(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の配列番号１〜４に示される塩基配列のうち、少なくとも連続した１５塩基よりなる塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
配列番号１：  ＡＡＣＡＧＣＧＧＴＴＡＣＡＴＴＧＴＣＴＧＧ    ……（ａ）
配列番号２：  ＡＡＣＣＧＴＡＡＣＡＴＣＧＣＴＣＴＴＧＣ      ……（ｂ）
配列番号３：  ＡＣＣＡＧＡＧＡＴＧＣＡＴＣＣＡＧＡＧＣ      ……（ｃ）
配列番号４：  ＧＧＣＧＴＣＡＴＣＧＴＡＴＡＣＡＣＡＧＧ      ……（ｄ）
【請求項２】
次の（Ｉ）及び（ＩＩＩ）から選ばれる少なくとも１組のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して増幅させたヌクレオチド断片。
（Ｉ）上記配列番号１に示される塩基配列（ａ）のうちの少なくとも連続した１５塩基よりなる塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び上記配列番号２に示される塩基配列（ｂ）のうちの少なくとも連続した１５塩基よりなる塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（ＩＩＩ）上記配列番号３に示される塩基配列（ｃ）のうちの少なくとも連続した１５塩基よりなる塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び上記配列番号４に示される塩基配列（ｄ）のうちの少なくとも連続した１５塩基よりなる塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
【請求項３】
請求項２記載のヌクレオチド断片を用いるベロ毒素遺伝子の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はベロ毒素遺伝子検出のためのオリゴヌクレオチド、これを用いて増幅されたヌクレオチド断片及びベロ毒素遺伝子の検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ベロ毒素産生性大腸菌は、出血性大腸炎に代表される食中毒症、溶血性尿毒症症候群等の重篤な疾患の原因菌であることが認められ、近年、これらの菌の迅速な検出が臨床検査分野で重要視されている。
【０００３】
従来、ベロ毒素産生性大腸菌の検査は、患者の便、感染源として疑われる食品、飲料水等から採取された検体を直接培養後、一次確認培養試験、二次確認培養試験、抗血清による凝集反応試験といった煩雑な操作により行われてきた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
ところが、培養にはそれぞれ１８〜２４時間を要するため、この検査は３〜４日もの長時間がかかるという問題点があった。また、血清型と起病性が必ずしも一致しないため、血清型の同定のみで起因菌の判定を行うことは困難であった。
【０００５】
本発明はかかる状況に鑑みなされたもので、迅速でかつ選択的にベロ毒素産生性大腸菌を同定検出するための方法を提供しようとするものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記の課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、ベロ毒素産生性大腸菌の産生するベロ毒素１型（以下、ＶＴ１）の遺伝子（以下、ＶＴ１遺伝子）又はベロ毒素２型（以下、ＶＴ２）の遺伝子（以下、ＶＴ２遺伝子）に選択的に結合するオリゴヌクレオチドを作製し、これらのオリゴヌクレオチドをプライマーとして増幅したヌクレオチド断片を検出することにより、ベロ毒素産生性大腸菌の病原因子であるＶＴ１及びＶＴ２のどちらか一方のみ又は両方を産生する菌を迅速でかつ選択的に検出できることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、
（１）下記の配列番号１〜４に示される塩基配列のうち、少なくとも連続した１５塩基よりなる塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
配列番号１：  ＡＡＣＡＧＣＧＧＴＴＡＣＡＴＴＧＴＣＴＧＧ    ……（ａ）
配列番号２：  ＡＡＣＣＧＴＡＡＣＡＴＣＧＣＴＣＴＴＧＣ      ……（ｂ）
配列番号３：  ＡＣＣＡＧＡＧＡＴＧＣＡＴＣＣＡＧＡＧＣ      ……（ｃ）
配列番号４：  ＧＧＣＧＴＣＡＴＣＧＴＡＴＡＣＡＣＡＧＧ      ……（ｄ）
（２）次の（Ｉ）及び（ＩＩＩ）から選ばれる少なくとも１組のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して増幅させたヌクレオチド断片、（Ｉ）上記配列番号１に示される塩基配列（ａ）のうちの少なくとも連続した１５塩基よりなる塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び上記配列番号２に示される塩基配列（ｂ）のうちの少なくとも連続した１５塩基よりなる塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（ＩＩＩ）上記配列番号３に示される塩基配列（ｃ）のうちの少なくとも連続した１５塩基よりなる塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び上記配列番号４に示される塩基配列（ｄ）のうちの少なくとも連続した１５塩基よりなる塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び
（３）上記（２）に記載のヌクレオチド断片を用いるベロ毒素遺伝子の検出方法に関する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明におけるオリゴヌクレオチドに用いられる下記の配列番号１〜４に示される塩基配列（ａ）〜（ｄ）は、ＶＴ１又はＶＴ２を選択的に検出するためのプライマーを得るために、まず、ＶＴ１又はＶＴ２の遺伝子配列の中から増幅領域として、サイズが１００〜２００ｂｐ、両増幅領域のサイズ差が２０〜１００ｂｐであることを目安とした特徴的配列を選び出し、その上流域と下流域に位置する約２０個の塩基の配列を選択したものである。ＶＴ１遺伝子の特徴的配列としては、３７５〜５４８番目に位置する、配列番号１に示される塩基配列（ａ）で始まり、配列番号２で示される塩基配列（ｂ）に相補的な配列で終わる塩基配列を対の片方とする１７４ｂｐの遺伝子配列を選択した。ＶＴ２遺伝子の特徴的配列としては、５１７〜６４４番目に位置する、配列番号３に示される塩基配列（ｃ）で始まり、配列番号４で示される塩基配列（ｄ）に相補的な配列で終わる塩基配列を対の片方とする１２８ｂｐの遺伝子配列を選択した。
配列番号１：  ＡＡＣＡＧＣＧＧＴＴＡＣＡＴＴＧＴＣＴＧＧ    ……（ａ）
配列番号２：  ＡＡＣＣＧＴＡＡＣＡＴＣＧＣＴＣＴＴＧＣ      ……（ｂ）
配列番号３：  ＡＣＣＡＧＡＧＡＴＧＣＡＴＣＣＡＧＡＧＣ      ……（ｃ）
配列番号４：  ＧＧＣＧＴＣＡＴＣＧＴＡＴＡＣＡＣＡＧＧ      ……（ｄ）
【０００９】
本発明のオリゴヌクレオチドは、プライマーとして用いるために、選択性、検出感度及び再現性の観点から、１５塩基以上の長さであることが必要で、１８塩基以上が好ましく、上記配列番号１〜４の塩基配列（ａ）〜（ｄ）又はその塩基配列（ａ）〜（ｄ）に相補的配列をそのままの長さで用いることがより好ましい。プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドは、化学合成等により合成したものでも天然の遺伝子から抽出したものでもどちらでも良い。また、プライマーは、検出用に蛍光標識等の標識がしてあっても良いし、標識していなくても良い。
【００１０】
本発明のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いることにより、ベロ毒素遺伝子に選択的なヌクレオチド断片を増幅できる。
すなわち、次の（Ｉ）に示されるオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用することにより、ＶＴ１遺伝子に特異的なヌクレオチド断片を増幅でき、次の（ＩＩＩ）に示されるオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用することにより、ＶＴ２遺伝子に特異的なヌクレオチド断片を増幅できる。また、（Ｉ）及び（ＩＩＩ）に示されるオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用することにより、ＶＴ１遺伝子に特異的なヌクレオチド断片とＶＴ２遺伝子に特異的なヌクレオチド断片を同時に増幅できる。
（Ｉ）上記配列番号１に示される塩基配列（ａ）のうちの少なくとも連続した１５塩基よりなる塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び上記配列番号２に示される塩基配列（ｂ）のうちの少なくとも連続した１５塩基よりなる塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（ＩＩＩ）上記配列番号３に示される塩基配列（ｃ）のうちの少なくとも連続した１５塩基よりなる塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び上記配列番号４に示される塩基配列（ｄ）のうちの少なくとも連続した１５塩基よりなる塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
【００１１】
プライマーの組合せを例示すると、ＶＴ１遺伝子に特異的なヌクレオチド断片を増幅するためのプライマーとしては次の（１）、ＶＴ２遺伝子に特異的なヌクレオチド断片を増幅するためのプライマーとしては次の（４）、ＶＴ１遺伝子に特異的なヌクレオチド断片とＶＴ２遺伝子に特異的なヌクレオチド断片を同時に増幅するためのプライマーとしては次の（７）等の組合せが挙げられる。
（１）（ａ）及び（ｂ）
（４）（ｃ）及び（ｄ）
（７）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）
【００１２】
本発明のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる遺伝子の増幅方法は、ＰＣＲ法等の常法により行うことができる。
【００１３】
ＰＣＲ法等により増幅されたヌクレオチド断片を含む反応液をアガロースゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、マイクロチップキャピラリ電気泳動等の電気泳動法などで、増幅されたヌクレオチド断片の存在、及びその長さを確認することができる。この確認に供する試料は、ＶＴ１遺伝子に特異的なヌクレオチド断片、及びＶＴ２遺伝子に特異的なヌクレオチド断片のいずれか片方を増幅した反応液、両者の混合液、ＶＴ１遺伝子に特異的なヌクレオチド断片、及びＶＴ２遺伝子に特異的なヌクレオチド断片を同時に増幅した反応液のいずれであってもかまわない。
その結果から検体中にプライマーに特異的な配列を持ったヌクレオチド断片、すなわちＶＴ１遺伝子及び／又はＶＴ２遺伝子が存在しているか否かが判定できる。この判定は、検体中のＶＴ１及びＶＴ２のどちらか一方のみ又は両方を産生するベロ毒素産生性大腸菌の有無を示すものとなる。
【００１４】
【実施例】
次に、実施例により本発明を説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
ベロ毒素産生性大腸菌株ＤＮＡ試料の調製
ベロ毒素産生性大腸菌Ｏ−１５７の臨床分離株２種（ＶＴ−１及びＶＴ−２産生株、ＶＴ−２産生株）、及びベロ毒素を産生しない大腸菌の臨床分離株４種（Ｅ．ｈｅｍａｎｉｉ、Ｏ−１２６、Ｏ−１４３、Ｏ−１５３）の合計６種の大腸菌の臨床分離株を、それぞれＬＢブロス液体培地を用いて３７℃で１８時間培養した後、１０8個の菌を含む量の培養液を取り１２０００ｒｐｍで５分間遠心分離してペレットに菌体を回収した。菌体からのＤＮＡ抽出は、核酸抽出剤ＳｅｐａＧｅｎｅセパジーン（三光純薬株式会社製商品名）を用いて、次のとおり行った。上記ペレットに試薬Ｉ（トリス塩酸緩衝液）１００μＬを加えて混和し、１０分間放置後、試薬II（チオシアン酸グアニジン）１００μＬを加えて緩やかに混和した後、さらに試薬III（クロロホルムを含む変性蛋白吸着剤）７００μＬ試薬IV（酢酸ナトリウム溶液）４００μＬを加えて乳濁化するまで１０秒間激しく振とうして、１２０００ｒｐｍ、５分間遠心分離して、核酸を含む上清を分取し、試薬Ｖ（核酸沈殿促進剤の酢酸緩衝液）を上清の１／１０量加え、さらにその総量と同量のイソプロピルアルコールを加えて転倒混和し、−２０℃で１時間静置した後、１２０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離して、上清を除去し、７０％エタノールを１ｍＬ加えて軽く転倒混和した後、１２０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離後、上清を除去し、得られた核酸を乾燥し、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）、０．１ｍＭＥＴＤＡ）に溶解し、２６０ｎｍの吸光度により５０μｇ／ｍＬのＤＮＡ試料を調製した。
【００１５】
ＰＣＲ法によるＤＮＡ断片の増幅
上記で得られた大腸菌の臨床分離株６種のＤＮＡ試料５０ｎｇをそれぞれ（上記抽出ＤＮＡ溶液１μＬ）、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、５０ｍＭ塩化カリウム、０．００１％（重量／容量）、２％（重量／容量）ＤＭＳＯ、０．２ｍＭｄＮＴＰｓ、１．２５ｕｎｉｔＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｅｒ社製）を含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）に溶解し、さらに上記配列番号１に示される塩基配列（ａ）のオリゴヌクレオチド、上記配列番号２に示される塩基配列（ｂ）のオリゴヌクレオチド、上記配列番号３に示される塩基配列（ｃ）のオリゴヌクレオチド、及び上記配列番号４に示される塩基配列（ｄ）のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて各々０．２μＭ溶解した反応液５０μＬをＰＣＲ用サーマルサイクラー（アステック社製 PROGRAM TEMP CONTROL SYSTEM PC-700）で９４℃で１分、５６℃で１分、７２℃で１分の反応を２０回くり返し、ＰＣＲ反応を行った。
【００１６】
アガロースゲル電気泳動法によるＤＮＡ断片の検出
上記により得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動法により確認した。ＰＣＲ産物４μＬにローディング緩衝液（宝酒造株式会社製商品名１０×Loading Buffer）１μＬを加え、０．５％（重量／容量）エチジウムブロマイドを含む４％（重量／容量）アガロースゲルにて５０Ｖで９０分間電気泳動した。その結果、ベロ毒素産生性大腸菌Ｏ−１５７の臨床分離株２種のＤＮＡからのＰＣＲ産物のみ増幅ＤＮＡ断片のバンドが確認された。ＶＴ−１及びＶＴ−２産生株の増幅ＤＮＡ断片では１２８ｂｐと１７４ｂｐの位置に２本のバンドが確認され、ＶＴ−２産生株の増幅ＤＮＡ断片では１２８ｂｐの位置にバンドが確認された。（図１）
また、ＰＣＲ反応に供する大腸菌の臨床分離株のＤＮＡ試料の量を５０ｎｇから減らして検出限界を求めた結果、最少ＤＮＡ試料２．５ｎｇからのＰＣＲ産物でアガロースゲル電気泳動による増幅ＤＮＡ断片のバンドが確認できた。
【００１７】
これらの結果から、上記配列番号１に示される塩基配列（ａ）のオリゴヌクレオチド、及び、上記配列番号２に示される塩基配列（ｂ）のオリゴヌクレオチド、をプライマーとして使用することにより、ＶＴ１遺伝子に特異的な１７４ｂｐのＤＮＡ断片を増幅させることができ、上記配列番号３に示される塩基配列（ｃ）のオリゴヌクレオチド、及び、上記配列番号４に示される塩基配列（ｄ）のオリゴヌクレオチド、をプライマーとして使用することにより、ＶＴ２遺伝子に特異的な１２８ｂｐのＤＮＡ断片を増幅させることができ、検体中のベロ毒素遺伝子の有無が容易に検出できることがわかった。増幅ＤＮＡ断片のバンドは、ベロ毒素産生性大腸菌Ｏ−１５７の臨床分離株２種（ＶＴ−１及びＶＴ−２産生株、ＶＴ−２産生株）でのみ検出され、ベロ毒素を産生しない大腸菌の臨床分離株４種（Ｅ．ｈｅｍａｎｉｉ、Ｏ−１２６、Ｏ−１４３、Ｏ−１５３）ではいずれも検出されなかったので、本発明のオリゴヌクレオチドは特異性に優れていることがわかった。
【００１８】
【発明の効果】
本発明によれば、検体の培養といった煩雑な操作をすることなく、迅速でかつ選択的に検体中のＶＴ１遺伝子及び／又はＶＴ２遺伝子を検出でき、検体中のベロ毒素産生性大腸菌の有無を確認できるので、その工業的価値は大である。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】実施例のアガロースゲル電気泳動結果
【図１】
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