(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号2の残基31〜36、51〜66および99〜106に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含み、かつ配列番号4の残基23〜33、49〜55および88〜98に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインをさらに含む、ヒストンに対する単離された抗体。
【請求項２】
配列番号2のポリペプチド配列を含む、請求項1記載の単離された抗体。
【請求項３】
配列番号４のポリペプチド配列を含む、請求項1記載の単離された抗体。
【請求項４】
前記アミノ酸配列がヒト抗体フレームワークにより保持される、請求項1〜3のいずれか1項記載の単離された抗体。
【請求項５】
抗体F(ab’)2またはscFvフラグメントの形態である、請求項1〜4のいずれか1項記載の単離された抗体。
【請求項６】
前記抗体が検出可能なまたは機能的な標識を有する、請求項１〜5のいずれか1項に記載の単離された抗体。
【請求項７】
請求項１〜6のいずれか1項に記載の抗体をコードする配列を含む、単離された核酸。
【請求項８】
配列番号2の残基31〜36、51〜66および99〜106に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含み、かつ配列番号4の残基23〜33、49〜55および88〜98に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインをさらに含むヒストンに対する抗体の調製方法であって、該抗体の発現をもたらす条件下で請求項1〜7のいずれか1項に記載の抗体をコードする配列を含む核酸を発現させ、該抗体を回収することを含む、上記調製方法。
【請求項９】
ヒトもしくは動物の身体の治療または診断方法に使用するための、請求項１〜8のいずれか1項に記載の単離された抗体。
【請求項１０】
特異的結合メンバーを含むヒストンに対する抗体の調製方法であって、
a）CDR1、CDR2およびCDR3コード化領域を欠失したVHドメインをコードする核酸の第1の出発レパートリーを用意すること；
b）CDR1、CDR2およびCDR3コード化領域を欠失したVLドメインをコードする核酸の第2の出発レパートリーを用意すること；
c）第1のレパートリーと、配列番号2の残基31〜36、51〜66および99〜106に記載のアミノ酸配列をコードするドナー核酸とを、該ドナー核酸が、欠失したCDR1、CDR2およびCDR3領域に挿入されるように結合し、これによって、VHドメインをコードする核酸の産物レパートリーを取得すること；
d）第2のレパートリーと、配列番号4の残基23〜33、49〜55および88〜98に記載のアミノ酸配列をコードするドナー核酸とを、該ドナー核酸が、欠失したCDR1、CDR2およびCDR3領域に挿入されるように結合し、これによって、VLドメインをコードする核酸の産物レパートリーを取得すること；
e）上記産物レパートリーの核酸を発現させること；
f）試験動物において、腫瘍：血液の最大局在比が注射後96時間で>3:1である特異的結合メンバーを選択すること；ならびに
ｇ）上記結合メンバー、または、それをコードする核酸を回収すること、
を含む、上記調製方法。
【請求項１１】
ステップ(f)で、試験動物において腫瘍：血液の最大局在比が>3:1であり、該比において、最小の器官対血液比が＜1:1である特異的結合メンバーを選択する、請求項10に記載の調製方法。
【請求項１２】
ヒト患者の腫瘍を治療するための医薬の製造における、請求項1〜8のいずれか1項に記載の抗体の使用。
【請求項１３】
前記抗体が別のポリペプチドに融合している、請求項1に記載の単離された抗体。
【請求項１４】
前記別のポリペプチドが前記抗体のC末端またはN末端に結合している、請求項13に記載の単離された抗体。
【請求項１５】
前記別のポリペプチドがポリペプチドリンカーによって前記抗体と結合している、請求項13に記載の単離された抗体。
【請求項１６】
前記別のポリペプチドが腫瘍の部位にターゲッティングされるように設計されている、請求項13に記載の単離された抗体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、腫瘍の壊死中心に結合する特異的結合メンバー、特に、抗体およびそのフラグメントに関する。これら特異的結合メンバーは、癌の治療に有用である。
【０００２】
背景技術
化学療法による、増殖性疾患、特に癌の治療は、ヒトまたは動物身体における標的増殖細胞と、他の正常細胞との相違の利用に基づくものであることが多い。例えば、多くの化学薬剤は、急速に複製中のDNAに取り込まれ、それによって、DNA複製および細胞分裂の過程が中断されるように設計される。別の手法は、腫瘍細胞の表面上の、成長したヒトの組織では通常発現されない抗原（胚抗原など）を同定するというものである。このような抗原を、抗体などの結合タンパク質によってターゲッティングし、これによって、腫瘍の部位に、毒性薬剤、あるいは、該部位で毒性薬剤を直接もしくは間接的に活性化する能力のある他の物質を送達することができる。
【０００３】
さらに最近開発された別の手法は、かなりの割合の腫瘍細胞が、細胞変性および細胞死の様々な段階にあるという事実をもとにしている。特定種類の細胞の自然代謝回転中に起こるプログラム細胞死（アポトーシス）とは違い、腫瘍細胞は変性性の制御されない死を迎えるのだが、その際、該腫瘍細胞は、異常な表面膜透過性を示すことがわかっている。欧州特許出願 EP-A-270340は、この現象を利用することによる、腫瘍の壊死細胞をターゲッティングすることができる、細胞の核成分に対するマウス抗体の調製を記載している。Millerら（Hybridoma、1993、12、689〜697）は、EP-A-270340に従って調整した特定の抗体を記載している。この抗体、TNT-1は、ヒストン画分H1に結合することがわかった。ヒストンは、クロマチン中で最も多量のタンパク質であり、各種ヒストンの濃度は、典型的な配列特異的DNA結合タンパク質の濃度より約5,000倍高い。Epsteinら（”Handbook of Targeted Delivery of Imaging Agents” CRC press, Inc.、1995、ed. VP Torchilin中）は、ME-180子宮頸癌を有するヌードマウスへの放射標識したTNT-1の取込みを記載し、他の器官の標識が認められなかったことを報告している。また同著者は、ヒトの患者に関する腫瘍画像化研究のために、131Iで標識したTNT-1のF(ab’)2フラグメントを使用した。
【０００４】
ヒトの治療にマウス抗体を使用する上で知られている問題点は、このような抗体の治療を繰り返すことによって、ヒト抗マウス抗体（HAMA）応答が起こることである。HAMA応答は、治療用量の減少につながる投与抗体の中和から、アレルギー応答、血清病、ならびに腎障害まで、非常に多様な影響を及ぼす。これらの問題点を解決するために、抗体のヒト化が進められてきた。最近では、様々なレパートリーのヒト抗体がクローン化されてきており、これらの抗体を、例えば、ファージ展示方法（McCaffertyら、WO92/01047）によってスクリーニングし、ヒト抗原に特異的なヒト抗体を同定することができる。
【０００５】
発明の開示
我々は、TNT-1抗体の結合特性について研究を重ね、類似結合プロフィールを備えると共に、動物モデルにおいて有用な腫瘍局在化をもたらすヒト抗体を獲得することを試みてきた。我々は、TNT-1は、主に核ヒストンH1に結合するが、核調製物中での他のヒストンと未同定タンパク質にも複合的パターンで結合することをみいだした。我々は、第1に核抽出物に対して、次にヒストンH1に対してスクリーニングし、類似した結合プロフィールを有する多数のヒト抗体を同定することができた。分析されたヒト抗体クローン間の結合プロフィールの類似性にもかかわらず、ただ１つ（以下、“NHS76”と表記する）だけが、さらに、非壊死組織および器官に対する低い交差反応性と、優れた腫瘍：血液局在比を示すことがわかった。試験したその他の候補抗体は、交差反応性を示すか、腫瘍：血液局在比が低いかのいずれかであった。
【０００６】
従って、同定されたNHS76 抗体の相補性決定領域(CDR）、特にCDR3領域に基づく抗体等の特異的結合タンパク質が、悪性腫瘍の壊死中心をターゲッティングするのに有用である。
【０００７】
添付の図面の図1に、NHS76 VH遺伝子の核酸配列と、その翻訳を示す。この核酸配列は、配列番号１とする。また、その翻訳は配列番号２とする。NHS76のVL遺伝子は、図2に示す。この核酸配列は配列番号３とし、その翻訳は配列番号４とする。両図面で、CDRは線で囲んで示してある。
【０００８】
第１の態様で、本発明は、細胞内抗原に結合する能力のある単離された特異的結合メンバーであって、配列番号２の残基99〜106と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド結合ドメインを含むことを特徴とする、上記特異的結合メンバーを提供する。本発明はまた、配列番号２の残基31〜36および51〜66と実質的に同一のポリペプチド結合ドメインのうちの１つまたは両方、好ましくは両方をさらに含む、上記単離された特異的結合メンバーを提供する。好ましい実施形態では、この結合ドメインは、ヒト抗体フレームワークにより保持される。このような実施形態の1例として、実質的に配列番号２に示される配列が挙げられる。
【０００９】
第2の態様では、本発明は、細胞内抗原に結合する能力のある単離された特異的結合メンバーであって、配列番号４の残基88〜98と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド結合ドメインを含むことを特徴とする、上記単離された特異的結合メンバーを提供する。本発明はまた、配列番号４の残基23〜33および49〜55と実質的に同一のポリペプチド結合ドメインのうちの１つまたは両方、好ましくは両方をさらに含む、上記単離された特異的結合メンバーを提供する。好ましい実施形態では、この結合ドメインは、ヒト抗体フレームワークにより保持される。このような実施形態の1例として、実質的に配列番号４に示される配列が挙げられる。
【００１０】
特に好ましい実施形態では、本発明は、配列番号２の残基99〜106と実質的に同一の配列を有する第１特異的結合メンバーと共に、配列番号４の残基88〜98と実質的に同一の配列を有する第2特異的結合メンバーを含む、特異的結合メンバーを提供する。本発明のこのような特異的結合メンバーは、抗体F(ab’)2フラグメントの形態であってもよい。
【００１１】
本発明の特異的結合メンバーは、検出可能または機能的標識を有していてもよい。
【００１２】
さらに別の態様では、本発明は、上に定義した特異的結合メンバーをコードする配列を含む単離された核酸を提供すると共に、上記結合メンバーの発現をもたらす条件下で該核酸を発現させ、さらに該結合メンバーを回収することを含む、本発明の特異的結合メンバーの調製方法を提供する。
【００１３】
本発明の特異的結合メンバーは、有効量の本発明の特異的結合メンバーを患者に投与することを含む、ヒト患者の腫瘍の治療方法等のヒトもしくは動物身体の治療法または診断方法に使用することができる。
【００１４】
本発明の上記およびその他の態様を以下に詳しく説明する。
【００１５】
発明の詳細な説明
Ａ．用語
「特異的結合メンバー」：
これは、互いに対して結合特異性を有する1対の分子メンバーを意味する。特異的結合対のメンバーは、天然由来のもの、あるいは、全体的もしくは部分的に合成により生成されたもののいずれでもよい。この分子対の一方のメンバーは、該分子対の他方のメンバーの特定の空間および極性構成に特異的に結合し、従って、それらに相補的である領域またはキャビティをその表面に有する。このように、上記対のメンバーは、相互に特異的に結合する特性を備えている。特異的結合対のタイプの例として、抗原−抗体、ビオチン−アビジン、ホルモン−ホルモン受容体、レセプター−リガンド、酵素−基質がある。本出願は、抗原−抗体タイプの反応に関する。
【００１６】
「抗体」：
これは、天然のものか、または、部分的もしくは全体的に合成により生成されたものかにかかわらず、免疫グロブリンを意味する。また、この用語は、抗体結合ドメインであるか、あるいは、抗体結合ドメインと相同である結合ドメインを有するあらゆるポリペプチドまたはタンパク質も含む。これらは、天然の起源に由来するものでもよいし、あるいは、部分的もしくは全体的に合成により生成されたものでもよい。抗体の例として、免疫グロブリンアイソタイプおよびそれらのアイソタイプサブクラス；Fab、scFv、Fv、dAb、Fb等の抗原結合ドメインを含むフラグメント；ならびにダイアボディ（diabodies）がある。
【００１７】
モノクローナル抗体およびその他の抗体を用いて、組換えDNA技術により、元の抗体の特異性を保持する別の抗体またはキメラ分子を作製することが可能である。そのような技術は、抗体の免疫グロブリン可変領域、または、相補性決定領域（CDR）をコードするDNAを、異なる免疫グロブリンの定常領域、あるいは、定常領域＋フレームワーク領域に、導入することを含む。例えば、EP-A-184187、英国特許第2188638A号、もしくはEP-A-239400を参照されたい。抗体を産生するハイブリドーマまたはその他の細胞を、遺伝的突然変異もしくはその他の改変に付すこともでき、これによって、産生される抗体の結合特異性を改変したり、あるいは、改変しないでおくことができる。
【００１８】
抗体は多様に改変することができるため、「抗体」という用語は、要求される特異性を備えた結合ドメインを有するものであれば、あらゆる特異的結合メンバーまたは物質を指すものと解釈すべきである。従って、この用語は、天然のものか、または全体的もしくは部分的に合成されたものかにかかわらず、免疫グロブリン結合ドメインを有する任意のポリペプチドを含む、抗体フラグメント、誘導体、機能上の同等物、ならびに抗体の相同体を包含する。従って、別のポリペプチドに融合させた免疫グロブリン結合ドメイン、もしくは同等物を有するキメラ分子も含まれる。キメラ抗体のクローン化および発現は、EP-A-0120694およびEP-A-0125023に記載されている。
【００１９】
全抗体のフラグメントが、抗原結合の機能を果たし得ることが明らかにされている。結合フラグメントの例には、（i）VL、VH、CLおよびCH1ドメインから成るFabフラグメント；（ii）VHおよびCH1ドメインから成るFdフラグメント；（iii）単一抗体のVLおよびVHドメインから成るFvフラグメント：（iv）VHドメインから成るdAbフラグメント（Ward, E.S.ら、Nature 341、544〜546（1989））；（v）単離されたCDR領域；（vi）F(ab’)2フラグメント、すなわち、２つの連結したFabフラグメントを含んでなる二価フラグメント；（vii）一本鎖Fv分子（scFv）（ここで、VHドメインおよびVLドメインは、ペプチドリンカーによって連結されており、これによって、２つのドメインが、会合して抗原結合部位を形成することができる（Birdら、Science、242、423〜426、1988；Hustonら、PNAS USA、85、5879〜5883、1988））；（viii）二重特異性一本鎖Fv二量体（PCT/US92/09965）および（ix）「ダイアボディ」、すなわち、遺伝子融合により構築される多価もしくは多重特異性フラグメント（WO94/13804；P. Holligerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444〜6448、1993）がある。
【００２０】
ダイアボディは、ポリペプチドの多量体であり、各ポリペプチドは、免疫グロブリン軽鎖の結合領域を有する第1ドメインと、免疫グロブリン重鎖の結合領域を有する第2ドメインとを含み、これら２つのドメインは連結されている（例えば、ペプチドリンカーにより）が、相互に会合して抗原結合部位を形成することはできない。抗原結合部位は、上記多量体内の１つのポリペプチドの第1ドメインと、該多量体内の別のポリペプチドの第2ドメインとの会合により形成される（WO94/13804）。
【００２１】
二重特異性抗体を用いる場合は、これらは、例えば、化学的にまたはハイブリッドハイブリドーマから調製する等、様々な方法（Holliger, P. およびWinter G. Current Opinion Biotechnol. 4、446〜449（1993））で作製することができる従来の二重特異性抗体であるか、あるいは、前記の二重特異性抗体フラグメントのいずれでもよい。全抗体よりも、scFv二量体またはダイアボディを用いるのが好ましい。ダイアボディおよびscFvは、可変ドメインだけを使用して、Fc領域を含めずに構築することができ、抗イディオタイプ反応の効果を低減することが可能である。二重特異性抗体の他の形態には、Trauneckerら、EMBO Journal、10、3655〜3659、（1991）に記載された一本鎖「ジャヌシンズ（Janusins）」が含まれる。
【００２２】
二重特異性全抗体とは反対に、二重特異性ダイアボディはまた、容易に構築して大腸菌中で発現させることができるため、特に有用であろう。適切な結合特異性を持つダイアボディ（ならびに、抗体フラグメント等のその他多くのポリペプチド）は、ライブラリーからのファージ展示（WO94/13804）を用いて、容易に選択することができる。ダイアボディの一方のアームを、例えば、抗原Ｘに対して特異性を有するように定常的に維持する場合には、他方のアームを多様化したライブラリーを作製して、適切な特異性を有する抗体を選択することができる。
【００２３】
「抗原結合ドメイン」：
これは、抗原の一部または全部に特異的に結合し、かつ、これらに相補的な領域を有する抗体部分を意味する。抗原が大きい場合には、抗体は、抗原の特定部分にしか結合せず、この部分をエピトープと呼ぶ。抗原結合ドメインは、１つまたは複数の抗体可変ドメインから得ることができる。好ましくは、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（VL）と、抗体重鎖可変領域（VH）とを含む。
【００２４】
「特異的」：
これは、特異的結合対の一方のメンバーが、その特異的結合相手以外の分子に対して何らの有意な結合を示さない状況を意味する。また、この用語は、例えば、抗原結合ドメインが、多数の抗原が保持する特定のエピトープに特異的である場合にも適用することができる。この場合、該抗原結合ドメインを保持する特異的結合メンバーは、該エピトープを保持する様々な抗原に結合することができる。
【００２５】
「含む」：
これは、一般に、含有する、すなわち、１つ以上の特徴もしくは成分の存在を許すという意味で用いられる。
【００２６】
「単離された」
これは、本発明の特異的結合メンバー、または、このような結合メンバーをコードする核酸が、本発明に従うものである状態を意味する。メンバーおよび核酸は、これらが天然にて共存している他のポリペプチドまたは核酸等の物質を、全くもしくは実質的に含まない。上記メンバーおよび核酸は、天然環境、あるいは、in vitroまたはin vivoで実施される組換えDNA技術によりそれらを調製する場合には、その調製を行う環境（例えば、細胞培養）において、前記他のポリペプチドまたは核酸等の物質と一緒に存在している。メンバーおよび核酸は、希釈剤またはアジュバントを用いて製剤化してもよく、またさらに、実際に使用するために単離することができる。例えば、該メンバーは、イムノアッセイに使用する目的で、マイクロタイタープレートに塗布するのに用いる場合には、通常、ゼラチンまたはその他の担体と混合される。あるいは、診断もしくは治療に用いる場合には、製剤学的に許容可能な担体または希釈剤と混合される。特異的結合メンバーは、天然に、もしくは、異種真核細胞系により、グリコシル化されていてもよいし、あるいはグリコシル化されていなくてもよい（例えば、原核細胞における発現により産生される場合）。
【００２７】
Ｂ．詳細な開示
本発明の単離された特異的結合メンバーは、細胞内抗原に結合する能力があるNHS76等のメンバーである。特に、該メンバーはヒトヒストンH1に結合する。しかし、本発明の特定の態様を成すNHS76抗体はまた、多様な細胞内抗原に対して、ある反応性パターンを示す。本発明の他の結合メンバーも、同じ、もしくは実質的に類似したパターンの反応性を示すことが好ましい。これは、配列番号２および配列番号４にそれぞれ示されるVHドメインおよびVLドメインを含む抗体と上記メンバーとを比較することにより、決定することができる。この比較は、通常はウエスタンブロットを用いて実施されるが、この方法では、該結合メンバーを、細胞の核調製物から調製した重複ブロットに対して結合させることにより、結合パターンを直接比較することができる。適切な核調製物、ならびに、ウエスタンブロットの条件は、下記の実施例で説明する。
【００２８】
特に、NHS76は、ヒストンに対して差別的結合を示す。これは、NHSが、ヒストンH1に対し最大の結合（これに、H3＞H2B＞H2A、H4が続く）を示すことを明らかにするヒストン結合のELISAデータ（以下の実施例７）に現れている。ヒストンへの結合の測定に適したウエスタンブロット条件については、下記の実施例で説明する。
【００２９】
以上概要を述べたように、我々は、NHS76抗体が、明らかに類似した結合プロフィールを有する他の抗体には共有されていないin vivo特性を有することをみいだした。１つの特定の理論によって拘束する意図はないが、これに対する１つの説明は、抗体の特異的抗体−抗原相互作用が、予想外に望ましいin vivo活性をもたらすというものである。抗体の、その標的抗原に対する結合は、その重鎖および軽鎖のCDRを媒介してなされ、その際CDR3の役割は、特に重要である。従って、NHS76の重鎖または軽鎖、好ましくはその両方のCDR3領域に基づく特異的結合メンバーは、in vivo治療に有用な特異的結合メンバーであると考えられる。
【００３０】
一般的に、配列番号２の残基99〜106、ならびに配列番号４の残基88〜98と実質的に同一のアミノ酸配列を含むCDR3領域は、CDR3領域と細胞内抗原との結合を可能にする構造として保持される。
【００３１】
「実質的に同一の」とは、本発明のCDR3領域が、配列番号２および配列番号４の指定領域と同一、または、高度に相同的のいずれかであることを意味する。「高度に相同的」とは、CDRにおいて、１〜５個、好ましくは１〜３個または１もしくは２個等のような１〜４個の置換があり得ることを意味する。
【００３２】
本発明のCDR3を保持する構造は、一般的に、再構成された免疫グロブリン遺伝子によってコードされる天然のVHおよびVL抗体可変ドメインのCDR3領域に対応する位置に、上記CDR3領域が位置するような、抗体重鎖または軽鎖配列、もしくはそれらの実質的部分から成る。免疫グロブリン可変ドメインの構造および位置は、（Kabat、E.A.ら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第４版、US Department of Health and Human Services、1987、ならびにその改訂版、現在、インターネットで利用可能（http：//immuno.bme.nwu.edu））を参照することにより、決定することができる。
【００３３】
好ましくは、配列番号２の残基99〜106と実質的に同一のアミノ酸配列は、ヒト重鎖可変ドメイン、もしくはその実質的部分中にCDR3として保持され、また配列番号４の残基88〜98と実質的に同一のアミノ酸配列は、ヒト軽鎖可変ドメイン、もしくはその実質的部分中にCDR3として保持される。
【００３４】
可変ドメインは、あらゆる生殖系列または再構成されたヒト可変ドメインに由来するものでも、あるいは、既知のヒト可変ドメインの共通配列に基づく合成可変ドメインでもよい。前節で定義したように、本発明のCDR3由来の配列は、組換えDNA技術を用いて、CDR3領域を欠失した可変ドメインのレパートリーに導入することができる。
【００３５】
例えば、Marksら（Bio/Technology、1992、10：779〜783）は、抗体可変ドメインのレパートリーを作製する方法を記載しており、この方法では、可変ドメイン領域の5’末端に向けられた、または、該末端に隣接する共通プライマーを、ヒトVH遺伝子の第3フレームワーク領域に対する共通プライマーと共に使用することにより、CDR3を欠失するVH可変ドメインのレパートリーを取得する。さらに、Marksらは、このレパートリーを、どのように特定抗体のCDR3と組み合わせることができるかを記載している。類似した方法を用いて、本発明のCDR3由来の配列を、CDR3を欠失したVHまたはVLドメインのレパートリーと一緒にシャッフルし、シャッフルした完全なVHまたはVLドメインをコグネイトVLまたはVHドメインと組み合わせることにより、本発明の特異的結合メンバーを取得することができる。次に、WO92/01047のファージ展示系等の適した宿主系においてレパートリーを展示することにより、適切な特異的結合メンバーを選択することができる。レパートリーは、104以上の任意の数の個々のメンバーから成るものであって、例えば、106〜108もしくは1010のメンバーから成る。
【００３６】
また、類似したシャッフリングまたは組み合わせ技術が、Stemmer（Nature、1994、370：389〜391）により開示されている。Stemmerは、β−ラクタマーゼ遺伝子に関する技術を記載しているが、この方法が、抗体の作製に使用できることを述べている。
【００３７】
さらに別の方法は、例えば、NHS76 VHまたはVL遺伝子のランダム突然変異誘発を利用して、完全な可変ドメイン内に突然変異を引き起こすことにより、本発明のCDR3由来の配列を保持する新規のVHまたはVL領域を作製する。このような技術は、Gramら（1992、Proc. Natl. Acad. Sci.、USA、89：3576〜3580）に記載されており、ここでは、誤りがちなPCRが用いられている。
【００３８】
使用することのできる別の方法は、VHまたはVL遺伝子のCDR領域に突然変異誘発を指向させることである。このような技術は、Barbasら（1994、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、91：3809〜3813）およびSchierら（1996、J. Mol. Biol. 263：551〜567）によって開示されている。
【００３９】
以上記載した全技術は、当業者には公知であり、それ自体は本発明に属さない。当業者は、これらの技術を用いて、当技術分野での慣用的方法により、本発明の特異的結合メンバーを取得することができるであろう。
【００４０】
免疫グロブリン可変ドメインの実質的部分は、少なくとも３つのCDR領域と、それらの介在フレームワーク領域とを含む。好ましくは、該部分はまた、第1および第4フレームワーク領域のいずれか、もしくは両方の少なくとも約50％を含む。この50％は、第1フレームワーク領域のC末端側b50％および第４フレームワーク領域のN末端側50％である。可変ドメインの実質的部分のN末端またはC末端に付加される残基は、天然の可変ドメイン領域と通常は結合していないものであってよい。例えば、組換えDNA技術を使用した本発明の特異的結合メンバーの構築によって、クローン化もしくはその他の操作ステップを容易にするために導入されたリンカーによりコードされたC末端残基の導入、あるいは該残基がもたらされる。他の操作ステップは、リンカーの導入により、本発明の可変ドメインを免疫グロブリン重鎖、その他の可変ドメイン（例えば、ダイアボディの生成における）、もしくは以下に詳しく述べるタンパク質標識を含む別のタンパク質配列に結合することを含む。
【００４１】
本発明の好ましい態様では、実質的に配列番号２および配列番号４に記載された配列に基づく結合ドメイン対を含む特異的結合メンバーが好ましく、これら配列のいずれかに基づく単一結合ドメインは、本発明のさらに別の態様を構成する。実質的に配列番号２に記載された配列に基づく結合ドメインの場合、免疫グロブリンVHドメインは、特異的に標的抗原に結合する能力があることがわかっていることから、このような結合ドメインは、細胞内抗原のターゲッティング因子として使用され得る。
【００４２】
一本鎖特異的結合ドメインのいずれの場合であっても、これらのドメインを用いて、本明細書中で開示したNHS 76抗体と同じくらい優れた、もしくはこれに等しいin vivo特性を有する２ドメイン特異的結合メンバーを形成する能力がある相補的ドメインをスクリーニングすることができる。
【００４３】
これは、WO92/01047に開示されているような、いわゆる階層的二重組合せ法を用いたファージ展示スクリーニング方法により実現することができる。この方法では、ＨまたはＬ鎖クローンのいずれかを含む個々のコロニーを用いて、他方の鎖（ＬまたはＨ）をコードするクローンの完全ライブラリーに感染させ、これによって得られた二本鎖特異的結合メンバーを、上記参照文献に記載された方法等のファージ展示法に従って、選択する。この技術は、Marksら（同上）によっても開示されている。
【００４４】
本発明の特異的結合メンバーは、さらに、抗体定常領域またはその部分を含んでもよい。例えば、配列番号４に基づく特異的結合メンバーは、そのＣ末端で、ヒトCκ鎖またはCλ鎖、好ましくはCλ鎖を含む抗体軽鎖定常ドメインと結合することができる。同様に、配列番号２に基づく特異的結合メンバーは、そのＣ末端で、免疫グロブリン重鎖の全部または部分と結合することができる。該免疫グロブリン重鎖は、あらゆる抗体アイソタイプ、例えば、IgG、IgA、IgEおよびIgM、ならびに、あらゆるアイソタイプサブクラス、特にIgG1およびIgG4に由来するが、IgG1が好ましい。
【００４５】
本発明の特異的結合メンバーの、特に、腫瘍：血液比およびクリアランス速度に関するin vivo特性は、NHS76に匹敵する。ヒトまたは動物被験者への投与の後、特異的結合メンバーは、腫瘍対血液の最大比が＞３：１を示すであろう。好ましくはこのような比において、特異的結合メンバーはまた、腫瘍部位から離れた器官で、器官対血液比が、＜１：１となる。これらの比は、投与された特異的結合メンバーの異化および分泌器官については除外する。従って、scFvおよびFabの場合（下記の実施例に示すように）には、結合メンバーは腎臓により分泌され、他の器官よりもこの腎臓により一層局在化している。全体IgGの場合には、クリアランスが少なくとも部分的には肝臓により行われる。最大局在比は、通常、特異的結合メンバーの投与から48〜96時間後に達成される。さらに具体的には、この比は、無胸腺ヌードマウスの片側の側腹部の皮下に形成された約0.2〜1.0ｇの腫瘍異種移植片において測定することができる。
【００４６】
本発明の抗体は、検出可能または機能的標識で標識してもよい。検出可能標識は、131Ｉまたは99Tc等の放射標識を包含し、抗体画像化の技術分野では公知の従来の化学的方法を用いて、これら標識を本発明の抗体に結合させることができる。標識はまた、セイヨウワサビペルオキシダーゼ等の酵素標識を含む。さらに、標識は、特異的コグネイト検出可能成分、例えば、標識されたアビジンへの結合により検出することのできるビオチン等の化学成分を含む。
【００４７】
機能的標識には、腫瘍の部位にターゲッティングさせることにより、腫瘍組織の破壊を引き起こすように設計された物質が含まれる。このような機能的標識は、リシン等の毒素、および腫瘍の部位でプロドラッグを活性薬剤へと変換する能力のある、細菌性カルボキシペプチダーゼまたはニトロレダクターゼなどの酵素を含む。
【００４８】
本発明の抗体は、ヒトまたは動物被験者の腫瘍、特に、壊死中心を有する固形腫瘍の診断および治療方法に使用するように設計される。これらの腫瘍は、限定するものではないが、子宮頸、卵巣、前立腺、肺、肝臓、膵臓、結腸および胃の腫瘍を含むあらゆる種類の原発性または二次性固形腫瘍であり得る。
【００４９】
本発明の抗体は、あらゆる適切な経路を介して、通常は、血流への注射、または、腫瘍部位への直接注射により、治療を必要とする患者に投与することができる。的確な投与量は、該抗体が診断もしくは治療のいずれを目的とするのか、腫瘍の大きさおよび位置、抗体の的確な種類（例えば、全抗体、フラグメントまたはダイアボディ）、ならびに、抗体に結合された検出可能または機能的標識の種類を含む、多くの要因に依存する。治療に放射性核種を用いる場合には、1回の適切な最大用量は約60mCi/m2であり、最大約250 mCi/m2までである。腫瘍画像化または腫瘍治療のいずれかを目的とする典型的な抗体用量は、0.5〜40mg、好ましくは、１〜４mgの範囲のF(ab’)2形態の抗体である。これは、成人患者の単回治療のための用量であり、小児および乳児には比例的に調節し、また、他の抗体構成についても、分子量に比例して調節することができる。治療は、医師の判断で、毎日、１週間に2回、毎週、または毎月の間隔で、繰り返すことができる。
【００５０】
現在のところ、腫瘍画像化および腫瘍治療の両方に、F(ab’)2抗体フラグメントを用いるのが好ましい。
【００５１】
本発明の特異的結合メンバーは、通常、医薬組成物の形態で投与され、この医薬組成物は、上記特異的結合メンバー以外に、少なくとも１つの成分を含むことができる。
【００５２】
このように、本発明の医薬組成物および本発明に従う使用のための医薬組成物は、活性成分のほかに、製剤学的に許容可能な賦形剤、担体、バッファー、安定剤、あるいは、当業者には公知のその他の物質を含有することができる。このような物質は非毒性であって、活性成分の効力を妨害しないものであるべきである。担体もしくはその他の物質の的確な種類は、経口、または例えば静脈内等の注射による投与経路に応じて異なる。
【００５３】
経口投与のための医薬組成物は、錠剤、カプセル、粉末もしくは液体の剤形としてもよい。錠剤は、ゼラチン等の固体担体またはアジュバントを含んでいてもよい。液体医薬組成物は、一般に、水、石油、動物油または植物油、鉱油もしくは合成油等の液体担体を含む。生理食塩水、デキストロースもしくはその他のサッカリド溶液、または、エチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコール等のグリコールを含有することもできる。
【００５４】
静脈内注射、または患部への注射の場合には、活性成分は、ピロジェンを含有せず、適したpH、等張性および安定性を有する、非経口用に許容可能な水溶液の剤形とする。当業者であれば、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、乳酸加リンゲル注射液等の等張性賦形剤を用いた適切な溶液を調製することができる。必要に応じて、保存剤、安定剤、バッファー、酸化防止剤および／またはその他の添加剤を含有してもよい。
【００５５】
組成物は、治療する病的状態に応じて、単独で投与するか、または他の治療と同時もしくは連続的に併用して投与することができる。他の治療には、非ステロイド系抗炎症剤（例えば、アスピリン、パラセタモール、イブプロフェンもしくはケトプロフェン）またはモルヒネ等のアヘン剤等の疼痛軽減剤、あるいは制吐薬を適した用量で投与することが含まれる。
【００５６】
本発明は、さらに、本発明の特異的結合メンバーをコードする、単離された核酸を提供する。核酸は、DNAおよびRNAを含む。好ましい態様では、本発明は、配列番号２の残基99〜106、または配列番号４の残基88〜98と同一のポリペプチド、さらに好ましくは、配列番号２および配列番号４のポリペプチド全体を含む、上記に定義した本発明のポリペプチドをコードする核酸を提供する。
【００５７】
本発明はまた、前記の少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むプラスミド、ベクター、転写または発現カセットの形態をした構築物を提供する。
【００５８】
さらに、本発明は、1つ以上の上記構築物を含む組換え宿主細胞を提供する。提供される任意の特異的結合メンバーをコードする核酸は、それ自体で、本発明の１つの態様を成し、同様に、該特異的結合メンバーの産生方法であってその産生のためにコード化核酸からの発現を含んでなる該方法も本発明の態様となる。発現は、適切な条件の下で、核酸を含む組換え宿主細胞を培養することにより都合よく達成することができる。発現による産生の後、任意の適切な方法を用いて特異的結合メンバーを単離および／または精製することができ、その後、必要に応じて用いることができる。
【００５９】
本発明の特異的結合メンバーおよびコード化核酸分子、ならびにベクターを、例えばそれらの天然環境から実質的に純粋もしくは均質な形態で、あるいは核酸の場合には、必要な機能を持つポリペプチドをコードする配列以外の核酸または遺伝子起源を一切もしくは実質的に含有せずに、単離および／または精製して提供することができる。本発明の核酸は、DNAまたはRNAを含んでもよいし、全体または部分的に合成されたものでもよい。
【００６０】
様々な異なる宿主細胞において、ポリペプチドのクローン化および発現のための系が周知である。適切な宿主細胞としては、細菌、哺乳動物細胞、酵母およびバキュロウイルス系が挙げられる。異種ポリペプチドの発現用に当業界で入手可能な哺乳動物細胞系には、チャイニーズハムスター卵巣細胞、HeLa細胞、新生児ハムスター腎細胞、NSOマウス黒色腫細胞、その他多くのものを含む。一般的な、好ましい細菌宿主は、大腸菌である。
【００６１】
大腸菌等の原核細胞での抗体および抗体フラグメントの発現については、当業界で十分確立されている。総説としては、例えば、Pluckthun、A. Bio/Technology 9：545〜551（1991）を参照されたい。また培養中の真核細胞での発現は、特異的結合メンバーの産生の一方法として、当業者には利用可能である。最近の総説として、例えば、Reff, M.E. （1993）Curr. Opinion Biotech. 4：573〜576；Trill J.J.ら、（1995）Curr. Opinion Biotech 6：553〜560を参照されたい。
【００６２】
適した調節配列（プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子、およびその他の配列が適宜含まれる）を含む適切なベクターを、選択または構築することができる。ベクターは、必要に応じて、プラスミド、例えばファージなどのウイルス、またはファージミドでよい。さらに詳細については、例えば、Molecular Cloning：a Laboratory Manual：第2版、Sambrookら、1989、Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照されたい。例えば、核酸構築物の調製、突然変異誘発、配列決定、細胞へのDNAの導入および遺伝子発現における核酸の操作、ならびにタンパク質の分析のための多くの公知方法およびプロトコルが、Short Protocols in Molecular Biology、第2版、Ausubelら編、John Wiley & Sons、1992に詳しく記載されている。SambrookらおよびAusubelらの開示内容は、本明細書に参照として組み込むものとする。
【００６３】
従って、本発明のさらに別の態様は、本明細書に開示した核酸を含む宿主細胞を提供する。さらに別の態様は、このような核酸を宿主細胞に導入することを含む方法を提供する。この導入には、あらゆる利用可能な技術を用いることができる。真核細胞の場合、適切な技術には、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストラン、エレクトロポレーション、リポソーム媒介トランスフェクション、ならびに、レトロウイルスもしくはその他のウイルス、例えばワクシニア、または昆虫細胞に対してはバキュロウイルスを用いた形質導入が含まれる。細菌細胞の場合には、適した技術には、塩化カルシウム形質転換、エレクトロポレーション、ならびにバクテリオファージを用いたトランスフェクションが含まれる。
【００６４】
上記の導入の後、例えば遺伝子発現のための条件下で宿主細胞を培養することにより、核酸からの発現を生起するか、あるいはその発現を可能にすることができる。
【００６５】
ある実施形態では、本発明の核酸は、宿主細胞のゲノム（例えば、染色体）に組み込まれる。組み込みは、標準的方法に従い、ゲノムとの組換えを促進する配列を含有させることにより、促進することができる。
【００６６】
本発明はまた、発現系において、前記のような構築物を用いて、前記のように特異的結合メンバーまたはポリペプチドを発現させることを含む方法を提供する。
【００６７】
下記の実施例により、本発明を説明する。
【００６８】
実施例１：
TNT-1と同等の抗体の単離
1a．抗原の調製
ヒト核抗原に特異的なクローンを生成するために、抗原の供給源として、ヒトバーキットリンパ腫細胞（Burkitt’s  lymphoma  cell）系のラジ（Raji）細胞を用いたが、これは、主に、G.K. Millerら、1993年、Hybridoma 第12巻、第6号、p.p. 689-697に記載されているように調製した。
【００６９】
培養物をペニシリン、ストレプトマイシン（Gibco BRL）および５％ウシ胎児血清（FetalClone II、Hyclone Europe Ltd）を加えたRPMI-1640＋L-グルタミン培地（Gibco BRL）中で増殖させた。細胞を、ローラーボトル中で増殖させ、１Lのバッチに作製した。培養物を1,000rpmで10分遠心分離して、得られた細胞をPBS溶液（Oxoid）で洗浄した。培養物を再度遠心した後、得られたペレットを90％FCS/10％DMSO中で凍結させた。各々の１Lのバッチから、1.3〜9.5×10８個の細胞が得られた。
【００７０】
核抽出物を調製するために、細胞ペレットをまず氷上で解凍し、10ml の10mM CaCl２、２μM PIPESバッファー中で穏やかに再懸濁した。細胞を1,000rpmで沈殿させてペレットにし、１％Nonidet P40を含有する同じバッファー中で再懸濁した。これを氷上で10分インキュベートすることにより、細胞膜を破壊した。少量を回収し、光学顕微鏡により分析した。これによって、完全な細胞は残っていないことがわかった。3,000rpmの瞬間遠心分離により、核を沈殿させてペレットにした。核（真珠様白色のペレット）を５mlのCa-PIPESバッファーに再懸濁した。１mlの核をペレットにし、１mlの滅菌TE pH8.0に再懸濁させた。これを、３×45秒の超音波破砕により、核膜を破壊した。残屑を13,000rpm、2分（微量遠心）にてペレットにし、上澄みを新しい試験管に移した。核抽出物の量を、換算係数10A260＝１mgヌクレオヒストンを用いて、260nmでの吸光度により決定した。該ヌクレオヒストンの収率は、1.2mg/mlと推定された。
【００７１】
１ｂ．ファージ抗体ライブラリーの誘導
ラジ細胞核抽出物に対する抗体として、２つの異なるファージ抗体レパートリー、VH合成（Nissimら、1994）レパートリーおよび大型scFv’（Vaughanら、1996）レパートリーを選択した。両レパートリーをそれぞれ次のように処理することにより、ファージミド粒子を得た。２Lの円錐フラスコ中で、500mlの予め温めた（37℃）2YTAG（100μｇ/mlアンピシリンおよび２％グルコースを添加した2YT培地）に、しかるべきライブラリーのグリセロール保存液（−70℃）の培養物由来の約３×1010個の細胞を播種した。OD600nmが、0.7になるまで（約２時間）、良好な通気の下、培養物を37℃で増殖させた。M13K07ヘルパーファージ（Stratagene）を感染効率（moi）が約10になるように（OD600nm：１が、培養物１ml当たり、５×10８細胞に相当すると仮定する）、上記培養物に添加した。培養物を、15分間静置状態で37℃でインキュベートした後、同じ温度で、45分間軽い通気（200rpm）を施した。培養物を遠心分離し、細胞ペレットから上澄みを除去した。細胞を500mlの2YTAK（100μｇ/mlアンピシリンおよび50μg/mlカナマイシンを添加した2YT培地）中に再懸濁し、培養物を良好な通気（300rpm）の下、30℃で一晩インキュベートした。ファージ粒子を精製し、ポリエチレングリコール（PEG）沈殿（Sambrookら、1990）により濃縮し、10mlの 1×TE中に再懸濁した。各々に塩化セシウムを添加し、溶解し、超遠心分離用遠心管に移し、Sorvall TFT 65.13ローター中で、16℃、42,000rpmにて一晩遠心分離した。セシウムで縞状を呈したファージを、針とスポイトで回収した後、Slide-a  Lyzer  Cassette（Pierce）を用いて、製造者の指示に従って、４℃で２×２L TE中で一晩透析した。ファージを使用するまで、４℃で保存した。
【００７２】
１ｃ．核抽出物でのファージ抗体ライブラリーのパンニング
TNT-1を取得するためにマウスの接種に用いたものと同じ抗原である、ラジ細胞核抽出物に対して、２つのレパートリーから得たファージをそれぞれ個別にパンニングした。大型scFvレパートリーについては、ライブラリーの１×10９の分量を個別に選択した。75mm×12mmの免疫試験管（immuno tube）（Nunc；Maxisorp）を１mlの無菌PBS中の10μg核抽出物で、４℃で一晩、続いて37℃で１時間放置し、被覆した。PBSで3回洗浄した後、試験管を３％MPBS（３％「マーベル（Marvel）」脱脂粉乳、１×PBS）で満たし、37℃で1時間インキュベートすることにより、ブロッキングした。洗浄を繰り返し、２mlの３％MPBS中のファージミド粒子（1012 tu）を添加し、試験管を37℃で1時間静置してインキュベートした。試験管をPBST（0.1％）で10回洗浄した後、さらにPBSで10回洗浄した。１mlの100mM-トリエチルアミンを添加し、室温で10分静置してインキュベートすることにより、結合したファージ粒子を試験管から溶出させた。溶出した物質を、１mlの1M-Tris.HCl（pH7.4）を含む試験管にピペットで移すことにより、ただちに中和した。ファージを４℃で保存した。1.5mlの溶出されたファージを用いて、対数的に増殖している10mlの大腸菌TG1に感染させた（Gibson、1984）。感染させた細胞を、２YTブロス（２YT  broth）中で、軽い通気の下、37℃で1時間増殖させ、次に、243mm×243mmディッシュ（Nunc）中の2YTAG培地上に塗布した。プレートを30℃で一晩インキュベートした。コロニーを、プレートからこすり取り、10mlの２YTブロス中に入れ、15％（v/v）グリセロールを添加し、−70℃で保存した。
【００７３】
２つのレパートリー各々の核抽出物に対する第1回目のパンニングで得られたグリセロール保存培養物を、ヘルパーファージを用いて取り出し、第2回目のパンニングのためのファージミド粒子を得た。250μｌのグリセロール保存液を用いて、50mlの2YTAGブロスに接種し、OD600nmが0.7に達するまで（約2時間）、250mlの円錐フラスコ内で、良好な通気の下、37℃でインキュベートした。M13K07ヘルパーファージ（moi＝10）を上記培養物に添加し、続いて37℃で15分静置しインキュベートした後、同じ温度で、45分間軽い通気（200rpm）を施した。培養物を遠心分離し、上澄みを細胞ペレットから除去した。細胞を予め温めた50mlの2YTAK中に再懸濁し、該培養物を、良好な通気の下、30℃でインキュベートした。
【００７４】
２つのレパートリーの各々の第1回目のパンニングから得られたファージを、前述と同様に、再度選択した。入念に洗浄した後、１mlの100mM-トリエチルアミンを用いて結合したファージを試験管から溶出し、これを0.5ml 1M-Tris.HCl（pH7.4）の添加により中和して、前述と同様、TG1細胞へと感染させた。
【００７５】
１ｄ．免疫検定のための個別選択クローンの増殖
第2回目の選択から得られた個別コロニーを用いて、96ウェル組織培養プレート（Corning）の個々のウェル中の100μlの2YTAGに接種した。プレートを適度に振とうしながら（200rpm）30℃で一晩インキュベートした。15％までグリセロールを各ウェルに添加し、これらのマスタープレートを、分析に使用するまで、−70℃で保存した。
【００７６】
１ｅ．核抽出物結合scFvを同定するためのELISA
核抽出物に特異的なクローンを、ファージに提示されたscFvを用いるELISAにより同定した。マスタープレートからの細胞を用いて、１ウェル当たり100μlの2YTAGを含む新しい96ウェル細胞培養プレートに接種した。これらのプレートを37℃で６〜８時間、またはウェル内の細胞が対数的に増殖するまで（OD600  0.2-1.0）、インキュベートした。moiが10になるまで、M13K07を各ウェルに添加し、静置状態で15分、次に、穏やかに振とうしながら（100rpm）45分、いずれも37℃でインキュベートした。プレートを2,000rpmで10分遠心分離し、上澄みを抜き取った。各細胞ペレットを100μlの2YTAG中に再懸濁し、30℃で一晩インキュベートした。
【００７７】
各プレートを2,000rpmで遠心分離し、各ウェルから100μlの上澄みを回収し、20μlの18％M6PBS（18％脱脂粉乳、６×PBS）中でブロッキングした後、室温で1時間静置した。その間、PBS中の2.5μg/ml核抽出物50μlもしくは50μlのPBSのみ（非被覆の対照プレートとする）のいずれかを用いて、4℃で一晩静置状態でブロックしておいたフレキシブルマイクロプレートを、3回PBSで洗浄し、3MPBS中で37℃で2時間静置状態でブロッキングした。次に、これらのプレートをPBSで3回洗浄し、50μlの予めブロックしたファージを核抽出物被覆もしくは非被覆の両プレートの各ウェルに添加した。プレートを37℃で1時間静置インキュベートした後、ファージを流し出した。PBST中で2分間のインキュベートを3回繰り返した後、PBS中で2分間のインキュベートを3回行い、プレートを洗浄した。これらはすべて室温で行った。
【００７８】
核抽出物被覆もしくは非被覆の両プレートの各ウェルに、3MPBSで1/10,000に希釈したヒツジ抗fd抗体（Pharmacia）50μlを添加し、プレートを37℃で1時間静置インキュベートした。各プレートを前述のように洗浄し、3MPBSで1/5,000に希釈したアルカリホスファターゼ標識ロバ抗ヒツジ抗体（Sigma）50μlを添加し、37℃で1時間静置インキュベートした。プレートを前記と同様に洗浄した後、0.9％NaClで2回すすいだ。発色性基質のpNPP（Sigma）を用いて、アルカリホスファターゼ活性を可視化した。マイクロプレートリーダーを用いて、405nmでの吸光度を測定することにより、各クローンにより生じる吸光度シグナルを評価した。
【００７９】
核抽出物被覆プレート上に生じたELISAのシグナルが、非被覆プレート上のそれの少なくとも2倍であった場合には、そのクローンを選択して、さらに分析する。分析した700のクローンのうち、約350個が、設定した基準を満たした。これらクローンの86を選択して、さらに特性決定を行った。
【００８０】
１ｆ．特異的ELISA
非被覆ウェルにではなく核酸抽出物に結合するものとして同定された86のクローンを、詳細な特異性についてさらに分析した。前述したように、ファージ上に提示されたscFvを用いて、特異的ELISAを実施した。マイクロタイタープレートのウェルを、50μlのPBS中の、5μg /ml核抽出物、5μg /mlヒストンH1（Boehringer Mannheim）、100μg/mlリゾチーム、またはPBS（非被覆ウェル）のいずれかで、4℃で一晩被覆し、37℃で1時間放置した。ファージおよびマイクロプレートの双方を予めブロックした後、各クローン由来の50μlのブロック済ファージを、各抗原で被覆したウェル、または、非被覆ウェルに添加した。前述と同様に、発色性基質pNPP（Sigma）を用いて、アルカリホスファターゼの活性を視覚化した。核抽出物およびヒストンH1に特異的だが、リゾチームまたは非被覆ウェルとの交差反応を示さないクローンをさらに分析した。核抽出物とヒストンH1の両抗原に対して生じるELISAシグナルが、リゾチームまたは非被覆ウェルのいずれかにおけるシグナルより少なくとも5倍大きかった場合には、そのクローンを核抽出物およびヒストンH1に特異的であるとした。TNT-1は、核抽出物とヒストンH1の両方に結合するが、リゾチームとは結合しない。29のクローンが、TNT-1に類似した結合プロフィールを呈示し、これらをさらに特性決定した。
【００８１】
実施例２：
ウエスタンブロット分析
２ａ．可溶性scFvの調製
TNT-1に類似した結合プロフィールを持つ29のクローンを、ウエスタンブロット分析により、核抽出物成分に対する結合について分析した。このために、50mlの培養物のペリプラズムから調製した可溶性scFvを使用した。２mlの一晩培養した培養物（2TYAG中に30℃で増殖させた）を50ml 2TYAに添加し、OD600が0.6になるまで、30℃でインキュベートした。IPTGを最終濃度１mMまで添加し、培養物を30℃で一晩増殖させた。細胞を50mlファルコン管中でペレットにし、５mlの氷冷50mM Tris−Cl(pH8）、20％スクロース、１mM EDTA中に入れた。懸濁液を氷上で30分インキュベートした後、SM-24ロータ中で、20分８Ｋで遠心分離した。上澄みをウエスタンブロット分析に用いた。
【００８２】
２ｂ．SDSポリアクリルアミドゲルの泳動
SDS-ポリアクリルアミドゲルをBio-Rad電気泳動セルにはめ込み、100ml の2.5×SDSローディングバッファーをスロットに添加することにより、水平な表面（Spirit level surface）を形成した。200mlの核抽出物サンプルを、ベータメルカプトエタノールを含む１×SDSローディングバッファー中で、90℃で2分加熱し、2.5×SDSローディングバッファーの上にのせた。ブロモフェノールブルー染料の先端が、ゲルの底部を通過するまで、20mAでゲルを泳動した。Bio-Radセミドライトランスファーセル(semi-dry transfer cell)24Ｖを用いて、ゲルからPVDFイモビロン-Pトランスファー膜上に、上記タンパク質をブロットした。この膜をメタノールで簡単に洗浄した後、空気乾燥した。係る膜を、約３mmの帯状片に切断した。
【００８３】
２ｃ．ウエスタンブロッティング
上記のようにして得た膜片をメタノール、次に水で簡単に洗浄した。各膜片を、12の個別のウェルに区分されたコースター試薬レザーバーにおいて、５％マーベル/PBS/Tween中で45分ブロッキングした。2.5mlのペリプラズム調製物に、0.5mlの18％ マーベル、６×PBSを添加し、室温で15分インキュベートすることにより、各クローンのペリプラズム抽出物をマーベル/PBS中で予めブロックした。このようにして予めブロックした抗体を各膜片に添加し、室温で1時間インキュベートした。これらの膜片を、PBS/ Tweenを数回交換して30分洗浄し、次に別の試薬レザーバーに移し、PBS で５分2回洗浄した。３％マーベル/PBS で1/100に希釈した9E10抗mycタグを膜片に添加し、室温で1時間インキュベートした。この膜片を、PBS/ Tweenを数回交換して30分洗浄し、次に、別の試薬レザーバーに移し、PBSで５分間2回洗浄した。３％マーベル/PBS で1/1000に希釈したヤギ抗マウスIgGペルオキシダーゼを膜片に添加し、室温で1時間インキュベートした。この膜片を、PBS/ Tweenを数回交換しながら1時間洗浄した後、別の試薬レザーバーに移し、５分間PBSで2回、また5分間塩水で2回洗浄した。各膜片を水で簡単に洗浄し、新しい試薬レザーバーに移した後、製造者の指示に従い、ECL（Amersham）を用いて現像した。このフィルムを上記膜片に2分から16時間暴露した。
【００８４】
ウシヒストンH1調製物および各抽出物について選択した候補物の2回目のウエスタンブロットを、ほぼ前記と同様に、ファルマシアファスト（Phast）ゲルシステムを用いた20％PhastGelで、実施した。
【００８５】
ウエスタンブロットから、多数の候補が、TNT1の結合プロフィールに近い結合プロフィールを有し、ヒストンH1およびヒストンH3を認識するが、他のコアヒストン、および該調製物中の他の非同定タンパク質にもある程度結合することが明らかになった。ウエスタンブロット分析により、NHS 16、NHS 19、NHS 39、NHS 45、NHS 65、NHS 76およびNHS 86の7個のクローンがTNT-1とほぼ同じ結合をすることがわかった。これらのTNT-1同等クローンを選択して、さらに分析した。また、別のクローン、NHS 22を選択して、さらに分析したところ、他の候補と類似したELISAプロフィールを有するが、ウエスタンブロットパターンは異なることがわかった。
【００８６】
すべての候補クローンが、TNT1様のプロフィールを示すわけではなく、これらのクローンの中には、結合プロフィールを決定するのに十分なシグナルを与えないものもあれば、TNT1のプロフィールとは異なるウエスタンブロットプロフィールを持つものもあった。実際、開始した抗原の複雑さを考慮に入れると、これほど多くのクローンが、TNT1のウエスタンブロットプロフィールと類似したプロフィールを有するのは驚くべきことである。
【００８７】
２ｄ．TNT-1同等ScFv抗体の配列決定
まずベクター特異的プライマーを用いて各クローン由来のインサートDNAを増幅することにより、TNT-1に同等のヒトscFv抗体のヌクレオチド配列を決定した。2YTAG寒天プレート上の個別のコロニーに由来する細胞を、pUC19リバースおよびfdtet配列をプライマーに用いる、インサートDNAのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅用の、鋳型として使用した。pUC19リバースは、配列：5’AGC GGA TAA CAA TTT CAC ACA GG 3’（配列番号５）を有する。fdtet配列は、配列：5’ GTC GTC TTT CCA GAC GTT AGT 3’（配列番号６）を有する。増幅条件は、94℃で1分、55℃で1分、72℃で2分、つづいて72℃で10分を30サイクル実施することからなる。PCRクリーンアップ・キット（Promega）を用いてPCR産物を精製し、H２Oで最終容量50μl とした。2μlから５μlの各インサート調製物を、Taq Dye-ターミネーターサイクルシークエンシングシステム（Applied Biosystems）を用いる配列決定用の鋳型として使用した。myc配列10およびPCR-L-Linkをプライマーに用いて各クローンの軽鎖を、また、PCR-H-LinkおよびpUC19リバースを用いて、各クローンの重鎖を、それぞれ配列決定した。これらプライマーの配列は次の通りである：
pUC19リバース：5’ AGC GGA TAA CAA TTT CAC ACA GG 3’（配列番号７）
myc配列10：5’ CTC TTC TGA GAT GAG TTT TTG 3’（配列番号８）
PCR-H-Link：5’ ACC GCC AGA GCC ACC TCC GCC 3’（配列番号９）
PCR-L-Link：5’ GGC GGA GGT GGC TCT GGC GGT 3’（配列番号10）
２ｅ．TNT-1に同等なScFv抗体の配列およびその供給源
抗体
前述した２つのライブラリーを用いて、8つの異なるTNT-1に同等な抗体を単離した。さらに、Jespersら（1994）、Biotechnology 12；899-903に記載されているのとほぼ同様の、抗原の供給源として核抽出物を用いるchTNT-1のエピトープの刷り込みにより、別のクローン、D3を単離した。各クローンの名称、その起源、ならびにその重鎖および軽鎖の生殖系列（germline）を以下に示す。NHS 76VHおよびVL鎖の配列（配列番号２および４）は図1および２に示す。
【００８８】
0004544744.tif 000002
これら８つのクローンの特異性とそれらの配列との間には、いかなる相関もないようである。非常に多様なVH/VLの組合せを使用すると、CDR領域が高度に変化可能になる。従って、TNT-1と同等のin vitro結合特性を備える抗体を、それらのアミノ酸配列から推定することはできないだろう。
【００８９】
実施例３：
候補クローンの完全な抗体型への転換
制限消化、連結反応、クローン化およびPCR
DNAの制限消化、連結反応およびクローン化は、記載されている（Sambrookら、1987）のとほぼ同様に実施した。50μlの各PCRは、10mM Tris  HCl pH8.85、25mM KCl、５mM（NH４）２SO４、2mM MgSO４、250μM dNTP、0.5μMの各プライマー、1U PwoI DNAポリメラーゼ（Boehringer Mannheim）および適量の鋳型DNAを含む。各反応混合物を、15-25サイクルの94℃、30秒；50℃、30秒；72℃、60秒に供した。
【００９０】
NH76 IgGを発現する細胞系の構築
ヒトIgG1抗体を発現する細胞系の構築のために、NHS76 scFv発現ファージ由来の重鎖および軽鎖可変領域を、ヒトIgG1およびヒトラムダ定常領域をそれぞれ含む哺乳動物発現ベクターにクローン化した。
【００９１】
続いて単一発現ベクターでのNHS76のVHおよびVL領域の可能なクローン化を助長するには、内在BamHI部位の欠失が必要であった。PCRによる突然変異誘発(PCR-directed  mutagenesis)（Ho、S.N.、Hunt, H.D、Horton、R.M.、Pullen, J.K. およびPease、L.R. 1989 Gene 77、51〜59）によって、NHS76 VHについてはP54（配列番号15）＋P58（配列番号17）およびP57（配列番号16）＋P17（配列番号13））をプライマーに用いて、そしてNHS76 VλについてはP61（配列番号20）＋P60（配列番号19）およびP59（配列番号18）＋P45（配列番号14）をプライマーに用いて、該制限部位を除去した。実施例３のオリゴヌクレオチドプライマーはすべて、表６に示す。予想したサイズのPCR産物を、VHにはP54＋P17を、また、VLにはP61＋P45をそれぞれ用いて、2回目のPCRを行って結合した。制限部位の除去によるアミノ酸配列の変化はみられなかった。
【００９２】
重鎖発現ベクター
P54およびP17を用いて増幅したNHS76 VH DNAはオーバーラップPCRにより、オリゴヌクレオチドP10（配列番号11）およびP17を用いて、シグナル配列、スプライス部位、およびM13VHPCR1（Orlandiら、1989）由来のイントロンを含有する158bp DNA断片に結合させた。539 bp PCR産物をHindIIIおよびApaIで切断し、HindIII−ApaI切断pGammal（Lonzaから取得）中にクローン化した。連結したDNAを大腸菌TG1に形質転換し、アンピシリン耐性コロニーを選別した。正しいインサートを有するプラスミドを同定し、pNHS76γlと名付けた。
【００９３】
軽鎖発現ベクター
ラムダ鎖発現用のベクターは、CκDNAがヒトCλDNAで置換されており、pCλと呼ばれる、pMR15.1（Lonzaから取得）の改変型である。P61およびP45で増幅したNHS76 VλDNAを、オーバーラップPCRによりオリゴヌクレオチドP11（配列番号12）およびP45を用いて、シグナル配列、スプライス部位およびM13VKPCR1（Orlandiら、1989）由来のイントロンを含有する168bp DNA断片に連結した。529 bp PCR産物をBstBIおよびPacIで切断し、BstBI−PacI切断pCλ中にクローン化した。連結したDNAを大腸菌TG1に形質転換し、アンピシリン耐性コロニーを選別した。正しいインサートを有するプラスミドを同定し、pNHS76lと名付けた。
【００９４】
NHS76 IgG発現
NHS76 IgGを、マウス骨髄腫細胞系NS0（ECACC 85110503）に発現させた。45μgのpNHS76γ1および15μgのpNHS76λ DNAを、PvuIで消化し、線状化し、エタノール沈殿後、100μlの水に溶解した。107 個のNSO細胞をPBSで洗浄し、0.9mlの PBSに再懸濁させ、ベクターDNAと混合した後、氷中に5分保持した。次に、３μFd、1.5kVの2パルスで細胞を電気穿孔し、氷中で10分インキュベートした。トランスフェクションした細胞を、Bebbingtonら（1992）の記載のとおり、２mMグルタミンと10％の透析済みウシ胎児血清（FCS）を含む30mlのダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）に添加した後、50μl量ずつを６×96ウェルプレートに分配した。24時間後、グルタミンを含まないDMEM／10％FCS（Bebbingtonら、1992）を各ウェルに添加した。トランスフェクションから3週間から6週間後、ヒトIgG分泌能について、ELISAを行って、コロニーを選別した。ELISAプレート（Immulon 4、Dynatech）のウェルを、１ウェル当たり100ngの50mM 炭酸水素ナトリウム／炭酸塩pH9.6中のヤギ抗ヒトIgG抗体（Sera-Lab）で被覆した。トランスフェクトしたコロニーを含むウェルから得た上澄みを、0.05％（v/v）Tween20含有PBS（PBST）の入ったウェルに、1時間添加しておいた。これらのプレートをPBSTで3回洗浄し、PBSTで1：2000-1：5000に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）結合ヤギ抗ヒトラムダ抗体（Sera-Lab）を100μl用いて、捕捉されたヒトIgGを検出した。室温で30分後、プレートをPBSTで3回洗浄し、100μlのOPD基質を添加した（50μl）。５-10分後に、50μlの12.5％（v/v）硫酸を添加して反応を停止し、A 490 nmを測定した。最大量のIgGを分泌するトランスフェクタントを、量を減らしたFCS、ガンマグロブリンを含まないFCS中、またはFCSの非存在下で、グルタミン非含有培地に増殖させた。次に、限界希釈法により細胞系をクローン化した。
【００９５】
抗体の精製
ヒトIgG1抗体をプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。NHS76 IgGを分泌するトランスフェクトしたNS0細胞を増殖させて得た上澄み液を、遠心分離および0.22μmフィルターろ過により、清澄化した。プロテインＡセファロースカラム（HiTrap、Pharmacia）をPBSで平衡化し、該上澄み液を加えた。次に、該カラムを10カラム容量のPBSで洗浄し、存在するウシIgG（培地中のウシ胎児血清由来の）はすべて、0.1M酢酸ナトリウムpH4.5で溶出して除去した。さらにPBSで洗浄した後、ヒトIgGを0.1M酢酸ナトリウムpH3.5で溶出した。溶出された画分を１ＭTris  HCl pH9.0で中和し、タンパク質を含む画分を280nmの吸光度の測定により特定した。抗体を含む画分を集め、PBSに対して透析した。
【００９６】
実施例４：
完全な抗体の消化
候補を、完全な抗体およびF(ab’)2フラグメント双方について、動物モデルに対して、試験した。これらは、ペプシン限定分解により生成したものである。披試験抗体の各々について、試験消化を実施した。下記のものを1.5mlの微量遠心管に加えた：
−25μlのPBS中の完全な抗体
−５μlの1M酢酸ナトリウムバッファー（pH３、3.5、4、4.5、５、または5.5のいずれか）
−最終濃度10μg/mg抗体（酵素／基質＝１／100）のペプシン
−総容量を50μlにする水
消化物を37℃でインキュベートし、サンプルを1、４、８および16時間後に取り出した。最終濃度0.3Mになるように3M  Tris-HCl pH8.8を添加することにより、反応を停止した後、10〜15％ファストゲル(Phast  gel)（Pharmacia）で分析した。
【００９７】
これによって各抗体について最適の消化条件が得られ、該条件を大量消化に適用した。消化の後、F(ab’)2フラグメントを、24ml のS200 FPLCカラムで精製し、14〜16.5mlの画分に溶出した。これらを集め、アミコンセントリプレップ（Amicon Centriprep ）YM10で約４mg/mlまで濃縮した。
【００９８】
実施例5：抗体のヨウ素化
ヨウ素化のために、まず必要な数のスクリュートップ・エッペンドルフ管をヨードゲンで被覆した。ヨードゲン（Pierce）をクロロホルムに1.2mg/mlの濃度で溶解させ、次に、クロロホルムで10分の１に希釈する。0.5mlを各管に添加し、これにN2の下で注意深く吹きつけた。これらを将来の使用に備えて、4℃で乾燥器内に保存した。ヨウ素化するために、0.5mgのタンパク質を氷上のヨードゲンの管に移し、ホウ酸塩標識バッファー（100ml 100mM Borax、100ml 0.9％NaCl、HClを用いてpHを8.5にする；フィルター滅菌済み）で0.5mlとした。適量のNa125I（250μCi−2.5mCi）を添加し、混合した後、氷上に10分放置した。微小なパスツールピペットを用いて、５％BSA/PBSで予めブロックして無菌PBSで5回洗浄してあるPD-10カラム（Pharmacia Boiotech）上に全反応物を移した。0.5ml量ずつの無菌PBSを連続的に上記カラムの上に添加し、通過させた。同じく0.5ml量ずつを管の底で回収する。次に、ガンマカウンターで、各画分をカウントする。ヨウ素化タンパク質は、通常、画分６-７に得られた。
【００９９】
実施例６：生体分布実験
NHS76のF(ab’)２フラグメントが胸腺欠損マウスにおけるヒト腫瘍異種移植片に局在できることを確認するために、実験を行った。雌の胸腺欠損nu/nu MF-1マウス（１群に４匹）に、107個のME-180ヒト頚癌細胞（ATCC HTB-33）を皮下注射した。約３-４週間後に、腫瘍を有するマウスに、10μg（37kBq）の125I-標識NHS76 IgGまたは125I-標識NHS76 F(ab’)2を尾静脈に注射した。注射後96時間までの選択した時点で、マウスを殺し、血液、腫瘍およびすべての主要器官を回収し、計量した（１時点につき４匹）。ガンマカウンター（Cobra II、Packard）で放射能を測定した。各器官１ｇ当たりの注射容量に対する百分率を決定し、器官：血液比を計算した。ME-180異種移植片モデルは、当業界では試験物質のヒトの臨床的有用性の指標として用いられる。Espteinら、”Handbook of Targeted Delivery of Imaging Agents”（前述）を参照されたい。表１および図３は、125I-標識NHS76 F(ab’)2の生体分布を示す。図３aは分布を、また、図３bは、組織：血液比の平均を示す。このフラグメントは、注射後（p.i.）24時間では、注射量に対してわずか１％だけを残して血液循環から速やかに除去されていた。NHS76 F(ab’)2は、注射後96時間では、腫瘍：血液比が4.3：１となるなど、時間経過と共に腫瘍局在が増加することを示している。調べた他の器官はいずれも、特異的残留は認められない。
【０１００】
図４ａおよび４ｂは、125I-標識D3 F(ab’)2の生体分布と、平均腫瘍：血液比をそれぞれ示す。データは表２に示す。D3は、24時間で血液循環への残留が注射量のわずか0.29%であり、血液循環からの排除が125I-標識NHS76 F(ab’)2よりも速いことがわかる。D3 F(ab’)2もまた、特異的腫瘍局在を示し、96時間での腫瘍：血液比は5.6：１である。しかし、皮膚における125Iの残留も認められる（皮膚：血液比は3.3：１）。NHS76と比較して、D3は、腫瘍への付着量がはるかに少ないことを示し、例えば、注射後96時間で、D3 F(ab’)2を含む腫瘍は、NHS76 F(ab’)2を含むものより放射能が６倍少ない。
【０１０１】
表3および４は、NHS45およびNHS86の125I-標識 F(ab’)2フラグメントの生体分布を示す。両フラグメントとも、注射後24時間での残留が注射量の0.1%と、NHS76 F(ab’)2よりも、血液循環から速く排除される。注射後24時間から96時間まで、両抗体フラグメントは腫瘍への取り込みを示し、腫瘍：血液比は＞３-５である。しかし、NHS45およびNHS86の両フラグメントには、他の器官での著しい残留も認められる。
【０１０２】
NHS19 F(ab’)2では、腫瘍特異的な取り込みは、あったとしても、ほとんど認められない（表5、図５ａおよび５ｂも参照のこと）。
【０１０３】
従って、NHS76 F(ab’)2は他の抗体のフラグメントとは対照的に、他の器官には一切特異的残留をせずに腫瘍に局在する能力を呈する。抗原結合特異性、血清での排除およびその全体的なヒトの特性によって、NHS76 F(ab’)2は、繰り返し投与が可能なin vivoでの診断または治療薬剤として、ヒトへの使用によく適した特性を備える合成物である。
【０１０４】
表１〜５は、ME-180腫瘍を有する胸腺欠損マウスにおける125I-標識F(ab’)2フラグメントの生体分布を示す。数値は、平均％注射量（ID）/ｇを表す（４-５匹からの器官の標準偏差）。
【０１０５】
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実施例７：
NHS76の抗原特異性
NHS76 IgGのヒストンへの結合能をELISAによって検定した。マイクロタイタープレート（Immulon IV、Dynatech）のウェルを、50mM重炭酸塩／炭酸塩バッファーpH9.6中の100ngウシヒストン（Boeringher Mannheim）で4℃で16時間被覆した。ウェルをPBST中の２％マーベル（MPBST）200μlで、37℃にて1時間ブロックした。PBSTで洗浄した後、100μlのMPBST中のNHS76  IgGをウェルに添加し、室温で1時間インキュベートした。洗浄した後、１：2000のHRPヤギ抗ヒトIgG抗体（Harlan Sera-Lab）100μlを添加することにより、結合したIgG抗体を検出した。室温で30分後、ウェルを洗浄し、100μlのo-フェニレンジアミン（24mMクエン酸、52mM Na２HPO４ pH5.2、0.003％H２O２中に0.4mg/ml）を添加した。6分後、50μlの12.5%硫酸を添加することにより反応を停止し、490nmで吸光度を測定した。NHS76 IgGの相対的結合は、ヒストンH1＞ヒストンH3＞ヒストンH2B＞ヒストンH4＝ヒストンH2A（図6）である。また、溶液状のヒストンへのNHS76 IgGの相対的結合を測定するための競合ELISAを行い、ELISAデータを確認した。
【０１０６】
NHS76 IgGのヒトおよび他の種由来のヒストンへの結合能をウエスタンブロッティングにより分析した。ラジ(Raji)細胞（ヒト）、NS0細胞（マウス）、JTC-19細胞（ラット）およびJH4細胞（モルモット）の核抽出物を、14％SDS-PAGで電気泳動した。ゲルをニトロセルロース膜（Amersham International）に電気的にブロットし、続いてMPBSTを用いて、室温で１時間ブロックした。次に、1μg/mlのNHS76 IgGと室温で50分インキュベートした。PBSTで４回洗浄した後、その膜をMPBST中で１：5,000のHRPヤギ抗ヒトIgGと、室温にて40分インキュベートした。入念な洗浄の後、その膜を、製造者の指示に従い、ECL試薬（Amersham）でインキュベートした。ウエスタンブロットの結果（図７a-c（異なる強度のバンドを現すため、３つの異なる暴露））から、ウシヒストンH1およびH3と一緒に泳動されるヒト、マウス、ラットおよびモルモットの細胞由来のタンパク質と、NHS76 IgGとが結合することが示された。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、NHS76 VH遺伝子の核酸配列とその翻訳配列を示す図である。
【図２】  図２は、NHS76 VL遺伝子の核酸配列とその翻訳配列を示す図である。
【図３】  図３aは、125I-標識 NHS76 F(ab')2の生体分布を示す図である。図３bは、125I-標識 NHS76 F(ab')2の組織：血液の平均比を示す図である。
【図４】  図４aは、125I-標識 DS F(ab')2の生体分布を示す図である。図４bは、125I-標識 DS F(ab')2の組織：血液の平均比を示す図である。
【図５】  図５aは、125I-標識 NHS19 F(ab')2の生体分布を示す図である。図５bは、125I-標識 NHS19 F(ab')2の組織：血液の平均比を示す図である。
【図６】  図６は、ELISAの実施により測定したNHS76 IgGのヒストン結合能を示す図である。
【図７】  図７は、様々な生物種由来のヒストンに対するNHS76 IgGのヒストン結合能を、ウェスタンブロッティングによって検出した結果を示す図である。図７a〜cは、強度の異なるバンドを現すために暴露時間を変えて行った結果をそれぞれ示す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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