(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ＢＣＣＭ−ＬＭＢＰに受託番号ＬＭＢＰ４２４８で寄託されているｃｒｙ２Ａｅ遺伝子によりコードされるタンパク質又はその殺虫性部分のアミノ酸配列、
ｂ）配列番号２のタンパク質又はその殺虫性部分のアミノ酸配列、
ｃ）配列番号２のタンパク質の１〜６２５位のアミノ酸配列、及び
ｄ）ＢＣＣＭ−ＬＭＢＰに受託番号ＬＭＢＰ４２４８で寄託されているｃｒｙ２Ａｅのコード配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされる殺虫性タンパク質のアミノ酸配列であって、ここで前記ＤＮＡが配列番号１のコード配列に、少なくとも９３％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
ここで、前記殺虫性部分は、配列番号２のアミノ酸位置５０〜アミノ酸位置６２５のアミノ酸配列を含むたんぱく質であり、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む殺虫性Ｃｒｙ２Ａｅタンパク質をコードする核酸。
【請求項２】
ａ）ＢＣＣＭ−ＬＭＢＰに受託番号ＬＭＢ４２４７で寄託されているｃｒｙ２Ａｆ遺伝子によりコードされるタンパク質又はその殺虫性部分のアミノ酸配列、
ｂ）配列番号４のタンパク質又はその殺虫性部分のアミノ酸配列、
ｃ）配列番号４の１〜６２５位のアミノ酸配列、及び
ｄ）ＢＣＣＭ−ＬＭＢＰに受託番号ＬＭＢＰ４２４７で寄託されているｃｒｙ２Ａｆのコード配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされる殺虫性タンパク質のアミノ酸配列であって、ここで、前記ＤＮＡが配列番号３のコード配列に少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
ここで、前記殺虫性部分は、配列番号４のアミノ酸位置５０〜アミノ酸位置６２５のアミノ酸配列を含むたんぱく質であり、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸。
【請求項３】
ａ）ＢＣＣＭ−ＬＭＢＰに受託番号ＬＭＢＰ４２４９で寄託されているｃｒｙ２Ａｇ遺伝子によりコードされるタンパク質又はその殺虫性部分のアミノ酸配列、
ｂ）配列番号６のタンパク質またはその殺虫性部分のアミノ酸配列、
ｃ）配列番号６のタンパク質の１〜６２０位のアミノ酸配列、及び
ｄ）ＢＣＣＭ−ＬＭＢＰに受託番号ＬＭＢＰ４２４９で寄託されているｃｒｙ２Ａｇのコード配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされる殺虫性タンパク質のアミノ酸配列であって、ここで、前記ＤＮＡが配列番号５のコード配列に少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
ここで、前記殺虫性部分は、配列番号６のアミノ酸位置５０〜アミノ酸位置６２０のアミノ酸配列を含むたんぱく質であり、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸。
【請求項４】
核酸がＤＮＡである、請求項１〜３のいずれか１項記載の核酸。
【請求項５】
天然に存在するＤＮＡ配列と比較して異なるコドン使用を有するが、同じタンパク質又はその殺虫性部分をコードする人工的ＤＮＡ配列を含む、請求項４記載の核酸。
【請求項６】
配列番号７又は９のＤＮＡ配列を含む、請求項５記載の核酸。
【請求項７】
ａ）ＢＣＣＭ−ＬＭＢＰに受託番号ＬＭＢＰ４２４８で寄託されているｃｒｙ２Ａｅ遺伝子によりコードされるタンパク質又はその殺虫性部分のアミノ酸配列、
ｂ）配列番号２のタンパク質又はその殺虫性部分のアミノ酸配列、
ｃ）配列番号２の１〜６２５位のアミノ酸配列、又は
ｄ）ＢＣＣＭ−ＬＭＢＰに受託番号ＬＭＢＰ４２４８で寄託されているｃｒｙ２Ａｅのコード配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされる殺虫性タンパク質のアミノ酸配列であって、ここで、前記殺虫性タンパク質が配列番号２のタンパク質と少なくとも９２％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
ここで、前記殺虫性部分は、配列番号２のアミノ酸位置５０〜アミノ酸位置６２５のアミノ酸配列を含むたんぱく質であり、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質。
【請求項８】
ａ）ＢＣＣＭ−ＬＭＢＰに受託番号ＬＭＢＰ４２４７で寄託されているｃｒｙ２Ａｆ遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列、
ｂ）配列番号４のタンパク質又はその殺虫性部分のアミノ酸配列、
ｃ）配列番号４の１〜６２５位のアミノ酸配列、又は
ｄ）ＢＣＣＭ−ＬＭＢＰに受託番号ＬＭＢＰ４２４７で寄託されているｃｒｙ２Ａｆのコード配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされる殺虫性タンパク質のアミノ酸配列であって、ここで、前記タンパク質が配列番号４のタンパク質と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
ここで、前記殺虫性部分は、配列番号４のアミノ酸位置５０〜アミノ酸位置６２５のアミノ酸配列を含むたんぱく質であり、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質。
【請求項９】
ａ）ＢＣＣＭ−ＬＭＢＰに受託番号ＬＭＢＰ４２４９で寄託されているｃｒｙ２Ａｇ遺伝子によりコードされるタンパク質又はその殺虫性部分のアミノ酸配列、
ｂ）配列番号６のタンパク質又はその殺虫性部分のアミノ酸配列、
ｃ）配列番号６のタンパク質の１〜６２０位のアミノ酸配列、
ｄ）ＢＣＣＭ−ＬＭＢＰに受託番号ＬＭＢＰ４２４９で寄託されているｃｒｙ２Ａｇのコード配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされる殺虫性タンパク質のアミノ酸配列であって、ここで、前記タンパク質が配列番号６のタンパク質と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ここで、前記殺虫性部分は、配列番号６のアミノ酸位置５０〜アミノ酸位置６２０のアミノ酸配列を含むたんぱく質であり、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質。
【請求項１０】
植物発現可能プロモーターの制御下、請求項４の核酸を含む遺伝子。
【請求項１１】
植物発現可能プロモーターの制御下、請求項５又は６に記載の核酸を含む遺伝子。
【請求項１２】
液胞、ミトコンドリア、クロロプラスト、プラスチドに指向させるため又は分泌のための、ターゲッティングペプチド又は輸送ペプチドをコードするＤＮＡをさらに含む、請求項１０記載の遺伝子。
【請求項１３】
液胞、ミトコンドリア、クロロプラスト、プラスチドに指向させるため、又は分泌のためのターゲッティングペプチド又は輸送ペプチドをコードするＤＮＡをさらに含む、請求項１１記載の遺伝子。
【請求項１４】
請求項１０又は１２記載の遺伝子を含むように形質転換された植物細胞、植物体又は種子。
【請求項１５】
請求項１１又は１３記載の遺伝子を含むように形質転換された植物細胞、植物体又は種子。
【請求項１６】
トウモロコシ、ワタ、イネ、タバコ、アブラナ、アブラナ属の各種、ナス、ダイズ、ジャガイモ、ヒマワリ、トマト、サトウキビ、チャノキ、マメ類、タバコ、イチゴ、クローバ、キュウリ、スイカ、コショウ、カラスムギ、オオムギ、コムギ、ダリア、グラジオラス、キク、サトウダイコン、ソルガム、アルファルファ、及びラッカセイからなる群より選択される、請求項１４に記載の植物細胞、植物体又は種子。
【請求項１７】
トウモロコシ、ワタ、イネ、タバコ、アブラナ、アブラナ属の各種、ナス、ダイズ、ジャガイモ、ヒマワリ、トマト、サトウキビ、チャノキ、マメ類、タバコ、イチゴ、クローバ、キュウリ、スイカ、コショウ、カラスムギ、オオムギ、コムギ、ダリア、グラジオラス、キク、サトウダイコン、ソルガム、アルファルファ、及びラッカセイ植物細胞、植物体又は種子からなる群より選択される、請求項１５に記載の植物細胞、植物体又は種子。
【請求項１８】
請求項１〜６のいずれか１項記載の核酸を含むよう形質転換された微生物。
【請求項１９】
請求項１０又は１１記載の遺伝子で植物細胞を形質転換すること、及びその細胞から、形質転換された耐虫性植物を再生させることを含む、植物を耐虫性にするための方法。
【請求項２０】
請求項１２又は１３記載の遺伝子で植物細胞を形質転換すること、及びその細胞から、形質転換された耐虫性植物を再生させることを含む、植物を耐虫性にするための方法。
【請求項２１】
昆虫が、ヘリオチス・ビレセンス（Heliothis virescens）、ヘリコベルパ・ジー（Helicoverpa zea）、ヘリコベルパ・アルミゲラ（Helicoverpa armigera）、アンチカルシア・ゲマタリス（Anticarsia gemmatalis）及びオストリニア・ヌビラリス（Ostrinia nubilalis）、キロ・スプレサリス（Chilo suppressalis）、キロ・パルテラス（Chilo partellus）、スキルポファガ・インセルチュラス（Scirpophaga incertulas）、セサミア・インフェレンス（Sesamia inferens）、ナファロクロシス・メヂナリス（Cnaphalocrocis medinalis）、マラスミア・パトナリス（Marasmia patnalis）、マラスミア・エクシグア（Marasmia exigua）、マラスミア・ルラリス（Marasmia ruralis）及びスキルポファガ・イノタタ（Scirpophaga innotata）からなる群より選択される、請求項１９又は２０記
載の方法。
【請求項２２】
ヘリオチス・ビレセンス（Heliothis virescens）、ヘリコベルパ・ジー（Helicoverpa zea）、ヘリコベルパ・アルミゲラ（Helicoverpa armigera）、アンチカルシア・ゲマタリス（Anticarsia gemmatalis）及びオストリニア・ヌビラリス（Ostrinia nubilalis）、キロ・スプレサリス（Chilo suppressalis）、キロ・パルテラス（Chilo partellus）、スキルポファガ・インセルチュラス（Scripophaga incertulas）、セサミア・インフェレンス（Sesamia inferens）、ナファロクロシス・メヂナリス（Cnaphalocrocis medinalis）、マラスミア・パトナリス（Marasmia patnalis）、マラスミア・エクシグア（Marasmia exigua）、マラスミア・ルラリス（Marasmia ruralis）及びスキルポファガ・イノタタ（Scirpophaga innotata）からなる群より選択される昆虫を殺傷するか、又は該昆虫の発生、受精能力若しくは成長を阻害するための、請求項７〜９のいずれか１項記載のタンパク質の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バチルス・チューリンゲンシス株により産生される殺虫性タンパク質をコードする新規核酸配列、具体的にはＤＮＡ配列に関する。具体的には、Ｃｒｙ２Ａｅ、Ｃｒｙ２Ａｆ及びＣｒｙ２Ａｇと命名されたタンパク質をコードする新規核酸配列、具体的にはＤＮＡ配列が提供され、これらは昆虫の害から植物を守るのに有用である。さらに、新規に単離されたＣｒｙ２Ａタンパク質の少なくとも１つをコードする核酸配列、具体的にはＤＮＡ配列で形質転換された微生物及び植物体も、本発明に含まれる。
【背景技術】
【０００２】
（ｉ）発明の分野：
バチルス・チューリンゲンシス（本明細書では「Ｂｔ」と略記する）は、害虫に対する特異的な毒性のため周知であり、植物の害虫を制御するためにほぼ１世紀前から使用されてきた。さらに近年、Ｂｔタンパク質を発現するトランスジェニック植物が作製され、それらが、植物に対する昆虫被害を良好に制御することが見出された（例えば、Vaeck et al., 1987, Jansens et al., 1997）。かなり多数の殺虫性Ｂｔ遺伝子が単離されているにもかかわらず、殺虫性タンパク質をコードする新規性遺伝子の探索は継続中である。実際、殺虫性Ｂｔタンパク質は、化学的殺虫剤と比較して、比較的狭い標的昆虫域を有することが知られている。また、同じ標的昆虫種に対して多数個の毒素を有することは、異なる作用様式を有するタンパク質の使用を可能にし、従って、昆虫の耐性の発達を防止するか、又は遅延させることができる。異なるアミノ酸配列を有する殺虫性Ｂｔタンパク質は、特定の昆虫に対して様々なレベルの殺虫効果を有し、様々な穀物植物体に関連する害虫を抑制できるように、いくつかの異なる殺虫性タンパク質を利用可能にすることが望まれる。
【０００３】
（ｉｉ）関連技術の説明：
以前に、いくつかの型のＣｒｙ２Ａタンパク質が同定された（参照により本明細書に組み込まれるCrickmore et al., 1998を参照）。本発明の新規Ｃｒｙ２Ａｅタンパク質は、Ｃｒｙ２Ａａ１タンパク質（Donovan et al., GenBank受託番号Ｍ３１７３８）と最も高い配列同一性を有するが、そのアミノ酸配列の約９％において依然異なる。Ｃｒｙ２Ａｆタンパク質に最も近似な配列同一性は、Ｃｒｙ２Ａｂ１タンパク質（Widner and Whiteley, GenBank 受託番号Ｍ２３７２４）に見られたが、両タンパク質は、アミノ酸配列の約５％において依然異なっている。
Ｃｒｙ２Ａｇタンパク質に最も近似な配列同一性は、Ｃｒｙ２Ａｃ１タンパク質（Wu et al., GenBank受託番号Ｘ５７２５２）に見られたが、両タンパク質はアミノ酸配列の約２０％において依然異なっている。
さらに、公知のＣｒｙ２Ａタンパク質は、Ｃｒｙ２Ａｄ１タンパク質（Choi et al., 1999）ならびに他のＣｒｙ２Ａａ、Ｃｒｙ２Ａｂ、及びＣｒｙ２Ａｃタンパク質（Cricmore et al., 1998）を含む。Ｃｒｙ２Ａ様タンパク質及びそれらをコードするＤＮＡ配列も、米国特許第5,338,544号、公開されたＰＣＴ特許出願WO00/26371号及び公開されたＰＣＴ特許出願WO98/40490号に記載されている。
植物におけるＣｒｙ２Ａ型タンパク質の発現は、例えばKota et al. (1999）及び公開されたＰＣＴ特許出願WO00/26371号に記載されている。
【０００４】
発明の目的及び開示
本発明によれば、ａ）ＢＣＣＭ−ＬＭＢＰに受託番号ＬＭＰＧ４２４８で寄託されているｃｒｙ２Ａｅ遺伝子によりコードされるタンパク質の最小毒性断片のアミノ酸配列、ｂ）ＢＣＣＭ−ＬＭＢＰに受託番号ＬＭＢＰ４２４７で寄託されているｃｒｙ２Ａｆ遺伝子によりコードされるタンパク質の最小毒性断片のアミノ酸配列、及びｃ）ＢＣＣＭ−ＬＭＢＰに受託番号ＬＭＢＰ４２４９で寄託されているｃｒｙ２Ａｇ遺伝子によりコードされているタンパク質の最小毒性断片のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列、具体的にはＤＮＡ配列が提供される。
【０００５】
本発明において特に好ましいのは、配列番号２のタンパク質の殺虫性断片のアミノ酸配列、配列番号４のタンパク質の殺虫性断片のアミノ酸配列、配列番号４のタンパク質の殺虫性断片のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列、具体的にはＤＮＡ配列である。
【０００６】
さらに、本発明により、配列番号２の１〜６３２位のアミノ酸配列、配列番号４の１〜６３２位のアミノ酸配列、及び配列番号６の１〜６２７位のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列、具体的にはＤＮＡ配列が提供される。
【０００７】
さらに、本発明により、天然に存在する配列と比較して異なるコドン使用を有するが、同じタンパク質又はその殺虫性断片をコードする人工配列を含む上記核酸配列、具体的にはＤＮＡ配列が提供され、そのようなコドン使用が、核酸配列、具体的にはＤＮＡで形質転換されるべき植物、具体的には宿主植物体のものと似ていることが好ましい。
【０００８】
さらに、本発明により、ａ）ＢＣＣＭ−ＬＭＢＰに受託番号ＬＭＢＰ４２４８で寄託されているｃｒｙ２Ａｅ遺伝子によりコードされるタンパク質の最小毒性断片のアミノ酸配列、ｂ）ＢＣＣＭ−ＬＭＢＰに受託番号ＬＭＢＰ４２４７で寄託されているｃｒｙ２Ａｆ遺伝子によりコードされるタンパク質の最小毒性断片のアミノ酸配列、及びｃ）ＢＣＣＭ−ＬＭＢＰに受託番号ＬＭＢＰ４２４９で寄託されているｃｒｙ２Ａｇ遺伝子によりコードされるタンパク質の殺虫性最小毒性断片のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質が提供される。
【０００９】
本明細書において特に好ましいのは、配列番号２のタンパク質の殺虫性断片のアミノ酸配列、配列番号４のタンパク質の殺虫性断片のアミノ酸配列、及び配列番号６のタンパク質の殺虫性断片のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質である。
【００１０】
また、植物発現可能プロモーターの制御下で前記定義のようなＤＮＡを含むキメラ遺伝子、それらのキメラ遺伝子を含有するよう形質転換された植物細胞、植物体、又は種子、具体的にはトウモロコシ、ワタ、イネ、タバコ、アブラナ、アブラナ属の各種、ナス、ダイズ、ジャガイモ、ヒマワリ、トマト、サトウキビ、チャノキ、マメ類、タバコ、イチゴ、クローバ、キュウリ、スイカ、コショウ、カラスムギ、オオムギ、コムギ、ダリア、グラジオラス、キク、サトウダイコン、ソルガム、アルファルファ、リンゴ、ナシ、イチゴ及びラッカセイからなる群より選択される植物細胞、植物体、又は種子も、本発明において提供される。本発明によると、キメラ遺伝子が、植物細胞の核、プラスチド又はミトコンドリアのＤＮＡに取り込まれることが可能であり、液胞、クロロプラスト、ミトコンドリア、プラスチドに指向させるため又は分泌のための、効果的なターゲッティングペプチド又は輸送ペプチドをコードするＤＮＡをも含むことが可能である。
【００１１】
さらに、本発明によれば、上記ＤＮＡ配列のいずれかを含有するよう形質転換された微生物、特にシュードモナス（Pseudomonas）属、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属、エシェリキア（Escherichia）属、又はバチルス（Bacillus）属が提供される。
【００１２】
さらに、本発明により、上記核酸配列、具体的にはＤＮＡ配列のいずれかを宿主細胞、具体的には植物細胞中で発現させること、及び昆虫をその宿主細胞と接触させることを含む、昆虫を制御するための方法、ならびに植物細胞を上記ＤＮＡ配列又はキメラ遺伝子のいずれかで形質転換すること、及び昆虫に対して抵抗性であるような細胞から形質転換された植物体を再生することを含む、植物体を耐虫性にする方法も提供される。
【００１３】
本発明は、鱗翅目の昆虫、具体的にはワタ、トウモロコシ又はダイズの鱗翅目の害虫を制御する方法に関し、この方法は、保護されるべき区域又は植物体に本明細書において定義のＣｒｙ２Ａタンパク質、好ましくは、本明細書において定義のＣｒｙ２Ａｅタンパク質を（すなわち、本発明のｃｒｙ２Ａ遺伝子で形質転換された植物体を植えることにより、又はＣｒｙ２Ａタンパク質を含有する組成物を噴霧することにより）施用することを含む。本発明は、ダイズ植物体への被害を最小限にするための、本発明のＣｒｙ２Ａタンパク質、具体的にはＣｒｙ２Ａｅタンパク質の、鱗翅目害虫に対する使用にも関する。
【００１４】
本発明は、鱗翅目イネ害虫、具体的には、鱗翅目のニカメイガ（rice stemborer）、イチモンジセセリ（rice skipper）、ハスモンヨトウ（rice cutworm）、アワヨトウ（rice armyworm）、イサゴムシ（rice caseworm）、又はコブノメイガ（rice leaffolder）、好ましくは、キロ・スプレサリス（Chilo suppressalis）、キロ・パルテラス（Chilo partellus）、スキルポファガ・インセルチュラス（Scripophaga incertulas）、セサミア・インフェレンス（Sesamia inferens）、ナファロクロシス・メヂナリス（Cnaphalocrocis medinalis）、マラスミア・パトナリス（Marasmia patnalis）、マラスミア・エクシグア（Marasumia exigua）、マラスミア・ルラリス（Marasmia ruralis）及びスキルポファガ・イノタタ（Scirpophaga innotata）からなる群より選択される昆虫を制御する方法に関し、この方法は、保護されるべき区域又は植物体に、本明細書において定義のＣｒｙ２Ａタンパク質、好ましくは本明細書において定義のＣｒｙ２Ａｅタンパク質を（すなわち、本発明のｃｒｙ２Ａ遺伝子で形質転換されたイネ植物体を植えることにより、又は本発明のＣｒｙ２Ａタンパク質を含有する組成物を噴霧することにより）施用することを含む。本発明は、イネ植物体の被害を最小限にするための、鱗翅目イネ害虫に対する、本発明のＣｒｙ２Ａタンパク質、具体的にはＣｒｙ２Ａｅタンパク質の使用にも関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明によれば、「核酸配列」とは、本発明のＣｒｙ２Ａタンパク質のいずれかをコードする、単鎖又は二重鎖形態のＤＮＡ又はＲＮＡ分子、好ましくはＤＮＡ又はＲＮＡ、具体的にはＤＮＡを意味する。本明細書において使用する「単離核酸配列」とは、単離された自然環境中には最早ない、例えば他の細菌宿主又は植物核ゲノム中の核酸配列を意味する。
【００１６】
本発明によれば、「タンパク質」又は「ポリペプチド」は、相互に同様にアミノ酸配列を意味し、機能性、サイズ、三次元構造又は起源を問わない。したがって、本発明のＣｒｙ２Ａタンパク質の断片又は部分は、本明細書では依然として「タンパク質」として言及される。
【００１７】
本発明によれば、新規Ｂｔ  Ｃｒｙトキシンをコードする核酸配列、具体的にはＤＮＡ配列が単離され特徴付けられている。新規遺伝子は、ｃｒｙ２Ａｅ、ｃｒｙ２Ａｆ、ｃｒｙ２Ａｇと命名され、それらがコードするタンパク質はＣｒｙ２Ａｅ、Ｃｒｙ２Ａｆ及びＣｒｙ２Ａｇと命名された。
【００１８】
本発明によれば、「Ｃｒｙ２Ａｅタンパク質」は、殺虫活性を保持する、配列番号２のアミノ酸配列の最小断片（以下、「最小毒性断片」とする）を含む任意のタンパク質、具体的には配列番号２の１〜６２５位、具体的には６３２位までのアミノ酸のアミノ酸配列を含む任意のタンパク質を意味する。これは、最小毒性タンパク質断片を含むハイブリッド又はキメラタンパク質、及び配列番号２のタンパク質の３つのドメインの少なくとも１つを含有するタンパク質を含む。さらに、この定義に含まれるのは、配列番号２のアミノ酸の変異体であり、例えばＧＣＧのウィスコンシンパッケージのＧＡＰプログラム（Madison, Wisconsin, USA，バージョン１０．０；ＧＡＰプログラムではＧＣＧデフォルトを使用；アミノ酸配列比較には、blosum62スコアリングマトリックスを使用）により対配列比較法を用いて決定されるアミノ酸配列レベルでの配列同一性が、少なくとも９２％、具体的には少なくとも９３％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％であるタンパク質、好ましくは、タンパク質の殺虫活性の著しい変化、好ましくは変化を起こすことなく、いくつかの、好ましくは５〜１０個、具体的には５個未満のアミノ酸を付加、置換又は欠失させたタンパク質、例えば配列番号８のＣｒｙ２Ａｅタンパク質である。
【００１９】
本明細書で使用する「配列Ｘを含むＤＮＡ／タンパク質」とは、少なくとも配列Ｘを含む又は含有するＤＮＡ又はタンパク質を意味し、例えばEP0193259に開示されているような選択可能なマーカータンパク質（の核酸配列）、輸送ペプチド（の核酸配列）、及び／又は５’若しくは３’リーダー配列などのヌクレオチドまたはアミノ酸配列を５’（又はＮ末端）及び／又は３’（又はＣ末端）に含むことができる。
【００２０】
本明細書で使用する、本発明のＣｒｙタンパク質の「最小毒性断片」とは、全長Ｃｒｙタンパク質を酵素、好ましくはトリプシンもしくはキモトリプシンにより消化して得ることができる殺虫活性を保持するＣｒｙタンパク質の最小断片又は部分、又はＣｒｙタンパク質をコードするＤＮＡ中にヌクレオチド欠失を生じさせることにより得ることができる、殺虫活性を保持するＣｒｙタンパク質の最小断片又は部分である。最小毒性断片のＮ末端及びＣ末端のアミノ酸配列の末端は、当分野において通常利用可能な技術により上記断片のアミノ酸配列決定により便利よく決定される。殺虫性活性を保持する本発明のＣｒｙ２Ａタンパク質断片については、典型的にはＮ末端を欠失させることができるが、Ｃ末端はほとんど欠失させることができない。本発明のＣｒｙ２Ａｅ及びＣｒｙ２ｆタンパク質については、Ｃ末端の６２５位のアミノ酸までの欠失（すなわち、Ｃ末端のアミノ酸が６２５位のアミノ酸となる）を、殺虫活性を保持しながら行うことができると予想され、Ｃｒｙ２Ａｇタンパク質については、Ｃ末端の６２０位のアミノ酸までの欠失（すなわち、Ｃ末端のアミノ酸が６２０位のアミノ酸となる）を、タンパク質の殺虫活性を保持しながら行うことができると予想される。本発明の３種のＣｒｙ２Ａタンパク質のアミノ酸配列中の５０位のアミノ酸付近までのＮ末端欠失、好ましくは５０位までのＮ末端欠失（すなわち、Ｎ末端アミノ酸が、配列表中に示す配列の５０位である）は、鱗翅目昆虫に対するその殺虫活性のほとんどを保持すると予想される。
【００２１】
本発明によれば、「Ｃｒｙ２Ａｆタンパク質」とは、配列番号４のアミノ酸配列の最小毒素断片を含む任意のタンパク質を意味し、具体的には配列番号４の１〜６２５位、具体的には６３２位までのアミノ酸配列を含む任意のタンパク質を意味する。これは、最小毒性タンパク質断片を含むハイブリッド又はキメラタンパク質、及び配列番号４のタンパク質の３つのドメインの少なくとも１つを含有するタンパク質を含む。さらに、この定義に含まれるのは、配列番号４のアミノ酸配列の変異体であり、例えばＧＣＧのウィスコンシンパッケージのＧＡＰプログラム（Madison, Wisconsin, USA，バージョン１０．０；ＧＡＰプログラムではＧＣＧデフォルトを使用；アミノ酸配列比較には、blosum62スコアリングマトリックスを使用）により対配列比較法を用いて決定されるアミノ酸配列レベルでの配列同一性が、少なくとも９５％、特に少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％であるタンパク質、好ましくは、タンパク質の殺虫活性の著しい変化、好ましくは変化を起こすことなく、いくつかの、好ましくは５〜１０個、具体的には５個未満のアミノ酸を付加、置換又は欠失させたタンパク質である。
【００２２】
本発明によれば、「Ｃｒｙ２Ａｇタンパク質」とは、配列番号６のアミノ酸配列の最小毒性断片を含む任意のタンパク質、具体的には配列番号６の１〜６２０位アミノ酸、特に６２７位までのアミノ酸配列を含む任意のタンパク質を意味する。これは、最小毒性タンパク質断片を含むハイブリッド又はキメラタンパク質、及び配列番号６のタンパク質の３つのドメインの少なくとも１つを含有するタンパク質を含む。さらに、この定義に含まれるのは、配列番号６のアミノ酸配列の変異体であり、例えばＧＣＧのウィスコンシンパッケージのＧＡＰプログラム（Madison, Wisconsin, USA，バージョン１０．０；ＧＡＰプログラムではＧＣＧデフォルトを使用；アミノ酸配列比較には、blosum62スコアリングマトリックスを使用）により対配列比較法を用いて決定されるアミノ酸配列レベルでの配列同一性が、少なくとも８０％、具体的には少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は少なくとも９９％であるタンパク質、好ましくは、タンパク質の殺虫活性の著しい変化、好ましくは変化を起こすことなく、いくつかの、好ましくは５〜１０個、具体的には５個未満のアミノ酸を付加、置換又は欠失させたタンパク質、である。
【００２３】
本明細書で使用する「ｃｒｙ２ＡｅＤＮＡ」、「ｃｒｙ２ＡｆＤＮＡ」、又は「ｃｒｙ２ＡｇＤＮＡ」とは、それぞれ上記定義のＣｒｙ２Ａｅ、Ｃｒｙ２Ａｆ又はＣｒｙ２Ａｇタンパク質をコードする任意のＤＮＡ配列を意味する。これらは、配列番号２、４若しくは６のタンパク質又は上記定義のそれらの殺虫性断片若しくは変異体をコードする、天然に存在するか、人工的又は合成のＤＮＡ配列を含む。本発明には、寄託されたゲノムＤＮＡ配列又は配列表に提供された配列のコード領域と十分に類似し、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でこれらのＤＮＡ配列とハイブリダイズすることができる（すなわち、その能力を有する）殺虫性タンパク質をコードするＤＮＡ配列も含まれる。本明細書で使用するストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、具体的には以下の条件をさす。関連するゲノムＤＮＡ配列をフィルター上に固定化し、５０％ホルムアミド、５％ＳＳＰＥ、２×デンハート試薬、及び０．１％ＳＤＳの中で４２℃で１〜２時間、又は６×ＳＳＣ、２×デンハート試薬、及び０．１％ＳＤＳの中で６８℃で１〜２時間、フィルターをプレハイブリダイズする。次いで、変性させた（ｄｉｇ又は放射）標識化プローブを、プレハイブリダイゼーション液へと直接添加し、インキュベーションを前記の適当な温度で１６〜２４時間実施する。次いで、インキュベーション後、フィルターを２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで室温で３０分間洗浄し、続いて０．５×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳで６８℃で３０分間の洗浄を２回行う。増感スクリーンを用いて、−７０℃で、Ｘ線フィルム（Kodak XAR-2又は等価物）へと２４〜４８時間フィルターを感光させることによりオートラジオグラフを確立する。無論、所望のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を保持する限り、同等な条件及びパラメータをこの過程において使用することができる。本発明のｃｒｙ２ＡｅＤＮＡの好ましい変異体は、上記の殺虫性Ｃｒｙ２Ａｅタンパク質変異体をコードするＤＮＡであるか、又は配列番号１のコード配列に対して少なくとも９２％、好ましくは少なくとも９３％〜９７％、具体的に少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、殺虫性タンパク質をコードするＤＮＡである。具体的には、このようなＤＮＡ配列は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下、ＢＣＣＭ−ＬＭＢＰに受託番号ＬＭＢＰ４２４８で寄託されているｃｒｙ２Ａｅのコード配列、又は配列番号１のコード配列に対してもハイブリダイズする。本発明のｃｒｙ２ＡｆＤＮＡの好ましい変異体は、上記の殺虫性Ｃｒｙ２Ａｆタンパク質変異体をコードするＤＮＡ，又は配列番号３のコード配列に対して、少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％又は９７％、より好ましくは少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する殺虫性タンパク質をコードするＤＮＡ配列である。具体的には、このようなＤＮＡ配列は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下、ＢＣＣＭ−ＬＭＢＰに受託番号ＬＭＢＰ４２４７で寄託されているｃｒｙ２Ａｆのコード配列又は配列番号３のコード配列にもハイブリダイズする。本発明のｃｒｙ２ＡｇＤＮＡの好ましい変異体は、上記のＣｒｙ２Ａｇタンパク質変異体をコードするＤＮＡ，又は配列番号５のコード配列に対して、少なくとも８６％、好ましくは８７％、具体的には少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列である。具体的には、このようなＤＮＡ配列は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下、ＢＣＣＭ−ＬＭＢＰに受託番号ＬＭＢＰ４２４９で寄託されているｃｒｙ２Ａｇのコード配列、又は配列番号５のコード配列にもハイブリダイズする。上記の配列同一性は、ＧＣＧのウィスコンシンパッケージのＧＡＰプログラム（Madison, Wisconsin, USA）バージョン１０．０（これらのＤＮＡ配列比較には、ＧＣＧデフォルトが使用され、「nwsgapdna」スコアリングマトリックスが使用された）を使用して計算し、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、上記定義のとおりである。
【００２４】
本明細書で使用するタンパク質の「殺虫活性」とは、好ましくは植物のような組換え宿主における発現により、昆虫へと与えられた場合に昆虫を殺傷するタンパク質の能力を意味する。本明細書で使用するタンパク質の「昆虫制御量」とは、植物に対する昆虫被害が減少し、かつ植物収量が有意に悪影響を受けないような状態で、例えば昆虫を殺傷するか、又は昆虫の発生、受精能力若しくは成長を阻害することにより、植物体を常食とする昆虫による植物に対する被害を、商業的に許容されるレベルにまで制限するために十分なタンパク質の量をさす。
本発明によると、本発明の新規Ｃｒｙタンパク質に対して感受性を有する昆虫を、昆虫制御量、好ましくは殺虫量のこのタンパク質に接触させる。本発明のタンパク質の好ましい標的昆虫は、具体的には北米及び南米各国においてトウモロコシ、ワタ、イネ及びダイズ植物体に経済的被害を与える害虫である。本発明のＣｒｙ２Ａタンパク質、具体的にはＣｒｙ２Ａｅタンパク質の特に好ましい標的昆虫は、ヘリオチス（Heliothis）属、ヘリコベルパ（Helicoverpa）属、スポドプテラ（Spodoptera）属、セサミア（Sesamia）属、アンチカルシア（Anticarsia）属、オストリニア（Ostrinia）属、キロ（Chilo）属、セサミア（Sesamia）属、マラスミア（Marasmia）属、スキルポファガ（Scirpophaga）属及びナファロクロシス（Cnaphalocrocis）属の昆虫、最も好ましくは、ヘリオチス・ビレセンス（Heliothis virescens）、ヘリコベルパ・ジー（Helicoverpa zea）、ヘリコベルパ・アルミゲラ（Helicoverpa armigera）、アンチカルシア・ゲマタリス（Anticarsia gemmatalis）及びオストリニア・ヌビラリス（Ostrinia nubilalis）である。
【００２５】
本明細書で使用する「Ｃｒｙ２Ａタンパク質」、「本発明のＣｒｙ２Ａタンパク質」、「Ｃｒｙタンパク質」又は「本発明のＣｒｙタンパク質」とは、本発明により単離され、同定され、本明細書においてＣｒｙ２Ａｅ、Ｃｒｙ２Ａｆ又はＣｒｙ２Ａｇタンパク質と定義された新規タンパク質のいずれか一つを意味する。本明細書で使用するＣｒｙタンパク質は、プロトキシンとも命名される全長サイズのタンパク質であってもよいし、殺虫活性が保持されている限り切断型であってもよいし、ハイブリッド又は融合タンパク質において異なるタンパク質との組合わせ体であってもよい。「Ｃｒｙプロトキシン」とは、天然に存在するＢｔＤＮＡ配列によってコードされるような全長の結晶性タンパク質を意味し、「Ｃｒｙトキシン」とは、その殺虫活性断片、具体的にはその最小毒性断片、典型的にはＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動により決定されるような約５０〜６５ｋＤ、具体的には約６０ｋＤの分子量範囲の最小毒性断片を意味する。本明細書で使用する「ｃｒｙ２Ａ遺伝子」、「ｃｒｙＤＮＡ」、又は「ｃｒｙ２ＡＤＮＡ」とは、本発明によるＣｒｙタンパク質をコードするＤＮＡ配列であり、上記定義のｃｒｙ２Ａｅ、ｃｒｙ２Ａｆ又はｃｒｙ２ＡｇＤＮＡ配列のいずれかを意味する。
【００２６】
本発明のＣｒｙタンパク質をコードする核酸配列、具体的にはＤＮＡ配列は、ブダペスト条約に従って、２０００年１０月６日にVakgroep voor Moleculaire Biologie-Plasmidencollectie, Universiteit Gent, K.L. Ledeganckstraat 35, B-9000 Gent, Belgium（以下、「ＢＣＣＭ−ＬＭＢＰ」と略記）に以下の受託番号で寄託された組換えE. coli株から従来の方法で単離することができる：ＢＣＣＭ−ＬＭＢＰ４２４７、ＸＬ１Ｂｌｕｅ：ｐＵＣ１０９９Ｅ／ｃｒｙ２ｃｌｏｎｅ１株（Ｃｒｙ２Ａｆタンパク質をコードする）；ＢＣＣＭ−ＬＭＢＰ４２４８、ＸＬ１Ｂｌｕｅ：ｐＵＣ１０９９Ｅ／ｃｒｙ２ｃｌｏｎｅ７株（Ｃｒｙ２Ａｅタンパク質をコードする）；及びＢＣＣＭ−ＬＭＢＰ４２４９、ＸＬ１Ｂｌｕｅ：ｐＵＣ２７６１Ａ／ｃｒｙ２ｃｌｏｎｅ１４１株（Ｃｒｙ２Ａｇタンパク質をコードする）。本発明のＣｒｙタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、通常の技術を用いて寄託された株から単離することができ、発現ベクターに挿入して、大量のＣｒｙタンパク質を産生させることができる。Ｃｒｙタンパク質を用いて、特異的モノクローナル又はポリクローナル抗体を従来技術により調製することができる（Hoefte et al., 1988）。
【００２７】
また、本発明に使用するＤＮＡ配列を合成的に作製することができる。実際、遺伝子コードの縮重のため、いくつかのアミノ酸コドンをタンパク質のアミノ酸配列を変えることなく他のものに置き換えることができる。さらに、いくつかのアミン酸を、タンパク質の殺虫活性を著しく変えることなく、好ましくは変えることなく、他の同等のアミノ酸で置き換えることができる。さらに、結合又はポア形成に関与する領域とは異なる、分子中の領域内におけるアミノ酸配列または組成の変化により、タンパク質の殺虫活性の相違が生じる可能性はより低い。本発明のＤＮＡ配列の同等物は、ストリンジェントな条件下、配列番号１、３又は５のＣｒｙタンパク質のＤＮＡ配列にハイブリダイズし、本発明のタンパク質と同じ殺虫特性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列、又は本発明の天然のｃｒｙ２Ａ遺伝子と比較して異なるコドン使用を有するが、同じ殺虫活性を有し、実質的に同じ、好ましくは同じアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む。本発明のＣｒｙ２Ａｅタンパク質のコドン最適化ＤＮＡ配列の例は、配列番号７及び９に見られる。これらのＤＮＡ配列は、利用可能なコドン使用表（配列番号７はワタにおける発現に、より適合させ、配列番号９はトウモロコシに、より適合させた）を用いて、植物遺伝子、具体的には標的とする植物の属又は種に天然の遺伝子において最も好ましいもの（Bennetzen & Hall, 1982; Itakura et al., 1977）にコドン使用を適応させることにより最適化させ、また、これらのＤＮＡ配列を最適化して、５又は６、好ましくは５を超える長さのＡＴ又はＧＣヌクレオチドのストレッチを除去し、さらに適切な制限部位を挿入した。
【００２８】
さらに、Ｃｒｙタンパク質のＮ末端を修飾して、最適な翻訳開始状況を有するようにし、タンパク質のＮ末端において１個以上のアミノ酸を付加又は欠失させることができる。ほとんどの場合、植物細胞中で発現させる本発明のタンパク質が最適翻訳開始のためにＭｅｔ−Ａｓｐ又はＭｅｔ−Ａｌａジペプチドで始まることが好ましく、ｃｒｙ２ＡＤＮＡ中、開始コドンの下流にＡｓｐ又はＡｌａアミノ酸をコードするコドンを新しい第二のコドンとして挿入することが必要となる。
【００２９】
無論、具体的な目的に応じて、コドン使用は異なるが同じタンパク質又は実質的に同じ殺虫活性を有する類似のタンパク質をコードするいかなるＤＮＡ配列も構築することができる。原核及び真核の発現系において、異質な宿主での遺伝子発現のためには、コドン使用を宿主細胞のものに変えることが望ましいと記載されている（Bennetzen & Hall, 1982; Itakura et al., 1977）。さらに、Ｂｔ結晶タンパク質遺伝子は、真核コドンに対し何らバイアスがないこと、及びＡＴに極めて富んでいることが知られている（Adang et al., 1985, Schnepf et al., 1985）。コドン使用表は文献（Wada et al., 1990; Murray et al., 1989）又は主要ＤＮＡ配列データベース（例えば、EMBL at Heidelberg, Germany）中で利用可能である。したがって、同じ又は実質的に同じタンパク質を生成するように、合成ＤＮＡ配列を構築することができる。本発明のＣｒｙタンパク質のアミノ酸配列が一度公知となれば、いくつかのＤＮＡ配列を作製できることは明白である。このような他のＤＮＡ配列は、遺伝子中の特定の部位を不活性化するために、例えば天然の配列中に存在する潜在性の制御又はプロセシング因子をＰＣＴ公開公報WO91/16432号及びWO93/09218号に記載のように選択的に不活性化することにより、又はすべてのコドン使用を、より近縁の宿主生物、好ましくは発現を所望する宿主生物のものに適合させることにより変化させた合成又は半合成ＤＮＡ配列を含む。コドン使用を宿主細胞に好ましいものに修飾するいくつかの技術は、特許及び特定の文献の中に見ることができる。コドン使用修飾の方法自体は、ほとんどの又はすべての潜在性制御配列又はプロセシング因子が他の配列で置き換えられている限り、本発明にとって重要ではない。植物中での発現に最適化したＤＮＡ配列の例を、添付の配列番号７及び９に示す。
【００３０】
上記のような、ＤＮＡ配列への小さな修飾は、通常通り、すなわちＰＣＲ媒介突然変異誘発により行うことができる（Ho et al., 1989, White et al., 1989）。
【００３１】
ＤＮＡ配列へのさらに顕著な修飾は、利用可能な技術を用いた所望のコード領域のde novoＤＮＡ合成により、通常通りに行うことができる。
【００３２】
用語「実質的に同じ」とは、Ｃｒｙタンパク質のアミノ酸配列に言及する場合には、比較するタンパク質のアミノ酸配列に対して５％以下、好ましくは２％以下異なるアミノ酸配列を含むことを意味し、Ｃｒｙタンパク質の毒性に言及する場合には、同じバイオアッセイ条件下で得られるＬＣ50値が、比較するタンパク質で得られるＬＣ50値の１０％以下、好ましくは５％以下異なるタンパク質を含む。
【００３３】
本明細書において使用するＣｒｙトキシンの「ドメイン」という用語は、本発明のＣｒｙトキシンの少なくとも一つの機能的特徴（例えば、結合及び／又は毒性特性）を有する新規ハイブリッドタンパク質を提供するために、別の（Ｃｒｙ）タンパク質へと転移させることができる特定の構造を有する毒素の任意の（１つ以上の）部分又は（１つ以上の）ドメインを意味する（Ge et al., 1991）。そのような部分は、本発明のＣｒｙタンパク質の結合及び／又は毒性特性を有するハイブリッドＢｔタンパク質の本質的な特性を形成しうる。そのようなハイブリッドタンパク質は、宿主の範囲を拡張し、毒性を改善し、かつ／又は昆虫の耐性の発達を防止するための方法において使用することができる（欧州特許公開公報（「EP」）408403; Visser et al., 1993）。
【００３４】
全ＤＮＡから調製された本発明のｃｒｙＤＮＡ配列を、適当な発現ベクターにライゲートさせ、E. coliを形質転換させ、次いで、Ｃｒｙタンパク質に対するモノクローナル又はポリクローナルの抗体を用いた、トキシンの発現に関する従来のコロニーイムノプロービング（immunoprobing）法（French et al., 1986）により、クローンをスクリーニングすることができる。
【００３５】
また、本発明のｃｒｙＤＮＡを、適当なＢｔシャトルベクター（Lereclus et al., 1992）にライゲートさせ、結晶マイナスＢｔ突然変異体へと形質転換させることもできる。次いで、（顕微鏡により検出される）結晶又は（ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検出される）結晶タンパク質の産生に関して、クローンをスクリーニングし、対照である結晶マイナス株と比較して、その殺虫活性について試験をすることができる。
【００３６】
本発明のＣｒｙタンパク質をコードする遺伝子は、ＤＮＡ配列を得るための従来の方法で配列決定することができる（Maxam and Gilbert, 1980; Sanger, 1977）。配列比較は、遺伝子が、以前に記載された、鱗翅目に対する活性を有するプロトキシン及びトキシンをコードする遺伝子（Hoefte and Whiteley, 1989; Crickmore, et al., 1998; http://epunix.biols.susx.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/index.htmlに見出されるCrickmoreら(1998)の出版物に対応するＢｔ目録ウェブサイト上の２０００年１０月１６日更新版）とは異なることを明らかにした。さらに、本発明のＣｒｙ２Ａタンパク質はこのＢｔ目録ウェブサイトの２００１年１２月１３日更新版に記載のいずれのバチルス・チューリンゲンシス結晶タンパク質配列と比較しても新規である。
【００３７】
新規に同定されたＣｒｙタンパク質プロトキシン型の殺虫有効部分をコードする、ＤＮＡ配列の殺虫有効部分は、遺伝子の配列解析の後、従来の方法で作製することができる。そのような断片においては、少なくともＢｔ結晶タンパク質の保存配列ブロック５（Hofte and Whiteley, 1989; Schnepf et al., 1998）に相同な配列が、そのようなタンパク質中に、好ましくはこの相同領域の２アミノ酸先まで含まれることが好ましい。Ｃｒｙ２Ａｅ及びＣｒｙ２Ａｆタンパク質では、この相同性領域は、配列番号２及び配列番号４のそれぞれ６２５位のアミノ酸で終了し、Ｃｒｙ２Ａｇでは、配列番号６の６２０位で終了する。Ｃｒｙタンパク質のアミノ酸配列は、単離されたＤＮＡ配列のＤＮＡ配列から決定することができる。Ｃｒｙタンパク質をコードするＤＮＡ配列の「殺虫有効部分（part）（又は部分（portion）若しくは断片）」とは、本明細書において「切断型遺伝子」又は「切断型ＤＮＡ」とも呼ばれ、Ｃｒｙタンパク質プロトキシン型よりも少ないアミノ酸を有するが、殺虫性であるポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を意味する。
【００３８】
本発明のＣｒｙタンパク質をコードするＤＮＡ配列の全部又は殺虫有効部分をE. coli、他のＢｔ株、及び植物において発現させるために、そのＤＮＡ配列の両端に適当な制限部位を導入することができる。これは、周知の手法を使用して、部位特異的突然変異誘発により実施することができる（Stanssens et al., 1989; White et al., 1989）。植物体における発現を改良するためには、ＰＣＴ公開公報WO91/16432号及びWO93/09218号; EP0 358 962及びEP0 359 472に従い、本発明のｃｒｙ遺伝子又はｃｒｙ遺伝子の殺虫有効部分のコドン使用を変更して、同等か、修飾されているか、人工的な遺伝子もしくは遺伝子部分を形成させてもよいし、あるいは適当なプロモーター（例えば、McBride et al., 1995、米国特許第5,693,507号）を使用して、Ｂｔ遺伝子もしくは遺伝子の一部を、プラスチド、ミトコンドリア又はクロロプラストゲノムに挿入し、そこで発現させることもできる。トウモロコシのような単子葉植物において発現を増強するためには、イントロン、好ましくは単子葉イントロンをキメラ遺伝子に付加することもできるし、ｃｒｙ遺伝子又はその殺虫有効部分のＤＮＡ配列を、翻訳的に影響のない様にさらに変化させ、コードされたアミノ酸配列を著しく変化させることなく、好ましくは変化させることなく、部位特異的なイントロン挿入の手段により及び／又はコドン使用への変化の導入、例えば、植物にとって最も好ましい、好ましくは特定の関連植物属へのコドン使用の適合化（Murray et al., 1989）により、遺伝子部分に存在する阻害の可能性があるＤＮＡ配列を修飾することもできる。
【００３９】
本発明の一実施態様によれば、タンパク質を、プラスチド、好ましくはクロロプラスト、ミトコンドリアなどの細胞内小器官に指向させ、又は細胞から分泌させ、潜在的にタンパク質の安定性及び／又は発現を最適化することが好ましい。この目的のために、本発明のキメラ遺伝子は、本発明のＣｒｙタンパク質コード領域に連結させた、シグナル又はターゲッティングペプチドをコードするコード領域を含む。本発明のタンパク質に含まれる特に好ましいペプチドは、クロロプラスト又は他のプラスチド標的指向のための輸送ペプチド、特に、その遺伝子産物がプラスチドに指向される植物遺伝子から複製された輸送ペプチド領域、Capellades et al.（米国特許第5,635,618号）の最適化輸送ペプチド、ホウレンソウ由来のフェレドキシン−ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼの輸送ペプチド（Oelmuller et al., 1993）、Wong et al. (1992）に記載の輸送ペプチド、及びＰＣＴ特許公開公報WO00/26371号に記載のターゲッティングペプチドである。また好ましいのは、ジャガイモプロテイナーゼインヒビターII（Keil et al., 1986）の分泌シグナル、イネのα―アミラーゼ３遺伝子の分泌シグナル（Sutliff et al., 1991）、及びタバコPR1タンパク質の分泌シグナル（Cornelissen et al., 1986）など、それらペプチドに連結されたタンパク質の細胞外分泌シグナルを送るペプチドである。
【００４０】
本発明により特に有用なシグナルペプチドは、クロロプラスト輸送ペプチド（例えば、Van Den Broeck et al. (1985)）、又はタンパク質のクロロプラストへの輸送を起こす米国特許5,510,471号及び米国特許第5,635,618号の最適化クロロプラスト輸送ペプチド、分泌シグナルペプチド、又はタンパク質を他のプラスチド、ミトコンドリア、ＥＲ、又は別の小器官に指向させるペプチドを含む。細胞内小器官への指向化又は植物細胞外へ又は、細胞壁への分泌のためのシグナル配列が、天然の指向化タンパク質又は分泌タンパク質、好ましくはKloesgen et al. (1989)、Kloesgen and Weil (1991)、Neuhaus & Rogers (1998）、Bih et al. (1999)、Morris et al. (1999)、Hesse et al.(1989)、Tavladoraki et al.(1998)、Terashima et al. (1999)、Park et al. (1997)、Shcherban et al. (1995)（これらの文献はすべて参考として本明細書に組み込まれる）に記載のもの、具体的には、トウモロコシ、ワタ、イネ又はダイズの指向化タンパク質又は分泌タンパク質からのシグナルペプチド配列に見出される。
【００４１】
さらに、本発明のＣｒｙタンパク質の結合特性は、当分野において公知の方法（例えば、Van Rie et al., 1990）を使用して、昆虫の中腸上で本発明のＣｒｙタンパク質が他の公知のＣｒｙタンパク質又はその他のＢｔタンパク質により認識（若しくは競合）されない部位と結合するか否かを決定して評価することができる。問題とする感受性昆虫において非競合的結合を示す様々な結合部位を有するＢｔトキシンは、昆虫が耐性を発達させた可能性のある公知のＢｔトキシンと置き換えるために、又は異なる作用様式を有するＢｔトキシンと組み合わせて使用して、特に植物体において発現させる場合にＢｔトキシンに対する昆虫の耐性の発達を防止又は遅延するために、極めて有益である。新規に単離されたＢｔトキシンは、その特徴のため、植物、例えばトウモロコシ又はイネのような単子葉植物ならびにワタ、ダイズ及びアブラナ科の各種植物のような双子葉植物を形質転換して、これらの植物体を昆虫被害から保護するために極めて有用である。ヘリコベルパ・ジーにおいて、Ｃｒｙ２Ａａタンパク質とＣｒｙ１Ａｃタンパク質の結合部位が共通ではないことが記載されている（English et al., 1994）。同様に、本発明のＣｒｙ２Ａタンパク質の結合特性が、関連のある害虫においてトランスジェニック植物中で現在用いられているＣｒｙ１又はＣｒｙ９の結合特性との比較において異なることが予想される。こうした結合特性の差異は、上記のような通常の結合アッセイにより測定することができる。特に、ある特定の害虫に対する耐虫性を管理する目的では、本発明のＣｒｙ２Ａタンパク質を他の昆虫制御タンパク質、具体的にはそのＣｒｙ２Ａタンパク質により認識される少なくとも１つの結合部位を認識しないＢｔ結晶タンパク質と組合わせることが好ましい。植物体、好ましくはワタ植物体において同時発現させるために、本発明のＣｒｙ２Ａタンパク質、好ましくはＣｒｙ２Ａｅタンパク質と組合わせる好ましい昆虫制御タンパク質として、Ｃｒｙ１Ｆタンパク質又はＣｒｙ１Ｆタンパク質に由来するハイブリッド（例えば、米国特許第6,326,169号、6,281,016号、6,218,188号に記載のハイブリッドＣｒｙ１Ａ−Ｃｒｙ１Ｆタンパク質、又はその毒性断片）、Ｃｒｙ１Ａ型タンパク質又はその毒性断片、好ましくはＣｒｙ１Ａｃタンパク質又はＣｒｙ１Ａｃタンパク質に由来するハイブリッド（例えば、米国特許5,880,275号に記載のＣｒｙ１Ａｂ−Ｃｒｙ１Ａｃハイブリッドタンパク質）、Estruch et al., 1996及び米国特許第6,291,156号に記載のＶＩＰ３Ａａタンパク質又はその毒性断片、ゼノラブダス（Xhenorhabdus）種、セラチア（Serratia）種またはホトラブダス(Photorhabdus）種の株からの殺虫タンパク質（例えば、Waterfield et al., 2001; ffrench-Constant and Bowen, 2000）を含む。一実施態様においては、そのような共発現は、既に昆虫制御タンパク質を発現している植物を本発明のＣｒｙ２Ａで形質転換することにより、又は昆虫制御タンパク質で形質転換させた植物と本発明のＣｒｙ２Ａタンパク質で形質転換させた植物を交配させることにより、容易に得ることができる。ワタ植物体では、第一の昆虫制御タンパク質としてＣｒｙ２Ａｅを使用し、第二の昆虫制御タンパク質としてＣｒｙ１Ａｃ又はＶＩＰ３Ａａタンパク質又はその誘導体を用いることが好ましい。トランスジェニック耐虫性植物に対する耐性を発達させるのを最小限に抑え又は防止するために、同じ植物体中で異なるＢｔ（又は同様に、他の昆虫制御タンパク質について）殺虫タンパク質を発現させるための方法は、欧州特許公報第0408403号に記載されている。
【００４２】
本発明のＣｒｙ２Ａタンパク質は、トランスジェニック植物体において、現在すでに市販されているＣｒｙ１  Ｂｔタンパク質などの昆虫制御タンパク質に対して昆虫が耐性を獲得した場合にも、昆虫の制御に便宜的に使用することができる。
【００４３】
好ましくは、選択目的だけでなく雑草防除の選択肢をふやす目的からも、本発明のトランスジェニック植物は、広範囲の除草剤、例えばグルホシネート又はグリホサートを主成分とする除草剤に対する耐性を付与するタンパク質をコードするＤＮＡで形質転換される。
【００４４】
Ｃｒｙタンパク質の殺虫有効部分をコードする、ｃｒｙ遺伝子の殺虫有効部分又はその等価物、好ましくはｃｒｙキメラ遺伝子は、単一の植物細胞の核ゲノムへと従来の方法で安定的に挿入することができ、そのようにして形質転換された植物細胞は、耐虫性の形質転換植物体を作製するために、従来の方法により使用することができる。これに関して、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）中のｃｒｙ遺伝子の殺虫有効部分を含有する無毒化されたＴｉプラスミドを使用して、植物細胞を形質転換することができ、そしてその後、例えばEP0116718、EP0270822、ＰＣＴ公開公報WO84/02913号、及び欧州特許公開公報（「EP」）0242246、及びGould et al., (1991)に記載された手法を使用して、形質転換された植物細胞から、形質転換された植物体を再生させることができる。好ましいＴｉプラスミドベクターは、各々、ＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡの境界配列間に、又は少なくとも右側境界配列の左方に、ｃｒｙ遺伝子の殺虫有効部分を含有する。無論、その他の型のベクターも植物細胞を形質転換するために使用でき、直接遺伝子移入（例えば、EP0 233 247に記載）、花粉媒介形質転換（例えば、EP0270356、ＰＣＴ公開公報WO85/01856号、及び米国特許第4,684,611号に記載）、植物ＲＮＡウイルスにより媒介される形質転換（例えば、EP0067553及び米国特許第4,407,956号に記載）、リポソーム媒介形質転換（米国特許第4536475号に記載）、並びにトウモロコシ（例えば、米国特許第6,140,553号；Fromm et al., 1990:Gordon-Kamm et al., 1990）及びイネ（Shimamoto et al., 1989; Datta et al., 1990）のある種の系を形質転換するための最近記載された方法、及び単子葉植物一般を形質転換するための方法（ＰＣＴ公開公報WO92/09696号）等その他の手法を使用することができる。ワタの形質転換において、特に好ましいのは、ＰＣＴ特許公開公報WO00/71733号に記載の方法である。ダイズの形質転換では、当分野に公知の方法、例えばHinchee et al. (1988)及びChristou et al. (1990）又はWO00/42207号の方法が参考にされる。
【００４５】
核ゲノムの形質転換のほか、プラスチドゲノム、好ましくはクロロプラストのゲノムの形質転換も本発明に含まれる。Kota et al. (1999）は、タバコクロロプラストでのＣｒｙ２Ａａタンパク質の過剰発現の方法を述べている。
【００４６】
得られた形質転換された植物体を、従来の植物繁殖スキームにおいて使用し、同一の特徴を有する形質転換された植物体をさらに作製し、又はｃｒｙ遺伝子の殺虫有効部分を他の多様な同一又は関連植物種へと導入することができる。形質転換された植物体から得られる種子は、安定なゲノム挿入物として、ｃｒｙ遺伝子の殺虫有効部分を含有している。形質転換された植物の細胞を、Ｃｒｙプロトキシン、好ましくはＣｒｙトキシンの殺虫有効部分を作製するため、従来の方法で培養することができ、それは、鱗翅目に対する従来の殺虫性組成物において使用するため回収することができる（米国特許第5,254,799号）。
【００４７】
ｃｒｙ遺伝子の殺虫有効部分、好ましくは切断型ｃｒｙ遺伝子は、挿入された遺伝子が、植物細胞における遺伝子部分の発現を指図しうるプロモーターの下流（即ち、３′）に、かつその制御下にあるよう、植物細胞ゲノムに挿入される。これは、好ましくは、ｃｒｙキメラ遺伝子を植物細胞ゲノム、特に核又はプラスチド（例えば、クロロプラスト）のゲノムへと挿入することにより達成される。好ましいプロモーターは、単離物ＣＭ１８４１（Gardner et al., 1981）、ＣａｂｂＢ−Ｓ（Franck et al., 1980）、及びＣａｂｂＢ−ＪＩ（Hull and Howell, 1987）のカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の強力な構成３５Ｓプロモーター（「３５Ｓプロモーター」）；Odell et al.(1985)に記載された３５Ｓプロモーター、ユビキチンファミリー由来のプロモーター（例えば、Christensen et al., 1992のトウモロコシのユビキチンプロモーター、Cornejo et al., 1993も参照のこと）、ｇｏｓ２プロモーター（de Pater et al., 1992）、ｅｍｕプロモーター（Last et al., 1990)、An et al.(1996)により記載されたプロモーターのようなシロイヌナズナ（Arabidopsis）アクチンプロモーター、Zhangら(1991)により記載されたプロモーターのようなイネアクチンプロモーター；カッサバベインモザイクウイルス（Cassava vein mosaic virus）のプロモーター（WO97/48819号, Verdauguer et al. (1998)）、サブテレニアンクローバースタントウイルスからのプロモーターのｐＰＬＥＸシリーズ（WO96/06932号、具体的にはＳ７プロモーター）、例えばｐＡｄｈ１Ｓ（GenBank 受託番号Ｘ０４０４９、Ｘ００５８１）などのアルコールデヒドロゲナーゼプロモーター、それぞれＴ−ＤＮＡの１′遺伝子及び２′遺伝子の発現を誘導するＴＲ１′プロモーター及びＴＲ２′プロモーター（それぞれ「ＴＲ１′プロモーター」及び「ＴＲ２′プロモーター」）（Velten et al., 1984）を含む。あるいは、挿入されたｃｒｙ遺伝子部分が特定の（１つ以上の）組織又は（１つ以上の）器官においてのみ発現されるような、構成性ではないが、植物体の１つ以上の組織又は器官（例えば、葉及び／又は根）に特異的なプロモーターを利用することができる。例えば、ｃｒｙ遺伝子の殺虫有効部分は、殺虫有効遺伝子部分を、米国特許第5,254,799号に開示されたようなその植物自身又はエンドウのような他の植物のリブロース−１，５−ビスホスフェートカルボキシラーゼ小サブユニット遺伝子のプロモーターのような光誘導性プロモーターの制御下に置くことにより、植物（例えば、トウモロコシ、ワタ）の葉において選択的に発現することができる。もう一つの代替法は、発現が、好ましくは昆虫の摂食などの損傷により、誘導可能なプロモーター、例えばCordera et al. (1994)により記載のＭＰＩプロモーター又は化学的因子を使用することである。
【００４８】
ｃｒｙ遺伝子の殺虫有効部分は、挿入された遺伝子部分が、適当な３′末端転写制御シグナル（即ち、転写物形成シグナル及びポリアデニル化シグナル）の上流（即ち、５′側）にあるよう、植物ゲノムに挿入される。これは、好ましくは、ｃｒｙキメラ遺伝子を植物細胞ゲノムへと挿入することにより達成される。好ましいポリアデニル化シグナル及び転写物形成シグナルは、形質転換された植物細胞において３′−非翻訳ＤＮＡ配列として機能する、ノプレンシンターゼ遺伝子（Depicker et al., 1982）、オクトピンシンターゼ遺伝子（Gielen et al., 1984）及びＴ−ＤＮＡ遺伝子７（Velten and Schell, 1985）のものを含む。
【００４９】
植物体が、容易に検出可能な融合タンパク質を発現するよう、ｃｒｙ遺伝子の殺虫有効部分を、カナマイシン耐性をコードするｎｅｏ遺伝子（EP0242236）のような選択可能又は評価可能なマーカー遺伝子と同一のプロモーターの制御下でハイブリッド遺伝子（米国特許第5,254,799号; Vaeck et al., 1987）として植物ゲノムへ場合により挿入してもよい。
【００５０】
植物細胞の形質転換を利用して、例えば、適切に形成させた後、穀物に施用できるＣｒｙ２Ａタンパク質を生成させるなど、植物細胞培養物中で大量に本発明のタンパク質を生成させることができる。本明細書においてトランスジェニック植物細胞に言及するときは、単離体若しくは組織培養としての植物細胞（又は植物プロトプラスト）、又は植物体若しくは分化した器官又は組織に含まれる植物細胞（又はプロトプラスト）を意味するが、どちらの可能性も具体的に本明細書には含まれる。したがって、詳細な説明または特許請求の範囲において植物細胞に言及するときは、培養における単離細胞のみを意味するのではなく、それがどのような場所にあっても、又はどのようなタイプの植物組織又は器官内に存在していても、あらゆる植物細胞を意味する。
【００５１】
抗鱗翅類タンパク質をコードするｃｒｙ遺伝子の全部又は一部は、鱗翅目又は鞘翅目に対する殺虫活性を有するバチルス．チューリンゲンシスのような他の細菌を形質転換するためにも使用することができる。それにより、広範囲の鱗翅目もしくは鞘翅目の害虫を駆除するため、又はさらなる鱗翅目害虫を駆除するために有用な形質転換されたＢｔ株を、作製することができる。適当なクローニング媒体に組み込まれた本発明のｃｒｙ遺伝子の全部又は一部による、シュードモナス属、アグロバクテリウム属、バチルス属、又はエシェリキア属の細菌のような細菌の形質転換は、従来の方法で、好ましくはMahillonら(1989)及びＰＣＴ特許公開公報WO90/06999号に記載されたような従来の電気穿孔技術を使用して実施できる。
【００５２】
本発明のｃｒｙ遺伝子を含有する形質転換されたバチルス種株は、多量の細胞を提供するため、従来の方法（Dulmage, 1981; Bernhard and Utz, 1993）により発酵することができる。充分に理解されている適切な条件（Dulmage, 1981）の下で、これらの株は、それぞれ、胞子を形成して、Ｃｒｙプロトキシンを含有する結晶タンパク質を多量に産生する。
【００５３】
本発明の、殺虫性の、特に抗鱗翅目性の組成物は、適当な担体、希釈剤、乳化剤、及び／又は分散剤（例えば、Bernhard and Utz, 1993により記載されたようもの）と共に、ｃｒｙ遺伝子で形質転換された微生物、又は好ましくはそれぞれのＣｒｙタンパク質、もしくはＣｒｙプロトキシン、トキシン、もしくは殺虫有効プロトキシン部分を活性成分として使用して、従来の方法で製剤化することができる。この殺虫性組成物は、湿潤性粉末、ペレット、顆粒、もしくは微粉として、又はフォーム、ゲル、懸濁液、濃縮液等の水性もしくは非水性の溶媒を含む液体製剤として製剤化することができる。
【００５４】
本発明に従い、昆虫、特に鱗翅目を制御するための方法は、保護されるべき場所（区域）へ殺虫量の本発明のＣｒｙタンパク質又はｃｒｙ遺伝子で形質転換された宿主を、施用（例えば、噴霧）することを含むことができる。保護される場所には、例えば、害虫の生息箇所もしくは成長中の植物、又は植物を成長させる区域が含まれる。
【００５５】
本発明は、さらに、鱗翅目ダイズ害虫、具体的には、鱗翅目のニカメイガ、イチモンジセセリ、ハスモンヨトウ、アワヨトウ、イサゴムシ（rice caseworm）、又はコブノメイガ（rice leaffolder）、好ましくは、キロ・スプレサリス（Chilo suppressalis）、キロ・パルテラス（Chilo partellus）、スキルポファガ・インセルチュラス（Scripophaga incertulas）、セサミア・インフェレンス（Sesamia inferens）、ナファロクロシス・メヂナリス（Cnaphalocrocis medinalis）、マラスミア・パトナリス（Marasmia patnalis）、マラスミア・エクシグア（Marasumia exigua）、マラスミア・ルラリス（Marasmia ruralis）及びスキルポファガ・イノタタ（Scirpophaga innotata）からなる群より選択される昆虫を制御する方法に関し、この方法は、保護されるべき区域又は植物に、本明細書定義のＣｒｙ２Ａタンパク質、好ましくは本明細書定義のＣｒｙ２Ａｅタンパク質を（すなわち、本発明のｃｒｙ２Ａ遺伝子で形質転換されたイネ植物体を植えることにより、又は本発明のＣｒｙ２Ａタンパク質を含有する組成物を噴霧することにより）施用することを含む。本発明は、イネ植物体の被害を最小限にするための、鱗翅目イネ害虫に対する、本発明のＣｒｙ２Ａタンパク質、特にＣｒｙ２Ａｅタンパク質の使用にも関する。
【００５６】
本発明はさらに、鱗翅目ワタ害虫を制御する方法に関し、その方法は、保護されるべき区域又は植物体に、本明細書において定義のＣｒｙ２Ａタンパク質、好ましくは本明細書において定義のＣｒｙ２Ａｅタンパク質を（すなわち、本発明のｃｒｙ２Ａ遺伝子で形質転換されたイネを植え付けすることにより、又は本発明のＣｒｙ２Ａタンパク質を含有する組成物を噴霧することにより）施用することを含む。本発明は、イネ植物体への被害を最小限にするための鱗翅目イネ害虫に対する本発明のＣｒｙ２Ａタンパク質、特にＣｒｙ２Ａｅタンパク質の使用にも関する。
【００５７】
本発明は、さらに、鱗翅目イネ害虫、具体的には、鱗翅目のニカメイガ、イチモンジセセリ、ハスモンヨトウ、アワヨトウ、イサゴムシ（rice caseworm）、又はコブノメイガ（rice leaffolder）、好ましくは、キロ・スプレサリス（Chilo suppressalis）、キロ・パルテラス（Chilo partellus）、スキルポファガ・インセルチュラス（Scripophaga incertulas）、セサミア・インフェレンス（Sesamia inferens）、ナファロクロシス・メヂナリス（Cnaphalocrocis medinalis）、マラスミア・パトナリス（Marasmia patnalis）、マラスミア・エクシグア（Marasumia exigua）、マラスミア・ルラリス（Marasmia ruralis）及びスキルポファガ・イノタタ（Scirpophaga innotata）からなる群より選択される昆虫を制御する方法に関し、この方法は、保護されるべき区域又は植物に、本明細書において定義のＣｒｙ２Ａタンパク質、好ましくは本明細書において定義のＣｒｙ２Ａｅタンパク質を（すなわち、本発明のｃｒｙ２Ａ遺伝子で形質転換されたイネ植物体を植え付けることにより、又は本発明のＣｒｙ２Ａタンパク質を含有する組成物を噴霧することにより）施用することを含む。本発明は、イネ植物体の被害を最小限にするための、鱗翅目イネ害虫に対する、本発明のＣｒｙ２Ａタンパク質、特にＣｒｙ２Ａｅタンパク質の使用にも関する。
【００５８】
Ｃｒｙプロトキシン又はトキシンを得るために、Ｃｒｙタンパク質を発現する組換え宿主の細胞を、適当な培養培地で従来の方法で増殖させ、その後、酵素的分解又は洗浄剤などの従来の手段を用いて溶解することができる。その後、プロトキシンを分離し、クロマトグラフィー、抽出、電気泳動などの標準的な技術により精製することができる。その後、プロトキシンをトリプシン消化することによりトキシンを得ることができる。
【００５９】
本発明のこれら及び／又は他の実施態様は、本発明の記載の一部を形成する、特許請求の範囲の記載中に反映される。
【００６０】
以下の実施例は、本発明を説明するものであって、発明又は求める保護を限定するためのものではない。実施例、特許請求の範囲、発明の記載中で言及する配列表は以下のとおりである。
【００６１】
配列表：
配列番号１−Ｃｒｙ２Ａｅタンパク質及びＤＮＡのアミノ酸及びＤＮＡ配列
配列番号２−Ｃｒｙ２Ａｅタンパク質のアミノ酸配列
配列番号３−Ｃｒｙ２Ａｆタンパク質及びＤＮＡのアミノ酸及びＤＮＡ配列
配列番号４−Ｃｒｙ２Ａｆタンパク質のアミノ酸配列
配列番号５−Ｃｒｙ２Ａｇタンパク質及びＤＮＡのアミノ酸及びＤＮＡ配列
配列番号６−Ｃｒｙ２Ａｇタンパク質のアミノ酸配列
配列番号７−ワタにおける発現用の人工的ｃｒｙ２ＡｅＤＮＡ配列
配列番号８−配列番号７のＤＮＡによりコードされるＣｒｙ２Ａｅタンパク質のアミノ酸配列
配列番号９−トウモロコシにおける発現用の人工的ｃｒｙ２ＡｅＤＮＡ配列。
【００６２】
実施例中、特記しない限り、組換えＤＮＡを作成し操作する手法は全て、Sambrook et al., Molecular Cloning-A Laboratory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY(1989), 及びAusubel et al.(1994)Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USAの第１及び２巻に記載された標準的な手法により実施される。植物分子生物学研究のための標準的な材料及び方法は、BIOS Scientific Publications Ltd(UK)及びBlackwell Scientific Publicaions Ltd(UK)により共同出版されたR.R.D.CroyによるPlant Molecular Biology Labfax(1993)に記載されている。ＰＣＲ技術のための手法は、M.A.Innis, D.H.Gelfand, J.J.Sninsky and T.J.White編の「PCR protocols: a guide to methods and applications」(Academic Press, Inc., 1990)に見出される。
【００６３】
実施例 
実施例１：株の特徴付け
ＢＴＳ０２７６１Ａ及びＢＴＳ０１０９９Ｅ株はそれぞれフィリピン（South Tagalog）及びベルギー（Deerlijk）で収集された穀物微粉試料より単離された。
【００６４】
各株は、従来の標準的な培地、好ましくはＴ3培地（トリプトン３g/l、トリプトース２g/l、酵母抽出物１．５g/l、５mg ＭｎＣｌ2、０．０５M Ｎａ2ＨＰＯ4・２Ｈ2Ｏ、０．０５M ＮａＨ2ＰＯ4・Ｈ2Ｏ、ｐＨ６．８、及び１．５％寒天）上で、好ましくは２８℃で培養することができる。長期保存のためには、等容量の胞子−結晶懸濁液を等容量の５０％グリセロールと混合し、これを−７０℃で保存するか、又は胞子−結晶懸濁液を凍結乾燥させることが好ましい。胞子形成のためには、Ｔ3培地上で２８℃で７２時間増殖させ、続いて４℃で保存することが好ましい。胞子形成中に株により産生された結晶タンパク質は、結晶中にパッケージされる。
【００６５】
実施例２：選択された鱗翅目昆虫種に対するＢＴＳ０２７６１Ａ株及びＢＴＳ０１０９９Ｅ株の殺虫活性
ＢＴＳ０１０９９Ｅ株及びＢＴＳ０２７６１Ａ株のいずれかに由来する胞子−結晶混合物の非希釈アルカリ（ｐＨ１２）抽出物で層にした人工飼料を与えられたヘリコベルパ・ジー（Helicoverpa zea）、ヘリコベルパ・アルミゲラ（Helicoverpa armigera）、ヘリオチス・ビレセンス（Heliothis virescens）、オストリニア・ヌビラリス（Ostrinia nubilalis）、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）、及びセサミア・ノナグリオイデス（Sesamia nonagrioides）の新生幼虫に対して毒性アッセイを実施した。
人工飼料（Vanderzant, 1962）を、コースター（Costar）４８穴プレートのウェルに分配した。抽出物２５μlを飼料の表面に（塗布し）、層状空気流中で乾燥させた。各ウェルに幼虫１匹を置き、１試料当たり１８匹の幼虫を使用した。７日目に死亡した幼虫及び生存している幼虫を計数した。死亡した幼虫の割合（％）を、以下の表Ｉに示す。
【００６６】
ＢＴＳ０２７６１Ａ及びＢＴＳ０１０９９Ｅ株の胞子／結晶混合物をバイオアッセイで試験をし、以下の結果を得た
【００６７】
【表１】
0004404549.tif 000002
【００６８】
＊：成長に若干影響を受けた生存幼虫。
陰性対照（標準飼料）：Ｈｚ：６％Ｍ、Ｈｖ：１７％Ｍ、Ｓｆ：０％Ｍ。
Ｈｚ：ヘリコベルパ・ジー；Ｈｖ：ヘリオチス・ビレセンス；Ｓｆ：スポドプテラ・フルギペルダ；Ｏｎ：オストリニア・ヌビラリス；Ｓｎ：セサミア・ノナグロイデス（ＮＴは試験せずを意味する）。
【００６９】
実施例３：Ｂｔ株ＢＴＳ０１０９９Ｅ及びＢＴＳ０２７６１Ａからの新規ｃｒｙ２Ａ遺伝子の同定及び特徴付け
適切なプライマーを用いて、ＢＴＳ０２７６１Ａ株及びＢＴＳ０１０９９Ｅ株からのｃｒｙ２Ａ遺伝子の一部を増幅した。その後、これらの増幅生成物を制限酵素で消化した。次いで、得られたパターンを、そのような消化を公知のｃｒｙ２Ａ遺伝子を含む株に由来する増幅生成物で行ったときに得られるパターンと比較した。制限消化パターンに基づき、ＢＴＳ０２７６１Ａ株及びＢＴＳ０１０９９Ｅ株からのｃｒｙ２Ａ遺伝子は新規であると考えられた。そこで、増幅生成物を配列決定した。これにより、増幅された断片が新規のｃｒｙ２Ａ遺伝子由来であることが確認された。すなわち、ＢＴＳ０２７６１Ａ株は、１つの新規ｃｒｙ２Ａ様遺伝子を含有し、株１０９９Ｅは２つの新規ｃｒｙ２Ａ様遺伝子を含有した。
【００７０】
ＢＴＳ０２７６１Ａ及びＢＴＳ０１０９９Ｅ株からの全ＤＮＡをＳａｕ３Ａで処理し、サイズで分画し、７〜１０ｋｂの断片をｐＵＣ１９Ｉ（ｐＵＣ１９の誘導体）にライゲートし、ＢａｍＨＩで切断し、ＴｓＡＰ（熱安定性アルカリホスファターゼ）で処理した。このライゲーション混合物をE. coli  ＸＬ１Ｂｌｕｅ中に電気穿孔させた。
【００７１】
ＤＩＧ標識したＰＣＲ断片をプローブとして使用するコロニーハイブリダイゼーションにより陽性クローンを同定した。組換えE. coli株を２０００年１０月６日にVakgroep voor Moleculaire Biologie-Plasmidencollectie, Universiteit Gent, K.L. Ledeganckstraat 35, B-9000 Gent, Belgium（以下、「ＢＣＣＭ−ＬＭＢＰ」と略記）に以下の受託番号で寄託された：ＢＣＣＭ−ＬＭＢＰ４２４７、ＸＬ１Ｂｌｕｅ：ｐＵＣ１０９９Ｅ／ｃｒｙ２ｃｌｏｎｅ１株（Ｃｒｙ２Ａｆと命名したタンパク質をコードする）；ＢＣＣＭ−ＬＭＢＰ４２４８、ＸＬ１Ｂｌｕｅ：ｐＵＣ１０９９Ｅ／ｃｒｙ２ｃｌｏｎｅ７（Ｃｒｙ２Ａｅと命名したタンパク質をコードする）；及びＢＣＣＭ−ＬＭＢＰ４２４９、ＸＬ１Ｂｌｕｅ：ｐＵＣ２７６１Ａ／ｃｒｙ２ｃｌｏｎｅ１４１（Ｃｒｙ２Ａｇと命名したタンパク質をコードする）。遺伝子は、ＮｏｔＩ−ＦｓｅＩ消化によりこれらの寄託されたクローンから単離することができる。これらのクローンからのインサートをシャトルベクターｐＳＬ４０１にサブクローニングした。得られたプラスミドをまずE. coli GM2163に形質転換した。この株からのプラスミド調製物をその後結晶マイナスバチルス・チューリンゲンシス変種berliner 1715株に電気穿孔させた。
その後、組換えＢｔ株からの胞子／結晶混合物から調製されたアルカリ抽出物を、バイオアッセイに使用して、新規Ｃｒｙ２Ａタンパク質の毒性を評価した。この抽出物を、上記実施例１に記載のとおりにアッセイした。結果を表ＩＩに示す。
【００７２】
【表２】
0004404549.tif 000003
【００７３】
「濃度」：Bradford法による株抽出物の総タンパク質濃度（μg/ml）；［Ｈａ」：ヘリオチス・アルミゲラ。他の略語は表Ｉ中上記のとおりである；含まれる対照（通常飼料、ＰＢＳ−ＢＳＡ添加又は非形質転換結晶マイナスＢｔ株１７１５）では有意な死亡率は認められなかった。
【００７４】
さらに、Ｃｒｙ２Ａｆタンパク質を発現する組換えクローンは、選択した鱗翅目昆虫に対する試験を行ったところ、有意な死亡率を示した。
【００７５】
さらに、分析を実施して、公知のＣｒｙ２Ａａ及びＣｒｙ２Ａｂタンパク質との比較において、組換え生成したＣｒｙ２Ａｅタンパク質のＬＣ５０及びＬＤ９０値を決定した。
このアッセイでは、昆虫ごとに異なる人工飼料をコースター２４穴プレートのウェルに分配した。ＸＬ１Ｂｌｕｅ：ｐＵＣ１０９９Ｅｃｌｏｎｅ７に由来するｃｒｙ２Ａｅ遺伝子を含有する組換えＢｔ株の胞子−結晶混合物のアルカリ（ｐＨ１２）抽出物５０μlを飼料表面に塗布し、層状空気流中で乾燥させた。スポドプテラ・フルギペルダ及びオストリニア・ヌビラリスの飼料は、水１０００ml、寒天２０g、トウモロコシ粉１１２g、小麦麦芽２８g、酵母３０g、アスコルビン酸４．８g、安息香酸１．２g、ニパジン１g、オーレオマイシン０．０６g、ニスタチン０．０３gを含んだ。ヘリオチス・ビレセンス及びヘリコベルパ・ジーの飼料は、水１０００ml、寒天２０g、ダイズ粉８１g、小麦麦芽３６g、スクロース１４．７g、コーン油５ml、Wesson塩混合物１０g、Vanderzantビタミン混合物９．５g、ソルビン酸１．１g、ニパジン１g、オーレオマイシン０．３４g、ニスタチン０．０６gを含んだ。種々のタンパク質濃度を試験して、ＬＣ５０値を決定できるようにした。ヘリコベルパ・ジー、ヘリオチス・ビレセンス及びスポドプテラ・フルギペルダに対する試験では、幼虫１匹を各ウェルに置き、１試料当たり２０匹の幼虫を使用した。オストリニア・ヌビラリスに対する試験では、各ウェルに幼虫２匹を置き、１試料当たり２４匹の幼虫を使用した。死亡した幼虫及び生存している幼虫を７日目（スポドプテラ・フルギペルダについては６日目、オストリニア・ヌビラリスについては５日目）に計測した。ＬＣ５０及びＬＣ９０値をプロビット解析（POLOプログラム、LeOraSoftware，1987, POLO-PC. A user's guide to probit or logic analysis. Berkeley, California）により計算した。結果を表ＩＩＩに示す。
【００７６】
【表３】
0004404549.tif 000004
【００７７】
ＮＴ：試験せず；濃度：関連のタンパク質を生成する組換えＢｔ株のアルカリ抽出物中の総タンパク質濃度（μg/ml）；アステリスクは、オストリニア・ヌビラリスの結果が、（「濃度」の欄のカッコの間に示される）異なるタンパク質濃度を有する異なるバッチで得られたことを示す；対照（通常飼料、ＰＢＳ−ＢＳＡ又は結晶マイナス対照Ｂｔ株）では死亡率は０〜５％以下である。
【００７８】
オストリニア・ヌビラリスに上記と同じ実験設定を用いて、但しベルベットビーン・キャタピラ（velvetbean caterpillar）、アンチカルシア・ゲマタリス（Anticarsia gemmatalis）に対して精製されたＣｒｙ２Ａｅタンパク質を用いて（各濃度で幼虫１匹を有する２０ウェルを試験）、この重要なダイズ害虫に対するこのタンパク質の高活性が明らかにされた。この昆虫に対する精製Ｃｒｙ２Ａｅタンパク質のＬＣ50値は、０．４４ng/cm2であることが見出され（信頼水準９５％；このＬＣ50値は、精製されたタンパク質の異なるバイオバッチの２回のアッセイの平均値である）、ＬＣ90値は７．７９ng/cm2であることが見出された（信頼水準９５％；このＬＣ90値は、精製されたタンパク質の異なるバッチにおけるの２回のバイオアッセイの平均値である）。オストリニアと精製Ｃｒｙ２Ａｅタンパク質に対して上記と同じ実験設定を用いて、このタンパク質のヘリコベルパ・ジー及びオストリニア・ヌビラリスに対する有意な毒性が確認された（これらの昆虫に対するＬＣ50値は、それぞれ、１４５．１ng/cm2及び４８．３１ng/cm2であることが明らかになった（信頼水準９５％、これらのＬＣ50値は、各昆虫に対する精製タンパク質の異なるバッチにおける２回のバイオアッセイの平均値である））。
【００７９】
これらの結果は、本発明の新規Ｃｒｙタンパク質、特にＣｒｙ２Ａｅタンパク質が、関連の鱗翅目害虫、特にダイズ、ワタ及びトウモロコシなどの植物に商業的被害を及ぼす害虫である、ヘリオチス・ジー、オストリニア・ヌビラリス、アンチカルシア・ゲマタリス及びヘリコベルパ・ジーに高い活性を有する有用なタンパク質であることを示す。
【００８０】
本発明の単離されたｃｒｙ２Ａ遺伝子について決定された配列、及び決定されたアミノ酸配列を、添付の配列表に示す。表ＩＶＡ及びＩＶＢに示すように、ＧＣＧのウィスコンシンパッケージのＧＡＰプログラムを用いた対配列比較は、他のＣｒｙ２Ａ配列（公知Ｃｒｙ２Ａタンパク質及びＤＮＡの配列については、Crickmore et al. (1998)及び上記のインターネットウェブサイトを参照のこと）との配列同一性のレベルを明らかにした（ＧＡＰプログラムではＧＣＧデフォルトを使用した。アミノ酸配列の比較には、blosum62スコアリングマトリックスを使用し、ＤＮＡ配列の比較には、nwsgapdnaスコアリングマトリックスを使用した）。
【００８１】
【表４】
0004404549.tif 000005
【００８２】
実施例４：形質転換植物における新規Ｃｒｙタンパク質の産生
Ｃｒｙ２Ａｅ、Ｃｒｙ２Ａｆ及びＣｒｙ２Ａｇタンパク質をそれぞれコードするキメラ遺伝子を、ＣａＭＶ  ３５Ｓ（Hull and Howell, 1987）及びユビキチン（Christensen et al., 1992）プロモーターなどのプロモーターを用いて、周知の手順を使用して作製した。オープンリーディングフレームのコドン使用が、公開されたＰＣＴ特許出願WO94/12264号に記載のように、発現効率を最適化するように宿主植物のものに適合されていることが好ましい。さらに、いくつかのキメラ遺伝子では、本発明のＣｒｙ２Ａタンパク質を植物のクロロプラストに指向化するために、輸送ペプチド（詳細な説明に記載されるとおり）をコードするＤＮＡ配列が含まれる。
Ｃｒｙ２Ａｅタンパク質をコードするキメラ遺伝子によるトウモロコシ及びワタの形質転換では、いくつかのキメラ遺伝子コンストラクトをアグロバクテリウム株のプラスミドに挿入する。これらのコンストラクトは、配列番号７のｃｒｙ２Ａｅコード配列が、カリフラワーモザイクウイルスからの３５Ｓ２プロモーター（Odell et al., 1985）、ペチュニアからのクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質遺伝子（Harpster et al., 1988）及びカリフラワーモザイクウイルスからの３５Ｓ遺伝子の３’転写終結・ポリアデニル化領域（Sanfacon et al., 1991）に機能的に連結しているｐＡＣＳ９及びｐＡＣＳ１１、ならびに同じ制御領域及び同じｃｒｙ２Ａｅコード領域を有するが、クロロプラスト指向性にさせるＴｐｓｓｕＡｔ輸送ペプチドをコードするＤＮＡ配列（Krebbers et al., 1988）もｃｒｙ２Ａｅコード領域の５’末端に挿入されており、輸送ペプチド融合タンパク質が産生されるコンストラクトｐＡＣＳ１２及びｐＡＣＳ１３を含む。これらのコンストラクトは、カッサバベインモザイクウイルス（Cassava Vein Mosaic Virus）のＣｓＶＭＶプロモーターの制御下に、選択可能なマーカーとしてグリホサート除草剤耐性タンパク質をコードするＤＮＡ配列（公開されたＰＣＴ特許出願WO97/04103号に記載され、最適化した輸送ペプチドに結合されている（米国特許第5,635,618号））又はグルホシネート除草剤耐性タンパク質（Thompson et al., 1987）をコードするＤＮＡ配列のいずれかを、及びノパリンシンターゼ遺伝子の３’転写終結ポリアデニル化領域（Depicker et al., 1982）をさらに含む。トウモロコシ細胞は、参考として組み込まれる米国特許第6140553号に記載の形質転換法を用いてアグロバクテリウム媒介形質転換によりｐＡＣＳ９、ｐＡＣＳ１１、ｐＡＣＳ１２及びｐＡＣＳ１３コンストラクトで安定に形質転換された。ワタ細胞は、参考として組み込まれるＰＣＴ特許公開公報WO00/71733号に記載のように、形質転換によりｐＡＣＳ９、ｐＡＣＳ１１、ｐＡＣＳ１２及びｐＡＣＳ１３コンストラクトで安定に形質転換された。イネ細胞は、公開されたＰＣＴ特許出願WO92/09696号に記載の方法で安定に形質転換される。タバコ細胞は、本質的に欧州特許第0116718号又はDeblaere et al. (1987）に記載される、アグロバクテリウム媒介形質転換を用いて、ｐＡＣＳ１１及びｐＡＣＳ１２コンストラクトで安定に形質転換された。
形質転換細胞及びそれから再生された植物体は、再生された植物が、すべてではなくても、ほとんどが形質転換されているように選択剤ホスフィノトリシン又はグリホサートを含有する培地で増殖させる。
再生された形質転換タバコ、トウモロコシ、ワタ及びイネ植物体をＣｒｙ２Ａ  ＥＬＩＳＡ、ノーザンブロット及びサザンブロット法により、殺虫有効性及び栽培学的特性に従って選択する。キメラｃｒｙ２Ａ遺伝子含有子孫植物体は、昆虫抵抗性及び形質転換された表現型の適切な分離とともに、非形質転換対照植物と比較して改善された昆虫に対する抵抗性を示す。タンパク質及びＲＮＡの測定は、植物における昆虫抵抗性の増加が、その細胞において新規Ｃｒｙ２Ａタンパク質のより高い発現を有することを示す。
【００８３】
【表５】
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【配列表】
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