(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＬＡクラスＩ分子又はその断片を含む複合体であって、前記ＨＬＡクラスＩ分子又はその断片が、
（ｉ）Ｔ細胞バインディングポーション、及び
（ii）前記ＨＬＡクラスＩ分子又はその断片を標的細胞に選択的に付着せしめる付着手段
を含み、
前記ＨＬＡクラスＩ分子又はその断片が認識ペプチドに結合又は付着し、
前記認識ペプチドが、Ｔ細胞認識のために前記ＨＬＡクラスＩ分子又はその断片に提示されるように構成され、
前記付着手段が、
（ａ）標的細胞表面上の標的細胞特異的な分子に対する高い親和性を有するリンキングポリペプチド、及び
（ｂ）前記リンキングポリペプチドを前記ＨＬＡクラスＩ分子又はその断片にカップリングせしめるカップリングシステム
を含み、
前記カップリングシステムが、
前記リンキングポリペプチドに結合する第１低分子、及び
前記ＨＬＡクラスＩ分子に結合する第２低分子を含み、
前記低分子の相互作用により、前記リンキングポリペプチドとＨＬＡクラスＩ分子との間に安定なブリッジが形成される、
複合体。
【請求項２】
カップリングシステムが、低分子の３ステップ鎖を含む請求項１記載の複合体。
【請求項３】
カップリングシステムが、ビオチン及びアビジン／ストレプトアビジンを含む請求項１又は２記載の複合体。
【請求項４】
カップリングシステムが、カルモジュリン及びカルモジュリン結合ペプチドを含む請求項１又は２記載の複合体。
【請求項５】
認識ペプチドが、強い細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘発するか、又は強力な免疫応答誘導能を有するペプチドを含む請求項１〜４のいずれか記載の複合体。
【請求項６】
認識ペプチドが、腫瘍特異的ペプチド、ウイルスペプチド、バクテリアペプチド、及び寄生生物ペプチドの１又は２以上を含む請求項１〜５のいずれか記載の複合体。
【請求項７】
認識ペプチドが、インフルエンザウイルスペプチド、麻疹ウイルスペプチド、エプスタイン−バールウイルスペプチド、溶解タンパク質ＢＺＬＦ１のＲＡＫＦＦＱＬＬエピトープを含むペプチド、サイトメガロウイルスペプチド、及び破傷風トキソイドペプチドからなる群から選択されるペプチドを含む請求項１〜６のいずれか記載の複合体。
【請求項８】
リンキングポリペプチドが、抗体又はその断片を含む請求項１〜７のいずれか記載の複合体。
【請求項９】
抗体が、モノクローナル抗体である請求項８記載の複合体。
【請求項１０】
付着手段が、抗原提示細胞表面上の分子に特異的に結合する請求項１〜９のいずれか記載の複合体。
【請求項１１】
インビトロで標的細胞にＨＬＡクラスＩ分子又はその断片及び付着手段を接触させる、標的細胞に請求項１〜９のいずれか記載の複合体を付着せしめる方法。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか記載の複合体をインビトロで標的細胞に付着せしめるステップを含む、標的細胞に対する免疫応答を作出又は強化する方法。
【請求項１３】
（ｉ）請求項１〜１０のいずれかに記載された複合体、及び
（ii）薬学上許される賦形剤又は担体を含む、医薬組成物。
【請求項１４】
付着手段が認識する細胞に細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘導する薬剤の調製における請求項１〜１０のいずれかに記載された複合体の使用。
【請求項１５】
認識ペプチドに対して被検者を免疫する薬剤の調製における請求項１〜１０のいずれか記載の複合体の使用。
【請求項１６】
１又は２以上の請求項１３記載の医薬組成物と、１又は２以上の前記組成物を被検者に投与するための手書き又は印刷した使用法とを含むキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、免疫原性ＨＬＡクラスＩ分子を付着させることにより、標的細胞に対する免疫応答を作出又は強化する方法に関する。本発明は、癌、白血病、ＨＩＶのようなウイルス感染を含む感染症、結核を含むバクテリア感染症、及びマラリアを含む寄生生物感染症等の悪性疾患の予防と治療に有用である。
【０００２】
細胞性免疫系における細胞傷害性Ｔ細胞は、「外来」マーキングを表出する細胞の認識に関与しており、該細胞に対する免疫応答を誘発する。各細胞傷害性Ｔ細胞は、多数の細胞表面認識レセプターを発現し、それら認識レセプターは、それぞれ特定の「外来」ペプチド配列に対して正確な特異性を有しており、Ｔ細胞がスキャンした細胞表面上に発現するＨＬＡクラスＩ分子に結合するよう適応している。ＨＬＡクラスＩ分子は、細胞の外側表面にペプチド結合のための溝（groove）を有する細胞表面分子であり、この溝は通常の条件下では、細胞内側から生じるペプチドに結合する。細胞傷害性Ｔ細胞上の認識レセプターが、スキャン細胞表面上におけるＨＬＡクラスＩ分子に結合すると、該認識レセプターは、ＨＬＡクラスＩ分子の溝と結合したペプチドとの接触が可能になり、そこに含まれるいかなるペプチドとも相互作用する。このペプチドが、該認識レセプターの特異性と適合した場合には、かかるＴ細胞が、そのスキャンした細胞を認識したことになり、その結果、該スキャン細胞に対する免疫応答を誘発し得る。
【０００３】
宿主免疫系における種々の特異性を有する細胞傷害性Ｔ細胞は、該宿主細胞のＨＬＡクラスＩ分子とはアロタイプが異なるＨＬＡクラスＩ分子を提示する細胞に対する免疫応答を認識し、かつ誘発する。この種の免疫応答は、「アロ反応性」応答として知られている。
【０００４】
細胞に対する免疫応答は、通常、該細胞の溶解、及び／又はサイトカインの局所的放出に帰因する。しかし、細胞傷害性Ｔ細胞は、いわゆる抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）の溶解を誘発しないことが明らかになっている。その代わり、Ｔ細胞が抗原提示細胞表面のＨＬＡクラスＩ分子を認識することにより誘発された免疫応答の結果、細胞傷害性Ｔ細胞の選択的増殖を直接認めることができる。次いで、このＴ細胞上の表面認識レセプターが認識する外来ペプチドを提示する何れの細胞に対しても、宿主免疫系は免疫される。
【０００５】
細胞性免疫系のエフェクター機序は、悪性の経過をたどる疾患、感染症、癌及び自己免疫疾患などの多くの疾患の予防、及び治療にとって、強力な手段であると考えられてきた。腫瘍細胞表面上の僅かなＨＬＡクラスＩ分子が、腫瘍細胞において選択的に又は過剰に発現するペプチドに結合し、免疫系の細胞傷害性Ｔ細胞によって認識され得る。そのようなペプチドは、非腫瘍細胞のＨＬＡクラスＩ分子上に稀にしかみられないか、若しくは全くみられないという点において、より腫瘍特異的である。かかる腫瘍特異的ペプチドの一例としては、メラノーマ細胞にみられるＨＭＷ−ＭＡＡ抗原が挙げられる。しかし、一般に腫瘍細胞に対して有効な免疫応答を刺激する、上記ペプチドを提示するＨＬＡ分子の数は非常に少ない。更に、上記ペプチドが抗原提示細胞表面においてＨＬＡクラスＩ分子によって提示されることはまずない。
【０００６】
腫瘍細胞に対する細胞性免疫系の応答を強化しようとする試みは、従来、腫瘍細胞免疫原性を増加させることに力点を置いてきた。特に、腫瘍細胞表面に免疫原性ＨＬＡクラスＩ分子を高レベルに発現させようとする、遺伝子療法技術を用いた種々の試みが行われてきた。Kang（Cancer Res. 57, 202-205, 1997）は、ＨＬＡ分子のリーダー配列における抗原性ペプチドを有するＨＬＡクラスＩ遺伝子をコードするｃＤＮＡの作製について報告している。一方、Stopeck（J Clinical Oncology 15, 341-349, 1997）は、メラノーマ患者のアロＨＬＡクラスＩのトランスフェクションについて報告している。その研究においては、臨床試験でのある種の応答について検討しており、遺伝子療法技術を用いたインビボでの、複数の部位における腫瘍細胞を標的にすることの困難さについても強調している。
【０００７】
本出願は、標的細胞に対する免疫応答を作出又は強化する改良方法について開示し、癌及び他の悪性の疾病、感染症、又は自己免疫疾患の予防法や治療法をより向上せしめるものである。
【０００８】
また、本発明の主題の一つは、ＨＬＡクラスＩ分子又はその断片を含む複合体に関するものであり、該ＨＬＡクラスＩ分子は、Ｔ細胞バインディングポーション（binding portion）、及び該ＨＬＡクラスＩ分子又はその断片を標的細胞に選択的に付着せしめる付着手段（attaching means）を有し、該ＨＬＡクラスＩ分子又はその断片が、認識ペプチドに結合又は付着し、かかる認識ペプチドは、該ＨＬＡクラスＩ分子又はその断片に提示されるように構成されていることを特徴としている。
本発明の他の主題は、該ＨＬＡクラスＩ分子又はその断片を標的細胞に付着せしめ、該ＨＬＡクラスＩ分子又はその断片がＴ細胞バインディングポーションを有し、該ＨＬＡクラスＩ分子又はその断片を該標的細胞に誘導するステップ、及び付着手段を有する点にある。
【０００９】
更に、本発明の主題は、ＨＬＡクラスＩ分子又はその断片を含む製剤成分にあり、該ＨＬＡクラスＩ分子又はその断片がＴ細胞バインディングポーションを有し、即ち該ＨＬＡクラスＩ分子又はその断片を選択的に標的細胞に付着せしめる手段を有し、適当な賦形剤又は担体を含む点にある。
【００１０】
ＨＬＡクラスＩ分子又はその断片はペプチドに結合し、該ペプチドは、該ＨＬＡクラスＩ分子又はその断片によるＴ細胞認識のために構成されている。当該ペプチドは、Garbocziの報告（PNAS 89, 1992, 3429-3433）に記載された手法により、該ＨＬＡクラスＩ分子又はその断片に付着せしめた。
【００１１】
該付着手段には、標的細胞表面上の標的細胞特異的な分子に対する高い特異的な親和性を有するリンキングポリペプチドを含むことが望ましい。ここで「標的細胞特異的な分子」とは、標的細胞表面上において、発現又は過剰発現することを特徴とする分子をいう。癌細胞における「標的細胞特異的な分子」には、例えば、癌胎児性抗原、胎盤アルカリホスファターゼ、多型上皮ムチン、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン、ＣＤ２０、前立腺特異的抗原、ｃａ−１２５、ＨＭＷ−ＭＡＡ、及びその他の腫瘍関連抗原のすべてが含まれる。
【００１２】
利便性の点から、リンキングポリペプチドには上記標的細胞特異的な分子に対する抗体、望ましくはモノクローナル抗体が含まれる（Riethmuller and Johnson, Curr. Opin. Immunol. 4, 1992, 647-655）。かかる目的に照らして好適な抗体には、Ｃ４６、８５Ａ１２、Ｈ１７Ｅ２、ＨＭＦＧ１、Ｗ１４、１Ｆ５、２２５．２８ｓ（Buraggi 1985, Cancer Res. 45, 3378-3387）等やその他の抗体が含まれる。これらの抗体を産生する不死化ハイブリドーマは、American Type Culture Collection,Rockville MD,USAに寄託されている。更に、抗体の例としては、Maloney et al（Blood 84, 1994, 2457-2466）、Riethmuller et al（Lancet 343, 1994, 1177-1183）、及びHird et al（Br. J. Cancer 68, 1993, 403-406）の文献にそれぞれ記載されている。
【００１３】
上記リンキングポリペプチドには、標的細胞特異的な分子に対する抗体や、上記抗体を前記ＨＬＡクラスＩ分子又はその断片にカップリングせしめるカップリングシステムが含まれる。かかるカップリングシステムには、抗体とＨＬＡクラスＩ分子に連結し、両者間に安定なブリッジを形成するよく特徴づけられた対の低分子の２又は３ステップ鎖が含まれる。ここで使用する対になった低分子としては、ビオチン及びアビジン／ストレプトアビジン（Moro, 1997, Cancer Res. 57, 1922-1928; Altman et al, Science 274, 1996, 94-96）、カルモジュリン及びカルモジュリン結合ペプチド（Neri, 1996, J. Invest. Dermatol. 107, 164-170）を例示することができるが、これらに限定されるものではない。他の上記リンキングポリペプチドとしては、前記ＨＬＡクラスＩ分子又はその断片に、直接付着しうるように適応させた、標的細胞特異的な分子に対する抗体を挙げることができる。
【００１４】
更に、本発明の実施の態様として、前記複合体が組換えタンパク質を含み、該組換えタンパク質が、上記ＨＬＡクラスＩ分子又はその断片からなる分子種と上記付着手段からなる分子種を含むものが挙げられる。
【００１５】
ＨＬＡクラスＩ分子又はその断片は、血漿又は血小板から精製することにより、あるいは組換えにより作製することにより得ることができる。ＨＬＡクラスＩ分子又はその断片は、Ｔ細胞が認識することができるように、更にウイルス、バクテリア、寄生生物、又は腫瘍特異的ペプチド等の特徴づけられた好ましいペプチドを結合及び提示するように構成することができる。上記ＨＬＡクラスＩ分子又はその断片、及び上記付着手段を、上記標的細胞周辺に誘導することにより、該標的細胞にＨＬＡクラスＩ分子又はその断片を付着させることができる。該標的細胞としては、インビトロでの培養細胞を用いてもよいが、患者の体内から採取した細胞の方が有利に用いることができる。該標的細胞としては、細胞障害性Ｔ細胞によって接触されるように構成されているものが望ましく、かかる細胞障害性Ｔ細胞は、不適合アロタイプとして、又は外来ペプチドに結合するものとして、該ＨＬＡクラスＩ分子又はその断片を認識するよう適応されており、かつ該標的細胞に対する免疫応答の誘発能を有している。
【００１６】
本発明の実施の一形態として、標的細胞に対する免疫応答の結果、溶解するタイプの標的細胞を挙げることができる。かかる標的細胞としては、癌細胞、白血病細胞、ＨＩＶウイルス又は他の細菌やウイルス、自己免疫疾患における有害活性に関与している細胞等、患者にとって望ましくない腫瘍細胞、疾患細胞、外来細胞を使用するのがよい。患者の該標的細胞に対する免疫応答誘発を促進するためには、前記ＨＬＡクラスＩ分子及びその断片は、該患者の細胞性免疫系から強力な免疫応答の作出能を有するものが望ましい。従って、上記ＨＬＡクラスＩ分子及びその断片は、ウイルスペプチド又は細菌ペプチド、望ましくは患者が曝されたことがあるウイルスペプチドや細菌ペプチドと結合するものがよい。特に上記ＨＬＡクラスＩ分子及びその断片は、インフルエンザウイルスペプチド、麻疹ウイルスペプチド、エプスタイン−バールウイルスペプチド、その中でも特に溶解タンパク質ＢＺＬＦ１のＲＡＫＦＦＱＬＬエピトープを含むエプスタイン−バールウイルスペプチド、サイトメガロウイルスペプチド又は破傷風トキソイドペプチドと結合するものが好ましい。その他、既に強力な細胞障害性Ｔ細胞応答、若しくは強力な免疫応答誘導能を有する何れのペプチドとの結合性を示す上記ＨＬＡクラスＩ分子及びその断片が挙げられる。上記ＨＬＡクラスＩ分子及びその断片のアロタイプは、患者のＨＬＡクラスＩ分子及びその断片のアロタイプと付加的に異なるため、上記標的細胞に対するアロ反応応答が、付加的に誘発される。
【００１７】
本発明の他の実施形態として、標的細胞として抗原提示細胞（ＡＰＣ）を挙げることができる。細胞障害性Ｔ細胞が、該抗原提示細胞に付着したＨＬＡクラスＩ分子及びその断片を認識する結果、細胞障害性Ｔ細胞が直接的及び選択的に増殖する。従って、前述のように特徴づけられた腫瘍特異的ペプチド、ウイルスペプチド、バクテリアペプチド、寄生生物ペプチド、又は、患者にとって望ましくない存在である疾患細胞、悪性細胞又は外来細胞表面上において、ＨＬＡクラスＩ分子が個別的・特徴的に提示する如何なるペプチド等を、上記ＨＬＡクラスＩ分子及びその断片が提示して、Ｔ細胞が認識することができるようになっている。悪性疾患に関連したペプチドは、寄生性の起源を有する(Khusmith, 1991, Science 252, 715-718)ものとして特徴づけられている（Brossart, 1998, Cancer Res. 58, 732-736 and Lucas, 1998, Cancer Res. 58, 743-752）。本発明によって、抗原提示細胞にＨＬＡクラスＩ分子又はその断片を付着させることにより、所定のペプチドを提示する細胞に対するインビボでの免疫や、あるいは特定の特異性を有する細胞障害性Ｔ細胞のエックスビボでの作出を行うことができる。
【００１８】
標的細胞が、腫瘍細胞又は感染微生物細胞であるとき、本発明の製剤成分を、腫瘍又は微生物性疾患の治療にそれぞれ用いることができ、必要に応じて患者に上記製剤成分を有効量投与することによって、腫瘍又は微生物性疾患の治療を行うことができる。
【００１９】
多くのタイプの腫瘍は腫瘍関連抗原を発現するが、その発現レベルは不均一であり、腫瘍細胞の中には抗体の標的にならずに直接溶解するものがある。しかし、アナロガス抗体−超抗原系のインビトロのデータから、活性Ｔ細胞が放出するサイトカインの高い局在量が、標的以外の他の腫瘍細胞を死滅させる可能性があることが報告されている（Dohlsten et al, Int. J. Cancer 54, 1993, 482-488）。ＭＨＣクラスＩ／ペプチド複合体を用いた標的システムにおいても同様な結果が生じると推察される。同様に、腫瘍中にサイトカインを放出する活性化細胞障害性Ｔ細胞が存在することによって、特異的抗腫瘍免疫応答が強化される可能性もある。
標的細胞が抗原提示細胞であり、ＨＬＡクラスＩ分子又はその断片が、腫瘍特異的ペプチド、又はウイルス、バクテリア、寄生生物又は細菌に感染した細胞表面のＨＬＡクラスＩ分子が個別的・特徴的に提示するペプチドのいずれかに結合するとき、本発明の製剤成分を、それぞれ腫瘍、又はウイルス、バクテリア、寄生生物、細菌感染の免疫化に用いることができ、必要に応じて患者への該製剤成分の有効量投与を含めた、患者の腫瘍、又はウイルス、バクテリア、寄生生物、細菌感染に対する免疫方法が与えられる。
【００２０】
インビボでのサイトカインのサポートにより、又は抗原特異的細胞障害性Ｔ細胞をエックスビボで増加させることにより、上記患者の応答性が向上することも考えられる。アビジンブリッジ等のターゲティングシステム構成成分に対する患者の免疫応答を最小化するため、一時的な免疫抑制（Ledermann et al, Int. J. Cancer 47, 1991, 659-664）を行うこともできる。
【００２１】
上記製剤成分の投与は、経口、舌下、経皮又は非経口による。
【００２２】
上述の製剤成分の有効量は、患者の体質、治療に対する苦痛感、及び患者の体重、年齢や状態による。
【００２３】
経口又は非経口投与に際しては、製剤成分を経口剤又は非経口剤等の単位投与量成分とすることが大いに望ましい。
【００２４】
混合剤を用い、かかる製剤成分を経口又は非経口投与に適するよう調製する。その形態としては、錠剤、カプセル、経口調剤、粉末剤、顆粒剤、トローチ剤、再構成粉末剤、注射、及び液体浸出溶液剤、懸濁液剤、坐剤等特に制限されない。
【００２５】
経口投与のための錠剤とカプセルは、通常単位投与量となっており、結合剤、充填剤、希薄剤、錠剤化剤、潤滑剤、崩壊剤、色素、香味料、及び湿化剤等の従来使用されてきた賦形剤を含む。該錠剤を、既知の手法によってコートすることもできる。
【００２６】
適切な充填剤としては、セルロース、マニトール、ラクトース、及び他の類似剤を挙げることができる。適切な崩壊剤としては、スターチ、ポリビニルピロリドン、及びナトリウムスターチグリコール酸塩等のスターチ由来物を挙げることができる。適切な潤滑剤には、例えばステアリン酸マグネシウムがある。製剤上許容できる適切な湿化剤としては、ラウリル硫酸ナトリウムを挙げることができる。
【００２７】
かかる固形経口調剤は、従来の方法で混合、充填又は錠剤化を行うことにより調製することができる。反復混合作業を行うことにより、充填剤を大量に使用した活性な薬剤を生産できる。かような作業工程は、勿論従来技術の範疇である。
【００２８】
経口液体調剤は、水性又は油性の懸濁液、溶液、乳剤、シロップ、エリキシル、あるいは、服用の前に水や他の適切な賦形剤を使って再構成する乾燥調剤等の形態をとる。かかる液体調剤には、例えばソルビトール、シロップ、メチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸アルミニウムジェル又は水素添加食用油等の懸濁剤；レシチン、ソルビタン、モノオレアート、アカシア等の乳化剤；アーモンドオイル、分画ココナッツオイル、グリセリン、プロピレングリコール又はエチルアルコール等のエステルの油性エステル等の非水性賦形剤（食用油を含む）；メチル又はプロピルｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル又はプロピル、ソルビン酸等の保存料、必要とあれば従来使用されてきた香味料や色素、上記の添加剤を従来と同様に加えてもよい。
【００２９】
経口剤には、腸溶コーティングした錠剤又は顆粒剤等の従来のサステインドリリース製剤が含まれる。
【００３０】
非経口調剤としては、滅菌賦形剤を含む液体単位投与の形態で調製できる。調剤成分は、賦形剤と濃度に依存して懸濁しても溶解してもよい。非経口溶液は、通常、適当なバイアル又はアンプルに入れて密封する前に、賦形剤中の調剤成分を滅菌フィルターの中で溶かし調製する。局所麻酔剤、保存剤、緩衝剤等のアジュバントを賦形剤に加えることが好ましい。安定性向上をはかるため、バイアルに充填し、製剤成分を凍結して真空状態で水分を除去することができる。
【００３１】
非経口懸濁液は、実質的に同じ製法で作製することができるが、異なる点は、製剤成分を滅菌賦形剤中にに懸濁する前に、溶解してエチレンオキサイドに曝すことにより滅菌する代わりに、賦形剤に懸濁する点である。改良法として、本発明における調剤の均一性を容易ならしめるために、界面活性剤又は湿化剤を製剤成分に含めてもよい。
【００３２】
上記調剤を治療に用いる際に、従来、手書き又は印刷した使用法をつけることが一般的である。
【００３３】
以下に本発明を実施する際の方法について例に基づき、又は添付の図面を参照して詳述する。
【００３４】
実施例１．
以下の材料を用いた。
標的細胞：ＨＬＡクラスＩアロタイプＨＬＡ−Ａ２を保有するヒトメラノーマ細胞株Ｍｅｌ１（Department of Immunology, Institute of Molecular Medicine, Oxfordに寄託）。該細胞株は、標準ＲＰＭＩ組織培養培地で生育したものである。ＨＬＡクラスＩアロタイプＨＬＡ−Ａ２を保有するヒトメラノーマ細胞株Ｍｅｌ２（Department of Immunology, Institute of Molecular Medicine, Oxfordに寄託）。該細胞株は、標準ＲＰＭＩ繊維培養培地で生育したものである。
【００３５】
付着手段：ヒトメラノーマ細胞上のＨＭＷ−ＭＡＡ抗原に結合するモノクローナル抗体２２５．２８ｓ（Buraggi, 1985, Cancer Res. 45, 3378-3387）。この抗原にビオチンをBayerの方法（Bayer, 1990, Methods Embryology, 184, 138-160）により、化学的に結合させた。精製鶏卵アビジンは、市販品（Societa Prodotti Antibiotici, Milan, Italy）を使用した。
【００３６】
ＨＬＡ：文献（Altman, 1996, Science 274, 94-96）記載のビオチン結合組換えＨＬＡクラスＩアロタイプＨＬＡ−Ａ２分子に、更にＨＩＶウイルスの部分である「ｇａｇ」ペプチドを含んだもの。このペプチドは、アミノ酸配列ＳＬＹＮＴＶＡＴＬを含む。調製／単離法は、文献（Johnson, 1991, J. Immunol, 147, 1512）記載の方法に基づいた。この「ｇａｇ」ペプチドを文献（Garboczi, 1992, PNAS, 89, 3429-3433）記載の方法に基づいてＨＬＡ−Ａ２分子に付着せしめた。
【００３７】
Ｔ細胞：文献（Altman, 1994, Science, 274, 94-96)記載の方法でＡ２＋ｖｅＨＩＶ患者から、ＨＬＡ−Ａ２／ｇａｇ特異的細胞障害性Ｔ細胞を採取した。
【００３８】
Ｍｅｌ２標的細胞表面にＨＬＡクラスＩ分子をディスプレイする付着手段を分析すべく、先ず約２００，０００個の細胞を、ビオチン結合モノクローナル抗体２２５．２８ｓと共に、最終濃度２０μｇ／ｍｌにおいて３７℃で３０分間インキュベートした。次に、該細胞を組織培養培地（ＲＰＭＩ１６４０、Gibco, Scotland）で洗浄した。Ｍｅｌ２細胞をアビジンと共に、最終濃度１０μｇ／ｍｌにおいて３７℃で１０分間インキュベートし、組織培養培地で洗浄した。最後に、該Ｍｅｌ２細胞をビオチン結合ＨＬＡクラスＩＨＬＡ−Ａ２／ｇａｇ分子と共に、最終濃度２０μｇ／ｍｌにおいて３７℃で２０分間インキュベートした。
【００３９】
処理したＭｅｌ２細胞に対する組換えＨＬＡ−Ａ２の結合を、抗ＨＬＡ−Ａ２モノクローナル抗体ＢＢ７．２（Santos-Aguado, 1988, J. Immunol, 141, 2811-2818）を付着させることによって調べた。次に該細胞を、３７℃で３０分間最終濃度１０μｇ／ｍｌのＢＢ７．２抗体と共にインキュベートし、組織培養培地で洗浄後、上記細胞をフィコエリトリン結合ウサギ抗マウス抗体（Sigma, Poole, UK）と共に、最終濃度１０μｇ／ｍｌにおいて３７℃で１０分間インキュベートし、Becton Dickson Facscanを用いて分析した。Ｍｅｌ２細胞表面に付着したＨＬＡ−Ａ２分子の存在を示す陽性シグナルが明らかにされた本分析結果を図２に示した。
【００４０】
本発明の手法に基づき、ＨＬＡ−Ａ２／ｇａｇ特異的Ｔ細胞クローンが、ＨＬＡ−Ａ２／ｇａｇをコートしたＭｅｌ１細胞を、溶解させる能力を分析すべく、クロム放出Ｔ細胞細胞障害性アッセイを行った。約１０6個のＭｅｌ１細胞を、１．８５μＢｑＮａ251ＣｒＯ4（Amersham International, Amersham, UK）と共に３７℃で１時間プレインキュベーションした。事前インキュベートした該Ｍｅｌ１細胞を、次にビオチン結合モノクローナル抗体２２５．２８ｓと、最終濃度２０μｇ／ｍｌにおいて３７℃で３０分間インキュベートし、組織培養培地で洗浄した。次にＭｅｌ１細胞をアビジンと、最終濃度１０μｇ／ｍｌにおいて３７℃で１０分間インキュベートし、再び組織培養培地で洗浄した。続いて該Ｍｅｌ１細胞を、３７℃で２０分間最終濃度２０μｇ／ｍｌのビオチン結合ＨＬＡクラスＩＨＬＡ−Ａ２／ｇａｇ分子とインキュベートし、組織培養培地で洗浄した。
【００４１】
ＨＬＡクラスＩＨＬＡ−Ａ２／ｇａｇでコートして、クロム処理したＭｅｌ１細胞を、ＨＬＡ−Ａ２／ｇａｇ特異的細胞障害性Ｔ細胞と、エフェクター細胞と標的細胞の比率が０：１から２０：１の範囲で、３７℃で２０時間インキュベートした。Ｎａ251ＣｒＯ4で処理したＭｅｌ１細胞が溶解することによって、放射クロムの放出が生じ、シンチレーションカウンターによって測定できる。ＨＬＡ−Ａ２／ｇａｇ特異的細胞障害性Ｔ細胞とのインキュベートによって、溶解したＭｅｌ１細胞のパーセンテージを分析するため、以下の測定法を用いた。▲１▼培地中のＭｅｌ１細胞からのクロムバックグラウンド放出（“Ｍ”）▲２▼Ｔ細胞とのインキュベート後のＭｅｌ１細胞からのクロム放出（“Ｅ”）▲３▼５％のトリトンＸ−１００ディタージェントで最終的に処理したＭｅｌ１細胞からのクロム放出（“Ｔ”）。ディタージェントで処理すると、他の無処理のＭｅｌ１細胞も全て溶解してしまう。
【００４２】
細胞障害性Ｔ細胞によるＭｅｌ１溶解のパーセンテージは、以下の式で計算した。
0004587566.tif 000002
【００４３】
本分析は、ビオチン結合２２５．２８ｓ、アビジン及びビオチン結合ＨＬＡ−Ａ２／ｇａｇで処理したＭｅｌ１細胞を用いて行った。コントロールとして、ビオチン結合２２５．２８ｓで処理したＭｅｌ１細胞、及びアビジン単独で、またアビジンで処理したＭｅｌ１細胞、及びビオチン結合ＨＬＡ−Ａ２／ｇａｇ単独でも本分析を行った。
【００４４】
本分析の主要な結果を図３に示す。その結果から、ＨＬＡ−Ａ２／ｇａｇ特異的細胞障害性Ｔ細胞によるＭｅｌ１細胞の有意溶解量（２０％）は、本発明の付着及びデリバリー手段の全構成物を用いてＭｅｌ１細胞を処理したときに生じることが示される（例えば、ビオチン接合２２５．２８ｓモノクローナル抗体、アビジン、及びビオチン接合ＨＬＡ−Ａ２／ｇａｇ）。コントロールを用いた分析からは、バックグラウンドレベルでの細胞溶解量の有意増加は認められなかった。
【００４５】
実施例２．
以下の材料を用いた。
標的細胞：ダウディ細胞株（ＭＨＣクラスＩ陰性）、メラノーマ株ＳＫ−ｍｅｌ−２９（ＨＬＡ−Ａ２．１陽性）及び２２１／Ａ２（ＨＬＡ−Ａ２．１陽性）を、５％ＣＯ2の３７℃のインキュベーター内で、１０％ウシ胎児血清及び抗生物質と共にＲＰＭＩ培地で保持した。
付着手段：ＨＭＷ−ＭＡＡ抗原に結合するモノクローナル抗体２２５．２８ｓ（Buraggi, 1985, Cancer Res. 45, 3378-3387）及び２Ｈ７。ビオチンをこれらの抗体に、文献（Bayer, 1990, Methods Embryology, 184, 138-160）記載の方法で、化学的に接合した。
精製鶏卵アビジンは、市販品（Societa Prodotti Antibiotici, Milan, Italy）を使用した。
【００４６】
ＨＬＡ：組換えＭＨＣクラスＩとペプチドとのビオチン化複合体を文献（Altman et al, Science 274, 1996, 94-96, Ogg et al, Science 279, 1998, 2103）記載の方法に従い作製した。ビオチンリガーゼ酵素ＢｉｒＡの標的配列をＣ末端に付加することにより修飾したＢ２Ｍ及びＭＨＣクラスＩヘビーチェインの原核発現に続いて、封入体の精製を行った。特異的ペプチドの周囲に重鎖及びＢ２Ｍをリフォールディングした後、ゲル濾過により４５ｋＤの複合体を単離し、ＡＴＰ、Ｍｇ2+及びビオチンの存在下でＢｉｒＡを用いて一晩ビオチン化した。その後ゲル濾過及び陰イオン交換によって精製した。
【００４７】
Ｔ細胞：ヒト細胞傷害性Ｔ細胞クローン０１０（ＨＬＡ−Ａ２／ｇａｇ７７−８５=ＳＬＹＮＴＶＡＴＬに特異的（Parker et al, J. Immunol. 149, 1992, 3580-3587））、及びＩＦ９（ＨＬＡ−Ａ２／ｍｅｌａｎ−Ａ２６−３５=ＥＡＡＧＩＧＩＬＴＶに特異的（Romero et al, J. Immunol. 159, 1997, 2366））を、５％ヒト血清及び１００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を加えた培地で保持した。
【００４８】
ＭＨＣクラスＩ／ペプチド複合体の安定性を、先ずＥＬＩＳＡ法により分析した。ＨＬＡ−Ａ２／Ｇａｇ３Ｙ、ＨＬＡ−Ａ２／Ｇａｇ３Ｆ、ＨＬＡ−Ａ２／Ｌｍｐ２、ＨＬＡ−Ｂ３５／Ｅｎｖ及びＨＬＡ−Ｂ３５／ｎｅｆを含む種々のＭＨＣクラスＩ／ペプチド複合体を、上述の手順で調製し、組織培養培地において１０ｕｇ／ｍｌ、３７℃で０−２０時間プレインキュベーションした。ＭＨＣクラスＩ分子（Parham, 1979）の立体構造を正しく認識するモノクローナル抗体Ｗ６／３２（ｐＨ９．６の炭酸塩緩衝液中５ｕｇ／ｍｌで４℃で一晩）でＥＬＩＳＡプレートをコートし、１％仔牛血清アルブミンにおいて３７℃で２時間インキュベートしてブロックした。ＭＨＣクラスＩ／ペプチド複合体を、ＥＬＩＳＡプレート上で室温で３０分間インキュベートし、ウサギ抗ヒトＢ２ミクログロブリンを用い、続いてアルカリホスファターゼ接合ヤギ抗ウサギ免疫グロブリン及び基質を用いて結合性を測定した。全インキュベーション産物はＰＢＳで丁寧に洗浄することにより分離した。
【００４９】
６００ｎｍにおける吸光度を、Titertec Multiscan ELISA読取り装置を用い測定した。各検体につき３回測定を行い、それらの平均読み取り値を求めた。
【００５０】
０、１、４、１６及び２０時間プレインキュベーションした検体から得た結果を図５に示した。その結果から、ＨＬＡ−Ａ２／ｇａｇ複合体は、３７℃の培養培地において顕著な安定性を示すことが判明した。２４時間を超えるとその安定性は半減すると推測される。
【００５１】
ＨＬＡ−Ａ２／ｇａｇ複合体を、０．５〜１ｍｇ／ｍｌで４℃で保存すると、少なくとも１２ヶ月は安定性が持続すると推測される（データは示さず）。
【００５２】
ダウディ細胞表面に、ＭＨＣクラスＩのディスプレイを生じせしめる付着手段能を明らかにするため、ＭＨＣクラスＩ欠損ダウディ細胞を、ビオチン化抗ＣＤ２０（Ancell, Nottingham, UK, モノクローナル抗体2H7(Berenson et al, Blood 67, 1986, 509-515)１μｇ／ｍｌで３０分間）、鶏卵アビジン(S.P.A., Milan, Italy, １０ｕｇ／ｍｌで１０分間)、ビオチン化したＨＬＡ−Ａ２／ｇａｇ(１０ｕｇ／ｍｌで１０分間)、及びＦＩＴＣで標識化した抗ＭＨＣクラスＩ（Ancell, Nottingham, UK; モノクローナル抗体３Ｆ１０(Eisenbarth et al, J. Immunol. 124, 1980, 1237-1244)を１０ｕｇ／ｍｌ）と連続して４℃でインキュベートした。並行して行ったコントロールでは、１若しくは他のインキュベーションを省略した。各インキュベーションの間で、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、２％のホルムアルデヒドを加えたＰＢＳに固定し、フローサイトメトリーで分析した。
【００５３】
標識系の３段階全てにおいてインキュベートした細胞は、無処理のダウディ細胞に比べ、その表面に、より多くの測定可能なＭＨＣクラスＩ／ペプチドを有していた（図６）。標識系３段階の内のいずれか２つの段階だけで処理した細胞からは、無処理の細胞から得たのと同様の蛍光量を検出した（データは示さず）。
【００５４】
本発明の手法に則って、ダウディ又はＳＫ−ｍｅｌ−２９細胞に対する特異的Ｔ細胞クローンの溶解能を分析するために、クロム放出細胞傷害性アッセイを行った。ダウディ又はＳＫ−ｍｅｌ−２９細胞を、２μＣｉ／μＬの51ＣｒＯ4と共に３７℃で１時間インキュベートしてから、ビオチン化モノクローナル抗体２Ｈ７又は２２５．２８ｓ（抗−ＨＭＷ−ＭＡＡ）のそれぞれと、更にアビジン、及びビオチン化ＨＬＡ−Ａ２／ｇａｇ複合体を、前述の手法により連続してインキュベートした。ペプチドを付加した標的細胞を、ｇａｇ７７−８５又はｍｅｌａｎ−Ａ２６−３５ペプチドと共に０．１μＭにおいて３７℃で１時間インキュベートした。洗浄後、標識した標的細胞を、２５００細胞／ウエルになるように９６ウエルの丸底プレートに移し、エフェクターと標的の比率（Ｅ：Ｔ）が種々に変化するように、ヒトＣＴＬを加えた。３７℃でインキュベートした後、上清２０μｌを回収し、51Ｃｒの放出量を測定した。各比率のエフェクターと標的で測定して得た細胞傷害性（溶解）の割合は、１００×（Ｅ−Ｍ）／（Ｔ−Ｍ）の計算式で求めた。Ｅは実験による放出量、Ｍは培地での放出量、Ｔは５％トリトンＸ−１００ディタージェントにおける放出量をそれぞれ意味する。
【００５５】
図７に示した結果は、２回ずつ行った実験の結果を平均したものである。これらの結果が示すように、ＣＴＬクローン（０１０）は、ＨＬＡ−Ａ２陽性標的（．２２１／Ａ２）をＨＬＡ−Ａ２／ｇａｇペプチドと共にプレインキュベーションした場合においてのみ、該標的を有効に溶解せしめた。このＣＴＬクローンは、本発明のＨＬＡ−Ａ２／ｇａｇ複合体で標的化したＭＨＣクラスＩ陰性ダウディ細胞を、同程度まで認識しかつ溶解した。標的化されないダウディ細胞及び標的系の２又は３種の成分によってのみ標的化された細胞は、認識されなかった（エフェクターと標的の比率が８０：１までの最大溶解量は４％未満）。
【００５６】
異なるＨＬＡ−Ａ２制限特異性（ＨＬＡ−Ａ２／ｍｅｌａｎ−Ａ）を示すコントロールＣＴＬは、ＨＬＡ−Ａ２／ｇａｇ複合体で標的化したダウディ細胞を溶解しなかった（図８）が、このことは標的アプローチの厳密な特異性を明示している。
【００５７】
ｇａｇペプチドだけを加えた無処理のダウディ細胞は、内因性ＭＨＣクラスＩが、欠損していることから、クローン０１０によって溶解されなかった（データは示さず）。
【００５８】
ＨＬＡ−Ａ２／ｇａｇ特異的ＣＴＬ株によるメラノーマ細胞株ＳＫ−ｍｅｌ−２９の溶解感度を高める、抗体に指令されたＨＬＡ−Ａ２／ｇａｇ複合体の能力を、図９に示した。エフェクターと標的の各比率において、表面蛋白質に結合した複合体が標的にしたメラノーマ細胞は、標的系３段階の内２つの成分だけと接触したコントロールより、実質的に多く溶解された。更に、ＨＬＡ−Ａ２を発現しないＭＭ９メラノーマ細胞も、同様に溶解された（データは示さず）。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ＨＬＡ分子を、腫瘍細胞表面にデリバリングする手段／概念を図式化して示した説明図である。
【図２】  ビオチン結合モノクローナル抗体２２５．２８ｓ、アビジン、ビオチン結合ＨＬＡ−Ａ２／ｇａｇ複合体、抗ＨＬＡ−Ａ２モノクローナル抗体ＢＢ７．２及びフィコエリトリン結合ウサギ抗マウス抗体で処理したＨＬＡ−Ａ２−ｖｅＭｅｌ２メラノーマ細胞のＦＡＣｓ分析を示した説明図である。
【図３】  ビオチン結合モノクローナル抗体２２５．２８ｓ、アビジン、及びビオチン結合ＨＬＡ−Ａ２／ｇａｇ複合体のデリバリーシステムで処理したＭｅｌ１細胞を用いたＴ細胞の細胞障害性クロム放出アッセイの結果を示した説明図である。これらの細胞を、エフェクター／標的の比率を０：１〜２０：１に設定して、ＨＬＡ−Ａ２／ｇａｇ特異的細胞障害性Ｔ細胞と共に２０時間インキュベートした。
【図４】  ＨＬＡクラスＩ／ペプチド複合体を、抗原提示細胞にデリバリングする手法／概念を図式化して示した説明図である。
【図５】  実施例２における各種ＭＨＣクラスＩ／ペプチド複合体の３７℃における安定性を調べたＥＬＩＳＡアッセイの結果を示した説明図である。
【図６】  ＨＬＡ−Ａ２が、ビオチン化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体を介して標的にしたＨＬＡクラスＩ欠損ダウディ細胞のＦＡＣＳ分析の結果を示した説明図である。トレース１（左側）は、無処理の標的化されていないダウディ細胞を示し、トレース２（右側）は、モノクローナル抗体／アビジン／ＨＬＡ−Ａ２／ｇａｇ／ＦＩＴＣ抗ＭＨＣクラスＩが標的にしたダウディ細胞を示す。蛍光トレース１の平均値は０．３１であり、蛍光トレース２の平均値は２４．３（任意の蛍光単位）だった。
【図７】  実施例２におけるクロム放出アッセイを４時間行った結果を示した説明図である。ＨＬＡ−Ａ２／ｇａｇデリバリーシステムの各種構成物が標的にしたＨＬＡクラスＩ欠損ダウディ細胞を、ＨＬＡ−Ａ２／ｇａｇ特異的細胞障害性Ｔ細胞クローンと共にインキュベートした。無処理の細胞と、ペプチドを添加した２２１．Ａ２細胞（ＨＬＡ−Ａ２＋ｖｅ）とを比較した。
【図８】  実施例２におけるクロム放出アッセイを４時間行った結果を示した説明図である。ＨＬＡ−Ａ２／ｇａｇが標的にしたダウディ細胞を、ＨＬＡ−Ａ２／ｇａｇ特異的細胞障害性Ｔ細胞クローン及びＨＬＡ−Ａ２／ＭｅｌａｎＡ特異的細胞障害性Ｔ細胞クローンと共にインキュベートした。
【図９】  実施例２におけるクロム放出アッセイを２０時間行った結果を示した説明図である。ＨＬＡ−Ａ２＋ｖｅＳＫ２９Ｍｅｌ細胞を、ＨＬＡ−Ａ２／ｇａｇ特異的細胞障害性Ｔ細胞クローンと共にインキュベートした。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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