(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１測定につき反応時間の異なる２点での測定を行うホモジニアスイムノアッセイにおいて、反応時間の短い方の測定値をＴ１、反応時間の長い方の測定値をＴ２としたとき、被検試料のＴ１があらかじめ設定された閾値Ａ未満の場合は、第１の式
Ｘ１＝（被検試料のＴ２）
で得られた値Ｘ１に基づいて反応量を求め、被検試料のＴ１が閾値Ａ以上のときは第２の式
Ｘ２＝（被検試料のＴ２）×（被検試料のＴ１）／Ａ
で得られた値Ｘ２に基づいて反応量を求め、閾値Ａが強陽性検体を希釈倍率を変化させて測定したＴ１に基づいて予め設定されることを特徴とする免疫分析方法。
【請求項２】
前記被検試料の反応量を、別途測定した１つまたはそれ以上のコントロール物質の測定値を用いて、相対的な反応量（カットオフインデックス）に換算することを特徴とする請求項１記載の免疫分析方法。
【請求項３】
前記カットオフインデックスへの換算が、第３の式
【数１】
0004404994.tif 000007
を用いて行うことを特徴とする請求項２記載の免疫分析方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、とくに、通常のイムノアッセイでは測定レンジを超えるような定性項目の測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
抗原抗体反応を利用した物質の測定方法は、生体内の様々な微量な成分を検出するのに利用されている。測定対象成分としては、例えば、免疫グロブリン、補体、ホルモン、ウイルス抗原、腫瘍マーカー、炎症マーカー、あるいは薬剤等がある。これらの測定成分に標準物質が存在し、また濃度を測定することによって臨床的に有意義である場合には、検量線を使って反応量を濃度に変換することにより定量試験が可能である。しかしそのような標準物質がない場合、あるいはその測定成分の有無に意義がある場合には、検量線を使わない簡便な定性試験が実施されている。
【０００３】
定性試験においては、判定は被検試料の反応量がある一定の値を超える場合に陽性、下回る場合を陰性とするのが一般的である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、臨床検査においてはこの判定だけでなく、反応量も同時に考慮することにより、患者における被検物質の濃度の高低を半定量的に捉え、診断に役立てようとする考え方が出てきた。しかし従来の定性試験用試薬では測定レンジに関して狭いものが多く、特に高値検体において反応量が頭打ちになってしまうため、被検物質の濃度変化を追うことができない。このため定性試験であっても広い測定レンジを持った測定方法が要望されていた。
【０００５】
例えばＨＢｅＡｇ測定では、低値検体における血中HBeAg濃度と臨床経過には相関があるが、高値においては測定法の頭打ちにより、測定できなかった。このため高値における測定レンジを拡大することにより、高値での血中HBeAg濃度の挙動が追跡できるようになり、より肝炎治療のモニタリングに役立てることができると期待されていた。しかし、従来のキットでは、反応量が頭打ちになってしまうため、高濃度領域でのＨＢｅＡｇ濃度の増減を調べることができなかった。
【０００６】
このため、ＨＢｅＡｇ測定では、低値検体における感度を確保したまま、高値検体の測定が可能な測定方法の開発が望まれている。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、１測定につき反応時間の異なる２点での測定を行うホモジニアスイムノアッセイにおいて、反応時間の短い方の測定値をＴ１、反応時間の長い方の測定値をＴ２としたとき、被検試料のＴ１があらかじめ設定された閾値Ａ未満の場合は、第１の式
Ｘ１＝（被検試料のＴ２）
で得られた値Ｘ１に基づいて反応量を求め、被検試料のＴ１が閾値Ａ以上のときは第２の式
Ｘ２＝（被検試料のＴ２）×（被検試料のＴ１）／Ａ
で得られた値Ｘ２に基づいて反応量を求めることを特徴とする。
【０００８】
また、前記被検試料の反応量を、別途測定した１つまたはそれ以上のコントロール物質の測定値を用いて、相対的な反応量（カットオフインデックス）に換算することもできる。
【０００９】
コントロール物質としては、例えば、陰性コントロールおよびカットオフコントロールを用いることができ、以下の第３の式
【数２】
0004404994.tif 000002
を用いて前記カットオフインデックスを算出することができる。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明において、陰性コントロールとは、測定対象成分を含まない溶液であり、水、緩衝液、陰性プール血清、測定対象成分の除去処理を行った血清などが挙げられる。
【００１１】
また、カットオフコントロールとは、陽性判定の基準となる反応量を有する物質であり、被検試料がこのカットオフコントロールよりも大きな反応量を示す場合には、その被検試料は陽性と判定される。
【００１２】
Ｔ２は反応が十分進行した時間帯での測定値を用いることが好ましい。この時間帯でのＴ２の測定は高感度で、低値検体の測定に適しているが、高値検体では頭打ちになってしまう。
【００１３】
Ｔ１は反応が頭打ちにならない時間帯での測定値であり、反応が十分進行していない時間帯での測定値を用いることが好ましい。この時間帯でのＴ１の測定は低感度であるが、Ｔ２の測定で頭打ちになってしまうような高値検体でも頭打ちにならずに測定することが可能である。
【００１４】
なお、あらかじめ陰性コントロールのＴ２とカットオフコントロールのＴ２を測定しておき、被検試料のＴ２の測定値を以下の式を用いてカットオフインデックスとして変換して相対反応量を求め、カットオフインデックスが１以上を陽性、１未満を陰性として判定することができることはすでに知られている（湯野  学、  他：ランリームＨＣＶの概要、Sysmex J 20:39-44,1997）。
【式４】
0004404994.tif 000003
【００１５】
ところがこの変換式では、反応が頭打ちになるような高濃度試料においては、カットオフインデックス値も同様に頭打ちになってしまう。この点について、まずT2の代わりに、T1とT2の積を利用する方法を考案した。この方法は高値検体においては測定レンジの拡大に役立つが、低値検体においてはT1がばらつきを持ち、単調増加する信頼性の高いT2の測定値にばらつきを掛けてしまうことになってしまう。
【００１６】
そこで、ある切り替えポイントを設定し、T1がある反応量（閾値A）未満の時には第1の式で被検試料の反応量を計算し、T1がある反応量（閾値A）以上の時には第2の式で被検試料の反応量を算出する方法を考案した。さらに、得られた被検試料の反応量を第３の式によりカットオフインデックスに変換することができる。このことによりT1が閾値Aよりも小さい低濃度試料において従来と同等の精度でカットオフインデックスを算出することが可能で、さらに高濃度試料においても、被検成分の増減を知ることが可能になる。
【００１７】
ここで、閾値Ａは別途定める一定値であり、Ｔ１が単調増加し始めたときの測定値を用いることができ、実験的に求めてもよいし、測定値から適当な数式を用いて算出してもよい。
【００１８】
本発明の好適な実施例においては、例えば、まず陰性コントロールのＴ２とカットオフコントロールのＴ２を測定し、また閾値Ａをあらかじめ決めておく。
【００１９】
次に被検試料のＴ１及びＴ２を測定する。そして、Ｔ１がＡ未満の場合、上記の第１の式を用いて反応量を算出し、Ａ以上の場合には上記第２の式を用いて反応量を算出する。
【００２０】
次いで、第３の式を用いて、カットオフインデックスに変換する。
【００２１】
なお、ホモジニアスイムノアッセイの例としては、免疫比濁法、ラテックス凝集法などが挙げられる。
【００２２】
【実施例】
本発明をラテックス凝集法に適用した実施例を示す。本実施例では、全自動免疫凝集測定装置ＰＡＭＩＡ−５０（シスメックス株式会社）を使用して、ＨＢｅＡｇの測定を行った。
【００２３】
ＰＡＭＩＡシリーズの測定原理は、抗原または抗体を感作したラテックス試薬と検体中の抗原または抗体との凝集反応で、未反応粒子数（Ｍ：ｍｏｎｏｍｅｒ）と反応により形成された凝集塊の数（Ｐ：ｐｏｌｙｍｅｒ）を半導体レーザーを用いた粒子計数装置で計数するものである。ＭとＰの総和をＴ：ｔｏｔａｌとし、Ｐ／Ｔ（凝集度）を算出する。
【００２４】
▲１▼HBe抗体感作ラテックス試薬の調製
HBe抗体（マウスモノクローナル抗体、市販品）60μgを含むGTA緩衝液（0.53mg/ml 3,3-ジメチルグルタル酸, 0.4mg/ml トリス, 0.35mg/ml  2-アミノ-2-メチル-1,3-プロパンジオール, pH4.6）950μlに、10%ポリスチレンラテックス（粒径約0.7μ, 市販品）50μlを加えて2時間静置した。これを10000×g, 10分間遠心し、沈殿に1% 牛血清アルブミン（市販品）を含むGTA緩衝液を1ml加えて、超音波処理した。この遠心から超音波処理までの工程を数回繰り返し、最後に遠心して沈殿に220mg/ml グリセリン、0.3% 牛血清アルブミンを含むGTA緩衝液（pH6.2)  1mlを加えて、超音波処理した。これをHBe抗体感作ラテックス試薬とした。
【００２５】
▲２▼反応緩衝液の調製
1.6mg/ml 3,3-ジメチルグルタル酸、1.1mg/ml 2-アミノ-2-メチル-1,3-プロパンジオール、18.18mg/ml トリス、5% 牛血清アルブミン、0.8% デキストラン（市販品）、pH6.70を調製し、反応緩衝液とした。
【００２６】
▲３▼ＨＢｅＡｇ高濃度試料の測定
被検試料として、Chemicon社RECOMBINANT HEPATITIS B"e" ANTIGENを陰性プール血清で希釈して０〜１０００００ｎｇ／ｍｌのＨＢｅＡｇ濃度既知試料を調製し、測定を行った。なお、抗原濃度は、メーカー測定法に準じて測定した。
【００２７】
全自動免疫凝集測定装置PAMIA-50を使用して、▲２▼で調製した反応緩衝液80μlと、上記で調製したHbeＡｇ濃度既知試料10μlを混合し、▲１▼で調製したHBe抗体感作ラテックス試薬10μlを加えて反応を開始した。反応温度は45℃とした。
【００２８】
反応開始後３０秒後に反応液19μlを回収して、凝集度（P/T: 2個以上凝集したラテックス粒子の数  ÷  ラテックス粒子の総数  ×  １００）を測定し、この値をT1とした。
【００２９】
反応開始後１５分後に反応液19μlを回収して、同様に凝集度を測定し、この値をT2とした。
【００３０】
結果を図１に示す。抗原濃度の上昇に伴い、Ｐ／Ｔは増加するが、抗原濃度が高すぎると、反応時間１５分後のＰ／Ｔ（Ｔ２）は６０％付近で頭打ちになる。
【００３１】
一方、反応時間３０秒後のＰ／Ｔ（Ｔ１）に着目すると、反応は頭打ちにならず、Ｔ２が頭打ちになるような抗原濃度においても、濃度とともに増加していることがわかる。
【００３２】
▲４▼各コントロールの調製
5% 牛血清アルブミンを含むPBS溶液（1.7mg/ml リン酸二水素ナトリウム、8.8mg/ml 塩化ナトリウム, pH 7.0）を調製し、陰性コントロールとした。
陰性コントロールにHBeリコンビナント抗原（市販品）を4ng/mlになるように添加したものをカットオフコントロールとした。
【００３３】
陰性コントロールにHBeリコンビナント抗原（市販品）を1000ng/mlになるように添加したものを陽性コントロールとした。
【００３４】
▲５▼HBe強陽性検体の希釈試料の調製
まずＢ型肝炎スクリーニング検査（HBs抗原、HBs抗体）で陰性と確認された血清をプールして、陰性プール血清を調製した。
【００３５】
次に市販のHBe強陽性検体（Clinical Science Laboratories社  ID:#19981001001）を陰性プール血清で順次２倍に希釈して、希釈試料の系列を調製した。
【００３６】
▲６▼コントロールの測定
全自動免疫凝集測定装置PAMIA-50を使用して、▲２▼で調製した反応緩衝液80μlと、▲４▼で調製したコントロール10μlを混合し、▲１▼で調製したHBe抗体感作ラテックス試薬10μlを加えて反応を開始した。反応温度は45℃とした。
【００３７】
反応開始後３０秒後に反応液19μlを回収して、凝集度（P/T: 2個以上凝集したラテックス粒子の数  ÷  ラテックス粒子の総数  ×  １００）を測定し、この値をT1とした。
【００３８】
反応開始後１５分後に反応液19μlを回収して、同様に凝集度を測定し、この値をT2とした。
【００３９】
この結果を表1に示す。各3回の測定結果の平均を算出し、▲７▼及び▲８▼においてカットオフインデックスの計算におけるパラメータとして利用した。
【００４０】
【表１】
0004404994.tif 000004
【００４１】
▲７▼HBe強陽性検体の希釈試料の測定
▲６▼と同様の方法で、▲５▼で調製した希釈試料を測定した。この測定結果を図２に、また、▲６▼で算出したパラメータを利用して従来法の計算式（式４）に当てはめて計算したカットオフインデックス、及び判定（1.0以上を＋：陽性、未満を−：陰性）、本発明の計算式（式３）に当てはめて計算したカットオフインデックス、及び判定を表2に示した。ここで本発明における切替ポイントＡは任意に設定できるが、今回はT1の測定値で1.00に設定して計算した。
【００４２】
【表２】
0004404994.tif 000005
【００４３】
表2において希釈倍率×１６以上の試料では、T1が切替ポイント未満のため、従来法と本発明で同じカットオフインデックスを示し、判定も同じである。このことにより臨床診断において最も重要である陰性・陽性の判定においては、従来と変わらない性能を持っていることが示された。
【００４４】
希釈倍率×１から×８の試料では、従来法では計算値が160程度で頭打ちになってしまうのに対して、本発明では希釈倍率に応じた計算値の伸びが見られた。
【００４５】
このことを更に明瞭にするため、表2の結果を図示したものを図３に示す。希釈倍率×１６以上ではカットオフインデックスの推移は直線的であり、希釈倍率と相関していることがわかる。このことはカットオフインデックスの推移が試料中のHBe抗原の濃度を反映したものであることを示している。希釈倍率×１から×８では、本発明でのみほぼ直線的な推移を示しており、この推移は×１６以上の推移を直線的に伸長したものになっている。このことから、本発明によって抗原濃度を反映したカットオフインデックスの推移が高濃度側に伸長し、より高濃度の試料の測定が可能になった（測定レンジが高濃度側に拡大された）ことが示された。
【００４６】
▲８▼実際の検体の測定
幾つかのHBe陽性検体についても▲６▼と同様の方法で測定した。この結果を表3に示す。T1が切替ポイント1.00に満たない検体（No.1, No.3, No.6, No.7）については従来法と同じカットオフインデックスが算出された。T1が切替ポイント1.00を超える検体のうち、特にNo.2とNo.4については、従来法でそれぞれ156.05, 166.34とほとんど近い値を示しているのに対し、本発明ではそれぞれ715.90, 1589.30と明らかな差となって表れている。
【００４７】
【表３】
0004404994.tif 000006
【００４８】
このことから、▲７▼で示された測定レンジの高濃度側への拡大が、実際の検体の測定においても有効であることが示された。
【００４９】
【発明の効果】
本発明によれば、従来法で反応が頭打ちになるような高値検体であっても、より高濃度まで頭打ちにならずに測定できる時間帯での測定値（Ｔ１）を組み込んで計算することで測定対象成分の増減を知ることができる。したがって、低値から高値までの幅広い反応量の変動を追跡でき、治療のモニタリングに極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＨＢｅＡｇ抗原濃度とＰ／Ｔの関係を示したグラフである。
【図２】  HBe強陽性検体の希釈試料を測定した結果を示したグラフである。
【図３】本発明の方法と従来法で求めたカットオフインデックス値を比較したグラフである。
【図１】
0004404994.tif 000008
【図２】
0004404994.tif 000009
【図３】
0004404994.tif 000010