞のトランスフェクションまたは形質転換に適切に適合した発現ベクターにおいて融合ポリペプチドとして産生される。
【００６１】
抗体（免疫グロブリンとしても知られる）は蛋白質分子であり、この分子は外来分子(抗原)に対して特異性を有するものである。免疫グロブリン(Ig)は、構造的に関連するタンパク質のクラスであり、２対のポリペプチド鎖〔１対の軽(L)(低分子量)鎖(κもしくはλ)、および１対の重(H)鎖(γ、α、μ、δおよびε)〕からなり、４つ全てが共にジスルフィド結合により連結される。ＨおよびＬ鎖の双方は、抗原の結合に寄与し、１つのＩｇ分子と別の該Ｉｇ分子との間でその双方は高度に可変性である。加えて、HおよびL鎖は、非可変性または定常性の領域を含む。
【００６２】
Ｌ鎖は２つのドメインからなる。カルボキシ末端ドメインは、特定タイプのＬ鎖間で本質的に同一であり、「定常」(C)領域と称される。アミノ末端ドメインは、Ｌ鎖の間で変化しており、抗体の結合サイトとして寄与する。その変異性から、その領域は「可変性」(V)領域と称される。
【００６３】
Ｉｇ分子のＨ鎖は、いくつかのクラス、α、μ、σ、α、およびγを含む（このなかにはいくつかのサブクラスが存在する）。1以上のユニットの２つの同一のHおよびL鎖からなる会合したＩｇ分子の名称は、その分子の具備するＨ鎖に由来する。
従って、５つのＩｇアイソタイプが存在する、即ち：IgA、IgM、IgD、IgEおよびIgG（Ｈ鎖の差に基づく４つのサブクラス、即ち、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4を有する)である。抗体の構造及びその多様な機能に関する更なる詳細な事項は、Using Antibodies: A laboratory manual, Cold Spring Harbour Laboratory Pressに記載されている。
【００６４】
キメラ抗体は組換え型の抗体であって、マウスまたはラット抗体の全てのＶ領域がヒト抗体Ｃ領域と結合された抗体である。ヒト化抗体は、組換え型のハイブリッド抗体であって、げっ歯類抗体Ｖ領域の相補性決定領域をヒト抗体Ｖ領域のフレームワーク領域と融合した抗体である。ヒト抗体に由来するＣ領域も使用される。相補性決定領域(CDRs)は、抗体の重および軽鎖双方のＮ末端ドメイン内の領域であって、Ｖ領域の大多数の変異は該決定領域に限定されている。これらの領域は、抗体分子の表面でループを形成する。これらのループは、抗体および抗原の間の結合表面を提供する。
【００６５】
非ヒト動物に由来する抗体は、外来の抗体に対する免疫応答と循環系からのその抗体の除去とを生じる。キメラおよびヒト化抗体の双方はヒト被験者に注射した際に減少した抗原性を有している、なぜなら組換え型のハイブリッド抗体内でげっ歯類（即ち、外来の)抗体の量は減少しており、一方でヒト抗体領域は免疫応答を惹起しないからである。これにより、弱い免疫応答と抗体のクリアランスの減少とを生じる。
これは、ヒト疾患の治療において治療的な抗体を用いる場合には明らかに望ましい。ヒト化抗体は、「外来の」抗体領域が少なくなるように設計され、従ってキメラ抗体に比べてより免疫原性が低いと考えられる。
【００６６】
本発明の更に好適な態様において、前記抗体はオプソニン抗体（opsonic antibodies）である。
【００６７】
食作用はマクロファージおよび多形核白血球（polymorphic leukocytes）が担っており、微生物、傷害されたもしくは死んだ細胞、細胞片、不溶性粒子および活性化した凝固因子の摂取並びに消化を伴う。オプソニンは、上記の異物（foreign bodies）の食作用を促進する薬剤である。オプソニン抗体（Opsonic antibodies）は、それゆえに同じ機能を提供する抗体である。オプソニンの例は、抗体のＦｃ部分または補体C3である。
【００６８】
本発明の別側面において、本発明によるヒト化された又はキメラの抗体を発現させるために適切なベクターを提供する。
【００６９】
本発明のなお更なる側面において、本発明によるヒト化された若しくはキメラの抗体をコード化したベクターで形質転換またはトランスフェクトされた細胞或いは細胞株を提供する。
【００７０】
本発明のなお更なる側面によると、本発明によるヒト化された若しくはキメラの抗体を産生するための方法が提供され、該方法は下記を含む、即ち：
(i)本発明によるヒト化された若しくはキメラの抗体をコード化している核酸分子を具備するベクターで形質転換またはトランスフェクトされた細胞を提供することと；
(ii)前記細胞を前記抗体の製造を助長する条件下で成長させることと；
(iii)前記抗体を前記細胞から又はその成長環境から精製することと；
を含む。
【００７１】
本発明のなお更なる側面において、これまで記載したようなモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株が提供される。
【００７２】
本発明の更なる側面において、本発明によるハイブリドーマ細胞株を用いて、本発明によるモノクローナル抗体を産生させる方法が提供される。
【００７３】
本発明の更なる側面において、本発明によるモノクローナル抗体を産生しているハイブリドーマ細胞株を調製するための方法が提供され、該方法は下記の工程を含む、即ち：
i)免疫適格な哺乳類（an immunocompetent mammal）を少なくとも表8または10に示されるアミノ酸配列を有する１ポリペプチド、或いはその断片を含む免疫原で免疫することと；
ii)免疫された免疫適格な哺乳類のリンパ球をミエローマ細胞と融合してハイブリドーマ細胞を形成することと；
iii)工程(ii)のハイブリドーマ細胞により産生されたモノクローナル抗体を(i)のアミノ酸配列に対する結合活性に関してスクリーニングすることと；
iv)ハイブリドーマ細胞を培養して前記モノクローナル抗体を増殖および／または分泌させることと；並びに
v)前記モノクローナル抗体を培養上清から回収することと、を含む。
【００７４】
好ましくは、前記免疫適格な哺乳類はマウスである。或いは、前記免疫適格な哺乳類はラットである。
【００７５】
ハイブリドーマ細胞を用いたモノクローナル抗体の産生は、当該技術分野において公知である。モノクローナル抗体を産生する方法は、KohlerおよびMilstein〔（Nature 256, 495-497 (1975)）、またDonillardおよびHoffman（"Basic Facts about Hybridomas" in Compendium of Immunology V. II ed. by Schwartz, 1981）に開示されており、これらは参照により援用される。
【００７６】
本発明の更なる側面において、Staphylococcus aureus関連の敗血症（septicaemia）、食中毒または皮膚疾患を治療する医薬の製造における抗体の使用が提供される。
【００７７】
本発明の別側面において、Staphylococcus epidermidis関連の敗血症、腹膜炎または心内膜炎を治療する医薬の製造における本発明の抗体の使用が提供される。
【００７８】
本発明の方法により同定されたポリペプチドが、病原体による感染〔例えば、敗血症；結核；細菌が関連した食中毒；血液感染症；腹膜炎；心内膜炎；敗血症；髄膜炎；肺炎；胃潰瘍；淋病；連鎖球菌性咽頭炎（strep throat）；streptococcalが関連する毒素ショック；壊死性の 筋膜炎；インペチゴ；ヒストプラスマ症；ライム病；胃腸炎；赤痢；細菌性赤痢〕が原因の疾患範囲に対する治療抗体の生産を促進することが明らかである。
【００７９】
以前に既に述べられたように、微生物は広範囲の病気を発症させる。下記に示される事項は、限定される事項ではないが、いくつかの微生物とその微生物が原因となる病気である。
【００８０】
【表Ａ】
0004404627.tif 000002
【００８１】
以下に本発明の態様が、実施例のみにより、また下記の材料、方法、および表を参照することにより説明される：
【００８２】
表１は、ぺプチド  HexAと反応性のモノクローナル抗体を産生するための免疫化（immunization）および採血のスケジュール（bleed schedule）を示す。
【００８３】
表２は、ペプチド  HexAで免疫したマウス血清の免疫アッセイを示す；
【００８４】
表３は、抗HexA  ハイブリドーマ上清のイムノアッセイを示す；
【００８５】
表４は、ぺプチド  29kDaぺプチドと反応性のモノクローナル抗体を産生するための免疫化および採血スケジュールを示す；
【００８６】
表５は、ぺプチド  29kDaで免疫したマウスからの９８日目の血清の免疫アッセイを示す；
【００８７】
表６は、T75カルチャーフラスコの抗29kDaハイブリドーマの上清のイムノアッセイを示す；
【００８８】
表７は、前記スクリーニング方法により同定されたS.aureausの部分的な遺伝子配列のＤＮＡ配列を示す；
【００８９】
表８は、表７に示されたＤＮＡ配列によりコードされたタンパク質配列を示す；
【００９０】
表９は、前記スクリーニング方法により同定されたS.epidermidisの部分的な遺伝子配列のＤＮＡ配列を示す；並びに
【００９１】
表１０は、表９に示されたＤＮＡ配列のタンパク質配列を示す；
【００９２】
［材料および方法］
S.aureusおよびS.epidermidisのゲノムライブラリーのスクリーニング
【００９３】
S.aureus  8325/4およびS.epidermidisのゲノムDNAのλZAP発現ライブラリを使用した。それは、全体ゲノムDNAの部分的なSau3A消化産物に由来する2〜1Okbの断片を含有している。これを前記ベクターのBamHl部位にクローン化した。前記ライブラリは、前記ゲノムの＞１０ｘ  被覆度（coverage）を含有している。前記ライブラリを、9cm直径ペトリ皿上の約20,000プラーク形成単位の初期スクリーンを用いて、プラークリフトによりプローブした。
使用したプレーティング細胞、それらの処理、プレーティング手順および緩衝液は、製造者の手引き(ストラタジーン)に記載されたとおりである。プレーティング細胞、大腸菌  XL1-Blue  MRF'をファージに感染させ、そして3mlのトップＬＢアガー（10mM  MgS04を含有）中にいれてＬＢプレート（10mM  MgS04を含有）上にプレーティングした。そのプレートを次にインキュベーションした（42℃、４時間）。8.5cm直径ニトロセルロースフィルターディスク(事前に10mM  IPTGに浸漬し、空気乾燥させた)を、各プレートに配置し、その位置をマークした。そのプレートを次に更にインキュベーションした（3.5時間、37℃）。そのフィルターを除去し、そしてTBST緩衝液中で洗浄し、6%（w/v）乾燥スキムミルクおよび3%（v/v）ブタ血清(シグマ)を含有しているTBST中で４℃、一晩ブロッキングした。前記血清を使用して前記フィルター上の任意のプロテインＡクローンをブロックした。そのフィルターを次にブロッキング溶液に希釈した患者血清(1/5000希釈)で処理する（９０分間、室温で）。抗血清は、主にS.aureus感染症から回復（convalescing）した患者から取得した。そのフィルターを次にTBST中で3x10分間洗浄する。使用した二次抗体はヤギ抗-ヒト全IgGアルカリホスファターゼ結合(シグマ)を1/30,000に希釈（ブロッキング溶液中で）したもので、それを室温で３０分間処理した。そのフィルターを次に上記のように洗浄し、標準の比色方法を用いて発色させた。
【００９４】
交差反応性のプラークは寒天プレート上に存在し、0.2mlファージ緩衝液（0.02mlクロロホルムを有する）中にそのプラークのコアを導入した。各コアストックの力価が決定され、ファージを約200プラーク／プレートでプレーティングした。プラークリフトとスクリーンを上記のように実施して単一の、純粋な、交差反応性クローンを取得した。
【００９５】
純粋なクローンを次にプレート上にスポット(1μl)し、0.5cm直径のコンフルエントプラークを生じさせた。30個の個々のクローンを各プレート上にスポットできる。プラークリフトを実施し、前記フィルターを適切な血清でプローブした。この様式でクローンを、他の患者の血清、非感染ドナーの血清および抗プロテインＡ血清との交差反応性に関して検査できる。
【００９６】
個々のクローンを次に切断して、ファージミド（大腸菌XLOLR中に）を製造者のプロトコール(ストラタジーン)を用いて作出した。各々のプラスミドのミニプレップを実施し、ゲノムインサート（genomic insert）のサイズを制限酵素地図を作成して決定した。クローン化したインサートの同一性を、ベクター配列に対するプライマーを用いてＤＮＡシークエンシングにより決定した（これによりインサートを横切ったシークエンシングが可能である）。パブリックドメインのデータベースに対して解明された配列を比較することより、クローン化した遺伝子（ｓ）の素性を決定することが可能である。
【００９７】
ハイブリダイゼーション溶液／条件
典型的には、ハイブリダイゼーション条件は、4〜6xSSPE(20xSSPEは、175.3g塩化ナトリウム、88.2g  NaH2PO4  H20および7.4g  EDTAを１リッターに溶解し、そしてpHを7.4に調整したものを含有する)；5〜1Oxデンハルト溶液(50xデンハルト溶液は、5gフィコール(タイプ400、ファルマシア)、5gポリビニルピロリドン  abd  5gウシ血清アルブミンを含有する)；100μg〜1.Omg/ml超音波処理したサケ／ニシンDNA；0.1〜1.0%ソディウムドデシル硫酸；随意的に40〜60%の脱イオン化したホルムアミドを使用する。ハイブリダイゼーション温度は、核酸標的配列のＧＣ含量に依存して変動するが、典型的には42℃〜65℃の間である。
【００９８】
試験候補のワクチンポリペプチドに関するマウスモデル
マウスの静脈内に5x107のS.aureusを注射し、そして死亡率、菌血症および膿瘍形成（abscess formation）を、その後７日間モニターした。この用量で１００％のマウスは４日を超えて菌血症であり、１００％は検出可能な膿瘍形成を肝臓および腎臓に有し、８０％を超えるマウスは４日以内に死亡する。注射した生物が低い用量では、菌血症は検出可能であるが死亡はしない。
【００９９】
免疫化プログラム
単一（Single）のタンパクを10〜100ug／マウスの用量でRIBIアジュバント中に混合して注射し、14および28日後にブーストし、その後の14および28日に彼等の血清中の抗体の評価をELISAを用いて実施する。タンパク質のグループを注射した場合、各々のタンパク質の最終的な量を1Oug／マウスにして、上記の免疫化スキームを実施する。
【０１００】
単一の又はグループのタンパク質の防御効率の評価
我々は上記のマウス感染モデルを採用して、試験されるタンパク質の防御効率を評価する。この目的を達するために、5マウスのグループを上記のような単独のタンパク質または５タンパク質の貯蔵物（pools）で免疫する。我々は注射したタンパク質に対する抗体力価をモニターし、高力価が達成された場合に我々はマウスにS aureusを高および低用量で接種する。免疫されなかった又はアジュバントのみで免疫されたコントロールマウスも、S aureusを接種される。全グループにおける菌血症、膿瘍形成および生存のレベルを測定する。感染の全パラメータは、防御抗体を高い循環レベルで有しているマウスにおいては抑制される。もし我々が防御を誘導するタンパク質のプールを見出せば、我々は個々の成分により誘導された防御と前記タンパク質のプールにより誘導された防御とを比較して、防御が単一のタンパク質により誘導されたのか又は複数のタンパク質に対する抗体の組み合わせ作用により誘導されたのかを判断する。
このアプローチを用いて、我々は防御的（protective）なタンパク質エピトープを同定する。
【０１０１】
マウス感染のインビボモデルを用いることに加え、我々はマウスから血清を取得し（そのマウスは上記のように注射される）、彼等の血清をオプソノファゴサイトーシス活性（opsonophagocytic activity）に関して補体依存的な系を用いてヒト多形核白血球の存在下でモニターする。このアッセイは、当該技術分野において公知である。このアッセイは、インビトロの代理的なもの（an in vitro surrogate）として、抗体の防御効率を測定するために使用される。次にオプソノファゴサイトーシス抗体を有するマウスから摘出した脾臓を、融合パートナーとして用いるS.aureusと反応性のモノクローナル抗体を作出する実験試行に使用した。
【０１０２】
この多方面のアプローチを用いることにより、防御的エピトープ（protective epitopes）（このエピトープはワクチンの構築やモノクローナル抗体の産生に使用できる）の同定可能性に関して高い確信を得られる。
【実施例】
【０１０３】
＜実施例１＞
ペプチド  HexAと反応性の抗体を検出するための免疫アッセイ
【０１０４】
HexAに対するマウス血清またはMAbsの結合を、HexAでコートしたウェル上で免疫アッセイにより測定した。PBS中でHexAの250〜500ng/ml溶液の100マイクロリッターを、Nunc  Maxisorp  Stripwellsに分配（反復をとる）し、そして一晩室温でインキュベーションした。非結合性の物質をPBS-Tで４回洗浄することによりウェルから除去した。非結合性の抗原をPBS-Tで４回洗浄することによりプレートから除去した。次に抗体（PBS-T中に希釈した）をウェルに添加し、室温で30〜60分間インキュベーションした。前記抗体の添加後、前記ウェルを室温で30〜60分間ドラフトフリーの環境下でインキュベーションした。そのウェルをPBS-Tで再び４回洗浄し、次に95μlの検出抗体を各ウェルに添加した。検出抗体には、ペルオキシダーゼ-標識ヤギ抗-マウスIgG(ガンマ特異的)（PBS-T中で1:10000に希釈）、またはペルオキシダーゼ-標識ウサギ抗-マウスIgG1（PBS-T中で1:6000に希釈）の何れかを使用した。
【０１０５】
室温での更なる30〜60分のインキュベーションに続いて、ウェルを４回PBS-Tで洗浄し、各ウェルに100μlのTMB基質溶液(BioFx  #TMBW-0100-01)を加えた。プレートを暗闇中室温で１５分間インキュベーションし、結合反応を100μlのTMB停止液(BioFx  #STPR-0100-01)を添加することにより停止させた。各ウェルの吸光度を450nmでプレートリーダーを用いて測定した。
【０１０６】
アイソタイプをZymed  Laboratories(Cat.  No.  90-6550)から入手したマウス免疫グロブリンアイソタイプキットを用いて決定した。
【０１０７】
ペプチド  HexAと反応性のモノクローナル抗体産生のためのマウス免疫
５匹の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（約８週齢）を表１に記載されたスケジュールにしたがいHexAで免疫した。全ての免疫は、50%RIBIアジュバント中で皮下に投与することにより実施された。マウスから採取した血清を免疫アッセイにより検査し、表２に記載のアッセイの結果に基づいてマウス2021をハイブリドーマ産生に関して選択した。マウス2021に32.5ugのHexA（PBS中）の追加免疫をハイブリドーマの産生の３日間前に接種（腹腔内に投与）した。
【０１０８】
【表１】
0004404627.tif 000003
表１  ペプチド  HexAと反応性のモノクローナル抗体産生のための免疫および採血スケジュール
【０１０９】
【表２】
0004404627.tif 000004
表２  ペプチド  HexAで免疫したマウスから採血した血清のイムノアッセイ
【０１１０】
HexA  ペプチドと反応性のハイブリドーマの調製
ハイブリドーマを、Shulman、WildeおよびKohler並びにBartalおよびHirshaut(34、48)の一般的方法により調製した。マウス2021をハイブリドーマ産生に関して免疫アッセイの結果に基づいて選択し、32.5ugの抗原で殺傷の３日前に追加免疫した。マウス2028から採取した脾臓細胞を分離し、マウスミエローマ細胞SP2/0(ATCCカタログ番号CRL  1581)と１０脾臓細胞：１ミエローマの比率で混合した。細胞を遠心分離(400Xg、10分間、室温で)によりペレットにし、そして血清フリーの培養液中で洗浄した。上清をできるだけ除去し、細胞混合物の融合を無菌の50ml遠心コニカル中で、1mlの温かい(37℃)ポリエチレングリコール(PEG；mw  1400；Boehringer  Mannheim)を60〜90秒間添加することにより達成した。PEGを1、2、4、8、16および19mlsの連続的な容量の無血清培地の緩徐な添加により希釈した。ハイブリドーマ細胞懸濁液を、培養液中に穏やかに再懸濁し、遠心分離(500Xg、10分間、室温で)によりペレットにした。上清を除去し、細胞を培養液RPMI1640〔15%の熱失活させたウシ胎児血清、0.05mM  ヒポキサンチンおよび16μMチミジンを添加した(HT培地)〕に再懸濁した。100μlのハイブリドーマ細胞を96ウェル組織培養プレートの952ウェルに移植した。８ウェル(プレートAのカラム1)に、約2.5X104  SP/20細胞を入れた（100μl中に）。SP/20細胞を、２４時間後に添加した選択培地による殺傷に関するコントロールとして用いた。
【０１１１】
ハイブリドーマ調製の24時間後、100μlのRPMI1640〔15%熱失活させたウシ胎児血清、0.1mMヒポキサンチン、0.8μMアミノプテリンおよび32μMチミジンを添加した(ＨＡＴ培地)〕を各ウェルに添加した。
ハイブリドーマ調製の96時間後、プレートA、カラム1のSP/20細胞は死亡したように思われ、このことはHAT選択培地が非融合SP/20細胞の殺傷に成功したことを示唆している。
【０１１２】
ハイブリドーマ調製の１０日後、全ウェルの上清をペプチド  HexAと反応性の抗体の存在についてELISAで検査した。この予備的なアッセイの結果に基づいて、３つのウェルの細胞を24ウェル培養皿に移し、増殖させた。これらの培養物の上清をペプチド  HexAと結合する抗体の存在に関してELISAにより再検査した。
【０１１３】
IgG-1-特異的な検出を用いて、ハイブリドーマ培養物  02-101FE1、02-101ED8および02-100JC10から得られた吸光度値は、それぞれ2.150、2.230および2.574であった（緩衝剤単独での吸光度の0.044と比較して）(表３)。吸光度は、ガンマ特異的な検出では低かった（しかし、なお陽性であった）（表３）。各々の培養物を増殖させ、凍結保存し、限定希釈によりクローン化した。各培養物の２−３クローンを増殖させ、後に評価するため凍結保存した。
【０１１４】
【表３】
0004404627.tif 000005
表３  抗HexA  ハイブリドーマ上清のイムノアッセイ
【０１１５】
＜実施例２＞
ペプチド  29kDaと反応性の抗体を検出するためのイムノアッセイ
【０１１６】
29kDaに対するマウス血清またはMAbsの結合を、免疫アッセイにより29kDaでコートしたウェル上で測定した。29kDaの500〜1000ng/ml溶液の100マイクロリッター（PBS中）を、Nunc  Maxisorp Stripwellsに分配（反復をとる）し、一晩室温でインキュベーションした。非結合性の物質をPBS-Tで４回洗浄することによりウェルから除去した。非結合性の抗原をPBS-Tで４回洗浄することによりプレートから除去した。次に抗体（PBS-T中に希釈した）をウェルに添加し、室温で30〜60分間インキュベーションした。前記抗体の添加後、前記ウェルを室温で30〜60分間ドラフトフリーの環境下でインキュベーションした。そのウェルをPBS-Tで再び４回洗浄し、次に95μlの検出抗体を各ウェルに添加した。前記検出抗体には、ペルオキシダーゼ-標識ヤギ抗-マウスIgG(ガンマ特異的)（PBS-T中で1:10000に希釈）、ペルオキシダーゼ-標識ウサギ抗-マウスIgG1（PBS-T中で1:6000に希釈）の何れかを使用した。
【０１１７】
室温での更なる30〜60分のインキュベーションに続いて、ウェルを４回PBS-Tで洗浄し、各ウェルに100μlのTMB基質溶液(BioFx  #TMBW-0100-01)を加えた。プレートを暗闇中室温で１５分間インキュベーションし、結合反応を100μlのTMB停止液(BioFx  #STPR-0100-01)を添加することにより停止させた。各ウェルを450nmでMolecular  Devices  Vmaxプレートリーダーを用いて測定した。
【０１１８】
アイソタイプをZymed  Laboratories(Cat.  No.  90-6550)から入手したマウス免疫グロブリンアイソタイプキットを用いて決定した。
【０１１９】
ペプチド  29kDaと反応性の抗体を検出するためのイムノアッセイ
29kDaに対するマウス血清またはMAbsの結合を29kDaでコートしたウェル上で免疫アッセイにより測定した。 29kDaの500〜1000ng/ml溶液の100マイクロリッター（PBS中）をNunc Maxisorp Stripwellsに分配（反復をとる）し、一晩室温でインキュベーションした。非結合性の物質をPBS-Tで４回洗浄することによりウェルから除去した。非結合性の抗原をPBS-Tで４回洗浄することによりプレートから除去した。次に抗体（PBS-T中に希釈し）をウェルに添加し、室温で30〜60分間インキュベーションした。抗体の添加後、ウェルを室温で30〜60分間ドラフトフリーの環境下でインキュベーションした。そのウェルをPBS-Tで再び４回洗浄し、次に95μlの検出抗体を各ウェルに添加した。前記検出抗体には、ペルオキシダーゼ-標識ヤギ抗-マウスIgG(ガンマ特異的)（PBS-T中で1:10000に希釈）、ペルオキシダーゼ-標識ウサギ抗-マウスIgG1（PBS-T中で1:6000に希釈）の何れかを使用した。
【０１２０】
室温での更なる30〜60分のインキュベーションに続いて、ウェルを４回PBS-Tで洗浄し、各ウェルに100μlのTMB基質溶液(BioFx  #TMBW-0100-01)を加えた。プレートを暗闇中室温で１５分間インキュベーションし、結合反応を100μlのTMB停止液(BioFx  #STPR-0100-01)を添加することにより停止させた。各ウェルを450nmでMolecular  Devices  Vmaxプレートリーダーを用いて測定した。
アイソタイプをZymed  Laboratories(Cat.  No.  90-6550)から入手したマウス免疫グロブリンアイソタイプキットを用いて決定した。
【０１２１】
ペプチド  29kDaと反応性モノクローナル抗体産生のためのマウス免疫
５匹の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（約８週齢）を表１に記載されたスケジュールにしたがいHexAで免疫した。全ての免疫は、50%RIBIアジュバント中で皮下に投与することにより実施された。マウスから採取した血清を免疫アッセイにより検査し、表２に記載のアッセイの結果に基づいてマウス2028をハイブリドーマ産生に関して選択した。マウス2028に50ugの29kDa（PBS中）の追加免疫をハイブリドーマの製造の３日間前に接種（腹腔内に投与）した。
【０１２２】
【表４】
0004404627.tif 000006
表４  ペプチド  29kDaと反応性のモノクローナル抗体産生のための免疫および採血スケジュール
【０１２３】
【表５】
0004404627.tif 000007
表５  ペプチド  29kDaで免疫したマウスから採血した９８日目の血清のイムノアッセイ
【０１２４】
29kDa  ペプチドと反応性のハイブリドーマの調製
ハイブリドーマを、Shulman、WildeおよびKohler並びにBartalおよびHirshaut(34、48)の一般的方法により調製した。マウス2028をハイブリドーマ産生に関して免疫アッセイの結果に基づいて選択し、50ugの抗原で殺傷の３日前に追加免疫した。マウス2028から採取した脾臓細胞を分離し、マウスミエローマ細胞P3X63Ag8.653 (ATCCカタログ番号CRL  1580)と１０脾臓細胞：１ミエローマの比率で混合した。細胞を遠心分離(400Xg、10分間、室温で)によりペレットにし、そして血清フリーの培養液中で洗浄した。上清をできるだけ除去し、細胞混合物の融合を無菌の50ml遠心コニカル中で、1mlの温かい(37℃)ポリエチレングリコール(PEG；mw  1400；Boehringer  Mannheim)を60〜90秒間添加することにより達成した。PEGを1、2、4、8、16および19mlsの連続的な容量の無血清培地の緩徐な添加により希釈した。ハイブリドーマ細胞懸濁液を、培養液中で穏やかに再懸濁し、遠心分離(500Xg、10分間、室温で)によりペレットにした。上清を除去し、細胞を培養液RPMI1640〔15%の熱失活させたウシ胎児血清、0.05mM  ヒポキサンチンおよび16μMチミジンを添加した(HT培地)〕に再懸濁した。100μlのハイブリドーマ細胞を96ウェル組織培養プレートの952ウェルに移植した。８ウェル(プレートAのカラム1)に、約2.5X104  P3X63Ag8.653細胞を入れた（100μl中）。P3X63Ag8.653細胞を、２４時間後に添加した選択培地による殺傷に関するコントロールとして用いた。
【０１２５】
ハイブリドーマ調製の24時間後、100μlのRPMI1640〔15%熱失活させたウシ胎児血清、0.1mMヒポキサンチン、0.8μMアミノプテリンおよび32μMチミジンを補充した(ＨＡＴ培地)〕を各ウェルに添加した。
ハイブリドーマ調製の96時間後、レートA、カラム1のP3X63Ag8.653細胞は死亡したように思われ、このことはHAT選択培地が非融合P3X63Ag8.653細胞の殺傷に成功したことを示唆している。
【０１２６】
ハイブリドーマ調製の１０日後、全ウェルの上清をペプチド  29kDaと反応性の抗体の存在についてELISAで検査した。予備的なアッセイの結果に基づいて、３つのウェルの細胞を24ウェル培養皿に移し、増殖させた。数日後、これらの培養物の上清をペプチド  29kDaと結合する抗体の存在に関してELISAで再検査した。
【０１２７】
ハイブリドーマ培養物  02-100EC7、02-100HH10および02-100FG5から得られた上清の吸光度値を、表３に示す。これらの結果に基づき、培養物02-100EC7およびHH10を増殖させ、凍結保存し、限界希釈によりクローン化した。各培養物の２−３クローンを増殖させ、後で評価するため凍結保存した。
【０１２８】
【表６】
表６  T75カルチャーフラスコの抗29kDaハイブリドーマ上清から採取した上清のイムノアッセイ
0004404627.tif 000008
【表a】
0004404627.tif 000009
0004404627.tif 000010
0004404627.tif 000011
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【０１２９】
【表７】
0004404627.tif 000022
0004404627.tif 000023
0004404627.tif 000024
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【０１３０】
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【表１０】
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【配列表】
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