(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
単数又は複数の不適合塩基対を有するポリヌクレオチドを識別する方法において、ストリンジェントな条件の上昇を見込むべく、オリゴヌクレオチドの単数又は複数のプリン残基がピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンによって置換された所定の配列を有するオリゴヌクレオチドの使用であって、前記方法は以下を有する、
（ａ）前記オリゴヌクレオチドを提供する、
（ｂ）それぞれが標的配列を有する少なくとも二つのポリヌクレオチドを提供する、ここで、前記ポリヌクレオチドの内の一つは前記オリゴヌクレオチドに対して完全に相補的な標的配列を有し、前記ポリヌクレオチドの少なくとももう一つは、単数又は複数の不適合塩基対を有する、
（ｃ）夫々の前記ポリヌクレオチドを、別々に、前記オリゴヌクレオチドと共にハイブリダイゼーション条件下でインキュベートする、そして
（ｄ）前記オリゴヌクレオチドと前記ポリヌクレオチドのそれぞれとの間のハイブリダイゼーション度を測定する、使用。
【請求項２】
前記オリゴヌクレオチドは、検出可能標識を有する請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記検出可能標識は、蛍光標識である請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記検出可能標識は、フルオレセインである請求項３に記載の使用。
【請求項５】
前記オリゴヌクレオチドは、複数の蛍光標識を有する請求項３に記載の使用。
【請求項６】
前記蛍光標識のうちの一つの蛍光標識の放出波長は、前記蛍光標識のうちの他の蛍光標識の吸収波長とオーバラップしている請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記オリゴヌクレオチドは、前記蛍光標識の蛍光放出を消光するクエンチング剤を有する請求項３に記載の使用。
【請求項８】
前記蛍光標識は、フルオレセインである請求項７に記載の使用。
【請求項９】
前記クエンチング剤は、テトラメチルローダミンである請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
前記方法は、ハイブリダイゼーション後に、前記蛍光標識と、前記クエンチング剤との空間関係を変化させる工程を有する請求項７に記載の使用。
【請求項１１】
前記蛍光標識と前記クエンチング剤との空間関係の変化は、前記オリゴヌクレオチドのエキソヌクレアーゼ加水分解によって行われる請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
エキソヌクレアーゼ加水分解の結果として標識の放出が起こる請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記オリゴヌクレオチドと前記各ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーション度は、ハイブリダイゼーション後に前記オリゴヌクレオチドから放出される標識の量によって測定される請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
前記複数のポリヌクレオチドは、一つのヌクレオチドが異なる請求項１に記載の使用。
【請求項１５】
前記複数のポリヌクレオチドは、一つのヌクレオチドが異なる請求項１２に記載の使用。
【請求項１６】
単数又は複数のグアニン残基が、６−アミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４，−ｄ］ピリミジン−４（５Ｈ）−オンによって置換されている請求項１に記載の使用。
【請求項１７】
単数又は複数のアデニン残基が、４−アミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンによって置換されている請求項１に記載の使用。
【請求項１８】
単数又は複数のプリン残基が、１Ｈ−ピラゾロ［３，４，−ｄ］ピリミジン−４（５Ｈ）−オンによって置換されている請求項１に記載の使用。
【請求項１９】
単数又は複数のプリン残基が、ヒポキサンチンによって置換されている請求項１に記載の使用。
【請求項２０】
前記オリゴヌクレオチドは、更に、単数又は複数の浅溝バインダ（ＭＧＢ）モアエティを有する請求項１に記載の使用。
【請求項２１】
前記浅溝バインダモアエティは、３−カルバモイル−１，２−ジヒドロ−（３Ｈ）−ピロロ［３，２−ｅ］インドール−７−カルボン酸エステルの三量体（ＣＤＰＩ３）と、Ｎ−メチルピロル−４−カルボックス−２−アミドの五量体（ＭＰＣ５）とから成るグループから選択される請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
前記オリゴヌクレオチドは、その長さが２１ヌクレオチド以下である請求項１に記載の使用。
【請求項２３】
前記オリゴヌクレオチドと前記各ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーション度は、前記オリゴヌクレオチドのプライミング能力によって測定される請求項１に記載の使用。
【請求項２４】
プライミングは増幅反応の一部として起こる請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
前記増幅反応はポリメラーゼ連鎖反応である請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
一つ以上のオリゴヌクレオチドが使用される請求項３に記載の使用。
【請求項２７】
二つのオリゴヌクレオチドが使用される請求項２６に記載の使用。
【請求項２８】
前記二つのオリゴヌクレオチドの第１は、蛍光ドナーを含み、前記二つのオリゴヌクレオチドの第２は蛍光アクセプタを含み、更に、前記蛍光ドナーの放出波長は前記蛍光アクセプタの吸収波長とオーバラップしている請求項２７に記載の使用。
【請求項２９】
ポリヌクレオチド中の標的配列の存在を検出する方法において、ストリンジェントな条件の上昇を見込むべく、オリゴヌクレオチドの単数又は複数のプリン残基がピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンによって置換されたオリゴヌクレオチドの使用であって、前記方法は以下を有する、
（ａ）前記標的配列の存在をテストされるべきポリヌクレオチドを提供する、
（ｂ）前記標的配列に対して実質的に相補的な配列を有する前記オリゴヌクレオチドを提供する、
（ｃ）前記ポリヌクレオチドと前記オリゴヌクレオチドとをハイブリダイゼーション条件下でインキュベートし、
（ｄ）ハイブリダイズされた核酸を同定する、使用。
【請求項３０】
前記複数のポリヌクレオチドが前記標的配列の存在に関してテストされ、これらポリヌクレオチドは単数又は複数の不適合塩基対を有する請求項２９に記載の使用。
【請求項３１】
前記複数のポリヌクレオチドは、前記標的配列中の一つのヌクレオチドが互いに異なる請求項３０に記載の使用
【請求項３２】
前記オリゴヌクレオチドは、浅溝バインダモアエティを有する請求項３１に記載の使用。
【請求項３３】
前記浅溝バインダモアエティは、３−カルバモイル−１，２−ジヒドロ−（３Ｈ）−ピロロ［３，２−ｅ］インドール−７−カルボン酸エステルの三量体（ＣＤＰＩ３）と、Ｎ−メチルピロル−４−カルボックス−２−アミドの五量体（ＭＰＣ５）とから成るグループから選択される請求項３２に記載の使用。
【請求項３４】
前記オリゴヌクレオチドは、伸長可能な３´−ヒドロキシ基を有するプライマーである請求項２９に記載の使用。
【請求項３５】
ハイブリダイズされた核酸が、前記プライマーを重合化酵素によって伸長することによって同定される請求項３４に記載の使用。
【請求項３６】
前記重合化酵素は熱安定酵素である請求項３５に記載の使用。
【請求項３７】
前記オリゴヌクレオチドは、増幅反応のプライマーである請求項３４に記載の使用。
【請求項３８】
前記増幅反応はポリメラーゼ連鎖反応である請求項３７に記載の使用。
【請求項３９】
プライマー伸長方法において、ストリンジェントな条件の上昇を見込むべく、単数又は複数のオリゴヌクレオチドの単数又は複数のプリン残基がピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンによって置換された単数又は複数のオリゴヌクレオチドの使用であって、前記方法は以下を有する、
（ａ）標的配列を含むポリヌクレオチドを提供する、
（ｂ）前記標的配列に対して相補的な単数又は複数の前記オリゴヌクレオチドプライマーを提供する、
（ｃ）重合化酵素とヌクレオチド基質とを提供する、そして
（ｄ）前記ポリヌクレオチドと、前記オリゴヌクレオチドプライマーと、前記酵素と、前記基質とを、重合化に適した条件下でインキュベートする、使用。
【請求項４０】
前記方法は、増幅反応の一部である請求項３９に記載の使用。
【請求項４１】
前記増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応である請求項４０に記載の使用。
【請求項４２】
前記方法は、ｃＤＮＡ分子の合成に使用される請求項３９に記載の使用。
【請求項４３】
ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する方法において、ストリンジェントな条件の上昇を見込むべく、オリゴヌクレオチドアレイの単数又は複数のプリン残基がピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンによって置換されたオリゴヌクレオチドのアレイの使用であって、前記方法は以下を有する、
（ａ）互いに異なる既知の配列を有する前記オリゴヌクレオチドのアレイを提供する、
（ｂ）前記ポリヌクレオチドを前記アレイと共にハイブリダイゼーション条件下でインキュベートする、そして
（ｃ）前記アレイ中のどのオリゴヌクレオチドに前記ポリヌクレオチドがハイブリダイズするかを判定する、
ここで、前記各オリゴヌクレオチド中の単数又は複数のプリン残基は、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンによって置換されている、使用。
【請求項４４】
ポリヌクレオチド中の標的配列のヌクレオチド配列を決定する方法における、ストリンジェントな条件の上昇を見込むべく、オリゴヌクレオチドの単数又は複数のプリン残基がピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンによって置換された所定の配列を有するオリゴヌクレオチドの使用であって、前記方法は以下を有する、
（ａ）前記標的配列を有するポリヌクレオチドを提供する、
（ｂ）前記オリゴヌクレオチドの単数又は複数のプリン残基がピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンによって置換され、かつ、前記少なくとも二つのオリゴヌクレオチドの一つが、前記標的配列に対して完全相補的な配列を有し、前記オリゴヌクレオチドの少なくとも他方が単数又は複数の不適合塩基対配列を有する、既知の配列の少なくとも二つのオリゴヌクレオチドを提供する、
（ｃ）前記夫々のオリゴヌクレオチドを、別々に、前記ポリヌクレオチドと共にハイブリダイゼーション条件下でインキュベートする、そして
（ｄ）前記各オリゴヌクレオチドと前記ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーション度を測定する、使用。
【請求項４５】
前記少なくとも一つの他方のオリゴヌクレオチドは、前記標的配列に対して単一ヌクレオチド不適合塩基対を有する請求項４４に記載の使用。
【請求項４６】
細胞中の遺伝子発現を調べる方法における、ストリンジェントな条件の上昇を見込むべく、オリゴヌクレオチドアレイの単数又は複数のプリン残基がピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンによって置換されたオリゴヌクレオチドのアレイの使用であって、前記方法は以下を有する、
（ａ）前記細胞中で発現される前記遺伝子を表わすポリヌクレオチドの集団を提供する、
（ｂ）互いに異なる配列の前記オリゴヌクレオチドのアレイを提供する、
（ｃ）前記ポリヌクレオチドの集団を前記アレイとハイブリダイゼーション条件下でインキュベートする、そして
（ｄ）前記アレイ中のどのオリゴヌクレオチドがポリヌクレオチドにハイブリダイズされたかを判定する、
ここで、前記各オリゴヌクレオチドの単数又は複数のプリン残基は、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンによって置換されている、使用。
【請求項４７】
対象の遺伝子の標的配列中の変異を同定する方法における、ストリンジェントな条件の上昇を見込むべく、オリゴヌクレオチドアレイの単数又は複数のプリン残基がピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンによって置換されたオリゴヌクレオチドのアレイの使用であって、前記方法は以下を有する、
（ａ）前記標的配列を有するポリヌクレオチドを提供する、
（ｂ）互いに配列の異なる前記オリゴヌクレオチドのアレイを提供する、ここで、これらの異なる配列は、野生タイプの標的配列と、異なる変異標的配列とを含む、
（ｃ）前記ポリヌクレオチドと前記アレイとをハイブリダイゼーション条件下でインキュベートする、そして
（ｄ）前記アレイ中のどのオリゴヌクレオチドが前記ポリヌクレオチドにハイブリダイズされたかを判定する、
ここで、前記各オリゴヌクレオチド中の単数又は複数のプリン残基は、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンによって置換されている、使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、オリゴヌクレオチドをプローブ及びプライマーとしての利用することに関する分子生物学の分野に関連する。本発明は、更に、プローブ及びプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション特性及び識別能力を改善するための改変核酸塩基の利用にも関する。
【０００２】
背景
分子生物学に現在使用されている多くの技術は、プローブ及び／又はプライマーとしてオリゴヌクレオチドを利用している。これらの技術を実施するに当たって、互いに関連してはいるが単数又は複数のヌクレオチドが異なる二つ又はそれ以上の配列間を識別可能であることが有利であることが多い。例えば、臨床的に有意の多くの変異は、野生タイプの配列から一つのヌクレオチドのみが異なる。哺乳類ゲノムの多型は、一つ又は少数のヌクレオチドの配列相違によって特徴付けられることが多い。そのような区別をする能力は、不一致識別として知られている。実際には、不一致識別は、それによって、所与のストリンジェンシにおいて、所定の配列オリゴヌクレオチドが、それに対してその全長に渡って相補的な（完全ハイブリッド又は完全一致）標的配列に対しては強くハイブリダイズするが（その一つの表現は、それらのハイブリッドが高い溶解温度を有していることである）、一つ又は少数のヌクレオチドでそのオリゴヌクレオチドの配列に対して非相補的である標的配列に対しては弱く検出可能な状態でしかハイブリダイズしない（不一致）という特性を述べるものである。ハイブリダイゼーション強度の違いは、特定のストリンジェンシにおいて、完全一致だとハイブリッドとして検出可能で、不一致ではハイブリッドを形成することができない、ということである。
【０００３】
核酸デュプレックス（ｄｕｐｌｅｘ）において、各塩基対が安定性に寄与している。従って、そのデュプレックスが短いほど、各塩基対のそのデュプレックスの安定性に対する相対的貢献度は大きなものとなる。その結果、オリゴヌクレオチドが短くなるほど、完全一致と不一致の間の安定性の相違は大きくなる。しかしながら、短いオリゴヌクレオチドは、完全に相補的な配列に対してさえ弱くしかハイブリダイズせず、従って、低いストリンジェント条件でハイブリダイズされなければならない。それにより、短いオリゴヌクレオチドの潜在的識別力は、その識別能力にとって不利な、低いストリンジェント条件以外では容易に利用することができない。もしも、特に単一ヌクレオチド不一致において、高いストリンジェント条件下、例えば、大半の増幅反応の昇温特性、で不一致識別が達成されれば、当該技術においてそれは大きな進歩となるであろう。
【０００４】
ピラゾロピリミジン塩基類似体（ｐｙｒａｚｏｌｏｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ  ｂａｓｅ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ）によるデュプレックスの安定化は既に報告されている。シーラ（Ｓｅｅｌａ）他（１９８８）Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．７１：１１９１−１１９８；シーラ（Ｓｅｅｌａ）他（１９８８）Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．７１：１８１３−１８２３；及びシーラ（Ｓｅｅｌａ）他（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：９０１−９１０。オリゴヌクレオチド中のピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン残基は、又、様々なペンダント基（ｐｅｎｎｄａｎｔ  ｇｒｏｕｐｓ）をオリゴヌクレオチドに付着させるための部位としても有用である。共有のＰＣＴ公報ＷＯ９０／１４３５３、１９９０年１１月２９日を参照。更に、単数又は複数のプリン残基がピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンによって置換されたオリゴヌクレオチドは、例えば、ベロウソフ（Ｂｅｌｏｕｓｏｖ）他（１９９８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６：１３２４−１３２８に記載されているように、より高いトリプレックス形成能力を示す。ピラゾロピリミジンは、オリゴヌクレオチド中に組み込まれた時、デュプレックス及びトリプレックス形成の向上を提供することができる。米国特許５，５９４，１２１。
【０００５】
発明の開示
本発明の課題は、ハイブリダイゼーションと不一致識別に関連する特性を改善する新規なオリゴヌクレオチド組成物を提供することにある。本発明の別の課題は、ハイブリダイゼーション、プライマー伸長、加水分解可能プローブアッセイ、ＰＣＲ，単一ヌクレオチド不一致識別、ヌクレオチド配列分析、アレイ分析及び、ヌクレオチドのプローブ及び／又はプライマーとしての使用を含むそれらに関連する技術のための改善された方法を提供することにある。
【０００６】
従って、一態様において、本発明は、少なくとも一つのプリンが単数又は複数のピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン塩基類似体によって置換された、改変オリゴヌクレオチド組成物を提供する。好適実施例において、グアニン類似体である６−アミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４，−ｄ］ピリミジン−４（５Ｈ）−オン（６−ａｍｉｎｏ−１Ｈ−ｐｙｒａｚｏｌｏ[３，４−ｄ]ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ−４（５Ｈ）−ｏｎｅ）（ｐｐＧ）によって、グアニンが置換され、及び／又は、アデニン類似体である４−アミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン（４−ａｍｉｎｏ−１Ｈ−ｐｙｒａｚｏｌｏ[３，４−ｄ]ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ）（ｐｐＡ）によってアデニンが置換される。他の実施例において、グアニン類似体である１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４（５Ｈ）−オン（１Ｈ−ｐｙｒａｚｏｌｏ[３，４−ｄ]ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ−４（５Ｈ）−ｏｎｅ）（ｐｐＩ）によって、グアニンが置換される。前記ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン置換オリゴヌクレオチドは、更に、検出可能標識及び／又は浅溝バインダ（ｍｉｎｏｒ  ｇｒｏｏｖｅ  ｂｉｎｄｅｒｓ）及び／又はその他のタイプの改変塩基又は塩基類似体等の他のモアエティ（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）を含むことができる。
【０００７】
本発明の更に別の態様は、核酸のハイブリダイゼーションの方法であって、前記核酸の少なくとも一つが、単数又は複数のプリン残基がピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン残基類似体によって置換された改変核酸である方法に関する。この方法によって、高い溶解温度と改善された不一致検出とが提供される。本発明によって改善されたハイブリダイゼーション方法は、これらのものに限定されるものではないが、ハイブリダイゼーション、プライマー伸長、単一ヌクレオチド多型検出、加水分解可能プローブアッセイ、ｃＤＮＡ合成、ヌクレオチド配列決定、増幅反応、及び、当業者に知られているもの等のその他の技術に使用することができる。
オリゴヌクレオチド中のグアニン塩基が前記グアニン類似体ｐｐＧによって置換されると、これら類似体を含有するプローブのＴm値は、グアニンを含有するオリゴヌクレオチドプローブのそれらよりも僅かに高くなる。従って、Ｇ含有及びｐｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションアッセイにおいて類似の性能を有する。しかしながら、ｐｐＧ置換オリゴヌクレオチドが加水分解可能プローブとして使用された場合（後述するように、又、米国特許５，２１０，０１５を参照）、二つの特性が大幅に向上する。第１に、完全一致ハイブリッドから得られる蛍光信号と、単一ヌクレオチド不一致を含むハイブリッドから得られるものとを比較した場合より高いＳ／Ｎ比として測定されるように、ｐｐＧ置換プローブは、不一致識別においてより効果的である。更に、ｐｐＧ置換プローブは、完全一致標的からより高い絶対値の信号を提供する。
【０００８】
つまり、この目的を達成するための本発明の第１特徴構成は、関連配列を有するポリヌクレオチドを識別する方法であって、該方法は以下の工程を有する、
（ａ）所定の配列を有するオリゴヌクレオチドを提供する、ここで、該オリゴヌクレオチドの単数又は複数のプリン残基はピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンによって置換されている、
（ｂ）それぞれが標的配列を有する少なくとも二つのポリヌクレオチドを提供する、ここで、前記ポリヌクレオチドの内の一つは前記オリゴヌクレオチドに対して完全に相補的な標的配列を有し、前記ポリヌクレオチドの少なくとももう一つは、関連標的配列を有する、
（ｃ）夫々の前記ポリヌクレオチドを、別々に、前記オリゴヌクレオチドと共にハイブリダイゼーション条件下でインキュベートする、そして
（ｄ）前記オリゴヌクレオチドと前記ポリヌクレオチドのそれぞれとの間のハイブリダイゼーション度を測定する点にある。
本発明の第２特徴構成は、上記第１徴構成において、前記オリゴヌクレオチドが、更に、検出可能標識を有する点にある。
本発明の第３特徴構成は、上記第２特徴構成において、前記検出可能標識が、蛍光標識である点にある。
本発明の第４特徴構成は、上記第３特徴構成において、前記標識が、フルオレセインである点にある。
本発明の第５特徴構成は、上記第３特徴構成において、前記オリゴヌクレオチドが、複数の蛍光標識を有する点にある。
本発明の第６特徴構成は、上記第５特徴構成において、前記蛍光標識のうちの一つの蛍光標識の放出波長が、前記蛍光標識のうちの他の蛍光標識の吸収波長とオーバラップしている点にある。
本発明の第７特徴構成は、上記第３特徴構成において、前記オリゴヌクレオチドが、更に、前記蛍光標識の蛍光放出を消光するクエンチング剤を有する点にある。
本発明の第８特徴構成は、上記第７特徴構成において、前記蛍光標識がフルオレセインである点にある。
本発明の第９特徴構成は、上記第８特徴構成において、前記クエンチング剤が、テトラメチルローダミンである点にある。
本発明の第１０特徴構成は、上記第７特徴構成において、更に、ハイブリダイゼーション後に、前記蛍光標識と、前記クエンチング剤との空間関係を変化させる工程を有する点にある。
本発明の第１１特徴構成は、上記第１０特徴構成において、前記蛍光標識と前記クエンチング剤との空間関係の変化が、前記オリゴヌクレオチドのエキソヌクレアーゼ加水分解によって行われる点にある。
本発明の第１２徴構成は、上記第１１特徴構成において、エキソヌクレアーゼ加水分解の結果として標識の放出が起こる点にある。
本発明の第１３特徴構成は、上記第１２特徴構成において、前記オリゴヌクレオチドと前記各ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーション度が、ハイブリダイゼーション後に前記オリゴヌクレオチドから放出される標識の量によって測定される点にある。
本発明の第１４特徴構成は、上記第１特徴構成において、前記複数のポリヌクレオチドは、一つのヌクレオチドが異なる点にある。
本発明の第１５特徴構成は、上記第１２特徴構成において、前記複数のポリヌクレオチドは、一つのヌクレオチドが異なる点にある。
本発明の第１６特徴構成は、上記第１特徴構成において、単数又は複数のグアニン残基が、６−アミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４，−ｄ］ピリミジン−４（５Ｈ）−オンによって置換されている点にある。
本発明の第１７特徴構成は、上記第１特徴構成において、単数又は複数のアデニン残基が、４−アミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンによって置換されている点にある。
本発明の第１８特徴構成は、上記第１特徴構成において、単数又は複数のプリン残基が、１Ｈ−ピラゾロ［３，４，−ｄ］ピリミジン−４（５Ｈ）−オンによって置換されている点にある。
本発明の第１９特徴構成は、上記第１特徴構成において、単数又は複数のプリン残基が、ヒポキサンチンによって置換されている点にある。
本発明の第２０特徴構成は、上記第１特徴構成において、前記オリゴヌクレオチドが、更に、単数又は複数の浅溝バインダ（ＭＧＢ）モアエティを有する点にある。
本発明の第２１特徴構成は、上記第２０特徴構成において、前記浅溝バインダモアエティが、３−カルバモイル−１，２−ジヒドロ−（３Ｈ）−ピロロ［３，２−ｅ］インドール−７−カルボン酸エステルの三量体（ＣＤＰＩ3）と、Ｎ−メチルピロル−４−カルボックス−２−アミドの五量体（ＭＰＣ5）とから成るグループから選択される点にある。
本発明の第２２特徴構成は、上記第１特徴構成において、前記オリゴヌクレオチドは、その長さが２１ヌクレオチド以下である点にある。
本発明の第２３特徴構成は、上記第１特徴構成において、前記オリゴヌクレオチドと前記各ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーション度が、前記オリゴヌクレオチドのプライミング能力によって測定される点にある。
本発明の第２４特徴構成は、上記第２３特徴構成において、プライミングが増幅反応の一部として起こる点にある。
本発明の第２５特徴構成は、上記第２４特徴構成において、前記増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応である点にある。
本発明の第２６特徴構成は、上記第３特徴構成において、一つ以上のオリゴヌクレオチドが使用される点にある。
本発明の第２７徴構成は、上記第２６特徴構成において、二つのオリゴヌクレオチドが使用される点にある。
本発明の第２８特徴構成は、上記第２７特徴構成において、前記二つのオリゴヌクレオチドの第１が、蛍光ドナーを含み、前記二つのオリゴヌクレオチドの第２が蛍光アクセプタを含み、更に、前記蛍光ドナーの放出波長が前記蛍光アクセプタの吸収波長とオーバラップしている点にある。
本発明の第２９特徴構成は、ポリヌクレオチド中の標的配列の存在を検出する方法であって、該方法は以下の工程を有する、
（ａ）前記標的配列の存在をテストされるべきポリヌクレオチドを提供する、
（ｂ）前記標的配列に対して実質的に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを提供する、
（ｃ）前記ポリヌクレオチドと前記オリゴヌクレオチドとをハイブリダイゼーション条件下でインキュベートし、
（ｄ）ハイブリダイズされた核酸を同定する、
ここで、前記オリゴヌクレオチドの単数又は複数のプリン残基は、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンによって置換されている点にある。
本発明の第３０特徴構成は、上記第２９特徴構成において、複数のポリヌクレオチドが前記標的配列の存在に関してテストされ、これらポリヌクレオチドは関連標的配列を有する点にある。
本発明の第３１特徴構成は、上記第３０特徴構成において、前記複数のポリヌクレオチドは、前記標的配列中の一つのヌクレオチドが互いに異なる点にある。
本発明の第３２特徴構成は、上記第３１特徴構成において、前記オリゴヌクレオチドは、更に、浅溝バインダモアエティを有する点にある。
本発明の第３３特徴構成は、上記第３２特徴構成において、前記浅溝バインダモアエティは、３−カルバモイル−１，２−ジヒドロ−（３Ｈ）−ピロロ［３，２−ｅ］インドール−７−カルボン酸エステルの三量体（ＣＤＰＩ3）と、Ｎ−メチルピロル−４−カルボックス−２−アミドの五量体（ＭＰＣ5）とから成るグループから選択される点にある。
本発明の第３４特徴構成は、上記第２９特徴構成において、前記オリゴヌクレオチドが、伸長可能な３´−ヒドロキシ基を有するプライマーである点にある。
本発明の第３５特徴構成は、上記第３４特徴構成において、ハイブリダイズされた核酸が、前記プライマーを重合化酵素によって伸長することによって同定される点にある。
本発明の第３６特徴構成は、上記第３５特徴構成において、前記重合化酵素は熱安定酵素である点にある。
本発明の第３７特徴構成は、上記第３４特徴構成において、前記オリゴヌクレオチドが、増幅反応のプライマーである点にある。
本発明の第３８特徴構成は、上記第３７特徴構成において、前記増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応である点にある。
本発明の第３９特徴構成は、プライマー伸長方法であって、該方法は以下の工程を有する、
（ａ）標的配列を含むポリヌクレオチドを提供する、
（ｂ）前記標的配列に対して相補的な単数又は複数のオリゴヌクレオチドプライマーを提供する、
（ｃ）重合化酵素とヌクレオチド基質とを提供する、そして
（ｄ）前記ポリヌクレオチドと、前記オリゴヌクレオチドプライマーと、前記酵素と、前記基質とを、重合化に適した条件下でインキュベートする、
ここで、前記単数又は複数のオリゴヌクレオチドプライマーの単数又は複数のプリン残基は、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンによって置換されている点にある。
本発明の第４０特徴構成は、上記第３９特徴構成において、該方法が、増幅反応の一部である点にある。
本発明の第４１特徴構成は、上記第４０特徴構成において、前記増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応である点にある。
本発明の第４２特徴構成は、上記第３９特徴構成において、該方法は、ｃＤＮＡ分子の合成に使用される点にある。
本発明の第４３特徴構成は、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する方法であって、該方法は以下の工程を有する、
（ａ）互いに異なる既知の配列を有するオリゴヌクレオチドのアレイを提供する、
（ｂ）前記ポリヌクレオチドを前記アレイと共にハイブリダイゼーション条件下でインキュベートする、そして
（ｃ）前記アレイ中のどのオリゴヌクレオチドに前記ポリヌクレオチドがハイブリダイズするかを判定する、
ここで、前記各オリゴヌクレオチド中の単数又は複数のプリン残基は、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンによって置換されている点にある。
本発明の第４４特徴構成は、ポリヌクレオチド中の標的配列のヌクレオチド配列を決定する方法であって、該方法は以下の工程を有する、
（ａ）前記標的配列を有するポリヌクレオチドを提供する、
（ｂ）前記オリゴヌクレオチドの単数又は複数のプリン残基がピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンによって置換され、かつ、前記少なくとも二つのオリゴヌクレオチドの一つが、前記標的配列に対して完全相補的な配列を有し、前記オリゴヌクレオチドの少なくとも他方が関連標的配列を有する、既知の配列の少なくとも二つのオリゴヌクレオチドを提供する、
（ｃ）前記夫々のオリゴヌクレオチドを、別々に、前記ポリヌクレオチドと共にハイブリダイゼーション条件下でインキュベートする、そして
（ｄ）前記各オリゴヌクレオチドと前記ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーション度を測定する点にある。
本発明の第４５特徴構成は、上記第４４特徴構成において、前記少なくとも一つの他方のオリゴヌクレオチドが、前記標的配列に対して単一ヌクレオチド不一致を有する点にある。
本発明の第４６特徴構成は、細胞中の遺伝子発現を調べる方法であって、該方法は以下の工程を有する、
（ａ）前記細胞中で発現される前記遺伝子を表わすポリヌクレオチドの集団を提供する、
（ｂ）互いに異なる配列のオリゴヌクレオチドのアレイを提供する、
（ｃ）前記ポリヌクレオチドの集団を前記アレイとハイブリダイゼーション条件下でインキュベートする、そして
（ｄ）前記アレイ中のどのオリゴヌクレオチドがポリヌクレオチドにハイブリダイズされたかを判定する、
ここで、前記各オリゴヌクレオチドの単数又は複数のプリン残基は、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンによって置換されている点にある。
本発明の第４７特徴構成は、対象の遺伝子の標的配列中の変異を同定する方法であって、該方法は以下の工程を有する、
（ａ）前記標的配列を有するポリヌクレオチドを提供する、
（ｂ）互いに配列の異なるオリゴヌクレオチドのアレイを提供する、ここで、これらの異なる配列は、野生タイプの標的配列と、異なる変異標的配列とを含む、
（ｃ）前記ポリヌクレオチドと前記アレイとをハイブリダイゼーション条件下でインキュベートする、そして
（ｄ）前記アレイ中のどのオリゴヌクレオチドが前記ポリヌクレオチドにハイブリダイズされたかを判定する、
ここで、前記各オリゴヌクレオチド中の単数又は複数のプリン残基は、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンによって置換されている点にある。
本発明の第４８特徴構成は、改変された所定の配列を有し、ここにおいて、前記所定の配列の単数又は複数のプリン残基がピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンによって置換されているオリゴヌクレオチドプローブである点にある。
本発明の第４９特徴構成は、上記第４８特徴構成において、更に、結合した浅溝バインダを有する点にある。
本発明の第５０特徴構成は、上記第４９特徴構成において、前記浅溝バインダは、１，２−ジヒドロ−（３Ｈ）−ピロロ［３，２−ｅ］インドール−７−カルボン酸エステルの三量体（ＣＤＰＩ3）と、Ｎ−メチルピロル−４−カルボックス−２−アミドの五量体（ＭＰＣ5）とから成るグループから選択される点にある。
本発明の第５１特徴構成は、上記第４８特徴構成において、更に、検出可能標識を有する点にある。
本発明の第５２特徴構成は、上記第５１特徴構成において、前記検出可能標識が、放射性同位元素、発色団、フルオロフォア、蛍光化学発光剤、電子化学発光剤、磁気標識、免疫学的標識、リガンド及び酵素標識から選択される点にある。
本発明の第５３特徴構成は、上記第５１特徴構成において、前記検出可能標識が、前記オリゴヌクレオチドの５’末端に位置している点にある。
本発明の第５４特徴構成は、上記第５１特徴構成において、前記検出可能標識が、前記オリゴヌクレオチドの３’末端に位置している点にある。
本発明の第５５特徴構成は、上記第５１特徴構成において、前記検出可能標識が、蛍光標識である点にある。
本発明の第５６特徴構成は、上記第５５特徴構成において、前記蛍光標識が、フルオレセイン、ローダミン、シアニン、フィコエリトリンから選択される点にある。
本発明の第５７特徴構成は、上記第５５特徴構成において、更に、前記蛍光標識の蛍光放出を消光するクエンチング剤を有する点にある。
本発明の第５８特徴構成は、上記第５１特徴構成において、複数の蛍光標識を有する点にある。
本発明の第５９特徴構成は、上記第５８特徴構成において、前記蛍光標識のうちの一つの蛍光標識の放出波長が、前記蛍光標識のうちの他の蛍光標識の吸収波長とオーバラップしている点にある。
本発明の第６０特徴構成は、上記第４８特徴構成において、前記プリン残基が、グアニン残基及びアデニン残基から選択される点にある。
本発明の第６１特徴構成は、上記第４８特徴構成において、前記プリン残基はグアニン残基であり、前記グアニン残基の全てがピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン残基によって置換されている点にある。
本発明の第６２特徴構成は、上記第４８特徴構成において、配列中に４つのグアニン残基を有し、夫々がピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン残基によって置換されている点にある。
本発明の第６３特徴構成は、上記第４８特徴構成において、配列中に６つのグアニン残基を有し、夫々がピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン残基によって置換されている点にある。
本発明の第６４特徴構成は、上記第４８特徴構成において、前記オリゴヌクレオチドプローブが、ハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチドプローブである点にある。
【０００９】
発明を実施する態様
本発明の実施は、特に銘記されない限り、有機化学、生化学、オリゴヌクレオチド合成及び改変、バイオコンジュゲートケミストリ（ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、核酸ハイブリダイゼーション、分子生物学、微生物学、遺伝学、組換えＤＮＡ、及び当該技術範囲内に於ける関連分野に於ける従来の技術を使用する。これらの技術は文献に完全に説明されている。例えば、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ），Ｆｒｉｔｓｃｈ＆Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ；Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８２）；サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ），フリッチュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ）およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ），ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ；Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）他，ＣＵＲＲＥＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７，１９８８，１９８９，１９９０，１９９１，１９９２，１９９３，１９９４，１９９５，１９９６）；Ｇａｉｔ（編集），ＯＬＯＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ  ＳＹＳＴＨＥＳＩＳ；  Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８４）；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（編集），ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ  ＡＮＤ  ＡＮＡＬＯＧＵＥＳ：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１）を参照。
【００１０】
単数又は複数のプリン残基（即ち、アデニン及び／又はグアニン）が、これらのピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン類似体によって置換された改変オリゴヌクレオチドは、非改変オリゴヌクレオチドによって形成されるものよりも強力なハイブリッド（即ち、デュプレックス）を形成する。ハイブリダイゼーション強度は通常、ハイブリッドデュプレックスの溶解温度（Ｔm）の測定によって評価される。これは、溶液中のデュプレックスを徐々に上昇する温度にさらし、そのデュプレックスの変性を、例えば、変性に伴う塩基対の分離を増加させる紫外線光の吸収率をモニタすることによって達成される。Ｔmは、一般に、完全デュプレックス構造から完全な変性状態（即ち、二つの単離された１本鎖ストランドの形成）への遷移の中間点の温度として定義される。単数又は複数のプリン残基がピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンによって置換されたオリゴヌクレオチドによって形成されたハイブリッドは、非置換オリゴヌクレオチドによって形成されたものよりも高い（Ｔm）を有する。
【００１１】
同時に、単数又は複数のプリン残基がピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンによって置換された改変オリゴヌクレオチドは、非置換オリゴヌクレオチドと比較してより高い不一致識別力を有する。なんら特定の理論によって限定されることを望むものではないが、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン改変オリゴヌクレオチドの改善された識別力に対する一つの貢献は、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン塩基が、自己対合又は非標準的塩基対合パートナーとの対合に関与する傾向が少なくなることから生じている可能性がある（即ち、Ｇは、Ｇ及びＴと塩基対合可能であるのに対して、ｐｐＧ及びｐｐＧ−Ｔ塩基対はその可能性が遥かに少ない）。
【００１２】
ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンヌクレオチドの構造と合成
本発明の改変オリゴヌクレオチドの好適実施例において、すべて又は実施的にすべての、グアニン含有ヌクレオチドユニットが、６−アミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４，−ｄ］ピリミジン−４（５Ｈ）−オン含有ヌクレオチド（ｐｐＧ）によって置換される。オリゴヌクレオチドのｐｐＧ含有部分が化１に示されている。より好適性の低い実施例において、全部ではないが、複数のグアニン含有ヌクレオチドユニットがｐｐＧによって置換される。
【００１３】
【化１】
0004558932.tif 000002
【００１４】
【化２】
0004558932.tif 000003
【００１５】
オプションとして、前記オリゴヌクレオチドのアデニン含有ユニットを、対応のピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン類似体、即ち、４−アミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンによって置換することもできる。このアデニン類似体を含むヌクレオチドユニットをｐｐＡと称し、オリゴヌクレオチドのｐｐＡ−含有部分が化２に示されている。従って、少なくとも一つのグアニン塩基がｐｐＧによって置換され、かつ、ｐｐＡ類似体を全く含まないオリゴヌクレオチド、更に、ｐｐＧに加えて、いくつか若しくは可能であればすべてのアデニンがｐｐＡによって置換されたオリゴヌクレオチド、更に、少なくとも一つのｐｐＡ類似体を有し、ｐｐＧは有さないオリゴヌクレオチドも、本発明の範囲に含まれる。
【００１６】
ｐｐＧとｐｐＡの２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシド（２−ｄｅｏｘｙ−β−Ｄ−ｒｉｂｏｆｕｒａｎｏｓｉｄｅｓ）、即ち、６−アミノ−１−（２´−デオキシ−β−Ｄ−エリスロ−ペンタフラノシル−（１Ｈ）−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−５（Ｈ）−オン（６−ａｍｉｎｏ−１−（２´−ｄｅｏｘｙ−β−Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ｐｅｎｔａｆｕｒａｎｏｓｙｌ−（１Ｈ）−ｐｙｒａｚｏｌｏ[３，４−ｄ]ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ−４（５Ｈ）−ｏｎｅ）及び４−アミノ−１−（２´−デオキシ−β−Ｄ−エリスロ−ペンタフラノシル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン（４−ａｍｉｎｏ−１−（２´−ｄｅｏｘｙ−β−Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｏｐｅｎｔａｆｕｒａｎｏｓｙｌ−１Ｈ−ｐｙｒａｚｏｌｏ[３，４−ｄ]ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ）が、合成され、最新の自動オリゴヌクレオチド合成装置でのオリゴヌクレオチド合成に適した対応の活性燐酸塩含有類似体（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ）は、シーラ（Ｓｅｅｌａ）他（１９８６ａ）Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ６９：１６０２−１６１３；シーラ（Ｓｅｅｌａ）他（１９８８ａ）Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｔａ  ７１：１１９１−１１９８；シーラ（Ｓｅｅｌａ）（１９８８ｂ）Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ７１：１８１３−１８２３；及びシーラ（Ｓｅｅｌａ）他（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １７：９０１−９１０に従って得られる。
【００１７】
本発明の前記改変オリゴヌクレオチド中に存在する塩基の更に別の改変として、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン  １Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４（５Ｈ）−オン（ｐｐＩ）に、単数又は複数のプリン塩基を置換させることができる。ｐｐＩとそれに対応のヌクレオチドとヌクレオチドとは、これら記載されたものに関連する方法によって得ることができる。シーラ（Ｓｅｅｌａ）他（１９８６ｂ）Ｌｉｅｂｉｇｓ，Ａｎｎ．Ｃｈｅｍ：１２１３−１２２１；シーラ（Ｓｅｅｌａ）他（１９８６ａ）前出；シーラ（Ｓｅｅｌａ）他（１９８８ａ）前出；シーラ（Ｓｅｅｌａ）他（１９８８ｂ）前出及び、シーラ（Ｓｅｅｌａ）他（１９８９）前出。
【００１８】
本発明の改変オリゴヌクレオチドの現在において好適な実施例において、糖又はグリコシドモアエティは、２−デオキシリボフラノシド（２−ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｆｕｒａｎｏｓｉｄｅｓ）であり、全てのヌクレオチド間結合は、自然発生的ホスフォジエステル結合である。しかし、別の実施例においては、２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノースの代りに、その他の糖、例えば、β−Ｄ−リボフラノースを含ませることができる。更に、β−Ｄ−リボフラノースを含ませて、リボースモアエティの２−ＯＨが、Ｃ1-6アルキル基（２−（Ｏ−Ｃ1-6アルキル）リボース）又は、Ｃ2-6アルキル基（２−（Ｏ−Ｃ2-6アルキル）リボース）によってアルキル化されるか、若しくは、フルオロ基によって置換される（２−フルオロリボース）。当業者に知られているもののような、前記オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに使用可能ないかなる糖モアエティも、使用可能である。
【００１９】
一実施例において、本発明の前記改変オリゴヌクレオチドの糖−燐酸塩バックボーンは、自然発生核酸に見られるもののような、ホスフォジエステル結合である。しかし、この糖−燐酸塩バックボーンは、これらに限定されるものではないが、α−Ｄ−アラビノフラノシド、α−２´−デオキシリボフラノシド又は２´，３´−ジデオキシ−３´−アミノリボフラノシドを含むオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに使用可能ないかなる構造のものであってもよい。α−Ｄ−アラビノフラノシドを含有するオリゴヌクレオチドは、米国特許５，１７７，１９６の教示に従って得ることができる。２´，３´−ジデオキシ−３´−アミノリボフラノシドを含むオリゴヌクレオチドは、チェン（Ｃｈｅｎ）他（１９９５）Ｎｕｃｅｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：２６６１−２６６８の方法に従って得ることができる。本発明の改変オリゴヌクレオチドの燐酸塩バックボーンは、又、オリゴヌクレオチドがホスホロチオエート結合及び／又はメチルホスホネートを含むようにも改変可能である。その他のバックボーン改変は、当業者に公知である。
【００２０】
本発明の改変オリゴヌクレオチドは、更に、単数又は複数の内部に位置するヌクレオチド塩基の３´末端、５´末端、若しくはそれらの両方、又は、内部及び片方又は両方の末端に、例えば、インターカレータ、脂肪親和性基、浅溝バインダ、レポーター基、キレート剤、架橋剤等のペンダント基を付加することも可能である。インターカレータ、脂肪親和性基、浅溝バインダ、レポーター基、キレート剤、架橋剤の性質と、それらのオリゴヌクレオチドへの付着は周知であり、例えば、米国特許５，５１２，６６７、５，４１９，９６６及び公報ＷＯ９６／３２４９６に開示されている。本発明のオリゴヌクレオチドは、又、その３´末端、又は５´末端又はそれらの両方に付着た比較的低分子量の「尾モアエティ」（ｔａｉｌ  ｍｏｉｅｔｙ）を有するものとすることができる。例えば、その尾モアエティは、燐酸塩、燐酸エステル、アルキル基、アミノアルキル基、又は脂肪親和基とすることができる。この尾モアエティは、又、インターカレータ、脂肪親和基、浅溝バインダ、レポーター基、キレート剤、架橋剤を本発明のオリゴヌクレオチドに結合させることができる。
【００２１】
これら尾モアエティの性質と、様々な尾モアエティを備えたオリゴヌクレオチドを得る方法とも、上述の米国特許５，５１２，６６７及び５，４１９，９６６に記載されている。
【００２２】
一好適実施例において、グアニンの代りにｐｐＧ及び／又はアデニンの代りにｐｐＡを含有する本発明の改変オリゴヌクレオチドは、更に、共役結合した浅溝バインダ（ＭＧＢ）を有する。例４及び５に示され後述されているように、グアニンの代りにｐｐＧを含有するＭＧＢ共役結合オリゴヌクレオチドを使用した場合に、最適な単一ヌクレオチド不一致識別が得られる。好適ＭＧＢモアエティとしては、３−カルバモイル−１，２−ジヒドロ−（３Ｈ）−ピロロ［３，２−ｅ］インドール−７−カルボン酸エステルの三量体（ＣＤＰＩ3）と、Ｎ−メチルピロル−４−カルボックス−２−アミドの五量体（ＭＰＣ5）がある。本発明の実施に使用可能なその他のＭＧＢモアエティは、ＷＯ９６／３２４９６に開示されている。
【００２３】
ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンの反応性前駆体は、上述した手順に従って得ることができ、これらの前駆体は、自動オリゴヌクレオチド合成の技術に使用可能である。そのような技術はルーチンであり、当業者には周知である。
【００２４】
本発明の使用方法
本発明は、非改変オリゴヌクレオチドと比較して、優れた不一致識別の新規で驚異的な特性を有する改変オリゴヌクレオチドを提供するものである。本発明の改変オリゴヌクレオチドは、プローブとして使用され、ここで、その標的配列に対するハイブリダイゼーションが、検出され、又は、プライマーとしてはその標的配列に対するハイブリダイゼーション後に改変オリゴヌクレオチドの３´末端から開始されるポリヌクレオチド合成が行われ、その合成生成物が（即ち、伸長生成物）が検出される。
【００２５】
標的配列とは、プローブ又はプライマーのためのハイブリダイゼーションの部位を有するヌクレオチド配列である。標的配列は、非限定的に、ゲノムＤＮＡ，ｃＤＮＡ及びＲＮＡを含むすべての核酸に見られ、野生タイプの遺伝子配列、変異遺伝子配列、非コード配列、調節配列等を含むことができる。標的配列の長さは、通常は、１００ヌクレオチド以下、好ましくは５０ヌクレオチド以下、最も好ましくは２１ヌクレオチド以下である。
【００２６】
オリゴヌクレオチドは、通常、その長さが、２００ヌクレオチド以下、好ましくは１５０ヌクレオチド以下、より好ましくは５０以下、最も好ましくは２１ヌクレオチド以下の短いヌクレオチドポリマーである。ポリヌクレオチドは、当該技術において、一般に、オリゴヌクレオチドより長いヌクレオチドのポリマーであるとみなされているが、オリゴヌクレオチドの上限とポリヌクレオチドの下限との間ではオーバラップがあることが認識されている。本発明に関しては、「オリゴヌクレオチド」とは、一般に、プローブ又はプライマーとして使用される、検出可能標識を有する核酸を意味し、ポリヌクレオチドとは、標的配列を含む核酸を意味するものとする。その結果、本発明の目的のためには、「オリゴヌクレオチド」と「ポリヌクレオチド」という用語は、ポリマの長さに関して限定的に解釈してはならない。
【００２７】
標的配列に対するプローブ及び／又はプライマーのハイブリダイゼーションは、周知の塩基対合特性、即ち、アデニンはチミン又はウラシルと対合し、グアニンはシトシンと対合するという特性に従って行われる。ヌクレオチドが第２のヌクレオチドとの対合を可能にすることを、ヌクレオチドの特性を相補性と称する。従って、アデニンはチミンとウラシルとに対して相補的であり、その逆も真であり、同様にグアニンはシトシンに対して相補的であり、その逆も真である。標的配列に対してその全長に渡って相補的なオリゴヌクレオチドは、完全相補的、完全一致、又は、その標的配列に対して完全相補的であるといわれ、その逆も真である。オリゴヌクレオチドとその標的配列は、これら二つの配列中の塩基の大半が相補的でありながらも一つ又は複数の塩基が非相補的又は不一致である関連する配列を有することがある。そのような場合、それらの配列は、実施的に相補的と呼ばれる。もしもオリゴヌクレオチドと標的配列との配列が、それらが一つの塩基を除いて全てのヌクレオチド部分において相補的である場合、そのオリゴヌクレオチドと標的配列とは、互いに単一ヌクレオチド不一致を有する。
【００２８】
本発明の改変ヌクレオチドは、その自然発生類似体の塩基対合特異性、即ち、ｐｐＧがシトシンに対して相補的であり、ｐｐＡがチミン及びウラシルに対して相補的である、という性質を保持している。ｐｐＧ及びｐｐＡの類似体は、グアニン及びアデニンと比較して、非相補的塩基に対する所謂「揺らぎ（ｗｏｂｂｌｅ）」対合の傾向が低い。
【００２９】
ハイブリダイゼーションの条件は当業者に周知であり、比較的広い範囲で変化可能である。ハイブリダイゼーションストリンジェンシとは、ハイブリダイゼーション条件が、不一致ヌクレオチドを含有するハイブリッドの形成には不利であり、これによって、完全一致ハイブリッド、又はより少数の不一致を有するハイブリッドの形成が促進される程度のことであり、より高いストリンジェンシは、不一致ハイブリッドに対する許容度が低いことに関連付けられている。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシに影響する要因としては、非限定的に、温度、ｐＨ、イオン強度、フォルムアミドやジメチルスルホキシド等の有機溶剤の濃度が挙げられる。当業者に周知であるが、ハイブリダイゼーションストリンジェンシは、温度上昇、イオン強度低下、溶剤濃度低下に従って高くなる。例えば、オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）他、前出；サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）他、前出；エム・エイ・イニス（Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓ）他（編集）ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｌｓ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９０；ビー・ディ・ヘイムズ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ）他（編集）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ；Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８５及びファン・ネス（ｖａｎ  Ｎｅｓｓ）他，（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：４１４３−５１５１を参照。
【００３０】
従って、オリゴヌクレオチドとその標的配列間のハイブリッド（デュプレックス）の形成において、オリゴヌクレオチドは、溶液中で、ハイブリダイゼーションに適した温度、イオン強度、ｐＨ等の条件下、即ち、ハイブリダイゼーション条件下で、標的配列を含むポリヌクレオチドとともにインキュベートされる。ハイブリダイゼーション条件は、状況に依っては、そのハイブリダイズさせる配列に単数又は複数の不一致を有する二つの核酸対と比較して、完全一致配列を有する二つの核酸間のハイブリダイゼーションに有利となるように選択される。その他の場合においては、ハイブリダイゼーション条件は、不一致配列間のハイブリダイゼーションを許容し、より少数の不一致を有する核酸間でのハイブリダイゼーションに有利となるように選択される。
【００３１】
ハイブリダイゼーション強度としても知られている、標的配列に対するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション度は、周知の方法によって測定される。一つの好適な方法は、ハイブリッドデュプレックスのＴmを測定する方法である。これは、前述したように、溶液中のデュプレックスを、徐々に上昇する温度にさらし、例えば、変性に伴う塩基対の分離とともに増加する紫外線光の吸収率によつて、そのデュプレックスの変性をモニタすることによって行われる。Ｔmは、一般に、変性に伴う紫外線吸収度の変化の中間の温度として定義される。或いは、もしもＴmが既知の場合には、ハイブリダイゼーション温度（一定のイオン強度、ｐＨ及び溶剤濃度に於ける）は、目的とするデュプレックスのＴm以下で、目的としないデュプレックスのＴm以上となるように選択することができる。この場合、ハイブリダイゼーション度の測定は、単にハイブリダイズされたプローブの存在をテストすることによって達成される。
【００３２】
もしもプローブが検出可能標識を含む場合には、ハイブリダイズしたプローブのアッセイは、通常、デュプレックス材中の標識の存在を検出するように構成される。これは、例えば、特にデュプレックス材を選択すること、特に一本鎖材を破壊すること、又は、これらの方法のなんらかの組み合わせを利用することに、によって達成できる。例えば、ハイブリダイゼーション反応混合物を、高ストリンジェンシ条件及び／又は一本鎖特異的ヌクレアーゼに晒すことができ、或いは、デュプレックスを、一本鎖核酸にではなく二本鎖核酸に対して特異的な親和性法によって精製することができる。本発明の一好適実施例において、プローブがデュプレックスに取り込まれた場合にのみ、標識が放出される条件において、前記標識が前記プローブから放出されることによって、デュプレックスが検出される。
【００３３】
核酸プローブに使用されるのに適した検出可能標識又はタグは当業者に周知であり、具体的には、非限定的に、放射性同位元素、発色団（ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅｓ）、フルオロフォア（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅｓ）、蛍光化学発光及び電子化学発光剤、磁気標識、免疫学的標識、リガンド及び酵素標識がある。適当な標識として、更に、質量標識、及び、コンビナトリアルケミストリライブラリの逆重畳（ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ）に使用されるもの、例えば、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、ガスクロマトグラフィ、質量スペクトル分析等によって認識可能なタグがある。
【００３４】
オリゴヌクレオチドを標識化する方法は、当業者にとって周知であり、具体的には、非限定的に、化学的及び酵素的方法がある。例えば、反応性化学基をオリゴヌクレオチドの特定部位に導入することは当業者に周知である。特定部位に位置する反応性化学基を含むオリゴヌクレオチドは、化学的方法によって標識をプローブに結合させるために、相補的反応基に取り付けられた標識と結合させることができる（例えば、求核性反応基を含むオリゴヌクレオチドを求電子性反応基に取り付けられた標識と反応させることができる）。標識の具体例と標識をオリゴヌクレオチドに取り付けるための具体的な方法は、例えば、米国特許５，２１０，０１５；Ｋｅｓｓｌｅｒ（編集），Ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，１９９２；Ｋｒｉｃｋａ（編集）Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｒｏｂｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９２；Ｈｏｗａｒｄ（編集）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，１９９３に開示されている。オリゴヌクレオチドの非特異的化学標識化は、オリゴヌクレオチドを、例えば、ヌクレオチド塩基の特異的な官能基反応する試薬と結合させて、同時又はその後に、そのオリゴヌクレオチドを標識と反応させることによって達成することができる。例えば、ドレイパー（Ｄｒａｐｅｒ）他（１９８０）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１９：１７７４−１７８１を参照。標識のオリゴヌクレオチドへの酵素的導入は、標識した前駆体を用いた酵素的改変又はオリゴヌクレオチドの重合により、或いは、既存のオリゴヌクレオチドに標識を酵素的に付加することによって、達成可能である。例えば、米国特許５，４４９，７６７を参照。改変酵素の具体例としては、非限定的に、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、ＲＮＡポリメラーゼ等がある。既存のオリゴヌクレオチドに標識を付加することが可能な酵素の具体例としては、非限定的に、リン酸化酵素（ｋｉｎａｓｅｓ）、末端転移酵素（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ）、リガーゼ、グリコシラーゼ等がある。
【００３５】
もしもオリゴヌクレオチドがプライマーとして作用することが可能な場合、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション度は、そのプライマーの伸長生成物のレベルを測定することによっても測定することができる。その場合、プライマーが標識化されるか、もしくは、重合化のための単数又は複数の前駆体（通常は、ヌクレオシド三燐酸塩）を標識化することができる。伸長生成物は、例えば、サイズ（例えば、ゲル電気泳動）、親和性法、又は、当業者に知られているその他の方法によって検出することができる。
【００３６】
単数又は複数の反応基を含むヌクレオチド単量体を、自動合成中にオリゴヌクレオチドに導入することができ、これらのヌクレオチドは、標識付着のポイントとして使用することができる。例えば、後述する例１を参照。又、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン含有リンカーアームを、自動合成によってオリゴヌクレオチドに導入することができ、種々の標識の付着のための部位として作用することができる。例えば、後述する例１とＷＯ９０／１４３５３を参照。
【００３７】
本発明のいくつかの実施例において、蛍光標識（フルオロフォア）及び／又は蛍光クエンチング剤を有するオリゴヌクレオチドが使用される。一好適実施例において、オリゴヌクレオチドは、フルオロフォアと、クエンチング剤との両方を含有する。蛍光標識としては、非限定的に、フルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｓ）、ローダミン（ｒｈｏｄａｍｉｎｅｓ）、シアニン（ｃｙａｎｉｎｅｓ）、フィコエリトリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎｓ）、その他、当業者に公知のフルオロホアがある。クエンチング剤は、放出された量の蛍光を減少させるべく（即ち、蛍光標識の放出をクエンチする）、フルオロホアによって放出されたエネルギを吸収することが可能な物質である。異なるフルオロホアは、異なるクエンチング剤によって消光される。一般に、特定のフルオロホア／クエンチング剤対のスペクトル特性は、クエンチング剤の単数又は複数の吸収波長がフルオロホアの単数又は複数の放出波長とオーバラップするものである。好適なフルオロホア／クエンチング剤対は、フルオレセイン／テトラメチルローダミンであり、上述した放出及び励起波長を比較することによって、当業者により、その他のフルオロホア／クエンチング剤対を選択することも可能である。
【００３８】
ポリメラーゼ連鎖反応等の昇温で行われる増幅アッセイ、又は、熱安定酵素を利用するその他の操作での使用のために、前記標識は、昇温において安定的なものとされる。重合化を含むアッセイのためには、標識は、その重合化酵素の活動の障害とならないものとされる。標識は、オリゴヌクレオチドの５´及び／又は３´末端に含ませることができ、及び／又は、その内部に含ませることができる。この標識は、前記オリゴヌクレオチドの塩基、糖又は燐酸塩モアエティのいずれか、又は、それ自身がこれらモアエティの一つに付着したなんらかのリンカー基に付着させることができる。
【００３９】
適用例
本発明の方法及び組成物は、標的配列に対するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが利用される、現在使用中及び今後開発される、様々な技術に使用可能である。これらのものとしては、非限定的に、１）標的配列に対するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが最終到達点である技術、２）オリゴヌクレオチドをプライマーとして使用し標的配列をテンプレートとして使用する単数又は複数のポリメラーゼ介在伸長工程の前に、標的配列に対する単数又は複数のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが行われる技術、３）標的配列に対するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを、別のプライマーの伸長を阻止するために使用する技術、４）標的配列に対するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション後に、そのオリゴヌクレオチドを加水分解して取り付けられた標識を放出する技術、そして、５）単数又は複数のオリゴヌクレオチドが標的配列にハイブリダイズされ、それら複数のオリゴヌクレオチド間の相互作用を測定する技術等がある。
【００４０】
ハイブリダイゼーションプローブ
本発明の一態様において、単数又は複数の改変オリゴヌクレオチドを、プローブ（単数又は複数）と核酸との間でハイブリダイゼーションアッセイすることによって前記核酸の標的配列を同定するためのプローブとして使用することができる。プローブは、如何なる検出可能な標識で標識化されていてもよく、又は、標的とのハイブリダイゼーションの前或いは後に二次標識化プローブとハイブリダイズすることによって、若しくは、標識と結合可能な反応基を備えることによって、ハイブリダイゼーションの前或いは後に標識化することができる。核酸プローブのハイブリダイゼーションの条件は当業者に周知である。例えば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）他，前出；オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）他，前出；イニス（Ｉｎｎｉｓ）他，前出、ヘイムズ（Ｈａｍｅｓ）他，前出、ファン・ネス（ｖａｎ  Ｎｅｓｓ）他，前出を参照。
【００４１】
ハイブリダイゼーションは、当業者に周知の複数の方法のいずれかを使用して、遊離プローブからハイブリダイズされたプローブを識別することによってアッセイすることができる（即ちハイブリダイズされた核酸を同定することができる）。これらの方法には、非限定的に、直接的又は（第２の支持体結合プローブへのハイブリダイゼーションによって）間接的に支持体に対して標的核酸を付着させ、その後プローブによって直接又は間接ハイブリダイゼーションを行い、ハイブリダイズしなかったプローブを除去するべく洗浄するものであったり、ヌクレアーゼ抵抗の測定であったり、浮遊密度測定であったり、核酸デュプレックスに対して特異的な親和法（例えば、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィ）であったり、同じ標的核酸に対してハイブリダイズされた複数のプローブ間の相互作用等がある。例えば、ファルコウ（Ｆａｌｋｏｗ）他，米国特許４，３５８，５３５；アーディア（Ｕｒｄｅａ）他，米国特許４，８６８，１０５及び５，１２４，２４６、Ｆｒｅｉｆｅｌｄｅｒ，Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ第２版、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，サンフランシスコ，１９８２；サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）他，前出、オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）他，前出、ヘイムズ（Ｈａｍｅｓ）他，前出、及びその他関連の参考資料を参照。
【００４２】
ここに開示される改変オリゴヌクレオチドは、特に、関連標的配列グループ中の一つの配列を識別するのに有用である。関連標的配列は、その配列が単数又は複数のヌクレオチド位置において異なるが、その長さの大きな部分に渡って相補的であるものである。本発明の一好適実施例において、改変オリゴヌクレオチドは、一つのヌクレオチドのみが異なる関連標的配列を識別可能である。例えば、完全一致配列は検出可能なハイブリッドを形成するが、一つのヌクレオチド不一致を有する二つの配列は検出可能なハイブリッドを形成しないハイブリダイゼーション条件を選択することが可能である。後述する例５を参照。
【００４３】
増幅プライマー
増幅手順は、標的核酸配列の多くコピーが、連続重合及び／又は連結反応によって、通常は指数関数的に産出されるものである。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等の多くの増幅反応は、反復したプライマー−依存重合反応を利用している。プライマーとは、第２のテンプレート核酸にハイブリダイズ可能で、ハイブリダイズされると、その第２核酸をテンプレートとして使用して、重合化酵素によって（ヌクレオチド基質の存在下において）伸長されることが可能な核酸である。重合化酵素としては、非限定的に、ＤＮＡ及びＲＮＡポリメラーゼ及び逆転写酵素等がある。熱安定性ポリメラーゼは、増幅反応において好ましい。異なる重合化酵素による重合化に好適な条件は当業者に周知である。例えば，サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）他，前出，オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）他，前出、イニス（Ｉｎｎｉｓ）他，前出を参照。一般に、重合化酵素によって伸長可能となるためには、プライマーは、ブロックされない３´末端、好ましくは、遊離の３´ヒドロキシ基を有さなければならない。増幅反応の生成物は、プライマーが重合化酵素によって伸長された伸長プライマーである。
【００４４】
従って、本発明の一実施例においてここに開示され請求項されている方法及び組成物は、ＰＣＲ等の改良された増幅反応に有用である。例えば、米国特許４，６８３，２０２；４，６８３，１９５及び４，８００，１５９を参照。本発明の実施は、特に、不要な配列と、単数又は少数のヌクレオチドが異なる特定の配列とを選択的に増幅する事を望む状況において有用である。
【００４５】
本発明によって提供される改善は、ＰＣＲ又は、非限定的に、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯｓ）でのプライミング、フラグメント長多型性分析、単一ヌクレオチドポリモリフィズム（ＳＮＰ）分析、マイクロサテライト分析等を含む、それに関連の増幅技術が使用されるすべてのタイプのアッセイ又は手続きに適用可能である。これら及びその他の技術は、そのうちの少数の用途を挙げると、遺伝子マッピング、疾患関連遺伝子の同定及びスクリーニング、及び薬物遺伝学に有用である。
【００４６】
標識化プローブを利用したアッセイ；加水分解可能プローブアッセイを含む
改変オリゴヌクレオチドのその他の利用法は、標識化プローブが標的及び／又は標的を含む伸長生成物にハイブリダイズされ、そのハイブリダイゼーションの結果として、標識の物理的状態が変化するアッセイに見られる。例えば、この種のアッセイの一例として、前記加水分解可能プローブアッセイは、ＤＮＡポリメラーゼ等の多くの重合化酵素は、固有の５´−３´エキソヌクレアーゼ活性を有するという事実を利用する。従って、プローブが、重合化のためのテンプレートとして作用することが可能な配列にハイブリダイズされると（例えば、増幅反応中に、プローブが二つの増幅プライマー間に位置するＤＮＡ領域にハイブリダイズされると）、上流側増幅プライマーで重合化を開始した重合化酵素は、そのプローブを末端から（エキソヌクレオリティックに）分解する（ｅｘｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）。前述したプローブのエキソヌクレオリティックな分解によって、このようなプローブに付けられた如何なる標識は放出される。放出された標識は、その標識の性質に応じて、当業者に周知の方法によって標識化プローブから分離され、検出される。例えば、放射性標識化されたフラグメントは、薄層クロマトグラフィによって分離され、オートラジオグラフィによって検出可能であり、一方、蛍光標識化されたフラグメントは、適当な励起波長での照射と適当な放射波長での観察によって検出可能である。米国特許５，２１０，０１５を参照。
【００４７】
一好適実施例において、プローブは、蛍光標識と、前記蛍光標識の蛍光放出を停止させるクエンチング剤との両方を含む。この場合、前記蛍光標識は、例えば蛍光標識がプローブからエキソヌクレオリティックに解離することによって、そのクエンチング剤に対する空間関係が変化するまでは検出不能である。従って、その標的配列へのハイブリダイゼーションの前に、前記フルオロホア／クエンチング剤で二重に標識したプローブは蛍光を発しない。フルオロホア／クエンチング剤標識化プローブがハイブリダイゼーションした後、それは、上流側プライマーで重合化を開始した重合化酵素の有するエキソヌクレアーゼ活性の基質となる。プローブのエキソヌクレオリティックな分解によって、プローブから、従ってクエンチング剤の近傍から、蛍光標識が遊離し、適当な励起波長での照射による蛍光信号の検出を可能にする。この方法は、遊離した標識を、無傷のプローブから分離する必要が無いという利点を有する。複合（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）アプローチは、それぞれが異なる標的配列に対して相補的であって識別可能な標識を備えた複数のプローブを利用し、複数の標的配列のアッセイを同時に可能にする。
【００４８】
この種のアッセイは、それが、その結果をリアルタイムでモニタすることが可能なホモゲナスアッセイ（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  ａｓｓａｙ）である（即ち、生成物分離工程が不要）である為、特に臨床用途において益々重要となってきている。例えば、ウィットワー（Ｗｉｔｔｗｅｒ）他（１９９７）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ２２：１３０−１３８を参照。高速、蛍光ベースの分子アッセイは、例えば、リアルタイムの外科及び治療用途にも利用される。
【００４９】
関連標的配列間を識別する改変オリゴヌクレオチドの高い能力によって、例えば、単一ヌクレオチド多型性の同定等において加水分解可能プローブアッセイを使用することが容易になる。後述する例４及び５は、加水分解可能プローブアッセイにおける改変オリゴヌクレオチドの使用を開示している。
【００５０】
蛍光クエンチングの原理を使用するその他のアッセイ、又、それらのアッセイに改変オリゴヌクレオチドを使用することの利点も、当業者には明白であろう。又、蛍光標識化改変オリゴヌクレオチドが、すべてのタイプのハイブリダイゼーションアッセイにおいて識別力の向上を提供するものであるとも当業者にとって明白であろう。
【００５１】
蛍光エネルギ転移
本発明の更に別の実施例において、改変オリゴヌクレオチドは、複数の蛍光標識化プローブを使用する様々な技術に利用可能である。これらのアッセイのいくつかにおいて、蛍光及び／又は蛍光標識の特性の変化は、ハイブリダイゼーションをモニタするのに使用される。例えば、蛍光共鳴エネルギ転移（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）（ＦＲＥＴ）が、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションのインジケータとして使用された。この技術の一実施例において、それぞれが別の蛍光標識を含む二つのプローブが使用される。これら標識の一つは、蛍光ドナーであり、他方は蛍光アクセプタであり、前記蛍光ドナーからの放出波長と前記蛍光アクセプタの吸収波長とがオーバーラップする。これらのプローブの配列は、標的が存在する場合に、それらが標的配列の隣接する領域にハイブリダイズし、これによって、蛍光ドナーと蛍光アクセプタとを互いに近接配置させるように選択される。標的核酸の存在時に、前記蛍光ドナーの吸収波長に対応する波長での照射によって、蛍光アクセプタから放出が起こる。これらのタイプのアッセイはホモゲナスアッセイであって、無反応プローブを除去する必要なくポジティブな信号を提供するという利点を有する。その詳細及びその他の具体例については、例えば、ヨーロッパ特許０７０６８５及びカルドゥッロ（Ｃａｒｄｕｌｌｏ）他（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：８７９０−８７９４を参照。
【００５２】
本発明の更に別の実施例は、同じ標的核酸にハイブリダイズした二つの異なるオリゴヌクレオチド間の相互作用を測定するこれら及びそれに関連の技術に関するものである。適当な蛍光ドナー／蛍光アクセプタ対の選択は、所与の対について、蛍光ドナーの放出波長が蛍光アクセプタの吸収波長とオーバラップするという原理に基づき、当業者にとって明らかであろう。関連標的配列間を識別する改変オリゴヌクレオチドの高い能力によって、単一ヌクレオチド多型等の同定においてＦＲＥＴに基づく技術を使用することが容易になる。
【００５３】
オリゴヌクレオチド連結反応を利用するアッセイ
改変オリゴヌクレオチドは、標的核酸上の隣接する部位に対して相補的な、二つ以上のオリゴヌクレオチドがその標的核酸の隣接部位にハイブリダイズされ、互いに連結されるアッセイにおいて有用である。例えば、ヨーロッパ特許３２０，３０８、ヨーロッパ特許公報３３６，７３１及び米国特許４，８８３，７５０を参照。連結反応のための条件は当業者に周知である。例えば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）他，前出、オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）他，前出、イニス（Ｉｎｎｉｓ）他，前出、を参照。連結された核酸は、例えば、出発オリゴヌクレオチドとの比較に於ける生成物のサイズの増加、によって同定可能である。ハイブリダイゼーションアッセイと同様、連結反応アッセイに改変オリゴヌクレオチドを使用することによって、関連標的配列間、特にオリゴヌクレオチド連結反応アッセイにおいて重要である、完全ハイブリッドと単一塩基不一致との間のより効率的な識別が可能となる。
【００５４】
ｃＤＮＡ合成
ｃＤＮＡ合成は、一般的に行われているように、ｍＲＮＡテンプレートをｃＤＮＡにコピーするために逆転写酵素を利用する。逆転写用のプライマーは、通常は、オリゴデオキシチミデレート（ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｔｈｙｍｉｄｙｌａｔｅ）であり、これは、大半のｍＲＮＡ分子の３´末端に見られるポリアデニレート尾に対して相補的である。しかしながら、ｃＤＮＡ合成が、テンプレートｍＲＮＡ分子の５´末端までずっと行われることはめったにない。従って、大半のｃＤＮＡライブラリは、ｍＲＮＡの３´末端近傍の配列は豊富であるが、５´末端の近傍の配列は不足している。その結果、ｍＲＮＡ配列の完全なｃＤＮＡ表示を得るためには、ｍＲＮＡの内部領域からプライミングされる単数又は複数の追加の合成反応が行われなければならない。改変オリゴヌクレオチドは、これらの内部プライミング工程に使用することができ、一つの遺伝子ファミリの異なるメンバーに見られるもののような、互いに密接に関連したｍＲＮＡ配列間の識別を可能にする。
【００５５】
更に、ｃＤＮＡの合成は、多くの場合、オリゴデオキシチミデレートプライマーのポリアデニレート尾に対するハイブリダイゼーションを促進するために、低ストリンジェント条件下で行われる。そのような条件下では、ｍＲＮＡは、分子間二次構造を容易にとることが知られており、その構造は逆転写酵素による伸長を阻害し、短い部分ｃＤＮＡ分子の生成をもたらす。これに対して、改変オリゴヌクレオチドをプライマーとして使用したｃＤＮＡ合成は、ｍＲＮＡテンプレート中の二次構造の最小化をもたらす、より高いストリンジェント条件下で行われ、これによって、より長いｃＤＮＡ生成物が得られる。
【００５６】
核酸配列決定システム
本発明の一実施例において、ｎ量体としてとりうる全てのオリゴヌクレオチドの集合体（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）（ｎは約１０以下の整数）が、ヌクレオチド配列を決定するための加水分解可能プローブアッセイに使用される。各オリゴヌクレオチドは、固有に標識化され、解離した標識の分析によって、それらオリゴヌクレオチドのどれが標的配列にハイブリダイズしたかが示される。ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの配列のアライメントによって、ヌクレオチド配列が提供される。高い識別能力を有する改変オリゴヌクレオチドは、この技術において特に有用である。
【００５７】
改変オリゴヌクレオチドは、又、最初サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４：５４６３−５４６７によって記載された、鎖終結法（ｃｈａｉｎ−ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）及びその派生方法等のＤＮＡ配列決定のプライマー依存方法にも有用である。鎖終結法に改変オリゴヌクレオチドを使用することによって、配列決定中のより高い不一致識別性が可能となり、これによって、例えば、二つ以上の互いに密接に関連した配列間を識別するための改良手段が提供される。
【００５８】
オリゴヌクレオチドアレイ
本発明の別実施例において、改変オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションと遺伝子発現のアレイベース分析による配列決定等の、オリゴヌクレオチドのアレイを利用する操作に使用される。ハイブリダイゼーションによる配列決定において、異なる既知の配列のオリゴヌクレオチドの所定のアレイを、単数又は複数のポリヌクレオチド、核酸又は核酸集団へのハイブリダイゼーションのためのプラットフォームとして使用する。ハイブリダイズしたその既知の配列のアライメントを判定することによって、テストポリヌクレオチドの配列を再構築することが可能である。或いは、野生タイプの配列と、対象遺伝子の所与の配列としてとりうるすべての変異配列とを有するオリゴヌクレオチドを、アレイ上に置くことができる。前記アレイを対象体又は生物学的標本から得たＤＮＡ又はＲＮＡに、ハイブリダイゼーション条件下において露出させることによって、その対象遺伝子のための野生タイプ又は変異状態を判定することができる。例えば、米国特許５，４９２，８０６；５，５２５，４６４及びＰＣＴ公報ＷＯ９２／１０５８８及びＷＯ９６／１７９５７を参照。これら両方の技術は、関連配列、特に、単一ヌクレオチドレベルで関連する配列間の識別を必要とし、従って、本発明の改変ヌクレオチドの高い識別特性によってこれらの技術において改良が提供されるであろう。アレイを構築するための材料には、非限定的に、ニトロセルロース、ガラス、シリコーンウエハ、光ファイバ、当業者に公知のもの等のアレイ構築に適したその他の材料が挙げられる。
【００５９】
アレイ技術に対する本発明の更に別の用途は、特定の細胞又は組織中に於ける遺伝子発現パターンの試験である。この場合、異なる遺伝子に対応するオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドが、表面上に配置され、例えば、特定の細胞又は組織タイプからの核酸サンプルが、ハイブリダイゼーション条件下でそのアレイとインキュベートされる。ハイブリダイゼーションが発生するそのアレイ上の部位を検出することによって、どのオリゴヌクレオチドがハイブリダイズしたか、従って、そのサンプルが採取された特定細胞又は組織中においてどの遺伝子が活性であるか、を判定することができる。
【００６０】
アレイ方法は、野生タイプと変異配列とを表面上の整列アレイ中に配置して、変異の同定のためにも使用可能である。ポリヌクレオチドサンプルをアレイと共にストリンジェント条件下でハイブリダイゼーションし、そのアレイ中のどのオリゴヌクレオチドがポリヌクレオチドにハイブリダイズするかを判定することによって、どのポリヌクレオチドが野生タイプ又は変異配列を有するか否かを判定することができる。臨床的に関連する遺伝子の多くの変異配列は一つ又は少数のヌクレオチド位置においてのみその野生タイプと異なっているので、本発明の改変オリゴヌクレオチドの高い識別能力は変異検出において改良を提供するであろう。
【００６１】
上述したアレイ技術のすべてにおいて、改変オリゴヌクレオチドの高い識別力は、感度と分解能とに於ける大幅な改良を提供するものである。
【００６２】
例
下記の例は、本発明を例示するものであって、限定するものではない。
【００６３】
加水分解可能プローブアッセイにおいて、標識化プローブをＰＣＲ反応に添加する。プローブは、二つのＰＣＲプライマー間の領域に対して相補的であり、その内の一つが他方の蛍光を消光する、二つのフルオロホアによって標識化される。前記プローブは、ＰＣＲにおいて通常使用されるストランド伸長温度（５５〜５７℃）で、又はそれ以上で、そのＰＣＲ生成物ストランドの一つのその相補的標的配列にハイブリダイズするように構成される。ＰＣＲに通常使用される重合化酵素（特に、Ｔａｑポリメラーゼ）は、固有の５´エキソヌクレアーゼ活性を有する。ＰＣＲ反応の伸長段階に於ける新しいストランドの合成中、この５´エキソヌクレアーゼ活性がテンプレートに結合した相補的ストランドに対して作用する。もしも、上述したように標識化されたプローブがテンプレートに結合したならば、前記重合化酵素の前記５´エキソヌクレアーゼ活性によって結合されたフルオロホアは開放される。開放されると、その蛍光は、もはや消光されず、蛍光信号が得られる。例えば、米国特許５，２１０，０１５；リヴァック（Ｌｉｖａｋ）他（１９９５）ＰＣＲ  Ｍｅｔｈ．Ａｐｐ．４：３５７−６３２及びハイド（Ｈｅｉｄ）他（１９９６）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．６：９８６−９９４を参照。
【００６４】
例１：二重標識化ＭＧＢ共役結合加水分解可能プローブの作成
５´レポータ色素を有するオリゴヌクレオチドプローブの合成
［（３´，６´− ジピバロイルフルオレシニル）−６−カルボキサミドヘキシル］−１−Ｏ−（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−フォスフォラミダイト（［（３´，６´− ｄｉｐｉｖａｌｏｙｌｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｙｌ）−６−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏｈｅｘｙｌ］−１−Ｏ−（２−ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ）−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｉｓｏｐｕｒｏｐｙｌ）−ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）（６−ＦＡＭ）及び３´−ＣＤＰＩ3−尾（スキーム１）。共役結合ＣＤＰＩ3尾を有するオリゴヌクレオチドを、ＣＤＰＩ3−ＣＰＧ支持体（〜２０−５０ｍｇ）上で標準３´−フォスフォラミダイト試薬（３´−ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ）を使用して１μｍｏｌスケールで作成した。ＣＤＰＩ3−ＣＰＧ支持体の作成は、ルクタノフ（Ｌｕｋｈｔａｎｏｖ）他（１９９５）Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．６：４１８−４２６に開示されている。共役結合ＭＧＢのないオリゴヌクレオチドは、標準的な方法で合成した。合成は、一つの例外、即ち、ＣＤＰＩ3共役結合オリゴヌクレオチドが合成されている時に、ＣＤＰＩ3モアエティのヨウ素化を避けるために、酸化工程において、（標準が０．１Ｍであるのに対して）０．０１Ｍのヨウ素溶液を使用したことを除き、製造業者によって供給されているプロトコルに従ってＡＢＩ３９４によって行われた。ＴＡＭＲＡ色素の合成後導入のためのアミノリンカー（下記参照）は、自動オリゴヌクレオチド合成の所望の工程において、Ｇ又はＡの代りに、保護アミノプロピルｐｐＧ又はアミノプロピルｐｐＡｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅを導入することによってオリゴヌクレオチドの３´末端の近傍に導入された（共有で、既に許可されている米国特許出願０８／３３４，４９０を参照）。前記プローブの５´末端にＦＡＭ色素を導入するために、オリゴヌクレオチドの合成の最後の工程において、５´−フルオレセインフォスフォラミダイト（６−ＦＡＭ，Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｃａｔ．＃１０−５９０１）を使用した。アンモニア処理（３０％アンモニア、１２〜１５時間，５０℃）による固体支持体からの開裂と完全な脱保護後、反応物を、濾過し、ロータリーエバポレーションによって乾燥させた。ＣＤＰＩ3尾を含むプローブを、０．１Ｍトリエチルアンモニウムアセテート緩衝液（ｐＨ７．４）中のアセトニトリルのリニア勾配（０→６０％，２０分間、２ｍＬ／分）で４．６ｘ２５０ｍｍ，Ｃ−１８，Ｄｙｎａｍａｘ３００Ａカラム（Ｒａｉｎｉｎ）でＲＰ−ＨＰＬＣによって分離した。ＣＤＰＩ3尾を含むプローブの画分を、ブタノールと共に、１．５ｍｌのプラスチック管中の６０〜１００μｌの容量に濃縮し、アセトン中の２％ＮａＣｌＯ4（又はＬｉＣｌＯ4，１．５ｍＬ）中で沈殿させ、アセトンで洗浄し、真空乾燥させた。これらＨＰＬＣ精製プローブを、（ｉ）ＴＡＭＲＡ色素の導入用として直接的、又は（ｉｉ）更に、８％変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製して（下記）、使用した。
【００６５】
ＴＡＭＲＡ残基の合成後導入（スキーム２）
テトラメチルローダミンのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ  ｅｓｔｅｒ）（ＴＡＭＲＡ  ＮＨＳエステル，Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｃａｔ＃５０−５９１０）を、製造業者によって提供されたプロトコルに従って、前記５´−ＦＡＭ，３´−ＣＤＰＩ3尾オリゴヌクレオチドプローブ（上述したように合成）のアミノプロピルｐｐＧ又はアミノプロピルｐｐＡ残基に導入した。この反応溶液を、次に、尿素（〜４００μｌ）で飽和させ、８％変性ポリアクリルアミドゲル（１．５ｘ２７ｍｍパケット、３８ｘ５０ｃｍプレート、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；ゲル緩衝液は７Ｍ尿素、２ｍＭ  ＥＤＴＡ，９０ｍＭトリス−ボレート，ｐＨ８．３を含有していた）上に載せた。ゲル精製を、一定の電力設定（１００ワット、５０〜５５℃）で行った。所望の共役結合生成物（即ち、６−ＦＡＭ，ＴＡＭＲＡ及びＣＤＰＩ3残基を含有するプローブ）がＴＡＭＲＡ特異的色によって検出され、これらをゲルから切り出した。ゲルスライスを、４〜６ｍｌの１００ｍＭトリスＨＣｌ，１０ｍＭトリメチルアンモニウムアセテート，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ７．８中で３７℃で一晩インキュベートした。最後に、前記共役結合物を、（ｉ）上述した逆相（ｒｅｖｅｒｓｅｄ  ｐｈａｓｅ）ＨＰＬＣ、又は（ｉｉ）製造業者（Ａｌｌｔｅｃｈ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）によって供給されたプロトコルに従ってＭＡＸＩ−ＣＬＥＡＮ  Ｃ１８カートリッジを使用して、ゲル抽出物から分離した。いずれのケースにおいても、プローブをブタノールで濃縮し、２％ＮａＣｌＯ4アセトン溶液中で沈殿させ、純粋アセトンで洗浄し、真空乾燥し、１００〜４００μｌの水中で溶解させ、−２０℃で保存した。
【００６６】
前記オリゴヌクレオチドプローブ中の共役結合モアエティの存在を、特定ＵＶ及び可視波長での吸収率によって確認した。次の波長を使用した。核酸検出用として２５５〜２６５ｎｍ，ＣＤＰＩ3検出用として３５０ｎｍ，６−ＦＡＭ検出用として４６０〜４８０ｎｍ，ＴＡＭＲＡ検出用として５７０ｎｍ。
【００６７】
例２：標的、プライマー、及びプローブ配列
ストラテジー
標的配列は、プラスミドｐＳＰ１８９に含まれるＥ．ｃｏｌｉ  ｓｕｐＦ遺伝子に位置する（図１，配列識別番号１）。パーリス（Ｐａｒｒｉｓ）他（１９９２）Ｇｅｎｅ  １１７：１〜５を参照。増幅に使用されるプライマーの結合部位は、プライマー１及びプライマー２として示され、プライマー１は、図１に図示されたものと同一の配列と極性を有し、プライマー２は、図１に図示されたものに対して逆相補的である配列と極性を有する。それぞれ５´末端がＦＡＭで標識化され、３´末端がクエンチング剤ＴＡＭＲＡで標識化されたオーバラップする配列を有する三つのプローブ、即ち、１２量体、１５量体、及び１８量体が合成された。１２量体と１５量体とは、更に、オリゴヌクレオチドの３´末端近傍に共役結合浅溝バインダ（ＣＤＰＩ3）を含んでいた。最後に、各プローブは、正常なグアニン残基（表中Ｇによって示す）を有していたか、もしくは、そのすべてのグアニン残基が、ｐｐＧによって置換されていた（表中ｐｐＧで示す）。これらのプローブを使用して、ハイブリダイゼーション強度と不一致識別に対するＧのｐｐＧによる置換の効果を判定した。
【００６８】
プライマー配列
順増幅プライマーは次の配列を有している：
5'-CTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGC-3'    配列識別番号２
逆増幅プライマーは次の配列を有している：
5'-TGTGATGCTCGTCAGGGGGG-3'        配列識別番号３
【００６９】
プローブの配列
前記１２量体は次の配列を有している：
5'-TTCCCGAGCGGC          配列識別番号４
前記１５量体は次の配列を有している：
5'-GGGTTCCCGAGCGGC      配列識別番号５
前記１８量体は次の配列を有している：
5'-GTGGGGTTCCCGAGCGGC    配列識別番号６
【００７０】
テンプレート配列
この研究に使用されたプローブに対して相補的な前記テンプレートの１８ヌクレオチド領域を、改変して、図１に図示する一連の点変異を作り出した。これら変異テンプレートのそれぞれを、前記三つのプローブでの別々のアッセイでに使用した。テンプレートのこの領域内の変異配列は、次の通りであった。尚、不一致ヌクレオチドは、太文字と下線によって示されている。
5'-GTGGGGTTCCCGAGCGGC      (完全一致)          配列識別番号：7
5'-GTGGAGTTCCCGAGCGGC      (32 G-A不一致)      配列識別番号：8
5'-GTGGGGTTTCCGAGCGGC      (36 C-T不一致)      配列識別番号：9
5'-GTGGGGTTGCCGAGCGGC      (36 C-G不一致)      配列識別番号：10
5'-GTGGGGTTACCGAGCGGC      (36 C-A不一致)      配列識別番号：11
5'-GTGGGGTTCTCGAGCGGC      (37 C-T不一致)      配列識別番号：12
5'-GTGGGGTTCACGAGCGGC      (37 C-A不一致)      配列識別番号：13
5'-GTGGGGTTCCCCAGCGGC      (39 G-C不一致)      配列識別番号：14
5'-GTGGGGTTCCCGTGCGGC      (40 A-T不一致)      配列識別番号：15
5'-GTGGGGTTCCCGAACGGC      (41 G-A不一致)      配列識別番号：16
5'-GTGGGGTTCCCGACCGGC      (41 G-C不一致)      配列識別番号：17
5'-GTGGGGTTCCCGAGCAGC      (43 G-A不一致)      配列識別番号：18
5'-GTGGGGTTCCCGAGCTGC      (43 G-T不一致)      配列識別番号：19
5'-GTGGGGTTCCCGAGCGTC      (44 G-T不一致)      配列識別番号：20
【００７１】
例３：加水分解可能プローブアッセイ
蛍光モニタリングを使用した加水分解可能プローブアッセイを、Ｉｄａｈｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から市販のライトサイクラ（Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ）を使用して行った。ウィットワー（Ｗｉｔｔｗｅｒ）他（１９９７ａ）Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２２：１３０〜１３８、及びウィットワー（Ｗｉｔｔｗｅｒ）他（１９９７ｂ）Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２２：１７６〜１８１。各反応混合物は以下を含んでいた。
４０ｍＭ  ＮａＣｌ
２０ｍＭ  トリス−Ｃｌ，ｐＨ８．９
５ｍＭ  ＭｇＳＯ4
０．０５％（ｗ／ｖ）  ウシ血清アルブミン
１２５μＭ  各ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ
０．５μＭ  各プライマー
０．５μＭ  プローブ
０．５Ｕ／１０μＬ  Ｔａｑポリメラーゼ
【００７２】
９４℃で０秒、４０サイクルの増幅を行った（即ち、温度は９４℃に昇温され、その後すぐにアニーリング／伸長温度にまで下げられた）、その後、アニーリング／伸長温度（これは、それぞれの実験において５５〜７５℃範囲で変化した；詳細については下記及び図中の凡例を参照）で１５秒であった。蛍光放出は、前記ライトサイクラと共に供給される製造者のソフトウエアにより解析され、５１５〜５６０ｎｍ（フルオレセイン）の蛍光と、５６０〜６３０ｎｍ（ローダミン）の蛍光の比で表わされた。
【００７３】
溶解温度（表３）は、ＰＥＣＳＳソフトウエアパッケージを使用して、ＰＴＰ−６温度コントローラを備えたＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  λ２Ｓ  ＵＶ／ＶＩＳ分光計によって測定された。
【００７４】
例４：ｐｐＧ置換の、Ｔmと単一ヌクレオチド不一致識別に対する作用
同じ標的配列領域に渡ってまたがる１２，１５又は１８ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを、加水分解可能プローブとして使用して、完全一致標的配列と、異なる単一ヌクレオチド不一致標的配列とに対するハイブリダイゼーションについてテストした（図１）。各プローブが、すべてのＧのｐｐＧによる置換有りと、無しとでテストされた。前記１２量体及び１５量体オリゴヌクレオチドは、更に、共役結合ＭＧＢを含んでいた。共通対のプライマーを使用して、標的配列を含むテンプレートのセグメントを増幅した。表１において蛍光値は、プローブが完全に一致した野生タイプ配列と（表において「一致」として示されている）、前記不一致変異配列の一つがテンプレートとして使用されたアッセイについて示されている。表１は、任意の蛍光単位で、４０サイクルのＰＣＲ後に発生された蛍光信号の量を示している。この値は、元のサンプル中に存在する標的のコピー数の推定値を提供し（ウィットワー（Ｗｉｔｔｗｅｒ）他，前出）、又、初期標的の等価量（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）については、そのアッセイ中の加水分解可能プローブの有効性のおよその測定値を提供している。これらの結果を二つの方法で示す。表１は、４０サイクルの増幅後にアッセイ中で測定された蛍光量の絶対値を示している。表２においては、各不一致プローブ／テンプレートハイブリッドの蛍光量値（４０サイクル後）は、完全一致ハイブリッドについて得られた値の百分率として示されている。
【００７５】
表１及び２に示されたデータから、ｐｐＧ置換を使用することの二つの利点が明らかである。第１に、プローブ中のＧをｐｐＧによって置換することによって、そのプローブで得られる測定信号の強度が増加する。いかなる特定のプローブからの信号も、アッセイに使用される条件に依存するものではあるが、ｐｐＧの追加が常に信号を増大させるという事実は、ｐｐＧ含有オリゴヌクレオチドによって形成されたハイブリッドが高いＴm値を有するということを暗示している。表３は、これがまさにその通りであることを示している。テストされたすべてのケースにおいて、ｐｐＧ置換オリゴヌクレオチドを含有するハイブリッドのＴmは、非置換オリゴヌクレオチドによって形成されたハイブリッドのそれよりも１〜４℃高い。
【００７６】
ｐｐＧ置換オリゴヌクレオチドを使用することの第２の利点は、プローブ中のｐｐＧの存在によって、単一ヌクレオチド不一致検出力が大幅に高まることである。所与のプローブ／テンプレート対によって得られる蛍光量が、完全一致プローブ／テンプレート対を使用するアッセイで得られる蛍光量の百分率として表わされた場合（表２）、一般に、Ｇ残基の代りにｐｐＧを含むことによって、完全一致標的から得られる信号に対する不一致標的から得られる信号の比率が減少することが判る。なんら特定の理論によって限定されることを望むものではないが、ｐｐＧ置換オリゴヌクレオチドによって得られる高い不一致識別力は、グアニンが、普通と異なる塩基対（即ち、シトシン以外の塩基との）を形成する傾向という、ｐｐＧがもっていない特性に関連するものであることが示唆される。
【００７７】
例５：単一ヌクレオチド不一致識別に対するｐｐＧ置換の作用
図２は、アニーリング／伸長がＭＧＢ−共役結合１５量体プローブと７２℃で行われた時の、加水分解可能プローブアッセイ（例３に記載したもの）の蛍光放出の時間変化を示している。完全一致（図中において「一致」として示される）によって最も高いレベルの信号が提供されているが、標的との単一ヌクレオチド不一致を含むプローブの多くからも検出可能な信号が得られる。しかしながら、もしもアッセイを、ＭＧＢ共役結合オリゴヌクレオチドプローブ中のすべてのグアニン残基がｐｐＧによって置換されていることを除いて同一条件で行ったならば、単一塩基不一致を含むプローブによる信号の発生は大幅に低減し、これに対して、完全一致プローブによって発生される信号の量は影響されない（図３）。更に、もしも、ｐｐＧ改変ＭＧＢ共役結合オリゴヌクレオチドプローブが、そのアニーリング／伸長温度が７５℃にまで昇温されたアッセイで使用されるならば、単一塩基不一致を有するプローブによる信号の発生は、完全に抑制され、これにたいして、ここでも、完全一致プローブによって発生される信号のレベルには影響がない（図４）。
【００７８】
従って、ＭＧＢ共役結合、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン塩基類似体による置換、及び適当な反応条件によって、高ストリンジェンシに於ける、完全一致ハイブリッドと、単一ヌクレオチド不一致を含むハイブリッドとの間の識別が容易となり、短いオリゴヌクレオチドを使用するハイブリダイゼーション反応において、かつて比類のない特異性レベルが可能となる。
【００７９】
【表１】
0004558932.tif 000004
【００８０】
【表２】
0004558932.tif 000005
【００８１】
【表３】
0004558932.tif 000006
【００８２】
以上、本発明を、理解を明瞭にする目的で、図示と具体例によっていくらか詳細に説明したが、当業者においては、本発明の精神から離脱することなく、様々な変更及び改変を行うことが可能であることは明らかであろう。従って、以上の説明及び具体例は、本発明の範囲を限定するものと見なされてはならない。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、プラスミドｐＳＰ１８９中に含まれるＥ．ｃｏｌｉ  ｓｕｐＦ遺伝子のヌクレオチド配列（配列識別番号１）を図示している。増幅プライマーのための標的配列の位置は、「プライマー１」及び「プライマー２」として表示されている。又、前記プローブの標的配列（「１２量体」、「１５量体」及び「１８量体」として示されている）と、これらプローブ標的配列に導入された単一ヌクレオチド置換（プローブ標的配列の下に図示）も図示されている。
【図２】図２は、浅溝バインダ（ＭＧＢ）−共役結合１５量体をプローブとして使用した加水分解可能プローブアッセイの結果を図示している。標的は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｓｕｐＦ遺伝子であった。アニーリング／伸長は、各サイクル２０秒間で７２℃で行われた。
【図３】図３は、ＭＧＢ共役結合１５量体をプローブとして使用した、加水分解可能プローブアッセイの結果を示している。この実験において、これらプローブ中の全てのグアニン塩基は、グアニン類似体ｐｐＧによって置換された。すべてのプローブは、更に、共役結合ＭＧＢも含んでいた。標的は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｓｕｐＦ遺伝子であった。アニーリング／伸長は、各サイクル２０秒間で７２℃で行われた。
【図４】図４は、ＭＧＢ共役結合１５量体をプローブとして使用した、加水分解可能プローブアッセイの結果を示している。この実験において、これらプローブ中の全てのグアニン塩基は、グアニン類似体ｐｐＧによって置換された。標的は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｓｕｐＦ遺伝子であった。アニーリング／伸長は、各サイクル２０秒間で７５℃で行われた。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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