(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコノバクター・オキシダンス・subsp・Ｆ−２７０２（Gluconobacter oxydans subsp F-2702）菌（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−７４４９）の菌体内酵素産生物を有効成分とする、肝癌、鼻咽頭癌、白血病またはリンパ腫を治療するための抗腫瘍剤であって、
該産生物が、該Ｆ−２７０２菌から産生され、かつ
下記の理化学的性質および生物学的性質：
元素分析(％)：炭素64.88％、水素5.52％(窒素、硫黄、リン、ハロゲンを含まない)
分子量（質量分析法）：約300
融  点：119℃以上（分解）
比旋光度（［α］20 D）：＋1.4035°（C=0.713、メタノール）
紫外吸収スペクトル（λmax、メタノール）：315nm、235nm、210nm
赤外吸収スペクトル(主な吸収値)：3400、3100-2800、2700-2600、1700、1620、1590、1520、1460、1390、1330、1280、1140、1090、1050、990、960、940、870、820、700cm-1
溶解性：ＤＭＳＯ、メタノール、エタノールに易溶。酢酸エチル、ジエチルエーテル
に可溶。ベンゼン、ｎ−ヘキサンに不溶。水に可溶。
呈色反応：濃硫酸、濃塩酸または70％過塩素酸により黄色乃至橙色を呈する
陽性−塩化第二鉄反応、2,4-ジニトロフェニルヒドラジン反応、エールリッヒ
のジアゾ反応
疑陽性−エールリッヒ反応
外  観：黄橙色
抗菌スペクトル：カビ類、酵母類に対して生育阻害活性を示す
をもつＦ−２７０２物質、またはその医薬として許容し得る塩であることを特徴とする該抗腫瘍剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、酢酸菌（Acetic Acid Bacteria）に属する微生物またはその菌体内酵素産生物を有効成分とする新規抗腫瘍剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
癌患者に対する化学療法の分野においては、抗腫瘍作用を有する物質として、ブレオマイシンやアドリアマイシン等の多くの微生物由来の代謝産物が見出され、臨床的に用いられている。しかしながら、多種多様な腫瘍に対してその効果は必ずしも一定ではなく、より優れた抗腫瘍剤の開発が求められている。
この度、本発明者らは酢酸菌が高い抗腫瘍活性を有する物質を産生することを見出した。
【０００３】
ある種の酢酸菌が抗生物質を産生することは報告されているが、酢酸菌に属する微生物が抗腫瘍活性を有する物質を産生することは未だ報告されていない。また、抗生物質の産生に関する報告も少なく、わずかにグルコノバクター sp. w-315（後に類縁菌のFrateuria（仮性酢酸菌）sp. w-315に変更された）が産生するポリエン系抗生物質Enacyloxin（J. Antibiotics, 第45巻, 第４号, 470-475頁, 1992年）、Gluconobacter oxydans CCRC10383株が産生するCephalexin（Proc. Natl. Sci. Council, ROC, 第16巻, 第４号, 184-187頁, 1992年）、および上記したGluconobacter oxydans subsp F-2702菌が産生するＦ−２７０２物質（Jikeikai Med. J., 第37巻, 335-342頁, 1990年）の例があるに過ぎない。
【０００４】
本発明者らは、先に名古屋市平針より採取した土壌試料より分離した酢酸菌の一種であるグルコノバクター・オキシダンス・subsp・F-2702（Gluconobacter oxydans subsp F-2702）と命名された菌体（以下、Ｆ−２７０２菌株）が、好気性条件下で培養すると強い抗カビ活性を有するＦ−２７０２物質を蓄積することを見出している（Jikeikai Med. J., 第37巻, 325-333頁, 1990年、特公平４−７３５７号公報）。
なお、Ｆ−２７０２菌株は、工業技術院微生物技術研究所（現、生命工学工業技術研究所）に微工研菌寄第７４４９号（ＦＥＲＭ  Ｐ−７４４９）として寄託されており、有効に使用することができる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、多種多様な腫瘍に対して効果を有する抗腫瘍活性を有する微生物またはその菌体内酵素産生物を有効成分とする新規な抗腫瘍剤を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、微生物の代謝産物について種々検討した結果、酢酸菌に属する微生物またはその菌体内酵素が産生する物質、特にＦ−２７０２物質が高い抗腫瘍活性を示すことを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、酢酸菌に属する微生物またはその菌体内酵素産生物を有効成分とする抗腫瘍剤を提供するものである。
【０００７】
【発明の実施の形態】
酢酸菌は、分類学的には、グルコノバクター（Gluconobacter）属およびアセトバクター（Acetobacter）属の２菌属を包含する（バージイズ・マニュアル・オブ・ディターミネイティブ・バクテリオロジー  第８版：Bergey's Manual of Determinative Bacteriolgy 8th Edition, 1974年）。また、両菌の中間的な性質を有する中間菌株も存在することが知られている（J. Gen. Appl. Microbiol., 第10巻, 95-125頁, 1964年、Int. J. Syst. Bacteriol., 第30巻, 547-556頁, 1980年など）。例えば、最近の16S ribosomal RNAの塩基配列の分類法により、グルコノバクター属およびアセトバクター属の中間属としてグルコノアセトバクター（Gluconoacetobacter）属が提案されている（Biosci. Biotechnol. Biochem., 第61巻, 第８号, 1244-1251頁, 1997年）。
【０００８】
本発明における酢酸菌に属する微生物とは、系統的に類縁菌である、グルコノバクター属、アセトバクター属、およびそれらの中間菌株のことをいう。また、エチルメタンスルホネート、紫外線照射、Ｎ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等の変異原で処理した変異株も包含する。そしてこれらの菌体が産生する抗腫瘍作用を有する物質を本発明の対象とする。これらのうち、グルコノバクター属に属する微生物が好ましく、特に、グルコノバクター・オキシダンス・subsp・F-2702（Gluconobacter oxydans subsp F-2702）菌が好ましい（特公平４−７３５７号参照）。
【０００９】
酢酸菌を、例えば、特公平４-７３５７号公報の記載に従って培養することにより抗腫瘍活性を有する物質を単離することができる。
要約すると、細菌を、グルコース、ペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、肉芽エキス等の栄養源を用いた培地中で培養でき、培地にはさらにアミノ酸を加えてもよい。培地に菌の生育を促進するような適当な物質、例えば、ビタミン類などを加えてもよい。
培養法としては、一般の好気性細菌の培養法と同様であるが、比較的少量の実験室規模では、液体静置培養で、空気と培養液との接触面をできるだけ広くしたほうがよく、振とう培養は適さない。
培養に適するｐＨは、ｐＨ６．０〜８．０、温度は２７℃〜３７℃であるが、通常ｐＨ６．８、温度３４℃で培養する。培養日数は通常４〜１０日である。
【００１０】
培養上清から抗腫瘍活性を有する菌体内酵素産生物を抽出、精製するには、通常用いられる抽出・精製手段を用いることができ、例えば、酢酸エチル、クロロホルム、ジエチエルエーテル等の有機溶剤を用いた抽出法と、重曹水またはリン酸緩衝液等の溶液による転溶を繰り返し、さらにカラムクロマトグラフィーを組み合わせて用いる。
【００１１】
このように抽出、精製される酢酸菌の菌体内酵素産生物としては、抗腫瘍活性を有するものであれば特に限定するものではないが、上記したＦ−２７０２物質が特に好ましい。Ｆ−２７０２物質は、下記の理化学的性質および生物学的特性を有する。
元素分析（％）：炭素64.88％、水素5.52％（窒素、硫黄、リン、ハロゲンを含まない）
分子量（質量分析法）：約300
融  点：119℃以上（分解）
比旋光度（［α］20 D）：＋1.4035°（C=0.713、メタノール）
紫外吸収スペクトル（λmax、メタノール）：315nm、235nm、210nm
赤外吸収スペクトル（主な吸収値）：3400、3100-2800、2700-2600、1700、1620、1590、1520、1460、1390、1330、1280、1140、1090、1050、990、960、940、870、820、700cm-1
溶解性：ＤＭＳＯ、メタノール、エタノールに易溶。酢酸エチル、ジエチルエーテルに可溶。ベンゼン、ｎ−ヘキサンに不溶。水に可溶。
呈色反応：濃硫酸、濃塩酸または70％過塩素酸により黄色乃至橙色を呈する。
陽性−塩化第二鉄反応、2,4-ジニトロフェニルヒドラジン反応、エールリッヒのジアゾ反応。
疑陽性−エールリッヒ反応
外  観：黄橙色
抗菌スペクトル：カビ類、酵母類に対して生育阻害活性を示す。
【００１２】
本発明の酢酸菌に属する微生物またはその菌体内酵素産生物を有効成分とする抗腫瘍剤は、多種多様な腫瘍に対して抗腫瘍活性を有し、例えば、肝癌、咽頭ガン、白血病、リンパ腫等の治療に用いることができる。
【００１３】
本発明の抗腫瘍剤を治療に用いる際には、患者の病態や用法に応じてさまざまな剤型のものが使用でき、例えば、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、錠剤などの内用剤、軟膏、パップ剤などの外用剤、注射剤あるいは坐剤などを挙げることができる。
酢酸菌またはその菌体内酵素産生物を、生理学的に許容される賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、保存剤、溶解剤などの添加剤と適宜混合し、周知の方法を用いて、上記したような剤形に調製できる。
【００１４】
本発明の抗腫瘍剤を実際の治療に用いる際の投与量は、対象となる患者の年齢、体重、性別、症状などを考慮して適宜決定される。例えば、Ｆ−２７０２物質を経口投与する場合、通常成人１日当たり０.００１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲で、非経口投与の場合、通常成人１日当たり０.０１〜１ｍｇ／ｋｇの範囲で使用される。
なお、本発明の抗腫瘍剤を抗腫瘍目的で用いた場合、明らかな毒性は認められない。
【００１５】
【実施例】
次に、実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００１６】
実施例１  Ｆ−２７０２物質の抽出および精製
ルービンフラスコを用い、グルコース１％、麦芽エキス０．５％、酵母エキス０．５％、肉エキス０．５％、ペプトン１％を含有する培地中でＦ−２７０２株を３４℃で４日間、好気性条件で静置培養した。１０Ｌの培養液を遠心分離により菌体と培養上澄とに分離した。上澄のｐＨをＨＣｌでｐＨ３．０に調整し、酢酸エチルで抽出した。溶媒層（６Ｌ）を真空下３０℃にて濃縮し、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．８）中に転溶させた。水層（２００ｍｌ）のｐＨをＨＣｌでｐＨ３．０に調整し、ＣＨＣｌ3で抽出した。溶媒層を再度０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．８）中に転溶させ、水層（２００ｍｌ）のｐＨをＨＣｌでｐＨ３．０に調整した後、ジエチルエーテルで抽出した。溶媒層（２００ｍｌ）を無水硫酸ナトリウムで脱水し、真空下３０℃にて濃縮した。
得られた粗生成物を溶出液にメタノールを用いたセファデックスＬＨ−２０（ファルマシア製）カラム（２．５ｘ４５０ｃｍ）のゲル濾過により精製し、さらに溶出液にＣＨ2Ｃｌ2を用いたセファデックスＬＨ−２０カラム（２．５ｘ９０ｃｍ）のゲル濾過により精製し、活性画分を単離した。
なお、活性はＵ９３７細胞に対する細胞毒性により調べた。
【００１７】
実施例２  細胞障害性試験
各種腫瘍細胞を用い、Ｆ−２７０２物質による腫瘍細胞障害性を調べた。以下の細胞を試験に供した。いずれの細胞もアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）より購入した。
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各細胞を１×１０4個となるように９６ウェルのプレートに植え、さらに常法により凍結乾燥させたＦ−２７０２物質を最終濃度１６０μｇ／ｍＬから、２倍に段階希釈となるように細胞に添加し、炭酸ガスインキュベーターで３日間３７℃で培養した。
３日後、Cell Counting Kit（同仁化学）を用いて、各細胞の生存率を調べた。その結果を図１および図２に示す。
この結果から、Ｆ−２７０２物質が各種腫瘍細胞に対して細胞障害性を有することが認められた。
この細胞障害性は、接着性細胞に比べて浮遊系細胞に強く作用し、Ｕ９３７、Ｐ３８８Ｄ１、ＴＨＰ−１に対しては、２０μｇ／ｍＬの濃度でその生育をほぼ抑えることができた。さらにこの細胞障害性は、比較的短時間から発揮されることも示された。
【００１８】
実施例３  アポトーシスアッセイ
アポトーシス（apoptosis）は、ＤＮＡ断片化やクロマチン凝縮、アポトーシス小体の形成などにより特徴づけられる細胞死の総称である。発生の過程では、細胞が様々な組織に分化すると同時に、使命を終えた一定の細胞がアポトーシスにより死に至ることから、アポトーシスは細胞の自殺機構とも考えられている。
近年、制癌剤や放射線による癌細胞のアポトーシス誘導が制癌剤の効果の判定や薬剤耐性の調査・研究に広く用いられている（Int. J. Oncol., 第１巻, 639-648頁, 1992年）。アポトーシスに起因するヌクレオソーム単位のＤＮＡ断片化は、アガロースゲル電気泳動法を用いて特徴的なＬａｄｄｅｒパターンを検出することにより、確認することができる（Analysis of cell death by flowcytometry. In: Cell Growth and Apoptosis. Apractical approach (Studzinski GP. ed), IRL press, Oxford, 143-167頁, 1995年）。そこで、ＨＬ−６０細胞（前骨髄性白血病細胞）を用い、Ｆ−２７０２物質によるアポトーシスの誘導の有無を調査した。
【００１９】
ＨＬ−６０細胞はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより購入した。このＨＬ−６０細胞を１×１０6個となるように３５ｍｍ径シャーレに植え、Ｆ−２７０２物質を２０μｇ／ｍＬとなるように細胞に添加した。対照物質として１μｇ／ｍＬのスタウロスポリンを用いた。５時間の培養後、アポラダーキット（寳酒造）を用いて添付の説明書に従って操作した後、ＤＮＡを回収し、２％アガロースゲル電気泳動を行い、ＤＮＡの断片化を調べた。
その結果、Ｆ−２７０２物質およびスタウロスポリンともに、ヌクレオソーム単位のＤＮＡ断片化を示すＬａｄｄｅｒパターンが検出され、アポトーシスの誘導が確認された（図３）。
【００２０】
【発明の効果】
本発明により、酢酸菌に属する微生物またはその菌体内酵素産生物が優れた抗腫瘍活性を有することが見出され、多種多様な腫瘍に対し用いることのできる抗腫瘍剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｆ−２７０２産物の腫瘍細胞に対する影響を示す。
【図２】Ｆ−２７０２産物の腫瘍細胞に対する影響を示す。
【図３】Ｆ−２７０２産物のＨＬ−６０細胞に対するアポトーシス誘導作用を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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