(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
定義された量のＤＮＡ標的物質を、媒体中の他の物質から単離する方法であって、以下の工程、
ａ．前記ＤＮＡ標的物質を含有する媒体を供給する工程、
ｂ．定義できる量の前記ＤＮＡ標的物質と可逆的に結合可能な所定量のシリカ含有固形支持体を供給する工程であって、工程（ａ）で供給された前記ＤＮＡ標的物質の量が、前記シリカ含有固形支持体の結合能力を超えている工程、
ｃ．前記シリカ含有固形支持体と前記媒体とを混合することによって、前記シリカ含有固形支持体と前記ＤＮＡ標的物質との複合体を形成する工程、
ｄ．前記ＤＮＡ標的物質を有する前記複合体を前記媒体から除去する工程、及び
ｅ．前記複合体から工程（ｃ）の前記ＤＮＡ標的物質を分離し、それによって、定義された量の前記ＤＮＡ標的物質を得る工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
定義された量のＤＮＡ標的物質を、媒体中の他の物質から単離する方法であって、以下の工程、
ａ．前記ＤＮＡ標的物質を含有する媒体を供給する工程、
ｂ．定義できる量の前記ＤＮＡ標的物質と可逆的に結合可能な所定量のシリカ磁性粒子を供給する工程であって、工程（ａ）で供給された前記ＤＮＡ標的物質の量が、前記粒子の結合能力を超えている工程、
ｃ．前記シリカ磁性粒子と前記媒体とを混合することによって、前記シリカ磁性粒子と前記ＤＮＡ標的物質との複合体を形成する工程、
ｄ．外部磁場の印加によって、前記ＤＮＡ標的物質を有する前記複合体を前記媒体から除去する工程、及び
ｅ．前記ＤＮＡ標的物質を溶離することによって、前記複合体から工程（ｃ）の前記標的物質を分離し、それによって、定義された量の前記ＤＮＡ標的物質を得る工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項３】
前記シリカ磁性粒子が多孔性である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記シリカ磁性粒子が非多孔性である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記シリカ磁性粒子がシリカ質オキシド被覆磁性粒子である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記媒体がカオトロピック塩を含有する、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記カオトロピック塩がグアニジンチオシアネートを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
工程（ａ）で供給される前記ＤＮＡ標的物質がポリメラーゼ連鎖反応の生成物である、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記ＤＮＡ標的物質がゲノムＤＮＡである、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＤＮＡ標的物質がプラスミドＤＮＡである、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
さらにＤＮＡタイピングプロセスで、前記溶離されたゲノムＤＮＡを分析する工程を含む請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記媒体がＤＮＡ標的物質を含有する固形支持体であり、かつ工程（ｃ）の前に、前記固形支持体を、カオトロピック塩を含む混合物と混合することによって、前記ＤＮＡ標的物質を前記固形支持体から分離する、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
前記固形支持体が紙である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記混合物を約６０℃〜約100℃の温度に加熱する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
さらに、前記溶離されたＤＮＡ標的物質の少なくとも一部分を配列決定する工程を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１６】
さらに、前記複合体から前記ＤＮＡ標的物質を溶離する前に、前記媒体からの除去後、前記複合体を洗浄する工程を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１７】
前記複合体が、アルコール及び塩を含む洗浄溶液によって洗浄される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
工程（ｅ）で溶離される前記ＤＮＡ標的物質を、水で溶離する、請求項２に記載の方法。
【請求項１９】
定義された量のＤＮＡ標的物質を、媒体中の他の物質から単離する方法であって、以下の工程、
ａ．前記ＤＮＡ標的物質を含有する媒体を供給する工程、
ｂ．粒子１ミリグラム当たり定義できる量の前記ＤＮＡ標的物質と可逆的に結合する能力を有する所定量のシリカ磁性粒子を供給する工程であって、工程（ａ）で供給された前記ＤＮＡ標的物質の量が、前記粒子の結合能力を超えている工程、
ｃ．前記媒体、前記シリカ磁性粒子、及びカオトロピック塩を含む混合物であって、前記混合物中の前記カオトロピック塩濃度が、前記ＤＮＡ標的物質を前記粒子に付着させるのに十分である前記混合物を形成する工程、
ｄ．前記ＤＮＡ標的物質の少なくともいくらかが前記シリカ磁性粒子に付着されるまで、前記混合物をインキュベートする工程、
ｅ．外部磁力によって、前記混合物から、前記シリカ磁性粒子と、前記付着されたＤＮＡ標的物質とを除去する工程、及び
ｆ．前記粒子を溶離溶液にさらすことによって、前記シリカ磁性粒子から工程（ｅ）の前記ＤＮＡ標的物質を溶離し、それによって、定義された量の前記ＤＮＡ標的物質を得る工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２０】
前記ＤＮＡ標的物質がゲノムＤＮＡである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＤＮＡ標的物質がプラスミドＤＮＡである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
さらに、前記溶離されたＤＮＡ標的物質の少なくとも一部分を配列決定する工程を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記カオトロピック塩がグアニジンチオシアネートを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
工程（ｃ）で形成される前記混合物中の前記カオトロピック塩の濃度が約0.1Ｍ〜７Ｍである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
前記シリカ磁性粒子が多孔性である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
前記シリカ磁性粒子が非多孔性である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
さらに、前記粒子から前記ＤＮＡ標的物質を溶離する前に、前記媒体からの除去後、前記シリカ磁性粒子を洗浄する工程を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
前記粒子が、アルコール及び塩を含む洗浄溶液によって洗浄される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２９】
前記溶離溶液が水である、請求項１９に記載の方法。
【請求項３０】
関心のある試料タイプ中のＤＮＡ標的物質を定量するための校正モデルを決定する方法であって、以下の工程、
ａ．第１の量の前記関心のある試料タイプを含む第１媒体を供給する工程、
ｂ．第２の量の前記関心のある試料タイプを含む第２媒体を供給する工程であって、前記第２の量が前記関心のある試料タイプの第１の量を超えている工程、
ｃ．第１の量の前記ＤＮＡ標的物質と可逆的に結合可能な第１の所定量のシリカ磁性粒子を、前記第１媒体と混合し、それによって前記第１媒体から、前記シリカ磁性粒子と前記ＤＮＡ標的物質との第１複合体を形成する工程であって、前記ＤＮＡ標的物質を含む第１媒体中の関心のある試料タイプの所定量が、前記第１媒体と混合した粒子の結合能力を超えている工程、
ｄ．第２の量の前記ＤＮＡ標的物質と可逆的に結合可能な第２の所定量の、シリカ磁性粒子を、前記第２媒体と混合し、それによって前記第２媒体から、前記シリカ磁性粒子と前記ＤＮＡ標的物質との第２複合体を形成する工程であって、前記ＤＮＡ標的物質を含む第２媒体中の関心のある試料タイプの所定量が、前記第２媒体と混合した粒子の結合能力を超えている工程、
ｅ．外部磁場の印加によって、前記第１媒体から前記第１複合体を、及び前記第２媒体から前記第２複合体を除去する工程、
ｆ．前記第１複合体及び前記第２複合体から、別々に前記ＤＮＡ標的物質を溶離し、前記第１複合体から単離されたＤＮＡ標的物質の第１溶離液と、前記第２複合体から単離されたＤＮＡ標的物質の第２溶離液を生成する工程、及び
ｇ．前記第１溶離液及び前記第２溶離液中のＤＮＡ標的物質の量を決定する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項３１】
工程（ｃ）で供給される粒子の前記所定量が、工程（ｄ）で供給される粒子の前記所定量と同一量である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記媒体が固形媒体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
前記媒体が紙である、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
前記媒体がスワブである、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
前記媒体が法医学試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
工程（ｃ）をカオトロピック塩の存在下で行う、請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
工程（ｃ）の前に前記媒体をカオトロピック塩と接触させ、該接触させた媒体を約６０℃〜１００℃の温度に加熱する、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、媒体中の他の物質から、定義された量のＤＮＡ標的物質を単離し、さらに処理又は分析するために適量の単離ＤＮＡ標的物質を生成する方法に関する。本発明は、詳細には、シリカ又はシリカ誘導体を含む磁気応答性粒子のような、定義できる量のＤＮＡ標的物質を可逆的に結合可能なシリカ含有固形支持体を用いて、定義された量のＤＮＡ標的物質を単離する方法に関する。
【０００２】
発明の背景
特定媒体中に存在するＤＮＡ標的物質の試験に関わる多くの分析法は、そのＤＮＡ標的物質が媒体中の他の物質から単離され、媒体から単離後に定量化される場合にのみ効を奏する。法医学的試料（例えば、犯行現場から収集された体液、容疑者から収集された血液又は頬側細胞等）中の他の成分からＤＮＡ標的物質を単離することは、試料中に存在する他の成分が該ＤＮＡ標的物質の分析を妨害しないことを保証するために重要である。不幸にも、法医学的試料は、非常に小さいか或いはひどく分解されていることが多く、その試料から単離されたＤＮＡ標的物質の定量化は時間がかかり、かつ困難である。さらに、所定量の血液中に存在する白血球の量は個体間でばらつきがあり、単離されるＤＮＡの量のばらつきをさらに増大させる。
【０００３】
親子鑑定及び犯罪現場に存在する生体試料の識別用の手段としてのＤＮＡタイピングの出現とともに、少量のゲノムＤＮＡを単離かつ定量するための信頼できる方法を開発することが必要になった。米国では、このようなシステムを開発する必要性は、ヒトゲノムＤＮＡの13個のショートタンデムリピート（“ＳＴＲ”）座からの分析結果のデータベースについての連邦捜査局設立に由来している。これら結果は、混合ＤＮＡ索引システム(combined DNA Index System)（“ＣＯＤＩＳ”）と呼ばれる集中化データベースに入れられている。ＳＴＲ分析システムは、増幅反応の使用に基づいており、極少量の、ナノグラムより少ない量でさえ分析可能にする。しかし、増幅は、増幅すべきＤＮＡの量が定義された範囲内であり、かつ増幅反応を阻害或いは妨害しうる混入物からＤＮＡが実質的に単離されている場合にのみ、うまく機能する。従って、ＳＴＲ座を増幅かつ分析する前に、標的ＤＮＡを精製かつ定量化して、増幅アーチファクトを観察するという危険を低減しなければならない。定量化は、ＤＮＡ配列決定のような他の処理でも重要である。
【０００４】
遺伝的同定タイピング用途でゲノムＤＮＡを単離及び定量するために現在使用されている手順は時間がかかり、かつあまりにとりとめがなく、自動化に適用できない。例えば、通常以下の手順を利用して、ＣＯＤＩＳ座のようなＳＴＲ座の増幅及び分析用にゲノムＤＮＡを単離及び定量している。第１に、種々の装置及び量を用いて個体から血液又は頬側スワブを得る。第２に、これら試料を処理して不定な純度と統合性のＤＮＡを単離する。第３に、適量を使用してアーチファクトを回避できるように、このＤＮＡを下流手順用に定量化する。第４に、分析すべき各ＳＴＲ座に特異的なプライマーを含む反応でＤＮＡを増幅する。最後に、増幅生成物を遺伝子型同定用のゲル又はキャピラリー電気泳動システムで分析する。全13個のＣＯＤＩＳ座を共増幅かつ分析する用途で設計された市販システムについては、GenePrint(登録商標)PowerPlexTM1.1及びGenePrint(登録商標) PowerPlexTM1.2システムを参照せよ（Promega Corporation,Madison,Wisconsin）。
【０００５】
白血球は、血液中のＤＮＡの主要ソースである。血液の白血球含量には、個体間の可変性又は該試料が得られた時点の個体の健康に基づく所定個体由来の試料の可変性のため、かなりの可変性がある。頬側スワブ試料中にも同様の可変性が存在し、使用するスワブのタイプの可変性、及び試料処理前の試料の貯蔵条件によって複合されている。
【０００６】
ポリメラーゼ連鎖反応による増幅について、上記ＤＮＡタイピング分析用のゲノムＤＮＡ増幅の文脈内でも以外でも、鋳型が少なすぎるとバンド強度が低くなり、或いは結果としてバンド増幅が起こらない。過剰なＤＮＡ鋳型は、しばしば過剰増幅に帰する。過剰増幅は、過剰な数のアーチファクトピーク及びスタッタ(stutter)バンド--主要な対立遺伝子ピークの真下の小さいピークとして定義される--によってわかる。また、高発生率のバックグラウンド活性及び多重の異なった色のバンドを分離できないこととして定義される“プルアップ(pull-up)”もありうる。過剰のアーチファクトが存在する場合は、より少量のＤＮＡの再増幅が必要かもしれない。スタッタバンドは、過剰のＤＮＡが存在し、かつＰＣＲ増幅生成物の分離にキャピラリー電気泳動法を使用する場合に特に顕著である。また、配列決定におけるように、全長増幅生成物の生産は、多すぎる鋳型ＤＮＡが存在するときに阻害されうる。換言すれば、ＰＣＲ増幅において、過剰の鋳型ＤＮＡは、部分増幅断片の存在と、完全増幅生成物の低量をもたらす。
【０００７】
さらに具体的には、法医学的用途でＰＣＲ又は他の増幅法を用いてＤＮＡを増幅する場合、単一反応でＤＮＡがあまりに多く増幅されると、その試料は過剰増幅され、かつ予測バンドのシグナル強度が検出器の所望範囲外に減少する傾向にある。伝統的には、これら困難はＤＮＡの精製後にＤＮＡを定量化することによって最小化されるが、付加的な工程、時間及び費用を必要とする。遺伝的同一性試験では、利用する分析システムで推奨される以上のＤＮＡが存在すると、解釈不能の結果を招き；このことが、特に法医学的分析の場合の非常に限定された試料を浪費しうる。
【０００８】
核酸の正確な定量化を必要とする別のＤＮＡ処理は配列決定である。ＤＮＡの配列決定は、媒体中に存在する配列決定反応を妨害しうる他の物質から単離された標的ＤＮＡの試料について行うと最善である。配列決定反応の開始前に標的ＤＮＡの試料を定量することも必要である。例えば、ＤＮＡ配列決定の分野では、配列決定反応におけるＤＮＡ鋳型の量はかなり狭い範囲内でなければならない。例えば、プラスミドＤＮＡを使用する場合、BigDyeTM Chemistry（Perkin Elmer  Biosystems）による自動化配列決定を用いるときは150〜300ngのＤＮＡが推奨される。同一の配列決定システムで配列決定鋳型としてＰＣＲ生成物を使用するときは、40〜80ngのＤＮＡが推奨される。鋳型があまり多すぎると、短い配列読み長さ、乏しい分解能又は高いエラー率という結果になる。鋳型が少なすぎると、最適な配列解読にはシグナル強度が弱すぎる。
【０００９】
プラスミドＤＮＡは、通常、配列決定反応用ＤＮＡのソースである。１個体群の細菌培養内のプラスミドＤＮＡ含量には、細胞当たりのプラスミドコピー数の可変性、用いる増殖培地の可変性、及び細胞集団の濃度のような因子によるかなりの可変性がある。
現在、試料中のＤＮＡ標的物質を定量化するのに種々の方法が使用されている。このような方法の１つは、分光光度的定量である。この方法では、そのＤＮＡ標的物質の最大吸収に対応する波長で、未知濃度の試料の吸光度数が読み取られる。例えば、260ナノメーター（nm）（“Ａ260”）における吸光度を用いて溶液中のＤＮＡ濃度が決定され、280nm（“Ａ280”）における吸光度を用いて溶液中のタンパク質濃度が決定される。260nmにおける吸光度数１は、二本鎖ＤＮＡでは１ミリリットル当たり約50マイクログラム（50μg）(μg/ml）に対応し、一本鎖ＤＮＡ及びＲＮＡでは40μg/mlに対応し、一本鎖オリゴヌクレオチドでは約20μg/mlに対応する。260nmと280nmの表示度数の比（“Ａ260/Ａ280”）は、ある標的核酸が、280nmで吸収するタンパク質及び他のいずれの物質からも単離されている程度の評価を与える。純粋な核酸調製品は少なくとも約1.8のＡ260/Ａ280値を有する。分光光度法の限界は、低量の核酸を検出かつ定量化するのに使用するには感度が十分でないことである。試料中の核酸濃度がミリリットル当たり約500ナノグラム（ng/ml）未満の場合、又は試料が紫外線を吸収若しくはクエンチする他の物質で汚染されている場合、不正確な結果が得られる。
【００１０】
単離後ＤＮＡを定量化する別の方法は、臭化エチジウム、SyberGreen（Molecular Dynamics,Sunnyvale,CA）又はPicoGreen（Molecular Probes,Eugene,OR）のような挿入染料を使用することである。正確に分光光度的に測定するにはＤＮＡが十分でない場合に、よく染料が使用される。臭化エチジウムの蛍光量は、紫外線源で可視化される場合、ＤＮＡの総質量に比例する。従って、既知量のＤＮＡと未知濃度の試料の既知量との標準曲線をアガロースゲル中で分析操作し、次いでゲルを臭化エチジウムで染色し、かつＵＶ光で見ることができる。このタイプのゲルは収量ゲルと呼ばれる。試料中のＤＮＡの量は、試料の蛍光を標準物質の蛍光と比較することによって評価できる。同様に、この方法はＤＮＡ挿入染料を有する溶液中で実施できる。約25pg/ml程度の低濃度のＤＮＡは、PicoGreenで検出しうる。溶液中のＤＮＡを定量化するための収量ゲル法又は染料使用の限界は、別のＤＮＡ試料と比較した収量の視覚的、分光光度的又は蛍光定量的な近似値を必要とすることである。この方法で得られる結果は可変性が高く、かつＤＮＡ試料中の混入成分が原因でエラーが生じやすい。
【００１１】
単離後の低量のヒトゲノムＤＮＡの定量化のために少なくとも２つの市販キットが入手可能である。これは、Life Technologies,Inc.（Gaithersburg,MD）製のACESTM 2.0ヒトＤＮＡ定量化プローブプラスシステムと、PE Applied Biosystems（Foster City,CA）製のQuantiblot(登録商標)ヒトＤＮＡ定量化キットである。これらキットは、通常ヒトＤＮＡで遺伝的同一性試験を行う研究室で使用される。Quantiblot(登録商標)システムは、単離ＤＮＡ試料に対する霊長類特有のビオチン化オリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションに基づいている。検出は、比色分析又は化学発光法のどちらでもよく；いずれの検出法も0.15〜10ngのヒトＤＮＡを定量化できる。しかし、試験は２時間までかかる。さらに、化学発光法はＸ線フィルム及び加工能力を必要とし、かつ霊長類由来のＤＮＡに対してのみ使用できる。ACESTMシステムは、同様のシステムであり、ＤＮＡ試料の膜への結合及びヒト特異的ＤＮＡプローブへのハイブリダイゼーションと蛍光による可視化が必要である。このシステムは0.04〜40ngのヒトＤＮＡを定量化できる。これら両システムは、挿入染料の限界と同一の限界を有し；すなわち、これら方法は、別のＤＮＡ試料と比較したその収量の視覚的な近似値を必要とする。
【００１２】
本分野では、過剰のＤＮＡ標的物質を含有する試料から、定義された量のＤＮＡ標的物質を除去できる方法が要望されている。この定義されたＤＮＡ量は、引き続き、解釈可能な結果を得るには過剰ＤＮＡの存在が有害である技法で使用できる。このような技法としては、限定するものではないが、ＰＣＲ増幅、ＳＴＲ分析、ＤＮＡ配列決定及び遺伝的同一性試験が挙げられる。
さらに、現存する定量化システムは、容易には自動化できず、かつＤＮＡ調製品中に残存する混入物に対して感受性であることが多い。分析してデータベース化すべく計画されている試料数が膨大なため、低処理能力ニーズを犠牲にせずに、従来のＳＴＲベースの工程を連結する高処理能力プロセスが望ましい。精製プロセスでＤＮＡを定量化する、試料からＤＮＡを単離するシステムは、１つのプロセス工程を排除し、かつ技術的に重大な進歩だろう。従来の定量化法よりもアーチファクトに対して低感受性なプロセスも望ましいだろう。
【００１３】
発明の概要
本発明は、定義された条件下、媒体からＤＮＡ標的物質を固相に吸着させ、該生体物質の定義された量を第２溶液中に移行させる。本方法に従って第２溶液中に移行された標的ＤＮＡは、別個の定量化工程なしで、配列決定用の鋳型又は増幅反応用の鋳型として使用できる。この技法は、下流プロセシング又は分析前に単離標的物質を別個に定量化する必要がないので、該方法は時間を節約し、かつそれ自体自動化に適合する。
本システムは、磁性粒子をベースとする分離によって細胞試料中の他の物質からＤＮＡ標的物質を単離することを含む。このアプローチは、磁気的分離が、低処理能力の手動形式又は高処理能力のロボット形式のどちらでも利用できるので、プロセシングのフレキシビリティーを斟酌する。
【００１４】
手短に言えば、一局面では、本発明は、媒体中の他の物質から、定義された量のＤＮＡ標的物質を、（ａ）前記ＤＮＡ標的物質を含有する媒体を供給し；（ｂ）前記ＤＮＡ標的物質の定義できる量と可逆的に結合可能な所定量(discrete quantity)のシリカ磁性粒子を供給し；（ｃ）前記シリカ磁性粒子を前記媒体と混ぜることによって、前記磁性粒子と前記ＤＮＡ標的物質との複合体を形成し；（ｄ）外部磁場の印加によって、前記媒体から前記ＤＮＡ標的物質を含有する前記複合体を除去し；かつ（任意に）（ｅ）前記ＤＮＡ標的物質を溶離して前記ＤＮＡ標的物質を複合体から分離することによって単離する方法を含み、それによって、定義された量の前記ＤＮＡ標的物質が得られる。好ましくは、工程（ａ）で供給されるＤＮＡの量は、前記粒子の可逆的な結合能力を超えている。引き続く用途及び供給されるシリカ磁性粒子の量によって、溶離工程が不要なこともある。
【００１５】
上記方法は、シリカ磁性粒子以外のシリカ含有固形支持体を用いても行うことができる。他のシリカ含有固形支持体を使用する場合、ＤＮＡ標的物質を含有する複合体は、遠心分離又はろ過のような種々の方法で媒体から除去できる。
本発明の方法の好ましい実施は、以下の工程を含む。ＤＮＡ標的物質を含有する特定タイプの媒体の試料をカオトロピック塩の存在下磁性粒子と混合するが、ここで前記磁性粒子は、このタイプの媒体由来のＤＮＡ標的物質を吸着するための既知又は定義できる能力を有する。この試料のタイプが細胞の場合、細胞は溶解されて溶液中にＤＮＡ標的物質を遊離し、そこでそれが粒子と複合体を形成する。他の細胞成分を洗い流した後、ＤＮＡ標的物質は、分離体積で溶離され、その結果、定義されたＤＮＡ標的物質濃度の溶液になる。本方法は、限定するものではないが、全血、白血球、精子細胞、頬側細胞、又は細菌細胞を含む種々多様な異なる試料タイプからＤＮＡ標的物質を単離する用途に好適である。好ましい実施形態では、試料中に存在するＤＮＡの量は、粒子の結合能力を超えている。このような試料は、限定するものではないが、液体状態、凍結乾燥され、犯罪現場で発見された物質上で乾燥され、又は固形支持体上に載っている状態（例えば、スワブ上の頬細胞又はろ紙上の血液細胞）を含む多くの異なる形態のいずれでも存在することができる。必要ならば、さらなる工程を利用して固形支持体から細胞を取り除くことができる。この精製されたＤＮＡ標的物質は、溶離溶液内に貯蔵され或いは磁性粒子に付着されたままでよい。このように、必要ならば、ＤＮＡ標的物質の複数試料を得、かつ使用することができる。
【００１６】
別の局面では、本発明は、好ましい形態のシリカ粒子、すなわちシリカ質オキシド被覆磁性粒子を用いて、媒体中の他の物質から、定義された量の標的ＤＮＡ物質を単離する方法であり、前記好ましい粒子は、粒子ミリグラム毎に定義できる量の標的ＤＮＡ物質と可逆的に結合可能である。本発明のこの局面は、以下の工程を含む。標的ＤＮＡ物質、シリカ質オキシド被覆磁性粒子、及びカオトロピック塩を含有する媒体を含む混合物が形成される。この塩濃度は、標的ＤＮＡ物質を粒子に付着させるのに十分である。ＤＮＡが混合物中のシリカ質オキシド被覆磁性粒子に付着されるまで、混合物をインキュベートし、又は混合状態にさせておく。そして、磁力を用いて混合物からシリカ質オキシド被覆磁性粒子を除去する。粒子を溶離溶液と接触させて、定義された量の標的ＤＮＡ物質をシリカ質オキシド被覆磁性粒子から溶離する。
【００１７】
さらなる局面では、本発明は、ＤＮＡ標的物質を含有する媒体から、定義された量のＤＮＡ標的物質を単離するためのキットである。本キットは、第１容器内の水溶液中に懸濁された所定量のシリカ質オキシド被覆磁性粒子を含み、ここで該粒子は特有の試料タイプ用媒体から定義できる量のＤＮＡ標的物質と可逆的に結合する能力を有する。任意に、本キットは本発明の方法に従って、ＤＮＡ標的物質を含有する媒体から、定義された量のＤＮＡ標的物質を単離するために必要な他の成分を含んでよい。例えば、本キットは、第２容器内のカオトロピック塩と第３容器内の洗浄溶液及び使用説明書を含みうる。
【００１８】
本発明のさらに別の局面は、関心のある試料タイプ中のＤＮＡ標的物質を定量化するための校正モデルを決定する方法であって、以下を含む方法である：（ａ）関心のある試料タイプの所定量を含有する第１媒体を供給する工程；（ｂ）関心のある試料タイプの異なった所定量を含有する第２媒体を供給する工程；（ｃ）第１所定量のシリカ磁性粒子を前記第１媒体と混合する工程であって、定義された量の前記シリカ磁性粒子は前記ＤＮＡ標的物質と可逆的に結合でき、それによって、前記第１媒体から前記シリカ磁性粒子と前記ＤＮＡ標的物質との第１複合体を形成する工程；（ｄ）第２の所定量のシリカ磁性粒子を前記第２媒体と混合する工程であって、前記シリカ磁性粒子は、定義された量の前記ＤＮＡ標的物質と可逆的に結合でき、それによって、前記第２媒体から前記シリカ磁性粒子と前記ＤＮＡ標的物質との第２複合体を形成する工程；（ｅ）外部磁場の印加によって、前記第１媒体から前記第１複合体を、及び前記第２媒体から前記第２複合体を除去する工程；（ｆ）前記第１複合体及び第２複合体から別々に前記ＤＮＡ標的物質を溶離し、前記第１複合体から単離されたＤＮＡ標的物質の第１溶離液、及び前記第２複合体から単離されたＤＮＡ標的物質の第２溶離液を生成する工程；（ｇ）第１溶離液中及び第２溶離液中のＤＮＡ標的物質の量を決定する工程。好ましくは、工程（ｃ）で供給される粒子の第１所定量は、工程（ｄ）で供給される第２の所定量の粒子と同量である。
【００１９】
１つの校正法は、実施例３で説明するように、最少試料サイズ（入手可能なＤＮＡの最少量）からの標的ＤＮＡの精製において、そのＤＮＡ標的物質が過剰に存在し、かつその結果精製される標的ＤＮＡも所望の標的範囲であるために必要な粒子の量を決定する工程を含む。最少試料サイズから要求される粒子の量を決定した後、より大きい試料サイズからの精製も所望範囲の濃度又は収量の精製標的ＤＮＡを生じるように保証することが重要である。この方法は、一般的に所望範囲の試料サイズから確実に得ることができるＤＮＡの最大量を決定し、ここで各試料から得られる標的ＤＮＡの量は標的ＤＮＡの所望の定量的範囲内にある。
【００２０】
別の校正法は、実施例８で説明するように、大過剰のＤＮＡ標的物質を含有することがわかっている試料サイズを使用することに依存するので、精製で用いる粒子の範囲は、得られるＤＮＡ標的物質の量を制限する因子であることがわかる。この方法を使用して、その用途にとって所望の有用性、及びその用途にとって要求される範囲内の標的ＤＮＡ量の精製をもたらす精製で用いる粒子の量を与える、標的ＤＮＡの最高量と最低量との間の関係が作られる。標的物質がＤＮＡの場合、校正モデルを構成するために生成される各溶離液中に存在する標的物質の量は、上述したように、好ましくはDNAQuant又はPicoGreen分析で決定される。
【００２１】
この発明が有用である種々の適用がある。２つのこのような分野としては、ＤＮＡ配列決定、特に自動化ＤＮＡ配列決定、及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような核酸増幅反応を含む遺伝分析が挙げられる。これら各適用では、ＤＮＡ標的物質の量は、明確な範囲内で維持されなければならない。遺伝分析としては、例えば、法医学的又は親子鑑定事例で使用される遺伝的識別、及び臨床研究所で使用される遺伝分析が挙げられる。このような場合、各増幅反応中のＤＮＡ標的物質の量がほぼ同一であることが有益である。一貫した量は、ゲル分析における一貫性のバンド強度及び限定されたアーチファクトにつながる。本発明は、転写媒介増幅のような他の増幅システムと共に使用してもよい。
【００２２】
本方法は、好ましいプラクティスでは、複数試料からＤＮＡ標的物質を同時に単離及び定量化することを考慮しているので、容易に自動化に適合できる。例えば、本方法を使用して、ある集団の複数個体から採取した血液又は他の組織試料から、定義された量の標的ゲノムＤＮＡを単離することができる。そして、その単離かつ定量化されたゲノムＤＮＡのＳＴＲ座のような関心のある座を、多くの公知の遺伝分析法のいずれによっても増幅かつ分析することができる。例えば、Promega CorporationのGenePrint(登録商標)ＳＴＲ分析システムを参照せよ。直前に述べたように使用して単離し、定量化し、かつＣＯＤＩＳ座のような複数のＳＴＲ座を複数反応で（例えば、PromegaのGeneGreen(登録商標)PowerPlexシステムを用いて）共増幅する場合、このようなＤＮＡタイピング結果のデータベースの情報量は急速に増えるだろう。このようなデータベースにあるデータが増えるほど、個体の識別、特に法医学的適用にとってデータベースが有用である。
【００２３】
本発明の方法で単離されたＤＮＡ標的物質は、標準的な分子生物学的方法によってさらに加工又は分析するのに十分に混入物質がない。種々の異なった媒体から種々の異なったＤＮＡ標的物質を単離かつ定量化するための本発明の適用については、以下の本発明の詳細な説明から明らかになるだろう。
以下の詳細な説明及び特許請求の範囲のレビューに基づき、当業者には本発明の他の特徴、利点及び有用性が明らかになるだろう。
【００２４】
発明の詳細な説明
ここで、部分的に以下の用語の定義を参照して、本発明を詳細に説明する。
本明細書で使用する場合、用語「定義された量」は、比較的狭い範囲内の量を意味する。範囲が未知の場合、詳細な説明で後述するように、特有の試料タイプ及び粒子タイプに適した範囲（すなわち、定義できる量）を決定しうる。範囲の変異は、部分的には、校正モデルを作るために利用される定量化法による制限に原因する。
「試料タイプ」は、ＤＮＡ標的物質を含有する試料の形態及びソースを意味する。種々の試料タイプが含まれ、限定するものではないが、液状血液、紙又はスワブのような固形支持体上の乾燥血液、頬側細胞、唾液等が挙げられる。
用語「ＤＮＡ標的物質」はＤＮＡを指し、限定するものではないが、プラスミドＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、染色体ＤＮＡ、制限酵素の消化によって生成されるＤＮＡ断片、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような増幅反応によって生成される増幅ＤＮＡ及び一本鎖ＤＮＡが挙げられる。
【００２５】
用語「校正モデル」は、特定の反応条件、試料タイプ及び粒子タイプに特有の１セットのデータを指し、精製によって得られたＤＮＡ標的物質の定義された量に対する粒子及び試料の量の相互関係を明かにする。
用語「シリカ含有固形支持体」は、定義された量のＤＮＡ標的物質を可逆的に結合できるシリカ又はシリカ誘導体を含む固形支持体（シリカ紙又はシリカ膜のような）を意味する。シリカは固形支持体上に被覆され又はその中に取り込まれていてもよい。シリカ磁性粒子は、特に好ましいシリカ含有固形支持体である。詳細な説明は、非常に好ましいシリカ磁性粒子の使用を指向しているが、本発明は他のシリカ含有固形支持体を利用するプロセスをも予想している。
用語「単離する」及び「から単離された」は、何らかの混入物が標的物質から除去されることを意味する。
【００２６】
本明細書で使用する場合、用語「磁性粒子」は、磁場は持たないが、磁場にさらされると磁気双極子を形成する物質、すなわち磁場の存在で磁化されうるが、磁場がないときはそれ自体磁気的でない物質を指す。この文脈で使用される場合、用語「磁性」は常磁性又は超常磁性を含む。本明細書で使用する場合、用語「磁性」は、低いキューリー温度を有する強磁性又はフェリ磁性体のような一時的な磁性体をも包含するが、このような一時的な磁性体は、このような物質を含有するシリカ磁性粒子が本発明によって生体物質を単離するために使用される温度範囲で常磁性であることを条件とする。
【００２７】
磁性粒子は、多年、タンパク質又は抗体のようなポリペプチド分子を単離及び精製するために使用されている。しかし、近年は、磁性粒子及び磁性粒子を使用する方法は、核酸物質の単離用に開発されている。核酸単離用に設計されたいくつかの異なるタイプの磁性粒子が文献に記載され、かつそれらタイプの粒子の多くは市販されている。このような粒子タイプの１つは、好ましくは孔径が調節された磁気応答性ガラスビーズである。例えば、CPG,Inc.（Lincoln Par,New Jersey,U.S.A.）製の磁性多孔性ガラス（ＭＰＧ）粒子；又は米国特許第4,395,271号；第4,233,169号；若しくは第4,297,337号（これらは参照によって本明細書に取り込まれる）に記載されている多孔性磁気ガラス粒子を参照せよ。しかし、核酸物質は、ガラスにとても密接に結合するので、一度ガラスに結合すると取り除くのが困難になる傾向がある。従って、磁性ガラス粒子からの溶離効率は、シリカのような物質を結合している少量の核酸を含有する粒子からの溶離効率と比較して低い傾向にある。直接結合して核酸を単離するために設計された第２タイプの磁気応答性粒子は、より小さい強磁性粒子で包埋され、かつガラスで被覆されたアガロースで構成される粒子である。例えば米国特許第5,395,498号を参照せよ。
【００２８】
用語「シリカ磁性粒子」は、シリカゲル、シリカ質オキシド、ガラス若しくは珪藻土のような固形シリカ、又は上記の２種以上の混合物を指す。ここで使用する場合、用語「シリカゲル」は、クロマトグラフィーグレードシリカゲル、多くの異なるソースから商業的に入手可能な物質を指す。シリカゲルは、最も一般的には、シリケート、例えばケイ酸ナトリウムを含有する溶液を酸性にして１０又は１１未満のｐＨにしてからその酸性化溶液をゲルにすることによって調製される。例えば、化学技術のKirk-Othmer百科事典、第６巻、第４版、Mary Howe-Grant,ed.,Jhon Wiley&Sons,pub.,1993,pp.773-775のシリカ調製の議論を参照せよ。用語「シリカ磁性粒子」は、本明細書で使用する場合、好ましくはシリカ磁性粒子１ミリグラム当たり定義できる量のＤＮＡ標的物質を結合する能力を有する上述の特性を持つ粒子を指す。本発明で使用するシリカ磁性粒子は、好ましくはさらにシリカゲルマトリックス中に取り込まれた強磁性体を含む。
【００２９】
ＤＮＡ標的物質を単離かつ定量化するこの発明の方法は、定義できる量のＤＮＡ標的物質を可逆的に結合可能ないずれのシリカ被覆固体材料を使用しても実施できる。しかしながら、本発明の方法は、好ましくは、参照によって本明細書に取り込まれるＰＣＴ公開番号WO98/31840で開示されているシリカ質オキシド(siliceous-oxide)被覆シリカ磁性粒子（「ＳＯＣＭ粒子」）を使用して実施される。本発明は、好ましくは以下の物理的特性を有するシリカ磁性粒子を用いて実施される。
この発明の方法で用いるシリカ磁性粒子は、多くの異なるいずれのサイズでもよい。用いるタイプの粒子を校正して、試料タイプに対するそのＤＮＡ結合能力を決定する。より小さいシリカ磁性粒子は、吸着のためにより大きい表面積（１質量単位基準当たり）を与えるが、より小さい粒子は、より大きい粒子に比し、このような粒子中に取り込むことのできる磁性体の量に限界がある。本発明で用いる多孔性シリカ磁性粒子の中間粒径は、好ましくは約１〜２５ミクロン、さらに好ましくは約３〜１５ミクロンである。粒度分布も変えることができる。しかし、比較的狭い粒度分布が好ましい。粒度分布は、好ましくは粒子の約８０質量％が中間粒径あたりの１０ミクロン範囲以内であり、さらに好ましくは８ミクロン範囲以内、最も好ましくは６ミクロン範囲以内であるような粒度分布である。
【００３０】
本発明の磁性粒子は、多孔性又は非多孔性でよい。磁性粒子が多孔性の場合、孔は、好ましくは標的核酸物質を固相粒子の内部に収容し、かつ該孔の内面上の官能基又はシリカに結合するのに十分な大きさにサイズ範囲が調節されている。磁性粒子が多孔性シリカ磁性粒子の場合、窒素ＢＥＴ法で測定される各シリカ磁性粒子の総孔容積は、好ましくは粒子質量の少なくとも約0.2ml/gである。本発明のｐＨ依存性イオン交換マトリックスの成分としての使用に特に好まれる多孔性シリカ磁性粒子の総孔容積は、窒素ＢＥＴ法で測定される場合、好ましくは該孔容積の少なくとも約５０％が直径600Å以上の孔内に包含される。非常に好ましい多孔性シリカ磁性粒子は、以下の特性を有する：約5.0〜8.5ミクロンの平均粒径、約１８〜５５ミクロン/gmのＢＥＴ表面積、及び約７ppmＦｅ2Ｏ3未満の酸浸出抵抗性。このような粒子は、Promega Corporationから多孔性MagneSilTM粒子として入手可能である。
【００３１】
用語「非多孔性」は、本明細書では本発明で用いるシリカ磁性粒子を指すために使用し、それらが仮に何らかの孔を有するとしても、直前で述べた多孔性シリカ磁性粒子よりもずっと小さい孔を有する。具体的には、「非多孔性」磁性粒子の孔は、小さすぎてＤＮＡ標的物質を収容できない。非多孔性粒子は、同径の多孔性粒子に比し、表面積も小さく、かついずれの所定ＤＮＡ標的物質を吸着する能力も少ない。この相違の結果として、同グラム質量の粒子を使用して同一媒体からＤＮＡ標的物質を単離する場合、多孔性粒子は、非多孔性粒子よりも多量のＤＮＡ標的物質を結合かつ遊離する大きい能力を有する。しかし、非多孔性粒子を用いて単離されたＤＮＡ標的物質は、含有混入物が少ない傾向にある。非常に好ましい非多孔性シリカ磁性粒子は、以下の特性を有する：約14.5ミクロンの平均粒径、約３ミクロン/gmのＢＥＴ表面積、及び約２ppmＦｅ2Ｏ3未満の酸浸出抵抗性。このような粒子は、Promega Corporationから非多孔性MagneSilTM粒子として入手可能である。
少なくとも２種の市販シリカ磁性粒子は、本発明の使用に特に好ましく、PerSeptive Biosystems製のBioMag(登録商標)Magnetic Particles、及びPromega Corporationから入手可能な多孔性及び非多孔性MagneSilTMシリカ磁性粒子である。
【００３２】
「複合体」は、ＤＮＡ標的物質が付着されたシリカ磁性粒子又は他のシリカ含有固形支持体を指す。ＤＮＡ標的物質の少なくとも一部は、適切な条件下で該シリカ磁性粒子から遊離（すなわち、可逆的に結合）されうる。遊離されるＤＮＡ標的物質の正確な割合は、所定セットの反応条件に対して相対的に一貫している限り重要でない。
用語「カオトロピック塩」は、本明細書で使用する場合、水溶液中に十分高濃度で存在するとき、その中に存在するタンパク質を変性し、かつ核酸に第２構造を失わせる特有イオンの塩を意味する。カオトロピックイオンは、液体の水中に存在する水素−結合網目構造を破壊し、それによってタンパク質を変性させ、また核酸をその正しく折りたたまれた又は構造化された対応物よりも熱力学的に安定にするので、これら効果を有すると考えられる。カオトロピックイオンとしては、グアニジウム、ヨーダイド、パークロレート、及びトリクロロアセテートが挙げられる。カオトロピック塩としては、塩酸グアニジン、チオシアン酸グアニジン（グアニジンイソチオシアネートと呼ばれることもある）、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、及びトリクロロ酢酸ナトリウムが挙げられる。
【００３３】
ＤＮＡ標的物質の同時単離及び定量化の方法は、以下のように実施できる。第１工程は、特定試料タイプから得られると予想されるＤＮＡ標的物質の量を、所定量の粒子を用いて決定するために使用する校正モデルを構築することである。通常セットの物理的特性を有するいずれの所定セットの磁性粒子も、同一条件下、粒子１ミリグラム当たりのＤＮＡ標的物質吸着のための定義された能力を有する。具体的には、所定セットの反応条件（シリカ磁性粒子の量を含む）では、使用する粒子の量の結合能力を超えてＤＮＡが過剰に存在するときに、同一量のＤＮＡ標的物質が特定試料タイプから得られる。従って、校正モデルを構築する工程は、所定セットの反応条件、試料タイプ及び粒子タイプに対して１回しか行う必要がない。
校正モデルが構築された後、そのＤＮＡ標的物質は、校正モデルを得るために使用したのと同一タイプの媒体から同一溶液条件下、かつ同一タイプの粒子を用いて単離される。
【００３４】
単離すべきＤＮＡ標的物質が細胞中に存在する場合、好ましくは、細胞を溶解緩衝液の存在下で破壊し、ＤＮＡ標的物質をその溶解緩衝液中に遊離する。ＤＮＡ標的物質が細胞内に包含される核酸標的物質である場合、好ましくは、シリカ磁性粒子と核酸が混合されたときにシリカ磁性粒子への核酸の吸着を促進しながら、溶液中に存在するタンパク質と他の物質を核酸から分離する溶解溶液中に細胞を溶解する。この標的物質が付着された粒子は、磁場によって他の細胞物質から分離し、その粒子を洗浄することができる。そして、所定量の水又は他の溶離溶液中に核酸標的物質を溶離し、定義された量のＤＮＡ標的物質が得られる。
【００３５】
代表的な校正モデルを得るために、実際の試料分析は、校正モデルを開発するために用いた同一反応条件下で行うべきである。これら条件としては以下が挙げられる：試料タイプ、粒子タイプ、磁性粒子と組み合わせた溶液条件、いずれかの洗浄溶液の組成物を含む洗浄手順、いずれかの溶離溶液の組成物、及び種々の方法工程が実行される温度。反応条件は、実験によって最適化できる。しかし、本方法の目的にとっては、最適化よりも反応条件の一貫性が重要である。
【００３６】
校正モデルは、以下のように得られる。溶解緩衝液を試料細胞に添加し、ＤＮＡ標的物質が自由にシリカ磁性粒子と複合するようにＤＮＡ標的物質を遊離する。分析すべき種々の既知又は測定された量の試料タイプに、所定量（既知、かつ好ましくは一定）量のシリカ磁性粒子が添加される。磁性粒子を試料に添加する前、添加するとき、又はその後に溶解緩衝液を添加してよい。液状全血では、溶解緩衝液は、シリカ被覆磁性粒子の前、又はそれと一緒に試料に添加される。好ましくは、溶解緩衝液は、シリカ被覆磁性粒子と一緒に試料に添加される。粒子とＤＮＡ標的物質の複合体が形成される条件下で、シリカ磁性粒子は溶解細胞と混合される。
【００３７】
ＤＮＡ標的物質とシリカ磁性粒子との複合体が、磁場の存在下でそのライセート溶液から分離されると、ライセート溶液は除去され、捨てられる。残存している複合体は、好ましくは少なくとも１回洗浄され、付加混入物を除去する。洗浄工程が含まれる場合、最後の洗浄工程後、既知量の溶離溶液を複合体に添加し、かつ磁場内で該溶離溶液から粒子を分離することによって、ＤＮＡ標的物質が複合体から溶離される。好ましくは、溶離溶液は水である。そして、その溶離されたＤＮＡ標的物質を含有する溶液の既知量を、さらに分析、例えば増幅、ゲル上の電気泳動又は公知の方法による定量化することができる。定量化の結果に基づき、溶離溶液中の単離されたＤＮＡ標的物質の総量を決定することができる。このデータは、特定試料タイプの種々の量の試料について粒子に可逆的に結合されるＤＮＡ標的物質の量に関する情報を提供する。
【００３８】
いずれかの所定試料の媒体の付加量を、所定量の粒子に添加すると、それから単離されるＤＮＡ標的物質の量は、粒子が飽和点に達するまで増加する。飽和点に接近すると、得られるＤＮＡ標的物質の量は、さらに試料が供給されても有意には増加しないだろう。ＤＮＡ標的物質が、粒子の結合能力を超えて存在する場合、過剰試料及び過剰ＤＮＡ標的物質は、容易に洗い流されるだろう。好ましくは、ＤＮＡ標的物質は、粒子の結合能力を超えて存在する。このように、同一条件下、かつＤＮＡが粒子の結合能力を超えて存在するという条件で、同量の粒子は、試料サイズとは関係なく、ある試料タイプからほぼ同量のＤＮＡを単離かつ遊離するだろう。
低い試料濃度では、ＤＮＡ濃度が結合能力をわずかに超えるような非常に少ない調節された量の粒子を添加すると有益である。種々の粒子の結合能力は変わるが、特定の粒子タイプ、試料タイプ及び反応条件については１度決定すればよい（例えば、実施例７で述べるような試験によって）。特定試料から単離されるＤＮＡの量を調節するので、過剰増幅シグナルを回避できる。
【００３９】
実施例１は、校正モデルの決定方法について述べる。実施例１は、液状ヒト血液由来のＤＮＡを可逆的に結合する非多孔性シリカ磁性粒子（500μg又は700μgのどちらかの量）の飽和点又は能力を示す。実施例１は、血液が４倍に増えても単離ＤＮＡは４倍よりもずっと少ない増加であることを示している。実施例１と同様に、実施例３は、どのようにして、校正モデルが、ずっと大きい試料サイズ（200μl〜１mlの全血）で得られるかを示している。実施例３では、ＤＮＡは粒子の可逆的結合能力を明らかに大きく超えている。従って、飽和点には既に達しており、飽和点を超える量を使用すれば、広範囲の試料量にわたって収量はかなり一貫している。これらＤＮＡ試料は、分光光度法で定量するのに十分に濃縮される。Ａ260／Ａ280データは、本発明の方法による高い試料純度を示している。実施例１及び３におけるような校正モデルは、プロセス条件を一定に保ち、かつ試料及び粒子の量を調節可能に変化させることによって、比較的狭い範囲のＤＮＡ標的物質を単離できることを示している。
【００４０】
ＳＴＲのようなゲノムタイピング分析の目的では、分析に使用できる範囲内の量である限り、単離されるＤＮＡ標的物質の正確な量は重要でない。この範囲は、利用するシステムによって決まる。例えば、PromegaのGenePrint(登録商標)PowerPlexTM1.1システムを使用する増幅は、アッセイ毎に約0.5〜５ngのＤＮＡを用いて実施して、過剰増幅を避け、かつ容易にゲノタイプされる(genotyped)試料を得るべきである。従って、校正モデルを、利用するシステムで使用できる範囲と比較することによって、使用可能量のＤＮＡ標的物質を単離するのに必要な試料及び粒子の量は、関心のある試料から該ＤＮＡ標的物質を単離する前に決定できる。
試料を分析用に置くシステムの製造業者の使用説明書及びプロトコルに基づき、所望の試料範囲を決定することができる。従って、所望量のＤＮＡ標的物質を得るために、校正モデルを利用して、粒子の量、試料の量、及び全単離ＤＮＡ標的物質の適切量又はフラクションのような適宜のパラメータを決定できる。
【００４１】
本発明の方法で単離かつ定量化されるＤＮＡ標的物質は、培養中の真核若しくは原核細胞又は組織、動物及び植物を含む多細胞生物から採取され若しくは得られる細胞；血液、リンパ液、尿、糞便、若しくは精液のような体液；胎仔若しくは胎児；食品；化粧品；又は他のいずれのソースの細胞からも得ることができる。ある種のＤＮＡは、オルガネラ、ウイルス、ファージ、プラスミド、ウイロイド又は細胞を感染させる同様のものから本発明によって単離される。細胞は溶解され、通常そのライセートは当業者に周知の種々の方法で処理されてＤＮＡの水溶液を得、それに本発明の分離又は単離方法が適用される。このような溶液中のＤＮＡは、通常タンパク質、ＲＮＡｓ又は他のタイプの成分のような他の成分と共に見出される。
【００４２】
ＤＮＡ標的物質は、ろ紙のような固形支持体上の試料由来でよい。固形支持体上の試料の少なくとも一部分をカオトロピック塩含有溶液に入れることによって、ＤＮＡ標的物質を固形支持体から取り除くことができる（実施例４〜５参照）。固形支持体からのＤＮＡ標的物質の除去を容易にするため、溶液の温度は、好ましくは約60℃〜100℃の範囲、最も好ましくは約90℃〜100℃の範囲である。好ましくは、カオトロピック塩溶液はｐＨ緩衝液をも含む。
【００４３】
このような物質のソースの性質と関係なく、本発明で単離されるＤＮＡ標的物質は、該ＤＮＡ標的物質と他の種を含む媒体中に供給される。ＤＮＡ標的物質は、シリカ磁性粒子に付着するのに利用できる形態の媒体中に存在しなければならない。ＤＮＡ標的物質が細胞内に包含される場合、細胞壁又は細胞膜が、その物質を粒子に付着させなくしうる。このような細胞が溶解又は十分に破壊されて、その中に包含されるＤＮＡ標的物質を周囲溶液中に遊離させたとしても、その溶液中の細胞デブリは標的物質のシリカ磁性粒子への付着を妨害しうる。従って、本発明の方法によって単離すべき標的物質が細胞内に包含される場合、好ましくは、まずその細胞を溶解又は破壊することで処理してライセートを生成し、さらに好ましくは媒体中に存在すると該標的物質のシリカ磁性粒子への付着を妨害しうる細胞デブリのライセートを清澄化する（例えば、遠心分離又は真空ろ過によって）ことによってさらに処理する。
【００４４】
細胞を溶解又は破壊して細胞内に包含されるＤＮＡ物質を遊離する多種の公知方法のいずれも、本発明の用途で細胞から媒体を生成するための使用に適する。細胞からＤＮＡ物質を遊離するために選択される方法は、その物質を含有する細胞の性質によって決まるだろう。例えば、真菌類細胞又は植物細胞のような比較的硬い細胞壁を有する細胞に、その中に包含される核酸物質を遊離させるためには、強力なプロテアーゼやホモジナイザーによる機械的剪断又は超音波処理器を用いた音波による破壊のような厳しい処置を使用する必要があるかもしれない。対照的に、大腸菌又は動物の血液細胞のような脂質二重層膜を有する細胞からは、単にこのような細胞を水溶液に懸濁させ、その溶液に洗浄剤を添加することによって容易にＤＮＡ物質を遊離させることができる。
【００４５】
上述したように、一旦ＤＮＡ物質が溶解又は破壊された細胞から遊離されると、そのＤＮＡ物質のシリカ磁性粒子への付着を妨害しそうな細胞デブリは、多種の公知技術又は技術の組合せによって除去できる。好ましくは、溶解又は破壊された細胞の溶液を遠心分離して粒状細胞デブリを除去する。任意に、その上清に、さらに他の物質の沈殿物を形成させる第２の溶液を添加して、その結果生じた溶液から遠心分離によって沈殿物を除去することによって、上清をさらに処理することができる。
【００４６】
関心のあるＤＮＡ物質が当初は大腸菌細胞内に包含されていたプラスミドＤＮＡの場合、このＤＮＡ物質は、好ましくは水酸化ナトリウム溶液のようなアルカリ性溶液を添加してライセートを生成することで細菌から遊離される。好ましくは、その結果生じる上清に、酸性緩衝液のような中和する溶液が添加され、さらに妨害する可能性のある物質の沈殿を形成する。こうして形成された沈殿は、好ましくは遠心分離又はろ過によって除去される。清澄化ライセートの残りの上清は、関心のあるＤＮＡ物質を含有する媒体である。
【００４７】
この発明の方法の第１工程で提供される媒体は、直接細胞から遊離された核酸物質を含有する必要はない。核酸物質は、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）で生成された増幅ＤＮＡ生成物のように、増幅反応の生成物でありうる。核酸物質は、制限酵素でＤＮＡを消化することによって生成されたＤＮＡの断片の形態でもありうる。媒体は、融解され或いは酵素的に消化された電気泳動ゲルと核酸物質の混合物の形態でもよい。生物学的標的を周囲細胞成分から遊離させると、ＤＮＡ標的物質は自由にシリカ磁性粒子に結合する。
【００４８】
シリカ磁性粒子とＤＮＡ標的物質の複合体は、複合体形成を促すように設計された条件下、ＤＮＡ標的物質を含有する媒体に粒子をさらすことによって形成される。複合体は、好ましくはシリカ磁性粒子、媒体、及びカオトロピック塩の混合物の形で生成される。
本発明のこのプラクティスで形成される混合物中のカオトロピックイオンの濃度は、好ましくは約0.1Ｍ〜7.0Ｍであるが、さらに好ましくは約0.8Ｍ〜4.5Ｍである。混合物中のカオトロピックイオンの濃度は、混合物中のシリカ磁性粒子にＤＮＡ標的物質を付着させるのに十分でなければならないが、標的物質を可逆的に変性し、分解し、又は該混合物から沈殿させるほど高くなくてよい。染色体ＤＮＡのような二本鎖ＤＮＡの大きい分子は、0.5〜２モルのカオトロピック塩濃度で安定であるが、約２モルを超えるカオトロピック塩濃度からは沈殿することが知られている。例えば、Piotr Chomczynskiに発行された米国特許第5,346,994号、カラム２、56〜63行を参照せよ。対照的に、プラスミドＤＮＡ、染色体ＤＮＡの制限酵素若しくはＰＣＲ断片、又は一本鎖ＤＮＡのようなＤＮＡの小分子は、２〜５モルのカオトロピック塩濃度で分解せずに溶液中に残存する。
本発明で用いるいずれのカオトロピック塩についても、塩の濃度は、その塩が本発明の実施で使用されるいずれの溶液中においても、該溶液が本発明の実施でさらされるすべての条件下で該溶液におけるその塩の溶解度未満にとどまることが望ましい。
【００４９】
本方法のプラクティスでは、媒体と試料の混合物は、少なくともいくらかのＤＮＡ標的物質がシリカ磁性粒子に付着して複合体を形成するまでインキュベートされる。このインキュベーション工程は、少なくとも０℃、好ましくは少なくとも４℃、さらに好ましくは少なくとも２０℃の温度で、インキュベーション温度が６７℃を超えないことを条件として行われる。インキュベーション工程は、シリカ磁性粒子がその可逆的に核酸物質を結合する能力を失い始める温度未満の温度で行わなければならない。インキュベーション工程は、最も好ましくは、ほぼ室温で（すなわち、約２５℃で）行われる。
ＤＮＡ標的物質が、細胞内に包含されるときは、その細胞をカオトロピック塩含有溶解溶液に溶解して、その同一溶液で細胞溶解と複合体形成を達成することが望ましい。
【００５０】
カオトロピック塩に加え、溶解溶液は、CHAPS[３-[３-コラミドプロピルジメチルアンモニオ]-１-プロパンスルホネート]又はTriton X-100(Sigma,St.Louis,MO)のような双極性又は非イオン性洗浄剤を含んでよい。好ましくは、溶解溶液は、ＤＮＡを構造的に損なわれないように維持するためｐＨ緩衝液を含有し、ｐＨを約7.0に安定させる。溶解溶液は、ＥＤＴＡのような二価カチオンキレート剤を含んでもよい。この溶解溶液は、ＤＮＡ標的物質を固形支持体から取り除くためににも有用である。
複合体形成後、この複合体は、磁場によって混合物から除去される。本発明の方法によって、最初の除去工程後に、磁場に加え、他形式の外力を使用してＤＮＡ標的物質を単離することもできる。好適な付加形式の外力としては、限定するものではないが、重力ろ過、真空ろ過及び遠心分離が挙げられる。
【００５１】
多種の公知手段のいずれを用いても、媒体から複合体を除去するのに使用される外部磁場を適切に媒体内に発生させることができる。例えば、粒子含有溶液の容器の外面に磁石を置き、粒子をその溶液の中を通って移動させ、かつ磁石に隣接する容器の内面に集めることができる。粒子が磁石によって発生される磁場によって容器内に保持されるように、磁石を容器の外面の適所に保持し、その間に溶液を容器からデカントして捨てる。そして、その容器に第２溶液を添加し、かつ磁石を除去して、粒子が第２溶液中に移動するようにできる。代わりに、磁化できるプローブを溶液中に挿入し、プローブを磁化して、溶液に浸漬されたプローブの末端上に粒子が沈積するようにもできる。そして、磁化された状態でプローブはその溶液から除去され、第２溶液中に浸漬され、かつ磁場を中断して第２溶液中に粒子を進ませることができる。シリカ磁性粒子を溶液から分離するのに十分ないずれの磁力源も、本発明の核酸単離法で使用するのに適する。磁気分離装置は商業的に入手可能である。例えば、MagneSphere(登録商標)Technology Magnetic Separation Stand又はPolyATract(登録商標)Series 9600TM Multi-Magnet、両方ともPromega Corporationから入手可能；MagneTight Separation Stand（Novagen,Madison,WI）；又はDynal Magnetic Particle Concentrator（Dynal,Oslo,Norway）を参照せよ。磁力は、好ましくはPromega Corporation製のMagneSphere(登録商標)Technology Magnetic Separation Stands（カタログ番号Z5331〜3、又はZ5341〜3）の１つのような磁気分離スタンドの形態で供給される。
【００５２】
本発明は、種々多様な試料タイプから関心のあるＤＮＡ標的物質を単離するための便利かつ効率的な手段を提供する。簡単に上述した磁力を用いて媒体から粒子を除去する、本発明の好ましい局面は、ＤＮＡ標的物質が可逆的に他のシリカ物質に結合される従来の単離方法を超える有意な利点を提供する。具体的には、本方法の磁気的除去工程は、従来のシリカ結合及び溶離単離法で必要とされる真空ろ過又は遠心分離工程の代わりをする。従って、本方法は特に自動化に適用できる。
【００５３】
本発明の方法の好ましい局面において、媒体から除去された複合体は、洗浄溶液内ですすぐことによって、少なくとも１回洗浄される。洗浄は、関心のあるＤＮＡ標的物質以外のいずれをも含む付加混入物を除去する。本方法のこの好ましい付加工程で用いられる洗浄溶液は、好ましくはシリカ磁性粒子から混入物を除去可能な溶液を含む。洗浄溶液は、好ましくは塩及び溶媒、好ましくはアルコールを含む。アルコールは、洗浄溶液のエバポレーションを容易にする。この最後の好ましい形態の洗浄溶液のアルコール濃度は、好ましくは少なくとも３０容量％、さらに好ましくは少なくとも４０容量％、最も好ましくは少なくとも５０容量％である。そのように使用されるアルコールは、好ましくはエタノール若しくはイソプロパノール又はそれらの混合物、さらに好ましくはエタノールである。塩は、好ましくは緩衝液の形態、最も好ましくはアセテート緩衝液の形態である。洗浄溶液中の塩濃度は十分高く、洗浄工程の際にシリカ磁性粒子から核酸物質が溶離されないことを保証する。
【００５４】
好ましくは、媒体から除去した後、複合体を洗浄溶液中に再懸濁させることによって複合体を洗浄する。好ましくは、第１洗浄後、複合体を洗浄溶液から除去し、少なくとももう１回洗浄し、最も好ましくは各洗浄工程で新鮮な洗浄溶液を用いて３回以上洗浄する。
定義できる量のＤＮＡ標的物質は、複合体の形で利用できる。いくつかの分析又は分子生物学的処理手順において、少量の磁性粒子はその処理を害し又は有意には妨害しない。従って、適切な処理では、最初にシリカ磁性粒子からＤＮＡ標的物質を分離することなく複合体を直接処理してよい。
しかしながら、好ましくは、さらに処理する前にシリカ磁性粒子からＤＮＡ標的物質が溶離される。これは、複合体を溶離溶液にさらすことによって達成できる。溶離効率（又は粒子から除去されるべく結合されるＤＮＡ標的物質の割合）は、所定セットの反応条件、粒子タイプ及び試料タイプについて相対的に一貫した割合で溶離する限り重要でない。定義された量のＤＮＡ標的物質が一貫して粒子に吸着し、かつ溶離できる限り、定量化は遂行されうる。
【００５５】
溶離溶液は、好ましくは低イオン強度の水溶液、さらに好ましくは水又は核酸物質が安定かつ実質的に無傷であるｐＨあたりの低イオン強度緩衝液である。ＴＥ緩衝液（すなわち、10mM トリス−ＨＣｌ、１mM エチレンジアミン−四酢酸（ＥＤＴＡ）、ｐＨ8.0）以下のイオン強度のいずれの水溶液も、本方法の溶離工程での使用に適するが、溶離溶液は、好ましくは約6.5〜8.5のｐＨに緩衝され、さらに好ましくは約7.0〜8.0のｐＨに緩衝される。ＴＥ緩衝液及び蒸留水又は脱イオン水は、本発明の用途に特に好ましい溶離溶液である。上述の好ましい形態の低イオン強度の溶離溶液は、核酸物質を粒子から確実に遊離させる。当業者には、この発明の方法で使用するのに好適な他の溶離溶液が容易にわかるだろう。本方法の溶離工程で複合体から溶離されたＤＮＡ標的物質は、好ましくはシリカ磁性粒子から分離される。
【００５６】
本発明の方法によって溶離されたＤＮＡ標的物質は、さらに単離せずに、分析又はさらなる分子生物学的手順による処理に適する。溶離ＤＮＡは、例えば、配列決定、制限酵素分析、又は核酸プローブハイブリダイゼーションによって分析できる。従って、本発明の方法は、例えば、病気の診断；病原体の同定；食品、化粧品、血液若しくは血液産物、又は病原体によるコンタミネーションによる他の産物の検査；法医学鑑定；親子鑑定；及び胎児若しくは胎仔の性識別のためのＤＮＡの分析に基づく方法の一部として適用できる。好ましくは、溶離ゲノムＤＮＡは、ＤＮＡタイピングプロセスで分析される。例えば、精製したらすぐに、そのＤＮＡは、従来の増幅及びＤＮＡタイピングシステムで使用できる。PowerPlexTM 1.1及びPowerPlexTM 2.1システム（Promega）は、ツーチューブ増幅システムにおける１３個のコアＣＯＤＩＳ座プラス性識別座、アメロゲニン、低スタッタペンタヌクレオチド反復座Penta Eの増幅を与える。これら２つのシステムは、試料混乱を保護するために共通の３座を有する。
【００５７】
本発明の方法で得られた溶離ＤＮＡは、さらに多くの方法、例えば、配列決定、転写、酵素反応で処理できる。溶離ＤＮＡ由来の制限酵素断片は、ベクターに結合して、クローニング又は発現に適した宿主に形質転換することができる。溶離ＤＮＡのセグメントは、標的核酸セグメントを増幅するための技術的に公知の種々の方法のいずれによっても増幅することができる。溶離ＤＮＡがプラスミド又は他のタイプの自己複製ＤＮＡであるならば、それは、そのＤＮＡに基づく遺伝子のクローニング又は発現に適した宿主に形質転換することができ、その形質転換された宿主内で発現できる。
【００５８】
本発明の方法を実施するために必要な成分は、既知量のＤＮＡ標的物質を媒体から単離するためのキット内に配置されうる。最低でも、このようなキットは以下を含むべきである：第１容器内の水溶液中に懸濁された所定量のシリカ質オキシド被覆磁性粒子であって、これら粒子はある試料タイプ用の媒体から、定義できる量のＤＮＡ標的物質を可逆的に結合する能力を有する。好ましくは、キットはカオトロピック塩をも含む。粒子は、カオトロピック塩を有する溶液中に懸濁されてよい。好ましくは、キットは洗浄溶液をも含む。
液状血液及び血痕（約５μl〜１０mLの血液）のために好適なキットは、以下の成分を含むことができる：溶解緩衝液、洗浄緩衝液、シリカ磁性粒子、及び任意に溶離溶液及び／又は磁気スタンド。好ましくは、溶解溶液は洗浄溶液を兼ねる。高処理能力システムは、上掲の成分に加えて９６−ウェルプレートを含むことができる。
プラスミド精製用に好適なキットは以下を含んでよい：細胞再懸濁溶液、溶解溶液、中和溶液、シリカ磁性粒子、洗浄溶液、及び溶離溶液。
【００５９】
以下の非限定的な実施例は、本発明の種々の実施形態を教示する。実施例、その他本明細書及び特許請求の範囲において、体積、ｐＨ及び濃度は、特に言及ししない限り、室温におけるものである。以下の各実施例では、最良の形態のシリカ磁性粒子、すなわち多孔性及び非多孔性MagneSilTM粒子のみを使用した。しかし、本発明の技術の当業者は、本開示の教示を利用して、その使用について以下の実施例で示される本発明の方法の局面で説明されている多孔性及び非多孔性MagneSilTM粒子以外のシリカ磁性粒子の形態を選択かつ使用できるだろう。
【００６０】
実施例
以下の実施例は、本発明の範囲を限定することなく、本発明の種々の局面を説明するために提供される。
実施例１  非多孔性MagneSilTMシリカ磁性粒子を用いた血液からのＤＮＡ単離
この実施例では、異なる量の非多孔性MagneSilTMシリカ磁性粒子（Promega Corp.）を使用して、可変サイズのヒト血液試料からＤＮＡを単離した。血液は、ＥＤＴＡ被覆バキュテナ(vacutainer)チューブ内に集め、使用するまで（２週間以下）４℃で貯蔵した。表１に示されるように、６μl〜２５μlの可変量の液状血液を1.5mlのコニカルチューブに入れた。そして、９３μlの溶解緩衝液（4.5Ｍグアニジンチオシアネート、１％Triton X-100、CHAPS[３-[３-コラミドプロピルジメチルアンモニオ]-１-プロパンスルホネート]、１０mM ＥＤＴＡ、１０mM トリスｐＨ7.3、ｐＨ6.8〜7.0に調整される）を含有する100μlの溶液、及び100μg/μlの非多孔性MagneSilTMシリカ磁性粒子を含有する５μl又は７μlの水を添加した。その溶液を簡単にボルテックスした。それからチューブを室温で５分間インキュベートし、簡単にボルテックスし、磁気スタンド（Promega）上に置いて溶液から粒子を分離した。溶液を慎重に除去し、100μlの洗浄溶液（100mM ＮａＣｌ、25％エタノール、25％イソプロピルアルコール）を添加した。チューブを磁気スタンドから離し、簡単にボルテックスし、磁気スタンドに戻した。洗浄溶液を除去し、さらに２回洗浄を繰返し、全部で３回洗浄した。最終洗浄液を除去後、粒子を室温で５分間空気乾燥させた。チューブを磁気スタンドから離し、100μlの水を添加してチューブを簡単にボルテックスした。チューブを６０℃で５分間置き、簡単にボルテックスしてから磁気スタンド上に置いた。このＤＮＡ溶液を0.5mlのコニカルチューブ内に移して貯蔵した。
【００６１】
表１は、500又は700μgの非多孔性MagneSilTMシリカ磁性粒子を用いて６〜２５μlの液状血液から得られたＤＮＡの全量を示す。ＤＮＡ濃度は、PicoGreen ＤＮＡ染料を製造業者（Molecular Probes,Eugene,OR）の推奨どおりに使用して決定した。使用した両方のMagneSilTM磁性粒子量は、近似的に飽和キネティクスを実証した。500μg量は飽和に近づき、700μg量は飽和よりわずかに少なかった。単離されたＤＮＡの量の変化は、血液、特に体積１０〜２５μlの血液の体積範囲の変化より極めて少なかった。
【００６２】
0004425513.tif 000002
【００６３】
実施例２  単離ＤＮＡの分析
この実施例では、実施例１で調製したＤＮＡを用いて、８個のショートタンデムリピート（ＳＴＲ）座に存在する対立遺伝子の同定のために分析した。実施例１で述べたように、700μgの非多孔性MagneSilTMシリカ磁性粒子（Promega）を用いて血液試料から精製されたＤＮＡの１μl試料を、製造業者の使用説明書に従ってPromegaのGenePrint(登録商標)PowerPlexTM 1.1システム（Promega ＃DC6091）を用いて増幅した。このシステムによるアッセイ毎に用いるＤＮＡは0.5〜５ngが推奨され、最も好ましい量は１ngのＤＮＡである。
GenePrint(登録商標)PowerPlexTM 1.1システムの技術マニュアルに記載されているとおりに、１μlの増幅生成物を変性ポリアクリルアミドゲル上に装填し、電気泳動させた。ゲルをFMBIO(登録商標) II 蛍光スキャナー（Hitachi,South San Francsco,CA）でスキャンした。それぞれ観察された対立遺伝子についてピーク高さを決定し、規準化した。データ点は、各試料について１５個の対立遺伝子の平均を示し、１に設定した１０μlの血液試料から調製されたＤＮＡから産生された混合対立遺伝子に対する高さである。下表２に、これらデータ点及標準偏差をまとめた。ピーク高さは、約２倍までしか変化せず、１０〜２５μlの血液の試料からはほとんど同一だった。データは、全試料が容易にゲノタイプされたことを示している。
【００６４】
0004425513.tif 000003
【００６５】
実施例３  非多孔性シリカ磁性粒子及びグアニジンチオシアネート
この実施例では、ヒト全血からゲノムＤＮＡを精製した。血液は、前日にＥＤＴＡ被覆バキュテナ内で引いてから４℃で貯蔵した。すべての精製は、三通りで行い、全工程及びインキュベーションは、特に言及しない限り部屋の温度及び圧力で行った。血液ライセートの磁気清澄化及びゲノムＤＮＡの精製は、PromegaのWizardTMゲノムＤＮＡ精製キット（A1620）の溶液及びグアニジンチオシアネートを用いる非多孔性シリカ磁性粒子を使用した。
１ml、800μl、600μl、400μl、及び200μlの血液を、3.0mlのWizardゲノム細胞溶解溶液を含有する別個の１５mlチューブに入れ、混合し、１０分間インキュベートした。そして、チューブを800Ｘｇで１０分間遠心分離した。溶液を除去すると、白血球（ｗｂｃ）ペレットがチューブ底に残った。
ｗｂｃペレットをボルテックスして1.0mlの核酸溶解溶液を添加した。それからチューブをボルテックスし、１時間３７℃でインキュベートした。そして、330μlのWizardTMゲノムタンパク質沈殿溶液を添加し、チューブをボルテックスし、800Ｘｇで１０分間遠心分離した。チューブから溶液を取り除き、100μl（100mg/ml）の非多孔性MagneSilTMシリカ磁性粒子を含有する無菌チューブに移し、その溶液をボルテックスした。
【００６６】
２mlの５Ｍグアニジンチオシアネート（ＧＴＣ）添加し、チューブを混ぜてから２分間インキュベートした。チューブを磁気ラック上に５分間置いた。粒子から分離された溶液を除去して捨てた。５mlのＳＶ全ＲＮＡカラム洗浄液（Promega,Z3100）を添加し、チューブを５秒間ボルテックスし、再びチューブを磁気ラック上に２分間置いた。粒子から分離された溶液を除去して捨てた。洗浄を繰り返した。最後の洗浄は、5.0mlの８０％エタノールを用いて行った。チューブを５秒間ボルテックスし、２分間磁気ラック上に置いた。粒子から分離された溶液を除去して捨てた。８０％エタノール洗浄を２回繰返し、全部で３回洗浄した。チューブを６０分間磁気ラック内で空気乾燥した。磁気ラックから取り除いた後、粒子上のＤＮＡを400μlのWizardTMゲノム再生溶液中で５分間溶離した。チューブを再び磁気ラック上に５分間置き、ＤＮＡ含有溶液を無菌チューブに移した。
PicoGreen分析により製造業者の使用説明書に従って分光光度分析（ＤＮＡは試料緩衝液中１：２に希釈された）により、またＤＮＡQuant分析により製造業者の使用説明書に従ってＤＮＡ精製結果を得、下表３にまとめた。結果は、図１にも示される。レーン１〜５は、それぞれ100、80、60、40及び20ngのPromegaゲノムＤＮＡ標準部分＃6304Aに対応する。レーン６及びそれより上は１０μlの試料で充填された。
【００６７】
0004425513.tif 000004
【００６８】
分光光度分析によると、平均収量は3.11μgだった。最低値は2.48つまり平均の79.8％だった。最高値は3.8つまり平均の122.3％だった。さらに図１に示されるPicoGreen分析によると、平均収量は1.6μgだった。最低値は1.1つまり平均の33％であり、最高値は2.0つまり平均から20％だった。従って、全試料は平均の33％以内だった。ＤＮＡQuantアッセイによれば、最低値は1.8であり、最高値は2.6だった。A260/A280値は、所望範囲の1.7〜1.9より高く、残留混入物の存在を反映しているかもしれない。
【００６９】
実施例４  血液が染みたＳ＆Ｓ903紙からのＤＮＡ単離
この実施例では、実施例１で述べたような溶解溶液を用いた以下の手順が、Ｓ＆Ｓ903紙（Schleicher＆Schuell）上で乾燥された血液からＤＮＡを遊離させることを示した。引き続き非多孔性シリカ磁性粒子を用いて遊離ＤＮＡを精製した。14mm2〜100mm2の範囲のサイズで、かつそれぞれ５μl〜50μlの血液を含有するＳ＆Ｓ903紙上のヒト血痕を切り抜いて1.5mlのコニカルチューブの底に置いた。実施例１で述べた溶解緩衝液100μlを50mm2以下のＳ＆Ｓ903紙を含有するチューブに添加し、100mm2のＳ＆Ｓ903紙には200μlの溶解緩衝液を添加した。そして、チューブを95℃で30分間置いた。チューブを熱源から離し、無菌ピペット先端部で紙を除去した。ピペット先端部でチューブの側面に対して紙を押しつけることによって、紙から過剰の液体を除去した。そして、700μgの非多孔性MagneSilTMシリカ磁性粒子を含有する７μlの水を添加し、チューブを緩やかにボルテックスして混ぜた。ＤＮＡ精製手順の残りは、実施例１に記載のとおりに行った。
【００７０】
各血痕から精製された１μlのＤＮＡを、実施例２で述べたようにGeneGreen(登録商標)PowerPlexTM 1.1システムで増幅した。１μlの増幅生成物を変性ゲル上に充填し、GeneGreen(登録商標)PowerPlexTM 1.1システム技術マニュアルの記載どおりに電気泳動させた。ゲルをFMBIO(登録商標) II 蛍光スキャナー（Hitachi,South San Francsco,CA）でスキャンした。それぞれ観察された対立遺伝子についてピーク高さを決定し、規準化した。下表４にリストされるデータ点は、各試料について１５個の対立遺伝子の平均及びその標準偏差を表し、高さは１に設定した１０μlの血液試料から調製されたＤＮＡから産生された混合対立遺伝子に対する高さである。各試料について規準化された平均ピーク高さはすべて５％以内であり、ＤＮＡが５、10、25、又は50μlのどの血痕から単離されたかには関係なく、増幅は均一であることを示している。
【００７１】
0004425513.tif 000005
【００７２】
下表５は、各試料内のピーク高さ間の標準偏差をリストする。偏差は、一貫して16〜20％であり、試料サイズには関係なく大小の対立遺伝子が均一に増幅されることを示している。
0004425513.tif 000006
【００７３】
実施例５  血液が染みたFTATM紙からのＤＮＡ単離
この実施例では、実施例１で述べた溶解緩衝液を用いて、FTATM紙（Life Technologies,Inc.Gaithersburg,MD）に付着されたＤＮＡを紙から遊離させたことを示す。引き続き非多孔性MagneSilTMシリカ磁性粒子を用いて遊離ＤＮＡを精製し、かつＳＴＲ分析に使用した。
ヒト血液が染みている指示サイズのFTATM紙（113mm2、57mm2、及び28mm2）を、実施例２で述べた溶解緩衝液100μl中、95℃で30分間加熱した。紙及び溶液をフィルターなしで回転バスケット内に置き（Millipore,Bedford,MA）、マイクロ遠心機内で２分間14,000rpmで遠心分離した。チューブに、７μlの水中の700μgの非多孔性MagneSilTMシリカ磁性粒子を添加し、簡単にボルテックスし、室温で５分間インキュベートした。チューブを簡単にボルテックスしてから磁気スタンド（Promega Corp.）上に置き、粒子を溶液から分離して溶液を除去した。100μlの洗浄緩衝液（実施例１に記載されている）で粒子を３回洗浄した。粒子を室温で５分間空気乾燥した。そして、粒子を有するチューブに100μlの水を添加し、チューブを60℃で５分間インキュベートした。チューブを簡単にボルテックスしてから室温で磁気スタンド内に置き、ＤＮＡ溶液を除去して４℃で貯蔵した。実施例２で述べたように、１μlの各溶液をGeneGreen(登録商標)PowerPlexTM 1.1システムで増幅し、増幅生成物を変性ゲル上に流し、FMBIO(登録商標) II 蛍光スキャナーでゲル分析した。ピーク高さを規準化し、それらを下表６に示した。この実施例では、データは、上記手順で使用する非多孔性MagneSilTM粒子の量が一定に保たれる場合、異なる量の血痕がついたFTATM紙からほぼ等量のＤＮＡが精製されたことを示している。
【００７４】
0004425513.tif 000007
【００７５】
実施例６  ＤＮＡ精製時の血液年齢を変える
この実施例では、血液が０〜131日の期間貯蔵された場合の本発明の手順で単離されたＤＮＡの質を比較する。血液が貯蔵されると、経時的に、ＤＮＡは変動する程度に劣化することが当業者には知られている。ヒト血液をＥＤＴＡ被覆バキュテナチューブ内に集め、４℃で貯蔵した。血液収集後０、22、29、及び131日で、実施例１で詳述したように、非多孔性MagneSilTMシリカ磁性粒子を用いて10μlの血液からＤＮＡを精製した。実施例２で述べたように、１μlの各精製ＤＮＡ溶液をGeneGreen(登録商標)PowerPlexTM 1.1システムで増幅した（各試料は三通りで分析される）。実施例２で述べたように、増幅されたＤＮＡを変性ポリアクリルアミドゲル上に流し、ピーク高さをFMBIO(登録商標)スキャナーで決定し、かつ０日の値に規準化した。下表７は、得られた平均規準化ピーク高さ及び標準偏差を示す。
【００７６】
0004425513.tif 000008
【００７７】
規準化平均ピーク高さは、全試料について最小変化を有しており、この定量精製手順に適するＤＮＡは、４カ月までの間貯蔵された血液から得られたことを示している。131日の試料は、基本的に同一の平均ピーク高さを有するが、小さい対立遺伝子は平均よりいくぶん高く、大きい対立遺伝子は平均より低かった。このことは、血液を引出し、かつ貯蔵してから131日で調製された試料を使用した場合に、より大きい標準偏差が観察されることによって示されている。しかし、全試料は、容易にゲノタイプされ、かつピーク高さは許容範囲内だった。
興味深いことに、実施例６は、ＤＮＡのサイズが結合及び溶離量に有意には影響しなかったことを示している。従って、より古い試料は分解しやすく、ひいてはＤＮＡのサイズを小さくするという試料年齢に基づいて、最初の校正モデルを調整することなく、信頼できる結果を得ることができる。
【００７８】
実施例７  MagneSilTMシリカ磁性粒子で単離されたゲノムＤＮＡの直接的なＳＴＲ分析での使用
この実施例は、ＳＴＲ分析で使用するためにMagneSilTMシリカ磁性粒子からＤＮＡを溶離する必要があるかどうかを決定するために設計された。
６つの685ngアリコートのヒトゲノムＤＮＡ K562（Promega Corp.）を、1.5mlのコニカルチューブ内の50μlＧＴＣ溶解緩衝液（６Ｍグアニジンチオシアネート、10mM ＥＤＴＡ、10mM トリスｐＨ6.0、１％ＣＨＡＰＳ、１％Triton X-100）中に入れた。平行実験では、50μlアリコートのヒト全血を100μlＧＴＣ溶解緩衝液を有する1.5mlのコニカルチューブ内に入れた。シリカ磁性粒子の量を減少させながら（2.5、0.5、0.1、0.02、0.004、0.0008μg）各試料に添加した。以下のように試料を処理した。1.5mlのコニカルチューブ内に400μlのＧＴＣ溶解緩衝液、50μlの多孔性MagneSilTMシリカ磁性粒子（100mg/ml）及び200μlの全血を入れた。チューブを約15秒間ボルテックスした。チューブを室温で10分間インキュベートし、５分後簡単にボルテックスした。チューブを磁気スタンド上に置いて粒子を捕捉した。粒子から分離された上清を除去し、650μlの洗浄緩衝液を添加し（25％イソプロパノール、25％エタノール、100mM ＮａＣｌ、10mMトリス、ｐＨ8.0）、チューブを簡単にボルテックスした。これを２回繰返し全部で３回洗浄した。そして、最後の洗浄液を除去し、粒子を20μlの洗浄緩衝液中に再懸濁させた。各単離の１μlを取り出し、増幅チューブの底に入れ、10分間空気乾燥した。これら試料をＳＴＲ分析で使用し、製造業者の使用説明書及び実施例２の記載どおりのGeneGreen(登録商標)PowerPlexTM 1.1システムを用いたＳＴＲ分析における１ngのK562と比較した。その結果のゲルは図２に示されている。“Ｌ”と表示されるレーンは対立遺伝子ラダーに対応する。
【００７９】
0004425513.tif 000009
【００８０】
MagneSilTM粒子の量を減少させて単離した試料と、１ngのK561 ＤＮＡとの比較により、極端に少量のゲノムＤＮＡが単離されたこと；粒子に結合したＤＮＡはＳＴＲ反応で直接使用できること；及び上述のＳＴＲアッセイにおけるバンド強度によって決定される１ngのK562 ＤＮＡにほぼ等価なＤＮＡを捕捉するために必要な粒子の量は、K562 ＤＮＡについては約0.1μg、また全血については約0.5μgであることがわかる。
【００８１】
実施例８−多孔性及び非多孔性シリカ磁性粒子による捕捉で単離されたＤＮＡの配列決定
この実施例は、粒子の最大ＤＮＡ結合能力より多いＤＮＡを含有する調製細菌ライセートに添加する多孔性及び非多孔性シリカ被覆磁性粒子の量を限定することによって、自動化配列決定での使用に好適なＤＮＡ量が確実に単離されたことを示す。この手順は、ＤＮＡ調製における混入物の存在によって偏りうる、分光光度分析又は他の定量分析でＤＮＡの濃度及び量を決定する必要性を排除した。
pGEM3Zf(+)プラスミド（Promega Corp.,Madison,WI)で形質転換されたDH5α細菌細胞（Life Technologies,Inc.,Gaithersburg,MD）を、ベックマン２ml BioBlock（140504）の各ウェル内に１ml、一晩中成長させた。細胞密度は、600nmで約２〜３ＯＤだった。存在する理論量のプラスミドは、300〜700コピー／細胞の範囲であり、結果として1.8〜4.1μg/ml培養の収量である（Sambrookら,1989,分子クローニング：研究室マニュアル、第２版、Cold Spring Harabor Laboratory,Cold Spring,NY）。BioBlock内で、細胞を10分間2000 x gで遠心分離してペレット化した。媒体をダカントし、プレートをペーパータオル上で軽くたたいていずれの残留液も吸い取らせた。
【００８２】
そして、細胞ペレットに75μlの細胞再懸濁緩衝液（Promega,A711T）を添加し、ピペットを上下してペレットを再懸濁させた。75μlの細胞溶解緩衝液（Promega,A712T）を添加し、ピペットを４回上下して溶液を混ぜた。100μlのWizardTMプラスSV 中和溶液（Promega,A713T）を添加し、ピペットを４回上下して溶液を混ぜた。
BioBlock内のチューブを2000 x gで10分間遠心分離した。ライセートを各チューブから除去し、96ウェルプレートの適宜のウェル内に置いた。
使用前に振って、MagneSilTMシリカ被覆磁性粒子（多孔性及び非多孔性）を再懸濁させた。下表９にリストしたように、希釈粒子の各タイプの量を変えながら添加してウェルを分離し、緩やかに混ぜ、室温で10分間インキュベートした。プレートを磁石上に置き、溶液を清澄化した（約10秒）。できるだけ少しの粒子だけを除去するように慎重に各ウェルからライセートを除去して捨てた。プレートを磁石から離し、40μlの80％エタノールを各ウェルに添加した。
【００８３】
ピペットを上下して粒子を再懸濁させた。プレートを再び磁石上に置き、清澄化ライセートを除去した。洗浄を繰り返した。２回目の洗浄液を除去した後、プレートを磁石上に10分間放置した。この後いずれの液体もウェルの底に排出したら、それをピペッタで取り除いた。そして10μlのナノピュア水ピュアを各ウェルに添加し、ピペットを上下して混ぜた。プレートを磁石上に置いて清澄化し、上清を無菌プレートに移した。
さらに処理することなく、以下に記載するような順及び逆プラスミド−特異的プライマー（Promega Corp.,Madison,WI）を用い、ABI 377機で、Big-DyeTM Cemistryにより、製造業者の使用説明書（ABI）に従って試料全体を配列決定した。シグナル強度及び精度は変化しているが、全試料を800塩基まで配列決定できた。下表９に精度を示し、下表１０にシグナル強度を示した。
順      ５'ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ３'[配列番号：１]
逆      ５'ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ３'[配列番号：２]
【００８４】
0004425513.tif 000010
【００８５】
0004425513.tif 000011
【００８６】
結果は、新しいプラスミドタイプ、粒子タイプ、又は試料タイプを初めて使用するときには、種々の量の粒子を用いて校正モデルを決定する必要性を示している。上表９の結果から、非多孔性粒子は、等量の多孔性粒子よりも結合能力が低いことが明白である。このことは、十分量のＤＮＡが同時的単離／定量化工程後のＤＮＡ配列決定反応に与えられることを保証するだろう。このタイプのプラスミドを用いたその後の全反応では、その使用される条件下で、定義された量の粒子によって精製可能な量がわかるので、もはや校正は必要ないだろう。
【００８７】
実施例９  製造業者のプロトコルに従って使用した場合と、細胞溶解緩衝液及びシリカ磁性粒子分離プロトコルで使用した場合のFTA(登録商標)紙上の血液試料の比較
FTA(登録商標)紙（Life Technologies,Inc.,Gaithersburg,MD）は、血痕を貯蔵する便利な手段である。しかし、FTA(登録商標)紙上にあるＤＮＡを分析する場合、いくつかの技術的困難がある。FTA(登録商標)紙の高い結合能力のため、また以前に公知の方法ではこのろ紙からＤＮＡを容易には分離できないため、紙の非常に小さいパンチ(punches)を用いて、増幅反応におけるＤＮＡのひどい過剰を回避しなければならない。さらに、FTA(登録商標)紙の能力は、所定量の液体に対するものである。従って、高低の白血球数を有する血液又は過剰量の血液で装填された試料は、矛盾した結果を与えるだろう。製造業者に推奨される精製プロセスは、増幅反応で直接ろ紙を使用する前に、20〜30分かかる５回の洗浄工程に加え、さらに60℃で20分の乾燥手順を必要とする。この手順は、ＤＮＡを増幅するたびに繰り返さなければならない。
【００８８】
この実施例では、FTA(登録商標)紙からの、この紙の製造業者が推奨するプロトコルによるＤＮＡ単離と、非多孔性MagneSilTMシリカ磁性粒子によるFTA(登録商標)紙からのＤＮＡ単離との比較が為される。100μlも血液に相当するFTA(登録商標)紙上の113mm2のヒト血痕を製造業者のプロトコルに従って精製した。１mmのパンチを作り、そのパンチを半分に分けた（0.5mm2又は４μlの血液に相当）。実施例２で述べたように、そのパンチをGeneGreen(登録商標)PowerPlexTM 1.1システムを用い、製造業者のプロトコル（Promega Corp.,#DC6090）に従って増幅し、変性ポリアクリルアミドゲル上に流した。
【００８９】
代わりに、57mm2のFTA(登録商標)血痕を、200μlの溶解緩衝液中95℃で30分間加熱し、その溶液と紙を回転バスケット内に置き、２分間遠心分離して溶液を紙から分離した。そして、700μgの非多孔性MagneSilTMシリカ磁性粒子を含有する７μlの水を添加し、その溶液を５分間室温でインキュベートした。チューブを磁気スタンド上に置くことによって、上清から粒子を分離した。上清を除去して捨てた。実施例１に記載の洗浄緩衝液で粒子を３回洗浄してから、室温で５分間空気乾燥した。そして100μlの水を添加し、試料を60℃で５分間インキュベートした。粒子を磁気スタンド上で分離し、ＤＮＡを含有する溶液を集めて無菌チューブに移した。実施例２に述べたように、１μl（約0.6mm2FTA(登録商標)パンチ又は約５μlの血液に相当）をGeneGreen(登録商標)PowerPlexTM 1.1ＤＮＡシステムで増幅し、変性ポリアクリルアミドゲル上に流した。
【００９０】
アクリルアミドゲル上で観察された増幅生成物のスキャンを分析し、それぞれピーク高さを平均ピーク高さで除して規格値を得た。各座で２つの対立遺伝子のピーク高さを平均した。結果を下表１１にまとめた。結果は、製造業者のプロトコルに従って使用したFTA(登録商標)試料は、ＳＴＲ増幅反応でアンバランスなピークを与えたことを示している。大きい対立遺伝子は増幅が不十分であり、より小さい対立遺伝子は過剰増幅された。上述したようにシリカ磁性粒子を用いてFTA(登録商標)ろ紙からＤＮＡを除去すると、ＳＴＲ増幅反応用途に妥当な量のＤＮＡを与え、かつ異なるサイズの対立遺伝子の優先的な増幅は観察されなかった。
【００９１】
0004425513.tif 000012
【００９２】
実施例１０  多孔性シリカ磁性粒子及び全血：試料サイズを増加しながら粒子の量を限定する
この実施例では、後述するプロトコルで、100mg/mlの濃度の一定量（７μl）の多孔性シリカ磁性粒子を用いて、三通りの100、200、及び300μlのヒト全血からＤＮＡを単離した。溶離されたＤＮＡをＵＶスペクトル、アガロースゲル電気泳動、及びPicoGreenアッセイ（Molecular Probes,Eugene,OR）で測定した。
７μlのよく混合した多孔性シリカ磁性粒子（100mg/ml）を９本の２mlネジ式キャップコニカルチューブにピペットで入れた。そして、100μl、200μl及び300μlのヒト全血の三通りの試料をそれぞれ３本のチューブに添加した。チューブを20秒間ボルテックスしてから室温で10分間インキュベートし、この間に１回ボルテックスして混ぜ合わせた。試料を再び混合し、磁気ラック上に置いた。５分間室温で磁性粒子を上清から分離させた。上清を除去して捨てた。そして、400μlの塩洗浄溶液を添加し、ボルテックスしてチューブの中身を混ぜた。チューブを磁気スタンド上に置くことによって、上清を粒子から分離し、上清を除去して捨てた。洗浄を２回繰り返して全部で３回洗浄した。
【００９３】
そして、400μlのアルコール洗浄液を添加し、ボルテックスによってチューブの中身を混ぜた。チューブを磁気スタンド上に置き、上清を除去して捨てた。アルコール洗浄を２回繰返し、全部で３回洗浄した。最後の上清の除去後、チューブを開放して室温で10分間空気乾燥した。それから粒子を50μlのＴＥ（10mMトリス、１mMＥＤＴＡ、ｐＨ7.3）と混ぜた。チューブを混合し、５℃で一晩中置いた。磁気スタンド上で粒子を上清から分離し、溶離されたＤＮＡを含有する上清を無菌チューブに移した。粒子を再び50μlのＴＥと混ぜ、混合し、かつ65℃で10分間置いた。磁気スタンド上で粒子を上清から分離し、上清をプールして100μlの混合ＤＮＡ溶離液量にした。
そして、70μlの溶液を280μlのＴＥと混ぜることによって、溶液中のＤＮＡ濃度をＵＶスペクトルで測定し、ＴＥで有害な信号が消されているＵＶ分光光度計で、260nm及び280nmにおける吸収を測定した。結果を下表１２にリストした。
【００９４】
0004425513.tif 000013
【００９５】
10μlの各試料をPromega G304AゲノムＤＮＡ標準（それぞれ200、100及び500ngの量のレーン２〜４）及びラムダHind IIIマーカーG171A（レーン１）と一緒に１％アガロースゲル上に流した。ゲルを臭化エチジウムで染色し、試料レーンをＵＶ光下、視覚的に標準と比較した。その結果のゲルは、図３に示される。試料１は150ngの全収量を含み、試料６は800ngの全収量を含み、かつ残りの試料は、約250ngの全収量を含むようだった。これは、ＵＶ分光光度計データが、約４から10の因子によって誤って上昇されていることを示している。これは、低いOD260：280比によって示されるように、残留アルコール又はタンパク質コンタミネーションが原因だろう。
製造業者の指示に従ってPicoGreenアッセイを行った。結果を下表１５にまとめた。ゲル写真及びPicoGreenデータから、９試料は約250ng〜959ngの全収量の範囲だった。試料６は異常値のようであり、おそらくこの試料中のＤＮＡの不均等な再水和の結果だろう。
【００９６】
0004425513.tif 000014
【００９７】
PicoGreen定量化データによると、平均収量は418ngだった。最低点は250.8ngつまり平均の60％だった。最高点は959ng（＃６−おそらく異常点）つまり平均の229％だった。平均の計算でこの点を無視すると、平均は350ngであり、最低点は250ngつまり平均の71％であり、最高点は510ngつまり平均の145％である。
上述したように、特定の好ましい実施形態を特に参照して、この発明を詳細に説明した。特許請求の範囲に記載される本発明の精神及び範囲を逸脱することなく、変形及び修正が達成できることを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ゲル電気泳動法で分画され、かつ臭化エチジウムで染色されたゲノムＤＮＡ試料の写真を示しており、ゲノムＤＮＡの試料は、実施例３で述べられるように、異なった所定量のヒト全血から、非多孔性MagneSilTMシリカ磁性粒子を用いて単離された。
【図２】  実施例７で述べられるように、可変量のMagneSilTMシリカ磁性粒子の存在下でＳＴＲ座を増幅後、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で分画後のK562組織培養細胞から単離されたヒトゲノムＤＮＡ及びＤＮＡの増幅されたＳＴＲ座の蛍光検出によって生成されたレーザー印刷画像のコピーである。
【図３】  ゲル電気泳動法で分画され、かつ臭化エチジウムで染色されたゲノムＤＮＡ試料の写真を示しており、ゲノムＤＮＡの試料は、実施例１０で述べられるように、ヒト全血から、多孔性MagneSilTMシリカ磁性粒子を用いて単離された。
【図１】
0004425513.tif 000015
【図２】
0004425513.tif 000016
【図３】
0004425513.tif 000017