(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
絶縁性フィルムの上に、スクリーン印刷法により、電極層及び電極層の周囲を囲む絶縁層を順次印刷し、カーボン層上に有機系合成物質を滴下乾燥することにより形成されたｐＨ変化を検出するｐＨ電極と、
前記ｐＨ電極上に、ウレアーゼ、水膨潤性高分子材料、界面活性剤及び緩衝物質の混合物の水溶液を滴下乾燥することにより形成された酵素層と、
酵素層の表面を覆って、酵素層の酵素の流失を防止し、尿素の拡散を制限し、測定液中の夾雑物質を除去する働きをする高分子物質の溶液を滴下乾燥することにより形成されたフィルター層と
を備えていること
を特徴とする使い捨てＢＵＮセンサー。
【請求項２】
絶縁性フィルムの上に、スクリーン印刷法により、電極層及び電極層の周囲を囲む絶縁層を順次印刷する工程と、
カーボン層上に有機系合成物質を滴下乾燥して、ｐＨ変化を検出するｐＨ電極を形成する工程と、
このｐＨ電極上に、ウレアーゼ、水膨潤性高分子材料、界面活性剤及び緩衝物質の混合物の水溶液を滴下乾燥して、酵素層を形成する工程と、
酵素層の表面を覆って、酵素層のウレアーゼの流失を防止し、尿素の拡散を制限し、測定液中の夾雑物質を除去する働きをする高分子物質の溶液を滴下乾燥して、フィルター層を形成する工程と
から成ることを特徴とする使い捨てＢＵＮセンサーの製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、全血、血漿、血清、尿など生体液中の尿素窒素を測定する使い捨てＢＵＮセンサー及びその製造法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、検量線の校正や電極の洗浄が不要で小型、使い捨てタイプの酵素センサーが実用に供されている。酵素センサーは、一般的には酵素反応を検知する作用極（酵素電極又は測定極とも言う）と、電気回路を形成する参照極（又は対極）を有する構造を持ち、作用極における酵素反応による物質変化を、それら電極により電気信号の変化として取り出し、その変化からその酵素と特異的に作用する基質の濃度を測定するものである。その中でよく使われている酵素センサーには酸化還元酵素を利用するものがある。例えば生成する過酸化水素、又は消費する酸素を検出物質とするアンペロメトリック型酵素センサーである（例えば特開平のグルコース酵素センサー）。また、酵素の酸化還元をメディエーションする電子伝達物質（メディエーターと呼ばれる）を介して電気信号を検出するアンペロメトリック型酵素センサーもある。更に、水
解酵素を利用し、それと選択的に反応する基質の水解生成物により電極信号の変化をポテンシオメトリックに測定することによって、その基質の濃度を定量することも可能である。
【０００３】
例えば、尿素、特に血液中の尿素窒素（ＢＵＮ）は、肝臓のタンパク中間代謝機能及び腎臓機能を反映する重要な臨床検査項目である為、それの測定用酵素センサーの開発は多数報告されている。尿素の測定には一般的に、水解酵素であるウレアーゼが利用されている。その水解反応の反応式を次に示す：
CO(NH2)2  ＋ H2O  → CO2  ＋ 2NH3
反応は、二酸化炭素（CO2 ）及びアンモニア（NH3 ）を生成する為、従来技術ではPCO2電極、即ちCO2 ガス透過膜を持つｐＨ電極（例えば、G.G.Guilbault ら、Anal.Chem.,44,2161(1972)) 、又はNH3 電極、即ちNH3 ガス透過膜を持つｐＨ電極（例えば、米国特許明細書第3，926，734 号参照）を用いて測定する。又は、水溶液中NH3 はアンモニアムイオン（NH4 ＋）選択性電極（例えば、米国特許明細書第4，476，005 号参照）、電気伝導度変化（例えば、米国明細書特許第5，698，083 号参照）又はｐＨ変化（例えば、文献R.M.Ianniello ら、Anal.Chim.Acta,146,249  (1983)）による測定も研究されている。
【０００４】
このように、ＢＵＮセンサーはバイオセンサーの一種で、この種のセンサーは一般に、測定すべき血液中の尿素窒素とウレアーゼという酵素との間で生じる酵素反応により生成するアンモニウムイオンや重炭酸イオンのような生成物或いはこのようなイオンの生成に伴うｐＨの変化を検出するように構成され、検出した値から尿素窒素の濃度に換算する。
【０００５】
ところで、このようなＢＵＮセンサーはその使用環境からして取扱い者の安全性の観点で使用後は破棄され、つまり使い捨てのものが一般的となってきている。そのため、測定の信頼性を高く維持しながらセンサー自体のコストをできるだけ低く抑えることが要求される。しかしながら、従来のこの種のセンサーの製造には普通、電子回路製造技術、特にエッチングやイオンプレーティングのような薄膜形成技術が使用されており、高価で大規模な製造装置が必要であり、製造工程が複雑となり、製造コストを十分に低減させることができていないのが実情である。
またこの種のセンサーは、センサーの校正及び測定にかかる時間もできるだけ短いことが望まれている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
従来の尿素測定センサーにおける問題点について説明する。
PCO2電極及びNH3 電極による尿素測定では、ガス選択透過膜を使う為、ｐＨ電極とガス透過膜の間に支持電解質液を保持させておく必要がある。これは使い捨てセンサーにとっては製造上の欠点となる。
また、溶液中長時間保存しておくと、ｐＨ電極の性能が低下し、溶液の蒸発の問題もあり、センサーの保存寿命が限定される。
また、アンモニアムイオン選択電極による測定方法では、その電極自体の選択性が悪い（他のイオンに対しても反応する）為、実用的ではない。従来のｐＨ測定に基づく尿素センサーでは、ガラスのｐＨ電極とウレアーゼ酵素とを組み合わせたものである為、同様に支持電解質が必要であり、小型化や製造の容易性の面で使い捨てセンサーとして利用するのは困難である。電気伝導度による測定では、検体試料のイオン強度が高いため、酵素反応によるイオン強度の変化量が少なく、実用的には問題が多い。
従って、安価に製造ができ、構造が簡単、さらに支持電解質溶液の不要なドライタイプの使い捨てのポテンシオメトリック型酵素センサーの提供が期待されている。
【０００７】
そこで、本発明は、上記のような従来技術に伴う問題点を解決して、低価格でしかも測定時間が短くかつ測定精度が高く、ｐＨ変化をｐＨ電極で検出する使い捨てＢＵＮセンサー及びその製造法を提供することを目的としている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記の目的を達成するために、本発明の第１の発明により提供される使い捨てＢＵＮセンサーは、絶縁性フィルムの上に、スクリーン印刷法により、電極層及び電極層の周囲を囲む絶縁層を順次印刷し、カーボン層上に有機系合成物質を滴下乾燥することにより形成されたｐＨ変化を検出するｐＨ電極と、前記ｐＨ電極上に、ウレアーゼ、水膨潤性高分子材料、界面活性剤及び緩衝物質の混合物の水溶液を滴下乾燥することにより形成された酵素層と、酵素層の表面を覆って、酵素層の酵素の流失を防止し、尿素の拡散を制限し、測定液中の夾雑物質（例えば、全血中の血球、蛋白質）を除去する働きをする高分子物質の溶液を滴下乾燥することにより形成されたフィルター層とを備えていることを特徴としている。
ｐＨ電極は好ましくはトリドデシルアミンのような水素イオンに反応する物質から成り得る。
酵素層は、測定時に測定液が速やかに浸透して酵素が溶けて反応が起こり易く、また酵素層中の界面活性剤は、水分の吸収を助けると共に測定に誤差を生じさせ易い気泡の発生を抑える働きをする。
【０００９】
、本発明の第１の発明により提供される使い捨てＢＵＮセンサーでは、スクリーン印刷を利用した低コスト、保存性良好で、構造が簡単なコーテッドワイヤタイプのｐＨ液膜電極を採用した。このｐＨ液膜電極は一定の感度があり、しかも室温保存で半年以上の保存寿命を持つ。また、直接このｐＨ液膜電極の表面に酵素反応層を設けることにより、検体試料を注入する際、検体中水分及びイオンは、酵素反応層を通してｐＨ電極の表面に達し、ｐＨ電極が働くようになる。同時に、測定基質も酵素層に拡散し、その中に固定されている酵素（及び補酵素）と反応し、その反応によるｐＨの変化をその下に設けたｐＨ電極でセンシングする。従って、本発明では、ｐＨ電極が働く為の支持電解質溶液の構成は不要である。それに一定な感度を持つコーテッドワイヤ型ｐＨ液膜電極を使用する為、従来のポテンシオメトリック型酵素センサーの検量線校正など面倒な手順も省略できる。従って、乾燥状態で保存ができ、安価、安定、使い捨てタイプのポテンシオメトリック型酵素センサーが提供できるようになる。
【００１０】
また、本発明の第２の発明による使い捨てＢＵＮセンサーの製造法は、絶縁性フィルムの上に、スクリーン印刷法により、電極層及び電極層の周囲を囲む絶縁層を順次印刷する工程と、カーボン層上に有機系合成物質を滴下乾燥して、ｐＨ変化を検出するｐＨ電極を形成する工程と、このｐＨ電極上に、ウレアーゼ、水膨潤性高分子材料、界面活性剤及び緩衝物質の混合物の水溶液を滴下乾燥して、酵素層を形成する工程と、酵素層の表面を覆って、酵素層のウレアーゼの流失を防止し、尿素の拡散を制限し、測定液中の夾雑物質を除去する働きをする高分子物質の溶液を滴下乾燥して、フィルター層を形成する工程とから成ることを特徴としている。
【００１１】
好ましくは、酵素層は、酵素（ウレアーゼ）、水膨潤性高分子材料０．０１〜２ｍｇ、界面活性剤０〜１μｌ及び緩衝物質５０μｌから成る水溶液を所定量滴下乾燥して形成され得る。ｐＨ電極を形成する有機系合成物質は、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）を基材としたｐＨ感応物質から成り得る。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下、添付図面を参照して本発明の実施の形態について説明する。図１には、本発明の一実施の形態による使い捨てＢＵＮセンサーを示す。図示ＢＵＮセンサーにおいて、１は基体を成すポリエチレンフィルムで、その上に銀ペースト層２、カーボン層３、及び絶縁体層４が設けられ、これらの層はスクリーン印刷法により形成される。カーボン層３上に絶縁体層４で画定された領域には、ｐＨ変化を検出するｐＨ電極５が設けられ、このｐＨ電極５はトリドデシルアミンのような水素イオンに反応する有機系合成物質のＰＶＣ膜から成る。ｐＨ電極５上には、酵素、水膨潤性高分子材料、界面活性剤及び緩衝物質等の混合物から成る酵素層６が設けられ、この酵素層６の径は図示したようにｐＨ電極５の径より小さく形成されている。酵素層６中の水膨潤性高分子材料は水分を吸収して保持する働きをし、また緩衝物質としては、Ｎａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４、ＣＨ３ＣＯＯＮａ−ＨＣｌ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌなどが使用され得る。酵素層６上には、この酵素層６の上面及び側周面を覆って、酵素層６の酵素の流失を防止し、尿素及び窒素の拡散を制限し、測定液中の夾雑物質（血球）を除去するフィルター層７が設けられている。フィルター層の材料としてはNafion、ポリビニルブチラールのような高分子物質が使用され得る。
【００１４】
図２には、本発明の使い捨てＢＵＮセンサーの製造法の好ましい実施の形態を示す。
図２のＡに示す第１の工程では、ポリエチレンフィルム１の上面に銀ペーストがスクリーン印刷法により印刷され、銀ペーストの薄膜層２が形成される。
図２のＢに示す第２の工程では、銀ペーストの薄膜層２の外表面を覆うようにカーボン層３がスクリーン印刷法により印刷される。
図２のＣに示す第３の工程において、カーボン層３を囲んで絶縁体から成るレジスト層４がスクリーン印刷法により形成され、このレジスト層４は図示したようにカーボン層３上にｐＨ電極５の形成領域を画定する。
【００１５】
図２のＤに示す第４の工程において、レジスト層４で画定されたカーボン層３上の凹部に、ポリ塩化ビニルを基材としたトリドデシルアミンのようなｐＨ感応物質の水溶液が滴下され、そして乾燥される。こうしてカーボン層３上にｐＨ電極５が形成される。図２のＥに示す第５の工程において、ｐＨ電極５上に、酵素（ウレアーゼ）と、水膨潤性高分子材料０．０１〜２ｍｇと、界面活性剤０〜１μｌと緩衝物質５０μｌとからなる水溶液が滴下され、そして予定の乾燥速度で乾燥される。こうしてｐＨ電極５上に、酵素層６が形成され、酵素層６の周縁部は図示しようにレジスト層４上にのびている。
【００１６】
最後の工程において、酵素層６上に、ポリビニルブチラールのような高分子物質の水溶液が滴下され、そして予定の乾燥速度で乾燥される。こうして酵素層６を覆うようにフィルター層７が形成される（図１参照）。なお、図示実施の形態においては酵素層６は、酵素反応によって生じるｐＨ変化を測定するため初期ｐＨ値を７．４に維持するように構成されている。
【００１７】
【実施例】
次に、本発明の尿素センサーの実施例について具体的に説明する。
実施例１
生体試料中尿素を測定する為の尿素センサーを下記のように作製した。
（１）ｐＨ電極基板の作製。
先ず、図３に示したように、絶縁性基板１０上に銀の指示電極１１及び参照電極１２の下地電極を内円及び外環形状に設ける。次に、内円銀の上に銀が露出しないように、また、外環の銀と繋がらないように導電性カーボンペーストを印刷し乾燥してカーボン層１３を形成した。更に基板の上にレジストを内円カーボン層１３の露出直径が1.0mm Φになるように、また参照電極１２を被せないように印刷し乾燥してレジスト層１４を形成し、電極基板を作製した。
【００１８】
（２）コーテッドワイヤ型ｐＨ液膜の構成。
上記の電極基板の銀参照電極を0.7M塩化カリウム中に、1mA の定電流で10秒間塩化銀形成処理を行い、洗浄、乾燥して参照電極１２を完成させた。また、指示電極カーボン層１３の上に規定組成で調製したｐＨ液膜溶液を一定容量滴下し、室温で乾燥させて、コーテッドワイヤｐＨ液膜電極１５を作製した。
【００１９】
（３）酵素反応層の構成。
先ず、酵素−ポリマー溶液を次のように調製した、ウレアーゼ（東洋紡（株）製、120 IU/mg ）10mg、PVA （和光純薬（株）製、ポリビニルアルコール、n = 500 ）1.0g をりん酸塩緩衝液100ml（0.02M） に溶解し均一に混合した。
次に、上記の溶液0.5ul を上記のｐＨ液膜指示電極１５の上に滴下し、室温で乾燥して酵素反応層１６を形成した。こうして尿素酵素センサーを作製した。
上記の尿素センサーの酵素反応層１６の表面に、更に高分子膜でコートした。この高分子膜は、例えばNafion溶液（5%、Wt% in water:n-propanol = 1:1 ）0.5 ulを上記の酵素反応層の上に滴下し、室温で乾燥して完成した。
【００２０】
試験例１
次に、実施例１に記載した尿素センサーを本発明の例として、試験例にてセンサー性能をテストした。
（１）尿素標準測定溶液の調製
まず、尿素標準水溶液を次のように調製する。80℃で乾燥した尿素（和光純薬（株）製、生化学用品）を50mMりん酸塩緩衝液（ｐＨ 7.38 ）に溶かし尿素の終濃度が40mMになるように調製した。
次に、上記の40mMの尿素溶液を50mMのりん酸塩緩衝液（ｐＨ 7.38 ）で希釈して尿素の終濃度が0mM から40mMまでの約15段階の濃度になるように調製した。
【００２１】
（２）ポテンシオメトリー法による尿素応答
先ず、尿素酵素センサーの作用極端子１７及び参照極端子１８をDigital Electrometer（（株）アドバンテスト製）の電位差測定端子に接続した。次ぎにそのセンサーを50mMのりん酸塩緩衝液（ｐＨ 7.38 、以下blank という）に浸けて、センサーの電位応答をGPIBコネクタを介してコンピュータに120秒間取り込んだ。次に、そのセンサーを上記の溶液から取り出し、尿素標準測定溶液の尿素濃度が2mM の溶液に浸け、60秒 間の電位応答を測定した。更に新しいセンサーを付け替え、新しい濃度の尿素溶液を同じ様な測定で繰り返した。尿素濃度が0 〜40mMまでの約15段階での測定を全て行った。  測定結果は、図４及び図５に示した。
【００２２】
図４は、尿素酵素センサーのblank 及び尿素に対する応答曲線である。尿素とウレアーゼの酵素反応により溶液が、アルカリ性になるため、ｐＨ液膜電極の出力電位は低くなる。この電位変化（絶対値）は、尿素濃度の上昇によって大きくなる傾向がある。
図５には、図４に示した様な応答曲線からデータに基づき、尿素濃度とセンサーの電位変化との対数関係を示す。この結果、本発明の尿素センサーは、尿素の濃度が5mM 前後で、感度は約55mV/Decade であった。また、1 〜20mMの範囲では直線関係があり、充分なダイナミックレンジを示した。
【００２３】
（３）尿素応答のｐＨ依存性
本発明では、ｐＨ液膜電極の上に載せた酵素反応層が、測定液の水素イオンの拡散に対してブロックしない為、測定液中の水素イオンが、酵素反応層を通してｐＨ電極へ拡散し、ｐＨ電極の応答に直接影響を与える。ここでサンプルのｐＨから尿素測定への影響を下記のように確認した。
先ず、ｐＨ 6.2〜ｐＨ 7.8のりん酸塩緩衝液（50mM）を数種類作った。その中に尿素を一定量溶かして終濃度が8mM になるように調製した。次に、この尿素溶液を（２）に記載したような手順で、ポテンシオメトリーによる測定を行った。測定結果は図６に示した。その結果、尿素の電位応答は、測定液のｐＨに大きく依存することが分かった。つまり。確認したｐＨ範囲（6.2 〜7.8 ）ではｐＨの上昇に伴い、センサーの電位変化（絶対値）も上昇した。
図６に示したようなｐＨ依存性を解決する為には、測定の時、サンプルのｐＨも同時に測定し、その測定値に基づき、尿素の測定値に対して補正が必要である。
【００２４】
生体サンプル、例えば、血液、尿等中のクレアラチン、クレアニチン等及びその他酵素反応により、溶液中水素イオンの濃度が変わるものであれば、本発明を利用できる。例えば、グルコースディヒトロギナーゼ（Glucose Dehydrogenase ）及び補酵素のNAD(P)＋を利用して、グルコースとの反応から水素イオンを生成する為、本発明によりグルコースの測定もできる。
【００２５】
【発明の効果】
以上説明してきたように、本発明による使い捨てＢＵＮセンサーにおいては、絶縁性フィルムの上に、スクリーン印刷法により、電極層及び電極層の周囲を囲む絶縁層を順次印刷し、カーボン層上に有機系合成物質を滴下乾燥することにより形成されたｐＨ変化を検出するｐＨ電極と、前記ｐＨ電極上に、ウレアーゼ、水膨潤性高分子材料、界面活性剤及び緩衝物質の混合物の水溶液を滴下乾燥することにより形成された酵素層と、酵素層の表面を覆って、酵素層の酵素の流失を防止し、尿素の拡散を制限し、測定液中の夾雑物質（例えば、全血中の血球、蛋白質）を除去する働きをする高分子物質の溶液を滴下乾燥することにより形成されたフィルター層とを備えているので、使い捨てセンサーとして重要な製造コストを大幅に低減でき、製品が安価になると共に、測定時に校正液がフィルター層に速かに浸透し、酵素層の酵素が溶けて反応し易い状態となり、しかも酵素層に含まれた緩衝物質の働きで酵素層に気泡が生じることがなく、従って、尿素及び窒素の濃度を精度良く測定することができるようになる。
【００２６】
また、本発明による使い捨てＢＵＮセンサーの製造法によれば、ポリエチレンフィルムの上にスクリーン印刷法により電極層を形成し、滴下乾燥工程でｐＨ電極と酵素層とフィルター層とをそれぞれ形成することで、ＢＵＮセンサーを製造するので、製造コストを大幅に低減でき、使い捨てセンサーとして安価な製品を提供できるようになる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明の一実施の形態による使い捨てＢＵＮセンサーを示す概略断面図。
【図２】  図１に示すＢＵＮセンサーの製造法の各工程態をを示す概略断面図。
【図３】  本発明による実施例の尿素酵素センサーの概略図。
【図４】  ポテンシオメトリーで測定した尿素酵素センサーの尿素標準溶液に対する電位応答曲線図であり、測定した尿素溶液の尿素濃度は0 、2 、5 、10、20、30mMである。
【図５】  尿素濃度とセンサーの電位応答の対数関係を示す図。
【図６】  本発明の尿素酵素センサーのｐＨ依存性を示す図。
【符号の説明】
１：ポリエチレンフィルム
２：銀ペーストの薄膜層（電極層）
３：カーボン層
４：レジスト層
５：ＰＨ電極
６：酵素層
７：フィルター層
１０：絶縁性基板
１１：銀の指示電極
１２：参照電極
１３：カーボン層
１４：レジスト層
１５： ｐＨ液膜電極
１６：酵素反応層
【図１】
0004404433.tif 000002
【図２】
0004404433.tif 000003
【図３】
0004404433.tif 000004
【図４】
0004404433.tif 000005
【図５】
0004404433.tif 000006
【図６】
0004404433.tif 000007