(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
OSF-2遺伝子の発現又はOSF-2タンパク質の産生を抑制する物質を有効成分とする心不全の予防又は治療剤であって、前記有効物質がアンチセンスヌクレオチドであり、配列番号５、１９、２０又は２１に記載の塩基配列において連続した１２個以上の塩基配列と相補的なヌクレオチドを含むものである、前記予防又は治療剤。
【請求項２】
アンチセンスヌクレオチドが、配列番号１２乃至１６からなる群から選択された少なくともひとつの配列を含むものである、請求項１記載の予防又は治療剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、心不全の予防又は治療剤、当該予防又は治療剤の有効成分に係る物質のスクリーニング方法、心不全診断剤もしくは診断キット及び非ヒト形質転換動物等に関する。
背景技術
慢性心不全は、心筋収縮力の低下により、心臓が各臓器へ十分量の血液を拍出できない状態に陥る疾患であり、その治療には従来心筋収縮力を増加させるジギタリス製剤やキサンチン製剤等の強心剤が使用されてきた。しかし、これらの薬剤は心筋エネルギーの過剰消費により、長期投与においては生命予後を悪化させることが明らかにされている。最近では、心不全状態で亢進している交感神経系やレニンアンジオテンシン系による心臓への過剰な負荷を軽減させるβ遮断薬やＡＣＥ阻害薬による治療が主流になってきている。しかし、依然として心不全患者の長期生命予後は不良であり、新しいメカニズムに基づく心不全治療薬の開発が望まれている。
従って、本発明における課題は、既存のメカニズムとは異なる新たな心不全の予防剤又は治療剤等の提供に関するものである。更に詳しくは、本発明は、ＯＳＦ−２遺伝子又はタンパク質に起因する心不全の増悪化を抑制することによる心不全の予防剤又は治療剤、当該薬剤の有効成分に係る物質のスクリーニング方法、ＯＳＦ−２遺伝子の発現や変異又はＯＳＦ−２タンパク質の産生をモニターすることからなる心不全の有用な診断方法及び心不全診断に用いる診断剤もしくは診断キット及びＯＳＦ−２遺伝子を強制的に発現しうる非ヒト形質転換動物等の提供を目的とする。
発明の開示
本発明者らは、心不全病態の進行に伴って、心臓における各種の遺伝子発現やタンパク質の発現変化がおこり、これらの変化が心不全病態と密接に関連しているとの予想のもと、適当な心不全モデルを用いて、心不全病態の進行とともに発現量の変化する遺伝子を検索した。その結果、骨芽細胞で特異的に発現する遺伝子として知られているＯＳＦ−２遺伝子が、心不全の進行とともに発現上昇することを見出した。そして、更なる検討の結果、当該遺伝子またはタンパク質が心不全の増悪化に影響を与えるものであることを見出し、その発現や機能を抑制する薬剤が新たな心不全治療剤になることから本発明を完成するに至った。
心不全治療薬の開発においては、各種の病態モデルが使われているが、特に、初期スクリーニングにおいては、モデル作製の簡便さ、解析のしやすさなどからラットのモデルが使用されることが多い。逆に、ラットモデルは、それぞれの制限はあるものの、ヒトの病態を反映するモデルとして認知されている。
心不全病態モデルラットとしては大動脈狭窄ラット、動静脈シャントラット、冠動脈結紮ラット、自然発症高血圧ラット（ＳＨＲ）、ダール食塩感受性ラット等が知られている。ダールラットはＳｐａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系ラットにおいて、８％の高食塩含有食を負荷し、継代交配を行うことにより、３代で高血圧易発性の食塩感受性ラット（Ｄａｈｌ−Ｓ）と、高血圧を生じない食塩抵抗性ラット（Ｄａｈｌ−Ｒ）とに分離されたものである。Ｄａｈｌ−Ｓラットについては京都大学の木原らの研究により、６週齢より８％の高食塩含有食を負荷することにより、代償性左室肥大を呈した後、収縮不全を伴う左室拡大、すなわち非代償性心不全へと移行し、肺鬱血により死亡することが示されている（Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｕｏｌ．，２６７，Ｈ２４７１−２４８２（１９９４））。本発明者等はモデルの作製に特殊な手法を必要とせず、短期間で心不全を発症させることができ、また、一個体において代償肥大期と非代償心不全期に明瞭に区分でき、ヒトの高血圧性心不全と発症過程が類似していることから、心不全病態モデルとしてダール食塩感受性ラットを選択した。
ある病態において発現が変化している遺伝子を検出する方法としては、サブトラクション法、ディッファレンシャル・ディスプレイ法、ドットブロット法、マイクロアレイ法などが知られている。本発明においてはサブトラクション法を用いて、心肥大期から心不全期に移行する過程で発現が変化する遺伝子を検出することに成功した。その一つは、骨芽細胞特異的因子として報告されているマウスＯＳＦ−２遺伝子と高い相同性を有することが明らかとなった新規なラットＯＳＦ−２遺伝子であった。
ＯＳＦ−２遺伝子は、マウス骨芽細胞株ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞に特異的に発現している遺伝子として分離同定された遺伝子であり（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２９４，２７１−２７８，１９９３、特開平５−２６８９８２）、骨芽細胞において、接着促進活性が報告されている（Ｊ．Ｂｏｎｅ．Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．１４，１２３９−１２４９，１９９９）。また、ウサギ腹部大動脈傷害モデルにおけるディッファレンシャル・ディスプレイ法による解析においてＯＳＦ−２遺伝子の発現が増加していることが報告されている（Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．４３，９−１３，１９９８）。さらに、最近、マウスを用いた実験において心肥大時にＯＳＦ−２を含む３０以上の遺伝子の発現が変化していること（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．，３２，８０５−８１５，２０００）、また、ラット心筋梗塞モデルにおいてＯＳＦ−２を含む２００以上の遺伝子の発現が変化していること（Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．，８６，９３９−９４５，２０００）が報告された。
しかしながら、心肥大又は心筋梗塞後、心不全病態への進行とともにさらなる発現誘導が起こることは、これまで知られておらず、特にＯＳＦ−２遺伝子又はＯＳＦ−２タンパク質が心不全病態の進行と共に病態の進行を促進する因子として働くのか又は病態の進行を抑制する因子として働くのかは全く知られていなかった。
そこで、心臓におけるこの遺伝子の発現と心不全病態の関わりを知ることにより新たな心不全治療剤の開発が可能になると考え、更なる検討を加えることにより本発明を完成させた。
まず、ＯＳＦ−２遺伝子の変化がダール心不全モデルラット特有の現象でないことを確認するため、大動脈狭窄ラット、動静脈シャントラット、自然発症高血圧ラット（ＳＨＲ）を用いて心不全病態の進行に伴うＯＳＦ−２遺伝子の発現を検討した。その結果、検討したすべてのモデルで同様の遺伝子発現の亢進が見られ、心不全病態における普遍的現象である可能性が強く示唆された。
次に、ＯＳＦ−２遺伝子が心臓に対してどのような作用を示すのかを検討するため、ラット心臓への遺伝子導入を行った。まず、ラットＯＳＦ−２遺伝子はこれまで知られていないので、新たに全長遺伝子を単離し、適当な発現ベクターを構築した後、ＯＳＦ−２遺伝子をラット心臓へ導入した。心エコーの測定および血行動態の測定を行った結果、ＯＳＦ−２遺伝子導入ラットでは左室壁の非薄化、左室内腔の拡大および心機能の低下が観察され、拡張型心筋症様の病態が誘導されることが判り、ＯＳＦ−２遺伝子又はＯＳＦ−２タンパク質が心不全の増悪化因子であることが明らかとなった。このような解析は、ラット以外の動物では難しく、ラット遺伝子を単離した意義は大きい。さらに、ＯＳＦ−２遺伝子の発現を抑制するアンチセンスヌクレオチドを心不全モデルであるダールラット心臓へ導入することにより、心不全による死亡を遅延させることが判明した。此に拠り、心不全病態の進行とともに起こるＯＳＦ−２遺伝子の発現又はＯＳＦ−２タンパク質の産生が心不全を増悪化していることが判明し、ＯＳＦ−２遺伝子の発現抑制又はＯＳＦ−２タンパク質の産生抑制若しくは機能抑制の作用を有する物質を有効成分とする薬剤が心不全の増悪化を抑制することが十分に示唆され本発明に至った。
即ち、本発明としては以下の事項を挙げることができる。
（１）ＯＳＦ−２遺伝子の発現、ＯＳＦ−２タンパク質の産生、ＯＳＦ−２タンパク質の機能又はＯＳＦ−２タンパク質の標的分子の機能を抑制する物質を有効成分とする心不全の予防剤又は治療剤。
（２）ＯＳＦ−２遺伝子の発現を抑制する物質を有効成分とする心不全の予防剤又は治療剤。
（３）ＯＳＦ−２タンパク質の産生を抑制する物質を有効成分とする心不全の予防剤又は治療剤。
（４）ＯＳＦ−２遺伝子の発現又はＯＳＦ−２タンパク質の産生を抑制する物質がアンチセンスヌクレオチドである上記（１）乃至（３）記載の心不全の予防剤又は治療剤。
（５）アンチセンスヌクレオチドが、配列番号５、１９、２０又は２１に記載の塩基配列において連続した１２個以上の塩基配列と相補的なヌクレオチドを含むものである上記（４）記載の心不全の予防剤又は治療剤。
（６）アンチセンスヌクレオチドが、配列番号１２乃至１６からなる群から選択された少なくともひとつの配列を含むものである上記（５）記載の心不全の予防剤又は治療剤。
（７）ＯＳＦ−２遺伝子の発現を抑制する物質が、以下の一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその生物学的に許容される塩である上記（１）又は（２）記載の心不全の予防剤又は治療剤。
0004534092.tif 000002
（式中、Ｒ１は水素原子、分岐していても良いアルキル基またはアルキル部分が分岐していても良いアラルキル基を示し、Ｒ２は水素原子、ハロゲン原子又はアミノ基を示し、Ｒ３，Ｒ４は独立して水素原子またはアシル基を示すか、あるいはＲ３，Ｒ４が一緒になってイソプロピリデン基を示し、ｎは０，１，２または３の整数を示す。）
（８）ＯＳＦ−２遺伝子の発現を抑制する物質が、上記一般式（Ｉ）において、Ｒ３及びＲ４がともに水素原子である化合物である上記（７）記載の心不全の予防剤又は治療剤。
（９）ＯＳＦ−２遺伝子の発現を抑制する物質が、上記一般式（Ｉ）において、Ｒ１、Ｒ３及びＲ４が水素原子、Ｒ２が塩素原子、ｎが３である化合物である上記（７）記載の心不全の予防剤又は治療剤。
（１０）ＯＳＦ−２遺伝子の発現を抑制する物質が、上記一般式（１）において、Ｒ１が（２−メチルフェニル）メチル基、Ｒ３及びＲ４が水素原子、ｎが０である化合物である上記（７）記載の心不全の予防剤又は治療剤。
（１１）ＯＳＦ−２タンパク質の機能を抑制する物質を有効成分とする上記（１）記載の心不全の予防剤又は治療剤。
（１２）ＯＳＦ−２タンパク質の標的分子の機能を抑制する物質を有効成分とする上記（１）記載の心不全の予防剤又は治療剤。
（１３）ＯＳＦ−２タンパク質の機能又はＯＳＦ−２タンパク質の標的分子の機能を抑制する物質が、ＯＳＦ−２タンパク質又はＯＳＦ−２タンパク質の標的分子に対する抗体である上記（１１）又は（１２）記載の心不全の予防剤又は治療剤。
（１４）合成若しくは遺伝子組換え技術により得られた物質、天然由来の物質又はそれらの誘導体である物質を、（１）ＯＳＦ−２遺伝子の発現制御領域及びＯＳＦ−２遺伝子若しくはレポーター遺伝子を有する細胞若しくは試験管内発現系、又は（２）ＯＳＦ−２タンパク質若しくはＯＳＦ−２タンパク質の標的分子、と接触させ、ＯＳＦ−２遺伝子若しくはレポーター遺伝子の発現量又はＯＳＦ−２タンパク質若しくはＯＳＦ−２タンパク質の標的分子の量を検出することを含む、心不全の予防又は治療効果を有する物質のスクリーニング方法。
（１５）合成若しくは遺伝子組換え技術により得られた物質、天然由来の物質又はそれらの誘導体である物質を、ＯＳＦ−２遺伝子の発現制御領域及びＯＳＦ−２遺伝子を有する細胞と接触させ、ＯＳＦ−２遺伝子の発現量を検出する、ことを含む上記（１４）記載の方法。
（１６）ＯＳＦ−２遺伝子の発現制御領域をレポーター遺伝子の翻訳領域の上流及び／又は下流に連結した発現ベクターを構築後、適当な宿主細胞に導入して培養し、当該培養細胞に合成若しくは遺伝子組換え技術により得られた物質、天然由来の物質又はそれらの誘導体である物質を添加し、一定時間後にレポーター遺伝子の発現量又はレポータータンパク質の量を検出する、ことを含む上記（１４）記載の方法。
（１７）合成若しくは遺伝子組換え技術により得られた物質、天然由来の物質又はそれらの誘導体である物質をＯＳＦ−２タンパク質又はＯＳＦ−２タンパク質の標的分子と接触させ、結合した又は結合しなかったＯＳＦ−２タンパク質の標的分子又はＯＳＦ−２タンパク質の量を検出する、ことを含む上記（１４）記載の物質のスクリーニング方法。
（１８）ＯＳＦ−２タンパク質又はＯＳＦ−２タンパク質の標的分子を支持体に固定化し、当該固定化したＯＳＦ−２タンパク質又はＯＳＦ−２タンパク質の標的分子に、合成若しくは遺伝子組換え技術により得られた物質、天然由来の物質又はそれらの誘導体である物質とＯＳＦ−２タンパク質の標的分子又はＯＳＦ−２タンパク質を添加し、結合した又は結合しなかったＯＳＦ−２タンパク質の標的分子又はＯＳＦ−２タンパク質の量を検出する、ことを含む上記（１７）記載の方法。
（１９）生体組織及び／又は体液を採取し、当該組織中のＯＳＦ−２遺伝子の発現量を測定すること、又はＯＳＦ−２遺伝子若しくは当該制御領域に係る変異を測定することを含む心不全の診断方法。
（２０）生体組織及び／又は体液を採取し、当該体液中のＯＳＦ−２タンパク質又は当該断片を測定することを含む心不全の診断方法。
（２１）ＯＳＦ−２遺伝子の発現量又はＯＳＦ−２タンパク質の産生量を測定する手段を含む心不全の診断剤又は診断キット。
（２２）以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子：
（ａ）配列番号６のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号６のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＯＳＦ−２タンパク質活性を有するタンパク質。
（２３）以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子：
（ａ）配列番号５の塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号５の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＯＳＦ−２タンパク質活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（２４）以下の（ａ）又は（ｂ）の組換えタンパク質：
（ａ）配列番号６のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号６のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＯＳＦ−２タンパク質活性を有するタンパク質。
（２５）ＯＳＦ−２遺伝子を過剰発現し、心不全病態モデルとして使用できる非ヒト形質転換動物。
（２６）上記（２５）記載の非ヒト形質転換動物を用いた心不全の予防剤又は治療剤の有効成分となりうる物質の評価方法又はスクリーニング方法。
（２７）上記（１４）乃至（１８）又は（２６）記載の方法により得られうる物質。
（２８）上記（２７）記載の物質を有効成分とする心不全の予防剤又は治療剤。
（２９）上記（１）乃至（１３）又は（２７）記載の物質を投与することを含む心不全の治療方法。
（３０）ＯＳＦ−２遺伝子のアンチセンスヌクレオチドを直接導入すること又は遺伝子治療に適したベクター（例えば、アデノウイルス由来ベクター）もしくはリポソームに組み込んで導入することを含む上記（２９）記載の心不全の治療方法。
（３１）心不全の予防剤又は治療剤の製造のための上記（１）乃至（１３）又は（２７）記載の物質の使用。
発明を実施するための最良の形態
本発明で心不全の予防剤又は治療剤の有効成分として使用できる物質には以下の（１）〜（３）に挙げるものを使用できる。
（１）ＯＳＦ−２遺伝子の発現を抑制する物質
ＯＳＦ−２遺伝子の発現を抑制する物質は、合成若しくは遺伝子組換え技術により得られた化合物又は天然由来の化合物並びにそれらの誘導体のいずれでもよいが、そのような物質としては、例えばＯＳＦ−２遺伝子のプロモーターやエンハンサー領域に作用しＯＳＦ−２遺伝子のｍＲＮＡへの転写を抑制する作用を持つ物質（例えば、アンチセンスヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ホスホロチオエート型等の修飾ヌクレオチド及びＰＮＡ（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）等を含む））、又は細胞中の何らかの因子（転写因子等）を介して同様の作用を示す物質（例えば、転写因子やｃｏ−ａｃｔｉｖａｔｏｒに結合し、ＤＮＡや他の転写因子、ｃｏ−ａｃｔｉｖａｔｏｒへの結合を阻害する物質等）が挙げられる。
ここでアンチセンスヌクレオチドというときの「ヌクレオチド」の語は、天然に存在する塩基および本来のホスホジエステル結合によって結合した糖部分から生成されたヌクレオチドおよびその類似体を意味する。したがって、この用語が含む第１の群は、天然に存在する種または天然に存在するサブユニットまたはそれらの同族体から生成された合成種である。また、サブユニットとは隣接するサブユニットに対してホスホジエステル結合または他の結合によって結合した塩基−糖の組み合わせをいう。またヌクレオチドの第２の群はその類似体であり、これはヌクレオチドと同様に機能するが、天然に存在していない部分を有する残基を意味する。これらには、安定性を増加するためにリン酸基、糖部分、３’，５’末端に化学修飾を施したヌクレオチドを含む。例えば、ヌクレオチド間のホスホジエステル基の酸素原子の１つを硫黄に置換したホスホロチオエート、−ＣＨ３に置換したメチルホスホネートなどが挙げられる。さらに、ヌクレオチド類似体としては、修飾された塩基形態、すなわち天然に通常見いだされるもの以外のプリンおよびピリミジンを含む種を用いてもよい。
本発明で使用する好ましいアンチセンスヌクレオチドは、配列番号５、１９、２０又は２１に記載の塩基配列において連続した１２個以上の塩基配列と相補的なヌクレオチド、好ましくは連続した１６個以上の塩基配列と相補的なヌクレオチド、より好ましくは連続した１８個以上の塩基配列と相補的なヌクレオチド、を含むものである。特に好ましいアンチセンスヌクレオチドは、配列番号１２乃至１６からなる群から選択された少なくともひとつの配列を有する。
さらに、本発明においてはアンチセンスヌクレオチドに代えて、ペプチド核酸（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．，４，３７３−３７８，１９９４）を用いることもできる。
また、ＯＳＦ−２遺伝子の発現を抑制する化合物の具体例としては、以下の一般式（Ｉ）で表わされる化合物又はその生物学的に許容される塩が挙げられる。
0004534092.tif 000003
上記式中、Ｒ１は水素原子、分岐していても良いアルキル基またはアルキル部分が分岐していても良いアラルキル基を示す。分岐していても良いアルキル基の例として、メチル基、エチル基、イソプロピル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基等が挙げられる。また、アルキル部分が分岐していても良いアラルキル基の場合は、アリール基部分はメチル基、エチル基、プロピル基などの低級アルキル基、メトキシ基、エトキシ基などの低級アルコキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基などで置換されていてもよく、代表的な例として、ベンジル基、（２−メチルフェニル）メチル基、（３−メチルフェニル）メチル基、（４−メチルフェニル）メチル基、（２−クロロフェニル）メチル基、（２−エチルフェニル）メチル基、（２−メトキシフェニル）メチル基、（２−メトキシカルボニルフェニル）メチル基、２−フェネチル基、（１−ナフチル）メチル基、（２−ナフチル）メチル基、２−（２−ナフチル）エチル基などが挙げられる。これらの中で、Ｒ１の好ましいものとして、水素原子、アルキル部分が分岐していても良いアラルキル基が挙げられ、その中でも、水素原子、（２−メチルフェニル）メチル基が特に好ましい。
Ｒ２は水素原子、ハロゲン原子又はアミノ基を示す。Ｒ２の好ましい例として、水素原子、塩素原子が挙げられる。
Ｒ３、Ｒ４は独立して水素原子またはアシル基を示すか、あるいはＲ３，Ｒ４が一緒になってイソプロピリデン基を示す。アシル基としては、アセチル基、プロピオニル基などの低級アルカノイル基が例示される。
ｎは、０，１，２，３を示し、０及び３が特に好ましい。尚、ｎが１，２，３の場合、リン酸性の水素原子の１以上がナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどのアルカリ金属またはアルカリ土類金属もしくは有機アミン類と塩を形成していても良い。
（２）ＯＳＦ−２タンパク質の産生を抑制する物質
ＯＳＦ−２タンパク質の産生を抑制する物質は、合成若しくは遺伝子組換え技術により得られた化合物又は天然由来の化合物並びにそれらの誘導体のいずれでもよいが、そのような物質としては、例えばＯＳＦ−２遺伝子のアンチセンスヌクレオチドによりＯＳＦ−２ｍＲＮＡのＯＳＦ−２タンパク質への翻訳を阻害する作用を持つ物質が挙げられる。ここでアンチセンスヌクレオチドというときの「ヌクレオチド」の語は、上記（１）に記載された「ヌクレオチド」と同意である。アンチセンスヌクレオチドとしては、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ホスホロチオエート型等の修飾ヌクレオチド又はＰＮＡ（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）等が挙げられ、ＯＳＦ−２遺伝子の構造遺伝子領域、３’−非翻訳領域、５’−非翻訳領域又はイントロン／エキソン結合部位のいずれをも標的として設計することができる。また、アンチセンス鎖の標的組織への導入方法は直接導入する方法、アンチセンスＲＮＡに転写されるように設計されたベクターを標的組織に導入する方法のどちらでも行うことができる。
また、ＯＳＦ−２  ｍＲＮＡの特定の構造を認識して切断するリボザイムも用いることができる。リボザイムとは、他のＲＮＡ分子を標的塩基配列特異的様式で切断しうる酵素活性を有する核酸分子であり、例えばハンマーヘッドまたはヘアピンのモチーフで形成することができる（Ｎａｔｕｒｅ，３２４，４２９，１９８６；Ａｎｎ．Ｒｅｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３０，２８５−２９４，１９９５；Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３８，２０２３−２０３７，１９９５）。リボザイムは、標的組織中に直接導入してもよく、脂質との複合体またはリポソームの形で導入してもよい。あるいは、リボザイムを発現するＤＮＡ又はＲＮＡベクターを標的組織に導入することができる。
（３）ＯＳＦ−２タンパク質の機能を抑制する物質、ＯＳＦ−２タンパク質の標的分子の機能を抑制する物質
本発明では、ＯＳＦ−２タンパク質の機能を抑制する物質、又はＯＳＦ−２タンパク質の標的分子の機能を抑制する物質を心不全の予防剤又は治療剤に用いることができる。ＯＳＦ−２タンパク質の標的分子とは、ＯＳＦ−２タンパク質によって、その構造もしくは活性が影響を受ける分子をいい、例えば、基質、結合相手、受容体などを含むが、これに限定されない。
ＯＳＦ−２タンパク質の機能を抑制する物質又はＯＳＦ−２タンパク質の標的分子の機能を抑制する物質は、合成若しくは遺伝子組換え技術により得られた化合物又は天然由来の化合物並びにそれらの誘導体のいずれでもよいが、そのような物質としては、例えばＯＳＦ−２タンパク質とＯＳＦ−２タンパク質が作用するＯＳＦ−２タンパク質の標的分子（例えば、受容体）の結合や細胞内でのシグナル伝達を阻害し、ＯＳＦ−２タンパク質のもつ活性を阻害する物質が挙げられる。例えば、ＯＳＦ−２タンパク質に対する抗体又はＯＳＦ−２タンパク質の標的分子に対する抗体などが挙げられる。抗体はポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよい。これらの抗体の作製方法としては、例えば、これらのタンパク質を発現細胞または組換え体の培養液などから精製し、これを適当なアジュバントとともにウサギ等に免疫し、その血清より定法に従って抗体画分を得ることができる。あるいは、マウス、ラット等を用いたモノクローナル抗体の作製、遺伝子組換技術、遺伝子組換動物等を用いたヒト型抗体や１本鎖抗体の作製なども用いることができるが、これらの記載の方法に限られるものではない。また、ＯＳＦ−２タンパク質やＯＳＦ−２タンパク質の標的分子を特異的に分解するプロテアーゼ、活性の無いＯＳＦ−２タンパク質（変異体を含む）やＯＳＦ−２標的分子のデコイ、可溶型受容体分子等も挙げられる。
上記（１）乃至（３）に係る物質がペプチドである場合、本願発明に係る薬剤を投与対象者に投与した後にその生体内においてペプチダーゼやプロテアーゼによる分解を受けない又は受けにくくするために、酵素の作用部位が修飾されたペプチド類似体も含まれる。例えば、当該類似体として、酵素の作用部位に係る一つ又はそれ以上のペプチド結合を他の共有結合の型で置き換えられたペプチド類似体や酵素の作用部位に係る一つ又はそれ以上のアミノ酸がＤ体アミノ酸であるペプチド類似体等が挙げられる。
（４）製剤
上記のような物質を有効成分として含有する製剤は、通常の製剤化の際に用いられる担体や賦形剤、その他の添加剤を用いて調製される。
本発明に係る医薬組成物の有効成分は、遊離型であっても、その医薬的に許容し得る塩であってもよい。無機酸との塩としては、例えば塩酸、硫酸、リン酸との塩が挙げられ、あるいは有機酸との塩としては、例えばギ酸、酢酸、酪酸、コハク酸、クエン酸等との酸付加塩として用いることができる。塩は、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム等の金属塩、有機塩基による塩の形態であってもよい。
有効成分は、公知の薬理学的に許容し得る担体、賦形剤、希釈剤等と混合して医薬に一般に使用されている投与方法、例えば、経口投与方法、又は静脈内投与、筋肉内投与もしくは皮下投与等の非経口投与方法によって投与するのが好ましい。本発明の医薬組成物は、例えば、有効成分を生理学的に許容される担体、香味剤、賦形剤、安定剤、希釈剤、乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤等と、適宜混和することにより製造することができ、錠剤、散剤、顆粒剤、溶液剤等としてもちいることができる。錠剤などに混和することができる添加剤としては、例えばゼラチンのような結合剤、コーンスターチのような潤滑剤等を用いることができ、また糖衣又は医溶性若しくは腸溶性物質のフィルムにより被膜してもよい。カプセルの剤型である場合には、前記の組成物に更に液状担体を含有させることができる。注射のための無菌組成物も、通常の処方を適用して製造することができる。注射用の水性液としてはブドウ糖などを含む等張液などがあげられ、ポリエチレングリコールのような適当な溶解補助剤などと併用してもよい。また、緩衝剤、安定剤、保存剤、酸化防止剤、無痛化剤などと配合してもよい。経口投与において、消化管内で有効成分が分解を受け易い場合、消化管内で分解を受けにくい製剤、例えば活性成分をリポソーム中に包容したマイクロカプセル剤として経口投与することも可能である。また、直腸、鼻腔内、舌下などの消化管以外の粘膜から吸収せしめる投与方法も可能である。この場合は座剤、点鼻スプレー、舌下錠といった形態で投与することができる。
また、遺伝子治療に用いる場合はアデノウイルス等公知の遺伝子治療に適したベクターにアンチセンスヌクレオチド等を組み込んで用いることもできる。
本発明の医薬組成物の投与量は、治療に用いられる場合、治療に有効な投与量が決められるが、当該投与量は投与対象者の年齢、体重、症状の程度及び投与経路等によって異なり、個々の場合に応じて決められる。通常、経口投与による場合、成人一日当たりの投与量は０．１〜１０００ｍｇ程度であり、これを１ないし数回に分けて投与すればよい。持続静脈内投与においては０．０１μｇ／ｋｇ／ｍｉｎ〜１．０μｇ／ｋｇ／ｍｉｎの範囲で投与することができ、０．０２５μｇ／ｋｇ／ｍｉｎ〜０．１μｇ／ｋｇ／ｍｉｎで投与するのが好ましい。
（５）スクリーニング方法
本願発明に係る予防剤又は治療剤の有効成分として用いうる物質のスクリーニング法としては、例えば以下のような方法が考えられる。
ＯＳＦ−２遺伝子の発現を抑制する物質又はＯＳＦ−２タンパク質の産生を抑制する物質のスクリーニングに用いるＯＳＦ−２遺伝子若しくはＯＳＦ−２タンパク質又はその誘導体は、何れの種由来のものであってもよく、例えばヒト、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、イヌ、サル、モルモットなどの哺乳動物由来のものが挙げられる。即ち、今回新たに見出されたラット由来の遺伝子（配列番号５）又はタンパク質（配列番号６）の他に公知の遺伝子又はタンパク質を挙げることができる。また、ＯＳＦ−２遺伝子には各種のスプライスバリアントが知られているので、本発明に係るＯＳＦ−２遺伝子及びＯＳＦ−２タンパク質はこれらのスプライスバリアント及びそこから翻訳されるタンパク質を含む。例えば、マウス由来のＯＳＦ−２遺伝子及びＯＳＦ−２タンパク質としては配列番号１９に示すものが挙げられ、ヒト由来のＯＳＦ−２遺伝子及びＯＳＦ−２タンパク質としては配列番号２０（胎盤由来）および２１（原発性腫瘍由来）に各々示すものを挙げることができる。さらに、ＯＳＦ−２遺伝子の部分配列を単独で、又は他の遺伝子とのキメラ遺伝子として用いることもできる。同様にＯＳＦ−２タンパク質の部分配列を単独で、又は他のペプチドと融合させて用いることもできる。
これらのうち、ヒトに対する予防又は治療剤の研究・開発に利用する上ではヒト由来のものを用いることが好ましい。また、動物モデル、即ち、ＯＳＦ−２遺伝子を強制的に発現し心不全症状を有する非ヒト形質転換動物を用いた研究・開発の必要性からは、マウス、ラットなどの動物由来のものを用いることが好ましい。
ＯＳＦ−２遺伝子の発現を抑制する物質又はＯＳＦ−２タンパク質の産生を抑制する物質のスクリーニングにおいては、レポーター遺伝子を利用した方法が一般に利用されている。レポーター遺伝子としては例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）、ルシフェラーゼなどが利用できる。ＯＳＦ−２遺伝子の発現を抑制する物質は、例えば、ＯＳＦ−２遺伝子の発現制御領域（プロモーター、エンハンサー領域等）をレポーター遺伝子の翻訳領域の上流及び／又は下流に連結した発現ベクターを構築し、適当な培養細胞等に導入し、その培養細胞に試料である物質（当該物質は、合成若しくは遺伝子組換え技術により得られた化合物又は天然由来の化合物並びにそれらの誘導体のいずれでもよい）を添加して、一定時間後にレポーター遺伝子の発現量、またはレポータータンパク質の量を測定することによりスクリーニングすることができる。ＯＳＦ−２遺伝子の発現制御領域（プロモーター、エンハンサー領域等）は市販の遺伝子（ｇｅｎｏｍｉｃ）ライブラリーから、ＯＳＦ−２  ｃＤＮＡの断片をプローブとしてプラークハイブリダイゼーションを行うことなどにより得ることができる。例えば、本発明の実施例においてはＣＯＳ−１細胞にＯＳＦ−２遺伝子のプロモーター領域をルシフェラーゼ遺伝子の上流につないだレポーターベクターを導入し、化合物を添加後ルシフェラーゼ活性を測定することにより、ＯＳＦ−２遺伝子の発現を抑制する化合物を見出した。本願発明に係る物質にはＯＳＦ−２遺伝子に作用する転写因子に対するおとり型核酸医薬であるデコイ（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５０，９９７−１０００，１９９０）等も含まれる。レポータータンパク質の量は酵素活性として測定することもできるし、タンパク質の発現量として抗体などを用いて測定することもできる。
また、ＯＳＦ−２タンパク質の産生を抑制するアンチセンスヌクレオチド又はリボザイム等は、ＯＳＦ−２タンパク質を発現している培養細胞にアンチセンスヌクレオチド又はリボザイム等を、例えばエレクトロポレーション法やリポソーム法などによって導入し、ＯＳＦ−２タンパク質の発現量を測定することによりスクリーニングすることができる。例えば、本発明の実施例においては、ＯＳＦ−２タンパク質を過剰発現させたＣＯＳ−１細胞においてＯＳＦ−２の翻訳開始コドンを標的とした一連のアンチセンスヌクレオチドを導入し、ＯＳＦ−２タンパク質の発現を抑制するアンチセンスヌクレオチドを見出したが、このような作用を持つアンチセンスヌクレオチドであれば、どのようなものでもよい。例えば、転写の抑制、プレｍＲＮＡのスプライシングを抑制、ｍＲＮＡの核膜通過を抑制する物質等も挙げられる。また、同様の手法はリボザイムのスクリーニングにも利用できる。用いる培養細胞としては、上記のごとく、ＯＳＦ−２遺伝子を導入した細胞を用いることもできるし、もともとＯＳＦ−２遺伝子を発現しているどのような細胞、たとえば、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２９４，２７１−２７８，１９９３）等であっても構わない。
ＯＳＦ−２タンパク質の機能を抑制する物質又はＯＳＦ−２タンパク質の標的分子の機能を抑制する物質のスクリーニング法としては、例えば、ＯＳＦ−２タンパク質の標的分子あるいはＯＳＦ−２タンパク質のいずれかをプレートなどに固定化した後に、試料である物質（当該物質は、合成化合物又は天然物由来の化合物若しくはそれらの誘導体のいずれでもよい）とＯＳＦ−２タンパク質又はその標的分子を添加し、結合した又は結合しなかったＯＳＦ−２タンパク質又はＯＳＦ−２タンパク質の標的分子の量をＥＬＩＳＡ，ＲＩＡ、蛍光標識などにより検出することで行うことができる。また、ＯＳＦ−２の標的分子を発現している細胞を用いて、標識したＯＳＦ−２と薬剤とを共存させ、一定時間後に適当な洗浄処理を行った後、ＦＡＣＳ，吸光度、発色法等により標識細胞数、標識の程度を測定することによっても、可能である。あるいは、ＯＳＦ−２の示す作用（例えば接着活性など）を指標に、培養細胞等の培養液中に、試料である物質（当該物質は、合成化合物又は天然物由来の化合物若しくはそれらの誘導体のいずれでもよい）を添加し、ＯＳＦ−２の示す作用の強さを測定することによりスクリーニングすることができる。
（６）診断方法、診断剤及び診断キット
ＯＳＦ−２遺伝子は、その発現量が心不全の悪化とともに上昇することが本発明者らにより明らかにされた。心不全患者のバイオプシーサンプルを用いて、ＯＳＦ−２遺伝子の発現量を測定することにより、心不全の増悪化の程度を知ることができる。例えば、患者のバイオプシーサンプルからＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）を用いて総ＲＮＡを抽出し、ＤＮａｓｅ処理を行った後に、ｃＤＮＡ合成を行い、適当なプライマーを用いて、ＰＣＲ反応によりＯＳＦ−２遺伝子を増幅し、ゲル電気泳動によってＯＳＦ−２に相当するバンドの濃さを判定するなどの方法により、ＯＳＦ−２遺伝子の発現量を測定することができる。ＯＳＦ−２遺伝子発現の定量は、この方法に限らず、例えば実施例３に記載の方法やノーザンハイブリダイゼーション法、ｃＤＮＡアレイ法などをはじめＲＮＡ，ＤＮＡの定量法であればどのような方法も利用できる。
また、本発明によりＯＳＦ−２遺伝子が心不全の増悪化因子であることが示されたことにより、ＯＳＦ−２遺伝子及びその制御領域に何らかの変異が存在することによりＯＳＦ−２タンパク質の機能が亢進したり、遺伝子発現量が増加したりする場合には、その変異を持っている個体は、心不全になり易い、あるいは、増悪化しやすい傾向を持つことが容易に考えられる。そこで、これらの遺伝子上の変異を試験することで、リスクファクターの診断が可能となる。遺伝子上の変異を知る方法としては、例えば、患者の血液サンプルから定法に従ってＤＮＡを分離し、実施例１−５に記載の方法により、その塩基配列を決定し、正常な配列と比較することにより行うことができる。また、一旦変異と心不全の関係が明確になれば、その変異のみを検出するＤＮＡチップ法、ＳＳＣＰ法などが利用できる。
また、ＯＳＦ−２は分泌蛋白であることが知られているので、遺伝子発現の上昇は心臓及び血中のＯＳＦ−２タンパク質の濃度の上昇を伴うことが容易に予想される。そこで、血液中のＯＳＦ−２タンパク質の濃度を測定することにより、心不全の増悪化の程度を知ることができる。測定方法としては、例えば、ＯＳＦ−２に対する抗体を利用したＥＬＩＳＡまたはＲＩＡ法、ＨＰＬＣやマススペクトロメトリーによる定量法などが利用できる。この際、ＯＳＦ−２タンパク質は完全な形である必要はなく、測定可能であれば断片化したものでも良い。
更に、本発明は上記の測定手段等を用いたＯＳＦ−２遺伝子の発現量又はＯＳＦ−２タンパク質の産生量を測定する手段を含む心不全の診断剤又は診断キットを包含する。
（７）ＯＳＦ−２遺伝子導入非ヒト形質転換動物
本発明において、ＯＳＦ−２遺伝子を強制的に過剰発現し心不全症状を有する非ヒト形質転換動物の宿主動物たる非ヒト動物としては、マウス、ラット、ウサギなどの小動物のほか、イヌ、ブタ、ヒツジ、ウシなどの大動物も対象となり、ＯＳＦ−２遺伝子を発現し、ＯＳＦ−２蛋白質の機能や生理作用を確認しうる動物であればどのような動物でも使用することができる。また、ＯＳＦ−２遺伝子を発現するプロモーターとしては、構成的に発現するプロモーター（ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター等）のほか、組織特異的に発現するプロモーター（αＭＨＣプロモーター、αアクチンプロモーター、等）、誘導発現型プロモーター（Ｃｒｅ−ｌｏｘＰシステム、テトラサイクリン誘導システム、エクダイソン誘導システム等）などを用いることができるが、遺伝子の発現を惹起するシステムであればどのようなシステムを用いても良い。
本発明では、誘導的かつ心臓組織特異的にＯＳＦ−２遺伝子を発現するトランスジェニック動物を提供する。誘導発現系としては、例えばエクダイソン誘導システムを用いることができる（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｃｉ．Ｕ，Ｓ．Ａ．，９３，３３４６−３３５１，１９９６；Ｎａｔｕｒｅ，３６６，４７６−４７９，１９９３；Ｃｅｌｌ，７１，６３−７２，１９９２）。この誘導発現系は、エクダイソン受容体とレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ受容体）を構成的に発現させ、この両者からなる受容体ヘテロダイマーが、エクダイソン存在下でエクダイソン応答領域と結合し、その下流にある目的の遺伝子の発現を誘導するようになっている。例えば、エクダイソン受容体とＲＸＲ受容体を発現する誘導用トランスジェニック動物とエクダイソン応答領域と目的の遺伝子を発現する発現用トランスジェニック動物を別々に作製し、両者の交配によりダブルトランスジェニック動物を作製する。このダブルトランスジェニック動物に、エクダイソンを投与することで目的の遺伝子を誘導することができる。
常法により、まず、エクダイソン応答領域の下流にＯＳＦ−２遺伝子を連結して得られるトランスジェニック動物製造用組換え遺伝子を導入した全能性細胞を、個体発生させて得られる動物（発現用トランスジェニック動物）及びその子孫であって、誘導的にＯＳＦ−２蛋白質を発現することを特徴とするトランスジェニック動物を作製する。
一方、心臓組織特異的に発現するプロモーターの下流にエクダイソン受容体遺伝子を連結した発現ユニットと、組織非特異的プロモーターの下流にＲＸＲ遺伝子を連結させた発現ユニットの両方を持つトランスジェニック動物製造用組換え遺伝子を導入した全能性細胞を、個体発生させて得られる動物及びその子孫（誘導用トランスジェニック動物）であって、心臓組織特異的にエクダイソン受容体蛋白質と全身にＯＲ蛋白質を発現することを特徴とするトランスジェニック動物を作製する。
ここで全能性細胞とは、潜在的に全ての細胞に分化する能力を有する細胞をいう。全能性細胞としては、たとえばマウスの場合、受精卵や初期胚のほか、多分化能を有するＥＳ細胞のような培養細胞を対象とすることができる。培養細胞へのＤＮＡ断片の導入法としては、静電パルス法、リポソーム法、リン酸カルシウム法などが利用できる。特に受精卵へのＤＮＡ溶液の物理的注入（マイクロインジェクション）法が好ましい。
本発明に係わるトランスジェニック動物の作製方法に用いる組換え遺伝子は胚発生期に挿入することが望ましい。ＤＮＡを注入した細胞を仮親動物に移植し、当該仮親動物を飼育出産させて所望の遺伝子が導入された仔動物である目的のトランスジェニック動物（始祖トランスジェニック動物）を得ることができる。導入遺伝子の存在は、当該動物の体の一部（例えば尾部先端）を切断し、体細胞のＤＮＡを抽出して、ＰＣＲ法やサザンブロット法などにより確認することができる。
更に、各始祖トランスジェニツク動物と正常動物とを交配させてＦ１動物（子孫動物）を得て、当該Ｆ１動物のうち形質が発現されたトランスジェニック動物同士、または正常動物と交配させて同型または異型接合体Ｆ２動物（子孫動物）を得る工程を更に含むことにより、本発明に係わるトランスジェニック動物の子孫動物を作製することができ、本発明者らも当該各トランスジェニック動物を作製することに成功している。
発現用トランスジェニック動物と誘導用トランスジェニック動物を交配させて、その両方の遺伝子の存在を確認することにより、ダブルトランスジェニック動物を得ることができ、このダブルトランスジェニック動物にエクダイソンを投与することで、誘導的かつ心臓組織特異的にＯＳＦ−２遺伝子を発現させるトランスジェニック動物を得ることができる。
本発明のトランスジェニック動物は、ＯＳＦ−２遺伝子が関与する疾患モデル（例えば心不全モデル）として、病態研究や薬物スクリーニング等に用いることができる。
また、本発明のトランスジェニック動物に候補物質を投与し、ＯＳＦ−２遺伝子の発現量、ＯＳＦ−２タンパク質の産生又は心機能の変化などを測定することにより、ＯＳＦ−２遺伝子が関与する疾患（例えば心不全）の予防剤又は治療剤の有効成分となりうる物質の評価又はスクリーニングを行うことができる。すなわち、本発明のトランスジェニック動物を用いたＯＳＦ−２遺伝子が関与する疾患の予防剤又は治療剤の有効成分となりうる物質の評価方法又はスクリーニング方法も本発明に含まれる。
産業上の利用可能性
本発明によって提供される心不全治療剤は、作用点が明確であり、ＯＳＦ−２遺伝子、タンパク質が関与する軽度〜重度の心不全に、従来とは違ったメカニズムに基づく有効性を発揮する。また、本発明のスクリーニング方法は、ＯＳＦ−２遺伝子またはタンパク質が関与する心不全をはじめとする、あらゆる疾患の治療薬の開発を可能とする。また、本発明の診断法によれば、心不全の増悪化の程度や発症リスクを予想することが可能となり、生活習慣や治療に生かすことができる。さらに、本発明に記載のトランスジェニック動物は、ＯＳＦ−２遺伝子が関与する疾患モデルとして、病態研究や薬物スクリーニング等に用いることができる。
本発明を以下の実施例により具体的に説明する。これらの実施例は説明のためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
実施例
実施例１：サブトラクション法によるＯＳＦ−２の検索
１−１  心不全病態モデルラットの作製及び左心室サンプルの採取
雄性ダール食塩感受性ラット（Ｄａｈｌ−Ｓ）（清水実験材料）を６週齢より８％高食塩含有食で飼育し、心肥大期（１１週齢）および心不全期（１４週齢）に各３匹の左心室を採取した。
１−２  ｍＲＮＡの調製
総ＲＮＡは上記左心室約５００ｍｇからＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）を用いて説明書に記載の方法にしたがって調製した。次に心肥大期、心不全期それぞれ３匹分を合わせた総ＲＮＡ約４００μｇよりＦａｓｔ  Ｔｒａｃｋ  ２．０  Ｋｉｔ（インビトロジェン社）を用いて説明書に記載の方法にしたがってｍＲＮＡを精製し、それぞれ約３μｇのｍＲＮＡを回収した。
１−３  ｃＤＮＡサブトラクション
ｃＤＮＡサブトラクションはＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔ  ｃＤＮＡ  ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（クローンテック社）により、説明書に記載の方法にしたがって行った。すなわち、上記１−２で得られたｍＲＮＡそれぞれ２μｇよりｃＤＮＡを合成し、制限酵素ＲｓａＩで消化した。次に、１４週齢から合成されたｃＤＮＡをテスターｃＤＮＡ、１１週齢から合成されたｃＤＮＡをドライバーｃＤＮＡとし、テスターｃＤＮＡにｋｉｔ添付の２種類のアダプターを別々に連結させた後、サブトラクトハイブリダイゼーションを行った。次に、アダプターに相補的なプライマーを用いてＰＣＲを行い、発現量に違いのあるｃＤＮＡ断片を特異的に増幅させ、増幅産物▲１▼を得た。
また、同様のサブトラクションを１１週齢から合成されたｃＤＮＡをテスターｃＤＮＡ、１４週齢から合成されたｃＤＮＡをドライバーｃＤＮＡとして行い、得られた増幅産物を増幅産物▲２▼とした。
１−４  ドットブロットスクリーニング
Ａ．ドットブロットの作製
増幅産物▲１▼をＰＣＲ  ＩＩベクター（インビトロジェン社）にＴＡクローニングし、挿入断片の入ったクローンを選択した。各クローンの挿入断片を増幅したＰＣＲ反応液、それぞれ１μｌを熱処理後、２枚のナイロンメンブレンフィルター（ベーリンガー社）にドットブロットし、ＵＶクロスリンカー（ストラタジーン社）により固定した。
Ｂ．ｃＤＮＡプローブの作製
増幅産物▲１▼を制限酵素ＲｓａＩ及びＥａｅＩ，ＳｍａＩで消化し、アダプターを除去し、ＤＩＧハイプライムＤＮＡラベリング／検出キットＩＩ（ベーリンガー社）を用いて説明書に記載の方法に従ってＤＩＧ−ｄＵＴＰでランダムプライム標識を行い、ｃＤＮＡプローブ▲１▼を作製した。増幅産物▲２▼より同様にして、ｃＤＮＡプローブ▲２▼を作製した。
Ｃ．スクリーニング
上記Ａで作製したドットブロットメンブランの一枚をｃＤＮＡプローブ▲１▼、他の一枚をｃＤＮＡプローブ▲２▼とハイブリダイゼーションを行い（ベーリンガー社のＤＩＧハイプライムＤＮＡラベリング／検出キットＩＩの説明書に記載の方法にしたがい、ＤＩＧイージーハイブ液中４２℃で一晩ハイブリダイゼーションを行い、２ｘＳＳＣ，０．１％ＳＤＳで室温にて５分間２回、０．１ｘＳＳＣ，０．１％ＳＤＳで６８℃にて１５分間２回洗浄）、キットに添付のブロッキングバッファー中でアルカリホスファターゼ標識ＤＩＧ抗体と反応後、ＣＳＰＤ  ｒｅａｄｙ−ｔｏ  ｕｓｅを加えて化学発光を進行させ、Ｘ線フィルムを露光させた。ｃＤＮＡプローブ▲１▼でのシグナルがｃＤＮＡプローブ▲２▼でのシグナルより強いクローンをポジティブクローンとして選択し、塩基配列の決定を行った。
１−５  塩基配列の決定
塩基配列は、ＴＨＥＲＭＯ  ＳｅｑｕｅｎａｓｅＴＭＩＩ  ｄｙｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ（アマシャムファルマシア社）を用いて自動ＤＮＡ配列読み取り装置モデル３７３Ａ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）で解析することにより決定した。得られた遺伝子配列をＧｅｎＢａｎｋのデーターバンクに照会した結果、クローンの一つ（ＳＦ０１４）がマウスＯＳＦ−２（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｄ１３６６４）と８６％ホモロジーのある遺伝子であることが判明した。
実施例２：ラットＯＳＦ−２  ｃＤＮＡのクローニング
ラットＯＳＦ−２ｃＤＮＡの単離はλｇｔ１１ベクターに挿入されたｒａｔ  ａｏｒｔａ  ｃＤＮＡ  ｌｉｂｒａｒｙ（クローンテック社）より作製した約４０００クローンのファージサブプール１０個（計約４万クローン）をＳＦ０１４の塩基配列を基に設計したプライマー（１）５’−ＧＴＴＣＡＴＴＧＡＡＧＧＴＧＧＣＧＡＴＧＧＴＣ−３’（配列番号１）と（２）５’−ＧＡＧＡＴＡＡＡＡＴＣＣＣＴＧＣＡＴＧＧＴＣＣＴ−３’（配列番号２）を用いてＰＣＲスクリーニングを行い、３個のポジティブなサブプールを得た。そのうち１個のサブプールを上記ＰＣＲによって増幅された断片をＡｌｋＰｈｏｓ  ＤｉｒｅｃｔＴＭ（アマシャムファルマシア社）を用いてアルカリフォスファターゼ標識したプローブを用いてハイブリダイゼーションによるスクリーニングを行い、１個のポジティブクローンｒａｔ  ＯＳＦ−２＃１を得た。その挿入断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（ストラタジーン社）のＥｃｏＲＩ部位に組み込み、実施例１−５の方法にしたがって全塩基配列を決定した。
得られたクローンの長さは約３ｋｂであり、マウスＯＳＦ−２（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｄ１３６６４）の２９２番から３’−末端までに相当するものであり、５’−末端が欠けたクローンであることが示唆された。そこで、ＳＭＡＲＴＴＭＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（クローンテック社）を用いて説明書に記載の方法にしたがって、ｒａｔ  ａｏｒｔａ  ｃＤＮＡを鋳型として、上記プライマー（２）５’−ＧＡＧＡＴＡＡＡＡＴＣＣＣＴＧＣＡＴＧＧＴＣＣＴ−３’（配列番号２）とｒａｔ  ＯＳＦ−２＃１の塩基配列を基に設計したプライマー（３）５’−ＣＡＣＧＧＴＣＧＡＴＧＡＣＡＴＧＧＡＣＡＡＣＡＣＣ−３’（配列番号３）を用いて５’−ＲＡＣＥ反応を行った。得られたＰＣＲ産物をインビトロジェン社のＰＣＲ  ＩＩベクターにＴＡクローニングし、ｒａｔ  ＯＳＦ−２  ５ＲＡＣＥ  ＃１と命名した。塩基配列を実施例１−５の方法にしたがって決定した。
その結果、ｒａｔ  ＯＳＦ−２  ５ＲＡＣＥ  ＃１は最初に得られたｒａｔ  ＯＳＦ−２＃１より５’方向に約３００ｂｐ長いクローンであり、５’−末端はマウスＯＳＦ−２（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｄ１３６６４）の５’−末端より１５ｂｐ長いクローンであった。さらにｒａｔ  ＯＳＦ−２  ５ＲＡＣＥ  ＃１の塩基配列を基に設計したプライマー（４）５’−ＡＣＧＧＡＧＣＴＣＡＧＧＧＣＴＧＡＡＧＡＴＧ−３’（配列番号４）と上記プライマー（３）５’−ＣＡＣＧＧＴＣＧＡＴＧＡＣＡＴＧＧＡＣＡＡＣＡＣＣ−３’（配列番号３）を用いて上記ｒａｔ  ａｏｒｔａ  ｃＤＮＡ  ｌｉｂｒａｒｙより作製した約４万クローンのファージサブプール１０個（計約４０万クローン）をＰＣＲスクリーニングすることにより２個のポジティブなサブプールを得た。そのうち１個のサブプールを上記ＰＣＲによって増幅される断片をプローブとしてハイブリダイゼーションによるスクリーニングを行い１個のポジティブクローンを得、ｒａｔ  ＯＳＦ−２＃２と命名した。挿入断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（ストラタジーン社）のＥｃｏＲＩ部位に組み込み、塩基配列を実施例１−５の方法にしたがって決定した。
得られたクローンの長さは約２．６ｋｂであり、５’−末端は５’−ＲＡＣＥで得られたクローンと同一であったが、３’−末端はマウスＯＳＦ−２（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｄ１３６６４）の２４１０番までに相当するクローンであった。また、先に得られたｒａｔ  ＯＳＦ−２  ５ＲＡＣＥ  ＃１の塩基配列とｒａｔ  ＯＳＦ−２＃２の相当する領域の塩基配列は全く同一であった。ｒａｔ  ＯＳＦ−２＃１とｒａｔ  ＯＳＦ−２＃２よりｒａｔ  ＯＳＦ−２  ｃＤＮＡの完全長を完成させた。この完全長ｃＤＮＡの塩基配列とこの塩基配列より翻訳されるアミノ酸配列を配列番号５及び６に示す。
実施例３：各種心不全モデルラットにおけるＯＳＦ−２遺伝子発現の解析
ＯＳＦ−２遺伝子は、ダールラットで心不全期に発現上昇する遺伝子として、サブトラクションにより選択された。この遺伝子が、実際にどの程度の発現変化を示すのか、また、ダールラット以外の各種の心不全モデルでも同様の変化を示すかを検証した。
３−１  モデルラットの作製及びサンプル採取
Ａ．ダール心不全モデルラット
雄性ダール食塩感受性ラット（Ｄａｈｌ−Ｓ）（清水実験材料）を６週齢より８％高食塩含有食で飼育し、心肥大期（１１週齢）および心不全期（１４週齢）に左心室を採取した。コントロールとしては、１０週齢の普通食のＤａｈｌ−Ｓラットを用いた。
Ｂ．腹部大動脈狭窄ラット（圧負荷モデル）
Ｂ−１．圧負荷によるラット心肥大モデルの作製方法
実験にはＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系の９週齢雄性ラットを用いた。ペントバルビタールナトリウム（４０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内投与によりラットを麻酔し、腹臥位に固定して開腹後、腹部大動脈を露出させ、左右の腎動脈間の部分を剥離した。２１Ｇ注射針を大動脈に沿わせ、左右の腎動脈間で大動脈とともに絹糸で結紮し、その後注射針を引き抜くことにより、大動脈狭窄を行った。本モデルにおいてはこのような腹部大動脈狭窄により収縮期血圧が上昇し、心臓の後負荷が増大して、左心室の肥大が生じる。
Ｂ−２．サンプルの採取
動脈の狭窄により収縮期血圧は手術後３ヶ月目、１７ヶ月目においてそれぞれ２３２ｍｍＨｇ，１８８ｍＨｇと通常より高い値を示した。３ヶ月目で、心重量／体重比の有意な上昇を認め、さらに、１７ヶ月目のラットは３ヶ月目に比べ心機能の指標であるＦｒａｃｔｉｏｎａｌ  Ｓｈｏｒｔｅｎｉｎｇ（ＦＳ）が５２％から２６％に低下した。よって狭窄手術後３ヶ月目を代償性肥大期、１７ヶ月目を非代償心不全期とし、それぞれの左心室を採取した。コントロールとしては、１０週齢のラットを用いた。
Ｃ．腹部動静脈シャントラット（容量負荷モデル）
Ｃ−１．容量負荷によるラット心肥大モデルの作製方法
実験にはＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系の９週齢雄性ラットを用いた。ペントバルビタールナトリウム（４０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内投与によりラットを麻酔し、腹臥位に固定して開腹後、腹部大動静脈を露出させ、大動脈の腎動脈分岐部及び大腿動脈分岐部において、それぞれクランプで血流を停止した。止血した部位で大動脈内に１８Ｇ注射針を挿入し、大静脈へと貫通させ、動静脈シャントを作製した。注射針を引き抜き、動脈部の傷口を手術用接着剤で塞ぎ、クランプをはずした。シャント部で静脈内に動脈血が流入するのを確認した後、閉腹した。本モデルにおいてはこのような腹部大動静脈シャントの形成により、静脈圧が上昇し、心臓の前負荷が増大して、右心房、右心室、左心房、左心室の順に負荷が加わり肥大が生じる。さらに、静脈系のコンプライアンスが低いため血液が貯流し、肺うっ血を呈する。
Ｃ−２．サンプル採取
術後、３ヶ月、１１ヶ月において、心エコーによる心機能測定を行った後、解剖、心重量ならびに解剖所見を確認した。手術後３ヶ月目にくらべ１１ヶ月目のラットではヘマトクリット値が低下すると共に全例で肺水腫が生じており、容量負荷が進行したものと思われた。また右心系の心重量／体重比や肺重量／体重比が増加し、右心室から肺にかけての鬱血が示唆された。ＦＳは５７％から３１％に低下した。したがってシャント手術後３ヶ月目を代償期、１１ヶ月目を非代償心不全期と判断し、それぞれの左心室を採取した。コントロールとしては、１０週齢のラットを用いた。
Ｄ．自然発症高血圧ラット（圧負荷モデル）
自然発症高血圧ラットとして知られているＳＨＲラットを飼育し、経時的に血圧、心エコー測定を行った。３ヶ月齢のＳＨＲは血圧および心重量／体重比が通常より高く、高血圧による心肥大を呈していた。１９ヶ月齢では、立毛、うずくまりなどの外見に加え、ＦＳは５６％から３２％に低下、収縮期血圧も低下し心不全を呈した。さらに、胸水、浮腫などの症状が見られた。それぞれ解剖によって左心室を採取した。
３−２  遺伝子の発現解析
遺伝子の発現解析はＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いたリアルタイムＰＣＲ定量システムにより定量した。
総ＲＮＡは各左心室よりＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）を用いて説明書に記載の方法に従って調製し、ＤＮａｓｅ処理を行った。ＤＮａｓｅ処理した総ＲＮＡそれぞれ１μｇより反応液５０μｌでＴａｑＭａｎ登録商標  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いてｃＤＮＡを合成した。ＯＳＦ−２検出用のプライマーおよびＴａｑＭａｎプローブはプライマーデザインソフトウェアＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓを用いてｒａｔ  ＯＳＦ−２  ｃＤＮＡの塩基配列を基に設計した（５）５’−ＴＧＣＡＡＡＡＡＧＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＧＧＴ−３’（配列番号７）、（６）５’−ＡＧＧＴＧＴＧＴＣＴＣＣＣＴＧＡＡＧＣＡＧＴ−３’（配列番号８）、（７）５’−ＦＡＭ  ＡＣＡＡＡＧＴＴＣＡＴＴＧＡＡＧＧＴＧＧＣＧＡＴＧＧＴＣ  ＴＡＭＲＡ−３’（配列番号９）を使用した。内部標準として用いたＧＡＰＤＨの検出はＴａｑＭａｎ登録商標  Ｒｏｄｅｎｔ  ＧＡＰＤＨ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用した。ＯＳＦ−２の検量線は実施例１記載のＳＦ０１４をコントロールプラスミドとし、ＧＡＰＤＨの検量線はｒａｔ  ＧＡＰＤＨの部分配列をＰＣＲにより増幅し、増幅産物をＰＣＲ  ＩＩベクター（インビトロジェン社）にＴＡクローニングして塩基配列を確認したものをコントロールプラスミドとし、それぞれ段階的に希釈することにより作製した。
リアルタイムＰＣＲ定量反応は上記ｃＤＮＡ０．４〜０．８μｌを鋳型として反応液４０μｌでＴａｑＭａｎ登録商標  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて説明書に記載の方法に従って行った。解析結果は内部標準であるＧＡＰＤＨの量で標準化し図１に示した。その結果すべてのモデルにおいて心不全病態の進行に伴いＯＳＦ−２遺伝子の発現亢進が見られた。
実施例４：Ｍｙｃ−Ｈｉｓ−ｒＯＳＦ−２融合タンパク質発現ベクターの構築
実施例２で得られたｒａｔ  ＯＳＦ−２遺伝子のコード領域から翻訳されるタンパク質のカルボキシル末端にＭｙｃエピトープと６個のヒスチジンタグを有し、ＣＭＶプロモーターを有する発現ベクターを作製した。
まず、ｐＴｒａｃｅｒ−ＣＭＶ２ベクター（インビトロジェン社）を制限酵素ＥｃｏＲＩとＥｃｏＲＶで消化したベクター断片に、実施例２で得られたｒａｔ  ＯＳＦ−２  ５ＲＡＣＥ  ＃１を制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化して得られた約５００ｂｐの断片と実施例２で得られたｒａｔ  ＯＳＦ−２＃１を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＨｐａＩで消化して得られた約２７８０ｂｐの断片をライゲーションキット（宝酒造（株））を用いて連結し、得られたプラスミドをｐＴｒａｃｅｒ−ＣＭＶ２／ｒＯＳＦ−２と命名した。このようにして作製したｐＴｒａｃｅｒ−ＣＭＶ２／ｒＯＳＦ−２を制限酵素ＥｃｏＲＩとＳｍａＩで消化し、ｒａｔ  ＯＳＦ−２遺伝子のコード領域を含む約２３３０ｂｐの断片を得、実施例２で得られたｒａｔ  ＯＳＦ−２＃１を鋳型としてその配列を基に設計したプライマー（８）５’−ＧＡＣＣＣＧＧＧＡＡＧＡＡＣＧＣＡＴＣＡＴＣ−３’（配列番号１０）とｒａｔ  ＯＳＦ−２の終止コドンの直前にＢｓｔＥＩＩサイトが挿入されるように設計したプライマー（９）５’−ＴＧＧＧＴＧＡＣＣＣＴＧＡＧＡＡＣＧＧＣＣＴＴＣＴＣＴＴＧＡＴＣ−３’（配列番号１１）を用いてＰＣＲを行い、精製後、制限酵素ＳｍａＩとＢｓｔＥＩＩで消化して約２７０ｂｐの断片を得た。以上の２つの断片を発現ベクター構築用のプラスミドｐｃＤＮＡ４／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ／ｔｙｐｅ  Ｃ（インビトロジェン社）を制限酵素ＥｃｏＲＩとＢｓｔＥＩＩで消化したベクター断片にライゲーションキット（宝酒造（株））を用いて連結し、得られたプラスミドをｐｃＤＮＡ４／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ／ｒＯＳＦ−２と命名した。挿入部分の全塩基配列は実施例１−５記載の方法により確認した。
実施例５：ｒＯＳＦ−２タンパク質発現ベクターの構築
実施例２で得られたｒａｔ  ＯＳＦ−２遺伝子の全コード領域を含みＣＭＶプロモーターを有する発現ベクターを作製した。実施例４で得られたｐＴｒａｃｅｒ−ＣＭＶ２／ｒＯＳＦ−２を制限酵素ＥｃｏＲＩとＰｍｅＩで消化し、ｒａｔ  ＯＳＦ−２遺伝子のコード領域を含む約３３００ｂｐの断片を得、この断片を前記ｐｃＤＮＡ４／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ／ｔｙｐｅ  Ｃ（インビトロジェン社）を制限酵素ＥｃｏＲＩとＰｍｅＩで消化して得られたベクター断片にライゲーションキット（宝酒造（株））を用いて連結し、ｐｃＤＮＡ４／ｒＯＳＦ−２と命名した。挿入部分の全塩基配列は実施例１−５記載の方法により確認した。
実施例６：ラット心臓へのＯＳＦ−２遺伝子導入による機能解析
６−１  発現プラスミドの大量調製
実施例５で作製した発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ４／ｒＯＳＦ−２）を大腸菌ＤＨ５α株に導入して増幅し、ＥｎｄｏＦｒｅｅＴＭＰｌａｓｍｉｄ  Ｇｉｇａ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製後、生理食塩水に溶解した。
６−２  ＨＶＪ−ｌｉｐｏｓｏｍｅの調製
先のプラスミド溶液２００μｇにＨＭＧ−１，−２ｍｉｘｔｕｒｅ（１ｍｇ／ｍｌ、和光純薬（株））を５０μｌ加え室温で１時間放置後ＢＳＳ溶液を総量２００μｌになるよう加えた。その混合溶液を−２０℃保存してある混合脂質（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄ  Ｉｎｃ．、シグマ（株）、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．８（１７），２１３３−２１４１（１９９７），Ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ，ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｈａｎｄｂｏｏｋ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ｖｏｌ．４，１２２−１２３（１９９８））の入ったガラス管に加えボルテックスミキサーにて３０秒激しく振盪し３７℃の恒温槽に３０秒間静置した。これを８回繰り返した後、水を張った超音波発生装置にガラス管を入れ６秒間超音波処理を行い、再度３０秒間ボルテックスミキサーにて振盪（１２０回／分）した。次に、精製したＨＶＪ  １ｍｌ（２００００ＨＡＵ以上）（金田安史：ＨＶＪ−ｌｉｐｏｓｏｍｅ法（遺伝子導入＆発現解析実験法；羊土社）７０−７９（１９９７）、佐伯嘉修，金田安史：ＨＶＪ−リポソームベクター（遺伝子治療  開発研究ハンドブック：日本遺伝子治療学会編）４２９−４３８（１９９９）、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．８（１７），２１３３−２１４１（１９９７），Ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ，ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｈａｎｄｂｏｏｋ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ｖｏｌ．４，１２２−１２３（１９９８））を直径３０ｍｍのプラスチックシャーレに分取しＵＶクロスリンカーに入れて蓋を取り１９８０ｍＪ／ｃｍ２の紫外線を照射して不活化させた。この不活化ＨＶＪをガラス管に加え氷上で１０分間置いた後ＢＳＳを１．３ｍｌ加えて３７℃の振盪型恒温槽にて１時間振盪した。次に、１０ｍｌの超遠心チューブに３０％ショ糖溶液を７．５ｍｌ入れＨＶＪ−ｌｉｐｏｓｏｍｅ液（ガラス管内の溶液）全量を静かに重層しスイングローターにて６２，８００×ｇで４℃、１．５時間超遠心した。ＨＶＪ−ｌｉｐｏｓｏｍｅはショ糖溶液上に白色の粒子として集積され、これをパスツールピペットで回収しＢＳＳにて総量３ｍｌに調整後４℃保存した。
６−３  ラットへの遺伝子導入
１２週齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（雄）の心臓左室（心尖および側尖部位）にＨＶＪ−ｌｉｐｏｓｏｍｅ／ＤＮＡ溶液（濃度６．７μｇ／ｍｌ）を１００μｌずつ３ケ所（総量３００μｌ）に３０ゲージ注射針にて打ち込んだ（ｒＯＳＦ−２群）。また、コントロールとしてｐｃＤＮＡ４／Ｈｉｓ−Ｍｙｃベクターを同様にして注入した（コントロール群）。
６−４  心エコー測定
導入後６週間目においてケタミン（５０ｍｇ／ｍｌ）、キシラジン（１０ｍｇ／ｍｌ）にて麻酔後、Ｃｏｒｅ  Ｖｉｓｉｏｎ  Ｐｒｏ  ＳＳＡ  ３５０Ａ（プローブ：７ＭＨｚ、東芝（株））を用いて心エコー測定を行った。結果は表１に示した通りでありコントロール群に比しｒＯＳＦ−２群ではＬＶＩＤＤ（左室拡張末期内径）及びＬＶＩＤＳ（左室収縮末期内径）において有意な差が見られ心拡大を引き起こすことが明らかとなった。
【表１】
0004534092.tif 000004
６−５  血行動態の測定
導入後６週間目においてペントバルビタール塩酸塩（５０ｍｇ／ｍｌ）にて麻酔後心内圧および血圧の測定を行った。結果を表２に示す。コントロール群に比しｒＯＳＦ−２群ではＬＶＰ（左心室圧）、ＬＶＥＤＰ（左室拡張末期圧）、＋ＬＶｄＰ／ｄＴ及び−ＬＶｄＰ／ｄＴに有意な差が得られ心機能の低下が示唆された。
【表２】
0004534092.tif 000005
実施例７：ＯＳＦ−２遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチの設計と選択
７−１  アンチセンスヌクレオチドの設計
アンチセンスヌクレオチドは翻訳開始点のＡＵＧを含み且つ３つの連続したグアニン（トリプレットＧ）を含まず且つヘアピン構造やセルファニールしない領域を選び、配列番号１２乃至１６に記す５種類を設計し、外部にて受託合成した。全てのアンチセンスヌクレオチドはホスホロチオエート型である。
７−２  アンチセンスヌクレオチドの選択
実施例５に記載したＭｙｃ−Ｈｉｓ−ｒＯＳＦ−２融合タンパク質発現ベクターｐｃＤＮＡ４／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ／ｒＯＳＦ−２をＣＯＳ−１細胞に導入し、上記１で作製したアンチセンスヌクレオチドを導入してＭｙｃ−Ｈｉｓ−ｒＯＳＦ−２融合タンパク質の発現を阻害するアンチセンスヌクレオチドをスクリーニングした。Ｍｙｃ−Ｈｉｓ−ｒＯＳＦ−２融合タンパク質の発現量はＭｙｃ特異的モノクローナル抗体（インビトロジェン社）を用いたＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）で定量した。具体的にはＣＯＳ−１細胞を２ｘ１０４細胞／ウェルになるように９６ウェルプレートに播種し、１６〜２４時間後に３２０ｎｇのＤＮＡ（ｐｃＤＮＡ４／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ／ｒＯＳＦ−２）をＯＰＴＩ−ＭＥＭ  Ｉ培地（ＧＩＢＣＯ社）に溶解し、１μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔ  ＡＭＩＮＥ  ２０００試薬（ＧＩＢＣＯ社）を含む同量のＯＰＴＩ−ＭＥＭ  Ｉ培地と混合し、室温で２０分間処理後、ＣＯＳ−１細胞へ添加し、３７℃においてインキュベートすることによりトランスフェクションを行った。次にＤＮＡ添加１〜４時間後に生理食塩水に溶解した一連のアンチセンスヌクレオチドを最終濃度１００ｎＭになるように各ウェルに添加し、さらに３日間３７℃においてインキュベートした。
培養上清５０μｌをＥＩＡ／ＲＩＡプレート（コースター社）に添加し、３７℃で１〜２時間放置することにより固定化し、２００μｌの０．１％Ｔｗｅｅｎを含むダルベッコーリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳＴ）で２回洗浄した。非特異的吸着を遮断するために遮断用溶液（１％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳＴ）で３７℃１時間処理し、２００μｌのＰＢＳＴで３回洗浄した。次に５０μｌの遮断用溶液で１：４０００に希釈したホースラディッシュパーオキシダーゼ標識された抗Ｍｙｃモノクローナル抗体（インビトロジェン社）を添加し、室温１時間放置することにより結合させ、２００μｌのＰＢＳＴで３回、ＰＢＳで１回洗浄した。５０μｌのＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジディン）試薬（ＫＰＬ社）を添加し、室温にて３０分放置した後、５０μｌの０．１Ｎ硫酸を添加することにより反応を停止し、マイクロプレートリーダーにて４５０ｎｍの吸光度を測定した。
その結果、図２に示すように翻訳開始コドンを標的とした一連のアンチセンスヌクレオチドはいずれもＯＳＦ−２タンパク産生阻害活性を有したが、配列番号１２のアンチセンスヌクレオチドが最も強く発現を阻害した。
次に配列番号１２に対応するセンス鎖であるセンスヌクレオチド（配列番号１７）及び配列番号１２の５’、３’の向きを逆にしたスクランブルヌクレオチド（配列番号１８）を作製し、各ヌクレオチドの最終濃度１０ｎＭにて上記と同様の実験を行った。その結果、図３に示すようにアンチセンスヌクレオチドはセンスヌクレオチド、スクランブルヌクレオチドよりも強いＯＳＦ−２タンパク産生阻害活性を有していることが判明した。
実施例８：アンチセンスヌクレオチドによるＯＳＦ−２遺伝子の発現抑制
８−１  ＨＶＪ−ｌｉｐｏｓｏｍｅの調製
実施例６．１で調製したプラスミド溶液２００μｇと実施例７にて選別したアンチセンスヌクレオチド溶液１．４ｍｇにＨＭＧ−１，−２ｍｉｘｔｕｒｅ（１ｍｇ／ｍｌ、和光純薬（株））を５０μｌ加え、以下実施例６に従ってＨＶＪ−ｌｉｐｏｓｏｍｅを調製した。また、センスヌクレオチド、スクランブルヌクレオチドも同様に調製した。
８−２  ラットへの遺伝子導入
１３週齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（雄）の心臓左室（心尖および側尖部位）にＨＶＪ−ｌｉｐｏｓｏｍｅ／ＤＮＡ溶液を１００μｌずつ３ケ所（総量３００μｌ）に３０ゲージ注射針にて打ち込んだ（ｒＯＳＦ−２／アンチセンス群、ｒＯＳＦ−２／センス群、ｒＯＳＦ−２／スクランブル群）。また、ポジティブコントロール群としてｐｃＤＮＡ４／ｒＯＳＦ−２をネガティブコントロール群としてｐｃＤＮＡ４／Ｈｉｓ−Ｍｙｃベクターを同様にして注入した。
８−３  心エコー測定
導入後３週間目においてケタミン（５０ｍｇ／ｍｌ）、キシラジン（１０ｍｇ／ｍｌ）にて麻酔後、Ｃｏｒｅ  Ｖｉｓｉｏｎ  Ｐｒｏ  ＳＳＡ  ３５０Ａ（プローブ：７ＭＨｚ、東芝（株））を用いて心エコー測定を行った。結果を表３に示す。ポジティブコントロール群（ｒＯＳＦ−２）あるいはｒＯＳＦ−２／センス群、ｒＯＳＦ−２／スクランブル群に比しｒＯＳＦ−２／アンチセンス群ではネガティブコントロール群（コントロール）と同様ＬＶＩＤＤ（左室拡張末期内径）及びＬＶＩＤＳ（左室収縮末期内径）が有意に小さく心拡大を抑制することが明らかとなった。
【表３】
0004534092.tif 000006
実施例９：  アンチセンスヌクレオチドによる心不全発症の抑制
９−１  ＨＶＪ−ｌｉｐｏｓｏｍｅの調製
実施例７にて選別したアンチセンスヌクレオチドをＢＳＳ緩衝液にて溶かし、そのうちの１．４ｍｇにＨＭＧ−１，−２ｍｉｘｔｕｒｅ（１ｍｇ／ｍｌ、和光純薬（株））を５０μｌ加え、以下実施例６．２に従ってＨＶＪ−ｌｉｐｏｓｏｍｅを調製した。また、センスヌクレオチドも同様に調製した。
９−２  ラットへの遺伝子導入
８週齢から８％食塩負荷飼料にて飼育した１３週齢のＤａｈｌ−Ｓラット（ＤＩＳ／Ｅｉｓ，エーザイ、雄）の心臓左室（心尖および側尖部位）にＨＶＪ−ｌｉｐｏｓｏｍｅ／ヌクレオチド溶液を７５μｌずつ４ケ所（総量３００μｌ）に３０ゲージ注射針にて打ち込んだ（アンチセンス群１３匹、センス群１３匹）。導入後、引き続き８％食塩負荷飼料にて飼育し、その生存率を調べた結果、遺伝子導入後３０週後の生存率は、センス群（６１．５％）、アンチセンス群（１００％）で、アンチセンス群で生存率の改善が見られた。
実施例１０：  ヒトＯＳＦ−２レポータプラスミドの作製
１０−１  ヒトＯＳＦ−２遺伝子上流領域のクローニング
ＥＭＢＬ−３ベクターに挿入されたｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｌｉｂｒａｒｙ（クローンテック社）より作製した約２５，０００クローンのファージサブプール１０個（計約２５万クローン）をヒトＯＳＦ−２遺伝子の上流領域を含むドラフト配列（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＬ１３８６７９）の塩基配列を基に設計したプライマー（１０）５’−ＡＡＧＡＡＴＡＴＴＡＡＡＡＧＴＴＡＴＴＴＧＴＧＧＧＣＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＴＧ−３’（配列番号２２）と（１１）５’−ＣＡＴＴＴＡＡＡＡＧＣＣＴＡＴＣＡＡＧＴＧＴＣＡＧＧＴＣＣＡＣＴＣＴＣ−３’（配列番号２３）を用いてＰＣＲスクリーニングすることにより、２個のポジティブなサブプールを同定し、このサブプールを上記ＰＣＲによって増幅された断片をＡｌｋＰｈｏｓ  ＤｉｒｅｃｔＴＭ（アマシャムファルマシア社）を用いてアルカリフォスファターゼ標識したプローブを用いてハイブリダイゼーションによるスクリーニングを行い、２個のポジティブクローンｈｕｍａｎ  ＯＳＦ−２  ｇｅｎｅ＃１、２を得た。ｈｕｍａｎ  ＯＳＦ−２  ｇｅｎｅ＃２の挿入断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（ストラタジーン社）のＸｈｏＩ認識部位に組み込み、ｐＢ−ｈＯＳＦｇ＃２を得、実施例１−５の方法にしたがって部分塩基配列を決定した。得られたクローンの長さは約１３．５ｋｂであり、ヒトドラフト配列（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＬ１３８６７９  ｖｅｒｓｉｏｎ１１）の１６３９７番から３０００２番までに相当するものであり、ヒトＯＳＦ−２遺伝子のイントロン２から上流領域が含まれていることがわかった。また、開始コドン（ＡＴＧ）から上流約２ｋｂに存在するＳｐｅＩ認識部位から開始コドンまでについては全塩基配列を決定した。この約２ｋｂの塩基配列を配列番号２４に示す。この約２ｋｂの塩基配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＬ１３８６７９  ｖｅｒｓｉｏｎ１１の配列に対して４塩基において変異が存在し、各々、ＳｐｅＩ認識部位を１番として、７６４番Ｇ（Ｔ）、９３６番Ｔ（Ｃ）、１０９９番Ｃ（Ｔ）及び２１０６番Ｇ（Ｃ）であった（（括弧内はＡＬ１３８６７９  ｖｅｒｓｉｏｎ１１の塩基配列）。
１０−２  ヒトＯＳＦ−２レポータープラスミドの作製
実施例１０−１で得たｈｕｍａｎ  ＯＳＦ−２  ｇｅｎｅ＃２を鋳型として、開始コドンの約２ｋｂ上流から開始コドンの直前までをプライマー（１２）５’−ＴＧＡＧＣＡＴＡＴＡＴＣＡＴＧＣＴＴＴＣ−３’（配列番号２５）と（１３）５’−ＡＡＴＣＡＴＣＴＣＧＡＧＴＣＴＣＴＣＣＧＴＴＧＣＡＧＴＴＡＧＴＣＣＣＣ−３’（配列番号２６）を用いたＰＣＲ法により増幅した。なお、プライマー（１３）は５’−末端に制限酵素ＸｈｏＩ認識部位を挿入するように設計されており、この増幅断片を制限酵素ＳｐｅＩ及びＸｈｏＩで消化して得られる約２ｋｂの断片を、ｐＧＬ３−ｅｎｈａｎｃｅｒ（プロメガ社）のルシフェラーゼ遺伝子の上流にある制限酵素ＮｈｅＩ及びＸｈｏＩで切断したベクター断片にライゲーションキット（宝酒造（株））を用いて連結し、ｐＧＬ３−ｈＯＳＦｇＥを得た。挿入部分の塩基配列を実施例１−５の方法にしたがって決定し、実施例１０−１で決定した塩基配列と同一であることを確認した。
実施例１１：  ヒトＯＳＦ−２遺伝子の発現に影響を与える化合物のスクリーニング
１１−１  ＣＯＳ−１細胞を用いたレポーターアッセイ
ＣＯＳ−１細胞を３ｘ１０４細胞／ウェルになるように９６ウェルプレートに播種し、１６〜２４時間３７℃で培養後、実施例１０で示したＯＳＦ−２レポータープラスミドｐＧＬ３−ｈＯＳＦｇＥをリポフェクトアミン２０００試薬（ＧＩＢＣＯ社）を用いて一過性に導入し、２４時間３７℃で培養後、培地交換を行い、２４時間後に候補化合物を添加し、その２４時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。ルシフェラーゼ活性の測定はルシフェラーゼアッセイシステム（プロメガ社）のプロトコールに従って行い、検出は１４２０マルチラベルカウンター（Ｗａｌｌａｃ社）を用いた。コントロールとしてＳＶ４０プロモーターの下流にルシフェラーゼ遺伝子が連結されたｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌ（プロメガ社）を用いて同様の実験を行った。この方法により多数の化合物をスクリーニングした結果、２−クロロ−アデノシントリフォスフェート四ナトリウム（２−Ｃｈｌｏｒｏａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ５’−ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ）、メトリフジル（Ｎ−［（２−Ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ］−ａｄｅｎｏｓｉｎｅ）がＯＳＦ−２プロモーター特異的にルシフェラーゼ活性を抑制することが明らかになった。なお、これらの化合物は以下の化学構造式を有する。
２−クロロ−アデノシントリフォスフェート四ナトリウム（２−Ｃｈｌｏｒｏａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ５’−ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍ）：
0004534092.tif 000007
メトリフジル（Ｎ−［（２−Ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ］−ａｄｅｎｏｓｉｎｅ）：
0004534092.tif 000008
１１−２  ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を用いた発現解析
本来ＯＳＦ−２を発現しているマウス骨芽細胞様細胞ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１（理研細胞開発銀行より購入）を５ｘ１０５細胞／ウェルになるように６ウェルプレートに播種し、２４時間３７℃で培養後に培地交換を行い、２４時間後に上記化合物を３０μＭの濃度で添加し、その２４時間後に細胞を回収し、細胞よりＲＮｅａｓｙ登録商標  Ｍｉｎｉ（キアゲン社）を用いて総ＲＮＡ調製し、実施例３−２の方法にしたがって、ＯＳＦ−２  ｍＲＮＡおよび内部標準ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの発現量をＰＣＲ定量システムにより定量した（ＯＳＦ−２  ｍＲＮＡ発現量は内部標準であるＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの発現量で標準化した）。その結果、２−クロロ−アデノシントリフォスフェート四ナトリウム、メトリフジルはＯＳＦ−２  ｍＲＮＡの発現を抑制することを確認した。
このように、本発明で示したスクリーニング系を用いることにより、ＯＳＦ−２遺伝子の発現に影響を与える化合物を見出すことができることが示された。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、各動物モデルにおける、ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量で標準化したＯＳＦ−２遺伝子の発現量を示す図である。
図２は、配列番号１２乃至１６の各アンチセンスヌクレオチドに係るＯＳＦ−２タンパク質産生阻害活性を示す図である。Ｃはコントロールを意味する。
図３は、アンチセンスヌクレオチド（配列番号１２）、センスヌクレオチド（配列番号１７）及びスクランブルヌクレオチド（配列番号１８）に係るＯＳＦ−２タンパク質産生阻害活性を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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