(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む２，４，５―Ｔの分析方法。
（Ａ）試料に加水して放置後、アセトン又はアセトニトリルで抽出する工程
（Ｂ）前記工程で得られた抽出液を濃縮する工程
（Ｃ）前記濃縮した抽出液をけいそう土カラムに注入し固相抽出する工程
（Ｄ）前記固相抽出により得られた流出液の溶媒を除去し、残留物に有機溶媒を添加し試験液を得る工程
（Ｅ）前記試験液を、液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ―ＭＳ／ＭＳ）により測定し２，４，５―Ｔを分析する工程
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ―ＭＳ／ＭＳ）を使用した農薬の分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
残留農薬を効率的に分析するためには、複数の農薬を一括して分析できることが好ましい。
厚生省生活衛生局では、衛化第４３号(平成９年４月８日)「残留農薬迅速分析法の利用について」において、多数の農薬を一括して分析する方法（以下「一斉分析法」ともいう。）を告示している。
この分析方法は、誘導体化処理をせずにガスクロマトグラフィー（以下「ＧＣ」ともいう。）で分析できる農薬、または高速液体クロマトグラフィ(以下「ＨＰＬＣ」ともいう。)で分析できるＮ―メチルカーバイト系農薬等に概ね適用することができ、その試験方法は、概略以下のとおりである。
【０００３】
試料をアセトン抽出した後、けいそう土カラムで固相抽出し、ゲル浸透クロマトグラフィ(以下「ＧＰＣ」ともいう。)により精製し、さらに、シリカゲルミニカラムとフロリジルカラムによる精製、又は塩酸処理により精製し、ＧＣ又はＨＰＬＣで測定する。
【０００４】
上記一斉分析法で、分析できない農薬、例えば２，４，５―Ｔやシヘキサチン等の分析方法は厚生労働省のホームページに掲示されている（非特許文献１参照）。
また、掲示されていない農薬としては、例えば、イミダクロプリド、ピペロニルブトキシドが挙げられるが、その方法は、「最新農薬の残留分析法」に記載されている（非特許文献２参照）。
【０００５】
前記厚生労働省ホームページに掲示されている２，４，５―Ｔの試験法は概略以下のとおりである。
【０００６】
試験液の調製工程は、抽出工程、加水分解工程、ブチルエステル化工程、精製工程からなる。
精製工程で得られた試験液をガスクロマトグラフィ・質量分析（以下「ＧＣ・ＭＳ」ともいう。）により測定し農薬の分析を行う。
【０００７】
また、前記厚生労働省ホームページに掲示されているシヘキサチンの試験法は概略以下のとおりである。
【０００８】
試験液の調製工程は、抽出工程、エチル化工程、精製工程からなる。
精製工程で得られた試験液をＧＣ・ＭＳにより測定し農薬の分析を行う。
【０００９】
前記「最新農薬の残留分析法」に記載された、イミダクロプリドの分析方法は概略以下のとおりである。
この分析法は環境庁告示イミグクロブリド試験法の一部を修正し、ヘキサン洗浄、ジクロロメタン転溶、アルカリ洗浄の操作に換えて多孔性ケイソウ土ＣＣを用いたものである。
試験液の調製工程は、アセトニトリルによる抽出、多孔けいそう土固相抽出、シリカゲルＣＣによる精製からなる。
得られた試験液をＨＰＬＣを使用し２７０ｎｍの波長の紫外線で測定し分析を行う。
【００１０】
前記「最新農薬の残留分析法」に記載された、ピペロニルブトキシドの分析方法は概略以下のとおりである。
この分析法は厚生省告示の残留農薬試験法の―部を修正したものであり、アセトンで抽出、ヘキサン転溶、ヘキサン−アセトニトリル分配、活性炭ＣＣで精製、ＨＰＬＣで定量する方法を、活性炭ＣＣをフロリジルミニカラムに換え、ＨＰＬＣの条件についても改良している。
試験液の調製工程は、アセトンによる抽出工程、ヘキサンによる転溶工程、ヘキサン−アセトニトリル分配工程（穀物のみ）、フロリジルＣＣによる精製工程からなる。
得られた試験液をＨＰＬＣを使用し３４０ｎｍの波長のけい光で測定し分析を行う。
【００１１】
以上のとおり、これらの農薬を分析する方法では、煩雑な試験液の調製工程が必要であり、農薬を一括した工程で測定することができなかった。
また、分析には多量の有機溶媒が必要であった。
【００１２】
【非特許文献１】厚生労働省ホームページ、インターネット〈URL：http://www.mhlw.go.jp/index.html〉
【非特許文献２】農薬残留分析法研究班編集、「最新農薬の残留分析法」、中央法規出版（株）、１９９５年４月１日
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって、本発明の目的は、試験液の調製工程を共通化することにより個別に分析していた農薬を一括して分析できる農薬の分析方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは上記の目的を達成するために鋭意研究を重ねた結果、２，４，５―Ｔの測定に液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ―ＭＳ／ＭＳ）を使用することにより、従来個別に分析していた農薬の試験液の調製工程を共通化し、効率よく２，４，５―Ｔが分析できることを見出し本発明を完成するに至った。
従って、本発明は、以下の工程を含む２，４，５―Ｔの分析方法である。
（Ａ）試料に加水して放置後、アセトン又はアセトニトリルで抽出する工程
（Ｂ）前記工程で得られた抽出液を濃縮する工程
（Ｃ）前記濃縮した抽出液をけいそう土カラムに注入し固相抽出する工程
（Ｄ）前記固相抽出により得られた流出液の溶媒を除去し、残留物に有機溶媒を添加し試験液を得る工程
（Ｅ）前記試験液を、液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ―ＭＳ／ＭＳ）により測定し２，４，５―Ｔを分析する工程
【発明の効果】
【００１５】
農薬の試験液調製工程を共通化したので、一括して農薬の分析ができるようになり、効率的に農薬分析を行うことができる。
また、本発明における試験液の調製工程における調製途中の試験液は、一斉分析法に使用することができるので非常に効率的である。
分析精度も従来の分析法と同等以上の精度を得ることができる。
さらに、従来方法に比較して有機溶媒等の使用量が少ないので環境負荷が少ない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１７】
本発明で農薬分析方法により分析できる試料は特に限定されないが、例えば、小麦、小麦粉、ライ麦、コーン、そば、米等の穀類や穀類調製品や果実類、野菜類等を挙げることができる。
【００１８】
試料が大きい場合は粒状又は粉状にしてから加水することが好ましい。例えば、小麦等の穀物粒は粉砕して粒状にしてから加水を行う。
小麦粉等の粉状物であればそのまま加水を行う。
加水は試料を膨潤させ抽出しやすくするために行い、加水後放置する時間は３０分〜２時間程度である。
また、加水量は試料に対し質量比で２倍程度である。
【００１９】
加水して放置後、アセトン又はアセトニトリルで抽出を行う。
抽出方法は、公知の方法が使用でき、例えば、ホモジナイザー、振とう機等を使用することができる。
アセトン又はアセトニトリルの使用量は特に限定されないが、試料に対し質量比で１０〜２０倍程度である。
【００２０】
前記工程で得られた抽出液を吸引ろ過や遠心分離により固液分離して抽出液をナスフラスコに移し適当な濃度に減圧濃縮する。
濃縮の割合は添加したアセトン又はアセトニトリルが除去できる程度である。
【００２１】
前記濃縮後の抽出液にはケイソウ土カラムを使用した抽出工程の効率を向上させるため必要に応じ塩化ナトリウムを添加することができる。
塩化ナトリウムの添加量は、塩化ナトリウムが溶解せずわずかに残る程度であり、加えすぎるとケイソウ土カラムを使用した抽出工程で酢酸エチルによる溶出が困難となる。
【００２２】
前記抽出液をけいそう土カラムに注入し、注入後１０分間程度放置して前記ナスフラスコを洗浄した酢酸エチルで固相抽出し流出液をナスフラスコに取り酢酸エチル等の溶媒を除去し乾固して残留物を得る。
使用するけいそう土の量は抽出液中の水分をすべて吸収できる量であればよく多すぎると酢酸エチルの使用量が多くなり好ましくない。  
また、使用する酢酸エチルの量はけいそう土の量によって異なるが、農薬の回収率が求める値以上になるよう適宜調整する。
【００２３】
前記残留物を有機溶媒で溶解し適当な量とし試験液とする。
使用する有機溶媒は、メタノール、エタノール、アセトン、アセトニトリル、シクロヘキサン、ｎ−ヘキサン又はこれらの混液を使用することができる。
残留物が多い場合は、以後の工程におけるフィルターの目詰まりを防ぐため必要に応じて遠心分離等で残留物を除去することができる。
【００２４】
前記試験液はＧＰＣ等で精製し一斉分析用試験液とすることができる。
一斉分析の方法は従来の一斉分析と同様である。
なお、ＧＰＣ等で精製した一斉分析用試験液を本発明の試験液として使用することはできない。
【００２５】
本発明における調製途中の試験液を用いて一斉分析法で分析できる農薬は従来の一斉分析法と同じであり、例えば有機塩素系農薬、ピレスロイド、有機リン系農薬、窒素系農薬、カーバメイト系農薬等である。
【００２６】
前記試験液は必要に応じてメタノール、エタノール、アセトン、アセトニトリル、シクロヘキサン、ｎ−ヘキサン又はこれらの混液等で定量し目開き０．２〜０．５μｍのフィルターを使用してろ過することができる。
【００２７】
前記試験液を、液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ―ＭＳ／ＭＳ）により測定し農薬を分析する。
【００２８】
液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ―ＭＳ／ＭＳ）とは、液体クロマトグラフィーで分離した液体中のサンプルをイオン化して、そのうちの１つを前駆イオン（以下「Ｑ１」ともいう。）として選択し、前記Ｑ１を分解してプロダクトイオン（以下「Ｑ３」ともいう。）を検出する方法をいう。
この分析に使用する機器は、市販品を使用することができ、例えば、ＨＬＰＣ装置として横河アナリティカルシステムズ株式会社製  ＨＰ１１００シリーズ（商品名）、質量分析機としてアプライドバイオシステムズジャパン株式会社製、ＡＰＩ２０００（商品名）を挙げることができる。
カラムはジーエルサイエンス株式会社製  Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３（商品名）やインタクト株式会社製  Ｕｎｉｓｏｎ  ＵＫ−Ｐｈｅｎｙｌ（商品名）等を測定する農薬によって適宜選択して使用する。
【００２９】
前記試験液を５〜１０μｌ程度、ＨＰＬＣにより分離を行う。
使用するカラムの充填剤としてはシリカゲルをオクタデシル基等で修飾したもの等を挙げることができ、粒径は３〜５μｍ程度である。
また、カラムの直径は２〜５ｍｍ程度であり、長さは１５０ｍｍ程度である。
移動相に使用する溶液は、水とアセトニトリル又はメタノールの混液が使用でき、水は必要に応じて蟻酸等の有機酸を０．１体積％程度含む水溶液であってもよい。
前記溶液のカラムへの流速は０．１〜１．０ｍｌ／分程度であり、カラムの温度は０〜５０℃程度に保持する。
【００３０】
前記ＨＰＬＣで分離した溶液は順次質量分析部に導入され溶液中の農薬をイオン化する。
イオン化はエレクトロスプレーイオン化法により、プラス又はマイナスにイオン化することができる。
イオン化した液体中のサンプルを選択しＱ１とする。
Ｑ１は検出する農薬の質量により適宜設定するが、通常１００〜５００［ｍ／ｚ］である。
ここで、［ｍ／ｚ］とは質量と電荷の比率である。
【００３１】
前記Ｑ１を分解し、Ｑ３として検出し農薬分析を行う。
Ｑ３は目的とする農薬により適宜選択する。
なお、従来の一斉分析法で使用されているＧＣ、ＨＰＬＣや液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ―ＭＳ）では、精度が十分でなく本発明の測定には使用できない。
【００３２】
前記Ｑ１及びＱ３は検出する農薬を希釈して前記液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ―ＭＳ／ＭＳ）で分析して予め求めることができる。
定量分析は、ピーク高さ法、ピーク面積法により行うことができるが精度の点でピーク面積法が好ましい。
【００３３】
本発明の方法によれば、従来個別に分析していた農薬をＱ１とＱ３を適宜選択することにより同一の試験液で測定することができる。
【００３４】
本発明の農薬に分析方法により分析できる農薬として、２，４，５―Ｔ、シヘキサチン、イミダクロプリド、ピペロニルブトキシド、メトプレンを挙げることができる。
【００３５】
２，４，５―Ｔはフェノキシ系除草剤の1つで、登録が失効されている農薬である。
現在の食品衛生法では小麦粉に基準値（検出されてはならない：検出限界０．０５ｐｐｍ）が設定されている農薬であり、ポジティブリスト制移行後は全食品から検出されてはいけない農薬の1つに指定されている。
２，４，５−Ｔの分析は誘導体化が必要な為、一斉分析法では分析出来ない農薬である。
【００３６】
シヘキサチンはダウケミカル社が開発した有機スズ系の殺虫剤で、国内では１９８５年に登録が失効している。
また、シヘキサチン（商品名：プリクラトン）は、２００２年の無登録農薬の使用で問題となった農薬の1つである。
現行の食品衛生法では小麦粉に基準値（検出されてはならない：検出限界０．０２ｐｐｍ）が設定されている農薬であり、ポジティブリスト制移行後は全食品から検出されてはいけない農薬の1つに指定されている。
シヘキサチンの分析は誘導体化操作が必要な為、一斉分析法では分析出来ない農薬である。
【００３７】
イミダクロプリドはニコチン性アセチルコリン受容体に作用して神経遮断により昆虫を麻痺、死亡させるニトロメチレン系殺虫剤である。
ポジティブリスト二次原案で小麦粉に基準値が設定された。
基準値はＣｏｄｅｘ基準の０．０３ｐｐｍである。
【００３８】
ピペロニルブトキシドは高砂香料が開発し、植物のオキシダント障害の防除に有効である。
用途はピレトリンなどの殺虫剤の共力剤として使用されている。
【００３９】
メトプレンはポジティブリスト移行後、小麦粉（２ｐｐｍ）、小麦全粒粉（５ｐｐｍ）及び小麦ふすま（１０ｐｐｍ）に基準が設定される農薬である。
【実施例】
【００４０】
［実施例１］
［２，４，５―Ｔの分析］
１．検出限界及び直線性の確認
２，４，５―Ｔをメタノールで希釈し、検出限界及び直線性の確認を行った。
液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ―ＭＳ／ＭＳ）の測定条件を表１に示す。
【００４１】
【表１】
0004549288.tif 000002
【００４２】
２，４，５-Ｔのリテンションタイムは１６．８分程度であった。
【００４３】
測定結果を表２に示す。
測定はピーク面積法で行った。
【表２】
0004549288.tif 000003
【００４４】
１ｐｐｂ〜１０００ｐｐｂまでの直線性については問題なかった。
【００４５】
２．添加回収試験
検出試料として小麦粉、小麦全粒粉、ライ麦粉を使用した。
試料に２，４，５―Ｔを１００ppb添加した処理区を作製し、回収率を算出した。
試料１０ｇに水２０ｍｌを添加し３０分間放置した。
放置後、アセトン１００ｍｌで１回抽出を行い、残渣をさらにアセトン５０ｍｌで洗浄し、合わせて抽出液を得た。
【００４６】
前記抽出液を１５ｍｌになるまで、減圧濃縮し、塩化ナトリウム６ｇを添加した。
添加後、前記抽出液をけいそう土カラムに全量注入し、１０分間放置した。
酢酸エチル１５０ｍｌで前記濃縮に使用した容器を洗い、その洗液を前記けいそう土カラムに注入し、流出を行い流出液を得た。
【００４７】
前記流出液の溶媒を除去し、残留物をアセトン／シクロヘキサン（容積比  １：９）溶液４ｍｌで溶解し３０００ｒｐｍで５分間遠心分離を行い、上清を得た。
【００４８】
前記上清１ｍｌをメタノール５ｍｌでメスアップし、０．４５μｍのフィルターでろ過して、２，４，５―Ｔの試験液を得た。
【００４９】
また、前記上清２ｍｌを分取用液体クロマトグラフィーに注入し、16分間から42分間の画分を採取し、減圧濃縮後、残留物をアセトンに溶解し、一斉分析用検液を得た。
【００５０】
前記試験液を、液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ―ＭＳ／ＭＳ）により測定した。
測定機器及び測定条件は表１のとおりである。
測定はピーク面積法により行った。
結果を表３に示す。
【００５１】
【表３】
0004549288.tif 000004
【００５２】
回収率は７０％〜１３０％の範囲内にあり、分析精度に問題はなかった。
【００５３】
既存法の検出限界は０．０２５ｐｐｍであったが、本発明の方法では０．００２ｐｐｍと分析精度が高い。
【００５４】
［参考例１］
［シヘキサチンの分析］
１．検出限界及び直線性の確認
シヘキサチンをメタノールで希釈し、検出限界及び直線性の確認を行った。
液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ―ＭＳ／ＭＳ）の測定条件を表４に示す。
【００５５】
【表４】
0004549288.tif 000005
【００５６】
シヘキサチンのリテンションタイムは４．２分程度であった。
【００５７】
測定結果を表５に示す。  
測定はピーク面積法で行った。
【００５８】
【表５】
0004549288.tif 000006
【００５９】
１ｐｐｂ〜１０００ｐｐｂまでの直線性については問題なかった。
夾雑物のピークが確認されたことから、検出限界を５ｐｐｂ（サンプル換算で１０ｐｐｂ）とした。
【００６０】
２．添加回収試験
実施例１の添加回収試験において、添加する農薬を２，４，５―Ｔからシヘキサチンに変更し、表４に示す液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ―ＭＳ／ＭＳ）の測定条件に変更した以外は実施例１と同様にして添加回収試験を行った。
測定はピーク面積法により行った。
結果を表６に示す。
【００６１】
【表６】
0004549288.tif 000007
【００６２】
回収率は７０％〜１３０％の範囲内にあり、分析精度に問題はなかった。。
【００６３】
既存法の検出限界は０．０１ｐｐｍであったが、本発明の方法では０．０１ｐｐｍと既存法と同程度の分析精度が得られた。
【００６４】
［参考例２］
［イミダクロプリドの分析］
１．検出限界及び直線性の確認
イミダクロプリドをメタノールで希釈し、検出限界及び直線性の確認を行った。
液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ―ＭＳ／ＭＳ）の測定条件を表７に示す。
【００６５】
【表７】
0004549288.tif 000008
【００６６】
イミダクロプリドのリテンションタイムは１１分程度であった。
【００６７】
測定結果を表８に示す。
測定はピーク面積法で行った。
【表８】
0004549288.tif 000009
【００６８】
１ｐｐｂ〜５０ｐｐｂ及び１ｐｐｂ〜１０００ｐｐｂまでの直線性について問題なかった。
検出限界を１ｎｇ（サンプル換算で２ｎｇ）とした。
【００６９】
２．添加回収試験
実施例１の添加回収試験において、添加する農薬を２，４，５―Ｔからイミダクロプリドに変更し、表７に示す液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ―ＭＳ／ＭＳ）の測定条件に変更した以外は実施例１と同様にして添加回収試験を行った。
測定はピーク面積法により行った。
結果を表９に示す。
【００７０】
【表９】
0004549288.tif 000010
【００７１】
回収率は７０％〜１３０％の範囲内にあり、分析精度に問題はなかった。。
【００７２】
本発明の方法では０．００２ｐｐｍの分析精度が得られた。
【００７３】
［参考例３］
［ピペロニルブトキシドの分析］
１．検出限界及び直線性の確認
ピペロニルブトキシドをメタノールで希釈し、検出限界及び直線性の確認を行った。
液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ―ＭＳ／ＭＳ）の測定条件を表１０に示す。
【００７４】
【表１０】
0004549288.tif 000011
【００７５】
ピペロニルブトキシドのリテンションタイムは１７．３分程度であった。
フラグメントイオンを得ることが出来なかった為（Ｑ1イオンが壊れなかった為）、Ｑ１とＱ３を同じ３６１．０〔ｍ/ｚ〕にした。
【００７６】
測定結果を表１１に示す。
測定はピーク面積法で行った。
【表１１】
0004549288.tif 000012
【００７７】
１ｐｐｂ〜１０００ｐｐｂまでの直線性については問題なかった。
夾雑物のピークが確認されたことから、検出限界を５０ｐｐｂ（サンプル換算で１００ｐｐｂ）とした。
【００７８】
２．添加回収試験
実施例１の添加回収試験において、添加する農薬を２，４，５―Ｔからピペロニルブトキシドに変更し、表１０に示す液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ―ＭＳ／ＭＳ）の測定条件に変更した以外は実施例１と同様にして添加回収試験を行った。
測定はピーク面積法により行った。
結果を表１２に示す。
【００７９】
【表１２】
0004549288.tif 000013
【００８０】
回収率は７０％〜１３０％の範囲内にあり、分析精度に問題はなかった。。
【００８１】
本発明の方法では０．０１ｐｐｍの分析精度が得られた。
【００８２】
［参考例４］
［メトプレンの分析］
１．検出限界及び直線性の確認
メトプレンをメタノールで希釈し、検出限界及び直線性の確認を行った。
液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ―ＭＳ／ＭＳ）の測定条件を表１３に示す。
【００８３】
【表１３】
0004549288.tif 000014
【００８４】
メトプレンのリテンションタイムは２３．０分程度であった。
【００８５】
測定結果を表１４に示す。
測定はピーク面積法で行った。
【００８６】
【表１４】
0004549288.tif 000015
【００８７】
５ｐｐｂ〜１００ｐｐｂまでの直線性については問題なかった。
夾雑物のピークが確認されたことから、検出限界を５０ｐｐｂ（サンプル換算で１００ｐｐｂ）とした。
【００８８】
２．添加回収試験
実施例１の添加回収試験において、添加する農薬を２，４，５―Ｔからメトプレンに変更し、表１３に示す液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ―ＭＳ／ＭＳ）の測定条件に変更した以外は実施例１と同様にして添加回収試験を行った。
測定はピーク面積法により行った。
結果を表１５に示す。
【００８９】
【表１５】
0004549288.tif 000016
【００９０】
回収率は７０％〜１３０％の範囲内にあり、分析精度に問題はなかった。。
【００９１】
本発明の方法では０．１ｐｐｍの分析精度が得られた。
【００９２】
［実施例６］
実施例１〜５において抽出液をアセトンからアセトニトリルに変更した以外は実施例１〜５と同様にして測定を行った。
いずれの場合も、実施例１〜５と同等の測定精度が得られた。
【００９３】
［参考例５］
実施例１において、２，４，５―Ｔに代えて、小麦粉にマラチオン、フェニトロチオン、クロルピリホス、パラチオン、ピリミホスメチル、メタクリホスを各１００ｐｐｂ添加し、一斉分析用検液を得た。
この検液を表１６に示す条件で一斉分析試験を行った。
測定はピーク面積法で行った。
結果を表１７に示す。
【００９４】
【表１６】
0004549288.tif 000017
【００９５】
【表１７】
0004549288.tif 000018
【００９６】
回収率は７０％〜１３０％の範囲内にあり、分析精度に問題はなかった。
本発明で得られた一斉分析用検液による一斉分析が可能であることが確認できた。