(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
化合物Ｎα−（２,４,６−トリイソプロイル−フェニルスルホニル）−３−アミジノ−（Ｄ,Ｌ）−フェニルアラニン−４−エトキシカルボニル−ピペラジド、Ｌ−エナンチオマーまたは該化合物の１つの薬学的に認容性の塩の、腫瘍治療のための薬剤を製造するための使用。
【請求項２】
化合物が生理学的に認容性の酸塩の形で存在する請求項１記載の使用。
【請求項３】
乳ガン、膵臓ガンおよび転移形成の治療のための請求項１または２記載の使用。
【請求項４】
前記化合物をその他の薬理作用を有する物質との複合体として使用する請求項１から３までのいずれか１項記載の使用。
【請求項５】
化合物を放射性マーカーとの、または細胞毒性物質との複合体として使用する請求項４記載の使用。
【請求項６】
リンパ細胞のターゲッティングのための薬剤を製造するための、化合物Ｎα−（２,４,６−トリイソプロイル−フェニルスルホニル）−３−アミジノ−（Ｄ,Ｌ）−フェニルアラニン−４−エトキシカルボニル−ピペラジドまたはその塩の使用。
【請求項７】
リンパ組織の疾患の診断または治療のための請求項６記載の使用。
【請求項８】
リンパ腫および転移形成を治療するための請求項６または７記載の使用。
【請求項９】
経口、局所、直腸または腸管外適用可能な薬剤を製造するための請求項１から８までのいずれか１項記載の使用。
【請求項１０】
錠剤、ドラジェー、カプセル、ペレット、座薬、液剤または経皮システムの形での、請求項１から９までのいずれか１項記載の使用。
【請求項１１】
Ｎα−（２,４,６−トリイソプロピル−フェニルスルホニル）−３−アミジノ−（Ｄ,Ｌ）−フェニルアラニン−４−エトキシカルボニル−ピペラジド、そのＬ−エナンチオマーまたは該化合物の１つの薬学的に認容性の塩。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明はウロキナーゼインヒビターとしての、特に悪性腫瘍および転移の治療のための、もしくはリンパ細胞のターゲッティング用薬剤およびリンパ組織の疾患、特にリンパ腫の治療用薬剤としての、３−アミジノ−フェニルアラニンの誘導体の使用に関する。
【０００２】
固形の腫瘍の周辺組織への拡大および転移の能力は、腫瘍細胞周辺の細胞外マトリックス（腫瘍間質）の分解もしくは変換と、もしくは基底膜の侵透能力と相関する。（病）生化学的関係は未だに最終的には解明されていないが、プラスミノーゲンアクチベーターウロキナーゼ（ｕＰＡ）およびウロキナーゼレセプター（ｕＰＡＲ）は中心的な意義を有する。ｕＰＡはプラスミノーゲンのプラスミンへの蛋白質加水分解を仲介する。プラスミンは広い作用範囲を有するプロテアーゼであり、これは細胞外マトリックスの成分、例えば、フィブリン、フィブロネクチン、ラミニンおよびプロテオグリカンの蛋白質骨組みを直接分解することができる。更にプラスミンは“潜在性”金属プロテアーゼおよびｕＰＡの不活性なプロ酵素、ｐｒｏ−ｕＰＡを活性化することができる。
【０００３】
腫瘍細胞および腫瘍間質の悪性でない細胞は酵素的に不活性なプロ酵素ｐｒｏ−ｕＰＡを合成し、かつ分泌する。プロテアーゼ、例えばプラスミンまたはカテプシンＢおよびＬはｐｒｏ−ｕＰＡを限定された蛋白分解により分解し、活性セリンプロテアーゼＨＭＷ−ｕＰＡ（ＨＭＷ＝高分子量）にする。ｐｒｏ−ｕＰＡおよび活性プロテアーゼＨＭＷ−ｕＰＡは細胞表面レセプターｕＰＡＲ（ＣＤ８７）に結合する。プラスミン（プラスミノーゲン）は同様に腫瘍細胞の細胞質膜上の特異的なレセプターに結合し、これにより腫瘍細胞の直接的な周辺での病巣形成およびプラスミノーゲン活性化の増幅を達成する。こうして湿潤性の細胞に、所定の移動に必要な基礎から蛋白分解により離れることなく、細胞外マトリックスを分解する可能性が与えられている。
【０００４】
多くの細胞生物学的研究において、腫瘍関連蛋白分解システムのカスケード様反応経路の範囲内で細胞に関連するプラスミノーゲンアクチベーターシステムが特別な位置価値を有することを示すことができた（Wilhelm et al., (1994) The Urokinase/Urokinasereceptor system: A new target for cancer therapy? In: Schmitt M., Graeff H., Kindermann G. (Hrsg): Prospects in Diagnosis and Treatment of Cancer. International Congress Series, Excerpta Medica 1050, Amsterdam, Elsevier 1994, pp145-156）。ヒト結腸ガン細胞の培養において、細胞外マトリックスを通過する能力が活性ｕＰＡでのｕＰＡ−レセプターの飽和度に依存しているということが観察された（Hollas et al., Cancer Res. 51(1991), 3690-3695）。同様に、細胞モデルにおいて、ｕＰＡの蛋白分解活性をＰＡＩ−１により（Cajot et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87(1990), 6939-6943）またはＰＡＩ−２により（Baker et al., Cancer Res. 50(1990), 4676-4684）阻害した場合、細胞の湿潤性の潜在的可能性の低下が見られた。これと同様な効果は蛋白分解に関して不活性のｕＰＡ−変種によるレセプターの遮断による細胞表面へのｕＰＡの結合を阻害する際に達せられた（Cohen et al., Blood 78(1991), 479-487; Kobayashi et al., Br. J. Cancer 67(1993), 537-544）。ｕＰＡＲの１部に対してアンチセンス転写を発現するプラスミドを用いての類表皮ガン細胞のトランスフェクションも、ｕＰＡＲ−合成低下により細胞の湿潤性の低下に導いた（Kook, EMBO J. 13(1994), 3983-3991）。ｕＰＡおよびＰＡＩ−１に対する抗体はインビトロで肺ガン細胞の湿潤性を低下させた（Liu et al., Int. J. Cancer 60(1995) 501-506）。
【０００５】
転移過程に対するプラスミノーゲンアクチベーターシステムの影響は、腫瘍−動物モデルでも裏付けられている。こうして、ニワトリの胚中でのヒトのガン細胞に由来する肺転移の形成はｕＰＡに対する抗体の添加によりほとんど完全に阻止された（Ossowski und Reich, Cell 35(1983), 611-619）。転移するヒトガン細胞に、蛋白分解に関して不活性であるがｕＰＡＲに結合するｕＰＡ−突然変異体をコードする、発現プラスミドを移入した。マウスモデルにおいて不活性なｕＰＡを合成するガン細胞は注射の後、移入されていない細胞に比べて明らかに僅かな数の転移を形成する（Crowley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(1993), 5021-5025）。ｕＰＡ−アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与した後、更にヌードマウス中のヒト子宮ガン細胞の腹腔内拡散の阻止が観察された（Wilhelm et al., Clin. Exp. Metast. 13(1995),296-302）。
【０００６】
近年、固形の悪性腫瘍を有する患者の診断のために、プラスミノーゲンアクチベーターシステムの因子（ｕＰＡ、ｕＰＡＲ、ＰＡＩ−１およびＰＡＩ−２）の臨床的意義が重点的に研究されている。その際、種々異なる腫瘍（例えば、胸、卵巣、胃、肺、腎臓など）におけるｕＰＡ−抗原含量は再発を示さない生存体においても死者にとっても、強力な診断ファクターである（例えばSchmitt et al., J. Obstet. Gynaecol. Oncol. 21(1955), 151-165; Jaenicke et al., Breast Cancer Res. Treat. 24(1993), 195-208; Kuhn et al., Gynecol. Oncol. 55(1994), 401-409; Nekarda et al., Lancet 343(1994), 117; Pedersen et al., Cancer Res. 54(1994), 4671-4675参照）。同様に、肺ガン組織（Pendersen et al., supra）および乳ガン組織（Duggan et al., Int. J. Cancer 61(1995), 597-600; Ronne et al., Breast Cancer Res. Treat. 33(1995), 199-207）中の、並びに胃ガンにおける腫瘍組織自体（Heiss et al., J. Clin Oncol. 13(1995), 2084-2093）中でも、骨髄中に分散した腫瘍細胞（Heiss et al., Nature Medicine 1(1995), 1035-1039）においてもｕＰＡＲの上昇した濃度が悪い診断と関連する。
【０００７】
合成ｕＰＡインヒビターの使用は、腫瘍細胞の湿潤および拡散を抑制する可能性を提供する。しかしながら、特異的ｕＰＡインヒビターの開発は困難を有する、それというのも組織タイプのプラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）はプラスミノーゲンのペプチド結合Ａｒｇ５６０／Ｖａｌ５６１の切断に同じ特異性を示すためである。従って、多くの場合、低分子量ｕＰＡインヒビターはｔＰＡをも阻害し、その結果ｔＰＡ仲介フィブリノリシスも阻害する。更に、合成ｕＰＡインヒビターはプラスミンを強く阻害しないということを達成しなければならない。
【０００８】
このような制約にもかかわらず、ｕＰＡに対して確かに特異性を有するいくつかの阻害物質が公知であるが、低い阻害能を有し、例えば、ベンズアミジン−およびβ−ナフタミジン−誘導体は、最も有効な化合物においてＫｉ＝２.２μｍｏｌ／ｌでｕＰＡを阻害し（Stuerzebecher und Markwardt, Pharmazie 33(1978), 599）、アミロリドはＫｉ＝７μｍｏｌ／ｌで阻害する（Vassalli und Belin, FEBS. Lett. 214(1987), 187-191）。
【０００９】
ＤＥ−Ａ−３０３５０８６はプロテアーゼ、例えばトリプシン、キモトリプシン、トロンビンまたはｕＰＡに対する阻害作用を有するシクロヘキサンカルボン酸誘導体を開示している。しかしながら、この試験した化合物は非常に僅かで、かつ非特異的なｕＰＡ−阻害を示す。ＥＰ−Ａ−０１８３２７１はリシン誘導体およびプロテアーゼインヒビターとしての使用を開示している。ベンズアミジノ−リシン誘導体（化合物１０８）も記載されており、これはインビトロでｕＰＡ−阻害を示すが、他のプロテアーゼ、例えばトリプシンまたは血漿カリクレインに対しても同様な作用を有する。ＷＯ９５／１７８８５はｕＰＡ−インヒビターとしての低分子ポリペプチドを開示している。
【００１０】
公知ｕＰＡ−インヒビターのそれ以外の群は４−置換ベンゾチオフェン−２−カルボキサミジンがあり、ベンゾチオフェン−６２３の場合はＫｉ＝０.１６ｍｍｏｌ／ｌである（Towle et al., Cancer Res. 53(1993), 2553-2559）。この阻害物質はｔＰＡおよびプラスミンに比較してｕＰＡに明らかに高い親和性を有する。ｕＰＡＲ結合ｕＰＡも高い効率で阻害される。しかしながら、この物質の欠点は、化学合成が複雑であり、かつこの構造の修飾の可能性はほとんどない、すなわちこの修飾の可能性を従来示すことができなかった。
【００１１】
従って、ｕＰＡのその他の阻害物質の開発は、種々異なる疾患における、特に腫瘍形成および転移におけるｕＰＡおよびｕＰＡＲの役割の解明のために非常に重要である。
【００１２】
３−アミジノフェニルアラニンのＮα−アリールスルホニル−誘導体およびＮα−アリールスルホニル−アミノ−アシル−誘導体はトロンビンの選択的阻害物質として（Markwardt et al., Thromb. Res. 17(1980), 425-431）もしくは凝固因子Ｘａの選択的阻害物質として（Stuerzebecher et al., Thromb. Res. 54(1989), 245-252）公知である。ＷＯ９２／０８７０９、ＷＯ９４／１８１８５、ＷＯ９６／０５１８９中にも血液凝固の阻害物質として、特にトロンビンの阻害物質としてアミジノフェニルアラニン誘導体の使用が記載されている。
【００１３】
３−アミジノフェニルアラニンのピペリジドまたはピペラジドを集中的に調べ、この中にフィブリノリシス酵素阻害のためのモデル構造も見いだされた（Stuerzebecher et al., J. Enzyme Inhibition 9, 87-99; Stuerzebecher et al., J. Med. Chem. 40, 3091-3099, 1997）。Stuerzebecher等により（1995）トロンビン、因子Ｘａ、プラスミンおよびトリプシンの阻害のみが記載されているが、Stuerzebecher等による（1997）ｕＰＡの阻害に関する記載も存在する。Ｎα−２−ナフチルスルホニル−、Ｎα−２−（２,２,５,７,８−ペンタメチルクロマン−６−イル）スルホニル−およびＮα−２−カンファー−１０−イル−スルホニル−置換された３−アミジノフェニルアラニンピペラジンにおいてｕＰＡに関して２８〜１４０μｍｏｌ／ｌのＫｉ値が見いだされ、これはトロンビンに関する阻害定数より、約１０３倍高い。こうして３−アミジノフェニルアラニン誘導体がウロキナーゼインヒビターとして好適であるということをベースとして出発することはできなかった。
【００１４】
しかしながら、意外にも第２位がフェニル基で置換された３−アミジノフェニルアラニン誘導体は選択的であり、かつインビボでｕＰＡの有効な阻害物質であることが見いだされた。更に、この物質がリンパ組織に高い選択性を示すこと、例えばリンパ細胞のターゲッティングのための、例えばリンパ組織の悪性疾患、例えばリンパ腫の治療のための薬剤として好適であることが見いだされた。
【００１５】
本発明はラセミ体として並びにＤ−またはＬ−体の化合物として存在する、一般式Ｉ
【００１６】
【化６】
0004603162.tif 000002
【００１７】
［式中、Ｒ１は
（ａ）ＯＨまたはＯＲ４であり、Ｒ４は場合により、例えばヒドロキシル、カルボキシル、スルホニル、ニトロ、シアノ、オキソまたは／およびハロゲンで置換されている、分枝または非分枝のＣ１〜Ｃ８−アルキル、Ｃ３〜Ｃ８−シクロアルキルまたはアラルキル、例えばベンジルまたはフェニルエチルであるか、
（ｂ）式
【００１８】
【化７】
0004603162.tif 000003
【００１９】
（式中、Ｒ５およびＲ６は、全構造と適合性の任意の基であり、特に
（ｉ）Ｒ５およびＲ６はＨであるか、
（ｉｉ）Ｒ５はＨであり、かつＲ６は場合により例えばヒドロキシ、カルボキシ、スルホニル、ニトロ、シアノ、オキソまたは／およびハロゲンで置換された分枝または非分枝のＣ１〜Ｃ８−アルキル、アラルキル、例えばベンジルまたはフェニルエチル、またはＣ５〜Ｃ８−シクロアルキルであるか、
（ｉｉｉ）Ｒ５およびＲ６はそれぞれ独立して、場合により例えばヒドロキシまたは／およびハロゲンで置換された非分枝または分枝のＣ１〜Ｃ４−アルキルであるか、または
（ｉｖ）Ｒ５はＨであり、かつＲ６は−ＮＨ２または特にアリールまたはヘテロアリールで置換されたアミノ基であるか、
（ｖ）Ｒ５はＨまたは場合により例えばヒドロキシまたは／およびハロゲンで置換された非分枝または分枝のＣ１〜Ｃ４−アルキルであり、Ｒ６はアミノ酸基、例えばα−、β−またはω−アミノカルボン酸またはアミノスルホン酸、ペプチド基、例えばアミノ酸５０個までの長さのペプチド基、またはポリペプチド基、例えばアミノ酸５０個より大きい〜１０００個の長さのポリペプチドである）の基を表すか、
（ｃ）式
【００２０】
【化８】
0004603162.tif 000004
【００２１】
（式中、ｍは数１または２を表し、かつメチレン基の１つ以上が場合により、例えばヒドロキシ−、カルボキシ−、Ｃ１〜Ｃ４−アルキル−またはアラルキル基、例えばベンジルまたはフェニルエチル、で置換されていてよく、この際基（ｃ）はラセミまたはＤ−またはＬ−配置であり、Ｒ７はＲ１の（ａ）、（ｂ）および（ｆ）の意味を表す）の基を表すか、
（ｄ）式
【００２２】
【化９】
0004603162.tif 000005
【００２３】
（式中、ｐ＝ｒ＝１、ｐ＝１およびｒ＝２またはｐ＝２およびｒ＝１であり、かつメチレン基の１つ以上が場合により、例えばヒドロキシ−、カルボキシ−、Ｃ１〜Ｃ４−アルキル−またはアラルキル基、例えばベンジルまたはフェニルエチル、で置換されていてよく、Ｒ７はＲ１の（ａ）、（ｂ）および（ｆ）の意味を表す）の基を表すか、
（ｅ）場合により２、３および４位の１つで、例えばＣ１〜Ｃ４−アルキル−、Ｃ１〜Ｃ３−アルコキシ−またはヒドロキシ基で置換されていてよい、ピペリジル基であり、
その際式（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）のヘテロ脂環式環に、場合により更に芳香族環または脂環式環、有利にフェニルまたはシクロヘキシル、がヘテロ原子に対して２、３位または３、４位で縮合しているか、
（ｆ）式
【００２４】
【化１０】
0004603162.tif 000006
【００２５】
（式中、Ｒ８は
（ｉ）場合により、例えばＣ１〜Ｃ６−アルキル−、Ｃ１〜Ｃ３−アルコキシ−、ヒドロキシ、カルボキシ、スルホニル、ニトロ、シアノ、オキソ、または／およびハロゲンで置換されたＣ１〜Ｃ６−アルキル基またはアリール基、例えばフェニル、ｐ−ハロゲンフェニル、ナフチル、
（ｉｉ）飽和または不飽和の、分枝または非分枝のＣ１〜Ｃ６−アルコキシ基、または
（ｉｉｉ）場合により、例えばＣ１〜Ｃ６−アルキル−、Ｃ１〜Ｃ３−アルコキシ−、ヒドロキシ、カルボキシ、スルホニル、ニトロ、シアノ、オキソ、または／およびハロゲンで置換されたフェノキシ−もしくはベンジルオキシカルボニル基を表す）の基を表すか、
（ｇ）式−ＣＯＸ
（式中、Ｘは
（ｉ）Ｈ、場合により、例えばヒドロキシ、カルボキシ、スルホニル、ニトロ、シアノ、オキソ、または／およびハロゲンで置換された、非分枝または分枝のアルキル基、有利にＣ１〜Ｃ６−アルキル基、特にメチル基、
（ｉｉ）場合により、例えばＣ１〜Ｃ６−アルキル、Ｃ１〜Ｃ３−アルコキシ、ヒドロキシ、カルボキシ、スルホニル、ニトロ、シアノ、オキソ、または／およびハロゲンで置換されたアリール基またはヘテロアリール基、例えばフェニル、ｐ−ハロゲンフェニル、チエニル、または
（ｉｉｉ）場合により、例えばヒドロキシ、カルボキシ、スルホニル、ニトロ、シアノ、オキソ、または／およびハロゲンで置換されたシクロアルキル基、有利にＣ３〜Ｃ１０−シクロアルキルを表す）のアシル基を表すか、
（ｈ）芳香族基が場合により、例えばハロゲン原子、Ｃ１〜Ｃ６−アルキル、Ｃ１〜Ｃ３−アルコキシ−、ヒドロキシ−、シアノ−、カルボキシ−、スルホニル−またはニトロ基、で置換されている、アラルキル基、例えばベンジルまたはフェニルエチルを表すか、
（ｉ）式−ＣＯＮＲ′Ｒ′′のカルボン酸アミド基、式−ＣＳＮＲ′Ｒ′′のチオカルボン酸アミド基または式−ＣＨ２−ＣＯＮＲ′Ｒ′′の酢酸アミド基
（式中、
（ｉ）Ｒ′およびＲ′′はＨであるか、
（ｉｉ）Ｒ′およびＲ′′はそれぞれ独立してＣ１〜Ｃ４−アルキル基であるか、
（ｉｉｉ）Ｒ′はＨであり、かつＲ′′はＣ１〜Ｃ４−アルキル基であるか、
（ｉｖ）Ｒ′はＨであり、かつＲ′′はアリール、例えばフェニル、であるか、または
（ｖ）Ｒ′およびＲ′′は窒素原子と共に、その他のヘテロ原子、例えばＮ、Ｏまたは／およびＳを有していてよい５〜７員のヘテロ脂環式環を形成する）を表すか、
（ｊ）ＳＯ２−Ｙ−基
（式中、Ｙは
（ｉ）場合により、例えばヒドロキシ、カルボキシ、スルホニル、ニトロ、シアノ、オキソまたは／およびハロゲンで、置換されたＣ１〜Ｃ８−アルキル基、有利にメチル、トリフルオロメチル、トリクロロメチル、を表すか、
（ｉｉ）場合により、例えばＣ１〜Ｃ６−アルキル、Ｃ１〜Ｃ３−アルコキシ、ヒドロキシ、カルボキシ、スルホニル、ニトロ、シアノ、オキソ、または／およびハロゲンで、置換されたアリールまたはヘテロアリール、例えばフェニル、４−メチル−フェニル、２,４,６−トリメチルフェニル、２,４,６−トリイソプロピル−フェニル、４−メトキシ−２,３,６−トリメチル−フェニル、２,２−ジメチル−６−メトキシ−クロマニル、２,２,５,７,８−ペンタメチル−クロマニル、アントラキノニル、ナフチルまたはキノリル、またはＯ−アリール、有利にＯ−フェニル、またはＯ−ヘテロアリール基を表すか、または
（ｉｉｉ）−ＮＲ′Ｒ′′を表し、この際Ｒ′およびＲ′′はそれぞれ独立してＨまたはＣ１〜Ｃ３−アルキル基を表す）を表すか、
（ｋ）場合により、例えばＣ１〜Ｃ６−アルキル−、Ｃ１〜Ｃ３−アルコキシ−、ハロゲン−、ヒドロキシ−または／およびオキソ基で、置換されている、炭素原子５〜８個を有する脂環式環を表すか、
（ｌ）場合により、例えばＣ１〜Ｃ６−アルキル−、Ｃ１〜Ｃ３−アルコキシ−、ヒドロキシ、カルボキシ、スルホニル、ニトロ、シアノ、オキソまたは／およびハロゲンで、置換されたヘテロアリール基、例えばピリジルまたはピリミジル、またはヘテロ脂環式基、例えばＮ−メチルピペリジルを表すか、
（ｍ）式−（ＣＨ２）ｎ−Ｘの官能基化アルキル基、
（式中、アルキル鎖は非分枝または分枝であり、ｎ＝１〜８を表し、官能基Ｘは（ｉ）ヒドロキシル基を表し、そのＨ−原子は場合によりＣ１〜Ｃ４−アルキル−、アラルキル−、例えばベンジルまたはフェニルエチル、アリール−、例えばフェニル、Ｃ１〜Ｃ４−ヒドロキシアルキル−またはアシル基であるＣＯ−アルキル（Ｃ１〜Ｃ６）により置換されている）を表すか、
（ｉｉ）ハロゲン原子を表すか、
（ｉｉｉ）式−Ｎ（Ａｌｋ）２の三級アミノ基を表し、ここでアルキル基は炭素原子１〜３個を有し、有利には同じ意味を有し、かつ窒素原子は場合により更にヘテロ原子、例えばＮ、Ｏまたは／およびＳを有していてよい、５〜７員のヘテロ脂環式環に属する）を表し、
Ｒ２は場合により、例えばＣ１〜Ｃ６−アルキル、Ｃ１〜Ｃ３−アルコキシ、ヒドロキシ、カルボキシ、スルホニル、ニトロ、シアノ、オキソまたは／およびハロゲン、で置換されたフェニル基、例えばフェニル、４−メチル−フェニル、２,４,６−トリメチル−フェニル、２,４,６−トリイソプロピル−フェニル、４−メトキシ−２,３,６−トリメチル−フェニルを表し、
Ｒ３はＨまたは分枝または非分枝のＣ１〜Ｃ４−アルキルであり、かつｎは０または１を表す］の３−アミジノフェニルアラニンから誘導された新規ウロキナーゼインヒビターに関する。
【００２６】
該化合物は塩として、有利に生理学的に認容性の酸塩として、例えば鉱酸、特に有利に塩酸塩または好適な有機酸の塩として存在する。
【００２７】
一般的に請求項中で定義した化合物のうちで、式中Ｒ１が式（ｂ）、（ｄ）および（ｆ）の基に相当し、Ｒ２がアルキル基でモノ、ジまたはトリ置換されたフェニル基、特に２,４,６−置換フェニル基、例えば２,４,６−トリイソプロピルフェニル基、を表し、ｎ＝０である化合物が特に有利である。
【００２８】
一般式Ｉの化合物は原則的に公知の方法、例えばＷＯ９２／０８７０９およびＷＯ９４／１８１８５中に記載されているような方法で製造され、その生物学的インビトロ活性にゆだねる。
【００２９】
（Ｌ）−、（Ｄ）−または（Ｄ,Ｌ）−３−シアノフェニルアラニン−メチルエステル−塩酸塩を、相応するスルホクロリドまたはスルホニル化アミノ酸もしくはそのハロゲン化物を用いて、塩基の存在下に、シアノ基を有する一般式Ｉの化合物（式中Ｒ１＝ＯＣＨ３であり、Ｒ２並びにＲ３およびｎが一般的に請求項に定義された意味に相当する）に変換する。これから緩和な酸性またはアルカリ性加水分解によりカルボン酸構造を有する一般式Ｉ（Ｒ１＝−ＯＨ）の化合物が得られ、これを酸触媒条件下に相応するアルコールでエステル化し、Ｒ１＝（ａ）の意味を有する一般式Ｉの化合物にする。ペプチド化学で常用の方法、例えばＨＯＢｔの存在下でのＤＣＣ法により、一般式Ｉのカルボン酸（Ｒ１＝−ＯＨ）と構造（ｂ）、（ｅ）および（ｆ）の親核性基との反応により一般式Ｉの相応するＲ１を有する化合物を提供可能である。Ｒ１＝（ｃ）および（ｄ）である化合物の合成のためには、最初にＲ１＝ＯＨの一般式Ｉのカルボン酸を構造（ｃ）および（ｄ）の脂環式アミノ酸エステル（ここでＲ７は有利に−ＯＣＨ３もしくは−ＯＣ２Ｈ５）と反応させ、得られたカルボン酸エステルを緩和な酸性またはアルカリ性条件下に加水分解し、相応するカルボン酸とし、その後これをすでに記載した方法でエステル化または構造（ｂ）、（ｅ）および（ｆ）の親核基と反応させることができ、この際Ｒ１＝（ｃ）ならびに（ｄ）およびＲ７＝（ａ）、（ｂ）、（ｅ）および（ｆ）の一般式Ｉの化合物が得られる。
【００３０】
アミジン構造を有する一般式Ｉの目標化合物はシアノ化合物から公知法で得られ、この際一般にシアノ基へのＨ２Ｓの付加により最初にチオアミドを獲得し、これを沃化メチルでＳ−メチル化してチオイミドエステルとし、引き続きアルコール性溶液中の酢酸アンモニウムでアミジノ化合物とする。更に、場合によりシアノ化合物からＨＣｌ−ガスの存在下に、および一定の場合不活性溶剤の存在で、メタノールまたはエタノールで相応するイミドエステル塩酸塩を製造し、アルコール性アンモニア溶液中での変換はそのアミジノ化合物に導く。
【００３１】
本発明によるウロキナーゼインヒビターは場合により少なくとも１種の好適な製薬学的な助剤または担持剤と一緒に、経口、皮下または静脈内投与可能な腫瘍予防および治療のための医薬製剤の製造のために、または診断に使用することができる。同様に、他の作用物質、例えば他のウロキナーゼインヒビター、例えば抗体または／およびペプチドとの組合せでの投与も可能である。
【００３２】
ヒトおよび動物における腫瘍予防および治療のための薬剤は局所、経口または非経口で、例えば皮下または静脈内で、錠剤、ドラジェー、カプセル、坐剤、溶液または経皮システム、例えば硬膏、の形で投与することができる。
【００３３】
特に有利な式（Ｉ）の化合物は、Ｎα−（２,４,６−トリイソプロピル−フェニルスルホニル）−３−アミジノ−（Ｄ,Ｌ）−フェニルアラニン−４−エトキシカルボニル−ピペラジド−塩酸塩もしくはそのＬ−エナンチオマーまたはこれらの化合物の薬学的に認容性の塩である。この物質は良好な溶解挙動を有する。トリス緩衝液（ｐＨ７.３）中には、これは５×１０-５ｍｏｌ／ｌの濃度まで可溶性である。エタノール５％の添加により、溶解性は２×１０-４ｍｏｌ／ｌに上昇し、ＤＭＳＯ５％の添加により、溶解性は１０-３ｍｏｌ／ｌに上昇する。
【００３４】
本発明による化合物は、悪性腫瘍の増殖または／および拡散、例えば膵臓ガンにおける腫瘍拡散、乳ガンの腫瘍増殖ならびに腫瘍の転移を非常に効果的に抑制することができる。その際、ｕＰＡ−インヒビターは場合により、他の抗腫瘍剤と、または他の治療手段、例えば照射または外科的手術と組み合わせて、使用することができる。更に、本発明によるインヒビターは他のｕＰＡ−関連疾患にとっても有効である（例えば、皮膚疾患である尋常性天疱瘡の水疱形成の阻止において有効である）。
【００３５】
本発明によるｕＰＡインヒビターは有利に、ｔＰＡ対してｕＰＡに関するＫｉ−値が少なくとも２分の１より、有利には少なくとも５分の１より小さく、特に有利には１０分の１である。更に本発明による化合物はトロンビンおよび因子Ｘａの効果的な阻害にとってＫｉ値が高すぎるので、血液凝固に非常に僅かに影響を与えるにすぎないという
ことは注目を引く。
【００３６】
本発明による一般式Ｉの物質は生理学的に有効な物質、例えば放射性標識または細胞毒性薬剤、例えば化学療法薬、例えばシスプラチンまたは５−フルオロウラシル、またはペプチドと複合体（Konjugate）の形で使用することができる。更に、この物質がキャリヤー小胞、例えばリポソームの膜中にも構築され、こうしてキャリヤー小胞中に封入された作用物質、例えば細胞毒剤、例えばドキソルビシンのターゲッティングを可能にした。
【００３７】
一般式ＩＩ：
Ｘ−Ｒ２
［式中、Ｘは任意の基、特に有機基、例えば式Ｉの化合物に関して定義されているものを表すか、または他の基、例えば生理学的に有効な物質、例えば細胞毒性薬剤、ペプチドまたは放射性標識、リピドまたは炭水化物を表し、Ｒ２は前記と同じものを表し、特に２,４,６−三置換フェニル基、例えば２,４,６−トリイソプロピルフェニルを表す］の物質に関するこれ以外の適用は、リンパ細胞のターゲッティングであり、これは他の組織タイプに対してリンパ節組織に対して１０〜２０倍高い親和性に基づき可能となる。有利にはＲ２はスルホニル基−ＳＯ２−を介して基Ｘと結合している。従って、この物質はリンパ組織、特に腫瘍転移および白血病のような悪性疾患の診断または治療のための薬剤として著しく優れている。この物質の投与は前に記載したようにして行うことができる。リンパ組織の疾患の治療は有利に例えば５から２０日間にわたっての何日間にもわたっての薬剤の投与、引き続き治療中断および場合による投与の複数回の繰り返しにより行われる。
【００３８】
以下に実施例および図面につき、本発明を詳細に説明する。
【００３９】
図１は本発明の物質の細胞毒性の測定の結果を示す図である、
図２はヒト乳ガンによるフィブリンマトリックスの分解の阻止のための実験の結果である、
図３および図４はラット中での乳ガン細胞の拡散、増殖および転移に対する本発明による物質の作用を示す、
図５はラット中での膵臓腫瘍の増殖に対する本発明による物質の作用を示す。
図６はマウス中でのヒト乳ガン細胞の増殖に関する本発明による物質の作用を示す。
【００４０】
実施例
１.    Ｎα−２,４,６−トリイソプロピルフェニルスルホニル−（Ｌ）−３−アミジノ−フェニルアラニン−４−エトキシカルボニル−ピペラジド−塩酸塩
１.１  Ｎα−２,４,６−トリイソプロピルフェニルスルホニル−（Ｌ）−３−シアノ−フェニルアラニン−メチルエステル
（Ｌ）−３−シアノフェニルアラニン−メチルエステル５ｇをジオキサン１００ｍｌ中に懸濁させ、Ｎ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）４.４５ｍｌを添加し、３０分間攪拌した。２,４,６−トリイソプロピルベンゼンスルホクロリド５.９７ｇを固体で添加した後、３日間攪拌し、その後沈殿したＮＭＭ−ＨＣｌを濾別し、この溶剤を留去し、得られた粗成生物をシリカゲル（ＫＧ）６０（クロロホルム）を介して精製した。収量：シロップ状物質８.３４ｇ（９０％）。
【００４１】
１.２  Ｎα−２,４,６−トリイソプロピルフェニルスルホニル−（Ｌ）−３−シアノ−フェニルアラニン
化合物１.１ ８.３４ｇを酢酸５０ｍｌおよび１Ｎ塩酸５０ｍｌからなる混合液中で８時間還流下に加熱し、酢酸エチルで２×抽出した後、合した酢酸エチル溶液をＭｇＳＯ４で乾燥し、溶剤を留去した。ＫＧ６０（クロロホルム）を介して精製した後、固体生成物５.８ｇが得られた（７２％）。
【００４２】
１.３  Ｎα−２,４,６−トリイソプロピルフェニルスルホニル−（Ｌ）−３−シアノ−フェニルアラニン−４−エトキシカルボニル−ピペラジド
化合物１.２ ５.７ｇをテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）１００ｍｌ中に溶かし、０℃に冷却し、α−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）２.２２ｇ、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）２.８２ｇを添加し、３０分間攪拌した。ＴＨＦ３０ｍｌ中の１−エトキシカルボニル−ピペラジン３.９４ｇの添加後、一夜攪拌し、その後析出したジシクロヘキシルウレア（ＤＣＵ）を濾別し、溶剤を留去し、得られた粗成生物をＫＧ６０（クロロホルム）を介して精製した。収量：無定形粉末、７.１ｇ（９６％）。
【００４３】
１.４  Ｎα−２,４,６−トリイソプロピルフェニルスルホニル−（Ｌ）−３−アミジノ−フェニルアラニン−４−エトキシカルボニル−ピペラジド塩酸塩
化合物１.３ ７.１ｇをピリジン３０ｍｌ中に溶かし、トリエタノールアミン（ＴＥＡ）３０滴を添加し、強力な硫化水素流を１０分間導入し、２日間室温で放置した。引き続き、溶剤を留去し、残分を酢酸エチルに溶かし、有機相を１Ｎ塩酸および飽和食塩溶液で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥し、この溶剤を留去した。このようにして得られたチオアミド７.２ｇをアセトン２５０ｍｌ中に溶かし、この溶液を沃化メチル１７ｇと混合し、室温で２日間遮光下に放置した。その後溶剤を留去し、チオイミドエステル−ヨウ化水素酸塩（８.５ｇ）をメタノール５０ｍｌ中に溶かし、酢酸アンモニウム１.９ｇを添加し、配合物を６０℃に４時間加熱した。溶剤を留去した後得られた粗成生物をSephadex LH20（メタノール）を介して精製した。このようにして得られたアミジン−ヨウ化水素酸塩をイオン交換体（Amberlite IRA-420）を介して塩酸塩に変換した。収量：無定形粉末、５.３ｇ（６９％）。
【００４４】
２.    Ｎα−２,４,６−トリイソプロピルフェニルスルホニル−（Ｄ,Ｌ）−３−アミジノフェニル−アラニル−ニペコチン酸−ベンジルアミド−塩酸塩
２.１  Ｎα−２,４,６−トリイソプロピルフェニルスルホニル−（Ｄ,Ｌ）−３−シアノ−フェニルアラニル−ニペコチン酸−エチルエステル
Ｎα−２,４,６−トリイソプロピルフェニルスルホニル−（Ｄ,Ｌ）−３−シアノ−フェニルアラニン（（Ｄ,Ｌ）−３−シアノフェニルアラニン−メチルエステル塩酸塩および相応するスルホクロリドから１.１および１.２と同様にして製造）４.５６ｇ、ＨＯＢｔ１.５ｇおよびＤＣＣ２.４２ｇをＤＭＦ５０ｍｌ中に溶かし、１時間攪拌し、その後ニペコチン酸−エチルエステル２.３６ｇを添加した。一夜攪拌後、析出したＤＣＵを濾別し、溶剤を留去し、残分を少量のメタノールに溶かし、結晶化するまで放置した。生じた沈殿を吸引濾過し、メタノールで洗浄し、かつ乾燥した。収量：４.４６ｇ（７５％）。
【００４５】
２.２  Ｎα−２,４,６−トリイソプロピルフェニルスルホニル−（Ｄ,Ｌ）−３−シアノ−フェニルアラニル−ニペコチン酸
前記のエチルエステル４.４ｇを酢酸３５ｍｌおよび１ＮＨＣｌ ２５ｍｌからなる混合液中で２時間還流下に加熱した。水１０ｍｌの添加後、冷却するために放置し、その際ワックス様の生成物が析出した。溶剤を注ぎ捨てた後に水２００ｍｌを添加し、長時間強力に攪拌し、得られた固体の物質を吸引濾過し、水で洗浄し、乾燥した。収量：３.８４ｇ（９２％）。
【００４６】
２.３  Ｎα−２,４,６−トリイソプロピルフェニルスルホニル−（Ｄ,Ｌ）−３−シアノ−フェニルアラニル−ニペコチン酸−ベンジルアミド
前記化合物２.２８ｇ、ＨＯＢｔ０.６ｇおよびＤＣＣ０.９７ｇをＤＭＦ２０ｍｌ中に溶かし、１時間攪拌し、引き続きベンジルアミン０.６ｇを添加し、更に１夜攪拌した。析出したＤＣＵを濾別した後、溶剤を留去し、残分をメタノール中に溶かし、この溶液を５％の炭酸水素ナトリウム溶液／氷中に注いだ。１時間後に生じた沈殿を吸引濾過し、水で洗浄し、かつ真空中で乾燥した。収量：２.４８ｇ（９４％）。
【００４７】
２.４  Ｎα−２,４,６−トリイソプロピルフェニルスルホニル−（Ｄ,Ｌ）−３−アミジノ−フェニルアラニル−ニペコチン酸−ベンジルアミド塩酸塩
化合物２.３ ２.４ｇをピリジン３０ｍｌ中に溶かし、ＴＥＡ３０滴を添加し、この溶液中に硫化水素を１０分間導入し、この配合物を２日間室温で放置した。引き続き、この溶剤を留去し、残分を酢酸エチルに取り込みかつ１Ｎ ＨＣｌと一緒に振盪した。飽和食塩溶液で有機相を洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥した後、この溶剤を留去した。このようにして得られたチオアミド２.３８ｇをアセトン１００ｍｌ中に溶かし、この溶液を沃化メチル６.５ｇと混合し、室温で２０時間遮光下に放置した。その後溶剤を留去し、チオイミドエステル−ヨウ化水素酸塩をメタノール５０ｍｌ中に溶かし、酢酸アンモニウム０.５ｇを添加し、配合物を６０℃で４時間水浴中で加熱した。溶剤を留去した後得られた粗成生物をＫＧ６０を介して精製した。この溶離を最初にクロロホルムで、その後クロロホルム／メタノール９：１で行った。このようにして精製したアミジン−ヨウ化水素酸塩をイオン交換体（Amberlite IRA-420）を介して塩酸塩に変換した。収量：無定形粉末、１.４５ｇ（５６％）。
【００４８】
該化合物の特徴付けを質量分析により行い、純度試験をＤＣおよびＨＰＬＣで実施した。
【００４９】
３.    選択された式Ｉの化合物によるウロキナーゼのインビトロ阻害
【００５０】
【表１】
0004603162.tif 000007
【００５１】
略語：ＴＩＰＰ＝２,４,６−トリイソプロピルフェニル
阻害作用の測定
インヒビター活性を測定するために、トリス緩衝液（含有されるインヒビター０.０５ｍｏｌ／ｌ、ＮａＣｌ ０.１５４ｍｏｌ／ｌ、エタノール５％  ｐＨ８.０）２００μｌ、基質（Ｈ２Ｏ中のPefachrome UK またはＢｚ−βＡｌａ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ；Pentapharm Ltd., Basel, Schweiz）２５μｌおよびｓｃ−ウロキナーゼ（Ribosepharm GmbH, Haan, Deutschland）５0μｌを２５℃でインキュベートした。３分後、反応を酢酸（５０％）２５μｌの添加により中断し、マイクロプレートリーダー（Microplate Reader : MR 5000, Dynatech, Denkendorf, Deutschland）により吸光度を４０５ｎｍで測定した。Ｋｉ−値をコンピュータプログラムによる線形回帰によりジキソン（Dixon）に従って検出した。Ｋｉ−値は標準偏差が２５％を下回る、少なくとも３つの測定からの平均値である。
【００５２】
４.    （Ｎα−（２,４,６−トリイソプロピルフェニルスルホニル）−（Ｌ）−３−アミジノ−フェニルアラニン−４−エトキシカルボニル−ピペラジド（ｕＰＡ−インヒビター）および比較としてのＮα−２−ナフチル−スルホニル−３−アミジノフェニルアラニン−Ｎ′−メチルピペラジド（ナフチルスルホニル誘導体）によるトリプシン型の種々のセリンプロテアーゼのインビトロ阻害
【００５３】
【表２】
0004603162.tif 000008
【００５４】
使用した酵素に関する阻害作用の測定を実施例３に記載された原理により実施した。
【００５５】
前記の値から、本発明によるウロキナーゼ阻害物質ｕＰＡ−インヒビターがウロキナーゼに関して一本鎖ｔＰＡ（ｓｃ−ｔＰＡ）より１０分の１より小さいＫｉ−値を示すことが、明らかになる。こうして、本発明による物質は選択的なウロキナーゼインヒビターとして好適である。比較にはナフチルスルホニル誘導体の阻害活性を記載するが、明らかに低いインビトロ抗−ｕＰＡ−活性を示す。
【００５６】
５.  細胞毒性の測定
細胞増殖／細胞毒性の測定のためには、テトラゾリウム塩の細胞による変換に基づく、市販のテスト（Promega）を使用した。この反応から生じた有色生成物をＥＬＩＳＡ−スペクトロメータ（ＩＣＮ−フロー）を用いて定量することができる。合成インヒビター（白丸）は単独では溶剤（黒丸）に比較してヒト卵巣細胞ＯＶ−ＭＺ−６の細胞増殖に全く影響を与えなかった（図１）。こうして、本発明によるｕＰＡ−インヒビターは４０μＭまでの薬理学的に有効な濃度で細胞毒性でない。
【００５７】
６.  ヒト乳ガン細胞によるフィブリンマトリックスの分解の阻害
細胞外マトリックスを分解する腫瘍細胞の能力を試験するために、フィブリンマトリックス分解−テストを開発し、使用した。腫瘍細胞の蛋白質分解活性が大きいほど、マトリックス上澄み中のフィブリン分解生成物の濃度は高い。マトリックス分解能は、ＥＬＩＳＡ（Ｄ−ダイマー）により検出される、フィブリン分解生成物の濃度に相当する。
【００５８】
２４穴の培養プレート中で、ＰＢＳ（ｐＨ７.４）中のフィブリノーゲン（５０ｍｇ／ｍｌ）２００ｍｌから一穴あたりトロンビン（１０Ｕ／ｍｌ）５０μｌおよびＣａＣｌ２（１５０ｍＭ）５０μｌにより、３７℃で３０分間インキュベートすることによりフィブリンゲルを形成した。乳ガン細胞２×１０５をウシ胎仔血清１０％およびＧｌｕ−プラスミノーゲン２μｇをプラスしたＤＭＥＭ培養培地１ｍｌ中で、このフィブリンマトリックス上に播種し、４時間インキュベートした。その後、上澄みを遠心分離し、細胞を除去し、フィブリン分解生成物をＥＬＩＳＡにより定量した。異なる濃度での本発明によるインヒビター（Ａ）の添加は、乳ガン細胞によるフィブリン分解を全く阻害しないナフチル誘導体（Ｂ）に比べて、乳ガン細胞によるマトリックス分解を明らかに阻害する（図２）。
【００５９】
７.  ラット中での腫瘍の拡散、腫瘍の増殖および転移に関するｕＰＡインヒビターのインビボテスト
Ａ）乳ガンモデル
ラット乳ガン・腫瘍フラグメントＢＮ−４７２  １０〜２５ｍｍ３を生後６〜７週間の雌のブラウンノルウェーラットの乳腺の皮下脂肪下に皮下垂直方向に移植した（０日）。動物の処置を腫瘍接種の２４時間後に、腹腔内に開始した。各グループは８匹の動物からなる。対照グループは注射溶液（１０％エタノール／生理食塩水（０.９％ＮａＣｌ）溶液）のみを有する。ナフチル誘導体（Ｂ）の比較グループおよび本発明によるｕＰＡ−インヒビター（Ａ）の治療グループは前記溶液において体重１ｋｇあたり１ｍｇの投与量で毎日腹腔内投与した。処置は４週間の期間にわたって実施した。
【００６０】
皮下腫瘍の測定および動物の体重を毎週測定した。処置の最後に、動物を殺し、腫瘍の質量、器官の質量および関連組織中への転移の数を測定した。
【００６１】
ｕＰＡ−インヒビター（Ａ）での処置は、ナフチル−誘導体（Ｂ）およびインヒビターなしの対照グループに比較して、原発腫瘍質量ならびに腋窩リンパ節の明らかな減少（ｐ＝０.００３もしくはｐ＝０.００５）に導いた（図３および４）。ｕＰＡ−インヒビターで処置した動物においては肺、肝臓、腎臓および脾臓の質量は対照動物に対して変わらなかった。
【００６２】
Ｂ）膵臓ガンモデル
ラットの移植可能でかつ転移する膵臓腺腫ＣＡ２０９４８を供与動物から取りだした。細胞を個々に単離した後に、同量の懸濁させた腫瘍細胞を各マトリゲル（Matrigel）２ｍｇと一緒に受容動物である、生後１０週間の雄のルイスラット（ｎ＝９）のそれぞれに皮下移植した。処置の実施および処置グループの構成はＡ）に記載されたと同じである。
【００６３】
図５から明らかなように、本発明によるｕＰＡ−インヒビター（白丸）はナフチル誘導体（黒丸）および対照グループ（三角形）に比較して、生じたラット膵臓ガンにおける腫瘍質量の減少および増殖の低下が見られる。
【００６４】
Ｃ）変更した投与法で実験の繰り返し
Ａ項およびＢ項に記載した実験をインヒビターの異なる投与法で繰り返した。この際乳ガンモデルにおいてインヒビターの日用量を変化させることなく、皮下投与し（ｎ＝９）、および膵臓ガンモデルにおいては腹腔内投与した（ｎ＝８）。この繰り返し実験の結果はすでに示した結果に傾向および大きさに関して相当する。
【００６５】
Ｄ）結果の総括
全ての実験において、インヒビターでの処置により、対照グループに比較して、腫瘍の大きさもしくは腫瘍の質量の著しい減少、および次世代の腫瘍の数もしくは量の著しい減少が達せられた。乳ガンモデルにおいては、インヒビター処置グループは、ベヒクルで処置した対照に比較して処置の終わりに平均腫瘍質量が２３％（腹腔内）もしくは３７％（皮下）に減少した。インヒビター処置グループにおける肺の病巣の数は９％（腹腔内）もしくは３２％（皮下）に、腋窩リンパ節の平均質量は２７％（腹腔内）もしくは４８％（皮下）に減少した。
【００６６】
膵臓ガンモデルにおいては、それぞれベヒクルで処置したグループに比較して、インヒビター処置グループにおける腫瘍含有膵臓の量は７６％（腹腔内）もしくは３４％（皮下）に、皮下腫瘍の量は５４％（腹腔内）もしくは６０％（皮下）に減少した。インヒビター処置グループにおいて検出した肝臓の病巣の数はベヒクルで処置した対照グループに比較して２９％（腹腔内）もしくは２％（皮下）であった。
【００６７】
体重増加の展開およびインヒビター処置グループおよびベヒクル処置グループ間の器官質量の比較は、インヒビターの場合によってはあり得る毒性を、記載した条件下で全く示さない。
【００６８】
８.  ヌードマウスにおけるヒト乳ガンの処置
ヒト乳ガン細胞の腫瘍増殖を阻止するインヒビターのインビボ効果をテストするために（ＭＤＡ−ＢＡ−２３１）、Ｂａｌｂ／ｃヌードマウス（生後４〜６週間）の右側部に細胞６×１０６個を皮下注射した。接種する前に腫瘍細胞を合成ｕＰＡ−インヒビターと前インキュベートした。２４時間後、このマウスを体重１ｋｇあたり１.２ｍｇの投与量でＡ）で記載されたように一週間に２回腹腔内処置した。腫瘍の大きさは毎週２つの最も大きな直径を測定することにより決定した。
【００６９】
図６から明らかなように、腫瘍体積はｕＰＡ−インヒビター（白丸）の投与において生理食塩水中のエタノールが投与された対照グループ（黒丸）におけるより明らかにゆっくりと増加する。
【００７０】
９.  ラット中のインヒビターの生体内分布
インヒビターの生体内分布は、５日間もしくは１０日間１日１回インヒビター１ｍｇ／ｋｇで腹腔内処置したラットの組織砕解における２つの独立した実験において検査した。砕解のためには組織それぞれ１００ｍｇを機械的に破砕し、生理学的食塩液中の１％トリトン（Triton）Ｘ−１００ ２００μｌと混合した。エタノール４００μｌの添加後、この破砕物を１分間超音波処理した。組織抽出物を１２０００×ｇで１５分間遠心分離した。前精製のために、上澄みをメタノール１ｍｌおよび水１ｍｌで平衡にしたＣ１８−シリカ逆相前カラム（Sep-Pak（Ｒ）cartridge C18, 1ml Waters, Eschborn, Deutschland）上に担持し、順次Ｈ２Ｏ １ｍｌ×２、１０％メタノール１ｍｌ、Ｈ２Ｏ １ｍｌ、５％アセトニトリル、０.０４％過塩素酸１ｍｌおよびＨ２Ｏ １ｍｌで洗浄し、７５％アセトニトリル、０.０４％過塩素酸５００μｌで溶離した。ＨＰＬＣ−分析を逆相Ｃ１８シリカカラム上で、過塩素酸０.０４％を含有する５〜５５％アセトニトリル傾斜溶液で実施した。
【００７１】
それぞれ実験した組織タイプ中のインヒビターの濃度（μｇ／ｇ）ならびに血漿および胆汁中の濃度（μｇ／ｍｌ）および相当するナフチルスルホニル誘導体の比較のために、次の表を示した。
【００７２】
【表３】
0004603162.tif 000009
【００７３】
５〜１０日間後に、インヒビターは多くの実験した組織タイプ中に約１〜３μｇ／ｇで存在した。インヒビターの血漿濃度は、それぞれ最後の腹腔内投与の２４時間後に、平均組織濃度より１０-１から１０-２倍低い。このことから組織に対する高い親和性および低い血漿蛋白結合を結論づけることができる。比較例において５日間にわたって投与したナフチルスルホニル誘導体の濃度は、種々の組織において、２０分の１〜３０分の１である。
【００７４】
インヒビターはリンパ節中に目立って濃縮を示した。独立した実験において、５日間毎日の投与後に気管傍リンパ節中に５.３もしくは７.５μｇ／ｇ、１０日間毎日の投与後に２１.６もしくは１６.４μｇ／ｇが測定された。腫瘍細胞は規則的にリンパ管を介して転移するので、リンパ容器中へのインヒビターの特異的な富化は重要であり、抗転移治療剤としてのその使用に有利である。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明の物質の細胞毒性の測定の結果を示す図である。
【図２】  ヒト乳ガンによるフィブリンマトリックスの分解の阻止のための実験の結果を示す図である。
【図３】  ラット中での乳ガン細胞の拡散、増殖および転移に対する本発明による物質の作用を示す図である。
【図４】  ラット中での乳ガン細胞の拡散、増殖および転移に対する本発明による物質の作用を示す図である。
【図５】  ラット中での膵臓腫瘍の増殖に対する本発明による物質の作用を示す図である。
【図６】  マウス中でのヒト乳ガン細胞の増殖に関する本発明による物質の作用を示す図である。
【図１】
0004603162.tif 000010
【図２】
0004603162.tif 000011
【図３】
0004603162.tif 000012
【図４】
0004603162.tif 000013
【図５】
0004603162.tif 000014
【図６】
0004603162.tif 000015