(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の構造を有する化合物（ここで立体記述子は相対立体化学を表す）。
【化１】
0004395549.tif 000005
【請求項２】
有効量の医薬上許容される担体と、下記の構造を有する化合物とを含む、医薬組成物。
【化２】
0004395549.tif 000006
【請求項３】
４−クロロエチル−５−メチル−１−（（シクロヘキシ−２−エニル）（ヒドロキシ）メチル）−６−オキサ−２−アザビシクロ（３．２．０）ヘプタン−３，７−ジオン。
【請求項４】
下記の構造を有する化合物。
【化３】
0004395549.tif 000007
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、放線菌目に属する海洋細菌の新規分類群の発見、ならびに医薬組成物、農薬、免疫調節因子、酵素及び酵素阻害物質として使用するためのタンパク質、二次代謝産物、及び生体分子を発見及び生成するためのこの分類群の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
放線細菌綱に属する微生物（一般に放線菌と呼ばれる）は、分類学上はグラム陽性細菌に属しており、地球環境において広範囲に存在している。放線菌は、多様な生物学的に活性な代謝産物を多く生じる多産な原料である。これらは、食品産業から製紙業に至る様々な産業的用途で使用するための薬品、農薬、低分子量酵素阻害物質、免疫調節因子、及び酵素を含む多くの有用な生成物の原料であった。またこれらの微生物は、病原体からの保護及び生長促進のための手段として農業においても有用であった。過去６０年の間に土壌放線菌から多くの有用な物質が発見されたが、一般的な土壌種は既に発見された代謝産物を生成することが多いので、新規生成物の収率は激減した。この理由により、有用な生成物の新しい原料を提供するような新しい放線菌分類群を発見するための多大な努力が行われてきた（Ｂｕｌｌら，２０００）。
【０００３】
放線細菌は、数多くある細菌の綱の１つである。放線細菌綱はさらに６つの目（１０の亜目に分類することができる放線菌目を含む）に細かく分類することができる。分類学的新規性を決定する古典的な方法は、形態学的特徴及び生理学的特徴、例えば色、菌糸体の有無、菌糸の枝分かれの特徴、胞子のパターン及び運動性、温度変化に対する耐性、塩度及びｐＨ、ならびに様々な基質の利用能等を含む。これらの特徴は、今なお分類学的分析の重要な構成要素であるが、菌株の独自性を確立するための、新しいより信頼できる方法は１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列分析であり、これは単離株についての進化論的情報も提供する（Ｓｔａｃｋｅｂｒａｎｄｔら，１９９７）。
【０００４】
放線細菌綱の中のある菌株の構成員は、ほぼ完全な１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列を放線細菌綱の最も深く枝分かれしている一員と比較して測定した際に１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列の類似性値が８０％を超えること、及びサインヌクレオチドが存在することによって示される（Ｓｔａｃｋｅｂｒａｎｄｔ，１９９７）。ある分類群に特徴的なサインヌクレオチドは、その分類群のメンバーの９５％を超えるメンバーにおいてそのヌクレオチドが存在することを基準に選択される。１６Ｓサインヌクレオチド配列は、細菌目の定義から、科から属へのさらに細かい分類に至るまで、様々な分類レベルについて使用することができる。この方法は、細菌の進化の効果的な数学的モデル、及び分類体系の中の分類学的地位を細菌に割り当てるための、主観的ではなく客観的な法則を提供する。
【０００５】
地表の７０％を海が覆っているという事実にもかかわらず、これまでに発見された全ての既知の放線菌属は陸生のものであった。実際に、これまでに海洋放線菌はたった１種しか記載されておらず（Ｈｅｌｍｋｅ及びＷｅｙｌａｎｄ，１９８４）、この種は周知の陸生属に属するものである。海洋堆積物から幾つかの放線菌が培養されたが、海洋単離株は、海に流出した休眠陸生胞子に由来するものと広く信じられている（Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ及びＨａｙｎｅｓ，１９８４）。「流出（ｗａｓｈ−ｉｎ）」説が唱えられているのは、海洋単離株の生長に海水を必要とせず、陸生種と密接に関係しており、また陸から距離が離れるにつれて数が減少する傾向にあるからである（Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ及びＷｉｌｌｉａｍｓ，１９８３）。多くの陸生放線菌は高い塩度及び圧力に耐えることができるため、またこれらの分布及び生理機能により、多くの放線菌が海中に洗い流され、これらが胞子として長期間生存することができる場所となる堆積物の中で回収されたと結論づけられた（Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ及びＨａｙｎｅｓ，１９８４）。これらの形式の研究によって、海洋放線菌は陸上の放線菌とは大きな違いがなく、従って新規な産業製品の原料としての利用価値がほどんどないと一般的に信じられるようになった。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要約）
本発明は、新属名Ｓａｌｉｎｏｓｐｏｒａという名が提案されている最初の主要な偏性海洋放線菌分類群の、発見、単離及び特徴付けである。この属に属するメンバーは、以下に挙げる一連の主な特徴によって簡単に識別される：
１．ナトリウム（海水）を生長のための必須要件とすること；
２．５つの１６Ｓ  ｒＲＮＡサインヌクレオチド（表３）のうち少なくとも４つが存在すること、及び１６Ｓ  ｒＲＮＡ系図法を用いるとＳａｌｉｎｏｓｐｏｒａ分岐群（クレード）と系統発生学的に密接な関連があること；
３．典型的には以下に挙げる形態学的特徴を含む特徴を有すること
ａ)コロニーの色がオレンジ色から褐色である、
ｂ)気中菌糸体が全くもしくは殆どない、
ｃ)コロニー表面を黒くする、拡散性のメラニン様色素及び胞子、
ｄ)単独でまたは塊になって生成される胞子を有する、細かく分かれた断片化されていない菌糸；
４．２０００年９月２７日にＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ；１２３０１  Ｐａｒｋｌａｗｎ  Ｄｒｉｖｅ；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，メリーランド  ２０８５２）の番号ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−２５０１とされた基準株に匹敵すること。
【発明の効果】
【０００７】
Ｓａｌｉｎｏｓｐｏｒａ群の発見は、海洋環境における放線菌についてのこれまでの概念に異論を呈するものであり、独特な偏性海洋放線菌の主要な集団が海の堆積物の中に広く存在するという初めての決定的証拠を提供する。Ｓａｌｉｎｏｓｐｏｒａ群のメンバーの化学的研究により、新規化合物が単離され、また生物学的に活性な抽出物が例外的に高い収率で回収された。このことは、これらの微生物が薬物の発見及び他の産業的用途に利用できることを示している。
【０００８】
本発明は、医薬組成物、農薬、免疫調節因子、酵素、及び酵素阻害物質において使用するためのタンパク質、二次代謝産物及び他の生物分子を発見ならびに作製するためのこの新規分類群の使用に関する。放線菌自体から活性分子を精製することもできるし、生育培地から代謝産物を精製してもよい。この属は、多くの薬理活性（例えば抗真菌性、抗菌性及び抗癌性）を示す活性生体分子を豊富に生ずる多産な原料である。抽出物及び生成物を当業者に周知である多くのアッセイで用いて、放線菌に由来する様々な化合物の活性を測定することができる。
【０００９】
本発明は、内在性放線菌株環境において又は他の生物において生体分子を生成するための、上記分類群のゲノムの使用に関する。遺伝子は、構成的もしくは誘導的プロモーターの制御下で、単独で又は集団で発現させてもよい。本発明の遺伝子は、組換え株又は過剰生産株としての異種宿主内で発現させてもよい。また、転写を制御するために、異種状況においてこのゲノムの他の部分、例えば転写調節エレメント等を用いることもできる。このゲノムは野生型であっても突然変異型であってもよい。突然変異は、自然発生的なものであってもよいし、当業者に周知である方法によってランダムに又は部位特異的に作製してもよい。
【００１０】
本発明は、異種生物から遺伝子産物を生成するための上記分類群の使用に関する。遺伝子を単独で又は集団で本発明の放線菌株の中に挿入して、タンパク質、二次代謝産物又は他の生体分子を発現させることができる。化合物は放線菌又は生長培地から単離することができる。
【００１１】
本発明は、病原体及び害虫からの保護、殺虫剤、除草剤、殺菌剤、ならびに農業及び水産養殖における生長促進のための、上記分類群の使用である。本発明の放線菌は、植物環境において有害な微生物に対抗することができ、非毒性の植物保護手段を提供するものである。
【００１２】
本発明は、添付の図面（図中において同じ参照番号は同じ部分を示す）を参照しながら、以下の発明の例示的な実施形態の詳細な説明を読むことにより、より深く理解できるであろう。
出願者は、特許手続きのための微生物寄託の国際認識に関するブダペスト条約の条項の下に、アメリカン・タイプ・カルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（１０８０１  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＢｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ヴァージニア州  ２０１１０−２２０９  米国）、および国際寄託当局（ＩＤＡ）に、下記の生体寄託を行った：
定義：  Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅ  Ｓａｌｉｎｏｓｐｏｒａ，系統  ＣＮＨ６４６
ＡＴＣＣ番号：  ＰＴＡ−２５０１
寄託日：  ２０００年９月２７日
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
（詳細な説明及び好適な実施形態）
Ｓａｌｉｎｏｓｐｏｒａ株は、海洋堆積物から一様に単離することができ、特徴的なサインヌクレオチド、生長のための海水（より厳密にはＮａ＋）の絶対的必要性、及び形態学的特徴によって区別される。大西洋、紅海、及びコルテス海から回収した熱帯及び亜熱帯の沿岸堆積物から５回の別々の機会にこの群に属する単離株を得た。このことは、これらの株が世界中に分布していることを示す。これらの研究で、合計１４７個の別々の堆積物サンプルを評価し、そのうち５１個が合計１８２種類のＳａｌｉｎｏｓｐｏｒａ単離株を産生した。これらの単離株のうち７つについて、徹底的な生理学的及び系統発生的評価を行った（表１）。続いて、更なる回収物から１，０００を超える株を得た。
【００１４】
株の天然の所在地：Ｓａｌｉｎｏｓｐｏｒａの組織形態を有する１，０００を超える株を代表する厳選された多様な単離株を用いて、徹底的な系統発生学的分析及び生理学的分析を行った。リストアップした全ての株について、ほぼ完全な（遺伝子全体の９５％を超える）１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列を得た。ＣＮＢ３９４及びＣＮＢ５１２は、海洋由来Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ（ミクロモノスポラ）単離株であり、分析を行ったところ、Ｓａｌｉｎｏｓｐｏｒａ属とＭｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ属とでは基本的な違いがあることが分かった。
【００１５】
【表１】
0004395549.tif 000002
【００１６】
テストした１８２株のＳａｌｉｎｏｓｐｏｒａ全ては、海水を脱イオン水に置き替えた寒天培地上で増殖することができなかった。系統分類学上異なる７株をさらに特徴付けたところ、ナトリウムを生長のために必要とする（偏性海洋細菌の一般的な生理学的特徴である）ことが分かった（表２）。ナトリウムの必要性については、グラム陰性海洋細菌において広範囲な研究が行われており、高度に進化した海洋適応構造（例えば呼吸依存性ナトリウムイオンポンプ及び／又はナトリウム依存性膜輸送メカニズム等）が存在することを示す。海水（ナトリウム）を生長のために必要とするのは、グラム陽性細菌においては極めて稀であり、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｎｏｎａｓｃｅｎｓを例外とする他は（Ｈｅｌｍｋｅ及びＷｅｙｌａｎｄ，１９８４）、放線菌についてはこれまで一度も報告されていない。
【００１７】
ナトリウム依存性生長についてのアッセイ：Ｓａｌｉｎｏｓｐｏｒａ（太字）及び海洋由来Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ単離株（ＣＮＢ３９４、ＣＮＢ５１２）における基本的な生長の差を示す生理学的生長分析を表２に示す。培地Ｍ１（この培地はＳａｌｉｎｏｓｐｏｒａ属及びＭｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ属の生長及び維持に最適であることが分かった）上でテストを行った。単離株は、漬けこんだ無菌綿棒を用いて栄養菌糸を各分析培地に接種した後、この培地を２５〜２８℃にて６〜８週間インキュベートしてスクリーニングした。ライカ立体鏡を用いて倍率１０−６４Ｘで定期的に生長をチェックした。天然海水（ＮＳＷ）または人工海水（ＡＳＷ  ＮＡ＋）の中で、全ての株は同じように良好に生長した。脱イオン水（ＤＩ）を用いて調製したＭ１上では、どのＳａｌｉｎｏｓｐｏｒａ単離株についても検出可能な生長は観察されなかった。２つのＭｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ単離株ＣＮＢ３９４及びＣＮＢ５１２は、海水ベースの培地に比べてＭ１  ＤＩ水でより良く生長した。生長のためのナトリウムの必要性を、調製した全てのナトリウム源を当モル量のカリウムで置換したＡＳＷで調製したＭ１（Ｍ１，ＡＳＷ  Ｋ＋）上でテストした。塩度３５の海水（この研究においてＭ１，ＮＳＷ培地で使用）におけるナトリウム濃度は４５０ｍＭである。塩化ナトリウム許容量の上限を決定するために、Ｍ１  ＤＩ水（塩化ナトリウムを加えて最終ナトリウム濃度を６００ｍＭ及び１０００ｍＭとしたもの）上での株の生長についてテストした。Ｓａｌｉｎｏｓｐｏｒａ単離株は、これらの高いナトリウムレベルでは生長を示さなかったが、海洋由来ＭｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａＣＮＢ３９４及びＣＮＢ５１２については、生長がはっきり表れた。
【００１８】
【表２】
0004395549.tif 000003
【００１９】
Ｓａｌｉｎｏｓｐｏｒａ単離株は、生物学的に活性な二次代謝産物の注目すべき原材料であることが分かっている。これまでのところ、調査した１０５株のうちの８６％が有意な癌細胞に対する細胞障害性を有する培養抽出物を生成した（ＨＣＴ−１１６ヒト結腸癌細胞系に対するＩＣ５０値は０．００４〜１６．４μｇ／ｍｌの範囲である）。また、様々な条件下で育成した培養物の抽出物からは、有意な抗真菌活性及び抗生物活性も観察され、３０％がアンホテリシン耐性であるＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓに対して１９．５μｇ／ｍｌ以下のＭＩＣ値を示し、３５％がバンコマイシン耐性のＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍに対して２５μｇ／ｍｌ以下の抽出物最小阻害濃度（ＭＩＣ）値を示した。
【００２０】
薄層クロマトグラフィー及び液体クロマトグラフィー／質量分析法ならびに反復遺伝子外回文ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＥＰ−ＰＣＲ）によると、株によって化学的及び遺伝的にかなりの多様性があることが分かった。１つの活性抽出物をバイオアッセイにより分画したところ、サリノスポラミドＡと名付けられた強力な細胞毒を含む一連の新規な代謝産物が単離された（ＨＣＴ−１６ヒト結腸癌細胞系に対してＩＣ５０＝１０ｎｇ／ｍｌ）（図１）。この分子は、抗菌性生成物ラクタシスチンの加水分解により得られる中間生成物であるｃｌａｓｔｏ−ラクタシスチンβ−ラクトン（オムラリドとも呼ばれる）と最も密接な関係がある。サリノスポラミドＡは、融合型β−ラクトンγ−ラクトン２環式環を持つ極めて強力な抗癌物質であることが判明した最初の天然生成物である。
【００２１】
Ｓａｌｉｎｏｓｐｏｒａ群は、はじめは、バハマへの遠征中に単離した堆積物から得た放線菌を系統発生論的に特徴付けた後に認められた。形態学的に異なる８つの株から得た部分的な１６Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子配列は、２０７位〜４６８位の間に４つのサインヌクレオチドが存在することを示した（大腸菌の付番方式；表３）。その後、これらのサインは、部分的に配列決定された４５株のＳａｌｉｎｏｓｐｏｒａ全てにおいて発見された。最も高い系統発生的多様性を示す２株（ＣＮＨ６４３及びＣＮＨ６４６）のほぼ全部を配列決定したところ（それぞれＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ０４０６１９及びＡＹ０４０６２０、これもまたこのグループに特徴的である１つの更なるサインヌクレオチド（１４５６位）を有することが分かった（表３）。これらの株から得た配列を整列させて系統発生論的分析を行うと、これらがＭｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ科の中で独特かつ一貫した分岐群を形成することが分かる（図２）。サインヌクレオチドはこの分岐群を１つにまとめ、及び高いブートストラップ値は、この科の中の現在記載されている９つの属とは明らかな別のものである、ということを支持する。
【００２２】
１６Ｓ  ｒＲＮＡサインヌクレオチド：Ｓａｌｉｎｏｓｐｏｒａ属及びＭｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ科の中の現在承認されている９属の１６Ｓ  ｒＲＮＡサインヌクレオチドを表３に表す。４５個の異なるＳａｌｉｎｏｓｐｏｒａ単離株を部分的に配列決定したところ、２０７位〜４６８位に４つ全てのサインヌクレオチドを有することが確認された。続いて、幾つか（２０個）のＳａｌｉｎｏｓｐｏｒａ単離株に由来する１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の３'側を配列決定した後に、１４５６位のサインヌクレオチドが発見された。Ｋｏｃｈら（１９９６）により過去に公表されたものに加え、これらは、Ｓａｌｉｎｏｓｐｏｒａ分岐群の一貫性を定義し、かつこの科の他のメンバーからＳａｌｉｎｏｓｐｏｒａ分岐群を区別する、この研究において観察された本来のサインである。リボソームデータベースプロジェクトの中のＭｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ科の全ての既存メンバーを用いて、サインヌクレオチドを大腸菌の２７〜１４９２位のヌクレオチドと整列させた。Ｓａｌｉｎｏｓｐｏｒａ属のメンバーは、この属の最も深い根にあたるメンバーであるＭｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｏｌｉｖａｓｔｅｒｏｓｐｏｒａに最も近い相同性（９７．１〜９７．７％相同性）を示し、これと、過去に公表された１２個のサインヌクレオチド位置のうち８個を共有する。したがって、Ｓａｌｉｎｏｓｐｏｒａ株は、最近記載されたＶｅｒｒｕｃｏｓｉｓｐｏｒａ  ｇｉｆｏｒｎｅｎｓｉｓ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｏｌｉｖａｓｔｅｒｏｓｐｏｒａと９８．０％の類似性を示し、過去に公表された１２個のサインヌクレオチドのうちの１１個を共有する）に比べて、系統発生学上これらに最も近い近接株と、大きく異なっている。
【００２３】
【表３】
0004395549.tif 000004
【００２４】
Ｓａｌｉｎｏｓｐｏｒａ群の定常度を決定するために、バハマで追従研究を行った。４つのトランセクト（０〜３０ｍ）から収集した２０個のサンプルから、３５５種類の放線菌が観察され、これらのうち９０％以上が特徴的なＳａｌｉｎｏｓｐｏｒａの組織形態を示した。このことは、この群が、海洋堆積物中において優勢な数で存在する放線菌である可能性を示唆している。観察されたもののうち、１００株を単離してさらに研究した。Ｓａｌｉｎｏｓｐｏｒａコロニー形成単位（ｃｆｕ）の平均数は、１．２〜２．３×１０３ｃｆｕ'ｓ／ｍｌ堆積物であった。５０％を超えるＳａｌｉｎｏｓｐｏｒａ単離株が低栄養培地（Ｍ４）上で現れ、このことは、適当な単離技法を用いることの重要性を示している。８つの異なるコロニー形態型のうち代表的なもの１３個を一部配列決定し、系統発生学上最も離れた単離株（ＣＮＨ８９８）のほぼ全体を配列決定した（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ０４０６２２）。
【００２５】
１９８９年にバハマで単離されたＳａｌｉｎｏｓｐｏｒａの形態学的特徴を有する３０種の放線菌を調べたところ（Ｊｅｎｓｅｎら，１９９１）、これらの株のうち２株を除く全てが、海水（Ｎａ＋）を生長のために必須要件とすることが分かった。６つの異なる形態型を示す海水を必要とする１０株を一部配列決定したところ、２０７〜４６８位の間に５つのＳａｌｉｎｏｓｐｏｒａサインヌクレオチドを有することが分かった（表３）。これらのうち２株（ＣＮＢ４４０及びＣＮＢ５３６、それぞれＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ０４０６１７及びＡＹ０４０６１８）のほぼ完全な１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列は、これらがＳａｌｉｎｏｓｐｏｒａ分岐群の異なるメンバーであることを示している（図２）。このように、１１年間の間に３回の別々の機会にバハマ沿岸の堆積物からこの新しい分類群に属する株が単離された。このことは、これらが堆積物中の細菌集落の定常メンバーであることを示している。
【００２６】
海水を生長のために必要としなかったにもかかわらず、Ｓａｌｉｎｏｓｐｏｒａに似たコロニー形態を示す２株（ＣＮＢ３９４及びＣＮＢ５１２）は、表３のＳａｌｉｎｏｓｐｏｒａサインを持たないことが分かった。これらの株のほぼ完全な１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列を分析したところ、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ａｕｒａｎｔｉａｃａ  Ｗ２ｂ株と９９．６〜９９．９％の類似性を示し、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ属について以前公表されたサインヌクレオチド（Ｋｏｃｈら，１９９６）の全てが存在することが分かった。進化系統樹は、ＣＮＢ３９４及びＣＮＢ５１２が、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ属のメンバーであることを明らかに表している（図２）。深海サンプル（Ｗｅｙｌａｎｄ，１９８１）を含む海洋堆積物から単離されたＭｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ単離株が報告されているが（Ｔａｋｉｚａｗａら，１９９３）、Ｓａｌｉｎｏｓｐｏｒａとは異なり、この属が陸の土壌から単離されたものであることは周知であり、海水を必要とする株は今までに報告されていない。
【００２７】
バハマ（２０００年の遠征）で作製した広範囲な潮上帯トランセクト（１０ヶ所、３０サンプル）から、１０００を超える放線菌コロニー（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ科のメンバーを少数（約２％）含む）が観察されたが、これらはいずれも生長のために海水を必要としなかった。潮上帯サンプルからＳａｌｉｎｏｓｐｏｒａ株を回収できなかったことは、これらの細菌が海洋環境に限定されているという観察結果を支持するものである。
【００２８】
Ｓａｌｉｎｏｓｐｏｒａのメンバーがより広い範囲に分布しているか否かを決定するために、紅海及びコルテス海から堆積物を回収した。４２個の紅海堆積物サンプルから、Ｓａｌｉｎｏｓｐｏｒａの組織形態を有し、かつ海水を生育のための必須要件とする２２個の単離株を得た。４つの主な形態型を示す６つの単離株を一部配列決定し、１株（ＣＮＨ７２５、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ０４０６２１）のほぼ完全な１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列を図２に表す。コルテス海から回収した３６の堆積物から、海水と必要とする放線菌２０株が単離され、これら全てはＳａｌｉｎｏｓｐｏｒａの形態学的特徴を有していた。５つの異なる形態型を示す８つの株を一部配列決定し、系統発生的に異なる単離株ＣＮＨ９６４（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ０４０６２３）のほぼ全体を配列決定した（図２）。これらの結果は、Ｓａｌｉｎｏｓｐｏｒａのメンバーが海洋堆積物中に広く分布していることを明らかに示している。
【００２９】
系統発生分析及び生理学的特徴は、Ｓａｌｉｎｏｓｐｏｒａ分岐群が、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ科の中の新しい属に該当することを示している。この研究ではこの属の中の多様性が明らかになったとは思えないが、この群の中における１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列の類似性（９８．６％）及び頑強な分岐群の形態は、この属が複数の種から構成されていることを示す（図２）。Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ科の中におけるＳａｌｉｎｏｓｐｏｒａ属の位置は、科に特有な１６Ｓ  ｒＤＮＡサインヌクレオチドの完全なセットの存在によって支持される（Ｓｔａｃｋｅｌｂｒａｎｄｔ，１９９７）。
【００３０】
放線菌を深海堆積物から回収することができるという証拠があるにもかかわらず、たった１種の海洋種しかこれまで記載されておらず（Ｈｅｌｍｋｅ及びＷｅｙｌａｎｄ，１９８４）、この属を土着性海洋微生物相の中にこの群を含めることは広く受け入れられていなかった（Ｂｕｌｌら，２０００）。本発明者等のデータは、偏性海洋放線菌の独特の集団が海洋堆積物中に広範囲かつ定常的に発生するという初めての決定的な証拠を提供する。系統発生学的及び生理学的な証拠は、これらの放線菌が新しい分類群を構成し、Ｓａｌｉｎｏｓｐｏｒａという新しい属名が提案された。Ｓａｌｉｎｏｓｐｏｒａ属の株は、様々な用途に有用である生物学的に活性な二次代謝産物を多く生成する多産な原料である。
【実施例】
【００３１】
（実施例１）
サンプルの収集及び細菌の単離。ＳＣＵＢＡによって堆積物の上部１ｃｍのサンプルを収集し、スタンピング法もしくは希釈／熱ショック法、またはその両方によって処理した。希釈／熱ショック法は、以下の通り行った：湿った堆積物１ｍｌを滅菌海水４ｍｌに加え、５５℃にて６分間加熱し、勢い良く攪拌し、１０−２〜１０−４の希釈物を寒天培地（Ｍ１〜Ｍ４）上に接種した。スタンピング法の場合、湿った堆積物１０ｍｌを無菌環境で滅菌アルミニウム皿に入れ、層流フードの中で乾燥し（約２４時間）、乳棒で軽くすりつぶし、滅菌発泡栓（直径１４ｍｍ）の中に圧入し、時計回りに８〜９回スタンピングを行って連続希釈効果を与えながら、寒天培地（Ｍ１〜Ｍ４）に接種した。全ての単離培地は、１００％濾過天然海水を用いて調製した。放線菌は、一般に、２５〜２８℃にて４〜６週間インキュベートした後に現れ、革様の質感を持つ、乾燥した、または折り畳まれた外観及び気中菌糸体を有するもしくは持たない分岐状糸状体を有するコロニーとしてみなされた。全ての単離培地に、オートクレーブ後に最終濃度１００μｇ／ｍｌシクロヘキシミド及び５μｇ／ｍｌリファンピシンとなるよう添加した。
【００３２】
培地は、当業者に周知である方法によって調製し、全ての培地は海水を含んでいた。培地の配合は以下の通りである：Ｍ１＝澱粉（１０ｇ）、酵母エキス（４ｇ）、ペプトン（２ｇ）、寒天（１８ｇ）、天然海水（１Ｌ）；Ｍ２＝グリセロール（６ｍｌ）、アルギニン（１ｇ）、Ｋ２ＨＰＯ４（１ｇ）、ＭｇＳＯ４（０．５ｇ）、寒天（１８ｇ）、天然海水（１Ｌ）；Ｍ３＝グルコース（６ｇ）、可溶化キチン（２ｇ）、寒天（１８ｇ）、天然海水（１Ｌ）；Ｍ４＝可溶化キチン（２ｇ）、寒天（１８ｇ）、天然海水（１Ｌ）；Ｍ５＝寒天（１８ｇ）、天然海水（１Ｌ）。
【００３３】
（実施例２）
ＤＮＡの精製、増幅、配列決定及び系統発生分析。ゲノムＤＮＡを以下のように調製した：Ｍ１寒天上で２５〜２８℃にて２〜４週間増殖させた栄養菌糸（１０ｍｇ）を液体に浸けこみ、標準法により作製した水性清澄化溶菌液を、０．７倍量のイソプロパノールを用いて沈殿させた。次に、得られたＤＮＡペレットを７０％エタノールで洗浄し、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．５）中に再懸濁して、最終濃度を１００ｎｇ／ｍｌとした。プライマーＦＣ２７（５'−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ）（配列番号１）及びＲＣ１４９２（５'−ＴＡＣＧＧＣＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ）（配列番号２）を用いたＰＣＲにより、ゲノムＤＮＡ鋳型（１０〜５０ｎｇ）から１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列決定用鋳型を増幅した。Ｑｉａｇｅｎ  ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲクリーンアップキットを用い、この製造業者のプロトコールに従ってＰＣＲ産物を精製した。ＦＣ２７プライマーを用いてヌクレオチド８０〜４８０（大腸菌のナンバリングシステム）から形態学的に異なる複数の株の部分配列を得た。合計１０個のプライマーを用いて、選択された１６Ｓ  ｒＤＮＡアンプリコンの上側及び下側の鎖についてほぼ全体を配列決定した。次に１０個のコンティグをアセンブルして、１４７９〜１４８３個の非曖昧ヌクレオチドからなる遺伝子配列を得た。１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列の超可変領域を除外して、合計１４０８個のアラインメントされたヌクレオチドを得た。ＲＤＰ類似性マトリックスのオンライン分析により１６Ｓ  ｒＤＮＡの類似性値を計算し、ＲＤＰデータベースの中の３つの最も近接するメンバーと比較した。ＢｉｏＥｄｉｔソフトウェア（Ｈａｌｌ，１９９９）を用い、ＲＤＰの中のＭｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ科のメンバーの二次構造（Ｍａｉｄａｋら，２００１）に配列を整列させた。それぞれＣｌｕｓｔａｌ  Ｗソフトウェア及びＰＨＹＬＩＰソフトウェアパッケージ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，１９９４；Ｆｅｌｓｅｎｓｔｅｉｎ，１９９３）の中の近接結合法及び節約ベースのアルゴリズムを用いて、系統発生分析を行った。Ｔｒｅｅｖｉｅｗ  １．６．１（Ｐａｇｅ，１９９６）を用いて樹状図（図２）を描いた。
【００３４】
（実施例３）
反復遺伝子外回文ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＥＰ−ＰＣＲ）による遺伝子分析。ＲＥＰ−ＰＣＲ（Ｖｅｒｓａｌｏｖｉｃら，１９９１）を用いてＳａｌｉｎｏｓｐｏｒａ株の遺伝子の多様性を解析した。この技法は、Ｓａｌｉｎｏｓｐｏｒａ群に適用する場合、鋳型として全ゲノムＤＮＡを、及びＧＣ含量の高いグラム陽性細菌のゲノム中に存在する反復配列に特異的なＰＣＲプライマーを用いる。任意の１株のＰＣＲ産物の長さは、ゲノム内における反復配列の位置に応じて異なり、様々な長さのアンプリコンの集団ができる。これらのアンプリコン集団をアガロースゲル上で分離すると、株に特有のバンドパターンが形成される。この出力の高い方法は、遺伝子的に異なる株の検出を可能とし、遺伝的多様性を評価する方法としての１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子分析よりも感度が高い。ＲＥＰ−ＰＣＲのバンドパターンを用いて、異なる遺伝子産物を生成できる別々の群へと株を選別する。ＲＥＰ−ＰＣＲのバンドパターンに基づく株のグループ分けは、二次代謝産物の生成に基づくグループと良く相関している。
【００３５】
（実施例４）
有用な産物の生成及び単離。Ｓａｌｉｎｏｓｐｏｒａ株を、Ｍ１及びＣＫＡ（澱粉（５ｇ）、魚類水溶性物質（４ｍｌ）、メンヘーデンミール（２ｇ）、ケルプ粉（２ｇ）、キトサン（２ｇ）、海水（１Ｌ））を含む複数の海水ベースの培地中で培養した。吸着性樹脂（ＸＡＤ−１６）をこの発酵物に加えてから２４時間後に収穫した（１１日目）。濾過により樹脂を回収し、脱イオン水で濯ぎ、アセトンで溶出した。あるいは、濾過により細胞を回収し、凍結乾燥し、アセトンで抽出した。抽出物を回転蒸発により濃縮し、残渣をＣ−１８フラッシュクロマトグラフィーにかけた後、ＨＰＬＣにかけた。新規発酵生成物の構造を、１次元ＮＭＲ、２次元ＮＭＲ、及び質量分光分析法を含む様々な方法を用いて解明した。
【００３６】
（実施例５）
抗細菌アッセイ。グラム陽性及びグラム陰性細菌に対する抗菌活性を示すために、標準法を用いて、培養したＳａｌｉｎｏｓｐｏｒａ株の抽出物をテストした。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（黄色ブドウ球菌）に対する抗菌活性をテストするために用いた方法について以下に詳細に説明する。同様の方法を用いて、他の生物に対する抗微生物活性をテストする。抽出物を公知の抗生物質と比較し、相対的な活性レベルを測定した。強力な抗菌活性を有する抽出物をさらに分析して、新規代謝産物の存在について調べた。
【００３７】
手短に言うと、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの培養物を、静止期になるまで１晩増殖させた。１ｍｌあたりの細菌の数を算出し、均一数の細菌を、新鮮な培地を含む個々のウェルの中に入れた。既知の抗菌剤を含む対象化合物（例えばＤＭＳＯ中のオキサシリン、０．０４ｍｇ／ｍＬ）を１列のウェルに加え、この細菌を殺すのに必要な濃度を決定するために、そのプレートを連続希釈した。３７℃にて一晩、プレートをインキュベートして、細胞を生長させた。自動プレート読取装置（６００ｎｍ）でサンプルを読み、ＭＩＣ濃度を測定した。
【００３８】
（実施例６）
抗真菌アッセイ。Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ（鵞口瘡カンジダ菌）に対する抗真菌活性を示すために、標準法を用いて、培養したＳａｌｉｎｏｓｐｏｒａ株から抽出物をテストした。抽出物を公知の抗生物質と比較し、それらの相対的な活性レベルを測定した。強力な抗真菌活性を有する抽出物をさらに分析して、新規代謝産物の存在について調べた。
【００３９】
手短に言うと、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの培養物を、静止期になるまで１晩増殖させた。１ｍｌあたりの細胞数を算出し、懸濁液を希釈し、９６穴プレートの個々のウェルに加えた。生存率の指標として、アラマーブルーを各ウェルに加えた。テスト抽出物を１列のウェルに加え、この真菌細胞を殺傷するのに必要な濃度を決定するために、そのプレートを連続希釈した。アンホテリシン等の公知の抗真菌剤を対照として用いた。３７℃にて１２〜１５時間、プレートをインキュベートした。自動プレート読取装置（６００ｎｍ）を用いて細胞濃度を測定し、ＭＩＣ濃度を測定した。
【００４０】
（実施例７）
結腸癌細胞及び卵巣癌細胞の生長の阻害についてのインビトロアッセイ。ＭＴＳアッセイによって、ヒト結腸癌細胞系ＨＣＴ１１６及びヒト卵巣癌細胞系Ａ２７８０に対する細胞または細胞培地からの抽出物の細胞障害性についてインビトロで評価した。９６穴マイクロリットルプレートに各ウェルあたり細胞４，０００個の割合で細胞を入れ、２４時間後に、抽出物（ＤＭＳＯ又は他の適当な溶剤中に溶解したもの）を加え、連続希釈を行った。これらの細胞を該化合物と一緒に３７℃にて７２時間インキュベートした後、テトラゾリウム染料ＭＴＳを最終濃度３３３μｇ／ｍｌとなるよう加え、電子結合剤メタ硫酸フェナジンを最終濃度２５μＭとなるよう加えた。ＭＴＳは、還元されると非水溶性の青色結晶ホルマザンへと変換され、これをマイクロプレート読取装置で４９０ｎｍの吸光度で読み取った。死細胞はＭＴＳを還元することができないので、ホルマザンの量は生存細胞の数と相関関係を有する。効能の目安として、細胞の５０％の増殖を阻害するのに必要な薬物濃度であるＩＣ５０を用いた。
【００４１】
（実施例８）
抗単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）アッセイ。ＭＴＳアッセイを用いて、抗ウイルス活性を測定することもできる。２つの全く同じ９６穴プレートにベロ細胞を載せ、ウイルス及び細胞障害性対照に感染させた。一方の細胞プレートをウイルスと一緒に３７℃にて１時間インキュベートした。両方のプレートに一連の濃度の対象抽出物を塗布し、プレートを５日間インキュベートした。ＭＴＳ溶液をプレートに加え、以下に記載するようにこれらのプレートを３時間インキュベートした。マイクロプレート読取装置で４９０ｎｍの吸光度を読み取ったところ、抗ウイルス活性及び細胞障害性と相関関係があった。
【００４２】
（実施例９）
過剰生産株を作成するためのＳａｌｉｎｏｓｐｏｒａ株の化学的突然変異誘発。Ｓａｌｉｎｏｓｐｏｒａ株の化学的突然変異誘発を行い、所望の生成物を過剰生成する株を作製することができる。例えば、低レベルで抗生物質を生成する株を、対数増殖期の中頃にエチルメチルスルホン酸（ＥＭＳ）で処理する。突然変異誘発を行った培養物をプレート上に画線し、個々のクローンを単離させる。個々のクローンから、培養物を増殖させ、粗精製物として又は純粋な抗生物質を単離する。突然変異誘発を行った株により生成される対象化合物の相対的収率を元の株と比較して、過剰生産株を選択する。
【００４３】
（実施例１０）
異種遺伝子の発現。放線菌株は、他のより生長の遅い生物から二次代謝産物を生成するための宿主として有用であった（Ｔａｎｇら，２０００）。遺伝子（単独又は集団の）を、Ｓａｌｉｎｏｓｐｏｒａ株の中で発現させて、タンパク質又は二次代謝産物を生成することができる。核酸を細菌の中に導入する方法は当業者に周知である。
【００４４】
（実施例１１）
遺伝子集団の単離及び発現。多くの放線菌抗生物質（例えばアクチノルホジン、フレノリシン、グラナチシン、グリセウシン、オクタテトラサイクリン、及びテトラセノマイシン等）は、密集したポリケチドシンテターゼ（ＰＫＳ）遺伝子（Ｈｏｐｗｏｏｄ、１９９５）によって生成される。ＰＫＳ遺伝子は、２つのタイプの大きな多機能性タンパク質に分類される。ＰＫＳ  Ｉ型遺伝子において、基質は、１つのタンパク質上の多くの活性部位を通って進む。ＰＫＳ  ＩＩ型遺伝子において、多重タンパク質複合体が生成され、基質は、１つのタンパク質から次のタンパク質へと進行する。ＰＫＳ  ＩＩ型遺伝子は、クローニングされ、（これらの本来のグループ分け又は新規の組み合わせにおいて）異種系の中で発現された。Ｓａｌｉｎｏｓｐｏｒａからの二次代謝産物を合成するための遺伝子を、他の放線菌に由来する遺伝子と組み合わせることにより、新規小分子の生成をもたらし得る生物学的に支援されたコンビナトリアル化学の新規方法を提供する。また、Ｓａｌｉｎｏｓｐｏｒａ生合成遺伝子を混ぜて異種宿主中で発現させ、新しい代謝産物を生成させることもできる。ＰＫＳ遺伝子は、モジュールとして生じるものだけではない。例えば、非リボソームペプチドシンテターゼはモジュラーでもあり、放線菌の中に頻繁に存在する。この新規Ｓａｌｉｎｏｓｐｏｒａ群に由来する生合成遺伝子集団は、異種株の中で新規分子を発現させるため、または天然の及び組換型の遺伝子産物を過剰発現させるための、遺伝子供給原料として使用することができる。
【００４５】
（実施例１２）
抗炎症性作用についてのアッセイ。マウス耳アッセイでホルボール誘導型炎症（浮腫）の阻害を測定することによって、Ｓａｌｉｎｏｓｐｏｒａ培養物からの抽出物をテストする。これは、炎症を抑える際の化合物の有効性を示すものとして受け入れられている一般的なテストである。浮腫を引き起こす刺激原、即ちホルボール１２−ミリスチン酸１３−酢酸（ＰＭＡ）を含む溶液中、該化合物をアセトン中で、マウスの耳の内側耳介に局所塗布する。ＰＭＡを単独で（１つの耳につき２μｇ）又は様々な量の抽出物と組み合わせて、左耳に適用し（１つの処理グループにつきマウス５匹）、アセトン（対照）を左耳に適用する。２３℃にて３時間２０分インキュベートを行った後、マウスを犠牲にし、耳を取り出し、内腔（ｂｏｒｅ）を取り出して重さを量る。左耳（処理）の重さから右耳（対照）の重さを引くことにより、浮腫を測定する。結果を、ＰＭＡと比べた浮腫の減少（阻害）％または増加（強化）％として記録する。
【００４６】
（実施例１３）
酵素阻害アッセイ。Ｓａｌｉｎｏｓｐｏｒａ株からの抽出物が酵素活性を阻害する能力についてテストすることができる。抽出物を上記のように調製し、酵素／基質混合物にこの抽出物の連続希釈液を加えて、この反応のＩＣ５０を決定することができる。
【００４７】
（実施例１４）
酵素活性アッセイ。対象基質（キチン、リグニン、セルロース及び他の難分解性生体高分子等を含むがこれらに限定されない）の存在下でＳａｌｉｎｏｓｐｏｒａ株を増殖させることによって、酵素活性をテストすることができる。基質によって、生成される生成物の量または残っている基質の量を決定するためのアッセイを行うことができる。
【００４８】
（実施例１５）
農業／水産養殖保護アッセイ。植物を病原体から保護するため、または一般的な生長を促進するためのアッセイは、標準的な温室試験で行うことができる。対象株を植物に直接適用したり、生育培地の中に組み込んだりすることができる。植物を病原体にさらして検証し、その生長を対照グループ（病原体のみで処理したもの、Ｓａｌｉｎｏｓｐｏｒａ株のみで処理したもの、または未処理もの）と比較することができる。生長率を比較して、所望の活性を有する株を選択することができる。
【００４９】
本発明の例示的な実施形態について単に例として上記に記載したが、当業者であれば、特許請求の範囲により定義された本発明の範囲を逸脱することなく、開示された実施形態に変更を加えることができることは理解されるであろう。
【００５０】
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【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】図１はＳａｌｉｎｏｓｐｏｒａ群から得た最初の新規な生物活性代謝産物であるサリノスポラミドＡの構造。この化合物を単離することにより、Ｓａｌｉｎｏｓｐｏｒａ群が、独特な生物学活性代謝産物の資源であることを証明する。この生産株を海水ベースの培地中で培養し、一連のクロマトグラフィー工程に従って、純粋な形で該化合物を得た。サリノスポラミドＡの構造は、１Ｄ及び２Ｄ核磁気共鳴及び高分解能質量スペクトルデータ解析を用いて解明した。
【図２】図２はＭｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ科に公式に属する全ての属の代表的なものと一緒にＳａｌｉｎｏｓｐｏｒａ分岐群の７つの異なるメンバーを示す、近接結合法を用いて作製した進化系統樹（Ｋｏｃｈら，１９９６）。距離を示すバーは、ヌクレオチド１００個あたりヌクレオチド１個の置換があることを示す。Ｓａｌｉｎｏｓｐｏｒａ分岐群は括弧内に示されている。Ｓａｌｉｎｏｓｐｏｒａ株を示す記号の横の括弧内には、その単離株を得た遠征の場所及び日付を示す。現在までに見つかったＳａｌｉｎｏｓｐｏｒａ群は、４００〜５００単離株を含み、これらは主な特徴１及び３（「発明の背景」に記載）を示した。これらの株は、３回の遠征で得られたものであり、まず得られた場所及び日付によって分類した後に各グループの中で形態学的多様性によって分類されたものである。これらの亜群の各々から、ほぼ完全な（その遺伝子の９５％を超える）１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の配列決定を行うために単離株を選択した。Ｐｈｙｌｉｐ  ａｎｄ  Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗパッケージに含まれる系統発生学プログラムを用いて分析を行い、Ｔｒｅｅｗｉｅｗ１．６．１を用いて樹状図を描いた。
【図１】
0004395549.tif 000008
【図２】
0004395549.tif 000009
【配列表】
0004395549000001.app