(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載の、４−ハロアセト酢酸エステルに作用し、（Ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルを生成する酵素活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号：１に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
（ｅ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列と８０%以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、
【請求項２】
請求項１に記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質。
【請求項３】
請求項１に記載のポリヌクレオチドが挿入された組換えベクター。
【請求項４】
更にβ-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを補酵素とする酸化還元反応を触媒することができる脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドが挿入された、請求項３に記載の組換えベクター。
【請求項５】
請求項１に記載のポリヌクレオチド、または請求項３に記載のベクターを発現可能に保持した形質転換体。
【請求項６】
請求項５に記載の形質転換体を培養し、４−ハロアセト酢酸エステルに作用し、（Ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルを生成する酵素活性を有する蛋白質、またはそれを含む画分を回収する工程を含む請求項２に記載の蛋白質の製造方法。
【請求項７】
請求項２に記載の蛋白質、又は、請求項５に記載の形質転換体を破砕することによって得た無細胞抽出液をケトンに作用させ、該ケトンを還元してアルコールを製造することを特徴とする、アルコールの製造方法。
【請求項８】
ケトンが、４-ハロアセト酢酸エステル誘導体であり、アルコールが(S)-４-ハロ-３-ヒドロキシ酪酸エステル誘導体である請求項７に記載のアルコールの製造方法。
【請求項９】
４-ハロアセト酢酸エステル誘導体が４-クロロアセト酢酸エチルエステルであり、アルコールが(S)-４-クロロ-３-ヒドロキシ酪酸エチルエステルである請求項８に記載のアルコールの製造方法。
【請求項１０】
更に付加的に酸化型β-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを還元型に変換する工程を含むことを特徴とする請求項７に記載のアルコールの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、光学活性アルコール、特に、（Ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルの製造に有用な新規な４−ハロアセト酢酸エステル還元酵素、該酵素蛋白質をコードするDNA、該酵素の製造方法、該酵素を用いたアルコール、特に（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エステル誘導体を製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、光学活性（Ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルの製造方法としては、次のような方法が知られている。
パン酵母など微生物を用いた不斉還元法
J.Am.Chem.Soc.,105,5925-5926(1983)
特開昭61-146191号公報等
３α−ヒドロキシステロイド脱水素酵素など酵素を用いた不斉還元法
特開平1-277494号公報
微生物に由来する４−ハロアセト酢酸エステルを還元し（Ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルを生成する酵素の遺伝子をクローニングし、大腸菌に於いて該遺伝子を発現させた組換え大腸菌により、４−ハロアセト酢酸エステルを還元し（Ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルを製造する方法等
WO 9835025
特開2000-236883
【０００３】
また、本発明者らは、大腸菌（Escherichia coli）及び枯草菌（Bacillus subtilis）由来のβ-ケトアシル-ACP還元酵素（以下、KRと省略することがある）が４−ハロアセト酢酸エステルを還元し、（Ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルを合成することを確認している。そして該酵素を利用した、（Ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステル合成法を確立した。脂肪酸合成酵素のうち、II型の脂肪酸合成酵素（新生化学実験講座４脂質Ｉ, p34-37）を構成するKRは、サブユニットの分子量が20,000 - 40,000程度で、分子量が小さい。また、これらのKRは、SH試薬で阻害されにくい特徴を有する。
【０００４】
更に本発明者らは、アルカリゲネス・ユートロファスや、ズーグロエア・ラミゲーラ(Zoogloea ramigera)の生産するアセトアセチル-CoA還元酵素が、４−ハロアセト酢酸エステルを還元し、（Ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルを合成する活性を有することを確認してきた（特開2000-189170）。アセトアセチル-CoA還元酵素（以下ARと省略することがある）をコードする遺伝子は、一般にphbB、あるいはphaBと省略される。また一般にKRをコードする遺伝子は、fabGと省略される。phbB、あるいはphaBは、fabGにホモロジーの高いポリβ−ヒドロキシ酸合成酵素(PHS)遺伝子を取得することにより、見出された。なおアルカリゲネス・ユートロファスは、現在はラルストニア・ユートロファ(Ralstonia eutropha)と呼ばれている。
しかしながら、公知の酵素を用いた方法は、いずれも酵素の安定性が低い、生産物の生産性が低い、あるいは生成物の蓄積濃度が低いなどの問題点を有していた。（Ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルの酵素的な合成を工業的に実施するには、これらの問題点の改善が望まれる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、（Ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルの製造に有用な、新規な４−ハロアセト酢酸エステル還元酵素をコードするDNAを取得する方法、新規な４−ハロアセト酢酸エステル還元酵素をコードするDNA、該DNAによりコードされる酵素、該酵素を利用した（Ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルの製造方法を提供することを課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、II型の脂肪酸合成酵素を構成するKRは、微生物、ウイルス、あるいは植物等に広く分布する可能性が高いことに着目した。したがって、通常の培養方法では生育しない微生物を含めた、種々の生物に由来するβ-ケトアシル-ACP還元酵素を取得できれば、その中から、有利な性状を備えた酵素を見出すことが可能になると考えた。より具体的には、有機溶媒耐性、安定性、立体選択性、あるいは組換え微生物による生産性に優れた酵素を取得することができるのではないかと考えた。
【０００７】
このような予測に基づいて、本発明者らは、公知のKRをコードする遺伝子(fabG)を解析して、比較的保存された領域を見出した。そしてこの部分に対応したPCRプライマーを合成し、fabG遺伝子の報告されていない微生物ゲノムDNAを鋳型としてPCRを行い、fabG遺伝子の一部を取得することができた。更に得られた遺伝子の塩基配列を利用して、fabG遺伝子の全領域をクローニングし、大腸菌などの宿主を用いて発現させた。その結果、発現した酵素が４−ハロアセト酢酸エステルを還元し、（Ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルを生成することを確認し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち本発明は、（Ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルの製造に有用な４−ハロアセト酢酸エステル還元酵素遺伝子を取得する方法、取得された遺伝子、該遺伝子によりコードされる４−ハロアセト酢酸エステル還元酵素、及びこれを利用した光学活性アルコールの製造方法に関する。
〔１〕 配列番号：３、および配列番号：４に記載の塩基配列、またはそれらの相補配列に相補的な少なくとも１５塩基の連続した塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの組み合わせからなる、４−ハロアセト酢酸エステルに作用し、（Ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルを生成する酵素活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の合成用プライマーセット。
〔２〕 以下の工程を含む、４−ハロアセト酢酸エステルに作用し、（Ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルを生成する酵素活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の取得方法。
（ａ）〔１〕に記載のプライマーセットを用い、生物に由来するポリヌクレオチドを鋳型としてPCRを行う工程、
（ｂ）工程（ａ）の増幅生成物を採取する工程、
（ｃ）前記増幅生成物の塩基配列を含み、かつ目的とする酵素活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を取得する工程、
〔３〕 生物が好熱性微生物である〔２〕に記載の方法。
〔４〕 下記（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載の、４−ハロアセト酢酸エステルに作用し、（Ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルを生成する酵素活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号：１に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
（ｅ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列と８０%以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、
〔５〕 〔４〕に記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質。
〔６〕 〔４〕に記載のポリヌクレオチドが挿入された組換えベクター。
〔７〕 更にβ-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを補酵素とする酸化還元反応を触媒することができる脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドが挿入された、〔６〕に記載の組換えベクター。
〔８〕 〔４〕に記載のポリヌクレオチド、または〔６〕に記載のベクターを発現可能に保持した形質転換体。
〔９〕 〔８〕に記載の形質転換体を培養し、４−ハロアセト酢酸エステルに作用し、（Ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルを生成する酵素活性を有する蛋白質、またはそれを含む画分を回収する工程を含む〔５〕に記載の蛋白質の製造方法。
〔１０〕 〔５〕に記載の蛋白質、該蛋白質を産生する微生物、もしくは該微生物の処理物、をケトンに作用させ、該ケトンを還元してアルコールを製造することを特徴とする、アルコールの製造方法。
〔１１〕 前記微生物が〔８〕に記載の形質転換体である〔１０〕に記載のアルコールの製造方法。
〔１２〕 ケトンが、４-ハロアセト酢酸エステル誘導体であり、アルコールが(S)-４-ハロ-３-ヒドロキシ酪酸エステル誘導体である〔１０〕に記載のアルコールの製造方法。
〔１３〕 ４-ハロアセト酢酸エステル誘導体が４-クロロアセト酢酸エチルエステルであり、アルコールが(S)-４-クロロ-３-ヒドロキシ酪酸エチルエステルである〔１２〕に記載のアルコールの製造方法。
〔１４〕 更に付加的に酸化型β-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを還元型に変換する工程を含むことを特徴とする〔１０〕に記載のアルコールの製造方法。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明において、４−ハロアセト酢酸エステルに作用し、（Ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルを生成する酵素活性を有する酵素を、４−ハロアセト酢酸エステル還元酵素と言う。本発明による４−ハロアセト酢酸エステル還元酵素は、４−ハロアセト酢酸エステルの3位カルボニル基を還元し、（Ｓ）配置の水酸基を生成することによって特徴付けられる。本発明において、４−ハロアセト酢酸エステル還元酵素活性は、４−クロロアセト酢酸エチル対する還元活性で表され、次のようにして確認することができる。
【００１０】
４−クロロアセト酢酸エチルに対する還元活性測定法:
100mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.5)、0.2mM還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以下、ＮＡＤＰＨと略す）、20mM ４−クロロアセト酢酸エチル及び酵素を合む反応液中30℃で反応させ、ＮＡＤＰＨの減少にともなう340nmの吸光度の減少を測定する。1Uは、１分間に１μmolのＮＡＤＰＨの減少を触媒する酵素量とする。また、蛋白質の定量は、バイオラッド製蛋白質アッセイキットを用いた色素結合法により行う。
【００１１】
本発明は、４−ハロアセト酢酸エステル還元酵素をコードする遺伝子の取得用プライマーセットに関する。本発明におけるプライマーセットは、配列番号：３、および配列番号：４に記載の塩基配列、またはそれらの相補配列に相補的な少なくとも１５塩基の連続した塩基配列を含むオリゴヌクレオチドの組み合わせからなる。本発明において「相補配列」とは、A:T、G:Cの塩基対からなる2本鎖DNAの一方の鎖に対する他方の鎖を構成する塩基配列を指す。また、「相補的」とは、少なくとも15個の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、少なくとも70% 、好ましくは少なくとも80% 、より好ましくは90% 、さらに好ましくは95% 以上の塩基配列上の相同性を有すればよい。相同性を決定するためのアルゴリズムはBLASTN等の公知のものを使用すればよい。
【００１２】
本発明者らは、既知のデータベース（SWISS-PROTなど）に記載されているβ−ケトアシルACP還元酵素遺伝子(fabG)のアラインメントを行って、図１の□で囲んだ領域において、生物種を越えてアミノ酸配列が保存されていることを見出した。配列番号：３および配列番号：４に示す塩基配列は、この保存されたアミノ酸配列をコードする縮重配列(degenerative sequence)である。本発明者らは、この領域に対して設定した縮重プライマー(degenerative primer)を利用することにより、幅広い生物種に由来する４−ハロアセト酢酸エステル還元酵素をコードする遺伝子を合成可能であることを見出した。
【００１３】
本発明において、４−ハロアセト酢酸エステル還元酵素としては、β−ケトアシルACP還元酵素やアセトアセチル-CoA還元酵素等を挙げることができる。一方、これらの酵素をコードする遺伝子を取得するための生物種は、特に限定されない。特に、β−ケトアシルACP還元酵素遺伝子が知られていない、細菌、ウイルス、あるいは植物等は、新規な４−ハロアセト酢酸エステル還元酵素を取得するために有用である。中でも、好熱性の微生物に由来する酵素は、一般に高い安定性を期待できるので、工業的に用いる酵素の供給源として好適である。熱に対して安定な酵素蛋白質は、酵素の精製においても有利である。すなわち、粗精製酵素を加熱することにより、酵素蛋白質に夾雑する成分は、分解やアグリゲートの形成等の変性を起こす。このとき、熱安定性を有する酵素蛋白質は、変性しない。その結果、目的とする酵素蛋白質の精製が容易となるのである。
【００１４】
また本発明は、前記プライマーセットを用いる、４−ハロアセト酢酸エステル還元酵素をコードする遺伝子の取得方法に関する。本発明の方法は、適当な生物に由来する遺伝子を鋳型として、PCRを行うことにより、fabG遺伝子の一部（コア領域）を取得することができる。鋳型とする遺伝子は特に限定されない。たとえば、先に挙げた細菌、ウイルス、あるいは植物等の遺伝子を用いることができる。遺伝子としては、ゲノムDNA、ゲノムRNA、ｍRNA,あるいはcDNAを用いることができる。植物ゲノムのように、遺伝子がイントロンによって分断されている場合には、cDNAを鋳型とするのが有利である。PCRにおいては、Taq DNA polymerase (宝酒造) 、KOD DNA polymerase (東洋紡）、Pfu DNA polymerase（Strategene）などが利用可能であり、製品に添付された指示書に記載された標準的な条件で反応を行えばよい。
【００１５】
PCRにより特異的な産物が得られない場合には、アニール温度を37℃に下げ、アニール温度から伸長温度60℃まで１分間に10℃ずつ徐々に昇温し、60℃で伸長反応を行った後、熱処理を行うサイクルを５サイクル行い、その後は、アニール温度を45℃に上げ、伸長反応を70℃で行った後、熱処理を行うサイクルを25サイクル行うことにより特異的なバンドの増幅を行うことができる。また、非特異的なPCR産物が得られる場合には、Nested PCR (BioTechniques 18, 609-610 (1995)) 等の手法により特異的なPCR産物を得ることができる。
【００１６】
このようにして合成される遺伝子は、通常、４−ハロアセト酢酸エステル還元酵素をコードする遺伝子のうち、その5'側、および3'側の末端配列を欠く断片（コア）である。ある遺伝子の、断片の塩基配列情報に基づいて、目的とする遺伝子の全長を取得する方法は公知である。
たとえば逆PCR;inverse PCR（Genetics 120, 621-623 (1988)）に基づいて、断片の両側に隣接する塩基配列が未知の領域を取得することができる。inverse PCRにおいては、染色体DNAを適当な制限酵素で消化後、自己環化させたDNAを鋳型として用いる。環化したDNAを鋳型として、既知のDNAの外側に伸長させるためのPCRプライマーを使ってPCRを行えば、塩基配列が未知の領域を増幅することができる。また、RACE法（Rapid Amplification of cDNA End、「PCR実験マニュアル」p25-33, HBJ出版局）などにより、遺伝子の全長を取得することも可能である。
その他、前記プライマーを用いたPCRの増幅生成物をプローブとして、ゲノムライブラリーやcDNAライブラリーを、ハイブリダイズスクリーニングすることにより、目的とする遺伝子を含むクローンを選択することもできる。
【００１７】
本発明は、下記（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載の、４−ハロアセト酢酸エステルに作用し、（Ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルを生成する酵素活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドに関する。
（ａ）配列番号：１に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
（ｅ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列と８０%以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、
（ａ）および（ｂ）に記載のポリヌクレオチドに対して、（ｃ）〜（ｅ）に記載のポリヌクレオチドを、本発明においては特にホモログという。
本発明のポリヌクレオチドは、DNA、RNA、両者のキメラ、あるいは人工的なヌクレオチド誘導体を含むことができる。配列番号：１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドは、好熱性細菌であるバチルス・ステアロサーモフィラス IFO 12550株から取得した4-ハロアセト酢酸エステル還元酵素遺伝子の塩基配列である。配列番号：１に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチドは、同菌株から、配列番号：１に記載の塩基配列情報に基づいて、PCRやハイブリダイゼーションによって取得することができる。あるいは、完全に人工的に合成することもできる。配列番号：１に記載の塩基配列は、配列番号：２に記載のアミノ酸配列をコードしている。本発明のポリヌクレオチドには、配列番号：２に記載のアミノ酸配列をコードすることができる、あらゆるポリヌクレオチドが含まれる。
更に本発明は、本発明のポリヌクレオチドのホモログに関する。当業者であれば、配列番号：１記載のDNAに部位特異的変異導入法（Nucleic Acid Res. 10,pp.6487 (1982), Methods in Enzymol.100,pp.448 (1983), Molecular Cloning 2ndEdt., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), PCR A Practical Approach IRL Press pp.200(1991)）などを用いて、適宜置換、欠失、挿入、および／または付加変異を導入することによりホモログを得ることが可能である。
【００１８】
また、本発明のホモログは、配列番号：１に示される塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチドであって、かつ、４−ハロアセト酢酸エステルを還元し、（Ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルを生成する活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドも含む。
ストリンジェントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチドとは、配列番号：１に記載中の任意の少なくとも20個、好ましくは少なくとも30個、たとえば40、60または100個の連続した配列を一つまたは複数選択したDNAをプローブDNAとし、たとえばECL direct nucleic acid labeling and detection system (Amersham Pharmaica Biotech社製）を用いて、マニュアルに記載の条件（wash：42℃、0.5x SSCを含むprimary wash buffer）において、ハイブリダイズするポリヌクレオチドを指す。
【００１９】
さらに、本発明のホモログは、配列番号：２に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは95%以上のホモロジーを有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含む。蛋白質のホモロジー検索は、たとえばSWISS-PROT、PIRなどの蛋白質のアミノ酸配列に関するデータベースや DDBJ、EMBL、Gene-BankなどのDNA配列に関するデータベース、DNA配列を元にした予想アミノ酸配列に関するデータベースなどを対象に、BLAST、FASTAなどのプログラムを利用して、例えば、インターネットを通じて行うことができる。
【００２０】
配列番号：２に記載のアミノ酸配列を用いてSWISS-PROT、PIRなど蛋白質に関するデータベースを対象にBLAST programを用いてホモロジー検索を行った結果、既知の蛋白質の中でもっとも高いホモロジーを示したのは、ストレプトミセス・コエリカラー(Streptomyces coelicolor)A3(2)由来のputative short chain oxidoreductaseであり、機能未知のゲノム解析に由来する予想ORFであり、identityは58%、positiveは72%であった。本発明の80％以上のホモロジーとは、例えば、BLASTプログラムを用いたPositiveの相同性の値を表す。
本発明のポリヌクレオチドは、４−ハロアセト酢酸エステル還元酵素活性を有する蛋白質の製造に有用である。あるいは本発明のポリヌクレオチドは、４−ハロアセト酢酸エステル還元酵素活性を有する蛋白質を用いた、光学活性アルコールの製造に有用である。
【００２１】
本発明は、前記ポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質に関する。本発明の配列番号：２に示すアミノ酸配列を含む蛋白質は、本発明の蛋白質の好ましい態様を構成する。配列番号：２に示すアミノ酸配列は、配列番号：１に記載の塩基配列によってコードされている。一方、本発明において、前記（ｃ）〜（ｅ）に記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質を、本発明の蛋白質のホモログという。
【００２２】
本発明の蛋白質は、前記（ａ）〜（ｅ）に記載のポリヌクレオチドを宿主に導入して発現させることにより得ることができる。さらに、本発明の蛋白質のホモログとは、配列番号：２に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは95%以上のホモロジーを有する蛋白質が含まれる。蛋白質のホモロジー検索は、たとえばSWISS-PROT、PIRなどの蛋白質のアミノ酸配列に関するデータベースや DDBJ、EMBL、Gene-BankなどのDNA配列に関するデータベース、DNA配列を元にした予想アミノ酸配列に関するデータベースなどを対象に、BLAST、FASTAなどのプログラムを利用して、例えば、インターネット通じて行うことができる。
【００２３】
配列番号：２に記載のアミノ酸配列を用いてSWISS-PROT、PIRなどアミノ酸配列を蓄積したデータベースを対象にBLAST programを用いてホモロジー検索を行った結果、既知の蛋白質の中でもっとも高いホモロジーを示したのは、ストレプトミセス・コエリカラー(Streptomyces coelicolor)A3(2)由来のputative short chain oxidoreductaseであった。このアミノ酸配列は、機能未知のゲノム解析に由来する予想ORFであり、identityは58%、positiveは72%であった。本発明の80％以上のホモロジーとは、例えば、BLASTプログラムを用いたPositiveの相同性の値を表す。
【００２４】
本発明のポリヌクレオチドを公知の発現ベクターに挿入することにより、4-ハロアセト酢酸エステル還元酵素発現ベクターが提供される。また、この発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養することにより、本発明の4-ハロアセト酢酸エステル還元酵素を組換え体として得ることができる。
【００２５】
本発明において4-ハロアセト酢酸エステル還元酵素を発現させるために、形質転換の対象となる微生物は、4-ハロアセト酢酸エステル還元酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターにより形質転換され、4-ハロアセト酢酸エステル還元酵素活性を発現することができる生物であれば特に制限はない。利用可能な微生物としては、たとえば以下のような微生物を示すことができる。
エシェリヒア(Escherichia)属
バチルス(Bacillus)属
シュードモナス(Pseudomonas)属
セラチア(Serratia)属
ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属
コリネバクテリイウム(Corynebacterium)属
ストレプトコッカス(Streptococcus)属
ラクトバチルス(Lactobacillus)属など宿主ベクター系の開発されている細菌
ロドコッカス(Rhodococcus)属
ストレプトマイセス(Streptomyces)属など宿主ベクター系の開発されている放線菌
サッカロマイセス(Saccharomyces)属
クライベロマイセス(Kluyveromyces)属
シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属
チゴサッカロマイセス(Zygosaccharomyces)属
ヤロウイア(Yarrowia)属
トリコスポロン(Trichosporon)属
ロドスポリジウム(Rhodosporidium)属
ピキア(Pichia)属
キャンディダ(Candida)属などの宿主ベクター系の開発されている酵母
ノイロスポラ(Neurospora)属
アスペルギルス(Aspergillus)属
セファロスポリウム(Cephalosporium)属
トリコデルマ(Trichoderma)属などの宿主ベクター系の開発されているカビ
【００２６】
形質転換体の作製のための手順および宿主に適合した組換えベクターの構築は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うことができる（例えば、Sambrookら、モレキュラー・クローニング、Cold Spring Harbor Laboratories）。微生物中などにおいて、本発明の4-ハロアセト酢酸エステル還元酵素遺伝子を発現させるためには、まず微生物中において安定に存在するプラスミドベクターやファージベクター中にこのDNAを導入し、その遺伝情報を転写・翻訳させる必要がある。そのためには、転写・翻訳を制御するユニットにあたるプロモーターを本発明のDNA鎖の5'-側上流に、より好ましくはターミネーターを3'-側下流に、それぞれ組み込めばよい。このプロモーター、ターミネーターとしては、宿主として利用する微生物中において機能することが知られているプロモーター、ターミネーターを用いる必要がある。これら各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター、ターミネータ−などに関して「微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版」、特に酵母に関しては、Adv.Biochem.Eng. 43, 75-102 (1990)、Yeast 8, 423-488 (1992)、などに詳細に記述されている。
【００２７】
例えばエシェリヒア属、特に大腸菌エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)においては、プラスミドベクターとして、pBR、pUC系プラスミドを利用でき、lac(β−ガラクトシダーゼ)、trp(トリプトファンオペロン)、tac、 trc (lac、trpの融合)、λファージ PL、PRなどに由来するプロモーターなどが利用できる。また、ターミネーターとしては、trpA由来、ファージ由来、rrnBリボソーマルRNA由来のターミネーターなどを用いることができる。これらの中で、市販のpSE420（Invitrogen製）のマルチクローニングサイトを一部改変したベクターpSE420D（特開2000-189170に記載）が好適に利用できる。
【００２８】
バチルス属においては、ベクターとしてpUB110系プラスミド、pC194系プラスミドなどが利用可能であり、染色体にインテグレートすることもできる。また、プロモーター、ターミネーターとしてapr(アルカリプロテアーゼ)、npr(中性プロテアーゼ)、amy(α−アミラーゼ)などが利用できる。
【００２９】
シュードモナス属においては、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)、シュードモナス・セパシア(Pseudomonas cepacia)などで宿主ベクター系が開発されている。トルエン化合物の分解に関与するプラスミドTOLプラスミドを基本にした広宿主域ベクター(RSF1010などに由来する自律的複製に必要な遺伝子を含む）pKT240などが利用可能であり、プロモーター、ターミネーターとして、リパーゼ（特開平5-284973）遺伝子などが利用できる。
【００３０】
ブレビバクテリウム属特に、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム(Brevibacterium lactofermentum)においては、pAJ43(Gene 39, 281 (1985))などのプラスミドベクターが利用可能である。プロモーター、ターミネーターとしては、大腸菌で使用されているプロモーター、ターミネーターがそのまま利用可能である。
【００３１】
コリネバクテリウム属、特にコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)においては、pCS11(特開昭57-183799)、pCB101(Mol.Gen.Genet. 196, 175 (1984)などのプラスミドベクターが利用可能である。
【００３２】
ストレプトコッカス(Streptococcus)属においては、pHV1301(FEMS Microbiol. Lett. 26, 239 (1985)、pGK1（Appl.Environ.Microbiol. 50, 94 (1985)）などがプラスミドベクターとして利用可能である。
【００３３】
ラクトバチルス(Lactobacillus)属においては、ストレプトコッカス属用に開発されたpAMβ1（J.Bacteriol. 137, 614 (1979)）などが利用可能であり、プロモーターとして大腸菌で利用されているものが利用可能である。
【００３４】
ロドコッカス(Rhodococcus)属においては、ロドコッカス・ロドクロウス(Rhodococcus rhodochrous)から単離されたプラスミドベクターが使用可能である (J.Gen.Microbiol. 138,1003 (1992))。
【００３５】
ストレプトマイセス(Streptomyces)属においては、HopwoodらのGenetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratories (1985)に記載の方法に従って、プラスミドを構築することができる。特に、ストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans)においては、pIJ486 (Mol.Gen.Genet. 203, 468-478, 1986)、pKC1064(Gene 103,97-99 (1991))、pUWL-KS (Gene 165,149-150 (1995))が使用できる。また、ストレプトマイセス・バージニア(Streptomyces virginiae)においても、同様のプラスミドを使用することができる（Actinomycetol. 11, 46-53 (1997))。
【００３６】
サッカロマイセス(Saccharomyces)属、特にサッカロマイセス・セレビジアエ(Saccharomyces cerevisiae) においては、YRp系、YEp系、YCp系、YIp系プラスミドが利用可能であり、染色体内に多コピー存在するリボソームDNAとの相同組換えを利用したインテグレーションベクター（EP 537456など）は、多コピーで遺伝子を導入でき、かつ安定に遺伝子を保持できるため極めて有用である。また、ADH(アルコール脱水素酵素)、GAPDH(グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素)、PHO(酸性フォスファターゼ)、GAL(β−ガラクトシダーゼ)、PGK(ホスホグリセレートキナーゼ)、ENO(エノラーゼ)などのプロモーター、ターミネーターが利用可能である。
【００３７】
クライベロマイセス属、特にクライベロマイセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)においては、サッカロマイセス・セレビジアエ由来2μm系プラスミド、pKD1系プラスミド（J.Bacteriol. 145, 382-390 (1981)）、キラー活性に関与するpGKl1由来プラスミド、クライベロマイセス属における自律増殖遺伝子KARS系プラスミド、リボソームDNAなどとの相同組換えにより染色体中にインテグレート可能なベクタープラスミド（EP 537456など）などが利用可能である。また、ADH、PGKなどに由来するプロモーター、ターミネーターが利用可能である。
【００３８】
シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属においては、シゾサッカロマイセス・ポンベ由来のARS (自律複製に関与する遺伝子)及びサッカロマイセス・セレビジアエ由来の栄養要求性を相補する選択マーカーを含むプラスミドベクターが利用可能である（Mol.Cell.Biol. 6, 80 (1986)）。また、シゾサッカロマイセス・ポンベ由来のADHプロモーターなどが利用できる（EMBO J. 6, 729 (1987)）。特に、pAUR224は、宝酒造から市販されており容易に利用できる。
【００３９】
チゴサッカロマイセス属(Zygosaccharomyces)においては、チゴサッカロマイセス・ロウキシ(Zygosaccharomyces rouxii)由来の pSB3（Nucleic Acids Res. 13, 4267 (1985)）などに由来するプラスミドベクターが利用可能であり、サッカロマイセス・セレビジアエ由来 PHO5 プロモーターや、チゴサッカロマイセス・ロウキシ由来GAP-Zr(グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素)のプロモーター（Agri.Biol.Chem. 54, 2521 (1990)）などが利用可能である。
【００４０】
ピキア(Pichia)属においては、ピキア・アンガスタ（旧名：ハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)）において宿主ベクター系が開発されている。ベクターとしては、ピキア・アンガスタ由来自律複製に関与する遺伝子（HARS1、 HARS2）も利用可能であるが、比較的不安定であるため、染色体への多コピーインテグレーションが有効である（Yeast 7, 431-443(1991)）。また、メタノールなどで誘導される AOX（アルコールオキシダーゼ）、FDH(ギ酸脱水素酵素)のプロモーターなどが利用可能である。また、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)などにピキア由来自律複製に関与する遺伝子(PARS1、PARS2)などを利用した宿主ベクター系や染色体への多コピーインテグレーションベクター（Invitrogen社よりPichia Expression Kitとして市販されている）が開発されており（Mol.Cell.Biol. 5, 3376(1985)）、高濃度培養とメタノールで誘導可能なAOXなど強いプロモーターが利用できる（Nucleic Acids Res.15,3859(1987)）。
【００４１】
キャンディダ(Candida)属においては、キャンディダ・マルトーサ(Candida maltosa)、キャンディダ・アルビカンス(Candida albicans)、キャンディダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、キャンディダ・ウチルス (Candida utilis) などにおいて宿主ベクター系が開発されている。キャンディダ・マルトーサにおいてはキャンディダ・マルトーサ由来ＡＲＳがクローニングされ（Agri.Biol.Chem.51,51,1587(1987)）、これを利用したベクターが開発されている。また、キャンディダ・ウチルスにおいては、染色体インテグレートタイプのベクターは強力なプロモーターが開発されている（特開平 08-173170）。
【００４２】
アスペルギルス(Aspergillus)属においては、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、アスペルギルス・オリジー(Aspergillus oryzae)などがカビの中で最もよく研究されており、プラスミドや染色体へのインテグレーションが利用可能であり、菌体外プロテアーゼやアミラーゼ、アミダーゼ由来のプロモーターが利用可能である(Trends in Biotechnology 7, 283-287 (1989))。
【００４３】
トリコデルマ(Trichoderma)属においては、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)を利用した宿主ベクター系が開発され、菌体外セルラーゼ遺伝子由来プロモーターなどが利用できる(Biotechnology 7, 596-603 (1989))。
【００４４】
また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が開発されており、特に蚕を用いた昆虫(Nature 315, 592-594 (1985))や菜種、トウモロコシ、ジャガイモなどの植物中に大量に異種蛋白質を発現させる系が開発されており、好適に利用できる。
【００４５】
また本発明は、前記4-ハロアセト酢酸エステル還元酵素のケトンの還元によるアルコールの製造方法に関する。アルコールとしては、たとえば（Ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステル誘導体を挙げることができる。酵素分子、その処理物、酵素分子を含む培養物、あるいは酵素を生成する微生物等の形質転換体が生きた状態で反応溶液と接触させることにより、本発明の酵素反応を行わせることができる。なお、酵素と反応溶液の接触形態はこれらの具体例に限定されるものではない。
【００４６】
本発明において、反応溶液は、酵素反応に必要な基質や補酵素を酵素活性の発現に望ましい環境を与える適当な溶媒に溶解、もしくは混合・懸濁したものである。補酵素には、反応を触媒する4-ハロアセト酢酸エステル還元酵素が利用しうる補酵素を用いる。たとえば配列番号：２のアミノ酸配列からなる酵素は、補酵素として還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(以下、ＮＡＤＰＨと略す)を要求する。一方基質には、酵素反応によって目的とする化合物に変換される基質化合物を利用する。生成物であるアルコールと基質化合物の関係については、後で具体的に述べる。
【００４７】
本発明における4-ハロアセト酢酸エステル還元酵素を含む微生物の処理物には、具体的には界面活性剤やトルエンなどの有機溶媒処理によって細胞膜の透過性を変化させた微生物、あるいはガラスビーズや酵素処理によって菌体を破砕した無細胞抽出液やそれを部分精製したものなどが含まれる。
【００４８】
本発明によるアルコールの製造方法におけるケトンとしては、４−ハロアセト酢酸エステル誘導体が好適に用いられる。ハロゲンとしては、塩素、臭素、ヨウ素原子等が挙げられ、特に塩素原子が好ましい。また、エステルとしては、メチルエステル、エチルエステル、プロピルエステル、イソプロピルエステル、ブチルエステル等の低級アルキルエステルが挙げられ、特にエチルエステルが望ましい。また、４−ハロゲン化アセト酢酸エステル誘導体としては、β位にハロゲン置換を含んでも良い低級アルキル基、ハロゲン等の置換を持つ誘導体も含まれる。
【００４９】
上記還元反応に付随して生成する酸化型の補酵素は、酵素反応によって再び還元型として再生することができる。たとえばＮＡＤＰＨから生成する酸化型のニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以下、ＮＡＤＰ＋と略す）は、酵素的にＮＡＤＰＨへ再生することができる。ＮＡＤＰＨへの再生は、微生物の持つＮＡＤＰ＋還元能（解糖系、メチロトローフのＣ１化合物資化経路など）を用いて行うことができる。これらＮＡＤＰ＋還元能は、反応系にグルコースやエタノール、ギ酸などを添加することにより増強することが可能である。また、ＮＡＤＰ＋からＮＡＤＰＨを生成する能力を有する微生物やその処理物、酵素を反応系に添加することによっても行うことができる。
【００５０】
たとえば、グルコース脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素、有機酸脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素など）、ヒドロゲナーゼ（アルカリゲネス(Alcaligenes)属、クロストリジウム属(Clostridium)などが生産する水素を電子供与体としてＮＡＤＰ＋還元反応を行う酵素(Biotechnol.Bioeng. 27, 1277-1281 (1985), Biocatal.Bioteransform. 15, 281-296 (1997))などを含む微生物、その処理物、ならびに部分精製もしくは精製酵素を用いて補酵素を再生することができる。このような再生に必要な反応を構成する成分は、本発明によるアルコールの製造のための反応系に添加する、固定化したものを添加する、あるいは補酵素の交換が可能な膜を介して接触させることができる。
【００５１】
また、本発明のポリヌクレオチドを含む組換えベクターで形質転換した微生物を宿主として生菌体の状態で前記アルコールの製造方法に利用する場合には、補酵素再生のための付加的な反応系を不要とできる場合がある。すなわち、補酵素再生活性の高い微生物を用いることにより、形質転換体を用いた還元反応において、補酵素再生用の酵素を添加することなく効率的な反応が行える。
さらに、補酵素再生に利用可能な酵素をコードするDNAと、本発明のＮＡＤＰＨ依存性4-ハロアセト酢酸エステル還元酵素をコードするDNAとを、同時に宿主に導入することによって、より効率的に還元反応を行うことも可能である。補酵素の再生に利用できる酵素としては、たとえばグルコース脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素、あるいは有機酸脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素など）等を示すことができる。
これらの２つもしくはそれ以上の遺伝子の宿主への導入には、不和合性をさけるために複製起源のことなる複数のベクターに別々に遺伝子を導入した組換えベクターにより宿主を形質転換する方法が用いられる。この他、単一のベクターに両遺伝子を導入する方法や、片方もしくは両方の遺伝子を染色体中に導入する方法などを利用することもできる。
【００５２】
単一のベクター中に複数の遺伝子を導入する場合には、プロモーター、ターミネーターなど発現制御に関わる領域をそれぞれの遺伝子に連結する方法やラクトースオペロンのような複数のシストロンを含むオペロンとして発現させることも可能である。
【００５３】
本発明の酵素を用いた還元反応は、水中、水と相溶性を有する有機溶媒との混合系で行うことができる。水と相溶性を有する溶媒としては、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトン、あるいはアセトニトリルなどを示すことができる。また、水に溶解しにくい有機溶媒中や、水に溶解しにくい有機溶媒と水性媒体との2相系において、本発明のための酵素反応を行うことができる。水に溶解しにくい有機溶媒としては、たとえば酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、ｎ−ヘキサン、シクロヘキサン、オクタン、あるいは１−オクタノール等を用いることができる。
【００５４】
本発明の酵素反応を構成する酵素は、固定化して用いることもできる。酵素を固定化する方法は、特に限定されない。たとえば、グルタルアルデヒド、アクリルアミド、κ−カラギーナン、アルギン酸カルシウム、イオン交換樹脂、セライトなどを用いて酵素を固定化する方法が公知である。本発明の反応は、膜リアクターなどを利用して行うことも可能である。膜リアクターを構成することができる膜としては、限外濾過膜、疎水性膜、カチオン膜、ナノフィルトレーション膜(J.Ferment.Bioeng. 83, 54-58 (1997))等を示すことができる。
【００５５】
本発明の反応は、反応温度4−70℃、好ましくは15−50℃、pH3−11、好ましくはpH6−8、基質濃度0.01−90%、好ましくは0.1−30%で行うことができる。反応系には必要に応じて補酵素ＮＡＤＰ＋もしくはＮＡＤＰＨが0.001mM−100mM、好ましくは、0.01−10mM添加できる。また、基質は反応開始時に一括して添加することも可能であるが、反応液中の基質濃度が高くなりすぎないように連続的、もしくは非連続的に添加することが望ましい。
【００５６】
ＮＡＤＰＨ再生のために反応系に添加される化合物は、基質ケトンに対してモル比で0.1−20、好ましくは１−５倍過剰に添加することができる。ＮＡＤＰＨ再生のための化合物としては、たとえばグルコース脱水素酵素を利用する場合のグルコース、ギ酸脱水素酵素を利用する場合のギ酸、アルコール脱水素酵素を利用する場合のエタノールもしくはイソプロパノール等が添加される。一方ＮＡＤＰＨ再生用の反応を構成する前記酵素は、本発明のＮＡＤＰＨ依存性4-ハロアセト酢酸エステル還元酵素に比較して酵素活性で0.1−100倍、好ましくは0.5−20倍程度添加することができる。
【００５７】
本発明のケトンの還元により生成するアルコールは、菌体、蛋白質の遠心分離、膜処理などによる分離、溶媒抽出、蒸留などを適当に組み合わせることにより精製することができる。
たとえば、（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルでは、微生物菌体を含む反応液を遠心分離し、微生物菌体をのぞいた後、その上清に酢酸エチル、メチルイソブチルケトンなどの溶媒を添加して(S)-4-クロロ-3-ヒドロキシ酪酸エチルを溶媒層に抽出する。これを相分離後、蒸留することにより純度の高い (S)-4-クロロ-3-ヒドロキシ酪酸エチルを精製することができる。精製された(S)-4-クロロ-3-ヒドロキシ酪酸エチルは、医薬品原料などに有用である。本発明によれば、光学活性アルコールを高純度で、効率良く得ることができる。光学異性体には、しばしば、生理活性が低いものや、副作用の原因となる化合物がある。したがって、医薬品原料においては、光学的な純度は、原材料の品質を大きく左右する。
【００５８】
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
［実施例１］（バチルス・ステアロサーモフィラスからの染色体DNAの調製）
バチルス・ステアロサーモフィラス IFO 12550株をM-64培地（ポリペプトン 10g, 酵母エキス 2.5g, 肉エキス 2g, グリセロール 2g, 塩化ナトリウム 2g, K2HPO4 2g, KH2PO4 2g, MgSO4・7H2O 0.1g, biotin 0.4μg/L, pH 7.2）中55℃で培養し、遠心分離により湿菌体を得た。
得られた湿菌体より、Qiagen Genome-Tipを用いて染色体DNAを精製した。
【００５９】
［実施例２］（4-ハロアセト酢酸エステル還元酵素遺伝子のコア領域のPCRによる増幅）
プライマーfabG-N (配列番号：３) 及びプライマーfabG-C (配列番号：４)を用い、実施例１により調製した染色体DNAを鋳型としてPCRを行った。PCRは、0.2mM dNTP, プライマーをそれぞれ50pmol, Taq DNA polymeraseを1U, 鋳型DNAを50ngもしくは125ng含む50μLの反応液中で行った。
【００６０】
PCRの条件は、以下のステップ１のサイクルを５サイクル、さらにステップ２のサイクルを２５サイクル行った。
（ステップ１）
変性        94℃    30秒
アニール    37℃    30秒
1分間に10℃の率で昇温
伸長        60℃    2分
（ステップ２）
変性        94℃    30秒
アニール    45℃    30秒
伸長        70℃    1分
【００６１】
PCR終了後、一部をアガロースゲル電気泳動により解析した結果、鋳型DNA量に関わらず550 bp付近に特異的なバンドが検出された。
0004603171.tif 000002
【００６２】
［実施例３］（4-ハロアセト酢酸エステル還元酵素遺伝子のコア領域のクローニング）
実施例２により増幅されたDNA断片を、フェノール−クロロホルム抽出後、エタノール沈殿によりDNAを回収した。得られたDNAをEcoRI, HindIIIにより2重消化し、アガロースゲル電気泳動により精製した。得られたDNA断片を、同じ制限酵素EcoRI, HindIIIにより制限酵素消化したpUC18とライゲーションし、目的とする550bp の挿入断片を有するプラスミドpBstKR-1を得た。
【００６３】
［実施例４］（4-ハロアセト酢酸エステル還元酵素遺伝子のコア領域の塩基配列の解析）
実施例３により得られたプラスミドpBstKR-1の挿入断片の塩基配列を解析した。DNA塩基配列の解析には、BigDye Terminator Cycle Sequencing ready Reaction Kit(アプライドバイオシステムズ製)を用いてPCRを行い、PRISM 310 Genetic Analyzer(アプライドバイオシステムズ製)により行った。決定されたコア領域の塩基配列を配列番号：５として示した。
【００６４】
［実施例５］（4-ハロアセト酢酸エステル還元酵素遺伝子のコア領域周辺のInverse PCR）
実施例１で調製した染色体DNAをHindIIIで消化し、自己環化反応後、SalI 消化して鋳型として用いた。まず、1st PCRとして、BST-N1NE（配列番号：６）、BST-C1NE（配列番号：８）をプライマーとしてPCRを行い、得られたPCR産物を精製後更に、BST-N2NE（配列番号：７）、BST-C2NE（配列番号：９）をプライマーとして2nd PCRを行った。PCRは、熱変性94℃, 1分、アニール55℃1分、伸長72℃3分のサイクルを30サイクル行った。
【００６５】
PCR終了後、反応液の一部をアガロース電気泳動した結果、特異的な約5kbの増幅断片が確認できた。
0004603171.tif 000003
【００６６】
［実施例６］（4-ハロアセト酢酸エステル還元酵素遺伝子のコア周辺領域の塩基配列の解析）
Inverse PCRで得られたDNA断片の塩基配列を直接解析した。その結果、β-ケトアシルACP還元酵素 (fabG遺伝子) の全域が含まれており、同時に、fabG遺伝子の上流にアシルＣｏＡ脱水素酵素（fabD遺伝子）及び下流にアシルキャリアープロテイン（ACP）遺伝子の一部が見いだされた。
得られた4-ハロアセト酢酸エステル還元酵素遺伝子は、762bpからなり、254アミノ酸をコードしていた。ORF部分の配列を配列番号：１に示した。
【００６７】
［実施例７］（4-ハロアセト酢酸エステル還元酵素遺伝子発現プラスミドの構築）
実施例６で得られた4-ハロアセト酢酸エステル還元酵素のORFの塩基配列を元に、大腸菌における発現プラスミド構築のためのプライマーFABG-E（配列番号：１０）、FABG-H（配列番号：１１）を合成した。0.2mM dNTP、5%ジメチルスルホキシド(DMSO)、プライマーを各10pmol、染色体DNA 50ng、ExTaq用緩衝液、ExTaq 2.5Uを含む50μLの反応液を用い、変性（94℃1分）、アニール（55℃1分）、伸長（72℃3分）を１サイクルとして30サイクル行った。反応には、GeneAmp PCR System 2400 (パーキンエルマー製)を用いた。
0004603171.tif 000004
得られたPCR産物をEcoRI, HindIIIで2重消化し、pTrc99A (ファルマシア製) のEcoRI, HindIII間にサブクローニングした。得られたプラスミドをpTrc-Bstとした。
pTrc-Bstのプラスミドマップを図２に示した。
【００６８】
［実施例８］（組換え4-ハロアセト酢酸エステル還元酵素の大腸菌による生産）
pTrc-Bstで形質転換した大腸菌JM109株を50mg/Lアンピシリンを含むLB培地（バクトトリプトン10g、バクト酵母エキス5g、塩化ナトリウム10g/1L、pH7.2）に植菌し、37℃で終夜培養した。約1日後に50mg/Lのアンピシリン及び119 mg/LのIPTG（イソプロピルチオガラクトピラノシド）を含む100mLのLB液体培地に植菌し、37℃で16〜20時間培養した。
【００６９】
培養した菌体を遠心分離により回収し、0.01% 2-メルカプトエタノールを含む100mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.4) 3mLに懸濁して、超音波（30sec破砕、30sec
intervalを20回繰り返す）により菌体破砕した。
遠心分離により上清を得た後、0.01% 2-メルカプトエタノールを含む10mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.4)に透析し、無細胞抽出液として利用した。
【００７０】
［実施例９］（組換え4-ハロアセト酢酸エステル還元酵素の熱処理と電気泳動）
実施例８で調製した無細胞抽出液を(lane 3), 無細胞抽出液30℃で10分熱処理したもの(lane 4)、30℃で20分処理したもの(lane 5)、30℃で40分処理したもの(lane 6)、60℃で10分処理したもの(lane 7)、60℃で20分処理したもの(lane 8)、60℃で40分処理したもの(lane 9)並びにベクターpTrc99Aのみで形質転換したJM109株より抽出した無細胞抽出液(lane 2)と分子量マーカー(lane 1)をドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)した。
【００７１】
図３に示したように、ベクターpTrc99Aで形質転換した菌由来の無細胞抽出液には見られない27kDaのバンド（図３中ではBstKR1として示した）がpTrc-Bstで形質転換した大腸菌に由来する無細胞抽出液には見られた。この分子量は、DNA配列から予想されるアミノ酸配列からの計算値27kDaとよく一致した。
また、中等度好熱菌由来の4-ハロアセト酢酸エステル還元酵素のもつ耐熱性を利用して、熱処理のみで極めて効率的に酵素の精製が行えることが示された。
【００７２】
［実施例１０］（組換え4-ハロアセト酢酸エステル還元酵素の基質特異性）
実施例８で調製した組換え4-ハロアセト酢酸エステル還元酵素を用いて種々の基質に対する活性を測定した。補酵素としては、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）のみを電子供与体として利用し、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）は利用できなかった。還元反応の基質としては、４−クロロアセト酢酸エチルを効率的に還元したが、大腸菌や枯草菌のβ−ケトアシルACP還元酵素の還元基質となるアセトアセチル-CoAを全く還元しなかった。また、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ＋）を電子受容体とした（Ｒ）もしくは（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルエステル酸化活性は全く有しなかった。
【００７３】
［実施例１１］（組換え4-ハロアセト酢酸エステル還元酵素の至適温度）
実施例８で調製した4-ハロアセト酢酸エステル還元酵素を用いて４−クロロアセト酢酸エチル還元反応の至適温度を測定した。
反応の至適温度は45℃であった。また、40℃から55℃の広い範囲で最大活性の80%以上の相対活性を図４に示した。なお反応の基質として用いた４−クロロアセト酢酸エチルは、高温では不安定な物質である。したがって、組換え4-ハロアセト酢酸エステル還元酵素を、高温で安定な他の基質化合物に対して作用させた場合には、酵素反応の至適温度が更に高くなる可能性がある。
【００７４】
［実施例１２］（組換え4-ハロアセト酢酸エステル還元酵素による（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチル生産）
実施例８で調製した4-ハロアセト酢酸エステル還元酵素を用いて４−クロロアセト酢酸エチルからの (S) -4-クロロ-3-ヒドロキシ酪酸エチル合成を行った。
200mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.5)、2% 4-クロロアセト酢酸エチル、基質に対して2等量のグルコース、1mM ＮＡＤＰ＋、38.4mUの4-ハロアセト酢酸エステル還元酵素、4-ハロアセト酢酸エステル還元酵素の2倍量のグルコース脱水素酵素（和光純薬）を含む反応液中で１晩反応させた。
【００７５】
反応終了液を用いて (S) -4-クロロ-3-ヒドロキシ酪酸エチルの光学純度の測定を以下の方法により行った。反応液から4-クロロ-3-ヒドロキシ酪酸エチルを酢酸エチルで抽出し、脱溶媒した後、光学分割カラムを用いた液体クロマトグラフィーにより分析した。光学分割カラムは、ダイセル化学工業株式会社製キラルセルOD（CHIRALCEL OD. 4.6mm × 25cm）を用い、n-ヘキサン：2-プロパノール＝93：7の溶離液、流速1mL/min、RI検出により行った。その結果、本発明によって生成した4-クロロ-3-ヒドロキシ酪酸エチルは、97.8%eeの（Ｓ）体であった。
【００７６】
また、生成された４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルをガスクロマトグラフィーで定量し、出発原料である４−クロロアセト酢酸エチルに対する収率を求めた。ガスクロマトグラフィーの条件は以下のとおりである。すなわち、サーモン−３０００ ５%クロモソルブＷ ６０−８０（ＡＷ−ＤＭＣＳ）(Thermon-3000 5% Chromosorb W 60〜80 (AW-DMCS)、 信和化工株式会社)、3.2mm ×210cmを用い、カラム温度150℃とし、水素炎イオン化検出器(FID)を利用して分析した。その結果、反応の収率は約48%であった。
【００７７】
【発明の効果】
本発明は、（Ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステル誘導体などの光学活性アルコールの生産に有用な新規なβ−ケトアシルACP還元酵素及びそのホモログの取得方法を提供する。更に子の方法に基づいて、バチルス・ステアロサーモフィラス由来のβ-ケトアシルACP還元酵素遺伝子、これによりコードされる蛋白質が提供された。本酵素を利用することにより、光学純度の高い (S) -4-クロロ-3-ヒドロキシ酪酸エチルの効率的な生産方法が提供された。
【００７８】
【配列表】
0004603171.tif 000005
0004603171.tif 000006
0004603171.tif 000007
0004603171.tif 000008
0004603171.tif 000009
0004603171.tif 000010
0004603171.tif 000011
0004603171.tif 000012
0004603171.tif 000013
【図面の簡単な説明】
【図１】fabGアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。
【図２】pTrc-Bstのプラスミドマップ。
【図３】組換え4-ハロアセト酢酸エステル還元酵素及びその熱処理物のSDS-PAGEの結果を表す写真である。
【図４】組換え4-ハロアセト酢酸エステル還元酵素の至適温度を示すグラフである。縦軸は相対活性、横軸は反応温度を表す。
【図１】
0004603171.tif 000014
【図２】
0004603171.tif 000015
【図３】
0004603171.tif 000016
【図４】
0004603171.tif 000017