(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程（Ａ）から（Ｃ）を備えて試料核酸の塩基配列を決定する塩基配列決定方法。
（Ａ）表面が導電性をもつ基板表面に標準核酸を固定し、走査型プローブ顕微鏡の微小プローブを用いて核酸を構成する各塩基種に固有の物理信号として、そのプローブと前記基板間に加えられたバイアス電圧の変化に対する電気的応答を塩基単位で取得して、それらの４種類の塩基に対応した物理信号としての前記電気的応答のみからなるデータベースを構築する工程、
（Ｂ）表面が導電性をもつ基板表面に試料核酸の識別の対象となる塩基配列を持つ部分を伸長した状態で固定し、前記プローブを用いて核酸を構成する各塩基種に固有の物理信号として、そのプローブと前記基板間に加えられたバイアス電圧の変化に対する塩基単位での電気的応答をデータベース用の物理信号を取得したときと同じ条件で塩基単位で取り出す工程、及び
（Ｃ）試料核酸について取り出した物理信号を前記データベース内の物理信号と照合して各塩基の塩基種を同定して塩基配列を決定する工程。
【請求項２】
前記電気的応答はプローブと塩基との間に流れるトンネル電流が一定になるようにフィードバック制御したときのそのバイアス電圧の変化に対する塩基像の高さの変化である請求項１に記載の塩基配列決定方法。
【請求項３】
前記電気的応答は、プローブと塩基間の距離を固定したときの、そのバイアス電圧の変化に対するプローブと塩基との間に流れるトンネル電流の変化である請求項１に記載の塩基配列決定方法。
【請求項４】
前記バイアス電圧は交流成分を含み、
前記電気的応答はそのバイアス電圧の変化に対するプローブと塩基との間の静電容量の変化である請求項１に記載の塩基配列決定方法。
【請求項５】
走査型プローブ顕微鏡からなり、核酸を固定する表面が導電性をもつ基板の表面に固定された核酸を微小プローブによって塩基単位で認識することができるとともに、認識した塩基に固有の物理信号としてそのプローブと前記基板間に加えられたバイアス電圧の変化に対する電気的応答を取り出すことのできる測定部と、
前記プローブを用いて取得した４種類の核酸構成塩基種に固有の物理信号としての前記電気的応答のみからなるデータベースを記憶した記憶部と、
前記プローブを用いて取得した試料核酸の物理信号としての前記電気的応答を前記データベース内の物理信号としての前記電気的応答と照合して各塩基の塩基種を同定して塩基配列を決定し出力するデータ処理部と、
を備えた塩基配列決定装置。
【請求項６】
前記データ処理部は決定された塩基配列を出力するための表示部を備えている請求項５に記載の塩基配列決定装置。
【請求項７】
前記測定部は、前記プローブと塩基間に流れるトンネル電流が一定になるようにフィードバック制御し、そのバイアス電圧の変化に対する塩基の高さの変化を前記電気的応答として測定する請求項５に記載の塩基配列決定装置。
【請求項８】
前記測定部は、前記プローブと塩基間の距離を固定し、前記バイアス電圧の変化に対するプローブと塩基との間に流れるトンネル電流の変化を前記電気的応答として測定する請求項５に記載の塩基配列決定装置。
【請求項９】
前記バイアス電圧は交流成分を含み、そのバイアス電圧の変化に対するプローブと塩基との間の静電容量の変化を前記電気的応答として測定する請求項５に記載の塩基配列決定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）の塩基配列決定に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸の塩基配列の決定法としては、マキサム・ギルバート法やサンガー法が広く用いられてきた。このうちサンガー法は、ターゲットとするＤＮＡと、蛍光標識されたＤＮＡ伸長阻害剤との反応を利用して様々な鎖長のＤＮＡ相補鎖を複製し、電気泳動法を併用して塩基配列を決定するもので、現在ではＤＮＡ塩基配列分析の主流となり、種々の改良が加えられてきている（特許文献１参照。）。【０００３】
また近年、特定の遺伝子の塩基配列の変異（１塩基多型：ＳＮＰｓ）を検出する方法として、ＤＮＡアレイを用いた検出方法が開発され、商品化されている。これは既知のＤＮＡを固定した基板上に蛍光標識した未知のＤＮＡを流してハイブリダイゼーションさせることにより、蛍光標識した未知のＤＮＡと結合した既知のＤＮＡから塩基配列を読み取る（特許文献２参照。）。【０００４】
この他に提案されている技術としては、相補鎖合成時に、基板上に固定された蛍光標識ＤＮＡポリメラーゼと、その種類ごとに特異的に蛍光標識されたヌクレオチドとの間で起こる蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を光学的に観察することにより元の塩基配列を決定する方法（特許文献３参照。）や、自己凝集又はハイブリダイズしたＤＮＡの三次元構造、形状などを走査型プローブ顕微鏡を用いて測定し、塩基配列を決定する方法（特許文献４，５参照。）等がある。
【特許文献１】特開平０５−０３８２９９号公報
【特許文献２】特表２００３−５２８６２６号公報
【特許文献３】米国特許第６,２１０,８９６Ｂ１号公報
【特許文献４】特開平９−２９９０８７号公報
【特許文献５】特開平１０−２１５８９９号公報
【特許文献６】特開平１０−２８２０４０号公報
【非特許文献１】「蛋白質  核酸  酵素」誌、Vol.48, No.5, PP.614-620 (2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従来法として広く用いられているサンガー法は、（１）ターゲットとなる１本鎖ＤＮＡの増幅工程、（２）伸張阻害剤を含む溶液中での相補鎖ＤＮＡの伸張工程、及び（３）電気泳動法による生成ＤＮＡの分離工程よりなり、各工程に煩雑な処理や長い時間を要する。また、伸長工程に使用される蛍光標識ヌクレオチド（サンガー試薬）は非常に高価であり、解析コストを低減する上で大きな障害となっている。さらに、最終段階で電気泳動を利用するため、一度に解析できる配列長が８００塩基程度と限られているため、多数のキャピラリーを電気泳動路として用意し電気泳動を並列で行なうことで解析速度の向上を図っているが、現行の技術では、オーダーメイド医療への適用を可能にするために必須となる飛躍的な解析速度の向上は困難である。【０００６】
ＤＮＡアレイを用いた１塩基多型分析法は、基板上へのプローブＤＮＡの集積度を上げることで解析速度の向上が容易に図れるため、近年主流になりつつあるが、ミスマッチに伴う配列の読み間違いや、基板担体に非特異的に吸着したターゲットＤＮＡの存在により、測定結果に誤差が生じるなどの問題がある。また、サンガー法と同様に、本方法では検出感度を向上させるための前処理として、ターゲットＤＮＡの増幅が必要となるが、この際、プローブの集積度向上とともに、増幅産物の飛散に由来する擬陽性の発現の可能性も大きくなる。【０００７】
また、蛍光共鳴エネルギー移動を利用する技術は、１秒間に１，０００塩基とも言われる酵素のＤＮＡ複製能力を利用すること、また一度に読めるＤＮＡ鎖長に理論上は制限がないことなどより、解析速度の大幅な向上を期待できるが、１分子レベルの蛍光観察が必要となるため、充分な感度を持った現行の光学系がないこと、また酵素の合成ミス、失活等、実用化には解決すべき問題が多い。【０００８】
ＤＮＡの三次元構造、形状などを走査型プローブ顕微鏡を用いて観察し、塩基配列を決定する方法は、得られる情報が独立した塩基種ごとの固有の情報でないため、核酸全体の構造、形状から塩基配列を類推しなければならず、膨大なデータベースの構築を必要とし、その類推アルゴリズムの開発も含め、実用化困難な問題が多い。【０００９】
本発明はターゲットとなる核酸の増幅を不要にして処理時間とコストを低下させるとともに、塩基種の同定を容易にすることのできる塩基配列決定方法と装置を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の塩基配列決定方法は、微小プローブを用いて核酸を構成する各塩基種に固有の物理信号を取得し、それらの物理信号からなるデータベースを構築しておき、以下の工程（Ａ）から（Ｃ）を備えて試料核酸の塩基配列を決定する。
（Ａ）試料核酸の識別の対象となる塩基配列を持つ部分を伸長した状態で基板表面上に固定する工程、
（Ｂ）前記基板表面上に固定された該核酸の前記部分に対し、データベース用の物理信号を取得したときと同じ条件で、該核酸を構成する個々の塩基を前記プローブを用いて測定し、各塩基に固有の物理信号を塩基単位で取り出す工程、及び
（Ｃ）取り出した物理信号を前記データベース内の物理信号と照合して各塩基の塩基種を同定して塩基配列を決定する工程。【００１１】
前記基板として少なくとも核酸を固定する表面が導電性をもつものを使用し、前記プローブを備えた測定装置として走査型プローブ顕微鏡を使用し、前記物理信号としてそのプローブと塩基間に加えられた電界に対する電気的応答を取り出すようにすることが好ましい。【００１２】
好ましい一形態では、前記電界は前記プローブと塩基間に印加されたバイアス電圧であり、前記電気的応答はプローブと塩基間に流れるトンネル電流が一定になるようにフィードバック制御したときのそのバイアス電圧の変化に対する塩基像の高さの変化である。塩基像の高さとは、トンネル電流が一定になるようにフィードバック制御されているときのプローブの高さ（Ｚ方向の位置）である。【００１３】
好ましい他の形態では、前記電界は前記プローブと塩基間に印加されたバイアス電圧であり、前記電気的応答は、プローブと塩基間の距離を固定したときの、そのバイアス電圧の変化に対するプローブと塩基との間に流れるトンネル電流の変化、すなわち走査型トンネル分光法（ＳＴＳ）で得られるＩ−Ｖ曲線である。【００１４】
好ましいさらに他の形態では、前記電界は前記プローブと塩基間に印加されたバイアス電圧であり、かつこのバイアス電圧は交流成分を含み、前記電気的応答はそのバイアス電圧の変化に対するプローブと塩基間の静電容量の変化である。【００１５】
本発明の塩基配列決定装置は、基板の表面に固定された核酸を微小プローブによって塩基単位で認識することができるとともに、認識した塩基に固有の物理信号を取り出すことのできる測定部と、前記プローブを用いて取得した核酸構成塩基種に固有の物理信号からなるデータベースを記憶した記憶部と、前記プローブを用いて取得した試料核酸の物理信号を前記データベース内の物理信号と照合して各塩基の塩基種を同定して塩基配列を決定し出力するデータ処理部と、を備えている。【００１６】
前記データ処理部は決定された塩基配列を出力するための表示部を備えていることが好ましい。
前記測定部は前記プローブと塩基間に電界を加えることができ、その電界に対する電気的応答を測定することのできる走査型プローブ顕微鏡を構成しているものが好ましい。この場合、前記電気的応答を前記物理信号として用いる。【００１７】
前記測定部の好ましい一形態は、前記電界として前記プローブと塩基間にバイアス電圧を印加し、プローブと塩基間に流れるトンネル電流が一定になるようにフィードバック制御し、そのバイアス電圧の変化に対する塩基の高さの変化を前記電気的応答として測定するものである。【００１８】
前記測定部の好ましい他の形態は、前記電界として前記プローブと塩基間にバイアス電圧を印加し、プローブと塩基間の距離を固定し、そのバイアス電圧の変化に対するプローブと塩基との間に流れるトンネル電流の変化を前記電気的応答として測定するものである。このときのトンネル電流は、トンネル電流値自体のみならず、バイアス電圧に対する１次又は高次の微分値も含むものである。【００１９】
前記測定部の好ましいさらに他の形態は、前記電界として前記プローブと塩基間に交流成分を含むバイアス電圧を印加し、そのバイアス電圧の変化に対するプローブと塩基との間の静電容量の変化を前記電気的応答として測定するものである。
【発明の効果】
【００２０】
本発明は、核酸を構成する各塩基のもつ物理的特性を、プローブにより直接計測するものであるため、前述した酵素の失活の問題や、核酸複製の際に発生する生物学的な読み取りミスを排除できる。【００２１】
１分子のＤＮＡを測定対象にできるため、ＰＣＲ増幅や、分離のための電気泳動を行なう必要がなく、煩雑な作業工程を省略することが可能であり、解析速度の飛躍的な向上が期待できる。【００２２】
非破壊の測定方法であるため、同一サンプルでの繰り返し測定も可能である。
解析の手段として光を用いないため、蛍光体や修飾ヌクレオチド等の高価な試薬が不要となり、解析コストを大幅に低減することが可能となる。【００２３】
また、測定の際、塩基識別の根拠となる物理信号を１塩基単位で得ることができるため、比較用のデータベースを構成する特性パターンは、核酸を構成する４種類の塩基に対応するもののみでよく、簡便なデータベースの構築が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明を走査型プローブ顕微鏡により実現する一実施例の装置構成を図１に概略的に示す。（Ａ）は概略ブロック図、（Ｂ）は試料核酸を固定した基板を示す平面図である。
測定部としての走査型プローブ顕微鏡は、その構成要素として先端に探針をもつ微小プローブ２と、制御装置４を備えている。試料の核酸６は少なくとも表面が導電性の基板８の表面上に固定されて走査型プローブ顕微鏡内のステージ上に載置される。制御装置４はプローブ２と基板８の表面との間にバイアス電圧Ｖｓを印加し、プローブ２から試料核酸６に流れるトンネル電流Ｉｔを検出するとともに、プローブ２の位置制御を行ない、試料核酸６から構成塩基単位でその塩基種に固有の物理信号Ｓを取り出す。【００２５】
走査型プローブ顕微鏡としては、原子間力顕微鏡、走査型近接場光顕微鏡等さまざまな種類のものを使用することができるが、好ましくは走査型トンネル顕微鏡である。またこのとき取り出す物理信号Ｓの一例は、核酸６の構成塩基によるバイアス電圧Ｖｓに対する電気的応答である。【００２６】
そのような電気的応答の一例は、プローブ２と塩基との間に流れるトンネル電流Ｉｔが一定になるようにプローブ２の高さをフィードバック制御（ＦＢ）したときのそのバイアス電圧Ｖｓの変化に対する塩基の高さの変化、すなわちプローブ２の高さの変化である。【００２７】
そのような電気的応答の他の例は、プローブ２と塩基間の距離を固定したときの、そのバイアス電圧Ｖｓの変化に対するプローブ２と塩基との間に流れるトンネル電流Ｉｔの変化又はその１次もしくは高次の微分値の変化である。
そのような電気的応答のさらに他の例は、バイアス電圧Ｖｓが交流成分を含んでいるときのそのバイアス電圧の変化に対するプローブ２と塩基との間の静電容量の変化である。【００２８】
１０はプローブ２を用いて制御装置４により取得した核酸構成塩基種に固有の物理信号からなるデータベースを記憶した記憶部である。近年、ＤＮＡ等の核酸分子を極小の分子素子として利用する試みがさかんに行なわれており、その電気伝導特性が核酸を構成する塩基配列によって大きく異なることが報告されている。この差異は、核酸の構成成分である４種類の塩基（アデニン、グアニン、シトシン、チミン）の酸化還元電位の違いに起因すると考えられており、この特性の違いをデータベースとして記憶部１０に記憶しておく。【００２９】
データベースとなる物理信号Ｓは、測定対象試料の核酸の測定に先立って取得され、記憶部１０に保存されている。データベース構築用に用いる標準核酸としては、同一塩基より構成される合成単鎖核酸のほか、単一塩基やヌクレオシド、ヌクレオチドなどを用いることができる。【００３０】
１２はデータ処理部であり、プローブ２を用いて取得した試料核酸８の物理信号を記憶部１０に保存されているデータベース内の物理信号と照合して各塩基の塩基種を同定して塩基配列を決定し出力する。データ処理部１２には出力部として表示装置が接続されており、決定された塩基種がその表示装置に表示されていく。試料核酸の塩基配列に従って順次その塩基種を同定していくことにより、塩基配列の決定となる。
データ処理部１２と記憶部１０はこの走査型プローブ顕微鏡に専用のコンピュータにより実現することもできるし、汎用のパーソナルコンピュータにより実現することもできる。【００３１】
塩基配列を解読しようとする核酸６を基板８に固定する方法を説明する。基板８の種類は金属結晶基板のほか、金属を蒸着した基板等、少なくとも表面が導電性であれば種類は問わない。核酸を基板上に固定する方法としては、目的とする核酸の溶液を真空中で瞬間的に基板上に噴霧して揮発成分を除去することにより核酸のみを基板表面に固定する方法（非特許文献１参照。）や、ストレプトアビジンとビオチンとの相互作用を利用する方法（特許文献６参照。）などがある。塩基のみを基板に固定する場合には、真空中での加熱蒸着法を用いることができるが、ＤＮＡやＲＮＡは真空中での加熱蒸着では分解するため、上記のような方法を用いる。【００３２】
（実施例）
走査型プローブ顕微鏡として走査型トンネル顕微鏡を用い、微小プローブと塩基間におけるトンネル電流のバイアス電圧依存性の一例として塩基高さのバイアス電圧依存性を物理信号として塩基配列を決定する方法の測定例を以下に示す。【００３３】
走査型トンネル顕微鏡の通常測定モードは、プローブの探針と試料との間にバイアス電圧を印加して探針と試料との間に流れるトンネル電流を検出し、そのトンネル電流が一定になるように探針と試料との距離をフィードバック制御するものである。プローブ２にはＸ，Ｙ及びＺ方向のそれぞれに駆動するピエゾ素子が設けられており、プローブ２の探針は基板８の表面上でＸ，Ｙ及びＺ方向に移動させられる。基板８の表面をＸ−Ｙ平面、基板８の表面からプローブ２に向かう方向をＺ方向とする。【００３４】
データベースを構築するために、アデニン、グアニン、シトシン、チミンの各塩基をそれぞれ含むＴＥ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ＥＤＴＡ−Ｎａ2）溶液をＣｕ（１１１）基板上に塗布し、真空中で加熱蒸着することにより塩基を基板上に固定した。測定の際、トンネル電流値を５ｐＡ−１０ｐＡの間の一定値に設定し、バイアス電圧を基板に対して−６Ｖから４Ｖまで段階的に変化させ、観察される塩基像の高さ（波形高さ）を測定した。【００３５】
印加したバイアス電圧を横軸に、観察された塩基像高さを縦軸にとったグラフを図２に示す。グラフに示すように、各塩基種により観測される高さパターンのバイアス電圧依存性に違いが見られることがわかる。このとき測定された高さの違いは、各塩基の持つπ電子系の占有側及び非占有側の軌道の電子状態分布の違いを反映しており、塩基固有の酸化還元電位を表している。これらの塩基の電子状態分布パターンをデータベース化し、記憶部１０に保持しておく。【００３６】
次に基板８に固定した試料核酸の測定を行なう。
まず、走査型トンネル顕微鏡の通常の測定モードにより、プローブ２の探針と基板８との間に一定の直流バイアス電圧が印加され、プローブ２がＸ，Ｙ方向に走査される。Ｘ，Ｙ方向の走査中に、プローブ２の探針が核酸６にｎｍ程度に接近すると、トンネル効果によりプローブ２の探針と核酸６との間にトンネル電流が流れる。制御装置４はこのトンネル電流を増幅し、それが一定になるようにプローブ２のＺ方向のピエゾ素子を駆動するＺ方向制御電圧 が印加されてプローブ２の探針の高さが制御されることにより、核酸６の画像が取得され、その画像中での塩基の位置が特定される。【００３７】
次にその得られた核酸６の画像を基にして、各位置の塩基の同定を行なう。その得られた核酸６の塩基位置にプローブ２の探針が位置決めされ、データベース用の物理信号を取得したときと同じ条件で、すなわちトンネル電流値を５ｐＡ−１０ｐＡの間の一定値に設定し、バイアス電圧を基板に対して−６Ｖから４Ｖまで段階的に変化させることにより、観察される塩基像の高さにより電子状態分布パターンが測定される。このようにして、測定対象となる核酸の各塩基より得られる電子状態分布パターンをデータベース内のものとを照合し、パターンマッチングにより最も類似度の大きいものがその塩基種であると同定される。このようにして塩基の配列に従って順次同定して時系列データ化することにより塩基配列を決定することができる。【００３８】
ここに示したものは、観察される塩基の高さのバイアス電圧依存性の例であるが、このほかにも、走査型トンネル分光法で得られるＩ−Ｖ曲線などの固有スペクトルパターンを用いて塩基配列を決定することができる。走査型トンネル分光法では、プローブ２の探針と核酸６との距離を固定した状態でプローブ２の探針と核酸６との間に印加するバイアス電圧を掃引してその電圧変化に依存したトンネル電流の変化をＩ−Ｖ曲線として取得し、そのＩ−Ｖ曲線を物理信号として塩基種の同定に利用する。【００３９】
そのほかにも、塩基種によるトンネル障壁の大きさの違い、微小プローブと塩基間の静電容量やその周波数特性の違いを、市販のキャパシタンスブリッジ等を用いて物理信号として取り出し、塩基配列を決定することもできる。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明ではＤＮＡやＲＮＡの塩基配列を決定するのに利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】（Ａ）は本発明を走査型トンネル顕微鏡により実現する一実施例を概略的に示すブロック図、（Ｂ）は試料核酸を固定した基板を示す平面図である。
【図２】同実施例におけるデータベースの一例を示すグラフである。
【符号の説明】
【００４２】
２      微小プローブ
４      制御装置
６      核酸
８      基板
１０      記憶部
１２      データ処理部
【図１】
0004558797.tif 000002
【図２】
0004558797.tif 000003