(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
異種RNA配列に機能的に連結された、ニューキャッスル病ウイルスのRNAポリメラーゼに対して特異的な結合部位と、NDVが介在する複製および転写に必要なシグナルとを含む、組換えRNA分子であって、ニューキャッスル病ウイルスのRNAポリメラーゼに対して特異的な結合部位と、NDVが介在する複製および転写に必要なシグナルとが、NDVのRNAゲノムの３'および５'非コードフランキング領域に含まれ、該３'および５'非コードフランキング領域が、以下のウイルスセンス配列：
0004558203.tif 000002
を有するものである、上記組換えRNA分子。
【請求項２】
異種RNAがウイルス抗原をコードする、請求項１に記載の組換えRNA分子。
【請求項３】
ウイルス抗原が、ヒト免疫不全ウイルス、ニューキャッスル病ウイルス、インフルエンザ、RSウイルス(respiratory syncytial virus)、マレク病ウイルス、伝染性ファルビキウス病ウイルス、伝染性気管支炎ウイルス、伝染性滑液包炎ウイルス、ニワトリ貧血ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウイルス、トリ白血症ウイルス、細網内皮症ウイルス、トリインフルエンザウイルス、狂犬病ウイルス、ネコジステンパーウイルス、水疱性口内炎ウイルス、牛疫ウイルス、または豚痘ウイルスに由来する、請求項２に記載の組換えRNA分子。
【請求項４】
ニューキャッスル病ウイルス遺伝子に機能的に連結された、ニューキャッスル病ウイルスのRNAポリメラーゼに対して特異的な結合部位と、NDVが介在する複製および転写に必要なシグナルとを含む、組換えRNA分子であって、弱毒化した表現型または免疫原性の増大をもたらす突然変異を含む組換えRNA分子であり、ここでニューキャッスル病ウイルスのRNAポリメラーゼに対して特異的な結合部位と、NDVが介在する複製および転写に必要なシグナルとが、NDVのRNAゲノムの３'および５'非コードフランキング領域に含まれ、該３'および５'非コードフランキング領域が、以下のウイルスセンス配列：
0004558203.tif 000003
を有するものである、上記組換えRNA分子。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換えRNA分子をコードするヌクレオチド配列と、NDV RNAポリメラーゼタンパク質ＰおよびＬをコードするヌクレオチド配列とを含む、組換え細胞。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換えRNA分子を含むマイナス鎖RNAウイルスを含むキメラウイルス。
【請求項７】
異種RNAがウイルス抗原に由来する、請求項６に記載のキメラウイルス。
【請求項８】
ウイルス抗原が、ヒト免疫不全ウイルス、ニューキャッスル病ウイルス、インフルエンザ、RSウイルス、マレク病ウイルス、伝染性ファルビキウス病ウイルス、伝染性気管支炎ウイルス、伝染性滑液包炎ウイルス、ニワトリ貧血ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウイルス、トリ白血症ウイルス、細網内皮症ウイルス、トリインフルエンザウイルス、狂犬病ウイルス、ネコジステンパーウイルス、水疱性口内炎ウイルス、牛疫ウイルス、または豚痘ウイルスに由来する、請求項７に記載のキメラウイルス。
【請求項９】
異種RNAをニューキャッスル病ウイルスのＨＮ遺伝子内に含む、請求項６に記載のキメラウイルス。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換えRNA分子と、複製および転写に必要なウイルス機能とをコードするヌクレオチド配列を、宿主細胞にトランスフェクトし、そして、その培養物から該キメラウイルスを回収することを含む、キメラなマイナス鎖RNAウイルスを産生する方法。
【請求項１１】
請求項４に記載の組換えRNA分子を含有する遺伝子工学的に操作されたニューキャッスル病ウイルス、および生理的に許容される賦形剤を含有するワクチン製剤であって、該ウイルスが弱毒化した表現型をもたらす改変を含む、上記ワクチン製剤。
【請求項１２】
前記改変が天然に存在する突然変異体に由来する、請求項１１に記載のワクチン製剤。
【請求項１３】
請求項１に記載の組換えRNA分子を含有する遺伝子工学的に操作されたキメラなニューキャッスル病ウイルス、および製薬上許容される賦形剤を含有するワクチン製剤であって、該ウイルスのゲノムが異種エピトープをコードする、上記ワクチン製剤。
【請求項１４】
異種エピトープがウイルス抗原である、請求項１３に記載のワクチン製剤。
【請求項１５】
ウイルス抗原が、ヒト免疫不全ウイルス、ニューキャッスル病ウイルス、インフルエンザ、RSウイルス、マレク病ウイルス、伝染性ファルビキウス病ウイルス、伝染性気管支炎ウイルス、伝染性滑液包炎ウイルス、ニワトリ貧血ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウイルス、トリ白血症ウイルス、細網内皮症ウイルス、トリインフルエンザウイルス、狂犬病ウイルス、ネコジステンパーウイルス、水疱性口内炎ウイルス、牛疫ウイルス、または豚痘ウイルスに由来する、請求項１４に記載のワクチン製剤。
【請求項１６】
異種エピトープが免疫賦活タンパク質である、請求項１３に記載のワクチン製剤。
【請求項１７】
異種エピトープが腫瘍抗原である、請求項１３に記載のワクチン製剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、その全文を参照により本明細書に組み込まれる、1998年９月１４日に出願の出願第09/152,845号の一部継続出願である。
【０００２】
１．発明の分野
本発明は、適切な宿主細胞系における異種遺伝子産物の発現、ならびに/または異種遺伝子産物を発現、パッケージング、および/もしくは提示する組換えウイルスの構築に使用されうる組換えニューキャッスル病ウイルスRNA鋳型に関する。該発現産物およびキメラウイルスはワクチン製剤に有利に使用されうる。また本発明は、遺伝子工学的に操作された、ワクチン製剤への使用に好適な(毒弱化した表現型または免疫原性の増大など）組換えウイルスを作製する改変および/または突然変異を含む組換えニューキャッスル病ウイルスにも関する。
【０００３】
本発明は、インターフェロンおよび関連する経路を誘導する組換えニューキャッスル病ウイルスに関する。本発明は、広範な病原体、および/または腫瘍特異抗原を含む抗原に対する組換えニューキャッスル病ウイルスおよびウイルスベクターの使用に関する。本発明は、負の極性の異種遺伝子コード配列を含む組換えニューキャッスル病ウイルスRNA鋳型を構築した例によって、実証される。本発明はさらに、正の極性の異種遺伝子コード配列を含む組換えニューキャッスル病ウイルスRNA鋳型の構築に関する。係る異種遺伝子配列は、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)に由来する配列を含む。
【０００４】
２．発明の背景
いくつかのDNAウイルスは、宿主細胞系において異種タンパク質を発現するように遺伝子工学的に操作されてきた（例えば、ワクシニアウイルス、バキュロウイルスなど）。最近、プラス鎖RNAウイルス（例えば、ポリオウイルス）を用いて、同じ様な利点が得られた。これらの構築物の発現産物（つまり異種遺伝子産物、または異種遺伝子産物を発現するキメラウイルス）は、ワクチン製剤（サブユニットウイルスワクチンまたは完全ウイルスワクチン）に潜在的に有用であると考えられる。ワクチンに使用する組換えウイルスまたはキメラウイルスの構築においてワクシニアなどのウイルスを使用することの障害の一つは、その主要なエピトープに変異形がないことである。このウイルス種の変異形の欠如のために、キメラワクシニアを繰り返して使用することは厳しく制限される。それは、複数のワクチン注射で該ウイルス種に対する宿主耐性が生じ、接種したウイルスは宿主に感染できなくなるからである。そのために、キメラワクシニアによる耐性の個体への接種は、免疫刺激を誘導しない。
【０００５】
対照的に、マイナス鎖RNAウイルスは、ワクチンに使用するキメラウイルスの構築について、魅力的な候補であろう。マイナス鎖RNAウイルス（例えばインフルエンザ）は、その広範な遺伝子の可変性が、耐性を生じさせることなく免疫系を刺激する膨大な種類のワクチン製剤の構築を可能するため望ましい。最近、感染性組換え体、またはキメラマイナス鎖RNA粒子の構築は、インフルエンザウイルスを用いて達成された(Paleseら、米国特許第5,166,057号、その全文を本明細書に参照により組み込む）。
【０００６】
2.1.  ニューキャッスル病ウイルス
エンベロープに囲まれたネガティブセンスゲノムの一本鎖RNAを含むウイルスファミリーは、非セグメント化ゲノムを有する群（パラミクソウイルス科(Paramyxoviridae)、ラブドウイルス科(Rhabdoviridae)）または、セグメント化ゲノムを有する群（オルソミクソウイルス科(Orthomyxoviridae)、ブンヤウイルス科(Bunyaviridae)、およびアレナウイルス科(Arenaviridae)）に分類される。本明細書中で記載および実施例で使用する、パラミクソウイルス科ファミリー（その詳細については後述する）は、ニューキャッスル病ウイルス(NDV)、パラインフルエンザウイルス、センダイウイルス、シミアンウイルス５，および流行性耳下炎ウイルスを含む。
【０００７】
ニューキャッスル病ウイルスは、線状一本鎖の非セグメント化ネガティブセンスRNAゲノムを含有するエンベロープで囲まれたウイルスである。ゲノムRNAは3'-NP-P-M-F-HN-Lの順に並んだ遺伝子を含有する（さらなる詳細は後述する）。該ゲノムRNAはまた、3'末端にリーダー配列も含む。
【０００８】
ビリオンの構造エレメントは、細胞形質膜由来の脂質二重層であるウイルスエンベロープを含む。糖タンパク質である赤血球凝集素-ノイラミニダーゼ(HN)は、エンベロープから突き出ており、該ウイルスにヘマグルチニンとノイラミニダーゼ活性の双方の含有を付与する。同じくウイルス膜と相互作用する、融合糖タンパク質(F)は、不活性型前駆体としてまず生産され、その後、翻訳後に切断されてジスルフィド結合した２つのポリペプチドが生成される。活性型Ｆタンパク質は、ウイルスエンベロープと宿主の細胞形質膜との融合を促進させることによりNDVの宿主細胞への侵入に関与している。マトリックスタンパク質（M)は、ウイルスの集合に関与しており、ウイルス膜ならびにヌクレオキャプシドタンパク質の両方と相互作用する。
【０００９】
ヌクレオキャプシドの主要なタンパク質サブユニットは、ヌクレオキャプシドタンパク質(NP)であり、これが該キャプシドを螺旋対称形にする。ＰおよびＬタンパク質は、ヌクレオキャプシドと関係する。リン酸化を受けるリンタンパク質（P）は、転写において調節的な役割を担っており、メチル化、リン酸化、およびポリアデニル化にも関与していると考えられている。Ｌ遺伝子は、RNA依存性RNAポリメラーゼをコードし、Ｐタンパク質とともにウイルスのRNA合成に必要である。ウイルスゲノムのコード許容量のほぼ半分を占めるＬタンパク質は、ウイルスタンパク質の中で最も大きく、転写および複製の双方において重要な役割を担っている。
【００１０】
RNAの複製に必要な細胞機構がないので、NDVを含む全てのマイナス鎖RNAウイルスの複製は複雑である。さらに、マイナス鎖ゲノムを、直接タンパク質に翻訳できず、まずプラス鎖（mRNA）コピーに転写されなければならない。従って、宿主細胞に侵入した際、ゲノムRNA単独では、必要なRNA依存性RNAポリメラーゼを合成することができない。Ｌ、Ｐ、およびＮＰタンパク質が、感染時にゲノムに伴って細胞内に侵入しなければならない。
【００１１】
ほとんどまたは全ての、NDV mRNAを転写するウイルスタンパク質が、それらの複製も行うという仮説がある。同じタンパク質の物の代替的な利用（つまり、転写または複製）を調節する機構は、明確に特定されていないが、一種以上のヌクレオキャプシドタンパク質、特にＮＰタンパク質の遊離型が豊富に存在することが関係しているようである。ウイルスの侵入に続いてすぐに、ヌクレオキャプシド中のネガティブセンスRNAを鋳型として用いて、Ｌタンパク質により転写が始まる。ウイルスのRNA合成は、翻訳の間にモノシストロン性mRNAを生成するように調節される。
【００１２】
ウイルスゲノムの複製は、マイナス鎖RNAウイルスによる感染において、転写に続く第二の必須な事象である。他のマイナス鎖RNAウイルスと同じく、ニューキャッスル病ウイルス（NDV）におけるウイルスゲノムの複製は、ウイルス特異的タンパク質によって仲介される。複製RNA合成の最初の産物は、NDVゲノムRNAの相補的コピー（つまり、正の極性）(cRNA）である。これらのプラス鎖コピー(アンチゲノム)は、プラス鎖mRNA転写物とはそれらの末端の構造に相違がある。mRNA転写物とは異なり、アンチゲノムcRNAは、5'末端にキャッピングおよびメチル化を受け、3'末端では末端切断およびポリアデニル化を受ける。該cRNAは、そのマイナス鎖鋳型と末端が同じ（coterminal）であり、相補型のゲノムRNAセグメントのそれぞれのゲノム情報を全て含む。該cRNAはNDVマイナス鎖ウイルスゲノム(vRNA)の合成に対する鋳型として作用する。
【００１３】
NDVマイナス鎖ゲノム(vRNA)およびアンチゲノム(cRNA)の双方とも、ヌクレオキャプシドタンパク質により、キャプシド形成を受ける；つまり、キャプシド形成していないRNA種だけがウイルスmRNAである。NDVにとっては、細胞質は、ウイルスRNA複製の場であると同時に、翻訳の場でもある。宿主細胞の細胞形質膜でウイルスの構成成分の集合が起こり、成熟ウイルスは出芽により放出される。
【００１４】
2.2.  マイナス鎖RNAウイルスの遺伝子操作
動物ウイルスのRNA依存性RNAポリメラーゼは、タンパク質構造および反応条件の多くの局面に関して広く研究されてきた。しかし、該ポリメラーゼにより最適の発現を促進する鋳型RNAのエレメントは、既存のウイルスRNA配列を用いて、推論による研究しかなされ得なかった。感染した細胞に見られる宿主がコードする多くのRNAの中から、ウイルスポリメラーゼが特定のウイルスRNAをどのようにして認識するのかということが分かっていないので、このプロモーター解析は興味深いものである。
【００１５】
プラスミドに由来するRNAをトランスフェクションによって細胞に導入すると、プラスセンスゲノムRNAを含む動物ウイルスを複製できる(例えば、Racanielloら、1981、Science 214: 916-919; Levisら、1986、Cell 44: 137-145)。ポリオウイルスの場合、精製したポリメラーゼはin vitroでの反応でゲノムRNAを複製し、このプラスセンスRNA調製物を細胞にトランスフェクトすると、感染する(Kaplanら、1985、Proc. Natl. Acad. Sci.USA 82:8424-8428)。しかし、RNAのホモポリマーがコピー可能になってからも(Wardら、1988、J.Virol. 62: 558-562)、ポリオウイルスがコードするポリメラーゼに対して転写プロモーターとして作用する鋳型エレメントは分かっていない。SP6転写物は、シンドビスウイルスゲノムについての欠陥干渉(DI)RNAのモデルを作製するのに使用されてきた。RNAが感染細胞に導入されると、複製され、パッケージングされる。シンドビスウイルスポリメラーゼによる認識およびウイルス粒子へのゲノムのパッケージングの双方を担うRNA配列は、ゲノムの5'末端の162ヌクレオチド(nt)および3'末端の19 ntの中にあることが示された(Levisら、1986、Cell 44: 137-145）。プラス鎖RNA植物ウイルスであるブロム−モザイクウイルス(BMV)の場合、SP６転写物を用いて、そのプロモーターが134 nt のtRNA様3'末端であると同定した(DreherおよびHall, 1988, J.Mol. Biol. 201:31-40)。ポリメラーゼの認識および合成は、配列および二次構造の特徴の双方に依存していることが示された(Dreherら、1984、Nature 311: 171-175)。
【００１６】
レプリカーゼを必要とする配列の研究には、ネガティブセンスRNAウイルスは手強かった。水疱性口内炎ウイルスの精製ポリメラーゼは、ウイルスに由来するリボ核タンパク質複合体（RNP)を鋳型として含む場合にのみ、転写活性を有する(DeおよびBanerjee、1985、Biochem. Biophys. Res. Commun. 126: 40-49; EmersonおよびYu、1975、J.Virol. 15: 1348-1356; NaitoおよびIshihama、1976、J.Biol.Chem. 251:4307-4314)。インフルエンザウイルスに関しては、ウイルスから精製した裸のRNAを用いてRNPを再構築したと報告された。ウイルスのヌクレオキャプシドおよびポリメラーゼタンパク質は、ゲルを用いて精製され、チオレドキシンを用いてウイルスRNA上で再生された(Szewczykら、1988、Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 85: 7907-7911)。しかし、これらの筆者らは、かかる調製物の活性がインフルエンザウイルスRNAに特異的であることは示さず、また、転写を促進するシグナルの解析も行わなかった。
【００１７】
最近になって、組換え逆遺伝子学的手法を用いるマイナス鎖RNAウイルスの回復が可能となった(Paleseら、米国特許第5,166,057号)。この手法は、最初、インフルエンザウイルスゲノムを遺伝子操作するのに適用されたが(Luytjesら、1989、Cell 59: 1107-1113; Enamiら、1990、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92: 11563-11567)、狂犬病ウイルス(Schnellら、1994、EMBO J. 13:4195-4203); RSウイルス(respiratory syncytial virus)(Collinsら、1991、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88: 9663-9667); およびセンダイウイルス(Parkら、1991、Proc.Natl.Acad.Sci. USA 88: 5537-5541; Katoら、1996、Genes Cell 1:569-579)を含む、広範なセグメント化および非セグメント化マイナス鎖RNAウイルスに適用することに成功した。しかし、この手法は、未だ、ニューキャッスル病ウイルスRNAゲノムには適用されていない。
【００１８】
３．発明の概要
本明細書に記載の組換えニューキャッスル病ウイルスRNA鋳型は、RNA依存性RNAポリメラーゼと一緒に使用して、異種遺伝子産物を適切な宿主細胞で発現させ、および/またウイルス粒子内の異種遺伝子をレスキューすることが可能である。一つの実施形態において、本発明は、インターフェロンおよび関連する経路を誘導する組換えニューキャッスル病ウイルスに関する。本発明は、ワクチン製剤における使用にとって、より好適な組換えウイルスを作り出す表現型(毒弱化した表現型および免疫原性の増大など)を導く改変を含む組換えニューキャッスル病ウイルスに関する。別の実施形態においては、本発明は、他のウイルス、病原体、細胞性遺伝子、腫瘍抗原などの遺伝子を含む異種遺伝子を含有する組換えニューキャッスル病ウイルスおよびウイルスベクターの遺伝子操作に関する。
【００１９】
別の実施形態では、本発明は、ワクチンとして利用するための組換えニューキャッスル病ウイルスおよびウイルスベクターの遺伝子操作に関する。本発明は、ヒトへの投与ならびに獣医学的な使用に適したワクチン製剤に関する。本発明のワクチンはネコやイヌを含むペット動物、キツネおよびアライグマを含む野生動物、ウマ、ウシ、ヒツジ、シチメンチョウ、およびニワトリを含む家畜および家禽に投与するために設計可能である。
【００２０】
さらに別の実施形態では、本発明は、突然変異型ニューキャッスル病ウイルス遺伝子をコードするように、またはニューキャッスル病ウイルスの異なる株に由来する遺伝子を組み合わせたものをコードするように、遺伝子操作された組換えニューキャッスル病ウイルスベクターおよびウイルスに関する。本発明のRNA鋳型は、DNA依存性RNAポリメラーゼを用いて適切なDNA配列を転写することにより調製する。得られたRNA鋳型は、負の極性を有し、ウイルスRNA合成装置が鋳型を認識できる適切な末端配列を含む。一方、ウイルスRNA合成装置が鋳型を認識できる適切な末端配列を含む正の極性のRNA鋳型も使用してよい。正の極性のRNA鋳型からの発現はDNA依存性RNAポリメラーゼによって認識されるプロモーターを有するプラスミドのトランスフェクションにより達成されうる。例えば、Ｔ７プロモーターの制御下にあるポジティブRNA鋳型をコードするプラスミドDNAはワクシニアウイルスＴ７系と組み合わせて使用できる。
【００２１】
二シストロン性mRNAを構築して、ウイルス配列の翻訳の内部開始を可能にし、通常の末端開始部位からの外来タンパク質をコードする配列を発現させることが可能であり、またその逆も可能である。あるいは、その転写単位に開始部位およびポリアデニル化部位を含有している内部転写単位から、外来タンパク質を発現させてもよい。他の実施形態では、得られる発現タンパク質が融合タンパク質になるように、外来遺伝子をNDV遺伝子内に挿入する。
【００２２】
本発明の組換え突然変異型ニューキャッスル病ウイルスRNA鋳型を、RNA依存性RNAポリメラーゼを発現する形質転換した細胞系をトランスフェクトするのに使用して、相補することができる。あるいは、適当なプロモーターから発現するプラスミドは、ウイルス特異的（キメラの）RNAのトランスフェクションに用いることができる。RNA依存性RNAポリメラーゼを提供するヘルパーウイルスを使用して、相補を達成することもできる。さらに、ニューキャッスル病ウイルスについての非ウイルス依存的な複製系についても記載する。ウイルスに特異的な複製および発現に必要なニューキャッスル病ウイルスタンパク質の最小のサブセットは、Ｌ、Ｐ、およびＮＰの３種のタンパク質であり、これらは、ワクシニアウイルスＴ７系によりプラスミドから発現され得る。さらに別の実施形態において、NDVゲノムのアンチゲノムコピーをコードするプラスミドを用いて、ウイルスゲノムを供給する場合、ウイルスに特異的な複製および発現に必要なニューキャッスル病ウイルスタンパク質の最小のサブセットは、ＬおよびＰタンパク質である。NDVゲノムのアンチゲノムコピーが転写される場合、ＮＰポリメラーゼタンパク質は最初に転写されるタンパク質であり、従って、さらにin transでＮＰポリメラーゼを提供する必要はない。
【００２３】
発現産物および/または得られるキメラビリオンはワクチン製剤への使用に有利であろう。本発明の発現産物およびキメラビリオンを遺伝子操作して、ウイルス抗原、腫瘍抗原および自己免疫性障害に関与する自己抗原を含む広範な病原体に対するワクチンを作製できる。特に、本発明のキメラビリオンを遺伝子操作して、抗HIVワクチンを作製できる。その場合、gp160由来の、および/またはHIVの内部タンパク質由来の免疫原性を有するポリペプチドを糖タンパク質であるＨＮタンパク質内へと遺伝子操作して、脊椎動物の液性および細胞性免疫応答の双方を誘起可能なワクチンを構築する。この目的のための組換えニューキャッスル病ウイルスの使用は、特に魅力あるものである。なぜならば、ニューキャッスル病ウイルスはヒトに対する病原性を持たないからである。腫瘍抗原を送達するための組換えニューキャッスル病ウイルスの使用は、該ウイルスの既知の抗腫瘍性および免疫増強特性を考えると、特に魅力的である。
【００２４】
3.1.  定義
本明細書で用いる以下の用語は、指示する意味を有するものである：
cRNA＝アンチゲノムRNA
HIV＝ヒト免疫不全ウイルス
Ｌ＝大型タンパク質
Ｍ＝マトリックスタンパク質（エンベロープの内側に並んでいる）
MDCK＝マディンダービー(Mardin Darby)イヌ腎臓細胞
MDBK＝マディンダービー(Mardin Darby)ウシ腎臓細胞
moi＝感染多重度
NA＝ノイラミニダーゼ（エンベロープ糖タンパク質）
NDV＝ニューキャッスル病ウイルス
NP＝核タンパク質（RNAと会合し、ポリメラーゼ活性に必須）
NS＝非構造タンパク質（機能は不明）
nt＝ヌクレオチド
PA、PB1、PB2＝RNA依存性RNAポリメラーゼ構成成分
RNP＝リボ核タンパク質
rRNP＝組換えRNP
vRNA＝ゲノムウイルスRNA
WSN＝インフルエンザA/WSN/33ウイルス
WSN-HKウイルス；WSNウイルス由来の７つの遺伝子およびインフルエンザA/HK/8/
68ウイルス由来のNA遺伝子を含む再構成（reassortment)したウイルス
【００２５】
４．図面の簡単な説明
（図面の簡単な説明については下記参照）
【００２６】
５．詳細な説明
本発明は、異種遺伝子、または突然変異型ニューキャッスル病ウイルス遺伝子、または異なるニューキャッスル病ウイルスの株に由来するウイルス遺伝子の組み合わせを発現する、遺伝子工学的に操作されたニューキャッスル病ウイルス、およびウイルスベクターに関する。本発明は、ウイルスRNA依存性RNAポリメラーゼと共に使用して、好適な宿主細胞において異種遺伝子産物を発現し、および/またはウイルス粒子内での異種遺伝子をレスキューすることが可能な組換えマイナス鎖NDVウイルスRNA鋳型の構築および使用に関する。本発明の特定の実施形態においては、異種遺伝子産物は、ヒト免疫不全ウイルスのゲノム由来のペプチドまたはタンパク質である。本発明のRNA鋳型は、バクテリオファージT7、T3、SP6ポリメラーゼ、またはポリメラーゼIのような真核生物ポリメラーゼなどのDNA依存性RNAポリメラーゼを用いて、適当なDNA配列をin vitroまたはin vivoのいずれかにおいて転写することにより調製しうる。
【００２７】
組換えRNA鋳型を使用して、補足を可能にするRNA依存性RNAポリメラーゼタンパク質を発現する連続的な/トランスフェクトした細胞系にトランスフェクトしてもよい。これは、NDV-CL(California strain/11914/1944様の株）（Meindlら、1974、Virology 58: 457-463)RNAの5'末端および3'末端のヌクレオチドに隣接したクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)遺伝子のコード領域（ネガティブセンス方向）を含むクローン化したDNAのRNA転写物をNDVポリメラーゼタンパク質を発現する細胞にトランスフェクトした実施例に示す通りである。好ましい実施形態では、非ウイルス依存的な複製系を使用して、キメラNDVを回復する。この場合においては、以下に記載する実施例によって示されるとおり、NDVゲノムまたはアンチゲノムをコードするプラスミドDNAをウイルスに特異的な複製および発現に必要なニューキャッスル病ウイルスタンパク質の最小部分集合をコードするプラスミドDNAとともに共発現する。
【００２８】
in vivoでNDVを再構築する能力は、外来遺伝子を発現するか、または突然変異NDV遺伝子を発現する、新規のキメラNDVウイルスの設計を可能にする。in vivoでNDVを再構築する能力はまた、NDVの異なる株に由来する遺伝子を発現する新規のキメラNDVの設計も可能にする。この目的を達成する一つの方法は、既存のNDV遺伝子の改変を含む。例えば、ＨＮ遺伝子を改変して、細胞外ドメインに外来配列を含ませてよい。異種配列が病原体のエピトープまたは抗原である場合、これらのキメラウイルスを使用して、これらの決定基が由来する病原体に対する防御免疫応答を誘導することが可能である。
【００２９】
本発明に従って、ヒト免疫不全ウイルスのgp160コード領域に由来するコード配列をNDVのＨＮコード配列に挿入してキメラRNAを構築し、そして、このキメラRNAセグメントを野生型NDVを感染させた宿主細胞にトランスフェクションしてキメラウイルスを作製する。さらに、このようなキメラウイルスは、脊椎動物の体液性および細胞性免疫応答の双方を誘起できる。さらに、本発明は、組換えまたはキメラNDVウイルスによるインターフェロンおよび関連する経路の誘導にも関する。
【００３０】
本発明は、広範なウイルス、および/または腫瘍抗原を含む抗原に対するワクチンを製剤化するための、本発明のウイルスベクターおよびキメラウイルスの使用に関する。本発明のウイルスベクターおよびキメラウイルスを用いて、体液性免疫応答、細胞性免疫応答を刺激することにより、または抗原に対する耐性を刺激することによって、対象となる免疫系を調節できる。本明細書で用いる場合、対象とは、ヒト、霊長類、馬、牛、羊、豚、山羊、犬、ネコ、鳥類種、および齧歯類を意味する。腫瘍抗原を送達する場合、本発明は、非固形腫瘍または小さな固形腫瘍のような免疫が介在する拒絶反応に影響され易い疾患を有する対象の処置に使用されうる。本明細書に記載のウイルスベクターおよびキメラウイルスによる腫瘍抗原の送達は、大きな固形腫瘍の摘出後の処置に有用であることも考えられる。本発明は、また、癌があると疑われる対象の処置にも有用であろう。
【００３１】
本発明は、制限するのではなく、単に記載の目的のために、(a)組換えRNA鋳型の構築、(b)組換えRNA鋳型を用いる異種遺伝子産物の発現、および(c)組換え型ウイルス粒子における該異種遺伝子のレスキュー：の段階に分け得る。考察を明確にするために、本発明を、NDV-CL(California strain/11914/1944 様の株）を用いる実施例において説明するが、NDVの任意の株を利用してよい。
【００３２】
5.1.  組換えRNA鋳型の構築
本発明の特定の実施形態とは、NDVのネガティブセンスゲノムRNAの5'および3'末端の正確なヌクレオチド配列を本発明者らが同定したことである。図５に示すように、本発明のNDVネガティブセンスゲノムRNAの5'および3'末端のヌクレオチド配列は、以前に開示されたNDVの3'末端配列とは有意に相違する。NDVの5'および3'末端の正確なヌクレオチド配列の同定により初めて、組換えNDV RNA鋳型の遺伝子工学的操作、組換えRNA鋳型の発現、および組換えNDV粒子のレスキューが可能となる。本発明は、図５に示したヌクレオチド配列を有する5'および3'末端を包含するだけでなく、野生型の末端の機能（つまり、鋳型を認識するウイルスRNA合成装置に必要なシグナル）を維持している該末端のあらゆる改変または突然変異、またはその断片のあらゆるものをも包含する。
【００３３】
ウイルスポリメラーゼ結合部位/プロモーターの補足物（例えば、本発明の3'-NDVウイルス末端の補足物、または3'-および5'-NDVウイルス末端の双方の補足物）に隣接する異種遺伝子コード配列を、当技術分野で周知の技術を用いて構築してもよい。得られるRNA鋳型は負の極性であってよく、ウイルスのRNA合成装置が鋳型を認識できるようにする適当な末端配列を含みうる。あるいはまた、ウイルスのRNA合成装置が鋳型を認識できるようにする適当な末端配列を含む正の極性のRNA鋳型も使用してよい。これらのハイブリッド配列を含む組換えDNA分子は、クローン化でき、バクテリオファージT7、T3、SP6ポリメラーゼ、またはポリメラーゼIなどの真核生物ポリメラーゼのようなDNA依存性RNAポリメラーゼによる転写が可能であり、ウイルスポリメラーゼの認識および活性化を可能にする適当なウイルス配列を有する組換えRNA鋳型をin vitroまたはin vivoで作製することができる。
【００３４】
さらに別の実施形態では、事実上あらゆる異種配列を本発明のキメラウイルスの中に構築できる。該異種配列には、限定するものではないが、１）病原体に特徴的な抗原；２）自己免疫疾患に特徴的な抗原；３）アレルゲンに特徴的な抗原；および４）腫瘍に特徴的な抗原、などを含む。例えば、本発明のキメラウイルスの中に操作して入れることが可能な異種遺伝子配列は、少数であるが名を挙げると、gp160のようなヒト免疫不全ウイルス(HIV)のエピトープ；Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（HBsAg)；ヘルペスウイルスの糖タンパク質（例えば、gD、gE）；ポリオウイルスのVP1；およびバクテリアおよび寄生虫のような非ウイルス性の病原体の抗原決定基などを含むが、これらに限定しない。
【００３５】
糖尿病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、悪性貧血、アジソン病、強皮症、自己免疫性萎縮性胃炎、若年性糖尿病、ジスコールドエリテマトーデス（discold lupus erythromatosus）などに特徴的な抗原を含む、自己免疫疾患に特徴的な抗原は、典型的には哺乳動物の細胞表面、細胞質、核、ミトコンドリア、組織などに由来するであろう。
【００３６】
花粉症、ほこり、カビ、胞子、ふけ、虫、および食物に由来する抗原を含む、アレルゲンとなる抗原は、一般的にタンパク質または糖タンパク質である。
【００３７】
腫瘍抗原に特徴的な抗原は、典型的に、腫瘍組織の細胞の細胞表面、細胞質、核、細胞小器官などに由来するであろう。例としては、突然変異した癌遺伝子にコードされるタンパク質、腫瘍関連ウイルスタンパク質、および糖タンパク質を含む、腫瘍タンパク質に特徴的な抗原が挙げられる。腫瘍は、口唇、鼻咽頭、咽頭および口腔、食道、胃、結腸、直腸、肝臓、胆嚢、膵臓、喉頭、肺および気管支、皮膚の黒色腫、乳房、子宮頚部、子宮（uterine)、卵巣、膀胱、腎臓、子宮(uterus)、脳および神経系の他の部位、甲状腺、前立腺、精巣、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫および白血病などの種類の癌に由来する腫瘍を含むが、これらに限定するものではない。
【００３８】
本発明の一つの特殊な実施形態においては、異種配列はヒト免疫不全ウイルス(HIV)のゲノムに由来し、好ましくは、ヒト免疫不全ウイルス-1またはヒト免疫不全ウイルス-2のゲノムに由来する。本発明の他の実施形態では、異種コード配列をNDV遺伝子のコード配列内に挿入して、NDVウイルスタンパク質内の異種ペプチド配列を含むキメラ遺伝子産物を発現させ得る。また本発明のこのような実施形態において、異種配列は、ヒト免疫不全ウイルスのゲノム、好ましくは、ヒト免疫不全ウイルス-1またはヒト免疫不全ウイルス-2のゲノムに由来してもよい。
【００３９】
異種配列がHIVに由来する場合には、このような配列は、env 遺伝子（つまりgp160、gp120、および/またはgp41の全てまたは一部をコードする配列）、pol 遺伝子（つまり、逆転写酵素、エンドヌクレアーゼ、プロテアーゼ、および/または、インテグラーゼの全てまたは一部をコードする配列）、gag 遺伝子（つまり、p7、p6、p55、p17/18、p24/25の全てまたは一部をコードする配列）、tat、rev、nef、vif、vpu、vpr、および/またはvpxに由来する配列を含むが、これらに限定はしない。
【００４０】
さらに他の実施形態では、キメラウイルス内へ操作可能な異種遺伝子配列は、免疫増強活性を有するタンパク質をコードする配列を含む。免疫増強性タンパク質の例としては、限定するものではないが、サイトカイン、１型インターフェロン、γインターフェロン、コロニー刺激因子、インターロイキン-1、-2、-4、-5、-6、-12が挙げられる。
【００４１】
これらのハイブリッド分子を構築する一つの手法は、NDV遺伝子のDNA補足物中に異種コード配列を、該異種配列がウイルスポリメラーゼ活性に必要なウイルス配列（つまり、ウイルスポリメラーゼ結合部位/プロモーター（以下ウイルスポリメラーゼ結合部位という）、およびポリアデニル化部位）に隣接するように挿入することである。好ましい実施形態においては、異種コード配列は、5'および3'末端の複製プロモーター、遺伝子の開始配列および遺伝子の終止配列、および5'および/または3'末端に見られるパッケージングシグナルを含むウイルス配列に隣接している。別の手法においては、ウイルスポリメラーゼ結合部位をコードするオリゴヌクレオチド、（例えば、ウイルスゲノムセグメントの3'末端または両端の補足物）を異種コード配列に連結し、ハイブリッド分子を構築する。以前は、標的配列内の外来遺伝子または外来遺伝子のセグメントの位置は、該標的配列内の適切な制限酵素部位の存在によって決められていた。しかし、分子生物学の最近の進歩により、この問題は大幅に小さくなった。制限酵素部位は、部位特異的突然変異誘発を利用して、標的配列内の任意の場所に容易に配置できる(例えば、Kunkel、1985、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82;488に記載の技術を参照のこと)。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術の変法(後述)によっても、配列（つまり、制限酵素部位）を特異的に挿入することが可能であり、また、ハイブリッド分子の容易な構築が可能である。あるいはまた、PCR反応を用いて、クローニングを必要とせずに、組換え型の鋳型を調製することが可能であろう。例えば、PCR反応を使って、DNA依存性RNAポリメラーゼプロモーター(例えば、バクテリオファージＴ３、Ｔ７、ＳＰ６)、および、異種遺伝子とNDVポリメラーゼ結合部位を含むハイブリッド配列を含む、２本鎖DNA分子の調製が可能である。続いて、この組換えDNAから直接RNA鋳型を転写できる。さらに他の実施形態では、RNAリガーゼを用いて、異種遺伝子の負の極性を特定するRNAとウイルスポリメラーゼ結合部位を連結することによって、組換えRNA鋳型をを調製してもよい。ウイルスポリメラーゼ活性に必要な配列、および本発明で用いられる構築物については、以下の小節に記載する。
【００４２】
5.1.1.  ＨＮ、Ｐ、ＮＰ、Ｍ、Ｆ、Ｌ遺伝子への異種遺伝子配列の挿入
ＨＮ、Ｐ、ＮＰ、Ｍ、Ｆ、またはＬタンパク質をコードする遺伝子セグメントは異種遺伝子産物の挿入に使用できる。これらのセグメントのいずれかへの外来遺伝子配列の挿入は、ウイルスのコード領域を外来遺伝子と完全に置換するか、または部分的に置換することにより達成できる。完全に置換するには、PCRにより指定される突然変異誘発（PCR-directed mutagenesis)を用いて行うのが、おそらく最良であろう。簡単に説明すると、PCRプライマーAは、5'から3'末端へ：クラスIIS制限酵素の部位のような、ユニークな（稀にしかない）制限酵素（言い換えれば、特異配列を認識するが、その配列の上流または下流でDNAを切断する「シフター酵素」）の部位； NDV遺伝子の領域に相補的な一続きのヌクレオチド；および外来遺伝子産物のカルボキシ末端コード部分に相補的な一続きのヌクレオチドを含む。PCRプライマーＢは、5'から3'末端へ：ユニークな制限酵素部位； NDV遺伝子に相補的な一続きのヌクレオチド；および外来遺伝子の5'コード部分に相当する一続きのヌクレオチドを含む。これらのプライマーを外来遺伝子のクローン化したコピーと共に用いるPCR反応の後、その産物を、ユニークな制限部位を用いて、切り出して、クローン化できる。クラスIIS制限酵素を用いて消化し、および精製ファージポリメラーゼを用いて転写することにより、外来遺伝子が挿入されているNDV遺伝子の正確な非翻訳末端を含むRNA分子が得られるであろう。別の実施形態においては、PCR開始反応を用いて、バクテリオファージプロモーター配列、およびハイブリッド遺伝子配列を含む二本鎖DNAを調製でき、RNA鋳型をクローニングせずに転写できる。
【００４３】
5.1.2  ＨＮ遺伝子への異種遺伝子配列の挿入
NDVのヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼ活性は、単一遺伝子、ＨＮにコードされている。ＨＮタンパク質は、ウイルスの主要な表面糖タンパク質である。多くのウイルス（インフルエンザなど）において、ヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼタンパク質は数多くの抗原部位を含むことが示された。従って、該タンパク質は、感染後の体液性免疫応答における潜在的な標的となる。それ故、ＨＮ内の抗原部位を外来タンパク質の一部分と置き換えることで、この外来ペプチドに対する旺盛な体液性応答を得ることができる。ある配列がＨＮ分子に挿入されて、ＨＮの外側表面に発現すると、免疫原性を有するであろう。例えば、HIVのgp160に由来するペプチドをＨＮタンパク質の抗原部位に配置すると、その結果として双方が体液性免疫を誘発する。別の手法では、ウイルス配列を全く欠失させることなく、外来ペプチド配列の抗原部位内への挿入が可能である。このような構築物の発現産物は、外来抗原に対するワクチンにおいて有用であるだろうし、実際、以前に議論されていた、ワクチン接種した宿主内での組換えウイルスの増殖に関する問題を回避できる。抗原部位にのみ置換物を含んでいる完全なＨＮ分子は、ＨＮの機能を果たしうるので、生存能力のあるウイルスの構築を可能とする。従って、該ウイルスは、別途のヘルパー機能を必要としないで、増殖できる。該ウイルスは、あらゆる偶発的な漏出の危険性を避けるために、他の手段により、弱毒化することも可能である。
【００４４】
他のハイブリッド構築物を、タンパク質を細胞表面に発現するように、またはタンパク質を細胞から放出できるように作製しうる。なぜならば、表面性糖タンパク質であるＨＮは、細胞表面への輸送に必要なアミノ末端の切断可能なシグナル配列、および膜での固定化（anchoring)に必要なカルボキシ末端配列を有しているからである。細胞表面に完全な形の外来タンパク質を発現させるには、これらのＨＮシグナルを用いてハイブリッドタンパク質を作製する必要がある場合がある。このような場合、該融合タンパク質は、別々の融合タンパク質として、他の内在性プロモーターによって発現されうる。あるいはまた、輸送シグナルのみが存在し、膜固定化ドメインがない場合、そのタンパク質は、細胞から分泌される。
【００４５】
5.1.3.  ２つのシストロンを有するRNAの構築および異種タンパク質の発現
ウイルス配列の翻訳の内部開始を可能にし、通常の末端にある開始部位から外来タンパク質コード配列を発現するための、２つのシストロンを有するmRNAを構築できるだろう。あるいはまた、ウイルス配列は通常の末端オープンリーディングフレームから翻訳され、一方、外来配列は内部の部位から始まるような、２つのシストロンを有するmRNA配列を構築してもよい。特定の内部リボソーム開始部位(IRES)配列を使ってよい。選択されるIRES配列は、ニューキャッスル病ウイルスのパッケージングの制限により妨害されないように、十分に短いものでなければならない。従って、このような２つのシストロンを用いる手法のために選択されるIRESは、長さが500ヌクレオチド以下であることが好ましく、250ヌクレオチドより小さいものが、より好ましい。さらに、用いるIRESが、ピコナウイルスの構成要素と、配列が共通ではなく、構造的に相同性のないことが好ましい。好ましいIRES構成要素は、限定はしないが、哺乳動物のBiP IRESおよびＣ型肝炎ウイルスのIRESを含む。
【００４６】
あるいはまた、外来タンパク質は、新しい内在性転写ユニットから発現でき、その場合、該転写ユニットは開始部位とポリアデニル化部位を有している。他の実施例では、得られる発現タンパク質が融合タンパク質になるように、外来遺伝子をNDV遺伝子に挿入する。
【００４７】
5.2.  組換えRNA鋳型を用いた異種遺伝子産物の発現
上述の通りに調製した組換え鋳型は、適切な宿主細胞で異種遺伝子産物を発現するための、または、異種遺伝子産物を発現するキメラウイルスを作製するための、さまざまな方法に利用できる。一つの実施形態では、組換え鋳型を用いて、適切な宿主細胞にトランスフェクトでき、異種遺伝子産物の高レベルな発現が導かれうる。高レベルの発現を提供する宿主細胞系は、NDVに重感染した細胞系のようなウイルス機能を提供する連続的な細胞系、NDVの機能を補足するように操作された細胞系などを含む。
【００４８】
本発明の他の実施形態では、異種遺伝子産物の発現を達成するために、組換え鋳型を用いて、ウイルスポリメラーゼタンパク質を発現する細胞系にトランスフェクトしてよい。この目的のために、Ｌタンパク質などのポリメラーゼタンパク質を発現する形質転換した細胞系を、適切な宿主細胞として用いてよい。宿主細胞を、ＮＰまたはＨＮなどの他のウイルス機能、またはさらなる機能を提供するように操作できる。
【００４９】
他の実施形態では、異種遺伝子産物の発現を達成するために、ヘルパーウイルスが、細胞が利用するRNAポリメラーゼタンパク質を提供することも可能である。
【００５０】
さらに他の実施形態では、ＮＰ、Ｐ、およびＬタンパク質などのウイルスタンパク質をコードするベクターで細胞をトランスフェクトできる。このようなベクターの例は図２Ａ〜２Ｃに示しておく。
【００５１】
5.3.  キメラマイナス鎖RNAウイルスの調製
キメラウイルスを調製するために、プラスセンスまたはマイナスセンスにNDVゲノムおよび/または外来タンパク質をコードする改変したNDVウイルスRNA、cDNAまたはRNAを用いて、複製およびレスキューに必要なウイルスタンパク質および機能を提供する細胞、または「親株」のNDVにも感染している細胞を、トランスフェクトしてよい。ほかの手法では、ゲノムまたはアンチゲノムNDV RNAをコードするプラスミド(野生型または改変型のいずれでも良い)を、ウイルスポリメラーゼタンパク質、（例えば、ＮＰ、ＰまたはＬ）をコードするプラスミドとともに、宿主細胞に共トランスフェクトしてもよい。他の実施形態では、アンチゲノムNDV RNAをコードするプラスミドは、ウイルスポリメラーゼタンパク質であるＰおよびＬをコードするプラスミドと共トランスフェクトしてよい。なぜなら、ＮＰポリメラーゼタンパク質はNDVゲノムのアンチゲノムコピーによって最初に翻訳されるので、ＮＰポリメラーゼをin transで付加的に提供する必要はない。
【００５２】
本発明のある実施形態では、逆遺伝学的技術を利用して、キメラマイナス鎖RNAウイルスを操作することも可能である。この技術は、ウイルスポリメラーゼによる認識、および成熟ウイルス粒子の産生のために必須であるパッケージングシグナルに不可欠なマイナス鎖ウイルスRNAの非コード領域を含む、合成組換えウイルスRNAの調製を包含する。合成組換えプラスミドDNAおよびRNAは、１９９２年１１月２４日に公開の米国特許5,166,057号；１９９８年１２月２９日に公開の米国特許5,854,037号；１９９６年２月２０日に公開された欧州特許公開EP 0702085A1；米国特許仮出願番号第09/152,845号；１９９７年４月３日に公開された国際特許公開PCT WO97/12032；１９９６年に１１月７日に公開されたWO 96/34625；欧州特許公開  EP-A780475；１９９９年１月２１日に公開されたWO 99/02657；１９９８年１１月２６日に公開されたWO98／53078；１９９８年１月２２日に公開されたWO98/02530；１９９９年４月１日に公開されたWO 99/15672；１９９８年４月２日に公開されたWO 98/13501；１９９７年２月２０日に公開されたWO 97/06270；１９９７年６月２５日に公開されたEPO 780 47SA1（それぞれは、全文を参照により本明細書に組み込む。）に記載の、当技術分野で公知の方法のいずれかによって、感染性ウイルス粒子の中で複製およびレスキューされる。
【００５３】
多くの異なった手法を用いて、マイナス鎖RNAウイルスをレスキューするために逆遺伝学的手法を適用できる。まず第一に、組換えRNAは組換えDNA鋳型から合成され、in vitroで精製ウイルスポリメラーゼ複合体と再構成されて、細胞をトランスフェクトするために使用できる組換えリボヌクレオタンパク質（RNP）を形成する。別の手法において、合成RNAをin vitroまたはin vivoのいずれかで転写する際にウイルスポリメラーゼタンパク質が存在する場合、より効率的なトランスフェクションが達成される。この手法を用いることで、合成RNAはcDNAプラスミドから翻訳されうる。cDNAプラスミドは、in vitroで、ポリメラーゼタンパク質をコードするcDNAプラスミドと一緒に転写されるか、またはポリメラーゼタンパク質の存在下で(すなわち、一過性または恒常的にポリメラーゼタンパク質を発現する細胞中で)in vivoで転写されてもよい。
【００５４】
別の実施形態では、逆遺伝学的技術と再構成（reassortant）技術を組み合わせて用いることにより、セグメント化したRNAウイルス中に所望のエピトープを有する弱毒化ウイルスを操作できる。例えば、弱毒化ウイルス（（自然淘汰、突然変異誘発または逆遺伝学的技術によって生じる）および、所望のワクチンエピトープを担持する株（自然淘汰、突然変異誘発または逆遺伝学的技術によって生じる）を、セグメント化したゲノムの再構成を可能にする宿主に共感染させてよい。その後、弱毒化された表現型および所望のエピトープの双方を提示する再構成体が選択されうる。
【００５５】
再構成に続いて、新しいウイルスが単離でき、そのゲノムをハイブリダイゼーション分析により同定できる。本明細書に記載のさらなる手法においては、感染性キメラウイルスの産生は、NDVウイルスポリメラーゼタンパク質を発現する宿主細胞系(例えば、ウイルス/宿主細胞発現系；ポリメラーゼタンパク質を発現するように操作された形質転換した細胞系など)で複製可能であり、そうすると、感染性キメラウイルスがレスキューされる。この例においては、ヘルパーウイルスは必要でない。なぜならば、発現されるウイルスポリメラーゼタンパク質によりこの機能が提供されるからである。
【００５６】
本発明において、当技術分野の当業者に周知の技術を用いて、キメラウイルスの複製とレスキューが達成できる。ある手法は、宿主細胞をトランスフェクトする前に、in vitroでの複製に必要なウイルスタンパク質および機能を供給することを含む。このような実施形態において、野生型ウイルス、ヘルパーウイルス、精製ウイルスタンパク質、または組換えにより発現したウイルスタンパク質の形で、ウイルスタンパク質が供給される。該ウイルスタンパク質は、キメラウイルスをコードする合成cDNAまたはRNAの転写の前、あるいは転写の際、または転写後に供給されうる。該混合物全体を宿主細胞へのトランスフェクトに用いてよい。他の手法では、複製に必要なウイルスタンパク質および機能は、キメラウイルスをコードする合成cDNAまたはRNAの転写の前、あるいは転写の際に供給されうる。このような実施形態において、野生型ウイルス、ヘルパーウイルス、ウイルス抽出物、ウイルスタンパク質を発現する合成cDNAまたはRNAの形で、複製に必要なウイルスタンパク質および機能が供給されて、感染またはトランスフェクションにより宿主細胞に導入される。この感染/トランスフェクションは、キメラウイルスをコードする合成cDNAまたはRNAの導入の前、または導入と同時に行う。
【００５７】
特に望ましい手法では、NDVウイルス遺伝子の全てを発現するように操作された細胞は、所望の遺伝子型を含む感染性キメラウイルスの産生を可能とし、従って選択システムを不要とする。理論的には、NDVの６個の遺伝子のいずれか、または該６個の遺伝子のいずれか一つの一部分を、外来配列と置換することが可能である。しかし、不完全なウイルス（正常のウイルス遺伝子産物が欠損しているか、または改変されているため、不完全である）を増殖させる能力が、この理論には不可欠な側面である。この問題を回避するための多くの可能な手法がある。一つの手法は、ある突然変異タンパク質を有するウイルスは、その同じタンパク質の野生型を恒常的に発現するように構築した細胞系内では増殖可能である。このようにして、細胞系がウイルスの突然変異を補足する。同様の技術を用いて、NDV遺伝子のいずれかを恒常的に発現する形質転換した細胞系を構築してもよい。これらの、ウイルスタンパク質を発現するように作成された細胞系を用いて組換えウイルスにおける欠損を補足して、該ウイルスを増殖できる。あるいはまた、特定の天然の宿主域の系を、組換えウイルスを増殖させるために利用することも可能である。
【００５８】
さらに他の実施形態においては、複製に必要なウイルスタンパク質および機能は、合成cDNAまたはRNAの形で遺伝物質として提供されて、キメラウイルスをコードする合成cDNAまたはRNAとともに転写されうる。特に望ましい手法においては、実施例に記載の通り（上述の第11節を参照のこと）、キメラウイルス、ならびにウイルスポリメラーゼおよび/または他のウイルス機能を発現するプラスミドを宿主細胞に共トランスフェクトする。
【００５９】
組換えウイルスを増殖させる他の手法は、野生型ウイルスとの共培養を含む。該手法は、単純に、組換えウイルスを得て、それと他の野生型ウイルス（好ましくはワクチンの株）を細胞に共感染させるだけでよい。該野生型ウイルスは、欠損したウイルス遺伝子産物を補足し、野生型および組換え型ウイルスの双方を増殖させねばならない。あるいは、組換えウイルスの増殖を助けるために、ヘルパーウイルスを用いてもよい。
【００６０】
もう一つの手法においては、合成した鋳型は、NDVウイルスポリメラーゼタンパク質を発現する組換えウイルスに共感染した細胞内で複製できる。実際、この方法を使用して、本発明の組換え感染性ウイルスをレスキューできる。この目的のために、NDVポリメラーゼタンパク質を、ウイルス発現ベクター（例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、バキュロウイルスなど）、またはポリメラーゼタンパク質を発現する細胞系（例えば、Krystalら、1986、Proc. Natl. Acad. Sci.USA 83:2709-2713） を含む（しかし、限定するわけではない）いずれかの発現ベクター/宿主細胞系において発現させ得る。さらに、６種のNDVタンパク質の全てを発現する宿主細胞への感染により、感染性キメラウイルス粒子を産生することができる。この系においては、産生される全ての組換えウイルスが所望の遺伝子型を有しているため、選択システムの必要性を省けるであろう。ウイルスの生存可能性を改変することなく、組換えウイルスを構築できることは、注目されるべきである。さらに、これらの改変ウイルスは、増殖可能であり、複製にヘルパー機能を必要としない。
【００６１】
5.4.  キメラウイルスを用いたワクチン製剤
本発明は、本発明の遺伝子操作したマイナス鎖RNAウイルスを含有するワクチン製剤を包含する。本発明は、NDV感染症に対してL防御を与えるように改変された組換えNDVウイルスのワクチン製剤における使用を包含する。他の実施形態においては、本発明の組換えNDVウイルスを、種々の病原体の任意のものに対する防御応答を誘導する外来エピトープを発現するためのビヒクルとして使用し得る。
【００６２】
本発明は、ヒトおよび動物に投与するワクチン製剤を包含する。特に本発明は、家庭用動物（イヌおよびネコなど）、野生動物（キツネおよびアライグマなど）、家畜類（ウシ、ウマおよびブタ、ヒツジおよびヤギなど）、ならびに家禽（ニワトリおよびシチメンチョウなど）に投与するワクチン製剤を包含する。
【００６３】
本発明は、NDV、マレク病ウイルス（MDV）、伝染性ファルビキウス病ウイルス（IBDV）、伝染性気管支炎ウイルス（IBV）、伝染性滑液包炎ウイルス、ニワトリ貧血ウイルス（CAV）、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ILV）、トリ白血症ウイルス（ALV）、細網内皮症ウイルス（RV）、およびトリインフルエンザウイルスを含む鳥類疾患を引き起こす因子に対して有用なワクチン製剤を包含する。
【００６４】
他の実施形態において、本発明は、狂犬病ウイルス、ネコ白血病ウイルス（FLV）およびイヌジステンパーウイルスを含む家畜病（domestic disease）を引き起こす因子に対し有用なワクチン製剤を包含する。さらに他の実施形態においては、本発明は、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、牛疫ウイルス、豚痘ウイルスに対する家畜類の防御に有用なワクチン製剤、およびさらに狂犬病ウイルスに対する野生動物の防御に有用なワクチン製剤を包含する。
【００６５】
逆方向遺伝学的アプローチにより作製された弱毒化ウイルスを本明細書に記載するワクチンおよび医薬製剤に使用し得る。また逆方向遺伝学的手法を使用して、ワクチン製造に重要な他のウイルス遺伝子にさらに突然変異を遺伝子操作し得る。すなわち、有用なワクチン株変異体のエピトープを弱毒化ウイルス中に遺伝子操作しうる。あるいは、完全に外来のエピトープ、例えば他のウイルス病原体または非ウイルス病原体に由来する抗原を弱毒化株中に遺伝子操作し得る。例えば、HIV（gp160、gp120、gp41）などの関係の無いウイルスの抗原、寄生生物（マラリアなど）の抗原、細菌もしくは真菌の抗原または腫瘍抗原を弱毒化株中に遺伝子操作し得る。あるいは、ウイルス親和性をin vivoにて改変するエピトープを本発明のキメラ弱毒化ウイルス中に遺伝子操作し得る。
【００６６】
実際には、任意の異種遺伝子配列をワクチンに使用するための本発明のキメラウイルス中に構築し得る。好ましくは、種々の病原体、または中和抗体に結合する抗原のいずれかに対して防御免疫応答を誘導するエピトープを、キメラウイルスにより、またはその一部として発現させ得る。例えば、本発明のキメラウイルス中に構築し得る異種遺伝子配列には、限定するものではないが、インフルエンザ糖タンパク質、特に、赤血球凝集素H5、H7、マレク病ウイルスのエピトープ；伝染性ファルビキウス病ウイルス（IBDV）、伝染性気管支炎ウイルス（IBV）、ニワトリ貧血ウイルス（CAV）、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ILV）、トリ白血症ウイルス（ALV）、細網内皮症ウイルス（RV）、トリインフルエンザウイルス（AIV）、狂犬病ウイルス、ネコ白血病ウイルス、イヌジステンパーウイルス、水疱性口内炎ウイルス、牛疫ウイルス、および豚痘ウイルスのエピトープが含まれる（Fieldsら(編)、1991, Fundamental Virology, 第2版, Raven Press, New Yorkを参照のこと。参照によりその全文を本明細書に組み入れる。）。
【００６７】
さらに他の実施形態において、キメラウイルス中に遺伝子操作し得る異種遺伝子配列には、免疫増強活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が含まれる。免疫増強タンパク質の例としては、限定するものではないが、サイトカイン、I型インターフェロン、γインターフェロン、コロニー刺激因子、インターロイキン-1、-2、-4、-5、-6、-12が含まれる。
【００６８】
さらに、ワクチンに使用するための本発明のキメラウイルス中に構築し得る異種遺伝子配列には、限定するものではないが、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、好ましくは1型または2型由来の配列が含まれる。好ましい実施形態においては、抗原の供与源となり得る免疫原性HIV由来のペプチドを、キメラNDV中に構築して、その後でそれを使用して脊椎動物の免疫応答を誘導し得る。かかるHIV由来のペプチドには、限定するものではないが、env遺伝子由来の配列（すなわち、gp160、gp120、および／もしくはgp41の全てもしくは一部をコードする配列）、pol遺伝子由来の配列（すなわち、逆転写酵素、エンドヌクレアーゼ、プロテアーゼ、および／もしくはインテグラーゼの全てもしくは一部をコードする配列）、gag遺伝子由来の配列（すなわち、p7、p6、p55、p17/18、p24/25の全てもしくは一部をコードする配列）、tat、rev、nef、vif、vpu、vpr、ならびに／またはvpxに由来する配列が含まれる。
【００６９】
他の異種配列は、いくつかを挙げると、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（HBsAg）；A型もしくはC型肝炎ウイルス表面抗原、エプスタイン-バーウイルスの糖タンパク質；ヒトパピローマウイルスの糖タンパク質；RSウイルス、パラインフルエンザウイルス、センダイウイルス、シミアンウイルス5もしくは流行性耳下腺炎ウイルスの糖タンパク質；インフルエンザウイルスの糖タンパク質；ヘルペスウイルスの糖タンパク質（例えばgD、gE）；ポリオウイルスのVP1；非ウイルス病原体（細菌および寄生生物など）の抗原決定基に由来し得る。他の実施形態においては、免疫グロブリン遺伝子の全てまたは一部を発現させ得る。例えば、かかるエピトープを模倣する抗イディオタイプ免疫グロブリンの可変領域を本発明のキメラウイルス中に構築し得る。
【００７０】
他の異種配列を腫瘍抗原から誘導し、得られたキメラウイルスを使用して腫瘍細胞に対する免疫応答を生じさせ、in vivoで腫瘍退縮をもたらし得る。これらのワクチンは、腫瘍治療のための他の治療処方計画と組み合わせて使用してもよい。かかる治療レジメンには、限定するものではないが、化学療法、放射線療法、外科手術、骨髄移植などが含まれる。本発明に従って組換えウイルスを、腫瘍関連抗原（TAA）を発現するように遺伝子操作し得る。該TAAには、限定するものではないが、T細胞により認識されるヒト腫瘍抗原（RobbinsおよびKawakami、1996, Curr. Opin. Immunol. 8: 628-636、参照によりその全文を本明細書に組み入れる）、メラニン細胞系統タンパク質（gp100、MART-1/MelanA、TRP-1(gp75)、チロシナーゼなど）、広く共有されている腫瘍特異的抗原（MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-1、N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ-V、p15など）、腫瘍特異的突然変異抗原（βカテニン、MUM-1、CDK4など）、ならびに乳癌、卵巣癌、頸癌、および膵癌の非メラノーマ抗原（HER-2/neu、ヒトパピローマウイルス-E6、-E7、MUC-1）が含まれる。
【００７１】
組換えウイルス生ワクチンまたは組換えウイルス不活化ワクチンのいずれかを製剤化し得る。宿主における操作により天然感染で生じるのと同種かつ同程度の持続性刺激がもたらされ、それゆえ実質的な長期持続性免疫を付与するので、生ワクチンが好ましい。かかる組換えウイルス生ワクチン製剤の製造は、慣例的方法を用いて達成し得るが、それには、細胞培養物中またはニワトリ胚の尿膜中でウイルスを増殖させ、続いて精製を行うことが含まれる。さらに、NDVがヒトにおいて非病原性であると示されているので、このウイルスは生ワクチンとしての使用に非常に適している。
【００７２】
上記の点に関して、ワクチン用途のための遺伝子操作したNDV（ベクター）の使用においては、これらの株に弱毒化特性あることが望ましい。トランスフェクションに使用する鋳型への適切な突然変異（例えば欠失）の導入によって、弱毒化特性を有する新規ウイルスが提供され得る。例えば、温度感受性または低温適応に関連する特定のミスセンス突然変異を欠失突然変異とし得る。これらの突然変異は、低温または温度感受性の突然変異体に関連する点突然変異よりも安定である必要があり、また復帰突然変異頻度が極めて低くなければならない。
【００７３】
あるいは、「自殺」特性を有するキメラウイルスを構築してもよい。かかるウイルスは、宿主内でほんの1もしくは数ラウンドの複製を行う。ワクチンとして使用する場合、該組換えウイルスは、制限された複製サイクルを経て、十分なレベルの免疫応答を誘導するが、ヒト宿主中ではそれ以上の複製サイクルを経て疾病を引き起こすことはない。1個以上のNDV遺伝子を欠損するまたは突然変異NDV遺伝子を有する組換えウイルスは、複製の連続的ラウンドを経ることができない。欠陥ウイルスは、かかる遺伝子を永久に発現する細胞系で産生させうる。必須遺伝子を欠損するウイルスは、これらの細胞系で複製するが、ヒト宿主に投与されると、複製のラウンドを完結することができない。かかる調製物は、この不全サイクルにおいて、免疫応答を誘導するのに十分な数の遺伝子を転写および翻訳し得る。あるいは、より多量の株を投与して、これらの調製物を不活化（死滅）ウイルスワクチンとして作用させてもよい。不活化ワクチンに関しては、異種遺伝子産物がビリオンと会合するように、異種遺伝子配列をウイルス成分として発現させるのが好ましい。かかる調製物の利点は、それらが天然タンパク質を含有し、ホルマリンまたは死滅ウイルスワクチンの製造に使用する他の薬剤による処理によって不活化を受けないことである。あるいは、cDNAから作製した突然変異NDVをほんの数ラウンドの複製を行うように、高度に弱毒化してもよい。
【００７４】
本発明のこの態様の他の実施形態においては、不活化ワクチン製剤を、キメラウイルスを「死滅」させるための慣例法を使用して調製し得る。不活化ワクチンは、それらの感染力が破壊されているという点で「死んでいる」。理想的には、ウイルスの感染力をその免疫原性に影響を及ぼすことなく破壊する。不活化ワクチンを調製するために、キメラウイルスを細胞培養物またはニワトリ胚の尿膜中で増殖させ、ゾーン超遠心分離法により精製し、ホルムアルデヒドまたはβ-プロピオラクトンにより不活化し、そしてプールする。得られたワクチンは通常筋肉内に接種する。
【００７５】
不活化ウイルスを、免疫応答を高めるために適切なアジュバンドと共に製剤化し得る。かかるアジュバントには、限定するものではないが、無機ゲル（水酸化アルミニウムなど）；界面活性物質（リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオンなど）；ペプチド；油乳剤；ならびに潜在的に有用なヒトアジュバント（BCGおよび挫瘡プロピオンバクテリウム(Corynebacterium parvum)など）が含まれ得る。
【００７６】
上述のワクチン製剤を導入するために多くの方法を使用することができ、これら方法には、限定するものではないが、経口、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、および鼻腔内経路が含まれる。ワクチン設計にかかる病原体の感染の自然経路によりキメラウイルスワクチン製剤を導入することが好ましい。
【００７７】
6.  実施例：組換えNDVによる外来遺伝子の発現およびパッケージング
NDVミニゲノムを用いたクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（CAT）の発現を記載する。NDVミニゲノムを、CAT遺伝子を含有する組換えプラスミドであるpNDVCATを用いて調製した。pNDVCATプラスミドは、配列中に、T7プロモーター、非コードNDV RNA配列の191ヌクレオチドを含むNDVゲノムRNAの5'末端、挿入された5ヌクレオチド （3'CTTAA）、逆方向および相補方向（complemented order）のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）遺伝子の完全コード配列、非コードNDV RNA配列の121ヌクレオチドを含むNDVゲノムRNA配列の3'末端、BbsIクローニング部位、ならびに鋳型のラン・オフ転写法を可能にするいくつかの制限部位を含む、pUC19プラスミドである。pNDVCATを、T7ポリメラーゼを用いて転写し、CAT遺伝子の付近に逆配向でニューキャッスル病ウイルスのセンスフランキング配列を有するRNAを作製し得る。
【００７８】
パラミクソウイルスRNAの長さは、RNA複製のレベルを決定する主要な因子であり、ゲノム複製は、ヌクレオチドの総数が6の倍数である場合に最も効率がよい。NDVに関しては、この6の法則が複製に重要であるかどうかの問題を、1〜5ヌクレオチドで異なるような種々の長さのCATミニレプリコンを作製することにより調べた。ゲノムが6で割り切れる構築物1つのみが高CAT活性を誘導することができた。
【００７９】
6.1.  ニューキャッスル病ウイルスミニゲノムの構築
NDVミニゲノムを構築するために、前掲に記載の通りに以下の手法を使用した。ゲノムNDV RNAの5'末端配列を、当技術分野で標準的な技法を用いてRACE（Gibco, BRL）により得た。RACE反応用の鋳型は、NDVビリオン（NDV-CL：California/11914/1944など）から精製したゲノムRNAであった。図３に示すように、この末端配列は、64ヌクレオチドのトレーラー配列および127ヌクレオチドのL遺伝子の非翻訳領域を含有していた。191ヌクレオチドのウイルス配列に隣接して位置するように、5ヌクレオチド配列（3' CCTTAA）を挿入した。CAT遺伝子は、ウイルスの5'末端と3'末端の非コード領域の間に位置する667ヌクレオチドのCATオープンリーディングフレームを含有した。NDV配列の3'末端領域を得るために、RT-PCRを使用した。RT-PCR反応用の鋳型は、NDVのin vitroポリアデニル化ゲノムRNAであった。図３に示すように、3'末端領域の121ヌクレオチドは、56ヌクレオチドのNP遺伝子の非翻訳領域および65ヌクレオチドのリーダー配列から構成された。得られたNDVミニゲノムの構築物を図１に示す。3'および5'の非コード末端領域のヌクレオチド配列を図３に示す。
【００８０】
6.2. NDV NP、PおよびL発現プラスミドの構築
第5節に記載のように、マイナス鎖RNAゲノムの転写または複製には、ウイルスによりもたらされるべきいくつかのタンパク質成分が必要であり、Lタンパク質、Pタンパク質およびNPタンパク質が含まれる。NDVミニゲノムからの発現を促進するために、L、PおよびNPタンパク質をそれぞれコードする遺伝子を、図2A〜Cに記載のようにpTM1発現ベクター中にクローニングした。pTM1発現ベクターは、T7プロモーター、目的の遺伝子（L、PまたはNP）の挿入用のいくつかのクローニング部位、T7ターミネーター、pUC19複製起点、およびアンピシリン耐性遺伝子を含有する。発現プラスミドを構築するために、NDV核タンパク質（NP）、リンタンパク質（P）およびポリメラーゼ（L）の全長DNAをRT-PCR増幅により得た。これらのDNAをT7ポリメラーゼ発現ベクターであるpTM1にそれぞれクローニングした（図2A〜C）。
【００８１】
6.3. NDVミニゲノムのRNA転写
NDVミニ遺伝子プラスミドからのRNA転写を、Ribomaxキット（Promega）を説明書に記載のように用いて実施した。ラン・オフ転写法を可能にするために、1μgのNDVミニゲノムプラスミド（pNDVCAT）をBbs Iにより消化した。続いてこの線状化プラスミドを転写反応（37℃にて2時間）の鋳型として使用した。鋳型DNAを除去するために、得られた反応混合物をRNase非含有DNaseにより処理（37℃にて15分間）し、フェノール-クロロホルム抽出、続いてエタノール沈殿を行って精製した。
【００８２】
6.4.  細胞トランスフェクション
Cos-1細胞または293T細胞を35 mmディッシュ上で増殖させ、トランスフェクションの前に1時間かけて感染多重度（moi）約1でヘルパーウイルスrVV T7を感染させた。次に該細胞をNDVのNP、PおよびLタンパク質をコードする発現ベクターを用いてトランスフェクトした。具体的には、トランスフェクションをDOTAP（Boehringer Mannheim）を用いて実施した。ヘルパーウイルス感染の後、細胞をpTM1-NP（1μg）、pTM1-P（1μg）およびpTM1-L（0.1μg）を用いて4時間かけてトランスフェクトした。Lタンパク質を欠損する対照トランスフェクションは、pTM1-NP（1μg）、pTM1-P（1μg）および偽pTM1-L（0μg）を用いて同様の細胞セットで実施した。4時間のインキュベーション期間の後、細胞を0.5μgのNDV-CATキメラ(-)RNAを用いたRNAトランスフェクションにかけた（図１参照）。RNAトランスフェクションの後、細胞を18時間インキュベートした。続いて細胞溶解物をCATアッセイのために回収した。
【００８３】
6.5. CATアッセイ
CATアッセイを、Gormanら、1982, Mol. Cell. Biol. 2: 1044-1051から改作した標準法に従って実施した。該アッセイでは、0.25M Trisバッファー（pH 7.5）中に10μlの14Cクロラムフェニコール（0.5μCi；8.3 nM；NEN）、20μlの40 mMアセチルCoA（Boehringer）および50μlの細胞抽出物を含有させた。インキュベーション時間は16〜18時間であった。
【００８４】
6.6.  結果
NP、P、L発現ベクター、およびキメラNDV-CAT RNAを用いてトランスフェクトしたそれぞれの細胞系において、トランスフェクションの18時間後に高レベルのCAT発現が得られた。さらに、Lタンパク質を欠損する対照のトランスフェクト細胞はCATを発現しなかった。
【００８５】
7.  特定の組換えDNAに由来するRNAを用いた感染性NDVウイルスのレスキュー
以下の小節に記載の実験は、特定の組換えDNAに由来するRNAを用いた感染性NDVのレスキューを示している。キメラNDV-CAT RNAに対応するRNAを使用して、ウイルスRNAの5'末端の191ヌクレオチドおよび3'末端ヌクレオチドの121ヌクレオチドが、モデルNDV RNAの転写、複製およびパッケージングに必要なシグナルを全て含有することを示し得る。NDVゲノムの転写単位全てを含有するRNAをトランスフェクトしたプラスミドから発現させ得る。したがってこの技法によって、cDNAクローンおよびこれらのゲノムの部位特異的突然変異誘発を用いた感染性NDVウイルスの遺伝子操作が可能になる。更にこの技法により、組織培養物、動物またはヒトにおける遺伝子発現に効率的なベクターとして使用し得る感染性キメラNDVウイルスの構築が可能になり得る。
【００８６】
8.  実施例：NDVゲノム中に挿入されたHIV抗原gp160エピトープを含有する組換えニューキャッスル病ウイルス
本明細書に記載の実施例において、キメラNDVを、HIVのgp160由来の異種抗原を発現させるために構築する。以下の小節に記載の実験は、NDVゲノム内にHIV gp160由来のペプチドを発現するキメラNDVを作製するための組換えRNA鋳型の使用を示すものである。またさらに、このキメラNDVを使用して、脊椎動物の体液および細胞が媒介する免疫応答を誘導する。
【００８７】
8.1.  プラスミドの構築
HIV gp160タンパク質を発現する組換えNDV cDNAクローンは、当技術分野で公知のいくつかの方法で構築し得る。例えば、図４に示すように、HIV EnvおよびGagタンパク質をNDVのいくつかの位置に挿入し得る。一例として、EnvおよびGagタンパク質をM遺伝子とL遺伝子との間に挿入する。異なる例として、EnvおよびGagタンパク質をNP遺伝子の3'側（リーダー配列とNPとの間）に挿入する。あるいは、これらのHIVタンパク質を3'末端におけるNDVエンベロープタンパク質（HNとF）の間に組み入れる。またこれらのタンパク質を任意のNDV遺伝子中に、またはそれらの間に挿入してもよい。
【００８８】
8.2.  感染性キメラウイルスの作製
組換えNDVゲノムを含むプラスミドに由来するRNAのトランスフェクションを、例えば、COS、293 MDBKなどの細胞にトランスフェクトし、感染性キメラウイルスの選択を既に記載されているように実施し得る。米国特許第5,166,057号を参照のこと（参照によりその全文を本明細書に組み入れる）。得られたRNAは、標準トランスフェクションプロトコルの手法を用いて野生型ウイルスを感染させた細胞中にトランスフェクトし得る。トランスフェクション後、上清を回収し、そして種々の希釈で使用して、NDV抗血清の存在下にて新鮮な細胞に感染させ得る。また上清を同じ抗血清の存在下におけるプラークアッセイにも使用し得る。続いてレスキューしたウイルスの精製および特性決定を行って、それを、例えば抗体産生に使用し得る。
【００８９】
8.3.  赤血球凝集阻害アッセイおよびウイルス中和アッセイ
赤血球凝集阻害（HI）アッセイを既に記載されている（Palmer, D.F.ら、1975, Immunol. Ser. 6:51-52）ように実施する。モノクローナル抗体（2G9、4B2、2F1O、25-5）を、ヒト抗-gp120モノクローナル抗体を用いて標準的な方法により調製する。モノクローナル抗体含有腹水液を、既に記載されている（Palmer, D.F.ら、1975, Immunol. Ser. 6:51-52）ように受容体破壊酵素で処理する。
【００９０】
ウイルス中和アッセイに関して、直径30mmのディッシュ中の細胞にウイルスを感染させる。1時間の吸着の後、種々の希釈で抗体を含有する寒天重層を添加する。続いて感染の72時間後に細胞単層を0.1%クリスタルバイオレットで染色する。
【００９１】
8.4.  免疫
6週齢のBALB/cマウスに、ウイルスをエーロゾル経路により感染させるか、または10μgの精製ウイルスを用いて腹腔内（i.p.）に免疫する。追加免疫に関しては全て、10μgの精製ウイルスをi.p.に投与する。それぞれの免疫後7日目に血清を回収する。
【００９２】
8.5.  ラジオイムノアッセイ
ラジオイムノアッセイを既に記載されている（Zaghouani, H.ら、1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5645-6549）ように実施する。簡単に説明すると、マイクロタイタープレートを、リン酸緩衝化食塩水（PBS）中の2% BSAで飽和させた5μg/ml のペプチド-BSAコンジュゲートで被覆し、種々の希釈の血清と共にインキュベートする。結合した抗体を125I標識抗マウスκモノクローナル抗体を用いて検出する。
【００９３】
8.6.  放射線免疫沈降法
H9ヒトT細胞系にHIVを急性に感染させる。感染後4日目に、5×107個の感染細胞を、35S-システイン、35S-メチオニン、および3H-イソロイシンを用いて標識する。その際、1ml当り100μCiの各同位体を含有する培地中に、該細胞が2×106個/mlとなるようにする。代謝標識の20時間後、放射性ビリオンを45,000 rpmにて1時間遠心分離を行ってペレット化する。続いて該ペレットを、1% Triton X-100および2mMフェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）を含有する1.0mlの溶解バッファー中に再懸濁する。約20μlの血清または0.5μgのモノクローナル抗体（20μl PBS中）および175μlのビリオン溶解物を、0.5％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、1 mg/ml BSA、2% Triton X-100、および50 mMリン酸ナトリウムを含有する0.5mlの免疫沈降バッファー（pH 7.4）中で4℃にて一晩インキュベートする。抗原-抗体複合体をプロテインA-セファロースビースに結合させ、10% SDS-ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動により分析する。
【００９４】
8.7. HIV-1中和アッセイ
in vitro中和アッセイを既に記載されている（Nara, P.L.ら、1987, AIDS Res. Hum. Retroviruses 3:283-302）ように実施する。簡単に説明すると、熱不活化血清の連続2倍希釈液を、H9細胞中で産生させた150〜200シンシチウム形成単位のHIVウイルスと共に室温で1時間インキュベートする。該ウイルス／血清混合物を50,000個のDEAE-デキストラン処理CEMss細胞（ポリ-L-リシンを用いてマイクロプレートディッシュに固着させてある）、または50,000個のH9懸濁細胞と共に37℃にて1時間インキュベートする。ウイルスの吸着後、未結合ウイルスを除去し、各ウエルに200μlの培地を添加する。感染後4日目に、50μlの上清培地をウイルスp24gagタンパク質定量（Coulter Source, Inc.）のために取り出す。CEMss細胞中のシンシチウムの総数は感染後5日目に計数する。中和力価を、ウイルスのみの対照ウエルと比較して算出し、シンシチウム数を50%以上低減させる、またはp24合成を50％以上阻害する最高血清希釈率の逆数として表す。
【００９５】
8.8. CTL応答の誘導
BALB/cマウスを、107 PFUのキメラNDVウイルスを含有する0.2 mlのウイルス懸濁液を用いて免疫する。7日後、脾臓細胞を採取し、既に記載されている（Zaghouani, H.ら、1992, J. Immunol. 148:3604-3609）ように、放射線照射した脾臓細胞単独、またはこれを免疫原性ペプチドで被覆したものを用い、上清中10%のコンカナバリンA存在下にて、in vitroで5日間再刺激する。
【００９６】
8.9.  細胞溶解アッセイ
ペプチドで被覆した標的細胞を、Na51 Cr4（100μCi/106個の細胞）を用いて37℃にて1時間かけて標識する。2回洗浄した後、細胞をV底96ウエルプレートに移し、エフェクター細胞を添加し、7% CO2中で37℃にてインキュベートする。4時間後、上清を回収して計数する。最大クロム放出は、細胞を1% Nonidet P40界面活性剤と共にインキュベートして決定する。特異的溶解の割合（％）は、以下に示す式に従って算出する：［（cpmサンプル−cpm自然放出）／（cpm最大放出−cpm自然放出）］×100。
【００９７】
9.  キメラNDV-CAT RNAの細胞内発現
NDVミニゲノムの発現効率を高めるために、NDV-CAT RNAの細胞内発現のためにプラスミド（pT7-NDV-CAT-RB）を構築した。これは、NDV-CAT RNAの3'非コード領域の末端のすぐ後にデルタ肝炎ウイルス由来のリボザイムを挿入して達成した。既にrVV-T7もしくはT7ポリメラーゼを発現する改変アンカラワクシニアウイルス（MVA-T7）を感染させてある293、293T、COS1、CV1、もしくはニワトリ胚繊維芽細胞（CEF）の細胞中にpTM1-NP、pTM1-P、pTM1-LおよびpT7-NDV-CAT-RTを共トランスフェクトすることにより、高レベルのCAT活性がもたらされた（図６）。このCAT活性は、NDV-CAT RNAの直接RNAトランスフェクションにより達成された活性よりも約100〜1,000倍高かった。
【００９８】
10.  特定の組換えDNAに由来するRNAを用いた感染性NDVウイルスのレスキュー
非ウイルス依存的プラスミド誘導系からの組換えウイルスのレスキューを達成するために、NDVの全長アンチゲノムの細胞内発現を可能にするプラスミドを構築した。NDV cDNAをNDVのカリフォルニア様（California-like；NDV-CL）株の精製RNAに由来するいくつかの断片でRT-PCRを実施した（Meindlら、1974, Virology 58: 457-463）。cDNA断片を連結し、T7プロモーターおよびリボザイムフランキング配列を有するプラスミド中に構築し、プラスミドpT7-NDV+RBを得た。XmaI制限部位を作製するサイレント突然変異をpT7-NDV+RBのLオープンリーディングフレーム中に導入した。10cmディッシュ中のCEF細胞単層にMVA-T7を感染多重度約0.1で感染させた。1時間後、細胞を2.4μgのpTM1-NP、1.2μgのpTM1-P、1.2μgのpTM-1Lおよび1.5μgのpT7-NDV+-RBを用いてトランスフェクト（リポフェクション）した。37℃にて8時間のインキュベーション後、新鮮な培地を添加した。トランスフェクションの20時間後に、ワクシニアウイルスインヒビターであるaraCを最終濃度が60μg/mlとなるよう添加した。トランスフェクション後2日目に、100μg/mlのaraCを含有する新鮮な培地を添加した。感染後4日目のトランスフェクト細胞からの上清を使用して、10日齢の孵化鶏卵の尿膜腔に接種した。37℃にて2日間のインキュベーション後、尿膜腔液を採取し、赤血球凝集反応によりNDV-CATウイルスの存在について陽性であることを認めた。レスキューしたウイルスから単離されたRNAの分析によって、新しく挿入されたXmaI部位の存在が確認され、該ウイルスがクローン化プラスミドcDNAに由来することが証明された。レスキュー手法のプロトコルの概略図を図７に示す。
【００９９】
11.  キメラNDVゲノムの内部シストロンからの外来遺伝子の発現
プラスミドpT7-NDV+-CAT/RN-RBは、NDV-CL cDNA中のHNオープンリーディングフレームをCATオープンリーディングフレームと置換することにより構築した。得られるキメラNDV RNAの総ヌクレオチド長が6で割り切れるように、さらに追加のヌクレオチドを非コード領域に付加した。MVA-T7ウイルスを既に感染させてあるCEF細胞単層中へ、pTN1-NP、pTM1-PおよびpTM1-Lと共にpT7-NDV+-CAT/HN-RBを共トランスフェクトすることによって、トランスフェクション後2日目に測定したものと同程度のCAT活性がもたらされた（図８）。これらの結果は、転写単位としてNDVゲノム中にクローニングされた外来遺伝子の発現用ベクターとしてNDVが使用可能であることを示している。
【０１００】
本発明は、記載した特定の実施形態によりその範囲を制限されるものではなく、該実施形態は本発明の個々の態様の1つの例示を意図するものである。機能的に同等な構築物、ウイルスまたは酵素はいずれも本発明の範囲内に入る。実際、当業者であれば、本明細書の記載および添付の図面から、本明細書に示し記載したものに加えて本発明の種々の変更が明らかだろう。かかる変更は、本発明の特許請求の範囲内に入ることを意図する。
【０１０１】
本明細書で引用した参照文献はいずれも、全ての目的についてその全体を参照により本明細書に組み入れる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  NDVミニゲノムの模式図である。上の図は、Ｔ７プロモーター；5'末端配列（ゲノムRNAの5'末端、191nt）；挿入されたヌクレオチド(CTTAA)； 667nt のCAT ORF；3'末端配列(ゲノムRNAの3'末端、121nt)BbsIおよびヌクレアーゼ部位を含む、PNDVCATプラスミドを示す。下の図は、in vitro転写により得られたキメラNDV-CAT RNAを示す。NDV-CATキメラミニゲノムのNDVに基づく増幅および転写の結果、トランスフェクトした細胞でCAT活性が検出される。
【図２】  図２Ａ〜Ｃ；PTMI発現ベクターの概略図を示す。
PTM1-NPは、NDVＮＰタンパク質をコードする。
PTM1-Pは、NDVＰタンパク質をコードする。
PTM1-LはNDVＬタンパク質をコードする。
【図３】  NDVの5'および3'末端の非コード領域のRNA配列（プラスセンス）を示す。CAT遺伝子の5'側の配列は、56ntのＮＰ遺伝子UTRに続く65ntのリーダー配列(太字)を含む、121ntのNDVプラスセンスゲノムの5'末端非コード領域を示す。CAT遺伝子の3'側の配列は、挿入したヌクレオチドcuuaa(小文字)、および127ntのL遺伝子のUTRに続く64ntのトレーラー領域（太字）を含む191ntのNDVプラスセンスゲノムの非コード末端領域を示す。
【図４】  図４ＡおよびＢは、組換えNDVクローンの構造の概略図を示す。図４Ｂ；HIVのEnvおよびGagを発現する感染性NDVを示す。上の図；Ｍ遺伝子とＬ遺伝子の間にHIVのEnvおよびGagが存在する。下の図；ＮＰ遺伝子の3'側にHIVのEnvおよびGagが存在する。
【図５】  NDVの3'および5'末端を、Kurillaら、1985、Virology 145:203-212 (3'末端)、およびYusoffら、1987、Nucleic Acids Research 15:3961-3976 (5'末端)の配列とアライメントをとった概略図である。
【図６】  外来遺伝子をNDVに基づいて発現させるための、プラスミドに基づく逆遺伝学的方法を示す。T7ポリメラーゼを発現する組換えワクシニアウイルスを細胞に感染させる。さらに、
１）NDVのＬ、ＮＰ、およびＰタンパク質を、T7プロモーター（それぞれ、pTM1-L、pTM1-NP、およびpTM1-P）の転写制御下にコードするプラスミドDNA、ならびに
２）T7プロモーターの転写制御下に、キメラNDV-CATミニゲノムをコードするプラスミドDNA（pT7-NDV-CAT-RB）、
を細胞にトランスフェクトする。リボザイム配列(RB)によって切断が促進されることにより、適切なNDV-CATミニゲノムの3'末端が得られる。NDV-CATキメラミニゲノムの増幅および転写により、トランスフェクトした細胞中にCAT活性が検出される。NDV-CATミニゲノムの3'および5'末端にある非コード領域は、黒の四角で表す。
【図７】  合成DNA由来のNDVのレスキューを示す。T7ポリメラーゼを発現する組換えワクシニアウイルスを細胞に感染させる。さらに、
１）NDVのＬ、ＮＰ、およびＰタンパク質を、T7プロモーター（それぞれ、pTM1-L、pTM1-NP、およびpTM1-P）の転写制御下にコードするプラスミドDNA、ならびに
２）T7プロモーターの転写制御下にNDVアンチゲノムをコードするプラスミドDNA（pT7-NDV+-RB）、
を細胞にトランスフェクトする。リボザイム配列(RB)によって切断が促進されることにより、適切なNDVアンチゲノムの3'末端が得られる。NDVアンチゲノムの増幅および転写により、感染性NDVウイルスがレスキューできる。NDVアンチゲノムの3'および5'末端にある非コード領域は、黒の四角で表す。
【図８】  内部転写単位と同様に、NDVアンチゲノム中に挿入された外来遺伝子のNDVに基づいた発現を示す。T7ポリメラーゼを発現する組換えワクシニアウイルスを細胞に感染させる。さらに、
１）NDVのＬ、ＮＰ、およびＰタンパク質を、T7プロモーター（それぞれ、pTM1-L、pTM1-NP、およびpTM1-P）の転写制御下にコードするプラスミドDNA、ならびに
２）T7プロモーターの転写制御下にキメラNDV-CATアンチゲノムをコードするプラスミドDNA（pT7-NDV-CAT-RB）、
を細胞にトランスフェクトする。キメラNDV-CATアンチゲノム中で、CATのオープンリーディングフレームを野生型NDVアンチゲノムの天然に存在するHNオープンリーディングフレームと置換する。リボザイム配列(RB)によって切断が促進されることにより、キメラNDV-CATアンチゲノムの適切な3'末端が得られる。キメラNDV-CATアンチゲノムの増幅および転写により、トランスフェクトした細胞中にCAT活性が検出される。キメラNDV-CATアンチゲノムの3'および5'末端にある非コード領域は、黒の四角で表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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