(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：４または５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項２】
配列番号：４または５に記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、および／または付加したアミノ酸配列からなり、精巣細胞分化誘導活性を有するタンパク質。
【請求項３】
配列番号：１または３に記載の塩基配列からなるDNAにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードするタンパク質であって、精巣細胞分化誘導活性を有するタンパク質。
【請求項４】
請求項１から３のいずれかに記載のタンパク質をコードするDNA。
【請求項５】
請求項４に記載のDNAを含むベクター。
【請求項６】
請求項４に記載のDNAを発現可能に保持する形質転換体。
【請求項７】
請求項６に記載の形質転換体を培養し、該形質転換体またはその培養上清から発現させたタンパク質を回収する工程を含む、請求項１から３のいずれかに記載のタンパク質を製造する方法。
【請求項８】
請求項１から３のいずれかに記載のタンパク質に特異的に結合する抗体。
【請求項９】
配列番号：１から３のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAに特異的にハイブリダイズし、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するDNA。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、精巣細胞の分化に関与するタンパク質および遺伝子に関し、生物科学分野、詳しくは発生生物の分野に属する。
背景技術
発生過程の中で、生殖細胞は体細胞とは異なる減数分裂を含む分化過程を経て精子形成を行う。これら精子形成の分化過程の段階は大きく分けて三つある。第一段階は、精原細胞の増殖と精母細胞への分化、第二段階は精母細胞の減数分裂、第三段階は精子への変態である。
近年、分子生物学の発達により、これらのステージに特異的な遺伝子発現をする遺伝子がいくつか単離された。例えば、精母細胞特異的な遺伝子として、Ｈｏｘ−１．４（Ｐｒｏｐｓｔ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２：２２７−３３）、ＨＳＰ７０のファミリーであるｆｅｒＴ（Ｓａｒｇｅ，Ｋ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ  ５０：１３３４−１３４３）、セリンスレオニンキナーゼであるＴＥＳＫ１（Ｔｏｓｈｉｍａ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：３１３３１−３１３３７）が報告されている。しかしながら、これらの遺伝子産物についての生物的及び物理的な役割については、いまだ知見に乏しい。
生殖細胞の分化過程特異的な発現をする遺伝子はそれぞれの生殖細胞の運命を決定づける基本的で重要な役割を担っており、その異常は不妊疾患などの原因となることが予想される。このため生殖細胞の分化過程に特異的な発現を示す遺伝子は、不妊疾患など生殖細胞分化の異常に起因する疾患の予防または治療のための医薬品開発の標的として、近年注目されている。
発明の開示
本発明は、精巣細胞の分化に関係する新規なタンパク質および該タンパク質をコードする遺伝子を提供する。また、本発明は、該タンパク質の製造などに用いられるベクター、形質転換体、および該タンパク質の製造方法を提供する。さらに、本発明は、該遺伝子の単離、検出などに用いられるオリゴヌクレオチドを提供する。
本発明者等は、細胞死を引き起こす未知のタンパク質をコードする遺伝子の発現を検討していたところ、偶然にも、初期の目的とは異なる、精巣特異的に発現する新規な遺伝子を単離するに至った。本発明者等は、単離した遺伝子につきデーターベース検索を行ったところ、該遺伝子はデーターベース上に有意な相同性を示す遺伝子が存在しない新規な遺伝子であった。該遺伝子がコードするタンパク質の構造につき解析を行ったところ、タンパク質はその一部において金属結合因子として知られているメタロチオネインの金属結合部位と同様な構造を保持していた。組織における発現解析においては、該遺伝子は精巣、特に精母細胞において極めて特異的に発現していた。一方、不妊マウスの精巣においては、その発現が認められなかった。また、マウス、ヒト染色体における該遺伝子の存在位置につき解析を行ったところ、不妊マウスとして異常が知られている遺伝子座と同様の場所に存在していた。これらの解析結果から、単離した遺伝子がコードするタンパク質が精巣の分化制御に関与していると考えられる。
本発明は、金属結合部位を有し、精巣分化の制御に関与する新規なタンパク質及びその遺伝子に関し、より具体的には、
（１）  配列番号：４または５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（２）  配列番号：４または５に記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、および／または付加したアミノ酸配列からなり、（１）に記載のタンパク質と機能的に同等なタンパク質、
（３）  配列番号：１または３に記載の塩基配列からなるＤＮＡにハイブリダイズするＤＮＡがコードするタンパク質であって、（１）に記載のタンパク質と機能的に同等なタンパク質、
（４）  （１）から（３）のいずれかに記載のタンパク質をコードするＤＮＡ、
（５）  （４）に記載のＤＮＡを含むベクター、
（６）  （４）に記載のＤＮＡを発現可能に保持する形質転換体、
（７）  （６）に記載の形質転換体を培養し、該形質転換体またはその培養上清から発現させたタンパク質を回収する行程を含む、（１）から（３）のいずれかに記載のタンパク質を製造する方法、
（８）  （１）から（３）のいずれかに記載のタンパク質に結合する抗体、
（９）  配列番号：１から３のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡに特異的にハイブリダイズし、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するＤＮＡ、を提供するものである。
本発明は、精原細胞から精母細胞への分化を制御していると考えられるＴｅｓｍｉｎタンパク質およびその遺伝子を提供する。
本発明者らは、転写過程におけるスプライシングの相違によると考えられる２種類のマウス由来のＴｅｓｍｉｎ  ｃＤＮＡを単離した。これらｃＤＮＡの塩基配列を配列番号：１および配列番号：２に、これらｃＤＮＡがコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：４に示す。また、本発明者らにより単離されたヒト由来のＴｅｓｍｉｎ  ｃＤＮＡの塩基配列を配列番号：３に、該ｃＤＮＡによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：５に示す。
配列番号：１および２に示すように、マウス由来のＴｅｓｍｉｎ  ｃＤＮＡは、２９５アミノ酸からなるタンパク質をコードするＯＲＦを有する。一方、配列番号：３に示すように、ヒト由来のＴｅｓｍｉｎ  ｃＤＮＡは２９９アミノ酸からなるタンパク質をコードするＯＲＦを有する。３５Ｓラベルしたメチオニンを用いたマウスＴｅｓｍｉｎインビトロ翻訳産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果、マウスのＴｅｓｍｉｎタンパク質は３２．５ｋＤａの分子量を示した（図３）。
また、ノーザンブロット解析及びＲＴ−ＰＣＲ法解析により、マウスおよびヒトＴｅｓｍｉｎ遺伝子は、それぞれ生体内組織の中で精巣にのみ発現している遺伝子であることが示された（図１、２）。ＲＴ−ＰＣＲ法による解析において、Ｔｅｓｍｉｎ遺伝子は、生後８日目までの未分化の状態ではほとんど発現が見られず、精分化が始まる１２日目以降発現が高まり、生後１８日目以降安定して高発現となる遺伝子であるということが示された。不妊マウスとして知られている、増殖因子レセプター「ｃ−ｋｉｔ」遺伝子を欠損したＷ／Ｗｖマウスにおいては、成熟した生後５２日目においても、Ｔｅｓｍｉｎ遺伝子の発現がほとんど見られなかった（図４）。これらの事実は、Ｔｅｓｍｉｎタンパク質が、精巣の分化に関与していることを示唆する。Ｔｅｓｍｉｎタンパク質やその遺伝子は、例えば、不妊病の治療などへの応用が考えられる。
本発明のＴｅｓｍｉｎタンパク質は、該タンパク質をコードするＤＮＡ（例えば、配列番号：１から３に記載の塩基配列を有するＤＮＡ）を、適当な発現ベクターに組み込み、これを適当な宿主細胞に導入して得た形質転換体から精製することにより調製することが可能である。さらに、遺伝子組み換え技術を利用した組み換えタンパク質として、後述するようにＴｅｓｍｉｎタンパク質をコードするＤＮＡで形質転換した細胞を培養することにより調製することが可能である。一方、天然のタンパク質は、当業者に周知の方法、例えば後述のＴｅｓｍｉｎタンパク質に結合する抗体を用いたアフィニティクロマトグラフィーを行うことにより、精巣組織から単離することが可能である。
また、当業者であれば、天然型のＴｅｓｍｉｎのみならず、公知の方法を用いてタンパク質中のアミノ酸の置換などを適宜行い、天然型のタンパク質と同等の機能を有する改変タンパク質を調製することが可能である。また、タンパク質のアミノ酸の変異は自然界においても生じうる。このようにアミノ酸の置換、欠失、付加などにより天然型のタンパク質に対してアミノ酸配列が変異した変異体であって、天然型のタンパク質と機能的に同等なタンパク質もまた本発明のタンパク質に含まれる。当業者に公知のアミノ酸を改変する方法としては、例えば、ＰＣＲによる部位特異的変異誘発システム（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ．Ｍａｒｔｌａｎｄ）、オリゴヌクレオチドによる部位特異的変異誘発法（Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．ａｎｄ  Ｆｒｉｔｓ，ＨＪ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４：３５０−３６７）、Ｋｕｎｋｅｌ法（Ｍｅｔｈｏｄｓ    Ｅｎｚｙｍｏｌ．８５，２７６３−２７６６（１９８８））などが挙げられる。アミノ酸の変異数は、通常、１０アミノ酸以内であり、好ましくは６アミノ酸以内であり、さらに好ましくは３アミノ酸以内である。
本発明において「機能的に同等」とは、変異タンパク質が、天然型のタンパク質と同様の生化学的活性および／または生物学的活性を有することを指す。これら活性としては、例えば、タンパク質の金属との結合活性や精巣細胞の分化誘導活性が挙げられる。
金属との結合活性の検出は、例えば、以下のように行なうことができる。まず、リコンビナントＴｅｓｍｉｎタンパク質をＥＤＴＡ処理し、Ｔｅｓｍｉｎタンパク質に結合していると考えられる重金属を取り除く。次に、ＥＤＴＡをゲル濾過で取り除き、測定したい重金属（例えば、Ｚｎ２＋、Ｃｄ２＋、Ｃｕ２＋など）を加え、リコンビナントＴｅｓｍｉｎタンパク質と反応させる。反応後、ＣＤ  ｓｐｅｃｔｒｏｐｏｌａｒｉｍｅｔｅｒ（Ｊａｓｃｏ社製Ｊ−５０００）を用いて、金属結合の有無をＣＤ  ｓｐｅｃｔｒａを用いて測定する（Ｐｒｅｓｔａ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊａｎ  １５；２２７（１−２）：２２６−２４０参照）。
また、精巣細胞分化誘導活性の検出は、例えば、以下のように行なうことができる。まず、マウスの精巣より遠心分離法により、精祖細胞、精原細胞、精母細胞を単離する。次に、Ｔｅｓｍｉｎ遺伝子を発現ベクター（例えば、ｐＢＫ−ＣＭＶベクター、ｓｔｒａｔｇｅｎｅ社）に組み込み、この組み込みを行った遺伝子をリポフェクタミン（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）により単離した細胞に導入し、数時間から数日間培養の後、分化の時期を同定する遺伝子マーカー（例えば、ＭＥＧ１やｓｓＨ２Ｂなど）の発現をＲＴ−ＰＣＲ法により確認する。
また、機能的に同等なタンパク質を単離するための他の方法としては、ハイブリダイゼーション技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．９．４７−９．５８，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．ｐｒｅｓｓ，１９８９）が当業者によく用いられている。即ち、当業者であれば、マウス、ヒト由来のＴｅｓｍｉｎタンパク質をコードするＤＮＡ（配列番号：１から３のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡ）またはその一部を基に、これと相同性の高いＤＮＡを単離して、該ＤＮＡからマウス、ヒト由来のＴｅｓｍｉｎタンパク質と機能的に同等なタンパク質を得ることも通常行いうることである。このようにマウス、ヒト由来のＴｅｓｍｉｎタンパク質をコードするＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡがコードするタンパク質であって、これらタンパク質と機能的に同等なタンパク質も本発明のタンパク質に含まれる。ハイブリダイズするＤＮＡを他の生物から単離する場合には、これらに制限されないが、例えば、ラット、ウサギ、ウシなどが用いられた場合、精巣の組織が単離に適している。ハイブリダイズ技術により単離されるＤＮＡは、通常、マウス、ヒト由来のＴｅｓｍｉｎタンパク質をコードするＤＮＡ（配列番号：１から３のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡ）と高い相同性を有する。高い相同性とは、アミノ酸レベルにおいて少なくとも４０％以上、好ましくは６０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列の同一性を指す。配列の相同性は、例えば、文献（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：７２６，１９８３）に記載の方法により算出することができる。
このような相同性の高いＤＮＡを単離するためのハイブリダイゼーションの条件（ストリンジェントな条件）の例を示せば、以下の如くである。即ち「Ｒａｐｉｄ−ｈｙｂｂｕｆｆｅｒ」（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＬＩＦＥ  ＳＣＩＥＮＣＥ社製）を用い、６８℃で３０分以上プレハイブリダイゼーションを行った後、標識したプローブを添加し、６８℃で１時間以上保温することによりハイブリダイゼーションを行う。その後、２ＸＳＳＣ，０．０１％ＳＤＳ中、室温で２０分の洗浄を３回、次いで、１ｘＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中、３７℃で２０分の洗浄を３回、次いで、１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５０℃で２０分の洗浄を２回行う。
また、本発明は、上記本発明のＴｅｓｍｉｎタンパク質をコードするＤＮＡを提供する。本発明のＤＮＡは、上記本発明のＴｅｓｍｉｎタンパク質をコードしうる限り、ｃＤＮＡの他、ゲノムＤＮＡや合成ＤＮＡなども含まれる。本発明のＤＮＡは、例えば、組み換えタンパク質の生産に利用しうる。即ち、本発明のＤＮＡ（例えば、配列番号：１、２）を適当な発現ベクターに挿入し、該ベクターを適当な細胞に導入して得た形質転換体を培養し、発現させたタンパク質を精製することにより組み換えタンパク質を調製することが可能である。組み換えタンパク質の生産に用いる細胞としては、例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞などの哺乳類細胞、Ｓｆ９細胞などの昆虫細胞、酵母細胞、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）が挙げられるが、これらに制限されない。また、細胞内で組み換えタンパク質を発現させるためのベクターは、宿主細胞に応じて変動するが、例えば、哺乳類細胞のベクターとしてはｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）や、ｐＥＧＦ−ＢＯＳ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１９９０，１８（１７），ｐ５３２２）などが、昆虫細胞のベクターとしてはＢａｃ−ｔｏ−ＢＡＣ  ｂａｃｕｌｏｖａｉｒｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）などが、酵母細胞のベクターとしてはＰｉｃｈｉａ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）などが、大腸菌のベクターとしてはｐＧＥＸ−５Ｘ−１（Ｐｈａｒａｍａｃｉａ社製）、ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｑｉａｇｅｎ社製）などが挙げられる。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、カチオニックリボソームＤＯＴＡＰ（ベーリンガーマンハイム社製）を用いた方法、エレクトロポーレーション法、塩化カルシウム法などの方法を用いて行うことができる。また、形質転換体の培養は、形質転換体の性質に応じて、当業者の公知の方法で行うことができる。得られた形質転換体からの組み換えタンパク質の精製は、当業者に公知の方法、例えば、文献「Ｔｈｅ  Ｑｉａｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ  ｈｊａｎｄｂｏｏｋ，Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ」記載の方法を用いて行うことが可能である。
本発明のＤＮＡは、その変異に起因する疾患の遺伝子治療に用いることも考えられる。特に、Ｔｅｓｍｉｎ遺伝子は、遺伝病である不妊マウスの原因遺伝子である可能性が考えられるため、不妊病の遺伝子治療への応用が期待される。遺伝子治療に用いる場合には、本発明のＤＮＡを、例えば、アデノウイルスベクター（例えば、ｐＡｄｅｘＬｃｗ）やレトロウイルスベクター（例えば、ｐＺＩＰｎｅｏ）などのウイルスベクターや非ウイルスベクターに挿入して、生体内の標的部位へ投与する。投与方法は、ｅｘ  ｖｉｖｏ法であっても、ｉｎ  ｖｉｖｏ法であってもよい。
また、本発明は、上記本発明のタンパク質に結合する抗体を提供する。本発明の抗体には、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体が含まれる。これら抗体は当業者に公知の方法により調製することができる。ポリクローナル抗体は、例えば、本発明のタンパク質（または部分ペプチド）をウサギなどの小動物に免疫し、血清を得て、これを例えば、硫安沈殿、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムなどにより精製することで調製することができる。また、モノクローナル抗体は、以下のようにして調製することができる。まず、本発明のタンパク質（または部分ペプチド）をマウスなどの小動物に免疫し、該マウスより脾臓を抽出し、これをすり潰して細胞にし、マウスミエローマ細胞とポリエチレングリコールなどの試薬を用いて融合させ、これにより得られた融合細胞（ハイブリドーマ）の中から、これらタンパク質に対する抗体を産生するクローンを選抜する。次いで、得られたハイブリドーマをマウス腹腔内に移植し、該マウスより腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムなどにより精製する。これにより調製された抗体は、本発明のタンパク質の精製、検出に利用できる他、抗体治療などへの応用も考えられる。得られた抗体を抗体治療などの目的で人体へ投与する場合には、免疫原性を低下させるため、ヒト型の抗体を用いると有効である。抗体をヒト型化する方法としては、モノクローナル抗体産生細胞から抗体遺伝子をクローニングし、その抗原決定部位を既存のヒト抗体に移植するＣＤＲグラット法などが知られている。また、免疫系をヒトのものを入れ換えたマウスを本発明のタンパク質で免疫して、通常のモノクローナル抗体と同様にヒト抗体を調製することもできる。
また、本発明は、上記本発明のＴｅｓｍｉｎタンパク質をコードするＤＮＡと特異的にハイブリダイズし、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するＤＮＡを提供する。ここで「特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、Ｔｅｓｍｉｎタンパク質以外のタンパク質をコードするＤＮＡとクロスハイブリダイゼーションが有意に生じないことを指す。このようなＤＮＡは、Ｔｅｓｍｉｎタンパク質をコードするＤＮＡを検出、単離するためのプローブとして、また増幅するためのプライマーとして利用可能である。Ｔｅｓｍｉｎ遺伝子は精巣のみに発現し、また精巣の中でも限定された時期にのみ発現している。このため、これらのＤＮＡは精巣分化のマーカー（検査薬）として利用することが可能である。また、Ｔｅｓｍｉｎ遺伝子は、遺伝病である不妊マウスの原因遺伝子である可能性が考えられるため、これらＤＮＡは、不妊病の検査に利用することも考えられる。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
［実施例１］  ＲＴ−ＰＣＲを用いたＴｅｓｍｉｎの遺伝子断片の単離
新規物質ＷＦ−１（１７００ｂｐを有する機能未知の新規遺伝子）の各臓器における発現をＲＴ−ＰＣＲ法によって解析した。具体的には、アイソジェン（日本ジーン社製）を用いて、ＩＣＲストレインマウス（日本クレア社製）の脳、肝臓、脾臓、腎臓、心臓、精巣からトータルＲＮＡを抽出した。ＲＮＡは６５℃で変性させた後、リバーストランスクリプターゼ：スパースクリプト２（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ社製）を用いｃＤＮＡを作成した。それぞれの臓器のｃＤＮＡを用い、配列番号：６および７に記載のＷＦ−１増幅用のオリゴプライマーを用い、９４℃で１分，５８℃で２分，７２℃で３分を３２サイクルの条件でＰＣＲ反応を行った。なお、対照としてのＧＡＰＤＨの増幅には配列番号：８および９のオリゴプライマーを用い、９４℃で１分，５８℃で２分，７２℃で３分を３０サイクルの条件でＰＣＲ反応を行った。その結果、偶然にも、配列番号：６および７に記載のＷＦ−１増幅用のオリゴプライマーを用いた検出において、精巣においてのみ特異的に発現する他の遺伝子の存在を見出した。このｃＤＮＡ断片を単離し、該ｃＤＮＡがコードする遺伝子を「Ｔｅｓｍｉｎ」と命名した（当初は、「Ｔｅｓｔｉｎ」と命名したが、その後「Ｔｅｓｍｉｎ」に改名した）。
［実施例２］  マウスＴｅｓｍｉｎ  ｃＤＮＡのクローニングとシークエンス
このｃＤＮＡ断片の配列をジデオキシチェーンターミネーション法により決定し、ＡＢＩ３７７自動配列塩基決定機で分析した。決定した配列につきデーターベース検索を行った結果、この配列はデーターバンク内に相同性を見いだせない新規遺伝子であることが判明した。そこで、このｃＤＮＡ断片を３２Ｐ放射標識してプローブを調製し、これを用いてマウス精巣ライブラリーをスクリーニングを行った。その結果、約１．７ｋｂの長さを有するクローンが得られた。
さらに５’末端の配列を決定するために、５’−ＲＡＣＥを行った。５’−ＲＡＣＥにおいては、Ｔｅｓｍｉｎ遺伝子に特異的な３つのアンチセンスプライマー、すなわちＳＰ１（配列番号：１０）、ＳＰ２（配列番号：１１）、ＳＰ３（配列番号：１２）及びマウス精巣由来５’−Ｍａｒａｔｈｏｎ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡを用いた。５’−ＲＡＣＥ法は「Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ  ＴＭ  ｃＤＮＡ  ｋｉｔ（マウス精巣）」（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）のプロトコールに従って行った。これにより得られたＴｅｓｍｉｎ  ｃＤＮＡの全塩基配列を配列番号：１（２２４１ｂｐ）および配列番号：２（１８６１ｂｐ）に示す。これら２つのｃＤＮＡは転写時のスプライシングの相違により生じたスプライシングバリアントであると考えられる。
これらのｃＤＮＡ配列につきデーターベース検索を行った結果、データーバンク内に有意な相同性を有する配列は見いだせなかった。これらｃＤＮＡは２９５アミノ酸からなる同一のタンパク質（ｐＩ−７．６４）をコードし、タンパク質データーベースにおいても有意に一致するものが見いだせなかった。
［実施例３］  ヒトＴｅｓｍｉｎｃＤＮＡのクローニングとシークエンス
マウスＴｅｓｍｉｎプラスミド（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ２ベクターにＴｅｓｍｉｎ遺伝子が挿入されたプラスミド）をＳｐｈＩ−ＳａｌＩで切断した１．７Ｋｂの遺伝子断片をプローブとして、ヒト精巣のｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行った。ハイブリダイゼーション条件は「Ｒａｐｉｄ−ｈｙｂ  ｂｕｆｆｅｒ」（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＬＩＦＥ  ＳＣＩＥＮＣＥ社製）を用い、６０℃で３０分プレハイブリダイゼーションを行った後、標識したプローブを添加し、６０℃で２時間保温することによりハイブリダイゼーションを行った。その後、２ＸＳＳＣ５０．０１％ＳＤＳ中、室温で２０分の洗浄を３回、次いで、１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、３７℃で２０分の洗浄を３回、次いで、１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５０℃で２０分の洗浄を２回行った。
これにより得られたヒトＴｅｓｍｉｎ  ｃＤＮＡの塩基配列を配列番号：３に示す。決定された塩基配列につきデーターベース検索を行ったが、マウスｃＤＮＡと同様にデーターバンク内に相同性を有するものは見いだせなかった。また、得られたヒトｃＤＮＡはマウスＴｅｓｍｉｎより４アミノ酸多い、２９９アミノ酸からなるタンパク質（ｐＩ−７．７１）をコードし、タンパク質データーベースにおいても有意に一致するものが見いだせなかった。しかしながら、ＢＬＡＳＴによるアミノ酸配列の解析の結果、マウス、ヒトのＴｅｓｍｉｎアミノ酸配列は部分的にはメタロチオネインファミリーの金属結合ドメインと非常に類似な構造を持つシスティンリッチなタンパク質であることが判明した。
メタロチオネインは肝臓において、重金属で発現が誘導されその金属毒を中和する活性を持つことが知られているタンパク質である。しかし、精巣においてはメタロチオネインは金属で誘導されることなしに、常に遺伝子発現をしている。そのため、精巣において、メタロチオネインは金属結合をする以外になんらかの重要な役割をしている可能性が考えられてきた。最近の知見として、ジンクフィンガー転写因子でかつ、リセプタータンパク質であるエストロゲンリセプターとメタロチオネインは試験管内において金属の転移を行うことが示された（Ｃａｎｏ−Ｇａｕｃｉ，Ｄ．ａｎｄ  Ｓａｒｋａｒ，Ｂ．（１９９６）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ３８６（１）：１−４）。そのため、メタロチオネインの金属結合部位が転写因子の制御に重要な役割をしているのではないかと考えられている。メタロチオネインファミリーの金属結合にはアミノ酸配列におけるシステイン構造を持つ配列「Ｃｙｓ−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ−Ｃｙｓ（Ｘは任意のアミノ酸を示す）」が重要な役割を担うとされている。
Ｔｅｓｍｉｎにおいてもこのシステイン構造（マウスにおいては１５７から１７１位、ヒトにおいては１６１から１７５位）が保存されていた。しかし、これまでに知られているメタロチオネインファミリーは６０−７０アミノ酸残基からなる比較的低分子であるのに対し、Ｔｅｓｍｉｎはこれらに比べてアミノ酸の鎖長が長かった（マウスは２９５アミノ酸残基、ヒトは２９９アミノ酸残基）。ＰＲＯＳＩＴＥによるドメインの検索の結果、マウスＴｅｓｍｉｎにおいてはＮ−ミリスチル化部位とカゼインキナーゼ２リン酸化部位を有していた。また、ヒトＴｅｓｍｉｎにおいてはｃＡＭＰとｃＧＭＰ依存性キナーゼリン酸化部位、プロテインキナーゼＣリン酸化部位、Ｎ−ミリスチル化部位、Ｎ−グリコシル化部位を有していた。その他に、ｃＡＭＰやｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼリン酸化部位やプロテインキナーゼリン酸化部位を有していた。
ＢＬＯＣＫＳによるドメイン検索において、マウスおよびヒトＴｅｓｍｉｎにおいて共通した部位が見出された。即ち、マウスおよびヒトＴｅｓｍｉｎは、「Ｈｉｇｈ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｉｒｏｎ−ｓｕｌｆａｔｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ」（マウスの８７から１０３位、ヒトの８７から１０３位）、「Ａｄｅｎｏｄｏｘｉｎ  ｆａｍｌｙ」（ｉｒｏｎ−ｓｕｌｆａｔｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）（マウスの１７７から１９４位、ヒトの１８１から１９８位）、「Ａｌｐｈａ−２−ｍａｖｒｏｇｌｏｂｕｒｉｎ  ｆａｍｉｌｙ  ｔｈｉｏｌｅｓｔｅｒ    ｒｅｇｉｏｎ」（マウスの２４３から２５２位、ヒトの２４７から２５６位）、「Ａｒｒｅｓｔｉｎｓ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ」（マウスの２６７から２７７位、ヒトの２７１から２８１位）、「Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ１４  ｐｒｏｔｅｉｎｓ」（マウスの５から２６位、ヒトの５から２６位）、「Ｃｏｏｐｅｒ  ａｍｉｎｅ  ｏｘｉｄａａｓｅ  ｔｏｐａｑｕｉｎｏｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ」（マウスの８１から１０９位、ヒトの８１から１０９位）、「ＶＦＷＣ  ｄｏｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ」（マウスの１３から１９位、１０５から１１３位、ヒトの１０５から１１３位）が確認された。また、ＰＲＩＮＴＳによって配列の特徴を解析したところ、マウス、ヒトＴｅｓｍｉｎともに「Ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ−ｌｉｋｅ  ＧＰＣＲ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ］（マウスの９３から１１７位、２３１から２５２位、２３２から２５３位、ヒトの４３から６７位、２３６から２５７位）を有していた。
［実施例４］  試験管内における転写翻訳
予想されるマウスＴｅｓｍｉｎのオープンリーディングフレームを確認するためにインビトロトランスレーションを行った。具体的には、精巣からクローニングしたｃＤＮＡ  ｐＢｌｕｓｅｓｃｒｉｐｔ−Ｔｅｓｍｉｎを、Ｌ−［３５Ｓ］メチオニンを添加したウサギ網状赤血球溶解物（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて試験管内で１時間、転写、翻訳を行った。翻訳産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で分離し、オートラジオグラフィーで検出した。その結果、ほぼ３２．５ｋＤａの大きさのタンパク質が検出された（図３）。この転写産物はマウスＴｅｓｍｉｎ配列内のＯＲＦとして考えられるタンパク質の大きさとよく一致していた。
［実施例５］  組み換えＴｅｓｍｉｎの調製
マウスＴｅｓｍｉｎ  ｃＤＮＡのオープンリーディングフレームを、ＥｃｏＲＩ部位を持つセンス（配列番号：１９）及びアンチセンス（配列番号：２０）プライマーを用い、ＰＣＲ反応によって増幅した。ＰＣＲ反応で増幅したフラグメントをｐＧＥＭ−Ｔベクターにクローン化し、その正確な配列を確認した。次いで、ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩを用いて切断し、最終的にＧＳＴ融合タンパク質を産生するｐＧＥＸ−２ＴＫベクターにクローン化した。このｐＧＥＸ２−ＴＫ内にクローン化したＴｅｓｍｉｎ産生物を大腸菌ＪＭ１０９に遺伝子導入し、ＩＰＴＧ０．２ｍＭを用いて３７℃で３時間誘導し、この大腸菌の溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で分離し、ＧＳＴ抗体を用いたウエスタンブロッティングにより検出した。その結果、ＧＳＴ融合部分の分子量２６ｋＤａを含んだ、５８．５ｋＤａのタンパク質が合成された（図８左）。組み換えタンパク質の大きさは、インビトロトランスレーションの結果と同様に分子の推定の大きさから予想されたものと同じであった。
［実施例６］  ノーザンブロット解析
マウス、ヒトの様々な組織のｍＲＮＡをレーンあたり２μｇのせたメンブレン（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐａｌｏ  ａｌｔｏ，ＣＡ）を購入し、ノーザンブロット解析を行った。プローブはマウスＴｅｓｍｉｎプラスミド（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ２ベクターにＴｅｓｍｉｎ遺伝子が挿入されたプラスミド）をＳｐｈＩ−ＳａｌＩで切断した１．７Ｋｂの遺伝子断片をプローブとして用いた。ハイブリダイゼーション条件は「Ｒａｐｉｄ−ｈｙｂ  ｂｕｆｆｅｒ」（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＬＩＦＥ  ＳＣＩＥＮＣＥ社製）を用い、６８℃で３０分プレハイブリダイゼーションを行った後、標識したプローブを添加し、６８℃で２時間保温することによりハイブリダイゼーションを行った。その後、２ＸＳＳＣ，０．０１％ＳＤＳ中、室温で２０分の洗浄を３回、次いで、１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、３７℃で２０分の洗浄を３回、次いで、１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５０℃で２０分の洗浄を２回行った。検出はオートラジオグラフィーによって行った。Ｔｅｓｍｉｎ遺伝子の発現はＲＴ−ＰＣＲ法による結果と同様に、精巣においてのみ検出され、マウスでは２．４Ｋｂと２．０Ｋｂの位置に（図１）、ヒトでは２．４Ｋｂの位置にのみ遺伝子発現を確認した（図２）。
［実施例７］  生殖細胞分化への関与
アイソジェン（日本ジーン社製）を用いて、ＩＣＲストレインマウスの生後４日、８日、１２日、１８日、４２日目の精巣から、また５６日目のＷ／Ｗｖストレインマウス（日本ＳＬＣ社製  種類ＷＢＢ６Ｆ１−Ｗ／Ｗｖ／このマウスは増殖因子Ｓ１ファクターのレセプターｃ−ｋｉｔ遺伝子を欠損したマウスで不妊マウスとして知られている。Ｃｈａｂｏｔ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３５（６１８５）：８８−９、Ｙｏｓｈｉｎａｇａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１３（２）：６８９−９９参照）の精巣からトータルＲＮＡを抽出し、ＲＮＡを６５℃で変性させた後、リバーストランスクリプターゼ：スパースクリプト２（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ社製）を用いＣＤＮＡを作成した。Ｔｅｓｍｉｎの反応は、配列番号：６および７に記載のオリゴプライマーを用い、９４℃で１分，５８℃で２分，７２℃で３分を３５サイクルの条件で行った。また対照としてのＧＡＰＤＨの反応は配列番号：７および８に記載のオリゴプライマーを用い、９４℃で１分，５８℃で２分，７２℃で３分を３０サイクルの条件で、ＭＥＧ１の反応には配列番号：１３および１４のオリゴプライマーを用い、９４℃で１分，５８℃で２分，７２℃で３分を３５サイクルの条件で、ｓｓＨ２Ｂの反応は配列番号：１５および１６のオリゴプライマーを用い、９４℃で１分，５８℃で２分，７２℃で３分を３５サイクルの条件でＰＣＲ反応を行った。なお、マーカーとして用いたＭＥＧ１は精原細胞から精母細胞への分裂時期に発現し（Ｄｏｎ，Ｊ．ａｎｄ  Ｗｏｌｇｅｍｕｔｈ，Ｄ．Ｊ．（１９９２）Ａｕｇ；３（８）：４９５−５０５）、また、ｓｓＨ２Ｂは精子形成時に発現するとするとして知られている（Ｕｎｎｉ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ，Ｏｃｔ；５３（４）：８２０−８２６）。
ＰＣＲ解析の結果、Ｔｅｓｍｉｎ遺伝子は生後８日目までは発現せず、その後１２日目でやや弱く、１８日目以降安定的な発現パターンを見せた（図４）。Ｔｅｓｍｉｎ遺伝子の精巣における発現はＭＥＧ１と同様の発現パターンを示した。このためＴｅｓｍｉｎが、ＭＥＧと同時期に発現制御されていることが判明した。
また、Ｗ／ＷｖマウスにおいてＴｅｓｍｉｎの発現を調べたところ、Ｗ／ＷｖマウスにおいてはＴｅｓｍｉｎ遺伝子が発現していないことが判明した。Ｗ／Ｗｖマウスは不妊マウスとして知られており、Ｔｅｓｍｉｎ遺伝子と不妊との関係が強く示された（図４）。
［実施例８］  インシチュー・ハイブリダイゼーション
マウスＴｅｓｍｉｎプラスミド（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ２ベクターにＴｅｓｍｉｎ遺伝子が挿入されたプラスミド）からＴ７、Ｔ３ポリメラーゼとジゴキシゲニン−ｄＵＴＰを用いて標識したＲＮＡプローブを作成した。このプローブを５０％ホルムアミド、１０％デキストラン硫酸、２ｘＳＳＣを含む溶液中でスライスしたマウスの精巣組織とハイブリダイズさせた。ハイブリダイズさせたスライドグラスをアルカリホスファターゼを結合した抗ジゴキシゲニン抗体中でインキュベートし発色基質ＮＢＴ／ＢＣＩＰを用いてハイブリダイゼーションに特異的なシグナルを検出した。その結果、Ｔｅｓｍｉｎは、精巣においても特に、精母細胞の時期において非常に特異的に発現していることが確認された（図５）。
［実施例９］  染色体上の配置
マウスＴｅｓｍｉｎに特異的なセンスプライマー（配列番号：６）及びアンチセンスプライマー（配列番号：７）を用いたＰ１バクテリオファージゲノムライブラリーのＰＣＲスクリーニングにより、マウスのＰ１ゲノムライブラリーを得た。また、ヒトＴｅｓｍｉｎに特異的なセンスプライマー（配列番号：１７）及びアンチセンスプライマー（配列番号：１８）を用い、マウスと同様のスクリーニング法により、ヒトのＰ１ゲノムライブラリーを得た。単離したＰ１クローンは蛍光インシチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）により染色体における局在性を調べるために使用した。マウス、ヒトのＰ１クローン由来のＤＮＡをニックトランスレーションによりジゴキシゲニン−ｄＵＴＰを用いて標識し、そのプローブを、５０％ホルムアミド、１０％デキストラン硫酸、２ｘＳＳＣを含む溶液中でマウス、ヒトの初期繊維芽細胞由来の分裂中期染色体とハイブリダイズさせた。ハイブリダイズさせたスライドグラスを蛍光標識した抗ジゴキシゲニン抗体中でインキュベートし、さらに４’６’ジアミノ−２−フェノールインドール（ＤＡＰＩ）を用いたカウンター染色によりハイブリダイゼーションに特異的なシグナルを検出した。
その結果、マウス、ヒトＴｅｓｍｉｎに特異的なプローブはクローニングされたそれぞれのＰ１クローンにハイブリダイズしたため、これらのＰ１クローンはＴｅｓｍｉｎ遺伝子をコードしていることが判明した。また、これらのＰ１クローンをプローブとしてＤＡＰＩ染色を行った結果、マウスでは１９番Ｂ染色体がヒトでは１１番染色体のｑ１３．２領域が、特異的に標識された。以上のことから、Ｔｅｓｍｉｎはマウス１９番Ｂ染色体上（図６）に、ヒトでは１１番ｑ１３．２染色体上（図７）に存在することが確認された。また、この結果をもとにＴｅｓｍｉｎとマウスの遺伝病との関わりをジャクソンラボラトリーのデーターベースを用いて調べたところ、Ｔｅｓｍｉｎの存在する１９番Ｂの位置の変異がマウスの不妊を引き起こすという研究が報告されている（Ｅｖａｎｓ，ＥＰ．（１９７７）Ｍｏｕｓｅ  Ｎｅｗｓ  Ｌｅｔｔｅｒ，１７）。この事実は、Ｔｅｓｍｉｎの変異がマウスの不妊症を引き起こしている可能性を示している。
［実施例１０］  細胞内での局在
ＥｃｏＲＩ部位を持つセンス（配列番号：１９）及びアンチセンス（配列番号：２０）プライマーを用いＴｅｓｍｉｎ  ｃＤＮＡの全てのオープンリーディングフレームを、また、ＥｃｏＲＩ部位を持つセンス（配列番号：１９）及びＳａｌＩ部位を持つアンチセンス（配列番号：２１）プライマーを用いＴｅｓｍｉｎ  ｃＤＮＡのオープンリーディングフレームから７０アミノ酸をディレーションするように設計された遺伝子を作製した。これらの遺伝子を制限酵素処理後、ｐＥＧＦＣ１ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）におけるＧＦＰ  ＯＲＦのＣ末端領域に挿入した。ＧＦＰ−Ｔｅｓｍｉｎ融合タンパク質をコードするこのプラスミドをカバーガラス上で生育しているＣＯＳ１細胞にＴｆｘ−５０（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて導入した。カバーグラスメタノール／アセトン（１：１）で固定し、ＰＢＳで３回洗浄した。細胞はエピフルオレッセンス光学系のオリンパスＢＨ−２顕微鏡で観察した。その結果、Ｔｅｓｍｉｎ全配列を融合させたタンパク質は細胞質内に局在していたが、Ｔｅｓｍｉｎの一部の配列を欠損させたものは核内に移行していることが明らかとなった（図８）。
［実施例１１］  Ｔｅｓｍｉｎタンパク質に結合する特異的抗体の作製
Ｔｅｓｍｉｎの遺伝子配列から予測される１８アミノ酸残基に対するペプチド抗体を作製した。具体的には、ペプチド合成機で１８個のアミノ酸配列（配列番号：２２）を作製し、この得られたペプチドにＫＬＨを架橋試薬で共有結合させた。次に、ＨＰＬＣでこのペプチドを精製後、ウサギに免疫し、４回に分けて段階的に血清を抽出し、最終的には全採決を行った。この血清をプロテインＡカラムにより精製しポリクローナル抗体を調製した。ＧＳＴを融合させたＴｅｓｍｉｎタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ法を用いたゲル上で分離し、ウエスタンブロッティング法によって検出することによって、この抗Ｔｅｓｍｉｎポリクローナル抗体がＴｅｓｍｉｎタンパク質を認識することを確認した（図９）。
ウェスタンブロッティングは、Ｔｅｓｍｉｎ  ｃＤＮＡを導入した大腸菌にイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加して組換えタンパク質の発現を誘導し後、その細胞溶解液に対してＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ない検出した（図９のＩＰＴＧ＋）。また、ＩＰＴＧを添加しない大腸菌の細胞溶解液を用いた検出も行なった（図９のＩＰＴＧ−）。
産業上の利用の可能性
本発明により、金属結合部位を有し、精巣細胞の分化に密接に関与するＴｅｓｍｉｎタンパク質およびその遺伝子が提供された。Ｔｅｓｍｉｎタンパク質およびその遺伝子は、精子形成の分化に関与し、さらには不妊マウスにおいて遺伝子発現がなく、また遺伝病である不妊マウスの原因遺伝子である可能性が考えられる。そのため、例えば、Ｔｅｓｍｉｎ遺伝子を体内もしくは細胞に導入することによって、不妊病の遺伝子治療への応用が期待される。また、Ｔｅｓｍｉｎは精巣のみに発現し、また精巣の中でも限定された時期にのみ発現している遺伝子であるため、精巣細胞の分化時期を決定するための検査薬としての応用も考えられる。さらには、Ｔｅｓｍｉｎはメタロチオネインと同様の金属結合部位を持つと考えられるため、メタロチオネインと同様の金属毒解毒薬としての応用も考えられる。また、精巣における金属との結合の意義を解析するような応用研究への利用も期待される。
【配列表】
0004395688.tif 000002
0004395688.tif 000003
0004395688.tif 000004
0004395688.tif 000005
0004395688.tif 000006
0004395688.tif 000007
0004395688.tif 000008
0004395688.tif 000009
0004395688.tif 000010
0004395688.tif 000011
0004395688.tif 000012
0004395688.tif 000013
0004395688.tif 000014
0004395688.tif 000015
0004395688.tif 000016
0004395688.tif 000017
0004395688.tif 000018
0004395688.tif 000019
0004395688.tif 000020
0004395688.tif 000021
0004395688.tif 000022
0004395688.tif 000023
0004395688.tif 000024
0004395688.tif 000025
0004395688.tif 000026
0004395688.tif 000027
0004395688.tif 000028
0004395688.tif 000029
【図面の簡単な説明】
図１は、マウスの様々な組織におけるＴｅｓｍｉｎ遺伝子の発現をノーザンブロット解析した結果を示す電気泳動写真である。
図２は、ヒトの様々な組織におけるＴｅｓｍｉｎ遺伝子の発現をノーザンブロット解析した結果を示す電気泳動写真である。
図３は、インビトロトランスレーションにより発現させたマウスＴｅｓｍｉｎタンパク質の分子量を検出した結果を示す電気泳動写真である。
図４は、ＩＣＲストレインマウスの生後４日、８日、１２日、１８日、４２日目の精巣、および５６日目のＷ／Ｗｖストレインマウスの精巣におけるＴｅｓｍｉｎ遺伝子の発現をノーザンブロット解析した結果を示す電気泳動像である。精巣分化のマーカーとして「ＭＥＧ１」および「ｓｓＨ２Ｂ」を用いた。また、対照として「ＧＡＰＤＨ」を用いた。
図５は、精巣組織におけるＴｅｓｍｉｎ遺伝子の発現をインシチュー・ハイブリダイゼーションで検出した結果を示す顕微鏡写真である。
図６は、Ｔｅｓｍｉｎ遺伝子に特異的なプローブを用いてマウス染色体におけるＴｅｓｍｉｎ遺伝子の存在を検出した結果を示す顕微鏡写真および存在位置を示す模式図である。
図７は、Ｔｅｓｍｉｎ遺伝子に特異的なプローブを用いてヒト染色体におけるＴｅｓｍｉｎ遺伝子の存在を検出した結果を示す顕微鏡写真および存在位置を示す模式図である。
図８は、完全なＴｅｓｍｉｎタンパク質およびその欠失変異体の細胞内での局在性を検出した顕微鏡写真である。
図９は、調製した抗Ｔｅｓｍｉｎ抗体を用いて、Ｔｅｓｍｉｎタンパク質（ＧＳＴとの融合タンパク質）をウェスタンブロッティングにより検出した結果を示す。抗ＧＳＴ抗体を用いた検出も併せて行なった。「ＩＰＴＧ＋」は、ｃＤＮＡを導入した大腸菌にイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加して組換えタンパク質の発現を誘導し後、その細胞溶解液に対してＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ない、ウェスタンブロッティングにより検出したものであり、「ＩＰＴＧ−」は、ＩＰＴＧを添加しない大腸菌の細胞溶解液を用いて検出したものである。
【図１】
0004395688.tif 000030
【図２】
0004395688.tif 000031
【図３】
0004395688.tif 000032
【図４】
0004395688.tif 000033
【図５】
0004395688.tif 000034
【図６】
0004395688.tif 000035
【図７】
0004395688.tif 000036
【図８】
0004395688.tif 000037
【図９】
0004395688.tif 000038