(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式Ｉ：
【化１】
0004603364.tif 000016
［式中、ａが１である場合、ｂは０であり；
ａが０である場合、ｂは１であり；
ｚは１〜７であり；
ｘが１である場合、ｙおよびｑは１であり、ｐは０であり；
ｐが１である場合、ｘおよびｑは０であり、ｙは１であり；さらに
Ｒ１がＨである場合、ｄは０〜８であり；
Ｒ１がＨでない場合、ｄは０であり；
Ｒ１は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる群から選択されるアミノ酸の側鎖であり；
Ｒ２は、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、ＮＲ３＋Ｈ、ＯＨ、ＳＨ、ＲＯ、ＲＳ、ＲＳＯ、ＲＳＯ２、ＣＯＲ、ＣＳＲ、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＲ、ＣＯＮＲ２、ＯＣＯＲおよびＳＣＯＲからなる群から選択され
Ｒは、アルキル、アルケニル、アリール、アラルキルまたはシクロアルキルであり；
Ｒ３は、ＨまたはＣＨ３であり；
Ｒｘは疎水基である］
で示される、治療における使用のためのペプチド、またはその医薬上許容される塩。
【請求項２】
Ｒｘが芳香族炭素環を含む、請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
芳香族環が６または１２員環またはその置換形態を含む、請求項２記載のペプチド。
【請求項４】
環が、低級アルキル、アルコキシ、ヒドロキシル、カルボキシ、アミン、チオール、ヒドラジド、アミド、ハライド、ヒドロキシル、エーテル、アミン、ニトリル、イミン、ニトロ、スルフィド、スルホキシド、スルホン、チオール、アルデヒド、ケト、カルボキシ、エステル、アミド基；セレノ基、チオ基およびその誘導体の少なくとも１つにより置換されている、請求項３記載のペプチド。
【請求項５】
環が１〜５個の置換基を含む、請求項３記載のペプチド。
【請求項６】
環が１〜２個の置換基を含む、請求項３記載のペプチド。
【請求項７】
芳香族炭素環が、ベンジル、フェニルおよびナフチル基からなる群から選択される、請求項２記載のペプチド。
【請求項８】
疎水性基が、４位に置換基を含む６員の芳香族炭素環である、請求項１または請求項２記載のペプチド。
【請求項９】
一般式ＩＩ：
【化２】
0004603364.tif 000017
［式中、ａが１である場合、ｂは０であり；
ａが０である場合、ｂは１であり；
ｚは１〜７であり；
ｘが１である場合、ｙおよびｑは１であり、ｐは０であり；
ｐが１である場合、ｘおよびｑは０であり、ｙは１であり；さらに、
Ｒ１がＨである場合、ｄは０〜８であり；
ＲがＨでない場合、ｄは０であり；
Ｒ１は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる群から選択されるアミノ酸の側鎖であり；
Ｒ２は、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、ＮＲ３＋Ｈ、ＯＨ、ＳＨ、ＲＯ、ＲＳ、ＲＳＯ、ＲＳＯ２、ＣＯＲ、ＣＳＲ、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＲ、ＣＯＮＲ２、ＯＣＯＲおよびＳＣＯＲからなる群から選択され、ここに、Ｒは、アルキル、アルケニル、アリール、アラルキルまたはシクロアルキルであり；
Ｒ３はＨまたはＣＨ３であり；
Ｒ４およびＲ５は、独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、アリール、アラルキル、ハロゲン、ＣＮ、ＮＯ２、アルコキシ、アリールオキシ、アラルキルオキシ、チオアルキルオキシ、チオアリールオキシ、チオアラルキルオキシ、＋Ｓ（ＣＨ３）２、ＳＯ３Ｈ、ＳＯ２Ｒ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、＋ＮＲ３、ＯＨ、ＳＨ、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＲ、ＣＯＮＲ２、ＣＨ２ＯＨ、ＮＣＯ、ＮＣＯＲ、ＮＨＯＨ、ＮＨＮＨ２、ＮＨＮＲＨ、ＣＨ２ＯＣＯＲ、ＣＨ２ＯＣＳＲ、ＣＯＲ、ＣＳＲ、ＣＳＯＲ、ＣＦ３およびＣＣｌ３からなる群から選択され、ここに、Ｒはアルキル、アルケニル、アリール、アラルキルまたはシクロアルキルである］
で示される、治療における使用のためのペプチド、またはその医薬上許容される塩。
【請求項１０】
一般式Ｉ：
【化３】
0004603364.tif 000018
［式中、ａが１である場合、ｂは０であり；
ａが０である場合、ｂは１であり；
ｚは１〜７であり；
ｘが１である場合、ｙおよびｑは１であり、ｐは０であり；
ｐが１である場合、ｘおよびｑは０であり、ｙは１であり；さらに
Ｒ１がＨである場合、ｄは０〜８であり；
Ｒ１がＨでない場合、ｄは０であり；
Ｒ１は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる群から選択されるアミノ酸の側鎖であり；
Ｒ２は、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、ＮＲ３＋Ｈ、ＯＨ、ＳＨ、ＲＯ、ＲＳ、ＲＳＯ、ＲＳＯ２、ＣＯＲ、ＣＳＲ、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＲ、ＣＯＮＲ２、ＯＣＯＲおよびＳＣＯＲからなる群から選択され
Ｒは、アルキル、アルケニル、アリール、アラルキルまたはシクロアルキルであり；
Ｒ３は、ＨまたはＣＨ３であり；
Ｒｘは４位に置換基を含む６員の芳香族炭素環である］
で示されるペプチド、またはその医薬上許容される塩。
【請求項１１】
芳香族環が、低級アルキル、アルコキシ、ヒドロキシル、カルボキシ、アミン、チオール、ヒドラジド、アミド、ハライド、ヒドロキシル、エーテル、アミン、ニトリル、イミン、ニトロ、スルフィド、スルホキシド、スルホン、チオール、アルデヒド、ケト、カルボキシ、エステル、アミド基；セレノ基、チオ基およびその誘導体の少なくとも１つにより置換されている、請求項１０記載のペプチド。
【請求項１２】
ペプチドが、遊離Ｎ末端、遊離Ｃ末端または遊離ＮおよびＣ末端の両方を含む、請求項１ないし１１のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１３】
医薬上許容される塩が酸付加塩、金属塩、アンモニウム塩またはアミノ酸付加塩である、請求項１ないし１２のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１４】
医薬上許容される塩が塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、アンモニウムまたはテトラメチルアンモニウム塩、リシン塩、グリシン塩またはフェニルアラニン塩である、請求項１３記載のペプチド。
【請求項１５】
さらに、水素結合基を含み、水素結合基と疎水性基の質量中心間の距離が、４オングストローム〜１２オングストロームを含む、請求項１ないし１４のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１６】
さらに、水素結合基を含み、水素結合基と疎水性基の質量中心間の距離が、５オングストローム〜１０オングストロームを含む、請求項１ないし１５のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１７】
置換基が、３〜１１オングストロームの半径を有する、請求項１６記載のペプチド。
【請求項１８】
置換基が、メチル、エチル、ｔ−ブチル、ｃ−ヘキシル、フェニル、ｎ−ブチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−オクチル、エトキシ、ｔ−ブトキシ、フェノキシ、ブトキシ、ベンジルオキシ、ｎ−ヘキシルオキシおよびｎ−オクチルオキシ基からなる群から選択される、請求項１７記載のペプチド。
【請求項１９】
抗不整脈剤として機能する、請求項１ないし１８のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項２０】
経口投与可能なペプチドである、請求項１ないし１９のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項２１】
ｈＰｅｐＴ１トランスポーターまたはその生物学的に活性なフラグメントに結合している、請求項１ないし２０のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項２２】
インビトロ血漿安定性アッセイにおいて、３０分を超える半減期を有する、請求項１ないし２１のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項２３】
インビトロ血漿安定性アッセイにおいて、４８時間を超える半減期を有する、請求項１ないし２２のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項２４】
酵素分解に対してペプチドを安定化させるために修飾されたペプチド結合を含む、請求項１ないし２３のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項２５】
抗不整脈ペプチドに対する作用部位である、組織、細胞または細胞分画に結合している、請求項１ないし２４のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項２６】
抗不整脈ペプチドが、ＡＡＰ、ＡＡＰ１０、ＨＰ５またはその機能的なアナログからなる群から選択される、請求項２３記載のペプチド。
【請求項２７】
組織、細胞または細胞分画の機能のモジュレーターである、請求項２３記載のペプチド。
【請求項２８】
抗不整脈ペプチドの機能に拮抗する、請求項２５記載のペプチド。
【請求項２９】
抗不整脈剤の機能に作用する、請求項２５記載のペプチド。
【請求項３０】
抗不整脈ペプチドの受容体のモジュレーターである、請求項２３記載のペプチド。
【請求項３１】
表１に示すペプチドからなる群から選択される、請求項１ないし３０のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項３２】
Ｈ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（４−ニトロベンゾイル）−ＯＨ（化合物１）；
Ｈ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（４−メトキシベンゾイル）−ＯＨ（化合物４）；
Ｈ−Ｄ−Ｌｙｓ（４−メトキシベンゾイル）−Ｇｌｙ−ＯＨ（化合物２１）；
Ｈ−Ｄ−Ｌｙｓ（４−ニトロベンゾイル）Ｇｌｙ−ＯＨ（化合物２２）；
Ｈ−Ｄ−Ｌｙｓ（４−ｔ−ブチルベンゾイル）−Ｇｌｙ−ＯＨ（化合物５４）；
Ｈ−Ｄ−Ａｓｎ（ＮＨ（４−ニトロベンジル）Ａｌａ−ＯＨ（化合物９６）
Ｈ−Ｄ−Ｌｙｓ（ベンゾイル）Ｇｌｙ−ＯＨ（化合物２３）または
Ｈ−Ｄ−Ａｓｎ（ＮＨ（４−メトキシベンジル）Ａｌａ−ＯＨ（化合物９５）
である、請求項１ないし３１のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項３３】
患者に治療的に有効な量の該ペプチドを投与することを含む、ギャップ結合コミュニケーションの障害に関する病的症状の治療用の医薬の製造における、請求項１ないし３２のいずれか一項に記載のペプチドの使用。
【請求項３４】
病的症状が、心血管疾患、気道上皮の炎症、歯槽組織の障害、膀胱失禁、難聴、内皮障害、糖尿病性網膜症、糖尿病性ニューロパシー、中枢神経系の虚血、脊髄の虚血、歯の組織障害、腎臓病、骨髄移植の不全、創傷、勃起不全、膀胱失禁、神経障害性の痛み、亜慢性および慢性の炎症、癌、移植不全；過剰な活性酸素種および／またはフリーラジカルおよび／または一酸化窒素により引き起こされる症状からなる群から選択される、請求項３３記載の使用。
【請求項３５】
骨粗鬆症あるいは骨の形成、成長または維持に影響を及ぼす他の病変を治療するための医薬の製造における、請求項１ないし３２のいずれか一項に記載のペプチドの使用。
【請求項３６】
医薬が経口投与するためのものである、請求項３３ないし３５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３７】
医薬がヒト患者に投与するためのものである、請求項３３ないし３６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３８】
請求項１ないし３２のいずれか一項に記載のペプチドおよび医薬担体を含む、医薬組成物。
【請求項３９】
組成物が経口投与可能である、請求項３８記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な記載】
【０００１】
発明の分野
本発明は、細胞内ギャップ結合コミュニケーションを調節することができる経口投与可能なジペプチドに関する。また、本発明は、かかるコミュニケーションを調節するためのペプチドの使用方法、該コミュニケーションに付随する症状の予防および／または治療用の医薬の製造におけるペプチドの使用方法および該ジペプチドを含む医薬組成物に関する。
【０００２】
発明の背景
細胞間コミュニケーションは、細胞恒常性、増殖および分化に必須であることの認識が強まっている。かかるコミュニケーションは、ギャップ結合により促進されると考えられている。これらの構造は、細胞をカップリングさせ、「クロス−トーク」を可能する経路であると考えられている。N. Sperelakis, William C. Col（編集者）によるSperelakis, N., (1989) Cell Interactions and Gap Junctionsを参照のこと。
【０００３】
ギャップ結合の構造および機能を解明するための試みがなされている。例えば、かかる結合は、隣接細胞間に形成される複合体型であることが報告されている。ほとんどのギャップ結合は、隣接細胞の内部（細胞質）を直接結合する凝集チャンネルからなると考えられている。成体哺乳類において、ギャップ結合は、循環血液エレメントを除くほとんどの細胞型において見られる。
【０００４】
より特別には、ギャップ結合は数百から数千の密集したギャップ結合チャンネル（２つのヘミチャンネルまたはコネキシンを含む）のクラスタを有する細胞膜の領域に特定されることが認識されている。２つの隣接細胞の細胞質区画を直接結合すると考えられている。ギャップ結合チャンネルは、開放および閉鎖状態を切り替えることができる。開放状態において、イオンおよび小分子は、細孔を通り抜けると考えられている。電気的刺激の伝達およびシグナリング分子の細胞間拡散は、ギャップ結合を介して行われる。
【０００５】
ギャップ結合間の「クロス−トーク」は、細胞代謝、増殖、細胞対細胞シグナル化および組織の完全性の調節において重要な役割を果たしていると考えられる、ギャップ結合細胞内コミュニケーション（ＧＪＩＣ）と称されている。
【０００６】
例えば、ＧＪＩＣは、細胞間の栄養物、イオンおよび体液の迅速な平衡化を可能にすると考えられている。また、ギャップ結合は、電気的に興奮した細胞において電気シナプスとして提供されると考えられている。多くの組織において、電気的カップリングは、活動電位の細胞対細胞伝達を化学シナプスよりもより速く行うことができると考えられている。例えば、心筋細胞および平滑筋細胞において、同期収縮に関与すると考えられている。
【０００７】
ＧＪＩＣにより媒介される他の機能が報告されている。例えば、ＧＪＩＣは、外部刺激に対する組織の反応性を増大させると考えられている。第２のメッセンジャーは、一般的には、ホルモン活性化細胞から静止細胞へ、結合チャンネルを通って移動し、その後活性化するのに十分に小さいと考えられている。
【０００８】
さらに、ギャップ結合が、化学的および／または電気的に発生するシグナルに対する細胞間経路を提供し、発生した区画の境界線を決定することに関与することが報告されている。ＧＪＩＣは、胚細胞において特定のパターンで生じ、ＧＪＩＣの障害は、発育異常および多くの化学物質の催奇形効果に関連していることが開示されている。さらに、ＧＪＩＣは、細胞活性の調整に関与すると考えられている。
【０００９】
ＧＪＩＣの異常と様々な病態間の繋がりをインビトロおよびインビボの両方において証明する報告がある。例えば、コネキシンの異常と心臓病は繋がりがあると考えられている。心臓におけるＣｘ４３の発現および分布のいくつかの研究が、Ｃｘ４３発現の減少度およびこのギャップ結合蛋白質の分布の変化パターンを記載している。Kaprielian, R. R., et al. (1998) Circulation 97: 651-660；およびSaffitz, J. E., etal., (1999) Cardiovasc Res. 42: 309- 317を参照のこと。
【００１０】
したがって、ギャップ結合機能異常または欠如と不整脈の危険性の増加の間の関連性についての分野が認識されている。コネキシン発現／分布の変化と慢性心臓病の間のさらなる関連性も考えられている。
【００１１】
ＧＪＩＣに影響を与えるペプチドを分析する試みがなされている。例えば、心臓においてギャップ結合伝導を増加させる能力を有する一群のペプチド（抗不整脈ペプチド）が開示されている。特に、分子量４７０Ｄを有するヘキサペプチドは、ウシの心房から単離されることが報告された。新生児ラット心筋細胞において、ペプチドは、ウアバイン、カルシウムまたはカリウムにより誘発される細動を、正常なリズムに変更することができることが報告されている。加えて、ペプチドは、カリウムとアセチルコリンの組み合わせにより誘発される単離ラット心房の不整脈動作を正常なリズムに変更することができることが報告されている。このペプチドは、しばしば、抗不整脈ペプチド（ＡＡＰ）と称される。例えば、Aonuma, S., et al. (1980) Chem Pharm Bull(Tokyo) 28: 3332-3339を参照のこと。
心臓においてＧＪＩＣを調節することができる重要なペプチドであることの理解が広まっている。
【００１２】
例えば、細胞培養において、ＡＡＰは、鼓動中心（beating center）の数、 伸展細胞の相対的含有量および蛋白質合成を増加させることが示されている。Aonuma, S., et al. (1980) Chem Pharm Bull (Tokyo) 28: 3340-3346を参照のこと。他の研究において、インビトロで観察されるＡＡＰの抗不整脈効果が確認されている。マウスにおいて、ＡＡＰは、Ｃａｌ２、ウアバインおよびアコチニン誘発不整脈に対して効果的であることが報告されている。Ronsberg, M. A., et al. (1986) Med. Sci. 14:350-351を参照のこと。
ＡＡＰ配列は開示されている。例えば、Aonuma, S., et al. (1982) J Pharmacobiodyn. 5: 40-48を参照のこと。
【００１３】
種々のＡＡＰ誘導体を調製する試みがなされている。例えば、Dikshit, M., et al. (1988) Indian J. Exp.Biol. 26: 874-876; Kohama, Y., et al. (1987) Chem. Pharm. Bull. (Tokyo) 35: 3928-3930；およびKohama, Y., et al. (1988) Chem. Pharm. Bull. (Tokyo) 36: 4597- 4599)を参照のこと。
【００１４】
例えば、一のかかる誘導体であるＡＡＰ１０は、ＧＪＩＣに影響を与えると考えられている。Dhein, S., et al. (1994) NaunynSchmiedebergs Arch Pharmacol. 350: 174-184;およびMuller, A., etal. (1997) Eur.J. Pharmacol. 327: 65-72を参照のこと。ＡＡＰは、ＧＪＩＣを改善し、活動電位のばらつきを減少させ、電動性を改善することが報告されている。
【００１５】
多くの抗不整脈ペプチドが、しばしば活動電位持続時間または形態に影響を与えることなく、ＧＪＩＣに正の影響を与えることの理解が広まっている。さらに、多くのかかるペプチドは、望ましくない催不整脈副作用がないと考えられている。かかる作用は、多くの現在入手できる抗不整脈剤の使用を限定していると考えられている。さらに、ＡＡＰならびにある種のＡＡＰ誘導体は、いくつかの望ましくない特徴、例えば、低安定性であり、治療効果を得るまでに高投与量を要すると考えられる。
【００１６】
多くの潜在的に重要なペプチドは、許容できる経口投与での利用能が欠けている。すなわち、ペプチドは、胃腸管、腸細胞またはその両方において分解する。このような場合、ペプチドは、より痛みがあり、不便な静脈内投与によって対象に投与される。
【００１７】
ＰｅｐＴ１と称される腸のペプチドトランスポーター蛋白質との接触を増強することにより、ある種の化合物の経口投与での利用能を改善することが試みられている。ＰｅｐＴ１トランスポーターシステムに関しては多くのことが知られている。Bailey, P. D., et al. (2000) Angew. Chem. Int. Ed. 39: 506；およびそこに示される引用文献を参照のこと。
より効果的なＧＪＩＣのペプチドモジュレーターが望まれている。特に、経口投与可能なペプチドモジュレーターが望まれている。
【００１８】
発明の概要
本発明は、一般的には、ギャップ結合細胞間コミュニケーション（ＧＪＩＣ）を調節するペプチドに関する。好ましいペプチドは、経口投与可能なものである。本発明は、ＧＪＩＣの低下に付随する病状の治療または予防における使用を含む、広範囲に有用な使用を含む。
【００１９】
本発明の好ましいペプチドは、下記一般式Ｉ：
【化１】
0004603364.tif 000002
【００２０】
［式中、ａが１である場合、ｂは０であり；
ａが０である場合、ｂは１であり；
ｚは１〜７であり；
ｘが１である場合、ｙおよびｑは１であり、ｐは０であり；
ｐが１である場合、ｘおよびｑは０であり、ｙは１であり；さらに、
Ｒ１がＨである場合、ｄは０〜８であり；
Ｒ１がＨでない場合、ｄは０であり；
【００２１】
ここに、Ｒは、アミノ酸の側鎖：例えば、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンであり；
Ｒ２は、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、ＮＲ３＋Ｈ、ＯＨ、ＳＨ、ＲＯ、ＲＳ、ＲＳＯ、ＲＳＯ２、ＣＯＲ、ＣＳＲ、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＲ、ＣＯＮＲ２、ＯＣＯＲ、ＳＣＯＲであり（Ｒは、アルキル、アルケニル、アリール、アラルキル、シクロアルキル等である）；
Ｒ３はＨ、ＣＨ３であり；
ここに、Ｒｘは、疎水性基であり、好ましくは、芳香族炭素環を含み、より好ましくは、６または１２員の芳香族炭素環を含む］
で示される。一の態様において、芳香環は、少なくとも１つの、低級アルキル、アルコキシ、ヒドロキシル、カルボキシ、アミン、チオール、ヒドラジド、アミド、ハライド、ヒドロキシル、エーテル、アミン、ニトリル、イミン、ニトロ、スルフィド、スルホキシド、スルホン、チオール、アルデヒド、ケト、カルボキシ、エステル、アミド基（そのセレノおよびチオ誘導体を含む）により置換されている。また、置換されていてもよい環は、セレノ基を有するまたは有しない、スルフィド、スルホキシド、スルホンおよびチオール誘導体を含む。芳香族炭素環が置換されている具体例において、かかる置換は、典型的には、約１０未満の置換数であり、より好ましくは、置換は、１〜５または１〜２の置換数である。
【００２２】
さらに、本発明は、一般式ＩＩ：
【化２】
0004603364.tif 000003
［式中、ａが１である場合、ｂは０であり；
ａが０である場合、ｂは１であり；
ｚは１〜７であり；
ｘが１である場合、ｙおよびｑは１であり、ｐは０であり；
ｐが１である場合、ｘおよびｑは０であり、ｙは１であり；さらに、
ＲがＨである場合、ｄは０〜８であり；
ＲがＨでない場合、ｄは０であり；
【００２３】
ここに、Ｒ１は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる群から選択されるアミノ酸の側鎖であり；
Ｒ２は、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、ＮＲ３＋Ｈ、ＯＨ、ＳＨ、ＲＯ、ＲＳ、ＲＳＯ、ＲＳＯ２、ＣＯＲ、ＣＳＲ、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＲ、ＣＯＮＲ２、ＯＣＯＲおよびＳＣＯＲからなる群から選択され、ここに、Ｒは、アルキル、アルケニル、アリール、アラルキルまたはシクロアルキルであり；
Ｒ３はＨまたはＣＨ３であり；
【００２４】
Ｒ４およびＲ５は、独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、アリール、アラルキル、ハロゲン、ＣＮ、ＮＯ２、アルコキシ、アリールオキシ、アラルキルオキシ、チオアルキルオキシ、チオアリールオキシ、チオアラルキルオキシ、＋Ｓ（ＣＨ３）２、ＳＯ３Ｈ、ＳＯ２Ｒ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、＋ＮＲ３、ＯＨ、ＳＨ、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＲ、ＣＯＮＲ２、ＣＨ２０Ｈ、ＮＣＯ、ＮＣＯＲ、ＮＨＯＨ、ＮＨＮＨ２、ＮＨＮＲＨ、ＣＨ２ＯＣＯＲ、ＣＨ２ＯＣＳＲ、ＣＯＲ、ＣＳＲ、ＣＳＯＲ、ＣＦ３およびＣＣｌ３からなる群から選択され、ここに、Ｒはアルキル、アルケニル、アリール、アラルキルまたはシクロアルキルである］
により示されるペプチドに関する。
【００２５】
また、かかるペプチドは、酵素分解に対するペプチドの安定性を改善するためにアルキル化または他の修飾がなされたペプチド結合を含み、および／またはＤ−アミノ酸を含んでいてもよい。
【００２６】
式Ｉおよび式ＩＩにより示されるより好ましいペプチドは、哺乳類に、特にヒト対象に経口投与可能である。経口投与利用能を確立するための種々のアッセイは、当該分野で公知のものであり、限定するものではないが、下記の種々の試験を含む。
【００２７】
経口利用能アッセイ
一のアッセイ（「ベイリー（Bailey）アッセイ」）は、予測アッセイであり、一般的に、本発明に従って、さらに下記する他の実証アッセイに続く。ベイリーアッセイにおいて、候補ペプチドは、ＰｅｐＴ１に結合する化合物をモデルとした基質テンプレートに事実上合わせており、インビトロおよびインビボでＰｅｐＴ１に結合する可能性があるペプチドを同定する。ベイリーアッセイは、本発明の経口投与可能なペプチドの検出を容易にするために用いることができる。
【００２８】
一の具体例において、式ＩおよびＩＩで示されるペプチドは、この基質テンプレートモデルと実質的に一致しており（例えば、ペプチドは、高いアフィニティーでｈＰｅｐＴ１に結合する前もって同定した基質と実質的に同じ三次元配列を示す）、したがって経口投与可能なペプチドのよい候補である。かくして、かかるペプチドは、典型的には、ジペプチドである。
【００２９】
より好ましいジペプチドは、ＰｅｐＴ１（すなわち、ペプチドのＮ末端からＣ末端まで）に対して高いアフィニティーを有する基質によるものとされる少なくとも以下の４つの特徴を示すものである。ペプチドは：１）Ｎ末端ＮＨ３＋基に対する強い結合部位；２）第１のペプチド結合のカルボニル基に対する水素結合；３）好ましくは、強い方向性ベクターを特徴とする疎水性ポケット；および４）カルボン酸結合部位を含む。好ましくは、モデルに従って、第１のカルボン酸結合部位に続いて、第２のカルボン酸結合部位がある。例えば、Bailey, P. D., etal, (2000)（上掲）を参照のこと。
【００３０】
前もって行った上記したベイリーアッセイを認証する一の実証アッセイは、「標準的なインビボ経口利用能アッセイ」である。このアッセイにおいて、ペプチドは、哺乳類に経口投与され、血液試料を経時的に得る。ペプチドの濃度を、標準的な定量アッセイ、例えばＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いて異なる時間間隔で測定して、当該分野で公知の慣用的な方法を用いて血漿蛋白質濃度対時間のプロットにより得られる曲線の下方の面積を計算する（ＡＵＣ）。好ましくは、異なるペプチドの投与量を、最大血漿濃度およびＡＵＣ値を用量に比例して増加させるこれらのペプチドの同定と平行して、複数の動物に投与する。対照として、同濃度のペプチドを、静脈内投与し、経口投与で得られたＡＵＣの値と、静脈内投与で得られたＡＵＣの値とを比較することができる。例えば、Milo Gibal (1991)Biopharmaceutics and Pharmacology, 4th edition（Lea and Sediger）を参照のこと。好ましい具体例において、経口投与利用能が良好であるペプチドは、経口投与後の用量標準化ＡＵＣが、静脈内投与後の用量標準化ＡＵＣの少なくとも２０％であるものである。
【００３１】
上記した標準的なインビボ経口利用能アッセイに従って、経口利用能が良好であると示されたペプチドは、ベイリーアッセイに一致してもしなくてもよい。
【００３２】
式ＩまたはＩＩで示される経口投与可能なペプチドをさらに実証するための、第２の実証アッセイを行うことは有用であるだろう。一のかかるアッセイにおいて、ペプチドのｈＰｅｐＴ１トランスポーターまたはその機能的に活性なフラグメントに結合する能力を測定する。好ましくは、本発明のペプチドは、ｈＰｅｐＴ１トランスポーターまたはその機能的に活性なフラグメントに対して良好なアフィニティーを有する。好ましくは、かかるペプチドのＫｉは、約２０ｍＭ未満、より好ましくは、約１０ｍＭ未満、さらにより好ましくは、約５ｍＭ未満または約１ｍＭ未満である。
【００３３】
ｈＰｅｐＴ１結合アッセイは、ついで、標準的なインビボ経口利用能アッセイでスクリーンするペプチドに対する最初のスクリーンとして行うことができ、および／または標準的なインビボ経口利用能アッセイの結果を確認するために行うことができる。しかしながら、標準的なインビボ経口利用能アッセイは、ペプチド経口利用能の最も意味のある試験を提供する。
【００３４】
加えて、上記式Ｉで示される好ましいペプチドは、「インビトロ血漿安定性アッセイ」または関連する表現として本明細書において称されるアッセイにより、良好な半減期を示す。かかるペプチドは、実質的に、上記したＰｅｐＴ１基質テンプレートモデル（ベイリーアッセイ）に一致する。しかしながら、いくつかのペプチドに関しては、ほとんどまたは全くこのモデルと一致しない。アッセイにおいて良好な安定性を示したペプチドは、一の具体例において、約４８時間を超える、例えば１２時間を超える、例えば６時間を超える、例えば、３時間を超える、例えば１時間を超える、３０分を超える半減期を有する。この具体例において、本発明のペプチドは、血中において高い安定性を示す。
【００３５】
本発明の範囲内のペプチドは、一の具体例において、遊離Ｎ末端および／またはＣ末端基を有する。これらの基は、いくつかの発明の使用に対して遊離したままであってもよい。しかしながら、他の具体例において、ペプチドは、遮断Ｃ末端基および遊離Ｎ基を特徴とすることができる。別法として、かかるペプチドは、遮断Ｎ末端および遊離Ｃ末端基または遮断ＮおよびＣ末端基を有していてもよい。ペプチドが、ｈＰｅｐＴ１に有意なアフィニティーで結合することができ、経口投与可能である限り、分子のいずれかの端の末端基の性質は重要ではない。検討したように、対象ペプチドが、ｈＰｅｐＴ１担体に結合する基質テンプレートモデルに実質的に一致するかどうかを測定することにより、ｈＰｅｐＴ１トランスポーターに対する「有意なアフィニティー」は、予測することができる。Bailey, P. D., etal. (2000)（上掲）を参照のこと。
【００３６】
加えて、ジペプチド内のアミノ酸残基は、Ｄ−またはＬ−アミノ酸であってもよい。ある態様において、化合物の安定性を増加させるために、Ｄ−アミノ酸が好ましい。
本発明のペプチドは、広範囲の重要な用途および利点を有する。
【００３７】
例えば、かかるペプチドは、ギャップ結合機能の低下により生じる細胞間コミュニケーションまたは細胞間コミュニケーションのカップリングまたは細胞コミュニケーションの誤った制御に付随する症状の予防および／または治療に用いることができ、ギャップ結合機能に付随する症状の予防および／または治療用の医薬の製造において用いることができる。一の態様において、本発明は、症状を患っているか、またはそれが進行する危険性がある患者に、治療的に有効な量の上記したペプチドのいずれかの投与方法を提供する。好ましくは、投与は経口投与である。一の好ましい態様において、患者はヒトである。
【００３８】
治療することができる症状の例としては、限定するものではないが、心血管疾患、気道上皮の炎症、歯槽組織の障害、膀胱失禁、蝸牛の疾患による難聴、内皮障害、糖尿病性網膜症および糖尿病性ニューロパシー、中枢神経系および脊髄の虚血、歯周疾患を含む歯の組織障害、腎臓病、骨髄移植の不全、創傷、勃起不全、膀胱失禁、神経障害性の痛み、亜慢性および慢性の炎症、癌および骨髄および幹細胞移植の不全、細胞および組織移植または手術のような医学手法の間に生じる症状；ならびに過剰な活性酸素種および／またはフリーラジカルおよび／または一酸化窒素により引き起こされる症状が挙げられる。
【００３９】
本発明は、さらに、上記したいずれものペプチドおよび医薬上許容される担体を含む、上記した方法において用いるのに適した医薬組成物を提供する。好ましくは、担体は、滅菌され、発熱物質不含であり、ウイルス不含である。さらにより好ましくは、組成物は経口投与可能である。
【００４０】
図面の簡単な説明
図１Ａおよび１Ｂは、本発明のある種の態様によるペプチドを生成するための合成スキームを例示的に示す。
図２は、ヒトの骨芽細胞における、化合物４、化合物２２、化合物２３および化合物９５の効果を示すＡＬＰ（アルカリホスファターゼ）に対する効果を示す。
【００４１】
発明の詳細な記載
上記したように、本発明は、ギャップ結合細胞間コミュニケーション（ＧＪＩＣ）を調節する経口投与可能なペプチドに関する。本発明は、ＧＪＩＣの障害に付随する病状の治療または予防における使用を含む、広範囲に有用な使用を含む。特に本発明のペプチドは、上記式Ｉで示される。
【００４２】
本発明のより特定のペプチドは、下記一般式ＩＩ：
【化３】
0004603364.tif 000004
［式中、ａが１である場合、ｂが０であり；
ａが０である場合、ｂは１であり；
ｚは１〜７であり；
ｘが１である場合、ｙおよびｑは１であり、ｐは０であり；
ｐが１である場合、ｘおよびｑは０であり、ｙは１であり；さらに、
Ｒ１がＨである場合、ｄは０〜８であり；
Ｒ１がＨでない場合、ｄは０であり；
【００４３】
Ｒ１は、アミノ酸側鎖：例えば、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンであり；
Ｒ２は、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、ＮＲ３＋Ｈ、ＯＨ、ＳＨ、ＲＯ、ＲＳ、ＲＳＯ、ＲＳＯ２、ＣＯＲ、ＣＳＲ、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＲ、ＣＯＮＲ２、ＯＣＯＲ、ＳＣＯＲであり（Ｒはアルキル、アルケニル、アリール、アラルキル、シクロアルキル等である）；
Ｒ３はＨ、ＣＨ３であり；
Ｒ４およびＲ５は、独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、アリール、アラルキル、ハロゲン、ＣＮ、ＮＯ２、アルコキシ、アリールオキシ、アラルキルオキシ、チオアルキルオキシ、チオアリールオキシ、チオアラルキルオキシ、＋Ｓ（ＣＨ３）２、ＳＯ３Ｈ、ＳＯ２Ｒ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、＋ＮＲ３、ＯＨ、ＳＨ、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＲ、ＣＯＮＲ２、ＣＨ２ＯＨ、ＮＣＯ、ＮＣＯＲ、ＮＨＯＨ、ＮＨＮＨ２、ＮＨＮＲＨ、ＣＨ２ＯＣＯＲ、ＣＨ２ＯＣＳＲ、ＣＯＲ、ＣＳＲ、ＣＳＯＲ、ＣＦ３およびＣＣｌ３からなる群から選択される（Ｒは、アルキル、アルケニル、アリール、アラルキル、シクロアルキル等である）］
で示される。
【００４４】
上記したように、ペプチドは、遊離Ｎ末端または遊離Ｃ末端あるいはその両方を含む。
好ましくは、ペプチドは、少なくとも１つの疎水性基および少なくとも１つの水素結合基を含む。本発明の一の態様において、ペプチドの三次元構造に関して、少なくとも１つの疎水性基と少なくとも１つの水素結合機の距離は、約４オングストローム〜約１２オングストローム、好ましくは、約５〜約１０オングストロームである。好ましくは、疎水性基は、限定するものではないが、ベンゾイルまたはベンジル基あるいはその置換または修飾形態を含む芳香族基である。置換ベンゾイルまたはベンジル基は、好ましくは、４位に置換基を含む。より好ましくは、置換基は、置換基を含めた球形において３〜１１オングストロームの半径を有する。適当な置換基は、限定するものではないが、メチル、エチル、ｔ−ブチル、ｃ−ヘキシル、フェニル、ｎ−ブチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−オクチル、エトキシ、ｔ−ブトキシ、フェノキシ、ブトキシ、ベンジルオキシ、ｎ−ヘキシルオキシ、ｎ−オクチルオキシを含む。
【００４５】
本発明の範囲内の一般式を有するさらに特定のペプチドを表１に示す。
【表１】
0004603364.tif 000005
【００４６】
【表２】
0004603364.tif 000006
【００４７】
【表３】
0004603364.tif 000007
【００４８】
【表４】
0004603364.tif 000008
【００４９】
【表５】
0004603364.tif 000009
【００５０】
本発明の一の態様のより特別なペプチドは、ギャップ結合により媒介される細胞間コミュニケーションを促進および／または維持または阻害する。一の具体例において、ペプチドは、ＡＡＰ、ＡＡＰ１０、ＨＰ５および／またはその機能的アナログの標的になる同じ細胞を標的にする抗不整脈ペプチドであってもよい。すなわち、ペプチドは、ＡＡＰ、ＡＡＰ１０、ＨＰ５および／またはそのアナログの機能に作用または拮抗することによりそれらの細胞の機能を調節することができる。また、本発明は、細胞間ギャップ結合コミュニケーションの障害に付随する病状の治療用の医薬組成物の調製および使用ならびにこれらの組成物の使用方法に関する。
【００５１】
本発明のさらに好ましいペプチドは、一またはそれ以上の以下のアッセイにおいて良好な活性を示す。経口投与可能な式ＩおよびＩＩで示されるペプチドを同定する必要性はないが、これらはさらに、ペプチドの一つまたは集まりの活性を確認および定量することに用いることができる。
【００５２】
本発明の一の具体例において、ペプチドは、Ｈ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（４−ニトロベンゾイル）−ＯＨ（化合物１）；Ｈ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（４−メトキシベンゾイル）−ＯＨ（化合物４）；Ｈ−Ｄ−Ｌｙｓ（４−メトキシベンゾイル）−Ｇｌｙ−ＯＨ（化合物２１）；Ｈ−Ｄ−Ｌｙｓ（４−ニトロベンゾイル）Ｇｌｙ−ＯＨ（化合物２２）；Ｈ−Ｄ−Ｌｙｓ（４−ｔ−ブチルベンゾイル）−Ｇｌｙ−ＯＨ（化合物５４）；およびＨ−Ｄ−Ａｓｎ（ＮＨ（４−ニトロベンジル）Ａｌａ−ＯＨ（化合物９６）からなる群から選択される。
【００５３】
他の具体例において、本発明のペプチドは、Ｈ−Ｄ−Ｌｙｓ（ベンゾイル）Ｇｌｙ−ＯＨ（化合物２３）およびＨ−Ｄ−Ａｓｎ（ＮＨ（４−メトキシベンジル）Ａｌａ−ＯＨ（化合物９５）からなる群から選択される。
さらなる他の本発明の具体例において、ペプチドは、Ｈ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（４−ニトロベンゾイル）−ＯＨ（化合物１）である。
一の態様における本発明のペプチドは、Ｈ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（４−メトキシベンゾイル）−ＯＨ（化合物４）である。
【００５４】
さらに、他の具体例において、ペプチドは、Ｈ−Ｄ−Ｌｙｓ（４−メトキシベンゾイル）−Ｇｌｙ−ＯＨ（化合物２１）である。
さらなる別の態様において、ペプチドは、Ｈ−Ｄ−Ｌｙｓ（４−ニトロベンゾイル）Ｇｌｙ−ＯＨ（化合物２２）である。
さらなる別の態様において、ペプチドは、Ｈ−Ｄ−Ｌｙｓ（４−ｔ−ブチルベンゾイル）−Ｇｌｙ−ＯＨ（化合物５４）である。
【００５５】
さらなる別の態様において、ペプチドは、Ｈ−Ｄ−Ａｓｎ（ＮＨ（４−ニトロベンジル）Ａｌａ−ＯＨ（化合物９６）である。
さらに別の具体例において、ペプチドは、Ｈ−Ｄ−Ｌｙｓ（ベンゾイル）Ｇｌｙ−ＯＨ（化合物２３）である。
さらなる別の具体例において、ペプチドは、Ｈ−Ｄ−Ａｓｎ（ＮＨ（４−メトキシベンジル）Ａｌａ−ＯＨ（化合物９５）である。
【００５６】
上記式ＩおよびＩＩで示される好ましいペプチドは、ギャップ結合コミュニケーションのモジュレーターとして（例えば、アゴニストまたはアンタゴニストとして）良好な機能を示した。一の態様において、ペプチドは、抗不整脈剤としての機能を有する。
【００５７】
一の具体例において、本発明の好ましいアゴニストペプチドは、「標準的な心筋細胞アッセイ」として本明細書に示されるアッセイにおいて、ＡＡＰのＧｊと実質的に同じまたはそれ以上である、細胞内伝導性（Ｇｊ）を提供する。
【００５８】
他の具体例において、好ましいアンタゴニストペプチドは、ＡＡＰのＧｊ未満のＧｊを提供し、および／またはＡＡＰの虚血細胞のＧｊを正常化する能力、すなわち、非虚血細胞において得られる値と実質的に同じＧｊに戻す能力を阻害する。本発明の一の態様において、本発明のアンタゴニストは、ＡＡＰのＧｊの少なくとも約４０％未満、例えば少なくとも約５０％未満、例えば、少なくとも約６０％未満、例えば少なくとも約７０％未満、例えば、少なくとも約８０％未満、例えば少なくとも９０％未満、例えば、少なくとも１００％未満のＧｊを提供する。
【００５９】
本発明のアンタゴニストの阻害特性は、上記したような相対的なＧｊに限定されるものではない。さらなる具体例およびアッセイにおいて、アンタゴニストは、異なる相対的なＧｊを示しうる。さらに、これは、比較ペプチド／化合物に依存しうる。
【００６０】
心臓
本発明のさらに好ましいペプチドは、「標準的なカルシウム誘発不整脈アッセイ」として示されるアッセイにおいて、ＣａＣｌ２の注入後のマウスのＡＶブロックの時間を増加させる。好ましくは、ペプチドは、ＡＡＰの活性の少なくとも約４０％、例えば、ＡＡＰの活性の少なくとも約５０％、例えば、ＡＡＰの活性の約６０％、例えば、ＡＡＰの活性の少なくとも約７０％、例えば、ＡＡＰの活性の少なくとも約８０％、例えば、ＡＡＰの活性の少なくとも約９０％、例えば、少なくともＡＡＰの活性と実質的に同じ活性、例えばＡＡＰの活性の約１１０％、例えば、少なくともＡＡＰの活性の約１２０％、例えばＡＡＰの活性の少なくとも約１３０％、例えば、ＡＡＰの活性の少なくとも約１４０％、例えば、ＡＡＰの活性約の１５０％、例えば、ＡＡＰの活性の少なくとも約１６０％、例えば、ＡＡＰの活性の少なくとも約１７０％、例えば、ＡＡＰの活性の少なくとも約１８０％、好ましくは、ＡＡＰの活性の少なくとも約１９０％、より好ましくは、ＡＡＰの活性の少なくとも約２００またはそれ以上の％（すなわち、ほとんど同じ継続時間のタイムラグを示す）を提供する。
【００６１】
さらに、ペプチドは、「標準的な心室リエントリーアッセイ」として示されるアッセイにおいて、リエントリー不整脈の発生率または梗塞域の大きさの減少を示す。好ましくは、ペプチドは、ＡＡＰの活性の少なくとも約４０％、例えば、ＡＡＰの活性の少なくとも約５０％、例えばＡＡＰの活性の約６０％、例えば、ＡＡＰの活性の少なくとも約７０％、例えば、ＡＡＰの活性の少なくとも約８０％、例えば、ＡＡＰの活性の少なくとも約９０％、例えば、少なくともＡＡＰと実質的に同じ活性、例えばＡＡＰの活性の約１１０％、例えば、ＡＡＰの活性の少なくとも約１２０％、例えば、ＡＡＰの活性の少なくとも約１３０％、例えば、ＡＡＰの活性の少なくとも約１４０％、例えばＡＡＰの活性の約１５０％、例えば、ＡＡＰの活性の少なくとも約１６０％、例えばＡＡＰの活性の少なくとも約１７０％、例えば、ＡＡＰの活性の少なくとも約１８０％、好ましくは、ＡＡＰの活性の少なくとも約１９０％、より好ましくは、ＡＡＰの活性の少なくとも約２００またはそれ以上の％を提供する（すなわち、同様の発生率の減少または同様またはより小さい梗塞域を与える）。
【００６２】
骨粗鬆症
ＧＪＩＣは骨形成において重要であることが解っている。加えて、好ましいペプチドは、加えてまたは別に、カルシウム波形成および／または骨芽細胞のアルカリホスファターゼ活性をペプチドの存在下で測定する「標準的な骨芽細胞活性アッセイ」として示されるアッセイにおいて、骨芽細胞活性を増加させる。好ましくは、かかるペプチドは、カルシウム波活性を増加させ、波に含まれる細胞数の増加として示される（カルシウム感受性蛍光色素、例えばフラ−２を用いて細胞内Ｃａ２＋のレベルを測定し、蛍光を発する細胞数を計数することにより得られる）。また、アルカリホスファターゼ活性は、標準的な比色アッセイを用いて測定する骨芽細胞活性を得るのに用いることもできる。本発明のアゴニストペプチドは、かかるアッセイにおいて、少なくともＡＡＰの活性の約１０％、例えば少なくとも約２０％の活性、例えば、少なくとも約３０％の活性、例えば少なくとも約４０％の活性、例えば、ＡＡＰの活性の少なくとも約５０％、好ましくは、少なくとも約７０％の活性、さらにより好ましくは、ＡＡＰの活性の１００％またはそれ以上の活性を提供する。
【００６３】
癌
本発明の好ましいペプチドは、別にまたは加えて、「標準的な腫瘍プロモーターアッセイ」として示されるアッセイにおいて、ＤＴＴのような腫瘍プロモーターにより介在されるＧＪＩＣ阻害を減少させる。好ましくは、ペプチドは、ＡＡＰに関して観察される減少よりも少なくとも５０％、好ましくは、７０％、より好ましくは、１００％またはそれ以上であるＧＪＩＣ阻害の減少を示す。
【００６４】
上記したように、本発明の態様は、ギャップ結合細胞間コミュニケーション（ＧＪＩＣ）を調節するペプチドを提供する。かくして、本発明の多くのペプチドは、一またはそれ以上の以下の特徴を含みうる：細胞非カップリングの減少能力、活動電位維持時間の分散の正常化能力および伝導速度の正常化能力、ギャップ結合正常化の細胞内量の制御能力（要すれば、アップレギュレートまたはダウンレギュレート）、コネキシンの発現；ギャップ結合の分解の正常化（阻害または増強）能力、コネキシンの血漿膜への細胞移動の正常化（増加または減少）能力；コネキシンを機能的ギャップ結合にアセンブリすることを促進する能力；既存のギャップ結合の開放の正常化能力、例えば、これらが阻害剤により封鎖された場合に開放を誘発または増強する能力（例えば、一またはそれ以上のコネキシンの細胞質のサイトカルボキシ末端領域（例えばＣｘ４３）の過剰リン酸化の媒介または増強によるか、またはこれらが異常に開放されている場合に封鎖することによる（例えば、シャルコー・マリー・ツース病）等）。
【００６５】
好ましい本発明のペプチドの活性を同定および所望により定量するのに有用な特定のアッセイを下記する。アッセイは、限定するものではなく、本発明のペプチドのギャップ結合調節能力に関して試験することができる種々のアッセイを説明するために単に与えられる。該アッセイは相互排他的ではないこと、すなわち、本発明のペプチドは、一の特定のアッセイにおいて活性を示すか、別の特定のアッセイにおいて異なる活性を示す、または活性を示さないこともありうることは理解されるだろう。このことは、個々のペプチドの多様性のおよび該ペプチドを試験するアッセイの型の影響である。
【００６６】
Ａ．標準的な経口利用能アッセイ
本発明の好ましい態様は、インビボで高い利用能を有するペプチドを提供することである。経口投与後のペプチドの吸収は、胃腸（ＧＩ）管における酵素または腸細胞の細胞内腔の酵素により分解されるので、限定されうる。さらに、ペプチドの物理化学的特性、特にその大きな水素結合能により、それらの分子が細胞間受動拡散により腸細胞に浸透されることを困難にする。しかしながら、胃腸液酵素に耐えたジおよびトリペプチドは、上部小腸の腸細胞の頂端膜に位置する膜蛋白質であるペプチドトランスポーターｈＰｅｐＴ１により、細胞内腔に侵入することができる。
【００６７】
したがって、本発明の好ましいペプチドは、ｈＰｅｐＴ１トランスポーターまたはそのアナログに対してアフィニティーを有するペプチドである。ＰｅｐＴ１トランスポーターに結合するペプチド化合物の三次元構造および主要な結合部位は、Bailey, P.D., et al., 2000（上掲）に記載されており、望ましいペプチドは、コンピュータにより上記したような結合部位内に最適に固定されるように設計することができる（例えば、Bailey, P. D., etal., (2000) （上掲）; Vinter, J. G., (1996) J. Comput Aided Des. 10: 417を参照のこと）。
【００６８】
式Ｉ、式ＩＩ、表１またはベイリーアッセイにより一般的に同定されたペプチドの経口利用能は、ＰｅｐＴ１トランスポーター、好ましくは、ｈＰｅｐＴ１トランスポーターに結合する能力に関して評価することができる。例えば、ＰｅｐＴ１ｃＤＮＡ、好ましくは、ｈＰｅｐＴ１ｃＤＮＡ（例えば、Covitz, K. M., etal., (1996) Pharm. Res. 13 (11): 1631-34を参照のこと）は、アフリカツメガエル（Xenopus）卵母細胞発現系において発現し、標識化したペプチドの卵母細胞への取り込みをモニターし、Temple, C. S., et al. (1996) J. Physio. (London) 494: 795; Meredith, D., etal., (1998) J. Physiol. (London) 512: 629に記載のようにＫｉ値に近似することができる。
【００６９】
本発明の一の態様において、標準的なインビボ経口利用能アッセイを行って、上記したようなベイリー基質テンプレートに最適に一致するように設計されたペプチドの経口利用能を測定する。このアッセイにおいて、ペプチドは、哺乳類、例えばラットに、経口投与可能形態（例えば、食物ペレットの一部または水溶液として）で経口投与し、同時に、同濃度のペプチドを静脈内投与する（例えば、大腿静脈および動脈に挿入したカテーテルを介して）。ペプチドは、経口および静脈内投与の両方で、１ｍｌ／ｋｇの容量中１０−５〜１０−１０個の濃度範囲でボーラス注射により投与することができる。動物に５００Ｉ．Ｕ．のヘパリンを静脈内投与し、５分後に最初の血液試料を採取する。対照血液試料「投与前」またはＢ．Ｄ．試料は、ペプチドの投与前約５分に採取する。投与溶液の試料（例えば、１０−５〜１０−１０Ｍ個のペプチドを含有する１００μｌの水）は、濃度測定の間維持される。血液試料は、Ｂ．Ｄ．５、１５、３０、６０、９０、１２０、１８０および２４０分で採取される。
【００７０】
標識化した氷冷ＥＤＴＡ安定化血液試料バイアルに血液を回収し、５分間４℃で遠心分離（１０，０００ｘｇ）に付すまで氷上で貯蔵した。血漿（１００μｌ）を採取し、標識化したポリプロピレンミクロ遠心分離バイアル（例えば０．５ｍｌのエッフェンドルフ）に移し、氷で冷却して、−２０℃で、さらなる分析まで貯蔵した。約４０μｌの濾液を、ＨＰＬＣカラム（ＸｔｅｒｒａＭＳＣ１８、３×５０ｍｍ、３．５μｍ粒子）に注入し、０〜１００％のＢの直線勾配を用いて４．０分で溶出した。カラムを、（アセトニトリル中の０．１％のギ酸または他の適当な緩衝液）で２．９分間洗浄し、緩衝液Ａ（水中０．１％のギ酸または他の適当な緩衝液）中で５分間平衡化し、ついで、次の試料の注入を行う。質量スペクトルは、当該分野で公知の方法を用いて行い、実施例１および２に記載する。
【００７１】
血漿試料中の化合物の濃度は、１．００〜１０００ｎＭの範囲をカバーする外部標準曲線から計算する。血漿濃度対時間データを、非コンパートメント分析を用いるＷｉｎＮｏｎＬｉｎ ３．５（Pharsight, Mountain view, CA）での薬物動力学的モデリングに用い、ＡＵＣ値を、当該分野で公知のように測定する。好ましくは、経口投与可能な本発明のペプチドは、約３０分内またはそれ未満で有意な血漿中レベルが観察される。ペプチドの静脈内投与を受けた動物において観察されたＡＵＣ値を、クリアランスとしてかかる効果を、および２つの系において同じであるべきである半減期を評価するのに用いる。
【００７２】
Ｂ．標準的な血漿安定性アッセイ
また、本発明は、インビトロまたはインビボで高い安定性を有するペプチドを提供する。一の態様において、ペプチドは、アルキル化された、または酵素分解に対してペプチドを安定化する他の修飾がなされたペプチド結合を含む。他の態様において、ペプチドは、一またはそれ以上のＤ−アミノ酸を含む。さらなる態様において、ペプチドは、標準的な安定性アッセイにおいて高い安定性を有する。
【００７３】
一の態様において、インビトロ血漿安定性アッセイを、２００２年２月２２日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ０２／０５７７３に記載のように行う。
ＰＣＴ／ＵＳ０２／０５７７３出願に記載されるように、ペプチドは、血漿または血清中でインキュベートすることができ、試料を、ＨＰＬＣまたはＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる分析に定期的に付して、分解されていないペプチドの量を定量することができる。かかる分析に対する適当な条件（カラム、溶媒、勾配および温度）は、ペプチドピークおよび血漿ピークが、同じ保持時間を有しないことを確実にするように推定する。これは、ペプチド、血漿の連続注入およびペプチドおよび血漿の同時注入し、ついで、十分な分離が得られるまで、ＬＣ法のパラメータを最適化する。また、同じ方法で試験するペプチド不含の対照血漿試料を得、評価することができる。試料は、限定するものではないが、ブランク、適当な濃度のペプチド（例えば０．１ｍｇ／ｍＬ）、ペプチド不含の血漿、ｔ＝０での１またはそれ以上の試料および各々の一定の間隔での１またはそれ以上の試料を含む。好ましくは、複数の試料を平行して用いる。試料濃度（ｍＡＵまたはイオン計数の最も高いピーク）を時間に対してプロットし、モノ指数関数減衰を記載する式にあてはめる（例えば、標準的なエクセルを用いる）。好ましくは、本発明のペプチドは、このアッセイを用いて測定して、約４８時間を超える、例えば２４時間を超える、例えば、１２時間を超える、例えば６時間を超える、例えば、３時間を超える、例えば１時間を超える、例えば３０分を超える半減期を有する。
【００７４】
血漿安定性は、インビボで標準的なアッセイを用いて試験する。例えば、ペプチドを哺乳類、例えばラットに、静脈内および経口投与の両方で、約１ｍｌ／ｋｇの容量でボーラス注射することにより投与することができる。好ましくは、ペプチドは、対照試料、例えば緩衝液または公知の安定性を有する抗不整脈ペプチドと平行して試験する。血液試料は異なる時間に採取する（例えば、Ｂ．Ｄ．５、１５、３０、６０、９０、１２０、１８０および２４０分、ここに、Ｂ．Ｄ．は、投与前を意味する）。試料中のペプチドの量は、当該分野で公知の方法、例えばＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いて定量することができる。例えば、血漿試料中のペプチドの濃度は、１．００〜１０００ｎＭの範囲をカバーする外部標準曲線から計算する。血漿濃度対時間データを、非コンパートメント分析を用いるＷｉｎＮｏｎＬｉｎ ３．５（Pharsight, Mountain view, CA）での薬物動力学的モデリングに用い、得られたＡＵＣのパラメータ、Ｆｐｏ、Ｃｌｂ、ｔ１／２、Ｃｍａｘおよびｔｍａｘを当該分野で公知のように測定する。
【００７５】
Ｃ．標準的な心筋細胞アッセイ
一の態様において、本発明のペプチドを投与して、心臓細胞およびギャップ結合機能を評価する。かかる方法に最適なペプチドは、標準的な心筋細胞アッセイにおいて同定することができる。一の態様において、心臓細胞は、哺乳類、例えばギニー・ピッグ心臓から、ランゲンドルフ（Langendorf）法に従ってコラゲナーゼと潅流することにより単離する。細胞をペプチドに曝し、当該分野で公知の方法を用いるパッチクランプ方によりＧＪＩＣを評価する。細胞間伝導（Ｇｊ）は、等式：
【数１】
0004603364.tif 000010
［式中、Ｉｐ，ｐｕｌｓｅおよびＩｐ，ｒｅｓｔは、それぞれ、パルス中およびパルス前の受動細胞中の電流を意味し、ＵｐおよびＵａは、受動および活性細胞の電圧を意味する］
を用いる。ペプチド投与でのＧｊ値の変化を、Ｇｊの相対的な変化を比較することにより評価する。例えば、ペプチド（例えば、約１０−８Ｍで）による刺激の前およびその間の機能として相対的なＧｊを計算することができる。
【００７６】
一の具体例において、ペプチドは、抗不整脈ペプチド、例えばＡＡＰ、ＡＡＰ１０、ＨＰ５およびその機能的なアナログのＧｊと実質的に同じＧｊ（約±１０％）を与える。一の態様において、細胞は虚血細胞であり、ペプチドは、非虚血細胞のものと実質的に同じＧｊ（±２０％、好ましくは、±１０％）を与える。
【００７７】
別の具体例において、本発明のペプチドは、抗不整脈ペプチド、例えばＡＡＰ、ＡＡＰ１０、ＨＰ５およびその機能的なアナログのＧｊとは異なるＧｊ（±４０％まで）を与える。
心筋細胞アッセイを行うことに関するさらなる詳細は、２００２年２月２２日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ０２／０５７７３に記載されている。
【００７８】
Ｄ．標準的なカルシウム誘発不整脈アッセイ
心臓細胞への投与に適したペプチドは、Lynch et al. (1981) J Cardiovasc. Pharmacol. 3: 49-60のモデルに従ってカルシウム誘発不整脈のインビボモデルで同定することができる。マウス（２５〜３０ｇ）を、神経遮断麻酔の組み合わせで麻酔し、静脈内カニューレを、尾の静脈に挿入する。リードＩＩ ＥＣＧシグナルを、ステンレススチールＥＣＧ電極を右の前肢および左の後肢に位置することにより連続的に記録する。接地電極を、右の後肢に置く。シグナルを増幅（×５，０００〜１０，０００）し、Hugo Sachs Electronic model 689 ECGモジュールによりフィルターをした（０．１〜１５０Ｈｚ）。アナログシグナルを、１２ビットのデータ獲得ボード（Data Translation model DT 321）によりデジタル化し、Windows NTのNotocord HEM 3.1ソフトウェアを用いて１０００Ｈｚでサンプリングする。１０分の平衡期間の後、ペプチドの試料を、尾の静脈に注入した。緩衝液で予備処理したマウスを、未処理の動物の対照レベルの測定のために試験した。注入量は、すべての試験において１００μｌである。
【００７９】
ＣａＣｌ２の注入（３０ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｌ／分、約１００ｍｇ／ｋｇ／分（塩化カルシウム−２−水和物、Riedel-de Haen, Germany））を、薬剤またはビヒクルの静脈内投与の３分後に開始する。第２のＡＶ−ブロックの開始までのタイムラグを、ＣａＣｌ２注入の開始から、最初の不整脈が生じるまでの時間として測定する。第２のＡＶ−ブロックの事象は、付随するＱＲＳの複合がないＰ波により特徴付けられるＡＶ伝導の一時的な障害として定義する。
【００８０】
応答は、ビヒクル処理したマウスにおいて生じる第２のＡＶ−ブロックまでの時間に関連して起こる。化合物（例えば、ペプチド、ＡＡＰ、ＡＡＰ１０または対照）の最大効果を測定する。好ましくは、本発明のペプチドは、化合物ＡＡＰ、ＡＡＰ１０、ＨＰ５またはその機能的なアナログに同程度である、抗不整脈活性を有する。すなわち、ペプチドは、ＣａＣｌ２の注入後のマウスのＡＶブロックまでの時間を増加させる。好ましくは、ペプチドは、ＡＡＰの活性の少なくとも約４０％、例えばＡＡＰの活性の少なくとも約５０％、例えばＡＡＰの活性の約６０％、例えばＡＡＰの活性の少なくとも約７０％、例えばＡＡＰの活性の少なくとも約８０％、例えばＡＡＰの活性の少なくとも約９０％、例えば少なくともＡＡＰの活性と実質的に同じ、例えばＡＡＰの活性の約１１０％、例えばＡＡＰの活性の少なくとも約１２０％、例えば、ＡＡＰの活性の少なくとも約１３０％、例えば、ＡＡＰの活性の少なくとも約１４０％、例えば、ＡＡＰの活性の約１５０％、例えばＡＡＰの活性の少なくとも約１６０％、例えばＡＡＰの活性の少なくとも約１７０％、例えばＡＡＰの活性の少なくとも約１８０％、好ましくは、ＡＡＰの活性の少なくとも約１９０％、より好ましくは、ＡＡＰの活性の少なくとも約２００またはそれ以上の％を提供する（すなわち、ペプチドは、ＡＡＰにより誘発されるものとほぼ同じ期間のタイムラグを示す）。
【００８１】
Ｅ．標準的な骨芽細胞活性アッセイ
細胞間コミュニケーションの調節は、骨指向性因子が骨形成細胞の活性を調節することによる機構を意味する。したがって、一の態様において、本発明のペプチドは、骨細胞間のギャップ結合コミュニケーションを増加させ、それによりインビボでの骨形成を増強することにより骨芽細胞活性を増加させるのに用いられる。
【００８２】
本発明のペプチドの効果は、例えば、カルシウム波活性および／またはアルカリホスファターゼ活性を測定することにより、ヒト骨芽細胞（ｈＯＢ）において予めアッセイすることができる。
【００８３】
一の態様において、細胞は、健康なボランティア（２０〜３６歳）の後腸骨棘の穿刺により得られたヒト骨髄から単離し：１０〜１５ｍｌの骨髄物質を、１００Ｕ／ｍｌのヘパリン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｈ−３１４９）を含有する１５ｍｌのＰＢＳ＋Ｃａ、Ｍｇ（Life Technologies、カタログ番号１４０４０）中に回収した。骨髄の単核細胞フラクションを、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ勾配（Nycomed Pharma、カタログ番号１００１９６７）で、３０分間２２００ｒｐｍで遠心分離に付すことにより単離する。回収した後、単核細胞フラクションを、培養培地で１回洗浄し、１８００ｒｐｍで１０分間遠心分離に付した。続いて、細胞を計数し、５×１０６細胞／１００ｍｍディッシュで培養培地で平板培養した。ｈＯＢ培地（すべての試薬がLife Technologiesから得られる）：１０％の心臓不活性化胎児子牛血清（カタログ番号１０１０６）および０．１％のペニシリン／ストレプトマイシン（カタログ番号１５１４０）を補足したＭＥＭｗ／ｏフェノールレッドｗ／Ｇｌｕｔａｍａｘ（カタログ番号０４１−９３０１３）。培地を次の日に交換し、細胞を、培地を７日毎に交換しながら、５％のＣＯ２雰囲気下３７℃で培養した。４〜６週間の培養後、細胞は、７０％のコンフルエンスに達するだろう。ついで、培地に、１００ｎＭのデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｄ−４９０２）を７日間補足する。ついで、細胞を、ビデオ画像実験のために平板培養する：２５ｍｍの＃１ガラスカバースリップを、３５ｍｍのディッシュ（または、６ウェルマルチディッシュの各々のディッシュ）上に置き、細胞を２．５×１０５細胞／カバースリップで平板培養して、使用前２〜３日の間培養した。
【００８４】
ＲＯＳ１７／２．８細胞を、１００ｍｍのディッシュで、５％のＣＯ２雰囲気下３７℃で培養し、培地を２〜３日毎に交換する。ＲＯＳ培地（すべての試薬をLife Technologiesから得た）：ＭＥＭ（カタログ番号３１０９５）に、１０％の心臓不活性化子牛血清（カタログ番号１６１７０）、１％のＮＥＡＡ（カタログ番号１１１４０）、１％のピルピン酸ナトリウム（カタログ番号１１３６０）、１％のＬ−グルタミン（カタログ番号２５０３０）および０．１％のペニシリン／ストレプトマイシン（カタログ番号１５１４０）を補足する。ビデオ画像実験に関して、細胞を、２〜３×１０５細胞／カバースリップで、カバースリップ上に平板培養し、使用前の２〜３日間培養する。
【００８５】
カバースリップ上で培養した細胞を、３７℃で３０分、５μＭのフラ−２−ＡＭ（Molecular Probes、カタログ番号Ｆ−１２２１）で満たし、新たな培地で２０分インキュベーションする。ついで、カバースリップをＰＤＭＩ−２培地チャンバー（Medical Systems Corp.）に貼り、Zeiss Axiovert顕微鏡において、ＣＯ２雰囲気下３７℃に維持する。細胞内カルシウム波を、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ５１７１極微操作装置を有するホウケイ酸ガラスマイクロピペットを用いて、単細胞を機械的に刺激することにより誘発した。
【００８６】
画像化は、ＭｅｔａＭｏｒｐｈ画像化システム（Ｕniversal Imaging）を用いて行う。励起光（３４０および３８０ｎｍ）を、モノクロメーター（T.I.L.L. Photonics GmbH）により与えた。画像を、強化ＣＣＤカメラ（ＤａｇｅＭＴＩ）で獲得し、ＭａｔｒｏｘＭＶＰ画像処理ボードでデジタル化した。ペプチドの存在および非存在下でのカルシウム波に含まれる細胞の数は、ＧＪＩＣの増加の尺度を与えるために用いることができる。
【００８７】
一の態様において、ペプチドの投与により、波に含まれる細胞の数は、対照、例えば緩衝液に曝した細胞と比較して、少なくとも約２倍に増加した。別の態様において、ペプチドの投与により、波に含まれる細胞の数は、少なくとも約２分の１に減少する。本発明のアゴニストペプチドは、かかるアッセイにおいて、ＡＡＰの活性の少なくとも約１０％、例えば少なくとも約２０％の活性、例えば少なくとも約３０％の活性、例えば少なくとも約４０％の活性、例えば、ＡＡＰの活性の少なくとも約５０％、好ましくは、少なくとも約７０％の活性、より好ましくは、活性ＡＡＰの活性の１００％またはそれ以上の活性を与える。
【００８８】
また、細胞は、アルカリホスファターゼ活性の存在を測定して、骨芽細胞活性の一般的な測定を得ることができる。一の態様において、細胞を、９６ウェルプレートにて、８０００細胞／ウェル（ｈＯＢ）または３０００細胞／ウェル（ＲＯＳ）の濃度で、２００μｌの正常培養培地で平板培養する。４日（またはＲＯＳ細胞に関しては３日）で、細胞を、２００μｌのＭＥＭ、０．１％のＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ−９４１８）で洗浄する。種々のペプチド、対照、ＡＡＰまたはＡＡＰ１０を含有する、適当な培地（例えば、２００μｌのＭＥＭ、０．１％のＢＳＡ）を含む試料を細胞に加え、培養を約４日（ＲＯＳ細胞に関しては２日）続ける。
【００８９】
約８日で（好ましくは、ＲＯＳ細胞に関して５日）、細胞を、当該分野で知られているようなアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）アッセイを用いるアルカリホスファターゼに関してアッセイする。ＡＬＰアッセイは、一般的には、酵素活性を測定する比色終点法であり、アルカリホスファターゼキット（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号１０４−ＬＬ）を用いて行うことができる。好ましくは、細胞は、２００μｌのＰＢＳ＋Ｃａで１回洗浄し、Ｍｇ、１００μｌのアルカリ緩衝液を各々のウェルに加え、細胞を３７℃で１０分間インキュベートする。１００μｌの基質溶液を、連続して、各々のウェルに加え、プレートを、３７℃で３０分間インキュベートした。１００μｌの２．０ＮのＮａＯＨを各々のウェルに加え、反応を停止させる。吸光度を、プレートリーダーを用いて４０５ｎｍで測定する。
【００９０】
本発明のアゴニストペプチドは、等張セイラインと比較して少なくとも約５％のアルカリホスファターゼ産生の増加、好ましくは等張セイラインと比較して少なくとも約１０％のアルカリホスファターゼ産生の増加、さらにより好ましくは、等張セイラインと比較して１５％またはそれ以上のアルカリホスファターゼ産生の増加を与える。アルカリホスファターゼの産生の増加は、骨芽細胞の活性の増加の尺度であり、したがって、骨形成の増加の尺度である。
【００９１】
Ｆ．標準的な腫瘍プロモーターアッセイ
また、殺虫剤ＤＤＴとして公知のものである化合物１，１−ビス（ｐ−クロロフェニル）−２，２，２−トリクロロエタンは、ギャップ結合コミュニケーションの阻害剤であり、腫瘍促進活性を有する。ギャップ結合数および大きさが減少することにより細胞−対−細胞コミュニケーションが阻害され、ＤＤＴへの曝露は、ギャップ結合蛋白質Ｃｘ４３のリン酸化（活性）形態の細胞内での減少に関連している。これらの作用は、化合物の発癌特性に関して極めて重要であると考えられる（X. Guan, et al. (1996) Carcinogenesis, 17 1791-1798; R. J. Ruch, et al. (1994) Carcinogenesis, 15 301-306)；B. V. Madhukar, et al. (1996) CancerLett. 106 117-123）。ペプチドの治療効果を測定する手段として、ヒト骨芽細胞におえるペプチドのＤＤＴ誘発非カップリングに対する効果を測定することができる。かくして、一の態様において、本発明のペプチドは、ＧＪＩＣの腫瘍プロモーター誘発減少を阻害または防止するのに用いられる（W. K. Hong, et al. (1997) Science, 278 1073-1077）。
【００９２】
一の代表的なアッセイにおいて、ヒト骨芽細胞を、健康なボランティア（２０〜３６歳）の後腸骨棘の穿刺により得られたヒト骨髄から単離する。約１０〜１５ｍｌの骨髄物質を、１００Ｕ／ｍｌのヘパリン（Sigma、カタログ番号Ｈ−３１４９）を補足した１５ｍｌのＰＢＳ＋Ｃａ、Ｍｇ（Life Technologies、カタログ番号１４０４０）中に集める。骨髄の単核細胞フラクションを、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ勾配（Nycomed Pharma、カタログ番号１００１９６７）で、２２００ｒｐｍで３０分間遠心分離することにより単離する。
【００９３】
単離後、単核細胞フラクションを、培養培地で１回洗浄し、１８００ｒｐｍで１０分間遠心分離に付す。続いて、細胞を計数し、培養培地中に８×１０６細胞／１００ｍｍディッシュで平板培養する。培地を翌日に交換し、細胞を、７日毎に培地を交換しながら、５％のＣＯ２雰囲気下３７℃で培養する。３〜４週間の培養後、細胞は、典型的には、７０％のコンフルエンスに到達する。ついで、培地に、１００ｎＭのデキサメタゾン（Sigma、カタログ番号Ｄ−４９０２）を７日間補足する。ついで、細胞を、ビデオ映像実験のために平板培養する。一般的には、細胞を、２．５×１０５細胞／カバースリップで平板培養し、画像化前２〜３日間培養する。
【００９４】
培養後、細胞をＰＤＭＩ−２培地チャンバー（Medical Systems Corp.）に貼り、Zeiss Axioverｔ顕微鏡において、ＣＯ２雰囲気下３７℃に維持する。マイクロインジェクションを、１０ｍＭのＬｕｃｉｆｅｒ Ｙｅｌｌｏｗ溶液（Sigma、カタログ番号Ｌ−０２５９）を充填したマイクロピペットを用いて行う。単層の細胞を、ＬＹで注意深く３０秒間注入する；マイクロピペットを、細胞から離し、３０秒後、染料移動を示した細胞の数を計数する。細胞培養のサブセットに関して、ＤＤＴを、最終濃度１３μＭの濃度で培地に加え、６０分間静置する。細胞の画像を、強化ＣＣＤカメラ（Dage MTＩ）で獲得し、画像化ソフトウェア（Universal Imaging）を用いるＭａｔｒｏｘＭＶＰ画像処理ボードでデジタル化した。
【００９５】
対照条件下（ＤＤＴ処理なし）、染料は、一般的には、平均１４．５細胞（ｎ＝１２）に広まる。ＤＤＴ−曝露細胞は、典型的には、平均７（ｎ＝１３）で細胞カップリングの減少を示す。
【００９６】
ペプチドを、１０−８ｍｏｌ／ｌの最終濃度の浴液に加え、１０分後、別のマイクロインジェクションを行う。好ましくは、本発明のアゴニストペプチドは、細胞−対−細胞染料移動の増加を示す。より好ましくは、この増加は、慣用的な統計試験、例えばＷｉｌｃｏｘｏｎ非パラメータ統計試験（ｐ＜０．０５で）を用いて測定して、対照試料（ペプチドなし）と有意に異なっている。好ましくは、ペプチドは、ＡＡＰで観察される減少よりも少なくとも約５０％、好ましくは、約７０％の、より好ましくは、約１００％またはそれ以上のＧＪＩＣ阻害の減少を示す。
【００９７】
このアッセイは、腫瘍促進に関連している低い細胞間カップリングの反転に高い治療効果を有する候補ペプチドを同定するのに用いることができ、一の態様において、かかるペプチドは、癌の進行の危険性があるまたは癌を患っている患者に投与される。ペプチドは、単独または他のペプチドと組み合わせて、および／または他の抗癌剤と治療的に組み合わせて用いることができる。
【００９８】
さらなる他のアッセイは、抗不整脈ペプチドＡＡＰ、ＡＡＰ１０、ＨＰおよびその機能的なアナログと実質的に同じ生物学的応答を誘発させる（例えば、アゴニストとして同定される）か、あるいは生理学的応答を阻害または抑制する（例えば、アンタゴニストとして同定される）ペプチドを同定するために行うことができる。適当なアッセイは、限定するものではないが、細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）のｃＡＭＰ形成を測定するアッセイ；ｃＡＭＰ効果アッセイ（例えば、ＣＨＯ細胞におけるＡＰＰ様化合物のホルスコリン刺激ｃＡＭＰ形成の阻害の測定）；心筋細胞におけるホスホイノシトール回転（Meier etal.）（E. Meier, et al. (1997) Drug Development Research, 40: 1-16）；およびグルコースおよび酸素喪失に対する応答を含む。
【００９９】
多くの標準的なアッセイを上に説明した。さらなるアッセイは、２００２年２月２２日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ０２／０５７７３に記載されており、これは出典明示により本明細書に組み入れる。これらのアッセイは、単に説明するものであって、発展可能な、および常識となった他の適当なアッセイも本発明の範囲に組み入れる。
【０１００】
医薬組成物
また、本発明は、１またはそれ以上の上記したペプチドを、医薬上許容される担体および／または希釈剤を組み合わせて含む医薬組成物に関する。かかる組成物は、好ましくは、経口投与に適した形態である。
【０１０１】
経口投与用の処方は、当業者によく知られた方法で、例えば一般的には「Remington's Pharmaceutical Sciences」, 17. Ed. Alfonso R. Gennaro (Ed.), Mark Publishing Company, Easton, PA, U.S.A., 1985およびより近年の版ならびに「Drugs and the Pharmaceutical Sciences」シリーズのモノグラフ、Marcel Dekkerに記載の方法により調製することができる。一の好ましい態様において、組成物は、錠剤、カプセル、顆粒、ペレット、トローチ、ロゼンジ等の形態であってもよい。適当な腸溶処方は、例えば米国特許第５，３５０，７４１号に記載されている。
【０１０２】
用いられる医薬担体または希釈剤は、慣用的な固体または液体担体であってもよい。固体担体の例としては、ラクトース、テラ・アルバ、シュークロース、シクロデキストリン、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはセルロースの低級アルキルエーテルが挙げられる。液体担体の例としては、シロップ、ピーナッツ油、オリーブ油、リン脂質、脂肪酸、脂肪酸アミン、ポリオキシエチレンおよび水が挙げられる。
【０１０３】
適当には、担体または希釈剤は、当該分野で公知の徐放性物質、例えば、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルを単独またはワックスと組み合わせて含んでいてもよい。
固体担体を経口投与用に用いる場合、製剤は、錠剤、粉末またはペレット形態でハードゼラチンカプセルに充填された形態であってもよく、またはトローチまたはロゼンジの形態であってもよい。固体担体の量は、広範囲に及ぶが、一般的には約２５ｍｇ〜約１ｇだろう。
液担体を用いる場合、製剤は、シロップまたは経口摂取に適した液体の形態でありうる。
【０１０４】
所定の治療において用いられる活性化合物の実際の好ましい量は、例えば、利用する特定の化合物、処方された特定の組成物、投与形態および対象の特徴、例えば種、性別、体重、健康状態および対象の年齢に応じて変化するだろうことが明らかだろう。所定の投与計画に対する最適な投与量は、前述のガイドラインに関して当業者により慣用的な投与量決定試験を用いて容易に決定することができる。適当な投与量範囲は、１日あたり、約１ｍｇ／体重ｋｇ〜約１００ｍｇ／体重ｋｇの範囲である。
【０１０５】
本発明の治療化合物は、適当には、プロトン化および水溶性形態、例えば医薬上許容される塩、典型的には酸付加塩、例えば、無機酸付加塩、例えば塩酸塩、硫酸塩またはリン酸塩または有機酸付加塩、例えば酢酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩またはクエン酸塩で投与される。また、本発明の治療化合物の医薬上許容される塩は、金属塩、特にアルカリ金属塩、例えばナトリウム塩またはカリウム塩；アルカリ土類金属塩、例えばマグネシウムまたはカルシウム塩；アンモニウム塩、例えばアンモニウムまたはテトラメチルアンモニウム塩；またはアミノ酸付加塩、例えばリシン、グリシンまたはフェニルアラニン塩を含みうる。
【０１０６】
また、本発明の化合物は、末梢血管疾患を治療するために局所投与することができ、クリームまたは軟膏として処方することができる。
また、本発明のペプチドは、非経口投与用の組成物、例えば滅菌溶液または懸濁液に処方することができる。本発明のペプチドは、非経口投与、特に静脈内、筋肉内、皮下、経鼻、直腸内、膣内または腹膜内投与することができる。
【０１０７】
本発明を、本発明の好ましい具体例を説明する以下の実施例においてさらに記載する。
【０１０８】
治療方法
一の態様において、本発明は、ＧＪＩＣの障害に付随する症状を患っている、または進行の危険性がある患者に、治療的に有効な量の上記に記載のいずれかのペプチドの投与方法を提供する。好ましくは、投与は経口である。本発明のペプチドを用いて治療されうる患者は、限定するものではないが、動物、好ましくは哺乳類、例えば齧歯類（マウス、ラット、ハムスターおよびウサギを含む）、イヌ、ブタ、ヤギ（一般的には、いずれかの家畜）および霊長類を含む。一の態様において、患者はヒトである。
【０１０９】
他の態様において、本発明は、治療的に有効な量の該ペプチドを患者に投与することを含む、ギャップ結合コミュニケーション障害が関与する病状の治療用の医薬の製造における、本発明のペプチド使用に関する。
【０１１０】
治療することができる症状の例としては、限定するものではないが、心血管疾患、気道上皮の炎症、歯槽組織の障害、膀胱失禁、蝸牛の疾患による難聴、内皮障害、糖尿病性網膜症および糖尿病性ニューロパシー、中枢神経系および精髄の虚血、歯周疾患を含む歯の組織障害、腎臓病、骨髄移植の不全、創傷、勃起不全、膀胱失禁、神経障害性の痛み、亜慢性および慢性の炎症、癌および骨髄および幹細胞移植の不全、細胞および組織の移植間または医療処置、例えば手術の間に生じる症状；ならびに、過剰な活性酸素種および／またはフリーラジカルおよび／または一酸化窒素により引き起こされる症状が挙げられる。
【０１１１】
不整脈
一の好ましい態様において、本発明は、心臓血管疾患、例えば、急性虚血性心疾患（例えば、安定狭心症、非安定狭心症、急性心筋梗塞）、鬱血性心不全（例えば、収縮性、拡張性、高心拍出量性、低心拍出量性、右または左心不全）、先天性心疾患、肺性心、心筋症、心筋炎、高血圧性心疾患、冠血行再建術等の間に生じる不整脈および血栓性合併症の治療用の、薬理学的に活性な抗不整脈ペプチドおよびその使用を提供する。
【０１１２】
特定の具体例において、本発明の抗不整脈ペプチドは、徐脈性不整脈（例えば、洞結節、房室結節、ヒス束、右または左脚の疾患による）およびリエントリーに付随する頻脈性不整脈（例えば、心房性期外複合、房室接合部複合、心室性期外複合、心房細動、心房粗動、発作性上室性頻拍症、洞結節リエントリー性頻拍、房室結節リエントリー性頻拍および非持続性心室頻拍）の治療および／または予防に、単独または抗不整脈化合物、例えば群Ｉの薬剤（例えば、リドカイン）、群ＩＩの薬剤（例えば、メトプロロールまたはプロプラロノール）、群ＩＩＩの薬剤（例えば、アミオダロンまたはソタロール）または群ＩＶの試薬（例えば、ベラパミル）と組み合わせ用いることができる。
【０１１３】
加えて、または別法として、本発明のペプチドは、１またはそれ以上のリエントリー不整脈；心室リエントリー（例えば、急性心筋梗塞、慢性心筋梗塞、安定狭心症および非安定狭心症の間に生じる）；感染性または自律神経性心筋症；心房細動；再分極交代；単源性心室頻泊；Ｔ波交代；徐脈性不整脈；および一般的な、心臓組織の収縮性低下、血栓症等の治療に用いられる。
【０１１４】
骨粗鬆症
さらなる態様において、本発明のペプチドは、骨粗鬆症または骨形成、成長または維持に影響される他の病状の予防および／または治療に用いられる。低酸素状態の間のヒト骨芽細胞間のＧＪＩＣの障害を正常化することができるペプチドは、特に、骨再吸収と比較して骨形成の低下を伴う骨疾患の治療に適している。かかる方法で用いるための最適なペプチドは、適切なＧＪＩＣの維持の結果として細胞の生存および増殖を測定する手段を提供する、骨芽細胞におけるアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性の増加に関するアッセイで選択することができる。一の態様において、ヒト骨芽細胞を１×１０−１３〜１×１０−６０のペプチドの異なる濃度で刺激し、未処理の対照と比較する。通常の培養条件下、ペプチドは、好ましくは、ＡＬＰ活性が増加する。さらにより好ましくは、ペプチドは、１０−１１〜１０−８ｍｏｌ／ｌの範囲の濃度で低酸素条件の間にＡＬＰ活性を刺激する。かくして、アッセイは、骨組織の血管形成、低酸素状態および虚血に付随する骨疾患の治療および／または予防用のペプチド組成物の最適化に用いることができる。
【０１１５】
別の態様において、本発明のペプチドは、細胞−対−細胞カップリングの低下が関与する関節疾患の予防および／または治療に用いられる。例えば、ペプチドは、代謝ストレスが関与する関節疾患の予防および／または治療に用いることができる。これらは、骨折軟骨の血管形成または治癒の低下に付随する関節炎のいずれの形態も含むだろう。
【０１１６】
癌
第２の別の態様において、本発明のペプチドは、癌の治療に有用である。発癌は成長因子、腫瘍形成および腫瘍抑制遺伝子が関与する成長制御機構の進行性機能障害により特徴付けられる。発癌および腫瘍形成における一般的なテーマは、ＧＪＩＣのダウンレギュレーションである。染料移動アッセイを用いる、腫瘍細胞におけるギャップ結合の透過率は、典型的には、組織の周囲のＧＪＩＣよりも低い。さらに、ギャップ結合のゲートは、ＧＪＩＣを減少させる腫瘍プロモーターにより影響を受けることが知られている。一の態様において、本発明のペプチドは、癌の治療に、単独または慣用的な抗癌剤と組み合わせて医薬として用いられる。
【０１１７】
創傷
さらなる態様において、本発明のペプチドは、創傷の治療、特に、創傷治癒を増進させるのに用いられる。創傷治癒は、多くの細胞型の相互作用に関連し、ギャップ結合により媒介される細胞間コミュニケーションは、組織の修復および再形成に関与する細胞の成長および発達の間の細胞代謝の調整において重要な役割を担っていると考えられる（K. M. Abdullah, et al. (1999) Endocrine, 10 35-41; M. Saitoh, et al. (1997) Carcinogenesis, 18 : 1319-1328; J. A. Goliger, etal. (1995) Mol. Biol. Cell, 6 1491-1501）。ペプチドは、当該分野でよく知られた担体（例えば、軟膏、クリーム等）を用いて局所投与することにより創傷部位に投与するか、または、例えば内部組織の創傷の治療、例えば慢性胃潰瘍の治療において全身投与することができる。
【０１１８】
内皮ギャップ結合細胞間コミュニケーションが関与しているさらなる機能は、外傷後、血管新生、内皮成長および老化後の内皮細胞の移動行動および血管運動応答の調整である（G. J. Christ, etal. (2000) Braz. J MedBiol. Res., 33: 423-429）。したがって、一の態様において、本発明のペプチドは、伝導血管応答の増強、および代謝要求の増加を伴う症状（例えば、運動、頻脈）および虚血の間に、血液供給を改善するために用いられる。
【０１１９】
また、ギャップ結合は、グリア区画の個々のメンバー間の組織的長距離シグナリングのための分子結合を提供すると考えられる。同様に、星状細胞は、ニューロン実質の近くの血管床および他の血管極に接触している一の先端を伴って機能的に分極するので、理想的に、ニューロンの代謝支持に適している（R. Dermietzel (1998) Brain Res. Brain Res. Rev., 26: 176-183）。したがって、一の好ましい具体例において、本発明のペプチドは、グリア細胞およびニューロン間の代謝支持を増加させることにより、脳の虚血性損傷の予防を必要とする患者に投与される。かかる患者は、例えば、鬱病、不安症、学習および記憶障害、恐怖症および幻覚の兆候が存在しうる、器質性精神病を患っている患者、または外傷性脳傷害を患っている患者を含む。好ましくは、かかるペプチドは、中枢神経系に対して利用できるように選択されまたは処方される（すなわち、担体と提供されるか、またはコンジュゲートされ、血管−脳の障壁を越える移動を促進する）。
【０１２０】
また、本発明のペプチドは、例えば、神経外傷、脳虚血および慢性神経変性疾患、例えばパーキンソン病またはハンチントン病（H. Aldskogius, et al. (1998) Prog. Neurobiol, 55: 1-26）の患者における、神経損傷後または未熟細胞（前駆細胞）の脳組織への移植の間の修復を促進するのに用いることができる。
【０１２１】
特定の具体例において、本発明のペプチドは、細胞間ギャップ結合チャンネルに影響を及ぼすので、白内障の治療および／または予防（D. Mackay, et al. (1999) AmJ Hum. Genet, 64 1357-1364）、角膜の栄養不足による病状における角膜の血管形成の治療および／または予防および角膜の損傷の治癒（S. G. Spanakis, et al.(1998) Invest OphthalmoLVis. Sci., 39: 1320-1328）および／または高血圧の予防に用いることができる。
【０１２２】
本発明のペプチドおよび医薬組成物は、ギャップ結合コミュニケーションの障害（異常な低下または増加）に付随する症状または病状を治療するのに用いることができることは当業者には明らかだろう。好ましくは、一またはそれ以上のペプチドあるいは一またはそれ以上のペプチドを含む医薬組成物を、治療を必要とする患者に、治療的に有効な量で投与する。本明細書で用いられる場合、「治療的に有効な量」なる用語は、所定の症状または病状の兆候を減少させる量、好ましくは、症状または病状を患っている患者の生理学的応答を正常化する量である。兆候の減少または生理学的応答の正常化は、当該分野で知られた方法を用いて測定することができ、所定の症状または病状により変化しうる。一の態様において、１またはそれ以上のペプチドまたは１またはそれ以上のペプチドを含む医薬組成物の医薬的に効果的な量は、測定可能な生理学的パラメータを、ＤＭＦなしの患者のパラメータと実質的に同じ値（好ましくは、±３０％以内、より好ましくは±２０％以内、さらにより好ましくは、±１０％以内の値）に回復する量である。
【０１２３】
実施例
本発明を、さらに、下記実施例を参照して説明するだろう。以下のものは単なる例示を目的としており、詳細の修飾は本発明の範囲内において行うことができることは明らかだろう。
【０１２４】
実施例１：ペプチド合成
好ましい一般的な方法を下記する。しかしながら、固相ペプチド合成のより詳細な記載は、Ｗ０９８／１１１２５（出典明示により本明細書に組み入れる）において見られる。
【０１２５】
ａ．一般的なペプチド合成
装置および合成法
ペプチドは、Ｎ−ａ−アミノ保護基としての９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）および側鎖の機能に適した一般的な保護基を用いて、濾過用のプリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器中で一括して合成した。
【０１２６】
溶媒
溶媒ＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Riedel de-Haen, Germany）を、強力なカチオン交換樹脂（Lewatit S 100 MB/H強酸、Bayer AG Leverkusen, Germany）を充填したカラムを通すことにより精製し、遊離アミンが存在する場合黄色（Ｄｈｂｔ−Ｏ−アニオン）を呈色する３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン（Ｄｈｂｔ−ＯＨ）を添加することにより、使用前に遊離アミンに関して試験した。溶媒ＤＣＭ（ジクロロメタン、分析用グレード、Riedelde-Haen, Germany）を精製することなく用いた。アセトニトリル（ＨＰＬＣ−グレード、Lab-Scan, Dublin Ireland）を精製することなく直接用いた。
【０１２７】
アミノ酸
Ｆｍｏｃ−保護アミノ酸は、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ（ＡＣＴ）から、適当な側鎖保護形態で購入した。別の保護アミノ酸（Ｂｏｃ−Ａｓｐ（ＯＦｍ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｄ−Ａｓｐ（ＯＦｍ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨＢｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｏｒｎ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨをＢａｃｈｅｍ（Switzerland）から；Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（ｉｖＤｄｅ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓａｒ−ＯＨをＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ（Switzerland）から得た。
【０１２８】
安息香酸およびベンジルアミン誘導体
安息香酸およびベンジルアミン誘導体は、Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、さらに精製することなく用いた。
【０１２９】
カップリング試薬
カップリング試薬ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）は、Riedelde-Haen, Germanyから、ＰｙＢｏｐは、Advanced ChemTechから購入した。
【０１３０】
リンカー
（４−ヒドロキシメチルフェノキシ）酢酸（ＨＭＰＡ）は、Novabiochem, Switzerlandから購入し；ＤＩＣの手段により生成される予備形成１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）エステルとして樹脂に結合させた。
【０１３１】
固体支持
ペプチドは、ＴｅｎｔａＧｅｌＳ樹脂０．２２〜０．３１ｍｍｏｌ／ｇ（ＴｅｎｔａＧｅｌ−Ｓ−ＮＨ２；TentaGel S-Ram, Rapp polymere, Germany）のＦｍｏｃ法に従って合成した。
【０１３２】
触媒および他の試薬
ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）は、Aldrich, Germanyから、エチレンジアミンはFlukaから、ピペリジンおよびピリジンは、Riedel-deHaen, Frankfurt, Germanyから購入した。４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）ピリジン（ＤＭＡＰ）は、Fluka, Switzerlandから、対照的な無水物が関与する結合反応において触媒といて用いた。エタンジチオールは、Riedel-deHaen, Frankfurt, Germanyから購入した。３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１，２，３−ベンゼンニトリルベンゾトリアジン（Ｄｈｂｔ−ＯＨ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）（ＨＯＡｔ）は、Fluka, Switzerlandから得た。
【０１３３】
カップリング法
第１のアミノ酸は、適当なＮ−α−保護アミノ酸から、ＤＭＦ中、対称無水物としてカップリングさせることができ、続くアミノ酸は、適当なＮ−α−保護アミノ酸およびＨＯＢｔまたはＨＯＡｔからＤＭＦ中のＤＩＣを用いて得られた系内で作製されたＨＯＢｔまたはＨＯＡｔエステルとしてカップリングさせることができた。アシル化を、試験中、Ｆｍｏｃの脱保護を妨げるために８０℃で行ったニンヒドリン試験によりチェックした（B. D. Larsen, A. Holm,Int. J Pept. Protein Res. 1994,43 1-9）
【０１３４】
Ｎ−α−アミノ保護基（Ｆｍｏｃ）の脱保護
Ｆｍｏｃ基の脱保護を、ＤＭＦ中２０％のピペリジンで処理（１×５および１×１０分）し、ついで、排出されたＤＭＦへのＤｈｂｔ−ＯＨの添加後に黄色が検出されなくなるまでＤＭＦを用いて洗浄する（それぞれ５×１５ｍｌ、５分）ことにより行った。
【０１３５】
アリル／Ａｌｏｃの脱保護
１５〜２０ｍｌのＣＨＣｌ３、ＡｃＯＨ、ＮＭＭ（３７：２：１）中に溶解した３等量のＰｄ（ＰＰｈ３）４の溶液を、ペプチド樹脂に添加した。処置を３時間室温で、混合物にＮ２流をバブリングさせながら続けた。
【０１３６】
ＨＯＢｔエステルのカップリング
３等量のＮ−α−アミノ保護アミノ酸を、３等量のＨＯＢｔおよび３等量のＤＩＣと共にＤＭＦに溶解し、ついで樹脂に添加した。
【０１３７】
予備形成された対称無水物
６等量のＮ−α−アミノ保護アミノ酸をＤＣＭに溶解し、０℃に冷却した。ＤＩＣ（３等量）を添加し、反応を１０分間続けた。溶媒を減圧下で除去し、残存物をＤＭＦに溶解した。溶液をすぐに樹脂に添加した後、０．１等量のＤＭＡＰを添加した。
【０１３８】
酸による、樹脂からのペプチドの開裂
ペプチドを、９５％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、Riedel-de Haen, Frankfurt, Germany）−水ｖ／ｖまたは９５％のＴＦＡおよび５％のエタンジオールｖ／ｖで、室温で２時間処理することにより、樹脂から開裂させた。濾過した樹脂を９５％のＴＦＡ−水で洗浄し、濾液と洗浄液を減圧下で蒸発させた。残渣をエーテルで洗浄し、酢酸−水から凍結乾燥した。粗凍結乾燥生成物を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分析し、エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＭＳ）により同定した。
【０１３９】
ＴｅｎｔａＧｅｌ樹脂上でのバッチ式ペプチド合成（ＰＥＧ−ＰＳ）
ＴｅｎｔａＧｅｌ樹脂（１ｇ、０．２２〜０．３１ｍｍｏｌ／ｇ）を、濾過のためのポリプロピレンフィルターを備え付けたポリエチレン容器に入れた。樹脂をＤＭＦ（１５ｍｌ）で膨張させ、ＤＭＦ中の２０％のピペリジン溶液で処理して、樹脂上の非プロトン化したアミノ基の存在を確実にした。樹脂を濾過し、濾過されたＤＭＦへのＤｈｂｔ−ＯＨの添加後に黄色が検出されなくなるまでＤＭＦで洗浄した。ＨＭＰＡ（３等量）を上記のように予備形成したＨＯＢｔ−エステルとしてカップリングさせ、カップリングを２４時間続けた。樹脂を濾過し、ＤＭＦで洗浄し（５×５ｍｌ、各々５分）、アシル化をニンヒドリン試験によりチェックした。第１のアミノ酸を、上記のように予備形成した対称無水物としてカップリングさせた。配列に従って以下のアミノ酸を、上記のように予め形成されたＦｍｏｃ−保護ＨＯＢｔエステル（３等量）としてカップリングさせた。特記しない限り、カップリングは２時間続けた。樹脂を、過剰の試薬を除去するために、濾過し、ＤＭＦで洗浄した（５×１５ｍｌ、各々５分）。すべてのアシル化を８０℃で行うニンヒドリン試験によりチェックした。合成が完了した後、ペプチド樹脂を、ＤＭＦ（３×１５ｍｌ、各々５分）、ＤＣＭ（３×１５ｍｌ、各々１分）および最終的にジエチルエーテル（３×１５ｍｌ、各々１分）で洗浄し、減圧下で乾燥した。
【０１４０】
分取ＨＰＬＣ条件
分取クロマトグラフィーを、ＡＦＣ２０００自動フラクションコレクター／オートサンプラーを備えたVISION Workstation（PerSeptive Biosystem）を用いて行った。ＶＩＳＩＯＮ−３ソフトウェアを、装置制御およびデータ獲得のために用いた。
【０１４１】
カラム
Kromasil（EKA Chemicals）ＫＲ１００−１０−Ｃ８  １００Å、Ｃ−８、１０；ＣＥＲ２２３０、２５０×５０．８ｍｍまたはＶＹＤＡＣ  ２１８ＴＰ１０１５５０、３００Å、Ｃ−１８、１０−１５、２５０×５０ｍｍ。用いられる緩衝系は、Ａ：ＭＱＶ中の０．１％のＴＦＡ；Ｂ：０．０８５％のＴＦＡ、１０％のＭＱＶ、９０％のＭｅＣＮを含む。流速は、３５〜４０ｍｌ／分であり、カラム温度は２５度であった。ＵＶ検出は、２１５ｎｍおよび２８０ｎｍで行った。適当な勾配は、個々のペプチドに対して最適化した。
【０１４２】
分析ＨＰＬＣ条件
勾配ＨＰＬＣ分析は、ＨＰ１１００  ４つ組みポンプ、ＨＰ１１００オートサンプラー、ＨＰ１１００カラムサーモスタットおよびＨＰ１１００多重波長検出器を含む、Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ ＨＰ１１００ＨＰＬＣ系を用いて行った。ＬＣソフトウェア（ｒｅｖ．Ａ．０６．０１）に関するHewlett Packard Chemstationを、機器制御およびデータ獲得に用いた。
【０１４３】
分析ＨＰＬＣに関して、異なるカラムを、必要に応じて、例えばＶＹＤＡＣ  ２３８ＴＰ５４１５、Ｃ−１８、５１１ｍ、３００ÅまたはＪｕｐｉｔｅｒ、ＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘＯＯＦ−４０５３−ＥＯ；５ＥｌｍＣ−１８、３００Å  １５０×４．６ｍｍを用いた。緩衝系は、Ａ：ＭＱＶ中の０．１％のＴＦＡ；Ｂ：０．０８５％のＴＦＡ、１０％のＭＱＶ、９０％のＭｅＣＮを含む。流速は、１ｍｌ／分であった。好ましいカラム温度は４０℃であった。ＵＶ検出は、２１５ｎｍで行った。上記したように、適当な勾配は、個々のペプチドに対して最適化した。
【０１４４】
質量分析
ペプチドを、超勾配メタノール（Labscan, Dublin, Ireland), Milli-Q 水 (Millipore, Bedford, MA）およびギ酸（Merck, Damstadt, Germany）（５０：５０：０．１ｖ／ｖ／ｖ）中の溶解して、１および１０μｇ／ｍｌの濃度を得た。ペプチド溶液（２０μｌ）を、ＬＣＴ質量分析計（Micromass, Manchester, UK）を用いる±０．１ｍ／ｚの精度のＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより正の極性モードで分析した。
【０１４５】
一般合成法
すべての合成において、乾燥ＴｅｎｔａＧｅｌ−Ｓ−ＮＨ２（０．２３ｍｍｏｌ／ｇ、１ｇ）を、濾過用のポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン溶液に入れ、「ＴｅｎｔａＧｅｌ樹脂でのバッチペプチド合成」に記載のように処理した。リシンおよびそのアナログ（例えば、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸、１，３ジアミノプロパン酸等）は、Ｃ末端にある場合、ｉｖＤｄｅまたは側鎖の機能のＡｌｏｃ保護のいずれかを有するＮ−αＦｍｏｃ保護誘導体としてカップリングされる（例えば、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨ）。リシンおよびそのアナログは、Ｎ末端にある場合、側鎖の機能のＦｍｏｃ保護を有するＮ−αＢｏｃ保護誘導体としてカップリングされる（例えば、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ）。アスパラギン酸、グルタミン酸およびそのアナログは、Ｃ末端にある場合、側鎖の機能のアリル保護を有するＮ−αＦｍｏｃ保護誘導体としてカップリングされる（例えば、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（Ｏアリル）−ＯＨ）。アスパラギン酸、グルタミン酸およびそのアナログは、Ｎ末端にある場合、側鎖の機能のＦｍ保護を有するＮ−αＢｏｃ保護誘導体としてカップリングされる（例えば、Ｂｏｃ−Ａｓｐ（ＯＦｍ）−ＯＨ）。上記した以外の他のアミノ酸は、Ｃ末端にある場合、側鎖の適当な保護を有するＮ−αＦｍｏｃ保護誘導体としてカップリングされ、Ｎ末端にある場合、側鎖の適当な保護を有するＮ−αＢｏｃ保護誘導体としてカップリングされる。
【０１４６】
すべての場合において、ジペプチドを合成し、ついで、リシン、アスパラ銀酸またはグルタミン酸またはそのアナログの側鎖保護基の脱保護をする。
リシンまたはそのアナログの場合、カルボン酸として機能的である疎水性基を、ＴＨＦ中のＤＩＣの手段により、系内で生成したＨＯＢｔエステルとしてカップリングする。
アスパラ銀酸およびグルタミン酸またはそのアナログの場合、アミンとして機能的である疎水性基を、トリエチルアミンにより触媒されるＤＭＦ中のＤＩＣの手段により、側鎖カルボン酸の予備生成されたＨＯＢｔエステルにカップリングする。
【０１４７】
すべてのカップリングを、少なくとも２時間続けた。アシル化を、上記した８０℃で行うニンヒドリン試験によりチェックした。合成が完了した後、ペプチド−樹脂をＤＭＦ（３×１５ｍｌ、各々１分、ＤＣＭ（３×１５ｍｌ、各々１分）、ジエチルエーテル（３×１５ｍｌ、各々１分）で洗浄し、減圧下で乾燥した。ついで、ペプチドを、上記したように樹脂から開裂させ、凍結乾燥した。
【０１４８】
上記した分取ＨＰＬＣを用いる精製の後、ペプチド生成物を回収し、ペプチドの同定を、ＥＳ−ＭＳにより行った。
上記した方法を、以下でさらに例示するすべてのペプチドおよび表１に示すペプチドの合成に用いた。代表的な合成スキームを図１Ａおよび１Ｂに示した。
【０１４９】
ｂ．個々のペプチドの合成
Ｈ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（４−ニトロベンゾイル）−ＯＨ（化合物１）の合成
リシンをＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（ｉｖＤｄｅ）ＯＨとして、Ｎ末端グリシンをＢｏｃ誘導体としてカップリングさせた。ｉｖＤｄｅ保護基を上記のように除去した。リシンおよびグリシンを最初に固体支持体上で合成した。ついで、ｉｖＤｄｄｅ基を除去し、続いて、４−ニトロ安息香酸を、ＴＨＦ中のＤＩＣを用いることにより系内で生成したＨＯＢｔエステルとしてカップリングした。上記したように分取ＨＰＬＣを用いて精製した後、３５ｍｇのペプチド生成物を９９％を超える純度で回収した。ペプチドの同定をＥＳ−ＭＳにより行った（実測値ＭＨ＋３５２．２８、計算値ＭＨ＋３５２．２１）。
【０１５０】
Ｈ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（４−シアノベンゾイル）−ＯＨ（化合物３）の合成
リシンをＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（ｉｖＤｄｅ）ＯＨとして、Ｎ末端グリシンをＢｏｃ誘導体としてカップリングさせた。ｉｖＤｄｅ保護基を上記のように除去した。リシンおよびグリシンを、最初に固体支持体上で合成した。ｉｖＤｄｄｅ基を除去し、続いて、４−シアノ安息香酸を、ＤＭＦ中のＤＩＣを用いて、系内で生成したＨＯＢｔエステルとしてカップリングさせた。上記した分取ＨＰＬＣを用いて精製した後、６ｍｇのペプチド生成物を、９０％を超える純度で回収した。ペプチドの同定をＥＳ−ＭＳにより行った（実測値Ｍ＋３３２．２５、計算値ＭＨ＋３３２．２１）．
【０１５１】
Ｈ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（４−メトキシベンゾイル）−ＯＨ（化合物４）の合成
リシンをＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（ｉｖＤｄｅ）ＯＨとして、Ｎ末端グリシンをＢｏｃ誘導体としてカップリングさせた。ｉｖＤｄｅ保護基を上記のように除去した。リシンおよびグリシンを、最初に固体支持体上で合成した。ｉｖＤｄｄｅ基を除去し、続いて、４−メトキシ安息香酸を、ＤＭＦ中のＤＩＣを用いて、系内で生成したＨＯＢｔエステルとしてカップリングさせた。上記した分取ＨＰＬＣを用いて精製した後、７ｍｇのペプチド生成物を、９５％を超える純度で回収した。ペプチドの同定をＥＳ−ＭＳにより行った（実測値Ｍ＋３３７．２８、計算値ＭＨ＋３３７．２１）。
【０１５２】
Ｈ−Ｌｙｓ（４−ニトロベンゾイル）−Ｇｌｙ−ＯＨ（化合物７）の合成
グリシンをＦｍｏｃ−グリシンとしてカップリングさせ、Ｎ末端リシンをＢｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）ＯＨとしてカップリングさせた。グリシンおよびリシンを、最初に固体支持体上で合成した。リシンの側鎖のＦｍｏｃを除去し、続いて、４−ニトロ安息香酸を、ＤＭＦ中のＤＩＣを用いて、系内で生成したＨＯＢｔエステルとしてカップリングさせた。上記した分取ＨＰＬＣを用いて精製した後、６４ｍｇのペプチド生成物を、９８％を超える純度で回収した。ペプチドの同定をＥＳ−ＭＳにより行った（実測値Ｍ＋３５２．１９、計算値ＭＨ＋３５２．２４）．
【０１５３】
Ｈ−Ｄ−Ｌｙｓ（４−メトキシベンゾイル）−Ｇｌｙ−ＯＨ（化合物２１）の合成
グリシンをＦｍｏｃ−グリシンとしてカップリングさせ、Ｎ末端リシンをＢｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）ＯＨとしてカップリングさせた。グリシンおよびリシンを、最初に固体支持体上で合成した。リシンの側鎖のＦｍｏｃを除去し、続いて、ＤＭＦ中のＤＩＣを用いて、４−メトキシ安息香酸を、ＤＭＦ中のＤＩＣを用いて、系内で生成したＨＯＢｔエステルとしてカップリングさせた。上記した分取ＨＰＬＣを用いて精製した後、３１ｍｇのペプチド生成物を、９７％を超える純度で回収した。ペプチドの同定をＥＳ−ＭＳにより行った（実測値ＭＨ＋３３７．２４、計算値ＭＨ＋３３７．２１）。
【０１５４】
Ｈ−Ｄ−Ｌｙｓ（４−ニトロベンゾイル）−Ｇｌｙ−ＯＨ（化合物２２）の合成
グリシンを、Ｆｍｏｃ−グリシンとしてカップリングし、Ｎ末端リシンを、Ｂｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）ＯＨとしてカップリングした。グリシンおよびリシンを、最初に固体支持体上で合成した。リシンの側鎖のＦｍｏｃを除去し、続いて、４−ニトロ安息香酸を、ＤＭＦ中のＤＩＣを用いて、系内で生成したＨＯＢｔエステルとしてカップリングした。上記した分取ＨＰＬＣを用いて精製した後、６５ｍｇのペプチド生成物を、９８％を超える純度で回収した。ペプチドの同定をＥＳ−ＭＳにより行った（実測値Ｍ＋３５２．２７、計算値ＭＨ＋３５２．２４）。
【０１５５】
Ｈ−Ｄ−Ｌｙｓ（ベンゾイル）−Ｇｌｙ−ＯＨ（化合物２３）の合成
グリシンをＦｍｏｃ−グリシンとしてカップリングさせ、Ｎ末端リシンをＢｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）ＯＨとしてカップリングさせた。グリシンおよびリシンを、最初に固体支持体上で合成した。リシンの側鎖のＦｍｏｃを除去し、続いて、安息香酸を、ＤＭＦ中のＤＩＣを用いて、系内で生成したＨＯＢｔエステルとしてカップリングした。上記した分取ＨＰＬＣを用いて精製した後、３１ｍｇのペプチド生成物を、９６％を超える純度で回収した。ペプチドの同定をＥＳ−ＭＳにより行った（実測値Ｍ＋３０７．２２、計算値ＭＨ＋３０７．２４）。
【０１５６】
Ｈ−Ｄ−Ｌｙｓ（４−ｔ−ブチルベンゾイル）−Ｇｌｙ−ＯＨ（化合物５４）の合成
グリシンを、Ｆｍｏｃ−グリシンとして、Ｎ末端リシンをＢｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）ＯＨとしてカップリングさせた。グリシンおよびリシンを、最初に固体支持体上で合成した。リシンの側鎖のＦｍｏｃを除去し、続いて、４−ｔ−ブチル安息香酸を、ＤＭＦ中のＤＩＣを用いて、系内で生成したＨＯＢｔエステルとしてカップリングさせた。上記した分取ＨＰＬＣを用いて精製した後、３４ｍｇのペプチド生成物を、９７％を超える純度で回収した。ペプチドの同定をＥＳ−ＭＳにより行った。（実測値Ｍ＋３６３．２７、計算値ＭＨ＋３６３．２２）。
【０１５７】
Ｈ−Ａｓｎ（ＮＨ（４−メトキシベンジル））−Ｄ−アラニン−ＯＨ（化合物８０）の合成
アラニンをＦｍｏｃ−Ｄ−アラニンとしてカップリングさせ、Ｎ末端アスパラギンをＢｏｃ−Ａｓｐ（ＯＦｍ）ＯＨとしてカップリングさせた。アラニンおよびアスパラギン酸を、最初に固体支持体上で合成した。アスパラギン酸の側鎖のＦｍを除去し、続いて、４−メトキシベンジルアミンを、トリエチルアミンを触媒として、ＤＭＦ中のＤＩＣを用いて、側鎖カルボン酸の予備生成ＨＯＢｔエステルにカップリングさせた。上記した分取ＨＰＬＣを用いて精製した後、１７ｍｇのペプチド生成物を、９８％を超える純度で回収した。ペプチドの同定をＥＳ−ＭＳにより行った（実測値Ｍ＋３２３．１７、計算値ＭＨ＋３２３．１５）。
【０１５８】
Ｈ−Ｄ−Ａｓｎ（ＮＨ（４−メトキシベンジル））−アラニン−ＯＨ（化合物９５）の合成
アラニンをＦｍｏｃ−アラニンとしてカップリングさせ、Ｎ末端アスパラギンをＢｏｃ−Ｄ−Ａｓｐ（ＯＦｍ）ＯＨとしてカップリングさせた。アラニンおよびアスパラギン酸を、最初に固体支持体上で合成した。アスパラギン酸の側鎖のＦｍを除去し、続いて、４−メトキシベンジルアミンを、トリエチルアミンを触媒として、ＤＭＦ中のＤＩＣを用いて、側鎖カルボン酸の予備生成ＨＯＢｔエステルとしてカップリングさせた。上記した分取ＨＰＬＣを用いて精製した後、２５ｍｇのペプチド生成物を、９８％を超える純度で回収した。ペプチドの同定をＥＳ−ＭＳにより行った（実測値Ｍ＋３２３．１２、計算値ＭＨ＋３２３．１５）。
【０１５９】
Ｈ−Ｄ−Ａｓｎ（ＮＨ（４−ニトロベンジル））−アラニン−ＯＨ（化合物９６）の合成
アラニンを、Ｆｍｏｃ−アラニンとして、Ｎ末端アスパラギンをＢｏｃ−Ｄ−Ａｓｐ（ＯＦｍ）ＯＨとしてカップリングした。アラニンおよびアスパラギン酸を、最初に固体支持体上で合成した。アスパラギン酸の側鎖のＦｍを除去し、続いて、４−ニトロベンジルアミンを、トリエチルアミンを触媒として、側鎖カルボン酸の予備生成ＨＯＢｔエステルにカップリングさせた。上記した分取ＨＰＬＣを用いて精製した後、１０２ｍｇのペプチド生成物を、９９％を超える純度で回収した。ペプチドの同定をＥＳ−ＭＳにより行った（実測値Ｍ＋３３８．１４、計算値ＭＨ＋３３８．１２）。
【０１６０】
実施例２
生物学的利用能
物質および方法
薬物動態スクリーニングおよび食物相互作用の研究
化学物質および物質
これらの実験に用いられる水は、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水第２の処理系と組み合わせた逆浸透系（Millipore, Bedford, MA, USA）から得られる高純度のものであった。メタノールLabscan Ltd.（Dublin, Ireland）から得た高等級のものである。ギ酸（９８〜１００％）をMerck（Darmstadt, Germany)から得た。ヘプタフルオロブタン酸のＨＰＬＣグレードは、Pierce（Rockford,III, USA）から得た。ラット（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）からのＥＤＴＡ安定化血漿は、Harlan Sera Lab Ltd.（Loughborough, UK）から得た。血液試料は、BD Vacutainer Systems（Plymouth, UK）からのカリウムＥＤＴＡでコートされたマイクロテイナーに回収した。限外濾過による試料精製は、Millipore（Bedford, MA, USA）から得られる３０００未満の分子量を取り除くＭｉｃｒｏｃｏｎ遠心分離濾過装置を用いて行った。
【０１６１】
装置
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析は、Micromass（Manchester, UK）のQuattro Ultima質量分析器と組み合わせたWaters Alliance 2790 ＨＰＬＣ装置で行った。ＬＣおよびＭＳは、両方とも、ＭａｓｓＬｙｎｘ３．５ソフトウェアにより制御した。ＭＳ／ＭＳ検出前のＬＣ分離を、ＸＴｅｒｒａＭＳＣ１８（２．０×５０ｍｍ）、３．５μｍの粒度（Waters, Milord, MA, USA）で行った。
【０１６２】
動物
１２匹の雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（約３５０ｇ）を、M & B（Denmark）から得、Ｈｙｐｎｏｒｍ（登録商標）−Ｄｏｒｍｉｃｕｍｅ（登録商標）麻酔の間にカテーテルを大腿静脈および動脈に挿入した。手術後、ラットを５日間回復させ、ついで、薬剤投与を開始した。
【０１６３】
薬剤および投与レベル
ジペプチド（化合物２２、化合物２１、化合物２３、化合物９６、化合物９５および化合物５４）を、ＴＦＡ塩として得、ＰＢＳ（２．６ｍＭのＫＣｌ、１３７ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＫＨ２ＰＯ４および８．２ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４（ｐＨ＝７．４に調節））に溶解して、５００μＭの濃度を得た。投与容量は、５００ｎｍｏｌ／ｋｇの投与量に対して１ｍＬ／ｋｇであった。各々の実験の後、投与溶液を水中の０．５％のギ酸で希釈し、薬剤物質の含有量をＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより分析した。投与溶液中の薬剤物質の濃度を、１〜１０００ｎＭの範囲の基準の応答から計算した。
【０１６４】
研究設計
薬剤物質を、交差研究において、２の動物に、静脈内および経口ボーラスとして投与した。経口投与は、薬剤投与の１７時間前絶食したラットに投与した。動物を薬剤投与の間４８時間休憩させた。最初の実験の後、ラットに、ヘパイン処理した血液を輸血した。
【０１６５】
薬剤投与の前に（５分）、ラットに、５００ＩＵヘパインを静脈内ボーラスとして投与し、対照血液試料を回収した。薬剤を投与した後、約２５０μＬの血液試料を、大腿動脈から以下の時点：投与前（Ｂ．Ｄ．）、静脈内投与後５、１５、３０、６０、１２０、１８０および２４０分およびＢ．Ｄ．、経口投与後１０、３０、５０、８０、１２０、１８０、２４０、および３００分で回収した。血液試料を、５分間、１０，０００ｘｇ（４℃）で遠心分離するまで氷で貯蔵し、血漿（１００μＬ）を、１．５ｍＬのポリプロピレンチューブに移し、試料調製およびＬＣ／ＭＳ／ＭＳするまで−２０℃で貯蔵した。
【０１６６】
試料調製およびＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析
血漿試料を氷上で解凍し、１００μＬの血漿を１００μＬの１％（ｖ／ｖ）のギ酸と混合し、ｍｉｃｒｏｃｏｎＹＭ−３濾過ユニットに移した。ついで、試料を１時間８，３００ｘｇ室温にて遠心分離に付した。濾液を、３００μＬのオートサンプラー容器に回収し、ＬＣカラムへの注入（４０μＬ）まで４℃で貯蔵した。クロマトグラフィーを、１００％の緩衝液Ａ（水中０．１％のギ酸）から１００％の緩衝液Ｂ（アセトニトリル中の０．１％のギ酸）の４分間の直線勾配を用いて５０℃で行い、ついで、緩衝液Ｂで３分間洗浄し、最終的に、緩衝液Ａを用いて７分間再平衡化した。薬剤物質の検出を、衝突ガスとしてアルゴンを用いるＭＳ／ＭＳで行った（１．３×１０−３ｍｂａｒ）。試験した化合物の各々に対する特定のＭＳ／ＭＳ設定を表２に与える。
【０１６７】
【表６】
0004603364.tif 000011
【０１６８】
データ分析
薬剤物質の血漿濃度を、上記したように試験した血漿から得られた外部較正曲線に対する面積から計算した。較正曲線は、ｌｏｇ（ピーク面積）対ｌｏｇ（濃度）の直線回帰により得た。較正曲線は、０．１〜１００ｎＭの範囲の濃度を対象とした。
【０１６９】
個々の動物からの血漿濃度対時間データを、非コンパートメント分析を用いるＷｉｎＮｏｎＬｉｎ ３．５（Pharsight, Mountain View, CA, USA）の薬物動力学モデリングに用い、血漿濃度曲線下の面積の値（ＡＵＣ）を記録した。経口生物学的利用能Ｆｐｏを、静脈内と経口投与後の投与量（Ｄ）標準化ＡＵＣの比の％として計算した：ＡＵＣｐｏ＊Ｄｊｖ／ＡＵＣｊｖ＊Ｄｐｏ。
【０１７０】
結果
６つの化合物の経口生物学的利用能を試験し、すべての化合物は、経口投与後に検出された。計算した生物学的利用能を表３にまとめた。化合物２２、２３、９６および９５の生物学的利用能は中程度（１０〜３１％）であり、化合物５４および２１の生物学的利用能は低かった（２〜８％）。
【０１７１】
【表７】
0004603364.tif 000012
【０１７２】
結論
発明のペプチドは、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおいて２〜３１％の利用能の範囲を有する経口利用能を示した。
【０１７３】
実施例３
骨芽細胞活性（ＡＬＰアッセイ）
物質および方法
ヒト一次骨芽細胞を、ボランティアのドナーの後腸骨棘の骨髄穿刺から得た。細胞を６週間の培養に用いた。細胞を、２４ウェルプレートで、８日間のプロセスで培養し、１×１０−１３〜１×１０−６の濃度の試験化合物で、少なくとも４日間の実験の間刺激した。細胞溶解物を、ＡＬＰ活性の測定用に回収した。１０〜１５人のドナーのｈＯＢ細胞を実験に用いた。ＡＬＰ測定に関しては、市販されているキット（アルカリホスファターゼキット、Sigma-Aldrich Denmark A/S）を用いた。すべての測定は、業者の指示に従って行った。
【０１７４】
分析
ＡＬＰを、実験の最終時点で回収した細胞溶解物で測定した。測定値をビヒクル処理対照培養物と比較した。
【０１７５】
データ分析
データを、平均偏差および標準偏差として、ならびに要すれば百分率として示した。Ｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡを、０．０５の有意レベルを用いるｐｏｓｔ−ｈｏｃ比較に関して、ＦｉｓｈｅｒのＬＳＤ試験を用いて行った。
【０１７６】
結果
【表８】
0004603364.tif 000013
【０１７７】
結論
本発明のペプチドは、アルカリホスファターゼの増加により測定されるように、一次培養物中のヒト骨芽細胞の活性を増加させた。
【０１７８】
実施例４
標準的なカルシウム誘発不整脈アッセイ
ジペプチドの抗不整脈効果を、Lynch etal. [6]のモデルに従って、カルシウム誘発不整脈のモデルで測定した。雄のＮＭＲＩマウス（２５〜３０ｇ；Bomholdtgaard,Ll. Skendsved, Denmark）を、神経遮断麻酔の組み合わせ（Ｈｙｐｎｏｒｍｏ（登録商標））（クエン酸フェンタニル０．３１５ｍｇ／ｍｌおよびフアニソン（ｆｕａｎｉｓｏｎｅ）１０ｍｇ／ｍｌ）＋ミダゾラム（５ｍｇ／ｍｌ））で麻酔した。Ｈｙｐｎｏｒｍ（登録商標）およびミダゾラムの市販の溶液を、希釈水中に１：１に希釈し、一部の希釈したＨｙｐｎｏｒｍｏ（登録商標）を、一部の希釈したミダゾラムと混合した。麻酔は、この溶液を５０〜７５μｌ／１０グラムマウスの投与量で皮下投与することにより誘発した。
【０１７９】
静脈内カニューレを、尾の静脈に挿入した。リード１１ＥＣＧシグナルを、右の前肢および左の後肢にステンレススチールＥＣＧ電極を配置することにより連続して記録した。接地電極を右の後肢に配置した。シグナルを増幅し（×５，０００−１０，０００）、Hugo Sachs Electronic model 689 ECGモジュールによりフィルターした（０．１〜１５０Ｈｚ）。アナログシグナルを１２ビットデータ獲得ボード（データ翻訳モデルＤＴ３２１）によりデジタル化し、Windows NTのNotocord HEM 3.1ソフトウェアを用いて１０００Ｈｚでサンプリングした。１０分の平衡期間後、薬物の試験試料を尾の静脈に注入し、ＣａＣｌ２静脈内注入（３０ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｌ／分、約１００ｍｇ／ｋｇ／分）の後３分で、（カルシウムクロライド−２−ヒドラット、Riedel-de Haen, Germany）の注入を開始した。
【０１８０】
ビヒクル（０．１％のウシアルブミンを有するリン酸塩緩衝化セイライン）で前処理したマウスを、未処理の動物の対照レベルの測定値として全ての日に試験した。すべての実験において、注入量は１００μｌであった。不整脈の開始に対するタイムラグ（ｔａｒｒ）を、ＣａＣｌ２注入の開始から、第２のＡＶブロック（付随するＱＲＳコンプレックスを伴わないＰ波により特徴付けられるＡＶ伝導の断続的な不全として定義する）の最初の不整脈減少が起こるまでの時間として測定した。
【０１８１】
結果
試験した化合物の％応答を表５に与える。所定の応答を、（ｔａｒｒ（試験化合物）−ｔａｒｒ（ビヒクル））×１００／ｔａｒｒ（ビヒクル）に従って評価する。
【０１８２】
【表９】
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【０１８３】
結論
本発明のペプチドは、抗不整脈効果および非抗不整脈効果の両方を示した。
【０１８４】
定義
特記しない限り、以下の定義は、記載において用いられる特定の用語を提供する。
【０１８５】
発明の詳細な説明および特許請求の範囲を通じて、天然アミノ酸の３文字コード、ならびに他のα−アミノ酸に関して一般に許容されている３文字のコード、例えばサルコシン（Ｓａｒ）を用いる。ＬまたはＤ型が特定されていない場合、問題のアミノ酸はＬまたはＤ型でありうることは理解されよう。
【０１８６】
「ハロゲン」なる用語は、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩを意味し、ＦおよびＩが好ましい。
「アルキル」なる用語は、いずれかの炭素原子から一の水素原子が脱離することによりアルカンから誘導される一価の基を意味する：ＣｎＨ２ｎ＋１−。非分枝アルカンの末端炭素原子から一の水素原子が脱離することによる基は、ノーマルアルキル（ｎ−アルキル）基のサブクラスを形成する：Ｈ［ＣＨ２］ｎ−。ＲＣＨ２−、Ｒ２ＣＨ−（ＲはＨではない）およびＲ３Ｃ−（ＲはＨではない）基は、それぞれ、一級、二級および三級アルキル基を意味する。Ｃ（１−２２）アルキルは、１〜２２個の炭素原子を有するアルキル基を意味し、Ｃ（１−６）アルキル、例えば、メチル、エチル、プロピル、ｉｓｏ−プロピル、ブチル、ペンチルおよびヘキシルならびにその可能性ある異性体を含む。
【０１８７】
「低級アルキル」なる用語は、約６個未満の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖アルキルを意味し、好ましくは、メチル、エチル、プロピルまたはブチルである。
【０１８８】
「アルケニル」なる用語は、１つまたはそれ以上の炭素−炭素二重結合を含有する直鎖または分枝鎖または環状炭化水素基を意味する。Ｃ（２−２２）アルケニルは、１〜２２個の炭素原子を有するいずれのアルケニル基を意味し、Ｃ（２−６）アルケニル、ビニル、アリル、１−ブテニルを含む。
【０１８９】
「アラルキル」なる用語は、アリールＣ（１−２２）アルキルを意味し、「アリール」なる用語は、本明細書にわたって、フェニルまたはナフチルを意味する。
【０１９０】
「疎水性基」なる用語は、置換されていてもよい芳香族炭素環、好ましくは、６または１２員の芳香族炭素環を意味する。「置換されていてもよい」なる用語は、それらのセレノおよびチオ誘導体を含む、少なくとも１つの低級アルキル、アルコキシ、ヒドロキシル、カルボキシ、アミン、チオール、ヒドラジド、アミド、ハライド、ヒドロキシル、エーテル、アミン、ニトリル、イミン、ニトロ、スルフィド、スルホキシド、スルホン、チオール、アルデヒド、ケト、カルボキシ、エステル、アミド基を有する６または１２員の芳香族炭素環を意味する。また、「置換されていてもよい」なる定義は、セレノ基を有するか、あまたは有していないスルフィド、スルホキシド、スルホンおよびチオール誘導体を含む。芳香族炭素環が置換されている具体例において、かかる置換は、典型的には、約１０置換、より好ましくは、約１〜５置換であり、約１または２置換が多くの本発明に対して好ましい。好ましいアルコキシ基は、メトキシ、エトキシおよびプロポキシを含む。具体的な疎水性基は、非置換ベンジル、フェニルおよびナフチルを含む。
【０１９１】
「水素結合基」なる用語は、（非共有結合）水素結合のドナーまたはアクセプターを意味する。水素結合基がドナーである具体例において、典型的には、これは少なくとも１つの水素原子に結合した電気陰性原子を含むだろう。かかる電気陰性原子の例としては、限定するものではないが、窒素、酸素、ハロゲン（例えば、Ｃｌ、Ｆ、Ｂｒ等）および硫黄が挙げられる。代表的な水素結合ドナーは、ヒドロキシル、アミン、チオール、ヒドラジドおよびアミドが挙げられる。第一の水素結合基がアクセプターである具体例において、好ましくは、これは、非結合電子対を含む原子である、少なくとも１つの上記したような電気陰性原子を含む。かかる電子対は、「ローンペア」と称される。好ましい水素結合アクセプターの例としては、限定するものではないが、ヒドロキシル、エーテル、アミン、ニトリル、イミン、ニトロ、アルデヒド、ケト、カルボキシ、エステル、アミド基；およびそのセレノ誘導体が挙げられる。また、そのセレノ誘導体を含む、適当なスルフィド、スルホキシド、スルホンおよびチオール水素結合アクセプターも想定される。
【０１９２】
「細胞間コミュニケーションモジュレーター」、「ギャップ結合促進物質」、「ギャップ結合コミュニケーションを促進する化合物」および「ギャップ結合オープナー」等は、すべて、この作用の背景にある特定の機構に関係なく、ＧＪＩＣを促進または維持または正常化する化合物を意味する。より特別には、「ギャップ結合オープナー」なる用語は、細胞外および細胞内の種の間のギャップ結合を通り抜けることができる分子の交換を正常化する（例えば増加させる）および／または増加したＧＪＩＣを正常化することができる物質を意味する。
【０１９３】
「アゴニスト」なる用語は、例えば、限定するものではないが、ＡＡＰ、ＡＡＰ１０、ＨＰ５ペプチドまたはその機能的なアナログの標的である、組織、細胞または細胞分画に作用して、組織、細胞または細胞分画において、ＡＡＰ、ＡＡＰ１０、ＨＰ５ペプチドまたはその機能的なアナログと、実質的にまたは少なくとも実質的に同じ生物学的応答を生じるペプチドを意味する。一の態様において、生物学的応答は、一またはそれ以上の：収縮、弛緩、分泌および酵素活性である。好ましくは、ペプチドは、組織、細胞または細胞分画に結合する。一の態様において、ペプチドは、ＡＡＰ、ＡＡＰ１０、ＨＰ５またはその機能的なアナログに結合する組織、細胞または細胞分画の受容体に結合する。
【０１９４】
しかしながら、「アゴニスト」の存在は、所定のペプチドの標的である組織、細胞または細胞分画と相互作用し、同じまたは少なくとも実質的に同じ生物学的応答を生じる。
【０１９５】
本明細書で用いられる場合、「抗不整脈ペプチドアゴニスト」なる用語は、ＡＡＰ、ＡＡＰ１０、ＨＰ５ペプチドまたはその機能的アナログの抗不整脈活性と実質的に同じまたはそれ以上の活性を有する、抗不整脈活性を含むペプチドおｗ意味する。「それ以上」は、ＡＡＰ、ＡＡＰ１０、ＨＰ５ペプチドまたはその機能的アナログの抗不整脈活性と比較して、低濃度のペプチドでまたは短時間で観察される抗不整脈活性を意味する。
【０１９６】
「アンタゴニスト」なる用語は、所定のペプチド、例えばＡＡＰ、ＡＡＰ１０、ＨＰ５ペプチドまたはその機能的なアナログと接触した組織、細胞、または細胞分画後に、組織、細胞または細胞分画において観察される一またはそれ以上の生物学的応答を阻害またはそれに拮抗するペプチドを意味する。一の態様において、生物学的応答は、一またはそれ以上の：収縮、弛緩、分泌および酵素活性である。好ましくは、ペプチドは、組織、細胞または細胞分画に結合する。一の態様において、ペプチドは、ＡＡＰ、ＡＡＰ１０、ＨＰ５またはその機能的なアナログに結合するおよび／または一またはそれ以上のＡＡＰ、ＡＡＰ１０、ＨＰ５、その機能的なアナログの受容体への結合を阻害する、組織、細胞または細胞分画の受容体に結合する。
【０１９７】
本明細書で用いられる場合、「正常化」なる用語は、応答を正常な患者において観察されるものと有意に異ならないものにする生理学的応答の変化を意味する。かくして、正常化は、関与する病状に応じて、増加または減少を含みうる。
【０１９８】
約約１０−６Ｍ未満のＥＣ５０、好ましくは１０−８Ｍ未満である。
【０１９９】
本明細書で用いられる場合、「経口利用能」なる用語は、経口投与した薬剤が血流に吸収される速度および範囲を意味する。
【０２００】
本明細書で用いられる略語を下記する。
【表１０】
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【０２０１】
本明細書に示されたすべての引用文献は出典明示により本明細書に組み入れる。
本明細書に記載されているものの変法、修飾および他の実施は、本発明および請求の範囲の精神および範囲から逸脱することなく、当業者は気付くだろう。
【図面の簡単な説明】
【０２０２】
（原文に記載なし）
【図１ａ】
0004603364.tif 000019
【図１ｂ】
0004603364.tif 000020
【図２】
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