(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２３、２４、２５、２６、２８、２９および５２から成る群より選択されるアミノ酸配列からなるＮＴＰペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のＮＴＰペプチドの少なくとも一つ、およびそのための担体を含む医薬組成物。
【請求項３】
請求項１に記載のＮＴＰペプチドに該当するアミノ酸配列をエンコードしている核酸。
【請求項４】
１個またはそれを超える請求項３に記載の核酸およびそのための薬学的に許容しうる担体を含む医薬組成物。
【請求項５】
哺乳動物の細胞の除去または破壊を必要とする状態を処置するための医薬組成物であって、請求項１に記載のＮＴＰペプチドを含んでなる、前記医薬組成物。
【請求項６】
経口、皮下、皮内、鼻腔内、静脈内、筋肉内、脊髄内、腫瘍内、局所および経皮からなる群より選択される方法によって投与する、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
外科的切除、移植（transplantation）、移植片接合（grafting）、化学療法、免疫療法、ワクチン接種、熱または電気剥離、寒冷療法、レーザー治療、光線療法、遺伝子治療および放射線からなる群より選択される少なくとも一つの処置での哺乳動物の処置前、中または後に、哺乳動物に投与する、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項８】
状態が、肺、乳房、胃、膵臓、前立腺、膀胱、骨、卵巣、皮膚、腎、洞、結腸、腸、胃、直腸、食道、心臓、脾臓、唾液腺、血液、脳およびその被膜、脊髄およびその被膜、筋肉、結合組織、副腎、上皮小体、甲状腺、子宮、精巣、下垂体、生殖器、肝、胆嚢、眼、耳、鼻、咽喉、扁桃、口、およびリンパ節およびリンパ系から成る群より選択される組織の良性または悪性腫瘍である、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項９】
状態が、肺、乳房、胃、膵臓、前立腺、膀胱、骨、卵巣、皮膚、腎、洞、結腸、腸、胃、直腸、食道、心臓、脾臓、唾液腺、血液、脳およびその被膜、脊髄およびその被膜、筋肉、結合組織、副腎、上皮小体、甲状腺、子宮、精巣、下垂体、生殖器、肝、胆嚢、眼、耳、鼻、咽喉、扁桃、口、およびリンパ節およびリンパ系から成る群より選択される組織の過形成、肥大または過成長である、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
状態が、肺、乳房、胃、膵臓、前立腺、膀胱、骨、卵巣、皮膚、腎、洞、結腸、腸、胃、直腸、食道、心臓、脾臓、唾液腺、血液、脳およびその被膜、脊髄およびその被膜、筋肉、結合組織、副腎、上皮小体、甲状腺、子宮、精巣、下垂体、生殖器、肝、胆嚢、眼、耳、鼻、咽喉、扁桃、口、およびリンパ節およびリンパ系から成る群より選択される、ウイルス、細菌または寄生生物によって変化した組織である、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
状態が、肺、乳房、胃、膵臓、前立腺、膀胱、骨、卵巣、皮膚、腎、洞、結腸、腸、胃、直腸、食道、心臓、脾臓、唾液腺、血液、脳およびその被膜、脊髄およびその被膜、筋肉、結合組織、副腎、上皮小体、甲状腺、子宮、精巣、下垂体、生殖器、肝、胆嚢、眼、耳、鼻、咽喉、扁桃、口、およびリンパ節およびリンパ系から成る群より選択される組織の奇形である、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
状態が、扁桃肥大である請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
状態が、前立腺過形成である請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
状態が、組織への美容修正である請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
細胞が、皮膚、眼、耳、鼻、咽喉、口、筋肉、結合組織、体毛および乳房から成る群より選択される組織の細胞である、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
状態が、血管性疾患である請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
状態が、痔疾である請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
状態が、拡張蛇行静脈である請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
血管性疾患が、アテローム性動脈硬化症または動脈硬化症である請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
状態が、炎症性疾患、自己免疫疾患、代謝性疾患、遺伝性／遺伝的疾患、外傷性疾患、物理的損傷、栄養欠乏性疾患、感染症、アミロイド症、線維症、蓄積症、先天性奇形、酵素欠乏性疾患、被毒（poisoning）、中毒（intoxication）、環境性疾患、放射線疾患、内分泌性疾患、変性疾患および機械的疾患から成る群の一つまたはそれを超えるものより選択される、請求項５に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、“Peptides Effective in the Treatment of Tumors and Other conditions Requiring the Removal or Destruction of Cells”という標題の、２００１年５月２５日出願の、本明細書中にその開示がそのまま援用される米国予備特許出願第６０／２９３，１５６号に優先権を主張する。
【０００２】
発明の背景
１．発明の分野
本発明は、ヒトの良性または悪性腫瘍のような、細胞要素の除去または破壊を必要とする状態を処置する方法であって、神経糸タンパク質のアミノ酸配列の一部分に該当するアミノ酸配列を含有するペプチドを用いる方法に関する。この方法には、単独のかまたは担体に抱合されたこれら化合物を、筋肉内、経口、静脈内、脊髄内、腫瘍内、鼻腔内、局所、経皮等によって投与することが含まれるが、これに制限されるわけではない。
【０００３】
２．関連技術の説明
多数の医学的処置および方法は、有害なまたは望ましくない組織の除去または破壊を伴う。このような重要な処置の例には、癌腫の外科的除去、転移性腫瘍の化学療法による破壊、腺（例えば、前立腺）過形成の減少が含まれる。他の例には、望ましくない顔毛の除去、いぼの除去、および望ましくない脂肪組織の除去が含まれる。これら処置の多くは、複雑且つ危険な外科手術によって侵襲性であるかまたは、標的とされないそれ以外の健康な組織を非侵襲性技術によって破壊する。
【０００４】
有害なまたは望ましくない細胞および組織を破壊し且つ（ｉ）外科手術を伴うことなくそれらの除去を容易にする；かまたは（ii）それらの追加の成長を阻害するが、主に局所作用を有し且つ全身毒性が全くまたは最小限にしかない有効な薬剤が必要とされている。
【０００５】
神経糸タンパク質およびそれらの関連分子は、本明細書中にその開示がそのまま援用される係属米国特許出願第 号、Methods of Treating Tumors and Related Conditions Using Neural Thread Proteins, に開示されたような薬剤の一つのクラスである。
【０００６】
癌は、細胞の制御されない成長および再生を引き起こす、細胞の内部調節機作の異常である。正常細胞は、組織を構成しているが、これら細胞が、特殊化した、制御されたおよび同調した単位として挙動するそれらの能力を失った場合（脱分化）、その欠損は、細胞集団の中に混乱をもたらす。これが生じた時に、腫瘍が形成される。
【０００７】
組織の良性過成長は、ある器官から細胞を除去することが望まれる異常である。良性腫瘍は、身体中のいたるところに転移することはないが、しかしながら、疾患症状を引き起こす細胞増殖である。このような腫瘍は、脳のような、器官の接近不能な部位に位置する場合、致命的でありうる。良性腫瘍は、肺、皮膚、下垂体、甲状腺、副腎皮質および髄質、卵巣、子宮、精巣、結合組織、筋肉、腸、耳、鼻、咽喉、扁桃、口、肝、胆嚢、膵臓、前立腺、心臓および他の器官を含めた多数の他の器官にある。
【０００８】
外科手術は、しばしば、癌の処置の第一段階である。外科手術の目的は異なる。それは、時々、できるだけ多くの明白な腫瘍を除去するのに、またはそれを少なくとも「縮小する（debulk）」（他の手段によって処置される必要がほとんどないように、一つまたは複数の大部分の腫瘍を除去する）のに用いられる。癌のタイプおよび場所に依存して、外科手術は、患者に若干の症状軽減を与えることもありうる。例えば、外科医が、拡張している脳腫瘍の大部分を除去することができるならば、頭蓋内部の圧力は減少し、患者の症状の改善をもたらすであろう。
【０００９】
全ての腫瘍が外科手術を行いやすいわけではない。あるものは、完全に除去することを不可能にさせる身体部分に位置することがありうる。これらの例は、脳幹（呼吸を制御する脳部分）の腫瘍、または主要血管中および周囲で成長した腫瘍であると考えられる。これらの場合、外科手術の役割は、腫瘍除去に関連した高い危険のために制限される。
【００１０】
ある場合には、外科手術は、単に必要がないので、腫瘍を縮小させるのに用いられない。一例は、化学療法および放射線療法の組合せにきわめて充分に応答するリンパ節の癌であるホジキンリンパ腫である。ホジキンリンパ腫の場合、外科手術は、治癒に達するためにはめったに必要とされないが、診断を決定するのにほとんど常に用いられる。
【００１１】
化学療法は、癌処置のもう一つの一般的な形態である。本質的には、それは、身体中のいたるところで急速に分裂している細胞（腫瘍中で見出されるものなど）を特異的に攻撃する投薬法（通常は、口または注射によって与えられる）の使用を伴う。これは、既に転移した癌、更には、血液およびリンパ系を介して拡散する高い可能性があるが、一次腫瘍より明白でない腫瘍を処置する場合に化学療法を有用にする。化学療法は、限局した腫瘍の外科手術および放射線療法への応答を促すのに用いることもできる。これは、例えば、頭部および頸部の若干の癌の場合である。
【００１２】
残念ながら、通常は急速に分裂するヒト身体中の他の細胞（胃の内層および体毛など）も、化学療法によって影響されることがありうる。この理由で、（全てではないが）若干の化学療法薬は、悪心または体毛損失を引き起こす。これら副作用は一時的であり、医師には、これら副作用の多くを緩和するのに役立つように与えることができる投薬法がある。したがって、概して、化学療法処置は、患者によって充分に許容される。知識が引き続き増えるにつれて、研究者は、癌細胞を死滅させるのにより良いだけでなく、患者への副作用もより少ない、より新しい化学療法薬を考案してきている。
【００１３】
化学療法は、いろいろな方法で患者に投与される。あるものは、毎日または１週間に１回、またはある他の計画で与えられる丸剤であり、あるものは、静脈内注射によって投与される。注射可能な化学療法については、患者は、処置のために診療室または病院に行く。他の化学療法薬は、血流中への１日２４時間の連続注入を必要とする。化学療法のこれらタイプについては、より軽度の外科的方法を行って、患者が身につける小型ポンプを植込む。次に、このポンプは、徐々に投薬を行う。多くの場合、永久口を患者の静脈に入れて、繰り返しの針刺しの必要をなくする。
【００１４】
放射線療法は、癌に対する戦いで一般的に用いられるもう一つの武器である。放射線は、腫瘍細胞内のＤＮＡを損傷することによって癌を死滅させる。この放射線は、二つの可能な方法で「適用される」。第一の最も一般的な方法は、放射線ビームを患者にきわめて正確に、腫瘍に集中して向けることを行う。これを行うために、患者は台の上に横になり、ビームはその患者の周囲を移動する。これは、数分を要するにすぎないが、（腫瘍のタイプに依って）処方される具体的な全「線量」に達するように、週に５日間、３〜６週間行われる。
【００１５】
近接照射療法と称される、時々用いられるもう一つの放射線法は、放射性ペレット（「シード」）またはワイヤを得、それらを体内の腫瘍部位に植込むことを行う。これら植込剤は、一時的または永久的でありうる。永久植込剤について、シード中の放射線は、何日間かまたは何週間かにわたって「崩壊」または減衰するので、患者は放射性でない。一時的植込剤については、放射線の全線量を、通常は、ほぼ２日で供給し、患者は、その時間中入院している必要がある。どちらのタイプの近接照射療法についても、放射線は、概して、確実に標的部位に供給されて、（化学療法の場合のように全身を処置することに対立するものとして）癌への局所制御を得る。
【００１６】
若干の高度に選択された患者は、骨髄移植に委ねられることがありうる。この方法は、通常は、患者が、特に攻撃性である癌を有するためにかまたは、彼らが、慣用的な療法で処置された後に再発した癌を有するために行われる。骨髄移植は、複雑な方法である。多数のタイプがあり、および、それらは副作用と治癒を引き起こす可能性が様々である。大部分の移植は、専門施設で行われるが、多くの場合、それらの使用は研究と考えられる。
【００１７】
更に別の療法が存在するが、それらの大部分は、臨床試験でなお調べられていて、標準的なケアにまだなっていない。例には、免疫療法、単クローン性抗体、抗血管新生因子および遺伝子治療の使用が含まれる。
【００１８】
免疫療法：いろいろな技術が、放射線または化学療法とは全く別個に、患者自身の免疫系を助けて癌と戦わせるように設計されている。しばしば、この目的を達成するために、研究者は、特別な由来のワクチンを患者に注射する。この分野の大部分の研究者は、黒色腫について行ってきたが、現在、他の癌も標的とされている。
【００１９】
単クローン性抗体：これらは、癌細胞と非癌細胞との細胞膜の違いを利用することによって癌細胞（および非正常細胞）に付着するように特別に設計されている小タンパク質である。患者にこれら抗体を投与する前に、それらは、しばしば、種々の細胞毒性化合物に「標識され」（付着され）または放射性にされて、その抗体が癌細胞を優先的に標的とすることによって、所望の細胞にその毒性薬を供給するようにする。
【００２０】
抗血管新生因子：癌細胞が急速に分裂し且つ腫瘍が成長すると、それらはすぐに血液供給を増大させることがありうる。これを埋め合わせるために、若干の腫瘍は、その周辺の血管を成長させるのに役立つことが分かっている化合物を分泌し、それによって、確実に癌細胞に栄養素を連続供給する。最近、研究者は、血管の成長を停止させることによっておよび／または追加の血液が癌細胞に達するのを妨げることによってこの過程を止める方法を研究している。
【００２１】
遺伝子治療：癌は、癌細胞の生産およびその過剰の増殖を最終的にもたらす一連の突然変異の産物である。癌は、癌の増殖を抑えるまたは停止させるように作用する、細胞を破壊する細胞のプログラム化細胞機作を作動させる、細胞の免疫認識を促す、または毒性代謝産物に変換するプロドラッグまたは腫瘍成長を阻害するサイトカインを発現する遺伝子を癌細胞に導入することによって処置することができる。
【００２２】
良性腫瘍および奇形は、外科手術、放射線療法、薬物療法、熱または電気剥離、寒冷療法およびその他を含めたいろいろな方法によって処置することもできる。良性腫瘍は、転移することはないが、それらは大きく成長することがありうるし且つ再発することがありうる。良性腫瘍の外科的摘出は、概して、いずれも外科手術が難しく且つ副作用があるが、下垂体腺腫、脳の髄膜腫、前立腺過形成およびその他のような若干の良性腫瘍については、しばしば繰り返し行われなければならない。
【００２３】
選択的細胞除去が望まれる場合の望ましくない細胞要素を伴う他の状態には、例えば、心疾患および発作が含まれる。これら状態は、典型的には、血管壁を歪め、管腔を狭くし、血流を圧迫し、病巣血餅の素因を与え、そして最終的には、遮断および梗塞をもたらす線維脂肪要素および修正平滑筋要素の増殖性病変であるアテローム性動脈硬化症によって引き起こされる。アテローム性動脈硬化症の処置には、バイパス移植片；人工移植片；再疎通、掻爬、放射線、レーザーまたは他の除去を含む血管形成；脂質減少によってアテローム性動脈硬化症を阻害する薬物療法；抗凝血療法；および食事、運動およびライフスタイルの一般的な測定が含まれる。外科的方法の危険および副作用を伴うことなくアテローム性動脈硬化症病変を除去する方法が必要とされている。
【００２４】
選択的細胞除去が望まれる場合の望ましくない細胞要素の他の例には、いぼのような、ウイルスに誘導される成長が含まれる。もう一つの例は、炎症状態で見出される肥大性炎症性塊、および肥大性瘢痕またはケロイドである。なお他の例は、望ましくない体毛、例えば、顔毛の除去のような美容の場合に、または顔の皮膚および結合組織または手足の皮膚および結合組織でのような美容目的に望ましくない組織部位の萎縮について見出される。
【００２５】
なお他の例は、当業者に容易に理解されるであろう。これら例の全てまたは大部分において、慣用的な療法の危険および副作用を伴うことなく、望ましくない細胞要素を除去するまたは破壊することができる処置が要求されている。望ましくない細胞要素をより正確に除去することも要求される。
【００２６】
神経糸タンパク質（ＮＴＰ）は、最近特性決定された脳タンパク質のファミリーである。このファミリーの一つのメンバーであるＡＤ７Ｃ−ＮＴＰは、神経突起萌芽に関連した機能を有する約４１ｋＤ膜関連リンタンパク質である（de la Monte et al., J.Clin.Invest., 100:3093-3104(1997); de la Monte et al., Alz..Rep., 2:327-332(1999); de la Monte SM and Wands JR, Journal of Alzheimer's Disease, 3:345-353(2001)）。ＡＤ７Ｃ−ＮＴＰをエンコードしている遺伝子および予想されるＡＤ７Ｃ−ＮＴＰのタンパク質配列は、識別され且つ記載されている（de la Monte et al., J.Clin.Invest., 100:3093-3104(1997)）。約４１ｋＤ種に加えて、神経糸タンパク質の他の種（約２６ｋＤ、約２１ｋＤ、約１７ｋＤおよび約１５ｋＤ）が識別されていて、神経外胚葉腫瘍、星状膠細胞腫および神経膠芽細胞腫に、ならびに低酸素症、スキーマ（schema）または脳梗塞による傷害に関連している（Xu et al., Cancer Research, 53:3823-3829(1993); de la Monte et al., J.Neuropathol.Exp.Neurol., 55(10):1038-50(1996), de la Monte et al., J.Neurol.Sci., 138(1-2):26-35(1996); de la Monte et al., J.Neurol.Sci., 135(2):118-25(1996); de la Monte et al., J.Clin.Invest., 100:3093-3104(1997); and de la Monte et al., Alz..Rep., 2:327-332(1999)）。
【００２７】
神経糸タンパク質の種類は、いずれも“Neural Thread Protein Gene Expression and Detection of Alzheimer's Disease”についての米国特許第５，９４８，６３４号；第５，９４８，８８８号；および第５，８３０，６７０号に、および“Method of Detecting Neurological Disease or Dysfunction”についての米国特許第６，０７１，７０５号に記載され且つ請求の範囲に記載されている。これら特許の開示は、本明細書中にそのまま具体的に援用される。それらに記載されているように、ＮＴＰは、細胞死の際にアップレギュレーションされ且つ生産される。よって、死滅したおよび死滅する神経細胞は、ＮＴＰを過剰生産すると記載され、したがって、その存在は、神経細胞の死およびアルツハイマー病（ＡＤ）の始まりを示している。
【００２８】
神経糸タンパク質の他の種類は、ＡＤ７Ｃ−ＮＴＰ遺伝子の他の産物（例えば、ＮＣＢＩ Entrez-Protein データベース Accession ＃ＸＰ＿０３２３０７  ＰＩＤ  ｇ１５９２８９７１に記載の１１２アミノ酸タンパク質）としてまたは神経糸タンパク質に類似している（例えば、ＮＣＢＩ Entrez-Protein データベース Accession ＃ＡＡＨ１４９５１  ＰＩＤ  ｇ１５９２８９７１に記載の１０６アミノ酸タンパク質、ＮＣＢＩ Entrez-Protein データベース Accession ＃ＸＰ＿０３９１０２  ＰＩＤ  ｇ１８５９９３３９に記載のもう一つの１０６アミノ酸タンパク質、およびＮＣＢＩ Entrez-Protein データベース Accession ＃ＡＡＨ０２５３４  ＰＩＤ  ｇ１２８０３４２１に記載の６１アミノ酸タンパク質）として識別されている。
【００２９】
神経糸タンパク質は、ＡＤに関連していて、ＮＴＰは、ＡＤにおける細胞死に関連してアップレギュレーションされる。ＡＤ７Ｃ−ＮＴＰｍＲＮＡは、対照と比較して、ＡＤ脳中でアップレギュレーションされ；脳およびＣＳＦ中のＡＤ７Ｃ−ＮＴＰタンパク質レベルは、対照よりもＡＤにおいて高く；そしてＡＤ７Ｃ−ＮＴＰ免疫反応性は、老人斑において、神経原線維変化（ＮＦＴ）において、変性ニューロン、神経網糸、およびＡＤおよびダウン症候群の脳でのジストロフィー性神経症萌芽において見出される（Ozturk et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 86:419-423(1989); de la Monte et al., J.Clin.Invest., 86(3):1004-13(1990); de la Monte et al., J.Neurol.Sci., 113(2):152-64(1992); de la Monte et al., Ann.Neurol., 32(6):733-42(1992); de la Monte et al., J.Neuropathol.Exp.Neurol., 55(10):1038-50(1996), de la Monte et al., J.Neurol.Sci., 138(1-2):26-35(1996); de la Monte et al., J.Neurol.Sci., 135(2):118-25(1996); de la Monte et al., J.Clin.Invest., 100:3093-3104(1997); and de la Monte et al., Alz..Rep., 2:327-332(1999)）。ＮＴＰは、神経網内の微細な突起中の細胞内に局在している、またはＡＤおよびダウン症候群双方の脳の細胞外である。de la Monte et al., Ann.Neurol., 32(6):733-42(1992)。
【００３０】
上昇したＡＤ７Ｃ−ＮＴＰタンパク質レベルは、ＡＤ患者のＣＳＦ中でも尿中でも見出されている（de la Monte and Wands, Front Biosci 7:989-96(2002); de la Monte and Wands, Journal of Alzheimer's Disease 3:345-353(2001); Munzar et al, Alzheimer's Reports 4:61-65(2001); Kahle et al, Neurology 54:1498-1504(2000) and Averback Neurology 55:1068(2000); Munzar et al, Alzheimer Reports 3:155-159(2000); de la Monte et al, Alzheimer's Reports 2:327-332(1999); Ghanbari et al, J Clin Lab Anal 12:285-288(1998); Ghanbari et al, J Clin Lab Anal 12:223-226(1998); Ghanbari et al, Journal of Contemporary Neurology 1998;4A:2-6(1998); and de la Monte et al., J.Clin.Invest., 100:3093-3104(1997)）。
【００３１】
ＮＴＰの過発現は、アルツハイマー病での細胞死の過程にも関連している（de la Monte and Wands, J.Neuropatho. and Exp.Neuro., 60:195-207(2001); de la Monte and Wands, Cell Mol Life Sci 58:844-49(2001)）。ＡＤ７Ｃ−ＮＴＰは、ダウン症候群脳組織においても識別されている（Wands et al., 国際特許公開ＷＯ９０／０６９９３号；de la Monte et al, J Neurol Sci 135:118-25(1996); de la Monte et al., Alz..Rep., 2:327-332(1999)）。若干の証拠は、ＮＴＰの過発現が正常眼圧緑内障に関連することもありうるということを示唆している（Golubnitschaja-Labudova et al, Curr Eye Res 21:867-76(2000)）。
【００３２】
ＮＴＰは、神経膠腫および神経芽細胞腫の in vitro 細胞培養物においても、in vivo の正常齧歯類動物の筋組織、皮下結合組織および皮膚においても、乳癌、皮膚癌および乳頭腫、結腸癌、脳神経膠腫、およびその他を含めた齧歯類動物モデルにおける種々の異なったヒトおよび非ヒト由来腫瘍においても、細胞死を引き起こすのに有効な物質であると証明されている。本明細書中にその開示がそのまま援用される係属米国特許出願第 号、Methods of Treating Tumors and Related Conditions Using Neural Thread Proteins を参照されたい。
【００３３】
関連出願の前述の説明を含ｓめたこの明細書中に、いずれかのおよび全ての米国特許を含めた本明細書中に記載のいずれかのおよび全ての公的に入手可能な論文は、本明細書中にそのまま具体的に援用される。関連技術の前述の説明は、いずれにせよ、係属米国特許出願を含めたそれらに記載されるいずれかの論文が、本発明の先行技術であると承認するものではない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００３４】
発明の要旨
当該技術分野において、望ましくない細胞要素を処置するための新しい、毒性がより少ない処置がなお必要とされている。本発明は、神経糸タンパク質のアミノ酸配列の一部分に該当するアミノ酸配列を含有するペプチドが、このような薬剤でもあるという驚くべき発見に関する。
【００３５】
本発明は、良性および悪性の腫瘍、腺（例えば、前立腺）過形成、望ましくない顔毛、いぼおよび望ましくない脂肪組織のような、望ましくない細胞増殖を処置する方法に関する。このような方法は、要求がある哺乳動物に、神経糸タンパク質（ＮＴＰ）のアミノ酸配列の一部分に該当するアミノ酸配列を含むペプチドの治療的有効量を投与することを含む。
【００３６】
このようなペプチド（「ＮＴＰペプチド」）は、単独で、または担体または抗体に抱合されて投与することができる。ＮＴＰペプチドは、筋肉内、経口、静脈内、腹腔内、大脳内（実質内）、脳室内、腫瘍内、病巣内、皮内、脊髄内、鼻腔内、眼内、動脈内、局所、経皮、エアゾル剤、注入、ボーラス注射、植込装置、徐放性システム等によって単独でかまたは担体に抱合されて投与することができる。或いは、ＮＴＰペプチドは、このペプチドを発現する遺伝子を投与することによって、このような生産を引き起こすワクチンを投与することによって、または遺伝子修飾かまたはそれ以外の理由でこのペプチドを in vivo で発現する細胞、細菌またはウイルスを導入することによって、in vivo で発現することができる。
【００３７】
更に、ＮＴＰペプチドは、良性および悪性の腫瘍、および他の望ましくないまたは有害な細胞成長を処置するための他の療法と連結して用いることができる。
前述の一般的な説明および次の詳細な説明は両方とも、代表するものおよび説明するためのものであり、請求の範囲に記載の発明について追加の説明を与えるためのものである。他の目的、利点および新規な特徴は、次の発明の詳細な説明から、当業者に容易に理解されるであろう。
【００３８】
好ましい態様の詳細な説明
「ＡＤ７Ｃ−ＮＴＰ」という用語は、de la Monte et al., J.Clin.Invest., 100:3093-3104(1997)、米国特許第５，９４８，６３４号、第５，９４８，８８８号および第５，８３０，６７０号の配列１２０および１２１、および GenBank ＃ＡＦ０１０１４４に記載の約４１ｋＤタンパク質、およびそれをコードする遺伝子および核酸配列を意味し、それについての核酸配列およびアミノ酸配列は、図１に示されている。「ＡＤ７Ｃ−ＮＴＰ」という用語は、ＡＤ７Ｃ−ＮＴＰの生物学的に活性なフラグメント、変異体、誘導体、ホモログおよび模擬体も包含する。
【００３９】
「ＮＴＰ」または「神経糸タンパク質」という用語は、神経糸タンパク質および関連分子（膵臓糸タンパク質を含めた）、およびそれらタンパク質をコードする核酸配列を意味し、次のタンパク質およびこれらタンパク質のアミノ酸配列をエンコードしている核酸配列が含まれる（が、これに制限されるわけではない）。
【００４０】
（ａ）ＡＤ７Ｃ−ＮＴＰ；
（ｂ）約４２ｋＤ、約２６ｋＤ、約２１ｋＤ、約１７ｋＤ、約１４ｋＤおよび約８ｋＤの種の、米国特許第５，９４８，６３４号、第５，９４８，８８８号、第５，８３０，６７０号および第６，０７１，７０５号、および de la Monte et al., J.Neuropathol.Exp.Neurol., 55(10):1038-50(1996)、de la Monte et al., J.Neurol.Sci., 138(1-2):26-35(1996); de la Monte et al., J.Neurol.Sci., 135(2):118-25(1996)、de la Monte et al., J.Clin.Invest., 100:3093-3104(1997) および de la Monte et al., Alz..Rep., 2:327-332(1999) に記載の神経糸タンパク質；
（ｃ）American Type Culture Collection, Manassas, Va. に受託番号ＨＢ−１２５４６として寄託されている単クローン性抗体＃２または American Type Culture Collection, Manassas, Va. に受託番号ＨＢ−１２５４５として寄託されている単クローン性抗体＃５によって特異的に認識されるタンパク質；
（ｄ）ＡＤ７Ｃ−ＮＴＰ遺伝子によってコードされるタンパク質；
（ｅ）１２２アミノ酸神経糸タンパク質であって、米国特許第５，８３０，６７０号、第５，９４８，６３４号および第５，９４８，８８８号による配列４０に記載され且つＮＣＢＩ Entrez-Protein Accession ＃ＡＡＥ２５４４７，ＰＩＤ  ｇ１００４８５４０に挙げられた、アミノ酸配列が図２に示されているもの；
（ｆ）１１２アミノ酸神経糸タンパク質であって、ＮＣＢＩ Entrez-Protein Accession ＃ＸＰ＿０３２３０７，ＰＩＤ  ｇ１４７２５１３２に挙げられた、アミノ酸配列が図３に示されているもの；
（ｇ）１０６アミノ酸神経糸タンパク質様タンパク質であって、ＮＣＢＩ Entrez-Protein Accession ＃ＡＡＨ１４９５１  ＰＩＤ  ｇ１５９２８９７１に挙げられた、アミノ酸配列が図４に示されているもの；
（ｈ）１０６アミノ酸神経糸タンパク質様タンパク質であって、ＮＣＢＩ Entrez-Protein Accession ＃ＸＰ＿０３９１０２  ＰＩＤ  ｇ１８５９９３３９に挙げられた、アミノ酸配列が図５に示されているもの；
（ｉ）９８アミノ酸神経糸タンパク質であって、米国特許第５，８３０，６７０号、第５，９４８，６３４号および第５，９４８，８８８号による配列３０に記載され且つＮＣＢＩ Entrez-Protein Accession ＃ＡＡＥ２５４４５，ＰＩＤ  ｇ１００４８５３８に挙げられた、アミノ酸配列が図６に示されているもの；
（ｊ）７５アミノ酸神経糸タンパク質であって、米国特許第５，８３０，６７０号、第５，９４８，６３４号および第５，９４８，８８８号による配列４８に記載され且つＮＣＢＩ Entrez-Protein Accession ＃ＡＡＥ２５４４８，ＰＩＤ  ｇ１００４８５４１に挙げられた、アミノ酸配列が図７に示されているもの；
（ｋ）６８アミノ酸神経糸タンパク質であって、米国特許第５，８３０，６７０号、第５，９４８，６３４号および第５，９４８，８８８号による配列３６に記載され且つＮＣＢＩ Entrez-Protein Accession ＃ＡＡＥ２５４４６，ＰＩＤ  ｇ１００４８５３９に挙げられた、アミノ酸配列が図８に示されているもの；
（ｌ）６１アミノ酸神経糸タンパク質様タンパク質であって、ＮＣＢＩ Entrez-Protein Accession ＃ＡＡＨ０２５３４，ＰＩＤ  ｇ１２８０３４２１に挙げられた、アミノ酸配列が図９に示されているもの；
（ｍ）膵臓糸タンパク質；
（ｎ）米国特許第６，０７１，７０５号に記載の神経膵臓糸タンパク質（ｎＰＴＰ）；および
（ｏ）American Type Culture Collection に寄託されたＨＢ９９３４、ＨＢ９９３５およびＨＢ９９３６から成る群によるハイブリドーマによって生産される抗体によって特異的に認識されるタンパク質。
【００４１】
「ＮＴＰ」という用語は、ＮＴＰの生物学的に活性なフラグメント、変異体、誘導体、ホモログおよびペプチド模擬体も包含する。
「生物学的に活性な」という用語は、有害なまたは望ましくない細胞および組織を破壊し、したがって、それらの除去を容易にするかまたはそれらの追加の成長を阻害する能力を有するタンパク質、ポリペプチドフラグメント、変異体、誘導体、ホモログまたはペプチド模擬体を意味し、本明細書中の実施例１の細胞培養細胞毒性検定において細胞を死滅させるまたは細胞の生存能力を減少させる能力、本明細書中の実施例２の in vivo 組織検定において細胞減少および／または組織壊死を引き起こす能力、または本明細書中の実施例３の腫瘍検定において細胞減少、組織壊死または腫瘍萎縮を引き起こす能力が含まれる（が、これに制限されるわけではない）。
【００４２】
本明細書中に記載のアミノ酸およびアミノ酸残基は、下の表に与えられる一般に認められている一文字または三文字コードによって表すことができる。
【００４３】
【表１】
0004584573.tif 000002
【００４４】
「ＮＴＰペプチド」という用語は、ＮＴＰ、好ましくは、ＡＤ７Ｃ−ＮＴＰ、およびＮＴＰフラグメント、好ましくは、ＡＤ７Ｃ−ＮＴＰフラグメントのアミノ酸配列の少なくとも一部分に該当するアミノ酸配列を含めたペプチドを意味し、このようなペプチドのホモログ、誘導体、変異体、融合タンパク質およびペプチド模擬体を包含する。「アミノ酸配列」という表現は、少なくとも２個、好ましくは、３個を超える隣接したアミノ酸を意味し、したがって、ＮＴＰペプチドは、ＮＴＰの配列中と同じであるまたは同じ隣接したアミノ酸に類似している少なくとも２個、好ましくは、それを超える隣接したアミノ酸を有するであろう。「ＮＴＰペプチド」という用語には、下に挙げるアミノ酸配列によって記載されるＡＤ７Ｃ−ＮＴＰのアミノ酸配列に由来する次のペプチドも含まれる（が、これに制限されるわけではない）。
【００４５】
【化１】
0004584573.tif 000003
【００４６】
【化２】
0004584573.tif 000004
【００４７】
【化３】
0004584573.tif 000005
【００４８】
【化４】
0004584573.tif 000006
【００４９】
【化５】
0004584573.tif 000007
【００５０】
【化６】
0004584573.tif 000008
【００５１】
「フラグメント」という用語は、ＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドのアミノ酸配列の連続部分配列を含むタンパク質またはポリペプチドを意味し、スプライス変異体のような天然に存在するフラグメントおよび天然に存在する in vivo プロテアーゼ活性によって得られるフラグメントを包含する。このようなフラグメントは、アミノ末端、カルボキシ末端および／または内部で（自然スプライシングによるように）切り取られていてよい。このようなフラグメントは、アミノ末端メチオニンを含んでまたは含むことなく製造することができる。「フラグメント」という用語は、同じＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドと一致していようと異なっていようと、直接的にかまたはリンカーを介して互いに連結された、共通したまたはしない連続アミノ酸配列を含むフラグメントを包含する。
【００５２】
「変異体」という用語は、ＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドのアミノ酸配列と比較して、１個またはそれを超えるアミノ酸の置換、欠失および／または挿入が存在するタンパク質またはポリペプチドを意味し、ＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドの天然に存在する対立遺伝子変異体または別のスプライス変異体を包含する。「変異体」という用語は、１個または複数の類似のもしくは相同のアミノ酸または１個または複数の類似しないアミノ酸での、ペプチド配列中の１個またはそれを超えるアミノ酸の置換を包含する。アミノ酸を、類似するまたは相同であると格付けしうる多数の尺度が存在する。（Gunnar von Heijne, Sequence Analysis in Molecular Biology, p.123-39 (Academic Press, New York, NY 1987。）好ましい変異体は、１個またはそれを超えるアミノ酸位置でのアラニン置換を包含する。他の好ましい置換には、そのタンパク質の全体の正味電荷、極性または疎水性にほとんどまたは全く作用しない保存的置換が含まれる。保存的置換は、下の表２に示される。
【００５３】
【表２】
0004584573.tif 000009
【００５４】
表３は、アミノ酸置換のもう一つのスキームを示す。
【００５５】
【表３】
0004584573.tif 000010
【００５６】
他の変異体には、（ａ）置換部位のポリペプチド主鎖の構造、例えば、シートまたはヘリックスコンホメーション、（ｂ）標的部位における分子の電荷または疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩を維持することへの作用が一層有意に異なる残基を選択することなどの、あまり保存的でないアミノ酸置換が含まれうる。概して、機能に一層有意に作用すると考えられる置換は、（ａ）グリシンおよび／またはプロリンが、別のアミノ酸で置換されている、または欠失しているまたは挿入されている；（ｂ）親水性残基、例えば、セリルまたはトレオニルが、疎水性残基、例えば、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリルまたはアラニルの代わりに（またはによって）置換されている；（ｃ）システイン残基が、いずれか他の残基の代わりに（またはによって）置換されている；（ｄ）電気陽性側鎖を有する残基、例えば、リシル、アルギニルまたはヒスチジルが、陰電荷を有する残基、例えば、グルタミルまたはアスパルチルの代わりに（またはによって）置換されている；または（ｅ）嵩高い側鎖を有する残基、例えば、フェニルアラニンが、このような側鎖を有していないもの、例えば、グリシンの代わりに（またはによって）置換されている置換である。他の変異体には、１個または複数の新規なグリコシル化および／またはリン酸化部位を生じるように設計されたものかまたは、１個または複数の既存のグリコシル化および／またはリン酸化部位を欠失するように設計されたものが含まれる。変異体は、グリコシル化部位、タンパク質分解切断部位および／またはシステイン残基に少なくとも１個のアミノ酸置換を包含する。変異体には、リンカーペプチド上のＮＴＰまたはＮＴＰペプチドアミノ酸配列の前または後に追加のアミノ酸残基を含むＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドも含まれる。例えば、システイン残基は、ジスルフィド結合の形成によってＮＴＰペプチドを環化させるために、ＮＴＰペプチドのアミノ末端にもカルボキシ末端にも加えることができる。「変異体」という用語は、ＮＴＰペプチドの３’末端かまたは５’末端に隣接した少なくとも１個〜２５個までの追加のアミノ酸を含むＮＴＰペプチドのアミノ酸配列を有するポリペプチドも包含する。
【００５７】
「誘導体」という用語は、プロセシングおよび他の翻訳後修飾のような自然過程によっても、化学修飾技術によって、例えば、１個またはそれを超えるポリエチレングリコール分子、糖、リン酸および／または他のこのような分子であって、この場合、１個または複数の分子が野生型ＮＴＰタンパク質またはペプチドに天然に結合していない分子の付加などによっても化学修飾されている化学修飾タンパク質またはポリペプチドを意味する。誘導体には塩が含まれる。このような化学修飾は、基本的教本およびより詳細なモノグラフに、更には、多くの研究文献に充分に記載されており、当業者に周知である。同じタイプの修飾が、ある与えられたタンパク質またはポリペプチドのいくつかの部位に同じまたはいろいろな程度で存在してよいということは理解されるであろう。更に、ある与えられたタンパク質またはポリペプチドは、多数のタイプの修飾を含有してよい。
【００５８】
修飾は、ペプチド主鎖、アミノ酸側鎖およびアミノ末端またはカルボキシル末端を含めた、タンパク質またはポリペプチド中のどこでも起こりうる。修飾には、例えば、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化（prenylation）、ラセミ化、グリコシル化、脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残基のγカルボキシル化、ヒドロキシル化およびＡＤＰ−リボシル化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化のような転移ＲＮＡに媒介されるアミノ酸のタンパク質への付加、およびユビキチン化が含まれる。例えば、Proteins--Structure And Molecular Properties, 2nd Ed., T.E.Creighton, W.h.Freeman and Company, New York (1993) and Wold,F., "Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects," pgs.1-12 in Posttranslational Covalent Modification Of Proteins, B.C.Johnson, Ed., Academic Press, New York (1983); Seifter et al., Meth.Enzymol. 182:626-646(1990) and Rattan et al., "Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging," Ann.N.Y.Acad.Sci. 663:48-62(1992) を参照されたい。「誘導体」という用語は、分岐状になる、または分岐を含んでまたは含むことなく環状になるタンパク質またはポリペプチドを生じる化学修飾を包含する。環状、分岐状および分岐環状タンパク質またはポリペプチドは、翻訳後自然過程によって生じることもできるし、完全な合成法によって製造することもできる。
【００５９】
「ホモログ」という用語は、場合により、二つのポリペプチドのアミノ酸の位置の類似性を比較するのに一般的に用いられる標準法によって決定される、ＮＴＰタンパク質、ＡＤ７Ｃ−ＮＴＰまたはＮＴＰペプチドのアミノ酸配列が、少なくとも７５％一致しているタンパク質を意味する。二つのタンパク質間の類似性または同一性の程度は、Computational Molecular Biology, Lesk,A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith,D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin,A.M., and Griffin,H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje,G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov,M. and Devereux,J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; and Carillo H. and Lipman,D., SIAM, J.Applied Math., 48:1073(1988) に記載のものが含まれるがこれに制限されるわけではない既知の方法によって容易に計算することができる。同一性を決定する好ましい方法は、調べられる配列間に最大の対合を与えるように設計されている。同一性および類似性を決定する方法は、公的に入手可能な計算機プログラムで体系化される。
【００６０】
二つの配列間の同一性および類似性を決定するのに有用な好ましい計算機プログラム方法には、ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux,J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1):387(1984)）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ（Atschul,S.F. et al., J.Molec.Biol., 215:403-410(1990)）が含まれるが、これに制限されるわけではない。ＢＬＡＳＴ  Ｘプログラムは、ＮＣＢＩおよび他の源から公的に入手可能である（ＢＬＡＳＴ Manual, Altschul,S., et al., ＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ Bethesda, Md. 20894; Atschul,S., et al., J.Mol.Biol., 215:403-410(1990)）。例として、ＧＡＰ（Genetic Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.）のような計算機アルゴリズムを用いて、配列同一性％が決定される予定の二つのタンパク質またはポリペプチドを、それぞれのアミノ酸を最適に対合させるために整列させる（アルゴリズムによって決定される「対合スパン」）。
【００６１】
ギャップオープニングペナルティー（gap opening penalty）（３ｘ（倍）平均ダイアゴナルとして計算される；「平均ダイアゴナル」は、用いられている比較マトリックスのダイアゴナルの平均である；「ダイアゴナル」は、具体的な比較マトリックスによって完全なアミノ酸各々に割り当てられるスコアまたは数である）およびギャップエクステンションペナルティー（gap extension penalty）（通常は、ギャップオープニングペナルティーの１／１０倍である）、更には、ＰＡＭ２５０およびＢＬＯＳＵＭ６２のような比較マトリックスを、このアルゴリズムと連結して用いる。標準的な比較マトリックス（ＰＡＭ２５０比較マトリックスについては、Dayhoff et al. in: Atlas of Protein Sequence and Structure, vol.5, supp.3[1978] を参照されたい；ＢＬＯＳＵＭ６２比較マトリックスについては、Henikoff et al., Proc.Natl.Acad.Sci USA, 89:10915-10919[1992] を参照されたい）も、このアルゴリズムによって用いることができる。次に、同一性％を、このアルゴリズムによって計算する。ホモログは、典型的には、ＮＴＰ、ＡＤ７Ｃ−ＮＴＰまたはＮＴＰペプチドと比較される場合、１個またはそれを超えるアミノ酸の置換、欠失および／または挿入を有するであろう。
【００６２】
「ペプチド模擬体」または「模擬体」という用語は、あるペプチドまたはタンパク質の生物学的活性を模擬しているが、もはや化学的性質がペプチドでない、すなわち、もはやペプチド結合（すなわち、アミノ酸間のアミド結合）を全く含有していない生物学的に活性な化合物を意味する。ここで、ペプチド模擬体という用語は、より広い意味で、プソイドペプチド、半ペプチドおよびペプトイドのような、もはや性質が完全にペプチドではない分子を包含するのに用いられる。このより広い意味でのペプチド模擬体の例（ペプチドの一部分が、ペプチド結合を欠いた構造によって置き換えられている場合）は、下に記載される。完全に非ペプチドであれ部分的に非ペプチドであれ、本発明によるペプチド模擬体は、そのペプチド模擬体が基づいているＮＴＰタンパク質またはペプチド中の活性基の三次元配置によく似ている反応性化学部分の空間的配列を与える。この活性部位の類似した幾何学的形の結果として、ペプチド模擬体は、ＮＴＰタンパク質またはペプチドの生物学的活性に類似する、生態系に対する作用を有する。
【００６３】
本発明のペプチド模擬体は、好ましくは、三次元形状も生物学的活性も、本明細書中に記載のＮＴＰペプチドに実質的に類似している。当該技術分野において知られているペプチドを構造的に修飾してペプチド模擬体を生じる方法の例には、Ｄ−アミノ酸残基構造をもたらす主鎖キラル中心の反転によって活性に悪影響を与えることなく、タンパク質分解への増加した安定性を特にＮ末端においてもたらすことが含まれる。一例は、"Tritriated D-ala1-Peptide T Binding," Smith C.S. et al., Drug Development Res., 15,pp.371-379(1988) という論文に与えられている。第二の方法は、Ｎ−Ｃ鎖間イミドおよびラクタムのような、安定性のために環状構造を変化させることである（Ede et al. in Smith and River (Eds.) "Peptides: Chemistry and Biology", Escom, Leiden (1991), pp.268-270）。この例は、本明細書中にその開示がそのまま援用される米国特許第４，４５７，４８９号（１９８５年），Goldstein,G. et al. に開示されたものなどの、コンホメーションが制限されたチモペンチン（thymopentin）様化合物において与えられている。第三の方法は、タンパク質分解に耐性を与えるプソイドペプチド結合によってＮＴＰペプチド中のペプチド結合を置換することを伴う。
【００６４】
概して、ペプチドの構造および生物学的活性に影響を与えない多数のプソイドペプチド結合が記載されている。このアプローチの一つの例は、レトロインベルソ（retro-inverso）プソイドペプチド結合を代用することである（本明細書中に援用される、"Biologically active retroinverso analogues of thymopentin", Sisto A. et al in River,J.E. and Marshall,G.R.(eds) "Peptides, Chemistry, Structure and Biology", Escom, Leiden (1990), pp.722-773） and Dalpozzo, et al. (1993), Int.J.Peptide Protein Res., 41:561-566）。この修飾によれば、これらペプチドのアミノ酸配列は、１個またはそれを超えるペプチド結合がレトロインベルソプソイドペプチド結合によって置き換えられていることを除いて、上記のＮＴＰペプチドの配列と一致しうる。好ましくは、最もＮ末端のペプチド結合が置換されているが、それは、このような置換が、Ｎ末端に作用するエキソペプチダーゼによるタンパク質分解に耐性を与えるからである。更に別の修飾を、アミノ酸の化学基を類似した構造の他の化学基で置き換えることによって行うこともできる。生物学的活性をほとんどまたは全く減少することなく酵素的切断への安定性を増加させることが知られているもう一つの適当なプソイドペプチド結合は、還元等配電子体（reduced isostere）プソイドペプチド結合である（本明細書中にそのまま援用される Couder, et al. (1993), Int.J.Peptide Protein Res., 41:181-184）。
【００６５】
したがって、これらペプチドのアミノ酸配列は、１個またはそれを超えるペプチド結合が等配電子体プソイドペプチド結合によって置き換えられていることを除いて、ＮＴＰペプチドの配列と一致しうる。好ましくは、最もＮ末端のペプチド結合が置換されているが、それは、このような置換が、Ｎ末端に作用するエキソペプチダーゼによるタンパク質分解に耐性を与えると考えられるからである。１個またはそれを超える還元等配電子体プソイドペプチド結合を含むペプチドの合成は、当該技術分野において知られている（上に引用される Couder, et al. (1993)）。他の例には、ペプチド結合を置き換えるためのケトメチレン結合またはメチルスルフィド結合の導入が含まれる。
【００６６】
ＮＴＰペプチドのペプトイド誘導体は、生物学的活性に重要な構造決定基を保持しているのにペプチド結合が除かれていることによって、タンパク質分解への耐性を与えているもう一つのクラスのペプチド模擬体である（本明細書中にそのまま援用される Simon, et al., 1992, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 89:9367-9371）。ペプトイドは、Ｎ−置換グリシンのオリゴマーである。天然アミノ酸の側鎖に各々該当する多数のＮ−アルキル基が記載されている（上に引用される Simon, et al. (1992)）。ＮＴＰペプチドの若干のまたは全てのアミノ酸を、置き換えられたアミノ酸に該当するＮ−置換グリシンで置き換えることができる。
【００６７】
「ペプチド模擬体」または「模擬体」という用語は、下に定義される逆Ｄペプチドおよび鏡像異性体も包含する。
「逆Ｄペプチド」という用語は、ＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドのＬ−アミノ酸配列と比較して逆の順序で配置されるＤ−アミノ酸から成る生物学的に活性なタンパク質またはペプチドを意味する。したがって、Ｌ−アミノ酸ＮＴＰペプチドのカルボキシ末端残基は、Ｄ−アミノ酸ペプチド等のアミノ末端になり、以下同様である。例えば、ＮＴＰペプチドＩＳＧＰＣは、ＣdＰdＧdＳdＩdになり、ここにおいて、Ｃd、Ｇd、Ｉd、ＰdおよびＳdは、Ｌ−アミノ酸Ｃ、Ｇ、Ｉ、ＰおよびＳにそれぞれ該当するＤ−アミノ酸である。
【００６８】
「鏡像異性体」という用語は、ＮＴＰペプチドのアミノ酸配列中の１個またはそれを超えるＬ−アミノ酸残基が、１個または複数の該当するＤ−アミノ酸残基で置き換えられている生物学的に活性なタンパク質またはペプチドを意味する。
【００６９】
本発明によって包含されるＮＴＰタンパク質（ＡＤ７Ｃ−ＮＴＰを含めた）およびＮＴＰペプチドおよびフラグメント、変異体、誘導体、ホモログおよび模擬体は、組換えＤＮＡ技術、タンパク質合成、および天然に存在するＮＴＰ、ＡＤ７Ｃ−ＮＴＰ、ＮＴＰペプチドおよびそれらのフラグメント、変異体、誘導体およびホモログの単離などの当業者に知られている方法を用いて製造することができる。
【００７０】
ＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドは、Sambrool et al.（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. [1989]）および／または Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishers Inc. and Wiley and Sons, N.Y. [1994] に記載された方法などの周知の組換えＤＮＡ技術方法を用いて製造することができる。
【００７１】
ＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドをエンコードしている遺伝子またはｃＤＮＡは、例えば、ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによってまたはＰＣＲ増幅によって得ることができる。ライブラリーをスクリーニングするのに有用なプローブまたはプライマーは、他の既知の遺伝子または遺伝子フラグメントについての配列情報に基づいて、例えば、他のＮＴＰタンパク質中で見出される保存モチーフなどの同じまたは関連した遺伝子ファミリーから生じることができる。更に、ＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドをエンコードしている遺伝子が一つの種から識別されている場合、その遺伝子の全部または一部分を、他の種から相同遺伝子を識別するためのプローブとして用いることができる。これらプローブまたはプライマーは、ＮＴＰ遺伝子を発現すると考えられる種々の組織源からｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするのに用いることができる。典型的には、スクリーニングから得られる偽陽性の数を最小限にするようにスクリーニングするために、高ストリンジェンシー条件が用いられるであろう。
【００７２】
ＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドをエンコードしている遺伝子を製造するもう一つの手段は、Engels et al. (Angew.Chem.Intl.Ed., 28:716-734[1989]) によって記載された方法のような当業者に周知の方法を用いた化学合成を用いることである。これら方法には、特に、核酸合成のためのホスホトリエステル法、ホスホロアミダイト法およびＨ−ホスホネート法が含まれる。このような化学合成に好ましい方法は、標準的なホスホロアミダイト化学を用いたポリマー支持合成である。典型的には、ＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドをエンコードしているＤＮＡは、数百ヌクレオチド長さであろう。約１００ヌクレオチドより大の核酸は、これら方法を用いていくつかのフラグメントとして合成することができる。次に、これらフラグメントを互いに連結して、完全長のＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドを形成することができる。通常は、タンパク質のアミノ末端をエンコードしているＤＮＡフラグメントは、メチオニン残基をエンコードしているＡＴＧを有するであろう。このメチオニンは、宿主細胞中で生産されるタンパク質が、その細胞から分泌されるように設計されているかどうかに依って、ＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドの成熟型に存在してよいしまたはしなくてよい。
【００７３】
ＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドをエンコードしている遺伝子、ｃＤＮＡまたはそのフラグメントは、標準的な連結技術を用いて適当な発現または増幅ベクター中に挿入することができる。このベクターは、典型的には、用いられる具体的な宿主細胞中で機能性であるように選択される（すなわち、ベクターは、遺伝子の増幅および／または遺伝子の発現が起こりうるような宿主細胞機構と適合性である）。ＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドをエンコードしている遺伝子、ｃＤＮＡまたはそのフラグメントは、原核生物、酵母、昆虫（バキュロウイルス系）および／または真核生物の宿主細胞中で増幅／発現することができる。宿主細胞の選択は、このＮＴＰタンパク質またはペプチドが、グリコシル化されるかおよび／またはリン酸化されるかどうかに一部分は依存するであろう。そのような場合、酵母、昆虫または哺乳動物の宿主細胞が好適である。
【００７４】
典型的には、いずれかの宿主細胞中で用いられるベクターは、少なくとも、５’フランキング配列（「プロモーター」とも称される）および他の調節要素、更には、１個または複数のエンハンサー、複製起点要素、転写終結要素、ドナーおよびアクセプタースプライス部位を含有する完全なイントロン配列、シグナルペプチド配列、リボソーム結合部位要素、ポリアデニル化配列、発現されるポリペプチドをエンコードしている核酸を挿入するためのポリリンカー領域、および選択可能マーカー要素を含有するであろう。これら要素は各々、下で考察される。場合により、ベクターは、「タグ」配列、すなわち、ＮＴＰタンパク質コーディング配列の５’末端または３’末端に位置するオリゴヌクレオチド分子を含有してよく；このオリゴヌクレオチド分子は、ポリＨｉｓ（ヘキサＨｉｓなど）、または商業的に入手可能な抗体が存在するＦＬＡＧ、ＨＡ（ヘマグルチニンインフルエンザウイルス）またはｍｙｃなどの他の「タグ」をエンコードしている。このタグは、典型的には、ポリペプチドの発現時にポリペプチドに融合し、そして宿主細胞からのＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドのアフィニティー精製のための手段として役立ちうる。アフィニティー精製は、例えば、アフィニティーマトリックスとしてこのタグに対する抗体を用いたカラムクロマトグラフィーによって行うことができる。場合により、このタグは、精製されたＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドから、ある種のペプチダーゼを用いるようないろいろな手段によって引き続き除去することができる。
【００７５】
ヒト免疫グロブリンのヒンジ領域およびＦｃ領域は、当業者によって、ＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドのＮ末端かまたはＣ末端において融合させうる。その後のＦｃ融合タンパク質は、プロテインＡアフィニティーカラムの使用によって精製しうる。Ｆｃは、長い薬物動態学的 in vivo 半減期を示すことが知られており、Ｆｃに融合したタンパク質は、未融合の対応物よりも実質的に長い in vivo 半減期を示すことが判明している。更に、Ｆｃ領域への融合は、いくつかの分子の生物活性に有用でありうる分子の二量体化／多量体化を可能にする。
【００７６】
５’フランキング配列は、相同であってよいし（すなわち、宿主細胞と同じ種および／または系統による）、異種であってよいし（すなわち、宿主細胞の種または系統以外の種による）、ハイブリッド（すなわち、１より多い源からの５’フランキング配列の組合せ）であってよいし、合成であってよいし、または天然のＮＴＰタンパク質またはペプチド遺伝子５’フランキング配列であってよい。そのようなものとして、５’フランキング配列源は、いずれの単細胞原核性生物または真核生物であってもよいし、いずれの脊椎動物または無脊椎動物であってもよいし、またはいずれの植物であってもよいが、但し、その５’フランキング配列は、宿主細胞機構中で機能性であり、しかも宿主細胞機構によって活性化されうるという条件付きである。
【００７７】
本発明のベクター中で有用な５’フランキング配列は、当該技術分野において周知のいくつかの方法のいずれによっても得ることができる。典型的には、ＮＴＰ遺伝子フランキング配列以外の本明細書中で有用な５’フランキング配列は、マッピングによっておよび／または制限エンドヌクレアーゼ消化によって予め識別されているので、適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて適当な組織源から単離することができる。ある場合には、５’フランキング配列の完全なヌクレオチド配列を知ることができる。ここで、５’フランキング配列を、核酸の合成またはクローニングについて上に記載された方法を用いて合成することができる。
【００７８】
５’フランキング配列の全部または一部分だけが知られている場合、それは、ＰＣＲを用いておよび／または同じ種または別の種から適当なオリゴヌクレオチドおよび／または５’フランキング配列フラグメントでゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって得ることができる。
【００７９】
５’フランキング配列が知られていない場合、５’フランキング配列を含有するＤＮＡのフラグメントは、例えば、コーディング配列または別の１個または複数の遺伝子さえも含有しうるより大きいＤＮＡ片から単離することができる。単離は、制限エンドヌクレアーゼ消化により、適当なＤＮＡフラグメントを単離するために慎重に選択された一つまたはそれを超える酵素を用いて行うことができる。消化後、所望のフラグメントを、アガロースゲル精製、Qiagen（登録商標）カラムまたは当業者に知られている他の方法によって単離することができる。この目的を達成するための適当な酵素の選択は、当業者に容易に理解されるであろう。
【００８０】
複製起点要素は、典型的には、商業的に購入される原核生物発現ベクターの一部分であり、宿主細胞中でのベクターの増幅を助ける。一定のコピー数へのベクターの増幅は、ある場合には、ＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドの最適発現に重要でありうる。選択されたベクターが複製起点部位を含有していない場合、既知の配列に基づいて化学合成し且つベクター中に連結することができる。転写終結要素は、典型的には、ＮＴＰタンパク質／ペプチドコーディング配列の３’末端に位置し、ＮＴＰタンパク質またはペプチドの転写を終結するのに役立つ。通常は、原核細胞中の転写終結要素は、Ｇ−Ｃの多いフラグメントにポリＴ配列が続く。この要素は、ライブラリーから容易にクローン化されるしまたはベクターの一部分として商業的に購入もされるが、上に記載されたような核酸合成の方法を用いて容易に合成することもできる。
【００８１】
選択可能マーカー遺伝子要素は、選択培地中で成長した宿主細胞の生存および成長に必要なタンパク質をエンコードしている。典型的な選択マーカー遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒素、例えば、原核生物宿主細胞について、アンピシリン、テトラサイクリンまたはカナマイシン、への耐性を与える、（ｂ）細胞の栄養要求性欠損を補足する；または（ｃ）複合培地から入手できない臨界的栄養素を供給する、タンパク質をエンコードしている。好ましい選択可能マーカーは、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子およびテトラサイクリン耐性遺伝子である。
【００８２】
Shine-Dalgarno 配列（原核生物）または Kozak 配列（真核生物）と一般的に称されるリボソーム結合要素は、通常は、ｍＲＮＡの翻訳開始に必要である。この要素は、典型的には、プロモーターの３’側で、合成されるＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドのコーディング配列の５’側に位置している。この Shine-Dalgarno 配列は様々であるが、典型的には、ポリプリンである（すなわち、高いＡ−Ｇ含量を有する）。多数の Shine-Dalgarno 配列が識別されており、各々、上記の方法を用いて容易に合成することができ且つ原核生物ベクター中で用いることができる。
【００８３】
ＮＴＰタンパク質またはペプチドが宿主細胞から分泌されることが望まれる場合、シグナル配列は、ＮＴＰタンパク質またはペプチドをそれが合成される宿主細胞の外に導くために用いることができ、このタンパク質のカルボキシ末端部分は、膜固定を妨げるために欠失していてよい。典型的には、このシグナル配列は、ＮＴＰ遺伝子またはｃＤＮＡのコーディング領域中に、または、ＮＴＰ遺伝子コーディング領域の５’末端に直接的に位置している。多数のシグナル配列が識別されており、選択された宿主細胞中で機能性であるそれらはいずれも、ＮＴＰ遺伝子またはｃＤＮＡと連結して用いることができる。したがって、このシグナル配列は、ＮＴＰ遺伝子またはｃＤＮＡに相同であってよいしまたは異種であってよい。更に、このシグナル配列は、上記の方法を用いて化学合成することができる。大部分の場合、シグナルペプチドの存在による宿主細胞からのポリペプチドの分泌は、ポリペプチドからのアミノ末端メチオニンの除去を引き起こすであろう。
【００８４】
多くの場合、ＮＴＰ遺伝子またはｃＤＮＡの転写は、ベクター中の１個またはそれを超えるイントロンの存在によって増加することがありうるが；これは、特に、ＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドが真核生物宿主細胞、特に、哺乳動物宿主細胞中で生産される場合に真実である。用いられるイントロンは、特に、用いられる遺伝子が完全長ゲノム配列またはそのフラグメントである場合、ＮＴＰ遺伝子内に天然に存在していてよい。このイントロンが（大部分のｃＤＮＡの場合のように）遺伝子内に天然に存在しない場合、１個または複数のイントロンは、別の源から得ることができる。フランキング配列およびＮＴＰ遺伝子に関するイントロンの位置は、このイントロンが有効であるように転写されるべきであるので、比較的重要である。そのようなものとして、発現ベクター中に挿入されるＮＴＰ遺伝子がｃＤＮＡ分子である場合、イントロンの好ましい位置は、３’〜転写開始部位の３’側、かつ、ポリＡ転写終結配列の５‘側である。ＮＴＰｃＤＮＡについて、好ましくは、１個または複数のイントロンは、それがこのコーディング配列を分断しないように、ｃＤＮＡ一方の側またはもう一方（すなわち、５’または３’）に位置しているであろう。いずれかのウイルス、原核生物および真核生物（植物または動物）を含めたいずれかの源からのいずれのイントロンも、本発明を実施するのに用いることができるが、但し、それは、それが挿入される一つまたは複数の宿主細胞と適合性であるという条件付きである。更に、本明細書中に含まれるのは、合成イントロンである。場合により、１より多いイントロンをベクター中に用いてよい。
【００８５】
上記の一つまたはそれを超える要素が、用いられるベクター中に既に存在していない場合、それらは、個々に得ることができ且つベクター中に連結することができる。これら要素の各々を得るのに用いられる方法は、当業者に周知であり、上記の方法（すなわち、ＤＮＡの合成、ライブラリースクリーニング等）に匹敵する。
【００８６】
本発明を実施するのに用いられる最終ベクターは、商業的に入手可能なベクターなどの出発用ベクターから構築することができる。このようなベクターは、完成したベクター中に含まれるべき若干の要素を含有していてよいしまたは含有していなくてよい。出発用ベクター中に所望の要素が全く存在しない場合、ベクター中に連結される要素の末端およびベクターの末端が連結に適合性であるように、一つまたは複数の適切な制限エンドヌクレアーゼでベクターを切ることによって、各々の要素をベクター中に個々に連結することができる。ある場合には、納得のいく連結を得るために、互いに連結されるこれら末端を「ブラントにする」ことが必要でありうる。ブラントにすることは、クレノウＤＮＡポリメラーゼまたはＴ４  ＤＮＡポリメラーゼを全４個のヌクレオチドの存在下で用いて、最初に「付着末端」にフィルインすることによって行われる。この手順は、当該技術分野において周知であり、例えば、Sambrook et al., 上記に記載されている。或いは、ベクター中に挿入される二つまたはそれを超える要素は、最初に、（それらが互いに隣接した位置にある予定ならば）互いに連結した後、ベクター中に連結することができる。
【００８７】
ベクターを構築するもう一つの方法は、いろいろな要素の連結を全て一つの反応混合物中で同時に行うことである。ここでは、これら要素の不適当な連結または挿入によって、多数のナンセンスまたは非機能性ベクターが生じるであろうが、しかしながら、機能性ベクターは、制限エンドヌクレアーゼ消化によって識別され且つ選択されうる。
【００８８】
本発明を実施するのに好ましいベクターは、細菌、昆虫および哺乳動物の宿主細胞と適合性であるものである。このようなベクターには、特に、ｐＣＲII、ｐＣＲ３、およびｐｃＤＮＡ３．１（Invitrogen Company, San Diego, Calif.）、ｐＢＳII（Stratagene Company, La Jolla, Calif.）、ｐＥＴ１５ｂ（Novagen, Madison, Wis.）、ＰＧＥＸ（Pharmacia Biotech, Piscataway, N.J.）、ｐＥＧＦＰ−Ｎ２（Clontech, Palo Alto, Calif.）、ｐＥＴＬ（BlueBacII; Invitrogen）およびｐＦａｓｔＢａｃＤｕａｌ（Gibco／ＢＲＬ，Grand Island, N.Y.）が含まれる。
【００８９】
ベクターを構築し、そして完全長または一部切断されたＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドをエンコードしている核酸分子をベクターの適当な部位に挿入した後、完成したベクターを、増幅および／またはポリペプチド発現に適した宿主細胞中に挿入することができる。宿主細胞は、原核生物宿主細胞（大腸菌（Ｅ．coli）など）または真核生物宿主細胞（酵母細胞、昆虫細胞または脊椎動物細胞など）であってよい。この宿主細胞は、適切な条件下で培養された場合、ＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドを合成することができ、引き続き、それを培地から（宿主細胞がそれを培地中に分泌する場合）または（それが分泌されない場合）それを生産する宿主細胞から直接的に集めることができる。
【００９０】
採集後、このＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドは、モレキュラーシーブクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等のような方法を用いて精製することができる。ＮＴＰタンパク質またはペプチドの生産のための宿主細胞の選択は、そのＮＴＰタンパク質またはペプチドがグリコシル化されるかまたはリン酸化される（この場合、真核生物宿主細胞が好適である）かどうかに、および宿主細胞が、生物学的に活性なタンパク質を、生物学的活性を有するＮＴＰタンパク質またはペプチドによって製造するようにそのタンパク質をその天然の三次構造（例えば、ジスルフィド橋の適当な配向等）に「フォールディング」することができる方法に一部分は依存するであろうが、このＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドは、下に考察されるような適切な化学的条件を用いた合成後に「フォールディング」されてよい。適当な細胞または細胞系は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ヒト胚性腎（ＨＥＫ）２９３または２９３Ｔ細胞、または３Ｔ３細胞などの哺乳動物細胞であってよい。適当な哺乳動物宿主細胞の選択、および形質転換、培養、増幅、スクリーニングおよび生成物の生産および精製の方法は、当該技術分野において知られている。他の適当な哺乳動物細胞系は、サルＣＯＳ−１およびＣＯＳ−７細胞系、およびＣＶ−１細胞系である。更に代表的な哺乳動物宿主細胞には、形質転換された細胞系を含めた、霊長類細胞系および齧歯類細胞系が含まれる。正常二倍体細胞、一次組織の in vitro 培養に由来する細胞系統、更には、一次外植体も適している。候補細胞は、遺伝子型に関して選択遺伝子を欠損していてよいし、または優先的に作用する選択遺伝子を含有していてよい。他の適当な哺乳動物細胞系には、マウス神経芽細胞腫Ｎ２Ａ細胞、ＨｅＬａ、マウスＬ−９２９細胞、スイス由来３Ｔ３系、Ｂａｌｂ−ｃまたはＮＩＨマウス、ＢＨＫまたはＨａＫハムスター細胞系が含まれるが、これに制限されるわけではない。
【００９１】
本発明に適した宿主細胞として同様に有用であるのは、細菌細胞である。例えば、Ｅ．coli のいろいろな系統（例えば、ＨＢ１０１、ＤＨ５．α、ＤＨ１０およびＭＣ１０６１）は、バイオテクノロジーの分野において宿主細胞として周知である。枯草菌（Ｂ．subtilis）、シュードモナス属種（Pseudomonas spp.）、他のバチルス属種（Bacillus spp.）、ストレプトミセス属種（Streptomyces spp.）等のいろいろな系統も、この方法に用いることができる。当業者に知られている多数の酵母細胞系統も、本発明のポリペプチドの発現に宿主細胞として利用可能である。
【００９２】
更に、望まれる場合、昆虫細胞系を本発明の方法で利用することができる。このような系は、例えば、Kitts et al.（Biotechniques, 14:810-817[1993]）、Lucklow et al.（Curr.Opin.Biotechnol., 4:564-572[1993]）および Lucklow et al.（J.Virol., 67:4566-4579[1993]）に記載されている。好ましい昆虫細胞は、Ｓｆ−９およびＨｉ５（Invitrogen, Carlsbad, Calif.）である。
【００９３】
選択された宿主細胞中へのベクターの挿入（「形質転換」または「トランスフェクション」とも称される）は、塩化カルシウム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクションまたはＤＥＡＥ−デキストラン法のような方法を用いて行うことができる。選択される方法は、一つには、用いられる宿主細胞のタイプの機能であろう。これら方法および他の適当な方法は、当業者に周知であり、例えば、Sambrook et al., 上記に記載されている。
【００９４】
ベクターを含有している（すなわち、形質転換されたまたはトランスフェクションされた）宿主細胞は、当業者に周知の標準的な培地を用いて培養することができる。この培地は、通常は、細胞の成長および生存に必要な全ての栄養素を含有するであろう。Ｅ．coli 細胞を培養するのに適した培地は、例えば、Luria Broth（ＬＢ）および／または Terrific Broth（ＴＢ）である。真核細胞を培養するのに適した培地は、ＰＲＭＩ１６４０、ＭＥＭ、ＤＭＥＭであり、これらはいずれも、培養されている具体的な細胞系によって必要とされる血清および／または増殖因子を補足されていてよい。昆虫培養に適した培地は、必要とされるイーストレート（yeastolate）、ラクトアルブミン加水分解産物および／またはウシ胎児血清を補足された Grace's 培地である。典型的には、形質転換された細胞のみの選択的成長に有用な抗生物質または他の化合物を、培地への補足物として加える。用いられる化合物は、宿主細胞を形質転換させたプラスミド上に存在する選択可能マーカー要素によって指示されるであろう。例えば、選択可能マーカー要素がカナマイシン耐性である場合、培地に加えられる化合物はカナマイシンであろう。
【００９５】
宿主細胞中で生産されたＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドの量は、当該技術分野において知られている標準法を用いて評価することができる。このような方法には、これ制限されることなく、ウェスタンブロット分析、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、非変性ゲル電気泳動、ＨＰＬＣ分離、質量分光分析、免疫沈降法、および／またはＤＮＡ結合ゲルシフト分析のような活性検定が含まれる。
【００９６】
ＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドが宿主細胞から分泌されるように設計されていた場合、大部分のＮＴＰタンパク質またはペプチドは、細胞培地中で見出されうる。この方法で製造されるタンパク質は、細胞からの分泌の際に、アミノ末端メチオニンが除去されるので、典型的には、それを有していないであろう。しかしながら、ＮＴＰタンパク質またはペプチドが宿主細胞から分泌されない場合、それは、細胞質および／または核（真核生物宿主細胞について）またはサイトゾル（グラム陰性細菌宿主細胞について）中に存在するであろうし、しかもアミノ末端メチオニンを有することがありうる。
【００９７】
宿主細胞の細胞質および／または核中にあるＮＴＰタンパク質またはペプチドについては、典型的には、宿主細胞を最初に機械的にまたはデタージェントで破壊して、細胞内内容物を緩衝溶液中に放出させる。次に、ＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドをこの溶液から単離することができる。
【００９８】
溶液からのＮＴＰタンパク質またはペプチドの精製は、いろいろな技法を用いて行うことができる。タンパク質が、そのカルボキシル末端かまたはアミノ末端に、ヘキサヒスチジン（ＮＴＰタンパク質／ヘキサＨｉｓ）のようなタグ、またはＦＬＡＧ（Sigma-Aldritch, St.Louis, MI）またはカルモジュリン結合ペプチド（Stratagene, La Jolla, CA）のような他の低分子ペプチドを含有するように合成された場合、それは、本質的には、アフィニティーカラムを介して溶液を通過させることによって一段法で精製することができ、その場合、カラムマトリックスは、このタグまたはタンパク質に直接的に高親和性を有する（すなわち、ＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドを特異的に認識する単クローン性抗体）。例えば、ポリヒスチジンは、高い親和性および特異性で、ニッケル、亜鉛およびコバルトに結合し；したがって、ニッケル基剤アフィニティー樹脂（Qiagen's ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓシステムまたは Invitrogen's Xpress System で用いられる）またはコバルト基剤アフィニティー樹脂（ＢＤ Biosciences−ＣＬＯＮＴＥＣＨ’ｓ Talon システムで用いられる）を用いる固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィーは、ＮＴＰタンパク質／ポリＨｉｓの精製に用いることができる。（例えば、Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, Section 10.11.8, John Wiley & Sons, New York [1993] を参照されたい）。
【００９９】
ＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドが、タグが取り付けられることなく製造され、しかも利用可能な抗体がない場合、他の周知の精製方法を用いることができる。このような方法には、これに制限されることなく、イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、モレキュラーシーブクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、ゲル溶離と組み合わせた未変性ゲル電気泳動、および分離用等電点電気泳動（「Isoprime」機械／技法、Hoefer Scientific）が含まれる。ある場合には、これら技法の二つまたはそれを超えるものを組み合わせて、増加した純度を得ることができる。
【０１００】
ＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドが主に細胞内で見出されるであろうと考えられる場合、細胞内物質（グラム陰性細菌については封入体を含めた）を、当業者に知られているいずれかの標準的な技法を用いて宿主細胞から抽出することができる。例えば、これら宿主細胞を、フレンチプレス、ホモジナイゼーションおよび／または超音波処理後の遠心分離により、溶解させてペリプラズム／細胞質の内容物を放出させることができる。ＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドが、サイトゾル中で封入体を形成した場合、それら封入体は、しばしば、細胞の内膜および／または外膜に結合しうるので、主に、遠心分離後のペレット材料中で見出されるであろう。次に、このペレット材料を、両極端ｐＨで、またはアルカリ性ｐＨでのジチオトレイトールまたは酸性ｐＨでのトリスカルボキシエチルホスフィンのような還元剤の存在下において、デタージェント、グアニジン、グアニジン誘導体、尿素または尿素誘導体のようなカオトロープ剤で処理して、封入体を放出させ、破砕し、可溶化させることができる。次に、ここで可溶性の形となったＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドは、ゲル電気泳動、免疫沈降法または類似のものを用いて分析することができる。
【０１０１】
ＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドを単離することが望まれる場合、単離は、下記および Marston et al.（Meth.Enz., 182:264-275[1990]）に記載のものなどの標準法を用いて行うことができる。ある場合には、ＮＴＰタンパク質またはペプチドは、単離時に生物学的に活性でなくてよい。このポリペプチドをその三次構造に「再フォールディング」または変換し且つジスルフィド結合を生じるいろいろな方法を用いて、生物学的活性を回復することができる。このような方法には、可溶化したポリペプチドを、特定の濃度のカオトロープの存在下において、通常は７を超えるｐＨに暴露することが含まれる。カオトロープの選択は、封入体可溶化に用いられる選択肢に極めて似ているが、通常は、より低い濃度であり、必ずしも可溶化に用いられるのと同じカオトロープではない。大部分の場合、再フォールディング／酸化溶液は、還元剤、または酸化型を特定の比率で加えた還元剤も含有して、ジスルフィドシャッフリングがタンパク質の１個または複数のシステイン橋の形成を引き起こすことを可能にする特定のレドックス電位を生じるであろう。一般的に用いられる若干のレドックス対には、システイン／シスタミン、グルタチオン（ＧＳＨ）／ジチオビスＧＳＨ、塩化第二銅、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）／ジチアンＤＴＴ、２−メルカプトエタノール（ｂＭＥ）／ジチオ−ｂ（ＭＥ）が含まれる。多くの場合、再フォールディングの効率を増加させるのに補助溶媒が必要であり、この目的に用いられるより一般的な試薬には、グリセロール、いろいろな分子量のポリエチレングリコール、およびアルギニンが含まれる。
【０１０２】
ＮＴＰタンパク質またはペプチド封入体が、宿主細胞中において有意の程度まで形成されない場合、ＮＴＰタンパク質またはペプチドは、主に、細胞ホモジネートの遠心分離後の上澄み中で見出されるので、このＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドは、下に示されるような方法を用いて上澄みから単離することができる。
【０１０３】
ＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドを部分的にまたは完全に単離することが好ましいこのような状況において、精製は、当業者に周知の標準法を用いて行うことができる。このような方法には、これに制限されることなく、電気泳動後の電気溶出、各種タイプのクロマトグラフィー（イムノアフィニティー、モレキュラーシーブおよび／またはイオン交換）および／または高速液体クロマトグラフィーが含まれる。ある場合には、完全な精製のために、これら方法の二つ以上を用いるのが好ましいことがありうる。
【０１０４】
組換えＤＮＡ技術を用いてＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドを製造し且つ精製することに加えて、ＮＴＰタンパク質、ＮＴＰペプチドおよびそれらのフラグメント、変異体、ホモログおよび誘導体は、化学合成法（固相ペプチド合成など）によって、Merrifield et al.（J.Am.Chem.Soc., 85:2149[1963]）、Houghten et al.（Proc Natl Acad.Sci.USA, 82:5132[1985]）および Stewart and Young（Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, III.[1984]）によって記載されたものなどの当該技術分野において知られている技法を用いて製造することができる。このようなポリペプチドは、アミノ末端上にメチオニンを含んでまたは含むことなく合成されてよい。化学合成されたＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドは、これら参考文献に記載の方法を用いて酸化して、ジスルフィド橋を形成することができる。これらＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドは、組換えによって製造されたまたは天然源から精製されたＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドに匹敵する生物学的活性を有すると考えられるので、リコンビナントまたは天然のＮＴＰタンパク質またはペプチドと交換可能に用いることができる。
【０１０５】
ＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドがポリマーに連結している化学修飾されたＮＴＰタンパク質およびペプチドの組成物は、本発明の範囲内に包含される。選択されるポリマーは、典型的には、水溶性であるので、それに結合しているタンパク質は、生理学的環境のような水性環境中で沈殿することはない。選択されるポリマーは、アシル化のための活性エステルまたはアルキル化のためのアルデヒドのような単一反応性基を有するように修飾されうるので、重合度は、本方法で与えられるように調節することができる。このポリマーは、いずれの分子量を有してもよく、分岐状であってよいしまたは未分岐であってよい。ＮＴＰタンパク質／ペプチドポリマーの範囲内に含まれるのは、ポリマーの混合物である。
【０１０６】
ある場合には、天然に存在するＮＴＰタンパク質またはＮＴＰペプチドの核酸および／またはアミノ酸変異体を製造するのが望ましいことがありうる。核酸変異体は、位置指定突然変異誘発、ＰＣＲ増幅または他の適当な方法を用いて製造することができるが、この場合、１個または複数のプライマーは、所望の点突然変異を有する（突然変異誘発技術の説明については、Sambrook et al., 上記および Ausubel et al., 上記を参照されたい）。Engels et al., 上記によって記載の方法を用いた化学合成も、このような変異体を製造するのに用いることができる。当業者に知られている他の方法も用いることができる。
【０１０７】
好ましい核酸変異体は、ＮＴＰタンパク質またはペプチドを製造するのに用いられる宿主細胞中におけるコドン選択の理由となるヌクレオチド置換を含有するものである。このような「コドン最適化」は、University of Wisconsin Package Version 9.0, Genetics Computer Group, Madison, Wis によって提供されるような高度に発現された細菌遺伝子のコドン選択のための「Ecohigh.Cod」のようなコドン出現頻度表を包含する計算機アルゴリサー（algorithers）によって決定することができる。他の有用なコドン出現頻度表には、「Celegans_high.cod」、「Celegans_low.cod」、「Drosophila_high.cod」、「Human_high.cod」、「Maize_high.cod」および「Yeast_high.cod」が含まれる。他の好ましい変異体は、野生型と比較される上記のような保存的アミノ酸変化をエンコードしている（例えば、天然に存在するアミノ酸側鎖の電荷または極性が、異なったアミノ酸での置換によって実質的に変化していない）もの、および／または新規な１個または複数のグリコシル化および／またはリン酸化部位を生じるように設計されたかまたは既存の１個または複数のグリコシル化および／またはリン酸化部位を欠失するように設計されたものである。
【０１０８】
ＮＴＰペプチド、それらのフラグメント、ホモログ、変異体、誘導体および塩は、当業者に知られている慣用的なペプチド合成技術を用いて製造することができる。これら技術には、化学カップリング法（Wunsch,E: "Methoden der organischen Chemie", Volume 15, Band 1+2, Synthese von Peptiden, thime Verlag, Stuttgart (1974), および Barrany,G.; Marrifield,R.B.: "The Peptides", eds. E.Gross, J.Meienhofer, Volume 2, Chapter 1, pp.1-284, Academic Press (1980) を参照されたい）、酵素カップリング法（Widmer,F. Johansen,J.T., Carlsberg Res.Commun., Vol.44, pp.37-46(1979), および Kullmann,W.: "Enzymatic Peptide Synthesis", CRC Press Inc. Boca Raton, Fla. (1987), および Widmer,F., Johansen,J.T. in "Synthetic Peptides in Biology and Medicines:, eds. Alitalo,K., Partanen,P., Vatieri,A., pp.79-86, Elsevier, Amsterdam (1985) を参照されたい）、またはこの方法の設計および経費に好都合であるならば、化学法および酵素法の組合せが含まれる。本明細書中に与えられるこれら指針および技術を用いて、当業者は、ＮＴＰペプチドまたはタンパク質のペプチド配列を変化させて、元のまたは天然のＮＴＰペプチドまたはタンパク質と同じまたは類似の生物学的活性（生物活性）を有するホモログを製造することができる。
【０１０９】
タンパク質は、一般的に、二つの望ましくない性質、すなわち、（１）不十分な生物学的利用能；および（２）短い作用期間を示すので、ある与えられたＮＴＰペプチドまたはタンパク質のタンパク質自体よりもむしろ模擬体を使用するのが好都合である。ペプチド模擬体は、関与する分子が、より広範囲に利用可能でもあるし、長い作用期間を有するのにも充分に小さいので、これら二つの主な障害を迂回する経路を与える。更に、ペプチド模擬体は、タンパク質およびペプチドよりも製造するのがはるかに安価である。最後に、タンパク質およびペプチドの安定性、貯蔵および免疫反応性に関連した問題であって、ペプチド模擬体では経験されない問題がある。
【０１１０】
したがって、上記のＮＴＰペプチドは、類似の生物学的活性を有することによって、類似の治療的有用性を有するこのような低分子化合物の開発に有用である。ＮＴＰペプチドのペプチド模擬体は、組合せ化学技術および当該技術分野において知られている他の技術を用いて開発することができる（例えば、Proceedings of the 20th European Peptide Symposium, ed. G.Jung, E.Bayer, pp.289-336 およびその参考文献を参照されたい）。
【０１１１】
当該技術分野において知られているペプチドを構造的に修飾してペプチド模擬体を生じる方法の例には、活性に悪影響を与えることなく、タンパク質分解への増加した安定性を特にＮ末端においてもたらしうるＤアミノ酸残基構造をもたらす主鎖キラル中心の反転が含まれる。一例は、"Tritriated D-ala1-Peptide T Binding," Smith C.S. et al., Drug Development Res., 15,pp.371-379(1988) という論文に与えられている。
【０１１２】
第二の方法は、Ｎ−Ｃ鎖間イミドおよびラクタムのような、安定性のために環状構造を変化させることである（Ede et al. in Smith and River (Eds.) "Peptides: Chemistry and Biology", Escom, Leiden (1991), pp.268-270）。この例は、本明細書中にその開示がそのまま援用される米国特許第４，４５７，４８９号（１９８５年），Goldstein,G. et al. に開示されたものなどの、コンホメーションが制限されたチモペンチン様化合物において与えられている。
【０１１３】
第三の方法は、タンパク質分解に耐性を与えるプソイドペプチド結合によってＮＴＰペプチド中のペプチド結合を置換することである。概して、ペプチドの構造および生物学的活性に影響を与えない多数のプソイドペプチド結合が記載されている。このアプローチの一つの例は、レトロインベルソプソイドペプチド結合を代用することである（本明細書中に援用される、"Biologically active retroinverso analogues of thymopentin", Sisto A. et al in River,J.E. and Marshall,G.R.(eds) "Peptides, Chemistry, Structure and Biology", Escom, Leiden (1990), pp.722-773） and Dalpozzo, et al. (1993), Int.J.Peptide Protein Res., 41:561-566）。この修飾によれば、これらペプチドのアミノ酸配列は、１個またはそれを超えるペプチド結合がレトロインベルソプソイドペプチド結合によって置き換えられていることを除いて、上記のＮＴＰペプチドの配列と一致しうる。好ましくは、最もＮ末端のペプチド結合が置換されているが、それは、このような置換が、Ｎ末端に作用するエキソペプチダーゼによるタンパク質分解に耐性を与えるからである。
【０１１４】
１個またはそれを超える還元レトロインベルソプソイドペプチド結合を含むペプチドの合成は、当該技術分野において知られている（上に引用される Sisto (1990) および Dalpozzo, et al. (1993)）。したがって、ペプチド結合は、ペプチド模擬体が元のペプチドに類似した構造をとることによって生物学的活性を示すことを可能にする非ペプチド結合によって置き換えることができる。更に別の修飾を、アミノ酸の化学基を類似した構造の他の化学基で置き換えることによって行うこともできる。生物学的活性をほとんどまたは全く減少させることなく酵素的切断への安定性を増加させることが知られているもう一つの適当なプソイドペプチド結合は、還元等配電子体プソイドペプチド結合である（本明細書中にそのまま援用される Couder, et al. (1993), Int.J.Peptide Protein Res., 41:181-184）。したがって、これらペプチドのアミノ酸配列は、１個またはそれを超えるペプチド結合が等配電子体プソイドペプチド結合によって置き換えられていることを除いて、ＮＴＰペプチドの配列と一致しうる。好ましくは、最もＮ末端のペプチド結合が置換されているが、それは、このような置換が、Ｎ末端に作用するエキソペプチダーゼによるタンパク質分解に耐性を与えると考えられるからである。１個またはそれを超える還元等配電子体プソイドペプチド結合を含むペプチドの合成は、当該技術分野において知られている（上に引用される Couder, et al. (1993)）。他の例には、ペプチド結合を置き換えるためのケトメチレン結合またはメチルスルフィド結合の導入が含まれる。
【０１１５】
ＮＴＰペプチドのペプトイド誘導体は、生物学的活性に重要な構造決定基を保持しているのにペプチド結合が除かれていることによって、タンパク質分解への耐性を与えているもう一つのクラスのペプチド模擬体である（本明細書中にそのまま援用される Simon, et al., 1992, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 89:9367-9371）。ペプトイドは、Ｎ−置換グリシンのオリゴマーである。天然アミノ酸の側鎖に各々該当する多数のＮ−アルキル基が記載されている（上に引用され且つ本明細書中にそのまま援用される Simon, et al. (1992)）。ＮＴＰペプチドの若干のまたは全てのアミノ酸を、置き換えられたアミノ酸に該当するＮ−置換グリシンで置き換えることができる。
【０１１６】
ペプチド模擬体の開発は、元のＮＴＰペプチドの三次構造を、ＮＭＲ分光学、結晶学および／または計算機支援分子モデリングによって決定することによって援助することができる。これら技術は、元のペプチドより高い力価および／または大きい生物学的利用能および／または大きい安定性を有する新規な組成物の開発を援助する（いずれも本明細書中にそのまま援用される、Dean (1994), BioEssays, 16:683-687; Cohen and Shatzmiller (1993), J.Mol.Graph., 11:166-173; Wiley and Rich (1993), Med.Res.Rev., 13:327-384; Moore (1994), Trends Pharmacol.Sci., 15:124-129; Hruby (1993), Biopolymers, 33:1073-1082; Bugg et al. (1993), Sci.Am., 269:92-98）。
【０１１７】
可能性のあるペプチド模擬化合物がいったん識別されると、それは、下の実施例に概説される方法を用いて合成し且つ検定して、その活性を評価することができる。ＮＴＰペプチドの生物学的活性および類似した三次元構造を有する、上の方法によって得られるペプチド模擬化合物は、本発明によって包含される。ペプチド模擬体を、上記の一つまたはそれを超える修飾を有するいずれかのＮＴＰペプチドから生じることができるということは、当業者に容易に明らかであろう。更に、本発明のペプチド模擬体を、治療的化合物としてのそれらの有用性に加えて、なお一層強力な非ペプチド化合物の開発に更に用いることができるということは明らかであろう。
【０１１８】
本発明は、更に、哺乳動物組織または体液試料中のＮＴＰペプチド、ＮＴＰタンパク質、ＮＴＰ  ＤＮＡまたは対応するＲＮＡの存在について、定性的にかまたは定量的に調べる検定のための、ＮＴＰペプチドおよびそれらの対応する核酸分子の使用に関する。ＮＴＰペプチド、ＮＴＰタンパク質およびそれらの対応する核酸分子は、ＮＴＰペプチド、ＮＴＰタンパク質またはエンコードされたＮＴＰペプチドまたはタンパク質が生物学的活性を示すにせよ示さないにせよ、このような検定における標品中に用いることができる。ＮＴＰ核酸配列は、哺乳動物組織または体液試料中のＮＴＰ  ＤＮＡまたは対応するＲＮＡの存在について、定性的にかまたは定量的に調べるのに有用なハイブリダイゼーションプローブ源でありうる。それ自体は生物学的に活性でないＮＴＰタンパク質またはペプチドは、ＮＴＰタンパク質またはペプチドを認識するおよび／またはそれに結合する抗体を製造するのに有用でありうる。このような抗体は、標準法を用いて製造することができる。
【０１１９】
したがって、ＮＴＰペプチドと反応する抗体、更には、このような抗体の短鎖抗体フラグメントおよび他の反応性フラグメントも、本発明の範囲内と考えられる。これら抗体は、多クローン性、単クローン性、リコンビナント、キメラ、一本鎖および／または二重特異性であってよい。典型的には、抗体またはそのフラグメントは、ヒト由来であるかまたは、「ヒト化」されている、すなわち、患者に投与された場合に、抗体への免疫反応を妨げるまたは最小限にするように製造されるであろう。好ましい抗体は、多クローン性かまたは単クローン性のヒト抗体である。抗体フラグメントは、Ｆab、Ｆab'等のような、本発明のＮＴＰペプチドと反応性であるいずれのフラグメントであってもよい。本発明によって更に提供されるのは、ある選択された哺乳動物に抗原としていずれかのＮＴＰペプチドを提示後、その哺乳動物の細胞（例えば、脾臓細胞）とある種の癌細胞とを既知の技法によって融合して不死化細胞系を作ることによって生じるハイブリドーマである。ＮＴＰペプチドの全部または一部分に対して向けられるこのような細胞系および抗体を生じるのに用いられる方法も、本発明によって包含される。
【０１２０】
これら抗体は、更に、体液または細胞試料中のＮＴＰタンパク質またはペプチドの存在を検出するために標識された形などで、in vivo および in vitro 診断または研究の目的に用いることができる。
【０１２１】
本発明は、更に、哺乳動物組織または体液試料中のＮＴＰペプチド、ＮＴＰタンパク質、ＮＴＰ  ＤＮＡまたは対応するＲＮＡの存在について、定性的にかまたは定量的に調べる検定における検量線基準としての一つまたはそれを超えるＮＴＰペプチドの使用を包含する。
【０１２２】
本発明は、良性および悪性の腫瘍、腺（例えば、前立腺）過形成、望ましくない顔毛、いぼおよび望ましくない脂肪組織のような、望ましくない細胞の除去を必要とする状態を処置する新規な方法に関する。このような方法は、要求がある哺乳動物に、治療的有効量のＮＴＰペプチドを投与することを含む。
【０１２３】
その状態は、例えば、肺、乳房、胃、膵臓、前立腺、膀胱、骨、卵巣、皮膚、腎、洞、結腸、腸、胃、直腸、食道、血液、脳およびその被膜、脊髄およびその被膜、筋肉、結合組織、副腎、上皮小体、甲状腺、子宮、精巣、下垂体、生殖器、肝、胆嚢、眼、耳、鼻、咽喉、扁桃、口、リンパ節およびリンパ系、および他の器官の腫瘍でありうる。
【０１２４】
本明細書中で用いられる「悪性腫瘍」という用語は、不十分に分化した、中程度に分化したおよび充分に分化した形で生じる全ての形のヒト癌、肉腫および黒色腫を包含する意味である。
【０１２５】
本発明は、外科手術の危険が少なく且つ望ましくない副作用もほとんどなく良性腫瘍を除去しうる処置への当該技術分野における要求を満たす。生体中の深部（例えば、脳、心臓、肺およびその他）のような外科的に危険な部位の良性腫瘍を除去する方法は、特に要求される。
【０１２６】
細胞を除去すべき状態を処置する方法は、外科的切除、化学療法および放射線などの、このような状態を処置する慣用的な方法と連結して用いることができる。ＮＴＰペプチドは、このような慣用的な処置の前、際または後に投与することができる。
【０１２７】
処置される状態は、肺、乳房、胃、膵臓、前立腺、膀胱、骨、卵巣、皮膚、腎、洞、結腸、腸、胃、直腸、食道、血液、脳およびその被膜、脊髄およびその被膜、筋肉、結合組織、副腎、上皮小体、甲状腺、子宮、精巣、下垂体、生殖器、肝、胆嚢、眼、耳、鼻、咽喉、扁桃、口、およびリンパ節およびリンパ系から成る群より選択される組織の過形成、肥大または過成長でもありうる。
【０１２８】
本発明の方法を用いて処置することができる更に別の状態は、肺、乳房、胃、膵臓、前立腺、膀胱、骨、卵巣、皮膚、腎、洞、結腸、腸、胃、直腸、食道、血液、脳およびその被膜、脊髄およびその被膜、筋肉、結合組織、副腎、上皮小体、甲状腺、子宮、精巣、下垂体、生殖器、肝、胆嚢、眼、耳、鼻、咽喉、扁桃、口、およびリンパ節およびリンパ系から成る群より選択される、ウイルス、細菌または寄生生物によって変化した組織である。
【０１２９】
処置される状態は、肺、乳房、胃、膵臓、前立腺、膀胱、骨、卵巣、皮膚、腎、洞、結腸、腸、胃、直腸、食道、血液、脳およびその被膜、脊髄およびその被膜、筋肉、結合組織、副腎、上皮小体、甲状腺、子宮、精巣、下垂体、生殖器、肝、胆嚢、眼、耳、鼻、咽喉、扁桃、口、およびリンパ節およびリンパ系から成る群より選択される組織の奇形でもありうる。
【０１３０】
具体的には、処置される状態は、扁桃肥大、前立腺過形成または痔疾でありうる。処置される状態は、アテローム性動脈硬化症または動脈硬化症などの血管性疾患、または拡張蛇行静脈などの血管性疾患でありうる。処置される状態は、皮膚、眼、耳、鼻、咽喉、口、筋肉、結合組織、体毛または乳房組織などの組織への美容修正でもありうる。
【０１３１】
ＮＴＰペプチドの治療的組成物は、本発明の範囲内である。このような組成物は、治療的有効量のＮＴＰペプチドを薬学的に許容しうる担体との混合物で含む。この担体物質は、好ましくは、哺乳動物への投与用水剤に一般的な他の物質を補足された注射用水であってよい。典型的には、治療的使用のためのＮＴＰペプチドは、一つまたはそれを超える生理学的に許容しうる担体、賦形剤または希釈剤と一緒に精製ＮＴＰペプチドを含む組成物の形で投与されるであろう。中性緩衝化食塩水または血清アルブミンと混合される食塩水は、代表的な適当な担体である。好ましくは、この生成物は、適当な賦形剤（例えば、スクロース）を用いて凍結乾燥物として製剤化される。他の標準的な担体、希釈剤および賦形剤は、所望により含まれてよい。組成物は、当業者に知られている緩衝剤を、ソルビトールまたはその適当な代用品が更に含まれうる、約ｐＨ７．０〜８．５のトリス緩衝液または約ｐＨ４．０〜５．５の酢酸緩衝液を含めた適当な範囲のｐＨ値で含む。
【０１３２】
望ましくない細胞要素に標的指向するための抗体、抗体フラグメント、抗体様分子、または細胞レセプター、シグナルペプチドまたは過発現された酵素などの特異的腫瘍マーカーに高親和性を有する分子に抱合されたまたは連結したまたは結合したＮＴＰペプチドの使用も、本発明の範囲に包含される。抗体、抗体フラグメント、抗体様分子、または特異的腫瘍マーカーに高親和性を有する分子は、特定の細胞または組織標的にＮＴＰペプチド抱合体を指向させるのに用いられる。例えば、示差的表面抗原または発現された抗原を含む腫瘍は、抗体、抗体フラグメントまたは抗体様結合分子によって標的とされうるし、そして腫瘍細胞は、ＮＴＰペプチドによって死滅しうる。抗体ターゲッティングを用いたこのようなアプローチは、投薬量を減少させる、標的細胞に結合し且つそれに取り込まれる可能性を増加させる、および転移性腫瘍および微視的サイズの腫瘍に標的指向し且つそれを処置することについての増加した有用性の考えられる利点を有する。
【０１３３】
本発明は、更に、腫瘍または他の望ましくない細胞の一つまたは複数の部位またはその付近での、腫瘍特異的または部位特異的酵素またはプロテアーゼによる、または腫瘍または他の望ましくない細胞を標的とする抗体抱合体による切断時に、腫瘍または他の望ましくない細胞の一つまたは複数の部位またはその付近でＮＴＰペプチドを放出する組成物を形成するための、タンパク質または他の分子に抱合されたまたは連結したまたは結合したＮＴＰペプチドの使用を包含する。
【０１３４】
本発明は、更に、処置される組織を、光線（レーザー治療または他の光力学的または光活性化治療の場合のような）、赤外線、紫外線、ｘ線またはγ線のような他の形の電磁線、局所熱、αまたはβ線、超音波発射、または他の局所エネルギー源への暴露時に、ＮＴＰペプチドまたはＮＴＰペプチドの若干の生物学的に活性なフラグメントを放出する組成物を形成するための、タンパク質または他の分子に抱合されたまたは連結したまたは結合したＮＴＰペプチドの使用を包含する。
【０１３５】
これらＮＴＰペプチドは、処置されている処方について適宜、単独で、またはサイトカイン、増殖因子、抗生物質、アポトーシス誘導性剤、抗炎症薬および／または化学療法薬のような他の医薬組成物と互いに一緒に、または組み合わせて用いることができる。
【０１３６】
本発明は、更に、樹状体（dendrimers）、フラーレン（fullerenes）、および他の合成分子、ポリマーおよび巨大分子を用いたＮＴＰペプチドの治療的組成物を包含するが、この場合、ＮＴＰペプチドおよび／またはその対応するＤＮＡ分子は、それだけでかまたは、腫瘍特異的マーカーのような他の種の分子と一緒に、その分子、ポリマーまたは巨大分子で抱合されている、それに付いているまたは中に封入されている。例えば、米国特許第５，７１４，１６６号、Bioactive and/or Targeted Dendimer Conjugates は、特に、一つまたは複数の標的支配物質と、少なくとも一つの生物活性物質とが抱合された少なくとも一つの樹状体を含んで成る樹状ポリマー抱合体を製造し且つ用いる方法を提供している。
【０１３７】
本発明は、更に、ＮＴＰペプチドおよび／または遺伝子と、脂質エマルジョン、ミセルポリマー、ポリマーミクロスフェア、電気活性ポリマー、ヒドロゲルおよびリポソームのようなドラッグデリバリービヒクルとの治療的組成物を包含する。
【０１３８】
望ましくない細胞に導入されるＮＴＰペプチドまたは関連遺伝子または遺伝子均等物の使用も、本発明の範囲に包含される。腫瘍内でのＮＴＰペプチドの過発現は、腫瘍中の細胞を死滅させ、それによって腫瘍細胞集団を減少させるのに用いることができる。望ましくない細胞要素を処置するためのＮＴＰペプチドの遺伝子または遺伝子均等物導入は、少ない投薬量しか必要としない、および標的とされる細胞要素が細胞子孫に継代される、それによって、頻繁な療法をあまり必要としない、およびより少ない全療法の利点を有すると考えられる。本発明は、更に、望ましくない細胞または隣接細胞への、ＮＴＰペプチドを含有する融合タンパク質をコードする遺伝子の導入を包含するが、この場合、遺伝子の発現および融合タンパク質の生産および／または分泌後、この融合タンパク質は、天然の酵素またはプロテアーゼによってかまたはプロドラッグによって切断されて、望ましくない細胞中、細胞またはその付近でＮＴＰペプチドを放出する。
【０１３９】
クローン化リコンビナントＮＴＰペプチド−抗体抱合体；クローン化リコンビナントＮＴＰペプチド−抗体フラグメント抱合体；およびクローン化リコンビナントＮＴＰペプチド−抗体様タンパク質抱合体の使用も、本発明の範囲に包含される。標的指向抱合体（抗体、抗体フラグメント、抗体様分子、または癌特異的レセプターまたは他の腫瘍マーカーに高親和性を有する分子）と組み合わされたクローン化ＮＴＰペプチドの利点は、このような分子が、クローン化抱合分子の製造および規格化生産の利点に加えて、上記の標的指向利点を兼備しているということである。
【０１４０】
経口投与用の固体剤形には、カプセル剤、錠剤、丸剤、散剤および顆粒剤が含まれるが、これに制限されるわけではない。このような固体剤形では、活性化合物は、次の、（ａ）クエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウムなどの一つまたはそれを超える不活性賦形剤（または担体）；（ｂ）デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトールおよびケイ酸などの充填剤または増量剤；（ｃ）カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースおよびアラビアゴムなどの結合剤；（ｄ）グリセロールなどの保湿剤；（ｅ）寒天、炭酸カルシウム、バレイショまたはタピオカデンプン、アルギン酸、若干の錯ケイ酸塩および炭酸ナトリウムなどの崩壊剤；（ｆ）パラフィンなどの溶液抑制剤（solution retarders）；（ｇ）第四級アンモニウム化合物などの吸収促進剤；（ｈ）アセチルアルコールおよびグリセリンモノステアラートなどの湿潤剤；（ｉ）カオリンおよびベントナイトなどの吸着剤；および（ｊ）タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウムまたはそれらの混合物などの滑沢剤の内少なくとも一つと混合されている。カプセル剤、錠剤および丸剤について、その剤形は、緩衝剤を含んでいてもよい。
【０１４１】
経口投与用の液状剤形には、薬学的に許容しうる乳剤、水剤、懸濁剤、シロップ剤およびエリキシル剤が含まれる。活性化合物に加えて、これら液状剤形は、水または他の溶媒などの当該技術分野において一般的に用いられる不活性希釈剤、可溶化剤および乳化剤を含んでいてよい。代表的な乳化剤は、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、綿実油、ラッカセイ油（groundnut oil）、トウモロコシ胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油およびゴマ油などの油剤、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、ソルビタンの脂肪酸エステル、またはこれら物質の混合物等である。
【０１４２】
このような不活性希釈剤の他に、この組成物には、湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤、甘味剤、着香剤および芳香剤のようなアジュバントも含まれうる。
本発明の組成物中の活性成分の実際投薬レベルは、具体的な組成物および投与方法について望まれる治療的応答を得るのに有効である治療的有効量のＮＴＰペプチドを得るように変更されてよい。したがって、選択される投薬レベルは、所望の治療的作用、投与経路、所望の処置期間、処置される個体または動物のサイズおよび他の因子に依存するであろう。
【０１４３】
ヒトを含めた哺乳動物では、有効量は、体表面積を基準として投与することができる。いろいろなサイズ、種の動物およびヒトについての投薬の相互関係（ｍｇ／Ｍ2（体表面）に基づく）は、E.J.Freireich et al., Cancer Chemother.Rep., 50(4):219(1966) によって記載されている。体表面積は、個体の身長と体重からほぼ決定することができる（例えば、Scientific Tables, Geigy Pharmaceuticals, Ardsley, N.Y. pp.537-538(1970) を参照されたい）。当業者に知られている技法を用い且つ本明細書中に与えられる指針および技法を用いて、当業者は、本発明で用いるためのＮＴＰペプチドの治療的有効量を決定することができるであろう。
【０１４４】
宿主に投与されるＮＴＰペプチドの全１日用量は、単回または分割用量であってよい。投薬単位組成物は、１日用量を調製するのに用いることができるように、その約数の量を含有してよい。しかしながら、いずれの特定の患者にも具体的な用量レベルは、体重、全身の健康状態、性別、食餌、投与時間および経路、投与される薬物の力価、吸収および排泄の速度、他の薬物との組合せ、および処置されている具体的な疾患の重症度を含めたいろいろな因子に依存するということは理解されるであろう。
【０１４５】
本発明によるＮＴＰペプチド組成物を投与する方法には、これら化合物を、筋肉内、経口、静脈内、腹腔内、大脳内（実質内）、脳室内、腫瘍内、病巣内、皮内、脊髄内、鼻腔内、眼内、動脈内、局所、経皮、エアゾル剤、注入、ボーラス注射、植込装置、徐放性システム等によって投与することが含まれるが、これに制限されるわけではない。
【０１４６】
本発明のＮＴＰペプチドを投与するもう一つの方法は、経皮または皮膚を通した経路による。このような態様の一つの例は、パッチの使用である。具体的には、パッチを、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中またはＤＭＳＯと綿実油の混合物中のＮＴＰペプチドの微細懸濁液で製造し且つ腫瘍含有哺乳動物の皮膚ポケット（pouch）内部の腫瘍部位から離れた皮膚と接触させることができる。他の基剤またはそれらと他の溶媒および固体支持体との混合物も、均等に作用すると考えられる。このパッチは、ＮＴＰペプチド化合物を溶液または懸濁液の形で含有しうる。次に、パッチを、患者の皮膚に、例えば、縫合、クリップまたは他の保持装置によって皮膚を合わせて折り重ね且つ保持することによって形成される患者の皮膚ポケット（pouch）中にそれを挿入することによって適用することができる。このポケットは、皮膚との連続接触が、哺乳動物に妨害されることなく確保されるようにして用いられるべきである。皮膚ポケットを用いることの他に、皮膚と接触しているパッチの確定した位置を確保するいずれの装置も用いることができる。例えば、接着ガーゼ包帯を用いて、皮膚上の適所にパッチを保持しうる。
【０１４７】
ＮＴＰペプチドは、徐放性製剤または調製品で投与することができる。徐放性調整品の適当な例には、造形品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形の半透過性ポリマーマトリックスが含まれる。徐放性マトリックスには、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（Ｕ．Ｓ．３，７７３，９１９号、ＥＰ５８，４８１号）、Ｌ−グルタミン酸およびγエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（Sidman et al, Biopolymers, 22:547-556[1983]）、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（Langer et al., J.Biomed.Mater.Res., 15:167-277[1981] および Langer, Chem.Tech., 12:98-105[1982]）、エチレン酢酸ビニル（Langer et al., 上記）またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９８８号）が含まれる。徐放性組成物には、リポソームも含まれうるが、これは、当該技術分野において知られているいくつかの方法のいずれかによって製造することができる（例えば、Eppstein et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 82:3688-3692[1985]; ＥＰ３６，６７６号；ＥＰ８８，０４６号；およびＥＰ１４３，９４９）。
【０１４８】
本発明のＮＴＰペプチドを投与するもう一つの方法は、処置される腫瘍または他の組織中へのＮＴＰペプチドの直接的または間接的注入による。このような態様の一つの例は、処置される腫瘍または他の組織中へのＮＴＰペプチドの直接的注射である。この処置は、処置される腫瘍または他の組織の退行または破壊を、バイオプシー、画像化、または組織成長を監視する他の方法によって監視することを伴う、単回注射、時々の多数回注射、または何時間か、何日間かまたは何ヶ月間かにわたる一連の注射から成ってよい。処置される腫瘍または他の組織中への注射は、鼻、口、耳、膣、直腸または尿道などの開口部中に挿入される装置によってよいし、または in vivo の腫瘍または組織に達するために切開によってよく、しかも１回または複数の注射に適当な部位を決定するために、超音波または光ファイバースコープなどの画像化システムまたは光学システムと連結して行うことができる。このような態様のもう一つの例は、組織へのＮＴＰペプチドの一定注入を長期に渡って行うことができる装置の使用である。
【０１４９】
本発明のＮＴＰペプチドを投与するもう一つの方法は、除去されるまたは破壊されることが必要とされるまたは望まれる腫瘍または他の組織または細胞要素を物理的に切除する、剥離する、またはそれ以外には死滅させるまたは破壊するのに用いられる外科的手順または類似の手順と連結しているが、この場合、本発明のＮＴＰペプチドは、この手順によって除去されないまたは破壊されないいずれかの腫瘍細胞または他の細胞要素を破壊するまたはその成長を遅らせるために、腫瘍または他の組織が除去された一つまたは複数の部位を取り囲む一つまたは複数の隣接部位に投与される。
【０１５０】
本発明のＮＴＰペプチドを投与するもう一つの方法は、処置される腫瘍または他の組織内への装置の植込による。このような態様の一つの例は、処置される腫瘍または他の組織中への、ＮＴＰペプチドを含有するウェファーの植込である。このウェファーは、治療的用量のＮＴＰペプチドを組織中に長期に渡って放出する。或いは、または更に、組成物を、ＮＴＰペプチドが吸収された膜、スポンジまたは他の適当な材料の患部中への植込によって局所投与することができる。植込装置が用いられる場合、この装置は、いずれか適当な組織または器官中に植込むことができ、そしてＮＴＰペプチドの供給は、この装置を介して直接的に、ボーラスによってよいし、または連続投与によってよいし、または連続注入を用いてカテーテルによってよい。
【０１５１】
代わりの投与方法は、ＮＴＰペプチドエンコーディング遺伝子の一つまたはそれを超えるコピーを、標的にされている且つ必要ならば、その遺伝子の一つまたは複数のコピーにＮＴＰペプチドを細胞内で生産開始することを誘導する細胞中に、導入することである。遺伝子治療を適用することができる一つの方式は、構成性または誘導性プロモーターに機能的に連結して「遺伝子治療ＤＮＡコンストラクト」を形成することができるＮＴＰペプチドエンコーディング遺伝子（ＮＴＰペプチドまたはそのフラグメント、変異体、ホモログまたは誘導体をエンコードしているゲノムＤＮＡか、ｃＤＮＡかおよび／または合成ＤＮＡ）を使用することである。このプロモーターは、内因性ＮＴＰペプチドエンコーディング遺伝子に相同であってよいしまたは異種であってよいが、但し、それは、このコンストラクトが挿入される細胞または組織のタイプで活性であるという条件付きである。この遺伝子治療ＤＮＡコンストラクトの他の成分には、必要により、部位特異的組込み用に設計されるＤＮＡ分子（例えば、相同的組換えに有用な内因性フランキング配列）、組織特異的プロモーター、一つまたは複数のエンハンサーまたはサイレンサー、親細胞にまさる選択的利点を与えることができるＤＮＡ分子、形質転換された細胞を識別する標識として有用なＤＮＡ分子、負の選択システム、細胞特異的結合剤（例えば、細胞ターゲッティングの場合のような）、細胞特異的インターナリゼーション因子、およびベクターによる発現を促す転写因子並びにベクター製造を可能にする因子が含まれてもよい。
【０１５２】
細胞または組織への in vivo または ex vivo 遺伝子供給手段には、裸ＤＮＡの直接的注射、バリスト法、リポソーム媒介導入、レセプター媒介導入（リガンド−ＤＮＡ複合体）、エレクトロポレーションおよびリン酸カルシウム沈降が含まれる（が、これに制限されるわけではない）。本明細書中に各々の開示がそのまま援用される米国特許第４，９７０，１５４号、ＷＯ９６／４０９５８号、米国特許第５，６７９，５５９号、米国特許第５，６７６，９５４号および米国特許第５，５９３，８７５号を参照されたい。それらには、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ポックスウイルス、レンチウイルス、パピローマウイルスまたは単純ヘルペスウイルスなどのウイルスベクターの使用、ＤＮＡ−タンパク質複合体の使用、およびリポソームの使用も含まれうる。遺伝子治療ベクターの使用は、例えば、本明細書中に各々の開示がそのまま援用される米国特許第５，６７２，３４４号、米国特許第５，３９９，３４６号、米国特許第５，６３１，２３６号および米国特許第５，６３５，３９９号に記載されている。
【０１５３】
ＮＴＰペプチドエンコーディング遺伝子は、ex vivo で遺伝子操作された若干の細胞を、本明細書中に記載されたような方法を用いて患者に植込むことによって供給されて、ＮＴＰペプチドまたはそのフラグメント、変異体、ホモログまたは誘導体を発現し且つ分泌することができる。このような細胞は、動物またはヒトの細胞であってよく、患者自身の組織に由来してよいしまたはヒトかまたは非ヒトの別の源に由来してよい。場合により、これら細胞は、不死化されていてよいしまたは幹細胞であってよい。しかしながら、免疫学的応答の機会を減少させるためには、これら細胞を、周囲組織の浸潤を免れるようにカプセル封入するのが好適である。カプセル封入材料は、典型的には、生体適合性の半透過性ポリマー封入体または膜であって、一つまたは複数のタンパク質産物を放出させるが、患者の免疫系によるまたは周囲組織からの他の有害な因子による細胞の破壊を妨げるものである。細胞の膜カプセル封入に用いられる方法は、当業者に公知であり、カプセル封入された細胞の製造および患者へのそれらの植込は、過度に実験することなく行うことができる。例えば、本明細書中に各々の開示がそのまま援用される米国特許第４，８９２，５３８号；同第５，０１１，４７２号；および同第５，１０６，６２７号を参照されたい。生きている細胞をカプセル封入するシステムは、ＰＣＴ  ＷＯ９１／１０４２５号に記載されている。リポソーム担体、生物侵食性（bio-erodible）粒子またはビーズのようないろいろな他の徐放または制御供給手段を製剤化する技術も、当業者に知られており、例えば、本明細書中にその開示がそのまま援用される米国特許第５，６５３，９７５号に記載されている。これら細胞は、カプセル封入を伴ってまたは伴うことなく、患者の適当な体組織または器官中に植込むことができる。
【０１５４】
次の実施例は、本発明を詳しく説明するために与えられる。しかしながら、本発明は、これら実施例に記載の具体的な条件または詳細に制限されないということは理解されるはずである。本明細書中、米国特許を含めた公的に入手可能な論文のいずれかのおよび全ての参照は、具体的に援用される。
【実施例】
【０１５５】
実施例１
この実施例の目的は、注射部位における組織へのＮＴＰペプチド＃４３の作用を決定することであった。
【０１５６】
８匹の正常ラットの、皮膚および皮下では各４か所の異なった病巣、および四肢骨格筋では各２か所の異なった病巣に、ステンレス鋼製２６ゲージ針によってプラスチックシリンジから供給される、１００〜４００ｍＬの量の食塩水中に０．１〜１ｍｇ／ｍＬの濃度のＮＴＰペプチド＃４３を注射した。
【０１５７】
これら被験動物を２４時間観察し、そして２４時間目に無痛屠殺した。これら４８個の浸潤病巣を切り取り、１０％ホルマリン中に固定し、パラフィン中に包埋し、そして標準的な組織病理学的方法によって染色し且つ調べた。
【０１５８】
同様の対照ラット群には、（１）食塩水中０．１％ウシ血清アルブミン、（２）正常ヒト血清、（３）生理食塩水、（４）非感染性細菌タンパク質、および（５）対照ペプチドを、上のように注射し、浄化後、調べ且つ屠殺して、切り取られた注射病巣を上のように処理した。
【０１５９】
結果
ＮＴＰペプチド＃４３の注射は、注射部位において多量の急性組織壊死を生じた。この壊死は、ＮＴＰペプチド＃４３が注射された部位の、筋組織、皮下結合組織、および皮膚において明白であった。２４時間目に、細胞は、青ざめ、萎縮し、そして壊死状態に見え、炎症細胞で浸潤があった。この壊死は、注射部位に相関し、注射部位より遠くへ広がっているようには見えなかった。
【０１６０】
軽症の炎症部位は別として、対照は、壊死または細胞損失の証拠を示さなかった。筋線維層の全範囲が壊死したＮＴＰペプチド＃４３注射とは対照的に、これら対照は、最小限の筋変化または筋変化不存在を示した。対照注射では、注射部位における軽症〜最小限の急性炎症と、針による病巣微量出血があった。
【０１６１】
実施例２
この実施例の目的は、注射部位における組織へのＮＴＰペプチド＃１７の作用を決定することであった。
【０１６２】
８匹の正常ラットの、皮膚および皮下では各４か所の異なった病巣、および四肢骨格筋では各２か所の異なった病巣に、ステンレス鋼製２６ゲージ針によってプラスチックシリンジから供給される、１００〜４００ｍＬの量の食塩水中に０．１〜１ｍｇ／ｍＬの濃度のＮＴＰペプチド＃１７を注射した。
【０１６３】
これら被験動物を２４時間観察し、そして２４時間目に無痛屠殺した。これら４８個の浸潤病巣を切り取り、１０％ホルマリン中に固定し、パラフィン中に包埋し、そして標準的な組織病理学的方法によって染色し且つ調べた。
【０１６４】
対照は、実施例１と同様であった。
結果
ＮＴＰペプチド＃１７の注射は、注射部位において多量の急性組織壊死を生じた。この壊死は、ＮＴＰペプチド＃１７が注射された部位の、筋組織、皮下結合組織、および皮膚において明白であった。２４時間目に、細胞は、青ざめ、萎縮し、そして壊死状態に見え、炎症細胞で浸潤があった。この壊死は、注射部位に相関し、注射部位より遠くへ広がっているようには見えなかった。
【０１６５】
軽症の炎症部位は別として、対照は、壊死または細胞損失の証拠を示さなかった。筋線維層の全範囲が壊死したＮＴＰペプチド＃１７注射とは対照的に、これら対照は、最小限の筋変化または筋変化不存在を示した。対照注射では、注射部位における軽症〜最小限の急性炎症と、針による病巣微量出血があった。
【０１６６】
実施例３
この実施例の目的は、注射部位における組織へのＮＴＰペプチド＃２０の作用を決定することであった。
【０１６７】
８匹の正常ラットの、皮膚および皮下では各４か所の異なった病巣、および四肢骨格筋では各２か所の異なった病巣に、ステンレス鋼製２６ゲージ針によってプラスチックシリンジから供給される、１００〜４００ｍＬの量の食塩水中に０．１〜１ｍｇ／ｍＬの濃度のＮＴＰペプチド＃２０を注射した。
【０１６８】
これら被験動物を２４時間観察し、そして２４時間目に無痛屠殺した。これら４８個の浸潤病巣を切り取り、１０％ホルマリン中に固定し、パラフィン中に包埋し、そして標準的な組織病理学的方法によって染色し且つ調べた。
【０１６９】
対照は、実施例１と同様であった。
結果
ＮＴＰペプチド＃２０の注射は、注射部位において細胞死および組織壊死を生じた。細胞死は、ＮＴＰペプチド＃２０が注射された部位の、筋組織、皮下結合組織、および皮膚に存在した。２４時間目に、それら部位の細胞は、青ざめ、萎縮し、そして壊死状態に見え、炎症細胞で浸潤があった。この細胞死および壊死は、注射部位にあり、注射部位より遠くへ広がっているようには見えなかった。
【０１７０】
軽症の炎症部位は別として、対照は、壊死または細胞損失の証拠を示さなかった。筋線維層の全範囲が壊死したＮＴＰペプチド＃２０注射とは対照的に、これら対照は、最小限の筋変化または筋変化不存在を示した。対照注射では、注射部位における軽症〜最小限の急性炎症と、時々の針による病巣微量出血があった。
【０１７１】
実施例４
この実施例の目的は、注射部位における組織へのＮＴＰペプチド＃１９の作用を決定することであった。
【０１７２】
８匹の正常ラットの、皮膚および皮下では各４か所の異なった病巣、および四肢骨格筋では各２か所の異なった病巣に、ステンレス鋼製２６ゲージ針によってプラスチックシリンジから供給される、１００〜４００ｍＬの量の食塩水中に０．１〜１ｍｇ／ｍＬの濃度のＮＴＰペプチド＃１９を注射した。
【０１７３】
これら被験動物を２４時間観察し、そして２４時間目に無痛屠殺した。これら４８個の浸潤病巣を切り取り、１０％ホルマリン中に固定し、パラフィン中に包埋し、そして標準的な組織病理学的方法によって染色し且つ調べた。
【０１７４】
対照は、実施例１と同様であった。
結果
上の実施例の場合のように、ＮＴＰペプチド＃１９の注射は、注射部位において細胞死および組織壊死を生じた。対照は、注射部位における急性炎症と、針による病巣微量出血とから成る最小限の変化または変化不存在を示した。
【０１７５】
実施例５
この実施例の目的は、注射部位における組織へのＮＴＰペプチド＃１６の作用を決定することであった。
【０１７６】
８匹の正常ラットの、皮膚および皮下では各４か所の異なった病巣、および四肢骨格筋では各２か所の異なった病巣に、ステンレス鋼製２６ゲージ針によってプラスチックシリンジから供給される、１００〜４００ｍＬの量の食塩水中に０．１〜１ｍｇ／ｍＬの濃度のＮＴＰペプチド＃１６を注射した。
【０１７７】
これら被験動物を２４時間観察し、そして２４時間目に無痛屠殺した。これら４８個の浸潤病巣を切り取り、１０％ホルマリン中に固定し、パラフィン中に包埋し、そして標準的な組織病理学的方法によって染色し且つ調べた。
【０１７８】
対照は、実施例１と同様であった。
結果
上の実施例の場合のように、ＮＴＰペプチド＃１６の注射は、注射部位において細胞死および組織壊死を生じた。対照は、注射部位における急性炎症と、針による病巣微量出血とから成る最小限の変化または変化不存在を示した。
【０１７９】
実施例６
この実施例の目的は、注射部位における組織へのＮＴＰペプチド＃１５の作用を決定することであった。
【０１８０】
８匹の正常ラットの、皮膚および皮下では各４か所の異なった病巣、および四肢骨格筋では各２か所の異なった病巣に、ステンレス鋼製２６ゲージ針によってプラスチックシリンジから供給される、１００〜４００ｍＬの量の食塩水中に０．１〜１ｍｇ／ｍＬの濃度のＮＴＰペプチド＃１５を注射した。
【０１８１】
これら被験動物を２４時間観察し、そして２４時間目に無痛屠殺した。これら４８個の浸潤病巣を切り取り、１０％ホルマリン中に固定し、パラフィン中に包埋し、そして標準的な組織病理学的方法によって染色し且つ調べた。
【０１８２】
対照は、実施例１と同様であった。
結果
上の実施例の場合のように、ＮＴＰペプチド＃１５の注射は、注射部位において細胞死および組織壊死を生じた。対照は、注射部位における急性炎症と、針による病巣微量出血とから成る最小限の変化または変化不存在を示した。
【０１８３】
実施例７
この実施例の目的は、注射部位における組織へのＮＴＰペプチド＃１４の作用を決定することであった。
【０１８４】
８匹の正常ラットの、皮膚および皮下では各４か所の異なった病巣、および四肢骨格筋では各２か所の異なった病巣に、ステンレス鋼製２６ゲージ針によってプラスチックシリンジから供給される、１００〜４００ｍＬの量の食塩水中に０．１〜１ｍｇ／ｍＬの濃度のＮＴＰペプチド＃１４を注射した。
【０１８５】
これら被験動物を２４時間観察し、そして２４時間目に無痛屠殺した。これら４８個の浸潤病巣を切り取り、１０％ホルマリン中に固定し、パラフィン中に包埋し、そして標準的な組織病理学的方法によって染色し且つ調べた。
【０１８６】
対照は、実施例１と同様であった。
結果
上の実施例の場合のように、ＮＴＰペプチド＃１４の注射は、注射部位において細胞死および組織壊死を生じた。対照は、注射部位における急性炎症と、針による病巣微量出血とから成る最小限の変化または変化不存在を示した。
【０１８７】
本発明の方法および組成物に、本発明の精神または範囲から逸脱することなく、いろいろな修正および変更を行うことができるということは、当業者に明らかであろう。したがって、本発明は、本発明のこれら修正および変更を包含するものである。
【図面の簡単な説明】
【０１８８】
【図１】図１は、ＡＤ７Ｃ−ＮＴＰ遺伝子およびその遺伝子のＡＤ７Ｃ−ＮＴＰタンパク質産物（米国特許第５，８３０，６７０号、第５，９４８，６３４号および第５，９４８，８８８号による配列１２０および１２１；de la Monte et al., J.Clin.Invest., 100:3093-3104(1997)；ＮＣＢＩ Entrez-Protein Accession ＃ＡＡＣ０８７３７；ＰＩＤ  ｇ３００２５２７）の完全なアミノ酸配列および核酸配列を示す図である［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１］。
【図２】図２は、１２２アミノ酸神経糸タンパク質（米国特許第５，８３０，６７０号、第５，９４８，６３４号および第５，９４８，８８８号による配列４０；ＮＣＢＩ Entrez-Protein Accession ＃ＡＡＥ２５４４７  ＰＩＤ  ｇ１００４８５４０）の完全なアミノ酸配列を示す図である［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２］。
【図３】図３は、１１２アミノ酸神経糸タンパク質（ＮＣＢＩ Entrez-Protein Accession ＃ＸＰ＿０３２３０７  ＰＩＤ  ｇ１５９２８９７１）の完全なアミノ酸配列を示す図である［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３］。
【図４】図４は、１０６アミノ酸神経糸タンパク質様タンパク質（ＮＣＢＩ Entrez-Protein Accession ＃ＡＡＨ１４９５１  ＰＩＤ  ｇ１５９２８９７１）の完全なアミノ酸配列を示す図である［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４］。
【図５】図５は、１０６アミノ酸神経糸タンパク質様タンパク質（ＮＣＢＩ Entrez-Protein Accession ＃ＸＰ＿０３９１０２  ＰＩＤ  ｇ１８５９９３３９）の完全なアミノ酸配列を示す図である［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５］。
【図６】図６は、９８アミノ酸神経糸タンパク質（米国特許第５，８３０，６７０号、第５，９４８，６３４号および第５，９４８，８８８号による配列３０；ＮＣＢＩ Entrez-Protein Accession ＃ＡＡＥ２５４４５，ＰＩＤ  ｇ１００４８５３８）の完全なアミノ酸配列を示す図である［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６］。
【図７】図７は、７５アミノ酸神経糸タンパク質（米国特許第５，８３０，６７０号、第５，９４８，６３４号および第５，９４８，８８８号による配列４８；ＮＣＢＩ Entrez-Protein Accession ＃ＡＡＥ２５４４８，ＰＩＤ  ｇ１００４８５４１）の完全なアミノ酸配列を示す図である［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７］。
【図８】図８は、６８アミノ酸神経糸タンパク質（米国特許第５，８３０，６７０号、第５，９４８，６３４号および第５，９４８，８８８号による配列３６；ＮＣＢＩ Entrez-Protein Accession ＃ＡＡＥ２５４４６，ＰＩＤ  ｇ１００４８５３９）の完全なアミノ酸配列を示す図である［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．８］。
【図９】図９は、６１アミノ酸神経糸タンパク質様タンパク質（ＮＣＢＩ Entrez-Protein Accession ＃ＡＡＨ０２５３４，ＰＩＤ  ｇ１２８０３４２１）の完全なアミノ酸配列を示す図である［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．９］。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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