(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）または（２）の化合物であって、A1、A2及びA3は互いに独立して水素、シアノ、ハロゲン及びスルホン酸からなる群から選択され、B1はハロゲン、シアノまたは水素を示し、B2は水素、アミド、ハロゲン及び1〜20のC原子を有するアルキル基からなる群から選択される、該化合物。
【化１】
（１）
0004603109.tif 000008
【化２】
（２）
0004603109.tif 000009
［式中、Ca〜CdはそれぞれC原子を表し、Ca及びCb並びにCc及びCdは単結合または二重結合によって結合され；X1〜X16は互いに独立してハロゲン、スルホン酸、水素及び1〜20のC原子を有するアルキル基からなる群から選択され、該アルキル基は1個のハロゲンまたはスルホン酸基で置換されていてもよく；R1はホスホルアミダイトであり、R2は、水素、1〜20のC原子を有するアルキル、ポリオキシヒドロカルビル単位、フェニル、またはアルキル鎖が1〜3の炭素原子を有するフェニルアルキルを表し、該アルキル及び／またはフェニル基は1個のヒドロキシ、ハロゲン、スルホン酸、アミノ、カルボキシまたはアルコキシが1〜4の炭素原子を有し得るアルコキシカルボニル基により置換されていてもよく；
R2及びX4は任意に0〜2のC原子からなる架橋により結合されていてもよい。］
【請求項２】
A1、A2、A3、B1及びB2を含む群の基の全てがフッ素または塩素を示す請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
A1、A2、A3及びB1を含む群の基の全てがフッ素または塩素を示し、B2が水素を示す請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
基X1、X2、X3、X4、X7及びX10が水素を示し、及び／または基X5、X6、X8、X9、X11及びX12がメチルを表す請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物、並びに炭水化物、タンパク質、抗体、核酸、核酸類似体、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、ハプテン、ホルモン及びビタミンからなる群より選択される少なくとも１つの分子を含む複合体。
【請求項６】
分子がオリゴヌクレオチドまたはヌクレオシドトリホスフェートである請求項５に記載の複合体。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物の蛍光染料としての使用。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物又は請求項５もしくは６に記載の複合体の、もう１種の染料またはもう１種の染料複合体を合わせた蛍光共鳴エネルギー転移系としての使用。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物又は請求項５もしくは６に記載の複合体の分析または診断系における使用。
【請求項１０】
請求項６に記載の複合体の核酸の標識及び／または検出のための使用。
【請求項１１】
もう１つの蛍光染料及び第２のオリゴヌクレオチドからなる少なくとも１種の第２の複合体を使用し、染料の励起の後に蛍光共鳴エネルギー転移が起こり得る請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
増幅反応の生成物が核酸として検出される請求項１０または１１に記載の使用。
【請求項１３】
生成物が各増幅サイクルの間または後に検出される請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
融解曲線分析を行う請求項１２に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、蛍光発光極大波長が約520〜720 nmの範囲である、新規な五環式ローダミン誘導体、これらの誘導体で標識された生物分子、及びそれらの診断系における使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
適当な反応性基を有する親水性の誘導体の形態のマーカー(標識物質)として使用することができる多数のローダミン誘導体が知られている。そのような化合物は例えば、テトラメチルカルボキシローダミンまたはカルボキシ-ローダミン101(RHODOS)のNHSエステルをアミノ基を含むタンパク質と反応させることにより得られ、これらは診断系において使用される。ハプテン-蛍光物質複合体の例はEP-A-285179号に記載されているが、記載された化合物は600 nm未満の波長に吸収極大を有する。
【０００３】
EP 0 543 333号は、600 nmより長波長側に吸収極大を有する長波長ローダミン様誘導体を開示している。しかしこの発明の時点においては、記載された化合物の対応するホスホルアミダイトへの変換は知られていなかった。
またEP 0 567 622号は、600 nmより長波長側に吸収極大を有する長波長ローダミン誘導体の製造を開示している。しかし、対応する核酸複合体の合成、及び核酸分析において確立されてきたもののような蛍光共鳴エネルギー転移系(fluorescence energy transfer system, Bio Techniques Vol. 22, No. 1, p. 130-138, 1997)の成分としての記載された化合物の使用はこれまで記載されていなかった。
【０００４】
そのスペクトル特性及び一般的な入手のしやすさにより、蛍光染料のフルオレセインが広く使用されており、多様な用途に使用されている。いわゆるFRET系において、フルオレセインは通常は蛍光共鳴エネルギー供与体として作用し、分析試験方法に応じて種々の蛍光共鳴エネルギー受容体を使用することができる可能性がある。しかし核酸分析におけるFRET系の使用はこれまではCy5 (PCR Methods Appl, 4, 357-362, 1995)及びローダミン誘導体TAMRA及びROX(Anal. Biochem., 252, 78-88, 1997)のようなシアニン誘導体の使用に限定されていた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
従って本発明の目的は、特に他の染料と共に蛍光共鳴電子伝達対を形成して分析あるいは診断目的のためのローダミン誘導体で標識された生体分子の使用を可能とする、長波長域の改善されたスペクトル特性を有する新規なローダミン誘導体を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
従って本発明は、一般式（１）または（２）の化合物であり、これまでに知られていた技術とは異なり、該化合物は、A1、A2及びA3が互いに独立してハロゲン、シアノ、水素、カルボン酸、リン酸またはスルホン酸を示し、B1がハロゲン、シアノまたは水素を示し、B2が水素、アミド、ハロゲン及び1〜20のC原子を有するアルキル基からなる群から選択されることを特徴とする。
【化３】
0004603109.tif 000002
（１）
【化４】
0004603109.tif 000003
（２）
【０００７】
［式中、Ca〜CdはそれぞれC原子を表し、Ca及びCb並びにCc及びCdは単結合または二重結合によって結合され得、X1〜X16は互いに独立してハロゲン、スルホン酸、水素または1〜20のC原子を有するアルキル基を表し、該アルキル基は1または数個のハロゲンまたはスルホン酸基で置換されていてもよい。R1及びR2は、同一であるか異なり、水素、1〜20のC原子を有するアルキル基、ポリオキシヒドロカルビル単位、フェニル、またはアルキル鎖が1〜3の炭素原子を有するフェニルアルキルを表し、該アルキル及び／またはフェニル基は1または数個のヒドロキシ、ハロゲン、スルホン酸、アミノ、カルボキシ、またはアルコキシが1〜4の炭素原子を有し得るアルコキシカルボニル基により置換されていてもよい。R1は少なくとも1つの活性化可能な基を含む。R2及びX4は任意に0〜2のC原子からなる架橋により結合されていてもよい。］
【０００８】
【発明の実施の形態】
A1、A2、A3及びB1の群の少なくとも1つの基がハロゲン、特にフッ素または塩素であるとき有利であることが判明した。好ましくは、基A1、A2、A3及びB1の全てがハロゲン、特にフッ素または塩素である。全ての基A1、A2、A3及びB1がいずれもフッ素のみあるいは塩素のみである場合、そのような化合物の製造は比較的単純である。B2が水素原子と同一である化合物も好ましい。しかし、B2はあるいはフッ素または塩素を示してもよく、全ての基A1、A2、A3、B1及びB2がいずれもフッ素のみあるいは塩素のみである場合、そのような化合物の合成は特に単純である。
【０００９】
基X1、X2、X3、X4、X7、X10、X14及びX15は、好ましくは水素である。基X5、X6、X8、X9、X11、X12、X13及びX16は好ましくはメチル基である。基X1、X2、X3、X4、X7及びX10の全てが水素を示し、基X5、X6、X8、X9、X11及びX12の全てがメチル基を表す化合物が特に好ましい。
基R1及びR2は同一であっても異なってもよいが、少なくともR1は、活性化可能な基、例えばアミノ、ヒドロキシル、カルボキシル等を含む。R1は好ましくはただ1つの活性化可能な基を含む。特に好ましい態様においては、R1はヒドロキシエチル基またはカルボキシプロピル基である。
R2がR1とは異なる場合は、R2は好ましくは水素または1〜20のC原子を有するアルキルである。その場合、特に好ましくは水素またはエチル基である。
【００１０】
本発明の化合物は、そのスペクトル特性(約500 nm以上の範囲における吸収極大、及び約520〜720 nmの間の範囲における発光極大)により、染料、特に蛍光染料として非常に適する分子を提供する。この点において、これらの分子のスペクトル特性は、A1、A2、A3及びB1に関してハロゲン基の種類、数及び位置を変更することによって変えることができる。このようにして、約520 nm〜720 nmの間の範囲でほとんどどのような吸収及び発光極大の蛍光染料でも製造することができる。従って、本発明のローダミン誘導体の蛍光染料としての使用も本発明の主題である。
【００１１】
本発明のローダミン誘導体を含む複合体を調製するために、例えば標識生体分子またはその他の分析用試薬に適した活性化誘導体を合成することができる。活性化誘導体は、基R1及びR2上の活性化可能な基のうちの少なくとも1つを使用することによって調製され、当業者に知られている公知の標準的なプロトコルによって活性化を行うことができる。通常、活性化はR1及びR2の少なくとも1つのヒドロキシル基、アミノまたはカルボキシル基によって得られる。
後の用途に応じて種々の反応性基を導入することができる。ホスホルアミダイト及びHホスホネートは例えばヒドロキシル基から誘導することができる。従って、ローダミンホスホルアミダイトまたはH-ホスホネートは通常、これまでに知られているプロトコルによって製造される(Methods in Mol. Biol. Vol 20, "Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Synthesis and Properties", S. Agrawal publisher Humana Press Totowa, NJ)。
また、N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステル及びマレインイミドアルキルアミドは通常、カルボキシル基から誘導される。NHSエステルは、好ましくはEP 0 543 333号に記載された方法によって製造され、該方法においては遊離カルボン酸をDCCまたはMEIのような縮合剤の存在下でNHSと反応させる。ローダミンイソチオシアネートは、好ましくはアミノ基をチオホスゲンと反応させて製造する(Advanced Organic Chemistry, McGraw Hill, 2nd edition, p. 383, 1997)。
【００１２】
従って本発明はまた、本発明のローダミンの活性化誘導体に関する。活性化誘導体の反応性基は、好ましくはホスホルアミダイト、N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステル、マレインイミドアルキルアミド、H-ホスホネートまたはイソチオシアネートである。
【００１３】
本発明はさらに、本発明のローダミン化合物またはそれらの活性化誘導体を結合することによって得られる複合体に関する。従って、そのような複合体は少なくとも2つの成分からなり、その1成分が本発明のローダミン誘導体である。複合体は前記活性化誘導体から出発して標準的なプロトコルによって製造される。各場合についての適した結合方法は当業者に知られている。
複合体の第2の成分が測定される結合パートナーに結合できれば直ちに本発明の複合体を分析的な目的のために使用することができ、適当な吸収波長の光による励起の後、形成された複合体は形成された複合体の発光蛍光によって検出される。
【００１４】
本発明の複合体は特に、診断目的のための分析あるいは医療用もしくは生体物質の分析に適している。従って本発明の主題は特に、生体分子と相互作用することができる複合体である。これらは通常、それ自体追加の成分として1または数個の生体分子を含む複合体である。
複合体に含まれるこれらの生体分子は、例えば、DNA、RNA、オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド誘導体のような一本鎖あるいは二本鎖核酸であり得、また例えばPNAのような修飾核酸類似体であり得るが、個々のヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体、ヌクレオチド類似体またはヌクレオシドトリホスフェートでもあり得る。そのような分子は、好ましくは、NHSエステルまたはホスホルアミダイトによって5'位置で標識され、あるいはそれとは異なり、好ましくはCPGのような染料置換キャリアー物質によって3'位置で標識される。核酸塩基のようなその他の部位での標識化も、好ましくはNHSエステルによって行う。
【００１５】
タンパク質、タンパク質複合体、抗体またはアミノ酸を標識する場合、イソチオシアネートにより結合を行うことが好ましい。その他の複合体成分の例としては、ビタミン、ステロイドホルモン、脂質分子及びハプテンがある。さらに、膜画分または全細胞のようなより複雑な生物学的構造を同様に標識することもできる。
【００１６】
本発明のローダミン誘導体と結合したオリゴヌクレオチドは、本発明の複合体の特別な態様である。このように標識されたオリゴヌクレオチドは、これまでに知られた方法において使用して核酸を検出し分析することができ、例えばin situハイブリダイゼーション(Meyne及びMyzis, Methods Mol. Biol. 33, 63-74, 1994)に使用することができ、あるいはまた種々の配列決定方法(Sheealyら、Anal. Chem. 67, 247-251, 1995)においてプライマーとして使用することができる。
【００１７】
化学合成による核酸標識化に加えて、本発明のローダミン染料で標識された核酸ポリメラーゼの基質、例えばリボヌクレオシドトリホスフェート、デオキシリボヌクレオシドトリホスフェート等を種々の酵素反応によって核酸に導入することができる。これはDNAについては、例えばニックトランスレーション(Rigbyら、J. Mol. Biol. 113, p. 237, 1977)あるいはランダムプライムラベリング(Feinberg及びVogelstein, Anal. Biochem. 137, p. 266, 1984)の方法を使用してDNAポリメラーゼにより行うことができる。RNAの場合、これは転写として、例えばT3、T7またはSP6 RNAポリメラーゼによって行うことができる。核酸標識化のための別の方法としては、ターミナルトランスフェラーゼによるいわゆる「3'テーリング反応」によるものがある。
【００１８】
従って、化学的あるいは酵素的方法により核酸を標識するための本発明の複合体の使用、及び核酸の検出及び分析のための本発明により標識されたハイブリダイゼーションプローブの使用もまた本発明の主題である。
分析試験のためには、本発明のローダミン誘導体は最初に、光源として例えばレーザー、レーザーダイオードまたはＬＥＤを使用して適当な波長の光で励起する。被検体に応じて、当業者に知られた測定方法により蛍光を検出する。例としては、in situ法のための蛍光顕微鏡観察、適当なフォトダイオードによる発光の検出がある。
【００１９】
適当な波長の放射エネルギーによる本発明の染料の直接の励起の代わりに、励起はいわゆる蛍光共鳴エネルギー転移によっても行うことができる。この方法においては、フルオレセインのような第2の蛍光染料を適当な波長の光で励起する。その後2つの染料が距離的に近接していることにより本発明のローダミン誘導体へのいわゆる非放射、すなわち放射なしのエネルギー転移が起こる(Van der Meerら、Resonance Energy Transfer, VCH, 1994)。特定の波長でこの分子から発せられる光の検出は、被検体を定量するために好ましく使用することができる。従って本発明はまた、本発明のローダミン誘導体または対応する複合体の蛍光共鳴エネルギー転移系の成分としての使用に関する。
【００２０】
この方法において、本発明の化合物は好ましくは共鳴エネルギー受容体の役目を果たし、この場合以下の構造式を有する化合物が特に適していることが判明した。
【化５】
0004603109.tif 000004
【化６】
0004603109.tif 000005
【００２１】
本発明の化合物のいずれについても(特にJA270及びJF9)、好ましい共鳴エネルギー供与体はフルオレセインまたはフルオレセイン複合体である。従って本発明はまた、本発明のローダミン誘導体または対応する複合体を、フルオレセインあるいは対応する複合体とともに蛍光共鳴エネルギー転移系における蛍光共鳴エネルギー受容体として使用することにも関する。
蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)の原理を使用して検出することができる蛍光染料で標識されたオリゴヌクレオチドのようなハイブリダイゼーションプローブは核酸の定量的検出に適している。例えば、オリゴヌクレオチドの場合、5'末端をFRET系の染料成分で標識し、3'末端をFRET系の他の染料成分で標識することができる。別の態様においてはオリゴヌクレオチドは内部標識してもよい。
【００２２】
一定の態様においては、2種の染料で標識したそのようなオリゴヌクレオチドを核酸増幅の間に使用して、蛍光共鳴エネルギー供与体の発光を測定することにより形成された生成物を検出する。オリゴヌクレオチドが標的に結合しない場合は、放射のないエネルギー転移から生じる供与体の蛍光は測定できない。これに対し、オリゴヌクレオチドが標的DNAに結合すると、使用するDNAポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性により2種の染料成分は空間的に互いに分離され、FRET供与体の蛍光を測定することが可能となる(米国特許第5,210,015号)。
【００２３】
好ましい態様においては、空間的に近接して標的核酸にハイブリダイズすることができる2種の異なるハイブリダイゼーションプローブに異なる染料を配置する。これらは例えば標的核酸の同じ鎖にハイブリダイズする2種のオリゴヌクレオチドプローブとすることができ、この場合1つの染料を第1のプローブの3'末端ヌクレオチドに配置し、他方の染料を第2のプローブの5'末端ヌクレオチドに配置してこの2つの間の距離を少数のヌクレオチドしか存在しないようにする。この数はO及び30の間とすることができる。JA270またはJF9のような本発明のローダミン誘導体と組合せてフルオレセインを使用する場合、O〜15、特に1〜5ヌクレオチドの距離、多くの場合は1ヌクレオチドの距離が有利であるということが判明した。染料成分の間のヌクレオチド距離が確保されれば、染料の1つを末端ではなく内部に結合したプローブを使用することも可能である。二本鎖標的核酸の場合、2つの染料成分の間の0〜30ヌクレオチドの一定のヌクレオチド距離が確保されれば、標的の異なる鎖に結合するプローブを使用することもできる。
【００２４】
従って、本発明の別の主題は、オリゴヌクレオチドとJA270またはJF9のような本発明のローダミン誘導体とからなる本発明の複合体の核酸を分析するための使用であって、この場合、第2のオリゴヌクレオチド及びもう1つの蛍光染料、好ましくはフルオレセインからなる別の複合体を使用し、好ましくは第2のオリゴヌクレオチドに結合した染料を励起した後に蛍光共鳴エネルギー転移が起こり得るようにしたものである。対応するように標識されたオリゴヌクレオチドの組合せは、以下においてFRET対と称する。
【００２５】
このようなFRET対の使用は、ポリメラーゼ連鎖反応の間あるいはその後に増幅産物を検出するために特に有利であることが判った。従って、本発明はさらに、核酸増幅反応の反応生成物を検出するためのFRET対の成分としての本発明の複合体の使用に関する。特定の態様においては、2つの増幅プライマーのうちの1つを同時に、使用される2つの染料のうちの1つで標識することができ、従ってFRETの2つの成分のうちの1つとなる。
【００２６】
増幅産物を検出するための適当なFRET対の使用により、PCR反応のいわゆるリアルタイムモニタリングが可能となり、これにおいては増幅産物の生成に関するデータを、行った反応サイクルの数に関連させて測定することができる。これは通常、増幅プライマーの必要なアニーリングの間の反応及び温度の条件の結果としてFRET対のオリゴヌクレオチドも標的核酸にハイブリダイズし、適当に励起されたとき対応する測定可能な蛍光シグナルが発せられるという事実によって得られる。従って、得られるデータは、定量測定するべき当初に使用された標的核酸の量を与える。従ってそのような態様は、生体試料のRNA濃度を定量する定量的RT-PCR実験に特に重要である。従って本発明はまた、核酸増幅反応の反応生成物を検出するためのFRET対の成分としての本発明の複合体の使用に関し、この場合反応生成物は各サイクルにおいて検出する。本発明のさらに別の主題は、増幅するべき核酸の定量測定を実施するためのFRET対の成分としての本発明の複合体の使用である。
【００２７】
別の態様においては、増幅生成物を増幅反応の終了の後に検出し、この場合、検出すべき標的核酸に対するFRET対のハイブリダイゼーションの後、今度は温度を融解曲線分析の一部として連続的に増加させる。同時に、発光蛍光を温度に関連付けて測定する。このようにして、一定のミスマッチのためにFRET対に対してより低いストリンジェンシーでハイブリダイズする配列を検出する。このようにして測定される融解温度は、点突然変異またはその他の多形性を検出するのに役立つ。従って本発明はまた、特に多形性あるいは点突然変異を同定する場合の融解曲線を決定するためのFRET対の成分としての本発明の複合体の使用に関する。
【００２８】
【実施例】
実施例1：
本発明の染料JA270の合成：
1-(2-ヒドロキシエチル)-6-(2,3,4,5-テトラクロロフェニル)-11-エチル-2,2,4,8,10,11-ヘキサメチル-10,11-ジヒドロ-2H-13-オキサ-11-アザ-1-アゾニア-ペンタセンパークロレート
第1段階:
2,2,4-トリメチル-7-メトキシ-1,2-ジヒドロキノリン
分子量: 203.05 g/mol
273 g(2.2 mol)のm-アニシジン、次いで221 g(2.2 mol)のメシチルオキシドを25 mlの氷酢酸に15〜20℃で滴下した。その後溶液を室温で約18時間攪拌した。次いで500 mlの臭化水素酸を20〜30℃で滴下した。室温で1時間攪拌した後、沈殿物を濾過した。湿潤状態のままの沈殿物を約1 lのアセトンに懸濁し、濾過し、乾燥した。200 gの2,2,4-トリメチル-7-メトキシ-1,2-ジヒドロ-キノリンハイドロブロミドを1 lの水及び500 mlのクロロホルムの混合液中に再懸濁した。懸濁液を10%の水酸化ナトリウム溶液で中和した。そして有機相を水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ロータリーエバポレーターで蒸発乾固した。短時間の後に緑色の油状物が固化した。固体をヘキサンから再結晶させた。67℃〜69℃の融点を有する無色結晶が39%の収率で得られた。
【００２９】
第2段階:
N-(2-ヒドロキシエチル)-2,2,4-トリメチル-7-メトキシ-1,2-ジヒドロキノリン分子量: 247 g/mol
51 g(0.4 mol)のN,N-ジイソプロピルエチルアミン、72.5 g (0.57 mol)の2-ブロモエタノール及びスパチュラ先端分のヨウ化カリウムを、5O g(0.24 mol)の2,2,4-トリメチル-7-メトキシ-1,2-ジヒドロキノリンに加えた。溶液を110〜120℃で24時間攪拌した。その後有機相を希水酸化ナトリウム溶液及び水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。その後溶媒を蒸留により完全に除去した。明緑色油状物を生成物として得た。
【００３０】
第3段階:
酢酸-(2-(2,2,4-トリメチル-7-メトキシ-1,2-ジヒドロキノリン-1-イル)-エチル)エステル
分子量:289 g/mol
18 g(O.l7 mol)の無水酢酸を10 g(0.04 mol)のN-(2-ヒドロキシエチル)-2,2,4-トリメチル-7-メトキシ-1,2-ジヒドロキノリンに加えた。10滴の濃硫酸をこれに加え、100〜110℃に1時間加熱した。反応混合物を氷上に注ぎ、クロロホルムで抽出した。有機相を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させて蒸留した。形成された明黄色油状物は140℃/10-3 mbarの沸点を有していた。
【００３１】
第4段階:
N-エチル-2,2,4-トリメチル-7-メトキシ-1,2-ジヒドロキノリン
分子量: 231.2g/mol
103 g(0.8 mol)のN,N-ジイソプロピルエチルアミン及び231 g(1.5 mol)のジエチルスルフェートを、100 g(O.49 mol)の2,2,4-トリメチル-7-メトキシ-1,2-ジヒドロキノリンに加えた。溶液を24時間還流させた。100 mlの10%水酸化ナトリウム水溶液及び200 mlのクロロホルムを反応混合物に加え、その後室温に冷却した。その後、有機相を水で数回洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を蒸留により完全に除去した。残留物を分画として蒸留した。94〜96℃/0.01 Torrの沸点を有する明黄色油状物が単離された。
【００３２】
第5段階:
N-エチル-7-ヒドロキシ-2,2,4-トリメチル-1,2-ジヒドロキノリンハイドロブロミド
分子量: 298.1 g/ml
60 g(0.25 mol)のN-エチル-2,2,4-トリメチル-7-メトキシ-1,2-ジヒドロキノリンを150 mlの氷酢酸に溶解し、150 mlの臭化水素酸を加えた。溶液を24時間還流させた。冷却した溶液を、氷/メタノール浴で攪拌した。その後、沈殿物を濾過し、アセトンで数回洗浄した。85%の収率で無色結晶が形成された。
【００３３】
第6段階:
N-エチル-7-ヒドロキシ-2,2,4-トリメチル-1,2-ジヒドロキノリン
分子量: 217.2 g/mol
200 gのN-エチル-7-ヒドロキシ-2,2,4-トリメチル-1,2-ジヒドロキノリンヒドロブロミドを1 lの水及び500 mlのクロロホルムの混合液中に懸濁した。pH値が約5になるまで20%酢酸ナトリウム溶液をこの懸濁液に加えた。有機相を水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ロータリーエバポレーターで蒸発乾固した。このようにして明褐色油状物が得られた。放出された塩基は非常に速く分解されるので、別の工程のために必要な量の塩基のみをハイドロブロミドから遊離させた。
【００３４】
第7段階:
6-(2-カルボキシ-3,4,5,6-テトラクロロベンゾイル)-1,2-ジヒドロ-1-エチル-7-ヒドロキシ-2,2,4-トリメチルキノリン
分子量: 503.2 g/mol
24 g(0.11 mol)のN-エチル-7-ヒドロキシ-2,2,4-トリメチル-1,2-ジヒドロキノリン及び31.6 g(0.11 mol)のテトラクロロフタル酸無水物を200 mlの1,2-ジクロロエタンに溶解し、3時間還流させた。冷却した後に溶液を濾過し、ロータリーエバポレーターで蒸発乾固した。残留物を約500 mlのクロロホルム中に懸濁し、沸騰するまで加熱した。固体(=生成物)を濾過した。収量を増やすために、母液をロータリーエバポレーターで蒸発乾固し、カラムクロマトグラフィーによって精製した。このためには、約3 gの粗生成物について約100 gのシリカゲル(ICNシリカ32-63, 60A)を分離物質として使用した。クロロホルム+5%エタノール混合液を溶出液として使用した。濾過した固体を約1 lのジエチルエーテルに溶解した。濾過した後、溶媒を蒸留により除去し、残留物を乾燥させて黄色固体を形成した。
【００３５】
第8段階:
1-(2-ヒドロキシエチル)-6-(2,3,4,5-テトラクロロフェニル)-11-エチル-2,2,4,10,11-ヘキサメチル-10,11-ジヒドロ-2H-13-オキサ-11-アザ-1-アゾニア-ペンタセンパークロレート(JA270)
分子量: 756.5 g/mol
8.7 g(0.017 mol)の6-(2-カルボキシ-3,4,5,6-テトラクロロ-ベンゾイル)-1,2-ジヒドロ-1-エチル-7-ヒドロキシ-2,2,4-トリメチル-キノリン及び5 g(0.017 mol)の酢酸-(2-(2,2,4-トリメチル-7-ヒドロキシ-1,2-ジヒドロキノール-1-イル)-エチル)エステルを、全ての成分が溶解するまで500 mlのジクロロメタン中で還流させた。その後、攪拌しながら20 gの五酸化リンを注意深く加え、加熱して1時間沸騰させた。その後、溶媒を減圧下に除去し、100 mlの70%硫酸を残留物に加えた。徐々に赤に着色した溶液を120℃で40分間攪拌した。反応混合液を冷却した後、500 mlの氷冷したエタノールにゆっくりと注ぎ、濾過した。50 mlの60%過塩素酸及び5 lの水を濾過した溶液に滴下した。沈殿した染料を濾過し、デシケーター中で五酸化リンで乾燥させた(収量; 5.6 g)。約2 gの粗生成物を60 mlのアセトン及び50 mlの2N塩酸の混合液に溶解し、20時間還流させた。冷却した後、過塩素酸及び水を加えることによって染料を沈殿させ、乾燥させた。その後染料をカラムクロマトグラフィー(Alox N/エタノール)によって精製した。その後、染料画分を濾過し、濃縮して再度沈殿させた。その後約1 gの染料をo-ジクロロベンゼンに溶解し、5時間還流させた。その後、溶媒を水中でなお減圧下において除去した。残留物を約50 mlの水でさらに3回蒸留した。その後、残留物をエタノール中に取り、濾過した。過塩素酸及び水を加えることによって染料を再度沈殿させた。エタノール中での吸収極大は、615 nmの波長にあることが判明した。このように合成された化合物は、下記構造式を有する。
【化７】
0004603109.tif 000006
【００３６】
実施例2
本発明のホスホルアミダイトの合成
1-(2-(2-シアノ-エトキシ)ジイソプロピルアミノ-ホスファニルオキシ)-エチル)-6-(2,3,4,5-テトラクロロフェニル)-11-エチル-2,2,4,8,10,11-ヘキサメチル-10,11-ジヒドロ-2H-13-オキサ-11-アザ-1-アゾニア-ペンタセンパークロレート
985 mg(1.5 mmol)の実施例1で製造したローダミン誘導体(2-ヒドロキシエチル)-6-(2,3,4,5-テトラクロロフェニル)-11-エチル-2,2,4,8,10,11-ヘキサメチル-10,11-ジヒドロ-2H-13-オキシ-11-アザ-1-アゾニア-ペンタセンパークロレート、及び257 mg(1.5 mmol)のジイソプロピルアミノテトラゾリドをアルゴン下50 mlの乾燥した塩化メチレン中に溶解した。450 mg(1.5 mmol)のビス(N,N-ジイソプロピル-アミノ)-シアノエチル-ホスフィンを添加した後、室温で1時間攪拌した。溶媒を蒸留によって除去し、残留物を150 mlの酢酸エチル中に取った。各回50 mlの5%炭酸水素ナトリウム溶液で混合物を二回洗浄した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、その後溶媒をロータリーエバポレーターで減圧下に除去した。残留物をジオキサン中に取り、ヘキサンで沈殿させた。沈殿物を濾過し、アセトニトリル中に溶解し、溶液を0.45μmのフィルター(Millipore SLHV025NS)を通して濾過した。濾液を減圧下に蒸発乾固した。残留物を30 mlのジオキサンから凍結乾燥させた。暗青色粉末が1 gの収量で得られた。
【００３７】
実施例3
ホスホルアミダイトによる標識オリゴヌクレオチドの製造
1-(2-(2-シアノ-エトキシ)ジイソプロピルアミノ-ホスファニルオキシ)-エチル)-6-(2,3,4,5-テトラクロロフェニル)-11-エチル-2,2,4,8,10,11-ヘキサメチル-10,11-ジヒドロ-2H-13-オキサ-11-アザ-1-アゾニア-ペンタセンパークロレート
p-tert-ブチル-フェノキシアセチル保護されたホスホルアミダイト(PerSeptive Biosystems、カタログ番号GEN O84290-084292)を使用して製造業者による標準的な条件下にABI 394合成器中でオリゴヌクレオチドを調製した。同じ装置を使用して、前記合成オリゴヌクレオチドの5'末端の最後の塩基の代わりにアセトニトリル中の本発明のホスホルアミダイト、1-(2-(2-シアノ-エトキシ)ジイソプロピルアミノ-ホスファニルオキシ)エチル-6-(2,3,4,5-テトラクロロフェニル)-11-エチル-2,2,4,8,10,11-ヘキサメチル-10,11-ジヒドロ-2H-13-オキサ-11-アザ-1-アゾニア-ペンタセンパークロレートの0.1 mmol溶液を使用して染料を結合した。標準的な条件下での酸化及び室温での25%アンモニアによるオリゴヌクレオチドの2時間の切断の後、オリゴヌクレオチドを得、これをその後HPLC(POROS OligoR3カラム、PerSeptive, Inc., Framingham, MA, 4.6 x 50 mm)によって精製した。標識したオリゴヌクレオチドは以下のようにして4 ml/分の流速で溶出した。
【００３８】
溶出液A:トリエチルアンモニウムアセテート、100 mmol/l; pH 6.9
溶出液B:トリエチルアンモニウムアセテート、100 mmol/l; pH 6.9/アセトニトリル(1:1)
勾配溶出:
- 2分100%A
- 10分100%の溶出液Aから100%の溶出液B
- 約20〜25% B(非標識オリゴの溶出)及び約55〜65%(標識オリゴの溶出)において約2〜3分間勾配を停止することにより、平均的に溶出した。溶出プロフィルは、260 nmで光学的に検出した。
【００３９】
実施例4:
本発明のNHSエステルの合成
1-(3-カルボキシプロピル)-6-(2,3,4,5-テトラクロロフェニル)-11-エチル-2,2,4,8,10,11-ヘキサメチル-10,11-ジヒドロ-2H-13-オキサ-11-アザ-1-アゾニア-ペンタセン-O-スクシンイミドエステルパークロレート
テトラクロロ-カルボキシフェニル前駆体はEP-0543 333号に記載された合成工程と同様に合成した。脱カルボキシル化は実施例1に記載したようにo-ジクロロベンゼン中で5時間還流沸騰させることにより行った。活性エステルは、ジシクロヘキシルカルボジイミド及びN-ヒドロキシ-スクシンイミドの存在下でEP 0543 333号の一般的な合成方法と同様に製造した。
【化８】
0004603109.tif 000007
【００４０】
実施例5:
NHSエステルによる5'-標識オリゴヌクレオチドの製造
本発明のNHSエステル1-(3-カルボキシプロピル)-6-(2,3,4,5-テトラクロロフェニル)-11-エチル-2,2,4,8,10,11-ヘキサメチル-10,11-ジヒドロ-2H-13-オキサ-11-アザ-1-アゾニア-ペンタセン-O-スクシンイミドエステルパークロレートによるオリゴヌクレオチドの標識化
最初に、標識化反応のために、末端アミノ基で5'末端を置換したオリゴヌクレオチドを製造した。5'末端アミノ官能基は、オリゴヌクレオチドをアミノリンカーホスホルアミダイト、すなわち「Aminolink 2」 (Applied Biosystems, Foster City, CA)または「5'-Amino-Modifier C6-TFA」(GLEN RESEARCH, Sterling, VA、カタログ番号10-1916-02)と反応させることにより通常の方法により導入した。エタノール沈殿により沈殿させたアミノ修飾オリゴヌクレオチド(約10〜15 A260単位、約50〜8O nmolに相当)を200μlのホウ酸ナトリウムバッファー、0.1 mol/l、pH 8.5に溶解した。200μlの1.6 mmolの NHSエステル1-(3-カルボキシプロピル)-6-(2,3,4,5-テトラクロロフェニル)-11-エチル-2,2,4,8,10,11-ヘキサメチル-10,11-ジヒドロ-2H-13-オキサ-11-アザ-1-アゾニア-ペンタセン-O-スクシンイミドエステルパークロレートのDMF溶液を加えた後、混合物を遮光して室温で15時間静置させた。その後混合物を「SpeedVac」(50℃に加熱)中で蒸発させた。残留物を1 mlの再蒸留水に溶解し、「POROS OligoR3」カラム(PerSeptive, Inc., Framingham, MA)、4.6 x 50 mmに適用し、以下のようにして4 ml/分の流速で溶出した。
【００４１】
溶出液A:トリエチルアンモニウムアセテート、100 mmol/l; pH 6.9
溶出液B:トリエチルアンモニウムアセテート、100 mmol/l; pH 6.9/アセトニトリル(1:1)
勾配溶出:
- 2分100%溶出液A (N-ヒドロキシ-スクシンイミドの溶出)
- 10分100%溶出液Aから100%溶出液B
- 約20〜25% B(非標識オリゴの溶出)
- 約55〜65%(標識オリゴの溶出)において約2〜3分間勾配を停止することにより、平均的に溶出した。
- 遊離染料は約85%において溶出する。
溶出プロフィルは、260 nmで光学的に検出した。
【００４２】
実施例6:
増幅の間のオンライン検出による定量的RT-PCR
実施例3に記載した方法により本発明のホスホルアミダイトで5'末端標識したオリゴヌクレオチドを、増幅核酸の定量的な検出のためにFRET対の一部として使用した。このために、TNF-α遺伝子のin vitro転写したRNA(Shiraiら、Nature 313, 803-806, 1985)を鋳型として滴定し(109〜107コピー/混合物)、1段階RT-PCRによって増幅した。RT-PCR混合物は、個々のPCR段階の間のオンライン検出のための2種の異なるように標識されたハイブリダイゼーションプローブを含むものとした。下流に位置するプローブは本発明による5'-JA270-標識したもの、上流側プローブはフルオレセインで3'標識したものとした。両方のプローブはアンプリコンの配列にハイブリダイズし、数個の塩基のみ離間しており、ハイブリダイズした状態で2種の標識の間で蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)が起こり得た。
3種の反応混合物のそれぞれは、2.5 U Tth DNAポリメラーゼ、1 x RT-PCRバッファー(Tth DNAポリメラーゼキット)、4 mM Mn2+、300μM dATP、300μM dCTP、300μM dGTP及び900μM dUTP、500 ng BSA、1μlのin vitro転写したRNA(109、108及び107コピー)、1μM フォワードプライマー(17量体、ヌクレオチド位置2588-2602)、1μMリバースプライマー (17量体、ヌクレオチド位置2956-2973)、0.4μM TNF-α(wt)特異的3'-フルオレセイン標識ハイブリダイゼーションプローブ(25量体、ヌクレオチド位置2638-2662)及びJA270-ホスホルアミダイト(25量体、ヌクレオチド位置2666-2690)で本発明により5'標識された0.4 μM TNF-α(wt)特異的ハイブリダイゼーションプローブを含むものとした。
【００４３】
反応混合物を増幅用キャピラリー中へピペットで入れ、増幅反応の間のオンライン蛍光検出のために適当なLight-Cycler(Wittwerら、BioTechniques 12, 176-181, 1997)中で、以下の温度サイクルにかけた。鋳型RNAは、55℃で10分以内で逆転写した(温度勾配20℃/s、測定していない)。その後cDNAを30秒間95℃で変性させた(温度勾配20℃/s、測定していない)。その後、cDNAをポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)により45サイクル増幅した。PCRの最初の段階で鋳型を1秒間99℃で変性させた(温度勾配20℃/s、測定していない)。PCRの第2段階では特異的なフォワードプライマー及びリバースプライマー、並びに2種のTNF-α(wt)特異的ハイブリダイゼーションプローブを鋳型に15秒間50℃でハイブリダイズさせ、FRET効果を検出可能なものとした。結果として生じた蛍光を、製造業者の説明書に従って、各キャピラリーについてアニーリング時間の終了時に測定した(温度勾配20℃/s、一回の測定)。第3段階においては、72℃において18秒以内で重合を行った(温度勾配20℃/s、測定していない)。PCR反応の45サイクルの後、キャピラリーを40℃に45秒冷却した。
【００４４】
図1に示した評価は、製造業者の説明書に従ってLightCyclerの数量化プログラムを使用して実施した。示した実験においては、in vitro転写したRNAの109〜107コピーを検出し量に従い滴定することが可能であり、31サイクルの後109コピーが初めて検出され、33サイクルの後108コピーが初めて検出され、36サイクルの後107コピーが初めて検出された。
【００４５】
実施例7:
FRET対を使用した融解曲線の決定による突然変異分析
実施例3に記載した方法により5'末端標識されたオリゴヌクレオチドを、ヒト第Ｖ因子遺伝子(Bertinaら、Nature 369, p. 64, 1994)のエクソン10中のヌクレオチド位置1691におけるGからAの点突然変異の検出のためのFRET対の一部として使用した。このために、特異的ゲノム第Ｖ因子断片をLightCycler中でPCR増幅反応により増幅した(Wittwerら、BioTechniques 12, 176-181, 1997)。PCR混合物(20μl)は、50 mM トリス、pH 8.3、3 mM MgCl2、250 μg/ml BSA、200 μM dATP、200μM dGTP、200 μM dCTP、600 μM dUTP、0.2 μMフォワードプライマー(エクソン10からのヌクレオチド位置1626-1647)、0.2 μMリバースプライマー(イントロン10からのヌクレオチド位置127-146)、0.1 μM 3'-フルオレセイン標識ハイブリダイゼーションプローブ(エクソン10からのヌクレオチド位置1684-1701+イントロン10からの1-5)、0.5μMの本発明のJA270で5'標識されたハイブリダイゼーションプローブ(ヌクレオチド位置1647-1682、エクソン10)及び1.6 UのTaqポリメラーゼを含むものとした。さらに1 ng第Ｖ因子野生型プラスミドDNA、1 ng異型接合体プラスミドDNAまたは1 ng同型接合突然変異体プラスミドDNAのいずれかを3種の混合物中に存在させた。突然変異部位にハイブリダイズする3'標識プローブは、野生型DNA配列に完全に相補的なものであった。
【００４６】
本発明の第2の5'標識プローブは、3'標識プローブの上流側にハイブリダイズし、両方の標識が1つの塩基のみによって隔てられ、共鳴エネルギー転移が起こることが可能であった。増幅反応の後に行った融解曲線において、より短い3'標識プローブが最初に融解し、共鳴エネルギー転移ができなくなった。変性、増幅及びその後の融解曲線は、以下の条件下にLightCycler中で実施した。
【００４７】
第1番目の変性(第1のサイクル)
時間      温度      温度勾配        測定
30秒      95℃      20℃/秒        なし
第2番目の増幅(50サイクル)
時間      温度      温度勾配        測定
0秒      95℃      20℃/秒        なし
10秒      50℃      20℃/秒         1回の測定
10秒      72℃       5℃/秒        なし
第3番目の融解曲線(第1のサイクル)
時間      温度      温度勾配        測定
0秒      95℃      20℃/秒        なし
10秒      45℃      20℃/秒        なし
0秒      85℃      0.2℃/秒      連続的な測定
【００４８】
図2に示すように、測定された融解曲線及び融解温度に対する得られた蛍光強度の陰性の最初の誘導体を使用して融解した点突然変異の遺伝子座にハイブリダイゼーションプローブが向かう温度を決定することができた。第Ｖ因子野生型プラスミドDNAの場合、融解温度は68℃であり、同型接合突然変異体第Ｖ因子プラスミドDNAについては60℃であり、異型接合体第Ｖ因子プラスミドDNAについては60℃及び68℃であった。
【００４９】
【図面の簡単な説明】
【図１】  FRET対の1つの成分が本発明により標識されたオリゴヌクレオチドであるFRET対を使用した増幅産物の検出によるmRNAの定量について実施例6で記載した実験の結果を示す。曲線は、行ったサイクル数に対する測定された蛍光をグラフとして示したものである。31サイクルの後初めて109コピーが検出でき、33サイクルの後初めて108コピーが検出でき、36サイクルの後初めて107コピーが検出できる。
【図２】  FRET対の1つの成分を本発明により標識されたオリゴヌクレオチドとした融解曲線測定による第Ｖ因子遺伝子の突然変異分析について実施例7で記載した実験の結果を示す。曲線は、融解温度に対する測定蛍光あるいはそれらの陰性の最初の誘導体をグラフとして示すものである(WT:野生型、M:同型接合体DNA； Ht:異型接合体DNA)。
【図１】
0004603109.tif 000010
【図２】
0004603109.tif 000011