(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）Ｂ型肝炎ウィルス表層抗原（ＨＢｓＡｇ）；
（ｂ）組換成熟単純ヘルペスウィルス−２（ＨＳＶ−２）糖タンパク質Ｄトランケーション体（ｒｇＤ２ｔ）抗原；
（ｃ）３Ｄ−ＭＰＬ；及び
（ｄ）水酸化アルミニウム；
を含んで成るワクチン組成物。
【請求項２】
３Ｄ−ＭＰＬの粒子の大きさが１００ｎｍ未満である、請求項１に記載のワクチン組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は新規のワクチン製剤、その調製方法、及び治療におけるその利用に関する。詳しくは、本発明は青年に投与するための併合ワクチンに関連する。
【０００２】
ＨＳＶ−２は陰部ヘルペスの主たる病因学的因子である。ＨＳＶ−２及びＨＳＶ−１（口唇ヘルペスの原因因子）は主として神経ガングリア細胞において急性疾患を誘導し、且つ潜伏感染症を樹立してしまう能力を特徴とする。
【０００３】
陰部ヘルペスは米国だけで約５百万人において発症しているものと推定され、毎年５００，０００の臨床例が記録されている（一次及び再発性感染症）。一次感染症は一般に思春期に発症し、そして痛そうな皮膚損傷の局部的出現を特徴とし、それは２〜３週間持続する。一次感染後６ヶ月以内に患者の５０％において疾患が再発する。患者の約２５％は毎年１０〜１５回の疾患の再発を被る。免疫無防備状態の患者においては、高頻度な再発の発症率が正常な患者集団におけるそれよりも統計学的に高い。
【０００４】
ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２ウィルスは共にウィルスの表層に位置する多数の糖タンパク質成分を有する。これらはｇＢ，ｇＣ，ｇＤ及びｇＥ等として知られる。
【０００５】
１又は複数種のＢ型肝炎抗原を含んで成るＢ型肝炎感染症の予防用のワクチンがよく知られている。例えば、Smithkline Beecham Biologicals由来のワクチンＥｎｇｅｒｉｘ−Ｂ (商標）がＢ型肝炎の予防に利用されている。このワクチンはＢ型肝炎表層抗原であり（特にHarford ら、Postgraduate Medical Journal, 1987, 63 (Suppl.2), p65-70に記載の通り、２２６個のアミノ酸のＳ−抗原）、そしてアジュバントとして水酸化アルミニウムを用いて調剤されている。
【０００６】
青年が特にかかり易い疾患を予防するのに有効な併合ワクチンのニーズがある。
ＷＯ−Ａ−９２  １１２９１には第一ポリペプチドを含んで成る免疫原性ハイブリドポリペプチドが記載され、かかる第一ポリペプチドはＨＳＶのｇＤの如き第二ポリペプチドに対してこの第一ポリペプチドにおける自然硫黄原子を介して共有結合したＢ型肝炎表層抗原である。
【０００７】
本発明はワクチン組成物であって
（ａ）Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）抗原及び
（ｂ）単純ヘルペスウィルス（ＨＳＶ）抗原と、
ＴＨ１細胞応答の優先的刺激因子であるアジュバントとの組合せを含んで成るワクチン組成物を提供する。
【０００８】
本発明は特にＨＢＶ及び／又はＨＳＶ感染症の危険性にありうる青年への投与に極めて有益である。
【０００９】
任意的に、本発明のワクチンは更に以下に記載の多数のその他の抗原を一又は複数含んで成る。
【００１０】
本発明に係るワクチン組成物は驚くべきことに干渉を示さない、即ち、本発明の組成物内の各々の抗原に対する免疫応答が、ＴＨ１細胞応答の優先的刺激因子であるアジュバントと一緒に個別に付与した各々の抗原により獲得される免疫応答と本質的に同じであることが見い出された。
【００１１】
Ｈａｖｒｉｘ (商標) ワクチン（これもSmithkline Beecham Biologicals由来）がＡ型肝炎感染症の予防に使用できるワクチンの例である。これはアジュバントとしての水酸化アルミニウムで調剤されている。このワクチンはホルモン（ホルムアルデヒド）で不活化されたＨＭ−１７５  Ａ型肝炎ウィルスの弱毒株を含んで成る（Andre ら、Drog. med. Virol., vol.37, p1-24を参照のこと。
【００１２】
本明細書において使用する語「Ａ型肝炎ウィルス（ＨＡＶ）抗原」は、Ａ型肝炎ウィルス、又は任意的に例えばホルムアルデヒドで不活化せしめたＨＡＶの弱毒株に由来するタンパク質のいずれかを意味するように用いている。ＨＡＶ抗原がＡ型肝炎ウィルスに由来するタンパク質であるなら、それは任意的に組換タンパク質であってよい。
【００１３】
Ｔｕｉｎｒｉｘ (商標) ワクチンは組換Ｂ型肝炎抗原と上記の不活化弱毒Ａ型肝炎ウィルスとの組合せである。このワクチンはＡ型肝炎及びＢ型肝炎に対する同時防御に利用されうる。
【００１４】
ヨーロッパ特許ＥＰ−Ｂ−０，３３９，６６７号（Ｃｈｅｍｏ  Ｓｅｒｏ）にはＡ型肝炎抗原とＢ型肝炎抗原とを組合せて併合ワクチンを作製する一般的な概念が記載されている。この明細書には、使用するアジュバンドは重要でない旨記載されている。それには免疫活性を所望の程度にまで高めることができ、且つ任意の副作用を及ぼさないものでなくてはならないとしか記載されていない。アルミニウムゲル、特に水酸化アルミニウムゲル及びリン酸アルミニウムゲルを使用してよい旨記載されている。
【００１５】
別の観点において、本発明はワクチン組成物であって：
（ａ）Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）抗原；
（ｂ）単純ヘルペスウィルス（ＨＳＶ）抗原；及び
（ｃ）Ａ型肝炎ウィルス（ＨＡＶ）抗原を、
ＴＨ１細胞応答の優先的刺激因子であるアジュバンドと一緒に含んで成るワクチン組成物を提供する。
【００１６】
かかるワクチンは特にＨＢＶ及び／又はＨＳＶ感染症、及び／又はＨＡＶ感染症の危険性にありうる青年への投与に極めて有益である。
【００１７】
免疫応答は広義には２つの究極的なカテゴリー、即ち、体液免疫応答又は細胞媒介免疫応答に分けることができうる（古典的には、各々抗体及び細胞エフェクター防御機構を特徴とする）。このような応答のカテゴリーはＴＨ１型応答 (細胞媒介応答) 及びＴＨ２型免疫応答 (体液応答）と称されている。
【００１８】
究極的なＴＨ１型免疫応答は抗原特異的ハロタイプ制限細胞障害性Ｔリンパ球の構築及びナチュラルキラー細胞応答を特徴としうる。マウスでは、ＴＨ１型応答は往々にしてＩｇＧ２のサブタイプの抗体の作製を特徴とし、ヒトではこれらはＩｇＧ１型抗体に相当する。ＴＨ２型免疫応答はマウスＩｇＧ１，ＩｇＡ及びＩｇＭ等の広域な免疫グロブリンアイソタイプの作製を特徴とする。
【００１９】
このような２タイプの免疫応答の展開の裏にある駆動力はサイトカインであると考えられうる。高レベルのＴＨ１型サイトカインは所定の抗原に対する細胞媒介免疫応答の誘導を優先する傾向にあり、一方高レベルのＴＨ２型サイトカインは抗原に対する体液免疫応答を優先する傾向にある。
【００２０】
ＴＨ１及びＴＨ２型免疫応答の違いは絶対的なものではない。実際には、個体は優先的ＴＨ１又は優先的ＴＨ２と称されている免疫応答を保持するようである。しかしながら、サイトカインの種類を、Mosmann and Coffman (Mosmann, T. R. and Coffman, R. L. (1989) TH1 and TH2 cells : different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology, 7, p145-173) によるネズミＣＤ４＋ｖｅＴ細胞クローンに記載の観点で検討するのが往々にして好都合である。伝統的には、ＴＨ１型応答はＴ−リンパ球によるＩＮＦ−γ及びＩＬ−２サイトカインの生産に関連する。往々にしてＴＨ１型免疫応答の誘導に直接関連するその他のサイトカイン、例えばＩＬ−１２はＴ細胞によっては生産されない。それに対し、ＴＨ２型応答はＩＬ−４，ＩＬ−５，ＩＬ−６，ＩＬ−１０及びβ−腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−β）の分泌に関連する。
【００２１】
所定のワクチンアジュバントはＴＨ１又はＴＨ２型サイトカイン応答のいずれかの刺激に極めて適することが知られている。伝統的には、種痘又は感染後の免疫応答のＴＨ１：ＴＨ２のバランスの最良の指標には、抗原による再刺激後のｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＴリンパ球によるＴＨ１又はＴＨ２サイトカインの生産量の直接的な測定及び／又は抗原特異的抗体応答のＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａ比の測定が挙げられる。
【００２２】
かくして、ＴＨ１型アジュバントはｉｎ  ｖｉｔｒｏで抗原により再刺激したときに高レベルのＴＨ１型サイトカインを生産するように単離Ｔ−細胞集団を刺激し、ＴＨ１型アイソタイプに関連する抗原特異的免疫グロブリン応答を誘導するものである。
【００２３】
ＴＨ１細胞応答を優先的に刺激できるアジュバントは国際特許出願ＷＯ９４／００１５３及びＷＯ９５／１７２０９に記載されている。
【００２４】
３デ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａ（３Ｄ−ＭＰＬ）は一のかかるアジュバントである。これはＧＢ２２２０２１１（Ribi) により知られている。化学的には、それは３デ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａと４，５又は６アシル化鎖の混合物であり、そしてRibi Immunochem. Montanaにより製造されている。３デ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａの好適な形態はヨーロッパ特許ＥＰ−Ｂ−０，６８９，４５４  Ｂ１号（Smithkline Beecham Biologicals SA)に開示されている。
【００２５】
好ましくは、３Ｄ−ＭＰＬの粒子は０．２２ミクロン膜で除菌濾過できるほどに十分に小さい（ヨーロッパ特許第０，６８９，４５４号に記載の通り）。３Ｄ−ＭＰＬの粒子の大きさは約１００nm又はそれ未満であることが好ましい。３Ｄ−ＭＰＬは１回の投与当り１０μｇ〜１００μｇ、好ましくは２５〜５０μｇの範囲で存在し、ここでこの抗原は一般に投与当り２〜５０μｇの範囲で存在するであろう。
【００２６】
別の好適なアジュバントは、キノラジャ・サポナリア・モリナ（Quillaja Saponaria Molina)の樹皮に由来するＨＰＬＣ精製された無毒な画分、ＱＳ２１を含んで成る。任意的に、これは３デ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａ（３Ｄ−ＭＰＬ）と、任意的に担体と共に混合されている。
【００２７】
ＱＳ２１の製造方法は米国特許第５，０５７，５４０号に開示されている。
【００２８】
ＱＳ２１を含む非反応原性アジュバント製剤は過去に発表されている（ＷＯ９６／３３７３９）。ＱＳ２１及びコレステロールを含んで成るかかる製剤は抗原と共に調剤したときに有効なＴＨ１刺激性アジュバントとなると示されている。かくして、本発明の一部を構成するワクチン組成物はＱＳ２１とコレステロールとの組合せを含みうる。
【００２９】
ＴＨ１細胞応答の優先的な刺激因子である更なるアジュバントには免疫調節オリゴヌクレオチド、例えばＷＯ９６／０２５５５に開示の非メチル化ＣｐＧ配列が含まれる。
【００３０】
様々なＴＨ１刺激アジュバント、例えば上記のものの組合せも、ＴＨ１細胞応答の優先的な刺激因子であるアジュバントの供与として考慮される。例えば、ＱＳ２１は３Ｄ−ＭＰＬと一緒に調剤できうる。ＱＳ２１：３Ｄ−ＭＰＬの比は一般に１：１０〜１０：１、好ましくは１：５〜５：１、そして往々にして実質的に１：１の程度であろう。最適な相乗効果のために好適な範囲は２．５：１〜１：１の３Ｄ−ＭＰＬ：ＱＳ２１である。
【００３１】
好ましくは、本発明に係るワクチン組成物の中には担体も入っていてよい。この担体は水中油エマルション、又はアルミニウム塩、例えばリン酸アルミニウム又は水酸化アルミニウムであってよい。
【００３２】
好適な水中油エマルションは代謝性油、例えばスクアレン、アルファートコフェロール及びＴｗｅｅｎ  ８０（商標）を含んで成る。更に、この水中油エマルションはｓｐａｎ  ８５及び／又はレシチン及び／又はトリカプリリンを含んでよい。
【００３３】
特に好適な観点において、本発明に係るワクチン組成物中の抗原は３Ｄ−ＭＰＬ及びみょうばんと組合せる。
【００３４】
ヒトへの投与のために典型的には、ＱＳ２１及び３Ｄ−ＭＰＬはワクチンの中に投与当り１μｇ〜２００μｇ、例えば１０〜１００μｇ、好ましくは１０μｇ〜５０μｇの範囲で存在するであろう。典型的には水中油は２〜１０％のスクアレン、２〜１０％のアルファートコフェロール及び０．３〜３％のＴｗｅｅｎ  ８０を含んで成るであろう。好ましくは、スクアレン：アルファートコフェロールの比は１以下とし、なぜならこれはより安定なエマルションを供するからである。ｓｐａｎ  ８５も１％のレベルで存在してよい。状況によっては、本発明のワクチンは安定剤を更に含むのが好都合でありうる。
【００３５】
無毒な水中油エマルションは好ましくは無毒な油、例えばスクアレン又はスクアレン、乳化剤、例えばＴｗｅｅｎ  ８０を水性担体中で含む。この水性担体は例えばリン酸緩衝食塩水であってよい。
【００３６】
水中油エマルション中にＱＳ２１，３Ｄ−ＭＰＬ及びトコフェロールを包含する特に強力なアジュバント製剤はＷＯ９５／１７２１０に記載されている。
【００３７】
本発明の組成物中のＨＳＶ抗原は好ましくはＨＳＶ−２に由来し、典型的には糖タンパク質Ｄである。糖タンパク質はウィルス膜上に位置し、そして感染細胞の細胞質にも見い出せる（Eisenberg R. J. ら、J. of Virol 1980, 35, 428-435)。それはシグナルペプチドを含む３９３個のアミノ酸を含んで成り、そして約６０kDの分子量を有する。ＨＳＶエンベロープ糖タンパク質全てのうち、おそらくはこれがもっとも良く特性決定されている（Cohen ら、J. of Virology, 60, 157-166)。ｉｎ  ｖｉｖｏで、それは細胞膜に対するウィルス結合において中心的な役割を果たすことで知られている。更に、糖タンパク質Ｄはｉｎ  ｖｉｖｏで中和抗体を誘導できることが示されている（Eingら、J. Med. Virology 127 : 59-65) 。しかしながら、潜伏性ＨＳＶ−２ウィルスは患者血清中の高い中和抗体力価の存在にもかかわらず、未だ再活性化でき、そして病気の再発を誘導できる。
【００３８】
本発明の態様は３０８個のアミノ酸のトランケーション型ＨＳＶ−２糖タンパク質Ｄであり、それは天然糖タンパク質のアミノ酸１〜３０６を含んで成り、このトランケーション型タンパク質のＣ末端にアスパラギン及びグルタミンが追加され、膜アンカー領域はない。この形態のタンパク質はシグナルペプチドを含み、それが切断されて２８３個のアミノ酸の成熟タンパク質となる。チャイニーズハムスター卵巣細胞中でのかかるタンパク質の生産がＧｅｎｅｎｔｅｃｈのヨーロッパ特許ＥＰ−Ｂ−１３９，４１７に記載されている。
【００３９】
この組換成熟ＨＳＶ−２糖タンパク質Ｄトランケーション体を本発明のワクチン製剤に使用するのが好ましく、そしてそれをｒｇＤ２ｔと命名する。
【００４０】
この抗原とアジュバント３Ｄ−ＭＰＬとの組合せはＷＯ９２／１６２３１に記載されている。
【００４１】
本発明の組成物中のＢ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）抗原は一般にＢ型肝炎表層抗原である。
【００４２】
Ｂ型肝炎表層抗原（ＨＢｓＡｇ）の調製は十分に発表されている。例えば、Harford ら、Develop. Biol. Standard 54, 第125 頁(1983)，Gregg ら、Biotechnology, 5, 第479 頁（1987),ＥＰＡ０，２２６，８４６、ＥＰＡ０，２９９，１０８及びそれらの中の引用文献に記載されている。
【００４３】
本明細書の中で用いる表現「Ｂ型肝炎表層抗原」（略してＨＢｓＡｇ又はＨＢＳ）には、任意のＨＢｓＡｇ抗原又はＨＢＶ表層抗原の抗原性を示すそのフラグメントが含まれる。ＨＢｓＡｇＳ抗原の２２６個のアミノ酸配列に加えて（Tiollaisら、Nature, 317, 489 (1985) 及びその中の引用文献）、本明細書に記載のＨＢｓＡｇは、所望するなら、上記の文献及びＥＰＡ０，２７８，９４０の中に記載のプレーＳ配列生体又はその一部を含みうる。本明細書に記載のＨＢｓＡｇは変異体、例えばＷＯ９１／１４７０３に記載の「エスケープ突然変異体」を意味することもある。更なる観点において、このＨＢｓＡｇは、ヨーロッパ特許出願第０，４１４，３７４号に記載のタンパク質、即ち、Ｂ型肝炎ウィルス大型（Ｌ）タンパク質（ａｄ又はａｙサブタイプ）のアミノ酸配列の一部から成り、アミノ酸配列が：
（ａ）当該Ｌタンパク質の残基１２−５２、次いで残基１３３−１４５、次いで残基１７５−４００；又は
（ｂ）当該Ｌタンパク質の残基１２、次いで残基１４−５２、次いで残基１３３−１４５、次いで残基１７５−４００；
のいずれかから成ることを特徴とするタンパク質を含んで成ってよい。
【００４４】
ＨＢｓＡｇはＥＰ０，１９８，４７４又はＥＰ０，３０４，５７８に記載のポリペプチドを意味してもよい。
【００４５】
通常、ＨＢｓＡｇは粒状の形態であろう。それはＳタンパク質だけを含んで成るか、又は複合粒子、例えば（Ｌ* Ｓ）（ここでＬ* は前記の通りであり、そしてＳはＢ型肝炎表層抗原のＳ−タンパク質を表わす）であってよい。
【００４６】
ＨＢｓＡｇはＷＯ９３／２４１４８に記載のようにリン酸アンモニウムに収着させてよい。
【００４７】
好ましくは、本発明の製剤において使用されるＢ型肝炎（ＨＢＶ）抗原は商品Ｅｎｇｅｒｉｘ−Ｂ（商標）（Smithkline Beecham Biologicals) に使用されるＨＢｓＡｇＳ抗原である。
【００４８】
３Ｄ−ＭＰＬと一緒にＢ型肝炎表層抗原を含んで成るワクチンはヨーロッパ特許出願ＥＰ−Ａ−０，６３３，７８４号に記載されている。
【００４９】
ヘルペスウィルス群の構成員であるアプステインバーウィルス（ＥＢＶ）はヒトにおいて一次疾患としての感染性単球細胞症を惹起する。主に、それは子供又は青年を冒かす。平均成人人口の９０％超がＥＢＶにより感染され、それは生存の間末梢Ｂ−リンパ球の中で存続する。このウィルスは耳下腺内で長期にわたり生産され、そして主としてそのウィルスを散布する個体からの唾液の交換により拡布される。ＥＢＶに感染した子供はほとんどが無症候性であるか、又は極めて温和な徴候を有し、一方感染した青年及び成人は発熱、咽頭炎及びアデノパシーを特徴とする典型的な感染性単球細胞症を発症する。感染した者はその人生の残りの間抗ＥＢＶ抗体を維持し、従って更なる感染に対して免疫されている。
【００５０】
感染性的性質の他に、ＥＢＶはリンパ球を急速分裂細胞へと形質転換せしめることが示され、それ故アフリカバーキットリンパ腫（ＢＬ）等のいくつかの異なるリンパ腫に関与していることが示されている。ＥＢＶは鼻咽頭癌腫（ＮＰＣ）の惹起にも関与しうる。世界中で、８０，０００の鼻咽頭癌腫の症例が生じていると推定され、そして中国系民族ではもっと広がっている。感染性単球細胞症はＥＢＶによる一次感染の結果である。それは更なる危険因子がなければ、生命を脅かす疾患ではない。
【００５１】
いわゆる膜抗原複合体を構成するＥＢＶウィルスエンベロープの４種類のタンパク質が発表されている。それらは通常ｇｐ２２０／３５０もしくはｇｐ２５０／３５０、又は単にｇｐ２５０もしくは３５０と称されている（ＥＰＡ１５１０７９を参照のこと）。ｇｐ３５０及びｇｐ２５０が中和抗体の生産を誘導し、またｇｐ３５０及びｇｐ２５０に対する抗体が中和能力を有するという確証がある。これらのタンパク質は可能なＥＢＶワクチンの候補である。ｇｐ２５０／３５０のＥＢＶ関連疾患の予防及び治療の用途についての更なる情報については、ＥＰ０，１７３，２５４を参照のこと。
【００５２】
主要ＥＢＶ表層糖タンパク質ｇｐ３５０／２２０は細胞膜タンパク質ＣＤ２１との相互作用を介してヒト標的細胞に感染する。ｇｐ３５０／２２０はヒトにおけるＥＢＶ中和抗体の主要標的であり、そしてｇｐ３５０／２２０のいくつかの形態がＥＢＶ関連疾患に対する防御を示している。好ましくは、本発明に係るワクチン組成物はＥＢＶのｇｐ３５０を含んで成るが、その他の防御性抗原を使用してもよい。
【００５３】
パピロマウィルスは小さなＤＮＡ腫瘍ウィルスであり、それは高度に種特異性である。今までに７０超の個別のヒトパピロマウィルス（ＨＰＶ）ゲノタイプが発表されている。ＨＰＶは一般に皮膚（例えばＨＰＶ−１及び−２）又は粘膜表層（例えばＨＰＶ−６及び−１１）のいずれかに特異的であり、そして通常は何か月も何年も存続する良性腫瘍（いぼ）の原因となる。かかる良性腫瘍は関連の個体にとって不快ではありうるが、数例を除き、生命を脅かす傾向にはない。
【００５４】
いくつかのＨＰＶも癌に関連する。ＨＰＶとヒト癌との間の最も強い関係は、ＨＰＶ−１６及びＨＰＶ−１８と頸部癌腫との間にあるものである。頸部癌は発展途上国において最も多い悪性腫瘍であり、毎年世界中で約５００，０００の新しい症例が発症している。ワクチンを用いて一次ＨＰＶ−１６感染症、そして更には樹立したＨＰＶ−１６含有癌でさえも積極的に撲滅することが現在技術的に可能である。ＨＰＶ−１６に対する予防及び治療的種痘の見込みについては、Cason J., Clin. Immunother. 1994 ; 1 (4) 293-306及びHagenesee M. E., Infections in Medicine 1997 14 (7) 555-556, 559-564を参照のこと。好ましくは、本発明に係るワクチン組成物は主要カスピドタンパク質、Ｌ１タンパク質を含んで成る。
【００５５】
今日、様々なタイプのＨＰＶが単離され、そして細菌中のクローニングシステム、そしてより最近ではＰＣＲ増幅の助けにより特性決定されている。ＨＰＶゲノムの分子統合は十分に特性決定された１型ウシパピロマウィルス（ＢＰＶ１）のそれとの対比基準に基づき決定される。
【００５６】
ささいな変動はあるにしても、発表されているＨＰＶゲノムは全て少なくとも７つの早期遺伝子、Ｅ１〜Ｅ７、並びに２つの後期遺伝子、Ｌ１及びＬ２を有する。更に、上流調節領域は調節配列を有し、それはＨＰＶゲノムのほとんどの転写現象を調節するようである。
【００５７】
Ｅ１及びＥ２遺伝子はウィルスの複製及び転写の調節の各々に関与し、そしてウィルスの組込みにより中断されがちである。Ｅ６及びＥ７、また最近の証拠が示すにはＥ５もウィルス形質転換に関与する。頸部癌腫に関与するＨＰＶ、例えばＨＰＶ１６及び１８において、腫瘍形成過程はウィルスＤＮＡの組込みを経て開始する。組込みはカスピドタンパク質Ｌ１及びＬ２をコードする遺伝子の不活化をもたらし、また正常な細胞分化及び癌腫の発育の暫時的な低下に結びつく２つの早期タンパク質Ｅ６及びＥ７の連続過剰発現を指令する。
【００５８】
頸部の癌腫は女性に一般的であり、そして前癌性中間段階から往々にして死に至る侵襲癌腫へと進行する。この疾患の中間段階は頸部上皮内新形成として知られ、そして症度の悪化の観点でＩ〜III へと等級分けされている。
【００５９】
臨床学的には、女性肛門性器管のＨＰＶ感染症は頸部扁平コンジロームとして明示され、その目印は頸部扁平上皮の表層及び中間細胞を主に冒かす空胞細胞症である。
【００６０】
ウィルスの細胞病理学的作用の結果である空胞細胞症は核周囲の透明な輪を有する核細胞として出現する。その上皮細胞は厚みを帯び、いぼ状の損傷外観を担う異常な角質化を伴う。
【００６１】
かかる扁平コンジロームはＨＰＶ１６又は１８血清型に対して陽性なら、それ自身侵襲性頸部癌腫の前駆損傷であると認められている頸部上皮内新形成（ＣＩＮ）及び現場癌腫（ＣＩＳ）への進行のためのハイ−リスク因子である。
【００６２】
国際特許出願ＷＯ９６／１９４９６号はヒトパピロマウィルスのＥ６及びＥ７タンパク質の変異体、特にこのＥ６及びＥ７タンパク質の双方において欠失を有するＥ６／Ｅ７の融合タンパク質を開示する。このような欠失融合タンパク質は免疫原性であると記載されている。
【００６３】
ＨＰＶ  Ｌ１をベースとするワクチンがＷＯ９４／００１５２，ＷＯ９４／２０１３７，ＷＯ９３／０２１８４及びＷＯ９４／０５７９２を開示されている。かかるワクチンはＬ１抗原をモノマー、カプソマー又はウィルス様粒子として含んで成りうる。かかる粒子は更にＬ２タンパク質を含んで成ってよい。その他のＨＰＶワクチンは早期タンパク質、例えばＥ７、又は融合タンパク質、例えばＬ２−Ｅ７を基礎とする。
【００６４】
本発明のワクチンにおいて、Ｔ細胞エピトープを有する免疫学的融合パートナーに連結されたＥ６又はＥ７タンパク質のいずれかを含んで成る組成物を利用するのが好ましい。
【００６５】
本発明の好適な形態において、この免疫学的融合パートナーはヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）Ｂのタンパク質Ｄに由来する。好ましくは、このタンパク質Ｄ誘導体はこのタンパク質の最初の約１／３、特に最初のＮ末端約１００〜１１０個のアミノ酸を含んで成る。
【００６６】
従って、本発明は、一の態様において、上記のＨＰＶに由来する抗原を含んで成る。好ましくは、本発明はＨＰＶ１６由来のタンパク質Ｄ−Ｅ６，ＨＰＶ１６由来のタンパク質Ｄ−Ｅ７，ＨＰＶ１８由来のタンパク質Ｄ−Ｅ７、及びＨＰＶ１８由来のタンパク質Ｄ−Ｅ６を含んで成る融合タンパク質を含んで成る。
【００６７】
本発明のタンパク質は好ましくはＥ．コリの中で発現させる。好適な態様において、これらのタンパク質は５〜９、好ましくは６個のヒスチジン残基を含んで成るヒスチジンテールを伴って発現させる。これらは精製を助けるうえで有利である。かかるタンパク質の製造の説明は同時係属中の英国特許出願ＧＢ９７１７９５３．５に完全に記載されている。
【００６８】
好適な観点において、本発明のワクチン組成物は更にバリセラ・ゾスター（Ｖａｒｉｃｅｌｌａ  Ｚｏｓｔｅｒ）ウィルス抗原（ＶＺＶ抗原）を含んで成る。ワクチン製剤の中に含ませるためのＶＺＶの適当な抗原にはLongneckerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 4303-4307 (1987) に記載のｇｐＩ−Ｖが挙げられる。
【００６９】
好適な態様において、ｇｐＩ（Ellis ら、米国特許第４，７６９，２３９号を参照）を使用する。ヨーロッパ特許ＥＰ−Ｂ−０，４０５，８６７  Ｂ１も参照のこと。
【００７０】
別の好適な観点において、本発明のワクチン組成物は更にヒトサイトメガロウィルス（ＨＣＭＶ）抗原を含んで成る。ＨＣＭＶはヘルペスウィルス科に属するヒトＤＮＡウィルスである。ＨＣＭＶは世界中の大部分において固有となっている。２つの集団間で、ＨＣＭＶは重篤な医学的症状の原因となっている。ＨＣＭＶは新生児における先天性障害の主因である。危険性のある第二の集団は免疫無防備患者、例えばＨＩＶ感染症に苦しむ者、及び移植を受けた患者である。この臨床学的疾患は発熱、肝炎、肺炎及び感染性単球細胞症等の様々な症状を惹起する。ＨＣＭＶに対するワクチンに利用するための好適な抗原はＷＯ９５／３１５５５に記載のｇＢ６８５である。ＨＣＭＶワクチンに利用するための免疫原も、ＷＯ９４／００１５０（Ｈｏｐｅ市）に記載のＨＣＭＶマトリックスタンパク質、ｐｐ６５により供されている。
【００７１】
一の好適な観点において、本発明のワクチン組成物は更にＶＺＶ及びＨＣＭＶ抗原の双方、特に上記の抗原を含んで成る。
【００７２】
別の好適な観点において、本発明のワクチン組成物は更にトキソプラスマ・ゴンジイイ抗原を含んで成る。トキソプラスマ・ゴンジイイは温血動物、例えばヒトにおけるトキソプラスマ症の原因となる偏性細胞内原虫寄生生物である。それは健康な個体では一般に臨床学的無症候であるが、トキソプラスマ症は妊婦及び免疫無防備患者において重篤な併合症を惹起しうる。トキソプラスマ・ゴンジイイに対するワクチンにおいて利用するための好適な抗原はＷＯ９６／０２６５４に記載のＳＡＧ１（Ｐ３０としても知られる）又はＷＯ９２／１１３６６に記載のＴｇ３４である。
【００７３】
一の好適な観点において、本発明のワクチン組成物は更にトキソプラスマ・ゴンジイイ抗原、特に上記の抗原と組合さったＶＺＶ抗原又はＨＣＭＶ抗原のいずれかを含んで成る。
【００７４】
好適な観点において、本発明のワクチン組成物は多価ワクチン、例えば四価又は五価ワクチンである。
【００７５】
本発明の製剤は防御免疫力を誘導するのに、たとえ極めて低い抗原用量（例えば５μｇのｒｇＤ２ｔはどの低さ）でさえも、極めて有効である。
【００７６】
これらは一次感染に対する優れた防御を供し、そして好都合には特異的な体液免疫応答（中和抗体）、更にはエフェクター細胞媒介（ＤＴＨ）免疫応答を刺激する。
【００７７】
本発明は更なる観点において医学療法において利用するため、特に単純ヘルペス感染症及びＢ型肝炎ウィルス感染症の治療及び予防において利用するための本明細書に記載のワクチン製剤を提供する。
【００７８】
本発明のワクチンは免疫学的防御量の抗原を含み、そして慣用の技術により調製できうる。
【００７９】
ワクチン調製品は一般にPharmacentical Biotechnology, Vol.61 Vaccine Design-the subunit and adjuvant approach, Power and Newman 編、Plenurn Press, 1995 ; New Trends and Developments in Vaccines, Voller ら編、University Park Press, Baltimore, Maryland, U. S. A. 1978 に記載されている。リポソーム内への封入は例えばFullerton 、米国特許第４，２３５，８７７号に記載されている。タンパク質の巨大分子への接合は例えばLikhite 、米国特許第４，３７２，９４５号及びArmor ら、米国特許第４，４７４，７５７号に開示されている。
【００８０】
各ワクチン剤型中のタンパク質の量は、典型的なワクチンにおいて有意に有害な副作用なく免疫防御応答を誘導する量として選定される。かかる量はどの特異的な免疫原を使用するかに依存して変わるであろう。一般に、各剤型は１〜１０００μｇのタンパク質、好ましくは２〜１００μｇ、最も好ましくは４〜４０μｇのタンパク質を含んで成るであろう。特定のワクチンについての最適な量は抗体力価及び被検体におけるその他の応答の検討を包含する標準試験により確認できる。最初の種痘に続き、被検体に約４週間目においてブーストを与えてよい。
【００８１】
ＨＳＶ又はＨＢＶウィルス感染症にかかり易い者の種痘に加えて、本発明の医薬組成物はかかるウィルス感染症に苦しむ患者を免疫療法学的に処置するために利用できうる。
【００８２】
本発明の更なる観点において、本明細書に記載の製造方法を提供し、ここでこの方法はヘルペスウィルス抗原及びＢ型肝炎ウィルス抗原をＴＨ−１誘導アジュバント、例えば３Ｄ−ＭＰＬと、更には好ましくは担体、例えばみょうばんと混合することを含んで成る。
【００８３】
所望するなら、本明細書に記載の多価ワクチン組成物を提供するため、他の抗原を任意の好都合な順序で添加してよい。
【００８４】
実施例１：ｇＤ＋ＨＢｓの組合せによる免疫原試験
この試験の目的はＡｌ（ＯＨ）3 ／３Ｄ−ＭＰＬ製剤中のＨＳＶ  ｇＤ／ＨＢＶ  ＨＢｓ組合せの適性の実証にある。これらの抗原を単独で又は組合せて使用して免疫することによりモルモットで誘導した免疫応答を比較した。ＨＢｓはＢ型肝炎表層抗原、詳しくは上記のＳ−タンパク質の略語である。ｇＤは上記のｒｇＤ2 ｔの略語である。
【００８５】
実験プロトコール
実験プロトコールは以下の通りとした。６匹の雌Ｈａｒｔｌｅｙモルモットのグループに下記の製剤を０日及び２８日目に筋肉内注射した：
−グループ１：ＨＢｓ５μｇ／Ａｌ（ＯＨ）3 １２５μｇ／３Ｄ−ＭＰＬ  １２．５μｇ
−グループ２：ｇＤ５μｇ／Ａｌ（ＯＨ）3 １２５μｇ／３Ｄ−ＭＰＬ  １２．５μｇ
−グループ３：ＨＢｓ５μｇ＋ｇＤ５μｇ／Ａｌ（ＯＨ）3 １２５μｇ／３Ｄ−ＭＰＬ  １２．５μｇ
−グループ４：ＨＢｓ５μｇ＋ｇＤ５μｇ／Ａｌ（ＯＨ）3 １２５μｇ／３Ｄ−ＭＰＬ* １２．５μｇ
＊異なる３Ｄ−ＭＰＬバッチ
【００８６】
動物から２回目の免疫の１４日及び３１日目に採血した。ＨＳＶ  ｇＤ及びＨＢＶ  ＨＢｓに対する体液免疫応答をＥＬＩＳＡで両時点で評価した。
【００８７】
遅延型敏感（ＤＴＨ）反応もＨＢｓについて評価した。これらは１０μｇのＨＢｓの皮内注射から成り、二重測定で行った。ＤＴＨ反応の発生を注射してから０，２４及び４８時間後を皮膚の厚みを測定することにより追跡した。
【００８８】
結果
１．抗体応答
抗−ｇＤ  ＥＬＩＳＡ力価を図１に示す。ｇＤで免疫したグループにおける抗−ｇＤ力価はｇＤ＋ＨＢｓの組合せで免疫した動物において誘導されたものと同等であった。製剤中のＨＢｓの存在は抗−ｇＤ抗体応答の誘導に影響を及ぼさなかった。
【００８９】
同様に、抗−ＨＢｓ抗体力価をＨＢｓ単独又はｇＤとの組合せで免疫した動物において比較した。図２は同等な抗−ＨＢｓ力価がＨＢｓ単独又はＨＢｓ＋ｇＤで免疫した動物において観察されたことを示す。
【００９０】
結果を図１〜４に示し、それから試験した製剤、ｇＤ／ＨＢｓ組合せが、同抗原を単独で利用することにより誘導された抗体応答を同等のそれ、及びＨＢｓ単独により誘導されたＤＴＨ応答と同等のそれを誘導するものと考えられうる。従って、ＤＴＨ応答、対、ＨＢｓにおける有意な差はＨＢｓ又はＨＢｓ＋ｇＤ種痘動物において認められなかった。ｇＤの存在はＨＢｓに対するＤＴＨ応答に影響を及ぼさなかった。
【００９１】
実施例２：ＰＲＯ３０実験  ＨＢＶ／ＨＳＶの組合せ
この試験の目的はＨＳＶモルモットモデルにおいて、３Ｄ−ＭＰＬ／みょうばん製剤中のｇＤ単独との対比における、３Ｄ−ＭＰＬ／みょうばん製剤中のＨＳＶ  ｇＤ＋ＨＢＶ  ＨＢｓ組合せの防御効能を検討することにある。３Ｄ−ＭＰＬ／みょうばん製剤は１０重量部のみょうばん、対、１重量部の３Ｄ−ＭＰＬを含んで成る。
【００９２】
実験プロトコール
１２匹の雌のＨａｒｔｌｅｙモルモットのグループを下記の製剤で免疫するか、又は未処置のままとした。
【００９３】
【表１】
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【００９４】
動物を０日及び２８日目にて２回筋肉内免疫した。それらは１０5 pfu のＨＳＶ２  ＭＳ株（１００μｌ）を５７日目において膣内負荷し（２回目の免疫の１ヶ月後）、次いで一次疾患（感染後４〜１２日）及び再発性疾患（感染後１３〜３９日）の臨床的徴候を毎日追跡した。誘導される防御は表１に記載の厳格な基準に従い、且つ累積採点曲を介して測定した。
【００９５】
第II免疫後１４日及び２８日目において集めた血清をその抗−ｇＤ  ＥＬＩＳＡ  Ａｂ力価（ＥＵ／mlとして表示）についても試験した；第II免疫後２８日目において獲得した血清をそのＨＳＶ中和活性についても試験した（「ＮＥＵＴＲＡ」；ＨＳＶ２に対して１００％の防御を供する血清希釈率の逆数に相当する力価）。
【００９６】
結果
血清学的結果：
免疫原データを下記の表及び図５に示す。
【００９７】
【表２】
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【００９８】
似たようなＥＬＩＳＡ及び中和力価が３Ｄ−ＭＰＬ／みょうばん製剤中のｇＤ（５μｇ）＋ＨＢｓ（５μｇ）の組合せ及びｇＤ／３Ｄ−ＭＰＬ／みょうばん製剤によって誘導された。
【００９９】
一次疾患に対する防御
図６（累積採点曲線）及び以下の表１に示すように、ｇＤ＋ＨＢｓ／３Ｄ−ＭＰＬ／みょうばん併合製剤は一次疾患に対し、３Ｄ−ＭＰＬ／みょうばん製剤中のｇＤのみを同じぐらいに良好な防御を供した。
【０１００】
再発性疾患に対する防御
ヘルペスの再発に対する防御を図７（累積採点曲線）及び以下の表２に示す。ｇＤ＋ＨＢｓ／３Ｄ−ＭＰＬ／みょうばん併合製剤は再発性疾患に対し、３Ｄ−ＭＰＬ／みょうばん製剤中のｇＤのみと同じぐらいに良好な防御を供した。
【０１０１】
ｇＤ＋ＨＢｓ及びｇＤのみのグループでは同じぐらいの数の動物において再発があった。正確には、これらのグループにおける同数の動物が観察期間（負荷後１３〜３９日目）の間に１回より多く再発した。再発したこれらの動物において、同等の損傷症度が記録された。
【０１０２】
【表３】
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【０１０３】
【表４】
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実施例３：
この試験の目的はアルミニウム塩及び３Ｄ−ＭＰＬと共に調合したＨＡＶ，ＨＢｓ及びｇＤを含んで成る併合ワクチンによりマウスで誘導した血清学免疫応答の検討にある。本実施例において用いたＡ型肝炎成分（「ＨＡＶ」と略す）はＨａｒｖｉｘの中に入っているＨＭ１７５株とした。
【０１０４】
材料及び方法
抗原／３Ｄ−ＭＰＬバッチ
ＨＢｓ：Ａｌ：４５５０μｇ／ml、予備収着化ＨＢｓ：２２７，６２μｇ／ml
ＨＡＶ：Ａｌ：１３８０μｇ／ml、ＨＡＶ：２５２３０ＥＵ／ml
ｇＤ：４９３μｇ／ml
３Ｄ−ＭＰＬ：９５７μｇ／ml
調合工程
・グループ１：ＨＢｓ  ＡｌＰＯ4 ／３Ｄ−ＭＰＬ
ＨＢｓ／Ｈ2 Ｏ／ＮａＣｌ／フェノキシ／ＡｌＰＯ4 を１５min ＋３Ｄ−ＭＰＬを１hr
・グループ２：ｇＤ  ＡｌＯＨ3 ／３Ｄ−ＭＰＬ
Ｈ２Ｏ／ＡｌＯＨ3 を５min ＋ｇＤを１５min ＋３Ｄ−ＭＰＬを３０min ＋ＰＢＳを１５min ＋フェノキシ
・グループ３：ＨＡＶ  ＡｌＯＨ3 ／３Ｄ−ＭＰＬ
Ｈ2 Ｏ／ＮａＣｌ／Ｐｈｅｎｏｘｙを５min ＋ＡｌＯＨ3 ／ＨＡＶを３０min ／３Ｄ−ＭＰＬ
・グループ４：
１．Ｈ2 Ｏ／ＮａＣｌ／フェノキシを５min ＋ＡｌＰＯ4 ／ＨＢｓを５min ＋３Ｄ−ＭＰＬを３０min
２．ｇＤ／ＡｌＯＨ3 を１５min ＋３Ｄ−ＭＰＬを３０min
１及び２を２０min 混合＋ＨＡＶを１hr混合。
【０１０５】
血清学測定
・抗ＨＢｓ及び抗ｇＤ抗体の定量は被覆抗原としてＨＢｓ又はｇＤを用いるＥＬＩＳＡにより実施した。抗原及び抗体の溶液はウェル当り５０μｌで使用した。抗原をＰＢＳの中で１μｇ／mlの最終濃度を希釈し、そして４℃にて一夜かけて９６穴マイクロタイタープレート（Maxisorb Immuno-plate, Nunc, Denmark) のウェルに収着させた。次いでのプレートを３７℃で１hr、１％の半血清アルブミン及び０．１％のＴｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳ（飽和バッファー）とインキュベーションした。飽和バッファー中の２倍希釈率の血清を抗原被覆プレートに加え、そして３７℃で１時間３０分インキュベーションした。これらのプレートをＰＢＳ  ０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０及び飽和バッファー中に１／１０００に希釈したビオチン接合抗マウスＩｇＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＵＫ）で４回洗った。洗浄工程の後、飽和バッファーに１／５０００又は１／１０００に希釈した（ＨＢｓ及び抗ｇＤ  ＥＬＩＳＡ各々）ストレプトアビジン−ビオチニル化ペルオキシダーゼ複合体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を更に３０分、３７℃で加えておいた。プレートを上記の通りにして洗浄し、そして０．１％のＴｗｅｅｎ  ２０、０．０５Ｍのクエン酸バッファー、pH４．５中のＯ−フェニレンジアミン（Ｓｉｇｍａ）０．０４％，Ｈ2 Ｏ2 ０．０３％の溶液と２０分インキュベーションした。反応をＨ2 ＳＯ4 ２Ｎで止め、そして４９２／６２０nmで測定を行った。ＥＬＩＳＡ力価はＳｏｆｔｍａｘＰｒｏにより対照から計算し（４通りのパラメーター式を利用し）、そしてＥＵ／mlで表示する。
【０１０６】
・抗ＨＡＶ抗体の定量はＥｎｚｙｍｕｎ  ＥＬＩＳＡ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）により、その製造者のプロトコールに従って実施した。
【０１０７】
実験プロトコール
７匹のＢａｌｂ／Ｃマウスのグループを下記の製剤で筋肉内免疫した（ヒト用量の１／１０に相当）：
１．ＨＢｓ（２μｇ）／ＡｌＰＯ４（５０μｇ）／３Ｄ−ＭＰＬ（５μｇ）
２．ｇＤ（２μｇ）／Ａｌ（ＯＨ）３（５０μｇ）／３Ｄ−ＭＰＬ（５μｇ）
３．ＨＡＶ（７２ＥＵ）／Ａｌ（ＯＨ）３（５０μｇ）／３Ｄ−ＭＰＬ（５μｇ）
４．ＨＡＶ（７２Ｕ）／Ａｌ（ＯＨ）３（５μｇ）＋ＨＢｓ（２μｇ）／ＡｌＰＯ４（４０μｇ）／３Ｄ−ＭＰＬ（２．５μｇ）＋ｇＤ（２μｇ）／Ａｌ（ＯＨ）３（５μｇ）／３Ｄ−ＭＰＬ（２．５μｇ）
【０１０８】
動物を０及び２１日目に５０mlのワクチンで２回免疫した。血清を免疫後様々な時点で集め（第Ｉ免疫の２１日後（２１ｐｏｓｔ  Ｉ）及び第II免疫の１４日後（１４ｐｏｓｔ  II））、そしてその抗ＨＡＶ，ＨＢｓ及びｇＤ抗体力価について試験した。
【０１０９】
結果
第Ｉ免疫の２１日後及び第II免疫の１４日後の個々のデータ−を表３に示し、そして以下にまとめる。
【０１１０】
【表５】
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【０１１１】
【表６】
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【０１１２】
【表７】
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【０１１３】
【表８】
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【０１１４】
所見
・併合ワクチンとアルミニウム塩及び３Ｄ−ＭＰＬ含有ＨＢｓワクチンとにおいて同等の抗−ＨＢｓ抗体力価が観察された。
・併合ワクチンとアルミニウム塩及び３Ｄ−ＭＰＬ含有ｇＤワクチンとにおいて同等の抗−ｇＤ抗体力価が観察された。
・併合ワクチンとアルミニウム塩及び３Ｄ−ＭＰＬ含有ＨＡＶワクチンとにおいて同等の抗−ＨＡＶ抗体力価が観察された。
【０１１５】
従って、ＨＢｓ，ｇＤ及びＨＡＶをアルミニウム塩及び３Ｄ−ＭＰＬ含有ワクチンの中で組合せたとき、干渉は認められなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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