(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管新生を調節するか、または血管新生疾患に関連する病状の予防および／または治療に有効である化合物の同定方法におけるＮＥＴポリペプチドの全てもしくは部分、またはＮＥＴポリペプチドの全てもしくは部分を発現する細胞の使用であって、
ＮＥＴポリペプチドが、
配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質および
配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質に対応するヒト以外の哺乳類由来のＮＥＴポリペプチド
からなる群より選択され、そして
ＮＥＴポリペプチドの部分が、Ａボックス（ヒト）＝配列番号２のａａ１−９０、Ｂボックス（ヒト）＝配列番号２のａａ１３３−１５１、Ｃボックス（ヒト）＝配列番号２のａａ３２１−３７８、Ｄボックス（ヒト）＝配列番号２のａａ２９０−２９９、ＮＩＤドメイン（ヒト）＝配列番号２のａａ１５３−３０８；ＪＥＸドメイン（ヒト）＝配列番号２のａａ２３３−３５３；ＣＩＤドメイン（ヒト）＝配列番号２のａａ２７４−２８２；Ａボックス（マウス）＝配列番号４のａａ１−９０、Ｂボックス（マウス）＝配列番号４のａａ１３３−１５１、Ｃボックス（マウス）＝配列番号４のａａ３２３−３８０、Ｄボックス（マウス）＝配列番号４のａａ２９１−３０１、ＮＩＤドメイン（マウス）＝配列番号４のａａ１５５−１９７；ＪＥＸドメイン（マウス）＝配列番号４のａａ２２２−２５３；ＣＩＤドメイン（マウス）＝配列番号４のａａ２７５−２２０に相当するフラグメントから選択されるＮＥＴフラグメントからなる前記使用。
【請求項２】
化合物の同定方法がＮＥＴの転写活性の変調を検出することからなる請求項１に記載の使用。
【請求項３】
化合物の同定方法がＮＥＴ／ＤＮＡ相互作用の変調を検出することからなる請求項１に記載の使用。
【請求項４】
化合物の同定方法がＮＥＴリン酸化の変調を検出することからなる請求項１に記載の使用。
【請求項５】
化合物の同定方法が、他のポリペプチドエレメントと相互作用するＮＥＴポリペプチドの全てまたはフラグメントの能力を評価することからなる請求項１に記載の使用。
【請求項６】
化合物がＮＥＴのアゴニストである請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
化合物がＮＥＴのアンタゴニストである請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
血管新生疾患に関連する病状が不充分な脈管化を含みそして血管新生の増加を必要とするものであって、それらは心臓虚血または末梢虚血、傷治癒の不良、脈管再狭窄、褥瘡またはうっ血性潰瘍、胃腸潰瘍、胎盤機能不全症、無菌壊死、骨折治癒の不良、肺性高血圧および全身性高血圧、発作、血管性痴呆、アルツハイマー病、ＣＡＤＡＳＩＬ、甲状腺偽嚢胞、リンパ性浮腫等から選択されるものである請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
血管新生疾患に関連する病状が増加された脈管化を含みそして血管新生の阻害を必要とするものであって、それらはアテローム性動脈硬化症、血管腫、血管内皮腫、いぼ、発毛、瘢痕ケロイド、アレルギー性湿疹、不正子宮出血、濾胞性嚢胞、卵巣過剰刺激、子宮内膜症、呼吸窮迫、腹水、腹膜硬化（透析患者）、癒着形成（腹腔外科）、筋肉および心臓作用過剰負荷、肥満、慢性関節リウマチ、滑膜炎、骨および軟骨伸延、骨髄炎、パンヌス成長、骨増殖体形成、炎症および感染症（肝炎、肺炎、糸球体腎炎）、喘息、鼻ポリープ、種々の臓器の移植、未熟児網膜症、糖尿病性網膜症、脈絡膜および他の眼内疾患、白軟化症、甲状腺炎、甲状腺肥大、膵臓移植等から選択されるものである請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
血管新生疾患に関連する病状がカポジ肉腫、腫瘍および／またはＮＥＴが活性化されているその他の病状から選択されるものである請求項７に記載の使用。
【請求項１１】
血管新生を調節する化合物を同定する方法であって、その方法が、
ｉ）哺乳類ＮＥＴ転写因子またはその部分を含む組成物を提供すること；
ii）その組成物と候補化合物とを接触させること；並びに
iii） ＮＥＴ機能を調節する上記候補化合物の能力を評価すること
からなり、ここで哺乳類ＮＥＴ転写因子は、
配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質および
配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質に対応するヒト以外の哺乳類由来のＮＥＴポリペプチドからなる群より選択され、そして
哺乳類ＮＥＴ転写因子の部分が、Ａボックス（ヒト）＝配列番号２のａａ１−９０、Ｂボックス（ヒト）＝配列番号２のａａ１３３−１５１、Ｃボックス（ヒト）＝配列番号２のａａ３２１−３７８、Ｄボックス（ヒト）＝配列番号２のａａ２９０−２９９、ＮＩＤドメイン（ヒト）＝配列番号２のａａ１５３−３０８、ＪＥＸドメイン（ヒト）＝配列番号２のａａ２３３−３５３、ＣＩＤドメイン（ヒト）＝配列番号２のａａ２７４−２８２；Ａボックス（マウス）＝配列番号４のａａ１−９０、Ｂボックス（マウス）＝配列番号４のａａ１３３−１５１、Ｃボックス（マウス）＝配列番号４のａａ３２３−３８０、Ｄボックス（マウス）＝配列番号４のａａ２９１−３０１、ＮＩＤドメイン（マウス）＝配列番号４のａａ１５５−１９７、ＪＥＸドメイン（マウス）＝配列番号４のａａ２２２−２５３、ＣＩＤドメイン（マウス）＝配列番号４のａａ２７５−２２０に相当するフラグメントから選択されるＮＥＴフラグメントからなることを特徴とする前記方法。
【請求項１２】
評価工程がＮＥＴの転写活性の変調を検出することからなる請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
Ｎｅｔの転写活性の変調が、転写因子のＮＥＴ転写活性化ドメインおよびＤＮＡ結合ドメインから構成されるキメラタンパク質の制御下において発現されたレポーター遺伝子の発現レベルの変化からなる請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
転写因子の前記ＤＮＡ結合ドメインがＧＡＬ４−ＤＮＡ結合ドメインである請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
発現レベルの変化の検出が、安定にトランスフェクトされた哺乳類細胞においてなされる請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
評価工程がＮＥＴ／ＤＮＡ相互作用の変調を検出することからなる請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
ＮＥＴ／ＤＮＡ相互作用がゲルシフトアッセイによって評価される請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ＮＥＴ／ＤＮＡ相互作用が、ＮＥＴタンパク質に結合する標識されたヌクレオチドの定量化によって評価される請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
評価工程の検出が、ＮＥＴリン酸化の変調を検出することからなる請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
ＮＥＴリン酸化の変調の検出が、キナーゼ活性の結果としてのＮＥＴリン酸化を測定することからなる請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
キナーゼがｐ３８α、ｐ３８β、ＥＲＫ１、ＥＲＫ２、ＪＮＫ１、ＪＮＫ２またはＪＮＫ３である請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
評価工程が、その他のポリペプチドエレメントまたは核酸と相互作用する哺乳類ＮＥＴ転写因子またはそのフラグメントの能力を評価することからなる請求項１１に記載の方法。
【請求項２３】
核酸と相互作用する哺乳類ＮＥＴ転写因子の能力が、ＳＲＥエレメントと相互作用するＮＥＴ ＳＲＦ結合ドメインの能力からなる請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
他のポリペプチドと相互作用する哺乳類ＮＥＴ転写因子の能力が、ＣｔＢＰエレメントと相互作用するＮＥＴ ＣｔＢＰ結合ドメイン（ＣＩＤ）の能力からなる請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
組成物が細胞または細胞抽出物である請求項１１に記載の方法。
【請求項２６】
化合物がＮＥＴのアゴニストである請求項１１に記載の方法。
【請求項２７】
化合物がＮＥＴのアンタゴニストである請求項１１に記載の方法。
【請求項２８】
血管新生を調節する化合物の能力を測定する方法であって、その方法はＮＥＴ遺伝子に突然変異を含み、血管新生が増加または減少している非ヒトトランスジェニック動物に該化合物を投与し、次いでその血管新生を未処置対照動物におけるそれと比較することからなる方法。
【請求項２９】
血管新生疾患に関連する病状を予防および／または治療するために有効な化合物を同定する方法であって、その方法はＮＥＴ遺伝子に突然変異を含み、血管新生が増加または減少している非ヒトトランスジェニック動物に該化合物を投与し、血管新生を測定し、未処置対照動物における血管新生と比較することからなる方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の分野】
本発明は、NET（ERP/SAP−2）タンパク質の活性の調節、およびNETタンパク質の活性を修飾または調節する化合物に関する。さらに、本発明は、前（pro-）血管新生または抗（anti-）血管新生の新規化合物を同定するためのNETのアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法、およびこれらの化合物の治療における使用に関する。また、本発明はNET遺伝子に突然変異のあるトランスジェニック動物に関する。
【０００２】
【発明の背景】
哺乳類細胞において、TCF（三量体形成因子(Ternary Complex Factor)）転写因子は、ets1ファミリーに属する。それらは自身のEtsのDNA結合ドメイン（85アミノ酸）を介してSRFダイマー（血清応答因子）に結合する際に血清応答エレメント（SRE）に結合することができる能力を分担する。三量体形成因子には任意の方向づけの必要性はないが、SRFコンセンサス部位（CC(A/T)6GG）の隣にSREコンセンサス配列(C/A)(C/A)GGA(A/T)の存在が必要である。数個の即時型遺伝子プロモーターにおけるこれら２つの配列の近傍は、血清または増殖因子としてののマイトジェンに応答するのみならず、ホルボールエステルおよびストレス刺激にも応答して、それらの転写を誘導する。これらの配列は、Etsタンパク質およびSRFが構造的に結合しているc-fosプロモーターにおいて最初に同定された。
【０００３】
TCFファミリーの既知のメンバーは、Elk-1、SAP-1およびNet（SAP-2、ERP）である。これらのタンパク質は広範に発現されている。
TCF転写因子のこのサブファミリーは、種々の機能ドメインの存在に関係する強い配列相同性パターンによって定義される。アミノ末端から始まりカルボキシル末端まで、TCFファミリーのメンバーは、それらのポリペプチド配列中に少なくとも４つの下記の相同性ボックスを示す。
- ＡボックスはETS DNA結合ドメインとも呼ばれ、それはSREコンセンサス配列の結合に直接関与する；
- Ｂボックス（短い親水性領域）は、SRFとの相互作用に関与する；
-  Ｃボックスの上流に位置するＤボックスは、MAPK標的ドメインに存在する；
- ＣボックスおよびＣ末端配列は、MAPキナーゼ（ERK、JNKおよびp38）によるリン酸化部位（６〜７個の(S/T)Pモチーフ）を含みそして転写活性化ドメインに存在する。
TCFによる転写活性化の誘導には、この調節ドメインにおけるMAPKによるTCFのリン酸化が必要である。
【０００４】
ヒトまたはマウスのポリペプチドのアミノ酸配列に関するＡ、Ｂ、ＣおよびＤボックスの位置は、Ａ(ヒト)＝1-90、Ｂ(ヒト)＝133-151、Ｃ(ヒト)＝321-378、Ｄ(ヒト)＝290-299；Ａ(マウス)＝1-90、Ｂ(マウス)＝133-151、Ｃ(マウス)＝323-380、Ｄ(マウス)＝291-301である。
【０００５】
三量体のTCF−SRF−SRE複合体の形成は、タンパク質／DNA結合（SREに対するTCFおよびSRFに対するSRFコンセンサス配列）およびTCF B−ボックスとSRFとの間のタンパク質／タンパク質の相互作用を同時に必要とする。この複合体アセンブリーは、MAPKによるTCFリン酸化によって促進される。
【０００６】
マウスのNetは、1994年にGiovane et al. (Genes Dev., 8, 1502-1513 (1994))によってクローン化され、また、T. LibermaNET al. (ERP a new member of the ets transcription factor／oncoprotein family : cloning, characterization and differential expression during B-lymphocyte development. Mol.Cell Biol. 1994, 14 : 3292-309) (ERP)（受入番号 L19953）によって報告されている。GenBankデータベースにおいては、ヒトの配列はZ36715、マウスの配列はZ32815である。マウスnet遺伝子の染色体局在は10C-D１に、そして対応するヒトnet遺伝子は12q22-23にマッピングされた。この最後の遺伝子座は現在、ELK3と称呼される。この局在化は、sap2遺伝子に一致する。Jackson laboratoryおよびHGMWは、今や、elk3が、net/erp（マウス）およびそれのヒトに相当するsap-2（ヒト）座のための共通の座であるということを承認した（Giovane et al.「マウスおよびヒトのゲノムの３つの相同領域における、estサブファミリーのメンバーである、net、elk１およびsap1（ELK3、ELK1およびELK4）の位置」、Genomics (1995) 29 :769-72）。
【０００７】
正常の細胞内容物におけるNetは転写においてリプレッサー活性を示す。これは、MAPKリン酸化およびTCF形成の両方への競合を介して説明され得る。Netアンチセンスは、血清によって刺激された場合にSRE活性を刺激する。リン酸化部位における競合の仮説は、c-fosのSREにおけるNetタンパク質のDNA結合活性が極わずかであることによって有効とされる。また、TCF依存性転写における抑制活性は、それらのETS−ドメイン結合を含む競合機構を介したｂHLH転写因子に関して最近記載された（Yates et al. Idヘリックス−ループ−ヘリックスタンパク質は、TCF ETS−ドメイン転写因子によって核タンパク質複合体形成を阻害する。EMBO J. (1999) 18 :968-76）。
【０００８】
また、各CTFのなかで、Netにはヘリックス−ループ−へリックスタンパク質−タンパク質相互作用モチーフが含まれるaa153−208間に存在する新規な阻害ドメイン（Novel Inhibitory Domain）であるNIDをも有する特殊性がある。このNIDは、Netによる特異的なDNA結合を阻害するだけでなく、活性化されたrasのシグナリングがない場合の転写活性化もまた阻害する(Maira et al. NET(ERP／SAP2) one of the Ras inductible TCFs, has a novel inhibitory domain with resemblance to the helix-loop-helix motif. EMBO J. (1996) 15 : 5849-65)。またNetは、第二の阻害ドメインであるCIDをaa 274-282に有し、CIDはCtBPと相互作用する（Criqui-Filipe et al. NET, a negative Ras switchable TCF, contains a second inhibitory domain, the CID, that mediates repression through interactions with CtBP and de-acetylation. EMBO J. (1999) 18 :3392-3403）。
【０００９】
NetのCドメインは、種々のMAPKコンセンサスリン酸化部位（T/S-P）において、MAPKカスケードのアクチベータ−の領域からのシグナリングを統合する。このアクチベータ−の性質によって、Netの転写ポテンシャルは、その細胞下の転位によって制御される。Net配列は、Dボックスに核局在シグナル（NLS）、そしてEts DNA結合ドメインに核輸送シグナル（NES）を含む。C. Ducret 等 （the NET repressor is regulated by nuclear export in response to anisomycin, UV and heat shock. M.C.B, 19: 7076-7087）により、JNK経路がNetタンパク質の活性な核輸送を誘導するということが示された。この作用は、活性な核輸送に必要とされる、CRM1へのNESの結合を阻害するレプトマイシンBによって阻害される。この活性なNESの存在は、Net配列に特異的である。このように、JNKはNetリン酸化に関与するが、この活性化はこの細胞質のシャッフリングによる転写活性化を生じない。JNKは、JEXボックス（aa 233-253）のリン酸化によって核−細胞質のシャッフリングを誘導する。反対に、転写活性化には、p38およびERK1-2 (Ras)経路によるCボックスのリン酸化が関与する（Ducret et al. Oncogene, 印刷中）。
【００１０】
Net転写活性は、がん遺伝子のRafによって活性化されるのではなく、がん遺伝子のRas、SrcおよびMosによって活性化され得る。従ってERKはNetの転写活性化には直接関与していないということが分かった。
【００１１】
本技術分野においては、細胞内の過程におけるNETの分子機能をよりよく理解することが必要である。さらに別のNET機能および/または細胞内成分との相互作用を同定することが技術的に必要である。本発明では、下記に議論されるように、この必要に関して述べる。
【００１２】
本明細書中に記載のいずれもの参照の引用は、該参照が本出願に対する「先行技術」として利用できるものとして解釈されるべきではない。
【００１３】
【発明の要約】
前述のように、本発明はNet転写因子の新規な機能の同定に関する。全く予想外のことだが、本出願人は、NETが血管新生に関与しそして哺乳類におけるNet遺伝子突然変異が血管系に影響を与えるということを見出した。本出願人は今や、通常の条件下でNETが血管新生のリプレッサーであるということを実証した。また本出願人は、NETが特定のSer残基のリン酸化によって活性化され得ることを示し、また活性化されたNETが血管新生を促進することを発見した。活性化されたNETが介する血管新生には、VEGFの分泌が含まれる。そしてNetが活性化されている状況において、NETの低下調節がVEGF分泌を減少させ、血管新生を減少させる。さらに、Netが活性化されている状況では、NETの低下調節により腫瘍形成が阻害され、低酸素性腫瘍に至ることが示された。
【００１４】
これらの知見によって、NETは血管新生の制御における重要な中間物質であることが分かる。正常な状況でのNETの低下調節は血管新生を増加させる。一方、疾患の状態またはNETが活性化されている状態でのNETの低下調節は、血管新生の減少をもたらす。この発見により、Net活性の変調による血管新生調節での新規治療方法に対する目標達成のための手段が提供される。また、この発見により、血管新生ないし血管新生疾患を包含する疾病の新規な研究用モデル系が提供されるし、またこれら疾病の予防または治療に有用な化合物を同定するための新規なスクリーニング方法も提供される。
【００１５】
従って、本発明の第一の特徴は、血管新生を調節するか、または血管新生疾患に関連する病状の予防および／または治療に有用である化合物を同定する方法におけるNETポリペプチドの全てまたは部分の使用を提供することにある。あるいはまた、本発明は、このような方法におけるNETポリペプチドの全てまたは部分を発現する細胞の使用を提供することにある。具体的な実施態様において、NETポリペプチドは、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の対立遺伝子変異体、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質のスプライス変異体、および配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する他種のタンパク質と相同のタンパク質からなる群から選択される。他の実施態様において、本発明方法で使用されるNETポリペプチドの部分は、Ａボックス(ヒト)＝aa1-90、Ｂボックス(ヒト)＝aa133-151、Ｃボックス(ヒト)＝aa321-378、Ｄボックス(ヒト)＝aa290-299、NIDドメイン(ヒト)＝aa153-308; JEXドメイン(ヒト)＝aa233-353; CIDドメイン(ヒト)aa274-282; Ａボックス(マウス)＝aa1-90、Ｂボックス(マウス)＝aa133-151、Ｃボックス(マウス)＝aa 323-380、Ｄボックス(マウス)＝aa291-301; NIDドメイン(マウス)＝aa 155-197；JEXドメイン(マウス)＝aa222-253; CIDドメイン(マウス)＝aa275-220に対応するフラグメントから選択されるNETのフラグメントを含む。マウスのNETポリペプチド配列は配列番号４に提供されている。
【００１６】
化合物を同定する方法は、NETの転写活性の変調を検出するか、またはNET／DNA相互作用の変調もしくはNETリン酸化の変調を検出するか、または他のポリペプチドエレメントと相互作用するNETポリペプチドの全てまたはフラグメントの能力を評価することからなる。
【００１７】
好ましい実施態様において、該化合物はNETのアンタゴニストであって、該化合物は血管新生疾患に関連する病状、例えばカポジ肉腫、腫瘍および／またはNETが活性化されている他の病状の予防および／または治療のために使用できる。血管新生疾患に関連する病状にはがんおよび固形腫瘍があるが、その場合にはNETのアンタゴニストが血管新生化合物として作用し（Netが活性化されている状態において）次いで腫瘍の予防、減少または後退をもたらす。
【００１８】
他の好ましい実施態様において、該化合物はNETのモジュレーター（アゴニストまたはアンタゴニストのいずれか）であり、そして該化合物はNETが活性化されていない状態で（または、細胞が形質転換されない条件下で）血管新生疾患に関連する病状の予防および／または治療に使用することができる。このような病状は、不十分な脈管化を含みそして血管新生の増加を必要とする。また、このような病状は、増加した脈管化を含みそして血管新生の阻害を必要とする。
【００１９】
前述したように、NETは血管新生の調節にとって重要な因子である。有利なことに、本発明は、Netの活性すなわち血管新生を調節する分子のスクリーニング方法を提供する。当業界における任意のスクリーニング方法、特に高いスループットスクリーニング方法を使用することができる。従って、本発明は血管新生を調節する化合物の同定方法を提供する。その方法は (ｉ) 哺乳類のNET転写因子からなる組成物を提供すること、(ii) その組成物を候補化合物と接触させることおよび (iii) NET機能を調節する該候補化合物の能力を評価することからなる。この方法の組成物は、細胞もしくは細胞抽出物または半精製抽出物もしくは精製されたNETポリペプチドであることができる。具体的な実施態様において、評価工程はNETの転写活性の変調を検出することからなり、例えば、NETの転写活性化ドメインおよび転写因子のDNA結合ドメイン（例えば、GAL4 DNA結合ドメイン）からなるキメラタンパク質の制御下で発現されたレポーター遺伝子の発現のレベルにおける変化を検出することからなる。発現の検出は、一時的にまたは安定にトランスフェクションされた哺乳類細胞において実施することができる。別の実施態様において、評価工程は、例えばゲルシフトアッセイまたはNETタンパク質に結合する標識されたヌクレオチドの定量化を用いて、NET/DNA相互作用の変調を検出することからなる。さらに別の実施態様において、評価工程は、NETのリン酸化の変調を検出することからなる。NETのリン酸化の変調の検出は、キナーゼ活性の結果としてNETのリン酸化を測定することからなることができる。該キナーゼはp38α、p38β、ERK1、ERK2、JNK1、JNK2またはJNK3であることができる。さらに別の実施態様において、評価工程は、他のポリペプチドエレメントと相互作用するNETポリペプチドの全てまたはフラグメントの能力を評価すること、例えばSREエレメントと相互作用するNET SRF結合ドメインの能力を評価すること、またはCtBPエレメントと相互作用するNET CtBP結合ドメイン（CIDドメイン）の能力を評価すること、または両方を評価することからなる。本発明のスクリーニング方法により、Netのアゴニストまたはアンタゴニストを同定することができる。
【００２０】
また、本発明の別の特徴は、NET遺伝子の突然変異からなるトランスジェニック非ヒト動物を提供することにある。具体的な実施態様において、その突然変異とは欠失である。好ましい実施態様において、その欠失が、選択的にスプライシングされたエキソン２を欠くNET mRNAをもたらす。この突然変異は、１つの対立遺伝子または両方の対立遺伝子に影響を及ぼすことがある。具体的な実施態様において上記動物はげっ歯類であるが、マウスが好ましい。
【００２１】
本発明のトランスジェニック動物により、血管新生疾患に関連する病状を調べるためのモデル系およびこれらの疾患の予防および／または治療に有用な化合物をスクリーニングおよび／または試験するためのモデル系が提供される。また、トランスジェニック動物由来の器官（例えば網膜、大動脈など）は、このような化合物をスクリーニングおよび／または試験するのに有用である。
【００２２】
それ故に、本発明の別の特徴は、血管新生を調節することができる化合物の能力を測定する方法を提供することにある。あるいはまた、本発明は、血管新生疾患に関連する病状の予防および／または治療に有効な化合物を同定する方法を提供する。好ましい方法は、NET遺伝子に突然変異を含むトランスジェニック動物に該化合物を投与し、次いで血管新生を未処置対照動物のそれと比較することからなる。
【００２３】
別の特徴において、本発明は血管新生を調節することが可能である化合物を提供する。具体的な実施態様において、血管新生の調節は、NET転写因子との結合または相互作用または競合を介して生じる。他の具体的な実施態様において、該化合物は活性化されたNET転写因子（すなわちリン酸化されたNET）と特異的に結合するかまたは相互作用することができる。これに関しては、本発明者等により、NETの活性化はマウスの配列の329、337、359、365、398、403の位置およびヒト配列の327、335、357、363、396、401の位置において、少なくとも６個のSer/Thrリン酸化モチーフ（S/T-Pモチーフ）の１つまたはそれ以上を含むということが確定された。359および365の位置（マウス）におけるリン酸化、または357および363の位置（ヒト）におけるリン酸化は、NETの活性化に特に重要である。他の実施態様において、該化合物は、NETリン酸化の上流における任意の特異的な事象の制御を介して血管新生を調節することができる。
【００２４】
本発明化合物は、NET遺伝子の低下調節または発現阻止を行うことが可能であるアンチセンス核酸であることができる。他の実施態様において、本発明の化合物は、細胞内結合タンパク質であることができる。さらに、別の実施態様において、本発明の化合物は、NETのドミナントネガテイブ突然変異体であることができる。
【００２５】
さらに別の特徴において、本発明は、細胞内のNETのレベルおよび/またはNETの生物学的活性を調節することが可能な化合物を細胞に投与することにより、細胞におけるNET発現を調節する方法を提供する。本発明の好ましい特徴において、該細胞は、任意の血管新生疾患に関連する病状に罹患した患者の細胞であり、該方法は、血管新生を調節することが可能な化合物を患者の細胞に投与することからなる。具体的な実施態様において、NETのレベルまたはNET活性の調節は、NET転写因子との結合または相互作用または競合を介して生じる。該化合物は小分子、NET遺伝子の発現を低下調節するかまたは発現阻止することが可能なアンチセンス核酸、細胞内結合タンパク質またはNETのドミナントネガテイブ突然変異体であることができる。該化合物は小分子またはポリペプチドであることができ、それらのNETとの相互作用によりNET転写因子の核局在化が防止される。
【００２６】
別の特徴において、本発明は、血管新生疾患に関与する病状の予防または治療を目的とした医薬品を製造するための、NET活性を調節する化合物またはそのような化合物の製薬上許容され得る塩の使用を提供する。該化合物は、NETのアゴニストまたはアンタゴニストであることができる。
【００２７】
さらに別の実施態様において、本発明は、細胞中のNETタンパク質のレベルを増加させることからなる、正常な（即ち、NETが活性化されていない）状況下で組織における血管新生を減少させる方法を提供する。NETタンパク質はマウスNETであることができるが、さらに好ましくはヒトNETである。好ましい実施態様では、NETタンパク質を発現させ得る条件下でNETをコードするベクターを細胞にトランスフェクトした。
【００２８】
あるいはまた、所望の場合には、本発明は、細胞中のNETタンパク質のレベルを減少させるかまたは細胞中のNETタンパク質の活性を減少させることからなる、正常な（即ち、NETが活性化されていない）状況下で組織における血管新生を増加させる方法を提供する。NETタンパク質のレベルは、NETアンチセンス核酸を細胞に導入することによって減少させることができ、そのアンチセンス核酸は細胞内条件下でNET mRNAにハイブリダイズする。あるいはまた、NETタンパク質の活性は、NETに結合して不活性化するのに十分なレベルで、NETに特異的に結合する一本鎖Fv抗体（scFv）を細胞に導入することによって減少させることができる。
【００２９】
さらに別の実施態様において、より好ましくはNETが活性化されている状態において、本発明は、細胞中のNETタンパク質のレベルを減少させること、または細胞中のNETタンパク質の活性を減少させることからなる、組織中の血管新生を減少させる方法を提供する。NETタンパク質のレベルは、細胞中へNETアンチセンス核酸を導入することによって減少させることができ、そのアンチセンス核酸は細胞内条件下でNET mRNAにハイブリダイズする。あるいは、NETタンパク質の活性は、 NETに結合して不活性化するのに十分なレベルで、NETに特異的に結合する一本鎖Fv抗体（scFv）を細胞中に導入することによって減少させることができる。
【００３０】
これらの目的およびその他の目的は本発明によって述べられているが、それについては添付の図面並びに下記の詳細な説明および実施例でさらに詳しく説明する。
【００３１】
図面の詳細な説明
図１：特異的にトランスフェクトされたNIH3T3細胞からの慣熟培地によって誘導されたマトリゲル（Matrigel）上のHUVEC細胞による微小管形成
NIH3T3細胞に、pCEFL−GPCR（図１ａ）単独で、p601D−アンチセンス−NETを有するpCEFL−GPCR（図１ｃ）またはp601D−トランスドミナント−NETを有するpCEFL−GPCR (図１ｅ)でトランスフェクトした。HUVEC細胞とのインキュベーションの前に、慣熟培地のいくつかを(ｂ) 0.2μg／mlの抗マウスVEGFポリクローナル抗体（総ヤギIgG；R&D SYSTEMS）または（ｄおよびｆ）10ng／mlの組換えヒトVEGF-A (R&D)のいずれかを用いてインキュベートした。各プレートを２４時間後に観察した(位相差、元倍率、×40)。
【００３２】
図２：慣熟培地におけるHUVEC細胞の増殖
NIH3T3細胞に、GPCR用のコントロールベクター（pCEFL）、即ち、アンチセンス−Netのためのコントロールベクター（p601D）を有するGPCR用ベクター、GPCRおよびアンチセンス−NetのためのベクターまたはGPCRおよびトランスドミナント(TD)−Netのためのベクターをトランスフェクトした。
【００３３】
図３：内因性Netのリン酸化
NIH3T3細胞に、GPCRのためのコントロールベクター(pCEFL) (第１列)またはGPCRのためのベクター（第２列）を上記のようにしてトランスフェクトした。１４時間後、 細胞を洗い、2.5時間増殖培地に置いた。次いで細胞をSB 203580 (10μM)（Alexis Corp.）またはU0126 (10μM) (Promega)で30分間処理した。６時間後、抽出物をSDS−PAGE、およびホスホセリン365 Netに対する抗体（antibody 2F3, Ducret et al.（Oncogene，出版中）または活性化型ERKに対する抗体（Promega）でのウエスタンブロッテイングにより解析した。
【００３４】
図４：GPCRによるVEGFプロモーターの活性化にはNetが必要
NIH3T3細胞に、GPCRのコントロールベクター（pCEFL）＋アンチセンス−Netのコントロールベクター(p601D)、pCEFL＋アンチ(Anti)Net、GPCR＋p601D、GPCR＋アンチNet、およびレポーター（即ちmdm2−Luc、ｐ21−Luc、VEGF−LucおよびpCMV−LacZ）を上記のようにトランスフェクトした。細胞を収集し、溶解し次いでルシフェラーゼアッセイを標準方法で実施した。
【００３５】
図５：トランスフェクトされたNIH3T3細胞からの慣熟培地におけるVEGFペプチドレベル
等量のNIH3T3細胞に、前述のようにしてpCEFL（GPCRのベクター）、GPCR＋p601D (アンチNetのベクター)、GPCR＋アンチNet、■Ras (Ras V12の不活化コ
ントロール)、Ras−V12＋p601D、Ras−V12＋アンチNET、p601D、アンチNETおよびピュ−ロマイシン発現ベクター(pSG5 Puro)をトランスフェクトした。２nMのピュ−ロマイシンを洗浄後添加した。48時間後、慣熟培地を回収し、細胞をトリプシン処理し、１mlの培地に再懸濁し、生細胞をトリパンブルー染色後にカウントした。VEGFペプチドレベルを、ELISA（Mouse−VEGF Quantikine kit, R&D）によって測定し、その結果を細胞数について補正した。
【００３６】
図６： GPCR形質転換されたクローンからの慣熟培地におけるVEGFペプチドレベル
NIH3T3細胞をpCEFLまたはGPCRで形質転換し、ネオマイシン（SIGMA）によって選択した。個々のクローンを選び、成長させ次いで上記のようにVEGFペプチドレベルを解析した。
【００３７】
図７：コントロール（p601D）およびアンチNetベクターをトランスフェクトしたプールまたは単離したGPCR形質転換されたクローンからの慣熟培地におけるVEGFペプチドレベル
GPCRで形質転換されたいくつかのクローンを、ピュ−ロマイシン発現ベクターと共にp601DまたはアンチNetで形質転換するかまたはトランスフェクトし、次いで２nMのピュ−ロマイシンで処理して安定に形質転換されたGPCR−コントロールクローン、GPCR−アンチNetクローンおよびp601DまたはアンチNetでトランスフェクトされたGPCRクローンのプールを得た。VEGFペプチドのレベルをELISA（マウス−VEGF Quantikineキット、R&D）によって測定し、その結果を細胞数について修正した。
【００３８】
図８：GPCR−コントロールおよびGPCR−アンチNetのプールおよびクローンにおけるNetおよびElkの発現
GPCRクローンに、ピューロマイシンベクターと共にp601DまたはアンチNETをトランスフェクトし、48時間ピューロマイシンで選択した。GPCR−コントロールおよびGPCR−アンチNETクローンを、 24時間10％ウシ胎児血清（FCS）含有のダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）において増殖させた（それらは集約しなかった）。細胞を収集し、抽出物をSDS−PAGE並びにNet、Elk-1およびTBPに対する抗体でのウエスタンブロッテイングによって解析した。
【００３９】
図９：GPCR−コントロールクローンおよびGPCR−アンチNetクローンによって形成された腫瘍の容量
異なるクローン由来の約106細胞をトリプシン処理し、PBSに再懸濁し、８〜10週令の雌のBALB／c nu／nuマウス（７匹のマウス／クローン、GPCR−コントロールおよびGPCR−アンチNetの両クローンに対して２個のクローン）の左側腹部に皮下注射した。注入後６〜16日後、最小および最大の腫瘍直径を２日毎にカリパスで測定し、腫瘍の容量を式：容量＝(4/3)×π×(1/2×小さい方の直径＋1/2×大きい方の直径)2sを用いて計算した。
【００４０】
図１０：ヌードマウスのGPCRクローンおよびGPCRアンチ−Netクローンによって生じた腫瘍の様子
腫瘍を有するBALB／c nu／nuマウス（図９に対する凡例を参照）を、注入後16日目に写真に撮った。矢印は、腫瘍によって誘導された新規に形成された血管を示すものである。
【００４１】
図１１：腫瘍における血管の密度
マウスを注入後16日目に殺し、腫瘍を除去し、10μmのパラフィンセクションを作製した。腫瘍における血管を、CD31に対する抗体（Pharmingen）で検出した。
【００４２】
図１２：腫瘍における血管でカバーされた領域
各クローンからの５つの腫瘍から得られたCD31で染色したパラフィンセクションを、コンピュータ制御された顕微鏡で解析した。各セクションからランダムに選択した５つの部分を、デジタルカメラで10倍に記録し、さらに形態計測的解析をNSURFXソフトウェアを用いて実施した。
【００４３】
図１３：腫瘍における低酸素性緊張の相違
マウスを殺す４時間前に、低酸素症のマーカーであるEF5 (Radiation Oncology Imaging Service Center, University of Pennsylvania; 10mM) を腫瘍を有するマウスに注入した（１mg／マウス）。低温槽部分（10μm）をCy5に結合させた抗−EF5抗体で染色し（Radiation Oncology Imaging Service Center, University of Pennsylvania）、デジタルカメラを具備したコンピュータ制御の蛍光顕微鏡で解析した。Radiation Oncology Imaging Service Center（University of Pennsylvania）により提供されたプロトコールに従った。
【００４４】
図１４：マウスNet遺伝子座の標的化された突然変異誘発
（Ａ）野生型Net対立遺伝子、標的ベクターおよび組換え変異体のNet対立遺伝子の略図
欠失したエキソン２は翻訳開始コドンを含み、Netタンパク質のDNA結合ドメイン中に１〜69アミノ酸をコードする。サザンブロット解析に用いた３′プローブの位置、並びにXbaで消化された13Kb（野生型）および５kb（変異対立遺伝子）の各フラグメントが示されている。ＢはBamHI、ＸはXbaＩの略記である。
（Ｂ）ヘテロ接合の（＋／−）異種交配からの子孫由来のXbaＩで消化されたDNAのサザンブロット解析
３′プローブを用いたハイブリダイゼーションにより、野生型対立遺伝子(WT)の13kbのフラグメントまたは５kbの標的化された対立遺伝子(M)のフラグメントに対応するバンドが得られた。
（Ｃ） 同じ子孫のPCR解析
遺伝子型は、一番上に表示され、矢印は、野生型(WT、1550bp)および標的化された対立遺伝子(M, 1300bp)に対する特異的な増幅産物を示すものである。PCRプライマーセット(UC54、UC56、UC57)は標的化されたスキームに示されている。
【００４５】
（Ｄ）RT−PCRによるNet転写物の検出
E16野生型およびホモ接合の変異型胚から単離したRNAは、Net遺伝子の異なるエキソン(エキソン１〜エキソン４)由来のプライマーとのRT-PCR反応に使用された。RT-PCRプライマーセットは、パネルの左部分に示されている。エキソン２の欠失について予期されたように、エキソン１／エキソン２のセットまたはエキソン２／エキソン３のセットとの変異体(-/-)RNAには増幅が全く見られない。しかし、野生型胚のように、変異体におけるエキソン３およびエキソン４(ex3/ex4のセット)の間で増幅産物が観察される。エキソン１およびエキソン３ (exl/ex3のセット)の間のRT-PCR反応は、小さな方の産物（90bp）が野生型（217bp）に比較してホモ接合の変異型胚に存在するということを示している。
（Ｅ）２週令の野生型、ヘテロ接合型およびホモ接合型のマウス由来の肺タンパク質抽出物のウエスタンブロット解析
49-kDa Netタンパク質の量は、ヘテロ接合変異動物(+/-)で減少し、ホモ接合突然変異動物(-/-)中でで完全に消失する。しかし、新規な42kDaタンパク質のバンドが変異体抽出物中に出現する（へテロ接合型）。
【００４６】
図１５：Netδ/δマウスの表現型
(Ａ,Ｂ) Netδ/δマウスの生存を、野生型およびヘテロ接合型(+/δ)動物と比較した。(Ｃ) 表現型の標本図は、Netδ/δマウスによって明らかになった。この動物は、出生後６日で呼吸困難の徴候を示し、２日後に死んだ。胸腔は、乳び流出を代表する乳状の液体で満ちていることが見出された。
【００４７】
図１６：Netδ／δ胸腔の組織学的解析
ヘマトキシリン−エオシン染色された野生型マウス胸郭(Ａ)および変異型マウス胸郭(Ｂ)の断面図が示されている。棒＝0.8mm。呼吸困難の徴候はNetδ/δマウスでは８日齢で観察され、それはコントロールとしての同腹のNet+/+マウスと一緒にこの組織学的調査のために殺された。胸膜腔は、はっきりと変異体中で拡張し、乳び流出（星印）によって満たされている。この流出の蓄積による肺および心臓の圧縮に注意されたい。写真(Ｃ)および(Ｄ)は、それぞれ(Ａ)および(Ｂ)において描かれた点線の四角い部分の拡大図である。Netδ/δマウスの胸壁(Ｄ)は、コントロール(Ｃ)に比較してリンパ管を拡張した。Ｒは肋骨; Ivはリンパ管。棒＝0.2mm
【００４８】
図１７：Netδ／δマウスにおける胸部リンパ管の拡張
Net+/+、VEGFR3+/-(A、C、E、G)およびNetδ/δ、VEGFR3+/-マウス(B、D、F、H)のリンパ管は、X-Gal染色(青)によって視覚化される。(B、DおよびF)10日齢で乳び胸症に至ったNetδ/δマウス。変異型胸壁(B)のリンパ管は、同腹のコントロール(A)と比較して拡張されている。棒＝90μm。同じ動物の心膜（CおよびD）のリンパ管および胸部皮膚（EおよびF）のリンパ管は、Netδ/δマウスで変わらない(棒＝42μm)。５日齢マウスでは、胸膜が流出し始める前に、胸部リンパ管が、同腹子コントロール(G)と比較してNetδ/δ(H)ではすでに拡張されている。Rは肋骨；icは肋間領域。(棒＝90μm)。
【００４９】
図１８：E7.5およびE8.5段階の胚におけるNetT（A、C、E、G、HおよびJ）並びにVEGF-R2（B、D、F、IおよびK）mRNA発現の全封入（whole-mount）原位置（in situ）ハイブリダイゼーション法による検出
(A, B) E7.5胚。(C, D)それらの卵黄嚢におけるE8.5胚の側面からみた写真。(E, F) E8.5胚の切開された卵黄嚢における発現。（G）切開された栄養膜の錐体の内側表面内のNet発現。E8.5段階の胚で観察された標識の腹側（H、I）および背側（J, K）の写真。略記：al、尿嚢；ch、絨毛膜；da、背部大動脈；em、胚組織; ep、栄養膜の錐体; ex、胚−外組織; ht、心臓; sv、静脈洞; ys、卵黄嚢。
【００５０】
図１９：E9.5およびE10.5におけるNet（A、CおよびE）およびVEGF−R2（B、DおよびF）の転写物の全封入mRNA検出
(A, B) E9.5胚の側面から見た写真。（C、D）E10.5胚の頭部領域における発現。（E、F）E10.5段階の胚からの主要な領域の側面からみた写真。略記：ao、大動脈; b、鰓弓; fl、前肢; fn、前頭鼻骨塊; hv、頭導管; isv、内体節管（intersomitic vessel）; md、下顎突起; mx、上顎突起; sl、硬節; uv、臍静脈。
【００５１】
図２０：E7.5、E8.5、E12.5、およびE14.5段階における原位置ハイブリダイゼーションによるNetおよびVEGF-R2発現の比較分析
凍結された連続部分は、NetおよびVEGF-R2プローブによって、写真に示したようにハイブリダイズされた。ここに示された段階の各列は、組織学を示すための明るい視野を含む（図４と同じ）。（A−C）および（D−F）は、母体の脱落膜に存在する、それぞれE7.5およびE8.5の胚の部分を示す。（G−I）および（J−L）は、それぞれE12.5およびE14.5の胚の矢状の部分を示す。略記：ad、副腎; ep、栄養膜錐体; gt、生殖細管; hd、頭部; ht、心臓; in、腸; ri、肋骨; li、肝臓; Ix、喉頭; md、下顎骨; tl、尾; ys、卵黄嚢。
【００５２】
図２１：E16.5における隣接した矢状部分におけるNetおよびVEGF-R2の発現（A−F）およびE14.5およびE16.5段階における肢軟骨分化中のNET発現（G−J）
（B）および（E）は、それぞれ頭部および胸部領域においてNet発現を示し、一方（C）および（D）はVEGF-R2パターンを示す。略記: ca、carsus; cp、脈絡叢; d, 指; im, 指間の間葉; ht，心臓; li，肝臓; lu, 肺; nc, 鼻軟骨; os, 骨化性中心; pvp, 神経周囲の血管嚢; ri、肋骨; ta, 足根; to，舌; 心室領域。
【００５３】
図２２：マウスの角膜におけるrhFGF-2によって誘発された血管新生
本技術は、本質的にはKenyo氏等（Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1996, 37 : 1625-1632）によって記述された。bFGF（90ng）およびスクラルフェート（45ng）を含むハイドロンペレットを、Netの野生型および変異型のマウスの両方の角膜に移植した。ペレット移植後３〜６日にそれらの眼を生体顕微鏡検査法によって検査した。
【００５４】
図２３：マウスの大動脈環血管新生アッセイにおける微小血管形成
本技術は、本質的にはGiovane氏等（Genes Dev. 1994, 8, 1502-13）により記述されたものである。12ウェルの組織培養等級プレートを、200μlのMatrigel（Becton-Dickinson）で覆い、30分間37℃でゲルにした。胸部大動脈を６〜８週齢のNetの野生型マウスおよび変異型マウスから摘出した。大動脈部分（１mm長） を、この層の頂上に横倒しにして置き、200μLのMatrigelで直に覆い、30分間でゲルにした。次いで、それらの輪を、内皮細胞成長に最適な増殖因子の組合わせで補填された血清非含有培地中で５日間インキュベートした（CloNETics, CA）。５日目に、新芽を顕微鏡で検査した。
【００５５】
図２４：Netポリペプチドのドメイン; 図２４ａ(ヒト)、図２４ｂ(マウス)
Ａボックス: (etsドメイン), Iwqfllqlll(NES)；Ｂボックス(SRF相互作用); NID(Net阻害ドメイン) ; JEX (リン酸化によって誘導されるJNK相互作用および輸送)；CID (CtBP相互作用ドメイン) ; Ｄボックス (NLSおよびERK1＋p38結合)；Ｃボックス(リン酸化誘導転写活性化)。
【００５６】
【発明の詳述】
NETの生物学的機能についてはほとんど知られていないため、NETの活性の生物学的標的を同定するためにトランスジェニックマウスにおけるNETの欠失の影響を確認する研究がなされた。本発明は、部分的には、このようなトランスジェニックマウスの発現系での観察に基づくものである。
【００５７】
従って、本発明は、小分子または天然産物のスクリーニングにおいて使用するための、NETタンパク質をコードするヒトcDNA、相同体、スプライシング変異体(variant)、一点変異体(single point mutant)もしくは欠失変異体、並びにこれらの配列によりコードされるタンパク質の使用に関する。実施例に記載の２−ハイブリッド系の使用、NETリン酸化の評価、活性が記載されたNETの修飾が、本発明の方法において使用できる。
【００５８】
また、NETは、血管新生を調節する目的で、遺伝子治療法に使用できる（コード化分子およびアンチセンス分子の両方を使用することができる）。NETの過剰発現または低下調節をベースとしたこれらの遺伝子治療に関する病状については後で述べるとおりである。
【００５９】
血管新生疾患に関連する病状には、がんおよび固形腫瘍が含まれる。該疾患ではNETのアンタゴニストが抗血管新生化合物として作用し（Netが活性化されている状況において）、腫瘍成長の予防、減少または後退に至る。本発明の方法または化合物が単独で、または治療方法の一部分として使用され得る疾患の例としては線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、骨膜腫、中皮腫、ユーイング腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸肉腫、膵臓がん、胸部がん、子宮がん、前立腺がん、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺がん、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原生癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管がん、絨毛癌、セミノーマ、胚がん、ウィルムス腫瘍、頚部がん、精巣がん、肺がん、小細胞肺がん、膀胱がん、上皮がん、神経膠腫、神経膠星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞種および網膜芽細胞種を挙げることができる。
【００６０】
別の好ましい実施態様において、該化合物はNETのモジュレーター（アゴニストまたはアンタゴニストのいずれか）であって、その化合物はNETが活性化されていない状態（細胞が形質転換していない状態）において血管新生疾患に関連する病状の予防および／または治療に使用することができる。
【００６１】
このような病状は不十分な血管新生を含み、血管新生の増加を必要とする。これらの病状には心臓または末梢の虚血、創傷治癒の不良、脈管再狭窄、うっ血性潰瘍の褥瘡、胃腸管潰瘍、胎盤機能不全症、無菌壊死、骨折の治癒の不良、肺性高血圧および全身性高血圧（血管pruning）、発作、血管性痴呆、アルツハイマー病、CADASIL、甲状腺偽嚢胞、リンパ性浮腫などが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００６２】
また、このような病状は増加された脈管化を含み、血管新生の阻害を必要とする。これらの病状にはアテローム性動脈硬化、血管腫、血管内皮腫、いぼ、毛髪成長、瘢痕ケロイド、アレルギー性浮腫、機能不全症不正子宮出血、小胞シスト、卵巣刺激過多、子宮内膜症、呼吸窮迫、腹水、腹膜硬化（透析患者）、接着形成（腹部手術）、筋肉および心臓負担過重、肥満、慢性関節リウマチ、滑膜炎、骨および軟骨破壊、骨髄炎、パンヌス成長、骨棘形成、炎症および感染症（肝炎、肺炎、糸球体腎炎）、喘息、鼻ポリープ、種々の臓器（肝臓、腎臓、…上皮）の移植、未熟児網膜症、糖尿病性網膜症、脈絡膜および他の眼内疾患、白軟化症、甲状腺炎、甲状腺肥大、膵臓移植などが含まれるが、これらに限定されるものでない。
【００６３】
本発明のこれらおよびその他の特徴、特に、NETタンパク質の発現、抗NET抗体の生成、NETの変調のスクリーニングアッセイ、NETのアンタゴニストまたはアゴニストを同定するためのスクリーニングアッセイ、および特に遺伝子治療適用のための、NETをコードするベクターの送達については、次のセクションで詳細に論ずる。セクションの見出しは、単に読み手の利便性のために準備されたものであり、いずれの点においても限定されるものとして考えるべきではない。
【００６４】
定義
本発明は、任意の動物、特に哺乳類または鳥類、さらに好ましくはヒトから供給されるNETポリペプチドをコードする遺伝子、例えば、NETの全長または天然に存在する形態、および該遺伝子の任意のフラグメントの使用を意図する。本明細書中で用いられる用語「遺伝子」は、ポリペプチドをコードするヌクレオチドの集合であって、cDNAおよびゲノムDNA核酸を包含する。ここで使用する「NET」は、NETポリペプチドを意味し、「net」はNETポリペプチドをコードする遺伝子を示す。また、NETタンパク質は、ELK-3、Sap-2およびERPとして知られている。ヒトnet遺伝子の核酸配列は、配列番号１に記載されており、対応するポリペプチドは配列番号２に与えられている。マウスnet遺伝子の核酸配列は配列番号３に提供されており、それに対応するポリペプチドは配列番号4に与えられている。
【００６５】
本発明に従って、当業者の技術範囲内において従来の分子生物学、微生物学および組換えDNA技術を用いることができる。このような技術は文献に完全に説明されている。例えば、Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (ここでは“Sambrook et aL, 1989”); DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and H (D.N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization [B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)]; Transcription And Translation [B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984)]; Animal Cell Culture [R.I. Freshney, ed. (1986)]; Immobilized Cells And Enzymes [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); F.M. Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994) を参照されたい。
それ故に、本明細書中に用いられる場合には、次の用語は下記に明示された定義を有する。
【００６６】
「クローニングベクター」は、レプリコン、例えばプラスミド、ファージまたはコスミドであって、それには別のDNAセグメントが結合してその結合されたセグメントの複製をもたらすことができる。「レプリコン」とは、生体内でDNA複製の自律性単位として機能する、即ち、それ自身の制御下で複製が可能である、任意の遺伝子エレメント（例えば、プラスミド、染色体、ウイルス）である。クローニングベクターは、一方の細胞の型で複製することができ、他方の型で発現することができる(「シャトルベクター」)。
【００６７】
「カセット」とは、特定の認識部位でベクター中に挿入され得るDNAのセグメントを意味する。DNAのセグメントは、所定のポリペプチドをコードし、そのカセット部位および制限部位は、転写および翻訳のための適切なリーディングフレーム中にカセットが確実に挿入されるように設計されている。
このようなDNAが細胞内部に導入された場合には、細胞は、外因性または異種DNAによって「トランスフェクトされ（transfected）」たのである。トランスフェクトされたDNAが表現型の変化に影響を与える場合には、細胞は、外因性または異種のDNAによって「形質転換され（transformed）」たのである。形質転換したDNAは、細胞のゲノムを構成する染色体DNAに結合（共有結合）することができる。
【００６８】
「核酸分子」とは、リボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジン；「RNA分子」）またはデオキシリボヌクレオシド(デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジンまたはデオキシシチジン；「DNA分子」) のリン酸エステルポリマー形態を意味するか、または一本鎖形態または二重らせんへリックスのいずれかにおけるそれらの任意のホスホエステル類縁体、例えば、ホスホロチオエートおよびチオエステルを意味する。二重らせんDNA−DNA、DNA−RNAおよびRNA−RNAヘリックスが可能である。核酸分子、特にDNA分子またはRNA分子という用語は、該分子の一次構造および二次構造にのみ関するものであり、それを任意の特定の三次構造に限定しない。このように、この用語には、特に線状または環状のDNA分子（例えば、制限フラグメント）、プラスミドおよび染色体に見出される二重らせんDNAが含まれる。特定の二重らせんDNA分子の構造を論ずる際に、配列は、転写されないDNA鎖（即ち、mRNAに相同な配列を有する鎖）の５′〜３′方向に沿った配列のみを与える通例によって本明細書中では記載され得る。「組換えDNA分子」は、分子生物学的操作を受けたDNA分子である。
【００６９】
核酸分子の一本鎖形態を適当な温度および溶液イオン強度の条件下で他の核酸分子にアニールすることができる場合には、核酸分子は、他の核酸分子（例えばcDNA、ゲノムDNAまたはRNA）へ「ハイブリダイズ可能（hybridizable）」である（Sambrook et al、同上参照）。温度およびイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。相同核酸を予めスクリーニングするために、低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションの条件、55℃のTmに対応して、例えば、５×SSC、0.1％ SDS、0.25％ ミルク、およびホルムアミドなし；または30％ホルムアミド、５×SSC、0.5％ SDSを使用することができる。中程度のストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、より高いTm、例えば、５×または６×SCCを有する40％ホルムアミドに対応する。高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、最も高いTm、例えば、50％ホルムアミド、５×または６×SCCに対応する。ハイブリダイゼーションには、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーにより塩基間のミスマッチが可能であるが、２つの核酸が相補的な配列を含むことが必要である。核酸のハイブリダイゼーションに好適なストリンジェンシーは、核酸の長さおよび技術的に周知である相補性の程度、可変性に左右される。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が大きくなればなるほど、これらの配列を有する核酸のハイブリッドに対するTm値が増大する。核酸のハイブリダイゼーションの（より高いTm値に対応する）相対的な安定性は以下の順序：RNA：RNA、DNA：RNA、DNA：DNAで減少する。長さ100ヌクレオチドよりも大きいハイブリッドに対して、Tmを計算する方程式が導き出された（Sambrook et al.、同上、9.50-0.51参照）。より短い核酸、即ち、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションのために、ミスマッチの部位がさらに重要になり、そしてオリゴヌクレオチドの長さがそれの特異性を決める（Sambrook et al.、同上、11.7-11.8を参照せよ）。好ましくは、ハイブリダイズ可能な核酸の最小の長さは、少なくとも約10ヌクレオチドであり、好ましくは少なくとも約15ヌクレオチドであり、さらに好ましくはその長さが少なくとも約20ヌクレオチドである。
【００７０】
具体的な実施態様において、「標準的ハイブリダイゼーション条件」という用語は、55℃のTmを意味し、上記のような条件で使用する。好ましい実施態様においてTmは60℃であり、より好ましい実施態様ではTmは65℃である。
【００７１】
本明細書中で使用する「オリゴヌクレオチド」という用語は、NETをコードするゲノムDNA分子、cDNA分子またはmRNA分子にハイブリダイズ可能な、一般的には少なくとも18ヌクレオチドの核酸を意味する。オリゴヌクレオチドは、例えば、32Ｐ-ヌクレオチドまたは標識例えばビオチンが共有結合されたヌクレオチドによって標識されることができる（同上、標識されたNETポリペプチドに関する議論参照）。１つの実施態様において、標識されたオリゴヌクレオチドは、NETをコードする核酸の存在を検出するためのプローブとして用いることができる。別の実施態様において、オリゴヌクレオチド（標識され得る一方または両方）は、NETの全長またはフラグメントのいずれかのクローニングか、またはNETをコードする核酸の存在を検出するためのPCRプライマーとして使用することができる。さらに別の実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドはNET DNA分子とトリプルへリックスを形成することができる。一般的に、オリゴヌクレオチドは、合成によって、好ましくは核酸合成機で製造される。従って、オリゴヌクレオチドは、非天然に生じるホスホエステルアナログ結合、例えばチオエステル結合などを用いて製造することができる。
【００７２】
DNAの「コード配列」は、適切な調節配列の制御下に置かれた場合に、生体内または生体外の細胞中でポリペプチドに転写および翻訳される二重らせんDNA配列である。コード配列の境界は、５′(アミノ)末端にある開始コドンおよび３′(ボックス)カルボキシル末端にある翻訳停止コドンによって決定される。コード配列は、真核性配列、原核性mRNA由来のcDNA、真核性（例えば哺乳類）DNA由来のゲノムDNA配列、およびさらに合成DNA配列を含むが、これらに限定されるものでない。コード配列が真核細胞における発現を目的とする場合には、通常、ポリアデニル化シグナルおよび転写末端配列はコード配列の３′に位置する。
【００７３】
「NETアンチセンス」とは、NETmRNA分子の少なくとも一部分に相補的であるRNA分子またはDNAの分子である。このようなアンチセンスポリヌクレオチドは、細胞中のNetポリペプチドmRNAの転写および／または翻訳を阻害するために使用することができ、それによって細胞中のNetポリペプチドの量の減少に影響を与える。Netアンチセンスに対するコード配列はベクターに導入されることができ、さらに細胞中で発現されることができる。従って、NetアンチセンスはssDNAまたはssRNA、メチルホスホネート骨格核酸、ホスホロチオエート骨格核酸、ポリアミド核酸および技術的に知られた同様のアンチセンス構造である。
【００７４】
「転写調節配列および翻訳調節配列」とは、DNA調節配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーターおよびそれらの同等物であり、宿主細胞においてコード配列の発現を提供する。真核細胞ではポリアデニル化シグナルが、調節配列である。
【００７５】
「プロモーター配列」は、細胞中でRNAポリメラーゼに結合し、次いでコード配列の下流（３′方向）の転写を開始することが可能なDNA調節領域である。本発明を明確にするために述べれば、プロモーター配列は、転写開始部位のそれの３′末端に結合し、上記のバックグラウンドで検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最低数の塩基またはエレメントを含むために上流（５′方向）に伸長する。プロモーター配列内には転写開始部位（例えば、ヌクレア−ゼS1でマッピングされることにより好都合に定義される）並びにRNAポリメラーゼの結合の原因となるタンパク質結合ドメイン(コンセンサス配列)が見出される。
【００７６】
コード配列は細胞中の転写調節配列および翻訳調節配列の「制御下」にあり、その時にRNAポリメラーゼがコード配列をmRNAに転写し、次いで（コード配列がイントロンを含む場合には）トランス−RNAがスプライシングを受け、コード配列によってコードされたタンパク質に翻訳される。
【００７７】
本明細書中で使用する全ての文法形態およびスペリングの語尾変化で表される「相同の（homologous）」という用語は、「共通の進化起源（common evolutionary origin）」を有する諸タンパク質間の類縁関係を意味し、例えばスーパーファミリー（例えば、イムノグロブリンスーパーファミリー）由来の蛋白質および異なる種類由来の相同タンパク質（例えば、ミオシン軽鎖など）の間の類縁関係を意味する（Reeck et al., 1987, Cell 50:667）。このようなタンパク質（およびそれらのコード遺伝子）は、高度のそれらの配列類似性によって表される配列相同性を有する。
【００７８】
従って、全ての文法形態で表される「配列類似性（sequesnce similarity）」という用語は、共通の進化的起源を有するかまたは有しないタンパク質の核酸またはアミノ酸の配列間の同一性または一致の程度を意味する（Reeck et al., 同上参照）。しかし、普通の慣用および本出願では、「相同の」という用語は、例えば「高度に」のような副詞によって修飾された場合には、配列類似性を意味するものであって、共通の進化的起源を意味するものではない。
【００７９】
具体的な実施態様において、２つのDNA配列は、それらのヌクレオチドの少なくとも約50％（好ましくは少なくとも約75％および最も好ましくは少なくとも約90％または95％）がDNA配列の決められた一定の長さに一致する場合には「実質的に相同」または「実質的に類似」する。実質的に相同である配列は、配列データバンクの配列において、または例えば特定の系に定義されたようなストリンジェントな条件下のサザンハイブリダイゼーション実験において入手し得る標準的なソフトウェアを用いてそれらの配列を比較することによって同定することができる。適切なハイブリダイゼーション条件を定義することは、当業者の技術の範囲内である。例えば、Maniatis et al., 同上; DNA Cloning, Vol.I & II, 同上; Nucleic Acid Hybridization、同上を参照されたい。
【００８０】
同様に、特定の実施態様において、２つのアミノ酸配列は、アミノ酸の30％以上が同一であるかまたは約60％以上が類似である（機能的に同一な）場合には、「実質的に相同」または「実質的に類似」である。好ましくは、類似または相同の配列は、例えば、GCG（Genetics Computer Group、Program Manual for the GCG Package, Version 7, Madison, Wisconsin）のパイルアッププログラムを用いる整列によって同定される。
【００８１】
「に対応する」（corresponding to）という用語は、類似性または相同性が、測定される分子と正確な位置が同一であるかまたは異なっているにせよ、類似または相同の配列に言及するのに本明細書において使用される。核酸またはアミノ酸の配列の整列には、スペースが含まれることがある。このように、「に対応する」という用語は、配列類似性に関するものであり、アミノ酸残基またはヌクレオチド塩基の数に関するものではない。
【００８２】
また、本発明は、任意の供給源、特にヒトcDNAまたはゲノムライブラリーからゲノムDNAまたはcDNAが単離され得るかどうかについて、NETをコードする哺乳類遺伝子の使用を意図するものである。net遺伝子を得る方法は、上記のように、技術的によく知られている（例えば、Sambrook et al., 1989, 上記参照）。
【００８３】
従って、任意の動物細胞はnet遺伝子の分子クローニングの核酸の供給源として役に立つ可能性がある。該DNAは、クローン化されたDNA（例えば、DNA「ライブラリー」）から技術的に知られた標準方法によって得ることができ、さらに好ましくは高レベル発現のタンパク質の組織（例えば、内皮細胞、繊維芽細胞、軟骨細胞、胸腺、脾臓、軟骨）から調製されたcDNAライブラリーから、化学合成によって、cDNAクローニングによって、または所望の細胞から精製されたゲノムDNAまたはそれのフラグメントのクローニングによって得られる（例えば、Sambrook et al, 1989, supra; Glover, D.M. (ed.), 1985, DNA Cloning: A Practical Approach, MRL Press, Ltd., Oxford, U.K. Vol. Ｉ, II参照）。ゲノムDNAから誘導されたクローンは、コード配列の外に調節領域およびイントロンDNA領域を含むことができ、cDNAから誘導されたクローンはイントロン配列を含まない。供給源が何であろうとも、遺伝子はその増殖のために好適なベクターに分子的にクローン化されるべきである。
【００８４】
また本発明では、NETとして同一または相同な機能活性を有する、NETの対立遺伝子の変異体、スプライシング変異体、類縁体および誘導体並びに他種由来のそれらの相同物をコードする遺伝子（即ち、cDNA）の使用も考えられる。NETに関連する誘導体および類縁体の産生および使用は、本発明の範囲内にある。具体的な実施態様において、その誘導体または類縁体は機能的に活性であって、即ち、全長の野生型NETに関連した１つ以上の機能的な活性を示すことができる。
【００８５】
NET誘導体は、機能的に同等な分子を提供する置換、付加または欠失によって、コードする核酸配列を変更させることによって作製され得る。未変性のNETに関する機能活性を増加または上昇させた誘導体を作製するのが好ましい。
【００８６】
スクレオチドコード配列の縮退のために、NET遺伝子と実質的に同じアミノ酸配列、例えば単一のアミノ酸変異体を含むアミノ酸配列をコードするその他のDNA配列を本発明の実施に使用することができる。これらには、NET遺伝子の配列内に同一のアミノ酸をコードする種々のコドンの置換によって変わり、従ってサイレントな変化をする対立遺伝子、他種由来の相同遺伝子およびNET遺伝子の全てまたは部分を含むヌクレオチド配列があるが、それらに限定されるものではない。同様に、本発明に用いられるNET誘導体には、機能的に等価なアミノ酸残基がその配列内の残基の代わりに置換されて保存的アミノ酸置換をもたらす改変された配列を含むNETタンパク質のアミノ酸配列の全てまたは部分を一次アミノ酸配列として含むものがあるが、これらに限定されるものでない。例えば、配列内に存在する１個以上のアミノ酸は同様な極性の他のアミノ酸によって置換されることができ、機能的等価物として作用し、サイレントな改変を生じる。配列内のアミノ酸の置換分は、そのアミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択されてもよい。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸にはアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが含まれる。芳香環構造を含むアミノ酸にはフェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンが含まれる。極性の中性アミノ酸にはグリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが含まれる。正に荷電した(塩基性)アミノ酸にはアルギニン、リシンおよびヒスチジンが含まれる。負に荷電した（酸性）アミノ酸にはアスパラギン酸およびグルタミン酸がある。このような改変は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または等電点によって測定される見掛け上の分子量に影響を及ぼすとは思われない。
【００８７】
特に好ましい置換は、
- 正電荷が維持され得るようにArgの代わりにLysおよびその逆；
- 負電荷が維持され得るるようにAspの代わりにGluおよびその逆；
- 遊離の-OHが維持され得るようにThrの代わりにSer；および
- 遊離の-CONH2が維持され得るようにAsnの代わりにGlnである。
【００８８】
アミノ酸置換がさらに、特に好ましい性質を有するアミノ酸を置換させるために導入されることもある。例えば、Cysは、他のCysとのジスルフィド橋のための可能な部位として導入されることができる。Hisは、特に「触媒」部位として導入され得る（即ち、Hisは酸または塩基として作用することができ、生化学的触媒作用において最も普通のアミノ酸である）。Proは、特にその平坦な構造のために導入され得ることがあり、該タンパク質の構造中にβ−ターンを誘導する。
【００８９】
本発明に使用されるNET誘導体および類縁体をコードする遺伝子は、技術的に知られた多様な方法によって製造できる。それらを製造する操作は、遺伝子またはタンパク質レベルで行うことができる。例えば、クローン化されたnet遺伝子配列は、技術的に知られた任意の膨大なストラテジーによって改変されることができる（Sambrook et al、1989、同上）。該配列は、制限エンドヌクレア−ゼで適当な部位において除去され、次いでさらに酵素的な修飾を施され、所望ならば、生体外で単離され、そしてライゲーションされる。NETの誘導体または類縁体をコードする遺伝子の製造において、NET遺伝子として同じ翻訳のリーディングフルーム内に改変された遺伝子を、翻訳停止シグナルによって中断されずに所望の活性がコードされる遺伝子領域に確実に残存させるよう注意がなされなければならない。
【００９０】
さらに、NETをコードする核酸配列は、生体外または生体内で突然変異されて、翻訳配列、開始配列および／または末端配列を創出し、および／または破壊することができるか、またはコード領域において変異を作製し、および／またはスプライシングを調節し、および／または新規な制限エンドヌクレアーゼ部位を形成することができるか、または、さらに生体外改変を促進するために前から存在するものを破壊することができる。１つの実施態様においてかつ本発明のトランスジェニック動物の調製のために、このような突然変異が、NetT機能を不活性化し、翻訳配列および／または開始配列を優先的に破壊または改変する。別の実施態様においてかつ遺伝子治療の目的にために、このような突然変異は、変異されたNet遺伝子産物の機能的な活性を増強することができる。技術的に知られた突然変異のための任意の技術を使用することができる。例えば、生体外での部位特異的突然変異誘発（Hutchinson, C., et aｌ, 1978, J. Biol. Chem. 253:6551; Zoller and Smith, 1984, DNA 3:479-488; Oliphant et aL, 1986, Gene 44:177; HutchinsoNET aｌ, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83:710）、TAB(R)リンカー（Pharmacia）等を使用できるが、これらに限定されるものでない。PCR技術は、部位特異的突然変異誘発にとって好ましい（Higuchi, 1989、“Using PCR to Engineer DNA", in PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H. Eriich, ed., Stockton Press, Chapter 6, pp. 61-70参照）。
【００９１】
同定されそして単離された遺伝子は、次に適切なクローニングベクターに挿入することができる。技術的に知られた多数のベクター−宿主系を使用することができる。可能なベクターとしてはプラスミドまたは改変されたウイルスを挙げることができるが、これに限定されない。しかし、ベクター系は、使用す宿主細胞と両立しなければならない。ベクターの例には、E. coli、バクテリオファージ、例えばλ誘導体、またはプラスミド例えばpBR322誘導体またはpUCプラスミド誘導体、例えばpGEXベクター、pmal-c、pFLAGなどがあるが、これらに限定されるものではない。
【００９２】
クローニングベクターへの挿入は、例えば、相補的突出末端を有するクローニングベクターへDNAフラグメントを結合させることによって達成することができる。しかし、DNAをフラグメントにするのに使用する相補的認識部位がクローニングベクター中に存在しない場合には、DNA分子の末端は酵素的に改変することができる。あるいは、所望される任意の部位は、DNA末端をヌクレオチド配列（リンカー）を結合させることによって生産され得る。即ち、これらの結合されたリンカーは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列をコードする特異的に化学合成されたオリゴヌクレオチドを含むことができる。組換え分子は、遺伝子配列の多くのコピーが生じるように、形質転換、トランスフェクション、感染、エレクトロポーレーション法などによって宿主細胞に導入されることができる。好ましくは、クローン化された遺伝子またはcDNAは、１つのシャトルベクタープラスミド上に含有され、クローニング細胞（例えば大腸菌）の拡張をもたらし、さらに所望されるならば、適切な発現細胞系へのその後の挿入のたに容易な精製を施す。例えば、シャトルベクターは１種以上の有機体中で複製可能なベクターである。それは酵母２μプラスミド由来の配列と大腸菌プラスミド由来の配列とを結合させることによってE. coliおよびSaccharomyces cerevisiaeの両方における複製用に調製されることができる。
【００９３】
NETポリペプチドの発現
NETをコードするヌクレオチド配列、その誘導体または類縁体、または例えばキメラタンパク質を含む機能的に活性なその誘導体は、適切な発現ベクター、即ち、挿入されたタンパク質コード配列の転写および翻訳に必須のエレメントを含有するベクターに挿入されることができる。このようなエレメントは、ここで「プロモーター」と呼ばれる。このように、NETをコードする核酸は、 発現ベクターのプロモーターと操作可能に会合する。cDNAおよびゲノム配列の両方が、このような調節配列の制御下でクローン化されそして発現され得る。また、発現ベクターは複製起点を含むのが好ましい。
【００９４】
必須の転写シグナルおよび翻訳シグナルは、組換え発現ベクター内に提供されることができるか、またはNETをコードする未変性（native）遺伝子および／またはその隣接領域によって供給されることができる。
【００９５】
潜在的な宿主ベクター系には、ウイルス感染した哺乳類細胞系（例えば、ワクシニアウイルス、 アデノウイルスなど）；ウイルス感染した昆虫細胞系（例えば、バキュロウイルス）；微生物、例えば、酵母ベクターを含む酵母；またはバクテリオファージ、DNA、またはコスミドDNAで形質転換されたバクテリアが含まれるが、これらに限定されるものではない。ベクターの発現エレメントは、それの強さおよび特異性が変化する。使用する宿主ベクター系に左右されるが、多数の適当な転写エレメントおよび翻訳エレメントのうちの任意の１つを使用することができる。
【００９６】
組換えNETタンパク質またはそれらの機能フラグメント、誘導体、キメラ構築物または類縁体は、組換えによるコード配列の増幅後、染色体に組み込んで発現されることができる。この点に関して、多数の増幅系のうち任意のものが、高レベルの安定した遺伝子発現を達成するのに使用できる（Sambrook et al., 1989,前記、参照）。
【００９７】
NETをコードする核酸からなる組換えベクターが導入された細胞は、その細胞によるNETの発現をもたらす条件下で適当な細胞培養培地中において培養される。
【００９８】
クローニングベクターにDNAフラグメントを挿入するための前述の任意の方法は、適当な転写／翻訳制御シグナルおよびタンパク質コード配列からなる遺伝子を含有する発現ベクターを構築するのに使用することができる。これらの方法には、生体外組換えDNA技術および合成技術並びに生体内組換え（遺伝的組換え）が含まれる。
【００９９】
NETタンパク質の発現は、技術的に知られた任意のプロモーター／エンハンサーエレメントによって制御され得るが、これらの調節エレメントは、発現のために選択された宿主において機能性でなければならない。NET遺伝子発現を制御するのに使用できるプロモーターには、SV40初期プロモーター領域（Benoist and Chambon，1981, Nature 290:304-310）、ラウス肉腫ウイルスの３′末端の長い繰り返し配列に含まれるプロモーター（Yamamoto, et al., 1980, Cell 22:787-797）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Brinster et al., 1982, Nature 296:39-42）; 例えばβ−ラクタマーゼプロモーターのような真核生物用発現ベクター（Villa-Kamaroff, et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731）、またはtacプロモーター（DeBoer, et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25）;“Useful proteins from recombinant bacteria”in Scientific American, 1980, 242:74-94もまた参照されたい; 酵母または他の菌類由来のプロモーターエレメント、例えばGal 4プロモーター、ADC（アルコール脱水素酵素）プロモーター、PGK（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター;および組織特異的に発現し、トランスジェニック動物に利用されている、動物の転写制御領域:膵臓の線房細胞において活性を有するエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Swift et al., 1984, Cell 38:639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515）; 膵臓β細胞において活性を有するインスリン遺伝子制御領域（Hanahan, 1985, Nature 315:115-122, リンパ球の細胞において活性を有する免疫グロブリン遺伝子制御領域（Grosschedl et al., 1984, Cell 38:647-658; Adames et al., 1985, Nature 318:533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444）、精巣、胸、リンパ球細胞およびマスト細胞において活性であるマウス乳腺腫瘍ウイルス制御領域（Leder et al., 1986, Cell 45:485-495）、肝臓で活性を有するアルブミン遺伝子制御領域（Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1:268-276）、肝臓で活性を有するα−フェトプロテイン遺伝子制御領域（Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammer et al., 1987, Science 235:53-58）、肝臓で活性を有するα1−抗トリプシン遺伝子制御領域（Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1:161-171）、骨髄性細胞において活性を有するβ−グロブリン遺伝子制御領域（Mogram et al., 1985, Nature 315:338-340; Kollias et al., 1986, Cell 46:89-94）、脳のオリゴデンドロサイト細胞において活性を有するミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域(Readhead et al., 1987, Cell 48:703-712)、骨格筋において活性を有するミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（Sani, 1985, Nature 314:283-286）、および視床下部で活性を有するゴナトトロピン放出ホルモン遺伝子制御領域（MasoNET aL, 1986, Science 234:1372-1378）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１００】
本発明のDNA配列を発現するのに多様な宿主／発現ベクターの組合わせを使用することができる。有用な発現ベクターは、例えば、染色体のセグメント、非染色体およぶ合成DNA配列からなることができる。適当なベクターには、SV40の誘導体および知られたバクテリアのプラスミド、例えば、E. coliプラスミド col E１、pCRl、pBR322、pMal-C2、pET、pGEX（Smith et al., 1988, Gene 67:31-40）、pMB9およびそれらの誘導体、プラスミド例えばRP4、ファージDNAS、例えば、ファージ１の多数の誘導体、例えば、NM989、および他のファージDNA、例えば、M13および糸状単鎖ファージDNA；酵母プラスミド、例えば２μプラスミドまたはそれの誘導体 、真核細胞において有用なベクター、例えば昆虫細胞または哺乳類細胞において有用なベクター、プラスミドおよびファージDNAの組合わせから誘導されたベクター、例えばファージDNAまたは他の発現制御配列を用いて改変したプラスミド、およびそれらの同等物が含まれる。
【０１０１】
例えば、バキュロウイルス発現系において、非融合型トランスファーベクター［例えば、pVL941（BamHIクローニング部位；Summers）、pVL1393（BamH1、SmaＩ、XbaＩ、EcoRＩ、NotＩ、XmaIII、BglII、およびPstＩクローニング部位；Invitrogen）、pVL1392（BglII、PstＩ、NotＩ、XmaIII、EcoRＩ、XbaＩ、SmaＩ、およびBamHＩクローニング部位；Summers and Invitrogen）、およびpBlueBacIII（BamHＩ、BglII、PstＩ、NcoＩおよびHindIIIクローニング部位、およびブルー／ホワイト組換えスクリーニング可能である；Invitrogen）などであるがこれに限定されない］および融合型トランスファーベクター［例えばpAc700（BamHIおよびKpnIクローニング部位、ここでBamHI認識部位は開始コドンで始まる；Summers）、pAc701およびpAc702 (pAc700と同じだが、異なるリーデイングフレームを有する)、pAc360 (ポリヘドリン開始コドンの36塩基対下流にあるBamHIクローニング部位；Invitrogen(195))、およびpBlueBacHisＡ、Ｂ、Ｃ（３つの異なるリーデイングフレーム、およびBamHＩ、BglII、PstＩ、NcoＩ、およびHindIIIクローニング部位、ProBond精製のためのＮ末端ペプチド、およびプラークのブルー／ホワイト組換えスクリーニング；Invitrogen (220)）などであるが、これらに限定されない］の両方を使用することができる。
【０１０２】
本発明での使用のために考えられる哺乳類用発現ベクターには、誘導プロモーター、例えばジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）プロモーターを有するベクターが含まれる。例えば、DHFR発現ベクターまたはDHFR／メタロプロテナーゼ共増幅ベクターを有するいずれかの発現ベクター、例えばpED（PstＩ、SalＩ、SbaＩ、SmaＩ、およびEcoRＩクローニング部位、クローン化された遺伝子およびDHFRの両方を発現するベクター；Kaufman, Current Protocols in Molecular Biology, 16.12（1991）を参照されたい）がある。あるいは、グルタミン合成酵素／メチオニンスルホキシミン共増幅ベクター、例えばpEE14（HindIII、XbaＩ、SmaＩ、SbaＩ、EcoRＩ、およびBclＩクローニング部位、ここで該ベクターはグルタミン合成酵素およびクローン化された遺伝子を発現する；Celltech）がある。別の実施態様において、エプステインバールウイルス（EBV）の制御下エピソームの発現を導くベクターを使用することができる。例えば、pREP4（BamH1、SfiＩ、XhoＩ、NotＩ、NheＩ、HindIII、NheＩ、PvuIIおよびKpnＩクローニング部位、 構成性ラウス肉腫ウイルスの長い末端繰り返し（Rous Sarcoma Virus Long terminal Repeat）(RSV−LTR)プロモーター、ハイグロマイシン選択可能なマーカー、Invitrogen）、pCEP4（BamHＩ、SfiＩ、XhoＩ、NotＩ、NheＩ、HindIII、NheＩ、PvuII、およびKpnＩクローニング部位、構成性ヒトサイトメガロウイルス（hCMV）即時型遺伝子、ハイグロマイシン選択可能なマーカー、Invitrogen）、pMEP4（KpnＩ、PvuＩ、NheＩ、HindIII、NotＩ、XhoＩ、SfiＩ BamHＩクローニング部位、誘導可能なメタロチオネインIIａ遺伝子プロモーター、ハイグロマイシン選択可能なマーカー：Invitrogen）、pREP8（BamHＩ、XhoＩ、NotＩ、HindIII、NheＩ、およびKpnＩクローニング部位、RSV−LTRプロモーター、ヒスチジノール選択可能なマーカー；Invitrogen）、pREP9（KpnＩ、NheＩ、HindIII、NotＩ、XhoＩ、SfiＩ、およびBamHＩクローニング部位、RSV−LTRプロモーター、G418選択可能なマーカー; Invitrogen）、およびpEBVHis（RSV−LTRプロモーター、ハイグロマイシン選択可能なマーカー、ProBond樹脂を介してＮ末端ペプチド精製可能であり、エンテロキナーゼによって分解される；Invitrogen）がある。本発明において使用するための選択可能な哺乳類発現ベクターには、pRc／CMV (HindIII、BstXＩ、NotＩ、SbaＩ、およびApaＩクローニング部位、G418選択；Invitrogen)、pRc／RSV (HindIII、SpeＩ、BstXＩ、NotＩ、XbaＩクローニング部位、G418選択；Invitrogen)などが含まれる。本発明による使用のためのワクシニアウイルス哺乳類発現ベクター（Kaufman，1991，同上参照）には、pSC11（SmaIクローニング部位、TK−およびβ−gal選択）、pMJ601（SalＩ、SmaＩ、AflＩ、NarＩ、BspMII、BamHＩ、ApaＩ、NheＩ、SacII、KpnＩ、およびHindIIIクローニング部位；TK−およびβ−gal選択）、およびpTKgptF1S（EcoRＩ、PstＩ、SalＩ、AccＩ、HindII、SbaＩ、BamHＩ、およびHpaクローニング部位、TKまたはXPRT選択）を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【０１０３】
また、酵母発現システムは、NETを発現するために本発明に従って使用することができる。例えば、二つのみ挙げれば、非融合型pYES2ベクター（XbaＩ、SphＩ、ShoＩ、NotＩ、GstXI、EcoRＩ、BstXI、BamHＩ、SacＩ、KpnＩおよびHindIIIクローニング部位、Invitrogen）または融合型pYESHisＡ、Ｂ、Ｃ（XbaＩ、SphＩ、ShoＩ、NotＩ、BstXI、EcoRＩ、BamHＩ、SacＩ、KpnＩ、およびHindIIIクローニング部位、ProBond樹脂で精製され、エンテロキナーゼで除去されたＮ−末端ペプチド；Invitrogen）があるが、それらを本発明に従って使用することができる。
【０１０４】
一旦、特定の組換えDNA分子が同定され、単離されれば、技術的に知られたいくつかの方法を使用して、それを増殖させることができる。一旦好ましい宿主系および増殖条件が確立されれば、組換え発現ベクターを量的に増殖させ、調製することができる。予め説明したように、使用できる発現ベクターには、いくつかの例を挙げれば、下記のベクターまたはそれらの誘導体、即ちヒトまたは動物のウイルス、例えば、ワクシニアウイルスまたはアデノウイルス、昆虫ウイルス、例えばバキュロウイルス、酵母ベクター、バクテリオファージベクター（例えば、λ）、並びにプラスミドおよびコスミドDNAベクターを挙げることができるが、それらに限定されるものではなである。
【０１０５】
さらに、挿入された配列の発現を調節するか、または所望の特別な方法で遺伝子産物を改変しかつ処理する宿主細胞系を選択してもよい。種々の宿主細胞はタンパク質の翻訳および翻訳後処理並びに修飾のために特徴的かつ特異的な機構を有する。適切な細胞系または宿主系は、発現される外来タンパク質の所望の修飾および処理を確実にするよう選択することができる。酵母での発現は生物学的に活性な産物を産生することができる。真核細胞での発現は未変性のフォールデイングの可能性を増大させることができる。さらに、哺乳類細胞での発現は、NET活性の再構築、または構築のためのツールを提供することが可能である。さらに、種々のベクター／宿主発現系は、処理反応（例えばタンパク質分解開裂反応）の後に種々の程度で影響を及ぼすことがある。
【０１０６】
ベクターは技術的に知られた方法、例えばトランスフェクション法、エレクトロポーレーション法、マイクロインジェクション法、トランスダクション法、細胞融合法、DAEAデキストラン法、リン酸カルシウム沈殿法、リポフェクション法（リソソーム融合法）、遺伝子銃の使用またはDNAベクタートランスポーターで所望の宿主細胞に導入される（例えば、Wu et al., 1992, J.Biol. Chem. 267:963-967; Wu and Wu, 1988, J. Biol. Chem. 263:14621-14624; Hartmut et al., カナダ特許出願第2,012,311号、1990年３月15日出願を参照されたい）。
【０１０７】
タンパク質の可溶化形態は、例えば界面活性剤で処理することによって、さらに所望の場合には音波処理かまたは上記のような他の機械的手法で培養液を回収するかまたは封入体を可溶化することにより得ることができる。可溶化されたか、または可溶なタンパク質は、多様な方法、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）、等電点フォーカスィング、２次元ゲル電気泳動、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニテイー、イムノアフィニテイー、およびサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、異なる溶解性、免疫沈降法、またはタンパク質の精製のための任意の他の標準技術を使用して単離することができる。
【０１０８】
NETに対する抗体
本発明によれば、組換えまたは化学合成によって製造されるNETポリペプチドもしくはそのフラグメントまたはその他の誘導体もしくは類縁体、例えば融合タンパク質は、NETポリペプチドを認識する抗体を産生するための抗原またはイムノゲンとして使用され得る。例えば、分子が免疫グロブリン（抗体）またはＴ細胞抗原受容体のような免疫系の抗原認識分子と特異的に相互作用可能である場合、その分子は「抗原性」である。抗原性ポリペプチドには少なくとも約５個の、好ましくは少なくとも約10個のアミノ酸が含まれる。分子の抗原部分は、抗体またはＴ細胞受容体認識に対するイムノ優性である抗原部分であることができるか、または免疫性を付与するために担体分子に抗原部分をコンジュゲートすることによって分子に抗体を産生させるのに使用する部分であることができる。抗原性を有する分子はそれ自体免疫性である必要はない。即ち、該分子は担体なしで免疫応答を生ずることが可能である。
【０１０９】
このような抗体としてはポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単鎖、FabフラグメントおよびFab発現ライブラリーを挙げることができるが、それらに限定されるものではない。本発明の抗NET抗体は交差反応性であることができる。即ち、それらは異なる種からのNETを認識することが可能である。ポリクローナル抗体は交差反応性の可能性が非常に高い。あるいはまた、本発明の抗体はNETの単一の形態（例えばマウスのNET）に特異的であることができる。このような抗体はヒトNETに特異的であるのが好ましい。
【０１１０】
技術的に知られた多様な方法は、NETポリペプチドまたはその誘導体もしくは類縁体に対するポリクローナル抗体の製造のために使用することができる。抗体製造用に、NETポリペプチドまたはその誘導体（例えばフラグメントまたは融合タンパク質）の注入によって種々の宿主動物を免疫化することができる。その動物にはウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。一つの実施態様において、NETポリペプチドまたはそのフラグメントは、免疫抗原性担体、例えばウシ血清アルブミン（BSA）またはキーホールリンペットヘモシアニン（KLH）にコンジュゲートすることができる。多様なアジュバントは宿主の種によるが、免疫応答性を増加させるのに使用することができる。そのアジュバントとしては、（完全な、または不完全な）フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、リソレシチンのような表面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、および潜在的に有用なヒトアジュバント、例えばBCG（カルメット−ゲラン菌）およびコリネバクテリウム・パルブムを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【０１１１】
NETポリペプチドまたはそのフラグメント、類縁体もしくは誘導体に対するモノクローナル抗体の調製のために、培養中継代細胞系によって抗体分子の産生を提供する任意の技術を使用することができる。これらにはKohlerおよびMilstein［Nature 256:495-497 (1975)］によって最初に開発されたハイブリドーマ法、並びにトリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術［Kozbor et al., Immunology Today 4:72 1983; Cote et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:2026-2030 (1983)］、およびヒトモノクローナル抗体を作製するためのEBV-ハイブリドーマ技術［Cole et al., in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96 (1985)］が含まれるが、これらに限定されるものではない。本発明のさらに別の実施態様において、モノクローナル抗体は無菌動物において産生されることができる［1989年12月28日発行の国際特許公開 WO 89/12690］。事実、本発明によれば、適当な生物学的活性を有するヒト抗体分子由来の遺伝子と一緒にNETポリペプチドに対して特異的なマウス抗体分子由来の遺伝子をスプライシングすることによって、「キメラ抗体」を製造するために開発された技術［MorrisoNET al., J. Bacteriol. 159:870 (1984); Neuberger et al., Nature 312:604-608 (1984)；Takeda et al., Nature 314:452-454 (1985)］を使用することができる。このような抗体は本発明の範囲内にある。このようなヒトまたはヒト化キメラ抗体はヒトの疾患または疾病（後述）の治療に使用するのが好ましい。その理由は、ヒト抗体またはヒト化抗体それ自体は、異種間抗体よりも免疫応答、特にアレルギー反応を誘導する可能性が遥かに少ないからである。
【０１１２】
本発明によると、一本鎖Fv（scFv）抗体の製造について記載の技術［Hustonの米国特許第5,476,786号および第5,132,405号; 米国特許第4,946,778号］を適合させて、NETポリペプチドに特異的な一本鎖抗体を製造することができる。本発明の別の実施態様では、Fab発現ライブラリーの構築について記載の技術［Huse et al., Science 246：1275-1281 (1989)］を使用すると、NETポリペプチドまたはその誘導体もしくは類縁体に所望の特異性を有するモノクローナルなFabフラグメントを迅速かつ容易に同定することができる。
【０１１３】
抗体分子のイディオタイプを含む抗体フラグメントは、知られた技術によって製造することができる。例えば、このようなフラグメントには抗体分子をペプシン消化することによって製造され得るF(ab')2フラグメント、F(ab')2フラグメントのジスルフィド橋を還元することによって製造され得るFab'フラグメント並びにパパインおよび還元試薬で抗体分子を処理することによって製造され得るFabフラグメントがあるが、それらの限定されるものではない。
【０１１４】
抗体の製造において、所望抗体のスクリーニングは、技術的に知られた方法、例えばラジオイムノアッセイ、ELISA (酵素結合型イムノソルベントアッセイ)、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫放射定量測定法、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散法、in situ イムノアッセイ（例えばコロイド状の金、酵素またはラジオアイソトープ標識を用いる）、ウエスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ（例えばゲル凝集アッセイ、血球凝集アッセイ）、補体結合アッセイ、免疫蛍光検査法、プロテインＡアッセイおよび免疫電気泳動アッセイなどで遂行することができる。一つの実施態様において、抗体結合は一次抗体上の標識を検出することによって検出される。別の実施態様において、一次抗体はその一次抗体に対する二次抗体または試薬の結合を検出することによって検出される。別の実施態様において二次抗体は標識される。イムノアッセイにおける結合を検出するための多くの方法が技術的に知られており、それらは本発明の範囲内に含まれる。例えば、NETポリペプチドの特異的なエピトープを認識する抗体を選択するために、このようなエピトープを含有するNETポリペプチドフラグメントに結合する生成物のための生成されたハイブリドーマを検定することができる。特定の種類の動物由来のNETポリペプチドに特異的な抗体を選択するために、その種類の動物由来の細胞によって発現されたか、または単離されたNETポリペプチドとの正の結合をベースとして選択することができる。
【０１１５】
前述の抗体は、上記または技術的に知られた検出技術のいずれかを用いて、NETポリペプチドの局在化および活性に関連する技術的に知られた方法、例えば、ウエスタンブロッテイング、原位置（in situ） NETポリペプチドイメージング、適切な生理学的試料中のそれらのレベル測定等の方法において使用することができる。
【０１１６】
具体的な実施態様として、NETポリペプチドの活性をアゴナイズまたはアンタゴナイズする抗体を産生させることができる。このような抗体は、リガンドを同定するための下記の各アッセイを用いて試験することができる。特に、このような抗体は細胞内に発現されたscFv抗体であることができる。
【０１１７】
スクリーニングアッセイ
血管新生におけるNetの役割の同定によって、新規な抗-または前−血管新生化合物の設計およびスクリーニングが可能になる。従って、NETポリペプチドの構造をベースとしたアゴニストまたはアンタゴニストの合理的な設計に加えて、本発明では技術的に知られた種々のスクリーニングアッセイを用いたNETの特異的リガンドを同定するための別法が意図される。
【０１１８】
技術的に知られた任意のスクリーニング方法を使用して、NETのアゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニングするか、あるいはNET/DNA結合のアンタゴニストをスクリーニングすることができる。
【０１１９】
本発明は、小分子のリガンドまたはリガンド類縁体および擬態物に対するスクリーニング並びに生体内でNETに結合しそしてNETの活性をアゴナイズまたはアンタゴナイズする天然のリガンドに対するスクリーニングを意図する。例えば、天然産物ライブラリーは、NET活性をアゴナイズまたはアンタゴナイズする分子について本発明のアッセイを用いてスクリーニングすることができる。
【０１２０】
NET活性をアゴナイズするか、またはアンタゴナイズする分子または化合物、および／またはNET／DNA相互作用を調節する分子または化合物により、Netによって制御される遺伝子の発現の調節解除（deregulation）および/または血管新生の調節解除に関与する病状を含む疾病の予防および/または治療のための新規な方法（venue）が提供され得る。
【０１２１】
この点に関して、本発明はまた、NET活性をアゴナイズまたはアンタゴナイズする分子または化合物、および／またはNET/DNA相互作用を調節する分子または化合物の治療上有効な量を投与することからなる、NET活性を阻害または活性化させる必要を有するか、またはNet転写因子の制御下で遺伝子発現を調節する必要を有する患者の治療方法を提供する。本発明は、医薬品製造用のこのような分子または化合物の使用を提供する。
【０１２２】
アンタゴニストの同定またはスクリーニングは、例えばＸ線結晶解析、中性子解析、核磁気共鳴スペクトロメトリーおよび構造決定のためのその他の技術を用いてタンパク質の構造特性を決定することによってさらに促進される。これらの技術は、アゴニストおよびアンタゴニストの合理的な設計または同定のための方法を提供するものである。
【０１２３】
別の方法では、大きなライブラリーを作製するために組換えバクテリオファージを用いる。「ファージを用いた方法（pharge method）」［Scott and Smith, 1990, Science 249:386-390 (1990); Cwirla, et al, Proc. Natl. Acad. Sci., 87:6378-6382 (1990); DevilNET al, Science, 249:404-406 (1990)］を用いて、非常に大型（106−108化学物質）のライブラリーを構築することができる。二番目の方法では、主として化学的方法が使用されるが、それにはGeysen法[GeyseNET al, Molecular Immunology 23:709-715 (1986); GeyseNET al. J. Immunologic Method 102:259-274 (1987)]およびFodor等による方法［Science 251:767-773 (1991)］がその例として挙げられる。Furka et al. [14th International Congress of Biochemistry. Volume 5, Abstract FR:013 (1988); Furka, Int. J. Peptide Protein Res. 37:487-493 (1991)]、Houghton [1986年12月発行の米国特許第4,631,211号] およびRutter et al. [1991年４月23日発行の米国特許第5,010,175号] には、アゴニストまたはアンタゴニストとして試験され得るペプチドの混合物を製造するための方法が記載されている。
【０１２４】
別の特徴において、合成ライブラリー［Needels et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10700-4(1993)；Ohlmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10922-10926 (1993); Lam et al., 国際特許公開 WO 92/00252; Kocis et al., 国際特許公開 WO 9428028, それらのそれぞれは完全に参照により本発明に組み込まれる］およびそれらの同等物を本発明に従ってNETリガンドをスクリーニングするのに使用することができる。
【０１２５】
スクリーニングは、NETを発現する組換え細胞を用いてか、あるいはまた、例えば前記のように組換えで製造された精製タンパク質を用いて実施することができる。例えば、NETのDNA結合部分かまたはNETのタンパク質結合部分を含む標識された可溶性NETの能力を用いて、前述の文献に記載のようにライブラリーをスクリーニングすることができる。
【０１２６】
一つの実施態様において、NETは直接的に標識されることができる。別の実施態様において、標識された二次試薬を使用して所定の分子（例えば、固相支持体に結合する分子）へのNETの結合を検出することができる。結合は、酵素標識によるin situ 発色団形成によって検出することが可能である。適当な酵素には、アルカリホスファターゼおよびホースラデイッシュペルオキシダーゼが含まれるが、これらに限定されるものではない。別の実施態様において、異なる所定のアクセプター分子上に２つの酵素標識を有する２つの発色性基質を用いて２色アッセイを使用することができる。交差反応性および単反応性のリガンドは２色アッセイで同定できる。
【０１２７】
本発明で使用するその他の標識には、着色されたラテックスビーズ、磁気性ビーズ、蛍光標識（いくつかのフルオロホアを挙げれば、例えば蛍光イソチオシアネート（FITC）、フィコエリスリン（PE）、テキサスレッド（TR）、ローダミン、遊離またはキレート化させたランタニド族の塩、特にEu3+がある）、化学蛍光分子、ラジオアイソトープまたは磁気共鳴イメージングラベルがある。２色アッセイは、２以上の着色されたラテックスビーズ、または種々の波長で発光するフルオロホアを用いて実施することができる。標識されたものは視覚的に、または機械的／光学的手段によって検出することができる。機械的または光学的手段には、蛍光活性化される選別手段、即ち、FACSの類似品、およびマイクロマニュピュレーター除去手段が含まれる。
【０１２８】
ここで実証されるように、NETタンパク質のレベルは、タンパク質の代謝性標識によって評価することができる。[35Ｓ]−メチオニンで補填された培養培地の存在下での組織バイオプシーの生体外インキュベーション中に代謝性標識が生じる場合には、検出されたマーカーのそれぞれのレベルが生体外条件によって影響され得る。[35Ｓ]-メチオニンによる代謝性の（または生合成の）標識の外に、本発明はさらに、[14C]-アミノ酸および[3Ｈ]−アミノ酸（不安定ではない位置に置換されるトリチウムを用いる）での標識を意図するものである。このように各化合物のサンプルまたはライブラリーは、その中のタンパク質を、例えば銀、金、クマジーブルーまたはアミド−シュワルツを用いた比色分析の染色、いくつかの技術を挙げれば、例えば[32Ｐ]−正リン酸塩、［125Ｉ］、［131Ｉ］によるアイソトープ標識、蛍光または化学発光法によるタグ、並びに、標識された抗体または特異的に結合するマーカーのパートナーを用いた免疫学的検出によって標識後、直接的に標識することができる。
【０１２９】
また、NET cDNAおよび誘導体を酵母スクリーニングにおいて２−ハイブリッド系で使用すると、NET、NET／DNA結合のアゴニストまたはアンタゴニストに対するリガンドを同定することができ、そしてリン酸化可能であるか、またはNetリン酸化を阻害するタンパク質を同定することができる。
【０１３０】
Net転写因子活性のモジュレータ−
いくつかの化合物は、本出願人によってNet転写因子のモジュレータ−として同定された。それらは例えば、p38シグナル経路の阻害剤であるSB203580：４−[５−（４−フルオロフェニル）−４−（４−（ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）フェニルメチルフルオキシド、またはERKシグナル経路の阻害剤であるPD98059：２−（２−アミノ−３−メトキシフェニル）−４Ｈ−クロメン−４−オンおよびU0126：１,４−ジアミノ−２,３−ジシアノ−１,４ビス［２−アミノフェニルチオ］ブタジエンである。
【０１３１】
医薬組成物
本発明の任意の化合物またはNETアンチセンスは、生体内で製薬上許容され得るビヒクルまたは担体中に導入されるのが好ましい。「製薬上許容され得る」という表現は、ヒトに投与した際に生理的に許容され得るものであって、かつアレルギーまたは類似の望ましくない反応、例えば胃部不快感、眩暈などを典型的には起さない分子および組成物について適用される。好ましくは、本明細書中で使用されるように、「製薬上許容され得る」という用語は、連邦政府または州政府の監督官庁によって認可されたか、または、動物およびさらに好ましくはヒト用に合衆国薬局方または他の一般的に認可された薬局方に列挙されたものを意味する。「担体」という用語は、化合物が一緒に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクルを意味する。このような製薬上の担体は滅菌用液体、例えば水および油状物であって、例えば石油、動物油、植物油、合成油、例えば落花生油、大豆油、ミネラルオイル、ごま油などであることができる。水または生理的食塩水並びに水性デキストロースおよびグリセロール溶液は、特に注入可能な溶液用の担体として使用するのが好ましい。好ましい製薬担体は、E.W. Martinによる“Remington's Pharmaceutical Sciences"に記載されている。
【０１３２】
トランスジェニック動物
「動物」という用語は、本明細書においてはヒト以外の全ての脊椎動物を含む意味で使用される。それはまた、胚の段階および胎児の段階を含む発育中の全ての段階における個々の動物を含む。「トランスジェニック動物」とは、例えばマイクロインジェクションまたは組換えウイルスを用いた感染によるような細胞より小さいレベルでの慎重な遺伝的操作によって、直接的または間接的に受け取られた遺伝子情報を有する１つ以上の細胞を含む動物である。この誘導されたDNA分子は染色体内で結合され得るか、または染色体外で複製可能なDNAであることができる。「生殖細胞系トランスジェニック動物」という用語は、遺伝情報が生殖細胞系に導入され、それによってその情報を子孫に移すことができる能力を与えるトランスジェニック動物を意味する。事実、このような子孫がその情報のいくつかまたは全てを有する場合には、その後それらはまたトランスジェニック動物になる。
【０１３３】
該情報は、レシピエントが属する動物の種には無関係であり、特定の個々のレシピエント、またはレシピエントが既に有する遺伝情報には無関係である。この最後の場合には、導入された遺伝子は天然の内因性遺伝子に比較すると異なって発現され得る。
【０１３４】
遺伝子は、単離されたRNA鋳型由来のcDNAを直接的合成またはいくつかのそれの組合わせにより調製することによって、遺伝子供給源から該遺伝子を単離することによって獲得することができる。
【０１３５】
発現されるためには、遺伝子は調節領域に操作可能に結合されるべきである。プロモーターのような調節領域を使用すると、ある種の組織または成長段階のある種の段階まで遺伝子発現を増加、減少、調節または指定することができる。プロモーターは、天然に生じるプロモーターである必要はない。本発明の「トランスジェニック非ヒト動物」は、非ヒト動物の生殖細胞系に「導入遺伝子」を導入することによって産生される。細胞へのDNAの導入を可能にする方法は、一般的に利用可能であって、技術的によく知られている。導入遺伝子を導入する様々な方法を使用することができる。一般的に、接合体はマイクロインジェクションのための最良の標的である。マウスでは、雄の前核が直径約20μmのサイズに達すると、DNA溶液の１〜２pLの再現可能な注入が可能になる。遺伝子導入用標的としての接合子の使用には、大きな利点がある。大抵の場合、注入されたDNAは、最初の卵割の前に宿主遺伝子に導入される（Brinster, et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82,4438-4442）。この結果、トランスジェニック非ヒト動物のほとんど全ての細胞は組み込まれた導入遺伝子を有する。一般的に、これはまた、生殖細胞の50％が導入遺伝子を収容するので、初代の子孫への導入遺伝子の効率的な伝達をもたらすことになる。接合子のマイクロインジェクションは、本発明の実施において導入遺伝子を組み込むのに好ましい方法である。
【０１３６】
また、レトロウイルス感染も、非ヒト動物に導入遺伝子を導入するのに使用できる。発育中の非ヒト胚は、胚盤胞段階まで生体外で培養することができる。この間、割球はレトロウイルス感染に対する標的であることができる（Jaenich, R. (1976) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73, 1260-1264）。割球の効率的な感染は、透明帯を除去するための酵素的処置によって得られる（HogaNET al., (1986) in Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.）。導入遺伝子を導入するのに使用するウイルスベクター系は、典型的には導入遺伝子を有する複製不良なレトロウイルスである(Jahner et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 6927-6931; Van der PutteNET al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 6148-6152)。トランスフェクションはウイルス産生細胞の単層上の割球を培養することによって容易かつ効率的に達成される（Van der Putten, 前記; Stewart etal., (1987) EMBO J. 6:383-388）。あるいはまた、後の段階で感染させることもできる。ウイルスまたはウイルス産生細胞を、胞胚腔に注入することができる（Jahner et al., (1982) Nature 298:623-628）。取り込みはトランスジェニック非ヒト動物を形成した細胞の一部においてのみ生じるので、初代動物のほとんどが導入遺伝子のモザイクになる。さらに、作製された動物は、ゲノムの種々の位置に導入遺伝子のレトロウイルスの挿入を含有する。これらの挿入は一般的に子孫において分離する。さらにまた、妊娠中期胚の子宮内レトロウイルス感染によって、低い効率ではあるが、生殖細胞に導入遺伝子を導入することができる（Jahner et al., (1982) 前記）。
【０１３７】
導入遺伝子の導入の標的細胞の三番目のタイプは、胚性幹細胞（ES）である。ES細胞は、生体外で培養された移植前の胚から得られる（Evans, M.J., et al., (1981) Nature 292, 154-156; Bradley, A., et al. (1984) Nature 309. 255-258; Gossler, et al., (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 9065-9060; and RobertsoNET al., (1986) Nature 322.445-448）。導入遺伝子は、DNAトランスフェクションまたはレトロウイルスが仲介する形質導入によって効率的にES細胞に導入される。得られた形質転換されたES細胞は、その後、非ヒト動物由来の胚盤胞と合一され得る。ES細胞は胚をコロニー化し、得られたキメラ動物の生殖細胞系に寄与する（再考用としてJaenisch, R. (1988) Science 240. 1468-1474参照）。
【０１３８】
導入されたDNAおよびその発現の存在を評価する方法は容易に入手できかつ技術的によく知られている。このような方法には、外来DNAを検出するためのDNA（サザン）ハイブリダイゼーション、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）、並びにDNA、RNAおよびタンパク質を検出するためのウエスタンブロットがあるが、これらに限定されるものではない。これらの方法には、MDM２を検出するための免疫学的技術および組織化学的技術が含まれる。
【０１３９】
本明細書中で使用する「導入遺伝子」とは、例えば後記実施例に記載の手段によるようにヒト介在によって非ヒト動物の生殖細胞系列中に導入されるDNA配列である。
【０１４０】
遺伝子治療およびトランスジェニックベクター
前述のように、「ベクター」とは、宿主細胞への本発明核酸の運搬のための任意の手段である。好ましいベクターはウイルスベクターであって、例えばレトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスである。すなわち、NETをコードする遺伝子もしくはcDNA、またはそれのNETポリペプチドドメインフラグメント、またはNET ScFvまたはNETドミナント突然変異体（mutant dominant）またはNETアンチセンスは、生体内（in vivo）、生体外（ex vivo）、生体外（in vitro）でウイルスベクターを用いるか、またはDNAの直接導入を介して導入される。標的化された組織における発現は、例えばウイルスベクターもしくは受容体リガンドを用いて、または組織特異的なプロモーターを用いてまたは両方を用いて、特定の細胞に対してトランスジェニックベクターを標的化することによって遂行できる。
【０１４１】
前述で指摘したように、本発明の発現ベクターを使用すると、NET活性のモジュレータ−のスクリーニングまたは生物学的試験のために細胞にトランスフェクトするか、または遺伝子治療（例えば、NET活性のレベルを増加または減少させる目的で）のためにまたは生体外でnet遺伝子またはnetアンチセンス遺伝子を送達するために細胞にトランスフェクトすることの両方を行うことができる。また、アンチ(anti)-NET scFvを発現するベクターは、下記に論じられる技術を用いて導入することができる。
【０１４２】
生体内または生体外における標的化（targeting）および治療方法に通常使用されるベクターは、DNAを基盤としたベクターおよびレトロウイルスベクターである。ウイルスベクターの構築化および使用の方法は技術的に知られている［例えば、Miller and Rosman, BioTechniques 7:980-990 (1992)参照］。ウイルスベクターは 複製において欠損があるのが好ましい。即ち、それらは標的細胞において自律的複製ができない。一般的に、本発明の範囲内で使用する複製欠損ウイルスベクターのゲノムは、感染した細胞中のウイルスの複製に必要である少なくとも１つの領域を欠失する。これらの領域は、当業者に知られた任意の方法によって、（全体または部分的に）削除され得るかまたは非機能的にさせるかのいずれかであることができる。これらの技術には、全除去および置換（他の配列による、特に挿入された核酸による）、部分的欠失または本質的な（複製のための）領域への１つ以上の塩基付加が含まれる。このような技術は、生体外（単離されたDNA上で）実施されるか、または遺伝子操作の技術を用いるか、または突然変異誘発剤による処置によって原位置で実施され得る。複製欠損ウイルスは、ウイルス粒子をカプセル化するのに必要なそのゲノム配列を保持するのが好ましい。
【０１４３】
DNAウイルスベクターには弱毒化または欠損DNAウイルス例えば、ヘルペス単純（simplex）ウイルス（HSV）、パピローマウイルス、エプスタインバールウイルス（EBV）、アデノウイルス、 アデノ随伴ウイルス（AAV）、ワクシニアウイルス、レンチウイルス等があるが、これらに限定されるものではない。完全にまたはほとんど完全にウイルス遺伝子を欠く欠損遺伝子が好ましい。欠損ウイルスは、細胞に導入後には複製能がなく、したがって産生ウイルス感染に達しない。欠損ウイルスベクターを使用すると、ベクターが他の細胞に感染可能であることに関係なく、特定の局在化した領域中の細胞への投与が可能になる。このように、特定の組織を特異的に標的化することができる。特定のベクターの例には、欠損ヘルペスウイルス１（HSV1）ベクター［Kaplitt et al., Molec. Cell. Neurosci. 2:320-330 (1991)］、糖タンパク質L遺伝子を欠く欠損ヘルペスウイルスベクター［特許公開 RD 371005 A］、または他の欠損ヘルペスウイルスベクター［国際特許公開  WO 94/21807, 1994年9月29日公開; 国際特許公開  WO 92/05263, 1994年4月2日公開］およびStratford-Perricaudet et al.［J. Clin. Invest.90:626-630 (1992); また La Salle et al., Science 259:988-990 (1993)参照］に記載されたような弱毒化アデノウイルスベクター、および欠損アデノ随伴ウイルスベクター［Samulski et al, J. Virol. 61:3096-3101 (1987); Samulski et al, J. Virol. 63:3822-3828 (1989); Lebkowski et al., Mol. Cell. Biol. 8:3988-3996 (1988)］があるが、これらに限定されるものではない。
【０１４４】
好ましくは、生体内投与には適当な免疫抑制処置をウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター）と併せて用いると、ウイルスベクターおよびトランスフェクトされた細胞の免疫不活化が避けられる。例えば、免疫抑制サイトカイン例えばインターロイキン−12 (IL−12)、インターフェロン−γ（IFN−γ）または抗CD4抗体を、ウイルスベクターに対する体液性または細胞性免疫応答をブロックするのに投与することができる［例えば、Wilson, Nature Medicine (1995)を参照されたい］。さらに、最小数の抗原を発現させるために設計されるウイルスベクターを使用するのが有利である。
【０１４５】
本発明は、遺伝子治療適用のために治療上有効量のNETアンチセンスまたはNET ScFvまたはNETドミナント変異体を発現するベクターの送達を意図する。NETドミナント変異体の例には、Maira et al.（EMBO J. (1996) 15:5849-65）によって提供されるC12またはGAL−N6がある。本明細書中において「治療上有効な量」という表現は、少なくとも約15％、好ましくは少なくとも約50％、さらに好ましくは少なくとも90％のNET活性を減少させ、最も好ましくは臨床的に十分なNET活性の阻害またはNETによって制御される遺伝子の発現の調節解除を防ぐのに十分な量の意味で使用される。あるいはまた、治療上有効な量は、宿主において臨床的に有意の状態での改善をもたらすのに十分な量である。
【０１４６】
あるいはまた、本発明は、遺伝子治療適用のために治療上有効な量のNETを発現するベクターの送達を意図する。本明細書中の「治療上有効な量」という表現は、宿主に対する活性、機能および応答において少なくとも約15％、好ましくは少なくとも50％、さらに好ましくは少なくとも90％減少させるのに十分な量、そして最も好ましくは臨床的に有意の欠損を防ぐにの十分な量であることを意味するのに使用される。あるいはまた、治療上有効な量は、宿主において臨床的に有意な状態での改善をもたらすのに十分な量であることを意味する。
【０１４７】
ウイルス性または非ウイルス性の任意のベクターは、製薬上許容され得るビヒクルまたは担体中に生体内導入されるのが好ましい。「製薬上許容され得る」という表現は、ヒトに投与された場合に、生理学上受容されることができかつ胃部不快感、眩暈などのようなアレルギーまたは類似の望ましくない反応を典型的に生じない分子または組成物に関する。好ましくは、本明細書中で使用する「製薬上許容され得る」という用語は、動物、さらに特にはヒトでの使用において、連邦政府または州政府の監督官庁が承認済みであるか、または合衆国薬局方、または一般的に認められた薬局方に列挙されているということを意味する。「担体」という用語は、該化合物がそれと一緒に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルに関する。このような医薬担体は、滅菌済みの液体、例えば水および油状物、例えば、石油または動物油、植物油、石油、例えば、落花生油、大豆油、ミネラルオイル、ごま油等であることができる。水または水溶液、塩水溶液、および水性デキストロースおよびグリセロール溶液は、好ましくは、特に注入可能な溶液用の担体として用いられる。好ましい医薬担体は、E.W. Martin.による“Remington's Pharmaceutical Sciences”に記載がある。
【０１４８】
アデノウイルスベクター
好ましい実施態様において、ベクターはアデノウイルスベクターである。アデノウイルスは、多様なタイプの細胞に本発明の核酸を効率的に運搬するために修飾することのできる真核性DNAウイルスである。多様な抗原型アデノウイルスが存在する。これらの抗原型のうち本発明の範囲内では２型または５型のヒトアデノウイルス（Ad2またはAd5）または動物起源のアデノウイルスを用いるのが好ましい（W094/26914参照）。本発明の範囲内で使用できる動物起源のアデノウイルスには、イヌ、ウシ、マウス（例：Mav1, Beard et aｌ., Virology 75 (1990) 81）、ヒツジ、ブタ、トリ、およびサル（例: SAV）の各起源のアデノウイルスが含まれる。動物起源のアデノウイルスは好ましくはイヌアデノウイルスであり、より好ましくはCAV2アデノウイルス（例えば、ManhattanまたはA26/61種(ATCC VR-800)）である。
【０１４９】
好ましくは、本発明の複製欠損アデノウイルスベクターには、ITR、キャプシド化配列および所定の核酸が含まれる。さらにより好ましくは、アデノウイルスベクターの少なくともＥ１領域が機能していないことである。好ましくはＥ１領域の欠失は、Ad5アデノウイルスの配列における455〜3329ヌクレオチド（PvuII−BglIIフラグメント）、あるいは382〜3446（HindII−Sau3Aフラグメント）に及ぶ。また、他の領域、特にE3領域（W095/02697）、E2領域（W094/28938）、E4領域（W094/28152、W094/12649およびW095/02697）または任意の後期遺伝子L1−L5も修飾されることができる。
【０１５０】
好ましい実施態様において、アデノウイルスベクターはE1領域（Ad 1.0）に欠失を有する。E1欠失アデノウイルスの例はヨーロッパ特許第185,573号に開示されており、その内容は参照により本発明に組み込まれる。別の好ましい実施態様において、アデノウイルスベクターはE1およびE4領域（Ad 3.0）において欠失を有する。E1/E4−欠失アデノウイルスの例は、W095/02697およびW096/22378に開示されており、その内容は本明細書に参照として組み込まれる。さらに別の好ましい実施態様において、アデノウイルスベクターは、E4領域および核酸が挿入されるE1領域中に欠失を有する（フランス(Fr)特許第9413355号参照、その内容は本明細書に参照により組み込まれる）。
【０１５１】
本発明の複製欠損組換えアデノウイルスは、当業者に知られた任意の技術によって製造することができる（Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917）。特に、それらは、なかんずく、アデノウイルスおよび所定のDNA配列を担持するプラスミドとの間の相同組換えによって製造することができる。適当な細胞系へのアデノウイルスおよびプラスミドの共トランスフェクション（cotransfection）の後に相同組換えが実施される。用いる細胞系は、好ましくは(ｉ)該エレメントによって形質転換可能であり、さらに(ii)複製欠損アデノウイルスのゲノムの部分に相補可能である配列を、好ましくは、組換えの危険性を避けるために組込まれた形態で含むべきである。使用できる細胞系の例としては、ヒト真核性腎臓細胞系293（Graham et al., J.Gen.Virol.36 (1977) 59）（それはAd5アデノウイルスのゲノムの左手部分（12％）をそのゲノムに組込まれて含有する）並びにW094/26914およびW095/02697の各出願中に記載のようなE1およびE4機能を補足することができる細胞系を挙げることができる。組換えアデノウイルスは、当業者に周知である標準的な分子生物学技術を用いて回収および精製される。従って、本発明はまた欠損組換えアデノウイルスにも関する。そのゲノムはNETをコードする遺伝子またはcDNA、またはそれのNETポリペプチドドメインフラグメント、およびNET ScFvまたはNETドミナント変異体をコードする配列を含有する。
【０１５２】
アデノ随伴ウイルスベクター
アデノ随伴ウイルス（AAV）は、安定かつ部位特異的な方法でそれらが感染する細胞のゲノム中への組込みが可能である比較的小さなサイズのDNAウイルスである。それらは細胞の成長、形態または分化になんらかの影響をもたらすことなく広範な細胞に感染することができ、そしてそれらはヒトの病状に関与するようには思われない。AAVゲノムはクローン化され、配列決定されそして特性付けられた。それは約4700塩基を含み、各末端には約145塩基の逆方向末端反復配列（ITR）領域が含まれ、ウイルスの複製起点として利用される。そのゲノムの残りは、キャプシド化機能を担持する２つの必須領域に分割される。該領域は、ウイルス複製およびウイルス遺伝子発現に含まれるrep遺伝子を含むゲノムの左手部分、およびウイルスのキャプシドタンパク質をコードするcap遺伝子を含むゲノムの右手部分である。
【０１５３】
生体内および生体外で遺伝子を運搬するためのAAVから誘導されたベクターの使用についての記載がある（WO 91/18088；WO 93/09239；US 4,797,368、US 5,139,941、EP 488 528参照）。これらの出版物には、rep遺伝子および／またはcap遺伝子が欠失し、所定の遺伝子によって置換される多様なAAV誘導構築物、並びに生体外（培養細胞中に）または生体内（有機体中に直接的に）に所定の該前記遺伝子を伝達するためのこれらの構築物の使用が記載されている。本発明の複製欠損組換えAAVは、２つのAAV逆方向末端繰り返し配列（ITR）領域に隣接する所定の核酸配列を含有するプラスミド並びにAAVキャプシド化遺伝子（rep遺伝子およびcap遺伝子）を担持するプラスミドとを、ヒトヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス）で感染させる細胞系に一緒にトランスフェクトすることによって調製することができる。生産されるAAV組換え体は、次いで標準法によって精製される。
【０１５４】
従って、本発明はまた、AAV−誘導組換えウイルスに関し、そのウイルスのゲノムは、AV ITRに隣接する、NETをコードする遺伝子またはcDNA、またはそのNETポリペプチドドメインフラグメント、NET ScFvまたはNETドミナント変異体をコードする配列を含む。本発明はまた、AAV ITRに隣接する、NETをコードする遺伝子もしくはcDNA、またはそのNETポリペプチドドメインフラグメント、NET ScFvまたはNETドミナント変異体をコードする配列を含むプラスミドに関する。このようなプラスミドはそのままで、所望により、リポソームベクター（シュードウイルス）に取り込まれるプラスミドを用いて、核酸配列を運搬するのに使用することができる。
【０１５５】
レトロウイルスベクター
別の実施態様において、NETをコードするnet遺伝子もしくはcDNA、またはそれのNETポリペプチドドメインフラグメント、またはNET ScFvまたはNETドミナント変異体は、例えば、AndersoNET al, 米国特許第5,399,346号; Maim et al., 1983, Cell 33:153; TemiNET al, 米国特許第4,650,764号; TemiNET al., 米国特許第4,980,289号; Markowitz et al., 1988, J. Virol. 62:1120; TemiNET al., 米国特許第5,124,263; ヨーロッパ特許第453242号, ヨーロッパ特許第178220号;BernsteiNET al. GeNET. Eng. 7 (1985) 235; McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689; Doughertyらによって1995年3月16日に公開された国際特許公開番号WO 95/07358、およびKuo et al., 1993, Blood 82:845に記載のようにして、レトロウイルスベクターに導入することができる。それらのレトロウイルスは、分裂中の細胞に感染したウイルスを組込んでいる。 そのレトロウイルスのゲノムには２つのLTR、１つのキャプシド化配列および３つのコード領域（gag、polおよびenv）が含まれる。組換えレトロウイルスベクターにおいて、gag、polおよびenv遺伝子は、一般的に全体または部分が欠失しており、所定のある異種の核酸配列で置換されている。これらのベクターは、異なる型のレトロウイルス、例えばHTV、MoMuLV（「マウスモロニー（Molony）白血病ウイルス」MSV（「マウスモロニー肉腫ウイルス」）、HaSV（「ハーベイ肉腫ウイルス」）；SNV（「脾臓壊死ウイルス」）；RSV（「ラウス肉腫ウイルス」）およびフレンドウイルスから構築されることができる。欠損レトロウイルスベクターは、W095/02697に開示されている。
【０１５６】
一般的に、核酸配列を含む組換えレトロウイルスを構築するために、LTR、キャプシド化配列およびコード配列を含むプラスミドが構築される。この構築物は、パッケージング細胞系をトランスフェクトするのに使用され、該細胞系は、プラスミド中では欠損するレトロウイルスの機能をトランスに（in trans）供給することができる。従って、一般的に、パッケージング細胞系は、gag、polおよびenv遺伝子を発現することができる。このようなパッケージング細胞系は、先行技術文献、特に、細胞系PA317（US4,861,719）；PsiCRIP細胞系（W090/02806）およびGP+envAm細胞系（W089/07150）に記載されている。さらに、組換えレトロウイルスベクターは、転写活性を抑制するためのLTR内、並びに、gag遺伝子の一部を含むこともある広範な被抱配列内に修飾を含むことができる（Bender et al., J. Virol. 61 (1987) 1639）。組換えレトロウイルスベクターは、当業者に知られた標準技術によって精製される。
【０１５７】
レトロウイルスベクターは、感染粒子として機能するか、または単回のトランスフェクションを受けるために構築され得る。前者の場合には、ウイルスは、がん性の形質転換性質の原因であるもの以外のそれの遺伝子の全てを維持するために改変され、そしてNETをコードする遺伝子もしくはcDNA、またはそれのNETのポリペプチドドメインフラグメント、またはNET ScFvまたはNETドミナント変異体を発現するために修飾されることができる。非感染性のウイルスベクターは、ウイルスのパッケージングシグナルを破壊するよう製造されるが、しかし非相同遺伝子およびパッケージングシグナルを含有するよう設計される共誘導されたウイルスのパッケージングを必要とする構造遺伝子を保持する。すなわち、産生されるウイルス粒子は別のウイルスを産生することができない。
標的化された遺伝子運搬は、1995年10月に公開された国際特許公開WO95/28494に記載されている。
【０１５８】
非ウイルス性ベクター
あるいはまた、NETをコードする遺伝子もしくはcDNA、またはそのNETポリペプチドドメインフラグメント、NET ScFvまたはNETドミナント変異体を含むベクターは、リポフェクションによって生体内に導入することができる。過去１０年間、生体外での核酸のカプセル化およびトランスフェクションのためのリポソームの使用が増加している。リポソーム仲介によるトランスフェクションで生じた困難および危険を抑えるように設計された合成カチオン脂質を使用すると、マーカーをコードする遺伝子の生体内トランスフェクション用のリポソームを調製することができる［Feigner, et. Al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:7413-7417 (1987); Mackey, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:8027-8031 (1988); Ulmer et al., Science 259:1745-1748 (1993)参照］。カチオン性脂質の使用は、負に帯電した核酸のカプセル化を促進し、さらにまた負に荷電した細胞膜による融合も促進させることができる［Feigner and Ringold, Science 337:387-388 (1989)］。核酸の運搬のために特に有用な脂質化合物および組成物は、国際特許公開W095/18863およびW096/17823、および米国特許第5,459,127に記載されている。生体内で特定の臓器に外来性遺伝子を導入するためのリポフェクションの使用には、一定の実用的利点がある。特定の細胞へのリポソームの分子ターゲティングは、一つの有利な分野を示す。明白なことだが、個々の細胞型への直接的なトランスフェクションが、細胞異質性を有する組織（例えば膵臓、肝臓、腎臓および脳）において特に利点がある。脂質は、標的化の目的のために他の分子に化学的に結合させることができる［Mackey, et. al.、同上］。標的のペプチド、例えば、ホルモンまたは神経伝達物質およびタンパク質、例えば抗体、または非ペプチド分子は、化学的にリポソームに結合可能である。
【０１５９】
また、その他の分子もトランスフェクションを促進するのに有用であり、その例としてはカチオン性オリゴポリペプチド（例えば国際特許公開W095/21931）、DNA結合タンパク質から誘導されたペプチド（例えば国際特許公開W096/25508）またはカチオン性ポリマー（例えば国際特許公開W095/21931）を挙げることができる。
【０１６０】
生体内でベクターを裸のDNAプラスミドとして導入することも可能である。遺伝子治療用の裸のDNAベクターは、技術的に知られた方法、例えばトランスフェクション法、エレクトロポーレーション法、マイクロインジェクション法、形質導入法、細胞融合法、DEAEデキストラン法、リン酸カルシウム沈殿法、遺伝子銃の使用、またはDNAベクタートランスポーターの使用［例えば、Wu et al., J. Biol. Chem. 267:963-967 (1992); Wu and Wu, J. Biol. Chem. 263:14621-14624 (1988); Hartmut et al., Canadian Patent Application No. 2,012,311, filed March 15,1990; Williams et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2726-2730 (1991)参照］によって、所望の宿主細胞中に導入することができる。また、受容体が仲介するDNA送達法も使用することができる［Curiel et al., Hum. GeNETher. 3:147-154 (1992); Wu and Wu,J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)］。
それ故に、本発明はまた、NETをコードする遺伝子またはcDNA、またはそれのNETポリペプチドドメインフラグメント、またはNET ScFvまたはNETドミナント変異体をコードする配列を含むプラスミドに関する。
以下に、本発明をよく理解できるように実施例について述べるが、それらは単に説明のためであって、本発明を限定するものではない。
【０１６１】
実験材料および実験方法
プラスミドおよび細胞系
pCEFL、pCEFL−GPCR、p601D−アンチセンスNETおよびp601D（空のベクター）はGiovane et al.（Genes Dev. 1994, 8, 1502-13）に記載されている。
Gal4−N5はMaira et al.（EMBO J. (1996) 15:5849-65）に記載されている。
pRAS V12、ΔRasはGiovane et al.（Genomics (1995) 29:769-72.）に記載されている。
【０１６２】
微小管形成
ａ．NIH3T3細胞（C11）を、pCEFL−KSHVGPCR（マウスEF12プロモーター）およびアンチNET発現ベクターまたは対応する空のベクター（p601D：BeddintoNET al.1989,Development 106:37-46）を使用して、リン酸カルシウム法によってトランスフェクトした。沈殿物を適用後16時間経過してから、細胞を２回DMEMで洗浄し、0.05％FCS含有DMEM中で48時間インキュベートした。培地を回収し、直に試験するかまたは−80℃に貯蔵した。
ｂ．HUVEC細胞（継代数４〜６回）を、10％FCS、ヘパリン（50ng／ml）、ECGF（内皮細胞増殖因子、Sigma、50ng／ml）およびグルタミン（２mM）を含有するDMEM／F12K中で増殖させた。
【０１６３】
ｃ．24マルチウェルプレートのウェルを、４℃において120ml／ウェルの生長因子の減少されたマトリゲルマトリックス（Growth Factor Reduced MATRIGEL Matrix；Collaborative Biomedical Products）でコートし、37℃で30分間インキュベートした。
ｄ．トリプシン化されたHUVEC細胞を、0.5〜1.0％ FCS、ヘパリン（50ng／ml）およびグルタミン（２mM）を含有するDMEM／F12Kに再懸濁し、次いで上記のマトリックスで被覆されたウェルに播種した（10,000細胞／ウェル）。
一旦細胞が接着したら（約４〜６時間）、工程「ａ」からの慣熟培地を添加した（１：１ 容量：容量）。プレートを16〜24時間後観察した。
【０１６４】
ｅ．生体外での血管新生活性の抗VEGF抗体阻害および組換えVEGF刺激。
工程「ａ」からの慣熟培地を、0.2mg／mlの抗マウスVEGFポリクローナル抗体（R&D）または50ng／ml組換えヒトVEGF（R&D）とともに１時間37℃でインキュベートし、次いで工程「ｄ」のように被覆されたマトリックスに添加し、ウェルにHUVECを播種した。
プレートを１６〜２４時間後観察した。
【０１６５】
ES細胞、胚およびマウスの遺伝子型
ES細胞または尾生検由来のゲノムDNAを単離し、100μLの10mM Tris−HCl  pH 8.0、１mM EDTAに再懸濁した。遺伝子型を決定するために、15μlのDNAをXbaで消化し、そして標的化構築物の外側の３′領域から単離した3.8kbを用いてサザンブロッテイングにより解析した。通常の解析のために、マウスは対立遺伝子特異的プライマー、即ちUC54（配列番号15）、UC56（配列番号16）およびUC57（配列番号17）を用いてPCRにより遺伝子型が決定された。PCR条件は、94℃で２分間の１サイクル、次いで94℃で30秒、64℃で30秒および72℃で45秒の30サイクル、並びに72℃で５分間の１サイクルであった。メーカー（Sigma）の使用説明書に記載のとおりに、各プライマー200ng＋PCR試薬（Sigma）を含有する25μLの反応物中で0.5μL DNAを使用した。生成物のサイズは、野生型由来の1550bpおよび標的対立遺伝子由来の1300bpである。
【０１６６】
RT-PCRプロトコール
RNAを、メーカーの指示どおり、Trizol（Gibco／BRL）でマウス組織から抽出した。１μgの総RNAを種々のエキソン特異的なプライマーを用いた逆転写に使用した。増幅反応の条件は、Giovane et al.（Genomics, 1995, 29: 769-72）によって記述されている。使用した各プライマーの対は、次のとおりであった。即ち、
EX１（配列番号 ８）／EX2a（配列番号 ９）:
CTAGAAATCTCCCCAAGAAGACTC ／ GTTGTCGTCATAGTATCTCAGCGC
EX2b (配列番号10) ／ EX3a (配列番号11):
TGCTGGACATCGAACGATGGCGAG / ACTTGTACACAAACTTCTGCCCGA
EX3b (配列番号12) ／ EX4 (配列番号13) :
CTGGAGCCCCTGAATCTGTCATCG ／ TCGAGGCCAGAAACAGTCCACTTG
EX1 (配列番号8) ／ EX3a (SEQ (c)11)
CTAGAAATCTCCCCAAGAAGACTC ／ ACTTGTACACAAACTTCTGCCCGA
【０１６７】
PCR産物を５％ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動、エチジウムブロミドでの染色、U.V.下での視覚化によって解析した。
【０１６８】
ウェスタンブロット
Ultraturaxホモジナイザーを用いてRIPAバッファー（150mM NaCl、１％NP-40、0.5％ デオキシコール酸、0.1％SDS、50mM Tris−HCl pH 8.0、２μg／ml アプロチニン、２μg／ml  ロイペプチン、および100μg／ml フェニルメチルスルフォニルフロリド）で組織を抽出した。タンパク質（200−300μg）を10％SDS PAGE上で電気泳動し、ニトロセルロース膜上に移し、精製375抗体および増大された化学ルミネッセンス検出キット（Amersham）を用いて検出した。
【０１６９】
【実施例】
実施例１：KSHV/HHV8 ORF 74によって誘発される血管新生はNETによって仲介される
カポジ肉腫ウイルス（KSHV/HHV8）は血管新生を刺激する（Boshoff, Nature, 391, 24-25(1998)）。そのORF74はＧタンパク質結合受容体（GPCR）をコードする。そのGPCRは形質転換させており、ERKおよびp38キナーゼシグナル伝達カスケードおよびVEGFaを含む経路を介して血管新生の表現型を誘導する。NIH3T3におけるGPCR発現は、主にVEGFaといった、培地中への血管新生因子の分泌を誘導する（Bais et al., 1998）。慣熟培地は、マトリゲル（Matrigel）中で増殖するヒト臍帯血管上皮細胞（HUVEC）による微小管形成を誘導し（図１ａ）、VEGFaに対する抗体はこの活性を中和する（図１ｂ）[(Bais et al.. Nature, 391, 86-89 (1998)参照)。
【０１７０】
NETがKSVH/HHV8ORF74によって誘発される血管新生に関与するかどうかを決定するために、アンチセンスNET RNAまたはトランスドミナントNET変異体（Gal.Net 219-409＝Gal4.N5）のいずれかによってNetが低下調節された場合に、GPCRを発現する細胞からの慣熟培地による微小管形成を試験した。
【０１７１】
本技術は、本質的には（Bais et al., 1998）に記載のとおりである。NIH3T3細胞を10％ウシ胎児血清（FCS）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中に維持し、６ウェルプレート中で、pCEFL−GPCR単独、p601D−アンチセンス−NETを有するpCEFL-GPCR、またはp601D-トランスドミナントNetを有するpCEFL-GPCRをBBSリン酸カルシウム法によってトランスフェクトした。16時間後、細胞を洗浄し、24時間新しい培地に維持した。HUVEC細胞とのインキュベーション前に、慣熟培地のいくらかを、(ｂ) 0.2μg／mlの抗マウス−VEGFポリクローナル抗体（総ヤギIgG; R&D SYSTEMS）または(ｄおよびｆ)10ng／ml組換えヒトVEGF（R&D）のいずれかとともに、１時間21℃でインキュベートした。24マルチウェルプレートのウェルを150μl/ウェルのMATRIGEL（Becton Dickinson Labware）で被覆し、30分間37℃でインキュベートした。10％ウシ血清含有培地中のHUVEC細胞（105／ウェル）を添加し、慣熟培地を一旦添加し、細胞を接着させた。 プレートを24時間後に観察した（位相差、元倍率、×40）。
【０１７２】
NETが、アンチセンスnet RNA（図１ｃ）またはトランスドミナントNet異性体（Gal.NET 219-409；図１ｅ）のいずれかによって低下調節された場合に、GPCR発現細胞からの慣熟培地によって形成された微小管が阻害された。
VEGFaを慣熟培地に添加すると、活性を誘導する微小管を回復したので、VEGFa産生はこの阻害に関与する（図１ｄおよびｃ、および１ｆおよび１ｅを比較されたい）。
【０１７３】
GPCRを発現するNTH3T3からの慣熟培地は、培養プレート上で成長するHUVEC細胞の増殖を刺激する［(Bais et al., 1998)参照］。GPCRにより誘導されるHUVECの増殖におけるNetの低下調節の効果を決定するために、Netがアンチセンスnet RNAまたはトランスドミナントNet変異体（Gal.NET 219-409, TD）のいずれかによって低下調節される場合のHUVEC細胞の増殖を試験した。
【０１７４】
NTH3T3細胞を、GPCRに対するコントロールベクタ（pCEFL）、GPCRに対するベクター、およびアンチセンス−Netに対するコントロールベクター（p601D）；GPCRに対するベクターおよびアンチセンス−Netまたはトランスドミナント（TD）-Netを用いて上記のようにトランスフェクシトした。10％ウシ血清含有培地中HUVEC細胞（105）をウェル毎に添加し（６ウェルクラスター、Costar 3516）、慣熟培地を一度添加し、細胞を接着させた。48時間後、細胞をトリプシンで処理し、１mlの培地中に再懸濁し、生細胞をトリパンブルー染色後にカウントした。
【０１７５】
これらの結果は、アンチセンスnet RNAまたはトランスドミナント変異体（TD）タンパク質のいずれかによるNetの低下調節は、GPCR により誘導されるHUVECの増殖を減少させるということを示す（図２）。コントロールは、GPCRを発現するNIH3T3からの慣熟培地が、培養プレート上で成長するHUVEC細胞の増殖を刺激することを示した［図２を参照し、GPCRおよびコントロールベクターを比較されたい］。
【０１７６】
以下の例においては、Netを介してGPCRにより誘発される血管新生の機序には、ERKおよびp38 MAPキナーゼシグナリングカスケードのGPCR活性化、内因性Netのリン酸化、VEGFaプロモーターの転写活性化、およびVEGFaペプチドの分泌が関与することが見出された。
【０１７７】
実施例２：Netを介してGPCRにより誘発される血管新生の機序には内因性Netのリン酸化が関与する：
内因性Netのリン酸化はホスホセリン365を認識するリン酸特異的な抗体でなされた。この抗体は、ERKおよびp38シグナリングカスケードによるNetのリン酸化により誘導される活性化に重要である。
NIH3T3細胞を、前記のように、GPCRに対するコントロールベクター（pCEFL）またはGPCRに対するベクター（pCEFL−GPCR）でトランスフェクトした。14時間後、細胞を洗浄し、2.5時間成長培地に置いた。次いで、細胞をSB 203580（10μM）（Alexis Corp.）またはU0126（10μM）(Promega) で30分間処置した。６時間後、抽出物をSDS−PAGEおよびホスホセリン365Netに対する抗体［2F3抗体Giovane et al.（Genomics(1995) 29:769-72）］ または活性化されたERK(Promega)を用いてウエスタンブロッテイングにより解析した。
【０１７８】
結果は図３に示されている。GPCRは、Netのリン酸化を誘導し（列1,2）、阻害剤であるSB 203580およびU 0126のそれぞれによって示されるように、その誘導はｐ38およびERK経路の両方に依存している（列３、４；SB 203580は使用条件下においてはERK活性化を阻害しないことに注目されたい）。
トランスフェクトされたNetのリン酸化により、およびGal4−Net（219-409）を用いた転写活性アッセイにおいて同様の結果（データは示さていない）が得られた。これらのデータは、ERKおよびp38経路の両方を介して、GPCRがリン酸化およびNetの活性化を誘導することを示している。p38経路またはERK経路の阻害剤がNETのリン酸化を阻害し、従ってGPCRによって誘発される血管新生を阻害するということが分かる。
【０１７９】
実施例３：Netを介してGPCRにより誘発される血管新生の機序にはVEGFaプロモーターの転写活性化が関与する：
Netがアンチセンスnet RNAによって低下調節される場合に、GPCRによるVEGFプロモーター活性化におけるNetの役割を試験した。NIH3T3細胞を、GPCRのコントロールベクター（pCEFL）＋アンチセンスNetのコントロールベクター（p601D）；pCEFL+アンチNet；GPCR＋p601D；GPCR＋アンチNet並びにレポーター：mdm2−Luc; p21−Luc; VEGF−LucおよびpCMV−LacZで前記のようにトランスフェクトした。細胞を収集し、溶解し、次いでルシフェラーゼアッセイを標準法によって実施した。
GPCRは、トランス活性化アッセイにおけるVEGFaプロモーターを活性化することが見出された（図４参照）。アンチセンスでのNetの低下調節は、VEGFaプロモーターのGPCR活性化を阻害した。低下調節は、アンチセンスnetがGPCRの存在下ではmdm２およびｐ21WAF１プロモーターの活性に影響を及ぼさないという点で特異的であるようである。
【０１８０】
実施例４： Netを介してGPCR により誘発される血管新生の機序にはVEGFaペプチドの分泌が関与する：
繊維芽細胞におけるGPCR発現がVEGFaペプチドの分泌を誘導するかどうかを試験するために、等量のNIH3T3細胞をpCEFL（GPCRのベクター）; GPCR＋p601D (アンチNetのコントロールベクター）；GPCR＋アンチNet；ΔRas；Ras−V12＋p601D；Ras−V12＋アンチ-Net；p601D；ピュ−ロマイシン発現ベクターを有するアンチ-Netを用いて、前記のようトランスフェクトした。洗浄後、２nMのピュ−ロマイシンを添加した。48時間後、慣熟培地を収集し、細胞をトリプシン処理し、１mlの培地中に再懸濁し、次いで生細胞をトリパンブルー染色後にカウントした。VEGFペプチドレベルをELISAによって測定し（マウス−VEGF Quantikineキット、R&D）、その結果を細胞数について補正した。
【０１８１】
繊維芽細胞におけるGPCR発現は、図５でGPCRベクターとコントロールのベクターとを比較することによって示されるように、培地中へのVEGFaペプチドの分泌を誘導した。アンチセンスのnetは、培地中へのVEGFaペプチドの分泌を阻害した。
Rasがん遺伝子は、VEGFa発現（Arbiser et al., PNAS USA, 94, 861-866 (1997)）およびNet活性（Giovane et al. Gene Dev, 8, 1502-1513, (1994)）の両方を刺激する。
【０１８２】
これらの結果は、Ras−V12によって誘導されたVEGFaペプチド分泌が、netアンチセンスによって阻害されたということを示している。
誘導されない条件下においてNetはリプレッサーである（Giovane et al., 1994）。アクチベータ−の不在下におけるNetのアンチセンスはVEGFaペプチドレベルを増加させたが、それは基本条件の下ではNetがVEGFa産生のリプレッサーであることを示している。
この例によれば、Net活性化物質（例えば、Rasがん遺伝子）が存在しない場合には、Net発現の阻害またはNet活性の阻害がVEGFaペプチド分泌の増加を介して血管新生を促進することができるということが立証される。
【０１８３】
また、この実施例によれば、Netが（例えば、Rasがん遺伝子によって）活性化されている場合に、Netの発現の阻害またはNet活性の阻害は、VEGFaペプチド分泌の減少を介して血管新生を阻害または減少させることができるということも立証される。
また、この実施例によれば、NetがERKおよび／またはp38経路を介したリン酸化（例えば、GPCRによる）により活性化される場合、そのような状況でのNet発現の阻害またはNet活性の阻害は、VEGFaペプチド分泌の減少を介して血管新生を阻害または減少させることができるということも立証される。
【０１８４】
Net発現の阻害は、アンチセンスNet、例えばp601DのEcoRI部位の逆方向での完全ｃDNA（Giovane et al., Gene Dev. 1994, 8 1502-13）、scFV、ds RNAで得られる。Net活性の阻害は、NetドミナントのGal-Net、例えばGal.N5もしくはC12により、またはリン酸化の阻害またはNet核転移の阻害によって得られる。
【０１８５】
実施例５：NETの低下調節はVEGFa分泌を減少させる：
VEGFa分泌におけるNETの低下調節の役割を調査する目的で、アンチセンスnetの存在下または不在下でGPCRを発現するNIH3T3細胞の安定なクローンを調製した。
NIH3T3細胞を、GPCRを発現するベクターおよび選択可能なマーカーである「ネオマイシン」を用いて形質転換させ、個々のクローンを取出し、増殖させ、次いでVEGFペプチドの発現を、空のベクターをトランスフェクトしたコントロールクローンと比較して解析した（図６）。
【０１８６】
２つの典型的なクローンを選択し、ピューロマイシン耐性を共に有するアンチセンスnetを発現するベクターまたはコントロールベクターを用いて再度形質転換させ、次いでピューロマイシンについて選択した（図７）。減少されたレベルのVEGFペプチドを発現するいくつかの独立したクローンを増殖させた。アンチセンスNetで形質転換されたクローンのプールの解析により、短期間の実験（図５参照）と同様に、それの全ての効果はVEGFa分泌を減少させることであることが示された。
【０１８７】
SDS−PAGEおよびウエスタンブロッテイングによるクローンの解析により、NET発現が減少するということが示された（アンチセンスおよびコントロールのクローンを参照されたい。図８；TBPは等量負荷のためのコントロールである）。
Netに対する高い相同性（タンパク質レベルで75％）を有するタンパク質であるElk１の発現は減少されなかったが、そのことはこのアンチセンスが特異的であることを示している。またこのアンチセンスは、H−RasおよびGPCRの発現に全く影響しなかった（データは示されていない）。
これらの結果から、NET活性がGPCRによって刺激される場合に、Net発現の阻害がVEGFaペプチド分泌を減少させ、それ故にアンチセンスのアンチNetがVEGFaペプチド分泌の減少を介して血管新生を阻害または減少させることができるということが確認される。
【０１８８】
実施例６：Netの低下調節はGPCRによる腫瘍形成を阻害する：
腫瘍の血管新生におけるNETの役割を調査するために、アンチセンスnetと一緒にまたはアンチセンスnetなしでGPCRを発現するNIH3T3細胞の安定なクローンを調製した（実施例５参照）。
腫瘍成長は、GPCRクローンおよびGPCR-アンチnetクローンを皮下注射した（１回の注射につき約106細胞）BalbC nu/nu８週齢雌マウスにおいて試験した。GPCRクローンは、GPCR-アンチセンス-netクローンよりも大きな腫瘍を形成した（図９）が、それはNetの低下調節がGPCRによる腫瘍形成を阻害することを示している。
試験し５つのクローンについて、Netの低下調節は腫瘍の容量を約70％（平均210〜30mm2）減少させた。
【０１８９】
実施例７：Netの低下調節によって低酸素性腫瘍が生じる：
GPCR腫瘍は赤い色をしており、腫瘍によって誘発された新しく形成された血管と関連していることが観察された（図１０、矢印参照）。対照的に、GPCR／アンチセンス-net腫瘍は小さく、外見的には血管は全く見えなかった。
腫瘍における血管を、CD31 (PECAM-1)に対する抗体を用いてパラフィンセクションで検出した。腫瘍の濃密な脈管構造はGPCR腫瘍において検出された（図１１、ａおよびｃ）が、一方、GPCR／アンチセンス-net腫瘍には血管がほとんどなかった。GPCR／アンチセンス-netクローンにおける血管によって覆われている表面領域は、GPCRクローンに比較して75％減少した（図12）。減少された血管密度は、GPCR/アンチセンス-netクローンによって形成された腫瘍の酸素レベルがより低いことを示唆する。各腫瘍は、低酸素症の確認マーカーであるEF5に対する蛍光免疫組織化学によって解析した（Evans et al., 1997）。腫瘍を有するマウスにEF5（１mg/マウス）を注入し、そして４時間後セクションを準備し、Cy5に結合する抗−EF5抗体で染色し、デジタルカメラの付いたコンピュータ制御の蛍光顕微鏡で解析した。コントロールGPCRクローンに比較するとGPCR/アンチセンス-netクローンにおいては、より高いレベルのEF5結合が存在した（図13）。これらのデータは、Netを欠くGPCR腫瘍が、恐らくは減少された血管密度によるのであろうが、低酸素性であることを示している。
【０１９０】
以上のことから考えると、これらの結果からは、Netが腫瘍血管新生に必要であるということが分かる。また、これらの結果は、NETの阻害剤が固形腫瘍の治療に有用な薬剤を提供することができるということをも立証している。
【０１９１】
実施例８：net遺伝子に欠失を有するマウスの構築（Netδ変異型マウス）
net遺伝子は、マウスでは相同組換えによって調節された。NetのDNA結合ドメインをコードするエキソン２は、PGK-neoカセットによって置換された（図14A）。
【０１９２】
Net遺伝子のクローニング
Net遺伝子を、マウス129／Sv系由来のゲノムDNAを含むλEMBL３ファージライブラリーからクローン化した。エキソン２を含有するクローンは、サザンブロット解析およびDNA配列決定によって特性付けされた。
ターゲッテイングベクターは、netゲノムクローンの５′末端由来の11.5-kb BamHI−Avalフラグメント、1.8-kb PGK−neoカセット、およびnetゲノムクローンの３′末端由来の1.2-kb AvaI−BamHIフラグメントをpBluescript KSベクターに挿入することにより構築された。
【０１９３】
Net遺伝子の標的破壊
ターゲッテイング構築物を、NotI消化によりベクターから切り取り、D4 ES細胞にエレクトロポーレーションを施した［Deirich and Dolle (1997) GeNETargeting in embryonic stem cells. In Methods in Developmental Toxicology and Biology (ed. S.T. Klug, R. Thiel) pp 111-123. Blackwell Scienceに記載のとおりの方法］。G418耐性ローン由来のゲノムDNAは、サザンブロット解析によって特性付けられた。DNAをXbaＩで消化し、各ブロットを、netゲノムクローンの３'末端由来の3.8−kb NcoI−NcoIフラグメントからなるプローブとハイブリダイズした。野生型対立遺伝子は13-kbフラグメントを、そして突然変異型対立遺伝子は５−kbフラグメントを産生する。
【０１９４】
ヘテロ接合型net ES細胞をC57BL／6胚盤胞に注入してキメラマウスを作製した。生殖細胞系を介して変異型Net対立遺伝子に伝達したキメラマウスを使用して、２つの異なる遺伝的バックグラウンド（129／SvおよびC57BL／6）にNet欠失変異体（NET δ）系マウスを作製した。各マウスを、プライマーのUC54、UC56およびUC57を用いてのマウスの尾由来のゲノムDNAでのPCRによってスクリーニングした。野生型対立遺伝子は1550-bpフラグメントを、そして突然変異型対立遺伝子は1300-bpフラグメントを産生する。
【０１９５】
UC54 TGAAACGTGTAATCCTTGTGTCCTC (配列番号５)
UC56 TAATTTCCAAGTTCTCGGCACGTAG (配列番号６)
UC57 GACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTA (配列番号７)
【０１９６】
図１４(Ａ)は、野生型Net対立遺伝子、ターゲッテイングベクターおよび組換え変異型Net対立遺伝子の略図である。欠失型エキソン２は、翻訳開始コドンを含み、Netタンパク質のDNA結合ドメインにおけるアミノ酸１〜69をコードする。サザンブロット解析に使用する３′プローブの位置は、13Kb（野生型対立遺伝子）および５kb（変異型対立遺伝子）のXbaIで消化されたフラグメントと同様に示されている。B, BamHI、X, XbaＩ。
【０１９７】
遺伝子は、サザンブロッテイング（図１４Ｂ）およびPCR（図１４Ｃ、プライマーおよびプローブについては図１４Ａ参照）によるマウスDNAの解析によって示されるように改変された。。図１４(Ｂ)は、ヘテロ接合型（＋/−）交雑由来の子孫からのXbaＩ−消化されたDNAのサザンブロット解析を示す。３′プローブを用いたハイブリダイゼーション法によって、野生型対立遺伝子（WT）の13kbまたは標的化された対立遺伝子（M）の５kbのフラグメントに対応するバンドが得られた。図１４(Ｃ)は、同じ子孫のPCR解析を示す。遺伝子型は図の一番上に示され、矢印は野生型（WT、1550 bp）および標的対立遺伝子（M、1300bp）に対する特異的な増幅産物を示している。PCRプライマーセット（UC54、UC56、UC57）は、ターゲッテイングスキームに示されている。実験材料および実験方法、即ち、「ES、胚およびマウスの遺伝子型」を参照されたい。
【０１９８】
マウスは、新規な選択的にスプライシングされたエキソン２を欠くmRNAを示し（図１４Ｄ）、そしてエキソン３の翻訳開始から得られるDNA結合ドメイン欠失の変異型タンパク質を発現する(Net δ、図１４Ｅ)。図１４(Ｄ)は、RT-PCRによるNet転写物の検出を示す。E16野生型およびホモ接合型変異型胚から単離されたRNAは、Net遺伝子(エキソン１〜エキソン４)の異なるエキソン由来のプライマーとのRT-PCR反応に使用した。RT-PCRプライマーセットは、パネルの左側に示されている。エキソン２の欠失が予期されたように、ex１/ex2またはex2/ex3セットを有する変異型（−/−）RNAでは増幅が見られない。野生型胚のように、変異型胚においてエキソン３とエキソン４（ex3/ex4セット）との間において増幅産物が観察された。エキソン１とエキソン３（ex１/ex3セット）との間のRT-PCR反応は、野生型（217bp）に比較してより小さな産物（90bp）がホモ接合型の変異体胚で存在するということを示している。図14(E)は、２週齢の野生型、ヘテロ接合型およびホモ接合型マウス由来の肺タンパク質抽出物のウエスタンブロット解析を示している。49-kDA Netタ」ンパク質の量は、ヘテロ接合型（＋/−）で減少し、ホモ接合型変異型動物（−/−）では完全に消失する。しかし、新規な42kDAタンパク質バンドは、（ヘテロ接合型と同様に）変異体抽出物に出現している。
【０１９９】
実施例９：マウスにおけるNet遺伝子突然変異は血管系に影響する：
ヘテロ接合型＋/δ 129Svマウスを交差した場合に、約25％の子孫が突然変異に対してホモ接合型（図１５Ａ）であると見出されたが、10週齢以内に約90％のホモ接合型動物が、乳び胸症の特徴である胸腔中の乳びの蓄積（図１５Ｃ）による呼吸困難で死んだ（図１５Ｂ）。いくつかの例において血管欠損が観察された（データは示されていない）が、透過性は低かった。乳び胸症のマウスの各セクションの組織学的試験では、ホモ接合型変異体マウスが循環器系の構造またはネットワークの欠陥によるリンパ性ドレナージに欠損を示す拡張型リンパ管（リンパ管拡張症；図１６、Iv参照）を有することが示された。そのリンパ管を、リンパ管にβ−ガラクトシダーゼを発現するヘテロ接合型のVEGF-R3-β-galノックインマウスを用いて同定した（Dumont et al., 1998）。このバックグラウンドで、乳び胸症罹患のnet δ/δマウスにおいて、それらのリンパ管は胸腔では拡張していたが（図17A＋B）、心臓（C＋D）または真皮（E＋F）では拡張はみられなかった。拡張型血管は、乳び症のない５日齢のδ/δマウスの胸腔(G & H）に、そして17.5dpcと同じ位早期に（データは示されてない）観察された。
129Svマウスにおけるリンパ管の表現型、およびいくらかのマウスで観察された血管の表現型は、Netが高発現している内皮細胞中のNet機能損失の直接的な結果であろう。
【０２００】
実施例１０：Netは内皮細胞において高発現される：
Netの発現を、全封入（図１８、１９） およびセクション（図２０、２１）での原位置（in situ）ハイブリダイゼーションによって胚形成中に調査した。E7.5において、netおよびVEGF-R2（内皮細胞マーカー）の発現が、大変良く似ている（図２０、ＢおよびＣ）。E8.5において、netおよびVEGF-R2は初期リンパ管卵黄嚢において共発現しており（図１８、Ｅ−Ｆ）、脈管形成している。心内膜において（図20、H−I）および尿嚢において(図18、JおよびK)も同様である。E9.5およびE10.5ではnetおよびVEGF-R2は、体節間（inter-somitic）の血管、大動脈（図１９、Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ）および主要な頭部の血管（図１９）において共発現されている。後のE12.5、E14.5およびE16.5においては、尾、肝臓、心臓、肺および腸（図２０、Ｇ−Ｌ）でのnetおよびVEGF-R2の多くの共発現領域が存在し、netが、内皮細胞中で高発現していることを示している。しかし、netおよびVEGF-R2発現に相違があり、それは特に軟骨分化の領域で高発現している（図２１、Ｇ−Ｊ）点にある。脈管形成および血管形成中のNetの発現は、マウスにおけるnet突然変異の結果を説明することができる（乳び胸症）。
【０２０１】
実施例１１：Egr-１遺伝子はNetに対する標的遺伝子である：
さらに、本発明により、Egr-１がnetδ/δ胚の肝臓およびいくつかの主要な血管中で過剰発現していることが見出された（データは示されていない）。Egr-1は、SREモチーフを有する即時型遺伝子であり、従ってこれは、Egr-1がNetの標的遺伝子であるということの証明となっている。
面白いことには、Egr-1は血管病理学に関係する[（Silverman and Collins, 1999）および（YaNET al. J. Clin Invest. 2000 Mar ; 105(5): 553-4）]。Egr-1は、特に血管形成術に起因する機械的損傷後の新内膜の形成に必要である。また、それは、明らかにその組織因子の調節を介しての低酸素血症中の脈管系におけるフィブリン沈着にとっても必要である。アテローム性動脈硬化症の病変において、特に平滑筋細胞において発現が持続している。δ/δ netマウスは、Netの低下調節がEgr-1活性を増加させるということを示唆している。それ故に、Netリプレッサー活性の回復は、血管形成術後の再狭窄の治療およびアテローム性動脈硬化症の治療において有用である。
【０２０２】
実施例１２：正常な条件下のNetは血管新生のリプレッサーである：
血管新生におけるNetの役割は角膜嚢技術で詳細に調べられた。この技術はYoshida等(Histol. Histopathol., 14,1287-1294 (1999))に記載されている。
bFGFによって誘発される血管新生は、netδ/δマウスではそれらの野生型の同腹子と比較して減少しており（図２２）、NetがbFGFによって誘発される血管新生に必要であるということを示している。
また、血管新生は、基本条件では単離された大動脈輪から伸長した内皮細胞によって研究されている。この技術は、Brown等（Lab. Invest, 75, 539-555 (1996)）に記載されている。
【０２０３】
変異型マウスからの血管伸長が増加していた(図２３)。この結果は血清（基本条件）中におけるアンチセンスnetの作用に関連しており、それはNetの抑制を除去し、その結果、VEGFぺプチドレベルを刺激するのである(図５)。
これらの結果は、基本条件下では血管新生がNetによって阻害されるということを示している。また、これらの結果は、Netの過剰発現またはNet変異細胞中のNet発現の回復が、血管新生の調節を増加させるということも示唆している。
【０２０４】
実施例１３：哺乳類のNET活性を調節する試薬のスクリーニング
前記の結果からは、GPCRまたはRasからVEGF産生へのシグナル伝達経路における中間物としての血管新生におけるNetの役割についての強い証拠が提供された。従って、GPCRまたはRasによるNetの活性化を防止する化合物は有用な抗血管新生薬剤を提供する。
いくつかのタイプのスクリーニングアッセイ、例えば細胞のレポーター遺伝子アッセイ、NET／DNA相互作用、酵母におけるタンパク質／タンパク質相互作用、リン酸化アッセイを意図することができる。
【０２０５】
13-A) Gal4-Net（C-末端）/gal4−レポーター遺伝子（Rasで形質転換された細胞または血管新生刺激によって活性化された細胞)に対する細胞内レポーター遺伝子アッセイ
この試験は、細胞をベースとした384ウェルフォーマットの、一般的なデュアルレポーター遺伝子アッセイとして記載されている。レポーター遺伝子システムで安定にトランスフェクトし、形質転換された２種のヒト細胞系が得られた。即ち、
HCT116クローンは、１) GAL4 DNA結合ドメインとNet転写活性化ドメイン（C-ドメイン）との間の融合タンパク質および ２）GAL4プロモーターの制御下におけるRenillaルシフェラーゼレポーター遺伝子を安定に発現する。
【０２０６】
非特異的に転写活性と相互作用する分子の選択を避けるために、負の調節がSW480結腸がんクローンを用いて付与され、高レベルのβ−カテニンタンパク質を発現し、さらにこの特定のアッセイにおいてはＴ細胞因子／Lef依存性プロモーターの制御下でホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子を安定に発現するか、または任意の他の遺伝子レポーターアッセイにおいては三量体複合体因子ファミリーに関与しないプロモーターの制御下でそのレポーター遺伝子を安定に発現する。
【０２０７】
このアッセイは４つの段階からなる。即ち、(ｉ) 384ウェルプレート上の所定の２つの細胞系に播種し、37℃で一晩インキュベートする(培地：フェノールレッド非含有D−MEM＋0.22μmフィルターで濾過した10％ FCS)；(ii) 候補化合物を添加する；(iii) LucLite試薬（Packard, Kit FireLite）を添加し、24時間インキュベーション（負の調節）の後にMicrobetaTMTrilux (EG&G Wallac) 上のホタルルシフェラーゼシグナルの読み（β−カテニン依存性転写の読み出し）を行う；および (iv) RenLite試薬を添加し、MicrobetaTMTrilux（EG&G Wallac）上のRenillaルシフェラーゼシグナルの読み出し（NET依存性転写の読み出し）を行う；からなる。
所定の分子はRenillaルシフェラーゼを阻害するが、しかしNETアッセイ（Net阻害剤）に対するホタル活性を阻害しない。また、アクチベーターはこのスクリーニングにおいてRenilla活性のアクチベーターを選択することによって見出すことも可能である。
【０２０８】
13-B) Net/DNA相互作用：
NETのこの性質は、いくつかの実験設定において実証されることができる。
- ゲルシフト法（Giovane et al. Gene Dev. 1994, 8, 1502-13）
- NETタンパク質上で保持された標識オリゴヌクレオチド（２−ストランド）の定量。標識されたオリゴヌクレオチドのこの配列はSRE配列に由来し；Netタンパク質は、真核細胞または原核細胞において（E. coliまたはバキュロウイルスのいずれかで）部分的に−DNA相互作用ドメイン−または完全長のいずれかで発現されることができ、好ましくはそれの精製を促進する目的で融合タンパク質（His、HA、GST、myc ....）として発現されることができる。この標識されたオリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号14  5′TCGAGCCGGAAGTGACGTCGA 3′（Giovane et al. Gene Dev. 1994, 8, 1502-13を参照せよ。）であることができる。
【０２０９】
13-C) 酵母におけるタンパク質/タンパク質相互作用：
13-C-1. 酵母におけるSRE上のNet/SRF相互作用
この試験は、酵母Saccharomyces cerevisiaeにおいて、NetがSREに結合するためにSRFと予め相互作用する必要性を阻害することによってNet依存性転写を阻害できる小分子のスクリーニングにある。
- 酵母CL9系は、一般的に２−ハイブリッド系のスクリーニングツールとして使用されるが、GAL4依存性の転写に依存したレポーターシステムを用いてトランスフェクトされる。機能性転写因子のタンパク質／タンパク質相互作用を介する再構築はレポーター遺伝子の発現に至る。ここで、該DNA上の特異的なSRE配列に結合する所定のタンパク質の能力を用いることができるので、ハイブリッド転写因子のこの人為的な再構築は、部分的に必要とされるのみである。高いバックグラウンドを避ける目的で、以下の構築物を使用する：
【０２１０】
- NetのAおよびBドメインaa 133-265（DNA結合およびSRF結合ドメイン）に限定されたNetの部分的cDNは、（選択マーカーと共に）酵母発現プラスミドにクローン化された。
- SRFの部分的cDNA（Net相互作用ドメインおよびSRE相互作用ドメインの両方に限定されたものである）は、pGAD1Oプラスミド（Clontech）にGal4転写活性化ドメインと共にフレームを合わせてクローン化された。
- SREエレメント  5′TACACAGGATGTCCATATTAGGACA 3′（配列番号 15）は、β−ガラクトシダーゼ、URA3またはCAN1、LEU2、HIS3、CYH2、GFP、...（該レポータータンパク質は、比色定量法、蛍光測定法または酵素的方法によって検出することができる）のようなレポーター遺伝子の発現を導くレポータープラスミドのプロモーター配列としてクローン化された。
【０２１１】
これらの３種のプラスミド（各プラスミド１μg）は、Gietz et al. （1995, studies on the transformation of intact yeast cells by LiAC／SS-DNA／PEG procedure. Yeast, 11 : 355-360）に記載のように、LiAC／PEGで処理することによって該酵母株中で形質転換された。NetおよびSRFの両方の発現は、相互作用するタンパク質としてレポーター遺伝子の発現を導く。該酵母株は、PDR遺伝子ファミリーまたはERG6遺伝子のいずれかに突然変異を導入することによって透過性になる。これらの遺伝子は解毒過程に関与する。
【０２１２】
該酵母系は、支持体のゲル化用の寒天を含有するかまたは含有せずに、YNB最小培地（Yeast Nitrogen Base (アミノ酸なし) ？ ６、７ｇ／Ｌ；グルコース（20ｇ／Ｌ）上で培養する。
タンパク質／タンパク質の相互作用を阻害する小分子は、レポーター遺伝子の活性（比色定量上の、感受性、…）を欠損する酵母を生育させる。
この試験は、それぞれのNetおよびSRF相互作用ドメインを構築物中で用いることによってNet-SRF相互作用に簡易化され、また限定されることができる。この場合には、cDNAの対応するフラグメントが、GAL4タンパク質の転写活性化ドメインとの融合タンパク質（Net-TAまたはSRF-TA）の発現用のｐGADIOプラスミド（Clontech）中でクローン化される。
【０２１３】
次いで他の１つが、GAL4タンパク質のDNA結合ドメインとの融合タンパク質（それぞれ、SRF-BDまたはNet-BD）の発現用のpGBT9 (Clontech)中でクローン化される。
ここで（CL9株:リバース２−ハイブリッドと称呼されるこの実験に使用されたCL９は、JC981株のcyh2変異体である。CYH2は、シクロヘキシミドの存在下で生育する能力を付与する。CL9株は、プラスミドによってトランスフェクトされ（trp1−901座位に組み込まれ）、その際、野生型CYH2遺伝子はGall(UAS)プロモーターの制御下において発現され、UASプロモーターはシクロヘキシミド感受性またはレポーター遺伝子発現のいずれかを制御している。
【０２１４】
このように、この試験は、透過性（permeabilized）酵母でのリバース２−ハイブリッド試験にある。タンパク質間の相互作用を阻害する小分子は、選択性生育培地（10μg／mlシクロヘキシミド）上に酵母の成長をもたらす。
これらの分子は、シクロヘキシミド含有培地上で同様のプロトコールによって試験される。
小分子の試験は、10μg/mlシクロヘキシミドを含有する選択培地上で形質転換された酵母を増殖させることからなる。試験する分子の滴を、デイッシュの表面に置く。陽性の分子は、成長輪（growth halo）を与える分子である。次いで陽性はレポーター遺伝子の発現をチェックすることによって証明される。
【０２１５】
13-C-2) Net-CtBP相互作用：
この二番目のリバース２−ハイブリッド試験を使用するが、今度は、Net cDNAがCIDボックスもまた含み、そこでCtBPタンパク質との相互作用ドメインがマッピングされた。SRF cDNAはCtBP cDNAによって置換された。形質転換された酵母のプロセッシングは同一である。
実施例13C-1 および２に関して、いくつかのプロトコールは米国特許の第5,283,173号; 第5,468,614号; 第5525490号; 第5,580,736号; 第5,885,779号に記載の文献から入手可能である。
【０２１６】
13-D) Netリン酸化：
Netのリン酸化は、ELISA法または抗ホスホNet抗体によって被覆されたCytostarプレート（Flashplates）、またはHTRF法のいずれかで定量化されることができる。
同時に選択遺伝子（ハイグロマイシン耐性、ネオマイシン耐性、....）を含む発現ベクターで安定にトランスフェクトされた、Rasで形質転換された哺乳類細胞のクローンにおいて、強力なプロモーター（例えば、CMVプロモーターのような）の制御下で、Netは過剰発現される。Netタンパク質は、特定のモノクローナル抗体（Flag、myc−タグ、HA、...）によって認識可能なペプチドとともに、それのN末端またはそれのC末端のいずれかでタグを付される。細胞をMW96プレートに播種し（10000〜100000細胞／ウェル）、NETのリン酸化の阻害剤として評価されるべき分子によって処理するか、または処理しない。
【０２１７】
HNTGバッファー（Hepes 20mM pH 7.5、NaCl 150mM、Triton 0.1％、グリセロール10％、およびホスファターゼおよびプロテアーゼの阻害剤：１mM Na3V04、アプロチニン2.2μg／ml、１μg／mlロイペプチン、１μg／mlアンチペイン、10μg／mlベンズアミジン、１μg／mlダイズトリプシン阻害剤、１μg／mlキモスタチン、１μg/mlペプスタチン−Ａ）、またはRIPAバッファー（50 mM Tris、pH 8.0、NaCl 150 mM、１％ NP-40、0.5％ デオキシコール酸ナトリウム、0.1％ SDS、１mM Na3V04、100μMフェニルメチルスルホニルフルオレート(PMSF)、25μg／mlアプロチニン、25μg／mlロイペプチン）のいずれか中に該分子を添加後24時間経過すると細胞は溶解される。
【０２１８】
次いで、細胞溶解液をモノクローナル抗体2F3で予め被覆したMW96プレートに移す。この抗体は、リン酸化されたNETタンパク質に特異的に結合する。
実験は、以下の伝統的なELISA法で実施する。各ウェル中のリン酸化されたNetの量の定量は、二次標識された抗−タグ抗体の結合を介して示される。この標識によって、酵素測定、比色定量測定、蛍光測定または放射活性測定による、結合した抗体の定量が可能になる。
【０２１９】
別の方法は、正リン酸Ｐ33またはＰ32で細胞抽出液を標識し、MoAB 2F3で予め被覆したMW96 Cytostarプレート（Amersham）中で細胞溶解液をインキュベートすることによる。３回のプレート洗浄後に、結合した放射活性をシンチレーションカウンターでカウントする。
これらの方法に代替する他の方法は、標識されたユーロピウムクリプテート MoAb 2F3を用いることによるHTRFのスクリーニング方法の適用にある。この場合には、各試薬は、細胞溶解液（ユーロピウムクリプテートで標識されたMoAb 2F3およびAPC（アロフィコシアニン）で標識された抗−タグ抗体）中に直接添加する。より簡易化する場合には、この二次抗体をさらにまたビオチン化することができる。すなわち反応混合物にAPC−ストレプトアビジンを添加する。
【０２２０】
このアッセイにおいては、ユーロピウムが337nmで励起する際に、抗−ホスホNet Euクリプテートおよび抗−タグAPC（Netリン酸化による）の近接により、ユーロピウムとアロフィコシアニン（AFC）との間で蛍光転移が生じる。２つの蛍光発光が、一方は622nmでそして他方は665nmで生じる。次いでこれらの蛍光発光率を測定する。即ち、<<(665／622)×10000である。
【０２２１】
13-E) Net誘導ペプチド（Dボックス）またはNetタンパク質の、それらのキナーゼ活性をベースとするｐ38またはERKスクリーニングテストにおける基質としての使用
この試験のために、一連のペプチドまたは組換えタンパク質：
-組換え哺乳類p38(αまたはβ)
-組換え哺乳類ERK1、ERK2
-組換え哺乳類JNK1、JNK2またはJNK3
を生産する。
【０２２２】
これらのタンパク質は融合タンパク質（E.coliまたはバキュロウイルスのいずれかにおける産生後、容易に精製され得るようなHA−タグまたはGST）であることができる。
-基質：ヒトまたはマウスのNetタンパク質のＣボックスまたはＤボックス（ヒトではaa289-407）の活性化ドメインまたは完全長Netタンパク質（前述のように発現される）に対応する組換えペプチド
【０２２３】
キナーゼ反応は、放射標識されたγ−ATPの存在下で実施する。反応混合物を30℃で１時間分子の存在下でインキュベートすることができ、次いでその反応を停止させ、各プレートをプレートシンチレーションリーダーにおいてカウントする。
このプロトコールの非放射能適応は、前記の蛍光トランスファーアッセイ（HTRF）を用いることによって可能である。
この場合には、Net基質はタグを付され、キナーゼ反応の後に13-Dに記載のと同じ試薬を使用することができた（ここでは冷ATPで実施）。Netがタグを付されていない場合には、それをビオチン化することができ、次いでストレプトアビジンAPCの使用が必要とされる。
【０２２４】
本発明は、本明細書に記載の特定の実施態様によって、その範囲を限定されるものではない。実際には、本明細書に記載のものの外に、種々の変形が、前記の記載および添付図面から当業者にとっては自明である。このような変形は、本発明の特許請求の範囲内にあるものである。
【０２２５】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【図１】  特異的にトランスフェクトされたNIH3T3細胞からの慣熟培地によって誘導されたマトリゲル（Matrigel）上のHUVEC細胞による微小管形成。
【図２】  慣熟培地におけるHUVEC細胞の増殖。
【図３】  内因性Netのリン酸化。
【図４】  GPCRによるVEGFプロモーターの活性化にはNetが必要。
【図５】  トランスフェクトされたNIH3T3細胞からの慣熟培地におけるVEGFペプチドレベル。
【図６】  GPCR形質転換されたクローンからの慣熟培地におけるVEGFペプチドレベル。
【図７】  コントロール（p601D）およびアンチNetベクターをトランスフェクトしたプールまたは単離したGPCR形質転換されたクローンからの慣熟培地におけるVEGFペプチドレベル。
【図８】  GPCR−コントロールおよびGPCR−アンチNetのプールおよびクローンにおけるNetおよびElkの発現。
【図９】  GPCR−コントロールクローンおよびGPCR−アンチNetクローンによって形成された腫瘍の容量。
【図１０】  ヌードマウスのGPCRクローンおよびGPCRアンチ−Netクローンによって生じた腫瘍の様子。
(Ａ)  GPCRクローンの腫瘍
(Ｂ)  GPCR‐アンチ Netクローンの腫瘍
矢印：腫瘍によって誘導された新規に形成された血管
【図１１】  腫瘍における血管の密度。
【図１２】  腫瘍における血管でカバーされた領域。
【図１３】  腫瘍における低酸素性緊張の相違。
【図１４】  マウスNet遺伝子座の標的化された突然変異誘発。
（Ａ）野生型Net対立遺伝子、標的ベクターおよび組換え変異体のNet対立遺伝子の略図
（Ｂ）ヘテロ接合の（＋／−）異種交配からの子孫由来のXbaIで消化されたDNAのサザンブロット解析
（Ｃ）同じ子孫のPCR解析
（Ｄ）RT−PCRによるNet転写物の検出
（Ｅ）２週令の野生型、ヘテロ接合型およびホモ接合型のマウス由来の肺タンパク質抽出物のウエスタンブロット解析
【図１５】  Netδ/δマウスの表現型。
(Ａ、Ｂ)  Netδ/δマウスの生存を、野生型およびヘテロ接合型(+/δ)動物と比較したもの
(Ｃ)  表現型の標本図
【図１６】  Netδ/δ胸腔の組織学的解析。
(Ａ)  野生型マウス胸郭
(Ｂ)  変異型マウス胸郭
(Ｃ)  (Ａ)における点線の四角い部分の拡大図
(Ｄ)  (Ｂ)における点線の四角い部分の拡大図
【図１７】  Netδ/δマウスにおける胸部リンパ管の拡張。
【図１８】  E7.5およびE8.5段階の胚におけるNetT（A、C、E、G、HおよびJ）並びにVEGF-R2（B、D、F、IおよびK）mRNA発現の全封入（whole-mount）原位置（in situ）ハイブリダイゼーション法による検出。
(Ａ、Ｂ)  E7.5胚
(Ｃ、Ｄ)  それらの卵黄嚢におけるE8.5胚の側面から見た写真
(Ｅ、Ｆ)  E8.5胚の切開された卵黄嚢における発現
(Ｇ)  切開された栄養膜の錐体の内側表面内のNet発現
(Ｈ―Ｋ)  E8.5段階の胚で観察された標識の腹側および背側の写真
【図１９】  E9.5およびE10.5におけるNet（Ａ、ＣおよびＥ）およびVEGF−R2（Ｂ、ＤおよびＦ）の転写物の全封入mRNA検出。
(Ａ、Ｂ)  E9.5胚の側面から見た写真
(Ｃ、Ｄ)  E10.5胚の頭部領域における発現
(Ｅ、Ｆ)  E10.5段階の胚からの主要な領域の側面から見た写真
【図２０】  E7.5、E8.5、E12.5、およびE14.5段階における原位置ハイブリダイゼーションによるNetおよびVEGF-R2発現の比較分析。
(Ａ−Ｃ、Ｄ−Ｆ)  母体の脱落膜に存在するE7.5およびE8.5胚の部分
(Ｇ−Ｉ、Ｊ−Ｌ)  E12.5およびE14.5の胚の矢状部分
【図２１】E16.5における隣接した矢状部分におけるNetおよびVEGF-R2の発現(Ａ−Ｆ)およびE14.5およびE16.5段階における肢軟骨分化中のNET発現(Ｇ−Ｊ)。
(Ｂ、Ｅ)  頭部および胸部領域におけるNet発現
(Ｃ、Ｄ)  頭部および胸部領域におけるVEGF-R2パターン
【図２２】マウスの角膜におけるrhFGF-2によって誘導された血管新生。
(Ａ、Ｂ)  Net野生型および変異型マウスのペレット移植角膜の生体顕微鏡検査結果
【図２３】マウスの大動脈環血管新生アッセイにおける微小血管形成。
【図２４ａ】（ヒト）Netポリペプチドのドメイン
Ａボックス：(etsドメイン),Iwqfllqlll(NES)
Ｂボックス：(SRF相互作用)
NID：(Net阻害ドメイン)
JFX：(リン酸化によって誘導されるJNK相互作用および輸送)
CID：(CtBP相互作用ドメイン)
Ｄボックス：(NLSおよびERK1+p38結合)
Ｃボックス：(リン酸化誘導転写活性化)
【図２４ｂ】（マウス）Netポリペプチドのドメイン
Ａボックス：(etsドメイン),Iwqfllqlll(NES)
Ｂボックス：(SRF相互作用)
NID：(Net阻害ドメイン)
JFX：(リン酸化によって誘導されるJNK相互作用および輸送)
CID：(CtBP相互作用ドメイン)
Ｄボックス：(NLSおよびERK1+p38結合)
Ｃボックス：(リン酸化誘導転写活性化)
【配列表】
0004566512.tif 000002
0004566512.tif 000003
0004566512.tif 000004
0004566512.tif 000005
0004566512.tif 000006
0004566512.tif 000007
0004566512.tif 000008
0004566512.tif 000009
0004566512.tif 000010
0004566512.tif 000011
0004566512.tif 000012
0004566512.tif 000013
0004566512.tif 000014
【図１】
0004566512.tif 000015
【図２】
0004566512.tif 000016
【図３】
0004566512.tif 000017
【図４】
0004566512.tif 000018
【図５】
0004566512.tif 000019
【図６】
0004566512.tif 000020
【図７】
0004566512.tif 000021
【図８】
0004566512.tif 000022
【図９】
0004566512.tif 000023
【図１０】
0004566512.tif 000024
【図１１】
0004566512.tif 000025
【図１２】
0004566512.tif 000026
【図１３】
0004566512.tif 000027
【図１４】
0004566512.tif 000028
【図１５】
0004566512.tif 000029
【図１６】
0004566512.tif 000030
【図１７】
0004566512.tif 000031
【図１８】
0004566512.tif 000032
【図１９】
0004566512.tif 000033
【図２０】
0004566512.tif 000034
【図２１】
0004566512.tif 000035
【図２２】
0004566512.tif 000036
【図２３】
0004566512.tif 000037
【図２４ａ】
0004566512.tif 000038
【図２４ｂ】
0004566512.tif 000039