(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効な薬理学的量のパラブロモフェナシル・ブロマイド（ＰＢＰＢ）を含む喘息の予防および／または治療剤。
【請求項２】
投与される患者が、ヒトを含めた動物であることが可能な、請求項１の剤。
【請求項３】
投与されるＰＢＰＢの濃度が０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の間の範囲である、請求項１の剤。
【請求項４】
投与されるＰＢＰＢの濃度が１ｍｇ／ｋｇ体重である、請求項１の剤。
【請求項５】
ＰＢＰＢが１週間にわたり投与される、請求項１の剤。
【請求項６】
ＰＢＰＢに副作用がない、請求項１の剤。
【請求項７】
ＰＢＰＢが、腹膜内、および経口経路からなる群より選ばれる経路により投与される、請求項１の剤。
【請求項８】
ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＩＦＮ−ガンマ、及びＩｇＥから選択される生体分子のレベルを調整する、請求項１の剤。
【請求項９】
ＰＢＰＢがＩＦＮ−ガンマのレベルの維持を助ける、請求項８の剤。
【請求項１０】
ＰＢＰＢがＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−１３レベルの減衰を助ける、請求項８の剤。
【請求項１１】
ＰＢＰＢがＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−１３レベルの増加を防止する、請求項８の剤。
【請求項１２】
ＰＢＰＢが好酸球レベルの減衰を助ける、請求項８の剤。（パーセント減少レベルを無理なく提供する）
【請求項１３】
ＰＢＰＢが好酸球レベルの増加を防止する、請求項８の剤。
【請求項１４】
ＰＢＰＢがＩｇＥレベルの５０％までの減衰を助ける、請求項８の剤。
【請求項１５】
ＰＢＰＢがＩｇＥレベルの増加を防止する、請求項８の剤。
【請求項１６】
ＰＢＰＢが気道狭窄（ＳＧａｗ）の防止を助ける、請求項８の剤。
【請求項１７】
ＰＢＰＢが基礎レベルの気道狭窄（ＳＧａｗ）の９６％までの回復を助ける、請求項１６の剤。
【請求項１８】
ＰＢＰＢが気道の反応性の防止を助ける、請求項８の剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有効な薬理学的量のパラブロモフェナシル・ブロマイド（ＰＢＰＢ）を患者に投与する段階を含む、患者の喘息を予防および／または治療する方法、およびそれを達成するべく生体分子のレベルを調整する方法にも関係する。
【背景技術】
【０００２】
喘息は気道の炎症性障害であり、可逆性の気道閉塞、気道過反応、高い血清ＩｇＥおよび気道における好酸球レベルによって特徴づけられる。この疾病は世界中の何百万人もの人々に影響を及ぼしており、流行病の発生比に達している（クックソン（Ｃｏｏｋｓｏｎ）、１９９９）。
【０００３】
喘息の分子的機構についての理解が増すにつれ、グルココルチコイド、伝達物質拮抗薬、サイトカイン調整薬、ホスホジエステラーゼ−４阻害剤、クロモン化合物、および免疫療法といった、多くの治療選択肢が報告されてきた（バーンズ（Ｂａｒｎｅｓ）、１９９９）。しかしながら、ステロイドはなお喘息の管理のための主力である。ステロイド療法には、骨粗鬆症、肥満、損なわれた損傷治癒、感染リスクの増加、視床下部−下垂体−副腎軸の抑制、筋障害、高血圧などといった多くの副作用があり（スタイテス（ｓｔｉｔｅｓ）ら、１９９７）、その有害な副作用から逃れる手段はない。それゆえ、副作用が非常に低いかまたは無視できるほど小さい非ステロイド性の抗喘息薬が必要である。
【０００４】
ホスホリパーゼＡ２（ＰＬ  Ａ２）は、ロイコトリエンおよびプロスタグランジンといった、喘息を含めた様々な炎症性疾患の病因に関連した種々のアラキドン酸代謝物の産生における鍵酵素である（ボートン（ｂｏｗｔｏｎ）ら、１９９７、チルトン（ｃｈｉｌｔｏｎ）ら、１９９６、ドラゼン（ｄｒａｚｅｎ）ら、１９９９）。ＰＢＰＢは、浮腫および筋毒性を阻止することが見出されている（メロ（ｍｅｌｏ）およびオウンビー（ｏｗｎｂｙ）、１９９９；エバンズ（ｅｖａｎｓ）およびオウンビー、１９９３）。
【０００５】
最近それは、炎症の発現に関係するいくつかの他の段階を阻害することが証明された。チトフ（Ｔｉｔｈｏｆ）および共同研究者らは、ＰＢＰＢがポリ塩化ビニルに誘導される好中球のスーパーオキシド（Ｏ２）放出を阻害することを証明した（チトフら、１９９６）。さらにこの化合物は、種々の炎症性サイトカインの発現に関与する重要な転写因子、ＮＦ−ｋＢのＤＮＡに対する結合活性を阻害することが報告されている（フォン・ピュイジェンブロック（ｖｏｎ  ｐｕｉｊｅｎｂｒｏｃｋ）ら、１９９９）。ＰＢＰＢはまた、ある細菌の内皮細胞への接着を低減することがモルモットの結腸において証明されている（グゥハタクルタ（Ｇｕｈａｔｈａｋｕｒｔａ）ら、１９９９）。ドゥツリ（Ｄｅｔｓｏｕｌｉ）（１９８５）および共同研究者らによるインビトロの研究は、ＰＢＰＢが、血小板活性化因子（ＰＡＦ）または卵白アルブミンによって誘導される肺実質細片の構築を低減することを証明した。このような多くのパラメータ、すなわちｐｌ  α２活性の増加（ボートン（Ｂｏｗｔｏｎ）ら、１９９７；メータ（Ｍｅｈｔａ）ら、１９９０）、ＮＦ−ｋｂのＤＮＡへの結合（バーンズ（Ｂａｒｎｓ）、１９９６）、スーパーオキシド放出（バーンズ、１９９０）および細胞接着（グンデル（Ｇｕｎｄｅｌ）ら、１９９１）が、喘息の病因に関係している。しかしながら、喘息の特徴に対するＰＢＰＢの作用を、ヒトまたは動物モデルのいずれかにおいて証明することが可能な、直接的なインビボの実験は今日に至るまでなかった。本発明の新規性は、アレルゲン誘導性の初期気道反応（ｅａｒ）および後期気道反応（ＬＡＲ）といった、マウスにおいて発生される喘息の固有の特徴の緩和についての、ＰＢＰＢの最初のインビボの証明にある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の主要な目的は、喘息を予防および／または治療する方法を開発することである。
【０００７】
本発明のもう一つの目的は、ヒトを含めた動物において、ＰＢＰＢを用いて喘息を予防および／または治療するための方法を開発することである。
【０００８】
本発明のなおもう一つの目的は、喘息を予防および／または治療するための、ＰＢＰＢの投与計画を決定することである。
【０００９】
本発明のさらにもう一つの目的は、動物において、喘息を予防および／または治療するための、ＰＢＰＢの投与経路を決定することである。
【００１０】
本発明のさらにもう一つの目的は、喘息の予防および／または治療を助けるための、生体分子のレベルを調整する方法を開発することである。
【００１１】
本発明のさらにもう一つの目的は、ＩＦＮ−ガンマのレベルに対するＰＢＰＢの効果を
決定することである。
【００１２】
本発明のさらにもう一つの目的は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−１３のレベルに対するＰＢＰＢの効果を決定することである。
【００１３】
本発明のさらにもう一つの目的は、好酸球レベルに対するＰＢＰＢの効果を決定することである。
【００１４】
本発明のさらにもう一つの目的は、ＩｇＥレベルに対するＰＢＰＢの効果を決定することである。
【００１５】
本発明のさらにもう一つの目的は、気道狭窄（ＳＧａｗ）に対するＰＢＰＢの効果を決定することである。
【００１６】
本発明のさらにもう一つの目的は、気道反応性に対するＰＢＰＢの効果を決定することである。
【００１７】
本発明のもう一つの目的は、喘息症状の発症の予防のためのリード分子（lead molecule）を提供することである。
【００１８】
本発明のなおもう一つの目的は、固有の喘息徴候を緩和することが可能な、治療薬の開発のためのリード分子を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明は、有効な薬理学的量のパラブロモフェナシル・ブロマイド（ＰＢＰＢ）を患者に投与する段階を含む、患者の喘息を予防および／または治療する方法、およびそれを達成するべく生体分子のレベルを調整する方法にも関係する。
【００２０】
したがって、本発明は、有効な薬理学的量のパラブロモフェナシル・ブロマイド（ＰＢＰＢ）を患者に投与する段階を含む、患者の喘息を予防および／または治療する方法、およびそれを達成するべく生体分子のレベルを調整する方法にも関係する。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の主な利点
１．本発明は、ＰＢＰＢが動物モデルにおいて発症された喘息の固有の特徴を阻害し、かつ喘息治療薬のための有効な薬剤の開発に使用されることが可能であることの、最初の証明である。
２．ＰＢＰＢは非ステロイド性であり、既存の治療用ステロイドより副作用が少ない。
３．この化合物は値段が高くはなく、入手しやすい。
４．ＰＢＰＢの用途は抗喘息薬のみに限定されず、ＩｇＥの上昇、ＩＬ−４、ＩＬ−５、および好酸球レベルの減少が重要な役割を果たしている他の炎症性の症状に対してでもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明の一つの態様においては、患者において喘息を予防および／または治療する方法は、有効な薬理学的量のパラブロモフェナシル・ブロマイド（ＰＢＰＢ）を患者に投与する段階を含む。
【００２３】
本発明のもう一つの態様においては、患者はヒトを含めた動物であることが可能である。
【００２４】
本発明のなおもう一つの態様においては、ＰＢＰＢの濃度は０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の間の範囲である。
【００２５】
本発明のさらにもう一つの態様においては、ＰＢＰＢの濃度は約１ｍｇ／ｋｇ体重である。
【００２６】
本発明のさらにもう一つの態様においては、ＰＢＰＢは約１週間にわたり投与される。
【００２７】
本発明のさらにもう一つの態様においては、ＰＢＰＢは副作用がない。
【００２８】
本発明のさらにもう一つの態様においては、ＰＢＰＢは、腹膜内、および経口経路からなる群より選ばれる経路により投与される。
【００２９】
本発明のもう一つの態様においては、喘息の予防および／または治療を助けるための生体分子のレベルを調整する方法は、有効な薬理学的量のパラブロモフェナシル・ブロマイド（ＰＢＰＢ）を患者に投与すること、および生体分子のレベルにおける変動を測定することの段階を含む。
【００３０】
本発明のさらにもう一つの態様においては、ＰＢＰＢはＩＦＮ−ガンマのレベルの維持を助ける。
【００３１】
本発明のさらにもう一つの態様においては、ＰＢＰＢはＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−１３レベルの減衰を助ける。
【００３２】
本発明のさらにもう一つの態様においては、ＰＢＰＢはＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−１３レベルの増加を防止する。
【００３３】
本発明のさらにもう一つの態様においては、ＰＢＰＢは好酸球レベルの減衰を助ける。
【００３４】
本発明のさらにもう一つの態様においては、ＰＢＰＢは好酸球レベルの増加を防止する。
【００３５】
本発明のさらにもう一つの態様においては、ＰＢＰＢはＩＧＥレベルの約５０％までの減衰を助ける。
【００３６】
本発明のさらにもう一つの態様においては、ＰＢＰＢはＩＧＥレベルの増加を防止する。
【００３７】
本発明のさらにもう一つの態様においては、ＰＢＰＢは気道狭窄（ＳＧａｗ）の防止を助ける。
【００３８】
本発明のさらにもう一つの態様においては、ＰＢＰＢはベースレベルの気道狭窄（ＳＧａｗ）の約９６％までの回復を助ける。
【００３９】
本発明のさらにもう一つの態様においては、ＰＢＰＢは気道の反応性の防止を助ける。
【００４０】
本発明のさらにもう一つの態様においては、ＰＢＰＢは気道の反応性の防止を助ける。
【００４１】
本発明のもう一つの態様においては、既存の抗喘息薬、特にステロイドは多くの副作用を有する。非ステロイド性の抗喘息薬を開発することが強く必要とされている。この状況において、非ステロイド性の抗炎症性化合物、パラブロモフェナシルブロマイド（ＰＢＰＢ）が、その抗喘息活性についてマウスの喘息モデルを用いて検査された。感作化の間のマウスへの薬理学的に有効な用量のＰＢＰＢの投与は、双方の喘息の特徴（ｅａｒおよびｌａｒ）の発症を防止した。この研究結果は、喘息の発症に対するＰＢＰＢの予防効果を示した。本発明はまた、ＰＢＰＢが、すでに損なわれた気道の特徴を示している動物に対して投与された時、既存の損なわれた特徴を緩和することを示した。ＰＢＰＢはＩＦＮ−ｙレベルを保持することが判明しており、気管支肺胞洗浄液（ｂａｌ）中のＩＬ−４、ＩＬ−５、および好酸球レベルを減衰させた。血清試料中のアレルゲンに特異的なＩｇＥのレベルもまた有意に低減されていた。
【００４２】
本発明のもう一つの態様においては、したがって本発明は、パラブロモフェナシル・ブロマイドの抗喘息薬としての新規な用途、および、
ａ．抗ＩｇＥｎｉｃタンパク質により動物を感作化して固有の喘息の特徴を誘導すること、
ｂ．動物の感作化の前、間、および後に、喘息の特徴を推定すること、
ｃ．薬理学的に有効な濃度のＰＢＰＢ溶液を、感作化の間、および後に、健康な動物に投与すること、および
ｄ．段階（ｂ）および（ｃ）の後犠牲にされた動物の免疫学的特徴を測定することを含む使用法に関する。
【００４３】
本発明のもう一つの態様においては、使用される動物モデルはｂａｌｂ／ｃマウス、ウサギ、およびモルモットから選ばれてよい。
【００４４】
本発明のもう一つの態様においては、動物を感作化するためのタンパク質は腹腔内注射またはエアロゾル吸入経路により投与されてよい。
【００４５】
本発明のなおもう一つの態様においては、感作化に用いられる生理食塩水中のタンパク質溶液は、注射あたり１０〜１００ｎｇか、生理食塩水中のエアロゾルによる吸入用には１〜５％の範囲の濃度において、卵白アルブミン、ウシ血清アルブミン、または任意の他の抗ＩｇＥｎｉｃタンパク質から選ばれてよい。
【００４６】
本発明のさらにもう一つの態様においては、ＰＢＰＢは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の濃度範囲において、経口的に動物へ投与されてよい。
【００４７】
本発明のなおもう一つの態様においては、喘息の特徴は、特異的気道コンダクタンスまたは特異的気道抵抗を測定する既知の方法により推定されてよい。
【００４８】
本発明のさらにもう一つの態様においては、免疫学的特徴は、既知の方法によってＩｇＥ、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−４、ＩＬ−５、および好酸球のレベルを推定することにより測定されてよい。
【００４９】
本発明のもう一つの態様においては、喘息は世界中の何百万もの人々に影響を及ぼしている気道の炎症性疾患である。この疾患は流行病の発生比に達しており［クックソン、１９９９］、若者達はますます非生産性にされつつある。喘息は気道閉塞、気道過反応、血清中の高いＩｇＥレベル、および気道中の好酸球によって特徴づけられる。この疾病の発症は、ｔｈ２細胞により分泌される前炎症性サイトカイン、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、およびＩＬ−５によって仲介される。一方、ｔｈ１細胞により分泌されるサイトカイン、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−ｙ）は、ｔｈ２サイトカインを阻害する。喘息反応は、初期−および後期相反応に分けられてよい。初期相はアレルゲンに対する２回目の暴露の直後に始まり、ヒスタミンおよび他の生理活性脂質によって仲介され、それらは結果として炎症および気道狭窄を生じる。後期相反応は８〜２４時間後に起こり、結果として気胞における炎症性細胞、すなわち好酸球、好中球などの浸潤を生じる。これらの細胞は中毒性の顆粒タンパク質を放出し、それは上皮を傷つけ、また脂質を含めた種々の仲介物を産生する（反応は、初期−および後期相反応に分けられてよい。初期相はアレルゲンに対する２回目の暴露の直後に始まり、ヒスタミンおよび他の生理活性脂質によって仲介され、それらは結果として炎症および気道狭窄を生じる。後期相反応は８〜２４時間後に起こり、結果として気胞における炎症性細胞、すなわち好酸球、好中球などの浸潤を生じる。これらの細胞は中毒性の顆粒タンパク質を放出し、それは上皮を傷つけ、また生理活性脂質を含めた種々の仲介物を産生する。）（バーンズら、１９９８）。
【００５０】
本発明のもう一つの態様においては、喘息の分子機構について理解が増すにつれ、多くの治療選択肢が報告されてきた（バーンズ、１９９９）。しかしながら、４０年を超えるステロイドの使用の後、これまでに代替品はなく、ベータ２−アドレナリン受容体拮抗薬とともに、ステロイドはなお喘息の管理のための主要な薬剤である。その副作用から逃れ得る手段はない。それゆえ、副作用が非常に低いかまたは無視できるほど小さい非ステロイド性の抗喘息薬に関する研究が必要である。
【００５１】
本発明のもう一つの態様においては、この状況において、ＰＢＰＢがマウス喘息モデルについて検査された。マウスはｏｖａの腹腔内およびエアロゾル吸入により感作化され、アレルゲン誘導性の初期気道反応（ｅａｒ）および後期気道反応（ｌａｒ）のような、固有の喘息の特徴を発症した。これらの喘息の特徴は、非侵襲性の技術、デュアルチャンバー全身プレチスモグラフ法により、特異的気道コンダクタンス（ＳＧａｗ）によって気道内径を測定することにより特徴づけられた。マウスにおける固有の特徴（初期および後期の）の発生の後、化合物ＰＢＰＢが全感作化期間を通じて経口的に与えられ、喘息の特徴の発生に対する予防効果が検査された。喘息の特徴に対するＰＢＰＢの治療効果を調べるためには、それは感作化の後１週間にわたってマウスに与えられ、その喘息の特徴が確認された。
【００５２】
本発明のもう一つの態様においては、無傷の意識のあるマウスにおいて、化合物の予防ならびに治療値を検査した後、血液および気管支肺胞洗浄（ｂａｌ）液の収集のためマウスは犠牲にされ、ＩｇＥ、サイトカインＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＦＮ−ｙ、およびホモファイル（ｈｏｍｏｐｈｉｌｅ）のレベルが測定された。卵白アルブミンに特異的なＩｇＥレベル（ｍ）血清およびＢＡＬ液中のＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＦＮ−ｙのレベルは、エライサ（Ｅｌｉｓａ）キットにより測定された。好酸球の広まりは、フローサイトメトリーにより、ＢＡＬ液中で測定された。
【００５３】
本発明のもう一つの態様においては、本発明は、動物における喘息固有の特徴の発症の予防に有効な化合物を提供する。たとえば、感作化の間、経口的にＰＢＰＢで処理されたマウスでは、気道狭窄および気道反応性の予防があった。
【００５４】
本発明のもう一つの態様においては、本発明はまたＰＢＰＢが感作化の後、すなわち気道の過剰反応性の発症の後にマウスに与えられた場合に有効であることも証明している。気道過剰反応の動物に対し、１週間にわたって経口的に投与されたＰＢＰＢは、アレルゲン誘導性の気道狭窄および、メタコリンに対する過剰反応性の双方を阻害した。このことは、この化合物の治療ポテンシャルを示した。
【００５５】
本発明のもう一つの態様においては、本発明はまた、低減された血清ＩｇＥレベルがそれを示すように、ＰＢＰＢが感作化を低減させ、またＢＡＬ液中のＩＦＮ−ｙレベルを保持したことも示した。
【００５６】
本発明のもう一つの態様においては、感作化の間、ならびに感作化の後の双方の、マウスへのＰＢＰＢの投与が、ＢＡＬ液中の好酸球の広まりを有意に低減した。この結果は、ＰＢＰＢがその薬理学的に有効な用量を投与することにより、炎症を抑制することを示唆している。有効量は、１ｍｇ／ｋｇ体重であることが判明した。
【００５７】
本発明は、動物モデルにおけるアレルゲン誘導性の初期気道反応（ｅａｒ）および後期気道反応（ｌａｒ）のような固有の喘息の特徴の発症を、前記動物に薬理学的有効量を投与することによって予防する、有効な薬剤、パラブロモフェナシル・ブロマイド（ＰＢＰＢ）を提供する。本発明はまたＰＢＰＢが、その薬理学的有効量を感作化の後に与えることにより、すでに発症したｅａｒおよびｌａｒを前記動物において弱めることも提供する。このことは、この化合物の治療効果を示した。本発明はまたＰＢＰＢが、ある免疫学的パラメータ、すなわち、喘息に関連する好酸球、ＩｇＥ、ＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＦＮ−ｙの変化を弱めることも証明する。したがって、ＰＢＰＢは非ステロイド性化合物であり、抗喘息薬の開発におけるリード分子として使用されることが可能である。
【００５８】
本発明は、パラブロモフェナシル・ブロマイドの抗喘息薬としての新規な用途に関する。パラブロモフェナシル・ブロマイド（ＰＢＰＢ）は、本文において、臨床喘息の治療のための抗喘息薬開発のリード分子としての可能性をもつことが示された。
【００５９】
以下の実施例は、本発明の様々な態様を例証する目的で示されており、どのような方法であれ本発明を制限することを意味するものではない。
【実施例】
【００６０】
実施例１
動物の感作化：
ＢＡＬＢ／ｃマウス、雄、８〜１０週齢、体重１８〜２２グラムは、研究室条件下に１週間慣された。マウスは、０、７、および１４日目に、２ｍｇの水酸化アルミニウムゲル上に吸着された１０マイクログラムの卵白アルブミン（ｏｖａ）（シグマ、米国）を含有する０．２ｍｌの食塩水を腔内に注射することにより、続いて１９から２３日目までの連続した５日間にわたる、２％ｏｖａ（生理食塩水中ｗ／ｖ）を用いた１日３０分間のエアロゾル吸入により感作化された。エアロゾルの誘発は、マウスをプレキシグラス（Ｐｌｅｘｉｇｌａｓ）チャンバー（２０ｘ１０ｃｍ３）内に置くことにより行なわれ、ｏｖａまたは食塩水のみは、ネブライザー（デビルビス（ｄｅｖｉｌｂｉｓｓ）、モデル６４５、米国）を用いて、７リットル／分の空気流速度でエアロゾル化された。  偽感作化マウスは、０、７、および１４日目に２ｍｇのａｌ（ｏｈ）３のみを含有する０．２ｍｌの食塩水を、その後、連続した５日間の、ｏｖａなしの食塩水のエアロゾルの吸入を受けた。
【００６１】
実施例２
ＰＢＰＢを用いたマウスの治療
化合物ＰＢＰＢ（シグマ、米国）は、無水アルコール中に溶解された（１０ｍｇ／ｍｌ）。ＰＢＰＢ（体積で２０μｌ）は、経口的に各マウスへ与えられた。感作化および損なわれた気道感受性の発症に対するＰＢＰＢの効果（予防効果、図１ａ）を評価するため、５群（各６匹のマウス）のマウスが使用された。一つの群は偽感作化された対照であり、もう一つの群は感作化された対照として維持された。残りの３群は、三つの異なる濃度のＰＢＰＢ（０．１および１０ｍｇ／ｋｇ体重）が、１日目から始まり感作化の最終日まで、毎日経口的に与えられた。偽感作化された、および感作化された対照マウスは、同じ方法で賦形剤のみ（２０μｌアルコール）が与えられた。すべての動物について、最初の特異的気道コンダクタンスおよび気道反応性の測定は、実験が始まる前に行なわれた。卵白アルブミン誘導性の気道狭窄および気道反応性は、感作化プロトコールが終了した後に測定された。測定は、以下に記述されたように行なわれた（実施例３、４、および５）。
【００６２】
感作化されたマウスに対するＰＢＰＢの治療効果をしらべるため（治療効果、図１ｂ）、マウスはＰＢＰＢ処理なしに、前と同様に感作化され、ｏｖａに対する気道狭窄およびメタコリンに対する気道反応性は、以下に記述されたように測定された。ｏｖａのエアロゾル誘発に対し、特異的気道コンダクタンスに少なくとも４０％の落込みを示している動物が、この研究用に選ばれた。感作化されたマウスは、無作為に各群６匹のマウスからなる４群に分けられた。３群のマウスは、各々０．１および１０ｍｇ／ｋｇ体重の用量でＰＢＰＢを含有するべく調整された、２０μｌのアルコール中の異なる濃度のＰＢＰＢが、１週間にわたって毎日与えられた。４番目の群は、２０μｌのアルコールのみを１週間与えられ、感作化された対照として使用された。気道狭窄および気道反応性は、その後再度測定された。
【００６３】
実施例３
気道内径の測定：
気道内径は、特異的気道コンダクタンス（ＳＧａｗ）によって測定された。ＳＧａｗは、気道内径の尺度であり、デュアルチャンバー全身プレスモグラフ（アグラワル（Ａｇｒａｗａｌ）、１９８１）を用いて推定された。デュアルチャンバー全身プレチスモグラフは、本発明者らの研究室において、マウスのサイズを適合させるべく設計された（図２）。収容されたマウスの呼吸に応じたボックスの圧力の変化は、圧力変換器（バリダイン（ｖａｌｉｄｙｎｅ）ｍｐ４５＋２ｃｍｈ２０）および、オシロシコープ、テクトロニックス（Ｔｅｋｔｒｏｎｉｘ）、モデル６１１６、米国）のｘ−チャンネルに接続されたキャリヤ・アンプ（バリダイン・モデルＣＤ１５キャリヤ・デモジュレータ）により測定された。プレチスモグラフの前チャンバーに取付けられたニューモタコグラフは、マウスの鼻孔における空気流を検出するべく使用された。この信号は、同じタイプの変換器および増幅器からなるもう一つのセットにより増幅され、それは次にオシロスコープのｙ−チャンネルに接続され、これら二つのチャンネル（ｘ−ｙ）の、ボックスの圧力対空気流は結合され、オシロスコープ上にループとして表示される。ｘ−ｙループの初期の吸気性のリムの勾配（ｔａｎ０）は、ＳＧａｗをコンピュータで計算するためのデータを提供した。ＳＧａｗは、呼吸中のマウスの呼気から吸気への移行の間の、ボックスの圧力の流れ関連性の変化に対する空気流変化の比であり、
【００６４】
【数１】
0004566750.tif 000002
【００６５】
のような誘導の後に得られる。
【００６６】
動物は、研究の開始時にボディボックスにおいて慣され、ループを記録する時点で個々のマウスは１０分間収容され、基本ループを正確にセットした。勾配の値は、少なくとも三つの類似したループを得たものについて記録された。値を記録するための類似した三つのループの選択に先立ち、いくつかのループが調べられた。ＳＧａｗの値を計算するため、上記の式が使用された（アグラワル、１９８１）。
【００６７】
実施例４
ＰＢＰＢは急性のｏｖａ誘導性の気道狭窄を抑制する：
マウスの気道狭窄は、実施例３に記述されたような、ｏｖａのエアロゾル誘発によるＳＧａｗの落込みによって測定された。感作化により発症される気道狭窄に対するＰＢＰＢの予防効果を研究するためには、マウスはＰＢＰＢ０．１、１、および１０ｍｇ／ｋｇ体重で、感作化期間を通じて処置された。ＳＧａｗのレベルは、ｏｖａのエアロゾル誘発の前および後に、すべての群において測定された（図３）。偽感作化されたマウスは、ｏｖａ誘発の後、そのＳＧａｗのベースレベルにおいて、何ら有意の減少を示さなかった。感作化されたマウスは、ｏｖａ誘発の際、ＳＧａｗレベルのベース値からの４８％の落込みを示した。感作化期間を通じた、異なる用量のＰＢＰＢを用いた動物の経口処置は、感作化されたマウスに比較して、用量依存性の様式で、ｏｖａの誘発に反応したＳＧａｗレベルの落込みを防止した。０．１ｍｇのＰＢＰＢ／ｋｇ体重を処置されたマウスは、わずか１７％のＳＧａｗレベルの落込みを示したのに対し、ｍｇのＰＢＰＢ／ｋｇ体重を受けた動物は、わずか４％のベースレベルからのＳＧａｗの落込みがあったにすぎない。１０ｍｇ／ｋｇ体重までのＰＢＰＢの用量のさらなる増加は、何ら付加的な効果を示さなかった（図３）。
【００６８】
治療効果を研究するため、ＰＢＰＢ（０．１、１、および１０ｍｇ／ｋｇ体重）は、１週間にわたり、すでに感作化された動物に対して経口的に投与された。図４に示されたように、ＳＧａｗの逆戻り（治療効果）が、用量依存性の様式で示された。ｍｇ／ｋｇ体重用量は、正常のベースレベルの８６％までＳＧａｗを回復し、用量１０ｍｇ／ｋｇ体重は、ほぼ（９６％）そのベースのＳＧａｗレベルまでの回復を示した（図４）。
【００６９】
実施例５
ＰＢＰＢはメタコリン（ＭＣｈ）に対する気道反応性を低減する
アセチル−ベータ−メタコリン（シグマ、米国）に対する気道反応性は、最後のｏｖａ吸入誘発から２４時間後に測定された。異なる濃度のメタコリン（３．１、６．２５、１２．５、５０，１００ｍｇ／ｍｌ）のエアロゾルが６０秒間与えられた。ＭＣｈ  ＰＤ３５値は、偽感作化、感作化、およびＰＢＰＢ処置マウスにおいて、感作化の間および後に図５に示されたように測定され、偽感作化された動物では、ｏｖａによる誘発の前後で、ＭＣｈ  ＰＤ３５に何ら変化がなかったのに対し、感作化されたマウスでは、ｏｖａ誘発の２４時間後に、その最初の値に比較して有意なＭＣｈ  ＰＤ３５値の落込み（８６％）があった（ｐ＜０．００５）。これらの感作化されたマウスの気道のＭＣｈ  ＰＤ３５における減少は、ＳＧａｗレベルの落込みによって観察されたような、ＭＣｈに対する気道の増大されたその過剰反応性を明らかに示していた。感作化の間のＰＢＰＢによるマウスの処置は、ベースレベルに向けて、ＭＣｈ  ＰＤ３５値を著しく減衰させた。ＭＣｈ  ＰＤ３５の減衰の度合いは用量依存性であり、その最初のレベルの９３％の回復が、ｍｇ／ｋｇ体重による処置について認められた。用量、１０ｍｇ／ｋｇ体重は、なおさらに良好な応答を示し、その最初のＭＣｈ  ＰＤ３５値のＳＧａｗを増加させた（１１５％）（図５）。さらに、すでに気道の過剰反応性を有している（ＭＣｈ  ＰＤ３５  ５．５±０．０６〜８．７±２．２）感作化された動物が、異なる濃度のＰＢＰＢで経口的に処置された場合、それらのＭＣｈ  ＰＤ３５値もまた、用量依存性の様式で回復された（図６）。値は、用量１ｍｇ／ｋｇ体重で、ベース値の８１％を超えるまで回復され、用量１０ｍｇ／ｋｇ体重は、ベースのＭＣｈ  ＰＤ３５値の９４％の回復を示した。偽感作化されたマウスでは、異なる用量のメタコリンによるエアロゾル誘発は、ＭＣｈ  ｐｄｊ５値において、ｏｖａ誘発後のその最初の値から何らの変化も示さなかった。
【００７０】
実施例６
感作化の間および後のＰＢＰＢ処置は血清ＩｇＥレベルを低減する。
血清ＩｇＥレベルは、Elisaにより全群のマウスにおいて測定された（図７）。ｏｖａに特異的なＩｇＥレベルは、酵素免疫測定法（Elisa）によって測定された。ＩｇＥレベルは、感作化されたマウスでは、偽感作化群（３０±ｎｇ／ｍｌ）に比較して、著しく増加していた（３８４±２２．８ｎｇ／ｍｌ）（図７）。興味深いことに、感作化を受けつつあるマウスに対するＰＢＰＢの経口投与は、血清中のＩｇＥレベルの上昇を用量依存性に防止した。ＰＢＰＢ（１ｍｇ／ｋｇ体重）が与えられたマウスの平均血清ＩｇＥレベルは、感作化された動物のものに比べて有意に（４０％）低かった。しかしながら、１０ｍｇのＰＢＰＢ／ｋｇ体重による処置は、ＩｇＥレベルに何ら付加的な効果を示さなかった。また、すでに感作化されたマウスに対し、ＰＢＰＢ（１ｍｇ／ｋｇ体重）が１週間にわたって与えられた場合、賦形剤で処置された感作化マウスのものに比較して、血清中のＩｇＥレベルに有意な（ｐ＜０．０５）落ち込み（４７％）があった（図７）。
【００７１】
実施例７
ＰＢＰＢはＢＡＬ液中の好酸球を阻害する。
ＢＡＬ液中の好酸球のレベルは、ベドナー（ｂｅｄｎｅｒ）ら（１９９９）により記述された方法を用いて、フローサイトメトリー（ファクスヴァンテージ（ｆａｃｓＶａｎｔａｇｅ）、ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、米国）により検出された。細胞は、サイズに基づきゲートされ、ゲートされた細胞の蛍光（ＦＳＣ対ＦＬ  １）およびパーセントが、セルクエスト（ｃｅｌｌ  ｑｕｅｓｔ）ソフトウェアを用いて測定された。データは、６匹のマウスの平均値として表されている。図８に示されたように、ＢＡＬ液中の好酸球のレベルは、ｏｖａ感作化されたマウスでは偽感作化マウスのものと比較して著しく上昇されていた。感作化の間の経口ＰＢＰＢ処置（１ｍｇ／ｋｇ体重）は、好酸球レベルの上昇を防止した。既に感作化されたマウスでは、ＰＢＰＢ（１ｍｇ／ｋｇ体重）による処置はまた、賦形剤のみで処置された感作化マウスのものと比較して、好酸球レベルを有意に低減した（ｐ＜０．０１）。
【００７２】
実施例８
ＰＢＰＢは、ＢＡＬ液中でＩＦＮ−ガンマを増加させ、ＩＬ−４およびＩＬ−５を減少させる。
サイトカインＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−４、およびＩＬ−５は、酵素免疫測定法（エライサ）キット（ＢＤファーミンジェン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、米国）により、製造業者のプロトコールによって、ＢＡＬ液中で測定された。
【００７３】
【表１】
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【００７４】
マウスはＰＢＰＢ（１ｍｇ／ｋｇ体重）を用いて、感作化の間および後に処置された。ＢＡＬ液中のサイトカインレベルは、感作化およびＰＢＰＢによる処置の後に測定された。データは、平均  １  ＳＥＭ（各群でｎ＝４）として表されている。
＊感作化群とは有意に異なる（ｐ＜０．０５）。
【００７５】
結果は、各試料のｐｇ／ｍｌで示された。結果（表１）は、ＰＢＰＢがサイトカインレベルに影響を及ぼすことを示した。感作化マウスにおいて、ＩＬ−４（１４３．０＋３．０ｐｇ／ｍｌ）およびＩＬ−５（１５８．７＋２２．５）のレベルは、偽感作化マウスのもの（７７．０＋１４．９ｐｇ／ｍｌおよび１０４．８＋１５．２）と比較して増加していた。感作化プロトコールの間および感作化後のＰＢＰＢ処置は、感作化マウスに比較して有意に減少していた（ｐ．０．０５）。一方、ＰＢＰＢはＩＦＮ−ｙを偽感作化マウスのレベルに向けて減衰させた。感作化の間および感作化の後にＰＢＰＢで処置された双方のマウス群において、ＩＦＮ−ｙ対ＩＬ−４の比（各々４．４および１０）には、感作化された対照マウスのもの（１．１）に比較して増加があった。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】ＰＢＰＢの予防および治療双方の効果に関するプロトコールを示している。
【図２】マウスをモデル系として用いた気道内径の測定を示している。
【図３】対照およびＰＢＰＢ処置マウスの双方における、ｏｖａエアロゾル誘発の前後の特異的気道コンダクタンスのレベルにおける変動を示している。
【図４】ｏｖａエアロゾル誘発マウスにおける、ＰＢＰＢの治療高価を反映している、ＳＧａｗの逆戻りを示している。
【図５】対照およびＰＢＰＢ処置マウスの双方における、メタコリン（ＭＣｈ）誘発の前後の特異的気道コンダクタンスのレベルにおける変動を示している。
【図６】メタコリン（ＭＣｈ）誘発マウスにおける、ＰＢＰＢの治療効果を反映しているＳＧａｗの逆戻りを示している。
【図７】血清中のＩｇＥレベルにおけるＰＢＰＢの低減効果を示している。
【図８】ＢＡＬ液中の好酸球におけるＰＢＰＢの阻害効果を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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