(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＶＳＶ（水疱性口内炎ウイルス）の標的細胞膜に対する融合を促進するのに効果的な異種Ｆタンパク質；ＶＳＶのＧタンパク質の膜隣接外部ドメインのカルボキシル末端の第２３〜７０アミノ酸残基からなる領域、ＶＳＶのＧタンパク質のＧステムポリペプチドのアミノ酸配列中の第４８３〜５１１番目のアミノ酸残基からなる細胞質内尾部ドメイン、膜貫通ドメインからなるＶＳＶのＧステムポリペプチド；ＶＳＶのＮ、Ｐ、及びＬタンパク質を含み、ＶＳＶのＧタンパク質をコードする核酸配列が欠失した、遺伝的に操作されたＶＳＶ。
【請求項２】
さらにＶＳＶのＭタンパク質を含む、請求項１記載の遺伝的に操作されたＶＳＶ。
【請求項３】
さらに抗受容体タンパク質を含む、請求項１又は２記載の遺伝的に操作されたＶＳＶ。
【請求項４】
Ｇステムポリペプチド及び抗受容体タンパク質が共通のｃＤＮＡ配列から発現される、請求項３記載の組換えＶＳＶ。
【請求項５】
Ｆタンパク質がパラミキソウイルス株ＳＶ５の融合タンパク質である、請求項１又は２記載の組換えＶＳＶ。
【請求項６】
ＶＳＶのＧステムポリペプチドが、ＶＳＶのＧステムポリペプチドの 404Ｇｌｙ及び４４０ｐｈｅの間の任意の残基から511ＡｒｇまでのＶＳＶ−Ｉｎｄｉａｎａ株（ＶＳＶIND）ポリペプチド断片を含む、請求項５記載の組換えＶＳＶ。
【請求項７】
ＶＳＶの細胞膜への融合を促進するのに有効な異種Ｆタンパク質を発現する組換えＶＳＶを生産する方法であって、以下の：
（Ａ）ＶＳＶのＮ、Ｐ、Ｌ及びＧタンパク質をコードするｃＤＮＡを適切な細胞に挿入する段階；
（Ｂ）少なくとも、ＶＳＶの複製のためのｃｉｓ作用シグナルを含む３’及び５’ＶＳＶのリーダー及びトレーラー領域；ＶＳＶのＮ、Ｐ、Ｍ及びＬタンパク質をコードする遺伝子群；及び、ＶＳＶのＧタンパク質の膜隣接外部ドメインのカルボキシル末端の第２３〜７０アミノ酸残基からなる領域、ＶＳＶのＧタンパク質のＧステムポリペプチドのアミノ酸配列中の第４８３〜５１１番目のアミノ酸残基からなる細胞質内尾部ドメイン、膜貫通ドメインからなるＧステムタンパク質、および異種Fタンパク質をコードする遺伝子を含む、ＶＳＶゲノムのポリシストロニックｃＤＮＡコピーを適切な細胞に挿入する段階；
（Ｃ）組換えＶＳＶの生産を可能にする条件下で細胞を培養する段階；及び
（Ｄ）前記組換えＶＳＶを単離する段階；
を含む、前記方法。
【請求項８】
ポリシストロニックｃＤＮＡがさらに、組換えＶＳＶが細胞を標的とするのに効果的な、抗受容体タンパク質をコードする遺伝子を含む、請求項７記載の方法。
【請求項９】
抗受容体タンパク質がＣＤ４、ＣＤ４誘導体、及び細胞膜上に発現された腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を認識する抗体又は抗体断片からなる群から選択される請求項８記載の方法。
【請求項１０】
ポリシストロニックｃＤＮＡがさらにＧステムポリペプチドをコードする遺伝子を含む請求項７記載の方法。
【請求項１１】
Ｆタンパク質がパラミキソウイルス株ＳＶ５Ｆタンパク質である請求項７記載の方法。
【請求項１２】
ＶＳＶの細胞膜への融合を促進するのに効果的な異種Ｆタンパク質を発現する組換えＶＳＶを生産する方法であって、以下の：
（Ａ）少なくともＶＳＶの複製のためのｃｉｓ作用シグナルを含む３’及び５’ＶＳＶリーダー、及びトレーラー領域、ＶＳＶのＮ、Ｐ、及びＬタンパク質をコードする遺伝子及び、ＶＳＶのＧタンパク質の膜隣接外部ドメインのカルボキシル末端の第２３〜７０アミノ酸残基からなる領域、ＶＳＶのＧタンパク質のＧステムポリペプチドのアミノ酸配列中の第４８３〜５１１番目のアミノ酸残基からなる細胞質内尾部ドメイン、膜貫通ドメインからなるＧステムタンパク質、および異種Fタンパク質をコードする遺伝子を含むポリシストロニックｃＤＮＡを適切な細胞に挿入する段階；
（Ｂ）ＶＳＶの複製のためのｃｉｓ作用シグナル及び少なくともＶＳＶのＧ及びＭタンパク質をコードする遺伝子を含むミニウイルスにより細胞を感染させる段階；
（Ｃ）ｃＤＮＡの発現を可能にし、組換えウイルスを生産させる条件下で細胞を培養する段階；及び
（Ｄ）前記組換えＶＳＶを単離する段階；
を含む、前記方法。
【請求項１３】
Ｆタンパク質がパラミキソウイルス株ＳＶ５Ｆタンパク質である、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
ポリシストロニックｃＤＮＡ又はミニウイルスがさらに抗受容体タンパク質をコードするｃＤＮＡを含む、請求項７〜１２いずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
ポリシストロニックｃＤＮＡ又はミニウイルスがさらにレポータータンパク質をコードするｃＤＮＡを含む、請求項７〜１２いずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
遺伝的に操作されたＶＳＶのウイルス外殻が標的細胞の細胞膜に融合する条件下で、請求項３の遺伝的に操作されたＶＳＶを標的細胞に接触させる段階を含む、標的細胞を遺伝的に操作されたＶＳＶに融合する方法。
【請求項１７】
標的細胞がＨＩＶ−１感染細胞であり、抗受容体タンパク質がＣＤ４又はＣＤ４誘導体である、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
抗受容体がウイルス、寄生虫、又は細菌により感染した細胞の表面に発現したウイルス、寄生虫、又は細菌タンパク質に結合するのに効果的な量の請求項３記載の遺伝的に操作されたＶＳＶを含む、ウイルス、寄生虫又は細菌感染した患者を治療するための医薬組成物。
【請求項１９】
抗受容体が疾患に関連する、又は疾患の細胞の表面に発現するタンパク質に結合するのに効果的な量の請求項１〜３いずれか１項の組換えＶＳＶを含む、疾患に罹患した患者を治療するための医薬組成物。
【請求項２０】
疾患の細胞又は組織が、腫瘍細胞、前腫瘍細胞、良性腫瘍、ポリープ、カフェオレ斑、白斑、及び皮膚母斑からなる群から選択される、請求項１９記載の医薬組成物。
【請求項２１】
異種Ｆタンパク質を同定する方法であって、以下の：
（Ａ）少なくともＶＳＶの複製のためのｃｉｓ作用シグナルを含む３’及び５’ＶＳＶリーダー及びトレーラー領域、Ｎ、Ｐ、及びＬタンパク質を含むＶＳＶ遺伝子群、ＶＳＶのＧタンパク質の膜隣接外部ドメインのカルボキシル末端の第２３〜７０アミノ酸残基からなる領域、ＶＳＶのＧタンパク質のＧステムポリペプチドのアミノ酸配列中の第４８３〜５１１番目のアミノ酸残基からなる細胞質内尾部ドメイン、膜貫通ドメインからなるＧステムタンパク質、Fタンパク質候補及び非ＶＳＶタンパク質の遺伝子を含む、第一のポリシストロニックｃＤＮＡを適切な細胞に挿入する段階；
（Ｂ）ＶＳＶの複製のためのｃｉｓ作用シグナル及びレポータータンパク質をコードする第二のｃＤＮＡを含むミニウイルスを細胞に感染させる段階；
（Ｃ）第一のｃＤＮＡ及びミニウイルスの複製による組換えＶＳＶの生産を可能にする条件下で細胞を培養する段階；
（Ｄ）前記組換えＶＳＶを単離する段階；
（Ｅ）前記組換えＶＳＶによる感染を可能にする条件下で、単離されたＶＳＶを感染していない細胞に接触させる段階；及び、
（Ｆ）レポータータンパク質が発現しているかどうかを決定する段階；
を含む、前記方法。
【請求項２２】
Ｆタンパク質を発現し、疾患又は異常細胞に感染することができる、請求項１記載の組換えＶＳＶを含む、疾患の進行又は退行を診断、検出、又は決定するための診断キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は組変えラブドウイルスの標的細胞への侵入および融合を促進する融合タンパク質を少なくとも発現する組変えラブドウイルスに関するものである。本発明はそのウイルス粒子の表面に融合タンパク質を発現する水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）を含む。融合タンパク質を発現するこれらの組変えラブドウイルスは、設計されたラブドウイルスには本来発見されないタンパク質の機能および特異性を研究するために、および診断および治療の目的において異常および病気の細胞（例えば、ウイルスに感染した細胞または癌細胞）を標的とする方法として使用することが可能である。本発明はまた組変えラブドウイルスの産生方法も開示する。
連邦政府による援助
本発明は部分的に以下の連邦政府助成金から、および政府が３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§４０１の下に権利を授与された結果として生じたものである：ＮＩＨ  ＧＭ５３７２６。
【０００２】
【従来の技術】
Ａ．ウイルスの標的細胞への利用
ウイルスは主に遺伝子治療の目的において、この１０年で標的細胞に適するように設計されてきた。遺伝子治療は、遺伝子およびしばしば病気の細胞の運搬を含み、通常は宿主細胞のゲノムへの遺伝子の挿入をも含む。アデノウイルス科、パルヴォウイルス科およびレトロウイルス科に属するウイルスが、細胞ゲノムへの遺伝子の挿入のためのみならず、特異的細胞または組織への遺伝子の運搬のためにも成功的に設計されてきた。
【０００３】
ウイルスを特異的細胞に運搬するためには、ウイルスはその型の細胞に感染することが可能でなければならない。ウイルスは一般的には全ての細胞または全ての生物にさえ感染可能というわけではない。ウイルスの細胞への感染能力は、そのウイルスがその宿主生物およびその生物のその細胞に対して有している「向性(tropism)」に基づいている。ウイルスが細胞に感染可能であるためには、その細胞は、ウイルスが認識して細胞の受容体に結合し、その上でエンドサイトーシス、ファゴサイトーシスまたはマクロピノサイトーシスのいずれかによって細胞に侵入することを可能とするような、ウイルスタンパク質に対する受容体を有しなければならない。細胞への侵入の直後に、ウイルスは複製を開始する。ウイルスが組織向性を有しない細胞に感染するためには、ウイルスが興味の対象である細胞または組織の表面に存在する受容体を認識および結合するようにウイルスを加工しなければならない。その場合でさえ、ウイルスが依然として複製不可能である可能性があり、その細胞で産生されていない細胞性の因子を付加的に必要とする可能性がある。
【０００４】
遺伝子治療用ウイルスベクターは一般的に、それらが標的とする細胞を殺したり、または溶解したりはしない。遺伝子治療に用いられるウイルスベクターは、薬剤のように治療上効果的なＤＮＡを運搬するために加工されている（例えば、Ｄ．Ｔ．Ｃｕｒｉｅｌら、米国特許第５，５４７，９３２号を参照せよ）。これらのベクターの中には、標的とした細胞内でのみ感染直後に複製することが可能であるものがある（Ｆ．ＭｃＣｏｒｍｉｃ，  米国特許第５，６７７，１７８号）。その他の遺伝子治療用ベクターはそれらが複製できないように加工されている。非複製遺伝子治療ベクターは通常は補助プラスミドを用いて（例えば、Ｇ．Ｎａｔｓｏｕｌｉｓ，米国特許第５，６２２，８５６号；Ｍ．Ｍａｒｎｏｕｎａｓ，米国特許第５，６４６，０３４号を参照せよ）、またはウイルスゲノム内には存在しない遺伝因子を与えるパッケージング細胞を用いて産生される。
【０００５】
遺伝子治療用ベクターは、利用しているウイルスベクターが本来有している野生型の向性を克服するための問題に直面している。これを克服するために、組織または細胞標的に感染することが可能であるような異なるウイルス科または属に由来する、他のウイルスに由来する外被タンパク質をコードするＤＮＡを有するようにウイルスゲノムを加工することによって偽型ウイルスが産生された。近年、アデノウイルスベクター（Ｍ．Ｃｏｔｔｅｎら、米国特許第５，６９３，５０９号）；アデノ関連ウイルスベクター（Ｊ．Ｓ．Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら、米国特許第５，５８９，３７７号）；レトロウイルスベクター（Ｂ．Ｏ．Ｐａｌｓｓｏｎら、米国特許第５，６１６，４８７号）；キメラ融合糖タンパク質を有するベクター（Ｓ．Ｋａｙｍａｎら、米国特許第５，６４３，７５６号）；ウイルスコートタンパク質に対する抗体を有するベクター（Ｃｏｔｔｅｎら）；通常はＨＩＶ−１に感染し得ない種であるサルにおける１型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）の研究を可能にするために、ハイブリッドウイルスを産生することによって加工されたウイルス（Ｊ．Ｓｏｄｒｏｓｋｉら、米国特許第５，６５４，１９５号）；および水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のＧタンパク質を有する偽型レトロウイルスベクター（Ｊ．Ｃ．Ｂｕｒｎｓら、米国特許第５，５１２，４２１号および第５，６７０，３５４号）について記述した多くの遺伝子治療特許が刊行されている。これらの遺伝子治療用ベクターの中には、遺伝子治療における使用のためのベクターの効力を維持すると同時に、直面した向性に関連する問題に対して幾つかの局面における克服を試みる方法を用いるものも存在する。
【０００６】
一時的な遺伝子治療のために、細胞に運搬された遺伝子の発現が一時的であり永遠ではないウイルス運搬体もまた作製されている（Ｉ．Ｈ．Ｍａｘｗｅｌｌら、米国特許第５，５８５，２５４号）。ジフテリア毒素の遺伝子（米国特許５，５８５，２５４号）などの、ある特定の毒素をコードする遺伝子を選択的に発現するベクターが作製されている。ウイルスベクターは、それらが感染する宿主細胞の免疫原性をより高めるように加工することもまた可能である（米国特許第５，５８０，５６４号）。
Ｂ．ラブドウイルスの細胞標的への使用
水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）および狂犬病ウイルス（ＲＶ）はいずれもラブドウイルス科に属する構成因子である。ＶＳＶはべシクロウイルス属に属し、ＲＶはリッサウイルス属に属する。ラブドウイルス科の全ての構成因子は、ラブドウイルス粒子の表面を形成する脂質膜エンベロープを有している。
（１）狂犬病ウイルス
Ｔ．Ｍｅｂａｔｓｉｏｎらによる最近の論文には、Ｇタンパク質の全体が欠失した、またはＧタンパク質の僅かな部分のみが発現しているような狂犬病ウイルス（ＲＶ）の加工について記載されている。この組変えＲＶはさらに、ＣＤ４またはＣＤ４およびＣＸＣＲ４補助受容体が組変えＲＶ粒子のエンベロープに発現するように加工された（Ｔ．Ｍｅｂａｔｓｉｏｎら、（１９９７）Ｃｅｌｌ  ９０：９４１−９５１）。これらの加工されたＲＶ偽型ウイルスの性質決定およびこれらを用いた実験により、Ｇタンパク質の尾部を有するＣＤ４／ＣＸＣＲ４構築物はＨＩＶ−１エンベロープタンパク質であるｇｐ１２０を発現する細胞に感染することが可能であることが示された。このウイルス系の欠点は、非ＲＶタンパク質（例えば、ＣＤ４およびＣＸＣＲ４）の効果的な取り込みが、Ｇタンパク質の少なくとも尾部（４４アミノ酸からなる細胞質ドメイン）がＣＤ４（ＲＶ−ＣＤ４）またはＣＸＣＲ４（ＲＶ−ＣＸＣＲ４）のいずれかに融合したキメラの形状でウイルス粒子上に発現したときにのみ起こる点である。ＲＶ−ＣＤ４および欠失型Ｇタンパク質キメラｃＤＮＡのみを発現する組変えＲＶはウイルス粒子上に検出可能な量のＣＤ４を有していない。しかし、ＲＶ−ＣＤ４およびＲＶ−ＣＸＣＲ４の両方を発現する組変えＲＶは、ウイルスエンベロープにＣＤ４およびＣＸＣＲ４の両方のタンパク質を有するウイルス粒子を産生した（Ｔ．Ｍｅｂａｔｓｉｏｎら、１９９７）。著者らの結論はＣＤ４由来のタンパク質は異種性の「キャリアー」タンパク質とともに複合体を形成した状態でのみ取り込まれるというものであった。ＲＶ構築物におけるそのキャリアータンパク質はＣＸＣＲ４補助受容体である。
（２）水疱性口内炎ウイルス
ＣＤ４もＶＳＶ粒子内で５種類全てのＶＳＶ遺伝子産物：Ｎ，Ｐ，Ｍ，ＧおよびＬ、とともに発現されている（Ｓｃｈｎｅｌｌら、（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１１３５９−１１３６５）。Ｓｃｈｎｅｌｌらによる、さらに最近の出版では、Ｇタンパク質をコードする遺伝子の全体が欠失していても（ΔＧ）、ＣＤ４およびＣＸＣＲ４などの補助受容体はウイルス粒子内での発現が可能であることを示した（Ｓｃｈｎｅｌｌら、（１９９７）Ｃｅｌｌ  ９０：８４９−８５７）。このＣＤ４／ＣＸＣＲ４組変え体はＧタンパク質をコードするＤＮＡを含む相補的なプラスミドを利用することによって産生された。ΔＧ組変えＶＳＶにおいて、ＣＸＣＲ４をコードする遺伝子はＣＤ４をコードする遺伝子の下流に配置した。ΔＧ−ＣＤ４ウイルスの量はＧタンパク質を有するＣＤ４構築物について報告されている量の２５％であった（Ｓｃｈｎｅｌｌら、１９９７）。しかし、ＣＤ４はＧタンパク質の非存在下にも関わらず、その他のＶＳＶタンパク質と同様の効率で組変えウイルス粒子に取り込まれた。ΔＧ−ＣＤ４構築物がＨＩＶ−１感染させたジャーカット細胞に感染する能力と、ＣＤ４およびＣＸＣＲ４の両方を含むＶＳＶΔＧ構築物（ΔＧ−ＣＤ４／ＣＸＣＲ４）の能力とを比較すると、ΔＧ−ＣＤ４／ＣＸＣＲ４  ＶＳＶ組変え体の１０％の割合でΔＧ−ＣＤ４構築物が感染した。さらに、ΔＧ−ＣＤ４／ＣＸＣＲ４はＨＩＶ−１陽性細胞の数を減少させることが可能であった。これらの構築物はＨＩＶ−１に感染した細胞またはＨＩＶ−１エンベロープタンパク質を発現する細胞に侵入および増殖する能力を有することが示された（Ｓｃｈｎｅｌｌら、１９９７）。
【０００７】
ＶＳＶおよびＲＶは同一のウイルス科、すなわちラブドウイルス科の構成因子であるが、ＶＳＶはあらゆるＧタンパク質の非存在下においても感染性のウイルス粒子を産生することが可能である。これに対して、ＲＶ組変え体は、非ＲＶタンパク質が、非ＶＳＶタンパク質に融合したＧタンパク質尾部を有するキメラとして提示された場合のみ機能することが可能である（Ｍｅｂａｔｓｉｏｎら、１９９７）。ＶＳＶウイルス粒子の脂質エンベロープに、それ自身でおよびキメラとしてではなく非ＶＳＶタンパク質を発現する能力があるがゆえに、ＣＤ４などの非ＶＳＶタンパク質が細胞表面におけるものと同一の３次元立体構造を形成するであろうという大きな見込みがなされる。
（３）非ＶＳＶ補助受容体タンパク質を有する組変えＶＳＶ
Ｍｅｂａｔｓｉｏｎら（１９９７）およびＳｃｈｎｅｌｌら（１９９７）により記載されている組変えラブドウイルスの使用における一つの欠点は、いずれの場合においてもＨＩＶ−１感染細胞に効果的に感染するためにはＣＸＣＲ４（ヒトＴリンパ球に由来する）などの補助受容体を必要とする点である。Ｍｅｂａｔｓｉｏｎら（１９９７）の組変えＲＶウイルスは付加的にＧタンパク質の尾部を必要とする。
（４）ウイルスエンベロープ融合タンパク質
外被を有するウイルスの細胞への侵入は、ウイルス外被が、細胞膜またはエンドサイトーシスに続くエンドソームまたはリソソームなどの細胞内区画へ融合した結果として起こる。パラミキソウイルスのサルウイルス５（ＳＶ５）の融合（Ｆ）タンパク質はウイルスエンベロープと細胞膜との融合を媒介する。これは組変え細胞内においてクローン化および発現されている。ＶＳＶのＧタンパク質を含むその他のウイルスエンベロープタンパク質は、インビトロでの融合活性のために酸性のｐＨを必要とし、およびこれとは対照的に、パラミキソウイルスＳＶ５  Ｆタンパク質は中性のｐＨにおいて細胞融合を起こすことが可能である。野生型のウイルスはＦタンパク質およびそれに結合するパラミキソウイルスのＨＮタンパク質の連係した挙動を通してその標的細胞と融合する。Ｆタンパク質およびＨＮタンパク質の両者を発現するように形質転換された細胞は隣接する細胞と融合し、シンシチウムを形成する。しかし、インビトロで作製されてＦタンパク質を含む小胞は、ウイルスＨＮタンパク質が共に存在するかまたはレクチン（すなわちコムギ胚芽アグルチニン）などのある抗レセプター分子が存在しない限り、標的細胞と融合を起こさない。Ｒ．Ｇ．Ｐａｔｅｒｓｏｎら、（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：７５２０−７５２４。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、組変えウイルスの脂質エンベロープの標的細胞の細胞膜への融合を促進するために異種性の「Ｆタンパク質」（本明細書において定義されている）を発現する組変えまたは遺伝学的に加工されたラブドウイルスに関するものである。このような構築物は、特異的補助受容体を必要とするかまたは特異的な細胞向性を示すような当業者に既知であるシステムの限界を克服する。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、組変えウイルスの標的細胞表面への融合を促進するために効果的である異種性のＦタンパク質またはそのポリペプチド断片を少なくとも含む組変えラブドウイルスに関連する。本発明の好ましい態様はパラミキソウイルス株ＳＶ５の融合タンパク質またはそのポリペプチド断片を本明細書で定義するＦタンパク質として使用する。好ましい組変えラブドウイルスは水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）または狂犬病ウイルス（ＲＶ）であり得る。狂犬病ウイルスの例では、融合タンパク質をコードするＤＮＡは好ましくはＲＶのＧタンパク質の一部、特にその「尾」の部分をコードするｃＤＮＡに融合させる。
【００１０】
本発明によって企図された組変えラブドウイルスはさらに第二の異種性の（すなわち、もう一つの非ラブドウイルス、非ＲＶまたは非ＶＳＶ）タンパク質を発現することが可能である。この異種タンパク質は組変えウイルスが標的細胞の細胞膜上に存在する特定の受容体を標的とするための接着タンパク質または抗受容体として使用することが可能である。このような異種接着タンパク質は、好ましくは病気の過程の一部として罹患したまたは異常を呈した細胞上に発現している糖タンパク質またはタンパク質を特異的に認識または結合する。好ましい接着タンパク質は、組変えラブドウイルスが細胞膜上にＧＰ１２０タンパク質を発現するＨＩＶ感染細胞を標的とするために機能するＣＤ４タンパク質またはその誘導体である。対応する接着タンパク質が本発明に従って加工されたラブドウイルスによって発現され得る、罹患または異常細胞上に発現するその他の受容体タンパク質は、寄生感染、ウイルス感染、細菌感染、腫瘍症、前腫瘍症、白斑症、ポリープ、皮膚科学上の病気（カフェオレ斑）および良性腫瘍に関連する病気から生じ得る。
【００１１】
本発明はさらにラブドウイルスの細胞膜への融合を促進するために効果的であるＦタンパク質またはそのポリペプチド断片を発現する組変えラブドウイルスの産生方法に関連する。本方法は、以下の工程を含む：（Ａ）ラブドウイルスＮ，Ｐ，ＬおよびＧタンパク質をコードするｃＤＮＡを適切な細胞に導入する；（Ｂ）ラブドウイルスの複製にシス作用するシグナルを含む少なくとも３’および５’末端のラブドウイルスのリーダーおよびトレーラー領域を含むポリシストロニックなｃＤＮＡコピー、Ｎ，Ｐ，Ｍ，およびＬラブドウイルスタンパク質をコードする遺伝子、およびＦタンパク質またはそのポリペプチド断片をコードする遺伝子の適切な細胞への導入；（Ｃ）組変えラブドウイルスの産生を許可する条件下での細胞の培養；および（Ｄ）上述の組変えラブドウイルスの単離。
【００１２】
上述の方法はさらにもう一種類の非ラブドウイルスタンパク質またはそのペプチド断片の発現のための手段を含む。この付加的な異種タンパク質は通常は接着タンパク質として機能し、それゆえに加工されたラブドウイルスが標的とすべき細胞の表面に発現している受容体を認識および結合する能力を有するべきである。本発明の一つの好ましい態様は、加工されたウイルスの融合タンパク質としてパラミキソウイルスＳＶ５株のＦタンパク質を発現することである。
【００１３】
本発明のもう一つの局面はラブドウイルスの細胞膜への融合を促進するために効果的なＦタンパク質またはそのポリペプチド断片を発現する組変えラブドウイルスを産生する方法に関連する。本方法は以下の工程を含む：（Ａ）ラブドウイルスの複製にシス作用するシグナルを含む少なくとも３’および５’末端のラブドウイルスのリーダーおよびトレーラー領域を含むポリシストロニックなｃＤＮＡコピー、Ｎ，Ｐ，およびＬラブドウイルスタンパク質をコードする遺伝子、およびＦタンパク質またはそのポリペプチド断片をコードする遺伝子の適切な細胞への導入；（Ｂ）ラブドウイルスの複製にシス作用するシグナルおよび少なくともラブドウイルスＧおよびＭタンパク質をコードする遺伝子を含むミニウイルスによる細胞の感染；（Ｃ）組変えラブドウイルスを産生するためにｃＤＮＡの発現を許可する条件下での細胞の培養；および（Ｄ）上述の組変えラブドウイルスの単離。
【００１４】
好ましい組変えラブドウイルスはＶＳＶおよびＲＶである。
【００１５】
融合タンパク質を発現する組変えラブドウイルスを用いたインビボまたはインビトロでの罹患細胞の標的法は、組変えウイルスによる感染を許可する条件下での、標的である罹患または異常細胞と組変えラブドウイルスの接着の工程を含む。本態様は、接着タンパク質または抗受容体として機能するためのもう一種類の非ラブドウイルスタンパク質のウイルス表面における付加的な発現を必要とし得る。組変えラブドウイルスによって標的とする上述の細胞は、標的細胞に感染直後のレポータータンパク質または蛍光タンパク質の発現をさらに含み得る。標的細胞は付加的に罹患または感染され得る。企図された一つの組変えラブドウイルスは融合工程の媒介としてパラミキソウイルスＳＶ５のＦタンパク質を発現するものである。
【００１６】
上記の組変えラブドウイルスはさらに、融合タンパク質を発現する治療上効果的な量の組変えラブドウイルスの患者への投与を含めた、ウイルス、寄生生物または細菌感染に罹患した患者の治療のために企図される。本組変えラブドウイルスは理想的にはウイルス、細菌または寄生生物に感染した細胞を未感染のものから認識および識別することが可能である。本組変えラブドウイルスは、感染の結果生じた細胞上に発現しているタンパク質に結合する。感染細胞に結合する機能を担う非ラブドウイルス（接着）タンパク質は組変えラブドウイルス遺伝子の制御配列に操作的に連結される。融合タンパク質を発現している組変えラブドウイルスによって発現される非ラブドウイルスタンパク質は罹患または異常細胞の表面に発現しているタンパク質を認識および結合することが可能であるような上述の方法は同様に病気を罹患した患者を治療するために企図される。治療用に企図された罹患したまたは異常の細胞または組織は腫瘍性細胞、前腫瘍性細胞、良性腫瘍、ポリープ、カフェオレ斑、白斑症、その他の皮膚のあざまたは損傷、または皮膚科学上の病気を含む。
【００１７】
本発明はまた本明細書にて定義される融合タンパク質の同定法に関連する。本方法は以下の工程を含む：（Ａ）ラブドウイルス複製にシス作用性に働くシグナルを含む３’および５’末端のラブドウイルスのリーダーおよびトレーラー領域を少なくとも含むポリシストロニックな第一のｃＤＮＡ、Ｎ，Ｐ，およびＬタンパク質をコードするラブドウイルス遺伝子、Ｆタンパク質候補および非ラブドウイルスタンパク質をコードする遺伝子の適切な細胞に導入；（Ｂ）ラブドウイルス複製にシス作用性に働くシグナルおよびレポータータンパク質をコードする第二のｃＤＮＡを含むミニウイルスの細胞への感染；（Ｃ）組変えラブドウイルスを産生するために第一のおよびミニウイルスの複製を許可する条件下での細胞の培養；（Ｄ）上述の組変えラブドウイルスの単離；（Ｅ）上述の組変えラブドウイルスによる感染を許可する条件下での、単離した組変えラブドウイルスの未感染細胞への接触；および（Ｆ）レポータータンパク質が発現しているか否かの決定。
発明の詳細な説明
Ａ  組み変えラブドウィルスの作製
（１）  融合タンパク質
本明細書中で使用されている「融合タンパク質」または「Ｆタンパク質」という用語は（１）特性として脂質エンベロープを有するウィルスに由来し、（２）遺伝的に操作されたウィルスの中で異型のタンパク質として発現された場合にウィルスのエンベロープの細胞膜への融合を促進する（そのような融合はウィルスのエンベロープ上の附加タンパク質（または「抗受容体」）が細胞膜上の受容体に結合することによって媒介される）、タンパク質（およびその融合促進性ポリペプチド断片）を意味する。故に本発明のFタンパク質が天然のウィルス性附加タンパク質以外のウィルスエンベロープ上の附加タンパク質の結合を促進する際に非特異的に機能することが可能であると予想される。本明細書中で意図されているＦタンパク質の一例は、より総称的な「Ｆタンパク質」または「融合タンパク質」ではなく本明細書中で特に「Ｆタンパク質」と呼称されるパラミキソウィルスのＳＶ５株の「Ｆタンパク質」として文献で知られている、ウィルスエンベロープ融合タンパク質である。
【００１８】
「附加タンパク質」とも呼称される「抗受容体」はウィルス粒子を細胞膜上の対応する「受容体」に附加する段階に必要である、ウィルスエンベロープ上のタンパク質を意味する。例えば、パラミキソウィルスのＳＶ５Ｆタンパク質の天然の抗受容体はウィルス性ＨＮタンパク質である。
【００１９】
「ウィルスの附加」は、感染の過程でウィルス粒子の脂質エンベロープ上の抗受容体が細胞表面の「受容体」を認識して結合する段階を意味する。当業者はウィルスの附加はウィルスエンベロープ膜の標的細胞の原形質膜との融合の前に先行する段階であると認識すると考えられる。融合はウィルス粒子が細胞に侵入するのに先行する段階である。
（２）使用するラブドウィルス
本発明中で使用を企図される「ラブドウィルス」はＶｅｓｉｃｕｌｏｖｉｒｕｓ属およびＬｙｓｓａｖｉｒｕｓ属由来のウィルスを含む。Ｖｅｓｉｃｕｌｏｖｉｒｕｓ属は水胞性口内炎ウィルス（ＶＳＶ）ニュージャージー血清型（ＶＳＶNS）、ＶＳＶ−インディアナ血清型（ＶＳＶIND ）、ＶＳＶ−アラゴアス株、コカルウィルス、ジュロナウィルス、カラジャスウィルス、マラバウィルス、ピリウィルス、カルカクイウィルス、ユボダノヴァックウィルス、イスファハンウイルス、シャンディプラウィルス、ペリネットウィルスおよびポルトン−Ｓウィルス（Ｒ．Ｒ．Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＩＮ  Ｂ．Ｎ．ＦＩＥＬＤＳ’ＶＩＯＲＯＧＹ  第３版  第１巻（１９９６））を含む。Ｌｙｓｓａｖｉｒｕｓ属は狂犬病ウィルス（ＲＶ）、ラゴスバトウィルス、モコラウィルス、ドゥーベンヘージウィルス、オボディアンウィルスおよびコトンカンウィルス（ＩＤ．）を含む。好ましい組み変えラブドウィルスはＶＳＶ（血清型および株は問わない）およびＲＶ（ＩＤ．）である。
【００２０】
すべてのラブドウィルスはヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質、リン酸化タンパク質（Ｐ、しかし当初はＮＳと表記されていた）、基質（Ｍ）タンパク質、糖タンパク質（Ｇ）および巨大（Ｌ）タンパク質をコードする５遺伝子を含む。これらの遺伝子はアンチセンスのゲノムＲＮＡ上に並んで存在し、３’−Ｎ−Ｐ−Ｍ−Ｇ−（Ｘ）−Ｌ−５’のように配列している。遺伝子の順序は合成されるタンパク質の比率を意味しているため重要である。ラブドウィルスのゲノムのいかなる操作でも、感染および複製に十分な可能性を保持するためには少なくとも５つの転写ドメインは保持されなければならない。ラブドウィルスはプラス鎖メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を転写するＲＮＡポリメラーゼを内在する。Ｘ遺伝子は全ラブドウィルスには存在しない。Ｘ遺伝子は魚類感染性造血壊死ウィルス、ウシ一過熱ウィルスの非構造糖タンパク質および狂犬病ウィルスの偽遺伝子に見られる非構造タンパク質をコードする。エキストラ（Ｘ）遺伝子はラブドウィルスゲノムの異なった位置で発見されている。感染細胞におけるＭタンパク質の合成は細胞には細胞変性的であり、最終的には細胞死を引き起こす。
【００２１】
「組み変えラブドウィルス」は本来ラブドウィルス由来ではないタンパク質を発現するウィルスを意味する。これは「偽型」または「キメラ」ウィルスを造る。「ミニウィルス」は、Ｎ−Ｐ−Ｍ−Ｌ、Ｎ−Ｐ−Ｌ、Ｎ−Ｐ−Ｇ−Ｌ、Ｍ−Ｇ、Ｇのみ、Ｍのみまたは４つ以下のＶＳＶ遺伝子のいかなる組み合わせをもコードするポリシストロン核酸分子を含む不完全なウィルス粒子を意味する。この不完全なウィルス粒子は複製能を持たない。
【００２２】
「組み変えラブドウィルス」または「組み変えＶＳＶ」または「組み変えＲＶ」は、少なくとも融合タンパク質またはそのポリペプチド断片を含む単数または複数のｃＤＮＡのトランスフェクションにより産生されるＶＳＶとＲＶを含む全ての組み変えラブドウィルスを意味する。単数または複数のｃＤＮＡのトランスフェクションにより産生される組み変えラブドウィルスはトランスで感染性ウィルス粒子を作製するミニウィルスまたは他のｃＤＮＡによりトランスに相補可能である。また、タンパク質は機能的なウィルス粒子産生に必要なタンパク質を安定して発現するヘルパー細胞の使用により供給可能である。
【００２３】
「ポリペプチド断片」はウィルス粒子の融合を促進および／または増進する、細胞の標的化を促進および／または増進する、ウィルスの力価および／または感染力などを促進および／または増進するような生物活性を有するタンパク質、抗体、抗受容体、受容体、ラブドウィルスタンパク質、ＶＳＶタンパク質などの断片を意味する。
【００２４】
さらに「非ラブドウィルスタンパク質」または「非ＶＳＶタンパク質」または「非ＲＶタンパク質」は融合タンパク質を発現するよう操作されている野生型のラブドウィルス（またはＶＳＶまたはＲＶ）では本来発現されないタンパク質やそのタンパク質のポリペプチド断片を意味する。
【００２５】
「感染性組み変え体」は、記載されているいずれかの方法により産生される、細胞感染後に他の標的細胞に感染可能な新ウィルス粒子を複製することが可能である組み変えラブドウィルスを意味する。「非感染性組み変え体」は、記載されているいずれかの方法により産生される、細胞感染後に新たなウィルス粒子を放出または産生不可能な組み変えラブドウィルスを意味する。例えば、ある「非感染性組み変え」ラブドウィルスはＮ、ＰおよびＬタンパク質をコードする遺伝子を含むがＧおよびＭタンパク質をコードする遺伝子を欠いている。
【００２６】
記載されている組み変えラブドウィルスおよびＶＳＶ構築物はさらにウィルス粒子のエンベロープ上で発現されている「エンハンサータンパク質」または「Ｇステムポリペプチド」を含む。（「Ｇステム」、「Ｇステムポリペプチド」または「エンハンサータンパク質」は、ラブドウィルスＧタンパク質の細胞質内尾部ドメイン、膜貫通ドメインおよび膜隣接外部ドメインのカルボキシ末端のおよそ２３アミノ酸から７０アミノ酸を含むポリペプチドを意味する。）企図されているその他のＧステムポリペプチドは他のラブドウィルスＧタンパク質由来の類似Ｇステムポリペプチドだけでなく、全ＶＳＶ血清型およびその血清型の全株の全Ｇタンパク質由来の類似領域を含む。これらのＧステムポリペプチドは組み変えウィルスの力価および感染力の増進に利用される。Ｇステムの機能性はエンベロープ感染力を査定することにより評価可能である。エンベロープ感染力はＦタンパク質と抗受容体を発現するラブドウィルスの構築物とＦタンパク質とＧステムを発現するラブドウィルスの構築物間で比較される。Ｇステムの付加はラブドウィルスの構築物の感染力を１００から１０8 倍増進可能である。
【００２７】
これらのＧステムポリペプチドは次の組み合わせでＦタンパク質および抗受容体タンパク質と共に発現されうる。（１）各々単独に発現したＧステムポリペプチド、Ｆタンパク質および抗受容体タンパク質またはそのポリペプチド断片、（２）単独に発現したＧステムポリペプチドおよび抗受容体タンパク質の読み取り枠の共通コードＤＮＡから発現したＦタンパク質、または（３）単独に発現したＦタンパク質および抗受容体タンパク質の読み取り枠の共通コードＤＮＡから発現したＧステムポリペプチド。
【００２８】
ＶＳＶ  Ｇステムポリペプチドの一例はＶＳＶ−Ｉｎｄｉａｎａ株のＶＳＶ
Ｇステムである（ＧｅｎＢａｎｋ  寄託番号６１３８４）。ＶＳＶIND336Ｎから始まるＧステムポリペプチドは本明細書中に企図されている。より好ましいＧステムポリペプチドはＶＳＶIND392Ｔ残基の後に始まる。最も好ましいＧステムポリペプチドは 404Ｇｌｙから 511Ａｒｇ（404ｇｈｇｍｌｄｓ  ｇｌｈｌｓｓｋａｑｖ  ｆｅｈｐｈｉｑｄａａ  ｓｑｌｐｄｄｅｉｌｆ  ｆｇｄｔｇｌｓｋｎｐ  ｉｄｆｖｅｇｗｆｓｓ  ｗｋｓｓｉａｓｆｆｆ  ｉｉｇｌｉｉｇｌｆｌ
ｖｌｒｖｇｉｙｌｙｉ  ｋｌｋｈｔｋｋｒｑｉ  ｙｔｄｉｅｍｎｒｌｇ  ｒ511）を含みうる。別の好ましいＶＳＶIND Ｇステムは434Ｐｒｏから 511Ａｒｇ（434ｐｄｄｅｉｌｆ  ｆｇｄｔｇｌｓｋｎｐ  ｉｄｆｖｅｇｗｆｓｓ  ｗｋｓｓｉａｓｆｆｆ  ｉｉｇｌｉｉｇｌｆｌ  ｖｌｒｖｇｉｙｌｙｉ  ｋｌｋｈｔｋｋｒｑｉ  ｙｔｄｉｅｍｎｒｌｇ  ｒ511）を含むポリペプチドを含む。他に企図されているＶＳＶIND ＧステムはＧタンパク質の 404Ｇｌｙの後に始まるＧステムを含む。 440Ｐｈｅから下流で始まるＶＳＶIND Ｇステムは高凝集表現型（high assembly phenotype)を有するが、 440Ｐｈｅより上流から始まるＧステム構築物より感染の特異性が低いためあまり好ましくない。故に企図されているＶＳＶIND Ｇステムは下に記載するように、、全細胞質尾部ドメイン（ＶＳＶ−Ｉｎｄｉａｎａ  Ｇタンパク質の二重下線部）および全膜貫通ドメイン（大文字の肉太活字で表記）だけでなく、膜隣接外部ドメインのカルボキシ末端部（例えば、外部ドメインのカルボキシ末端の少なくとも２３から１２７アミノ酸）も含む。
【００２９】
【化１】
0004544497.tif 000002
（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）
【００３０】
上記記載ドメインを含む他のラブドウィルスだけでなく他の血清型またはＶＳＶ株由来の他の類似Ｇステムポリペプチドは当業者に容易に明白だと考えられる。
（３）ｃＤＮＡを用いた組み変えラブドウィルスの作製
（ｉ）組み変えラブドウィルス作製に必要なＤＮＡ
感染性ラブドウィルスまたは非感染性ラブドウィルスを産生するために「必要なｃＤＮＡ」という語句は融合タンパク質を発現する感染性または非感染性のいずれかの組み変えラブドウィルス粒子の産生に必要な核酸分子を意味する。これらの組換えウィルスは（１）完全にｃＤＮＡを使用すること、または（２）ヘルパー細胞にトランスフェクションしたｃＤＮＡとの組み合わせ、または（３）細胞にトランスフェクションしたｃＤＮＡにより産生することが可能であり、さらに感染性または非感染性いずれかの組み変えラブドウィルス粒子の産生に必要な残存している構成要素または活性をトランスで供給するミニウィルスに感染される。これらの方法を使用する際に（例えば、ミニウィルス、ヘルパー細胞系またはｃＤＮＡトランスフェクションのみ）、必要な最小構成要素は（１）ラブドウィルスＮタンパク質によるゲノム（またはアンチゲノム）ＲＮＡのカプシド中での包含、および（２）相当するゲノムまたはアンチゲノム（複製の中間生成物）ＲＮＡの複製のためのシス作用シグナルを含むＲＮＡ分子である。
【００３１】
複製要素またはレプリコンとは、５’端および３’端にラブドウィルスのリーダー配列およびトレーラー配列を最小に含んでいるＲＮＡストランドを意味する。ゲノム配列では、リーダーは３’端におよびトレーラーは５’端にある。これら二つの複製シグナル間にあるＲＮＡは同様に複製される。リーダーおよびトレーラー領域にはさらにＮタンパク質によるカプシドでの包含の目的および転写および複製を開始するために必要なポリメラーゼの結合のための最小シス作用因子を含まなければならない。
【００３２】
ミニウィルスを使用して加工されたラブドウィルスまたはＶＳＶｓの調製のためには、Ｇ遺伝子を含むミニウィルスはまたＧタンパク質ｍＲＮＡを産生するための適切な開始および終始シグナルを伴ったリーダー領域、トレーラー領域およびＧ遺伝子も含むと考えられる。もしミニウィルスがさらにＭ遺伝子を含むならば、Ｍタンパク質ｍＲＮＡを産生するための適切な開始および終始シグナルもまた存在しなければならない。
【００３３】
加工されたラブドウィルスゲノム内に含まれる全遺伝子にとって、遺伝子はそれらの遺伝子を発現およびタンパク産物の産生を許す適切な開始および終始シグナルを側に置く。
【００３４】
「非感染性」加工ラブドウィルスを産生するために、加工されたラブドウィルスは最小レプリコン要素およびＮ、ＰおよびＬタンパク質を持たなければならない、およびＭ遺伝子を含まなければならない（一例は下記の例に記載されているΔＧ構築物である）。これは細胞から発芽するが、非感染性粒子であるウィルス粒子を産生する。「感染性」粒子を産生するためには、ウィルス粒子は附加タンパク質または抗受容体の使用を通じて、ウィルス粒子の結合および融合を媒介可能であるタンパク質を付加的に含まなければならない。ラブドウィルス本来の抗受容体はＧタンパク質である。
【００３５】
「適当な細胞」は下記に明白にされる三方法のいずれかで組換えラブドウィルスの集合を許すいかなる細胞を意味する。
【００３６】
感染性ウィルス粒子を調製するために、適切な細胞系（例えばＢＨＫ細胞）は最初に、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼまたはＴ３またはＳＰ６ポリメラーゼ（Ｕｓｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４：２２２−２２４またはＲｏｄｒｉｇｕｅｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４：４８５１−４８５７参照）のような他の適当なバクテリオファージポリメラーゼをコードする、種痘ウィルスｖＴＦ７−３（Ｔ．Ｒ．Ｆｕｅｒｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
３：８１２２−２６）または、その相当物によって感染される。次に細胞はＧ、Ｎ、Ｐ、ＬおよびＭラブドウィルスタンパク質をコードする遺伝子を含む個々のｃＤＮＡに感染される。これらのｃＤＮＡは組み変えラブドウィルス粒子を構築するタンパク質を供給すると考えられる。細胞は当該技術分野において知られたいずれの方法でもトランスフェクションされうる（例えば、リポソームおよび電気穿孔法など）。細胞系はまたパラミキソウィルスＳＶ５株のＦタンパク質のような融合タンパク質をコードするｃＤＮＡでトランスフェクションされる。融合タンパク質をコードする遺伝子はそれ自身で細胞にトランスフェクションまたはＧタンパク質尾部の一部をコードするＤＮＡに融合されうる。Ｍｅｂａｔｓｉｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）より記載されているＦタンパク質のＧタンパク質尾部への融合は感染性または非感染性組み変えＲＶビリオンを調製する際に必要と考えられる。
【００３７】
さらにまた、ラブドウィルスゲノムＲＮＡに等価なものを含む「ポリシストロンｃＤＮＡ」も細胞系にトランスフェクションされる。もし感染性の組み変えラブドウィルス粒子が感染細胞の中で細胞を溶解するべきであるならば、融合タンパク質またはそのポリペプチド断片をコードする遺伝子だけでなくＮ、Ｐ、ＭおよびＬタンパク質をコードする遺伝子が存在しなければならない。もし感染性、組み変えラブドウィルス粒子が細胞溶解性であることを予定しないならば、Ｍタンパク質をコードする遺伝子はポリシストロンＤＮＡには含まれない。「ポリシストロンｃＤＮＡ」は、少なくともＮ、ＰおよびＬタンパク質をコードする遺伝子を含む転写単位を含むｃＤＮＡを意味する。組み変えラブドウィルスのポリシストロンＤＮＡはまた融合タンパク質またはそのポリペプチド断片をコードする遺伝子を含んでもよい。あるいは、融合タンパク質またはその断片はトランスで供給されてもよい。他の企図される態様はレポータータンパク質または蛍光タンパク質（例えば、緑蛍光タンパク質およびその派生物、βーガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチル基転移酵素など）をコードする遺伝子、Ｎ−Ｐ−ＬまたはＮ−Ｐ−Ｌ−Ｍ遺伝子、および融合タンパク質を含むポリシストロンｃＤＮＡである。他の企図されるポリシストロンＤＮＡは、附加タンパク質をコードする遺伝子、並びに融合タンパク質をコードする遺伝子、レポーターをコードする遺伝子、およびＮ−Ｐ−Ｌ遺伝子とＮ−Ｐ−Ｌ−Ｍ遺伝子のいずれか一つを含んでもよい。組み変えＲＶを加工する際、融合タンパク質および附加タンパク質をコードする遺伝子は、Ｍｅｂａｔｓｉｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）より記載されているようにＧ尾部に融合させねばならないと考えられる。組み変えラブドウィルスを発生させる最初の工程はｃＤＮＡ由来のゲノムまたはアンチゲノムに相当するＲＮＡの発現である。それからＮタンパク質によりＲＮＡは包含されそしてＰ／Ｌタンパク質により複製される。こうして生成されたウィルスを回収できる。もしＧタンパク質が組み変えＲＮＡゲノムを欠いているならば、トランスで供給されなければならない。もしＧおよびＭタンパク質両方を欠いているならば、両方はトランスで供給されなければならない。
【００３８】
［非感染性ラブドウィルス」粒子の調製には、細胞にトランスフェクションされるポリシストロンｃＤＮＡがラブドウィルスのみのＮ、ＰおよびＬ遺伝子を含むことを除いて、方法は上記と同様でよい。非感染性ラブドウィルス粒子のポリシストロンｃＤＮＡは付加的にレポーター遺伝子をコードする遺伝子を付加的に含んでもよい。Ｇタンパク質をコードする遺伝子を欠損した組み変えＶＳＶを産生する方法に関する付加的な記載は、Ａ．Ｔａｋａｄａ  ｅｔａｌ．，（１９９７出版）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ参照。
（ｉｉ）ウィルスを産生する細胞の培養
トランスフェクションされる細胞は通常は望ましい温度、通常はおよそ３７℃で少なくとも２４時間培養される。非感染性ウィルス粒子のためには、上清は集められおよびウィルス粒子は分離される。感染性ウィルス粒子のためには、ウィルスを含む上清は採集されおよび新鮮な細胞に移される。その新鮮な細胞はおよそ４８時間培養され、および上清は集められる。
（ｉｉｉ）組み変えラブドウィルスの精製
「分離」またはラブドウィルスを「分離すること」という用語は、細胞破片が殆ど残らないようにウィルス粒子を培養および精製する過程を意味する。一例は上清を含むビリオンをとりそして種痘ウィルスおよび細胞破片を除去するために０．１−０．２μ孔サイズのフィルター（たとえば、ミレックス−ＧＳ、ミリポア）にそれらを通過させることが考えられる（実施例１参照）。あるいは、ビリオンはショ糖勾配のような勾配を用いて精製可能である。組み変えラブドウィルス粒子はペレットに形成され、そしていずれかの望ましい賦形剤または担体に再懸濁されうる。力価は例えば、抗Ｍ（２３Ｈ１２）または抗Ｎ（１０Ｇ４）タンパク質特異的な抗体（Ｌ．Ｌｅｆｒａｎｃｏｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８２）Ｖｉｏｌｏｇｙ  １２１：１５７−６７）を用いた間接的な免疫蛍光法により決定可能である。
（４）ｃＤＮＡおよびミニウィルスまたはヘルパー細胞系を用いた組み変えラブドウィルスの作製法
「ミニウィルス」および「ヘルパー細胞」（「ヘルパー細胞系」とも知られている）の両方は同様のものを供給する。すなわち、ラブドウィルスビリオンの集合のためのラブドウィルスタンパク質源を供給する。ラブドウィルスミニウィルスの一例は、Ｅ．Ａ．Ｓｔｉｌｌｍａｎ  ｅｔａｌ．，（１９９５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：２９４６−５３により報告されているようにＧおよびＭタンパク質のみを発現するＶＳＶミニウィルスである。ヘルパーウィルスおよびミニウィルスはラブドウィルスタンパク質の遺伝子をコードするトランスフェクションされたＤＮＡから産生されないラブドウィルスタンパク質を供給する方法として用いられている。
【００３９】
ミニウィルスを使用する際には、細胞はＴ７ＲＮＡポリメラーゼを供給する目的の為に上記記載のように種痘ウィルスにより感染される。好ましいポリシストロンＲＮＡ、およびＮ、ＰおよびＬ遺伝子を含むプラスミドが細胞にトランスフェクションされる。トランスフェクション混合物はおよそ３時間後に除去され、そして細胞は、約１  ｍ．ｏ．ｉ．でミニウィルスに感染される。ミニウィルスは欠損しているＧおよび／またはＭタンパク質を供給する（Ｓｔｉｌｌｍａｎ
ｅｔａｌ．，（１９９５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：２９４６−５３参照）。細胞にトランスフェクションされるポリシストロンＲＮＡは感染性または非感染性組み変えラブドウィルスのどちらが望まれるかに依存すると考えられる。
【００４０】
あるいは、ミニウィルスはＮ、ＰおよびＬ遺伝子を供給するために使用されうる。ミニウィルスはまたＮ、ＰおよびＬに加えてＭタンパク質の産生にも使用可能である。ミニウィルスはまたＧタンパク質を産生可能である。
【００４１】
ヘルパー細胞系を使用する際に、欠損しているラブドウィルスタンパク質をコードする遺伝子はヘルパー細胞系により産生される。ヘルパー細胞系は野生型Ｇタンパク質をコードしない組み変えラブドウィルス粒子を産生するためにＮ、Ｐ、ＬおよびＧタンパク質を有する。タンパク質は組み変えウィルスゲノムの一部ではない遺伝子またはＤＮＡから発現される。これらのプラスミドまたは他のベクターシステムは細胞系のゲノムに安定して組み込まれる。タンパク質はそれで細胞質のレプリコンではなく細胞のゲノムから産生される。ヘルパー細胞系はヘルパーウィルスにより発現されない他のラブドウィルス遺伝子を含むポリシストロンＤＮＡおよびプラスミドｃＤＮＡにより感染可能である。使用されるポリシストロンＲＮＡは感染性または非感染性組み変えラブドウィルスのどちらが望まれるかに依存すると考えられる。さもなければ、欠損している遺伝子産物（例えば、Ｇおよび／またはＭ）の供給は上記記載のように遂行されると考えられる。Ｂ．組み変えラブドウィルスの使用法
上記記載のように産生された組み変えラブドウィルスは（１）感染病原体（例えば、バクテリア、寄生虫またはウィルス）に感染された細胞を標的、（２）疾病したまたは異常な細胞を標的、（３）研究目的のため他のウィルスのエンベロープタンパク質の研究、（４）疾病または感染の治療および異常細胞の除去、（５）診断目的のため特異的な細胞また組織の想像および（６）診断および／または疾病追跡のためのキットとして使用に使用されることが可能である。
（１）感染病原体に感染された細胞の標的化
融合タンパク質を発現する組み変えラブドウィルスはさらに何らかの感染病原体（例えば、バクテリア、寄生虫またはウィルス）による感染に起因する細胞表面に位置するタンパク質を認識する附加タンパク質もまた発現するよう加工されうる。そのような組み変えラブドウィルスは（１）もし組み変えウィルスによる感染が生じるならばレポータータンパク質の産生により感染病原体の存在を診断することまたは（２）感染を治療することに利用されうると考えられる。
【００４２】
企図される一例は融合タンパク質と共にＣＤ４タンパク質を発現するラブドウィルスである。ＲＶを使用する際は、ＣＤ４および融合タンパク質の双方はプラスミドにより創造されると考えられるが、そこにはこれらのタンパク質をコードする遺伝子はＭｅｂａｔｓｉｏｎ  ｅｔａｌ．，１９９７に記載されているようにＧタンパク質尾部をコードする遺伝子に融合されている。ＲＶ構築物におけるＧタンパク質尾部の欠損は組み変えＲＶ構築物の表面にＣＤ４および融合タンパク質の発現を妨げると考えられる。ＶＳＶを使用する際は、ＣＤ４および融合タンパク質はＧタンパク質の一部に融合されずに単独で発現されてもよい。ＣＤ４および融合タンパク質をコードする遺伝子はＮおよびＰ遺伝子の下流に、しかしＬ遺伝子の前に配置されると考えられる。Ｌ遺伝子はこれらの構築物における最終遺伝子である。適切な凝集が生じるためにはラブドウィルスタンパク質の比が全構築物において十分同等に残存することが重要である。
【００４３】
パラミキソウィルスＳＶ５株のＦタンパク質およびＣＤ４を発現するＶＳＶはＨＩＶ−１が感染したマクロファージおよびＴ細胞双方に感染可能と考えられる。そのような組み変えＶＳＶはさらにＨＩＶ−１が感染した細胞に侵入するレポータータンパク質を発現するよう加工されうる。この構築物はＳｃｈｎｅｌｌ
ｅｔａｌ．，１９９７およびＭｅｂａｔｓｉｏｎ  ｅｔａｌ．，１９９７により記載されている構築物、これは補受容体ＣＸＣＲ４が存在するためＴ細胞のみに感染可能であるが、に対比している。ＣＤ４／ＣＸＣＲ４構築物はＨＩＶ−１が感染したマクロファージではなくＨＩＶ−１が感染したＴ細胞のみに付加する。インビトロで細胞を標的する（組織培養細胞またはバイオプシーのような組織試料由来の細胞）目的には、分離した組み変えラブドウィルスは当該技術分野において知られている技術を用いて細胞と培養される。組み変えラブドウィルスによる感染の検出は緑蛍光タンパク質のようなレポーター遺伝子の存在を決定することにより行われる。
【００４４】
インビボで細胞を標的する目的には、分離した組み変えラブドウィルスは血管内（ｉ．ｖ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、皮下（ｓ．ｃ．）、経口または組み変えウィルスが組織に射出されうるいずれかの方法で（例えば、針またはカテーテル）投与されることが可能である。あるいは、組み変えラブドウィルスは上皮細胞への挿入により特異的に投与されることも可能である。投与の他の方法は吸引が考えられる。組み変えウィルスは循環、付加、感染およびレポーター遺伝子を産生する十分な時間を与えられると考えられる。レポータータンパク質は２４時間以内および３６時間以内では必ず検出可能と考えられる。
【００４５】
企図される標的にされる細胞に感染したウィルス病原体は次のウィルス科の一部を含む。Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ、Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ、ＲｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅおよびＲｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ。付加的な組み変えラブドウィルスにより標的にされるウィルス病原体は、アフリカ豚コレラウィルス、ボルナ病ウィルス、Ｘ肝炎、ＨＩＶ−１、１型ヒトＴリンパ細胞ウィルス（ＨＴＬＶ−１），ＨＴＬＶ−２、レンチウィルス、エプスタインバールウィルス、乳頭腫ウィルス、単純疱疹ウィルス、Ｂ肝炎およびＣ肝炎を含む。
【００４６】
感染宿主に細胞内に存することが可能なバクテリア病原体のタンパク質はまた組み変えラブドウィルスにより感染を企図される潜在的な標的である。企図される細胞内バクテリアは、他の中で、Ｓｈｉｎｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ種、ミコバクテリウムおよびクラミジアを含む（Ｇ．Ｌ．Ｍａｎｄｅｌｌ，”Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ”ＩＮ  ＣＥＣＩＬ  ＴＥＸＴＢＯＯＫ  ＯＦ  ＭＥＤＩＣＩＮＥ，（Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏ．，１９９６）１５５６−７参照）。これらのバクテリアは組み変えラブドウィルスが付加すると考えられる感染細胞の表面にバクテリア関連タンパク質を発現することを予期されると考えられる。
【００４７】
細胞内に存する寄生虫病原体のタンパク質はまた組み変えラブドウィルスによる感染を企図される標的である。企図される細胞内寄生虫は例えば原虫類を含む。細胞に感染する原虫類はＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ（例えば、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐ．Ｖｉｖａｘ、Ｐ．ｏｖａｌｅおよびＰ．ｍａｌａｒｉａｅ）、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉおよびＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属の寄生虫を含む。
疾病の及び／または異常な細胞は、先に記載された通りの同一の投与方法により先に記載された組換えラブドウイルスを使用することにより標的となる。疾病のまたは異常な細胞は、ネオプラスティック細胞、プレネオプラスティック細胞、良性腫瘍、またはポリープ、カフェオレスポット、白斑症、及びその他の皮膚のあざを完全に含む。
【００４８】
組換えラブドウイルスは、疾病のまたは異常な細胞に発現する受容体を認識及び結合する、抗受容体を使用することにより標的となる。組換えラブドウイルスビリオンの融合体は、先に記載された通りの融合タンパク質により媒介される。組換えラブドウイルスにおいて可能性のある抗受容体は、あらゆる特定の細胞受容体に対する自然の抗受容体を含む。
【００４９】
選択的には、組換えラブドウイルスは抗体またはそのポリペプチド断片、つまり二重機能抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2 、Ｆｃ、Ｆｖ、または一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を、それらの付着タンパク質を発現するように設計することが可能である。そのような抗体断片は、特定の受容体を同一と認識及び結合するように構築される。これらの抗体は人間、またはキメラ抗体（以下を参照。Ｓ．  Ｌ．
Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  「抗体分子、遺伝子工学の」、分子生物学及び生物工学；Ａ  ＣＯＭＰＲＥＨＥＮＳＩＶＥ  ＤＥＳＫ  ＲＥＦＥＲＥＮＣＥ  １９９５；
Ｓ．  Ｄ．  Ｇｉｌｌｉｅｓら（１９９０）Ｈｕｍ．  Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ１（１）：  ４７−５４；  Ｅ．  ＪＡＲＬＯＷ  及びＤ．  ＬＡＮＥ、抗体；  研究室マニュアル（１９８８）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、の考察及び追加参照）を人間化することが可能である。機能のある一本鎖抗体をウイルスの表面の発現させることは、バッカニアウイルスを用い、報告された（Ｍ．  Ｃ．  Ｇａｌｍｉｃｈｅら（１９９７）
Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｏｌ．  ７８：３０１９−３０２７）。同様の方法が、融合タンパク質及び抗体または抗体断片を発現する組換えラブドウイルスを作成することにより利用された。例えば、細胞表面に発現される腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）（例えば、ＰＭＡまたはＰＳＡ）を標的とするモノクローナル抗体の遺伝子は、単離され、当該技術修得者に知られるとおりの、望まれる組換えラブドウイルス生産するために使用することが可能である。
【００５０】
例えば、ＴＡＡを認識する抗体の遺伝子は、Ｆタンパク質、完全なＧタンパク質またはＧステムのいずれかを融合または、Ｆタンパク質及びＧタンパク質またはＧステムの組み合わせにおける発現を可能にする。抗体の例は、悪性前立腺上皮細胞と反応するが良性前立腺組織（例えばＡＴＣＣ  Ｎｏ．  ＨＢ−９１１９；  ＡＴＣＣ  ＨＢ−９１２０；  及びＡＴＣＣ  Ｎｏ．  ＨＢ−１１４３０）とは反応しない、または悪性乳癌細胞とは反応するが通常乳細胞（例えばＡＴＣＣ  Ｎｏ．  ＨＢ−８６９１；  ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＨＢ−１０８０７；  及びＨＢ−１０８０１１）とは反応しない抗体を含む。その他の疾病組織と反応するが通常組織とは反応しない抗体またはその断片は、当業者には明白である。
（３）その他のウイルスの外被タンパク質の研究
脂質膜外被を発現するウイルスの外被タンパク質は、組換えラブドウイルスを使用することにより研究可能である。そのような組換えウイルスは、（１）特定のウイルス外被タンパク質の向性；及び（２）ウイルス外被タンパク質により標的とされる細胞受容体（抗受容体）の研究を許諾する。ある危険なウイルスのため、実験法は高度封じ込め領域に対する通常の必要性以外で進めることが可能である。この研究における興味のウイルス外被タンパク質は、以下のウイルスファミリーのものである、例えば：Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ、  Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ、  Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ、  Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ、
Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ、  Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ、Ｈｅｐａｄｎａｖｒｉｄａｅ、  Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｙｖｉｒｉｄａｅ、  Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、  Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ、  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ、及びＲｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ。タンパク質を発現する脂質外被を有する追加のウイルスは以下を含む、アフリカ豚熱ウイルス、ボルナ病ウイルス、及び肝炎Ｘ。組換えラブドウイルスを利用した研究の完了した危険なウイルスは、その他の全てを含む：エボラウイルス（ザイール、レストン、スーダンのサブタイプ）、マールブルグウイルス、ラッサ熱、デング熱、ハンタウイルス、韓国易性出血熱、キャサヌール森ウイルス、プームラウイルス、ソウルウイルス、サル易性出血熱ウイルス、ＨＩＶ、ＨＬＴＶ、及び南アメリカ易性出血熱ウイルス（Ｂ．  Ｎ．
ＦＩＥＬＤＳ’  ＶＩＲＯＬＯＧＹ  一巻及び二巻、ニューヨーク、ＮＹ  １９９６）。
【００５１】
他のウイルスの外被タンパク質を発現するラブドウイルスの生産は、上記記載と同一の技法により成し遂げられた。標的細胞に対する組換えラブドウイルスの投与はまた、先に記載されたとおりの技法により行われた。実施例６は、エボラウイルスレストン株の外被タンパク質を発現する組換えＶＳＶを記載する。
（４）組換えラブドウイルスを利用した疾病または感染の治療法
「疾病細胞」により、ウイルス、バクテリア、寄生虫に感染した細胞、または、組織学的または遺伝学的に組織型に対し異常な細胞を意味する。上記記載の組換えラブドウイルス顆粒は、疾病または感染の結果の状況を治療または回復するために、使用することが可能である。もし、疾病または異常な細胞が標的となり組換えラブドウイルスに感染しＭタンパク質が発現すると、感染した細胞はＭタンパク質の細胞毒性の結果として結局は死ぬであろう。融合タンパク質を発現しない組換えＶＳＶ構築物は、この理由によりＨＩＶ−１に感染した細胞を殺し、数を減少させる（Ｓｃｈｎｅｌｌら、１９９７参照）。
【００５２】
例えば特定の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を認識する抗体または抗体断片を発現する組換えラブドウイルスは、少なくとも一つのＴＡＡを発現するある癌細胞を標的とする（Ｖ．  Ｔ．  ＤＥＶＩＴＡら、ＣＡＮＣＥＲ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＡＮＤ  ＰＲＡＣＴＩＣＥ  ＯＦ  ＯＮＣＯＬＯＧＹ（１９９６））。修飾されたラブドウイルスの標的として働く潜在的ＴＡＡは、以下を含む：脳腫瘍において発現するβ−ヒト絨毛性ゴナドトロピンホルモン（β−ＨＣＧ）及びα−フェトタンパク質（ＡＦＰ）；乳癌において発現するＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２の産物及び癌胎児性抗原（ＣＥＡ）；メラノーマに関連するチロシナーゼ及びＭＡＲＴ−１抗原；ｃ−ｅｒｂＢファミリー；乳癌組織において発現するＭＵＣ１／ＲＥＰ；ＴｕＡｇ−１；及び肺ガンにおいて発現する上皮細胞成長因子受容体（ＥＧＦＲ）（Ｖ．  Ｔ．  ＤＥＶＩＴＡら、ＣＡＮＣＥＲ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＡＮＤ  ＰＲＡＣＴＩＣＥ  ＯＦ  ＯＮＣＯＬＯＧＹ（１９９６））。この様なラブドウイルス偽型は、癌細胞を標的として感染の後には癌細胞を溶解し殺す組換えラブドウイルスを、治療に効果的な量を個人に感染させることにより癌を治療するための使用が完了している。組換えラブドウイルスの発現のための他のＴＡＡは当業者に知られている。
【００５３】
本発明の組換えラブドウイルスは、侵入後標的細胞において複製し、他の標的細胞に再感染することが可能となるよう設計されている。これらの組換えラブドウイルスは健康な細胞に感染することは不可能である。
（５）細胞のイメージング法
診断のため、疾病の進行または退化の決定、または特定の組換えラブドウイルスが細胞に感染可能か否か研究するために、組換えラブドウイルスはレポータータンパク質または蛍光タンパク質を発現するよう構築することが可能である。これらのレポータータンパク質は、組換えラブドウイルスが成功裏に細胞に感染したときだけ、転写、翻訳される。レポータータンパク質の存在あるいは不在が、組換えラブドウイルスが細胞に感染可能か否かを決定する。あるいは、レポータータンパク質を発現する組換えラブドウイルスは、ウイルス外被タンパク質の向性または他のタンパク質−タンパク質（例えば、受容体−リガンド）の相互作用を研究するとき用いられる。レポータータンパク質の検出は疾病の存在を指示する。実施例５及び７は、細胞のイメージに使用される代表的組換えラブドウイルスを記載する。
（６）疾病細胞検出のための診断キット
上記記載の通り、疾病または異常な細胞に感染可能であり、感染に成功するとレポータータンパク質を生産する組換えラブドウイルスを含むキットが準備可能である。組換えラブドウイルスは、疾病に関連した細胞受容体を認識するよう準備される。例えば、組換えラブドウイルスにより発現される付着タンパク質は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を認識し、癌あるいは特定の型の癌を検知することが可能である。これらのキットは、より早く検出する、及びいかなる疾病が存在するかより正確に検出するために、存在する組織学的染色技術と結びつけて使用することが可能である。キットは追加的には、疾病の段階を確認するために使用可能である（例えば、癌の１段階に対し癌の４段階）。これは、いかなる診断法または診断法らが、特定の目的の疾病を治療するのに適切であるかを診断及び決定する目的に対し有用である。
【００５４】
所望のキットは、例えば生研由来の組織標本に結合するよう準備された組換えラブドウイルスを有する。この組織標本または吸引された細胞は、当業者の知るとおり、組換えラブドウイルスと共に培養される。キットラブドウイルスと共に保温した後、細胞及び／または組織は受容体タンパク質の存在または不在を試験される。
【００５５】
キットは上記の通りインビボ使用のためにも準備される。準備前の組換えラブドウイルスは、以前に考察された投与法の一つにより、目標に投与されうる。受容体遺伝子の発現は皮膚細胞において、または外科的診断の最中に検出される。手術のために、疾病または異常な細胞に対し、健康な（または通常の）細胞を検出することは、外科医にどの程度の量の疾病組織が切除を必要としているかを、ラブドウイルスにより感染された細胞におけるレポータータンパク質の発現を試験することにより外縁を決定することにより、決定させることを許容する。
【００５６】
従って以下の実施例は、特に所望される本発明の態様を注意し、いかなる方法においても発表の残部を限定するよう解釈すべきではない。他の一般的な配置は当業者には明らかである。
【００５７】
【実施例】
実施例１  修飾されたラブドウイルスの作成
組換えＶＳＶ  ｃＤＮＡの構築。本実施例においてパラミキソウイルスＳＶ５のＦタンパク質を発現する組換えＶＳＶを構築するために使用した方法の図は、図５において示す。切断型細胞質領域を有するＧタンパク質をコードする全長ＶＳＶ  ｃＤＮＡは、ｐＶＳＶＦＬ（＋）INJGにおける野生型Ｇタンパク質をコードする遺伝子を置き換えることにより作成された（Ｎ．  Ｌａｗｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  （１９９５）  ９２：４４７７−４４８１）。ＣＴ−１の他のバージョンもまた構築された、これは３つの継続した停止コドンを有し、細胞質尾部コード領域のＮｈｅＩ認識部除去の残りの部分を有した。この変異体はＣＴ−１ＴＳ（ＣＴ−１  Ｔｒｉｐｌｅ
Ｓｔｏｐ）と呼称され、ヌクレオチド９７５−９９７（ＶＳＶ−インディアナの完全なゲノム配列は、ＧｅｎＢａｎｋ  ＃Ｊ０２４２８を参照）に相補的なセンス鎖プライマー（ＭＷ−３６）を用いた標準的ＰＣＲ仲介型変異導入法により作成された、このヌクレオチドはＧタンパク質ｃＤＮＡにおけるＫｐｎＩ認識部の５’であり、アンチセンスオリゴヌクレオチド（５’-TATATＧＣＴＡＧＣＴＴＡＴＴＡＴＴＡTCGGAGAACCAAGAATAGTCCAATG - ３’）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）である。導入された３つの停止コドンは、太字で示し、クローニングに用いたＮｈｅＩ認識部は下線で示した。
【００５８】
Ｇタンパク質欠損変異体をコードするプラスミド（ｐＶＳＶ−ΔＧ）は、ｐＶＳＶＦＬ（＋）−２よりＭｌｕＩからＮｈｅＩ断片を除去し（Ｌａｗｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  （１９９５）  ９２：４４７７−８１）、クレノー断片により埋め、その後プラスミドを再結合することにより作成された。そのため、ｐＶＳＶ−ΔＧは、Ｇタンパク質遺伝子の転写制御配列及び３’非転写領域部分を保った、しかし、Ｇタンパク質のコード領域の読み取り枠（ＯＲＦ）を欠いていた。オリゴヌクレオチド由来のポリリンカー領域（５’−ＭｌｕＩ−ＫｐｎＩ−ＸｈｏＩ−ＳｍａＩ−ＥａｇＩ−ＮｈｅＩ−３’）も、異種遺伝子のＧタンパク質遺伝子転写単位に対する挿入を容易にするため、ＭｌｕＩ及びＮｈｅＩ認識部の間に導入された。このプラスミド（ｐＶＳＶ  ΔＧ−ＰＬ）は、ヒトＣＤ４（ｐＶＳＶ  ΔＧ−ＣＤ４）または、ＣＤ４の膜貫通及び細胞質領域がＶＳＶ  Ｇタンパク質の対応する領域と置き換えられたキメラＣＤ４タンパク質（ΔＧ−ＣＤ４Ｇ）のいずれかをコードする組換えＶＳＶ  ｃＤＮＡを生産するために使用された。
【００５９】
ＨＡＧＳ構築物（ＨＡタグ付きＧステム）はＶＳＶ  Ｇタンパク質の欠損型をコードし、ｐＶＳＶＦＬ（＋）−２のＧタンパク質遺伝子の５’非翻訳領域におけるＭｌｕＩ認識部に重なるプライマー及び、アンチセンスオリゴヌクレオチド（５’-AGGATGＴＴＣＧＡＡＡＧＣＧＴＡＡＴＣＴＧＧＴＡＣＡＴＣＡＴＡＣＧＧＡＴＡｃｔｔｇｃａａｔｔｃａｃｃｃｃｔｔａｇ−３’）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）を用いたＰＣＲ仲介型変異導入により作成された、これはＶＳＶ  Ｇタンパク質における１２８０部のＮｓｐＶ認識部（下線）に重なり、Ｇタンパク質のシグナルペプチド（小文字）とＨＡ抗原決定基（太字）に相補的な配列を融合し、Ｇタンパク質外部領域の膜近位「ステム」領域が続いた。同様の構築物（Ｇステム）もまた、ＨＡ抗原決定基を含んでいないが、適切な変異導入プライマーを使用することにより作成された。
【００６０】
組換えＶＳＶの回収と生産。変異体Ｇタンパク質をコードする感染能のあるウイルスは、約３×１０6 のＢＳＫ−２１細胞にバッカニアウイルスｖＴＦ７−３を感染させることによりプラスミドから回収した（Ｔ．Ｒ．Ｆｕｅｒｓｔら、（１９８６）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８３：８１２２−８１２６）、このバッカニアウイルスはＴ７ポリメラーゼをコードする。一時間の後、種菌は除去され、細胞は、５μｇの適切なｐＶＳＶ−Ｇ変異体プラスミド及び、各々５μｇ、３μｇ、５μｇ及び１μｇのＶＳＶのインディアナセロ型（ＶＳＶIND ）由来の野生型Ｇ、Ｎ、Ｐ及びＬ遺伝子からなるＤＮＡリポソーム懸濁液により、形質転換された。細胞形質転換は、重量比が各１：２．５のジメチルジオクタデシル臭化アンモニウム（ＤＤＡＢ）及びＬ−α−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）からなる（Ｒｏｓｅら、（１９９１）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １０：５２０−５２５）リポソーム懸濁液を用い、リポソーム形質転換試薬はエタノール導入（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １８：１０２７−１０３２）により準備されたのを除けば、先に記載のとおりに（Ｗｈｉｔｔら（１９９１）Ｆｏｃｕｓ  １３：８−１２）行われた。形質転換した培養液は２４時間保温し、上清を５×１０6 の新鮮なＢＨＫ細胞に置いた。４８時間の保温の後、上清を１２５０×ｇで１０分間遠心し、０．２μ孔サイズのフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＳ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濾過し、バッカニアウイルスを除去した。
【００６１】
ＶＳＶ−ΔＧ、ΔＧ−ＣＤ４／Ｇ及びΔＧ−ＣＤ４の回収は、一次形質転換体由来の上清を２×１０６のＢＨＫ細胞を含む皿に直接移したことを除けば、ＣＴ変異体のために記載したとおりに行われた、このＢＨＫ細胞はｖＴＦ７−３により前感染され、１０μｇのＧタンパク質発現プラスミドｐＢＳ−Ｇ−φＴにより形質転換されていた。２４時間の保温の後、上清を集め、細胞は３％パラホルムアルデヒドにより固定し、抗Ｍタンパク質特異的（２３Ｈ１２）またはＮタンパク質特異的（１０Ｇ４）モノクローナル抗体（Ｌ．  Ｌｅｆｒａｎｃｏｉｓら、（１９８２）１２１：１５７−１６７）を用いた間接蛍光抗体により試験した。成功した回収物由来の上清は、１−β−Ｄアラビノフラノシルシトシン（ＡｒａＣ、２５μｇ／μｌ）存在下で一過的にＧタンパク質を発現するＢＨＫ細胞に感染させるために使用された。Ｇ相補ウイルスの機能する原液は残存するバッカニアウイルスを除去するために０．２μフィルターで濾過し、感染後１０から１６時間の後、上記記載の抗体またはＮＩＨ  ＡＩＤＳ  研究及び参照試薬プログラムより得た抗ＣＤ４モノクローナル抗体Ｓｉｍ．２（Ｄ．  Ｅ．  ＭｃＣａｌｌｕｓら、Ｖｉｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｏ．（１９９２）  ５：１６３−１７２）を用い、間接蛍光抗体顕微鏡により力価を決定した。
【００６２】
ＶＳＶミニウイルスを用いたＶＳＶ−ＨＡＧＳ回収。組換えＶＳＶ−ＨＡＧＳは、ＶＳＶのＧ及びＭタンパク質のみを発現する（Ｅ．  Ａ．  Ｓｔｉｌｌｍａｎら、Ｊ．  Ｂｉｒｏｌｏｇｙ（１９９５）  ６９：２９４６−２９５３）ＶＳＶミニウイルス（ＧＭＭＧ）が、相補するＧタンパク質の元を提供するために使用された選択的戦略により回収された。約１０６のｖＴＦ７−３感染細胞が、１０μｇのｐＶＳＶ−ＨＡＧＳ及び、各々３μｇ、５μｇ、及び１μｇの野生型ＶＳＶIND のＮ、Ｐ及びＬタンパク質をコードするプラスミドにより形質転換された。形質転換体混合物は３時間の後除去し、細胞は一つの、感染多重度のＧＭＭＧ粒子により超感染された。ＧＭＭＧミニウイルスを１時間吸収した後、新鮮な培地を細胞に直接加えた。上清は１８時間後まで収穫し、その後バッカニアウイルスを除去するために濾過した。
実施例２  融合タンパク質を含む組換えＶＳＶの細胞へのインビトロ投与
濾過物を１０ｃｍ皿において細胞に投与した。１８から２４時間の後、細胞を細胞変性効果（ＣＰＥ）試験した。ＣＰＥを示す培養液由来の上清は力価を測定し、個々のプラークを精製した。精製単離したプラークはＢＨＫ細胞を一つの感染多重度で、尾部変異体ウイルスの原液を生産するよう感染させるために使用された。各変異体より単離されたウイルスＲＮＡを直接配列を読むことが、回収されたウイルスが適切な変異を含んでいるか確認するために行われた。
【００６３】
ＶＳＶ−ＨＡＧＳミニウイルス技術由来の濾過された各上清の二分の一は、新鮮な細胞に感染させるために使用した。成功した回収物は、培養液が感染後１８から２４時間で通常のＶＳＶ感染すると現れる特徴的な細胞変性効果を示したときに指摘された。これら培養液由来の上清は、力価を測定し、共相補ウイルスの原液は新鮮な細胞に０．０１の感染多重度で感染させることにより生産された。ＶＳＶ−ＨＡＧＳ及びＧＭＭＧの両方を含む上清は、２４時間収穫され、ＶＳＶ−ＨＡＧＳ及びＧＭＭＧ粒子は遠心により集められた、その後、２０％−４５％スクロース濃度勾配を用いたバンド形成により分離した。通常ＧＭＭＧの約３００倍のＶＳＶ−ＨＡＧＳを含む下部分画は横に穴を開けることにより回収し、ＧＭＭＧに対するＶＳＶ−ＨＡＧＳの量を、Ｎタンパク質特異的（ＶＳＶ−ＨＡＧＳ用）またはＧタンパク質特異的モノクローナル抗体を利用した免疫蛍光に基ずく力価解析により決定した。ＧＭＭＧの存在しないＶＳＶ−ＨＡＧＳの原液を得るため、部分的に精製したＶＳＶ−ＨＡＧＳはＶＳＶのニュージャージーセロ型由来のＧタンパク質（ＧNJ）を発現することにより完了した。その後、ＶＳＶのインディアナセロ型（ＶＳＶIND）に特異的な中和抗体を培養培地に加えた。使用されたインディアナ特異的血清の量は、ＶＳＶ−ＨＡＧＳ／ＧＭＭＧ共感染細胞により生産された全てのウイルスを中和した。ＧＮＪを発現する細胞及び抗ＶＳＶIND 中和抗体の存在下において３つの継続的経路の後、ＶＳＶ−ＨＡＧＳの力価は約１０8 ＩＵ／ｍｌに達した、一方０．５ｍｌの上清は検知可能なＧＭＭＧを含んでいなかった。ＶＳＶ ＧINDタンパク質で補われた純粋なＶＳＶ−ＨＡＧＳの高力価の原液は、上記記載の通りＶＳＶΔＧのために作成された。
実施例３  修飾されたＶＳＶのインビボでの細胞への投与
上記記載のいずれかの方法により用意された組換えＶＳＶ粒子は、ＨＩＶ−１に感染した対象に接種される。対象に投与されるウイルスの濃度は様々で良いが、投与に望ましいウイルスの力価は、おおよそ１０6 から１０12ＩＵ／ｍｌのオーダーに存在すべきである。使用されるウイルスの量は、もし患者が比較的多数の感染細胞を有している場合多くても良い。実施例１において記載された収穫されたウイルスは導入目的に適切な担体または賦形剤に再懸濁する。
実施例４  パラミキソウイルスＳＶ５  Ｆタンパク質及びエボラウイルスの外被タンパク質を発現する組換えＶＳＶの感染力の解析
プラスミド。エボラレストンウイルスグリコタンパク質（ＲｅｓＧＰ）（Ａ．  Ｓａｎｃｈｅｚら、（１９９６）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９３：３６０２−３６０７）、ＶＳＶ  Ｇタンパク質（Ｊ．  Ｋ．  Ｒｏｓｅら、（１９８２）Ｃｅｌｌ  ３０：  ７５３−７６２）及びインフルエンザＡ／トルコ／アイルランド／１３７８／８３（Ｈ．  Ｎｉｗａら、（１９９１）Ｇｅｎｅ  １０８：  １９３−２００）の全長をコードするｃＤＮＡは、各々ｐＣＲｅｓＧＰ、ｐＣＶＳＶＧ及び、ｐＣＴＨに当てる。
【００６４】
細胞。ベロ、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ及びＭＤＢＫ細胞は、１０％ウシ胎児血漿（ＦＣＳ）、Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）、ビタミン及びアミノ酸溶液（Ｇｉｂｃｏ）、及びペニシリン−ストレプトマイシン溶液（Ｓｉｇｍａ）を補ったＥａｇｌｅの最小必須培地（ＭＥＭ）において成長させた。Ｌ−細胞のためには、ウマ血清をＦＣＳの代わりに使用した。２９３Ｔ、ＣＯＳ−１、ＮＩＨ−３Ｔ３及びＴｂｌＬｕ細胞は、１０％ＦＣＳ、Ｌ−グルタミン、及び抗体を含む、高グルコースＤｕｌｂｅｃｃｏの修飾Ｅａｇｌｅ培地において培養した。Ｅ．  Ｒｕｓｌｅｙ博士（ヴァンダービルト大学）により提供されたＣＨＯクローン２２細胞は、５％ＦＣＳ、Ｌ−グルタミン、及び抗体を含むＨａｍのＦ−１２培地において培養した。Ｓ．  Ｍａｋｉｎｏ博士（テキサス大学）より提供されたネズミ星状腫細胞系列であるＤＢＴ細胞は、１０％ウシ新生児血漿、リン酸トリプトースブロス（Ｇｉｂｃｏ）及び抗体を補ったＭＥＭにおいて成長させた。蚊幼虫細胞系列であるクローンＣ６／３６細胞は、ＥａｒｌのＢＳＳ、必須でないアミノ酸、Ｌ−グルタミン及び１０％ＦＣＳを補ったＭＥＭにおいて成長させた。
【００６５】
組換えＶＳＶの生産。ＶＳＶゲノム（インディアナセロ型、ＶＳＶIND ）（Ｎ．  Ｄ．  Ｌａｗｓｏｎら、１９９５）の全長ｃＤＮＡクローンにおけるＧタンパク質遺伝子のコード領域は、セリン６５をトレオニンに置換した修飾型の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（Ｍ．  Ｃｈａｌｆｉｅら、（１９９４）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６３：  ８０２−５）のコード領域に置き換えた。このプラスミドは、ｐＶＳＶ−ΔＧ* を当てた。６０ｍｍ皿におけるＢＨＫ細胞は、感染効率１０のバクテリオファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼをコードする組換えバッカニアウイルスｖＴＦ７−３（Ｔ．  Ｒ．  Ｆｕｅｒｓｔら、１９８６）に、３７℃で１時間感染させた。感染した細胞は、ｐＶＳＶ−ΔＧ* 、ＶＳＶヌクレオキャプシドタンパク質（Ｎ）、ホスホタンパク質（Ｐ）、ポリメラーゼタンパク質（Ｌ）及びグリコタンパク質（Ｇ）を発現するプラスミドをそれぞれ先に示されたとおり（Ｅ．  Ａ．  Ｓｔｉｌｌｍａｎら、（１９９５）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６９：  ２９４６−２９５３）、１０、３、５、１、及び３μｇの重量比で共形質転換させた。使用した形質転換効率は、通常ＶＳＶが複製するときに観察される転写及び翻訳効率に匹敵した。
【００６６】
上清液は形質転換後４８時間収穫し、上清の半分は、ｖＴＦ７−３に感染し５μｇのＧタンパク質だけをコードするプラスミドで形質転換された細胞の、第二のプレートに感染させるために使用した。細胞は感染後２４時間で、蛍光顕微鏡によりＧＦＰ発現を試験した。蛍光細胞の存在は、ＶＳＶゲノムが成功裏に回収されたことを示した。２５μｇ／ｍｌのシトシン−β−Ｄ−アラビノフラノシド存在下でプラスミドＤＮＡよりＧタンパク質を発現する細胞に対する、Ｇタンパク質を補ったＶＳＶΔＧ* （ＶＳＶΔＧ* −Ｇ）を含む上清の追加経路は、高力価のＶＳＶΔＧ* −Ｇ原液を得るために行われた。ウイルス原液は、バッカニアウイルスを除去するために、０．２μＭ孔の膜を経由する濾過を行った。上清液におけるウイルス力価は、再びＢＨＫ細胞に感染させ、蛍光顕微鏡によりＧＦＰを発現する細胞の数を定量化することにより決定した。
【００６７】
ＶＳＶ  ＧまたはＲｅｓＧＰを補った、または補わなかったＶＳＶΔＧ* の準備。２９３Ｔ細胞は、リポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ）を使用し、ｐＣＶＳＶＧ、ｐＲｅｓＧＰまたはｐＣＡＧＧＳにより形質転換した。形質転換後３６時間で、細胞は上記記載のＶＳＶΔＧ−Ｇ* を、約１から４の感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）において３７℃で１時間感染させた。これらはその後、ＰＢＳで３回洗浄し、培地を加えた。ＣＯ2 保温庫において３７℃で２４時間保温した後、培養液を集め、細胞を除去するために遠心した。各ウイルス原液は使用まで−８０℃で保存した。
【００６８】
異なる細胞系列における受容体結合タンパク質を補った組換えＶＳＶの滴定。単層細胞は、カバーガラスの上で成長させ、ＰＢＳで洗浄し、ウイルス希釈系列を用い感染させた。３７℃での１時間吸引の後、種菌を吸引し成長培地を加えた。細胞はＣＯ2 保温庫において３７℃で１２から１４時間保温し、ＰＢＳで洗浄し、１０％ホルマリンＰＢＳで固定した。異なる細胞系列における組換えＶＳＶの感染単位は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現する細胞の数を数えることにより決定した。
実施例５  ＶＳＶ−エボラレストン偽型の向性の決定法及び感染細胞の解析
本実施例は、Ａ．  Ｔａｋａｄａら、「エボラレストンウイルスグリコタンパク質の機能解析の新たなシステム」（印刷中１９９７）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ
Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡに由来する。上記記載の通り準備した組換えＶＳＶウイルス粒子を使用した細胞向性の決定は、以下の通りである。単層細胞は、カバーガラスの上で成長させ、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、ウイルス希釈系列を用い感染させた。３７℃での１時間吸引の後、種菌を吸引し成長培地を加えた。細胞はＣＯ2 保温庫において３７℃で１２から１４時間保温し、ＰＢＳで洗浄し、１０％ホルマリンＰＢＳで固定した。異なる細胞系列において発現する組換えウイルスの感染単位は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現する細胞の数を数えることにより決定した。組換えＶＳＶ構築物：ＶＳＶΔＧ* −Ｇ、ＶＳＶΔＧ* −ＲｅｓＧＰ、及びＶＳＶΔＧ* により成功裏に感染した細胞の実施例を図４に示す。これら組換えＶＳＶ構築物の感染力は表１において示す。
【００６９】
【表１】
0004544497.tif 000003
【００７０】
結果。ＶＳＶ・G* ーGと比べ、ＶＳＶ・G* ーＲｅｓＧＰウイルスストックの感染力は細胞株の種類に深く依存した。霊長類由来細胞（例えばＶｅｒｏ、２９３ＴおよびＣＯＳー１）に由来するＶＳＶ・G* ーＲｅｓＧＰの感染力価は、ハムスター、イヌ、畜牛、マウス、チキンまたはコウモリに由来する細胞の１００倍高かった。ＶＳＶ・G* ーＲｅｓＧＰはＣ６／３６昆虫細胞には感染しなかった。これらの結果は、エボラウイルスの細胞への侵入の鍵となる決定基（例えば抗受容体の特異的な親和特性）が動物種間で異なることを示唆する。
【００７１】
ＲｅｓＧＰの組変えＶＳＶ粒子への組み込み。ウイルスタンパク質はまた、１０％ＳＤＳーＰＡＧＥにより還元条件下で解析された。図３はＶＳＶＧ遺伝子（レーン１）、ＲｅｓＧＰ遺伝子（レーン２）、またはベクタープラスミドのみ（レーン３）を含む発現ベクタープラスミドに感染した２９３Ｔ細胞の溶解物を示す。２９３Ｔ細胞は組変え体ウイルスの感染３０時間後、［３５Ｓ］−メチオニンで５時間標識した。細胞溶解物中のタンパク質は、ＶＳＶ  Ｇタンパク質（図３、レーン１）またはＲｅｓＧＰ（レーン２、レーン３）に特異的なモノクローナル抗体を用い沈殿された。ＶＳＶ  Ｇタンパク質（レーン４；ＶＳＶ・G≠ーG）,ＲｅｓＧＰ（レーン５；ＶＳＶ・G* ーＲｅｓＧＰ）により相補された、また相補されなかった（レーン６）ＶＳＶ・G* を含む組変えＶＳＶは、［３５Ｓ］−メチオニンで標識され、および２５ー４５％スクロース勾配を通した微分遠心および沈降分離によって精製された。
実施例６  組変え体ＶＳＶに感染した細胞における緑蛍光プロテイン（ＧＦＰ）発現の経時解析。
【００７２】
プラスミドからの感染ウイルスの回収。感染粒子の回収は、１０６のＢＨＫー２１細胞をｖＴＦ７ー３ワクシニアで６０分感染させ、およびその後１０μｇの様々な全長ＶＳＶ構築物をコードするプラスミド、および３μｇ、５μｇ、および１μｇのＶＳＶIND ヌクレオキャプシドタンパク質（Ｎ）、りん酸化タンパク質（Ｐ）およびポリメラーゼ（Ｌ）各々で形質転換することにより完了する。細胞は二日間、ウイルス粒子の複製および組み立てが可能となるよう、培養された。細胞の上清はその後新鮮なＢＨＫ細胞上で直接培養され、細胞はウイルスが増幅可能となるよう２４時間培養された。これらの培養液からの上清は、その後上記のように濾過膜を通された。濾過膜は新鮮なＢＨＫー２１細胞上に移された。数時間の吸収に従い、上清はＦＣＳを含むＤＭＥＭで置換された。ＶＳＶ感染のＣＰＥを呈する培養物の培地は、その後除去されおよびウイルスはプラーク精製された。ウイルスストックは、例えば単離プラークのおよそ１０５プラーク形成単位で１０７細胞の感染による結果として調製された。これらの培養物からの上清は、その後の全ての感染に用いられた。回収された全てのウイルスから単離されたウイルスＲＮＡの直接の塩基配列決定は、ウイルスがプラスミド由来であったことを保証するため実施される。
【００７３】
・GーＧＦＰ感染細胞におけるＧＦＰの経時発現。ＢＨＫー２１細胞は、ＶＳＶ  Ｇタンパク質のトランス型で偽型とされた・GーＧＦＰ粒子で感染された。細胞は示された時間に蛍光顕微鏡を用いてＧＦＰの発現を検出された。同平面の位相差画像もまた収集され、図６の右手のパネルに示す。
実施例７  ウイルス、バクテリアまたは寄生生物により感染された個体の治療法。
【００７４】
対象は、感染因に由来するタンパク質の細胞表面への結合をもたらすウイルス、寄生生物またはバクテリアのいずれかによって感染された標的細胞に対し、上述のように工作された組変え体ラブドウイルスを用いて治療される。このタンパク質は、組変え体ラブドウイルス剤の組変え体抗受容体によって標的とされ得る受容体となる。
一実施例はＨＩＶー１によって感染された対象の治療であり得る。ＣＤ４タンパク質は、組変え体ラブドウイルスの表面に異種由来の融合タンパク質と同様に発現され得る。組変え体ラブドウイルスは、成熟ＨＩＶー１エンベロープタンパク質であるｇｐ１２０を発現する細胞を、認識、結合および感染する能力がある。組変え体ラブドウイルスは、Ｍタンパク質をコードする遺伝子を含む多シストロン性の核酸を含み得る。このラブドウイルスは、感染した細胞を溶解可能であり得る。結果的に、マクロファージおよびＴ細胞のようなＨＩＶー１感染細胞の数は、減少し得、およびウイルスはそれにより抑制され得る。投薬された組変え体ラブドウイルスの量は、ほとんどの遺伝子治療ベクターを用いる際投薬される量とおよそ同様であり得る。
実施例８  発癌対象の治療法
組変え体ＶＳＶは、ＣＥＡ、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）またはＰＭＡのような、組変え体がある型の癌に伴うタンパク質を識別し得る接着タンパク質（抗受容体）を発現することを除き、上述のように調製される。
実施例９  融合タンパク質のポリペプチド断片を含む組変え体ラブドウイルスの作製。
【００７５】
ＶＳＶのような組変え体ラブドウイルスは、ＳＶ５  Ｆタンパク質、またはＧタンパク質の推定多量体化ドメイン、膜貫通ドメインおよびＧタンパク質の細胞内尾部を包囲するＶＳＶ  Ｇタンパク質のステム領域に連結する融合タンパク質断片のような融合タンパク質を発現するよう構築される。これらの構築物は、感染細胞に用いられ、および結果となるウイルスの感染力が様々な細胞系で比較され得る。
実施例１０  ｃＤＮＡのみを用いる融合タンパク質の識別法
ＶＳＶのような組変え体ラブドウイルスは、接着タンパク質および融合タンパク質の候補を発現するよう構築される。接着タンパク質はＣＤ４であり得、および標的細胞はＨＩＶー１のエンベロープタンパク質ｇｐ１２０／ｇｐ１６０を発現する細胞であり得る。候補となる融合タンパク質を発現する構築物は、パラミキソウイルスＳＶ５およびＣＤ４（陽性対照）融合タンパク質を発現する構築物、およびＣＤ４およびＶＳＶ  Ｇタンパク質のみを発現するＶＳＶ構築物と比較されてよい。これらの構築物による感染度は、上記および例５および６に記載された緑蛍光タンパク質のようなレポータータンパク質を用いて比較され得る。
【００７６】
構築物は明細書中で述べられたいかなる方法を用いて調製され得る。
実施例１１  ＳＶ５  Ｆタンパク質で偽型化された組変え体ＣＤ４ーＶＳＶのＨＩＶ  ｇｐ１６０発現細胞に対する感染力
パラミキソウイルスＳＶ５  Ｆタンパク質を用いたＣＤ４ーＶＳＶの偽型化。ＳＶ５  Ｆタンパク質を（ワクシニアＴ７発現系を用い）発現するＢＨＫー２１細胞は、野生型ＶＳＶ  Ｇタンパク質で先に偽型化されたＣＤ４ーＶＳＶで感染された。上清は感染後１８時間で収穫され、ワクシニアウイルスを除去するよう濾過された。結果となる上清は、ＣＤ４およびＳＶ５の両方をウイルスエンベロープ内に有するが、ＶＳＶ  Ｇタンパク質を欠く組変え体ＶＳＶを含む。接種原（例えばＧタンパク質偽型化ＣＤ４ウイルス）からの残留感染力は、ＶＳＶ  Ｇタンパク質特異的な中和抗原の添加によって算出された。
【００７７】
ＨＩＶ  ｇｐ１６０発現細胞上のＳＶ５  Ｆタンパク質による偽型組変え体ＣＤ４−ＶＳＶの感染力。ＢＨＫー２１細胞は、Ｔ７  ＲＮＡ  ポリメラーゼを発現する組変え体ワクシニアウイルスで感染され、およびＨＩＶ  ｇｐ１６０タンパク質をコードする様々な量の発現プラスミドで形質転換された。細胞表面へのｇｐ１２０ーｇｐ４１の吸収が可能となる１０時間後、細胞はＣＤ４／ＦーＶＳＶで感染された。すべてのプレートは、等量のＣＤ４／Ｆウイルス接種源で感染された。細胞は、さらに６時間、ＶＳＶ特異的タンパク質が発現可能となるまで培養され、免疫蛍光顕微鏡によってＶＳＶ  Ｎタンパク質の発現を調べられた。一プレート当たりの感染細胞数は、ＶＳＶ  Ｎタンパク質に対する免疫耐性のある細胞を計測することにより決定された。図７は、ｇｐ１６０をコードする増加量のプラスミドに感染した細胞中に、・G ＶＳＶ偽型ＣＤ４ーＳＶ５  Ｆに感染され多細胞数の結果的な増加がある。
【００７８】
実施例１２  前立腺ガンを標的とするＰＳＡ特異的ＳｃＦｖをコードする組変え体ＶＳＶの産生
ＳｃＦｖーＧＳの構築。まず、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）または他の腫瘍特異的抗原を産生するハイブリドーマ細胞系由来のＶーＨおよびＶーＬドメインは、ＳｃＦｖーＧＳを構築する標準的な方法によりクローン化される。簡潔には、様々なドメインの配列は、好ましいハイブリドーマ細胞から単離された、ポリＡを含むｍＲＮＡのＲＴーＰＣＲ増幅により得られる。ポリＡ  ＲＮＡは逆転写（ＲＴ）反応の鋳型として用いられ、および使用されるプライマーは先に述べられたものに類似したものである（Ｒ．Ｏｒｌａｎｄｉ  ら。（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：３８３３−３８３７）。
増幅されたＶドメインは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中へクローン化され、および増幅領域の配列は標準的な方法により決定される。配列は読み枠を解析されおよび既知のＶＨ（可変重鎖）およびＶＬ（可変軽鎖）配列と比較され得る。ひとたび配列が確定されると、これらのクローンはＳｃＦｖ遺伝子構築に用いられる。ＶＨおよびＶＬをコードする配列はオリゴヌクレオチドリンカーを用い連結される。リンカーは、最初のＶ領域のＣ末端および２番目のＶ（可変）領域のＮ末端とをＶL −（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）−ＶH ポリペプチドへとつなぐ、短いＧｌｙ−Ｓｅｒペプチドをコードする。全長ＳｃＦｖ遺伝子は、真核細胞中での後の発現においてタンパク質が粗面小胞体を標的とし、および分泌されるように、ＶＳＶ
Ｇタンパク質のシグナル配列をコードする配列に連結される。発現解析が、ＳｃＦｖが機能的で、および好ましい抗原（例えばＰＳＡ）に結合可能であることを保証するために用いられる。
【００７９】
次にＳｃＦｖをコードする領域は、ＶＳＶ  Ｇタンパク質の膜固定ステム領域をコードする配列に連結される。Ｇステム配列へ導入された唯一の制限酵素認識部位は、読み枠が損なわれないように、二つのコード領域を連結するのに用いられる。結果となる分子は、ＶＳＶ  Ｇステム（ＳｃＦｖーＧＳ）のＥ４２２アミノ酸に融合したＳｃＦｖドメインからなる。発現解析は、分子が発現されおよび感染細胞の細胞膜に局在することを保証するのに用いられる。
【００８０】
最後に、ＳｃＦｖーＧＳ遺伝子は、遺伝子がＶＳＶの転写制御下に置かれるようにｐＶＳＶーＧーＦの多クローニング部位へとクローン化される。結果となる構築物はｐＶＳＶーＳｃＦｖーＦと呼ばれる。組変え体ＳｃＦｖーＦウイルスは標準的な手順によりｐＶＳＶーＳｃＦｖーＦプラスミドから回収される。未処理ＶＳＶーＳｃＦｖーＦは、野生型ＶＳＶ  Ｇタンパク質を発現しない細胞に運搬され産生される。
【００８１】
ＰＳＡを発現する腫瘍細胞の攻撃。ＬＮＣａＰ細胞株は前立腺癌のモデル細胞株である。これらの細胞はＰＳＡを発現しおよび組変え体ＳｃＦｖーＦウイルスの標的として振舞い得ることが知られる。ＬＮＣａＰ細胞は、標準的な培養条件で生育されおよび組変え体ＳｃＦｖ−Ｆウイルスを含む上清が加えられる。細胞は軽度に接着されおよび単細胞層は容易に破壊されるため、接種源は除去されない。感染は、典型的な免疫蛍光に基づく感染中枢測定を用い、接種１５時間後に見積もられる。対照群は、野生型組変え体ＶＳＶ、膜固定Ｇステムのみを含む非感染変異体ＶＳＶーＨＡＧＳ、および融合（Ｆ）タンパク質を除くＳｃＦｖーＧＳポリペプチドのみをコードする組変え体での感染を含む。特異性は、ＰＳＡを発現しない正常細胞に対してＳｃＦｖーＦウイルスの感染力を査定することによって決定される。
【００８２】
同様に、これらの構築物は前立腺ガンの研究に用いられる動物モデルにおいて解析され得る。ヒト前立腺癌のマウスモデル系が、開発されており、および記載された研究の規範であり得る。純粋組変え体ＶＳＶ−ＳｃＦｖーＦは、ヒト前立腺特異的腫瘍を有する動物に投与される。動物は、組変え体ウイルスの投与の結果として、有害な効果が見られるか否か決定するため、数週間観察される。動物は殺され、および腫瘍塊は大きさ、質量の変化、血管新生および転移を調べらる。対照は、陰性対照となるＶＳＶーＨＡＧＳでの感染を含む。付加的対照は、融合（Ｆ）タンパク質を含まない組変え体ＶＳＶ−ＳｃＦｖ−ＧＳの投与である。ＶＳＶ−ＨＡＧＳ同様、このウイルスは非感染性であり得る。ＶＳＶ−ＨＡＧＳ構築物は、ウイルスエンベロープにＳｃＦｖ−ＧＳポリペプチドを持つウイルスの投与に伴う効果の評価を可能にする。
実施例１３  ＶＳＶ−ＣＤ４組変え体の感染力
ＶＳＶ−ＣＤ４組変え体の感染力を研究するため、ＢＨＫー２１細胞は、ＣＤ４ーＧ、ＣＤ−４ＧＳの一方、またはＣＤ４ーＧおよびＨＡＧＳの両方をコードする野生型Ｇタンパク質偽型組変え体・GーＶＳＶで感染された。偽型ウイルスは６０分間吸収され、接種源は除去され、および細胞単層は残留接種源を除去するため完全に洗浄された。続く感染で細胞は、５％ＦＣＳを含む培地で１６時間培養された。培養後、純粋組変え体ＶＳＶ／ＣＤ４−Ｇ、ＣＤ４ＧＳまたはＣＤ４−ＧおよびＨＡＧＳウイルスの混合物を含む培地は、回収され、遊離細胞は２，５００ｒｐｍで１０分遠心分離され除去された。上清のアリコートは、ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質の亜類型ＨＸＢを発現する細胞を感染するのに用いられた。上清は６０分間無血清培地中で吸収された。すなわち接種源は除去されおよび無血清培地へ移行された。感染力は、免疫蛍光顕微鏡により、ＶＳＶヌクレオキャプシドタンパク質を発現する細胞数の解析により測定された。
【００８３】
１０μｌのみのＣＤ４−ＧＳまたはＣＤ４Ｇ＋ＨＡＧＳの上清が用いられた一方、１００μｌのＶＳＶ／ＣＤ４−Ｇの上清が感染力測定に用いられた。総数６０のＶＳＶ／ＣＤ４−Ｇ感染細胞が培養皿全体で見つけられた。この結果は、およそ１ｍｌあたり６００感染単位（ＩＵ／ｍｌ）の力価に相当する。対照的に、ＣＤ４−ＧＳまたはＣＤ４Ｇ＋ＨＡＧＳの力価は、＞１０8 ＩＵ／ｍｌであった。
【００８４】
結果。図８で示されたデータは、ウイルスエンベロープ中にＣＤ４−Ｇを含みヒトケモカイン共役受容体を欠くウイルスが、Ｔ親和性ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質（ＨＸＢ）を発現する細胞への感染力が極度に低いことを示す。対照的に、ＣＤ４−ＧＳ（例えば”Ｇステム”といったＶＳＶ  Ｇタンパク質外ドメインのＥ４２２アミノ酸に連結したＣＤ４外ドメイン）は、非常に高い特異的な感染力を示した。ＣＤ４−ＧＳの特異的感染力は、野生型ＶＳＶの野生型標的宿主細胞に対してみられる特異的な感染力にほぼ匹敵する。さらに、ＶＳＶ／ＣＤ４−ＧＳによるＨＩＶ−１エンベロープ発現細胞への感染は、ケモカイン共役受容体を必要としない。精製されたＶＳＶ／ＣＤ４−ＧＳビリオンの解析は、ＣＤ４−ＧＳの一部（〜５０％）がＣＤ４／Ｇステム連結部、またはその近傍で切断されることを明らかにした。感染細胞中でのタンパク質の細胞膜への輸送中に起きるこの切断は、膜固定切断産物（Ｇステム）だけでなく全長ＣＤ４−ＧＳ分子の両方を持つウイルス粒子の放出をもたらす（図９）。切断はＣＤ４−Ｇでは起きず、および結果としてＶＳＶエンベロープはＣＤ４−Ｇのみで構成される。
【００８５】
Ｇステム（この場合ＨＡＧＳと呼ばれるＨＡ抗原認識部位標識型）がビリオンの感染力を増大し得るかを決定するために、ＣＤ４−Ｇを含む細胞はＣＤ４−ＧまたはＨＡＧＳのいずれかをコードするウイルスで別々に共感染させた。これらの細胞から産生されたウイルスは、エンベロープ中にＣＤ４−ＧおよびＨＡＧＳの両方を含んだ。ＣＤ４−Ｇ／ＨＡＧＳウイルスの感染力は、ＣＤ４−ＧＳの感染力と実質的に同等であった。これらの結果は、ＶＳＶ  Ｇステムが、この場合ＣＤ４−Ｇである異種結合タンパク質とともにウイルスエンベロープへ編入されたときウイルス粒子の感染力を増幅し得ることを示す。他の異種結合タンパク質候補はすでに技術を有するものに知られている。
実施例１４  Ｇステムを含むＶＳＶ組変え体：感染力およびモデル
ウイルス産生およびＧステム編入。ウイルスは、図８で実施された実験で示されたように産生された。この上清は、感染後１６時間で回収された。ビリオンは超遠心分離により濃縮され、ウイルス量およびビリオンのタンパク質含有量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定された。ビリオンタンパク質は、クマシーブルー染色またはＶＳＶ  Ｇタンパク質の細胞内ドメインに特異的な抗体を用いたウエスタンブロット解析によって可視化された（図９参照）。
結果。ＶＳＶ／ＣＤ４ーＧ感染細胞は、ΔＧーＶＳＶとおよそ同量のウイルスを産生する。これは野生型ＶＳＶの１０分の１に相当する。対照的に、ＶＳＶ／ＣＤ４ＧＳは野生型とほぼ同量（野生型の〜７０ー７５％）のウイルスを産生する。ＶＳＶーＧの細胞質ドメインの最後の１５アミノ酸を認識しおよび結合する抗体を用いた、ＣＤ４ーＧおよびＣＤ４ーＧＳウイルスの同等量の免疫ブロット解析（図９）は、ＣＤ４ーＧＳが切断され、相当するＧステム断片は、全長ＣＤ４ーＧＳ分子とともに組変え体ＶＳＶビリオンへ編入されることを示す。
様々な細胞種から生産されたＶＳＶ／ＣＤ４−ＧＳの細胞に対する感染能力。本質的には図８の実験において記載されたような、示された細胞種においてウィルスが生産された。様々な細胞主のＶＳＶによる溶解に対する感受性に依存する感染後の様々な時点において上清が回収された。上清の一部は感染能力試験に用いられ、残りは超遠心分離され、ビリオンが沈殿された。各々の細胞種により生産されたウィルスの量はSDS−PAGE  によってタンパク質が分離された後、クマシーブルーにより染色されたゲルの濃度測定によって決定された。図１０に示された相対的な感染力は、上清から沈澱化されたウィルスタンパク質に対して標準化の後の感染能力の量を表す。相対的な感染能力はＩＵ／ｍｌには対応しない。
【００８６】
【表２】
0004544497.tif 000004
【００８７】
Ｘ４（Ｔ細胞反応性外殻）およびＲ５特異的外殻（マクロファージ反応性外殻）に対するＶＳＶ／ＣＤ４−Ｑ４２７構築物の感染能力を評価するために、ＢＨＫ−２４細胞が、５１１アミノ酸Ｇタンパク質のＱ４２７において融合されたＣＤ４−ＧＳをコードする、野生型Ｇタンパク質の偽型組変えＧ−ＶＳＶによって感染された。この偽型ウィルスは６０分間吸収され、接種物が除去され、接種物の残留がないように単層細胞はよく洗浄された。感染された培養物は５％ＦＣＳを含む培養液中で１６時間放置された。放置の後に、純粋な組変えＶＳＶ／ＣＤ４−ＧＳ（Ｑ４２７）ウィルスを含む、感染された培養物由来の培養液が採集され、剥離した細胞は２５００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により除去された。１００μｌの上清の一部が示されたＨＩＶ−１外殻タンパク質を発現するＨｅＬａ細胞に、以下のように感染させるために用いられた。ＨＩＶ−１外殻タンパク質は、ＮＩＨ  ＡＩＤＳ  ＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＲｅｆｅｒｅｎｃｅＲｅａｇｅｎｔＰｒｏｇｒａｍによって供給された牛痘ウィルスベクターを用いて発現された。発現のためには、無血清培地中で６０分間吸収されることにより、示された牛痘ウィルスベクターにより、ＨｅＬａ細胞が感染された。接種物は除去され、５％ＦＣＳおよび１００μｇ／ｍｌのＡｒａＣ培養液によって置換された。細胞は３０分間放置され、１００μｌのＶＳＶ／ＣＤ４−ＧＳ（Ｑ４２７）上清が培養液に直接加えられ、培養物は４時間放置されてＨＩＶ−１外殻の発現およびＣＤ４−ＧＳ（Ｑ４２７）ウィルスの吸収が行われた。４時間後、接種物をを含む培養液が除かれ、ＡｒａＣおよび血清を含む培養液により置換された。培養物はさらに１０時間放置され、細胞は３％パラホルムアルデヒドによって固定された。ＶＳＶヌクレオキャプシド（Ｎ）タンパク質を発現している細胞の数を、Ｎ−特異的モノクローナル抗体を用い、免疫蛍光顕微鏡により検出することで調べることで、感染能力が試験された。
【００８８】
表２のデータはＶＳＶ／ＣＤ４−ＧＳが、Ｔ−およびＭ−反応性ＨＩＶ−１外殻タンパク質の両方を発現している細胞に感染できることを示す。この感染能力はケモカイン受容体に依存しない様式で起こる、なぜなら、組変えウィルスは、ヒトケモカイン受容体を発現していないハムスター細胞株（ＢＨＫ−２１）中で生産されたからである。感染能力は明らかにＨＩＶ−１外殻タンパク質の発現に依存する。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼをコードする組変え牛痘ウィルス（ｖＴＦ７−３）に感染した細胞または正常なＨｅＬａ細胞（牛痘ウィルスに感染していないがＡｒａＣの存在下で生育させられた）はＶＳＶ／ＣＤ４−ＧＳ感染に感受性がない。加えて、解裂していない（例えばｇｐ１６０）融合欠損型突然変異の（ｖＣＢ−１６により発現された）ＬＡＩ  ＩＩＩＢを発現する細胞は、このタンパク質が細胞表面に発現されていても（データは示されない）、感染に対して感受性を持たないから、感染能力は機能的なＨＩＶ−１外殻タンパク質（例えばｇｐ１２０−ｇｐ４１）を必要とする。牛痘ベクターはＣ．Ｃ．Ｂｒｏｄｅｒｅｔａｌ．、（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：９００４−９００８に記載されたものと同様である。
【００８９】
短縮型のＶＳＶ  Ｇタンパク質はＧタンパク質の細胞外ドメインの膜に近接した４２アミノ酸、膜貫通ドメインの２０アミノ酸および細胞質側尾部の２９アミノ酸からなる。翻訳と共に小胞体に挿入された後にシグナルペプチダーゼにより解裂されるＶＳＶ−Ｇタンパク質シグナル配列を含む前駆体から、このタンパク質は作られる。我々が解析したうち最長のステムは膜に近接する細胞外ドメインの５９アミノ酸をもち、（融合活性の増強を示す）最短のものは細胞外ドメインの２９アミノ酸を持つ。
【００９０】
膜に結合されたＧステムは、様々なウィルスヘテロ融合タンパク質の融合活性を増強するように見える。これはＴ−およびＭ−反応性ウィルスの両方由来のＨＩＶ−１  ｇｐ１２０−ｇｐ４１、パラミキソウィルス  ＳＶ５のＦタンパク質、およびＶＳＶのＮｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ  セロタイプ糖タンパク質の融合活性を含む。我々は、これらの融合タンパク質により形成された融合孔をステムが何らかの方法で安定化させることで増強すると仮定する。融合孔の存在は普通、これらのタンパク質の全体の融合活性を明確に示す他の補因子の存在を必要とする。ＨＩＶ−１外殻タンパク質の場合は、補因子はケモカイン共受容体であり、パラミキソウィルスのＦタンパク質についてはその同族のＨＮタンパク質であり、ＶＳＶＧタンパク質については酸性ｐＨによる活性化である。
【００９１】
後の議論および実施例は、単に望ましい態様の詳細な記載を提示するものであると理解されるべきである。当該技術分野において通常の技能を有する者にとって、本発明の精神および展望から離れることなく、多様な修飾および等価物が作製され得ることは明らかである。上記に論じられたまたは引用された全ての特許、雑誌記事およびその他の事項は、その全体が参考文献として本明細書に含まれる。この申請書はその全体が本明細書に参考文献として含まれる、１９９７年１２月２２日に提出されたＵ．Ｓ．Ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｅｒｉａｌ  番号６０／０６８、４７２からの優先権を主張する。
【図面の簡単な説明】
【図１ＡおよびＢ】  粒子産生の定量化およびウエスタンブロット解析による糖タンパク質の取り込み。
【図２ＡおよびＢ】  ｗｔ−ＶＳＶ，ＣＴ−１およびΔＧウイルスの出芽の図式化。
【図３】  ＲｅｓＧＰのＶＳＶ粒子への取り込み。
【図４】  組変えＶＳＶによる感染直後の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現。ＶＳＶ  ΔＧ* −Ｇ、ＶＳＶ  ΔＧ* −ＲｅｓＧＰまたはＶＳＶ  ΔＧ* をベロ細胞に感染させ、感染から１２時間後に蛍光顕微鏡下で観察した。
【図５】  感染性組変えＶＳＶのプラスミドからの回収法を示した図。感染性粒子の回収は、１０６個のＢＨＫ−２１細胞をｖＴＦ７−３により６０分間感染させ、次に細胞を様々な全長のＶＳＶ構築物をコードする１０μｇのプラスミド、ＶＳＶｉｎｄヌクレオキャプシドタンパク質（Ｎ）、リンタンパク質（Ｐ）、およびポリメラーゼ（Ｌ）をコードする、各々３μｇ、５μｇ、および１μｇのプラスミドによりトランスフェクションさせる。ウイルス粒子の複製および構築のために細胞を二日間保温する。細胞の上清を新鮮なＢＨＫ細胞の上に直接乗せ、ウイルス複製を起こすために細胞を２４時間保温する。ワクシニアウイルスを除去するために、これらの培養から回収した上清を０．２μ濾紙（Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＳ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に通過させ、１ｍｌの濾過上清を新鮮なＢＨＫの上に乗せる。１時間の吸収の後、上清をＤＭＥＭ−ＦＣＳで置換する。細胞壊死効果（ＣＰＥ）を示す培養培地を取り出し、ウイルスをプラーク精製する。ウイルスの保存液は、引き続き１０７個の細胞をおよそ１０５プラーク形成単位（ｐ．ｆ．ｕ．）のプラーク単離物に感染させることによって調製する。これらの培養から得た上清を以降の全ての感染に使用する。回収したウイルスがプラスミドに由来することを確認するために、各々の回収されたウイルスから単離したウイルスＲＮＡの直接配列決定を実行する（実施例１を参照せよ）。
【図６】  ΔＧ−ＧＦＰ感染細胞におけるＧＦＰ発現の経時変化およびＳＶ５  Ｆタンパク質により偽型化した組変えＣＤ４−ＶＳＶの、ＨＩＶ  ｇｐ１６０発現細胞への感染性。
【図７】  ＳＶ５  Ｆタンパク質により偽型化した組変えＣＤ４−ＶＳＶの、ＨＩＶ  ｇｐ１６０発現細胞への感染性。
【図８】  ＶＳＶ−ＣＤ４組変え体の感染性。右側の列は位相差顕微鏡下の細胞を示す。左側の列は、免疫蛍光顕微鏡下で抗ＶＳＶ  Ｎタンパク質抗体を用いて検出されたＶＳＶ−ＣＤ４組変え体感染細胞を示す。上段の図はＶＳＶＣＤ４−Ｇに曝された細胞である。中段の図はＶＳＶ／ＣＤ４−Ｑ４２７組変え体に曝されている細胞である。下段の図はＶＳＶ／ＨＡＧＳ／ＣＤ４−Ｇに曝されている細胞である。
【図９】  ウイルス産生およびＧ−ステムの取り込み。左側の図は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシーブルーにより染色した様々な組変えＶＳＶ構築物のタンパク質を示す。右側の図は、ＶＳＶ  Ｇタンパク質の細胞質ドメインを認識する抗体を用いてＧタンパク質を検出したウエスタンブロット解析である。それゆえに、Ｇ  ステム、異種タンパク質ＣＤ４−ＧおよびＣＤ４−ＧＳが本抗体によりすべて検出される。
【図１０】  ＨＸＢ２細胞の感染のための様々な株化細胞から作製したＶＳＶ／ＣＤ４−ＧＳウイルス粒子の感染性。ＣＤ４−Ｑ４２７およびＣＤ４−Ｇ組変え体の感染性はＢＨＫ、ＨｅＬａ（Ｈｅｌａ）、Ｄ−１７、ＱＴ−６、ＬおよびＳｆ９細胞において試験した。相対感染性は、ＶＳＶ  Ｇタンパク質全体を発現するＣＤ４−Ｇ構築物における値よりもＧ  ステム構築物（例えば、ＣＤ４−Ｑ４２７）に対する値の方がより高かった。
【図１】
0004544497.tif 000005
0004544497.tif 000006
【図２】
0004544497.tif 000007
0004544497.tif 000008
【図３】
0004544497.tif 000009
【図４】
0004544497.tif 000010
【図５】
0004544497.tif 000011
【図６】
0004544497.tif 000012
【図７】
0004544497.tif 000013
【図８】
0004544497.tif 000014
【図９】
0004544497.tif 000015
【図１０】
0004544497.tif 000016