(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
流体成分と非流体成分を有する生物学的サンプルから流体を分離する装置において、
複数のミクロスフェアを接触する関係（abutting  relation）に配置して、当該ミクロスフェアの間に間隙空間（interstitial  spaces）を形成し、
これによりミクロスフェアが生物学的サンプルと流体的に連通するように配置されたとき、前記間隙空間が連続して複数の毛細管チャンネルを形成するようにし、
該毛細管チャンネルを通る流体成分の毛細管流れにより非流体成分が流体成分から分離されるようにし、
複数の大ミクロスフェアの間に複数の小ミクロスフェアを散在させ、前記複数の大ミクロスフェアをほぼ接触する関係に配置して、当該大ミクロスフェアの間に間隙空間を形成して、当該間隙空間が連続して複数の毛細管チャンネルを形成するようにし、前記複数の小ミクロスフェアは、前記大ミクロスフェアによって形成された間隙空間を占有し、前記毛細管チャンネルを通って移動でき、前記毛細管チャンネルを通って流れるように前記流体成分によって前方に運ばれるような十分に小さなサイズである、生物学的サンプルから流体を分離する装置。
【請求項２】
前記小ミクロスフェアは少なくとも１つの標識がつけられている請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記標識は、放射性標識、蛍光標識、金属、蛋白質、ペプチド、抗原および抗体からなる群から選ばれる請求項２に記載の装置。
【請求項４】
前記生物学的サンプルは被分析物（analyte）を含み、前記標識は抗体であり、前記被分析物に指向（direct）する単一特異性（specificity）を有する請求項２に記載の装置。
【請求項５】
前記複数の小ミクロスフェアはさらに複数のグループのミクロスフェアからなり、各グループは異なる標識で含浸（impregnate）され、各グループは大ミクロスフェアの分離ゾーン（separate  zone）に大ミクロスフェアの間に散在されている請求項１に記載の装置。
【請求項６】
前記ミクロスフェアのサイズは前記サンプルの粘性により選択される請求項１に記載の装置。
【請求項７】
前記ミクロスフェアは流体不浸透性物質（fluid−permeable  material）に包まれ（bundle）ている請求項１に記載の装置。
【請求項８】
前記ミクロスフェアは、流体の表面張力により、またはミクロスフェアを乾燥させることにより接触する関係に維持されている請求項１に記載の装置。
【請求項９】
前記サンプルを搬送して前記ミクロスフェアと流体的に連通させる流体搬送手段（fluid−conveying  means）を有する請求項１に記載の装置。
【請求項１０】
生物学的サンプルは血液であり、前記流体成分は血漿である請求項１から９のいずれかに記載の装置。
【請求項１１】
流体成分と非流体成分を有する生物学的サンプルを分析する検定装置において、
一定距離離れた第１と第２の対向する面によって形成された少なくとも１つのチャンバーであって、前記距離は前記流体成分が少なくとも一つの流体入口を通って毛細管作用により前記チャンバーに引き込まれるような距離であり、流体が引き込まれる少なくとも１つの流体入口と前記チャンバー内に配置された少なくとも１つの試薬（reagent）とを有し、これにより前記流体入口と流体的に連通させられた流体サンプルが毛細管作用により引き込まれ、所定容量の流体サンプルでほぼ満たすようにした少なくとも１つのチャンバーと、
複数のミクロスフェアからなり、該複数のミクロスフェアを接触する関係（abutting  relation）に配置して、当該ミクロスフェアの間に間隙空間（interstitial  spaces）を形成して当該間隙空間が接続して複数の毛細管チャンネルを形成するようにし、当該ミクロスフェアが前記チャンバーへの流体入口と流体的に連通するように配置され、複数の小さなミクロスフェアが複数の大きなミクロスフェアの間に散在され、複数の大きなミクロスフェアが実質的に接触する関係に配置され、それらの間に間隙空間が形成され、当該間隙空間が接続して複数の毛細管チャンネルを形成し、複数の小なミクロスフェアが実質的に大きさが小さく、大きなミクロスフェアで形成された間隙空間を占有し、毛細管チャンネルを通って移動し、毛細管チャンネルを通って流れる際に、流体成分によって前方に運ばれるようにした動的毛細管フィルタ（dynamic  capillary  filter）とからなり、
これにより、ミクロスフェアが生物学的サンプルと流体的に連通するように配置されたときに、前記非流体成分が前記接触するミクロスフェアの間隙空間を通るサンプルの流体成分の毛細管流れによりサンプルの流体成分から分離され、前記流体入口に引き込まれ、前記毛細管チャンバーを流体で満たすようにした生物学的サンプルを分析する検定装置。
【請求項１２】
前記サンプルを搬送して前記ミクロスフェアと流体的に連通させる流体搬送手段を有する請求項１１に記載の検定装置。
【請求項１３】
前記流体入口に近接するサンプル棚（sample  shelf）を有し、該サンプル棚に前記ミクロスフェアが配置されている請求項１１に記載の検定装置。
【請求項１４】
前記複数の小ミクロスフェアは少なくとも一つの標識をつけられている請求項１１に記載の検定装置。
【請求項１５】
複数のグループのミクロスフェアを有し、各グループは異なる標識で含浸（impregnate）され、大ミクロスフェアの分離ゾーン（separate  zone）に大ミクロスフェアとともに散在されている請求項１１に記載の検定装置。
【請求項１６】
前記試薬は前記毛細管チャンバーの内面に付着された片に配置されている請求項１１に記載の検定装置。
【請求項１７】
前記試薬は前記毛細管チャンバーの内面に印刷または被覆された少なくとも１つの抗体からなる請求項１６に記載の検定装置。
【請求項１８】
前記流体サンプルについて複数の検定を行うために、前記毛細管チャンバー内に複数の試薬が配置されている請求項１１に記載の検定装置。
【請求項１９】
前記試薬は、蛋白質、抗体、核酸、脂質、ステロイド、複素環化合物（heterocyclic  compound）、薬剤またはこれらの組合わせを含む請求項１８に記載の検定装置。
【請求項２０】
１または複数の流体サンプルについて複数の検定を行うために複数の毛細管チャンバーが設けられている請求項１１に記載の検定装置。
【請求項２１】
前記流体サンプルの被分析物（analyte）に結合（bind）する試薬の割合を検出するアナライザをさらに有する請求項１１に記載の検定装置。
【請求項２２】
前記アナライザの較正のための基準線を設定する較正片（calibration  strip）をさらに有する請求項２１に記載の検定装置。
【請求項２３】
前記検定の結果と関連する患者識別情報を含むインジケータをさらに有する請求項２１に記載の検定装置。
【請求項２４】
前記インジケータはバーコードからなり、前記アナライザはバーコードリーダからなる請求項２３に記載の検定装置。
【請求項２５】
前記アナライザは分光計からなる請求項２１に記載の検定装置。
【請求項２６】
前記アナライザはデジタル伝送システムを介してデータをデジタルで伝送することができる請求項２１に記載の検定装置。
【請求項２７】
バイオチップを覆うマスクをさらに有し、該マスクは前記試薬上を搬送され、前記試薬を囲むバイオチップの一部を不透明に（opaque）する請求項２１に記載の検定装置。
【請求項２８】
請求項１による装置を利用して、流体成分と非流体成分を有する生物学的サンプルから流体成分を分離する方法において、
（ａ）複数のミクロスフェアを接触する関係に配置して、当該ミクロスフェアの間に間隙空間を形成し、当該間隙空間が連続して複数の毛細管チャンネルを形成するようにし、前記サンプルを前記複数のミクロスフェアと流体的に連通（fluid  communication）させるステップと、
（ｂ）前記流体成分が前記毛細管チャンネルを通る流体成分の流れにより前記非流体成分から分離される際に前記流体成分を収集するステップと、
からなる生物学的サンプルの非流体成分から流体成分を分離する方法。
【請求項２９】
前記生物学的サンプルが血液で、前記流体成分が血漿である請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記複数の小ミクロスフェアは少なくとも一つの標識を含浸されて、血漿が大ミクロスフェア間の間隙間隔を通って流れる際に、前記標識を血漿に放出するようにした請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３１】
異なる標識で含浸された複数のグループの小ミクロスフェアが大ミクロスフェアの分離ゾーンで大ミクロスフェアとともに散在されている請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記ミクロスフェアは流体不浸透性物質に包まれている（bundle）請求項２８から３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
前記ミクロスフェアは前記血漿の表面張力によりまたはミクロスフェアを乾燥させることにより接触した関係に維持されている請求項２８から３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
前記生物学的サンプルを前記ミクロスフェアと流体的に連通させるために流体搬送手段が設けられている請求項２８から３３のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
請求項１１による装置を利用して分析する方法において、
（ａ）流体成分が毛細管作用により毛細管チャンバーに引き込まれ、前記試薬と反応するように、流体成分と非流体成分を有する流体サンプルを流体入口と流体的に連通させるステップと、
（ｂ）前記試薬が前記流体サンプル内の被分析物に結合（bind）したか否かを決定するために試薬を分析するステップと、
からなる検定を行う方法。
【請求項３６】
前記サンプルに結合（bind）する試薬の割合を決定するために前記試薬を分析するステップをさらに有する請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記毛細管チャンバーの既知の容量から、前記毛細管チャンバーをほぼ満たす流体サンプルの容量を決定するステップをさらに有する請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記生物学的サンプルが血液であり、流体成分が血漿である請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記試薬は前記毛細管チャンバーの内面に付着された片に配置されている請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
前記試薬は前記毛細管チャンバーの内面に印刷（print）された選択された抗体からなる請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記流体サンプルについて複数の検定を行うために、前記毛細管チャンバー内に複数の試薬が配置されている請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記試薬は蛋白質と抗体を含む請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記試薬は、蛋白質、抗体、核酸、脂質、ステロイド、複素環化合物（heterocyclic  compound）、薬剤またはこれらの組合わせを含む請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
１または複数の流体サンプルについて複数の検定を行うために複数の毛細管チャンバーが設けられている請求項３５に記載の方法。
【請求項４５】
基準線（baseline）を設定するためにバイオチップに押印（imprint）された較正片を利用して前記アナライザを較正するステップをさらに有する請求項３５に記載の方法。
【請求項４６】
前記検定の結果と前記検定装置に貼り付けられたインジケータに含まれる患者識別情報を関連させるステップをさらに有する請求項３５に記載の方法。
【請求項４７】
前記インジケータはバーコードからなる請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記検定の結果をコンピュータデータベースに記録するステップをさらに有する請求項３５に記載の方法。
【請求項４９】
前記データベースの複数の検定からのデータを編集（compile）するステップをさらに有する請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
１または複数の選択された異常（disorder）のプロフィールを生成するために、前記データにニューラルネットアルゴリスムを適用するステップをさらに含む請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記データの統計的意義（statistical  significance）を決定するために、前記データにレシーバ操作の特徴分析（receiver  operating  characteristic  analysis）を適用するステップをさらに含む請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記データの統計的意義（statistical  significance）を決定するために、前記データにレシーバ操作の特徴分析（receiver  operating  characteristic  analysis）を適用するステップをさらに含む請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記試薬が前記流体サンプル内の被分析物に結合（bind）したか否かを決定するために試薬を分析するステップの前に、所望の時間間隔の後に前記毛細管チャンバーから前記流体サンプルを取り除くステップを有する請求項３５に記載の方法。
【請求項５４】
前記毛細管チャンバーから前記流体サンプルを取り除くために、芯（wick）または毛細管を前記流体サンプルと流体的に連通する請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
流体成分と非流体成分を有する生物学的サンプルの流体成分中の被分析物（analyte）を検出する方法において、
（ａ）前記生物学的サンプルを、複数のミクロスフェアからなり、該複数のミクロスフェアを接触する関係（abutting  relation）に配置して、当該ミクロスフェアの間に間隙空間（interstitial  spaces）を形成して、当該間隙空間が連続して複数の毛細管チャンネルを形成する動的毛細管フィルタと流体的に連通させ、複数の大ミクロスフェアの間に複数の小ミクロスフェアを散在させ、前記複数の大ミクロスフェアをほぼ接触する関係に配置して、当該大ミクロスフェアの間に間隙空間を形成して、当該間隙空間が連続して複数の毛細管チャンネルを形成するようにし、前記複数の小ミクロスフェアは、前記大ミクロスフェアによって形成された間隙空間を占有し、前記毛細管チャンネルを通って移動でき、前記毛細管チャンネルを通って流れるように前記流体成分によって前方に運ばれるような十分に小さなサイズであり、流体成分を非流体成分から分離するステップと、
（ｂ）被分析物が存在する場合に前記流体成分中に被分析物を検出するステップと、
（ｃ）ニトロセルロース・クロマトグラフィ片上で分離するために、前記流体成分をニトロセルロース・クロマトグラフィ片と流体的に連通させるステップと、
からなる分析方法。
【請求項５６】
前記流体成分を、前記サンプルの流体成分中に存在する被分析物に結合（binding）する被分析物特定標識（analyte  specific  label）で含浸（impregnate）されたニトロセルロース片と流体的に連通させることにより、ステップ（ｂ）において被分析物を検出する請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記流体成分を、前記サンプルの流体成分中に存在する被分析物に結合（binding）する被分析物特定標識（analyte  specific  label）で含浸（impregnate）された第２グループのミクロスフェアと流体的に連通させることにより、ステップ（ｂ）において被分析物を検出する請求項５５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、ミクロスフェア等の適切な微小粒子と、被分析物特異標識化法（analyte  specific  labeling）とを用い、血液等の生物学的サンプルから、血漿等の流体成分を分離する装置に関する。本発明は、また、生物流体中に存在する被分析物（analyte）の量を定量的に決定する装置および方法に関する。さらに、本発明は、注意点検定方法（point−of−care  assay  method）および装置を用い、生物流体サンプル中に存在する一以上の被分析物を測定する定量的検定方法および装置に関する。このサンプルは、一以上の微生物を試験する目的で調製された懸濁液であっても良い。この試験結果は、適切な解析装置を用いて解析することもでき、また、この検定試験結果をデジタル送信システムを用いて送信し、データのさらに詳細な評価を行なうこともできる。
【０００２】
背景技術
現在では、流体中の被分析物を測定する単一ステップ検定法（one  step  assay）には多数の例がある。ごく普通の検定法は妊娠試験装置のものであり、この場合には、尿サンプルを試験パッドに接触させることで、毛細管流により、尿が吸着性（bibulous）クロマトグラフィ片に沿って移動し、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（HCG：human  chorionic  gonadotropin）と、吸着性クロマトグラフィ片に含まれる試薬との反応により、ＨＣＧの存在が、通常、着色した線として現われることにより検出される。これは、クロマトグラフィ・検定法の一例である。
【０００３】
１９９８年６月１６日発行の米国特許第５，７６６，９６１号および１９９８年６月２３日発行の米国特許第５，７７０，４６０号の名称は、いずれも、「単一ステップ側流（lateral  flow）非吸着性検定法」である。ここで、「非吸着性（non−bibulous）側流」とは、流体中に溶解されるか又は分散された全ての成分が、永久にトラップさたり又は濾過されるのではなく、安定化膜の横手方向での乱れが比較的少ない流れを形成しながら、実質的に同じ速度で移動することを意味する。これは、クロマトグラフィの構成において起こるような、一以上の成分を吸着するか又は吸収する能力を有する材料において一以上の成分が選択的に保持される現象とは異なる。この単一ステップ・検定法では、サンプル（問題とする被分析物を含み得るもの）が「サンプル収集ゾーン」に収集され、そこから「標識化ゾーン」へと流れる。ここで、サンプルが特定の結合試薬（binding  reagent）と接触し、被分析物分子に検出可能分子（「検定標識」）が結合される。次いで「捕捉ゾーン」へと流れ、ここで、検出可能分子（visible  moieties）と結合した被分析物分子が捕捉される。
【０００４】
１９９６年６月３０日発行の米国特許第５，５４０，８８８号「流体移送検定装置」には、生化学診断検定装置が記載されている。これは、多孔質材料で形成された２つの流体流路を備え、この流路の端に流体を同時に接触させると、毛細管流によって流体が共通の場所に移送される。これらの流路はある位置で相互に連結し、その先は、電気的ブリッジ回路に類似した配置を有する。この回路の分岐の流水抵抗を選択することにより、ブリッジ全体における流れを制御できる。
【０００５】
１９９４年４月５日発行の米国特許第５，３００，７７９号「毛細管流装置」には、流路を規定する装置を用い、試薬と混合されたサンプル中に存在する被分析物を測定する方法および装置が記載されている。結合反応による特定の結合が、流量、流動媒質の光パターン、光吸収、または光散乱、の変化を生じさせ、これにより、問題とする被分析物の測定が可能となる。
【０００６】
１９９２年５月５日発行の米国特許第５，１１０，７２４号「マルチ被分析物装置」には、一滴の血液サンプル中に存在する多数の被分析物の検定を行なう検定装置が記載されている。サンプル流体が移送部位に移動する際に血漿から血球を分離するための濾過および分配用基質を通過する血液サンプルの毛細管流によって、ディスペンサが、微小体積の血液サンプルを多数の移送部位に分配する。この装置の試験板には多数の吸収材パッドが設けてあり、各パッドには、選択された被分析物の検出に使用される試薬成分が含まれている。この試験板は、パッドの露出表面領域がその関連するサンプル移送部位に接触する場所である移送位置に向かう方向およびそれから離れる方向で、ディスペンサ上に取付けられている。これは、サンプル流体を、これらの位置から支持体上のパッドへと同時に移送するためである。
【０００７】
米国特許第５，０３９，６１７号「活性化部分的トロンボプラスチン時間測定用毛細管流装置および方法」には、全血サンプルに対する活性化部分的トロンボプラスチン時間（APTT：activated  partial  thromboplastin  time）の測定が記載されている。この方法では、ＡＰＴＴ分析を行なうための試薬を入れた毛細管にサンプルを付着させ、この毛細管内の血液の流れが停止するまでの凝血時間を測定する。これは、凝血に基づいた危険度評価の一例である。
【０００８】
米国特許第４，７５３，７７６号「フィルタおよびこのフィルタから延びる毛細管流経路を備えた血液分離装置」には、赤血球から血漿を分離する方法が記載されている。この方法を用いた装置においては、フィルタから反応領域へ血漿を移動させる駆動力は、管状の毛細管による毛細管力である。フィルタは、特定の特性を有する微細グラスファイバ・フィルタの中から選択される。
【０００９】
１９９２年４月４日発行の米国特許第５，１３５，７１９号「フィルタおよびこのフィルタから延びる毛細管流経路を備えた血液分離装置」には、同様の発明が記載されており、前記グラスファイバ・フィルタは、０．１０〜７．０μmの直径を有するファイバから製造される。
【００１０】
１９８４年５月８日発行の米国特許第４，４４７，５４６号「毛細管中に光ファイバを設けた蛍光イムノ検定法」には、抗原抗体複合体の一成分（たとえば、抗体）の単層が固定されていると共に、軸方向に配置された光ファイバを備えた、微細な直径を有する短い毛細管が記載されている。
【００１１】
１９９７年３月１１日発行の米国特許第５，６１０，０７７号「特異結合検定を実施する方法および装置」には、公知の、抗原抗体結合検定法が記載されている。この方法では、被分析物（試験を行なうべき対象物質）を含む可能性のあるサンプル（ａ）が、試験を行なうべき対象物質に結合する抗体（ｂ）を固体支持体上に固定したもの、および、検出可能なマーカーに共役する、試験を行なうべき対象物質に対する抗体（ｃ）と混合され、その結果、試験を行なうべき対象物質に結合する抗体（ｂ）と（ｃ）との間の複合体が形成され、これにより、マーカーが固定され、検出される。
【００１２】
１９９０年６月２４日発行の米国特許第４，９４３，５２２号「側流非吸着性膜検定手順」には、「指示薬ゾーン（indicator  zone）」に固定された結合対の一成分を有する多孔質膜である試験基体を使用する、イムノ検定等の、特異結合対検定を実施する方法および装置が記載されている。サンプルを付着させると、横手方向に揃って指示薬ゾーンを通過し、サンプル中に被分析物が存在すれば、固定された特異結合成分と複合体を形成し検出される。新しい検出方法では、観察可能な粒子を複合体中に捕捉する方法を用いる。たとえば、複合体の検出のための観察可能粒子として、血液中の血球を用いる。
【００１３】
全血サンプルから赤血球を分離する方法の一例は、１９９２年６月２日発行の米国特許第５，１１８，４２８号「全血サンプルから赤血球を分離する方法」に見られる。この方法では、酸を含んだ溶液と混合した全血サンプルから赤血球を分離する。すなわち、酸溶液との混合の後に、濾過、遠心分離、またはデカンテーションにより、結合した赤血球を除去し、実質的に赤血球を含まない血清サンプルないし血漿サンプルを得る。
【００１４】
米国特許第５，０７３，４８４号「定量分析装置および方法」では、流路に沿って間隔を空けて配置したいくつかの反応物含有反応ゾーンを備えた流体流路に沿って被分析物が測定される。反応ゾーンにおける被分析物、反応物、または所定の生成物、を検出する検出手段が用いられ、反応の起こったゾーンの数が、流体中の被分析物の量を示す。
１９８６年７月１６日発行の米国特許第５，５３６，４７０号「全血中の被分析物を決定するための試験担体」では、血液サンプル付着操作側からは、検出側にある赤血球へのアクセスはできない。分析反応の結果、検出側で、光学的に検出可能な変化が起こる。
【００１５】
被分析物の測定または検出を行なう現在の単一ステップ・検定法における重大な欠点は、これらの方法では、定量的結果ではなく定性的結果しか得られないことである。すなわち、被分析物が存在するか否かを決定することはできるが、サンプル中に存在する被分析物の実際の量や濃度を知ることができない。本発明に係る検定法では、決定可能な体積で試験が行なえれば、定量的結果が得られる。従来の方法では、流体が試験片を流れ去らねばならないので、反復試験において試験サンプルの正確な体積を再現性良く特定することができなかった。
【００１６】
クロマトグラフィ片およびグラスファイバ片を使用する従来の方法では、試験片内でタンパク質および標識を移動させるために、最初に大きな体積の生物流体を必要とする。特に、生物流体が血液であって、最初にこの血液サンプルから血漿を分離せねばならない場合には、このことが当てはまる。本発明に係る装置および方法の利点は、一以上の被分析物を分析する際にも、非常に少量の流体サンプルで充分であることである。さらに、本発明に係る検定方法および装置では、試験体積を一定に維持することができ、したがって、反復試験において、複数サンプル間または同一サンプル内で直接比較できる定量的データが得られるという利点を有する。
【００１７】
流体サンプルの検定中に全血からの血漿の分離が行なわれることも、本発明に係る検定装置および方法の利点である。つまり、サンプルの検定に先立って血液から血球成分を分離する必要がない。よって、患者による処置の現場での検定法の利用を可能にするという著しい利点が存する。たとえば、患者のベッドのそばで、または診察室において、患者自身がこれを行なうことが可能となる。本発明の好適な実施例においては、本発明の検定装置および方法により、一以上の流体サンプルに対する一以上の診断的検定または予後的検定に適した、総合的注意点器具（generic  point−of−care  platform）が得られる。
【００１８】
発明の概要
本発明の態様によれば、生物学的サンプルの流体成分を分離する方法が与えられる。一つの実施例では、生物学的サンプルはミクロスフェアのグループと接触して置かれ、および流体成分は流体部分がミクロスフェアを通して流れながら毛細管作用によってサンプルから分離する。好ましい実施例では、ミクロスフェアは規定された直径または大きさである。他の実施例では不均一な大きさおよび／または形状の粒子が、ミクロスフェアを使用する代わりに流体部分を生物学的サンプルから分離するために使用できる。
【００１９】
本発明の態様によれば、注意点（point−of−care）検定方法および装置を使用して流体サンプル中の一つ以上の被分析物を測定する定量検定方法および装置が設けられる。検定および装置は患者自身が枕もとでまたは医局で使用するように設計される。検査結果は適当な分析器を使用して分析され、そして随意的に検定検査結果は地域外（off−site）の専門家によって更なるデータの評価を行うために、デジタル伝送システムによって伝送される。
【００２０】
ミクロスフェアまたは他の粒子は、流体部分を非流体部分から抽出するまたは区画するための動的フィルタとして作用する。ビーズは分離ステップの間運動を示すので、チャンネルは過渡的（transient）であろう。従って、迅速な一時的毛細管抽出は、ミクロスフェアまたは粒子間の間隙空間によって形成された過渡毛細管チャンネルによって作られた動的毛細管フィルタによる。
【００２１】
本発明の態様によれば、時宜を得た方法で血液を含む小容量の生物学的流体を検査する検定方法および携帯用検定装置が設けられる。本発明の別の態様によれば、生物学的流体のサンプルを検査する方法および装置が設けられている。この態様では、一貫した容量の生物学的流体サンプルが一つ以上の被分析物について検査され、検査から得られるデータは収集および、例えば特別な病状に関係するデータベース中への編集に使用される。最後に、収集されたデータは神経網アルゴリズムを訓練するために使用できる。次に、このアルゴリズムは所定の検査対象の個々の検査結果に基づく診断および／または予後徴候情報を提供するために使用できる。
【００２２】
血液の検定に関する本発明の別の態様によれば、血液の細胞質成分は、ミクロスフェアビーズに血液全体を露出させることにより、細胞質成分ではなく血漿を毛細管作用によってミクロスフェアビーズ間に形成された空間を通過させることにより、血漿から分離される。本発明は細胞を血液中の血漿から分離することに限定されず、より広い適用を含む。ミクロスフェアビーズは生物学的流体の細胞質成分から流体成分を分離するために使用できる。ミクロスフェアビーズは流体フィルタとして効果的に作用している。
【００２３】
本発明の別の態様によれば、サンプル中の血液から血漿を分離する装置が提供されている。この装置は接触する関係（abutting  relation）に配置され、かつその間に複数の毛細管チャンネルを形成する複数のミクロスフェアを有し、それによってミクロスフェアが血液サンプルと流体連通状態に配置された時、血液サンプルの細胞質および血漿成分は接触ミクロスフェア間の間隙空間によって形成された毛細管チャンネルを通る血漿成分の毛細管流によって分離される。
【００２４】
本発明の別の態様によれば、この装置は、複数の小ミクロスフェアのグループを有する。各小ミクロスフェアは、それぞれ異なる標識（label）で含浸され、かつ大ミクロスフェアの別のゾーン中で大ミクロスフェアとともに散在する。ミクロスフェアは実質的に同じ直径でよく、またはミクロスフェアは異なる直径でも良い。選択されるミクロスフェアの大きさは、サンプルの粘度、または除去若しくは分離することを望む成分の大きさに基づく。
【００２５】
本発明のさらに別の態様によれば、ミクロスフェアは流体透過物質（fluid−permeable  material）中に包まれ（bundled）、またはミクロスフェアはミクロスフェアを通過する流体、例えば血漿の表面張力によって接触する関係に維持される。本発明のさらに別の態様によれば、単にミクロスフェアとしても知られるミクロスフェアビーズは装置の表面で乾燥される。
【００２６】
本発明の別の態様によれば、この装置は流体入口に近接してサンプル棚（sample  shelf）を有し、ミクロスフェアはサンプル棚に配置される。
【００２７】
本発明のさらに別の態様によれば、この装置は、複数の小ミクロスフェアを有し、該小ミクロスフェアが大ミクロスフェア間の間隙空間を占有（occupy）し、かつ大ミクロスフェア間の間隙空間を通して流体が流れる時、流体中に標識を放出するように、複数の大ミクロスフェアが散在する少なくとも一つの標識で含浸される。それぞれ異なる標識で含浸されかつ大ミクロスフェアの別のゾーンの中で大ミクロスフェアが散在する複数の小ミクロスフェアがあってもよい。代案として、小ミクロスフェアは移動性があり、流体が大ミクロスフェアによって形成された毛細管チャンネルに沿って通過する時、流体によって前方へ搬送されるようにしてもよい。
【００２８】
本発明の別の態様によれば、この装置は、検定結果と関連される患者識別情報、例えばバーコードリーダによって読むことのできるバーコードを含む表示器（indicator）を有する。
【００２９】
本発明の別の態様によれば、流体を生物学的サンプルから分離する方法が与えられる。サンプルは流体成分と非流体成分であり、方法は次のステップを含む。すなわち、
（ａ）サンプルを、接触する関係に配置されかつその間に毛細管チャンネルを構成するように接続する複数の間隙空間を形成する複数のミクロスフェアと流体連通状態に持ち込み、および
（ｂ）毛細管チャンネル通る流体成分の毛細管流れによって流体成分が分離される際に流体成分を収集する。
【００３０】
本発明の別の態様によれば、毛細管距離だけ離隔配置された第一および第二対向表面によって規定された毛細管チャンバからなり、流体入口と毛細管チャンバー内部に配置された少なくとも一つの試薬を有する装置を利用して検定を行う方法が設けられ、次のステップを有する。すなわち、
（ａ）流体サンプルが毛細管作用によって毛細管チャンバー内部に引き込まれ、そして試薬と反応するように流体サンプルを流体入口と流体連通状態に導き、および
（ｂ）試薬が流体サンプル中の被分析物に結合（bind）するか否かを決定するために試薬を分析する。
【００３１】
本発明の別の態様によれば、方法はさらにサンプルに結合する試薬の割合を決定するために試薬を分析するステップを有する。
【００３２】
本発明の別の態様によれば、方法はさらに一つ以上の流体サンプルについての複数の検定を行う複数の毛細管チャンバーを有する。本発明の別の態様によれば、検査結果はコンピュータデータベースに記録され、およびさらに一つ以上の選択された障害のプロフィールを生成するために、訓練された神経網アルゴリズムに適用できる。検定はさらに、データの統計的有意性を決定するためにデータに対して受信者動作特性検定（receiver  operating  characteristic  analysis）を適用するステップを有する。
【００３３】
本発明の別の態様によれば、芯すなわち毛細管が流体サンプルを毛細管チャンバーから除去するために流体サンプルと流体連通状態に持ち込まれる。
本発明の別の態様によれば、ミクロスフェアは生物学的流体中の流体成分から細胞質成分を、例えば血液全体から血漿を分離するために使用される。流体成分はクロマトグラフィ検査片で検査できる。さらに本発明のミクロスフェアビーズは標準のクロマトグラフィ検定において濾過装置に加えて標識装置（labeling  device）として使用できる。
【００３４】
規定された形状と大きさの均一なミクロスフェアを使用する、ここに記述された本発明の総ての態様によれば、ミクロスフェアはさらに以下に記述されるように異なる大きさ、および／または形状の不均一な粒子によって置換することができるであろう。例えば珪砂はポリスチレンミクロスフェアビーズと置き換えるために使用できるであろう。他の適当な粒子は本記述の恩恵を受ける当業者に知られているものでもよい。
【００３５】
この好ましい実施例の他のおよび更なる詳細は図面と共に以下に記述される好ましい実施例の詳細な説明に記述される。
【００３６】
本発明を図示する目的で、図面に現在の好ましい形式が示されている。本発明は示された詳細な配置と手段に限定されることを意図していない。本発明は添付図面を参照して詳細に記述され、各図において同一符号は同一部分を示す。
【００３７】
好ましい実施例の詳細な説明
本発明は、ミクロスフェアビーズまたは他の適当な粒子を使用して生物学的サンプルから流体成分を分離する方法に関する。本発明はさらに、生物学的流体サンプル中の被分析物の有無を分析する装置と方法に関する。本発明はまた、一つの態様において生物学的流体サンプル中に存在する一つ以上の被分析物を精密に計量することに関する。一方、本発明はまた定量的結果でない、定性的結果も同様に提供できる。本発明はさらに検査結果を説明でき、さらに人間または動物が蒙るであろう、または将来蒙る見込みのあるある医療状態を特定するために使用できる検定に関する。本発明はさらに、本発明に規定される検査検定の結果が、将来ある状態または病状を展開する人間または動物の蓋然性を予測するために使用できる予後徴候検定技術に関する。これらの色々な実施例がここに詳細に記述される。
【００３８】
ここに記述される好ましい実施例は人間の生物学的サンプルの検査に関して記述されるが、このような検定と方法論は他の動物の生物学的サンプルを検定するためにも等しく使用できるであろう、ということが良く理解される。特に本発明は、明白に獣医学業務に適用性を有するであろう。さらにこの明細書で使用される用語流体サンプルは、懸濁液や流体の流れおよび／または毛細管作用によって分離できる流体部分を有する他のサンプルを含むように広く解釈されることを意図している。
【００３９】
対象の被分析物を含む流体成分と非流体成分を有する生物学的流体サンプルにおいて、本発明は次の何れかを単独で、または組合せて測定するために使用できる。
ａ）サンプル中の被分析物の存在
ｂ）サンプル中の被分析物の不存在
ｃ）サンプル中の被分析物の濃度
ｄ）サンプル中の被分析物の全量。
【００４０】
本発明の検定方法と装置によって測定できる適切な被分析物は、それに限らないが次のものを含む。すなわち、酵素、蛋白質、バクテリア、ウイルス、抗原、抗体、免疫グロブリン、薬物、およびホルモン。他の適切な被分析物も当業者に公知である。本発明の検定と装置は、性能強化薬物（performance  enhancing  drug）または他の街上薬物（street  drug）のような人間の生物学的サンプルにおける乱用薬物（drug  of  abuse）の検出と測定のために有用である。
【００４１】
ある生物学的サンプルは最初に細胞質成分を分離しなくても検定できるが、しかしながら例えば血液の場合、細胞質成分は検定を邪魔する。検定前に細胞質成分を除去することが必要であるまたは好ましい生物学的サンプルの場合には、先ず流体成分を細胞質成分から分離することが必要である。例えば血液の場合、血液の細胞質成分が血漿中に存在する被分析物の検査を邪魔しないように、全血液から血漿を分離することが必要である。
【００４２】
驚くべきことに、生物学的サンプルの流体成分は、サンプルをミクロスフェアビーズの群（grouping）に適用（apply）することにより、その非流体成分から分離できることが本発明で認識された。サンプルが適用された時、流体成分はミクロスフェアビーズ間に流れ、それによってそれを簡単かつ効果的な方法で細胞質成分から分離する。ビーズが群を形成した時に、流体成分がビーズ間に形成される空間を通して毛細管作用により移動する際に、ビーズは、流体成分を非流体成分から分離する手段として作用する。従って、血液の場合、血漿は血液サンプル中の細胞から分離される。驚くべきことに、ミクロスフェアは全血液から血漿を迅速にかつ効果的に分離し尽くす能力を有することが、本発明で認識された。
【００４３】
この特許出願の目的にために、ビーズ間の空間は“間隙空間（interstitial  spaces）”または“細孔（pores）”と呼ばれる。流体は一つの間隙空間から次の間隙空間へ毛細管作用によって流れると信じられる。
【００４４】
本発明では、ビーズ間の間隙空間を通過する流体の流れは、ビーズ間の空間によって形成されるチャンネルに沿う流れに喩えられる。流体が“毛細管”作用によってビーズ間に流れると思われるので、チャンネルは“毛細管”チャンネルと言われる。
【００４５】
ミクロスフェアが群を形成すると、小さな空間すなわち間隙空間がミクロスフェアビーズ間に形成される。ミクロスフェアビーズ間に形成される空間の大きさは、ミクロスフェアの曲率半径の関数である。本発明の目的のために、曲率半径はミクロスフェアの直径と同じである。ミクロスフェアビーズの大きさとビーズ間に形成される細孔の大きさとの間の関係を理解するために、細孔直径に対するミクロスフェア直径の比は略１から０．４であることが知られている。血漿を全血液から分離し尽くす場合、４μｍの細孔の大きさが最適であると考えられる。従ってこの特別な実施例についてのビーズの大きさは、１０μｍであるべきである。このことは容易な流体の流れを生じ（従ってより速い流体の流れ）、一方細胞は依然として細孔を通過することを妨げられる。ビーズ間に形成された小さな空間は、流体が存在する時ある毛細管現象を与える。
【００４６】
驚くべきことに、ここに教示されるように、本発明の原理に従って非均一な大きさおよび形状の粒子も同様に作用することが発見された。非均一粒子の特定の例が、以下の例７に記述される。ミクロスフェアビーズに関する以下の記述は、シリカおよび他の同等物のような他の類似の分離粒子の使用にもまた適用できる原理を教示することが理解される。
【００４７】
本発明において、血液中の赤血球および白血球はビーズの片側に留まり、一方血液サンプルの血漿部分は、ビーズ間に形成された間隙空間または細孔に沿う毛細管作用によってビーズを通過するので、ミクロスフェアの使用は、血漿を全血液から分離するための効果的なかつ廉価な手段である。本発明で観察された毛細管作用は、流体を前方に引き出すためにミクロスフェアによって流体上に作用する表面張力に関係すると考えられる。流体はミクロスフェア間を前方に引き出されるので、そのことはミクロスフェア領域に存在する如何なる試薬にも移動性を与える追加の利点を提供する。例えばミクロスフェア層は、二次抗体または別の検出分子で含浸されるであろう。
【００４８】
ミクロスフェアビーズは流体フィルタとして効果的に作用し、そしてそれなりに単純な流体濾過、分離、または区分が必要な検定における如何なる点においても使用できる。ミクロスフェアは毛細管作用によって流体成分を非流体成分から濾過し、分離し、または区分（partition）するように作用すると信じられているので、ミクロスフェアフィルタは毛細管フィルタと呼ぶことができ、この用語がその目的のためにここで使用される。毛細管フィルタは、流体成分の区分の間に顕微鏡下で移動するのが見られるという意味において動的フィルタ（dynamic  filter）である。あるビーズは移動し、他は静止したままであるが、ビーズの全体的な移動は顕微鏡的に観察される。ビーズの移動によってある毛細管チャンネルは閉じ、他は開くであろうということが期待される。この意味において、毛細管チャンネルは過渡的であろう。ビーズと粒子間の間隙空間はまた、流体区分の間ビーズまたは粒子の移動によって同じ過渡状態を示すことが期待される。
【００４９】
ミクロスフェアは、例えば吸収または結合（coupling）によってそれらに結合（bound）される被分析物特定抗体（analyte  specific  antibodies）を有することができるであろう。血漿を含む流体はミクロスフェアによって形成された毛細管チャンネルを通過するので、被分析物はミクロスフェア上に含まれる二次抗体に移動性を持たせ、次いでバイオチップ中に含まれる一次抗体と反応するであろう。しかしながらミクロスフェアは単に細胞質成分を流体成分から分離するように作用するのみで、ミクロスフェアは抗体によって標識される必要はない。
【００５０】
先行技術は、サンプル中に存在する細胞または他の物質から邪魔されることなく、流体部分に検査を実施するために、クロマトグラフ用紙または他の繊維状材料を使用し、細胞質成分から生物学的サンプルの流体成分を運び出し（wick）ていた。本発明のミクロスフェアはクロマトグラフ用紙に存在するファイバーによる制約なしに改良された流体の流れを提供するので、それは先行技術に対する利点を提供する。ミクロスフェアは、抗体または他の適当な標識のような蛋白質の結合のために優れた表面を与える、ということにさらに利点を提供する。
【００５１】
流体成分を分離するために使用されるミクロスフェアビーズの大きさは、サンプルの粘度に基づいて変えることができる。より大ビーズはビーズ間のより速い流体の流れのためにより高粘度のサンプルに使用するべきである。また、異なる色のビーズは、それらが標識として使用されかつ被分析物に結合する時、ビーズの視覚化を促進するために使用できる。結合ビーズはまた、分光計によるその後の検出のために如何なる結合被分析物の密度も増加するのに役立つ。ビーズの正規パターンはまた、回折の差（diffraction  difference）が結合ビーズの検出と測定用に使用できることを意味する。
【００５２】
生物学的サンプルは、ビーズの上部またはビーズの側部に適用することができる。
【００５３】
好ましい実施例では、登録商標Ｂａｎｇ’ｓの下で販売されるもののような乳濁液（latex）ミクロスフェアビーズが使用される。ビーズは、流体懸濁液の状態で供給される。ビーズは使用時に湿潤状態か乾燥状態に維持できる。ビーズが流体成分を分離する限り、ガラスを含めて他のタイプのビーズも本発明で使用できるであろう。
【００５４】
流体成分を生物学的サンプルから素早く分離するためにミクロスフェアビーズを使用することは、サンプル中に存在する被分析物を検出し計量する検定に組み込むことができる。
【００５５】
本発明の一つの態様によれば、ミクロスフェアビーズを使用して流体サンプルを生物学的サンプルから分離する方法が、流体サンプル中に存在するであろう一つ以上の被分析物を分析するための１ステップ検定（one−step  assay）に組み込まれる。検定は規定容積のチャンバーと関連して実施される。好ましい実施例では、チャンバーは流体サンプルを分離するミクロスフェアビーズと、サンプル中の被分析物を検出しおよび/または測定する検出手段とを有する。検出手段は、サンプル中の被分析物を検出する色々な既知の方法の何れからも引き出すことができる。例えば被分析物は、被分析物に特有の抗体または抗原のような検出蛋白質を使用して認識できる。被分析物が検出蛋白質に結合する時、それは密度を変え、そして測定できる。代案として、検出蛋白質は検出できる別の標識に結合できる。例えば検出蛋白質は検出分子が被分析物に結合した時に密度が増加し、このことが検出または測定されるように、小さなビーズに付着してもよい。他の適当な標識は、金のような金属、蛍光標識、化学的標識または比色標識を含むであろう。
【００５６】
本発明の一つの態様によれば、本発明は血液のような生物学的サンプルの検定に使用する小さなチップまたはカセットの形態でに注意点（point−of−care）診断または予後徴候（prognostic）検査に関係する。本発明は、本発明によって教示される単純な検定用の“バイオチップ”と呼ばれる小さくコンパクトな検定装置を教示する。
【００５７】
本発明の装置において、血液、尿、唾液または他の生物学的流体の液滴中に存在する被分析物の定量的測定が測定できる特定の容積を規定するために、二つのキャリア表面（carrier  surface）を組み合せている。好ましい実施例において、問題の表面はカバーガラスと顕微鏡スライドであるが、本発明はこれらの特定の実施例にのみ限定されることを意図するものではない。本発明の重要な態様は、流体サンプルが毛細管作用によって規定の容積の空間に入るという事実である。したがって、規定された空間はここでは毛細管チャンバーとして参照される。顕微鏡スライドとカバーガラスの場合、毛細管チャンバーはカバーガラスと底面とスライドの上面との間の空間の容積である。
【００５８】
本発明の好ましい実施例によれば、プレートすなわちスライド間に存在する流体の量は、スライド間の空間の容積によって決定される。従ってある場合には、数マイクロリットルの非常に小さな容積の精密検査を考慮する小さな検査システムが設計できる。
【００５９】
サンプル中の被分析物の濃度を定量的に測定しおよび一つの検査からの検査結果を別のものと比較するために、検定が実施される毎に流体サンプルの同一検査容積を有することが有利である。この方法で、被分析物測定は変動容積についての調整をする必要なしに直接評価できる。被分析物の濃度または量は、困難を伴わずにおよび検査毎に同一性をもって直接評価できる。本発明のバイオチップのチャンバーは、その規定の容積を提供する。
【００６０】
本発明の一つの態様によれば、被分析物の測定が実施される流体容積は標準化される。本発明の別の態様によれば、針を通して管状の血液を採ることによってのみ可能な大容積を必要とするよりも、例えば指の突き刺しからの滴状の血液のみでこれらの検査を実施できることは最も実際的であるので、非常に小さな血液容積中の血液細胞から血漿を分離する方法が与えられる。
【００６１】
好ましい実施例では、バイオチップ検査装置は決定可能な容積のチャンバーを有する。チャンバーは第一および第二対向キャリア表面で規定される。表面は、それらが毛細管作用によって二つの表面間に流体が流れるのに十分狭い距離だけ分離されるように置かれる。チャンバーは、それが規定空間を形成するような規定容積を有する。チャンバーは、流体サンプルを流入させる一つ以上の流体入口個所を有する。この明細書において、流体が毛細管作用によって流入するので、チャンバーはまた毛細管チャンバーとして参照される。
【００６２】
本発明の目的のために、互いに接合された二つのキャリア表面のこの配置は“バイオチップ”と呼ばれるが、またカセットまたはカートリッジとしても知られるであろう。
【００６３】
意図は、標準化できるコンパクトな携帯用検査システムを提供することである。特に好ましい実施例において、例えば底部表面は顕微鏡スライドであり、上部表面は顕微鏡カバーガラスである。顕微鏡スライドおよびカバーガラスは容易に入手でき、従って有用なキャリア表面である。別の例では、二つの顕微鏡スライドの一方を他方の上に載置できる。その中に流体が毛細管作用によって流入する決定可能な容積の規定空間がある限り、如何なるプレートでもよい。
【００６４】
毛細管チャンバー中に入ると、流体サンプルは、二つの表面の端部およびエッジでの表面張力により保持される。装置は、小さな大きさで携帯可能であり、それは分析器に挿入することができ、そして被分析物と検出分子間の反応生成物は分析器を使用して測定される。ある好ましい実施例を記述する目的で、キャリア表面はプレートと呼ばれる。しかしながら本発明は平坦なプレートのみに限定されない。同様に蛋白質、抗原および他の検出分子を結合できる総てのタイプの表面は、本発明の範囲であると考えられる。特にキャリア表面の組成は、それに限定されないがガラス、プラスチックおよび金属を含む。
【００６５】
本発明の好ましい実施例では、生物学的サンプルの液滴は顕微鏡スライドの上部表面に置かれ、毛細管チャンバーに入る前にサンプルの細胞質成分はミクロスフェアビーズの群を通る流体成分の移動によって除去される。例えば血液の場合血漿はビーズ間の間隙空間によって形成された毛細管チャンネルを通しての移動により血液の細胞質成分から分離され、次いで流体は被分析物がチャンバー中の試薬とその中で反応する検査チャンバーに入り、反応生成物はサンプル中に存在する被分析物の測定である。
【００６６】
流体が一旦規定空間に入ると、それはキャリア表面の内面に存在する一つ以上の試薬に曝される。試薬は従って毛細管チャンバー内に曝され、および究極的に毛細管チャンバーを充満する流体サンプル中に存在するであろう一つ以上の被分析物と反応するために利用できる。試薬は標識がつけられ、流体サンプル中に存在する被分析物の量はサンプル中の被分析物の、チャンバー内の試薬との相互作用から生じる反応生成物に基づいて測定される。検査結果は次いでサンプル中に存在する被分析物の量を決定するために標準較正と比較される。本発明の好ましい実施例において、試薬は好ましくは蛋白質印刷によってキャリア表面に付着される一つ以上の被分析物特定抗体である。
【００６７】
あるいは、別の実施例では、抗原がキャリア表面の内面に存在し、サンプル中の抗原特定抗体の量が測定される。キャリア表面に結合された時、蛋白質または他の検出分子は、規定の空間内に突出し、そこでサンプル中の被分析物と反応できる。キャリア表面の内面に存在する検出分子は、当業者によって知られる色々な方法の何れか一つで表面に結合してもよい。
【００６８】
検出分子はコートされ、印刷され、または別に当業者に良く知られた色々な技術の一つを使用して一方または他方のプレートに結合される。免疫学的検定法についての数多くの技術が当業者に知られており、および例えばC.P.PriceおよびD.J.Newman eds.（StocktonPress）著“Principles  and  Practice  of  Immunology”（1997）に記述されており、この文書はここに参考文献としてこの特許出願に組み込まれ、かつここに全文詳述されるようにその一部とされる。
【００６９】
二つのプレート間の距離は、血漿のような流体を毛細管作用によって二つのプレート間に効果的に引き込み、および流体を規定容積中に保持するプレートの能力によってのみ制限される。使用されるプレートの大きさはまた、検査の望ましい容積のような実際上の考慮によって決められるであろう。より大きい表面積のプレートはより大きい容積を生じるであろう。
【００７０】
本発明によれば、血液の液滴のような流体サンプルは二つのプレートの一つのエッジに置かれ、そしてプレート間に規定される空間に引き込まれる。流体サンプルは、当業者に知られている多数の手段によって、二つのプレートのエッジに対して引き込まれるであろう。その最も単純な形態では、サンプルは、エッジに直接接触させられ、流体サンプルの部分が規定容積の空間を完全に充填するように空間中に引き込まれる。例えば患者の指をプレートに接触させることによるなど。適切な定量的分析が実施できるように、サンプルは常に規定容積を完全に満たしていることが本検定では重要である。標準化モデルでは、容積は一つのバイオチップと他のバイオチップとで一定であるであろう。
【００７１】
別の好ましい実施例では、プレートは流体サンプルが容易に除去できるように互いに結合される。例えば流体流入点と反対側に端部において結合される。
【００７２】
別の例では、二つのプレート間の空間はレーンに分割され、各レーンの容積は同様に知られるであろう。この取り組みにより多重検査が単一サンプルについて為されるであろう。
【００７３】
血漿蛋白質を測定することが望まれる血液サンプルを扱う時、細胞から血漿を分離することが必要である。本発明では、検査結果は最初から終わりまで短時間フレームで、好ましくは１から３０分のオーダーで利用できるようにすることが望ましい。本発明の利点は、血液サンプルから血漿を分離するためにミクロスフェアビーズを使用することにより、例えばガラス繊維またはクロマトグラフ片を使用して生じるであろう遅延が排除されるので、流体サンプルが先行技術の検定よりも短時間に検査チャンバーに入る、ということである。遠心力装置のような煩わしい設備は、細胞分離に必要ではない。その総ては、注意点（point−of−case）で実施される検査を促進する。
【００７４】
本発明のバイオチップ装置は色々な検定が一つのサンプルについて実施されるようにするので、本発明は先行技術を越える更なる利点を有する。このことは検査結果が得られるスピードを促進し、検査に必要なサンプルの量を最小にする。
【００７５】
被分析物特定抗体（analyte−specific  antibodies）それ自身は、このような検定の技術における当業者に既知の色々な標識の何れか一つで標識することができる。好ましい標識の例は、蛍光標識、比色性標識、別のミクロスフェア、金粒子または如何なる高コントラスト分子をも含む。他の標識は、標識の存在が検出できる限り適切であろう。同様に検査ビーズよりも小さい直径を有するミクロスフェアビーズは、小ビーズが流体サンプル（例えば血漿）の移動によって大ビーズを通して流通させられるように、使用できる。小さなビーズはそれに応じて標識することができる。
【００７６】
被分析物を含む流体サンプルが二つのプレート間の規定空間に入る時、更なる抗体抗原反応が生じるであろう。本発明では、上部プレート、例えばカバーガラスは流体と接触する表面上に結合された被分析物特定試薬を有する。本発明の好ましい実施例では、被分析物特定試薬は蛋白質プリンタを使用してキャリアプレートの内側表面上に印刷される。適切な蛋白質印刷装置は市場で良く知られている。これらはインクジェット、スプレイ、ピエゾ電気またはバブルジェット蛋白質プリンタを含む。ピエゾ電気プリンタが好ましい。被分析物特定試薬は、一般的に蛋白質である検出分子として作用する。これらの分子はガラス、金属およびプラスチック表面に付着する。好ましい表面は、ポリスチレンまたはポリプロピレンを含む。このような印刷装置の使用は、異なる“レーン”が規定され、および異なる被分析物が単一流体サンプルを使用して同時に評価できるように、色々な異なる被分析物特定検出分子をプレートまたはカバーガラス上に印刷させる本発明において有利である。追加の背景および較正レーンが同じ検査チャンバー内に設けられる。
【００７７】
被分析物が被分析物特定検出分子と反応した後、測定可能反応生成物が作られるであろう。比色性、または蛍光性、または他の反応生成物が適当な分光計または読取り器に接続された他の適当な検出器を使用して読むことができるように、バイオチップキャリア表面は無色または透明であることが好ましい。被分析物および被分析物特定検出分子が互いに反応する時、反応レーンの密度に変化が生じる。本発明の好ましい実施例では、密度の変化はサンプル中に存在する被分析物の量を決定するために測定される。背景雑音を低減し、従って検定感度を増加するために、マスクが本発明の好ましい実施例によって設けられる。図１を参照して、マスク３２はプレート上のレーン２６、２８および３０に対応する開口部３６、３８および４０を除いて、不透明材料で作られる。マスクはレーン自身のみが読み込まれることができるように、上部プレート１０上にきちんと適合するように設計される。マスクの使用は背景雑音の量を低減し、およびレーン中の密度変化を読む時基準線の値を設定する利点を有する。
【００７８】
本発明の好ましい態様では、バイオチップは、例えば被分析物が標識された抗体と反応した後に色の変化を読む携帯用スペクトロメータによって読まれるように設計される。スペクトロメータはまた使用される検査試薬によって密度、膜厚、質量吸着または回折の変化を読むことが出来るであろう。分析器例えばスペクトロメータが、一旦必要なデータ計算を実施したならば、結果は電話線を通じて、または携帯電話または他のコンピュータネットワークシステムによってデジタル伝送により伝送可能である。あるいは抗体／被分析物反応間に生じる変化は、もし無線周波数センサーがバイオチップ検出システムに組み込まれるならば、無線周波数の変化によって検出または測定できる。
【００７９】
図１に戻って、本発明のバイオチップの好ましい実施例が略式分解透視図で図示されている。二つのキャリアプレート１０および１２が設けられる。二つのプレートは参照番号１４で示されるようにその間に固定容積を規定する。その上に生物学的サンプル１８が適用できる適用ゾーン（application  zone）１６として作用する棚を提供するために、下部プレート１２は上部プレート１０よりも長くしてもよい。棚は本発明に必須ではないが、サンプルがミクロスフェアビーズによって分離される場所を提供する。ビーズはプレートの境界内部の毛細管チャンバー１４の入口に置くことができ、かつサンプルは毛細管作用によってチャンバーに入るバイオチップのエッジに適用されるであろう、ということが可能ある。
【００８０】
また、適用ゾーン１６は、標識ゾーン２２を含みまたは含まなくて良いミクロスフェアビーズ２０の収集（collection）が付着されている。ミクロスフェアビーズ２０は流体透過物質を使用してグループ化されまたは束ねることができる。図１および２を簡略するために、ミクロスフェアビーズ２０および標識ゾーン２２が別々の規定領域として図示されている。しかしながらミクロスフェアビーズは自分自身に標識を担うことができる。この実施例は、二つのゾーンはミクロスフェアビーズが二つの役割、すなわち流体の分離と、流体がそこに曝される標識の表示とを果たすように、一つに集められている。
【００８１】
一つ以上の大きさのミクロスフェアビーズが存在していてもよい。一つの実施例では、小ミクロスフェアは大ビーズによって形成される間隙空間中に横たわることができるであろう。小ビーズはそれがビーズを通過しながら被分析物に結合するであろう二次標識を着けることができるであろう。標識は流体中の被分析物に結合するか、あるいは小ビーズに取り付けられた標識は流体中の被分析物に付着するであろうし、および小ビーズは次いで流体と共に毛細管チャンバー内へ移行するであろう。同時に流体サンプル中の如何なる細胞質成分もミクロスフェアビーズフィルタを通過しないであろう。
【００８２】
患者ＩＤは、それがバイオチップ上の検査検出区域を邪魔しないまたは被分析物がキャリアプレート表面に結合された物質との反応後にバイオチップの読取りを邪魔しない限り、プレート１０または１２の何れに添付されても良い。プレート１０および１２は無色および／または透明であることが好ましい。
【００８３】
三つの検出区域２６、２８、３０、すなわち較正印刷ゾーン２６、検出器印刷ゾーン２８および基準線印刷ゾーン３０がキャリアプレート１０の内面に印刷される。三つの検出区域またはゾーンは、一つのバイオチップがどのように設立されるかを図示するため、例示のためのみに描かれている。しかしながら色々なレーンが存在でき、および較正および／または背景に示されるレーンの数は検査される物により変えることができる。
【００８４】
検査は、三つのレーンにのみ限定されない。色々なレーンが規定できる。本発明の好ましい実施例では、三つのレーンが背景読取りの評価とバイオチップの較正を行うために一つのプレート上に印刷される。背景および較正検出ゾーンは総て同じバイオチップ上に置かれる必要はない、ということが理解される。検査被分析物と同じ検定中のサンプルキャリアプレート上に背景と較正読取りを為すことが有利であり、それによって検査結果の変動を低減する。
【００８５】
背景マスク３２は、随意的に設けられる。マスクはコートされたまたは印刷された検出ゾーン／レーンを阻止することなしに、キャリアプレート１０の外側表面を覆うように設計される。従って、開口部３６、３８および４０は、例えば検査結果を読取る時背景の邪魔を低減するためにマスク中に存在する。背景マスクは、上部プレートの内側表面上に識別される検出ゾーン２６、２８および３０に対応する開口部３６、３８および４０を備えて不透明材料で作られる。マスクの開口部４０は、試薬が存在しないプレート１０の一部に開口部４０が曝される限り、図示されるように対応検査ゾーン３０を有する必要はない。
【００８６】
図１は抗体／標識ゾーン２２およびミクロスフェア２０の両方を図示するが、これらの両ゾーンは、実施しようと選択する検査のタイプによって随意的である。流体サンプル１８が適用ゾーン１６に適用される時、二つのプレート１０と１２が最初に出会うエッジ３４にそれが到達する前に、それは抗体／標識ゾーン２２（もし存在するならば）、およびミクロスフェアビーズゾーン２０（もし存在するならば）を通して流れる。図１の略式図において、ミクロスフェアビーズとエッジ３４によって識別される流体流入点間にギャップがある。本発明のこの配置は動作するであろうが、もしミクロスフェアビーズゾーン２０および／または標識ゾーンがキャリアプレート１０のエッジ３４に接触するならば、それは最も好ましいであろう。このような構成の一つの例が図５および６に図示されている。この構成は流体サンプルが移行する最小の距離を与え、さらにこれは検査用に必要な流体サンプルの量を最小にし、そして例１により詳細に記述される。
【００８７】
流体サンプルは、エッジ３４の下で既知の容積を規定するチャンバー１４中に引き込まれる。流体サンプルは、適用ゾーン１６に沿ってミクロスフェアと標識ゾーンを通過し、そしてチャンバー１４を完全に充填するために十分な容積であるべきである。本発明のバイオチップは、血液の単一液滴が検査用に十分なサンプルの大きさとなり得るように、小さな大きさに縮尺できる。多くの寸法がここに教示される原理に基づいて構成することが可能である。１ｃｍ×３ｃｍの寸法は便利な大きさの装置を作るが、為されるべき検査の性質は最適チップの大きさを指示するであろう。図１に図示されるように、棚部分１６は底部プレート上に伸長する。この棚部分上に生物学的サンプルが適用できる。他の実施例では、例えば顕微鏡スライドに保持された検査部分は大きいであろうが、スライド上に位置する検査検定物それ自身は非常に小さい。検定は約１マイクロリットル程に小さいサンプル流体容積を容れるように小型化できる。
【００８８】
図２は、図１に参照したものと同じ要素を図示する線２−２に沿って取られた断面である。図２Ａは、流体がチャンバーから除去されるように装置の端部が開放できることを図示する線線２Ａ−２Ａに沿った、図２の端部の立面図である。ある人は、例えば全サンプルについて検査したいと望む場合、流体をチャンバーから除去することを望むかもしれない。適当な芯材料が開口端部に適用され、該芯により流体が引き出され、追加の流体がチャンバーに入る。このことは、連続的または不連続的プロセスのどちらでもできる。
【００８９】
図１、２および２Ａの総てに、プレート１０および１２を互いに保持する一つの方法である接着材５８のスポットが図示されている。接着材５８は、本発明の別の実施例である図６にもまた図示されている。
【００９０】
図７および７Ａは、１ステップ検定での分離のミクロスフェア方法の別の使用を図示する。この実施例において、ミクロスフェアはクロマトグラフィ紙と共に使用される。生物学的サンプル１８は、ミクロスフェアスライド５２’のような表面上に置かれる。それは、（図示されるように）ミクロスフェアビーズ５０上に直接またはその傍に置くことができる。サンプルの流体成分は次いでビーズ５０を通して流れ、サンプル１８中に存在する非流体成分から分離する。ビーズは標識パッド６２と接触するガラス繊維フィルタパッド６０に接触し、またはその間近かに位置する。標識パッド６２は、通常流体サンプル中の被分析物を標識するために当該標識で含浸されたガラス繊維パッドである。流体は、フィルタ６０と標識パッド６２を通して流れる。流体中に存在する如何なる被分析物もそれが標識パッドを通して流れる時、標識されるであろう。流体は次いでニトロセルロースクロマトグラフィ片６４中に流れ、そこで検査結果が通常ニトロセルロース片上の色彩の変化または帯として読取られる。代案として、ミクロスフェア５０はフィルタとして使用されるのでガラス繊維フィルタ６０は完全に削除できる（図示せず）。
【００９１】
最後に図７Ａに図示されるように、ガラス繊維パッド６２はミクロスフェアビーズ６６で置換できる。この場合ビーズ６６はフィルタとしてではなく標識のソースとして作用し、およびガラス繊維フィルタ６０’はそれぞれビーズ５０および６６の二組の間のスペーサとして役立つ。流体成分の濾過が必要でない適用について、ミクロスフェア６６は、ミクロスフェアフィルタ５０またはガラス繊維フィルタ６０’を必要とせずに流体中に存在する被分析物に直接標識するために使用できる。
【００９２】
図７および７Ａは、ここに教示した本発明のミクロスフェアビーズ技術を使用して現行の検定方法論が如何に変更できるかを図示する。
【００９３】
本発明の検定装置および技術は、それらが流体サンプルの多くの種類の小さな容積について使用できるという点で非常に有用である。記述は特定的に蛋白質を参照したが、標識システムがシステムにおいてマーカーの検出と測定用に案出できる限り、他のマーカーの如何なる数も適当であろう。例えば本発明は、バクテリア、ウィスル、菌類、または他の感染有機体のような微生物を測定および／または検出するために使用できるであろう。本発明のバイオチップ装置は標準値の表が構成できるように、検定のタイプおよび被分析物のタイプについて較正できる。本発明の検定システムは、患者システム中の特別のホルモンのレベルまたは薬剤の量さえも検出でき、およびこの標準化データは与えられた個々についての診断および／または予後徴候決定を行うために使用できる。
【００９４】
標準値の表が一旦構成されると、データは通常の作業および患者の医療的経歴、現在の健康状態および検査結果に基づいて構成されたデータベースで修正される。随意的にデータはモデム、インターネット、ケーブル線、電話線、人工衛星または他の同様な技術を経由したコンピュータネットワーク上のデジタル伝送システムによって伝送できる。これらのデータベースは現在の患者検査結果と診断を評価し、および与えられた個人についてのある健康成果を予測する神経網アルゴリズムの開発に使用できる。神経網アルゴリズムの一つの例が以下の例３に見出され、およびサンプル受信者動作特性曲線（ＲＯＣ）が図８に図示されている。
【００９５】
適用された神経網についてのアルゴリズムの開発は、評価対象の医療状態の機能であろう。患者データの大量の量は、最初に信頼性のある予測成果を有するために蓄積されなければならないであろう。神経網は、本発明の標準化検定を使用して診断的または予後徴候的な被分析物の濃縮を認識するように訓練できる。データおよびアルゴリズムは、読取り器からの印刷出力が検査結果を提供するのと同時に特別の診断または予後徴候も識別するように、読取り器例えばスペクトロメータ中に置かれた電子チップでエンコードされる。神経網アルゴリズムにおいて、診断または予後徴候はデータ点の数が増加するにつれて最適化されるであろう。患者データが多い程予測および／または診断結果は大きな確実性でなされるであろう。パーセント確実性は計算でき、かつ設けられた分析器に備えられた電子メモリーチップ中に貯えられたデータベースとの比較による測定データの分析に基づいて、医師または技師に与えることができる。現在の技術は検査結果を印刷出力する時点で、読取り器自身で実際の標準曲線を表示することが可能である。
【００９６】
スペクトロメータの使用に加え、および本発明の別の態様に従って、バイオチップはキャリアプレート１０に組み込まれた無線周波数センサーを有する。一つ以上の検出区域で反応が起きる時、無線周波数に測定可能な変化が生じ、適当な無線周波数変化検出装置を使用して無線周波数のこの変化を検出することにより反応の有無またはさらにその程度が測定でき、または検出できる。
【００９７】
本発明では同じバイオチップ上で一つより多い検査が同時に進行でき、従って診断または予後徴候の確実性が改善できる。マーカーの数が増加する程、測定の確実性も増加する。
【００９８】
本発明のバイオチップ／カセットの使用の多くの例の一つは、患者の血液の液滴を使用して末梢血管疾患を示す血液蛋白を測定することである。
【００９９】
ミクロスフェアは、サンプルの流体部分が非流体部分から分離されながら、分離／濾過ステップの間、光学顕微鏡の下で観察された。ミクロスフェアのあるものは運動しており、他のものは静止したままであることが観察された。分離は動的であり分離中のビーズまたは粒子の作用は、動的毛細管作用である。流体部分の分離または抽出は、瞬時である。
【０１００】
本発明はまた、ここに記述されたミクロスフェアビーズ以外の小さな粒子にも適用可能である。特に本発明の分離技術はまた、例えば砂粒のようなシリカ系粒子を含む不均一粒子を使用しても、仮にこれらの粒子が以下の例７に示されるように必ずしも球形でなくまた均一な大きさでなくとも作動する。
【０１０１】
ここに記述された例に示されるように、不均一および／または非球形粒子またはビーズを使用する適当な分離／濾過が達成できる。不均一性は分離を幾分遅くさせるので分離を効率低くさせるが、少なくとも定性的検定については依然として効果的な分離が達成される。
【０１０２】
例えば砂粒を使用する例７において、例４、５および６に記述されたミクロスフェアビーズを使用した分離と同じ時限でより僅かの有機体しかサンプルから分離されないので、分離は同じように効率的に発生するようには思われない。しかしながら有機体は成功裏に分離され、かつそれに応じてさらに検査できまたは検定できる。シリカまたは他の同様な粒子の使用はそれらが廉価でありかつ未開発および開発途上国で容易に入手できるのでミクロスフェアビーズに対して有利である。
【０１０３】
本発明の検定および装置は、大腸菌株Ｏ１５７：Ｈ７、サルモネラ、リステリア、クラミジアおよび他のバクテリアおよびウィルスのような微生物のようなある生物学的サンプル中の有害かつ病原性のバクテリアの存在を識別するのに特に有用である。例えば本発明の検定は、ある病原菌について食品サンプルを検査するために使用できる。それらはまた、感染病の診断用に人間用または獣医学薬剤に使用できるであろう。
【０１０４】
本発明で教示された方法論によって起きる動的分離が、図９−１８と例４−７に図示されている。
【０１０５】
この例から、本発明のミクロスフェアビーズは一般に粒子現象に一般化でき、および本発明は球形ビーズに限定されない。むしろそれはバイオチップ上のフィルタに砂粒を使用して、図７に図示されるような不均一な大きさと形状の粒子を含む。珪砂は市場で購入できるミクロスフェアビーズよりもかなり廉価な選択であろうし、従ってこの技術のより広い使用を行わせるであろう、ということが期待される。珪砂を使用するバクテリアの分離は、例えば同じ時間フレーム内により少ないバクテリアしか分離されずそれ程効率的ではなかったが、それは多くの用途に十分である。
【０１０６】
シリカ型粒子の使用の別の利点は、シリカは蛋白質と核酸を選択的に結合することがこの技術分野で知られていることである。シリカ系分離粒子はある蛋白質および／または核酸配置機構を案出するために使用できるであろう。
【０１０７】
例４−７の総てにおいて分離は殆ど瞬間的であり、粒子の大きさの制限は、隔離しようと望むバクテリア、微生物または他の被分析物によって制限された。当業者は、サンプル中に存在するバクテリアの種類に基づいて粒子のどの大きさを選択するかを知るであろう、ということが期待される。もしバクテリアが未知であるならば、当業者は予想される期待の大きさに基づいて粒子の大きさを取り上げ、そして上記のように一般に０．４から１の比に従ってビーズの大きさを選択するであろう。
【０１０８】
本発明の好ましい実施例の更なる詳細は、それが添付特許請求の範囲を限定するものではない、と理解される以下の例に図示される。
【０１０９】
実施例１：血漿流の確認、およびヒト全血からの血漿の分離
図３〜６に模式的に示すように、１０μmラテックス・ミクロスフェア・ビーズ（バング（Bang：登録商標）製）５０を約１５マイクロリットルだけスライドグラス５２に滴下し、乾燥させた。カバーグラス５４をスライドグラスに当て、その端で、スライドグラスに沿って、乾燥ビーズを押し寄せた。これにより、乾燥ビーズがスライドグラスから離れると共に、乾燥ビーズの集合体が反り返って湾曲部５６が生じた。このカバーグラスを、その端がこの「湾曲部」に接触した状態で、スライドグラスに載せた（図５、６に示す）。このカバーグラスの一端が乾燥ビーズの湾曲部の端に平行な状態で、整然と固定されると共に、この端は開放状態に保たれた。これは、流体が、ビーズ部分を通過し、カバーグラスとスライドグラスとの間に形成された毛細チャンバ内に流れることができるようにするためである。カバーグラスを、カバーグラスの角５８で、マニキュア液により接着し、スライドグラスに対し確実に固定した。カバーグラスは、毛細管作用が起こることを意図していない部分で固定したので、カバーグラスの下を流体が自由に流れることができる状態であった。
【０１１０】
２０マイクロリットルのヒト全血１８を、残っている５〜１０マイクロリットルのミクロスフェア・ビーズに載せた。つまり、ヒト全血サンプルを、湾曲部を構成していないビーズの残余部分の上に載せ、血漿成分を、毛細管作用によりミクロスフェア・ビーズの湾曲部を通して自由に移動させ、カバーグラスとスライドグラスとの間に形成された空間（毛細チャンバ）内に流入させた。この効果を双眼光学顕微鏡で観察した。血液サンプルをビーズに付着させると直ちに、血漿が全血から分離し始メータ。湾曲部が血漿に浸潤されるにつれ、カバーグラスとスライドグラスとの間の毛細管作用により、純粋かつ透明で血球を含まない血漿が、カバーグラスの下に形成されたカバーグラスとスライドグラスとの間の空間内に引き込まれた。このチャンバが、計算可能な所定の体積を有する既知の空間を形成するのである。
【０１１１】
これにより、ミクロスフェア・ビーズが、容易かつ効果的に全血から血漿を分離し、ミクロスフェア・ビーズの間に形成された毛細管チャネルを通して毛細管チャンバ内に導き得ることが判る。
【０１１２】
実施例２：クロマトグラフィ片と組合せたミクロスフェア分離
ヒト全血サンプル中の被分析物の検定に関して、この実施例（図７に模式的に示す）では、ヒト全血の血液サンプルからの血漿のミクロスフェア分離の使用法を説明する。血漿は、ラテックス・ミクロスフェア・ビーズ（バング（Ｂａｎｇ：登録商標）製）５０を用いて分離され、次いで、標準のニトロセルロース・クロマトグラフィ片に導かれた。
【０１１３】
従来技術において赤血球を保持するために普通に使用されるグラスファイバ・パッドに、約２０マイクロリットルの１０μmラテックス・ビーズを載せた。１滴（約６０マイクロリットル）のヒト血液を、ラテックス・ミクロスフェアに接触する状態で表面５２’に載せた。グラスファイバ・パッド６０は、実効的にビーズ５０と標識パッド６４との間のスペーサとして機能すると同時に、第２のフィルタとしても利用され得る。グラスファイバ・フィルタ６０は、完全に取り除いても良く、その場合には、ミクロスフェア・ビーズ５０が直接に標識パッド６４に接触する（図示しない）。
【０１１４】
血液が、堆積したビーズを浸潤し、約２分以内に透明な血漿がニトロセルロース・クロマトグラフィ片に達する。これは肉眼および顕微鏡により観察された。この実施例から、血液からの血漿のミクロスフェア分離法が、標準のニトロセルロース・クロマトグラフィ片と共に使用できることが判る。したがって、明らかに、本方法は、このようなクロマトグラフィ片を用いた試験法において血液から血漿を分離するための有用な方法である。
【０１１５】
別の実施例を図７Ａに示す。この場合には、試験装置の標識領域として、グラスファイバ標識パッド６２に代えてミクロスフェア・ビーズ６６を用いる。グラスファイバ・フィルタ・パッド６０’は、２組のビーズ５０および６６の間のスペーサとして使用される。
【０１１６】
実施例３：ニューラル・ネットワークによるマーカー解析
ニューラル・ネットワークは、被分析物ベクトルａ＝ａ（ａ１，ａ２，…，ａｎ）を入力とし、０と１との間の値を出力する数学関数Ｎ（Ｗ，ａ）である。加重パラメータＷは、トレーニング期間中に、トレーニング・パターン｛ｐ＝（ｂ１，ｂ２，…，ｂｎ，Ｔ）｝を用いて調節する。ここで、ｂ１，…，ｂｎはトレーニング用タンパク質ベクトルであり、Ｔは目標出力値である。凝血試験の場合には、Ｔは、凝血に対して１であり、非凝血に対して０である。
【０１１７】
パラメータＷは、新たな試験データに対する良好な性能を維持しながら誤差
0004544498.tif 000002
が最小となるように調節する。
【０１１８】
ネットワークのトレーニングが完了すれば、試験データを分類するためにネットワーク遮断値（network  cutoff）Cを選択する。試験ベクトルａ 、所与の遮断値C、目標出力Ｔに対する試験結果をＴＳＴ（Ｃ，ｂ，Ｔ）とする。
｛１（Ｎ（ａ）＞Ｃの場合）
ＴＳＴ（Ｃ，ｂ，Ｔ）＝｛
｛０（その他の場合）
この場合、試験の感度および特異度（specificity）を分析することができる。
Ｔ＝１かつＴＳＴ（Ｃ，ｂ，Ｔ）＝１の場合は真および正（True  Positive）
Ｔ＝０かつＴＳＴ（Ｃ，ｂ，Ｔ）＝１の場合は偽および正（False  Positive）
Ｔ＝０かつＴＳＴ（Ｃ，ｂ，Ｔ）＝０の場合は真および負（True  Negative）
Ｔ＝１かつＴＳＴ（Ｃ，ｂ，Ｔ）＝０の場合は偽および負（False  Negative）
感度＝ＴＰ／（ＴＰ＋ＦＮ）
特異度＝ＴＮ／（ＴＮ＋ＦＰ）
様々な遮断値に対して感度と１−特異度との関係をプロットすれば、ＲＯＣ（receiver  operator  characteristic）曲線が得られる。
【０１１９】
ニューラル・ネットワーク
一組のトレーニング・パターン｛ｐ＝（Ｉ１，Ｉ２，…，Ｉ１，ＴＡＲ）｝から始める。ここで、Ｉｊは入力値、ＴＡＲは目標値（ＴＡＲ＝０またはＴＡＲ＝１）である。そうして、目標値に近い値を出力するようにニューラル・ネットワークをトレーニングする。
【０１２０】
ニューラル・ネットワークは３層を備える。つまり、第１の入力層、第２の背後層（hidden layer）、第３の出力層である。
【図表１】
入力層          背後層              出力層
0004544498.tif 000003
【０１２１】
ニューロンは一組の加重｛ｗ（ｉ，ｊ，ｋ）｝によって接続されている。たとえば、ｗ（１，２，４）は、第１層の２番目のニューロンを第２層の４番目のニューロンに接続する。
【０１２２】
各パターンについて、各ニューロンに対する活性化度（activation）と称される数字を割り当てる。これは、発火（firing）する確率（provability）の指標となる。活性化度は以下のように、再帰的に定義される。
｛Ｉｊ（ｉ＝１の場合）
ａ（ｉ，ｊ）＝｛
｛１/（１＋exp（−sum（ｋ）｛ｗ（ｉ−１，ｋ，ｊ）ａ（ｉ−１，ｋ ）｝））
【０１２３】
誤差は、
ＥＲＭＳ＝ＳＱＲＴ｛ｓｕｍ｛（ｔ−ａ（２，１））＾２ ｝ ｝
として計算される。ここで、和（sum）は、すべてのパターンに渡って取る。
【０１２４】
加重は，新たなデータに対して良好な性能を維持しながらＥＲＭＳが最小となるように調節する。
【０１２５】
【図表２】
0004544498.tif 000004
【０１２６】
実施例４：ヨーグルトからの乳酸桿菌の分離
乳酸桿菌（Lactobocillus）を含む約１０マイクロリットルのヨーグルトを本発明に係る検定装置（本明細書中では「バイオチップ」と称する）に載せた。バイオチップ上に分離用ビーズが存在しない場合には、図９に示したように、視野中に固体粒子が観察された（ヨーグルト中に存在する乳酸桿菌の他に）。分離前には、視野中に数個の細菌だけが見られた（図９）。
【０１２７】
これに対し、図１０に示したように、直径１５μmのミクロスフェア・ビーズを用いた分離操作では、サンプルから細菌が良好に分離された。図９に見られた固体粒子が、全く見られない。分離後には、分離された流体部分には細菌だけが見られる（図１０）。分離はほぼ瞬間的に行なわれた。ミクロスフェア・ビーズにより、ヨーグルト中の固体粒子の残余部分からの細菌の単離が迅速かつ容易に行なわれ、分離された細菌のさらに詳細な試験が可能となった。これにより、サンプル中に存在する細菌の型の決定が可能となる。たとえば、細菌または微生物の型を決定する特定の抗原試験によって、細菌またはその他の微生物の型が決定できる。
【０１２８】
直径１０μmのミクロスフェア・ビーズを用いた分離操作によっても、図１１に示したように同様な結果が得られた。図１１では、一視野あたりの細菌数は少ないが、同様に、ヨーグルトからの細菌の分離が有効に行なわれている。
【０１２９】
実施例５：パン懸濁液からの大腸菌の分離
本実施例では、本発明に係る方法および装置を用いて、パン懸濁液から大腸菌（E.  coli）がうまく分離された。
【０１３０】
最初に、パンとＮａＣｌの混合物を調製した。重量２００ｍｇのパンを用いた。このパンに、１５０ｍＭのＮａＣｌ溶液を５００マイクロリットルだけ加えて反復混合することでパン懸濁液を調製した。大腸菌（ＤＨ５α株）を１００マイクロリットルだけパン懸濁液に加えた。懸濁液を再び撹拌して大腸菌／パン懸濁液を調製した。１００マイクロリットルの大腸菌／パン懸濁液を「バイオチップ」に載せると、ほぼ瞬時にして、ミクロスフェア・ビーズが作用して、細菌を含む流体成分がサンプルから分離された。しかも、懸濁液からの固体粒子の混入はなかった。図１２に、分離前の大腸菌／パン懸濁液の典型的な視野を示す。図１３には、直径１５μmのミクロスフェア・ビーズを用いた分離操作によって得られた流体部分で細菌が良好に分離されている様子を示す。分離状況は良好であった。
【０１３１】
実施例６：牛糞からの細菌の分離
本実施例では、本発明に係る方法および装置を用いて、牛糞から細菌が分離された。５００ｍｇの牛糞に１５０ｍＭのＮａＣｌ溶液を５００マイクロリットルだけ加えて混合することで懸濁液を調製した。５マイクロリットルの懸濁液サンプルを分離用に使用し、バイオチップに載せた。分離前（図１４）および分離後（図１５、１６）の顕微鏡写真を示す。本実施例の分離操作は、直径１５μmのミクロスフェア・ビーズを用いて行なった。サンプルを「バイオチップ」に載せると、ほぼ瞬時にして、ミクロスフェア・ビーズにより、細菌を含む流体成分が分離された。これにより、分離された細菌を詳細な同定のために染色することができる。直径１５μmのビーズを用いても（図１５）、また、直径１０μmのビーズを用いても（図１６）、良好に分離された。
【０１３２】
実施例７：砂のシリカ粒子を用いた分離
本実施例では、市販されている標準のポリスチレン・ビーズに加えて、他のタイプの粒子を試験した。シリコーン・ベースの粒子の安定性を試験するために、ミクロスフェア・ビーズを砂粒子（珪砂）で代替した。３つの試験を行なった。すなわち、牛糞、大腸菌／パン懸濁液、血液、である。珪砂を水と混合してスラリーとし、バイオチップに塗布した。バイオチップ上の砂粒子の大きさは、１ｍｍのスケールとの比較から知ることができる（図１７）。
【０１３３】
図１８の牛糞、および図１９の大腸菌／パン懸濁液に関しては、図に示したように良好に分離されはしたが、しかし、濾過用にポリスチレン・ビーズを用いた上述の実施例５、６での実験ほどに良好でははなかった。この粒子を用いた場合に分離が良好ではなかったことの原因は、多分、粒子サイズおよび形状の不均一と考えられる。しかし、砂粒子／珪砂の使用でも未だ明瞭に分離されるので、これがポリスチレン・ビーズの使用に対する可能な代替方法であることは明らかである。
【０１３４】
全血をバイオチップに付着させ、珪砂粒子を通して濾過した。この場合には、粒子サイズが大きいために（直径１０μmのミクロスフェア・ビーズと比較して）、赤血球が濾過粒子を通過した。均一な血液スメア（smear）が得られた。
【０１３５】
日常的に用いられている実験例をこれ以上説明しなくとも、当業者ならば、上に詳しく述べた本発明の実施例と同様な多数の例を、認識し、確認することができると考えられる。そのような同様の例は、以下に掲げる請求の範囲に含まれるものとする。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明の装置の実施形態の概略分解斜視図。
【図２】  図１に示す好ましい実施形態の１Ａ−１Ａ線長手方向断面図。
【図２Ａ】  図２に示す装置の２Ａ−２Ａから見た端面立面図。
【図３】  例１に記載された実施形態の側面図で、カールを形成するのを開始するときのビードに対するカバースリップを示す。
【図４】  例１に記載された実施形態の側面図で、形成後のカールを示す。
【図５】  顕微鏡スライド上のビードに対するカバースリップの位置を示す。
【図６】  例１に記載された実施形態の平面図。
【図７】  例２に記載された実施形態の側面図で、標識パッド変体を示す。
【図７Ａ】  例２に記載された他の実施形態の側面図で、標識パッドのミクロスフェアビードとの置換を示す。
【図８】  ニューラルネットワークのリスク分析テストに対する予想されたテスト結果のＲＯＣ曲線の一例を示す。
【図９】  光倍率顕微鏡を使用して倍率４００ｘで撮られた顕微鏡写真で、バイオチップの棚に塗布された未分離のヨーグルトの外観を示す。
【図１０】  光倍率顕微鏡を使用して倍率４００ｘで撮られた顕微鏡写真で、１５マイクロメータの径を有するミクロスフェアビードを使用して分離した後の図９に示すヨーグルトの流体部分を示す。
【図１１】  光倍率顕微鏡を使用して倍率４００ｘで撮られた顕微鏡写真で、１０マイクロメータの径を有するミクロスフェアビードを使用して分離した後の図９に示すヨーグルトの流体部分を示す。
【図１２】  光倍率顕微鏡を使用して倍率４００ｘで撮られた顕微鏡写真で、バイオチップの棚に塗布された未分離の大腸菌とパンの懸濁液の外観を示す。
【図１３】  光倍率顕微鏡を使用して倍率４００ｘで撮られた顕微鏡写真で、１５マイクロメータの径を有するミクロスフェアビードを使用して分離した後の図１２に示す大腸菌／パン懸濁液の流体部分を示す。
【図１４】  光倍率顕微鏡を使用して倍率４００ｘで撮られた顕微鏡写真で、バイオチップの棚に塗布された乳牛の糞便の外観を示す。
【図１５】  光倍率顕微鏡を使用して倍率４００ｘで撮られた顕微鏡写真で、１５マイクロメータの径を有するミクロスフェアビードを使用して分離した後の図１４に示す乳牛の糞便の流体部分を示す。
【図１６】  光倍率顕微鏡を使用して倍率４００ｘで撮られた顕微鏡写真で、１０マイクロメータの径を有するミクロスフェアビードを使用して分離した後の図１４に示す乳牛の糞便の流体部分を示す。
【図１７】  光倍率顕微鏡を使用して撮られた顕微鏡写真で、バイオチップに棚に塗布されたスケールが１ｍｍのシリカサンドを示す。
【図１８】  光倍率顕微鏡を使用して倍率４００ｘで撮られた顕微鏡写真で、シリカサンド粒子を使用して分離した後の図１２に示す大腸菌／パン懸濁液の流体部分を示す。
【図１９】  光倍率顕微鏡を使用して倍率４００ｘで撮られた顕微鏡写真で、シリカサンド粒子を使用して分離した後の図１４に示す乳牛の糞便の流体部分を示す。
【符号の説明】
１０  上部プレート
１２  下部プレート
１４  毛細管チャンバー
１６  適用ゾーン
１８  生物学的サンプル
２０  ミクロスフェアビーズ
２２  標識ゾーン
【図１】
0004544498.tif 000005
【図２】
0004544498.tif 000006
【図２Ａ】
0004544498.tif 000007
【図３】
0004544498.tif 000008
【図４】
0004544498.tif 000009
【図５】
0004544498.tif 000010
【図６】
0004544498.tif 000011
【図７】
0004544498.tif 000012
【図７ａ】
0004544498.tif 000013
【図８】
0004544498.tif 000014
【図９】
0004544498.tif 000015
【図１０】
0004544498.tif 000016
【図１１】
0004544498.tif 000017
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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