(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般構造式：
0004558952.tif 000020
（式中、Ｌはリポソームの脂質二重層中に導入するために適当な疎水性部分であって、コレステロール、ジアシルグリセロール及びリン脂質から選択され、Ｒ1は一級又は二級のアミン部分を含む治療薬を表し、該治療薬はジチオベンジル部分にウレタン結合を介して共有結合されており、そしてＣＨ2Ｒ1基の配向はオルト位置及びパラ位置から選ばれる）を有する複合体であって、リポソームの医薬送達ビヒクルにおいて使用するための複合体。
【請求項２】
前記複合体が一般構造式
0004558952.tif 000021
（式中、Ｒ2及びＲ3は８〜２４個の炭素原子を有する炭化水素である）を有する、請求項１の複合体。
【請求項３】
Ｒ2及びＲ3が１２〜２２個の炭素原子を有する炭化水素である、請求項２の複合体。
【請求項４】
Ｒ2とＲ3とが同じ長さを有する炭化水素鎖である、請求項２の複合体。
【請求項５】
前記医薬が、マイトマイシンＣ、マイトマイシンＡ、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、及び５−フルオロウラシルからなる群から選ばれる、請求項１の複合体。
【請求項６】
治療薬が、構造：
0004558952.tif 000022
（式中Ｒ4は治療薬の残基を表す）を有する複合体を形成するためにジチオベンジル部分に共有的に結合されている、請求項１の複合体。
【請求項７】
Ｒ4が第一級アミン又は第二級アミン部分を含有し、それによりジチオベンジルと治療薬との間にウレタン結合を形成する治療薬残基である、請求項６の複合体。
【請求項８】
前記治療薬がマイトマイシンＡ、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン及びポリペブチドからなる群から選ばれる、請求項７の複合体。
【請求項９】
一般構造式：
0004558952.tif 000023
（式中、Ｌはリポソームの脂質二重層中に導入するために適当な疎水性部分であって、コレステロール、ジアシルグリセロール及びリン脂質から選択され、Ｒ1は一級又は二級のアミン部分を含む治療薬を表し、該治療薬はジチオベンジル部分にウレタン結合を介して共有結合されており、そしてＣＨ2Ｒ1基の配向はオルト位置及びパラ位置から選ばれる）を有する複合体を１〜３０モルパーセント含む、小胞形成性脂質からなるリポソームを含み、
しかも該治療薬は生理学的条件又は人工的に誘導された条件に応答してインビボで該複合体から放出される、
リポソーム組成物。
【請求項１０】
前記複合体が一般構造式：
0004558952.tif 000024
（式中、Ｒ2及びＲ3は８〜２４個の炭素原子を有する炭化水素である）を有する複合体である、請求項９のリポソーム組成物。
【請求項１１】
Ｒ2及びＲ3が１２〜２２個の炭素原子を有する炭化水素である、請求項１０のリポソーム組成物。
【請求項１２】
Ｒ2とＲ3とが同じ長さの炭化水素鎖である、請求項１０のリポソーム組成物。
【請求項１３】
前記医薬が、マイトマイシンＣ、マイトマイシンＡ、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、及び５−フルオロウラシルからなる群から選ばれる、請求項９のリポソーム組成物。
【請求項１４】
治療薬が構造：
0004558952.tif 000025
（式中Ｒ4は治療薬の残基を表す）を有する複合体を形成するためにジチオベンジル部分に共有的に結合されている、請求項９のリポソーム組成物。
【請求項１５】
Ｒ4が第一級アミン又は第二級アミン部分を含有し、それによりジチオベンジルと治療薬との間にウレタン結合を形成する治療薬残基である、請求項１４のリポソーム組成物。
【請求項１６】
前記治療薬が、マイトマイシンＡ、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン及びポリペプチドからなる群から選ばれる、請求項１５のリポソーム組成物。
【請求項１７】
小胞形成性脂質からなりそして一般構造式：
0004558952.tif 000026
（式中、Ｌはリポソームの脂質二重層中に導入するために適当な疎水性部分であり、コレステロール、ジアシルグリセロール及びリン脂質から選択され、Ｒ1は一級又は二級のアミン部分を含む治療薬を表し、該治療薬はジチオベンジル部分にウレタン結合を介して共有結合されており、そしてＣＨ2Ｒ1基の配向はオルト位置及びパラ位置から選ばれる）を有する複合体の１〜３０モルパーセントからなるリポソームを調製し、
それにより該調製が、生理学的条件又は人工的に誘導された条件に応答してインビボで該複合体から放出するまで医薬をリポソーム中に保持することに有効である、
ことを含む、その中に医薬を保持するリポソームを調製するための方法。
【請求項１８】
前記調製は、一般構造式：
0004558952.tif 000027
（式中、Ｒ2及びＲ3は８〜２４個の炭素原子を有する炭化水素である）を有する複合体を調製することを包含する、請求項１７の方法。
【請求項１９】
Ｒ2及びＲ3が１２〜２２個の炭素原子を有する炭化水素である、請求項１８の方法。
【請求項２０】
Ｒ2とＲ3とが同じ長さの炭化水素鎖である、請求項１８の方法。
【請求項２１】
前記調製は、マイトマイシンＣ、マイトマイシンＡ、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、及び５−フルオロウラシルからなる群から選ばれる医薬を含む複合体を調製することを包含する、請求項１７の方法。
【請求項２２】
前記調製は、構造：
0004558952.tif 000028
（式中、Ｒ4は治療薬の残基を表す）を有する複合体を形成するためにジチオベンジル部分に共有的に結合されている治療薬を含む複合体を調製することを包含する、請求項１７の方法。
【請求項２３】
Ｒ4が第一級アミン又は第二級アミン部分を含有し、それによりジチオベンジルと治療薬との間にウレタン結合を形成する治療薬残基である、請求項２２の方法。
【請求項２４】
前記治療薬がマイトマイシンＡ、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン及びポリペプチドからなる群から選ばれる、請求項２３の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、疎水性部分、開裂可能な結合および治療薬からなる複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）に関する。さらに特定的には、本発明はリポソーム配合物に導入される、脂質、開裂可能な結合および医薬からなる複合体に関する。本複合体は変性されていない状態で医薬を放出するために、インビボでおだやかなチオ開裂（ときにはチオール類溶媒を加えての分解を言う）条件下に開裂可能である。
【０００２】
（技術分野）
リポソーム類は種々の治療目的のためにそして特にリポソーム類の全身投与
により目標とする領域または細胞に治療薬を運ぶために、用いられる閉じられた脂質小胞である。水溶性生体適合性重合体、特にポリエチレングリコールの鎖で架橋された表面を有するリポソーム類は、重要な医薬運搬体となって来た。これらのリポソーム類は重合体コーティングがないリポソーム以上に延長された血液循環活動寿命を提供する。架橋された重合体鎖はリポソームを遮蔽するかまたは隠蔽し、かくして血漿たんぱく質による非特異的相互反応を最小化する。これはまた、マクロファージおよび細網内皮細胞システムの他の細胞により認知されなかったリポソームが循環するので、インビボでリポソームが取り除かれるかまたは排除される速度を遅延化する。さらに、いわゆる高められた浸透性および保持作用に起因して、リポソーム類は損傷されたまたは拡張された血管構造物、例えば腫瘍、炎症の部位に蓄積する傾向を有する。
【０００３】
延長された血管循環時間は、目標領域、細胞または部位に到達することを、全身的に投与されたリポソーム類に可能にするために、多くの場合望ましい。例えば約１２時間より長い血液循環活動時間は、リポソームが全身的に分布しそして次に腫瘍領域に溢れ出なければならないので、腫瘍領域に対するリポソーム治療のために好ましい。
【０００４】
リポソームに基づく治療に伴う１つの問題は、全身分布のために十分な時間にわたってリポソーム内に医薬を保持すべきことである。この問題は、長く循環するリポソーム類、即ち、架橋された重合体鎖を有するリポソームが投与された時に特に関係する問題である。有効に装入されそして長い期間にわたって保持されそして次に放出されることが出来る医薬は比較的に少ない。
【０００５】
医薬保持を改良するための１つの方法は、取り込まれた医薬がより小さい浸透性となる二重層にする脂質二重層成分を選ぶことである。しかしながら、脂質二重層は、所望の時間に、例えば目標部位に局在化または十分な体内分布後に、二重層を横切っての移送によりまたは脂質小胞破壊により医薬が放出されるように十分に流動性であるべきである。
【０００６】
医薬保持を改良するための他の方法は、リポソームの脂質二重層中の脂質に医薬を共有的に結合させることである（Ｗａａｌｋｅｓ、等によるＳｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐ．，６：１５−２２（１９９０）；Ａｓａｉ、等によるＢｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，２１：７６６−７７１（１９９８））。
【０００７】
長い血液循環活動寿命を有しそして所望の時間にわたって、取り込んだ医薬を保持することが出来、しかも要求に応じて医薬を放出することが出来るリポソーム組成物を配合することが望ましいだろう。これらの特徴を達成させるために当業界において記載された１つの方法は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）のような非小胞形成性脂質およびメトキシ−ポリエチレングリコール−ジステァロイルホスファチジルエタノールアミン（ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ）のような脂質を安定化する脂質二重層からリポソームを配合することであった（Ｋｉｒｐｏｔｉｎ，Ｄ．、等によるＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３８８：１１５−１１８（１９９６））。この方法において、そのｍＰＥＧは開裂可能な結合を介してＤＳＰＥに結合されている。結合の開裂は、リポソーム含有物のすみやかな放出のためにリポソームを不安定化する。
【０００８】
リポソーム類にＰＥＧ重合体鎖を結合するための不安定な結合は記載されていた（米国特許第５，０１３，５５６号、同第５，８９１，４６８号、ＷＯ９８／１６２０１）。これらのリポソーム組成物中の不安定な結合は、リポソームからＰＥＧ重合体鎖を開放して、例えば目標リガンドに結合された表面を露出させるかまたは目標細胞とのリポソームの融合を始動させる。
【０００９】
しかしながら、今日まで、インビボでの使用のために適当な条件下でリポソームから重合体鎖を開放する手段は達成されていなかった。例えば或る種の開放可能な結合は重合体鎖の開放を達成させるために、１，４−ジチオトレイトールのような有能なチオ開裂剤を必要とする。この還元剤はインビボでの使用のために許容出来ない。リポソーム脂質にＰＥＧを結合する既知の開放可能な結合に関しての他の問題は、開放可能な結合の開裂が自然的なものではないそして望ましくない変性された脂質を生成することである。したがって、インビボでの使用のために適しておりそして開裂後に、その自然のままの変性されていない形での医薬または治療約を生成する開裂可能な結合が当業界においていぜんとして必要とされている。
【００１０】
ＥＰ０３１７９５７において、Ｓｅｎｔｅｒはジサルファイドベンジルカルバメートまたはカーボネートリンカーを用いて抗体が医薬に結合されておりそしてジサルファイド結合の還元が医薬放出を行う、医薬−抗体プロドラッグを記載している。Ｓｅｎｔｅｒの教示は、１，４−ジチオトレイトール、グルタチオン、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨのような還元剤の作用下に医薬−リガンドプロドラッグ分子の開裂に特異的である。血液流を通して循環するリポソーム中に導入される場合、そのようなリンカーの挙動は、Ｓｅｎｔｅｒの開示に基づいては予想されることが出来ない。例えば、リポソームにおいて、重合体と脂質との間のリンカーはＰＥＧコーティング中に埋め込まれるかまたは隠蔽されるだろう。Ｓｅｎｔｅｒにおけるような１種の医薬−リガンドプロドラッグの放出を心に描くことは比較的に容易である：しかしながら、重合体鎖のリポソーム表面コーティング中におけるような密にパックされたバリア（障壁）の部分である場合のリンカーの開放は容易に予想されることが出来ない。
【００１１】
上記のように、延長された血液循環時間は、ＰＥＧコーティングされたリポソームの望ましい特徴であり、約１２時間より長い血液循環活動寿命は腫瘍領域に対するリポソーム治療のために好ましい。Ｓｅｎｔｅｒの開示は、リポソームの血液循環中のような内因性還元条件下に、リポソームに導入された複合体の放出速度論に関してのガイダンスを提供していない。
【００１２】
（発明の開示）
発明の概要：
したがって、リポソームからの放出のために所望の時間期間にわたって医薬が保持されている、リポソーム組成物を提供することが本発明の目的である。
【００１３】
複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）が、脂質二重層（ｌｉｐｉｄ  ｂｉｌａｙｅｒ）中に固定するための疎水性部分、おだやかなチオ開裂（ときにはチオール類溶媒を加えての分解とも言う：ｔｈｉｏｌｙｔｉｃ）条件に応答して開裂出来る結合および治療薬から構成される、リポソームにおいて使用するための、複合体を提供することが本発明の他の目的である。
【００１４】
１つの面において、本発明は、複合体が一般構造式：
0004558952.tif 000002
（式中、Ｌはリポソームの脂質二重層中に導入するために適当な疎水性部分であり、Ｒ1はジチオベンジル部分に共有結合された治療薬を表しそしてＣＨ2Ｒ1基の配向はオルト位置またはパラ位置から選ばれる）を有する、リポソームの医薬送り出しビヒクルにおいて使用するための複合体を包含する。
【００１５】
１つの態様において、治療薬が、ウレタン、アミン、アミド、カーボネート、チオカーボネート、エーテルおよびエステルからなる群から選ばれた結合により共有的に結合されている。
【００１６】
他の態様において、Ｌはコレステロール、ジアシルグリセロール類、燐脂質類およびそれらの誘導体からなる群から選ばれる。
【００１７】
なお他の態様において、Ｌは一般構造式：
0004558952.tif 000003
（式中、Ｒ2およびＲ3は約８〜約２４個の炭素原子を有するかあるいは他の態様において、約１２〜２２個の炭素原子を有する炭化水素である）を有する複合体を生成するためのジアシルグリセロール誘導体である。なお他の態様において、Ｒ2とＲ3とは同じ長さの炭化水素鎖である。
【００１８】
他の態様において、医薬はマイトマイシンＣ、マイトマイシンＡ：ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、フルオロデオキシウリジン、ヨードデオキシウリジン、エトポシド、ＡＺＴ、アシクロビル、ビダラビン、アラビノシルシトシン、ペントスタチン、キニジン、アトロピン、クロラムブシル、メトトレキサート、ミトザントロンおよび５−フルオロウラシルからなる群から選ばれる。
【００１９】
なお他の態様において、治療薬は構造：
0004558952.tif 000004
（式中、Ｒ4は治療薬の残基を表す）を有する複合体を形成するためにジチオベンジル部分に共有的に結合されている。
【００２０】
１つの態様において、Ｒ4は第一級アミンまたは第二級アミン部分を含有する治療薬残基であり、それによりジチオベンジルと治療薬との間にウレタン結合を形成する。この態様において、治療薬は、例えばマイトマイシンＡ、マイトマイシンＣ、ブレオマイシンまたはポリペプチド類であることが出来る。
【００２１】
他の態様において、Ｒ4は、ジチオベンジルと治療薬との間にエステル結合を形成する、カルボキシ含有治療薬の残基である。この態様における例示的医薬はクロラムブシルまたはメトトレキサートを包含する。
【００２２】
他の態様において、Ｒ4は、ヒドロキシル部分を含有する治療薬残基であり、それによりジチオベンジルと治療薬との間にカーボネート結合を形成する。この態様における例示的医薬は、フルオロデオキシウリジン、ヨードデオキシウリジン、エトポシド、ＡＺＴ、アシクロビル、ビダラビン、アラビノシルシトシン、ペントスタチン、キニジン、ミトザントロンおよびアトロピンを包含する。
【００２３】
他の面において、本発明は、上記一般構造式を有する複合体の約１〜約３０モルパーセントを含む、小胞形成性脂質からなるリポソームを含むリポソーム組成物を包含する。治療薬は、生理学的条件または人工的に誘導された条件に応答してインビボで複合体から放出される。
【００２４】
なお他の面において、本発明は、小胞形成性脂質から構成されそして上記複合体の約１〜約３０モルパーセントから構成されるリポソームを造ることからなる、リポソーム中に医薬を保持するための方法を包含する。リポソームは、生理学的条件または人工的に誘導された条件に応答して複合体から放出するまで、リポソーム中に医薬を有効に保持する。
【００２５】
本発明のこれらのおよび他の目的および特徴は、添付の図面と一緒に本発明の以下の詳細な記載を読むときに、一層十分に認識されるだろう。
【００２６】
発明の詳細な記載：
Ｉ．定義：
語句“リポソームの脂質二重層中に導入するために適当な疎水性部分”は、リポソームの脂質二重層の疎水性二重層領域中に組み込まれることが出来る疎水性部分を含む任意の材料を意図する。そのような疎水性部分は、燐脂質類およびジアシルグリセロール類のような、疎水性脂質ティル（尾部）と親水性極性ヘッド（頭部）とを有する両親媒性（ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ）脂質を包含する、典型的には脂質類である。トリグリセリド類、ステロール類、そして燐脂質類、ジアシルグリセロール類、ステロール類およびトリグリセリド類の、誘導体そして天然源から誘導されたまたは合成的に造られた他の脂質類がまた、意図される。
【００２７】
“治療薬残基”のような用語“残基”は、医薬分子の少なくとも１つの原子が置き換えられるかまたは取り除かれて結合を形成する、他の分子との結合を形成するために反応された医薬分子を意図する。
【００２８】
本明細書において用いられるものとして“ポリペプチド”は、アミノ酸の重合体を言っておりそしてアミノ酸の特定の長さの重合体を言わない。したがって、例えば用語ペプチド、オリゴペプチド、たんぱく質および酵素はポリペプチドの定義内に包含される。この用語はまた、ボリペプチドのそのあとで表現される変性、例えばグリコシル化、アセチル化、燐酸化、等を包含する。
【００２９】
以下の省略語が本明細書において用いられる：ＰＥＧ＝ポリ（エチレングリコール）、ｍＰＥＧ＝メトキシ−ＰＥＧ、ＤＴＢ＝ジチオベンジル、ＤＳＰＥ＝ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ＨＳＰＣ＝水素添加された大豆ホスファチジルコリン、ＭＭＣ＝マイトマイシンＣ。
【００３０】
ＩＩ．複合体組成および製造方法：
１つの面において、本発明は、形状：
0004558952.tif 000005
（式中、Ｌは、リポソームの脂質二重層に導入するために適当な疎水性部分であり，Ｒ1は、ジチオベンジル部分に共有的に結合された治療薬残基を表しそしてＣＨ2Ｒ1基の配向はオルト位置およびパラ位置から選ばれる）の複合体を包含する。疎水性部分のＬは典型的には、ジアシルグリセロール類、ステロール類、燐脂質類、これらの脂質の誘導体、他の天然に存在する脂質およびそれらの合成類似体のような脂質類である。
【００３１】
本複合体において、治療薬は共有結合によりジチオベンジル部分に結合され、それにより、構造式においてＲ1で表される医薬残基を形成する。結合は当業者により認識されるように、医薬および反応化学に従って変化するだろう。好ましい態様において、治療薬はウレタン、アミン、アミド、カーボネート、チオカーボネート、エーテルおよびエステルからなる群から選ばれた結合によりジチオベンジル部分に共有的に結合されている。
【００３２】
ウレタン結合はＯ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−Ｒ4またはＯ（Ｃ＝Ｏ）Ｎ＝Ｒ4（但し、Ｒ4は治療薬残基を表す）の形を取る。例えばマイトマイシンＣ、マイトマイシンＡ、ブレオマイシンそして２、３の名前が挙げられる治療ポリペプチド類のような第一級アミンまたは第二級アミンを含有する医薬は医薬中にアミン部分を有するウレタン結合を形成するように反応される。
【００３３】
カーボネート結合は、Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−Ｒ4（但し、Ｒ4は医薬残基を表す）の形を取りそしてカーボネート結合は医薬中のフェノール、アルコールあるいはヒドロキシル部分から由来する。チオカーボネートはＯ（Ｃ＝Ｏ）Ｓ−Ｒ4（但し、Ｒ4は医薬残基を表す）の形を取りそしてその結合は医薬中の部分から由来する。カーボネート結合を形成するようにジチオベンジルアルコールと反応するためのそのような部分を有する例示的医薬は、フルオロデオキシウリジン、ヨードデオキシウリジン、エトポシド、ＡＺＴ、アシクロビル、ビダラビン、アラビノシルシトシン、ペントスタチン、キニジン、ミトザントロンおよびアトロピンを包含する。
【００３４】
エステル結合は、Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−Ｒ4（但し、Ｒ4は医薬残基を表す）の形を取る。その結合は治療薬中のカルボン酸部分との反応から由来しそしてクロラムブシルとジチオベンジルとの間にエステル結合を有する複合体の例は下に示される。メトトレキサートは、複合体のジチオベンジル部分とのエステル結合を形成することが出来る医薬の他の例である。
【００３５】
ジチオベンジル部分に医薬を結合するウレタン、カーボネートまたはエステル結合を有する複合体は一般に以下の構造式により表されることが出来る：
0004558952.tif 000006
（式中、Ｒ4は治療薬の残基を表す）。
【００３６】
他の態様において、複合体はエーテル結合を含み、その結合はＯ−Ｒ4（但し、Ｒ4は治療薬残基を表す）の形を取る。その結合は典型的には、医薬上のアルコール官能基との反応から由来する。
【００３７】
アミン結合は、Ｎ＝Ｒ4（但しＲ4は医薬残基を表す）の形の結合でありそしてその結合は、ジチオベンジルのＣＨ2部分と医薬中のＮとの直接結合である。アミン結合が形成される医薬５−フルオロウラシルを有する複合体は下に示される。アミド結合はまた、治療薬としてのペプチド類と形成されることが出来、その場合において、アスパラギン酸またはグルタミン酸のようなアミノ酸残基の遊離のカルボキシルがジチオベンジルアミンと縮合される。
【００３８】
アミド結合は、ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）−Ｒ4（但しＲ4は医薬残基を表す）の形を取る。
【００３９】
図１は本発明に従う例示的複合体の製造のための合成反応方式を示す。この態様において、中間体化合物であるパラ−ジアシルジグリセロールジチオベンズアルコール（化合物ＩＶ）の合成は、その後での選ばれた治療薬との反応のために造られる。化合物ＩＶは、３−メルカプト−１，２−プロパンジオール（化合物Ｉ）を過酸化水素と反応させてラセミ−３，３’−ジチオビス（１，２−プロパンジオール）（化合物ＩＩ）を形成することにより、例１において記載されたとおりにして造られる。ラセミ−３，３’−ジチオビス（１，２−プロパンジオール）は、疎水性部分Ｒを用いてアシル化される。例えばＲは、約８〜約２４個の炭素原子を有する脂肪酸であることが出来る。例１はＲがステアリン酸である場合の反応手順を詳細に記載している。他の態様において、Ｒは約１２〜約２２個の炭素原子を有する脂肪酸である。化合物ＩＩのアシル化は、ラセミ−３，３’−ジチオビス（１，２−プロパンジステアロイル）（化合物ＩＩＩ）を生成し、これは塩化スルフリルおよび４−メルカプトベンズアルコールと反応されて所望の中間体生成物パラ−ジアシルジグリセロール−ジチオベンズアルコール（化合物ＩＶ）を形成する。化合物ＩＶは反応性カルボキシル部分（Ｒ’ＣＯ2Ｈ）を含有する医薬と容易に反応されて、医薬がエステル結合を介してＤＴＢに結合されている脂質−ジチオベンジル（ＤＴＢ）−医薬複合体（化合物Ｖ）を形成する。化合物ＩＶはまた、反応性アミン部分（Ｒ’−ＮＨ2）を含有する医薬と容易に反応されて、医薬がウレタン結合によりＤＴＢに結合されている脂質−ＤＴＢ−医薬複合体（化合物ＶＩ）を生成する。化合物ＩＶはまた、反応性ヒドロキシル部分（Ｒ’ＯＨ）を含有する医薬と容易に反応されて医薬がカーボネート結合によりＤＴＢに結合されている、脂質−ＤＴＢ−医薬複合体（化合物ＶＩＩ）を形成する。
【００４０】
種々の医薬が本発明の複合体において使用するために意図される。特に本発明は、反応のために適当な、アミン（ＮＨまたはＮＨ2）、カルボキシル、スルフヒドリルまたはヒドロキシル部分を有する医薬を意図する。本明細書において使用される用語として、“反応のために適当な”とは、例えば医薬がジチオベンジルアルコール、の形でのジチオベンジル部分と反応することが出来る、列挙された部位の１つを有することを意味する。例示的医薬は反応のために適当なＮＨ基を有する、５−フルオロウラシル、反応性のカルボキシルを有するクロラムブシルそして反応性アミン（アジリジン基）を有するマイトマイシンＣを包含する。これらの医薬は本発明の例示的態様の合成を例示するために使用されそして図３〜図９に関連して論じられている。使用するために意図される他の例示的医薬は、マイトマイシンＣ、マイトマイシンＡ、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、フルオロデオキシウリジン、ヨードデオキシウリジン、エトポシド、ＡＺＴ、アシクロビル、ビダラビン、アラビノシルシトシン、ペントスタチン、キニジン、アトロピン、クロラムブシル、メトトレキサート、ミトザントロンおよび５−フルオロウラシルを包含する。ポリペプチド類、アミノグリコシド類、アルカロイド類はすべて本発明において使用するためにまた適当である。
【００４１】
例１はまた、本複合体を形成するための中間体化合物として役に立つことが出来る、オルト−ジアシルジグリセロールジチオベンズアルコールの製造のための反応条件を詳細に記載している。
【００４２】
図２Ａ〜図２Ｂは、脂質−ＤＴＢ−医薬複合体の製造（図２Ａ）および還元剤の存在下に複合体のチオ開裂を示す。図２Ａにおいて示されるように、疎水性部分Ｒがステアリン酸（ＣＨ3（ＣＨ2）16ＣＯ2Ｈ）のような脂肪酸Ｒ”（ＣＯ）ＯＨから由来する、図１の化合物ＶＩＩは、ホスゲン（ＣＯＣｌ2）の存在下に、アミン含有医薬であるＨ2Ｎ医薬と反応される。この反応は図２Ａにおいて例示される脂質−ＤＴＢ−医薬複合体を生成する。還元性条件、即ちシステインまたはグルタチオンのような還元剤にさらされた際、複合体は分解して図２Ｂに示される生成物を生ずる。図示されているように、本複合体のチオ開裂（ときにはチオール類溶媒を加えての分解による開裂を言う：ｔｈｉｏｌｙｔｉｃ  ｃｌｅａｖａｇｅ）は、変性されていない自然の状態での医薬の再生成を結果として生ずる。このことは、下に示されるように、複合体中の医薬が患者にインビボ投与するためにリポソーム類に容易に導入されることが出来るので、望ましい特徴である。さらに、本複合体の形における医薬は、また下に示されるように毒性でない。投与の後にそして内因性還元剤にさらされるかあるいは外因性還元剤にさらされた際に、複合体は分解して、その生来の状態でのそして生物学的活性を有する医薬を生成する。
【００４３】
図３Ａにおいて、５−フルオロウラシルの複合体の製造のための合成反応方式が例示されている。化合物ＩＶの、パラ−ジアシル−ジグリセロール−ジチオベンザルアルコールは、パラ−トルエンスルホニルクロリドと反応されて中間体化合物ＩＸを生成する。５−フルオロウラシルアニオンまたはそのナトリウム塩（化合物Ｘ）との反応は所望の脂質−ＤＴＢ−５−フルオロウラシル複合体（化合物ＸＩ）を生成する。還元剤Ｄ’−ＳＨにさらされた際の脂質−ＤＴＢ−５−フルオロウラシル複合体（化合物ＸＩ）の分解は図３Ｂにおいて示される。その複合体のチオ開裂（チオール類溶媒を加えての分解による開裂）は、変性されていない形での５−フルオロウラシルの生成を生ずる。
【００４４】
図４はジアシルジグリセロール−ＤＴＢ−５−フルオロウラシル複合体の製造のための別の合成反応方式を示す。図４において、クロロ蟻酸１−クロロエチル（化合物ＸＩＩ）は、パラ−ジアシル−ジグリセロール−ジチオベンザルアルコール（化合物ＩＶ）と反応されて反応性クロロエチルカーボネート−ＤＴＢ−ジアシルジグリセロール中間体（化合物ＸＩＩＩ）を形成する。その中間体は、次にトリエタノールアミン（ＴＥＡ）の存在下に５−フルオロウラシルと反応されて脂質−ＤＴＢ−５−フルオロウラシル複合体（化合物ＸＩＶ）を生成する。その複合体のチオ開裂（チオール類溶媒を加えての分解による開裂）および５−フルオロウラシルの生成はまた図４において示される。
【００４５】
本複合体の他の態様は、図５において示される。この態様において、反応性のカルボキシル部分を含有する医薬であるクロラムブシル（化合物ＸＶ）は１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）およびジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）の存在下に、パラ−ジアシル−ジグリセロール−ジチオベンザルアルコール（化合物ＩＶ）と反応されて脂質−ＤＴＢ−クロラムブシル複合体（化合物ＸＶＩ）を形成する。還元剤にさらした際に、その複合体はチオ開裂的に分解して示された生成物になる。クロラムブシルは次に変性されていない状態で再生される。
【００４６】
図６Ａは、本発明の他の態様に従う複合体の合成を示す。示される反応方式において、反応性アミン部分を含有する医薬であるマイトマイシンＣ（図６Ｂ中の化合物ＸＶＩＩ）は、ホスゲンの存在下にパラ−ジアシル−ジグリセロール−ジチオベンザルアルコール（化合物ＩＶ）と反応されてジアシルジグリセロール−ジチオベンジル−マイトマイシンＣ複合体（化合物ＸＶＩＩＩ）を形成する。合成の詳細は例２において提供される。
【００４７】
図６Ｂは、ジアシルジグリセロール−ＤＴＢ−マイトマイシンＣ複合体のチオ開裂分解を示す。還元剤の存在下に、その複合体は分解してマイトマイシンＣ（ＸＶＩＩ）および図示される他の生成物を再生する。
【００４８】
上に記載されているように、本複合体における疎水性部分は任意の多種の疎水性部分、例えば脂質類から選ばれることが出来る。上の例において、ジアシルジグリセロール脂質は、構造式：
0004558952.tif 000007
（式中、Ｒ2およびＲ3は約８〜約２４個の炭素原子を有する炭化水素である）を有する複合体を形成するために用いられた。
【００４９】
疎水性部分としてのジアシルグリセロールに加えて、他の脂質が意図される。図７は本複合体における疎水性部分としてコレステロールが使用される他の態様を示す。コレステロール（化合物ＸＩＶ）は、トリエタノールアミン（ＴＥＡ）の存在下にジクロロメタン中のメタンスルホニルクロリドと反応される。得られた中間体は次にチオール誘導体に転換されそして最後に主要なジチオベンジルアルコールに転換され、これはジアシルグリセロールについて上記した様式と同じ様式でマイトマイシンＣを結合するために用いられる。
【００５０】
コレステロール−ＤＴＢ−マイトマイシンＣ複合体の製造のための別の反応方式は図８に示される。メトキシカルボニルジチオエチルアミンはクロロ蟻酸コレステロールと直接に反応されてウレタン結合を形成する。次にメルカプトベンジルアルコールはＤＴＢ−コレステロール化合物を得るために用いられる。マイトマイシンＣは上にそして例２に記載されたとおりにして結合される。
【００５１】
上に記載された種々の複合体は単なる例示であることが当業者により認識されよう。広い種々の他の疎水性部分そしてドキソルビシンおよびダウノルビシンのような他の医薬が本発明において使用するために意図されそして適当である。下に記載される本発明を支持するのに行われた追加の研究において、図６Ａにおいて造られたとおりの複合体（化合物ＸＶＩＩＩ）であるパラ−ジステアロイル−ＤＴＢ−マイトマイシンＣが用いられた。参照を容易にするために、この複合体は図９Ａにおいて示される。ジパルミトイル脂質のような、他のジアシル脂質が用いられることが出来ることが認識されるべきでありそして図９Ｂはパラ−ジパルミトイル−ＤＴＢ−マイトマイシンＣ複合体を示す。本複合体がまた異性体結合を有することが出来ることがまた認識されよう。このことは図９Ｃに示されるようなオルト−ジパルミトイル−ＤＴＢ−マイトマイシンＣ複合体により明らかである。
【００５２】
ＩＩＩ．複合体を含むリポソーム類の製造：
他の面において、本発明は、小胞形成性脂質および上記のような複合体からなるリポソーム組成物を包含する。リポソーム類は、種々の治療目的のためにそして特にリポソーム類の全身投与により目標領域または細胞に治療薬を運ぶために用いられる、閉じられた脂質小胞である。特に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような、親水性重合体鎖の表面コーティングを有するリポソーム類は、これらのリポソーム類が重合体コーティングのないリポソーム類以上に、延長された血管循環活動寿命時間を提供するので、望ましい。その重合体は血液たんぱく質に対してバリア（障壁）として働き、それによりたんぱく質の結合そしてマクロファージおよび細網内皮細胞システムの他の細胞による吸収および除去のためにリポソームを認知するのを防止する。
【００５３】
本発明に従うリポソーム類は、１つの態様において、小胞形成性脂質および場合により他の二重層成分（ｂｉｌａｙｅｒ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）である脂質と組み合わせて複合体を含む。“小胞形成性脂質類”は水中で二重層小胞を自然に形成する脂質類である。小胞形成性脂質は、好ましくは２つの炭化水素鎖、典型的にはアシル鎖および極性ヘッド基を有する。２つの炭化水素鎖が典型的には長さにおいて約１２〜約２４個の炭素原子でありそして種々の程度の不飽和を有する、当業界に知られている種々の合成小胞形成性脂質および天然に存在する小胞形成性脂質が存在する。例は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）およびスフィンゴミエリン（ＳＭ）のような燐脂質類である。本発明において使用するために好ましい脂質は、水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）である。他の好ましい群の脂質類はジアシルグリセロール類である。これらの脂質類は市販されているかまたは刊行された方法に従って造られることが出来る。
【００５４】
小胞形成性脂質は、或る程度の流動性または堅さを達成させるために、血清中のリポソームの安定性を制御するために、そしてリポソーム中に取り込まれている薬剤の放出の速度を制御するために、選ばれることが出来る。一層堅い脂質二重層または脂質結晶二重層を有するリポソーム類は、比較的に堅い脂質、例えば比較的に高い相転移温度、例えば約８０℃までの相転移温度を有する脂質を導入することにより造られることが出来る。堅い脂質、即ち飽和された脂質は脂質二重層における一層大きな膜堅さに寄与する。コレステロールのような他の脂質成分は脂質二重層構造での膜堅さに寄与することがまた知られている。
【００５５】
脂質の流動性は、比較的に流動性の脂質、典型的には例えば室温または室温以下（約２０〜２５℃）の比較的に低い液体ないしは液体−結晶相転移温度を有する液体相を有する脂質を導入することにより達成される。
【００５６】
リポソーム類はまた、脂質二重層中に導入されることが出来る、ステロール類のような、他の成分を含むことが出来る。これらの他の成分は典型的には、二重層膜の内部の疎水性領域と接触している疎水性部分、そして膜の外側の極性表面に向かって配向された極性ヘッドグループを有する。
【００５７】
本発明のリポソーム類における他の脂質成分は、親水性重合体で誘導化された小胞形成性脂質である。この脂質成分において、誘導体化された脂質は脂質二重層の内部表面および外部表面の両方の上で親水性重合体鎖の表面コーティングの形成を生ずる。典型的には，約１〜２０モルパーセントの誘導体化された脂質が脂質組成物に含まれる。
【００５８】
小胞形成性脂質で誘導体化するために適当な親水性重合体は、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメチルエーテル、ポリメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリヒドロキシプロピルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリエチレングリコールおよびポリアスパルタミド（ｐｏｌｙａｓｐａｒｔａｍｉｄｅ）を包含する。それらの重合体は単独重合体としてあるいはブロック共重合体またはランダム共重合体として使用されることが出来る。
【００５９】
好ましい親水性重合体鎖は好ましくは、約５００〜約１０，０００ダルトン、好ましくは約１，０００〜約５，０００ダルトンの分子量を有するＰＥＧ鎖としてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）がある。ＰＥＧのメトキシ末端封鎖されたまたはエトキシ末端封鎖された類似体はまた、好ましい親水性重合体である。これらの重合体は、例えば約１２〜約２２０，０００ダルトンの、種々の重合体寸法で市販されている。
【００６０】
本発明のリポソーム類は典型的には、約１〜約３０モルパーセント、好ましくは約５〜約３０モルパーセント、さらに好ましくは約５〜約２０モルパーセントの脂質−ＤＴＢ−医薬複合体を含む。本発明の支持に行われた研究において、小胞形成性脂質である水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、メトキシ−ポリエチレングリコールで誘導体化されたジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ）および図９Ａにおいて示された複合体であるパラ−ジステアロイル−ＤＴＢ−マイトマイシン（化合物ＸＶＩＩＩ）からなるリポソームが例４Ａ〜例４Ｂにおいて記載されているとおりにして造られた。リポソーム配合物の１つは６０／３０／５／５のモル比で存在する脂質ＨＳＰＣ／コレステロール／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ／パラ−ジステアロイル−ＤＴＢ−マイトマイシンＣ（化合物ＸＶＩＩＩ）であって、コレステロールを含んでいた（例４Ａ）。コレステロールを含有しない第２配合物が造られそして特徴づけられた（例４Ｂ）。この配合物において、脂質ＨＳＰＣ／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ／パラ−ジステアロイル−ＤＴＢ−マイトマイシンＣ（化合物ＸＶＩＩＩ）が９０／５／５のモル比で存在した。
【００６１】
ＩＶ．複合体含有リポソーム類のインビトロ特徴づけ：
Ａ．インビトロ医薬放出：
リポソームが例４Ａ〜例４Ｂにおいて記載されたとおりにして造られそして還元剤にさらした後のマイトマイシンＣの放出の速度を測定するためにインビトロで特徴づけられた。そのインビトロ研究のために、試験媒体に、典型的には約１５０μＭの濃度でシステインを添加することにより還元条件が誘導された。インビボ内因性還元条件は医薬の放出のための脂質−ＤＴＢ−医薬複合体のチオ開裂分解を行うために十分であろうことが認識されよう。インビボでの還元条件はシステインまたはグルタチオンのような適当な還元剤の投与により人工的に誘導されることが出来ることがさらに意図される。
【００６２】
リポソーム配合物、例えばＨＳＰＣ／コレステロール／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ／複合体化合物ＸＶＩＩＩ（以後“コレステロール含有配合物”と言う）およびＨＳＰＣ／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ／複合体化合物ＸＶＩＩＩ（以後“コレステロール含有なしリポソーム配合物”と言う）は、２４時間１５０μＭのシステインの存在下に３７℃でインキュベートされた。サンプルを選ばれた時間の点で取り出しそして複合体の量および遊離のマイトマイシンＣの量を定量化するために、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）により分析した。ＨＰＬＣ条件は例５において記載されている。
【００６３】
図１０Ａ〜図１０Ｂは、２種のリポソーム配合物についてのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。図１０Ａにおいて、コレステロール含有なしリポソーム配合物についての結果が示される。時間がゼロで、検出出来る遊離のマイトマイシンＣは存在せずそしてすべての測定出来る医薬は、リポソームに結合されている脂質−ＤＴＢ−医薬複合体の形にある。インキュベーション時間が増加するにつれて、リポソームから放出されそして遊離な形で検出出来るマイトマイシンＣの量が増大し、それに対応してマイトマイシンＣ結合複合体の存在が減少している。
【００６４】
図１０Ｂは、コレステロール含有リポソーム配合物についての結果を示す。時間ゼロで取り出された第１サンプルにおいて検出出来る遊離のマイトマイシンＣは存在しなかった。１５０μＭのシステイン中でのインキュベーションの１時間後に、少量の遊離医薬が検出され、脂質−ＤＴＢ−マイトマイシンＣ複合体結合のリポソームの分解を示す。図１０Ａと比較して、コレステロール含有リポソームは一層は一層ゆっくりとして複合体分解速度そしてそれに応じての医薬の一層ゆっくりとしての放出を生ずる。
【００６５】
図１１は、図１０Ａ〜図１０Ｂにおけるクロマトグラムから決定されたとおりの、２種のリポソーム配合物から放出されたマイトマイシンＣのパーセントを示すプロットである。コレステロール含有なしリポソーム（中が黒いダイアモンド形点）は、コレステロール含有リポソーム（中が黒い円形点）より一層高い放出速度を有した。コレステロール含有なし配合物について２時間後に、５０％より多くのマイトマイシンＣが複合体結合リポソームから放出された。両方の配合物について、２４時間インキュベーション期間の終わりに８０％より多くの医薬が放出された。
【００６６】
他の研究において、２種のリポソーム配合物が１．５ｍＭのシスティン中でインキュベーションされた。例５において記載されたとおりにして分析を行いそして図１２Ａ〜図１２Ｂにおいて結果を示す。図１２Ａはコレステロール含有なしリポソーム（ＨＳＰＣ／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ／脂質−ＤＴＢ−マイトマイシンＣ）中に導入されている脂質−ＤＴＢ−医薬複合体から放出されたマイトマイシンＣのパーセントを示す。１５０μＭでインキュベーション中のパーセント放出が比較のために示される（中が黒いダイアモンド形点）。見られるように、高い濃度の還元剤（１．５ｍＭ：中が白いダイアモンド形点）は、複合体の分解の速度および医薬放出の速度においての増大を生ずる。
【００６７】
図１２Ｂは、コレステロールを含有するリポソーム配合物についての結果を示す。１．５ｍＭのシステイン還元剤（中が白い円形点）中でインキュベートされたリポソームは、１５０μＭのシステイン（中が黒い円形点）中でインキュベートされた同じリポソームより有意義に高い分解速度を有する。
【００６８】
Ｂ．インビトロ細胞毒性：
脂質−ＤＴＢ−マイトマイシンＣ複合体（化合物ＸＶＩＩＩ）を含有するリポソームのインビトロ細胞毒性が、マウス肺癌系のＭ−１０９細胞を用いて評価された。例６において記載されているとおりに、Ｍ１０９細胞は、遊離のマイトマイシンＣの存在下にあるいはジステアロイル−ＤＴＢ−マイトマイシンＣ複合体を含有するリポソームの存在下にインキュベートされた。例６Ａにおいて特定されたモル比を用いて例４Ａ〜例４Ｂにおいて記載されたとおりにして造られたリリポソームが試験された。１５０μＭ、５００μＭおよび１０００μＭの濃度でシステインは、複合体のチオ開裂分解およびマイトマイシンＣの放出を行うために幾つかの試験細胞に加えられた。
【００６９】
ＩＣ５０値は、例６に記載されたとおりに、対照増殖速度の５０％阻止を起こさせる医薬濃度して取り上げられる。結果を表１に示す。
【００７０】
0004558952.tif 000008
１）ＭＭＣ＝マイトマイシンＣ
２）ＨＳＰＣ／コレステロール／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ／ジステアロイル−
ＤＴＢ−ＭＭＣ（９０／４５／５／５）
３）ＨＳＰＣ／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ／ジステアロイル−ＤＴＢ−ＭＭＣ
（９０／５／５）
４）ｎ．ｄ．＝行われなかった
【００７１】
細胞毒性研究から測定されたＭ１０９マウス癌細胞のパーセント増殖率が図１３において示される。パーセント増殖率は、マイトマイシンＣの不存在下にそしてシステインの不存在下に、Ｍ１０９細胞の増殖率に基づくパーセンテージとして表されそしてｎＭでのマイトマイシンＣ濃度の関数として示される。細胞の増殖率は例６において記載されているとおりにして測定された。見られるように、細胞増殖率のパーセントは、システインの濃度が増大するにつれて、コレステロール含有リポソーム（中が白い円形点）およびコレステロール含有なしリポソーム配合物（中が黒い正方形点）の両方について減少している。システインが遊離のマイトマイシンＣの活性に対して影響を有しないことそしてマイトマイシンＣが複合体から放出されて細胞増殖を有効に阻止することがまた見られることが出来る。
【００７２】
遊離の形でのマイトマイシンＣで処理されたあるいはリポソームに結合された脂質−ＤＴＢ−医薬複合体で処理されたＭ１０９マウス癌細胞のインビトロ増殖率は図１４Ａ〜図１４Ｂに示される。図１４Ａにおいて、コレステロール含有なしのリポソーム配合物についての結果が示される。プロットにおいてＭ１０９細胞の増殖率は、医薬およびシステインの不存在下にＭ１０９細胞の増殖に基づくパーセンテージとして表されそしてｎＭでのマイトマイシンＣの濃度の関数として示される。遊離の形でのマイトマイシンＣ（中が白い三角形点）で処理された細胞そして遊離の形でのマイトマイシンＣ  ＋  １０００μＭ（中が黒い三角形点）で処理された細胞は遊離の形での医薬の毒性に起因して増殖率における減少を示す。ＨＳＰＣ／ＰＥＧ−ＤＳＰＥ／ＤＳＰＥ−ＤＴＢ−マイトマイシンＣ（中が白い円形点）で処理された細胞そして１５０μＭ（中が白いダイアモンド形点）、５００μＭ（中が黒い円形点）および１０００μＭ（中が白い正方形点）の濃度で加えられた追加のシステインと共に該リポソーム配合物で処理された細胞はシステイン投与量に依存する様式で細胞に対する細胞毒性を示した。
【００７３】
図１４Ｂは、コレステロール含有リポソーム配合物についての同様なプロットである。コレステロールを含有するリポソーム  ＋  １５０μＭ（中が白いダイアモンド形点）、５００μＭ（中が黒い円形点）および１０００μＭ（中が白い正方形点）の濃度の追加のシステインで処理された細胞について、同じパターンが観察された。即ち、システインの濃度が増大するにつれて細胞増殖率が減少した。これは、システイン濃度との直接の相関関係でシステイン誘発のマイトマイシンＣの放出を示す。リポソーム配合物とは異なって、遊離の形でのマイトマイシンＣ（中が白い三角形点）で処理された細胞のインビトロ増殖率は、遊離の形でのマイトマイシンＣ  ＋  １０００μＭのシステイン（中が黒い三角形点）で処理された細胞の増殖率と同じであった。
【００７４】
図１５は、遊離のマイトマイシンＣの、そしてリポソーム配合物の、μＭでのシステイン濃度の関数としての、細胞毒性におけるパーセント増大を示す。細胞毒性における増大は、ＩＣ５０における、パーセント低下、例えばシステインの不存在におけるＩＣ５０に対してのシステインの存在におけるＩＣ５０ｘ１００（（ＩＣ５０（システインなし）／ＩＣ５０（システイン有り））ｘ１００）により決定された。見られるように、細胞毒性のパーセントは、コレステロール含有リポソーム配合物（中が白い三角形点）およびコレステロール含有なしリポソーム配合物（中が黒い円形点）の両方について、システイン濃度が増大するにつれて有意義に増大している。遊離のマイトマイシンＣ（中が黒い正方形点）の細胞毒性はシステインの存在により影響されなかった。
【００７５】
その細胞毒性データは、コレステロール含有なしリポソーム配合物がシステインにより一層影響されることを示している。或るシステイン濃度でのコレステロール含有なしリポソーム配合物のＩＣ５０は、単独の遊離医薬のＩＣ５０より２倍のみだけ低い。コレステロール含有リポソーム配合物はコレステロール含有なしリポソーム配合物よりも低い細胞毒性である。そのデータはまた、システインが腫瘍細胞の細胞毒性効果を有しないことそしてシステインが遊離マイトマイシンＣの細胞毒性に対して影響しないことを示している。システインがリポソームに結合されたマイトマイシンＣの細胞毒性を、投与量依存様式で増大させることがまたデータから明らかである。したがって、リポソーム配合物について観察された細胞毒性効果は、脂質−ＤＴＢ−医薬複合体からのマイトマイシンＣのシステイン媒介放出により大部分が説明される。
【００７６】
Ｃ．インビボ薬物速度論：
コレステロール含有リポソームおよびコレステロール含有なしリポソーム配合物のインビボ薬物速度論がねずみにおいて調べられた。例７において記載されているとおりにして、遊離の形での、あるいは本発明に従う脂質−ＤＴＢ−マイトマイシンＣ複合体の形でリポソームに導入された、マイトマイシンＣの約０．１ｍｇ／ｍｌの一回の静脈内ボーラス注射（血管中を薬液が塊となって移動するような注射法）で動物を処置した。注射後に血液サンプルを取り出しそしてマイトマイシンＣの量について分析した。結果を図１６Ａ〜図１６Ｂに示す。
【００７７】
図１６Ａは、静脈内注射後の時間での時間の関数としてねずみの血液中のマイトマイシンＣの濃度（μｇ／ｍＬ）を示す。見られるように、遊離の形で静脈内に投与された遊離のマイトマンシンＣ（中が白い正方形点）は血液から迅速に取り除かれる。リポソームに結合された脂質−ＤＴＢ−医薬複合体の形でのマイトマイシンＣは実質的に長い時間期間にわたっての循環において残っている。コレステロール含有リポソームと組み合わされたマイトマイシンＣ（中が黒いダイアモンド形点）およびコレステロール含有なしリポソームと組み合わされたマイトマイシンＣ（中が黒い円形点）は２０〜２５時間にわたって１０μｇ／ｍＬより多くの濃度で血液中で検出された。
【００７８】
図１６Ｂは、試験配合物の静脈注射後の時間での時間の関数として血液中の残っている注射投与量のパーセントを示す。約５分より長い時間の点で遊離のマイトマイシンＣ（中が白い正方形点）の投与量は血液中に実質的に残っていない。しかしながら、リポソーム配合物の注射後２０時間でマイトマイシンＣの投与量の約１５〜１８パーセントが循環に残っている。このことは、マイトマイシンＣ−ＤＴＢ−脂質複合体が循環している間にリポソーム内に安定な状態のままでありそして最小のチオ開裂が血漿中で起こることを示している。それ故に、このシステムは、延長された血液循環活動寿命を有しそして腫瘍中への高められた蓄積を有する長く循環するリポソーム類（ＳｔｅａｌｔｈRリポソーム類）との適合性（和合性）があると思われる。
【００７９】
（発明を実施するための最良の形態）
Ｖ．実施例：
以下の例は本明細書に記載された本発明をさらに例示しそしていかなるやりかたであっても、本発明の範囲を限定することが意図されない。
【００８０】
材料：
すべての材料は、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのような適当な市販の会社から得られた。
【００８１】
例  １：
パラ−ジアシルジグリセロールジチオベンズアルコール（化合物ＩＶ）および
オルト−ジアシルジグリセロールジチオベンズアルコールの合成：
Ａ．パラ−ジアシルジグリセロールジチオベンズアルコール：
この反応は図１において例示されている。化合物ＩＩおよび化合物ＩＩＩを造るためにＳｙｎｄｅｒ，Ｗ．Ｒ．の方法（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌｉｐｉｄ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２８：９４９（１９８７））に従った。
【００８２】
５ｍｌの水中の３−メルカプト−１，２−プロパンジオール（化合物Ｉ：１ｇ（９．２６ミリモル））を含有する、１００ｍｌの丸底フラスコを氷浴中に置いた。この迅速にかき混ぜているフラスコに、３０〜４０℃の温度を維持しながら過酸化水素（正確に０．５モル当量、５２５μｌ（４．６３ミリモル））を滴下して加えた。発熱処理の終わりに、その反応混合物を室温で一夜かき混ぜながら放置した。２０ｍｌの分割量でアセトニトリルを連続的に添加することにより、回転蒸発を用いて水を共沸させた。アセトニトリル添加の処理は３〜４回又はすべての水が除去するまで繰り返され、透明な油状物を生じた。金属ヘラを用いてフラスコをこすりそして−２０℃で一夜冷却した後に油状生成物は固体化した（化合物ＩＩ、ラセミ−３，３’−ジチオビス（１，２−プロパンジオール））。このチョーク状固体を、Ｐ2Ｏ5状で真空乾燥させた。収量：６３０ｍｇ（６３％）。
0004558952.tif 000009
【００８３】
そのラセミ−３，３’−ジチオビス（１，２−プロパンジオール）生成物（化合物ＩＩ）は、オーブン乾燥された１００ｍＬの丸底フラスコにその化合物（９８０ｍｇ、４．６ミリモル）を加えそして乾燥塩化メチレン（４０ｍＬ）中に溶解することによりアシル化された。これに、ステアリン酸（４．９２ｇ、１７．１ミリモル）および触媒として４−（ジメチルアミノ）ピリジニウム４−トルエンスルホネート（１．３８ｇ、４．６ミリモル）を加えそして２０分間、室温（２５℃）でかき混ぜた。次にジイソプロピルカルボジイミド（３．１ｍｌ、２０ミリモル）をピペットで加えそして室温で一夜反応させた。ＧＦ上ＴＬＣシリカ（ヘキサン中１０％酢酸エチル）は、該ジオール基の完全な反応を示した。（ラセミ−３，３’−ジチオビス（１，２−プロパンジオール）Ｒｆ＝０．６０；ラセミ−３，３’−ジチオビス（１，２−プロパンジステアロイル）Ｒｆ＝０．３５）。ＡｍｂｅｒｌｙｓｔRＡ−２１のやや塩基性のイオン交換樹脂（〜３ｇ）およびＡｍｂｅｒｌｙｓｔR１５の強い酸性のイオン交換樹脂（〜３ｇ）を反応混合物に加えた。３０分間振り混ぜた後に、樹脂を濾過しそして濾液を乾燥するために取り出した。残留物を３回イソプロパノール（各々１００ｍＬ）から再結晶化させた。固体生成物、ラセミ−３，３’−ジチオビス（１，２−プロパンジステアロイル）（化合物ＩＩＩ）を集めそしてＰ2Ｏ5上で乾燥させた。
収率：７０％（４．１ｇ）、融点５４〜５５℃。
0004558952.tif 000010
【００８４】
次の工程で、ラセミ−３，３’−ジチオビス（１，２−プロパンジステアロイル）（化合物ＩＩＩ）（２．９７ｇ、２．３３ミリモル）をトルエン（３０ｍＬ）中に溶解しそして氷浴中に置いた。塩化スルフリル（１．９ｍＬ、２３．２ミリモル）をフラスコ中にピペットで入れそしてその混合物を３０分間冷たい氷浴温度でかき混ぜた。フラスコを次に室温に置きそしてもう３０分間かき混ぜた。回転蒸発器を用いて過剰の塩化スルフリルを除去した。新しい（２０ｍｌ）分割量のトルエンを反応フラスコに加えそして氷浴上に置いた。これに、ゆっくりとした速度でトルエン中の４−メルカプトベンズアルコール（７８０ｍｇ、５．６ミリモル）の溶液を加えた。５分間の反応時間後に、回転蒸発を用いてすべての溶媒を蒸発させて乾燥した。温かい酢酸エチル（１０ｍＬ）を反応フラスコに加えて固体を溶解しそして不溶性物質を濾去した。酢酸エチル溶液に５０ｍＬのエーテルを加えて沈殿を生じさせそして固体生成物（パラ−ジアシル−ジグリセロール−ジチオベンザルアルコール、化合物ＩＶ）を濾過により集めた。この処理を２回繰り返した。収率：７５％。
【００８５】
生成物（パラ−ジアシル−ジグリセロール−ジチオベンザル−アルコール、化合物ＩＶ）を精製するためにクロロホルム中シリカゲルカラム（２０ｘ２．５ｃｍ）を造った。サンプルを最小容量のクロロホルム中に溶解しそして２つの異なる移動性相の添加を用いてクロマトグラフィにかけた。まず１００％ＣＨＣｌ3（１００ｍｌ）が溶離された。この分画は不純物ジチオベンジルアルコールを含有した。この確認は、1ＨＮＭＲにより行われた。次にクロロホルム中１５％メタノールへの移動性相の変化を行い、フラッシュクロマトグラフィにかけることにより純粋な生成物を集めた。ＣＨ3ＯＨ：ＣＨＣｌ3（１５：８５）の５００ｍｌで溶離することにより純粋なＤＧＴＢＡ（ＴＬＣによる１つのスポット）を集めた。溶媒の蒸発後にその固体をｔ−ＢｕＯＨから凍結乾燥しそしてＰ2Ｏ5上で真空乾燥させた。最終精製は収率を４０％（１．４ｇ）に低下させた。
0004558952.tif 000011
【００８６】
５ｍｇのサンプルを元素分析のために研究所（Ｍｉｄｗｅｓｔ  Ｍｉｃｒｏ
Ｌａｂ）に提出した。
【００８７】
0004558952.tif 000012
【００８８】
Ｂ．オルト−ジグリセロールジチオベンズアルコール：
ラセミ−３，３’−ジチオビス（１，２−プロパンジステアロイル）（化合物ＩＩＩ）（２００ｍｇ、０．１５６ミリモル）をトルエン（３０ｍＬ）中に溶解しそして氷浴中に置いた。塩化スルフリル（３９μｌ、０．４７ミリモル）をピペットでフラスコに入れそしてその混合物を３０分間冷たい氷浴温度でかき混ぜた。次にフラスコを室温に置きそしてもう３０分間かき混ぜた。回転蒸発器を用いて過剰の塩化スルフリルを除去した。新しい（２０ｍＬ）分割量のトルエンを反応フラスコに加えそして氷浴上に置いた。これにトルエン中の２−メルカプトベンズアルコール（４８ｍｇ、３５ミリモル）をゆっくりとした速度で加えた。５時間の反応時間の後に回転蒸発を用いてすべての溶媒を蒸発させて乾燥した。温かい酢酸エチル（１０ｍＬ）を反応フラスコに加えてその固体を溶解しそして不溶性物質を濾去した。酢酸エチル溶液に５０ｍＬのエーテルを加えて沈殿を生じさせそして固体生成物（オルト−ジアシル−ジグリセロール−ジチオベンザルアルコール）を濾過により集めた。この処理を２回繰り返した。固体をＰ2Ｏ5上で真空乾燥させた。収率：７５％（１９０ｍｇ）。
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【００８９】
例  ２：
パラ−ジアシルジグリセロールジチオベンザル−マイトマイシンＣ
（化合物ＸＶＩＩＩ）の合成：
この反応は図６Ａにおいて例示されている。
５０ｍＬの丸底フラスコにホスゲン（３．１ミリモル）およびトルエン（５ｍＬ）を装入しそして溶液を０℃に冷却した。トルエン（２．５ｍＬ）中のパラ−ジアシル−ジグリセロール−ジチオベンザル−アルコール（化合物ＩＶ、例１において記載されているとおりにして造られた：０．３１ミリモル）の溶液を造った。次にそのアルコール溶液を該ホスゲン溶液に滴下して加えた。その混合物を一夜放置して室温に温めた。１８時間後にその溶液を真空濃縮して過剰のホスゲンを除去した。その粗製塩化アシルをトルエン（５ｍＬ）中に再溶解した。
【００９０】
マイトマイシンＣ（０．３１ミリモル）、ジメチルアミノピリジン（０．０３１ミリモル）およびＤＭＦ（１ｍＬ）の溶液が造られた。マイトマイシンＣ溶液を該塩化アシル溶液に滴下して加えた。１時間後に、トルエンを蒸発除去しそして粗製生成物をシリカ上でクロマトグラフィ（１：１ヘキサン：酢酸エチル）にかけた。次に精製された生成物をｔ−ＢｕＯＨ（５０ｍＬ）中に取りそして凍結乾燥した。生成物は紫色固体であった（１８３ｍｇ、５３％）Ｒｆ＝０．３８（５０％ヘキサン：酢酸エチル）。
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【００９１】
例  ４：
リポソーム製造：
Ａ．コレステロール含有リポソーム：
１．リポソーム製造：
６０〜６５℃で１ｍｌの脱水エタノールに、５９ｍｇのＨＳＰＣ、１４．４ｍｇのコレステロール、１７．４ｍｇのｍＰＥＧ−ＤＳＰＥおよび７．４ｍｇのパラ−ジステアロイル−ＤＴＢ−マイトマイシンＣ（６０／３０／５／５のモル比）を加えそして溶解してしまうまで、約１０分間混合した。
【００９２】
蒸留水中１０ｍＭのヒスチジンおよび１５０ｍＭのＮａＣｌからなる水和媒体を７０℃に温めた。
【００９３】
混合しながら、温かい該脂質溶液を温かい（６３〜６７℃）該水和媒体に迅速に加えて不均質寸法を有するリポソームの懸濁液を造った。その懸濁液を６３〜６７℃で１時間混合した。
【００９４】
２．押し出し：
テフロンを裏張りしたスティンレススチール容器に入れられたポリカーボネートフィルターカートリッジに通過させての制御された押し出しにより、リポソームを所望の平均粒子寸法直径に大きさを整えて形を造った。そのリポソーム懸濁液は、６〜８時間期間の押し出し処理中に６３〜６５℃に維持された。
【００９５】
３．ダイアフィルトレーション：
ダイアフィルトレーション（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）によりリポソーム懸濁液からエタノールを除去した。消毒水中にヒスチジン（１０ｍＭ）および塩化ナトリウム（１５０ｍＭ）を溶解することによりヒスチジン／塩化ナトリウム溶液を造った。溶液のｐＨを約７に調節した。０．２２μｍのＤｕｒａｐｏｒｅフィルター中を通過させてその溶液を濾過した。リポソーム懸濁液は、該ヒスチジン／塩化ナトリウム溶液を用いて約１：１（容量／容量）に希釈されそしてポリスルホン中空繊維限外濾過器中に通過されてダイアフィルトレーションが行われた。エタノールを除去するために、該ヒスチジン／塩化ナトリウム溶液に対して８回容量交換が行われた。処理液体温度は約２０〜３０℃に維持された。合計のダイアフィルトレーション時間は約４．５時間であった。
【００９６】
４．滅菌濾過：
リポソーム懸濁液を３３〜３８℃に加熱しそして０．２μｍのＧｅｌｍａｎ
Ｓｕｐｏｒポリエーテルスルホンフィルター中に通過させて濾過した。合計の濾過時間は約１０分であった。
【００９７】
各々の処理工程（水和、押し出し、透析および濾過）の後に、脂質濃度および複合体／医薬濃度がＨＰＬＣにより測定された。リポソーム粒子寸法は動的光散乱により測定されそして外部の懸濁媒体中の“遊離の”、結合されていないマイトマイシンＣの量はＨＰＬＣにより測定された。
【００９８】
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１）複合体＝化合物ＸＶＩＩＩ、パラ−システアロイル−ＤＴＢ−マイトマイシンＣ、
２）ＭＭＣ＝マイトマイシンＣ。
【００９９】
Ｂ．コレステロール含有なしリポソーム配合物：
９０／５／５のモル比で、ＨＳＰＣ、ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥおよびパラ−ジステアロイル−ＤＴＢ−マイトマイシンＣの脂質組成物を用いて、上に記載されたとおりにしてリポソームを造った。特定的には８８．５ｍｇのＨＳＰＣ、１７．９ｍｇのｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ（ＰＥＧの平均分子量＝２０００ダルトン）および
７．３ｍｇの該複合体を１ｍＬのエタノールに溶解した。リポソームの寸法、脂質および医薬の濃度そして外部懸濁媒体中の遊離マイトマイシンＣの濃度は各々の処理工程の後に測定された。
【０１００】
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１）複合体＝化合物ＸＶＩＩＩ、パラ−ジステアロイル−ＤＴＢ−マイトマイシンＣ、
２）ＭＭＣ＝マイトマイシンＣ。
【０１０１】
例  ５：
インビトロ特徴づけのためのＨＰＬＣ条件：
例４Ａおよび例４Ｂにおいて記載されたとおりにして造られたリポソームを、０．６Ｍのオクタイルグルコピラノシド（ｏｃｔａｙｌｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）に希釈した。リポソームを３７℃で１５０ｍＭのシステインの存在下にインキュベートした。ゼロ時間、３０分、１時間、２時間、４時間および２４時間でサンプルを取り出した。Ｗａｔｅｒ  Ｓｙｍｍｅｔｒｙ  Ｃ８の３．５ｘ５ｃｍのカラムを用いてＨＰＬＣにより２０μＬ容量を分析した。流速は１ｍＬ／分でありそして移動相勾配は以下のとおりであった：
【０１０２】
0004558952.tif 000017
【０１０３】
例  ６：
細胞毒性研究：
Ａ．リポソーム製剤：
例４Ａ〜例４Ｂにおいて記載されたとおりにして造られたリポソームは、
ＨＳＰＣ／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ／ジステアロイル−ＤＴＢ−マイトマイシンＣ（９０／５／５）またはＨＳＰＣ／コレステロール／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ／ジステアロイル−ＤＴＢ−マイトマイシンＣ（９０／４５／５／５）からなっていた。そのリポソーム製剤は０．４５μｍセルロース膜を通過させて滅菌濾過されそして押し出しにより寸法低下されなかった。リポソーム配合の後に、イソプロパノール中１０〜２０倍希釈により溶解化されたリポソームにおいて３６０ｎｍでの吸光度によりマイトマイシンＣの濃度が測定されそして燐脂質濃度は無機燐酸塩アッセイにより測定された。
【０１０４】
コレステロール含有リポソームは２７５±９０ｎｍの平均直径を有した。コレステロール含有なしリポソームは１５０±５０ｎｍの平均直径を有した。両方のリポソーム配合物中の燐脂質濃度は１０μＭ／ｍＬでありそして両方の配合物中のマイトマイシンＣの濃度は１２０μｇ／ｍＬであった。
【０１０５】
Ｂ．化学的感受性アッセイおよび増殖率測定：
遊離のマイトマイシンＣあるいはリポソーム中に導入されたジステアロイル−ＤＴＢ−マイトマイシンＣ複合体の形でのマイトマイシンＣ、の細胞毒性作用は僅かに修正された以前に記載されたメチレンブルー染色法（Ｈｏｒｏｗｉｔｚ，Ａ．Ｔ．等によるＢｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１１０９，２０３−２０９（１９９２））により比色的にアッセイされた。そのアッセイが完了した際に、細胞は固定されそしてメチレンブルー染色アッセイを用いて評価された。
【０１０６】
そのアッセイにおいて、２００μｌ分割量（ＲＰＭＩ−１６４０媒地＋１０％うし胎児血清）中の自然増殖培養からの１５００Ｍ１０９マウス癌細胞が９６ウエルの平底ミクロ滴定平板上で平板培養された。培養での２０時間後、細胞が結合され且つ増殖を再開している間に、２０μｌの試験配合物（遊離のマイトマイシンＣまたはリポソーム配合物）を各々のウエルに加えた。医薬濃度における各々１０倍増加について、４つの医薬濃度ポイントが試験された。各々の試験は、３つ組ウエルにおいてそして２つの平行平板において行われた。それらの細胞は７２時間連続して処置された。
【０１０７】
７２時間の処置期間の後に１０分間各々のウエルに５０μｌの２．５％グルタルアルデヒドの添加により培養を固定した。平板を脱イオン水で３回、０．１Ｍのほう酸塩緩衝液（ｐＨ８．５）で１回洗浄しそして次に室温（２０〜２５℃）で１００μｌのメチレンブルー（０．１Ｍ緩衝液ほう酸塩中１％、ｐＨ８．５）で６０分間染色した。平板を脱イオン水の５つの浴中ですすぎ洗いをして細胞に結合していない染料を除去しそして次に乾燥した。染料は３７℃で６０分間２００μｌの０．１ＮのＨＣｌで抽出されそして光学濃度がミクロプレート分光測光器を用いて測定された。
【０１０８】
分光測光吸光度と十分に相関している血球計を用いて細胞を計数することにより細胞数が決定された。初期細胞平板培養濃度は、研究の終わりでの細胞数と吸光度との間の直線関係を確実にするために選ばれた。各々の研究において、６つのウエルが固定された後に初期の平均の吸光度を測定するために医薬が加えられた。この値は、増殖率（ＧＲ）そして以下の方程式：ＤＴ＝ｌｎ２／ｌｎ〔（ＯＤt／ＯＤc）／ｈ〕（式中、ｌｎは自然対数を表し、ＤＴは時間での倍加時間を表し、ＯＤtは研究の終わりでの試験ウエルの光学濃度を表し、ＯＤcは研究の開始での対照ウエルの光学濃度を表しそしてｈは時間でのインキュベーションの持続期間を表す）を用いて対照細胞及び医薬処理された細胞の倍加時間（ＤＴ）を計算するために用いられた。
【０１０９】
増殖率は、ＧＲ＝（ｌｎ２／ＤＴ）として計算された。パーセント増殖阻止あるいは対照増殖率のパーセントは、医薬処理細胞の増殖率を非処理対照細胞の増殖率により分割することにより得られた。対照増殖率の５０％の阻止を起こさせる医薬濃度（ＩＣ50）は増殖阻止曲線の２つの最も近い値の補間法により計算された。
【０１１０】
マイトマイシンＣは、１０-8〜１０-5Ｍの範囲でアッセイされた。結合された複合体を有するリポソーム配合物は、１０-8〜３ｘ１０-5Ｍの範囲でアッセイされた。相互作用研究のためにシステイン（ミズリー州セントルイスのＳＩＧＭＡ製）は１５０、５００または１０００μＭの最終濃度で、マイトマイシンＣまたはリポソーム配合物と一緒に加えられた。
結果を表１にそして図１３、１４および１５Ａ〜１５Ｂに示す。
【０１１１】
例  ７：
インビボ薬物速度論研究：
Ａ．リポソーム配合物：
コレステロール含有リポソームおよびコレステロール含有なしリポソームは例５Ａおよび例５Ｂにおいて記載されているとおりにして造られた。
【０１１２】
遊離の形でのマイトマイシンＣの溶液は１１９μＬのエタノール中にマイトマイシンＣの１１．９ｍｇを溶解することにより造られた。溶解後、１０ｍＭヒスチジン／１５０ｍＭ食塩水の溶液の約１１．８μＬを加えた。使用の前に、ヒスチジン／食塩水溶液を用いて，該マイトマイシンＣ溶液を１００μｇ／ｍＬに希釈しそして濾過した。
【０１１３】
Ｂ．動物：
８匹のねずみを以下のとおりに処置グループに無作為的に分けた：
【０１１４】
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【０１１５】
試験配合物の１回の静脈内注射がボーラス投与量として投与された。注射後に以下の時間で各々の動物から血液サンプルを取り出した：３０秒、１５分、３０分、１時間、２時間、４時間、８時間、２４時間、４８時間、７２時間及び９６時間。血液サンプル中のマイトマイシンＣの量を下に示されたＨＰＬＣ方法により測定した。７．５％ＥＤＴＡの５．１ｍＬ中にヨードアセトアミドの１９９．３ｍｇを入れることにより２００ｍＭのヨードアセトアミド溶液が造られた。その２００ｍＭのヨードアセトアミド溶液の１５μＬを各々の１μＬの血液サンプルに入れた。
【０１１６】
Ｃ．血漿中のマイトマイシンＣを測定するためのＨＰＬＣ法：
１．溶液調製：
脱イオン水を充たした１Ｌ容量のフラスコ中に１．３２１ｇの燐酸アンモニウムを入れることにより１０ｍＭの燐酸アンモニウムを含有する水性緩衝液（ｐＨ＝７）を造った。混合液をかき混ぜそしてｏ−燐酸を用いてｐＨを７．０に調節した。使用の前に、その緩衝液を０．４５μｍのナイロンフィルター中に通過させて濾過した。
【０１１７】
Ｗａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ二重ポンプ（ｂｉｎａｒｙ  ｐｕｍｐ）を用いて勾配プログラムによりメタノールの移動相および該水性緩衝液は、混合された。
【０１１８】
２．標準溶液および品質対照サンプルの調製：
２つの別々の重量のマイトマイシンＣおよびマイトマイシンＣ複合体が標準および品質対照サンプルとして調製された。１ｍｇのマイトマイシンＣおよび１ｍｇのマイトマイシンＣ複合体が秤量されそして別々に１ｍＬの希釈液（２０％のクロロホルムと８０％のメタノールとの混合液）に溶解された。両方の化合物の原料溶液の濃度は１ｍｇ／ｍＬであって、標準および品質対照サンプルのために、数種の希釈液が希釈において造られて５μｇ／ｍＬから１００μｇ／ｍＬまでの濃度を得た。
【０１１９】
ねずみ血漿の０．１ｍＬの分割量が、適当な容量（１０μＬ〜５０μＬ）のマイトマイシンＣ標準溶液と、そしてマイトマイシンＣ複合体標準溶液と、混ぜ合わされた。その濃度範囲はマイトマイシンＣについて０．０５〜５．０μｇ／ｍＬそしてマイトマイシンＣ複合体について０．１〜５μｇ／ｍＬであった。最終容量はメタノールで１ｍＬに調節された。品質対照サンプルを造るために同様な方法に従った。品質対照サンプルについての濃度は、ねずみ血漿において、マイトマイシンＣについて０．１、０．５および５μｇ／ｍＬでありそしてマイトマイシンＣ複合体について０．１、１および５μｇ／ｍＬであった。サンプルは、室温で１０分間３，０００ｒｐｍで回転沈降（ｂｅ  ｓｐｕｎ  ｄｏｗｎ）された。上澄み液の３００μＬは、注射のための３００μＬの挿入管を含有するＨＰＬＣ小瓶に移された。
【０１２０】
３．サンプル調製：
１００μＬの血漿サンプルは、９００μＬのメタノールを用いて変性され、次に３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離された。上澄み液の３００μＬの分割量は注射のための３００μＬの挿入管を含有するＨＰＬＣ小瓶に移された。
【０１２１】
４．クロマトグラフィ条件：
ＳｕｐｅｌｃｏRＣ−８（５μ、４．６ｍｍｘ５ｃｍ）カラムが用いられた。移動相Ａは１０ｍＭの燐酸アンモニウム（ｐＨ７）であった。移動相Ｂはメタノールであった。流速は１ｍＬ／分であってそして検出は３６０ｎｍでのＵＶによった。注射容量は４０μＬでありそして典型的な実験時間は１５分であった。勾配プログラムは以下のとおりであった：
【０１２２】
0004558952.tif 000019
【０１２３】
５．アッセイおよび計算：
低い濃度から高い濃度までの調製された直線性標準（６つの濃度水準）が注射された。品質対照および血漿サンプルは次に分析ために注射された。
【０１２４】
ピーク域および保持時間は、ＰＥ−Ｎｅｌｓｏｎ  Ｔｕｒｂｏｃｈｒｏｍ（版４．１）システムにより決定された。マイトマイシンＣおよびマイトマイシンＣ複合体の濃度は線形回帰プログラムを用いて計算された。その方法の直線性は６つの濃度水準からの標準応答を用いて評価された。データは、１／ｘ2の重量係数を用いて線形回帰方程式ｙ＝Ｂ*ｘ  ＋  Ａに合わせられた。その方法の精度および正確さは、品質対照サンプルからばかりでなく、標準の逆算濃度から評価された。
結果を図１６Ａおよび図１６Ｂに示す。
【０１２５】
本発明は、特定の態様に関して記載されたけれども、本発明から離れることなしに種々の変更および修正が行われることが出来ることが当業者に認識されるだろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】  アミン−、ヒドロキシ−、またはカルボキシル−含有医薬とさらに反応するためのパラ−ジアシルジグリセロール−ジチオベンジルアルコールの製造のための合成反応方式を示す。
【図２Ａ】  反応性ジアシルジグリセロ−ル−ジチオベンジルカーボネートに、アミノ含有医薬を結合するための一般反応方式を示す。
【図２Ｂ】  図２Ａにおける複合体のチオ開裂（チオール類を加えての分解による開裂）後の生成物を示す。
【図３Ａ】  ジアシルジグリセロール−ジチオベンジル−５−フルオロウラシル複合体の製造のための合成反応方式を示す。
【図３Ｂ】  図３Ａにおける複合体のチオ開裂後の生成物を示す。
【図４】  ジアシルジグリセロール−ジチオベンジル−５−フルオロウラシル複合体の製造のための別の合成反応方式そしてその複合体のチオ開裂後の生成物を示す。
【図５】  ジアシルジグリセロール−ジチオベンジル−クロラムブシル複合体の製造のための合成反応方式そしてその複合体のチオ開裂後の生成物を示す。
【図６Ａ】  ジアシルジグリセロール−ジチオベンジル−マイトマイシンＣ複合体の製造のための合成反応方式を示す。
【図６Ｂ】  図６Ａにおける複合体のチオ開裂後の生成物を示す。
【図７】  コレステロール−ジチオベンジル−マイトマイシンＣ複合体の製造のための合成反応方式を示す。
【図８】  コレステロール−ジチオベンジル−マイトマイシンＣ複合体の製造のための他の合成反応方式を示す。
【図９Ａ】  図９Ａ〜図９Ｃの３種の脂質−ジチオベンジル−マイトマイシンＣ複合体のうちの１種のパラ−ジステアロイル−ＤＴＢ−マイトマイシンＣの構造を示す。
【図９Ｂ】  図９Ａ〜図９Ｃの３種の脂質−ジチオベンジル−マイトマイシンＣ複合体のうちの１種のパラ−ジパルミトイル−ＤＴＢ−マイトマイシンＣの構造を示す。
【図９Ｃ】  図９Ａ〜図９Ｃの３種の脂質−ジチオベンジル−マイトマイシンＣ複合体のうちの１種のオルト−ジパルミトイル−ＤＴＢ−マイトマイシンＣの構造を示す。
【図１０Ａ】  図面において、システインの存在下でのリポソームのインキュベーションの時間の関数として一連のクロマトグラムを示す、ＨＳＰＣ／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ／脂質−ＤＴＢ−マイトマイシンＣからなっているリポソームについてのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１０Ｂ】  図面において、システインの存在下でのリポソームのインキュベーションの時間の関数として一連のクロマトグラムを示す、ＨＳＰＣ／コレステロール／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ／脂質−ＤＴＢ−マイトマイシンＣからなっているリポソームについてのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１１】  システインの存在下でのインキュベーションの時間の関数として、ＨＳＰＣ／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ／脂質−ＤＴＢ−マイトマイシンＣ（中が黒いダイアモンド形点）およびＨＳＰＣ／コレステロール／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ／脂質−ＤＴＢ−マイトマイシンＣ（中が黒い円形点）、からなるリポソーム類から放出されたマイトマイシンＣのパーセントを示すプロットである。
【図１２Ａ】  １５０μＭ（中が黒い記号）の濃度および１．５ｍＭ（中が白い記号）の濃度で、システインの存在下のインキュベーションの時間の関数として、ＨＳＰＣ／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ／脂質−ＤＴＢ−マイトマイシンＣからなるリポソームから放出されたマイトマイシンＣのパーセントを示すプロットである。
【図１２Ｂ】  １５０μＭ（中が黒い記号）の濃度および１．５ｍＭ（中が白い記号）の濃度で、システインの存在下のインキュベーションの時間の関数として、ＨＳＰＣ／コレステロール／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ／脂質−ＤＴＢ−マイトマイシンＣからなるリポソームから放出されたマイトマイシンＣのパーセントを示すプロットである。
【図１３】  遊離のマイトマイシンＣ（中が白い三角形点）、ＨＳＰＣ／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ／脂質−ＤＴＢ−マイトマンシンＣからなるリポソーム（中が黒い正方形点）、そしてＨＳＰＣ／コレステロール／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ／脂質−ＤＴＢ−マイトマイシンＣからなるリポソーム（中が白い円形点）について、ｎＭでのマイトマイシンＣの量の関数として、医薬およびシステインの不存在下にＭ１０９細胞の増殖に基づくパーセンテージとして表された、Ｍ１０９細胞の増殖率のプロットである。
【図１４Ａ】  ｎＭでのマイトマイシンＣ濃度の関数として、医薬またはシステインの不存在化での、Ｍ１０９細胞の増殖に基づくパーセンテージとして表された、Ｍ１０９細胞の増殖率のプロットである。遊離形でのマイトマイシンＣで処置された細胞（中が白い三角形点）そして遊離形でのマイトマイシンＣ  ＋１０００μＭのシステインで処置された細胞（中が黒い三角形点）が示される。ＨＳＰＣ／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ／脂質−ＤＴＢ−マイトマイシンＣからなるリポソーム配合物で処置された細胞（中が白い円形点）そして１５０μＭ（中が白いダイアモンド形点）、５００μＭ（中が黒い円形点）および１０００μＭ（中が白い正方形点）濃度で加えられた追加のシステインを有する該リポソーム配合物で処置された細胞がまた示される。
【図１４Ｂ】  ｎＭでのマイトマイシンＣ濃度の関数として、医薬またはシステインの不存在下での、Ｍ１０９細胞の増殖に基づくパーセンテージとして表された、Ｍ１０９細胞の増殖率のプロットである。遊離形でのマイトマイシンＣで処置された細胞（中が白い三角形点）そして遊離形でのマイトマイシンＣ  ＋１０００μＭのシステインで処置された細胞（中が黒い三角形点）が示される。ＨＳＰＣ／コレステロール／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ／脂質−ＤＴＢ−マイトマイシンＣからなるリポソーム配合物で処置された細胞（中が白い円形点）そして１５０μＭ（中が白いダイアモンド形点）、５００μＭ（中が黒い円形点）および１０００μＭ（中が白い正方形点）の濃度で加えられた追加のシステインを有する該リポソーム配合物で処置された細胞がまた示される。
【図１５】  システインの種々の濃度でのインビトロ中のＭ１０９細胞に対する、遊離のマイトマイシンＣ（中が黒い正方形点）、ＨＳＰＣ／コレステロール／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ／脂質−ＤＴＢ−マイトマイシンＣからなるリポソーム（中が黒い円形点）と組み合わされているマイトマイシンＣおよびＨＳＰＣ／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ／脂質−ＤＴＢ−マイトマイシンＣからなるリポソーム（中が白い三角形点）と組み合わされているマイトマイシンＣの、（（ＩＣ５０（システインなし）／ＩＣ５０（システイン有り））ｘ１００により決定されたとおりの）細胞毒性におけるパーセント増大を示すプロットである。
【図１６Ａ】  遊離のマイトマイシンＣ（中が白い正方形点）、ＨＳＰＣ／コレステロール／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ／脂質−ＤＴＢ−マイトマイシンＣ（中が黒いダイアモンド形点）からなるリポソームおよびＨＳＰＣ／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ／脂質−ＤＴＢ−マイトマイシンＣ（中が黒い円形点）からなるリポソーム、の静脈内注射後の時間での時間の関数としてねずみの血液中のマイトマイシンＣの濃度を示すプロットである。
【図１６Ｂ】  遊離のマイトマイシンＣ（中が白い正方形点）、ＨＳＰＣ／コレステロール／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ／脂質−ＤＴＢ−マイトマイシンＣ（中が黒いダイアモンド形点）からなるリポソームおよびＨＳＰＣ／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ／脂質−ＤＴＢ−マイトマイシンＣ（中が黒い円形点）からなるリポソーム、の静脈内注射後の時間での時間の関数としてねずみの血液中に残っている注射された投与量のパーセントを示すプロットである。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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