(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：３５で表されるアミノ酸配列からなるベータセルリンにおいて、Ｎ末端から１ないし４０個のアミノ酸残基が欠失していてもよく、Ｃ末端から３番目のアミノ酸残基Ｌｅｕを含むＣ末端から３または４個のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列からなり、膵臓β細胞の分化促進活性が保持され、上皮細胞増殖促進活性が低減された、ベータセルリンムテインまたはその塩。
【請求項２】
上皮細胞増殖促進活性に対する膵臓β細胞の分化促進活性の比が、ベータセルリンのそれに比べて２倍以上である請求項１記載のベータセルリンムテインまたはその塩。
【請求項３】
Ｎ末端から１ないし４０個のアミノ酸残基が欠失した請求項１記載のベータセルリンムテインまたはその塩。
【請求項４】
（１）配列番号：１で表されるアミノ酸配列、（２）配列番号：１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から１ないし４０個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（３）配列番号：２で表されるアミノ酸配列または（４）配列番号：２で表されるアミノ酸配列のＮ末端から１ないし４０個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列からなる請求項１記載のベータセルリンムテインまたはその塩。
【請求項５】
（１）配列番号：３で表されるアミノ酸配列または（２）配列番号：４で表されるアミノ酸配列からなる請求項１記載のベータセルリンムテインまたはその塩。
【請求項６】
配列番号：３７で表されるアミノ酸配列からなる請求項１記載のベータセルリンムテインまたはその塩。
【請求項７】
配列番号：３８で表されるアミノ酸配列からなる請求項１記載のベータセルリンムテインまたはその塩。
【請求項８】
膵臓β細胞の分化促進活性が保持され、上皮細胞増殖促進活性が低減された、配列番号：４４で表されるアミノ酸配列からなるベータセルリンムテインまたはその塩。
【請求項９】
膵臓β細胞の分化促進活性が保持され、上皮細胞増殖促進活性が低減された、配列番号：４５で表されるアミノ酸配列からなるベータセルリンムテインまたはその塩。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれかに記載のベータセルリンムテインをコードするＤＮＡを含有する組換えベクターで形質転換された形質転換体を培養し、該ベータセルリンムテインを生成せしめることを特徴とする請求項１から９のいずれかに記載のベータセルリンムテインまたはその塩の製造法。
【請求項１１】
請求項１から９のいずれかに記載のベータセルリンムテインまたはその塩を含有してなる医薬組成物。
【請求項１２】
組成物が糖尿病予防・治療薬である請求項１１記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はベータセルリン（ＢＴＣ）の膵臓β細胞への分化促進活性（ＢＴＣ活性）を保持したまま平滑筋細胞等の上皮細胞の増殖促進活性（ＥＧＦ活性）を低減させたムテイン（以下、改変体または改変分子と称することもある）及びその製造法などに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトベータセルリンは、１７８アミノ酸からなる前駆体より切り出された８０アミノ酸からなる蛋白性因子でその全アミノ酸配列が明らかにされている〔Sasadaら；バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Biochem. Biophys. Res. Commun.）,１９０：１１７３（１９９３）〕。生体内に存在するベータセルリンは極めて微量で、これを取得するのは困難であったが、遺伝子組換え技術を用いた製造法が特開平６−８７８９４号公報などに記載されている。ベータセルリンは当初マウス３Ｔ３細胞に対する増殖促進活性を持つ因子として見出されたが、その後、血管平滑筋細胞、網膜色素上皮細胞に対しても増殖促進活性（ＥＧＦ活性）を有することが明らかとなった［Shingら；サイエンス（Science），２５９：１６０４（１９９３）］。さらに、ベータセルリンは膵臓未分化肝細胞に作用して、インシュリンを産生する膵臓β細胞への分化を促進する作用（ＢＴＣ活性）を有する〔Mashimaら；ジャーナル  オブ  クリニカル  インビスティゲーション（J. Clin. Invest.），９７：１６４７（１９９６）〕ことより、糖尿病（例えば、インスリン依存性糖尿病）、糖尿病における膵臓機能障害などの予防・治療剤として有用であるものと考えられる［Miyagawaら、１９９７年日本糖尿病学会 講演要旨集，１２５］。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながらベータセルリンは前述のような血管平滑筋細胞、網膜色素上皮細胞に対する増殖促進活性を併せ持つため、糖尿病治療剤として応用する場合にはこれらの増殖活性が問題である。
そのため膵臓β細胞への分化促進作用を維持したまま、血管平滑筋細胞等に対する増殖促進活性を低減することが可能であるならば、より医薬品としての可能性を高めることができるが、これまでそのようなベータセルリン改変体については知られていない。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らはベータセルリンの改変体について種々の検討を重ねた結果、ベータセルリンの改変により膵臓β細胞への分化促進活性を保持したまま平滑筋細胞等の増殖促進活性を低減させることを可能たらしめるベータセルリン改変体であって、生体内に投与した場合に抗原性の問題を生じない改変体を初めて見出し、さらに研究を続けた結果、本発明を完成させた。すなわち、本発明はベータセルリンの改変体及びその改変体を取得する方法などに関する。
【０００５】
すなわち、本発明は、
（１）膵臓β細胞の分化促進活性が保持され、上皮細胞増殖促進活性が低減されたベータセルリンムテインまたはその塩；
（２）上皮細胞増殖促進活性に対する膵臓β細胞の分化促進活性の比が、ベータセルリンのそれに比べて２倍以上である前記（１）記載のベータセルリンムテインまたはその塩；
（３）ベータセルリンのＮ末端から１ないし４０個のアミノ酸残基が欠失していてもよく、Ｃ末端から１ないし４番目のアミノ酸残基において、Ｃ末端から３番目のアミノ酸残基ＬｅｕもしくはＣ末端から４番目のアミノ酸残基Ａｓｐを含む１ないし４個のアミノ酸残基が欠失または他のアミノ酸残基もしくは他のペプチド鎖に置換された前記（１）記載のベータセルリンムテインまたはその塩；
（４）Ｎ末端から１ないし４０個のアミノ酸残基が欠失した前記（３）記載のベータセルリンムテインまたはその塩；
（５）▲１▼配列番号：１で表されるアミノ酸配列、▲２▼配列番号：１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から１ないし４０個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、▲３▼配列番号：２で表されるアミノ酸配列または▲４▼配列番号：２で表されるアミノ酸配列のＮ末端から１ないし４０個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列を含有する前記（３）記載のベータセルリンムテインまたはその塩；
（６）▲１▼配列番号：１で表されるアミノ酸配列、▲２▼配列番号：２で表されるアミノ酸配列、▲３▼配列番号：３で表されるアミノ酸配列または▲４▼配列番号：４で表されるアミノ酸配列を含有する前記（３）記載のベータセルリンムテインまたはその塩；
（７）▲１▼配列番号：３７で表されるアミノ酸配列または▲２▼配列番号：３８で表されるアミノ酸配列を含有する前記（３）記載のベータセルリンムテインまたはその塩；
（８）ベータセルリンのＮ末端の１ないし３０個のアミノ酸残基が欠失していてもよく、Ｃ末端から第２２番目のアミノ酸残基と第２３番目のアミノ酸残基との間に１ないし５個のアミノ酸残基が挿入された前記（１）記載のベータセルリンムテインまたはその塩；
（９）ベータセルリンのＮ末端の１ないし３０個のアミノ酸残基が欠失した前記（８）記載のベータセルリンムテインまたはその塩；
（１０）配列番号：４４で表されるアミノ酸配列を有する前記（８）記載のベータセルリンムテインまたはその塩；
（１１）配列番号：４５で表されるアミノ酸配列を有する前記（８）記載のベータセルリンムテインまたはその塩；
（１２）前記（１）記載のベータセルリンムテインをコードするＤＮＡを含有する組換えベクターで形質転換された形質転換体を培養し、該ベータセルリンムテインを生成せしめることを特徴とする前記（１）記載のベータセルリンムテインまたはその塩の製造法；
（１３）前記（１）記載のベータセルリンムテインまたはその塩を含有してなる医薬組成物；および
（１４）組成物が糖尿病予防・治療薬である前記（９）記載の医薬組成物などに関する。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明のベータセルリン改変体（ベータセルリンムテイン）は、上述のとおり、ＢＴＣ活性が保持されたまま、ＥＧＦ活性が低減あるいは減弱されている。
ここで、ベータセルリンとは、Sasadaら；バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Biochem. Biophys. Res. Commun.）, １９０：１１７３（１９９３）に記載のとおり、Asp Gly Asn Ser Thr Arg Ser Pro Glu Thr Asn Gly Leu Leu Cys Gly Asp Pro Glu Glu Asn Cys Ala Ala Thr Thr Thr Gln Ser Lys Arg Lys Gly His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys Ile Lys Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gln Thr Pro Ser Cys Val Cys Asp Glu Gly Tyr Ile Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val Asp Leu Phe Tyr（配列番号：３５）で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドのことを意味する。
ＢＴＣ活性が保持されたベータセルリンムテインとしては、ベータセルリンのＢＴＣ活性の２０％以上、好ましくは５０％以上の活性を有するベータセルリンムテインが挙げられる。
ＥＧＦ活性が低減されたベータセルリンムテインとしては、ベータセルリンのＥＧＦ活性の約２０％以下、好ましくは１５％以下の活性を有するベータセルリンムテインが挙げられる。
【０００７】
ＢＴＣ活性を保持したまま、ＥＧＦ活性が低減された本発明のベータセルリンムテインとしては、上皮細胞増殖促進活性に対する膵臓β細胞の分化促進活性の比が、ベータセルリンのそれに比べて２倍以上であるベータセルリンムテインまたはその塩が好ましい。
ＢＴＣ活性を保持したまま、ＥＧＦ活性が低減された本発明のベータセルリンムテインとして具体的には、ベータセルリンのＮ末端から１ないし４０個のアミノ酸残基が欠失していてもよく、Ｃ末端から１ないし４番目のアミノ酸残基において、Ｃ末端から３番目のアミノ酸残基ＬｅｕもしくはＣ末端から４番目のアミノ酸残基Ａｓｐを含む１ないし４個のアミノ酸残基が欠失または他のアミノ酸残基もしくは他のペプチド鎖に置換されたベータセルリンムテインまたはその塩などがあげられ、さらに具体的には、Ｎ末端から１ないし４０個または１ないし２０個のアミノ酸残基が欠失した前述のベータセルリンムテインなどがあげられる。
【０００８】
上記の「他のアミノ酸残基もしくは他のペプチド鎖に置換されたベータセルリンムテイン」中の他の「他のアミノ酸残基もしくは他のペプチド鎖に置換」とは、ＢＴＣ活性を保持したまま、ＥＧＦ活性が減弱された本発明のベータセルリンムテインの「ＢＴＣ活性を保持したまま、ＥＧＦが減弱される」という特徴を損なわない範囲での置換であれば、特にアミノ酸残基またはペプチド鎖の種類は問わない。上記の「他のアミノ酸」の具体例として、非極性（疎水性）アミノ酸（例、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニンなど）、極性（中性）アミノ酸（例、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミンなど）、陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸（例、アルギニン、リジン、ヒスチジンなど）、負電荷をもつ（酸性）アミノ酸（例、アスパラギン酸、グルタミン酸など）などがあげられる。上記の「他のペプチド鎖」の具体例としては、上記の「他のアミノ酸」が２個以上結合してなるペプチド鎖のことをいい、好ましくは２ないし４個のアミノ酸残基からなるペプチド鎖などがあげられる。
【０００９】
「ベータセルリンのＮ末端から１ないし４０個のアミノ酸残基が欠失していてもよくＣ末端から１ないし４番目のアミノ酸残基において、Ｃ末端から３番目のアミノ酸残基ＬｅｕもしくはＣ末端から４番目のアミノ酸残基Ａｓｐを含む１ないし４個のアミノ酸残基が欠失または他のアミノ酸残基もしくは他のペプチド鎖に置換されたベータセルリンムテイン」の具体的な例としては、
（１）ベータセルリンのＮ末端から７６番目までのアミノ酸配列（Asp Gly Asn Ser Thr Arg Ser Pro Glu Thr Asn Gly Leu Leu Cys Gly Asp Pro Glu Glu Asn Cys Ala Ala Thr Thr Thr Gln Ser Lys Arg Lys Gly His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys Ile Lys Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gln Thr Pro Ser Cys Val Cys Asp Glu Gly Tyr Ile Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val）を保持し、Ｃ末端から１ないし４番目のアミノ酸残基（Asp Leu Phe Tyr）において、Ｃ末端から３番目のアミノ酸残基ＬｅｕもしくはＣ末端から４番目のアミノ酸残基Ａｓｐを含む１ないし４個のアミノ酸残基が欠失または他のアミノ酸残基もしくは他のペプチド鎖に置換されたベータセルリンムテイン、例えば、
▲１▼  Asp Gly Asn Ser Thr Arg Ser Pro Glu Thr Asn Gly Leu Leu Cys Gly Asp Pro Glu Glu Asn Cys Ala Ala Thr Thr Thr Gln Ser Lys Arg Lys Gly His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys Ile Lys Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gln Thr Pro Ser Cys Val Cys Asp Glu Gly Tyr Ile Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val（配列番号：２）で表されるアミノ酸配列を含有するベータセルリンムテイン、
▲２▼  Asp Gly Asn Ser Thr Arg Ser Pro Glu Thr Asn Gly Leu Leu Cys Gly Asp Pro Glu Glu Asn Cys Ala Ala Thr Thr Thr Gln Ser Lys Arg Lys Gly His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys Ile Lys Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gln Thr Pro Ser Cys Val Cys Asp Glu Gly Tyr Ile Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val Asp（配列番号：１）で表されるアミノ酸配列を含有するベータセルリンムテイン、
▲３▼  Asp Gly Asn Ser Thr Arg Ser Pro Glu Thr Asn Gly Leu Leu Cys Gly Asp Pro Glu Glu Asn Cys Ala Ala Thr Thr Thr Gln Ser Lys Arg Lys Gly His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys Ile Lys Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gln Thr Pro Ser Cys Val Cys Asp Glu Gly Tyr Ile Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val Leu Phe Tyr（配列番号：５）で表されるアミノ酸配列を含有するベータセルリンムテイン、
▲４▼  Asp Gly Asn Ser Thr Arg Ser Pro Glu Thr Asn Gly Leu Leu Cys Gly Asp Pro Glu Glu Asn Cys Ala Ala Thr Thr Thr Gln Ser Lys Arg Lys Gly His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys Ile Lys Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gln Thr Pro Ser Cys Val Cys Asp Glu Gly Tyr Ile Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val Leu Phe （配列番号：６）で表されるアミノ酸配列を含有するベータセルリンムテイン、
▲５▼  Asp Gly Asn Ser Thr Arg Ser Pro Glu Thr Asn Gly Leu Leu Cys Gly Asp Pro Glu Glu Asn Cys Ala Ala Thr Thr Thr Gln Ser Lys Arg Lys Gly His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys Ile Lys Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gln Thr Pro Ser Cys Val Cys Asp Glu Gly Tyr Ile Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val Leu（配列番号：７）で表されるアミノ酸配列を含有するベータセルリンムテイン、
▲６▼  Asp Gly Asn Ser Thr Arg Ser Pro Glu Thr Asn Gly Leu Leu Cys Gly Asp Pro Glu Glu Asn Cys Ala Ala Thr Thr Thr Gln Ser Lys Arg Lys Gly His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys Ile Lys Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gln Thr Pro Ser Cys Val Cys Asp Glu Gly Tyr Ile Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val Asp Phe Tyr（配列番号：８）で表されるアミノ酸配列を含有するベータセルリンムテイン、
▲７▼  Asp Gly Asn Ser Thr Arg Ser Pro Glu Thr Asn Gly Leu Leu Cys Gly Asp Pro Glu Glu Asn Cys Ala Ala Thr Thr Thr Gln Ser Lys Arg Lys Gly His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys Ile Lys Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gln Thr Pro Ser Cys Val Cys Asp Glu Gly Tyr Ile Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val Asp Phe （配列番号：９）で表されるアミノ酸配列を含有するベータセルリンムテイン、および
▲８▼  ベータセルリンのＣ末端から３番目のアミノ酸残基（Ｌｅｕ）が他のアミノ酸残基で置換されたベータセルリンムテインなどがあげられる。
なかでも、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するベータセルリンムテインまたは配列番号：２で表されるベータセルリンムテインが特に好ましい例としてあげられる。
【００１０】
（２）ベータセルリンのＮ末端から１ないし４０番目までのアミノ酸残基（Asp Gly Asn Ser Thr Arg Ser Pro Glu Thr Asn Gly Leu Leu Cys Gly Asp Pro Glu Glu Asn Cys Ala Ala Thr Thr Thr Gln Ser Lys Arg Lys Gly His Phe Ser Arg Cys Pro Lys）が欠失していてもよく、
Ｎ末端から４１番目ないし７６番目のアミノ酸配列（Gln Tyr Lys His Tyr Cys Ile Lys Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gln Thr Pro Ser Cys Val Cys Asp Glu Gly Tyr Ile Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val）を保持し、Ｃ末端から１ないし４番目のアミノ酸残基（Asp Leu Phe Tyr）において、Ｃ末端から３番目のアミノ酸残基ＬｅｕもしくはＣ末端から４番目のアミノ酸残基Ａｓｐを含む１ないし４個のアミノ酸残基が欠失または他のアミノ酸残基もしくは他のペプチド鎖に置換されたベータセルリンムテイン、好ましくは、
（i）ベータセルリンのＮ末端から１ないし３７番目までのアミノ酸残基（Asp Gly Asn Ser Thr Arg Ser Pro Glu Thr Asn Gly Leu Leu Cys Gly Asp Pro Glu Glu Asn Cys Ala Ala Thr Thr Thr Gln Ser Lys Arg Lys Gly His Phe Ser Arg）が欠失していてもよく、
Ｎ末端から３８番目ないし７６番目のアミノ酸配列（Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys Ile Lys Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gln Thr Pro Ser Cys Val Cys Asp Glu Gly Tyr Ile Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val）を保持し、Ｃ末端から１ないし４番目のアミノ酸残基（Asp Leu Phe Tyr）において、Ｃ末端から３番目のアミノ酸残基ＬｅｕもしくはＣ末端から４番目のアミノ酸残基Ａｓｐを含む１ないし４個のアミノ酸残基が欠失または他のアミノ酸残基もしくは他のペプチド鎖に置換されたベータセルリンムテイン、
（ii）ベータセルリンのＮ末端から１番目のアミノ酸残基（Asp）が欠失していてもよく、
Ｎ末端から２番目ないし７６番目のアミノ酸配列（Gly Asn Ser Thr Arg Ser Pro Glu Thr Asn Gly Leu Leu Cys Gly Asp Pro Glu Glu Asn Cys Ala Ala Thr Thr Thr Gln Ser Lys Arg Lys Gly His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys Ile Lys Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gln Thr Pro Ser Cys Val Cys Asp Glu Gly Tyr Ile Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val）を保持し、Ｃ末端から１ないし４番目のアミノ酸残基（Asp Leu Phe Tyr）において、Ｃ末端から３番目のアミノ酸残基ＬｅｕもしくはＣ末端から４番目のアミノ酸残基Ａｓｐを含む１ないし４個のアミノ酸残基が欠失または他のアミノ酸残基もしくは他のペプチド鎖に置換されたベータセルリンムテイン、
（iii）ベータセルリンのＮ末端から１ないし２３番目のアミノ酸残基（Asp Gly Asn Ser Thr Arg Ser Pro Glu Thr Asn Gly Leu Leu Cys Gly Asp Pro Glu Glu Asn Cys Ala）が欠失していてもよく、
Ｎ末端から２４番目ないし７６番目のアミノ酸配列（Ala Thr Thr Thr Gln Ser Lys Arg Lys Gly His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys Ile Lys Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gln Thr Pro Ser Cys Val Cys Asp Glu Gly Tyr Ile Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val）を保持し、Ｃ末端から１ないし４番目のアミノ酸残基（Asp Leu Phe Tyr）において、Ｃ末端から３番目のアミノ酸残基ＬｅｕもしくはＣ末端から４番目のアミノ酸残基Ａｓｐを含む１ないし４個のアミノ酸残基が欠失または他のアミノ酸残基もしくは他のペプチド鎖に置換されたベータセルリンムテインなどが挙げられ、例えば、
【００１１】
(a)  Arg Lys Gly His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys Ile Lys Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gln Thr Pro Ser Cys Val Cys Asp Glu Gly Tyr Ile Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val（配列番号：４）で表されるアミノ酸配列を含有するベータセルリンムテイン、
(b)  Arg Lys Gly His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys Ile Lys Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gln Thr Pro Ser Cys Val Cys Asp Glu Gly Tyr Ile Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val Asp（配列番号：３）で表されるアミノ酸配列を含有するベータセルリンムテイン、
(c)  Arg Lys Gly His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys Ile Lys Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gln Thr Pro Ser Cys Val Cys Asp Glu Gly Tyr Ile Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val Leu Phe Tyr（配列番号：１０）で表されるアミノ酸配列を含有するベータセルリンムテイン、
(d)  Arg Lys Gly His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys Ile Lys Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gln Thr Pro Ser Cys Val Cys Asp Glu Gly Tyr Ile Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val Leu Phe （配列番号：１１）で表されるアミノ酸配列を含有するベータセルリンムテイン、
(e)  Arg Lys Gly His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys Ile Lys Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gln Thr Pro Ser Cys Val Cys Asp Glu Gly Tyr Ile Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val Leu（配列番号：１２）で表されるアミノ酸配列を含有するベータセルリンムテイン、
(f)  Arg Lys Gly His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys Ile Lys Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gln Thr Pro Ser Cys Val Cys Asp Glu Gly Tyr Ile Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val Asp Phe Tyr（配列番号：１３）で表されるアミノ酸配列を含有するベータセルリンムテイン、
(g)  Arg Lys Gly His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys Ile Lys Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gln Thr Pro Ser Cys Val Cys Asp Glu Gly Tyr Ile Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val Asp Phe（配列番号：１４）で表されるアミノ酸配列を含有するベータセルリンムテイン、
(h)  ベータセルリンのＮ末端から３１ないし８０番目のアミノ酸配列で表される部分ペプチドにおいて、Ｃ末端から３番目のアミノ酸残基（Ｌｅｕ）が他のアミノ酸残基で置換されたベータセルリンムテイン、
(i)  Gly Asn Ser Thr Arg Ser Pto Glu Thr Asn Gly Leu Leu Cys Gly Asp Pro Glu Glu Asn Cys Ala Ala Thr Thr Thr Gln Ser Lys Arg Lys Gly His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys Ile Lys Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gln Thr Pro Ser Cys Val Cys Asp Glu Gly Tyr Ile Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val（配列番号：３７）で表されるアミノ酸配列を含有するベータセルリンムテイン、および
(j)  Ala Thr Thr Thr Gln Ser Lys Arg Lys Gly His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys Ile Lys Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gln Thr Pro Ser Cys Val Cys Asp Glu Gly Tyr Ile Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val（配列番号：３８）で表されるアミノ酸配列を含有するベータセルリンムテインなどがあげられる。
【００１２】
なかでも、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：３７または配列番号：３８で表されるアミノ酸配列を含有するベータセルリンムテインが好ましく、さらに好ましくは、配列番号：３７または配列番号：３８で表されるアミノ酸配列を含有するベータセルリンムテインである。最も好ましくは配列番号：３８で表されるアミノ酸配列を含有するベータセルリンムテインである。
上記（１）、（２）に記載の本発明のベータセルリンムテインの好ましい例中、特に好ましいものとしては、▲１▼配列番号：１で表されるアミノ酸配列、▲２▼配列番号：１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から１ないし４０個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、▲３▼配列番号：２で表されるアミノ酸配列、▲４▼配列番号：２で表されるアミノ酸配列のＮ末端から１ないし４０個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、▲５▼配列番号：３７で表されるアミノ酸配列または▲６▼配列番号：３８で表されるアミノ酸配列を含有するベータセルリンムテインである。
さらに好ましくは、▲１▼配列番号：１で表されるアミノ酸配列、▲２▼配列番号：２で表されるアミノ酸配列、▲３▼配列番号：３で表されるアミノ酸配列、▲４▼配列番号：４で表されるアミノ酸配列、▲５▼配列番号：３７で表されるアミノ酸配列または▲６▼配列番号：３８で表されるアミノ酸配列を含有するベータセルリンムテインがあげられる。特に好ましくは配列番号：３８で表されるアミノ酸配列を含有するベータセルリンムテインである。
【００１３】
ＢＴＣ活性を保持したまま、ＥＧＦ活性が低減された本発明のベータセルリンムテインとして具体的には、（１）ベータセルリンのＮ末端の１ないし３０個のアミノ酸残基が欠失していてもよく、Ｃ末端から第２２番目のアミノ酸残基と第２３番目のアミノ酸残基との間に１ないし５個のアミノ酸残基が挿入されたベータセルリンムテインまたはその塩、（２）配列番号：４５で表されるアミノ酸配列を有するベータセルリンムテインまたはその塩なども挙げられる。
上記「アミノ酸残基が挿入されたベータセルリンムテイン（改変分子）」の「アミノ酸」の具体例としては、非極性（疎水性）アミノ酸（例、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニンなど）、極性（中性）アミノ酸（例、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミンなど）、陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸（例、アルギニン、リジン、ヒスチジンなど）、負電荷をもつ（酸性）アミノ酸（例、アスパラギン酸、グルタミン酸など）などがあげられる。アスパラギン、プロリン、セリンが好ましい。該「ペプチド鎖」としては、上記「アミノ酸」が２ないし５個結合してなるペプチド鎖のことをいい、好ましくは２ないし４個のアミノ酸残基からなるペプチド鎖などがあげられる。
【００１４】
「Ｎ末端の１ないし３０個のアミノ酸残基が欠失していてもよいベータセルリン」としては、たとえば（１）上記配列番号：３５で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、（２）Ｎ末端の１ないし３０個のアミノ酸残基が欠失したベータセルリン改変分子、（３）ベータセルリンのＮ末端の第１番目から第３０番目のアミノ酸配列中にアミノ酸残基（例、１ないし５個のアミノ酸残基）が挿入されたベータセルリン改変分子などが含まれる。
該「Ｎ末端の１ないし３０個のアミノ酸残基が欠失したベータセルリン改変分子」には、（１）ベータセルリンのＮ末端側の１ないし３０個のアミノ酸残基が欠失したもの、（２）ベータセルリンのＮ末端側の１ないし３０個のアミノ酸残基が欠失し、アミノ酸残基（例、１ないし５個のアミノ酸残基）が付加したものなどが含まれる。
【００１５】
「ベータセルリンのＮ末端の１ないし３０個のアミノ酸残基が欠失していてもよく、Ｃ末端から第２２番目のアミノ酸残基（すなわち、配列番号：３５で表されるアミノ酸配列のＮ末端から第５８番目のアミノ酸残基：Ｇｌｎ）と第２３番目のアミノ酸残基（すなわち、配列番号：３５で表されるアミノ酸配列のＮ末端から第５９番目のアミノ酸残基：Ｔｈｒ）との間に１ないし５個のアミノ酸残基が挿入されたベータセルリン改変分子」は、ベータセルリンのＮ末端の１ないし３０個のアミノ酸残基のどの部分のアミノ酸が欠失していてもよい、Ｃ末端から第２２番目のアミノ酸残基と第２３番目のアミノ酸残基との間に１ないし５個のアミノ酸残基が挿入されたベータセルリン改変分子であればよく、具体例としては、
▲１▼ Asp Gly Asn Ser Thr Arg Ser Pro Glu Thr Asn Gly Leu Leu Cys Gly Asp Pro Glu Glu Asn Cys Ala Ala Thr Thr Thr Gln Ser Lys Arg Lys Gly His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys Ile Lys Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gln Asn Pro Ser Thr Pro Ser Cys Val Cys Asp Glu Gly Tyr Ile Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val Asp Leu Phe Tyr（配列番号：４６）で表されるアミノ酸配列を含有するベータセルリン改変分子、
▲２▼ ベータセルリンのＮ末端から１ないし３０番目までのアミノ酸残基（Asp Gly Asn Ser Thr Arg Ser Pro Glu Thr Asn Gly Leu Leu Cys Gly Asp Pro Glu Glu Asn Cys Ala Ala Thr Thr Thr Gln Ser Lys）が欠失していて、かつ
Ｃ末端から第２２番目のアミノ酸残基と第２３番目のアミノ酸残基との間に１ないし５個のアミノ酸残基が挿入されたベータセルリン改変分子、例えば、 Arg Lys Gly His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys Ile Lys Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gln Asn Pro Ser Thr Pro Ser Cys Val Cys Asp Glu Gly Tyr Ile Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val Asp Leu Phe Tyr （配列番号：４４）で表されるアミノ酸配列を含有するベータセルリン改変分子などがあげられる。
本発明の「ベータセルリン改変分子」として、好ましくは、配列番号：４４または配列番号：４５で表されるアミノ酸配列を含有するベータセルリン改変分子などがあげられる。
【００１６】
本明細書におけるベータセルリンムテインはペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。またこれらのベータセルリンムテインはＣ末端が通常カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート（−ＣＯＯ-）であるが、Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮＨ2）またはエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。エステルのＲとしては、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルまたはｎ−ブチルなどのＣ1-6アルキル基、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ3-8シクロアルキル基、フェニル、α−ナフチルなどのＣ6-12アリール基、ベンジル、フェネチル、ベンズヒドリルなどのフェニル−Ｃ1-2アルキル、もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ1-2アルキルなどのＣ7-14アラルキル基、ピバロイルオキシメチル基などがあげられる。
また、本発明のベータセルリンムテインにはＮ末端にＭｅｔが付加したものも含まれる。
【００１７】
本発明のベータセルリンムテインの塩としては、生理学的に許容される塩基（例えばアルカリ金属など）や酸（有機酸、無機酸）との塩が用いられるが、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。このような塩としては例えば無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、シュウ酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
本発明のベータセルリンムテインは、例えば、特開平６−８７８９４に記載の遺伝子工学的又はベータ腫瘍細胞の培養により得られたベータセルリンを自体公知のプロテアーゼ処理、好ましくはカルボキシペプチダーゼ処理さらに好ましくはウシ膵臓カルボキシペプチダーゼＡ処理することによっても調製する事が可能である。また、後述のペプチド合成法に準じて製造することもできる。また、後述するベータセルリンムテインをコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによっても製造することができる。
ベータセルリンをヒトや温血動物の組織または細胞から製造する場合、ヒトや温血動物の組織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行い、該抽出液を、塩析、透析、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
【００１８】
ペプチドの合成法としては、例えば固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、本発明のベータセルリンムテインを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のベータセルリンムテインを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としてはたとえば、以下の▲１▼〜▲５▼に記載された方法が挙げられる。
▲１▼ M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチド シンセシス (Peptide Synthesis), Interscience Publishers, New York (1966年)▲２▼ Schroeder および Luebke、ザ ペプチド(The Peptide), Academic Press, New York (1965年)
▲３▼ 泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株) （1975年）
▲４▼ 矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、 タンパク質の化学IV、 205、(1977年)
▲５▼ 矢島治明監修、続医薬品の開発 第14巻 ペプチド合成 広川書店
また、反応後は通常の精製法、たとえば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明のポリペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られるポリペプチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法によって遊離体に変換することができる。
【００１９】
ベータセルリンムテインのアミド体は、アミド形成に適した市販のペプチド合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂などを挙げることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするペプチドの配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、必要に応じて高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的のアミド体を取得する。
上記した保護されたアミノ酸の縮合に関しては、ペプチド合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としてはＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドなどが挙げられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ、ＨＯＯＢｔなど）とともに保護されたアミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対称酸無水物またはＨＯＢｔエステルあるいはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護されたアミノ酸の活性化を行ったのちに樹脂に添加することができる。保護されたアミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、ペプチド縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。たとえばＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン、クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジンなどの三級アミン類、ジオキサン、テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル、プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル、酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はペプチド結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１．５ないし４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行うことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化して、後の反応に影響を及ぼさないようにすることができる。
【００２０】
原料アミノ酸のアミノ基の保護基としては、たとえば、Ｚ、Ｂｏｃ、ターシャリーペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが挙げられる。カルボキシル基の保護基としては、たとえばＲとして上記したＣ1-6アルキル基、Ｃ3-8シクロアルキル基、Ｃ7-14アラルキル基の他、２−アダマンチル、４−ニトロベンジル、４−メトキシベンジル、４−クロロベンジル、フェナシル基およびベンジルオキシカルボニルヒドラジド、ターシャリーブトキシカルボニルヒドラジド、トリチルヒドラジドなどが挙げられる。
セリンおよびスレオニンの水酸基は、たとえばエステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては例えばアセチル基などの低級アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭素から誘導される基などが挙げられる。また、エーテル化に適する基としては、たとえばベンジル基、テトラヒドロピラニル基、ターシャリーブチル基などである。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、たとえばＢｚｌ、Ｃｌ2−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、ターシャリーブチルなどが挙げられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、Ｔｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、ベンジルオキシメチル、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどが挙げられる。
【００２１】
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、たとえば対応する酸無水物、アジド、活性エステル［アルコール（たとえば、ペンタクロロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢｔ）とのエステル］などが挙げられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、たとえば対応するリン酸アミドが挙げられる。
保護基の除去（脱離）方法としては、たとえばＰｄ黒あるいはＰｄ炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども挙げられる。上記酸処理による脱離反応は一般に−２０℃〜４０℃の温度で行われるが、酸処理においてはアニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタンジチオール、１，２−エタンジチオールのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
反応に関与すべきでない官能基への保護基の導入法およびその保護基の脱離法、反応に関与する官能基の活性化法などは、自体公知の方法またはそれに準じた方法に従って行えばよい。
【００２２】
また、ベータセルリンムテインのアミド体を得る別の方法としては、まず、カルボキシル末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化した後、アミノ基側にペプチド鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いたペプチドとＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除いたペプチド（またはアミノ酸）とを製造し、この両ペプチドを上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護ペプチドを精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗ポリペプチドを得ることができる。この粗ポリペプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望のポリペプチドのアミド体を得ることができる。
ベータセルリンムテインのエステル体を得るにはカルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、ポリペプチドのアミド体と同様にして所望のポリペプチドのエステル体を得ることができる。
【００２３】
本発明のベータセルリンムテインをコードするＤＮＡとしては、（１）ベータセルリンのＮ末端から１ないし４０個のアミノ酸残基が欠失していてもよく、Ｃ末端から１ないし４番目のアミノ酸残基において、Ｃ末端から３番目のアミノ酸残基ＬｅｕもしくはＣ末端から４番目のアミノ酸残基Ａｓｐを含む１ないし４個のアミノ酸残基が欠失または他のアミノ酸残基もしくは他のペプチド鎖に置換されたベータセルリン、（２）ベータセルリンのＮ末端の１ないし３０個のアミノ酸残基が欠失していてもよく、Ｃ末端から第２２番目のアミノ酸残基と第２３番目のアミノ酸残基との間に１ないし５個のアミノ酸残基が挿入されたベータセルリンムテイン、（３）配列番号：４５で表されるアミノ酸配列を有するベータセルリンムテインをコードするＤＮＡを含有するＤＮＡであればいかなるものであってもよい。具体的には、本発明の配列番号：１ないし配列番号：１４、配列番号３７、配列番号３８、配列番号：４４、配列番号：４５、配列番号：４６で表されるアミノ酸配列を含有するベータセルリンムテインをコードする塩基配列を含有するものがあげられる。
より具体的には、（１）配列番号：１ないし配列番号：１４で表されるアミノ酸配列を含有するベータセルリンムテインをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１５ないし配列番号：２８で表される塩基配列を有するＤＮＡを含有するＤＮＡ、（２）配列番号３７および配列番号３８で表されるアミノ酸配列を含有するベータセルリンムテインをコードするＤＮＡとしては、配列番号：４２および配列番号：４３で表される塩基配列を有するＤＮＡを含有するＤＮＡ、（３）配列番号：４７ないし配列番号：４９で表される塩基配列を有するＤＮＡを含有するＤＮＡ、（４）ストリンジェントな条件下で上記（１）ないし（３）で規定された配列とハイブリダイズする哺乳動物由来のＤＮＡ、（５）遺伝コードの縮重のため上記（１）ないし（４）に定められている配列とハイブリッド形成しないが、同一アミノ酸配列をもつポリペプチドをコードするＤＮＡなどが用いられる。ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じた方法に従って行うことができる。上記ストリンジェントな条件としては、例えば４２℃、５０％ホルムアミド、４×ＳＳＰＥ(１×ＳＳＰＥ＝１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4・Ｈ2Ｏ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ７．４）、５×デンハート溶液、０．１％ＳＤＳである。
【００２４】
本発明のベータセルリンムテインを、ベータセルリンムテインをコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって製造する場合に用いられる本発明のベータセルリンムテインの発現ベクターは、例えば、（１）本発明のベータセルリンムテインをコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（２）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどが用いられる。
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。
形質転換する際の宿主が動物細胞である場合には、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ＳＲαプロモーターなどが利用できる。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰLプロモーター、ｌｐｐプロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨ１プロモーター、ＧＡＬプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
【００２５】
発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐrと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等が挙げられる。特に、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ-）細胞を用いてＤＨＦＲ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、チミジンを含まない培地によっても選択できる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、ベータセルリンムテインのＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｐｈｏＡ・シグナル配列、ＯｍｐＡ・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、メイテイングファクターα(ＭＦα)・シグナル配列、インベルターゼ・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、例えばインシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築されたベータセルリンムテインをコードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。
【００２６】
宿主としては、たとえばエシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫または昆虫細胞、動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌としては、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２・ＤＨ１〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），６０巻，１６０(１９６８)〕，ＪＭ１０３〔ヌクイレック・アシッズ・リサーチ，（Nucleic Acids Research），９巻，３０９(１９８１)〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Journal of Molecular Biology）〕，１２０巻，５１７(１９７８)〕，ＨＢ１０１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，４１巻，４５９(１９６９)〕，Ｃ６００〔ジェネティックス（Genetics），３９巻，４４０(１９５４)〕，ＭＭ２９４〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），７３巻，４１７４(１９７６)〕などが用いられる。
バチルス属菌としては、たとえばバチルス・サチルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４〔ジーン，２４巻，２５５(１９８３)〕，２０７−２１〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Journal of Biochemistry），９５巻，８７(１９８４)〕などが用いられる。
酵母としては、たとえばサッカロマイセス  セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ-，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２などが用いられる。
昆虫としては、例えばカイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、ネイチャー（Nature），３１５巻，５９２(１９８５)〕。
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodoptera frugiperda cell；Ｓｆ細胞）、Trichoplusia ni の中腸由来のＭＧ１細胞、Trichoplusia ni の卵由来の High FiveTM 細胞、Mamestra brassicae 由来の細胞または Estigmena acrea 由来の細胞などが用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Bombyx mori N；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ATCC CRL1711）、Ｓｆ２１細胞〔以上、Vaughn, J.L.ら、イン・ヴィトロ（in Vitro），１３巻，２１３−２１７頁（１９７７年）〕などが用いられる。
【００２７】
動物細胞としては、たとえばサルＣＯＳ−７細胞、Ｖｅｒｏ細胞、チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ、ＤＨＦＲ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（ｄｈｆｒ-ＣＨＯ細胞）、マウスＬ細胞、マウス３Ｔ３細胞、マウスミエローマ細胞，ヒトＨＥＫ２９３細胞、ヒトＦＬ細胞、２９３細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＡＬＢ３Ｔ３細胞、Ｓｐ−２／Ｏ細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌を形質転換するには、たとえばプロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），６９巻，２１１０(１９７２)、ジーン（Gene），１７巻，１０７(１９８２)などに記載の方法に従って行なわれる。
バチルス属菌を形質転換するには、たとえばモレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Molecular & General Genetics），１６８巻，１１１(１９７９)などに記載の方法に従って行われる。
酵母を形質転換するには、たとえばプロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），７５巻，１９２９(１９７８)に記載の方法に従って行なわれる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、たとえばバイオ／テクノロジー（Bio/Technology）,６巻，４７−５５頁（１９８８年）などに記載の方法に従って行なわれる。
動物細胞を形質転換するには、たとえばヴィロロジー（Virology），５２巻，４５６(１９７３)に記載の方法に従って行なわれる。
【００２８】
発現ベクターの細胞への導入方法としては、例えば、リポフェクション法〔Felgner, P.L. et al. プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America），８４巻，７４１３頁（１９８７年）〕、リン酸カルシウム法〔Graham, F. L. and van der Eb, A. J.ヴィロロジー（Virology），５２巻，４５６−４６７頁（１９７３年）〕、電気穿孔法〔Nuemann, E. et al. エンボ・ジャーナル（EMBO J.），１巻，８４１−８４５頁（１９８２年）〕等が挙げられる。
このようにして、本発明のベータセルリンムテインをコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体が得られる。
なお、動物細胞を用いて、本発明のベータセルリンムテインを安定に発現させる方法としては、上記の動物細胞に導入された発現ベクターが染色体に組み込まれた細胞をクローン選択によって選択する方法がある。具体的には、上記の選択マーカーを指標にして形質転換体を選択する。さらに、このように選択マーカーを用いて得られた動物細胞に対して、繰り返しクローン選択を行なうことにより本発明のベータセルリンムテイン等の高発現能を有する安定な動物細胞株を得ることができる。また、ｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして用いた場合、ＭＴＸ濃度を徐々に上げて培養し、耐性株を選択することにより、ｄｈｆｒ遺伝子とともに、本発明のベータセルリンムテインをコードするＤＮＡを細胞内で増幅させて、さらに高発現の動物細胞株を得ることもできる。
【００２９】
上記の形質転換体を本発明のベータセルリンムテインをコードするＤＮＡが発現可能な条件下で培養し、本発明のベータセルリンムテインを生成、蓄積せしめることによって、本発明のベータセルリンムテインを製造することができる。
宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、たとえばグルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、たとえばアンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としてはたとえば塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、酵母、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えばグルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Miller），ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Journal of Experiments in Molecular Genetics），４３１−４３３，Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、たとえば３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。
宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行い、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
【００３０】
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、たとえばバークホールダー（Burkholder）最小培地〔Bostian, K. L. ら、「プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），７７巻，４５０５(１９８０)〕や０.５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Bitter, G. A.ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），８１巻，５３３０（１９８４）〕が挙げられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、Grace's Insect Medium（Grace, T.C.C.,ネイチャー（Nature）,195,788(1962)に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、たとえば約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Science），１２２巻，５０１(１９５２)〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Virology），８巻，３９６(１９５９)〕，ＲＰＭＩ １６４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（The Journal of the American Medical Association）１９９巻，５１９(１９６７)〕，１９９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Proceeding of the Society for the Biological Medicine），７３巻，１(１９５０)〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
特にＣＨＯ（ｄｈｆｒ-）細胞およびｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして用いる場合には、チミジンをほとんど含まない透析ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地を用いるのが好ましい。
【００３１】
上記培養物から本発明のベータセルリンムテインを分離精製するには、例えば下記の方法により行なうことができる。
本発明のベータセルリンムテインを培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過によりポリペプチドの粗抽出液を得る方法などが適宜用い得る。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどのたんぱく変性剤や、トリトンＸ−１００（登録商標。以下、ＴＭと省略することがある。）などの界面活性剤が含まれていてもよい。
培養液中にベータセルリンムテインが分泌される場合には、培養終了後、自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。
このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれる本発明のポリペプチドの精製は、自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法やクロマトフォーカシングなどの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
【００３２】
かくして得られる本発明のベータセルリンムテインが遊離体で得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、組換え体が産生する本発明のベータセルリンムテインを、精製前または精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ベータセルリンムテインを部分的に除去することもできる。蛋白修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。
得られるベータセルリンムテインは、例えば、特開平１０−１９１９８９号公報等に記載のリフォールディング工程に付してもよい。また、Ｎ末端にＭｅｔが付加したベータセルリンムテインを特開平１０−１９１９８９号公報等に記載のＮ末端のＭｅｔの除去反応に付すことにより、 Ｎ末端のＭｅｔを除去することもできる。
かくして生成する本発明のベータセルリンムテインの存在は特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイなどにより測定することができる。
【００３３】
本発明のベータセルリンムテインをコードするＤＮＡまたは本発明のベータセルリンムテインもしくはその塩は、糖尿病（例えば、インシュリン依存性糖尿病（Ｉ型糖尿病）など）、糖尿病における膵臓機能障害、老人性のインシュリン分泌低下に伴う膵臓機能低下症などの改善剤および未分化型膵臓ガンなど（特に糖尿病（例えば、インシュリン依存性糖尿病など）の予防・治療薬など）の医薬の開発に用いることができる。
さらに、本発明のベータセルリンムテインもしくはその塩またはそれをコードするＤＮＡはＥＧＦ活性が減弱されていることおよび抗原性の問題がないことから、安全で低毒性な医薬として有用である。本発明のベータセルリンムテインもしくはその塩またはそれをコードするＤＮＡは、糖尿病（例えば、インシュリン依存性糖尿病）、糖尿病における膵臓機能障害、老人性のインシュリン分泌低下に伴う膵臓機能低下症などの改善剤および未分化型膵臓ガンなどの疾病の治療・予防剤として用いることができる。
【００３４】
本発明のベータセルリンムテインもしくはその塩またはそれをコードするＤＮＡを上述の医薬として使用する場合、常套手段に従って実施することができる。例えば、必要に応じて糖衣や腸溶性被膜を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、該化合物またはその塩を生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えばゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤製造法にしたがって処方することができる。
注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などがあげられ、適当な溶解補助剤、たとえばアルコール（たとえばエタノール）、ポリアルコール（たとえばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（たとえばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としてはゴマ油、大豆油などがあげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。
【００３５】
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えばヒトや哺乳動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル、マントヒヒ、チンパンジーなど）に対して投与することができる。
本発明のベータセルリンムテインもしくはその塩の投与量は、症状などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に成人の糖尿病患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０.１から１００ｍｇ、好ましくは約１．０から５０ｍｇ、より好ましくは約１．０から２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、たとえば注射剤として、成人の糖尿病患者（体重６０ｋｇとして）に対し、一日につき約０．０１から３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１から２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１から１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００３６】
本明細書および図面において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＤＮＡ    ：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ  ：相補的デオキシリボ核酸
Ａ      ：アデニン
Ｔ      ：チミン
Ｇ      ：グアニン
Ｃ      ：シトシン
ＥＤＴＡ  ：エチレンジアミン四酢酸
ＡＰＭＳＦ：（ｐ−アミジノフェニル）メタンスルホニルフルオライド塩酸塩
ＳＤＳ    ：ドデシル硫酸ナトリウム
ＴＦＡ    ：トリフルオロ酢酸
Ｇｌｙ    ：グリシン
Ａｌａ    ：アラニン
Ｖａｌ    ：バリン
Ｌｅｕ    ：ロイシン
Ｉｌｅ    ：イソロイシン
Ｓｅｒ    ：セリン
Ｔｈｒ    ：スレオニン
Ｃｙｓ    ：システイン
Ｍｅｔ    ：メチオニン
Ｇｌｕ    ：グルタミン酸
Ａｓｐ    ：アスパラギン酸
Ｌｙｓ    ：リジン
Ａｒｇ    ：アルギニン
Ｈｉｓ    ：ヒスチジン
Ｐｈｅ    ：フェニルアラニン
Ｔｙｒ    ：チロシン
Ｔｒｐ    ：トリプトファン
Ｐｒｏ    ：プロリン
Ａｓｎ    ：アスパラギン
Ｇｌｎ    ：グルタミン
ＮＭＰ    ：Ｎ−メチルピロリドン
【００３７】
また、本明細書中で繁用される置換基、保護基および試薬を下記の記号で表記する。
Ｍｅ    ：メチル基
Ｅｔ    ：エチル基
Ｂｕ    ：ブチル基
Ｐｈ    ：フェニル基
ＴＣ    ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキサミド基
Ｂｏｍ  ：ベンジルオキシメチル
ＰＡＭ  ：フェニルアセトアミドメチル
Ｔｏｓ  ：ｐ−トルエンスルフォニル
ＨＯＮＢ：Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネンー２，３−ジカルボキシイミド
Ｂｚｌ  ：ベンジル基
Ｚ      ：ベンジルオキシカルボニル基
Ｂｒ−Ｚ：２−ブロモベンジルオキシカルボニル基
Ｃｌ−Ｚ：２−クロルベンジルオキシカルボニル基
Ｂｏｃ  ：ｔ−ブチルオキシカルボニル基
ＨＯＢｔ：１−ヒドロキシベンズトリアゾール
ＤＣＣ  ：Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＴＦＡ  ：トリフルオロ酢酸
Ｆｍｏｃ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル基
ＤＮＰ  ：ジニトロフェニル基
Ｂｕｍ  ：ターシャリーブトキシメチル基
Ｔｒｔ  ：トリチル基
【００３８】
本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号：１〕
本発明のベータセルリンムテイン（ＢＴＣ１−７７）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２〕
本発明のベータセルリンムテイン（ＢＴＣ１−７６）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：３〕
本発明のベータセルリンムテイン（ＢＴＣ３１−７７）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：４〕
本発明のベータセルリンムテイン（ＢＴＣ３１−７６）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：５〕
本発明のベータセルリンムテイン（ＢＴＣ１−７６、７８−８０）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：６〕
本発明のベータセルリンムテイン（ＢＴＣ１−７６、７８、７９）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：７〕
本発明のベータセルリンムテイン（ＢＴＣ１−７６、７８）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：８〕
本発明のベータセルリンムテイン（ＢＴＣ１−７７、７９、８０）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：９〕
本発明のベータセルリンムテイン（ＢＴＣ１−７７、８０）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１０〕
本発明のベータセルリンムテイン（ＢＴＣ３１−７６、７８−８０）のアミノ酸配列を示す。
【００３９】
〔配列番号：１１〕
本発明のベータセルリンムテイン（ＢＴＣ３１−７６、７８、７９）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１２〕
本発明のベータセルリンムテイン（ＢＴＣ３１−７６、７８）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１３〕
本発明のベータセルリンムテイン（ＢＴＣ３１−７７、７９、８０）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１４〕
本発明のベータセルリンムテイン（ＢＴＣ３１−７７、７９）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１５〕
配列番号：１で表されるアミノ酸配列で表されるベータセルリンムテインをコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１６〕
配列番号：２で表されるアミノ酸配列で表されるベータセルリンムテインをコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１７〕
配列番号：３で表されるアミノ酸配列で表されるベータセルリンムテインをコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１８〕
配列番号：４で表されるアミノ酸配列で表されるベータセルリンムテインをコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１９〕
配列番号：５で表されるアミノ酸配列で表されるベータセルリンムテインをコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：２０〕
配列番号：６で表されるアミノ酸配列で表されるベータセルリンムテインをコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
【００４０】
〔配列番号：２１〕
配列番号：７で表されるアミノ酸配列で表されるベータセルリンムテインをコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：２２〕
配列番号：８で表されるアミノ酸配列で表されるベータセルリンムテインをコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：２３〕
配列番号：９で表されるアミノ酸配列で表されるベータセルリンムテインをコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：２４〕
配列番号：１０で表されるアミノ酸配列で表されるベータセルリンムテインをコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：２５〕
配列番号：１１で表されるアミノ酸配列で表されるベータセルリンムテインをコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：２６〕
配列番号：１２で表されるアミノ酸配列で表されるベータセルリンムテインをコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：２７〕
配列番号：１３で表されるアミノ酸配列で表されるベータセルリンムテインをコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：２８〕
配列番号：１４で表されるアミノ酸配列で表されるベータセルリンムテインをコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：２９〕
後述の実施例１および実施例４で用いられたプライマー１の塩基配列を示す。
〔配列番号：３０〕
後述の実施例１および実施例４で用いられたプライマー２の塩基配列を示す。
【００４１】
〔配列番号：３１〕
後述の実施例１０および実施例２７で用いられたプライマーＲＩ−１の塩基配列を示す。
〔配列番号：３２〕
後述の実施例１０および実施例２７で用いられたプライマーＲＩ−３の塩基配列を示す。
〔配列番号：３３〕
後述の実施例１０および実施例２７で用いられたプライマーＲＩ−１Ｃｌａの塩基配列を示す。
〔配列番号：３４〕
後述の実施例１０および実施例２７で用いられたプライマーＲＩ−３Ｘｈｏの塩基配列を示す。
〔配列番号：３５〕
ベータセルリンのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：３６〕
ベータセルリンをコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：３７〕
本発明のベータセルリンムテイン（ＢＴＣ２−７６）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：３８〕
本発明のベータセルリンムテイン（ＢＴＣ２４−７６）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：３９〕
後述の実施例１３で用いられたプライマー３の塩基配列を示す。
〔配列番号：４０〕
後述の実施例１３および実施例１６で用いられたプライマー４の塩基配列を示す。
【００４２】
〔配列番号：４１〕
後述の実施例１６で用いられたプライマー５の塩基配列を示す。
〔配列番号：４２〕
配列番号：３７で表されるアミノ酸配列で表されるベータセルリンムテインをコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：４３〕
配列番号：３８で表されるアミノ酸配列で表されるベータセルリンムテインをコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：４４〕
本発明のベータセルリン改変分子（ＢＴＣ３１−５８，Ａｓｎ，Ｐｒｏ，Ｓｅｒ，５９−８０）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：４５〕
本発明のベータセルリン改変分子（Ａｓｎ，Ｓｅｒ，Ａｓｐ，Ｓｅｒ，Ｇｌｕ，ＢＴＣ３８−８０）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：４６〕
本発明のベータセルリン改変分子（ＢＴＣ１−５８，Ａｓｎ，Ｐｒｏ，Ｓｅｒ，５９−８０）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：４７〕
配列番号：４６に示されるアミノ酸配列で表されるベータセルリン改変分子をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：４８〕
配列番号：４４に示されるアミノ酸配列で表されるベータセルリン改変分子をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：４９〕
配列番号：４５に示されるアミノ酸配列で表されるベータセルリン改変分子をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：５０〕
後述の参考例１および実施例２２で用いられたプライマーＢＴ−９５ｈの塩基配列を示す。
〔配列番号：５１〕
後述の参考例１および実施例２３で用いられたプライマーＢＴ−９４ｈの塩基配列を示す。
〔配列番号：５２〕
後述の実施例２２で用いられたプライマーＰＥＴ−１の塩基配列を示す。
〔配列番号：５３〕
後述の実施例２２で用いられたプライマーＢＴＣ−１の塩基配列を示す。
〔配列番号：５４〕
後述の実施例２２で用いられたプライマーＢＴＣ−２の塩基配列を示す。
〔配列番号：５５〕
後述の実施例２２で用いられたプライマーＢＴＣ−３の塩基配列を示す。
〔配列番号：５６〕
後述の実施例２３で用いられたプライマーＢＴＣ−７の塩基配列を示す。
【００４３】
後述の実施例１で得られた形質転換体大腸菌［エシェリヒア  コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）］ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＴＣＩＩＢＴＣ７７は、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−６５８４として１９９８年１１月２４日付で通産省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託されている。また１９９８年１１月２日付で受託番号ＩＦＯ  １６２１４として財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託されている。
後述の実施例４で得られた形質転換体大腸菌［エシェリヒア  コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）］ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＴＣＩＩＢＴＣ７６は、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−６５８３として１９９８年１１月２４日付で通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。また１９９８年１１月２日付で受託番号ＩＦＯ  １６２１３として財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託されている。
【００４４】
後述の実施例１３で得られた形質転換体大腸菌［エシェリヒア  コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）］ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＴＣＩＩＢＴＣ２−７６は、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−６９４８として１９９９年１１月２４日付で通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。また１９９９年１１月９日付で受託番号ＩＦＯ  １６３３４として財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託されている。
後述の実施例１６で得られた形質転換体大腸菌［エシェリヒア  コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）］ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＴＣＩＩＢＴＣ２４−７６は、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−６９４９として１９９９年１１月２４日付で通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。また１９９９年１１月９日付で受託番号ＩＦＯ  １６３３５として財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託されている。
後述の参考例１で用いられたプラスミドｐＴＢ１５１６を保持するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳ，ｐＴＢ１５１６は、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に１９９２年（平成４年）４月２１日から受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−３８３６として寄託され、また財団法人発酵研究所に１９９２年（平成４年）４月１６日から受託番号ＩＦＯ１５２８２として寄託されている。
【００４５】
【実施例】
以下に実施例および参考例を示し、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００４６】
実施例１
７７残基型（Ｃ末端３残基欠失型）ベータセルリン発現株の構築
７７残基型（Ｃ末端３残基欠失型）ベータセルリン発現プラスミドを、以下のように構築した〔図１〕。
７７残基型（Ｃ末端３残基欠失型）ベータセルリンの構造遺伝子を、ベータセルリン発現プラスミドｐＢＯ４１［Ｓｅｎｏら；Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ，  １３：１８１（１９９６）］より、構造遺伝子の上流に隣接してＮｄｅ Ｉ切断部位及び開始コドンを持つプライマー１（５'−ＣＡＴＡＴＧＧＡＴＧＧＧＡＡＴＴＣＣＡＣＣＡＧＡＡＧＴＣＣＴＧ）、及び７７番目のアスパラギン酸の後に終止コドン及びＢａｍ ＨＩ切断部位を持つプライマー２（５'−ＧＧＡＴＣＣＣＴＡＧＴＣＡＡＣＴＣＴＣＴＣＡＣＡＣＣＴＴＧＣＴＣＣ）を用いて、ＰＣＲで増幅した。ＰＣＲにより増幅した遺伝子を、ＴＡ ｏｒｉｇｉｎａｌ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（インヴィトロジェン社製）を用いてｐＣＲ２．１ベクターに連結し、ｐＣＲ２．１／ＢＴＣ７７を作製した。これを大腸菌ＪＭ１０９に導入し、アンピシリン耐性とβ−ガラクトシダーゼ活性を指標として形質転換体を選択した。ｐＣＲ２．１／ＢＴＣ７７を有する形質転換体を培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ８ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてｐＣＲ２．１／ＢＴＣ７７を調製した。
ｐＢＲ３２２をＮｄｅ Ｉで切断、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ，宝酒造株式会社製）で末端を平滑化し、再度連結する事によって、Ｎｄｅ Ｉ認識部位を欠損させたｐＢＲｄｅｓＮｄｅを作製した。ｐＥＴ３ｃをＢｇｌ ＩＩ−Ｅｃｏ ＲＶで切断し、約０．２６ｋｂｐの断片を回収した後、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで末端を平滑化し、ｐＢＲｄｅｓＮｄｅのＳｃａ Ｉ断片と連結して、ｐＢＲ／Ｔ７ ｄｅｓＮｄｅを作製した。また、部位特異的変異導入（Ｑｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ，ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）により、ｐＢＲ３２２のＢａｍ ＨＩ認識部位を欠損させたｐＢＲ３２２ｄｅｓＢａｍを作製した。ｐＢＲ３２２ｄｅｓＢａｍのＳｐｈ Ｉ−Ｅｃｏ ＲＶ断片をｐＢＲ／Ｔ７ ｄｅｓＮｄｅのＳｐｈ Ｉ−Ｅｃｏ ＲＶ断片と連結して、テトラサイクリン耐性発現ベクターｐＴＣＩＩを作製した。ｐＣＲ２．１／ＢＴＣ７７をＮｄｅＩ及びＢａｍ ＨＩで切断してアガロース電気泳動を行い、約２４０ ｂｐの７７残基型ベータセルリン構造遺伝子をＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｓｐｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて回収した。発現ベクターｐＴＣＩＩをＮｄｅ Ｉ及びＢａｍ ＨＩで切断してアガロース電気泳動を行い、同様に約４．６ ｋｂｐのバンドを回収した。７７残基型ベータセルリン構造遺伝子を発現ベクターｐＴＣＩＩのＮｄｅ Ｉ−Ｂａｍ ＨＩ断片と連結した後、大腸菌ＪＭ１０９に導入してテトラサイクリン耐性で形質転換株を選択し、その株より再度プラスミドを回収して、発現プラスミドｐＴＣＩＩＢＴＣ７７とした。
このｐＴＣＩＩＢＴＣ７７を大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）に導入して、テトラサイクリン耐性で形質転換株を選択し、７７残基型ベータセルリン発現株ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＴＣＩＩＢＴＣ７７を取得した。
【００４７】
実施例２
７７残基型ベータセルリン発現株の培養
７７残基型ベータセルリン発現株ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＴＣＩＩＢＴＣ７７を１０ｍｇ／Ｌのテトラサイクリンを含むＬＢ培地（１％ ペプトン、０．５％ 酵母エキス、０．５％ 塩化ナトリウム）１リットルで３０℃１６時間培養した。得られた培養液１５０ｍＬを主発酵用培地（１．６８％ リン酸一水素ナトリウム、０．３％ リン酸二水素ナトリウム、０．１％ 塩化アンモニウム、０．０５％ 塩化ナトリウム、０．０２４％ 硫酸マグネシウム、０．０２％ ニューポールＬＢ−６２５、０．０００５％ 塩酸チアミン、１．５％ ブドウ糖、１．０％ カザミノ酸、１．０％ イーストエキス）１．５リットルを仕込んだ２Ｌ容ジャーファーメンターに移植して、３７℃、通気量 ２Ｌ／ｍｉｎ、撹拌回転数 ５００ｒｐｍで通気撹拌培養を開始した。培養液の濁度が約１２００クレット単位になった時点で、５．９５ｍｇ／Ｌ分のイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加した。ＩＰＴＧ添加時、添加後１，２．５時間に０．７５％のグルコースを添加し培養開始９時間後まで培養を行った。培養液を１００００ｒｐｍで３０分間遠心分離を行い、菌体を集めた。
【００４８】
実施例３
Ｍｅｔ−７７残基型ベータセルリンの精製
実施例２で得られた菌体５ｇに１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＡＰＭＳＦ及び７Ｍ グアニジン塩酸塩を含む０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１０ｍＬを加え、４℃で一晩攪拌し抽出を行った後、遠心分離（１００００ｒｐｍ、２０分間）を行った。得られた上清液１０ｍＬに０．５ｍＭ 酸化型グルタチオン、１ｍＭ 還元型グルタチオン、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１Ｍ アルギニン塩酸塩及び２Ｍ 尿素を含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）２５０ｍＬを加え、４℃で一晩リフォールディングを行った後。遠心分離（１００００ｒｐｍ、２０分間）を行い、遠心上清液２６０ｍＬを得た。この遠心上清液をＹＭ３膜（分画分子量：３０００、ミリポア社）を用いて濃縮を行った。濃縮脱塩液８０ｍＬに２Ｍ尿素を１２０ｍＬ加えた後、塩酸でｐＨ５．０に調整した。遠心分離（１００００ｒｐｍ、２０分間）を行い、得られた遠心上清液を５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化したＳＰ−トヨパール６５０Ｍカラム（２．２ｃｍ×１２ｃｍ、東ソー社）に毎分１０ｍＬの流速で吸着させ、平衡化に用いた緩衝液でよく洗浄した後、０Ｍから１．０Ｍの塩化ナトリウム直線濃度勾配により溶出を行った。Ｍｅｔ−７７残基型ベータセルリンを含む画分を集め、その１／３量を０．１  ％トリフルオロ酢酸で平衡化したＣ４Ｐ−５０カラム（１．０ｃｍ×２５ｃｍ、昭和電工社）に吸着させ、１３．５％から２１．２％のアセトニトリル直線濃度勾配によりＭｅｔ−７７残基型ベータセルリンを溶出した。同じ操作をさらに２回行い得られた溶出液を０．０２  ％トリフルオロ酢酸で透析し、凍結乾燥を行った。凍結乾燥粉末を蒸留水１０ｍＬで溶解し、酢酸型にしたＡＧ１−Ｘ８カラム（１．０ｃｍ×１０ｃｍ、日本バイオラッド社）を通過させた後、再度凍結乾燥を行いＭｅｔ−７７残基型ベータセルリン８ｍｇを得た。
【００４９】
実施例４
７６残基型（Ｃ末端４残基欠失型）ベータセルリン発現プラスミドの構築
７６残基型（Ｃ末端４残基欠失型）ベータセルリンの発現プラスミドは以下のように構築した〔図２〕。
７６残基型（Ｃ末端４残基欠失型）ベータセルリンの構造遺伝子を、実施例１で構築したｐＴＣＩＩ／ＢＴＣ７７より、構造遺伝子の上流に隣接してＮｄｅ Ｉ切断部位及び開始コドンを持つプライマー１（５'−ＣＡＴＡＴＧＧＡＴＧＧＧＡＡＴＴＣＣＡＣＣＡＧＡＡＧＴＣＣＴＧ）及び７６番目のバリンの後に終止コドン及びＢａｍ ＨＩ切断部位を持つプライマー２（５'−ＧＧＡＴＣＣＣＴＡＡＡＣＴＣＴＣＴＣＡＣＡＣＣＴＴＧＣＴＣＣＡＡＴＧ）を用いて、ＰＣＲで増幅した。ＰＣＲにより増幅した遺伝子を、ＴＡ ｏｒｉｇｉｎａｌ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（インヴィトロジェン社製）を用いてｐＣＲ２．１ベクターに連結し、ｐＣＲ２．１／ＢＴＣ７６を作製した。これを大腸菌ＪＭ１０９に導入し、アンピシリン耐性とβ−ガラクトシダーゼ活性を指標として形質転換体を選択した。  ｐＣＲ２．１／ＢＴＣ７６を有する形質転換体を培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ８Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてｐＣＲ２．１／ＢＴＣ７６を調製した。
ｐＣＲ２．１／ＢＴＣ７６をＮｄｅ Ｉ及びＢａｍ ＨＩで切断してアガロース電気泳動を行い、約２４０ ｂｐの７６残基型ベータセルリン構造遺伝子をＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｓｐｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてを回収した。実施例１で調製した発現ベクターｐＴＣＩＩをＮｄｅ Ｉ及びＢａｍ ＨＩで切断してアガロース電気泳動を行い、同様に約４．６ｋｂｐのバンドを回収した。７６残基型ベータセルリン構造遺伝子を発現ベクターｐＴＣＩＩのＮｄｅ Ｉ−Ｂａｍ ＨＩ断片と連結した後、大腸菌ＪＭ１０９に導入してテトラサイクリン耐性で形質転換株を選択し、その株より再度プラスミドを回収して、発現プラスミドｐＴＣＩＩＢＴＣ７６とした。
このｐＴＣＩＩＢＴＣ７６を大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）に導入して、テトラサイクリン耐性で形質転換株を選択し、７６残基型ベータセルリン発現株ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＴＣＩＩＢＴＣ７６を取得した。
【００５０】
実施例５
７６残基型ベータセルリン発現株の培養
７６残基型ベータセルリン発現株ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＴＣＩＩＢＴＣ７６を１０ｍｇ／Ｌのテトラサイクリンを含むＬＢ培地（１％ ペプトン、０．５％ 酵母エキス、０．５％ 塩化ナトリウム）１リットルで３０℃１６時間培養した。得られた培養液を主発酵用培地（１．６８％ リン酸一水素ナトリウム、０．３％ リン酸二水素ナトリウム、０．１％ 塩化アンモニウム、０．０５％ 塩化ナトリウム、０．０２４％ 硫酸マグネシウム、０．０２％ ニューポールＬＢ−６２５、０．０００５％ 塩酸チアミン、１．５％ ブドウ糖、１．０％ カザミノ酸、１．０％ イーストエキス）２０リットルを仕込んだ５０Ｌ容発酵槽に移植して、３７℃、通気量２０Ｌ／ｍｉｎ、撹拌回転数２１０ｒｐｍで通気撹拌培養を開始した。培養液の濁度が約１２００クレット単位になった時点で、５．９５ｍｇ／Ｌのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加した。ＩＰＴＧ添加時、添加後２及び３．５時間にそれぞれ０．７５％のグルコースを添加し培養開始１１時間後まで培養を行った。培養液を１００００ｒｐｍで３０分間遠心分離を行い、菌体５４０ｇを集めた。
【００５１】
実施例６
Ｍｅｔ−７６残基型ベータセルリンの精製
実施例５で得られた菌体３７５ｇに１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＡＰＭＳＦ及び７Ｍ グアニジン塩酸塩を含む０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０） １．０Ｌを加え、４℃で一晩攪拌し抽出を行った後、遠心分離（１００００ｒｐｍ、２０分間）を行った。得られた上清液１．０Ｌに０．５ｍＭ 酸化型グルタチオン、１ｍＭ 還元型グルタチオン、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１Ｍ アルギニン塩酸塩及び２Ｍ 尿素を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１９Ｌを加え、４℃で一晩リフォールディングを行った後、遠心分離（１００００ｒｐｍ、２０分間）を行い、遠心上清液２０Ｌを得た。この遠心上清液をペリコンカセットシステム（分画分子量：５０００、ミリポア社）を用いて濃縮を行った。濃縮脱塩液３．３Ｌに２Ｍ 尿素を１３．２Ｌ加えた後、塩酸でｐＨ５．０に調整した。５０ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化したＰＯＲＯＳ ５０ＨＳカラム（２．２ｃｍ×１２ｃｍ、日本パーセプティブ社）に毎分３０ｍＬの流速で吸着させ、平衡化に用いた緩衝液でよく洗浄した後、０．３Ｍから１．３Ｍの塩化ナトリウム直線濃度勾配により溶出を行った。７６残基型ベータセルリンを含む画分を集め、蒸留水で３倍に希釈した後、５０  ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）で平衡化したＴＳＫｇｅｌ ＣＭ−５ＰＷカラム（２．１５ｃｍ×１５ｃｍ、東ソー社）に添加した。  Ｍｅｔ−７６残基型ベータセルリンが吸着したＴＳＫｇｅｌ  ＣＭ−５ＰＷカラムを、０．２４Ｍから０．４４Ｍの塩化ナトリウム直線濃度勾配により溶出を行った。Ｍｅｔ−７６残基型ベータセルリンを含む画分を集め、０．１  ％トリフルオロ酢酸で平衡化したＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−１２０Ｔカラム（２．１５ｃｍ×３０ｃｍ、東ソー社）に吸着させ、１７％から２４％のアセトニトリル直線濃度勾配によりＭｅｔ−７６残基型ベータセルリンを溶出した。溶出液を０．０２％  トリフルオロ酢酸で透析し、凍結乾燥を行った。凍結乾燥粉末を蒸留水１０ｍＬで溶解し、酢酸型にしたＡＧ１−Ｘ８カラム（１．０ｃｍ×１０ｃｍ、日本バイオラッド社）を通過させた後、再度凍結乾燥を行いＭｅｔ−７６残基型ベータセルリン９３ｍｇを得た。
【００５２】
実施例７
ベータセルリン改変体の特徴の決定
実施例３で得られたＭｅｔ−７７残基型ベータセルリン及び実施例６で得られたＭｅｔ−７６残基型ベータセルリンの特徴を以下のように決定した。
ａ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を用いた分析
ベータセルリン改変体及び特開平１０−１９１９８９号に記載の方法により調製したＭｅｔ−８０残基型ベータセルリンをサンプルバッファー（１２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１％  ドデシル硫酸ナトリウム、１５％  グリセロール、５％  ２−メルカプトエタノール、０．００５％  ブロムフェノールブルー）で懸濁し、マルチゲル１５／２５（第一化学薬品）で電気泳動を行った。泳動後のゲルをラピッド  ＣＢＢ  ＫＡＮＴＯ（関東化学社）で染色を行ったところ、いずれもほぼ単一バンドであった〔図３〕。
ｂ）アミノ酸組成分析
ベータセルリン改変体を４％チオグリコール酸を含む６Ｎ塩酸で１１０℃、２４及び４８時間気相加水分解を行い、アミノ酸分析計（日立Ｌ−８５００ＡＡｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ａｎａｌｙｚｅｒ）を用いてアミノ酸組成を決定した。その結果、いずれの改変体も開始コドンＡＴＧに由来するメチオニンを含み、ｃＤＮＡ塩基配列から予想されるアミノ酸組成と一致した〔表１，表２〕。
【００５３】
【表１】
0004512222.tif 000002
【００５４】
【表２】
0004512222.tif 000003
【００５５】
ｃ）Ｎ末端アミノ酸配列分析
Ｎ末端アミノ酸配列分析を気相プロテインシーケンサー（アプライドバイオシステムズ  モデル４７７Ａ）を用いて決定した。その結果、いずれの改変体もｃＤＮＡ塩基配列から予想されるアミノ酸組成と一致した。いずれの改変体も８０残基型と同様に開始コドンＡＴＧに由来するメチオニンをＮ末端に有していた〔表３，表４〕。
【００５６】
【表３】
0004512222.tif 000004
【００５７】
【表４】
0004512222.tif 000005
【００５８】
ｄ）Ｃ末端アミノ酸分析
気相ヒドラジン分解法（１００℃、６時間）により、Ｃ末端アミノ酸をアミノ酸分析計（日立Ｌ−８５００ＡＡｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ａｎａｌｙｚｅｒ）を用いて決定した。Ｍｅｔ−７７残基型ベータセルリンではアスパラギン酸が、Ｍｅｔ−７６残基型ベータセルリンではバリンが検出された〔表５，表６〕。
【表５】
0004512222.tif 000006
【表６】
0004512222.tif 000007
【００５９】
実施例８
３Ｔ３細胞を用いた増殖促進活性の測定
モレキュラー・セル・バイオロジー、８巻、５８８（１９８８）に記載のごとく、静止状態の３Ｔ３ Ａ３１−７１４クローン４（インターナショナル・ジャーナル・オブ・キャンサー、１２巻、４６３（１９７３））中への3Ｈ−チミジンの取り込みによって増殖促進活性を測定した。
すなわち、５％ ウシ血清を含むダルベッコ改変イーグルＭＥＭ培地を用いて、１０００細胞／ｍＬになるように懸濁した３Ｔ３ Ａ３１−７１４クローン４を９６ウェルプレートに１００μＬづつ播き、炭酸ガスインキュベーター内（５％炭酸ガス、９５％空気）において３７℃で１日培養した。上清７５μＬを抜き取り、血清を含まないダルベッコ改変イーグルＭＥＭ培地を１００μＬ加える事により血清濃度を１％にした。さらに２日間培養した後、種々の濃度の実施例３で調製したＭｅｔ−７７残基型ベータセルリン、実施例６で調製したＭｅｔ−７６残基型ベータセルリン及び特開平１０−１９１９８９号に記載の方法により調製したＭｅｔ−８０残基型ベータセルリンを添加した。添加１６時間後に3Ｈ−チミジン［アマーシャム・ファルマシア・バイオテク］を０．２５μＣｉ／ｗｅｌｌ加え、その４時間後に細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、５％ ＳＤＳを１００μＬ加え細胞を溶解した。細胞溶解液をシンチレーションバイアルに移し、シンチレーターＡ（和光純薬社）を１ｍＬ加え、シンチレーションカウンターで3Ｈ−チミジンの細胞への取り込みを測定した〔図４〕。
【００６０】
実施例９
ＡＲ４２Ｊ細胞を用いたβ細胞分化促進活性の測定
化学発癌剤で誘発された膵臓癌由来細胞株ＡＲ４２Ｊ［Ｃｈｉｒｉｓｔｏｐｈｅ；アメリカン・ジャーナル・オブ・フィジオロギー（Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．），２６６：Ｇ９６３（１９９４）］を、実施例３で調製したＭｅｔ−７７残基型ベータセルリン、実施例６で調製したＭｅｔ−７６残基型ベータセルリンまたは特開平１０−１９１９８９号に記載の方法により調製したＭｅｔ−８０残基型ベータセルリン及び１０％ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグルＭＥＭ培地を用いて１０5細胞／ｍＬになるように懸濁し、５００μＬをチャンバースライドに播き、炭酸ガスインキュベーター内（５％  炭酸ガス、９５％空気）において３７℃で５日間培養した。５日後に細胞をＰＢＳで１回洗浄した後に、１０％ホルムアルデヒドで固定し、０．１％ トライトンＸ−１００で５分間処理した後に、ブロックエース（雪印、日本）を添加し室温で４０分間ブロッキングを行った。１０％ ブロックエースで希釈した抗インスリン抗体（アドバンスド・イムノ・ケミカル社）を添加し室温、４０分間反応した。０．１％ トライトンＸ−１００を添加し室温５分間放置した後、ＰＢＳで３回洗浄した。１０％ブロックエースで希釈したＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  Ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）標識抗マウスＩｇＧ抗体（カッペル社）を添加し、室温で４０分間反応した。０．１％トライトンＸ−１００を添加し室温５分間放置した後、ＰＢＳで３回洗浄し、蛍光顕微鏡で観察した。いずれのベータセルリンを添加した場合においても、蛍光染色された細胞、すなわちインスリンを産生するβ細胞に分化した細胞が観察された〔図５〕。
【００６１】
実施例１０
ヒト胎盤アルカリフォスファターゼ遺伝子発現ベクターの構築
β細胞への分化促進活性はインスリンプロモーターの下流にレポーターとしてアルカリフォスファターゼを連結したものにより形質転換されたＡＲ４２Ｊ細胞を用いても実施した。すなわちベーターセルリンによりβ細胞へと分化した細胞はアルカリフォスファターゼを産生し、このアルカリフォスファターゼの活性を測定することによりβ細胞への分化促進活性を定量的に測定することが可能である。
ラット尾から常法に従ってゲノムＤＮＡを調製した。このＤＮＡをテンプレートとして、既報のラットインスリンＩＩ遺伝子プロモーターの塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ：Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｊ００７４８）をもとに合成したプライマーＲＩ−１［５’−ＡＧＡＧＴＣＡＡＧＧＡＴＣＣＣＣＣＡＡＣＣＡＣＴ−３’］およびＲＩ−３［５’−ＡＧＣＴＧＧＴＣＡＣＴＴＡＧＧＧＣＴＧＧＧＧ−３’］を用いてＰＣＲ法によりインスリンプロモーター領域０．７５Ｋｂを増幅した。さらに、このＰＣＲ産物をテンプレートとしてプライマーＲＩ−１Ｃｌａ［５’−ＧＡＡＴＣＧＡＴＡＧＡＧＴＣＡＡＧＧＡＴＣＣＣＣＣＡ−３’］およびＲＩ−３Ｘｈｏ［５’−ＧＡＣＴＣＧＡＧＣＴＧＧＴＣＡＣＴＴＡＧＧＧ−３’］を用いてＰＣＲを行った。増幅された０．７５Ｋｂ  ＤＮＡ断片を単離し、ｐＴ７Ｂｌｕｅベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ  ６９８２０−１）に組み込んで得られたプラスミドｐＴＢ１８８１を用いてクローニングされた断片の塩基配列を決定し、ラットインスリンプロモーターであることを確認した。プラスミドｐＴＢ１８８１をＸｈｏ Ｉ−Ｃｌａ Ｉで切断してラットインスリンプロモーターである０．７３ｋｂ  ＤＮＡ断片を得た。次にヒト胎盤アルカリフォスファターゼ（ＰＬＡＰ）をコードする２．０  ｋｂ  ｃＤＮＡ（Ｊ．Ｂｅｒｇｅｒら、Ｇｅｎｅ  ６６，１（１９８８））の発現プラスミドｐＴＢ１３３０をＸｈｏ Ｉ−Ｈｉｎｄ  ＩＩＩで切断して得られた２．７ｋｂ  ＤＮＡ断片（ＰＬＡＰｃＤＮＡ、ＳＶ４０由来スプライシング部位およびポリＡ付加部位、ｐＢＲ３２２由来ｏｒｉおよびアンピシリン耐性遺伝子を含む）を単離し、前述のラットインシュリンプロモーター領域０．７３ｋｂ Ｘｈｏ Ｉ−Ｃｌａ Ｉ断片をＴ４ ＤＮＡリガーゼ反応によって連結してプラスミドｐＴＢ１８９８を得た。
【００６２】
実施例１１
ＰＬＡＰ発現ＡＲ４２Ｊ細胞の構築
ＡＲ４２Ｊ細胞にＰＬＡＰ発現プラスミドｐＴＢ１８９８とＴｎ５のｎｅｏr遺伝子を含むプラスミドｐＭＣｎｅｏｐｏｌｙ  Ａ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）をトランスフェクション試薬ＴｒａｎｓＩＴTM−ＬＴ１（Ｍｉｒｕｓ、ＰｅｎＶｅｒａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて同時に導入した。導入後の細胞は１０％牛胎児血清を加えたＤＭＥＭで２日間培養した後、Ｇ４１８（ゲネテシン、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）８００  μｇ／ｍＬを添加した選択培地に加えて培養を続けた。Ｇ４１８耐性となって生育した細胞を限界希釈法によりクローンを単離した。
各クローンの細胞を２４穴プレートに播き、Ｍｅｔ−８０残基型ベータセルリンを２０  ｎｇ／ｍＬ添加および無添加で４日間培養し、培養上清を集めて６５℃３０分間熱処理を行った後、培地中のアルカリフォスファターゼ活性を測定した。８０残基型ベータセルリン添加時にアルカリフォスファターゼ活性の上昇が認められるクローンを選択した。いくつかのクローンの結果を以下の〔表７〕に示す。
【表７】
0004512222.tif 000008
【００６３】
実施例１２
ＰＬＡＰ発現ＡＲ４２Ｊ細胞を用いたβ細胞分化促進活性の測定
実施例１１で構築したＰＬＡＰ発現ＡＲ４２Ｊ細胞を、各種濃度の実施例３で調製したＭｅｔ−７７残基型ベータセルリン、実施例６で調製したＭｅｔ−７６残基型ベータセルリンまたは特開平１０−１９１９８９号に記載の方法により調製したＭｅｔ−８０残基型ベータセルリン及び１０％ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグルＭＥＭ培地を用いて１０5細胞／ｍＬになるように懸濁し、１００μＬを９６ウェルプレートに播き、炭酸ガスインキュベーター内（５％ 炭酸ガス、９５％ 空気）において３７℃で５日間培養した。５日後に培養上清をサンプリングし、６５℃で３０分間処理した後、５０μＬをあらかじめ５０μＬの２ＸＳＥＡＰ（２Ｍ ジエタノールアミン、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、２０ｍＭ ホモアルギニン）を添加した９６ウェルマイクロプレートに加えた。３７℃で１０分間保った後、２０ｍｇ／ｍＬのｐ−ニトロフェニルリン酸（シグマ社）を１０  μＬ添加し３７℃で１６時間反応を行った〔図６〕。Ｍｅｔ−７７残基型ベータセルリンおよびＭｅｔ−７６残基型ベータセルリンはＭｅｔ−８０残基型ベータセルリンとほぼ同じ分化誘導促進活性を示した。
【００６４】
実施例１３
２−７６残基型（Ｎ末端１残基、Ｃ末端３残基欠失型）ベータセルリン発現株の構築
２−７６残基型（Ｎ末端１残基、Ｃ末端３残基欠失型）ベータセルリンの発現プラスミドは以下のように構築した〔図７〕。
２−７６残基型（Ｎ末端１残基、Ｃ末端３残基欠失型）ベータセルリンの構造遺伝子を、７６残基型（Ｃ末端３残基欠失型）ベータセルリン発現プラスミドｐＴＣＩＩＢＴＣ７６［実施例４］より、２番目のグリシンの上流に隣接してＮｄｅ Ｉ切断部位及び開始コドンを持つプライマー３（５'−ＣＡＧＣＡＴＡＴＧＧＧＧＡＡＴＴＣＣＡＣＣＡＧＡＡＧＴＣＣＴ）、およびＣ末端のバリンの後に終止コドン及びＢａｍ ＨＩ切断部位を持つプライマー４（５'  −ＧＧＡＴＣＣＣＴＡＡＡＣＴＣＴＣＴＣＡＣＡＣＣＴＴＧＣＴＣＣＡＡＴＧ）を用いて、ＰＣＲで増幅した。ＰＣＲにより増幅した遺伝子を、ＴＡ ｏｒｉｇｉｎａｌ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（インヴィトロジェン社製）を用いてｐＣＲ２．１ベクターに連結し、ｐＣＲ２．１ＢＴＣ２−７６を作製した。これを大腸菌ＪＭ１０９に導入し、アンピシリン耐性を指標として形質転換体を選択した。ｐＣＲ２．１ＢＴＣ２−７６を有する形質転換体を培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ８ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてｐＣＲ２．１ＢＴＣ２−７６を調製した。
ｐＣＲ２．１ＢＴＣ２−７６をＮｄｅ Ｉ及びＢａｍ ＨＩで切断してアガロース電気泳動を行い、約２３０ ｂｐの２−７６残基型ベータセルリン構造遺伝子をＱＩＡＧＥＮ ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて回収した。発現ベクターｐＴＣＩＩ［実施例１］をＮｄｅ Ｉ及びＢａｍ ＨＩで切断してアガロース電気泳動を行い、同様に約４．６ｋｂｐのバンドを回収した。２−７６残基型ベータセルリン構造遺伝子を発現ベクターｐＴＣＩＩのＮｄｅ Ｉ−Ｂａｍ ＨＩ断片と連結した後、大腸菌ＪＭ１０９に導入してテトラサイクリン耐性で形質転換株を選択し、その株より再度プラスミドを回収して、発現プラスミドｐＴＣＩＩＢＴＣ２−７６とした。
このｐＴＣＩＩＢＴＣ２−７６を大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）に導入して、テトラサイクリン耐性で形質転換株を選択し、２−７６残基型ベータセルリン発現株ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＴＣＩＩＢＴＣ２−７６を取得した。
【００６５】
実施例１４
２−７６残基型ベータセルリン発現株の培養
２−７６残基型ベータセルリン発現株ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＴＣＩＩＢＴＣ２−７６を１０ｍｇ／Ｌのテトラサイクリンを含むＬＢ培地（１％ ペプトン、０．５％ 酵母エキス、０．５％ 塩化ナトリウム）３０ｍＬで３０℃、１６時間培養した。得られた培養液を主発酵用培地（１．６８％ リン酸一水素ナトリウム、０．３％ リン酸二水素ナトリウム、０．１％ 塩化アンモニウム、０．０５％ 塩化ナトリウム、０．０１２％ 硫酸マグネシウム、０．０００７％ 塩酸チアミン、１．５％ ブドウ糖、１．５％ ハイケース）２００ｍＬを入れた１Ｌ容マイヤー６本に１０ｍｌずつ移植して、３７℃、撹拌回転数２００ｒｐｍで撹拌培養を開始した。培養液の濁度が約１６０クレット単位になった時点で、５．９５  ｍｇ／Ｌ分のイソプロピル−β−Ｄーチオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加した。ＩＰＴＧ添加後４時間後まで培養を行った。培養液を９０００ｒｐｍで３０分間遠心分離を行い、菌体５．１ｇを集めた。
【００６６】
実施例１５
２−７６残基型ベータセルリンの精製
実施例１４で得られた菌体５ｇに１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＡＰＭＳＦ及び７Ｍ グアニジン塩酸塩を含む０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１５ｍＬを加え、４℃で一晩撹拌し抽出を行った後、遠心分離（９０００ｒｐｍ、１０分間）を行った。得られた上清液１５ｍＬに０．５ｍＭ 酸化型グルタチオン、１ｍＭ 還元型グルタチオン、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１Ｍ アルギニン塩酸塩及び２Ｍ 尿素を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）２５０ｍＬを加え、４℃で一晩リフォールディングを行った後、遠心分離（１００００ｒｐｍ、１０分間）を行い、遠心上清液２６５ｍＬを得た。この遠心上清液に２Ｍ 尿素を１Ｌ加えた後、酢酸でｐＨ５．０に調整し、４℃で一晩静置した。遠心分離（１００００ｒｐｍ、１０分間）を行い、得られた遠心上清液を５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化したＰＯＲＯＳ ５０ＨＳカラム（２．２ｃｍ×１２ｃｍ、日本パーセプティブ社）に毎分３０ｍＬの流速で吸着させ、平衡化に用いた緩衝液でよく洗浄した後、０．３Ｍから１．３Ｍの塩化ナトリウム直線濃度勾配により溶出を行った。２−７６残基型ベータセルリンを含む画分を集め、５０  ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）で３倍に希釈した後、この緩衝液で平衡化したＴＳＫｇｅｌ  ＣＭ−５ＰＷカラム（０．７５ｃｍ×７．５ｃｍ、東ソー社）に添加した。２−７６残基型ベータセルリンが吸着したＴＳＫｇｅｌ ＣＭ−５ＰＷカラムを、０．３Ｍから０．５Ｍの塩化ナトリウム直線濃度勾配により溶出を行った。２−７６残基型ベータセルリンを含む画分を集め、０．１％ トリフルオロ酢酸で平衡化したＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−１２０Ｔカラム（２．１５ｃｍ×３０ｃｍ、東ソー社）に吸着させ、２０％から４４％のアセトニトリル直線濃度勾配により２−７６残基型ベータセルリンを溶出した。溶出液を凍結乾燥した後、蒸留水５ｍＬで溶解し、酢酸型にしたＡＧ１−Ｘ８カラム（１．０ｃｍ×１０ｃｍ、日本バイオラッド社）を通過させた後、再度凍結乾燥を行い２−７６残基型ベータセルリン０．７ｍｇを得た。
【００６７】
実施例１６
２４−７６残基型（Ｎ末端２３残基、Ｃ末端３残基欠失型）ベータセルリン発現株の構築
２４−７６残基型（Ｎ末端２３残基、Ｃ末端３残基欠失型）ベータセルリンの発現プラスミドは以下のように構築した〔図８〕。
２４−７６残基型（Ｎ末端２３残基、Ｃ末端３残基欠失型）ベータセルリンの構造遺伝子を、実施例４で調製した７６残基型（Ｃ末端３残基欠失型）ベータセルリン発現プラスミドｐＴＣＩＩＢＴＣ７６より、２４番目のアラニンの上流に隣接してＮｄｅ Ｉ切断部位及び開始コドンを持つプライマー５（５’−ＣＡＧＣＡＴＡＴＧＧＣＴＡＣＣＡＣＣＡＣＡＣＡＡＴＣＡＡＡＧ）、およびＣ末端のバリンの後に終止コドン及びＢａｍ ＨＩ切断部位を持つプライマー４（５’−ＧＧＡＴＣＣＣＴＡＡＡＣＴＣＴＣＴＣＡＣＡＣＣＴＴＧＣＴＣＣＡＡＴＧ）を用いて、ＰＣＲで増幅した。ＰＣＲにより増幅した遺伝子を、ＴＡ ｏｒｉｇｉｎａｌ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（インヴィトロジェン社製）を用いてｐＣＲ２．１ベクターに連結し、ｐＣＲ２．１ＢＴＣ２４−７６を作製した。これを大腸菌ＪＭ１０９に導入し、アンピシリン耐性を指標として形質転換体を選択した。ｐＣＲ２．１ＢＴＣ２４−７６を有する形質転換体を培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ８ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてｐＣＲ２．１ＢＴＣ２４−７６を調製した。
ｐＣＲ２．１ＢＴＣ２４−７６をＮｄｅ Ｉ及びＢａｍ ＨＩで切断してアガロース電気泳動を行い、約１６０ｂｐの２４−７６残基型ベータセルリン構造遺伝子をＱＩＡＧＥＮ ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて回収した。実施例１で調製した発現ベクターｐＴＣＩＩをＮｄｅ Ｉ及びＢａｍ ＨＩで切断してアガロース電気泳動を行い、同様に約４．６ｋｂｐのバンドを回収した。２４−７６残基型ベータセルリン構造遺伝子を発現ベクターｐＴＣＩＩのＮｄｅ Ｉ−Ｂａｍ ＨＩ断片と連結した後、大腸菌ＪＭ１０９に導入してテトラサイクリン耐性で形質転換株を選択し、その株より再度プラスミドを回収して、発現プラスミドｐＴＣＩＩＢＴＣ２４−７６とした。
このｐＴＣＩＩＢＴＣ２４−７６を大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）に導入して、テトラサイクリン耐性で形質転換株を選択し、２４−７６残基型ベータセルリン発現株ＭＭ２９４（ＤＥ３）ｐＴＣＩＩＢＴＣ２４−７６を取得した。
【００６８】
実施例１７
２４−７６残基型ベータセルリン発現株の培養
２４−７６残基型ベータセルリン発現株ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＴＣＩＩＢＴＣ２４−７６を１０ｍｇ／Ｌのテトラサイクリンを含むＬＢ培地（１％ ペプトン、０．５％ 酵母エキス、０．５％ 塩化ナトリウム）３０ｍＬで３０℃、１６時間培養した。得られた培養液を主発酵用培地（１．６８％ リン酸一水素ナトリウム、０．３％ リン酸二水素ナトリウム、０．１％ 塩化アンモニウム、０．０５％ 塩化ナトリウム、０．０１２％ 硫酸マグネシウム、０．０００７％ 塩酸チアミン、１．５％ ブドウ糖、１．５％ ハイケース）１５０ｍＬを入れた１Ｌ容マイヤー５本に移植して、３７℃、撹拌回転数２００ｒｐｍで撹拌培養を開始した。培養液の濁度が約１６０クレット単位になった時点で、５．９５ｍｇ／Ｌ分のイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加した。ＩＰＴＧ添加後４時間後まで培養を行った。培養液を１００００ｒｐｍで３０分間遠心分離を行い、菌体３．９ｇを集めた。
【００６９】
実施例１８
２４−７６残基型ベータセルリンの精製
実施例５で得られた菌体３．９ｇに１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＡＰＭＳＦ及び７Ｍ グアニジン塩酸塩を含む０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１２ｍＬを加え、４℃で一晩撹拌し抽出を行った後、遠心分離（９０００ｒｐｍ、１０分間）を行った。得られた上清液１２ｍＬに０．５ｍＭ 酸化型グルタチオン、１ｍＭ 還元型グルタチオン、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１Ｍ アルギニン塩酸塩及び２Ｍ 尿素を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）２００ｍＬを加え、４℃で一晩リフォールディングを行った後、遠心分離（１００００ｒｐｍ、１０分間）を行い、遠心上清液２１２ｍＬを得た。この遠心上清液に２Ｍ尿素を０．８Ｌ加えた後、酢酸でｐＨ５．０に調整し、４℃で一晩静置した。遠心分離（１００００ｒｐｍ、１０分間）を行い、得られた遠心上清液を５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化したＰＯＲＯＳ ５０ＨＳカラム（２．２ｃｍ×１２ｃｍ、日本パーセプティブ社）に毎分３０ｍＬの流速で吸着させ、平衡化に用いた緩衝液でよく洗浄した後、０．３Ｍから１．３Ｍの塩化ナトリウム直線濃度勾配により溶出を行った。２４−７６残基型ベータセルリンを含む画分を集め、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）で３倍に希釈した後、この緩衝液で平衡化したＴＳＫｇｅｌ ＣＭ−５ＰＷカラム（０．７５ｃｍ×７．５ｃｍ、東ソー社）に添加した。２４−７６残基型ベータセルリンが吸着したＴＳＫｇｅｌ  ＣＭ−５ＰＷカラムを、０．３Ｍから０．５Ｍの塩化ナトリウム直線濃度勾配により溶出を行った。２４−７６残基型ベータセルリンを含む画分を集め、０．１％ トリフルオロ酢酸で平衡化したＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−１２０Ｔカラム（２．１５ｃｍ×３０ｃｍ、東ソー社）に吸着させ、２０％から４４％のアセトニトリル直線濃度勾配により２４−７６残基型ベータセルリンを溶出した。溶出液を凍結乾燥した後、蒸留水５ｍＬで溶解し、酢酸型にしたＡＧ１−Ｘ８カラム（１．０ｃｍ×１０ｃｍ、日本バイオラッド社）を通過させた後、再度凍結乾燥を行い２４−７６残基型ベータセルリン０．４ｍｇを得た。
【００７０】
実施例１９
ベータセルリン改変体の特徴の決定
実施例３で得られた２−７６残基型ベータセルリン及び実施例６で得られた２４−７６残基型ベータセルリンの特徴を以下のように決定した。
ａ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を用いた分析
ベータセルリン改変体及び実施例６で調製した７６残基型ベータセルリンをサンプルバッファー（１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１％ ドデシル硫酸ナトリウム、１５％ グリセロール、５％ ２−メルカプトエタノール、０．００５％ ブロムフェノールブルー）で懸濁し、マルチゲル１５／２５（第一化学薬品）で電気泳動を行った。泳動後のゲルをラピッド ＣＢＢ ＫＡＮＴＯ（関東化学社）で染色を行ったところ、いずれもほぼ単一バンドであった〔図９〕。
ｂ）アミノ酸組成分析
ベータセルリン改変体を４％チオグリコール酸を含む６  Ｎ塩酸で１１０℃、２４及び４８時間気相加水分解を行い、アミノ酸分析計（日立Ｌ−８５００Ａ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ａｎａｌｙｚｅｒ）を用いてアミノ酸組成を決定した。その結果、いずれの改変体もｃＤＮＡ塩基配列から予想されるアミノ酸組成と一致した〔表８，表９〕。
【００７１】
【表８】
0004512222.tif 000009
【００７２】
【表９】
0004512222.tif 000010
【００７３】
ｃ）Ｎ末端アミノ酸配列分析
Ｎ末端アミノ酸配列分析を気相プロテインシーケンサー（アプライドバイオシステムズ  モデル４７７Ａ）を用いて決定した。その結果、いずれの改変体もｃＤＮＡ塩基配列から予想されるアミノ酸配列と一致した〔表１０，表１１〕。
【００７４】
【表１０】
0004512222.tif 000011
【００７５】
【表１１】
0004512222.tif 000012
【００７６】
ｄ）Ｃ末端アミノ酸分析
気相ヒドラジン分解法（１００℃、６時間）により、Ｃ末端アミノ酸をアミノ酸分析計（日立Ｌ−８５００Ａ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ａｎａｌｙｚｅｒ）を用いて決定した。いずれの改変体もバリンが検出された〔表１２，表１３〕。
【表１２】
0004512222.tif 000013
【表１３】
0004512222.tif 000014
【００７７】
実施例２０
１）Ａ４３１細胞を用いたＥＧＦバインディングアッセイ
ＥＧＦレセプター高発現株であるヒト扁平上皮癌細胞Ａ４３１細胞を用いた125Ｉ−ＥＧＦに対する結合阻害活性によって細胞増殖促進活性を測定した。
すなわち、１０％ ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグルＭＥＭ（ＤＭＥＭ）培地を用いて、１０5細胞／ｍＬになるように懸濁したＡ４３１細胞を９６ウェルプレートに１００μＬずつ播き、炭酸ガスインキュベーター内（５％炭酸ガス、９５％空気）において３７℃で２日間培養した。２日後に２０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび０．１％ ウシ血清アルブミンを含む、ＤＭＥＭとＦ−１２を等量混合した結合培地２００μＬ／ウェルで３回洗浄した後、各種濃度の標識されていないＥＧＦ、実施例１５で調製した２−７６残基型ベータセルリン、実施例１８で調製した２４−７６残基型ベータセルリン、実施例６で調製したＭｅｔ−７６残基型ベータセルリン、または特開平１０−１９１９８９号に記載の用法により調製したＭｅｔ−８０残基型ベータセルリン及び０．２５ｎＭ  125Ｉ−ＥＧＦ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク）を含む結合培地１００μＬを添加した。４℃、９０分静置した後に結合培地２００μＬで３回洗浄し、１％ ＳＤＳを含む０．１Ｎ 水酸化ナトリウム水溶液２００μＬで細胞を溶解した。細胞溶解液をシンチレーションバイアルに移し、シンチレーターＡ（和光純薬社）を１ｍＬ加え、シンチレーションカウンターで125Ｉ−ＥＧＦに対する結合阻害活性を測定した。
２）ヒト胎盤アルカリフォスファターゼ発現ＡＲ４２Ｊ細胞を用いたβ細胞分化促進活性の測定
ＰＬＡＰ発現ＡＲ４２Ｊ細胞を、各種濃度の実施例１５で調製した２−７６残基型ベータセルリン、実施例１８で調製した２４−７６残基型ベータセルリン、実施例６で調製したＭｅｔ−７６残基型ベータセルリン、または特開平１０−１９１９８９号に記載の用法により調製したＭｅｔ−８０残基型ベータセルリン及び１０％ ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグルＭＥＭ培地を用いて１０5細胞／ｍＬになるように懸濁し、１００μＬを９６ウェルプレートに播き、炭酸ガスインキュベーター内（５％炭酸ガス、９５％  空気）において３７℃で５日間培養した。５日後に培養上清をサンプリングし、６５℃で３０分間処理した後、５０μＬをあらかじめ５０μＬの２ｘＳＥＡＰ（２Ｍ ジエタノールアミン、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、２０ｍＭ ホモアルギニン）を添加した９６ウェルマイクロプレートに加えた。２０ｍｇ／ｍＬのｐ−ニトロフェニルリン酸（シグマ社）を１０μＬ添加し３７℃で１６時間反応を行った。いずれの改変体もＥＧＦ活性対ＢＴＣ活性の比がＭｅｔ−８０残基型ベータセルリンの５％ほどに低下し、Ｍｅｔ−７６残基型ベータセルリンと同程度でありＮ末欠失による影響は認められなかった。
３)上記１）および２）の結果を〔表１４〕にまとめ示す。
【表１４】
0004512222.tif 000015
【００７８】
実施例２１
Ｃｙｓ３−Ｃｙｓ４間にヘレギュリン（Ｈｅｒ）に由来する３残基が挿入されたｈＢＴＣ５０改変分子Ａ発現プラスミドｐＴＢ１９８５の構築
ｐＴＢ１９７６をテンプレートとして、（１）５'側プライマーＰＥＴ−１：５'−ＧＡＡＡＴＡＡＴＴＴＴＧＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧ−３'および３'側プライマーＢＴＣ−１：５'−ＡＧＧＡＧＧＧＣＧＴＣＧＡＧＧＧＧＴＴＣＴＧＣＴＣＧＧＣＣＡ−３'、（２）５'側プライマーＢＴＣ−２：５'−ＴＧＧＣＣＧＡＧＣＡＧＡＡＣＣＣＣＴＣＧＡＣＧＣＣＣＴＣＣＴ−３'および３'側プライマーＢＴＣ−３：５'−ＴＣＴＡＴＧＣＧＣＡＣＣＣＧＴＴＣＴＣＧＧＡＧＣＡＣＴＧＴＣ−３'を用いて、それぞれＰＣＲを行った。
次に（１）と（２）のＰＣＲ産物の混合物をテンプレートとして、５'側プライマーＢＴ−９５ｈ、３’側プライマーＢＴ−９４ｈを用いてＰＣＲを行い、ｈＢＴＣ５０のＣｙｓ３−Ｃｙｓ４間にＨｅｒの配列中の３アミノ酸（Ａｓｎ，Ｐｒｏ，Ｓｅｒ）を挿入した改変分子ＡをコードするＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片をＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化後、ｐＥＴ−３ｃのＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ部位に組み込み、ｐＴＢ１９８５を作製した。
【００７９】
実施例２２
Ｎ末７残基をその部位に相当する上皮成長因子（ＥＧＦ）の５残基で置換されたｈＢＴＣ５０改変分子Ｂ発現プラスミドｐＴＢ１９８７の構築
ｐＴＢ１９７６をテンプレートとして、５'側プライマーＢＴＣ−７：５'−ＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＡＣＡＧＣＧＡＣＴＣＴＧＡＧＴＧＣＣＣＣＡＡＧＣ−３'および３'側プライマーＢＴ−９４ｈを用いてＰＣＲを行い、ｈＢＴＣ５０のＮ末７残基を相当するＥＧＦの５残基に置換した改変分子ＢをコードするＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片をＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化後、ｐＥＴ３ｃのＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ部位に組み込み、ｐＴＢ１９８７を作製した。
【００８０】
実施例２３
大腸菌での発現
Ｔ７ファージのΦ１０プロモーターの支配下に、後述の参考例および上記の実施例で得られたプラスミドｐＴＢ１９７６、プラスミドｐＴＢ１９８５およびプラスミドｐＴＢ１９８７を、発現用大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に導入した。それぞれの大腸菌組換え体を１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび１０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含むＬＢ培地を用いて３７℃で培養した。クレットユニット１６０の時点でイソプロピル β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを最終濃度０．４ｍＭになるように添加し、さらに３７℃で４時間培養を継続した。培養後遠心により集菌し、抽出操作まで−８０℃で保存した。
【００８１】
実施例２４
ｈＢＴＣ５０、改変分子Ａおよび改変分子Ｂの精製
４−１）大腸菌封入体の調製
４００ｍｌの培養液から集めた菌体を２０ｍｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０％ ｓｕｃｒｏｓｅ、１０ｍＭ ＥＤＴＡに懸濁して、凍結・融解した後、氷中に３０分間静置して完全に細胞を溶かした。氷冷下で超音波破砕（１０ｓｅｃ，３回）後、遠心（９０００ｒｐｍ，１５ｍｉｎ，４℃：Ｂｅｃｋｍａｎ）して再度沈殿を集めた。この洗浄操作を３回繰り返して封入体を調製した。
４−２）タンパクの抽出およびリフォールデイング
４−１）で得られた封入体を８ｍｌの７Ｍ  ｇｕａｎｉｄｉｎｅ−ＨＣｌ、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＣＨ3ＣＯＯＨ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡに懸濁して４℃、１時間スターラーで穏やかに撹拌し、組換えタンパクを抽出した。次に還元型グルタチオンを０．１Ｍになるように添加して、ＮａＯＨ溶液でｐＨを８．４に合わせた後、抽出液中に窒素ガスを吹き込み空気と置換した。室温で２時間静置した後、２０倍容量の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＣＨ3ＣＯＯＨ（ｐＨ８．０）、０．５ｍＭ フェニルメチルスルホニルフルオリド、１ｍＭ ベンズアミジンで稀釈した。遠心（９０００ｒｐｍ，１５ｍｉｎ，２５℃）して不溶物を除いた上清に、酸化型グルタチオンを０．５ｍＭになるように添加し、室温で１６時間静置した。次いで、遠心（９０００ｒｐｍ，１５ｍｉｎ，２５℃）上清を凍結乾燥して濃縮後、４℃で５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＣＨ3ＣＯＯＨ（ｐＨ５．５）、１ｍＭＥＤＴＡに透析（Ｓｐｅｃｔｒａ  ｐｏｒ：ＭＷＣＯ  １，０００）した。透析後、遠心（９０００ｒｐｍ，１５ｍｉｎ，４℃）上清を酢酸セルロース膜（Ｍｉｌｌｅｘ  ＧＶ，０．２２  ｕｍ：Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濾過して、不溶物を除いた。
４−３）タンパクの精製
リフォールデイングしたタンパクを含む溶液を５０ｍＭ  酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）で平衡化した陽イオン交換ＨＰＬＣカラム（２５０×４．１ｍｍ  Ｉ．ｄ．，Ｓｙｎｃｈｒｏｍ  ＣＭ３００，Ｓｙｎｃｈｒｏｐａｋ）にかけ、０−１ＭのＮａＣｌ濃度勾配でタンパクを溶出、分画した。ＯＤ280でモニターした溶出画分を、０．１％ ＨＣｌ、１％ ＣＨ3ＣＮで平衡化したＣ4逆相ＨＰＬＣカラム（１５０×４．６ｍｍ  Ｉ．ｄ．，Ｕｌｔｒｏｎ  ３００  Ｃ4：Ｃｈｒｏｍａｔｏｐａｃｋｉｎｇ  Ｃｅｎｔｅｒ）にかけて、１−４０％のＣＨ3ＣＮ濃度勾配で溶出した。次にカラムクロマトグラフィーで得たピーク画分を凍結乾燥した。改変分子ＡおよびＢの収量は、各々７８．７μｇおよび１０３．１μｇであった。
４−４）タンパクの純度検定
精製標品の純度検定の目的で、Ｃ18逆相ＨＰＬＣカラム（１５０×４．６ｍｍｉ．ｄ．，ＯＤＳ１２０Ｔ，Ｔｏｓｏｈ）にかけて、１５〜３０％のＣＨ3ＣＮ濃度勾配で溶出し、改変分子ＡおよびＢのピークパターンの単一性を確認した。両タンパクの純度は９４％以上であることが分かった。
【００８２】
実施例２５
３Ｔ３細胞を用いた細胞増殖促進活性の測定
モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー、8巻、588頁、1988年に記載の方法に準じ、静止状態の３Ｔ３  Ａ３１−７１４クローン４（インターナショナル・ジャーナル・オブ・キャンサー、１２巻、４６３頁、１９７３年）中への3Ｈ−チミジンの取り込みによって細胞増殖促進活性を測定した。
５％ ウシ血清を含むダルベッコ改変イーグルＭＥＭ培地を用いて、１０００細胞／ｍＬになるように懸濁した３Ｔ３  Ａ３１−７１４クローン４を９６ウェルプレートに１００μＬづつ播き、炭酸ガスインキュベーター内（５％炭酸ガス、９５％空気）において３７℃で１日培養した。上清７５μＬを抜き取り、血清を含まないダルベッコ改変イーグルＭＥＭ培地を１００μＬ加えることにより血清濃度を１％にした。さらに２日間培養した後、種々の濃度の上記の実施例で調製したｈＢＴＣ５０、改変分子Ａまたは改変分子Ｂを添加した。添加１６時間後に3Ｈ−チミジン［アマーシャム・ファルマシア・バイオテク］を０．２５μＣｉ／ｗｅｌｌ加え、その４時間後に細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、５％  ＳＤＳを１００μＬ加え細胞を溶解した。細胞溶解液をシンチレーションバイアルに移し、シンチレーターＡ（和光純薬社）を１ｍＬ加え、シンチレーションカウンターで3Ｈ−チミジンの細胞への取り込みを測定した。
この測定結果より、８０残基型ベータセルリン（標準品）の最大取り込み値を１００％として、５０％の活性を示した時のｈＢＴＣ５０および改変分子の濃度（ＥＤ50）を求めた結果を〔表１５〕に示す。
【表１５】
0004512222.tif 000016
【００８３】
実施例２６
ＡＲ４２Ｊ細胞を用いたβ細胞分化誘導活性の測定
上記で調製したｈＢＴＣ５０、改変分子Ａ、改変分子Ｂおよび特開平１０−１９１９８９号に記載の方法により調製した８０残基型ベータセルリン（ｈＢＴＣ８０）から選ばれる１種と、１０％ ウシ胎児血清とを含むダルベッコ改変イーグルＭＥＭ培地に、化学発癌剤で誘発された膵臓癌由来細胞株ＡＲ４２Ｊ［Chiristophe; アメリカン・ジャーナル・オブ・フィジオロギー(Am. J. Physiol.）,２６６巻、Ｇ９６３頁、１９９４年］を１０5細胞／ｍＬになるように懸濁し、５００ μＬをチャンバースライドに播き、炭酸ガスインキュベーター内（５％ 炭酸ガス、９５％ 空気）において３７℃で５日間培養した。５日後に細胞をＰＢＳで１回洗浄した後に、１０％ ホルムアルデヒドで固定し、０．１％ トリトンＸ−１００で５分間処理した後に、ブロックエース（雪印、日本）を添加し、室温で４０分間ブロッキングを行った。１０％ ブロックエースで希釈した抗インスリン抗体（アドバンスド・イムノ・ケミカル社）を添加し室温、４０分間反応した。０．１％ トリトンＸ−１００を添加し室温５分間放置した後、ＰＢＳで３回洗浄した。１０％ ブロックエースで希釈したＦＩＴＣ（Fluorescein Isothiocyanate）標識抗マウスＩｇＧ抗体（カッペル社）を添加し、室温で４０分間反応した。０．１％トリトンＸ−１００を添加し室温５分間放置した後、ＰＢＳで３回洗浄し、蛍光顕微鏡で観察した。
その結果、ｈＢＴＣ８０を添加した場合と同様に、ｈＢＴＣ５０、改変分子Ａおよび改変分子Ｂを添加した場合においても、蛍光染色された細胞、すなわちインスリンを産生するβ細胞に分化した細胞が観察された。
また、インスリン産生細胞の出現頻度は、ｈＢＴＣ８０、ｈＢＴＣ５０、改変分子Ａおよび改変分子Ｂ間で差が見られなかった。
【００８４】
実施例２７
ＰＬＡＰ発現ＡＲ４２Ｊ細胞を用いたβ細胞分化誘導活性の測定
３−１） ヒト胎盤アルカリフォスファターゼ遺伝子発現ベクターの構築
β細胞への分化促進活性はインスリンプロモーターの下流にレポーターとしてアルカリフォスファターゼ遺伝子を連結したものにより形質転換されたＡＲ４２Ｊ細胞を用いても実施した。すなわちベーターセルリンによりβ細胞へと分化した細胞はアルカリフォスファターゼを産生し、このアルカリフォスファターゼの活性を測定することによりβ細胞への分化促進活性を定量的に測定することが可能である。
ラット尾から常法に従ってゲノムＤＮＡを調製した。このＤＮＡをテンプレートとして、既報のラットインスリンＩＩ遺伝子プロモーターの塩基配列（GenBank:Accession No. J00748）をもとに合成したプライマーＲＩ−１：５'−ＡＧＡＧＴＣＡＡＧＧＡＴＣＣＣＣＣＡＡＣＣＡＣＴ−３'およびプライマーＲＩ−３：５'−ＡＧＣＴＧＧＴＣＡＣＴＴＡＧＧＧＣＴＧＧＧＧ−３'を用いてＰＣＲ法によりインスリンプロモーター領域０．７５ Ｋｂを増幅した。さらに、このＰＣＲ産物をテンプレートとしてプライマーＲＩ−１Ｃｌａ：５'−ＧＡＡＴＣＧＡＴＡＧＡＧＴＣＡＡＧＧＡＴＣＣＣＣＣＡ−３'およびプライマーＲＩ−３Ｘｈｏ：５'−ＧＡＣＴＣＧＡＧＣＴＧＧＴＣＡＣＴＴＡＧＧＧ−３'を用いてＰＣＲを行った。増幅された０．７５ Ｋｂ ＤＮＡ断片を単離し、ｐＴ７Ｂｌｕｅベクター（Novagen 69820-1）に組み込んで得られたプラスミドｐＴＢ１８８１を用いてクローニングされた断片の塩基配列を決定し、ラットインスリンＩＩプロモーターであることを確認した。プラスミドｐＴＢ１８８１をＸｈｏ Ｉ−Ｃｌａ Ｉで切断してラットインスリンプロモーターである０．７３ｋｂ  ＤＮＡ断片を得た。次にヒト胎盤アルカリフォスファターゼ（ＰＬＡＰ）をコードする２．０  ｋｂ ｃＤＮＡ（J. Bergerら、Gene 66, 1(1988)）の発現プラスミドｐＴＢ１３３０をＸｈｏ Ｉ−Ｈｉｎｄ ＩＩＩで切断して得られた２．７ｋｂ ＤＮＡ断片（ＰＬＡＰ  ｃＤＮＡ、ＳＶ４０由来スプライシング部位およびポリＡ付加部位、ｐＢＲ３２２由来ｏｒｉおよびアンピシリン耐性遺伝子を含む）を単離し、前述のラットインシュリンプロモーター領域０．７３ｋｂ Ｘｈｏ Ｉ−Ｃｌａ Ｉ断片をＴ４ ＤＮＡリガーゼ反応によって連結してプラスミドｐＴＢ１８９８を得た。
【００８５】
３−２）ＰＬＡＰ発現ＡＲ４２Ｊ細胞の構築
ＡＲ４２Ｊ細胞にＰＬＡＰ発現プラスミドｐＴＢ１８９８とＴｎ５のｎｅｏr遺伝子を含むプラスミドｐＭＣｎｅｏｐｏｌｙ  Ａ（STRATAGENE）をトランスフェクション試薬ＴｒａｎｓＩＴTM−ＬＴ１（Mirus、PenVera Corporation）を用いて同時に導入した。導入後の細胞は１０％牛胎児血清を加えたＤＭＥＭで２日間培養した後、Ｇ４１８（ゲネチシン、GIBCO BRL）８００μｇ／ｍＬを添加した選択培地にかえて培養を続けた。Ｇ４１８耐性となって生育した細胞を限界希釈法によりクローンを単離した。
各クローンの細胞を２４穴プレートに播き、８０残基型ＢＴＣを２０ｎｇ／ｍＬ添加および無添加で４日間培養し、培養上清を集めて６５℃、３０分間熱処理を行った後、培地中のアルカリフォスファターゼ活性を測定した。８０残基型ベータセルリン添加時にアルカリフォスファターゼ活性の上昇が認められるクローンを選択し、その中の1クローンＡＲ７１−１０４を以下の検討に用いた。
３−３）ＰＬＡＰ発現ＡＲ４２Ｊ細胞を用いたβ細胞分化誘導活性の測定
各種濃度の上記で調製したｈＢＴＣ５０、改変型分子Ａおよび改変型分子Ｂから選ばれる１種と、１０％ウシ胎児血清とを含むダルベッコ改変イーグルＭＥＭ培地に、上記３−２）で構築したＰＬＡＰ発現ＡＲ４２Ｊ細胞を３×１０4細胞／ｍＬになるように懸濁し、１００μＬを９６ウェルプレートに播き、炭酸ガスインキュベーター内（５％  炭酸ガス、９５％空気）において３７℃で５日間培養した。５日後に培養上清をサンプリングし、６５℃で３０分間処理した後、５０μＬをあらかじめ５０μＬの２ＸＳＥＡＰ（２Ｍ ジエタノールアミン、１ｍＭ   ＭｇＣｌ2、２０ｍＭ ホモアルギニン）を添加した９６ウェルマイクロプレートに加えた。３７℃で１０分間保った後、２０ｍｇ／ｍＬのｐ−ニトロフェニルリン酸（シグマ社）を１０μＬ添加し３７℃で１６時間反応を行い、４０５ｎｍの吸光度Ａ405を測定した。
ｈＢＴＣ５０添加時の最大吸光度を１００％とした際の５０％の活性を示すのに必要なタンパク濃度（ＥＤ50）を〔表１６〕に示す。
【表１６】
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【００８６】
参考例１
５０残基型ヒトベータセルリン（ｈＢＴＣ５０）発現プラスミドｐＴＢ１９７６の構築
８０残基型ｈＢＴＣ ｃＤＮＡを組み込んだプラスミドｐＴＢ１５１６（特開平６−８７８９４号公報記載；受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−３８３６，受託番号ＩＦＯ １５２８２）をテンプレートとして、プライマーＢＴ−９５ｈ：５'−ＡＧＣＡＴＡＴＧＣＧＧＡＡＡＧＧＣＣＡＣＴＴＣＴＣＴＡＧＧＴ−３'およびＢＴ−９４ｈ：５'−ＣＴＧＧＡＴＣＣＴＡＧＴＡＡＡＡＣＡＡＧＴＣＡＡＣＴＣＴＣＴ−３'を用いてＰＣＲを行った。ｈＢＴＣのＣ末５０残基型の５'末端に翻訳開始コドンおよびＮｄｅＩサイトを、３'末端に終止コドンおよびＢａｍＨＩサイトをそれぞれ挿入したＰＣＲ産物をＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化し、Ｔ７ファージのΦ１０プロモーターを保持する発現用プラスミドｐＥＴ−３ｃ（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ部位に  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（Ｔａｋａｒａ）を用いて組み込み、ｈＢＴＣ５０の発現プラスミドｐＴＢ１９７６を作製した。組み込んだｃＤＮＡの塩基配列はＡＢＩ社のＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ３７７  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）により確認した。
プラスミドｐＴＢ１９７６の構築の概略を〔図１０〕に示す。
【００８７】
【発明の効果】
本発明のベータセルリンムテインまたはその塩は、ＢＴＣ活性を保持したまま、ＥＧＦ活性が減弱されており、抗原性の問題もないことから、優れた糖尿病治療薬として有用である。
【００８８】
【配列表】
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【００８９】
【図面の簡単な説明】
【図１】７７残基型（Ｃ末端３残基欠失型）ベータセルリン発現プラスミドの構築図を示す。
【図２】７６残基型（Ｃ末端４残基欠失型）ベータセルリン発現プラスミドの構築図を示す。
【図３】実施例７で行われたベータセルリンムテインの電気泳動の結果を示す図を示す。
【図４】実施例８で行われた3Ｈ−チミジンの細胞への取り込み結果を示す図を示す。
【図５】実施例９に記載のβ細胞に分化した細胞に関する蛍光顕微鏡写真図を示す。
【図６】実施例１２で行われたβ細胞分化促進活性の結果を示す図を示す。
【図７】２−７６残基型（Ｎ末端１残基、Ｃ末端４残基欠失型）ベータセルリンの発現プラスミドの構築図を示す。
【図８】２４−７６残基型（Ｎ末端２３残基、Ｃ末端４残基欠失型）ベータセルリンの発現プラスミドの構築図を示す。
【図９】実施例１９で行われた泳動後のゲルの染色結果を示す図を示す。
【図１０】参考例１記載のプラスミドｐＴＢ１９７６の構築の概略を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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