(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化合物番号（１）または（２）またはその薬理的に許容し得る塩から選ばれる１種または２種のＰＤＥ４阻害剤を有効成分とし、ＰＤＥ４阻害剤が骨折部位で徐々に放出されるように生体内適合性かつ生体内分解性ポリマーを含む局所投与用の骨折治癒促進用組成物。
【化１】
0004510384.tif 000033
【請求項２】
ＰＤＥ４阻害剤が下記化合物（１）である請求項１記載の組成物。
【化２】
0004510384.tif 000034
【請求項３】
ＰＤＥ４阻害剤が下記化合物（２）である請求項１記載の組成物。
【化３】
0004510384.tif 000035
【請求項４】
生体内適合性かつ生体内分解性ポリマーが水難溶性である請求項１〜３のいずれか１項記載の組成物。
【請求項５】
マイクロスフェア形態である請求項４記載の組成物。
【請求項６】
マイクロスフェアの粒子径が０．１〜１５０μｍである請求項５記載の組成物。
【請求項７】
ＰＤＥ４阻害剤の含量が０．０００１〜８０重量％である請求項６記載の組成物。
【請求項８】
水難溶性の生体内適合性かつ生体内分解性ポリマーがヒドロキシ脂肪酸のポリエステルである請求項４〜７のいずれか１項記載の組成物。
【請求項９】
水難溶性の生体内適合性かつ生体内分解性ポリマーがポリ乳酸、乳酸−グリコール酸共重合体、および２−ヒドロキシ酪酸−グリコール酸共重合体から選ばれる１種または２種以上である請求項８記載の組成物。
【請求項１０】
水難溶性の生体内適合性かつ生体内分解性ポリマーが平均分子量２０００〜８０００００を有する請求項８または９記載の組成物。
【請求項１１】
分散剤を含有する水溶液に、マイクロスフェアを０．０００１〜１０００ｍｇ／ｍｌとなるように懸濁したマイクロスフェア含有注射剤である請求項１０記載の組成物。
【請求項１２】
下記化合物番号（１）または（２）から選ばれる化合物またはその薬理的に許容しうる塩から選ばれる１種または２種のＰＤＥ４阻害剤を有効成分とする骨折治癒促進用組成物。
【化４】
0004510384.tif 000036
【請求項１３】
局所投与用である請求項１２記載の組成物。
【請求項１４】
ＰＤＥ４阻害剤が下記化合物（１）である請求項１２または１３記載の組成物。
【化５】
0004510384.tif 000037
【請求項１５】
ＰＤＥ４阻害剤が下記化合物（２）である請求項１２または１３記載の組成物。
【化６】
0004510384.tif 000038
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、骨折治癒促進用組成物、さらに詳しくは、ＰＤＥ４阻害剤を有効成分とする医薬組成物であって、好ましくは、ＰＤＥ４阻害剤と生体内適合性かつ生体内分解性ポリマーとを含有し、特にマイクロスフェア製剤の形態にして、さらに好ましくはマイクロスフェア含有注射剤として、局所的に適用して骨折の治癒を促進することができる医薬組成物を提供するものである。
背景技術
骨折は骨組織の生理的連続性が部分的或いは完全に断たれた状態をいい、その発生機転により、（ａ）外力による骨折、（ｂ）病的骨折、（ｃ）疲労骨折に分類することができる。また、骨折の状態は骨折線（骨離断により生じた裂隙と接する骨端をたどった線）により、亀裂骨折、若木骨折、横骨折、斜骨折、螺旋骨折、分節骨折、粉砕骨折、剥離骨折、圧迫骨折、陥没骨折等に分類されている（医学大辞典１８版第７１９〜７２０頁、南山堂発行）。
一般に、骨折の治癒には相当の期間を要し、治癒する迄の間、日常生活に支障をきたすこととなる。また、高齢化に伴い、病的骨折の１つである骨粗鬆症患者の骨折が著しく増大している。特に、大腿骨頚部の骨折は長期の入院が必要となり、長期入院による痴呆等を含む内科的合併症を発症する危険性が高く、大きな社会問題、経済的重要問題となりつつある。
骨折の治癒過程は、大きく次の３期に分類されており（骨折治療学、２０００年４月南江堂発行第２９〜３７頁および第４６〜５１頁）、骨折治癒において重要な修復期においては、骨形成および骨溶解（骨吸収）を繰り返す骨のリモデリングとは異なるメカニズムで治癒が進行すると考えられている。
（１）骨周囲の組織が損傷され、骨折間隙が血腫によって占拠された状態となり、骨折部位で炎症を生じる炎症期
（２）骨折間隙の血腫が除去され、肉芽組織となり、軟仮骨が形成され、これが骨形成機序によって、次第に硬仮骨に置き換わっていく過程（内軟骨骨化）と骨膜に存在する骨形成細胞により新生骨が形成される過程（線維性骨化）が並行して進行する修復期
（３）形成された新生骨が、長期間にわたって骨吸収と骨形成とが繰り返されて、変形が矯正され、骨欠陥部が補強される再造形期
また、再造形期においては、新生骨が形成されており、ある程度の強度を有するため、日常生活に支障をきたすことは少ないが、修復期は相当の期間を要すると共に、日常生活への制約が大きいため、この期間を短縮することが臨床的には重要である。
従来、骨折治癒を促進する物質として、骨形成蛋白（ＢＭＰ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）等のペプチド性生理活性物質が知られており［プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ユー・エス・エイ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、第８７巻、第２２２０〜２２２４頁（１９８９年）］、また、特開平９−２６３５４５号には、特開平４−３６４１７９号記載の次式化合物を骨形成促進剤として使用し、これを乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）でマイクロカプセル化した局所投与用製剤が開示されている。
0004510384.tif 000002
また、ボーン（Ｂｏｎｅ）第２７巻、第６号、第８１１〜８１７頁（２０００年）には、ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）阻害剤が細胞内のサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）のレベルを上昇させることにより、骨量（ｂｏｎｅ  ｍａｓｓ）を向上させる可能性が検討され、一般的ＰＤＥ阻害剤であるペントキシフィリン、選択的ＰＤＥ４阻害剤であるロリプラムを、毎日、マウスに皮下注射することにより、背骨、大腿骨の骨密度上昇、骨皮質の肥厚が見られたことが記載されている。
しかしながら、上記研究では、あくまで、骨折以外の部位すなわちリモデリング過程での通常の骨形成部分における薬理作用について検討されているにすぎず、ＰＤＥ４阻害剤の骨折治癒促進作用については全く記載されていない。
発明の開示
本発明は、骨折の早期治癒を促す、骨折治癒促進用の新しい医薬組成物を提供することを目的とする。本発明の他の目的は、骨折部位に局所的に適用することにより、薬効成分の全身的な作用の発現を抑え、所望の部位における骨折の治癒促進作用のみを効率よく発現し得る局所用組成物を提供することである。本発明のさらに他の目的は、局所に投与することにより薬効成分が徐々に放出され、１回の投与で長時間薬効を発揮し得る骨折治癒促進用徐放性デポ製剤を提供することである。
本発明者らは、各種化合物の薬理作用を研究するうちに、ＰＤＥ４阻害作用を有する化合物が、骨折修復過程に作用することを知り、研究を重ねたところ、該ＰＤＥ４阻害作用を有する化合物が骨折の治癒を促進し得ることを見出し、本発明を完成した。
すわわち、本発明は、ＰＤＥ４阻害剤を有効成分とする骨折治癒促進用組成物を提供するものである。本発明は、特に、骨折部位に局所的に適用するのに適した製剤、特にデポ製剤の、骨折治癒促進用組成物を提供するものである。
発明を実施するための最良の形態
本発明の骨折治癒促進用組成物は、骨折の治癒過程、とりわけ、その修復期において優れた効果を有し、骨折部位における軟仮骨形成、軟仮骨からの硬仮骨へ置き換わる過程である内軟骨骨化を促進して骨折の治癒を促進することができる。
本発明の医薬組成物は、ＰＤＥ４阻害剤を有効成分とし、これに通常の医薬用賦形剤または希釈剤を配合して調製される。好ましい医薬組成物は、ＰＤＥ４阻害剤と生体内適合性かつ生体内分解性ポリマーとを含有する徐放性の局所投与用の組成物である。該局所投与用組成物は、さらに、マイクロスフェア形態とすることが好ましく、そのマイクロスフェアは注射剤の形態とすることもできる。
本発明の医薬組成物において、活性成分として用いられるＰＤＥ４阻害剤としては、ＰＤＥ４阻害活性を有する化合物がすべて含まれ、例えば、特開平５−２２９９８７号、特開平９−５９２５５号、特開平１０−２２６６８５号、欧州公開Ｎｏ．１５８３８０、国際公開Ｎｏ．９４／２５４３７、米国特許Ｎｏ．５２２３５０４、国際公開Ｎｏ．９５／４０４５、欧州公開Ｎｏ．４９７５６４、欧州公開Ｎｏ．５６９４１４、欧州公開Ｎｏ．６２３６０７、欧州公開Ｎｏ．１６３９６５、米国特許Ｎｏ．５６０５９１４、国際公開Ｎｏ．９５／３５２８２、国際公開Ｎｏ．９６／２１５、米国特許Ｎｏ．５８０４５８８、米国特許Ｎｏ．５５５２４３８、国際公開Ｎｏ．９３／９１１８、国際公開Ｎｏ．９６／３１４８５、欧州公開Ｎｏ．４５９５０５、国際公開Ｎｏ．９７／２２５８５、欧州公開Ｎｏ．７３８７１５、国際公開Ｎｏ．９１／１６３１４、国際公開Ｎｏ．９６／２１８、国際公開Ｎｏ．９７／１８２０８、欧州公開Ｎｏ．１５８３８０、国際公開Ｎｏ．９９／５０２７０、欧州公開Ｎｏ．２６０８１７、国際公開Ｎｏ．９８／１１１１３、国際公開Ｎｏ．９４／２２８５２、欧州公開Ｎｏ．４３２８５６、米国特許Ｎｏ．４１９３９２６、国際公開Ｎｏ．９８／１３３４８、国際公開Ｎｏ．９６／６８４３、特表２０００−５０３６７８号（＝国際公開Ｎｏ．９８／１４４３２）、特表２０００−５０２７２４号（＝国際公開Ｎｏ．９８／９９６１）、特表２０００−５１０１０５号（＝国際公開Ｎｏ．９７／４００３２）、特表２０００−５１４８０４号（＝国際公開Ｎｏ．９８／２４４０）、特表２０００−５０２３５０号（＝国際公開Ｎｏ．９７／２３４５７）、特表２０００−５０１７４１号（＝国際公開Ｎｏ．９７／２５８５）等に記載の化合物が挙げられる。
本発明の骨折治癒促進用組成物に適したＰＤＥ４阻害剤は、トレンズ・イン・ファーマコロジカル・サイエンシーズ（Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）１１巻１５０〜１５５頁の記載に従って分類したＰＤＥ１〜５のうち、ＰＤＥ４に対して他のＰＤＥ（ＰＤＥ１〜３および５）に対するよりもより強い阻害作用を有する選択的ＰＤＥ４阻害剤が好ましく、ＰＤＥ４に対する阻害作用が他のＰＤＥに対するよりも１０倍以上強いものが好ましい。より好ましいものは、他のＰＤＥに対するよりも５０倍以上、さらに好ましくは１００倍以上の阻害作用を有するものである。
好ましいＰＤＥ４阻害剤は、アドバンシーズ・イン・サイクリック・ヌクレオチド・リサーチ（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃｙｃｌｉｃ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）１０巻、６９〜９２頁［１９７９年レイベン・プレス（Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ）発行］記載の方法に準じて測定したＰＤＥ４阻害活性のＩＣ５０が０．１〜１０００ｎＭ、好ましくは０．１〜１００ｎＭの化合物である。より好ましくは、ＩＣ５０は１００ｎＭ未満である。
選択的ＰＤＥ４阻害剤の具体例としては、下記構造で示される化合物番号（１）〜（５７）の化合物またはその薬理的に許容し得る塩が挙げられる。
0004510384.tif 000003
0004510384.tif 000004
0004510384.tif 000005
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ＰＤＥ４阻害活性を有する化合物は、化学構造上から、次の（Ａ）〜（Ｄ）に分けることが出来、それらのうちから適宜選択されるが、本発明におけるＰＤＥ４阻害剤としては、（Ａ）および（Ｂ）の化合物が好ましく、（Ａ）の化合物がとりわけ好ましい。
（Ａ）  ナフタレン骨格またはこれに類似する部分構造を有する化合物［例えば、化合物番号（１）、（２）、（３８）、（４７）、（５２）〜（５７）］、
（Ｂ）  ３−シクロペンチルオキシ−４−メトキシフェニル構造またはこれに類似する部分構造を有する化合物［例えば、化合物番号（６）、（９）、（１１）、（１２）、（１４）、（１７）、（１９）、（２０）、（２１）、（２４）、（２５）、（２６）、（２７）、（３３）、（３４）、（３５）、（３９）、（４０）、（４４）、（４９）、（５０）、（５１）］、
（Ｃ）  キサンチン骨格またはこれに類似する部分構造を有する化合物［例えば、化合物番号（５）、（７）、（２８）、（２９）、（３０）、（３１）、（３２）、（３６）、（３７）、（４１）、（４３）、（４６）］、および
（Ｄ）  上記（Ａ）〜（Ｃ）以外の構造を有する化合物［例えば、化合物番号（３）、（４）、（８）、（１０）、（１３）、（１５）、（１６）、（１８）、（２２）、（２３）、（４２）、（４５）、（４８）］
上記（Ａ）の化合物としては、例えば、下記一般式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）で示される化合物およびそれらの薬理的に許容し得る塩を挙げることができる。
0004510384.tif 000014
（式中、Ｒ１およびＲ２は同一または異なって、水素原子、水酸基、シクロ低級アルキルオキシ基、または置換基を有していてもよい低級アルコキシ基を表すか、或いは、互いに末端で結合して低級アルキレンジオキシ基を形成し、Ｒ３は置換基を有していてもよい含窒素複素６員環式基、−ＯＲ４およびＯＲ５は同一または異なって、保護されていてもよい水酸基を表す）（特開平５−２２９９８７号）
0004510384.tif 000015
（式中、Ｒ１’およびＲ２’は同一または異なって水素原子または保護されていてもよい水酸基を表し、Ｒ３’およびＲ４’のいずれか一方が、保護されていてもよい水酸基置換メチル基、他方が水素原子、低級アルキル基または保護されていてもよい水酸基置換メチル基であり、Ｒ５’およびＲ６’は同一または異なって、水素原子、置換されていてもよい低級アルキル基、置換されていてもよいフェニル基または保護されていてもよいアミノ基を表すか、あるいは互いに末端で結合して隣接する窒素原子とともに置換されていてもよい複素環式基を形成している）（特開平９−５９２５５号）
0004510384.tif 000016
（式中、Ａは式：
0004510384.tif 000017
から選ばれるいずれか１つの基［但し、Ｒ１”およびＲ２”は同一または異なって、水素原子または保護されていてもよいヒドロキシ基、Ｒ３１は保護されていてもよいヒドロキシメチル基、Ｒ３２は水素原子、低級アルキル基または保護されていてもよいヒドロキシメチル基、Ｒ３３は置換基を有していてもよい低級アルキル基、Ｒ４１は保護されていてもよいヒドロキシメチル基、Ｒ４２は保護されていてもよいヒドロキシメチル基、点線は二重結合の存在または非存在を表す］を表し、Ｒ５”およびＲ６”は同一または異なって、水素原子または保護されていてもよいアミノ基を表すか、あるいは互いに末端で結合して隣接する窒素原子と共に置換されていてもよい複素環式基を形成している。）（特開平１０−２２６６８５号）
本発明の骨折治癒促進用組成物の有効成分であるＰＤＥ４阻害剤としては、（Ａ）の化合物のうち、ナフタレン骨格またはイソキノリン骨格を有する化合物またはその薬理的に許容し得る塩がとりわけ好ましく、化合物番号（１）および（２）の化合物またはその薬理的に許容し得る塩がとりわけ好ましい。
ＰＤＥ４阻害剤が全身的に作用した場合には、投与量によっては嘔吐や胃酸分泌を引き起こすこともあるため［セルラー・シグナリング（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）９（３−４）２２７〜２３６頁（１９９７年）］、本発明の骨折治癒促進用組成物は骨折部位の近傍に、局所投与され、全身的な薬物の血中濃度を上昇させず、骨折部位での薬物濃度を維持するようにするのが望ましい。また、このような目的を達成するためには、徐放性とするのが望ましく、徐放性とすることにより、投与回数を少なくし、患者負担の軽減を図ることもできる。
本発明の組成物の好ましい形態としては、局所投与で薬物を徐々に放出するデポ剤（例えばペレット製剤、ゲル製剤、マトリックス製剤、マイクロスフェア製剤、生体内適合性かつ生体内分解性ポリマーの水溶液に薬物を添加して徐放化した製剤、投与時には溶液であるが、生体内に投与されることによってゲルを形成するように設計された製剤、一般に整形外科の領域での使用が報告されている種々基剤に封入した製剤等）が挙げられる。
ペレット剤としては、例えば、末端カルボキシル基がアルコールによりエステル化された乳酸−グリコール酸共重合体微粒子と薬物とを圧縮成型して得られる長期徐放性製剤（特開２００１−１８７７４９号）等を挙げることができる。
ゲル製剤としては、例えば、ジャーナル・オブ・コントロールド・リリース（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ）５９（１９９９）７７−８６記載の、ポリエチレングリコールを化学的に結合させたヒアルロン酸と薬物とをリン酸緩衝液に溶解させたゲル製剤等を挙げることができる。
マトリックス製剤としては、例えば、コラーゲンの粒状物質中または繊維膜中に薬物を含浸した製剤、コラーゲンの粒状物質中または繊維膜の調製中に薬物を添加して含有させた製剤（特開平１０−１８２４９９号、特開平６−３０５９８３号）等を挙げることが出来る。
生体内適合性かつ生体内分解性ポリマーの水溶液に薬物を添加して徐放化した製剤としては、例えば、ヒアルロン酸ナトリウムの水溶液に薬物を添加して徐放化した製剤等が考えられる。
投与時には溶液であるが、生体内に投与されることによってゲルを形成するように設計された製剤としては、例えば、ジャーナル・オブ・コントロールド・リリース（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ）３３（１９９５）２３７−２４３記載の、乳酸−グリコール酸共重合体と薬物とをＮ−メチル−２−ピロリドンに溶解させた製剤、同２７（１９９３）１３９−１４７記載の、乳酸−グリコール酸共重合体とポリエチレングリコールとのブロック共重合体等の低温では溶液状態で存在するが、体温ではゲルとなる高分子と薬物を含有する製剤を挙げることができる。
一般に整形外科の領域で報告されている種々の基剤に封入した製剤としては、例えば、基剤（例えば、水難溶性の生体内適合性かつ生体内分解性ポリマー、ポリメチルメタクリレート、ヒドロキシアパタイト、トリカルシウムホスフェート等）と薬物とを混合して製造される製剤［バイオマテリアルズ（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ）２１巻、２４０５−２４１２頁（２０００年）、インターナショナル・ジャーナル・オブ・ファーマシューティクス（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ）２０６巻１−１２頁（２０００年）］を挙げることができる。
骨折治癒に要する期間における投与回数を少なくする上からは、局所投与により、有効量のＰＤＥ４阻害剤を障害を有する骨折部位に徐々に放出するものが好ましい。
デポ剤の内、注射剤の形で局所に投与し易いマイクロスフェアの場合、注射針を通過する粒径であるのが好ましく、粒子径が０．０１〜１５０μｍ、とりわけ０．１〜１００μｍの範囲であるものが疾患部位への刺激を抑制できる点では好ましい。
本発明のＰＤＥ４阻害剤を有効成分とする骨折治癒促進用組成物は、骨折部位の近傍に、局所的に投与することを考えれば、投与量を小さくするのが好ましく、組成物（例えばマイクロスフェア製剤）中のＰＤＥ４阻害剤の量は０．０００１〜８０重量％とするのが好ましく、さらに好ましくは０．００１〜５０重量％、さらに好ましくは０．０１〜５０重量％である。
有効成分としてのＰＤＥ４の投与量は、用いるＰＤＥ４阻害剤の種類、対象の体重、年齢、症状、適用部位等に応じて医師により適宜決定されるが、局所適用の場合、通常、疾患部位あたり１ｎｇ〜１ｇの範囲である。
本発明の骨折治癒促進用組成物は、ＰＤＥ４阻害剤と薬理的に許容される賦形剤または希釈剤とから、常法に従って調製されるが、好ましい組成物は、ＰＤＥ４阻害剤と生体内適合性かつ生体内分解性ポリマーとを配合して調製される。
このうち、水難溶性の生体内適合性かつ生体内分解性ポリマーは、１ｇを溶解するのに、水（２５℃）が１０００ｍｌ以上必要となるような生体内適合性かつ生体内分解性ポリマーであり、具体的には、ヒドロキシ脂肪酸ポリエステルおよびその誘導体（例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリクエン酸、ポリリンゴ酸、ポリ−β−ヒドロキシ酪酸、ε−カプロラクトン開環重合体、乳酸−グリコール酸共重合体、２−ヒドロキシ酪酸−グリコール酸共重合体、ポリ乳酸とポリエチレングリコールとのブロック共重合体、ポリグリコール酸とポリエチレングリコールとのブロック共重合体、乳酸−グリコール酸共重合体とポリエチレングリコールとのブロック共重合体など）、α−シアノアクリル酸アルキルエステルのポリマー（例えば、ポリブチル−２−シアノアクリレートなど）、ポリアルキレンオキサレート（例えば、ポリトリメチレンオキサレート、ポリテトラメチレンオキサレートなど）、ポリオルソエステル、ポリカーボネート（例えば、ポリエチレンカーボネート、ポリエチレンプロピレンカーボネートなど）、ポリオルソカーボネート、ポリアミノ酸（例えば、ポリ−γ−Ｌ−アラニン、ポリ−γ−ベンジル−Ｌ−グルタミン酸、ポリ−γ−メチル−Ｌ−グルタミン酸など）、ヒアルロン酸エステルなどが挙げられ、これらの１種または２種以上を用いることができる。他の使用可能な生体内適合性かつ生体内分解性ポリマーとしては、ヒアルロン酸ナトリウム、コンドロイチン硫酸、コラーゲン、ゼラチン、フィブリン等が挙げられる。
水難溶性の生体内適合性かつ生体内分解性ポリマーのうち、特に好ましいものはヒドロキシ脂肪酸のポリエステルである。それらは平均分子量が２０００〜約８０００００の範囲内、より好ましくは２０００〜約２０００００の範囲内のものが特に好適であり、平均分子量が５０００〜５００００の範囲のものが最も好適である。
また、上記ヒドロキシ脂肪酸のポリエステルのうち、更に好ましいのは、ポリ乳酸、乳酸−グリコール酸共重合体、２−ヒドロキシ酪酸−グリコール酸共重合体である。乳酸−グリコール酸共重合体における乳酸／グリコール酸のモル比は、好ましくは９０／１０〜３０／７０、より好ましくは８０／２０〜４０／６０であり、２−ヒドロキシ酪酸−グリコール酸共重合体における２−ヒドロキシ酪酸／グリコール酸のモル比は、好ましくは９０／１０〜３０／７０、より好ましくは８０／２０〜４０／６０である。
前記ＰＤＥ４阻害剤をデポ剤とするには、その形態に応じて、適宜製剤化することができ、必要に応じて、製剤化に先立ち、予めＰＤＥ４阻害剤を微粒子化してもよい。
ＰＤＥ４阻害剤を微粒子化するには、慣用の微粒子製法を適宜使用することができ、ジェットミル粉砕、ハンマーミル粉砕、回転ボールミル粉砕、振動ボールミル粉砕、ビーズミル粉砕、シェーカーミル粉砕、ロッドミル粉砕、チューブミル粉砕等により、物理的に粉砕する粉砕法や、薬物を一旦溶媒に溶解後、ｐＨ調整、温度変化、溶媒組成の変更等を行って、晶析させ、遠心分離あるいは濾過等の方法で回収するいわゆる晶析法を採用することができる。
本発明の医薬組成物の上記各種製剤を製造するには、ＰＤＥ４阻害剤に合わせて、既知の製法を適宜適用することができる。
例えば、マイクロスフェア製剤を製造するには次の方法が用いられる。また、ＰＤＥ４阻害剤が塩を形成しているために、マイクロスフェアへの取り込み率が悪い場合には、酸または塩基を用いて遊離の形に変換した後、マイクロスフェア化してもよい。
（１）水中乾燥法：
沸点が水より低く水と非混和性である有機溶媒に水難溶性の生体内適合性かつ生体内分解性ポリマーを溶解させた溶液（水難溶性ポリマー溶液）に薬物を含有させ、かくして得られる有機相を水相中に分散してＯ／Ｗ型エマルションを調製後に、該有機溶媒を除去する方法であり、例えば、特公昭５６−１９３２４号、特開昭６３−９１３２５号、特開平８−１５１３２１号、ジャインらの文献（Ｋａｊｅｅｖ  Ｊａｉｎら、″Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｂｙ  Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  Ｐｏｌｙ（Ｅｓｔｅｒ）Ｄｅｖｉｃｅｓ：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ″，Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、２４（８）巻、７０３−７２７頁、１９９８年）、特開昭６０−１００５１６号、特開昭６２−２０１８１６号、特開平９−２２１４１７号、および特開平６−２１１６４８号に記載の方法と同様にして行われる。
（２）相分離法：
水難溶性の生体内適合性かつ生体内分解性ポリマーの有機溶媒溶液に、薬物もしくは薬物水溶液を溶解・分散させ、これに硬化剤を撹拌下徐々に加え、析出固化させる方法であり、例えば特開昭６０−６７４１７号、米国特許第５５０３８５１号、米国特許第５０００８８６号、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．４２（１）巻、１６〜２４頁（１９９６年）および前記ジャインらの文献に記載の方法と同様にして行われる。
（３）噴霧乾燥法：
水難溶性の生体内適合性かつ生体内分解性ポリマーの有機溶媒溶液に、薬物を溶解・分散させるか、または薬物水溶液を分散させ、これをスプレーノズルでスプレードライヤー（噴霧乾燥器）の乾燥室内へ噴霧し、きわめて短時間に噴霧液滴内の有機溶媒を揮発させる方法であり、例えば、特開平１−１５５９４２号、特開平５−１９４２００号、特開平５−７０３６３号、特開平８−１５１３２１号、特開平９−２２１４１７号、米国特許第５９２２２５３号、「Ｓｐｒａｙ  Ｄｒｙｉｎｇ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８４）、ディージィの文献［Ｐａｒｔｉｃｋ  Ｂ．Ｄｅａｓｙ、「Ｍｉｃｒｏｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ」（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８４）］、および前記ジャインらの文献などに記載の方法と同様にして行われる。
（４）溶媒拡散法：
薬物および水難溶解性の生体内適合性かつ生体内分解性ポリマーを溶解させた水混和性有機溶媒の溶液を、保護コロイド剤の水溶液に添加し、攪拌乳化して微粒子を得る方法であり、例えば、特開平５−５８８８２号、特開平９−１１０６７８号、インターナショナル・ジャーナル・オブ・ファーマシューティクス（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ）１８７巻、１４３〜１５２（１９９９）に記載の方法と同様にして行われる。
上記「水中乾燥法」では、有機相の形態によって調製法が異なるが、いずれも常法にしたがって行うことができる。該有機相の形態としては以下のものが含まれる。
（ａ）水難溶性の生体内適合性かつ生体内分解性ポリマー溶液に、薬物が直接溶解もしくは分散されている有機相。これを水相中に分散するとＯ／Ｗ型エマルションとなる（特公昭５６−１９３２４号、特開昭６３−９１３２５号、特開平６−３２７３２号、特開平８−１５１３２１号、特開平６−３２７３２号、前記ジャインらの文献など）。
（ｂ）水難溶性の生体内適合性かつ生体内分解性ポリマー溶液に、薬物水溶液が分散されているＷ／Ｏ型エマルションからなる有機相。そのＷ／Ｏ型エマルションを水相中に分散すると、（Ｗ／Ｏ）／Ｗ型エマルションとなる（特開昭６０−１００５１６号、特開昭６２−２０１８１６号、特開平９−２２１４１７号、前記ジャインらの文献など）。
（ｃ）２種以上の水難溶性の生体内適合性かつ生体内分解性ポリマーを用い、一方のポリマー溶液中に分散されている他方のポリマー溶液中に、薬物が溶解もしくは分散しているＯ／Ｏ型エマルションからなる有機相。そのＯ／Ｏ型エマルションを水相中に分散すると（Ｏ／Ｏ）／Ｗ型エマルションとなる（特開平６−２１１６４８号）。
上記いずれの形態の有機相においても常法により、例えば、断続振盪法、プロペラ型またはタービン型撹拌機を用いる混和法、コロイドミル法、ホモジナイザーを用いる方法、超音波照射法などによって、エマルションを形成させる。
これらの方法において用いられる有機溶媒としては、ハロゲン化炭化水素系溶媒（塩化メチレン、クロロホルム、四塩化炭素、クロロエタン、ジクロロエタン、トリクロロエタンなど）、脂肪酸エステル系溶媒（酢酸エチル、酢酸ブチルなど）、芳香族炭化水素系溶媒（ベンゼン）、脂肪族炭化水素（ｎ−ヘキサン、ｎ−ペンタン、シクロヘキサンなど）、ケトン系溶媒（メチルエチルケトンなど）、エーテル系溶媒（ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、メチルイソブチルエーテルなど）が挙げられる。
上記のエマルションを形成させる際、エマルションを安定化するために乳化剤、例えばアニオン性界面活性剤（オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム等）、非イオン性界面活性剤（ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル［Ｔｗｅｅｎ８０、Ｔｗｅｅｎ６０（日光ケミカルズ製）等］、ポリエチレンヒマシ油誘導体［ＨＣＯ−６０、ＨＣＯ−５０（日光ケミカルズ製）］、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、レシチン、ゼラチン等）を水相に添加してもよい。
また、ＰＤＥ４阻害剤に加えて、他の成分を配合する場合は、上記Ｏ／Ｗ型エマルションを形成する際に、有機溶媒相にそれらを添加するのが好ましい。なお、薬効成分含量の高いマイクロスフェア製剤を得るためには、有機相の調製に際して薬効成分濃度を高くしておく必要があり、この場合、薬効成分の水相への流出を防ぐために、水相中に浸透圧調節剤を添加することもできる（日本特許第２６０８２４５号を参照）。
上記のようにして得られるＯ／Ｗ型エマルションを水中乾燥法に付すことにより、エマルションに含まれる有機溶媒を除去してマイクロスフェアを製造する。
有機溶媒を除去するには、そのエマルション系を加温したり、減圧下に置くか、または気体を吹きつける方法などの慣用の方法が採用され、たとえば、開放系で溶媒を留去する方法（特公昭５６−１９３２４号、特開昭６３−９１３２５号、特開平８−１５１３２１号、特開平６−２１１６４８号）、閉鎖系で溶媒留去する方法（特開平９−２２１４１８号）などが採用され得る。また、多量の外水相を用いて溶媒を抽出・除去する方法（日本特許第２５８２１８６号）によっても行うことができる。
また次の方法も、ＰＤＥ４阻害剤の種類に応じて、適宜適用することができる。
薬物、生体内分解性ポリマーおよび水と混和する前記ポリマーの良溶媒（溶媒Ａ：アセトン、テトラヒドロフラン等）を含む溶液を、溶媒Ａと混和する前記ポリマーの貧溶媒（溶媒Ｂ：水、エタノール等）および溶媒Ａと混和しない前記ポリマーの貧溶媒（溶媒Ｃ：グリセリン等）を含む均一混合液中に添加して乳化することにより、ポリマー溶液が分散相、均一混合液が連続相を形成するエマルションを調製し、分散相から溶媒Ａを除去する方法（国際公開Ｎｏ．０１／８０８３５）。
水より沸点の低い有機溶媒（塩化メチレン、酢酸エチル等）および水難溶性ポリマーを含む有機相が水相に乳化したエマルションから水中乾燥法でマイクロスフェアを製造するにあたり、（１）気体分離膜（浸透気化膜、多孔性膜等）を備えた装置を用い、（２）水中乾燥に付されるエマルションを気体分離膜の一方の側に供給し、（３）気体分離膜の他方の側へエマルションに含まれる有機溶媒を留去する方法（国際公開Ｎｏ．０１／８３５９４）。
さらに、マイクロスフェアを水相中で有機溶媒の沸点以上に加温し（特開２０００−２３９１５２号）、または高融点添加物でマイクロスフェアを覆った後、加温乾燥する（特開平９−２２１４１７号）ことにより、マイクロスフェアに残存する有機溶媒を除去することもできる。
このようにして得られるマイクロスフェアは遠心分離、濾過或いは篩などで回収し、その表面に付着した水相添加物等を洗浄除去し、所望により、マイクロスフェア同士の凝集を防止するために糖あるいは糖アルコール、無機塩等、好ましくは、ラクトース、マンニトール、ソルビトールなどの凝集防止剤を添加した後、凍結乾燥に付す。この際、所望の粒子径のマイクロスフェアを得るために、篩にかけることが好ましく、特にマイクロスフェア製剤を注射剤として用いる場合に、通針性を向上させるために、例えば１５０μｍまたはそれ以下の径で篩過を行うのが好ましい。
「相分離法」によってマイクロスフェアを製造するためには、前記水中乾燥法で用いたものと同様の有機溶媒の他、アセトン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジオキサンなどの両親媒性溶媒を使用することもできる。これらの有機溶媒を用いた水難溶性ポリマーの有機溶媒溶液にＰＤＥ４阻害剤および所望により他の成分、またはそれらの水溶液を加えて溶解または分散させ、有機相を形成させる。この有機相を上記有機溶媒と混和しない溶媒（分散媒）、たとえばシリコンオイル類、流動パラフィン、ゴマ油、大豆油、コーン油、綿実油、ココナッツ油、アマニ油などに撹拌下徐々に添加してＯ／Ｏ型エマルションを形成させる。所望により分散媒には界面活性剤を添加してもよい。このエマルションを冷却して水難溶性ポリマーを固化させる、もしくは加熱して有機相中の溶媒を蒸発させることで水難溶性ポリマーを固化させる。または攪拌下このエマルションに硬化剤、たとえばヘキサン、シクロヘキサン、メチルエチルケトン、オクタメチルシクロテトラシロキサン等を徐々に添加する、もしくは硬化剤にエマルションを徐々に添加することによって、水難溶性ポリマーを析出させることでマイクロスフェアを形成させる。
このようにして形成されたマイクロスフェアは遠心分離、濾過あるいは篩などで回収し、その表面に付着した溶媒や添加剤をヘキサンや精製水などで洗浄除去し、所望により通風乾燥、減圧乾燥、凍結乾燥などに付す。あるいは前記水中乾燥法の場合と同様に、凝集防止剤などを添加した後、凍結乾燥に付す。
なお、相分離法における内部有機相の形態としては以下のものが含まれる。
（ａ）水難溶性の生体内適合性かつ生体内分解性ポリマー溶液に、薬物が直接溶解もしくは分散されている有機相。
（ｂ）水難溶性の生体内適合性かつ生体内分解性ポリマー溶液に、薬物水溶液が分散されているＷ／Ｏ型エマルションからなる有機相。
（ｃ）２種以上の水難溶性の生体内適合性かつ生体内分解性ポリマーを用い、一方のポリマー溶液中に分散されている他方のポリマー溶液中に、薬物が溶解もしくは分散もしくは薬物溶液が分散しているＯ／Ｏ型エマルションからなる有機相。
また「噴霧乾燥法」によってマイクロスフェアを製造するには、前記相分離法で用いたものと同様の有機溶媒を用い、これに水難溶性の生体内適合性かつ生体内分解性ポリマーを溶かし、その有機溶媒溶液に、ＰＤＥ４阻害剤および所望により他の成分を溶解、分散させるか、またはそれら薬物の水溶液を分散させ、その分散液をスプレーノズルを通して噴霧乾燥器内に噴霧して有機溶媒を揮発させてマイクロスフェアを形成させる。
用いられる噴霧乾燥器は市販の製品、例えばパルビス・ミニ・スプレイ（Ｐｕｌｖｉｓ  Ｍｉｎｉ  Ｓｐｒａｙ）ＧＳ３１（ヤマト製）、ミニスプレードライヤー（柴田科学製）などがいずれも使用され得る。
このようにして得られるマイクロスフェアは水中乾燥法で得られるものと同様に後処理に付されて所望のマイクロスフェア製剤が得られる。
「溶媒拡散法」において、水混和性有機溶媒としてはアセトン、メタノール、エタノール、これらの混合溶媒が挙げることができ、必要に応じて薬物を溶解し得る揮発性溶媒（塩化メチレン、クロロホルム）を加えてもよい。保護コロイド剤としてはポリビニルアルコールを挙げることが出来る。
本発明のＰＤＥ４阻害剤を有効成分とする骨折治癒促進用組成物をマイクロスフェアの形で骨折部位の近傍に投与する場合には、局所的に投与するのが好ましく、局所への注射または埋め込みが好ましい。
マイクロスフェアを注射剤とするには、分散剤を含有する水溶液に本発明で得られるマイクロスフェアを、０．０００１〜１０００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．０００５〜８００ｍｇ／ｍｌ、さらに好ましくは０．００１〜５００ｍｇ／ｍｌの濃度となるように分散して調製することができる。
用いられる分散剤としては、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ８０、Ｔｗｅｅｎ６０（日光ケミカルズ製）など）、ポリエチレンヒマシ油（ＨＣＯ−６０、ＨＣＯ−５０（日光ケミカルズ製）など）等の非イオン界面活性剤、カルボキシメチルセルロースナトリウム等のセルロース系分散剤、アルギン酸ナトリウム、デキストラン、ヒアルロン酸ナトリウムが挙げられる。これらの分散剤は、マイクロスフェアの分散性を向上させ、薬効成分の溶出を安定化させる働きがあり、通常、０．０１〜２重量％、好ましくは０．０５〜１重量％で添加される。
上記注射剤には、適宜、保存剤（メチルパラベン、プロピルパラベン、ベンジルアルコール、クロロブタノール、ソルビン酸、ホウ酸、アミノ酸、ポリエチレングリコール類など）、等張化剤（塩化ナトリウム、グリセリン、ソルビトール、ブドウ糖、マンニトールなど）、ｐＨ調節剤（水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、塩酸、リン酸、クエン酸、シュウ酸、炭酸、酢酸、アルギニン、リジンなど）、緩衝剤（リン酸水素ナトリウム、リン酸水素カリウムなど）が配合される。
注射剤には、更に、必要に応じて、ステロイド系消炎鎮痛剤、非ステロイド系消炎鎮痛剤を溶解・分散してもよい。ステロイド系消炎鎮痛剤としては、例えば、デキサメタゾン、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、ハロプレドン、パラメタゾン、ヒドロコルチゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ベタメタゾン等をあげることができる。また、非ステロイド系消炎鎮痛剤としては、イブプロフェン、ケトプロフェン、インドメタシン、ナプロキセン、ピロキシカム等を挙げることができる。
また、ＰＤＥ４阻害剤を含有するマイクロスフェアの注射剤は、上記懸濁液のほか、用時調製用に、凝集防止剤およびマイクロスフェアを含有する固形製剤と分散剤および注射用蒸留水を組み合わせた注射剤キットとすることもできる。
キットに使用する固形製剤は、凝集防止剤を含む水溶液にマイクロスフェアを懸濁後、凍結乾燥、減圧乾燥、噴霧乾燥等することにより、調製することができ、とりわけ、凍結乾燥で調製するのが好ましい。
固形製剤の製造に際しては、注射用蒸留水への再分散性を向上させるために、凝集防止剤（マンニトール、ソルビトール、ラクトース、ブドウ糖、キシリトール、マルトース、ガラクトース、シュクロース等）を含む水溶液に分散剤を添加することもでき、分散性のよい固形剤とすることもできる。必要に応じて、分散剤と共に、ステロイド系消炎鎮痛剤、非ステロイド系消炎鎮痛剤を組合せた注射用キットとすることも出来る。
本発明のＰＤＥ４阻害剤を有効成分とする骨折治癒促進用組成物は、各種温血哺乳動物、例えば、ヒト、家畜動物（ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ）、愛玩動物（イヌ、ネコ）等に用いることができる。
本発明のＰＤＥ４阻害剤を有効成分とする骨折治癒促進用組成物の適応症としては、（ａ）外力による骨折、（ｂ）病的骨折（骨粗鬆症に伴う骨折、骨軟化症に伴う骨折、悪性腫瘍に伴う骨折、多発性骨髄腫に伴う骨折、先天性骨形成不全に伴う骨折、骨嚢胞症に伴う骨折、化膿性骨髄炎に伴う骨折、大理石病に伴う骨折、栄養障害に伴う骨折）、（ｃ）疲労骨折をあげることができる。また、本発明のＰＤＥ４阻害剤を有効成分とする骨折治癒促進組成物は、亀裂骨折、若木骨折、横骨折、斜骨折、螺旋骨折、分節骨折、粉砕骨折、剥離骨折、圧迫骨折、陥没骨折等の何れにも適用することができる。
［実施例］
つぎに、実験例、実施例および試験例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する。なお、以下の実施例等において用いる化合物番号は前記化学構造式で示した好ましいＰＤＥ４阻害剤の具体例の化合物番号を意味する。
実験例１（正常ラットにおける骨折治癒促進）
（予備飼育）
ＣＤ（ＳＤ）ＩＧＳラット（日本チャールズリバー；雄性；７週齢）を室温（２３±２℃）、湿度（４０〜７０％内で維持）で７日間飼育した。飼育期間中、市販の餌（オリエンタルバイオ製；ＣＥ−２）を自由摂取させた。
（骨折治癒）
エーテル麻酔下で、上記ラットの左下肢部の毛を剃り、７０％水性エタノールで消毒後、ハサミで腓骨を露出させ、爪切り用ハサミ（夏目製作所製；Ｂ−１７）で腓骨を切断した。切断面をピンセットで合わせ、検体投与群（１群：２０匹）には、それぞれ、化合物番号（１）０．１ｍｇまたは０．５ｍｇを含む実施例２−（１）で製造した薬物含有マイクロスフェアを切断部位周辺にスパーテルで置いた後、絹糸で縫合した。一方、検体非投与群（１群：２０匹）には対照例１−（１）で製造した薬物非含有マイクロスフェアを同量ずつ切断部位周辺にスパーテルで置いた後、絹糸で縫合した。何れの群も縫合後、７０％水性エタノールで消毒した。縫合後６週間後に、各群１０匹づつエーテル麻酔下で開腹、放血により安楽死させ、腓骨を摘出した。
（実験結果）
（１）腓骨骨密度および骨塩量の測定
縫合後６週間後に摘出された腓骨を、ＤＸＡ骨密度測定装置（Ａｌｏｋａ製；ＤＣＳ−６００）を用いて骨折部位（走査幅１ｍｍ）の骨密度と骨塩量を測定した。
骨密度および骨塩量の測定結果はそれぞれ表１および表２に示す。
0004510384.tif 000018
0004510384.tif 000019
上記表１および表２に示すとおり、薬物含有マイクロスフェアを投与した群では、薬物量依存的に、骨折部位の骨密度および骨塩量が増加していることが判明した。
（２）腓骨体積測定
縫合後６週間後に摘出された腓骨の体積を、プレシスモメーター（室町機械製；ＴＫ−１０１）を用いて測定した。
骨体積の測定結果は表３に示す。
0004510384.tif 000020
0004510384.tif 000021
上記表３に示すとおり、薬物含有マイクロスフェアを投与した群では、薬物量依存的に、腓骨の骨体積が向上していることが判明した。
（３）腓骨強度測定
縫合後６週間後に摘出された腓骨を、骨強度測定装置（室町機械製；ＴＫ−２５２Ｃ）を用い、３点折曲げ試験により、骨強度の測定を行った。即ち、骨折面から左右４ｍｍずつ離れた２点を支え、骨折面上部から３ｍｍ／分で圧力をかけ被験骨を破断させた。このとき被験骨を破断させるのに要した最大力を破断強度とした。また、被験骨を破断させるまでに費やされた総エネルギーを破断エネルギーとした。
破断エネルギーと破断強度の測定結果をそれぞれ表４および表５に示す。
0004510384.tif 000022
0004510384.tif 000023
上記表４および５に示すとおり、薬物含有マイクロスフェアを投与した群では、薬物量依存的に、骨折部位の骨強度が向上していることが判明した。
実験例２（正常ラットにおける骨折治癒促進）
（予備飼育）
ＣＤ（ＳＤ）ＩＧＳラット（日本チャールズリバー；雄性；７週齢）を室温（２３±２℃）、湿度（５０±２０％）で７日間飼育した。飼育期間中、市販の餌（オリエンタルバイオ製；ＣＥ−２）を自由摂取させた。
（骨折治癒）
エーテル麻酔下で、上記ラットの左下肢部の毛を剃り、７０％水性エタノールで消毒後、ハサミで腓骨を露出させ、爪切り用ハサミ（夏目製作所製；Ｂ−１７）で腓骨を切断した。切断面をピンセットで合わせ、検体投与群（１群：１５匹）には、それぞれ、化合物番号（２）０．００４ｍｇ、０．０２ｍｇ、０．１ｍｇまたは０．５ｍｇを含む実施例７で製造したマイクロスフェアを切断部位周辺にスパーテルで置いた後、絹糸で縫合した。一方、検体非投与群（１群：１５匹）には対照例２で製造した薬物非含有マイクロスフェアを同量ずつ切断部位周辺にスパーテルで置いた後、絹糸で縫合した。何れの群も縫合後、７０％水性エタノールで消毒した。２週間後に各群５匹、４週間後に各群１０匹づつエーテル麻酔下で開腹、放血により安楽死させ、腓骨を摘出した。
（実験結果）
（１）腓骨骨密度および骨塩量の測定
縫合後２週間後に摘出された腓骨を、ＤＸＡ骨密度測定装置（Ａｌｏｋａ製；ＤＣＳ−６００）を用いて骨折部位（走査幅１ｍｍ）の骨密度と骨塩量を測定した。
骨密度および骨塩量の測定結果をそれぞれ表６および表７に示す。
0004510384.tif 000024
0004510384.tif 000025
表６および表７に示すとおり、薬物含有マイクロスフェアを投与した群では、薬物量依存的に、骨折部位の骨密度および骨塩量が増加していることが判明した。
（２）腓骨体積測定
縫合後２週間後に摘出された腓骨の体積を、プレシスモメーター（室町機械製；ＴＫ−１０１）を用いて測定した。その骨体積の測定結果を表８に示すとおりである。
0004510384.tif 000026
表８に示すとおり、薬物含有マイクロスフェアを投与した群では、薬物量依存的に、腓骨の骨体積が向上していることが判明した。
（３）腓骨強度測定
縫合後４週間後に摘出された腓骨を、骨強度測定装置（室町機械製；ＴＫ−２５２Ｃ）を用い、３点折曲げ試験により、骨強度の測定を行った。即ち、骨折面から左右４ｍｍずつ離れた２点を支え、骨折面上部から３ｍｍ／分で圧力をかけ被験骨を破断させた。このとき被験骨を破断させるまでに費やされた総エネルギーを破断エネルギーとした。その破断エネルギーの測定結果を表９に示す。
0004510384.tif 000027
表９に示すとおり、薬物含有マイクロスフェアを投与した群では、薬物量依存的に、骨折部位の骨強度が向上していることが判明した。
実験例３（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験）
（肋軟骨細胞の単離）
ＮＺ系ウサギ（北山ラベス；雄性；４週齢）から肋軟骨を摘出し、ハンク平衡塩溶液（Ｈａｎｋ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ；カルシウムおよびマグネシウムなし；ライフテック社製、以下、ＨＢＳＳ）に浸した。肋軟骨を肋骨と共に１本ずつ切り取り、脂肪および筋肉を取り去った後、肋軟骨の成長軟骨層部分を切り取った。集めた成長軟骨層をメス（フェザー社製）で細かく刻み、ウサギ４羽分を１本の遠心管に集めた。遠心管にエチレンジアミンテトラ酢酸−４ナトリウム塩を０．１％の濃度に溶解したＨＢＳＳ（ｐＨ７．２）４０ｍｌを添加して、成長軟骨層を懸濁し、３７℃で２０分間撹拌した。遠心管を遠心（１５００ｒｐｍ、１０分）した後、上清を吸引除去し、遠心管中の沈殿物にトリプシンを０．２％の濃度に溶解したＨＢＳＳ（ｐＨ７．２）４０ｍｌを加えて懸濁した後、３７℃で１時間撹拌した。遠心管を遠心（１５００ｒｐｍ、１０分）した後、上清を吸引除去し、ＨＢＳＳで２回洗浄した後、１００ｍｌのコラーゲナーゼ（和光純薬製、０３４−１０５３３）を０．１％の濃度に溶解したＨＢＳＳ１００ｍｌに懸濁し、３７℃で３時間撹拌した。遠心管の内容物をセルストレーナー（目開き：４０μｍ）に通し、通過した内容物を遠心管４本に分け入れた。４本の遠心管に、それぞれ、培養液（α−ＭＥＭ、ライフテック製）４０ｍｌを加えて、遠心（１５００ｒｐｍ、１０分）した後、上清を吸引除去し、沈殿物をピペットマンで１本の遠心管に集めた。遠心管に同培養液４０ｍｌを加え、再度、遠心（１５００ｒｐｍ、１０分）した。培養液を加えて遠心することによる洗浄操作を更に３回繰り返し、沈殿物に同培養液を添加して懸濁し、５ｍｌ程度の懸濁液として、細胞数をカウントした。
（肋軟骨細胞の培養）
上記肋軟骨細胞の懸濁液を１ウェル当たりの細胞数が５万個となるように２４ウェルに分注した。翌日、各ウェルの培養液を上記培養液で交換し、分注後５日目の培地交換以降、検体含有培地として、下記表１０に示した試験化合物を添加した培地（ビヒクルとしてジメチルスルホキシドを０．１％含有）でウェルの培養液を交換した。一方、検体非含有培地としては、試験化合物を含有しない（ビヒクルのみ含有）以外は全く同一の培地を用い、検体含有培地と同時期にウェルの培養液を交換した。この際、培養液には、アスコルビン酸リン酸エステルを０．２ｍＭとなるように添加した。アルシアンブルー染色を行なう場合には、培養液交換は分注後５、７、９、１２、１４日目に行い、分注後１６日目にアルシアンブルー染色を行なった。
（軟骨基質産生）
各ウェルの培養液を除いた後、パラホルムアルデヒドを４％の濃度に溶解した中性緩衝液１ｍｌを添加し、室温で３０分間放置することにより、細胞を固定した。その後、リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）１ｍｌで２回洗浄し、軟骨基質（プロテオグリカン）を選択的に着色するアルシアンブルーＢＧＸ（シグマ製；Ａ３１５７）を０．１％の濃度に溶解した０．１Ｍ塩酸をフィルター濾過後、１ｍｌ／ウェルとなるように分注した。各ウェルに６Ｍ塩酸グアニジン水溶液０．５ｍｌを加えてアルシアンブルーを溶解させ、６２０ｎｍの吸光度を測定し、各ウェルの軟骨基質量（プロテオグリカン産生量）を推定し、各試験化合物における、ビヒクルを１００としたプロテオグリカン産生率（％）を算出した。その結果を表１０に示す。
0004510384.tif 000028
0004510384.tif 000029
実験例４（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験）
他の化合物（化合物番号（５２）〜（５５）、対比上化合物番号（２）についても行った）について上記実験例３と全く同様にして軟骨基質（プロテオグリカン）産生量を測定した。その結果を表１１に示す。
0004510384.tif 000030
上記表１０および表１１に示すとおり、試験したＰＤＥ４阻害作用を有する化合物はいずれも軟骨基質（プロテオグリカン）産生促進効果を示し、特に化合物番号（１）、（２）、（５２）および（５３）は著しい基質産生促進作用が認められた。
実験例５（軟骨細胞の石灰化）
前記実験例３において、試験化合物として化合物番号（１）（１０−４Ｍ）を用いた以外、同様にして（肋軟骨細胞の単離）および（肋軟骨細胞の培養）処理を行ってウェルで培養した後、各ウェルの培養液を除き、ついで、ホルムアルデヒドを４％の濃度に溶解した中性緩衝液１ｍｌを添加し、室温で３０分間放置することにより、細胞を固定した。その後、リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）１ｍｌで２回洗浄し、石灰化した部分を選択的に着色する硝酸銀の５％水溶液を分注し、発色まで室温で放置した。各ウェルを蒸留水で洗浄後、５％チオ硫酸ナトリウム水溶液で反応を停止させ、蒸留水で洗浄後に写真撮影を行なった。また、細胞を１ｍｌの１００％エタノールで１時間固定した後、０．１％のアルザリンレッド（シグマ製）を溶解させたエタノール溶液で１時間染色し、さらに１００％エタノールで２回洗浄した後に写真撮影を行なった。
その結果を図１に示す。図１からも明らかなように、ＰＤＥ４阻害剤の化合物番号（１）を添加した培地で培養すると、培養４週目において、明らかに石灰沈着が認められ、カルシウム沈着増加作用を有することが確認された。
実験例６（ウサギにおける欠損橈骨の再生）
（予備飼育）
日本白色ウサギ（雄性；１１週；１群４羽）を室温（２３±２℃）、湿度（５５±１５％）で７日間飼育した。飼育期間中、市販の餌（オリエンタルバイオサービス製；ＬＲＣ４）を自由摂取させた。
（骨折治癒）
ペントバルビタールナトリウム麻酔下で、上記ウサギ右前腕の筋肉から橈骨を剥離し、骨膜をはがして、ボーンカッターで骨幹部を１０ｍｍ切断し、除去した。実施例７−（１）で製造した化合物番号（２）のマイクロスフェア（化合物番号（２）を８μｇまたは４０μｇ含有）をゼラチンカプセル（カプスゲル社製  ５号）に充填の上、対照例２で製造したマイクロスフェアを充填してゼラチンカプセルに充填したマイクロスフェア総量を１５ｍｇとした。ゼラチンカプセルを１個ずつ骨除去部に置き、骨膜をカプセルを覆うように整復し、縫合した。対照群には、対照例で製造したマイクロスフェアを同様にゼラチンカプセルに封入したものを与えた。筋肉、表皮も縫合し、消毒を行った。縫合後６週間後に、ウサギをペントバルビタールナトリウム麻酔下で放血により安楽死させ、右前腕骨を摘出した。
（実験結果）
摘出された右前腕骨について、肩側の骨折線上を近位端とし、近位端から５ｍｍ手首側を遠位端とした。遠位端について、ｐＱＣＴ（ノーランドストラテックス社製；ＸＣＴ−９６０Ａ）を用いて総骨面積（ｍｍ２）、骨強度指標（ＳＳＩ：ｍｍ３）（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｌｃｉｕｍ  ｖｏｌ．１０，３５−４１，２０００）を測定した。
結果を図２に示す。図２から明らかに、本発明のＰＤＥ４阻害剤を含有するマイクロスフェア製剤による処置群では、総骨面積および骨強度指標のいずれに関しても、対照群に比較して向上している。この結果は、ＰＤＥ４阻害剤の有効性を示すものである。
実験例７（糖尿病ラットにおける骨折治癒促進）
（予備飼育）
ＣＤ（ＳＤ）ＩＧＳラット（日本チャールズリバー；雄性；７週齢）を室温（２３±２℃）、湿度（５５±１５％）で７日間飼育した。飼育期間中、市販の餌（オリエンタルバイオサービス製；ＣＲＦ−１）を自由摂取させた。
（糖尿病誘発）
上記ラットに、糖尿病を誘発するストレプトゾトシン（Ｓｉｇｍａ社製）を０．０５Ｍ濃度になるように、クエン酸生理食塩緩衝液（ｐＨ４．５）に溶解した溶液を、ストレプトゾトシンが６０ｍｇ／ｋｇとなるように静脈内注射した。１週間後に尾先より採血し、血糖測定装置（モレキュラーデバイス社製、Ｍ−ＳＰｍａｘ２５０）を用いて、血糖値を測定した。この測定結果を基に、群間の血糖値に有意な差が生じないように群分けを行った。平均血糖値は４２６．１２〜４２８．２３ｍｇ／ｄｌであった。
（骨折治癒）
エーテル麻酔下で、上記ラットの左下肢部の毛を剃り、７０％水性エタノールで消毒後、ハサミで腓骨を露出させ、爪切り用ハサミ（夏目製作所製；Ｂ−１７）で腓骨を切断した。切断面をピンセットで合わせ、検体投与群（１群：１２匹）には、それぞれ、化合物番号（２）０．０３ｍｇまたは０．１ｍｇを含む実施例７−（１）で製造したマイクロスフェアを切断部位周辺にスパーテルで置いた後、絹糸で縫合した。一方、検体非投与群（１群：１２匹）には対照例２で製造した薬物非含有マイクロスフェアを同量ずつ切断部位周辺にスパーテルで置いた後、絹糸で縫合した。何れの群も縫合後、７０％水性エタノールで消毒した。縫合後６週間後に、エーテル麻酔下で開腹、放血により安楽死させ、腓骨を摘出した。
（実験結果）
腓骨塩量の測定
縫合後６週間後に摘出された腓骨のうち、８本をランダムに選び、ＤＸＡ骨密度測定装置（Ａｌｏｋａ製；ＤＣＳ−６００）を用いて骨折部位（走査幅１ｍｍ）の骨塩量を測定した。結果を
に示す。
0004510384.tif 000031
表１２に示すとおり、骨折の治癒が遅れるとされている糖尿病についても、動物モデルにおいて、ＰＤＥ４阻害剤は、濃度依存的に骨塩量増加効果を示した。腓骨強度測定
骨塩量測定に用いた腓骨を、骨強度測定装置（室町機械製；ＴＫ−２５２Ｃ）を用い、３点折曲げ試験により、骨強度の測定を行った。即ち、骨折面から左右４ｍｍずつ離れた２点を支え、骨折面上部から３ｍｍ／分で圧力をかけ、被験骨を破断させた。このとき、被験骨を破断させるのに要した最大力を破断強度とした。また、被験骨を破断させるまでに費やされた総エネルギーを破断エネルギーとした。結果を表１３に示す。
0004510384.tif 000032
表１３に示すとおり、骨折の治癒が遅れるとされている糖尿病についても、動物モデルにおいて、ＰＰＤＥ４阻害剤処置により破断強度および破断エネルギーが増加した。
（Ｘ線写真）
縫合後６週間後に摘出された腓骨４本をマイクロフォーカスＸ線拡大撮影システム（富士写真フイルム製；μＦＸ−１０００）にて撮影した（管電圧：２５ｋＶ；管電流：８０μＡ；２０秒）。
検体非投与群では骨の切断部位の空隙が埋まっていなかったが、いずれの投与量であっても、検体投与群では骨の切断部位の空隙は埋まり、骨の盛り上がりが見られた。
実験例８（ラットにおける骨折部位のｃＡＭＰ量上昇）
（予備飼育）
ＣＤ（ＳＤ）ＩＧＳラット（日本チャールズリバー；雄性；７週齢）を室温（２３±２℃）、湿度（５５±１５％）で７日間飼育した。飼育期間中、市販の餌（オリエンタルバイオサービス製；ＣＲＦ−１）を自由摂取させた。
（骨折治癒）
エーテル麻酔下で、上記ラットの左下肢部の毛を剃り、７０％水性エタノールで消毒後、ハサミで腓骨を露出させ、爪切り用ハサミ（夏目製作所製；Ｂ−１７）で腓骨を切断した。切断面をピンセットで合わせ、検体投与群（１群：６匹）には、それぞれ、化合物番号（２）０．１ｍｇを含む実施例７−（１）で製造したマイクロスフェアを切断部位周辺にスパーテルで置いた後、絹糸で縫合した。一方、検体非投与群（１群：６匹）には対照例２で製造した薬物非含有マイクロスフェアを同量ずつ切断部位周辺にスパーテルで置いた後、絹糸で縫合した。また、対照群（１群：６匹）では切断面をピンセットで合わせ、そのまま、絹糸で縫合した。何れの群も縫合後、７０％水性エタノールで消毒した。縫合後０、３、７、１４、２８、４２日後に、各群１匹ずつエーテル麻酔下で開腹、放血により安楽死させ、腓骨を摘出した。
（ｃＡＭＰ量の測定）
摘出した腓骨の骨折部分を１ｃｍの長さに切断し、液体窒素で凍結保存した。切断によって得られた骨片を−８０℃で粉砕し、粉砕物に６％トリクロロ酢酸３００μｌを添加して懸濁し、超音波攪拌を行った。懸濁液を遠心分離（１２０００ｒｐｍ、１５分）し、上清をエーテル抽出しトリクロロ酢酸を除去した後、７５℃で５分処理することにより、上清からエーテルを除去した。こうして得られた上清のｃＡＭＰ量をｃＡＭＰ  ＥＩＡシステム（Ａｍａｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ製）で測定した。
（実験結果）
ｃＡＭＰ量の測定結果を図３に示す。図３に示すように、ＰＤＥ４阻害剤非投与群（▲）および対照群（○）では、７日目をピークとしたｃＡＭＰ量の穏やかな上昇が認められ、その後漸減した。これに対し、化合物番号（２）投与群（●）では、７日目をピークとした顕著なｃＡＭＰ量の上昇が認められ、その後速やかに対照群のレベルに戻った。このことは、ＰＤＥ４阻害剤により細胞内ｃＡＭＰの分解が抑制され、骨折部位でｃＡＭＰ量が上昇していることを示唆している。
実験例９（糖尿病ラットにおける骨折部位のｃＡＭＰ量上昇）
（予備飼育）
ＣＤ（ＳＤ）ＩＧＳラット（日本チャールズリバー；雄性；８週齢）を室温（２３±２℃）、湿度（５５±１５％）で７日間飼育した。飼育期間中、市販の餌（オリエンタルバイオサービス製；ＣＲＦ−１）を自由摂取させた。
（糖尿病誘発）
上記ラットに、糖尿病を誘発するストレプトゾトシン（ＳＴＺ；Ｓｉｇｍａ社製）を０．０５Ｍ濃度になるように、クエン酸生理食塩緩衝液（ｐＨ４．５）に溶解した溶液を、ストレプトゾトシンが６０ｍｇ／ｋｇとなるように静脈内注射した。１週間後に尾先より採血し、血糖測定装置（モレキュラーデバイス社製、Ｍ−ＳＰｍａｘ２５０）を用いて、血糖値を測定した。この測定結果を基に、群間の血糖値に有意な差が生じないように群分けを行った。各群の平均血糖値は４０４．５〜４１０．００ｍｇ／ｄｌであった。
（骨折治癒）
エーテル麻酔下で、上記糖尿病ラット（５群：各５匹）および無処置ラット（健常ラット、５群：各５匹）の左下肢部の毛を剃り、７０％水性エタノールで消毒後、ハサミで腓骨を露出させ、爪切り用ハサミ（夏目製作所製；Ｂ−１７）で腓骨を切断した。切断面をピンセットで合わせ、絹糸で縫合した。何れの群も縫合後、７０％水性エタノールで消毒した。縫合後０、３、７、１４、２８日後に、糖尿病ラットおよび無処置ラットより１群５匹ずつエーテル麻酔下で開腹、放血により安楽死させ、腓骨を摘出した。
（ｃＡＭＰ量の測定）
摘出した腓骨の骨折部分を１ｃｍの長さに切断し、液体窒素で凍結保存した。切断によって得られた骨片を−８０℃で粉砕し、粉砕物に６％トリクロロ酢酸３００μｌを添加して懸濁し、超音波攪拌を行った。懸濁液を遠心分離（１２０００ｒｐｍ、１５分）し、上清をエーテル抽出してトリクロロ酢酸を除去した後、７５℃で５分処理することにより、上清からエーテルを除去した。こうして得られた上清のｃＡＭＰ量をｃＡＭＰ  ＥＩＡシステム（Ａｍａｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ製）で測定した。
（実験結果）
ＰＤＥ４阻害剤で処置した、ＳＴＺ処置群（糖尿病ラット（○））および無処置群（健常ラット（●））におけるｃＡＭＰ量の測定結果（骨折部分におけるｃＡＭＰ量の経時変化）を図４に示す。
実施例１
（１）化合物番号（１）０．１ｇおよび乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸＝５０／５０；平均分子量２００００；ＰＬＧＡ５０２０：和光純薬製）１．９ｇに塩化メチレン４．０ｇを添加し、３０分間振盪溶解することにより油相（Ｏ）を形成した。
（２）油相を０．５％ポリビニルアルコール（ポバールＰＶＡ−２２０Ｃ：クラレ製）水溶液８ｍｌに加え、ホモジナイザー（Ｐｏｌｙｔｏｒｏｎ：Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ製）を用いて２５℃で５分間乳化することにより、水相に油相が分散した乳化液（Ｏ／Ｗ）を製造した。
（３）この乳化液を精製水１０００ｍｌに添加し、スリーワンモーター（新東科学製）を用いて４００ｒｐｍで攪拌しながら、２５℃で３時間液中乾燥することにより塩化メチレンを除去した。
（４）生成するマイクロスフェア懸濁液から、目開き１５０μｍのフィルターを通して凝集物を除去し、目開き２０μｍのフィルターで吸引ろ過することにより水相を除去した。得られたマイクロスフェアに少量の精製水を添加し、凍結乾燥することにより、マイクロスフェア１．６ｇを得た。
得られたマイクロスフェア１０ｍｇをアセトニトリル３ｍｌに溶解し、０．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液７ｍｌを加えてミキサー（Ｔｏｕｃｈ  ｍｉｘｅｒ  ＭＴ−５１：Ｙａｍａｔｏ製）にて攪拌後、２０００ｒｐｍで５分遠心分離し、上清を分取した。上清の一部をＦＬ−ＨＰＬＣ（カラム；Ｈｙｐｅｒｓｉｌ  ５−ＯＤＳ  直径４ｍｍ、長さ３００ｍｍ：ジーエルサイエンス製、励起波長：３１５ｎｍ、蛍光波長：４６５ｎｍ）にかけ、別途作成した薬物溶液の検量線からこれに含まれる薬物量を測定し、これと上清量とからマイクロスフェア中の薬物含有量を算出した。その結果、薬物の含有量は４．２１％であった。
また、得られたマイクロスフェアをポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ８０：日光ケミカルズ製）の希薄溶液に適量分散させ、粒度分布測定装置ＳＡＬＤ−１１００（島津製）にて粒度分布を測定し、平均粒子径を算出した。その結果、平均粒子径は５７μｍであった。
（５）上記（４）で得られたマイクロスフェアを、カルボキシメチルセルロースナトリウム（ニチリン化学工業製）を０．５％、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ８０：日光ケミカルズ製）を０．１％含む生理食塩水（分散媒）に２．５ｍｇ／ｍｌの薬物割合となるように添加し、ミキサー（Ｔｏｕｃｈ  ｍｉｘｅｒ  ＭＴ−５１：Ｙａｍａｔｏ製）にて、十分攪拌することにより、マイクロスフェア分散液を調製した。
実施例２
（１）乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸＝５０／５０；平均分子量２００００；ＰＬＧＡ５０２０：和光純薬）０．５７ｇと乳酸重合体（平均分子量２００００；ＰＬＡ００２０：和光純薬製）１．３３ｇを混合して用いること以外は、実施例１−（１）〜（４）と同様にして、マイクロスフェア１．６ｇを得た。
実施例１−（４）と同様にしてマイクロスフェア中の薬物含有量および平均粒子径を測定した。その結果、薬物含有量は３．７０％、平均粒子径は４７．７μｍであった。
（２）上記（１）で得られたマイクロスフェアを実施例１−（５）と同様に処理してマイクロスフェア分散液（薬物割合：２．５ｍｇ／ｍｌ）を調製した。
実施例３
（１）乳酸重合体（平均分子量２００００；ＰＬＡ００２０：和光純薬製））を用いること以外は、実施例１−（１）〜（４）と同様にして、マイクロスフェア１．５ｇを得た。
実施例１−（４）と同様にしてマイクロスフェア中の薬物含有量および平均粒子径を測定した。その結果、薬物含有量は３．７３％、平均粒子径は５２．２μｍであった。
（２）上記（１）で得られたマイクロスフェアを実施例１−（５）と同様に処理してマイクロスフェア分散液（薬物割合：２．５ｍｇ／ｍｌ）を調製した。
実施例４
（１）化合物番号（１）０．２ｇおよび乳酸重合体（平均分子量２００００；ＰＬＡ００２０：和光純薬製）０．３ｇに塩化メチレン１．０ｇを添加し、ミキサー（Ｔｏｕｃｈ  ｍｉｘｅｒ  ＭＴ−５１：Ｙａｍａｔｏ製）にて十分攪拌、溶解することにより、油相（Ｏ）を形成した。
（２）油相を０．２５％メチルセルロース（メトローズ：信越化学社製）水溶液４ｍｌに加え、ホモジナイザー（Ｐｏｌｙｔｏｒｏｎ：Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ製）を用いて２５℃で５分間乳化することにより、水相に油相が分散した乳化液（Ｏ／Ｗ）を製造した。
（３）この乳化液を精製水４００ｍｌに添加し、スリーワンモーター（新東科学製）を用いて４００ｒｐｍで攪拌しながら、２５℃で３時間液中乾燥することにより塩化メチレンを除去した。
（４）生成するマイクロスフェア懸濁液から、目開き１５０μｍのフィルターを通して凝集物を除去し、目開き２０μｍのフィルターで吸引ろ過することにより水相を除去した。得られたマイクロスフェアに少量の精製水を添加して凍結乾燥することでマイクロスフェアを得た。実施例１−（４）と同様にしてマイクロスフェア中の薬物含有量および平均粒子径を測定した。その結果、薬物含有量は３９．６％、平均粒子径は３３．４μｍであった。
実施例５
（１）化合物番号（１）０．０５ｇおよび乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸＝５０／５０；平均分子量２００００；Ｒ２０２Ｈ：ベーリンガーインゲルハイム社製）０．４５ｇに塩化メチレン１．０ｇを添加し、ミキサー（Ｔｏｕｃｈ  ｍｉｘｅｒ  ＭＴ−５１：Ｙａｍａｔｏ製）にて十分攪拌、溶解することにより、油相（Ｏ）を形成した。
（２）油相を０．５％ポリビニルアルコール（ゴセノールＥＧ−４０：日本合成化学工業製）水溶液４０ｍｌに加え、ホモジナイザー（Ｐｏｌｙｔｏｒｏｎ：Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ製）を用いて２５℃で４分間乳化することにより、水相に油相が分散した乳化液（Ｏ／Ｗ）を製造した。
（３）この乳化液を予め４００ｍｌの精製水を入れた円筒状密閉容器（内径１１０ｍｍ；内容積１０００ｍｌ）に注ぎ、スリーワンモーター（ＢＬ−６００；ＨＥＩＤＯＮ社製）に装着した直径５０ｍｍの４枚攪拌羽根（プロペラＲ型；ＨＥＩＤＯＮ社製）により２５℃、４００ｒｐｍで攪拌すると同時に、容器内に挿入した円筒型シリコーンゴム製中空糸膜モジュール（永柳工業株式会社製）を用い、中空糸の内側に窒素ガスを通気して容器内から塩化メチレンを除去した。この際の窒素ガス通気速度は２Ｌ／分とした。この操作を１時間行った。
なお、円筒型シリコーンゴム製中空膜糸モジュールとしては、次の仕様を有するＮＡＧＡＳＥＰ  Ｍ６０−１８００円筒型を使用した。
円筒の直径          ：１００ｍｍ
円筒の長さ          ：１２０ｍｍ×１２０ｍｍ
中空糸膜の膜厚      ：６０μｍ
中空糸膜の内径      ：２００μｍ
中空糸膜の外径      ：３２０μｍ
中空糸の本数        ：１８００
中空糸膜の有効膜面積：０．１５ｍ２
（４）生成するマイクロスフェア懸濁液から、目開き１５０μｍのフィルターを通して凝集物を除去し、目開き２０μｍのフィルターで吸引ろ過することにより水相を除去した。得られたマイクロスフェアに少量の精製水を添加して凍結乾燥することでマイクロスフェアを０．２６ｇ得た。実施例１−（４）と同様にしてマイクロスフェア中の薬物含有量および平均粒子径を測定した。その結果、薬物含有量は３．０７％、平均粒子径は７１．７μｍであった。
実施例６
（１）化合物番号（２）０．０５ｇおよび乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸＝５０／５０；平均分子量２００００；ＲＧ５０２Ｈ：ベーリンガーインゲルハイム社製）０．４５ｇに塩化メチレン２．５ｇを添加し、ミキサー（Ｔｏｕｃｈ  ｍｉｘｅｒ  ＭＴ−５１：Ｙａｍａｔｏ製）にて十分攪拌、溶解することにより、油相（Ｏ）を形成した。
（２）油相を０．５％ポリビニルアルコール（ポバールＰＶＡ−２２０Ｃ：クラレ製）水溶液３ｍｌに加え、ホモジナイザー（Ｐｏｌｙｔｏｒｏｎ：Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ製）を用いて２２℃で５分間乳化することにより、水相に油相が分散した乳化液（Ｏ／Ｗ）を製造した。
（３）上記（１）および（２）の操作を５回繰り返し、得られた乳化液（５回分）を併せた上で、精製水１０００ｍｌに添加し、スリーワンモーター（新東科学製）を用いて４００ｒｐｍで攪拌しながら、２５℃で１時間３０分、次いで４０℃で１時間、２５℃で３０分間液中乾燥することにより塩化メチレンを除去した。
（４）生成するマイクロスフェア懸濁液から、目開き１５０μｍのフィルターを通して凝集物を除去し、目開き２０μｍのフィルターで吸引ろ過することにより水相を除去した。得られたマイクロスフェアに少量の精製水を添加して凍結乾燥することでマイクロスフェア２．３ｇを採取した。
得られたマイクロスフェア１０ｍｇをアセトニトリル３ｍｌに溶解し、０．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液６ｍｌを加えてミキサー（Ｔｏｕｃｈ  ｍｉｘｅｒ  ＭＴ−５１：Ｙａｍａｔｏ製）にて攪拌後、２０００ｒｐｍで５分遠心分離し、上清を分取した。上清の一部をＵＶ−ＨＰＬＣ（カラム；Ｈｙｐｅｒｓｉｌ  ５−ＯＤＳ  直径４ｍｍ、長さ３００ｍｍ：ジーエルサイエンス製、測定波長：２４０ｎｍ）にかけ、別途作成した薬物溶液の検量線からこれに含まれる薬物量を測定し、これと上清量とからマイクロスフェア中の薬物含有量を算出した。また、実施例１−（４）と同様にして平均粒子径を測定した。その結果、薬物含有量は９．９％、平均粒子径は２６．４μｍであった。
（５）上記（４）で得られたマイクロスフェアを実施例１−（５）と同様に処理してマイクロスフェア分散液（薬物割合：０．１ｍｇ／ｍｌ）を調製した。
実施例７
（１）乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸＝７５／２５；平均分子量２００００；ＰＬＧＡ７５２０：和光純薬製）を用いること、ならびに塩化メチレンの添加量を２．０ｇとする以外は、実施例６−（１）〜（４）と同様にして、マイクロスフェア２．２ｇを得た。
実施例６−（４）と同様にしてマイクロスフェア中の薬物含有量および平均粒子径を測定した。その結果、薬物含有量は１０．１％、平均粒子径は２７．０μｍであった。
（２）上記（１）で得られたマイクロスフェアを実施例６−（５）と同様に処理してマイクロスフェア分散液（薬物割合：０．１ｍｇ／ｍｌ）を調製した。
対照例１（実施例２の対照）
（１）乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸＝５０／５０；平均分子量２００００；ＰＬＧＡ５０２０：和光純薬）０．６ｇと乳酸重合体（平均分子量２００００）１．４ｇに塩化メチレン４．０ｇを添加し、３０分間振盪溶解することにより油相（Ｏ）を形成する。以下、実施例１−（１）〜（４）と同様にして、薬物を含まないマイクロスフェア１．７ｇを得た。
（２）プラセボ分散液の製造
上記（１）で得られたマイクロスフェアを実施例１−（５）と同様にして、マイクロスフェア分散液を調製した。
対照例２（実施例７の対照）
乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸＝７５／２５；平均分子量２００００；ＰＬＧＡ７５２０：和光純薬製）０．４５ｇに塩化メチレン２．０ｇを添加し、ミキサー（Ｔｏｕｃｈ  ｍｉｘｅｒ  ＭＴ−５１：Ｙａｍａｔｏ製）にて十分攪拌、溶解することにより、油相を形成した。以下、実施例６−（２）〜（４）と同様にして、薬物を含まないマイクロスフェア２．２ｇを得た。
試験例１
試験管にマイクロスフェア１０ｍｇを入れ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ８０含有リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）の１０ｍｌを添加し、３７℃の空気恒温庫中の回転培養機にて２５ｒｐｍで攪拌した。攪拌開始時から一定時間後に、溶出液を遠心分離（２０００ｒｐｍ、５分）し、上清から９ｍｌをサンプリングして、ＦＬ−ＨＰＬＣ（カラム；Ｈｙｐｅｒｓｉｌ  ５−ＯＤＳ  直径４ｍｍ、長さ３００ｍｍ：ジーエルサイエンス製、励起波長：３１５ｎｍ、蛍光波長：４６５ｎｍ）にかけ、別途作成した薬物溶液の検量線からこれに含まれる薬物量を測定し、これとサンプリングの量とから薬物溶出量を算出した。
また、サンプリング後の試験管に、ｐＨ７．４リン酸緩衝液９ｍｌを添加し、同様の条件で攪拌、サンプリングして薬物溶出量を算出する操作を経時的に繰り返した。
最終のサンプリング後、試験管から残りの溶出液を除去し、残存するマイクロスフェア中に含まれる薬物量を実施例１−（４）の方法で測定した。
この操作を実施例１、実施例２ならびに実施例３で得られたマイクロスフェアについて行った。その結果を図５に示す。
なお、溶出した薬物量とマイクロスフェアに残存した薬物量の合計を１００％として、溶出率を算出した。
試験例２
ＳＤ系雄性ラット（７週令、１群３匹、日本ＳＬＣ）を１２時間照明、室温：２３±２℃、自由摂水・摂餌の条件下で１週間の馴化期間後、ポリエチレングリコール４００（和光純薬社製）を１０％含んだ生理食塩水に溶解した化合物番号（１）（１ｍｇ／ｍｌ）を１匹当たり０．５ｍｌ（総薬物投与量：０．５ｍｇ／ラット）の割合で大腿静脈から急速投与した。
薬物投与後、経時的にエーテル麻酔下で頚静脈よりヘパリンを添加した注射筒で血液を採取し遠心分離により血漿を得た。血漿０．１ｍｌに内部標準溶液と１Ｍのリン酸水素２カリウム０．２ｍｌを添加し、クロロホルム７．０ｍｌを添加後、１０分間振とう、５分間遠心分離して５ｍｌの有機相を分取した。採取した有機相を窒素気流下、４０℃で蒸発乾固し、移動相の０．５ｍｌで再溶解後にＦＬ−ＨＰＬＣ（カラム；Ｈｙｐｅｒｓｉｌ  ５−ＯＤＳ  直径４ｍｍ、長さ３００ｍｍ：ジーエルサイエンス製、励起波長：３１５ｎｍ、蛍光波長：４６５ｎｍ）により血漿中濃度を測定した。その結果を図６に示す。
試験例３
ＳＤ系雄性ラット（７週令、１群５匹、日本ＳＬＣ）を１２時間照明、室温：２３±２℃、自由摂水・摂餌の条件下で１週間の馴化期間後、実施例１−（５）、実施例２−（２）、実施例３−（２）で得られたマイクロスフェア分散液を１匹当たり２ｍｌ（総薬物投与量：５ｍｇ／ラット）の割合で背部皮下に投与した。薬物投与後、経時的にエーテル麻酔下で頚静脈よりヘパリンを添加した注射筒で血液を採取し遠心分離により血漿を得た。血漿中の化合物濃度は試験例２と同様の方法で測定した。ＰＤＥ４阻害剤をマイクロスフェア化することにより、ＰＤＥ４阻害剤を１／１０量しか含まない生理食塩水溶液を静脈注射した場合（試験例２）と比べても、ＰＤＥ４阻害剤の最高血漿中濃度を１／２５の１〜１／１００に抑制することができた。その結果を図７に示す。
試験例４
ＳＤ系雄性ラット（７週令、１群５匹、日本ＳＬＣ）を１２時間照明、室温：２３±２℃、自由摂水・摂餌の条件下で１週間の馴化期間後、実施例２−（２）で得られたマイクロスフェア分散液を１匹当たり２ｍｌ（総薬物投与量：５ｍｇ／ラット）の割合で背部皮下に投与した。
薬物投与３、７、１０、１４、２１、３５日後、投与部位よりマイクロスフェアを回収した。回収したマイクロスフェアに内部標準物質を含有したアセトニトリル５ｍｌを添加して、ホモジナイザー（Ｐｏｌｙｔｏｒｏｎ：Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ製）で溶解した。３０００ｒｐｍ、５分間遠心分離後の上清３ｍｌを採取し、０．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液７ｍｌを加えてミキサー（Ｔｏｕｃｈ  ｍｉｘｅｒ  ＭＴ−５１：Ｙａｍａｔｏ製）にて攪拌後、２０００ｒｐｍで５分遠心分離し、上清を分取した。上清の一部をＫＣプレップオムニ１３（片山化学社製）で濾過してＦＬ−ＨＰＬＣ（カラム；Ｈｙｐｅｒｓｉｌ  ５−ＯＤＳ  直径４ｍｍ、長さ３００ｍｍ：ジーエルサイエンス製、励起波長：３１５ｎｍ、蛍光波長：４６５ｎｍ）にかけ、別途作成した薬物溶液の検量線からこれに含まれる薬物量を測定し、これと上清量とからマイクロスフェア中の薬物残存量を算出した。その結果を図８に示す。
試験例５
ＳＤ系雄性ラット（７週令、日本ＳＬＣ）を１２時間照明、室温：２３±２℃、自由摂水・摂餌の条件下で１週間の馴化期間後、実施例６−（５）ならびに７−（２）で得られた化合物番号（２）含有マイクロスフェア分散液を１匹当たり１ｍｌ（総薬物投与量：０．１ｍｇ／ラット）の割合で背部皮下に投与した。
経時的に投与部位よりマイクロスフェアを回収し、アセトニトリル１０ｍｌを添加してホモジナイザー（Ｐｏｌｙｔｏｒｏｎ：Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ製）で溶解した。３０００ｒｐｍ、５分間遠心分離後の上清３ｍｌを採取し、０．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液６ｍｌを加えてミキサー（Ｔｏｕｃｈ  ｍｉｘｅｒ  ＭＴ−５１：Ｙａｍａｔｏ製）にて攪拌後、２０００ｒｐｍで５分遠心分離し、上清を分取した。上清の一部をＫＣプレップオムニ１３（片山化学社製）でろ過してＵＶ−ＨＰＬＣ（カラム；Ｈｙｐｅｒｓｉｌ  ５−ＯＤＳ  直径４ｍｍ、長さ３００ｍｍ：ジーエルサイエンス製、測定波長：２４０ｎｍ）にかけ、別途作成した薬物溶液の検量線からこれに含まれる薬物量を測定し、これと上清量とからマイクロスフェア中の薬物残存量を算出した。その結果を図９に示す。
産業上の利用の可能性
本発明の骨折治癒促進用組成物は、ＰＤＥ４阻害剤を有効成分とし、特に、骨折部位に局所投与することにより、ＰＤＥ４阻害剤の全身作用による副作用を伴うことなく、骨折治癒の修復期における内軟骨骨化を加速することにより、骨折の治癒を促進することができ、近年特に問題になっている高齢者や、糖尿病患者、骨粗鬆症患者における骨折の早期治癒を促し、寝たきりとなるのを防ぎ、安定した日常生活をもたらす効果を発揮する。また、ＰＤＥ４阻害剤と生体内適合性かつ生体内分解性ポリマーを含有する組成物をデポ剤の形とし、特にマイクロスフェアの形態で注射剤として骨折部位に局所的に注射することにより持続的に効果を発揮することができ、さらに優れた効果が得られる。
【図面の簡単な説明】
図１は、ウサギ肋軟骨細胞の培養における化合物番号（１）の軟骨細胞石灰化（カルシウム沈着）作用を示す写真の模写図である。
図２は、ＰＤＥ４阻害剤（化合物番号（２））マイクロスフェアで処置したウサギにおける欠損橈骨の再生状況を示すグラフであり、上側の図は総骨面積（ｍｍ２）、下側の図は骨強度指標（ＳＳＩ：ｍｍ３）と、化合物（２）の投与量との関係を示している。
図３は、ＰＤＥ４阻害剤（化合物番号（２））マイクロスフェアで処置したラット腓骨骨折部位における、ｃＡＭＰ量の経時変化を示すグラフである。
図４は、正常ラットおよびＳＴＺ誘発糖尿病ラットにおける腓骨の骨折部分におけるｃＡＭＰ量の経時変化を示すグラフである。
図５は、実施例１−（４）、実施例２−（１）および実施例３−（１）のマイクロスフェアのインビトロでの溶出特性を示すグラフである。
図６は、化合物番号（１）を静脈内投与した場合の、血漿中濃度の経時変化を示すグラフである。データは平均値±標準偏差（例数：３）で示した。
図７は、実施例１−（５）、実施例２−（２）および実施例３−（２）で得られたマイクロスフェア分散液を皮下注射した場合の血漿中濃度の経時変化を示すグラフである。データは平均値±標準偏差（例数：５）で示した。
図８は、実施例２−（２）で得られたマイクロスフェア分散液を皮下注射した場合の製剤中に残存している化合物番号（１）の経時変化を示すグラフである。データは平均値±標準偏差（例数：５）で示した。
図９は、実施例６−（５）および実施例７−（２）で得られたマイクロスフェア分散液を皮下注射した場合の製剤中に残存している化合物番号（２）の経時変化を示すグラフである。データは平均値±標準偏差（例数：４）で示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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