(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の一般式：
【化１】
0004510381.tif 000020
[式中、
ａ）「ｍ」は２から３の範囲の整数であり；
ｂ）Ｒ＊は第四級アンモニウムであり；
ｃ）Ｙは酸素原子またはメチレンであり；及び
ｄ）Ｒ１はメチル基または水素原子である]
を有するチオフェンモノマー［ただし、以下の化合物を除く］。
【化２】
0004510381.tif 000021
【化３】
0004510381.tif 000022
（式中、ｎは４であり、ＲはＣＨ３である）
【化４】
0004510381.tif 000023
（式中、ｎは３であり、ＸはＩである）
【請求項２】
式中、
ａ）「ｍ」＝３であり；
ｂ）Ｒ＊は＋ＮＥｔ３であり；
ｃ）Ｙは酸素原子であり；及び
ｄ）Ｒ１はメチル基である
請求項１に記載のモノマー。
【請求項３】
式中、
ａ）「ｍ」＝２であり；
ｂ）Ｒ＊は下式：
【化５】
0004510381.tif 000024
であり；
ｃ）Ｙは酸素原子であり；及び
ｄ）Ｒ１はメチル基である
請求項１に記載のモノマー。
【請求項４】
式中、
ａ）「ｍ」＝２であり；
ｂ）Ｒ＊は下式：
【化６】
0004510381.tif 000025
であり；
ｃ）Ｙは酸素原子であり；及び
ｄ）Ｒ１はメチル基である
請求項１に記載のモノマー。
【請求項５】
式中、
ａ）「ｍ」＝２であり；
ｂ）Ｒ＊は下式：
【化７】
0004510381.tif 000026
であり；
ｃ）Ｙはメチレン基であり；及び
ｄ）Ｒ１は水素原子である
請求項１に記載のモノマー。
【請求項６】
下式：
【化８】
0004510381.tif 000027
を有する、請求項２に記載のモノマー。
【請求項７】
下式：
【化９】
0004510381.tif 000028
を有する、請求項３に記載のモノマー。
【請求項８】
下式：
【化１０】
0004510381.tif 000029
を有する、請求項４に記載のモノマー。
【請求項９】
下式：
【化１１】
0004510381.tif 000030
を有する、請求項５に記載のモノマー。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれか一項記載のモノマー単位を複数含む多分散ポリマー。
【請求項１１】
請求項２に記載のモノマーの調製方法であって、
ａ）式１：
【化１２】
0004510381.tif 000031
の分子を、式２：
【化１３】
0004510381.tif 000032
の試薬と、ハロゲン化銅の存在下で反応させ、式３：
【化１４】
0004510381.tif 000033
の化合物を含む第一の反応混合物を形成する工程；
ｂ）前記第一の反応混合物から前記式３の化合物を単離する工程；
ｃ）前記式３の化合物をエチルブロミドと反応させ、前記モノマーを含む第二の反応混合物を形成する工程；及び
ｄ）前記第二の反応混合物から前記モノマーを回収する工程；
を含む方法。
【請求項１２】
前記ハロゲン化銅がＣｕＩである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項３に記載のモノマーの調製方法であって、
ａ）式４：
【化１５】
0004510381.tif 000034
の化合物を、１−メチルイミダゾールと反応させ、反応混合物を形成する工程；及び
ｂ）前記反応混合物から前記モノマーを回収する工程；
を含む方法。
【請求項１４】
請求項４に記載のモノマーの調製方法であって、
ａ）式４：
【化１６】
0004510381.tif 000035
の化合物を、１，２−ジメチルイミダゾールと反応させ、反応混合物を形成する工程；及び
ｂ）前記反応混合物から前記モノマーを回収する工程；
を含む方法。
【請求項１５】
請求項５に記載のモノマーの調製方法であって、
ａ）式６：
【化１７】
0004510381.tif 000036
の化合物を、１−メチルイミダゾールと反応させ、反応混合物を形成する工程；及び
ｂ）前記反応混合物から前記モノマーを回収する工程；
を含む方法。
【請求項１６】
請求項１から９のいずれか一項記載のモノマーの重合方法であって、酸化剤の存在下で前記モノマーを反応させ、以下の一般式：
【化１８】
0004510381.tif 000037
[式中、
ａ）「ｍ」は２から３の範囲の整数であり；
ｂ）「ｎ」は３から１００の範囲の整数であり；
ｃ）Ｒ＊は第四級アンモニウムであり；
ｄ）Ｙは酸素原子またはメチレンであり；及び
ｅ）Ｒ１はメチル基または水素原子である]
の多分散ポリマーを形成する工程を含む方法。
【請求項１７】
前記酸化剤がＦｅＣｌ３またはＫ２Ｓ２Ｏ８である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
Ｒ１がメチル基であり、前記ポリマーが部位規則的で水溶性である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記ポリマーが熱安定性であり、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１６から１８のいずれか一項記載の方法から得られるポリマー。
【請求項２１】
請求項１に記載の繰り返しチオフェン部分を含む正に荷電した多分散ポリマーの荷電、蛍光、または発色の変化を検出することによる、核酸の存在を検出するための、請求項１に記載の繰り返しチオフェン部分を含む正に荷電した多分散ポリマーの使用。
【請求項２２】
前記正に荷電したポリマーが、前記核酸に相補的な標的と反応させられる、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
前記正に荷電したポリマーが、前記相補的な標的にイオン的に結合されている、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
前記核酸に相補的な標的が固体の支持体に結合され、次いで前記核酸が前記相補的な標的と反応させられ、前記固体の支持体によってその捕獲が生じて複合体が形成され、次いで前記正に荷電したポリマーが、前記相補的な標的と前記核酸との前記複合体と反応させられる、請求項２１に記載の使用。
【請求項２５】
前記核酸に相補的な標的が固体の支持体に結合され、次いで前記正に荷電したポリマーが前記相補的な標的と反応させられ、前記固体の支持体によってその捕獲が生じて複合体が形成され、次いで前記核酸を、前記相補的な標的と前記正に荷電したポリマーとの前記複合体と反応させられる、請求項２１に記載の使用。
【請求項２６】
前記固体の支持体が、電極、光ファイバー、ガラススライド、及びガラスビーズからなる群から選択される、請求項２４または２５に記載の使用。
【請求項２７】
核酸の精製のための、請求項２４から２６のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、負に荷電したポリマーの検出、特に配列選択的核酸検出のための単純で信頼できる方法に関する。とりわけ本発明は、感染及び各種の疾患の迅速な診断に必須である、配列選択的核酸検出法に関する。
【背景技術】
【０００２】
スルホン酸部分を有するポリチオフェン誘導体と、一つ以上の十分にデザインされたアミン含有分子（静電的相互作用）との複合体は、外的な刺激に対して応答性であることが示されている（ＰＣＴ／ＣＡ９８／０１０８２）。とりわけそれらは、サーモクロミズム、フォトクロミズム、イオノクロミズム、またはバイオクロミズムを生じる、熱、光、または各種の化学的及び生化学的分子に曝された場合、顕著な構造変化を受けることが示されている。これらのスルホン酸含有ポリチオフェン誘導体は正に荷電しておらず、かくして負に荷電したポリマーに対して特定のアフィニティーを有さない。
【０００３】
配列選択的核酸検出のための方法のサーチは、重要な研究分野に進歩しており、化学、物理学、生化学等のような各種の学問分野出身の研究者の注意を実質的に集めている。その結果、ある興味深いＤＮＡハイブリダイゼーションセンサーが、最近提案されている１−５。
【０００４】
しかしながら、これらの新たに開発されたアプローチのほとんどは、分析物に蛍光タグまたは電気活性タグを結合することによって検出を実施する。
【０００５】
検出の前に、核酸の官能化を必要としないアッセイは、電気化学的または光学的トランスデューサーとして、接合した場応答性ポリマー（ポリピロール、ポリチオフェン等）の使用を報告している６，７，２３，２４。実際、分析物のラベリングを使用することなく、ハイブリダイゼーション現象を電気的または光学的シグナルに変換する、いくつかのオリゴヌクレオチド官能化接合的ポリマーの能力が示されている８−１０。この検出メカニズムは、相補的オリゴヌクレオチドの捕獲を通じた電気的及び／または光学的特性の変更に基づいている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
かくして、核酸の迅速で特異的な同定のための、より単純で、より高感度で、より信頼できる方法に対する必要性が存在する。これらの核酸は、感染及び疾患の診断のために使用できるであろう。実際、検出の前に核酸の官能化（核酸の化学的操作）、または複雑な反応混合物を必要としないアッセイは、以下の特徴を有するであろう：それは、現在利用可能なアッセイより使用が単純であり、高い度合いの実効性を有するであろう。そのようなアッセイは非常に有益であり、それ故所望されるであろう。
【０００７】
本発明は、これら及び他の必要性に適合することを探求している。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
一般的な意味で、本発明は、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションを、明らかに判断可能な光学的（発色的、蛍光的、または発光的）または電気的シグナルに容易に変換できる、新規なカチオン性で水溶性のポリチオフェン誘導体に関する。これらのポリマーは、単一のヌクレオチドのみによって異なる核酸の、特異的ハイブリダイゼーションと非特異的ハイブリダイゼーションの間を識別できる。
【０００９】
特に本発明は、以下の一般式
【化１】
0004510381.tif 000002
[式中、「ｍ」は２から３の範囲の整数であり；Ｒ＊は第四級アンモニウムであり；Ｙは酸素原子またはメチレンであり；及びＲ１はメチル基または水素原子である]
を有するチオフェンモノマーからなるカチオン性で水溶性のポリマーの合成及び使用に関する。
【００１０】
本発明はさらに、以下の工程：
ａ）負に荷電したポリマーに相補的な標的を、チオフェンポリマーと接触させ、二本鎖を形成する工程；
ｂ）前記二本鎖を、負に荷電したポリマーと接触させる工程；及び
ｃ）負に荷電したポリマーの存在の指標として、荷電、蛍光、または発色の変化を検出する工程；
を含む、負に荷電したポリマーの存在の検出方法を含む。
【００１１】
前述の方法のための負に荷電したポリマーは、酸性タンパク質、グリコサミノグリカン、ヒアルロナン、ヘパリン、クロマトグラフィー基質、培養基質、及び核酸からなる群から選択されて良い。
【００１２】
本発明はさらに、以下の工程：
ａ）第一の核酸に相補的な標的を、チオフェンポリマーと接触させ、二本鎖を形成する工程；
ｂ）前記二本鎖を、第一の核酸と接触させ、特異的なハイブリダイゼーションを生成する工程；
ｃ）前記二本鎖を、第二の核酸と接触させ、非特異的なハイブリダイゼーションを生成する工程；及び
ｄ）荷電、蛍光、または発色の変化を検出する工程；
を含む、少なくとも一つのヌクレオチドによって第一の核酸とは異なる第二の核酸から、第一の核酸を識別する方法を含む。
【００１３】
最後に本発明は、負に荷電したポリマーの存在を検出するための、及び負に荷電したポリマーを精製するための、繰り返しチオフェン部分を含む正に荷電したポリマーの使用のような、数多くの特異的応用を企図する。
【００１４】
さらなる範囲及び応用可能性は、以下に記載される詳細な説明から明らかとなろう。しかしながら、本発明の精神及び範囲内で各種の変化及び変更が当業者に明らかであるため、この詳細な記載は、本発明の好ましい実施態様を示す一方で、説明の目的でのみ示されていると解されるべきである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の他の目的及び付随する特徴は、説明の目的のための記載された本発明の以下の詳細な説明を参考にして容易に認識され、同時により良く理解されるであろう。
【００１６】
広義では、本発明は、負に荷電したポリマーに結合した場合に、明らかに検出可能な光学的（発色的、蛍光的、または発光的）、または電気的シグナルを生産する、新規なカチオン性で水溶性のポリチオフェン誘導体を提供する。
【００１７】
本発明は、単一のヌクレオチドによってのみ異なる核酸の特異的ハイブリダイゼーション及び非特異的ハイブリダイゼーションの間を識別可能なポリマーを提供する。
【００１８】
本発明は、改良された研究ツール、特に真核生物、並びに細菌及び古細菌のような原核生物由来の核酸を検出するための手段を提供する。
【００１９】
本発明はまた、新規な核酸検出法、とりわけ本発明のポリチオフェン誘導体の使用に基づく新規な検出装置の開発を提供する。
【００２０】
本発明はさらに、改良された臨床診断、つまり感染試薬の検出、遺伝学的疾患の診断、及び薬理ゲノミクス分野での使用に有用なツールを提供する。
【００２１】
本発明はさらに、改良された法医学的（法医学上の）診断、とりわけヒト及び動物の認知、「法医学的」ツール、及び他の遺伝学的試験ツールを提供する。
【００２２】
本発明はまた、改良された植物の同定を提供する。
【００２３】
本発明はまた、環境上及び産業上のスクリーニング、とりわけ遺伝学的に変性された生物のためのスクリーニング、病原性試薬の検出、栄養性のトレース能力、産業上興味ある生物の同定（例えば栄養性、製薬学的または化学的発酵、及び土壌の混在）を提供する。
【００２４】
本発明はまた、天然または合成起源の核酸及びグリコサミノグリカンのような負に荷電したポリマーに対するアフィニティーを有し、これらのポリマーの精製を可能にするポリチオフェンを提供する。例えば、ポリチオフェンが固体の支持体に結合している場合、核酸はアフィニティー及び／またはイオン交換クロマトグラフィーによって精製できる。
【００２５】
本発明はまた、広範囲の応用が可能である、熱安定性でオートクレーブ可能なポリチオフェンを提供する。
【００２６】
本発明はさらに、酸性タンパク質（キネシン）、グリコサミノグリカン（ヒアルロナン、ヘパリン）及びいずれかの天然または合成の負のポリマーのような負に荷電したポリマーを、ポリチオフェンと結合することによって検出またはブロックできる方法及びツールを提供する。
【００２７】
有利には、この新規なアプローチは、迅速で、特異的で、高感度で、非常に多用途で、さらに単純である。それは、一本鎖または二本鎖の負に荷電したオリゴヌクレオチドまたは核酸断片と、カチオン性で電気的に活性で光学活性なポリ（３−アルコキシ−４−メチルチオフェン）誘導体との間の各種の静電的相互作用及び立体的な構造変化に基づく。それは、ゲノム分析及び分子診断のための単一試薬のアッセイ法を可能にする。さらに、前述の検出法はまた、核酸の溶液、ゲル電気泳動によって分離された核酸、ガラススライドまたはプレート、シリコーンチップ、または他のポリマーのような固体の支持体に固定化された核酸について使用できる。
【００２８】
合成
水溶性で、カチオン性で、電気的に活性で、光学活性なポリ（３−アルコキシ−４−メチルチオフェン）の調製のための好ましい合成スキームが以下に示される。
【００２９】
モノマー１の合成は、３−ブロモ−４−メチルチオフェン(Aldrich Co.)から開始する二工程法で実施される（スキーム１参照）。第一の工程は、El Kassmi等１１によって報告された、ＣｕＩによって触媒されるチオフェン環での求核置換反応である。第二の工程は、アセトニトリル中の第三級アミンと１−ブロモエタンの間の第四級化反応を含む１２。
【化２】
0004510381.tif 000003
【００３０】
同様に、モノマー２は、３−（２−ブロモエトキシ）−４−メチルチオフェン（化合物４）と１−メチルイミダゾール(Aldrich Co.)から調製される（スキーム２参照）。化合物４は、Leclerc等１３によって開発された方法に従って調製される。１−メチルイミダゾールと化合物４との間の第四級化反応は、所望のモノマーイミダゾリニウム塩２を提供する１４。
【化３】
0004510381.tif 000004
【００３１】
同様に、モノマー３の合成は、３−チオフェンエタノール（化合物５）のその対応するメシラート保護化誘導体（化合物６）への変換を含む。１−メチルイミダゾールと化合物６との間の第四級化反応は、所望のモノマーイミダゾリウム塩３を提供する。
【化４】
0004510381.tif 000005
【００３２】
モノマーイミダゾリウム塩４の合成は、１，２−ジメチルイミダゾールを使用する化合物４の第四級化反応を含む。
【化５】
0004510381.tif 000006
【００３３】
カチオン性チオフェンモノマーの調製を反映するより一般的な方法はスキーム５に表されており、ここで「ｍ」は２または３に等しい整数であり；「ｙ」は酸素原子またはメチレン基であり；及びＲ１は水素原子またはメチル基である。
【化６】
0004510381.tif 000007
【００３４】
Ｒ＊がＥｔ３Ｎである場合、Ｙは酸素原子であり、Ｒ１はメチル基であり、「ｍ」は３に等しい。Ｒ＊が１−メチルイミダゾールである場合、Ｙは酸素原子であり、Ｒ１はメチル基であり、「ｍ」は２に等しい。Ｒ＊が１−メチルイミダゾールである場合、Ｙはメチレン基であり、Ｒ１は水素原子であり、「ｍ」は２に等しい。Ｒ＊が、１，２−ジメチルイミダゾールである場合、Ｙは酸素原子であり、Ｒ１はメチル基であり、「ｍ」は２に等しい。
【００３５】
イミダゾールの固有の化学的及び物理的特性は、電気化学的検出に好ましい広い電気化学的ウインドウを提供する。
【００３６】
全てのポリマー、とりわけカチオン性で、水溶性で、電気的に活性なポリマー１，２，３及び４（スキーム６）を、クロロホルム中の酸化剤としてＦｅＣｌ３またはＫ２Ｓ２Ｏ８を使用して、対応するモノマーの酸化化学的重合によって合成した。この重合法は、約５ｋＤａの平均分子量と、約３の多分散度を有する、十分に定義された部位規則的な３−アルコキシ−４−メチルチオフェンポリマー（１，２及び４）、並びに部位不規則的な３−アルキルチオフェンポリマー（３）を生成する１６。「ｎ」は３から約１００まで変化できることに注意。生成したポリマー（酸化剤としてＦｅＣｌ３を使用する）は、ＦｅＣｌ４−、Ｃｌ−及びＢｒ−のようなアニオンの混合物を含む。一つのみの特異的カウンターアニオン（例えばＣｌ−、Ｂｒ−、Ｉ−、ＣＨ３ＳＯ３−等のような親水性カウンターアニオン、またはＢＦ４−、ＣＦ３ＳＯ３−、ＰＦ６−等のような疎水性カウンターアニオン）を有するカチオン性ポリマーを生産するために、透析または沈降によって、アニオン性交換反応を実施する。予測されるように、全ての生成したポリマーは、親水性アニオンの存在下で水溶液に可溶性であることが見出された。
【化７】
0004510381.tif 000008
【００３７】
いずれかの水溶性カチオン性高分子電解質として、本発明のポリチオフェン誘導体は、負に荷電したオリゴマー及びポリマーと強力な複合体を形成できる１７。この複合体化は、特異的な光学的特性を有する複合体の形成を引き起こす。例えば５５℃で、カチオン性ポリマー２の水溶液（０．１ＭのＮａＣｌまたは１０ｍＭのトリスバッファー／０．１ＭのＮａＣｌ）は黄色である（λｍａｘ＝３９７ｎｍ）。比較的短い波長でのこの吸収最大値は、ポリチオフェン誘導体のランダムコイル構造に関連している６。１当量の（モノマー単位ベースで）所定のオリゴヌクレオチド（２０マー）の添加の後、二本鎖と称されるものの形成のため混合物を赤色となる（λｍａｘ＝５２７ｎｍ）。１当量の相補的オリゴヌクレオチドの存在下で混合した５分後で、おそらく新たな複合体（三本鎖）の形成のため、溶液は黄色となる（λｍａｘ＝５２１ｎｍ）（図１及び５）。
【００３８】
両タイプの高分子電解質のこれらの構造的遷移の模式的記載が、図６に示されている。
【００３９】
サーモクロミズム性、ソルバトクロミズム性、及びアフィニティークロミズム性の部位規則的ポリ（３−アルコキシ−４−メチルチオフェン）に関する以前の研究に基づいて６、これらの発色効果は、おそらく、三本鎖で観察されるもの（より接合的ではなく、非平面構造）と比較した二本鎖の接合したポリマー（より接合的であり、平面構造）の各種の立体構造のため、及び、一本鎖オリゴヌクレオチド（核酸）（５×１０４Ｍ−１）について観察されるものより、二本鎖オリゴヌクレオチド（核酸）（１×１０５Ｍ−１）についての接合されたポリマーのより強力なアフィニティーのために生成する。
【００４０】
コントロール実験では、キャプチャープローブのものと同一のオリゴヌクレオチドの溶液への添加は、発色の変化を引き起こさないことが示された（図２）。
【００４１】
これらの複合体化の特異性を確認するために、１または２のヌクレオチドのみによって異なる二つのペアの相補的オリゴヌクレオチド（２０マー）を合成し（表１）、注意深く調べた。わずかであるがはっきりとしたＵＶ可視吸収スペクトルの変化が、２のミスマッチを有するオリゴヌクレオチド標的の場合で観察される。１のみのミスマッチでさえ、完全なハイブリダイゼーションと不完全なハイブリダイゼーションの間を識別することが可能である（図１３）。この場合、５５℃での混合の３０−６０分後に、同様な黄色の水溶液が観察されるため、比色測定の差異は、複合体の異なる速度論に主に基づく。しかしながら、室温に溶液を配置することによって、混合の５分後にハイブリダイゼーション反応を停止することが可能である。これらの方法に引き続き、安定な黄色及びオレンジ色の溶液が得られる（曲線ｃ及びｅ）（図１３）。この比色測定法の検出限界は、１００μＬの全容量で約１×１０１３分子のオリゴヌクレオチド（２０マー）である。
【００４２】
非常に類似する結果が、ポリマー１（図１７）とポリマー４（図１８）、及び各種のオリゴヌクレオチドで得られている。図２０は、０から５の範囲のミスマッチを有する標的オリゴヌクレオチドを使用した場合の、ポリマー２のＵＶ可視吸収スペクトルを示す。図２１は、各種の位置での常に２のミスマッチを有する標的オリゴヌクレオチドを使用する、ポリマー２のＵＶ吸収の結果を説明する。これらの結果は、前記ポリマーが、ミスマッチしたヌクレオチド塩基の性質とは独立に、且つミスマッチの位置または長さとは独立に、完全にマッチしたハイブリッドとミスマッチしたハイブリッドの間を識別できることを示す。さらに、複数のミスマッチから単一のミスマッチを識別することも可能である。
【００４３】
【表１】
0004510381.tif 000009
【００４４】
ＤＮＡの特定の配列領域の濃度は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用することによって増幅でき、本発明の比色定量法は、これらのＰＣＲ産物に対して拡張できる。実際、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の導入は、少量のＤＮＡを検出する問題を解決しており、本発明は、ＰＣＲ産物の同定において使用できる。４３０−５３０ｎｍの吸収範囲における分光学的結果は、ポリマー２／Ｘ１二本鎖によって、２のみのヌクレオチドで異なるCandida albicansとCandida dubliniensisアンプリコンの特異的光学的検出を説明している。そのような検出は、１００μＬのＰＣＲ容量で通常生成される濃度（約３×１０１２コピー）で、ＰＣＲ産物から直接４５分で実施できた。ＰＣＲに関する実験的な詳細、及びCandidaの同定のための標的配列の選択は、共に継続する特許出願（ＰＣＴ／ＣＡ００／０１１５０）に提供されている。
【００４５】
さらに、図１９に示されているように、円二色性（ＣＤ）測定は、ポリチオフェン骨格の右旋性ヘリックス配向の特徴である、三本鎖における４２０ｎｍで集中する二シグナル性の(bisignate)ＣＤスペクトルである、ランダムコイル状態でのポリマー３についての光学活性を明らかにする。そのような右旋性ヘリックス構造は、ＤＮＡの負に荷電したリン酸骨格に対するポリマーの結合に適合的である。ＵＶまたはＣＤ測定により熱的安定性の研究は、二本鎖と三本鎖の間の異なる熱的安定性を示し、この特性は、より緊縮な洗浄条件について極端に有用であろう。
【００４６】
オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションの蛍光測定検出はまた、ランダムコイル状態（単離した状態）で、または凝集した状態で、正に荷電したポリ（３−アルコキシ−４−メチルチオフェン）の蛍光量子収率の差異に基づくことが可能である１６。例えば５５℃で、ポリマー２の黄色の出現は蛍光的である（０．０３の量子収率）が、１当量の負に荷電したオリゴヌクレオチドの添加の際に、放射スペクトルの強度は強力に減少する（クエンチする）。完全なハイブリダイゼーションの場合では、ポリマー状三本鎖は、より強力な放射を与える（図７）。同じオリゴヌクレオチドの添加の際に、ハイブリダイゼーションは生じず、溶液は蛍光強度の変化を示さない（図８）。励起源としてレーザーを使用する場合、非常に低い検出限界が得られる。２００μＬの容量で、３×１０６分子程度の相補的オリゴヌクレオチド（２０マー）の存在を検出可能であり、これは２×１０−１４Ｍの濃度に対応する。さらに、蛍光接合ポリマーに対するオリゴヌクレオチドの共有結合によって、または高い強度の青色ダイオード（励起源）及び非分散性の干渉フィルターベースのシステムに基づく最適化された蛍光検出スキームを使用することによって、より高感度でより特異的な検出能力が達成される。
【００４７】
ポリマー１及び２の電気化学的特性は、図９に示されるように、水溶液中のＤＮＡハイブリダイゼーションの検出のために使用できる８，１０。レーザー沈着法によるレーザーを使用して２５，２６、第一の工程は、アンモニウム官能化インジウムスズオキシド（ＩＴＯ）表面１８，２７に対する一本鎖オリゴヌクレオチドＸ１からなるキャプチャープローブの結合を必要とした。純水ですすいだ後、変性電極と称されるものを、相補的オリゴヌクレオチドＹ１の存在下で浸液してハイブリダイズさせた。生成した電極を、正に荷電したポリマー１または２（モノマー単位で１０−４Ｍ）の水溶液で発現させ、それは表面に存在するＤＮＡの量の関数であるシグナルを提供する。コントロール実験として、オリゴヌクレオチドＸ１の水溶液をＸ１変性ＩＴＯ電極に加え、次いでポリマー１または２の水溶液に移した。この方法では、これらのポリマーは、サンプル中に存在するオリゴヌクレオチドに対する「マストランスデューサー」として機能する。
【００４８】
ＤＮＡハイブリダイゼーションの検出はさらに、各種のカチオン性ポリ（３−アルコキシ−４−メチルチオフェン）（ポリマー１及び２）を使用する以下の二つの実施例によって説明される、かくして得られた結果は、図１０及び１１に説明されている。
【００４９】
両者の場合で、最大のアノード電流は、ブランクコントロールと比較して、完全なハイブリダイゼーションの場合でより重要である。さらに、より高い電位（約４０−５０ｍＶ）へのシフトが、特異的なハイブリダイゼーションが生じる場合で観察される（ポリマー２について５２ｍＶと比較して、ポリマー４について３８ｍＶ）。より高い酸化電流は、二本鎖オリゴヌクレオチドに対するポリマーのより強力なアフィニティーにより説明できる一方で、酸化電位のポジティブなシフトは、特異的ハイブリダイゼーションの場合でより接合的ではない構造の形成によって説明される。これは、以前の光学的測定と一致する。
【００５０】
より小さい電極[Ｓ（表面）＝１０ｍｍ２]を使用するアッセイは、２×１０１１分子のオリゴヌクレオチド（２０マー）の検出を可能にした。この非常に単純な電気化学的方法体系は、オリゴヌクレオチド官能化接合物ポリマーを使用する電気化学的方法で得られる最高の結果１０よりも、二桁のオーダーまですでにより高感度である。明らかに、電極のサイズを減少することによって、且つ標的分子のサイズを増大することによって、さらにより小さい検出限界が得られるはずである。
【００５１】
検出の特異性をさらに増大するために、オリゴヌクレオチドプローブを、ポリチオフェン誘導体に共有結合できる。
【００５２】
ＤＮＡ配列の検出はまた、スキーム７に以下に示されるように電気化学的に実施できる。
【化８】
0004510381.tif 000010
【００５３】
ＤＮＡプローブは、伝導性表面に共有結合で固定化できる（図１２）。これは、表面に対して大量のＤＮＡプローブの結合を可能にし、小さい表面についての特異性と検出限界を改良する。
【００５４】
第一の工程は、一本鎖ＤＮＡプローブの共有結合による、伝導性基体（ＩＴＯ、ＳｎＯ２、金、ドープ処理したケイ素、または他の伝導性基体）の変性を含む。相補的ＤＮＡ鎖をハイブリダイズし、ポリマーをハイブリダイズしたプローブに捕獲させる。観察された電気化学的シグナルは、ハイブリダイズしたプローブ（ｄｓ−ＤＮＡ）と、ハイブリダイズしていないプローブ（ｓｓ−ＤＮＡ）で異なる。伝導性表面にＤＮＡプローブを結合するために、リンカーを使用できる。リンカーの末端基は、一方の末端が伝導性基体と容易に反応して共有結合を形成する一方で、他方の末端は、反応性官能基とＤＮＡとの間でスペサー（炭素２４）の存在下または不存在下で、「末端変性化」（ＳＨ、ＮＨ２、ＣＯＯＨ等）ＤＮＡプローブと容易に反応するようになっている１９，２０，２１。伝導性基体表面と反応するリンカーの末端基は、シラン誘導体、例えばアルコキシシラン、またはクロロシランであることができる。リンカーの他方の末端基は、アルデヒド、カルボン酸、第一級アミン、スクシンイミドエステル部分、または「末端変性化」ＤＮＡ、つまりカップリング剤の補助の存在下または不存在下で、共有結合の形成を引き起こす特異的末端基を有するＤＮＡプローブと反応可能な他の官能基からなることができる。
【００５５】
チオール基によるオリゴヌクレオチドの固定化は、その３’または５’末端基を通じて実施できる。従って、ガラス表面へのＤＮＡの固定化のための文献の方法２８，２９，３０に従って、ＩＴＯ表面にＤＮＡを固定化した。
【００５６】
さらに、金または他の金属及び金属酸化物のような各種の他の表面に対して「末端変性化」ＤＮＡプローブを結合することも可能である２２。ビーズ、ガラススライド、光学的繊維、またはいずれかの他の適切な非金属製固体支持体のような非金属製表面もまた可能である。金表面へのＤＮＡの固定化は、既知の印刷された方法に従って達成され、結合したプローブの密度は、濃度及び反応時間に依存して変化できる３１，３２。ハイブリダイゼーション効率は、相補的鎖を添加する前に基体を加熱することによって最適化できる３１，３３。ポリマー沈着は、ポリマー溶液に垂直に基体を浸液することによって、及びポリマー溶液の塩濃度と温度を変化させることによって最適化できる。洗浄はさらに、ハイブリダイズしていないプローブとのポリマーの寄与を制限するために最適化できる。
【００５７】
三本鎖について観察されるシグナルは、おそらくハイブリダイゼーションが生じる場合のより高い電位に向かう小さなシフトで、二本鎖について観察されるものよりも強力であるはずである。ＤＮＡの量は三本鎖の場合でより高く、それはより高量の負の荷電の存在を意味する。三本鎖の場合では、結合している２当量のポリマー（正の荷電）が存在すると予測される。さらに、１当量のみのポリマーがＤＮＡに結合している場合では、高い塩濃度または上昇した温度でより不安定であるため、ハイブリダイズしていないプローブ（ｓｓ−ＤＮＡ）上のポリマーは、ハイブリダイズしたプローブ（ｄｓ−ＤＮＡ）上のＤＮＡに結合したポリマーと比較してより容易に洗浄される。二本鎖由来の全てのポリマーを実質的に洗浄する一方で、三本鎖由来のものを完全なままにする洗浄によって、三本鎖から直接由来するシグナル（ハイブリダイズしたプローブ＋ポリマー）が保証される。最後に、ミスマッチを有する標的は、異なるシグナルを与え、不完全なハイブリダイゼーションのためおそらくより低い電流を与えるであろう。
【００５８】
ＤＮＡハイブリダイゼーションの電気化学的検出は、図１４−１６２説明されるポリマー２及びポリマー３を使用することによって、さらに説明される。
【実施例】
【００５９】
実施例１：チオフェン上での芳香族求核置換の一般的方法；化合物３の合成
水酸化ナトリウム（０．４ｇ、１５ｍｍｏｌ）を、５０ｍＬのＤＭＥ中のＮ，Ｎ−ジエチルプロパンアミン（２．０ｇ；１５．２ｍｍｏｌ）の溶液に、窒素下で０から１０℃の間で加え、生成した混合物を環境温度で２０分間攪拌した。２０ｍＬのＤＭＡ（２０ｍＬ）に溶解した３−ブロモ−４−メチルチオフェン（２．０ｇ、１１．３ｍｍｏｌ）と、ＣｕＩ（１．０７ｇ、５．６５ｍｍｏｌ）を反応混合物に加えた。その後反応混合物を９５℃で一晩窒素下で攪拌し、塩化メチレンで希釈し、濾過した。有機相を水で３回洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、蒸発させた。粗産物を、溶出液としてＣＨ２Ｃｌ２を使用し、その後ＭｅＯＨを使用して、シリカゲルでのクロマトグラフィーによって精製した。
【数１】
0004510381.tif 000011
【００６０】
実施例２：第四級化反応の一般的方法：モノマー１の合成
１−ブロモエタン（６ｍＬ、８０．４ｍｍｏｌ）を、６０ｍＬのアセトニトリル中の化合物３（０．４ｇ、１．８ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。反応混合物を窒素下で７０℃で３日間攪拌した。アセトニトリルの蒸発後、粗産物を無色のパウダーとして酢酸エチルから結晶化した。
【数２】
0004510381.tif 000012
【００６１】
実施例３：モノマー２の合成
１−メチル−イミダゾール（１．０ｍＬ、１２．３ｍｍｏｌ）を、ＣＨ３ＣＮ（３５ｍＬ）中に溶解した産物４（０．５４ｇ、２．４６ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。精製した反応混合物を、７０℃で２日間攪拌した。溶媒の蒸発後、粗産物を暖かい酢酸エチルで二度、室温でジエチルエーテルで二度洗浄し、純白の固体の化合物としてモノマー２を得た。
【数３】
0004510381.tif 000013
【００６２】
実施例４：モノマー３の合成
メタンスルホニルクロリド（２．４ｍＬ；３１．２ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン（５０ｍＬ）中の３−チオフェンエタノール（２．０ｇ；１５．６ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（４．３ｍＬ；３１．２ｍｍｏｌ）の溶液に滴下した。反応混合物を室温で２時間攪拌した。有機相をＮａＨＣＯ３溶液で洗浄し、引き続き水で数回洗浄し、最後にＭｇＳＯ４で乾燥し、濃縮した。粗産物を、溶出液としてＣＨ２Ｃｌ２／ヘキサン（１／１）を使用するシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、化合物６を得た（５９％）：
【数４】
0004510381.tif 000014
【００６３】
１−メチルイミダゾール（０．４ｇ；４．８５ｍｍｏｌ）を、トルエン（２０ｍＬ）中の化合物６（０．２ｇ；０．９７ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。反応混合物を９４℃で２日間攪拌した。溶媒の蒸発に引き続き、粗産物を暖かい酢酸エチルで洗浄し、液体としてモノマー３を得た。
【数５】
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【００６４】
実施例５：モノマー４の合成
実施例３に記載の方法に引き続き、第四級化反応を実施した。
【数６】
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【００６５】
実施例６：化学重合の一般的方法：ポリマー１の合成
窒素下のクロロホルム（２３ｍＬ）中の三塩化鉄（０．９４ｇ、５．８ｍｍｏｌ）の溶液に対して、クロロホルム（１５ｍＬ）中のモノマー１（０．４８７ｇ、１．４ｍｍｏｌ）の溶液を滴下した。混合物を室温で２日間攪拌した。反応混合物を蒸発させて乾燥し、粗産物をメタノールで迅速に洗浄し、過剰なアセトンに溶解し、過剰な塩化テトラブチルアンモニウムまたは臭化テトラブチルアンモニウムの添加により沈降した。暗赤色のポリマーをメタノール中に溶解し、数滴のヒドラジンの添加により脱ドープ処理した。最終溶液を蒸発させた。生成ポリマーを、アセトン中の塩化テトラブチルアンモニウムまたは臭化テトラブチルアンモニウムの飽和溶液で数回洗浄し、６時間に亘りアセトンでＳｏｘｌｅｔ抽出し、次いで減圧下で乾燥し、ポリマー１を得た（０．３２ｇ、６６％）。
【００６６】
実施例７：光学的検出の一般的方法
ｉ）合成オリゴヌクレオチド
クォーツＵＶキュベットにおいて、１００μＬ（７．４７×１０−８の正の荷電の繰り返し単位（ＲＵ））のポリマー２の溶液を、０．１ＭのＮａＣｌまたは１０Ｍｍのトリスバッファープラス０．１ＭのＮａＣｌ（ｐＨ＝８）のそれぞれを含む水溶液（３ｍＬ）に加えた。混合物を５分間５５℃に加熱し、黄色の出現物を得た。次いで１２μＬ（７．４７×１０−８の負の荷電のＲＵ）のオリゴヌクレオチド溶液（キャプチャープローブ）を加え、生成した赤色の溶液をさらに５分間５５℃で維持した。適切なオリゴヌクレオチド標的を、５５℃で５分間かけて溶液に加えた。最終の黄色はポジティブの結果を示し、完全なハイブリダイゼーションが生じたことを意味する。他方で、赤色または赤ピンク色は、それぞれ特異的なハイブリダイゼーションが存在しないこと、または部分的なハイブリダイゼーション（二つのミスマッチ）を示す（それぞれ図１−３）。
【００６７】
ｉｉ）ＰＣＲ産物
ＰＣＲ産物から得たアンプリコン（二本鎖１４９塩基対）を、Qiagen社により市販されている<QIAquick>によって事前精製した。Ｈ２Ｏ（９０μＬ）を遠心チューブに加え、次いで６．７μＬ（５．０３×１０−９ｍｏｌの正の荷電）のポリマー２の溶液を加え、次いでオリゴヌクレオチドキャプチャープローブＹ１（２μＬ；５．０３×１０−９ｍｏｌの負の荷電）を加え、最後に１ＭのＮａＣｌ（２０μＬ）を加えた。生成した混合物を５０℃で１０分間加熱した。精製したＰＣＲ産物を新たに変性し、冷水で冷却し、次いで前述の溶液に加えた。ハイブリダイゼーション反応を５０℃で３５分間維持し、発色の変化を視覚的またはＵＶ測定によって観察した（図４）。
【００６８】
実施例８：蛍光検出の一般的方法
蛍光測定計を使用することを除いて、光学的検出について記載されたものと同様の方法を使用した。「二本鎖」（正に荷電したポリマーとオリゴヌクレオチドキャプチャープローブの間の会合）の蛍光強度は、凝集形態のポリマーの蛍光クエンチング特性のため、弱いまたは有意ではなかった（実質的にゼロ）。完全なハイブリダイゼーションが生じた場合、蛍光シグナルはより有意となる（図７）。
【００６９】
実施例９：電気化学的検出の一般的方法
ハイブリダイゼーションの電気化学的試験を、コントロールブランクと関連させて実施した。６０μＬ（１．４４×１０−８ｍｏｌの負の荷電）のキャプチャーオリゴヌクレオチドＹ１を、環境温度で５分間アミノ化ＩＴＯ電極（Ｓ＝５０ｍｍ２）に沈着させた。水で洗浄後、６０μＬ（１．４４×１０−９ｍｏｌの負の荷電）の標的オリゴヌクレオチドＸ１を加え、ハイブリダイゼーションを５５℃で２０分かけて実施した。次いで電極を１０分かけて室温に冷却し、０．３ＭのＮａＣｌ、０．０３ＭのＮａＯＡｃ、及び０．１％のＳＤＳ（ｐＨ７）及び水で二度洗浄した。１００μＬ（１×１０−８ｍｏｌの正の荷電）のポリマー１または２の溶液を５分間変性電極に広げ、次いでＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ（１／４）及び水で洗浄した。サイクル電流電圧測定を、水性０．１ＭのＮａＣｌ溶液で実施した（図１０及び１１）。
【００７０】
実施例１０：共有プローブで置換された電極の調製の一般的方法
ｉ）ＩＴＯ電極に対するＤＮＡプローブの共有結合（ポリマー２）
ＩＴＯスライドを、ヘキサン（１０分）、メタノール（１０分）、及び超純水（１０分）でソニケートし、次いで４０℃で３０分の期間、王水溶液（Ｈ２Ｏ２／Ｈ２Ｏ／ＮＨ４ＯＨ，１／５／１）で処理した。生成したスライドを水で迅速に洗浄し、次いで水中及びアセトン中でソニケートし、空気、窒素またはアルゴンで乾燥し、１１０℃で２から１０分加熱した。これに引き続き、スライドを３時間不活性雰囲気下で、５％メルカプトプロピルトリメトキシシランを含む酸性化エタノール溶液（９５％エタノール中の１ｍＭ酢酸）に浸液し、引き続き新鮮なエタノール（９５％）及び超純粋滅菌水でソニケートした。最後にスライドを１１０℃で少なくとも１時間加熱し、室温に冷却し、その後ＤＮＡで変性した。
【００７１】
ＤＮＡの沈着、ハイブリダイゼーション、及びポリマー沈着に引き続き、他に記載がなければ軌道性シェイカーを使用して洗浄を実施する。それぞれ約１ｃｍの直径の円を形成するスポットである、各ＩＴＯスライドに沈着したクエン酸ナトリウムバッファー（３０ｍＭ、ｐＨ＝４、５０μＬ）中のＳＨ−炭素２４−ＤＮＡの溶液を使用して、ＤＮＡ結合を実施する。沈着反応を、２０−２４時間の期間に亘り加湿チェンバーで実施する。沈着していないＤＮＡを流し、スライドを５×ＳＳＣ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、その後１×ＳＳＣ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０及び０．１ＭのＮａＣｌで洗浄する。
【００７２】
ｉｉ）ハイブリダイゼーション（ＩＴＯ、ポリマー２）
５０μＬのＲＣ−ＤＮＡ（Ｙ１）またはプローブＸ１（ブランク試験）（２×ＳＳＣ中に２５μＭ）を、ＤＮＡスポットに沈着する。次いでスライドを加湿環境で５５℃で約３時間加熱し、次いで１５分間室温に冷却する。非反応ＤＮＡを流し、スライドを２×ＳＳＣ、ＮａＣｌ（０．１Ｍ）で洗浄し、１×ＳＳＣ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、ＮａＣｌ（０．１Ｍ）で洗浄する。
【００７３】
ｉｉｉ）ポリマー沈着（ＩＴＯ、ポリマー２）
ポリマー２を電極に沈着する。スライドを室温で５分間ポリマー２の溶液（０．０１ＭのＮａＣｌ中に１０−４Ｍの２ｍＬ）に垂直に浸液する。次いでスライドを２ｍＬのＮａＣｌ溶液（０．０１Ｍ）に浸し、次いで２ｍＬのＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ（１／４）溶液に浸し、最後に２ｍＬのＮａＣｌ溶液（０．０１Ｍ）に浸す。
【００７４】
ｉｖ）ハイブリダイゼーション（ＩＴＯ、ポリマー３）
３０μＬのＹ１（２．５μＭ／０．１ＭのＮａＣｌ）を、ＩＴＯ電極の表面に配置されたハイブリダイゼーションチェンバーに挿入する。スライドを加湿環境で５５℃で約２時間加熱し、次いで室温に冷却する。ハイブリダイゼーションチェンバーを除去し、スライドを０．１ＭのＮａＣｌ溶液で洗浄し、最後にアルゴンで乾燥する。
【００７５】
ｖ）ポリマー沈着（ＩＴＯ、ポリマー３）
ポリマー３を電極に沈着する。３０μＬのポリマー３の水溶液（１０−４Ｍ）を、ＩＴＯ電極の表面に配置されたハイブリダイゼーションチェンバーに挿入する。スライドを５５℃で２０分加熱する。ハイブリダイゼーションチェンバーを除去し、スライドを０．８ＭのＮａＣｌ溶液の第一の部分で５５℃で洗浄し、次いで新たな部分で室温に冷却しながら洗浄する。最後にスライドを０．１ＭのＮａＣｌ溶液で室温ですすぐ。
【００７６】
ｖｉ）金電極に対するＤＮＡプローブの共有結合（ポリマー２）
金スライドを、ヘキサン、メタノール、及び水で連続的にすすぐ。次いでプレートを約１５分の期間ピラナフ(pyranah)溶液（Ｈ２Ｏ２３０％／Ｈ２ＳＯ４濃縮／；３０／７０）で処理する。次いでスライドをナノピュア滅菌水で徹底的に洗浄し、アルゴンで乾燥する。
【００７７】
５０μＬのＳＨ−炭素２４−ＤＮＡの溶液（１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ＝７）；Ｋ２ＨＰＯ４＋ＫＨ２ＰＯ４中に２５μＭ）を使用して、不活性環境下でＤＮＡ沈着を実施する。溶液を１ｃｍ２の表面に沈着し、不活性環境下で約１６時間処理する。非反応性ＤＮＡを流し、スライドをＨ２Ｏ、２×ＳＳＣ、及び滅菌水で連続的に洗浄する。
【００７８】
ポリマー２を電極に沈着する。５０μＬのポリマー２の溶液（０．１ＭのＮａＣｌ中に１０−５Ｍ）をＤＮＡスポットに沈着し、スライドを５５℃で約３０分加熱する。次いでスライドを室温でＮａＣｌ溶液（０．１Ｍ）で繰り返し洗浄する。
【００７９】
添加の順序は、前記実施例に記載されたもの、つまり相補的（または非相補的またはミスマッチを有する）ＤＮＡ鎖を、共有結合ＤＮＡ鎖に加え、次いでポリマー溶液を加えることに従う必要なはないことに注意すべきである。ポリマー溶液は、相補的（または非相補的またはミスマッチを有する）ＤＮＡ鎖の添加の前に加えても良い。
【００８０】
実施例１１：核酸及び他のそのような負に荷電した分子の精製のための、本発明のポリマーの使用
本発明に記載されたポリマーは、負に荷電した分子、特に核酸に対して高いアフィニティーを有する。さらに、それら水溶液に可溶性であり、広範囲の温度で非常に安定である。それ故、これらの特性を、核酸及び他の負に荷電した分子の精製に使用することが可能である。クロマトグラフィー分離は、以下の工程を含むであろう：（１）ポリマーを固定化する工程；（２）静電的相互作用が分析物とポリマーの間で可能なような条件下で、固定化したポリマーで分離されるように分析物を適用する工程；及び（３）分析物とポリマーの間の静電的相互作用が離れる条件を適用することによって、分析物を溶出する工程。
【００８１】
ポリマーの固定化は、ガラスビーズのような適切な固体の支持体、または他のタイプのポリマーで形成されたビーズにポリマーを共有結合することによって達成できる。別法として、固体の支持体に対する結合は、実施例１０に記載されたような静電的相互作用を介しても達成できるであろう。後者の場合で、キャプチャーオリゴヌクレオチドが固体の支持体に共有結合される場合、ポリマーは静電的結合のみによって結合されるため、最終溶出工程で分析物と共にポリマーが溶出すると期待されるであろう。発色の変化は、クロモグラフィー方法をモニターするために使用できるであろう。
【００８２】
ポリマーに分析物を結合するための条件は、水、０．１ＭのＮａＣｌ、及び１０ｍＭトリスバッファー／０．１ＭのＮａＣｌのような低イオン性荷電の溶液を好ましくは含むであろう。各種の洗浄条件が、分析物の非所望の分画を除去するために適用できる。別法としてｐＨ変化が、ポリマーに対する分析物の結合のための条件を得るために使用できるであろう。
【００８３】
分析物を溶出する条件は、１．０ＭのＮａＣｌ溶液、またはポリマーとの静電的相互作用に競合可能な十分に高いカウンターイオン濃度を含むいずれかの他の溶液のような、高いイオン性荷電の溶液を含む。再び述べるが、別法としてｐＨ変化を、分析物を溶出するための条件を得るために使用できるであろう。
【００８４】
実施例１２：メッセンジャーＲＮＡの検出
精製され、in vitroで転写され、ポリアデニル化された、ＮＡＣ１をコードするArabidopsis thaliana遺伝子のメッセンジャーＲＮＡをStratageneから購入した。完全にマッチした相補的ＤＮＡオリゴヌクレオチドＮ１(5' CGAGGCTTCCATCAATCTTA 3')を、Perkin-Elmer 391合成器でホスホルアミダイト化学により合成した。非関連のＹ２ＤＮＡオリゴヌクレオチドを同様な態様で得た。全ての試薬、及びＲＮＡと接触される液体操作材料を、ＲＮアーゼフリーであることを確認し、またはＲＮアーゼを不活性化するためにジエチルピロカルボナートで処理した(J. Sambrook及びD. W. Russel, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, CSHL Press, 2001)。検出器に１００ボルトを適用し、４２０±１０ｎｍで励起セットで、５３０±５ｎｍで蛍光放射を測定して、Variant Cary Eclipse分光光度計で４２．５℃で蛍光測定を実施した。
【００８５】
ポリマー２とオリゴＮ１の間の二本鎖を、８．６６×１０１３コピーのオリゴＮ１を、当量の正に荷電したポリマー２と接触させることによって形成した。２μＬの水中に３０秒間室温で反応を実施した。１μｌの二本鎖混合物を２ｍＬの水中に希釈し、最初の蛍光シグナルの測定のためクォーツキュベットに入れた。その後、８．６６×１０１３コピーの加熱処理した（９５℃で２分）ＮＡＣ１メッセンジャーＲＮＡを加えて混合することによって、三本鎖を４２．５℃で形成した。三本鎖の蛍光を測定した。同じ二本鎖及び三本鎖を、ＤＮＡオリゴヌクレオチドＹ２を使用して作製し、これはＮＡＣ１メッセンジャーＲＮＡの配列と有意なホモロジオーを有さない。
【００８６】
蛍光は、Ｙ２／ポリマー２／ＮＡＣ１三本鎖より、Ｎ１／ポリマー２／ＮＡＣ１三本鎖で有意に高く、それによって、メッセンジャーＲＮＡと２０マーのＤＮＡオリゴヌクレオチドの特異的なハイブリダイゼーションと非特異的なハイブリダイゼーションの間を識別するポリマー２の能力が示された。
【００８７】
結論として、単純な光学的及び電気化学的手段によって、核酸の検出が可能である新規な方法体系が開発された。この迅速で、選択的で、用途の広い方法は、プローブまたは分析物に対する化学的反応を必要とせず、カチオン性ポリ（３−アルコキシ−４−メチルチオフェン）誘導体と、一本鎖オリゴヌクレオチドまたは二本鎖（ハイブリダイズした）核酸断片との間の各種の静電的相互作用及び立体構造変化に基づく。本発明のポリマーベースの方法は単純で特異的であり、核酸の迅速な検出のための柔軟なプラットホームを提供する。
【００８８】
ポリチオフェンは熱安定性でオートクレーブ可能であり、それ故広範囲の応用が可能である。
【００８９】
ここで使用される用語及び記載は、説明のためのみの理由で示された好ましい実施態様であり、以下の特許請求の範囲に定義される本発明を実施する際に当業者に可能であると認識される多くの変形を制限することを企図するものではない。
【００９０】
〔参考文献〕
0004510381.tif 000017
0004510381.tif 000018
0004510381.tif 000019
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】図１は、１ｃｍの光学パス長を使用する、５５℃で０．１ＭのＮａＣｌ／Ｈ２Ｏでの、ａ）ポリマー２；ｂ）ポリマー２／Ｘ１二本鎖；ｃ）ポリマー２／Ｘ１／Ｙ１三本鎖の、２．４×１０−５Ｍ（モノマー単位ベースで）溶液のＵＶ可視吸収スペクトルを示す図である。
【図２】図２は、５５℃で０．１ＭのＮａＣｌ／Ｈ２Ｏでの、ａ）ポリマー２；ｂ）ポリマー２／Ｘ１二本鎖；ｃ）ポリマー２／Ｘ１／Ｘ１混合物の、２．４×１０−５Ｍ（モノマー単位ベースで）溶液のＵＶ可視吸収スペクトルを示す図である。
【図３】図３は、５５℃で０．１ＭのＮａＣｌ／Ｈ２Ｏでの、ａ）ポリマー２；ｂ）ポリマー２／Ｘ１二本鎖；ｃ）ポリマー２／Ｘ１／Ｙ２混合物の、２．４×１０−５Ｍ（モノマー単位ベースで）溶液のＵＶ可視吸収スペクトルを示す図である。
【図４】図４は、２のヌクレオチドのみによって異なるCandida albicans対Candida dubliniensisアンプリコンの特異的光学検出を示す図である。
【図５】図５は、ポリマー２−オリゴヌクレオチド二本鎖（左のチューブの溶液が赤紫色に発色した）；ポリマー２−ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド三本鎖（中央のチューブの溶液が黄色に発色した）；及び二つのミスマッチを有する部分的にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを有するポリマー２（右のチューブの溶液がピンク色に発色した）の写真を示す図である。
【図６】図６は、ポリマー２とオリゴヌクレオチドの間の二本鎖と三本鎖の形成を示す図である。
【図７】図７は、特異的ハイブリダイゼーションの間の蛍光強度を示す図である。
【図８】図８は、ハイブリダイゼーションが存在しない間の蛍光強度を示す図である。
【図９】図９は、ＤＮＡハイブリダイゼーションの電気化学的検出に関与する各種の工程を示す図である。
【図１０】図１０は、０．１ＭのＮａＣｌ／Ｈ２Ｏにおける、完全なハイブリダイゼーション（実線）の場合と、コントロールブランク（破線）の場合のＩＴＯ修飾電極（Ｓ＝５０ｍｍ２）でのポリマー１のサイクル電流電圧曲線を示す図である。スキャン速度は１００ｍＶ／ｓである（２の連続したサイクル）。
【図１１】図１１は、０．１ＭのＮａＣｌ／Ｈ２Ｏにおける、完全なハイブリダイゼーション（実線）の場合と、コントロールブランク（破線）の場合のＩＴＯ修飾電極（Ｓ＝５０ｍｍ２）でのポリマー２のサイクル電流電圧曲線を示す図である。スキャン速度は１００ｍＶ／ｓである（２の連続したサイクル）。
【図１２】図１２は、伝導性表面でのＤＮＡプローブの共有結合、相補的ＤＮＡ鎖とのその後のハイブリダイゼーション、及び伝導性ポリマーとのその発現を示す図である。
【図１３】図１３は、０．１ＭのＮａＣｌ／Ｈ２Ｏにおける５５℃での、ａ）ポリマー１、ｂ）ポリマー２／Ｘ１二本鎖、ｃ）ポリマー２／Ｘ１／Ｙ１三本鎖、ｄ）ポリマー２／Ｘ１／Ｙ２混合物、及びｅ）ポリマー２／Ｘ１／Ｙ３混合物の、２．４×１０−５Ｍ（モノマー単位ベースで）溶液のＵＶ可視吸収スペクトルを示す図である。キャプチャープローブＸ１：5' CATGATTGAACCATCCACCA 3'、及びその完全な相補的標的Ｙ１：3' GTACTAACTTGGTAGGTGGT 5'は、Candida albicansに特異的なＤＮＡオリゴヌクレオチドペアであり、キャプチャープローブＸ２：5' CATGATTGAAGCTTCCACCA 3'、及びその完全な相補的標的Ｙ２：3' GTACTAACTTCGAAGGTGGT 5'は、Candida dubliniensisに特異的なＤＮＡオリゴヌクレオチドペアである；Ｙ３：3' GTACTAACTTCGTAGGTGGT 5'は、C. albicans及びC. dubliniensisキャプチャープローブの両者と一つのミスマッチを有するようにデザインされた相補的標的ＤＮＡオリゴヌクレオチドである。
【図１４】図１４は、１００ｍＶ／ｓのスキャン速度を使用する０．１ＭのＮａＣｌ／Ｈ２Ｏにおける、完全なハイブリダイゼーション（Ｘ１／Ｙ１；実線）の場合、及び二つのコントロールブランク（Ｘ１／Ｙ１、点線及びＸ１、破線）の場合での、ＩＴＯ変性電極（５０ｍｍ２）に結合したポリマー２（ポリマー２を有するＳＨ−炭素２４−ＤＮＡ）のサイクル電流電圧曲線を示す図である。
【図１５】図１５は、０．１ＭのＮａＣｌ／Ｈ２Ｏにおける、完全なハイブリダイゼーション（Ｘ１／Ｙ１；実線）の場合、及び二つのコントロールブランク（Ｘ１、破線）の場合での、金変性電極（５０ｍｍ２）に結合したポリマー２（ポリマー２を有するＳＨ−炭素２４−ＤＮＡ）のサイクル電流電圧曲線を示す図である。電極は、スキャンの１０分前から−０．４Ｖの電位にかけられた；使用されたスキャン速度は５０ｍＶ／ｓであった。
【図１６】図１６は、５０ｍＶ／ｓのスキャン速度を使用する０．１ＭのＮａＣｌ／Ｈ２Ｏにおける、完全なハイブリダイゼーション（Ｘ１／Ｙ１；実線）の場合、及び二つのコントロールブランク（Ｘ１、破線、及びシラン化ＩＴＯ（ＤＮＡなし）、一点破線）の場合での、ＩＴＯ変性電極（５０ｍｍ２）に結合したポリマー３（ポリマー３を有するＳＨ−炭素２４−ＤＮＡ）のサイクル電流電圧曲線を示す図である。
【図１７】図１７は、５５℃で０．１ＭのＮａＣｌ／Ｈ２Ｏでの、ａ）ポリマー１／Ｘ１二本鎖；ｂ）ポリマー１／Ｘ１／Ｙ１三本鎖の、２．４×１０−５Ｍ（モノマー単位ベースで）溶液のＵＶ可視吸収スペクトルを示す図である。
【図１８】図１８は、２５℃で０．１ＭのＮａＣｌ／Ｈ２Ｏでの、ａ）ポリマー４；ｂ）Ｘ１／Ｙ１／ポリマー４三本鎖；ｃ）Ｘ１／Ｙ１ポリマー４混合物の、２．４×１０−５Ｍ（モノマー単位ベースで）溶液のＵＶ可視吸収スペクトルを示す図である。
【図１９】図１９は、０．１ＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭトリス緩衝溶液における５５℃での、ポリマー３／Ｘ１／Ｙ１三本鎖の２．４×１０−５Ｍ（モノマー単位ベースで）溶液のサイクル二色性を示す図である。
【図２０】図２０は、ａ）ポリマー２；ｂ）二本鎖（Ｘ１＋ポリマー２）；ｃ）三本鎖（Ｘ１＋Ｙ１＋ポリマー２）；ｄ）２のミスマッチを有する三本鎖（Ｘ１＋5' TGGTGGATGCATCAATCATG 3'）、３のミスマッチを有する三本鎖（Ｘ１＋5' TGGTGGATACATCAATCATG 3'）、５のミスマッチを有する三本鎖（Ｘ１＋5' TGGTGGAAACAACAATCATG 3'）；ｅ）１のミスマッチを有する三本鎖（Ｘ１＋5' TGGTGGATGCTTCAATCATG 3'）の５５℃での、０．１ＭのＮａＣｌ及びＴＥにおける７．９×１０５Ｍの溶液のＵＶ可視分光学的スペクトルを示す図である。
【図２１】図２１は、ａ）ポリマー２；ｂ）二本鎖（Ｘ１＋ポリマー２）；ｃ）三本鎖（Ｘ１＋Ｙ１＋ポリマー２）；ｄ）２のミスマッチを有する三本鎖（Ｘ１＋Ｙ２）、（Ｘ１＋5' TGGTAGATGCTTCAATCATG 3'）、（Ｘ１＋5' TGGTGGTTGCTTCAATCATG 3'）、（Ｘ１＋5' TGGTGGATGCTTTAATCATG 3'）、（Ｘ１＋5' TGGTGGATGCTTCATTCATG 3'）、（Ｘ１＋5' TGGTGGATGCTTCAATTATG 3'）の５５℃での、０．１ＭのＮａＣｌ及びＴＥにおける７．９×１０５Ｍの溶液のＵＶ可視分光学的スペクトルを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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