(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
レーザ光を発する光源と、
この光源からのレーザ光のスポットを試料の所定位置に保持させるスポット保持手段と、
前記試料からの光を検出する検出手段と、
前記試料に対して刺激を与えるトリガ信号を発生するトリガ発生手段と、
前記トリガ発生手段のトリガ信号に同期して同期信号を発生する同期信号発生手段と、
この同期信号発生手段の同期信号に応じて前記試料に対するレーザ光の照射の要否を切替えるレーザ光切替え手段と
を具備したことを特徴とする光走査型顕微鏡。
【請求項２】
前記同期信号発生手段の２つの同期信号間に複数の同期信号を発生する高速同期信号発生手段を有し、
前記レーザ光切替え手段は、前記高速同期信号発生手段の高速同期信号に応じて前記試料に対するレーザ光の照射の要否を切替えることを特徴とする請求項１記載の光走査型顕微鏡。
【請求項３】
前記スポット保持手段は、前記同期信号発生手段の同期信号に同期させてレーザ光のスポット保持位置を移動可能にしたことを特徴とする請求項１または２記載の光走査型顕微鏡。
【請求項４】
波長の異なるレーザ光を発する複数の光源と、
これら光源からのレーザ光のスポットを試料の所定位置に保持させるスポット保持手段と、
前記試料からの光を検出する検出手段と、
前記試料に対して刺激を与えるトリガ信号を発生するトリガ発生手段と、
前記トリガ発生手段のトリガ信号に同期して同期信号を発生する同期信号発生手段と、
前記複数の光源に対応させて複数設けられ、前記同期信号発生手段の同期信号に応じて順に選択され、それぞれ前記試料に対する前記光源のレーザ光の照射の要否を切替えるレーザ光切替え手段と
を具備したことを特徴とする光走査型顕微鏡。
【請求項５】
前記同期信号発生手段の２つの同期信号間に複数の同期信号を発生する高速同期信号発生手段を有し、
前記レーザ光切替え手段は、前記高速同期信号発生手段の高速同期信号に応じて順に選択され、それぞれ前記試料に対するレーザ光の照射の要否を切替えることを特徴とする請求項４記載の光走査型顕微鏡。
【請求項６】
前記スポット保持部は、前記同期信号発生手段の同期信号に同期させてレーザ光のスポット保持位置を移動可能にしたことを特徴とする請求項４または５記載の光走査型顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生物、医学分野の研究に用いられる光走査型顕微鏡に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
生物、医学の研究において、レーザ光を用いた走査型共焦点顕微鏡（以下、ＬＳＭと称する）の利用が広く一般的になってきている。特に、ＬＳＭは、生きた細胞の生理現象の解明の研究に広く用いられてきており、この分野での研究の必須の道具になっている。
【０００３】
一般的なＬＳＭでは、２次元、３次元または時間変化を合わせて通称４次元での画像取得にその機能の主眼がおかれ、得られた画像をもとに３次元画像の構築や解析が行なわれている。
【０００４】
ところで、ＬＳＭでの画像取得には、通常蛍光試薬が用いられ、レーザ光により細胞内に導入した蛍光試薬を励起し、細胞から発せられた蛍光を集光することで細胞の画像を得るようにしている。
【０００５】
ところが、このような蛍光試薬は、レーザ光の照射強度と時間に比例して励起される蛍光強度が急激に減衰することが知られている。
【０００６】
このため、蛍光試薬の退色を少しでもなくすため、特定の部分領域を任意に切り出す方法が考えられている。特開平９−１８９８６４号公報は、このような考えに基づくもので、レーザ光を発する光源から細胞（以下、試料と称する。）までの光路中に、レーザ光が試料に向かうのを阻止する状態と、試料に向かうのを許可する状態とを切り替えるレーザ光切り替え手段を設け、このレーザ光切り替え手段を走査位置情報に基づき走査範囲内の所定の部分領域で切り替えるようにしている。
【０００７】
このような構成によれば、走査中にレーザ光を切り替えることで、所定の部分領域のみの画像を得ることが可能で、同時に、既に得られた画像をもとに所定領域のみを切り出し指定し、画像を得ることが可能になる。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
ところで、最近、脳・神経研究において、神経細胞相互間の繋ぎであるシナプスと呼ばれる部位の、より一層の厳密な解析が新たな研究テーマとして浮上してきている。
【０００９】
ところが、ここで取り扱う、シナプス間の信号伝達は、数ｍｓｅｃ以下と非常に速く、こうした部位の変化を観察するには、上述した特開平９−１８９８６４号公報に開示された２次元走査するものでは、十分な観察を行なうことができない。
【００１０】
このような事情から、レーザ光を一点に固定し、このポイントでの変化の観察を行なうことが考えられている。この場合、光学的な観察と、以前より実施されている電気信号計測による細胞の生理現象の観察とを同時に行なう必要があり、こうした電気信号による計測では、同期信号発生手段による信号と計測手段とを同期させて細胞への刺激を一定周期で繰り返してその変化を観察するようにしている。また、このような観察では、繰り返しの周期をより短くしたいとの要求もあり、こうした変化の観察は、短くて数分から数時間に至るまで行なわれる。
【００１１】
本発明は上記事情に鑑みてなされたもので、試料のより詳細な観察を可能にした光走査型顕微鏡を提供することを目的とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
請求項１記載の発明は、レーザ光を発する光源と、この光源からのレーザ光のスポットを試料の所定位置に保持させるスポット保持手段と、前記試料からの光を検出する検出手段と、前記試料に対して刺激を与えるトリガ信号を発生するトリガ発生手段と、前記トリガ発生手段のトリガ信号に同期して同期信号を発生する同期信号発生手段と、この同期信号発生手段の同期信号に応じて前記試料に対するレーザ光の照射の要否を切替えるレーザ光切替え手段とを具備したことを特徴としている。
【００１３】
請求項２記載の発明は、請求項１記載の発明において、前記同期信号発生手段の２つの同期信号間に複数の同期信号を発生する高速同期信号発生手段を有し、前記レーザ光切替え手段は、前記高速同期信号発生手段の高速同期信号に応じて前記試料に対するレーザ光の照射の要否を切替えることを特徴としている。
【００１４】
請求項３記載の発明は、請求項１または記載の発明において、前記スポット保持手段は、前記同期信号発生手段の同期信号に同期させてレーザ光のスポット保持位置を移動可能にしたことを特徴としている。
【００１５】
請求項４記載の発明は、波長の異なるレーザ光を発する複数の光源と、これら光源からのレーザ光のスポットを試料の所定位置に保持させるスポット保持手段と、前記試料からの光を検出する検出手段と、前記試料に対して刺激を与えるトリガ信号を発生するトリガ発生手段と、前記トリガ発生手段のトリガ信号に同期して同期信号を発生する同期信号発生手段と、前記複数の光源に対応させて複数設けられ、前記同期信号発生手段の同期信号に応じて順に選択され、それぞれ前記試料に対する前記光源のレーザ光の照射の要否を切替えるレーザ光切替え手段とを具備したことを特徴としている。
【００１６】
請求項５記載の発明は、請求項４記載の発明において、前記同期信号発生手段の２つの同期信号間に複数の同期信号を発生する高速同期信号発生手段を有し、前記レーザ光切替え手段は、前記高速同期信号発生手段の高速同期信号に応じて順に選択され、それぞれ前記試料に対するレーザ光の照射の要否を切替えることを特徴としている。
【００１７】
この結果、本発明によれば、試料上の所定位置に対する変化を一定の周期で繰り返し観察することができる。
【００１８】
本発明によれば、さらにレーザ光を高速に切替えることができる。
【００１９】
本発明によれば、試料上のレーザ光のスポット位置を移動しながら、試料の詳細観察を実現できる。
【００２０】
本発明によれば、異なる波長の蛍光を同時に励起し、これらの観察を行なうことができる。
【００２１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施形態を図面に従い説明する。
【００２２】
（第１の実施の形態）
図１は、本発明が適用される光走査型顕微鏡の概略構成を示している。図において、１、２は、レーザ光を発生するレーザ光源で、これらレーザ光源１、２は、波長の異なるレーザ光を発するものである。そして、これらレーザ光源１、２から発せられるレーザ光は、レーザ光切換え部３を介して光分光器４に進む。
【００２３】
レーザ光切替え部３は、後述するトリガ発生器１３のトリガ信号に同期して制御部１１より与えられるレーザ光切替え信号によりレーザ光が試料７に向かうのを許可する第１の状態とレーザ光が試料７に向かうのを阻止する第２の状態を切替えるもので、例えば、ＡＯＴＦフィルタ（透過波長選択フィルタ）などが用いられる。光分光器４は、光を任意の波長で選択反射・透過するものである。
【００２４】
そして、光分光器４で反射されたレーザ光は、光走査部５、対物レンズ６を介して試料７に照射される。ここで、光走査部５は、試料７に対しレーザ光を２次元的に走査するとともに、試料７の所定位置にレーザ光のスポットを保持させる機能を有している。
【００２５】
また、試料７からの光は、対物レンズ６、光走査部５を介して光分光器４に進み、今度は、光分光器４を透過され、ピンホール１４を介して光選択器８に入射される。光選択器８は、例えば、５７０ｎｍ以下の任意の波長の光を反射、５７０ｎｍ以上の波長の光を透過するものである。
【００２６】
そして、光選択器８を透過された光は、第１の光検出器９で、光選択器８より反射された光は、第２の光検出器１０でそれぞれ検出される。
【００２７】
一方、制御部１１は、パソコン１２に接続されていて、パソコン１２からの指令に基づいて同期信号発生手段のトリガ発生器１３にトリガ信号を発生させ、このトリガ信号を試料７に対し刺激として与え、このときのトリガ信号に同期して、レーザ光切替え部３にレーザ光切替え信号を与えるようになっている。
【００２８】
次に、このように構成した実施の形態の動作を説明する。
【００２９】
まず、光走査部５によりレーザ光のスポット位置を移動して、試料７上の所望の位置に保持させる。
【００３０】
この状態から、制御部１１の指示により、トリガ発生器１３より図２（ａ）に示すようなトリガ信号が発生し、試料７に刺激として与えられる。また、このトリガ信号に同期して同図（ｂ）に示すようなレーザ光切替え信号がレーザ光切替え部３に与えられる。これにより、レーザ光切替え部３は、レーザ光源１（２）からのレーザ光が試料７に向かうのを阻止する第２の状態から試料７に向かうのを許可する第１の状態に切替え、この間、レーザ光は、光分光器４で反射され、光走査部５、対物レンズ６を介して試料７に照射される。また、試料７からの反射光または蛍光は、対物レンズ６、光走査部５を介して光分光器４に進み、ピンホール１４を介して光選択器８に入射する。この光選択器８を透過された光は、第１の光検出器９で、光選択器８より反射された光は、第２の光検出器１０でそれぞれ検出される。
【００３１】
この場合、トリガ発生器１３のトリガ信号の繰り返し周波数とレーザ光切替え部３での第１および第２の状態の切替え時間は任意に設定可能であるが、例えばトリガ信号の繰り返し周波数を１ＫＨｚとすると、レーザ光切替え信号の繰り返し周波数は、１ＫＨｚで、切替え時間は、０．７ｍｓｅｃとなる。
【００３２】
従って、このようにすれば、レーザ光のスポット位置を試料７の所望する１点に固定し、この状態からトリガ発生器１３よりトリガ信号を発生し、試料７に刺激として与えるとともに、このトリガ信号に同期して、レーザ光切替え部３によりレーザ光の試料７へのレーザ光の照射の要否を切替え、試料７からの反射光または蛍光の検出を可能にしたので、例えば、上述したシナプスと呼ばれる部位の変化に対しても、一定周期で繰り返し刺激を与えながら、繰り返して変化を観察することができるようになり、この種試料のより詳細な観察を実現することができる。
【００３３】
（第２の実施の形態）
図３は、本発明の第２の実施の形態の概略構成を示すもので、図１と同一部分には、同符号を付している。
【００３４】
この場合、レーザ光源１、２にそれぞれ対応させてレーザ光切替え部２１、２２を設けている。その他は、図１と同様である。
【００３５】
このようにしても、基本的には、第１の実施の形態と同様である。まず、光走査部５によりレーザ光のスポット位置を移動して、試料７上の所望の位置に保持させる。この状態から、制御部１１の指示により、トリガ発生器１３より図４（ａ）に示すようなトリガ信号が発生し、試料７に刺激として与えられ、また、このトリガ信号に同期して同図（ｂ）に示すようなレーザ光切替え信号ａ、ｂがレーザ光切替え部２１と２２に交互に与えられ、レーザ光切替え部２１、２２が順に選択される。
【００３６】
これにより、レーザ光切替え信号ａがレーザ光切替え部２１に与えられると、レーザ光源１のレーザ光が、試料７に照射され、試料７からの反射光または蛍光が第１および第２の光検出器９、１０で検出され、また、レーザ光切替え信号ｂがレーザ光切替え部２２に与えられると、レーザ光源２のレーザ光が、試料７に照射され、試料７からの反射光または蛍光が第１または第２の光検出器９、１０で検出されるようになる。
【００３７】
従って、このようにしても上述した第１の実施の形態と同様な効果が得られ、加えて、レーザ光源１、２から波長の異なるレーザ光が交互に試料７に照射するようにできるので、異なる波長の蛍光を同時に励起し、これらの観察を行なうことができる。
【００３８】
（第３の実施の形態）
図５は、本発明の第３の実施の形態の概略構成を示すもので、図１と同一部分には、同符号を付している。
【００３９】
この場合、トリガ発生器１３からのトリガ信号の１周期内に複数の同期信号を発生する高速同期信号発生器３１を設け、この高速同期信号発生器３１からの高速同期信号に同期して、レーザ光切替え部３にレーザ光切替え信号を与えるようになっている。
【００４０】
このようにしても、基本的には、第１の実施の形態と同様で、制御部１１の指示により、トリガ発生器１３より図６（ａ）に示すようなトリガ信号が発生し、試料７に刺激として与えられ、また、このトリガ信号に同期して高速同期信号発生器３１より同図（ｂ）に示すような高速同期信号が発生し、この高速同期信号に同期してレーザ光切替え信号をレーザ光切替え部３に与えられる。
【００４１】
従って、このようにしても上述した第１の実施の形態と同様な効果が得られ、加えて、高速同期信号に同期して、さらにレーザ光を高速に切替えることができるので、試料のさらなる詳細な観察が可能になる。
【００４２】
（第４の実施の形態）
第７は、本発明の第４の実施の形態の概略構成を示すもので、図２と同一部分には、同符号を付している。
【００４３】
この場合、トリガ発生器１３からのトリガ信号の１周期内に複数の同期信号を発生する高速同期信号発生器３２を設け、この高速同期信号発生器３２からの高速同期信号に同期して、レーザ光切替え信号ａ、ｂをレーザ光切替え部２１、２２に交互に与え、順に選択するようになっている。
【００４４】
このようにしても、基本的には、第２の実施の形態と同様で、制御部１１の指示により、トリガ発生器１３より図８（ａ）に示すようなトリガ信号が発生し、試料７に刺激として与えられ、また、このトリガ信号に同期して高速同期信号発生器３２より同図（ｂ）に示すような高速同期信号が発生し、この高速同期信号に同期して同図（ｃ）（ｄ）に示すようにレーザ光切替え信号ａ、ｂがレーザ光切替え部２１と２２に交互に与えられる。
【００４５】
従って、このようにしても上述した第２の実施の形態と同様な効果が得られ、加えて、高速同期信号に同期して、さらにレーザ光を高速に切替えることができるので、試料のさらなる詳細な観察が可能になる。
【００４６】
（第５の実施の形態）
上述した実施の形態では、レーザ光のスポット位置を試料７上の所望する１点に固定するようにしたが、この第５の実施の形態では、レーザ光のスポット位置を固定せずに、任意に動かすことができるようになっている。
【００４７】
この場合、基本的には、図７に示す第４の実施の形態で述べたものと同様で、制御部１１の指示により、トリガ発生器１３より図９（ａ）に示すようなトリガ信号が発生すると、このトリガ信号に同期して同図（ｂ）に示すようにレーザ光のスポット位置がＡ点とＢ点との間で交互に切替えられる、また、トリガ信号に同期して高速同期信号発生器３２より同図（ｃ）に示すような高速同期信号が発生し、この高速同期信号に同期して同図（ｄ）（ｅ）に示すようにレーザ光切替え信号ａ、ｂがレーザ光切替え部２１と２２に交互に与えられる。
【００４８】
従って、このようにすれば、レーザ光のスポット位置を移動しながら、試料のより詳細な観察を実現することができる。
【００４９】
なお、上述した各実施の形態では、レーザ光切替え部３は、制御部１１に接続される場合を述べているが、パソコン１２に直接接続してもよい。また、トリガ信号は、トリガ発生器１３より発生するようにしたが、外部からトリガ信号を入力するようにしてもよい。さらに、光選択器８は、５７０ｎｍの波長を境に分光するものを説明したが、他の波長のものを用いてもよく、またハーフミラーを用いてもよい。さらにまた、上述では２個のレーザ光源１、２の場合を述べたが、レーザ光源は、１個でも３個以上であってもよい。
【００５０】
また、上述した実施の形態では、各同期信号を一定周期で発生させたもので説明したが、これに限るものでなく、例えば、途中で周期を変えたり、任意に発生させるようにしてもよい。また、２個のレーザ光の切替えは、交互に行なわず例えば任意に選択するようにしてもよい。また、上述した実施の形態では、光走査部５でレーザ光を２次元的に走査させていたが、レーザ光を固定しておき試料（ステージ側）を２次元的に移動させてもよい。
【００５１】
【発明の効果】
以上述べたように本発明によれば、試料上の所定位置にレーザ光のスポットを保持した状態で、同期信号に応じて、試料に照射されるレーザ光の要否を高速に切り替えることにより、試料のより詳細な観察を実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第１の実施の形態の概略構成を示す図。
【図２】第１の実施の形態の動作を説明するためのタイムチャート。
【図３】本発明の第２の実施の形態の概略構成を示す図。
【図４】第２の実施の形態の動作を説明するためのタイムチャート。
【図５】本発明の第３の実施の形態の概略構成を示す図。
【図６】第３の実施の形態の動作を説明するためのタイムチャート。
【図７】本発明の第４の実施の形態の概略構成を示す図。
【図８】第４の実施の形態の動作を説明するためのタイムチャート。
【図９】本発明の第５の実施の形態の動作を説明するためのタイムチャート。
【符号の説明】
１．２…レーザ光源
３…レーザ光切換え部
４…光分光器
５…光走査部
６…対物レンズ
７…試料
８…光選択器
９…第１の光検出器
１０…第２の光検出器
１１…制御部
１２…パソコン
１３…トリガ発生器
１４…ピンホール
２１、２２…レーザ光切替え部
３１、３２…高速同期信号発生器
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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