(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
微粒子の表面にポリエチレンイミン及びその架橋剤の硬化被膜を形成したアニオン交換体であり、該硬化被膜が下記工程により製造されたアニオン交換体。
（１）ポリエチレンイミンの架橋剤を溶解した水溶液中に微粒子を分散させる第１の工程、（２）ポリエチレンイミン及びアルカリ金属水酸化物の水溶液を添加し、ポリエチレンイミンと架橋剤との架橋反応を抑制しながら微粒子表面にポリエチレンイミン及びその架橋剤の硬化被膜を形成する第２の工程。
【請求項２】
微粒子の表面にポリエチレンイミン及びその架橋剤の硬化被膜を形成したアニオン交換体の製造方法であって、下記工程からなる製造方法。
（１）ポリエチレンイミンの架橋剤を溶解した水溶液中に微粒子を分散させる第１の工程、（２）ポリエチレンイミン及びアルカリ金属水酸化物の水溶液を添加し、ポリエチレンイミンと架橋剤との架橋反応を抑制しながら微粒子表面にポリエチレンイミン及びその架橋剤の硬化被膜を形成する第２の工程。
【請求項３】
前記ポリエチレンイミンは分子量が１０００以下であることを特徴とする請求項２記載の製造方法。
【請求項４】
前記微粒子は径が１００オングストローム以上の孔を有する多孔質粒子であることを特徴とする、請求項２記載の製造方法。
【請求項５】
前記微粒子は、表面にグリシジル基、ハロゲン化アルキル基、アルデヒド基からなる群より選ばれる１種以上の官能基を有するものであることを特徴とする、請求項２記載の製造方法。
【請求項６】
前記架橋剤は、エピクロルヒドリン又は多官能エポキシ化合物であることを特徴とする請求項２記載の製造方法。
【請求項７】
前記アルカリ金属水酸化物は、水酸化ナトリウムであることを特徴とする請求項２記載の製造方法。
【請求項８】
前記多官能エポキシ化合物は、エチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリプロピレングリコールジグリシジルエーテル、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル、グリセロールポリグリシジルエーテル、ソルビトールポリグリシジルエーテルからなる群より選ばれる１種以上の化合物であることを特徴とする請求項６記載の製造方法。
【請求項９】
請求項１記載のアニオン交換体からなるクロマトグラフィー用充填剤。
【請求項１０】
請求項９の充填剤を充填してなるクロマトグラフィー用充填カラム。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本願発明は、アニオン交換体等に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
イオン交換基を有する微粒子は、分離材料として純水製造、クロマトグラフ分離などの分野で広く用いられているが、イオン交換基としてポリエチレンイミンを導入したアニオン交換体は、液体クロマトグラフィーの分野においてアミノ酸、ペプチド、タンパク質、核酸、そして糖類等の分析、分取の目的で用いられたり、キレート樹脂として用いられている。
【０００３】
ポリエチレンイミンを導入したアニオン交換体は、ポリエチレンイミンをクロロメチルスチレン等のハロゲン化アルキル基を有する微粒子に導入する方法（例えばアメリカ特許第４１９１８１４号）や、グリシジル基又はハロゲン化アルキル基を有するアクリル微粒子導入する方法（例えばアメリカ特許第４１１１８５９号）、無機系担体に対し静電的吸着を利用してポリエチレンイミンを吸着させた後、架橋剤を用いて吸着したポリエチレンイミンを架橋させる方法（例えばアメリカ特第４２４５００５号）等が知られており、微粒子の性質に応じて種々の応用が試みられている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
ハロゲン化アルキル基やエポキシ基を有する微粒子に対してポリエチレンイミンを導入する場合、分子量の大きいポリエチレンイミンを導入してもイオン交換容量はほとんど増加しない。これは、ポリエチレンイミンが基材に対して平面的に導入されてしまうためと考えられるが、ポリエチレンイミンを多層的（立体的に）に導入するため、大量のポリエチレンイミンと大量の架橋剤を同時に添加すると両者が反応系全体に分布しているために反応系全体が硬化してアニオン交換体を製造することができなくなる。上記のアメリカ特許第４２４５００５号は、架橋剤を用いてポリエチレンイミンで担体を被覆する方法に関するものであるが、かかる方法でも反応に供するポリエチレンイミン及び架橋剤の量には制限があり、イオン交換容量の増大を目的として大量のポリエチレンイミンと大量の架橋剤を添加し反応を行おうとするならば、反応系全体が硬化して前記の様な課題が生じるのである。
【０００５】
そこで本願発明の目的は、従来と比較して大量のポリエチレンイミンと大量の架橋剤を用いてイオン交換容量の大きいアニオン交換体を製造する方法であって、反応系が硬化することによりアニオン交換体の製造ができなくなるという課題を生じることのない製造方法等を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成する本願請求項１の発明は、微粒子の表面にポリエチレンイミン及びその架橋剤の硬化被膜を形成したアニオン交換体であり、該硬化被膜が（１）ポリエチレンイミンの架橋剤を溶解した水溶液中に微粒子を分散させる第１の工程、及び、（２）ポリエチレンイミン及び触媒の水溶液を添加し、ポリエチレンイミンと架橋剤との架橋反応を抑制しながら微粒子表面にポリエチレンイミン及びその架橋剤の硬化被膜を形成する第２の工程により製造されたアニオン交換体である。
【０００７】
また前記目的を達成する本願請求項２の発明は、微粒子の表面にポリエチレンイミン及びその架橋剤の硬化被膜を形成したアニオン交換体の製造方法であって、（１）ポリエチレンイミンの架橋剤を溶解した水溶液中に微粒子を分散させる第１の工程、及び、（２）ポリエチレンイミン及び触媒の水溶液を添加し、ポリエチレンイミンと架橋剤との架橋反応を抑制しながら微粒子表面にポリエチレンイミン及びその架橋剤の硬化被膜を形成する第２の工程からなる。
【０００８】
本願請求項３の発明は、請求項２の発明に係り、前記ポリエチレンイミンが分子量が１０００以下であることを特徴とする。本願請求項４の発明は、請求項２の発明に係り、前記微粒子が、径が１００オングストローム以上の孔を有する多孔質粒子であることを特徴とする。本願請求項５の発明は、請求項２の発明に係り、前記微粒子が表面にグリシジル基、ハロゲン化アルキル基、アルデヒド基からなる群より選ばれる１種以上の官能基を有するものであることを特徴とする。本願請求項６の発明は、請求項２の発明に係り、前記架橋剤がエピクロルヒドリン又は多官能エポキシ化合物であることを特徴とする。本願請求項７の発明は、請求項２の発明に係り、前記触媒が水酸化ナトリウムであることを特徴とする。本願請求項８の発明は、請求項２の発明に係り、前記多官能エポキシ化合物がエチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリプロピレングリコールジグリシジルエーテル、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル、グリセロールポリグリシジルエーテル、ソルビトールポリグリシジルエーテルからなる群より選ばれる１種以上の化合物であることを特徴とする。
【０００９】
本願請求項９の発明は、前記請求項１記載のアニオン交換体からなるクロマトグラフィー用充填剤である。そして本願請求項１０の発明は、請求項９記載の充填剤を充填してなるクロマトグラフィー用充填カラムである。以下、本願発明を詳細に説明する。
【００１０】
本願発明のアニオン交換体は、イオン交換容量が大きく、かつ、タンパク質等の対象サンプルの吸着容量が大きいという特徴を有するが、これは前記のように反応系を硬化させることなく微粒子に対してポリエチレンイミンを多層的に被覆したことによる効果である。本願発明のアニオン交換体は、イオン交換容量を大きく、かつ、タンパク質等の対象サンプルの吸着容量が大きいにもかかわらず、液体クロマトグラフィー用の充填剤として用いた場合の通液特性が良好で、低圧操作が可能である。また本願発明は粒子径の小さい粒子に適用可能であるため、対象サンプルの高い分離能をを実現できる。
【００１１】
本願発明で使用する微粒子は、その表面にグリシジル基、ハロゲン化アルキル基、アルデヒド基からなる群より選ばれる１種以上の官能基を有しているものを例示できる。具体的には、例えばエポキシ基、ハロゲン化アルキル基又はアルデヒド基を有しているか、或いは後に導入可能であれば有機系及び無機系の公知である微粒子を用いることができる。微粒子に後にエポキシ基、ハロゲン化アルキル基又はアルデヒド基等を導入する方法は、従来から知られた方法を用いれば良い。また微粒子の粒径には特に制限がないが、液体クロマトグラフィーにおいて使用した場合に良好な分離能を発揮するよう、粒径が１から１００マイクロメータ程度の微粒子であることが好ましい。
【００１２】
微粒子は、その表面に細孔を有していない、いわゆる非多孔性微粒子であっても良いが、イオン交換容量を高めるために１００オングストローム以上の孔を有する多孔性粒子を用いることが好ましい。好ましく表面に細孔を有する微粒子を用いれば、該細孔中にポリエチレンイミンの硬化皮膜を形成可能となるから、より多量のポリエチレンイミンを導入することによってイオン交換容量を大きくできるのである。
【００１３】
微粒子としては、例えば有機系微粒子や無機系微粒子を用いることができる。有機系微粒子としては、例えば単官能ビニルモノマーと多官能ビニルモノマーを組み合わせた微粒子や架橋多糖微粒子等を挙げることができる。単官能ビニルモノマーとしては、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、２，３−ジヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート等の（メタ）アクリル酸ヒドロキシアルキルエステル、グリシジル（メタ）アクリレート等の（メタ）アクリル酸グリシジルエステル、３−クロロ−２−ヒドロキシ（メタ）アクリレート、３−ブロモプロピル（メタ）アクリレート等の（メタ）アクリル酸ハロゲン化アルキルエステル、アクリル酸、メタクリル酸、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル等の（メタ）アクリル酸エステル、クロロメチルスチレン、ビニルベンジルアルコール、ビニルベンジルグリシジルエーテル、ヒドロキシスチレンなどのスチレン誘導体、酢酸ビニル等を具体的に例示できる。また多官能ビニルモノマーとしては、エチレングリコールジ（メタ）アクリル酸エステル、グリセロールジ（メタ）アクリル酸エステル等のポリオール（メタ）アクリル酸エステル、ジビニルベンゼン、トリアリルイソシアヌレート等を具体的に例示できる。また架橋多糖微粒子の多糖としては、セルロース、アガロース、デキストラン、マンノース等を例示できる。一方無機系微粒子としては、シリカ、ゼオライト、チタニア、酸化アルミ、ヒドロキシアパタイト等を例示できる。
【００１４】
ポリエチレンイミンは、架橋剤と共に微粒子と反応させる被覆反応の際に、当該反応系全体が硬化してアニオン交換体の製造ができないという事態を引き起こさないために、分子量１００００以下、特に１０００以下のものを用いることが好ましい。また反応系への添加量も、反応系全体の硬化を引き起こさないように微粒子に対して０．３から０．５重量部とすることが特に好ましい。
【００１５】
本願発明に用いる架橋剤は、ポリエチレンイミンを架橋して微粒子表面に硬化皮膜を形成するためのものである。かかる架橋剤としては特に制限はないが、例えば水溶性のエピクロルヒドリン又は水溶性の多官能エポキシ化合物を例示できる。多官能エポキシ化合物の具体例としては、例えばエチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリプロピレングリコールジグリシジルエーテル、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル、グリセロールポリグリシジルエーテル、ソルビトールポリグリシジルエーテル等を例示できる。これらの架橋剤は単独で、或いは２種類以上を組み合わせて使用する事もできる。使用量は特に制限されないが、微粒子に対して０．３から０．５重量部とすることが好ましい。
【００１６】
ポリエチレンイミンの架橋反応を促進するために用いる触媒としては、アルカリ金属水酸化物を例示できる。具体的には、例えば水酸化ナトリュウム、水酸化カリュウム等を例示できる。これらは、水溶液の状態で反応系中に添加するが、使用量は微粒子に対して０．１から０．２重量部とすることが好ましい。
【００１７】
本願発明のアニオン交換体の製造は、以下に説明する工程からなる。第１の工程は、ポリエチレンイミンの架橋剤を溶解した水溶液中に微粒子を分散させる工程である。水溶液は、微粒子と同等重量使用することが好ましい。そして第２の該工程は、ポリエチレンイミン及び触媒の水溶液をこれに添加し、ポリエチレンイミンと架橋剤との架橋反応を抑制しながら微粒子表面にポリエチレンイミン及びその架橋剤の硬化被膜を形成する工程である。第２の工程では、微粒子及び架橋剤を水中に溶解、分散させた状態で、撹拌しながらポリエチレンイミン及びアルカリ金属水酸化物等の触媒水溶液を添加する工程であるが、ポリエチレンイミンと架橋剤との架橋反応を抑制するために、ポリエチレンイミン及びアルカリ金属水酸化物水溶液を３０分から２時間かけて添加することが好ましい。なお硬化皮膜の形成は、約４０℃の条件下で十分に進行し、２時間程度反応を継続すれば十分である。
【００１８】
以上の工程に加え、例えば製造されたアニオン交換体を塩酸水溶液や純水等で洗浄し、精製することについては特に制限はない。
【００１９】
以上に説明した工程によって製造される本願発明のアニオン交換体は、クロマトグラフィー用の充填材として有用であり、例えばガラス、金属製のカラムに充填すれば、クロマトグラフィー用カラムとしてアニオン性タンパク質等の分離、分析又は分取のために使用することができる。
【００２０】
【発明の実施の形態】
以下、実施例を挙げて本願発明を更に具体的に説明するが、本願発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２１】
実施例１
５００ｍｌ三口フラスコに、表面に径が１０００オングストロームの細孔径を有し、粒子径が１０マイクロメータである多孔性の親水性ビニルポリマー粒子５０ｇ、純水５０ｇ及びエピクロルヒドリン５０ｇを入れ、拌棒を取り付けて４０℃に設定したオイルバスに漬けてゆっくりと攪拌した。これとは別に２００ｍｌフラスコに苛性４０ｇ、純水６０ｇを計り取り溶解した。なお前記多孔性の親水性ビニルポリマー粒子は、市販のカラム（ＴＳＫｇｅｌＧ５０００ＰＷＸＬ、商品名、東ソー（株）製）から抜き出して本実施例に使用した。
【００２２】
苛性溶液をペリスタポンプを用いて上記ゲル溶液に１時間かけて滴下し、滴下終了後も更に１時間に渡って攪拌を継続し、微粒子表面のエポキシ化を行った。反応終了後、ガラスフィルタを用いて純水による洗浄を行った。エポキシ化反応終了後、ガラスフィルタを用いて微粒子を分離し、純水で洗浄した。
【００２３】
以上のようにして得られたエポキシ化微粒子（５０ｇ）を３００ｍｌ三口フラスコに計り取り、エチレングリコールジグリシジルエーテル２０ｇ、純水５０ｇを加えて４０℃のオイルバスに漬け、攪拌した。これとは別に２００ｍｌフラスコに４Ｎ−水酸化ナトリュウム５０ｍｌ及びポリエチレンイミン（和光純薬工業（株）製、分子量６００）２０ｇを混合した。
【００２４】
上記溶液をエポキシ化微粒子と架橋剤の分散液に加え、２時間に渡って攪拌して硬化皮膜形成反応を行った。反応終了後、ガラスフィルタを用いてアニオン交換体を分離し、０．５Ｎ塩酸水溶液、純水の順で洗浄した。このようにして製造されたアニオン交換体のイオン交換容量は０．１２ｍｅｑ／ｍｌであった。
【００２５】
以上のようにして得られたアニオン交換体を４．６ｍｍＩ．Ｄ．×５ｍｍＬカラムに充填し、タンパク質吸着容量をブレークスルー法にて測定した。ブレークスルー法による測定条件及び測定装置は以下の通りである。
【００２６】
ポンプ            ＣＣＰＭ−ＩＩ  （商品名、東ソー（株）製）
オートサンプラー  ＡＳ−８０２０  （商品名、東ソー（株）製）
検出器            ＵＶ−８０２０  （商品名、東ソー（株）製）
サンプル          １０ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ（シグマ社製）
サンプル注入量    ５ｍｌ
測定波長          ＵＶ２８０ｎｍ
溶離液            ２０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）
タンパク質溶出による吸光度変化の１０％高さをブレーク点としてタンパク質（ＢＳＡ）の吸着容量を計算したところ、１５０ｍｇＢＳＡ／ｍｌであった。
【００２７】
上記のアニオン交換体を５．０ｍｍＩ．Ｄ．×５０ｍｍＬ．カラムに充填してタンパク質の分離を行った。測定装置は上記と同一であり、分離条件は以下の通りである。
【００２８】
0004433617.tif 000002
図１に上記測定の結果を示す。図１から、実施例１のアニオン交換体はタンパク質の吸着容量が大きく、かつ、高い分離能を発揮することが分かる。また上記測定を実施した際の流路系の圧力（送液圧力）は１．０ＭＰａであったことから、実施例のアニオン交換体は通液特性が良好で、かかる吸着容量と分離能を低い送液圧力で発揮し得ることも分かる。
【００２９】
実施例２
架橋剤を１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテルに変更した以外は実施例１と同様の工程によってアニオン交換体を製造した。イオン吸着容量は０．１１ｍｅｑ／ｍｌであり、タンパク質の吸着容量は１３５ｍｇＢＳＡ／ｍｌであった。
【００３０】
比較例１
架橋剤及び４Ｎ水酸化ナトリュウム水溶液を用いなかった以外は実施例１と同様の工程によってアニオン交換体を製造した。このアニオン交換体は、ポリエチレンイミンのみをエポキシ化微粒子に導入したものであり、本願発明のイオン交換体とは異なり、ポリエチレンイミンの硬化皮膜は形成されない。
【００３１】
このようにして製造したアニオン交換体のイオン吸着容量は０．０４ｍｅｑ／ｍｌであり、実施例１と同様にして測定したタンパク質吸着容量は４２ｍｇＢＳＡ／ｍｌであった。
【００３２】
比較例２
４Ｎ−水酸化ナトリュウム水溶液を用いなかった以外は実施例１と同様の工程によってアニオン交換体の製造を試みたが、反応系全体が硬化してしまい、微粒子を反応系から取り出すことができなかった。
【００３３】
比較例３
実施例１で調製したエポキシ化微粒子を３００ｍｌ三口フラスコに５０ｇ計り取り、トリエチルアミン２８％水溶液（東京化成試薬（株）製）１０ｍｌ、純水５０ｇを加えて４０℃のオイルバスに漬け、２時間に渡って攪拌した後、ガラスフィルタで微粒子を分離し、０．５Ｎ塩酸水溶液、純水の順で洗浄してアニオン交換体を得た。
【００３４】
このようにして製造したアニオン交換体のイオン交換容量は０．０３ｍｅｑ／ｍｌであり、実施例１と同様にして測定したタンパク質吸着容量は３５ｍｇＢＳＡ／ｍｌであった。また本比較例で製造したアニオン交換体を実施例１と同様にしてカラムに充填し、グラジエント時間を３０分に変更した以外は同様のタンパク質の分離を行った。
【００３５】
図１に結果をあわせて示すが、本願発明のアニオン交換体では比較例で製造したアニオン交換体に比べてはるかに大きいイオン交換容量とタンパク質の吸着容量を有するにもかかわらず、各タンパク質の溶出ピークが幅広くなったり、送液圧力が高くなるということはなかった。
【００３６】
【発明の効果】
本願発明のアニオン交換体は、微粒子表面導入ポリエチレンイミン型として、微粒子でありながら、イオン交換容量が大きく、かつ、タンパク質等の対象サンプルに対する吸着容量が大きいため、キレート樹脂又は液体クロマトグラフィー用充填剤として有用である。特に液体クロマトグラフィー用充填剤として用いた場合には、高吸着容量、高保持力、高分離能を低操作圧で実現できるという優れた効果を発揮し得るものであり、対象サンプルの分取はもとより、大量の共存物質中の微量成分分析においても有効なものである。。
【００３７】
本願発明のアニオン交換体は、微粒子であるため通液特性が良好かつ高い分解能を発揮し得るという効果もある。しかも通液特性が良好であるため、低い送液圧力でかかる効果を発揮するのである。従って本願発明のアニオン交換体を充填したカラムを用いてタンパク質分析等を行う場合に、操作圧力（送液圧力）を高める必要なしに大量のサンプルを一度に処理することも可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、実施例１及び比較例３における結果、即ちタンパク質分離を行ったときに得られたクロマトグラフを示す図である。図中横軸は試料を測定装置に注入してからの時間（分）を示す。
【図１】
0004433617.tif 000003