(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血栓溶解作用を有するプロテアーゼを生産するプロテアーゼ生産菌である、フザリウムsp.BLB（FERM BP-10493）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、優れた血栓溶解作用を発揮する新規プロテアーゼ、これを生産するプロテアーゼ生産菌及び該プロテアーゼの製造方法に関する。更に、本発明は、上記プロテアーゼを含有する血栓溶解剤又は食品、及び上記プロテアーゼ生産菌を用いて製造される発酵食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロテアーゼは、タンパク質やペプチドにおけるペプチド結合を加水分解する一群の酵素であり、これまでに微生物や動植物に由来する種々のプロテアーゼが開発され、医薬品や食品の分野で利用されている。例えば、テンペ又はテンペ菌に含まれるプロテアーゼには、血栓溶解作用があり、血栓溶解剤として有用であることが報告されている（特許文献１参照）。【０００３】
しかしながら、従来、医薬品や食品の分野で利用されているプロテアーゼでは、酸性からアルカリ性域の幅広いpH範囲において安定なものは殆ど知られていない。幅広いpH範囲において安定であるプロテアーゼは、食品や医薬品等への応用において有用である。中でも、幅広いpH範囲において安定であって血栓溶解作用を有するプロテアーゼは、血栓症を治療又は予防するための医薬品や食品として有用性が高く、その開発が望まれている。
【特許文献１】特開平３−２７７２７９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで、本発明は、酸性からアルカリ性域の幅広いpH範囲において安定であり、優れた血栓溶解作用を有するプロテアーゼ、該プロテアーゼを生産するプロテアーゼ生産菌、及び該プロテアーゼの製造方法を提供することを目的とする。更に、本発明は、上記プロテアーゼを含有する血栓溶解剤又は食品、及び上記プロテアーゼ生産菌を用いて製造される発酵食品を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者等は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、ハイビスカスの葉を使用して製したテンペから分離したフザリウム属に属する糸状菌（フザリウムsp.BLB株  FERM BP-10493）は、酸性からアルカリ性域の幅広いpH範囲において安定であり、優れた血栓溶解作用を有する新規なプロテアーゼを生産することを見出した。また、上記プロテアーゼは食品や医薬品の原料として使用できることを見出した。更に、当該微生物は食することができ、該微生物を用いて豆類や穀類を発酵させて得られる発酵食品は、上記プロテアーゼを含んでおり、血栓症の治療又は予防用の食品やその他の健康食品として有用であることを見出した。本発明は、これらの知見に基づいて、更に改良を重ねることにより完成したものである。【０００６】
即ち、本発明は、下記に掲げるプロテアーゼ、プロテアーゼ生産菌、プロテアーゼの製造方法、血栓溶解剤、食品、及び発酵食品である：
項１．  下記性質を有するプロテアーゼ：
（１）作用／基質特異性：フィブリンに対する分解活性を有する。また、合成基質であるH-D-Ile-Pro-Arg-pNA、H-D-Val-Leu-Lys-pNA、及びBz-L-Arg-pNAに対する分解活性を有する。
（２）作用pH及び至適pH：少なくともpH6.5〜11.5で作用し、至適pHは約8.5〜9.5である。
（３）pH安定性：4℃、20時間の処理条件において少なくともpH2.5〜11.5の範囲で安定である。
（４）作用温度及び至適温度：少なくとも30〜50℃で作用し、至適温度は、至適温度は約45〜50℃である。
（５）温度安定性：pH5、10分間の処理条件で少なくとも約55℃まで安定である。
（６）分子量：SDS-PAGEによる推定分子量は、約27000である。
（７）阻害特性：0.01mg/mlのSBTIによっては阻害されないが、1mMのPMSF及び0.1mMのDFPにより阻害される。
項２．  フザリウム属に属する微生物由来である、項１に記載のプロテアーゼ。
項３．  以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のいずれかのタンパク質：
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ請求項１の（１）及び（７）の欄に記載の特性を備えているプロテアーゼであるタンパク質。
項４．  項３記載のタンパク質をコードする遺伝子。
項５．  以下の（i）又は（ii）のDNAからなる遺伝子：
(i)配列番号２で表される塩基配列からなるDNA
(ii)配列番号２で表される塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ請求項１の（１）及び（７）の欄に記載の特性を備えているプロテアーゼであるタンパク質をコードするDNA。
項６．  以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子：
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ請求項１の（１）及び（７）の欄に記載の特性を備えているプロテアーゼであるタンパク質
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と80％以上の相同性を有し、且つ項１の（１）及び（７）の欄に記載の特性を備えているプロテアーゼであるタンパク質。
項７．  項４乃至６のいずれかに記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
項８．  項７に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
項９．  項８に記載のプロテアーゼ生産菌を培養し、培養物からプロテアーゼを回収することを特徴とする、プロテアーゼの製造方法。
項１０．  フザリウム属に属し、項１に記載のプロテアーゼを生産する、プロテアーゼ生産菌。
項１１．(iii)配列番号３で示される塩基配列又はこれと98％以上の相同性を有する塩基配列からなるITS-5.8SrDNAを有する、又は
(iv)配列番号４で示される塩基配列又はこれと98％以上の相同性を有する塩基配列からなる28SrDNAを有する、
ことを特徴とする項１０に記載のプロテアーゼ生産菌。
項１２．  フザリウムsp.BLB（FERM BP-10493）である、項１０に記載のプロテアーゼ生産菌。
項１３．  項１０乃至１２のいずれかに記載のプロテアーゼ生産菌を培養し、培養物からプロテアーゼを回収することを特徴とする、プロテアーゼの製造方法。
項１４．  項１に記載のプロテアーゼ又は項３に記載の蛋白質を含有する、血栓溶解剤。
項１５．  血栓症の患者又は血栓症の予防が必要とされている人に、項１に記載のプロテアーゼ又は項３に記載の蛋白質を血栓症の治療又は予防に有効な量投与する工程を含む、血栓症の治療又は予防方法。
項１６．  項１に記載のプロテアーゼ又は項３に記載の蛋白質の、血栓溶解剤を製造するための使用。
項１７．  項１に記載のプロテアーゼ又は項３に記載の蛋白質を含有する、食品。
項１８．  項１０乃至１２のいずれかに記載のプロテアーゼ生産菌を食品原料に接種して発酵させた発酵食品。
【発明の効果】
【０００７】
本発明のプロテアーゼは、優れた血栓溶解作用を有し、酸性からアルカリ性域の幅広いｐＨ範囲において安定であるので、その工業的応用範囲が広く、特に、食品や医薬等の分野において有用である。【０００８】
また、本発明のプロテアーゼ生産菌を使用して製した発酵食品は、該プロテアーゼの作用に基づいて有用生理活性を発揮できるので、健康食品としての価値が高い。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明のプロテアーゼ（フザリウムsp.BLB株由来）の作用温度及び至適温度を示す図である。
【図２】本発明のプロテアーゼ（フザリウムsp.BLB株由来）のpH安定性を示す図である。
【図３】本発明のプロテアーゼ（フザリウムsp.BLB株由来）の作用温度及び至適温度を示す図である。
【図４】本発明のプロテアーゼ（フザリウムsp.BLB株由来）の熱安定性を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
１．プロテアーゼ
本発明のプロテアーゼの酵素学的諸性質について以下に説明する。【００１１】
（プロテアーゼ活性測定法−フィブリン平板法）
牛血漿由来フィブリノーゲン（シグマ社製）を0.5重量％の濃度となるように0.1Mリン酸緩衝液pH7.2に溶解する。不溶物は、ろ紙（東洋濾紙,No.2）で濾過する。この溶液を角2号シャーレ（144×104×16mm）に20ml分注し、攪拌しながら50U/mlトロンビン溶液を100μl添加する。フィブリンが形成され凝固した後、37℃で30分間プレインキュベーションする。このフィブリン平板（人工血栓）に試料（プロテアーゼ溶液）を30μl滴下し、37℃で4時間後の溶解面積（長径×短径）を測定する。この面積を同様にして測定したウロキナーゼと比較することにより、該面積をウロキナーゼ国際単位に換算することもできる。【００１２】
（プロテアーゼ活性測定法−カゼイン分解法）
100mMのホウ酸緩衝液(pH10)を用いて最終濃度1重量％となるように調製したハマルステン氏カゼイン溶液1.5ml中に試料（プロテアーゼ溶液）0.5mlを添加し、37℃で10分間反応する。0.44M トリクロロ酢酸溶液2mlを添加して反応を停止し、20分間放置後沈殿物をろ過する。そのろ液1mlに0.44M炭酸ナトリウム水溶液5mlとフェノール試薬（100ml当たり、タングステン酸ナトリウム二水和物9.1g、モリブデン酸ナトリウム二水和物2.3g、リン酸4.5ml、塩酸9.1ml、硫酸リチウム13.6g含有）1mlを順に加え、20分間放置後、吸光波長660nmにおける吸光度を測定する。上記の測定において、酵素単位は1分間に1μgのチロシンに相当する酸可溶性タンパク質分解物を遊離する酵素量を1unitと定義した。【００１３】
（プロテアーゼ活性測定法−合成基質法）
200mMの各種緩衝液500μl中に、50ｍMの合成基質5μlと試料（プロテアーゼ溶液）455μlを添加し、37℃で10分間反応を行い、吸光波長405nmにおける吸光度を測定する。上記の測定において、酵素単位は1分間に1nmoleのp-ニトロアニリンを遊離する酵素量を1unitと定義した。【００１４】
（１）作用及び基質特異性
フィブリンに対して強い分解活性を有する。【００１５】
合成基質であるH-D-Ile-Pro-Arg-pNAに対する分解活性を100として、各種合成基質に対する分解活性（相対活性(%)）を表１に示す。合成基質であるH-D-Ile-Pro-Arg-pNA、H-D-Val-Leu-Lys-pNA及びBz-L-Arg-pNAに対して分解活性を有する。特に、H-D-Ile-Pro-Arg-pNA及びH-D-Val-Leu-Lys-pNAに対して強い分解活性を有する。一方、合成基質であるSuc-Ala-Ala-Pro-Leu-pNA、Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA及びGle-Phe-pNAに対する分解活性を有していない。【００１６】
【表１】
0004549386.tif 000002
【００１７】
（２）作用ｐＨ及び至適ｐＨ
各種緩衝液（pH2-3グリシン‐塩酸緩衝液、pH3.5-6酢酸緩衝液、pH6-8リン酸緩衝液、pH8-9トリス-塩酸緩衝液、pH9-12グリシン-水酸化ナトリウム緩衝液）にて、Bz-L-Arg- pNAの分解活性を測定した結果を図１に示す。図１に示すように、少なくともpH6.5〜11.5で作用し、至適ｐＨは約8.5〜9.5である。尚、ここで「作用する」とは、至適pH（pH9.5）における活性を100％とした場合の相対活性で30％以上を示すことを意味する。【００１８】
（３）ｐＨ安定性
50mMの各種緩衝液（pH2-3グリシン‐塩酸緩衝液、pH3.5-6酢酸緩衝液、pH6-8リン酸緩衝液、pH8-9トリス-塩酸緩衝液、pH9-12グリシン-水酸化ナトリウム緩衝液）中に本プロテアーゼを加え、4℃で20時間放置した。かかる処理後のプロテアーゼについて、合成基質であるBz-L-Arg-pNAを用いて、グリシン-水酸化ナトリウム緩衝液（pH9.5）にて、残存活性を測定した（図２）。図２に示すように、4℃、20時間の処理条件において少なくともpH2.5〜11.5の範囲で安定である。尚、ここで「安定である」とは、残存活性が90％以上を示すことを意味する。【００１９】
（４）作用温度及び至適温度
合成基質であるBz-L-Arg-pNAを用いて、100mMの酢酸緩衝液pH5.0にて、30〜60℃における分解活性を測定した結果を図３に示す。図３に示すように、少なくとも30〜50℃で作用し、至適温度は約45〜50℃である。尚、ここで「作用する」とは、至適温度（50℃）における活性を100％とした場合の相対活性で30％以上を示すことを意味する。
【００２０】
（５）温度安定性
50mMの酢酸緩衝液pH5.0中に本プロテアーゼを加え、20〜80℃で10分間放置した。かかる処理後のプロテアーゼについて、合成基質であるBz-L-Arg-pNAを用いて、グリシン-水酸化ナトリウム緩衝液pH9.5にて、残存活性を測定した（図４）。図４に示すように、pH5、10分間の処理条件で少なくとも約55℃まで安定である。尚、ここで「安定である」とは、残存活性が90％以上を示すことを意味する。【００２１】
（６）分子量
SDS-PAGE（Laemmliの方法）により測定した推定分子量は、約27000である。【００２２】
（７）阻害特性
50mMの酢酸緩衝液pH5にて、各種プロテアーゼ阻害剤を共存させて37℃で1時間放置後、合成基質であるBz-L-Arg-pNAを用いて活性を測定した。阻害剤非存在下での活性を100とした場合の相対活性(%)を算出したものを表２に示す。表２から分かるように、本プロテアーゼは、1mMのPMSF及び0.1mMのDFPにより阻害される。一方、本プロテアーゼは、0.01mg/mlのSBTIによっては阻害されない。また、本プロテアーゼは、表２に示す他のプロテアーゼ阻害剤によっても、阻害されない。
【００２３】
【表２】
0004549386.tif 000003
【００２４】
なお、本明細書においてプロテアーゼ阻害剤に関する各略記号の意味は次の通りである；SBTI：大豆トリプシンインヒビター、SSI：ストレプトマイセスズブチリシンインヒビター、ε-ACA：ε-アミノカプロン酸、PMSF：フェニルメチルスルフォニルフルオライド、TPCK：N-トシル-L-フェニルアラニルクロロメチルケトン、DFP：ジイソプロピルフルオロホスフェート、EDTA：エチレンジアミン四酢酸、E-64：t-エポキシサクシニル-L-ロイシルアミド（4-グアニジノ）ブタン、SPI：ストレプトマイセスペプシンインヒビター。【００２５】
以上のような酵素学的性質から、本発明のプロテアーゼは、トリプシンタイプのセリンプロテアーゼの１種と考えられるものの、SBTIに阻害されず、また基質特異性や広いpH安定性などから、従来のセリンプロテアーゼとは明らかに異なる新規プロテアーゼである。【００２６】
本発明のプロテアーゼは、幅広いpH域において安定性であるため、多岐にわたる分野で応用することができる。例えば、後述する血栓溶解剤や食品としての応用の他、難分解性蛋白質の分解、食肉の軟化、アミノ酸の製造、医薬や食品に応用可能な生理活性ペプチドの製造、パンの製造、発酵食品（例えば、チーズなど）の製造等において利用できる。【００２７】
更に、本発明は、アミノ酸配列の観点から、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のタンパク質を提供する：
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ上記（１）及び（７）の欄に記載の特性を備えているプロテアーゼであるタンパク質
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と80％以上の相同性を有し、且つ上記（１）及び（７）の欄に記載の特性を備えているプロテアーゼであるタンパク質。【００２８】
配列番号１で表されるアミノ酸配列は、配列番号２で表される塩基配列のオープンリーディングフレーム(ORF)がコードしているアミノ酸配列に相当している。【００２９】
上記(ｂ)のタンパク質において、「１個若しくは２個以上」の範囲は特に限定されないが、例えば1〜50個、好ましくは1〜25個、より好ましくは1〜12個、更に好ましくは1〜9個、特に好ましくは1〜5個を意味する。【００３０】
特定のアミノ酸配列において、1若しくは２個以上のアミノ酸が置換、欠失、若しくは付加させる技術は公知である。【００３１】
上記(ｃ)の蛋白質において、配列番号１で表されるアミノ酸配列との相同性としては、80％以上、好ましくは90％以上、特に好ましくは95％以上であることが望ましい。【００３２】
アミノ酸配列の相同性は、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができる。具体的には、BLAST（J.Mol.Biol., 215, 403, 1990）の解析ソフトを用いて計算される。【００３３】
また、上記（ｂ）及び（ｃ）のタンパク質において、プロテアーゼ活性は、上記（１）及び（７）の欄に記載の特性に加えて、上記（２）〜（５）に記載の特性のいずれか少なくとも１つを満たすものが好ましく、特に、上記（２）〜（５）に記載の特性の全てを満たすものが好適である。【００３４】
２．プロテアーゼ生産菌
本発明は、更に、上記プロテアーゼを生産する微生物（プロテアーゼ生産菌）として、フザリウム属に属する微生物を提供する。当該プロテアーゼ生産菌としては、フザリウム属に属し、前記性質を有するプロテアーゼを生産することができるものであれば、いかなるものでもよい。かかる生産菌の一例として、ハイビスカスの葉を使用して製したテンペから分離したフザリウムsp. BLB株が挙げられる。当該フザリウムsp. BLB株は、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質を産生する能力を有している。なお、当該フザリウムsp. BLB株には、マイコトキシンの産生能がないことが確認されている。以下に、フザリウムsp.BLB株の菌学的性質及び遺伝学的性質を示す。【００３５】
（ｉ）菌学的性質
バクトポテトデキストロース寒天培地（Bacto Potato Dextrose Agar;ベクトンディッキンソン社製）、バクトオートミール寒天培地（Bacto Oatmeal Agar；ベクトンディッキンソン社製）、及びバクトマルトエキストラクト含有寒天培地［２重量％のバクトマルトエキストラクト（Bacto Malt Extract;ベクトンディッキンソン社製）＋1.5重量％の寒天を含有］の各プレートに接種し、25℃で最長6週間培養を行うと、下記特性を示す。
(a)生育
全てのプレートにおける25℃での生育は早く、培養10日以内に直径85ｍｍプレートの全面を覆う生育を示す。
(b)菌糸
菌糸はビロード状（veltinous）から羊毛状（Floccose）で、表面色調は当初より白色を示し、裏面着色は認められない。分生子の着生によるコロニー表面の変化は観察されない。
(c)可溶性色素
可溶性色素（soluble pigment）の産生は認められない。
(d)分生子
小分生子（microconidia）と大分生子（macroconidia）が形成される。小分生子はフィアロ型（phialidic）で、Acremonium属様の分生子柄（cinidiophere）の構造である。分生子柄はほぼ単生であり、柄（stipe）は比較的長いものが多く形成される。小分生子は1〜2細胞で、粘性を持ち、柄先端より塊状（slimy）となり、形状は紡錘形（fusiform）で、表面は平滑（smooth）である。大分生子は気中菌糸基部に形成され、2〜4細胞性で、三日月状（luniform）となり、表面は平滑で、脚胞（foot cell）を有する。大分生子の幅は中厚で、長さは中程度のものが多く形成される。【００３６】
(ii)遺伝学的性質
フザリウムsp.BLB株の染色体DNAに含まれるITS-5.8SrDNA領域（internal transcription spacer領域及び5.8SリボゾームRNA遺伝子）（以下、ITS-5.8SrDNAという）の塩基配列を配列表の配列番号３に示す。また、フザリウムsp.BLB株の染色体DNAに含まれる28SリボソームRNA遺伝子（以下、28SrDNAという）の塩基配列を配列表の配列番号４に示す。これらITS-5.8SrDNA及び28SrDNAの塩基配列の決定は、フザリウムsp.BLB株からゲノムDNAを抽出し、該ゲノムDNAを鋳型として、PCRを行ってITS-5.8SrDNA及び28SrDNA領域を増幅し、常法に従ってその全長の塩基配列を決定することによって行った。なお、ITS-5.8SrDNAのPCRによる増幅にはプライマーITS5及びITS4（White, T. J., T. Bruns, S. Lee, and J. W. Tayer. (1990) Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA gene for phylogenetics. In Innis, M. A., Gelfand, D. H., Sninsky, J. J., and White,T. J. (eds) PCR protocols, a guide to methods and applications, Academic Press,Inc., New York, pp. 315-322）を使用し、また、28SrDNAのPCRによる増幅にはプライマーNL1及びNL2（O’Donnell, K. (1993) Fusarium and its near relatives. In Reynolds, D. R. and Tayor, J. W. (Eds) The Fungal Holomorph: Mitotic, Meiotic and Pleomorphic Speciation in Fungal Systematics, CAB International Wallingford, UK, pp. 225-233）を使用した。【００３７】
フザリウムsp.BLB株のITS-5.8SrDNA及び28SrDNAの塩基配列についてGenBankのデータベースに対するBLAST検索を行ったところ、フザリウムsp.BLB株は、フザリウム属に属する種名未詳菌株であることが確認された。【００３８】
当該フザリウムsp.BLB株は、平成17年1月20日に、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番１号  中央６（郵便番号305-8566））に、受託番号FERM P-20370として受託されている。また、この菌株は、現在国際寄託に移管されており、その寄託番号はFERM BP-10493である。【００３９】
上記フザリウムsp.BLB株以外に、当該プロテアーゼ生産菌の具体例としては、配列番号３で示される塩基配列又はこれと98％以上の相同性を有する塩基配列からなるITS-5.8SrDNAを有する糸状菌；及び配列番号４で示される塩基配列又はこれと98％以上の相同性を有する塩基配列からなる28SrDNAを有する糸状菌が例示される。【００４０】
３．プロテアーゼの製造方法
本発明のプロテアーゼの製造方法は、上記プロテアーゼ生産菌を培養し、培養物からプロテアーゼを採取することにより実施することができる。【００４１】
本発明の製造方法に使用する培地としては、当該微生物が良好に生育してプロテアーゼを生産する適当な培地であれば特に制限されず、適当な炭素源、窒素源、無機塩、その他栄養源を含有する合成培地或いは天然培地を使用することができる。例えば、培地の炭素源としては、グルコース、スクロース、フラクトース、マルトース、グリセリン、デキストリン、オリゴ糖、デンプン、糖蜜、コーンスティープリカー、麦芽エキス、有機酸等が挙げられる。また、窒素源としては、コーンスティープリカー、酵母エキス、各種ペプトン、大豆粉、肉エキス、フスマエキス、カゼイン、アミノ酸及び尿素等の有機窒素源、硝酸塩、アンモニウム塩等の無機窒素源等が挙げられる。無機塩類としては、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、鉄塩及びその他の金属塩等が挙げられる。更に、その他の栄養源としては、ビタミン類、アミノ酸類、核酸類等が挙げられる。【００４２】
培養は、固体培養又は液体培養のいずれでもよく、一般の微生物の培養に準じて行うことができる。好ましくは、液体培養である。液体培養は、通気攪拌培養又は振盪培養等によって行うことができる。また、液体培養の場合、培養方式については、回分培養、流加培養、連続培養の何れの方式であってもよい。培養条件（温度、pH等）は、培養するプロテアーゼ生産菌の生育特性に応じて適宜設定することができる。培養温度の一例として、20〜35℃、好ましくは25〜30℃を挙げることができる。また、pH条件の一例としてはpH4〜8、好ましくはpH5〜7を例示できる。培養時間としては、培養方法、培地の種類及び量、温度及びpH条件等で異なり、一律に規定することはできないが、通常、24〜120時間、好ましくは60〜90時間程度とすることができる。【００４３】
斯くして培養して得られた菌体及び培養上清には、プロテアーゼが蓄積されている。菌体内からプロテアーゼを溶出させるには、常法に従って行うことができる。具体的には、培養液をそのまま、或いは遠心分離又は濾過等により菌体を分離して、これを超音波、フレンチプレス又は高圧ホモジナイザー等の機械的破砕処理、シクロヘキサン、トルエン又は酢酸エチル等による処理、或いはリゾチームによる溶菌処理に供することによってプロテアーゼを菌体外に溶出させる方法を例示できる。このようにして得られるプロテアーゼ溶出液及びプロテアーゼ含有培養上清を必要に応じて目的の純度及び濃度となるように精製することもできる。プロテアーゼを精製するには、例えば、溶媒抽出、各種樹脂（例えば、イオン交換、吸着、分子篩等）処理、膜（例えば、メンブレンフィルター、限外濾過、精密濾過、逆浸透等）処理、活性炭処理、超臨界流体抽出処理、蒸留処理、晶析又はその他の処理を、単独又は二種以上を任意の順序で適宜組み合わせて行い、プロテアーゼ活性画分を回収する方法を挙げることができる。【００４４】
また、本発明のプロテアーゼは、上記の製造方法の他、後述するように、該プロテアーゼのアミノ酸配列をコードする遺伝子を導入した形質転換体を培養することにより製造することもできる。【００４５】
４．上記プロテアーゼをコードする遺伝子、組換えベクター、及び形質転換体
遺伝子
本発明は、更に、上記プロテアーゼをコードする遺伝子を提供する。【００４６】
具体的には、本遺伝子として、上記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子が例示される。前述するように、特定のアミノ酸配列において、1又は２個以上のアミノ酸を置換、欠失、若しくは付加させる技術は公知であり、上記(ｂ)のタンパク質をコードする遺伝子の製造も、市販のキット等を用いて公知の方法に従って実施される。【００４７】
また、別の態様として、上記プロテアーゼをコードする遺伝子として、具体的には、以下の（i）又は（ii）のDNAからなるポリヌクレオチドである：
(i)配列番号２で表される塩基配列からなるDNA
(ii)配列番号２で表される塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つフィブリン、H-D-Ile-Pro-Arg-pNA、H-D-Val-Leu-Lys-pNA、及びBz-L-Arg-pNAに対する分解活性を有し、0.01mg/mlのSBTIによってBz-L-Arg-pNAに対する分解活性が阻害されないタンパク質をコードするDNA。【００４８】
ここで、上記(ii)のDNAにおいて、ストリンジェントな条件とは、例えば、65℃で5×SSC溶液（１倍濃度のSSC溶液の組成は、150ｍＭ塩化ナトリウム、15ｍＭクエン酸ナトリウム）中でハイブリダイズさせ、更に0.1％のSDSを含有する0.5×SSC溶液で65℃で洗浄する条件を意味する。ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションの各操作は、「Molecular Cloning (Third Edition)」 (J. Sambrook & D. W. Russell, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)に記載されている方法等、従来公知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなる。【００４９】
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAは、通常、プローブとして使用するDNAの塩基配列と一定以上の相同性を有し、その相同性は、例えば70％以上、好ましくは80％以上、更に好ましくは90％以上、特に好ましくは95％以上が挙げられる。塩基配列の相同性は、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができる。具体的には、BLAST（J.Mol.Biol., 215, 403, 1990）の解析ソフトを用いて計算される。【００５０】
本遺伝子は、上記プロテアーゼ生産菌から常法に従って調製した全mRNAを鋳型として、本遺伝子の全長を増幅可能なように設計したプライマーを用いて、RT-PCR法により取得することができる。また、本遺伝子は上記プロテアーゼ生産菌由来のcDNAライブラリーを鋳型として、本遺伝子の全長を増幅可能なように設計したプライマーを用いてPCR法により取得することもできる。【００５１】
PCR法による本遺伝子の増幅は、鋳型となるcDNA、PCRバッファー、プライマー対（フォワードプライマー及びリバースプライマー）、dNTP mixture（デオキシヌクレオシド三リン酸の混合物）、及びDNAポリメラーゼを含む反応液中で、温度の上下のサイクルを繰り返すことによって実施される。フォワードプライマー及びリバースプライマーは、例えば、本遺伝子の５’末端又はその周辺及び３’末端又はその周辺に位置する任意の約１０〜４０ｂｐのヌクレオチド配列に基づき設計され、常法に従って合成される。具体的には、当該PCRに使用されるプライマー対としては、TempeRTFored1 primer(5’-CCTTCGCCTGTTCTTCATCAT-3’)及びTempeRTRevese1 primer(5’-AGTACCTAAGCCAAAATATGC-3’)のプライマー対が例示される。PCRバッファーは、使用するDNAポリメラーゼ等に応じて適宜選択され、市販品を用いることができる。dNTP mixture及びDNAポリメラーゼについても、市販品を用いることができる。PCRの反応は、慣用的な手順に従うか又はDNAポリメラーゼの指示書に従って行うことができ、必要に応じて反応温度、反応時間、反応サイクル、反応組成等を適宜変更して実施することもできる。PCRの条件としては、例えば、98℃で20秒間（変性）、55℃で20秒間（アニーリング）、68℃で60秒間（伸長）からなる反応工程を１サイクルとして、これを３０サイクル行う条件を挙げることができる。【００５２】
組換えベクター
上記遺伝子は、適当なベクター中に導入して使用される。本発明で使用可能なベクターは、自立的に複製するベクター（例えばプラスミド等）であってもよく、また宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製されるものであってもよい。当該ベクターとして、具体的には、細菌プラスミド、バクテリオファージ、トランスポゾン、ウイルス（例えばバキュロウイルス、パポバウイルス、ＳＶ４０、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルス等）等に由来するベクター；プラスミド及びバクテリオファージの遺伝学的エレメント由来のベクター（例えばコスミドおよびファージミド等）が挙げられる。【００５３】
当該ベクターは、発現ベクターであることが望ましい。発現ベクターにおいて、本遺伝子は、転写に必要な要素（例えば、プロモーター等）が機能的に連結されている。【００５４】
上記遺伝子を含む組換えベクターは、上記遺伝子の配列と、複製及び制御に関する情報を担う配列（例えばプロモーター、リボソーム結合部位、ターミネーター、シグナル配列、エンハンサー等）、選択マーカー遺伝子の配列等を構成要素としており、これらを公知の方法により組み合わせることにより作製される。【００５５】
上記遺伝子は、公知の方法によりベクターＤＮＡに挿入することができる。例えば、適当な制限酵素を用いてＤＮＡ及びベクターＤＮＡを特定部位で切断し、混合してリガーゼにより再結合することができる。また、上記遺伝子に適当なリンカーをライゲーションし、これを目的に適したベクターのマルチクローニングサイトへ挿入することによっても組換えベクターを得ることができる。【００５６】
形質転換体
上記遺伝子が組み込まれた組換えベクターを、大腸菌、バチルス属細菌等の細菌；酵母；昆虫細胞；動物細胞等の公知の宿主細胞に対して、公知の方法で導入することによって、上記遺伝子が導入された形質転換体が得られる。遺伝子導入方法としては、特に制限されないが、好ましくは、染色体内へのインテグレート法が挙げられる。上記組換えベクターの宿主細胞への導入は、宿主細胞の種類に応じて、公知の方法から適宜選択して行うことができる。組換えベクターを宿主細胞へ導入する方法として、具体的には、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、マイクロインジェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション等が例示される。【００５７】
上記遺伝子が導入された形質転換体を培養し、培養物から本発明のプロテアーゼを回収することにより、本発明のプロテアーゼを製造することができる。【００５８】
培養は、宿主に適した培地を用いて継代培養又はバッチ培養を行えばよい。培養は、形質転換体の内外に生産されたプロテアーゼ量を指標にして、本発明のプロテアーゼが適当量得られるまで行えばよい。【００５９】
プロテアーゼの回収方法については、前記「２．プロテアーゼの製造方法」の欄に記載する方法と同じ方法で実施できる。【００６０】
５．血栓溶解剤及び食品
上記プロテアーゼは、血栓溶解作用に優れており、血栓溶解剤の有効成分として使用することにより、血栓症の治療や予防に有用である。例えば、上記プロテアーゼをそのまま、或いはマイクロカプセル化して、これを血栓溶解剤として直接静注することにより用いることができる。また、上記プロテアーゼを常法に従って、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤等の形態に製剤化して、これを血栓溶解剤として経口投与するにより用いることもできる。【００６１】
当該血栓溶解剤の投与量については、投与対象者の性別や年齢、血栓症の症状の程度、該剤の形態や投与方法等によって異なるが、通常、１日当たり上記プロテアーゼの投与量が0.001〜20ｇ、好ましくは0.01〜10ｇとなる量が例示される。【００６２】
当該血栓溶解剤は、上記投与量単位に製剤化することが望ましい。【００６３】
また、上記プロテアーゼは、血栓溶解作用と共に、幅広いpH域において安定性であるので、各種形態の食品に配合することもできる。このように上記プロテアーゼを含有する食品は、血栓症の治療又は予防用の食品として有用である他、易吸収性食品、タンパク質強化食品等としても有用である。【００６４】
上記プロテアーゼを含有する食品において、該プロテアーゼの含有割合は、食品の形態等に応じて適宜設定することができるが、通常0.0001〜20重量％、好ましくは0.001〜10
重量％が挙げられる。また、当該食品の１日当たりの摂取量としては、食品の形態、摂取者の性別や年齢等に応じて異なるが、１日当たり上記プロテアーゼの摂取量に換算して0.001〜20ｇ、好ましくは0.01〜10ｇに相当する量が例示される。【００６５】
６．発酵食品
上記プロテアーゼ生産菌は、安全性に問題が無く、人体に無害であるので、そのまま食することができるため、該菌を発酵食品の製造に使用することができる。即ち、本発明は、更に、上記プロテアーゼ生産菌を食品原料に接種して発酵させることにより得られる発酵食品を提供する。【００６６】
当該発酵食品の製造に使用される食品原料としては、例えば、大豆、ピーナッツ、小豆、そら豆等の豆類；米、麦等の穀物；ココナツ；おから等が挙げられる。当該発酵食品の内、好適なものとして、食品原料として豆類を用いて製したものが例示される。【００６７】
当該発酵食品は、食品原料に水分含量が30〜70重量％となるように水を加え、必要に応じて殺菌をした後、上記プロテアーゼ生産菌を接種して、20〜35℃で24〜72時間培養することにより製造することができる。また、必要に応じて、食品原料に、プロテアーゼ生産菌の生育を促進する物質（例えば、デンプン等）を添加しておくこともできる。【００６８】
当該発酵食品は、上記プロテアーゼが含有されているため、該プロテアーゼの作用に基づいて血栓溶解作用を初めとする種々の生理作用を発揮するため、健康食品として有用である。また、上記プロテアーゼ生産菌を用いて製した大豆発酵食品は、従来のテンペ菌を使用して製したテンペに比して、異なる風味が呈され、新たな嗜好性を備えていると共に、上記プロテアーゼの作用に基づいて優れた生理活性が発揮される点で優れている。
【実施例】
【００６９】
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
実施例１  プロテアーゼの製造
ハイビスカスの葉を使用して製したテンペから分離したフザリウムsp.BLB株（FERM BP-10493）を、30ｍｌの液体培地（脱脂大豆粉末2重量％、グルコース2重量％、ポリペプトン0.5重量％、酵母エキス0.2重量％、KH2PO40.1重量％、及びMgSO4 0.05重量％含有）に1白金耳接種し、28℃で、72時間振とう培養し、これを前培養液とした。次いで、15ｍｌの前培養液を、1.5Ｌの液体培地（脱脂大豆粉末4重量％、グルコース3重量％、酵母エキス0.2重量％、KH2PO40.1重量％、K2HPO40.1重量％、MgSO4_0.05重量％、及びシリコン0.03重量％含有）に接種し、ジャーファーメンターで通気量0.5VVM、28℃で72時間培養した。【００７０】
得られた培養液をフィルタープレスで固液分離した。得られた培養上清のプロテアーゼ活性を、前記カゼイン分解法に従って測定したところ、68.2units／mlであった。また、得られた培養上清のプロテアーゼ活性を前記フィブリン平板法に従って測定したところ、1500IU／mlであった。【００７１】
実施例２  プロテアーゼの精製
実施例１で得られた培養上清3500mlを70%飽和となるように硫酸アンモニウムを添加し、タンパク質を塩析した。遠心分離して得られた沈殿物を100mlの20mM酢酸緩衝液（pH 5.0）に溶解し、同緩衝液で透析脱塩した。更に、透析内液350mlを同緩衝液で平衡化させたCM-TOYOPEARLカラム（4.5×30ｃｍ、東ソー社製）に通液してタンパク質をカラムに吸着させ、0.5M NaCl濃度までの同緩衝液を用いた直線濃度勾配法により吸着したタンパク質を溶出した。カゼイン及びフィブリン分解活性画分190mlを回収し、これに再度70%飽和となるように硫酸アンモニウムを添加し、タンパク質を塩析した。遠心分離して得られた沈殿物を0.2MのNaClを含む同緩衝液3mlに溶解し、Superdex 75カラム（Amersham Bioscience社製）を用いてゲル濾過を行い、カゼイン及びフィブリン分解活性画分を回収した。【００７２】
斯くして得られた画分（最終精製物）には、以下の特性を備えるプロテアーゼが精製されていることが確認された：(1)最終精製物について、作用及び基質特異性について確認したところ、前記表１に示す結果が得られた。なお、最終精製物のプロテアーゼ活性は、カゼイン分解法で634U/mgであった。(2)最終精製物について、作用ｐＨ及び至適ｐＨについて確認したところ、図１に示す結果が得られた。(3)最終精製物について、ｐＨ安定性について確認したところ、図２に示す結果が得られた。(4)最終精製物について、作用温度及び至適温度について確認したところ、図３に示す結果が得られた。(5)最終精製物について、温度安定性について確認したところ、図４に示す結果が得られた。(6)最終精製物について、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ったところ、単一のバンド（推定分子量約27000）を示した。(7)最終精製物について、阻害剤の影響を確認したところ、前記表２に示す結果が得られた。【００７３】
また、斯くして得られた最終精製物は、マウスを用いた急性毒性試験により安全性が確認された。また、当該最終精製物には、突然変異誘起性も陰性であることも確認された。【００７４】
実施例３  プロテアーゼのアミノ酸配列、及びこれをコードする塩基配列の同定
＜実施例２で得られたプロテアーゼをコードするゲノムDNA配列の同定＞
上記実施例２で得られたタンパク質について、Ｎ末端側のアミノ酸配列を解析した。そして、上記実施例２で得られたタンパク質のＮ末端側のアミノ酸配列は、Fusarium oxysporum、Phaeosphaeria nodorum SNP1及びVerticillium dahliae由来のトリプシンに対する相同性があることが分かった。そこで、これらの情報を考慮して、プライマー対A（5’-GGCGACTTTCCCTTCATCGTGAGCAT-3’及び5’-TCACCCTGGCAAGAGTCCTTGCCACC-3’）を設計した。このプライマー対Aを用いて、フザリウムsp.BLB株（FERM BP-10493）のゲノム DNAを鋳型にしてPCR反応を行った。PCR反応にはLA Taq polymerase (TaKaRa社)を用いた。ゲノムDNAはフザリウムsp.BLB株からISOPLANT(ニッポンジーン社)を用いて抽出した。この結果、約600 bpのDNA断片が増幅した。【００７５】
次に、この増幅断片をシークエンスし、新たなプライマー対B（5’-ACCATTCCCATTGTCTCTCGCGCCACTT-3’及び5’-GGCGTTAAGAAGGGTACCACCGCACCAA-3’）を設計した。一方、フザリウムsp.BLB株のゲノム DNAをSalI 消化した後、自己伸長（self ligation）させた。これを鋳型にして、プライマー対Bを用いてインバースPCR反応を行った結果、約2.5 KbpのDNA断片が増幅した。【００７６】
更に、得られた増幅断片をシークエンスし、新たなプライマー対C（5’-CTTGCCAGGGTGACAGCGGTGGCCC-3’及び5’-CAAGGATCAGCATCCCGATGAGGAAAGT-3’）を設計した。一方、フザリウムsp.BLB株のゲノム DNAをSacI 消化した後、自己伸長（self ligation）させた。これを鋳型にして、プライマー対Cを用いてインバースPCR反応を行った結果、約4 KbpのDNA断片が増幅した。この増幅断片をシークエンスし、本発明のプロテアーゼをコードする1740 bpのゲノム塩基配列（配列番号５）が明らかになった。尚、ここでの遺伝子操作に用いた試薬は、TaKaRa社製のものを使用した。また、DNAシークエンスにはBigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems社)を用いた。【００７７】
＜実施例２で得られたプロテアーゼをコードするcDNA配列、及びアミノ酸配列の同定＞
上記で同定されたゲノム塩基配列（配列番号５）にはイントロンが存在する為、実施例２で得られたプロテアーゼをコードする領域を特定するには、cDNAの塩基配列の同定が必要である。そこで、以下の方法に従って、実施例２で得られたプロテアーゼをコードするcDNA配列、及びアミノ酸配列の同定を行った。【００７８】
まず、フザリウムsp.BLB株の培養液及びFastRNA Pro Kit (BIO 101社)を用いて、全RNAを取得した。更に、得られた全RNAから、SuperScriptIII ファーストストランドシステム(インビトロジェン社)及びオリゴdT primerを用いて、cDNA ライブラリーを調製した。また、別途、TempeRTFored1 primer (5’-CCTTCGCCTGTTCTTCATCAT-3’)とTempeRTRevese1 primer (5’- AGTACCTAAGCCAAAATATGC-3’)とを作製した。そして、このプライマー対、LA Taq(TaKaRa社)及び上記で得られたcDNAライブラリーを用いて、目的のcDNAをPCR法により増幅した。PCR反応条件は(98℃20sec., 55℃20sec., 68℃60sec.)の30cycleで行った。増幅した約800 bpのDNA断片をシークエンスした結果、実施例２で得られたプロテアーゼをコードするcDNA配列（配列番号２）及び実施例２で得られたプロテアーゼのアミノ酸配列（配列番号１）が明らかになった。【００７９】
実施例２で得られたプロテアーゼのアミノ酸配列（配列番号１）は、Fusarium oxysporum由来のトリプシンとは76％の相同性を示し、Phaeosphaeria nodorum SNP1由来のトリプシンとは62％の相同性を示すことが明らかとなった。【００８０】
実施例４  発酵食品の製造
1kgの大豆を、3Lの1.0重量％乳酸水溶液中に一夜浸漬し、皮を除去した。その後、皮を除去した大豆を1.0重量％乳酸水溶液に浸漬し、30分間蒸煮した。次いで、蒸煮後の大豆に20ｇのデンプンを添加して混合し、フザリウムsp.BLB株の前培養液3mlを接種し、28℃で48時間培養して、大豆発酵食品（テンペ）を製造した。斯くして得られた大豆発酵食品（テンペ）は、従来のテンペ菌（Rhizopus）を使用して製造したテンペとは、異なった風味が醸されており、新たな嗜好性を有する大豆発酵食品であることが確認された。【００８１】
また、上記で得られた大豆発酵食品1gを、4mlの生理的食塩水に添加して、28℃で3時間攪拌した後、遠心分離により上清を回収した。得られた上清のプロテアーゼ活性を前記フィブリン平板法に従って測定した。また、比較のために、フザリウムsp.BLB株の代わりに、従来のテンペ菌（Rhizopus）を使用して、上記と同様の方法で大豆発酵食品（テンペ）を作成し、同様にプロテアーゼ活性を測定した。この結果、フザリウムsp.BLB株を用いて製造した大豆発酵食品の場合、その溶解面積は150mm2であったのに対して、従来のテンペ菌を用いて製造したテンペでは70mm2であった。【００８２】
以上の結果から、フザリウムsp.BLB株を用いて大豆発酵食品（テンペ）を製造することにより、従来のテンペ菌を使用する場合に比して、血栓溶解活性が高い発酵食品が提供できることが確認された。【００８３】
また、上記で得られた大豆発酵食品は、マウスを用いた急性毒性試験により安全性が確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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