(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）
【化１】
0004534317.tif 000018
（式中、ＬはＣ６−Ｃ１４アリール基、または、窒素原子、酸素原子あるいは硫黄原子の少なくとも１種を１〜４個含むＣ４−Ｃ１２ヘテロアリール基を表し、ＭはＣ１−Ｃ３アルキル基を表す。）
で示されるカルボン酸異性体Ａを一般式（２）
【化２】
0004534317.tif 000019
（式中、Ｌ及びＭは前記と同じ意味を表す。）
で示されるカルボン酸異性体Ｂに変換する能力を有し、ノカルディア・ディアファノゾナリアJCM３２０８株（Nocardia  diaphanozonaria）の培養液、菌体若しくは菌体処理物、又はサッカロポリスポラ・ヒルスタ  サブスピーシス  コベンシス（Saccharopolyspora  hirsutasubsp.  Kobensis）JCM９１０９株の培養液、菌体若しくは菌体処理物である微生物学的材料を、一般式（１）で示されるカルボン酸異性体Ａに作用させることを特徴とする一般式（２）で示されるカルボン酸異性体Ｂの製造方法。
【請求項２】
一般式（１）で示されるカルボン酸異性体ＡにおけるＬがＣ６−Ｃ１４アリール基であることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
一般式（１）で示されるカルボン酸異性体ＡにおけるＭがメチル基であることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項４】
微生物学的材料が、ノカルディア・ディアファノゾナリアJCM３２０８株（Nocardia  diaphanozonaria）の培養液、菌体若しくは菌体処理物である請求項１記載の製造方法。
【請求項５】
一般式（１）
0004534317.tif 000020
（式中、ＬはＣ６−Ｃ１４アリール基、または、窒素原子、酸素原子あるいは硫黄原子の少なくとも１種を１〜４個含むＣ４−Ｃ１２ヘテロアリール基を表し、ＭはＣ１−Ｃ３アルキル基を表す。）
で示されるカルボン酸異性体Ａを一般式（２）
0004534317.tif 000021
（式中、Ｌ及びＭは前記と同じ意味を表す。）
で示されるカルボン酸異性体Ｂに変換する能力を有し、ノカルディア・ディアファノゾナリアJCM３２０８株（Nocardia  diaphanozonaria）の培養液、菌体若しくは菌体処理物、又はサッカロポリスポラ・ヒルスタ  サブスピーシス  コベンシス（Saccharopolyspora  hirsutasubsp.  Kobensis）JCM９１０９株の培養液、菌体若しくは菌体処理物である微生物学的材料を、一般式（３）
Ｌ−ＣＨ（Ｍ）−ＣＯＯＨ      （３）
（式中、ＬはＣ６−Ｃ１４アリール基、または、窒素原子、酸素原子あるいは硫黄原子の少なくとも１種を１〜４個含むＣ４−Ｃ１２ヘテロアリール基を表す。）
で示されるカルボン酸に作用させることを特徴とする光学純度の向上方法。
【請求項６】
微生物学的材料が、ノカルディア・ディアファノゾナリアJCM３２０８株（Nocardia  diaphanozonaria）の培養液、菌体若しくは菌体処理物である請求項５記載の向上方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、カルボン酸異性体の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
光学活性カルボン酸類は、抗炎症剤等の医薬中間体、除草剤等の農薬中間体として広く用いられており、目的とする医薬・農薬の絶対立体配置に応じた光学異性体がその原料として必要とされる。
一方、微生物学的材料（微生物の培養液、菌体、菌体処理物等）を用いる化合物の製造方法、いわゆるバイオコンバージョン法は、一般的に温和な条件で反応を行うことができるなどの点で有利な方法とされている。
そして、バイオコンバージョン法により一般式（Ｘ）
【化３】
0004534317.tif 000002
（式中、Ｌ’はアリール基又はアリールオキシ基を表す。）で示される化合物にある種の微生物を作用させて、一般式（Ｙ）
【化４】
0004534317.tif 000003
（式中、Ｌ’は前記と同じ意味を表す。）
で示される化合物を製造する方法が知られている（特開平２−６５７８５、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１５５−１６３（１９９８）、特開昭６０−４３３８８、特開昭６０−４３３８９等）。
しかしながら、該方法により得られる化合物は一般式（Ｙ）で示される絶対立体配置を有する化合物に限られており、一般式（Ｙ）とは反対の絶対立体配置を有する化合物を効率的に製造する方法が求められていた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
すなわち、本発明では一般式（２）
【化５】
0004534317.tif 000004
（式中、ＬはＣ６−Ｃ１４アリール基、窒素原子、酸素原子または硫黄原子の少なくとも１種を１〜４個含むＣ４−Ｃ１２ヘテロアリール基を表し、ＭはＣ１−Ｃ３アルキル基を表す。）
で示される絶対立体配置を有するカルボン酸異性体を効率的に製造する方法を提供することを課題とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明らは、カルボン酸異性体の製造方法について鋭意検討した結果、ある種の微生物学的材料が一般式（１）
【化６】
0004534317.tif 000005
（式中、ＬおよびＭは前記と同じ意味を表す。）
で示されるカルボン酸異性体の不斉炭素に基づく絶対立体配置を反転させて、一般式（２）
【化７】
0004534317.tif 000006
（式中、ＬおよびＭは前記と同じ意味を表す。）
で示されるカルボン酸異性体Ｂ（以下、カルボン酸異性体Ｂ（２）と記す。）を生産する能力を有し、これを用いて反応させることによりカルボン酸異性体Ｂ（２）が得られることを見出して、本発明を完成した。即ち、本発明は、一般式（１）
【化８】
0004534317.tif 000007
（式中、ＬはＣ６−Ｃ１４アリール基、窒素原子、酸素原子または硫黄原子の少なくとも１種を１〜４個含むＣ４−Ｃ１２ヘテロアリール基を表し、ＭはＣ１−Ｃ３アルキル基を表す。）
で示されるカルボン酸異性体Ａを一般式（２）
【化９】
0004534317.tif 000008
（式中、Ｌ及びＭは前記と同じ意味を表す。）
で示されるカルボン酸異性体Ｂに変換する能力を有し、ノカルディア・ディアファノゾナリアJCM３２０８株（Nocardia  diaphanozonaria）の培養液、菌体若しくは菌体処理物、又はサッカロポリスポラ・ヒルスタ  サブスピーシス  コベンシス（Saccharopolyspora  hirsutasubsp.  Kobensis）JCM９１０９株の培養液、菌体若しくは菌体処理物である微生物学的材料を、一般式（１）で示されるカルボン酸異性体Ａに作用させることを特徴とする一般式（２）で示されるカルボン酸異性体Ｂの製造方法及び、一般式（３）
Ｌ−ＣＨ（Ｍ）−ＣＯＯＨ      （３）
（式中、ＬはＣ６−Ｃ１４アリール基、窒素原子、酸素原子または硫黄原子の少なくとも１種を１〜４個含むＣ４−Ｃ１２ヘテロアリール基を表し、ＭはＣ１−Ｃ３アルキル基を表す。）
で示されるカルボン酸に、一般式（１）で示されるカルボン酸異性体Ａを一般式（２）で示されるカルボン酸異性体Ｂに変換する能力を有する上述の微生物学的材料を作用させることを特徴とする光学純度の向上方法を提供するものである。
【０００５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明方法を詳細に説明する。
【０００６】
まず、本発明方法に使用される一般式（１）で示されるカルボン酸異性体Ａについて説明する。本発明方法において、使用される一般式（１）で示されるカルボン酸異性体ＡにおけるＬは、Ｃ６−Ｃ１４アリール基、Ｃ４−Ｃ１２ヘテロアリール基を表す。ここで、Ｃ６−Ｃ１４アリール基としては、例えばフェニル基、ナフチル基等が挙げられ、Ｃ４−Ｃ１２ヘテロアリール基としては、異種原子として窒素原子、酸素原子または硫黄原子の少なくとも１種を１〜４個含むものが好ましく、例えば、
【０００７】
【化１０】
0004534317.tif 000009
等を挙げることができる。
【００１０】
Ｌにおいて、置換基を有するＣ６−Ｃ１４アリール基、置換基を有するＣ４−Ｃ１２ヘテロアリール基、置換基を有するＣ６−Ｃ１４アリールオキシ基及び置換基を有するＣ４−Ｃ１２ヘテロアリールオキシ基における置換基（以下、本置換基と記す。）としては、例えば、フェニル基；Ｃ１−Ｃ３アルキル基、Ｃ１−Ｃ３アルコキシ基、アミノ基、シアノ基、水酸基およびハロゲン原子から選ばれる１種以上で置換されたフェニル基；フェノキシ基；Ｃ１−Ｃ３アルキル基、Ｃ１−Ｃ３アルコキシ基、アミノ基、シアノ基、水酸基およびハロゲン原子から選ばれる１種以上で置換されたフェノキシ基；ベンゾイル基；Ｃ１−Ｃ３アルキル基、Ｃ１−Ｃ３アルコキシ基、アミノ基、シアノ基、水酸基およびハロゲン原子から選ばれる１種以上で置換されたベンゾイル基；テノイル基；ベンゼン環と縮合していてもよいピロリル基；ピリジノイミダゾリル基；ベンゼン環と縮合していてもよいオキサゾリル基；ベンゼン環と縮合していてもよいピロリジン−２−オン−１−イル基；ベンジルオキシ基；ピリジル基；Ｃ１−Ｃ３アルキル基、Ｃ１−Ｃ３ハロアルキル基、Ｃ１−Ｃ３アルコキシ基およびハロゲン原子から選ばれる１種以上で置換されたピリジル基；ピリジルオキシ基；Ｃ１−Ｃ３アルキル基、Ｃ１−Ｃ３ハロアルキル基、Ｃ１−Ｃ３アルコキシ基およびハロゲン原子から選ばれる１種以上で置換されたピリジルオキシ基；Ｃ１−Ｃ６アルキル基；Ｃ１−Ｃ３アルコキシ基、アミノ基、シアノ基、水酸基およびハロゲン原子から選ばれる１種以上で置換されたＣ１−Ｃ６アルキル基；Ｃ１−Ｃ３アルコキシ基；Ｃ１−Ｃ３アルキルチオ基；メチレンジオキシ基；水酸基；シアノ基；カルボキシル基；Ｃ２−Ｃ５アルキルオキシカルボニル基；アミノ基；モノまたはジ（Ｃ１−Ｃ５）アルキルアミノ基；モノまたはジ（Ｃ３−Ｃ５）アルケニルアミノ基；アミノカルボニル基；およびハロゲン原子を挙げることができ、ＬにおけるＣ６−Ｃ１４アリール基、Ｃ４−Ｃ１２ヘテロアリール基、Ｃ６−Ｃ１４アリールオキシ基またはＣ４−Ｃ１２ヘテロアリールオキシ基の水素原子の１個以上、通常は１〜５個が、同一又は相異なる本置換基で置換される。
【００１１】
本置換基の好ましい例としては、フェニル基、ｐ−クロロフェニル基、ｐ−ヒドロキシフェニル基、フェノキシ基、ｐ−クロロフェノキシ基、ｐ−ヒドロキシフェノキシ基、ベンゾイル基、
【００１２】
【化１２】
0004534317.tif 000010
【００１３】
ベンジルオキシ基、２−ピリジル基、３−ピリジル基、４−ピリジル基、２−ピリジルオキシ基、３−ピリジルオキシ基、４−ピリジルオキシ基、５−トリフルオロメチル−２−ピリジルオキシ基、３−クロロ−５−トリフルオロメチル−２−ピリジルオキシ基、２，３−メチレンジオキシフェニル基、３，４−メチレンジオキシフェニル基、メチル基、エチル基、ブチル基、イソブチル基、モノクロロメチル基、トリフルオロメチル基、メトキシ基、エトキシ基、メチルチオ基、エチルチオ基、アミノカルボニル基、メチレンジオキシ基、水酸基、シアノ基、アミノ基、カルボキシル基、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、フッ素原子、塩素原子および臭素原子が挙げられる。
【００１４】
Ｌとしては、好ましくはフェニル基、３，５−ジクロロフェニル基、２，４−ジクロロフェニル基、４−クロロ−２−ニトロフェニル基、４−イソブチルフェニル基、３−ベンゾイルフェニル基、３−フルオロ−４−フェニルフェニル基、３−フェノキシフェニル基、ｐ−クロロフェノキシフェニル基、１−ナフチル基、２−ナフチル基、６−メトキシ−２−ナフチル基、４−クロロ−２−メチルフェニル基、４−イソブテニルアミノフェニル基、４−（５−トリフルオロメチルピリジル−２−オキシ）−フェニル基、４−（３−クロロ−５−トリフルオロメチルピリジル−２−オキシ）フェニル基、２−ピリジル基、３−ピリジル基、４−ピリジル基、フェノキシ基、３，５−ジクロロフェノキシ基、２，４−ジクロロフェノキシ基、４−クロロ−２−ニトロフェノキシ基、４−イソブチルフェノキシ基、３−ベンゾイルフェノキシ基、３−フルオロ−４−フェニルフェノキシ基、３−フェノキシフェノキシ基、ｐ−クロロフェノキシフェノキシ基、１−ナフチルオキシ基、２−ナフチルオキシ基、６−メトキシ−２−ナフチルオキシ基、４−クロロ−２−メチルフェニルオキシ基、４−イソブテニルアミノフェノキシ基、４−（５−トリフルオロメチルピリジル−２−オキシ）−フェノキシ基、４−（３−クロロ−５−トリフルオロメチルピリジル−２−オキシ）フェノキシ基、２−ピリジルオキシ基、３−ピリジルオキシ基、４−ピリジルオキシ基、
【００１５】
【化１３】
0004534317.tif 000011
【００１６】
【化１４】
0004534317.tif 000012
等を挙げることができる。
【００１７】
本発明方法において使用されるカルボン酸異性体Ａ（１）においてＭで示されるＣ１−Ｃ３アルキル基として、具体的にはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基およびイソプロピル基を挙げることができる。
【００１８】
カルボン酸異性体Ａ（１）としては、より具体的には、
【００１９】
【化１５】
0004534317.tif 000013
【００２０】
【化１６】
0004534317.tif 000014
【００２１】
【化１７】
0004534317.tif 000015
【００２２】
【化１８】
0004534317.tif 000016
【００２３】
【化１９】
0004534317.tif 000017
等を挙げることができる。
【００２４】
本発明製造方法における原料としては、通常、カルボン酸異性体Ａ（１）若しくはカルボン酸異性体Ａ（１）とカルボン酸異性体Ｂ（２）との混合物を挙げることができる。カルボン酸異性体Ａ（１）とカルボン酸異性体Ｂ（２）との混合物を用いる場合にも、カルボン酸異性体Ａ（１）が選択的に反応してカルボン酸異性体Ｂ（２）に変換される。カルボン酸異性体Ａ（１）とカルボン酸異性体Ｂ（２）との混合比率は特に限定されないが、ラセミ体（カルボン酸異性体Ａ（１）とカルボン酸異性体Ｂ（２）との１：１の混合物）を用いることが、原料価格、入手性等の工業的な見地からは有利である。
【００２５】
次に本発明方法の具体的な反応条件について説明する。
本発明方法は、通常、水中で、あるいはリン酸ナトリウム、リン酸カリウム等のリン酸のアルカリ金属塩などの無機酸塩、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム等の酢酸のアルカリ金属塩等の有機酸塩等を含む緩衝液中で行われ、反応液中における原料化合物の濃度は通常３０％（ｗ／ｖ）程度以下が適しており、好ましくは０．０１〜２０％（ｗ／ｖ）程度である。本発明製造方法に使用される微生物学的材料の使用量は、反応時間や菌体又は菌体処理物の活性の高さを考慮して適宜決定される。例えば、原料化合物に対して０．０１〜２００重量倍、好ましくは０．１〜５０重量倍である。反応温度は通常１０〜７０℃程度が適しており、好ましくは２０〜６０℃程度である。反応液のｐＨは通常４〜１２程度が適しており、好ましくは５〜１１程度である。反応時間は、たとえば所望するカルボン異性体酸Ｂ（２）の生成比率等に応じて適宜設定することができる。通常は、１６〜２４０時間程度であるが、反応の終点を高速液体クロマトグラフィー等の分析方法により適宜分析して決めることもできる。
【００２６】
本発明方法を実施するにあたって、界面活性剤、補酵素、金属塩、微量栄養源、有機溶媒等を補助剤として反応液に添加すると、反応時間の短縮や変換率の向上に有効な場合があり、必要に応じてこれらの補助剤を単独又は任意に組み合わせて反応液に添加することもできる。使用し得る界面活性剤としては具体的には、例えばドデシル硫酸ナトリウム、ポリエチレングリコールモノ−ｐ−イソオクチルフェニルエーテル又は臭化セチルピリジニウム等を挙げることができ、補酵素としては具体的には、例えばニコチンアミドアデニンヌクレオチド、ピリドキサルリン酸、コエンザイムＡ等を挙げることができる。金属塩として具体的には、例えばリン酸二水素一カリウム、リン酸一水素二ナトリウム、硫酸マグネシウム７水和物、硫酸第一鉄７水和物、硫酸亜鉛７水和物、硫酸マンガン３水和物、塩化コバルト６水和物等を挙げることができ、微量栄養源として具体的には、例えば酵母エキス等を挙げることができる。また、有機溶媒としては、例えばｎ−ヘプタン、シクロヘキサン、もしくはイソオクタン等のアルカン類、メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル等のエーテル類、メタノール、イソプロパノールもしくはｎ−オクタノール等のアルコール類、ジメチルスルホキシド等のスルホキシド類、アセトン等のケトン類、オキサロ酢酸、ピルビン酸、α−ケト酪酸等のケト酸類、ピルビン酸メチル等のケト酸のアルキルエステル類等を挙げることができる。
【００２７】
かくして得られるカルボン酸異性体Ｂ（２）は、公知の方法を適宜組み合わせて用いることにより、反応液から回収することができる。例えば、反応液から遠心分離等により本発明方法に用いられた微生物学的材料を分離後、上澄みを酸性に調整し、トルエン、ヘプタンまたはジエチルエーテル等の有機溶媒で抽出・分液し水層を除いた後、該有機溶媒を減圧留去することにより得られ、必要に応じてカラムクロマトグラフィー等により精製することもできる。
【００２８】
さらに、本発明方法に使用する微生物学的材料について説明する。
本発明において使用する微生物学的材料（以下、本発明微生物学的材料と記す。）とは、カルボン酸異性体Ａ（１）を、カルボン酸異性体Ｂ（２）に変換する能力を有する微生物（以下、本発明微生物と記す。）の培養液、菌体、または菌体処理物等を意味する。
本発明微生物は、前記の能力を有していれば、例えば、自然界から分離された微生物の野性株であっても、該野生株から薬剤や紫外線等によって誘導された変異株であってもよい。当該微生物はカルボン酸異性体Ａ（１）、例えば、（Ｓ）−２−フェニルプロピオン酸を、カルボン酸Ｂ（２）、例えば、（Ｒ）−２−フェニルプロピオン酸に変換する能力を指標にして選抜してくることができる。
なお、より具体的な説明は後述の実施例１に記載する。
【００２９】
本発明微生物の好適な例としては例えば放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）類に属する、ノカルディア・ディアファノゾナリア（Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｄｉａｐｈａｎｏｚｏｎａｒｉａ）、サッカロポリスポラ・ヒルスタ（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｈｉｒｓｕｔａ）が挙げられ、具体例としては、ノカルディア・ディアファノゾナリア（Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｄｉａｐｈａｎｏｚｏｎａｒｉａ）ＪＣＭ３２０８株、サッカロポリスポラ・ヒルスタ  サブスピーシス  コベンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｈｉｒｓｕｔａ  ｓｕｂｓｐ．  ｋｏｂｅｎｓｉｓ）ＪＣＭ９１０９株である。
【００３０】
本発明微生物の培養には、微生物における通常の培養に使用される炭素源や窒素源、有機ないし無機塩等を適宜含む各種の培地を用いることができる。例えば、炭素源としては、グルコース、フルクトース、シュクロース、デキストリン等の糖類、グリセロール、ソルビトール等の糖アルコール、フマル酸、クエン酸、ピルビン酸等の有機酸等が挙げられる。これら炭素源の培地への添加量は通常０．１〜１０％（ｗ／ｖ）程度とするとよい。窒素源としては塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸のアンモニウム塩、フマル酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム等の有機酸のアンモニウム塩、肉エキス、酵母エキス、麦芽エキス、大豆粉、コーステイープリカー、綿実粉、乾燥酵母、カゼイン加水分解物等の天然有機窒素源またはアミノ酸類があげられる。このうち天然有機窒素源またはアミノ酸類は、多くの場合、炭素源として兼用することができる。窒素源の添加量は通常０．１〜１０％（ｗ／ｖ）程度とするとよい。また無機塩類としては、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム等のリン酸塩、塩化カリウム、塩化ナトリウム、塩化コバルト６水和物等の塩化物塩、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄７水和物、硫酸亜鉛７水和物、硫酸マンガン３水和物等の硫酸金属塩等を挙げることができ、その添加量は、通常０．０００１％（ｗ／ｖ）〜１％（ｗ／ｖ）程度とするとよい。
【００３１】
本発明微生物の培養は、微生物における通常の方法に準じて行うことができ、固体培養、液体培養（試験管振盪式培養、往復振盪式培養、ジャーファーメンター（Ｊａｒ  Ｆｅｒｍｅｎｔｅｒ）培養、タンク培養等）のいずれも可能である。
【００３２】
培養温度は、微生物が生育する範囲で適宜設定できるが、例えば約１５〜４０℃であり、培地のｐＨは、好ましくは例えば約６〜８を挙げることができる。培養時間は、培養条件によって異なるが、通常約１〜１０日間を望ましく挙げることができる。
【００３３】
本発明微生物学的材料は、例えば本発明微生物の培養液、菌体、または菌体の処理物などの種々の形態を含むものである。ここで、菌体の処理物は、例えば、凍結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、菌体摩砕物、菌体の自己消化物、菌体の超音波処理物、酵素、菌体のアルカリ処理物等、あるいはこれらの処理物、前記の培養物や菌体等を、例えばシリカゲルやセラミック等の無機担体、セルロース、イオン交換樹脂へ結合又は吸着させる担体結合法やポリアクリルアミド、含硫多糖ゲル（例えばカラギーナンゲル）アルギン酸ゲル、寒天ゲル等の高分子の網目構造の中に閉じ込める包括法などの公知の方法に準じて不溶化し、容易に分離可能な状態に加工したもの（固定化物）を意味する。
【００３４】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
２−フェニルプロピオン酸及び２−フェノキシプロピオン酸の定量分析及び光学異性体分析は以下の条件のガスクロマトグラフィーにて実施した。
・カラム；Ｃｈｉｒａｓｉｌ−ＤＥＸ  ＣＢ（クロムパック社製、長さ：２５ｍ、内径：０．３２ｍｍ）
・カラム温度；１５０℃
・検出器；フレームイオン法
・化合物の定量は絶対検量線法による。
【００３５】
実施例１（微生物のスクリーニング）
土壌を採取し、該土壌１．０ｇを、減菌水５ｍｌに懸濁する。５分間静置後、上澄液０．１ｍｌをヘプトン０．５重量％、肉エキス０．３重量％および各種の一般式（３）で示されるカルボン酸又はカルボン酸異性体Ａ（１）  ０〜０．５重量％からなる培地（ｐＨ７．０）を含む寒天培地上に広げて３０℃で培養を行い、集落を形成させた後、その中からカルボン酸異性体Ａ（１）をカルボン酸異性体Ｂ（２）に変換する能力を有する微生物を選抜する。
微生物の選抜は下記のように行う。集落を形成した微生物を、グリセロール１．０％（ｗ／ｖ）、ポリペプトン（日本製薬製）０．２％（ｗ／ｖ）肉エキス粉末（極東製薬製）０．３％（ｗ／ｖ）、酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）０．３％（ｗ／ｖ）、リン酸二カリウム０．１％（ｗ／ｖ）、リン酸一カリウム０．１％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム７水和物０．０３％（ｗ／ｖ）の組成の減菌培地（ｐＨ７．０）１０ｍｌを入れた試験管にて３０℃で振盪しながら３日間培養する。この培養液から遠心分離（１０００×ｇ、１０分間）によって菌体を集め、これに１０ｍｌの１００ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）を加えて再度懸濁し、遠心分離（１０００×ｇ、１０分間）によって菌体を集め湿菌体を得る。こうして得られる湿菌体を１ｍｌの１００ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）に懸濁し、菌体懸濁液とする。
得られる菌体懸濁液０．３ｍｌと、５．５５ｍＭ（Ｓ）−２−フェニルプロピオン酸／１００ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）溶液２．７ｍｌとを試験管に入れ、これを往復振盪（２５０回／分、振幅２ｃｍ）させながら３０℃でインキュベーションする。１９０時間後、反応液の一部を取り、遠心分離により菌体を除去した上澄み液を採取した後、ガスクロマトグラフィーにて２−フェニルプロピオン酸の定量分析および光学異性体分析を行う。分析の結果に基いて、２−フェニルプロピオン酸のＲ／Ｓ光学異性体比が１より大きい値となる微生物を特定することにより、目的とする微生物を得ることができる。
【００３６】
実施例２
グリセロール１．０％（ｗ／ｖ）、ポリペプトン（日本製薬製）０．２％（ｗ／ｖ）、肉エキス粉末（極東製薬製）０．３％（ｗ／ｖ）、酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）０．３％（ｗ／ｖ）、リン酸二カリウム０．１％（ｗ／ｖ）、リン酸一カリウム０．１％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム７水和物０．０３％（ｗ／ｖ）の組成の減菌培地（ｐＨ７．０）１００ｍｌを入れた５００ｍｌ容坂口フラスコに、あらかじめ同じ組成の培地にて培養されたＮｏｃａｒｄｉａ  ｄｉａｐｈａｎｏｚｏｎａｒｉａ  ＪＣＭ３２０８株の培養液を１ｍＬ植菌して、３０℃で往復振盪しながら３日間培養した。
この培養液から遠心分離（１０００×ｇ、１０分間）によって菌体を集め、これに１０ｍｌの１００ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）を加えて再度懸濁し、遠心分離（１０００×ｇ、１０分間）によって菌体を集め湿菌体を得た。こうして得られた湿菌体を１０ｍｌの１００ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）に懸濁し、菌体培養液とした。また、（Ｓ）−２−フェニルプロピオン酸を、１００ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）に５．５５ｍＭになるように溶解し、これを基質液とした。試験管内で基質液２．７ｍｌに菌体懸濁液０．３ｍｌを加えて、往復振盪（２５０回／分、振幅２ｃｍ）させながら３０℃でインキュベーションした。１９０時間後反応液の一部を取り、遠心分離により菌体を除去した上澄み液を採取し、ガスクロマトグラフィーにて分析したところ、２−フェニルプロピオン酸は反応液中に４．３ｍＭ存在しており、その光学異性体比はＲ：Ｓ＝８０：２０であった。
【００３７】
一方、（Ｓ）−２−フェニルプロピオン酸に代えて（Ｒ）−２−フェニルプロピオン酸を用いた以外は上記例と同様の操作を行った。１９０時間後反応液の一部を取り、遠心分離により菌体を除去した上澄み液を採取し、ガスクロマトグラフィーにて分析したところ、（Ｓ）−２−フェニルプロピオン酸は全く検出されなかった。
【００３８】
実施例３
１００ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）に（ＲＳ）−２−フェニルプロピオン酸を７．４ｍＭになるように溶解して調製した基質液２．７ｍｌに、実施例２記載の方法と同じにして調製した菌体懸濁液０．３ｍｌを加えて、試験管内で往復振盪（２５０回／分、振幅２ｃｍ）させながら３０℃でインキュベーションした。７２時間後反応液の一部を取り、遠心分離により菌体を除去した上澄み液を採取し、ガスクロマトグラフィーにて分析したところ、２−フェニルプロピオン酸は反応液中に６．５ｍＭ存在しており、その光学異性体比はＲ：Ｓ＝６０：４０であった。
【００４１】
【発明の効果】
本発明によれば、医薬、農薬等の中間体として有用なカルボン酸異性体Ｂ（２）を効率的に製造することが可能となる。