(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１または複数の免疫グロブリンを含有する溶液からの免疫グロブリンの単離方法であって、次の操作：
a）１または複数の免疫グロブリンを含有しそして2.0〜10.0の範囲のpHおよび2.0以下のイオン強度に相当する全塩分を有する溶液を、下記の一般式：
Ｍ−ＳＰ１−Ｌ
（上式中、Ｍは母材主鎖を表し、ＳＰ１はジビニルスルホン由来スペーサーではないスペーサーを表し、そしてＬは単環式または二環式の置換または非置換の芳香族または複素環式芳香族成分を含んで成るリガンドを表し、該スペーサー（ＳＰ１）ならびに／あるいは芳香族または複素環式芳香族成分は酸性基を担持している）
の固相母材と接触させ、それにより免疫グロブリンの少なくとも一部が固相母材に結合された状態になり；
b）免疫グロブリンが結合された固相母材を前記溶液から分離し；
c）所望により固相母材を洗浄し；そして
d）固相母材から１または複数の免疫グロブリンを遊離させるために固相母材を溶離剤と接触させる
ことを含んで成り、
少なくとも基準（ａ）と（ｃ）を満たすという第一の条件：
（ａ）本明細書中に記載の「標準的免疫グロブリン結合試験」において2.0〜10.0の範囲のpHで試験した時に、固相母材が少なくとも50％の結合効率を有すること；または
（ｃ）1M NaOH中での固相母材の安定性が、本明細書中に記載の「標準的免疫グロブリン結合試験」において測定した時に、遮光下で室温で７日間の1M NaOH中での母材のインキュベーションが、結合最大pH値よりも１pH単位だけ低いpHから結合最大pH値よりも１pH単位だけ高いpHまでのpH範囲での結合効率を、対応する未処理の母材に比べて25％未満減少させるような安定性であること；および
リガンド−Ｌの分子量が500ダルトン以下であり、リガンド濃度が水和し沈降した固相母材１ｍｌ当たり１５〜１００μモルであるという第二の条件
を有する方法。
【請求項２】
前記酸性基がカルボン酸基（-COOH）、スルホン酸基（-SO2OH）、スルフィン酸基（-S（O）OH）、ホスフィン酸基（-PH（O）（OH））、ホスホン酸モノエステル基（-P（O）（OH）（OR））またはホスホン酸基（-P（O）（OH）2）より選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＳＰ１が、式-CH2-CH（OH）-CH2-（エピクロロヒドリン由来）、-（CH2）3-O-CH2-CH（OH）-CH2-（アリル−グリシジルエーテル由来）、-CH2-CH（OH）-CH2-O-（CH2）4-O-CH2-CH（OH）-CH2-（ブタンジオールジグリシジルエーテル由来）から成る短鎖脂肪族ビラジカルまたは単結合から選ばれる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
リガンド−スペーサーアーム接合体（ＳＰ１−Ｌ）の分子量が最大３００ダルトンである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記二環式複素環式芳香族リガンドＬがインドール、プリン、キノリン、ベンゾフラン、ベンゾイミダゾール、ベンゾチアゾールおよびベンゾオキサゾールより選ばれた化合物から誘導される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記リガンドＬがベンゾイミダゾール、ベンゾチアゾールおよびベンゾオキサゾールより選ばれた化合物から誘導される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
断片−ＳＰ１−Ｌの全部が実質的に同一である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
免疫グロブリン含有溶液のpHが6.0〜9.0の範囲内である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
免疫グロブリン含有溶液の全塩分が0.05〜2.0の範囲のイオン強度に相当する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
免疫グロブリン含有溶液が0.4Ｍ以下の濃度の離液性塩を含んで成る、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
使用する溶離剤（操作（ｄ））が10％（v/v）未満の有機溶剤を含んで成る、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
溶液が固相母材１ｇあたり0.1〜30mgの範囲の免疫グロブリンを含んで成る、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
Ｌがベンゼン基またはナフタレン基より選ばれる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
Ｌがチオフェン、フラン、ピラン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、イソチアゾール、イソオキサゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジンおよびピリダジン基より選ばれた単環式複素環式芳香族基；またはインドール、プリン、キノリン、ベンゾフラン、ベンゾイミダゾール、ベンゾチアゾールおよびベンゾオキサゾール基より選ばれた二環式複素環式芳香族基；より選ばれた複素環式芳香族成分である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
Ｌがピリジン、ベンゾイミダゾール、ベンゾチアゾールまたはベンゾオキサゾール基より選ばれる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
リガンドＬが、ジヒドロキシ安息香酸；アミノ安息香酸；ジアミノ安息香酸；メルカプト安息香酸；メルカプトニコチン酸；メルカプトテトラゾール酢酸；ベンゾイミダゾール；ベンゾチアゾール；およびベンゾオキサゾール、より選ばれた化合物から誘導される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記リガンドが、２，５−ジヒドロキシ安息香酸、２−アミノ安息香酸、３−アミノ安息香酸、４−アミノ安息香酸、２−メルカプト安息香酸、２−メルカプトニコチン酸、５−メルカプト−１−テトラゾール酢酸、２−メルカプトベンゾイミダゾール、４−アミノフタル酸および５−アミノイソフタル酸、より選ばれた化合物から誘導される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
固相母材の洗浄（操作（ｃ））が、負電荷を持つ洗浄剤を含む水溶液で洗浄することを含んで成る、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
固相母材の洗浄（操作（ｃ））が、負電荷を持つ洗浄剤を含む無機または有機塩緩衝液で洗浄することを含んで成る、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
タンパク質含有溶液が負電荷を持つ洗浄剤を含んで成る、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、様々な原料からの免疫グロブリンの単離または精製方法およびそのための固相母材に関する。
発明の背景
免疫グロブリン−すなわち抗体−は、哺乳類、鳥類および魚類の様々な体液中に存在し、動物を攻撃する物質、細菌およびウイルスに対する該動物の保護剤として機能する、非常に重要な種類のタンパク質である。免疫グロブリンは典型的には動物の血液、乳汁および唾液並びに他の体液および分泌液中に存在する。
免疫グロブリンが所有する生物活性は、ヒトや脊椎動物の診断、健康管理および治療部門の様々な応用分野で現在探究されている。
診断
抗体は長年にわたり病気の診断において多種多様な関連物質の検出や定量と関連して重要な分析手段として用いられており、食品の品質管理、環境管理、薬物乱用、並びに工業プロセスの監視および制御といった領域でますます重要になってきている。
このような目的には、適当な宿主動物、例えばウサギやヒツジの高度免疫処置により、あるいはまた、ハイブリドーマ細胞培養物中でのモノクローナル抗体の生産により、所望の抗体を生産することができる。
宿主動物中かまたは細胞培養物中のいずれかでの一次生産の後、典型的には数種類の単離工程により原料中に存在する大量の別物質から抗体が単離される。分析用途での抗体活性に対するこれらの別物質の干渉を避けるためにこの単離操作は必要である。
健康管理および治療用途
濃縮免疫グロブリンの筋内注射による受動免疫は、感染症に対する一時的保護として周知の用途であり、これは典型的には、人々が世界の或る地域から別の地域へと旅行するときに用いられる。ヒトへのこの種の処置の成功は脊椎動物の分野において現在追跡調査されており、新生のヒツジ、ウマ、ブタおよびニワトリの受動免疫が適用されそしてそれらの生後第一週の動物の生存率を高めるために進展しつつある。この分野での重要な問題点は、もちろんそのような処置の費用であり、これは免疫グロブリン濃縮物の費用によるところが大きい。
例えば牛乳からの動物免疫グロブリンの単離は、経口健康管理としてまたは更には例えばエイズ（AIDS）患者において胃腸感染を回避もしくは処置するための治療物質としても研究中である。そのような用途には、生成物の純度と費用の両方が非常に重要である。
治療用途への抗体の更に複雑な用途は、ヒト生物体中の特定細胞、例えば癌細胞に対して特異的結合親和力を有する抗体に非常に有効な薬物が共有結合で連結される、いわゆる「薬物ターゲッティング」に基づいている。この技術は、薬物が病的細胞上で濃縮され、化学療法を使う時にしばしば起こる深刻な副作用を伴わずに、薬物の最大効果を与えることを保証する。そのような目的には、抗体は非常に注意深く管理され且つ高純度のものでなければならず、そして一次生産を実施する典型的な方法はハイブリドーマ細胞培養物中でのモノクローナル抗体の生産によるかまたは遺伝子操作された細菌、例えば大腸菌（Ｅ．コリ）の醗酵によるかのいずれかである。
免疫グロブリンの単離
上述した免疫グロブリンの用途はいずれも粗製原料からの抗体の数種類の単離を必要とするが、各種の用途は抗体産物の最終純度および許容できる費用に関してそれ自体異なる要求を有する。
一般に、非常に広範囲に及ぶ生成物の最終純度、収率および費用を与える、免疫グロブリンの単離に利用できる非常に広範囲の様々な方法が存在する。
免疫グロブリンの伝統的な単離方法は、溶液中に他のタンパク質群を残しながら免疫グロブリンを含んで成るタンパク質画分を選択的に可逆性沈澱させることに基づく。典型的な沈澱剤はエタノール、ポリエチレングリコール、離液性（抗カオトロピック）塩、例えば硫酸アンモニウムおよびリン酸カリウム、並びにカプリル酸である。
典型的には、それらの沈澱方法は非常に不純な生成物を与え、同時に時間がかかり且つ面倒である。更に、原料への沈澱剤の添加は別の目的への上清の使用を難しくし、且つ廃棄問題を生む。これは例えば乳漿（ホエー）や血漿からの免疫グロブリンの大規模精製について言うときに特に関連がある。
イオン交換クロマトグラフィーは免疫グロブリンの単離にしばしば使われる別の周知のタンパク質分画方法である。しかしながら、この方法は、抗体の効率的結合を保証するのに必要なイオン強度とpHの束縛に加えて、異なる免疫グロブリンが異なる等電点を有するために、一般的には適用できない。
プロテインＡおよびプロテインＧアフィニティークロマトグラフィーは、主として使用が容易であることと高純度が得られることから、免疫グロブリンの単離と精製に、特にモノクローナル抗体の単離に、非常に平易で且つ広く普及している方法である。平易ではあるけれども、プロテインＡとプロテインＧは使用者にとって次のような幾つかの問題を生じることも認識されている：中でも、非常に高費用であること、異なるモノクローナル抗体で結合効率が可変的であること（特にマウスＩｇＧ1）、生成物中にプロテインＡ／プロテインＧが漏出すること、および典型的な洗浄溶液（例えば１Ｍ水酸化ナトリウム）中での母材の安定性が低いこと。これらの欠点の各々は、ささいなものから非常に深刻で且つ禁制の結果までに及ぶ、特有の結果を個々の用途にもたらす。
疎水性クロマトグラフィーも広く記載されている免疫グロブリンの単離方法である。例えば、Pharmacia LKB Biotechnology,1991により出版された“Application Note 210,BioProcess Media”中に記載されている。この文献中には、細胞上清からモノクローナル抗体を精製する目的での技術水準の製品“Phenyl Sepharose High Performance”が記載されている。今までに使用されている別の疎水性母材と同様に、免疫グロブリンを効率的に結合させるためには原料に離液性塩を添加することが必要である。連続的勾配または段階的勾配で離液性塩の濃度を下げることにより、母材から結合抗体が放出される。高純度生成物が目的物であるなら、疎水性クロマトグラフィーを別の工程と組み合わせることが推奨される。
この方法の欠点は原料に離液性塩を添加する必要性である。というのは、これは廃棄問題を引き起こし、それによって大規模使用者に費用の増大を課すからである。細胞培養上清以外の別の原料、例えば乳漿、血漿および卵黄では、多くの場合、原料への離液性塩の添加は大規模用途では禁制であろう。何故なら、塩は、数千リットルの廃液を捨てることの問題と共に、免疫グロブリンを単離した後の原料を何か経済的に有効に利用することを妨害し得るからである。
チオフィリック吸着クロマトグラフィーは、免疫グロブリンの単離のための新規クロマトグラフィー吸着原理として1985年にJ.Porathにより導入された（J.Porath他,FEBS Letters,第185巻,306頁,1985）。この論文には、遊離メルカプト基を含む様々なリガンドと結合されたジビニルスルホン活性化アガロースが0.5Ｍ硫酸カリウム、即ち離液性塩の存在下でどれくらい免疫グロブリンの特異的結合を示すかが記載されている。ビニルスルホンスペーサーからのスルホン基と、リガンド中の生成チオエーテル基が記載の特異性と抗体結合能を得るために不可欠な構造であると推定された。しかしながら、リガンドが更に芳香族基を含めば、チオエーテルが窒素または酸素で置き換え可能であることが後に示された（K.L.Knudsen他,Analytical Biochemistry,第201巻,170頁,1992）。
チオフィリッククロマトグラフィーについて記載された母材は一般的に良好な性能を示すけれども、それらも免疫グロブリンの効率的結合を保証するために、原料に離液性塩を添加するという重大な欠点を有する。これは上述した理由で問題である。
エポキシ活性化アガロースに結合した別のチオフィリックリガンドがJ.Porath他,Makromol.Chem.,Makromol.Symp.,第17巻,359頁,1988およびA.Schwarz他,Journal of Chromatography B,第664巻,83-88頁,1995中に開示されており、例えば、２−メルカプトピリジン、２−メルカプトピリミジンおよび２−メルカプトチアゾリンが開示されている。しかしながら、それらの親和性母材はまだ、離液性塩の添加なしに抗体の効率的結合を保証するには不適当な親和定数を有している。
タンパク質および別の生体分子の結合と単離
WO96/00735とWO96/09116はタンパク質およびペプチドを精製するための樹脂（母材）を開示しており、該樹脂は標的タンパク質またはペプチドを結合するpHでは無電荷であり、それによって疎水的相互作用を促進し、且つ標的タンパク質またはペプチドを脱着するpHでは電荷を持ち、それによって樹脂と標的タンパク質またはペプチドとの間で確立された疎水的相互作用を破壊する、イオン化できるリガンドおよび／または官能基を含むことにより特徴づけられる。WO96/00735は、２−メルカプトベンゾイミダゾールをエポキシ活性化セファロース６Ｂにカップリングさせる可能性を言及している。しかし、実際のリガンド濃度は開示されておらず、エポキシ基の含量が1.02〜1.28ミリモル／ｇ乾燥物質の範囲であると開示されているエポキシ活性化セファロースを使ってカップリングが実施された。
WO92/16292は、ジビニルスルホン活性化アガロースにカップリングされた多数の様々なリガンドと、タンパク質（好ましくは免疫グロブリン）のチオフィリック吸着のための固相母材の使用を開示している。具体的に言及されているのは、ジビニルスルホン活性化アガロース上にリガンドとして４−アミノ安息香酸を含んで成る固相母材である。WO92/16262でのタンパク質の吸着、好ましくは免疫グロブリンの吸着は、高濃度の離液性塩の存在下で、すなわち2.25以上のイオン強度で実施されている。
発明の簡単な説明
驚くべきことに、高い効率で且つ塩類、特に離液性塩を結合工程でほとんどまたは全く使用しないことに関しておよび広範囲の免疫グロブリンを結合する能力に関して特別な利点を伴って、広く異なる原料からの異なる種類の免疫グロブリンの新規単離および／または精製方法において数種類の芳香族または複素環式芳香族物質を使用できることを発見した。更に、それらの母材はNaOH中での安定性に関して特別な利点を有し、これは固相母材を使用後に再生しようとする時に特に関係がある。
よって、本発明の目的は、１または複数の免疫グロブリンを含有する溶液からの免疫グロブリンの単離方法であって、次の操作：
a）１または複数の免疫グロブリンを含有しそして2.0〜10.0の範囲のpHおよび2.0以下のイオン強度に相当する全塩分を有する溶液を、下記の一般式：
Ｍ−ＳＰ１−Ｌ
（上式中、Ｍは母材の主鎖を表し、ＳＰ１はスペーサーを表し、そしてＬは単環式または二環式の置換または非置換の芳香族または複素環式芳香族成分を含んで成るリガンドを表す）
の固相母材と接触させ、それにより免疫グロブリンの少なくとも一部が固相母材に結合された状態になり；
b）免疫グロブリンが結合された固相母材を前記溶液から分離し；
c）所望により固相母材を洗浄し；そして
d）固相母材から１または複数の免疫グロブリンを遊離させるために固相母材を溶離剤と接触させる
ことを含んで成り、
ただし、次の基準（ａ），（ｂ）および（ｃ）のうちの少なくとも２つを満たすという第一の条件：
（ａ）本明細書中に記載の「標準的免疫グロブリン結合試験」において2.0〜10.0の範囲のpHで試験した時に、固相母材が少なくとも50％の結合効率を有すること；または
（ｂ）本明細書中に記載の「モノクローナル抗体アレイ結合試験」において2.0〜10.0の範囲のpHで試験した時に、固相母材が試験した全ての免疫グロブリンについて少なくとも60％の平均結合効率を有すること；または
（ｃ）1M NaOH中での固相母材の安定性が、本明細書中に記載の「標準免疫グロブリン結合試験」において測定した時に、遮光下で室温で７日間の1M NaOH中での母材のインキュベーションが、結合最大pH値よりも１pH単位低いpHから結合最大pH値よりも１pH単位高いpHまでのpH範囲での結合効率を、対応する未処理の母材に比べて25％未満だけ減少させるような安定性であること；および
リガンド−Ｌの分子量が500ダルトン以下であるという第二の条件
を有する方法を提供する。
本発明は更に、下記の一般式：
Ｍ−ＳＰ１−Ｌ
（上式中、Ｍは母材の主鎖を表し、ＳＰ１はスペーサーを表し、そしてＬは単環式または二環式の置換または非置換の芳香族または複素環式芳香族成分を含んで成るリガンドを表す）
を有する、複数の官能基を担持している機能化された母材主鎖を含んで成る固相母材であって、
次の基準（ａ），（ｂ）および（ｃ）のうちの少なくとも２つを満たし：
（ａ）本明細書中に記載の「標準的免疫グロブリン結合試験」において2.0〜10.0の範囲のpHで試験した時に、固相母材が少なくとも50％の結合効率を有すること；
（ｂ）本明細書中に記載の「モノクローナル抗体アレイ結合試験」において2.0〜10.0の範囲のpHで試験した時に、固相母材が試験した全ての免疫グロブリンについて少なくとも40％の平均結合効率を有すること；または
（ｃ）1M NaOH中での固相母材の安定性が、本明細書中に記載の「標準的免疫グロブリン結合試験」において測定した時に、遮光下で室温で７日間の1M NaOH中での母材のインキュベーションが、結合最大pH値よりも１pH単位だけ低いpHから結合最大pH値よりも１pH単位だけ高いpHまでの範囲内のpHにおける結合効率を、対応する未処理の母材に比べて25％未満だけ減少させるような安定性であること；そして
リガンド−Ｌの分子量が500ダルトン以下であるという第一の条件；および
ＭがアガロースでありそしてＳＰ１がビニルスルホンから誘導される時、Ｌは４−アミノ安息香酸でないという第二の条件
を有する、本発明の方法での使用に特に適している固相母材を提供する。
芳香族または複素環式芳香族成分が場合によりスペーサーＳＰ２を経由して酸性基を担持している前記母材も同様に、タンパク質含有溶液（原料）に離液性塩を添加する必要なしに、且つ結合したタンパク質を母材から溶離させるのに多量の有機溶剤を使用する必要なしに、タンパク質の単離および精製に適することが更に発見された。
かくして、本発明は、次の式
Ｍ−ＳＰ１−Ｘ−Ａ−ＳＰ２−ＡＣＩＤ
（上式中、Ｍは母材主鎖を表し；ＳＰ１はスペーサーを表し；Ｘは−Ｏ−，−Ｓ−または−ＮＨ−を表し；Ａは単環式または二環式の置換または非置換の芳香族または複素環式芳香族成分を表し；ＳＰ２は随意のスペーサーを表し；そしてＡＣＩＤは酸性基を表す）
により示される複数の官能基を担持している機能化された母材主鎖を含んで成る固相母材であって、
リガンド−Ｌの分子量が500ダルトン以下であるという第一の条件；および
ＭがアガロースでありそしてＳＰ１がビニルスルホンから誘導される時、Ｌは４−アミノ安息香酸でないという第二の条件
を有する固相母材を提供し；更には
１または複数のタンパク質を含有する溶液からのタンパク質の単離方法であって、次の操作：
a）１または複数の免疫グロブリンを含有しそして2.0〜10.0の範囲のpHおよび2.0以下のイオン強度に相当する全塩分を有する溶液を、請求項44〜57のいずれか一項に記載の固相母材と接触させ、それにより免疫グロブリンの少なくとも一部が固相母材に結合された状態になり；
b）免疫グロブリンが結合された固相母材を前記溶液から分離し；
c）所望により固相母材を洗浄し；そして
d）固相母材から１または複数の免疫グロブリンを遊離させるために固相母材を溶離剤と接触させ、ここで使用される溶離剤は10％（v/v）未満の有機溶剤を含む；
を含んで成る方法も提供する。
発明の詳細な説明
免疫グロブリンの単離
一般に、免疫グロブリンの単離方法は数段階に分けることができる：
（ａ）固相母材の平衡化
（ｂ）固相と免疫グロブリン溶液との接触
（ｃ）固相の洗浄
（ｄ）溶液からの固相の溶出
（ｄ）結合した免疫グロブリンの溶離
（ｅ）固相母材の再生
しかしながら、いつも全段階が実施されるのかそうでないかは特定の用途に依存するだろう。よって、重要な段階は接触、分離および溶出段階であり、平衡化、洗浄および再生段階は、実際の用途に関連した特定の必要条件に従って実施してもよいし実施しなくてもよい。分離段階の形式は実際の構成による（下記参照）。
・平衡化
固相母材を免疫グロブリン含有溶液と接触させる前に、母材と溶液の両方が確実に免疫グロブリンの所望の結合を生じる状態にあるようにすることが好ましい。従って、この点について、pH、イオン強度および温度といったパラメーターを調整すること、そして場合によっては免疫グロブリンの結合を促進しそして／または不純物の結合を防止するために別の種類の物質を添加することが必要かもしれない。
よって、固相母材を溶液（例えばpH、イオン強度などを調整するためのまたは界面活性剤を導入するための緩衝液）で洗浄して固相に必要な性質をもたらすことにより固相母材の平衡化を行うことは、随意の段階である。
・接触
固相母材が球形または不規則形の粒子の形である時、１または複数の免疫グロブリンを含む溶液の接触は、固相母材を含有する充填層カラム中でまたは流動床／膨潤床カラム中で実施することができる。免疫グロブリンの結合を可能にするために一定時間だけ固相母材を溶液と混合する、単純なバッチ操作でも接触を実施することができる。
固相母材が透過性または半透性の膜またはシートの形である時は常に、確実に免疫グロブリンが膜またはシートの表面上および／または多孔質構造中に固定化されたリガンドと密接に接触するように、膜またはシートの表面の向こうへおよび／または多孔性構造を通って免疫グロブリン含有溶液をポンプ注入する／押込むことにより実施される。
この方法の詳細な指針は、“Purification Tools for MonoclonalAntibodies”,Gagnon,P.,Validated Biosystems,1996に与えられている。
・洗浄
固相母材を免疫グロブリン含有溶液と接触させた後、結合しなかったまたは弱く結合した物質、例えば別のタンパク質、脂質、核酸または母材からの他の不純物を除去するために、所望により洗浄操作が行われる。しかしながら、免疫グロブリンの高純度が重要でない場合には、洗浄操作を省略して工程数を減らし且つ洗浄溶液を節約してもよい。
免疫グロブリンの高純度が要求される他の場合には、溶出を開始する前に、異なる洗浄緩衝液を使って数種類の異なる洗浄操作を実施してもよい。
使用する洗浄緩衝液はクロマトグラフィー用吸着剤の性質および免疫グロブリンを結合するリガンドの性質に依存するだろう。洗浄緩衝液は吸着剤への免疫グロブリンの結合を妨害してはならず、すなわち、吸着剤の中とその周囲に存在している不純物含有溶液を洗浄緩衝液で単純置換することにより、またはこの置換と吸着剤に結合した不純物を脱離させることとを組み合わせることにより、望ましくない不純物だけが除去されるようにpH、塩濃度および他の添加剤を調整すべきである。母材に結合した不純物の脱着は、pHおよび／またはイオン強度を変えることにより、あるいは吸着剤か不純物のいずれかと競合的に相互作用する物質を洗浄緩衝液に添加して、吸着剤から不純物を排除することにより、達成することができる。
洗浄（本発明の方法の操作（ｃ））は、好ましくは免疫グロブリン含有溶液から残りのものを除去するためと、別の種類の生体分子を除去するために実施される。
・溶出
結合した免疫グロブリンの溶出は、通常、結合した免疫グロブリンを含んで成る固相母材を、母材上のリガンドから免疫グロブリンを遊離させる溶液と接触させることにより行われる。これにより免疫グロブリンは溶液中に放出され、そして母材から洗い流すことができる。免疫グロブリンを遊離させるのに用いる溶液は一般に、免疫グロブリンの結合に使用したものとは異なる性質を有し、例えば、該溶液は異なるpH、異なるイオン強度、異なる温度を有し、そして／または有機溶剤（好ましくは少量だけ）、洗浄剤、カオトロピック剤または他の変性試薬を含んでもよい。それらの種々のパラメーターの変更の組合せが通常は使用される。
溶出は、結合条件から非結合条件へと条件を徐々に変更する溶液を適用することにより実施してもよい。典型的にはこの操作は勾配溶出と呼ばれる。
免疫グロブリンが固相母材から溶出液中へと遊離されたら、それ自体既知の様々な随意手段によりこの溶出液から免疫グロブリンを回収することができる。最も単純な場合では、免疫グロブリンを何ら変更なしにそのまま使用してもよいが、多くの場合は、ある種の濃縮操作、例えば限外濾過、凍結乾燥または沈澱（例えば塩析）が好ましいだろう。免疫グロブリン溶液は随意性質の追加の処理段階で更に十分に精製してもよい。
・再生
固相母材は所望により清浄することができ、すなわち免疫グロブリンの溶出後に再生することができる。この操作は、典型的には固相の表面を汚す不純物の生成を最少にするため、および／または母材を滅菌して工程中に使用する装置および固相から漏れて繁殖する微生物による生成物の汚染を避けるために、行われる。そのような再生段階を実施する一般的なやり方は、母材を清浄しそして／または微生物を殺すことができる溶液で固相母材を洗浄することである。この目的に使われる典型的な溶液は、例えば、0.1〜1.0Ｍ水酸化ナトリウム；過酸または過酸化水素の溶液；変性剤、例えば塩酸グアニジン；活性塩素を含む溶液、例えば次亜塩素酸溶液、有機溶剤、例えばエタノール；洗剤などである。この目的に特に好ましい方法は、0.1〜1.0Ｍ水酸化ナトリウムを使用することであり、何故なら、非常に高い効率で、低費用で、塩酸により中和が容易で、且つ廃棄問題が無いからである。
本発明の好ましい態様では、該方法は（i）平衡化（随意段階）、（ii）接触、（iii）洗浄（随意段階）、（iv）分離、（v）溶出、および（vi）再生を含んで成り、再生前に段階（i）〜（v）のサイクルが１回または数回繰り返され、そして再生後に固相母材が再利用される。
結合、洗浄および溶出段階で用いる条件は、得られる免疫グロブリンの結合効率、収率および純度にとって非常に決定的である場合がある。本発明に係る種々の固相母材は、最適結果を保証するのに異なる結合、洗浄および溶出条件を必要とするかもしれない。同様に原料の性質も、特定の単離方法に非常に重要な影響を及ぼすだろう。例えば、ハイブリドーマ細胞培養上清からの非常に希薄なモノクローナル溶液（典型的には10〜100μg/ml）は、より濃厚な溶液、例えば腹水（１〜５mg／ml）中に存在する同種の抗体とは異なる挙動をし、そして例えば乳漿（１〜２mg／ml）中に存在する免疫グロブリンは血漿／血清（５〜20mg／ml）等からの免疫グロブリンとは異なる別の条件を必要とするだろう。
別の種類の不純物の組成（すなわち含量）は、原料ごとにかなり異なり、例えば卵黄はハイブリドーマ細胞培養上清に比較して非常に異なる組成を有する。
上述した通り、固相母材への抗体の結合を増強するように様々な物質を免疫グロブリン含有溶液に添加することが一般に可能である。
特定の態様では、本発明は、少なくとも10％、例えば少なくとも30％、好ましくは少なくとも50％、例えば少なくとも70％、より好ましくは少なくとも80％、例えば少なくとも90％、特に少なくとも99％の純度の単離された免疫グロブリンを与える免疫グロブリンの単離方法およびそのための固相母材に関する。
上述した通り、固相母材の結合効率最大pH値は2.0〜10.0の範囲内、多分3.0〜9.0の範囲にあるだろう。従って、その最大値近くで単離方法を実施することが最も適当である（もちろんこれは免疫グロブリン／固相母材の種々の組合せによって異なり得る）。よって、免疫グロブリン（または一般的にタンパク質）を含有する溶液のpHは、好ましくは2.0〜10の範囲内、例えば3.0〜9.0の範囲内であろう。しかしながら、リガンドの型および母材主鎖に依存して、pH域は好ましくは3.0〜7.0または6.0〜9.0である。
リガンドが−Ｘ−Ａ−ＳＰ２−ＡＣＩＤ型のものである時、免疫グロブリン含有溶液のpHは、母材のその特定型に予想される最大結合効率に相当する、2.0〜6.0の範囲内、好ましくは2.5〜5.5の範囲内、例えば3.0〜5.5の範囲内、または4.0〜5.5の範囲内にあるべきだと思われる。
上記（ａ）の接触操作には、免疫グロブリンを母材に結合させるために過剰量の離液性塩を添加する必要がないことがわかった。よって、免疫グロブリン含有溶液の全塩分（NaClを含む）は、2.0以下、好ましくは0.05〜2.0、例えば0.05〜1.4、特に0.05〜1.0の範囲内のイオン強度に相当するような分だけありさえすればよい。別の必要条件としては、離液性塩自体の濃度ができるだけ低濃度であることであり、よって、離液性塩の濃度がせいぜい0.4Ｍ、好ましくはせいぜい0.3Ｍ、特に0.2Ｍ以下、例えば0.1Ｍ以下である免疫グロブリン含有溶液を使って操作することが可能であると示された。
離液性塩の例は“Purification Tools for Monoclonal Antibodies”Gagnon,P.,Validated Biosystems,1996中に与えられており、そこには離液性イオンのホフマイスター系列が記載されている。
溶液中の免疫グロブリンの濃度については、固相母材が非常の広域の濃度範囲で機能できると思われるので、固相母材はハイブリドーマ細胞培養上清中のような0.001〜0.2の範囲の、好ましくは0.01〜0.1mg／mlの範囲の、乳汁および乳漿中のような0.2〜2.0mg／mlの範囲の、様々な動物の血清および血漿のような5.0〜20mg／mlの範囲の、そして更には初乳のような20〜80mg／mlの範囲の、免疫グロブリン含有溶液中の免疫グロブリンの濃度に等しく効率的に機能すると思われる。
本発明は、固相母材１ｇあたり免疫グロブリン0.1〜30mg、例えば固相母材１ｇあたり免疫グロブリン0.2〜2mgまたは5.0〜25mgを含んで成る溶液に特に適当である。
よって、免疫グロブリンを含む溶液は免疫グロブリンの人工溶液並びに生物学的溶液、例えば粗製醗酵ブロス；哺乳類細胞培養物、例えばハイブリドーマ細胞培養物；遺伝子操作された微生物（例えば大腸菌）の培養物からの醗酵ブロス；腹水、例えばマウスおよびラット腹水；ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ、ウサギ、ヤギ、モルモットおよびロバからの乳汁、乳漿、血液、血漿および血清；並びに卵黄、例えばニワトリ卵黄であることができる。
更に、免疫グロブリン含有溶液が負電荷を持つ洗浄剤を含む時、純度に関して特別な利点が得られることが証明された（実施例を参照のこと）。何かの理論に縛られずに、洗浄剤が母材への別の生体分子の接着を抑制すると思われる。そのような洗浄剤の例は硫酸オクチル、ブロモフェノールブルー、オクタンスルホネート、ラウリルサルコシン酸ナトリウム、およびヘキサンスルホネートである。
また、洗浄段階（本発明の方法の操作（ｃ））でも、多分同じ理由で、負電荷を持つ洗浄剤の使用が有利である。洗浄剤は単独で使用してもよく、または緩衝剤、例えば離液性塩緩衝剤と併用してもよい。洗浄段階での離液性塩の使用（少量）は、結合段階（操作（ａ））で離液性塩を使用することに比べて、重要でない廃棄物問題だけを提示する（結合段階はほとんどの場合大量使用を伴うことから）。
更に、本発明の方法に使用される固相母材の優れた性質は、溶出段階（操作（ｄ））で有機溶剤を使用しなくても発揮され、従って好ましくは、使用する溶離剤が10％（v/v）未満、より好ましくは５％未満の有機溶剤を含んで成る。最も好ましくは、有機溶剤を全然使用しない。
あるいは、実施例14に示されるように、より多量の非毒性溶剤、例えばプロピレングリコール、例えば40％までのプロピレングリコールを施用してもよい。
接触段階（操作（ａ））とその後の段階、すなわち分離、洗浄および溶出段階は、様々な方法で実施することができる。選択される物理的手段はしばしばその規模と工程を繰り返さなければならないかどうかにより左右される。本発明に係る固相母材は、開発および工業目的で使用されるほとんどどんな構成でも使用できる。よって、固相母材は、例えば攪拌バッチ法で、充填層クロマトグラフィーカラム法で、および流動床法で、免疫グロブリン含有溶液と接触せしめることができる。詳しい指針は、“Purification Tools for Mono-clonal Antibodies”,Gagnon,P.,Validated Biosystems,1996に与えられている。
本発明に従って免疫グロブリンの単離を実施するための別の必要な手段は、従来の方法論に準じる。
本発明は、様々な免疫グロブリン濃度、典型的にはハイブリドーマ細胞培養上清中の約10μg/mlおよび乳汁や乳漿中の約１〜２mg／mlから、種々の動物血清／血漿中の約５〜20mg／mlまで、そして更には初乳中の50〜60mg／mlまでに及ぶ免疫グロブリン濃度を有する、多種多様な原料からの免疫グロブリンの単離および精製方法を提供する。免疫グロブリンの結合および単離を潜在的に妨害する種々の不純物の性質および相対濃度も、異なる免疫グロブリン源の間で大きく異なる。
免疫グロブリンの幾つかの用途では、免疫グロブリンが高度に純粋であり、例えば99％より高い純度を有することが非常に重要である。これは特に、免疫グロブリンを治療薬として使おうとする時に常に当てはまるが、別の用途でも必要なことがある。診断分野では、必要とされる純度は多数の因子、例えば抗体が誘導体化されないで使用されるのか（この場合には高純度が要求されないかもしれない、即ち50％未満）または抗体が酵素、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼのようなシグナル分子で標識されなければならないのか（この場合には抗体はしばしば少なくとも80％以上の純度であることが要求される）に依存し得る。別の用途でも、純度の必要性は相応して異なり得る。しかしながら、生成物の適切な使用を可能にするためには、免疫グロブリンの純度は乾燥物質基準で少なくとも10％であるというのが一般的要求であるようだ。しかし、それが明確となるように、本発明はこれらの課題を解決するための指針を提供する。
固相母材
上述した通り、本発明の方法は固相母材の使用を含み、ここで前記固相母材は、次の式：
Ｍ−ＳＰ１−Ｌ
（上式中、Ｍは母材主鎖を表し、ＳＰ１はスペーサーを表し、そしてＬは単環式または二環式の置換されることがある芳香族または複素環式芳香族成分を含んで成るリガンドを表す）
により示される複数の官能基を有する機能化された母材主鎖を含んで成りそして一定の基準を満たさなければならない。
固相母材は、母材主鎖として、それ自体タンパク質および他の生体分子の固相分離に適用可能であることが知られている任意の天然または合成の有機または無機材料、例えば寒天およびアガロース；セルロース、セルロースエーテル、例えばヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース；デンプン；ガム、例えばグアーガム、アラビアガム、インドガム、トラガカントガム、ローカストビーンガム、キサンタンガム；ペクチン；ムチン；デキストラン；キチン；キトサン；アルギネート；カラギーナン；ヘパリン；ゼラチン；合成ポリマー、例えばポリアミド、例えばポリアクリルアミドおよびポリメタクリルアミド、ポリイミド、ポリエステル、ポリエーテル、高分子ビニル化合物、例えばポリビニルアルコールおよびポリスチレン、ポリアルケン；無機材料、例えばケイ酸含有材料、例えば非晶質シリカおよび石英を含む二酸化珪素、シリカ、金属シリケート、孔制御ガラスおよびセラミック；金属酸化物および硫化物；あるいはそれらの天然または合成の有機または無機材料の組合せを含んで成ってもよい。
母材主鎖は好ましくは寒天、アガロース、セルロース、セルロースエーテル、例えばヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリアミド、例えばポリアクリル（またはメタクリル）アミド、ポリビニルアルコール、シリカおよび孔制御ガラスから選ばれる。
母材主鎖として特に着目されるのは、例えば寒天またはアガロースビーズ、例えばPharmacia Biotech,Swedenからのセファロース（Sepharose）およびスーパロース（Superose）ビーズ、並びにBioRad,USAからのバイオゲルＡ（Biogel A）；デキストラン型ビーズ、例えばPharmacia Biotechからのセファデックス；セルロース型ビーズおよび膜、例えばSecheza,Czechoslovakiaからのペルローザ（Perloza）セルロース；複合材料ビーズ、例えばPharmacia Biotechからのセファクリル（Sephacryl）およびスーパーデックス（Superdex）ビーズ；合成有機ポリマーのビーズ、例えばToso-Haas,USAからのフラクトゲル（Fractogel）；Perceptive Biosystems,USAからのPOROS基材、BioRadからのバイオレックス（Bio-Rex）、バイオゲルＰ（Biogel P）およびマクロプレプ（Macro Prep）；TESSEKからのHEMAおよびセパロン（Separon）；BioSepra,USAからのハイパーＤ（Hyper D）およびトリスアクリル（Trisacryl）基材、3M,USAからのエンザクリル（Enzacryl）およびアズラクトン（Azlactone）；ケイ酸含有材料のビーズ、例えばBioprocesing,Englandからの孔制御ガラスPROSEPおよびBioSepraからのスフェロシル（Spherocil）；並びにビーズまたは膜の形のシリカ被覆複合材料、例えばArbor Technologies,USAからのACTI-DISK,ACTI-MODおよびシクロセプ（CycloSep）である。
典型的には、固相母材並びにそれから得られる機能化された固相母材は、例えば不規則な粒子または球状ビーズ、膜もしくはシート、成形面、またはスティックの形であることができる。固相材料は更に、タンパク質に対して完全にもしくは部分的に透過性であるかまたは完全に不透性であってもよい。特に興味深い本発明の態様は、母材が１〜10000μm、好ましくは10〜1000μmの範囲のサイズ；例えば高性能用途には10〜60μm、調製目的には50〜500μm、好ましくは50〜300μmのサイズを有する不規則なまたは球状のビーズの形である。
特に着目される母材の形態は、密度制御用粒子を含んで成る集塊の形の密度制御母材である。流動床または膨潤床クロマトグラフィー、並びに非充填式カラム中での様々なバッチ式クロマトグラフィー、例えば攪拌タンク中での単純なバッチ吸着のための大規模操作に特に適用できるそれらの集塊は、WO92/00799に記載されており、これは参考として本明細書中に組み込まれる。
リガンドＬは、この目的に適用できることが知られている任意の型の共有結合によって、リガンドと固相材料との間の直接化学反応によるかまたは母材主鎖とリガンドとを連結できるようにするそれ自体既知の適当な試薬で固相材料もしくはリガンドを予備活性化することにより、固相材料に結合されてもよい。そのような適当な活性化試薬の例は、エピクロロヒドリン、エピブロモヒドリン、アリル−グリシジルエーテル；ビス−エポキシド、例えばブタンジオールジグリシジルエーテル；ハロゲン置換脂肪族化合物、例えばジクロロプロパノール、ジビニルスルホン；カルボニルジイミダゾール；アルデヒド、例えばグルタル酸ジアルデヒド；キノン；臭化シアン；過ヨウ素酸塩、例えばメタ過ヨウ素酸ナトリウム；カルボジイミド；クロロトリアジン、例えばシアヌル酸クロリド；スルホニルクロリド、例えばトシルクロリドおよびトレシルクロリド；Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド；トルエン−４−スルホン酸２−フルオロ−１−メチルピリジニウム；オキサゾロン；マレイミド；ピリジルジスルフィド；並びにヒドラジドである。それらの中で、単結合とは異なるスペーサー基ＳＰ１を残す活性化試薬、例えばエピクロロヒドリン、エピブロモヒドリン、アリル−グリシジルエーテル、ビスエポキシド、ハロゲン置換脂肪族化合物、ジビニルスルホン、アルデヒド、キノン、臭化シアン、クロロトリアジン、オキサゾロン、マレイミド、ピリジルジスルフィドおよびヒドラジドが好ましい。
特に着目される活性化試薬は、エポキシ化合物、例えばエピクロロヒドリン、アリル−グリシジルエーテルおよびブタンジオールジグリシジルエーテルである。
場合によって、例えばジビニルスルホンが活性化試薬として使われる場合、活性化試薬は固相母材への免疫グロブリンの結合に寄与する官能基の一部を構成することもある。その他の場合は、活性化試薬は官能基と母材との反応の最中に母材から遊離される。これはカルボニルジイミダゾールやカルボジイミドを使用する場合である。
上述した可能性は、母材ＭとリガンドＬとを連結する随意スペーサーＳＰ１の存在を定義することと関連づけられる。本明細書中では、スペーサーＳＰ１は母材とリガンドとの間に結合を形成する活性化試薬の一部と見なされる。よって、スペーサーＳＰ１は活性化試薬と関与するカップリング反応に相応する。ある場合には、例えばカルボジイミドを使う時、活性化試薬は母材のまたはリガンド試薬の活性化形態を構成する。カップリング後、リガンドと母材との間に活性化試薬の一部分が全く残されないなら、ＳＰ１は単純に単結合である。
別の場合、スペーサーＳＰ１は結合特性を果たす官能基の不可欠部分、すなわちリガンドであり、これはスペーサーＳＰ１が機能的に活性な部位もしくは置換基、例えばチオール、アミン、酸性基、スルホン基、ニトロ基、ヒドロキシ基、ニトリル基、または水素結合、静電的結合もしくは析力、電荷移動などを通して相互作用することができる他の基を含んで成る場合に特に重要であろう。
更に別の場合、スペーサーＳＰ１は、固相母材の結合特性に重要な役割を果たす芳香族または複素環式芳香族環を含んでもよい。これは例えば固相母材またはリガンド用の活性化試薬としてキノンまたはクロロトリアゾンが使われる場合である。
好ましくは、スペーサーＳＰ１は単結合であるかまたはエピクロロヒドリン、アリル−グリシジルエーテル、ビス−エポキシド、例えばブタンジオールジグリシジルエーテル、ハロゲン置換脂肪族化合物、例えば１，３−ジクロロプロパン−２−オール、アルデヒド、例えばグルタル酸ジアルデヒド、ジビニルスルホン、キノン、臭化シアン、クロロトリアジン、例えばシアヌル酸クロリド、トルエン−４−スルホン酸２−フルオロ−１−メチルピリジニウム、マレイミド、オキサゾロンおよびヒドラジドから選ばれた活性化試薬に由来するビラジカルである。
好ましくは、スペーサーＳＰ１は、例えば式-CH2-CH（OH）-CH2-（エピクロロヒドリンから）、-（CH2）3-O-CH2-CH（OH）-CH2-（アリル−グリシジルエーテルから）もしくは-CH2-CH（OH）-CH2-O-（CH2）4-O-CH2-CH（OH）-CH2-（ブタンジオールジグリシジルエーテルから）の短鎖脂肪族ビラジカル；または単結合から選ばれる。
固相母材から溶出生成物（例えば免疫グロブリン）中への材料（例えばリガンドおよび／またはスペーサー）の漏出の危険性のために、リガンド（またはリガンド＋随意のスペーサー）の分子量はできる限り低くなるように選ぶのが有利である。プロテインＡ、プロテインＧ、合成ペプチドおよび他の比較的高分子量のリガンド（例えば色素）を使用することの主たる欠点は、放出された一部リガンド（場合によりスペーサーを含む）を溶出された免疫グロブリンから分離することが困難であるかまたは不可能でさえあることである。その理由は、それぞれの分子量の差が小さいためと、それらの成分が互いに結合しやすい本来の性質を有するためである。これは、免疫グロブリンを治療薬として使用する予定である場合には、患者においてアレルギー性ショックや他の深刻な症状を引き起こすといった有害な影響を及ぼす可能性がある。リガンド（スペーサーを含む）の分子量が小さければ小さいほど、漏出されたリガンドをより高い効率で免疫グロブリン生成物から分離することができる。リガンド（またはリガンド−スペーサーアーム接合体）が最少可能分子量を有することのもう１つの重要な利点は、注射／摂取前に免疫グロブリンから分離されなかったかもしれない漏出材料が、分子量が小さければ小さいほど最少の抗原性を惹起するだろうし、それ故に一般に高分子量リガンドよりも比較的生体に受け入れられるだろうということである。
従って、リガンドＬは500ダルトン未満の分子量、好ましくは400ダルトン未満、より好ましくは300ダルトン未満、例えば250ダルトン未満、更には200ダルトン未満の分子量を有するのが好ましい。
リガンド−スペーサーアーム接合体（−ＳＰ１−Ｌ）に関しては、分子量が500ダルトン未満、好ましくは400ダルトン未満、例えば300ダルトン未満、更には250ダルトン未満であるのが好ましい。
本発明によれば、母材は単独でまたはスペーサーＳＰ１と（更には母材主鎖とも）共同して免疫グロブリンをそれに結合できるようにする。リガンドの決定的部分は１または複数の置換基（そのうちの１つは好ましくは酸性成分を含む置換基である）を担持することがある単環式または二環式の芳香族または複素環式芳香族成分であることがわかる。
「単環式または二環式」という用語は、問題の成分のコア部分が、それぞれベンゼンやナフタレンのように、１つの環または２つの縮合環から成っているものを意味し、従ってビフェニルのように２つの別個の環を含むリガンドを意味するのではない。
リガンドＬの芳香族または複素環式芳香族部分の構造は、芳香族または複素環式芳香族環上に１または複数の置換基を有することがある非常に広範囲の様々な構造を包含できることが発見された。しかしながら、本発明の目的物である免疫グロブリンを効率的に結合するかどうか、または結合が中または低程度だけであるのかどうかに関して、どの置換基が例えばベンゼン環上に存在すべきかは、むしろ決定的であるように思われる。
リガンドは、それらが誘導される個々のおよび別々の化学化合物に相当する命名法を使って本明細書中呼称されるけれども、実際のリガンドＬはそのような化合物の基（radical）であることを理解すべきである。
しかしながら、我々の予備実験結果に基づくと、官能基として次の型の芳香族または複素環式芳香族基を含んで成る母材を使用することが特に好ましい：安息香酸、例えば２−アミノ安息香酸、３−アミノ安息香酸、４−アミノ安息香酸、２−メルカプト安息香酸、４−アミノ−２−クロロ安息香酸、２−アミノ−５−クロロ安息香酸、２−アミノ−４−クロロ安息香酸、４−アミノサリチル酸、５−アミノサリチル酸、３，４−ジアミノ安息香酸、３，５−ジアミノ安息香酸、５−アミノイソフタル酸、４−アミノフタル酸；桂皮酸、例えばヒドロキシ桂皮酸；ニコチン酸、例えば２−メルカプトニコチン酸；ナフトエ酸、例えば２−ヒドロキシ−１−ナフトエ酸；キノリン、例えば２−メルカプトキノリン；テトラゾール酢酸、例えば５−メルカプト−１−テトラゾール酢酸；チアジアゾール、例えば２−メルカプト−５−メチル−１，３，４−チアジアゾール；ベンゾイミダゾール、例えば２−アミノベンゾイミダゾール、２−メルカプトベンゾイミダゾールおよび２−メルカプト−５−ニトロベンゾイミダゾール；ベンゾチアゾール、例えば２−アミノベンゾチアゾール、２−アミノ−６−ニトロベンゾチアゾール、２−メルカプトベンゾチアゾールおよび２−メルカプト−６−エトキシベンゾチアゾール；ベンゾオキサゾール、例えば２−メルカプトベンゾオキサゾール；チオフェノール、例えばチオフェノールおよび２−アミノチオフェノール；２−（４−アミノフェニルチオ）酢酸；芳香族または複素環式芳香族スルホン酸およびホスホン酸、例えば１−アミノ−２−ナフトール−４−スルホン酸およびフェノール類、例えば２−アミノ−４−ニトロフェノール。Ｍがアガロースであり、ＳＰ１がビニルスルホンから誘導され、そしてＬが４−アミノ安息香酸である場合は、WO92/16292の発明の固相母材に関連して、具体的に除外されることに注意すべきである。
リガンドの詳細構造は、様々な源からの免疫グロブリンの単離に関連した重要な機能的性質を決定づけると思われる。よって、遠縁のまたは近縁の芳香族構造を含んで成る異なるリガンドを、異なる原料からの抗体の単離に用いると、免疫グロブリンの結合強度、結合選択性、結合能および総収率に有意な変化をもたらすと思われる。
中性付近のpH（約pH5〜pH9）での免疫グロブリンの結合には、複素環式芳香族環系と縮合したベンゼン環から誘導された基を含んで成るリガンド、例えばベンゾイミダゾール、例えば２−メルカプトベンゾイミダゾールおよび２−メルカプト−５−ニトロベンゾイミダゾール；ベンゾチアゾール、例えば２−アミノ−６−ニトロベンゾチアゾール、２−メルカプトベンゾチアゾールおよび２−メルカプト−６−エトキシベンゾチアゾール；ベンゾオキサゾール、例えば２−メルカプトベンゾオキサゾールから選ばれたリガンドを使用することが好ましい。前者のリガンド群には属さないけれども同じく中性付近のpHでの免疫グロブリンの結合に好ましいのは、チオフェノール類、例えばチオフェノールおよび２−アミノチオフェノールの群より選ばれたリガンドである。
上記説明と本明細書中に示した結果から明らかであるように、リガンドＬは好ましくは、次の式：
−Ｘ−Ａ−ＳＵＢ
（ここでＸは−Ｏ−，−Ｓ−または−ＮＨ−を表し、Ａは芳香族もしくは複素環式芳香族環または環系を表し、そしてＳＵＢは１または複数の置換基を表す）
を有する基から選ばれる。
活性化母材主鎖との反応後に固相母材のリガンド部分を形成する芳香族または複素環式芳香族化合物は、芳香族または複素環式芳香族成分に直接結合したヒドロキシ基（Ｘが−Ｏ−である）、メルカプト基（Ｘが−Ｓ−である）またはアミノ基（Ｘが−ＮＨ−である）を含まなければならないことから、Ｘがリガンドの不可欠部分であることは理解される。そのような化合物の例は、３−ヒドロキシ桂皮酸、２−メルカプト安息香酸および２−アミノ安息香酸である。もし芳香族または複素環式芳香族化合物が例えばヒドロキシ基の他にアミノ基も含むならば、得られる固相母材はそれぞれアミノ基を通してとヒドロキシ基を通してリンカーに結合されているリガンドの混合物を含んで成ってもよいことは理解されるだろう。
芳香族基は好ましくはベンゼン基とナフタレン基から選ばれる。
芳香族基は、好ましくはベンゼン基、例えばフェニル、１，２−フェニレン、１，３−フェニレン、１，４−フェニレン、１，２，３−ベンゼントリイル、１，２，４−ベンゼントリイル、１，３，５−ベンゼントリイル、１，２，３，４−ベンゼンテトライル、１，２，３，５−ベンゼンテトライル、１，２，４，５−ベンゼンテトライルおよび１，２，３，４，５−ベンゼンペンタイルである。
複素環式芳香族基は、好ましくは単環式複素環式芳香族基、例えばチオフェン、フラン、ピラン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、イソチアゾール、イソオキサゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジンおよびピリダジン基；並びに二環式複素環式芳香族基、例えばインドール、プリン、キノリン、ベンゾフラン、ベンゾイミダゾール、ベンゾチアゾールおよびベンゾオキサゾール基から選ばれる。
複素環式芳香族基は好ましくはピリジン、ベンゾイミダゾール、ベンゾチアゾールおよびベンゾオキサゾールから選ばれる。
高純度免疫グロブリン単離物のための好ましいリガンド群は、２−アミノ安息香酸、２−メルカプト安息香酸、３−アミノ安息香酸、４−アミノ安息香酸、４−アミノ−２−クロロ安息香酸、２−アミノ−５−クロロ安息香酸、２−アミノ−４−クロロ安息香酸、４−アミノサリチル酸、５−アミノサリチル酸、３，４−ジアミノ安息香酸、３，５−ジアミノ安息香酸、５−アミノイソフタル酸、４−アミノフタル酸のようなアミノ安息香酸類の中から選ばれる。
高純度の単離された免疫グロブリンを与える別の好ましいリガンド群は、桂皮酸、例えば２−ヒドロキシ桂皮酸、３−ヒドロキシ桂皮酸および４−ヒドロキシ桂皮酸の群である。
高純度免疫グロブリンのための更に別の好ましいリガンド群は、置換基としてカルボン酸基とアミノ基を含んで成る複素環式芳香族化合物、例えば２−アミノニコチン酸、２−メルカプトニコチン酸、６−アミノニコチン酸および２−アミノ−４−ヒドロキシピリミジンカルボン酸の群より誘導される。
アガロース母材主鎖およびエポキシ化合物由来のスペーサーは、特に上記の好ましいリガンド群と組み合わせると特に適当である。
芳香族または複素環式芳香族成分上の置換基に関しては、ＳＵＢは好ましくは少なくとも１つの酸性基を含んで成る。
特に着目される本発明の態様では、ＳＵＢは下式：
−ＳＰ２−ＡＣＩＤ
（上式中、ＳＰ２は随意の第二のスペーサーを表し、ＡＣＩＤは酸性基を表す）
の置換基を少なくとも１つ含んで成る。
本明細書中、「酸性基」という用語は、約6.0未満のpKa値を有する基、例えばカルボン酸基（-COOH）、スルホン酸基（-SO2OH）、スルフィン酸基（-S（O）OH）、ホスフィン酸基（-PH（O）（OH））、ホスホン酸モノエステル基（-P（O）（OH）（OR））およびホスホン酸基（-P（O）（OH）2）を意味するものである。酸性基のpKa値は好ましくは1.0〜6.0の範囲内であるだろう。
酸性基は好ましくはカルボン酸、スルホン酸およびホスホン酸から選ばれる。
基ＳＰ２はＣ1-6アルキレンおよびＣ2-6アルケニレンから選ばれるか、あるいはＳＰ２は単結合を表す。関連するビラジカルの例は、メチレン、エチレン、プロピレン、プロペニレン、イソプロピレンおよびシクロヘキシレンである。好ましくはＳＰ２はメチレン、エチレンまたは単結合を表す。
本発明の一態様では、ＳＵＢは１つの基−ＳＰ２−ＡＣＩＤを表す。この場合、ＳＰ２は好ましくは単結合である。
しかしながら、ＳＵＢは置換基−ＳＰ２−ＡＣＩＤの他に、ヒドロキシ、アミノ、シアノ、モノ−およびジ（Ｃ1-6アルキル）アミノ、ハロゲン、例えばヨード、ブロモ、クロロおよびフルオロ、スルファニル、ニトロ、Ｃ1-6アルキルカルボキシおよびアミノカルボキシ、モノ−およびジ（Ｃ1-6アルキル）アミノカルボキシ、カルボキシ、スルホノ、スルホンアミド、Ｃ1-6アルキルとのホスホン酸エステル、置換されることがあるＣ1-12アルキル、置換されることがあるＣ2-12アルケニル、置換されることがあるＣ1-12アルキニルおよび置換されることがあるＣ1-12アルコキシ、またはチオエステル、から独立に選ばれた１または複数の他の置換基を表してもよい。あるいは該置換基が芳香族または複素環式芳香族成分の炭素原子の２原子価と一緒になってオキソ基を形成する酸素原子である。更に、ＳＵＢは上述したような基−ＳＰ２−ＡＣＩＤを表してもよい。ＳＵＢについて定義される置換基はＬについて定義される随意の置換基に相応すると理解すべきである。
別の好ましい態様では、ＳＵＢは置換基−ＳＰ２−ＡＣＩＤの他に、ヒドロキシ、アミノ、シアノ、ハロゲン、スルファニル、ニトロ、置換されることがあるＣ1-6アルキル、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、イソブチルおよびシクロヘキシル、置換されることがあるＣ2-6アルケニル、置換されることがあるＣ2-6アルキニル、置換されることがあるＣ1-6アルコキシ、カルボキシおよびスルホノから独立に選ばれた１または複数の別の置換基を表し、あるいは該置換基は芳香族または複素環式芳香族成分の炭素原子の２原子価と一緒になってオキソ基を形成する酸素原子である。この場合も、ＳＰ２は好ましくはメチレン、エテニレンまたは単結合を表し、好ましくは単結合を表す。
本明細書中、「Ｃ1-12アルキル」という語は、直鎖もしくは枝分かれ鎖または環状であることができる１〜12個の炭素原子を有するアルキル基、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、tert−ブチル、ペンチル、ヘキシル、オクチル、ドデシル、シクロペンチル、シクロヘキシル、デカリニル等を意味するものである。
「置換されることがあるＣ1-12アルキル」という語は、カルボキシ；保護されたカルボキシ、例えばカルボキシエステル、例えばＣ1-6アルコキシカルボニル；アミノカルボニル；モノ−およびジ（Ｃ1-6アルキル）アミノカルボニル；アミノ−Ｃ1-6アルキルアミノカルボニル；モノ−およびジ（Ｃ1-6アルキル）アミノ−Ｃ1-6アルキルアミノカルボニル；アミノ；モノ−およびジ（Ｃ1-6アルキル）アミノ；Ｃ1-6アルキルカルボニルアミノ；ヒドロキシ；保護されたヒドロキシ、例えばアシルオキシ、例えばＣ1-6アルカノイルオキシ；スルホノ；Ｃ1-6アルキルスルホニルオキシ；ニトロ；フェニル；フェニル−Ｃ1-6アルキル；ハロゲン；ニトリロ；並びにメルカプトから選ばれた１もしくは複数の、好ましくは１〜３個の基により置換されることがある、Ｃ1-12アルキルを意味するものである。
置換されたＣ1-12アルキル基の例は、カルボキシ−Ｃ1-12アルキル（例えばカルボキシメチルおよびカルボキシエチル）、保護カルボキシ−Ｃ1-12アルキル、例えばエステル化カルボキシ−Ｃ1-6アルキル（例えばＣ1-6アルコキシカルボニル−Ｃ1-12アルキル、例えばメトキシカルボニルメチル、エトキシカルボニルメチルおよびメトキシカルボニルエチル）、アミノカルボニル−Ｃ1-12アルキル（例えばアミノカルボニルメチル、アミノカルボニルエチルおよびアミノカルボニルプロピル）、Ｃ1-6アルキルアミノカルボニル−Ｃ1-12アルキル（例えばメチルアミノカルボニルメチルおよびエチルアミノカルボニルメチル）、アミノ−Ｃ1-6アルキルアルキルアミノカルボニル−Ｃ1-12アルキル（例えばアミノメチルアミノカルボニルメチルおよびアミノエチルアミノカルボニルメチル）、モノおよびジ（Ｃ1-6アルキル）アミノ−Ｃ1-6アルキルアミノカルボニル−Ｃ1-12アルキル（例えばジメチルアミノメチルアミノカルボニルメチルおよびジメチルアミノエチルアミノカルボニルメチル）、モノおよびジ（Ｃ1-6アルキル）アミノ−Ｃ1-12アルキル（例えばジメチルアミノメチルおよびジメチルアミノエチル）、ヒドロキシ−Ｃ1-12アルキル（例えばヒドロキシメチルおよびヒドロキシエチル）、保護ヒドロキシ−Ｃ1-12アルキル、例えばアシルオキシ−Ｃ1-12アルキル（例えばＣ1-6アルカノイルオキシ−Ｃ1-12アルキル、例えばアセチルオキシエチル、アセチルオキシプロピル、アセチルオキシブチル、アセチルオキシペンチル、プロピオニルオキシメチル、ブチリルオキシメチルおよびヘキサノイルオキシメチル）である。
本明細書中、「Ｃ2-12アルケニル」という語は、直鎖もしくは枝分かれ鎖または環状であることができ、鎖または環の中の任意の位置に１もしくは複数の二重結合が存在してもよい、２〜12個の炭素原子を有するモノ−、ジ−またはポリ−非置換アルキル基を意味し、例えばビニル、１−プロペニル、２−プロペニル、ヘキセニル、デセニル、１，３−ヘプタジエニル、シクロヘキセニル等を意味する。置換基がシス配置とトランス配置の両方に存在するものもある。本発明の範囲はシス形とトランス形の両方を包含する。
本明細書中、「Ｃ2-12アルキニル」という語は、２〜12個の炭素原子を有し且つ１もしくは複数の三重結合を含んでいる直鎖または枝分かれ鎖アルキル基、例えばエチニル、１−プロピニル、２−プロピニル、２−ブチニル、１，６−ヘプタジイニル等を意味する。
「置換されることがあるＣ2-12アルケニル」と「置換されることがあるＣ2-12アルキニル」という表現の中で、「置換されることがある」という語は、指摘の成分が「置換されることがあるＣ1-12アルキル」について上記に定義した基のうちの１つにより１回または複数回、好ましくは１〜３回置換されてもよいことを意味するものである。
「置換されることがあるＣ1-12アルコキシ」という語は、慣用的な化学命名法と同様、「置換されることがあるＣ1-12アルキル」について上記に指摘した置換基により１回または複数回、好ましくは１〜３回置換されてもよい、置換されることがあるＣ1-12アルキル−オキシ基を表す。
「Ｃ1-6アルキル」、「Ｃ2-6アルケニル」、「Ｃ2-6アルキニル」および「Ｃ1-6アルコキシ」という語はそれぞれ、「Ｃ1-12アルキル」、「Ｃ2-12アルケニル」、「Ｃ2-12アルキニル」および「Ｃ1-12アルコキシ」基の短鎖類似体を表す。
「Ｃ1-6アルキレン」と「Ｃ2-6アルケニレン」という語はそれぞれ「Ｃ1-6アルキル」と「Ｃ2-6アルケニル」について定義された基のビラジカルを意味するものである。
本発明は何らかの特定の理論に縛られるべきではないが、複素環式芳香族環系中に存在するかまたはその上の置換基として存在することがある、１もしくは複数のヘテロ原子と共同した複素環式芳香族成分または芳香族成分の特定の電子配置が、免疫グロブリンの特異的結合並びに別のタンパク質の結合に関係すると想像される。
よって、本発明の興味深い態様では、リガンドが、例えば環原子としてまたは（複素環式）芳香族環上の置換基として、例えばアミノもしくはニトロ基またはスルホン酸基もしくはホスホン酸基として、少なくとも１つの窒素、硫黄またはリン原子を含んで成る。
特に興味深い置換基の組合せは、少なくとも１つのアミノまたはメルカプト基と、カルボン酸、スルホン酸およびホスホン酸から選ばれた少なくとも１つの酸性基との任意組合せであると思われる。
同一母材主鎖上における本明細書中に定義された２種以上のリガンド型の組合せは、免疫グロブリンの高結合効率および／または高純度に関してある程度の利点をもたらすと考えられる。しかしながら、本発明の重要な態様では、固相母材上の官能基の全部が実質上同一である。
負または正電荷を持つ成分、例えば正電荷を持つアミノ基または負電荷を持つカルボン酸、スルホン酸もしくはホスホン酸基、を既に含んで成る母材にリガンドをカップリングさせることにより、生成物の結合効率と純度を増大することが観察され得る。
リガンド濃度が本発明の母材の機能的性質にとって非常に重要な場合もある。例えば、あるリガンド濃度では免疫グロブリンの高度な選択的結合を示すが、リガンド濃度の増加が結合選択性の低下を引き起こすことがある。当業者に周知であるように、高すぎるリガンド濃度は、多重結合点のメカニズムにより、固相主鎖上のリガンド間隔が狭くなりすぎるために、不必要な不純物の強力結合を引き起こし得る。リガンド濃度を低く維持すると、より大きな距離でリガンドの間隔が開けられるので、多部位で結合することによる不純物の結合を引き起こさないであろう。高すぎるリガンド濃度の別の不利な影響は、所望のタンパク質（例えば免疫グロブリン）を多重結合部位により結合するという危険である。そのような多重結合は、タンパク質（例えば免疫グロブリン）を適当な溶出緩衝液で遊離せしめる際に困難を引き起こし得る。ある場合には、そのように高度に置換された固相母材から生成物を遊離させるために強い変性条件および／または有機溶剤を使用する必要さえあるかもしれない。これは結果として生物活性の低下を伴う。
固相母材のリガンド濃度は幾つかの異なるやり方で明示することができる。リガンド濃度を記載する１つのやり方は、乾燥物質１ｇあたりに存在するリガンドの量を（例えばμモル／ｇ乾燥物質として）表すことである。これは、例えばリガンド濃度を固相母材の乾燥（例えば凍結乾燥）試料の元素分析により測定すれば直接得られる結果である。しかしながら、リガンド濃度は沈降した湿潤固相母材１ml（しばしば充填層母材１mlとも呼ばれる）上に存在するリガンドの量として表すこともできる。これは、水和した固相母材中の乾燥物質含量が同時に決定されれば、乾燥した固相母材を基にした測定値から容易に計算される数値である（すなわち、乾燥物質のｇ／沈降した湿潤固相母材のml）。リガンド濃度を表す別のやり方は、湿潤だが吸引排水した母材１ｇ中に存在するリガンドの量として表すことである。この数値も同様に、湿潤だが吸引排水した母材１ｇあたりの固相乾燥物質含量が同時に決定されれば、乾燥物質に基づいた測定値から容易に計算される。
よって、本発明の固相母材のリガンド濃度は、好ましくは固相母材の乾燥物質１ｇあたり10〜990μモルの範囲であり、例えば100〜990μモル／ｇ、より好ましくは200〜980μモル／ｇ、特に250〜975μモル／ｇであり；または
本発明の固相母材のリガンド濃度は、好ましくは水和し沈降した固相母材１mlあたり１〜145μモル、例えば10〜120μモル／ml、より好ましくは15〜100μモル／ml、特に20〜80μモル／mlであり；または
本発明の固相母材のリガンド濃度は、好ましくは湿潤だが吸引排水した固相母材１ｇあたり１〜130μモル、例えば10〜110μモル／ｇ、より好ましくは20〜100μモル／ｇ、特に20〜90μモル／ｇである。
既に上記から明らかであろうが、本発明の目的は高結合効率を有する固相母材を提供することである。
よって、本発明の範囲内で有用である固相母材は、３つの基準（ａ），（ｂ）および（ｃ）（上記参照）のうちの２つ、例えば基準（ａ）と（ｂ）、基準（ａ）と（ｃ）、または基準（ｂ）と（ｃ）を満たさなければならない。好ましくは３つの基準全てが満たされる。
基準（ａ）に関しては、本明細書中に記載の別の基準と組み合わせてまたはそれに代わるものとして、固相母材が本明細書中に記載の「標準的免疫グロブリン結合試験」において2.0〜10.0の範囲のpHで試験した時に少なくとも50％の結合効率を有することが非常に望ましい。本発明に係る母材の大部分の最大結合効率（これは例えば0.5pH単位の増分を使って或るpH範囲に渡って結合効率を試験することにより、半pH単位内で非常に正確に評価することができる）が3.0〜9.0の範囲内、例えばリガンドの性質によって3.0〜7.0の範囲内または6.0〜9.0の範囲内にあると想到される。
免疫グロブリン単離用の固相母材の一般的評価を実施する時には、pH4.5およびpH7.0での結合効率が特に重要であるとわかったので、好ましい態様では、本発明は本明細書中に記載の「標準的免疫グロブリン結合試験」においてpH4.5またはpH7.0で少なくとも50％の結合効率を有する固相母材に関する。
特に興味深い本発明の態様では、固相母材は本明細書中に記載の「標準的免疫グロブリン結合試験」において、pH1.0〜pH11.0の範囲内、特にpH3.0〜pH9.0の範囲内の少なくとも１つの溶媒pH値で、より特にはpH4.5またはpH7.0で、少なくとも50％、好ましくは少なくとも60％、より好ましくは少なくとも70％、特に少なくとも80％、例えば少なくとも90％の結合効率を有する。
更に、本発明の目的は、最終使用者が免疫グロブリンの各クローンについて個別に試験しなければならない多数の製品を使う代わりに１つの固相母材を当てにすることができるように、広範囲の免疫グロブリンを結合することができる固相母材を提供することである。
よって、基準（ｂ）に関して、固相母材は、「モノクローナル抗体アレイ結合試験」において、2.0〜10.0の範囲内、例えば3.0〜9.0の範囲内、例えば3.0〜7.0または6.0〜9.0の範囲内で試験した時に、試験した免疫グロブリンに対して少なくとも50％、例えば少なくとも60％、好ましくは少なくとも70％、特に少なくとも80％、特に少なくとも90％の平均結合効率を有するのが好ましい。典型的には、結合効率は２つのpH値、例えばpH4.5とpH7.0で測定され、次いでその２つのpH値のうちの１つを中心にして0.5の増分でpH値を変えることにより、最も有効な結合効率を与える最適値が求められる。
溶脱の低危険性と再生の可能性に関して興味深く且つ重要である母材の機能安定性は、リガンドの化学的構造により影響を受けることがあり、すなわち１Ｍ水酸化ナトリウムといった苛酷な再生条件に対する安定性はリガンド構造並びに母材主鎖および任意のスペーサー成分に依存する。
従って、基準（ｃ）に関して、1M NaOH中の固相母材の安定性（実施例８参照）は、本明細書中に記載の「標準的免疫グロブリン結合試験」に従って測定した時、遮光下で室温で７日間の1M NaOH中での母材のインキュベーションが、結合最大pH値より１pH単位低くから結合最大pH値より１pH単位高くまでのpH範囲での結合効率を、対応する未処理の母材に比べて50％未満、好ましくは25％未満だけ減少させるようなものであることが好ましい。好ましくは、減少が15％未満、例えば10％未満、特に５％未満である。
次の式：
Ｍ−ＳＰ１−Ｘ−Ａ−ＳＰ２−ＡＣＩＤ
（上式中、Ｍは母材主鎖を表し；ＳＰ１はスペーサーを表し；Ｘは−Ｏ−，−Ｓ−または−ＮＨ−を表し；Ａは単環式または二環式の置換されることがある芳香族または複素環式芳香族成分を表し；ＳＰ２は随意のスペーサーを表し；そしてＡＣＩＤは酸性基を表す）を有する複数の官能基を担持している機能化された母材主鎖を含んで成る固相母材であって、
リガンド−Ｌの分子量が500ダルトン以下であるという第一の条件を有する固相母材
は、それ自体新規であり（具体的には、リガンドとして、離液性塩と組み合わせて免疫グロブリンの単離に使用されている、K.L.Knudsen他,Analytical Biochemistry,第201巻,170頁,1992年およびWO92/16292中に開示された４−アミノ安息香酸を除く）、そしてそれらは免疫グロブリンの単離および／または精製に加えて一般にタンパク質および他の生体分子の単離および／または精製にも非常に適することが見出された。
更に、式Ｍ−ＳＰ１−Ｘ−Ａ−ＳＰ２−ＡＣＩＤの官能基を含んで成る上述の固相母材は、タンパク質および他の生体分子のpH依存性可逆的結合にも同様に適用できることが見出された。
かくして、本発明は、次の操作：
a）１または複数のタンパク質を含有し1.0〜6.0の範囲のpHおよび2.0以下のイオン強度に相当する総含塩量を有する溶液を、式：Ｍ−ＳＰ１−Ｘ−Ａ−ＳＰ２−ＡＣＩＤの固相母材と接触させ、それによりタンパク質の少なくとも一部が固相母材に結合された状態になり；
b）タンパク質が結合された固相母材を前記溶液から分離し；
c）所望により固相母材を洗浄し；そして
d）固相母材から１または複数のタンパク質を遊離させるために固相母材を溶離剤と接触させ、ここで施用される溶離剤が10％（v/v）未満の有機溶剤を含んで成る
を含んで成る方法も提供する。
タンパク質含有溶液のpHは、好ましくは1.0〜6.0、例えば2.0〜6.0、特に3.0〜5.5、例えば4.0〜5.0の範囲内であり、そして溶離剤のpHは6.0〜11、好ましくは6.0〜9.0の範囲内である。
免疫グロブリンの単離方法と同様に、タンパク質含有溶液の全塩分は好ましくは2.0以下、例えば0.05〜2,0の範囲内、例えば0.05〜1.4、特に0.05〜1.0の範囲内のイオン強度に相当し、そして／または離液性塩の濃度は好ましくは0.4Ｍ以下、例えば0.3Ｍ以下、特に0.2Ｍ以下、特に0.1Ｍ以下である。更に、上記と同様、接触段階（操作（ａ））でおよび／または洗浄段階（操作（ｃ））で負電荷を持つ洗浄剤を使用することが有利である。好ましくは、洗浄段階（操作（ｃ））が負電荷を持つ洗浄剤を含んで成る無機または有機塩緩衝液を使用することを含んで成る。
タンパク質および他の生体分子の単離方法は多数のタンパク質に使用することができ、その例はプロテアーゼ、例えばプロ酵素、トリプシン、キモトリプシン、サブチリシン、ペプシン、プラスミノーゲン、パパイン、レニン、トロンビンおよびエラスターゼ；リパーゼ、グルコシダーゼ；キシラナーゼ；レクチン；アルブミン；醗酵ブロスからのタンパク質；乳汁および乳清からのタンパク質；血液、血漿および血清からのタンパク質；魚廃棄物からのタンパク質；畜殺場廃棄物からのタンパク質、例えば器官および組織抽出物、例えばウシ腸アルカリホスファターゼ；並びに植物抽出物からのタンパク質、例えばジャガイモ、トマト、ヤシからのタンパク質、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼである。
固相母材の合成
一般的に固相母材は、それ自体既知の方法により、例えば固相母材をそれ自体既知の試薬で活性化した後で活性化母材にリガンドを結合せしめることにより、あるいは所望によりまず活性化母材にスペーサーを結合した後でリガンドを適当な縮合試薬によってスペーサーに結合せしめるか、またはスペーサーを第二の活性化後に該リガンドと結合せしめることによって、リガンドと母材の間にスペーサーＳＰ１を組み込むことにより、本発明の共有結合したリガンドを含んで成るように誘導体化することができる。
試薬の順序および選択は、カップリングさせようとする実際のリガンドと、例えば反応性基の含量、例えばヒドロキシル、アミノ、メルカプトおよびシラノール等の含量を考慮して誘導体化しようとする固相材料とに依存するだろう。ある場合には、固相母材の代わりにリガンドを活性化または誘導体化し、次いで誘導体化されたリガンドを固相母材と反応させることが好ましいかもしれない。
よって、本発明の固相母材を合成する好ましい方法では、固相母材を、まず固相母材と反応できそれによってリガンドとの次なる反応のために固相母材を活性化することができる試薬と反応させ、所望により活性化試薬を洗い流し、次いで活性化された固相母材をリガンド含有溶液と反応させ、そして所望により、過剰な反応体に対して母材を清浄化する１または複数の適当な溶液を使って、共有結合によって固定化されたリガンドを含んで成る固相母材を洗浄する。
ある場合には、２つの試薬を混合することにより活性化とリガンドのカップリングを併合して、反応を並行して起こさせることが可能な場合がある。これは、費用と時間を節約し且つ廃水の量を最少にするために非常に有利である。よって、活性化とカップリング段階は好ましくは１つの併合段階で実施される。
更に、活性化および／またはカップリング反応が反応媒質に有機溶剤を添加する必要なしに実施できれば、かなり有利である。それらの有機溶剤は、反応試薬を可溶化するためまたは反応性種の加水分解を確実に最小限に抑えておくためにしばしば使われる。しかしながら、有機溶剤の使用は、爆発の危険性、健康危害の危険性、廃棄問題および溶剤自体の比較的高い費用のため、工程の費用と危険性を増す。よって、活性化および／またはカップリング操作は反応媒質に何ら有機溶剤の添加なしに実施されるのが好ましい。
実施例
本発明を以下の実施例１〜15により例証する。
実施例１．固相の誘導体化
１Ａ）アガロースビーズのエピクロロヒドリン活性化
Hispanagarからのアガロースビーズの活性化：
・「高」レベル活性化：
アガロースビーズの１：１水中懸濁液（Hispanagar,６％アガローズビーズ，粒度100〜140μｍ）約1000mlを、ガラス濾過器上で脱イオン水で洗浄し、次いで１分間吸引排水した。湿潤だが吸引排水したアガロースビーズ700ｇを560mlの水と70mlの32.5％（w/v）水酸化ナトリウムの混合物中に秤量した。次いでこの懸濁液を90mlのエピクロロヒドリン（ALDRICHカタログ番号E105-5）に添加した後、かい形攪拌機を使って室温（20〜25℃）で６時間穏やかに攪拌した。次にアガロースビーズを吸引濾過器上で約20ｌの水で洗浄し、最後に水の中に懸濁した。活性化アガロースビーズは４℃で保存した時、この懸濁液中で数週間にわたり安定であることがわかった。
Porath,J.,Laas,T.,Janson,J.-C.,J.of Chromatography,第103巻,49-69頁,1975年およびSundberg,L.& Porath,J.,J.of Chromatography,第90巻,87-98頁,1974年に記載されたようなチオ硫酸滴定法により、活性化アガロースビーズ上の活性エポキシ基の濃度を測定した。この滴定からの結果は、活性化ビーズが湿潤だが吸引排水したビーズ１ｇあたり70μモルのエポキシ基濃度〔これは972μモル／ｇ乾燥物質または54μモル／ml湿潤沈降ビーズ（水溶液）に相当する〕を有することを示した。
・「低」レベル活性化：
活性エポキシ基の含量が低い母材の製造には、反応混合物が200ｇの湿潤だが吸引排水したアガロースビーズ、160mlの水、20mlの２Ｍ水酸化ナトリウムおよび11.5mlのエピクロロヒドリンから成ること以外は、上記と同じ手順に従って行った。
チオ硫酸滴定は、湿潤だが吸引排水したビーズ１ｇあたり21μモルのエポキシ基〔これは292μモル／ｇ乾燥物質または16μモル／ml湿潤沈降ビーズ（水溶液）に相当する〕の存在を示した。
PharmaciaおよびBioradからのアガロースビーズの活性化：
上記と同じ活性化手順をPharmaciaからのアガロースビーズ（Sepharose 4BおよびSepharose 6B）とBioradからのアガロースビーズ（Biogel A-5m Gel,粒度38〜75μmおよびBiogel A-15m Gel,粒度75〜150μm）に使用した。
それらの固相上の活性エポキシ基の滴定は次の結果を与えた：
排水したビーズ１ｇあたりのエポキシ基のμモル
Sepharose 4B                    40
Sepharose 6B                    52
Biogel A 5m Gel                 65
Biogel A 15m Gel                46
１Ｂ）Fractogelのエピクロロヒドリン活性化
MERCK社からのFractogel TSK HW-55（F）,粒度32〜63μmカタログ番号14981）とFractogel TSK HW-65（F）,粒度32〜63μm（カタログ番号14984）を、アガロースビーズについて上述したのと同じ手順でエピクロロヒドリンにより活性化した。それらの固相上の活性エポキシ基の生成濃度はそれぞれ、98および53μモル／ｇ排水済ビーズであった。
１Ｃ）アガロースビーズのブタンジオールジグリシジルエーテル活性化
Hispanagarからの６％アガロースビーズ100ｇをガラス濾過器上で水洗しそして吸引により１分間排水した。次いで該ビーズを75mlの0.6M NaOH中に懸濁し、その後75mlの１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテルを添加した。かい形攪拌器で室温で18時間穏やかに攪拌した後、母材を水（約３ｌ）で洗浄した。
母材中に取り込まれたエポキシ基の量のチオ硫酸滴定は、吸引排水した母材１ｇあたり55μモルの含有量を与えた。
１Ｄ）アガロースビーズのジビニルスルホン活性化
Hispanagarからのアガロースビーズの活性化
アガロースビーズの１：１水中懸濁液（Hispanagar,６％アガローズビーズ，粒度100〜140μｍ）約1400mlを、ガラス濾過器上で脱イオン水で洗浄し、次いで１分間吸引排水した。湿潤だが吸引排水したアガロースビーズ700ｇを350mlの0.5Ｍリン酸カリウム緩衝液pH11.5の中に秤量した。35mlのジビニルスルホンを添加し、そして得られた懸濁液をかい形攪拌機で室温で２時間攪拌した。次に母材をガラス漏斗上に移し、20ｌの水、５ｌの30％エタノール／水、最後に５ｌの水で洗浄した。得られた活性化母材は、チオ硫酸滴定法により測定すると、吸引排水したビーズ１ｇあたり45μモルの活性ビニル基の含量を有することがわかった。
１Ｅ）活性化母材へのリガンドのカップリング
カップリング一般手順
実施例１Ａ〜Ｄに言及した活性化母材への種々のリガンドのカップリングはいずれも、次の一般手順に従って実施した：
1）活性化ビーズを吸引濾過器上で２〜３容の脱イオン水で洗浄した。ガラス漏斗上でのわずかな吸引によりビーズを排水し、100mlのスクリューキャップ付プラスチック瓶の中に20ｇの湿潤だが排水したゲルを秤量した。
2）１ｇのリガンドを20mlの水に溶かし、そして２Ｍ水酸化ナトリウムを使ってpH10.5〜11.0に滴定した（溶解性の低い幾つかのリガンドについては、pHをpH11.5〜12.5に調整した）。得られた溶液を活性化母材と混合した。回転攪拌機上で室温で18時間穏やかに攪拌することにより、ゲルを溶液と共にインキュベートした。
3）次いでゲルを２ｌの水で洗浄した。
リガンドの水溶解性が低かった場合には、代わりに50％エタノール溶液を使用して溶解を行い、次いで２Ｍ水酸化ナトリウムを使ってpH10.5〜11.0に滴定した。この場合には、水での最終洗浄の代わりに、１ｌの50％エタノールによる洗浄段階に続き、１ｌの水による別の洗浄段階を実施した。
ジビニルスルホン活性化アガロースをカップリングに使用する時、カップリング混合物のpHは12.6の代わりにpH11.5に調整した。
可能な時は常に、炭素、水素、窒素、酸素および硫黄の元素分析により、カップリングしたリガンドの濃度を測定した。更に、カップリングしたリガンド上の特徴的な官能基の酸−塩基滴定により、カップリングしたリガンドの量を測定することが可能であった。
エポキシ活性化６％アガロースビーズへのリガンドのカップリング
上記に記載したカップリング一般手順に従って、次の化学物質（リガンド）をエピクロロヒドリン活性化６％アガロースビーズ（実施例１Ａ）（Hispanagar,粒度100〜140μｍ）にカップリングせしめた：２−ヒドロキシ安息香酸、３−ヒドロキシ安息香酸、４−ヒドロキシ安息香酸、２，５−ジヒドロキシ安息香酸、２−ヒドロキシ桂皮酸、３−ヒドロキシ桂皮酸、４−ヒドロキシ桂皮酸、３，５−ジニトロサリチル酸、２−ヒドロキシ−３−メトキシ安息香酸、３−ヒドロキシ−４−メトキシ安息香酸、２−ヒドロキシ−５−メトキシ安息香酸、４−ヒドロキシ−３−メトキシ安息香酸、３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシ安息香酸、２−アミノ−４，５−ジメトキシ安息香酸、５−スルホサリチル酸、５−クロロサリチル酸、４−ヒドロキシ−３，５−ジニトロ安息香酸、２−アミノ安息香酸、３−アミノ安息香酸、４−アミノ安息香酸、２−アミノ−３，５−ジヨード安息香酸、２−メルカプト安息香酸、２−メルカプトニコチン酸、アニリン−２−スルホン酸、２−ピリジルヒドロキシメタンスルホン酸、４−アセトアミドフェノール、５−メルカプト−１−テトラゾール酢酸、１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸、３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸、２−ヒドロキシ−１−ナフトエ酸、２，３−ピリジンジカルボン酸、４−ピリジルチオ酢酸、２−ピリミジルチオ酢酸、２−メルカプトキノリン、イミダゾール、２−メルカプトイミダゾール、２−メルカプト−１−メチルイミダゾール、３−メルカプト−１，２，４−トリアゾール、５−メルカプト−１−メチルテトラゾール、２−メルカプトチアゾリン、２−メルカプト−５−メチル−１，３，４−チアジアゾール、２，５−ジメルカプト−１，３，４−チアジアゾール、ベンゾイミダゾール、２−ヒドロキシベンゾイミダゾール、２−アミノベンゾイミダゾール、２−メルカプトベンズイミダゾール、２−メルカプト−５−ニトロベンゾイミダゾール、ベンゾチアゾール、２−アミノベンゾチアゾール、２−アミノ−６−ニトロベンゾチアゾール、２−アミノ−６−エトキシベンゾチアゾール、２−メルカプトベンゾチアゾール、６−エトキシ−２−メルカプトベンゾチアゾール、６−アミノ−２，５−ジヒドロイミダゾ〔２，１−ｂ〕ベンゾチアゾール、２−メルカプトベンゾオキサゾール、２−（２−ヒドロキシフェニル）ベンゾオキサゾール、フェノール、２−クロロフェノール、３−クロロフェノール、４−クロロフェノール、２，４，６−トリメチルフェノール、２，３，５−トリメチルフェノール、４−メトキシフェノール、２，６−ジメトキシフェノール、３，４，５−トリメトキシフェノール、チオフェノール、４−クロロチオフェノール、２−アミノチオフェノール、ベンジルメルカプタン、４−メトキシベンジルメルカプタン、４−メチルチオ−ｍ−クレゾール、アニリン、２，４−ジメチルアニリン、３，５−ジメトキシアニリン、３，４，５−トリメトキシアニリン、２−メチルメルカプトアニリン、４−メチルメルカプトアニリン、２，４，６−トリメチル−ｍ−フェニレンジアミン、２，３−ジシアノヒドロキノン、２−フェニルフェノール、４−フェニルフェノール、４−ベンジルオキシフェノール、４，４−ジアミノフェニルスルホン、��−ヒドロキシピリジン、２，３−ジヒドロキシピリジン、２，６−ジヒドロキシピリジン、２−ヒドロキシ−５−ニトロピリジン、３−シアノ−４，６−ジメチル−２−ヒドロキシピリジン、４−ヒドロキシ−２−メルカプトピリジン、２−メルカプトピリジン、２−アミノピリジン、４−アミノ−２−クロロ安息香酸、３−アミノ−４−クロロ安息香酸、２−アミノ−５−クロロ安息香酸、２−アミノ−４−クロロ安息香酸、２−アミノ−５−ニトロ安息香酸、４−アミノサリチル酸、５−アミノサリチル酸、３，４−ジアミノ安息香酸、３，５−ジアミノ安息香酸、４−アミノメチル安息香酸、５−アミノイソフタル酸、４−アミノフタル酸、４−アミノ馬尿酸、３−アミノ−１，２，４−トリアゾール−５−カルボン酸、１−アミノ−２−ナフトール−４−スルホン酸、２−（４−アミノフェニルチオ）酢酸、２−アミノ−４−ニトロフェノール、４−アミノフェニル酢酸、１−アミノシクロヘキサンカルボン酸、２−アミノベンジルアルコール。
それぞれの母材上の凍結乾燥試料に対して元素分析により決定した時のリガンド濃度は一般に全て、湿潤だが吸引排水した母材１ｇあたりリガンド50〜70μモルの範囲内であった。
１Ｆ）様々な固相へのリガンドのカップリング
次の別の固相：低レベルに活性化したHispanagarからのエポキシ活性化アガロースビーズ（実施例１Ａ）、PharmaciaとBioradからのエポキシ活性化アガロースビーズ（実施例１Ａ）、Merckからのエポキシ活性化Fractogel（実施例１Ｂ）、Hispanagarからのブタンジオールジグリシジルエーテル活性化アガロースビーズ（実施例１Ｃ）およびHispanagarからのジビニルスルホン活性化アガロースビーズ（実施例１Ｄ）の各々に２−メルカプト安息香酸（２−ＭＢＡ）、４−アミノ安息香酸（４−ＡＢＡ）および２−メルカプトベンゾイミダゾール（２−ＭＢＩ）をカップリングせしめた。全カップリングが実施例１−Ｅに記載のカップリング一般手順に従った。
得られたリガンド濃度を各母材の凍結乾燥試料の元素分析により測定し、そして湿潤だが吸引乾燥した母材１ｇあたりのリガンドのμモルとして計算し表示した。（湿潤だが吸引乾燥した母材１ｇは沈降したビーズ約1.1〜1.3mlに相当するが、乾燥物質含量はビーズの型によってかなり大きく異なり得る。）
合成固相母材上のリガンド濃度：
（湿潤だが吸引排水したビーズ１ｇあたりのμモルとして表示）
低レベルに活性化したHispanagarからのエポキシ活性化アガロースビーズ（実施例１Ａ）：
0004425994.tif 000002
PharmaciaとBioradからのエポキシ活性化アガロースビーズ（実施例１Ａ）：
0004425994.tif 000003
Merckからのエポキシ活性化Fractogel（実施例１Ｂ）：
0004425994.tif 000004
Hispanagarからのブタンジオールジグリシジルエーテル活性化アガロースビーズ（実施例１Ｃ）：
0004425994.tif 000005
Hispanagarからのジビニルスルホン活性化アガロースビーズ（実施例１Ｄ）：
0004425994.tif 000006
実施例２．標準的免疫グロブリン結合試験
実施例１に従って合成した種々の固相母材を全て試験するために、いつでも再現できる標準試験を考案した。この試験は、原料の組成とpHに関して標準化された条件下で様々な母材の免疫グロブリン結合効率を測定できるようにデザインした。
希薄細胞培養上清からのモノクローナル抗体の単離に対して試験の最大適切性を確保するために、典型的な細胞培養培地をウシ胎児血清と混合することによってハイブリドーマ細胞を培養するのに使用する条件を模倣し、そしてこの「人工培養上清」に精製済免疫グロブリンを添加した。全ての試薬は標準試薬であり且つ市販のものである。
「人工培養上清」の定義
溶液250mlにつき：
・236.5mlの細胞培養培地DMEM（Imperial,UK,カタログNo.7-385-14）
・12.5mlのウシ胎児血清（Life Technologies,Denmark,カタログNo.10106-060）
・1.0mlの精製ポリクローナルマウスIgＧ（Sigma,USA,カタログNo.I-8765,10mg／ml）
・0.244gのアジ化ナトリウム（Sigma,USA,カタログNo.S-2002）
を有し、40μgマウスIgＧ／ml、５％ウシ胎児血清および15mMアジ化ナトリウムを含み且つ約8.0のpHを有する溶液を与えた。
この溶液は免疫グロブリンの劣化なしに４℃で数週間安定であることがわかった。
標準手順
1）試験する母材約100mgをガラス漏斗上で10mlの脱イオン水で洗浄した後、60秒間吸引排水する。3.0mlの試験管に湿潤（排水済）固相母材100mgを秤量し、母材を試験しようとするpH値を有する「人工培養上清」2.50mlを添加する。試験管をストッパーで密封し、懸濁液をローラーミキサー上で室温（20〜25℃）で２時間インキュベートする。次いで試験管を2000RPMで５分間遠心して母材を沈降させる。次いで母材粒子が持ち越されないようにしながら、別の試験管にピペットで移すことにより上清を固相母材から分離する。その後、沈澱用抗体としてウサギ抗マウス免疫グロブリン（DAKO,Denmark,カタログNo.Z109）を使って、単純放射状免疫拡散法（D.Catty & C.Raykundalia“Antibodies-a practical approach”,第Ｉ巻,137-168頁,1988）により上清中の未結合の免疫グロブリンの濃度を測定する。
母材に結合したマウス免疫グロブリンの比率を次の式に従って計算した：
結合した比率＝〔１−（上清中濃度／出発原料中濃度）〕×100％
この方法の精度は±５％より高い。
２Ａ）高免疫グロブリン結合効率のスクリーニング
結合効率を試験するための上記標準手順を、Hispanagarからのエピクロロヒドリン活性化６％アガロースビーズを基材として使用しそして実施例１Ａと１Ｅに従って合成した広範囲の異なる固相母材を試験するために使用した。
pH4.5とpH7.0でそれぞれ実施した結合試験の結果を下の表Ｉに与える。
0004425994.tif 000007
0004425994.tif 000008
0004425994.tif 000009
0004425994.tif 000010
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表から明らかなように、免疫グロアブリンを全く結合しないリガンドもあるし、80〜100％の範囲の非常に効率的な結合を示すものもあり、そして30〜60％の範囲の中間的な結合効率を示すリガンドもある。
１−アミノシクロヘキサンカルボン酸（参考）からの結果より明らかなように、効率的結合には芳香族または複素環式芳香族成分が必要であると思われる。
１Ｆ）別の固相へのリガンドのカップリング
次の別の固相：低レベルに活性化したHispanagarからのエポキシ活性化アガロースビーズ（実施例１Ａ）、PharmaciaとBioradからのエポキシ活性化アガロースビーズ（実施例１Ａ）、Merckからのエポキシ活性化Fractogel（実施例１Ｂ）、Hispanagarからのブタンジオールジグリシジルエーテル活性化アガロースビーズ（実施例１Ｃ）およびHispanagarからのジビニルスルホン活性化アガロースビーズ（実施例１Ｄ）の各々に、２−メルカプト安息香酸（２−ＭＢＡ）、４−アミノ安息香酸（４−ＡＢＡ）および２−メルカプトベンゾイミダゾール（２−ＭＢＩ）をカップリングせしめた。
いずれのカップリングも実施例１Ｅに記載のカップリング一般手順に従った。
得られたリガンド濃度を各母材の凍結乾燥試料の元素分析により測定し、そして湿潤だが吸引乾燥した母材１ｇあたりのリガンドのμモルとして計算し表示した。（湿潤であるが吸引乾燥した母材１ｇは沈降したビーズ約1.1〜1.3mlに相当するが、乾燥物質含量はビーズの型によってかなり大きく異なり得る。）
合成固相母材のリガンド濃度：
（湿潤だが吸引排水したビーズ１ｇあたりのμモルとして表示）
低レベルに活性化したHispanagarからのエポキシ活性化アガロースビーズ（実施例１Ａ）：
0004425994.tif 000012
PharmaciaとBioradからのエポキシ活性化アガロースビーズ（実施例１Ａ）：
0004425994.tif 000013
Merckからのエポキシ活性化Fractogel（実施例１−Ｂ）：
0004425994.tif 000014
Hispanagarからのブタンジオールジグリシジルエーテル活性化アガロースビーズ（実施例１Ｃ）：
0004425994.tif 000015
Hispanagarからのジビニルスルホン活性化アガロースビーズ（実施例１Ｄ）：
0004425994.tif 000016
実施例３．モノクローナル抗体アレイ結合試験
本実施例は、免疫グロブリン精製のための従来技術の固相母材と本発明の固相母材との間の結合効率の相違を例証する。
比較実験のために、７種類のモノクローナル抗体を生産することができる７種類の細胞系をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）より獲得し、そして下記の標準手順に従って増殖させた。その後、次の固相：プロテインＡアガロース（従来技術母材）、Avidchrom（従来技術母材）、並びにエポキシ活性化２−メルカプト安息香酸アガロース、４−アミノ安息香酸アガロースおよび２−メルカプトベンゾイミダゾールアガロース（以上本発明母材）の各々を使って、各モノクローナル抗体の結合効率を試験した。
この実験は、５種類の固相と７種類の商業的に入手可能な細胞系からの培養上清とのバッチ式インキュベーションの間に抗体結合効率を測定するようにデザインした。
モノクローナル抗体：
・細胞系：ATCCより入手可能な次の７種類の細胞系を標準試験に含めた：
0004425994.tif 000017
・培養：この実験に使用するモノクローナル抗体培養上清は、ウシ胎児血清を含む培地〔RPMI-X（Medicult,Denmark,カタログNo.20230500）＋５％ウシ胎児血清（Imperial,United Kingdom,カタログNo.83041）〕中で対応するマウスおよびラットハイブリドーマ細胞を培養することにより調製した。５つの細胞系を培養するのに使う方法論は従来技術において十分確立されておりそしてG.Brown & N.R.Ling,“Antibodies-a practical approach”第Ｉ巻,81〜104頁（1988）に記載されている。３週間培養した後、遠心分離により細胞を除去し、上清を濾過して残留粒子を取り除いた。沈澱用抗体としてウサギ抗マウス免疫グロブリンおよびウサギ抗ラット免疫グロブリン（DAKO,Denmark,カタログNo.Z109およびZ147）を使って単純放射状免疫拡散法（D.Catty & C.Raykundalia,“Antibodies-a practical approach”第Ｉ巻,137〜168頁,1988年に記載）により５種類の培養上清中のモノクローナル抗体の濃度を測定すると、全てのクローンで30〜60μg/mlの範囲内であることがわかった。その後、30μg/mlの最終濃度に達するように希釈することにより、各培養上清中のモノクローナル抗体の含量を標準化した。全ての上清に対して同じ条件を保証するために、希釈は５％ウシ胎児血清を含む培地を使って行った。
・固相：Repligen Corporation,USAからのプロテインＡアガロース（カタログNo.IPA-300,ロットNo.RN2917）；Unisyn Technolo-gies,USAからのAvidchrom（カタログNo.3100-0025,ロットNo.96-0404-1）；並びにHispanagar,Spainからのエピクロロヒドリン活性化６％アガロースビーズを基材として使用しそして実施例１Ａと１Ｅに従って合成した、２−メルカプト安息香酸アガロース、４−アミノ安息香酸アガロースおよび２−メルカプトベンゾイミダゾールアガロース。リガンド濃度を元素分析により測定すると、湿潤だが排水した母材１ｇあたりそれぞれ65、69および69μモルであることがわかった（凍結乾燥試料について元素分析により測定した時の乾燥物質１ｇあたり903、958および958μモルに相当する）。
次の手順に従って、７種類のモノクローナル抗体上清（30μg抗体／mlに標準化したもの）と共にインキュベートすることにより、上記５種類の固相母材をそれらのモノクローナル結合効率について試験した。
「モノクローナル抗体アレイ結合試験」の標準手順：
試験すべき母材約100mgをガラス漏斗上で10mlの脱イオン水で洗浄した後、60秒間吸引排水する。3.0mlの試験管に湿潤（排水済）固相母材100mgを秤量し、母材を試験しようとするpH値に調整した4.0mlのモノクローナル抗体培養上清を添加する。試験管をストッパーで密封し、懸濁液をローラーミキサー上で室温（20〜25℃）で２時間インキュベートする。次いで試験管を2000RPMで５分間遠心して母材を沈降させる。次いで母材粒子が持ち越されないようにしながら、別の試験管にピペットで移すことにより上清を固相母材から分離する。この後、上清中の未結合の免疫グロブリンの濃度を単純放射状免疫拡散法により測定する。
次の式に従って母材に結合したモノクローナル抗体の比率を算出する：
結合した比率＝〔１−（上清中の濃度／30μg/ml）〕×100％
この方法の精度は±５％より高い。
種々の固相についての培養上清のｐＨ調整法：
・プロテインＡアガロース：0.05Ｍの最終TRIS濃度へのTRIS／HClの添加により、モノクローナル抗体培養上清をpH8.2に調整した。
・Avichrom：0.05Ｍの最終リン酸塩濃度へのリン酸水素カリウム／HClの添加により、モノクローナル抗体培養上清をpH7.4に調整した。
・２−メルカプト安息香酸および４−アミノ安息香酸アガロース：0.05Ｍの最終酢酸濃度への酢酸／水酸化ナトリウムの添加により、モノクローナル抗体培養上清をpH4.5に調整した。
・２−メルカプトベンゾイミダゾールアガロース：0.05Ｍの最終リン酸塩濃度へのリン酸水素カリウム／HClの添加により、モノクローナル抗体培養上清をpH7.0に調整した。
結合効率％
0004425994.tif 000018
表からわかるように、本発明の固相母材、すなわち２−メルカプト安息香酸アガロース、４−アミノ安息香酸アガロースおよび２−メルカプトベンゾイミダゾールアガロースは、種々のクローンで非常に一定した高い結合効率（典型的には50〜100％結合の範囲）を示し、一方で従来技術の固相母材、すなわちプロテインＡアガロースおよびAvidchromは、より変動的な結合効率（0〜100％結合の範囲）を示した。各吸着剤について平均結合効率を計算すると、それらのデータから、52％と53％の平均結合効率を有する従来技術吸着剤は、75〜95％の範囲の平均結合効率を有する本発明の吸着剤よりも有意に低い効率であることがわかる。
実施例４．リガンドとしての２−メルカプト安息香酸
様々な結合および洗浄条件下での免疫グロブリンの単離
表Ｉの結果から示唆されるように、２−メルカプト安息香酸は希薄培養上清からのモノクローナル抗体の単離・精製にとって非常に興味深いリガンドであるようだ。従って、最大の結合効率並びに溶出液中の抗体の収率および純度を達成するように最適の結合および洗浄条件を確立することを目指して、実施例２に記載の「人工培養上清」を使用してこの固相母材の更なる研究を実施した。
２−メルカプト安息香酸アガロースは、Hispanagarからのエピクロロヒドリン活性化６％アガロースビーズを基剤として使用し、そして実施例１Ａと１Ｅに記載の通りに合成した。２つの異なる方法によりリガンド濃度を測定した時、元素分析により測定すると湿潤だが排水した母材１ｇあたり65μモルであり、また固定化されたリガンドの安息香酸部分の酸−塩基滴定により測定すると60μモルであることがわかった。
一般的に実験は次の手順に従って実施した。
1）２−メルカプト安息香酸アガロースの少量アリコートを、ガラス漏斗上で穏やかに吸引しながら水（特に断らない限り、全ての水がMilli Q水の水質であった）で洗浄し、次いで１分間軽く吸引して余分な水を排水した。
2）次いで湿潤だが排水した母材0.4gを試験管に秤量し、そこにその特定実験に対して特定のpH値を有する「人工培養上清」10mlを添加した。その後、更に追加の添加剤と共にまたは伴わずに、懸濁液をローラーミキサー上で室温で２時間インキュベートして免疫グロブリンの効率的結合を確実にした。
3）インキュベーション後、母材を内径５mmのカラムに移し、余分な「人工培地」を排水し、そして特定実験に特定のスキームに従って洗浄した。洗浄は、カラムに４×４ml洗浄緩衝液を添加しそしてカラムからの素通り液を１画分に集めることにより行った。
4）結合した免疫グロブリンの最終溶出は、カラムに４×2.5mlの緩衝液を添加しそして溶出液を１画分に集めることにより行った。当該実験にはポンプを使用せず、全てのカラムを重力のみによって流した（平均流速は0.5〜1.0ml／分）。
5）結合させた後の上清中の未結合画分、洗浄画分および溶出液画分の間の免疫グロブリンの相対分布を調べるために分析を行った。これは、沈澱用抗体としてウサギ抗マウス免疫グロブリン（DAKO A/S,Denmark,カタログNo.Z109）を使って単純放射状免疫拡散法（D.Catty & C.Raykundalia,“Antibodies-a practical approach”第Ｉ巻,137〜168頁,1988）により行った。
次いで、上清中に存在する未結合の免疫グロブリンの量から結合効率を計算し、原料中の母材に添加した全量の％として表した。
収率は、溶出液画分に検出された免疫グロブリン添加量の％として計算した（即ち、100％の収率は溶出液中１mgのIgＧに等しい）。
溶出した免疫グロブリンの純度は、還元条件下でのSDS-PAGE（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド電気泳動）に続き、タンパク質バンドのクーマシーブリリアントブルー染色により分析した。（Precastゲル4-20％トリス−グリシン、１mm、カタログNo.EC6025、30mAで１時間泳動；トリス−グリシン−ＳＤＳ泳動緩衝液、カタログNo.LC2675；トリス−グリシン試料緩衝液、カタログNo.LC2676；クーマシー染色キットLC6025、以上すべてNovex,USAより）
全タンパク質含量の％として表される純度は、クーマシー染色しそして乾燥したポリアクリルアミドゲルのスキャンニングと画像処理により決定した。このためには、Kem-En-Tec A/S,Denmarkから入手可能なCREAMシステム（カタログNo.6010＋6050）を使った。
４Ａ）様々なpH値で結合を実施することの効果
２−メルカプト安息香酸母材が「人工培養上清」から免疫グロブリンを効率的に結合するであろうpH範囲を確立するために、以下の実験を行った。実施例２の表Ｉに示したように、この母材はpH4.5では100％を結合しそしてpH7.0では０％を結合する。この実験では、結合を3.0〜6.5のpH範囲で行った時の、溶出液の結合効率、収率および純度を測定する。どの場合も、使用する洗浄緩衝液は、１Ｍ水酸化ナトリウムを使って、結合のpHと同じpHに調整した10mMクエン酸緩衝液であった。使用する溶出緩衝液はどの場合も0.05Ｍホウ酸／NaOH+0.5Ｍ塩化ナトリウム,pH8.6であった。
結果：
0004425994.tif 000019
表から明らかなように、効率的結合は6.0未満のpH値で達成され、pH4.5では100％に達する。同時に、結合段階を4.5より高いpHで実施すれば比較的高い純度が得られることも示唆される。
４Ｂ）様々な洗浄手順／洗浄緩衝液pHの効果
収率を高レベルに維持しながら溶出液の純度を最適にすることを目指して、一連の実験を行った。このために、様々な洗浄手順を試験した。全ての試験は、結合のpHとしてpH4.5を使って実施し、そして全ての溶出は0.05Ｍホウ酸／NaOH+0.5Ｍ NaCl,pH8.6を用いて行った。
結果：
0004425994.tif 000020
表からわかるように、溶出液の純度は高pHで洗浄することにより増加させることができるが、pH5.5より上のpH増加は収率を有意に低下させる。
４Ｃ）高pHでの様々な洗浄手順／離液性塩の効果
様々な離液性塩を含有するpH8.0の一連の洗浄緩衝液を使用して、収率の有意な低下なしに溶出液の純度を向上させる洗浄緩衝液の能力について試験すること以外は、実施例３Ｂに記載した通りに実験を行った。
結果：
0004425994.tif 000021
上記結果は、結合pHよりも高いpHと組み合わせた洗浄緩衝液中の離液性塩の存在が、収率を減少させることなく溶出液の純度を有意に増加させ得ることを示す。この結果を得るためには、或る濃度の離液性塩が必要であることも明白である。低すぎる濃度は洗浄画分中への免疫グロブリンの損失を引き起こし、これは非常に低い収率をもたらす。理解できるように、必要な濃度は離液性塩の性質に依存し、例えばホフマイスター系列（本明細書中に引用されるGagnonを参照のこと）によると強離液性塩と見なされる硫酸アンモニウムは、溶出液中の高収率を確保するためにわずか約1.0〜1.1Ｍの濃度を有する必要があるのに対し、ホフマイスター系列によると弱い離液性塩と見なされる塩化ナトリウムは、収率が妥当なレベルに増加するより前に約４Ｍの濃度を有する必要がある。
４Ｄ）種々の洗浄手順／種々の添加剤の効果
上記（実施例４Ｂと４Ｃ）と同様に行う試験において、洗浄緩衝液に洗浄剤および他の添加剤を添加することの効果を調べた。
結果：
0004425994.tif 000022
上記実験より得られた結果は、負電荷を持つ洗浄剤（例えばオクタンスルホン酸、ヘキサンスルホン酸、硫酸オクチルおよびラウリルサルコシン酸ナトリウム）を含む緩衝液で母材を洗浄することにより得られた溶出液の純度に正の効果を示すのに対して、Tween20やPluronic F68のような電荷を持たない洗浄剤の添加は溶出免疫グロブリンの純度にほとんどまたは全く効果がないらしいことを明白に示す。同様に、アルブミン（不要な不純物）に対して高い結合親和力を有することが知られているブロモフェノールブルーも、生成物の収率を傷つけることなく純度に有意な効果を有することがわかる。更に、得られる効果は、洗浄緩衝液が高濃度の離液性塩を含むかどうかに加えて、存在する場合には、使用する離液性塩の選択とは無関係であるように見える。
４Ｅ）結合中の種々の添加剤の効果
この実験は、２−メルカプト安息香酸アガロースとのインキュベーション中に「人工培養上清」に種々の洗浄剤および他の化学物質を添加することの純度および収率に対する効果を調べるために実施した。全ての試験において、結合のpHはpH5.0であり、使用する洗浄緩衝液は1.1M硫酸アンモニウム／NaOH,pH8.0であり、そして溶出緩衝液は0.05Mホウ酸／NaOH＋0.5M塩化ナトリウム,pH8.6であった。それ以外は上記の一般手順に記載した通りに実験を実施した。
結果：
0004425994.tif 000023
上記結果は、２−メルカプト安息香酸アガロースとのインキュベーション前に「人工培養上清」への或る種の負電荷を持つ洗浄剤（または両親媒性物質）の添加が、溶出液の最終純度に有意な影響を有することを示す。これは例えば、カプロン酸およびカプリル酸並びにラウリルサルコシン酸塩のような物質の場合であり、それに対して安息香酸、ラウリルスルホベタイン、スベリン酸、セバシン酸およびオクタンスルホン酸のような他の負電荷を有する物質は試験した濃度において非常に小さな効果を有するように見える。中性洗浄剤であるTween20や陽性洗浄剤１−オクチル−Ｎ−メチルグルカミンは全く効果がないらしいことも見て取れる。
４Ｆ）原料へのラウリルサルコシン酸ナトリウムの添加と組み合わせた種々の洗浄緩衝液の効果
この実験は、負電荷を持つ洗浄剤の原料への添加を一連の種々の洗浄緩衝液組成と組み合わせることの効果を証明する。全ての実験において、２−メルカプト安息香酸アガロースと混合する前に「人工培養上清」に１mg／mlのラウリルサルコシン酸ナトリウムを添加し、結合のpHはpH5.0であり、そして溶出緩衝液はどの場合でも0.05Mホウ酸／NaOH＋0.5M塩化ナトリウム,pH8.6であった。それ以外は上述した一般手順に従った。
結果：
0004425994.tif 000024
実施例５．リガンドとしての４−アミノ安息香酸
種々の条件下でのモノクロナール抗体の単離
４−アミノ安息香酸は、モノクローナル抗体精製に際して使用するのに非常に興味深いと思われる本発明の別の芳香族酸である（表Ｉ，実施例２）。下記試験は、Hispanagarからの６％アガロースを基剤として使用しそして実施例１Ａと１Ｅに従って合成した４−アミノ安息香酸アガロースの性能に対する種々の結合および洗浄条件の影響を実証する。使用する母材を元素分析により分析すると、湿潤だが排水した母材１mlあたり69μモルの４−アミノ安息香酸基の含有量を有すると測定された。
試験は実施例４の一般手順に記載した通りに実施した。
５Ａ）種々のpH値で結合を行うことの効果
４−アミノ安息香酸母材が「人工培養上清」から免疫グロブリンを効率的に結合するであろうpH範囲を確立するために次の実験を行った。実施例２の表１に示されるように、この母材はpH4.5で90％を結合しそしてpH7.0では０％を結合する。本実験では、結合をpH範囲4.0〜6.5内で行った時の溶出液の結合効率、収率および純度を測定する。全ての場合、使用する洗浄緩衝液は１Ｍ水酸化ナトリウムで結合のpHと同じpHに調整した10mMクエン酸緩衝液であった。使用する溶出緩衝液はどの場合も0.05Mホウ酸／NaOH＋0.5M塩化ナトリウムpH8.6であった。
結果：
0004425994.tif 000025
表から明らかなように、効率的結合は5.5より低いpHで達成され、pH4.5では90％に達する。同時に、結合段階を4.5より高いpHで行うと比較的高い純度が得られることも示される。
５Ｂ）種々の洗浄操作／洗浄緩衝液pHの効果
収率を高レベルに維持しながら溶出液の純度を最適化するという目的で、一連の試験を行った。この目的上、ある範囲の種々の洗浄操作を試験した。全ての試験は結合のpHと同じpH4.5で行い、全ての溶出は0.05Mホウ酸／NaOH＋0.5M NaCl pH8.6を使って行った。
結果：
0004425994.tif 000026
表からわかるように、より高いpHで洗浄することにより溶出液の純度を増加させることができるが、pH6.0より高いpHへの増加は収率を有意に減少させる。
実施例６．２−メルカプトニコチン酸
種々の条件下でのモノクローナル抗体の単離
２−メルカプトニコチン酸は、モノクローナル抗体精製に際して使用するのに非常に興味深いと思われる本発明の別の芳香族酸である（表Ｉ，実施例２）。次の試験は、Hispanagarからのエピクロロヒドリン活性化６％アガロースを基剤として使用しそして実施例１Ａと１Ｅに従って合成した２−メルカプトニコチン酸アガロースの性能に対する種々の結合および洗浄条件の影響を実証する。使用する母材を元素分析により分析すると、湿潤だが排水した母材１mlあたり63μモルの２−メルカプトニコチン酸基の含有量を有すると測定された。
試験は実施例４の一般手順に記載された通りに実施した。
それらの２つの試験において、洗浄および溶出条件を一定に維持しながら結合のpHを変えることの効果を調べた。どちらの場合も洗浄緩衝液は1.1M硫酸アンモニウム／NaOH pH8.0＋5mg/ml硫酸オクチルであり、そして溶出緩衝液は0.05Mホウ酸／NaOH pH8.6＋0.5M塩化ナトリウムであった。
「人工培養上清」は１Ｍ塩酸を使ってそれぞれpH4.5および5.0に調整し、その他の添加は行わなかった。
結果：
0004425994.tif 000027
上記から明らかなように、両結合pH値において溶出液中の免疫グロブリンの良好な収率を与えるが、溶出される免疫グロブリンの純度は、結合pHをpH4.5からpH5.0に上昇させることにより有意に増加する。
原料にラウリルサルコシン酸ナトリウムを添加することの効果
次の試験では、２つの異なるpH値で「人工培養上清」に様々な量のラウリルサルコシン酸ナトリウムを添加することの効果を調べる。全ての試験において、使用する洗浄緩衝液は1.1M硫酸アンモニウム／NaOH pH7.5であり、そして溶出緩衝液は0.05Mホウ酸／NaOH pH8.6＋0.5M塩化ナトリウムであった。
固相母材と混合する前に、「人工培養上清」に３段階の濃度にラウリルサルコシン酸ナトリウムを添加し、次いで１Ｍ塩酸でそれぞれpH4,5とpH5.0に調整した。
結果
pH4.5での結合
0004425994.tif 000028
pH5.0での結合
0004425994.tif 000029
実施例７．２−メルカプトベンゾイミダゾール
モノクローナル抗体の単離
表Ｉに指摘されるように、２−メルカプトベンゾイミダゾールは免疫グロブリンの単離用リガンドの別の興味深い基である（ベンゾイミダゾール、ベンゾオキサゾールおよびベンゾチアゾール）。本実施例は、実施例２に記載の「人工培養上清」からの免疫グロブリンの結合および単離へのこのリガンドの適用を例証する。
２−メルカプトベンゾイミダゾールアガロースは、Hispanagarからのエピクロロヒドリン活性化６％アガロースを基剤として使用しそして実施例１Ａと１Ｅに従って合成した。リガンド濃度を元素分析により分析すると、湿潤だが排水した母材１gあたり69μモルであると測定された。
下記の試験において、種々の濃度の添加剤ポリビニルピロリドンを含む「人工培養上清」と共に２−メルカプトベンゾイミダゾールアガロースをインキュベートすることにより得られる収率と純度を、実施例４に記載の一般手順に従って測定する。結合のpHは塩酸でpH4.5に調整し、洗浄緩衝液は0.01Mリン酸カリウム＋0.5M塩化ナトリウムpH7.5であり、そして溶出緩衝液は0.01Mクエン酸／NaOH pH3.5であった。
結果
0004425994.tif 000030
上記結果は、２−メルカプトベンゾイミダゾールアガロースが適用されたモノクローナル抗体をほとんど全部結合することができ（すなわち95％の収率を与える）、且つ同時に実質的に精製された溶出液を与えることを示す。ポリビニルピロリドンのような物質を添加することにより純度を更に増加させることができる。
実施例８．高pHでの安定性
２−メルカプトベンゾイミダゾールを、実施例１Ａに記載の通りに調製したエピクロロヒドリン活性化６％アガロースビーズ（Hispanagar）および実施例１Ｄに従って調製したジビニルスルホン活性化６％アガロースビーズ（Hispanagar）にカップリングせしめた。両カップリング手順とも実施例１Ｅに従った。
２つの母材の２−メルカプトベンゾイミダゾールの含有量を元素分析により測定すると、それぞれ湿潤の（排水した）母材１ｇあたり69μモルおよび湿潤の（排水した）母材１mlあたり42μモルであると測定された。
下記の手順に従うことにより、両母材を１Ｍ水酸化ナトリウム中でのインキュベーションに対するそれらの安定性について試験した。
標準的安定性試験
Ｉ）試験する予定の母材約1000mgをガラス漏斗上で100mlの脱イオン水で洗浄した後、60秒間吸引排水する。湿潤の（排水した）固相母材500mgを「NaOH」というラベルを付けた10.0mlの試験管に秤量し、9.0mlの１Ｍ水酸化ナトリウムを添加した後、１分間穏やかに混合する。別の湿潤の（排水した）固相母材500mgを「水」というラベルを付けた10mlの試験管に秤量し、9.0mlの水を加えた後、１分間穏やかに混合する。
試験管をストッパーで密封し、室温で（20〜25℃）７日間遮光保存する。
次いで両母材を別々にガラス漏斗上で200mlの水で洗浄した後、60秒間吸引排水する。
II）各々の母材を実施例２に記載した「標準的免疫グロブリン試験」により試験する。
１Ｍ水酸化ナトリウムに対する固相母材の安定性を、次の式：
安定性＝（NaOH処理した母材の結合効率／対照の結合効率）×100％
に従って計算し、水だけの中でインキュベートした対照に比較した百分率として表した。
結果
0004425994.tif 000031
この結果は、ジビニルスルホン活性化アガロースを使って製造した母材がNaOH中での安定性が乏しいのに対して、エポキシ活性化アガロースは安定な固相母材を与えることを示す。更に、２−メルカプトベンゾイミダゾールはそれ自体安定なリガンドであることが証明される。
実施例９．様々な種からのポリクローナル抗体の単離
リガンドとしての２−メルカプト安息香酸
本実施例は、様々な種からのポリクローナル抗体に対する２−メルカプト安息香酸アガロースの結合効率並びに溶出液中の該抗体の収率および純度を例証する。この実験には５つの別の種からの血清を使用した。
ポリクローナル抗体：使用するポリクローナル抗体は次の種からの正常血清に由来した：ヤギ、ウマ、ウサギ、ブタおよびヒト。それらの血清は新鮮な血液を室温で24時間凝固させた後に穏やかな遠心により得られた。
固相母材：２−メルカプト安息香酸アガロースはHispanagarからのエポキシ活性化６％アガロースビーズを基材として使用し、実施例１Ａと１Ｅに記載の通りに合成した。リガンド濃度を元素分析により測定すると、湿潤だが排水した母材１ｇあたり65μモルであると測定された。
次の手順に従って固相母材をカラム中でポリクローナル抗体結合効率について試験した。
１）母材をガラス漏斗上で水洗し、最後に排水した。湿潤だが排水した固相母材１ｇを小さなカラム（内径５mm）中に秤量した。母材を５mlの緩衝液（10mMクエン酸ナトリウム,pH5.0）で洗浄した。１mlの試料（１Ｍ塩酸でpH5.0に調整したもの）をカラムに適用した。カラムを20mlの洗浄緩衝液Ｉ（5mg／mlの１−オクタンスルホン酸ナトリウムを含む1.1M硫酸アンモニウム,pH8.0）で洗浄した。次いでカラムを５mlの洗浄緩衝液II（1.1M硫酸アンモニウム,pH8.0）で洗浄した。10mlの溶出緩衝液（0.05Mホウ酸／NaOH＋0.5M塩化ナトリウム,pH8.6）で母材を溶出させた。実験には全くポンプを使用せず、全カラムを重力だけで流した（流速約0.5〜1.0ml／分）。
２）結合後の素通り液中の未結合画分、洗浄画分および溶出液の間の免疫グロブリンの相対分布を調べるために分析を行った。この分析は、沈澱用抗体として種特異的抗免疫グロブリン抗体を使って、単純放射状免疫拡散法（D.Catty & C.Raykundalia,“Antibodies-a practical approach”,第Ｉ巻,137〜168頁,1988に記載）により行った。
次いで素通り液中に存在する未結合の免疫グロブリンの量から結合効率を計算し、そして原料中の母材に添加した全量の百分率として表した。
溶出液画分中に観察される添加した免疫グロブリンの百分率として収率を計算した。
溶出した免疫グロブリンの純度は、還元条件下でのSDS-PAGE（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）に続くクーマシーブリリアントブルーでのタンパク質バンドの染色により分析した。（Precastゲル4-20％トリス−グリシン、１mm、カタログNo.:EC6025、30mAで１時間泳動；トリス−グリシンＳＤＳ泳動緩衝液、カタログNo.:LC2675；トリス−グリシン試料緩衝液、カタログNo.:LC2676；クーマシー染色キット、カタログNo.:LC6025、以上全てNovex,USAより）
全タンパク質含量の％として表した純度は、クーマシー染色し乾燥したポリアクリルアミドゲルのスキャンニングと画像処理により決定した。この目的にはKem-En-Tec A/S,Denmarkから入手可能であるCREAMシステム（カタログNo.:6010＋6050）を使用した。
結果
0004425994.tif 000032
実施例10．ウシ血清からのIgＧの単離
リガンドとしての２−メルカプトベンゾイミダゾール
本実施例は、リガンドとして２−メルカプトベンゾイミダゾールを使ってウシ血清からIgＧを単離・精製できることを証明する。
ウシ血清：使用するウシ血清は正常血清であった。この血清は新鮮な血液から室温で24時間の凝固後に穏和な遠心により得られた。
固相母材：２−メルカプトベンゾイミダゾールアガロースは、Hispanagarからのエポキシ活性化６％アガロースを基材として使用しそして実施例１Ａと１Ｅに従って合成した。リガンド濃度を元素分析により測定すると、湿潤だが排水した母材１ｇあたり69μモルであると測定された。
次の手順に従って、固相母材をカラム中でのそれのポリクローナル結合効率について試験した。
１）母材をガラス漏斗上で水洗し、最後に排水した。湿潤だが排水した固相母材２ｇを小さなカラム（内径５mm）中に秤量した。母材を５mlの緩衝液（10mMクエン酸ナトリウム,pH7.0）で洗浄した。２mlのウシ血清をカラムに適用した。カラムを10mlの洗浄緩衝液（10mMクエン酸ナトリウム,0.25M NaCl,pH7.0）で洗浄した。次いで20mlの溶出緩衝液（10mMクエン酸ナトリウム,pH3.0）で母材を溶出させた。流速は1.0ml／分であった。
２）結合後の素通り液中の未結合画分、洗浄画分および溶出液の間の免疫グロブリンの相対分布を調べるために分析を行った。この分析は、沈澱用抗体としてウサギ抗ウシ免疫グロブリン（DAKO,Denmark,カタログNo.:Z247）を使って、単純放射状免疫拡散法（D.Catty & C.Raykundalia,“Antibodies-a practical approach”,第Ｉ巻,137〜168頁,1988に記載）により行った。
次いで素通り液中に存在する未結合の免疫グロブリンの量から結合効率を計算し、そして原料中の母材に添加した全量の百分率として表した。
収率と純度は実施例４に記載の通りに測定した。
結果
0004425994.tif 000033
実施例11．卵黄からの免疫グロブリンの単離
リガンドとしての２−メルカプトベンゾイミダゾール
本実施例は、リガンドとして２−メルカプトベンゾイミダゾールを使って卵黄からIgＧを単離・精製できることを証明する。
卵黄：卵黄（正常ニワトリ卵）を0.25M NaClで１：１希釈した。試料を10,000rpmで20分間遠心した。
固相母材：２−メルカプトベンゾイミダゾールアガロースは、Hispanagarからのエポキシ活性化６％アガロースを基材として使用しそして実施例１Ａと１Ｅに従って合成した。リガンド濃度を元素分析により測定すると、湿潤だが排水した母材１ｇあたり69μモルであると測定された。
次の手順に従って、カラム中で固相母材を卵黄由来の免疫グロブリンを結合する効率について試験した。
１）母材をガラス漏斗上で水洗し、最後に排水した。湿潤だが排水した固相母材２ｇを小さなカラム（内径５mm）中に秤量した。母材を10mlの緩衝液（10mM KH2PO4,pH6.1）で洗浄した。４mlの試料をカラムに適用した。カラムを10mlの洗浄緩衝液（10mM KH2PO4,pH6.1）で洗浄した。次いで16mlの溶出緩衝液（10mMクエン酸ナトリウム,pH3.5）で母材を溶出させた。
２）結合後の素通り液中の未結合画分、洗浄画分および溶出液の間の免疫グロブリンの相対分布を調べるために分析を行った。この分析は、沈澱用抗体としてウサギ抗ニワトリIgＧ（Sigma,USA,カタログNo.:C-6409）を使って、単純放射状免疫拡散法（D.Catty & C.Raykundalia,“Antibodies-a practical approach”,第I巻,137〜168頁,1988に記載）により行った。
次いで素通り液中に存在する未結合の免疫グロブリンの量から結合効率を計算し、そして原料中の母材に添加した全量の百分率として表した。
収率と純度は実施例４に記載の通りに測定した。
結果
0004425994.tif 000034
実施例12．ウシ胎児血清からのIgＧおよびヘモグロブリンの涸渇
本実施例は、ウシ胎児血清からIgＧとヘモグロビンを涸渇する本発明の幾つかの固相の効率を例証する。この実験は、14種類の固相を使ってバッチ式インキュベーション中に結合効率を測定するようにデザインした。
ウシ胎児血清：ウシ胎児血清は新しく採取した血液から室温で24時間の凝固後に穏和な遠心分離により得られた。
固相：次の固相を使った：２−メルカプトベンゾイミダゾールアガロース、チオフェノールアガロース、４−クロロチオフェノールアガロース、２−アミノチオフェノールアガロース、４−メチルメルカプトアニリンアガロース、２−メルカプト−５−ニトロベンゾイミダゾールアガロース、ベンジルメルカプタンアガロース、２−クロロフェノールアガロース、３−クロロフェノールアガロース、４−クロロフェノールアガロース、２−メルカプトベンゾオキサゾールアガロース、２−メルカプトピリジンアガロース、２，５−ジメルカプト−１，３，４−チアジアゾールアガロース、６−エトキシ−２−メルカプトベンゾチアゾールアガロース。前記アガロースは全て、Hispanagarからのエポキシ活性化６％アガロースを基材として使用しそして実施例１Ａと１Ｅに従って合成した。リガンド濃度を元素分析により測定すると、湿潤だが排水した母材１ｇあたり60〜70μモルの範囲内であると認められた。
次の手順に従って、固相母材をウシ胎児血清からIgＧとヘモグロビンを涸渇させる効率について試験した。
１）母材をガラス漏斗上で0.2M NaClで洗浄し、最後に排水した。湿潤だが排水した固相母材0.5gを試験管中に秤量し、そこに５mlのウシ胎児血清を添加した。次いでその懸濁液をローラーミキサー上で室温で２時間インキュベーションした。
２）インキュベーション後、試験管を2000RPMで５分間遠心して母材を沈降させ、上清の試料を採取して血清中に残存するIgＧの量の測定に使った。これは、沈澱用抗体としてウサギ抗ウシ免疫グロブリン（DAKO,Denmark,カタログNo.:Z247）を使って、単純放射状免疫拡散法（D.Catty & C.Raykundalia,“Antibodies-a practical approach”,第Ｉ巻,137〜168頁,1988に記載）により行った。
３）ヘモグロブリンの濃度を414nmで分光光度測定した。血清中に未結合のまま残ったヘモグロブリンの百分率を次の式により計算した：
（吸着後のウシ胎児血清の吸光度Ａｂｓ414nm／ウシ胎児血清の吸光度Ａｂｓ414nm）×100％
結果
0004425994.tif 000035
実施例13．２−メルカプト安息香酸アガロースを使ったウシ膵臓からのトリプシノーゲンおよびキモトリプシノーゲンの単離
本実施例は、プロテアーゼ、例えばウシ膵臓からのトリプシンおよびキモトリプシンの単離および精製のための適当な母材としての２−メルカプト安息香酸アガロースの使用を例証する。
膵抽出物：M.Laskowski,Methods in Enzymology,第II巻,9〜10頁,1955年に記載されたような硫酸抽出により調製されたウシ膵抽出物から、プロ酵素トリプシノーゲンとキノトリプシノーゲンとして２つのプロテアーゼを単離した。抽出後、２Ｍ水酸化ナトリウムの添加により懸濁液をpH2.5に調整し、濾過と4000rpmでの30分間の遠心分離により清澄化した。精製の直前に、抽出物を2M NaOHでpH4.5に調整し、そして4000rpmで５分間遠心して上清を集めた。
固相母材：２−メルカプト安息香酸アガロースは、Hispanagarからのエピクロロヒドリン活性化６％アガロースビーズを基材として使用しそして実施例１Ａと１Ｅに従って合成した。リガンド濃度を２つの方法により測定し、元素分析により測定すると湿潤だが排水した母材１ｇあたり65μモルであり、そして固定化されたリガンドの安息香酸部分の酸−塩基滴定により測定すると湿潤だが排水した母材１ｇあたり60μモルであると認められた。
次の手順に従って、トリプシンとキモトリプシンを結合する効率について固相母材を試験した。
１）母材をガラス漏斗上で水洗し、最後に排水した。湿潤だが排水した固相母材2.5gをカラム（内径５mm）中に秤量した。母材を10mlの緩衝液（10mMクエン酸ナトリウム,pH4.5）で洗浄した。50mlの抽出物をカラムに適用した。母材を15mlの洗浄緩衝液（10mMクエン酸ナトリウム,pH4.5）で洗浄した。次いで10mlの溶出緩衝液（50mMホウ酸,0.5M NaCl,pH8.7）を使って母材を溶出せしめた。
２）溶出液の純度を還元条件下でのSDS-PAGE（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）に続いてタンパク質バンドのクーマシーブリリアントブルー染色により分析した。（Precastゲル4-20％トリス−グリシン、１mm、カタログNo.EC6025、30mAで１時間泳動；トリス−グリシンＳＤＳ泳動緩衝液、カタログNo.LC2675；トリス−グリシン試料緩衝液、カタログNo.LC2676；クーマシー染色キット、カタログNo.LC6025、以上全てNovex,USAより）
結果
0004425994.tif 000036
この結果から明らかなように、驚くべきことに、この種のリガンド、すなわち、特異的リガンドとしての２−メルカプト安息香酸により代表される、本発明の酸性基を含有する芳香族リガンドは、比較的低いpH値で且つ比較的高いイオン強度で（すなわち約0.25のイオン強度で）プロテアーゼのようなタンパク質を非常に効率的に結合できることがわかった。
実施例14．ウマ血清からの免疫グロブリンの精製
本実施例は、ウマ血清からの免疫グロブリンの精製のための、アガロースビーズにカップリングした２−メルカプトベンゾイミダゾールの使用を例証する。更にこの型の母材を使う様々な溶出条件の使用も例証する。
ウマ血清：ウマ血清は、採取したばかりの新鮮な血液から、室温で24時間凝固後に穏和な遠心分離により得られた。
固相母材：２−メルカプトベンゾイミダゾールアガロースは実施例１Ａと１Ｅに記載の通りに調製した。リガンド濃度は湿潤だが吸引排水した母材１ｇあたり69μモルであると測定された。
手順：
１）母材をガラス漏斗上で水洗し、最後に排水した。湿潤だが排水した固相母材2gを小型カラム（内径５mm）中に秤量した。母材を５mlの10mMリン酸カリウム,pH7.0で洗浄した。0.1M HClでpH7.0に調整したウマ血清２mlをカラムに適用した。カラムを10mlの洗浄緩衝液（10mMリン酸カリウム,0.1M NaCl,pH7.0）で洗浄した。次いで20mlの溶出緩衝液（下記参照）を使って母材を溶出せしめた。流速は1.0ml／分であった。
この手順は、３種類の溶出緩衝液を使用する以外は同じである３系列の実験で使用した。
溶出緩衝液Ａ＝20mMクエン酸ナトリウムpH3.0
溶出緩衝液Ｂ＝50mMエタノールアミン／HCl pH11.0
溶出緩衝液Ｃ＝10mMリン酸カリウムpH7.0＋30％（v/v）１，２−プロパンジオール
２）結合後の素通り液中の未結合画分、洗浄画分および溶出液の間の免疫グロブリンの相対分布を調べるために分析を行った。この分析は、沈澱用抗体としてウサギ抗ウマ免疫グロブリンＧ（Sigma,USA,カタログNo.:H-9015）を使って、単純放射状免疫拡散法（D.Catty & C.Raykundalia,“Antibodies-a practical approach”,第Ｉ巻,137〜168頁,1988に記載）により行った。
次いで素通り液中に存在する未結合の免疫グロブリンの量から結合効率を計算し、そして原料中の母材に添加した総量の百分率として表した。実施例４に記載した通りに純度と収率を測定した。
結果
0004425994.tif 000037
上記結果は、２−メルカプトベンゾイミダゾールアガロースがウマ免疫グロブリンの精製に効率的な固相母材であること、そして弱酸性または弱塩基性のいずれかの緩衝液を使って、あるいはまた、溶出される免疫グロブリンの収率や純度を損なうことなく１，２−プロパンジオールのような非毒性有機溶剤を含む中性緩衝液を使って、溶出を実施できることを示した。
実施例15．種々の固相母材によるウシ血清アルブミン結合効率
本実施例は、ウシ血清アルブミンの標準的結合アッセイにおける種々の固相母材の効率を例証する。
固相：実施例１Ａと１Ｅに記載した通りにHispanagarからのエピクロロヒドリン活性化アガロースビーズを基材にして特定の範囲の固相母材を製造した。
ウシ血清アルブミン溶液pH4.0（ＢＳＡ pH4.0）：精製ウシ血清アルブミン（Biofac A/S,Denmark）を20mMクエン酸ナトリウムpH4.0＋0.2M塩化ナトリウム中に10mg／mlの最終濃度になるように溶かした。
ウシ血清アルブミン溶液pH7.0（ＢＳＡ pH7.0）：精製ウシ血清アルブミン（Biofac A/S,Denmark）を20mMクエン酸ナトリウムpH7.0＋0.2M塩化ナトリウム中に10mg／mlの最終濃度になるように溶かした。
手順：
標準的アルブミン結合アッセイ：
固相母材を真空吸引濾過器上で10容の脱イオン水で洗浄し、穏やかな吸引により１分間排水した。1.0gの吸引排水した母材の２試料を２本の10mlの試験管中に秤量し、１本目の試験管には6.0mlのＢＳＡ pH4.0をそして２本目の試験間には6.0mlのＢＳＡpH7.0を添加した。Hispanagarからの活性化せずに吸引排水した元のアガロースビーズの２つの1.0g試料も、負の対照として２つの6.0mlＢＳＡ溶液に添加した。次いでそれらの試験管をストッパーで密封し、懸濁液をローラーミキサー上で室温（20〜25℃）で２時間インキュベートした。次いで試験管を2000RPMで５分間遠心して母材を沈降させた。母材が持ち越されないようにしながら、ピペットで別の試験管に移すことにより上清を固相母材から分離し、そして小さな非吸着性0.2μｍフィルター（Millipore,USA）を通して濾過した。この後、分光光度計上で280nmでの光学濃度（ＯＤ）を測定することにより、上清中の未結合のＢＳＡの濃度を測定した。
次いで下式に従って母材に結合したＢＳＡの量を算出した。
吸引排水した母材１ｇあたりの結合したＢＳＡのmg＝
〔１−（試験上清のＯＤ／対照のＯＤ）〕×60
この方法の精度は±５％より高い。
結果
下表は、カップリングさせたリガンドおよびＢＳＡ溶液のpHの関数として、湿潤だが吸引排水した母材１ｇあたりの結合したＢＳＡの量（mg）を与える。
0004425994.tif 000038