(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者におけるパクリタキセル療法による顆粒球減少症の発症のリスクを予測する方法であって、前記被験者から単離された遺伝子について、ＢＵＢ１ｂ遺伝子中の配列番号６で規定される配列の１１番目の塩基における遺伝子多型、ＢＵＢ１ｂ遺伝子中の配列番号７で規定される配列の１１番目の塩基における遺伝子多型、ＢＵＢ１ｂ遺伝子中の配列番号８で規定される配列の１１番目の塩基における遺伝子多型、ＢＵＢ１ｂ遺伝子中の配列番号９で規定される配列の１１番目の塩基における遺伝子多型、およびＢＵＢ１ｂ遺伝子中の配列番号１０で規定される配列の１１番目の塩基における遺伝子多型からなる群より選択される１またはそれ以上の遺伝子多型を同定する工程を含む方法。
【請求項２】
被験者から単離された遺伝子が、以下の（Ａ）〜（Ｅ）：
（Ａ）ＢＵＢ１ｂ遺伝子中の配列番号６で規定される配列の１１番目の塩基におけるジェノタイプがＡ／Ａである；
（Ｂ）ＢＵＢ１ｂ遺伝子中の配列番号７で規定される配列の１１番目の塩基におけるジェノタイプがＴ／Ｔである；
（Ｃ）ＢＵＢ１ｂ遺伝子中の配列番号８で規定される配列の１１番目の塩基におけるジェノタイプがＣ／Ｃである；
（Ｄ）ＢＵＢ１ｂ遺伝子中の配列番号９で規定される配列の１１番目の塩基におけるジェノタイプがＣ／Ｃである；
（Ｅ）ＢＵＢ１ｂ遺伝子中の配列番号１０で規定される配列の１１番目の塩基におけるジェノタイプがＴ／Ｔである；
のうち１またはそれ以上である場合に、顆粒球減少症の発症のリスクが高いと予測する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
被験者から単離された遺伝子が、以下の（Ｆ）〜（Ｊ）：
（Ｆ）ＢＵＢ１ｂ遺伝子中の配列番号６で規定される配列の１１番目の塩基におけるジェノタイプがＡ／ＧまたはＧ／Ｇである；
（Ｇ）ＢＵＢ１ｂ遺伝子中の配列番号７で規定される配列の１１番目の塩基におけるジェノタイプがＧ／ＴまたはＧ／Ｇである；
（Ｈ）ＢＵＢ１ｂ遺伝子中の配列番号８で規定される配列の１１番目の塩基におけるジェノタイプがＣ／ＴまたはＴ／Ｔである；
（Ｉ）ＢＵＢ１ｂ遺伝子中の配列番号９で規定される配列の１１番目の塩基におけるジェノタイプがＣ／ＴまたはＴ／Ｔである；
（Ｊ）ＢＵＢ１ｂ遺伝子中の配列番号１０で規定される配列の１１番目の塩基におけるジェノタイプがＣ／ＴまたはＣ／Ｃである；
のうち１またはそれ以上である場合に、顆粒球減少症の発症のリスクが低いと予測する、請求項１記載の方法。
【請求項４】
さらに、前記被験者から単離された遺伝子について、ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子中の配列番号１で規定される配列の１１番目の塩基における遺伝子多型、ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子中の配列番号２で規定される配列の１１番目の塩基における遺伝子多型、ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子中の配列番号３で規定される配列の１１番目の塩基における遺伝子多型、ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子中の配列番号４で規定される配列の１１番目の塩基における遺伝子多型、ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子中の配列番号５で規定される配列の１１番目の塩基における遺伝子多型からなる群より選択される１またはそれ以上の遺伝子多型を同定する工程を含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
被験者におけるパクリタキセル療法による顆粒球減少症の発症のリスクを予測する方法であって、前記被験者から単離された遺伝子について、ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子中の配列番号４で規定される配列の１１番目の塩基およびＢＵＢ１ｂ遺伝子中の配列番号６で規定される配列の１１番目の塩基における遺伝子多型を同定することを含む請求項４記載の方法。
【請求項６】
ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子中の配列番号４で規定される配列の１１番目の塩基におけるジェノタイプがＴ／Ｔであり、かつＢＵＢ１ｂ遺伝子中の配列番号６で規定される配列の１１番目の塩基におけるジェノタイプがＡ／ＡまたはＧ／Ｇであるときに、顆粒球減少症の発症のリスクが高いと予測する、請求項５記載の方法。
【請求項７】
ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子中の配列番号４で規定される配列の１１番目の塩基におけるジェノタイプがＡ／ＴまたはＡ／Ａであり、かつＢＵＢ１ｂ遺伝子中の配列番号６で規定される配列の１１番目の塩基におけるジェノタイプがＡ／Ｇであるときに、顆粒球減少症の発症のリスクが低いと予測する、請求項５記載の方法。
【請求項８】
被験者におけるパクリタキセル療法による顆粒球減少症の発症のリスクを予測するための診断用キットであって、前記被験者から単離された遺伝子について、ＢＵＢ１ｂ遺伝子中の配列番号６で規定される配列の１１番目の塩基における遺伝子多型、ＢＵＢ１ｂ遺伝子中の配列番号７で規定される配列の１１番目の塩基における遺伝子多型、ＢＵＢ１ｂ遺伝子中の配列番号８で規定される配列の１１番目の塩基における遺伝子多型、ＢＵＢ１ｂ遺伝子中の配列番号９で規定される配列の１１番目の塩基における遺伝子多型、およびＢＵＢ１ｂ遺伝子中の配列番号１０で規定される配列の１１番目の塩基における遺伝子多型からなる群より選択される１またはそれ以上の遺伝子多型を同定するための試薬を含有することを特徴とするキット。
【請求項９】
さらに、ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子中の配列番号１で規定される配列の１１番目の塩基における遺伝子多型、ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子中の配列番号２で規定される配列の１１番目の塩基における遺伝子多型、ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子中の配列番号３で規定される配列の１１番目の塩基における遺伝子多型、ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子中の配列番号４で規定される配列の１１番目の塩基における遺伝子多型、およびＣＹＰ２Ｃ８遺伝子中の配列番号５で規定される配列の１１番目の塩基における遺伝子多型からなる群より選択される１またはそれ以上の遺伝子多型を同定するための試薬を含有する、請求項８記載のキット。
【請求項１０】
前記試薬が、
ＢＵＢ１ｂ遺伝子中の配列番号６で規定される配列の１１番目の塩基を含む領域に対応するＤＮＡを増幅するよう設計されたＰＣＲプライマー対；
ＢＵＢ１ｂ遺伝子中の配列番号７で規定される配列の１１番目の塩基を含む領域に対応するＤＮＡを増幅するよう設計されたＰＣＲプライマー対；
ＢＵＢ１ｂ遺伝子中の配列番号８で規定される配列の１１番目の塩基を含む領域に対応するＤＮＡを増幅するよう設計されたＰＣＲプライマー対；
ＢＵＢ１ｂ遺伝子中の配列番号９で規定される配列の１１番目の塩基を含む領域に対応するＤＮＡを増幅するよう設計されたＰＣＲプライマー対；
ＢＵＢ１ｂ遺伝子中の配列番号１０で規定される配列の１１番目の塩基を含む領域に対応するＤＮＡを増幅するよう設計されたＰＣＲプライマー対；
からなる群より選択される１またはそれ以上のプライマー対である、請求項９記載の診断用キット。
【請求項１１】
さらに、ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子中の配列番号１で規定される配列の１１番目の塩基を含む領域に対応するＤＮＡを増幅するよう設計されたＰＣＲプライマー対；ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子中の配列番号２で規定される配列の１１番目の塩基を含む領域に対応するＤＮＡを増幅するよう設計されたＰＣＲプライマー対；ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子中の配列番号３で規定される配列の１１番目の塩基を含む領域に対応するＤＮＡを増幅するよう設計されたＰＣＲプライマー対；ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子中の配列番号４で規定される配列の１１番目の塩基を含む領域に対応するＤＮＡを増幅するよう設計されたＰＣＲプライマー対；および、ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子中の配列番号５で規定される配列の１１番目の塩基を含む領域に対応するＤＮＡを増幅するよう設計されたＰＣＲプライマー対；からなる群より選択される１またはそれ以上のプライマー対を含む、請求項１０記載の診断用キット。
【請求項１２】
前記試薬が、
ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子中の配列番号４で規定される配列の１１番目の塩基を含む領域に対応するＤＮＡを増幅するよう設計されたＰＣＲプライマー対；および
ＢＵＢ１ｂ遺伝子中の配列番号６で規定される配列の１１番目の塩基を含む領域に対応するＤＮＡを増幅するよう設計されたＰＣＲプライマー対
を含む、請求項１０記載の診断用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、遺伝子多型を同定することにより、パクリタキセル療法の副作用の一つである顆粒球減少症の発症のリスクを予測する方法、ならびにかかる方法を実施するための診断用キットに関する。
【背景技術】  パクリタキセルは、タキソール（登録商標）などの名称でも知られるジテルペン誘導体のアルカロイドである。微小管蛋白重合を促進することにより微小管の安定化・過剰形成を引き起こし、紡錐体の機能を障害することにより細胞分裂を阻害する抗腫瘍剤であり（Ｍａｎｆｒｅｄｉ，Ｊ．Ｊ．ａｎｄ  Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ｓ．Ｂ．Ｔａｘｏｌ：ａｎ  ａｎｔｉｍｉｔｏｔｉｃ  ａｇｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ａ  ｎｅｗ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ．Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．，２５：８３−１２５，１９８４）、乳癌、卵巣癌、胃癌および非小細胞肺癌等の種々の癌の治療に広く用いられている。パクリタキセル療法の最適投与量および投与スケジュールについては、現在も種々の臨床試験が進行中である。パクリタキセル療法による副作用の主要なものの１つは顆粒球減少症であり、この副作用の発症のために投与量が制限されている（例えば、Ｓｅｉｄｍａｎ，Ａ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．Ｄｏｓｅ−ｄｅｎｓｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ｗｅｅｋｌｙ  １−ｈｏｕｒ  ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ  ｉｎｆｕｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ，１６：３３５３−３３６１，１９９８）。
パクリタキセル療法による副作用を低下させる方法として、患者の遺伝子を分析することにより副作用を予測し、その薬剤の使用または投与量を決定する方法が研究されている。このような研究から、薬剤代謝に関連するか、あるいは薬剤活性と機能的に関連している遺伝子が、薬剤の副作用の発症の原因である可能性が明らかになった。例えば、チトクロームＰ４５０ファミリー等の薬剤代謝関連遺伝子におけるいくつかのｃＳＮＰｓが、高い頻度でいくつかの薬剤の副作用と相関していることが示されている（Ｒｅｌｌｉｎｇ，Ｍ．Ｖ．ａｎｄ  Ｄｅｒｖｉｅｕｘ，Ｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ，１：９９−１０８，２００１）。しかし、これらの高リスク遺伝子多型のアレル頻度は比較的低いため、大部分の患者について副作用を生ずる可能性を説明するには不十分である。したがって、パクリタキセル療法による副作用の発症と遺伝子多型との相関に関するさらなる研究が必要とされている。
特開２００３−９３０６８は、代謝酵素ＣＹＰ２Ｃ８の多型を調べることにより、患者のパクリタキセルに対する感受性を予測する方法を開示する。しかし、この出願に開示されるアミノ酸変異を伴う遺伝子変異はいずれもアレル頻度が低い。例えば、この出願の発明者らは、これらのアレル頻度が＜０．００７であると報告している（Ｓｏｙａｍａ，Ａ．，Ｙ．Ｓａｉｔｏ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）．”Ｎｏｎ−ｓｙｎｏｎｙｍｏｕｓ  ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｆｏｕｎｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＣＹＰ２Ｃ８  ｇｅｎｅ  ｒｅｓｕｌｔ  ｉｎ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．”Ｂｉｏｌ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｕｌｌ  ２４（１２），１４２７−１４３０）。
本発明の目的は、パクリタキセル療法における顆粒球減少症の発症の可能性を予測するための方法ならびにキットを提供することである。
【発明の開示】
本発明は、被験者から単離された遺伝子について、ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子中の配列番号１で規定される配列の１１番目の塩基における遺伝子多型、ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子中の配列番号２で規定される配列の１１番目の塩基における遺伝子多型、ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子中の配列番号３で規定される配列の１１番目の塩基における遺伝子多型、ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子中の配列番号４で規定される配列の１１番目の塩基における遺伝子多型、ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子中の配列番号５で規定される配列の１１番目の塩基における遺伝子多型、ＢＵＢ１ｂ遺伝子中の配列番号６で規定される配列の１１番目の塩基における遺伝子多型、ＢＵＢ１ｂ遺伝子中の配列番号７で規定される配列の１１番目の塩基における遺伝子多型、ＢＵＢ１ｂ遺伝子中の配列番号８で規定される配列の１１番目の塩基における遺伝子多型、ＢＵＢ１ｂ遺伝子中の配列番号９で規定される配列の１１番目の塩基における遺伝子多型、およびＢＵＢ１ｂ遺伝子中の配列番号１０で規定される配列の１１番目の塩基における遺伝子多型からなる群より選択される１またはそれ以上の遺伝子多型を同定する工程を含む、被験者におけるパクリタキセル療法による顆粒球減少症の発症のリスクを予測する方法を提供する。これらの配列は以下の表１に示される。
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本発明の１つの態様においては、ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子中の配列番号１で規定される配列の１１番目の塩基におけるジェノタイプがＧ／Ｇであるときに、顆粒球減少症の発症のリスクが高いと予測され、Ａ／ＧまたはＡ／Ａであるときに、顆粒球減少症の発症のリスクが低いと予測される。
本発明の別の態様においては、ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子中の配列番号２で規定される配列の１１番目の塩基におけるジェノタイプがＴ／Ｔであるときに、顆粒球減少症の発症のリスクが高いと予測され、Ｃ／ＴまたはＣ／Ｃであるときに、顆粒球減少症の発症のリスクが低いと予測される。
本発明の別の態様においては、ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子中の配列番号３で規定される配列の１１番目の塩基におけるジェノタイプがＧ／Ｇであるときに、顆粒球減少症の発症のリスクが高いと予測され、Ａ／ＧまたはＡ／Ａであるときに、顆粒球減少症の発症のリスクが低いと予測される。
本発明の別の態様においては、ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子中の配列番号４で規定される配列の１１番目の塩基におけるジェノタイプがＴ／Ｔであるときに、顆粒球減少症の発症のリスクが高いと予測され、Ａ／ＴまたはＡ／Ａであるときに、顆粒球減少症の発症のリスクが低いと予測される。
本発明の別の態様においては、ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子中の配列番号５で規定される配列の１１番目の塩基におけるジェノタイプがＧ／Ｇであるときに、顆粒球減少症の発症のリスクが高いと予測され、Ａ／ＧまたはＡ／Ａであるときに、顆粒球減少症の発症のリスクが低いと予測される。
本発明の別の態様においては、ＢＵＢ１ｂ遺伝子中の配列番号６で規定される配列の１１番目の塩基におけるジェノタイプがＡ／Ａであるときに、顆粒球減少症の発症のリスクが高いと予測され、Ａ／ＧまたはＧ／Ｇであるときに、顆粒球減少症の発症のリスクが低いと予測される。
本発明の別の態様においては、ＢＵＢ１ｂ遺伝子中の配列番号７で規定される配列の１１番目の塩基におけるジェノタイプがＴ／Ｔであるときに、顆粒球減少症の発症のリスクが高いと予測され、Ｇ／ＴまたはＧ／Ｇであるときに、顆粒球減少症の発症のリスクが低いと予測される。
本発明の別の態様においては、ＢＵＢ１ｂ遺伝子中の配列番号８で規定される配列の１１番目の塩基におけるジェノタイプがＣ／Ｃであるときに、顆粒球減少症の発症のリスクが高いと予測され、Ｃ／ＴまたはＴ／Ｔであるときに、顆粒球減少症の発症のリスクが低いと予測される。
本発明の別の態様においては、ＢＵＢ１ｂ遺伝子中の配列番号９で規定される配列の１１番目の塩基におけるジェノタイプがＣ／Ｃであるときに、顆粒球減少症の発症のリスクが高いと予測され、Ｃ／ＴまたはＴ／Ｔであるときに、顆粒球減少症の発症のリスクが低いと予測される。
本発明の別の態様においては、ＢＵＢ１ｂ遺伝子中の配列番号１０で規定される配列の１１番目の塩基におけるジェノタイプがＴ／Ｔであるときに、顆粒球減少症の発症のリスクが高いと予測され、Ｃ／ＴまたはＣ／Ｃであるときに、顆粒球減少症の発症のリスクが低いと予測される。
さらに本発明においては、本発明により同定されたＳＮＰｓの１またはそれ以上を任意に組み合わせて、顆粒球減少症の発症のリスクをより高い精度で予測することができる。後述の実施例に示されるように、特定のＳＮＰｓの組み合わせと顆粒球減少症の発症率との相関が特に高いことが見いだされた。すなわち、本発明は、被験者から単離された遺伝子について、ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子中の配列番号４で規定される配列の１１番目の塩基およびＢＵＢ１ｂ遺伝子中の配列番号６で規定される配列の１１番目の塩基における遺伝子多型を同定することを含む、被験者におけるパクリタキセル療法による顆粒球減少症の発症のリスクを予測する方法を提供する。
好ましくは、ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子中の配列番号４で規定される配列の１１番目の塩基におけるジェノタイプがＴ／Ｔであり、かつＢＵＢ１ｂ遺伝子中の配列番号６で規定される配列の１１番目の塩基におけるジェノタイプがＡ／ＡまたはＧ／Ｇであるときに、顆粒球減少症の発症のリスクが高いと予測される。また好ましくは、ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子中の配列番号４で規定される配列の１１番目の塩基におけるジェノタイプがＡ／ＴまたはＡ／Ａであり、かつＢＵＢ１ｂ遺伝子中の配列番号６で規定される配列の１１番目の塩基におけるジェノタイプがＡ／Ｇであるときに、顆粒球減少症の発症のリスクが低いと予測される。
さらに別の観点においては、本発明は、被験者におけるパクリタキセル療法による顆粒球減少症の発症のリスクを予測するための診断用キットを提供する。該キットは、被験者から単離された遺伝子について、ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子中の配列番号１で規定される配列の１１番目の塩基における遺伝子多型、ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子中の配列番号２で規定される配列の１１番目の塩基における遺伝子多型、ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子中の配列番号３で規定される配列の１１番目の塩基における遺伝子多型、ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子中の配列番号４で規定される配列の１１番目の塩基における遺伝子多型、ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子中の配列番号５で規定される配列の１１番目の塩基における遺伝子多型、ＢＵＢ１ｂ遺伝子中の配列番号６で規定される配列の１１番目の塩基における遺伝子多型、ＢＵＢ１ｂ遺伝子中の配列番号７で規定される配列の１１番目の塩基における遺伝子多型、ＢＵＢ１ｂ遺伝子中の配列番号８で規定される配列の１１番目の塩基における遺伝子多型、ＢＵＢ１ｂ遺伝子中の配列番号９で規定される配列の１１番目の塩基における遺伝子多型、およびＢＵＢ１ｂ遺伝子中の配列番号１０で規定される配列の１１番目の塩基における遺伝子多型からなる群より選択される１またはそれ以上の遺伝子多型を同定するための試薬を含有することを特徴とする。
本発明のキットに含有される試薬は、好ましくは以下の核酸分子から選択される１またはそれ以上の核酸分子である：
ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子中の配列番号１で規定される配列の１１番目の塩基を含むかまたはこれに隣接する少なくとも１０個の連続するヌクレオチド配列、またはこれに相補的なヌクレオチド配列を有する核酸分子；
ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子中の配列番号２で規定される配列の１１番目の塩基を含むかまたはこれに隣接する少なくとも１０個の連続するヌクレオチド配列、またはこれに相補的なヌクレオチド配列を有する核酸分子；
ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子中の配列番号３で規定される配列の１１番目の塩基を含むかまたはこれに隣接する少なくとも１０個の連続するヌクレオチド配列、またはこれに相補的なヌクレオチド配列を有する核酸分子；
ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子中の配列番号４で規定される配列の１１番目の塩基を含むかまたはこれに隣接する少なくとも１０個の連続するヌクレオチド配列、またはこれに相補的なヌクレオチド配列を有する核酸分子；
ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子中の配列番号５で規定される配列の１１番目の塩基を含むかまたはこれに隣接する少なくとも１０個の連続するヌクレオチド配列、またはこれに相補的なヌクレオチド配列を有する核酸分子；
ＢＵＢ１ｂ遺伝子中の配列番号６で規定される配列の１１番目の塩基を含むかまたはこれに隣接する少なくとも１０個の連続するヌクレオチド配列、またはこれに相補的なヌクレオチド配列を有する核酸分子；
ＢＵＢ１ｂ遺伝子中の配列番号７で規定される配列の１１番目の塩基を含むかまたはこれに隣接する少なくとも１０個の連続するヌクレオチド配列、またはこれに相補的なヌクレオチド配列を有する核酸分子；
ＢＵＢ１ｂ遺伝子中の配列番号８で規定される配列の１１番目の塩基を含むかまたはこれに隣接する少なくとも１０個の連続するヌクレオチド配列、またはこれに相補的なヌクレオチド配列を有する核酸分子；
ＢＵＢ１ｂ遺伝子中の配列番号９で規定される配列の１１番目の塩基を含むかまたはこれに隣接する少なくとも１０個の連続するヌクレオチド配列、またはこれに相補的なヌクレオチド配列を有する核酸分子；
ＢＵＢ１ｂ遺伝子中の配列番号１０で規定される配列の１１番目の塩基を含むかまたはこれに隣接する少なくとも１０個の連続するヌクレオチド配列、またはこれに相補的なヌクレオチド配列を有する核酸分子。
ここで、核酸分子が塩基を「含む」とは、核酸分子の配列中に標的とするＳＮＰ部位に対応する塩基が含まれていることを意味し、この塩基は核酸分子の内部に位置していても、５’末端または３’末端に位置していてもよい。このような核酸分子は、ＳＮＰのタイピングにおいて、ハイブリダイゼーションプローブ、ＴａｑＭａｎプローブ等として用いることができる。さらに、本発明の核酸分子はＳＮＰ部位の周囲の領域とは無関係な配列をさらに含有していてもよい。このような核酸分子は、ＳＮＰのタイピングにおいて、インベーダー法におけるプライマリープローブとして用いることができる。また、核酸分子が塩基に「隣接する」とは、核酸分子が、標的とするＳＮＰ部位に対応する塩基を含まないが、ＳＮＰ部位に隣接する上流または下流の連続するヌクレオチド配列を含むことを意味する。配列番号１で規定される配列の１１番目の塩基に「隣接する」配列の例は、配列番号１で規定される配列の１−１０番目の塩基を含む配列であり、別の例は１２−２１番目の塩基を含む配列である。このような核酸分子は、ＳＮＰのタイピングにおいて、インベーダー法におけるインベーダープローブまたはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法およびプライマーエクステンション法におけるプライマーとして用いることができる。これらのプローブは、本発明の教示にしたがって、ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子またはＢＵＢ１ｂ遺伝子の配列を参照することにより設計することができる。
また好ましくは、本発明のキットに含有される試薬は、以下のプライマー核酸分子から選択される１またはそれ以上の核酸分子である：
ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子中の配列番号１で規定される配列の１１番目の塩基を含む領域に対応するＤＮＡを増幅するよう設計されたＰＣＲプライマー対；
ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子中の配列番号２で規定される配列の１１番目の塩基を含む領域に対応するＤＮＡを増幅するよう設計されたＰＣＲプライマー対；
ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子中の配列番号３で規定される配列の１１番目の塩基を含む領域に対応するＤＮＡを増幅するよう設計されたＰＣＲプライマー対；
ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子中の配列番号４で規定される配列の１１番目の塩基を含む領域に対応するＤＮＡを増幅するよう設計されたＰＣＲプライマー対；
ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子中の配列番号５で規定される配列の１１番目の塩基を含む領域に対応するＤＮＡを増幅するよう設計されたＰＣＲプライマー対；
ＢＵＢ１ｂ遺伝子中の配列番号６で規定される配列の１１番目の塩基を含む領域に対応するＤＮＡを増幅するよう設計されたＰＣＲプライマー対；
ＢＵＢ１ｂ遺伝子中の配列番号７で規定される配列の１１番目の塩基を含む領域に対応するＤＮＡを増幅するよう設計されたＰＣＲプライマー対；
ＢＵＢ１ｂ遺伝子中の配列番号８で規定される配列の１１番目の塩基を含む領域に対応するＤＮＡを増幅するよう設計されたＰＣＲプライマー対；
ＢＵＢ１ｂ遺伝子中の配列番号９で規定される配列の１１番目の塩基を含む領域に対応するＤＮＡを増幅するよう設計されたＰＣＲプライマー対；
ＢＵＢ１ｂ遺伝子中の配列番号１０で規定される配列の１１番目の塩基を含む領域に対応するＤＮＡを増幅するよう設計されたＰＣＲプライマー対。
これらのプライマー対は、種々のタイピング法において標的遺伝子を増幅するために用いることができる。これらのプライマー対は、本発明の教示にしたがって、ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子またはＢＵＢ１ｂ遺伝子の配列を参照することにより設計することができる。増幅のための好適なプライマー対の設計方法は当該技術分野においてよく知られている。
発明の詳細な説明
本発明においては、パクリタキセル療法による副作用と関連する遺伝子多型を検索するため、まず薬剤代謝関連遺伝子ならびに薬理学的にパクリタキセルの作用機序に関連する遺伝子２９８個を選定した。次にこれら２９８個の遺伝子内に存在するＳＮＰｓをＪＳＮＰデータベース上で検索を行い、２，７２７個のＳＮＰｓを抽出した。パクリタキセルを投与した５４名の乳癌患者の末梢血からＤＮＡを抽出し、ＳＮＰｓのタイピングを行ったところ、後述の実施例に示されるように、ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子内にマップされた５個のＳＮＰ（ＩＭＳ−ＪＳＴ１１１８９８（配列番号１）、ＩＭＳ−ＪＳＴ１０５８７４（配列番号２）、ＩＭＳ−ＪＳＴ０８２３９７（配列番号３）、ＩＭＳ−ＪＳＴ０７１８５２（配列番号４）、ＩＭＳ−ＪＳＴ０７１８５３（配列番号５））、ならびにＢＵＢ１ｂ遺伝子内にマップされた５個のＳＮＰ（ＩＭＳ−ＪＳＴ０７４５３８（配列番号６）、ＩＭＳ−ＪＳＴ０７９８３７（配列番号７）、ＩＭＳ−ＪＳＴ０４４１６４（配列番号８）、ＩＭＳ−ＪＳＴ０６３０２３（配列番号９）、ＩＭＳ−ＪＳＴ０４２５６９（配列番号１０））について、顆粒球減少症の発症との相関が見いだされた。
なお、上記のＩＭＳ−ＪＳＴ番号は、ＪＳＮＰデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｓｎｐ．ｉｍｓ．ｕ−ｔｏｋｙｏ．ａｃ．ｊｐ／）におけるエントリー番号であり、ＮＣＢＩのｄｂＳＮＰデータベースをはじめとする各種データベースから検索することができる。本明細書においては、本発明において見いだされたこれらのＳＮＰｓの位置をより明確に示すために、ゲノム配列中の当該ＳＮＰ部位およびその前後各１０塩基を含む配列をそれぞれ配列番号１−１０として示し、これらの配列番号を参照してＳＮＰｓを表している。後にシークエンスエラーや新たな多型が発見されることにより、これらの配列番号に示される塩基配列の一部が変動するかもしれないことは、当業者には明らかであろう。
ＣＹＰ２Ｃ８（チトクロームＰ４５０，ファミリー２，サブファミリーＣ，ポリペプチド８）は、種々の薬物の代謝に関与するチトクロームＰ４５０であり、染色体位置１０ｑ２３．３３にマップされている。パクリタキセルの代謝は主に肝細胞において行われ、代謝物は胆汁中に排泄される。パクリタキセルの解毒化にはＣＹＰ２Ｃ８による加水分解能が重要な働きをしており、これによりパクリタキセルが解毒化された６α−ヒドロキシパクリタキセルに分解される（Ｒａｈｍａｎ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔａｘｏｌ  ｔｏ  ６  α−ｈｙｄｒｏｘｙｔａｘｏｌ  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ２Ｃ８．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，５４：５５４３−５５４６，１９９４）。このため、ＣＹＰ２Ｃ８蛋白質がパクリタキセルの血中濃度の決定に重要な働きをしていることが考えられる。このことはＣＹＰ２Ｃ８が副作用とも関連している可能性を示唆している。ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子にはいくつかのｃＳＮＰがあることが知られている。例えば、アミノ酸の置換を伴う５箇所のｃＳＮＰのうち一つ（４１６Ｇ−＞Ａ）は、パクリタキセルの代謝速度がワイルドタイプに比べて遅くなることが知られている（Ｂａｈａｄｕｒ，Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．ＣＹＰ２Ｃ８  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ｉｎ  Ｃａｕｃａｓｉａｎｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｗｉｔｈ  ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ  ６ａｌｐｈａ−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｌｉｖｅｒ  ｍｉｃｒｏｓｏｍｅｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，６４：１５７９−１５８９，２００２；Ｄａｉ，Ｄ．，．ｅｔ  ａｌ．Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ＣＹＰ２Ｃ８  ｄｅｃｒｅａｓｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ｄｒｕｇ  ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ  ａｎｄ  ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ  ａｃｉｄ．Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，１１：５９７−６０７，２００１）。しかし、日本人を対象としたアレル頻度の解析研究において、これらのｃＳＮＰｓの頻度は極めて低いことが知られている。実際、本発明において実施したタイピングにおいても５４検体から１１９６Ａ＞Ｇの変異アレルが一つ見つかったのみである。これらのことからＣＹＰ２Ｃ８遺伝子に存在する既知のｃＳＮＰｓはパクリタキセルの顆粒球減少症にはほとんど関与していないことが示唆される。本発明により見いだされたＳＮＰｓは、未知のメカニズムで顆粒球減少症と関連しているものと考えられる。
ＢＵＢ１ｂ遺伝子は、出芽酵母において有糸分裂のチェックポイントに関連しているＢＵＢ遺伝子のホモログであり、染色体位置１５ｑｌ５にマップされている（Ｃａｈｉｌｌ，Ｄ．Ｐ．，．ｅｔ  ａｌ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｍｉｔｏｔｉｃ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ，３９２：３００−３０３，１９９８；Ｈｏｙｔ，Ｍ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｇｅｎｅｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ａｒｒｅｓｔ  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ，６６：５０７−５１７，１９９１．；Ｌｉ，Ｒ．ａｎｄ  Ｍｕｒｒａｙ，Ａ．Ｗ．Ｆｅｅｄｂａｃｋ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｍｉｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｂｕｄｄｉｎｇ  ｙｅａｓｔ．Ｃｅｌｌ，６６：５１９−５３１，１９９１）。パクリタキセルの抗腫瘍効果は微小管の重合を促進させることにより発揮され、微小管がパクリタキセルの標的分子である。これらのことは、ＢＵＢ１ｂ遺伝子とパクリタキセルの薬理作用が、機能的な面で関連があることを示唆している。
本発明において、パクリタキセル療法による副作用との相関が見いだされたＳＮＰｓの位置および多型の情報を以下の表に示す。
0004549297.tif 000003
0004549297.tif 000004
0004549297.tif 000005
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本発明の方法においては、パクリタキセルによる治療が計画されているか、あるいはパクリタキセルを投与されている被験者から末梢血液、他の体液、細胞、組織等を採取し、これらの試料から定法によりゲノムＤＮＡを調製する。必要な場合には、タイピングすべき部位の配列を増幅する。遺伝子多型のタイピングは、当該技術分野において知られるかまたは開発されつつある種々の方法のいずれかを用いて容易に行うことができる。タイピング方法の例としては、直接シークエンス法、インベーダー法、ＴａｑＭａｎ法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法、プライマーエクステンション法およびハイブリダイゼーション法等が挙げられるが、これらに限定されない。
直接シークエンス法を用いる場合には、ＳＮＰ部位を含む領域のＤＮＡをＰＣＲにより増幅し、このＰＣＲ産物の配列を直接シークエンスすることにより、ＳＮＰを同定することができる。
インベーダー法を用いる場合には、ＳＮＰ部位から３’側に特異的な配列を含むインベーダープローブと、テンプレートのＳＮＰ部位から５’側に特異的な配列および無関係なフラップ配列を含むプライマリープローブとを用意する。これらのプローブと、フラップと相補的な配列と自己相補的な配列を含み蛍光色素とクエンチャーとの両方で標識されているＦＲＥＴプローブ、およびテンプレートの存在下でクリベースを作用させる。プライマリープローブがテンプレートとハイブリダイズすると、ＳＮＰ部位にインベーダープローブの３’末端が侵入し、この構造がクリベースにより切断されてフラップが遊離する。フラップはＦＲＥＴプローブと結合して、クリベースにより蛍光色素部分が切断されて、蛍光が発生する。フラップ−ＦＲＥＴプローブを２組用意し、異なる蛍光色素で標識することにより、１回のアッセイで各ホモ接合体とヘテロ接合体とを区別することができる。
ＴａｑＭａｎ法を用いる場合には、蛍光色素とクエンチャーにより標識したアレル特異的プローブを標的部位にハイブリダイズさせて、この部位を含む領域を増幅するよう設計したプライマーでＰＣＲ反応を行う。プライマーからの伸長反応が進むと同時に、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの５’エキソヌクレアーゼ活性により、ハイブリダイズしたプローブが切断される。蛍光色素がクエンチャーと離れると蛍光が生じ、これを検出することによりＳＮＰを同定することができる。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法を用いる場合には、ＳＮＰ部位に隣接するプライマーを作成し、ＰＣＲ増幅させたサンプルＤＮＡを鋳型として、ｄｄＮＴＰを用いて１塩基分だけプライマー伸長を行う。伸長反応生成物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳで質量分析することにより、付加したｄｄＮＴＰを識別する。
ハイブリダイゼーション法を用いる場合には、ＳＮＰ部位を含む領域のＤＮＡをＰＣＲにより増幅し、ＳＮＰ部位に特異的なプローブを用いてハイブリダイゼーションにより増幅産物を検出する。さらに、これらの方法に加えて、ＲＦＬＰ法、ＤＮＡチップ法、分子ビーコン法、ライゲーション法などの種々の方法が開発されており、本発明においてはこれらのいずれをも用いることができる。
本発明の方法にしたがえば、本発明において同定されたＳＮＰ部位の１またはそれ以上についてタイピングを行い、後述の実施例において示される統計データを参照して、パクリタキセル療法による副作用の発症のリスクを予測することができる。本発明の方法は、好ましくはモンゴロイドに、特に好ましくは日本人に適用される。より好ましくは、本発明において同定されたＣＹＰ２Ｃ８遺伝子中のＳＮＰと、ＢＵＢ１ｂ遺伝子中のＳＮＰについてタイピングを行い、これらの結果を組み合わせることにより、パクリタキセル療法による副作用の発症のリスクを予測する。そのような組み合わせの例としては、
0004549297.tif 000013
0004549297.tif 000014
が挙げられる。
本発明はまた、上述のタイピング法において用いるための試薬を含む、パクリタキセル療法による副作用の発症のリスクを予測するためのキットを提供する。試薬の例はプローブおよびプライマーである。本発明において同定されたＳＮＰ部位を含む遺伝子の領域を増幅するために用いられるプライマーは、好ましくは１５−３０塩基の長さであり、標的ＳＮＰ部位を挟みかつＰＣＲ反応により所望の長さの増幅産物が生成されるよう設計される。インベーダー法において用いられるプライマリープローブは、標的ＳＮＰ部位から５’側の標的領域に特異的な配列を含み、さらに無関係なフラップ配列を含む。また、インベーダー法において用いられるインベーダープローブおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法およびプライマーエクステンション法において用いられるプライマーは、標的ＳＮＰ部位に対応する塩基を含まないが、ＳＮＰ部位に隣接する上流または下流の連続するヌクレオチド配列を含む。このようなプローブおよびプライマーの設計方法ならびに合成方法は当該技術分野においてよく知られている。
本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。また，本出願が有する優先権主張の基礎となる出願である日本特許出願２００３−３７５３６９号の明細書および図面に記載の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。
【実施例】  以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが，これらの実施例は本発明の範囲を制限するものではない。
臨床サンプル
５４名の乳癌患者がパクリタキセルの術前化学療法の臨床試験に登録された。患者選択の条件について要約すると以下の通りである。１）７０歳以下で病理組織学敵に確認されたステージＩＩまたＩＩＩａの乳癌患者であること、２）生理学的機能が適切であること（ＷＢＣ＞４，０００ｍｍ３，血小板カウント＞１０，０００ｍｍ３，ヘモグロビンレベル＞１０ｇ／ｄｌ，血清クレアチニン濃度＜１．２ｍｇ／ｄｌ，血清総ビリルビンレベル＜１．５ｍｇ／ｄｌ，ＧＯＴ／ＧＰＴ＜６０／７０）。本治療の前に化学療法あるいは放射線療法が施行されていないことなどである。すなわち、パクリタキセルの術前化学療法の臨床試験が施行された５４名は、臨床上また組織学的にもほぼ同一のステージであり、前症例とも化学療法の施行歴はなかった。患者は、一週間に一回、８０ｍｇ／ｍ２のパクリタキセルを１時間かけて点滴投与された。この投与を１２週間継続した。これらの患者に最も高頻度に観察された副作用は顆粒球減少症であり、２４名の患者に認められた。
副作用の定義
副作用の有無を確認するために各患者について毎週、白血球数、赤血球数、ヘモグロビン量、血小板数が測定された。治療中に認められた副作用は米国Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＣｏｍｍｏｎ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ（ＮＣＩ−ＣＴＣ）に基づいて評価されグレード分類が行われた（Ｔｒｏｔｔｉ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｍｍｏｎ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｃｒｉｔｅｒｉａ：ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０．ａｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｇｒａｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｃｕｔｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ：ｉｍｐａｃｔ  ｏｎ  ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｒａｄｉａｔ  Ｏｎｃｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｐｈｙｓ，４７：１３−４７，２０００参照）。すべての臨床情報はＳＣＴＳ２１システム（三井情報開発）を用いて匿名化され、以後の解析に用いられた。顆粒球減少症のグレードがＮＣＩ−ＣＴＣの分類にてグレード１〜４までを示した患者を顆粒球減少症ありとし、グレード０の患者を顆粒球減少症なしとした。顆粒球減少症あり群となし群間で年齢、発症年齢間に相関は認められなかった。
ＳＮＰｓのタイピング
パクリタキセルの副作用と関連する遺伝子多型を検索するため、まず薬剤代謝関連遺伝子ならびに薬理学的にパクリタキセルの作用機序に関連する遺伝子２９８個を選定した。次にこれら２９８個の遺伝子内に存在するＳＮＰｓをＪＳＮＰデータベース上で検索を行い、２，７２７個のＳＮＰｓを抽出した。
本研究に用いた５４症例についてインベーダー法を用いて２９８遺伝子内にある２，７２７カ所のＳＮＰのタイピングを行った。５４名の患者から末梢血１４ｍｌを採取した。末梢血からＤＮＡを抽出する方法については標準的な方法を用いた。インベーダー法によるタイピングを行う前に、標的とするＳＮＰ部位の周辺約５００ｂｐをＰＣＲ法にて増幅した。その際１０ｎｇのＤＮＡをテンプレートとして用い、また４８個のプライマーセットを用いたマルチプレックスＰＣＲを行うことにより４８カ所のＤＮＡ断片を同時に増幅した。各ＳＮＰ部位周辺を増幅するために用いたプライマーはＪＳＮＰデータベースに記載されている配列に基づいて作製したものを用いた。ＰＣＲの反応は以下の組成にて行った（６．７ｍＭ  ＭｇＣｌ２，６７ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ，１６．６ｍＭ  ＮＨ４ＳＯ４，１０ｍＭ  ２−メルカプトエタノール，６．７μＭ  ＥＤＴＡ，１，５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ，１０％  ＤＭＳＯ，１ｐｍｏｌの各プライマー，および０．０５ＵのＥｘ−Ｔａｑ）。ＰＣＲの反応は最初のディネーチャー反応は９４℃にて２分間行い、次に９４℃１５秒、６０℃１５秒、７２℃２分の３ステップを３５回繰り返した。Ｍｕｌｔｉｍｅｋ９６反応ロボットを用いてＰＣＲ産物を滅菌蒸留水にて希釈した後、ＴＡＮＧＯ分注機を用いてインベーダー反応用カードに分注した。次にＣａｒｔｅｓｉａｎ分注機を用いてインベーダー反応試薬をインベーダー用反応カードに分注した。インベーダー反応試薬には、アレル特異的オリゴヌクレオチド、Ｃｌｅａｖａｓｅ  ＶＩＩ、そしてＦＡＭあるいはＲｅｄｍｏｎｄ  ＲｅｄにてラベルされたＦＲＥＴカセットが含まれている。これらの試薬はＴｈｉｒｄ  Ｗａｖｅ社より購入した。蛍光シグナルはＴＥＣＡＮ  Ｕｌｔｒａにて検出し、ジェノタイプはＦＡＭとＲｅｄｍｏｎｄ  Ｒｅｄの信号強度を２次元チャートに展開したものを用いて決定した。
ジェノタイピングを行った２，７２７ＳＮＰｓのうち２，１２３ＳＮＰｓについては８０％以上の症例においてタイピングの決定を行うことができた。ジェノタイプの正確性について検討を行うため、ランダムに選んだ３ＳＮＰｓのタイピングデータをＲＦＬＰ法にて決定したジェノタイプと比較した所、調べた約１，０００超のジェノタイプの全てで両タイピング法での結果が一致した。このことからタイピングの正確性は非常に高いものであることが示唆された。また、各ＳＮＰについてＨａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ平衡状態であるかどうかについてカイ２乗検定を用いて行ったところ、調べた全てのＳＮＰｓがＨａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇの平衡状態にあることが示唆された。
副作用と関連するＳＮＰｓの検索および相関解析
まず最初に、各遺伝子毎にハプロタイプブロック構造の構築を行った。同一遺伝子内にマップされたＳＮＰについて、任意の２つのＳＮＰ間の連鎖不平衡係数｜Ｄ’｜をすべての組み合わせについて推定し、これをＳＮＰの位置順に並べたマトリックスを作成した。もし２つのＳＮＰ間の｜Ｄ’｜が０．９以上であれば、２遺伝子間はハプロタイプブロックを形成しているものと推定した。その結果、タイピングを行った２９８遺伝子は４１９個のハプロタイプブロックに分割されることが分かった。
次に副作用と相関するＳＮＰを同定するために、２段階のスクリーニングを行った。第一段階では、副作用がある群とない群間でのジェノタイプの分布について、２ｘ３分割表を用いた独立性の検定を行った。第一段階のスクリーニングにより顆粒球減少症と相関を認める２箇所のハプロタイプブロックが見いだされた。これらのハプロタイプブロックには各々ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子内にマップされた５個のＳＮＰ、ならびにＢＵＢ１ｂ遺伝子内にマップされた５個のＳＮＰが含まれていた。ｐ値の最低値はＣＹＰ２Ｃ８遺伝子を含むハプロタイプブロックでは０．００６５、ＢＵＢ１ｂ遺伝子を含むハプロタイプブロックでは０．０１０であった。
第一段階で同一ハプロタイプブロック内あるいは同一遺伝子内にある全てのＳＮＰ  ｐ値が０．０５以下であるものを第２段階の解析に用いた。第２段階では、優性遺伝モデルあるいは劣性遺伝モデルを想定した２ｘ２分割表を作成し、独立性の検定をＦｉｓｈｅｒ’ｓ  ｅｘａｃｔ  ｔｅｓｔを用いて行った。
0004549297.tif 000015
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第２段階の解析では２つの遺伝子にマップされたＳＮＰのいずれも劣性遺伝形式を想定した場合より高い相関を認めた。最も高い相関を認めたＳＮＰはＣＹＰ２Ｃ８遺伝子にマップされたＳＮＰではＩＭＳ−ＪＳＴ０７１８５２（ｐ＝０．００２０，オッズ比１０．７）であり、ＢＵＢ１ｂ遺伝子にマップされたＳＮＰではＩＭＳ−ＪＳＴ０７４５３８（ｐ＝０．００６２，オッズ比５．１１）であった。ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子内に存在する３箇所の既知のｃＳＮＰが、本研究で使用したＳＮＰｓと関連があるかどうかを調べるため、これら３箇所のｃＳＮＰｓのジェノタイプをＲＦＬＰ法を用いて決定した。その結果一症例に１１９６Ａ＞Ｇ部位のヘテロ接合体を認めたのみで、他の症例では３箇所のｃＳＮＰ全てでワイルドタイプであった。このことからＣＹＰ２Ｃ８遺伝子内に存在する３箇所のｃＳＮＰｓの頻度は非常に低いものと推定された。また、ＢＵＢ１ｂ遺伝子内にマップされる一個のＳＮＰ（ＩＭＳ−ＪＳＴ０４４１６４）における多型はアミノ酸置換（Ａｒｇ−＞Ｇｌｎ）を伴うｃＳＮＰである。本研究ではワイルドタイプであるＡｒｇを持つアレルをホモに持つ割合が顆粒球減少症を示す患者で多いことが示された。
ジェノタイプの組み合わせによる副作用出現確率の推定
ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子上の一個のＳＮＰとＢＵＢ１ｂ遺伝子上の一個のＳＮＰのジェノタイプの組み合わせの各々について副作用出現の確率を計算した。計算にはロジスティック回帰モデルを用いた。その際４個の変数を用い、ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子上のＳＮＰのアレルタイプ２種類と、ＢＵＢ１ｂ遺伝子上のＳＮＰのアレルタイプ２種類を各々割り当てた。ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ  ｒａｔｉｏ  ｔｅｓｔを用い最も適切なＳＮＰの組み合わせを検索し、ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子上のＩＭＳ−ＪＳＴ０７１８５２とＢＵＢ１ｂ遺伝子上のＩＭＳ−ＪＳＴ０７４５３８の組み合わせを選択した（ｐ＜０．０００５３２）。この２つのＳＮＰｓのジェノタイプ別の副作用出現確率を表１３に示す。アレル頻度はＪＳＮＰデータベースより得られた各々のＳＮＰのアレル頻度より推定した。
0004549297.tif 000017
本発明により、２つの遺伝子の２個のＳＮＰを用いれば顆粒球減少症発症の可能性を確実に予測することができることが示された。ＣＹＰ２Ｃ８遺伝子上のＩＭＳ−ＪＳＴ０７１８５２とＢＵＢ１ｂ遺伝子上のＩＭＳ−ＪＳＴ０７４５３８のジェノタイプの組み合わせがＴ／ＴとＡ／Ａ、あるいはＴ／ＴとＧ／Ｇの組み合わせであれば顆粒球減少症を発症する確立が非常に高いと考えられる。ＪＳＮＰデータベースにおいて公開されているアレル頻度をもとにすれば、これら２つのジェノタイプの組み合わせの日本人における頻度はそれぞれ０．１２と０．０４である。他方、顆粒球減少症を発症する確率が低いと考えられるジェノタイプの組み合わせは、Ａ／ＴとＡ／Ｇ、あるいはＡ／ＡとＡ／Ｇの組み合わせであり、これらの組み合わせの日本人における頻度はそれぞれ０．２３と０．１４である。以上の結果を組み合わせれば、日本人の約半数についてはパクリタキセル治療における顆粒球減少症の発症の有無を予測できることがわかる。
【配列表】
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