(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
担体又は容器に蛋白質を吸着して非特異的吸着の低減された担体又は容器を製造するにあたり、蛋白質溶液に浸漬した状態で、該担体又は容器に対してマイクロ波を照射することからなる、担体又は容器の製造方法。
【請求項２】
前記蛋白質溶液は、血清アルブミンを含有する溶液であることを特徴とする、請求項１の製造方法。
【請求項３】
前記蛋白質溶液は、血清アルブミンを含有し、かつ、ｐＨをｐＨ３．０から６．５に調整した溶液であることを特徴とする、請求項１又は２の製造方法。
【請求項４】
担体又は容器に蛋白質を吸着して非特異的吸着の低減された担体又は容器を製造するにあたり、血清アルブミンを含有し、かつｐＨをｐＨ３．０から４．０に調整した蛋白質溶液に該担体又は容器を浸漬することからなる、担体又は容器の製造方法。
【請求項５】
前記担体又は容器には、前記蛋白質の吸着に先立ち、リガンドが結合されていることを特徴とする、請求項１から４のいずれかに記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生化学、臨床化学、製薬化学などの分野において分離分析・分離精製手段として使用されるクロマトグラフィー、電気泳動、免疫測定などに用いられる担体又は容器であって、蛋白質の非特異的な吸着を抑制し得る担体又は容器を製造し、又は、任意の対象物質を特異的に結合するための担体又は容器を製造するための方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、そしてヘテロジニアスイムノアッセイ等、化学、生化学或いは医学等の分野では、担体を利用して分離分析、分離精製を行うことが広く行われている。これらは、担体上の特定の官能基や、担体上に吸着等によって固定された蛋白質中の特定部位等と、目的成分（物質）との相互作用を利用するものであり、分離精度や測定感度が高いことから、例えば生体試料中の微量成分の分離分析や分離精製に多用されている。
【０００３】
分離分析の工程では、目的成分や、目的成分に関連したシグナルを生成するための、抗体や抗原等に酵素等を結合した標識物質が、非特異的に担体や容器に吸着することがあり、分離分析の高感度化を目指す場合には、この様な非特異的な吸着が大きな障害となる。特に、目的成分が極微量にしか存在しない成分である場合には、上記の様な非特異的吸着によって、実際に分析し得る目的成分量が減少することになるし、また、担体に非特異的に吸着した標識物質からのシグナルが大きくなって、分離分析におけるＳ／Ｎ比が悪化することになる。
【０００４】
また、分離精製の工程でも、上記同様に目的成分が担体や容器に吸着することがあるが、これにより、実際に回収し得る目的成分量が減少して、目的成分の回収率が低下することになる。
【０００５】
上記のような非特異的な吸着を低減する目的で、例えば、ヘテロジニアス免疫測定等の担体を用いる分離分析では、担体上に抗原又は抗体を固定化した後、担体上の疎水吸着点を免疫反応に無関係な蛋白質でブロッキングすることが一般に行われている。蛋白質を用いる以外にも、例えばポリビニルアルコールを用いてブロッキングを行う方法（特開平４−１９５６１号公報参照）や、２−メタクリロイルオキシエチルスルホイルコリン重合体を用いてブロッキングを行う方法（特開平７−８３９２３号公報参照）等も報告されている。またこの一方で、免疫反応を行う容器（反応容器）に対する目的成分や標識物質の非特異的吸着を低減するために、吸着防止剤を反応溶液に添加することも行われている（特開平１１−２４８７０６号公報参照）。
【０００６】
担体に対する非特異的吸着を低減するためには、担体表面における親水性を上げ、担体と吸着成分との間の立体反発力を強めることが効果的であると言われている。蛋白質は約２０種類のアミノ酸より構成され、水溶液中では疎水性アミノ酸側鎖が水分子との接触面積を小さくするように内側に配置されてコアを形成し、解離性アミノ酸側鎖や極性アミノ酸側鎖が外側に配置されて周囲の水と接触するような立体構造を取るが、周囲の水の一部は水和水として蛋白質に結合し、水和層を形成する。したがって、蛋白質を用いて担体表面をブロッキングすることは、担体に対して新たに親水性を付与することになるから、目的成分等の非特異的吸着を防止する方法として有効と考えられている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、蛋白質を単に担体に吸着させるという、従来のブロッキング方法では、蛋白質が担体に吸着することによって吸着変性が生じ、目的成分との間で新たな相互作用が生まれ、この結果、担体に対する目的成分の非特異的吸着が誘発されることがある。したがって、担体を用いる分離分析を更に高感度化するためには、担体に対する目的成分や標識物質の非特異的吸着量を、従来にも増して低減する必要があった。前記したように、蛋白質に代えて合成ポリマーをブロッキングに使用する方法も知られているが、この方法には、合成ポリマーの調製が複雑で、コスト高である、という課題がある。
【０００８】
また、クロマトグラフィーやゲル電気泳動法を用いて生体成分等の目的成分を分離分析し、又は分離精製する場合にも、分析感度を向上し、又は目的成分の回収率を向上するには、目的成分や標識物質の担体や容器への非特異的吸着を低減する必要がある。このため、クロマトグラフィーや電気泳動においては、担体基材に親水性ポリマーを使用したり（Ｙ．Ｋａｔｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，ｖｏｌ．２６６，ｐ３８５，１９８３）、担体や容器を親水性ポリマーでブロッキングすることが行われているが、目的成分が生体試料中の微量成分である場合、その種類によっては、効果の無いこともあった。
【０００９】
そこで本発明の目的は、分離分析及び／又は分離精製における目的成分や標識物質の非特異的吸着を防止或いは低減して、分離分析の測定感度を向上し、又は、分離精製における回収率を向上できる、担体や容器の製造方法を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するためになされた本願請求項１の発明は、担体又は容器の製造方法であり、担体又は容器に蛋白質を吸着して非特異的吸着の低減された担体又は容器を製造するにあたり、蛋白質溶液に浸漬した状態で、該担体又は容器に対してマイクロ波を照射することからなる。
【００１１】
また前記目的を達成するためになされた本願請求項２の発明は、担体又は容器の製造方法であり、担体又は容器に蛋白質を吸着して非特異的吸着の低減された担体又は容器を製造するにあたり、蛋白質溶液にマイクロ波を照射した後、該蛋白質溶液に該担体又は容器を浸漬することからなる。
【００１２】
そして前記目的を達成するためになされた本願請求項３の発明は、前記請求項１又は２の発明に係り、前記蛋白質溶液が血清アルブミンを含有することを特徴とする。本願請求項４の発明は、前記請求項１又は２の発明に係り、前記蛋白質溶液が血清アルブミンを含有し、かつｐＨをｐＨ３．０から６．５に調整した溶液であることを特徴とする。
【００１３】
前記目的を達成するためになされた本願請求項５の発明は、担体又は容器に蛋白質を吸着して非特異的吸着の低減された担体又は容器を製造するにあたり、血清アルブミンを含有し、かつｐＨをｐＨ３．０から６．５に調整した蛋白質溶液に該担体又は容器を浸漬することからなる。
【００１４】
そして本願請求項６の発明は、前記請求項１乃至５の発明に係り、前記担体又は容器には、前記蛋白質の吸着に先立ちリガンドが吸着されていることを特徴とする。以下、本発明を詳細に説明する。
【００１５】
本発明は、担体又は容器の表面に蛋白質を吸着させることにより、該表面の親水性を上げ、これにより目的成分や標識物質等の非特異的吸着を防止又は低減した担体等の製造方法に関するものである。ここで、表面に吸着させる蛋白質として好ましくは血清アルブミン、更に好ましくは酸性条件下で酸変性させた血清アルブミンを、マイクロ波によって変性した後に担体や容器に吸着させ、マイクロ波によって変性する過程で担体や容器に吸着させ、或いは、担体や容器に吸着した後に変性させることを特徴とする。また本発明の別の態様では、好ましくは血清アルブミンである蛋白質を、酸性条件下で酸変性させ、担体や容器に吸着させることを特徴とする。
【００１６】
これまでにも、マイクロ波を利用する技術が無かった分けではないが、従来知られていたのは、免疫学的活性成分を固定化した不溶性粒子担体にマイクロ波を照射して、粒子を短時間で均一に分散させる技術（特開平５−１８９７２号公報参照）や、或いは、抗原抗体反応時にマイクロ波を照射して反応を促進させる技術（特開平６−４３１６１号公報参照）であって、マイクロ波のもつ振とう、攪拌効果を利用するに過ぎない技術である。また、マイクロ波の蛋白質に対する変性効果を利用する技術として、組織標本を調製するに際して組織の固定を迅速に行う技術（特開平８−３３３８６号公報参照）があるが、これらでは、本発明のように担体や容器への非特異的吸着の抑制又は低減という効果については何ら記載していない。本発明は、マイクロ波の照射や酸変性により、蛋白質の親水性界面を効率よく表面に露出させるという効果や、担体や容器に変性された蛋白質が吸着した場合において、マイクロ波照射によりその配向性（親水性界面の向き）が整うという効果が得られるとの知見に基づいて完成されたものである。
【００１７】
本発明により製造された担体や容器は、蛋白質の吸着が制限され、その製造工程において表面に吸着させた血清アルブミン等の蛋白質はもとより、分離分析や分離精製操作における蛋白質、すなわち、目的成分、標識物質、更にはこれら以外の他夾雑蛋白質の吸着を抑制又は低減するものである。
【００１８】
本発明において、担体や容器とは、例えば、スチレン、エチレングリコール、アクリル酸、メタクリル酸等のポリマー系又はコポリマー系、シリカやフェライトなどの無機系の材料を用いて形成したもの、更にはこれらにスルホプロピル基、ジエチルアミノエチル基等のイオン交換基、トシル基、トレシル基、エポキシ基などの反応性官能基を導入した担体や容器である。担体や容器は、その形状には制限がなく、例えば、プレート状、ビーズ状、微粒子状、ゲル状、チューブ状、カップ状のものを例示することができる。
【００１９】
例えば免疫分析においては、抗原や抗体等のリガンドを担体や容器に結合したうえで、他の蛋白質、すなわち目的成分（測定しようとする成分）や標識物質（例えば検出可能な蛍光物質や酵素等を結合した抗原や抗体等）等が担体等に非特異的に吸着することを防止する必要がある。本発明の担体や容器は、かかる免疫分析等に使用するために、蛋白質を吸着させるのに先立ち、上記のようなリガンドが結合されていても良い。ここでリガンドは、本発明によって製造される担体や容器を用い、分析又は精製等を行う場合の対象物質に対して特異的に結合し得る物質を意味し、前記の抗原や抗体の他、例えばレセプター、酵素、アビジン、ビオチン、ストレプトアビジン、核酸等が例示できる。
【００２０】
マイクロ波は、周波数が３００ＭＨｚから３００ＧＨｚの電磁波である。かかるマイクロ波は、各種の通信手段として、或いはその加熱効果を利用した調理用電子レンジや温熱療法に利用されている。本発明において担体や容器、或いは蛋白質溶液に照射するマイクロ波は、水分子の回転エネルギー領域に作用を及ぼすことのできる発振周波数、出力のものであれば制限はない。かかるマイクロ波の周波数及び出力は、具体的には、発振周波数が１０００〜１００００ＭＨｚで、出力が１００〜１０００Ｗ程度である。例えば、調理用電子レンジに内蔵されているマグネトロンから発振されるマイクロ波は、周波数が２４５０ＭＨｚ、出力が２００〜６００Ｗ程度であり、本発明を実施するために利用できる。
【００２１】
本発明において、担体や容器に吸着させる蛋白質としては、牛血清アルブミン（以下ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（以下ＨＳＡ）、卵白アルブミン、カゼイン、ゼラチン、γ―グロブリン、イムノグロブリン等を例示できるが、担体や容器に対する吸着性が高く、そして、マイクロ波変性や酸変性により容易に親水性が高められることから、少なくともＢＳＡ又はＨＳＡを含む蛋白質溶液を使用することが特に好ましい。また、本発明の担体や容器を、特にヒト由来の成分を分離分析するために使用するのであれば、測定系に影響を与える可能性が小さいＢＳＡを含む蛋白質溶液を使用することが好ましい。上記のような蛋白質は、例えば通常の免疫分析におけるブロッキング操作において使用する種々の緩衝液、例えば、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、炭酸緩衝液等に溶解した状態で使用すれば良い。この場合の蛋白質濃度は、０．１から１０重量％程度とすることを例示できる。
【００２２】
マイクロ波を照射する蛋白質溶液のｐＨは、製造後の担体や容器に対する目的成分等の蛋白質の非特異的吸着量を最小化できるｐＨとすることが好ましい。かかるｐＨ値は、吸着させる蛋白質の、等電点やｐＨによる変性特性にあわせて予備的に検討を行うことで求めることができる。
【００２３】
本発明は、少なくとも血清アルブミンを含む蛋白質溶液用い、マイクロ波を照射することなく、単に蛋白質溶液のｐＨを酸性にして血清アルブミンを酸変性させ、これを担体や容器に吸着させることによって前記同様の効果を達成するものである。また、マイクロ波を照射する場合であっても、少なくとも血清アルブミンを含む蛋白質溶液のｐＨを酸性にして酸変性させておくと、マイクロ波を照射したのみの場合と比較して、非特異的吸着の低減効果を顕著にすることが可能である。このような酸変性による効果は、血清アルブミンが酸変性することによって分子界面の親水性が高められるためである。血清アルブミンを酸変性させる場合には、蛋白質溶液のｐＨを３．０から６．５、特に好ましくはｐＨ３．０から４．０の範囲に調整することが好ましい。
【００２４】
蛋白質溶液に対するマイクロ波の照射は、蛋白質溶液の温度を０から３７℃の範囲に維持したうえで、１０から１００秒程度行えば良いが、例えば調理用電子レンジを用いて室温下で３０秒以上マイクロ波を照射する場合は、出力が比較的高いため、蛋白質溶液の突沸を防止することが重要である。このためには、例えば蛋白質溶液を氷冷する等することが好ましい。これにより、突沸や温度上昇による変性が生じることがなく、本発明の効果を達成することが可能となる。より詳しい照射条件については、吸着させる蛋白質の種類に応じて事前に予備的検討を行い、製造後の担体や容器に対する目的成分等の蛋白質の非特異的吸着量を最小化できるように設定することが好ましい。
【００２５】
本発明の実施にあたっては、前記蛋白質溶液に担体又は容器を浸漬した状態でマイクロ波を照射しても良いし、蛋白質溶液に対してマイクロ波を照射した後に、該蛋白質溶液に担体又は容器を浸漬しても良い。前記蛋白質溶液に担体又は容器を浸漬した状態でマイクロ波を照射する場合は、蛋白質溶液に担体又は容器を浸漬するのと同時にマイクロ波を照射して、マイクロ波によって変性した蛋白質を担体又は容器に吸着すると共に、担体又は容器に蛋白質を吸着した後に、マイクロ波の照射よって吸着した蛋白質を変性することが例示できる。しかしながら、後の実施例からも明らかなように、蛋白質溶液に担体又は容器を浸漬し、担体又は容器に蛋白質を前もって吸着しておき、その後、マイクロ波を照射することが好ましい。この場合、マイクロ波の照射は、担体又は容器に対する蛋白質の吸着が飽和状態となった後に行うことが特に好ましい。
【００２６】
本発明は、マイクロ波の照射及び／又は酸変性を利用し、変性された蛋白質を担体や容器の表面に吸着させることで、それ以外の蛋白質が非特異的に吸着することを抑制し又は低減するものである。従って、前記したように、担体や容器に、予めリガンドが結合されている場合には、該リガンドがマイクロ波の照射及び／又は酸変性によって特異的な結合対象物質との反応性を失わないようにすることが重要である。一方で、後の実施例に示したように、リガンドを結合した担体や容器に対してマイクロ波を照射すると、その分子配向効果によりリガンドの結合部位が外側（溶液側）を向き、有効リガンド量、すなわち真に結合対象物質と結合し得るリガンド量が増加する、という、従来知られていないマイクロ波照射の効果がある。したがって、予めリガンドを結合した担体や容器については、マイクロ波の照射によりリガンドが変性して反応性が低下する可能性、リガンドが酸変性して反応性が低下する可能性、そしてマイクロ波照射によるリガンドの分子配向効果により有効リガンド量が増加する可能性を比較考慮するために、後の実施例１から３の記載に従って予備実験を行い、その結果に基づいて本発明のいずれの方法を採用するか決定することが好ましい。予備実験の結果、リガンドが酸性に調整した蛋白質溶液中で変性して前記反応性を失ってしまう場合には、これを避けるために酸性に調整していない蛋白質溶液を使用し、及び／又は、リガンドがマイクロ波の照射によって変性して前記反応性を失ってしまう場合には、蛋白質溶液に対してマイクロ波を照射した後に、該溶液に担体や容器を浸漬すると良い。
【００２７】
なお、担体や容器に予めリガンドを結合する方法は、単にリガンドを吸着させるものであっても良いし、化学的な結合によって結合するものであっても良い。また担体や容器をリガンドと直接結合するのではなく、リガンドと特異的に結合し得る物質を前記のような方法で結合しておき、この物質を介してリガンドを結合しても良い。
【００２８】
以上のようにして製造される本発明の担体や容器は、種々の用途に使用し得るものである。例えば、分離精製の工程では、工程に供する試料や分離精製によって得られた成分を入れるための容器、チューブ等に使用できる。またクロマトグラフィー等では、担体ゲルや、場合によってはこれを保持するカラムとしても使用できる。また、蛋白質試料を取り扱うための使い捨てピペットチップや、遠心分離を行うための遠心管等とすることもできる。
【００２９】
分離分析の工程では、例えば、目的成分に対する第１の特異的結合物質を予め結合した担体や容器について蛋白質を吸着させた後、試料及び目的成分に対する第２の特異的結合物質（標識物質）と混合し、担体や容器を洗浄し、そして担体や容器上に形成された、第１の特異的結合物質−目的成分−第２の特異的結合物質（標識物質）との複合体中の標識を検出する等のいわゆるサンドイッチタイプの免疫分析の他、いわゆる競合タイプの免疫分析や核酸分析に代表されるアフィニティー分析に使用することが例示できる。ここでいう標識物質は、例えば、蛍光色素、発光物質、酵素、吸光物質、ジニトロフェニル基を有する化合物等の標識を結合した抗原、抗体、レセプター、酵素等であり、蛋白質を含むものであれば、本発明の担体や容器の効果を十分に発揮できる。
【００３０】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明を更に詳細に説明するために実施例を示すが、これらは本発明の一実施の形態を示すものであり、本発明を限定するものではない。
【００３１】
実施例  １
以下に示す、２種類の製造方法により、本発明の担体を製造した。
【００３２】
（方法１）
表面をフェライトで被覆したエチレン−酢酸ビニル共重合体製の担体（粒径約１．６ｍｍ、以下フェライトビーズと記載する）約１０００個を、１５ｍｌサイズのポリプロピレン製遠沈管７本にそれぞれ取った。０．５％の蛋白質（ＢＳＡ、ＨＳＡ、ゼラチン、カゼイン、ウシγ−グロブリン、ヤギイムノグロブリンG又は卵白アルブミンの、合計７種類の蛋白質のうちの一種類）及び０．１％アジ化ナトリウムを含む０．１Ｍトリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０を調製し、フェライトビーズの入ったそれぞれの遠沈管に１０ｍｌずつ添加して静かに転倒混和後、４℃にて１２時間以上静置した。
【００３３】
（方法２）
方法1で使用したのと同一のフェライトビーズ３個を２ｍｌのマイクロチューブに取り、方法１と同一の蛋白質溶液（合計７種類のうちの一種類を含む蛋白質溶液）を２００μｌ添加した。マイクロチューブを１０分間予備氷冷した後、キャップを開け、氷冷した状態で調理用電子レンジ（ＭＲ−Ｍ２５、ターンテーブル方式、発振周波数２４５０ＭＨｚ、定格高周波出力５００Ｗ、日立製作所（株）製)に入れ、「強」で正確に30秒間マイクロ波を照射した。チューブを取り出し、キャップを閉め、３７℃のインキュベータ内にて６時間振盪撹拌し、４℃にて保存した。
【００３４】
方法１又は２の様にして製造した担体をそれぞれ３個ずつ、２ｍｌのマイクロチューブに取り、蛋白質溶液をアスピレータにて完全に吸引除去した後、１ｍｌの０．１％ＢＳＡを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）にて２回洗浄した。０．１％ＢＳＡを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で３．７μｇ／ｍｌに希釈したアルカリホスファターゼ標識抗αフェトプロテイン抗体溶液（東ソー（株）製）を１００μｌずつ添加し、３７℃にて１０分間振盪した。
【００３５】
アルカリホスファターゼ標識抗αフェトプロテイン抗体溶液を吸引除去した後、担体を１ｍｌの０．０４４％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む０．１Ｍ  ＮａＣｌ溶液にて３回洗浄した。この溶液を吸引除去したのち、担体を１２×７５ｍｍのガラス製チューブに移し、アルカリ性ホスファターゼ活性測定用の化学発光基質（ＣＳＰＤ、０．２ｍＭ溶液、Ｔｒｏｐｉｘ社製）を１００μｌ分注し、ただちに発光検出器（商品名ＬＵＭＡＴ  ＬＢ９５０１、ベルトールド社製）にて発光量をカウントした。測光時間は、検出器へのセット直後から２０秒間とした。
【００３６】
図１は、発光の測定結果を示すものである。７種類のすべての蛋白質において、マイクロ波を照射することにより、非特異的吸着量が低減した。マイクロ波照射後の非特異的吸着量は、ＢＳＡ及びカゼインが同程度で最も低く、特にＢＳＡはマイクロ波照射による非特異的吸着量の低減率が最も高かった。
【００３７】
実施例  ２
以下に示す、３種類の製造方法により、本発明の担体を製造した。
【００３８】
（方法１）
フェライトビーズ約１０００個を、１５ｍｌサイズのポリプロピレン製遠沈管に取り、合計１４種類の、ｐＨが異なる蛋白質溶液（０．５％ＢＳＡと０．１％アジ化ナトリウムを含む、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ３．０から７．５）、又は、０．５％ＢＳＡと０．１％アジ化ナトリウムを含む、０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０から１１．２））を１０ｍｌ添加して静かに転倒混和後、４℃にて１２時間以上静置した。
【００３９】
（方法２）
フェライトビーズ３個を２ｍｌのマイクロチューブに取り、方法１と同一の蛋白質溶液（合計１４種類）を２００μｌ添加した。マイクロチューブを１０分間予備氷冷した後、キャップを開け、氷冷した状態で調理用電子レンジ（ＭＲ−Ｍ２５、ターンテーブル方式、発振周波数２４５０ＭＨｚ、定格高周波出力５００Ｗ、日立製作所（株）製)に入れ、「強」で正確に30秒間マイクロ波を照射した。チューブを取り出し、キャップを閉め、３７℃のインキュベータ内にて６時間振盪撹拌し、４℃にて保存した。
【００４０】
（方法３）
まず、担体を入れることなく、方法１と同一の蛋白質溶液（合計１４種類）のみを１０ｍｌずつ１５ｍｌサイズのポリプロピレン製遠沈管に取り、３０分間予備氷冷した後、キャップを開け、氷冷したままの状態で前記調理用電子レンジに入れて「強」で正確に３０秒間マイクロ波を照射した。その後、各蛋白質溶液に約１０００個のフェライトビーズをそれぞれ添加し、キャップを閉め、４℃にて１２時間以上静置し、保存した。
【００４１】
方法１から３の様にして製造した担体をそれぞれ３個ずつ、２ｍｌのマイクロチューブに取り、蛋白質溶液をアスピレータにて完全に吸引除去した後、１ｍｌの０．１％ＢＳＡを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）にて２回洗浄した。０．１％ＢＳＡを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で３．７μｇ／ｍｌに希釈したアルカリホスファターゼ標識抗αフェトプロテイン抗体溶液（東ソー（株）製）を１００μｌずつ添加し、３７℃にて１０分間振盪した。
【００４２】
アルカリホスファターゼ標識抗αフェトプロテイン抗体溶液を吸引除去した後、担体を１ｍｌの０．０４４％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む０．１Ｍ  ＮａＣｌ溶液にて３回洗浄した。この溶液を吸引除去したのち、担体を１２×７５ｍｍのガラス製チューブに移し、アルカリ性ホスファターゼ活性測定用の化学発光基質（ＣＳＰＤ、０．２ｍＭ溶液、Ｔｒｏｐｉｘ社製）を１００μｌ分注し、ただちに発光検出器（商品名ＬＵＭＡＴ  ＬＢ９５０１、ベルトールド社製）にて発光量をカウントした。測光時間は、検出器へのセット直後から２０秒間とした。
【００４３】
図２は、発光の測定結果を示すものである。方法１により、マイクロ波を照射することなく製造した担体では、担体への蛋白質（標識物質、すなわちアルカリホスファターゼ標識抗αフェトプロテイン抗体）の非特異的吸着量が、ｐＨがｐＨ３．０から６．５、特にｐＨ３．０から４．０の蛋白質溶液を用いた場合、ｐＨ７．０から８．０の蛋白質溶液を用いた場合と比較して、顕著に低減した。方法２又は方法３により、マイクロ波を照射して製造した担体では、方法１によりマイクロ波を照射せずに製造した担体に比較して、方法２におけるｐＨ３．０で製造したものを除き、他は蛋白質溶液のｐＨに関わらず、蛋白質の非特異的吸着量の低い担体を製造することができた。
【００４４】
方法２において、ｐＨが３．５から６．０の蛋白質溶液を用いて製造した担体や、方法３において、ｐＨが３．０から４．０の蛋白質溶液を用いて製造した担体は、方法１において、ｐＨが７．０から８．０の蛋白質溶液を用いて製造した担体、すなわち、従来から製造されている担体と比較すると、明らかに蛋白質の非特異的吸着量が低減されており、特に、方法２においてｐＨが４．０の蛋白質溶液を用いることで、非特異的吸着量の最も低い担体を製造することができた。なお、方法２により製造された担体では、蛋白質の非特異的吸着量の測定間変動幅が、他の方法で製造した担体の測定間変動に比べて小さくなることも明らかとなった。
【００４５】
実施例  ３
（１）抗甲状腺刺激ホルモン抗体固定化フェライトビーズの調製
１００ｍｌのスクリューキャップ付ガラス容器を用いて、５００μｇの抗甲状腺刺激ホルモン抗体Ｆａｂ'画分（東ソー（株）製）を含む、０．１％アジ化ナトリウム添加０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を５０ｍｌ調製した。約４０００個のフェライトビーズをこの抗体溶液に添加して３３℃にて1時間撹拌し、物理吸着により結合させた。前記混合前後の溶液を高速ゲル浸透クロマトグラフィーに供して担体への抗体結合量を求めた結果、抗体はビーズに全量結合した。
【００４６】
上清を吸引除去して担体を取り出し、約２０００個ずつ、５０ｍｌの２本の遠心チューブに分けた。うち一方の担体は、４０ｍｌの０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）にて、他方の担体は４０ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ４．０）にてそれぞれ2回洗浄した後、それぞれ０．５％ＢＳＡと０．１％アジ化ナトリウムを含む同一の緩衝液（それぞれ同一のｐＨ）を分注し、４℃にて２４時間以上静置した。
【００４７】
以上のように処理した２種類の担体それぞれを、約１０００個ずつ、２本の５０ｍｌ遠心チューブに分け、前記した方法１又は方法２に基づいて、担体を製造した。すなわち、方法１として、１本ずつ、合計２本の遠沈管中の担体について、静かに転倒混和後、４℃にて１２時間以上静置して担体とした。そして方法２として、他の１本ずつ、合計２本の遠沈管中の担体について、３０分間予備氷冷した後、氷冷状態で前記調理用電子レンジにて「強」で正確に３０秒間マイクロ波を照射し、その後室温下にて６時間ローラー撹拌(９ｒｐｍ)し、同溶液中で４℃にて保存した。
【００４８】
（２）甲状腺刺激ホルモンの１ステップサンドイッチ分析
上記（１）において製造した２種類の担体それぞれを、１２個ずつ用いて、免疫分析を行った。各担体を全自動エンザイムイムノアッセイ装置（商品名ＡＩＡ−２１、東ソー（株）製）専用の分析容器に入れ、蛋白質溶液を吸引除去した後、２００μｌの０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）にて1回洗浄し、更に、０．１％ＢＳＡを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で３．７μｇ／ｍｌに希釈したアルカリホスファターゼ標識抗甲状腺刺激ホルモン抗体（東ソー（株））を１００μｌ分注した。この一方で、甲状腺刺激ホルモン(ＴＳＨ)標準液（０及び５０．１μＩＵ／ｍｌ）（東ソー（株）製）をそれぞれ専用のサンプルカップに取り、前記のようにして調製した、担体を入れた分析容器とともに装置にセットして、自動測定を行った。
【００４９】
サンプルの分注後、３７℃、４０分間の抗原抗体反応を行い、Ｂ／Ｆ洗浄を経て、アルカリ性ホスファターゼ活性測定用蛍光基質である１ｍＭの４−メチルウンベリフェリルリン酸溶液を２２０μｌ添加後、基質添加直後から３００秒間でのレートアッセイを行って、結果を濃度換算した。
【００５０】
図３及び図４は、それぞれ、０μＩＵ／ｍｌ及び５０．１μＩＵ／ｍｌのＴＳＨを含む標準液についての測定結果を示す図である。０μＩＵ／ｍｌ標準液の測定結果は、抗体を結合した担体とこれを入れた分析容器への蛋白質、すなわち目的成分（ＴＳＨ）又は標識物質（アルカリホスファターゼ標識抗甲状腺刺激ホルモン抗体）の非特異的吸着量を反映したものである。この測定結果に関しては、マイクロ波を照射して製造した担体（方法２）では、マイクロ波を照射せずに製造した担体（方法１）と比較して、非特異的吸着量が、ｐＨが８．０の蛋白質溶液を使用した場合は７５％、そしてｐＨが４．０の蛋白質溶液を使用した場合は６３％に低減された。
【００５１】
５０．１μＩＵ／ｍｌ標準液の測定結果は、主として、蛋白質の非特異的な吸着量ではなく、担体上に形成されたサンドイッチ免疫複合体の量を反映したものである。この結果に関しては、マイクロ波を照射して製造した担体（方法２の担体）では、マイクロ波を照射せずに製造した担体（方法１の担体）と比較して、ｐＨが８．０の蛋白質溶液を使用した場合でも７８％高い値となった。これは、マイクロ波の分子配向効果により、抗体分子の抗原結合部位が溶液側を向いて、有効抗体量すなわち抗原と結合し得る抗体量が増加した結果であると考えられる。マイクロ波を照射して製造した担体（方法２）であっても、ｐＨが４．０の蛋白質溶液を使用した場合、同ｐＨ８．０の蛋白質を用いて製造した場合の約５０％の酵素活性にとどまっているのは、担体に結合したリガンド（抗体）に対するマイクロ波の配向効果がｐＨに依存的であるためと考えられる。
【００５２】
図５は、図３及び図４に示した測定値について、２ＳＤ法による検出下限界値を求めた結果を示すものである。マイクロ波を照射して製造した担体（方法２）では、マイクロ波を照射せずに製造した担体（方法１）と比較して、ｐＨが８．０の蛋白質溶液を使用した場合、約５０％、すなわち約２倍の高感度化が達成されたことが分かる。
【００５３】
なお、本実施例からは、フェライト等の導電性素材が含まれている担体や容器にマイクロ波を照射しても、該導電性素材の特性（磁性等）や担体等に予め結合されたリガンドの反応性に対する悪影響は認められないことも分かる。
【００５４】
実施例４
イオン交換クロマトグラフィー用充填剤ＤＥＡＥ−５ＰＷのブロッキングおよび充填カラムの作製
市販のイオン交換ゲル（商品名ＤＥＡＥ−５ＰＷ、東ソー（株）製）を乾燥重量でそれぞれ４ｇずつ、２本の５０ｍｌのポリプロピレン製遠沈管に取り、一方には０．５％ＢＳＡと０．１％アジ化ナトリウムを含む１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を２０ｍｌ、他方には０．５％ＢＳＡと０．１％アジ化ナトリウムを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ４．０）を２０ｍｌ添加して、泡立てないよう静かに転倒混和した。ローラー式撹拌機にて室温下、９ｒｐｍで１８時間撹拌した後、２本の遠沈管中のゲル懸濁液をそれぞれ１０ｍｌずつ、別のキャップ付きポリプロピレン製のチューブ（１４ｍｌサイズ）に取り、氷水の入った３００ｍｌのポリプロピレン製ビーカーに１０分間漬けて氷冷した。
【００５５】
再度転倒混和を行った後、キャップを外してから再度ビーカーにもどし、そのビーカーをただちにターンテーブル方式の前記調理用電子レンジに入れ、「強」で正確に３０秒間マイクロ波を照射した。チューブを取り出し、キャップを付けてローラー式撹拌機にて室温下、９ｒｐｍで６時間撹拌した。
【００５６】
マイクロ波を照射せずに製造した２種類の担体（方法１の担体）と、マイクロ波を照射して製造した２種類の担体（方法２の担体）、更には前記ゲルを０．１％アジ化ナトリウムを含む１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁した対照担体の合計５種類の担体を、４．６ｍｍＩＤ×３．５ｃｍのステンレス製カラムに流速４ｍｌ／分で高圧充填した。充填液は、それぞれの担体を製造する過程で使用した緩衝液であり、対照担体については０．１％アジ化ナトリウムを含む１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）である。
【００５７】
充填後、各担体のイオン交換基と結合したＢＳＡを解離させるために、各カラムに対して１Ｍ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）を流速０．５ｍｌ／分で１時間供し、洗浄した。
【００５８】
以上のようにして調製した担体への蛋白質の非特異的吸着を観察するために、以下のような条件にて担体基材との吸着性が高いＢＳＡをサンプルとしてカラムに供し、その回収率を測定した。なお、サンプルとしたＢＳＡは担体に吸着させた蛋白質そのものであるが、担体は、上記のように製造後、高塩濃度溶液で十分に洗浄したので問題はなく、担体への吸着性を正しく反映したものと考えられる。
【００５９】
（分析条件）
試料：２５０μｇ／ｍｌのＢＳＡ溶液、
注入量：２０μｌ、
溶離液；
Ａ;２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、
Ｂ;０．５Ｍ 塩化ナトリウムを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、
溶出条件；
ＡからＢへのリニアグラジエント（５分）、
流速：１．０ｍｌ／分、
検出：ＵＶ（２８０ｎｍ）での吸光度測定。
【００６０】
カラムを流路から外した状態、すなわちいずれのカラムも使用せずに、単に試料のみを流路系に注入して求めたピーク面積を１００とし、カラムを流路に組み込んだ状態、すなわち各カラムに試料を通過させて得られたピーク面積の百分率を回収率として求め、図５に示した。言い換えれば、カラム中の担体に吸着した蛋白質（ＢＳＡ）の分だけ回収率は低下し、回収率の高い担体ほど、蛋白質（ＢＳＡ）の非特異的な吸着が低いものである。
【００６１】
方法２によって、マイクロ波を照射して製造した担体を充填したカラムでは、ｐＨが８．０の蛋白質溶液を用いた場合の回収率が８６％、ｐＨが４．０の蛋白質溶液を用いた場合の回収率が８８％となり、対照担体の回収率７６％を大幅に上回った。方法２によってマイクロ波を照射して製造した担体に関する結果のうち、ｐＨが４．０の蛋白質を使用した担体の結果が、方法１においてマイクロ波を照射せずにｐＨ４．０の蛋白質溶液を用いて製造した担体と同程度の回収率しか示さなかったのは、担体以外にエンドフィッティングへの蛋白質（ＢＳＡ）の吸着が起きているためと考えられる。すなわち、ｐＨが４．０の蛋白質溶液を用いた場合には、方法１又は方法２のいずれの方法で製造した担体でも、実質的には１００％の回収率を達成しており、１２％の回収率低下分は、おもにエンドフィッティングを中心としたカラム内接液部への蛋白質吸着に起因すると考えられる。
【００６２】
【発明の効果】
本発明によって提供される担体や容器の表面には、マイクロ波の照射及び／又は酸処理によって変性され、親水性の向上した蛋白質が吸着されているため、従来実施されている、未変性の蛋白質を吸着させる方法（いわゆる通常のブロッキング方法）により製造した担体や容器と比較して、蛋白質の非特異的吸着をより抑制又は低減できる。この結果、本発明の担体や容器を用いた場合には、分離分析や分離精製における測定感度や回収率を向上できる。
【００６３】
上記効果は、担体や容器に吸着させる蛋白質として、少なくとも血清アルブミンを含む溶液を用いると、血清アルブミンを酸変性させるのみでも達成されるものであるが、酸変性に加えてマイクロ波を照射するという形態によれば、後述する付加的な効果も達成できる。すなわち、抗体等のリガンドを結合した後にマイクロ波を照射すると、マイクロ波の分子配向効果により、リガンド分子の抗原結合部位を溶液側に向かせ、有効リガンド量を増加することができるため、分離分析や分離精製における測定感度のより一層の向上、分離精製におけるより一層の回収率の向上を達成できる。
【００６４】
本発明の担体や容器に対して、例えば、目的成分に対するリガンドである、抗体又は抗原を結合して免疫分析を行う場合等の効果は、具体的には以下の通りである。まず、目的成分である抗原や抗体、更には標識と結合した標識物質（標識抗体や標識抗原等）の蛋白質の担体等への非特異的吸着を低減できるため、標識を検出する際のバックグランドシグナルを減少できる。これは、測定感度の向上に寄与するものである。加えて、担体や容器に抗体や抗原を結合した後、蛋白質溶液中でマイクロ波を照射して製造したものでは、マイクロ波のもつ分子配向効果が表面に吸着した蛋白質のみならず、リガンドである抗体や抗原にも及び、その結果、抗体や抗原は、その抗原結合部位が溶媒側により多く配向されるようになり、有効固相抗体量が増加する。これは、測定感度の向上はもとより、検出下限界の改善に寄与する。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、実施例１で製造した担体の、蛋白質の非特異的吸着の抑制効果を示した図である。図中左から順にＢＳＡ、ＨＳＡ、ゼラチン、カゼイン、ウシγ―グロブリン、ヤギイムノグロブリンＧそして卵白アルブミンの結果を示す。
【図２】図２は、実施例２で製造した担体の、蛋白質の非特異的吸着の抑制効果を示した図である。
【図３】図３は、実施例３で製造した担体を用いて免疫分析を行った場合の結果を示す図である。
【図４】図４は、実施例３で製造した担体を用いて免疫分析を行った場合の結果を示す図である。
【図５】図５は、実施例３で製造した担体を用いて免疫分析を行った場合の結果を示す図である。
【図６】図６は、実施例４で製造した担体を用いてイオン交換クロマトグラフィーを行った場合の結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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