(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１１のＮ末端蛋白質分解部分のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む、単離されそして／または組換え技術で生産された脊椎動物ヘッジホッグポリペプチド。
【請求項２】
少なくとも１００個の連続するアミノ酸を含む配列番号１１のＮ末端部分のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含んで成る、請求項１記載の単離されそして／または組換え技術で生産された脊椎動物ヘッジホッグポリペプチド。
【請求項３】
約１９ｋＤａの分子量を有する請求項１記載のポリペプチド。
【請求項４】
（ｉ）ヘッジホッグアミノ酸配列がマウスの天然ヘッジホッグ遺伝子によりコードされており、（ｉｉ）ヘッジホッグアミノ酸配列が約１９ｋＤａの分子量を有するヘッジホッグ蛋白質のＮ末端断片を含んでおり、（ｉｉｉ）ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４もしくはＨｏｘｄ遺伝子の発現を誘導し、（ｉｖ）汚染蛋白質の乾燥重量が２０％未満まで精製されており、または（ｖ）汚染蛋白質の乾燥重量が５％未満まで精製されている、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項５】
配列番号１１の少なくとも１５０の連続するアミノ酸を含むＮ末端部分のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含んで成る請求項２記載のポリペプチド。
【請求項６】
アミノ酸配列が配列番号４の脊椎動物ヘッジホッグ核酸と６５℃における０．２ＸＳＳＣの洗浄段階を含むストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされる請求項１乃至５のいずれかの一に記載のポリペプチド。
【請求項７】
融合蛋白質である請求項１、２および５のいずれか一に記載のポリペプチド。
【請求項８】
融合蛋白質が、さらに（ｉ）該融合蛋白質の存在を検出するための検出可能な標識、または（ｉｉ）該融合蛋白質に固定化するためのマトリックス結合ドメインを包含する請求項７記載のポリペプチド。
【請求項９】
翻訳後修飾されている請求項１、２および５のいずれかの一に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
グリコシル化されている請求項９記載のポリペプチド。
【請求項１１】
（ｉ）乾燥重量で少なくとも８０％まで精製されているか、または（ｉｉ）乾燥重量で少なくとも９５％まで精製されている請求項１、２および５のいずれかの一に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
製薬学的に許容される媒体、担体または希釈液中に配合された請求項２記載のポリペプチドを含む調製物。
【請求項１３】
請求項１または２記載のヘッジホッグポリペプチドのエピトープと特異的に反応する抗体調製物。
【請求項１４】
請求項１または２記載のヘッジホッグポリペプチドのエピトープと結合する抗体調製物。
【請求項１５】
調製物がモノクローナル抗体を含んで成る請求項１４記載の抗体調製物。
【請求項１６】
調製物がポリクローナル抗体を含んで成る請求項１３または１４記載の抗体調製物。
【請求項１７】
請求項１または２に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んで成り、かつ、（ｉ）中胚葉由来組織の増殖、生存もしくは分化を誘導できるか、または（ｉｉ）外胚葉由来組織の増殖、生存もしくは分化を誘導できるポリペプチドをコードする単離された核酸。
【請求項１８】
発現ベクターとして使用するのに適するようにヌクレオチド配列と機能するように連結された転写調節配列をさらに含んで成る請求項１７記載の核酸。
【請求項１９】
（ｉ）請求項１７に記載の核酸を含み、かつ、真核細胞中でヘッジホッグポリペプチドの発現を引き起こす転写調節配列に機能できるように連結された遺伝子構築物、および
（ｉｉ）該遺伝子構築物を細胞に送達し、そして該遺伝子構築物により細胞にトランスフェクションを引き起こすための遺伝子送達組成物、
を含んで成る組換えトランスフェクション用キット。
【請求項２０】
組換えウイルス粒子、リポソームおよびポリカチオン性核酸結合剤からなる群より選ばれる、請求項１９記載の組換えトランスフェクション用キット。
【請求項２１】
原核細胞および真核細胞の少なくとも一種で複製でき、かつ、請求項１７または１９に記載の核酸を含んで成る発現ベクター。
【請求項２２】
請求項２１に記載された発現ベクターでトランスフェクションされ、ヘッジホッグポリペプチドを発現する宿主細胞。
【請求項２３】
請求項２２に記載の細胞を細胞培養培地中で培養して組換えヘッジホッグポリペプチドを発現し、該ヘッジホッグポリペプチドを細胞培養物から単離することを特徴とする組換えヘッジホッグポリペプチドの生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脊椎動物胎仔パターン誘導性ヘッジホッグ様蛋白質、特に、そのＮ末端断片、及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
パターン形成は、胎仔細胞が分化細胞の定序空間配列を形成する活性である。より高等な生物体の身体的な複雑性は、胚発生の間に細胞内因性系統と細胞外因性シグナル伝達との相互作用を通して生じる。誘導的相互作用は、最も初期の体型プランの確立から組織系のパターン形成、そして組織分化の間の多様な細胞タイプの形成に至るまでの、脊椎動物の発生における胎仔のパターン形成にとって不可欠である（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３参照）。発生面での細胞相互作用の効果は様々である。典型的には応答性細胞が、ある経路の細胞分化から他の経路へと多様化するが、これは、非誘導化および誘導化の両状態の応答性細胞とも異なる細胞を誘導することによって行われる（誘導）。時によっては細胞がその近傍にある細胞を誘導して自分達と同じように分化させ（同質誘導）；他の場合では、細胞はそれらの近傍の細胞が自分と同じように分化することを阻害する。初期発達での細胞相互作用は連続的である可能性があり、そのため２つの細胞種間の初期誘導により多様な進行性増幅がもたらされる。その上、誘導性相互作用は胎仔においてのみ生じるのではなく、成体細胞においても同様に生じ、かつ形態形成パターンの確立および維持、ならびに分化の誘導を行うように作用することが可能である（非特許文献４参照）。
【０００３】
全脊椎動物における神経系の起源を原腸形成の終末まで追跡することが可能である。この時期に、胎仔の背側の外胚葉が上皮性から神経性へとそれ自体の運命を変化させる。新規に形成された神経外胚葉は肥厚してゆき神経板と呼ばれる扁平構造を形成するが、この神経板は、ある種の脊椎動物では正中溝（神経溝）および肥厚側縁（神経ひだ）を特徴とする。分化の初期段階では、この神経板は既にその前後方向（Ａ−Ｐ）および正中側面軸（Ｍ−Ｌ）に沿う領域的分化を呈示する。この神経ひだは結局のところ背側正中線で癒合して神経管を形成し、これがその前端部で脳に、そして後端部で脊髄に分化して行くだろう。神経管の閉鎖が生じると背側／腹側の違いがそれ以前の中外側分化により形成される。従って神経管形成の終末では、神経管は、前後方向（Ａ−Ｐ）、背−腹方向（Ｄ−Ｖ）、および中外側（Ｍ−Ｌ）の極性を有する（例えば、非特許文献５、非特許文献６参照）。神経管内での細胞の運命を特定する誘導性相互作用が脊椎動物胎仔神経系の初期パターンを確立する。脊髄では細胞タイプの同定は一部には２つの正中細胞群、すなわち脊索および底板からのシグナルにより制御され、これらの細胞群が神経管細胞の、底板、運動ニューロン、および他の脊椎動物のニューロンタイプへの分化を誘導する（非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９。非特許文献１０参照）。それに加え、底板からのシグナルが交連ニューロン生成の配向および方向を決める原因となっている（非特許文献１１参照）。神経管のパターン形成以外にも、脊索および底板は、腹側領域における背側体節派生物の分化を阻害することによって体節のパターン形成を制御するシグナル産生の原因ともなっている（非特許文献１２、非特許文献１３参照）。
【０００４】
他の重要なシグナル伝達中枢は、極性活性帯（ｔｈｅ  Ｚｏｎｅ  ｏｆ  Ｐｏｌａｒｉｚｉｎｇ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ）すなわち「ＺＰＡ」と称される発達中の肢芽の後方間葉内に存在する。肢芽の後方領域からの組織を第二肢芽の前縁に移植すると、生じる四肢は前後方向軸に沿った鏡像配列での追加的な指を伴って発生するであろう（非特許文献１４参照）。この知見により、ＺＡＰが四肢の正常な前後パターン形成の原因となっていることのモデルがもたらされた。ＺＡＰは「モルフォゲン」と称されるシグナルを放出すること
により機能を果たすと仮定されており、このモルフォゲンは初期胚芽を横切る濃度勾配を形成する。このモデルに従うと、ＺＡＰから様々な距離にある細胞の運命がこのモルフォゲンの局所濃度により決定され、このモルフォゲンの特異的閾値により完璧な構造が誘導される（非特許文献１５参照）。この仮説は、指重複の程度が移植されたＺＰＡ細胞の数に比例するという所見により支持されている（非特許文献１６参照）。
【０００５】
仮想的なＺＰＡモルフォゲンについての候補物が同定されているが、これは、レチノイン酸の源は、これを肢芽前部内に挿入した場合に同タイプの鏡像指重複をもたらすことが可能であるという発見によるものである（非特許文献１７、非特許文献１８参照）。外因性レチノイン酸に対する応答は、モルフォゲンモデルが必要としたのと同じく濃度依存性である（非特許文献１９参照）。その上、レチノイン酸の示差分布は肢芽を横切り、ＺＡＰ領域では一層高い濃度で存在している（非特許文献２０参照）。
【０００６】
しかしながら最近の証拠により、レチノイン酸はＺＡＰ活性の原因となる内因性因子ではありそうもないことが示されている（非特許文献２１、非特許文献２２参照）。現在では直接的に内因性シグナルを模倣するというよりはむしろ、レチノイン酸埋没物は異所性ＺＡＰを誘導することにより作用を行うと考えられている。レチノイン酸埋没物の遠位かつ外胚葉の真下に位置する前方四肢組織は、その組織を連続的に他の肢芽に移植することによりＺＰＡ活性を獲得することが証明されている（非特許文献２３、非特許文献２４参照）。それとは対照的に、ＺＰＡ移植片に隣接する組織はＺＰＡ活性を獲得することがない（非特許文献２５参照）。従って外因性レチノイン酸は四肢のパターン形成においてＺＰＡの上流で作用するものとみなされている。
【０００７】
ＺＰＡ作用の直ぐ下流の標的は知られていない。しかしながらＺＰＡ−誘導性パターン重複間に異所的に活性化される一連の重要な遺伝子は、ホックスド（Ｈｏｘｄ）クラスターの５’遺伝子である。これらの遺伝子は通常は肢芽の後縁から出現する重生パターン内で発現される（非特許文献２６、非特許文献２７参照）。この重生パターンのホックス（Ｈｏｘ）遺伝子発現が、四肢の前後軸に沿って産生される構造の同一性を決定することが直接証明されている（非特許文献２８参照）。このことにより予測されるように、解剖学的レベルで構造の鏡像重生を産生するＺＰＡ移植片により、分子レベルでの鏡像重生でのホックスド（Ｈｏｘｄ）遺伝子の異所性活性化が初めてもたらされる（非特許文献２９、非特許文献３０参照）。これらの重要な遺伝子の発現を調節する分子性シグナルは現在では解明されていない。
【０００８】
【非特許文献１】Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｅ．、（１９９０）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １０８：３６５−３８９
【非特許文献２】Ｇｕｒｄｏｎ，Ｊ．Ｂ．、（１９９２）Ｃｅｌｌ  ６８；１８５−１９９
【非特許文献３】Ｊｅｓｓｅｌｌ，Ｔ．Ｍ．、ｅｔ  ａｌ．、（１９９２）Ｃｅｌｌ  ６８：２５７−２７０
【非特許文献４】Ｊ．Ｂ．Ｇｕｒｄｏｎ（１９９２）Ｃｅｌｌ  ６８：１８５−１９９
【非特許文献５】Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（３ｒｄ）、ｅｄｓ．  Ｋａｎｄｅｌ、Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ａｎｄ  Ｊｅｓｓｅｌｌ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ：ＮＹ、１９９１
【非特許文献６】Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（３ｒｄ）、ｅｄ．  Ｓ．Ｆ．Ｇｉｌｂｅｒｔ、Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ：Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ  ＭＡ、１９９１
【非特許文献７】ｖａｎ  Ｓｔｒａａｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ａｎａｔ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．  １７７：３１７−３２４
【非特許文献８】Ｐｌａｃｚｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１７：２０５−２１８
【非特許文献９】Ｙａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｃｅｌｌ  ６４：０３５−６４７
【非特許文献１０】Ｈａｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５０：３３９−３４１
【非特許文献１１】Ｐｌａｃｚｅｋ，Ｍ  ｅｔ  ａｌ．、（１９９０）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１０：１９−３０）
【非特許文献１２】Ｂｒａｎｄ−Ｓａｂｅｒｉ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．、（１９９３）Ａｎａｔ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．１８８：２３９−２４５
【非特許文献１３】Ｐｏｒｑｕｉｅ，Ｏ．ｅｔ  ａｌ．、（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５２４２−５２４６
【非特許文献１４】Ｓａｕｎｄｅｒｓ  ａｎｄ  Ｇａｓｓｅｌｉｇ、（１９６８）Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ、ｐｐ．７８−９７
【非特許文献１５】Ｗｏｌｐｅｒｔ、（１９６９）Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．２５：１−４７
【非特許文献１６】Ｔｉｃｋｅｌ、（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ２５４：１９９−２０２
【非特許文献１７】Ｔｉｃｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、（１９８２）Ｎａｔｒｅ  ２９６：５６４−５６５
【非特許文献１８】Ｓｕｍｍｅｒｂｅｌｌ、（１９８３）Ｊ．Ｅｍｂｒｙｏｌ  ７８：２６９−２８９
【非特許文献１９】Ｔｉｃｋｌｅ  ｅｔ  ａｌ．、（１９８５）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．  １０９：８２−９５
【非特許文献２０】Ｔｈａｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｅｉｃｈｅｌｅ、（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２７：６２５−６２８
【非特許文献２１】Ｂｒｏｃｋｅｓ、（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５０：１５
【非特許文献２２】Ｔａｂｉｎ、（１９９１）Ｃｅｌｌ  ６６：１９９−２１７
【非特許文献２３】Ｓｕｍｍｅｒｂｅｌｌ  ａｎｄ  Ｈａｒｖｅｙ、（１９８３）Ｌｉｍｂ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｐｐ．１０９−１１８
【非特許文献２４】Ｗａｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．、（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５０：８１−８３
【非特許文献２５】Ｓｍｉｔｈ、（１９７９）Ｊ．Ｅｍｂｒｙｏｌ  ５２：１０５−１１３
【非特許文献２６】Ｄｏｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：７６７−７７２）
【非特許文献２７】Ｉｚｐｉｓｕａ−Ｂｅｌｍｏｎｔｅ  ｅｔ  ａｌ．、（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５０：５８５−５８９
【非特許文献２８】Ｍｏｒｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．、（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３５８：２３６−２３９
【非特許文献２９】Ｎｏｈｎｏ  ｅｔ  ａｌ．、（１９９１）Ｃｅｌｌ  ６４：１１９７−１２０５
【非特許文献３０】Ｉｚｐｉｓｕａ−Ｂｅｌｍｏｎｔｅ  ｅｔ  ａｌ．、（１９９１）  Ｎａｔｕｒｅ  ３５０：５８５−５８９
【発明の開示】
【０００９】
本発明は、脊椎動物生体内に存在する新規の蛋白質一族（本明細書では今後「ヘッジホッグ（ｈｅｄｇｅｈｏｇ）」蛋白質として引用される）の発見に関し、この蛋白質は脊椎動物における分化組織の定序空間配列の形成および維持に広く関連することが明らかであり、かつインビトロおよびインビボの両方における一連の様々な脊椎動物組織を作製および／または維持するのに用いることが可能である。
【００１０】
一般的には、本発明は、ヘッジホッグポリペプチド、好ましくは一つもしくは複数の主題のヘッジホッグポリペプチドの実質的に純粋な精製物を特徴とする。本発明はまた、組換え的に産生されるヘッジホッグポリペプチドも提供する。好ましい態様では、このポリペプチドは以下のような生物学的活性を有し、それらは：中胚葉由来組織（例えば、背側中胚葉に由来する組織）の増殖、生存、および／または分化を調節する能力；外胚葉由来組織（例えば、神経管、神経冠、もしくは頭部間葉）の増殖、生存、および／または分化を調節する能力；内胚葉由来組織（例えば、原腸に由来する組織）の増殖、生存、および／または分化を調節する能力である。その上、好ましい態様では、主題のヘッジホッグ蛋白質は二次的シグナル伝達性分子（例えば、トランスフォーミング成長因子β一族のメンバー、ならびに繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）一族のメンバー）の発現を誘導する能力を有する。
【００１１】
ある態様では、このポリペプチドはソニックヘッジホッグ（Ｓｏｎｉｃ ｈｅｄｇｅｈｏｇ）（Ｓｈｈ）ポリペプチド（例えば、配列番号１３もしくは１１により表される哺乳類のＳｈｈ、配列番号８により表される鳥類のＳｈｈ；もしくは配列番号１２により表される魚類のＳｈｈ）と同一もしくは相同である。例えば、Ｓｈｈポリペプチドが、配列番号８、１１、１２、もしくは１３の内のいずれかにより表されるポリペプチドに少なくとも７０％相同であるアミノ酸配列を有することが好ましいが、より高い配列相同性（例えば、８０％、９０％、もしくは９５％）を有するポリペプチドも期待される。例示的なＳｈｈ蛋白質は配列番号４０により表される。このＳｈｈポリペプチドは全長蛋白質（例えば、配列表に示されるもの）を含むことが可能であるか、あるいは例えば少なくとも５、１０、２０、５０、１００、もしくは１５０アミノ酸の長さの断片を含むことが可能である。好ましいヘッジホッグポリペプチドは、そのヘッジホッグ蛋白質の天然の蛋白質分解断片（例えば、ヒトＳｈｈ蛋白質のおおよそＣｙｓ−２４〜Ｇｌｕ−１８８、もしくはおおよそＡｓｐ−１８９〜Ａｌａ−４７５からの断片、もしくはそのアナログ断片）におおまかに対応するＳｈｈ配列を含む。
【００１２】
他の態様では、ポリペプチドはインディアンヘッジホッグ（Ｉｎｄｉａｎ ｈｅｄｇｅｈｏｇ）（Ｉｈｈ）ポリペプチド（例えば、配列番号１４により表されるヒトＩｈｈ、もしくは配列番号１０により表されるマウスＩｈｈ）と同一もしくは相同である。例えば、Ｉｈｈポリペプチドは、配列番号１０もしくは１４のいずれかにより表されるポリペプチドに少なくとも７０％相同であるアミノ酸配列を有することが好ましいが、より高い配列相同性（例えば、８０％、９０％、もしくは９５％）を有するＩｈｈポリペプチドも期待される。このポリペプチドは、それらの配列により部分的に表される全蛋白質配列を含むことが可能であるか、あるいは例えば少なくとも５、１０、２０、５０、１００、もしくは１５０アミノ酸の長さの断片を含むことが可能である。好ましいＩｈｈポリペプチドは、配列番号１４により表されるヒトＩｈｈのＡｒｇ−１〜Ｇｌｕ−９４を含むＮ−末端断片、もしくはＨｉｓ−９５〜Ｓｅｒ−３３１２を含むＣ−末端断片、あるいはそれらのアナログ断片を含む。
【００１３】
更に別の態様では、ポリペプチドはデザートヘッジホッグ（Ｄｅｓｅｒｔ ｈｅｄｇｅｈｏｇ）（Ｄｈｈ）ポリペプチド（例えば、配列番号９）により表されるマウスＤｈｈ）と同一もしくは相同である。例えば、Ｄｈｈポリペプチドは配列番号９により表されるポリペプチドに少なくとも７０％相同であるアミノ酸配列を有することが好ましいが、より高い配列相同性（例えば、８０％、９０％、もしくは９５％）を有するＤｈｈポリペプチドも期待される。このポリペプチドは、それらの配列により表される全長蛋白質を含むことが可能であるか、あるいは例えば少なくとも５、１０、２０、５０、１００、もしくは１５０アミノ酸の長さの断片を含むことが可能である。好ましいＤｈｈポリペプチドはその蛋白質のＮ−末端部分（例えば、配列番号９のＣｙｓ−２３〜Ａｓｐ−１８９もしくは
Ａｓｎ−１９０〜Ｇｌｙ−３６９、あるいはそれらのアナログ断片）に相当するＤｈｈ配列を含む。
【００１４】
その上、今後記載されるように、ヘッジホッグポリペプチドは、その蛋白質の天然に存在する形態の生物学的活性のアゴニスト（例えば、模擬物）もしくは別法ではアンタゴニストのいずれかであることが可能であり、例えばこのポリペプチドは本当のヘッジホッグ蛋白質に対して反応性を示す細胞の分化および／または増殖および／または生存を調節することが可能である。主題のヘッジホッグ蛋白質の同族体には蛋白質分解による開裂に対する耐性を示す蛋白質の変種が含まれ、それらの変種は例えば、有望な開裂配列を変化させるか、もしくはその蛋白質に関連する酵素活性を不活化させる突然変異に起因する。
【００１５】
本発明のヘッジホッグポリペプチドはグリコシル化されることが可能であるか、あるいは逆に、発現系の選択によるか、もしくはグリコシル化を不可能にさせるための蛋白質配列の改変により炭水化物が減少しているアナログをも提供することが可能である。グリコシル化形態にはグリコサミノグリカン鎖での誘導化が含まれる。同様に、内因性シグナル配列を欠損するヘッジホッグポリペプチドを作製することが可能である（ただし、このポリペプチドは典型的には、その蛋白質のプロ形態で存在するとしても開裂を受ける）。
【００１６】
主題の蛋白質は更にキメラ分子としても提供されることが可能であり、これは例えば、融合蛋白質の形態をとる分子である。例えば、ヘッジホッグ蛋白質は、ある第二ポリペプチド（例えば、ヘッジホッグに無関係なアミノ酸配列を有する第二ポリペプチド）を含む組換え融合蛋白質として提供されることが可能であり、一例ではこの第二ポリペプチド部分はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼであり、別の例ではこの第二ポリペプチド部分はアルカリ性ホスファターゼのような酵素活性であり、更に別の例ではこの第二ポリペプチド部分はエピトープ標識である。
【００１７】
本発明の更に別の態様は免疫原性調製物中のヘッジホッグポリペプチドを含む免疫原に関し、その免疫原はヘッジホッグポリペプチドに特異的な免疫応答を誘導することが可能であり；その応答は一例ではホルモン応答であり、別の例では抗体応答であり、更に別の例では細胞性応答である。好ましい態様ではこの免疫原は抗原決定基を含み、その例は配列番号８〜１４の内の一つにより表される蛋白質からの独特な抗原決定基である。
【００１８】
本発明の更に別の態様は、ヘッジホッグ免疫原のエピトープと特異的に反応する抗体および抗体精製物を特徴とする。
【００１９】
本発明の他の態様は、ヘッジホッグポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する実質的に単離された核酸を提供する。好ましい態様では、コードされるポリペプチドは野生型ヘッジホッグ蛋白質により媒介される誘導性現象に対する特異的作動作用もしくは拮抗作用を行う。この核酸のコーディング配列は、配列番号１〜７の内の一つに表されるコーディング配列と同一である配列を含むことが可能であるか、あるいはそれらの配列の内の一つもしくは複数に単に相同であるに過ぎないことが可能である。例えばヘッジホッグをコードする配列は、配列番号１〜７の内の一つもしくは複数のものの内のヌクレオチド配列に少なくとも７０％相同である配列を有することが好ましいが、より高い配列相同性（例えば、８０％、９０％、もしくは９５％）も期待される。この核酸によりコードされるポリペプチドは、配列番号８〜１４の内の一つに表されるアミノ酸配列（例えば、それらの全長蛋白質の内の一つ）を含むことが可能であるか、あるいはその核酸の断片を含むことが可能であり、その断片は例えば、一例では少なくとも５、１０、２０、５０、もしくは１００アミノ酸の長さである断片をコードすることができる。その核酸によりコードされるポリペプチドは、ヘッジホッグ蛋白質の天然に存在する形態の生物学的活性のアゴニスト（例えば、模擬物）、或いはアンタゴニストのいずれかであることが可能である
。
【００２０】
その上、所定の好ましい態様では、主題のヘッジホッグ核酸は、例えば転写プロモーターもしくは転写エンハンサー配列の内の少なくとも一つである転写調節配列を含むであろうし、そしてその転写調節配列はそのヘッジホッグ遺伝子配列に操作的に連結されるであろう。このような調節配列を用いて、ヘッジホッグ遺伝子配列を発現ベクターとしての使用に適するようにさせることが可能である。
【００２１】
更に別の好ましい態様では、核酸を緊縮（またはストリンジェントな）条件下で、配列番号１〜７の内の一つもしくは複数の内の少なくとも１２の連続ヌクレオチドに相当する核酸プローブにハイブリダイズさせるが、少なくとも２０の連続ヌクレオチドに相当する核酸プローブに対するハイブリダイゼーションが好ましく；かつ配列番号１〜７の内の一つもしくは複数の内の少なくとも４０、５０、もしくは７０の連続ヌクレオチドに相当する核酸プローブに対するハイブリダイゼーションが一層好ましい。
【００２２】
本発明は更にトランスジーンを有する形質転換非−ヒト動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリ、カエル、もしくはブタ）を特徴とするが、それらの動物の例は、本明細書に記載されるヘッジホッグ遺伝子の異種形態を含む（および、好ましくは発現する）か、あるいは内因性ヘッジホッグ遺伝子を過誤発現する動物であり、その例は主題のヘッジホッグ蛋白質の内の一つもしくは複数の発現が中断される動物である。このような形質転換動物は、突然変異を生じているかもしくは過誤発現されるヘッジホッグ対立遺伝子を含む細胞性および組織性障害を研究するための、あるいは薬剤スクリーニングにおける使用のための動物モデルとして役立ちうる。
【００２３】
本発明はまた、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含むプローブ／プライマーを提供し、この場合、このオリゴヌクレオチドは、配列番号１もしくはそれらの天然に存在する突然変異体のセンスもしくはアンチセンス配列の内の少なくとも１０の連続ヌクレオチドに対して緊縮条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含む。複数クラスの脊椎動物ヘッジホッグ蛋白質の各々に対して特異的な核酸プローブが本発明により企画され、それは例えば、Ｓｈｈ対Ｉｈｈ対Ｄｈｈ対Ｍｈｈをコードする各核酸の間を識別することが可能なプローブである。好ましい態様では、このプローブ／プライマーは更にそれらに連結されたラベル基を含み、かつ検出されることが可能である。そのラベル基は、例えば、放射性同位元素、蛍光化合物、酵素、および酵素補助因子からなる群より選択されることが可能である。本発明のプローブは、ヘッジホッグ蛋白質の過誤発現に関連する機能不全を同定するための診断検査用キットの一部分として用いられることが可能であり、その一例は、患者から単離された細胞の試料中で主題のヘッジホッグ蛋白質をコードする核酸のレベルを検出するためのキットであり；別の例は、細胞中のヘッジホッグｍＲＮＡレベルを測定するため、もしくはゲノムヘッジホッグ遺伝子が突然変異もしくは欠損を生じているか否かを決定するためのキットである。オリゴヌクレオチドが少なくとも１０ヌクレオチド分の長さであることが好ましいが、２０、３０、５０、１００、もしくは１５０ヌクレオチド分の長さのプライマーも期待される。
【００２４】
更に別の態様では、本発明は、ヘッジホッグ蛋白質とヘッジホッグレセプターとの間の相互作用のインヒビター、或いは活性化剤のために検査化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。例示的な方法には、（ｉ）ヘッジホッグレセプター（可溶性もしくは膜結合性（完全細胞を含む）のいずれか）すなわちヘッジホッグポリペプチドと検査化合物とを、例えばこの検査化合物がなければ、そのヘッジホッグ蛋白質とヘッジホッグレセプターとが相互作用することが可能な条件下で結合させる段階；および（ｉｉ）ヘッジホッグ蛋白質とレセプターとを含む複合体の形成を、その複合体を直接定量することによるか、もしくはヘッジホッグ蛋白質の誘導効果を測定するかのいずれかにより決定する
段階、を含む。検査化合物の存在下での複合体の形成における統計的に有意な変化（例えば、減少）は（その検査化合物の非存在下において観察されるものと比較した場合の）、ヘッジホッグ蛋白質とレセプターとの間の相互作用の調節（例えば、阻害）を示す。
【００２５】
本発明の他の態様は、ヘッジホッグ蛋白質に対して応答する細胞の分化状態を誘導および／または維持する、増殖を生じさせる、そして／あるいは生存率を亢進させる方法に関し、この方法は、その細胞をヘッジホッグアゴニストに接触させることにより行われる。例えば本発明は細胞培養技術に適用可能であり、その例は、生存もしくは分化状態がヘッジホッグ機能に依存する神経細胞もしくは他の細胞の培養時などである。更にヘッジホッグアゴニストおよびアンタゴニストを治療的関与のために用いることが可能であり、それは例えば、中枢神経系および末梢神経系の両方におけるニューロンおよび他の神経性細胞の生存および維持を亢進させるため、ならびに他の脊椎動物の器官形成経路（例えば、他の外胚葉のパターン形成、ならびに所定の中胚葉および内胚葉分化過程）に影響を及ぼすためのものである。脊椎動物ヘッジホッグ様蛋白質に加え、本発明は更に、主題のヘッジホッグ蛋白質と類似様式で脊椎動物生物体の細胞および組織を誘導させるためのドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のヘッジホッグ（Ｄｒｏｓ−ＨＨ）の使用も企画する。
【００２６】
本発明の他の態様は、被験体（例えば、ヒト患者）が望ましくない細胞増殖もしくは分化の異常制御を特徴とする疾患の危険にさらされているかどうかを決定する方法を提供する。この方法は、被験体の組織内で、（ｉ）ヘッジホッグ蛋白質（例えば、配列番号２に記載される遺伝子）もしくはその同族体をコードする遺伝子の突然変異；あるいは（ｉｉ）ヘッジホッグ遺伝子の過誤発現、の内の少なくとも一つを特徴とする遺伝子病変の存在もしくは非存在を検出することを含む。好ましい態様では、遺伝子病変の検出は：ヘッジホッグ遺伝子からの一つもしくは複数のヌクレオチドの欠損；その遺伝子への一つもしくは複数のヌクレオチドの添加、その遺伝子の内の一つもしくは複数のヌクレオチドの置換、その遺伝子の総体的染色体再構成；その遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写のレベルにおける変化；その遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写の非野生型タイプのスプライシングパターンの存在；あるいはその蛋白質の非野生型タイプレベル、の内の少なくとも一つの存在を確認することを含む。
【００２７】
例えば、遺伝子病変の検出には、（ｉ）ヘッジホッグ遺伝子（例えば、配列番号１〜７の内の一つに表される核酸、あるいはそれらの天然に存在する突然変異体、あるいはヘッジホッグ遺伝子に生来随伴する５’もしくは３’フランク配列）のセンスもしくはアンチセンス配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含むオリゴヌクレオチドを含むプローブ／プライマーを提供すること；（ｉｉ）その組織の核酸にそのプローブ／プライマーを露出すること；および（ｉｉｉ）その核酸へのそのプローブ／プライマーのハイブリダイゼーションにより、遺伝子的病変の存在もしくは非存在を決定すること（例えばこの場合には、その病変の検出には、そのヘッジホッグ遺伝子の、および場合によってはフランク核酸配列のヌクレオチド配列を決定するためにプローブ／プライマーを用いることが含まれる）、を含むことが可能である。例えば、そのプローブ／プライマーを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に、もしくは連結連鎖反応（ＬＣＲ）に利用することが可能である。別の態様では、ヘッジホッグ蛋白質のレベルが、そのヘッジホッグ蛋白質との特異的免疫反応性を示す抗体を用いる免疫アッセイにおいて検出される。
【００２８】
本発明の実施は、他に別の記載がない限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、形質転換生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の通常の方法を利用するであろうし、これらの方法は当該技術分野の範疇に含まれる。このような技術は刊行物においてかなり広範囲に記載されている。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ  Ｅｄ．、ｅｄ  ｂｙ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：１９８９）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｖｏｌｕｍｅｓ
Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ  ｅｄ．、１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔｅｄ．、１９８４）；Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第４，６８３，１９５号；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  （Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．１９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．１９８４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．、１９８７）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ
Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｉｓｅ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．、Ｎ．Ｙ．）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ
Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ  ｅｄｓ．、１９８７、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍｅｔｈｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌｓ．１５４  ａｎｄ  １５５（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．  ｅｄｓ．）、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ、ｅｄｓ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｖｉｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＶ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｋｗｅｌｌ、ｅｄｓ．、１９８６）；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ、（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８６）、を参照されたい。
【００２９】
＜発明の詳細な記述＞
胎仔の誘導性シグナルは脊椎動物のパターン形成で機能を果たす主要調節蛋白質であり、かつ胎児期での操作を行って脊椎動物の胎仔の器官形成を特定することが知られている重要なシグナル伝達中枢内に存在する。例えば、これらのシグナル伝達構造は脊索を含むが、この脊索とは神経系の形成を開始させ、かつ様々なタイプのニューロンをその系内で特定するのを補助する一過性構造である。この脊索は更に体軸に沿った中胚葉のパターン形成をも調節する。明らかなシグナル伝達活性を有する他の異なる群の細胞は神経管の底板（脊髄および脳の前駆体）であり、これは更に様々な神経細胞タイプの分化に対するシグナル伝達を行う。更に四肢を形成する芽の底に存在する中胚葉の領域（極性活性帯もしくはＺＰＡと称される）が、生育中の四肢の正しいパターン形成を最終的には生じさせるモルフォゲンを分泌することによりシグナル伝達中枢として作動すると、一般的には考えられている。
【００３０】
本発明は、脊椎動物族の遺伝子によりコードされる蛋白質（本明細書ではヘッジホッグ関連性遺伝子と称される）がこれらの胎仔パターン形成中枢により産生されるシグナルを含むことの発見に関する。本明細書に記載されるように、開示される脊椎動物ヘッジホッグ（ｈｈ）同族体の各々は、胎仔のパターン形成における重要な役割を表す空間的および時間的に制限された発現ドメインを表す。例えば以下に提供される結果は、脊椎動物ｈｈ遺伝子が、後方肢芽、ヘンゼン（Ｈｅｎｓｅｎ’ｓ）結節、初期脊索、神経管の底板、前腸および後腸、ならびにそれらの派生物において発現されることを示している。これらは全て、周囲の胎仔組織の適切なパターン形成に必要とされることが知られる重要なシグナル伝達中枢である。
【００３１】
本発明により提供される脊椎動物の細胞間シグナル伝達分子であるヘッジホッグ一族は、少なくとも４つのメンバーで成り立っている。これらのメンバーの内の３つは、本明細
書ではデザート（Ｄｅｓｅｒｔ）ヘッジホッグ（Ｄｈｈ）、ソニック（Ｓｏｎｉｃ）ヘッジホッグ（Ｓｈｈ）、およびインディアン（Ｉｎｄｉａｎ）ヘッジホッグ（Ｉｈｈ）として引用され、魚類、鳥類、および哺乳類を初めとする全脊椎動物に存在する。第四のメンバーは本明細書ではムーンラット（Ｍｏｏｎｒａｔ）ヘッジホッグ（Ｍｈｈ）として引用され、魚類に特異的に出現する。添付される配列表に従うと（表１も参照せよ）、ニワトリＳｈｈポリペプチドは配列番号１によりコードされ；マウスＤｈｈポリペプチドは配列番号２によりコードされ；マウスＩｈｈポリペプチドは配列番号３によりコードされ；マウスＳｈｈポリペプチドは配列番号４によりコードされ；ゼブラフィッシュＳｈｈは配列番号５によりコードされ；ヒトＳｈｈポリペプチドは配列番号６によりコードされ；そしてヒトＩｈｈポリペプチドは配列番号７によりコードされる。
【００３２】
表１
脊椎動物ヘッジホッグ配列の基準
ヌクレオシド          アミノ酸      
ニワトリＳｈｈ            配列番号１            配列番号８
マウスＤｈｈ              配列番号２            配列番号９
マウスＩｈｈ              配列番号３            配列番号１０
マウスＳｈｈ              配列番号４            配列番号１１
ゼブラフィッシュＳｈｈ    配列番号５            配列番号１２
ヒトＳｈｈ                配列番号６            配列番号１３
ヒトＩｈｈ                配列番号７            配列番号１４
【００３３】
本発明の一定の脊椎動物ヘッジホッグ蛋白質（ｈｈ）は配列番号８〜１４により特定され、かつ、魚類、鳥類、および哺乳類起源を初めとする脊椎動物生物体からクローン化されることが可能である。これらの蛋白質はヘッジホッグ蛋白質として刊行物に引用されるドロソフィラ蛋白質とは異なっており、後者は混乱を避ける目的で本明細中では今後「Ｄｒｏｓ−ＨＨ」として引用されるであろう。様々なｈｈ同族体間の配列変種に加え、脊椎動物ヘッジホッグ蛋白質は多数の異なる形態で天然に存在するらしく、それらにはプロ形態、全長成熟形態、およびそれらの数々のプロセシング化断片が含まれる。プロ形態には細胞外ドメインの分泌を指令するためのＮ−末端シグナルペプチドが含まれる一方で、全長成熟形態はこのシグナル配列を欠いている。成熟形態の更に進んだプロセシングが幾つかの事例では明白に生じており、このプロセシングによりその蛋白質の生物学的活性断片が取得される。例えば、ソニックヘッジホッグはさらなる蛋白質分解性プロセシングを受けて、約１９ｋＤａおよび２７ｋＤａの２本のペプチドを産生し、その両者共が分泌される。蛋白質分解性断片形成に加えて、脊椎動物ヘッジホッグ蛋白質は更に翻訳後に改変を受けることが可能であり、これは例えばグリコシル化により行われるが、細菌により産生される（例えば、非グリコシル化）形態の蛋白質が天然蛋白質のある程度の活性を依然として維持していることも明らかである。
【００３４】
以下の実施例に記載されるように、本発明により提供されるｃＤＮＡは、まず部分的ドロソフィラｈｈ  ｃＤＮＡクローン（０．７ｋｂ）でマウスゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより取得される。陽性プラークを同定し、そして一つのマウスクローンを選択した。その後にこのクローンをプローブとして用いて、マウスＤｈｈ遺伝子の全コーディング配列を含むゲノムクローンを取得した。添付される実施例に記載されるように、ノザンブロットおよびインサイチューハイブリダイゼーションにより、マウスＤｈｈがこの検査および可能性としては卵巣においても発現され、そして更には頭部および体幹の知覚ニューロンにも関連していることが証明された。Ｄｈｈは雄での検査においてはセルトリ細胞により発現される分泌型細胞であることが明白であり、このＤｈｈは、恐らく有糸分裂因子および生存因子として雄の生殖細胞の維持に必要とされる。Ｄｈｈ突然変異体は不妊の雄となる。それに加えてＤｈｈは性腺の分化の第一兆候の内の一つとして発現
され、そのためＤｈｈは性決定性遺伝子Ｓｒｙの標的である可能性がある。興味深いことに神経細胞体それ自体（軸索のみ）からは全く発現が検出されず、このことによりＤｈｈがシュワン（Ｓｈｗａｎｎ）細胞により産生されているらしいことが示される。
【００３５】
ニワトリｈｈ遺伝子をコードするｃＤＮＡを取得する目的で、ドロソフィラｈｈエキソン２のアミノおよびカルボキシ末端に相当する縮重オリゴヌクレオチドを設計した。以下の実施例に示されるように、これらのオリゴヌクレオチドを用いてニワトリゲノムＤＮＡからＰＣＲ断片を単離した。その後にこれらの断片をクローン化および配列決定した。１０のクローンが２つの異なるｈｈ同族体、すなわちニワトリＤｈｈおよびニワトリＳｈｈを産生した。その後にこのニワトリＳｈｈを用いて段階２１／２２の肢芽のｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行い、これのことにより全長Ｓｈｈクローンが取得された。
【００３６】
他の脊椎動物ヘッジホッグ同族体を同定する目的で、ニワトリクローン（ＤｈｈおよびＳｈｈ）を用いてニワトリＤＮＡを含むゲノムサザンブロットの探索を行った。以下に示されるように、ゲノムＤＮＡを、そのプローブ配列内での開裂は行わない様々な酵素で切断した。このＤＮＡをゲル上で泳動させ、そしてナイロンフィルターに転移させた。プローブは、各２２０ｂｐのクローンをコンカテマー内に連結させ、そしてその後にランダムプライマーキットでラベル化することにより取得した。これらのブロットのハイブリダイゼーションを行い、そして低緊縮条件下で洗浄した。各場合において３本のハイブリダイズ化バンドがオートラジオグラフィー後に観察され、その内の一本は有意に強度が高く（各プローブとは異なるバンド）、このことにより少なくとも３本の脊椎動物ｈｈ遺伝子が存在することが示された。実施された追加的ｃＤＮＡおよびゲノムのスクリーニングにより、ニワトリおよびマウスからの３本のｈｈ同族体（Ｓｈｈ、Ｄｈｈ、およびＩｈｈ）、ならびにゼブラフィッシュからの４本のｈｈ同族体（Ｓｈｈ、Ｄｈｈ、Ｉｈｈ、およびＭｈｈ）が取得された。弱目のハイブリダイゼーションシグナルにより、この遺伝子一族はもっと大きなものである可能性があることが示唆された。それに加えて、多数の弱目のハイブリダイズ性ゲノムクローンが単離された。それに続き、ニワトリヘッジホッグ同族体から取得された同一プローブを利用してヒトゲノムライブラリーをスクリーニングした。その後にヒトゲノムライブラリーから取得されたＰＣＲ断片の配列決定を行い、そしてそのヒト配列から取得されるＰＣＲプローブを用いてヒト胎児ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。ヒトのソニックヘッジホッグ蛋白質（Ｓｈｈ）をコードする全長ｃＤＮＡ、ならびにヒトのインディアンヘッジホッグ蛋白質（Ｉｈｈ）をコードする部分的ｃＤＮＡをその胎児ライブラリーから単離し、そしてそれらを組換えヒトヘッジホッグ蛋白質の源とした。
【００３７】
様々な脊椎動物ｈｈ同族体の発現パターンを決定する目的で、インサイチューハイブリダイゼーションを、ニワトリ、マウス、および魚類の発育中の胎仔において実施した。以下の実施例に記載されるように、各ｈｈ同族体の得られる発現パターンは各種にまたがって類似しており、そしてこのことによりｈｈ遺伝子は多数の重要な胎仔シグナル伝達中枢において発現されることが示された。例えば、Ｓｈｈはヘンゼン結節、脊索、発育中の脊索の腹側底板、および肢芽の基底部のＺＰＡにおいて発現される。Ｓｈｈはまたマウス胎仔（受精後１１．５日目）における分化された運動ニューロンにおいても発現され、従ってＳｈｈはニューロン発達の後期段階における一つの役割を担っている可能性があり、それは恐らく増殖の際の段階であると思われるが、ただしこの細胞集団の生存の際の役割である可能性がより強い。Ｉｈｈは胎仔の卵黄嚢および後腸において発現され、そして軟骨形成に関与するものとも思われ；Ｄｈｈは睾丸において発現され；そしてＭｈｈ（ゼブラフィッシュにおいてのみ）は脊索および所定の頭部神経において発現される。
【００３８】
その上、実験的証拠により、一定のヘッジホッグ蛋白質は、中胚葉中のＢｍｐ−２（ＴＧＦ−β類縁物質）および外胚葉中のＦｇｆ−４を初めとする二次的シグナル伝達性分子
の発現を開始することが示されている。中胚葉は、ヘッジホッグシグナル伝達に応答して標的遺伝子発現を活性化させるために外胚葉由来のコンピテント因子（一つもしくは複数）（これには、Ｆｇｆ−４が含まれる）を必要とする。例えば、ソニックおよびＦｇｆ−４の発現は後方中胚葉と重複性ＡＥＲ（これは、その芽の遠心縁に沿って前後方向に伸展する多裂上皮の縁である）との間を操作する正のフィードバックループにより同調的に調節される。これらのデータにより、発育中の四肢における成長およびパターン形成の統合についての基礎的知識が提供され、このことが本明細書中一層詳細に記載される骨疾患の治療における重要な手がかりとなり得る。
【００３９】
腸の形態形成にとって重要である内胚葉と中胚葉との間での誘導的相互作用において演じられるヘッジホッグ蛋白質の役割を決定するために、インサイチューハイブリダイゼーションおよび組換えレトロウイルス注入を発育中のニワトリヒナ胎仔中で実施した。腹側中胚葉を誘導して近傍内胚葉による腸特異的分化を受けさせる。以下の実施例に記載されるように、ニワトリヒナ腸形成の初期段階ではＳｈｈは内胚葉により発現され、そしてＢＭＰ−４（ＴＧＦ−β類縁物質）が近傍の臓側中胚葉内で発現される。ソニックの異所性発現は臓側中胚葉中でのＢＭＰ−４の発現を誘導するに十分なものであり、このことはソニックが内胚葉から中胚葉への誘導性シグナルとして作用することを示唆する。後続の臓器特異的内胚葉分化は臓側中胚葉からの領域的誘導性シグナルに依存する。ホックス（Ｈｏｘ）遺伝子は形態学的境界に相当する境界領域を有する未分化のニワトリヒナ後腸中胚葉内において発現され、このことにより腸の形態形成を調節する際の役割が示唆される。
【００４０】
従って本発明のある種の態様は、脊椎動物ヘッジホッグ蛋白質をコードする核酸、ヘッジホッグ蛋白質それ自体、ｈｈ蛋白質に対して免疫反応性を示す抗体、およびそのような組成物の調製法に関する。その上、本発明は、診断および治療用のアッセイ法、ならびに例えば脊椎動物ヘッジホッグ同族体の異常発現を初めとする疾患を検出および治療するための試薬を提供する。それに加えて、脊椎動物ヘッジホッグ同族体のヘッジホッグ結合性部分（例えば、ヘッジホッグレセプター、リガンド、他の細胞外マトリックス構成成分など）への結合を調節することが可能な作用物質を同定するための薬物発見用アッセイが提供される。このような作用物質は、細胞の成長および／または分化を変化させるのに治療学的に有用であり得る。本発明の他の態様は以下に記載されるか、あるいは本開示を考慮すれば当業者には明らかになるであろう。
【００４１】
便宜を図るため、本明細書、実施例、および添付される請求の範囲において利用される一定の用語をここに集成する。
【００４２】
本明細書において用いられる際には用語「核酸」は、例えばデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）および適切な場合にはリボ核酸（ＲＮＡ）のようなポリヌクレオチドを意味する。この用語は更に等価物として、ヌクレオチドアナログから作製されるＲＮＡもしくはＤＮＡのいずれかのアナログを含み、かつ記載される態様に適用可能な際には、一本鎖（センスもしくはアンチセンス）および二本鎖のポリヌクレオチドを含むことが理解されるべきである。
【００４３】
本明細書において用いられる場合には用語「遺伝子」もしくは「組換え遺伝子」は、本発明の脊椎動物ｈｈポリペプチドの内の一つをコードする読み取り枠を含む核酸を意味し、これにはエキソンおよび（場合によっては）イントロン配列が含まれる。「組換え遺伝子」は、脊椎動物ｈｈポリペプチドをコードし、かつ脊椎動物ｈｈコード化エキソン配列を含む核酸を意味するが、これは場合によっては染色性体脊椎動物ｈｈ遺伝子からか、もしくは無関係の染色体遺伝子からかのいずれかに由来するイントロン配列を含むことがある。主題の脊椎動物ｈｈポリペプチドをコードする例示的組換え遺伝子が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、もしくは配列番号７に
より表される。用語「イントロン」は所定の脊椎動物ｈｈ遺伝子内に存在するＤＮＡ配列を意味し、これは蛋白質には翻訳されず、かつ一般的にはエキソン間に見いだされる。
【００４４】
本明細書に使用される場合には、用語「トランスフェクション」は、核酸（例えば、発現ベクター）を核酸媒介性遺伝子転移によるレシピエント細胞内への組込みを意味する。「形質転換」は本明細書で用いられる際には、細胞の遺伝子型が外因性ＤＮＡもしくはＲＮＡの細胞性組込みの結果として変化を受ける過程を意味し、そして例えば形質転換化細胞は脊椎動物ｈｈポリペプチドの組換え形態を発現するか、あるいはアンチセンス発現がその転移化遺伝子により生じる場合には、脊椎動物ｈｈ蛋白質の天然に存在する形態の発現が破壊される。
【００４５】
本明細書に用いられる際には用語「ベクター」は、予め結合させてある他の核酸を輸送することが可能な核酸分子を意味する。あるタイプの好ましいベクターはエピソームであり、これはすなわち染色体外複製が可能な核酸である。好ましいベクターは、連結させてある核酸の自律的複製および／または発現が可能なものである。操作可能に連結させてある遺伝子の発現を指令することが可能なベクターは、本明細書では「発現ベクター」として引用される。一般的には、組換えＤＮＡ技術において利用される発現ベクターは「プラスミド」の形態をとることが頻繁にあり、これは一般的には環状二本鎖ＤＮＡループを意味し、これはそのベクター形態では染色体には結合しない。本明細書では「プラスミド」および「ベクター」は互換的に用いられるが、それはプラスミドがベクターの最も一般的に用いられる形態であるためである。しかしながら本発明は、等価機能の作用を行い、かつ本明細書に関して今後当業者に知られるようになる他の形態の発現ベクターを含むことを意図する。
【００４６】
「転写調節配列」は本明細書の全体を通し、例えば開始シグナル、エンハンサー、およびプロモーターのようなＤＮＡ配列を意味するために用いられる遺伝子用語であり、この配列によっては操作的に連結されている蛋白質コーディング配列の転写の誘導および制御が行われる。好ましい態様では、組換え脊椎動物ヘッジホッグ遺伝子の内の一つの転写はプロモーター配列（もしくは他の転写調節配列）の制御下に置かれており、この配列は発現が意図される細胞タイプにおける組換え遺伝子の発現を制御する。組換え遺伝子が、天然に存在する形態のヘッジホッグ蛋白質の転写を制御する配列と同一あるいは異なる転写調節配列の制御下に置かれることが可能であることも理解されるであろう。
【００４７】
本明細書において用いられる際には用語「組織特異的プロモーター」は、プロモーターとして作用する、すなわちそのプロモーターに操作可能に連結される選択されたＤＮＡ配列の発現を調節するＤＮＡ配列を意味し、そしてこのプロモーターは、例えば神経性起源の細胞（一例では、ニューロン細胞）のような、ある組織の特異的細胞内での選択されたＤＮＡ配列の発現をもたらす。この用語は更に、いわゆる「漏出性（ｌｅａｋｙ）」プロモーターをも網羅し、このプロモーターは主にある組織内での選択されたＤＮＡの発現を調節するが、他の組織内での発現も同様にもたらす。
【００４８】
本明細書において用いられる際には「形質転換動物」はいずれかの動物、好ましくは非ヒト哺乳類、鳥類、もしくは両生類であって、かつその動物の細胞の内の一つもしくは複数の細胞がヒトの介入により組込まれる異種核酸を含み、その組込みは例えば当該技術分野において良く知られる形質転換技術により行われる。核酸は、直接もしくは間接的に細胞内に組込まれるが、それは慎重な遺伝子操作（例えば、マイクロインジェクションによるか、もしくは組換えウイルスでの感染による）による細胞の前駆体内への導入により行われる。用語「遺伝子操作」は古典的な交雑育種もしくはインビトロ受精は含まず、むしろ組換えＤＮＡ分子の組込みを意味する。この分子は染色体内に組込まれることができるか、あるいは染色体外で複製するＤＮＡであることができる。本明細書に記載される典型
的な形質転換動物においては、トランスジーンが細胞に脊椎動物ｈｈ蛋白質の内の一つの組換え形態（例えば、アゴニスト形態もしくはアンタゴニスト形態のいずれか）の発現をもたらす。しかしながら組換え脊椎動物ｈｈ遺伝子がサイレントとなっている形質転換動物も企画されており、その例は、以下に記載されるＦＬＰもしくはＣＲＥレコンビナーゼ依存的構築物である。本発明の「非ヒト動物」は、例えば齧歯類、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などを含む。好ましい非ヒト動物は、ラットおよびマウスを初めとする齧歯類一族から選択され、最も好ましくはマウスであるが、例えばゼノパス（Ｘｅｎｏｐｕｓ）属のメンバーのような形質転換両生類および形質転換ニワトリも、一例では胎仔形成および組織形成に影響を及ぼし得る作用物質を理解および同定するための重要な道具を提供することが可能である。用語「キメラ動物」は本明細書内では、組換え遺伝子が見いだされるか、あるいはその動物の内の全てではないが一部の細胞において組換え体が発現される動物を意味する。用語「組織特異的キメラ動物」は、組換え脊椎動物ｈｈ遺伝子の内の一つが存在し、そして／またはそれが一部の組織では発現されるが他の組織では発現されないことを意味する。
【００４９】
本明細書において用いられる際には用語「トランスジーン」は、それが組込まれる形質転換動物もしくは細胞にとって部分的もしくは完全に異種、すなわち外因性であるか、あるいはそれが組込まれる形質転換動物もしくは細胞の内因性の遺伝子にとって同種であるが、ただしそれが組込まれる細胞のゲノムを変化させるような方法でその動物のゲノム内に挿入されるように設計される、もしくは挿入される核酸配列（例えば、脊椎動物ｈｈポリペプチドの内の一つをコードするもの）を意味する（例えば、この配列は天然の遺伝子のものとは異なる位置に挿入されるか、あるいはその挿入によりノックアウトがもたらされる）。トランスジーンは一つもしくは複数の転写調節配列、および選択された核酸の至適発現に必要である可能性がある他のいずれかの核酸（例えば、イントロン）を含むことが可能である。
【００５０】
良く知られているように、特別なポリペプチドのための遺伝子が、ある個体のゲノム内での単一もしくは多重コピーとして存在する可能性がある。このような重複遺伝子は同一であることができるか、あるいはヌクレオチド置換、添加、もしくは欠失を初めとする所定の改変事項を有することができる（これらの遺伝子はそれでも依然として実質的には同一活性を有するポリペプチドをコードする）。用語「脊椎動物ｈｈポリペプチドをコードするＤＮＡ配列」は従って、特別な個体内での一つもしくは複数の遺伝子を意味することができる。その上、ヌクレオチド配列内での所定の差異が個々の生物体間に存在することがあり、これは対立遺伝子と称される。このような対立遺伝子の違いは、同一の生物学的活性を有する蛋白質を依然としてコードするコード化ポリペプチドのアミノ酸配列における違いをもたらすことも、そうでないこともある。
【００５１】
「相同性」は、２本のペプチド間もしくは２本の核酸分子間の配列類似性を意味する。相同性は、比較目的で整列させることができる各配列の位置を比較することにより決定することが可能である。比較される配列の位置が同一塩基もしくはアミノ酸で占められている場合には、それらの分子はその位置では相同となる。配列間の相同性の度合いは、それらの配列により共有される適合性もしくは相同的な位置の数の関数となる。「無関係の」もしくは「非相同性」配列は、本発明の脊椎動物ｈｈ配列の内の一つのものと４０パーセントを下回る同一性を有するが、２５パーセントを下回る同一性であることが好ましい。
【００５２】
「細胞」、「宿主細胞」、もしくは「組換え宿主細胞」は、本明細書では互換的に用いられる用語である。このような用語が特別な主題の細胞のみを意味するばかりではなく、そのような細胞の子孫もしくは潜在的な子孫をも意味することが理解される。所定の改変が、突然変異もしくは環境的影響のいずれかに起因して次の世代に生じる可能性があるがために、このような子孫は事実上その親細胞と同一でないことがあるが、しかし依然とし
て本発明に用いられる際にはその用語の範囲内に含まれる。
【００５３】
「キメラ蛋白質」もしくは「融合蛋白質」は、主題の脊椎動物ｈｈポリペプチドの内の一つをコードする第一アミノ酸配列の、脊椎動物ｈｈ蛋白質の内の一ついずれかのドメインに関して外来性でありかつそれとは実質的に相同ではないドメインを特定する第二アミノ酸配列との融合物である。キメラ蛋白質は第一蛋白質をも発現する生物体内に見いだされる（たとえ異なる蛋白質であったとしても）外来性ドメインを示すことができるか、あるいは異なる種類の生物体により発現される蛋白質構造の「種間」もしくは「遺伝子間」などの融合体であることができる。一般的には融合蛋白質は、一般式Ｘ−ｈｈ−Ｙ［式中、ｈｈは脊椎動物ｈｈ蛋白質の内の一つに由来する蛋白質の一部分を表し、そしてＸおよびＹは独立に、非存在であるか、あるいはある類似性生物体中の脊椎動物ｈｈ配列の内の一つ（天然に存在する突然変異体を含む）には関連しないアミノ酸配列を示す］により表すことが可能である。
【００５４】
本明細書において用いられる際には用語「トランスフォーミング成長因子−ベータ」および「ＴＧＦ−β」は、脊椎動物に汎存的に見いだされる構造的に関連するパラ分泌性ポリペプチドの一族、および後世動物の成長、分化、および形態形成因子という大一族の原型を表す（総説に関しては、Ｍａｓｓａｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）  Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ６：５９７−６４１；およびＳｐｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １１９：１０１７−１０２１、を参照されたい）。この一族には、「骨形態形成蛋白質」すなわち「ＢＭＰ（複数）」が含まれ、これは、単独でかもしくは適切な補助因子と組合わされた際に骨沈着を誘導することが可能な、骨から単離された蛋白質およびその断片、ならびに合成ペプチドを意味する。ＢＭＰ（例えば、ＢＭＰ−１、−２、−３、および−４）の調製法は、例えば、国際公開第８８／００２０５号において記載されている。Ｗｏｚｎｅｙ（１９８９）  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔ  Ｒｅｓ  １：２６７−２８０は、ＢＭＰ−２に密接に関連する追加的ＢＭＰ蛋白質を記載しており、そしてこの蛋白質はＢＭＰ−５、−６、および−７と表示されている。国際公開第８９／０９７８７号および国際公開第８９／０９７８８号は「ＯＰ−１」と称される蛋白質を記載しており、これは現在ではＢＭＰ−７であることが知られている。他のＢＭＰが当該技術分野において知られている。
【００５５】
用語「単離された」は核酸（例えば、ＤＮＡもしくはＲＮＡのようなもの）に関して本明細書において用いられる場合には更に、その巨大分子の天然の源中に存在する各々他のＤＮＡもしくはＲＮＡから分離された分子を意味する。例えば、主題の脊椎動物ｈｈポリペプチドの内の一つをコードする単離された核酸は僅か１０キロベース（ｋｂ）の核酸配列（これは、天然の状態ではゲノムＤＮＡ内の脊椎動物ｈｈ遺伝子を即座にフランクする）を含むことが好ましく、僅か５ｋｂのそのような天然に存在するフランク配列であることが一層好ましく、そして１．５ｋｂを下回るそのような天然に存在するフランク配列であることが最も好ましい。用語「単離された」は本明細書において用いられる場合には更に、組換えＤＮＡ技術により作製された場合には細胞性物質、ウイルス性物質、もしくは培養培地を実質的に含まないか、あるいは化学的に合成された場合には化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない核酸もしくはペプチドを意味する。その上、「単離された核酸」は、断片としては天然には存在せず、かつ天然の状態では見いだされないであろう核酸断片を含むことを意味する。
【００５６】
以下に記載されるように、本発明のある態様は、脊椎動物ｈｈ同族体をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸および／またはそのような核酸の等価物に関する。用語「核酸」は本明細書に用いられる場合には、等価物としての断片を含むことが意図される。用語「等価物」は、機能的に等価なｈｈポリペプチドもしくは本明細書に記載されるもののような脊椎動物ｈｈ蛋白質の活性を有する機能的に等価なペプチドをコードするヌ
クレオチド配列を含むことが理解される。等価なヌクレオチド配列は、一つもしくは複数のヌクレオチド置換、添加、もしくは欠失により異なる配列（例えば対立遺伝子変異体）を含むであろうし；そしてそのため、遺伝子コードの縮合に起因して配列番号１〜７に示される脊椎動物ｈｈ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列とは異なる配列を含むであろう。等価物は更に、緊縮条件下（すなわち、約１Ｍの塩中に形成されるＤＮＡ二重らせんの融解温度（Ｔｍ）を下回る約２０〜２７℃に等しい）で、配列番号１〜７に表されるヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列をも含むであろう。ある態様では、等価物は更に、配列番号１〜７にの内のいずれかに示されるヌクレオチド配列から取得され、かつ進化的にその配列に関連する核酸配列をも含むであろう。
【００５７】
それに加えて、所定の状況下では、天然に存在する形態の蛋白質の生物学的活性のサブセットのみを亢進もしくは阻害させる目的では、ｈｈアゴニストもしくはｈｈアンタゴニストのいずれか一つとしての限定された能力で機能する主題のヘッジホッグポリペプチドの内の一つの同族体を提供することが有利である可能性があることが一般的に評価されるであろう。従って、特異的生物学的効果は限定された機能の同族体での処理により除去され、かつその処理によっては天然に存在する形態のヘッジホッグ蛋白質の生物学的活性の全てに向けられるアゴニストもしくはアンタゴニストでの処理と比較するとより少ない副作用がもたらされることが可能である。
【００５８】
主題のヘッジホッグ蛋白質の内の一つの同族体は突然変異誘発により作製することが可能であり、これは例えば、不連続な点突然変異（一つもしくは複数）もしくは切断により行われる。例えば、突然変異は取得されてくるｈｈポリペプチドの生物学的活性と実質的に同一な活性か、もしくは稀にはそのような生物学的活性のサブセットを保持する同族体を生じる可能性がある。別法ではその蛋白質のアンタゴニスト形態が作製されることが可能であり、これは例えばｈｈレセプターへの競合的結合などにより、その蛋白質の天然に存在する形態の機能を阻害することが可能である。
【００５９】
脊椎動物ｈｈ蛋白質の活性を有するとして本明細書に引用されるポリペプチドは、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、もしくは配列番号１４の内のいずれかに示される脊椎動物ｈｈ蛋白質のアミノ酸配列の全部もしくは一部分に相当するアミノ酸配列を有するペプチドとして特定され、かつそれは脊椎動物ｈｈ蛋白質の少なくとも一つの生物学的活性を有する。脊椎動物ｈｈ蛋白質のそのような生物学的活性の例には、発育中の脊椎動物胎仔の頭部、四肢、肺、中枢神経系（ＣＮＳ）の形成もしくは分化、あるいは中胚葉のパターン形成を誘導する（もしくはそうでなければ調節する）能力が含まれる。好ましい態様では、この生物学的活性が神経発生（例えば、運動ニューロン誘導性活性、ニューロン分化誘導活性、もしくはニューロン生存亢進性活性）を調節する能力を含むことが可能である。本発明のヘッジホッグ蛋白質は更に、器官形成を（一例では、例えば骨格形成活性による四肢のパターン形成に影響を与える能力を介することで）調節する能力を含む生物学的活性をも有することが可能である。本発明のヘッジホッグ蛋白質に関連する生物学的活性は更に、幹細胞もしくは生殖細胞の分化を誘導する能力（これは軟骨形成を誘導する能力あるいは精子発生における関連性を初めとする能力である）を含むことが可能である。本発明のヘッジホッグ蛋白質は更に、以下のものを含む生物学的活性を特徴とし、それらの活性とは：中胚葉由来組織（例えば、背側中胚葉に由来する組織）の増殖、生存、および／または分化を調節する能力；外胚葉由来組織（例えば、神経管、神経冠、もしくは頭部間葉に由来する組織）の増殖、生存、および／または分化を調節する能力；内胚葉由来組織（例えば、原腸に由来する組織）の増殖、生存、および／または分化を調節する能力である。その上、以下の実施例に示されるように、主題のヘッジホッグ蛋白質は二次的シグナル伝達分子の発現を誘導する能力を有し、そのような二次的シグナル伝達分子には例えば、骨形態発生蛋白質（例えば、ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−４）を初めとするトランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦβ）の
メンバー、ならびに繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）一族（例えば、Ｆｄｆ−４）のメンバーがある。主題のヘッジホッグ蛋白質の他の生物学的活性は本明細書に記載されるか、あるいは当業者には当然のことながら自明であろう。本発明に従うとポリペプチドは、それが脊椎動物ヘッジホッグ蛋白質の天然に存在する形態の特異的アゴニストもしくはアンタゴニストである場合には生物学的活性を有する。
【００６０】
好ましい核酸は、配列番号８〜１４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の相同性、より好ましくは７０％の相同性、そして最も好ましくは８０％の相同性を示すアミノ酸配列を含む脊椎動物ヘッジホッグポリペプチドをコードする。配列番号８〜１４の内の一つにおいて表されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、一層好ましくは少なくとも約９５％、そして最も好ましくは少なくとも約９８〜９９％の相同性を示すポリペプチドをコードする核酸もやはり本発明の範囲内に含まれる。ある態様ではその核酸は、主題の脊椎動物ｈｈポリペプチドの内の少なくとも一つの活性を有するペプチドをコードするｃＤＮＡである。核酸は、配列番号１〜７のコーディング領域に相当するヌクレオチド配列の全部もしくは一部分を含む。
【００６１】
本発明の他の態様は、配列番号１〜７の内の一つに表される核酸に対して高緊縮性条件下もしくは低い緊縮条件下でハイブリダイズする核酸を提供する。ＤＮＡハイブリダイゼーションを亢進させる適切な緊縮条件（例えば、約４５℃での６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、およびその後の５０℃での２．０×ＳＳＣの洗浄）は当業者に知られているか、あるいはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）、６．３．１〜６．３．６、において見いだすことが可能である。例えば、洗浄段階での塩濃度を、５０℃での約２．０×ＳＳＣの低緊縮条件から５０℃での約０．２×ＳＳＣの高緊縮条件までから選択することが可能である。その上、洗浄段階の温度を室温での低緊縮性（約２２℃）から約６５℃での高緊縮性条件へと増加させることが可能である。
【００６２】
遺伝子コードの縮重に起因して、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、もしくは配列番号７の内の一つに示されるヌクレオチド配列とは異なる配列を有する核酸も、やはり本発明の範囲内に含まれる。このような核酸は機能的に等価なペプチドをコードするが（すなわち、脊椎動物ｈｈポリペプチドの一つの生物学的活性を有するペプチド）、しかし遺伝子コードの縮重に起因して配列表に示される配列とは異なる。例えば、多数のアミノ酸が一つを上回るトリプレットにより表示される。同一アミノ酸もしくは同義語を特定するコドン（例えば、ＣＡＵおよびＣＡＣは各々ヒスチジンをコードする）により「サイレント」突然変異がもたらされる可能性があるが、この「サイレント」突然変異は脊椎動物ｈｈポリペプチドのアミノ酸配列には影響を及ぼさない。しかしながら、主題のｈｈポリペプチドのアミノ酸配列の変化をもたらすＤＮＡ配列の多形性が脊椎動物間に存在するであろうことが予期される。当業者は、脊椎動物ｈｈポリペプチドの活性を有するポリペプチドをコードする核酸の内の一つもしくは複数のヌクレオチド（最高約３〜５％のヌクレオチド）でのこれらの変異体が、天然の対立遺伝子変異体に起因して所定の種の個体間に存在する可能性があることを認識するであろう。
【００６３】
脊椎動物ヘッジホッグ蛋白質の活性部分をコードする核酸の断片も、やはり本発明の範囲内に含まれる。本明細書に用いられる場合には「ヘッジホッグ遺伝子断片」は、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、橋列番号１３、もしくは配列番号１４において表される脊椎動物ｈｈ蛋白質の全アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を下回るヌクレオチドを有する核酸を意味し、そして更にその断片は（好ましくは）全長蛋白質の幾つかの生物学的活性を保持するペプチドをコードする（例えば、その断片は、発育中の脊椎動物胎仔の頭部、四肢、肺、中枢神経系（ＣＮＳ）の形成および分化を誘導する、もしくは中胚葉のパターン形成能力を保持する）。本発明の範囲内に
含まれる核酸断片には、他のヘッジホッグ同族体を検出するためのスクリーニングプロトコールにおける使用のための他の種からの核酸と高緊縮性条件もしくは低い緊縮性条件下でハイブリダイズすることが可能であるもの、ならびにヘッジホッグ蛋白質をコードする核酸の存在を検出する際の使用のためのヒト種からの核酸とハイブリダイズすることが可能なものが含まれ、これらには例えばｍＲＮＡスプライシング変異体のような別のイソ形態が含まれる。本発明内に含まれる核酸は更に、リンカー配列、改変化制限エンドヌクレアーゼ部位、および主題のｈｈポリペプチドの組換え形態の分子クローニング、発現、もしくは精製に役立つ他の配列も含むことができる。
【００６４】
以下に記載される実施例により示されるように、ヘッジホッグ蛋白質をコードする核酸を、多数の真核生物細胞のいずれかに存在するｍＲＮＡから取得することが可能である。本発明の脊椎動物ｈｈポリペプチドをコードする核酸を、成体および胎仔の両方から取得されるゲノムＤＮＡから取得することも可能であるはずである。例えば、ｈｈ蛋白質をコードする遺伝子を、本明細書に記載されるプロトコール、ならびに当業者に一般的に知られるｃＤＮＡもしくはゲノムライブラリーのいずれかからクローン化することが可能である。ヘッジホッグ蛋白質をコードするｃＤＮＡは胎仔細胞を初めとする細胞（例えばヒト細胞を例とする哺乳類細胞）から総ｍＲＮＡを単離することにより取得することが可能である。その後に二本鎖ｃＤＮＡを総ｍＲＮＡから調製し、そしてその後に多数の既知の技術の内の一つを用いて適切なプラスミドもしくはバクテリオファージベクター内に挿入することが可能である。脊椎動物ｈｈ蛋白質をコードする遺伝子を、本発明により提供されるヌクレオチド配列情報に従って、既に確立されているポリメラーゼ連鎖反応を用いてクローン化することも可能である。本発明の核酸はＤＮＡもしくはＲＮＡであることが可能である。好ましい核酸は配列番号１〜７からなる群から選択される配列により表されるｃＤＮＡである。
【００６５】
本発明の他の態様は、「アンチセンス」療法における単離された核酸の使用に関する。本明細書に用いられる際には「アンチセンス」療法は、細胞性条件下で主題のヘッジホッグ蛋白質の内の一つもしくは複数をコードする細胞性ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡと特異的にハイブリダイズする（例えば、結合する）オリゴヌクレオチドプローブもしくはそれらの誘導体の投与もしくはインサイチュー作製を意味し、この療法によりそのヘッジホッグ蛋白質の発現が阻害されるが、これは例えば、転写および／または翻訳の阻害により行われる。この結合は、通常の塩基対相補性によるか、あるいは例えばＤＮＡ二重らせんへの結合の場合には、その二重らせんの主溝内での特異的相互作用を介する可能性がある。一般的には「アンチセンス」療法は、当該技術分野において一般的に利用される技術の範囲を意味し、そしてオリゴヌクレオチド配列への特異的結合に依存するいずれかの療法を含む。
【００６６】
本発明のアンチセンス構築物は、例えば発現プラスミドとして輸送されることが可能であり、この発現プラスミドは細胞内で転写される場合には、脊椎動物ｈｈ蛋白質をコードする細胞性ｍＲＮＡの少なくとも非反復部分に相補的であるＲＮＡを産生する。別法ではアンチセンス構築物はオリゴヌクレオチドプローブであり、これはエックスビボで作製され、かつ細胞内に組み込ませる場合には、脊椎動物ｈｈ遺伝子のｍＲＮＡおよび／またはゲノム配列とハイブリダイズすることにより発現の阻害をもたらす。このようなオリゴヌクレオチドプローブは、内因性ヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼおよび／またはエンドヌクレアーゼ）に対する耐性を示す改変化オリゴヌクレオチドであることが好ましく、そしてそのためインビボで安定である。アンチセンスオリゴヌクレオチドとしての使用のための例示的核酸分子は、ＤＮＡのホスホルアミデート、ホスホチオエート、およびメチルホスホネートアナログである（米国特許第５，１７６，９９６号、第５，２６４，５６４号、および第５，２５６，７７５号、も参照されたい）。追加として、アンチセンス療法において有用なオリゴマーを構築するための一般的研究方法が、例えば、Ｖａｎ
ｄｅｒ  Ｋｒｏｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：９５８−９７６；およびＳｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ４８：２６５９−２６６８、により総説にまとめられている。
【００６７】
従って、本発明の改変化オリゴマーは治療、診断、および研究の状況において有用である。治療的適用法では、オリゴマーを一般的なアンチセンス療法にとって適切な方法で利用する。このような療法については、本発明のオリゴマーを、多種多様な投与法（全身性投与、および局所投与すなわち限局性投与を含む）用に製剤することが可能である。技術および製剤法は一般的に、Ｒｅｍｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｍｅａｄｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、において見いだすことができる。全身投与のためには注射が好ましく、これには筋肉内注射、静脈内注射、腹膜内注射、および皮下注射が含まれ、本発明のオリゴマーは液体溶液、好ましくは生理学的適合性を示す緩衝液（例えば、ハンクス（Ｈａｎｋ’ｓ）溶液もしくはリンゲル（Ｒｉｎｇｅｒ’ｓ）溶液）内で製剤することが可能である。その上、このオリゴマーを固形形態で製剤し、そして使用直前に溶解もしくは懸濁させることができる。凍結乾燥化形態も含まれる。
【００６８】
全身投与もやはり経粘膜的もしくは経皮手法によって可能となり、あるいはこの化合物を経口的に投与することが可能である。経粘膜もしくは経皮投与については、貫通予定の関門にとって適切な浸透剤がその製剤中に用いられる。このような浸透剤は一般的には当該技術分野において知られており、そしてこれらには例えば、経粘膜投与用には胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体が含まれる。それに加えて、浸透を容易にさせるのに洗剤を用いることができる。経粘膜投与は、鼻腔内噴霧を介してか、もしくは座薬を用いて行うことができる。経口投与については、オリゴマーは通常の経口投与形態（例えば、カプセル、錠剤、および強壮剤）に製剤される。局所投与用には本発明のオリゴマーは、当該技術分野において一般的に知られる軟膏剤（ｏｉｎｔｍｅｎｔｓ）、軟膏剤（ｓａｌｖｅｓ）、ゲル剤、もしくはクリーム剤に製剤される。
【００６９】
治療における使用に加えて、本発明のオリゴマーを、それらが特異的に結合する標的ＤＮＡもしくはＲＮＡ配列の存在もしくは非存在を検出するための診断試薬として用いることができる。このような診断用検査はこれ以降に更に詳細に記載される。
【００７０】
同様に、本発明のアンチセンス構築物は、ヘッジホッグ蛋白質の内の一つの正常な生物学的活性を拮抗することにより、インビボおよびエックスビボ組織培養の両方での組織の操作（例えば、組織分化）において用いることができる。
【００７１】
更にこのアンチセンス技術（例えば、アンチセンス分子のマイクロインジェクション、あるいはｈｈ  ｍＲＮＡもしくは遺伝子配列に関してその転写物がアンチセンスとなるプラスミドでのトランスフェクション）を、分化現象におけるｈｈの役割、ならびに成体組織中でのｈｈの正常な細胞性機能を調査するのに用いることが可能である。このような技術を細胞培養において利用することが可能であるが、しかし、これを形質転換動物の作製において使用することも可能である。
【００７２】
本発明は更に、少なくとも一つの転写調節配列に操作可能に連結される脊椎動物ｈｈポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターを提供する。「操作可能に連結される」は、ヌクレオチド配列が、そのヌクレオチド配列の発現を可能にさせる様式で調節配列に連結されることを意味することが意図される。調節配列は当業者には認識され、かつ主題のｈｈ蛋白質の発現を指令するように選択される。従って、用語「転写調節配列」は、プロモーター、エンハンサー、および他の発現調節因子を含む。このような調節配列は、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０）において記載される。例えば、多種多様の発現制御配列（すなわち、あるＤＮＡ配列に操作可能に連結された場合にはそのＤＮＡ配列の発現を調節する配列）の内のいずれかのものをこれらのベクターに用いて本発明の脊椎動物ｈｈポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を発現させることができる。このような有用な発現制御配列には、例えば、ウイルスＬＴＲ（例えば、マウスのモロニー（Ｍｏｌｏｎｅｙ）白血病ウイスル）、ＳＶ４０の初期および後期プロモーター、アデノウイルス、もしくはサイトメガロウイルスの極初期のプロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣもしくはＴＲＣ系、Ｔ７プロモーター（このプロモーターの発現はＴ７  ＲＮＡポリメラーゼにより指令される）、ファージλの主要オペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄコート蛋白質用の調節領域、３−ホスホグリセレートキナーゼおよび他の糖分解酵素用のプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーター（例えば、Ｐｒｏ５）、イーストα−交配因子のプロモーター、バキュロウイルス系のポリヘドロンプロモーター、および原核生物もしくは真核生物細胞、あるいはそれらのウイルスの遺伝子の発現を調節することが知られている他の配列、ならびにそれらの様々な組み合わせ物、が含まれる。発現ベクターの設計は、トランスフォームされる予定の宿主細胞の選択、および／または発現されることが所望される蛋白質の種類のような因子に依存する可能性があることが理解されるべきである。その上、ベクターのコピー数、そのコピー数を制御するための能力、およびそのベクターによりコードされるいずれかの他の蛋白質の発現（例えば、抗生物質マーカー）も配慮されるべきである。ある態様では、発現ベクターは、主題のヘッジホッグポリペプチドのアゴニスト活性を有するペプチドをコードするか、あるいは別法ではｈｈ蛋白質のアンタゴニスト形態であるペプチドをコードする組換え遺伝子を含む。このような発現ベクターを用いて細胞をトランンスフェクトし、そしてそのことにより、本明細書において記載される核酸によりコードされる融合蛋白質を初めとするポリペプチドを産生させることが可能である。
【００７３】
それに加えて、本発明の遺伝子構築物を遺伝子療法プロトコールの一部分として用いて、主題の脊椎動物ヘッジホッグ蛋白質の内の一つのアゴニストもしくはアンタゴニストのいずれかの形態をコードする核酸を輸送することが可能である。従って本発明の他の態様は、インビボもしくはインビトロトランスフェクションのための発現ベクター、および特別なタイプの種類における脊椎動物ｈｈポリペプチドの発現の特徴を記載し、その特徴により、天然に存在する形態の蛋白質が過誤発現される組織内でのヘッジホッグ誘導性シグナル伝達の機能が再構成されるか、あるいは別法では廃止されるか；そうでなければ組織の分化を変化させるかもしくは新生物の形質転換を阻害する蛋白質の形態が輸送される。
【００７４】
主題の脊椎動物ｈｈポリペプチドの発現構築物およびその突然変異体を、いずれかの生物学的に有効な担体（例えば、インビボで細胞に組換え遺伝子を効率よく輸送することが可能ないずれかの製剤もしくは組成物）中に含まれた状態で投与することができる。研究方法には、組換えレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、および単純ヘルペスウイルス−１を初めとするウイルスベクター、あるいは組換え細菌性プラスミドもしくは真核生物プラスミド内への主題の遺伝子の挿入が含まれる。ウイルス性ベクターは細胞を直接トランスフェクトし；プラスミドＤＮＡは、例えばカチオン性リポソーム（リポフェクション）もしくは誘導化させた（例えば、抗体複合体形成化）ポリリシン複合体、グラミシジンＳ、人工ウイルスエンベロープ、もしくは他のそのような細胞内担体、ならびに遺伝子構築物の直接的注射、もしくはインビボで実施されるＣａＰＯ４沈殿の助けを借りて輸送することが可能である。適切な標的細胞の形質導入が遺伝子療法における最初の重要な段階を意味するため、特別な遺伝子輸送系の選択は、意図される標的の表現型および投与経路（例えば、局所的もしくは全身的）のような因子に依存するであろうことが認識されるであろう。その上、ヘッジホッグ発現のインビボ形質導入用に提供される特別な遺伝子構築物も、インビトロでの細胞の形質導入（例えば、以下に記載されるエック
スビボでの組織培養系）にとっても有用であることが認識されるであろう。
【００７５】
細胞内への核酸のインビボ組込みのための好ましい研究方法は、所望されるヘッジホッグポリペプチドの特別な形態をコードする核酸（例えば、ＤＮＡ）を含むウイルスベクターの使用によるものである。ウイルスベクターでの細胞の感染は、大集団の標的細胞が核酸を受け取ることができるという利点を有する。それに加えて、ウイルスベクター内にコードされる分子（例えば、そのウイルスベクター内に含まれるｃＤＮＡ）は、ウイルスベクターの核酸を取り込んでいる細胞内で効率良く発現される。
【００７６】
レトロウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターは一般的には、インビボでの外因性遺伝子の転移用に選択された組換え遺伝子輸送系（特にヒト内への）であることが一般的に理解されている。これらのベクターは細胞内への遺伝子の効率の良い輸送法を提供し、かつ輸送される核酸は安定にその宿主の染色体ＤＮＡ内に組込まれる。レトロウイルスの利用のための主要な必要事項は、それらの使用の安全性を確実なものにすることであり、それは特に細胞集団内での野生型ウイルスの蔓延の可能性に関しての安全性について言える。複製欠損性レトロウイルスのみを産生する特殊化細胞株（「パッケージング細胞」と称される）の開発により、遺伝子療法用のレトロウイルスの利用性が増大し、かつ欠損レトロウイルスは遺伝子療法目的用の遺伝子輸送における使用について詳細にその特徴が決定されている（総説については、Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．（１９９０）  Ｂｌｏｏｄ  ７６：２７１、を参照されたい）。従って、そのレトロウイルスに複製欠損を付与する主題の蛋白質の内の一つをコードする核酸によりレトロウイルスコーディング配列の一部分（ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ）が置換されている組換えレトロウイルスを構築することが可能である。その後にその複製欠損レトロウイルスを、標準技術によるヘルパーウイルスの使用を介して標的細胞を感染するのに用いることが可能であるビリオン内にパッキングする。組換えレトロウイルスを産生し、かつそのようなウイルスでインビトロもしくはインビボで細胞を感染させるためのプロトコールは、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｆ，Ｍ，ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ）  Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、（１９８９）、Ｓｅｃｔｉｏｎｓ  ９．１０−９．１４、および他の標準的研究室用マニュアルにおいて見いだすことができる。適切なレトロウイルスの例には、ｐＬＪ、ｐＺＩＰ、ｐＷＥ、およびｐＥＭが含まれ、これらは当業者には良く知られている。環境栄養性および両栄養性の両方のレトロウイルス系を調製するのに適するパッケージングウイルス株の例には、ΨＣｒｉｐ、ΨＣｒｅ、Ψ２、およびΨＡｍが含まれる。レトロウイルスは様々な遺伝子を多くの異なる細胞タイプ（ニューロン細胞を初めとする）内にインビトロおよび／またはインビボで組込ませるのに用いられている（例えば、Ｅｇｌｉｔｉｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１３９５−１３９８；Ｄａｎｏｓ  ａｎｄ  Ｍｕｌｌｉｇａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：６４６０−６４６４；Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：３０１４−３０１８；Ａｒｍｅｎｔａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：６１４１−６１４５；Ｈｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：８０３９−８０４３；Ｆｅｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８８：８３７７−８３８１；Ｃｈｏｗｈｕｒｙ
ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４５：１８０２−１８０５；ｖａｎ  Ｂｅｕｓｅｃｈｅｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ  ８９：７６４０−７６４４；Ｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ３：６４１−６４７；Ｄａｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：１０８９２−１０８９５；Ｈｗｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：４１０４−４１１５；米国特許第４，８６８，１１６号；米国特許第４，９８０，２８６号、国際公開第８９／０
７１３６号；国際公開第８９／０２４６８号；国際公開第８９／０５３４５号；および国際公開第９２／０７５７３号、を参照されたい）。
【００７７】
その上、レトロウイルスの感染スペクトラムを制限することが可能であり、そしてその結果レトロウイルスを基にするベクターの感染スペクトラムを制限することが可能となり、これらのことはウイルス粒子の表面上のウイルスパッケージング蛋白質を改変することにより行われることが既に示されている（例えば、国際公開第９３／２５２３４号および国際公開第９４／０６９２０号を参照されたい）。例えば、レトロウイルスベクターの感染スペクトラムの改変用の手法には：ウイルスｅｎｖ蛋白質に細胞表面抗原に特異的な抗体をカップリングさせること（Ｒｏｕｘ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）  ＰＮＡＳ  ８６：９０７９−９０８３；Ｊｕｌａｎ  ｅｔ  ａｌ（１９９２）  Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．
７３：３２５１−３２５５；およびＧｏｕｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １６３：２５１−２５４）；もしくはウイルスｅｎｖ蛋白質に細胞表面レセプターリガンドをカップリングさせること（Ｎｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６６：１４１４３−１４１４６）がある。カップリングは、ある蛋白質もしくは他の様々なもの（例えば、ｅｎｖ蛋白質をアシアロ糖蛋白質に転換させるためのラクトース）との化学的に架橋した形態をとることが可能であるし、同様に融合蛋白質（例えば、一本鎖抗体／ｅｎｖ融合蛋白質）を作製することによる手法も可能である。この技術は一定のタイプの組織にその感染を限定するか、もしくはそうでなければその感染を配向させるのに有用である一方で、更に環境栄養性ベクターを両栄養性ベクターに転換するのにも用いることが可能である。
【００７８】
それに加えて、レトロウイルス遺伝子輸送の使用は更に、レトロウイルスベクターのｈｈ遺伝子の発現を制御する組織特異的もしくは細胞特異的転写調節配列の使用により亢進させることが可能である。
【００７９】
本発明に有用な他のウイルス遺伝子輸送系は、アデノウイルス由来のベクターを利用する。アデノウイルスのゲノムを、そのゲノムが目的の遺伝子産物をコードおよび発現するが、しかし、正常な溶解性ウイルス周期において複製する能力に関してはそのゲノムを不活化させるように操作することが可能である。例えば、Ｂｅｒｋｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６１６；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：４３１−４３４；およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄ
ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｃｅｌｌ  ６８：１４３−１５５、を参照されたい。アデノウイルス株Ａｄタイプ５  ｄｌ３２４もしくは他のアデノウイルス株（例えば、Ａｄ２、Ａｄ３、Ａｄ７など）に由来する適切なアデノウイルスベクターは、当業者には熟知されている。組換えアデノウイルスは、それらを用いて多種多様のタイプの細胞を感染することができるという点で所定の条件下では有利であり得、それらのタイプの細胞には、気道上皮組織（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）、先に引用）、内皮細胞（Ｌｅｍａｒｃｈａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：６４８２−６４８６）、肝細胞（Ｈｅｒｚ  ａｎｄ  Ｇｅｒａｒｄ（１９９３）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：２８１２−２８１６）、および筋肉細胞（Ｑｕａｎｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：２５８１−２５８４）が含まれる。その上、ウイルス粒子は比較的安定であり、かつ精製および濃縮が可能であり、そして先と同様に、感染性のスペクトラムに影響を及ぼすように改変することが可能である。その上、組み込まれたアデノウイルスＤＮＡ（およびそこに含まれる外来性ＤＮＡ）は宿主細胞のゲノム中に組込まれることはないが、エピソームには維持されており、このことにより組込まれたＤＮＡが宿主ゲノム（例えば、レトロウイルスＤＮＡ）内に組込まれる状況における挿入的突然変異誘発の結果として生じることが可能な潜在的問題が回避される。その上、外来性ＤＮＡに関するアデノウイルスゲノムの保持能力は、他の遺伝子輸送ベクターと
比較すると大きい（最高８キロベース）（Ｂｅｒｋｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．先に引用される；Ｈａｊ−Ａｈｍａｎｄ  ａｎｄ  Ｇｒａｈａｍ  （１９８６）  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５７：２６７）。現在用いられている大半の複製欠損のアデノウイルスベクターであって、そのため本発明により好まれるものは、ウイルスＥ１およびＥ３遺伝子の全てもしくは部分を欠損しているものの、８０％程のアデノウイルスゲノム物質を保持はしている（例えば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９７９）  Ｃｅｌｌ  １６：６８３；Ｂｅｒｋｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、上述；およびＧｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ内、Ｅ．Ｊ．Ｍｕｒｒａｙ、Ｅｄ（Ｈｕｍａｎａ、Ｃｌｉｆｔｏｎ、ＮＪ、１９９１）  ｖｏｌ．７．ｐｐ．１０９−１２７）。挿入されたヘッジホッグ遺伝子の発現は、例えば、Ｅ１Ａプロモーター、主要後期プロモーター（ＭＬＰ）、および関連するリーダー配列、Ｅ３プロモーター、もしくは外因的に添加されたプロモーター配列の制御下に置かれることが可能である。
【００８０】
主題のｈｈ遺伝子の内の一つの輸送に有用な更に外のウイルスベクター系はアデノ関連性ウイルス（ＡＡＶ）である。アデノ関連性ウイルスは、天然に存在する欠損ウイルスであり、これは他のウイルス（例えばアデノウイルスもしくはヘルペスウイルス）を効率の良い複製および産生性周期のためのヘルパーウイルスとして必要とする（総説としては、Ｍｕｚｙｚｋａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ．Ｍｉｃｒｏ．  ａｎｄ
Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９２）  １５８：９７−１２９、を参照されたい）。これは更に、そのＤＮＡを非分裂性細胞内に組み込ませることができ、かつ高頻度の安定な組込みを呈する数少ないウイルスの内の一つでもある（例えば、Ｆｌｏｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）  Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７：３４９−３５６；Ｓａｍｕｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．  ６３：３８２２−３８２８；およびＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．  ６２：１９６３−１９７３、を参照されたい）。ＡＡＶのわずか３００塩基対程を含むベクターをパッケージし、そして組込ませることが可能である。外因性ＤＮＡ用の空間は約４．５ｋｂに限定されている。例えば、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．  ５：３２５１−３２６０において記載されるようなＡＡＶベクターを用いてＤＮＡを細胞内に組み込ませることが可能である。様々な核酸が、ＡＡＶベクターを用いて異なるタイプの細胞内に組込まれている（例えば、Ｈｅｒｍｏｎａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８１：６４６６−６４７０：Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．  ４：２０７２−２０８１；Ｗｏｎｄｉｓｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）  Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  ２：３２−３９；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．  ５１：６１１−６１９；およびＦｌｏｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：３７８１−３７９０）。
【００８１】
先に説明されるもののようなウイルス輸送方法に加え、非ウイルス的法を利用して、動物の組織内の主題のヘッジホッグポリペプチドの発現をもたらすことも可能である。遺伝子輸送のたいていの非ウイルス方法は、巨大分子の取り込みおよび細胞内輸送のための哺乳類細胞により用いられる正常なメカニズムを頼みにしている。好ましい態様では、本発明の非ウイルス性遺伝子輸送系は、標的細胞による主題のｈｈポリペプチド遺伝子の組込みのための細胞内組込み経路を頼みとしている。このタイプの例示的な遺伝子輸送系には、リポソーム由来の系、ポリリシン複合体、および人工ウイルスエンベロープが含まれる。
【００８２】
臨床的環境下では、治療用ヘッジホッグ遺伝子のための遺伝子輸送系を、多数の方法の内のいずれかにより患者内に組込ませるが、そのような方法の各々は当該技術分野において熟知されている。例えば、遺伝子輸送系の薬剤学的調製物を全身的に取り込ませること
が可能であるが、それは例えば静脈内注射により行われ、そして標的細胞内の蛋白質の特異的形質導入が、遺伝子輸送用賦形剤、細胞タイプもしくは組織タイプの発現により提供されるトランスフェクションの特異性により優先的に生じるが、これはそのレセプター遺伝子の発現を制御する転写調節配列、もしくはそれらの組み合わせ物に起因する。他の態様では、組換え遺伝子の最初の輸送は、動物内への組込みに関しては一層その制約が強く、かなり局在化されたものとなる。例えば、遺伝子輸送用賦形剤をカテーテル（米国特許第５，３２８，４７０号を参照されたい）、もしくは定位注射（例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ
ａｌ．（１９９４）  ＰＮＡＳ  ９１：３０５４−３０５７、を参照されたい）により取り込ませることが可能である。例えば配列番号１〜７からなる群において表されるクローンの内のいずれか一つのような脊椎動物ｈｈ遺伝子を、一例では、Ｄｅｖ  ｅｔ  ａｌ．（（１９９４）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔ  Ｒｅｖ  ２０：１０５−１１５）により記載される技術を用いる電気穿孔法により、遺伝子療法用構築物内に輸送することが可能である。
【００８３】
遺伝子療法用構築物の薬剤学的調製物は本質的には、許容される稀釈剤中の遺伝子輸送系からできていることが可能であるか、あるいは遺伝子輸送用賦形剤が埋め込まれている徐放性マトリックスを含むことが可能である。別法では、完全な遺伝子輸送系を組換え細胞（例えば、レトロウイルスベクター）から未処理のままで作製することが可能である場合には、この薬剤学的調製物は、その遺伝子輸送系を産生する一つもしくは複数の細胞を含むことが可能である。
【００８４】
本発明の他の態様は、ヘッジホッグ蛋白質の組換え形態に関する。天然のヘッジホッグ蛋白質に加え、本発明により好まれる組換えポリペプチドは、配列番号８〜１４の内のいずれかにより記載されるアミノ酸配列と少なくとも６０％は相同であり、より好ましくは７０％相同であり、そして最も好ましくは８０％相同である。ヘッジホッグ蛋白質の活性（すなわちアゴニスト活性もしくはアンタゴニスト活性の内のいずれか）を保持し、かつ配列番号８〜１４からなる群より選択される配列と、少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、そして最も好ましくは少なくとも約９８〜９９％の相同性を示すポリペプチドも、やはり本発明の範囲内に含まれる。
【００８５】
用語「組換え蛋白質」は組換えＤＮＡ技術により産生される本発明のポリペプチドを意味し、この場合一般的には脊椎動物ｈｈポリペプチドをコードするＤＮＡが適切な発現ベクター内に挿入され、今度はその発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換させて異種蛋白質を産生させる。その上、成句「〜に由来する」は、組換えヘッジホッグ遺伝子に関しては、天然のヘッジホッグ蛋白質のアミノ酸配列か、もしくはその蛋白質の天然に存在する形態の置換および欠損（切断を含む）を含む突然変異により生じるそれらに類似するアミノ酸配列を有する蛋白質を「組換え蛋白質」の意味内に含むことが意味される。
【００８６】
本発明は更に、脊椎動物生物体、特に哺乳類（例えば、ヒト）に由来する遺伝子によりコードされ、かつ配列番号８〜１４に表されるヘッジホッグ蛋白質に進化に関与するアミノ酸配列を有する主題のヘッジホッグポリペプチドの内の一つの組換え形態に関する。このような組換えｈｈポリペプチドは、添付される配列表の野生型（「本物の」）ヘッジホッグ蛋白質の少なくとも一つの生物学的活性のアゴニストもしくはアンタゴニストのいずれかの役割の内の一つとして機能することが可能である。用語「進化に関与する」は、脊椎動物ヘッジホッグ蛋白質のアミノ酸配列に関しては、天然に生じるアミノ酸配列を有するポリペプチド、および更に例えば組み合わせ突然変異誘発により取得される脊椎動物ｈｈポリペプチドの突然変異体変種の両方を意味する。本発明により好まれるこのような進化的に取得されたヘッジホッグ蛋白質のポリペプチドは、配列番号８〜１４からなる群より選択されるアミノ酸配列と、少なくとも６０％の相同性、より好ましくは７０％の相同性、そして最も好ましくは８０％の相同性を示す。配列番号８〜１４からなる群より選択
される配列と少なくとも約９０％の、より好ましくは少なくとも約９５％の、そして最も好ましくは少なくとも約９８〜９９％の相同性を有するポリペプチドも、やはり本発明の範囲内に含まれる。
【００８７】
本発明は更に、主題のヘッジホッグポリペプチドを産生する方法に関する。例えば、主題のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を指令する核酸ベクターでトランスフェクトさせた宿主細胞を、そのペプチドの発現を生じさせることが可能な適切な条件下で培養することが可能である。ポリペプチドヘッジホッグは、その組換え脊椎動物ｈｈポリペプチドを含む細胞から分泌され、かつその細胞と培地との混合物から単離することができる。別法では、その組換えｈｈ遺伝子からシグナルペプチド配列を除去することによりそのペプチドを細胞質内に保持させておき、そしてその細胞を回収し、溶菌し、そしてその蛋白質を単離することができる。細胞培養物は、宿主細胞、培地、および他の副産物を含む。細胞培養に適切な培地が当該技術分野において良く知られている。この組換えｈｈポリペプチドを、細胞培養培地、宿主細胞、もしくはその両方から、蛋白質の精製について当該技術分野において知られる技術を用いて単離することが可能であり、それらの技術には、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動、およびそのようなペプチドに特異的な抗体での免疫親和性精製が含まれる。好ましい態様では、この組換えｈｈポリペプチドは、その精製を容易にさせるドメインを含む融合蛋白質であり、その一例は、ｈｈ／ＧＳＴ融合蛋白質である。
【００８８】
本発明はまた、主題のヘッジホッグポリペプチドの組換え形態を発現するようにトランスフェクトさせた細胞にも関する。宿主細胞はいずれかの原核生物細胞もしくは真核生物細胞であることができる。従って、脊椎動物ヘッジホッグ蛋白質のクローニングにより取得され、かつその全長蛋白質の全てもしくは選択された部分をコードするヌクレオチド配列を用いて、微生物もしくは真核生物の細胞課程を介することで脊椎動物ｈｈポリペプチドの組換え形態を産生することが可能である。このポリヌクレオチド配列の、ある遺伝子構築物（例えば、発現ベクター）内への連結、ならびに真核生物（イースト、鳥類、昆虫類、もしくは哺乳類）あるいは原核生物（細菌細胞）のいずれかである宿主内への形質転換もしくはトランスフェクションが、他の良く知られる蛋白質（例えば、インスリン、インターフェロン類、ヒト成長ホルモン類、およびＩＬ−１、ＩＬ−２など）を産生する際に用いられる標準方法である。類似の方法もしくはその改変法を利用して、組換えヘッジホッグポリペプチドを、本発明に従う微生物学的手法もしくは組織培養技術により調製することが可能である。
【００８９】
組換えヘッジホッグ遺伝子を、ｈｈ蛋白質もしくはその部分をコードする核酸を、原核生物細胞、真核生物細胞、もしくはその両方のいずれか内の発現に適するベクター内に連結させることにより産生することが可能である。主題のｈｈポリペプチドの組換え形態の産生のための発現ベクターには、プラスミドおよび他のベクターが含まれる。例えば、ヘッジホッグポリペプチドの発現に適するベクターには、以下のタイプのプラスミドが含まれ、それらは：原核生物細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））における発現用のｐＢＲ３２２由来のプラスミド、ｐＥＭＢＬ由来のプラスミド、ｐＥＸ由来のプラスミド、ｐＢＴａｃ由来のプラスミド、およびｐＵＣ由来のプラスミドである。
【００９０】
イーストにおける組換え蛋白質の発現用には多数のベクターが存在する。例えば、ＹＥＰ２４、ＹＩＰ５、ＹＥＰ５１、ＹＥＰ５２、ｐＹＥＳ２、およびＹＲＰ１７は、Ｓ．ケレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）内への遺伝子構築物の組込みの際に役立つクローニングおよび発現用の媒介体である（例えば、Ｂｒｏａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ内、ｅｄ．  Ｍ．Ｉｎｏｕｙｅ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ｐ８３、を参照にされたい（これは引用により本明細書に取り込まれる））。これらのベクターは
、ｐＢＲ３２２  ｏｒｉの存在に起因して大腸菌内で、そしてイーストの２ミクロンプラスミドの複製決定基に起因してＳ．ケレビシアエ内で複製することが可能である。それに加えて、薬剤耐性マーカー（例えば、アンピリシン）を使用することが可能である。説明的な態様では、ｈｈポリペプチドを、配列番号１〜７に表されるヘッジホグ遺伝子の内の一つのコーディング配列のサブクローニングにより産生される発現ベクターを組換え方法を用いて利用することにより産生している。
【００９１】
好ましい哺乳類発現ベクターは、細菌内でのベクターの増殖を容易にするための原核生物配列と、真核生物細胞内で発現される一つもしくは複数の真核生物転写単位の両方を含む。ベクターに由来する、ｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＳＶ２ｇｐｔ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ｐＴｋ２、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＴ７、ｐｋｏ−ｎｅｏ、およびｐＨｙｇは、真核生物細胞のトランスフェクションに適する哺乳類発現ベクターの例である。これらのベクターの内の幾つかは、原核生物および真核生物の両細胞における複製および薬剤耐性選択を容易にさせるために、細菌性プラスミド（例えば、ｐＢＲ３２２）からの配列で改変させる。別法では、ウイルスの誘導体（例えば、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ−１）もしくはエプスタイン−バールウイルス（ｐＨＥＢｏ、ｐＲＥＰ−由来のもの、およびｐ２０５））を、真核生物細胞内での蛋白質の一過性発現用に用いることができる。プラスミドの調製および宿主生物体の形質転換において利用される様々な方法が当該技術分野において熟知されている。原核生物および真核生物の両細胞に適する他の発現系、ならびに一般的組換え方法については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ  Ｅｄ．、ｅｄ  ｂｙ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：１９８９）の第１６および１７章を参照されたい。
【００９２】
ある事例では、組換えヘッジホッグポリペプチドを、バキュロウイルス発現系の使用により発現させることが所望されることがある。このようなバキュロウイルス発現系の例には、ｐＶＬ−由来のベクター（例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、およびｐＶＬ９４１）、ｐＡｃＵＷ−由来のベクター（例えば、ｐＡｃＵＷ１）、ならびにｐＢｌｕｅＢａｃ−由来のベクター（例えば、β−ｇａｌ含有性ｐＢｌｕｅＢａｃ  ＩＩＩ）がある。
【００９３】
ｈｈ蛋白質の内のある部分のみを発現させることが所望される場合には（例えば、Ｎ−末端の一部分を欠いた形態、すなわちシグナルペプチドを欠損する切断突然変異体）、開始コドン（ＡＴＧ）を、発現が予定される所望の配列を含むオリゴヌクレオチド分画に添加することが必要であることがある。Ｎ−末端位置のメチオニンが酵素メチオニンアミノペプチダーゼ（ＭＡＰ）の使用により酵素的に開裂され得ることは当該技術分野では熟知されている。ＭＡＰは大腸菌（Ｂｅｎ−Ｂａｓｓａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １６９：７５１−７５７）およびサルモネラ  ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）からクローン化され、かつそのインビトロでの活性が組換え蛋白質において証明されている（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）  ＰＮＡＳ  ８４：２７１８：１７２２）。従って、Ｎ−末端メチオニンの除去は、それが所望される場合には、インビボではＭＡＰを産生する宿主内（例えば、大腸菌もしくはＣＭ８９もしくはＳ．ケレビシアエ）でヘッジホッグ由来のポリペプチドを発現させることによるか、あるいはインビトロでは精製されたＭＡＰ（例えば、Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（上述）の方法）の使用によるかのいずれかにより達成することが可能である。
【００９４】
別法では、そのポリペプチドのコーディング配列を、異なるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む融合遺伝子の一部分として取り込ませることが可能である。この
タイプの発現系は、ヘッジホッグ蛋白質の免疫原性断片を産生することが所望される場合の条件下では有用であり得る。例えば、ロタウイルスのＶＰ６カプシド蛋白質を、単体形態もしくはウイルス粒子形態のいずれかで、そのｈｈポリペプチドの複数部分についての免疫原性担体蛋白質として用いることが可能である。抗体が作製された主題のヘッジホッグ蛋白質のその部分に相当する核酸配列を後期ワクシニアウイルス構造蛋白質用のコーディング配列を含む融合遺伝子構築物内に組み込ませて、ビリオンの部分としてｈｈエピトープを含む融合蛋白質を発現する一連の組換えウイルスを産生することが可能である。Ｂ型肝炎の表面抗原融合蛋白質を利用する免疫原性融合蛋白質の使用に関しては、組換えＢ型肝炎ビリオンを同様にこの役割において利用することが可能であることが証明されている。同様に、ｈｈ蛋白質の一部分およびポリオウイルスカプシド蛋白質を含む融合蛋白質をコードするキメラ構築物を作製して、一連のポリペプチド抗原の免疫原性を亢進させることが可能である（例えば、欧州特許出願第０２５９１４９号；およびＥｖａｎｓ  ｅｔ
ａｌ．（１９８９）  Ｎａｔｕｒｅ  ３３９：３８５；Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．  ６２：３８５５；およびＳｃｈｌｉｅｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．  ６６：２、を参照されたい）。  ペプチドを基にする免疫化のための多重抗原ペプチド（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ）系も免疫原を作製するのに利用することが可能であり、この系ではｈｈポリペプチドの所望部分がオリゴマー性の分岐状リシンコア上でのペプチドの有機化学的合成から直接取得される（例えば、Ｐｏｓｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）  ＪＢＣ  ２６３：１７１９、およびＮａｒｄｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
１４８：９１４、を参照されたい）。ｈｈ蛋白質の抗原決定基を細菌細胞により発現および提示させることも可能である。
【００９５】
免疫原性を亢進させるための融合蛋白質の利用に加え、融合蛋白質も蛋白質の発現を容易にさせ得、そしてそのためこれを本発明の脊椎動物ｈｈポリペプチドの発現の際に用いることが可能であることが広く認識される。例えば、ヘッジホッグポリペプチドをグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ−融合）蛋白質として作製することが可能である。このようなＧＳＴ−融合蛋白質はヘッジホッグポリペプチドの簡便精製を可能にさせ得るが、それは例えば、グルタチオン−誘導化マトリックスの使用によって行われる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｅｄｓ．  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎ．Ｙ．：Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、１９９１）を参照されたい）。他の態様では、精製リーダー配列（例えば、ポリ−（Ｈｉｓ）／エンテロキナーゼ開裂部位配列）をコードする融合遺伝子を用いて、ｈｈ蛋白質のＮ−末端（例えば、プロ形態のもの）に天然に生じるシグナル配列を、Ｎｉ２＋金属樹脂を用いる親和性クロマトグラフィーによるポリ（Ｈｉｓ）−ｈｈ蛋白質の精製を可能にする目的で置換することが可能である。この精製リーダー配列をその後には、エンテロキナーゼでの処理により除去することが可能である（例えば、Ｈｏｃｈｕｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）  Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ４１１：１７７；およびＪａｎｋｎｅｃｈｔ  ｅｔ  ａｌ．  ＰＮＡＳ  ８８：８９７２、を参照されたい）。
【００９６】
融合遺伝子を作製するための技術は当業者に知られている。本質的には、異なるポリペプチド配列をコードする様々なＤＮＡ断片の連結は、通常の方法に従い、連結のための平滑末端もしくは食い違い末端、適切な末端を提供するための制限酵素消化、適切である場合には粘着性末端の充填、所望されない連結を回避するためのアルカリ性ホスファターゼ処理、および酵素的連結を利用して実施される。他の態様では、この融合遺伝子を自動化ＤＮＡ合成機を初めとする通常の技術により合成することが可能である。別法では、遺伝子断片のＰＣＲ増幅を、この２本の連続的遺伝子断片の間に相補的張り出し部分を生じるアンカープライマーを用いて実施することが可能であり、これらの増幅断片をその後にアニールさせてキメラ遺伝子配列を作製することが可能である（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｅｄｓ．  Ａｕｓｕ
ｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ：１９９２、を参照されたい）。
【００９７】
ヘッジホッグポリペプチドを化学的に改変させて、他の化学的部分（例えば、グリコシル基、脂質、リン酸エステル、およびアセチル基など）で共役結合的複合体もしくは凝集性複合体を形成させることによりｈｈ誘導体を作製することもできる。ヘッジホッグ蛋白質の共有結合性誘導体は、先のような化学的部分を、その蛋白質のアミノ酸側鎖上の官能基に連結させるか、あるいはそのポリペプチドのＮ−末端もしくはＣ−末端で連結させることにより調製することが可能である。
【００９８】
例えば、ヘッジホッグ蛋白質を、細胞外マトリックスの構成成分に結合し、かつ細胞表面へのそのアナログの局在化を亢進させる部分（ただし、その蛋白質に天然の状態で関連する配列以外のもの）を含むように作製することが可能である。例えば、フィブロネクチン「タイプ−ＩＩＩ反復部分」に由来する配列（一例では、テトラペプチド配列Ｒ−Ｇ−Ｄ−Ｓ）（Ｐｉｅｒｓｃｈｂａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）  Ｎａｔｕｒｅ  ３０９：３０−３；およびＫｏｒｎｂｌｉｈｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）  ＥＭＢＯ  ４：１７５５−９）をｈｈ蛋白質に添加して、ＥＣＭ構成成分の結合を介することで細胞へのそのキメラ分子の連結を支援することが可能である（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：４９１−４９７；Ｐｉｅｒｓｃｈｂａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２６２：１７２９４−８；Ｈｙｎｅｓ（１９８７）  Ｃｅｌｌ  ４８：５４９−５４；およびＨｙｎｅｓ（１９９２）  Ｃｅｌｌ  ６９：１１−２５）。
【００９９】
本発明はまた、単離された形態であるか、あるいはそうでなければ他の細胞性蛋白質および細胞外蛋白質（特に、形態発生蛋白質、あるいは他の細胞外性、すなわち通常ではヘッジホッグポリペプチドに結合することができる細胞表面結合性蛋白質）を実質的に含まない単離されたヘッジホッグポリペプチドを入手可能にさせる。用語「実質的に他の細胞性蛋白質もしくは細胞外性蛋白質（本明細書では「混在性蛋白質」としても引用される）を含まない」、あるいは「実質的に純粋もしくは精製された調製物」は、２０％を下回る（乾燥重量による）混在性蛋白質を有する、および好ましくは５％を下回る混在性蛋白質を有するｈｈポリペプチドの調製物を含むとして特定される。主題のポリペプチドの機能性形態は、最初には本明細書に記載されるクローン化遺伝子を用いることにより精製された調製物として調製することが可能である。「調製された」によっては、ペプチドもしくはＤＮＡもしくはＲＮＡ配列について言及する場合には、それは指示される分子が他の生物学的巨大分子（例えば、他の蛋白質）が実質的に非存在である状態で存在することを意味する。用語「精製された」は本明細書において用いられる際には、好ましくは少なくとも８０乾燥重量％、一層好ましくは９５〜９９乾燥重量％の範囲内の、そして最も好ましくは少なくとも９９．８重量％で存在する同じタイプの生物学的巨大分子を意味する（しかし、水、緩衝液、および他の小分子、特に５０００を下回る分子量を有する分子は存在し得る）。用語「純粋な」は本明細書において用いられる際には、直前の「精製された」と同一の数値的制限を有することが好ましい。「単離された」および「精製された」は、それらの天然状態での天然物質もしくは構成成分に分離された（例えば、アクリルアミドゲル内で）天然物質のいずれをも含みはしないが、ただし純粋な（例えば、混在性蛋白質、もしくはクロマトグラフィー用試薬（例えば、変性剤、およびポリマー類（例えば、アクリルアミドもしくはアガロース））を含まない）物質もしくは溶液のいずれかとして取得された物質は例外である。好ましい態様では、精製されたヘッジホッグ調製物は、ヘッジホッグが正常に産生される同一の動物からのいずれかの混在性蛋白質をも含まないであろうが、これは例えば、非ヒト細胞におけるヒトヘッジホッグ蛋白質の組換え発現により達成され得る。
【０１００】
組換えポリペプチドについて先に記載したように、単離されたｈｈポリペプチドは、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、もしくは配列番号１４において表されるアミノ酸配列、あるいはそれらの相同配列の全てもしくは一部分を含むことが可能である。主題のヘッジホッグ蛋白質の好ましい断片は、成熟蛋白質のＮ−末端およびＣ−末端蛋白質分解的断片に相当する（例えば、実施例６および９を参照されたい）。
【０１０１】
ヘッジホッグ蛋白質の単離されたペプチジル部分は、そのようなペプチドをコードする核酸の対応断片から組換え的に産生されるペプチドをスクリーニングすることにより取得することが可能である。その上、断片は当該技術分野において知られる技術を用いることで化学的に合成することが可能であり、そのような技術の例は、通常のＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相ｆ−Ｍｏｃもしくはｔ−Ｂｏｃ化学法である。例えば、本発明のヘッジホッグポリペプチドは、断片の重複を伴わない所望される長さの複数断片に任意に分割することができるか、あるいは好ましくは所望の長さの重複断片へと分割することができる。これらの断片を産生し（組換え法によるか、もしくは化学的合成により）、そして検査を行って、野生型（例えば、「本物の」）ヘッジホッグ蛋白質のアゴニストもしくはアンタゴニストのいずれかとして機能し得るそのようなペプチジル断片を同定することが可能である。
【０１０２】
本発明の組換えヘッジホッグポリペプチドは更に、生来のヘッジホッグ蛋白質の同族体をも含み、それらの例は、例えば可能な開裂配列を変化させるか、もしくはその蛋白質に関連する酵素活性を不活化させるかの突然変異に起因することで、蛋白質分解性開裂に対して耐性を示す蛋白質型である。本発明のヘッジホッグ同族体はまた、生来の蛋白質とは異なる様式で翻訳後の改変を受けている蛋白質も含む。脊椎動物ヘッジホッグ蛋白質の例示的誘導体には、Ｎ−グリコシル化部位を欠損するか（例えば、非グリコシル化された蛋白質を産生するため）、あるいはＮ−末端および／またはＣ−末端配列を欠損するポリペプチドが含まれる。  主題の脊椎動物ｈｈポリペプチドの構造の改変は、治療的もしくは予防的効率、あるいは安定性（例えば、エックスビボでの貯蔵寿命、およびインビボでの蛋白質分解酵素による分解に対する耐性）を亢進させるという目的のためであり得る。このような改変化ペプチドは、その蛋白質の天然に存在する形態の少なくとも一つの活性を保持するために設計される場合には、本明細書に一層詳しい詳細が記載されるヘッジホッグポリペプチドの機能的等価物であると見なされる。このような改変化ペプチドは、例えば、アミノ酸置換、欠失、もしくは添加により産生することが可能である。
【０１０３】
例えば、ロイシンのイソロイシンもしくはバリンでの単独置換、グルタミン酸でのアスパラギン酸の単独置換、セリンでのスレオニンの単独置換、もしくは構造的に関連するアミノ酸でのアミノ酸の類似置換（すなわち、イソ構造的および／またはイソ電気的突然変異）は、得られる分子の生物学的活性には主要な影響を及ぼさないであろうということが予期されるのは道理にかなったことである。保存的置換は、それらの側鎖が互いに関連し合うアミノ酸一族内で行われる置換である。一般的にはコード化されるアミノ酸は４つの一族に分割することができ、それらは：（１）酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性＝リシン、アルギニン、ヒスチジン；（３）無極性＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；ならびに（４）非荷電極性＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン、である。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは時としては一まとめにして芳香族アミノ酸として分類される。類似様式でアミノ酸レパートリーを、（１）酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性＝リシン、アルギニン、ヒスチジン、（３）脂肪族性＝グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン（セリンとスレオニンは場合によっては別に脂肪族−ヒドロキシルとして分類される）；（４）芳香属性＝フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン；（５）アミド＝アスパラギン、グルタミン；ならびに（６）硫黄含有性＝システインお
よびメチオニン、として分類することが可能である（例えば、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２ｎｄ  ｅｄ．、Ｅｄ．ｂｙ  Ｌ．Ｓｔｒｙｅｒ、ＷＨ  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．：１９８１、を参照されたい）。ペプチドのアミノ酸の変化が機能性ヘッジホッグ同族体をもたらすか否か（例えば、野生型形態を模倣するもしくは拮抗するように作用するという意味における機能）を、その変異体ペプチドが野生型蛋白質に類似する様式で細胞内における応答を生じる能力を評定するか、あるいはそのような応答を競合的に阻害することによるかによって容易に決定することが可能である。一つを上回る置換が行われているポリペプチドを同一様式で簡単に検査することが可能である。
【０１０４】
本発明は更に、主題のヘッジホッグ蛋白質の一連の組み合わせ突然変異体、ならびに切断突然変異体を作製する方法を企画しており、かつ特にヘッジホッグ蛋白質用のレセプターに結合する際に機能を示す潜在的変異体配列（例えば、同族体）を同定するのに有用である。このような組み合わせライブラリーをスクリーニングする目的は、例えば、アゴニストもしくはアンタゴニストのいずれかとして作用するか、あるいは別法では新規の活性をいっしょくたんに保持することが可能である、新規のｈｈ同族体を作製することである。詳細に説明するために記載するが、ヘッジホッグ同族体をこの方法により、コグネートレセプターに対する一層効率のよい結合が提供されるが、それでも依然としてｈｈに関連する活性の少なくとも一部分を保持するように工学的に作製することが可能である。従って、組み合わせライブラリー由来の同族体を、その蛋白質の天然に存在する形態に関連する効力を増加させるように作製することが可能である。同様に、ヘッジホッグ同族体を、この組み合わせ研究法により、アンタゴニストとして作用し（それらが例えば他の細胞外マトリックス構成成分（例えば、レセプター）への結合を模倣はするが、それでもいずれかの生物学的応答を誘導しないという意味合いで）、そのことにより生来のヘッジホッグもしくはヘッジホッグアゴニストの作用を阻害するように作製することが可能である。それに加えて、この方法によるｈｈの所定のドメインの操作により融合蛋白質における使用に一層適するドメインを提供することが可能であるが、そのドメインとは例えば、細胞外マトリックスから取得される、および／または細胞外マトリックス構成成分に結合する他の蛋白質の複数部分を組込んでいるものである。
【０１０５】
本発明のある態様では、ヘッジホッグ同族体の集団もしくは他の関連性蛋白質についてのアミノ酸配列が、好ましくは可能である最高の相同性を亢進させるように整列させてある。このような変異体集団は、例えば、一つもしくは複数の種からのｈｈ同族体を含むことが可能である。整列させられた配列の各位置に出現するアミノ酸は、組み合わせ配列の縮重セットを作製するように選択される。好ましい態様では、ヘッジホッグ変異体の異型ライブラリーを核酸レベルでの組み合わせ突然変異誘発により作製し、そしてそのヘッジホッグ変異体は異型遺伝子ライブラリーによりコードされる。例えば、合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列中に酵素法により連結させることが可能であり、その結果、可能なｈｈ配列の縮重セットは、個々のポリペプチドとしてか、あるいは別法ではその中にｈｈ配列のセットを含むより大きな蛋白質のセット（例えば、ファージ呈示用のもの）として発現される。
【０１０６】
図５Ａに説明されるように、変異体集団の配列を分析するには、目的のアミノ酸配列を配列相同性に呼応させて整列させることが可能である。特別な変異体の整列配列からのアミノ酸の存在もしくは非存在は、対照配列の内の選択された共通の長さに関連しており、この関連性は実際上のものであるか、あるいは人工的なものであることがあり得る。配列のアラインメントでの最高の相同性を維持する目的で、対照配列と比較する際の変異体の配列中の欠損を、アミノ酸スペース（●もしくは＊）により表すことができる一方で、対照配列と比較する際のその変異体の挿入的突然変異を無視し、そして整列させた時点でその変異体の配列から省略することが可能である。例えば、図５Ａは、様々な種からのｈｈの様々なクローン化形態のアラインメントを含む。図５Ａに示されるｈｈクローンのアラ
インメントの分析により、潜在的なｈｈ配列を含むポリペプチドの縮重ライブラリーの作製をもたらすことが可能である。
【０１０７】
説明的な態様では、各Ｓｈｈクローンの内のエキソン１／２をコードする配列のアラインメント（例えば、成熟蛋白質のＮ−末端の約１６５残基）により、一般式：
【０１０８】
【化１】
0004404923.tif 000002
［式中、各縮重位置「Ｘ」は、ヒト、マウス、ニワトリ、もしくはゼブラフィッシュのＳｈｈクローンの内の一つにおける位置に生じるアミノ酸であることが可能であるか、そうでなければこのライブラリーを拡張するために、各Ｘを、これらの位置の各々において天然の状態で出現するアミノ酸についての保存的置換となろうアミノ酸の中から選択することも可能である］
により表されるＳｈｈポリペプチドの縮重セットが産生される。例えば、Ｘａａ（１）は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｒｙ、もしくはＴｒｐを表し；Ｘａａ（２）は、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、もしくはＬｙｓを表し；Ｘａａ（３）は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、もしくはＴｈｒを表し；Ｘａａ（４）はＧｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、もしくはＴｈｒを表し；Ｘａａ（５）は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、もしくはＧｌｎを表し；Ｘａａ（６）は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、もしくはＨｉｓを表し；Ｘａａ（７）は、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｙ、Ｔｒｐ、もしくはＰｈｅを表し；Ｘａａ（８）は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、もしくはＨｉｓを表し；Ｘａａ（９）は、Ｍｅｔ、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、もしくはＴｈｒを表し；そしてＸａａ（１０）は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、もしくはＴｈｒを表す。更に一層拡張的なライブラリーでは、各Ｘはいずれかのアミノ酸から選択されることが可能である。
【０１０９】
類似様式で、ヒト、マウス、ニワトリ、およびゼブラフィッシュのヘッジホッグクローン（図５Ｂ）の内のいずれかのアライメントを、一般式
【０１１０】
【化２】
0004404923.tif 000003
［式中、先と同様に、各縮重位置「Ｘ」は、野生型クローンの内の一つの対応位置で生じるアミノ酸であることが可能であり、かつ保存的置換となるであろうアミノ酸残基を含むこともできるか、そうでなければ各Ｘはいずれかのアミノ酸であることが可能である］
により表される縮重ポリペプチド配列を提供することが可能である。例示的態様では、Ｘａａ（１）は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、もしくはＴｙｒを表し；Ｘａａ（２）は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、もしくはＩｌｅを表し；Ｘａａ（３）は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、もしくはＡｒｇを表し；Ｘａａ（４）はＬｙｓ、Ａｒｇ、もしくはＨｉｓを表し；Ｘａａ（５）は、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、もしくはアミノ酸ギャップを表し；Ｘａａ（６）は、Ｇｌ
ｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、もしくはアミノ酸ギャップを表し；Ｘａａ（７）は、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、もしくはＬｙｓを表し；Ｘａａ（８）は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、もしくはＴｈｒを表し；Ｘａａ（９）は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、もしくはＴｈｒを表し；Ｘａａ（１０）は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、もしくはＴｈｒを表し；Ｘａａ（１１）は、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、もしくはＡｓｎを表し；Ｘａａ（１２）は、Ｍｅｔ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、もしくはＴｈｒを表し；Ｘａａ（１３）は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、もしくはＰｒｏを表し；Ｘａａ（１４）は、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、もしくはＬｙｓを表し；Ｘａａ（１５）は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、もしくはＬｙｓを表し；Ｘａａ（１６）は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、もしくはＴｙｒを表し；Ｘａａ（１７）は、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、もしくはＬｙｓを表し；Ｘａａ（１８）は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、もしくはＴｈｒを表し；Ｘａａ（１９）は、ＴｈｒもしくはＳｅｒを表し；Ｘａａ（２０）は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、もしくはＧｌｎを表し；Ｘａａ（２１）は、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、もしくはＬｙｓを表し；Ｘａａ（２２）は、ＡｓｐもしくはＧｌｕを表し；Ｘａａ（２３）はＳｅｒもしくはＴｈｒを表し；Ｘａａ（２４）は、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、もしくはＡｓｎを表し；Ｘａａ（２５）はＧｌｕもしくはＡｓｐを表し；Ｘａａ（２６）は、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、もしくはＬｙｓを表し；Ｘａａ（２７）はＧｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、もしくはＩｌｅを表し；Ｘａａ（２８）は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、もしくはＳｅｒを表し；Ｘａａ（２９）は、Ｍｅｔ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、もしくはＨｉｓを表し；Ｘａａ（３０）は、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、もしくはＬｙｓを表し；Ｘａａ（３１）は、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、もしくはＬｙｓを表し；Ｘａａ（３２）は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、もしくはＰｈｅを表し；Ｘａａ（３３）は、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、もしくはＧｌｕを表し；Ｘａａ（３４）は、ＡｓｐもしくはＧｌｕを表し；Ｘａａ（３５）は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、もしくはＩｌｅを表し；Ｘａａ（３６）は、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、もしくはＬｙｓを表し；Ｘａａ（３７）は、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、もしくはＳｅｒを表し；Ｘａａ（３８）は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、もしくはＣｙｓを表し；Ｘａａ（３９）は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、もしくはＳｅｒを表し；Ｘａａ（４０）は、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、もしくはＬｙｓを表し；Ｘａａ（４１）は、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、もしくはＩｌｅを表し；Ｘａａ（４２）は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、もしくはＩｌｅを表し；Ｘａａ（４３）は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、もしくはＣｙｓを表し；Ｘａａ（４４）は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、もしくはＳｅｒを表し；Ｘａａ（４５）はＡｓｐもしくはＧｌｕを表す。
【０１１１】
潜在的なｈｈ同族体のライブラリーを縮重オリゴヌクレオチド配列から作製することが可能である方法は多く存在する。縮重遺伝子配列の化学合成を自動化ＤＮＡ合成機において実施し、そしてその後に合成遺伝子を適切な発現ベクターに連結することが可能である。遺伝子の縮重セットの目的は、一つの混合物の中に潜在的ｈｈ配列の所望されるセットをコードする全配列を提供することである。縮重オリゴヌクレオチドの合成は当該技術分野においては熟知されている（例えば、Ｎａｒａｎｇ，ＳＡ（１９８３）  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ３９：３；Ｉｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ、Ｐｒｏｃ  ３ｒｄ  Ｃｌａｖｅｌａｎｄ  Ｓｙｍｐｏｓ．  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、ｅｄ．ＡＧ  Ｗａｌｔｏｎ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  ｐｐ２７３−２８９；Ｉｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）  Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８：１０５６；Ｉｋｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）  Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １１：４７７、を参照されたい）。このような技術は他の蛋白質の定方向進化において利用されている（例えば、Ｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０；Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）  ＰＮＡＳ  ８９：２４２９−２４３３；Ｄｅｖｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）
Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：４０４−４０６；Ｃｗｉｒｌａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）
ＰＮＡＳ  ８７：６３７８−６３８２；ならびに米国特許第５，２２３，４０９号、第５，１９８，３４６号、および第５，０９６，８１５号を参照されたい）。
【０１１２】
点突然変異により作製される組み合わせライブラリーの遺伝子産物のスクリーニングのため、および所定の性質を有する遺伝子産物についてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための広範囲にわたる技術が当該技術分野において知られている。このような技術は一般的には、ヘジホッグ同族体の組み合わせ突然変異誘発により作製される遺伝子ライブラリーの迅速スクリーニングに適用可能であろう。大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするために最も広く用いられる技術は典型的には、複製可能な発現ベクター内への遺伝子ライブラリーのクローニング、得られるベクターライブラリーでの適切な細胞の形質転換、および所望される活性の検出により、その産物が検出される遺伝子をコードするベクターの比較的簡便な単離を容易にする条件下でのその組み合わせ遺伝子の発現を含む。以下に記載される説明的なアッセイの各々により、必要に応じて高処理能分析が可能となり、組み合わせ突然変異誘発技術により作製される大量の縮重ヘッジホッグ配列がスクリーニングされる。
【０１１３】
ある態様では、この組み合わせライブラリーは分泌されるように（例えば、このライブラリーのポリペプチドは全てシグナルペプチドを含むが、貫膜ドメインもしくは細胞質ドメインは含まない）設計され、かつ胎仔細胞と同時培養することが可能な真核生物細胞をトランスフェクトするのに用いられる。組み合わせライブラリーを発現する細胞により分泌される機能的ヘッジホッグ蛋白質は、隣接する胎仔細胞へと拡散し、そして特別な生物学的応答（例えば、説明の目的で挙げるとすると、ニューロンの分化）を誘導するであろう。特別なニューロン細胞（例えば、Ｉｓｌｅｔ−１もしくはＰａｘ−１）のエピトープに対する抗体を用いると、ニューロン誘導の検出パターンは、段階的機能に類似するであろうし、そして活性ヘッジホッグ同族体を産生する細胞の単離（一般的には数回の反復選択周期の後に行われる）を可能にするであろう。同様に、ｈｈアンタゴニストを、その培養培地に添加される野生型ヘッジホッグの効果から近接する細胞を保護するための機能性アンタゴニストを産生する細胞の能力により類似様式で選択することが可能である。
【０１１４】
具体的に説明するために、標的細胞を２４−ウエルマイクロタイタープレート内で培養する。他の真核生物細胞を組み合わせｈｈ遺伝子ライブラリーでトランスフェクトし、そしてそのマイクロタイタープレートのウエル内に適合することが可能な細胞培養挿入物（例えば、Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、カタログ＃４０４４６）内で培養する。この細胞培養挿入物をそのウエル内に入れ、その結果、その挿入物内の細胞により分泌される組換えｈｈ同族体はその挿入物の多孔性底部を介して拡散し、そしてそのマイクロタイタープレートウエル内の標的細胞と接触する。ヘッジホッグ蛋白質の機能性形態が標的細胞内での測定可能な応答を産生するのに十分な期間が経過した後に、その挿入物を除去し、そしてその標的細胞における変異体ヘッジホッグ蛋白質の効果を決定する。例えば、標的細胞が神経冠細胞であり、かつｈｈ同族体からの所望される活性がニューロン分化の誘導である場合には、Ｉｓｌｅｔ−１に特異的な蛍光ラベル化抗体もしくは他のニューロンマーカーを用いて、そのウエル内の機能性ｈｈの指標としての標的細胞の誘導についての評定を行うことが可能である。活性について陽性の評価を示すウエルに相当する挿入物からの細胞を破裂により取り出し、そして幾つかの挿入断片について再培養を行うが、この課程を活性クローンが同定されるまで反復する。
【０１１５】
更に他のスクリーニングアッセイでは、候補となるヘッジホッグ遺伝子産物が細胞もしくはウイルス粒子の表面上に提示され、かつ特定の細胞もしくはウイルス粒子がこの遺伝子産物を介してヘッジホッグ結合性部分（例えば、ヘッジホッグレセプター、もしくはヘッジホッグ蛋白質と結合するリガンド）と接着する能力が「パニングアッセイ」において検出される。このようなパニング段階は胎仔から培養される細胞上で実施することが可能である。例えば、この遺伝子ライブラリーを細菌細胞の表面膜蛋白質についてその遺伝子内にクローン化させることが可能であり、かつ得られる融合蛋白質をパニングにより検出することが可能である（Ｌａｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、国際公開第８８／０６６３０号；Ｆｕｃｈｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７０−１３７１：およびＧｏｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）  ＴＩＢＳ  １８：１３６−１４０）。類似様式で、ｈｈに結合する蛍光ラベル化分子を用いて、潜在的な機能性ｈｈ同族体についての評価を行うことが可能である。細胞を肉眼的に調査し、かつ蛍光顕微鏡下で分離することが可能であるか、あるいは細胞の形態により蛍光活性化セルソーターによる分離が可能になる場合がある。
【０１１６】
別の態様では、この遺伝子ライブラリーはウイルス粒子の表面上で融合蛋白質として発現される。例えば線維状ファージ系では、外来性ペプチド配列を感染性ファージの表面上に発現させ、そのことにより２つの重要な利益を付与することが可能である。第一には、これらのファージを非常に高濃度の親和性マトリックスに適用可能であるために、大量のファージを一度にスクリーニングすることが可能である。第二に、各感染性ファージはその表面上に組み合わせ遺伝子産物を提示するため、特別なファージが低収率で親和性マトリックスから回収される場合には、そのファージをもう一度別の回の感染により増幅することが可能である。ほぼ同一の大腸菌線維状ファージ  Ｍ１３、ｆｄ、およびｆｌの群が最も頻繁にファージ提示ライブラリーにおいて用いられ、ファージｇＩＩＩもしくはｇＶＩＩＩのいずれかのコート蛋白質を用いてウイルス粒子の最終パッケージングの破壊を伴うことなく融合蛋白質を作製することが可能である（Ｌａｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  国際公開第９０／０２９０９号；Ｇａｒｒａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．、国際公開第９２／０９６９０号；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．、（１９９２）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２６７：１６００７−１６０１０；Ｇｒｉｆｆｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）  ＥＭＢＯ  Ｊ
１２：７２５−７３４；Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、（１９９１）  Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８、およびＢａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  ＰＮＡＳ  ８９：４４５７−４４６１）。
【０１１７】
具体的な態様では、組換えファージ抗体系（ＲＰＡＳ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｃａｔａｌｏｇ  ｎｕｍｂｅｒ  ２７−９４００−０１）は、ｈｈ組み合わせライブラリーを発現およびスクリーニングするのに用いるために容易に改変することが可能である。例えば、ＲＰＡＳキットのｐＣＡＮＴＡＢ  ５  ファゲミドは、ファージｇＩＩＩコート蛋白質をコードする遺伝子を含む。このｈｈ組み合わせ遺伝子ライブラリーをｇＩＩＩシグナル配列の近傍のファゲミド内にクローン化させることが可能であり、その結果その遺伝子はｇＩＩＩ融合蛋白質として発現されるであろう。連結後、このファゲミドを用いてコンピテント大腸菌ＴＧ１細胞を形質転換させる。形質転換化細胞をその後にＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージで感染させてファゲミドおよびその候補物ｈｈ遺伝子挿入断片を救済する。得られる組換えファージは特異的候補物ｈｈをコードするファゲミドＤＮＡを含み、かつ対応する融合コート蛋白質の一つもしくは複数のコピーを提示する。ファージが提示する候補物ヘッジホッグ蛋白質はｈｈレセプターに結合可能であり、この候補ヘッジホッグ蛋白質をパニングにより選択もしくは濃縮する。例えば、ファージライブラリーを培養化胎仔細胞に適用させ、そして非結合のファージをその細胞から洗い出すことが可能である。その後に結合化ファージを単離し、そしてその組換えファージが野生型タイプｇＩＩＩコート蛋白質の少なくとも一つのコピーを発現する場合には、それらのファージは大腸菌に感染する能力を保持しているであろう。従って、連続周期の大腸菌の再感染およびパニング
によりｈｈ同族体が高度に濃縮され、このｈｈ同族体をその後に、アゴニストおよびアンタゴニストを分化させる目的で更に進んだ生物学的活性についてのスクリーニングにかけることが可能である。その上、例えば、２つもしくはそれを上回る異なるｈｈ−応答性細胞での分別性パニングは、野生型蛋白質に関連する選択的に一層範囲の狭い生物学的活性のヘッジホッグ同族体の単離を容易にさせることが可能である。
【０１１８】
本発明は更に、本発明の脊椎動物ｈｈポリペプチドのｈｈレセプターとの結合を破壊することが可能である擬態物（例えば、ペプチドもしくは非ペプチド性作用物質）を産生するための脊椎動物ｈｈ蛋白質の変形法を供給する。従って、先に記載されるような突然変異誘発技術は更に、例えば主題の脊椎動物ｈｈポリペプチドの他の細胞外マトリックス構成成分への結合に関与する蛋白質−蛋白質相互作用に参与するヘッジホッグ蛋白質の決定基のマップを作製するのにも有用である。説明するために記載すると、ｈｈレセプターの分子認識に関わる主題のｈｈポリペプチドもしくはｈｈリガンドの重要残基を決定および使用して、本物のヘッジホッグ蛋白質の、その部分との結合を競合的に阻害するヘッジホッグ由来のペプチド疑似物を作製することが可能である。例えば他の細胞外蛋白質を結合するのに関わる各主題のヘッジホッグ蛋白質のアミノ酸残基のマッピングを行う目的でスキャニング突然変異誘発を利用することにより、ヘッジホッグ蛋白質のアミノ酸残基を模倣（このことにより相互作用が容易になる）するペプチド疑似物化合物を作製することが可能である。その後にこのような疑似物を用いてヘッジホッグ蛋白質の正常機能を妨害することができる。例えば、このような残基の非加水分解性ペプチドアナログを、ベンゾジアゼピン（例えば、Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ内、Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｓｈａｌｌ  ｅｄ．、ＥＳＣＯＭ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｌｅｉｄｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ、１９８８、を参照されたい）、アゼピン（例えば、Ｈｕｆｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ内、Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｓｈａｌｌ  ｅｄ．、ＥＳＣＯＭ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｌｅｉｄｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ、１９８８、を参照されたい）、置換化ガンマーラクタム環（Ｇａｒｖｅｙ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ；Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ中、Ｇ，Ｒ，Ｍａｒｓｈａｌｌ  ｅｄ．、ＥＳＣＯＭ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ；Ｌｅｉｄｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ、１９８８、を参照されたい）、ケト−メチレン  擬ペプチド（Ｅｗｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ２９：２９５；およびＥｗｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ内（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ９ｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ）  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．社、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＩＬ、１９８５）、β−ターンジペプチドコア（Ｎａｇａｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ  ２６：６４７；およびＳａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）  Ｊ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ  １：１２３１）、ならびにβ−アミノアルコール（Ｇｏｒｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  １２６：４１９；およびＤａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  １３４：７１）を用いて作製することが可能である。
【０１１９】
本発明の他の態様は、脊椎動物ヘッジホッグ蛋白質との特異的反応性を示す抗体に関する。例えば、ヘッジホッグ蛋白質から取得される免疫原（例えば、ｃＤＮＡ配列を基にするもの）を用いることにより、抗−蛋白質／抗−ペプチド抗血清もしくはモノクローナル抗体を、標準的プロトコールにより作製することが可能である（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ｅｄ．ｂｙ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ
Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ：１９８８）を参照されたい）。哺乳類（例えば、マウス、ハムスター、もしくはウサギ）をこのペプチドの免疫原性形態（例えば、脊椎動物ｈｈポリペプチド、もしくは抗体応答を誘導することが可
能な抗原性断片）で免疫化することが可能である。蛋白質もしくはペプチドに免疫原性を付与する技術には、担体への複合体形成もしくは当該技術分野で熟知される他の技術が含まれる。ヘッジホッグ蛋白質の免疫原性部分をアジュバントの存在下で投与することが可能である。免疫化の進行を、血漿もしくは血清中の抗体力価の検出によりモニターすることが可能である。標準的ＥＬＩＳＡもしくは他の免疫アッセイを抗原としての免疫原と共に用いて抗体のレベルを評価することが可能である。好ましい態様では主題の抗体は脊椎動物生物体（例えば、哺乳類）のヘッジホッグ蛋白質、もしくは密接に関与する同族体（例えば、少なくとも８５％の相同性を示す、好ましくは少なくとも９０％の相同性を示す、そしてより好ましくは少なくとも９５％の相同性を示すもの）の抗原決定基（例えば、配列番号８〜１４により表される蛋白質の抗原決定基）、に対して免疫特異性を示す。本発明の更に好ましい態様では、例えば個別のヘッジホッグ同族体（例えば、Ｓｈｈ対Ｄｈｈ対Ｉｈｈ）に対する免疫選択性を示す抗体を提供する目的では、抗−ｈｈポリペプチド抗体は、例えば配列番号８〜１４の内のいずれかに対して８５％を下回る相同性を示す；別の例では配列番号８〜１４の内のいずれかに対して９５％を下回る相同性を示す；また別の例では配列番号８〜１４の内の一つと９８〜９９％を下回る相同性）を示す蛋白質とは実質的には交差反応性を示さない（すなわち、特異的には反応しない）。「実質的には交差反応性を示さない」によっては、この抗体が、配列番号８〜１４の蛋白質の内の一つもしくは複数に対する抗体の結合親和性と比較して少なくとも１桁程度の、より好ましくは少なくとも２桁程度の、そして更に好ましくは３桁程度低い、非相同性蛋白質に対する親和性を有することが意味される。
【０１２０】
ヘッジホッグ蛋白質の抗原調製物での動物の免疫化の後には、抗−ｈｈ抗血清を取得し、かつ所望される場合にはポリクローナル抗−ｈｈ抗体を血清から単離することが可能である。モノクローナル抗体を産生するには、抗体産生性細胞（白血球）を免疫化動物から回収し、そしてそれを標準的体細胞融合方法により不滅性細胞（例えば、白血病細胞）と融合させてハイブリーマ細胞を産生することが可能である。このような技術は当該技術分野において熟知されており、例えば、ハイブリドーマ技術（元々は、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）  Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５−４９７、により開発された）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、（１９８３）  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ、４：７２）、およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．、（１９８５）  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．ｐｐ．７７−９６）が含まれる。ハイブリドーマ細胞は本発明の脊椎動物ｈｈポリペプチドとの特異的反応性を示す抗体の産生について免疫化学的な方法でスクリーニングし、そしてモノクローナル抗体を、そのようなハイブリドーマ細胞を含む培養物から単離することが可能である。
【０１２１】
用語「抗体」は本明細書において用いられる場合には、主題の脊椎動物ｈｈポリペプチドの内の一つとの特異的反応性をも示すその断片を含むことが意図される。抗体を通常の技術を用いて断片化し、そしてその断片を完全抗体について先に記載したのと同一の様式で利用性についてのスクリーニングを行うことが可能である。例えば、Ｆ（ａｂ）２断片をペプシンでの抗体の処理により作製することが可能である。得られるＦ（ａｂ）２断片をジスルフィド結合を還元するように処理してＦａｂ断片を産生することが可能である。本発明の抗体は更に、その抗体の少なくとも一つのＣＤＲ領域により付与されるヘッジホッグ蛋白質に対する親和性を有する二重特異性でありかつキメラな分子を含むことが意図される。
【０１２２】
本物のヘッジホッグポリペプチドもしくはヘッジホッグ変異体に対するモノクローナルおよびポリクローナルの両抗体（Ａｂ）、ならびに抗体断片（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ）２）を用いて、一つもしくは複数のヘッジホッグ蛋白質の作用を遮断し、そして例
えば胎仔形成および／または分化組織の維持におけるこれらの蛋白質の役割の研究を可能にすることが可能である。例えば、精製されたモノクローナルＡｂ（複数）をニワトリヒナもしくはマウス胎仔の肢芽内に直接注入することが可能である。以下の実施例には、ｈｈが例えば１０．５日令の胎仔の肢芽内で発現されることが証明されている。従ってこの発達段階における抗−ｈｈＡｂ（複数）の使用により、インビボでの四肢の形成におけるｈｈの効果の評価が可能になり得る。類似の研究方法では、抗−ｈｈモノクローナルＡｂ（複数）を産生するハイブリドーマもしくは抗−ｈｈＡｂ（複数）が懸濁されている生物分解性ゲルを、ｈｈの作用が遮断されることが意図される領域の近位に存在するかもしくはその領域内に含まれる部位に移植することが可能である。この性質の実験は、四肢のパターン形成および組織形成に関わる可能性のあるこの因子および他の因子の役割を解読する手助けとなり得る。
【０１２３】
ヘッジホッグエピトープに特異的に結合する抗体を、各主題のｈｈポリペプチドの発現の量およびパターンを評価する目的で、組織試料の免疫学的組織染色にも用いることが可能である。抗−ヘッジホッグ抗体を免疫沈降および免疫ブロッティングにおいて診断的に用いて、臨床検査用方法の一部分として組織内のヘッジホッグ蛋白質レベルを検出および評価することが可能である。例えば、このような測定法は神経性疾患（例えば、脱神経様もしくは非活動性様症状によって表される疾患）の発症もしくは進行の予想評価の際に有用であり得る。同様に、個体におけるｈｈレベルをモニターする能力により、そのような疾患に冒された個体のための一定の療養法の効能を決定することが可能となり得る。ｈｈポリペプチドのレベルは体液（例えば、脳脊髄液もしくは羊液の試料）中において測定することができるか、あるいは組織（例えば、生検により取得されるもの）において測定することが可能である。抗−ｈｈ抗体を用いる診断アッセイには、例えば、神経変性性疾患、特に出生時に出現する疾患の初期診断を補助するように設計される免疫アッセイが含まれ得る。抗−ｈｈポリペプチド抗体を用いる診断アッセイは更に、分化上での疾患、ならびに新生物性もしくは過形成性疾患の初期診断および表現型決定の際の補助となるように設計された免疫アッセイも含むことが可能である。
【０１２４】
本発明の抗−ｈｈ抗体の他の適用法は、発現ベクター（例えば、λｇｔ１１、λｇｔ１８−３２、λＺＡＰ、およびλＯＲＦ８）内に構築されるｃＤＮＡライブラリーの免疫学的スクリーニングの際に実施される。このタイプのメッセンジャーライブラリーは正しい読み取り枠および配向で挿入されているコーディング配列を有するため、このライブラリーは融合蛋白質を産生することが可能である。例えば、λｇｔ１１は、アミノ末端がβ−ガラクトシダーゼアミノ酸配列でできており、かつカルボキシ末端が外来性ポリペプチドでできている融合蛋白質を産生することが可能である。ｈｈ蛋白質の抗原性エピトープ（例えば、同一種からの特別なヘッジホッグ蛋白質もしくは他の同族体のオートローガスエピトープ）をその後に抗体で検出することが可能であるが、それは例えば、感染させたプレートから取り出してきたニトロセルロースフィルターを抗−ｈｈ抗体と反応させる際に可能となる。このアッセイにより検出される陽性ファージを、その後に感染化プレートから単離することが可能である。従って、ヘッジホッグ同族体の存在を検出し、そしてそれを他の動物からクローン化することが可能であり、同様にヒトからのイソ形態（スプライシング変異体を初めとするもの）を変化させることも可能である。
【０１２５】
それに加えて、脊椎動物生物体からのｈｈ遺伝子のクローニングから決定されるヌクレオチド配列は更に、他のタイプの細胞（例えば、他の組織からの細胞）内でのヘッジホッグ同族体、ならびに他の脊椎動物生物体からのｈｈ同族体の同定および／またはクローニングの際の使用のために設計されるプローブおよびプライマーの作製を考慮したものとなるであろう。例えば、本発明は更に実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含むプローブ／プライマーを提供し、そのオリゴヌクレオチドは緊縮条件下で、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号７、もしくは
天然に存在するそれらの突然変異体からなる群から選択されるセンスもしくはアンチセンス配列の内の少なくとも１０の連続ヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含む。例えば、配列番号１〜７に表される核酸を基にするプライマーをＰＣＲ反応に用いてヘッジホッグ同族体をクローン化することが可能である。同様に、主題のヘッジホッグ配列を基にするプローブを用いて、同一蛋白質もしくは同族体蛋白質をコードする転写物もしくはゲノム配列を検出することが可能である。好ましい態様では、このプローブは更にそれに結合させてあるラベル基を含み、かつ検出されることが可能である（例えば、このラベル基は、放射性同位体、蛍光性化合物、酵素、および酵素補助因子からなる群より選択される）。
【０１２６】
このようなプローブを、ヘッジホッグ蛋白質を過誤発現する細胞もしくは組織を同定するための診断検査キットの一部分として用いることも可能であり、それは例えば、患者からの細胞試料内のヘッジホッグをコードする核酸のレベルを測定すること：一例では、ｈｈ  ｍＲＮＡレベルを検出するか、あるいはゲノムｈｈ遺伝子が突然変異もしくは欠損を生じているか否かを決定することにより実施される。
【０１２７】
説明のために記載すると、ヌクレオチドプローブを主題のヘッジホッグ遺伝子から作製することが可能であり、そしてこのヌクレオチドプローブにより、未処理組織および組織試料をヘッジホッグをコードする転写物の存在（もしくは非存在）について組織学的にスクリーニングすることが容易になる。抗−ヘッジホッグ抗体の診断的使用に類似して、ｈｈメッセージもしくはゲノムｈｈ配列に対するプローブの使用を、対立遺伝子突然変異（これは、例えば新生物性もしくは過形成性疾患（例えば、望ましくない細胞増殖）、あるいは異常な組織分化の際に出現する可能性がある）の予防的および治療的評価法の両方について用いることが可能である。既述の要領での免疫アッセイと組み合わせて用いると、このオリゴヌクレオチドプローブは、ヘッジホッグ蛋白質の発現（もしくはその欠損）に関連する幾つかの異常性に関与する可能性のある進行性疾患についての分子的基盤の決定を容易にするのを補助することが可能である。例えば、ポリペプチド合成上での変異がコーディング配列における突然変異とは区別されることが可能である。
【０１２８】
従って、本発明の方法は、被験体が分化もしくは望ましくない細胞増殖の異常制御を特徴とする疾患についての危険性にさらされているかどうかを決定するための方法を提供する。例えば、主題のアッセイを、ヘッジホッグ遺伝子の内の一つもしくは複数における変化に関連する遺伝子的および後天的疾患のスクリーニングおよび診断に用いることが可能である。好ましいい態様では、主題の方法は一般的に：被験体（例えば、ヒト患者）の組織試料内における遺伝子病変の存在もしくは非存在を決定することを含むことを特徴とすることが可能であり、その遺伝子病変は、（ｉ）ヘッジホッグ蛋白質をコードする遺伝子の突然変異もしくは（ｉｉ）ヘッジホッグ遺伝子の過誤発現を特徴とする。説明のために記載するが、そのような遺伝子病変を、（ｉ）ヘッジホッグ遺伝子からの一つもしくは複数のヌクレオチドの欠失、（ｉｉ）ヘッジホッグ遺伝子への一つもしくは複数のヌクレオチドの添加、（ｉｉｉ）ヘッジホッグ遺伝子の一つもしくは複数のヌクレオチドの置換、（ｉｖ）ヘッジホッグ遺伝子の総括的染色体の再配列、（ｖ）ｈｈ遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物のレベルの総括的変化、（ｖｉ）脊椎動物ｈｈ遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物の非野生型スプライシングパターンの存在、および（ｖｉｉ）ヘッジホッグ蛋白質の非野生型タイプのレベル、の内の少なくとも一つの存在を確認することにより決定することが可能である。本発明のある態様では、配列番号１〜７、もしくは天然に存在するそれらの突然変異体、あるいは脊椎動物ｈｈ遺伝子と天然の状態で関連する５’もしくは３’フランク配列またはイントロン配列からなる群から選択されるセンスもしくはアンチセンス配列にハイブリダイズすることが可能なヌクレオチド配列の領域を含むオリゴヌクレオチドを含むプローブ／プライマーが提供される。このプローブを組織試料の核酸に露出し；そしてそのプローブの試料核酸へのハイブリダイゼーションを検出する。ある態
様では、病変の検出は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号および第４，６８３，２０２号を参照されたい）においてか、あるいは別法では連結連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、Ｌａｎｄｅｇｒａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４１：１０７７−１０８０；およびＮａＫａｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．（１９４４）  ＰＮＡＳ  ９１：３６０−３６４、を参照されたい）において、このプローブ／プライマーを利用することを含み、これらの反応の内の後者は、ヘッジホッグ遺伝子内の点突然変異を検出するのに特に有用であり得る。別法では、免疫アッセイを利用して、可溶性もしくは膜結合性のいずれかのｈｈ蛋白質のレベルを決定することが可能である。
【０１２９】
更に外の診断用スクリーニングではヘッジホッグ蛋白質の源が直接利用される。本明細書に記載されるように本発明のヘッジホッグ蛋白質は分化の誘導に関与している。従って、一定の分化による疾患および／または増殖性疾患の病因を、冒されている組織によるヘッジホッグ感受性の喪失により表すことが可能である。その後にヘッジホッグ蛋白質の誘導的な量に対する組織もしくは細胞試料の応答を用いて、一定の細胞性形質転換および変性性症状を検出および特徴付けることが可能である。例えば、患者からの組織／細胞試料をヘッジホッグアゴニストで処理し、そしてその処理に対するその組織の応答を決定することが可能である。応答を、例えばヘッジホッグ誘導の結果としての表現型の変化を基にして定質化および／または定量化することが可能である。例えば、ヘッジホッグ処理により誘導される遺伝子産物の発現を免疫アッセイにより採点することが可能である。パッチド（ｐａｔｃｈｅｄ）蛋白質は例えば、Ｄｒｏｓ−ＨＨに応答してドロソフィラ内では正の方向の制御を受け、そして本明細書における所見と照らし合わせてみると、仮想的脊椎動物同族体も同様に正の方向の制御を受けるであろう。従って、患者試料の細胞におけるパッチッド（ｐａｔｃｈｅｄ）の発現の検出により、ヘッジホッグ応答性ではない組織の検出が可能となり得る。同様に、他の表現型マーカーについての採点により、ヘッジホッグに対する応答を決定するための手法が提供される。
【０１３０】
それに加えて、精製された組換えヘッジホッグポリペプチドを入手可能にすることにより、本発明は薬物についてのスクリーニングに利用することが可能なアッセイの開発が容易になるが、そのような薬物にはヘッジホッグ同族体が含まれており、このヘッジホッグ同族体は主題のヘッジホッグポリペプチドの正常な細胞性機能、あるいは細胞性分化および／または増殖の異常発生過程、ならびにそれらに随伴する疾患におけるそれらの役割のアゴニストもしくはアンタゴニストのいずれかである。ある態様では、このアッセイにより、ヘッジホッグポリペプチドとヘッジホッグレセプターとの間の結合を調節する化合物の能力が評定される。様々なアッセイフォーマットが十分なものであろうし、そして本発明を考慮することにより当業者はそのようなアッセイフォーマットを思い浮かべるであろう。
【０１３１】
化合物および天然の抽出物のライブラリーを検査する多くの薬物スクリーニングプログラムでは、一定の期間で調査される化合物数を最大限にさせる目的で高処理能アッセイが所望される。無細胞系において実施されるアッセイ（例えば、精製された、もしくは半精製された蛋白質を用いることに端を発することがあるアッセイ）が「初期」スクリーニングとしては好まれることがしばしばあるが、その理由は、それらの系が、検査化合物により媒介される分子標的の変化の迅速な進行および比較的容易なスクリーニングを可能にさせるために作製され得るという点にある。それに加えて、検査化合物の細胞性毒性および／または生物学的利用性の効果は一般的にはインビトロでの系では無視されることが可能であり、その代わりにそのようなアッセイは、レセプター蛋白質との結合親和性の変化の際に出現する可能性がある分子標的における薬物の効果について主に焦点を当てている。従って、本発明の例示的スクリーニングアッセイにおいては、目的の化合物を、通常はヘッジホッグ蛋白質と結合することが可能なヘッジホッグレセプターポリペプチドと接触さ
せる。化合物とレセプターとの混合物にはその後に、ヘッジホッグポリペプチドを含む組成物を添加する。レセプター／ヘッジホッグ複合体の検出および定量化により、そのレセプター蛋白質とヘッジホッグポリペプチドとの間の複合体形成を阻害する（もしくは亢進させる）時点でのその化合物の効力を決定するための手段が提供される。その化合物の効力は、検査化合物の様々な濃度を用いて取得されるデータからの用量応答曲線を作製することにより評定することが可能である。その上、対照アッセイを実施して比較用のベースラインを提供することも可能である。対照アッセイにおいては単離および精製されたヘッジホッグポリペプチドがレセプター蛋白質を含む組成物に添加され、そしてレセプター／ヘッジホッグ複合体の形成が検査化合物の非存在下で定量化される。
【０１３２】
具体的な態様では、ヘッジホッグレセプターとして利用されるポリペプチドを、ドロソフィラのパッチド（ｐａｔｃｈｅｄ）蛋白質もしくはその脊椎動物同族体から作製することが可能である。例えば、Ｓｈｈの、形質転換ドロソフィラにおけるＤｒｏｓ−ＨＨを活性化する経路に対する能力を考慮すると（実施例４を参照されたい）、脊椎動物ヘッジホッグ蛋白質はドロソフィラＨＨレセプターに結合することが可能であると結論付けすることができる。従って例示的スクリーニングアッセイには、パッチ化（ｐａｔｃｈｅｄ）蛋白質の適切な部分（橋列番号４２）が含まれ、その例は、実質的な細胞外ドメイン（例えば、残基Ｌｙｓ−９３〜Ｈｉｓ−４２６、およびＡｒｇ−７００〜Ａｒｇ−９６６）の内の一つもしくは両方である。例えば、パッチ化蛋白質は可溶性形態で提供されることが可能であり（その例は、細胞外ドメインの内の一つのものの調製物、もしくは非構築型リンカーにより共役結合で連結される二つの細胞外ドメインの両方のものの調製物（例えば、Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）  ＰＮＡＳ  ８５：４８７９；および米国特許第５，０９１，５１３号を参照されたい）であり）、あるいはそのパッチ化蛋白質がリポソーム性調製物の部分として提供されるか、もしくは細胞の表面上に発現されることが可能である。
【０１３３】
ヘッジホッグポリペプチドとヘッジホッグレセプターとの間の複合体形成は様々な技術により検出することができる。例えば、複合体の形成の調節を、一例として検出性ラベル化蛋白質（例えば、放射性ラベル化、蛍光性ラベル化、もしくは酵素的ラベル化ヘッジホッグポリペプチド）を用いることで、免疫アッセイによるか、もしくはクロマトグラフィー的検出により定量化することが可能である。
【０１３４】
典型的には、ヘッジホッグレセプッターもしくはヘッジホッグポリペプチドのいずれかを固定化させて、その蛋白質の内の一つの非複合体形成化形態からのレセプター／ヘッジホッグ複合体の分離を容易にさせ、同時にこのアッセイの自動化の便宜を図ることが所望されるであろう。ある態様では融合蛋白質が提供されるが、その融合蛋白質にはその蛋白質をマトリックスに結合できるようにさせるドメインが付加されている。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／レセプター（ＧＳＴ／レセプター）融合蛋白質を、グルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）もしくはグルタチオン誘導化マイクロタイタープレート上に吸収させることが可能であり、それをその後にヘッジホッグポリペプチド（例えば、３５Ｓ−ラベル化ヘッジホッグポリペプチド）および検査化合物と結合させ、そして複合体形成を実施させる条件下で（例えば、塩およびｐＨについての生理学的条件下で）インキュベートすることが可能であるが、もう少し強目の緊縮条件が所望されることもある。インキュベーション後には、そのビーズを洗浄していずれかの非結合化ヘッジホッグポリペプチドを取り除き、そしてマトリックスビーズに結合した放射性ラベルを直接決定する（例えば、シンチレーション液にビーズを浸して行う）か、あるいはレセプター／ヘッジホッグ複合体を解離させた後の上清中での決定が行われる。別法では、この複合体をビーズから解離させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによる分離を行い、そしてそのビーズ分画内に見いだされるヘッジホッグポリペプチドのレベルを標準的電気泳動技術を用いてそのゲルから定量化する。
【０１３５】
マトリックス上に固定化された蛋白質のための他の技術も、この主題のアッセイにおける使用に利用可能である。例えば、ヘッジホッグレセプター蛋白質の可溶性部分を、ビオチンおよびストレプトアビジンの複合体形成を利用して固定化することが可能である。例えば、ビオチニル化レセプター分子を、ビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド）から、当該技術分野において熟知される技術（例えば、ビオチニル化用キット、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社、Ｒｏｃｋｆｏｌｄ、ＩＬ）を用いて調製し、そしてそれをストレプトアビジンでコートした９６ウエルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）のウエル内に固定化することが可能である。別法では、ヘッジホッグレセプターとの反応性は示すが、ヘッジホッグ結合を妨害はしない抗体をそのプレートのウエルに対して誘導化させ、そしてそのレセプターをそのウエル内で抗体複合体形成により捕捉させることが可能である。先の要領で、ヘッジホッグポリペプチドおよび検査化合物の調製物を、そのプレートのレセプター提示性ウエル内でインキュベートし、そしてそのウエル内に捕獲されたレセプター／ヘッジホッグ複合体の量を定量することが可能である。このような複合体を検出するための例示的方法には、ＧＳＴ−固定化複合体について先に記載されるものに加えて、ヘッジホッグポリペプチドとの反応性を示す抗体、あるいはレセプター蛋白質との反応性を示しかつヘッジホッグポリペプチドとの結合について競合的である抗体を用いる、複合体の免疫検出法；ならびにヘッジホッグポリペプチドに関連する酵素活性を検出することによる酵素関連アッセイが含まれる。後者の例では、酵素がヘッジホッグポリペプチドに化学的に複合体形成を行わせるか、あるいはその酵素はヘッジホグポリペプチドとの融合蛋白質として提供されることが可能である。説明のために記載すると、ヘッジホッグポリペプチドをアルカリ性ホスファターゼと化学的に架橋させるか、もしくは遺伝子的に融合させ、そしてその複合体内に捕捉されるヘッジホッグポリペプチドの量をその酵素の色素産生性基質（例えば、パラニトロフェニルホスフェート）を用いて評価することが可能である。同様に、ヘッジホッグポリペプチドおよびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼを含む融合蛋白質を提供し、そして複合体形成を、１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼンを用いてＧＳＴ活性を検出することにより定量化することが可能である（Ｈａｂｉｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９７４）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２４９：７１３０）。
【０１３６】
複合体に捕捉される蛋白質の内の一つを定量化するための免疫検出を頼みとする方法のためには、その蛋白質に対する抗体（例えば、本明細書に記載される抗−ヘッジホッグ抗体）を用いることが可能である。別法では、その複合体内で検出される予定の蛋白質は、融合蛋白質の形態をとる「エピトープ標識化」蛋白質であることが可能であり、これには、ヘッジホッグポリペチドもしくはヘッジホッグレセプター配列に加え、抗体を容易に利用することが可能な第二ポリペプチド（例えば、市販の起源からのもの）が含まれる。例えば、先に記載のＧＳＴ融合蛋白質は、ＧＳＴ部分に対する抗体を用いることで結合の定量化用に用いることも可能である。他の有用なエピトープ標識には、ｍｙｃ−エピトープ（例えば、Ｅｌｌｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６６：２１１５０−２１１５７、を参照されたい）（これはｃ−ｍｙｃからの１０残基を含む）、ならびにｐＦＬＡＧ系（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．社）、もしくはｐＥＺＺ−プロテインＡ系（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、ＮＪ）が含まれる。
【０１３７】
ｈｈレセプターの所望の蛋白質（もしくは他のヘッジホッグ結合性分子）が可溶性形態で提供され得ない場合には、リポソームベシクルを用いてそのレセプターの操作可能かつ単離可能な源を提供することが可能である。例えば、パッチ化蛋白質の本物の形態および組換え形態の両方を、人工脂質ベシクル内（例えば、ホスファチジルコリンリポソーム）もしくは細胞膜由来のベシクル内（例えば、Ｂｅａｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）  Ｃｅｌｌ  ６８：８０９−８１８；Ｎｅｗｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）  Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ  ２２：６１１０−６１１７；およびＲｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６２：１１３６９−１１３７４、を参照されたい）に再構築することが可能である。
【０１３８】
先に記載される無細胞アッセイに加えて、本発明により提供される脊椎動物ヘッジホッグ蛋白質の容易に入手できる源も、小分子のアゴニスト／アンタゴニストなどを同定するための細胞を基にするアッセイの作製を容易にする。組み合わせライブラリーをスクリーニングするために先に記載された細胞を基にするアッセイに類似して、ヘッジホッグ誘導に対して感受性を示す細胞を、ヘッジホッグ蛋白質および目的の検査作用物質と接触させるが、このアッセイでは標的細胞によるヘッジホッグ誘導性応答における調節についての採点は、その検査作用物質の存在および非存在下で行われる。無細胞アッセイと同様に、ヘッジホッグ活性において統計的に有意な変化（阻害もしくは増強のいずれか）を生じる作用物質を同定することが可能である。説明的態様では、運動ニューロン前駆体細胞（神経板の体外移植組織からのもの）を標的細胞として用いることが可能である。このような体外移植化細胞の、例えばＳｈｈでの処理により、その細胞の運動ニューロンへの分化がもたらされる。ＬＩＭホメオドメイン蛋白質Ｉｓｌｅｔ−１（Ｔｈｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）  Ｎｅｕｒｏｎ  ７：８８１−８８９；Ｅｒｉｃｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１５５５−１５６０）と、免疫グロブリン様蛋白質ＳＣ１（Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  １０６：２６−３７）との同時発現を検出することにより、候補作用物質が運動ニューロン分化のＳｈｈ誘導を増強もしくは阻害する能力を測定することが可能である。ヘッジホッグ蛋白質は、精製された源としてか、あるいはその細胞を発現し、かつ標的細胞と一緒に同時培養される細胞／組織の形態で提供されることが可能である。
【０１３９】
更に別の態様では、本発明の方法を使用してヘッジホッグレセプターを単離およびクローン化することが可能である。例えば、本発明の精製化ヘッジホッグ蛋白質を利用して、ヘッジホッグ蛋白質に対する感受性を示す細胞から調製された細胞分画からのヘッジホッグレセプター蛋白質を沈殿させることが可能である。例えば、精製化ヘッジホッグ蛋白質をビオチンで誘導化させ（例えば、ＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎ、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、カタログ番号２１４２０Ｇ、を用いることで）、そしてそのビオチニル化蛋白質を利用して膜結合化ｈｈレセプターを飽和させることが可能である。ヘッジホッグ結合化レセプターを次にはストレプトアビジン上に吸着もしくは固定化させることが可能である。所望される場合には、ヘッジホッグ−レセプター複合体を、化学的架橋剤で架橋結合させることが可能である。このような様式で、ｈｈレセプターを精製するが、好ましくは均一物にほぼ近い状態にまで精製することが可能である。単離されたｈｈレセプターをその後には、例えばトリプシンで部分的に消化させ、そして得られるペプチドを逆相クロマトグラフィーにより分離することが可能である。このクロマトグラフィー分画をその後に、エドマン（Ｅｄｏｍａｎ）分解により分析して、その蛋白質分解性断片の内の２つもしくはそれを上回るものについての一本鎖配列が取得される。これらの各トリプシン分解断片について化学的に決定されたアミノ酸配列からオリゴヌクレオチドプライマーのセットをＰＣＲ用に設計することが可能である。これらのプライマーを用いてゲノムおよびｃＤＮＡの両ライブラリーをスクリーニングすることが可能である。レセプターをクローニングするための類似手法を利用して、例えばソマトッスタチンレセプターのための組換え遺伝子が取得されている（Ｅｐｐｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６７：１５６０３−１５６１２）。
【０１４０】
発現クローニングによりヘッジホッグレセプターを同定するための他の技術は本開示を考慮することで明らかになるであろう。例えば、精製化ｈｈポリペプチドをマイクロタイタープレートのウエル内に固定化し、そして例えばｃＤＮＡライブラリー（例えば、ヘッジホッグ誘導の原因であることが予測される組織からのもの）でトランスフェクトさせた
ＣＯＳ細胞と接触させることが可能である。このパニングアッセイからは、ヘッジホッグレセプター分子を発現する細胞を、固定化させたヘッジホッグ蛋白質への結合に基づいて単離することが可能である。他のクローニング系がＦｌａｎａｇａｎおよびＬｅｄｅｒの国際公開第９２／０６２００号に記載されており、この系は、ヘッジホッグ／アルカリ性ホスファターゼ融合蛋白質への結合を基にしてヘッジホッグレセプターが保存される発現クローニング系の使用を必要とする（Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）  Ｃｅｌｌ
７９：１５７−１６８、も参照されたい）。  本発明の他の態様は、脊椎動物ヘッジホッグ蛋白質に対する感受性を示す細胞の分化段階を誘導および／または維持し、生存率を亢進させ、そして／あるいは増殖を亢進させる方法に関し、その方法は、その細胞を、ｈｈアゴニストもしくはｈｈアンタゴニストと接触させることにより実施されるが、それはそのような状況が保証されることがあるためである。例えば、脊椎動物内の分化組織の定序空間的配置の形成におけるヘッジホッグ蛋白質の明らかに広範囲にわたる関与という本所見を考慮することで、主題の方法を用いてインビトロおよびインビボの両方において一連の異なる脊椎動物組織を作製および／または維持することが可能であろうことが本発明により企画される。ｈｈ作用物質は、それが誘導性もしくは抗誘導性のいずれであったとしても、適切な場合には先に記載されるいずれかの調製物であることが可能であり、これには、単離されたポリペプチド、遺伝子療法用の構築物、アンチセンス分子、ペプチド擬態物、もしくは本明細書において提供される薬物アッセイにおいて同定される作用物質が含まれる。その上、ドロソフィラにおける脊椎動物ヘッジホッグ蛋白質の活性についての所見に基づくと、治療および診断用の使用の目的でのｈｈ作用物質は、Ｄｒｏｓ−ＨＨ蛋白質およびその同族体を含むことが可能である。その上、ヘッジホッグ蛋白質の源は、精製化蛋白質もしくは組換え細胞に加え、一つもしくは複数のヘッジホッグ蛋白質を天然の状態で産生する細胞もしくは組織体外移植片であることが可能である。例えば実施例２に記載されるように、胎仔からの神経管体外移植組織、特に底板組織はＳｈｈポリペプチドのための源を提供することが可能であり、この源を患者内に移植するか、あるいはそうでなくとも適切な場合には、この源により分化の誘導もしくは維持が提供されることが可能である。
【０１４１】
例えば、本方法は細胞培養技術に適用可能である。インビトロニューロン培養系は、神経の発達の研究、ならびに神経栄養性因子（例えば、神経成長因子（ＮＧＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、および脳由来の神経栄養因子（ＢＤＮＦ））の同定のための基本的かつ必要不可欠な道具であることが判明している。一旦ニューロン細胞を最終分化状態にさせたら、その細胞は典型的には他の最終分化細胞タイプに変化することはないであろう。しかしながら、ニューロン細胞はそれにもかかわらず容易にそれらの分化状態を喪失することが可能である。このことは、ニューロン細胞を成体組織からの培養物中で生育させた場合、およびニューロン細胞が再生中に芽株を形成する場合に共通に観察される。本方法は、ニューロン細胞を様々な分化段階に維持する目的での十分な制限的環境を確保するための手法を提供し、かつこの方法を、例えば他の栄養因子の比活性を検査するために設計された細胞培養物に利用することが可能である。主題の方法のこのような態様においては、培養細胞を、ｈｈポリペプチドもしくは既述のアッセイにおいて同定された作用物質と、ニューロン分化を誘導する（例えば、幹細胞の）もしくは分化の喪失を阻止することによる最終分化ニューロン細胞の培養物の完全性を維持させる目的で接触させることが可能である。この培養物中のヘッジホッグ蛋白質の源は、例えば、その細胞培養培地に直接添加されるか、あるいは別法ではポリマー製装置（これは様々なニューロン細胞の成長を支援し、かつその蛋白質に連結させてある）に担持されているおよび／もしくはそこから放出される精製化もしくは半精製化蛋白質から取得され得る。ヘッジホッグ蛋白質の源は更に、予定されるニューロン細胞と同時培養され、かつ組換え野生型ヘッジホッグ蛋白質を産生する細胞であることも可能である。別法では、この源は、組換えヘッジホッグ蛋白質を産生するように工学的に作製されたニューロン細胞それ自体であることも可能である。例示的態様ではナイーブニューロン細胞（例えば、幹細胞）を、その細胞の例えば
知覚ニューロン、もしくは別法では運動ニューロンへの分化を誘導させる目的で、ｈｈアゴニストで処理する。このようなニューロン培養物を、簡便アッセイ系として、そして治療的処理用の移植用細胞の源として用いることが可能である。例えば、ｈｈポリペプチドは、米国特許第５，３１８，９０７号などに記載される嗅覚ニューロン培養物を樹立および維持するのに役立つことがある。
【０１４２】
本発明に従うと、多数の非腫瘍性神経前駆細胞をインビトロで調製し、かつヘッジホッグ蛋白質との接触により分化を誘導させることが可能である。一般的には、動物から神経前駆体細胞を単離する段階、これらの細胞をインビトロもしくはインビボで不滅化させる段階（好ましくは、複数の成長因子の存在下で）、およびこれらの細胞を、ヘッジホッグアゴニストに接触させることにより特別な神経表現型（例えば、ニューロンおよび神経膠）に分化させる段階を含む方法が提供される。
【０１４３】
前駆体細胞は、その前駆体をそれらの分化が必要とされるまで抑制された状況下に維持する持続性阻害的影響下に置かれていると考えられる。しかしながら、これらの細胞を増殖させることを可能にする最近の技術が提供されており、そして最終分化状態をとり、かつそのために非分裂性となっているニューロンとは異なり、これらの前駆体細胞を無制限の数で産生することが可能であり、かつこれらは神経変性性疾患を患う異種および自己宿主内への移植に非常に適している。
【０１４４】
「前駆体」によっては、制限なしに分裂することが可能であり、かつ特異的条件下では最終分化状態をとる（例えば、ニューロンおよび神経膠）娘細胞を産生することが可能なオリゴ分化能もしくは多分化性幹細胞が意味される。これらの細胞を、異種もしくは自己宿主内への移植のために用いることが可能である。「異種」によっては、その前駆体細胞が元々取得されてきた動物以外の宿主が意味される。「自己」によっては、その前駆体細胞が元々取得されてきたのと同一の宿主が意味される。
【０１４５】
細胞は、いずれかの動物からの胎仔、新生仔、幼仔、もしくは成体の神経組織から取得することが可能である。「いずれかの動物」によっては、いずれかの魚類、爬虫類、鳥類、両生類、もしくは哺乳類などが意味される。最も好ましいドナーは哺乳類、特にマウスおよびヒトである。異種ドナー動物の場合には、その動物を安楽死させ、そして脳および目的の特異領域を無菌方法を用いて取り出すことがある。特に目的とされる脳領域には前駆体細胞が取得され得るいずれかの領域が含まれ、その前駆体細胞はその宿主の脳の変性領域に機能を回復させるように作用するであろう。これらの領域には、中枢神経系（ＣＮＳ）の領域（これらには、大脳皮質、小脳、中脳、脳幹、脊髄、および脳室組織が含まれる）、ならびに末梢神経系（ＰＮＳ）の領域（これには、頸動脈小体および副腎髄質が含まれる）がある。より具体的には、これらの領域には、大脳基底核、好ましくは線状の領域が含まれ、これは尾状核および果核、ならびに様々な細胞群（例えば、淡蒼球、視床下核、基底核（これはアルツハイマー疾患（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ）患者において変性していることが見いだされている）、もしくは黒質部緻密骨質（これはパーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ）患者において変性していることが見いだされている）で構成されている。
【０１４６】
ヒトの異種神経前駆体細胞は、選択的中絶から取得される胎仔組織、あるいは新生仔、幼仔、もしくは成体の器官ドナーから取得されることがある。自己神経組織は生検により取得されるか、あるいは神経組織が除去される神経手術を受ける患者から、具体的には癲癇手術中、およびより具体的には側頭葉摘出術および海馬摘出術中に取得され得る。
【０１４７】
細胞は、個々の細胞をその組織の連結性細胞外マトリックスからの解離によりドナー組織から取得され得る。解離はいずれかの既知の方法を用いて達成され得、それには、酵素
（例えば、トリプシン、およびコラーゲンなど）での処理が含まれ、そうでない場合には解離の物理的方法（例えば、鈍器）を用いることにより達成される。胎仔細胞の解離は組織培養培地中で実施することが可能である一方で、幼仔および成体の細胞の解離に好ましい培地は人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）である。通常のａＣＳＦは、１２４ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、１．３ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのＣａＣｌ２、２６ｍＭのＮａＨＣＯ３、および１０ｍＭのＤ−グルコースを含む。低Ｃａ２＋のａＣＳＦは同一の成分を含むが、例外は、３．２ｍＭの濃度でのＭｇＣｌ２および０．１ｍＭの濃度でのＣａＣｌ２である。
【０１４８】
解離細胞を、細胞増殖を援助することが可能ないずれかの既知の培養培地（これには、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ、およびＦ−１２などが含まれる）中に入れるが、この培地は細胞の代謝に必要な補足物を含んでおり、それらは例えば、グルタミンおよび他のアミノ酸類、ビタミン類、無機物類、および有用な蛋白質（例えば、トランスフェリンなど）である。培地は、イースト、細菌、および真菌類の混入を予防するための抗生物質も含むことができ、その例は、ペニシリン、ストレプトマイシン、およびゲンタマイシンなどである。幾つかの事例においては、培地はウシ、ウマ、およびニワトリなどから取得される血清を含むことがある。細胞にとって特に好ましい培地は、ＤＭＥＭとＦ−１２との混合物である。
【０１４９】
培養用の条件は、生理学的条件に近いものであるはずである。培養培地のｐＨは、生理学的ｐＨ、好ましくはｐＨ６〜８、より好ましくはｐＨ７に近い値、更に一層具体的には約ｐＨ７．４であるべきである。細胞は生理学的温度に近い温度、好ましくは３０℃〜４０℃、より好ましくは３２℃〜３８℃の間、そして最も好ましくは３５℃〜３７℃の間であるべきである。
【０１５０】
細胞は懸濁物中もしくは固定化支持体上で生育させるべきであるが、前駆体の増殖は、「神経球体」の形成により多数の細胞が作製されるように懸濁物内で実施されるのが好ましい（例えば、Ｒｅｙｎｏｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：１０７０−１７０９：および国際公開第９３／０１２７５号、国際公開第９４／０９１１９号、国際公開第９４／１０２９２号、および国際公開第９４／１６７１８号を参照されたい）。懸濁細胞の継代（すなわち、分割）の場合には、フラスコを良く震盪し、そして神経球体をフラスコの底部隅に落ち着かせる。その後にこの球体を５０ｍｌの遠心管に移し、そして低速度で遠心する。培地を吸引し、細胞を成長因子を含む少量の培地中に再懸濁させ、そして細胞を機械的に解離させかつ別のアリコートの培地中に再懸濁させる。
【０１５１】
培養培地中の細胞懸濁物に前駆体細胞の増殖を可能にさせるいずれかの成長因子を補足し、そしてこの懸濁物を細胞を保持することが可能ないずれかの容器内に撒種するが、先に記載したように、これは培養フラスコもしくはローラーボトル内で実施するのが好ましい。細胞は典型的には３７℃のインキュベーター内では３〜４日以内に増殖し、そして増殖を、細胞の解離および成長因子を含む新鮮な培地中での再懸濁による継代後のいずれかの時点で再開させることが可能である。
【０１５２】
支持体が不存在である場合には、細胞をフラスコの床からはがし取り、そして懸濁物中での増殖を継続させて未分化な細胞の中空球体を形成させる。インビトロで約３〜１０日おいた後、増殖性クラスター（神経球体）に２〜７日毎に、そしてより具体的には２〜４日毎に、緩和な条件の遠心および成長因子を含む培地中での再懸濁による給餌を施す。
【０１５３】
インビトロで６〜７日おいた後、その神経球体中の個々の細胞を、鈍器での神経球体の物理的解離により、より具体的にはピペットでの神経球体の粉砕により分離させることが可能である。解離させた神経球体からの単一細胞を成長因子を含む培養培地中に懸濁させ
、そして細胞の分化を、その細胞をヘッジホッグアゴニスト、ならびに（場合によっては）分化を持続させることが可能ないずれかの他の因子（例えば、ｂＦＧＦなど）の存在下でプレート培養（もしくは、再懸濁）することにより誘導することが可能である。
【０１５４】
ヘッジホッグアゴニストおよびアンタゴニストの他の使用を更に詳細に説明するために、脳内移植片が中枢神経系治療に対する追加的アプローチとして出現していることを特筆する。例えば、損傷を受けた脳組織を修復するためのあるアプローチは、胎仔もしくは新生仔の動物からの細胞の成体脳への移植を必要とする（Ｄｕｎｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ  １２３：２６５−２８９；およびＦｒｅｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ５：６０３−６１６）。様々な脳領域からの胎仔ニューロンは成体脳内にうまく取り込まれ、そしてそのような移植片は行動障害を軽減することが可能である。例えば、基底核へのドーパミン作動性突起の病変により誘導される運動障害は、胎仔ドーパミン作動性ニューロンの移植片により回避され得る。新皮質の病変形成後に損なわれる複雑な認識機能も、胎仔の皮質細胞の移植片により部分的に回復され得る。ヘッジホッグ蛋白質もしくは擬態物（例えば、ＳｈｈもしくはＤｈｈ）の培養物中での使用により分化の喪失を回避することが可能であり、あるいは胎仔組織（特に、ニューロン幹細胞）が用いられる際には、これらの蛋白質を用いて分化を誘導することが可能である。
【０１５５】
本発明に有用な幹細胞が一般的に知られている。例えば、数々の神経冠が同定されており、その内の幾つかは多分化能を示し、かつ運命の決定されていない神経冠細胞を表しているようであり、そして他のものは一つのタイプの細胞のみ（例えば、知覚ニュユーロン）を作製することが可能であり、かつ運命の決定された前駆体細胞を表すようである。本方法において利用される、このような幹細胞を培養するためのヘッジホッグ蛋白質の役割は、運命が未決定の前駆体の分化を誘導し、そしてそのことにより運命の決定された前駆体細胞を生じることか、あるいは運命の決定された前駆体細胞の発達的宿命に最終分化したニューロン細胞になるようにという更に詳細な制限をもたらすことであり得る。例えば、本方法をインビトロで用いて、神経冠細胞の、神経膠細胞、シュヴァン細胞、クロム親和性細胞、コリン作動性交感ニューロンもしくは副交感ニューロン、ならびにペプチド作動性およびセロトニン作動性ニューロンの分化を誘導および／または維持することが可能である。ヘッジホッグ蛋白質は単独で用いることが可能であるか、あるいはニューロン前駆体細胞の特別な分化運命をより具体的に亢進させるように作用する他の神経栄養因子と組み合わせて用いることが可能である。後者の事例では、ｈｈポリペプチドは、処理を施した細胞が特別な表現型を達成し、その結果その細胞は第二の神経栄養因子と接触した際に適切な誘導を受けて所定の発達経路に従う準備ができているようになることを確実に行わせるものと見なされる。類似の様式で、比較的未分化の幹細胞もしくは初期の神経芽細胞でさえもヘッジホッグアゴニストでの処理により培養物中に維持され、かつ分化を生じることが可能である。例示的な初期細胞培養物は、より明白な分化が既に生じる以前でさえも、胎仔の神経板もしくは神経管から回収された細胞を含む。
【０１５６】
機能的ヘッジホッグ活性の存在下で培養される細胞の移植および先に記載される他のインビトロでの使用に加え、本発明の更に別の態様は、中枢神経系および末梢神経系の両方におけるニューロンおよび他の神経性細胞の生存を亢進させるためのヘッジホッグ蛋白質もしくは疑似物の治療的適用法に関する。神経系の発達中および更におそらくは成体状態にあるニューロン分化を調節するヘッジホッグ蛋白質の能力は、所定のヘッジホッグ蛋白質が、正常細胞の維持、機能的作業、および加齢；化学的もしくは機械的病変を伴う細胞における修復および再生過程；ならびに所定の病原性条件下での分化の喪失からもたらされる変性および未熟を予防することに関して成体ニューロンの制御を容易にさせることが当然予測され得る。この理解を考慮すると、本発明は具体的には以下の事柄から生じる神経学的症状の治療（予防および／またはその症状の重篤度の軽減）に対する主題の方法の
適用を企図しており、それらの事柄とは：（ｉ）神経系に対する急性、亜急性、もしくは慢性の傷害（これには創傷傷害、化学的傷害、化学的損傷、血管損傷および欠損（例えば、脳卒中により生じる虚血）（これらは感染性／炎症性、および腫瘍誘導性傷害を伴う）；（ｉｉ）神経系の加齢（これにはアルツハイマー病が含まれる）；（ｉｉｉ）神経系の慢性神経変性性疾患（これにはパーキンソン病、ハンチントン（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ）舞踏病、および筋萎縮性側索硬化症など、ならびに脊髄小脳変性症が含まれる）；ならびに（ｉｖ）神経系もしくは傷害を受けている神経系の慢性免疫性疾患（これには多発性硬化症が含まれる）、である。
【０１５７】
多くの神経学的疾患は神経性要素の個別の集団の変性に関連しており、そしてヘッジホッグアゴニストを含む治療用養生法で治療可能であることがある。例えば、アルツハイマー病は数々の神経伝達物質系（新皮質に伝わるもの、および皮質に留まるものの両方）における欠損に関連する。例えば、アルツハイマー病を患う患者の基底核は、年齢が一致する対照と比較した際に多量の神経の喪失（７５％）を有するという所見が得られている。アルツハイマー病はこれまでに知られている痴呆の明らかに最も一般的な形態であるものの、数々の他の疾患が痴呆を生じ得る。これらの内の数々のものは、中枢神経系の様々な部位、特に大脳皮質におけるニューロンの死を特徴とする変性性疾患である。しかしながら痴呆の幾つかの形態は大脳皮質の下に横たわる視床もしくは白質の変性に関与している。すなわち認識性機能障害は、遠心性神経および求心性神経の変性による皮質領域の単離によりもたらされる。ハンチントン病は線条体内および皮質性コリン作動性ニューロン、ならびにＧＡＢＡ作動性ニューロンの変性に関与する。ピック（Ｐｉｃｋ’ｓ）病は前頭葉および前側頭葉の新皮質における数々のニューロン変性であり、時としては線条内のニューロンの死を伴う。このような変性性症状を患う患者の治療には、ヘッジホッグポリペプチド、もしくはそれらの効果を模倣する作用物質の適用が含まれることが可能であり、その目的は、例えばニューロンの損失を生じる分化およびアポトーシス現象を制御すること（例えば、現存するニューロンの生存を亢進させるためのもの）、ならびに損傷を被っている領域内の前駆体細胞による分化および再生を亢進させることである。好ましい態様では、ヘッジホッグ作用物質の源は、変性の領域内もしくはその近位に定位的に提供される。変性誘導性痴呆に加えて、一つもしくは複数の主題のヘッジホッグ蛋白質の薬剤学的調製物を時としては振顫および不随意運動の発症を伴う神経変性性疾患の治療に適用することが可能である。例えばパーキンソン病は主に皮質下構造が冒されており、かつ黒質線状体経路、縫線核、青斑核、および迷走神経の運動核の変性を特徴とする。バリスムは典型的には視床下核への損傷に関与しており、多くは急性血管障害がその原因である。末梢神経系の体細胞分裂が究極的には冒されており、かつ神経筋障害として発症する神経形成性および筋障害性疾患も含まれる。その例には、慢性萎縮症（例えば、筋萎縮性側索硬化症、ギラン−バレー症候群、および慢性末梢神経障害）、ならびに他の障害（これらは、進行性延髄麻痺もしくは脊髄性筋萎縮症として発症し得る）が含まれる。本方法は、筋緊張低下もしくは運動失調をもたらす小脳の疾患（例えば、病変に対して同側性の四肢における疾患をもたらす小脳の病変）の治療に有用である。例えば、ヘッジホッグ同族体の調製物を用いて、前葉（虫部および下肢領域）に関与する小脳皮質変性の限定された形態（例えば、アルコール依存症患者に共通なもの）を治療することが可能である。
【０１５８】
具体的な態様では主題の方法を筋萎縮性側索硬化症の治療に用いている。ＡＬＳは上位および下位の運動ニューロンを含む複合性疾患に与えられる名称である。患者は、進行性筋萎縮症、進行性延髄麻痺、原発性側索硬化症、もしくはそれらの症状の組み合わせを呈することがある。主な病理学的異常性は、脊髄の下位運動ニューロンおよび大脳皮質の上位運動ニューロンの選択的かつ進行性変性を特徴とする。ヘッジホッグアゴニスト、特にＤｈｈの治療的適用法を単独でか、もしくは他の神経栄養因子（例えば、ＣＮＴＦ、ＢＤＮＦ、もしくはＮＧＦ）と組み合わせて用いて、ＡＬＳ患者における運動ニューロン変性の予防および／または逆行を行うことが可能である。
【０１５９】
本発明のヘッジホッグ蛋白質は末梢神経系の自律神経障害の治療にも用いることが可能であり、その自律神経障害には、平滑筋および内分泌腺組織（例えば、腺状組織）の神経支配を冒す疾患が含まれる。例えば、主題の方法を使用して頻脈もしくは心房不整脈を治療することが可能であり、これらの症状は心臓の横紋筋の神経支配を行う神経の変性性症状から生じることがある。
【０１６０】
その上、所定のヘッジホッグ蛋白質の有望な役割（これは添付される実施例、主に、頭部および体幹（肢芽を含む）の知覚および運動ニューロンにおける各ヘッジホッグ発現のデータから明らかになる）は、軸索ニューロンの樹状突起形成過程の進展および維持におけるヘッジホッグ蛋白質の役割に関する。ヘッジホッグ蛋白質の有望な役割には、結果的には軸索突起形成の誘導、およびそれらの軸索形成過程への神経支配性細胞の分化および／または維持を亢進させる能力が含まれる。従って、本明細書に記載されるヘッジホッグアゴニストもしくは他のヘッジホッグ作用物質を含む組成物を利用して、数々のタイプの神経節ニューロン、交感性および知覚性ニューロン、ならびに運動ニューロンの生存および突起再生を支援するか、あるいは別法ではその作用に拮抗することができる。特にこのような治療用組成物は、例えば、病変誘導性の死から様々なニューロンを救助するように設計された治療法において、ならびにそのような損傷後のそれらのニューロンの突起再生を誘導するのに有用であることがある。このような疾患には、ＣＮＳ創傷性感染、感染症（例えば、水痘帯状疱疹ウイルスでの感染）、代謝性疾患、栄養失調、毒性作用物質（例えば、シスプラチン治療）が含まれるが、これらには限定されない。更に、所定のヘッジホッグ作用物質（例えば、アンタゴニスト形態）は知覚ニューロンの選択的除去に有用である可能性があり、これは例えば慢性疼痛症候群の治療の際に用いられる。
【０１６１】
適切であれば、ヘッジホッグ作用物質を、中枢および末梢の神経損傷の修復のための神経プロテーゼ挿入術において用いることが可能である。特に、座滅もしくは切断された軸索にプロテーゼの使用による挿入を施す場合には、ヘッジホッグポリペプチドをそのプロテーゼに添加して樹状突起形成過程の成長および再生の速度を増加させることが可能である。例示的神経誘導チャネルが、米国特許第５，０９２，８７１号および第４，９５５，８９２号に記載されている。従って、切断された軸索形成過程はその軸索が切断された場所からその神経末端へと、プロテーゼ神経ガイドにより伸長することが可能であり、そのガイドは、例えばヘッジホッグポリペプチドもしくは疑似物を含む半固形製剤を含むか、あるいはその内壁に沿ったヘッジホッグ蛋白質での被覆が施されている。
【０１６２】
他の態様では、主題の方法を新生物性もしくは過形成性悪性転換（例えば、中枢神経系において生じることがあるもの）の治療に用いることが可能である。例えば、一定のヘッジホッグ蛋白質（もしくはｈｈアゴニスト）はニューロン細胞の分化を誘導するが、この蛋白質を利用して、そのような悪性転換化細胞を分裂終了状態もしくはアポトーシス状態のいずれかにさせることが可能である。ヘッジホッグ作用物質での治療は自己分泌ループ（例えば、ＴＧＦ−βもしくはＰＤＧＦの自己刺激性ループ）の破壊を容易にすることがあり、このループは数々のニューロン腫瘍の新生物性悪性転換にかかわるものと見なされている。従ってヘッジホッグアゴニストを、例えば、悪性神経膠腫、神経髄芽腫、神経外胚葉腫、および脳室上衣腫の治療において用いることができる。
【０１６３】
本発明の更に別の態様は、ヘッジホッグ蛋白質は既述の神経分化に加えて他の脊椎動物の器官形成経路にかかわる形態形成性シグナルであり、かつ他の内胚葉パターン形成、ならびに中胚葉と内胚葉の両方の分化過程において明らかな役割を有するという発見の適用に関する。以下の実施例に記載されるように、Ｓｈｈがシグナル伝達分子（これには、中胚葉におけるＢｍｐ−２および外胚葉におけるＦｇｆ−４が含まれる）の発現を開始させることによる適切な四肢の成長およびパターン形成における役割を演じていることは自明
である。従って本発明により、ヘッジホッグ蛋白質を含む組成物を、非ニューロン組織の産生および維持を必要とする細胞培養および治療法の両方に利用することも可能であることが予期される。
【０１６４】
ある態様では、本発明は、ヘッジホッグ蛋白質（例えば、Ｓｈｈ）が明らかに、消化管、肝臓、肺、および原腸に由来する他の器官の形成の原因となる幹細胞の発育を制御することにかかわっているという発見を利用している。以下の実施例に記載されるように、Ｓｈｈは腸の形態形成にとって重要である内胚葉から中胚葉への誘導性シグナルとして作用する。従って、例えばヘッジホッグアゴニストを、正常な肝臓の多重代謝機能を有することが可能な人工肝臓の開発および維持に利用することが可能である。例示的な態様では、ヘッジホッグアゴニストを用いて、肝臓細胞培養物からの消化管幹細胞の分化を誘導することが可能であり、このことを細胞外マトリックスを植生させるのに用いることが可能であるか、あるいは生物適合性ポリマーを被包して、移植用および体外人工肝臓の両方を形成するのに用いることが可能である。
【０１６５】
他の態様では、ヘッジホッグアゴニストの治療用組成物を、そのような人工肝臓、ならびに胎仔肝臓構造の移植と組み合わせて用いて、腹膜内移植、血管形成、およびインビボでの移植化肝臓組織の分化および維持を促進させることが可能である。
【０１６６】
更に他の態様では、ヘッジホッグアゴニストを治療的に利用して、物理的、化学的、もしくは病理的傷害後にそのような器官を調節することが可能である。例えば、ヘッジホッグアゴニストを含む治療用組成物を部分的肝切除術後の肝臓修復に利用することが可能である。同様に、ヘッジホッグアゴニストを含む治療用組成物を用いて、肺気腫の治療における肺組織の再生を亢進させることが可能である。
【０１６７】
本発明の更に別の態様では、ヘッジホッグアゴニストを含む組成物をインビトロでの骨格組織の形成（例えば、骨格形成性幹細胞から）、ならびに骨格組織欠損症のインビボでの治療において用いることが可能である。本発明は具体的には、骨格形成性活性（例えば、軟骨形成および／または骨形成を誘導する能力）を維持するヘッジホッグアゴニストの使用を企画している。「骨格組織欠損症」によっては、その欠損症の起源の遺憾にかかわらず（例えば、外科手術の介入、腫瘍の除去、潰瘍形成、移植、破損、あるいは他の創傷性もしくは変性性症状）、骨もしくは結合組織を回復することが所望されるいずれかの部位での骨もしくは他の骨格結合性組織における欠損症が意味される。
【０１６８】
例えば、本発明により、結合組織に軟骨機能を回復させるための有効な治療方法および組成物が利用可能になる。このような方法は、例えば変性性損耗の結果である軟骨組織の欠損もしくは病変（例えば、関節炎をもたらすもの）、ならびにその組織への創傷（これは例えば、裂傷半月板組織の位置異常、半月板切除術、裂傷靭帯による関節の緩み、関節の悪性腫瘍、骨折）により生じることがあるか、もしくは遺伝性疾患により生じることがある他の機械的関節運動傷害の修復に役立つ。本修復法は更に、軟骨基質のリモデリング（例えば、形成外科手術もしくは再構成性手術）、ならびに歯根膜手術にも有用である。本方法は更に、従来の修復措置（例えば、半月板、靭帯、もしくは軟骨の外科的修復後のもの）を改善するのにも適用できる。その上、創傷形成後十分早い時期に適用する場合には、この方法により変性性疾患の発症もしくは症状再燃を予防することができる。
【０１６９】
本発明のある態様では、主題の方法は、治療学的に十分量のヘッジホッグアゴニスト、特にＩｈｈアゴニストを用いて、冒された結合組織を治療し、その組織内に包埋される軟骨細胞の分化および／または増殖を刺激することにより結合組織内での軟骨修復応答を生じさせることを含む。ヘッジホッグアゴニストでの治療による軟骨細胞の誘導により、その後には、治療した細胞による新規の軟骨基質の合成がもたらされ得る。関節軟骨、関節
間軟骨（半月）、肋軟骨（真骨と胸骨とを連結させる）、靭帯、および腱のような結合組織は特に、主題の方法を用いる再構成性および／または再生治療における治療で処理することが可能である。本明細書に用いられる際には、再生性療法には、組織の機能障害が明白に証明される地点にまで進行してしまっている変性状態の治療、ならびに変性が初期段階であるかもしくは切迫状態にある場合の組織の予防的治療が含まれる。主題の方法を更に、新規の軟骨の定常的産生を維持させることにより繊維性組織への無機質化の広がりを予防するのにも用いることが可能である。
【０１７０】
具体的な態様では、主題の方法を用いて可動関節（例えば、膝、足首、肘、腰、手首、手指もしくは脚指のいずれかの中手指節関節、あるいは側頭下顎関節）の軟骨の治療に用いることが可能である。この治療法を、関節の半月、関節の関節軟骨、もしくはその両方に適用することが可能である。更に詳細に説明するために、主題の方法を用いて膝の変性性疾患（例えば、損傷性創傷（例えば、スポーツ創傷、もしくは過度の摩耗）、あるいは骨変形性関節炎の結果であることがある）を治療することが可能である。例えば関節鏡針での関節内へのヘッジホッグアゴニストの注入を用いて、冒されている軟骨を治療することが可能である。幾つかの事例では、注入した作用物質は既述のハイドロゲルもしくは他の徐放性賦形剤の形態をとることが可能であり、その目的は、その作用物質の治療組織とのより広域でかつ定期的な接触を図るためである。
【０１７１】
本発明は更に、主題の方法の、軟骨移植およびプロテーゼ療法での使用を企画している。今日までには自己軟骨もしくは同種軟骨のいずれかの移植からの新規の軟骨の成長はほとんど成功していない。例えば、異なる組織間：例えば、関節、半月軟骨、靭帯、および腱の間、同一靭帯もしくは腱の２つの末端の間、ならびに組織の表面部と深部との間、では軟骨および線維軟骨の性質が変化しているために問題が生じてしまう。これらの組織の帯状配列は機械的特質の段階的変化を反映することがあり、そして移植組織（これはこのような状況下ではまだ分化してはいない）が適切な応答を示す能力を欠損する場合に失敗が生じる。例えば、半月軟骨を用いて前方十字靭帯を修復する際には、この組織は純粋な線維状組織への変質形成を受ける。軟骨形成を亢進させることにより、主題の方法を用いて特にこの問題を処理することが可能であるが、それはその移植細胞を、新規の環境に一層適合しやすくさせ、かつ効率よくその組織の初期発生段階の肥大性軟骨細胞を模倣させることによって実施される。従って、主題の方法により提供されるこの移植組織中の軟骨形成の作用、および活発に組織をリモデルさせる機械力が協働することで、その移植片に与えられるべき新規の機能に一層適する改善化移植を行うことが可能となる。
【０１７２】
類似様式で主題の方法を適用させて、軟骨プロテーゼの作製およびその移植の両方を亢進させることが可能である。改良された治療法に対する必要性が、コラーゲン−グリコサミノグリカン鋳型（Ｓｔｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）  Ｃｌｉｎ  Ｏｒｔｈｏｐ  Ｒｅｌａｔ  Ｒｅｄ  ２５２：１２９）、単離された軟骨細胞（Ｇｒａｎｄｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）  Ｊ  Ｏｒｔｈｏｐ  Ｒｅｓ  ７：２０８；およびＴａｋａｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  ２：４４９）、ならびに天然もしくは合成ポリマーに連結させた軟骨細胞（Ｗａｌｉｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）  Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｊｔ  Ｓｕｒｇ  ７１Ｂ：７４；Ｖａｃａｎｔｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）  Ｐｌａｓｔ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒ  Ｓｕｒｇ  ８８：７５３；ｖｏｎ  Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）  Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ  ２５：３２９；Ｆｒｅｅｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）  Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ
２７：１１；およびｔｈｅ  Ｖａｃａｎｔｉ  ｅｔ  ａｌ．米国特許第５，０４１，１３８  号）を基にする新規の軟骨を作製する目的の研究の動機となっている。例えば、軟骨細胞を、ポリマー（例えば、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、アガロースゲル、もしくはそのポリマー主鎖の無毒性モノマーへの加水分解の作用のため長時間にわたり分解する他のポリマー）から形成される生物分解性でありかつ生物適合性の多孔質マトリックス上で
の培養により成長させることが可能である。このマトリックスは、移植片の定着が生じるまでその細胞に十分な栄養素および気体交換を提供するように設計されている。この細胞を、移植予定の細胞にとって十分な細胞容積および密度が生じるまでインビトロで培養することが可能である。このマトリックスの一つの利点は、それらを個別の状況に応じて所望される形状に鋳造もしくは形成することが可能であることであり、その結果最終製品は患者自体の耳もしくは鼻（一例として）に非常に類似した形態となるか、あるいは可撓性マトリックス（このマトリックスは例えば関節における移植の時点での操作を考慮したものである）を使用することができる。
【０１７３】
主題の方法のある態様では、移植片を培養過程中にヘッジホッグアゴニスト（例えば、Ｉｈｈアゴニスト）と接触させるが、その目的は、培養物中に分化軟骨細胞を誘導および／または維持することであり、同時にその移植片内で軟骨マトリックス産生を更に刺激化させることである。このような様式では培養細胞は軟骨形成性細胞に典型的な表現型（すなわち、肥大性）を維持させることが可能となり、そしてそのためマトリックスの定着および軟骨組織の産生が持続する。
【０１７４】
他の態様では、移植された装置をヘッジホッグアゴニストで処理するが、その目的は、移植されたマトリックスを活発にリモデルさせ、かつそのマトリックスを意図される機能にとって一層適切なものにさせることである。組織移植について先に既述したように、人工移植片は、そのマトリックスが移植される実際の力学的環境に匹敵する状況内では生じることのない同一の欠点が問題となる。主題の方法によるマトリックス上での軟骨細胞の活性化により、置換されることが意図される組織に類似する特質をその移植片が獲得することが可能となり得る。
【０１７５】
更に外の態様ではこの主題の方法を用いてプロテーゼの付着を亢進させる。説明するために記載すると、主題の方法を歯根膜プロテーゼの移植に用いることが可能であり、この場合、周囲の結合組織の治療がそのプロテーゼ付近の歯根膜靭帯の形成を刺激化し、同時にそのプロテーゼの近位での線維状組織の形成を阻害する。
【０１７６】
更に別の態様では主題の方法を、そのようなマトリックス組織の欠損を生じている動物の部位での骨の産生（骨形成）のために利用することが可能である。インディアンヘッジホッグは特に肥大性軟骨細胞に関連しており、この軟骨細胞は最終的には骨芽細胞と入れ替わる。例えば、本発明のヘッジホッグ作用物質の投与を、被検体中の骨喪失を治療するための方法の一部として利用することができ、それは例えば、骨粗鬆症および他のオステオペニア性疾患の予防および／または逆行のため、ならびに骨の成長および成熟を調節するために実施される。例えば、ヘッジホッグアゴニストを含む調製物を利用して、一例として軟骨内骨化を誘導することが可能であるが、それは、少なくとも軟骨組織前駆体の形成が骨化の「モデル」を形成するのを容易にさせる場合に限定される。ヘッジホッグアゴニストの治療用組成物に、必要とされる場合には他の骨誘導性因子（例えば、骨成長因子（例としては、ＴＧＦ−β因子（その例としては骨形態形成因子ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−４）、ならびにアクチビン）を補足することが可能であり、そしてこのヘッジホッグアゴニストの治療用組成物は更に、骨吸収の阻害剤（例えば、エストロゲン、ビスホスホネート、フッ化ナトリウム、カルシトニン、もしくはタモキシフェン、あるいは関連化合物）を含むか、もしくはそれらと組み合わせて投与することができる。しかしながら、ヘッジホッグ蛋白質（例えば、ＩｈｈおよびＳｈｈ）がＢＭＰ（複数）の上流に存在しそうであることが認識されるであろう（これは例えば、ｈｈ治療がＢＭＰ（複数）の内因性発現を他の因子のものと同時に開始させるという利点を有するであろうことを意味する）。
【０１７７】
本発明の更に他の態様では、ヘッジホッグアンタゴニストを用いて精子形成を阻害することが可能である。従って、ヘッジホッグ蛋白質が睾丸生殖細胞の分化および／または増
殖ならびに維持にかかわっているという本所見を考慮すると、ヘッジホッグアンタゴニストを利用して天然に存在するヘッジホッグ蛋白質の作用を遮断することが可能である。好ましい態様では、このヘッジホッグアンタゴニストは精子形成に関してＤｈｈの生物学的活性を阻害するが、それは睾丸内のヘッジホッグレセプターへの競合的結合による阻害である。類似の様式で、ヘッジホッグアゴニストおよびアンタゴニストは通常の卵巣機能を調節するのに有用である可能性がある。
【０１７８】
ヘッジホッグポリペプチドの源は、それが細胞培養物のためのものであるか、あるいはインビボ適用のためのものであるかのいかんにかかわらず、その源は精製された蛋白質組成物の形態をとってもよく、あるいはそのポリペプチドの組換え形態もしくは内因性形態のいずれかを発現する細胞（例えば、胎仔組織（一例では、底板組織外植片））からのものであってもよい。更に、本明細書に記載される脊椎動物ヘッジホッグポリペプチドのこれらの形態に加えて、本発明は更に、脊椎動物生物体の細胞および組織を誘導するためのドロソフィラヘッジホッグ（Ｄｒｏｓ−ＨＨ）蛋白質の使用を企画している。
【０１７９】
蛋白質組成物の例では、ヘッジホッグ蛋白質、もしくは薬剤学的に許容されるその塩を、生物学的に許容される媒質（例えば、水、緩衝化食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、あるいはそれらの適切な混合物）を用いて投与用に簡便に製剤することができる。選択された媒質中の活性成分（一つもしくは複数）の至適濃度は製薬化学者に熟知される方法に従って経験的に決定することが可能である。本明細書で用いられる際には、「生物学的に許容される媒質」は、いずれかおよび全ての、溶液、分散用媒質などを含み、これらはその薬剤学的調製物の投与経路に所望されるのに適切なものであることができる。薬剤学的な活性物質のためのこのような媒質の使用は当該技術分野において知られている。いずれかの通常の媒質もしくは作用物質がヘッジホッグ蛋白質の活性にとって不適合性である場合を除外して、本発明の薬剤学的調製物におけるその蛋白質の使用が企画されている。適切な賦形剤および他の蛋白質も含むそれらの製剤は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓというテキスト（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．、ＵＳＡ  １９８５）において記載されている。これらの賦形剤には注射用「貯蔵製剤」が含まれる。先の事柄に基づくと、このような薬剤学的製剤には、一つもしくは複数の薬剤学的に許容される賦形剤もしくは稀釈剤と組み合わせてあり、かつ適切なｐＨおよび生理学的液体と等張である緩衝化媒質内に含まれるヘッジホッグ同族体（例えば、Ｓｈｈ、Ｄｈｈ、もしくはＭｈｈ）の溶液もしくは凍結乾燥粉末が含まれるが、これらには限定されない。詳細な説明のみを目的とし、かつ同物質により限定されることはないものとして、ヘッジホッグ蛋白質での神経系疾患の治療のための溶液の形態で調製されることができる可能な組成物もしくは製剤は、米国特許第５，２１８，０９４号に記載されている。凍結乾燥化された調製物の場合には、例えばマニトールもしくはグリシンのような（しかし、これらには限定されない）担持用賦形剤を用いることができ、かつ所望される容積の適切な緩衝化溶液が提供されるであろうため、所望のｐＨの十分量の等張緩衝化溶液が取得される。類似の溶液を所望の容積の等張液中のｈｈの薬剤学的組成物について用いることもでき、かつ適切な濃度でのリン酸もしくはクエン酸緩衝化食塩水溶液の使用も含まれ（しかし、これらには限定されない）、その結果いつでも所望のｐＨ（例えば、中性ｐＨ）の等張薬剤学的調製物を取得することができる。
【０１８０】
治療の部位での外因性ｈｈの導入の方法には、皮内的、筋肉内的、腹膜内的、静脈内的、皮下的、経口的、経鼻的、および局所的方法があるが、これらには限定されない。それに加えて、本発明の薬剤学的組成物を中枢神経系内に、いずれかの適切な経路により導入することが所望されることがあるが、これらの経路には、脳室内注射およびクモ膜下内注射が含まれる。脳室内注射は、たとえばレザーバー（一例では、Ｏｍｍａｙａレザーバー
）に連結させてある脳室内カテーテルにより容易になることがある。
【０１８１】
導入の方法は更に、再注入可能もしくは生物分解性装置により提供されることもある。インビボでの薬剤の制御的輸送用の様々な徐放性ポリマー装置が最近開発および検査されており、これらには蛋白質性生物薬剤が含まれる。多様な生物適合性ポリマー（ハイドロゲルを初めとする）には、生物分解性および非分解性ポリマーの両方が含まれるが、これらを用いて特別な標的部位でのｈｈの徐放性放出のための移植片を形成することが可能である。本発明のこのような態様を、予めポリマー性装置内に取り込ませてある外因性の精製化ヘッジホッグ蛋白質の輸送用に、もしくはポリマー性装置内に被包化させた細胞から産生されるヘッジホッグの輸送用に用いることが可能である。
【０１８２】
移植片の所定の態様の主要な特色はｈｈの直線的放出であり得、これはポリマー組成物および泡状物の操作を介して達成することが可能である。モノマー組成物もしくはポリマー形成技術の選択により、水の量、多孔度、および得られる透過性特性を制御することが可能である。形状、サイズ、ポリマー、および移植法の選択は、治療予定の疾患および個々の患者の応答に応じて個々の事例毎に決定することが可能である。このような移植片の作製は、一般的には当該技術分野において知られている。例えば、Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＆  Ｄｅｎｔａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、ｅｄ．  ｂｙ  Ｄａｖｉｄ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ（ＭＩＴ  Ｐｒｅｓｓ：Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、１９９０）；およびＳａｂｅｌらの米国特許第４，８８３，６６６号を参照されたい。移植片の他の態様では、ヘッジホッグ蛋白質を産生する細胞の源、もしくは精製されたｈｈを含むハイドロゲルマトリックスの溶液は、移植用中空繊維内に被包される。このような繊維を予備遠心し、そしてその後にヘッジホッグの源を充填するか（Ａｅｂｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．米国特許第４，８９２，５３８号；Ａｅｂｉｓｈｅｒ  ｅｔ
ａｌ．米国特許第５，１０６，６２７号；Ｈｏｆｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）
Ｅｘｐｔ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．  １１０：３９−４４；Ｊａｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）  Ｐｒｏｇ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．  ８２：４１−４６；およびＡｅｂｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）  Ｊ．Ｂｉｏｍｅｃｈ．Ｅｎｇ．  １１３：１７８−１８３）、あるいはｈｈの源に関してポリマー性コートを形成するように作用するポリマーと同時押し出しにかけることが可能である（Ｌｉｍの米国特許第４，３９１，９０９号；Ｓｅｆｔｏｎの米国特許第４，３５３，８８８号；Ｓｕｇａｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）  Ｔｒａｎｓ  Ａｍ．Ａｒｔｉｆ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｏｒｇａｎｓ  ３５：７９１−７９９；Ｓｅｆｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．  ２９：１１３５−１１４３；およびＡｅｂｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  １２：５０−５５）。
【０１８３】
本発明の更に別の態様では、薬剤学的ヘッジホッグ蛋白質を他の作用物質との組み合わせ治療剤の部分として投与することが可能である。例えば、この組み合わせ治療剤はヘッジホッグ蛋白質と共に少なくとも一つの栄養因子を含むことが可能である。例示的な栄養因子には、神経成長因子、毛様体神経栄養因子、神経鞘腫由来の成長因子、神経膠成長因子、横紋筋由来の神経栄養因子、血小板由来の成長因子、および散乱因子（ＨＧＴ−ＳＦ）が含まれる。抗分裂促進因子も用いることが可能であり、それは例えば、周囲の神経膠細胞もしくは神経膠星状細胞の増殖が神経細胞の再生時に所望されない場合である。このような抗分裂促進剤の例には、サイトシン、アラビノシド、５−フルオロウラシル、ヒドロキシ尿素、およびメトトレキセートが含まれる。
【０１８４】
本発明の他の態様は、本発明の異種ヘッジホッグ遺伝子を発現するか、もしくは動物の組織もしくは細胞タイプの少なくとも一つにおいて破壊されている一つもしくは複数のゲノムヘッジホッグ遺伝子を有する形質転換非ヒト動物を特徴とする。従って本発明は、発育異常のための動物モデルを特徴とし、その動物は過誤発現されるヘッジホッグ対立遺伝
子を有する。例えば、一つもしくは複数のｈｈ対立遺伝子が欠損しているか、あるいはそうでない場合にはｈｈ対立遺伝子が不活化させられているマウスを育種することが可能である。このようなマウスモデルをその後に利用して、過誤発現されるヘッジホッグ遺伝子から生じる疾患の研究を行い、同時にこのモデルを類似の疾患のための有望な治療剤の評定用に用いることが可能である。
【０１８５】
本発明の他の態様は、本発明のトランスジーンを含む細胞（その動物の）からできており、かつ好ましくはその動物の一つもしくは複数の細胞内で外因性ヘッジホッグ蛋白質を発現する（場合によってではあるが）形質転換動物に関する。ヘッジホッグトランスジーンはその蛋白質の野生型形態をコードすることが可能であるか、あるいはその同族体をコードすることが可能であり、その同族体にはアゴニストおよびアンタゴニスト、ならびにアンチセンス構築物が含まれる。好ましい態様では、そのトランスジーンの発現は細胞の特異的サブセット、組織、もしくは発達段階に限定されるが、これは、例えば所望されるパターンでの発現を制御するシス−活性化配列を利用することによる。本発明では、ヘッジホッグ蛋白質のそのようなモザイク発現は多くの形態の系統分析にとって必須のものであり得、かつ追加的に、例えばヘッジホッグ発現の欠損の効果の評定を行う手段を提供することが可能であり、このヘッジホッグ発現は、それさえなければ正常である胎仔内での組織の小パッチにおける発育を総括的に変化させることがある。この目的のために、組織特異的調節配列および条件的調節配列を用いて所定の空間的パターン形成におけるこのトランスジーンの発現を制御することが可能である。その上、発現の時間的パターンは、例えば条件的組換え系もしくは原核生物の転写調節配列により提供され得る。
【０１８６】
トランスジーンの発現を考慮した遺伝子技術は、当業者に知られるインビボにおける部位特異的遺伝子操作を介して調節することが可能である。例えば、標的配列の遺伝子組み換えの触媒作用を行うリコンビナーゼの調節化発現を考慮してある遺伝子系が利用可能である。本明細書で用いられる際には「標的配列」は、リコンビナーゼにより遺伝子組み換えが施されるヌクレオチド配列を意味する。標的配列はリコンビナーゼ認識配列によりフランクされ、かつ一般的にはリコンビナーゼ活性を発現する細胞内で切り出されるかもしくは逆転されるかのいずれかの作用を受ける。リコンビナーゼが触媒作用を行う組換え現象は、標的配列の組換えが主題のヘッジホッグ蛋白質の内の一つの発現の活性化もしくは抑制のいずれかをもたらすように設計することが可能である。例えば、組換えｈｈ遺伝子（例えば、アンタゴニスト性同族体もしくはアンチセンス転写物をコードするもの）の発現を妨害する標的配列の切り出しは、その遺伝子の発現を活性化するように設計することが可能である。この蛋白質の発現の妨害は、様々なメカニズムによりもたらされることが可能であり、そのメカニズムとは例えば、プロモーター因子もしくは内部ストップコドンからのｈｈ遺伝子の空間的分離である。その上、このトランスジーンを作製することが可能であるが、この場合、この遺伝子のコーディング配列はリコンビナーゼ認識配列によりフランクされ、かつ元々そのプロモーター因子に関して３’−５’の配向で細胞内にトランスフェクトされている。このような場合では、標的配列の逆位によりその主題の遺伝子が再配向させられることになるであろうが、それは、プロモーター可動性転写活性を考慮してそのプロモーター因子に関連する向きでそのコーディング配列の５’末端を配置することにより行われる。  具体的な態様では、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系（Ｌａｋｓｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）  ＰＮＡＳ  ８９：６２３２−６２３６；Ｏｒｂａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）  ＰＮＡＳ  ８９：６８６１−６８６５）、もしくはサッカロミセス  ケレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＦＬＰリコンビナーゼ系（Ｏ’Ｇｏｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：１３５１−１３５５；国際公開第９２／１５６９４号）のいずれかを用いてインビボでの部位特異的遺伝子組み換え系を作製することが可能である。ＣｒｅリコンビナーゼはｌｏｘＰ配列間に位置する介在性標的配列の部位特異的組換えの触媒作用を行う。ｌｏｘＰ配列は３４塩基対のヌクレオチド反復配列であり、この配
列にＣｒｅリコンビナーゼが結合し、かつこの配列はＣｒｅリコンビナーゼ介在性遺伝子組換えを必要とする。ｌｏｘＰ配列の配向により、Ｃｒｅリコンビナーゼが存在する際にその介在性標的配列が切り出されるかもしくは反転するかが決定され（Ａｂｒｅｍｓｋｉ
ｅｔ  ａｌ．（１９８４）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２５９：１５０９−１５１４）；このＣｒｅリコンビナーゼはｌｏｘＰ配列が正の反復配列としての配向である際にはその標的配列の切り出しの触媒作用を行い、そしてｌｏｘＰ配列が逆の反復配列としての配向である際にはその標的配列の反転の触媒作用を行う。
【０１８７】
従って、標的配列の遺伝子組み換えはＣｒｅリコンビナーゼの発現に依存する。このリコンビナーゼの発現は、調節制御に供されるプロモーター因子により調節を受けることが可能であり、それは例えば、外因的に添加された作用物質による組織特異的、発達段階特異的、誘導性、もしくは抑制性制御である。この調節的制御により、リコンビナーゼ発現がそのプロモーター因子により介在される細胞内のみにおける標的配列の遺伝子組み換えがもたらされるであろう。従って、組換えヘッジホッグ蛋白質の活性化発現を、リコンビナーゼ発現の制御を介して調節することが可能である。
【０１８８】
組換えｈｈ蛋白質の発現を調節するためのｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系の使用は、Ｃｒｅリコンビナーゼおよび主題の蛋白質の両方をコードするトランスジーンを含む形質転換動物の構築を必要とする。Ｃｒｅリコンビナーゼと組換えヘッジホッグ遺伝子との両方を含む動物を、「二重」形質転換動物の構築を介して提供することが可能である。そのような動物を提供するための簡便法は、トランスジーン（例えば、ｈｈ遺伝子およびリコンビナーゼ遺伝子）を各々含む２匹の形質転換動物を交雑させることである。
【０１８９】
リコンビナーゼ−媒介性発現用フォーマットにおいてヘッジホッグトランスジーンを含む形質転換動物を最初に構築することにより得られる一つの利点は、その主題の蛋白質（アゴニストもしくはアンタゴニストのいかんにかかわらず）はその形質転換マウス内での発現の際に有毒であり得るという可能性に端を発している。このような事例では、主題のトランスジーンが全組織内でサイレントである創立動物集団を増殖および維持することが可能である。この創立動物集団の各個体を、例えば一つもしくは複数の組織内および／または所望される時間的パターンでリコンビナーゼを発現する動物と交雑させることが可能である。従って、例えばアンタゴニスト性ｈｈトランスジーンがサイレントである創立動物集団の作製により、特別の組織もしくは所定の発達段階におけるヘッジホッグ媒介性誘導の破壊が例えば致死的表現型をもたらすであろう創立動物からの子孫の研究を可能になるであろう。
【０１９０】
類似の条件トランスジーンは、ヘッジホッグトランスジーンの発現を容易にさせる目的で同時に発現されるべき原核生物蛋白質を必要とする原核生物プロモーター配列を用いて提供され得る。例示的プロモーターおよび対応するトランス作用性原核生物蛋白質は、米国特許第４，８３３，０８０号に記載されている。
【０１９１】
その上、この条件トランスジーンの発現は遺伝子療法様方法により誘導することが可能であり、この方法ではトランス作用性蛋白質（例えば、リコンビナーゼもしくは原核生物蛋白質）をコードする遺伝子が組織に輸送され、そして例えば細胞タイプに特異的な様式での発現を生じる。この方法によりヘッジホッグトランスジーンは成体期に入っても、そのトランス作用因子の導入による「刺激の開始」が施されるまではサイレントのままでいる。
【０１９２】
例示的態様では、本発明の「形質転換非ヒト動物」はトランスジーンを非ヒト動物の生殖細胞内に組み込ませることにより作製される。様々な発達段階にある胎仔標的細胞を用いてトランスジーンの組込みを行うことが可能である。
【０１９３】
ヘッジホッグノックアウトすなわち破壊性形質転換動物を作製する方法もやはり一般的に知られている。例えば、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ、（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ，、１９８６）を参照されたい。リコンビナーゼ依存的ノックアウト動物も作製することが可能であり、これは例えば、内因性ｈｈ遺伝子のリコンビナーゼ標的配列フランク部分を挿入するための相同性組換えにより行われ、その結果、ヘッジホッグ対立遺伝子の不活化の組織特異的および／または時間的制御を既述のように制御することが可能になる。
【０１９４】
＜実施例＞
本発明はここでは一般的に記載されており、以下の実施例の引用により一層容易に理解されるであろうが、その実施例は単に本発明の一定の特徴および態様の具体的な説明を目的とすることを意図し、かつ本発明を制限することは意図していない。
【実施例１】
【０１９５】
ニワトリソニックヘッジホッグのクローニングおよび発現
（ｉ）実験方法
ドロソフィラヘッジホッグ（Ｄｒｏｓ−ＨＨ）（配列番号３４）（Ｌｅｅ，Ｊ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）  Ｃｅｌｌ  ７１：３３−５０；Ｍｏｈｌｅｒ，Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．、（１９９２）  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１５：９５７−９７１）およびマウスインディアンヘッジホッグ（Ｉｈｈ）（配列番号１０）の間に保存される配列に相当する縮重ＰＣＲプライマー、ｖＨＨ５０（配列番号１８）、ｖＨＨ３０（配列番号１９）、およびｖＨＨ３１（配列番号２９）を用いて、２２０塩基対（ｂｐ）断片をニワトリゲノムＤＮＡから増幅した。１５の単離物からの２本の異なる配列、ｐＣＨＡ（配列番号３５）およびｐＣＨＢ（配列番号３６）をクローン化したところ、各配列はマウスＩｈｈに対する高い相同性を示した（図１）。単離物ｐＣＨＡから作製された一本のプローブは胎仔組織内での発現を検出しなかった。しかしながら単離物ｐＣＨＢは胎仔頭部、体幹、もしくは肢芽ＲＮＡから調製されたＲＮＡの内の４ｋｂのメッセージを検出した。従ってこのクローン化ＰＣＲ断片をプローブとして用いて、Ｈａｍｂｕｒｇｅｒ  Ｈａｍｉｌｔｏｎの段階２２（Ｈａｍｂｕｒｇｅｒ，Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．、（１９５１）  Ｊ．Ｍｏｒｐｈ．  ８８：４９−９２）の肢芽ＲＮＡから以下に記載される要領で調製された非増幅化ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行った。
【０１９６】
一本の１．６キロベース（ｋｂ）ｃＤＮＡクローン、ｐＨＨ−２を特徴決定のために選択し、そしてこれを今後の全分析に用いた。このｃＤＮＡをコードする遺伝子をソニックヘッジホッグ（Ｓｏｎｉｃ  Ｈｅｄｇｅｈｏｇ）（セガ（Ｓｅｇａ）社のコンピューターゲームアニメキャラクターにちなんで）と名付けた。全ｃＤＮＡの配列決定により、４２５アミノ酸（ａａ）の蛋白質をコードする可能性のある一本の長い読み取り枠の存在を確認した。このクローンは予想されるイニシエーターメチオニンの２２０ｂｐ上流から始まり、そしてストップコドンを約７０ｂｐ通過するところにまで広がっている。共通ポリアデニル化シグナルは３’非翻訳領域内には全く同定されなかった。第二の有望なイニシエーターメチオニンがアミノ酸残基４に存在する。両方のメチオニンの周囲を取り巻くこの仮想的翻訳開始シグナルは同等な効力を有するものと予測される（Ｋｏｚａｋ，Ｍ．（１９８７）  Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １５：８１２５−８１３２）。ｐＨＨ−２ソニックｃＤＮＡを用いて段階２４の胎仔ニワトリヒナＲＮＡのノザンブロットの検索を行う場合には、約４ｋｂの一本のｍＲＮＡ種が肢芽および体幹組織内に検出される。このメッセージサイズは、１８Ｓおよび２８ＳのリボソームＲＮＡの位置に対する比較を行うことにより予想された。ハイブリダイズされたｍＲＮＡはホスホスクリーンへの２日間の露出後に可視化された。ソニックｃＤＮＡクローンｐＨＨ−２はたった１．６ｋｂしかない
ため、このクローンは恐らく約２．４ｋｂの非翻訳配列を喪失しているものと思われる。
【０１９７】
ＰＣＲクローニング
全標準的クローニング技術は、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）に従って実施し、そして全酵素はＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社から取得した。ドロソフィラヘッジホッグ蛋白質（配列番号３４）（Ｌｅｅ，Ｊ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ、（１９９２）  Ｃｅｌｌ  ７１：３３−５０）のアミノ酸残基１６１〜２３７に相当する縮重オリゴヌクレオチドを合成した。これらの縮重オリゴヌクレオチド、ｖＨＨ５Ｏ（配列番号１８）、ｖＨＨ３Ｏ（配列番号１９）、およびｖＨＨ３１（配列番号２０）は、Ｅｃｏ  ＲＩ、Ｃｌａ  Ｉ、およびＸｂａ  Ｉ部位もサブクローニングを容易にするために、それぞれの５’末端に含んでいた。これらのオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列を以下に示す：
【０１９８】
【化３】
0004404923.tif 000004
［この配列中、Ｉはイノシンを表す］。ネスト型ＰＣＲを、最初にｖＨＨ５ＯおよびｖＨＨ３Ｏのプライマー対を用いてニワトリゲノムＤＮＡを増幅し、そしその後に更にその産物をｖＨＨ５ＯおよびｖＨＨ３Ｉプライマー対を用いて増幅することにより実施した。各事例における反応条件は：９３℃で２．５分間の初期変性、その後に９４℃で４５秒間、５０℃で１分間７２℃で１分間の３０周期を行い、そして７２℃で５分間の最終インキュベーション、であった。２２０ｂｐのＰＣＲ産物をｐＧＥＭ７ｚｆ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）内にサブクローン化した。２本の独特なクローン、ｐＣＨＡ（配列番号３５）およびｐＣＨＢ（配列番号３６）の同定を行った。
【０１９９】
ＤＮＡ配列分析
ヌクレオチド配列は、ジデオキシ鎖停止方法（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．、（１９７７）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７４：５４６３−５４６７）により、セクアナーゼ（Ｓｅｑｕａｎａｓｅ）ｖ２．０  Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ（ＵＳ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）を用いて決定した。ｐＨＨ−２の５’および３’ネスト型欠損を、ヌクレアーゼ  Ｅｘｏ  ＩＩＩおよびＳ１（Ｅｒａｓｅ  ａ  Ｂａｓｅ、Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いることにより作製し、そして個々のサブクローンの配列決定を行った。ＤＮＡおよびアミノ酸配列は、ＧＣＧ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．、（１９８４）Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １２：３８７−３９４）およびＤＮＡｓｔａｒソフトウエアーの両方を用いて分析した。関連配列についての検索は、ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎにより提供されるＢＬＡＳＴネットワークサービス（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．、（１９９０）  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−４１０）を介して実施した。
【０２００】
サザンブロット分析
５μｇのニワトリヒナゲノムＤＮＡをＥｃｏ  ＲＩおよび／またはＢａｍ  ＨＩで消化し、１％のアガロースゲル上で分画化し、そしてナイロン膜（Ｇｅｎｅｓｃｒｅｅｎ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ社）に転移させた。このフィルターを３２Ｐ−ラベル化ｈｈａもしくはｈｈｂで、ハイブリダイゼーション緩衝液（０．５％  ＢＳＡ、５００ｍＭ  ＮａＨＰＯ４、７％  ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．２；Ｃｈｕｒｃｈ，Ｇ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．、（１９８４）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８１：１９９１−１９９５）中で検索した。ブロットを６３℃下、０．５％のウ
シ血清アルブミン、５０ｍＭ  ＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、５％  ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中で一度、次いで４０ｍＭ  ＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、１％  ＳＤＳ、１ｍＭ
ＥＤＴＡ中で二度洗浄し、そしてＫｏｄａｋ  ＸＡＲ−５フィルム上で可視化させた。
【０２０１】
ニワトリソニックｃＤＮＡクローンの単離
段階２２の肢芽ｃＤＮＡライブラリーをλｇｔ１０内に、Ｅｃｏ  ＲＩ／Ｎｏｔ  Ｉリンカーを用いて構築した。未増幅化ファージプラーク（１０６）をナイロンフィルター（Ｃｏｌｏｎｙ／Ｐｌａｑｕｅスクリーン、ＮＥＮ社）に転移させ、そしてＰＣＲクローン
ｐＣＨＡ（配列番号３５）およびｐＣＨＢ（配列番号３６）からのα３２Ｐ−ラベル化プール挿入断片でスクリーニングした。ハイブリダイゼーションを４２℃下、５０％ホルムアルデヒド  ２×ＳＣＣ、１０％  硫酸デキストラン、１％  ＳＤＳ中で実施し、そしてサザンブロット方法において記載される要領で洗浄した。８つの陽性プラークを同定し、精製し、そしてそれらのｃＤＮＡ挿入断片をＥｃｏ  ＲＩで切り出し、そしてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）内にサブクローン化させた。８つ全てが同一の制限パターンを伴う約１．７ｋｂの挿入断片を有していた。一つのプラスミドｐＨＨ−２を配列決定用に選択し、そしてこれを今後の全操作に用いた。
【０２０２】
ジゴキシゲニン−ラベル化リボプローブの調製
プラスミドｐＨＨ−２をＨｉｎｄ  ＩＩＩで直線化し、そしてＴ３  ＲＮＡポリメラーゼ（アンチセンスプローブ用）もしくはＢａｍ  ＨＩで転写させ、そして非放射活性性ジゴキシゲニン転写物の調製についての供給社の説明事項に従ってＴ７  ＲＮＡポリメラーゼで転写させた。この転写反応後、ＲＮＡを沈殿させ、そしてこれをＲＮＡｓｅ非含有性水中に再懸濁させた。
【０２０３】
ホールマウント（Ｗｈｏｌｅ−Ｍｏｕｎｔ）インサイチューハイブリダイゼーション
ホールマウントインサイチューハイブリダイゼーションを、Ｐａｒｒ，Ｂ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．、（１９９３）  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１９：２４７−２６１；Ｓａｓａｋｉ，Ｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１８：４７−５９；Ｒｏｓｅｎ，Ｂ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．  ９：１６２−１６７から改変させたプロトコールを用いて実施した。インキュベートしたハクショクレグホン（Ｗｈｉｔｅ  Ｌｅｇｈｏｒｎ）の受精卵（Ｓｐａｆａｓ社）を、室温下でカルシウム／マグネシウム非含有性リン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）中で解離させた卵子および胎仔外膜から取り出した。他に別の記載がない限り、全洗浄は室温で５回実施した。胎仔を４℃下、ＰＢＳ中の４％のパラホルムアルデヒドで一晩固定し、４℃下ＰＢＴ（０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ）で２回洗浄し、そしてＰＢＴ中の一連の上昇濃度のメタノール溶液（２５％、５０％、７５％、２×１００％メタノール）を介して脱水した。胎仔を今後使用するまで−２０℃に保存した。
【０２０４】
プレ肢芽および肢芽両段階の胎仔を一連の下降濃度のメタノール溶液およびその後の２度にわたるＰＢＴ中での洗浄を介して再水和させた。肢芽段階の胎仔をＰＢＴ中の６％過酸化水素中で脱色し、ＰＢＴで３回洗浄し、プロテイナーゼＫ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ社、２μｇ／ｍｌ）で１５分間浸透化させ、ＰＢＴ中の２ｍｇ／ｍｌグリシンで１０分間、次いでＰＢＴで２回洗浄した。プレ肢芽段階の胎仔はＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％  ＮＰ−４０、０．５％  デオキシコレート（Ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ）、０．１％  ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）中での３度の３０分間の洗浄により浸透化させた。全連続段階において、プレ肢芽および肢芽段階の胎仔は同等に処理した。胎仔を、ＰＢＴ中の４％  パラホルムアルデヒド／０．２％  グルテルアルデヒドで固定し、ＰＢＴで４回、予備ハイブリダイゼーション緩衝液（５０％  ホルムアミド、５×ＳＳＣ、１％  ＳＤＳ、５０μｇ／ｍｌの全イーストＲＮＡ、５０μｇ／ｍｌ  ヘパリン、ｐＨ４．５）で一度洗浄し、そして新鮮な予備ハイブリダ
イゼーション緩衝液で１時間、７０℃下でインキュベートした。この予備ハイブリダイゼーション緩衝液をその後にハイブリダイゼーション緩衝液（１μｇ／ｍｌのジゴキシゲニンラベル化プローブを含む予備ハイブリダイゼーション緩衝液）に置き換え、そして７０℃で一晩インキュベートした。
【０２０５】
ハイブリダイゼーション後、胎仔を３×３０分間、７０℃下で、溶液１（５０％  ホルムアミド、５×ＳＳＣ、１％  ＳＤＳ、ｐＨ４．５）で、３×３０分間、７０℃下で、溶液３（５０％  ホルムアミド、２×ＳＳＣ、ｐＨ４．５）で、次いで室温で３回、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳ（２ｍＭ  レバミソールを含むＴｒｉｓ緩衝化食塩水）で洗浄した。抗体の非特異的結合は、胎仔を１０％の非働化ヒツジ血清を含むＴＢＳ／０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０内で２．５時間、室温で予備遮断し、かつ抗−ジゴキシゲニンＦａｂアルカリ性−ホスファターゼ複合体（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ社）を非働化させた１％ヒツジ血清および約０．３％の非働化ニワトリヒナ胎仔粉末を含むＴＢＳ／０．１％
Ｔｗｅｅｎ−２０内で予備インキュベートすることにより回避させた。１％のヒツジ血清を含むＴＢＳ／０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０中での予備吸着化抗体を用いる４℃での一晩のインキュベーションの後に、胎仔を３×５分間、室温下、ＴＢＳ／０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０で洗浄し、その後にも、５×１．５時間の室温下、ＴＢＳ／１％  Ｔｗｅｅｎ−２０での洗浄、および４℃下、ＴＢＳ／１％  Ｔｗｅｅｎ−２０での一晩の洗浄を施した。この緩衝液を、３×１０分間のＮＴＭＴ（１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０、２ｍＭのレバミソール）での洗浄により交換した。抗体検出反応は、胎仔を検出用溶液（０．２５ｍｇ／ｍｌのＮＢＴおよび０．１３ｍｇ／ｍｌのＸ−Ｐｈｏｓを含むＮＴＭＴ）でインキュベートすることにより実施した。一般的には、プレ肢芽段階の胎仔は５〜１５時間インキュベートし、そして肢芽段階の胎仔は１〜５時間インキュベートした。検出反応が完了したと思われた後、胎仔をＮＴＭＴで二度、ＰＢＴ（ｐＨ５．５）で一度洗浄し、ＰＢＴ中の４％
パラホルムアルデヒド／０．１％グルテルアルデヒドでの後固定を行い、そしてＰＢＴで数度洗浄した。胎仔を、ＰＢＴ中の一連のグリセロール（３０％、５０％、７０％、および８０％）を通して清浄化する場合もある。全胎仔に関しては、透過光下でＮｉｋｏｎズーム式立体顕微鏡を用いるＫｏｄａｋ  Ｅｋｔａｒ  １００  ＡＳＡ  フィルムでの写真撮影を行った。選択された胎仔に、ＰＢＳ中の３０％スクロース内での脱水による凍結断片標本作製用の処理を施し、その後にそれをゼラチン内に包埋し、そして凍結した。２５μｍｌの凍結切片標本をスーパーフロストプラススライド（ｓｐｅｒｆｒｏｓｔ  ｐｌｕｓ  ｓｌｉｄｅ）（Ｆｉｓｈｅｒ社）上に回収し、ＰＢＳ中で再水和させ、そしてゲルバトールでのマウントを行った。切片標本に関しては、Ｎｏｍａｒｓｋｉ光学レンズで、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｐｈｏｔ顕微鏡およびＫｏｄａｋ  Ｅｋｔａｒ  ２５  ＡＳＡ  フィルムを用いる写真撮影を行った。
【０２０６】
（ｉｉ）ニワトリソニックｈｈおよびＤｒｏｓ−ＨＨと他の脊椎動物ソニックｈｈ蛋白質との間の配列相同性比較
演繹されるソニックアミノ酸配列（配列番号８）を図２に示し、そしてドロソフィラヘッジホッグ蛋白質（配列番号３４）と比較した。全読み取り枠に関して、この２本の蛋白質はアミノ酸レベルでは４８％の相同性を示す。予想されるドロソフィラ蛋白質は、ソニックの蛋白質のアミノ末端を６２ａａ分越えて伸長する。このＮ−末端伸長部分は、そのハエ蛋白質（配列番号３４）の仮想的シグナルペプチド（残基１〜２６）の前に存在し、かつドロソフィラヘッジホッグの分泌型形態のプロセシングの間に除去されると仮定されている（Ｌｅｅ，Ｊ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．、（１９９２）  Ｃｅｌｌ  ７１：３３−５０）。ソニック蛋白質（配列番号８）の残基１〜２６の配列は真核生物のシグナルペプチドのための共通配列に非常に良く適合し（Ｌａｎｄｒｙ，Ｓ．Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．、（１９９３）  Ｔｒｅｎｄｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．  １６：１５９−１６３）、かつそのためソニックに関してその機能を果たすものと思われる。その上、図３はハイドロパシー
プロットを示し（Ｋｙｔｅ，Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．、（１９８２）  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  １５７：１３３−１４８）、この図から、ソニック蛋白質（配列番号８）の残基１〜２６が、同定されている真核生物のシグナルペプチドと一致する高い疎水性モーメントを呈することが示される。仮想的シグナル配列の開裂は、ｖｏｎ  Ｈｅｎｊｉｅ，Ｇ．（１９８６）  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．  １１：１９８６、の予測方法に従うと、Ｃ−末端〜残基２６に生じるはずである。単一の有望なＮ−連結化グリコシル化部位は、ソニック蛋白質（配列番号８）のアミノ酸残基２８２に位置している。予測されるソニック蛋白質はいずれかの他の強いコンセンサスモチーフは含まず、かつヘッジホッグ一族以外のいずれかの他の蛋白質との相同性も示さない。
【０２０７】
ソニックのマウス（配列番号１１）およびゼブラフィッシュ（配列番号１２）の同族体も単離されている。これらとドロソフィラ配列との比較を、図４に概略的に示す。脊椎動物蛋白質の全ては類似の予測構造を有し：仮想的シグナルペプチドがアミノ末端に存在し、その後にずば抜けた類似性を示す１８２アミノ酸領域（ニワトリ対マウスでは９９％の同一性、およびニワトリ対ゼブラフィッシュでは９５％の同一性を示す）およびあまり保存率の高くないカルボキシ−末端領域が続く。
【０２０８】
（ｉｉｉ）ニワトリゲノム中に存在する少なくとも３つのヘッジホッグ同族体
ニワトリヘッジホッグをコードする２本の異なるＰＣＲ産物がゲノムＤＮＡから増幅されているため、ニワトリヘッジホッグ一族内の遺伝子の総数を推定する必要があった。２本のＰＣＲクローン  ｐＣＨＡ（配列番号３５）およびｐＣＨＢ（配列番号３６）を用いて、ゲノムサザンブロットを先の「実験方法」に記載される緩やかな緊縮条件下で探索した。このブロットは、５μｇのニワトリ染色体ＤＮＡをＥｃｏ  ＲＩおよびＢａｍ  ＨＩを単独もしくは組み合わせて用いて消化することにより作製した。各プローブは別々の制限断片に関して最強の反応を示した。例えば、ｐＣＨＡで探索したブロットは各Ｂａｍ  ＨＩレーンにおいて３本のバンドを示し、それらの内の１本は６．６ｋｂの強いバンドであり、そして２本は３．４および２．７ｋｂの弱いバンドであった。ｐＣＨＢで探索したブロットは２．７ｋｂのバンドを最大強度で示し、一方で３．４および６．６ｋｂのバンドは弱めであった。強度についての類似の変化が、Ｂａｍ  ＨＩ／Ｅｃｏ  ＲＩおよびＥｃｏ  ＲＩのレーンにおいても観察され得る。露出時間は７２時間であった。このデータにより、各プローブが異なるニワトリヘッジホッグ遺伝子を認識すること、および特徴は未決定であるにせよ第三のニワトリヘッジホッグ同族体がニワトリゲノム内に存在することが示される。
【０２０９】
（ｉｖ）ソニック転写の部位を特定するノザン分析
ノザン分析を実施し、このことによりソニックがニワトリヒナの発達中に発現されることが確認された。原腸形成期から初期器官形成期までのニワトリヒナ胎仔内でのソニックの空間的および時間的発現を、ホールマウントインサイチューハイブリダイゼーションにより、全長ソニックｃＤＮＡ（配列番号１）に相当するリボプローブを用いて決定した。
【０２１０】
段階２４のニワトリヒナ肢芽および体幹（頭部および四肢を含まない）から単離された２０μｇの総ＲＮＡを、０．８％のアガロースホルムアルデヒドゲル上で分画化し、そしてナイロン膜（Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ、Ａｍｅｒｓｈａｍ社）に転移させた。このブロットをｐＨＨ−２からの１．６ｋｂのＥｃｏ  ＲＩ挿入断片で探索した。ランダムプライマーでの探索を行ったα−３２Ｐラベル化挿入断片を、４２℃下でハイブリダイゼーション緩衝液（１％  ＢＳＡ、５００ｍＭ  ＮａＨＰＯ４、７％  ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．２）中でハイブリダイズさせ、そして６３℃下、０．５％のウシ血清アルブミン、５０ｍＭのＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、５％のＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ中で一回、次いで４０ｍＭのＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、１％のＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ中で一回洗浄した。この像をホスホイメージャー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ社）を用
いて可視化させ、そしてビデオモニターからの直接写真撮影を行った。
【０２１１】
（ｖ）中期原腸形成期中のソニックの発現
ソニックメッセージは、分析した最も初期の段階である初期段階４での原腸形成中の胞胚葉において検出される。染色は、ヘンゼン結節に相当する領域内の原始線条の前端部に局在している。原腸形成が進行するにつれて、この原始線条はその最大頭尾方向の長さにまで伸展してゆき、この後にヘンゼン結節が尾方向に退化し、そして原始線条は短縮する。この結節退化の初期の時点では、ソニックｍＲＮＡをその結節上およびその結節後方の正中線細胞中に検出することが可能である。その後の段階５までにはこの結節は完全に伸展した原始線条の長さの約１／３ほどを移動しており、顕著なソニック発現は、その結節および胎仔の正中線において観察され、これは発生中の頭部形成過程時にその前方限界に達する。頭側レベルでの断片標本により、ソニックｍＲＮＡは陥入軸面内胚葉系中胚葉に限定されていることが示され、このような内胚葉系中胚葉は前腸および脊索に寄与する組織である。より尾方では（しかし、依然としてヘンゼン結節の前方に位置するものであるが）、軸面中胚葉の染色は存在せず、かつソニックの発現は外胚葉原基に限定されている。結節自体では、高レベルのソニックメッセージが非対称の分布状態で観察され、これは原子窩の左側および後方にまで伸展する。この非対称分布は一貫して観察され（段階５〜７の胎仔の６／６）、そして常にその原子窩の左側に局在する。結節上およびこの結節のすぐ後方では、ソニック発現は外胚葉原基に限定されており、かつ中胚葉もしくは内胚葉のいずれにも観察されない。基盤を形成する軸面中胚葉で発現は無発現であるにもかかわらず、背側外胚葉原基層でソニックが発現されることは、基盤を形成する中胚葉でのソニックの発現が常に正中線神経管発現の以前に生じる後期段階とは顕著な対称を成す。
【０２１２】
（ｖｉ）頭側ひだ段階中のソニックの発現
頭部突起の形成および分化過程中では、ソニック  ｍＲＮＡは神経管の正中線細胞、前腸、およびほぼ全域の軸面中胚葉において検出される。段階７では、ソニックメッセージは結節上およびその結節前方の腹側正中線細胞において非対称の状態で容易に検出される。ソニック発現の頭側限界は胎仔の前方の大半の部分にまで伸展しており、この領域ではソニックは前腸および脊索前中胚葉で発現される（Ａｄｅｌｍａｎｎ，Ｈ．Ｂ．、（１９３２）  Ａｍ．Ｊ．Ａｎａｔ．  ３１、５５−１０１）。段階８では、ソニックの発現はヘンゼン結節の前方の全腹側正中線に沿って存続する一方で、結節領域自体はもはやソニックを発現していない。異なる軸レベルでの横方向切片標本により、段階８ではソニックは脊索と、ヘンゼン結節の前方から後方前腸までの重複性腹内側神経外胚葉とにおいて同時発現される。ソニックメッセージのレベルは神経管内では不均一であり；最高レベルは中脳および後脳予定領域で見いだされ、その前後方向で徐々にレベルが減少する。ヘンゼン結節から吻側脳への神経管での増加レベルの発現は、神経外胚葉の発達令を反映する可能性があり、それは分化が後方から前方へと進行するためである。胎仔の最前端部では、発現は背側および腹側前腸の正中線細胞、ならびに脊索前中胚葉において観察される。脊索前中胚葉は重複性外胚葉と密接な接触状態にあるにもかかわらず、後者はソニック発現を欠損している。
【０２１３】
（ｖｉｉ）初期ＣＮＳ分化中のソニックの発現
段階１０〜１４では、ソニック発現は脊索、腹側神経管（底板を含む）、および腸前駆体内で検出される。段階１０までには、前脳、中脳、および後脳を生じる頭側神経外胚葉の顕著な発現が存在する。段階１０ではソニックｍＲＮＡは後脳および後方中脳の腹側正中線内で豊富に発現される。この発現は、前方中脳および後方前脳の側面にまで伸展する。発現はこの段階もしくはこれ以降の段階では頭側前脳にまでは伸展しない。切片標本により、ソニックは、脊索、脊索前中胚葉、および前腸の前方正中線において発現されることが示される。神経外胚葉での発現は前脳から尾方向に伸展する。ソニックを発現する胎仔の最後方領域では染色は脊索内のみに観察され、そしてその上に重なる神経外胚葉では
見いだされない。このことは初期発現の場合とは対称的であり、初期発現の場合には、ソニック発現の後方ドメインは、外胚葉原基には存在するが、下層を成す中胚葉もしくは内胚葉には存在しない細胞を含む。前方腸門のレベルでの中腸前駆体も弱いソニック発現を示す。
【０２１４】
段階１４では発現は三つの胚葉層全てにおいて継続する。閉鎖性中腸の上皮組織はソニックを、咽頭内胚葉および前方前腸の部分と同時に発現する。尾芽に対して側方および後方の外胚葉も弱い発現を示す。この段階では、ソニックは脊索の全長に沿って発現もされ、この脊索はここでは頭側方面では中脳領域にのみ伸展し、そして胎仔の前端部の神経外胚葉にはもはや接触しない。脊索の前方にある頭部内胚葉系中胚葉における発現はもはや観察されない。神経管では、ソニックは前脳、中脳、および後脳の腹側正中線に沿って、ならびに脊髄の後方に見いだされる。前脳では、発現は、後脳と比較すると後方に伸展している。中腸レベルでは、神経管内でのソニックの発現は底板を越えて一層後方領域にまで伸展するように見える。段階１０で観察されると同様に、段階１４でのソニックは脊索において見いだされるものの、胎仔の最後方領域内での腹側神経管には見いだされない。神経外胚葉発現が胎仔後方で最初に観察される場合には、その発現は脊索と接触しているように思われる正中線細胞内に存在する。後期段階では発現は、段階１４で発現を示した領域で継続されており、それはすなわち、ＣＮＳ、腸上皮組織（これには尿膜管外胚葉が含まれる）、および軸面中胚葉である。
【０２１５】
（ｖｉｉｉ）後方肢芽中胚葉で発現されるソニック
肢芽は最初は側板中胚葉の局所肥厚として形成される。段階１７中に遠位成長が生じるにつれて、ソニック発現は前肢および後肢の両方の後方領域において明らかになってくる。前肢のレベルでの段階２１までの切片標本により、肢芽におけるソニック発現は、内胚葉系中胚葉組織に限定されることが示される。四肢の発育中のソニックの一層詳細な発現の特徴は、以下の実施例３に論議される。簡便に記載すると、肢芽が成長するにつれて、ソニックの発現は前後方向の軸に沿って細まり、外胚葉にぴったりと密着する後縁に沿う細線状となる。発現は芽のより近位の領域には見いだされない。高レベルのソニック発現はおおよそ段階２５／２６まで維持され、この段階では染色は弱くなってくる。ソニックの発現は段階２８以後の翅芽もしくは脚芽ではもはや観察されない。
【実施例２】
【０２１６】
ＣＮＳおよび四肢の極性の調節に関わるマウスソニックヘッジホッグ
（ｉ）実験方法
ヘッジホッグファージクローンの単離
哺乳類ｈｈ遺伝子の最初のスクリーニングは先の要領で、Ｄｒｏｓ−ＨＨ遺伝子のエキソン１および２を含む７００ｂｐのＰＣＲ断片を用いて実施した。１２９／ＳｖラムダＦｉｘ  ＩＩゲノムライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）の内の約１００万プラークを、α−３２Ｐ−ｄＡＴＰラベル化プローブと、低緊縮性（５５℃下、６×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、５×デンハート（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ）中；最終洗浄を、６０℃下、０．５×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳで２０分間実施）でハイブリダイズさせた。Ｄｈｈ遺伝子に相当する５つの交差ハイブリダイズ性ファージプラークが精製された。制限酵素分析により、全クローンは重複していることが示された。選択された制限酵素消化をその後に実施して、それらのクローンの内の一つのマッピングおよびサブクローン化を行った。Ｄｒｏｓ−ＨＨ断片と交差ハイブリダイズさせたｐＧＥＭ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）もしくはＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）中のサブクローンの配列決定を、ＡＢＩ自動化ＤＮＡ配列決定機を用いて実施した。
【０２１７】
マウスＩｈｈおよびＳｈｈを、ニワトリヒナｃＤＮＡクローンを用いる、８．５日令のλｇｔ１０マウス胎仔ｃＤＮＡライブラリー（Ｆａｈｒｎｅｒ，Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．、（
１９８７）  ＥＭＢＯ  Ｊ．６：１２６５−１２７１）の１００万のプラークに対する低緊縮性ハイブリダイゼーション（既述の要領）により同定した。１．８ｋｂのＩｈｈならびに０．６４および２．８ｋｂのＳｈｈ挿入断片を含むファージプラークが同定された。これらの挿入断片を切り出し、そして改変化Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ（ＵＳＢ社）を用いるジデオキシ鎖停止配列決定法用のＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）内にサブクローン化した。大きい方のＳｈｈクローンは部分的にプロセシングを受けているｃＤＮＡを含んでおり、このｃＤＮＡ内ではエキソン１／２連結部でのスプライシングが生じていなかった。
【０２１８】
追加的ＩｈｈおよびＳｈｈ  ｃＤＮＡクローンのスクリーニングを実施するために、８．５日令のλＺＡＰＩＩ  ｃＤＮＡライブラリーを、高緊縮性（６５℃下、６×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、５×デンハート中；最終洗浄を６５℃下、０．１×ＳＳＣ、０．１％
ＳＤＳ中で３０分間実施）で、ＩｈｈおよびＳｈｈマウスｃＤＮＡクローンを用いて探索した。追加的Ｉｈｈクローンは全く同定されなかった。しかしながら幾つかの２．６ｋｂ（明らかに全長を含む）のＳｈｈクローンが単離された。元々の０．６４および２．８ｋｂ  Ｓｈｈクローン中には存在しない追加的５’コーディング領域のＤＮＡ配列がそれらの２．６ｋｂ挿入断片の内の一つの分析により取得された。
【０２１９】
ノザンブロット分析
Ｓｈｈの発現を、ＲＮＡブロット分析により、成体の脳、脾臓、腎臓、肝臓、肺、性交後１６．５日目の脳、肝臓、および肺；性交後９．５〜１７．５日目の全胎仔；性交後９．５日目の前脳、中脳、ならびに性交後１０．５日目の脳からの２０μｇの総ＲＮＡを用いて調査した。ＲＮＡ試料は１．２％のアガロースゲル上で電気泳動的に分離させ、転移させ、そしてＧｅｎｅｓｃｒｅｅｎ（ＤｕＰｏｎｔ社）に紫外線照射により架橋結合させ、そして２×１０６ｃｐｍ／ｍｌのα−３２Ｐ−ｄＡＴＰラベル化マウスＳｈｈプローブ（λｇｔ１０のスクリーニングからの２．８ｋｂの挿入断片）で探索した。ハイブリダイゼーションを４２℃下、５０％のホルムアミド、５×デンハート、５×ＳＳＰＥ、０．１％のＳＤＳ、６．５％のデキストラン、２００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ中で実施した。最終洗浄は５５℃下、０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中で実施した。このブロットを６日間、同定用スクリーンの存在下に露出させた。
【０２２０】
インサイチューハイブリダイゼーション、β−ガラクトシダーゼ染色、および組織学的分析
性交後７．２５〜１４．５日目の胎仔を、ＳｈｈもしくはＨＮＦ−３βのいずれかの発現について、Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ、（１９９２）  Ｉｎ  ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ．  Ｏｘｆｏｒｄ；Ｐａｒｒ  ｅｔ  ａｌ．、（１９９３）  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１９：２４７−２６１に記載される要領でジゴキシゲニンラベル化ＲＮＡプローブに対するホールマウントインサイチューハイブリダイゼーションにより分析した。このマウスＳｈｈプローブは、元々のＳｈｈ
ｃＤＮＡ挿入断片のＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）のＸｂａ  ＩおよびＨｉｎｄ  ＩＩＩ消化物のＴ７（２．８ｋｂ）もしくはＴ３（０．６ｋｂ）転写により作製された、２．８ｋｂもしくは０．６ｋｂのいずれかのＲＮＡ転写物であった。ＨＮＦ−３βプローブは、ＨＮＦ−３β  ｃＤＮＡクローン（Ｓａｓａｋｉ，Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．、（１９９３）  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１８：４７−５９）のＨｉｎｄ  ＩＩＩ直線化および１．６ｋｂの転写物のＴ７ポリメラーゼ転写により作製された。胎仔に関しては、Ｏｌｙｍｐｕｓ−ＳＺＨ光学顕微鏡上で、Ｋｏｄａｋ  Ｅｋｔａｃｈｒｏｍｅ  ＥＰＹ  ６４Ｔカラースライドフィルムを用いる写真撮影を行った。
【０２２１】
野生型およびＷＥＸＰ２−ＣＳｈｈ形質転換胎仔からの切片標本を調製し、そして３５Ｓ−ＵＩＰラベル化ＲＮＡプローブ（Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ，Ｄ．Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．、（
１９８７）  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ９９：４９３−５００）とのハイブリダイゼーションを実施した。切片標本に関しては、ＭｃＭａｈｏｎ，Ａ．Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．、（１９９２）  Ｃｅｌｌ  ６９：５８１−５９５において記載される要領での写真撮影を行った。
【０２２２】
βでのＷＥＸＰ２−ｌａｃＺ胎仔のβ染色は、Ｗｈｉｔｉｎｇ，Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．、（１９９１）  Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．  ５：２０４８−２０５９に従って実施した。野生型およびＷＥＸＰ２−ＣＳｈｈ形質転換胎仔の一般的組織学的分析は、ヘマトキシリンおよびエオジンでの対比染色を施したボーイン（Ｂｏｕｉｎ’ｓ）固定化胎仔のパラフィン切片標本上で実施した。組織学的検査方法はＫａｕｆｍａｎ，Ｍ．Ｈ．（１９９２）
Ｔｈｅ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｍｏｕｓｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、Ｌｏｎｄｏｎ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、により記載される要領で実施した。切片標本に関しては、Ｌｅｉｔｚ  Ａｒｉｓｔｏｐｌａｎ複式顕微鏡上で、Ｋｏｄａｋ  ＥＰＹ  ６４Ｔカラースライドフィルムを用いる写真撮影を行った。
【０２２３】
形質転換動物用のＤＮＡ構築物
ゲノムＷｎｔ−ｌ断片は、λＧＥＭ１２（Ｐｒｏｍｅｇａ社）１２９／Ｓｖマウスゲノムライブラリーを、マウスＷｎｔ−ｌ遺伝子の４番目のエキソンから取得された３７５ｂｐのＭｌｕ  Ｉ−Ｂｇｌ  ＩＩ断片でスクリーニングすることにより取得された。これらのクローンの内の一つ（Ｗｌ−１５．１）をこの研究に用いた。
【０２２４】
ｐＷＥＸＰ２発現ベクターの作製への第一段階として、Ｗｌ−１５．１を制限酵素Ａａｔ  ＩＩおよびＣｌａ  Ｉで完全に消化させ、そして２７７４ｂｐのＡａｔ  ＩＩ−Ｃｌａ  Ｉ断片を単離した。この断片を、Ａａｔ  ＩＩおよびＣｌａ  Ｉで切断したｐＧＥＭ−７Ｚｆベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）に連結させて、ｐＷｌ−１８を作製した。このプラスミドをＨｉｎｄ  ＩＩで消化させ、そしてアニールさせたオリゴヌクレオチド  ｌａｃ１（配列番号２１）およびｌａｃ２（配列番号２２）に連結させてｐＷｌ−１８Ｓ＊を作製した（これは、Ｃｌａ  Ｉ制限部位の下流に改変化ポリリンカーを有する）。この構築物（ｐＷｌ−１８Ｓ＊）をＣｌａ  ＩおよびＢｇｌ  ＩＩで消化させ、そして２．５ｋｂの３’Ｃｌａ  Ｉ−Ｂｇｌ  ＩＩエキソン−イントロン領域および５．５ｋｂの３’Ｂｇｌ  ＩＩ−Ｂｇｌ  ＩＩ  Ｗｎｔ−ｌエンハンサーの両方に連結させて、ｐＷＲＥＳ４を作製した。この構築物は１０．５ｋｂのゲノム領域を含み、この領域は、Ｗｎｔ−ｌ翻訳開始コドンの上流で開始し（ＡＴＧから約１．０ｋｂ上流のＡａｔ  ＩＩ部位に存在する）、そしてＷｎｔ−ｌポリアデニル化シグナルの５．５ｋｂ下流のＢｇｌ  ＩＩ部位にまで伸長する。このプラスミドは更に、３’転写領域（ただしこの領域は非翻訳領域である）内に逆方向に挿入された２５０ｂｐのネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）遺伝子領域も含む。最終的には、ＷＥＸＰ２発現ベクターを作製するために、２ｋｂのＳｆｉ  Ｉ断片を、ｐＷＲＥＳ４から、Ｓｆ−１（配列番号２３）およびＳｆ−２（配列番号２４）のオリゴヌクレオチドを用いて増幅させた。この増幅化断片をＳｆｉ  Ｉで消化し、そしてＳｆｉ  Ｉで直線化させたｐＷＲＥＳ４内に挿入してｐＷＥＸＰ２を作製した。このことによりＷｎｔ−ｌの翻訳開始コドンが破壊され、そしてそれを、Ｎｒｕ  Ｉ、Ｅｃｏ  ＲＶ、Ｓａｃ  ＩＩ、およびＢｓｔ  ＢＩ  制限部位（これらは、ｐＷＥＸＰ２内では非反復である）を含むポリリンカーで置換する。
【０２２５】
ｐＷＥＸＰ２−ｌａｃＺ構築物は、ｐＳＤＫｌａｃＺｐＡベクターから単離された末端充填化Ｂｇｌ  ＩＩ−Ｘｈｏ  Ｉ  ｌａｃＺ断片を、Ｎｒｕ  Ｉで切断したｐＷＥＸＰ２発現ベクター内に挿入することにより取得された。同様に、ＷＥＸＰ２−ＣＳｈｈ構築物は、全長ニワトリヒナＳｈｈコーディング配列（配列番号１）を含む末端充填化Ｘｂａ  Ｉ  ｃＤＮＡ断片を、Ｎｒｕ  Ｉで切断したＷＥＸＰ２発現ベクター内に挿入することにより取得された。
【０２２６】
オリゴヌクレオチド配列は以下のとおりである：
【０２２７】
【化４】
0004404923.tif 000005
【０２２８】
形質転換胎仔の作製および遺伝子型決定
形質転換マウス胎仔は、直線ＤＮＡ断片の、Ｂ６ＣＢＡＦ１／Ｊ（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ×ＣＢＡ／Ｊ）受精体のオス前核内へのマイクロインジェクションにより作製した。ＣＤ−１もしくはＢ６ＣＢＡＦ１／Ｊメスを注入化胎仔のレシピエントとして用いた。Ｇ０マウス胎仔を、性交後９．５、１０．５、および１１．５日目で回収し、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＳＺＨ  立体光学顕微鏡を用いてＫｏｄａｋ  ＥＰＹ−６４Ｔカラースライドフィルムでの写真撮影を行い、その後に先に既述の要領の処理を施した。  ＷＥＸＰ２−ｌａｃＺおよびＷＥＸＰ２−ＣＳｈｈ形質転換胎仔を、卵黄嚢のプロテイナーゼ−Ｋ消化物のＰＣＲ分析により同定した。簡潔に記載すると、卵黄嚢を注意深く母体組織および胎仔組織から切り離し、同腹兄弟間の交差汚染を回避させ、その後にＰＢＳで一回洗浄した。５５℃下、５０μｌのＰＣＲ−プロテインキナーゼ−Ｋ消化用緩衝液（ＭｃＭａｈｏｎ，Ａ．Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．、（１９９０）  Ｃｅｌｌ  ６２：１０７３−１０８５）内での一晩のインキュベーションの後、１μｌの加熱不活化消化物を、先に記載される反応成分を用いる（ＭｃＭａｈｏｎ，Ａ．Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．、（１９９０）  Ｃｅｌｌ  ６２：１０７３−１０８５））以下に示す４０周期分の２０μｌの容量でのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に供した（９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分）。ＷＥＸＰ２−ｌａｃＺ形質転換胎仔の場合には、オリゴヌクレオチド１３７（配列番号２５）および１３８（配列番号２６）が３５２ｂｐのｌａｃＺ特異的産物を増幅する。ＷＥＸＰ２−ＣＳｈｈ胎仔の場合には、オリゴヌクレオチドＷＰＲ２（Ｗｎｔ−ｌ−特異的）（配列番号２７）および９２４（ニワトリＳｈｈ−特異的）（配列番号２８）が、ＷＥＸＰ２発現ベクター内のニワトリヒナ−Ｓｈｈ  ｃＤＮＡの挿入断片連結点の橋渡しをする３４５ｂｐ断片を増幅する。表２はＷＥＸＰ２−Ｃ−Ｓｈｈ形質転換調査の結果をまとめてある。
オリゴヌクレオチド配列は以下のとおりである：
【０２２９】
【化５】
0004404923.tif 000006
【０２３０】
（ｉｉ）マウスｈｈ遺伝子
マウスゲノムと性交後８．５日目の（ｄｐｃ）ｃＤＮＡライブラリーの組み合わせスクリーニングにより３本の哺乳類ｈｈ相対物（図５Ａ）が同定され、これらは本明細書ではデザート（Ｄｅｓｅｒｔ）、インディアン（Ｉｎｄｉａｎ）、およびソニック（Ｓｏｎｉｃ）ヘッジホッグ（各々、Ｄｈｈ、Ｉｈｈ、およびＳｈｈ）として引用されるであろう。Ｄｈｈをコードする配列（配列番号２）は、マウスゲノムライブラリーの低緊縮性スクリーニングにより同定されるクローンの分析から決定された。５本の重複性ラムダーファージクローンの内の一つのＤＮＡ配列決定により、Ｄｒｏｓ−ＨＨ遺伝子のものと同一の位置に存在するイントロンにより中断される単一の読み取り枠をコードする３つの相同性領
域が同定された（図５Ａ）。エキソン１／２境界を横切るスプライシングは、成体精巣ＲＮＡから作製された第一鎖ｃＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅により確認された。Ｉｈｈ（配列番号３）の部分配列およびＳｈｈ（配列番号４）のコーディング領域の全配列は、性交後８．５日目のｃＤＮＡライブラリーから単離された重複性ｃＤＮＡクローンの分析から決定された。最長のＳｈｈクローン（２．６ｋｂ）は、胎仔ＲＮＡ内に存在するＳｈｈ転写物と比較すると全長を有するように思われる。１．８ｋｂの部分長のＩｈｈ  ｃＤＮＡは、ポリアデニル化共通配列および短いポリＡテイルの存在により証拠付けられるように３’末端で完結している。
【０２３１】
予想されるＤｒｏｓ−ＨＨ蛋白質配列（配列番号３４）と、マウスＤｈｈ（配列番号９）、Ｉｈｈ（配列番号１０）、およびＳｈｈ（配列番号１１）、ならびにニワトリヒナＳｈｈ（配列番号８）、およびゼブラフィッシュＳｈｈ（配列番号１２）のものとのアラインメントにより、ｈｈ一族の数々の興味深い特色が明らかにされる（図５Ａ）。全脊椎動物ｈｈ−蛋白質は、開始用メチオニンの直ぐ下流に約２０アミノ酸のアミノ末端疎水性領域を含む。これらの新規のｈｈ蛋白質の特性は未だに調査されてはいないものの、この領域がシグナルペプチドを構成し、そして脊椎動物ｈｈが分泌型蛋白質であるということがもっともらしい。シグナルペプチドの開裂は、全ｈｈ蛋白質において、絶対に保存される６つのアミノ酸連続配列、ＣＧＰＧＲＧ（配列番号２９）（残基８５〜９０に相当する）（図５Ａ）の直前に生じることが予測される（ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ，Ｇ．、（１９８６）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １４：４６８３−４６９０）。このことにより、各々４１および４４ｋｄであるプロセシングを受けたマウスＤｈｈ（配列番号９）およびＳｈｈ（配列番号１１）が作製される。興味深いことに、Ｄｒｏｓ−ＨＨ（配列番号３４）は疎水性ドメインを越える実質的なアミノ末端伸長部分を含むことが予測され、このことによりドロソフィラ蛋白質がタイプＩＩ分泌メカニズムにより分泌経路に参入することが示唆される。このことにより、その蛋白質の４３ｋｂの分泌型形態を放出するために後続の開裂を必要とするであろう貫膜結合型蛋白質が作製されるであろう。Ｄｒｏｓ−ＨＨのインビトロ分析は、この解釈と一致するものである（Ｌｅｅ，Ｊ．Ｊ．
ｅｔ  ａｌ．、（１９９２）  Ｃｅｌｌ  ７１：３３−５０）。しかしながらその疎水性領域の直ぐ上流の第二メチオニン（配列番号３４の位置５１）での一過性の転写開始も存在するように思われ（Ｌｅｅ，Ｊ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．、（１９９２）  Ｃｅｌｌ  ７１：３３−５０）、このことにより、Ｄｒｏｓ−ＨＨはその脊椎動物相対物と同様に、通常のアミノ末端シグナルペプチド配列の認識により分泌されることもある。
【０２３２】
脊椎動物ｈｈに関連する蛋白質配列のデータベース検索ではいずれかの有意な相同性を同定することができず、例外はＤｒｏｓ−ＨＨであった。それに加えて、蛋白質モチーフの「ＰＲＯＳＩＴＥ」データバンクによっても、異なるｈｈ蛋白質において保存されるいずれかのペプチドモチーフは見いだされなかった。従って、このｈｈは仮想的細胞シグナル伝達性分子の新規の一族を表す。
【０２３３】
アミノ酸アラインメントの一つの特色は、ｈｈ配列の高い保存性である。脊椎動物ｈｈは、予測されるプロセシングを受けたポリペプチド配列全体を通してＤｒｏｓ−ＨＨと４７〜５１％のアミノ酸同一性を共有する（図６）。ＤｈｈはＩｈｈおよびＳｈｈのものと比較するとやや高めの同一性を有し、このことによりＤｈｈはＤｒｏｓ−ＨＨのオートログである可能性がある。保存はその蛋白質のアミノ末端側半分（実際には位置８５（予測される共有される開裂部位の直ぐ後ろ）〜位置２４９）において最も高く、６２％のアミノ酸がドロソフィラと脊椎動物蛋白質との間では完全に不変である。マウスＤｈｈ、Ｉｈｈ、およびＳｈｈ（これらの配列は、保存性が一層高めであるこの領域で重複している）の比較により、ＩｈｈおよびＳｈｈは、Ｄｈｈ配列（８０％のアミノ酸同一性：残基８５〜２６６）と比較すると一層密接に関連していることが示される（９０％のアミノ酸同一性：残基８５〜２６６）。従ってＩｈｈとＳｈｈとは恐らく、より最近に生じた遺伝子重
複現象から生じたものと思われる。
【０２３４】
Ｓｈｈ蛋白質同士の間での交差種の比較により、更に一層厳密な配列保存性が示される。予想されるプロセシングを受けた全配列全体では、マウスおよびニワトリヒナのＳｈｈは８４％のアミノ酸残基を共有している（図６）。しかしながらアミノ末端側半分（位置８５〜２６６）では、マウスとニワトリは９９％の、そしてマウスとゼブラフィッシュは９４％の同一性を、１８０のアミノ酸領域において示している。保存性は位置２６６以降では急落する（図５Ａ）。配列番号４０は、今日までに同定された全脊椎動物Ｓｈｈ遺伝子（ヒト、マウス、ニワトリ、およびゼブラフィッシュ）のアミノ末端における共通配列を示す。配列番号４１は、様々な種（マウス、ニワトリ、ヒト、およびゼブラフィッシュ）において今日までに同定された脊椎動物ヘッジホッグ遺伝子（Ｓｈｈ、Ｉｈｈ、およびＤｈｈ）のアミノ末端側半分における共通配列を示す。  まとめとして、ｈｈ一族のメンバーは恐らく高度に保存されたアミノ末端側半分およびより変異性の高いカルボキシル末端側半分からなる分泌型蛋白質であるらしい。脊椎動動物Ｓｈｈ蛋白質の極度に高い種間保存により、脊椎動物種全体にわたりＳｈｈ機能が保存されているらしいことが指摘される。
【０２３５】
（ｉｉｉ）軸面正中線でのマウスＳｈｈの発現
マウスにおけるＳｈｈの発現を、脊椎動物の発達におけるマウスＳｈｈ（配列番号１１）の役割を探る目的で調査した。胎仔および成体のＲＮＡ試料のノザンブロットを放射性ラベル化マウスＳｈｈ  ｃＤＮＡプローブで探索した。約２．６ｋｂのＳｈｈ転写物が性交後９．５日目の全胎仔ＲＮＡ、ならびに性交後９．５および１０．５日目のＲＮＡ断片中に検出された。後期胎仔段階からの総ＲＮＡ試料においては発現は全く検出されなかった。調査を行った後期胎仔および成体組織ＲＮＡのＳｈｈ発現は、性交後１６．５日目および成体の肺においてのみ検出された。
【０２３６】
Ｓｈｈの厳密な時間的および空間的発現を一層詳細に特定するために、広域にわたる一連のホールマウントおよび連続切片標本のインサイチューハイブリダイゼーションを、各々性交後７．２５日目（原腸形成の中期線条卵筒段階）〜性交後１３．５日目のマウス胎仔試料に対して、ジゴキシゲニンおよび３５Ｓ−放射ラベル化ＲＮＡプローブを用いて実施した。Ｓｈｈ発現は節板（これは。両生類の形成体およびニワトリのヘンゼン結節のマウス相対物である）の出現以前の中期原腸形成段階（性交後７．２５日目）では全く検出されない。原子線条が完全に伸展し、そして頭突起の正中線中胚葉が節板から出現してくる際に（性交後７．５〜７．７５日目）、Ｓｈｈはこの頭突起において独占的に発現される。後期頭部ひだの段階では、Ｓｈｈは、予定脳下の前方に広がる頭突起の節板および正中線中胚葉において発現される。体節形成直前ではＳｈｈは、予定脳の下に横たわる正中線中胚葉の前方境界部にまで伸展する。体節が形成される際には胚軸は尾側方向に伸展する。脊索（これは、頭突起の尾側伸展を表す）もＳｈｈを発現し、そして発現は節板において維持される。
【０２３７】
興味深いことに、８体節（性交後８．５日目）までには強いＳｈｈ発現がＣＮＳ中に出現する。発現は、頭突起の頭側境界より上方にある中脳の腹側正中線で開始する。１０体節までには正中線でのＣＮＳ発現は、前脳においては頭側方向に、そして後脳および頭側脊髄内へと尾側方向に伸展する。発現は後脳では予定底板に限定されている一方で、中脳発現は腹外側方向に伸展する。前脳では形態的底板は存在しないが、ここでの腹側Ｃｈｈ発現は中脳に関して継続する。１５体節までには、腹側ＣＮＳ発現は、間脳の頭限界から体節領域の予定脊髄にまで連続する。次の１８〜２４時間以降、２５〜２９体節段階までは、ＣＮＳ発現は増強され、かつ前脳発現は眼茎にまで頭側方向に伸展する。他の全てのＣＮＳ領域とは対称的に、間脳の頭側半分ではＳｈｈは腹側正中線では発現されず、この領域の直ぐ後方の２本の線条中で発現され、この両線条はその頭側限界に存在する前脳床
において再度癒合する。脊索および底板の両方におけるＳｈｈの発現は、少なくとも性交後１３．５日目までは持続する。
【０２３８】
数々のグループが最近、ドロソフィラのフォークヘッド（ｆｏｒｋｈｅａｄ）遺伝子に関連する転写因子の一族の脊椎動物メンバーのクローニングおよび発現を報告している。その内の一つであるＮＨＦ−３βはＳｈｈに対して発現の点では数々の類似点を示しており（Ｓａｓａｋｉ，Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．、（１９９３）  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１８：４７−５９）、このことによりＨＮＦ−３βがＳｈｈの有望な調節因子である可能性があることが示唆される。この可能性を調査するために、ＨＮＦ−３βとＳｈｈの発現の直接比較を実施した。ＨＮＦ−３β転写物は、頭突起の出現以前に最初に節板で検出され（Ｓａｓａｋｉ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．、（１９９３）、上述、により以前に報告されているように）、そしてその発現はＳｈｈが発現される以前に生じる。この節板からは発現は、頭突起内において前方に進行し、これはＳｈｈ発現と類似する。ＣＮＳ内でのＨＮＦ−３βの活性化は最初には予定中脳および後脳内で２〜３体節時に観察され、これはＳｈｈ発現の開始以前のものである。５体節になるまでは、中脳での発現は腹外側方向に広がり、前脳内へと前方向に、およびその体節領域の神経軸のかなり下方にある予定底板内に尾側方向へと伸展する。強い発現がこの時期には節板および脊索において維持される。しかしながら１０体節までには頭突起での発現は喪失し、そして２５〜２９体節までには脊索での発現は最極尾側脊索においてのみ存在する。正中線中胚葉におけるＨＮＦ−３βの一過性発現とは対称的に、底板での発現は少なくとも性交後１１．５日目になるまでは安定に持続する。従って、正中線中胚葉と腹側ＣＮＳとの両方におけるＨＮＦ−３βとＳｈｈの発現間には数々の空間的類似性が存在し、かつこの両遺伝子は同一細胞内で発現されるように思われる。しかしながらこの両領域内では、ＨＮＦ−３βの発現はＳｈｈのものより先に生じている。主な違いは、頭突起および脊索内でのＨＮＦ−３βの一過性発現、ならびに前頭内でのＳｈｈ発現である。ＨＮＦ−３βとＳｈｈとは類似の広範囲にわたる腹側および腹外側中脳、ならびに尾側間脳発現を共有する一方で、Ｓｈｈのみが、より頭側方向で前脳内に伸展する。一般的には、これらの結果はＳｈｈ発現の初期活性化がＨＮＦ−３βにより調節されている可能性があるというモデルに一致する。
【０２３９】
ＳｈｈおよびＨＮＦ−３β発現ドメインにおける類似性も、やはり正中線に存在する最終中胚葉中に出現する。前腸嚢内での広域にわたるＨＮＦ−３β発現は、以前にＳａｓａｋｉ，Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．、（１９９３）、上述、により報告されているように５体節において出現する。Ｓｈｈも、前脳の直ぐ下方に存在する内胚葉において発現される。両遺伝子は、８〜１１体節での頭側および尾側の内胚葉において活性を示す。ＨＮＦ−３βは均一に発現される一方で、Ｓｈｈ発現は最初は細胞の２本の腹外側線条に限定されている。Ｓｈｈの腹側限定型発現は少なくとも性交後９．５日目までは予定腸の最尾側領域内で持続する一方で、ＨＮＦ−３βは背側−腹側軸に沿って均一に発現される。両方の遺伝子は性交後９．５日目では咽頭外胚葉内で発現され、かつ発現は腸内では少なくとも性交後１１．５日目まで維持される。その上、胎仔および成体の肺ＲＮＡ内でのＳｈｈの発現により、Ｓｈｈの内胚葉発現は少なくとも幾つかの内胚葉由来器官内では継続する可能性があることが示唆される。
【０２４０】
（ｉｖ）四肢におけるＳｈｈの発現
Ｓｈｈの発現は正中線構造に限定されてはいない。３０−３５体節（性交後９．７５日目）までには、発現が前肢芽内の後方細胞の小グループ内で検出される。前肢芽は、体節８〜１２とは逆に、おおよそ１７〜２０の体節段階では側腹部での間葉細胞外嚢として形成される。Ｓｈｈ発現は、約３０〜３５体節までは前肢では検出されず、それは四肢の最初の出現後１２時間を超過する時期に相当する。発現は後方に独占的に出現し、かつ間葉細胞に限定されている。性交後１０．５日目までには、前四肢および後四肢の両方が体の側腹部からしっかりと伸びてきている。この時点では、Ｓｈｈは上にかぶさっている外胚
葉と密接に関連した状態をとる両四肢の後方遠位面内で強く発現される。この段階での切片標本の分析により、後方間葉細胞の約６つの細胞分の幅を占める線条内でのＳｈｈ発現が検出される。前四肢ではＳｈｈ発現は性交後１１．５日目までには停止する。しかしながら後方遠位での発現は後四肢では依然として検出される。四肢発現は、性交後１２．５日目を越える場合には全く検出されない。
【０２４１】
（ｖ）Ｓｈｈの異所性発現
移植調査は主にニワトリヒナにおいて実施し、この研究により、脊索および底板に由来する細胞シグナルがＣＮＳの腹側面のパターン形成を行うことが示された（詳細は先に記載される）。四肢では、両方の肢芽中の後方、すなわち極性活性帯（ＺＰＡ）の細胞の集団により産生される一過性シグナルが前後方向軸の全面的なパターン形成を調節すると考えられる。従って、Ｓｈｈの配列（これにより、分泌型蛋白質、ならびに正中線中胚葉、底板、および四肢における発現様式が予測される）により、Ｓｈｈシグナル伝達は腹側ＣＮＳおよび四肢におけるパターン形成調節を媒介する可能性が示唆される。
【０２４２】
Ｓｈｈが初期哺乳類ＣＮＳ内における腹側の発達を調節することができるか否かを決定するために、Ｗｎｔ−ｌエンハンサーを用いて発現の正常ドメインを変化させた。Ｗｎｔ−ｌは劇的なパターンの発現を示し、このような発現は体節形成の直前に予定中脳において開始される。神経ひだが隆起および癒合して神経管を包囲するため、中脳でのＷｎｔ−ｌ発現はその中脳の直ぐ前方の狭い環式領域、すなわち、中脳のすぐ前方腹側中脳、ならびに間脳、中脳、髄脳、および脊髄の背側正中線に限定されるようになる（Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ，Ｄ．Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．、（１９８７）  Ｃｅｌｌ．５０：７９−８８；ＭｃＭａｈｏｎ，Ａ．Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．、（１９９２）  Ｃｅｌｌ  ６９：５８１−５９５；Ｐａｒｒ，Ｂ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．、（１９９３）  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１９：２４７−２６１）。
【０２４３】
Ｗｎｔ−ｌ発現ドメイン内でのｌａｃＺレポーター構築物の本質的に正常な発現は、Ｗｎｔ−ｌポリアデニル化配列の下流に存在する５．５ｋｂのエンハンサー領域に依存するということが決定された。Ｗｎｔ−ｌドメイン内でのｃＤＮＡクローンの異所性発現用の構築物を作製し、そして形質転換動物内で、ｌａｃ−Ｚレポーター（ｐＷＥＸＰ−ｌａｃＺ；図９）を用いて検査した。４つのＧ０形質転換胎仔の内の２つが容易に検出されるβ−ガラクトシダーゼ活性を示し、そしてこの両者においては発現は正常のＷｎｔ−ｌ発現ドメイン全体に生じていた。５．５ｋｂのエンハンサーをも含む類似の構築物でのより広範囲にわたる調査により、類似の配列が取得された。幾つかの異所性発現が新規に出現した神経冠細胞内に観察され、これは恐らくβ−ガラクトシダーゼＲＮＡの永続性もしくは背側由来の神経管内の蛋白質の結果であると思われる。従って、Ｗｎｔ−ｌ発現構築物により、中脳中、および多くのＣＮＳの背側面でのｃＤＮＡ配列の効率の良い異所性発現が可能になる。
【０２４４】
ニワトリヒナＳｈｈ  ｃＤＮＡの２本の並列するヘッド−テイルコピーを含むＳｈｈ異所性発現構築物（ｐＷＥＸＰ−ＣＳｈｈ）を作製した（図７）。この研究法を利用することにより、ニワトリヒナＳｈｈの異所性発現は、内因性マウスＳｈｈ遺伝子のものから識別される。ニワトリヒナＳｈｈは、マウス遺伝子に対して高い度合いの配列同一性および類似発現を示す。従って、Ｓｈｈ機能が脊椎動物中で広域にわたり保存されている可能性がかなり高く、この結論は更に、ゼブラフィッシュにおける同一遺伝子の研究によっても支持されている。
【０２４５】
表２は数々の形質転換実験の結果を示し、この研究ではＧ０集団を性交後９．５および１１．５日目に回収している。各発達段階において同定される形質転換胎仔のおおよそ半分が、明白で一貫したＣＮＳ表現型を有していた。５．５ｋｂのＷｎｔ−ｌエンハンサー
を用いる対照研究（ここではわずか半分の形質転換動物のみがトランスジーンを発現するであろう）を基に我々が予測したとうり、大半の胎仔においては異所的に発現されるニワトリヒナＳｈｈ、すなわち異常表現型という結果がもたらされることが明白である。
【０２４６】
【表１】
0004404923.tif 000007
性交後９．５日目では、弱い表現型を示す胎仔は中央間脳から髄脳までの開放性神経板を示す。同一段階で一層強い表現型を示す胎仔では全間脳が開放性となっており、かつ終脳および眼の発達が形態学的異常を示す。Ｗｎｔ−ｌの最前方中脳発現は、より尾側にある領域のものと比較すると低くなっているため、重篤度の違いが様々なＧ０胎仔におけるニワトリヒナＳｈｈ発現のレベルにおける違いに関連している可能性がある。開放性神経ひだの外側縁ではＷｎｔ−ｌは正常に発現されるが、間脳から髄脳に伸展する神経組織の肥厚が存在する。頭側の表現型は性交後１０．５日目と１１．５日目とでは類似している。しかしながら後の方の段階ではＣＮＳの頭側発現に遅延が生じているようである。
【０２４７】
背側頭側表現型に加えて、脊髄には進行性背側表現型が存在する。性交後９．５日目では、脊髄は形態学的には正常であるように見えるが、極頭側レベルは例外である。しかしながら性交後１０．５日目までには前四肢もしくは後四肢にまで伸展する背側異常形態が存在する。性交後１１．５日目までには全形質転換胎仔がほぼ全脊髄に沿う背側表現型を示した。表面的には脊髄はひだ状の起伏を有する見かけを示し、このことにより背側方向での細胞特性の変化が示唆される。この背側表現型および頭側表現型を、形質転換胎仔の組織学的分析により調査した。
【０２４８】
極端なＣＮＳ表現型を示す性交後９．５日目の胎仔からの切片標本は、頭側ＣＮＳ発達中に広域に広がる背側の混乱を示す。間脳における神経／外胚葉連結点が異常を示す。神経組織は表面外胚葉の平面的上皮組織とは全く異なる柱状上皮組織形態を有し、側背方向に広がるように見える。髄脳は、間脳および中脳と同様に頭側方向への開放性を示す。興味深いことに、髄脳内には不連続的側背領域が存在し、この形態はＷｎｔ−ｌ発現の正常部位に近接する正常上衣板領域とは異なる。これらの細胞はその基底に核が存在する緊密な局在化した上皮組織を形成し、その形態は底板に類似しており、かつ他のＣＮＳ領域とは異なる。背側由来の神経冠の分化が形質転換胎仔中で生じ、これは頭側神経節の存在から観察することが可能である。頭側脊髄では神経管は、背側方向に膨隆しているように見え、これは表面の異常形態に起因する可能性がある。
【０２４９】
性交後１１．５日目までにはＣＮＳ発達は全背側脊髄に沿って後四肢に至るまでかなりの異常を示す。脊髄の背側半分は肥大および膨隆を示す。背側知覚神経支配が生じるが、ニューロン弾道の組織化には高度の異常が存在する。最も顕著なのは脊髄中の背側細胞の形態（これは、通常では顕著な明染色性核および細胞質を有する延長化細胞である）が劇
的に変化する。脊髄の背側半分の大半が小さく密に凝縮した細胞でできており、その細胞は暗染色性核を有し、細胞質はほとんど見当たらない。それに加えて、これらの密に凝集した細胞はその数が多いように思われ、このことが背側ＣＮＳの異常成長をもたらすように思われる。それとは対照的に、腹側の発達は正常であり、背側根神経節も同様に正常であり、これらの源は背側脊髄に由来する神経性細胞内に存在する。
【０２５０】
（ｖｉ）底板遺伝子発現を活性化する異所性Ｓｈｈ発現
ニワトリヒナＳｈｈの異所性発現が背側ＣＮＳ内での腹側正中線発達の不適切な活性化をもたらすか否かを決定するために、２本の底板発現型遺伝子、ＨＮＦ−３βおよびマウスＳｈｈの発現を調査した。性交後９．５日目の形質転換胎仔は頭側Ｗｎｔ−ｌ発現ドメイン全体にわたるＨＮＦ−３βの異所性発現を示す。腹側正中線での正常発現に加えて、ＨＮＦ−３β転写物は、高レベルで中脳の背側（実際には非癒合型脳ひだ中の後方）面に沿う中脳／後脳連結部の直ぐ頭側にあたる環状領域内発現され、かつ髄脳の根板内では弱めに発現される。Ｗｎｔ−ｌを発現しない後脳内では発現は全く観察されない。従って、Ｓｈｈの異所性発現により、頭側Ｗｎｔ−ｌ発現ドメイン全体にわたるＨＮＦ−３βの活性化がもたらされる。
【０２５１】
連続切片標本におけるニワトリヒナＳｈｈ発現とＨＮＦ−３βの発現との間の関連も調査した。性交後９．５日目および１０．５日目の脳でのＨＮＦ−３βの活性化は背側面に局在化しており、ニワトリヒナＳｈｈの観察されている異所性発現との良好な一致を見せている。興味深いことに、マウスＳｈｈも背側方面で活性化される。従って、この２つの初期底板マーカーはニワトリヒナＳｈｈに応答して誘導される。
【０２５２】
性交後９．５日目から１１．５日目までは脊髄の表現型は一層重篤になる。底板経路の活性化が、観察された表現型における役割を担うという可能性を調査した。異所性ＨＮＦ−３βおよびＳｈｈ転写物が依然として存在する脳とは対照的に、これらの底板マーカーの誘導はほとんど観察されないか、あるいは全く観察されない。従って、背側脊髄は細胞の表現型において広域にわたる形質転換を示すにもかかわらず、このことは底板発達の誘導からもたらされるのではなさそうである。
【実施例３】
【０２５３】
ＺＰＡ活性を媒介するニワトリヒナソニックヘッジホッグ
（ｉ）実験方法
レチノイン酸ビーズ移植
受精させたハクショクレグホンのニワトリ卵子を段階２０になるまでインキュベートし、そしてその後にその卵子に、Ｔｉｃｋｌｅ，Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．、（１９８５）  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．  １０９：８２−９５、により記載される要領で、１ｍｇ／ｍｌのレチノイン酸（ＲＡ、Ｓｉｇｍａ社）に浸したＡＧ−Ｘ２イオン交換ビーズ（Ｂｉｏｒａｄ社）での移植術を施した。簡便に記載すると、そのビーズを１５分間、ＤＭＳＯ中の１ｍｇ／ｍｌのＲＡに浸し、２度洗浄し、そして肢芽の前縁上のＡＥＲ下に移植する。２４もしくは３６時間後に、移植を施した胎仔の内の数匹を回収し、そしてＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒド中で一晩固定し、そしてその後に既述の要領でホールマウントインサイチューハイブリダイゼーション用の処理を施した。残りの動物は胎仔日令１０まで発育させて、用いたＲＡの用量が鏡像重複を誘導することが可能であることを確認した。対照動物にはＤＭＳＯに浸したビーズでの移植を施し、そしてその動物は異常表現型もしくは遺伝子発生は全く示さなかった。
【０２５４】
プラスミド
他に特別な記載がない限り、全標準クローニング技術は、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．、（１９８９）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｎ．Ｙ．：Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）に従って実施し、そして全酵素はＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社から取得した。ｐＨＨ−２は、ニワトリソニックヘッジホッグ（配列番号１）の全コーディング領域を含むｃＤＮＡである。ＲＣＡＳＢＰ（Ａ）およびＲＣＡＳＢＰ（Ｅ）は、異なる宿主範囲を有するウイルスをコードする複製−コンピテントレトロウイルスベクターである。ＲＣＡＮＢＰ（Ａ）は、第二スプライスアクセプターが除去されているＲＣＡＳＢＰ（Ａ）の変異体である。このことにより、挿入された遺伝子を発現することが可能ではなく、かつウイルス感染の効果の対照として作用するウイルスがもたらされる（Ｈｕｇｈｅｓ，Ｓ．Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．、（１９８７）  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．  ６１：３００４−３０１２；Ｆｅｋｅｔｅ，Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．、（１９９３）  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．  １３：２６０４−２６１３）。ＲＣＡＳＢＰ／ＡＰ（Ｅ）は、ヒト胎盤のアルカリ性ホスファターゼｃＤＮＡを含むＲＣＡＳＢＰ（Ｅ）の変種である（Ｆｅｋｅｔｅ，Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．、（１９９３ｂ）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：２３５０−２３５４）。ＳＬＡＸ１３はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ＋由来のプラスミドであり、ｖ−ｓｒｃ（アダプタープラスミドＣＬＡ１２−Ｎｃｏからのもの、Ｈｕｇｈｅｓ，Ｓ．Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．、（１９８７）  Ｊ．Ｖｉｏｌ．  ６１：３００４−３０１２）の第二Ｃｌａ  Ｉ制限部位および５’非翻訳領域がそのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔポリリンカー内の５’のＥｃｏ  ＲＩ（およびＣｌａ  Ｉ）部位内にクローン化されている。第一（Ｍ１）もしくは第二（Ｍ２）メチオニン（位置４に存在する）のいずれかからのソニックをコードするＲＣＡＳＢＰプラスミドを、ｃＤＮＡの５’末端を改変するためのオリゴヌクレオチドを用いるｐＨＨ−２の１．７ｋｂのソニック断片のＳＬＡＸ−１３内への第一シャトルにより構築し、その結果、第一もしくは第二メチオニンのいずれかがＳＬＡＸ−１３のＮｉｃ  Ｉ部位に関してインフレームとなる。ソニックのアミノ酸配列はこれらの構築物以内では突然変異を生じない。その後にＭ１およびＭ２ソニックＣｌａ  Ｉ断片（ｖ−ｓｒｃ  ５’ＵＴＲ：ソニック）を、各々ＲＣＡＳＢＰ（Ａ）、ＲＣＡＮＢＰ（Ａ）、およびＲＣＡＳＢＰ（Ｅ）内にサブクローン化させて、ソニック／ＲＣＡＳ−Ａ１、ソニック／ＲＣＡＳ−Ａ２、ソニック／ＲＣＡＮ−Ａ１、ソニック／ＲＣＡＮ−Ａ２、ソニック／ＲＣＡＳ−ＥＡ、およびソニック／ＲＣＡＳ−Ｅ２を作製した。
【０２５５】
ニワトリ胎仔、細胞株、およびウイルス産生
全実験操作は、ＳＰＡＦＡＳ（Ｎｏｒｗｉｃｈ社、Ｃｏｎｎ）により受精させた状態で提供された閉鎖群からの標準的な特異的病原体非含有性ハクショクレグホンのニワトリヒナ胎仔（Ｓ−ＳＰＦ）において実施した。卵子を３７．５℃でインキュベートし、そしてＨａｍｂｕｒｇｅｒ，Ｖ．  ｅｔ  ａｌ．、（１９５１）  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｏｒｐｈ．  ８８：４９−９２、に従う処理を施した。全ニワトリヒナ胎仔の繊維芽細胞（ＣＥＦ）は、Ｃ．Ｃｅｐｋｏにより提供された。Ｓ−ＳＰＦ胎仔およびＣＥＦはＲＣＡＳＢＰ（Ａ）感染に対する感受性を示すが、ＲＣＡＳＢＰ（Ｅ）感染に対しては耐性を示すことが予め示されている（Ｆｅｋｅｔｅ，Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．、（１９９３ｂ）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：２３５０−２３５４）。株１５ｂ  ＣＥＦはＲＣＡＳＢＰ（Ａ）および（Ｅ）の両方による感染に対する感受性を示す。これらのウイルス宿主範囲は対照実験により確認されていた。ＣＥＦ培養物を増殖させ、そして既述の要領でレトロウイルスベクターＤＮＡでトランスフェクトさせた（Ｍｏｒｇａｎ，Ｂ．Ａ．
ｅｔ  ａｌ．、（１９９３）  Ｎａｔｕｒｅ  ３５８：２３６−２３９；Ｆｅｋｅｔｅ，Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．、（１９９３ｂ）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：２３５０−２３５４）。全ウイルスを、既述の要領で回収および濃縮した（Ｍｏｒｇａｎ，Ｂ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．、（１９９３）  Ｎａｔｕｒｅ  ３５８：２３６−２３９；Ｆｅｋｅｔｅ，Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．、（１９９３ｂ）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：２３５０−２３５４）、そしてこれは約１０８ｃｆｕ／ｍｌの力価を有していた。
【０２５６】
細胞移植
ＲＣＡＳＢＰ／ＡＰ（Ｅ）、ソニック／ＲＣＡＳ−Ｅ１、もしくはソニック／ＲＣＡＳ−Ｅ２のいずれかで予め感染させてある株１５ｂ  ＣＥＦを含む一枚の６０ｍｍデッシュを５０〜９０％密集状態にまで増殖させ、軽いトリプシン処理を施し、そしてその後に臨床用遠心機内で１０００ｒｐｍでの５分間の遠心処理を行った。ペレットを１ｍｌの培地に再懸濁させ、マイクロセントリフュージ管に移し、そしてその後に２分間２０００ｒｐｍでマイクロセントリフュージにかけた。３７℃での３０分のインキュベーション後、ペレットを２分間２０００ｒｐｍで再度遠心し、そしてその後に０．０１％の硫酸ネイルブルーを含む培地中で軽く染色した。約３００μｍ×１００μｍ×５０μｍのペレット分画を楔としてｈｈ段階１９−２３の翅芽の前方領域に移植した（Ｒｉｌｅｙ，Ｂ．Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．、（１９９３）  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１８：９５−１０４、による記載される要領で）。胎生１０日令の時点でその胎仔を回収し、ＰＢＳ中の４％ホルムアルデヒド中に固定し、アルシアングリーンで染色し、そしてサリチル酸メチルで洗浄した（Ｔｉｃｋｌｅ，Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．、（１９８５）  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．  １０９：８２−９５）。
【０２５７】
ウイルス感染
濃縮させたソニック／ＲＣＡＳ−Ａ１もしくはソニック／ＲＣＡＳ−Ａ２を、段階２０−２２の翅芽の前縁上のＡＥＲ下に注入した。感染後２４〜３６時間目に胎仔を回収し、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒド中で固定し、そして既述の要領でホールマウントインサイチューハイブリダイゼーション用の処理を施した。
【０２５８】
（ｉｉ）ソニック発現とＺＰ活性との同時局在化
ＺＰＡ活性は、肢芽内で空間的および時間的の両方で注意深くマッピングされている（Ｈｏｎｇ，Ｌ．Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．、（１９８５）  Ｊ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．ｅｘｐ．Ｍｏｒｐｈ．  ８７：１６３−１７４）。これらの実験では、ニワトリヒナ胎仔発生の様々な位置および段階からの肢芽組織の小ブロック（Ｈａｍｂｕｒｇｅｒ，Ｖ．  ｅｔ  ａｌ．、（１９５１）  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｏｒｐｈ．  ８８：４９−９２）を宿主肢芽の前方に移植し、そしてＺＰＡ活性の強度を指重複の度合いに従って定量化した。活性は最初は肢芽発達の前に側腹部に沿って弱く検出された。この活性は、肢芽の近位後縁内において段階１９で初めて最高強度に達した。段階２３までには、この活性は肢芽の後縁全長に伸展する。この活性はその後に後縁に沿って遠位方向に移動し、その結果、段階２５までには活性はもはや側腹部の基盤では検出されなくなる。その後に活性は、それが段階２９で最後に検出されるまで衰退の一途を辿る。
【０２５９】
内因性極性化活性のこの詳細なマップにより、ある範囲の発達段階にわたるＺＰＡ活性とソニック発現との空間パターン間の関連性の度合いを決定する機会が提供された。ホールマウントインサイチューハイブリダイゼーションを用いて、肢芽におけるソニック発現の空間的および時間的パターンをアッセイした。ソニック発現は、肢芽形成の開始時である段階１７になるまでは検出されず、この時点では活性は斑点状のパターンとして微弱に観察され、これは少数の細胞内での斑点状発現を反映している。この地点からソニック発現パターンは、ＺＰＡの一とぴったり一致して進行して行き、このことは発現の位置および強度の両方の点でＨｏｎｉｇ，Ｌ．Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．、（１９８５）  Ｊ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．ｅｘｐ．Ｍｏｒｐｈ．  ８７：１６３−１７４、により決定されている事実と一致する。
【０２６０】
（ｉｉｉ）レチノイン酸によるソニック発現の誘導
肢芽の前縁に挿入されたレチノイン酸の源は、鏡像重複を生じることが可能な異所性組織を誘導するであろう（Ｓｕｍｍｅｒｂｅｌｌ，Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．、（１９８３）  Ｉ
ｎ  Ｌｉｍｂ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ（Ｎ．Ｙ．：Ａｌａ  Ｒ．Ｌｉｓｓ）ｐｐ．１０９−１１８；Ｗａｎｅｋ，Ｎ．  ｅｔ  ａｌ．、（１９９１）  Ｎａｔｕｒｅ  ３５０：８１−８３）。この活性の誘導はレチノイン酸に対する即座の応答ではなく、むしろ発揮されるのに約１８時間を要する（Ｗａｎｅｋ，Ｎ．
ｅｔ  ａｌ．、（１９９１）  Ｎａｔｕｒｅ  ３５０：８１−８３）。この誘導が発揮される際には、分極性活性は移植されたレチノイン酸源の周囲には見いだされず、むしろ肢芽の縁に沿う間葉細胞内中のその源の遠位に見いだされる（Ｗａｎｅｋ，Ｎ．  ｅｔ  ａｌ．、（１９９１）  Ｎａｔｕｒｅ  ３５０：８１−８３）。
【０２６１】
ソニック発現が本当にＺＰＡ組織の誘導性を示すとしたら、その発現はレチノイン酸により異所的に誘導されるＺＰＡ組織内において誘導されるはずである。これを検査するために、レチノイン酸に浸したビーズを肢芽の前方に移植し、そして様々な長さの時間経過後に、ホールマウントインサイチューハイブリダイゼーションを用いてソニックの発現をアッセイした。肢芽が成長する際にも、そのビーズは分化を開始する組織の近位に包埋されたままになっている。異所性ソニック発現は最初には、ビーズ移植の２４時間目に間葉細胞内に検出される。この発現はそのビーズの遠位縁から少し離れた距離で見いだされる。３６時間目までにはソニックは、肢芽の後方における内因性ソニック発現と比較すると、鏡像パターン内における前方内胚葉のすぐ下にある線条内のビーズから遠位で強く発現される。
【０２６２】
（ｉｖ）四肢のパターン形成における異所性発現の効果
ソニックの正常発現パターンはレチノイン酸により誘導されるソニック発現パターンと同様に、ソニックがＺＰＡにより産生されるシグナルであることと一致する。ソニック発現がＺＰＡ活性にとって十分なものであるか否かを決定するために、その遺伝子を肢芽内で異所的に発現させた。この実験の大半においては、我々はＲＣＡＳ（Ｈｕｇｈｅｓ，Ｓ．Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．、（１９８７）  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．  ６１：３００４−３０１２）と称される複製−コンピテントレトロウイルスベクターの変異体を、ソニック配列をニワトリヒナ細胞内に導入するため、およびそれらの発現を稼働させるための両方の伝達体として利用した。ニワトリの特別な種に限定された宿主域を有する鳥類レトロウイルスのサブタイプが存在するという事実を利用して、ソニック／ＲＣＡＳウイルスで感染させた領域を制御した（Ｗｅｉｓｓ，Ｒ．（ｅｔ  ａｌ．）（１９８４）  ＲＮＡ  Ｔｕｍｏｒ  Ｖｉｒｕｓｅｓ、Ｖｏｌ．１  Ｗｅｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．、（Ｎ．Ｙ．：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）ｐｐ．２０９−２６０）；Ｆｅｋｅｔｅ，Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．、（１９９３ａ）  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．
１３：２０６４−２６１３）。従って。タイプＥ包膜蛋白質を含むベクター（ＲＣＡＳ−Ｅ、Ｆｅｋｅｔ，Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．、（１９９３ｂ）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：２３５０−２３５４）は、我々の研究室で日常的に用いられているＳＰＡＦＡＳ非近交ニワトリヒナ胎仔の細胞を感染することができない。しかしながら、ＲＣＡＳ−Ｅは株１５ｂのニワトリヒナ胎仔からの細胞を感染することが可能である。大多数の実験においては、インビトロで株１５ｂ胎仔から調製された初期ニワトリヒナ胎仔繊維芽細胞（ＣＥＦ）が感染を受けた。感染化細胞をペレット化させ、そしてＳ−ＳＰＦ宿主肢芽の前方内に作製されたスリット内に移植した。そのベクターの限定された宿主域に起因し、従って感染もその移植片に限定され、かつ宿主肢芽を通しては伝播しなかった。
【０２６３】
移植された細胞の運命を決定し、かつ移植方法のいずれかの効果を制御するために、ヒト胎盤のアルカリ性ホスファターゼを発現する対照ＲＣＡＳ−Ｅベクターを用いた。アルカリ性ホスファターゼ発現は組織化学的に容易にモニターすることが可能であり、そしてそのため感染化細胞の位置をいずれかの段階においても簡便に追跡することが可能である。移植後２４時間以内では、細胞は肢芽の前縁内で近位方向および遠位方向に分散される
。その後に細胞は肢芽の前方部分全体にわたって分散し、そして胎仔の側腹部内に入って行くのが観察される。
【０２６４】
アルカリ性ホスファターゼ発現性細胞もしくは非感染化細胞での移植を施した肢芽は、未処理の野生型四肢とは識別不能の構造を有する四肢を生じる。このような四肢は特徴的な前方から後方への指パターン２−３−４を有する。ＺＰＡ移植片は、その芽内での移植片の設置法（Ｔｉｃｋｌｅ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９８１）  Ｎａｔｕｒｅ  ２５４：１９９−２０２）および移植された組織の量（Ｔｉｃｋｌｅ，Ｃ．（１９８１）  Ｎａｔｕｒｅ  ２８９：２９５−２９８）に依存して様々なパターンの指を生じる。幾つかの事例では、結果は単一指２の重複のように弱くなることがある。しかしながら至適事例では、ＺＰＡ移植片は指の完全な鏡像重複、４−３−２−２−３−４もしくは４−３−２−３−４の産生を誘起する（図８を参照されたい）。分極性活性の効率を最後方の指の重複を基にして評価する採点システムが考案されており：指４の重複の発達をもたらすいずれかの移植片は１００％の分極性活性を反映するとして特定されている（Ｈｏｎｉｇ，Ｌ．Ｓ．
ｅｔ  ａｌ．、（１９８５）  Ｊ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．Ｅｘｐ．Ｍｏｒｐｈ．  ８７：１６３−１７４）。
【０２６５】
ソニックを発現する１５ｂ繊維芽細胞の移植片により、ある範囲のＺＰＡ−様表現型が生じた。幾つかの事例では、得られた四肢は、単に指２の鏡像対照重複の存在により野生型から逸脱することとなった。ソニック−感染化ＣＥＦ細胞の移植から生じる最も一般的な指の表現型は指２が損なわれている指４および３の鏡像重複：４−３−３−４である。多くのこのような事例では、中央２本の指は４−３／３／４パターンとして癒合しているように思われる。多くの事例ではその移植片により、至適ＺＰＡ移植片に匹敵する指の完全鏡像重複、４−３−２−２−３−４が誘導された。指の重複を除外しても、ソニックの異所性発現は近位要素の偶発的重複も生じることがあり、それには橈骨もしくは尺骨、上腕骨、および烏口骨が含まれる。これらの近位表現型はＺＰＡ移植片の特性ではないものの、これらは細胞の運命の前後方向の再特異性決定と一致する。幾つかの事例、すなわち橈骨もしくは尺骨が最も一般的に重複する場合には、一層複雑な指パターンが観察される。典型的には追加指３が重複化橈骨の遠位に形成される。
【０２６６】
ＺＡＰ移植片により生じる鏡像重複は骨格要素に限定されてはいない。例えば、羽芽は通常は四肢の後縁に沿ってのみ存在する。異所性ソニック発現の結果としての鏡像重複を呈する四肢は、それらの前縁および後縁の両方に羽芽を有し、これはＺＰＡ移植片において観察されるものに類似する。
【０２６７】
ＺＰＡ移植片は、肢芽の前縁に挿入された際には四肢パターンを変化させる強力な能力を有する一方で、その移植片は後縁に挿入された際には全く効果を示さない（Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｊ．Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．、（１９６８）  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｉｎｔｒｅｒａｃｔｉｏｎ、Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｂｉｌｌｉｎｇｈａｍ、ｅｄｓ．（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ：Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ）ｐｐ．７８−９７）。多分、後方効果の欠損は、その芽のその領域に既に存在していた分極性活性の結果であると思われる。このことと一致して、肢芽の後方に挿入されたソニック発現性細胞の移植片は決して指の数に変化を起こすことがない。幾つかのこのような移植片は四肢要素の形状に歪みを生じ、その最も一般的なものは、野生型の羽と比較した際の指３および４の遠位先端のわずかな後方屈曲である。
【０２６８】
（ｖ）ホックスド（Ｈｏｘｄ）遺伝子活性における異所性ソニック発現の効果
ホックスド（Ｈｏｘｄ）遺伝子の正しい発現は、特異的骨格要素が決定される過程の一部である（Ｍｏｒｇａｎ，Ｂ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．、（１９９３）  Ｎａｔｕｒｅ  ３５８：２３６−２３９）。ニワトリ肢芽の前方内へのＺＰＡの移植は、ホックスド遺伝子発
現の正常配列を反映するパターンでのホックスド遺伝子の遂次転写を異所的に活性化する（Ｎｏｈｎｏ，Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．、（１９９１）  Ｃｅｌｌ  ６４：１１９７−１２０５；Ｉｚｐｉｓｕａ−Ｂｅｌｍｏｎｔｅ，Ｊ．Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．、（１９９１）  Ｎａｔｕｒｅ  ３５０−：５８５−５８９）。異所性ソニック発現はＺＰＡ移植片と同一のパターン重複をもたらすため、我々は、ソニックがホックスド遺伝子の遂次活性化をももたらすものと推測した。
【０２６９】
この仮説を検査するために、前方芽にソニック／ＲＣＡＳ−Ａ２（すなわち、ニワトリ胎仔の宿主株を直接感染することが可能なウイルスである）を挿入した。この研究方法は、ソニックを発現する領域は厳密には制限せず（ウイルス注入のタイミング、位置、および力価により僅かながらな制御は行われるが）、そしてそのため一層変化に富んだ結果を生じることが予測された。しかしながら、感染化肢芽内に蔓延したウイルスの動態を検査する実験により、感染化細胞は少なくとも４８時間はその芽の前縁付近に局在したままになっていることが示される。ホックスド遺伝子発現は、ホールマウントインサイチューハイブリダイゼーションによって、感染後の様々な時間にモニターした。予測どうり、これらの遺伝子は対照四肢の後方での発現に相当する鏡像パターンで活性化された。例えば、３６時間後にはホックスド−１３は、感染化肢芽の広範囲に広がる遠位領域内に鏡像対称パターンとして発現される。類似の結果が他のホックスド遺伝子に関して取得された（原稿準備中）。
【実施例４】
【０２７０】
ゼブラフィッシュ胎仔における分極性活性を伴って組織内で発現されるドロソフィラヘッジホッグの機能的保存化同族体
（ｉ）実験方法
クローニングおよび配列決定
３３時間令ゼブラフィッシュ胎仔λｇｔ１１  ｃＤＮＡライブイラリーの約１．５×１０６プラークを低緊縮性下でのプラークハイブリダイゼーション（ＭｃＧｉｎｎｉｓ，Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．、（１９８４）  Ｎａｔｕｒｅ  ３０８：４２８−４３３）により、プローブとして２本のｈｈ配列の組み合わせ物、すなわち：ドロソフィラｈｈ  ４００ｂｐ
Ｅｃｏ  ＲＩ断片およびマウスＩｈｈ  ２４６ｂｐ  Ｂａｍ  ＨＩ−Ｅｃｏ  ＲＩエキソン  ２断片、を用いてスクリーニングした。４つのクローンが単離され、そしてそれらをｐＵＣ１８  Ｔ３Ｔ７（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）のＥｃｏ  ＲＩ部位内にサブクローン化した。クローン８．３の両方の鎖の配列決定はネスト型遺伝子欠失（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）および内部オリゴヌクレオチドプライマーを用いて実施した。ＤＮＡ配列および生じるアミノ酸配列は、「Ｇｅｎｅｗｏｒｋｓ」（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ社）およびＧＣＧソフトウエアーパッケージを用いて分析した。
【０２７１】
ＰＣＲ増幅
縮重オリゴヌクレオチド  ｈｈ５．１（配列番号３０）およびｈｈ３．３（配列番号３１）を用いてゲノムゼブラフィッシュＤＮＡを増幅した。
【０２７２】
【化６】
0004404923.tif 000008
ＰＣＲは、９４℃での初期変性、およびその後の４７℃下１分間、７２℃下２分間、および９４℃下１分間の３５周期分、および７２℃での最終伸長反応を用いて実施した。産物をｐＵＣ１８（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）内にサブクローン化した。
【０２７３】
インサイチューハイブリダイゼーション
ゼブラフィッシュ胎仔のインサイチューハイブリダイゼーションは、Ｏｘｔｏｂｙ，Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．、（１９９３）  Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．  ２１：１０８７−１０９５に記載される要領で、以下の改変事項を伴いながら実施した：胎仔を一連のメタノール溶液内ではなくむしろ一連のエタノール溶液内で再水和させ；プロテイナーゼＫ消化を５分間に短縮させ、そして後続洗浄をグリシン非含有性ＰＢＴｗ内で実施し；抗体をＰＢＴｗ、２ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ（ヒツジ血清非含有性）内で予備吸着させ；そして抗体インキュベーションをＰＢＴｗ、２ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ内で実施した。ドロソフィラ胎仔は既述の要領で処理およびハイブリダイズさせた。
【０２７４】
組織学的調査
染色させた胎仔は、既述の要領で（Ｇｏｄｓａｖｅ，Ｓ．Ｆ．  ｅｔ    ａｌ．、（１９８８）  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １０２：５５５−５６６）一連のエタノール：ブタノール溶液に通して脱水し、そしてＦｉｂｌｏｗａｘ内に包埋した。８μｍの切片標本をＡｎａｇｌｉａｎ回転式ミクロトーム上で切断した。
【０２７５】
ＲＮＡプローブ合成
Ｓｈｈ発現の分析用に２つの異なる鋳型を用いて、一致した結果が取得されており、それらの鋳型とはすなわち；（ｉ）Ｂｇｌ  ＩＩで直線化させたｐｈｈ［ｃ］８．３（保存化領域を除外してあるアンチセンスＲＮＡプローブを転写するためのもの）、および（ｉｉ）Ｈｉｎｄ  ＩＩＩで直線化させたｐｈｈ［ｃ］８．３（完全なｃＤＮＡを網羅するアンチセンスＲＮＡを転写するためのもの）である。全インサイチューハイブリダイゼーションは一層良好なシグナルが取得される後者のプローブを用いて実施した。他のプローブは以下のとおりであった：Ａｘｉｓａｌ Ｄｒａ  Ｉ直線化ｐ６ＴＩＮ（Ｓｔｒ  ｈｌｅ，Ｕ．  ｅｔ  ａｌ．、（１９９３）  Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．  ７：１４３６−１４４６）（この場合、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼを用いる）、Ｅｃｏ  ＲＩで直線化させ、そしてＴ７で転写させたｇｃｓ；ｐａｘ２のＢａｍ  ＨＩで直線化させたｐｃＦ１６（Ｋｒａｕｓｓ，Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．、（１９９１）  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１３：１１９３−１２０６）（この場合、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いる）。インサイチューハイブリダイゼーションは、１ｎｇ／ｍｌの最終濃度でのラベル化ＲＮＡを用いて実施した。アンチセンスプローブは、製造業者のプロトコール（ＤＩＧ  ＲＮＡ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  Ｋｉｔ、ＢＣＬ社）に従って転写させた。
【０２７６】
ゼブラフィッシュ株
野生型の魚は、Ｇｏｌｄｆｉｓｈ  Ｂｏｗｌ社、Ｏｘｆｏｒｄから取得された創立用集団から養育した。突然変異体サイクロックス（ｃｙｃｌｏｐｓ）（単眼）株ｂｌ６および突然変位体ノーテイル（ｎｏｔａｉｌ）（無尾）株ｂｌ６０およびｂｌ９５は、Ｅｕｇｅｎｅ社、Ｏｒｅｓｏｎ、から取得された。魚は２８℃下、１４時間／１０時間の明／暗周期下で飼育した。
【０２７７】
ＲＮＡ注入
Ｓｈｈの読み取り枠は、ＰＣＲにより、オリゴヌクレオチド
【０２７８】
【化７】
0004404923.tif 000009
を用いて増幅し、そしてｐＳＰ６４Ｔ（Ｋｒｅｉｇ，Ｐ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．、（１９８４）  Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １２：７０５７−７０７０）のＢｇｌ  ＩＩＩ部
位内にサブクローン化させた。このベクターは、ＲＮＡ安定化用の５’および３’非翻訳ゼノパス  β−グロブリン配列を含み、そしてゼノパス内でのＲＮＡ注入実験用に一般的に用いられている。約１００μｇ／ｍｌの濃度でのインビトロ転写化Ｓｈｈ  ＲＮＡを、１細胞〜４細胞段階での自然に生まれたゼブラフィッシュ胎仔の単一細胞内に、圧力パルス化Ｎａｒｉｓｈｉｇｅマイクロインジェクターを用いて注入した。注入された容積はピコリットルの範囲内に含まれるものであった。胎仔を、注入後２０〜２７時間目にＢＴ−Ｆｉｘ中で固定し（Ｗｅｓｔｅｒｆｉｅｌｄ，Ｍ．（１９８９）  Ｔｈｅ  Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  Ｂｏｏｋ、（Ｅｕｇｅｎｅ：Ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｏｒｅｇｏｎ  Ｐｒｅｓｓ））、そしてａｘｉａｌプローブでのホールマウントインサイチューハイブリダイゼーションについて先に記載された要領で処理した。
【０２７９】
形質転換ドロソフィラ
全Ｓｈｈ  ＯＲＦを含むＥｃｏ  ＲＩ断片をプラスミドｐｈｈ［ｃ］８．３から精製し、そしてホスファターゼ処理を施してあるＥｃｏ  ＲＩ消化形質転換ベクターｐＣａＳｐｅＲｈｓ（Ｔｈｕｍｍｅｌ，Ｃ．Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．、（１９８８）  Ｇｅｎｅ  ７４：４４５−４５６）と連結させた。組換えプラスミド（これは、ヒートショックプロモーターに対しては正方向でＳｈｈ  ＯＲＦを含むｐＨＳ  Ｓｈｈである）を、形質転換化コロニーからのミニプレップＤＮＡの制限酵素分析後に選択し、そしてこれを用いてドロソフィラ胎仔を、標準的なマイクロインジェクション方法（Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｄ．Ｂ．  （１９８６）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｌｏａｃｈ、Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｄ．Ｂ．、ｅｄ．、（Ｏｘｆｏｒｄ：ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ）ｐｐ．１−３８）の使用により形質転換させた。
【０２８０】
ドロソフィラ胎仔における異所性発現
適切なトランスジーンを保持する胎仔を２時間の間隔を開けて回収し、顕微鏡用のガラス製スライド上の１％アガロースの薄層上に移し、そして３７℃の水浴層中に浮遊させてあるプラスチック製ペトリ皿内で３０分間インキュベートした。熱処理後、胎仔を２５℃に戻し、その後に既述の要領で、ＤＩＧラベル化一本鎖Ｓｈｈ、ｗｇもしくはｐｔｃ  ＲＮＡプローブを用いるインサイチューハイブリダイゼーション用の固定を施した（Ｉｎｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．、（１９９１）  Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．  １：２６１−２６７）。
【０２８１】
（ｉｉ）ゼブラフィッシュヘッジホッグ同族体の分子クローニング
ドロソフィラｈｈに相同な配列を単離するための最初の試みとして、ゼブラフィッシュのゲノムＤＮＡライブラリーを低緊縮性下、部分的ｃＤＮＡであるｈｈＰＣＲ４．１（ドロソフィラ遺伝子の第一および第二エキソンに相当する）を用いてスクリーニングした（Ｍｏｈｌｅｒ，Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．、（１９９２）  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１５：９５７−９７１）。このスクリーニングは失敗であることが判明したが；マウスゲノムライブラリーの類似スクリーニングにより、ｈｈとの有意な相同性を示す単一クローンが取得され、後にそれをＩｈｈと表示した。ドロソフィラ遺伝子の第二エキソンに相同な配列を含むこのラムダークローンからの２６４ｂｐのＢａｍ  ＨＩ−Ｅｃｏ  ＲＩ断片をサブクローン化し、そしてこれをドロソフィラの部分的ｃＤＮＡ断片と共に用いて、３３時間令の胎仔から抽出されたＲＮＡから調製されたλｇｔ１１ゼブラフィッシュｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。このスクリーニングにより重複挿入断片を含む４つのクローンが取得され、その中の最長のものは１．６ｋｂの長さであり、本明細書ではこれをＳｈｈ（配列番号５）として引用する。
【０２８２】
（ｉｉｉ）ドロソフィラの体節極性遺伝子ヘッジホッグに相同なゼブラフィッシュ遺伝子の一族
Ｓｈｈ（配列番号１２）およびｈｈ（配列番号３４）の予想アミノ酸配列のアラインメ
ントにより４７％の同一性が示され、このことによりＳｈｈがドロソフィラ遺伝子の同族体であることが確認された。エキソン２内での顕著な保存性が生じており、この８０アミノ酸分の長さのドメインは、ＳｈｈとＤｒｏｓ−ＨＨとの間で７２％の同一性を示す（図９Ａ）。このドメインは更に、これまでにクローン化されている全ｈｈ関連遺伝子内では高率で保存されており、そしてそのためｈｈ蛋白質の機能には必須のものであるように思われる。カルボキシ−末端に近接する約３０のアミノ酸からなる第二ドメインは６１％のアミノ酸同一性のみを示すに過ぎないが、保存性置換を考慮に入れた場合にはＳｈｈとｈｈとの間に８３％の類似性を示し、そしてそのためやはり機能的に重要なものである可能性がある（図９Ｂ）。翻訳後改変の仮想部位を示すことが可能であるものの、これらの位置はＳｈｈとｈｈとの間では保存されてはいない。
【０２８３】
Ｌｅｅ，Ｊ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．、（１９９２）  Ｃｅｌｌ  ７１：３３−５０、は、ｈｈのアミノ−末端に近接するシグナル配列開裂の仮想部位（ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ，Ｇ．（１９８６）  Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １１、のアルゴリズムにより予測される）により下流がフランクされる２１アミノ酸の疎水性伸長部分を同定している。この疎水性伸長部分およびｈｈの仮想的シグナル配列開裂部位の両方共はＳｈｈ内に保存されており、このことによりこの蛋白質がシグナル伝達分子であることが示唆される。ｈｈとは対照的に、ＳｈｈのＮ−末端はその疎水性伸長部分の方向には伸びていない。
【０２８４】
既述の、Ｄｒｏｓ−ＨＨとマウスＩｈｈエキソン２との間の高相同性ドメインをフランクするアミノ酸に相当する縮重オリゴヌクレオチドを用いると、予測されたサイズの断片がＰＣＲによりゼブラフィッシュゲノムＤＮＡから増幅される。サブクローニングおよび配列決定後には３本の異なる配列が増幅されたように思われ、それらの全ての配列は互いに、かつＤｒｏｓ−ＨＨ（配列番号１０）と高い相同性を示す。これらの内の一つはＳｈｈに相当する一方で（これは本明細書中では２−ｈｈ（ａ）（配列番号１６）および２−ｈｈ（ｂ）（配列番号１７）として引用される）、他の２本は追加的なゼブラフィッシュｈｈ相同体（配列番号５）を示す。これらの追加的相同体の内の一つに相当するｃＤＮＡが最近同定されており、このことによりこの同族体が転写されることが確認された。従ってＳｈｈは、新規の脊椎動物遺伝子一族のメンバーであることが意味される。
【０２８５】
（ｉｖ）発達中のゼブラフィッシュ胎仔内でのＳｈｈ発現
原腸期
Ｓｈｈ発現は背側中胚葉における胎仔発生の６０％被服嚢胚形成期あたりで最初に検出される。転写は、胎仔胎盾に相当し、両生類形成体の等価物である三角形状部において示され、この転写は内部細胞層、すなわち胚盤葉下層に限定されている。腸形成中には予定中胚葉性細胞が内巻となって胚盤葉下層を形成し、その胎仔の将来の軸に収束し、約７０％の被覆嚢が動物極に達する。この段階ではＳｈｈ発現性細胞はその軸の後方３分の１にわたって広がり、そしてそのシグナル強度は完全に均一という訳ではなく、細胞のその伸長性三角部の頂端と比較すると基盤においてより強いように思われる。
【０２８６】
Ｓｈｈ転写のこの初期空間的分布は、アキシャル（ａｘｉａｌ）、すなわちフォークヘッド（ｆｏｒｋｈｅａｄ）−関連性遺伝子について先に記載されたものを思い起こさせるものであるが；８０％の被覆嚢ではアキシャル（ａｘｉａｌ）発現は更に胎仔の動物極にまで伸展し、そしは我々はＳｈｈ発現をこれらの初期発達段階においては頭部領域には見いだしてはいない。
【０２８７】
９．５時間令の発達時では１００％の被覆嚢により、Ｓｈｈ発現ドメインの後端部がここでは細胞の継続バンドを構成し、これが頭部内に伸展してゆく。Ｓｈｈ発現の正確な前方境界を決定するために、胎仔をＳｈｈおよびｐａｘ−２（以前では、ｐａｘ［ｂ］）のプローブと共に同時にハイブリダイズさせたところ、その初期発現ドメインは後方中脳を
示した（Ｋｒａｕｓｓ，Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１３：１１９３−１２０６）。この段階までにはＳｈｈ発現ドメインの前方境界は動物極の中央に位置するようになっており、かつアキシャル（ａｘｉａｌ）のものとほぼ一致する。同一段階では、ヘモボックス遺伝子グースコイド（ｇｏｏｓｅｃｏｉｄ）（ｇｓｃ）を発現する脊索前板細胞が予定前脳と重複しかつその下層を成す（Ｓｔａｔｃｈｅｌ，Ｓ．Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．、（１９９３）  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１７：１２６１−１２７４）。アキシャル（ａｘｉａｌ）は更にこの段階では頭部中胚葉組織において発現されるものとも考えられる一方で、我々は同一細胞内でＳｈｈが発現されるか否かを確認することができないでいる。染色した胎仔の切片標本により、頭部Ｓｈｈはこの段階までには神経外胚葉組織において独占的に発現される可能性があることが示唆される。
【０２８８】
（ｖ）体節形成
体節形成の開始（発達の約１０．５時間目）までには、頭部でのＳｈｈ発現は脳の腹側床に明らかに限定されており、これは間脳の先端から後脳全体へと尾側方向に伸展する。この段階ではアキシャル（ａｘｉａｌ）の発現も頭部中胚葉からは消失し、そして脳床に同様に限定されるが；それとは対照的にＳｈｈの発現は、単に中脳の前縁にまで伸展するのみである。この時点ではｇｓｃ発現は非常に微弱になっており、かつ背側正中線から離れるように遊走するように思われる細胞の環状領域に限定される。
【０２８９】
体幹形成が継続する間はＳｈｈ発現は、頭側−尾側方向に進行して、中枢神経系（ＣＮＳ）の腹側領域全体に伸展する。脊髄に沿う方向では、この発現ドメインは単列細胞、すなわち底板に限定されるが、徐々に後脳および中脳に広がり、それは直径でいうと５〜７細胞分になり、同時に腹側間脳および前脳先端の２つの強染色性隆起内への三角形型後方伸展も示し、これは恐らく視床下部になるように運命づけられている領域内への伸展であると思われる。
【０２９０】
底板でのＳｈｈの誘導が生じている際には、下層を成す中胚葉での発現が消失し始めるが、これはアキシャル（ａｘｉａｌ）の場合と類似様式での消失となる（Ｓｔｒ  ｈｌｅ，Ｕ．  ｅｔ  ａｌ．、（１９９３）  Ｇｅｎｅ  ＆  Ｄｅｖ．  ７：１４３６−１４４６）。この負の方向の調節は頭側〜尾側配列においても進行し、このことは脊索分化を伴う細胞形状の変化と一致する。２２体節段階までには中胚葉Ｓｈｈ発現は脊索の尾側領域および伸長性尾芽内に限定され、そこでは未分化細胞の隆起が比較的高レベルでＳｈｈを発現し続けている。中脳での発現は菱形形状領域に広がり；そこでの細胞再構築は前脳構造の９０゜の屈曲、すなわち腹側中脳の下に存在する視床下部の位置決定を生じる。これらの後方視床下部組織はＳｈｈを発現しない。腹側中脳におけるＳｈｈ発現に加えて、発現性細胞の成す細い線条が第三脳室のいずれかの側の背側方向に、腹側中脳内のＳｈｈドメインの頭端部から骨端の上端部（しかしこれは含まない）へと伸展する。最頭側Ｓｈｈ発現性細胞は視床下部に限定される。終脳では追加的Ｓｈｈ発現は１〜２細胞分の幅の線条内で開始する。
【０２９１】
発達の３６時間目までには、腹側ＣＮＳ内でのＳｈｈ発現は更に変化を受ける。発現は尾芽の底板内では持続するものの、脊髄内の一層頭側に位置する底板細胞はその遺伝子の発現を停止している。それとは対照的に後脳および前脳では、Ｓｈｈ発現が持続し、かつ更に変化を受ける。
【０２９２】
２６〜２８時間令では、Ｓｈｈ発現は胸鰭原基内に出現し、そしてこれは卵黄を覆う上皮細胞層の下に存在する細胞の肥厚板様の広がりとして可視化される。発達の３３時間目までには高レベルの転写が胸芽の後縁内に存在し；同時に発現は、第一鰓の後方の細い線条内で開始する。発現は初期幼仔の後方細胞内の胸鰭芽内で継続する。この段階ではＳｈｈ転写は、更に後腸の内腔に近接する細胞内でも検出される。
【０２９３】
（ｖｉ）サイクロップス（単眼）突然変異体およびノーテイル（無尾）突然変異体におけるＳｈｈの発現
Ｓｈｈを発現するアキシャル（Ａｘｉａｌ）組織の分化に影響を及ぼす２つの突然変異体が、分化した底板を欠損するサイクロップス（ｃｙｃｌｏｐｓ）（ｃｙｃ）突然変異体についての同型接合性ゼブラフィッシュ胎仔において記載されている（Ｈａｔｔａ，Ｋ．
ｅｔ  ａｌ．、（１９９１）  Ｎａｔｕｒｅ  ３５０：３３９−３４１）。それとは対照的に、同型接合性ノーテイル（ｎｏｔａｉｌ）（ｎｔｌ）胎仔は、脊索成熟の欠損および欠損尾構造の正常発達の破壊を特徴とする（Ｈａｌｐｅｒｎ，Ｍ．Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．、（１９９３）  Ｃｅｌｌ  ７５：９９−１１１）。
【０２９４】
Ｓｈｈ発現の変化はｃｙｃ胎仔では早くも原腸形成の終末には出現し、発現の前方限界は正確に後方中脳内の２本のｐａｘ−２線状と一致する。従って、野生型胎仔とは対照的に、Ｓｈｈ発現は中脳および前脳の正中線構造内では全く検出されない。５体節段階までには、Ｓｈｈ転写物は脊索内に存在し、これはこの段階では菱脳神経小節４まで伸展するが；より前方構造では発現は全く検出されない。それに加えて、Ｓｈｈ発現は腹側神経隆条内、特に中脳および前脳の腹側部分では全く検出されない。
【０２９５】
発達２４時間目では、形態学的に可視化されるｃｙｃ表現型は、腹側間脳の完全欠失に起因する正中線上での両眼の癒合である。より初期の発達段階と同様に、Ｓｈｈ発現は神経組織からは欠失している。野生型胎仔の伸長性尾芽内でのＳｈｈ発現は、脊髄全体にわたる一列の底板細胞として観察される。ｃｙｃ突然変異体では、そのようなＳｈｈ誘導は腹側脊髄の細胞内では全く生じず、例外は、尾付近で一過性の発現を示す幾つかの散乱細胞である。同様に、Ｓｈｈ発現は腹側神経管では頭側方向には全く観察されない。しかしながら小グループのＳｈｈ発現性細胞が骨端下方に検出され、これは恐らくは野生型胎仔の間脳内のＳｈｈ発現性細胞の最背側群に相当するものと思われる。
【０２９６】
同型接合性ノーテイル（ｎｔｌ）胎仔ではＳｈｈ染色は発達２４時間目では中胚葉組織内では全く観察されず、このことはこれらの胎仔内での脊索の欠損に一致し；それとは対照的に、腹側ＣＮＳ全体での発現は影響を全く受けていない。しかしながら体節形成開始の直前である尾芽段階ではＳｈｈ発現は脊索前駆体細胞内で明白に検出される。
【０２９７】
（ｖｉｉ）底板マーカーの発現を誘導するゼブラフィッシュ胎仔内への合成Ｓｈｈ転写物の注入
発達中胎仔におけるＳｈｈの活性を調査するために、ゼノパスでの遺伝子機能の分析に利用されるものに類似する過剰発現手法を適用した。新しく受精させたゼブラフィッシュ卵子に合成Ｓｈｈ  ＲＮＡを注入し、そしてこれを１４もしくは２４時間後に固定化させた。Ｓｈｈの異所性活性の結果生じる細胞の運命の可能な変化についてのアッセイとして、我々はアキシャル（Ａｘｉａｌ）発現を分析することに決定したが、それはこの遺伝子がＳｈｈが正常に発現される細胞についてのマーカーとして作用するためである。劇的ではあるが高度に局在化されるアキシャル（Ａｘｉａｌ）の異所性発現が、発達２４時間後に固定された注入化胎仔の有意な比率（２１／８０）で観察された。冒された胎仔は間脳におけるアキシャル（Ａｘｉａｌ）の発現の広範囲にわたるドメイン、および中脳での異所性アキシャル（Ａｘｉａｌ）発現を示すが；終脳および脊髄内での異所性発現が観察された事例は存在しない。注入化胎仔の多くは更に、分散した前脳構造、特に小さめの脳室および発達状況の乏しい眼を示す。１４時間後に固定化した胎仔の中でも、類似の比率で（８／４２）、間脳内のアキシャル（Ａｘｉａｌ）線状の広範囲かつ背側の伸展、ならびに中脳でのアキシャル（Ａｘｉａｌ）染色の背側伸展が示され；再び、アキシャル（Ａｘｉａｌ）発現の変化は後脳では全く観察されず、例外は、尾先端の発現性細胞数の増加であった。
【０２９８】
（ｖｉｉｉ）ｈｈ−依存性経路を活性化させるドロソフィラ胎仔におけるＳｈｈの過剰発現
ドロソフィラとゼブラフィッシュとの間のｈｈ遺伝子の高度な構造類似性が更に機能レベルにまで至っているかどうかを発見する目的で、過剰発現系を用いてハエにおけるＳｈｈの活性を検査した。ＨＳＰ７０プロモーターにより稼働されるＤｒｏｓ−ＨＨの発現により、ｈｈ活性の両方の正常標的の異所性活性化がもたらされ；ｗｇ転写ドメインは伸展することで各擬体節の３分の１〜半分の間を充填する一方で、ｐｔｃはｅｎを発現するものを除外する全細胞において異所的に活性化される（Ｉｎｇｈａｍ，Ｐ．Ｗ．  （１９９３）  Ｎａｔｕｒｅ  ３６６：５６０−５６２）。ハエと魚類との遺伝子の活性を比較するために、ＨＳ  Ｓｈｈ構築物のためのハエ形質転換体を既述の要領で作製し、そしてＨ
Ｓｈｈ形質転換ハエと同一のヒートショック療法に供した。２度の３０分にわたるヒートショックの第二回目直後に固定化させたＨＳ  ＳｈｈはＳｈｈ  ｃＤＮＡの汎存性転写を呈する。同様に処理した胎仔を第二ヒートショック後３０もしくは９０分目に固定し、そしてｗｇもしくはｐｔｃ転写についてアッセイした。両遺伝子とも、ヒートショック処理を施したＨ  Ｓｈｈ胎仔に見られるものに類似の様式で異所的に活性化されているのが観察され；従ってこのゼブラフィッシュＳｈｈ遺伝子は内因性ｈｈ遺伝子と同一経路を活性化することが可能である。
【実施例５】
【０２９９】
ヒトＨｅｄｇｅｈｏｇのクローニング、発現および位置決定
（ｉ）実験手順
ヒトｈｅｄｇｅｈｏｇ  ｃＤＮＡクローンの単離
ヒナのＳｈｈ（Ｒｉｄｄｌｅら、（１９９３）  Ｃｅｌｌ：７５：１４０１−１４１６）をクローン化するために使用した縮重ヌクレオチドは、ネスティッドＰＣＲ（ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ）  ヒトゲノムＤＮＡにより増幅するために使用した。これらのオリゴは次の通りである：
【０３００】
【化８】
0004404923.tif 000010
推定された２２０ｂｐ  ＰＣＲ生成物をｐＧＥＭ７ｚｆ（プロメガ：Ｐｒｏｍｅｇａ）中にサブクローン化し、そしてＳｅｑｕｅｎａｓｅ  ｖ２．０（Ｕ．Ｓ．バイオケミカルズ：Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を使用して配列決定した。１つのクローンがマウスＩｈｈおよびマウスＳｈｈと配列（Ｅｃｈｅｌａｒｄら、（１９９３）  Ｃｅｌｌ  ７５：１４１７−１４３０）高いヌクレオチド類似性を示し、そしてこれをλｇｔ１０ファージ中のヒト胎児肺５’−ストレッチおよびｃＤＮＡライブラリー（クローンテック：Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をスクリーニングするために使用した。このライブラリーを同社が提案する手順に従いスクリーニングし、そして２つの陽性プラークを同定、精製、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ＋（ストラタジーン：Ｓｔｒａｔａｇｅｇｎｅ）中にサブクローン化し、そしてシークエンシングし、そしてそれらＳｈｈ（配列番号：６）およびＩｈｈ（配列番号：７）のヒト相同物として同定した。
【０３０１】
１つのクローンはＳｈｈのヒト相同物ならびに非翻訳配列の５’の１５０ｂｐおよび３’の３６ｐｂの完全なコーディング配列を含んでいた。他のクローンは、Ｉｈｈのヒト相同物であるが、コーディング配列３の’の３３０ｂｐから、第１および第２エキソンの間の推定上の境界に近い点にまで広がっている。これらのクローンの同一性は、ネズミおよびヒナの遺伝子に対する比較により決定した。ヒトＳｈｈによりコードされているタンパク質は、マウスＳｈｈに対して９２．４％の全同一性を有し、アミノ末端の半分については９９％の同一性を含む。カルボキシル末端の半分も高度に保存されているが、マウスＳｈｈ中に存在しない短い１６および１１アミノ酸長を含む。ヒトＩｈｈタンパク質はマウスＩｈｈに対して９６．８％同一である。この２つの推定上のヒトタンパク質も高度に関連しており、特にそれらのアミノ末端半分は９１．４％同一である。それらはカルボキシル末端半分が有意に異なり、ここではわずかに４５．１％の同一性を表すだけである。これら全てのこれらタンパク質のアミノ部分の高レベルな類似性は、この領域がこの種類の発信分子の活性に必須なドメインをコードすることを意味している。
【０３０２】
ノーザンブロッティング 
ヒト成人組織から単離したｐｏｌｙ  Ａ＋ＲＮＡから調製したマルチプル組織ノーザンブロット（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｂｌｏｔ（クローンテック）を、完全長３２Ｐ−標識ヒトＳｈｈクローンまたは３２Ｐ−標識ヒトＩｈｈクローンと、同社の提案する手法に従いハイブリダイズさせた。
【０３０３】
ジゴキシゲニン  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション 
切片：正常なヒトの妊娠第二トリメスターの流産児標本を、ＰＢＳ中で洗浄し、そして４℃でＰＢＳ中のパラホルムアルデヒドで一晩固定し、２４時間４℃ＰＢＳ中の５０％スクロースで平衡化し、そして次にｏｃｔ中に包埋する前に１時間ｏｃｔ中の５０％スクロース中に置いた。クリオスタット標本（１０−２５ｍｍ）をスーパーフロスト（ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ）およびスライド（フィッシャー：Ｆｉｓｈｅｒ）で集め、そして−８０℃に使用するまで保存した。４％パラホルムアルデヒド中での後固定に続いて、スライドをＲｉｄｄｌｅら（１９９３）  Ｃｅｌｌ  ７５：１４０１−１４１６のように、以下の変更を加えて処理した：プロティナーゼＫ消化を室温で１−１５分間行い（切片の厚さに依存する）、プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションおよび洗浄時間を１／１０に減らした。
全載：正常なヒトの妊娠第二トリメスターの流産児標本を、ＰＢＳ中で洗浄し、そして４℃でＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドで一晩固定し、Ｒｉｄｄｌｅら（１９９３）
Ｃｅｌｌ  ７５：１４０１−１４１６のように処理した。
【０３０４】
Ｓｈｈ  Ｐ１  クローンの単離
ヒト  Ｓｈｈ遺伝子をＰ１ライブラリー（ＰｉｅｒｃｅおよびＳｔｅｒｎｂｅｒｇ、１９９２）から、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）スクリーニングによりＰ１クローンについて単離した。２つのオリゴヌクレオチドプライマーをヒトＳｈｈ配列から得た。ＰＣＲに使用したこの２つのオリゴヌクレオチドプライマーは：
【０３０５】
【化９】
0004404923.tif 000011
ＰＣＲ反応はアニーリング温度が６５℃であることを除いて、すでに記載されている（Ｔｈｉｅｒｆｅｌｄｅｒら、１９９４）標準的条件を使用して行った。これらのプライマーは、ヒトおよびＰ１クローンＤＮＡから１１９ｂｐ断片を増幅した。Ｐ１クローンをＳＨ
ＨＰ１と命名した。Ｐ１クローンを単離した後、これらのオリゴヌクレオチドをシークエンシングプライマーとして使用した。ＣＡ反復をコードする２．５Ｋｂ  ＥｃｏＲＩ断片をこのＰ１クローンから、すでに記載された方法（Ｔｈｉｅｒｆｅｌｄｅｒら、１９９４）を使用してサブクローン化した。このＣＡ反復配列を増幅するオリゴヌクレオチドプライマーは、フランキング配列から作られた：
【０３０６】
【化１０】
0004404923.tif 000012
【０３０７】
ヒトＩｈｈおよびＳｈｈ遺伝子のマッピング
ヒトＩｈｈ遺伝子を、ＮＩＧＭＳマッピングパネル２（ＧＭ１０８２６Ｂ）からの体細胞ハイブリッドを使用して染色体２にマップした。
【０３０８】
Ｓｈｈ遺伝子を、ＮＩＧＭＳマッピングパネル２（ＧＭ１０７９１およびＧＭ１０８６８）からの体細胞ハイブリッドを使用して染色体７にマップした。
【０３０９】
染色体７の四肢奇形座とＳｈｈ遺伝子との間の関連は、標準的方法により示された。ＬＤ族はすでに記載されていた（Ｔｋｕｋｕｒｏｖら、（１９９４）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．６：２８２−２８６）。Ｓｈｈ遺伝子付近の配列を持つＣＡ反復を、ＳＨＨＣＡＦおよびＳＨＨＣＡＲプライマーを使用して、ＰＣＲによりＬＤ族の全ての員のＤＮＡから増幅した。ＣＡ反復とＬＤ族中に分離しているＬＤ疾患遺伝子との間の関連を、ＭＬＩＮＫプログラム（Ｏｃｔ，１９６７）により予想した。浸透度を１００％に設定し、そして対立遺伝子頻度はＬＤ族中の非関連配偶子を使用して測定した。
【０３１０】
種間戻し交配マッピング
種間戻し交配子孫は、記載されているように（ＣｏｐｅｌａｎｄおよびＪｅｎｋｉｎｓ、（１９９１）  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．７：１１３−１１８）、Ｆ１雌性およびＣ５７ＢＬ／６Ｊ  雄性とを交配することにより（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ  ｘ  Ｍ．ｓｐｒｅｔｕｓ）作成した。全部で２０５  Ｎ２マウスを使用してＩｈｈおよびＤｈｈ座をマップした。ＤＮＡ単離、制限酵素消化、アガロースゲル電気泳動、サザンブロットトランスファーおよびハイブリダイゼーションは、本質的に記載されている（Ｊｅｎｋｉｎｓら、（１９８２）  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４３：２６−３６）ように行った。すべてのブロットをＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋ナイロン膜（アマシャム：Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて調製した。プローブ（マウスｃＤＮＡの〜１．８ｋｂ  ＥｃｏＲＩ断片）は、ＢｇｌＩＩでの消化後にＣ５７ＢＬ／６ｊ（Ｂ）  ＤＮＡ中の８．５ｋｂの主要バンドならびにＭ．ｓｐｒｅｔｕｓ（Ｓ）  ＤＮＡ中の主要６．０ｋｂ断片を検出した。Ｓｈｈプローブ（マウスｃＤＮＡの〜９００ｂｐ  ＳｍａＩ断片）は、７．５および２．１ｋｂ（Ｂ）ならびに４．６および２．１（Ｓ）のＨｉｎｃＩＩ断片を検出した。Ｄｈｈプローブ、およびマウスゲノムＤＮＡの〜８００ｂｐのＢａｍＨｉ／ＥｃｏＲｉ断片は、ＳｐｈＩでの消化後に、４．７および１．３ｋｂ（Ｂ）および８．２および１．３ｋｂ（Ｓ）の主要断片を検出した。Ｍ．ｓｐｒｅｔｕｓ特異的断片の存在および不在は、戻し交配にしたがった。
【０３１１】
種間特異的戻し交配におけるＩｈｈ、ＳｈｈおよびＤｈｈ座の位置決定をするために使用した座に関するプローブおよびＲＦＬＰの記載は報告されている。それらには：Ｆｎ１、ＶｉｌおよびＡｃｒｇ、染色体１（Ｗｉｌｋｉｅら、（１９９３）  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ
１８：１７５−１８４）、Ｇｎａｉｌ、Ｅｎ２、Ｉｌ６、染色体５（Ｍｉａｏら、（１９９４）  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９１：１１０５０−１１０５４）およびＰｄｇｆｂ、Ｇｄ
ｃ１およびＲａｒｇ、染色体１５（Ｂｒａｎｎａｎら、（１９９２）  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ
１３：１０７５−１０８１）。組換え距離は記載されているように（Ｇｒｅｅｎ，（１９８１）  結合、組換えおよびマッピング（Ｌｉｎｋａｇｅ，ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍａｐｐｉｎｇ）。“動物育種実験における遺伝学および可能性（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ）”第７７−１１３、オックスフォード大学出版、ＮＹ）、コンピュータープログラム  ＳＰＲＥＴＵＳ  ＭＡＤＮＥＳＳを使用して算出した。遺伝子オーダーは、対立遺伝子分布パターンを説明するために必要な組換え回数を最小にすることにより決定した。
【０３１２】
（ｉｉ）ヒトＳｈｈおよびＩｈｈの発現
ＳｈｈおよびＩｈｈ発現の組織分布を調査するために、様々な成人ヒト組織由来のｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ試料を２つのｃＤＮＡクローンを用いて釣り上げた。試験した組織の中で、〜２．７ｋｂのＩｈｈ−特異的メッセージのみが肝臓および腎臓中に検出される。Ｓｈｈ転写物は、試験した成人組織のいずれのＲＮＡ中にも検出されなかった。全ての試料は、対照プローブを用いたハイブリダイゼーションにより測定した時、およそ等量の完全なＲＮＡを含んだ。
【０３１３】
遺伝子のｈｅｄｇｅｈｏｇ族を、ハエおよび脊椎動物における胚のパターニングのメディエーターとして同定した。これらの遺伝子の成人の発現はこれまでに報告されていない。これらの結果は、Ｉｈｈがさらに成人肝臓および腎臓で役割を果たしていることを示している。ｈｅｄｇｅｈｏｇ遺伝子は細胞間シグナルをコードするので、Ｉｈｈはこれらの器官中で異なる細胞型の特性を調整する機能を果たしているかもしれない。Ｓｈｈは成人において発信分子として使用されることもでき、組織中のここでは見られないか、あるいはこれらの条件下では低すぎて検出できない。
【０３１４】
様々な妊娠中期のヒト胎児器官において、Ｓｈｈの発現を調査するために、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを使用した。Ｓｈｈ発現は内胚葉から派生した組織に主に存在する：呼吸上皮、腎臓の回収ダクト、尿管上皮、肝細胞および小腸上皮。Ｓｈｈは胎児心臓または胎盤組織には検出できない。発現の強度は初期の分化している組織中で増加し（腎芽体、ベース絨毛（ｂａｓｅ  ｖｉｌｌｉ）、分枝肺芽体）、そして分化した組織（例えば糸球）では減少するか、あるいは存在しない。Ｓｈｈの発現は発芽している呼吸管に隣接する間葉に存在する。肝細胞中のＳｈｈ発現の非均一的パターンは、成人肝臓中の他の遺伝子の発現と合致する（Ｄｉｎｇｅｍａｎｓｅら、（１９９４）Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ５６：１５３−１６２）。絨毛のベース、腎芽体および肺芽体は、すべてＳｈｈを発現している領域であり、それらは活発に成長し、そして分化している領域であり、Ｓｈｈがこれらの過程に重要であることを示唆している。
【０３１５】
（ｉｉｉ）ヒトＳｈｈおよびＩｈｈの染色体地図の位置
Ｓｈｈはマウスおよびヒナの発生中にパターン化を媒介すると知られており、そしてＳｈｈおよびＩｈｈ発現はヒトにおいて同様な役割を示唆していることから、これらの遺伝子の突然変異が胚の致死率または先天性欠陥を導くと期待される。この可能性を調査する１つの方法は、これらが任意の周知な遺伝性疾患と遺伝的に関連しているかどうかを見ることである。
【０３１６】
ＳｈｈおよびＩｈｈ−特異的プライマーを、各々の配列から設計し、そしてネズミ−ヒト体細胞ハイブリッドパネルに関するＰＣＲ反応に使用した。対照のネズミＤＮＡはこのプライマーを使用して特異的なバンドを増幅しなかった。対照的に、数種のネズミ−ヒト−ヒトハイブリッドは、Ｓｈｈを染色体７ｑに、そしてＩｈｈを染色体２に定めることができる適切な大きさのＰＣＲ生成物を生じた。
【０３１７】
ヒナＳｈｈの中心的役割の１つは、四肢の前−後方軸を調節することにある。ヒトの先天的多合指症は最近、染色体７ｑ３６にマップされた（Ｔｓｕｋｕｒｏｖら、（１９９４）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．  ６：２８２−２８６；Ｈｅｕｔｉｎｋら、（１９９４）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．  ６：２８７−２９１）。この疾患の表現型は四肢での異常なＳｈｈ発現から予想しうる欠陥と一致する。したがって、Ｓｈｈの染色体的位置はより正確に、特に多合指症座と関連してマップされた。
【０３１８】
Ｐ１ファージライブラリーは、ＰＣＲ増幅用のＳｈｈ特異的プライマーを使用してスクリーニングし、そしてクローンＳＨＨＰ１を単離した。クローンＳＨＨＰ１はＳｈｈ配列を含んでいた。［ＣＡ］／［ＧＴ］プローブを使用して、このファージのＥｃｏＲＩ消化物をサザンブロットすると、２．５ｋｂのＥｃｏＲＩ断片がＣＡ反復を含むことが示された。このサブクローン化ＥｃｏＲＩ断片のヌクレオチド配列分析では、ＣＡ反復がＥｃｏＲＩ部位の近くにあることが示された。ＣＡ反復を挟むプライマーを設計し、複雑な多合指症と大きく類似する個体について、７ｑに関する他のマーカーと比べてＳｈｈの位置をマップするために使用した（Ｔｓｕｋｕｒｏｖら、（１９９４）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．  ６：２８２−２８６）。Ｓｈｈマップは７ｑ３６上のＤ７５５５０に近く、この実験では組換えは起こらなかった。１回の組換えがそれらの間に観察された多合指症座とも大変近く、しかし異なった（最大ｌｏｄ値＝４．８２、〇＝０．０５）。１つの影響を受けていない個体（家系番号Ｖ−１０、Ｔｓｕｋｕｒｏｖら、（１９９４）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．  ６：２８２−２８６）は、全ての影響を受けた家族の員に見いだされるＣＡ反復対立遺伝子に連結したＳｈｈを有する。Ｅｎ２およびＳｈｈ遺伝子座との間に組換えは観察されなかった（最大ｌｏｄ値＝１．８２、〇＝０．０）。
【０３１９】
（ｉｖ）ネズミＩｈｈ、ＳｈｈおよびＤｈｈ遺伝子の染色体マッピング
ネズミのＩｈｈ、ＳｈｈおよびＤｈｈの染色体位置は、［（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ  ｘ  Ｍ．ｓｐｅｔｒｕｓ）Ｆ１  Ｘ  Ｃ５７ＢＬ／Ｊ）］マウスの交配から派生した種間戻し交配マッピングパネルを使用して決定した。遺伝子マッピングに有用な情報をもたらす制限断片長多型（ＲＦＬＰｓ）を同定するために、各々の座に由来するｃＤＮＡ断片を、数種の異なる制限酵素を用いて別個に消化したＣ５７ＢＬ／６ＪおよびＭ．ｓｐｒｅｔｕｓゲノムＤＮＡのサザンブロットハイブリダイゼーション分析のプローブとして使用した。次に種間戻し交配における各ＲＦＬＰの種分布パターンを、戻し交配マウスのＭ．ｓｐｒｅｔｕｓに特異的なＲＦＬＰの存在または不在に従い決定した。
【０３２０】
Ｉｈｈは、Ｆｎ１から２．７  ｃＭ遠位のマウス染色体１の中心領域にマップされ、そして普通に分類される１９０種類の動物のＶｉｌとは組換えが起こらず、２つの位置が１．６ｃＭ内であることを示唆した（９５％よりも高い信頼レベル）（図１６）。Ｓｈｈは、Ｃｈａｎｇら（１９９４）  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２０：３３３９−３３５３に従い、Ｅｎ２から０．６ｃＭ遠位かつＩ１６に１．９ｃＭ近位のマウス染色体５の近位領域にマップされた。ＤｈｈはＧｄｃ１から０．６ｃＭ遠位のマウス染色体１５の大変遠位な領域にマップされ、そして普通に分類される１６０種類の動物のＲａｒｇとは組換えが起こらず、２つの座が互いに１．９ｃＭ以内にあることを示唆していた（９５％より高い信頼レベル）（図１６）。
【０３２１】
染色体１、５および１５の種間特異的マップを、多くの非クローン化マウス突然変異のマップの位置を報告する、コンポジットマウス結合マップ（ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ  ｍｏｕｓｅ  ｌｉｎｋａｇｅ  ｍａｐｓ）と比較した（Ｍ．Ｔ．Ｄａｖｉｓｓｏｎ、Ｔ．Ｈ．Ｒｏｄｅｒｉｃｋ、Ａ．Ｌ．ＨｉｌｌｙａｒｄおよびＤ．Ｐ．Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅにより編集され、そしてメリーランド州、バー  ハーバーのザ  ジャクソン  ラボラトリーで保持されているコンピューター化されたデータベースであるＧＢＡＳＥから提供されている）
。このｈｅｍｉｍｅｌｉｃ  ｅｘｔｒａ−ｔｏｅ（Ｈｘ）マウス  突然変異体は、染色体５のＥｎ２から１．１ｃＭ遠位（Ｍａｒｔｉｎら、（１９９０）  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ６：３０２−３０８）、Ｓｈｈが位置した所に極めて接近した位置にマップされた。Ｈｘは、軸前方の多指症および四肢全てに影響するヘミメリア（ｈｅｍｉｍｅｌｉａ）を生じる優勢突然変異である（Ｄｉｃｋｉｅ，（１９６８）  Ｍｏｕｓｅ  Ｎｅｗｓ  Ｌｅｔｔ  ３８：２４；ＫｎｕｄｓｅｎおよびＫｏｃｈｈａｒ，（１９８１）  Ｊ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．Ｅｘｐ．Ｍｏｒｐｈ．６５：Ｓｕｐｐｌ．２８９−３０７）。Ｓｈｈはすでに四肢で発現することが示された（Ｅｃｈｅｌａｒｄら、（１９９３）  Ｃｅｌｌ  ７５：１４１７−１４３０）。ＳｈｈおよびＨｘが強力に関連しているのかどうかを決定するために、Ｈｘが分離している戻し交配パネル中の分布に従った。ＳｈｈとＨｘとの間の２つの組換え体が同定され、したがって２つの座が対立している可能性が排除され、そしてこれらの観察はここでもＣｈａｎｇら（１９９４）  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２０：３３３９−３３５３の観察と一致した。ＩｈｈおよびＤｈｈに近い幾つかの他の突然変異があるが、対応する遺伝子中の変化に関する明らかな候補は無い。
【０３２２】
マウス染色体１の中央領域は、ヒト染色体２ｑと相同性を共有する（図１６に要約）。この間隔にＩｈｈが位置することは、Ｉｈｈのヒト相同物も同じく２ｑにあるであろうことを示唆している。同様に、Ｄｈｈのヒト相同物もヒト染色体１２ｑにあるのだろう。
【実施例６】
【０３２３】
タンパク質溶解処理は２つの分泌形Ｓｏｎｉｃ  Ｈｅｄｇｅｈｏｇを生じる
（ｉ）実験手順
インビトロ翻訳まよびプロセッシング
マウスおよびヒナのｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇコーディング配列を、ＳＰ６ファージプロモーターならびにキセノプス  ラエビス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）β−グロビン遺伝子に由来する５’および３’非翻訳配列の両方を含むベクターｐＳＰ６４Ｔ（Ｄ．Ｍｅｌｔｏｎの好意により提供された）中に挿入した。直線鋳型を作成するために、ＳａｌＩを用いた制限エンドヌクレアーゼ消化後、１ｍＭのｃａｐ  構造類似体（ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇｍ；ベーリンガーマンハイム社：Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｃ）が存在する中でＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ（プロメガ社：Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｉｎｃ．）を使用して、ＲＮＡをインビトロ転写した。ＤＮＡ鋳型を取り出すためにＲＱ１  ＤＮａｓｅ  Ｉ（プロメガ社）を用いて消化した後、鋳型をフェノール：クロロホルム抽出およびエタノール沈殿により精製した。
【０３２４】
ウサギ  網状赤血球溶解物（プロメガ社）を、製造元の指示に従い使用した。各反応に、１２．５μｌの溶解物は０．５−２．０μｇのインビトロ転写ＲＮＡを用いてプログラムした。反応は２０μＣｉの発現標識ミックス（ＮＥＮ／デュポン社：ＤｕＰｏｎｔ社）を含んだ。インビトロプロセッシングおよび分泌を取り扱うために、１．０−２．０μｌのイヌ  膵臓ミクロソーム膜（プロメガ社）を反応に含んだ。２５μｌの最終的な反応容量を３０℃に１時間インキューベーションした。各反応のアリコート（０．２５から３．０μｌの間）を３分間、レムリーの試料緩衝液（ＬＳＢ：１２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ［ｐＨ  ６．８］；２％  ＳＤＳ；１％  ２−メルカプトエタノール；０．２５ｍｇ／ｍｌブロモフェノールブルー）中で煮沸し、その後１５％のポリアクリルアミドゲルで分離した。固定化ゲルをＥｎＨａｎｃｅ（ＮＥＮ／デュポン社）を製造元の指示に従い使用してフルオログラフィーを行った。
【０３２５】
グリコシル化はエンドグリコシダーゼＨ（Ｅｎｄｏ  Ｈ；ニューイングランドバイオラボズ社：Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）を用いて、製造元の指示に従いインキューベーションすることにより行った。反応は１−２時間、３７℃で行い、その後反応生成物をポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）で分析した。
【０３２６】
アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  Ｏｏｃｙｔｅ）卵母細胞注入および標識
卵母細胞を酵素的に脱卵胞化（ｄｅｆｏｌｌｉｃｕｌａｔｅｄ）し、そしてＯＲ２（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ［ｐＨ  ７．２］、８２ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４）ですすいだ。健康な第６期の卵母細胞に３０ｎｇのインビトロ転写した、キャップ付きマウスＳｈｈ  ＲＮＡ（上記のように調製）を注入した。２時間の回収時間の後、健康な注入卵母細胞および非注入対照を、ウェルあたり０．２ｍｌのＯＲ２（０．１ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシンおよび０．４ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを補充した）を含む９６−ウェルディシュ中の１０の群にて室温で培養した。インキューベーション培地に５０μＣｉの発現標識ミックスを補充した。注入３日後、培養培地を回収し、そしてＳｈｈタンパク質の発現を免疫沈降により分析した。卵母細胞をＯＲ２で数回すすぎ、その後１μｇ／ｍｌのアプロチニン、２μｇ／ｍｌのロイペプチンおよび１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を補充したＴＥＮＴ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ  ８．０］；１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ；１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００；１０μｌ／卵母細胞）中で溶解させた。１３，０００×ｇで１０分間、４℃で遠心した後、可溶性タンパク質上清を回収し、そして免疫沈降（以下を参照）により分析した。
【０３２７】
Ｃｏｓ細胞トランスフェクションおよび標識
Ｃｏｓ細胞を、１０％のウシ胎児血清（ギブコ／ＢＲＬ：Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（ギブコ／ＢＲＬ）および５０ｍＵ／ｍｌ  ペニシリンおよび５０μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン（ギブコ／ＢＲＬ）を補充したダルベッコの改良イーグル培地（ＤＭＥＭ；シグマ社：Ｓｉｇｍａ，Ｉｎｃ．）中で培養した。３５ｍｍまたは６０ｍｍの皿（ファルコン社：Ｆａｌｃｏｎ，Ｉｎｃ）中のサブコンフルエントなｃｏｓ細胞をそれぞれ、２ｍｇまたは６ｍｇのスーパーコイル化プラスミドＤＮＡで一時的にトランスフェクトした。トランスフェクション後の４２から４４時間の間で、細胞を４−６時間、０．５ｍｌ（３５ｍｍ皿）または１．５ｍｌ（６０ｍｍ皿）中での血清フリーＤＭＥＭ（システインおよびメチオニン（ギブコ／ＢＲＬ）を欠き、そして１２５μＣｉ／ｍｌの各発現標識ミックスおよびＬ−３５Ｓ−システイン（ＮＥＮ／ディポン）を補充している）で標識した。標識後、培地を回収し、そして免疫沈降に使用した。細胞を冷ＰＢＳですすぎ、そして０．５ｍｌ（３５ｍｍ皿）または１．５ｍｌ（６０ｍｍ皿）のＴＥＮＴ（上記のプロテアーゼインヒビターを含む）を加えることにより、そして４℃で３０分間ゆるやかに回転することにより組織培養皿中で溶解した。溶解物を遠心により（１３０００×ｇで５分間、４℃）清澄化し、そして上清を免疫沈降により分析した（以下を参照にされたい）。
【０３２８】
バキュロウイルス作成および感染
カルボキシ末端に挿入したｍｙｃ  エピトープタグとともにマウス  ｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇを発現する組換えバキュロウイルスを、Ｂａｃｕｌｏｇｏｌｄキット（ファーミンゲン社：Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｉｎｃ．）を使用して作成した。最初のウイルス作成にＳｆ９細胞を使用し、続いて無血清培地（ＥｘＣｅｌｌ  ４０１；インビトロゲン社：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）中のＨｉｇｈ  Ｆｉｖｅ  細胞（インビトロゲン社）中で２回の増幅を行った。Ｓｈｈコーディング配列を欠くバキュロウイルスも対照として構築した。タンパク質誘導のために、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ  細胞を約１５の多重度で感染させた。３日後、培地および細胞を穏やかにピペットで回収した。細胞を遠心（１０００×ｇ）で集め、そして培地をウエスタンブロット分析用に回収した。細胞ペレットを２回、冷ＰＢＳ中で洗浄し、そしてＴＥＮＴおよびプロテアーゼインヒビター中（上記を参照にされたい）で、マイクロ遠心管中で３０分間、４℃で回転させることにより溶解した。溶解物を上記のようにウエスタンブロッティング前に清澄化した。
【０３２９】
ウエスタンブロッティング
ウエスタンブロッティングのために、０．２５ｍｌの培地試料（全体の１％）をＴＣＡで沈殿させ、再度１５μｌのＬＳＢに溶解した。細胞溶解試料（全体の１％）を、水および濃縮（５Ｘ）ＬＳＢで最終容量を１５μｌにした。試料を、１５％のアクリルアミドゲルで分離する前にＳ分間煮沸した。タンパク質をＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ；ミリポア社：Ｍｉｌｉｐｏｒｅ，Ｉｎｃ．）に移し、そして０．２％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＢＬＯＴＴＯ（ＰＢＳ中の５％重量／容量  無−脂肪乾燥ミルク）でブロックした。ヒト  ｃ−ｍｙｃエピトープを認識するハイブリドーマ上清（９Ｅ１０；Ｅｖａｖ，Ｇ．Ｉ．ら、（１９８５）  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３６１０−３６１６）を、１：２００の希釈で１時間加え、続いてヤギ抗−マウス−アルカリホスファターゼ結合物（プロメガ社）の１：５０００希釈物を３０分間加えた。バンドをＬｕｍｉ−Ｐｈｏｓ  ５３０  試薬（ベーリンガー−マンハイム）を使用して、製造元の指示に従い視覚化した。  
【０３３０】
免疫沈降
細胞溶解物（アフリカツメガエル卵母細胞またはｃｏｓ細胞）を、ＴＥＮＴ（プロテアーゼインヒビターを上記のように加えた）で０．５ｍｌとした。培地試料（ＯＲ２またはＤＭＥＭ）を、１３０００×ｇで５分間遠心（４℃）することにより清澄化し、そして１０×  ＴＥＮＴを最終濃度１×（最終容量：０．５−１．５ｍｌ）となるように加えた。ｃ−ｍｙｃモノクローナル抗体ハイブリドーマ上清を、最終容量の１／２０加えた。試料を１時間４℃で回転させ、次に０．１ｍｌの１０％（容量／容量）プロテインＡ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−４Ｂ（ファルマシア社：Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｉｎｃ．）を加えた。試料をさらに１４−１６時間回転させた。免疫複合体を４回、１．０ｍｌのＴＥＮＴで洗浄した。免疫沈降物質を溶出し、そして１０分間、２５μｌの１×ＬＳＢ中で煮沸することにより変性させた。遠心後、試料を１５％アクリルアミドゲルで分離し、そしてすでに記載したようにフルオログラフィーで処理した。Ｅｎｄｏ  Ｈ消化用試料を溶出させ、そして提供された変性緩衝液中で１０分間煮沸し、続いてＥｎｄｏ  Ｈで１−２時間、３７℃で消化することにより変性させた。濃縮（ＳＸ）ＬＳＢを加え、そして試料を上記のように電気泳動した。
【０３３１】
抗−マウスＳｈｈ血清を用いた免疫沈降のために、試料（Ｃｏｓ細胞溶解物およびＤＭＥＭ）を１時間、氷上で３μｌのプレ−免疫血清とともにインキューベーションし、続いて０．１ｍｌの１０（容量／容量）％のプロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを加えることにより前清澄化した。１時間４℃で回転した後、上清を回収し、そして１時間氷上で３μｌの放血抗−マウスＳｈｈ血清（以下を参照にされたい）とともにインキューベーションすることにより回収した。次にプロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅとのインキューベーション、洗浄、溶出および電気泳動を上記のように行った。
【０３３２】
Ｃｏｓ細胞の免疫蛍光染色
トランスフェクションの２４時間後、細胞を８−チャンバースライド（ラボテック社：ＬａｂＴｅｋ  Ｉｎｃ．）に移し、そしてさらに２４時間付着させた。細胞を２％パラホルムアルデヒド／０．１％グルタルアルデヒド中で固定し、ＰＢＳ中で洗浄し、そして１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００（Ｍｕｎｒｏ，Ｓ．およびＰｅｌｈａｍ，Ｈ．Ｒ．Ｂ．，（１９８７）  Ｃｅｌｌ  ４８：８９９−９０７）中で透過性化した。ＰＢＳ中で洗浄した後、細胞を１０分間、１ｍｇ／ｍｌのホウ酸水素ナトリウム中で処理した。細胞をｃ−ｍｙｃモノクローナル抗体ハイブリドーマ上清（１：１０に希釈）およびアフィニティー精製したマウスＳｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ抗血清（１：４に希釈）とともに４５分間、続いて１：１００ヤギ−抗マウスＩｇＧ−ＲＩＴＣおよび１：１００ヤギ抗−ウサギＩｇＧ  ＦＩＴＣ（サザン  バイオテクノロジー  アソシエイツ社：Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）と４５分間インキューベ
ーションした。ＤＡＰＩ（シグマ社）を０．３μｇ／ｍｌで含んだ。スライドをＳｌｏ−Ｆａｄｅ（モレキュラープローブ社：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）にのせ、そしてＬｅｉｔｚ  ＤＭＲ化合物顕微鏡で写真を取った。
【０３３３】
抗体生産および精製
マウスＳｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇのアミノ酸４４−１４３をコードするＰＣＲ断片を、ｐＧＥＸ−２Ｔ（ファルマシア社）の枠内のＥｃｏＲＩ部位にクローン化した。形質転換した細菌はＩＰＴＧで誘導し、そして融合タンパク質を製造元の指示に従いグルタチオン−Ａｇａｒｏｓｅアフィニティーカラム（ファルマシア社）で精製した。ニュージーランド  ホワイト  ラビットの接種、ならびに試験および生成物放血は、ハゼルトン  リサーチ  プロダクツ社（Ｈａｚｅｌｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．）で行った。
【０３３４】
グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）および細菌タンパク質に対する抗体の血清を放血するために、ｐＧＥＸ−２Ｔで形質転換し、そしてＩＰＴＧで誘導した大腸菌の溶解物をＡｆｆｉ−Ｇｅｌ  １０（バイオ−ラッド社：Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｉｎｃ．）と結合させた。血清をバッチ中で２時間、放血マトリックスとともにインキューベーションし、その後遠心（１０００×ｇで５分間）し、そして上清を回収した。アフィニティーマトリックスを作成するために、精製した細菌が発現したタンパク質（マウスＳｏｎｉｃ
ｈｅｄｇｅｈｏｇのアミノ末端２／３に相当する）を、Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ  １０（バイオ−ラッド社）に結合した。放血した抗血清を始めにバッチ中のこのマトリックスに吸着させ、次にカラムに移した。マトリックスをＴＢＳＴ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ  ７．５］、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００）で洗浄し、そして精製した抗体を１０ベット容量の０．１５Ｍ  グリシン［ｐＨ２．５］で溶出した。溶液を１容量の１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］で中和し、そして１６０容量のＰＢＳに対して透析した。
【０３３５】
他の抗体をｈｅｄｇｅｈｏｇタンパク質に対して作成し、そしてｈｈタンパク質に対して得られた３つのポリクローナルウサギ抗血清を以下のように特性決定した：Ａｂ７７−カルボキシル処理（ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ）したヒナＳｈｈペプチド（２７ｋｄ）とのみ反応する；Ａｂ７９−アミノ処理（ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ）したヒナ、マウスおよびヒトＳｈｈペプチド（１９ｋｄ）と反応する。ヒナおよびマウス由来の２７ｋｄペプチドと弱く反応する。またマウスＩｈｈとも反応する；そしてＡｂ８０−ヒナ、マウスおよびヒトのアミノペプチド（１９ｋｄ）とのみ反応する。
【０３３６】
（ｉｉ）インビトロ翻訳Ｓｏｎｉｃ  Ｈｅｄｇｅｈｏｇはタンパク質溶解処理され、そしてグリコシル化される
ヒナおよびマウスＳｈｈの読み取り枠は、予想される分子の大きさが４６．４キロダルトン（ｋＤａ）および４７．８ｋＤａの、それぞれ４２５および４３７アミノ酸ｉ１次翻訳産物をコードする（Ｅｃｈｅｌａｒｄ，Ｙ．ら、（１９９３）  Ｃｅｌｌ  ７５：１４１７−１４３０；Ｒｉｄｄｌｅ，Ｒ．Ｄ．ら、（１９９３）  Ｃｅｌｌ  ７５：１４０１−１４１６）。さらなるタンパク質配列の調査で、アミノ末端残基の短い広がり（ヒナについては２６、マウスについては２４）が高度に疎水性であり、そしてシグナルペプチドをコードすると予想された。これらの配列を除去すると、４３．７ｋＤａ（ヒナＳｈｈ）および４５．３ｋＤａ（マウス  Ｓｈｈ）のタンパク質を生成する。また、各タンパク質はＮ−結合グリコシル化のためのシグナルコンセンサス部位を（Ｔａｒｅｎｔｉｎｏ，Ａ．Ｌ．ら、（１９８９）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３２：１１１−１３９）、残基２８２（ヒナ）および２７９（マウス）に含む。これらのＳｈｈタンパク質の特徴を図１１にまとめる。
【０３３７】
ヒナまたはマウスＳｈｈのいずれかをコードするインビトロ翻訳メッセンジャーＲＮＡでプログラムされたウサギ網状赤血球は、それぞれ４６ｋＤａおよび４７ｋＤａの分子の大きさのタンパク質を合成する。これらの値はアミノ酸配列の調査により予想された値と良く一致する。Ｓｈｈタンパク質の翻訳後修飾を調査するために、イヌの膵臓ミクロソーム膜調製物をこの翻訳反応に含んだ。この調製物はシグナルペプチド開裂およびコアのグリコシル化のような処理を可能にする。Ｓｈｈタンパク質がこれらの膜の存在中で合成されるとき、見かけ上の分子の大きさが約１９および２８ｋＤａ（ヒナ）、または１９および３０ｋＤａ（マウス）の２つの生成物が、４６ｋＤａおよび４７ｋＤａの形に加えて見られる。膜の存在下で合成された物質をエンドグリコシダーゼＨ（Ｅｎｄｏ  Ｈ）で消化したとき、２つの大きなタンパク質の移動度は増加する。Ｅｎｄｏ  Ｈ消化した形態の見かけ上の分子の大きさは、ヒナＳｈｈについては４４ｋＤａおよび２６ｋＤａ、そしてマウスＳｈｈについては４５ｋＤａおよび２７ｋＤａである。ミクロソーム膜の存在下で合成された最大タンパク質のＥｎｄｏ  Ｈ消化後の分子の大きさの減少は、予想されるシグナルペプチドの除去と一致する。Ｅｎｄｏ  Ｈ処理後の移動度のシフトは、Ｎ−結合グリコシル化が起こり、そして２６ｋＤａ（ヒナ）および２７ｋＤａ（マウス）タンパク質がグリコシル化部位を含むことを示している。
【０３３８】
ミクロソーム膜の存在下で翻訳された時の２つの低分子量バンドの出現（今後“プロセス化形態”と呼ぶ）は、シグナルペプチド開裂が生じたことに加えてタンパク質溶解も起こったことを示唆している。プロセス化形態を合わせた分子量の大きさ（ヒナについては１９ｋＤａおよび２６ｋＤａ；マウスについては１９ｋＤａおよび２７ｋＤａ）は、シグナルペプチド開裂タンパク質のおよそ予想された大きさとなり（ヒナについては４４ｋＤａそしてマウスについては４５ｋＤａ）、１回のみのさらなる開裂が起こったことを示唆している。
【０３３９】
マウスＳｈｈタンパク質配列は、ヒナの配列よりも１２アミノ酸残基長い（４３７対４２５残基）。ヒナおよびマウスＳｈｈタンパク質配列の整列により、これらのさらなるアミノ酸がタンパク質のカルボキシ末端に近いことが明らかである（Ｅｃｈｅｌａｒｄ，Ｙ．ら、（１９９３）  Ｃｅｌｌ  ７５：１４１７−１４３０）。より大きなプロセス化形態は２つの種の間で分子の大きさが約１ｋＤａ異なり、これらのペプチドがＳｈｈタンパク質のカルボキシ末端部分を含むと思われる。分子の大きさが同一である、より小さなプロセス化形態はおそらくアミノ末端部分から成るのだろう。
【０３４０】
（ｉｉｉ）Ｓｈｈペプチドの分泌
Ｓｈｈタンパク質のインビボ合成を調査するために、マウスタンパク質を数種の真核細胞型中で発現させた。合成タンパク質を検出し、そして後の精製を容易にするために、トロンビン制限プロテアーゼ用の認識部位を含む２５アミノ酸配列、続いてヒトｃ−ｍｙｃタンパク質に由来する１０アミノ酸配列および６つの連続したヒスチジン残基を含むようにカルボキシ末端を操作した。このｃ−ｍｙｃ配列はエピトープタグとして役立ち、モノクローナル抗体（９Ｅ１０；Ｅｖａｎら、（１９８５）  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３６１０−３６１６んのによる検出を可能にする。カルボキシ末端を付加した、合わせた分子の大きさは約３ｋＤａである。
【０３４１】
キセノプス  ラエビス卵母細胞
ｃ−ｍｙｃ抗体を用いた免疫沈降は、Ｓｈｈ  ｍＲＮＡを注入した代謝的に標識されたキセノプス  ラエビス卵母細胞の溶解物中の数種のタンパク質を検出する。細胞溶解物およびカルボキシ末端にｃ−ｍｙｃエピトープタグを持つマウスＳｈｈをコードするＲＮＡを注入した３５Ｓ標識卵母細胞からの培地、または対照卵母細胞からの培地を、ｃ−ｍｙｃモノクローナル抗体との免疫沈降により分析した。約４７ｋＤａのバンドが、３０ｋＤａ付近に移動する二重バンドとして見える。Ｅｎｄｏ  Ｈでの処理で、最大タグをの移動
度が増加し、そして二重バンドは約３０ｋＤａの種類に分解する。これらの観察はインビトロで見られる挙動に似ている。カルボキシ末端付加により加えられた分子の大きさを考慮すると、最大のタンパク質はシグナルペプチド開裂形態に相当し、一方二重バンドはグリコシル化された、またはグリコシル化されていない、より大きなプロセス化形態に対応する。エピトープタグはタンパク質のカルボキシ末端に位置するので、Ｓｈｈのカルボキシ末端部分として、３０ｋＤａペプチドの同一性を確認した。１９ｋＤａの種類を検出できなかったことは、タンパク質のアミノ末端領域のその同一性を支持している。
【０３４２】
Ｓｈｈがアフリカツメガエル卵母細胞により分泌されのるかどうかを試験するために、注入卵母細胞がインキューベーションされている培地をｃ−ｍｙｃ抗体を用いた免疫沈降によりプローブした。グリコシル化されたより大きなプロセス化形態よりも、わずかにゆっくりと移動する単一バンドを観察した。このタンパク質はＥｎｄｏ  Ｈに非感受性である。ほとんどの分泌された糖タンパク質がゴルジ装置を通って移動するとき、Ｅｎｄｏ  Ｈに対する感受性を失い、そして一連のグリコシダーゼにより修飾されるので（Ｋｏｒｎｆｅｌｄ．Ｒ．およびＫｏｒｎｆｅｌｄ，Ｓ．，（１９８５）  Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５４：６３１−６６４）、この結果は予想されるものである。Ａｓｎ−結合炭水化物部分の酵素的成熟は、分泌されたより大きなタンパク質の移動度が、細胞内物質に対してわずかに減少することからも説明できた。Ｅｎｄｏ  Ｈ消化後、シグナルペプチド開裂タンパク質よりもわずかに低い移動度のバンドが現れ、いくつかのＳｈｈタンパク質がタンパク質溶解プロセッシングを受けずに分泌されることを示唆している。Ｅｎｄｏ
Ｈ消化無しの培地中にこのタンパク質を検出できなかったことは、ゴルジ中での炭水化物修飾の程度における異質性を示唆し、物質が明らかなバンドとして移動することを妨げている。この物質のＥｎｄｏ  Ｈ消化後の単一バンドへの分解は、炭水化物構造がゴルジ装置中では完全に成熟しないことを示唆している。プロセッシングされていないタンパク質とより大きなプロセッシングされた形態との間の構造的差異は、この観察による（Ｋｏｒｎｆｅｌｄ，Ｒ．およびＫｏｒｎｆｅｌｄ，Ｓ．，（１９８５）  Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５４：６３１−６６４）。
【０３４３】
Ｃｏｓ細胞
哺乳類細胞型中でのマウスＳｈｈの挙動を、トランスフェクトしたｃｏｓ細胞を使用して調査した。タンパク質の合成および分泌は、ｃ−ｍｙｃ抗体を使用する免疫沈降により監視した。トランスフェクトしたｃｏｓ細胞は、注入したアフリカツメガエル卵母細胞中で検出された同じＳｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ種を発現し、Ｅｎｄｏ  Ｈ消化後のその挙動も同一である。さらに、３０ｋＤａのグリコシル化形態の分泌がｃｏｓ細胞中で観察され、ならびに分泌後のＥｎｄｏ  Ｈに対する特徴的な非感受性も観察される。ほとんどの分泌されたタンパク質は、細胞内のグリコシル化されたより大きなプロセス化形態と共に移動するが、少量のわずかに低い移動度のタンパク質も培地中に検出される。アフリカツメガエル卵母細胞培養物中のように、タンパク質溶解プロセッシングを受けていない幾つかのＳｈｈが培地中で明らかであるが、Ｅｎｄｏ  Ｈ消化後のみである。
【０３４４】
バキュロウイルス感染細胞
無脊椎動物細胞型中でのマウスＳｈｈタンパク質を挙動を調査するために、そしてＳｈｈペプチド精製の可能性を求めるために、カルボキシ末端タグを持つＳｈｈコーディング配列を置いた組換えバキュロウイルスを、Ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ遺伝子プロモーターの制御下に構築した。昆虫細胞が組換えバキュロウイルスで感染した時、ｃ−ｍｙｃ抗体を用いたウエスタンブロッティングにより、Ｓｈｈペプチドは細胞溶解物および培地中に検出できた。
【０３４５】
このシステムで検出されたＳｈｈ生成物は、上記のものと同様であった。しかし、Ｅｎｄｏ  Ｈ消化後の細胞溶解物中には非プロセス化タンパク質はほとんど見られず、そして
培地中にも検出できなかった。これはタンパク質溶解プロセッシングが、これらの細胞中では他の２つの細胞型またはインビトロ翻訳系よりも効率的に起こることを示唆している。他の発現系で見られるようなグリコシル化および非グリコシル化３０ｋＤａ形態に対応する二重バンドが検出され、そしてＥｎｄｏ  Ｉ耐性ペプチドが分泌される。しかし他の系とは異なり、これら全ての分泌されたより大きな形態はグリコシル化された細胞内物質とともに移動するようである。
【０３４６】
（ｉｖ）高度に保存されたアミノ末端ペプチドの分泌
プロセス化されたＳｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇタンパク質のアミノ末端部の挙動を決定するために、ｃ−ｍｙｃエピトープタグを推定上のシグナルペプチド開裂部位の３２アミノ酸後に置いた（図１２）。Ｃｏｓ細胞を、カルボキシ末端またはアミノ末端付近にｃ−ｍｙｃタグを含むＳｈｈ発現構築物でトランスフェクトした。この構築物がｃｏｓ細胞中で発現したとき、完全長のタンパク質およびより小さいプロセス化形態（ｃ−ｍｙｃタグの付加により約２０ｋＤａ）の両方を、標識細胞からの抽出物の免疫沈降により検出した。しかし、２０ｋＤａの生成物は培地中にかろうじて検出されるだけである。カルボキシ末端ｃ−ｍｙｃタグ構築物で平行してトランスフェクトした細胞では、完全長および３０ｋＤａ生成物の両方が、細胞溶解物および培地からすでに記載したように沈殿した。
【０３４７】
アミノ末端ｃ−ｍｙｃタグは、小さいプロセス化形態の分泌効率に影響を及ぼすかもしれないので、このタンパク質の発現をマウスＳｈｈのアミノ酸４４から１４３に対する抗血清を使用してｃｏｓ細胞中で調査した（図１２）。カルボキシ−末端ｃ−ｍｙｃタグ構築物でトランスフェクションした後、細胞溶解物中の強い発信にもかかわらず、抗−Ｓｈｈ血清を用いた免疫沈降により、大変低いレベルのより小さなプロセス化形態が培地中に検出された。これはｍｙｃ抗体でも結果を再現する。
【０３４８】
Ｓｈｈタンパク質の亜細胞での位置を調査するために、ｃｏｓ細胞をカルボキシ末端タグ付Ｓｈｈ構築物でトランスフェクトし、そしてマルチ−チャンバースライド上に置き、固定そして透過性化した。細胞を抗−Ｓｈｈ血清およびｃ−ｍｙｃ抗体で同時にインキューベーションし、続いてＦＩＴＣ結合ヤギ抗−ウサギ−ＩｇＧおよびＲＩＴＣ結合ヤギ抗−マウス−ＩｇＧとインキューベーションした。核を染色するためにＤＡＰＩを含んだ。抗−Ｓｈｈ血清で、ゴルジ装置の特徴である強いペリヌクレアー染色が観察された。同じ亜細胞領がｃ−ｍｙｃ抗体でも染色された。２つの抗体調製物を用いた、この染色パターンの一致は、培地中に検出される少レベルの小さいプロセス化形態が小胞体中に停留するものではないことを示唆している。
【０３４９】
（ｖ）ヘッジホッグ（Ｈｅｄｇｅｈｏｇ）プロセッシング
まとめると、上記の考察はマウスおよびヒナのＳｈｈ遺伝子が、さらにタンパク質溶解プロセッシングを受ける分泌糖タンパク質をコードすることを示している。データはこのプロセッシングが様々な細胞型で明らかに同様な様式で起こることを示し、これはＳｈｈタンパク質の一般的特徴であり、特定の発現系に独特なものではないことを示唆している。マウスＳｈｈに関しては、データはこのタンパク質溶解プロセッシングの両方の生成物が分泌されることを示している。これらの考察を図１３にまとめる。
【０３５０】
１９ｋＤａアミノペプチドは、２７ｋＤａカルボキシペプチドよりも培地中に低レベルで蓄積することが観察された。これはいったん分泌されると、この種の非効率的な分泌、または迅速な回転を反映しているかもしれない。あるいは、小さい形態は細胞表面または細胞外マトリックス成分と結合し、培地中に検出することが難しくなっているのかもしれない。分泌された大きな形態のＥｎｄｏ  Ｈに対する非感受性は、分泌糖タンパク質に共通の特徴である。ゴルジ装置を通って移動する間、Ａｓｎ−結合炭水化物部分は、一連の特異的なグリコシダーゼにより修飾される（Ｋｏｒｎｆｅｌｄ，Ｒ．およびＫｏｒｎｆｅ
ｌｄ，Ｓ．，（１９８５）  Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  ５４：６３１−６６４；Ｔａｒｅｎｔｉｎｏ，Ａ．Ｌ．，ら（１９８９）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３２：１１１−１３９を参照にされたい）。これらの修飾は構造を、未成熟な“高マンノース”から成熟した“複合体”型に転換する。このプロセスの１段階で、ゴルジ酵素、α−マンノシダーゼＩＩが複合体から２つのマンノース残基を除去し、Ｅｎｄｏ  Ｈに対して非感受性にする（Ｋｏｒｎｆｅｌｄ，Ｒ．およびＫｏｒｎｆｅｌｄ，Ｓ．，（１９８５）  Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  ５４：６３１−６６４）。
【０３５１】
マウスおよびヒナのＳｈｈのプロセス化された形態の分子の大きさに関する観察に基づき、予想される第２タンパク質溶解開裂部位は、第２および第３エキソンによりコードされる配列の境界付近に位置するのであろう。興味深いことには、この領域はｈｅｄｇｅｈｏｇタンパク質の最も高度に関連した部分の終結となっている。アミノ末端（小さい）形態は、タンパク質の最も高度に保存された部分を含む。事実、エキソン１および２によりコードされるアミノ酸（推定上のシグナルペプチド開裂部位の上流の配列は排除する）は、Ｄｒｏｓ−ＨＨおよびマウスＳｈｈの間で６９％の同一性を共有し、そしてヒナおよびマウスＳｈｈの間では９９％の同一性を共有する。第３エキソンにコードされる領域のアミノ酸同一性は、マウス対キイロショウジョウバエでさらに低く３０％であり、そしてマウス対ヒナで７１％である（Ｅｃｈｅｌａｒｄ，Ｙ．，ら、（１９９３）  Ｃｅｌｌ  ７５：１４１７−１４３０）。したがって、Ｓｈｈの２つのプロセス化された形態は保存され、ならびに異なる発信活性がＳｈｈ遺伝子の別個のコーディングエキソン中に分離されたのかもしれない。さらに、非プロセス化タンパク質の幾つかがアフリカツメガエル卵母細胞およびｃｏｓ細胞により分泌されるという観察は、これが別の機能を有するかもしれないという可能性を生む。
【０３５２】
マウスＳｈｈの生化学的挙動は、キイロショウジョウバエＨｅｄｇｅｈｏｇ（Ｄｒｏｓ−ＨＨ）タンパク質について記載された挙動と極めて似ている（Ｌｅｅ，Ｊ．Ｌ．ら、（１９９２）  Ｃｅｌｌ  ７１：３３−５０；Ｔａｂａｔａ，Ｔ．ら、（１９９２）  Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．６：２６３５−２６４５）。ミクロソーム存在下でのＤｒｏｓ−ＨＨ  ｍＲＮＡのインビトロ翻訳は、完全長タンパク質ならびに予想される内部（ＩＩ型）シグナルペプチドの開裂後の生成物に相当する分子の大きさを有する生成物を表した（Ｌｅｅ，Ｊ．Ｌ．ら、（１９９２）  Ｃｅｌｌ  ７１：３３−５０）。興味深いことには、さらなるプロセス化形態は観察されなかった。しかし、そのような形態は２０から３０ｋＤａの間に移動する分解産物にり曖昧である。カルボキシ−末端６１アミノ酸を欠くタンパク質形状態をコードするＲＮＡが翻訳された時、分解産物は見られなかったが、まだマウスＳｈｈで観察されたタンパク質溶解プロセッシングの証拠はない。同様な現象がこれらの実験で観察された。タンパク質溶解プロセッシングの程度の減少は、１０カルボキシ−末端アミノ酸が欠けているマウスＳｈｈタンパク質がインビトロで翻訳される時、またはｃｏｓ細胞中で発現される時に見られる（データは示さず）。これはＤｒｏｓ−ＨＨタンパク質のカルボキシ末端配列が、プロセッシングの効率に影響を与えることとは離れて作用することを示唆している。
【０３５３】
インビボで、Ｄｒｏｓ−ＨＨのプロセッシングは実証されている（Ｔａｂａｔａ，Ｔ．ら、（１９９２）Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．６：２６３５−２６４５）。ｈｈ発現ベクターをトランスフェクトしたシュナイダー細胞からの溶解物のイムノブロットでは、マウスＳｈｈについて記載されたものと同様な、２つの小さい分子量形態が明らかである。これらの生成物は、熱ショック誘導性ｈｈ構築物を発現するハエから派生した幼虫および成虫原基の抽出物中にも検出された。したがって、Ｄｒｏｓ−ＨＨタンパク質に幾つかの異なる形態があることは明らかである。
【０３５４】
（ｖｉ）Ｈｅｄｇｅｈｏｇ発信
細胞間発信に関する基準を満たすためには、ｈｅｄｇｅｈｏｇタンパク質はその発現のドメイン外で検出されなければならない。これはＤｒｏｓ−ＨＨに関しては明らかに実証された。ほぼ完全長のＤｒｏｓ−ＨＨタンパク質に対して作成した抗血清を使用して、ＴａｂａｔａおよびＫｏｒｎｂｅｒｇ（Ｔａｂａｔａ，Ｔ．およびＫｏｒｎｂｅｒｇ，Ｔ．Ｂ．，（１９９２）  Ｃｅｌｌ  ７６：８９−１０２）は、胚セグメント中のＲＮＡ発現ドメインよりもわずかに広い片中に、ならびに前方からちょうど翅成虫原基中のＲＮＡ発現ドメインの境界にタンパク質を検出する。同様に、Ｔａｙｌｏｒら、（１９９３）  Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．４２：８９−９６は、Ｄｒｏｓ−ＨＨのアミノ末端に対する抗血清を使用して、胚セグメント中にｈｈ  ＲＮＡを発現する細胞に隣接する細胞内の不連続パッチ中にＤｒｏｓ−ＨＨタンパク質を検出したが、これはタンパク質溶解プロセッシングデータ（Ｔａｂａｔａ，Ｔら、（１９９２）Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．６：２６３５−２６４５）に基づき、カルボキシル開裂生成物を認識しないようである。
【０３５５】
ｈｈ遺伝子を発現する細胞以外のＤｒｏｓ−ＨＨの検出は、ｈｈ突然変異体の表現型と一致する。これらの動物において、各胚のパラセグメント中の細胞のパターン化は破壊され、異常なクチクラパターンを生じ、ｗｇ突然変異体に見られるものを暗示する。さらに分析では、ｈｈ遺伝子機能の損失がｈｈ発現ドメインのちょうど前にある細胞の薄い片中にｗｇ発現の損失を導くことが明らかとなった（Ｉｎｇｈａｍ，Ｐ．Ｗ．およびＨｉｄａｌｇｏ，Ａ．，（１９９３）  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１７：２８３−２９１）。これはＤｒｏｓ−ＨＨが隣接細胞にｗｇ発現を維持するように作用することを示している。偏在して発現するＤｒｏｓ−ＨＨがｗｇの異所的活性化を導く、という観察はこのモデルを支持する（Ｔａｂａｔａ，Ｔ．およびＫｏｒｎｂｅｒｇ，Ｔ．Ｂ．，（１９９２）  Ｃｅｌｌ  ７６：８９−１０２）。これらの遺伝的研究に加えて、Ｄｒｏｓ−ＨＨがその発現部位から離れて、表皮のパターン化に影響をするように作用する間接的証拠もある（Ｈｅｅｍｓｋｅｒｋ，Ｊ．およびＤｉＮａｒｄｏ，Ｓ．，（１９９４）  Ｃｅｌｌ  ７６：４４９−４６０）。
【０３５６】
隣の細胞、ならびにｈｈ発現部位から離れて位置する細胞に対するＤｒｏｓ−ＨＨの明らかな効果は、発生している脊椎ＣＮＳの脊索および床板、ならびに四肢のＺＡＰへの影響を暗示している。脊索（Ｓｈｈ発現の高レベル部位）は、一定の依存様式で床板の形成を誘導し、一方脊索および床板（別の強いＳｈｈ発現領域）は両方とも離れて運動ニューロンを誘導することができる（Ｐｌａｃｚｅｋ、Ｍ．ら、（１９９３）  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１７：２０５−２１８；Ｙａｍａｄａ，Ｔ．ら、（１９９３）  Ｃｅｌｌ  ７３：６７３−６８６）。
【０３５７】
さらにＺＰＡ活性は、Ｓｈｈが転写される四肢芽体の極めて後方中の細胞のパターン化だけでなく、このゾーンの数百ミクロン前方にも必要である。証拠の幾つかの系はＳｈｈが床板を誘導し（Ｅｃｈｅｌａｒｄ，Ｙ．ら、（１９９３）  Ｃｅｌｌ  ７５：１４１７−１４３０；Ｒｏｅｌｉｎｋ、Ｈ．ら、（１９９４）  Ｃｅｌｌ  ７６：７６１−７７５）、そしてＺＰＡの発信活性を媒介（Ｒｉｄｄｌｅ，Ｒ．Ｄ，ら、（１９９３）  Ｃｅｌｌ  ７５：１４０１−１４１６）できることを示す。Ｓｈｈが開裂することが示されたので、プロセス化ペプチドは異なる活性を有することができると予想できる。より分泌されにくく、より安定性が低いか、または細胞表面または細胞外マトリックスに留まると思われる小さいアミノ末端形態は、局所的に作用するかもしれない。対照的に、大きなカルボキシ末端ペプチドは恐らく離れて機能することができる。このように、Ｓｈｈペプチドは脊椎動物の胚で異なる発信機能を媒介することができる。
【実施例７】
【０３５８】
Ｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇおよびＦｇｆ−４は、発生している四肢芽体の成長およびパターン化を統合するために、発信カスケードおよびフィードバックループを通って作用
する
（ｉ）実験手順
ニワトリＦｇｆ−４およびＢｍｐ−２のクローニング
２４６ｂｐのニワトリＦｇｆ−４遺伝子断片を、ニワトリの第２２期四肢芽体ライブラリーから、ＰＣＲによりクローン化した。縮重プライマーはすでにクローン化されたＦｇｆ−４およびＦｇｆ−６遺伝子に対して設計した：
【０３５９】
【化１１】
0004404923.tif 000013
変性は９４℃で２分間、続いて９４℃で３０秒間、５０℃で６０秒間、そして７２℃で３０秒間を３０サイクル、そして最後の伸長が７２℃で５分間であった。ＰＣＲ生成物はＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ＋ベクターにサブクローン化した。クローンをシークエンシングし、そしてＦｇｆ−４を、すでに公開されているＦｇｆ−４遺伝子およびＬｅｅ  Ｎｉｓｗａｎｄｅｒの好意により提供されたニワトリＦｇｆ−４配列とを比較することにより確認した。
【０３６０】
ＢＭＰ−関連配列は、Ｂａｓｌｅｒら、（１９９３）により記載されたようなプライマーおよび条件を使用して、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔで調製した第２２期の後方四肢芽体ｃＤＮＡライブラリーから増幅した。増幅したＤＮＡをクローン化し、そしてλ−Ｚａｐ（ストラタジーン：Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で調製した第２２期四肢芽体ライブラリーをスクリーニングするために使用した。単離されたｃＤＮＡはニワトリＢｍｐ−２であった。この同一性は公開されているクローン（Ｆｒａｎｃｉｓら、（１９９４）  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２０：２０９−２１８）との配列比較により、ならびにそのニワトリ胚中での発現パターンにより確認した。
【０３６１】
ヒナの手術および組換えレトロウイルス
全ての実験操作は、ＳＰＡＦＡＳ（ノースウィッチ、コネティカット州）により提供された白色  レグホン（Ｓ−ＳＰＦ）のヒナの胚で行った。卵はＨａｍｂｕｒｇｅｒおよびＨａｍｉｌｔｏｎ（１９５１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｏｒｐｈ．８８：４９−９２に従い段階を追った。
【０３６２】
Ｓｏｎｉｃ／ＲＣＡＳ−Ａ２、またはインフルエンザヘモアグルチニンエピトープタグをｈｅｄｇｅｈｏｇタンパク質のカルボキシル末端に含む変異体のウイルス上清（Ｓｏｎｉｃ７．１／ＲＣＡＳ−Ａ２、機能的にＳｏｎｉｃ／ＲＣＡＳ−Ａ２とは区別できない）を、記載されたように（Ｈｕｇｈｅｓら、（１９８７）  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．  ６１：３００４−１３；ＦｅｋｅｔｅおよびＣｅｐｋｏ、（１９９３）  Ｍｏｌ．＆  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３：２６０４−１３；Ｒｉｄｄｌｅ．ら、（１９９３）  Ｃｅｌｌ  ７５：１４０１−１６）調製した。焦点注射のために、第１８−２１期の胚の右翅をナイルブルーサルフェート（リンガー溶液中０．０１ｍｇ／ｍｌ）で一時的に染色して、ＡＥＲを明らかにした。微量の濃縮ウイルス上清をＡＥＲの下に注射した。
【０３６３】
ＡＥＲは、電気的に研いだタングステンワイヤー針を使用して取り出した。幾つかの胚は、実質的にＮｉｓｗａｎｄｅｒら、（１９９３）  Ｃｅｌｌ  ７５：５７９−８７）に記載されたように、０．０２５ｍｍの白金ワイヤーで四肢芽体をステープルで止めた（Ｇ
ｏｏｄｆｅｌｌｏｗ、ケンブリッジ、英国）、ＦＧＦ−４溶液（０．８ｍｇ／ｍｌ：ジェネティクス  インスティチュート：Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅからの好意による）またはＰＢＳに浸したヘパリン−アクリル酸ビーズを有した。
【０３６４】
ＡＥＲ除去後にＳｏｎｉｃ／ＲＣＡＳウイルスで感染させた四肢は、露出した中胚葉の大部分にわたって感染し、実質的に感染したことが確実であった。ＦＧＦ−４含浸ビーズおよびウイルスの両方を受容した胚は、ビーズの下のみ感染した。
【０３６５】
ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーションおよび写真
単一色全載ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを記載されたように（Ｒｉｄｄｌｅら、（１９９３）  Ｃｅｌｌ  ７５：１４０１−１６）行った。２色全載ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを、実質的にＪｏｗｅｔｔおよびＬｅｔｔｉｃｅ（１９９４）  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ，１０：７３−７４に記載されているように行った。第２色検出は、０．１２５ｍｇ／ｍｌマゼンタ−ホス（Ｍａｇｅｎｔａ−ｐｈｏｓ）（バイオシンス：Ｂｉｏｓｙｎｔｈ）を基質として発色した。５μｍ切片の放射活性ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、本質的にＴｅｓｓａｒｏｌｌｏら、（１９９２）  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１５：１１−２０に記載されているように行った。
【０３６６】
以下のプローブは全載および切片ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに使用した：Ｓｏｎｉｃ：ｐＨＨ２の１．７ｋｂ断片（Ｒｉｄｄｌｅら、（１９９３）  Ｃｅｌｌ  ７５：１４０１−１６）。Ｂｍｐ−２：全読み取り枠をコードする１．５ｋｂ断片。ＦＧＦ−４：上記の２５０ｂｐ断片。Ｈｏｘ  ｄ−１１：６００ｂｐ断片、Ｈｏｘｄ−１３：４００ｂｐ断片、両方とも５’非翻訳配列およびホメオボックスの上流のコーディング配列を含む。ＲＣＡＳ：ＲＣＡＳの９００ｂｐ  ＳａｌＩ−ＣｌａＩ断片（Ｈｕｇｈｅｓら、（１９８７）  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３００４−１２）。
【０３６７】
（ｉｉ）外因Ｂｍｐ−２およびＨｏｘｄ遺伝子発現に対するソニックの関係
インビボソニックで（Ｓｏｎｉｃ）により調節される遺伝子の最良の候補は、Ｈｏｘｄ遺伝子クラスターの遠い員であり、Ｈｏｘｄ−９から−１３およびＢｍｐ−１２である。したがって、正常なヒナの胚の一連の段階において、これら遺伝子の発現ドメインの関連性を分析した。Ｈｏｘｄ−９およびＨｏｘｄ−１０は、第１８期初期でＳｏｎｉｃ発現が初めて検出できる前、第１６期に推定の翅領域全体に発現する（ＨａｍｂｕｒｇｅｒおよびＨａｍｉｌｔｏｎ，（１９５１）  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｏｒｐｈ．８８：４９−９２）。Ｈｏｘｄ−１１発現は第１８期初期に初めて検出でき、Ｓｏｎｉｃと同時であり、Ｓｏｎｉｃと共に広がるドメイン中である。Ｈｏｘｄ−１２およびＨｏｘｄ−１３の発現は、その直後に始まる。これらの結果は、たとえ全ての５つが初期の四肢芽体内に集合していても、Ｓｏｎｉｃは通常、直接的または間接的にクラスターの後者３つの員のみの発現を誘導するかもしれないことを示唆している。
【０３６８】
四肢の外側成長が進行しているとき、Ｓｏｎｉｃ発現は芽体の後方の縁に留まる。対照的に、最初はＳｏｎｉｃドメイン周辺の後方に集まっているＨｏｘｄ遺伝子発現ドメインは、大変ダイナミックで、そしてそれらの同心的特徴を失う。第２３期までに、Ｈｏｘｄ−１１ドメインは前方に広がり、そしてＳｏｎｉｃのドメインを越えてはるか遠くはなれるが、Ｈｏｘｄ−１３発現は遠方に片寄り、そしてＳｏｎｉｃから置き換わる。
【０３６９】
Ｂｍｐ−２がＳｏｎｉｃ前に発現するのかどうかは明らかでないが（Ｆｒａｎｃｉｓら、（１９９４）  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２０：２０９−２１８）、Ｂｍｐ−２はＳｏｎｉｃ発現の最も初期にＳｏｎｉｃドメインと明らかに重複し、そしてそれを囲む中胚葉ドメイン中に発現する。四肢芽体が発生するとき、Ｂｍｐ−２の中胚葉発現はＳｏｎｉｃ発現の回りに中心をもつ後方四肢縁付近に留まるが、Ｓｏｎｉｃよりもより大きなドメ
インである。このＳｏｎｉｃおよびＢｍｐ−２発現間の一致は第２５期くらいまで続き、ＳｏｎｉｃおよびＨｏｘｄ遺伝子発現間の一致よりも一層長期間である。第２５期の後に、Ｂｍｐ−２発現は遠位にシフトし、そしてもはやＳｏｎｉｃを中心とはしない。
【０３７０】
（ｉｉｉ）誘導されたＢｍｐ−２およびＨｏｘｄ遺伝子発現に対するＳｏｎｉｃの関連性
Ｈｏｘｄ遺伝子の発現ドメインは、時間経過とともにＳｏｎｉｃ ｈｅｄｇｅｈｏｇの発現ドメインと別れるという事実は、Ｓｏｎｉｃがその発現後期パターンを直接調節していないことを意味する。これは後期発現ドメインが遺伝的にＳｏｎｉｃの下流である可能性を排除するものではない。そうであれば、外的に発現するＳｏｎｉｃが、その外的なシーンを反復するＨｏｘｄ遺伝子発現のプログラムを開始すると期待されるだろう。したがって、Ｓｏｎｉｃの誤発現（ｍｉｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）後の様々な時間でのＨｏｘｄ遺伝子発現の空間的分布を比較した。初期芽体（第１８−２０期）の前方辺縁中胚葉の翅の１点（ＡＥＲの下）に、ニワトリのＳｏｎｉｃ  ｃＤＮＡを発現する複製可能なウイルスを接種した。この手法により発現した異所的Ｓｏｎｉｃは、前方中胚葉外側成長およびＡＦＲの前方伸長の両方を導く。
【０３７１】
感染した四肢中のＳｏｎｉｃおよびＨｏｘｄ遺伝子発現ドメインを、切片化して、および完全な胚中で分析した。ウイルスＳｏｎｉｃメッセージは、Ｈｏｘｄ−１１誘導と同時に、そしておよそ同一の広がりをもって、感染約１８時間後に最初に前方縁で検出される。このことはＳｏｎｉｃがＨｏｘｄ−１１発現を迅速に誘導でき、そして注射後のラグはＳｏｎｉｃ発現を達成するために必要な時間を表していることを示唆している。感染後３５時間までに、増殖している細胞内の側方のウイルスの広がりと組合わさった感染細胞の遠方への外側成長は、ウイルス発現を遠位縁およびテーパー（ｔａｐｅｒｓ）近位で最もひろいウェッジ（ｗｅｇｄｅ）に導く。この時までに、Ｈｏｘｄ−１１発現はＳｏｎｉｃ−発現細胞のエッジに関して前−後方および遠位の両方から、外因性Ｈｏｘｄ−１１ドメインのより遠方の点を映すと思われるドメインに広がった。弱いＨｏｘｄ−１３発現も、Ｓｏｎｉｃ発現ドメインのサブセット中の遠方縁で３５時間に検出される。感染５１時間後、ＳｏｎｉｃとＨｏｘｄ−１１発現の関連性は、３５時間後に観察された関連性と同様であるが、誘導されたＨｏｘｄ−１３発現は、異所的成長の遠位部分に限定された野生型レベルに達した。したがって異所的なＨｏｘｄ発現ドメインは、Ｓｏｎｉｃが発現している領域よりも発現の外因性パターンをより良く反映する。これはＨｏｘｄ発現を調節する多くの因子があるが、その作用はＳｏｎｉｃの下流であることを示唆している。
【０３７２】
外因性Ｂｍｐ−２発現ドメインは、Ｓｏｎｉｃの発現ドメインと良く相関しており、そしてＢｍｐ−２はＺＰＡ移植片により誘導されるので、Ｂｍｐ−２もＳｏｎｉｃにより誘導されるのかどうかを調べた。Ｂｍｐ−２は通常、初期芽体中の２つの場所で発現し、それらは後方中胚葉およびＡＥＲ全体である（Ｆｒａｎｃｉｓ、ら（１９９４）  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２０：２０９−２１８）。注射した四肢芽体ではさらなるＢｍｐ−２発現が、前方中胚葉および前方に広がったＡＥＲの両方に見られる。Ｂｍｐ−２発現ドメインがウイルス発現ドメインよりもわずかに制限されていることは、Ｂｍｐ−２誘導の遅れを示唆している。中胚葉および外胚葉の両方でのＢｍｐ−２発現は、したがって中胚葉中のＳｏｎｉｃ活性の下流標的である。Ｈｏｘｄ遺伝子の発現ドメインとは対照的に、外因および異所的なＢｍｐ−２発現ドメインは、Ｓｏｎｉｃの発現ドメインと良く相関している。このことはＢｍｐ−２発現が、Ｈｏｘｄ遺伝子の発現よりも、より直接的にＳｏｎｉｃにより調節されていることを示唆している。
【０３７３】
（ｉｖ）Ｓｏｎｉｃへの応答に対するＡＥＲおよびコンペテンス
Ｈｏｘｄ遺伝子の発現の異所的活性化は、ウイルスが感染した領域から離れて偏向し、恐らくＡＥＲからの外胚葉因子がＳｏｎｉｃにより誘導されるＨｏｘｄ遺伝子に必要であることを示唆している。これを試験するために、Ｓｏｎｉｃウイルスを、恐らくＡＥＲの
影響を受けない第２１期の中心軸に近い中胚葉に注射した。Ｓｏｎｉｃ発現のレベルは遠方注射で観察されたレベルに匹敵したが、Ｓｏｎｉｃの近位誤発現は、Ｈｏｘｄ遺伝子またはＢｍｐ−２の異所的誘導を生じず、またいかなる形態的効果も生じなかった（データは示さず）。Ｓｏｎｉｃの近位誤発現後の遺伝子誘導の欠損は、Ｓｏｎｉｃに暴露されるだけではこれら遺伝子の発現を誘導するには不十分であることを示唆している。
【０３７４】
Ｓｏｎｉｃウイルスの注射を、ＡＥＲの前方半分を手術により除去した後の第２０／２１期四肢芽体の前方縁中胚葉に行うことにより、これをより厳しく試験した。胚は回収前にさらに３６−４８時間成長させた。この期間に、四肢芽体の後方半分に残るＡＥＲは、芽体のほとんど野生型の外側成長およびパターン化を促進する。遺伝子発現は切片化したもの、および完全な胚中で監視した。ＡＦＲの存在下、Ｓｏｎｉｃは前方中胚葉増殖およびＨｏｘｄ−１１、Ｈｏｘｄ−１３およびＢｍｐ−２の発現の両方を誘導する。重層したＡＥＲの不在により、Ｓｏｎｉｃは上記バックグラウンドの中胚葉増殖またはこれら遺伝子の発現のいずれも誘導しない。ＡＥＲからのシグナルはしたがって、Ｓｏｎｉｃの中胚葉に対する増殖的およびパターン化効果の両方を可能にするために必要である。
【０３７５】
ＦＧＦタンパク質の投与が、ＰＤ外側成長およびパターン化の促進というようなＡＥＲの他の機能を援助できので、ＦＧＦもＳｏｎｉｃへの応答に対する中胚葉のコンペテンスを促進するかもしれない、ということを決定しようと考えた。ＦＧＦ−４−含浸ビーズを、Ｓｏｎｉｃウイルスに感染したＡＥＲ−露出前方中胚葉にステープルで取り付けた。遺伝子発現および中胚葉外側成長を前述のように監視した。ＳｏｎｉｃウイルスおよびＦＧＦ−４タンパク質の両方の存在下で、Ｈｏｘｄ−１１、Ｈｏｘｄ−１３およびＢｍｐ−２の発現はすべて誘導される。誘導された遺伝子の発現レベルは外因性の発現レベルと等しいか、それよりも大きく、規模においてはＡＥＲ存在下でのそれらの誘導に等しい。しがって、Ｆｇｆ−４はＳｏｎｉｃへの応答に対する中胚葉のコンペテンスを誘導することができる。
【０３７６】
Ｓｏｎｉｃ単独ではＡＥＲ不在下でのそれらの遺伝子発現または中胚葉増殖を誘導するには不十分であり、一方ＳｏｎｉｃおよびＦＧＦ−４との組み合わせは増殖および遺伝子発現の両方を誘導する。次にＦＧＦ−４単独で、遺伝子誘導または中胚葉増殖に対して効果を有するかのどうかを確認した。Ｓｏｎｉｃウイルスの不在下でＦＧＦ−４を投与すると、ＨｏｘｄまたはＢｍｐ−２遺伝子の発現を上記対照レベルに誘導しないが、ＦＧＦ−４単独で中胚葉外側成長を誘導する。これらの結果は、中胚葉遺伝子の活性化にＳｏｎｉｃの中胚葉に対する直接的作用が必要であり、そしてＳｏｎｉｃに対する増殖性応答はＦＧＦの誘導のために間接的であることを示唆している。
【０３７７】
（ｖ）ＳｏｎｉｃはＡＥＲ中で極性化（ｐｏｌａｒｉｚｅｄ）ＦＧＦ−４発現を誘導する
Ｆｇｆ−４はマウス四肢芽体のＡＥＲ中で、段階的様式（ｇｒａｄｅｄ  ｆａｓｈｉｏｎ）で発現し、ＡＥＲの後方領域で最大発現となり、前方隆起で検出できないレベルに減少する（ＮｉｓｗａｎｄｅｒおよびＭａｒｔｉｎ、（１９９２）  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１４：７５５−６８）。したがって、Ｆｇｆ−４がヒナのＡＥＲで非対称的に発現するのかどうか、およびその発現がＳｏｎｉｃにより誘導されるのかどうかを調査することが適切であった。ニワトリのＦｇｆ−４遺伝子断片を、Ｌ．ＮｉｓｗａｎｄｅｒおよびＧ．Ｍａｒｔｉｎにより提供された情報に基づき設計されたマウスＦｇｆ−４およびアフリカツメガエルｅ−Ｆｇｆ配列に由来する縮重プライマーを使用して、ＰＣＲにより第２２期ニワトリ四肢芽体ライブラリーからクローン化した。遺伝子同一性の評価は、ネズミＦｇｆ−４（ＮｉｓｗａｎｄｅｒおよびＭａｒｔｉｎ、（１９９２）  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１４：７５５−６８）の１次配列、ならびに発現パターンの比較に基づいた。全載ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション分析は、ＡＥＲ中の強いヒナのＦｇｆ−４発現を示した。Ｆｇｆ−４はＢｍｐ−２のようにＡＥＲの前方境界までにに発現するが、
ＡＥＲの形態終結前に前方ドメイン末端終わり、Ｎｉｓｗａｎｄｅｒら、（１９９４）  Ｎａｔｕｒｅ（印刷中）によっも観察された前方偏向を形成する。発現はおよそ第１８期に最初に遠方ＡＥＲに検出される。外側成長は後方の偏向発生を進行させる。発現ピークはほぼ２４／２５期であり、そして次に２８／２９期までに消失する。
【０３７８】
Ｆｇｆ−４の発現ドメインは、Ｓｏｎｉｃが後方中胚葉で発現するときに後方に偏向するようになる。この観察は後方ＡＥＲ中のＦｇｆ−４発現に影響を及ぼすＳｏｎｉｃと一致する。ＡＥＲ中のＦｇｆ−４発現に対するＳｏｎｉｃの効果を試験するために、第１８−２０期の胚をＳｏｎｉｃウイルスで、ＡＥＲの前方限界を越えたそれらの前方縁に１回感染させた。胚は１−２日後、前方ＡＥＲの伸長が明らかになった時に回収した。Ｆｇｆ−４の発現をｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションで分析した。Ｆｇｆ−４発現は、ＡＥＲの最前方（ａｎｔｅｒｉｏｒｍｏｓｔ）セグメント、外来発現ドメインを持つ不連続領域、およびウイルスＳｏｎｉｃ感染のドメインの重層に誘導される。この結果は伸長したＡＥＲ中に誘導されるＢｍｐ−２発現とは対照的であり、これは常に外因性発現ドメインと連続している。誘導されたＦｇｆ−４発現の非対称性は、ＳｏｎｉｃがＺＰＡ移植片よりもはるかに伸長したＡＥＲを極性化することを示している（ＭａｃｃａｂｅおよびＰａｒｋｅｒ、（１９７９）  Ｊ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．Ｅｘｐ．Ｍｏｒｐｈ．５３：６７−７３）。ＦＧＦそれ自体が四肢中胚葉に分裂促進的であるので、これらの結果は重層ＡＥＲ中のマイトジェン誘導を通って間接的に遠方の増殖を誘導するＳｏｎｉｃとよく一致する。
【０３７９】
（ｖｉ）Ｆｇｆ−４によるＳｏｎｉｃの相互調節
このようにＳｏｎｉｃはＡＥＲ中のＦｇｆ−４発現の上流に現れる。しかしＡＥＲは後方中胚葉の極性化活性の維持に必要なので（ＶｏｇｅｌおよびＴｉｃｋｌｅ、（１９９３）  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １９：１９９−２０６；Ｎｉｓｗａｎｄｅｒら、（１９９３）Ｃｅｌｌ  ７５：５７９−８７）、ＳｏｎｉｃもＡＥＲの下流かもしれない。もしＳｏｎｉｃがＡＥＲにより調節され、そしてＡＥＲがＳｏｎｉｃにより調節されるならば、それらは正のフィードバックループを通って互いに援助しあっていることを意味する。
【０３８０】
ＺＰＡ活性のＡＥＲ依存性がＳｏｎｉｃ遺伝子の転写レベルで制御されるのかどうかを試験するために、四肢芽体の後方半分からＡＥＲを除去した後のＳｏｎｉｃ発現をアッセイした。Ｓｏｎｉｃ発現は、ＡＥＲ除去から１０時間以内に、反対側にある対称四肢と比較して手術した四肢で減少し、Ｓｏｎｉｃ発現がまさにＡＥＲ依存性であるにとを示している。このＳｏｎｉｃ発現のＡＥＲからのシグナルに対する依存性は、ＡＥＲの機能の１つがＳｏｎｉｃ発現を後方中胚葉のより遠方へ強制することであることをを示唆している。
【０３８１】
ＦＧＦの分裂促進活性およびコンペテンス−誘導特性に加えて、ＦＧＦはＺＰＡを維持するためにＡＥＲと代わることもできる。ＦＧＦがＳｏｎｉｃの発現を支持できるのかどうかを試験するために、ＦＧＦ−４タンパク質中に含浸したビーズを、後方ＡＥＲ除去後に四肢芽体の後方−遠位チップに付けた。胚は、ＦＧＦ−４ビーズを受容しなかった手術した四肢芽体中のＳｏｎｉｃ発現が大変減少した時、約２４時間後にＳｏｎｉｃ発現についてアッセイした。強いＳｏｎｉｃ発現が後方中胚葉中（ビーズを移植したところのきわめて近位）に検出でき、そして反対側に生じた四肢に見られるＳｏｎｉｃ発現の通常ドメインに影響する。ＦＧＦ−４がＳｏｎｉｃ発現を維持できるという知見により、後方中胚葉中のＳｏｎｉｃ発現と後方ＡＥＲ中のＦｇｆ−４発現の間の正のフィードバックループに必要な要素が確立する（Ｎｉｓｗａｎｄｅｒら、（１９９４）  Ｎａｔｕｒｅ（印刷中）も参照にされたい）。
【０３８２】
ＳｏｎｉｃによるＢｍｐ−２発現の誘導にはＡＥＲからのシグナルが必要であり、そし
てそのドメインは時間経過にわたりＳｏｎｉｃのドメインと相関する。したがって、Ｂｍｐ−２の連続した発現にはＡＥＲからのシグナルも必要であるのかどうかを確認すること、そしてそうであればそれらをＦＧＦ−４により置き換えることができるのかを確認することは興味深いことだった。これを試験するために、後方ＡＥＲ除去後に、そしてそれをＦＧＦ−４ビーズと交換した後のＢｍｐ−２発現をアッセイした。Ｂｍｐ−２発現はＡＥＲ除去の数時間内に消失し、そしてＦＧＦ−４により援助されることができる。これらのデータは、Ｓｏｎｉｃのように、後方中胚葉中のＢｍｐ−２発現の維持がＡＥＲからのシグナルに依存することを示しており、ＦＧＦのようになると考えられる。
【０３８３】
（ｖｉｉ）Ｓｏｎｉｃに対する中胚葉の応答
明らかにＡＥＲは四肢の中胚葉にコンペテンスシグナルを提供するために必要なので、ＡＥＲの下にある中胚葉だけがＳｏｎｉｃに反応性であることが判明した。この点でＡＥＲ中で発現するＦｇｆ−４はＡＥＲと代わることができ、したがって中胚葉にＨｏｘｄおよびＢｍｐ−２遺伝子発現を促進するために、Ｓｏｎｉｃと組合わさって作用するにちがいない。ＦＧＦはアクチビンがアフリカツメガエルの軸性中胚葉をパターン化するためにも必要なので、ＦＧＦは多くの有益な経路中で許容される因子なのかもしれない（Ｃｏｒｎｅｌｌおよびｋｉｍｅｌｍａｎ、（１９９４）  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２０：２１８７−２１９８；ＬａＢｏｎｎｅおよびＷｈｉｔｍａｎ、（１９９４）  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２０：４６３−４７２）。
【０３８４】
ＡＥＲ不在下でＳｏｎｉｃおよびＦＧＦ−４に反応するＨｏｘｄおよびＢｍｐ−２発現の誘導は、中胚葉がＳｏｎｉｃタンパク質の直接的な標的組織であることを示唆している。ＳｏｎｉｃはＡＥＲ中のＦｇｆ−４発現を誘導できるので、ＳｏｎｉｃもＡＥＲ中にコンペテンス因子の誘導を通して、中胚葉に対して間接的に作用することになる。
【０３８５】
（ｖｉｉｉ）Ｓｏｎｉｃにより誘導されるシグナルの下流の標的およびカスケード
５つのＡｂｄＢ−様Ｈｏｘｄ遺伝子、Ｈｏｘｄ−９からＨｏｘｄ−１３は、始めは四肢芽体の後方の中心に対して集合したパターンで発現され、このパターンはそれらが共通のメカニズムによって制御されていることを示唆しているにちがいない（Ｄｏｌｌｅら、（１９８９）  Ｃｅｌｌ  ７５：４３１−４４１；Ｉｚｐｉｓｕａ−Ｂｅｌｍｏｎｔｅら、（１９９１）  Ｎａｔｕｒｅ  ３５０：５８５−９）。Ｈｏｘｄ遺伝子発現の外因性の、および誘導されたドメインの分析は、Ｓｏｎｉｃが通常、Ｈｏｘｄ−１１、−１２および−１３の発現を誘導することを示唆する。対称的に、Ｈｏｘｄ−９および−１０発現はＳｏｎｉｃ  ｍＲＮＡが検出できる前に始まることが判明した。これは少なくとも２つの異なるメカニズムが翅芽体中のＨｏｘｄ遺伝子発現を制御し、その１つのみがＳｏｎｉｃに依存性であることを意味する。
【０３８６】
幾つかの観察から、Ｈｏｘｄ発現ドメインの生成はＳｏｎｉｃに直接的に制御されているのではなく、むしろＳｏｎｉｃの下流であるシグナルにより制御されていることが示唆されている。このＨｏｘｄ発現ドメインはＳｏｎｉｃから急速に別れ、そして幾つかの異なるサブドメインに進化する。さらに、ネズミＨｏｘｄ−１１遺伝子プロモーターの分析のように、これらのサブドメインは別個に制御されているようであり、これが独立した後方および遠位要素を含むことを示唆している（Ｇｅｒａｒｄら、（１９９３）  Ｅｍｂｏ．Ｊ．１２：３５３９−５０）。さらに、Ｈｏｘｄ−１１から−１３の遺伝子発現の開始はＡＥＲに依存しているが、その発現はＡＥＲ除去後に維持される（Ｉｚｐｉｓｕａ−Ｂｅｌｍｏｎｔｅら、（１９９２）  Ｅｍｂｏ．Ｊ．１１：１４５１−７）。Ｓｏｎｉｃ発現は同様な条件下で急速に消失するので、このことはＨｏｘｄ遺伝子発現の維持がＳｏｎｉｃとは無関係であることを意味する。異所的なＳｏｎｉｃは四肢中にＨｏｘｄ発現ドメインの反復（ｒｅｃａｐｉｔｕｌａｔｉｏｎ）を誘導できるので、間接的なエフェクターがＨｏｘｄ発現ドメインの正しいパターン化を調節するようであるが、それらはＳｏｎｉ
ｃの下流であると結論できる。これらの間接的効果の潜在的なメディエーターには、中胚葉中のＢｍｐ−２およびＡＥＲからのＦｇｆ−４が含まれる。
【０３８７】
Ｈｏｘｄ遺伝子とは対称的に、後方四肢中胚葉中のＢｍｐ−２遺伝子発現は、Ｓｏｎｉｃにより連続的に調節されているようである。外因性および異所的なＢｍｐ−２発現の両方はＳｏｎｉｃに相当することが判明した。さらに、連続するＢｍｐ−２発現はＡＥＲに依存し、そしてＦＧＦ−４により援助されることができる。これはＳｏｎｉｃ発現もＡＥＲにより維持され、そしてＦＧＦ−４により援助されることができるという事実を間接的に結論しているようである。事実、Ｂｍｐ−２発現は分泌されたＳｏｎｉｃタンパク質に対する細胞の直接的応答にちがいない。このＢｍｐ−２とＨｏｘｄ遺伝子発現との間の差異は、Ｓｏｎｉｃ下流の多くの経路が中胚葉の遺伝子発現を調節していることを示唆している。
【０３８８】
Ｂｍｐ−２自体は、Ｓｏｎｉｃにより誘導されるパターン化の出来事のカスケードにおいて、第２の発信分子の候補である。Ｂｍｐ−２はＴＧＦ−β族の分泌分子であり、そしてその発現はＳｏｎｉｃにより誘導されることができる。これは進化的に保存された経路であり、Ｄｒｏｓ−ＨＨのように、Ｓｏｎｉｃのキイロショウジョウバエの相同物がｄｐｐ（Ｂｍｐ−２の相同物）の目および翼成虫盤中の発現を活性化するようである（Ｈｅｂｅｒｌｅｉｎら、（１９９３）  Ｃｅｌｌ  ７５：９１３−２６；Ｍａら、（１９９３）
Ｃｅｌｌ  ７５：９２７−３８；ＴａｂａｔａおよびＫｏｒｎｂｅｒｇ、（１９９４）
Ｃｅｌｌ  ７６：８９−１０２）。Ｄｒｏｓ−ＨＨの発現は通常、翼盤の後方に限定される。盤の前方のＤｒｏｓ−ＨＨの異所的な発現は、ｄｐｐの異所的な発現を生じ、そして最終的に二重の鏡像対称性を持つ翅構造を生じる（ＢａｓｓｌｅｒおよびＳｔｒｕｈｌ、（１９９４）  Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：２０８−２１４）。この効果はヒナの四肢中でのＳｏｎｉｃの異所的発現の表現型の結果に明らかに匹敵する。
【０３８９】
（ｉｘ）Ｓｏｎｉｃ発現の調節
Ｓｏｎｉｃ発現は中胚葉の外側成長中の極めて初期に、四肢芽体の後方で活性化される（Ｒｉｄｄｌｅら、（１９９３）  Ｃｅｌｌ  ７５：１４０１−１６）。この局所化した発現を開始させる因子は未だに同定されていないが、マウスの四肢芽体の前方縁でのＨｏｘｂ−８の異所的発現は、前方ＡＥＲ下のＳｏｎｉｃ発現の第２ドメインの活性化を生じる（Ｃｈａｒｉｔｅら、（１９９４）  Ｃｅｌｌ  ７８：５８９−６０１）。レチノイン酸はインビトロでＨｏｘｂ−８および他のＨｏｘ遺伝子の発現を誘導できると知られているので（Ｍａｖｉｌｉｏら、（１９８８）  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ３７：７３−７９）、外因性のレチノイン酸は、極めて初期の四肢芽体中あるいは四肢芽体形成前のわき腹のいずれかに、上流Ｈｏｘ遺伝子の発現を誘導することによりＳｏｎｉｃを発現する能力のある細胞を作るように作用することができる。
【０３９０】
幾つかの証拠の系では、いったん誘導されれば、Ｓｏｎｉｃ発現は後方ＡＥＲからのシグナルに依存することを示唆している。後方の四肢中胚葉中での開始後、Ｓｏｎｉｃ発現ドメインは四肢芽体が成長するつれて遠方に移動し、常にＡＥＲの下に留まっている。同様に、Ｓｏｎｉｃ発現はレチノイン酸ビーズの移植により、四肢芽体の前方縁に対しても誘導されることができるが、誘導された異所的発現はＡＥＲ直下の中胚葉に限られている（Ｒｉｄｄｌｅら、（１９９３）  Ｃｅｌｌ  ７５：１４０１−１６）。さらに、ＺＰＡ活性はＡＥＲの除去後、急速に消え（Ｎｉｓｗａｎｄｅｒら、（１９９３）  Ｃｅｌｌ  ７５：５７９−８７；ＶｏｇｅｌおよびＴｉｃｋｌｅ、（１９９３）  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１９：１９９−２０６）、そしてＺＰＡ移植片はＡＥＲの極めて近位に位置したときのみ機能する（Ｔａｂｉｎ、（１９９１）  Ｃｅｌｌ  ６６：１９９−２１７；Ｔｉｃｋｌｅ、（１９９１）  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ 同上  １：１１３−２１）。連続したＳｏｎｉｃ発現が後方ＡＥＲからのシグナルに依存するというこの観察は、これらの
観察の基礎となるメカニズムを明らかにする。
【０３９１】
ＡＥＲ−派生シグナルに対するＳｏｎｉｃ発現の信用性は、四肢発生中のＳｏｎｉｃ発現の遠方シフトに関する説明を示唆する（Ｒｉｄｄｌｅら、（１９９３）  Ｃｅｌｌ  ７５：１４０１−１６）。ＡＥＲからのシグナルは、発達し、そして次にＡＥＲの遠位置換を生じるゾーン（ｚｏｎｅ）の中胚葉細胞の遠方外側成長も促進する。したがって、Ｓｏｎｉｃ発現の維持にはＡＥＲからのシグナルが必要なので、その発現ドメインは同様に置き換わるのだろう。
【０３９２】
ＡＥＲをＦＧＦ−４含浸ビーズに置き換えると、Ｓｏｎｉｃ発現が維持されることが判明した。この結果はＺＰＡ活性がＦＧＦ族の員によりインビボおよびインビトロで維持されることができるというこれまでの知見と一致する（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、（１９９３）
Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１７：１４２１−３３；Ｎｉｓｗａｎｄｅｒら、（１９９３）  Ｃｅｌｌ  ７５：１４０１−１６；ＶｏｇｅｌおよびＴｉｃｋｌｅ、（１９９３）
Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１９：１９９−２０６）。Ｆｇｆ−４は通常、後方ＡＥＲで発現するので、これらの結果はＦｇｆ−４がＳｏｎｉｃ発現の維持に関与する外胚葉からのシグナルであることを示唆している。
【０３９３】
（ｘ）ＳｏｎｉｃおよびＡＥＲの調節および維持
Ｓｏｎｉｃは、内因性ＡＥＲに関して逆の極性を有するＡＥＲの前方伸長を誘導できる。この極性はＡＥＲ中で２つのマーカーの発現を調査することにより示される。正常四肢中で、Ｂｍｐ−２はＡＥＲ全体に発現するが、一方Ｆｇｆ−４はＡＥＲの前方２／３に発現する。異所的Ｓｏｎｉｃ発現から生じる伸長したＡＥＲにおいて、Ｂｍｐ−２はここでもＡＥＲ全体に見いだされ、一方Ｆｇｆ−４発現は偏向しており、ＡＥＲの両側に見いだされ、Ｓｏｎｉｃを発現している前方および後方中胚葉に重なっている。これらの結果は、ＡＥＲの前−後方極性が下層中胚葉により調節されるようであること、ならびにＺＰＡ移植片が異所的な、極性化したＡＥＲ組織を導くというこれまでの観察（ＭａｃｃａｂｅおよびＰａｒｋｅｒ、（１９７９）  Ｊ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．Ｅｘｐ．Ｍｏｒｐｈ．５３：６７−７３）と一致する。この結果はまた、ＡＥＲの正常なＡＰ極性が内因性のＳｏｎｉｃ発現の反映であることも示唆している。誘導されたＡＥＲは、誘導された構造の完全なＰＤ外側成長を促進するに十分である（Ｒｉｄｄｌｅら、（１９９３）  Ｃｅｌｌ  ７５：１４０１−１６）。したがってＡＥＲの維持に必要ないかなる因子もＳｏｎｉｃの下流である。
【０３９４】
（ｘｉ）ＳｏｎｉｃとＦｇｆ−４との間の正のフィードバックループ
異所的なＡＥＲでのＳｏｎｉｃによるＦｇｆ−４発現の誘導、ならびにＦＧＦ−４によるＳｏｎｉｃ発現の維持は、ＳｏｎｉｃおよびＦｇｆ−４発現が通常、正のフィードバックループにより維持されていることを示唆している。そのようなフィードバックループは中胚葉の外側成長およびパターン化の調整を行うことができる。Ｓｏｎｉｃが中胚葉組織をパターン化し、そしてＦｇｆ−４発現を調節し、一方ＦＧＦ−４タンパク質が中胚葉増殖を誘導し、そしてＳｏｎｉｃ発現を維持するので、この調整が可能である。さらに中胚葉組織は、Ｆ８ｆ−４により提供されるコンピテンス活性と関連して、Ｓｏｎｉｃによってのみパターン化されることができる。したがってパターン化は常に増殖と同時に起こる。
【０３９５】
外部的に投与したＦｇｆ−４がＦＧＦ族の異なる員の活性を模しているかもしれないという可能性が残る。例えば、Ｆｇｆ−２は四肢中胚葉およびＡＥＲ中に発現し（Ｓａｖａｇｅら、（１９９３）  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  １９８：１５９−７０）、そして四肢組織に対してＦｇｆ−４と同様な効果を有する（ＮｉｓｗａｎｄｅｒおよびＭａｒｔｉｎ、（１９９３）  Ｎａｔｕｒｅ  ３６１：６８−７１；Ｎｉｓｗａｎ
ｄｅｒら、（１９９３）  Ｃｅｌｌ  ７５：５７９−８７；Ｒｉｌｅｇら、（１９９３）
Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１８：９５−１０４；Ｆａｌｌｏｎら、（１９９４）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６４：１０４−７）。
【０３９６】
（ｘｉｉ）四肢の外側成長およびきパターン化の調整化調節
発生している四肢のパターン化および外側成長は、２つの主要な発信センター、ＺＰＡおよびＡＥＲにより調整されると知られている。ＺＰＡおよびＡＥＲの活性の分子メディエーターとしてのＳｏｎｉｃおよびＦＧＦの同一性は、これら発信センターの活性をそれらの調節から分け、そしてそれらが機能する経路を通る発信の調査を可能にした。
【０３９７】
上記に示した結果は、Ｓｏｎｉｃタンパク質に応答する細胞の能力がＡＥＲにより生成されたＦＧＦに依存していることを示唆している。またＳｏｎｉｃは、中胚葉遺伝子発現パターンの調節に関与する第２シグナルのカスケードを誘導することも判明した。さらなる証拠は、Ｓｏｎｉｃにより開始された正のフィードバックループについて判明し、これはＳｏｎｉｃの後方中胚葉発現およびＡＥＲ中のＦｇｆ−４を維持する。この記載したフィードバックループは、それにより四肢のＡＰおよびＰＤ軸に沿った外側成長およびパターン化が統合して調節されることができるメカニズムを示唆している。
【０３９８】
上記の結果はさらに、第２シグナルの相互作用により生成する構造パターンが決まる、第２シグナルのカスケードの引き金を引く短い範囲のシグナルとしてＳｏｎｉｃが作用することを示唆している。このデータは、前方−後方四肢軸に沿った中胚葉をパターン化するために、同時に近位−遠位外側成長を調節しながら、どのようにＳｏｎｉｃがＡＥＲと調和して作用するかを説明するモデルを作るために組み合わせることができる、多くの誘導性経路を示唆している。
【０３９９】
誘導後、Ｓｏｎｉｃは四肢外胚葉および中胚葉の両方にシグナルを送る。Ｓｏｎｉｃは後方に偏向したＦｇｆ−４の発現を含む明らかな極性をＡＥＲ形成に与え、そしてＡＥＲは連続したＳｏｎｉｃ発現に依存するようになる。中胚葉は、重層している外胚葉から許容できるシグナルを受用するかぎり、Ｂｍｐ−２のような第２発信分子を発現することにより、そしてＨｏｘｄ遺伝子を活性化することにより、Ｓｏｎｉｃシグナルに反応する。Ｂｍｐ−２発現は連続したＳｏｎｉｃ発現に直接依存し、一方Ｈｏｘｄ遺伝子の連続した発現は急速にＳｏｎｉｃ非依存性になる。相互的様式で、後方中胚葉中のＳｏｎｉｃ ｈｅｄｇｅｈｏｇ発現の維持はＡＥＲからのシグナルに依存するようになる。ＡＥＲにより発現される因子はＳｏｎｉｃ発現および活性に必要なだけでなく、分裂促進的でもあり、成長およびパターン化は複雑に関連するようになる。互いに依存する発信センターを通った四肢発生の調整により、ＡＰおよびＰＤ構造は一列に並んで誘導され、そしてパターン化される。本明細書で解明した経路は、したがって四肢パターン化の支配を制御するための分子的枠組みを提供する。
【実施例８】
【０４００】
Ｓｏｎｉｃ、ＢＭＰ−４およびＨｏｘ遺伝子発現は、脊椎動物およびキイロショウジョウバエの消化管のパターン化において保存された経路を示唆する
（ｉ）実験手法
ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーションおよび写真
ＴＧＦ−およびＢＭＰ族の員を増幅するために設計したプライマーを使用して、ＢＭＰプローブを単離し（Ｂａｓｌｅｒ，Ｋ．，ら、（１９９３）  Ｃｅｌｌ  ７３：６８７−７０２）、８つの別個の１２０ｂｐ  ＢＭＰ断片を、第２２期のニワトリの後方四肢芽体プラスミドｃＤＮＡライブラリーから増幅した。これらの断片をプールし、そしてＲｉｄｄｌｅら、（１９９３）  Ｃｅｌｌ  ７５：１４０１−１６に構築された、非増幅第２２期芽体ラムダｚａｐ  ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために使用した。単離
したＢＭＰ関連クローンは、ニワトリのＢＭＰ−２に対応する約１．９ｋｂ  ｃＤＮＡクローン、およびニワトリのＢＭＰ−４に対応する約１．５ｋｂ  ｃＤＮＡクローンであった。両クローンとも全コーディング領域を含む。ＳｏｎｉｃクローンはＲｉｄｄｌｅら、（１９９３）  Ｃｅｌｌ  ７５：１４０１−１６に記載されているように得た。ジゴキシゲニン−ＵＴＰ標識ＲＮＡプローブをＲｉｄｄｌｅら、（１９９３）  Ｃｅｌｌ  ７５：１４０１−１６に記載されているように転写した。簡単に説明すると、回収したヒナの胚を一晩、４％パラホルムアルデヒド中で固定し、そしてＰＢＳ中で洗浄し、次にＲｉｄｄｌｅら、（１９９３）  Ｃｅｌｌ  ７５：１４０１−１６に記載されているように全載  ｉｎ ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション法を行った。胚を腹または背側表面から透過光下で、ニコン、ズーム  立体顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  ｚｏｏｍ  ｓｔｅｒｅｏ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）を使用して、コダック（Ｋｏｄａｋ）  Ｅｋｔａｒ  １００  ＡＳＡ  フィルムを用いて写真を取った。
全載  ｉｎ ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション胚および内蔵を、Ｒｉｄｄｌｅら、（１９９３）  Ｃｅｌｌ  ７５：１４０１−１６に記載されているように切片にした。１５−２５μｍの横軸区分を風乾し、そしてＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｐｈｏｔ  顕微鏡およびコダック  Ｅｋｔａｒ  ２５  ＡＳＡフィルムを使用して、ブライトフィールド（Ｂｒｉｇｈｔｆｉｅｌｄ）またはヌマルスキー（ｎｕｍａｒｓｋｉ）オプティックスで写真を取った。
【０４０１】
ヒナの胚および組換えレトロウイルス
ニワトリＳｏｎｉｃの完全長  ｃＤＮＡを発現するために、Ｒｉｄｄｌｅら、（１９９３）  Ｃｅｌｌ  ７５：１４０１−１６に記載されているように工作したレトロウイルスベクターを、第８−１３期のニワトリの胚の片側に注射し、中期−胚レベルで明らかな内胚葉を標的とした。この段階で、ＣＩＰは形成しなかったし、またＳｏｎｉｃもＢＭＰ−４も注射した領域で発現しなカッタ。注射は腹側を上向きにして培養した胚の腹側に行った（Ｎｅｗ，Ｄ．Ａ．Ｔ．（１９５５）  Ｅｍｂｒｙｏｌ．Ｅｘｐ．Ｍｏｒｐｈ．３：３２０−３１）。胚を注射の１８−２８時間後に回収し、そして全載ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション用に調製し（上記のｉｎ ｓｉｔｕ  実験の記載を参照にされたい）、ＳｏｎｉｃまたはＢＭＰ−４ジゴキシゲニン標識プローブとハイブリダイズさせた。
【０４０２】
Ｈｏｘ  遺伝子との  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション
全載ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション用に、Ｈｏｘａ−９、−１０、−１１、−１３；ｂ−９、ｃ−９、−１０、−１１；ｄ−９、−１０、−１１、−１２および−１３のニワトリ相同物のクローン化したｃＤＮＡを使用して、ジゴキシゲニン−ＵＴＰ標識リボプローブを転写した。飼育したニワトリの胚をＰＢＳ中で回収し、内蔵摘出した。内蔵器官ブロックを４％パラホルムアルデヒド中で一晩固定し、そして全載ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行った。方法および写真技術は、上記の通りである。
【０４０３】
（ｉｉ）全載ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーションにより測定したヒナの胚第１３期におけるＳｏｎｉｃおよびＢＭＰ−４の発現
ヒナの消化管形態形成は第８期に始まり（ＨａｍｂｅｒｇｅｒおよびＨａｍｉｌｔｏｎ、（１９８７）  Ｎｕｔｒ．６：１４−２３）、前方の明らかな内胚葉が折り畳まれている腹側を持ち、前腸門（ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｐｏｒｔａｌ：ＡＩＰ）を形成した（Ｒｏｍａｎｏｆｆ，Ａ．Ｌ．，（１９６０）  鳥類の胚（Ｔｈｅ  Ａｖｉａｎ  Ｅｍｂｒｙｏ）、マクミラン社（Ｔｈｅ  Ｍａｃｍｉｌｌａｎ  Ｃｏ．，ＮＹ．）。これが後方に延長して前腸を形成する。内胚葉の陥入の第二波は、後方で第１３期に始まり、尾腸門（ｃａｕｄａｌ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｐｏｒｔａｌ：ＣＩＰ）を生成する。このＣＩＰは前方に伸び、後腸を形成する。脊椎動物の消化管の内胚葉においてこれまでに記したＳｏｎｉｃ発現（Ｒｉｄｄｌｅら、（１９９３）  Ｃｅｌｌ  ７５：１４０１−１６；Ｅｃｈｅｌａｒｄら、（１９９３）  Ｃｅｌｌ  ７５：１４１７−１４３０
）は、ＡＩＰおよびＣＩＰの内胚葉唇において、制限されたパターンで初期に発現する。Ｓｏｎｉｃ発現はＡＩＰおよびＣＩＰの内胚葉で、前消化管閉鎖段階で検出される。後期、第２８期の胚で、Ｓｏｎｉｃは内胚葉に限定されてすべてのレベルの消化管で発現する（前−、中期−および後期−消化管）。Ｓｏｎｉｃは四肢芽体（Ｒｉｄｄｌｅら、（１９９３）  Ｃｅｌｌ  ７５：１４０１−１６）および神経管（Ｅｃｈｅｌａｒｄら、（１９９３）  Ｃｅｌｌ  ７５：１４１７−１４３０；Ｋｒａｕｓら、（１９９４）  Ｃｅｌｌ
７５：１４３７−１４４４；Ｒｏｅｌｉｎｋら、（１９９４）  Ｃｅｌｌ  ７６：７６１−７７５））を含む、胚の他の領域中の重要な指示シグナルになると知られている。初期の消化管内胚葉は、非−消化管間充識と結合したとき、消化管−特異的中胚葉分化を引き起こすと知られているので（Ｈａｆｆｅｎら、（１９８７）  Ｎｕｔｒ．６：１４−２３）、Ｓｏｎｉｃが内蔵中胚葉に対するシグナルとして機能するかもしれないと予想した。Ｓｏｎｉｃの作用に関する可能性のある標的遺伝子は、脊椎動物のＳｏｎｉｃの相同物であるＤｒｏｓ−ＨＨが隣接細胞中のＴＧＦ−β関連遺伝子ｄｐｐの発現を活性化する、キイロショウジョウバエの成虫盤の類似により示唆された（Ｔａｂａｔａ  ａｂｄ  Ｋｏｒｎｂｅｒｇ、（１９９４）  Ｃｅｌｌ  ７６：８９−１０２；Ｈｅｂｅｒｌｅｉｎら、（１９９３）  Ｃｅｌｌ  ７５：９１３−９２６；Ｍａら、（１９９３）  Ｃｅｌｌ  ７５：９１３−９２６：Ｂａｓｌｅｒら、（１９９３）  Ｃｅｌｌ  ７３：６８７−７０２）。ｄｐｐの２つの脊椎動物の相同物、ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−４がある。ＢＭＰ−４の最初の検出しうる発現は、発生している消化管中で第一に観察できるＳｏｎｉｃの発現と同時におこる。ＢＭＰ−４はＡＩＰおよびＣＩＰでＳｏｎｉｃに隣接するドメイン中で発現するが、隣接腹側中胚葉に限られている。ＢＭＰ−４消化管発現は、内蔵中胚葉中のみで、後期胚、第３３期の胚まで持続する。両方の遺伝子の組織制限的発現は、研究したすべての段階で維持されている。ＢＭＰ−２はＡＩＰおよびＣＩＰで消化管中には発現しないが、後期の消化管中胚葉中の細胞クラスター中でＢＭＰ−４とは明らかに異なるパターンを発現する。
【０４０４】
（ｉｉｉ）Ｓｏｎｉｃの異所的発現は、発生しているヒナの中胚葉組織中にＢＭＰ−４の異所的発現を誘導する
ＳｏｎｉｃがＢＭＰ−４を中胚葉中に誘導できるのかどうかを試験するために、四肢発生におけるＳｏｎｉｃの役割を研究するためにすでに使用した異所的発現系を採用した（Ｒｉｄｄｌｅら、（１９９３）  Ｃｅｌｌ  ７５：１４０１−１６）。Ｓｏｎｉｃを発現するように作成したコンピテントなレトロウイルスの複製を、インビトロの第８−１３期のヒナの胚の推定上の内胚葉および内蔵中胚葉に中−胚位置の片側に注射した（Ｎｅｗ、Ｄ．Ｔ．Ａ．（１９５５）、Ｅｍｂｒｙｏｌ．Ｅｘｐ．Ｍｏｒｐｈ．３：３２０−３２１）。胚を１８−２６時間後にｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションで調査したとき、Ｓｏｎｉｃの正常な野生型発現がＡＩＰ、ＣＩＰおよび中線（神経管および脊索）で検出される。異所的なＳｏｎｉｃの発現は、左腹側面に片方に存在する。また野生型Ｓｏｎｉｃ発現は、神経管および脊索の床板に見られる。異所的な発現は、内蔵内胚葉で片方に見られ、それは内蔵中胚葉および体性中胚葉の下にある。ＢＭＰ−４発現は、正常なＣＩＰの中胚葉中の発現に加えて、中胚葉中の注射部位に誘導されたと見ることができる。野生型ＢＭＰ−４発現は、神経管のほとんどの背側点および神経管に隣接した対称的な側面領域に見られる。誘導されたＢＭＰ−４発現は、内蔵中胚葉のＳｏｎｉｃウイルス注射部位に偏って存在し、そして内蔵内胚葉には存在しない。
【０４０５】
ＢＭＰ−４自体は分泌タンパク質なので、誘導カスケード中で２次シグナルとして機能し、キイロショウジョウバエ成虫盤中のＤｒｏｓ−ＨＨからｄｄｐへのシグナルカスケード（Ｔａｂａｔａ  ａｂｄ  Ｋｏｒｎｂｅｒｇ、（１９９４）  Ｃｅｌｌ  ７６：８９−１０２；Ｈｅｂｅｒｌｅｉｎら、（１９９３）  Ｃｅｌｌ  ７５：９１３−９２６；Ｍａら、（１９９３）  Ｃｅｌｌ  ７５：９１３−９２６；Ｂａｓｌｅｒら、（１９９３）  Ｃｅｌｌ  ７３：６８７−７０２）、および四肢芽体中のＳｏｎｉｃからＢＭＰ−２への
シグナルカスケードに類似している。消化管では、ＢＭＰ−４は内胚葉へのフィードバックループまたは内蔵中胚葉内の一部のいずれかとして、２次シグナルとして作用できる。この後者の可能性は、ＢＭＰ−４遺伝子の欠失に関するマウスのホモ接合体での知見と一致し、内蔵中胚葉は閉じることができない。
【０４０６】
（ｉｖ）発生しているヒナの消化管中でのＨｏｘ遺伝子の発現
初期の脊椎動物の消化管の形態形成におけるＳｏｎｉｃの内胚葉−から−中胚葉シグナルとしての明らかな役割と、キイロショウジョウバエ相同物、Ｄｒｏｓ−ＨＨの役割との間には顕著な相似がある。Ｄｒｏｓ−ＨＨ（Ｓｏｎｉｃのように）は、形態発生の初期からキイロショウジョウバエの消化管内胚葉に発現する（Ｔａｙｌｏｒら、（１９９３）  Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．４２：８９−９６）。その推定上のレセプター、班（ｐａｃｈｅｄ）は、内胚葉−中胚葉誘導相互作用中にＤｒｏｓ−ＨＨ（Ｓｏｎｉｃのように）を関連させる内蔵中胚葉中に見いだされる。これは、キイロショウジョウバエの消化管発生の調節に関与すると知られている他の遺伝子も、ヒチの消化管形態発生に役割を果たすかもしれないという考えを導いた。キイロショウジョウバエ消化管内胚葉中の局所的に特異的なパターンは、中胚葉中の同型遺伝子の限定的発現が関与する経路により調節されている（ＭａＧｉｎｎｉｓおよびＫｒｕｍｌａｕｆ、（１９９２）  Ｃｅｌｌ  ６８：２８３−３０２）。脊椎動物の消化管のパターン化に関する基礎はほとんど解明されていないが、胚の幾つかの他の領域で、Ｈｏｘ遺伝子がパターン調節の鍵として関連した。脊椎動物Ｈｏｘ遺伝子は、菱脳、脊椎および四肢の発生において構造的境界と関連する重層した前後ドメイン中に発生する（ＭｃＧｉｎｎｉｓおよびＫｒｕｍｌａｕｆ、（１９９２）  Ｃｅｌｌ  ６８：２８３−３０２）。これらの遺伝子も発生している脊椎動物の後消化管中で発現するのかどうか、そしてそれらの発現ドメインがヒナ消化管の形態的境界と関連するのかどうかを試験するために、全載ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを使用した。
【０４０７】
管腔の消化管分化は、３つの形態的および生理的に異なる領域を形成する：前−、中−および後−消化管である。前−消化管および後−消化管はそれぞれ、ＡＩＰおよびＣＩＰで始まる異なる初期の消化管から派生したものである。最終的にこれらの管は、第２４−２８期あたりで卵黄茎と会い、そして融合する。中消化管は、卵黄茎のちょうど前方および後方の前消化管および後消化管原基から形成する。
【０４０８】
後消化管のほとんどの後方派生物は汚溝、共通の消化管−泌尿口である。後消化管の残りは大腸に成長する。中消化管／後消化管境界は、一対の管構造、盲のう（哺乳類の虫垂に類似する）により分けられ、これは第１９−２０期に中消化管／後消化管境界に出芽している広がりを形成する。盲のうの前方に、中消化管は小腸を形成する。
【０４０９】
ヒナの後消化管中のＨｏｘ遺伝子クラスターの５’員の発現パターンを、全載ｉｎ ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーションにより研究した。消化管中のＨｏｘ遺伝子発現パターンはダイナミックである。それらは始めに（第１０期までに）、前方および後方に広がる広い中胚葉ドメイン中に発現する。後にそれらは限定される。第２５期までに、ＨｏｘａおよびＨｏｘｄクラスターのＡｂｄ−Ｂ様遺伝子は、その発現を後消化管中胚葉に場所的に制限される。最も前方に発現する遺伝子、Ｈｏｘａ−９は、遠位の中消化管の中胚葉内に発現の前方境界を有する（中消化管長の約遠方１／３の点まで）。ＡおよびＤ  Ｈｏｘクラスター内の各連続的遺伝子は、発現のより後方ドメインを有する。Ｈｏｘａ−１０、Ｈｏｘａ−９およびＨｏｘｄ−１０はその発現が盲のうに限定されている。Ｈｏｘａ−１１およびＨｏｘｄ−１１は、発現の前方限界をおよそ中消化管／後消化管境界の中−盲のうに有する（Ｒｏｍａｎｏｆｆ，Ａ．Ｌ．，（１９６０）  鳥類の胚。マクミラン社、ＮＹ）。Ｈｏｘｄ−１２は前方限界を盲のうの後方境界に有し、そして後消化管から汚溝にわたって後方に伸びている。Ｈｏｘａ−１３およびＨｏｘｄ−１３は、消化管内胚葉内の盲のうから汚溝に発現する唯一のＡｂｄ−Ｂ様遺伝子である。
【０４１０】
後消化管中で発現すると判明したＢまたはＣ  Ｈｏｘクラスターの唯一の員は、Ｈｏｘｃ−９である。Ｈｏｘｃ−９の発現は、中消化管の中胚葉中で、その偽Ｈｏｘａ−９およびＨｏｘｄ−９と重複するが、鋭い後方境界を有し、中−盲のう中のＨｏｘａ−１１およびＨｏｘｄ−１１に相補的である。
【０４１１】
Ａｂｄ−Ｂ様Ｈｏｘ遺伝子の限定的発現は、中消化管／後消化管に汚溝、大腸、盲のう、中−盲のうを形成する消化管の連続的領域、および中消化管の下部（恐らく中消化管のその部分は後方の消化管３と同定される）を分けるようである。さらにこれらの分子的な出来事は場所的な差異を予兆している。すべてのＨｏｘ遺伝子の発現は、後消化管腔が閉じるかなり前（第２８期まで）の第１４期までに検出でき、そして調査した後の段階で維持されている。後消化管中胚葉および上皮の細胞分化は、後の第２９−３１期に始まる（Ｒｏｍａｎｏｆｆ，Ａ．Ｌ．，（１９６０）  鳥類の胚。マクミラン社、ＮＹ）。
【０４１２】
これらの結果は、特別なＨｏｘ遺伝子が消化管の形態発生を調節する原因であることを示唆している。これと一致して、Ｈｏｘｃ−８発現の前方限界がくちばしにシフトしたトランスジェニックマウスの消化管に、明らかな同型の変化がある：前消化管表皮の部分が中消化管と誤−分化する（ＰｏｌｌｏｃｋおよびＢｉｅｂｅｒｉｃｈ、（１９９２）  Ｃｅｌｌ  ７１：９１１−９２３）。
【０４１３】
（ｖ）脊椎動物およびキイロショウジョウバエの消化管形成に関与する調節遺伝子の発現における保存
脊椎動物の消化管中のＳｏｎｉｃ、ＢＭＰ−４およびＨｏｘ遺伝子の発現パターンと、キイロショウジョウバエの消化管の形態形成中のそれらの相同物の間には興味深い相似がある（図１５）。この保存は、キイロショウジョウバエにおいて、これらの遺伝子が担う役割が遺伝的に明らかなので特に興味深い。Ｄｒｏｓ−ＨＨ（脊椎動物の相同物、Ｓｏｎｉｃのように）は、消化管内胚葉中で初期段階に発現し、そして内蔵中胚葉に対するシグナルとなりうる（Ｔａｙｌｏｒら、（１９９３）  Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．４２：８９−９６）。キイロショウジョウバエの消化管中で、Ｄｒｏｓ−ＨＨ発現と他の遺伝子発現の活性化との間には直接な関係は知られていない。しかし、キイロショウジョウバエの成虫盤において、Ｄｒｏｓ−ＨＨは発信カスケード中ｄｐｐの発現を活性化すると知られている（Ｋｒａｕｓら、（１９９４）  Ｃｅｌｌ  ７５：１４３７−１４４４；Ｈｅｂｅｒｌｅｉｎら、（１９９３）  Ｃｅｌｌ  ７５：９１３−９２６；Ｍａら、（１９９３）  Ｃｅｌｌ  ７５：９１３−９２６；Ｂａｓｌｅｒら、（１９９３）  Ｃｅｌｌ  ７３：６８７−７０２）。後に消化管発生において、中胚葉でのｄｐｐの生成は中胚葉および内胚葉の両方の同型遺伝子の発現調節に貢献する（Ｂｉｅｚ，Ｍ．（１９９４）  ＴＩＧ  １０：２２−２６）。キイロショウジョウバエの同型遺伝子は、消化管内蔵中胚葉で発現し、そしてその発現は中消化管の形態的境界を決定すると知られている。これは隣接する内胚葉で遺伝子発現の正しい誘導に関与し、相互作用のメディエーターの１つはｄｐｐである（Ｂｉｅｚ，Ｍ．（１９９４）  ＴＩＧ  １０：２２−２６）。もしＤｒｏｓ−ＨＨがキイロショウジョウバエの中消化管において同型遺伝子の最終的な活性化に必要ならば、これはＳｏｎｉｃがＨｏｘ遺伝子の上流アクチベーターとして機能する、脊椎動物の四肢芽体における状況と類似し（Ｒｉｄｄｌｅら、（１９９３）  Ｃｅｌｌ  ７５：１４０１−１６）、おそらく発信カスケードにＢＭＰ−２が関与している。
【０４１４】
脊椎動物およびキイロショウジョウバエの消化管で、調節遺伝子の発現の極端な保存は、パターン化メカニズムの保存を示唆している。キイロショウジョウバエの遺伝的研究により確立された経路は、脊椎動物の消化管の局在化および形態発生に関する分子的基礎に直接的な視点を提供する。
【実施例９】
【０４１５】
細菌が発現したＨｅｄｇｅｈｏｇタンパク質は運動ニューロン誘導活性を保持する
マウスＳｈｈ遺伝子の様々な断片を、精製しやすいようにｐｏｌｙ（Ｈｉｓ）リーダー配列を持つ融合タンパク質として、ｐＥＴ１１Ｄベクター中にクローン化した。簡単に説明すると、成熟Ｍ−Ｓｈｈタンパク質（配列番号１１のＣｙｓ−２５からＳｅｒ−４３７に対応する）またはＮ−末端含有配列、および配列
【０４１６】
【化１２】
0004404923.tif 000014
を有するＮ−末端外因性リーダーをコードする融合遺伝子を、ｐＥＴ１１Ｄにクローン化し、そして大腸菌に導入した。ｐｏｌｙ（Ｈｉｓ）−Ｓｈｈ融合タンパク質をニッケルキレートクロマトグラフィーを使用して、販売元の指示に従い精製し（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）  カタログ  ３０２１０）、精製したタンパク質からｐｏｌｙ（Ｈｉｓ）リーダーをトロンビン処理により開裂した。
【０４１７】
精製Ｓｈｈタンパク質調製物を、ニワトリ胚から得た組織外植片（神経管）に加え、そして定められた培地中（例えば血清無し）で培養した。Ｍ−Ｓｈｈタンパク質を、０．５ｐＭから５ｎＭの間の最終濃度で加え、そして胚の外植片の運動ニューロン表現型への分化をＩｓｌｅｔ−１抗原の発現により検出した。細菌が生産したタンパク質は、最低５−５０ｐＭの濃度で外植片培養物中で活性となることが示された。すべての１９ｋｄのアミノ末端断片および約９ｋｄのカルボキシ末端断片を含むＳｈｈポリペプチド（実施例６を参照にされたい）は、運動ニューロン誘導活性および弱い床板誘導活性の両方を表し、これらの活性がＮ−末端断片にあることを示しているようである。
【０４１８】
上記の全ての文献および公開資料は引用により本明細書に編入する。
【０４１９】
本発明の主な態様または特徴を以下に示す。
【０４２０】
１．  脊椎動物ヘッジホッグ（ｈｅｄｇｅｈｏｇ）蛋白質に同一もしくは相同であり、かつ配列番号３４とは同一でないアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むヘッジホッグ様蛋白質の実質的に純粋な調製物。
【０４２１】
２．  蛋白質が、配列番号１、配列番号４、配列番号５、もしくは配列番号６に表されるポリペプチドと同一もしくは相同なアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むソニックヘッジホッグ（Ｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ）蛋白質である、上記１のヘッジホッグ様蛋白質。
【０４２２】
３．  蛋白質が配列番号４０により表されるポリペプチドを含む、請求の範囲２のヘッジホッグ様蛋白質。
【０４２３】
４．  蛋白質が、配列番号３もしくは配列番号７に表されるポリペプチドと同一もしくは相同であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むインディアンヘッジホッグ（Ｉｎｄｉａｎ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ）蛋白質である、上記１のヘッジホッグ様蛋白質。
【０４２４】
５．  蛋白質が、配列番号２に表されるポリペプチドと同一もしくは相同であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むデザートヘッジホッグ（Ｄｅｓｅｒｔ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ）蛋白質である、請求の範囲１のヘッジホッグ−様蛋白質。
【０４２５】
６．  蛋白質が、配列番号４１により表されるポリペプチドを含む、上記１のヘッジホ
ッグ様蛋白質。
【０４２６】
７．  蛋白質が、中胚葉性もしくは外胚葉性の細胞の増殖、分化、もしくは生存の内の少なくとも一つを調節する、上記１のヘッジホッグ様蛋白質。
【０４２７】
８．  蛋白質が、神経分化誘導性活性、神経生存亢進性活性、四肢パターン形成性活性、幹細胞／前駆体細胞誘導性活性、生殖細胞誘導性活性、およびそれらの組み合わせ物からなる群より選択される生物学的活性を有する、上記７のヘッジホッグ様蛋白質。
【０４２８】
９．  蛋白質が、中胚葉性もしくは外胚葉性の細胞の増殖、分化、もしくは生存の内の少なくとも一つに対する作動作用を行う、上記７ヘッジホッグ様蛋白質。
【０４２９】
１０．  蛋白質が、中胚葉性もしくは外胚葉性の細胞の増殖、分化、もしくは生存の内の少なくとも一つに対する拮抗作用を行う、上記７のヘッジホッグ様蛋白質。
【０４３０】
１１．  蛋白質がグリコシル化される、上記１のヘッジホッグ様蛋白質。
【０４３１】
１２．  蛋白質が、１９ｋｄのおおよその分子量を有する脊椎動物ヘッジホッグ蛋白質のＮ−末端部分を含む、上記１のヘッジホッグ様蛋白質。
【０４３２】
１３．  蛋白質が、２７ｋｄのおおよその分子量を有する脊椎動物ヘッジホッグ蛋白質のＣ−末端部分を含む、上記１のヘッジホッグ様蛋白質。
【０４３３】
１４．  上記１の蛋白質の一部分を含む免疫原であって、前記免疫原が配列番号３４の蛋白質のいずれかの部分から抗原的に識別される免疫原。
【０４３４】
１５．  上記１のヘッジホッグ様蛋白質のエピトープとの特異的反応性を示す抗体調製物。
【０４３５】
１６．  脊椎動物ヘッジホッグ蛋白質もしくはその部分と同一もしくは相同であるヘッジホッグポリペプチド配列を含む組換え蛋白質であって、その組換え蛋白質が前記脊椎動物ヘッジホッグ蛋白質の少なくとも一つの生物学的活性のアゴニストもしくは前記脊椎動物ヘッジホッグ蛋白質の少なくとも一つの生物学的活性のアンタゴニストのいずれかの役割の内の一つとしての機能を果たし、前記ヘッジホッグ配列が配列番号３４とは異なる組換え蛋白質。
【０４３６】
１７．  ヘッジホッグアミノ酸配列が、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、および配列番号１４からなる群に表される脊椎動物ヘッジホッグ蛋白質のアミノ酸配列と少なくとも６０パーセントの相同性を示す、上記１６の組換え蛋白質。
【０４３７】
１８．  ヘッジホッグアミノ酸配列が、配列番号１３のＣｙｓ−２４〜Ｇｌｕ−１８８におおよそ相当する脊椎動物ヘッジホッグ蛋白質のＮ−末端部分を含む、上記１６の組換え蛋白質。
【０４３８】
１９．  ヘッジホッグアミノ酸配列が、配列番号１３のＡｓｎ−１８９〜Ａｌａ−４７５におおよそ相当する脊椎動物ヘッジホッグ蛋白質のＣ−末端部分を含む、上記１６の組換え蛋白質。
【０４３９】
２０．  蛋白質が更に、前記ヘッジホッグポリペプチド配列に加えて、前記ヘッジホッグ
蛋白質とは異なるアミノ酸配列を有する第二ポリペプチド配列を含む融合蛋白質である、上記１６の組換え蛋白質。
【０４４０】
２１．  前記第二ポリペプチドが、前記融合蛋白質の存在を検出するための検出用ラベルであるか、あるいは前記融合蛋白質を固定化させるためのマトリックス結合性ドメインである、上記２０の組換え蛋白質。
【０４４１】
２２．  配列番号８の残基２７〜４２５；端列番号９の残基２２〜３９６；配列番号１０の残基１〜３３６；配列番号１１の残基２５〜４３７；配列番号１２の残基２４〜４１８；配列番号１３の残基２４〜４７５；および配列番号１４の残基１〜３１２からなる群より選択されるヘッジホッグアミノ酸と少なくとも７０パーセント相同であるアミノ酸配列を含む、組換えヘッジホッグ蛋白質。
【０４４２】
２３．  配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、および配列番号１４からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するヘッジホッグ蛋白質に特異的に結合する抗体との交差反応を示すアミノ酸配列を有する、単離されたヘッジホッグ蛋白質もしくは組換えヘッジホッグ蛋白質。
【０４４３】
２４．  配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号７からなる群より選択される核酸配列に対して緊縮性条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされる、単離されたヘッジホッグポリペプチドもしくは組換えヘッジホッグポリペプチド。
【０４４４】
２５．  脊椎動物ヘッジホッグ蛋白質もしくはその一部分に同一もしくは相同であり、かつ配列番号３４とは同一でないアミノ酸配列を有するヘッジホッグポリペプチドをコードする単離された核酸。
【０４４５】
２６．  核酸が、内胚葉性もしくは外胚葉性の細胞の増殖、分化、もしくは生存の内の少なくとも一つを調節するヘッジホッグポリペプチドをコードする、請上記２５の核酸。
【０４４６】
２７．  核酸が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号７からなる群により選択されるヘッジホッグ核酸配列の内の少なくとも１２の連続ヌクレオチドにより表される配列を有する核酸プローブに対して緊縮条件下でハイブリダイズする、上記２５の核酸。
【０４４７】
２８．  前記ヌクレオチド配列に操作可能に連結された転写調節配列を更に含み、その結果前記核酸を発現ベクターとしての使用に適するようにさせる、上記２５の核酸。
【０４４８】
２９．  原核生物細胞および真核生物細胞の内の少なくとも一つの中での複製が可能であり、かつ上記２５の核酸を含む発現ベクター。
【０４４９】
３０．  上記２９の発現ベクターでトランスフェクトされ、かつ前記ヘッジホッグポリペプチドを発現する宿主細胞。
【０４５０】
３１．  上記３０の細胞を細胞培養培地内で培養して前記ヘッジホッグポリペプチドを発現させ、そして前記細胞培養物から前記ヘッジホッグポリペプチドを単離することを含む、組換えヘッジホッグポリペプチドの産生方法。
【０４５１】
３２．  上記２５の核酸を含むトランスジーンを宿す細胞を有する形質転換動物。
【０４５２】
３３．  （ｉ）上記２５の核酸を含み、かつ真核生物細胞内で前記ヘッジホッグポリペプチドの発現を生じるための転写調節配列に操作可能に連結された遺伝子構築物、および
（ｉｉ）前記遺伝子構築物を細胞に輸送し、かつその細胞を前記遺伝子構築物でトランスフェクトさせるための遺伝子輸送用組成物、を含む、組換えトランスフェクション系。
【０４５３】
３４．  遺伝子輸送用組成物が、組換えウイルス性粒子、リポソーム、およびポリカチオン性核酸結合性作用物質からなる群より選択される、上記３３の組換えトランスフェクション系。
【０４５４】
３５．  形質転換脊椎動物であって、ヘッジホッグ誘導性経路が、拮抗性ヘッジホッグポリペプチドの発現もしくはヘッジホッグ遺伝子の破壊のいずれかの内の一つにより前記動物の一つもしくは複数の組織内で阻害される形質転換脊椎動物。
【０４５５】
３６．  実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含み、前記オリゴヌクレオチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、もしくは天然に存在するそれらの突然変異体のセンスもしくはアンチセンス配列の内の少なくとも１５の連続ヌクレオチドに対して緊縮条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含む、プローブ／プライマー。
【０４５６】
３７．  プローブ／プライマーが更にそれらに連結されるラベル基を含み、かつ検出されることが可能である、上記３６のプローブ／プライマー。
【０４５７】
３８．  脊椎動物ヘジホッグ  ｍＲＮＡ転写物を含み、請求の範囲３６のプローブ／プライマーを含む、脊椎動物ヘッジホッグ蛋白質をコードする核酸のレベルを細胞試料中で測定するための、細胞を検出するための検査用キット。
【０４５８】
３９．  ある被験体が、望ましくない細胞分化、脱分化、もしくは増殖を特徴とする疾患の危険にさらされているかどうかの決定方法であって、前記被験体の組織試料中で、
ヘッジホッグ蛋白質もしくはその同族体をコードする遺伝子の突然変異；および前記遺伝子の過誤発現、
の内の少なくとも一つを特徴とする遺伝子病変の存在もしくは非存在を決定することを含む方法。
【０４５９】
４０．  前記遺伝子病変の検出が、
ｉ．      前記遺伝子からの一つもしくは複数のヌクレオチドの欠損、
ｉｉ．    前記遺伝子への一つもしくは複数のヌクレオチドの添加、
ｉｉｉ．  前記遺伝子の一つもしくは複数のヌクレオチドの置換、
ｉｖ．    前記遺伝子の総括的染色体再配列、
ｖ．      前記遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物のレベルでの総括的変化、
ｖｉ．    前記遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物の非野生型スプライシングパターンの存在、および
ｖｉｉ．  前記蛋白質の非野生型タイプレベル、
の内の少なくとも一つの存在を確認することを含む、上記３９の方法。
【０４６０】
４１．  前記遺伝子病変の検出が、
ｉ．      配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、もしくは天然に存在するそれらの突然変異体、また前記遺伝子に天然の状態で関連する５’もしくは３’フランク配列の内の一つもしくは複数のセンスもしくはアンチセンス配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含むオリゴヌクレオチ
ドを含むプローブ／プライマーを提供すること；
ｉｉ．    前記プローブ／プライマーを前記組織の核酸に露出すること；および
ｉｉｉ．  前記プローブ／プライマーの前記核酸に対するハイブリダイゼーションにより、前記遺伝子病変の存在もしくは非存在を検出すること、
を含む、上記３９の方法。
【０４６１】
４２．  前記病変の検出が、前記プローブ／プライマーを利用して前記遺伝子のヌクレオチド配列、および場合によっては前記フランク核酸配列のヌクレオチド配列を決定することを含む、上記３９の方法。
【０４６２】
４３．  前記病変の検出が、前記プローブ／プライマーをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）中で利用することを含む、上記３９の方法。
【０４６３】
４４．  前記病変の検出が、前記プローブ／プライマーを連結連鎖反応（ＬＣＲ）中で利用することを含む、上記３９の方法。
【０４６４】
４５．  前記蛋白質のレベルが免疫アッセイ中で検出される、上記４０の方法。
【０４６５】
４６．  （ｉ）  脊椎動物ヘッジホッグ蛋白質の少なくとも一つの生物学的活性のアゴニスト、もしくは前記脊椎動物ヘッジホッグ蛋白質の少なくとも一つの生物学的活性のアンタゴニストのいずれかの役割の内の一つとして機能することが可能な少なくとも一つのポリペプチド；および
（ｉｉ）薬剤学的に許容される担体、
を含む、薬剤学的投与に適する組成物。
【０４６６】
４７．  前記ポリペプチドが、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号３４、配列番号４０、および配列番号４１からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、上記４６の薬剤学的組成物。
【０４６７】
４８．  ある細胞をニューロン細胞表現型に分化させることを誘導するための方法であって、前記細胞を上記１の蛋白質と接触させることを含む方法。
【０４６８】
４９．  ある動物中で、細胞成長、細胞分化、もしくは細胞生存を調節するための方法であって、ヘッジホッグポリペプチドの治療学的有効量を投与することを含む方法。
【０４６９】
５０．  ニューロン細胞死を特徴とする神経系の変性疾患を治療するための、患者に、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号３４、配列番号４０、配列番号４１、もしくはその同族体からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むヘッジホッグポリペプチドの薬剤学的調製物の治療学的有効量を投与することを含む方法。
【０４７０】
５１．  前記ヘッジホッグポリペプチドの前記治療学的有効量が前記患者のニューロン細胞の脱分化を阻害する、上記５０の方法。
【０４７１】
５２．  前記神経性細胞表現型が神経膠細胞である、上記５１の方法。
【０４７２】
５３．  前記神経性細胞表現型が神経細胞である、上記１の方法。
【０４７３】
５４．  前記変性障害が神経筋障害である、上記５０の方法。
【０４７４】
５５．  前記変性障害が自律神経障害である、上記５０の方法。
【０４７５】
５６．  前記変性障害が中枢神経系障害である、上記５０の方法。
【０４７６】
５７．  前記変性障害が、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ピック病、ハンチントン病、多発性硬化症、無酸素性虚血によりもたらされるニューロン障害、外傷によりもたらされるニューロン障害、および自然加齢過程に関連するニューロン変性からなる群より選択される、上記５０の方法。
【０４７７】
５８．  投与される神経栄養性活性を有する成長因子の治療学的有効量を前記患者に投与することを更に含む。上記５０の方法。
【０４７８】
５９．  前記成長因子が、神経成長因子、毛様体神経栄養性成長因子、神経鞘腫由来の成長因子、神経膠成長因子、線条体由来の神経栄養性因子、血小板由来の成長因子からなる群より選択される、上記５８の方法。
【０４７９】
６０．  脊椎動物ヘッジホッグ蛋白質の一部分のペプチド疑似物であって、ペプチド疑似物が前記脊椎動物ヘッジホッグ蛋白質の生物学的活性の少なくとも一部分を調節するペプチド疑似物。
【０４８０】
６１．  脊椎動物生物体からの未分化細胞をヘッジホッグポリペプチドと接触させることにより細胞培養物中に作製される分化細胞。
【０４８１】
６２．  分化細胞がニューロン細胞である、上記６１の分化細胞。
【０４８２】
６３．  ニューロン細胞がドーパミン作動性細胞である、上記６２の分化細胞。
【図面の簡単な説明】
【０４８３】
【図１】２本のニワトリヒナｈｈクローンのアミノ酸配列、ニワトリヘッジホッグ−Ａ（ｐＣＨＡ；配列番号３５）、およびニワトヘッジホッグ−Ｂ（ｐＣＨＢ；配列番号３６）を表す。これらのクローンは、図１にも示されるドロソフィラ配列（配列番号３４の残基１６１〜２３２に相当する）の下線を施したアミノ酸残基に相当する縮重プライマーを用い、その後にニワトリゲノムＤＮＡを用いるネスト型ＰＣＲを行うことにより取得した。
【図２】ニワトリヒナＳｈｈ（配列番号８）とそのドロソフィラ同族体（配列番号３４）のアミノ酸配列を比較する整列図である。Ｓｈｈ残基１〜２６は提唱されているシグナルペプチドに相当する。同一残基は類似性を強調するために四角で囲ってあり、かつギャップの挿入も施してある。Ｓｈｈのヌクレオチド配列はＧｅｎｂａｎｋに提出してある。
【図３】ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８２）の方法により作製された予想ニワトリＳｈｈ蛋白質のためのハイドロパシープロットである。疎水性の値がアミノ酸の位置に対してプロットされている。負の値によりその蛋白質の疎水性ドメインが予測される。
【図４】様々なｈｈ蛋白質のアミノ酸配列を比較する整列図である。ニワトリＳｈｈのアミノ末端上の白抜き領域は仮想的シグナルペプチドに相当する。黒塗り四角部分は配列番号８のアミノ酸残基２６〜２０７からの高度に保存された領域を意味する。矢印はドロソフィラ遺伝子内のエキソン境界を示す（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｃｅｌｌ  ７１：３３−５０）。各場合共、蛋白質をニワトリＳｈｈ（配列番号８）と比較し、そしてアミノ酸同一性パーセンテージを各領域の四角内に示した。
【図５Ａ】ドロソフィラｈｈ（Ｄ−ｈｈ；配列番号３４）、マウスｈｈ（Ｍ−Ｄｈｈ；配列番号９；Ｍ−Ｉｈｈ；配列番号１０；Ｍ−Ｓｈｈ；配列番号１１）、ニワトリｈｈ（Ｃ−Ｓｈｈ；配列番号８）、およびゼブラフィッシュｈｈ（Ｚ−Ｓｈｈ；配列番号１２）を比較する予想アミノ酸配列の「積み重ね式」整列図である。予想される疎水性貫膜／シグナル配列をイタリック体で示し、そして予想されるシグナル配列プロセシング部位に矢印を付してある。ドロソフィラｈｈおよびＭ−Ｄｈｈ読み取り枠を中断するイントロンの位置を矢印により示してある。６本の予想ｈｈ蛋白質間で共有される全アミノ酸を太字体で示してある。
【図５Ｂ】脊椎動物のヘッジホッグ蛋白質のＮ−末端部分および予想縮重配列「ＣＯＮ」（配列番号４１）の配列整列図である。
【図６】図５Ａに示される予想されるプロセシング後のｈｈ蛋白質間のアミノ酸同一性の種間および交差種比較図である。全値はパーセンテージである。括弧内の図は保存アミノ酸置換を考慮した際の類似性を表す。
【図７】マウス胎仔におけるニワトリヒナＳｈｈの異所性発現を研究するために形質転換研究において用いられたＤＮＡ構築物の概略図である。構築物は、Ｗｎｔ−ｌ発現ドメインにおけるｃＤＮＡクローンの異所性発現用に作製され、かつｌａｃ−Ｚレポーター（ｐＷＥＸＰ−ｌａｃＺ（対照として使用））およびニワトリヒナＳｈｈレポーター（ｐＷＥＸＰ−ＣＳｈｈ）を用いて形質転換マウス胎仔中でテストした。ｐＷＥＸＰ−ＣＳｈｈは構築物ニワトリヒナＳｈｈ  ｃＤＮＡの２本の縦列ヘッド−テイルコピーを含む。ＷＥＸＰ２−ＣＳｈｈ形質転換研究の結果を表１に示す。
【図８】前後方向四肢パターン形成および極性活性帯（ＺＰＡ）についての、ＳａｕｎｄｅｒｓおよびＧａｓｓｅｌｉｎｇ（１９６８）を基にしたモデルである。図の左側部分は段階２０の肢芽の略図を示す。体節を肢芽の左余白に沿ってブロックとして描いてあり；同一パネルの右側部分には成熟した羽が描かれている。後方四肢の孵化領域がＺＰＡである。通常は発育を遂げた羽根は３本の指ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶを含む。この図は更に、一つの肢芽から他の四肢の前縁へのＺＰＡの移植の結果を示す。ここでは成熟した四肢は６本の指ＩＶ、ＩＩＩ、ＩＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶを正常パターンの鏡像重複として含む。両パネルにおける大きな矢印は、指の同一性を特定するのに作用するＺＰＡにより産生されるシグナルを表す。
【図９Ａ】および９ＢはゼブラフィッシュＳｈｈおよびドロソフィラｈｈのアミノ酸配列の比較を説明する。図９ＡはゼブラフィッシュＳｈｈ（Ｚ−Ｓｈｈ）とドロソフィラｈｈのアミノ酸配列の整列図である。同一のアミノ酸を縦線で連結させてある。ドットは至適アラインメントのために導入されたギャップを示す。仮想的貫膜／シグナルペプチド配列に下線を施してある（Ｋｙｔｅ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８２）  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １５７：１３３−１４８）。ドロソフィラ遺伝子におけるエキソン境界の位置を矢印で示してある。Ｚ−Ｓｈｈとｈｈとの間で最高の類似性を示す領域はエキソン２と重複している。
【図９Ｂ】Ｚ−Ｓｈｈとドロソフィラｈｈとの概略的比較図である。黒塗り四角部分は、アミノ末端と比較した際の仮想的貫膜／シグナルペプチド配列の位置を示す。配列相同性を、化学的に類似するアミノ酸のアラインメントを評価することにより採点し、そして四角で囲まれた領域内での類似性のパーセンテージを示してある。
【図１０】３つの異なるゼブラフィッシュｈｈ同族体からの予想された部分的アミノ酸配列の整列図である。これらの配列の内の１本がＳｈｈに相当する一方で、他の２本はｈｈ（ａ）およびｈｈ（ｂ）と称される２本の特定されている追加的ｈｈ同族体である。これら３本の部分的同族体中でのアミノ酸の同一性を縦線により示してある。
【図１１】ニワトリヒナおよびマウスのＳｈｈ蛋白質の概略図である。仮想的シグナルペプチドおよびＡｓｎ−結合化グリコシル化部位が示されている。数値はアミノ酸の位置を意味する。
【図１２】ｍｙｃ−標識化Ｓｈｈ構築物の概略図である。ｃ−ｍｙｃエピトープ標識の位置、および蛋白質分解性開裂部位の予想位置が示される。カルボキシ末端標的化構築物のシグナルペプチドの後の黒塗り部位は、ウサギ内で抗血清を作製するのに用いたグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合蛋白質中に含まれる領域を表す。
【図１３】Ｓｈｈプロセシングの概略的ダイアグラムである。シグナルペプチドの開裂（黒塗り四角）、予想されるＡｓｎ残基（Ｎ）でのグリコシル化、および続発性蛋白質分解性開裂が説明されている。クエスチョンマークは蛋白質分解性開裂の正確な部位が未決定であることを示す。炭化水素部分を表す様々な記号は、ゴルジ体中のこの構造の成熟を表す。シグナルペプチド開裂化蛋白質から伸びている破線矢印は、この種の分泌が、ゼノパス（Ｘｅｎｏｐｕｓ）の卵子およびｃｏｓ細胞において見られるＳｈｈの不完全な蛋白質分解性プロセシングのアーティファクトである可能性を示している。
【図１４】四肢の同調成長およびパターン形成についてのモデルの概略的ダイアグラムである。ソニック（Ｓｏｎｉｃ）が中胚葉に直接シグナルを伝達させて、ホックスド（Ｈｏｘｄ）およびＢｍｐ−２遺伝子の発現を誘導するとして提唱されている。これらの中胚葉遺伝子の誘導は、重複ＡＥＲからのコンピテントシグナルを必要とする。このようなシグナルの一つがＦｇｆ−４であるらしい。ＡＥＲにおけるＦｇｆ−４の発現はソニック（Ｓｏｎｉｃ）から中胚葉への間接的シグナル伝達経路を提供するソニック（Ｓｏｎｉｃ）により誘導され得る。ＦＧＦ（複数）もやはりＺＰＡ中のソニック（Ｓｏｎｉｃ）の発現を維持し、このことによりシグナル伝達中枢の相対的な位置を制御する正のフィードバックループが完成される。Ｆｇｆ−４は中胚葉にコンピテントシグナルを提供する一方で、このＦｇｆ−４は更に中胚葉増殖を亢進させもする。従って中胚葉のパターン形成は、その増殖を亢進させる同一シグナルに依存する。このメカニズムは込み入った仕組みにより、四肢のパターン形成と成長とを統合させる。
【図１５Ａ】ドロソフィラおよび脊椎動物の腸のパターン形成の概略的ダイアグラムである。ドロソフィラ中腸（Ａ）のパターン形成の原因となる調節性相互作用を、発現データを基にして、脊椎動物後腸（Ｂ）のパターン形成についてのモデルと比較している。形態学的領域の特徴を左側（ＡおよびＢ）に示し、臓側中胚葉において発現される遺伝子を中央パネルに示し、腸管管腔内胚葉における遺伝子を右側に示す。ＨＯＭ／Ｈｏｘ遺伝子発現ドメインを四角で囲ってある。領域的発現性分泌型遺伝子産物を線により示してある。矢印は活性化相互作用を、縞線は阻害性相互作用を表す。ドロソフィラの腸（Ａ）における調節的相互作用が遺伝子的調査により確立されているが、ｄｐｐとヘッジホッグとの間の関連については例外であり、この関連についてはドロソフィラの成虫原基におけるそれらの相互作用に基づき、ヘッジホッグは内胚葉から中胚葉へのシグナルであるらしく、かつｄｐｐがその中胚葉で発現されることが仮説として提唱されている。
【図１５Ｂ】ドロソフィラおよび脊椎動物の腸のパターン形成の概略的ダイアグラムである。ドロソフィラ中腸（Ａ）のパターン形成の原因となる調節性相互作用を、発現データを基にして、脊椎動物後腸（Ｂ）のパターン形成についてのモデルと比較している。形態学的領域の特徴を左側（ＡおよびＢ）に示し、臓側中胚葉において発現される遺伝子を中央パネルに示し、腸管管腔内胚葉における遺伝子を右側に示す。ＨＯＭ／Ｈｏｘ遺伝子発現ドメインを四角で囲ってある。領域的発現性分泌型遺伝子産物を線により示してある。矢印は活性化相互作用を、縞線は阻害性相互作用を表す。ドロソフィラの腸（Ａ）における調節的相互作用が遺伝子的調査により確立されているが、ｄｐｐとヘッジホッグとの間の関連については例外であり、この関連についてはドロソフィラの成虫原基におけるそれらの相互作用に基づき、ヘッジホッグは内胚葉から中胚葉へのシグナルであるらしく、かつｄｐｐがその中胚葉で発現されることが仮説として提唱されている。
【図１６】マウスゲノム中のＩｈｈ、Ｓｈｈ、およびＤｈｈの染色体の位置の概略的ダイアグラムである。これらの遺伝子座は種間戻し交雑分析によりマッピングされた。戻し交雑動物における遺伝子座およびフランク遺伝子の隔離パターンを全遺伝子座についてタイプ分けし、そして染色体マップの上部に示してある。遺伝子座の個々の対については、より多くの動物でのタイプ分けを実施した。各カラムは、（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ×Ｍ．スプレトゥス（Ｍ．ｓｐｅｒｔｕｓ））Ｆ１親から受け継がれた戻し交雑子孫中に同定される染色体を表す。陰つき四角はＣ５７ＢＬ／６Ｊ対立遺伝子の存在を示し、そして白抜き四角はＭ．スプレトゥス対立遺伝子の存在を示す。各タイプの染色体を受け継ぐ子孫の数が各カラムの下部に列挙されている。連結する遺伝子に関連するＩｈｈ、Ｓｈｈ、およびＤｈｈの位置を示す部分的染色体連鎖マップが示される。組換えＮ２動物の数を、各対の遺伝子座間の染色体マップの左側にタイプ分けしたＮ２動物の総数について示してある。センチモルガン（±１標準誤差）での遺伝子距離として表示される組換え頻度も示されている。各遺伝子座間で組換えが全く検出されない場合には、最高９５％の信頼性限界の組換え距離が括弧内に示されている。遺伝子の順序は対立遺伝子分布パターンを説明するのに必要な組換え現象数を最低限に押さえることにより決定した。ヒト染色体における遺伝子座の位置は、Ｊｏｈｎ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ）のＷｉｌｌｉａｍ．Ｈ．Ｗｅｌｃｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙにより維持されているヒト連鎖情報のコンピューター制御化データベースであるＧＤＢ（ゲノムデータベース（Ｇｅｎｏｍ  Ｄｅｔａ  Ｂａｓｅ））から取得することが可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ（１）】
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【図５Ａ（２）】
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【図５Ａ（３）】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ（１）】
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【図９Ａ（２）】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【配列表】
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