(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２又は配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む腫瘍関連差別的発現遺伝子−１２（ＴＡＤＧ−１２）タンパク質をコードするＤＮＡ断片であって：
（ａ）配列番号１又は配列番号３に示される配列を含む単離ＤＮＡ断片；
（ｂ）前記（ａ）の単離ＤＮＡ断片に対してハイブリダイズし、かつＴＡＤＧ−１２タンパク質をコードする単離ＤＮＡ断片；および
（ｃ）遺伝暗号の縮重のためコドン配列において前記（ａ）および（ｂ）の単離ＤＮＡ断片と異なり、かつ配列番号２又は配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むＴＡＤＧ−１２タンパク質をコードする単離ＤＮＡ断片；
より成る群から選択されるＤＮＡ断片。
【請求項２】
請求項１記載のＤＮＡ断片、および細胞における該ＤＮＡ断片の発現に必要な調節要素を含むことを特徴とするベクター。
【請求項３】
前記ＤＮＡ断片が、配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むＴＡＤＧ−１２タンパク質をコードすることを特徴とする請求項２記載のベクター。
【請求項４】
請求項３記載のベクターで形質転換され、配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むＴＡＤＧ−１２タンパク質を発現することを特徴とする宿主細胞。
【請求項５】
細菌細胞、哺乳類細胞、植物細胞または昆虫細胞であることを特徴とする請求項４記載の宿主細胞。
【請求項６】
前記細菌細胞が大腸菌であることを特徴とする請求項５記載の宿主細胞。
【請求項７】
請求項１記載のＤＮＡ断片に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
単離および精製した配列番号２又は配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む腫瘍関連差別的発現遺伝子−１２（ＴＡＤＧ−１２）タンパク質であって：
（ａ）配列番号１又は配列番号３に示される配列を含む単離ＤＮＡ断片；
（ｂ）前記（ａ）の単離ＤＮＡ断片に対してハイブリダイズし、かつＴＡＤＧ−１２タンパク質をコードする単離ＤＮＡ断片；および
（ｃ）遺伝暗号の縮重のためコドン配列において前記（ａ）および（ｂ）の単離ＤＮＡ断片と異なり、かつ配列番号２又は配列番号４に示されるアミノ酸配列に含まれるＴＡＤＧ−１２タンパク質をコードする単離ＤＮＡ断片；
より成る群から選択されるＤＮＡによってコードされることを特徴とする単離および精製ＴＡＤＧ−１２タンパク質。
【請求項９】
請求項８記載のＴＡＤＧ−１２タンパク質に対する抗体。
【請求項１０】
配列番号８、３５、３６、５５、５６、８３、８４、９７、９８、１１９、１２０、１２２、１２３または１３６に示される配列を含むＴＡＤＧ−１２タンパク質の免疫原断片および適切なアジュバントを含むことを特徴とする免疫原組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
関連出願への相互参照
本出願は一部継続特許出願であり、１９９９年３月３日に出願の米国特許出願第０９／２６１，４１６号に基づき米国特許法第１２０条による優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、概して、細胞生物学および新生物性疾患の診断の分野に関連する。より詳細には、本発明は、卵巣癌において過剰発現される、腫瘍関連差別的発現遺伝子−１２(Tumor Associated Differentially-Expressed Gene-12)（ＴＡＤＧ−１２）と称される膜貫通型セリンプロテアーゼに関するものである。
【０００３】
関連技術
腫瘍細胞は、その原発部位から遊離される一連のプロテアーゼの発現に基づき、さらに離れた部位に移動して致死性をもたらす。その転移性は腫瘍細胞および腫瘍周囲のストローマ細胞によるプロテアーゼの異常発現パターンの結果である［１−３］。転移性となるほとんどの腫瘍において、腫瘍周囲の細胞外マトリックス成分を破壊し、基底膜を破壊して血流またはリンパ系へ接近し、さらに逆向きにその過程を繰り返して第二の宿主部位に定着することが必要である［３−６］。それら過程の全ては、同調プロテアーゼカスケードと現在思われているものに基づく。さらには、腫瘍細胞は、進行的に腫瘍を増殖させる増殖因子および血管新生促進因子を活性化するためにプロテアーゼの力を用いる［１］。従って、腫瘍関連プロテアーゼの同定、および治療手段としてのそれら酵素の阻害を目的とした多数の研究がなされてきた。より重要なこととして、多くのそれらプロテアーゼの分泌性および／高レベルでの発現は、患者血清における異常レベルでの検出を可能とし、例えば前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）は前立腺癌の早期診断を可能とする［７］。
【０００４】
プロテアーゼは、腫瘍増殖、腫瘍細胞の脱落およびターゲット器官の浸潤に直接関連している。各クラスのプロテアーゼは、限定はされないが、（１）最初の腫瘍領域の周囲のストローマの消化、（２）腫瘍細胞の解離をもたらす細胞接着分子の消化、および（３）転移性増殖および腫瘍増殖因子と血管新生促進因子の両方の活性化のための基底膜の浸潤に関連する。
【０００５】
多くの形態の癌において、この１０年間に診断および治療が劇的に改善されている。しかしながら、診断前に進んだステージに疾患を進行させるあいまいな兆候のため、卵巣癌の５年生存率は、依然として５０％未満である。ＣＡ１２５抗原の利用は卵巣癌の再発をモニターするためのマーカーとして有用であるが、早期診断のための理想的マーカーであることは証明されていない。従って、細胞から分泌または遊離されかつ卵巣癌において高発現される新しいマーカーは、早期診断のためおよび卵巣癌患者における治療的介入のために有用な手段を提供することができる。
【０００６】
先行技術は、癌において過剰発現されるプロテアーゼの完全な同定を欠き、従って、特に卵巣癌のための、早期疾患の指標として有用な腫瘍マーカーを欠いている。詳細には、膜貫通型セリンプロテアーゼであるＴＡＤＧ−１２は、これまで核酸またはタンパク質の何れも同定されていなかった。本発明は、本技術分野における長年の必要性および要求を満たすものである。
【０００７】
発明の概要
本発明は、腫瘍関連差別的発現遺伝子（ＴＡＤＧ）ファミリーの新しいメンバーであるＴＡＤＧ−１２、ならびに切断タンパク質産物をもたらし得るＴＡＤＧ−１２の変異スプライシング形態（ＴＡＤＧ−１２Ｖ）について開示する。ＴＡＤＧ−１２は卵巣癌において過剰発現される膜貫通型セリンプロテアーゼである。ＴＡＤＧ−１２の完全なｃＤＮＡが同定されている（配列番号１）。その配列は４５４アミノ酸から成る推定上のタンパク質（配列番号２）をコードし、そのタンパク質は潜在的な膜貫通領域、ＬＤＬ受容体様領域、スカベンジャー受容体システインリッチ領域およびセリンプロテアーゼ領域を包含する。それらの特性は、ＴＡＤＧ−１２が細胞表面において発現され、さらに治療および診断マーカーの分子ターゲットととして用いられ得ることを暗示する。
【０００８】
本発明の１つの実施形態において、（ａ）ＴＡＤＧ−１２タンパク質をコードする単離ＤＮＡ断片；（ｂ）上記（ａ）の単離ＤＮＡ断片に対してハイブリダイズし、かつＴＡＤＧ−１２タンパク質をコードする単離ＤＮＡ断片；（ｃ）遺伝暗号の縮重のためコドン配列において上記（ａ）および（ｂ）の単離ＤＮＡ断片と異なり、かつＴＡＤＧ−１２タンパク質をコードする単離ＤＮＡ断片：より成る群から選択されたＴＡＤＧ−１２タンパク質をコードするＤＮＡ断片を提供する。詳細には、そのＤＮＡ断片は、配列番号１または配列番号３に示される配列を有する。
【０００９】
本発明の別の実施形態において、本発明のＤＮＡを発現し得るベクター／宿主細胞を提供する。
【００１０】
本発明のさらに別の実施形態において、（ａ）ＴＡＤＧ−１２タンパク質をコードする単離ＤＮＡ；（ｂ）上記（ａ）の単離ＤＮＡに対してハイブリダイズし、かつＴＡＤＧ−１２タンパク質をコードする単離ＤＮＡ；（ｃ）遺伝暗号の縮重のためコドン配列において（ｃ）上記（ａ）および（ｂ）の単離ＤＮＡと異なり、かつＴＡＤＧ−１２タンパク質をコードする単離ＤＮＡ：より成る群から選択されたＤＮＡによってコードされる単離および精製したＴＡＤＧ−１２タンパク質を提供する。詳細には、そのＴＡＤＧ−１２タンパク質は配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する。
【００１１】
本発明のさらに別の実施形態において、（ａ）細胞から採取したｍＲＮＡを標識ハイブリダイゼーションプローブと接触させ；さらに（ｂ）そのプローブとｍＲＮＡとのハイブリダイゼーションを検出する：工程を含むＴＡＤＧ−１２タンパク質の発現を検出する方法を提供する。
【００１２】
本発明は、さらに、この中に開示のＴＡＤＧ−１２タンパク質またはｍＲＮＡを検出することによって癌または他の悪性過形成(malignant hyperplasia)を診断する方法を提供する。
【００１３】
本発明のさらに別の実施形態において、細胞内でベクターが発現に必要な要素に作動可能に結合した逆配向のＴＡＤＧ−１２のＤＮＡ断片を包含するように細胞にベクターを導入することによって細胞中における内因性ＴＡＤＧ−１２ｍＲＮＡの発現を阻害する方法を提供する。
【００１４】
本発明のさらに別の実施形態において、ＴＡＤＧ−１２タンパク質またはその断片に対する抗体を導入することによって細胞中におけるＴＡＤＧ−１２タンパク質の発現を阻害する方法を提供する。
【００１５】
本発明のさらに別の実施形態において、ＴＡＤＧ−１２タンパク質に特異的なターゲット部分および治療部分を有する化合物を投与することによって、ターゲット治療の方法を提供する。詳細には、ＴＡＤＧ−１２タンパク質は、配列番号２または配列番号４に示すアミノ酸配列を有する。
【００１６】
本発明は、さらに、ＴＡＤＧ−１２タンパク質またはその断片を個体に接種することによって、個体にＴＡＤＧ−１２に対するワクチン接種を行う方法を提供する。詳細には、ＴＡＤＧ−１２タンパク質は、配列番号２または配列番号４に示すアミノ酸配列を有する。ＴＡＤＧ−１２断片として、配列番号８に示す配列を有するＴＡＤＧ−１２Ｖの切断形態、およびＴＡＤＧ−１２タンパク質の９残基断片から１２残基断片までの断片が挙げられる。
【００１７】
本発明のさらに別の実施形態において、ＴＡＤＧ−１２タンパク質の免疫原断片および適切なアジュバントを含む免疫原組成物を提供する。ＴＡＤＧ−１２断片として、配列番号８に示す配列を有するＴＡＤＧ−１２Ｖペプチドの切断形態、およびＴＡＤＧ−１２タンパク質の９残基断片から１２残基断片までの断片が挙げられる。
【００１８】
本発明の他の態様、特徴および利点は、以下の開示の目的で提供された本発明の現在の好ましい実施形態の記載から明らかであろう。
【００１９】
図面の簡単な説明
本発明の上記の特徴、利点および目的、ならびに明らかになるであろう他のことが達成されかつ詳細に理解され得るように、添付図面に例示された本発明のある実施形態を参照することによって上記において簡単に要約された本発明についてのより詳細な説明を行う。それら図面は本明細書の一部を構成する。しかしながら、添付図面は本発明の好ましい実施形態を例示したものであり、本発明の範囲を限定することを意図していないことに注意すべきである。
【００２０】
図１Ａは、重複セリンプロテアーゼプライマーを用いた約１８０ｂｐの予測されたＰＣＲ産物および約３００ｂｐの予測外のＰＣＲ産物が、正常卵巣ｃＤＮＡからは増幅されない（レーン1）が、卵巣腫瘍ｃＤＮＡから異常に増幅される（レーン２）ことを示す。ＰＣＲ反応のためのプライマー配列を水平の矢印で示唆する。図１Ｂは、ＴＡＤＧ−１２が１８０ｂｐバンドからサブクローン化され、一方、大きな３００ｂｐバンドがＴＡＤＧ−１２Ｖを指定することを示す。その配列において、１８０ｂｐ（ヌクレオチド配列が配列番号５、推測アミノ酸配列が配列番号６）が、追加の１３３塩基の挿入を有する３００ｂｐＴＡＤＧ−１２Ｖ（ヌクレオチド配列が配列番号７、推定アミノ酸配列が配列番号８）と重複することが分かった。その挿入（垂直の矢印）はフレームシフトをもたらし、ＴＡＤＧ−１２Ｖの転写を生じさせて変異アミノ酸配列を有するＴＡＤＧ−１２の切断形態を潜在的に産生する。
【００２１】
図２は、ＴＡＤＧ−１２のノーザンブロット分析において、２．４、１．６および０．７ｋｂの３つの転写物が顕示されたことを示す。それら転写物は、卵巣腫瘍および癌細胞株において顕著なレベルで認められたが、正常卵巣では低レベルでのみ認められた。
【００２２】
図３はＴＡＤＧ−１２を詳細に調べたＲＮＡドットブロット（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を示す。最も転写量の多い心臓に代表されるように、５０全てのヒト組織において、転写物が検出された（バックグラウンドレベルで）。被殻、扁桃、腎臓、肝臓、小腸、骨格筋および副腎が中間レベルのＴＡＤＧ−１２転写物を有することも分かった。
【００２３】
図４は、オープンリーディングフレームの予測４５４アミノ酸（配列番号２）と共に、ＴＡＤＧ−１２のｃＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。ヌクレオチド配列内において、転写開始のためのコザックのコンセンサス配列およびポリアデニル化シグナルに下線を引いている。タンパク質配列において、潜在的な膜貫通領域を線で囲んでいる。セリンプロテアーゼ領域の触媒三つ組残基を丸で囲み、さらに潜在的なタンパク質分解部位として指定されている触媒領域の先頭に矢印で印をつけている。＊は転写を終結させる終止コドンを表す。
【００２４】
図５Ａは、セリンプロテアーゼＴＭＰＲＳＳ２（Ｕ７５３２９、配列番号１４）からの他のＬＤＬＲ−Ａモチーフ、補体サブユニットＣ８（Ｐ０７３５８、配列番号９）、糖タンパク質ＧＰ３００の２つのＬＤＬＲ−Ａ領域（Ｐ９８１６４、配列番号１１−１２）およびセリンプロテアーゼのマトリプターゼ(matriptase)（ＡＦ１１８２２４、配列番号１０）と整列させて、ＴＡＤＧ−１２の３５アミノ酸ＬＤＬＲ−Ａ領域（配列番号１３）を示す。ＴＡＤＧ−１２は他のセリンプロテアーゼと最も高い類似性を有し、ＴＭＰＲＳＳ２に対して５４％類似し、マトリプターゼに対して５３％類似する。高度に保存されたシステイン残基を太字で示す。図５Ｂは、ヒトマクロファージスカベンジャー受容体（Ｐ２１７５７、配列番号１６）、ヒトエンテロキナーゼ（Ｐ９８０７３、配列番号１９）、ウシエンテロキナーゼ（Ｐ２１７５８、配列番号１５）およびセリンプロテアーゼＴＭＰＲＳＳ２（配列番号１８）等の他のドメインファミリーメンバーと整列させて、ＴＡＤＧ−１２のＳＲＣＲ領域（配列番号１７）を示す。前記と同様にＴＡＤＧ−１２はその領域内においてプロテアーゼＴＭＰＲＳＳ２に対して最も類似性を示し、４３％類似する。図５Ｃは、プロテアーゼＭ（Ｕ６２８０１、配列番号２０）、トリプシノーゲンＩ（Ｐ０７４７７、配列番号２１）、血漿カリクレイン（Ｐ０３９５２、配列番号２２）、ヘプシン（Ｐ０５９８１、配列番号２５）およびＴＭＰＲＳＳ２（配列番号２４）等の他のヒトセリンプロテアーゼと整列させて、ＴＡＤＧ−１２のプロテアーゼ領域（配列番号２３）を示す。各配列のコンセンサス配列を示している。
【００２５】
図６は、ＴＡＤＧ−１２（上段パネル）およびＴＡＤＧ−１２Ｖ（下段パネル）について実施した半定量的ＰＣＲ分析を示す。内部対照としてのβ−チューブリン産物のＰＣＲ増幅と並行して、ＴＡＤＧ−１２またはＴＡＤＧ−１２Ｖの増幅を実施した。ＴＡＤＧ−１２転写物は５５の癌の内４１において過剰発現していることが認められた。ＴＡＤＧ−１２Ｖ転写物は調べた２２の癌の内８において過剰発現していることが認められた。上段パネルの試料は下段パネルの試料と必ずしも同じでないことに注意すべきである。
【００２６】
図７は、ＴＡＤＧ−１２特異的ペプチドに対して作成されたポリクロナールウサギ抗体を用いて実施した正常卵巣および卵巣腫瘍の免疫組織化学染色を示す。正常卵巣（図７Ａ）において顕著な染色は検出されなかった。調べた２９の癌の内２２において強い陽性染色が観察された。図７Ｂおよび図７Ｃは、それぞれ、漿液性癌および粘液性癌を示す。何れも腫瘍細胞の細胞質に亘り広汎な染色を示したが、ストロ−マ細胞は相対的に染色されずに残った。
【００２７】
図８は、細胞内でのＴＡＤＧ−１２の経過を示す。正常環境において、ＴＡＤＧ−１２転写物は適切にスプライシングされて、得られたタンパク質は細胞表面において発現され、そこでプロテアーゼによって活性形態に分解される。残されたリガンド結合領域の役割は特定されていないが、活性化、内在化またはその両方のために他の分子に結合し得ることを想像できる。いくつかの腫瘍において生じるＴＡＤＧ−１２Ｖの転写物は突然変異の結果でありおよび／またはｍＲＮＡの弱いプロセシングは機能的プロテアーゼ領域を持たないＴＡＤＧ−１２の切断形態を産生し得る。さらには、その切断産物は腫瘍細胞表面における新規なエピトープを提供し得る。
【００２８】
発明の詳細な説明
卵巣癌において発現されているセリンプロテアーゼを調べるため、それらタンパク質における最も高度に保存されたアミノ酸に対して設計された重複ＰＣＲプライマーを利用するＰＣＲに基づく差別的表示技術を用いた［９］。結果として、腫瘍関連差別的発現遺伝子−１２（ＴＡＤＧ−１２）と称される新規な細胞表面のマルチドメイン(multi-domain)セリンプロテアーゼを同定した。ＴＡＤＧ−１２は多くの卵巣腫瘍において過剰発現すると思われる。ＴＡＤＧ−１２の細胞外特性は、ＴＡＤＧ−１２特異的測定法を介した腫瘍の検出を可能とする。さらには、調べた腫瘍の３５％において、ＴＡＤＧ−１２Ｖと称されるＴＡＤＧ−１２のスプライシング変異体が上昇レベルで検出された。ＴＡＤＧ−１２Ｖは将来の治療的アプローチのための独特な腫瘍特異的ターゲットとなり得る変化したアミノ酸配列と共に、ＴＡＤＧ−１２の切断形態をコードする。
【００２９】
ＴＡＤＧ−１２ ｃＤＮＡは２４１３塩基対長（配列番号１）であり、４５４アミノ酸タンパク質（配列番号２）をコードする。変異形態のＴＡＤＧ−１２Ｖ（配列番号３）は２９４アミノ酸タンパク質（配列番号４）をコードする。ＴＡＤＧ−１２よび／またはＴＡＤＧ−１２Ｖ遺伝子を利用し得ることは、種々の応用につながる多くの研究を可能とする。例えば、卵巣癌、ならびに乳癌、前立腺癌、肺癌および結腸癌等の他の癌における診断的または治療的ターゲットとしてＴＡＤＧ−１２および／またはＴＡＤＧ−１２Ｖ遺伝子を用いることができる。
【００３０】
本発明に基づき、当業技術内の従来の分子生物、微生物および組換えＤＮＡ技術を用いて差し支えない。そのような技術は文献に全て記載されている。例えば、Maniatis, Fritsch＆Sambrook, “Molecular Cloning”: A Laboratory Manual (1988); “DNA Cloning: A Practical Approach”, Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985); “Oligonucleotide Synthesis” (M.J. Gait ed. 1984); “Nucleic Acid Hybridization” [B.D.Hames＆S.J.Higgins eds. (1985)]; “Transcription and Translation” [B.D. Hames ＆S.J. Higgins eds. (1984)]; “Animal Cell Culture” [R.I. Freshney, ed. (1986)]; “Immobilized Cells And Enzymes” [IRL Press, (1986)]; B.Perbal, “A Practical Guide To Molecular Cloning” (1984)を参照。
【００３１】
従って、この中に出てきた場合に、以下の用語は次に示す定義を有する。
【００３２】
この中で用いられた「ｃＤＮＡ」の用語は遺伝子のｍＲＮＡ転写物のＤＮＡ複製物を称する。
【００３３】
この中で用いられた「誘導アミノ酸配列」の用語は、ｃＤＮＡにおける３塩基連鎖を読むことによって特定されるアミノ酸配列を意味する。
【００３４】
この中で用いられた「ライブラリーをスクリーニングする」の用語は、標識プローブを用いて、適切な条件下においてプローブに対して相補的である配列が特定ＤＮＡライブラリ−中に存在するか否かを調べる方法を称する。さらには、「ライブラリーをスクリーニングする」ことは、ＰＣＲによって実施しても差し支えない。
【００３５】
この中で用いられた「ＰＣＲ」の用語は、米国特許第４，６８３，１９５号および第４，６８３，２０２号（Mullis）の主題であるポリメラーゼ連鎖反応、ならびに当業界で現在公知である他の改良法を称する。
【００３６】
この中に記載のアミノ酸は、好ましくは、「Ｌ」異性体である。しかしながら、ポリペプチドによる免疫グロブリン−結合の所望の機能的特性が維持される限り、「Ｄ」異性体の残基もＬアミノ酸残基を代用し得る。ＮＨ２はポリペプチドのアミノ末端に存在するフリーのアミノ基を称する。ＣＯＯＨはポリペプチドのカルボキシ末端に存在するフリーのカルボキシル基を称する。標準ポリペプチド命名法, J Biol. Chem., 243: 3552-59 (1969)を踏まえて、アミノ酸残基の省略形は当業界で公知である。
【００３７】
この中で、全てのアミノ酸残基配列は、左から右への方向がアミノ末端からカルボキシ末端への従来の方向で示されていることに注意すべきである。さらには、アミノ残基配列の始めまたは終わりにおけるダッシュ記号は、１つ以上のアミノ酸残基から成る別の配列に対するペプチド結合を指示する。
【００３８】
「レプリコン」は、インビボにおいてＤＮＡ複製の自律単位として機能する；すなわち、それ自体の制御下において複製し得る任意の遺伝要素（例えば、プラスミド、染色体、ウィルス）である。
【００３９】
「ベクター」は、例えばプラスミド、ファージまたはコスミドのようなレプリコンであり、それに対して別のＤＮＡ断片が結合してその結合した断片の複製をもたらすことができる。
【００４０】
「ＤＮＡ分子」は、一本鎖形態または二本鎖螺旋形態の何れかのデオキシリボヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミンまたはシトシン）の重合体を称する。ＤＮＡ分子の用語は、その分子の１次および２次構造のみを称し、特定の３次構造に限定されない。従って、ＤＮＡ分子の用語は、特に、直線ＤＮＡ分子（例えば制限酵素断片）、ウィルス、プラスミドおよび染色体において認められる二本鎖ＤＮＡを含む。この中で構造について議論する際に、ＤＮＡの転写されない鎖（すなわちｍＲＮＡに相同な配列を有する鎖）に沿って５’から３’方向にある配列のみを与える通常のやり方に従う。
【００４１】
「複製起点」は、ＤＮＡ合成を開始するＤＮＡ配列を称する。
【００４２】
ＤＮＡ「コード配列」は、適切な調節配列の制御下に置かれた場合に、インビボにおいて、転写されかつポリペプチドに翻訳される二本鎖ＤＮＡ配列を称する。５’（アミノ）末端における開始コドンおよび３’（カルボキシル）末端における翻訳終止コドンによって、コード配列の境界を特定する。コード配列として、限定はされないが、原核生物の配列、真核生物のｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳類）のＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列および合成ＤＮＡ配列等が挙げられる。ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列は、通常、コード配列の３’側に位置する。
【００４３】
転写および翻訳の制御配列は、宿主細胞においてコード配列の発現をもたらす、例えばプロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター等のＤＮＡ調節配列である。
【００４４】
「プロモーター配列」は、細胞においてＲＮＡポリメラーゼに結合しかつ下流（３’側）のコード配列の転写を開始し得るＤＮＡ調節領域である。本発明を特定する目的において、プロモーター配列は、その３’末端において転写開始部位に結合し、さらに、バックグラウンドを越える検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最小数の塩基または要素を含むように上流（５’側）に伸長する。プロモーター配列内に、転写開始部位、ならびにＲＮＡポリメラーゼに対する結合を担うタンパク質結合部位（コンセンサス配列）が認められるであろう。真核生物のプロモーターは、必ずではないが、「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボックスを包含することが多い。原核生物プロモーターは、−１０および−３５コンセンサス配列に加えて、シャイン・ダルガーノ配列を包含する。
【００４５】
「発現調節配列」は、別のＤＮＡ配列の転写および翻訳を制御および調節するＤＮＡ配列である。ＲＮＡポリメラーゼがコード配列をｍＲＮＡに転写し、さらにその転写物がそのコード配列によってコードされるタンパク質に翻訳される場合、コード配列は転写および翻訳調節配列の「制御下」にある。
【００４６】
「シグナル配列」はコード配列の近くに包含されていて差し支えない。その配列は、宿主細胞に伝達してそのポリペプチドを細胞表面に方向付けしあるいはそのポリペプチドを媒体中に分泌するようなそのポリペプチドのＮ末端にあるシグナルペプチドをコードし、そのシグナルペプチドは、そのタンパク質が細胞から遊離する前に宿主細胞によって切り離される。シグナル配列は原核生物および真核生物に天然に存在する種々のタンパク質に関連することが分かるであろう。
【００４７】
本発明のプローブについて言及する際にこの中で用いられる「オリゴヌクレオチド」の用語は、２つ以上、好ましくは３つより多くのリボヌクレオチドを包含する分子として定義される。その正確なサイズは、そのオリゴヌクレオチドの最終機能および用途に依存する多くの因子に基づくであろう。
【００４８】
この中で用いられている「プライマー」の用語は、精製制限酵素消化物の場合のような自然に生じたものあるか、あるいは合成したものであるかにかかわらず、核酸鎖に相補的であるプライマー伸長産物の合成が誘導されるような条件下、すなわち適切な温度およびｐＨにおいてヌクレオチドおよびＤＮＡポリメラーゼのような誘発剤の存在下に置かれた場合に、合成の開始地点として働き得るオリゴヌクレオチドを称する。プライマーは一本鎖であっても二本鎖であっても差し支えなく、誘発剤の存在下において所望の伸長産物の合成を開始するのに十分な長さである必要がある。プライマーの正確な長さは、温度、プライマーの起源および使用する方法等の多くの因子に依存するであろう。例えば、診断に用いる場合には、ターゲット配列の複雑さに依存し、オリゴヌクレオチドプライマーは通常１５−２５以上のヌクレオチドを包含するが、それより少ないヌクレオチドを包含するものであっても差し支えない。
【００４９】
この中のプライマーは、特定ターゲットＤＮＡ配列の異なる鎖に対して「実質的に」相補的であるように選択される。このことは、プライマーが各鎖とハイブリダイズするのに十分相補的でなければならないことを意味する。従って、プライマー配列は、鋳型の正確な配列を反映する必要はない。例えば、プライマー配列の残り部分がその鎖に相補的であるプライマーの５’末端に、非相補的ヌクレオチド断片が結合していて差し支えない。あるいは、プライマー配列がその鎖に十分な相補性を有しまたはその鎖とハイブリダイズして伸長産物の合成のための鋳型を形成することを条件として、非相補的塩基またはより長い配列がプライマー中に散在していて差し支えない。
【００５０】
この中で用いられている「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限酵素」の用語は、特異的ヌクレオチド配列部分またはその近くで二本鎖ＤＮＡを切断する酵素を称する。
【００５１】
外因性または異種ＤＮＡが細胞内に導入された場合、細胞はそのようなＤＮＡによって「形質転換されている」。形質転換ＤＮＡは細胞のゲノム中に（共有結合して）一体化されても一体化されなくても差し支えない。例えば、原核細胞、酵母および哺乳類細胞において、形質転換ＤＮＡは、プラスミドのようなエピソーム要素上に保持されていて差し支えない。真核細胞に関して、安定に形質転換された細胞は、形質転換ＤＮＡが染色体に一体化されて染色体複製を介して娘細胞に受け継がれるような細胞である。その安定性は、真核細胞が、形質転換ＤＮＡを包含する娘細胞の集団から成る細胞株またはクローンを樹立する能力によって説明される。「クローン」は、有糸分裂によって単一の細胞または祖先に由来する細胞集団である。「細胞株」は何世代にも亘りインビトロで安定に増殖し得る初代細胞のクローンである。
【００５２】
ヌクレオチドの約７５％以上（好ましくは約８０％以上、さらに最も好ましくは約９０％または９５％以上）がＤＮＡ配列の特定された長さに亘り一致する場合、２つのＤＮＡ配列は「実質的に相同である」。配列データバンクにおいて利用可能な標準ソフトウェアを用いて配列を比較することによって、あるいは、例えば、特定の系のために決定された厳しい条件下におけるサザンハイブリダイゼーション実験において、実質的に相同である配列を同定することができる。適切なハイブリダイゼーション条件を決定することは、当業技術の範囲内である。例えば、Maniatis et al., supra; DNA Cloning, Vols. I＆II, supra; Nucleic Acid Hybridization, supraを参照。
【００５３】
ＤＮＡ構築物の「異種」領域は、より大きなＤＮＡ分子内の同定可能なＤＮＡ断片であって、そのより大きな分子に関連して天然では認められないＤＮＡ断片である。従って、その異種領域が哺乳類遺伝子をコードする場合、通常、その遺伝子は、その由来生物のゲノム中ではその哺乳類遺伝子に隣接しないようなＤＮＡに隣接するであろう。別の例において、コード配列は、そのコード配列自体が天然では認められないような構造である（例えば、ゲノムコード配列がイントロンまたは天然遺伝子と異なるコドンを有する合成配列を包含するようなｃＤＮＡ）。対立遺伝子変異または自然に生じる突然変異事象は、この中で定義されたＤＮＡの異種領域を生じさせない。
【００５４】
そのような研究のために最も一般的に用いられる標識は、放射性元素、酵素、紫外線に暴露された際に蛍光を発する化学物質等である。多くの蛍光物質が公知であり、標識として用いることができる。蛍光物質として、例えば、フルオレセイン、ローダミン、オーラミン、テキサスレッド、ＡＭＣＡブルーおよび黄燐イエロー(Lucifer Yellow)が挙げられる。特定検出物質は、ヤギにおいて調製しかつイソチオシアネートを介してフルオレセインに結合させた抗ウサギ抗体である。
【００５５】
また、放射性元素または酵素を用いてタンパク質を標識しても差し支えない。任意の現在利用可能な測定法によって放射能標識を検出することができる。3Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、５１Ｃｒ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉおよび１８６Ｒｅから好ましいアイソトープを選択することができる。
【００５６】
酵素標識も同様に有用であり、任意の現在利用されている比色、分光測光、蛍光測光、電流滴定またはガス定量技術によって検出することができる。カルボジイミド、ジイソシアネート、グルタールアルデヒド等のような架橋分子を用いた反応によって、選択された粒子に酵素を結合させる。それら方法において用いられる多くの酵素は公知でありかつ利用できる。好ましい酵素は、ペロキシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼとペロキシダーゼ、およびアルカリホスファターゼである。代用の標識物質および方法の開示を例示する目的で、米国特許第３，６５４，０９０号、第３，８５０，７５２号および第４，０１６，０４３号を参照する。
【００５７】
本技術分野において開発されかつ利用される特定測定系は受容体測定法として知られている。受容体測定法において、測定すべき物質を適切に標識し、次に、多くのその標識物質を特定細胞試験コロニーに接種して、その後、標識物質が細胞受容体に結合する割合を特定するために結合試験を行う。その方法において、物質間の親和性の違いを確かめることができる。
【００５８】
本技術分野において有用である測定法は、「シス／トランス」測定法として知られている。詳細には、その測定法は２つの遺伝子構築物を用い、第一の構築物は通常適切な細胞株にトランスフェクトされた場合に特定の関心受容体を連続的に発現するプラスミドであり、第二の構築物は受容体／リガンド複合体の制御下においてルシフェラーゼのような受容体を発現するプラスミドである。従って、例えば、特定受容体に対するリガンドとして化合物を評価するのが望ましい場合、第一のプラスミドは選択された細胞株において受容体の発現をもたらす構築物であり、一方、第二のプラスミドは特定受容体に対する応答要素が挿入されたルシフェラーゼ遺伝子に結合したプロモーターを有するであろう。試験された化合物が受容体のアゴニストである場合、そのリガンドは受容体と複合体を形成し、さらに得られた複合体はその反応要素に結合してルシフェラーゼ遺伝子の転写を開始させるであろう。得られた化学ルミネセンスを光度測定によって測定し、さらに用量反応曲線を作成して公知リガンドのものと比較する。前記プロトコルは米国特許第４，９８１，７８４号に詳細に記載されている。
【００５９】
この中で用いられている「宿主」の用語は、原核細胞のみでなく、酵母、植物および動物細胞等の真核細胞も含むことを意味する。本発明のヒトＴＡＤＧ−１２タンパク質をコードする組換えＤＮＡ分子または遺伝子を用いて、当業者に周知な任意の技術を利用して、宿主を形質転換させて差し支えない。原核生物を形質転換させる目的で、本発明のヒトＴＡＤＧ−１２タンパク質をコードする遺伝子のコード配列を包含するベクターを用いることが特に好ましい。原核宿主として、大腸菌、Ｓ・ティムフィムリウム(S. tymphimurium)、セラシア・マルセッセンスおよび枯草菌が挙げられる。真核宿主として、ピッチア・パストリス(Pichia pastoris)のような酵母、哺乳類細胞および昆虫細胞が挙げられる。
【００６０】
通常、宿主との関連において、挿入ＤＮＡ断片の効率的な転写を促進させるプロモーターを包含する発現ベクターを用いる。発現ベクターは、通常、複製起点、プロモーター、ターミネーター、ならびに形質転換細胞において表現型の選択をもたらし得る特定遺伝子を包含する。当業界で公知の手段に従って形質転換宿主を発酵および培養して、最適な細胞増殖を得ることができる。
【００６１】
本発明は、実質的に純粋なＴＡＤＧ−１２タンパク質をコードするＤＮＡを含み、そのＤＮＡ鎖は、配列番号１または配列番号３に示す配列の少なくとも１５連続ヌクレオチドから成る配列を包含するプローブに対して、非常に厳しい条件下でハイブリダイズするであろう。本発明のＤＮＡによってコードされるタンパク質は、配列番号２または配列番号４に記載されたアミノ酸と８０％以上（好ましくは８５％以上、さらに最も好ましくは９５％以上）の配列の一致を有するであろう。より好ましくは、そのＤＮＡは、図４のヌクレオチド（配列番号１）のコード配列、またはそのような配列の縮重変異体を包含する。
【００６２】
本発明のＤＮＡがハイブリダイズするプローブは、図４に記載したヌクレオチド（配列番号１）のコード配列またはその相補体の好ましくは２０連続ヌクレオチド、より好ましくは４０ヌクレオチド、よりさらに好ましくは５０ヌクレオチド、最も好ましくは１００ヌクレオチド以上（１００％まで）の配列から成る。そのようなプローブは、（ａ）細胞から採取したｍＲＮＡを標識ハイブリダイゼーションプローブと接触させ；さらに（ｂ）そのプローブとｍＲＮＡとのハイブリダイゼーションを検出する工程を含む方法によってヒト細胞におけるＴＡＤＧ−１２の発現を検出するのに有用である。
【００６３】
また、本発明は、配列番号１に記載のヌクレオチドの１から２４１３までのヌクレオチドの領域または配列番号３に記載のヌクレオチドの１から２５４４までのヌクレオチドの領域の１５連続ヌクレオチド以上（好ましくは２０、より好ましくは３０、さらにより好ましくは５０、最も好ましくは全てのヌクレオチド）の配列を包含する実質的に純粋なＤＮＡを含む。また、本発明は、その新規なＤＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。本発明の技術を考慮して、当業者は本ＤＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを容易に開発することができる。
【００６４】
「非常に厳しい条件」は、例えば約０．１ｘＳＳＣの塩濃度による６５℃での洗浄条件のような、高温および低い塩濃度によって特徴付けされるＤＮＡハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件、あるいは機能的にそれに対応するような条件を意味する。例えば、非常に厳しい条件として：５０％ホルムアミドの存在下における約４２℃でのハイブリダイゼーション；１％ＳＤＳを含有する約２ｘＳＳＣによる約６５℃での１回目の洗浄；続く約０．１ｘＳＳＣによる約６５℃での２回目の洗浄：が挙げられる。
【００６５】
「実質的に純粋なＤＮＡ」は、その環境中のいくつかのまたは全ての分子の分離（部分精製または全精製）によって、あるいは請求ＤＮＡに隣接する配列の変化によって生じた、そのＤＮＡが自然に生じた環境の一部ではないＤＮＡを意味する。従って、その用語は、例えば、ベクター、自律複製プラスミドもしくはウィルスに組み込まれたまたは原核生物または真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれた組換えＤＮＡ、あるいは他の配列から独立した分離分子（例えば、ｃＤＮＡ、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または制限エンドヌクレアーゼ消化によって作成されたゲノムもしくはｃＤＮＡ断片）として存在する組換えＤＮＡを含む。また、その用語は、例えば融合タンパク質のような追加のポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えＤＮＡを含む。また、その用語は、ＴＡＤＧ−１２の選択的スプライシング変異体（ＴＡＤＧ−１２Ｖ）をコードする、配列番号３に示すヌクレオチドの一部を包含する組換えＤＮＡを含む。
【００６６】
ＤＮＡは、配列番号１または配列番号３に記載のヌクレオチドのコード配列に対して、約７０％以上、好ましくは７５％以上（例えば８０％以上）、最も好ましくは９０％以上の配列同一性を有する。その２つの配列間の同一性はマッチングまたは同一位置の数の一次関数である。例えば２つのＤＮＡ分子のそれぞれにおいて所定の位置がアデニンによって占められている場合のように、その２つの配列両方におけるサブユニット部位が同じ単量サブユニットで占められている場合に、その位置においてそれら２つの配列は同一である。例えば、長さが１０ヌクレオチドの配列中の７つの位置が、第二の１０ヌクレオチド配列中の対応する位置と同一である場合に、その２つの配列は７０％配列同一性を有する。比較配列の長さは、通常、５０ヌクレオチド以上であり、好ましくは６０ヌクレオチド以上、より好ましくは７５ヌクレオチド以上、最も好ましくは１００ヌクレオチドである。通常、配列分析ソフトウェア（Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705）を用いて、配列同一性を測定する。
【００６７】
本発明は、ヒトＴＡＤＧ−１２タンパク質をコードするＤＮＡ配列を包含するベクターを含み、そのベクターは、作動可能に結合したａ）複製起点；ｂ）プロモーター；およびｃ）ＴＡＤＧ−１２タンパク質をコードするＤＮＡ配列：を包含する宿主細胞において複製することができる。好ましくは、本発明のベクターは、配列番号１または配列番号３に示すＤＮＡ配列の一部を包含する。「ベクター」は、例えばプラスミドまたはウィルス核酸のような複製可能な核酸構築物として定義される。ＴＡＤＧ−１２タンパク質をコードする核酸を増幅および／または発現させるためにベクターを用いることができる。発現ベクターは、細胞においてポリペプチドの発現をもたらし得る適切な制御配列に、ポリペプチドをコードする核酸配列が作動可能に結合した複製可能な構築物である。そのような制御配列の必要性は、選択された細胞および選択された形質転換法に依存して変化するであろう。通常、制御配列は、転写プロモーターおよび／またはエンハンサー、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位、ならびに転写および翻訳の終結を制御する配列を含む。適切な転写および調節制御シグナルを包含する発現ベクターを構築するために、当業者に周知の方法を用いることができる。例えば、Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Ed.), Cold Spring Harbor Press, N.Y. に記載の技術を参照のこと。転写制御配列が効率的に遺伝子の転写を制御する場合には、遺伝子およびその転写制御配列が「作動可能に結合している」と定義される。本発明のベクターとして、限定はされないが、プラスミドベクターおよびウィルスベクターが挙げられる。本発明の好ましいウィルスベクターは、レトロウィルス、アデノウィルス、アデノ随伴ウィルス、ＳＶ４０ウィルスまたはヘルペスウィルスが挙げられる。
【００６８】
「実質的に純粋なタンパク質」は、天然において付随する成分の少なくともいくつかから分離されたタンパク質を意味する。通常、インビボにおいて目的タンパク質と共に自然に生じたタンパク質および天然の他の有機分子を含まないで６０重量％以上の純度である場合に、そのタンパク質は実質的に純粋である。好ましくは、調製物の純度は、７５重量％以上、より好ましくは９０重量％以上、さらに最も好ましくは９９重量％以上である。例えば、天然供給源からの抽出によって；ＴＡＤＧ−１２ポリペプチドをコードする組換え核酸の発現によって；またはタンパク質の化学合成によって：実質的に純粋なＴＡＤＧ−１２タンパク質を得ることができる。カラムクロマトグラフィー、ＴＡＤＧ−１２に特異的な抗体を用いたイムノアフィニティークロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはＨＰＬＣ分析のような任意の適切な方法によって純度を測定することができる。天然の状態で目的タンパク質に付随する不純物の少なくともいくつかから分離された場合には、そのタンパク質は天然において付随する成分を実質的に含まない。従って、化学的に合成されたまたはそれが天然において由来する細胞と異なる細胞系において産生されたタンパク質は、定義によれば、天然において付随する成分を実質的に含まない。従って、実質的に純粋なタンパク質は、大腸菌または他の原核生物において合成された原核生物タンパク質、あるいは自然に生じた任意の他の有機体を含む。
【００６９】
実質的に完全長のタンパク質に加えて、本発明はＴＡＤＧ−１２タンパク質の断片（例えば抗原性断片）も含む。この中で用いられたポリペプチドに適用される「断片」は、一般的に１０残基以上、より一般的に２０残基以上、さらに好ましくは３０残基以上（例えば５０残基）の長さであるが、完全な無傷の配列より短い。例えば、天然のまたは組換えのＴＡＤＧ−１２タンパク質の酵素消化によって、または特定されたＴＡＤＧ−１２の断片をコードする発現ベクターを用いた組換えＤＮＡ技術によって、または化学合成によって、当業者に公知の方法でＴＡＤＧ−１２タンパク質の断片を作成することができる。この中に記載の方法によって、候補断片がＴＡＤＧ−１２の特性（例えばＴＡＤＧ−１２に特異的な抗体に結合する）を示す能力を評価することができる。当業者に公知の標準プロトコルによって、精製ＴＡＤＧ−１２またはＴＡＤＧ−１２の抗原性断片を用いて新規な抗体を作成しまたは既存の抗体を試験する（例えば、診断的測定における陽性コントロールとして）ことができる。免疫原としてＴＡＤＧ−１２またはＴＡＤＧ−１２の断片を用いることによって例えばウサギにおいて作成されたポリクロナール抗血清も本発明に含まれる。当業者に公知であるモノクロナールおよびポリクロナール抗体作成の標準プロトコルを用いる。組換えＴＡＤＧ−１２ｃＤＮＡクローンを同定する能力、および公知のｃＤＮＡクローンからＴＡＤＧ−１２ｃＤＮＡクローンを区別する能力について、本方法によって作成したモノクロナール抗体をスクリーニングすることができる。
【００７０】
さらには、例えば選択的ｍＲＮＡスプライシングまたは選択的タンパク質プロセッシング事象の産物のような配列番号１または配列番号３の一部によって少なくともその一部がコードされているＴＡＤＧ−１２タンパク質、あるいはＴＡＤＧ−１２の配列の一部分が欠失しているＴＡＤＧ−１２タンパク質も本発明に含まれる。例えば標識、リガンドまたは抗原性を高める手段として作用するような別のポリペプチドに、その断片または完全ＴＡＤＧ−１２ポリペプチドを共有結合させて差し支えない。
【００７１】
また、本発明は、ＴＡＤＧ−１２に特異的に結合するポリクロナールまたはモノクロナール抗体も含む。本発明は、完全なモノクロナール抗体のみならず、例えばＦａｂまたは(Ｆａｂ)2断片；人工単鎖Ｆｖ分子；または例えばマウス由来の１つの抗体の結合特異性および例えばヒト由来の別の抗体の残りの部分を有する抗体のようなキメラ分子：等の免疫活性抗体断片も含む。
【００７２】
１つの実施形態において、抗体またはその断片を毒素、または放射性標識、非放射性同位体標識、蛍光標識、化学ルミネセンス標識、常磁性標識、酵素標識または比色標識等の検出可能な標識に結合させて差し支えない。適切な毒素の例として、ジフテリア毒素、シュードモナス内毒素Ａ、リシンおよびコレラ毒素が挙げられる。適切な酵素標識として、リンゴ酸ヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、δ−５−ステロイドイソメラーゼ、アルコール脱水素酵素、α−グリセロールリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ペロキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ等が挙げられる。適切な放射性標識として、３Ｈ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３２Ｐ、３５Ｓ、１４Ｃ等が挙げられる。
【００７３】
本発明の方法に基づいて、インビボ診断のために常磁性同位体を用いて差し支えない。磁気共鳴映像法において有用である元素について多くの例がある。インビボでの核磁気共鳴映像法について検討するために、例えば、Schaefer et al., (1989) JACC 14, 472-480; Shreve et al., (1986) Magn. Reson. Med. 3, 336-340; Wolf, G.L., (1984) Physiol. Chem. Phys. Med. NMR 16, 93-95; Wesbey et al., (1984) Physiol. Chem. Phys. Med. NMR 16, 145-155; Runge et al., (1984) Invest. Radiol. 19, 408-415を参照。適切な蛍光標識の例として、イソチオシアネート標識、ローダミン標識、フィコエリスリン標識、フィコシアニン標識、アロフィコシアニン標識、オフタルデヒド(ophthaldehyde)標識、フルオレサミン標識等が挙げられる。化学ルミネセンス標識の例として、ルミナル標識、イソルミナル標識、芳香族アクリジニウムエステル標識、イミダゾール標識、アクリジニウム塩標識、シュウ酸エステル標識、ルシフェリン標識、ルシフェラーゼ標識、エクオリン標識等が挙げられる。
【００７４】
当業者は、本発明に基づいて用い得る他の適切な標識を知っているであろう。当業者に公知の標準技術を用いて、それら標識を抗体またはその断片に結合させることができる。一般的な技術は、Kennedy et al., (1976) Clin. Chim. Acta 70, 1-31; and Schurs et al., (1977) Clin. Chim. Acta 81, 1-40に記載されている。後者の文献に記載のカップリング技術はグルタールアルデヒド法、過ヨウ素酸法、ジマレイミド法、ｍ−マレイミドベンジル−Ｎ−ヒドロキシ−スクシニミドエステル法である。それら方法の全てが参照によってこの中に組み込まれる。
【００７５】
生物試料中のＴＡＤＧ−１２タンパク質を検出する方法も本発明の範囲内であり、その方法は、例えば放射性にタグ付けしたＴＡＤＧ−１２特異的抗体のような標識抗体と試料とを接触させ、さらにその抗体が試料中の成分に結合したか否かを特定する工程を含む。
【００７６】
この中に記載のように、本発明は多くの診断的利点および用途を提供する。例えば、本発明において開示されたＴＡＤＧ−１２タンパク質は、そのタンパク質が腫瘍細胞において高度に過剰発現されていることから、様々な組織における癌を診断するのに有用である。ＴＡＤＧ−１２に特異的なエピトープに結合する抗体（またはその抗原結合断片）は癌または新生物の形質転換を診断するための生物試料中のＴＡＤＧ−１２タンパク質を検出する方法において有用である。その方法は、癌を有することが疑わしい患者から生物試料（例えば細胞、血液、血漿、組織等）を採取し、さらにＥＬＩＳＡのような標準免疫測定技術を用いてＴＡＤＧ−１２を検出する工程を含む。生物試料に対する抗体結合は、その試料がＴＡＤＧ−１２内のエピトープに特異的に結合する成分を含むことを示唆する。
【００７７】
同様に、標準のノーザンブロット法を用いて、当業者に公知の従来のノーザンハイブリダイゼーション技術に基づいて、癌を有することが疑わしい細胞または組織中におけるＴＡＤＧ−１２ｍＲＮＡの相対的量を確かめることができる。そのノーザン法は、例えば、配列番号１または配列番号３に相補的である配列を有する完全長の一本鎖ＤＮＡ、あるいは２０以上（好ましくは３０以上、より好ましくは５０以上、さらに最も好ましくは１００以上の連続ヌクレオチドの長さ）の上記ＤＮＡ配列の断片の何れかを包含する放射性標識ＴＡＤＧ−１２ｃＤＮＡのようなハイブリダイゼーションプローブを用いる。当業者に周知の任意の多くの異なる方法によってそのＤＮＡハイブリダイゼーションプローブを標識することができる。
【００７８】
免疫測定においてＴＡＤＧ−１２タンパク質に対する抗体を用いて、新生物性形質転換の疑いが高い組織におけるＴＡＤＧ−１２タンパク質発現レベルの上昇を検出することができる。ノーザンブロット法および分析を用いてそれら同じ用途を達成できる。
【００７９】
本発明は、（ａ）ＴＡＤＧ−１２タンパク質をコードする単離ＤＮＡ断片；（ｂ）上記（ａ）の単離ＤＮＡ断片に対してハイブリダイズし、かつＴＡＤＧ−１２タンパク質をコードする単離ＤＮＡ断片；（ｃ）遺伝暗号の縮重のためコドン配列において上記（ａ）および（ｂ）の単離ＤＮＡ断片と異なり、かつＴＡＤＧ−１２タンパク質をコードする単離ＤＮＡ断片：より成る群から選択されたＴＡＤＧ−１２タンパク質をコードするＤＮＡ断片に関する。好ましくは、そのＤＮＡは、配列番号１または配列番号３に示す配列を有する。より好ましくは、そのＤＮＡは配列番号２または配列番号４に示すアミノ酸配列を有するＴＡＤＧ−１２タンパク質をコードする。
【００８０】
また、本発明は、本発明のＤＮＡを発現し得るベクターおよび／または宿主細胞に関する。好ましくは、そのベクターは、配列番号２または配列番号４に示すアミノ酸配列を有するＴＡＤＧ−１２タンパク質をコードするＤＮＡを包含する。代表的宿主細胞として、細菌細胞、酵母細胞、哺乳類細胞および昆虫細胞が挙げられる。
【００８１】
また、本発明は（ａ）ＴＡＤＧ−１２タンパク質をコードする単離ＤＮＡ；（ｂ）上記（ａ）の単離ＤＮＡに対してハイブリダイズし、かつＴＡＤＧ−１２タンパク質をコードする単離ＤＮＡ；（ｃ）遺伝暗号の縮重のためコドン配列において上記（ａ）および（ｂ）の単離ＤＮＡと異なり、かつＴＡＤＧ−１２タンパク質をコードする単離ＤＮＡ：より成る群から選択されたＤＮＡによってコードされる単離および精製したＴＡＤＧ−１２タンパク質に関する。好ましくは、その単離および精製したＴＡＤＧ−１２タンパク質は配列番号２または配列番号４に示すアミノ酸配列を有する。
【００８２】
また、本発明は、（ａ）細胞から採取したｍＲＮＡを標識ハイブリダイゼーションプローブと接触させ；さらに（ｂ）そのプローブとｍＲＮＡとのハイブリダイゼーションを検出する：工程を含む、この中に記載のＴＡＤＧ−１２タンパク質の発現を検出する方法に関する。
【００８３】
切断産物ＴＡＤＧ−１２Ｖを含む、ＴＡＤＧ−１２遺伝子および遺伝子産物のための多くの潜在的用途がある。
【００８４】
本発明の１つの実施形態において、生物試料中のＴＡＤＧ−１２タンパク質を検出することによって癌を診断する方法を提供しており、その方法において、ＴＡＤＧ−１２タンパク質の存在または不在が癌の存在または不在を示唆する。好ましくは、生物試料は、血液、尿、唾液、涙液、間質液、腹水、腫瘍組織生検試料および循環腫瘍細胞である。さらに好ましくは、ＴＡＤＧ−１２タンパク質の検出は、ノーザンブロット、ウェスタンブロット、ドットブロット、ＥＬＩＳＡサンドイッチ法、ラジオイムノアッセイ、ＤＮＡアレイチップおよびフローサイトメトリーより成る群から選択される手段によって成される。卵巣癌、乳癌、肺癌、結腸癌、前立腺癌、およびＴＡＤＧ−１２が過剰発現する他の癌を検出するためにそのような方法を用いる。
【００８５】
本発明の別の実施形態において、生物試料中におけるＴＡＤＧ−１２タンパク質またはＴＡＤＧ−１２ｍＲＮＡを検出することによって悪性過形成を検出する方法を提供する。さらに、ＴＡＤＧ−１２タンパク質またはＴＡＤＧ−１２ｍＲＮＡを基準情報と比較することによって、診断または治療を提供することができる。好ましくは、ＴＡＤＧ−１２ｍＲＮＡを検出するためにＰＣＲ増幅を用い、ここで用いられるプライマーは配列番号２８−３１より成る群から選択される。さらに好ましくは、ＴＡＤＧ−１２タンパク質に対する抗体への免疫親和性によって、ＴＡＤＧ−１２タンパク質の検出を行う。
【００８６】
本発明のさらに別の実施形態において、発現に必要な要素に作動可能に結合した逆配向のＴＡＤＧ−１２のＤＮＡ断片を包含するベクターを導入することによって、細胞中の内因性ＴＡＤＧ−１２ｍＲＮＡの発現を阻害する方法を提供する。結果として、そのペクターは細胞中においてＴＡＤＧ−１２アンチセンスｍＲＮＡを産生し、そのアンチセンスｍＲＮＡは内因性ＴＡＤＧ−１２ｍＲＮＡにハイブリダイズし、それによって内因性ＴＡＤＧ−１２ｍＲＮＡの発現を阻害する。
【００８７】
本発明のさらに別の実施形態において、ＴＡＤＧ−１２タンパク質またはその断片に対する抗体を導入することによってＴＡＤＧ−１２タンパク質の発現を阻害する方法を提供する。結果として、その抗体がＴＡＤＧ−１２タンパク質またはその断片に結合することによって、ＴＡＤＧ−１２タンパク質の発現を阻害する。
【００８８】
切断形態を含むＴＡＤＧ−１２遺伝子産物をターゲット治療のために用いることができる。詳細には、そのような治療を必要とする個体に、ＴＡＤＧ−１２タンパク質に特異的なターゲット部分および治療部分を有する化合物を投与する。好ましくは、ターゲット部分は、ＴＡＤＧ−１２タンパク質に治する抗体およびＴＡＤＧ−１２タンパク質に結合するリガンドまたはリガンド結合領域より成る群から選択される。ＴＡＤＧ−１２タンパク質は、配列番号２および配列番号４に示すアミノ酸配列を有する。好ましくは、治療部分は、放射性同位体、毒素、化学療法剤、免疫促進剤および細胞傷害性物質より成る群から選択される。卵巣癌、肺癌、前立腺癌、結腸癌およびＴＡＤＧ−１２が過剰発現する他の癌より成る群から選択される疾患を有する個体を治療するために、そのような方法を用いることができる。
【００８９】
本発明のさらに別の実施形態において、個体にＴＡＤＧ−１２タンパク質またはその断片を接種することによって、個体にＴＡＤＧ−１２に対するワクチン接種を行いまたは免疫反応を生じさせる方法を提供する。詳細には、ＴＡＤＧ−１２タンパク質またはその断片は、ＴＡＤＧ−１２活性を欠き、その接種によって個体中に免疫反応を誘導し、それによって個体にＴＡＤＧ−１２に対するワクチン接種を行う。好ましくは、その個体は、癌を有し、癌を有する疑いが高く、あるいは癌になる危険性がある。さらに好ましくは、ＴＡＤＧ−１２タンパク質は、配列番号２または配列番号４に示すアミノ酸配列を有するが、一方ＴＡＤＧ−１２断片は配列番号８に示す配列を有しまたは９残基断片から２０残基断片までの断片である。９残基断片の例として、配列番号３５、３６、５５、５６、８３、８４、９７、９８、１１９、１２０、１２２、１２３および１３６が示されている。
【００９０】
本発明のさらに別の実施形態において、ＴＡＤＧ−１２タンパク質の免疫原断片および適切なアジュバントを含む免疫原組成物を提供する。好ましくは、ＴＡＤＧ−１２タンパク質の免疫原断片は、配列番号８に示す配列を有し、あるいは９残基断片から２０残基断片までの断片である。９残基断片の例として、配列番号３５、３６、５５、５６、８３、８４、９７、９８、１１９、１２０、１２２、１２３および１３６が示されている。
【００９１】
以下の実施例は、本発明の種々の実施形態を例示する目的で与えられており、何ら本発明を限定することを意図していない。
【００９２】
実施例１
組織採取および保存
患者の子宮摘出、両方の卵巣摘出、または新生組織の外科的除去の際に、標本を回収して氷上に置いた。特定組織試料の単離および同定のために、その標本を研修医の病理学者に渡した。最終的に、液体窒素中においてその試料を凍結し、実験記録に記入して、−８０℃に保存した。時々、ヒト組織ネットワーク協会（ＣＨＴＮ）から追加の標本を得た。それら試料はＣＨＴＮによって調製され、ドライアイスに入れて出荷された。到達すると、それら標本を実験記録に記入して、−８０℃で保存した。
【００９３】
実施例２
ｍＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ合成
６９の卵巣腫瘍（４の良性腫瘍、１０の低悪性潜在的腫瘍(low malignant potential tumor)、および５５の癌）、ならびに１０の正常卵巣を外科的標本から得て、液体窒素中において凍結した。American Type Culture Collection(Rockville, MD)から、ヒト卵巣癌細胞株ＳＷ６２６およびＣａｏｖ３、ヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓを購入した。１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清および抗生物質を補足したダルベッコの調製イーグル培地中において、サブコンフルエントになるまで細胞を培養した。
【００９４】
以前記載された方法［１４−１６］によって、ｍＲＮＡの抽出およびｃＤＮＡ合成を実施した。ＲｉｂｏＳｅｐ ｍＲＮＡ単離キット(Becton Dickinson Labware)を用いてｍＲＮＡを単離した。その方法において、オリゴ（ｄＴ）セルロースを介したアフィニティークロマトグラフィーを用いて、組織溶解物からポリＡ＋ｍＲＮＡを直接単離した。第一鎖ｃＤＮＡ合成キット(CLONTECH)を用いたランダムヘキサマープライミング(random hexamer priming)によって、ｍＲＮＡ（５．０μg）を用いてｃＤＮＡを合成した。
【００９５】
実施例３
重複プライマーを用いたＰＣＲおよびＴＡＤＧ−１２ｃＤＮＡのクローニング
セリンプロテアーゼのための触媒三つ組残基の周囲のアミノ酸のコンセンサス配列のための重複プライマーとして、前進の５’−ＴＧＧＧＴＩＧＴＩＡＣＩＧＣＩＧＣＩＣＡ（ＣＴ）ＴＧ−３’（配列番号２６）、および反対の５’−Ａ（ＡＧ）ＩＡ（ＡＧ）ＩＧＣＩＡＴＩＴＣＩＴＴＩＣＣ−３’（配列番号２７）を用いて、正常および癌のｃＤＮＡからの産物を比較した。プロメガＴ−ベクタープラスミド中に適切なバンドを連結し、さらに選択培地中で増殖するＪＭ１０９細胞（Promega）を形質転換するためにその連結産物を用いた。個々のコロニーを選択した後、それらコロニーを培養し、さらにウィザードミニプレップＤＮＡ精製システム（Promega）によってプラスミドＤＮＡを単離した。PRISM Ready Reaction Dye Deoxyターミネーターサイクルシークエンスキット(Applied Biosystems)を用いて、ヌクレオチド配列決定を実施した。直接ｃＤＮＡ配列決定のために、Applied Biosystemsモデル３７３Ａ ＤＮＡシークエンスシステムを用いた。
【００９６】
初代のＴＡＤＧ−１２サブクローンを無作為に標識して、標準ハイブリダイゼーション技術［１１、１５］によって卵巣腫瘍ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして用いた。そのライブラリーは、ステージIII／グレードIIIの卵巣腺癌患者の癌細胞から単離したｍＲＮＡを用いて、λＺＡＰ中において構築された。２３１５ヌクレオチドの長さの３つの重複するクローンを得た。遺伝子バンクＥＳＴデータベースにおいて利用可能なクローンとの相同性によって、ポリＡテイルを含むほとんどの３’配列をコードする最後の９９ヌクレオチドを同定した。
【００９７】
実施例４
定量的ＰＣＲ
定量的ＰＣＲを用いて、ＴＡＤＧ−１２のｍＲＮＡ過剰発現を特定した。以前報告された方法［１６］に基づいて、定量的ＰＣＲを実施した。オリゴヌクレオチドプライマーとして：ＴＡＤＧ−１２のために、前進の５’−ＧＡＡＡＣＡＴＧＴＣＣＴＴＧＣＴＣＴＣＧ−３’（配列番号２８）、および反対の５’−ＡＣＴＡＡＣＴＴＣＣＡＣＡＧＣＣＴＣＣＴ−３’（配列番号２９）；変異ＴＡＤＧ−１２のために、５’−ＴＣＣＡＧＧＴＧＧＧＴＣＴＡＧＴＴＴＣＣ−３’（配列番号３０）、反対の５’−ＣＴＣＴＴＴＧＧＣＴＴＧＴＡＣＴＴＧＣＴ−３’（配列番号３１）；β−チューブリンのために、前進の５’−ＣＧＣＡＴＣＡＡＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＡＡ−３’（配列番号３２）、反対の５’−ＴＡＣＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＣＴＧＡＧＡ−３’（配列番号３３）：を用いた。内部対照としてβ−チューブリンを利用した。ＰＣＲ反応混合物は、最終容積２５μl中に、反応バッファー(Promega)と共に、ｍＲＮＡ（５０ng）から誘導されたｃＤＮＡ、ＴＡＤＧ−１２遺伝子およびβ−チューブリン遺伝子のためのセンスおよびアンチセンスプライマー（５pmol）、ｄＮＴＰs（２００μmol）、α−３２ＰｄＣＴＰ（５μＣｉ）、ならびにＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（０．２５ｕｎｉｔ）を含む。β−チューブリン遺伝子と並行させて、ターゲット配列を増幅した。サーマルサイクラー(Thermal Cycler)(Perkin-Elmer Cetus)において、ＰＣＲを３０サイクル実施した。ＰＣＲの各サイクルは、９４℃での３０秒間の変性、６０℃での３０秒間のアニーリング、および７２℃での３０秒間の伸長を含む。２％アガロースゲル上でＰＣＲ産物を分離し、さらに、ホスホイメージャー(Molecular Dynamics)を用いることによって、各ＰＣＲ産物の放射能を特定した。本研究は、ホスホイメージャーによって測定した発現比（ＴＡＤＧ−１２／β−チューブリン）を用いて遺伝子発現を評価し、さらに、正常卵巣の平均値＋２ＳＤを、過剰発現を特定するためのカットオフ値として定義した。正常卵巣と腫瘍の平均値を比較するために、student’s t testを用いた。
【００９８】
実施例５
ＴＡＤＧ−１２／ＴＡＤＧ−１２Ｖの配列決定
クローニング部位近くのプラスミド特異的プライマーを利用して、使用説明書に従って、PRISMTM Ready Reaction Dye DeoxyTMターミネーター(Applied Biosystems cat#401384)を用いて配列決定反応を実施した。Centri-stepTMスピンカラム(Princeton Separation cat.# CS-901)を用いて、完了した配列決定反応から残留染色ターミネーターを除去した。Applied Biosystemsモデル３７３Ａ ＤＮＡシークエンスシステムを利用可能であり、配列分析のために用いた。
【００９９】
実施例６
抗体産生
ＴＡＤＧ−１２カルボキシ末端タンパク質配列であるＮＨ２−ＷＩＨＥＱＭＥＲＤＬＫＴ−ＣＯＯＨ（ＷＩＨＥＱＭＥＲＤＬＫＴ、配列番号３４）由来の多価抗原ペプチドにポリリジンを結合させたものでホワイトニュージーランドウサギを免疫することによって、ポリクロナールウサギ抗体を作成した。そのペプチドは、完全長ＴＡＤＧ−１２中に存在するが、ＴＡＤＧ−１２Ｖには存在しない。ＲｉＢｉアジュバント中において乳化させたペプチド（約１００μg）でウサギを免疫した。続く追加免疫を６週間に３回実施し、さらに最終免疫の１０日後に、ウサギの血清を採取した。ドットブロット分析によって血清を試験して、ＴＡＤＧ−１２特異的ペプチドに対する親和性を特定した。ウサギの免疫前血清を陰性対照として用いた。
【０１００】
実施例７
ノーザンブロット分析
１％ホルムアルデヒド−アガロースゲルにｍＲＮＡ（１０μg）を装填し、電気泳動し、さらにHybond-N+ナイロン膜(Amersham)上にブロットした。Prime-a-Gene標識システム(Promega)によって、３２Ｐ標識ｃＤＮＡプローブを作成した。上記と同じプライマーによって増幅したＰＣＲ産物をプローブのために用いた。ブロットを３０分間プレハイブリダイズさせ、さらにExpressHybハイブリダイゼーション溶液(CLONTECH)中の３２Ｐ標識ｃＤＮＡプローブと、６８℃で６０分間ハイブリダイズさせた。β−チューブリンプローブを用いて、相対的ゲル装填量を特定するための対照ハイブリダイゼーションを実施した。
【０１０１】
同じハイブリダイゼーション法によって、正常なヒト組織；脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、結腸および末梢血白血球、ならびに正常ヒト胎児組織；脳、肺、肝臓および腎臓を評価した(Human Multiple Tissue Northern Blot; CLONTECH)。
【０１０２】
実施例８
免疫組織化学
Vectastain Elite ABCキット(Vector)を用いて、免疫組織化学染色を実施した。ホルマリン固定およびパラフィン包埋した標本をいつものように脱パラフィン処理し、さらに、０．０１Ｍクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．０）中においてマイクロ波熱処理を用いて処理した。加湿チャンバー中において３０分間、正常なヤギ血清と共にその標本をインキュベートした。加湿チャンバー中において１時間、ＴＡＤＧ−１２ペプチド抗体をその標本と共にインキュベートした。リン酸緩衝生理食塩水で過剰な抗体を洗浄して除いた。ビオチン化抗ウサギＩｇＧと共に３０分間インキュベートした後、その標本をＡＢＣ試薬(Vector)と共に３０分間インキュベートした。ＡＢＣ基質系(DAKO)を用いて最終産物を可視化し、さらに標本にする前にヘマトキシリンで対比染色した。一次抗体の代わりに正常血清を用いることによって、陰性対照を実施した。
【０１０３】
実施例９
ＴＡＤＧ−１２およびＴＡＤＧ−１２変異体の触媒領域サブクローンの単離
卵巣腫瘍において発現されているセリンプロテアーゼを同定するために、それら酵素の触媒三つ組残基の保存領域に対して設計された重複ＰＣＲプライマーを用いた。鋳型としての正常卵巣または卵巣腫瘍の何れかのｃＤＮＡと共に、保存ヒスチジンの周囲の領域に対して設計されたセンスプライマー、および保存アスパラギン酸の周囲の領域に対して設計されたアンチセンスプライマーを用いた。卵巣腫瘍ｃＤＮＡとの反応において、約１８０ｂｐの予測されたサイズの強い産物のバンド、ならびにいくつかの卵巣腫瘍ｃＤＮＡにおいて強い発現を示した約３００ｋｂの予測外のＰＣＲ産物が観察された（図１Ａ）。それらＰＣＲ産物の両方をサブクローン化し、さらに配列決定した。１８０ｂｐバンドからのサブクローンの配列（配列番号５）は、大きい方のバンドが１３３ヌクレオチドの追加の挿入部分を有することを除いて、その大きい方の予測外のバンドにおいて同定された配列（配列番号７）に相同であることが見出された（図１Ｂ）。適切なサイズの小さい方の産物は他の公知のプロテアーゼと相同であるタンパク質配列（配列番号６）をコードするが、一方、挿入部分（配列番号８）を有する配列はセリンプロテアーゼ触媒領域からのフレームシフト、およびそれに続く未熟な翻訳終止コドンをコードする。また、４つの各腫瘍由来のＴＡＤＧ−１２変異体をサブクローン化し、さらにその配列を決定した。その配列および挿入部分は一致することが分かった。ＰＣＲによってそれらｃＤＮＡ派生クローンのゲノム配列を増幅しかつ調べて、変異転写産物をもたらすであろう潜在的なＡＧ／ＧＴスプライシング部位を包含することがわかった。
【０１０４】
実施例１０
ＴＡＤＧ−１２発現のノーザンブロット分析
転写サイズおよび組織分布を調べるため、触媒領域サブクローンを無作為に標識して、正常卵巣組織、卵巣腫瘍、ならびに癌細胞株ＳＷ６２６、ＣＡＯＶ３、ＨｅＬａ、ＭＤ−ＭＢＡ−４３５ＳおよびＭＤ−ＭＢＡ−２３１のノーザンブロットを調べるのに用いた（図２）。２．４、１．６および０．７ｋｂの３つの転写物が観察された。正常卵巣および卵巣腫瘍のブロットにおいて、正常卵巣では最も小さい転写サイズの０．７ｋｂのバンドの発現が低かったが、一方、漿液性癌では全ての転写物（２．４、１．６および０．７ｋｂ）が異常に存在していた。さらには、正常ヒト組織：膵臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、結腸および末梢血白血球、ならびに正常ヒト胎児組織：脳、肺、肝臓および腎臓についてノーザンブロットを調べた。同じ３つの転写物が全てのそれら組織において弱く発現されていることが分かった（データは示していない）。相対的な試料装填量の対照として、ヒトβ−チューブリン特異的プローブを利用した。さらには、５０のヒト組織についてＲＮＡドットブロットを調べて、示された全ての組織において、そのクローンが弱く発現されていることを特定した（図３）。心臓において最も高いレベルであり、被殻、扁桃、腎臓、肝臓、小腸、骨格筋および副腎において中間レベルであることが分かった。
【０１０５】
実施例１１
ＴＡＤＧ−１２の配列決定および特徴付け
プローブとして触媒領域サブクローンを用い、標準ハイブリダイゼーション技術によって、λＺＡＰ中に構築された卵巣腫瘍ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。プローブと重複した２つのクローンを同定し、さらに２３１６ヌクレオチドに相当することが分かった。遺伝子バンクのＥＳＴデータベースにおいて利用可能なクローンとの相同性によって、ポリ−アデニル化シグナルおよびポリ（Ａ）テイルを包含するその転写物の３’末端の９７ヌクレオチドを同定した。これによって、転写物の全サイズを２４１３塩基とした（配列番号１、図４）。それに続く遺伝子バンクのゲノムデータベースのスクリーニングは、ＴＡＤＧ−１２が１７染色体からのコスミドに相同であることを示した。そのコスミドは登録番号ＡＣ０１５５５５を有する。
【０１０６】
同定されたｃＤＮＡは、腫瘍関連差別的発現遺伝子１２（ＴＡＤＧ−１２）と称される、４５４アミノ酸（配列番号２）から成る予測タンパク質を産生するであろうオープンリーディングフレームを包含する。その配列を遺伝子バンクデータベースに提出して、登録番号＃ＡＦ２０１３８０を与えられた。相同配列プログラムを用いたところ、そのタンパク質は、アミノ末端細胞質領域、潜在的なII型膜貫通領域およびそれに続く低密度リポタンパク質受容体様クラスＡ領域（ＬＤＬＲ−Ａ）、スカベンジャー受容体システインリッチ領域（ＳＲＣＲ）、および細胞外セリンプロテアーゼ領域等のいくつかの領域を包含する。
【０１０７】
ＴＭＰｒｅｄプログラムによって予測したところ、ＴＡＤＧ−１２は潜在的な膜貫通領域として働き得る疎水性の高いアミノ酸領域を包含し、その領域は細胞質内にタンパク質のアミノ末端を残して、リガンド結合領域およびプロテアーゼ領域を細胞外空間に曝している。その一般構造はヘプシン［１７］およびＴＭＰＲＳＳ［１８］等の他の公知の膜貫通型プロテアーゼと一致し、さらにＴＡＤＧ−１２はＴＭＰＲＳＳ２プロテアーゼにその構造が特に類似している。
【０１０８】
ＴＡＤＧ−１２のＬＤＬＲ−Ａ領域は、アミノ酸７４から１０８の配列（配列番号１３）によって表される。ＬＤＬＲ-Ａ領域は、当初は、ＬＤＬ受容体内において、６不変システイン残基および高度に保存されたアスパラギン酸およびグルタミン酸残基を包含する一連の約４０アミノ酸の反復配列として同定された［１９］。その最初の同定以来、その領域に相同なモチーフを包含する多数の他の遺伝子が同定された［２０］。マトリプターゼ、ＴＭＰＲＳＳ２およびいくつかの補体成分等のＬＤＬＲ−Ａモチーフを包含するいくつかのプロテアーゼが同定された。ＴＡＤＧ−１２と他の公知のＬＤＬＲ−Ａ領域との比較を図５Ａに示す。それら配列の類似性は、４４％から５４％の類似または同一アミノ酸の範囲である。
【０１０９】
ＬＤＬＲ−Ａ領域に加えて、ＴＡＤＧ−１２は、ＳＲＣＲファミリーのＡ群に対する相同性を有する別の細胞外リガンド結合領域を包含する。そのタンパク質領域のファミリーは、一般的に、約１００アミノ酸から成る配列内の６システイン残基の保存によって定義される［２３］。ＴＡＤＧ−１２のＳＲＣＲ領域は、アミノ酸１０９から２０６によってコードされ（配列番号１７）、その領域を他のＳＲＣＲ領域と整列させることによって、３６％から４３％の間の類似性を有することが分かった（図５Ｂ）。しかしながら、ＴＡＤＧ−１２は６つの保存システイン残基の内４つしか持たない。このことは、プロテアーゼＴＭＰＲＳＳ２において認められるＳＲＣＲ領域に類似する。
【０１１０】
また、ＴＡＤＧ−１２タンパク質は、プロテアーゼのチロシンファミリーのセリンプロテアーゼ領域を包含する。ＴＡＤＧ−１２の触媒領域を他の公知のプロテアーゼと整列させて図５Ｃに示す。それら配列間の類似性は、４８％から５５％の範囲であり、ＴＡＤＧ−１２はセリンプロテアーゼＴＭＰＲＳＳ２に最も類似しており、ＴＭＰＲＳＳ２も膜貫通領域、ＬＤＬＥ−Ａ領域およびＳＲＣＲ領域を包含する。ＳＲＣＲ領域の下流側に、そのファミリーの多くのセリンプロテアーゼに共通の潜在的な分解／活性化部位である保存アミノ酸モチーフ（ＲＩＶＧＧ）がある［２５］。このことは、ＴＡＤＧ−１２が細胞表面に運ばれ、そこで、リガンド結合領域が細胞外分子と相互作用することができかつプロテアーゼ領域が潜在的に活性化されることを示唆する。また、ＴＡＤＧ−１２は保存システイン残基（アミノ酸２０８および２４３）を包含しており、その残基は、他のプロテアーゼにおいて、活性化プロテアーゼを他の細胞外領域に結合させ得るジスルフィド結合を形成する。
【０１１１】
実施例１２
選択的転写産物の定量的ＰＣＲによる特徴付け
本来のＴＡＤＧ−１２サブクローンは、最初の重複プライマーＰＣＲ実験において高発現されているとして同定された。１３３ｂｐの挿入部分を有するＴＡＤＧ−１２変異体（ＴＡＤＧ−１２Ｖ）もその最初の実験において容易に検出された。その発現の頻度、および正常卵巣と卵巣腫瘍との間でその発現レベルが異なるか否かを特定するために、既に認証されている半定量的ＰＣＲ技術を用いた［１６］。ＰＣＲ分析において、放射性標識ヌクレオチドの存在下、ＴＡＤＧ−１２またはＴＡＤＧ−１２Ｖの何れかに特異的な産物と共に、β−チューブリンの産物を同時増幅させた。アガロースゲル電気泳動によってその産物を分離し、さらに各ＰＣＲ産物の相対的装填量を定量化するためにホスホイメージャーを用いた。ＴＡＤＧ−１２およびＴＡＤＧ−１２Ｖの両方におけるそれら増幅産物の例を図６に示す。正常卵巣試料中において調べたβ−チューブリンに対するＴＡＤＧ−１２（またはＴＡＤＧ−１２Ｖ）の平均比＋／−２ＳＤとして、正常な発現を定義した。その結果を表１および表２に要約する。ＴＡＤＧ−１２は評価した５５の癌の内４１において過剰発現されているが、一方、変異体は２２の癌の内８において異常に高いレベルで存在することが認められた。student’s t testによって特定したところ、それらの差は統計的に有意であった（ｐ＜０．０５）。
【０１１２】
【表１】
0004558948.tif 000002
【表２】
0004558948.tif 000003
実施例１３
卵巣腫瘍細胞におけるＴＡＤＧ−１２の免疫組織化学分析
ＴＡＤＧ−１２タンパク質について調べるために、カルボキシ末端のアミノ酸配列中に位置するペプチドに対するポリクロナールウサギ抗血清を開発した。それら抗体を用いて、ＴＡＤＧ−１２タンパク質の発現レベルを調べ、さらに免疫学的局在決定によって正常卵巣および卵巣腫瘍細胞内でのその局在性を調べた。正常卵巣組織では全く染色が観察されなかった（図７Ａ）が、一方、試験した２９の腫瘍の内２２において顕著な染色が観察された。図７Ｂおよび７Ｃにおいて、代表的腫瘍試料を示している。ＴＡＤＧ−１２は細胞質に亘り広汎に認められ、輸送経路中のタンパク質であることが示唆されることに注意すべきである。また、予想通り、それら腫瘍試料において、ＴＡＤＧ−１２は細胞表面において認められる。免疫組織化学分析のために開発されかつ用いられた抗体はＴＡＤＧ−１２Ｖ切断タンパク質を検出しないことに注意すべきである。
【０１１３】
免疫組織化学染色の結果を表３に要約する。２９の卵巣腫瘍の内２２がＴＡＤＧ−１２の陽性染色を示したが、正常卵巣上皮はＴＡＤＧ−１２抗原の発現を全く示さなかった。１０の漿液性腺癌の内８つ、８の粘液性腺癌の内８つ、２の明細胞癌の内１つ、さらに６の子宮内膜癌の内４つが陽性染色を示した。
【０１１４】
【表３】
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実施例１４
ペプチドの順位付け
ワクチンまたは免疫刺激のために、それぞれ９−マーから１１−マーのＴＡＤＧ−１２タンパク質を調べて、一般人口の上位８つのハプロタイプに対する各ペプチドの結合を順位付けした［Parker et al., (1994)］。http://www-bimas. dcrt. nih. gov/ molbio /hla bind/において、その分析に用いられるコンピュータープログラムを見つけることができる。表４は、各ペプチドの特定ＨＬＡ対立遺伝子に対する結合の予測半減期に基づくペプチドの順位付けを示す。より長い半減期は、そのペプチドと特定ＨＬＡ分子とのより強い結合を示唆する。ＨＬＡ対立遺伝子に対して強く結合するＴＡＤＧ−１２ペプチドは推定上の免疫原であり、かつ個体にＴＡＤＧ−１２に対するワクチン接種を行うために用いられる。
【０１１５】
【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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結論
本研究において、ＰＣＲに基づく方法によって、セリンプロテアーゼを同定した。ノーザンブロットによって、その遺伝子の最も大きな転写物は約２．４ｋｂであり、その転写物は卵巣腫瘍において高レベルで発現されているが、調べた他の全ての組織では最少レベルでのみ認められることが分かった。新規な細胞表面マルチドメインセリンプロテアーゼをコードする完全長ｃＤＮＡをクローン化し、ＴＡＤＧ−１２と命名した。その４５４アミノ酸タンパク質は、細胞質領域、２型膜貫通領域、ＬＤＬＲ−Ａ領域、ＳＲＣＲ領域およびセリンプロテアーゼ領域を包含する。半定量的ＰＣＲ分析を用いて、ＴＡＤＧ−１２が多くの試験した腫瘍において過剰発現していることが分かった。免疫組織化学染色によって、場合によってそのタンパク質が腫瘍細胞の細胞表面に局在することを確認し、このことはＴＡＤＧ−１２がいくつかの細胞外タンパク質分解機能を有することを示唆する。興味深いことに、ＴＡＤＧ−１２は調べた腫瘍の３５％において存在する変異スプライシング形態も有する。その変異ｍＲＮＡは、腫瘍細胞表面上に独特なペプチド配列をもたらす切断タンパク質を生じさせる。
【０１１６】
そのタンパク質は、そのマルチドメイン分子に対して独特な特性を与え得る２つの細胞外領域を包含する。プロテアーゼに関連したＬＤＬＲ−Ａ機能の正確な役割は不確かであるが、その領域がカルシウムおよび他の正電荷を持つリガンドに結合する能力を有することは確かである［２１，２２］。このことは、プロテアーゼの調節またはそれに続くその分子の内在化において重要な役割を果たすであろう。ＳＲＣＲ領域は、当初はマクロファージスカベンジャー受容体内において同定され、かつリポタンパク質に結合することが機能的に説明された。ＳＲＣＲ領域はリポタンパク質に結合し得るのみならず、様々なポリヌクレオチド分子にも結合することができる［２３］。より最近の研究において、免疫系の成熟に関連する細胞接着分子に対するプロテアーゼと異なる機能を有するタンパク質において、その領域ファミリーのメンバーが同定された。さらには、ＴＭＰＲＳＳ２と同様にＴＡＤＧ−１２は、そのＳＲＣＲ領域内に、６つの保存システイン領域の内４つしか持たない。その違いによって、独特なリガンド結合特性を与えるそれら領域の異なる構造特性がもたらされる。現時点では、ＣＤ６をコードするＳＲＣＲのみがよく証明されている。ＣＤ６の場合、ＳＲＣＲ領域は細胞接着分子ＡＬＣＡＭに結合する［２３］。その細胞接着の仲介は、新規に同定されたＳＲＣＲ領域に基づく新規な研究のための有用な出発点であるが、その領域の複数の機能の可能性を見過ごすことはできない。ＳＲＣＲ領域が細胞接着型の相互作用をし得ることは確かであるが、他の型のリガンドに結合する能力も考慮すべきである。
【０１１７】
現時点では、ＴＡＤＧ−１２の正確な役割は不確かなままである。プロテアーゼ領域に対する基質は同定されておらず、また細胞外ＬＤＬＲ−ＡおよびＳＥＣＲ領域のリガンドも同定されていない。図８は、本発明において開示された情報と共に、ＴＡＤＧ−１２の作用モデルを表す。ＴＡＤＧ−１２または切断ＴＡＤＧ−１２Ｖタンパク質の何れかの産生をもたらす２つの転写物が産生される。それらタンパク質の何れかが細胞表面に潜在的に標的化される。ＴＡＤＧ−１２は活性化セリンプロテアーゼになることができるが、ＴＡＤＧ−１２Ｖは細胞表面にある場合には腫瘍特異的エピトープを表わすことができる切断タンパク質産物となる。
【０１１８】
今日における卵巣癌の治療における問題は、依然として初期ステージでの疾患の診断ができないことである。腫瘍細胞増殖に必須であるプロテアーゼのような疾患過程において初期に発現される遺伝子を同定すること［２６］は、治療を改善するための重要なステップである。その知識によって、より早期ステージにおいてそのような癌を診断するために、例えばこの中に記載のＴＡＤＧ−１２プロテアーゼまたは以前記載されたプロテアーゼ等の高発現遺伝子を検出する方法を設計することが可能であろう。また、マーカーのパネルは、予測情報を提供し、さらに個々の患者のための治療計画をもたらすことができる。あるいは、プロテアーゼ等の酵素の阻害は卵巣癌の進行を遅くしかつ患者の生活の質を改善するための効果的な手段と成り得る。ＴＡＤＧ−１２およびＴＡＤＧ−１２Ｖの他の特性も将来の研究に重要であると考えなければならない。細胞外リガンド結合領域は薬剤送達システムのための天然のターゲットである。ＴＡＤＧ−１２Ｖタンパク質に関連する異常なペプチドは、優れたターゲット薬剤の送達または免疫刺激をもたらすことができる。
【０１１９】
以下の引例がこの中で挙げられている
【表１１】
0004558948.tif 000012
【表１２】
0004558948.tif 000013
本明細書に記載の任意の特許または公報は本発明が属する分野の当業者のレベルを示唆する。各公報が参照によって組み込まれることを特異的にかつ個別に指示している場合と同範囲で、それら特許および公報は参照によってこの中に組み込まれる。
【０１２０】
当業者は、本発明をうまく応用して、その目的を達成しかつ記載のおよび本来の結果ならびに利点を得ることを容易に理解するであろう。この中において方法、手段、処置、分子および特定化合物と共に記載した本実施例は、現在での好ましい実施形態の代表であり、例示であり、本発明の範囲に対する限定として見なされない。当業者はそれらに対する変化および他の用途を考えつき、それらは本請求の範囲によって特定された本発明の精神に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】  図１Ａは、重複セリンプロテアーゼプライマーを用いた約１８０ｂｐの予測されたＰＣＲ産物および約３００ｂｐの予測外のＰＣＲ産物が、正常卵巣ｃＤＮＡからは増幅されない（レーン1）が、卵巣腫瘍ｃＤＮＡから異常に増幅される（レーン２）ことを示す
【図１Ｂ】  図１Ｂは、ＴＡＤＧ−１２が１８０ｂｐバンドからサブクローン化され、一方、大きな３００ｂｐバンドがＴＡＤＧ−１２Ｖを指定することを示す
【図２】  図２は、ＴＡＤＧ−１２のノーザンブロット分析において、２．４、１．６および０．７ｋｂの３つの転写物が顕示されたことを示す
【図３】  図３は、ＴＡＤＧ−１２を詳細に調べたＲＮＡドットブロット（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を示す
【図４】  図４は、オープンリーディングフレームの予測４５４アミノ酸（配列番号２）と共に、ＴＡＤＧ−１２のｃＤＮＡ配列（配列番号１）を示す
【図５Ａ】  図５Ａは、セリンプロテアーゼＴＭＰＲＳＳ２（Ｕ７５３２９、配列番号１４）からの他のＬＤＬＲ−Ａモチーフ、補体サブユニットＣ８（Ｐ０７３５８、配列番号９）、糖タンパク質ＧＰ３００の２つのＬＤＬＲ−Ａ領域（Ｐ９８１６４、配列番号１１および１２）およびセリンプロテアーゼのマトリプターゼ(matriptase)（ＡＦ１１８２２４、配列番号１０）と整列させて、ＴＡＤＧ−１２の３５アミノ酸ＬＤＬＲ−Ａ領域（配列番号１３）を示す
【図５Ｂ】  図５Ｂは、ヒトマクロファージスカベンジャー受容体（Ｐ２１７５７、配列番号１６）、ヒトエンテロキナーゼ（Ｐ９８０７３、配列番号１９）、ウシエンテロキナーゼ（Ｐ２１７５８、配列番号１５）およびセリンプロテアーゼＴＭＰＲＳＳ２（配列番号１８）等の他のドメインファミリーメンバーと整列させて、ＴＡＤＧ−１２のＳＲＣＲ領域（配列番号１７）を示す
【図５Ｃ】  図５Ｃは、プロテアーゼＭ（Ｕ６２８０１、配列番号２０）、トリプシノーゲンＩ（Ｐ０７４７７、配列番号２１）、血漿カリクレイン（Ｐ０３９５２、配列番号２２）、ヘプシン（Ｐ０５９８１、配列番号２５）およびＴＭＰＲＳＳ２（配列番号２４）等の他のヒトセリンプロテアーゼと整列させて、ＴＡＤＧ−１２のプロテアーゼ領域（配列番号２３）を示す
【図６】  図６は、ＴＡＤＧ−１２（上段パネル）およびＴＡＤＧ−１２Ｖ（下段パネル）について実施した半定量的ＰＣＲ分析を示す
【図７】  図７は、ＴＡＤＧ−１２特異的ペプチドに対して作成されたポリクロナールウサギ抗体を用いて実施した正常卵巣および卵巣腫瘍の免疫組織化学染色を示す
【図８】  図８は、細胞内でのＴＡＤＧ−１２の経過を示す
【配列表】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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