(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヌクレオフォスミンをBRCA1-BARD1と反応させることを含む、ヌクレオフォスミンをポリユビキチン化する方法。
【請求項２】
ヌクレオフォスミンをBRCA1-BARD1と反応させてヌクレオフォスミンをポリユビキチン化することを含む、ヌクレオフォスミンを安定化させる方法。
【請求項３】
ポリユビキチン化がin vitro又はin vivo（ヒトの生体内を除く）で行われるものである、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
CDK2-サイクリンE及び／又はCDK2-サイクリンAを用いてBARD1をリン酸化することを含む、ヌクレオフォスミンのポリユビキチン化を抑制する方法。
【請求項５】
CDK2-サイクリンE及び／又はCDK2-サイクリンAを用いてBARD1をリン酸化することを含む、BRCA1の分解を促進させる方法。
【請求項６】
CDK2-サイクリンE及び／又はCDK2-サイクリンAを用いてBARD1をリン酸化することを含む、BRCA1-BARD1のユビキチンリガーゼ活性を不活化する方法。
【請求項７】
BARD1のリン酸化部位がS148、S251、S288及びT299のうち少なくともS251である、請求項４〜６のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、ヌクレオフォスミンをＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１と反応させることを含む、ヌクレオフォスミンをポリユビキチン化する方法に関する。
【背景技術】  ＢＲＣＡ１は、乳癌及び卵巣癌の癌抑制遺伝子であり、乳癌研究の分野で最も重要な遺伝子の一つである１−４。最近、本発明者らは、ＢＲＣＡ１及びＢＡＲＤ１がＲＩＮＧヘテロダイマー型ユビキチンリガーゼを形成すること、家族性乳癌の原因となるＢＲＣＡ１におけるミスセンス変異により、このリガーゼ活性が完全に失活することを発見した１，９。さらに、本発明者らは、ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１によって触媒されるポリユビキチン鎖が、２６Ｓプロテアソームによるタンパク質分解のシグナルとして機能する従来のＬｙｓ−４８結合型ではなく、今までにないＬｙｓ−６結合型のユビキチン鎖であること、および、ｉｎ  ｖｉｔｒｏではこれらのポリユビキチン鎖が２６Ｓプロテアソームによって脱ユビキチン化されることを報告した２，３。しかし、このユビキチンリガーゼの活性が、ＢＲＣＡ１の癌抑制機能にどのように関わっているのかについては、明らかになっていない。この主な理由は、リガーゼ活性の基質が同定されていなかったことと、活性を制御する上流のシグナルが明らかになっていなかったことによるものである。
ＮＰＭは、Ｇ１期の間は中心体に存在し、ＮＰＭがＧ１／Ｓ移行期の間にＣＤＫ２−サイクリンＥによっててリン酸化され、中心体より離れることにより、中心体複製が開始することが報告されている７，８。ＮＰＭは分裂期には再び中心体に戻り、分裂後の娘細胞の中心体がＮＰＭを有するようになることから、ＮＰＭが中心体複製のライセンス因子である可能性が指摘されている。しかし、どのようにしてＮＰＭが分裂期に中心体に戻ってくるのかは明らかになっていない。一方、ＢＲＣＡ１の欠失によって中心体の過剰複製が引き起こされ、ゲノムを不安定化させることが分かっているが、そのメカニズムも明らかとなっていない。
【発明の開示】
上記のように、ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１リガーゼがどのようにしてＤＮＡ修復、細胞周期の進行及び中心体の複製等の、様々な細胞の過程を調節するのかについては明らかではない４−６。そこで、本発明は、ヌクレオフォスミンをＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１と反応させることを含む、ヌクレオフォスミンをポリユビキチン化することを目的とする。本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１が、核内リン酸化タンパク質であるヌクレオフォスミン／Ｂ２３（ＮＰＭ）と結合し、ＮＰＭのポリユビキチン化を触媒することでＮＰＭが安定化されることを見出した。
本発明の一つの態様において、ヌクレオフォスミンをＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１と反応させることを含む、ヌクレオフォスミンをポリユビキチン化する方法が提供される。
本方法において、ポリユビキチン化はｉｎ  ｖｉｔｒｏ、又は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて実施することができる。
本発明の一つの態様として、ヌクレオフォスミンをポリユビキチン化することを含む、ヌクレオフォスミンを安定化させる方法が提供される。
本発明の他の一つの態様として、ＣＤＫ２−サイクリンＥ及び／又はＣＤＫ２−サイクリンＡを用いてＢＡＲＤ１をリン酸化することを含む、ヌクレオフォスミンのポリユビキチン化を抑制する方法、ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１を解離させる方法、ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１のユビキチンリガーゼ活性を不活化する方法が提供される。本方法においては、ＢＡＲＤ１のリン酸化部位は、Ｓ１４８、Ｓ２５１、Ｓ２８８及びＴ２９９からなる群から選ばれる少なくとも３つの部位でありうる。また、前記部位は、Ｓ１４８、Ｓ２８８及びＴ２９９でもよく、Ｓ１４８、Ｓ２５１、Ｓ２８８及びＴ２９９でもよい。
本発明の一つの態様として、ＢＲＣＡ１並びにＣＤＫ２−サイクリンＥ及び／又はＣＤＫ２−サイクリンＡを共発現させることを含む、ＢＲＣＡ１を核から細胞質へ輸送させる方法が提供される。
【図面の簡単な説明】  図１は、２つの異なるスクリーニングによりＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１リガーゼの基質としてＮＰＭが同定されたことを示す図である。［＊］及び［＊＊］は、それぞれＭｙｃ−ＢＲＣＡ１（１−７７２）及びＨＡ−ＢＡＲＤ１を示す。
図２は、ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１によるＮＰＭのユビキチン化を示す図である。Ａにおける矢印頭は、非−ユビキチン化Ｆｌａｇ−ＮＰＭの位置を示す。Ｄにおける矢印頭は、ユビキチン化Ｆｌａｇ−ＮＰＭの位置を示す。［＊］は、ＩｇＧを示す。
図３は、ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１によるＮＰＭのユビキチン化はプロテアソーム分解のシグナルではないことを示す図である。Ａのレーン１−４は、Ｆｌａｇ−ＮＰＭを０．５μｇ、レーン２ではＭｙｃ−ＢＲＣＡ１１−７７２及びＨＡ−ＢＡＲＤ１を０．０５μｇ、レーン３では、Ｍｙｃ−ＢＲＣＡ１１−７７２及びＨＡ−ＢＡＲＤ１を０．２５μｇ、レーン４では、Ｍｙｃ−ＢＲＣＡ１１−７７２及びＨＡ−ＢＡＲＤ１を１μｇ、プラスミドを２９３Ｔ細胞にトランスフェクトしたものである。
図４は、分裂期における、ＮＰＭとＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１との共在及びＮＰＭのユビキチン化を示す図である。ＡのＭｅｒｇｅは、２つのタンパク質（ＮＰＭとＢＡＲＤ１）の画像を重ね合わせたものを示す。ＢおよびＣのＭｅｒｇｅは２つのタンパク質（Ｂ：ＢＲＣＡ１とα／β−ｔｕｂｕｌｉｎ  Ｃ：ＮＰＭとＢＲＣＡ１）及び核の画像を重ね合わせたものを示す。Ｄでは、フローサイトメトリーでモニターしたＤＮＡ含量を上部に示す。
図５は、ＢＡＲＤ１の細胞周期に依存した発現を示す図である。Ａはダブルチミジンブロックによる細胞周期の同調、Ｂはチミジンノコダゾールブロックによる同調を示す。各図の上部は、ブロックを解除した後の各タンパク質の発現を免疫ブロットで経時的に示した結果を、下のグラフは阻害を解除した後の細胞周期の経過をＦＡＣＳ分析でモニターした結果を示す。Ａｓｙｎは非同調細胞を示す。
図６は、ＣＤＫ２サイクリンＡ１／Ｅ１及びＣＤＫ１サイクリンＢ１が、ＢＡＲＤ１のＮＨ２末端側をリン酸化することを示す図である。＊はＩｇＧを、ＷＴは野生型を、Ｋ２／Ｅ１はＣＤＫ２−ｃｙｅｌｉｎ  Ｅ１を、Ｋ２／Ａ１はＣＤＫ２−ｃｙｃｌｉｎ  Ａ１を、Ｋ１／Ｂ１はＣＤＫ１−ＣｙＣｌｉｎ  Ｂ１、ＨＡ−ＢＡＲＤ１−Ｐはリン酸化ＨＡ−ＢＡＲＤ１をそれぞれ示す。
図７Ａ−Ｃは、ＣＤＫ−サイクリンＥ及びＣＤＫ−サイクリンＡが、ＮＰＭのユビキチン化を抑制することを示す図である。Ｋ２／ＥはＣＤＫ２−サイクリンＥを、Ｋ２／ＡはＣＤＫ２−サイクリンＡを、Ｋ１／ＢはＣＤＫ１−サイクリンＢをそれぞれ示す。Ｄは、ＣＤＫ２−サイクリンＥ１及びＣＤＫ２−サイクリンＡ１が濃度依存的にＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１のユビキチンリガーゼ活性を抑制することを示す図である。レーン２及び６ではＣＤＫ２−サイクリンＥ１量０．２μｇを、レーン３及び７ではＣＤＫ２−サイクリンＥ１量０．６μｇを、レーン４及び８ではＣＤＫ２−サイクリンＥ１量２μｇ加えたものである。ＷＴは野生型を、ＭＴはＢＡＲＤ１Ｓ１４８Ａ／Ｓ２５１Ａ／Ｓ２８８Ａ／Ｔ２９９Ａを示す。
図８は、ＢＲＣＡ１及びＢＡＲＤ１は、細胞質に輸送され、ＣＤＫ２−ｃｙｃｌｉｎ  Ｅ１との共発現により不安定化することを示す図である。Ａ．上段は抗−ＨＡ抗体を、下段は抗−ＨＡ抗体反応後抗−Ｍｙｃ抗体を再プローブした免疫ブロットで解析していることを示す。Ｂ．レーン２はＣＤＫ２−サイクリンＥ１を０．１μｇ、レーン３は０．５μｇ、レーン４は１．５μｇ加えたものである。Ｍｙｃ−ＢＲＣＡ１１−７７２、ＨＡ−ＢＡＲＤ１はどのレーンにも各々１μｇ加えている。各々のタンパク質の定常状態は、上段では、抗−ＨＡ抗体を、２段目では、抗−ＨＡ抗体反応後に抗−Ｍｙｃ再プローブを用いて免疫ブロットで解析していることを示す。Ｃ．上段ではＭｙｃ−ＢＲＣＡ１１−７７２、ＨＡ−ＢＡＲＤ１及びｐｃＤＮＡ３ベクターを用いて、下段では、Ｍｙｃ−ＢＲＣＡ１１−７７２、ＨＡ−ＢＡＲＤ１及びＣＤＫ２−サイクリンＥ１を２９３Ｔ細胞に強制発現させたものである。Ｄ．レーン１及び２では、ＦＬＡＧ−ＢＲＣＡ１、ＨＡ−ＢＡＲＤ１及びｐｃＤＮＡ３ベクターを用いて、レーン３及び４では、ＦＬＡＧ−ＢＲＣＡ１、ＨＡ−ＢＡＲＤ１及びＣＤＫ２−サイクリンＥ１を用いたことを示す。また、Ｎは核を、Ｃは細胞質を示す。２段目は、上段を更に長時間露光した場合を示す。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明は、ヌクレオフォスミンをＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１と反応させることを含む、ヌクレオフォスミンをポリユビキチン化する方法に関する。ＮＰＭは、Ｍ期において紡錘体極でＢＲＣＡ１と共在し、ユビキチン化される。Ｇ１／Ｓ移行期及びＳ期の間はＣＤＫ２−サイクリンＥ及びＣＤＫ２−サイクリンＡが、ＮＰＭをリン酸化し、ＮＰＭを中心体から解離することが知られている７，８が、興味深いことに、この時期にＣＤＫ２はＢＡＲＤ１をもリン酸化する。この結果、ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１解離が起こり、従って、ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１によるＮＰＭのユビキチン化が抑制される。ＢＲＣＡ１の欠失により中心体過剰複製、染色体分配異常が起こるが、この新規なＣＤＫ２−ＢＲＣＡ１−ＮＰＭ経路が、中心体複製におけるＢＲＣＡ１の役割を担うメカニズムであることが示される。
以下、本発明について詳細に説明する。
１．ヌクレオフォスミン、ＢＲＣＡ１、ＢＡＲＤ１
本発明のヌクレオフォスミン（以下、「ＮＰＭ」という場合がある）とは、ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１ユビキチンリガーゼの基質である。全ての細胞において、リボゾーム生合成、アポトーシス抑制、ヒストンシャペロン機能など、多様な生物学的活性を有する。ヌクレオフォスミンには、例えば、ヌクレオフォスミン／Ｂ２３／ＮＯ３８（ＮＰＭ）が含まれる。ヌクレオフォスミンは、本発明者らによって、質量分析器（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）を用いた２つのスクリーニングによりＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１の基質として同定された。ＮＰＭは、Ｍ期において紡錘体極でＢＲＣＡ１と共在し、ユビキチン化される。Ｇ１／Ｓ移行期及びＳ期の間はＣＤＫ２−サイクリンＥ及びＣＤＫ２−サイクリンＡが、ＮＰＭをリン酸化し、ＮＰＭを中心体から解離し、中心体を娘中心小体に分割させることが知られている７，８。Ｓ期の間、ＮＰＭは中心体と結合できないが、その間、娘中心小体が中心体、それに続いて２つの紡錘体極に成熟する。従って、中心体複製の制御機構としてＣＤＫ２−ＢＲＣＡ１−ＮＰＭ経路が存在し、ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１によるＮＰＭのユビキチン化が、分裂期の間にＮＰＭが紡垂体極に再局在するのに重要な役割を果たしている。
ＢＲＣＡ１は、乳癌及び卵巣癌の癌抑制遺伝子であり、乳癌研究の分野で最も重要な遺伝子の一つである。また、ＢＲＣＡ１は、ＢＡＲＤ１と共にＲＩＮＧヘテロダイマーを形成すると、高いユビキチンリガーゼ活性を獲得する１−４。マウスのＢｒｃａ１遺伝子の標的破壊により中心体の過剰増幅とゲノム不安定性がおこる１３，１４。分裂期の間にＢＲＣＡ１は中心体に局在する。また、ＢＲＣＡ１はγ−チューブリンと結合することが報告されている１５，１６。
ＢＡＲＤ１は、ＢＲＣＡ１と結合するＲｉｎｇフィンガー蛋白質（ＢＲＣＡ１  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｒｉｎｇ  Ｄｏｍａｉｎ１）として同定された。
ＢＲＣＡ１及びＢＡＲＤ１は、ＲＩＮＧヘテロダイマー型ユビキチンリガーゼを形成するが、家族性乳癌の原因となるＢＲＣＡ１におけるミスセンス変異により、このリガーゼ活性は完全に失活する１，９。
ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１リガーゼは、ＤＮＡ修復、細胞周期の進行及び中心体の複製等の様々な細胞の過程を調節する。免疫細胞染色実験によれば、細胞周期の各期のＮＰＭ、ＢＲＣＡ１及びＢＡＲＤ１の挙動は以下の通りである。すなわち、間期においてＮＰＭは核小体に存在するが、ＢＲＣＡ１とＢＡＲＤ１は核小体以外の核内に存在する。しかし、分裂期には、それらは、紡垂体付近の核周辺及び中心体（紡錘体極）に共在する。さらに、チミジン−ノコダゾールブロックによって細胞周期を分裂期に同調させたＨｅＬａ細胞を用いた試験により、ＮＰＭは、分裂期からＧ１期に移行する短期間にポリユビキチン化されることが判明した。細胞周期の間の細胞内局在及びＮＰＭとの共在を観察するために、ＢＡＲＤ１のＣ末端に対するウサギポリクローナル抗体を調製して用いることができる。細胞周期の同調はフローサイトメトリーでモニターし、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＮＰＭユビキチン化をＩＰ−ウェスタン解析により評価することができる。
さらに、ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１によって触媒されるポリユビキチン鎖は、２６Ｓプロテアソームによるタンパク質分解のシグナルとして機能する従来のＬｙｓ−４８結合型ではなくＬｙｓ−６結合型のユビキチン鎖であり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏではこれらの鎖が２６Ｓプロテアソームによって脱ユビキチン化される２，３。ＮＰＭも、ｉｎ  ｖｉｖｏでＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１によりユビキチン化され、安定化するが、このユビキチン化は、２６Ｓプロテアソーム依存性タンパク質分解のシグナルとしては機能しない。
ＮＰＭはまた、分裂期の間に紡垂体極に再分布することは注目に値する１７。ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１によるＮＰＭのユビキチン化は、この再分布にとって重要であり得、その欠如により中心体の過剰複製が起こりうる。さらに、ＮＰＭの多くの機能、すなわちＤＮＡ損傷後のアップレギュレーション１８、細胞周期とアポトーシス１９，２０及びクロマチンリモデリングにおける役割２１，２２がＢＲＣＡ１の機能と重複している。従って、ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１によるＮＰＭのユビキチン化は、ＢＲＣＡ１の公知の機能を担う一つのメカニズムでありうる。
２．ユビキチン化／ポリユビキチン化
ユビキチン化とは、ユビキチン活性化酵素（Ｅ１）、ユビキチン結合酵素（Ｅ２）およびユビキチンリガーゼ（Ｅ３）などの酵素が協同して、基質となるタンパク質にユビキチンを次々と結合させていく過程である。このユビキチン化の生理的意義は、基質を２６Ｓプロテアソーム−依存性分解へと導くことであり、これはユビキチン上のＬｙｓ−４８を介したユビキチン−ユビキチン連結による１１，１２。しかし、本発明者や他の研究者らは、最近、ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１が従来とは異なるＬｙｓ−６結合型ポリユビキチン鎖の形成を触媒することを発見したが、それは、分解の標的とされる代わりに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、精製２６Ｓプロテアソームにより脱ユビキチン化されるというものである２，３。
本明細書において「自己ユビキチン化」とは、ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１がユビキチンリガーゼ活性を有することにより、ＢＲＣＡ１自体がユビキチン化の基質タンパク質となり、他のユビキチンリガーゼによることなく自らユビキチンを結合させるものである。
ＮＰＭのユビキチン化は、２６Ｓプロテアソーム依存性タンパク質分解のシグナルとしては機能しない。ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１−介在ＮＰＭユビキチン化がＮＰＭを分解するための標的とするのか否かはｉｎ  ｖｉｖｏでの安定性を測定することにより判断できる。この場合、ＮＰＭ単独で発現させた場合と、ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１存在下で共発現させた場合に、共発現の場合の方がＮＰＭの安定性が高い場合は、ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１によるＮＰＭユビキチン化はプロテアソーム分解のシグナルではないといえる。また、ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１−介在ＮＰＭユビキチン化がＮＰＭを分解するための標的とするのか否かはパルスーチェイス分析によっても測定できるし、プロテアソーム阻害剤であるＭＧ１３２又はＬＬｎＬによる処理をすることもできる。この場合、ユビキチン化Ｆｌａｇ−ＮＰＭ量が増加しない場合に、ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１によるＮＰＭユビキチン化はプロテアソーム分解のシグナルではないといえる。これらの知見は、ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１によるＮＰＭユビキチン化が、タンパク質分解以外のメカニズムを介してＮＰＭの機能に影響を与えることを示す。
ＮＰＭは、また、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでもＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１によりユビキチン化されることが明らかである。ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１がｉｎ  ｖｉｔｒｏでＮＰＭをユビキチン化するか否かは、リコンビナントタンパク質のみを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏのシステムで試験することができる。例えば、タグ標識したＮＰＭ、ＢＲＣＡ１及びＢＡＲＤ１とＥ１、Ｅ２、ユビキチンとをインキュベートし、タグ標識したＮＰＭを、適当な抗体を用いて免疫ブロットを行うことができる。このような系を用いると、精製システムにおけるＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１−依存性ＮＰＭユビキチン化が示される。
３．ＣＤＫ２−サイクリンによるＢＡＲＤ１のリン酸化
ＣＤＫとは、サイクリン依存性キナーゼをいい、ＣＤＫ２−サイクリンＥは、ＣＤＫ２とサイクリンＥとの複合体を、ＣＤＫ２−サイクリンＡは、ＣＤＫ２とサイクリンＡとの複合体をそれぞれ意味する。両者は共に細胞周期調節系で協働しており、ＣＤＫ２−サイクリンＥの複合体は、細胞のＧ１／Ｓコミットメントポイント（開始点）通過を誘導し、さらにＣＤＫ２−サイクリンＡの複合体が続くＤＮＡ複製装置の活性化に必要と考えられている。なお、本明細書の以下に記載がある、サイクリンＢは、ＣＤＫ１（ｃｄｃ２）複合体を形成し、分裂期の開始を誘導するものである。
このＣＤＫ２−サイクリンＥ及びＣＤＫ２−サイクリンＡは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、完全にＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１によるＮＰＭのポリユビキチン化を抑制する。ＣＤＫ２がＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１によるＮＰＭのユビキチン化を抑制するメカニズムとして２つのことが考えられる。
１）ＣＤＫ２によるＮＰＭのリン酸化によってＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１がＮＰＭを認識できなくなる。
２）ＣＤＫ２はＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１リガーゼを直接リン酸化し、その活性を抑制する。
２つのモデルを区別するために、まず、ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１リガーゼが、ＣＤＫ２リン酸化部位を有しない変異体をユビキチン化しうるか否かを試験することができる。これにより、上記変異体は、ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１リガーゼによってユビキチン化され、このユビキチン化はＣＤＫ２によって抑制されることが分かる。ＢＡＲＤ１はＣＤＫ２−サイクリンＥ１の基質なので、ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１ユビキチンリガーゼ活性の抑制は、ＢＡＲＤ１のリン酸化に直接影響を受けている可能性がある。しかし、ＢＡＲＤ１の非リン酸化変異体を介したＢＲＣＡ１の自己ユビキチン化も、ＣＤＫ２−サイクリンＥ１によって抑制されるため、ＣＤＫ２によるＮＰＭユビキチン化の抑制が全てＢＡＲＤ１のリン酸化に起因するものではないことがわかる。
ＣＤＫによるＢＡＲＤ１のリン酸化は、ＢＡＲＤ１とＣＤＫ−サイクリンを共発現させた場合に、ＢＡＲＤ１の分子量が変動するかを測定することにより解析することができる。この泳動位置の変化は、ＢＡＲＤ１の免疫沈降物をアルカリフォスファターゼ処理することにより消失する。この現象も、ＢＡＲＤ１がＣＤＫ２キナーゼの基質であることを裏づけている。この場合に、ＢＡＲＤ１のＮＨ２末端断片やＢＡＲＤ１のＣＯＯＨ末端断片などを用いることにより、ＢＡＲＤ１のリン酸化がどの領域で起こっているかを決定することができる。また、ＣＤＫが、ＢＡＲＤ１を直接リン酸化するか否かを検討するには、ＢＡＲＤ１がｉｎ  ｖｉｔｒｏでＣＤＫの基質となりうるか検討するればよい。これにより、ＢＡＲＤ１は、ＮＨ２末端側で、ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１のヘテロダイマー形成とは独立した態様でＣＤＫ１及びＣＤＫ２によりリン酸化されることが示される。
ＢＡＲＤ１のＮＨ２末端側にリン酸化部位がＳ１４８／Ｓ２５１／Ｓ２８８／Ｔ２９９の４箇所あることがわかる。これらの４つの部位を変異させた変異体は、ＣＤＫ２−サイクリンＥ１によってもＣＤＫ１−サイクリンＢ１によってもほとんど分子量の変動を示さないため、この４ヶ所がリン酸化部位であることが示された。ＢＡＲＤ１の上記変異体はＣＤＫ２によるユビキチンリガーゼ活性の抑制に感受性を有したままであるし、ＣＤＫ１がＣＤＫ２と同じ部位でＢＡＲＤ１をリン酸化しても、ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１のリガーゼ活性は抑制されないため、リン酸化自体は、ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１ユビキチンリガーゼのダウンレギュレーションにそれほど重要ではないと考えられる。ＢＡＲＤ１とＣＤＫ１−サイクリンＢとの共発現がｉｎ  ｖｉｖｏでＢＡＲＤ１のリン酸化を引き起こすが、ＢＡＲＤ１とＢＲＣＡ１との結合には影響しないことは、ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１の機能は、細胞周期中の各時期における細胞周期キナーゼによりそれぞれ異なった制御を受けていることを示す。
上記のＣＤＫ２−サイクリンＥ及びＣＤＫ２−サイクリンＡによるＢＡＲＤ１のリン酸化によりＢＲＣＡ１及びＢＡＲＤ１は解離し、その結果、ユビキチンリガーゼ活性が不活化される。ＢＲＣＡ１自己ユビキチン化を測定することにより、ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１ヘテロダイマー固有のリガーゼ活性に対する、ＣＤＫ２−サイクリンＥ及びＣＤＫ２−サイクリンＡの効果を試験することができる。それによれば、ＣＤＫ１−サイクリンＢがＢＲＣＡ１の自己ユビキチン化を抑制しないのに対し、ＣＤＫ２−サイクリンＥ及びＣＤＫ２−サイクリンＡはともにＢＲＣＡ１の自己ユビキチン化を完全に抑制する。注目すべきことに、ＣＤＫ２−サイクリンＥ及びＣＤＫ２−サイクリンＡはともに、ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１を分解する。
サイクリンＥのタンパク質レベルでの発現は、散発性乳癌において顕著に変動しており、その高度な発現レベルは、悪性予後と有意に相関する２３。
本発明に関して、ＣＤＫ２−サイクリンＥ１及びＡ１がＢＲＣＡ１及びＢＡＲＤ１のタンパク質発現にどのような影響を与えるかについては、ユビキチンリガーゼ活性に対応するＢＲＣＡ１及びＢＡＲＤ１の定常状態レベルが、用量依存的にＣＤＫ１−サイクリンＢ１ではなく、ＣＤＫ２−サイクリンＥ１／Ａ１により劇的に減少する。また、細胞を［３５Ｓ］−メチオニンでラベルしパルス−チェイス試験する場合、ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１複合体をＣＤＫ２−サイクリンＥ１で共発現させると、細胞中での半減期は、顕著に減少することから、タンパク質発現の減少はタンパク質の分解によるものであることが示される。本発明により、高レベルのサイクリンＥの存在は、ＢＲＣＡ１のユビキチンリガーゼ活性を低下させることが示される。したがって、ＢＲＣＡ１のユビキチンリガーゼ活性は、家族性乳癌に加え、散発性乳癌にも関与していることが示される。
４．ＢＲＣＡ１の核から細胞質への輸送
以前、ＢＲＣＡ１及びＢＡＲＤ１は、核から細胞質への輸送により分解されるという報告があった。ＣＤＫ２−サイクリンＥ１をＢＲＣＡ１と共発現させた場合の、核および細胞質中のＢＲＣＡ１タンパク質レベルを定量すると、ＣＤＫ２−サイクリンＥ１が存在しない場合、細胞質のＢＲＣＡ１のタンパク質レベルは、核で観察されるタンパク質レベルよりも低く、ＣＤＫ２−サイクリンＥ１と共発現させた場合は、細胞質ＢＲＣＡ１タンパク質のレベルは、核で見られるタンパク質レベルよりも高いことが判明した。従って、ＣＤＫ２−サイクリンＥ１の存在下で、ＢＲＣＡ１は核から細胞質へ輸送されると考えられる。
以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明は、これら実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
本実施例全体を通し、所定の方法は、以下の通りに行った。
方法
抗体、発現構築体及び精製タンパク質
ＨＡ（１２ＣＡ５，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、Ｍｙｃ（９Ｅ１０，ＢａｂＣｏ）、Ｆｌａｇ（Ｍ２，Ｓｉｇｍａ）、ポリユビキチン（Ａｆｆｉｎｉｔｉ）、α−及びβ−チューブリン（ＤＭＩＡ＋ＢＭＩＢ，Ｎｅｏｍａｒｋｅｒｓ）及びＮＰＭ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ又はＺｙｍｅｄ）に対するマウスモノクローナル抗体並びにＢＲＣＡ１に対するウサギポリクローナル抗体である（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ｃ−２０）は市販のものを購入した。ＢＡＲＤ１のＣ末端に対して作製されたウサギポリクローナル抗体を合成ペプチドＣＶＭＳＦＥＬＬＰＬＤＳ（配列番号３）を用いて生成し、使用前にアフィニティー精製した。細胞の蛍光免疫染色における特異性を競合ペプチドを用いて確認した。
全長ヒトＮＰＭ（Ｂ２３．１）のｃＤＮＡ（配列番号１）を、ＨｅＬａ細胞のｃＤＮＡライブラリーからＰｆｘポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いてＰＣＲで増幅した。増幅した全長ヒトＮＰＭ（Ｂ２３．１）のｃＤＮＡを、Ｎ−末端Ｆｌａｇ  ｔａｇを有する哺乳動物発現ｐｃＤＮＡ３ベクター、又は、Ｎ−末端６ｘ  Ｈｉｓ−Ｆｌａｇ  ｔａｇを有する大腸菌発現ベクターであるｐＥＴにサブクローニングした。ＢＲＣＡ１、ＢＡＲＤ１及びＨＡ−ユビキチン用の哺乳動物発現プラスミドはＨａｓｈｉｚｕｍｅ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ＲＩＮＧ  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ  ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１  ｉｓ  ａ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  ｌｉｇａｓｅ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｂｙ  ａ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，１４５３７−１４５４０（２００１）、Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ  ａｎｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｅｓ  ｒｅｖｅａｌ  Ｌｙｓ−６−ｌｉｎｋｅｄ  ｐｏｌｙｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  ｃｈａｉｎｓ  ｃａｔａｌｙｚｅｄ  ｂｙ  ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  ｌｉｇａｓｅ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．ｉｎ  ｐｒｅｓｓ［ｏｎｌｉｎｅ  ｒｅｓｏｕｒｃｅ］に記載の方法で行った１、２。切断変異体を作製するために終止コドンを含む点突然変異を、ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）によって生成した。用いた全てのプラスミドは、ＤＮＡシークエンスによって確認した。サイクリン及びＣＤＫの哺乳動物発現プラスミドは、Ｏｈｔａ，Ｔ．，Ｘｉｏｎｇ，Ｙ．，Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ−ａｎｄ  Ｓｋｐｌ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅ２Ｆ１  ｂｙ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ＲＯＣ−ｃｕｌｌｉｎ  ｌｉｇａｓｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓ．６１，１３４７−１３５３（２００１）及びＭａｅｄａ，Ｉ．Ｏｈｔａ，Ｔ．Ｋｏｉｚｕｍｉ，Ｈ．Ｆｕｋｕｄａ，Ｍ．Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１  ｂｙ  ＲＯＣ１−ＣＵＬ１  ａｎｄ  ＲＯＣ１−ＣＵＬ３．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４９４，１８１−１８５（２００１）に記載の方法２６，２７で調製した。
ウサギＥ１（Ａｆｆｉｎｉｔｉ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、ウシユビキチン（Ｓｉｇｍａ）及びＦｌａｇ−ユビキチン（Ｓｉｇｍａ）は市販のものを購入した。Ｈｉｓ−ＵｂｃＨ５ｃ、並びにＨｉｓ−ＢＲＣＡ１及びＨｉｓ−ＢＡＲＤ１の切断Ｎ−末端断片は、上記のＨａｓｈｉｚｕｍｅらの方法で作製した１。全長のＨｉｓ−Ｆｌａｇ−ＮＰＭは、ニッケルアガロースビーズとそれに続く抗−Ｆｌａｇ抗体架橋アガロースビーズを用いた２段階精製を行うことにより得た。精製タンパク質をＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅで染色し、その濃度を、デンシトメーター（ＬＡＳ  ３０００，Ｆｕｊｉ  ｆｉｌｍ）を用いて標準タンパク質と比較することにより測定した。
細胞培養、発現及び免疫学的手法
細胞を１０％ウシ胎仔血清（２９３Ｔ，ＨｅＬａ及びＣＯＳ７）又は１０％新生ウシ血清（３Ｔ３  Ｓｗｉｓｓ）及び１％抗生物質−抗真菌剤（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ）を添加したダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）改変Ｅａｇｌｅ’ｓ培地で培養し、Ｏｈｔａ，Ｔ．，Ｍｉｃｈｅｌ，Ｊ．Ｊ．，Ｓｃｈｏｔｔｅｌｉｕｓ，Ａ．Ｊ．，＆  Ｘｉｏｎｇ，Ｙ．ＲＯＣ１，ａ  ｈｏｍｏｌｏｇ  ｏｆ  ＡＰＣ１１，ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ  ａ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｃｕｌｌｉｎ  ｐａｒｔｎｅｒｓ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  ｌｉｇａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  ３，５３５−５４１（１９９９）に記載された標準的なリン酸カルシウム沈殿法２４を用いて細胞に発現させた。プロテアソーム阻害剤の効果を調べるために、細胞を、ＭＧ１３２（２０μＭ）、ＬＬｎＬ（２０μＭ）又は等量のＤＭＳＯ溶剤（１μｌ／ｍｌ培地）で細胞回収前に１０時間処理した。チミジン−ノコダゾールによる細胞周期の同調は、Ｏｈｔａ，Ｔ．，Ｍｉｃｈｅｌ，Ｊ．Ｊ．，＆  Ｘｉｏｎｇ，Ｙ．Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｃｕｌｌｉｎ  ｐａｒｔｎｅｒｓ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ＲＯＣ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １８，６７５８−６７６６（１９９９）に記載の方法２５で行った。
その後、細胞をｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅで染色し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いたフローサイトメトリーに供した。
ｉｎ  ｖｉｖｏでユビキチン化された基質の検出を含む免疫沈降及び免疫ブロット法は、抗−Ｆｌａｇ抗体結合アガロースビーズ（Ｍ２，Ｓｉｇｍａ）からＦｌａｇ−ＮＰＭを製造者の説明書に従って抽出するためにＦｌａｇペプチドを用いること以外は、上記したＨａｓｈｉｚｕｍｅら及びＮｉｓｈｉｋａｗａらの方法のとおりである１，２。
ｉｎ  ｖｉｔｒｏユビキチン化アッセイは、反応にＨｉｓ−Ｆｌａｇ−ＮＰＭ（０．５μｇ）を加えること以外は、上記したＨａｓｈｉｚｕｍｅら及びＮｉｓｈｉｋａｗａらの方法に従って行った１，２。
ｉｎ  ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイは、Ｏｈｔａ，Ｔ．，＆  Ｘｉｏｎｇ，Ｙ．Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ−ａｎｄ  Ｓｋｐ１−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅ２Ｆ１  ｂｙ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ＲＯＣ−ｃｕｌｌｉｎ  ｌｉｇａｓｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１，１３４７−１３５３（２００１）に報告したように行った２６。免疫沈降したＨＡ−ＢＡＲＤ１の脱リン酸化のため、ＨＡ−ＢＡＲＤ１を結合させたビーズを、２Ｕのウシ腸管アルカリフォスファターゼ（Ｔａｋａｒａ）とともに３７℃で３０分間インキュベートした。
また、キナーゼアッセイではＣＤＫ２−サイクリンＥ１又はＨＡ−ＣＤＫ１−サイクリンＢ１を発現させた２９３Ｔ細胞から沈降して得た抗−ＣＤＫ２または抗−ＨＡ免疫複合体をキナーゼとして用い、基質タンパク質２μｇを用いて行った。核分画及び細胞質分画の調製のために、細胞をバッファーＡ［１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＮａＦ、及びプロテイナーゼ阻害剤］を用いて４℃で５分間溶解し、２６−ゲージ注射針で３回通した。細胞質上清分画は、４，０００×ｇで２分間遠心分離を行った後に獲得した。残ったペレットから核分画を得るために、バッファーＢ［５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％ＮＰ−４０、５０ｍＭ  ＮａＦ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＮａＶＯ３、及びプロテイナーゼ阻害剤］の中で超音波をかけることにより抽出した。
パルス−チェイス分析は、２９３細胞を［３５Ｓ］−メチオニンで１時間パルスラベルしたのち追跡した。
質量分析器を用いたスクリーニング
ユビキチン化反応は、上記のＮｉｓｈｉｋａｗａらの方法２と同様な手順で、Ｍｙｃ−ＢＲＣＡ１（１−７７２）及びＢＡＲＤ１を発現する２９３Ｔ細胞から沈降されたプロテインＡアガロースビーズに結合した抗−Ｍｙｃ免疫複合体とＦｌａｇ−ユビキチン、Ｅ１、Ｈｉｓ−ＵｂｃＨ５ｃを用いて行った。１０個の反応液（各３０μｌ）から得られた上清を回収して３０μｌ容量の抗−Ｆｌａｇ抗体架橋ビーズ（Ｓｉｇｍａ）とともにインキュベートし、Ｆｌａｇ−ユビキチンが共有結合したタンパク質を沈降させた。このビーズから、０．１ｍｇ／ｍｌのＦｌａｇペプチドを含有する２５ｍＭ重炭酸アンモニウム３０μｌ中にて、Ｆｌａｇ−ユビキチン結合タンパク質を抽出し、７．４μｇ／ｍｌトリプシンを用いて３０℃で２０時間消化した。
もう一つの方法として、ＨＡ−ＢＡＲＤ１（１−４０８）と、野生型又は変異体（Ｉ２６Ａ）Ｆｌａｇ−ＢＲＣＡ１（１−２２２）のいずれかとの複合体と相互作用するタンパク質を、上記のように免疫沈降して抽出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、製造者の説明書に従ってＳｙｐｒｏ  Ｒｕｂｙ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ）により染色した。目的のバンドをゲルから切り出し、製造者の説明書に従ってＩｎ  Ｇｅｌ  Ｄｉｇｅｓｔ  Ｋｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてトリプシンで消化した。
得られたペプチド断片を上記のＮｉｓｈｉｋａｗａらの方法２でＬＣ／ＭＳ／ＭＳにて解析した２。得られた衝突誘起解離スペクトルをＭａｓｃｏｔソフトウェアで解析した。
間接免疫細胞化学
増殖細胞を３％ホルマリンで１５分間固定し、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で５分間浸透した。細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、０．５％ＢＳＡ添加ＰＢＳでブロックし、抗−ＮＰＭ抗体、抗−α／β−チューブリン抗体、抗−ＢＡＲＤ１抗体及び抗−ＢＲＣＡ１抗体で染色した。紡錘体極でのＢＲＣＡ１及びＮＰＭの共在を検出するために、Ｈｓｕ，Ｌ．Ｃ，＆  Ｗｈｉｔｅ  ＲＬ．ＢＲＣＡ１  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｃｅｎｔｒｏｓｏｍｅ  ｄｕｒｉｎｇ  ｍｉｔｏｓｉｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５，１２９８３−１２９８８（１９９８）に報告されているように１５、細胞を冷メタノールで固定し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００緩衝液で浸透した。１次抗体を、以下の濃度でブロッキング緩衝液中に希釈した：抗−ＮＰＭ（０．５μｇ／ｍｌ）；抗−α／β−チューブリン（１μｇ／ｍｌ）；抗−ＢＡＲＤ１（３μｇ／ｍｌ）：及び抗−ＢＲＣＡ１（２μｇ／ｍｌ）。ＦＩＴＣ又はローダミン結合２次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を１：５０に希釈して用いた。核を０．５μＭ  ＴＯ−ＰＲＯ−３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅ）で対比染色した後、細胞を蛍光マウント培地（ＢｉｏＬａｄ）でマウントし、共焦点レーザー顕微鏡（ＬＳＭ  ５１０，Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）で観察した。
【実施例１】ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１リガーゼによりユビキチン化された基質の異なる２つのスクリーニングによるＮＰＭの同定
第一に、本発明者らは、ユビキチンリガーゼ免疫複合体が基質を含有しうるとの仮説を立てて以下の通りに試験した。すなわち、Ｆｌａｇ−ユビキチンが共有結合したタンパク質を、Ｍｙｃ−ＢＲＣＡ１（１−７７２）−ＢＡＲＤ１免疫複合体から、上記したとおりに作製した。反応上清部分を、抗−Ｆｌａｇ抗体を用いた免疫ブロット法により分析し（図１ａ左パネル）、残りの部分を用いて、ナノスケールキャピラリー液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）でポリユビキチン化された生成物を解析した（図１ａ）。同定されたタンパク質のうち、ヌクレオフォスミン／Ｂ２３（ＮＰＭ）は１７個のペプチドを有し、Ｍｏｗｓｅスコア１２６で最も高い可能性を示した（表１）。
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第２に、本発明者らは、基質タンパク質がユビキチンリガーゼと一過性に結合し、この結合がリガーゼ活性の失活により安定化されるであろうという仮説を立て、野生型ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１リガーゼに結合するタンパク質及び触媒作用的に不活性なＢＲＣＡ１（Ｉ２６Ａ）−ＢＡＲＤ１リガーゼに結合するタンパク質を比較した。すなわち、ＨＡ−ＢＡＲＤ１（１−４０８）と、Ｆｌａｇ−ＢＲＣＡ１（１−２２２）の野生型又はＩ２６Ａ変異体のいずれかとを発現する２９３Ｔ細胞から沈降した抗−Ｆｌａｇ免疫複合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離して、Ｓｙｐｒｏ  Ｒｕｂｙで染色した。３８−４０ｋＤａ付近に移動するタンパク質（矢印）を消化して、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳに供した。その結果、ＢＲＣＡ１中のＩ２６Ａの変異では、ＢＡＲＤ１との結合は保持されていたが、ＵｂｃＨ５ｃとの結合は消失し、ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１のヘテロダイマー酵素は触媒作用的には失活した９。おおよそ３８−４０ｋＤａのタンパク質が、変異リガーゼ複合体中のみに高レベルで存在し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによってＮＰＭと同定された（図１ｂ及び表１）。従って、異なる２つのスクリーニングにより、同一のタンパク質であるＮＰＭが同定された。
ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１とＮＰＭ間との結合を、一過性発現させた細胞を用いて、免疫沈降（ＩＰ）−ウェスタンブロット解析により確認した（図１ｃ）。すなわち、Ｍｙｃ−ＢＲＣＡ１（１−７７２）、ＨＡ−ＢＡＲＤ１及びＦｌａｇ−ＮＰＭのプラスミドを組み合わせて２９３Ｔ細胞に同時に発現させた。全細胞溶解液（図１ｃ上の２つのパネル）又は免疫沈降物（ＩＰ）を、抗−ＨＡ／Ｍｙｃ、抗−ＨＡ抗体及び抗−Ｍｙｃ抗体を用いた免疫ブロット（ＩＢ）に供した。抗−ＨＡ／Ｍｙｃは、抗−ＨＡ抗体、続いて抗−Ｍｙｃ抗体を再プローブとする免疫ブロット法を表す。ＮＰＭとＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１複合体とのｉｎ  ｖｉｖｏにおける結合は、ＩＰ−ウェスタンブロット解析により示した（レーン４）。発現させるときにＢＲＣＡ１又はＢＡＲＤ１のいずれかを除くと、ＮＰＭは消去した（レーン１及び２）。このことは、ＮＰＭとの結合は、ヘテロダイマー型ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１に依存することを示す。
２９３Ｔ細胞の溶解液をＢＡＲＤ１に対する抗体で免疫沈降させたものを、ウェスタンブロットで解析した。その結果、ＢＡＲＤ１免疫複合体におけるＢＡＲＤ１（図１ｄレーン１、上パネル）及びＮＰＭ（同レーン１、下パネル）が検出され、ＢＡＲＤ１抗原ペプチド（同レーン２）が特異的に競合することが示された。従って、内因性のＮＰＭも、ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１リガーゼ複合体と物理的に結合し、その基質となることが考えられた。
【実施例２】ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１によるＮＰＭのユビキチン化の確認
ＮＰＭがＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１ユビキチンリガーゼの基質か否かを決定するために、２９３Ｔ細胞にＦｌａｇ−ＮＰＭをＨＡ−ｔａｇｇｅｄユビキチン、Ｍｙｃ−ＢＲＣＡ１（１−７７２）及びＢＡＲＤ１と共発現させた（図２ａ）。上記発発現３６時間後に細胞を回収し、１％ＳＤＳ含有緩衝液中で煮沸した後、、０．１％まで希釈し、抗−Ｆｌａｇ抗体でＦｌａｇ−ＮＰＭを免疫沈降した。その後、抗−ＨＡ抗体（図２ａ上部）又は抗−Ｆｌａｇ抗体（図２ａ下部）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離したＮＰＭ沈降物の免疫ブロットを行った。ポリユビキチン化されたＮＰＭはラダー状の特徴を示した（レーン３）。Ｆｌａｇ−ＮＰＭ、ＨＡ−ユビキチン、Ｍｙｃ−ＢＲＣＡ１（１−７７２）、又はＢＡＲＤ１を除去すると、いずれもＮＰＭのラダーは見られなかったが、これは、ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１−依存性ＮＰＭユビキチン化という考えを裏づける。
もう一つのＲＩＮＧ型Ｅ３リガーゼであるＭＤＭ２が、公知の基質である癌抑制遺伝子ｐ５３のユビキチン化を効率よく促進する１０がことが知られているため、ｉｎ  ｖｉｖｏリガーゼアッセイでは、ｉｎ  ｖｉｖｏでユビキチン化されたＭｙｃ−ｐ５３及びＦｌａｇ−ＮＰＭを上記のとおりに検出した。その結果、ＮＰＭに対する活性は検出できなかった（図２ｂ、レーン３及び６）。一方、ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１はｐ５３のユビキチン化をほとんど引き起こさなかった（レーン２）。
ＮＰＭのユビキチン化が過剰発現に起因するＮＰＭのｍｉｓｆｏｌｄｉｎｇによって引き起こされるという可能性を取り除くために、内因性ＮＰＭもまたＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１によってユビキチン化されるか否かを試験した（図２ｃ）。ＨＡ−ｔａｇｇｅｄユビキチンを、Ｍｙｃ−ＢＲＣＡ１（１−７７２）及びＢＡＲＤ１とともに２９３Ｔ細胞で共発現させた。ユビキチン化された内因性ＮＰＭを１．５μｇの抗−ＮＰＭ抗体を用いて２９３Ｔ細胞から免疫沈降し、抗−ＨＡ抗体を用いた免疫ブロットによりＮＰＭユビキチン化を解析した。野生型リガーゼを添加すると、ポリユビキチン化されたＮＰＭが検出された（レーン４）。しかし、ＢＲＣＡ１においてＩ２６Ａ変異が置換された場合は、ＮＰＭのユビキチン化は消失した。これは、ＮＰＭのユビキチン化がＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１のユビキチンリガーゼ活性に依存することを示している（レーン５）。
さらにＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１がｉｎ  ｖｉｔｒｏでＮＰＭをユビキチン化するか否かをリコンビナントタンパク質のみを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏのシステムで試験した（図２ｄ）。精製ユビキチン、Ｅｌ、Ｅ２／Ｈｉｓ−ＵｂｃＨ５ｃ、Ｈｉｓ−ＢＲＣＡ１（１−３０４）及びＨｉｓ−ＢＡＲＤ１（１４−１８９）と大腸菌により精製したＨｉｓ−Ｆｌａｇ−ＮＰＭとをＡＴＰ存在下でインキュベートした。反応物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、た後、抗−Ｆｌａｇ抗体を用いて免疫ブロットを行った。その結果、ゲル上を緩慢に泳動する２つの生成物を検出し得た（レーン７）。基質ＮＰＭ、ユビキチン、Ｅ２／Ｈｉｓ−ＵｂｃＨ５ｃ、ＢＲＣＡ１又はＢＡＲＤ１を除去すると、全て、このＮＰＭのユビキチン化が消失した。これは、精製システムにおけるＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１−依存性ＮＰＭユビキチン化を示すものである。従って、本発明者らは、ＮＰＭがＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１  Ｅ３ユビキチンリガーゼの基質であると結論した。
【実施例３】ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１によるＮＰＭユビキチン化がプロテアソーム分解のシグナルとなりうるか否かの確認
上記のように、本発明者や他の者らは、最近、ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１が従来とは異なるＬｙｓ−６結合型ポリユビキチン鎖の形成を触媒することを発見したが、それは、分解の標的とされる代わりに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、精製２６Ｓプロテアソームにより脱ユビキチン化されるというものである２，３。従って、本発明者らは、ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１−介在ＮＰＭユビキチン化がＮＰＭを分解するための標的とするのか否かをｉｎ  ｖｉｖｏでの安定性を測定することにより試験した（図３）。すなわち、Ｆｌａｇ−ＮＰＭとともにＭｙｃ−ＢＲＣＡ１１−７７２及びＨＡ−ＢＡＲＤ１プラスミドを、６ウェルプレート内の２９３Ｔ細胞に発現させた。１ウェルあたりの全プラスミＤＮＡが２．５μｇとなるように、ｐｃＤＮＡ３ベクターを添加して調整した。抗−ＨＡ抗体、抗−Ｆｌａｇ抗体及び抗−α／β−チューブリン抗体を用いた免疫ブロットにより、各タンパク質の細胞内発現量を解析した。２９３Ｔ細胞におけるＦｌａｇ−ＮＰＭの定常発現レベルは、ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１の共発現により減少することはなく、むしろＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１の量に依存して増加した（図３ａ）。
その後、Ｆｌａｇ−ＮＰＭ、ｐｃＤＮＡ３及びＭｙｃ−ＢＲＣＡ１／ＢＡＲＤ１を発現させた２９３Ｔ細胞をシクロヘキサミド（１０μＭ）とともにインキュベートし、４，８，１２時間追跡した。Ｆｌａｇ−ＮＰＭの細胞内発現量を、抗−Ｆｌａｇ抗体を用いた免疫ブロットで解析した。このようなパルスーチェイス分析でもまた、ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１がＮＰＭを安定化することを裏付けられた（図３ｂ）。
さらに、プロテアソーム阻害剤であるＭＧ１３２（２０μＭ）、ＬＬｎＬ（２０μＭ）又はＤＭＳＯ溶剤のいずれかで１０時間処理した細胞から、実施例２で記載したように、ｉｎ  ｖｉｖｏでＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１−ユビキチン化Ｆｌａｇ−ＮＰＭを検出した。しかし、ユビキチン化Ｆｌａｇ−ＮＰＭ量は増加しなかった（図３ｃ）。これらの知見は、ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１によるＮＰＭユビキチン化が、タンパク質分解以外のメカニズムを介してＮＰＭの機能に影響を与えることを示す。
【実施例４】分裂期におけるＮＰＭとＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１との共在及びＮＰＭユビキチン化の確認
ＢＡＲＤ１のＣ末端に対するウサギポリクローナル抗体を調製し、細胞周期の間の細胞内（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ）局在及びＮＰＭとの共在を観察するために用いた（図４）。増殖Ｓｗｉｓｓ  ３Ｔ３細胞（ａ）又はＣＯＳ７細胞（ｂ、ｃ）を、各々、３％ホルマリン又は冷メタノールで固定した。それらを、抗−ＮＰＭ抗体、抗−α／β−チューブリン抗体、抗−ＢＡＲＤ１抗体及び抗−ＢＲＣＡ１抗体、次いで、ＦＩＴＣ（緑）−又はローダミン（赤）−結合２次抗体で染色した。核は、ＴＯ−ＰＲＯ−３（青）で染色した。
その結果、間期の細胞では、ＢＡＲＤ１は核小体以外の核内に局在し、ＮＰＭは核小体に局在し、両者は共在しなかった（図４ａ、各パネルの左の３つの細胞）。これに対して分裂期の細胞では、ＮＰＭはＢＡＲＤ１と共在するが、特に、紡錘体付近に共在した（図４ａ、各パネル右の１つの細胞）。
次に、ＢＲＣＡ１及びＮＰＭが紡錘体極で検出される条件下においてＢＲＣＡ１及びＮＰＭの局在を観察した（図４ｂ）。ＢＲＣＡ１は紡錘体極でＮＰＭと共在した（図４ｃ）。これは、分裂期におけるＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１による、細胞周期に依存したＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１−ＮＰＭの相互作用及びＮＰＭの機能調節を示すものである。
さらに、分裂期におけるＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１とＮＰＭとの結合が細胞周期に依存したＮＰＭユビキチン化と相関するか否かを検討するため、ＨｅＬａ細胞をチミジン−ノコダゾール処理によってＧ２／Ｍ移行期に同調させた。その後、０．５，１，２，４時間後に細胞周期に再導入し、続いて、Ｇ１期に移行させた（図４ｄ）。細胞周期の同調はフローサイトメトリーでモニターし、同調させた細胞を１％ＳＤＳバッファー中で煮沸し、希釈し、１．５μｇ／ｍｌの抗−ＮＰＭ抗体で免疫沈降した後、抗−ユビキチン抗体で免疫ブロットを行った。免疫ブロットの前にニトロセルロース膜を煮沸して、抗体認識の感度を上げた。このように、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＮＰＭユビキチン化をＩＰ−ウェスタン解析により評価した。ＮＰＭユビキチン化は、細胞を分裂期停止から解除した後すぐ（０．５時間及び１時間の時点）に検出されたが、分裂期で停止した細胞、又はＧ１期の細胞では見られなかった。
【実施例５】ＢＡＲＤ１のＮＨ２末端でのＣＤＫ１／２によるリン酸化の検討
本発明者らは、ＢＡＲＤ１がＣＤＫでリン酸化されるか否かを検討するため、ＣＤＫ／サイクリンの共発現によって、ＢＡＲＤ１の分子量が変動するかを試験した。すなわち、Ｍｙｃ−ＢＲＣＡ１１−７７２及びＨＡ−ＢＡＲＤ１のＮＨ２末端（１−３２０）断片かＣＯＯＨ末端（４１１−７７７）断片を２９３Ｔ細胞にＣＤＫ−サイクリンあるいはｐｃＤＮＡ３ベクターと共発現させた。その結果、ＨＡ−ＢＡＲＤ１４１１−７７７（ＢＡＲＤ１のＣＯＯＨ末端断片４１１−７７７）を、ＣＤＫ／サイクリンと共発現させても変化がなかったにもかかわらず、ＨＡ−ＢＡＲＤ１１−３２０（ＢＡＲＤ１のＮＨ２末端断片１−３２０）を、ＣＤＫ／サイクリンと共発現させると、ゲル上でタンパク質の緩慢な移動が見られた（図６Ａ）。ＨＡ−ＢＡＲＤ１１−３２０を免疫ブロットをすると、少なくとも３つの生成物が得られた（図６Ａ、Ｂ、Ｄ矢印）。
ＨＡ−ＢＡＲＤ１１−３２０を免疫沈降し、抗−ＨＡ抗体で免疫ブロットした。アガロースビーズで固定したＨＡ−ＢＡＲＤ１１−３２０をアルカリフォスファターゼ（ＡＰ＋）で、又はバッファーのみ（−）でインキュベートした。その結果、上記３つの生成物は、アルカリフォスファターゼ処理をすると消失した（図６Ｂ）。これにより、３つの生成物は、ＢＡＲＤ１のリン酸化物であることが示された。次に、発明者らは、前記キナーゼが、ＢＡＲＤ１を直接リン酸化するか否かを検討するために、ＢＡＲＤ１の精製組換えＮＨ２末端断片がｉｎ  ｖｉｔｒｏでＣＤＫの基質となりうるか検討した。精製組換えＧＳＴ（図６Ｃ、レーン１、４、７）Ｈｉｓ−ＢＡＲＤ１１４−１８９（レーン２、５、８）及びＨｉｓ−ＢＡＲＤ１１−３２０（レーン３、６、９）をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅで染色するか（ＣＢＢ、左）、または［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ及び、ＣＤＫ２−サイクリンＥ１（レーン４−６）か又はＣＤＫ１−サイクリンＢ１（レーン７−９）とインキュベートした。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離して、オートラジオグラフィーで解析した。その結果、Ｈｉｓ−ＢＡＲＤ１４−１８０もＨＡ−ＢＡＲＤ１１−３２０も共に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＣＤＫ２−サイクリンＥ１及び、ＣＤＫ１−サイクリンＢ１によりリン酸化された（図６Ｃ）。
ＨＡ−ＢＡＲＤ１１−３２０のｉｎ  ｖｉｖｏでの移動シフトの結果と同様、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでリン酸化されたＨＡ−ＢＡＲＤ１１−３２０でもいくつかのバンドが示され、ＨＡ−ＢＡＲＤ１１−３２０の断片に１以上のリン酸化部位があることが示された。精製されたＢＡＲＤ１をｉｎ  ｖｉｔｒｏでリン酸化する能力は、ＢＲＣＡ１が前記キナーゼが相互作用するためには特に必要ではないことを意味する。この考えを裏付けるものとして、ＢＲＣＡ１の共発現は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＢＡＲＤ１のリン酸化の量には影響しない。本発明者らは、変異解析によりＢＡＲＤ１中に４つのリン酸化部位をマッピングし、ＢＡＲＤ１  Ｓ１４８Ａ／Ｓ２５１Ａ／Ｓ２８８Ａ／Ｔ２９９Ａという変異体を同定したが、これらは、ＣＤＫ２−サイクリンＥ１（図６Ｄ）でもＣＤＫ１−サイクリンＢ１でもほとんど分子量の変動を示さなかった。これらの結果から、ＢＡＲＤ１は、ＮＨ２末端で、ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１のヘテロダイマー形成とは独立した態様でＣＤＫ１及びＣＤＫ２によりリン酸化されることが示された。
【実施例６】細胞周期依存的なＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１によるＮＰＭユビキチン化の原因となる分子メカニズムの解明
本発明者らは、次に、分裂期のみにＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１によってＮＰＭユビキチン化が起こる原因となる分子メカニズムを解明することを試みた。ＮＰＭがＧ１／Ｓ移行期でＣＤＫ２−サイクリンＥによりリン酸化され、その結果、中心体からＮＰＭが解離して中心体を娘中心小体に分割させることが報告されている７，８。Ｓ期の間、ＮＰＭは中心体と結合できないが、その間、娘中心小体が中心体、それに続いて２つの紡錘体極に成熟する。本発明者らは、ＮＰＭは、中心体複製の間、ＣＤＫ２−サイクリンＥ１のリン酸化により調節されるため、ＣＤＫ２がＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１リガーゼによるＮＰＭユビキチン化に影響を及ぼすか否かを検討した。２９３Ｔ細胞にＭｙｃ−ＢＲＣＡ１（１−７７２）、ＢＡＲＤ１、Ｆｌａｇ−ＮＰＭ及びＨＡ−ｔａｇｇｅｄユビキチンを発現させた。ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１により、ｉｎ  ｖｉｖｏでユビキチン化された生成物を、実施例２に記載したように検出した。ＣＤＫ−サイクリンを共発現させた。驚くべきことに、ＣＤＫ２−サイクリンＥ及びＣＤＫ２−サイクリンＡは、ともに、ｉｎ  ｖｉｖｏでＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１によるＮＰＭユビキチン化を完全に抑制した（図７Ａ、レーン３及び４）。同一のアッセイにおいて、ＣＤＫ１−サイクリンＢは、ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１によるＮＰＭユビキチン化を干渉し得なかったが（レーン５）、これは、ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１リガーゼ活性の抑制においてＣＤＫ２の特異的な機能を示す。
【実施例７】ＣＤＫ２のＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１のユビキチンリガーゼ活性の抑制
本発明者らは、２つのモデルを区別するために、まず、ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１リガーゼが、ＣＤＫ２リン酸化部位がない変異体であるＮＰＭ（Ｔ１９９Ａ）をユビキチン化しうるか否かを試験した８（図７Ｂ）。手順は実施例６に従って行った。ＣＤＫ−サイクリンを共発現させ、野生型の代わりにＦｌａｇ−ＮＰＭのリン酸化部位変異体を用いた。ＮＰＭ（Ｔ１９９Ａ）は、ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１リガーゼによってユビキチン化され（レーン１）、このユビキチン化はＣＤＫ２によって抑制された（レーン２）。従って、ＣＤＫ２によるＮＰＭユビキチン化の抑制がＮＰＭリン酸化に起因するものではないことが示された。
次に本発明者らは、ＢＲＣＡ１自己ユビキチン化を測定することにより、ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１ヘテロダイマー固有のリガーゼ活性に対する、ＣＤＫ２−サイクリンＥ及びＣＤＫ２−サイクリンＡの効果を試験した。手順は実施例６に従って行った。ＣＤＫ−サイクリンを共発現させ自己ユビキチン化されたＭｙｃ−ＢＲＣＡ１を検出するための免疫沈降には抗−Ｍｙｃ抗体を用いて行った。ＣＤＫ１−サイクリンＢがＢＲＣＡ１の自己ユビキチン化を抑制しなかったのに対し、ＣＤＫ２−サイクリンＥ及びＣＤＫ２−サイクリンＡはともにＢＲＣＡ１の自己ユビキチン化を完全に抑制した（図７Ｃ）。以上の結果から、ＣＤＫ２−サイクリンＥ及びＣＤＫ２−サイクリンＡがＢＡＲＤ１をリン酸化し、ＮＰＭを含む基質に対するＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１リガーゼ活性を抑制することが示された。
ＢＡＲＤ１はＣＤＫ２−サイクリンＥ１の基質なので、ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１ユビキチンリガーゼ活性の抑制は、ＢＡＲＤ１のリン酸化に直接の影響を与えうる。しかし、ＢＡＲＤ１の非リン酸化変異体である、ＢＡＲＤ１  Ｓ１４８Ａ／Ｓ２８８Ａ／Ｔ２９９Ａを介したＢＲＣＡ１の自己ユビキチン化も、ＣＤＫ２−サイクリンＥ１によって抑制される（図７Ｄ）。
ＢＡＲＤ１の上記非リン酸化変異体はＣＤＫ２によるユビキチンリガーゼ活性の抑制に感受性を有したままであるし、ＣＤＫ１がＣＤＫ２と同じ部位でＢＡＲＤ１をリン酸化しても、ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１のリガーゼ活性は抑制されないため、リン酸化自体は、ＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１ユビキチンリガーゼのダウンレギュレーションにそれほど重要ではないと考えられる。
【実施例８】ＣＤＫ２がＢＲＣＡ１及びＢＡＲＤ１のタンパク質発現レベルに与える影響の検討
発明者らは、ＣＤＫ２がＢＲＣＡ１及びＢＡＲＤ１のタンパク質発現レベルに影響を与えるかどうかを試験した。すなわち、２９３Ｔ細胞にＭｙｃ−ＢＲＣＡ１１−７７２、ＨＡ−ＢＡＲＤ１を発現させて、抗−ＨＡ抗体、続いて抗一Ｍｙｃ抗体を再プローブとする免疫ブロット法を行ったところ、ユビキチンリガーゼ活性と対応して、ＢＲＣＡ１及びＢＡＲＤ１のどちらの定常状態レベルも、ＣＤＫ１−サイクリンＢ１ではなく（図８Ａレーン５）、ＣＤＫ２−サイクリンＥ１／Ａ１により劇的に減少した（図８Ａレーン３及び４）。また、６０ｍｍのディッシュ中の２９３Ｔ細胞に、ＣＤＫ２−サイクリンＥ１量を０．１、０．５及び１．５μｇとしたものを、Ｍｙｃ−ＢＲＣＡ１１−７７２、ＨＡ−ＢＡＲＤ１をコードするプラスミドを各々１μｇとともに発現させて、各々のタンパク質の定常状態を、抗−ＨＡ抗体、抗−Ｆｌａｇ抗体、抗−Ｍｙｃを用いた免疫ブロットで解析した。その結果、ＢＲＣＡ１及びＢＡＲＤ１のどちらの定常状態レベルも、用量依存的に減少した（図８Ｂ）。ＣＤＫ１−サイクリンＢ１ではＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１の安定性に変化はないが、これは細胞中にキナーゼ活性がないためではない。なぜならば、ＢＡＲＤ１のリン酸化が明らかに検出されているからである（図８Ａレーン５）。
さらに、Ｍｙｃ−ＢＲＣＡ１１−７７２、ＨＡ−ＢＡＲＤ１及び親ｐｃＤＮＡ３ベクター（上段）又はＣＤＫ２−サイクリンＥ１（下段）を発現させた２９３Ｔ細胞を［３５Ｓ］−メチオニンでパルス−チェイス試験した。その後、細胞溶解液を抗−Ｍｙｃ抗体で免疫沈降し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離して、オートラジオグラフィーで解析したところ、ＣＤＫ２−サイクリンＥ１の共発現で細胞中のＢＲＣＡ１−ＢＡＲＤ１複合体の半減期は、顕著に減少した（４−６時間から２時間以下まで：図８Ｃ）。これより、発現の減少はタンパク質の分解によるものであることが示された。
【実施例９】ＣＤＫ２−サイクリンＥ１によるＢＲＣＡ１及びＢＡＲＤ１の細胞質への輸送
ＢＲＣＡ１及びＢＡＲＤ１は、核から細胞質への輸送により分解されるという報告があった。発明者らは、ＣＤＫ２−サイクリンＥ１をＢＲＣＡ１と共発現させ、ＣＤＫ２−サイクリンＥ１が、ＢＲＣＡ１との局在に影響を与えるのかどうかを試験した。２９３Ｔ細胞をＦＬＡＧ−ＢＲＣＡ１、ＨＡ−ＢＡＲＤ１及び親ｐｃＤＮＡ３ベクター又はＣＤＫ２−サイクリンＥ１で一過性発現させた。細胞質ＢＲＣＡ１の分解を防ぐために、細胞回収６時間前にプロテアソーム阻害剤であるｃａｒｂｏｂｅｎｚｏｘｙｌ−ｌｅｕｃｉｎｙｌ−ｌｅｕｃｉｎｙｌ−ｌｅｕｃｉｎａｌ（ＭＧ１３２）を細胞に添加した。核および細胞質中のＢＲＣＡ１タンパク質レベルを定量するために、細胞を核（Ｎ）プール及び細胞質（Ｃ）プールに分画した後、免疫ブロットした。ＣＤＫ２−サイクリンＥ１が存在しない場合、細胞質のＢＲＣＡ１のタンパク質レベルは、核で観察されるタンパク質レベルよりも低い（図８Ｄ、上段、レーン１及び２）。ＣＤＫ２−サイクリンＥ１の共発現において、細胞質ＢＲＣＡ１タンパク質のレベルは、核で見られるタンパク質レベルを超えていた（図８Ｄ、上から２段目、レーン３及び４）。これらの結果より、ＣＤＫ２−サイクリンＥ１の共発現により、ＢＲＣＡ１が核から細胞質へ輸送されることが考えられた。
【実施例１０】ＢＡＲＤ１の細胞周期に依存した発現
ＢＡＲＤ１が細胞周期のなかでどのように発現されるのかを調べるために以下の試験を行った。ＨｅＬａ細胞を２重チミジン阻害（Ａ）を行ってＧ１／Ｓ移行期に同調させた。また、チミジン−ノコダゾール阻害（Ｂ）を行って分裂期に同調させた。阻害を解除した後の細胞周期の経過をＦＡＣＳ分析でモニターした。また、細胞は、解除後適当な時間に抗体で免疫ブロットすることにより解析した。その結果、ＢＡＲＤ１の発現レベルは、分裂期で最も高く、緩慢な移動バンドが見られ（図５Ａレーン８、ｂレーン１〜３）、ＢＲＣＡ１及びサイクリンＢ１の発現増強の時期に一致した。Ｍ／Ｇ１移行期にＢＡＲＤ１は２つのバンドに分かれ（図５Ａレーン９、ｂレーン４）、細胞がＧ１期に入ると優勢な迅速なバンドに移行した（図５Ａレーン１０、ｂレーン５）。これに同調して、ＢＲＣＡ１及びサイクリンＢ１は消失した。ＢＡＲＤ１の発現レベルはＧ１期及びＳ期でダウンレギューレーションされ、特に、サイクリンＥ１が発現されるＧ１後期（図５Ａレーン２、ｂレーン８）からは顕著にダウンレギューレーションされた。
以下の参考文献は、参照として本明細書の全体に組み込まれる。
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【配列表フリーテキスト】配列番号３：プライマー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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