(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
造血幹細胞と血管内皮細胞とを多孔材料を介して接触させ、互いに偽足同士で接着させた状態で培養する、造血幹細胞の増殖方法。
【請求項２】
上記造血幹細胞及び上記血管内皮細胞では、レセプター型チロシンキナーゼTIE2が活性化していることを特徴とする請求項１記載の造血幹細胞の増殖方法。
【請求項３】
造血幹細胞に対する培養液と血管内皮細胞に対する培養液とを異なる組成とすることを特徴とする請求項１記載の造血幹細胞の増殖方法。
【請求項４】
上記多孔材料は外周面に多孔を有する中空糸であり、当該中空糸の内部に上記造血幹細胞を培養し、当該中空糸の外部に上記血管内皮細胞を培養することで、上記造血幹細胞と上記血管内皮細胞とを多孔材料を介して接触させ、互いに偽足同士で接着させた状態とすることを特徴とする請求項１記載の造血幹細胞の増殖方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、造血幹細胞等の臓器特異的幹細胞をインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で増殖することを可能ならしめる臓器特異的幹細胞の増殖方法及び増殖装置に関する。
【背景技術】  幹細胞は、生体内において生態学適所（ニッチとも呼ばれる）と総称される領域で未分化性と自己複製が営まれると考えられている。しかし、一般的に、本領域では、ニッチを構成する細胞が幹細胞と接着し、幹細胞の未分化性を維持しているものの、その自己複製や増殖は抑制されている。すなわち、ニッチ領域において、幹細胞は分裂を停止したいわゆる静止期に陥っていると考えられている。
幹細胞は種々の再生医療に応用できることから、生体外における幹細胞の培養技術に関して様々な試みがなされている。現在、ＥＳ細胞や成体幹細胞等において、多胚葉に分化可能な細胞レベルでの試験管内増殖の技術が確立しつつある。しかしながら、臓器特異的幹細胞については、試験管内増殖の増殖誘導は不可能である。
【特許文献１】特願２００１−３８３７３７号
【特許文献２】特願２０００−６１５７３７号
【発明の開示】
そこで、本発明は、上述した実状に鑑み、目的とする臓器特異的幹細胞を幹細胞レベルで増殖させることを可能ならしめる増殖方法及び増殖装置を提供することを目的とする。
発明者らは、上述した目的を達成するために鋭意検討した結果、幹細胞が生体内のニッチ領域で未分化性を維持し且つ静止期状態にあるという既存の概念が全ての現象を説明しうるものではなく、幹細胞が生体内のニッチ領域で未分化性を維持しながらも増殖可能であるといった環境を新規に見出すことに成功した。すなわち、本発明は以下を包含するものである。
（１）  臓器特異的幹細胞と血管内皮細胞とを緩やかに接着させた状態で培養する、臓器特異的幹細胞の増殖方法。
（２）  上記臓器特異的幹細胞と上記血管内皮細胞とは、互いに偽足同士で接着していることを特徴とする（１）記載の臓器特異的幹細胞の増殖方法。
（３）  上記臓器特異的幹細胞及び上記血管内皮細胞では、レセプター型チロシンキナーゼＴＩＥ２が活性化していることを特徴とする（１）記載の臓器特異的幹細胞の増殖方法。
（４）  上記臓器特異的幹細胞は造血幹細胞であることを特徴とする（１）記載の臓器特異的幹細胞の増殖方法。
（５）  上記臓器特異的幹細胞と上記血管内皮細胞とを、多孔材料を介して接触させた状態で培養することを特徴とする（１）記載の臓器特異的幹細胞の増殖方法。
（６）  臓器特異的幹細胞に対する培養液と血管内皮細胞に対する培養液とを異なる組成とすることを特徴とする（１）記載の臓器特異的幹細胞の増殖方法。
（７）  臓器特異的幹細胞を培養するための第１培養部と、
血管内皮細胞を培養するための第２培養部と、
上記第１培養部と上記第２培養部との間を区画する多孔部材と、
を備える臓器特異的幹細胞の培養装置。
（８）  上記多孔部材は多孔膜であり、当該多孔膜が上記第１培養部及び上記第２培養部の間に配設されたことを特徴とする（７）記載の臓器特異的幹細胞の増殖装置。
（９）  上記多孔部材は、外周面に多孔を有する中空糸であり、上記第１培養部が当該中空糸の内部であり、上記第２培養部が当該中空糸の外部であることを特徴とする（７）記載の臓器特異的幹細胞の増殖装置。
（１０）  上記第１培養部に接続された臓器特異的幹細胞供給路と、上記第２培養部に接続された血管内皮細胞供給路とを更に備えることを特徴とする（７）記載の臓器特異的幹細胞の増殖装置。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００４−１１９１７９号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】  図１は、本発明を適用した臓器特異的幹細胞の培養装置の一例を示す断面図である。
図２は、臓器特異的幹細胞の培養装置における臓器特異的幹細胞と血管内皮細胞と接着状態を模式的に示す要部断面図である。
図３は、本発明を適用した臓器特異的幹細胞の培養装置の他の例を示す斜視図である。
図４は、本発明を適用した臓器特異的幹細胞の培養装置の更に他の例を示す斜視図である。
図５は、図４に示す培養装置における臓器特異的幹細胞と血管内皮細胞と接着状態を模式的に示す要部断面図である。
図６は、ＴＩＥ２抗体、ｃ−Ｋｉｔ抗体或いはＦｌｋ−１抗体で免疫染色した胎児期マウスにおける臍腸間膜動脈近傍の写真である。
図７は、ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１によるＴＩＥ２の活性化及び細胞接着誘導を検証した結果を示す写真である。
図８は、野生型マウス並びにＴＩＥ２遺伝子のノックアウトマウスにおける臍腸間膜動脈近傍の写真である。
図９Ａは、胎児肝内における組織学的観察の結果を示し、血管内皮細胞からなる巣状網内で造血幹細胞が増殖している現場を示す写真である。
図９Ｂは、図９Ａの一部を拡大した写真である。
図９Ｃは、成体骨髄内における組織学的観察の結果を示し、血管内腔において造血幹細胞が増殖する現場を示す写真である。
図１０は、恒常的活性化型マウスＴＩＥ２遺伝子を導入したトランスジェニックマウスにおける臍腸間膜動脈内で、造血幹細胞の増殖する現場を示す写真である。
図１１は、恒常的活性化型ＴＩＥ２あるいは野生型ＴＩＥ２を発現するｂＥｎｄ３と恒常的活性化型ＴＩＥ２を発現するＢａ／Ｆ３細胞との細胞接着を検討した結果を示す写真である。
図１２は、造血幹細胞と血管内皮細胞とが緩やかに接着した状態において、造血幹細胞が自己複製したことを示す写真である。
図１３Ａ及びＢはそれぞれ、人の臍帯血から回収した造血幹細胞であっても、血管内皮細胞と緩やかな接着状態を作出することによって、増殖したことを示す写真である。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、図面を参照して本発明を詳細に説明する。
臓器特異的幹細胞の培養方法
本発明に係る臓器特異的幹細胞の培養方法においては、増殖目的である臓器特異的幹細胞を血管内皮細胞に対して緩やかに接着させて培養する。本発明において、臓器特異的幹細胞とは、特定の臓器への分化する機能を有する成体幹細胞である。臓器特異的幹細胞としては、造血幹細胞、神経幹細胞、血管幹細胞、心筋幹／前駆細胞、神経幹細胞、肝幹細胞等をあげることができる。中でも本発明に係る臓器特異的幹細胞の増殖方法及び増殖装置では、臓器特異的幹細胞として造血幹細胞を適用することが好ましい。
臓器特異的幹細胞として造血幹細胞を使用する場合、造血幹細胞は、例えば、骨髄から回収した骨髄細胞群、臍帯血、末梢血、胎児肝臓、胎児脾臓をはじめ全身から採取することができる。より具体的に造血幹細胞は、臍帯血あるいは骨髄や末梢血から回収した単核球成分から、フローサイトメトリー等を用いて、Ｌｉｎ陰性、ｃ−Ｋｉｔ陽性及びＣＤ３４陽性（あるいは陰性）細胞として単離することができる。
また、血管内皮細胞は、例えば、骨髄から回収した骨髄細胞群、臍帯血、臍帯静脈、臍帯動脈を初め全身から採取することができる。より具体的に血管内皮細胞は、骨髄から回収した骨髄細胞群から、フローサイトメトリー等を用いて、ＣＤ４５陰性及びＣＤ３１陽性細胞として単離することができる。
なお、臓器特異的幹細胞及び血管内皮細胞は、いかなる動物に由来するものであってもよいが、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット等を挙げることができる。特に本発明に係る増殖方法によって得られた臓器特異的幹細胞を再生医療に用いる場合には、再生医療対象の患者から採取した臓器特異的幹細胞及び血管内皮細胞を使用することが好ましい。
本発明に係る増殖方法では、臓器特異的幹細胞を血管内皮細胞に対して緩やかに接着させる。緩やかな接着とは、組織学的な観察上、造血幹細胞が血管内皮細胞と完全には解離することなく血管内皮細胞の近傍で増殖していることから、血管内皮細胞の近傍に臓器特異的幹細胞が存在する状態を意味する。また、組織学的に緩やかな接着とは、臓器特異的幹細胞と血管内皮細胞とが偽足を介して接着した状態と定義することもできる。なお、臓器特異的幹細胞と血管内皮細胞とが緩やかに接着している状態においては、少なくとも、臓器特異的幹細胞と血管内皮細胞とが分泌する分子の影響を互いに受けうる距離を有している。より具体的に臓器特異的幹細胞と血管内皮細胞とが緩やかに接着している状態においては、臓器特異的幹細胞と血管内皮細胞との距離が１〜１０μｍ程度の距離を有していることが好ましい。より具体的に、中空糸の外側に血管内皮細胞、中空糸の内側に臓器特異的幹細胞を位置させることにより、臓器特異的幹細胞を血管内皮細胞に対して緩やかに接着させることができる。
臓器特異的幹細胞を増殖させる際の培養条件としては、特に限定されず一般的に動物細胞の培養に用いられる培地及び各種条件（温度、ｐＨ、ＣＯ２等の条件）をそのまま或いは改変して適用することができる。培養液としては、例えば、ＤＭＥＭ培養液、ＭＥＭ培養液、α−ＭＥＭ培養液、ＲＰＭＩ培養液、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液等を挙げることができる。また、これら培養液に適量の牛血清を添加したものを使用してもよい。添加される牛血清の量は、特に限定されず、細胞の起源や種類に応じて適宜設定される。好ましくは０％〜２０％、より好ましくは５％〜１０％程度の牛血清を添加するとよい。牛血清に代えて、ニュートリドーマ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ社製）、ヒト血清等を使用してもよい。培養温度やＣＯ２等の条件は、用いる細胞の性質に応じて適宜設定されるが、一般に４〜６％ＣＯ２、３３〜３７℃で行われる。細胞の培養期間も特に限定されず、臓器特異的幹細胞の増殖が終了するまで、適宜培地交換を行いながら培養を行えばよい。
なお、本発明に係る増殖方法によって臓器特異的幹細胞を増殖するとともに、増殖した臓器特異的幹細胞に分化を誘導してもよい。分化を誘導するには、細胞の分化増殖を促すサイトカインを適宜培養液に添加してもよい。そのようなサイトカインとしては、例えば、ＥＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＨＧＦ等のＥＧＦファミリー、ＴＧＦ−α、β、ＢＭＰ等のＴＧＦファミリー、ＩＬ−１〜１７のＩＬファミリー、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｅｐｏ、ＴＰＯ、ＳＣＦなどのサイトカイン、ＶＥＧＦ−Ａ等のＶＥＧＦファミリー、ＰＤＧＦ−ＢＢ等のＰＤＧＦファミリー、エフリンＢ等のエフリンファミリー、ＬＩＦ、ＴＮＦαなどを挙げることができる。
添加されるサイトカインの量は、用いるサイトカインや細胞の性質に応じて適宜設定される。例えば、臓器特異的幹細胞として造血幹細胞を使用した場合、ＩＬ−１〜１７のＩＬファミリー、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｅｐｏ、ＴＰＯ、ＳＣＦなどのサイトカインによって造血幹細胞を血液細胞に分化させることができる。
臓器特異的幹細胞の培養装置
本発明に係る臓器特異的幹細胞の増殖装置は、上述したような臓器特異的幹細胞の増殖を可能とする、臓器特異的幹細胞を血管内皮細胞に対して緩やかに接着させた状態を維持できる構成を有するものである。すなわち、本発明に係る増殖装置は、臓器特異的幹細胞を血管内皮細胞に対して緩やかに接着させた状態を維持して当該臓器特異的幹細胞を培養する装置である。
このような増殖装置の一例としては、図１に示す増殖装置を挙げることができる。この増殖装置は、臓器特異的幹細胞を培養するための第１培養部１と、血管内皮細胞を培養するための第２培養部２と、第１培養部１及び第２培養部２の間を区画する多孔部材３とを備える。また、図示しないが、図１に示す増殖装置は、第１培養部１内に臓器特異的幹細胞を含む培養液を供給するための供給路、及び第２培養部２内に血管内皮細胞を含む培養液を供給するための供給路を備えることが望ましい。
第１培養部１及び第２培養部２は、例えば、一般的に動物細胞の培養に使用される培養皿等の所定の厚みを有する容器を使用することができる。多孔部材３は、０．１〜３０μｍ径、好ましくは１〜１０μｍ径、より好ましくは２〜５μｍ径の孔４が形成された膜を使用することができる。多孔部材３は、１〜２００μｍ、好ましくは２〜８０μｍ、より好ましくは５〜１０μｍの厚みであることが好ましい。より具体的に多孔部材３としては、ポリエチレン、セルロースジアセテート、ポリアクリロニトリル、ポリスルフォン、ポリメチルメタクリレート、ポリフェニレンエーテル、ポリカーボネート、ポリ乳酸、ポリカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリイミドなどがあげられるがこれに限定されるものではない。
多孔部材３の表面には、細胞マトリックス成分がコーティングされていることが好ましい。細胞マトリックス成分をコーティングすることによって、多孔部材３の表面に対する臓器特異的幹細胞及び血管内皮細胞の接着を促進することができる。細胞マトリックス成分としては、特に限定されないが、ビトロネクチン及び／又はフィブロネクチンを使用することができる。
このように構成された増殖装置を用いて臓器特異的幹細胞を増殖させるには、先ず、第１培養部１に臓器特異的幹細胞を含む培養液を供給するとともに、第２培養部２に血管内皮細胞を含む培養液を供給する。第１培養部１に供給された臓器特異的幹細胞及び第２培養部２に供給された血管内皮細胞とは、多孔部材３を介して緩やかに接着することとなる。すなわち、図２に模式的に示すように、血管内皮細胞６は、その細胞質を孔４から第１培養部１内に向かって突出させ、臓器特異的幹細胞５に対して緩やかに接着することとなる。
この状態で、上述した「臓器特異的幹細胞の培養方法」で記載した培養条件を設定することによって、第１培養部１内の臓器特異的幹細胞を増殖させることができる。
また、本発明に係る増殖装置の他の例としては図３に示すような増殖装置を挙げることができる。図３に示す増殖装置は、複数の第１培養部１ａ、１ｂと、複数の第２培養部２ａ、２ｂ、２ｃとを交互に重ね合わせた構成である。この増殖装置において、多孔部材３は、第２培養部２ａと第１培養部１ａの間、第２培養部２ｂと第１培養部１ａの間、第２培養部２ｂと第１培養部１ｂの間、第２培養部２ｃと第１培養部１ｂの間にそれぞれ配設されている。また、図３に示す増殖装置は、複数の第１培養部１ａ、１ｂ及び複数の第２培養部２ａ、２ｂ、２ｃに独立して培養液等を供給できるように、複数の第１培養部１ａ、１ｂ及び複数の第２培養部２ａ、２ｂ、２ｃそれぞれに連結された供給路７及び排出路８を備えている。
このように構成された増殖装置であっても、図１に示した増殖装置と同様にして臓器特異的幹細胞を増殖させることができる。また、複数の培養部１ａ及び１ｂにおいて、それぞれ異なる種類の臓器特異的幹細胞を増殖させることもできるし、同種の臓器特異的幹細胞を増殖させることも可能である。
さらに、本発明に係る増殖装置の他の例としては、図４に示すように、多孔部材からなる複数の中空糸１０を備え、中空糸１０の内側の空間を第１培養部とし、複数の中空糸１０の外側に形成される間隙を第２培養部とする増殖装置を挙げることができる。なお、図４は、増殖装置を模式的に示す図であり、複数の中空糸１０以外の構成は省略して示している。
多孔部材からなる中空糸１０としては、例えば、ポリエチレン、セルロースジアセテート、ポリアクリロニトリル、ポリスルフォン、ポリメチルメタクリレート、ポリフェニレンエーテル、ポリカーボネート、ポリ乳酸、ポリカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリイミドなどを使用することができるがこれに限定されるものではない。
図４に示す増殖装置は、例えば、複数の中空糸１０の両端部を除いた領域を、血管内皮細胞を含む培養液に浸漬するとともに、複数の中空糸１０の一方端部から臓器特異的幹細胞を含む培養液を供給して使用することができる。或いは、図４に示す増殖装置は、図示しないが、複数の中空糸１０の全体を挿入するに足る形状の筒状部材を備えるものであってもよい。この場合、増殖装置は、筒状部材内部に複数の中空糸１０を挿入した状態で、筒状部材内面と複数の中空糸１０の外周面とで形成される空間に血管内皮細胞を含む培養液を供給するとともに、複数の中空糸１０の一方端部から臓器特異的幹細胞を含む培養液を供給して使用することができる。
図４に示す増殖装置においても、複数の中空糸１０内に供給された臓器特異的幹細胞及び複数の中空糸１０で形成される間隙に供給された血管内皮細胞とは、中空糸の外面（多孔部材）を介して緩やかに接着することとなる。すなわち、図５に模式的に示すように、血管内皮細胞６は、その細胞質を孔４から中空糸内に向かって突出させ、臓器特異的幹細胞５に対して緩やかに接着することとなる。
この状態で、上述した「臓器特異的幹細胞の培養方法」で記載した培養条件を設定することによって、中空糸内の臓器特異的幹細胞を増殖させることができる。特に、中空糸の内腔で臓器特異的幹細胞を培養することによって、当該臓器特異的幹細胞が細胞塊を形成しやすい環境を実現することができる。すなわち、図４に示す増殖装置において中空糸の内腔で構築される環境は、生体における血管内をより正確に疑似させていると言える。
再生医療への応用
本発明に係る臓器特異的幹細胞の製造方法及び製造装置によれば、従来において困難であったインビトロにおける臓器特異的幹細胞の増殖が可能となる。また、得られた臓器特異的幹細胞の分化を誘導して所望の臓器細胞（血球細胞、神経細胞など）を取得することも可能となる。得られた臓器細胞或いは臓器特異的幹細胞は、再生医療に使用することができる。
特に、材料となる臓器特異的幹細胞や血管内皮細胞として、移植すべき哺乳動物個体のものを用いれば、当該哺乳動物において拒絶反応を起こすことなく移植可能な臓器特異的幹細胞や臓器細胞を得ることができる。すなわち、本発明の方法で得られる臓器特異的幹細胞や臓器細胞は、拒絶反応を防止した再生医療に好適に利用することができる。したがって、本発明による心再生は医療業界に対する多大な貢献をもたらす。
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】造血幹細胞の組織学的性質
本発明者等の既報（Ｔａｋａｋｕｒａ  Ｎ．，Ｈｕａｎｇ  Ｘ．Ｌ．，Ｎａｒｕｓｅ  Ｔ．，Ｈａｍａｇｕｃｈｉ  Ｉ．，Ｄｕｍｏｎｔ  Ｄ．Ｊ．，Ｙａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ  Ｇ．Ｄ．＆  Ｓｕｄａ  Ｔ．：Ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＴＩＥ２  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ９：６７７−６８６  １９９８）によれば、図６に示すように、胎児期の造血幹細胞は先ず、臍腸間膜動脈という胎児と卵黄嚢を連結する唯一の動脈内で発生している。そして、造血幹細胞は、当該動脈内において血管内皮細胞に接着し細胞塊を形成している。
また、同報によれば、造血幹細胞の膜に発現するレセプター型チロシンキナーゼＴＩＥ２が、そのリガンドであるａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１により活性化することにより、コラーゲンやフィブロネクチンへの造血幹細胞の細胞接着が誘導される。つまり、造血組織において観察される造血幹細胞増殖領域において、血管内皮細胞へ造血幹細胞の接着は、造血幹細胞が分泌するａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１が自らのＴＩＥ２を活性化することによって生じることが示唆されている（図７参照）。
さらに、同報によれば、ＴＩＥ２ノックアウトマウスでは、胎児期の造血幹細胞の血管内皮細胞への接着とクラスター形成が観察される臍腸間膜動脈内で造血幹細胞の接着が認められない。このことから、ＴＩＥ２は、マトリックスへの細胞接着機能を介して、造血幹細胞の血管内皮細胞への接着に関与していることが明らかとなっている（図８参照）。
さらにまた、造血組織である胎児肝における組織学的観察を行ったところ、図９Ａ及びＢに示すように、造血幹細胞は血管内皮細胞に包囲され、血管内皮細胞からなる巣状網内で造血幹細胞が増殖している現場が存在することを解明した。組織学的解析によって、図９Ａ及びＢに示す領域において造血幹細胞は、血管内皮細胞とは強固に接着せず、偽足様構造により連結した状態で増殖していることが明らかとなった。成体骨髄内の造血幹細胞の局在を解析したところ、図９Ｃに示すように、一部の血管領域で、血管内腔において造血幹細胞が増殖する現場を解明した。
図９Ａ乃至Ｃの結果より、造血幹細胞は、血管内皮細胞と強固に接着せず、血管内皮細胞と緩やかに接着した状態で増殖することが明らかとなった。
【実施例２】  本実施例では、実施例１で得られた知見に基づいて、造血幹細胞と血管内皮細胞との接着の強弱が造血幹細胞の増殖に与える影響を検討した。
先ず、恒常的活性化型マウスＴＩＥ２遺伝子を以下のように作製した。野生型マウスＴＩＥ２において、膜直下領域に位置する８４９番目のＡｒｇをＴｒｐに変化させるように、変異型マウスＴＩＥ２遺伝子を構築した。恒常的活性化型マウスＴＩＥ２は、ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１が結合することなしに、二量体を形成することができ、恒常的に活性化する。
次に、定法に従い、得られた恒常的活性化型マウスＴＩＥ２遺伝子を、ＴＩＥ２プロモーター制御下で発現するようにしたトランスジェニックマウスを作製した。本マウスは妊娠１０日目に貧血により死亡した。妊娠９日目の胎児をワックス内に包埋し、切片をこの時期の造血幹細胞と血管内皮細胞の両者に発現するＣＤ３１に対する抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）で免疫染色した。９日目の野生型マウス胎児では臍腸間膜動脈内で造血幹細胞の増殖する現場が観察されるが（図１０左）、恒常的活性化型ＴＩＥ２を発現するマウスでは血管内に存在するＣＤ３１陽性造血幹細胞が形態的に扁平な形状を呈して血管内皮細胞に強固に接着しており、正常マウスと比べ造血幹細胞数も減少していることが判明した（図１０右）。
この結果より、造血幹細胞を増殖させるには、造血幹細胞の近傍に血管内皮細胞が存在せねばならないが、造血幹細胞と血管内皮細胞とが強固に接着した状態では造血幹細胞の増殖を阻害することが判明した。
【実施例３】  本実施例では、実施例２の結果を踏まえ、インビトロで恒常的活性化型ＴＩＥ２による血液細胞株と血管内皮細胞株との接着誘導を検討した。
先ず、ｐＭｙレトロウイルスベクターに、実施例２で作製した恒常的活性化型ＴＩＥ２遺伝子および野生型のＴＩＥ２遺伝子を組み込み、常法に従いウイルス液を作製した。次に、ウイルス液を用いてＢａ／Ｆ３（Ｂリンパ球前駆細胞株＝血液細胞株）とｂＥｎｄ３（血管内皮細胞株）にレトロウイルスを感染させ、各細胞株に恒常的活性化型ＴＩＥ２或いは野生型ＴＩＥ２を発現させた。
次に、恒常的活性化型ＴＩＥ２あるいは野生型ＴＩＥ２を発現するｂＥｎｄ３をＰＫＨ６７（Ｓｉｇｍａ社製）で緑の蛍光色に染色し、通常のｂＥｎｄ３細胞と１０４個の細胞同士を混ぜ合わせて、径３ｃｍの培養皿で培養した。培養後、恒常的活性化型ＴＩＥ２を発現するＢａ／Ｆ３細胞をＰＫＨ２６（Ｓｉｇｍａ社製）で赤色の蛍光色にラベルし、先のｂＥｎｄ３細胞上に１０４個を播種した。１時間静置後、培養皿内で浮遊する細胞を回収し、赤色の蛍光標識されたＢａ／Ｆ３細胞の接着状況を蛍光顕微鏡（ＩＸ−７０：オリンパス社製）にて観察した。
結果を図１１に示す。図１１右は野生型ＴＩＥ２を発現するｂＥｎｄ３細胞上に恒常的活性化型ＴＩＥ２を発現するＢａ／Ｆ３細胞を播種した結果を示し、図１１左は恒常的活性化型ＴＩＥ２を発現するｂＥｎｄ３細胞上に恒常的活性化型ＴＩＥ２を発現するＢａ／Ｆ３細胞を播種した結果を示す。
この結果より、恒常的活性化型ＴＩＥ２を発現するｂＥｎｄ３細胞と、恒常的活性化型ＴＩＥ２を発現するＢａ／Ｆ３細胞とは選択的に接着することが明らかとなった。血管内皮細胞にもＴＩＥ２が発現することから、造血幹細胞が分泌するａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１は、血管内皮細胞に発現するＴＩＥ２も活性化することが判明した。そして、造血幹細胞を増殖させるには、造血幹細胞に発現したＴＩＥ２及び血管内皮細胞に発現したＴＩＥ２が共に活性化していることが好条件であることが明らかとなった。
【実施例４】  本実施例では、インビトロにおける造血幹細胞の増殖を検討した。
先ず、８週齢のＣ５７Ｂ１／６マウスの骨髄から常法を用いて骨髄細胞を回収した。次に、骨髄細胞をＣＤ４５、ＣＤ３１の抗体（いずれもＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）にて染色して、ＣＤ４５陰性ＣＤ３１陽性の血管内皮細胞をフローサイトメトリー（Ｅｐｉｃｓ  ｃｏｕｌｔｅｒ社製）にて回収した。また、同時に血液細胞分化抗原（ＣＤ４，ＣＤ８，Ｂ２２０，Ｍａｃ−１，Ｇｒ−１，ＴＥＲ１１９）に対する抗体（総称してＬｉｎ抗体；いずれもＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）およびｃ−Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）とＴＩＥ２に対する抗体で骨髄細胞を染色し、Ｌｉｎ陰性ｃ−Ｋｉｔ陽性ＴＩＥ２陽性の造血幹細胞を上記と同様に回収した。
次に、１０４個の血管内皮細胞を、コラーゲンコートした径３ｃｍの培養皿（旭テクノグラス社製）上で、ＲＰＭＩ１６４０（Ｓｉｇｍａ社製）と１０％牛血清を含む培養液にＶＥＧＦ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を最終濃度１０ｎｇ／ｍｌを添加した培養液で３日間培養した。培養後、生存した血管内皮細胞上に造血幹細胞を１０３個播種し、ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒ（ＳＣＦ）を最終濃度５０ｎｇ／ｍｌとなるよう添加して更に培養した。
血管内皮細胞の近傍で増殖する造血幹細胞は、再度ＴＩＥ２に対する抗体により免疫染色して、蛍光顕微鏡（オリンパス社製）下で観察した。その結果を図１２に示す。図１２左は位相差顕微鏡画像であり、図１２右は蛍光顕微鏡画像である。
この結果から、造血幹細胞と血管内皮細胞とが緩やかに接着した状態において、造血幹細胞が２〜３日の培養によって２〜３個に自己複製できることが証明された。
また、異なる実験系で同様にインビトロにおける造血幹細胞の増殖を検討した。
先ず、血管内皮細胞株ＭＳＳ３１を通常の培養皿上でＲＰＭＩ１６４０（Ｓｉｇｍａ社製）を基本培地として１０％牛血清を含む培養液中で培養しｃｏｎｆｌｕｅｎｔな状態とした。同時に、実施例３と同様にして恒常的活性化型ＴＩＥ２を遺伝子導入したＭＳＳ３１も同条件で培養しｃｏｎｆｌｕｅｎｔな状態とした。
次に、人の臍帯血よりフィコール（アマシャム社製）を用いて単核球成分を分画採取した。さらにヒトＬｉｎ抗体（コールター社製）、ｃ−Ｋｉｔ及びＣＤ３４に対する抗体（いずれもＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）を用いてＬｉｎ陰性ｃ−Ｋｉｔ陽性ＣＤ３４陽性細胞として造血幹細胞をフローサイトメトリー（Ｅｐｉｃｓ  ｃｏｕｌｔｅｒ社製）を用いて回収した。
次に、回収された造血幹細胞をＰＫＨ２６（Ｓｉｇｍａ社製）で赤く蛍光標識した。得られた１０３個の造血幹細胞分画を前述した野生型ＭＳＳ３１及び恒常的活性化型ＴＩＥ２導入ＭＳＳ３１上に播種し、ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒ（ＳＣＦ）を最終濃度５０ｎｇ／ｍｌとなるよう添加して３日間培養し、幹細胞の状況を蛍光顕微鏡下で観察した。その結果を図１３Ａ及びＢに示す。図１３Ａ左は野生型ＭＳＳ３１を用いた場合の位相差顕微鏡画像であり、図１３Ａ右は野生型ＭＳＳ３１を用いた場合の蛍光顕微鏡画像である。図１３Ｂ左は恒常的活性化型ＴＩＥ２導入ＭＳＳ３１を用いた場合の位相差顕微鏡画像であり、図１３Ｂ右は恒常的活性化型ＴＩＥ２導入ＭＳＳ３１を用いた場合の蛍光顕微鏡画像である。
この結果から、人の臍帯血から回収した造血幹細胞であっても、血管内皮細胞と緩やかな接着状態を作出することによって、増殖可能であることが判明した。
【産業上の利用可能性】  本発明によれば、造血幹細胞等の臓器特異的幹細胞の新規な増殖方法及び増殖装置を提供することができる。本発明によれば、臓器特異的幹細胞をインビトロにおいて増殖させるシステムを確立させることができ、再生医療に臓器特異的幹細胞を広く利用することが可能となる。したがって、本発明は、特に再生医療業界に多大な貢献をもたらす。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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