(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式
【化１】
0004395573.tif 000008
と一般式
【化２】
0004395573.tif 000009
の構成単位から成り、（ａ）／（（ａ）＋（ｂ））（モル比）＞７０％であるキトサンから誘導される酸化キトサン化合物であって、化１及び化２の式中ＣＨ2ＯＨ基のＣＯＯＸ基（但し、ＸはＨ、ＮａまたはＫを表す）への酸化率が１〜１００モル％であり、化１の式中ＮＨ2基のＮＨＣＯＣＨ3基へのアセチル化率が４０〜９５モル％である重量平均分子量が５，０００以上であって、且つｐＨ７、温度２５℃での水に対する溶解度が０．１ｇ／１００ｇ以上である酸化キトサン化合物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は酸化キトサン化合物に関し、特に水溶性酸化キトサン化合物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
キチンはカニやエビなどの甲殻類、カブトムシやコオロギなどの昆虫類の骨格物質に多く存在するほか、菌類や細胞壁にも存在し、N-アセチルD-グルコサミン残基が多数、β-(1,4)-結合した多糖類である。そして地球上でもっとも豊富な有機化合物であるセルロ−スと類似の構造を有し、２位の炭素に結合している水酸基に代えてアセトアミド基をもつアミノ多糖類である。キトサンはキチンの脱アセチル化合物でグルコサミンのβ-(1,4)-結合した多糖類である。
【０００３】
これら天然多糖類は、近年新しいタイプの生分解性高分子材料として、また生体親和性材料として注目され、その利用について多くの研究がなされ、数々の知見が得られている。キチン、キトサンについていえば、創傷治癒促進効果、抗凝血作用、免疫賦活活性、静菌・抗菌活性などさまざまな生物活性効果が報告されている。更にまた、細胞認識やそれに伴う情報伝達機構など生体機能発現において、糖鎖が鍵物質として重要な役割を演じていることも明らかになりつつある。
【０００４】
しかしながら、キチン、キトサンは一般に水不溶性であり、これを医用材料として利用する場合、取扱い上の利便性、各種化学薬品、薬剤との相溶性、薬効の均一性、加工性等の観点から、広範なｐＨ領域に於いて水溶性であることが望ましい。
【０００５】
水可溶化方法の一つとして、キチン、キトサンに室温でエチレンオキシドガスを反応させる方法が知られている（千手諒一、沖益哲、日本農芸化学会誌、２３、４３２，（１９５０））。
しかしながら、エチレンオキシドガスでは６位の炭素以外に３位の炭素などにも反応し位置選択性が無く、実験を追試したが、置換度が２０〜５０％程度では水不溶であった。
また、アルカリキチン、アルカリキトサンにモノクロロ酢酸を室温で反応させる方法も知られているが、カルボキシメチル基が生体に副作用を示す可能性がある。
【０００６】
また、キトサンに塩基の存在下、ヨウ化メチルを室温で作用させる方法も知られている（Domard,A.,M.Rinaudo,C.Terrassion,Int.J.Biol.Macromol.,105(1986)）。
しかしながら、メチル基が生体に副作用を示す可能性があり、３，６位の炭素などにも反応し位置選択性がない。
キトサンを酢酸水溶液で溶かし乾燥させる方法も知られているが、水溶液は酸性になりアルカリ性になった場合沈殿する。
また、キチンの脱アセチル化率を４５〜５５モル％に調整する方法も知られているが、工業的に係る範囲に調整することは極めて困難であることに加え、事実市販品も水不溶性である。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
そこで本発明者らは広範囲のｐＨ領域において水可溶性の酸化キトサン化合物を得るべく種々検討を重ねた結果、本発明を完成したものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
即ち本発明は一般式
【０００９】
【化３】
0004395573.tif 000002
と一般式
【００１０】
【化４】
0004395573.tif 000003
の構成単位から成り、（ａ）／（（ａ）＋（ｂ））（モル比）＞７０％であるキトサンから誘導される酸化キトサン化合物であって、化１及び化２の式中ＣＨ2ＯＨ基のＣＯＯＸ基（但し、ＸはＨ、ＮａまたはＫを表す）への酸化率が１〜１００モル％であり、化１の式中ＮＨ2基のＮＨＣＯＣＨ3基へのアセチル化率が４０〜９５モル％である重量平均分子量が５，０００以上であって、且つｐＨ７、温度２５℃での水に対する溶解度が０．１ｇ／１００ｇ以上である酸化キトサン化合物に関する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下に本発明の酸化キトサン化合物の製造方法について詳記する。
先ず、本発明のキトサンについていえば、上式から明らかな通り、本発明の対象とするキトサンはアセチル化率３０％以下のものである。即ち、アセチル化率が３０％以上の場合、水可溶性酸化キトサン化合物を得ることが極めて困難となる。
【００１２】
先ずキトサンを酢酸塩にする。酢酸塩にする方法としては使用するキトサンのアミノ基のモル数に対し１．５〜４倍モル、更に好ましくは２〜３倍モルの酢酸を加え、約１５〜４０℃、更に好ましくは２０〜２５℃で１〜３時間攪拌する（但し、脱アセチル化率が１００％のキトサンＸｇの場合、キトサンのアミノ基のモル数はＸｇ／１６１ｇ（キトサンの構成糖の分子量）で算出する）。このとき使用する酢酸の濃度としては０．５〜１０モル濃度（モル濃度はｍｏｌ／ｌ）、より好ましくは１〜５モル濃度である。
【００１３】
次いでこれを５０〜１００℃で乾燥し、キトサン酢酸塩とする。酢酸に代えて塩酸を使用することもできるが、後に詳記する酸化容易性の点から酢酸が好ましい。尚、塩酸の使用条件は酢酸の場合と同じである。酢酸塩を乾燥する理由は、水分を可能な限り少なくするためである。
次いで更に上記キトサン酢酸塩に濃酢酸、即ち８０〜９９．８重量％、より好ましくは９５．０〜９９．８重量％の酢酸を加えてよく攪拌する。ここで濃酢酸を使用する理由は、濃酢酸でキトサン酢酸塩を懸濁させた場合、後述する６位の炭素の酸化が、容易に行われることによる。
【００１４】
即ち、次記６位の炭素のＣＨ2ＯＨ基の酸化はＣＨ2ＯＨ→ＣＨＯ→ＣＯＯＨの酸化反応工程を経て酸化されるが、ＣＨ2ＯＨ→ＣＨＯの反応は水分が少ない程反応速度が速いためである。
従って、上記の如くキトサン酢酸塩を乾燥することなくエバポレーター等を利用して濃縮しても良い。要は経済性を考慮して酸化反応工程に付する前に可能な限り水分を少なくすることが望ましい。
【００１５】
次いでこの懸濁液に過塩素酸を加え、キトサン酢酸塩をキトサン過塩素酸塩に変換する。このとき溶液は一般にゼリー状となる。過塩素酸に代えて塩酸、硫酸を使用することもできるが、濃度、添加量、反応度合 を充分に管理しないと、後述する酸化反応において２位、３位の炭素が酸化される可能性があり望ましくない。
過塩素酸の使用量は、キトサン酢酸塩のアミノ基のモル数に対し１〜３倍モル、より好ましくは１．５〜２倍モルが良い。使用する過塩素酸の濃度は４〜８モル濃度、より好ましくは５〜７モル濃度が良い。更に好ましくは６モル濃度近傍がよい。
上記モル倍率を逸脱するとキトサン構造が壊れ、開環する可能性がある。またキトサン過塩素酸塩への変換時間、換言すれば、反応時間は１時間で充分である。キトサン過塩素酸塩に変換する理由は、アミノ基に結合している酢酸イオン（ＣＨ3ＣＯＯ-）を、より酸度の強い過塩素酸イオン（ＣｌＯ4-）に置換し、安定なゼリー状即ち、ゲル状の過塩素酸塩とすることにより、次に行う酸化反応において２位、３位の炭素の酸化を防止することにある。
【００１６】
次に、このキトサン過塩素酸懸濁液（ゲル状態は攪拌により懸濁液状態となる）に酸化剤を加えて６位の炭素、即ちＣＨ2ＯＨ基の酸化を行う。酸化剤としては過マンガン酸ナトリウム、過マンガン酸カリウム、過酸化水素、次亜塩素酸ナトリウム、次亜塩素酸カリウム、硝酸等を使用することができるが、反応効率の点から無水クロム酸が最も望ましい。
無水クロム酸の使用量は所望する酸化率により異なるが、５０モル％酸化率を所望する場合ＣＨ2ＯＨ基の１．５〜４倍モル、より好ましくは２〜３倍モルである。酸化反応温度は常温、酸化反応時間は５〜６時間である。１００モル％酸化率を所望する時は、望ましくは０℃以下の温度で、ゆっくりと反応させるが、後記する製造方法を採用することが推奨される。
【００１７】
次いで、得られた酸化キトサンを濾別する。
濾別方法としては遠心分離機、フィルタープレス、真空濾過機等任意の濾別方法を採用することができる。
【００１８】
次いで、濾別分離により得られた酸化キトサンをアルカリ溶液に溶解する。使用するアルカリ剤としては水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アルカノールアミン、アンモニア水溶液等が好例として挙げられるが、とりわけ水酸化ナトリウム、水酸化カリウムが望ましい。アルカリ剤の使用量は酸化キトサン溶液ｐＨが１２以上になるように添加し、水により酸化キトサン濃度が概ね０．００１〜０．０１モル濃度、より好ましくは０．００４〜０．００６モル濃度になるよう調整する。
【００１９】
次いで、この酸化キトサンアルカリ水溶液にメタノールを添加する。酸化キトサンに対するメタノールの使用割合は、キトサン酸化率、後述するアセチル化率等によっても異なるが、例えばキトサンの酸化率５０モル％、アセチル化率９５モル％を所望する場合、酸化キトサン１００部に対しメタノール１５０〜５００部である。
使用するメタノールの濃度としては９０〜９８重量％が好ましい。ここでメタノールを使用する理由は、アセチル化率を向上させるためであり、メタノールを使用しない場合、無水酢酸が加水分解を生起しアセチル化率が向上しないものと推定される。なお、メタノールの他に、エタノール、イソプロパノール、ブタノール等も使用することができるが、メタノールが極性が大きく、アセチル化反応効率を最も大きくすることができる。
【００２０】
次いでこのメタノール溶液に、無水酢酸を加えて酸化キトサンのアミノ基をアセチル化する。無水酢酸の添加量は、所望するアセチル化率に応じて決定すれは良いが、例えばアセチル化率８０モル％を所望する場合は、酸化キトサンのアミノ基モル数に対して無水酢酸０．９倍モルを添加すればよい。アセチル化率８０モル％以上を所望するときは、酸化キトサンのアミノ基モル数に対し１倍モル以上の無水酢酸を使用することが望ましい。アセチル化反応の反応時間はアセチル化率、酸化率等により異なり一概に限定することはできないが、概ね６時間〜２日間でアセチル化は完了する。
【００２１】
このようにしてアセチル化された酸化キトサン化合物は、これを濾別し、ｐＨ１２以上のアルカリ溶液とした後、透析、限外濾過、イオン交換樹脂等により脱塩する。必ずしも高純度品である必要がないときは、そのまま噴霧乾燥、静置乾燥等任意の乾燥手段により乾燥しても良い。
【００２２】
本発明酸化キトサン化合物を製造する方法としては、収率、作業性、原料入手容易性、製造設備の簡便性、その他経済性等から以上述べた方法が最良であるが、本発明酸化キトサン化合物は、他の方法によっても製造することができる。
【００２３】
以下、本発明酸化キトサン化合物の他の製造方法について詳記する。
先ずキトサンを有機溶媒に膨潤させる。
膨潤させる方法としては、キトサンに高濃度、例えば９９重量％以上のN,N-ジメチルホルムアルデヒドを加え、キトサンを分散させる。N,N-ジメチルホルムアルデヒド１００部に対し、概ねキトサン１〜１０部を添加分散させる。次にキトサンのアミノ基のモル数に対し２〜３倍モルの無水フタル酸を加え、１００〜１３０℃で１０〜１５時間反応させ常温に冷却した後、これに水、望ましくは脱イオン水を加え、上記反応により得られたＮ−フタロイル化キトサンを沈殿させる。この沈殿物を任意の手段により濾別する。次いでこれを５０〜１００℃で乾燥する。
【００２４】
無水フタル酸を使用する理由は、選択的にアミノ基を保護することにある。この乾燥N-フタロイル化キトサンを高濃度例えば９９重量％以上のピリジン溶液に溶解する。溶解量はピリジン１００部に対し、概ねN-フタロイル化キトサン１〜１０部を添加溶解する。
【００２５】
続いて、この溶解液にトリチルクロライドを添加する。トリチルクロライドの添加量は６位の炭素、即ちＣＨ2ＯＨ基モル数に対し１〜３倍モルであり、１倍モル以下の場合６位の炭素を充分に保護することができない。尚、トリチルクロライドは粉末状で加えても良いし、溶液として加えても良い。反応温度としては８０〜９５℃、反応時間は２０〜２４時間である。
この溶液を室温まで冷却後、続いて３位の炭素のＯＨ基を保護するために無水酢酸を添加する。無水酢酸の使用量はこのＯＨ基モル数に対し、１〜４倍モルである。１モル倍以下の場合３位の炭素を充分に保護することができない。
【００２６】
反応温度は常温で、反応時間は１０〜１４時間で充分である。反応後の溶液に全量が沈殿するに充分な水、望ましくは脱イオン水を加え、沈殿物を生成させ、これを濾別、乾燥（５０〜１００℃）し、N-フタロイル-3-O-アセチル-6-O-トリチルキトサンを得る。この反応過程で極めて重要なことは、先ず６位の炭素を保護し、次いで３位の炭素を保護することである。逆順の場合６位の炭素と３位の炭素がアセチル化され本発明の酸化キトサン化合物を得ることができない。
【００２７】
次いで、上記方法により得たN-フタロイル-3-O-アセチル-6-O-トリチルキトサンを酢酸水溶液に懸濁する。酢酸濃度としては略６．０〜１２．０モル濃度であり、この酢酸水溶液１００部に対し、N-フタロイル-3-O-アセチル-6-O-トリチルキトサン１．５部を添加し乾燥する。酢酸溶液に添加する理由は保護基である６位の炭素のトリチル基を脱保護することにある。反応温度は４０〜８０℃、反応時間は１０〜１４時間が良い。脱保護をする酸としては上記酢酸の他、塩酸、硫酸、シュウ酸、クエン酸等の鉱酸、有機酸を利用することもできる。脱保護により得られたN-フタロイル-3-O-アセチルキトサンを濾別、乾燥(５０〜１００℃）し、乾燥N-フタロイル-3-O-アセチルキトサンを得る。
【００２８】
次いで、この乾燥N-フタロイル-3-O-アセチルキトサンの６位の炭素を酸化する。酸化方法としてはＣＨ2ＯＨ（６位炭素）のモル数に対し１〜３倍モルの次亜塩素酸を加え、常温で０．５〜３時間酸化反応を行う。次亜塩素酸濃度としては１０〜２０重量％のものを使用する。酸化剤としては上記次亜塩素酸の他、過マンガン酸ナトリウム、過酸化水素、過塩素酸、硝酸等を利用することができる。また、酸化に際しては触媒を使用することが好ましく、触媒としてはルテニウム、タングステン、ニッケル等が推奨されるが、これらに限定されるものではない。酸化物はクロロホルムにより抽出する。クロロホルムの使用量は酸化物１〜１０部に対し、概ね１００〜２００部である。
クロロホルム抽出後、エバポレーターで溶媒を除去し、クロロホルム抽出物を５０〜１００℃で乾燥し、N-フタロイル-3-O-アセチルキトサン酸化物を得る。
【００２９】
次に６〜１０モル濃度のヒドラジン１００〜２００部にN-フタロイル-3-O-アセチルキトサン酸化物１〜１０部を懸濁し、８０〜９０℃で３０〜３５時間反応させアミノ基の保護基となっているフタロイル基をアミノ基から完全に分離・脱保護する。反応終了後、これを常温に冷却し、これに水、望ましくは脱イオン水を加え3-O-アセチルキトサン酸化物を完全に沈殿させる。これを濾別し、濾別ケーキ（乾物換算）１０部に対し、５〜１０モル濃度のアルカリ剤を添加攪拌し、常温で１０〜１４時間脱アセチル化反応を行わせ、３位の炭素のアセチル基を脱保護化する。使用するアルカリ剤としては水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア水、アルカノールアミン等が好例として挙げられる。脱保護化後の酸化キトサンを濾別する。濾別後の酸化キトサンは乾燥し、アミノ基のアセチル化に供せられる。アセチル化は前記の方法を踏襲すればよい。
【００３０】
さて、本発明に於いてアセチル化率、分子量、溶解度等は以下の方法により測定した。
〔酸化キトサン化合物のアセチル化率の測定方法〕
1ＨＮＭＲを使用し３ｐｐｍ付近に現れる２位のプロトンシグナルの積分値をＡ、２ｐｐｍ付近に現れるＮ−アセチル基のメチルプロトンの積分値をＢとすると次式の関係が成立する。Ａ：Ｂ＝Ｘ：３（１−Ｘ）・・・（１）、ＤＤＡ＝｛３Ａ／（Ｂ＋３Ａ）｝×１００・・・（２）。上記式（１）及び（２）よりＤＤＡを算出する。但し、ＤＤＡ：脱アセチル化率、Ｘ：ＤＤＡ／１００。
【００３１】
［分子量の測定法］
分子量測定には(株)島津製作所製液体クロマトグラフLC-6Aを使用し、カラムには旭化成工業(株)Asahipac GS510M、GS510H、GS310H、GS220Hを連結させたGPCカラムを使用した。検出器には(株)島津製作所製RIDetector RID-2Aを使い、標準物質として昭和電工(株)製Pullulan P-800、P-200、P-100、P-50、P-20、P-10、P-5、Ｎ-acetyl-D-glucosamine（和光純薬工業(株)製）を用いて検量線を作成し、分子量を算出した。
【００３２】
［溶解度の測定法］
サンプルを所定量精秤し、これを１モル濃度の水酸化ナトリウム水溶液２５ｍｌに加え、よく攪拌し、各ｐＨ（１モル濃度の塩酸をゆっくり、０．０１ｍｌずつ滴下することにより調整）に於ける懸濁液の透過度（波長６００ｎｍで測定）が９０％以上の場合を溶解していると判定した。
【００３３】
［６位の炭素の酸化率測定法］
サンプル１０ｍｇを０．１モル濃度の水酸化ナトリウム水溶液１０ｍｌに溶解し、これをアセトン：水＝２０：１（重量比）の溶液５０ｍｌに投入し析出させた。これを遠心分離で上澄みと沈殿物に分離した。同様の析出操作を１０回繰り返し未反応の水酸化ナトリウムを除去した。得られたＮａ型の酸化キトサン化合物を５０℃で２４時間乾燥した。これを１モル濃度の塩酸１０ｍｌに溶解し完全にＮａを遊離させた後、ICP(Inductively Coupled Plasma：誘導結合型プラズマ)発光分析装置を用いてＮａ量を測定しＮａ量から６位の炭素の酸化率を算出した。
【００３４】
さて、本発明酸化キトサン化合物の溶解性について述べると、本発明酸化キトサン化合物の溶解性は６位の炭素の酸化率とアセチル化率によりｐＨ７近傍を中心に大きく変化する。
例えばアセチル化率が一定の場合ｐＨ７近傍においては酸化率が大きくなる程溶解性は大きくなる。ｐＨ７近傍以下、即ちほぼｐＨ６以下においては酸化率が一定の場合アセチル化率が小さい程溶解性は大きくなる。
一方、ｐＨ７近傍以上、即ちほぼｐＨ８以上においてはアセチル化率が一定の場合、酸化率が大きい程溶解性は大きくなる。
ところで、前記の如く、本発明酸化キトサン化合物の酸化率は、
【００３５】
【化５】
0004395573.tif 000004
及び
【００３６】
【化６】
0004395573.tif 000005
の式中ＣＨ2ＯＨ基のＣＯＯＸ基への酸化率が１〜１００モル％であり、１モル％以下になると特にアルカリ側での溶解度が小さくなる。また
【００３７】
【化７】
0004395573.tif 000006
式中ＮＨ２基のＮＨＣＯＣＨ3基への変換・即ちアセチル化率が４０モル％以下においても上記と同様特にアルカリ側での溶解度が小さくなる。またアセチル化率が９５モル％を上廻ると、酸性側での溶解度が極めて小さくなる。
【００３８】
本発明酸化キトサン化合物は前記のとおり、ｐＨ７近傍での溶解度が高いことに特にその特徴を有し、一般的には酸化率６０〜８０モル％、アセチル化率２０〜３０％の範囲で溶解度は最も大きくなり、例えばｐＨ７の水に対して、分子量３０，０００の場合１〜３ｇ／１００ｇの溶解度を有する。
【００３９】
次に本発明酸化キトサン化合物の分子量について言及すれば、重量平均分子量５，０００以上である。重量平均分子量５，０００以下では、ある程度の溶解性を有し、本発明の如き反応処理を必要としないことによる。尚、一般的に重量平均分子量が大きくなる程、全てのｐＨ領域に於いて溶解性は小さくなる。
【００４０】
本発明酸化キトサン化合物は広範囲のｐＨ領域において溶解性を有するため、創傷治癒促進剤、腫瘍増殖抑制剤、鎮痛抑制剤、ガン細胞転移抑制剤等の医療用材料、保湿材、皮膜剤、肌荒れ防止等の化粧品添加物等の用途において特に有用であるが、これらの用途に限定されるものではない。以下に本発明の実施例を挙げ更に説明するが、これら実施例に限定されるものではない。尚、％は特に断らない限り重量％を表す。
【００４１】
【実施例】
[実施例１]
脱アセチル化率１００％のキトサン１ｇに１．８モル濃度酢酸３０ｍｌを添加し、２０℃で２時間攪拌し完全に溶解させた。これに１２．６モル濃度酢酸２４ｍｌを加え攪拌し、エバポレーターで水分を除去し全量が２０ｍｌになるまで濃縮した。これに１６．６モル濃度酢酸８０ｍｌを加えキトサン酢酸懸濁液１００ｍｌを調製した。キトサン酢酸懸濁液を攪拌しながら、６モル濃度過塩素酸１．２ｍｌを滴下しキトサン過塩素酸塩とした。この時系内はゼリー状のゲルになった。これを攪拌して懸濁状態にし、無水クロム酸１．６ｇを添加し、２時間反応させた。得られた酸化キトサン懸濁液を遠心分離により分離し、酸化キトサン全量を蒸留水６０ｍｌに溶解した。溶解後１モル濃度水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ１２に調整し、１時間攪拌した。得られた溶液を分画分子量３，０００の透析膜を有する透析装置を用いｐＨ７になるまで約３日間透析を行った。ｐＨ７の透析液を凍結乾燥し、酸化キトサン０．８５ｇを得た。
【００４２】
得られた酸化キトサンを、１モル濃度水酸化ナトリウム水溶液２０ｍｌに溶解させ、これに８０ｍｌのメタノールを加え攪拌した。その溶液に無水酢酸０．５ｍｌを添加し室温で１２時間反応した。これを１モル濃度水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ７になるまで中和し、エバポレーターでメタノールを除去した後、１モル濃度水酸化ナトリウム水溶液で再度ｐＨ１２に調整し、再び１時間攪拌した。得られた溶液を分画分子量３，０００のセルロース透析膜を有する透析装置を用いｐＨ７になるまで約３日間透析を行った。ｐＨ７の透析液を凍結乾燥し本発明の酸化キトサン化合物０．８ｇを得た。この化合物をＩＣＰ発光分析装置を使用し測定した結果、カルボキシ基への変換率即ち、酸化率は３０モル％であった。ＮＭＲでアセチル化率を測定した結果アセチル化率７０モル％であった。また重量平均分子量は６７，０００であった。さらに酸化キトサン化合物０．１ｇをｐＨ７、温度２５℃の水１０ｇに溶解させたところ完全に溶解した。
【００４３】
尚、得られた酸化キトサン化合物の６位の炭素は、ＣＯＯＮａ型である。そこで、次に６位の炭素のＣＯＯＨ型を得るため、次の操作を行い溶解性を調べた。即ち、上記で得られた酸化キトサン化合物の０．１ｇを１モル濃度塩酸水溶液５０ｍｌに溶解させた。この溶液を分画分子量３，０００の透析膜を有する透析装置を用い、ｐＨ７になるまで約３日間透析を行った。
ｐＨ７の透析液を凍結乾燥し、ＣＯＯＨ型の酸化キトサン化合物０．０９ｇを得た。この得られた酸化キトサン化合物０．０２ｇをｐＨ７、温度２５℃の水１０ｇに溶解させたところ完全に溶解した。このようなＣＯＯＨ型の酸化キトサン化合物は、塩の影響で物性が変化しやすい薬剤への配合には極めて有用である。
また、６位の炭素のＣＯＯＫ型を望むときは、上記に於ける水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ１２に調整することに代えて、水酸化カリウムで同様の調整を行えばよい。
【００４４】
[実施例２]
脱アセチル化率１００％のキトサン１ｇを蒸留水１００ｍｌに懸濁させ、これに2,2,6,6-テトラメチル-1-ピペリジン・オキソアンモニウム５０ｍｇを添加し、反応中はｐＨ１０．８に保ち２時間反応させた。得られた生成物を遠心分離により分離した。得られた生成物に１モル濃度水酸化ナトリウム４０ｍｌを添加し、１時間攪拌し溶解させた。得られた溶液を分画分子量３，０００のセルロース透析膜を有する透析装置を用いｐＨが７になるまで約３日間透析を行った。十分透析した透析液を凍結乾燥し、酸化キトサン０．８５ｇを得た。
【００４５】
得られた酸化キトサンを１モル濃度水酸化ナトリウム２０ｍｌに溶解させ、８０ｍｌのメタノールを加え、さらに攪拌した。この溶液に無水酢酸０．５ｍｌを添加して室温で１２時間反応した。これを１モル濃度水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ７になるまで中和しエバポレーターでメタノールを除去した後、１モル濃度水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ１２に調製し、再び１時間攪拌した。得られた溶液を分画分子量３，０００のセルロース透析膜を有する透析装置を用いｐＨ７になるまで約３日間透析を行った。ｐＨ７の透析液を凍結乾燥し、本発明酸化キトサン化合物０．８ｇを得た。この化合物をＩＣＰ発光分析装置で測定したところ、カルボキシ基への変換率、即ち酸化率は３５モル％であった。ＮＭＲでアセチル化率を測定した結果アセチル化率７０モル％であった。また重量平均分子量は９８，０００であった。さらに酸化キトサン化合物０．１ｇをｐＨ７、温度２５℃の水１０ｇに溶解させたところ完全に溶解した。
【００４６】
[比較例１]
アセチル化率１００％のキチン１．２５ｇを蒸留水１００ｍｌに懸濁させ、2,2,6,6-テトラメチル-1-ピペリジン・オキソアンモニウム５０ｍｇを添加し、反応中ｐＨを１０．８に保ち２時間反応させてキチンの６位のＣＨ2ＯＨ基を酸化した。得られた生成物を遠心分離により分離し、その生成物を１モル濃度の水酸化ナトリウム４０ｍｌに溶解させようと試みたが白濁し、ゲル状にはなったが溶解はしなかった。
【００４７】
[実施例３]
実施例１と同じ方法で酸化キトサンを調製した。酸化キトサン０．８４ｇを１モル濃度水酸化ナトリウム２０ｍｌに溶解させ、これに８０ｍｌのメタノールを加えさらに攪拌した。この溶液に無水酢酸０．３２ｍｌを添加し室温で１２時間反応した。これを１モル濃度水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ７に中和した後、エバポレーターでメタノールを除去した後１モル濃度水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ１２に調整し、再び１時間攪拌した。得られた溶液を分画分子量３，０００のセルロース透析膜を有する透析装置でｐＨ７になるまで約３日間透析を行った。ｐＨ７の透析液を凍結乾燥し、本発明酸化キトサン化合物０．８ｇを得た。この化合物をＩＣＰ発光分析装置で測定したところ、カルボキシ基への変換率、即ち酸化率は３５モル％であった。ＮＭＲでアセチル化率を測定した結果アセチル化率４０モル％の酸化キトサン化合物を得た。また重量平均分子量は６５，０００であった。酸化キトサン化合物０．０５ｇをｐＨ７、温度２５℃の水１０ｇに溶解させたところ完全に溶解した。
【００４８】
[比較例２]
実施例１と同じ方法で酸化キトサンを調製した。この酸化キトサンを１モル濃度水酸化ナトリウム２０ｍｌに溶解させ８０ｍｌのメタノールを加えさらに攪拌した。この溶液に無水酢酸０．２５ｍｌを添加し室温で１２時間反応した。これを１モル濃度水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ７に中和した後、エバポレーターでメタノールを除去した後、１モル濃度水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ１２に調整し再び１時間攪拌した。得られた溶液を分画分子量３，０００のセルロース透析膜を有する透析装置を用いｐＨ７になるまで約３日間透析を行った。ｐＨ７の透析液を凍結乾燥することにより本発明酸化キトサン化合物０．８ｇを得た。この化合物をＩＣＰ発光分析装置で測定したところ、カルボキシ基への変換率、即ち酸化率は３５モル％であった。ＮＭＲでアセチル化率を測定した結果、アセチル化率３５モル％の酸化キトサン化合物を得た。酸化キトサン化合物を０．０５ｇをｐＨ７、温度２５℃の水１０ｇに溶解させたところ溶解しなかった。
【００４９】
[実施例4]
実施例１と同じ方法でアセチル化率２０モル％のキトサンを酸化し、酸化キトサンを調整した。このアセチル化率２０％酸化キトサン０．８ｇを１モル濃度水酸化ナトリウム水溶液２０ｍｌに溶解させ８０ｍｌのメタノールを加え、さらに攪拌した。この溶液に無水酢酸０．４２ｍｌを添加し室温で１２時間反応した。１モル濃度水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ７に中和した後、エバポレーターでメタノールを除去し、さらに１モル濃度水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ１２に調製し、再び１時間攪拌した。得られた溶液を分画分子量３，０００のセルロース透析膜を有する透析装置を用い、ｐＨ７になるまで約３日間透析を行った。ｐＨ７の透析液を凍結乾燥し本発明酸化キトサン化合物０．８ｇを得た。この化合物をＩＣＰ発光分析装置で測定したところ、カルボキシ基への変換率即ち酸化率は３５％であった。ＮＭＲでアセチル化度を測定したところアセチル化率６０モル％（測定値は８０モル％であるが、キトサンがアセチル化率２０モル％であるからアセチル化率は６０モル％）である。また重量平均分子量６４，０００であった。さらに酸化キトサン化合物０．１ｇをｐＨ７、温度２５℃の水１０ｇに溶解させたところ完全に溶解した。
【００５０】
[実施例５]
酸化剤である無水クロム酸の添加量を０．６ｍｌにし、反応時間を０．３時間としたことを除いては実施例１と同様の方法により本発明酸化キトサン化合物を製造した。得られた酸化キトサン化合物をＩＣＰ発光分析装置で測定したところカルボキシル基への変換率、即ち酸化率は１モル％であり、アセチル化率は７０モル％であった。また重量平均分子量は７２，０００であった。酸化キトサン化合物０．０２ｇをｐＨ７、温度２５℃の水１０ｇに溶解させたところ完全に溶解した。
【００５１】
[比較例３]
酸化剤である無水クロム酸の添加量を０．３ｍｌにし、反応時間を０．３時間としたことを除いては実施例１と同様の方法により酸化キトサン化合物を製造した。得られた酸化キトサン化合物をＩＣＰ発光分析装置で測定したところカルボキシル基への変換率、即ち酸化率は０．５モル％であり、アセチル化率７０モル％であった。酸化キトサン化合物０．０２ｇをｐＨ７、温度２５℃の水１０ｇに溶解させたところ大半が沈殿した。
【００５２】
[実施例６]
脱アセチル化率１００％のキトサン４ｇに濃度９９．８重量％のN,N-ジメチルホルムアミド１００ｍｌを添加し室温で２時間攪拌し完全に分散させた。これに無水フタル酸７．３ｇを加え反応容器に還流管を接続し１３０℃で１２時間反応させた。全量を４℃に冷却した脱イオン水５００ｍｌに注ぎN-フタロイル化キトサンを沈殿させた。これを遠心分離により分離し、１１０℃で１２時間乾燥した。得られた乾燥N-フタロイル化キトサンに濃度９９．８重量％のピリジン１００ｍｌを添加し、室温で２時間攪拌し完全に溶解させた。これにトリチルクロライド１３．８ｇを加え反応容器に還流管を接続し９０℃で２４時間反応後、室温まで冷却させた。冷却後無水酢酸５ｍｌを加え室温で12時間反応させた。これに脱イオン水５００ｍｌを加え、N-フタロイル-3-O-アセチル-6-O-トリチルキトサンを沈殿させた。得られたN-フタロイル-3-O-アセチル-6-O-トリチルキトサンを遠心分離機により分離し、１１０℃で１２時間乾燥した。
【００５３】
得られた生成物の全量を１０モル濃度酢酸水溶液１００ｍｌに懸濁させ６０℃で１２時間攪拌した。反応後１モル濃度水酸化ナトリウムでｐＨ７に中和し遠心分離により分離し、１１０℃で１２時間乾燥した。
得られたN-フタロイル-3-O-アセチルキトサンに１３重量％の次亜塩素酸２７．５ｍｌ、ルテニウム触媒１０ｍｇを加え室温で２時間反応させた。次いで得られた酸化物は１００ｍｌクロロホルムにより抽出した。クロロホルム抽出後、エバポレーターで溶媒を除去し、クロロホルム抽出物を約７０℃で乾燥しN-フタロイル-3-O-アセチルキトサン酸化物を得た。次に１０モル濃度のヒドラジン１００ｍｌにN-フタロイル-3-O-アセチルキトサン酸化物を懸濁させ、９０℃で３０時間反応させアミノ基の保護基となっているフタロイル基をアミノ基から完全に分離・脱保護した。反応終了後、これを室温に冷却し、脱イオン水５００ｍｌに加え3-O-アセチルキトサン酸化物を完全に沈殿させた。これを濾別し、１０モル濃度の水酸化ナトリウム水溶液１００ｍｌを加え、室温で１４時間攪拌し、脱アセチル化反応を行わせ、３位の炭素のアセチル基を脱保護した。脱保護後の酸化キトサンを遠心分離により濾別した。これを１１０℃で１２時間乾燥し酸化キトサンを得た。
【００５４】
得られた酸酸化キトサンを蒸留水８０ｍｌに分散させた後、１モル濃度水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ１２に調整し１時間攪拌した。得られた溶液を分画分子量３，０００のセルロース透析膜を有する透析装置を用いｐＨ７になるまで約３日間透析を行った。ｐＨ７の透析液を凍結乾燥し、酸化キトサンを得た。
【００５５】
得られた酸化キトサン０．８５ｇを１モル濃度水酸化ナトリウム水溶液２０ｍｌに溶解させ、８０ｍｌのメタノールを加えさらに攪拌した。その溶液に無水酢酸０．５ｍｌを添加し、室温で１２時間反応した。これを１モル濃度水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ７になるまで中和し、エバポレーターでメタノールを除去した後１モル濃度水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ１２に調整し、１時間攪拌した。得られた溶液を分画分子量３０００のセルロース透析膜を有する透析装置を用い、ｐＨ７になるまで約３日間透析を行った。ｐＨ７の透析液を凍結乾燥し、本発明酸化キトサン化合物０．８ｇを得た。この化合物をＩＣＰ発光分析装置で置換度を測定したところ、カルボキシ基への変換率、即ち酸化率は５０モル％であった。ＮＭＲでアセチル化率を測定したところアセチル化率７０モル％の酸化キトサン化合物を得た。尚、重量平均分子量は８３，０００であった。
酸化キトサン化合物０．１ｇをｐＨ７、温度２５℃の水１０ｇに溶解させたところ完全に溶解した。
【００５６】
[実施例７]
実施例１と同様の方法により酸化率、アセチル化率の異なる各種酸化キトサン化合物を製造し、各ｐＨに於ける溶解性を実施例１と同様の方法により測定した結果、表１の通りであった。尚、溶解性はサンプルＮｏ．１〜３に於いてそれぞれサンプル０．０５ｇ、０．１ｇ、０．２ｇを温度２５℃の水に溶解した場合である。
【００５７】
【表１】
0004395573.tif 000007
注）ｐＨは塩酸と水酸化ナトリウム水溶液で調整した
【００５８】
【発明の効果】
本発明酸化キトサン化合物は広範囲のｐＨ領域において溶解し、特にｐＨ７近傍で高い水溶性を有するため、これを医療用材料として使用するときは甚だ利便性がよい。