(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の酵素学的性質を有するBacillus属に属する細菌由来のポリガラクツロナーゼ。
（１）作用：ポリガラクツロン酸（ペクチン酸）、ペクチン及びプロトペクチンに作用し、ポリガラクツロン酸のα−１，４結合をエキソ的に加水分解し、ジガラクツロン酸を生成する。
（２）最適反応ｐＨ：ｐＨ８付近（トリス−塩酸緩衝液）
ｐＨ８〜１１において最適反応ｐＨにおけるプロトペクチナーゼ活性の３０％以上のプロトペクチナーゼ活性を有する。
（３）最適反応温度：約５０℃（トリス−塩酸緩衝液、ｐＨ８．０）
（４）ｐＨ安定性：ｐＨ７〜１１．５（３０℃、３０分間処理）
（５）耐熱性：約５０℃まで安定（トリス−塩酸緩衝液、ｐＨ８．０、３０分間処理）
（６）分子量：約１０５０００（ゲル濾過法）
（７）等電点：ｐＨ４．６付近（等電点電気泳動法）
【請求項２】
配列番号１に示すアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる請求項１記載のポリガラクツロナーゼ。
【請求項３】
バチルス エスピー ＫＳＭ−Ｐ３５８（Bacillus sp. KSM-P358；FERM P-17560）由来である請求項１又は２記載のポリガラクツロナーゼ。
【請求項４】
バチルス エスピー ＫＳＭ−Ｐ３５８（Bacillus sp. KSM-P358；FERM P-17560）。
【請求項５】
配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質又は該アミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり且つポリガラクツロナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項６】
配列番号２に示す塩基配列又は該塩基配列の１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されたポリガラクツロナーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を有するものである請求項５記載の遺伝子。
【請求項７】
請求項５又は６記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項８】
請求項７記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項９】
請求項８記載の形質転換体を培養することを特徴とするポリガラクツロナーゼの製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は洗浄剤、繊維処理剤等として有用なポリガラクツロナーゼ及びそれをコードする遺伝子に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
ポリガラクツロナーゼは、一般にペクチナーゼとも呼ばれ、ポリガラクツロン酸（ペクチン酸）やペクチンを分解する加水分解酵素である。斯かるポリガラクツロナーゼは、その最適反応ｐＨを酸性−弱酸性に有していることから、主に食品工業用酵素として用いられていたが、最近では、衣料用洗剤酵素としての利用が試みられている（特開昭６０−２２６５９９号公報、特公平６−３９５９６号公報、ＷＯ９８／０６８０９号公報等）。
【０００３】
ポリガラクツロナーゼを衣料用洗剤に用いる場合には、酵素がアルカリ性領域で作用すること、界面活性剤、キレート剤等の洗浄剤成分に対して安定であることが必要である。また、木綿繊維上のペクチン質はプロトペクチンとして存在することから、アルカリ性領域において、不溶性のプロトペクチンに作用してペクチンを遊離するプロトペクチナーゼ活性を有するポリガラクツロナーゼが必要である。
【０００４】
従来、アルカリ至適のポリガラクツロナーゼとしては、Bacillus sp. P-4-N株の生産するエンド型のポリガラクツロナーゼ（特公昭４８−６５５７号公報）が報告されていたが、斯かる酵素は反応にカルシウムイオンを要求するキレート耐性の低い酵素であって洗剤への応用は困難である。また最近では、プロトペクチナーゼ活性を有するペクチン酸リアーゼの洗浄剤への利用も考えられている（特開平１１−１４０４８９号公報）。
しかし、アルカリ性領域で作用するポリガラクツロナーゼであって、プロトペクチナーゼ活性を有する酵素はこれまでに全く知られていなかった。
【０００５】
本発明の目的は、界面活性剤、キレート剤等の洗浄剤成分に安定で、アルカリ領域で作用しプロトペクチナーゼ活性を有するポリガラクツロナーゼ及びそれをコードする遺伝子、並びに遺伝子工学的手法により該ポリガラクツロナーゼを効率よく大量生産するための方法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、土壌中の微生物が産生する酵素の中から、アルカリ領域で作用し、界面活性剤、キレート剤耐性等の洗浄剤成分に安定で、且つプロトペクチナーゼ活性を有するポリガラクツロナーゼを見出すと共に、該ポリガラクツロナーゼをコードする遺伝子のクローニング及び遺伝子組換えによる生産技術の確立に成功した。
【０００７】
すなわち、本発明は少なくともpH８〜１１において最大プロトペクチナーゼ活性の３０％以上のプロトペクチナーゼ活性を有するポリガラクツロナーゼ、及び当該ポリガラクツロナーゼを生産する微生物を提供するものである。
【０００８】
更に本発明は、当該ポリガラクツロナーゼをコードする遺伝子、該遺伝子を含有する組換えベクター、該組換えベクターを含む形質転換体及びこれらを用いたポリガラクツロナーゼの製造法を提供するものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明のポリガラクツロナーゼは、少なくともpH８〜１１においてプロトペクチナーゼ活性、すなわちプロトペクチン分解活性を有する。当該プロトペクチン分解活性は、プロトペクチンのポリガラクツロン酸の部分を分解して可溶化するもの（Ａタイプ）である。
プロトペクチナーゼ活性は、しつけ糸(基質)をマックルベイン氏緩衝液(pH５以上７以下)、トリス−塩酸緩衝液(pH７以上９以下)及びグリシン−水酸化ナトリウム(pH９以上１１以下)の各緩衝液、塩化カルシウム及びポリガラクツロナーゼを含む反応液に入れ、所定温度、時間反応させた後、上清液中に遊離したペクチンをオルシノール塩酸法で測定して得られた生成ペクチン量で測定した。最適反応ｐＨにおける生成ペクチン量に対する各ｐＨにおける生成ペクチン量の比、即ち最大プロトペクチナーゼ活性に対する相対比率で評価した。
【００１０】
また、アルカリ領域においてもポリガラクツロナーゼ活性、すなわちポリガラクツロン酸の加水分解活性を有する。当該ポリガラクツロナーゼ活性は、エキソ型であり、ジガラクツロン酸を生成する。このように本発明のポリガラクツロナーゼは、アルカリ領域おいて、不溶性天然ペクチンであるプロトペクチン及びその一部であるポリガラツクロン酸の両方に作用してジガラクツロン酸を生成するため、植物性繊維上のプロトペクチンに付着した汚れや、ケチャップ、ジャム等の不溶性ペクチン含量の高い食物の食べこぼしや染み汚れの除去に有効である。
【００１１】
本発明のポリガラクツロナーゼは、更に界面活性剤及びキレート剤に対して安定である。例えば、ドデシル硫酸ナトリウム０．２％含有液中で８０％以上の活性を保持する。また、２mMＥＤＴＡ含有液中で８０％の活性を保持する。
【００１２】
本発明のポリガラクツロナーゼは、更に次の酵素学的性質を有するのが好ましい。
（１）作用：ポリガラクツロン酸（ペクチン酸）、ペクチン及びプロトペクチンに作用し、ポリガラクツロン酸のα−１，４結合をエキソ的に加水分解し、ジガラクツロン酸を生成する。
（２）最適反応pH：pH８付近（トリス−塩酸緩衝液）
（３）最適反応温度：約５０℃（トリス−塩酸緩衝液、pH８．０）
（４）pH安定性：pH７〜１１．５（３０℃、３０分間処理）
（５）耐熱性：約５０℃まで安定（トリス−塩酸緩衝液、pH８．０、３０分間処理）
（６）分子量：約１０５０００（ゲル濾過法）
（７）等電点：pH４．６付近（等電点電気泳動法）
【００１３】
本発明のポリガラクツロナーゼは、例えばプロトペクチナーゼ活性を有するポリガラクツロナーゼ生産菌を培養し、培養物から採取することにより製造される。
【００１４】
本発明のポリガラクツロナーゼを生産する菌としては、Bacillus属に属する細菌、例えばＫＳＭ−Ｐ３５８株を挙げることができる。当該ＫＳＭ−Ｐ３５８株は次の菌学的性質を有する。
【００１５】
Ａ  形態学的性質
（ａ）細胞の形、大きさ：桿菌（０．６〜０．８×２．４〜３．２μｍ）
（ｂ）多形性：無し
（ｃ）運動性：有り
（ｄ）胞子（大きさ、形、位置、膨潤の有無）：楕円形、０．６〜０．８×１．２〜１．６μｍ、準端、膨潤有り
（ｅ）グラム染色：不定（ＣＶＴ寒天培地には生育せず）
（ｆ）抗酸性：陰性
（ｇ）肉汁寒天培地上での生育：白色、全縁のコロニーを形成
【００１６】
Ｂ  生理学的性質
（ａ）硝酸塩の還元：＋
（ｂ）脱窒反応：−
（ｃ）ＭＲテスト：−
（ｄ）ＶＰテスト：−
（ｅ）インドール生成：−
（ｆ）硫化水素の生成：−
（ｇ）デンプン加水分解：−
（ｈ）ゼラチン加水分解：＋
（ｉ）カゼイン加水分解：＋
（ｊ）クエン酸の利用：−
（ｋ）無機窒素の利用：−
（ｌ）ウレアーゼ：＋
（ｍ）オキシダーゼ：＋
（ｎ）カタラーゼ：＋
（ｏ）リトマスミルク：色調の変化は認められない
（ｐ）生育温度範囲：１８〜４１℃
（ｑ）生育pH範囲：pH７〜９
（ｒ）嫌気条件下での生育：生育せず
（ｓ）ＯＦテスト：−
（ｔ）グルコースからのガス産生：−
（ｕ）塩化ナトリウムに対する耐性：２％で生育せず
（ｖ）糖からの酸生成：以下の糖類からの酸生成は認められなかった。ガラクトース、キシロース、アラビノース、シュークロース、グルコース、マンニトール、マンノース、イノシトール、ソルビトール、トレハロース、ラクトース、グリセリン、マルトース、フラクトース、ラフィノース、メリビオース、可溶性デンプン
【００１７】
ＫＳＭ−Ｐ３５８株の形態学、生理学的性質について「Bergey's Manual of Systematic Bacteriology」(Williams & Wilkins社、1984年）の記載に準じ比較検討した結果、本菌株はBacillus brevisに近縁な菌種であると考えられた。しかし、その性質は既知のBacillus brevisとは一致せず、他のBacillus属細菌の諸性質とも一致しないため、新規なBacillus属細菌として本菌株を工業技術院生命工学研究所へバチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｐ３５８（Bacillus sp. KSM-P358；FERM P-17560）として寄託した。
【００１８】
ＫＳＭ−Ｐ３５８株等のポリガラクツロナーゼ生産菌を用いて本発明のポリガラクツロナーゼを生産するには、菌株を同化性の炭素源、窒素源、その他の必須栄養素を含む培地に接種し、常法に従い振盪培養あるいは通気攪拌培養すれば良い。培地のpHは、７〜９に調整するのが好ましい。
【００１９】
かくして得られた培養物中からのポリガラクツロナーゼの採取及び精製は、一般の方法に準じて行うことができる。即ち、培養物から遠心分離または濾過することで菌体を除き、得られた培養上清液から常法手段により目的酵素を濃縮することができる。このようにして得られた酵素液または乾燥粉末はそのまま用いることもできるが更に公知の方法により結晶化や造粒化することができる。
【００２０】
Bacillus sp. KSM-P358由来のポリガラクツロナーゼは以下のような酵素学的性質を有する。
【００２１】
なお、ポリガラクツロナーゼ活性の測定は、以下のように行った。
〔標準酵素活性測定法〕
試験管に０．２mLの０．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH８．０）、０．２mLの１％（ｗ／ｖ）ポリガラクツロン酸（ＩＣＮバイオメディカル；ｌｏｔ１４４８２、水酸化ナトリウム溶液にてpH６．８に調整）、０．５mLの脱イオン水を添加し、３０℃で５分間恒温した。これに０．１mLの適当に希釈した酵素液（希釈は脱イオン水により行った）を加え２０分間反応させた後、１mLのジニトロサリチル酸試薬を添加し、沸水中で５分間還元糖の発色を行った。氷水中で急冷した後、４mLの脱イオン水を加え５３５nmにおける吸光度を測定し還元糖の生成量を求めた。尚、ブランクは酵素液を加えずに処理した反応液にジニトロサリチル酸試薬を加えた後、酵素液を添加し、同様に発色させたものを用意した。酵素１単位（１Ｕ）は、上記反応条件下において１分間に１μmol のＤ−ガラクツロン酸相当の還元糖を生成する量とした。
【００２２】
（１）基質特異性
ポリガラクツロン酸の代わりにエステル化度の異なるペクチン（２８、６７、９３％）を基質とし、標準活性測定法により反応速度を調べた。エステル化度２８％のペクチン（シグマ；ｌｏｔ７４Ｈ１０９２）では約５０％、エステル化度６７％のペクチン（シグマ；ｌｏｔ７４Ｈ１０９３）に対しては約５％の反応速度で分解したが、エステル化度９３％のペクチン（シグマ；ｌｏｔ２５Ｈ０１２３）に対しては、本条件下で分解活性は認められなかった。
次に基質として３０cmのしつけ糸（金鈴印）１本（約２５mg）を用い、市販の衣料用洗剤溶液〔０．０６７％（ｗ／ｖ）〕及び酵素（０．２Ｕ）を添加し、３０℃、１時間反応を行った。反応液（２mL）を遠心分離し、上清液中に遊離したペクチンをオルシノール塩酸法により測定した。その結果、反応液中に約４５μｇのペクチン遊離が認められた。木綿繊維表面のプロトペクチンに作用しＡタイプに属するプロトペクチナーゼ活性を有していた。
【００２３】
（２）基質の分解様式
５０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．５）、０．２％ポリガラクツロン酸、０．２mM塩化カルシウムからなる反応液に０．０５Ｕの酵素を添加し、全量を０．２５mLとした。３０℃、３０分間反応させた液を薄層クロマトプレート（kiesel gel  ６０：メルク）に約１０μＬスポットし、ｎ−ブタノール：酢酸：水＝５：２：３（ｖ／ｖ）の溶媒系にて展開を行った。反応物の検出にはアニスアルデヒド−硫酸溶液を用い、プレートに噴霧後、１００℃、１０分間乾燥器中で発色させた。その結果、反応生成物としてジガラクツロン酸のみが検出され、本酵素はエキソ型のポリガラクツロナーゼであった。
また、２ｇのしつけ糸、０．０６７％市販衣料用洗剤、１０mMグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH１０．５）から成る反応液に２Ｕの酵素を添加し、全量を２０mLとし、３０℃で１〜８時間反応させた。経時的にサンプリングを行い、上記の方法により薄層クロマトグラフィーを行った結果、反応１時間後からモノガラツクロン酸及びジガラクツロンが検出された。このことからプロトペクチンに対してもエキソ型に作用していた。
【００２４】
（３）ポリガラクツロナーゼ活性の最適反応pH
マックルベイン氏緩衝液（pH５〜７）、トリス−塩酸緩衝液（pH７〜９）、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH９〜１１）の各緩衝液（１００mM）を用いて最適反応pHを調べた結果、本酵素はpH８．０のトリス−塩酸緩衝液中で最も高い反応速度を示し、また、pH５〜９の広範囲で最大活性の５０％以上の活性を示した（図１）。
【００２５】
（４）プロトペチクナーゼ活性の最適反応pH
基質として３０cmしつけ糸（金鈴印）１本（２５mg）を用い、マックルベイン氏緩衝液（pH５〜７）、トリス−塩酸緩衝液（pH７〜９）、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH９〜１１）の各緩衝液（５０mM）、０．４mMの塩化カルシウムを含む反応液（２mL）にポリガラクツロナーゼ（０．２Ｕ）を添加し、３０℃、１時間反応を行い上清液中に遊離したペクチンをオルシノール塩酸法により測定した。その結果、本酵素はpH８．０のトリス−塩酸緩衝液中で最も高い反応速度を示した。また、pH５から１１の広範囲で最大活性の３０％以上の活性を示した（図２）。
【００２６】
（５）最適反応温度
１００mMトリス−塩酸緩衝液（pH８．０）中、１０℃〜８０℃の各温度で酵素反応を行い、最適反応温度を調べた結果、本酵素は５０℃付近に最適反応温度を示し、４０℃〜６０℃の範囲で最大活性の５０％以上の活性を示した。また、１mMの塩化カルシウムを反応系に添加すると最適反応温度は、５５℃付近にシフトすると共に高温側での反応速度を高めた。即ち、４０℃〜７０℃の範囲において最大活性の５０％以上の活性を示した（図３）。
【００２７】
（６）安定pH範囲
マックルベイン氏緩衝液（pH２〜８）、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH７〜１１．５）、塩化カリウム−水酸化ナトリウム緩衝液（pH１０〜１２．５）の各緩衝液（５０mM）中に本酵素を加え、３０℃、３０分間恒温した後、残存活性を測定した結果、本酵素はグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH９．５）中での残存活性を１００％とした場合、pH７〜１１．５の範囲で８０％以上の残存活性を示した（図４）。尚、各処理において１mMの塩化カルシウムを添加しても酵素の安定性の増大に影響を与えなかった。
【００２８】
（７）耐熱性
５０mMトリス−塩酸緩衝液（pH８．０）中に本酵素を添加し、５℃〜８０℃の各温度で３０分間恒温した後の残存活性を測定した。本酵素は、この条件下において５０℃まで非常に安定であり、６０℃以上で急激に失活した（図５）。尚、各温度において１mMの塩化カルシウムを添加しても酵素の安定性には影響を与えなかった。
【００２９】
（８）分子量
ａ．ゲル濾過法：１００mM塩化ナトリウムを含む２０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．０）にて平衡化したトヨパールＨＷ５５カラム（１．５×６５cm）に本酵素を載せ約３６mL／ｈの流速で溶出を行った。標準タンパク質としてカタラーゼ（２３２０００）、アルドラーゼ（１５８０００）、牛血清アルブミン（６７０００）、卵白アルブミン（４３０００）を用い、それぞれの溶出液量と分子量から検量線を作製し、本酵素の分子量を求めたところ約１０５０００と推定された。ｂ．ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法：ゲル濾過法により溶出された酵素活性画分を濃縮し、７．５％アクリルアミドゲルを用いてＳＤＳ−電気泳動を行った。標準タンパク質としてミオシン（２０００００）、β−ガラクトシダーゼ（１１６２００）、ホスホリラーゼ（９７４００）、牛血清アルブミン（６７０００）を用い、それぞれの移動度と分子量から検量線を作製し、本酵素の分子量を求めた結果、約１０３０００と推定された。
【００３０】
（９）等電点
ＰＡＧ−Ｐｌａｔｅ（ファルマシア；pH３．５〜９．５）を用いて本酵素の等電点電気泳動を行った。泳動したゲルを１０mMリン酸緩衝液（pH７．０）中に浸した後、ポリガラクツロン酸を含む寒天プレート〔１．０％ポリガラクツロン酸、０．１％リン酸１水素カリウム、１．０％塩化ナトリウム、５０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．５）、１．０％寒天〕上に置いた。３７℃、３時間恒温した後、ゲルを取り去り、１％セチルトリメチルアンモニウムブロマイド溶液を注いだ。約１０分後に活性を伴う溶解斑が生じた部分のタンパク質移動度と標準タンパク質（バイオラッド）の等電点と移動度から得られた検量線により本酵素の等電点は、pH４．６付近であった。
【００３１】
（１０）アミノ末端配列
本酵素のＳＤＳ−電気泳動後、イモブロン膜（ミリポア）へタンパク質をブロッティングし、クマーシーブリリアントブルー溶液にて染色した。分子量１０３０００付近のタンパク質バンド部分を切り出し裁断した後、プロテインシークエンサー（４７６Ａ型：アプライドバイオシステム）を用いてアミノ末端配列を決定した。その結果、本酵素の９番目までのアミノ末端配列は、Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−（Ｐｒｏ  ｏｒ  Ｓｅｒ  ｏｒ  Ａｌａ）−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｐｒｏであった。
【００３２】
（１１）各種化合物の影響
本酵素の活性に及ぼす各種化合物の影響は、各化合物を所定濃度になるよう反応系へ添加し、活性測定を行うことにより調べた結果、本酵素は、ｐ−クロロマーキュリ安息香酸（０．５mM）で約６０％、クエン酸（５mM）で約３５％阻害された。ＥＤＴＡ（２、５mM）では、約２０％、７５％阻害、ＥＧＴＡ（５mM）では約６５％とそれぞれ阻害されたが、完全に失活するものではなくキレート剤耐性を示した（表１）。
【００３３】
【表１】
0004395243.tif 000002
【００３４】
（１２）界面活性剤の影響
各種界面活性剤を０．２％（ｗ／ｖ）になるように添加した反応系において、酵素の反応性を調べた結果、高濃度の界面活性剤の存在下においても本酵素は、対象に比べ８０％以上の活性を発現した（表２）。
【００３５】
【表２】
0004395243.tif 000003
【００３６】
（１３）金属塩の影響
各種金属塩を標準反応系に１mM添加し、酵素活性に与える影響を調べた結果、本酵素は塩化カルシウム、塩化マグネシウム、塩化マンガン、塩化第１鉄、塩化第２鉄により、対照に比べ１１６〜１３５％と活性化された。一方、塩化亜鉛、塩化銅により約９５％、８５％とそれぞれ阻害を受けた。次いで塩化ニッケル、塩化コバルトによって約７０％、６０％の阻害を受けた（表３）。
【００３７】
【表３】
0004395243.tif 000004
【００３８】
上述したポリガラクツロナーゼ産生菌、例えばBacillus属に属する微生物、好ましくはBacillus sp. KSM-P358株(FERM P-17560)等から、例えばショットガン法、ＰＣＲ法で目的とする遺伝子をクローニングする方法等により、本発明のポリガラクツロナーゼをコードする遺伝子をクローニングすることができる。
【００３９】
本発明のポリガラクツロナーゼ遺伝子は、例えば、配列番号１に示すアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードするものが好ましい。ここで、該アミノ酸配列中のアミノ酸の欠失、置換又は付加（以下、変異ということがある）は、ポリガラクツロナーゼ活性を失わない限り、その変異アミノ酸の数及び部位は制限されるものではない。また、配列番号１のアミノ酸配列におけるＮ末端には、１〜数個のアミノ酸が付加又は欠失していてもよい。
【００４０】
配列番号１に示すアミノ酸番号１〜９５３の間で、他の酵素との相同性を検討すると、いずれもエキソ型のポリガラクツロナーゼであるErwinia chrysanthemi PehX(He and Collmer, J. Bacteriol., 172, 4988 4995, 1990)、Ralstonia Solanacearum PehB(Huahg and Allen, J. Bacteriol., 179, 7369-7378, 1997)とそれぞれ２９．１％、２８．５％の相同性を示すのみであり、配列番号１に示すアミノ酸からなるポリガラクツロナーゼは、これまでに報告のない新規な配列を有する酵素である。
【００４１】
本発明ポリガラクツロナーゼ遺伝子は、上記のように配列番号１のアミノ酸配列又はその前記変異体をコードするものが好ましいが、特に配列番号２で示される塩基配列又は該塩基配列の１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有するものが好ましい。
【００４２】
ポリガラクツロナーゼ遺伝子を含む組換えベクターを作製するには、目的とする宿主内で遺伝子を発現するのに適した任意のベクターにポリガラクツロナーゼ遺伝子を組込めばよい。斯かるベクターとしては、大腸菌を宿主とする場合、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２等が挙げられ、枯草菌を宿主とする場合、ｐＵＢ１１０等が挙げられる。
【００４３】
かくして得られた組換えベクターを用いて宿主を形質転換するには、常法、例えばプロトプラス法、コンピテントセル法、エレクトロポレーション法等により行われる。宿主としては微生物が好ましく、Bacillus属（枯草菌）、Streptomyces属（放線菌）等のグラム陽性菌；Escherichia coli（大腸菌）等のグラム陰性菌；Saccharomyces属（酵母）、Aspergillus属（カビ）等の真菌等が挙げられる。
【００４４】
得られた形質転換体を培養し、当該培養液からポリガラクツロナーゼを採取すれば、ポリガラクツロナーゼを得ることができる。培養は微生物の資化可能な炭素源、窒素源その他の必須栄養素を含む培地に接種し、常法に従って行えばよい。かくして得られた培養液から、一般に知られている酵素の採取及び精製方法に準じた方法により、ポリガラクツロナーゼを得ることができる。
【００４５】
【実施例】
実施例１  ポリガラクツロナーゼ生産菌のスクリーニング
日本各地の土壌を滅菌水に懸濁したものを８０℃、２０分間熱処理し、下記組成の寒天平板培地に塗布した。３０℃の培養器で３〜５日間静置培養し、菌の生育後、冷蔵庫で冷却した。生育した菌の周辺にペクチンの分解に伴う溶解斑が検出されたものについて選抜し、シングルコロニー化を繰り返し、ポリガラクツロン酸分解酵素の生産能を検定した。このようにして得られた多くの菌株は、主にペクチン酸リアーゼを生産したが、その中でポリガラクツロナーゼ生産菌としてBacillus sp. KSM-P358株を得た。
【００４６】
【表４】
0004395243.tif 000005
【００４７】
実施例２  Bacillus sp. KSM-P358株によるポリガラクツロナーゼの生産上述のスクリーニングにより得られたBacillus sp. KSM-P358株の培養は、５００mL容坂口フラスコに５０mLの培地を加え、３０℃、２日間好気的に行った。培地組成は、０．５％（ｗ／ｖ）ペクチン、１．５％ポリペプトンＳ、０．５％酵母エキス、１．０％魚肉エキス、０．１％リン酸２水素カリウム、０．０２％硫酸マグネシウム７水塩、５０mMトリス−塩酸緩衝液（pH８．６、別滅菌）であった。培養液中に生産されるポリガラクツロナーゼ活性は、２mMＥＤＴＡを添加しペクチン酸リアーゼ活性を完全に失活させて測定を行った。この測定法により、培養液あたり２００〜４００Ｕ／Ｌの生産量を得た。
【００４８】
実施例３  ポリガラクツロナーゼの精製
Bacillus sp. KSM-P358株の培養液を遠心分離（８０００×ｇ、１５分間、４℃）し上清液（２Ｌ）を得た。これを透析膜に入れポリエチレングリコール２００００（和光純薬）をまぶして内液の濃縮を行った。更に限外濾過用モジュール（ＡＩＰ１０１０：旭化成）により濃縮、脱塩を行った。得られた濃縮液（１００mL）は１mMジチオスレイトールを含む２０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．０）にて平衡化しておいたＤＥＡＥトヨパール６５０Ｍカラム（３×１５cm：東ソー）に添着した。約５００mLの平衡化緩衝液を用いて非吸着タンパク質を洗浄溶出させた後、０から０．２Ｍ塩化ナトリウムを含む緩衝液（５００mLずつ）を用い、濃度勾配溶出法により吸着タンパク質の溶出を行った。約０．１Ｍの塩化ナトリウム濃度付近にポリガラクツロナーゼ活性が溶出された。次いで、ＤＥＡＥトヨパール６５０Ｍカラムで同様の精製操作を行い、ペクチン酸リアーゼ活性を含まないポリガラクツロナーゼ画分を得た（１００mL）。本活性画分を限外濾過（ＹＭ１０メンブレン：アミコン）により濃縮し、０．１Ｍ塩化ナトリウム及び１mMジチオスレイトールを含む２０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．０）にて平衡化しておいたトヨパールＨＷ５５カラム（１．５×６５cm：東ソー）へ供した。同緩衝液にて溶出されたポリガラクツロナーゼ活性画分を集めた（１０mL、４２Ｕ、１４mgタンパク質）。
上記精製操作により得られたポリガラクツロナーゼ画分は、前述の酵素学的性質を示した。
【００４９】
実施例４  Bacillus sp. KSM-P358株染色体ＤＮＡの調製
Bacillus sp. KSM-P358株をポリペプトンＳ（日本製薬製）主成分とする液体培地にて、３０℃で一晩振盪培養し、種培養とした。この種培養液を同様の培地に接種し、約８時間振盪培養したものを主培養とした。主培養液から遠心分離にて回収した菌体から、SaitoとMiuraの方法（Biochim. Biophys. Acta, 72, 619-629, 1963）にて染色体ＤＮＡを調製した。
【００５０】
実施例５  Bacillus sp. KSM-P358ポリガラクツロナーゼの部分アミノ酸配列
１）Ｎ末端アミノ酸配列の決定
Bacillus sp. KSM-P358株の培養液から各種クロマトグラフィーによって精製した酵素を、プロテインシークエンサー476A（PEアプライドバイオシステム社製）に供し、Ｎ末端アミノ酸配列を９残基決定した。得られた配列は、Lys-Ser-Glu-Gly-(Pro or Ser or Ala)-Pro-Asn-Ala-Proであった。
【００５１】
２）リジルエンドペプチダーゼ分解による中間アミノ酸配列の決定
精製酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ソディウムドデシル硫酸−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）を行った１２．５％のポリアクリルアミドゲルから回収した酵素に対して、重量比で約１０００分の１のリジルエンドペプチダーゼ（和光純薬工業製）を添加し、６０mMのトリス−塩酸緩衝液（pH９）中にて２５℃で１５時間恒温した。UL TRAFREE MCスピンカラム(0.45μｍＰＶＤＦ膜、ミリポア社製)にて回収した試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、Milliblot type I(ミリポア社製)を用いてＰＶＤＦ膜ヘエレクトロプロティングし、転写後のＰＶＤＦ膜をクマシーブリリアントブルーにて染色した。染色後のＰＶＤＦ膜から染色されたタンパク質バンドを切り出し、プロテインシークエンサー476Aに供した。リジルエンドペプチダーゼ部分分解物から得られたアミノ酸配列(中間アミノ酸配列Ａ)は、Asn-Ile-Leu-Phe-Arg-Asn-Asn-Ala-Leu-Glu-Glyであった。
【００５２】
３）Ｖ８プロテアーゼ分解による中間アミノ酸配列の決定
精製試料に０．０１％となるようにＳＤＳを加え１００℃にて１０分間煮沸したものに、重量比で約６０分の１のＶ８プロテアーゼ(ベーリンガーマンハイム社製)を加え、110mMのトリス−塩酸緩衝液(pH8.5)中にて、１０℃で１５時間恒温した。回収した試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、エレクトロプロティング後のＰＶＤＦ膜からタンパク質バンドを切り出し、プロテインシークエンサー476Aに供した。Ｖ８プロテアーゼ部分分解物から得られたアミノ酸配列(中間アミノ酸配列Ｂ)は、Phe-Glu-(Thr or Asn or Arg)-Ala-Arg-Pro-Tyr-(Gly or Pro)-(Ala or Ile)-Gly-Ala-Proであった。
【００５３】
実施例６  Ｐ３５８ポリガラクツロナーゼ遺伝子のクローニング
精製酵素のＮ末端アミノ酸配列から配列番号３に示した混合塩基を用いたプライマーを作製した。同様に、リジルエンドペクチダーゼ部分分解物から得られた中間アミノ酸配列Ａをもとに、配列番号４、５に示したプライマー、Ｖ８プロテアーゼ部分分解物のアミノ酸配列Ｂから配列番号６に示したプライマーを作製した。
これらのプライマーを使用し、実施例４で調製したBacillus sp. KSM-P358株染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを実施した。配列番号３、４のプライマーの組合せと配列番号５、６のプライマーの組合せにて、それぞれ約１．３kbp、１．１kbpの増幅断片が得られ、塩基配列の解析の結果、推定されるアミノ酸配列がそれぞれのアミノ酸配列と一致したことから、ＰＣＲ増幅断片は目的とするKSM-P358ポリガラクツロナーゼ遺伝子の一部であることが判明した。
これらＰＣＲ増幅断片の塩基配列をもとに配列番号７、８に示すプライマーを作製し、これらのプライマーと染色体ＤＮＡを制限酵素EcoR Iで切断したのちに、T4 DNA Ligaseにて自己閉環させたものを鋳型ＤＮＡとして、inverse ＰＣＲを実施した。このようにして得られた約３．０kbpの増幅断片の塩基配列の解析を行い、決定した塩基配列から配列番号９、１０に示すプライマーを作製し、これらとBacillus sp. KSM-P358株染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行い、全長約４．５kbpのP358ポリガラクツロナーゼ遺伝子断片を取得した。
【００５４】
実施例７  Ｐ３５８ポリガラクツロナーゼ遺伝子塩基配列の決定
実施例６で調製したＰＣＲ増幅断片０．５〜１μｇを鋳型として、BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit(PEアプライドバイオシステム社製)を用いてシークエンス解析試料を調製し、３７７ＤＮＡシークエンサー(PEアプライドバイオシステム社製)にてＰ３５８ポリガラクツロナーゼ遺伝子の塩基配列を決定した（配列番号１３）。その結果、Ｐ３５８ポリガラクツロナーゼは配列番号１３の塩基番号５４０〜３４７９に示すように２９４０残基の塩基配列によりコードされ、９８０アミノ酸残基より構成される酵素であることが判明した。
さらに、アミノ酸配列中には、精製酵素から決定したＮ末端アミノ酸配列とプロテアーゼ部分分解物から決定した中間アミノ酸配列が確認された。Ｎ末端アミノ酸配列から終止コドン(TAA)までの９５３アミノ酸からなるポリガラクツロナーゼの分子量は、１０３，８１０  Ｄａと推定された。
【００５５】
実施例８  Ｐ３５８ポリガラクツロナーゼ発現プラスミドの作製
実施例７で決定したＰ３５８ポリガラクツロナーゼ遺伝子の塩基配列を基に、配列番号１１、１２に示す配列のプライマーを作製し、実施例４にて調製したBacillus sp. KSM-P358株染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを実施し、Ｐ３５８ポリガラクツロナーゼをコードするＤＮＡ断片を増幅した。
この際、使用するプライマーにはプラスミドベクターpHY300PLK(ヤクルト社製)のマルチクローニングサイトに効率よくクローニングすることが可能となるように、制限酵素SalI、XbaIの認識配列を付加させた。
プラスミドベクターpHY300PLK及びP358ポリガラクツロナーゼ遺伝子のＰＣＲ増幅断片を制限酵素SalI、XbaIにて消化した後、GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit(ファルマシア社製)を用いた精製を行った。
精製試料を重量比で１：１となるように混合した後、T4 DNA Ligaseにより結合させ、この結合サンプルを用いて、E. coli HB101コンピテントセル(宝酒造社製)の形質転換を行った。得られた形質転換体の中から任意の形質転換体を選別し、選別した形質転換体からプラスミドの調製を行い、このプラスミドを制限酵素SalI、XbaIにて消化した。アガロース電気泳動にてＰＣＲ増幅断片の挿入が確認されたプラスミドをpHYK358PECとした（図６）。
【００５６】
実施例９  pHYK358PECを用いた枯草菌形質転換体によるポリガラクツロナーゼの生産
プラスミドpHYK358PECを用い、プロトプラスト法(Chang and Choen. Mol. Gen. Genet., 168, 111-115, 1978)にてBacillus subtilis ISW1214株(ヤクルト社製)の形質転換を行った。得られた形質転換体を、１５μｇ／mLのテトラサイクリンを添加したLB培地に接種し、３０℃で一晩振盪培養を行い種培養とした。この種培養液をポリペプトンＳあるいはコーンスティープリカー、マルトースを主成分とする主培養培地４０mLに１％（v/v)になるように接種し、３０℃、１２０rpmで４日間、振盪培養を行った。組換えポリガラクツロナーゼの生産量は、この培養条件で約１０００〜３０００Ｕ／Ｌであった。
【００５７】
実施例１０  組換えポリガラクツロナーゼの特性
実施例９で得られた培養液上清を陰イオン交換樹脂に吸着させ、塩化ナトリウム濃度勾配にて溶出させて精製し、この精製した組換え酵素の性質について検討した結果、以下に示すように、その性質は野生型のP358ポリガラクツロナーゼの性質とよく一致した。
【００５８】
１）最適反応ｐＨ
標準酵素活性測定法のかわりに、５０mMトリス−塩酸緩衝液(pH7〜9.5)、５０mMグリシリン−水酸化ナトリウム緩衝液(pH9〜11)を用い、最適反応pHを調べたところ、本酵素はトリス-塩酸緩衝液中(pH8.0)で最も高い反応速度を示した。
【００５９】
２）分子量
電気泳動用標準タンパク質(バイオラッド社製)を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ(12.5％アクリルアミドゲル)にて分子量を求めた結果、本酵素の分子量は約１０５kDaであると推定された。
【００６０】
３）プロトペクチナーゼ活性
３０cmしつけ糸(金鈴印)１本(25mg)を基質に用い、０．４mM塩化カルシウムを含む５０mMグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液(pH10)を酵素反応液として、これに０．２Uの酵素(ポリガラクツロナーゼ活性)を加え最終液量を２．０mLとした。３０℃で１時間の反応を行った後、上清に遊離したペクチン質をオルシノール塩酸法により測定した。結果、上記条件において０．２Uのポリガラクツロナーゼあたり約４０μｇのペクチンを遊離することが認められた。
【００６１】
【発明の効果】
本発明のポリガラクツロナーゼは、ポリガラクツロン酸に対しエキソ的に作用するが最適反応pHをpH８付近に有し、アルカリ性領域においても活性を維持すること、またプロトペクチナーゼ活性を示すことから衣料用洗剤酵素、繊維処理用酵素として有用である。また、本発明のポリガラクツロナーゼ遺伝子を用いることにより、当該ポリガラクツロナーゼを単一且つ大量に生産することが可能となる。
【００６２】
【配列表】
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【００６３】
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【００７０】
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【００７２】
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【００７３】
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【００７４】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のポリガラクツロナーゼ活性に及ぼすpHの影響を示す図である。
【図２】本発明のプロトペクチナーゼ活性に及ぼすpHの影響を示す図である。
【図３】本発明のポリガラクツロナーゼ活性に及ぼす温度の影響を示す図である。
【図４】本発明のポリガラクツロナーゼ安定性に及ぼすpHの影響を示す図である。
【図５】本発明のポリガラクツロナーゼ安定性に及ぼす温度の影響を示す図である。
【図６】ポリガラクツロナーゼ遺伝子(Bacillus sp.KSM-P358株由来)のプラスミドベクター(pHY300PLK)への導入と構築したポリガラクツロナーゼ発現分泌ベクターpHYK358PECを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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