(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜７またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０〜１４から成る群のいずれか１つより選ばれる配列からなるペプチド。
【請求項２】
ヒトまたは動物の身体を診断する方法に使用される、請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
請求項１に記載のペプチドに対して特異な抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項４】
ヒトまたは動物の身体を診断する方法に使用される、請求項３記載の抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項５】
請求項１記載のペプチドを示すシゲラ様トキシンの診断試験方法であって、
ｉ）  請求項３記載の抗体またはその抗原結合性フラグメントをサンプルと反応させる工程；
ｉｉ）  該抗体または抗原結合性フラグメントと該ペプチドの結合反応を検出する工程；および
ｉｉｉ）該結合反応の検出をシゲラ様トキシンの存在と相関させる工程、を含む方法。
【請求項６】
シゲラ様トキシンに対して特異的な抗体の診断試験方法であって、
ｉ）請求項１記載のペプチドをサンプルと反応させる工程；
ｉｉ）抗体−抗原結合反応を検出する工程；および
ｉｉｉ）該抗体−抗原結合反応の検出をシゲラ様トキシンに対して特異的な抗体の存在と相関させる工程、を含む方法。
【請求項７】
サンプルが患者由来のサンプルである、請求項５または６記載の診断試験方法。
【請求項８】
請求項５〜７のいずれかに記載の診断試験方法を実施するための診断試験キット。
【請求項９】
請求項１記載のペプチドまたは請求項３記載の抗体もしくはその抗原結合性フラグメント結合剤を使用することを含む、生体外［ｅｘ  ｖｉｖｏ］でシゲラ様トキシンを検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、シゲラ様トキシン（シゲラ様毒素）（Shigella-like toxins : SLT）、特に大腸菌（E. coli）Ｏ１５７：Ｈ７のシゲラ様トキシンの免疫原性エピトープ、免疫原としてのおよび治療または診断におけるその使用、それらを特異的に中和する薬剤（作用物質）（例えば、抗体および抗原結合性フラグメント）、治療および診断におけるそれらの使用、ならびにそのための方法に関する。
【０００２】
【従来の技術とその課題】
シゲラ様トキシン〔志賀様（Shiga-like）トキシンおよびベロトキシンとしても知られている〕は、周知であり（Schmitt, C.K.他、1991, Infection and Immunity, 59(13) : 1065-1073）、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７を含む広範囲の病原体によって産生され、感染すると血液性の下痢および急性の腎臓不全を引き起こし、多くの患者（特に若年者や老人）を死に至らしめる。発生は、散発的ではあるが、規模が大きく医療関係機関に多くの負担を与えることになる（Berkelman, R.L.他、1994, Science, 264 : 368-370 ; Slutsker, L.他、1997, Ann. Intern. Med., 126 : 505-513）米国だけでも、１年間に推定で20,000例の大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７の感染が起こっている。感染は、汚染された食品（特にハンバーガーのような粉砕ビーフ製品）を消費し、そして、子供の保育施設における個人間接触によって起こることが多い。感染発生は、この他、スコットランドおよび日本（1996, BMJ, 313 : 1424）北西太平洋地域（Antibiotic-Resistant Bacteria, Office of Technology Assessment, Congress of the United States, pp 150-151）ならびにカナダ（Slutsker, L. 他、1997, Ann. Intern. Med, 126 : 506-513）からも報告されているが、発生はこれらの地域に限定されるものではない。
【０００３】
感染性病原体の多くは後天的な多重薬剤耐性を有し、そして、抗生物質治療によってバクテリアがシゲラ様トキシンの産生を増大させ得るようになることが見出されている（Antibiotic-Resistant Bacteria, 上述）。シゲラ様トキシンを発現する病原体に対する新しい治療法の必要性が長年にわたって論じられている（例えば、上述のAntibiotic-Resistant Bacteria参照）。大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７のシゲラ様トキシンに対して特異的な抗体は治療効果があるだろうということは示唆されている（Antibiotic-Resistant Bacteria,上述）が、今日まで抗体が治療に用いられたことはない。
【０００４】
各種のシゲラ様トキシンがクローニングされ配列決定が行われている（Meyer, T. 他、1992, Zbl. Bakt., 276 : 176-188, Schmitt, C.K. 他、1991, Infection and Immunity, 59(3) : 1065-1073, Ramotar, K. 他、1995, J. Clin. Microbiol., 33(3) : 519-524）。しかし、該トキシンの免疫原性領域、特に、特異的エピトープは明らかにされていない。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
このたび本発明者は、大腸菌のシゲラ様トキシン由来の多数のエピトープ、特に、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７のエピトープを明らかにすることに成功した。該エピトープは広範囲の用途を有する。例えば、ワクチンのような免疫原として治療に使用することができ、あるいは、該エピトープに特異的に結合する作用物質（例えば、抗体）を検出して診断を行うこともできる。さらに、該トキシンを中和する中和薬剤（例えば抗体）を産生するのに用いることもできる。該エピトープに結合する作用物質は治療および診断の両方に使用することができる。
【０００６】
本発明に従えば、SEQ ID NO（配列番号）１〜７から成る群のいずれか１つから選択される配列を有するシゲラ様トキシンのエピトープが提供される。該エピトープは、SEQ ID NO : １および３のいずれかから選択される配列を有するものとすることもできる。さらに、本発明のエピトープは、シゲラ様トキシンを含むペプチドとして表すこともできる。
【０００７】
SEQ ID NO：１〜７のエピトープは、これまで確認（同定）されたことも無ければ示唆されたことも無いものである。各種のＳＬＴ（シゲラ様トキシン）の配列が知られてはいるが、特定のエピトープは明らかにされていない。
【０００８】
さらに、本発明のエピトープは、該エピトープのアナログ（類縁体）を包含するものとする。アナログは、例えばミモトープの形態で容易に作製することができ（Geysen, H.M. 他、1987, Journal of Immunological Methods, 102 : 259-274 ; Geysen, H.M. 他、1988, J. Mol. Recognit, 1(1) : 32-41 ; Jung, G.およびBeck-Sickinger, A.G., 1992, Angew. Chem. Int. Ed. Eng., 31 : 367-486）、これには商業的に利用できるミモトープ設計技術を用いればよい。
【０００９】
シゲラ様トキシンは、例えば大腸菌由来のものであり、そして、例えば、Ｏ１５７：Ｈ７、Ｏ１５７：Ｈ−およびＯ２６：Ｈ１１から成る群より選ばれる大腸菌Ｏ１５７由来のものである。別の態様として、シゲラ様トキシンは、例えば、シゲラ・ソンネイ（Shigella sonnei）、シゲラ・ボイディ（Shigella boydii）、シゲラ・フレキシネリー（Shigella flexneri）およびシゲラ・ディゼンテリエ（Shigella dysenteriae）から成る群より選ばれるものである。
【００１０】
本発明に従うエピトープは、ヒトまたは動物の身体の治療法または診断法に用いることができる。
【００１１】
本発明に従うエピトープは、例えば、免疫源（例えばワクチン）として使用することができる。
【００１２】
本発明に従えば、さらに、本発明に従うエピトープに対して特異的な結合剤（結合性薬剤）が提供される。そのような結合剤には、本発明に従うエピトープを認識する能力を有するいずれの分子も包含される。例えば、結合剤は、抗体またはその抗原結合性フラグメント（断片）である。
【００１３】
抗体についてはよく知られている（Harlow, E.およびLane, D., "Antibodies-A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, New York, 1988参照）。本発明に従う抗体は、全抗体であってもよく、あるいはその抗原結合性フラグメントであってもよく、そして、一般に、いずれの免疫グロブリンクラスに属するものでもよい。すなわち、例えば、ＩｇＭまたはＩｇＧ抗体である。抗体またはそのフラグメントは、動物性、例えば哺乳動物由来のものでもよく、例えば、マウス、ラット、ヒツジまたはヒト由来のものである。また、抗体は、天然の抗体またはそのフラグメントでもよいが、所望に応じて、組換えによる抗体フラグメント、すなわち、組換えＤＮＡ技術を用いて産生された抗体または抗体フラグメントであってもよい。
【００１４】
組換えによる抗体または抗体フラグメントとして特に挙げると以下のようなものがある：（１）抗原結合性部位を有する抗体であって、少なくともその一部が別異の抗体に由来するもの、例えば、或る抗体の超可変領域または相補性決定領域が第２の別異の抗体の可変フレームワーク領域に結合された抗体（例えば、ヨーロッパ特許明細書第239400号に記載されているもの）；（２）非Fv配列が他の別異の抗体由来の非Fv配列により置換された組換え抗体またはフラグメント（例えば、ヨーロッパ特許明細書第171469、173494および194276号に記載されているもの）；または（３）実質的に天然のイムノグロブリンの構造を保有している組換え抗体またはフラグメントであって、ヒンジ領域のシステイン残基の数が天然のイムノグロブリンとは異なり、該組換え抗体またはフラグメントの表面ポケットの１個またはそれ以上のシステイン残基が天然のイムノグロブリン中に存在する他のアミノ酸残基と置換しているもの（例えば、国際特許出願PCT／ＧＢ88／00730およびＰＣＴ／ＧＢ88／00729に記載されているもの）。
【００１５】
抗体または抗体フラグメントは、ポリクローナルまたはモノクローナルのいずれでもよい。それらは、少なくとも１つのエピトープに特異的なものである。
【００１６】
抗原結合性の抗体フラグメントとしては、例えば、全抗体のタンパク質加水分解に由来するフラグメント、例えば、F(ab')2、Fab'もしくはFabフラグメント、または組換えＤＮＡ技術によって得られたフラグメント（例えば、国際特許出願ＰＣＴ／ＧＢ88／0747に記載されているもの）が挙げられる。
【００１７】
本発明に従う抗体は、周知の免疫学的手法により調製することができる。すなわち、例えば、タンパク質を適当な宿主（ホスト）に注入し、その血清を集めて、適当な精製および／または濃縮（例えば、アフィニティ媒体として固定化タンパク質を用いるアフィニティクロマトグラフィ）を行うことにより所望のポリクローナル抗体を得ることができる。別の方法として、例えば、Kohler他の方法（1976, Eur. J. Immunol., 6 : 511）の方法を用いて、タンパク質が感染した宿主から脾細胞またはリンパ球を回収し不死化させ、得られた細胞を集めてモノクローナル抗体を産生する単一の遺伝学的細胞系を得るようにしてもよい。抗体フラグメントは、従来の手法、例えば、ペプシンやパパインを用いる酵素分解によって得ることができる。本発明に従う組換え抗体を得ることが所望される場合には、該抗体は、例えば、ヨーロッパ特許出願第171469号、173494号、194276号および239400号明細書に記載されている方法を用いて得ることができる。
【００１８】
本発明に従う抗体には、従来から知られた手法を用いて、検出可能なラベルで標識したり、または、エフェクター分子、例えば、薬剤（例えば、抗菌剤）、トキシンまたは酵素と結合（複合化）してもよく、本発明は、そのような標識化抗体または抗体複合体も含むものとする。すなわち、本発明に従う結合剤は、シゲラ様トキシンに結合するのみでなく、該トキシンの中和も行う（すなわち、その細胞毒性を抑制する）ものである。
【００１９】
かくして、本発明に従う結合剤は、ヒトまたは動物の身体の治療法および診断法に用いることができる。
【００２０】
本発明に従えば、さらに、シゲラ様トキシンに起因する疾病を治療するための薬剤の製造に、本発明に従うエピトープまたは結合剤を使用する。さらに、シゲラ様トキシンに起因する疾病の治療用薬剤の製造方法であって、本発明に従うエピトープまたは結合剤を使用することを含む方法が提供される。
【００２１】
このように、本発明は、治療又は診断に使用され得るシゲラ様トキシンのエピトープ、ならびに該エピトープに由来する結合剤であって、それ自身も診断または治療のいずれにも使用することができる結合剤を提供する。
【００２２】
さらに、本発明に従えば、本発明に従うエピトープを示すシゲラ様トキシンの診断試験方法であって、
i）本発明に従う結合剤をサンプルと反応させる工程；
ii）結合剤−エピトープ結合反応を検出する工程；および
iii）該結合反応の検出をシゲラ様トキシンの存在と相関させる工程、
を含む方法が提供される。
【００２３】
結合剤は例えば抗体であり、診断試験方法として、
i）本発明に従う抗体をサンプルと反応させる工程；
ii）抗体−抗原結合反応を検出する工程；および
iii）該結合反応の検出をシゲラ様トキシンの存在と相関させる工程、
を含む方法が提供される。
【００２４】
結合剤が抗体またはその抗原結合性フラグメントである場合は、エピトープは抗原とみなすことができる。
【００２５】
さらに、シゲラ様トキシンに対して特異的な抗体の診断試験方法であって、
i）本発明に従うエピトープをサンプルと反応させる工程；
ii）抗体−抗原結合反応を検出する工程；および
iii）該抗体−抗原結合反応の検出をシゲラ様トキシンに対して特異的な抗体の存在と相関させる工程、
を含む方法が提供される。
【００２６】
サンプルは例えば患者由来のものであり、例えば血清サンプルまたは腹腔透析液であるが、シゲラ様トキシンを含有しまたは含有すると予測される他のいずれのサンプルも勿論使用され得る。
【００２７】
さらに、本発明の別の側面に従えば、本発明に従う診断試験方法を実施するための診断試験キットも提供される。診断試験キットはよく知られており、例えば、ＷＯ88／08534に従うようなディップスティックを含んでいてもよい。該試験キットには、本発明に従う診断試験方法に用いられる説明書が含まれるようにしてもよい。
【００２８】
本発明に従えば、さらに、ヒトまたは動物の身体を治療または診断する方法であって、本発明に従うエピトープまたは結合剤を使用することを含む方法が提供される。
【００２９】
本発明に従う薬剤および治療方法は当業者に明らかな手法によって実施される。例えば、薬剤上許容される担体（キャリア）、稀釈剤または賦形剤を用いて薬剤を調製することができる（Remington's Pharmaceutical Sciences and US Pharmacopeia (1984) Mack Publishing Company, Easton, PA, USA参照）。薬剤および治療の実施に当たっては、製薬学的に有効量のエピトープまたは結合剤を使用する。適正な用量は当業者には明らかであり、例えば用量−反応実験により容易に決定することができる。
【００３０】
【発明の実施の形態】
本発明をさらに明らかにするため、以下に本発明に従うエピトープおよびそれらを含むペプチドについて説明するが、これは単なる例示のためのものである。
【００３１】
【実施例】
大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７（1996, MBJ, 313 : 1424）感染したいろいろな患者から感染段階の異なる血清を入手した。この血清についてエピトープマッピングを行い（下記）、比較を行うことにより、大腸菌により発現されたＳＬＴのサブユニットＡについて誘導されたアミノ酸配列（Verotoxin, Meyer, T. 他、1992, Zbl. Bakt., 276 : 176-188）に含まれるエピトープを明らかにした。
エピトープマッピング
上記の誘導アミノ酸配列に含まれ互いにオーバーラップする一連のノナペプチドを合成した。合成は、以前にGeysenらにより報告された手法（1987, Journal of Immunological Methods, 102 : 259-274）に従い、エピトープスキャンニングキット（米国CambridgeのCambridge Research biochemicals社製）の試薬を用いてポリウレタンピン上で行った。ペプチド１（ウエル１）は残基１から９で構成され（SEQ ID NO : ８）、ペプチド２（ウエル２）は残基２から１０で構成され（SEQ ID NO : ９）、その他も同様にした。これを、大腸菌Ｏ１５７由来のベロトキシンについて実施した。患者血清（1000倍稀釈）に対する各クローンの反応性をＥＬＩＳＡによりＩｇＧについて測定した。データは、インキュベーションから３０分後のＡ４０５として表した。
【００３２】
３人の患者から、感染の初期段階（感染から3日）および感染の後期段階（感染後6週）における血清対を入手した。各ウエルに関し、３人の患者の結果を合計することにより初期血清および後期血清の双方について平均値を算出した。初期血清の結果から後期血清の結果を差し引いた。少なくとも３つの連続するウエルが陽性（少なくとも０．１９）である領域をエピトープが形成しているものとみなした。次に、感染により後に死亡した患者由来の単一の血清（感染から３日目に採取）についても調べた。得られた値を、上述の生存患者の初期血清の平均値から差し引いた。少なくとも３つの連続するウエルが陽性（少なくとも０．１９）である領域をエピトープが形成しているものとみなした。
【００３３】
この結果、７種類のエピトープ（それぞれ、SEQ ID NO : １〜７）が明らかにされた。この７種類のエピトープは、上述の基準の少なくとも一方を満たした。エピトープ１および３は、該基準の両方を満たした（表１参照）。
【００３４】
【表１】
0004397523.tif 000002
互いにオーバーラップする既述したのと同じ一連のノナペプチドを用いて以下のように更にエピトープマッピングを行った。
患者の血清の採集
ＨＵＳ（溶血性尿毒症候群）に罹っていることが確認された患者から６つの血清を入手した。また、大便サンプルから大腸菌Ｏ１５７が分離されたがＨＵＳまでには進行していない患者から３つの血清を入手し、さらに、陰性コントロールとして白血病患者から１つの血清を入手した。すべての血清についてＩｇＧを測定した。
結果
ＨＵＳ患者由来の６つの血清および便サンプル陽性の患者由来の３つの血清について平均吸光度値を加え、そして陰性コントロールを差し引き、連続した３つ以上のウエルにおいてカットオフが０．５よりも大きい吸光度を有した場合にエピトープが形成されているものとした。この基準により合計で７種類のエピトープが明らかにされた。それらが生じたエピトープおよびペプチドの番号は表４に記している。Ｂサブユニットにおいては、エピトープは示されなかった。
【００３５】
更に追加の実験を以下のように行った。
【００３６】
材料および方法
マルチプルペプチド合成装置ＢＴ７４００（英国LutonのBiotech Instruments社製）により短鎖ペプチドとして５種類の領域を合成した。これを間接ＥＬＩＳＡに用いた。ペプチドの番号とアミノ酸配列の関係は、ペプチド１〜５が、それぞれSEQ ID NO : 10〜14である。ペプチド１は、SEQ ID NO : ２のエピトープを有する。ペプチド２は、SEQ ID NO : ３のエピトープを有する。ペプチド３は、SEQ ID NO : ４のエピトープを有する。ペプチド４および５は、SEQ ID NO : ５のエピトープを有する。
【００３７】
臨床歴の異なる２５の血清、すなわち、大腸菌感染が認められない患者由来の３つの血清、溶血性尿毒症候群と診断されて入院し培養便が大腸菌Ｏ１５７に関して陽性であった患者由来の２０の血清、および、大腸菌Ｏ１５７関連疾病から回復した患者から４週間後に採集した２つの血清について試験した。対をなす血清については、それぞれ、１と２および３と４と番号をつけた。コントロール血清は２３〜２５と番号をつけた（表２参照）。
間接ＥＬＩＳＡ
マイクロタイタープレートにペプチドを吸着させ、各ペプチドについて次のような操作を行った。ペプチドを０．０１Ｍのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．２）の２ｍｌに溶かし、同じ緩衝液中で１００倍稀釈して１０μｇ／ｍｌの濃度にした。
（１）ペプチド（０．０１ＭのＰＢＳ中１０μｇ／ｍｌ）のアリコート１５０μｌをFalcon3912マイクロアッセイプレートのウエルにピペットで注入し４℃で１晩インキュベートした。
（２）０．０１MのＰＢＳ（ｐＨ７．２）に溶かした０．０５％Tweenを用いて４回（４×１０分）洗浄することにより非結合ペプチドを除去した。
（３）０．０１MのＰＢＳに溶かした２％スキムミルク‐１０％ＦＣＳを用いて３７℃で１時間、プレートのブロッキングを行った。
（４）０．０１ＭのＰＢＳに溶かした０．０５％のTween２０を用いて４回（４×１０分）プレートを洗浄し、マイクロアッセイプレートのウエル内に被検血清（ブロッキング溶液中で１００倍稀釈）を添加し（各血清について３個のウエルを使用）、３７℃で２時間インキュベートした。
（５）０．０１MのＰＢＳに溶かした０．０５％のTween２０を用いてプレートを４回（４×１０分）洗浄し、二次抗体として抗ヒトＩｇＭ（またはＩｇＧ）ペルオキシダーゼ複合体（ブロッキング溶液中で１０００倍稀釈）を添加し、３７℃で１時間インキュベートした。
（６）０．０１ＭのＰＢＳに溶かした０．０５％のTween２０を用いてプレートを４回（４×１０分）洗浄した後、０．００１MのＰＢＳを用いて更に洗浄を行った。次に、０．０１％（ｗ／ｖ）の過酸化水素を含むｐＨ４．０のクエン酸緩衝液に溶かした調製直後の２，２−アジノ−ビス[３−エチルベンズ−チアゾリン−６−スルホン酸]ジアンモニウム（ＡＢＴＳタブレット）の０．５ｍｇ／ｍｌ中で室温下に攪拌しながらプレートを４５分間インキュベートした。
（７）各プレートにコントロール用ウエルを使用した。ＡＢＴＳ溶液のみを有する３つのウエル、および、ＡＢＴＳ溶液＋抗ヒトＩｇＧまたはＩｇＭセイヨウワサビペルオキシダーゼ複合体を有する３つのウエルを使用した。
（８）ＥＬＩＳＡプレートリーダー（Titertek-Multiscan）を用い４０５ｎｍの波長における光学密度（ＯＤ）測定を行った。
（９）患者血清毎に３つのウエルのそれぞれについて平均示度を求めた。
結果
結果を表２にまとめている。カットオフＯＤをＩｇＭについては０．２およびＩｇＧについては０．３とすると、ペプチド４が最も免疫反応性が大きかった。但し、コントロール血清の１つがＩｇＭについて陽性であった。カットオフＯＤが０．２５（ＩｇＭ）および０．３５（ＩｇＧ）に上昇するとペプチド５が最も免疫反応性であった（表３参照）。
【００３８】
カットオフの感度を高くし、そして、ＩｇＭおよび／またはＩｇＧが陽性であれば血清は陽性であると定義すると、ペプチド１は症例において、ペプチド２は６症例において、ペプチド３は１２症例において、ペプチド４は１６症例において、そしてペプチド５は９症例において陽性であった。症例６，７および１５由来の血清は、５種類のペプチドのいずれについても陰性であった。症例１由来の血清対は、ペプチド１，３，４および５に対してはＩｇＭの上昇が示されたが、ＩｇＧのレベルは一定のままであった。症例２由来の血清対は、ペプチド１，２，３および４に対してＩｇＭの上昇、およびペプチド２および３に対してＩｇＧの上昇を示した。
【００３９】
結論
大腸菌Ｏ１５７のトキシン由来のペプチドに対する抗体を作製し、これを用いてエピトープマッピングの結果を確認し、また、分子内のこれらの領域が抗体治療の標的となり得ることを確認した。ペプチド４および５は同じエピトープ（SEQ ID NO : ５）を含有したが、ペプチド４においては、これは大腸菌由来の相応する配列に結合され、一方、ペプチド５においては、これはシゲラ・ディゼンテリエ（Shigella dysenteriae）のホロトキシン（Fraser他、Nature Structural Biology, 1(1) : 59-64）由来のもとの等価であった。シゲラ・ディゼンテリエ由来の配列に対する免疫原性が低くなっていることは、大腸菌Ｏ１５７由来のエピトープに対する反応の特異性を明らかにするものである。
【００４０】
【表２】
0004397523.tif 000003
【００４１】
【表３】
0004397523.tif 000004
【００４２】
【表４】
0004397523.tif 000005
【配列表】
0004397523000001.app