(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ア）乃至（ウ）から選択される核酸分子；
（ア）配列表の配列番号１１又は配列番号１３に記載のヌクレオチド配列と９０％以上同一なヌクレオチド配列からなり、且つ、スフィンゴ脂質をリン酸化する活性を有する蛋白質をコードする核酸分子、
（イ）配列表の配列番号１２又は配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする核酸分子、
（ウ）配列表の配列番号１１又は配列番号１３に記載のヌクレオチド配列からなる核酸分子。
【請求項２】
ＤＮＡである請求項１記載の核酸分子。
【請求項３】
ベクター及び請求項２の核酸分子を含む組換えＤＮＡ構築物。
【請求項４】
前記ベクターが発現ベクターである請求項３記載の組換えＤＮＡ構築物。
【請求項５】
前記ベクターが原核生物ベクター、又は、真核生物ベクターである請求項３又は４記載の組換えＤＮＡ構築物。
【請求項６】
請求項３乃至５のいずれかに記載の組換えＤＮＡ構築物で形質転換された宿主細胞。
【請求項７】
前記細胞が原核生物由来、又は、真核生物由来である請求項６の宿主細胞。
【請求項８】
下記の（Ａ）又は（Ｂ）に記載のポリペプチド；
（Ａ）請求項１の核酸分子にコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチド、（Ｂ）配列表の配列番号１２又は１４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項９】
請求項６又は７に記載の宿主細胞を、請求項８に記載のポリペプチドが生産される条件下で培養することを含む請求項８に記載のポリペプチドの生産方法。
【請求項１０】
請求項８のポリペプチドを特異的に認識する抗体。
【請求項１１】
下記の工程からなる請求項８に記載のポリペプチドのスフィンゴ脂質リン酸化活性を抑制または刺激する薬剤または医薬を検出する方法：
(a)請求項３乃至５のいずれか記載の組換えＤＮＡ構築物を細胞内に供給し、請求項８に記載のポリペプチドが該細胞内で生産されるようにする工程;
(b)該細胞に少なくとも一種類の医薬または薬剤を加える工程、及び
(c) 該細胞内の脂質のスフィンゴシンキナーゼ依存性のリン酸化を測定し、測定結果を該医薬または薬剤を入れていない対照と比較することにより、該医薬または薬剤が当該リン酸化を抑制または刺激するか否かを検出し、該対照と比較して脂質のスフィンゴシンキナーゼ依存性のリン酸化が減少する場合は、抑制する医薬または薬剤であるとし、該対象と比較して脂質のスフィンゴシンキナーゼ依存性のリン酸化が増加する場合は刺激性医薬または薬剤であるとする工程。
【請求項１２】
下記の工程を含む、試料中の請求項８に記載のポリペプチドの存在を検出する方法；
(i) 試料を請求項１０に記載の抗体と接触させる工程;及び
(ii)当該抗体と抗原の間で形成される抗原抗体複合体が存在するかしないかを検出する工程。
【請求項１３】
配列表の配列番号１１又は配列番号１３に記載のヌクレオチド配列中の連続した１８乃至４０のヌクレオチドと同一又は相補的なヌクレオチド配列からなるＰＣＲ用プライマーであるヌクレオチド。
【請求項１４】
配列表の配列番号１１又は配列番号１３に記載のヌクレオチド配列中の連続した２０乃至５００のヌクレオチドと同一、又は、相補的なヌクレオチド配列からなるプローブであるヌクレオチド。
【請求項１５】
請求項１３乃至１４に記載のヌクレオチドの内少なくとも一つのヌクレオチドと試料を接触させる工程を含むことからなる、試料中の請求項８に記載のポリペプチドをコードする核酸分子を検出する方法。
【請求項１６】
方法が、ポリメラーゼ連鎖反応、ノーザンハイブリダイゼーション、又は、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションである請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１３乃至１４に記載のヌクレオチドの内少なくとも一つのヌクレオチド及び付随的な試薬を含むキット。
【請求項１８】
下記の工程を含む、試料中に含まれる請求項８に記載のポリペプチドを定量的に検出する方法；
(i) 試料を請求項１０に記載の抗体と接触させる工程;及び
(ii)当該抗体と抗原の間で形成される抗原抗体複合体を定量的に検出する工程。
【請求項１９】
抗原抗体複合体の検出方法が、蛍光抗体分光法、比色法、ラジオイムノアッセイ又はサンドイッチ分析である事を特徴とする請求項１２又は１８に記載された方法。
【請求項２０】
請求項１０に記載の抗体及び付随的な試薬を含む検出用キット。
【請求項２１】
抗体が、酵素標識、放射性同位体標識、非放射性同位体標識又は化学発光標識されていることを特徴とする請求項２０に記載の検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願のクロスリファレンス）
本出願は、３５  ＵＳＣ  １１９（ｅ）の下で優先権が主張される２０００年４月３日に提出された仮出願番号６０／１９４，３１８の利益を請求する。
（政府の権利）
本発明は、国立衛生研究所からの許可ＧＭ  ４３８８０、及び米国陸軍医学研究及び材料指令前立腺癌研究プログラム（ＶＥＮ）からの博士号取得後奨学金ＢＣ９６１９６８の下における合衆国の支援によりなされた。
合衆国政府はこの発明において一定の権利を有している。
（本発明の背景）
（本発明の技術分野）
本発明は哺乳類(例えば、マウス及びヒト)のスフィンゴシンキナーゼタイプ２アイソフォーム、該アイソフォームの分子クローニング、及び該アイソフォームの使用方法に関する。
【０００２】
スフィンゴシンキナーゼタイプ１と比較すると、スフィンゴシンキナーゼタイプ２は別個の性質を有している。
【０００３】
（背景技術）
スフィンゴシン−１−ホスフェート（ＳＰＰ）は、生物学的に活性なスフィンゴ脂質代謝物質であり、細胞の内部及び外部において多様な生物学的プロセスを調節する。細胞内では、細胞の増殖と生存を調節するセカンドメッセンジャーとして働き、細胞外では、Ｇ−タンパク質結合レセプターであるＥＤＧ−１サブファミリーに対するリガンドとして作用する(Spiegel,  S.,  J.  Leukoc.  Biol.,  65,  (1999),  341-344;  Goetzl,  E.  J.,  An,  S.  FASEB  J.,  12,  (1998),  1589-1598)。従って、ＳＰＰは、細胞の成長及び生存を調節するセカンドメッセンジャーとしての重要な役割を果たす(Olivera,  A.,  Spiegel.  S.,  Nature,  365,  (1993),  557-  560;  Cuvillier,  O.,  Pirianov,  G.,  Kleuser,  B.,  Vanek,  P.  G.,  Coso.  O.  A.,  Gutkind,  S.,  and  Spiegel,  S.,  Nature,  381,  (1996),  800-803)。
【０００４】
多くの外部刺激、特に成長及び生存因子が、スフィンゴシンからＳＰＰを生成させる酵素であるスフィンゴシンキナーゼ（ＳＰＨＫ）を活性化する。
【０００５】
この急速に拡大しているリストには下記のものが含まれる：血小板由来の発育因子（ＰＤＧＦ）(Olivera,  A.,  Spiegel  S.,  Nature,  365,  (1993),  557-560;  Pyne,  S.,  Chapman,  J.  Steele,  L.,  and  Pyne,  N.  J.,  Eur.  J.  Biochem.,  237,  (1996),  819-826;  Coroneos,  E.,  Martinez,  M.,  McKenna,  S.  and  Kester,  M.,  J.  Biol.  Chem.,  270,  (1995),  23305-23309)、神経成長因子（ＮＧＦ）(Edsall,  L.  C.,  Pirianov,  G.  G.,  and  Spiegel.  S.,  J.  Neurosci.,  17,  (1997),  6952-6960;  Rius,  R.  A.,  Edsall,  L.  C.,  and  Spiegel,  S.,  FEBS  Lett.,  417,  (1997),  173-176)、ビタミンＤ３（Kleuser,  B.,  Cuvillier,  O.,  and  Spiegel.  S.,  Cancer  Res.,  58,  (1998),  1817-1824）、ムスカリン性アセチルコリン作用薬(Meyer  zu  Heringdorf,  D.,  Lass,  H.,  Alemany,  R.,  Laser.  K.  T.,  Neumann,  E.  Zhang,  C.,  Schmidt,  M.,  Rauen.  U.,  Jakobs,  K.  H.,  and  van  Koppen,  C.J.,  EMBO  J.,  17,  (1998),  2830-2837)、ＴＮＦ−α（Xia,  P.,  Gamble,  J.  R.,  Rye,  K.  A.,  Wang,  L.,  Hii.  C.  S.  T.,  Cockerill,  P.,  Khew-Goodall,  Y.,  Bert,  A.  G.,  Barter,  P.  J.,  and  Vadas,  M.  A.,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA,  95,  (1998),  14196-14201）及び免疫グロブリンレセプターＦｃｅＲ１の架橋(Choi,  O.  H.,  Kim,  J.-H.,  and  Kinet,  J.  P.,  Nature,  380,  (1996),  634-636)及びＦｃｇＲ１(Melendez,  A.,  Floto,  R.  A.,  Gillooly,  D.  J.,  Harnett,  M.  M.,  and  Allen,  J.  M.,  J.  Biol.  Chem.,  273  (1998),  9393-9402)。
【０００６】
細胞内のＳＰＰはさらに、ＩｎｓＰ３とは無関係に、細胞内の貯蔵からカルシウムを動員し(Meyer  zu  Heringdorf,  D.,  Lass,  H.,  Alemany,  R.,  Laser,  K.  T.,  Neumann,  E.  Zhang,  C.,  Schmidt,  M.,  Rauen,  U.,  Jakobs.  K.  H.,  and  van  Koppen,  C.  J.,  EMBO  J.,  17,  (1998),  2830-2837;  Mattie,  M.,  Brooker,  G.,  and  Spiegel,  S.,  Biol.  Chem.,  269,  (1994),  3181-3188)、増殖を促す種々のシグナル経路を誘導し(Rani,  C.S.,  Berger,  A.,  Wu.  J.,  Sturgill,  T.  W.,  Beitner-Johnson,  D.,  LeRoith,  D.,  Varticovski,  L.,  and  Spiegel,  S.,  J.  Biol.  Chem.,  272,  (1997),  10777-l0783;  Van  Brocklyn,  J.  R.,  Lee.  M.  J.,  Menzeleev,  R,  Olivera,  A.,  Edsall,  L.,  Cuvillier,  O.,Thomas,  D.  M.,  Coopman.  P.  J.  P.,  Thangada,  S.,  Hla.  T.,  and  Spiegel,  S.,  J.  Cell  Biol.,  142,  (1998),  229-240)、アポトーシスを抑制する(Cuvillier.  O.,  Pirianov,  G.,  Kleuser,  B.,  Vanek,  P.  G.,  Coso,  O.  A.,  Gutkind.  S.,  and  Spiegel,  S.,  Nature,  381,  (1996),  800-803;  Edsall,  L.  C.,  Pirianov,  G.  G.,  and  Spiegel,  S.  J.  Neurosci.,  17,  (1997),  6952-6960;  Van  Brocklyn,  J.R.,  Lee.  M.  J.,  Menzeleev,  R.,  Olivera.  A.,  Edsall,  L.,  Cuvillier,  O.,  Thomas,  D.  M.,  Coopman.  P.  J.  P.,  Thangada,  S.,  Hla.  T.,  and  Spiegel  S.,  J.  Cell  Biol.,  142,  (1998),  229-240)。
【０００７】
さらに、スフィンゴシンキナーゼの拮抗阻害剤はＳＰＰの生成を阻止し、これらの様々な刺激によって引き起こされるカルシウム輸送、細胞の増殖及び生存を選択的に阻止する(Spiegel,  S.,  J.  Leukoc.  Biol.,  65,  (1999),  341-344)。従って、スフィンゴ脂質代謝物質、セラミド及びＳＰＰのレベルの動的な平衡と、その結果生じる相反するシグナル経路の調整が、細胞の運命を決定する重要な因子であることが示唆されている(Cuvillier,  O.,  Rosenthal,  D.  S.,  Smulson,  M.  E.,  and  Spiegel,  S.,  J.  Biol.  Chem.,  273.  (1998),  2910-2916)。例えば、ストレス刺激はセラミドを増加させアポトーシスを誘導するが、生存因子はＳＰＨＫを刺激してＳＰＰレベルの増加を導き、これがアポトーシスを抑制する (Cuvillier.  O.,  Rosenthal,  D.  S.,  Smulson.  M.  E.,  and  Spiegel,  S.,  J.  Biol.  Chem.,  273.  (1998),  2910-2916)。
【０００８】
さらに、ＳＰＨＫ経路はＳＰＰの生成を通じて、ＴＮＦ−αに誘導される内皮細胞の活性化の媒介に重大な影響を及ぼし(Xia,  P.,  Gamble.  J.  R.,  Rye,  K.  A.,  Wang,  L.,  Hii,  C.  S.  T.,  Cockerill,  P.,  Khew-Goodall,  Y.,  Bert,  A.  G.,  Barter,  P.  J.,  and  Vadas.  M.  A.,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA.  95,  (1998),  14196-14201)、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の、サイトカインに誘導される接着分子の発現を阻止する能力は、このスフィンゴ脂質レオスタットをリセットする能力と関連している(Xia.  P.,  Gamble,  J.  R.  ,  Rye,  K.  A.,  Wang,  L.,  Hii.  C.  S.  T.,  Cockerill.  P.,  Khew-Goodall,  Y.,  Bert,  A.  G.,  Barter,  P.  J.,  and  Vadas,  M.  A.,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA,  95,  (1998),  14196-14201)。これは、粥状動脈硬化及び関連する冠状動脈の心臓病の進展に対するＨＤＬの保護機能にとって重要な意味合いを有する。最近のデータはさらにスフィンゴ脂質レオスタットをアレルギー反応に結びつけた(Prieschl,  E.,  E.,  Csonga,  R.,  Novotny,  V.,  Kikuchi,  G.  E.,  and  Baumruker,  T.,  J.  Exp.  Med.,  190,  (1999),  1-8)。
【０００９】
ＳＰＰが、Ｇ−タンパク質結合性細胞表面レセプターＥＤＧ−１のリガンドであるという発見により、ＳＰＰへの関心が最近高まってきた(Van  Brocklyn,  J.  R.,  Lee,  M.  J.,  Menzeleev,  R.,  Olivera.  A.,  Edsall,  L.,  Cuvillier,  O.,  Thomas,  D.  M.,  Coopman,  P.  J.  P.,  Thangada,  S,  Hla,  T.,  and  Spiegel,  S.,  J.  Cell  Biol.,  142,  (1998),  229-240;  Lee,  M.  J.,  Van  Brocklyn,  J.  R.,  Thangada,  S.,  Liu,  C.  H.,  Hand,  A.  R.,  Menzeleev,  R.,  Spiegel,  S.,  and  Hla,  T.,  Science,  279,  (1998),  1552-1555)。これは、やはりＳＰＰの特異的なレセプターである、ＥＤＧ−３、−５、−６及び−８と呼ばれる他のいくつかの関連するレセプターの同定を急速に導いた(Goetzl,  E.  J.,  and  An.  S.,  FASEB  J.,  12,  (1998),  1589-1598;  Spiegel,  S.,  and  Milstein,  S.,  Biochem.  Biophys.  Acta.,  1484(2-3)  :107-16,  (2000))。ＳＰＰと構造的に類似するが４位でのｔｒａｎｓ二重結合を欠き、しかもリゾホスファチジン酸でもスフィンゴシルホスホリルコリンでもないスフィンゴシン−１−ホスフェートも、これらのレセプターに結合する(Van  Brocklyn,  J.  R.,  Tu,  Z.,  Edsall,  L.  C.,  Schmidt,  R.  R.,  and  Spiegel,  S.,  J.  Biol.  Chem.,  274,  (1999)  4626-4632)。このことは、ＥＤＧ−１が、ＳＰＰと高い親和性及び特異性をもって結合するＧ−タンパク質結合レセプターの類に属することを示す（Goetzl,  E.  J.  and  An,  S.,  FASEB  J.,  12,  (1998),  1589-1598;  Spiegel.  S.  and  Milstien,  S.,  Biochem.  Biophys.  Acta.,  1484(2-3):107-16,  (2000)）。
【００１０】
レセプターのＥＤＧ−１類は、主として心血管・神経系において、区別可能に発現し、様々なＧ−タンパク質に結合する。これにより最終的に細胞タイプ及びＥＤＧレセプターの相対的な発現に依存する多面的反応へと繋がる種々のシグナル伝達経路を調節することができる。ＧＰＣＲであるＥＤＧ−１類の生物学的機能は完全には解明されていないが、最近の研究では、ＳＰＰのＥＤＧ−１への結合が細胞の移動及び化学走性を促すこと（Wang,  F.,  Van  Brocklyn,  J.  R.  ,  Hobson,  J.  P.,  Movafagh,  S.,  Zukowska-Grojec,  Z.,  Milstien.  S.,  and  Spiegel,  S.  J.  Biol.  Chem.,  274,  (1999),  35343-35350;  English,  D.,  Kovala,  A.  T.,  Welch,  Z.,  Harvey,  K.  A.,  Siddiqui,  R.  A.,  Brindley,  D.  N.,  and  Garcia,  J.  G.,  J.  Hematother.  Stem  Cell  Res.,  8,  (1999),  627-634）、そして結果として、血管新生を調節する可能性のあること(Wang.  F.,  Van  Brocklyn,  J.  R.,  Hobson,  J.  P.,  Movafagh.  S.,  Zukowska-Grojec,  Z.,  Milstien,  S.,  and  Spiegel,  S.  J.  Biol.  Chem.,  274  (1999)  ,  35343-35350;  Lee,  O.  H.,  Kim,  Y.  M.,  Lee,  Y.  M.,  Moon,  E.  J.,  Lee,  D.  J.,  Kim,  J.  H.,  Kim,  K.  W.,  and  Kwon,  Y.  G.,  Biochem.  Biophys.  Res.  Commun.,  264,  (1999)  743-750;  Lee,  M.  J.,  Thangada,  S.,  Claffey,  K.  P.,  Ancellini,  N.,  Liu,  C.  H.,  Kluk,  M.,  Volpi,  Sha'afi,  R.  I.,  and  Hla,  T.,  Cell,  99,  (1999),  301-312)が示唆されている。ＥＤＧ−５は、ニューロンの分化及び発生にとって重要な、軸索突起収縮における細胞骨格の再編成に役割を果たしている可能性がある（Van  Brocklyn,  J.  R.,  Tu,  Z.,  Edsall,  L.  C.,  Schmidt,  R.  R.,  and  Spiegel,  S.,  J.  Biol.  Chem.,  274,  (1999),  4626-4632;  MacLennan,  A.  J.,  Marks,  L.,  Gaskin,  A.  A.,  and  Lee,  N.,  Neuroscience,  79,  (1997)  ,  217-224）。
【００１１】
ＳＰＰの役割の厳密な評価には、その代謝を調節する酵素のクローニングを要する。最近、ネズミ腎臓ＳＰＨＫが明らかな均質度で精製され（Olivera,  A.,  Kohama,  T.,  Tu,  Z.,  Milstien,  S.,  and  Spiegel,  S.  J.  Biol.  Chem.,  273,  (1998),  12576-12583）、続いて最初の哺乳類ＳＰＨＫがクローン化され、ｍＳＰＨＫと命名された（Kohama,  T.,  Olivera,  A.,  Edsall,  L.,  Nagiec,  M.  M.,  Dickson,  R.,  and  Spiegel,  S.,  J.  Biol.  Chem.,  273,  (1998),  23722-23728）。これらとは別に、ＬＣＢ４及びＬＣＢ５と命名された二つの遺伝子も、Saccharomyces  cerevisiae中のＳＰＨＫ類をコードするとして示された（Nagiec,  M.  M.,  Skrzypek,  M.,  Nagiec,  E.  E.,  Lester,  R.  L.,  and  Dickson,  R.  C.,  J.  Biol.  Chem.,  273,  (1998)  19437-19442）。さらに、データベースにより、虫、植物及び哺乳動物を含む多数の広範囲な異なった生物種において、ｍＳＨＰＫ１の同族体が確認され、またこの酵素が高度に保存された遺伝子群のうちのひとつにコードされることが示された（Kohama,  T.,  Olivera,  A.,  Edsall,  L.,  Nagiec,  M.  M.,  Dickson,  R.,  and  Spiegel,  S.,  J.  Biol.  Chem.,  273,  (1998),  23722-23728）。既知のＳＰＨＫ１の推定アミノ酸配列の比較により、高度に保存されたアミノ酸の５つのブロックが明らかになった（Kohama,  T.,  Olivera,  A.,  Edsall,  L.,  Nagiec,  M.  M.,  Dickson,  R.,  and  Spiegel,  S.,  J.  Biol.  Chem.,  273,  (1998),  23722-23728）。しかしながら、いくつかの証拠は、多数の哺乳類ＳＨＰＫアイソフォームがあり得ることを示唆している。
【００１２】
血小板中のＳＰＨＫ活性はクロマトグラフィーにより、界面活性剤に対する異なる反応性及び既知のＳＰＨＫ阻害剤による阻害といういくつかの型に分画されうるであろうという発見は、ヒトの血小板中の多数の酵素型の存在を示す（Banno,  Y.,  Kato,  M.,  Hara,  A.,  and  Nazawa,  Y.,  Biochem.  J.,  335,  (1998),  301-304）。さらに、包括的データベースに対するホモロジー検索により、ＮＣＢＩの発現配列タグ（ｄｂＥＳＴ）のいくつかがｍＳＰＨＫ１ａの保存された領域に対してかなり高い相同性を有していることが明らかになり（Kohama,  T.,  Olivera,  A.,  E:dsall,  L.,  Nagiec,  M.  M.,  Dickson,  R.,  and  Spiegel,  S.,  J.  Biol.  Chem.,  273,  (1998)  ,  23722-23728)、実質的に差はなかった。
【００１３】
ＵＳＰ  ５，３７４，６１６は、哺乳類細胞の細胞増殖促進のための、スフィンゴシルホスホリルコリンを含有する組成物に関する。
【００１４】
ＷＯ  ９９／６１５８１には、マウスのスフィンゴシンＳＰＨＫ１ａ（３８１アミノ酸）及びＳＰＨＫ１ｂ（３８８アミノ酸）をコードするＤＮＡ断片が記載されている。
（発明の開示）
本発明の目的は、哺乳類（例えばマウスまたはヒト）のスフィンゴシンキナーゼタイプ２アイソフォームをコードする、単離及び精製されたＤＮＡ、及びそれによりコードされるペプチドを提供することにある。
【００１５】
本発明の別の目的は、ベクター及び上記ＤＮＡを含む組換えＤＮＡ構築物、並びに該組換えＤＮＡ構築物で形質転換された宿主細胞を提供することにある。
【００１６】
本発明のさらに別の目的は、該宿主細胞を培養することにより、マウス及びヒトのスフィンゴシンタイプ２アイソフォームペプチドを生産する方法を提供することにある。
【００１７】
本発明のさらに別の目的は、スフィンゴシンキナーゼ活性を抑制または促進する薬剤または医薬を検出するための方法を提供することにある。
【００１８】
本発明のさらに別の目的は、増加または減少した細胞増殖または増加または減少した細胞死に起因する疾病の治療または改善のため；並びに癌、再狭窄もしくは糖尿病性神経障害のような細胞の異常な移動もしくは運動性に起因する疾病の治療または改善のために、生物学的過程を調節する方法を提供することにある。
【００１９】
本発明は、また、スフィンゴシンキナーゼタイプ２アイソフォームのペプチドをコードする単離及び精製されたＤＮＡであって、Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ｂａｎｋｉｔ３２５７８７の配列及び  Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ｂａｎｋｉｔ３２５７５２の配列からなる群より選択される配列を含むＤＮＡにも関する。
【００２０】
本発明は、さらに下記の工程からなるスフィンゴシンキナーゼタイプ２活性を抑制または促進する薬剤または医薬を検出する方法に関する：
（ａ）前記組換えＤＮＡ構築物を細胞内に供給し、スフィンゴシンキナーゼタイプ２アイソフォームが該細胞内で生産されるようにすること；
（ｂ）該細胞に少なくとも一種類の医薬または薬剤を加えること、及び
（ｃ）細胞内の脂質のスフィンゴシンキナーゼ依存性のリン酸化を測定し、医薬または薬剤を入れていない対照と比較することにより、該医薬または薬剤がスフィンゴシンキナーゼタイプ２活性を抑制または促進するか否かを検出すること（該対象と比較して脂質のスフィンゴシンキナーゼ依存性のリン酸化が減少する場合は、抑制する医薬または薬剤であることを示し、該対象と比較して脂質のスフィンゴシンキナーゼ依存性のリン酸化が増加する場合は促進性医薬または薬剤であることを示す）。
【００２１】
上記に記載されたように、本発明はさらに、必要に応じて哺乳動物（例えばヒト）に、薬学的に有効な量の上記のようなペプチドを投与することを含む、哺乳動物において生物学的過程（例えばマイトジェネシス、アポトーシス、ニューロンの発生、化学走性、血管新生及び炎症反応）を調節する方法に関する。
【００２２】
さらに、上記に記載されたように、本発明は、必要に応じて哺乳動物（例えばヒト）に、薬学的に有効な量の上記のようなペプチドを投与することを含む、増加した細胞死または減少した細胞増殖に起因する疾病の治療または改善のための方法に関する。
【００２３】
さらに、上記のように、本発明は、必要に応じて哺乳動物（例えばヒト）に、薬学的に有効な量の上記のようなペプチドに対する抗体を投与することを含む、減少した細胞死または増加した細胞増殖に起因する疾病の治療または改善のための方法に関する。
【００２４】
さらに、上記のように、本発明は、必要に応じて哺乳動物（例えばヒト）に、薬学的に有効な量の上記のようなペプチドに対する抗体を投与することを含む、癌、再狭窄及び糖尿病性神経障害からなる群より選択される細胞の異常な移動または運動性に起因する疾病の治療または改善のための方法に関する。
【００２５】
本発明は、（ａ）生物学過程を調節するか、（ｂ）増加した細胞死または減少した細胞増殖に起因する疾病を治療または改善するか、（ｃ）減少した細胞死または増加した細胞増殖に起因する疾病を治療または改善するか、（ｄ）細胞の異常な移動または運動性に起因する疾病（例えば癌、再狭窄及び糖尿病性神経障害）を治療または改善するための、（ｉ）上記のような薬学的に有効な量のペプチドまたは上記のようなペプチドの抗体、並びに（ｉｉ）薬理学的に許容される担体を含む組成物に関する。
【００２６】
本発明は、さらに、スフィンゴシンキナーゼタイプ２活性を減少させるかまたは失わせる薬剤または医薬のスクリーニング方法に関し、該方法は、該薬剤または医薬の存在下でスフィンゴシンキナーゼタイプ２酵素活性の減少を検出することを含む。
【００２７】
さらに、本発明は、下記の工程を含む、試料中のスフィンゴシンキナーゼタイプ２アイソフォームの存在を検出する方法に関する：
（ｉ）試料を、スフィンゴシンキナーゼタイプ２を認識する抗体と接触させること；及び
（ｉｉ）スフィンゴシンキナーゼタイプ２とこれに特異的な抗体の間で形成される複合体が存在するか存在しないかを検出すること。
【００２８】
また、本発明は、試料をポリメラーゼ連鎖反応にかけ、スフィンゴシンキナーゼタイプ２の存在を検出することを含む、試料中のスフィンゴシンキナーゼタイプ２を検出する方法に関する。
【００２９】
本発明は、スフィンゴシンキナーゼタイプ２ＲＮＡまたはｃＤＮＡへのハイブリダイゼーション及び／またはスフィンゴシンキナーゼタイプ２配列の増幅に適する、スフィンゴシンキナーゼタイプ２ＲＮＡまたはｃＤＮＡに特異的なプライマーまたはオリゴヌクレオチド及び適当な付随的な試薬を含む、試料中のスフィンゴシンキナーゼタイプ２ＲＮＡ／ｃＤＮＡの検出のための診断キットに関する。
【００３０】
スフィンゴシンキナーゼは、スフィンゴシンのリン酸化を触媒し、ＳＰＰを生じさせる。マウスと、最近クローニングされたヒトのスフィンゴシンキナーゼ−１（ＳＰＨＫ１）（Kohama,  et  al.,  J.  Biol.  Chem.,  273,  23722-23728,  (1998)）に対する配列の相同性に基づいて、本発明は別のタイプのマウス及びヒトのスフィンゴシンキナーゼ（ｍＳＰＨＫ２とｈＳＰＨＫ２）のクローニング、機能的な特徴付け及び組織分布に導かれた。
【００３１】
本発明のｍＳＰＨＫ２及びｈＳＰＨＫ２は、６１７及び６１８個のアミノ酸からなるタンパク質を各々コードし、いずれもＳＰＨＫ１より大きく、いずれも既にＳＰＨＫ１で見つかっている保存領域を含んでいるが、それらの配列は中心部とアミノ末端とにおいて相当に相違する。複数のヒト及びマウスの組織のノーザンブロット分析により、ＳＰＨＫ２のｍＲＮＡ発現がＳＰＨＫ１のそれとは著しく異なっていて、脳、心臓、腎臓、睾丸及び肝臓において最も高いことが明らかになった。ＳＰＨＫ１の発現は７日齢マウス胚において最大となるのに対し、ＳＰＨＫ２の発現は１１日齢の胚で初めて検出可能であり、その後増加する。
【００３２】
ｍＳＰＨＫ２またはｈＳＰＨＫ２の発現ベクターで一時的にトランスフェクトしたヒト胚２９３腎細胞において、ＳＰＨＫ活性の増加が認められ、その結果ＳＰＰレベルが高くなった。明らかに、ＳＰＨＫ２はＳＰＨＫ１とは多少異なる基質特異性を有していた。Ｄ−エリスロスフィンガニン（ジヒドロスフィンゴシン，ＤＨＳ）はＳＰＨＫ２にとってＤ−エリスロスフィンゴシンより良好な基質であったのに対し、ＤＨＳはＳＰＨＫ１の有力な阻害剤であった。
【００３３】
より少ない程度ではあるが、ＳＰＨＫ２は、さらにフィトスフィンゴシン及びＤ，Ｌ−トレオジヒドロスフィンゴシンのリン酸化に触媒作用を及ぼした。ＳＰＨＫ１の拮抗阻害剤であるＤＭＳは驚くべきことにＳＰＨＫ２の非拮抗阻害剤であった。イオン強度を高めるとＳＰＨＫ１が阻害されたが、ＫＣｌとＮａＣｌは著しくＳＰＨＫ２活性を刺激した。さらに、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及びＢＳＡはＳＰＨＫ１に対するそれらの影響とは対照的に、ＳＰＨＫ２を阻害した。一方、ホスファチジルセリンは両方のタイプを刺激した。ここに示すデータは、ＳＰＨＫ２がこの脂質リン酸化酵素の増加しているクラスに属する新規な物質であり、種々の生物学的過程の調整、例えばマイトジェネシス、アポトーシス、ニューロンの発生、化学走性、脈管形成、また炎症反応において重要であることを示す。
（図面の簡単な説明）
発明を説明する目的で、特徴、観点及び利点を図中に示す。しかしながら、本発明は、図中に表されたものに限定されないと理解されるべきである。
Ｆｉｇ．１Ａは、予測されたアミノ酸配列の非Ｃｌｕｓｔａｌｗアラインメントに基づいたマウスのタイプ２スフィンゴシンキナーゼ（ｍＳＰＨＫ２）とヒトのタイプ２スフィンゴシンキナーゼ（ｈＳＰＨＫ２）の予測されるアミノ酸配列を示す。同一で保存されたアミノ酸置換はそれぞれ暗灰色及び淡灰色の陰をつけている。ダッシュは配列中のギャップを表わす。また、右側上の数は、ｍＳＰＨＫ２のアミノ酸配列を示す。保存された領域（Ｃ１〜Ｃ５）は、線で示されている。
Ｆｉｇ．１ＢはＳＰＨＫ１とＳＰＨＫ２の保存された領域の説明図である。ｍＳＰＨＫ２の一次配列がｍＳＰＨＫ１ａのそれと比較されている。
Ｆｉｇ．２Ａ、２Ｂ及び２Ｃは、タイプ１及びタイプ２スフィンゴシンキナーゼの組織特異的な発現を示すノーザンブロットである。
【００３４】
Ｆｉｇ．２Ａ中、ｍＳＰＨＫ２（上段のパネル）及びｍＳＰＨＫ１ａ（中段のパネル）プローブは、末端が標識され、以下に記載されているようなマウス組織からのポリ（Ａ）＋ＲＮＡブロットにハイブリダイズした。レーン１：心臓；２：脳；３：ひ臓；４：肺；５：肝臓；６：骨格筋；７：腎臓；８：精巣。β−アクチンプローブ（下段のパネル）をローディングコントロールとして用いた。
Ｆｉｇ．２Ｂは、ｈＳＰＨＫ２の組織特異的な発現を示す。レーン１：脳；２：心臓；３：骨格筋；４：結腸；５：胸腺；６：脾臓；７：腎臓；８：肝臓；９：小腸；１０：胎盤；１１：肺；１２：白血球。
Ｆｉｇ．２Ｃは、マウス胚発生中のｍＳＰＨＫ１ａとｍＳＰＨＫ２の発現を示す。７日、１１日、１５日及び１７日のマウス胚からのポリ（Ａ）＋ＲＮＡブロットをＦｉｇ．２Ａと同様に検出した。
【００３５】
Ｆｉｇ．３Ａ及び３Ｂは組換えＳＰＨＫ２の酵素活性を示すグラフである。
【００３６】
Ｆｉｇ．３Ａ中、ＨＥＫ２９３細胞は、一時的に空のベクターで、またはｍＳＰＨＫ２またはｈＳＰＨＫ２の発現ベクターでトランスフェクトされている。２４時間後に細胞質ゾル（白のバー）及び顆粒分画（斜線で塗られたバー）中のＳＰＨＫ活性を測定した。それぞれ、データは平均値±Ｓ．Ｄ．である。また、親細胞及びベクターでトランスフェクトされた細胞は、各々２６及び３７ｐｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇの基礎ＳＰＨＫ活性を有していた。
【００３７】
Ｆｉｇ．３Ｂは、ＳＰＨＫ２でトランスフェクトした後のＳＰＰの質量レベルの変化を示す。以下に記載したように、空のベクター（白抜き）で、ｍＳＰＨＫ２（左上がりの斜線）で、またはｈＳＰＨＫ２（右上がりの斜線）でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞中のＳＰＰの質量レベルを測定した。データはｐｍｏｌ／ｎｍｏｌリン脂質、で表される。
【００３８】
Ｆｉｇ．４Ａ〜４Ｄは、ｍＳＰＨＫ２の基質特異性を示すグラフである。
【００３９】
Ｆｉｇ．４Ａは、ｍＳＰＨＫ２でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の細胞質ゾル中で測定された、様々なスフィンゴシン類似体または他の脂質（５０  ｍＭ）のＳＰＨＫ依存性のリン酸化を示すグラフである。レーン：１：Ｄ−エリスロスフィンゴシン（Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｏ  Ｓｐｈ）；２：Ｄ−エリスロジヒドロスフィンゴシン（Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｏ  ＤＨＳ）；３：Ｄ，Ｌ−ｔｈｒｅｏ  ＤＨＳ；４：Ｎ，Ｎ−４−ジメチルスフィンゴシン（ＤＭＳ）；５：Ｃ２−セラミド；６：Ｃ１６−セラミド；７：ジアシルグリセロール；８：ホスファチジルイノシトール；９：フィトスフィンゴシン。データは、Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｏ  Ｓｐｈのリン酸化度（％）として表される。
【００４０】
Ｆｉｇ．４Ａ〜４Ｄは、Ｎ，Ｎ−ジメチルスフィンゴシンによる組換えＳＰＨＫ２の非拮抗的阻害を示すグラフである。
【００４１】
Ｆｉｇ．４Ｂは、ＤＭＳによるｍＳＰＨＫ２の投与量依存性の阻害を示す。Ｆｉｇ．４Ａに示すように形質転換した後のＨＥＫ２９３細胞溶菌液中のＳＰＨＫ活性は、ＤＭＳの濃度を増加させながら、１０(Ｍ  Ｄ−エリスロスフィンゴシンを用いて測定された。
【００４２】
Ｆｉｇ．４Ｃは、ＤＭＳ阻害の反応速度解析を示す。ＳＰＨＫ活性は、ＤＭＳの不存在下（白抜きの円）またはこれらの１０μＭ（塗りつぶした四角形）または２０μＭ（塗りつぶした三角形）の存在下で、Ｄ−エリスロスフィンゴシンの濃度を変えながら測定した。
Ｆｉｇ．４Ｄは、ラインウィーバー−バークプロットである。Ｄ−エリスロスフィンゴシンのＫｍは３．４μＭであった。ＤＭＳのＫｉ値は１２μＭであった。
【００４３】
Ｆｉｇ．５Ａ〜５Ｅは、ｍＳＰＨＫ２に対するｐＨ依存性及び塩の効果を示すグラフである。
【００４４】
Ｆｉｇ．５Ａは、下記の緩衝剤を使用して調整されたｐＨを有するリン酸化酵素緩衝剤中で測定された、形質転換されたＨＥＫ２９３細胞中の細胞質ゾルのＳＰＨＫ２活性を示す：２００ｍＭ  酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５〜５．５、白抜きの円）；２００ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ６〜７、塗りつぶした円）；２００ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ６．５〜８、白抜きの四角形）；２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７〜７．５、塗りつぶした四角形）；２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ７．５〜９、白抜きの三角形）；及び２００ｍＭホウ酸塩（ｐＨ１０、塗りつぶした三角形）。
【００４５】
Ｆｉｇ．５Ｂ〜５Ｅは、塩類がＳＰＨＫ２を刺激するが、ＳＰＨＫ１を阻害することを示す。
【００４６】
Ｆｉｇ．５Ｂ及び５Ｃ中、ＨＥＫ２９３細胞溶菌液中のＳＰＨＫ活性は、ＮａＣｌ  （白抜きの四角形）またはＫＣｌ（塗りつぶした円）の非存在下または存在下で、ｍＳＰＨＫ１（Ｆｉｇ．５Ｂ）またはｍＳＰＨＫ２（Ｆｉｇ．５Ｃ）でトランスフェクトした２４時間後に測定した。
【００４７】
Ｆｉｇ．５Ｄは、ＫＣｌによるＳＰＨＫ２活性化の反応速度解析を示す。ｍＳＰＨＫ２活性は、Ｄ−エリスロスフィンゴシンの濃度を変えながら、ＫＣｌの非存在下（白抜きの円）、５０ｍＭ  ＫＣｌ（白抜きの四角形）の存在下、または２００ｍＭ  ＫＣｌ（塗りつぶした四角形）の存在下で測定した。
【００４８】
Ｆｉｇ．５Ｅは、Ｆｉｇ．５Ｄからのデータのラインウィーバー−バークプロットである。Ｋｍ値はＫＣｌの存在によって影響を受けなかった。Ｖｍａｘ値は、０、５０及び２００ｍＭのＫＣｌの存在下で、各々０．１、０．３及び１（ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ）であった。
【００４９】
Ｆｉｇ．６Ａ〜６Ｂは、ＳＰＨＫ１とＳＰＨＫ２の活性にＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が異なる効果を奏することを示すグラフである。ＨＥＫ２９３細胞は、ｍＳＰＨＫ１ａ（白抜きの円）またはｍＳＰＨＫ２（塗りつぶした円）で形質転換した。また、細胞溶菌液中の各々の活性は、示された濃度のＴｒｉｔｏｎＸ−１００（Ｆｉｇ．６Ａ）またはＢＳＡ（Ｆｉｇ．６Ｂ）の存在下で、２４時間後に測定された。
【００５０】
Ｆｉｇ．６Ｃは、ホスファチジルセリンが、ＳＰＨＫ１とＳＰＨＫ２の活性に対して同様の効果を持つことを示すグラフである。ＨＥＫ２９３細胞はｍＳＰＨＫ１ａ（円）またはｍＳＰＨＫ２（三角形）で形質転換した。また、細胞溶菌液中の各々の活性は、示された濃度のホスファチジルセリン（塗りつぶした記号）またはホスファチジルコリン（白抜きの記号）の存在下で２４時間後に測定した。データは、添加物の非存在下で測定した対照の活性に対するパーセンテージで示した。
（発明の詳細な説明）
一つの実施態様において、本発明は、哺乳類（例えばマウス及びヒト）のスフィンゴシンキナーゼタイプ２アイソフォームをコードするＤＮＡまたはｃＤＮＡセグメントに関する。
【００５１】
さらに、本発明の単離された核酸分子には、遺伝子コードの縮重によって上記のものとかなり異なった配列を含むが、哺乳類スフィンゴシンキナーゼタイプ２をコードするＤＮＡ分子を含む。当然ながら、遺伝子コード及び種特異的なコドンの優先順位は当該分野において知られている。従って、上記のように縮重の変化を生じさせること、例えばコドンの発現を特定の宿主について最適化すること（例えば、ヒトのｍＲＮＡのコドンをＥ．ｃｏｌｉのような細菌宿主に好ましいものに変えること）は、当業者にとって汎用技術である。
【００５２】
本発明の核酸分子は、ｍＲＮＡのようなＲＮＡの形態でよく、または例えばクローニングにより得られたか合成的に生産されたｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡを含むＤＮＡの形態でもよい。ＤＮＡは二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、“センス鎖”としても知られるコード鎖でもよく、“アンチセンス鎖”ともいわれる非コード鎖でもよい。
【００５３】
「単離された」核酸分子は、生来の環境から取り出された核酸分子、ＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。例えば、ベクターに含まれている組換ＤＮＡ分子は、本発明の目的のために単離されたと考えられる。単離されたＤＮＡ分子の別の例としては、異種起源の宿主細胞中に保持された組換ＤＮＡ分子または溶液で（部分的にまたは実質的に）精製されたＤＮＡ分子が挙げられる。単離されたＲＮＡ分子は、本発明のＤＮＡ分子のｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏのＲＮＡ転写物を含む。本発明における単離された核酸分子は、合成的に産生された分子をも含む。
【００５４】
本発明はさらに、ここに記載されたヌクレオチド配列の部分または断片をコードする核酸分子に関する。断片は、Ｆｉｇ．１ＡのｍＳＰＨＫ２とｈＳＰＨＫ２についてののヌクレオチド配列の一部であって、少なくとも１０の連続するヌクレオチドの長さを有し、Ｆｉｇ．１Ａ中の各ヌクレオチド配列の第１ヌクレオチドの位置を１とした時に、任意に選択された二つの整数の一方が５’−ヌクレオチドの位置を表し、もう一方が３’ヌクレオチドの位置を表すものを含む。すなわち、少なくとも１０または１０と、Ｆｉｇ．１ＡのｍＳＰＨＫ２またはｈＳＰＨＫ２の全ヌクレオチド配列の長さから１を引いた数、の間の整数の連続するヌクレオチド塩基の長さを有する断片の５’及び３’のヌクレオチドの位置のすべての組合せを含む。
【００５５】
さらに、本発明は、ヌクレオチドの位置によってではなく、ヌクレオチドの大きさによって特定された断片を含むポリヌクレオチドを含む。本発明は連続するヌクレオチドにおいて、１とヌクレオチド配列全長マイナス１の間の整数から選ばれた、任意の断片サイズを有するものを含む。好ましい大きさは２０乃至５０のヌクレオチドを含む；５０乃至３００のヌクレオチドの大きさはプライマー及びプローブとして有用である。典型的な配列が由来し得る領域は、例えば、Ｆｉｇ．１Ａの中で示される領域Ｃ１−Ｃ５のような前記配列内の特異的なエピトープまたは領域をコードする領域を含むものであるが、これに限定されない。
【００５６】
また別の側面として、本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で上記本発明のポリヌクレオチド配列、例えばＦｉｇ．１Ａに示される核酸配列またはその特定の断片を含む、とハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子を提供する。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ'ｓ溶液、１０％硫酸デキストラン及び２０μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含む溶液中、４２(Ｃで一晩インキュベーションし、続いて約６５(Ｃの０．１×ＳＳＣ中でフィルタを洗浄することを意味する。
【００５７】
本発明のポリペプチドをコードする配列またはその部分配列は、当該分野で知られている追加の機能を提供する他の配列と融合されていても良い。該他の配列の例として、マーカー配列、または融合ポリペプチドの精製を容易にするペプチド、ヘルパーＴ細胞刺激を提供することが知られている抗原決定基を有するペプチド、翻訳後修飾のための部位をコードするペプチド、もしくは異種起源のリーダー配列のような、所望の位置への融合タンパク質のターゲティングのためのアミノ酸配列をコードする配列等が挙げられる。
【００５８】
本発明は、さらに、Ｆｉｇ．１Ａに示されるスフィンゴシンキナーゼタイプ２アイソフォームポリペプチドの一部、類似体または誘導体をコードする本発明の核酸分子の変異体に関する。変異体は、天然のアレル変異体のように、天然に生じ得る。「アレル変異体」は、生体の染色体の与えられた座を占める遺伝子のいくつかの代替的な型の一つを意味する。自然発生でない変異体は既知の突然変異誘発技術によって生じ得る。そのような変異体は、コード領域、非コード領域またはその両方において、一つ以上のヌクレオチドの置換、欠失または付加によって生じさせたものを含む。コード領域の変更は、保存的なまたは保存的でないアミノ酸の置換、欠失または付加を生じさせ得る。特にこれらのうち好ましいのは、ここに示されたスフィンゴシンキナーゼタイプ２アイソフォームポリペプチドまたはそれの部分の特性及び活性を変更しない、サイレントな置換、付加及び欠失である。この観点からも保存的な置換が好ましい。
【００５９】
別の側面として、本発明にはＦｉｇ．１Ａに示されるスフィンゴシンキナーゼタイプ２アイソフォームをコードする核酸分子と少なくとも９０乃至９９％の同一性を有する核酸分子が含まれる。これらの核酸は、それらがスフィンゴシンキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするか否かに関係なく含まれる。「スフィンゴシンキナーゼタイプ２活性を有するポリペプチド」とは、下記のアッセイで測定されるような、本発明のスフィンゴシンキナーゼタイプ２アイソフォームの活性と類似しているが同一ではない活性を示すポリペプチドを意味する。本発明のポリペプチドの生物活性もしくは機能は、高度に構造の同一性／類似性を有する他の生体からのポリペプチドと類似しているか同一であると予想される。
【００６０】
別の実施態様においては、本発明は、ベクター及び上記のようなＤＮＡ配列を含む組換ＤＮＡ分子に関する。ベクターは、プラスミド、細菌ウィルス、コスミド、ＹＡＣ、ＤＮＡベクターのような真核生物の発現ベクター、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、またはバキュロウイルスベクター、レトロウイルスのベクターまたはアデノウイルスのベクターのようなウイルスベクター、または当該分野で知られている他のものの形態であり得る。クローニングされた遺伝子は、プロモーター配列のような一定の制御配列または誘導可能及び／または細胞タイプに特異的な配列の制御下におかれてもよい（つまり、操作可能に結合されていてもよい）。適当なプロモーターは、当該分野において通常の技術を有する者に知られている。発現構築物は、さらに転写開始、終了のための部位、及び転写された領域の翻訳のためのリボソーム結合部位を含んでいてもよい。使用するのに好ましいベクターは、いくつか例を挙げると、ｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ２（Life  Technologies社）、ｐｃＤＮＡ３（Invitrogen社）である。
【００６１】
宿主細胞の中への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、エレクトロポレーション、感染、及び当該分野で知られている他の方法、及びCurrent  Protocols  in  Molecular  Biology,  Ausubel,F.M.  et  al.  (Eds),  Wiley  &  Sons,  Inc.のような標準の実験手引書に記載されている他の方法により達成することができる。上記及び下記に引用された全ての文献は、その全体が参考文献として本明細書に組み入れられる。
【００６２】
別の実施態様において、本発明は、上記の組換ＤＮＡ構築物により安定に形質転換されたかトランスフェクトされた宿主細胞に関する。宿主細胞は、原核生物（例えば細菌）、より下等な真核生物（例えば酵母または昆虫）、より高等な真核生物（例えばラット及びヒトを含むがこれに限定されない全ての哺乳類）であり得る。
【００６３】
指定の宿主と互換性を有する適当な調節配列が使用される場合、原核生物及び真核生物宿主細胞の両方を所望のコーディング配列の発現のために使用してもよい。原核生物の宿主の中では、大腸菌が最も頻繁に使用される。原核生物のための発現調節配列は、所望によりオペレーター部分を含んでいるプロモーター及びリボソーム結合部位を含んでいる。原核生物の宿主と互換性をもつトランスファーベクターは、一般に、例えばｐＢＲ３２２、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性を付与するオペロンを含むプラスミド、及び抗生物質耐性マーカーを付与する配列を含む様々なｐＵＣベクターから誘導される。これらのマーカーは選抜によって、成功した形質転換体を得るために使用され得る。一般的なクローニング方法の参考としては、例えば、Maniatis,  Fitsch  and  Sambrook著「Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual」(1982)または  D.  N.  Glover編「DNA  Cloning,  Volumes  I  and  II」(1985)が挙げられる。
【００６４】
ヒトのＳＰＨＫ２をコードするｃＤＮＡが挿入されたプラスミドを有する形質転換体、即ちＥ．ｃｏｌｉ  ｐＣＲ３．１−ｈＳＰＨＫ２  ＳＡＮＫ  ７０２００は、〒３０５−８５６６  茨城県つくば市東１丁目１−３、工業技術院生命工学工業技術研究所に、２０００年３月２９日に受託番号ＦＥＲＭＢＰ−７１１０で寄託されている。
【００６５】
本発明のＤＮＡ配列は、ＩｇＧ分子、アジュバント、担体またはグルタチオンＳ転移酵素のようなＳＰＨＫの精製のための助剤またはヒスチジンタグとして知られている一連のヒスチジン残基をコードする配列に操作可能な形で結合したベクターー中に存在することができる。組換分子は、培養系において真核細胞、例えば哺乳類の細胞、酵母細胞をトランスフェクトするのに適当であり得る。Saccharomyces  cerevisiae、Saccharomyces  carlsbergensis及びPichia  pastarisは最も一般に使用される酵母宿主であり、便利な菌宿主である。酵母ベクターのための調節配列は当該分野で知られている。発現のための宿主として利用可能な哺乳類細胞系は当該分野で知られており、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から得られる多くの不死化された細胞系を含む。いくつか例を挙げると、ＨＥＫ２９３細胞及びＮＩＨ３Ｔ３細胞が挙げられる。適当なプロモーターも当該分野で知られており、例えばＳＶ４０、ラウス肉腫ウィルス（「ＲＳＶ」）、アデノウイルス（「ＡＤＶ」）、ウシ乳頭腫ウィルス（「ＢＰＶ」）及びサイトメガロウィルス（「ＣＭＶ」）のようなウイルスのプロモーターが挙げられる。
【００６６】
哺乳類細胞は、さらにターミネーター配列及びポリＡ付加配列を要するかもしれない；発現を増加するエンハンサー配列が含まれていてもよく；遺伝子の増幅を引き起こす配列も望ましいかもしれない。これらの配列は当該分野で知られている。
【００６７】
形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞は、上記のＤＮＡ配列源として使用することができる。組換分子が発現系の形態をとる場合、形質転換またはトランスフェクトされた細胞は、下記のタンパク質源として使用することができる。
【００６８】
別の実施態様において、本発明は、ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬデータバンク受託番号ｂａｎｋｉｔ３２５７８７及びｂａｎｋｉｔ３２５７５２に対応するヌクレオチド配列の使用に関する。
【００６９】
上記ヌクレオチド配列から発現させたポリペプチドまたはアミノ酸配列とは、該ヌクレオチド配列によりコードされたポリペプチドと同一のアミノ酸配列からなるポリペプチドか、またはその部分であって、少なくとも２個乃至５個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも８個乃至１０個のアミノ酸、そしてさらに好ましくは少なくとも１５個のアミノ酸を含んでいるポリペプチドであるか、または該配列によりコードされたポリペプチドで免疫学的に同定可能なポリペプチドであるということができる。
【００７０】
組換えまたは誘導ポリペプチドは、必ずしも指定の核酸配列から翻訳されなくてもよい；それは、任意の方法、例えば、化学合成または組換え発現系の発現により生成されてもよい。さらに、ポリペプチドは、例えばアジュバントのようなその抗原性を増加させる他のタンパク質またはポリペプチドに融合することができる。
【００７１】
上記のように、本発明の方法は、上記の核酸分子またはベクターの宿主細胞への挿入及び目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の宿主細胞による発現によって、任意の長さの任意のポリペプチドを生産するのに適している。
【００７２】
形質転換された宿主細胞を生産するための宿主細胞中への核酸分子またはベクターの導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、カチオンの脂質を媒介としたトランスフェクション、エレクトロポレーション、導入、感染または他の方法により達成することができる。そのような方法は  Davisら著「Basic  Methods  In  Molecular  Biology」  (1986)  のような多くの標準的な実験手引書に記載されている。
【００７３】
一度形質転換された宿主細胞が得られれば、細胞は、宿主細胞成長を支える炭素、窒素及び必須ミネラルの同化可能な源を含む任意の適当な栄養培地中で、ｐＨと温度の任意の生理学的に許容される条件下で培養され得る。組換えポリペプチドを生産する培養条件は、宿主細胞を形質転換するために使用されるベクターのタイプによって異なる。例えば、ある発現ベクターは、組換えポリペプチドの生産のための形質発現を始めるためにある一定温度での培養、または細胞増殖培地に一定の化学薬品もしくはインデューサーの添加のような制御手順を含む。従って、ここで使用される用語「組換えポリペプチドの製造条件」は、いかなる培養条件にも限定されるものではない。上記の宿主細胞及びベクター用の適当な培地及び条件は、当該分野でよく知られている。宿主細胞中で生産された後、目的のポリペプチドはいくつかの技術によって単離することができる。宿主細胞から目的のポリペプチドを取り出すには、細胞を溶菌するか、または破壊する。この溶菌は、低張溶液に細胞を接触させることにより、リゾチームのような細胞壁を分解する酵素による処理により、超音波処理により、高圧処理により、または上記の方法の組合せにより行ってもよい。通常の技術者に知られている細菌細胞の破壊及び溶菌のための他の方法を使用してもよい。
【００７４】
破壊に続いて、ポリペプチドは、複雑な混合物中の粒子の単離に適する任意の技術によって細胞破砕物から分離することができる。その後、ポリペプチドはよく知られた単離技術によって精製することができる。精製用の適当な技術としては、下記のものが挙げられるが、これらに限定されることはない：硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、電気泳働、免疫吸着、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、イムノアフィニティクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、高性能ＬＣ（ＨＰＬＣ）、高速ＬＣ（ＦＰＬＣ）、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィー。
【００７５】
組換えまたは融合タンパク質は、検出可能に標識して及び非標識で、診断のツールとして、及びスフィンゴシン−１−リン酸塩を生産するための方法において使用することができ、並びに下記のように試料中のＳＰＰ量を測定するための方法において使用することができる。さらに、組換えタンパク質は細胞死を減少させる及び／または細胞増殖を増加させる治療薬として使用することができる。形質転換された宿主細胞は、例えば、宿主タンパク質、化学的に誘導された薬剤、及びＳＰＨＫ２の発現をダウンレギュレーションするか変更するために細胞と相互作用する他のタンパク質、またはその補因子のような、ＳＰＨＫ２の機能を抑制する医薬及び薬剤の有効性を分析するために使用することが出来る。
【００７６】
別の実施態様では、本発明は、上記の組換えタンパク質（またはポリペプチド）に特異的なモノクローナルまたはポリクローナル抗体に関する。例えば、抗体は上記ペプチド、または少なくとも１０個のアミノ酸、好ましくは１１〜１５個のアミノ酸からなる上記ペプチドの断片に対するものであることができる。当該分野の通常の技術者は、標準の方法を用いて、本発明のタンパク質（またはポリペプチド）、またはその特徴を有する部分に対するモノクローナル及びポリクローナル抗体を作ることができる。抗体を生産するための材料及び方法は、当該分野でよく知られている（例えば、Goding著「Monoclonal  Antibodies:  Principles  and  Practice」第４章（1986）参照）。
【００７７】
スフィンゴシンキナーゼタイプ２の発現のレベルはいくつかのレベルで検出することができる。当該分野でよく知られている標準の方法を用いて、スフィンゴシンキナーゼタイプ２  ＲＮＡの検出及び定量のための分析を、設計することができ、これには、特に、ノーザンハイブリダイゼーション分析、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析、及びＰＣＲ分析が含まれる。核酸ハイブリダイゼーションの方法については、例えば、Maniatis、Fitsch及びSambrook著「Molecular  Cloning  A  Laboratory-Manual」  (1982)またはD.  N.  Glover編「DNA  Cloning」  第１巻及び第２巻  (1985)またはAusubel,  F.  M.ら編「Current  Protocols  in  Molecular  Biology」  （Wiley  &  Sons,  Inc.刊）が参考になるだろう。
【００７８】
スフィンゴシンキナーゼタイプ２  ＲＮＡの検出のためのポリヌクレオチドプローブは、マウスの配列として受託番号、ＡＦ０６８７４８及び／またはＡＦ０６８７４９で登録され、入手可能な配列から設計することができる(Kohama,  T.,  et  al.,  J.  Biol.  Chem.,  273:23722-23728)。例えば、試料から単離されたＲＮＡは、ニトロセルロース膜等の表面にコーティングすることができ、ノーザンハイブリダイゼーションのために調製することができる。生検試料のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの場合は、例えば組織試料は、当該分野でよく知られた標準技術によりハイブリダイゼーション用に調製でき、特にスフィンゴシンキナーゼタイプ２  ＲＮＡを認識するポリヌクレオチド配列とハイブリダイズすることができる。試料ＲＮＡとポリヌクレオチドの間で形成されたハイブリッドの存在は、当該分野で知られた方法、いくつか例を挙げると放射化学または免疫化学的な方法により検出することができる。
【００７９】
当該分野の技術者は、かなり長いか、対応する核酸配列に高度の末端重複を有すると考えられるアミノ酸配列の領域を包含するプローブを製造するのが望ましいことを見出すかもしれない。他の場合には、該遺伝子の異なる領域の各々に、２セットのプローブを同時に使用するのが望ましいかもしれない。使用されるプローブの正確な長さは重要ではないが、典型的なプローブ配列は５００ヌクレオチド以下であり、さらに典型的には２５０ヌクレオチド以下であり；１００ヌクレオチド以下でもよく、７５ヌクレオチド以下でもよい。より長いプローブ配列は、関連する標的配列が識別されるのに十分な違いを備えた独特のポリヌクレオチド領域を包含する必要があるかもしれない。この理由のため、プローブは、約１０から約１００ヌクレオチドまで、及びより好ましくは約２０から約５０のヌクレオチドまでの長さである。
【００８０】
スフィンゴシンキナーゼタイプ２のＤＮＡ配列は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用して、スフィンゴシンキナーゼタイプ２の検出に使用されるプライマーを設計するために使用することができる。プライマーは、特に、スフィンゴシンキナーゼタイプ２の存在・不存在の検出または標準と比較することによる定量の目的のため、スフィンゴシンキナーゼタイプ２  ＲＮＡの逆転写によって生産されたスフィンゴシンキナーゼタイプ２  ｃＤＮＡに、特異的に結合することができる。プライマーは、７〜４０ヌクレオチド、好ましくは１０〜３５のヌクレオチド、最も好ましくは１８〜２５のヌクレオチドであり、スフィンゴシンキナーゼタイプ２配列の領域と相同であるか相補的である。
【００８１】
ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲ反応に必要な試薬及び対照は当該分野においてよく知られている。その後、増幅産物は、例えばゲル分画、放射化学及び免疫化学の技術によって、スフィンゴシンキナーゼタイプ２配列の存在または不存在について分析され得る。この方法は、少数の細胞しか必要としないので有利である。一度スフィンゴシンキナーゼタイプ２が検出されれば、同じ方法を用いて、正常細胞から得られた結果との比較により、該細胞がスフィンゴシンキナーゼタイプ２を過剰発現しているか、発現が減少しているの決定をなすことができる。スフィンゴシンキナーゼタイプ２  ＲＮＡレベルの増加は、細胞増殖の増加及び細胞死の減少と関連する。
【００８２】
別の実施態様において、本発明は、細胞中のスフィンゴシンキナーゼタイプ２  ＲＮＡ検出用の診断キットに関する。該キットは、１またはそれ以上の容器に入ったスフィンゴシンキナーゼポリヌクレオチドのＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲによるスフィンゴシンキナーゼタイプ２の検出用のスフィンゴシンキナーゼタイプ２オリゴヌクレオチドプライマー、またはｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションもしくはノーザン解析による細胞中の、スフィンゴシンキナーゼタイプ２  ＲＮＡの検出用のスフィンゴシンキナーゼタイプ２ポリヌクレオチドを含むパッケージユニットを含み、いくつかのキットにおいては、目的の方法のために使用される種々の試薬の容器が含まれる。キットは、さらに次のアイテムの１つ以上を含んでいてもよい：ポリメラーゼ、緩衝剤、説明書、対照、検出用の標識物。キットは、本発明による方法を実施するために適当な比率で混合された試薬の容器を含んでもよい。試薬の容器は、本方法を実施する時に、計量工程を不要にするように単位量の試薬を含んでいるのが好ましい。
【００８３】
さらに別の実施態様において、本発明は、特定の生物試料中のスフィンゴシンキナーゼタイプ２のレベルを識別し定量する方法を提供する。試料中のスフィンゴシンキナーゼタイプ２のレベルを識別する（または定量する）ことのできる様々な方法を、この目的のために使用することができる。
【００８４】
スフィンゴシンキナーゼタイプ２を検出する診断分析法は、器官もしくは組織切片からの細胞の生検またはｉｎ  ｓｉｔｕ分析法、または腫瘍または正常な組織からの細胞の吸引を含んでもよい。さらに、分析法は、器官、組織、細胞、尿、血清、または血液からの細胞抽出物、または他の体液または抽出物について行われてもよい。
【００８５】
生検試料を分析する場合、分析法は、分析すべき試料を天然または合成のスフィンゴシンキナーゼタイプ２リガンド、またはスフィンゴシンキナーゼタイプ２を認識するポリクローナルもしくはモノクローナル抗体、またはスフィンゴシンキナーゼタイプ２を検出することができる抗血清と接触させること、及び試料中に存在するスフィンゴシンキナーゼタイプ２と添加されたスフィンゴシンキナーゼタイプ２リガンドまたは抗体の間で形成された複合体を検出することを含むであろう。
【００８６】
スフィンゴシンキナーゼタイプ２リガンドまたは基質には、天然または合成のリガンド、及び動物または植物のような天然の出所から誘導されたそれらの誘導体に加えて、例えばスフィンゴシンが含まれる。他のスフィンゴシンキナーゼタイプ２リガンドとしてはカルモデュリンが挙げられる。
【００８７】
スフィンゴシンキナーゼタイプ２リガンドもしくは抗スフィンゴシンキナーゼタイプ２抗体、またはスフィンゴシンキナーゼタイプ２を検出することができるリガンド及び抗体の断片は、癌のような細胞増殖の増加または細胞死の減少に関連した疾病の診断及び予後における使用のために、様々な標識及び標識方法を使用して標識することができる。本発明において使用することができる標識の例としては、酵素標識、放射性同位体標識、非放射性同位体標識及び化学発光標識が挙げられるが、これらに限定されることはない。
【００８８】
適当な酵素標識の例として下記のものが挙げられる：リンゴ酸脱水素酵素、ブドウ状球菌核酸分解酵素、デルタ−５−ステロイド異性化酵素、酵母アルコール脱水素酵素、アルファグリセリンリン酸脱水素酵素、トリオースリン酸塩異性化酵素、ペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β‐ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース-6-リン酸塩ヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ等。
【００８９】
適当な放射性同位体の標識の例として下記のものが挙げられる：3Ｈ、111Ｉｎ、125Ｉ、32Ｐ、35Ｓ、14Ｃ、57Ｔｏ、58Ｃｏ、59Ｆｅ、75Ｓｅ、152Ｅｕ、90Ｙ、67Ｃｕ、21Ｃｉ、211Ａｔ、212Ｐｂ、47Ｓｃ、l09Ｐｄ、11Ｃ、19Ｆ及び131Ｉ。
【００９０】
適当な非放射性の同位体標識の例としては、157Ｇｄ、55Ｍｎ、162Ｄｙ、52Ｔｒ及び46Ｆｅが挙げられている。
【００９１】
適当な蛍光標識の例としては、152Ｅｕ標識、フルオレセイン標識、イソチオシアネートI標識、ローダミン標識、フィコエリトリン標識、フィコシアニン標識、アロフィコシアニン標識及びフルオレサミン標識が挙げられる。
【００９２】
化学発光の標識の例としては、ルミナール標識、イソルミナール標識、芳香性アクリジニウムエステル標識、イミダゾール標識、アクリジニウム塩標識、シュウ酸塩エステル標識、ルシフェリン標識及びルシフェラーゼ標識が挙げられる。
【００９３】
当該分野における通常の技術者は、本発明により使用され得る他の適当な標識を知っているであろう。これらの標識のリガンド及び抗体またはその断片への結合は、当該分野における通常の技術者によく知られた標準の技術を使用して行うことができる。典型的な技術は、Kennedy,  J.  H.  et  al.,  (1976),  Clin.  Chem.  Acta.,  70,  1-31、及び  Schurs,  A.  H.  W.  M.,  et  al.,  (1977),  Clin.  Chem.  Acta.,  81,  1-40に記載されている。後者の中で言及されているカップリング技術は、グルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸塩法、ダレミド（dalemide）法等である。
【００９４】
本発明の抗体(または抗体の断片)の検出は、担体の使用により改良してもよい。よく知られている担体としては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然及び変性セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース及びマグネタイトが挙げられる。本発明の目的のために、担体の性質はある程度まで可溶性か、または不溶性であり得る。結合させた分子がスフィンゴシンキナーゼタイプ２に結合することができる限り、支持体は事実上いかなる可能な構造をもとり得る。従って、支持体の構造は、ビーズのような球状、または試験管の内面のような管状、または棒の外表面のような円筒状であり得る。さもなければ、表面はシートまたは試験片のように水平でもよい。当該分野における通常の技術者は、モノクローナル抗体を結合するのに適当な他の多くの担体を知っているか、またはルーチンの実験によって確認することができるであろう。
【００９５】
上記のスフィンゴシンキナーゼタイプ２のリガンドまたは抗体、または抗体もしくはリガンドの断片は、定量的にまたは定性的にスフィンゴシンキナーゼタイプ２の存在を検出するのに使用され得る。そのような検出はラジオイムノアッセイ、イムノメトリックアッセイ（immunometic  assay）のような当該分野における通常の技術者に知られている様々な免疫定量法のうちのどれを使用して行ってもよい。当該分野においてよく知られている標準の方法を用いると、診断アッセーは、表面(即ち固体担体)、例えば微量滴定プレートまたは薄膜(例えばニトロセルロース膜))に、スフィンゴシンキナーゼタイプ２またはスフィンゴシンキナーゼタイプ２の断片に特異的な抗体をコーティングし、そしてこれをスフィンゴシンキナーゼタイプ２を有するおそれのある被験者からの試料と接触させることにより行うことができる。試料中のスフィンゴシンキナーゼタイプ２とこれに特異的な抗体の間で形成された複合体の存在は、蛍光抗体分光法または比色法のような当該分野において共通の既知の検査法のいずれかにより検出することができる。ラジオイムノアッセーについての良い記載は、Work,  T.  S.ら著「Laboratory  Techniques  and  Biochemistry  in  Molecular  Biology」(1978)  （North  Holland  Publishing  Company,  N.Y.刊）に見られ、本明細書に参考文献として組み入れられる。サンドイッチ分析は、Wide著、Kirkham  及び  Hunter）編「Radioimmune  Assay  Method」  （1970）  （E.&S.  Livingstone  Edinburgh）の１９９〜２０６頁に記載されている。
【００９６】
本発明の診断方法は、小細胞癌、大細胞癌、扁平上皮癌及び腺癌のような肺癌、胃癌、前立腺の腺癌、漿液性嚢胞腺癌及び粘液性嚢胞腺癌のような卵巣癌、卵巣の胚細胞腫瘍、睾丸癌及び胚細胞腫瘍、膵臓の腺癌、胆道の腺癌、肝細胞癌、腎細胞癌、腺癌及びミュラー擬態の腫瘍(癌肉腫)を含む子宮内膜癌腫、腺癌及び扁平上皮癌のような子宮頚内膜、子宮膣部及び膣の癌、基底細胞癌、黒色腫及び皮膚外肢腫瘍、食道の癌腫、扁平上皮癌及び腺癌を含む鼻咽腔及び口腔咽頭の癌、唾液腺癌、神経膠、ニューロン、髄膜起源の腫瘍を含む脳及び中枢神経系腫瘍、末梢神経の腫瘍、軟繊維肉腫、及び硬骨と軟骨の肉腫の癌を含む癌に罹患している患者における増殖及び転移の可能性を予測するものである。スフィンゴシンキナーゼタイプ２  ＲＮＡまたはスフィンゴシンキナーゼタイプ２タンパク質を増加したレベルで発現するこれらの腫瘍細胞は増殖を増加させ、細胞死を減少させた。
【００９７】
該タンパク質は、スフィンゴシンキナーゼタイプ２活性の阻害剤を識別するために使用することができる。酵素分析を用いれば、スフィンゴシンキナーゼタイプ２酵素活性の減少または消失をもたらす天然の及び合成の薬剤及び医薬を発見することができる。スフィンゴシンキナーゼタイプ２の活性の減少が検出される限り、阻害剤の作用機構についての知識は必要ではない。阻害剤は、酵素基質または補因子を結合または単離させるか、または酵素自体を、直接的に、例えば薬剤または医薬の酵素への不可逆結合により、または間接的に、例えばスフィンゴシンキナーゼタイプ２基質と結合する薬剤を導入することにより、阻害する薬剤または医薬を含み得る。本発明に関する薬剤または医薬は、スフィンゴシンキナーゼタイプ２活性の部分的または完全な阻害し得る。
【００９８】
スフィンゴシンキナーゼタイプ２の阻害剤にはＤＬ−トレオジヒドロスフィンゴシン（ＤＨＳ）、及びより最近に発見されたEdsall,  L.  C.  et  al.,  (1998),  Biochemistry,  37,  12892-12898に記載されている阻害剤、Ｎ，Ｎ−ジメチルスフィンゴシン（ＤＭＳ）が含まれる。スフィンゴシンキナーゼタイプ２の阻害剤は、癌、粥状動脈硬化、神経組織変性の病気、即ち卒中、アルツハイマー病のような疾病の治療または改善に使用されてもよい。
【００９９】
スフィンゴシンキナーゼタイプ２（即ち、ヒトまたは動物中の）のレベルを減少させるか、またはスフィンゴシンキナーゼタイプ２活性を減少または抑制する薬剤は、スフィンゴシンキナーゼタイプ２の増加したレベルに関連するあらゆる疾病または癌のような増加した細胞増殖に関連する疾病の治療に使用してもよい。腫瘍細胞中のスフィンゴシンキナーゼタイプ２のレベルが、正常細胞のスフィンゴシンキナーゼタイプ２のレベルの約２〜３倍である場合、最大約１０〜１００倍である場合、スフィンゴシンキナーゼタイプ２のレベルが増加していると判断される。スフィンゴシンキナーゼタイプ２  ＲＮＡを減少させる薬剤には下記のものが含まれるが、これに限定されることはない：スフィンゴシンキナーゼタイプ２  ＲＮＡを消化することのできる１つまたはそれ以上のリボザイム、またはスフィンゴシンキナーゼタイプ２の翻訳を阻止または減少させてスフィンゴシンキナーゼタイプ２のレベルを減少させるようにスフィンゴシンキナーゼタイプ２ＲＮＡにハイブリダイズすることができるアンチセンスオリゴヌクレオチド。これらのアンチセンスオリゴヌクレオチドはＤＮＡとして、ウイルスエンベロープレセプタータンパク質を含むプロテオリポソームにトラップされたＤＮＡとして(Kanoda,  Y.  et  al.,  (1989),  Science,  5,  243,  375)、またはアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡが生成するように標的細胞で発現しうるベクターの一部として投与され得る。特定の細胞タイプ中で、例えば乳腺で発現されるベクターは、当該分野で知られている。乳腺中の遺伝子発現の条件の制御の例については、Furth,  J.  Mammary  Gland  Biol.  Neopl.,  2,  (1997),  373参照。
【０１００】
さもなければ、ＤＮＡは担体と共に注射することができる。担体はインターロイキンに代表されるサイトカインのようなタンパク質、ポリリシン-糖タンパク質担体であってもよい。そのような担体タンパク質及びベクター及びこれらの使用方法は当該分野で知られている。さらに、ＤＮＡを小さな金のビーズにコーティングし、該ビーズを例えば遺伝子ガンを用いて肌に注射することもできる(Ulmer,  T.  B.  et  al.,  Science,  259,  (1993),  1745)。
【０１０１】
また別の態様として、抗体、またはスフィンゴシンキナーゼタイプ２を減少または阻止できる化合物、即ち、スフィンゴシンキナーゼタイプ２の発現、生産または活性を減少または阻止できる化合物、例えばアンタゴニストは、単離され、実質的に精製されたタンパク質として、またはスフィンゴシンキナーゼタイプ２減少または阻害剤が生産されるように標的細胞中で発現することができる発現ベクターの一部として提供されてもよい。さらに、様々なイオンのような補因子、即ちＣａ2+または酵素の安定性に影響する因子をスフィンゴシンキナーゼタイプ２の発現及び機能を調整するために投与することができる。これらの製剤は標準的な経路で投与することができる。一般に、配合剤は、局所、経皮、腹腔内、経口、直腸、非経口投与（例えば、静脈内、皮下、筋肉内）経路で投与され得る。スフィンゴシンキナーゼタイプ２阻害化合物がゆっくり全身に放出されるように、スフィンゴシンキナーゼタイプ２阻害化合物を、ドラッグデリバリーが望まれる部位の近く、例えば腫瘍部位に埋め込まれる生分解性高分子に組み込んでもよい。生分解性高分子及びそれらの使用は、例えばBrem  et  al.,  J.  Neurosurg.,  74,  (1991),  441-446に詳細に記載されている。これらの化合物は、スフィンゴシンキナーゼタイプ２の阻害を達成するのに十分な量で受容者に提供されるように意図される。同様に、スフィンゴシンキナーゼタイプ２の発現、生産、安定性または機能に負の影響を及ぼすことができる薬剤は、スフィンゴシンキナーゼタイプ２の阻害を達成するのに十分な量で受容者に提供されるように意図される。量は、薬剤の量、投与経路等がそのような反応に影響を及ぼすのに十分であれば、スフィンゴシンキナーゼタイプ２の阻害または誘導を「達成する」のに十分であるというべきである。
【０１０２】
細胞増殖におけるスフィンゴシンキナーゼタイプ２の機能に鑑みれば、ＳＰＨＫ２のアゴニストのようなスフィンゴシンキナーゼタイプ２のレベルを刺激する薬剤は、ＳＰＨＫ２の減少または細胞増殖の減少に関連するあらゆる疾病の治療に使用されてもよい。この場合、ＳＰＨＫ２はそのような増殖、例えば発達遅延を増加させることができる。
【０１０３】
受容者としての患者にスフィンゴシンキナーゼタイプ２の発現または機能を調節する薬剤を与える場合、投与される薬剤の投与量は、患者の年齢、体重、身長、性別、一般的な病状、病歴などのような要因に依存して変わるであろう。一般に、受容者には約１ｐｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）の範囲の薬剤を投与するのが望ましいが、それより低いか、またはより高い量を投与することもできる。
【０１０４】
組成物は受容者としての患者がその投与を許容することができる場合に、「薬理学的に許容され得る」と言える。投与された量が生理学的に有意義な場合、そのような薬剤は「治療上有効な量」で投与されたと言える。その存在が、受容者としての患者に生理学的に検出できる変化をもたらす場合、その薬剤は生理学的に有意義である。本発明の化合物は、公知の方法により製剤化され、医薬として有用な組成物に調製される。これにより、これらの材料またはその機能的な誘導体は、薬理学的に許容され得る担体媒体と混合物として混合される。適当な媒体及びその製剤としては、他のヒトタンパク質(例えばヒト血清アルブミン)が例えばOsol,  A.ら編「Remington's  Pharmaceutical  Sciences」第１６版  Mack  Easton  PA.  (1980)に記載されている。有効な投与に適した薬学的に許容され得る組成物を形成するために、それらの組成物は、適当な量の担体媒体と共に有効な量の上記化合物を含むであろう。
【０１０５】
作用期間を制御するために、別の製剤法を用いてもよい。放出制御製剤は、ポリマーを化合物と組み合わせるか、または吸収させることにより達成してもよい。制御されたデリバリーは、適当な高分子（例えばポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニル、ピロリドン、エチレンビニルアセテート、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースまたは硫酸プロタミン）、高分子の濃度及び放出の持続を制御するための混入法を選択することにより実施することができる。放出制御製剤により作用期間を制御する別の可能な方法は、ポリエステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリ(乳酸)またはエチレン酢酸ビニルコポリマーのような高分子材料の粒子に、本発明の化合物を組み込むことである。さもなければ、これらの薬剤をポリマー粒子に組込む代わりに、例えば界面重合法により製造されたマイクロカプセル、例えばゼラチンマイクロカプセル用のヒドロキシメチルセルロース、及びポリ(メタクリル酸メチル)マイクロカプセルに、コロイドの薬物送達システム、例えばリポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノパーティクル及びナノカプセルに、またはマクロエマルジョンに捕捉することも可能である。そのような技術は「Remington's  Pharmaceutical  Sciences」（1980）に開示されている。
【０１０６】
本発明は、さらに、上記診断治療方法に使用するためのキットを提供する。本発明によるキットは、本発明の組成物を一種類またはそれ以上含んでいる１個またはそれ以上のバイアル、チューブ、アンプル、ボトル等の容器を含んでいてもよい。
【０１０７】
本発明のキットは、１種類またはそれ以上の本発明の化合物または組成物、及び１種類またはそれ以上の賦形剤、希釈剤またはアジュバントを含んでいてもよい。
【０１０８】
ここまで詳細に本発明を記載してきたが、同じことは、下記の実施例への言及によって、より明白に理解されるであろう。ただし、これらは説明の目的のためにのみ含まれており、本発明を限定する意図ではない。
【０１０９】
下記の材料及び方法が、以下に記載された実施例において使用された。
【０１１０】
（実施例）
材料
ＳＰＰ、スフィンゴシン及びＮ、Ｎ−ジメチルスフィンゴシンはBiomol  Research  Laboratory  Inc.（plymous  Meeting,  PA）から入手した。他のすべての脂質はAvanti  Polar  Lipids（Birmingham,  AL）から購入された。［ｇ−３２Ｐ］ＡＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）は、Amersham（Arlington  Heights,  IL）から購入された。ポリ‐Ｌ‐リジン及びコラーゲンはBoehringer  Mannheim  （Indianapolis,  IN）から得られた。制限酵素はNew  England  Biolabs（Beverly,  MA）から得られた。多数のマウス成体組織のポリ（Ａ）＋ＲＮＡブロットはClontech（Palo  Alto,  CA）から購入された。「Lipofectamine  PLUS」及び「Lipofectamine」は、Life  Technologies.  Inc.（Gaithersburg,  MD）から購入された
実施例１：  マウススフィンゴシンキナーゼタイプ２（ｍＳＰＨＫ２）のｃＤＮＡクローニング
ＥＳＴデータベースのＢＬＡＳＴサーチにより、ｍＳＰＨＫ１ａ(Kohama,  T.  ,  Olivera,  A.,  Edsall,  L.,  Nagiec,  M.  M.,  Dickson,  R.  and  Spiegel,  S.,  J.  Biol.  Chem.,  273,  (1998),  23721-23728)の保存された領域にかなり高い相同性を有するが、実質的な配列差を有するマウスＥＳＴクローン（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡ８３９２３３）を同定した。このＥＳＴを使用して、２つの異なるＰＣＲアプローチによって、ｍＳＰＨＫ２で示されるＳＰＨＫの第二のアイソフォームがクローニングされた。
【０１１１】
第一のアプローチでは、マウスｃＤＮＡライブラリー（Stratagene）からのＰＣＲクローニングが使用された。約１×ｌ０6のファージを、２０枚の１５０ｍｍのプレートに入れ、プラークを集め、そしてプラスミドを標準の方法を用いて単離した(Ausubel,  F.  M.,  Brent,  R.,  Kingston,  R.  E.,  Moore,  D.  D.,  Smith,  J.  A.,  Seidman,  J.  G.,  and  Struhl,  K.,  Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  Green  Publishing  Associates  and  Wiley-  Interscience,  New  York  (1987))。最初のＰＣＲ反応は配列特異的なプライマー（Ｍ−３−１、5'-CCTGGGTGCACCTGCGCCTGTATTGG（SEQ  ID  NO：ｌ））及びＭ１３リバースプライマーを用いて行なわれた。最長のＰＣＲ産物をゲル精製し、配列特異的なアンチセンスのプライマー（Ｍ−３−２、5'-CCAGTCTTGGGGCAGTGGAGAGCC-3'（SEQ  ID  NO：２））及びＴ３プライマーを含む第二のＰＣＲのための鋳型として使用した。最終ＰＣＲ産物を、「ＴＯＰＯ  ＴＡ」クローニングキット（Invitrogen）を用いてサブクローニングし、その後、配列決定をした。プラチナハイファイＤＮＡポリメラーゼを用いて、下記のサイクルパラメーターのＰＣＲ増幅を行った：９４℃で３０秒、５５℃で４５秒及び７０℃で２分を３０サイクルと、最終プライマー伸長を７２℃で５分。
【０１１２】
第二のアプローチにおいて、ｃＤＮＡ末端の迅速な増幅用の５'ＲＡＣＥシステム（ライフテクノロジーズ）を用いてメーカーのプロトコルに従い、５'ＲＡＣＥ  ＰＣＲを実施した。ポリ（Ａ）＋ＲＮＡはQuick  Prep  mRNA  Purification  Kit（Pharmacia）を用いて、Swiss  ３Ｔ３繊維芽細胞から単離された。第一のｃＤＮＡ鎖は５ｍｇのSwiss  ３Ｔ３ポリ（Ａ）＋ＲＮＡにより、ＡＡ８３９２３３の配列から設計された標的アンチセンスプライマー（ｍ−ＧＳＰｌ、5'-AGGTAGAGGCTTCTGG（SEQ  ID  No．３））及びＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（Life  Technologies）を用いて、４２℃５０分間で合成した。このｃＤＮＡを鋳型とし、ＬＡ  Ｔａｑポリメラーゼ（Takara）を用いて、連続二回のＰＣＲ反応が、以下のように行なわれた：第１のＰＣＲについては、５'ＲＡＣＥ  Ａｂｒｉｄｇｅｄアンカープライマー5'-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG（SEQ  ID  NO：４）及び標的特異的アンチセンスプライマーｍ−ＧＳＰ２、5'-GCGATGGGTGAAAGCTGAGCTG（SEQ  ID  N0：５）を用い、９４℃で２分に続いて、９４℃で２分、５５℃で１分、７２℃で２分のサイクルが３０サイクル、及び７２℃で５分のプライマー伸長を行なった；第２のＰＣＲについては、兄-リング温度が６５℃であること以外は同じ条件を用いて、Abridged  Universal  Amplification  Primer（ＡＵＡＰ）、5'-GGCCACGCGTCGACTAGTAC（SEQ  ID  NO：６）及びm-GSP3,5'-AGTCTCCAGTCAGCTCTGGACC（SEQ  ID  NO：７）を用いる。ＰＣＲ産物はｐＣＲ２．１へクローニングし、配列決定した。このＰＣＲ産物をｐＣＲ３．１及びｐｃＤＮＡ３発現ベクターにサブクローニングした。
実施例２:  ヒトスフィンゴシンキナーゼ−２（ｈＳＰＨＫ２）のｃＤＮＡクローニング
ＨＥＫ２９３細胞からのポリ（Ａ）+ＲＮＡを５'ＲＡＣＥ反応のために使用
した。標的特異的アンチセンスプライマー(h-GSPl、5'-CCCACTCACTCAGGCT(SEQ  ID  N0:8));h-GSP2、5'-GAAGGACAGCCCAGCTTCAGAG(SEQ  ID  NO:9)及びh-GSP3、5'-ATTGACCAATAGAAGCAACC(SEQ  ID  NO:10)を、ヒトのＥＳＴクローン(受託番号ＡＡ２９５５７０)の配列から設計した。第一の鎖ｃＤＮＡは、５μｇのＨＥＫ２９３  ｍＲＮＡ及びｈ−ＧＳＰ１を用いて合成した。５'ＲＡＣＥ  Ａｂｒｉｄｇｅｄアンカープライマーとｈ−ＧＳＰ２を用いて行なう最初のＰＣＲ反応において、このｃＤＮＡを鋳型として用いた。その後、ネステッドＰＣＲを、ＡＵＡＰプライマーとｈ−ＧＳＰ３を使用して行なった。得られたＰＣＲ産物を上記のようにクローニングし、配列決定した。
実施例３：  ＳＰＨＫ２の過剰発現及び活性
ヒト胚腎細胞(ＨＥＫ２９３(ATCC  CRL-1573))及びＮＩＨ  ３Ｔ３繊維芽細胞(ATCC  CRL-1658)をOlivera.  A.,  Kohama,  T.,  Edsall,  L.  C.,  Nava,  V.,  Cuvillier,  O.,  Poulton,  S.,  and  Spiegel,  S.,  J.  Cell  Biol.,  147,  (1999),  545-558に記載されたように培養した。ＨＥＫ２９３細胞をポリ‐Ｌ‐リジンをコートした６ウェルプレートに、６×１０5／ウェルで接種した。２４時間後、細胞を、１ウェルあたり１μgの単一ベクター単独またはスフィンゴシンキナーゼ構築物を含むベクター及び６μlのLipofectamine  PLUS試薬及び４μlのLipofectamine試薬を加え、トランスフェクトした。トランスフェクションの１〜３日後に、細胞を、Kohama,  T.,  Olivera,  A.,  Edsall.  L.,  Nagiec,  M.  M.,  Dickson,  R.,  and  Spiegel,  S.,  J.  Biol.  Chem.,  273,  (1998),  23722-23728に記載されているような凍結融解により収穫し溶解した。いくつかの実験においては、細胞溶菌液を６０分間１００，０００×ｇの遠心分離によって細胞質ゾルと細胞膜に分画した。ＳＰＨＫ活性は、特記しない限り、４ｍｇ／ｍｌのＢＳＡとの複合体として調製されたスフィンゴシン及び２００ｍＭ  ＫＣｌを含有するキナーゼ緩衝液中の［ｇ−３２Ｐ］ＡＴＰ緩衝液  (Olivera,  A.とSpiegel,  S.著、Bird,  I.M.編「Methods  in  Molecular  Biology」  (1998)  ,  Vol.  105,  233-242,  Humana  Pres,  Inc.,  Totowa,  N.J.)の存在下で測定した。３２Ｐ−ＳＰＰはＴＬＣによって分離され、前記のphosphoimagerで測定した。
実施例４：  ＳＰＰの脂質抽出及び測定
細胞をＰＢＳで洗浄し、２．５μｌの濃塩酸を含む１ｍｌのメタノールで掻き取った。２ｍｌのクロロホルム／１Ｍ  ＮａＣｌ（１：１，ｖ／ｖ）及び１００μｌの３Ｎ  ＮａＯＨを添加し、相を分離することにより脂質を抽出した。ＳＰＰを含み、スフィンゴシン、セラミド及び大部分のリン脂質を含まない塩基性水相をシリコーン化されたガラス管に移した。有機相は１ｍｌのメタノール／ｌＭ  ＮａＣｌ（１：１，ｖ／ｖ）、及び５０μｌの３Ｎ  ＮａＯＨで再抽出し、水相を合わせた。水相中のＳＰＰの質量測定、及び有機相中のリン脂質の合計量は、Edsall,  L.  C.,  Pirianov,  G.  G.,  and  Spiegel.  S.,  J.  Neurosci.,  l7,  (1997)  6952-6960  及び  Edsall.  L.  C.,  and  Spiegel,  S.,  Anal.  Biochem.,  272,  (1999)  80-86)に記載されているように正確に測定された。
実施例５：  ノーザンブロッティング分析
複数のマウス成体及びヒトの組織及びマウス胎児からのポリ（Ａ）＋ＲＮＡを１レーン当たり２μｇ含むポリ（Ａ）＋ＲＮＡブロットは、Clontechから購入した。ブロットを、ゲル精製及び[32P]dCTPによる標識化の後、１．２ｋｂのＰＳＴＩ断片のマウスＥＳＴ  ＡＡ３８９１８７（ｍＳＰＨＫ１プローブ）、１．５ｋｂのｐＣＲ３．１−ｍＳＰＨＫ２のＥｃｏＲＩ断片または０．３ｋｂのｐＣＲ３．１−ｈＳＰＨＫ１のＰｖｕｌｌ断片とハイブリダイズさせた。６５℃で一晩のExpressHyb緩衝液(Clontech)中でのハイブリダイゼーションを、メーカーのプロトコルに従って行った。ブロットを、ローディングコントロールとしてのb-アクチン(Clontech)で再プローブした。バンドの量をMolecular  Dynamics  Phosphoimagerを用いて測定した。
結果
タイプ２スフィンゴシンキナーゼのクローニング
ＥＳＴデータベースのブラストサーチにより、いくつかのＥＳＴが最近クローニングされたｍＳＰＨＫ１ａ配列とかなり高い相同性を有することがわかった。プライマーを、これらのＥＳＴの配列から設計し、マウス脳ｃＤＮＡライブラリーからのクローニング及び５’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲのアプローチにより、新しいマウス及びヒトスフィンゴシンキナーゼ（ｍＳＰＨＫ２とｈＳＰＨＫ２と命名された）のクローニングのために使用した。
【０１１３】
ｍＳＰＨＫ２及びｈＳＰＨＫ２のアミノ酸配列のClustalWアラインメントを、Ｆｉｇ．１Ａに示す。ｍＳＰＨＫ２及びｈＳＰＨＫ２のオープンリーディングフレームは、８３％の同一性及び９０％の類似性を有し、各々６１７及び６１８アミノ酸のポリペプチドをコードする。既にＳＰＨＫ１ｓで確認されている高度に保存された５つの領域（Ｃ１：Ｃ５）(Kohama,  T.,  Olivera.  A.,  Edsall,  L.,  Nagiec.  M.  M.,  Dickson,  R.,  Spiegel.  S.,  J.  Biol.  Chem.,  273,  (1998)  23722-  23728)もタイプ２キナーゼの両方に存在した。興味深いことに、ＳＰＨＫ１のＣｌ領域中の不変の正の変化を受けたモチーフＧＧＫＧＫモチーフは、ＳＰＨＫ２の中のＧＧＲＧＬに変わっており、これにより、これが以前に提案されたようなＡＴＰ結合部位の一部ではないことが提案される(Kohama,  T.,  Olivera,  A.,  Edsall.  L.,  Nagiec,  M.  M.,  Dicksan,  R.,  Spiegel,  S.,  J.  Biol.  Chem.,  273,  (1998)  23722-23728)。モチーフ探索により、さらに、ｍＳＰＨＫ２及びｈＳＰＨＫ２の保存されたＣｌ領域（アミノ酸１４７〜２８４）のすぐ前の領域で始まる領域が、ジアシルグリセロールキナーゼ触媒部位と相同性を有していることを明らかになった。
【０１１４】
ＳＰＨＫ１と比較して、ＳＰＨＫ２はいずれも、２３６の追加のアミノ酸（Ｆｉｇ．１Ｂ）を含むはるかに大きなタンパク質をコードする。さらに、それらの配列は中心部及びアミノ末端ではＳＰＨＫ１とかなり異なっている。しかしながら、ｍＳＰＨＫ２のアミノ酸１４０の後は、タイプ１及びタイプ２のＳＰＨＫの配列は、かなり類似性を有している。領域Ｃ１〜Ｃ４を含むこれらの配列（ｍＳＰＨＫ１のアミノ酸９〜２２６、ｍＳＰＨＫ２の１４１〜３６０）は、４７％の同一性及び７９％の類似性（Ｆｉｇ．１Ｂ）を有している。該タンパク質のＣ末端部分、ｍＳＰＨＫ１についてはアミノ酸２２７〜３８１、ｍＳＰＨＫ２については４８０〜６１７には、４３％の同一性と７８％の類似性を有する大きな相同性領域がある  (Ｆｉｇ．１Ｂ)。これらの領域の相違は、ＳＰＨＫ２が単純な遺伝子重複として生じているのではないであろうことを示唆している。
スフィンゴシンキナーゼタイプ２の組織分布
マウス成体中のＳＰＨＫ２ｍＲＮＡ発現の組織分布を、ノーザンブロッティング（Ｆｉｇ．２Ａ）によってＳＰＨＫ１のそれと比較した。成体の肝臓、心臓、腎臓、睾丸及び脳を含むほとんどの組織では、優勢な３．１ｋｂのＳＰＨＫ２  ｍＲＮＡ種が検出され、これは遍在した発現を示している。しかしながら、発現のレベルは著しく変化しており、成体の肝臓及び心臓において最も高く、骨格筋及び脾臓（Ｆｉｇ．２Ａ）においてはかろうじて検出できる程度であった。対照的に、ｍＳＰＨＫ１の発現パターンは全く異なっており、肝臓中の発現はｍＳＰＨＫ２のように優勢ではなく、成人の肺、脾臓及び肝臓で最も高いｍＲＮＡの発現が見られた。ｍＳＰＨＫ１及びｍＳＰＨＫ２は両方とも、胚発生中に一時的に差別的に発現した。ｍＳＰＨＫ１は、７日齢のマウス胚（Ｅ７）で高度に発現し、Ｅ１１の後（Ｆｉｇ．２Ｂ）に劇的に減少した。対照的に、Ｅ７では、ｍＳＰＨＫ２発現がｍＳＰＨＫ１よりはるかに低く、Ｅ１７まで徐々に増加した。ｈＳＰＨＫ２  ２．８ｋｂのｍＲＮＡ転写物は、成体の腎臓、肝臓及び脳中で主として発現し、他の組織（Ｆｉｇ．２Ｃ）では、発現性は遙かに低い。興味深いことに、ヒトの腎臓中におけるＳＰＨＫ２の発現は非常に高く、マウスにおいては比較的はるかに低い。一方、肝臓については反対のパターンとなった。
組換えスフィンゴシンキナーゼタイプ２の活性
ｍＳＰＨＫ２とｈＳＰＨＫ２が本当にＳＰＨＫをコードしているかどうかを調べるために、ＨＥＫ２９３細胞を、対応するｃＤＮＡを含む発現ベクターで一時的にトランスフェクトした。ＳＰＨＫが可溶で且つ細胞膜結合型で細胞に存在し得ることは従来の研究で示されているので(Olivera,  A.,  and  Spiegel,  S.,  Nature,  365,  (1993)  557-560;  Banno,  Y.,  Kato,  M.,  Hara,  A.,  and  Nozawa,  Y.,  Biochem.  J.,  335,  (1998)  301-304;  Buehrer,  B.  M.,  and  Bell,  R.  M.,  J.  Biol.  Chem.,  267,  3154-3159;  Olivera.  A.  Rosenthal,  J.,  and  Spiegel,  S.,  Anal.  Biochem.,  223,  (1994)  306-312;  Ghash,  T.  K.,  Bian.  J.,  and  Gill,  D.  L.,  J.  Biol.  Chem.,  269,  (1994),  22628-22635)、組換えＳＰＨＫ２の活性はトランスフェクトした細胞の細胞質ゾル及び細胞膜分画の両方で測定した。以前にKohama,  T.,  Olivera,  A.,  Edsall,  L.,  Nagiec.  M.  M.,  Dickson,  R.,  and  Spiegel,  S.,  J.  Biol.  Chem.,  273,  (1998)  23722-23728に記載されているように、未処理またはベクター処理されたＨＥＫ２９３細胞は、低レベルのＳＰＨＫ活性を有している（Ｆｉｇ．３Ａ）。ｍＳＰＨＫ２及びｈＳＰＨＫ２でトランスフェクションした２４時間後に、in  vitroのＳＰＨＫ活性は各々２０倍及び３５倍に増加し、その後減少した（Ｆｉｇ．３Ａ）。これとは対照的に、ｍＳＰＨＫ１でトランスフェクトした細胞のＳＰＨＫ活性ははるかに高く、トランスフェクションの２４時間後の基礎レベルの６１０倍以上であり、このレベルが少なくとも３日間続いた（図示せず）。ＨＥＫ２９３細胞と同様、ｍＳＰＨＫ１でトランスフェクションしたＮＩＨ  ３Ｔ３繊維芽細胞は、ｍＳＰＨＫ２でトランスフェクションしたものよりもはるかに高いＳＰＨＫ活性となった。トランスフェクションしていない細胞と同様に、ｍＳＰＨＫ１でトランスフェクトした細胞のＳＰＨＫ活性の大部分は細胞質ゾルにあることが既に見出されている(Kohama.  T.,  Olivera,  A.,  Edsall,  L.,  Nagiec,  M.  M.,  Dickson,  R.,  and  Spiegel,  S.,  J.  Biol.  Chem.,  273,  (1998)  23722-23728)。Kyte-Daolittleヒドロパシー・プロットは、疎水性膜スパン(membrane-spanning)領域の存在を示唆しなかったが、ｍＳＰＨＫ２またはｈＳＰＨＫ２でトランスフェクトした細胞においても、同様にＳＰＨＫ活性は膜関連であり、各々１７％及び２６％であった（Ｆｉｇ．３Ｂ）。
【０１１５】
ｍＳＰＨＫ２とｈＳＰＨＫ２によるＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクションも、ＳＰＨＫにより生成する産物であるＳＰＰが２．２倍及び３．３倍になるという増加をもたらし（Ｆｉｇ．３Ｃ）、これはｍＳＰＨＫ１ａによるトランスフェクション後のスフィンゴ脂質代謝物質レベルに関する従来の研究に合致しており、レベルの増加とin  vitro酵素活性との相関関係の欠如を示している。(Kohama,  T.,  Olivera.  A.,  Edsall,  L.,  Nagiec,  M.  M.,  Dickson,  R.,  and  Spiegel,  S.,  J.  Biol.  Chem.,  273,  (1998)  23722-23728;  Olivera,  A.,  Kohama,  T.,  Edsall,  L.  C.,  Nava,  V.,  Cuvillier,  O.,  poulton,  S.,  and  Spiegel,  S.,  J.  Cell  Biol.,  147,  (1999)  ,  545-  558)。
組換えｍＳＰＨＫ２の性質
基質特異性
ＳＰＨＫ２は、ＳＰＨＫ１に対しかなり高い相同性を有するが、実質的な配列差がある。従って、それらの酵素の特性を比較する意義があった。典型的なミカエリス‐メンテン型反応速度論を、組換えＳＰＨＫ２について考察した（データは示していない）。基質としてのＤ−エリスロスフィンゴシンについてのＫｍは、３．４μＭでありＳＰＨＫ１について既に見出されているＫｍ(Olivera.  A.,  Kohama,  T.,  Tu,  Z.,  Milstien,  S.,  and  Spiegel,  S.,  J.  Biol.  Chem.,  273,  (1998),  12576-12583)と殆ど同一である。天然に生じたＤ−エリスロスフィンゴシン異性体はＳＰＨＫ１の最良の基質であったが(Kohama,  T.,  Olivera,  A.,  Edsall.  L.,  Nagiec,  M.  M.,  rickson,  R.,  and  Spiegel,  S.,  J.  Biol.  Chem.,  273,  (1998)  23722-23728)、Ｄ−エリスロジヒドロスフィンゴシンは、ＳＰＨＫ２についてはＤ−エリスロスフィンゴシンよりも良い基質であった（Ｆｉｇ．４Ａ）。さらに、Ｄ、Ｌ−トレオジヒドロスフィンゴシン及びフィトスフィンゴシンはＳＰＨＫ１によって全くリン酸化されなかったが、ＳＰＨＫ２によっては、スフィンゴシンよりははるかに低い効率ではあったがかなりリン酸化された。ＳＰＨＫ１と同様に、Ｎ，Ｎ−ジメチルスフィンゴシン（ＤＭＳ）を含む他の脂質、Ｃ２またはＣ１６セラミド、ジアシルグリセロール及びホスファチジルイノシトールは、ＳＰＨＫ２（Ｆｉｇ．６Ａ）によってリン酸化されなかった。これはスフィンゴイド塩基に対する高い特異性を示唆する。
【０１１６】
ＤＭＳ及びＤＨＳは、ＳＰＨＫ１の有力な拮抗阻害剤であることが既に示されており(Edsall,  L.  C.,  Van  Brocklyn,  J.  R.,  Cuvillier,  O.,  Kleuser,  B.,  and  Spiegel,  S.,  Biochemistry,  37,  (1998))、また様々な生理学的刺激に起因する細胞内のＳＰＰレベルの増加を止めるために使用されている(Olivera,  A.,  and  Spiegel,  S.,  Nature,  365,  (1993),  557-560;  Cuvillier,  O.,  Pirianov,  G.,  Kleuser.  13.,  Vanek,  P.  G.,  Coo,  O.  A.,  Gutkind,  S.,  and  Spiegel,  S.,  Nature,  381,  (1996),  800-803;  Edsall,  L.  C.,  Pirianov,  G.  G.,  and  Spiegel,  S.,  J.  Neurosci,  17,  (1997),  6952-6960;  Meyer  zu  Heringdorf,  D.,  Lass,  H.,  Alemany,  R.,  Laser.  K.  T.,  Neumann,  E.,  Zhang,  C.,  Schmidt,  M.,  Rauen,  U.,  Jakobs,  K.  H.,  and  van  Koppen,  C.  J.,  EMBO  J.,  17,  2830-2837;  Choi,  O,  H.,  Kim,  J.-H.,  and  Kinet,  J.-P.,  Nature,  380,  (1996)  ,  634-636;  Melendez,  A.,  Floto,  R.  A.,  Gillooly.  D.  J.,  Harnett,  M.  M.,  and  Allen,  J.  M.,  J.  Biol.  Chem.,  273,  9393-9402;  Machwate,  M.,  Rodan,  S.  B.,  Radan,  G.  A.,  and  Harada,  S.  I.,  Mol.  Pharmacol.,  54,  (1998),  70-77)。しかしながら、ＤＨＳは、ＳＰＨＫ２の基質であるので、その生産物であるジヒドロＳＰＰは、細胞表面ＳＰＰ  ＥＤＧ−ｌ類レセプターへの結合及び活性化については、ＳＰＰと同じくらい有力であり、ＳＰＨＫ２の役割を調べるためのツールとして使用することはできない。従って、ＳＰＨＫ２に対する基質ではないＤＭＳの抑制の可能性を特徴づけることは重要であった。驚くべきことに、さらに、ＤＭＳはＳＰＨＫ２（Ｆｉｇ．４Ｂ）の有力な阻害剤であるが、非競合的な方法で作用していることがわかった（Ｆｉｇ．４Ｃ及びＦｉｇ．４Ｄ）。ＳＰＨＫ２によるＤＭＳのＫｉ値は、ＳＰＨＫ１によるＫｉ値、４μＭよりわずかに高いため、両方のタイプのＳＰＨＫを阻害する有用なツールとなる。
【０１１７】
ｍＳＰＨＫ２は、６．５乃至８の中性のｐＨ範囲で最高の活性を有し、ｐＨ７．５で最適の活性を有していたが（Ｆｉｇ．５Ａ）、ｐＨ依存性はＳＰＨＫ１のものと似ていた（データは示さない）。活性は、この範囲より下または上のｐＨ値では著しく減少した。
ＫＣｌ及びＮａＣｌの影響
ヒトの血小板におけるＳＰＨＫ活性の殆どは、膜に関連し、１Ｍ  ＮａＣｌにより抽出可能である(Banno,  Y.  ,  Kato,  M.,  Hara,  A.  and  Nozawa,  Y.,  Biochem.  J.,  335,  (1998),  301-304)。さらに、塩により抽出可能なＳＰＨＫは細胞質ゾルの酵素とは異なる特性を有している。従って、組換えＳＰＨＫ１及びＳＰＨＫ２に対する高い塩濃度の影響を調べるのは興味深いことである。興味深いことに、高いイオン強度は、それらの活性について完全に反対の効果を有していた。ＳＰＨＫ１はＮａＣｌ及びＫＣｌのいずれによっても著しく阻害され、２００ｍＭ（Ｆｉｇ．５Ｂ）の濃度で、各々５０％の阻害を引き起こした。これとは対照的に、ＳＰＨＫ２活性は、塩濃度を増加させることにより劇的に刺激され、４００ｍＭの濃度で最大の結果が得られた。またＫＣｌではＮａＣｌよりはるかに有効であった。しかしながら、この濃度より１  Ｍ分でも塩濃度が高いとＳＰＨＫ２活性は急激に減少した（Ｆｉｇ．５Ｃ）。従って、ＳＰＨＫ１とＳＰＨＫ２の活性は、イオン強度の変化については完全に反対の応答をした。高濃度の塩の存在または不存在におけるｍＳＰＨＫ２のカイネティックアッセイは、スフィンゴシンのＫｍ値は変化しないがＶｍａｘ値は増加することを示した（Ｆｉｇ．５Ｄ及びＦｉｇ．５Ｅ）。これらの観察の生理学上の重要性は、これから決定されるべきであるが、それは異なる細胞下の局在化と関係があると考えられる。
基質の提供
スフィンゴ脂質は非常に脂肪親和性が強いので、in  vitro  ＳＰＨＫ分析においては、スフィンゴシンは通常ＴｒｉｔｏｎＸ−１００によるミセル型で存在するか、またはＢＳＡとの複合体として存在する(Olivera,  A.,  Rosenthal,  J.,  and  Spiegel.  S.,  J.  Cell.  Biochem.,  60,  (1996)  ,  529-S37;  Olivera,  A.,  Barlow,  K.  D.,  and  Spiegel,  S.,  Methods  Enzymol,  311,  (2000),  215-223)。さらに、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００のような界面活性剤がラット脳抽出物におけるＳＰＨＫ活性(Buehrer,  B.  M.,  and  Bell.  R.  M.,  J.  Biol.  Chem.,  267,  (1992),  3154-3159)及びラットの腎臓からの酵素の活性(Olivera,  A.,  Kohama,  T.,  Tu,  Z.,  Milstien,  and  Spiegel,  S.,  J.  Biol.  Chem.,  273,  (1998),  12576-12583)を刺激することが示されており、ラットの腎臓のＳＰＨＫの安定性がある種の界面活性剤の存在で増加することが既に見出されている(Olivera,  A.,  Kohama,  T.,  Tu,  Z.,  Milstien,  and  Spiegel,  S.,  J.  Biol.  Chem.,  273,  (1998),  12576-12583)。しかしながら、ＳＰＨＫ１及びＳＰＨＫ２の活性に対するＴｒｉｔｏｎＸ−１００の濃度増加の影響を比較した場合、いくつかの予測しない結果が見出された。０．００５％未満の界面活性剤の濃度はなんの効果も有しなかったが、それより高い濃度ではＳＰＨＫ２は抑制され、ＳＰＨＫ１活性は著しく増加させられた（Ｆｉｇ．６Ａ）。０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００濃度では、ＳＰＨＫ１活性は４倍以上増加したが、ＳＰＨＫ２はほぼ完全に抑制された。
【０１１８】
興味深いことに、基質としてスフィンゴシンＢＳＡ複合体を用いる通常のＳＰＨＫ分析条件からＢＳＡ濃度を増加させること、即ち、０．２ｍｇ／ｍｌのＢＳＡは、ＳＰＨＫ１活性（Ｆｉｇ．６Ｂ）には影響を与えずに、ＳＰＨＫ２活性に濃度依存の阻害を引き起こした。従って、細胞または組織抽出物中のＳＰＨＫ活性を測定する場合、基質調製方法は、混合ミセルかＢＳＡ複合体かにより、注意深く最適化しなければならない。ＴｒｉｔｏｎＸ−１００とＢＳＡの効果が異なると、二つのタイプのＳＰＨＫの関連する発現に依存して異なる結果を生じるからである。
リン脂質の効果
酸性リン脂質、特にホスファチジルセリン、及びホスファチジン酸及びホスファチジルイノシトール、並びにカルジオリピンは、少ないながら、Ｓｗｉｓｓ  ３Ｔ３線維芽細胞溶菌液中のＳＰＨＫ活性の増加を用量依存的に誘導するが、中性のリン脂質はなんの効果も生じなかった。(Olivera,  A.,  Rosenthal,  J.,  and  Spiegel,  S.,  J.  Cell.  Biochem.,  60,  (1996),  529-537)。一致したのは、組換えＳＰＨＫ１及びＳＰＨＫ２がホスファチジルセリンによって刺激されたこと；両者の活性が４０μｇ／ｍｌの濃度で４倍に増加して最大となり、それより高い濃度では投与量依存的に阻害されたことである。他のリン脂質、例えばホスファチジルコリンはこの酵素活性には何ら影響も与えないので、ホスファチジルセリンのこれらの効果は特異的と考えられる。これとは対照的に、ヒトの血小板中のＳＰＨＫの３つの主なタイプの活性は、ホスファチジルセリンによる影響を受けない(Banno,  Y.,  Kato,  M.,  Hara,  A,  and  Nozawa,  Y.,  Biochem.  J.,  335,  (1998),  301-304)。
【０１１９】
ホスファチジルセリンがＳＰＨＫの酵素活性を増強するメカニズムはまだ解明されていない。一つの可能性は、ホスファチジルセリンが、よりよく基質であるスフィンゴシンを提供するユニークな膜構築性を有するということである。別の可能性は、ＳＰＨＫがセリンヘッドグループの構造を特異的に認識する決定群を含み、これらの決定群が、膜を有するＳＰＨＫの相互作用によってのみ露出されるようになるからであるかもしれないということである。この点では、ホスファチジルセリン対するプロテインキナーゼＣの著しい特異性についての分子的機序は、非常に討論の価値がある。しかしながら、最近のデータにより、脂質構造及び非膜構造がホスファチジルセリンによるタンパク質キナーゼＣの調整の主な決定群であることが示された(Johnsan,  J.  E.,  Zimmerman,  M.  L.,  Daleke,  D.  L.,  and  Newton,  A.  C.,  Biochemistry,  37,  (1998),  12020-  12025)。
【０１２０】
ＳＰＨＫ１との著しい相同性を有するデータベース中の多数のＥＳＴの存在、並びにS.cerevisiae中の異なるＳＰＨＫをコードするいくつかの遺伝子の同定(Nagiec,  M.  M.,  Skrzypek,  M.,  Na.giec,  E.  E.,  Lester,  R.  L.,  and  Dickson,  R.  C.,  J.  Biol.  Chem.,  273,  (1998),  19437-19442)は、大きくて重要なＳＰＨＫ遺伝子ファミリーが存在することを示唆している。ＳＰＨＫ２は、特にタイプ１のＳＰＨＫｓで既に確認されている保存領域(Kohama,  T.,  Olivera,  A.,  Edsall,  L.,  Nagiec,  M.  M.,  Dickson,  R.,  and  Spiegel.  S.,  J.  Bial.  Chem.,  273,  (1998),  23722-23728)において、ＳＰＨＫ１と高い相同性を有するが、さらに大きく（ＳＰＨＫ１及びＳＰＨＫ２は各々６５．２及び６５．６ｋＤａであるのに対し、ｍＳＰＨＫ１ａは４２．４ｋＤａ）、さらに２３６個の付加的なアミノ酸を含む。さらに、その異なる組織発現、一時的に増加する発現、細胞の局在化、及びイオン強度及び界面活性剤に応じた動力学的特性は、ＳＰＨＫ１とは完全に異なり、細胞の成長及び生存を調節するという重要な役割を果たすことが知られているＳＰＨＫ１とは異なる機能を有し、異なる方法でＳＰＰレベルを調節すると考えられる。従って、タイプ２のＳＰＨＫは、血管新生やアレルギー反応のようなＳＰＰに起因する多くの生物学的反応のうち、いくつかの調整に関係すると考えられる。
【０１２１】
【表１】
（表１−１）
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【０１２２】
（表１−２）
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【０１２３】
（表１−３）
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【０１２４】
【表２】
（表２−１）
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【０１２５】
（表２−２）
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【０１２６】
（表２−３）
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【０１２７】
（表２−４）
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【０１２８】
（表２−５）
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【０１２９】
（表２−６）
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【０１３０】
（表２−７）
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【０１３１】
（表２−８）
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【０１３２】
（表２−９）
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【０１３３】
（表２−１０）
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【０１３４】
（表２−１１）
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【０１３５】
（表２−１２）
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【０１３６】
（表２−１３）
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【０１３７】
（表２−１４）
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【０１３８】
（表２−１５）
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【０１３９】
（表２−１６）
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【０１４０】
（表２−１７）
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【０１４１】
（表２−１８）
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【０１４２】
（表２−１９）
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【０１４３】
（表２−２０）
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【０１４４】
（表２−２１）
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【０１４５】
（表２−２２）
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【０１４６】
（表２−２３）
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【０１４７】
本明細書は、説明のために提供されるのであって、限定のためのものではなく、本発明の範囲を逸脱することなく種々の修正及び変更をなし得ることが認識されるであろう。
【０１４８】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
発明を説明する目的で、特徴、観点及び利点を図中に示す。しかしながら、本発明は、図中に表されたものに限定されないと理解されるべきである。
【Ｆｉｇ．１】（Ｆｉｇ．１Ａ）
Ｆｉｇ．１Ａは、予測されたアミノ酸配列の非Ｃｌｕｓｔａｌｗアラインメントに基づいたマウスのタイプ２スフィンゴシンキナーゼ（ｍＳＰＨＫ２）とヒトのタイプ２スフィンゴシンキナーゼ（ｈＳＰＨＫ２）の予測されるアミノ酸配列を示す。同一で保存されたアミノ酸置換はそれぞれ暗灰色及び淡灰色の陰をつけている。ダッシュは配列中のギャップを表わす。また、右側上の数は、ｍＳＰＨＫ２のアミノ酸配列を示す。保存された領域（Ｃ１〜Ｃ５）は、線で示されている。
（Ｆｉｇ．1Ｂ）
Ｆｉｇ．１ＢはＳＰＨＫ１とＳＰＨＫ２の保存された領域の説明図である。ｍＳＰＨＫ２の一次配列がｍＳＰＨＫ１ａのそれと比較されている。
Ｆｉｇ．２Ａ、２Ｂ及び２Ｃは、タイプ１及びタイプ２スフィンゴシンキナーゼの組織特異的な発現を示すノーザンブロットである。
【Ｆｉｇ．２】  （Ｆｉｇ．２Ａ）
Ｆｉｇ．２Ａ中、ｍＳＰＨＫ２（上段のパネル）及びｍＳＰＨＫ１ａ（中段のパネル）プローブは、末端が標識され、以下に記載されているようなマウス組織からのポリ（Ａ）＋ＲＮＡブロットにハイブリダイズした。レーン１：心臓；２：脳；３：ひ臓；４：肺；５：肝臓；６：骨格筋；７：腎臓；８：精巣。β−アクチンプローブ（下段のパネル）をローディングコントロールとして用いた。
（Ｆｉｇ．２Ｂ）
Ｆｉｇ．２Ｂは、ｈＳＰＨＫ２の組織特異的な発現を示す。レーン１：脳；２：心臓；３：骨格筋；４：結腸；５：胸腺；６：脾臓；７：腎臓；８：肝臓；９：小腸；１０：胎盤；１１：肺；１２：白血球。
【Ｆｉｇ．２Ｃ】Ｆｉｇ．２Ｃは、マウス胚発生中のｍＳＰＨＫ１ａとｍＳＰＨＫ２の発現を示す。７日、１１日、１５日及び１７日のマウス胚からのポリ（Ａ）＋ＲＮＡブロットをＦｉｇ．２Ａと同様に検出した。
【Ｆｉｇ．３】  Ｆｉｇ．３Ａ及び３Ｂは組換えＳＰＨＫ２の酵素活性を示すグラフである。
（Ｆｉｇ．３Ａ）
Ｆｉｇ．３Ａ中、ＨＥＫ２９３細胞は、一時的に空のベクターで、またはｍＳＰＨＫ２またはｈＳＰＨＫ２の発現ベクターでトランスフェクトされている。２４時間後に細胞質ゾル（白のバー）及び顆粒分画（斜線で塗られたバー）中のＳＰＨＫ活性を測定した。それぞれ、データは平均値±Ｓ．Ｄ．である。また、親細胞及びベクターでトランスフェクトされた細胞は、各々２６及び３７ｐｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇの基礎ＳＰＨＫ活性を有していた。
（Ｆｉｇ．３Ｂ）
Ｆｉｇ．３Ｂは、ＳＰＨＫ２でトランスフェクトした後のＳＰＰの質量レベルの変化を示す。以下に記載したように、空のベクター（白抜き）で、ｍＳＰＨＫ２（左上がりの斜線）で、またはｈＳＰＨＫ２（右上がりの斜線）でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞中のＳＰＰの質量レベルを測定した。データはｐｍｏｌ／ｎｍｏｌリン脂質、で表される。
【Ｆｉｇ．４】  Ｆｉｇ．４Ａ〜４Ｄは、ｍＳＰＨＫ２の基質特異性を示すグラフである。
（Ｆｉｇ．４Ａ）
Ｆｉｇ．４Ａは、ｍＳＰＨＫ２でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の細胞質ゾル中で測定された、様々なスフィンゴシン類似体または他の脂質（５０  ｍＭ）のＳＰＨＫ依存性のリン酸化を示すグラフである。レーン：１：Ｄ−エリスロスフィンゴシン（Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｏ  Ｓｐｈ）；２：Ｄ−エリスロジヒドロスフィンゴシン（Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｏ  ＤＨＳ）；３：Ｄ，Ｌ−ｔｈｒｅｏ  ＤＨＳ；４：Ｎ，Ｎ−４−ジメチルスフィンゴシン（ＤＭＳ）；５：Ｃ２−セラミド；６：Ｃ１６−セラミド；７：ジアシルグリセロール；８：ホスファチジルイノシトール；９：フィトスフィンゴシン。データは、Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｏ  Ｓｐｈのリン酸化度（％）として表される。
Ｆｉｇ．４Ｂ〜４Ｄは、Ｎ，Ｎ−ジメチルスフィンゴシンによる組換えＳＰＨＫ２の非拮抗的阻害を示すグラフである。
（Ｆｉｇ．４Ｂ）
Ｆｉｇ．４Ｂは、ＤＭＳによるｍＳＰＨＫ２の投与量依存性の阻害を示す。Ｆｉｇ．４Ａに示すように形質転換した後のＨＥＫ２９３細胞溶菌液中のＳＰＨＫ活性は、ＤＭＳの濃度を増加させながら、１０(Ｍ  Ｄ−エリスロスフィンゴシンを用いて測定された。
（Ｆｉｇ．４Ｃ）
Ｆｉｇ．４Ｃは、ＤＭＳ阻害の反応速度解析を示す。ＳＰＨＫ活性は、ＤＭＳの不存在下（白抜きの円）またはこれらの１０μＭ（塗りつぶした四角形）または２０μＭ（塗りつぶした三角形）の存在下で、Ｄ−エリスロスフィンゴシンの濃度を変えながら測定した。
（Ｆｉｇ．４Ｄ）
Ｆｉｇ．４Ｄは、ラインウィーバー−バークプロットである。Ｄ−エリスロスフィンゴシンのＫｍは３．４μＭであった。ＤＭＳのＫｉ値は１２μＭであった。
【Ｆｉｇ．５】  Ｆｉｇ．５Ａ〜５Ｅは、ｍＳＰＨＫ２に対するｐＨ依存性及び塩の効果を示すグラフである。
（Ｆｉｇ．５Ａ）
Ｆｉｇ．５Ａは、下記の緩衝剤を使用して調整されたｐＨを有するリン酸化酵素緩衝剤中で測定された、形質転換されたＨＥＫ２９３細胞中の細胞質ゾルのＳＰＨＫ２活性を示す：２００ｍＭ  酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５〜５．５、白抜きの円）；２００ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ６〜７、塗りつぶした円）；２００ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ６．５〜８、白抜きの四角形）；２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７〜７．５、塗りつぶした四角形）；２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ７．５〜９、白抜きの三角形）；及び２００ｍＭホウ酸塩（ｐＨ１０、塗りつぶした三角形）。
Ｆｉｇ．５Ｂ〜５Ｅは、塩類がＳＰＨＫ２を刺激するが、ＳＰＨＫ１を阻害することを示す。
（Ｆｉｇ．５ＢおよびＦｉｇ．５Ｃ）
Ｆｉｇ．５Ｂ及び５Ｃ中、ＨＥＫ２９３細胞溶菌液中のＳＰＨＫ活性は、ＮａＣｌ  （白抜きの四角形）またはＫＣｌ（塗りつぶした円）の非存在下または存在下で、ｍＳＰＨＫ１（Ｆｉｇ．５Ｂ）またはｍＳＰＨＫ２（Ｆｉｇ．５Ｃ）でトランスフェクトした２４時間後に測定した。
（Ｆｉｇ．５Ｄ）
Ｆｉｇ．５Ｄは、ＫＣｌによるＳＰＨＫ２活性化の反応速度解析を示す。ｍＳＰＨＫ２活性は、Ｄ−エリスロスフィンゴシンの濃度を変えながら、ＫＣｌの非存在下（白抜きの円）、５０ｍＭ  ＫＣｌ（白抜きの四角形）の存在下、または２００ｍＭ  ＫＣｌ（塗りつぶした四角形）の存在下で測定した。
（Ｆｉｇ．５Ｅ）
Ｆｉｇ．５Ｅは、Ｆｉｇ．５Ｄからのデータのラインウィーバー−バークプロットである。Ｋｍ値はＫＣｌの存在によって影響を受けなかった。Ｖｍａｘ値は、０、５０及び２００ｍＭのＫＣｌの存在下で、各々０．１、０．３及び１（ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ）であった。
【Ｆｉｇ．６】  （Ｆｉｇ．６ＡおよびＦｉｇ．６Ｂ）
Ｆｉｇ．６Ａ〜６Ｂは、ＳＰＨＫ１とＳＰＨＫ２の活性にＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が異なる効果を奏することを示すグラフである。ＨＥＫ２９３細胞は、ｍＳＰＨＫ１ａ（白抜きの円）またはｍＳＰＨＫ２（塗りつぶした円）で形質転換した。また、細胞溶菌液中の各々の活性は、示された濃度のＴｒｉｔｏｎＸ−１００（Ｆｉｇ．６Ａ）またはＢＳＡ（Ｆｉｇ．６Ｂ）の存在下で、２４時間後に測定された。
（Ｆｉｇ．６Ｃ）
Ｆｉｇ．６Ｃは、ホスファチジルセリンが、ＳＰＨＫ１とＳＰＨＫ２の活性に対して同様の効果を持つことを示すグラフである。ＨＥＫ２９３細胞はｍＳＰＨＫ１ａ（円）またはｍＳＰＨＫ２（三角形）で形質転換した。また、細胞溶菌液中の各々の活性は、示された濃度のホスファチジルセリン（塗りつぶした記号）またはホスファチジルコリン（白抜きの記号）の存在下で２４時間後に測定した。データは、添加物の非存在下で測定した対照の活性に対するパーセンテージで示した。
【図１Ａ−１】
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【図１Ａ−２】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
0004584525.tif 000067
【図４Ａ】
0004584525.tif 000068
【図４Ｂ】
0004584525.tif 000069
【図４Ｃ】
0004584525.tif 000070
【図４Ｄ】
0004584525.tif 000071
【図５Ａ】
0004584525.tif 000072
【図５Ｂ】
0004584525.tif 000073
【図５Ｃ】
0004584525.tif 000074
【図５Ｄ】
0004584525.tif 000075
【図５Ｅ】
0004584525.tif 000076
【図６Ａ】
0004584525.tif 000077
【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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