(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式
【化１】
0004395574.tif 000005
と一般式
【化２】
0004395574.tif 000006
の構成単位から成り、（ａ）／（（ａ）＋（ｂ））（モル比）＞７０％であるキトサンから誘導される酸化キトサン化合物であって、化１及び化２の式中ＣＨ2ＯＨ基のＣＯＯＸ基（但し、ＸはＨ、ＮａまたはＫを表す）への酸化率が１〜１００モル％であり、化１の式中ＮＨ2基のＮＨＣＯＣＨ3基へのアセチル化率が４０〜９５モル％である重量平均分子量が５，０００以上であって、且つｐＨ７、温度２５℃での水に対する溶解度が０．１ｇ／１００ｇ以上である酸化キトサン化合物を含有してなる好中球活性抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は好中球活性抑制剤に関し、特に水溶性酸化キトサン化合物を利用した好中球活性抑制剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体は病原微生物から自己を守るために、感染防御機構を備えている。その機能は大きく自然免疫系と獲得免疫系とに分けられる。病原微生物が侵入すれば、まず自然免疫系が働くが、食細胞即ち、好中球は自然免疫系の一員であり、接着、走化、貪食、殺菌などの一連の機序により病原体、主に細菌を生体から排除する役割をする。接着、走化は血管内を流れている好中球が血管から出て病原体のいるところにたどり着く段階であり、貪食、殺菌は病原体を排除する段階である。
【０００３】
好中球はこのような段階を経て病原体を排除し、本来生体防御に機能して有用な作用を発揮する。
【０００４】
好中球が殺菌を行うとき、好中球は病原微生物に向けて数種類の活性酸素を放出し、これらは極めて強力な殺菌作用を発揮する。しかし、活性酸素が病原微生物以外の周囲に放出されると、組織障害を生じることになる。活性酸素はスーパーオキシドディスムターゼ（以下ＳＯＤと略す）などの抗酸化酵素で除去でき、殺菌作用より過剰であっても少ない量であればＳＯＤにより除去できるが、大量の活性酸素の放出は疾病、発ガン、老化を引き起こす原因となる。このことから好中球の活性化の促進は場合によっては副作用を招来することになる。
【０００５】
そこで、好中球の過剰の活性酸素を除去・抑制する物質が数多く研究され、使用されている。例えば生体内物質としては、ビタミンＣ（アスコルビン酸）、ビタミンE、ユビキノール、カロテノイド類が挙げられる。しかしながらビタミンCは分子量が低く水溶性であり、すぐに体内から排出され効果が持続できない。またビタミンCは過剰摂取した場合吐き気、下痢を起こすことがある。ビタミンE、ユビキノール、カロテノイド類は脂溶性であり細胞部にしか存在できず吸収されにくい。過剰に摂取すると発疹、食欲不振、下痢などの副作用をひきおこすことがあるといわれている。
【０００６】
また抗炎症剤などに用いられる生体外物質としてはサルファ剤、塩酸テトラサイクリン、コルヒチンなどが挙げられる。しかしながら、サルファ剤は、耐性菌ができ、また肝臓障害、腎臓障害が懸念される。塩酸テトラサイクリンは吐き気、食欲不振、下痢、口内炎、肝臓、血液障害を招来することが心配される。またコルヒチンは、腹痛、発疹、発熱、血液障害、末梢神経炎を起こすことがある。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明者らはカニやエビなどの甲殻類、カブトムシやコオロギなどの昆虫類の骨格物質に多く存在するほか、菌類、細胞壁等生体に存在するキチンを原料として製造される酸化キトサン化合物が好中球活性抑制剤として有効に作用することを発見し、かかる知見に基づき本発明を完成したものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
即ち本発明は一般式
【０００９】
【化３】
0004395574.tif 000002
【００１０】
と一般式
【００１１】
【化４】
0004395574.tif 000003
【００１２】
で示されるキトサンから誘導される酸化キトサン化合物であって、式中ＣＨ2ＯＨ基のＣＯＯＸ基（但し、ＸはＨ、ＮａまたはＫを表す）への酸化率が１〜１００モル％であり、式中ＮＨ2基のＮＨＣＯＣＨ3基へのアセチル化率が４０〜９５モル％である重量平均分子量が５０００以上であって、且つｐＨ７、温度２５℃での水に対する溶解度が０．１ｇ／１００ｇ以上である酸化キトサン化合物を含有してなる好中球活性抑制剤に関する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明に使用する酸化キトサン化合物は種々の方法により製造することができ、詳しい製造方法は特願平11-60162号に記載されているが、その一例を示せば次の通りである。
【００１４】
先ずキトサンを酢酸塩にする。酢酸塩にする方法としては使用するキトサンのアミノ基のモル数に対し１．５〜４倍モル、更に好ましくは２〜３倍モルの酢酸を加え、約１５〜４０℃、更に好ましくは２０〜２５℃で１〜３時間攪拌する（但し、脱アセチル化率が１００％のキトサンＸｇの場合、キトサンのアミノ基のモル数はＸｇ／１６１ｇ（キトサンの構成糖の分子量）で算出する）。このとき使用する酢酸の濃度としては０．５〜１０モル濃度（モル濃度はｍｏｌ／ｌ）、より好ましくは１〜５モル濃度である。
【００１５】
次いでこれを５０〜１００℃で乾燥し、キトサン酢酸塩とする。酢酸に代えて塩酸を使用することもでき、使用条件は酢酸の場合と同じであるが、後に詳記する酸化容易性の点から酢酸が好ましい。酢酸塩を乾燥する理由は、水分を可能な限り少なくするためである。
次いで更に上記キトサン酢酸塩に濃酢酸、即ち８０．０〜９９．８重量％、より好ましくは９５．０〜９９．８重量％の酢酸を加えてよく攪拌する。ここで濃酢酸を使用する理由は、濃酢酸でキトサン酢酸塩を懸濁させた場合、後述する６位の炭素の酸化が、容易に行われることによる。
【００１６】
即ち、次記６位の炭素のＣＨ2ＯＨ基の酸化はＣＨ2ＯＨ→ＣＨＯ→ＣＯＯＨの酸化反応工程を経て酸化されるが、ＣＨ2ＯＨ→ＣＨＯの反応は水分が少ない程反応速度が速いためである。
従って、上記の如くキトサン酢酸塩を乾燥することなくエバポレーター等を利用して濃縮しても良い。要は経済性を考慮して酸化反応工程に付する前に可能な限り水分を少なくすることが望ましい。
【００１７】
次いでこの懸濁液に過塩素酸を加え、キトサン酢酸塩をキトサン過塩素酸塩に変換する。このとき溶液は一般にゼリー状となる。過塩素酸に代えて塩酸、硫酸を使用することもできるが、濃度、添加量、反応度合 を充分に管理しないと、後述する酸化反応において２位、３位の炭素が酸化される可能性があり望ましくない。
過塩素酸の使用量は、キトサン酢酸塩のアミノ基のモル数に対し１〜３倍モル、より好ましくは１．５〜２倍モルが良い。使用する過塩素酸の濃度は４〜８モル濃度、より好ましくは５〜７モル濃度が良い。更に好ましくは６モル濃度近傍がよい。
上記モル倍率を逸脱するとキトサン構造が壊れ、開環する可能性がある。またキトサン過塩素酸塩への変換時間、換言すれば、反応時間は１時間で充分である。キトサン過塩素酸塩に変換する理由は、アミノ基に結合している酢酸イオン（ＣＨ3ＣＯＯ-）を、より酸度の強い過塩素酸イオン（ＣｌＯ4-）に置換し、安定なゼリー状即ち、ゲル状の過塩素酸塩とすることにより、次に行う酸化反応において２位、３位の炭素の酸化を防止することにある。
【００１８】
次に、このキトサン過塩素酸懸濁液（ゲル状態は攪拌により懸濁液状態となる）に酸化剤を加えて６位の炭素、即ちＣＨ2ＯＨ基の酸化を行う。酸化剤としては過マンガン酸ナトリウム、過マンガン酸カリウム、過酸化水素、次亜塩素酸ナトリウム、次亜塩素酸カリウム、硝酸等を使用することができるが、反応効率の点から無水クロム酸が最も望ましい。
無水クロム酸の使用量は所望する酸化率により異なるが、５０モル％酸化率を所望する場合ＣＨ2ＯＨ基の１．５〜４倍モル、より好ましくは２〜３倍モルである。酸化反応温度は常温、酸化反応時間は５〜６時間である。１００モル％酸化率を所望する時は、望ましくは０℃以下の温度で、ゆっくりと反応させるが、後記する製造方法を採用することが推奨される。
【００１９】
次いで、得られた酸化キトサンを濾別する。濾別方法としては遠心分離機、フィルタープレス、真空濾過機等任意の濾別方法を採用することができる。
【００２０】
濾別分離により得られた酸化キトサンをアルカリ溶液に溶解する。使用するアルカリ剤としては水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アルカノールアミン、アンモニア水溶液等が好例として挙げられるが、とりわけ水酸化ナトリウム、水酸化カリウムが望ましい。アルカリ剤の使用量は酸化キトサン溶液ｐＨが１２以上になるように添加し、水により酸化キトサン濃度が概ね０．００１〜０．０１モル濃度、より好ましくは０．００４〜０．００６モル濃度になるよう調整する。
【００２１】
次いで、この酸化キトサンアルカリ水溶液にメタノールを添加する。酸化キトサンに対するメタノールの使用割合は、キトサン酸化率、後述するアセチル化率等によっても異なるが、例えばキトサンの酸化率５０モル％、アセチル化率９５モル％を所望する場合、酸化キトサン１００部に対しメタノール１５０〜５００部である。
使用するメタノールの濃度としては９０〜９８重量％が好ましい。ここでメタノールを使用する理由は、アセチル化率を向上させるためであり、メタノールを使用しない場合、無水酢酸が加水分解を生起しアセチル化率が向上しないものと推定される。なお、メタノールの他に、エタノール、イソプロパノール、ブタノール等も使用することができるが、メタノールが極性が大きく、アセチル化反応効率を最も大きくすることができる。
【００２２】
次いでこのメタノール溶液に、無水酢酸を加えて酸化キトサンのアミノ基をアセチル化する。無水酢酸の添加量は、所望するアセチル化率に応じて決定すれは良いが、例えばアセチル化率８０モル％を所望する場合は、酸化キトサンのアミノ基モル数に対して無水酢酸０．９倍モルを添加すればよい。アセチル化率８０モル％以上を所望するときは、酸化キトサンのアミノ基モル数に対し１倍モル以上の無水酢酸を使用することが望ましい。アセチル化反応の反応時間はアセチル化率、酸化率等により異なり一概に限定することはできないが、概ね６時間〜２日間でアセチル化は完了する。
【００２３】
このようにしてアセチル化された酸化キトサン化合物は、これを濾別し、ｐＨ１２以上のアルカリ溶液とした後、透析、限外濾過イオン交換樹脂等により脱塩する。必ずしも高純度品である必要がないときは、そのまま噴霧乾燥、静置乾燥等任意の乾燥手段により乾燥しても良い。
【００２４】
本発明酸化キトサン化合物を製造する方法としては、収率、作業性、原料入手容易性、製造設備の簡便性、その他経済性等から以上述べた方法が最良であるが、本発明酸化キトサン化合物は、他の方法によっても製造することができる。即ち、前記物性を有するものであればどのような方法で製造したものであっても良い。
【００２５】
本発明について述べると本発明好中球活性抑制剤は活性酸素を出す細胞の産生能力を抑える働きをする。好中球は通常１０の値の活性酸素を産生すとすると、１０の能力で血液中で常に最初に細菌に対する防御を行う。
【００２６】
しかし、更に細菌による刺激があった場合、活性化因子であるサイトカインの一種であるＩＬ(interleukin)1,8、ＴＮＦ(tumer necrosis facter)などが好中球の活性酸素の産生能力を上げ、例えば一時的に好中球は１０００の活性酸素産生能を持つに至る。この場合活性化好中球は通常の好中球の１００細胞の働きをすることになる。
【００２７】
しかし、この場合、正常細胞の損傷も急激に増加し、炎症等疾病を招来する。即ち、本発明はこのような場合における好中球活性酵素産生能を抑制することを目的とする。
【００２８】
本発明の好中球活性抑制剤の作用効果について言えば、酸化率が高い程活性酸素の産生抑制効果は高くなる。また、アセチル化率が高いほど産生抑制効果は高くなる。本発明抑制剤の作用機構については明らかではないが、本発明抑制剤のカルボキシ基が好中球のレセプターに作用して活性酸素産生を抑制すると考えられる。従って酸化率が上がれば活性酸素の抑制効果が高くなるものと推定される。またアセチル化率が上がった場合抑制効果が高くなるのは、水溶性の向上によるか、あるいは好中球が生体中のpH７付近では負に帯電していることからアセチル基が増えた方がキトサンのＮＨ3+(アミノ基のカチオン)の量が少なくなり、好中球内のレセプターによるカルボキシ基の認識がＮＨ3+により妨害されないためアセチル化率が高い程抑制効果が高くなると考えられる。
【００２９】
次に本発明の好中球活性抑制剤の適用方法について言えば、本発明に用いる酸化キトサン化合物は水溶性であるためすべての剤に適用できる。特に軟膏剤、注射剤に適し、錠剤とした場合も優れた薬効を示す。軟膏剤として使用する場合、親水性軟膏の成分であるプロピレングリコール、白色ワセリン、ステアリルアルコール等軟膏基材１００ｇに本発明抑制剤２〜５gを混合し患部に薄く塗布する。注射剤で投与する場合は、蒸留水、生理食塩水、５％ブドウ糖液などの一般に注射液に使われる成分１００ｍｌに本発明抑制剤を約０．５〜２g混合溶解し、皮下注射、筋肉注射、静脈注射で投与することが出来る。注射剤は内服に比べ吸収に時間がかからず、しかも少量の投与で良い。一般的には経口投与を１とすれば、皮下注射は約１／２、筋肉注射は約１／３、静脈注射は約１／４でよい。
【００３０】
本発明抑制剤の投与は次のような症状の場合に投与される。例えば、創傷を創傷被覆材で治療した場合で、治癒が進むにつれ傷と正常細胞の間に炎症が現れた時や、好中球の過剰な活性で肺炎などＳＩＲＳ(Systemic inflammatory response syndrom: 全身性炎症反応症候群)と診断された場合に適用される。なお、ＳＩＲＳは感染症、手術、外傷、熱傷、急性膵炎などの場合に起こりうる。以下に本発明の実施例を揚げ更に説明する。
【００３１】
【実施例】
[実施例１]
好中球の活性酸素産生の測定方法は、化学発光法を用いて測定することにより行った。測定装置はBerthold社製のBiolumat LB9505を使用し、３７℃で化学発光値を測定した。ＨＢＳＳ（Hanks balanced salt solution）３５０μｌと本発明抑制剤（重量平均分子量６．４万、酸化率２０％、アセチル化率７０モル％、溶解度１３．３ｇ／１００ｇ−水）５０μｌ（本発明抑制剤濃度１０ｍｇ／ｍｌ）と、犬全血１００μｌを攪拌し１５分間インキュベートした。１５分間インキュベートで好中球の活性を変化させた後に、化学発光物質であるルミノール液（２ｍｇ／ｍｌ）２０μｌを加えた後、ザイモザン（１０ｍｇ／ｍｌ）を５０μｌ添加し、全量５７０μｌ中で好中球がこのザイモザンを貪食する際の活性酸素産生量を測定した。比較物質（重量平均分子量５．８万、酸化率０％、脱アセチル化率５０モル％キトサン、溶解度６．５ｇ／１００ｇ−水）５０μｌ（ＤＡＣ５０濃度１０ｍｇ／ｍｌ）添加の場合の好中球の化学発光値と、本発明抑制剤を添加した場合の好中球の化学発光値のＲＩを算出し比較した。尚、ＲＩは次式により求めた。
ＲＩ(Relative Intensity)(％)=（本発明抑制剤または比較物質とザイモザンを入れたときのピークカウント／ザイモザンをいれたときのピークカウント）×１００
本発明抑制剤の好中球活性酸素産生能のＲＩは６２％であり、比較のために用いたＤＡＣ５０のＲＩは４７０％であった。本発明抑制剤は活性酸素産生を良く抑制した。また、死細胞を選択的に染色できるトリファンブルー染色を用い、本発明抑制剤でインキュベートした好中球の死細胞数をカウントしたが、死細胞は見られなかった。また本発明抑制剤の赤血球凝集作用の有無を血液凝集試験、顕微鏡観察で調べたところ赤血球の凝集は見られなかった。
赤血球凝集試験はＨＢＳＳ４００μｌに犬全血１００μｌと本発明抑制剤５０μｌを加え１５分間インキュベートした後、赤血球の凝集の有無を黙視で観察した。更に光学顕微鏡観察（４００倍）確認を行った。
【００３２】
[実施例２〜５]
実施例１と同様の方法で、本発明抑制剤（本発明例）５０μｌ（濃度１０ｍｇ／ｍｌ）添加及び類似の化合物（比較例）５０μｌ（濃度１０ｍｇ／ｍｌ）添加についてＲＩを測定した。その結果を表１に示した。
【００３３】
【表１】
0004395574.tif 000004
【００３４】
なお、D-グルコース及びD-グルコン酸については和光純薬工業株式会社製特級品を、セルロースについては半井テスク株式会社製粉末試薬を、デキストリン及びグリコールキトサンについては和光純薬工業株式会社製試薬を用いた。その他のものは発明者が合成を行ったものである。
【００３５】
【発明の効果】
本発明好中球活性抑制剤は自然界に豊富に存在するキチンから製造した酸化キトサン化合物であり、正常細胞を死滅させることなく有効に好中球活性酸素産生能を抑制することができ、活性酵素の過剰な放出に起因し生ずる炎症等各種疾病を治癒することができる。