(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
多発性骨髄腫を治療するための医薬の製造におけるアプリジンの使用。
【請求項２】
前記アプリジンが、併用療法を提供するために他の1種もしくは複数の薬物との組合せで使用される、請求項1に記載のアプリジンの使用。
【請求項３】
多発性骨髄腫の治療において使用するために、アプリジンと、製薬上許容できる担体、媒体または希釈剤とを含む製薬組成物。
【請求項４】
アプリジンを含む製薬組成物と、再構成剤とを別々の容器に含む、アプリジンを投与するための多発性骨髄腫の治療のための医用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の治療における、特に多発性骨髄腫の治療におけるアプリジンおよび類似体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
多発性骨髄腫は、1つのクローンに由来する形質細胞の悪性増殖を代表するものである。多発性骨髄腫および骨髄腫という用語は、交換可能に使用されてもよい。
【０００３】
形質細胞は、生体が有害な物質を排除するのを促進するために、血流中を移動する蛋白質である抗体を産生する。それぞれのタイプの形質細胞は、1種類の抗体を大量に作ることによって1つの特定の物質のみに反応する。これらの抗体は、その1つの物質を見つけて作用する。生体は、多くのタイプの形質細胞を持っているので、多くの物質に反応することができる。癌が形質細胞を侵すと、生体はこれらの細胞を増々産生し続ける。この必要とされない形質細胞は、全て異常であり、全てまったくよく似ており、骨髄腫細胞と呼ばれる。骨髄腫細胞は、骨髄の内部や骨の固い外側部分に集まる傾向がある。ときには、1つの骨にのみ集まり、単一の塊、すなわち形質細胞腫と呼ばれる腫瘍を形成する。しかし、多くの場合、骨髄腫細胞は、多くの骨に集まり、しばしば多くの腫瘍を形成して他の問題を引き起こす。これが起きたときには、その疾患を多発性骨髄腫(MM)と呼ぶ。
【０００４】
MMの人々は、異常に多数の同一の形質細胞を持っているので、過剰量の1つのタイプの抗体も持っている。腫瘍、その産物、およびそれに対する宿主の反応は、多くの器官機能傷害および骨痛または骨折、腎不全、感染に対する敏感性、貧血、高カルシウム血症、そしてときには凝固異常、神経性症状、および過粘稠度の血管性徴候という結果をもたらす。
【０００５】
MMは、西側世界において2番目に多く診断される血液性悪性疾患であり、米国内だけでも新たな症例の年間発生率は約15000件である。残念ながら、MMは現在のところ不治の疾患と考えられており、この疾患に対する細胞毒化学療法に基づく療法の有効性を向上させるための過去約30年にわたる多大な努力にもかかわらず、MM患者の全体的な生存期間は、3〜4年を中央値として本質的に変わっていない。重要なことに、MM患者の1/3超である65歳未満の患者におけるMM診断年齢の中央値は、診断時で55歳未満である。このような大きな割合の比較的若いMM患者にとって、MMという診断は、たとえ併存する他の病的状態がなくとも、彼らの全体的な生存期間が、同年代の非MM患者の平均推定余命よりもかなり短かくなる確率が高いことを意味している。
【０００６】
最近、MMの治療管理における一連の重要な進歩、すなわちサリドマイド(およびその免疫調節性誘導体)とプロテアソーム阻害物質という2つの新しいクラスの抗癌剤の抗MM活性の証拠資料が得られている。これらの薬剤は、従来的すなわち大量投与細胞毒化学療法に基づく療法措置に対して再発/不応性であったMM患者の組において活性であることが示されてはいるが、かなりの割合のMM患者がそれらの新しい薬剤に対して新規の抵抗性を持ち、一方で初期反応患者(耐久性のある完全な寛解を達成した者でさえ)も最終的には再発しうる。したがって、MM患者の転帰をさらに向上させるために、そして望むらくは、現在のところ不治である腫瘍症において高い治癒率を達成するために、新しいクラスの抗MM薬剤の開発が緊急に必要とされている。
【特許文献１】国際公開第02/2596号
【特許文献２】国際公開第91/9485号
【特許文献３】国際公開第98/1352号
【特許文献４】国際公開第99/42125号
【特許文献５】国際公開第01/76616号
【特許文献６】国際公開第01/35974号
【特許文献７】国際公開第02/30441号
【特許文献８】国際公開第02/2596号
【非特許文献１】Fairclothら、1995年、Proceedings 8th ECCO Congress、パリ、要約番号122、529
【非特許文献２】Loboら、1997年、Anticancer Res、17、333〜336頁
【非特許文献３】Fairclothら、1996年、Ann Oncol.、7、34
【非特許文献４】Jimeno J.ら、2002年、Ann Oncol.、13 (suppl. 5)、Abst.、65P
【非特許文献５】Fairclothら、1999年、Proc. Am. Assoc. Cancer Res.、40、要約2612
【非特許文献６】Fairclothら、1998年、Proc. Am. Assoc. Cancer Res.、39、要約227
【非特許文献７】Mitsiades C.S.ら、Blood、2001年、98、795〜804頁
【非特許文献８】Mitsiades N.ら、Proc Natl Acad Sci USA、2002年、99、14374〜14379頁
【非特許文献９】Mitsiades N.ら、Blood、2003年、101、2377〜2380頁
【非特許文献１０】Mitsiades C.S.ら、Oncogene、2002年、21、5673〜5683頁
【非特許文献１１】Chauhan D.ら、Blood、1996年、87、1104〜1112頁
【非特許文献１２】Hideshima T.ら、Cancer Res.、2001年、61、3071〜3076頁
【非特許文献１３】Uchiyama H.ら、Blood.、1993年、82、3712〜3720頁
【非特許文献１４】Mitsiades N.ら、Blood.、2003年、101、4055〜4062頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
我々は、アプリジンが非常に強力な抗多発性骨髄腫活性を持つことを初めて確証した。
【０００８】
アプリジン(デヒドロディデムニンB)は、地中海性被嚢類Aplidium albicansから単離された環状デプシペプチドである。
【０００９】
【化１】
0004584245.tif 000002
【００１０】
本明細書で使用する場合、アプリジンという用語は、受容者へ投与したとき、当該化合物のアプリジンを(直接的または間接的に)提供することが可能な製薬上許容できる塩、エステル、溶媒和化合物、水和物またはプロドラッグ化合物のいずれも対象として含む。塩や他の誘導体、およびプロドラッグの調製は、当該分野で知られている方法によって実行することができる。
【００１１】
アプリジン類似体は、国際公開第02/2596号に開示される化合物を含む。
【００１２】
アプリジン、アプリジン類似体、それらの使用、調合および合成についてのさらなる情報は、特許出願である国際公開第91/9485号、国際公開第98/1352号、国際公開第99/42125号、国際公開第01 76616号、国際公開第01/35974号、国際公開第02/30441号および国際公開第02/2596号に見出すことができる。我々は、これらのPCTテキストのそれぞれの内容を特定の参照によってここに取り込んでいる。
【００１３】
アプリジンは、インビトロと臨床の両方の第一および第二相試験において、抗癌剤として有用である可能性を持つことが示されている。アプリジンは、VEGF分泌の遮断、タンパク質合成およびシグナル伝達の阻害を含みそしてG1細胞周期停止をも含むいくつかの作用様式を有する。第一／二相試験における用量規定毒性は、重度の骨髄抑制の顕著な欠如をともなう筋毒性であった。
【００１４】
アプリジンは、ヒト腫瘍充実細胞系、特に非小細胞型肺および結腸腫瘍細胞に対して強力なインビトロ活性を示し、IC50値がそれぞれ0.18nMおよび0.45nMである(Fairclothら、1995年、Proceedings 8th ECCO Congress、パリ、要約番号122、529;  Loboら、1997年、Anticancer Res、17、333〜336頁)。国立癌研究所(NCI)のヒトインビトロパネルにより、非小細胞型肺癌(NSCLC)、メラノーマ、卵巣および結腸直腸癌細胞系に対する選択性が確認された(Fairclothら、1996年、Ann Oncol.、7、34)。
【００１５】
この海洋性デプシペプチドを用いた初期の研究は、B16メラノーマのようなマウス腫瘍に対するインビボ活性を示唆した(Fairclothら、1995年、Proceedings 8th ECCO Congress、パリ、要約番号122、529)。さらに、ヒトの異種移植腫瘍を有するマウスにおいて行われた別のインビボ研究は、乳房MX-1および結腸CX-1に対する活性を確認した(Fairclothら、1996年、Ann Oncol.、7、34)。小児白血病における第一相試験が進行中である(Jimeno J.ら、2002年、Ann Oncol.、13 (suppl. 5)、Abst. 65P)。最後に、アプリジンは、皮下移植された胃、前立腺およびバーキットリンパ腫のヒト異種移植片ならびに中空繊維内の膀胱癌腫に対してもインビボ抗腫瘍活性を呈することが示されている(Fairclothら、1999年、Proc. Am. Assoc. Cancer Res.、40、要約2612、Fairclothら、1998年、Proc. Am. Assoc. Cancer Res.、39、要約227)。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、多発性骨髄腫の治療におけるアプリジンおよび類似体の使用を対象とする。
【００１７】
本発明はまた、多発性骨髄腫の治療に使用するために、アプリジンまたは類似体と、製薬上許容できる担体、媒体または希釈剤とを含む製薬組成物を対象とする。
【００１８】
本発明はさらに、多発性骨髄腫を発症した任意の哺乳動物、とりわけヒトを治療するための方法であって、前記発症した個体に治療有効量のアプリジンまたは類似体を投与することを含む方法を提供する。
【００１９】
別の態様では、本発明は、多発性骨髄腫を治療するための医薬の製造におけるアプリジンまたは類似体の使用を対象とする。
【００２０】
本発明はさらに、アプリジンまたはアプリジン類似体を含む製薬組成物と、再構成剤とを収容する別々の容器を含むキットを提供する。再構成の方法も提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
多発性骨髄腫(MM)の治療管理における最近の進歩にもかかわらず、現在のところこの疾患には治癒的療法が存在しない。この疾患は、西側世界において2番目に多く診断される血液悪性疾患である。とりわけ、従来および/または新規の療法に最適には反応しないか再発してしまう患者において抗MM活性を持つ新規の治療剤の同定は、いまだに緊急の優先事項である。
【００２２】
我々は、アプリジン(APL)、すなわち新しい海洋由来のデプシペプチドが、インビトロでMM細胞に対して非常に強力であることを見出した。具体的には、我々は、APLの臨床的に意味のある濃度が、従来の抗MM剤(例えば、デキサメタゾン、アルキル化剤、アントラサイクリン)または新規の抗MM剤(例えば、サリドマイド、免疫調節性サリドマイド誘導体、プロテアソーム阻害物質PS-341[ボルテゾミブ]、Apo2L/TRAIL)に抵抗性のMM細胞系、あるいはMM細胞に対する主要な抗アポトーシス調節因子を過剰発現している細胞などを含むヒトMM細胞系の広範なパネルに対して活性であることを認めた。MTT比色生存検定は、我々のパネルの細胞系に対して普遍的に活性であり、(MM細胞系の圧倒的多数派のための)IC50用量が10nM以下の範囲にあることを示した。重要なことに、この強力なインビトロ抗MM活性は、この薬剤の充実腫瘍での第一相臨床試験において臨床的に達成可能であるAPLの濃度によって誘発した。さらに、これらのIC50値は、最もAPL感受性の高い充実腫瘍細胞におけるこの薬剤のインビトロ活性に匹敵しうるものであった。
【００２３】
APLのインビトロ抗MM活性は細胞系モデルのみに制限されているのではないことをさらに確認するために、我々は、サリドマイドまたはその類似体および/またはプロテアソーム阻害に対して抵抗性の患者から新しく単離された原発性MM腫瘍細胞に対するAPLの効果も試験した。MM患者からの10個の原発腫瘍検体(CD138+ CD38+ MM腫瘍細胞についての純度90%超)の予備試験において、我々は、我々の細胞系パネルの試験から得られた結果に一致するアプリジンのインビトロ抗MM活性を観察した。総合すると、原発性MM腫瘍検体およびMM細胞系に対するアプリジンのインビトロ研究の結果は、この薬剤が、従来の療法または強力な抗MM活性を持つ他の新しい薬剤に対する新規のまたは獲得した抵抗性を持つMM細胞を含む広いスペクトルのMM細胞に対して活性でありうることを示している。
【００２４】
サイトカインまたは細胞接着に介在される局所的骨髄(BM)微小環境(例えばBM間質細胞)の相互作用は、従来の療法(例えば、デキサメタゾンまたは細胞毒化学療法)からMM細胞を保護する(refs)が、APLは、MM細胞のBM間質細胞との共培養モデルにおいてこの保護効果を克服することができる。
【００２５】
加えて、APLは、細胞毒化学療法に誘発された細胞死に対してMM細胞を感作し、エキソビボ共培養モデルにおけるBM間質細胞またはMM細胞による血管新生促進性サイトカイン(例えば、VEGF)の分泌を抑止した。これは、増大した抗MM活性を達成するためにアプリジンを従来の細胞毒化学療法に基づくプロトコルと組み合わせることができることを示唆する。APLと他の抗癌薬との対比でのMM細胞の感受性のパターンの比較分析は、APLで処理したMMの用量反応関係が、薬物の投与に関連した用量反応関係とは異なることを示した。これはさらに、APLの抗MM特性は、現在入手可能な抗MM薬とは異なる分子機構によって介在されるという見解を支持し、また、現在のところ臨床開発段階にある他の新たな療法に抵抗性でありうるMMのサブグループに対してさえもAPLが活性となり得ることを示唆する。これらの知見が、充実腫瘍に対する臨床試験でのAPLの好ましい安全プロフィールと結びついた。
【００２６】
本発明のためには、アプリジンの類似体をAPLすなわちアプリジンそのものの代わりとして用いることができる。典型的には、そのような化合物は、国際公開第0202596号に規定されたような化合物である。本発明のための化合物の例は、国際公開第0202596号中に与えられた好ましい化合物を含み、特に、我々は、国際公開第0202596号中に与えられた好ましい化合物および関連する態様の考察をこの特許明細書に組み入れる。とりわけ、該類似体は構造的にアプリジンに近く、通常は、1つのアミノ酸または末端側鎖においてアプリジンと異なっている。その異なるアミノ酸は、該分子の環状部分にまたは側鎖に存在しうる。そのような化合物の多くの例は、国際公開第0202596号に与えられており、それらは本発明における使用のための候補である。
【００２７】
アプリジンまたは類似体の医薬製剤は、例えば、経口(頬側または舌下を含む)、直腸、鼻、局所(頬側、舌下または経皮を含む)、膣や非経口的(皮下、筋肉内、静脈内または皮内)経路などの、いかなる経路による投与にも適合できる。そのような製剤は、製薬分野で知られている任意の方法によって、例えば、活性成分を担体(複数でも可)や賦形剤(複数でも可)と関連させることによって、調製してもよい。
【００２８】
アプリジンまたは類似体を含有する製薬組成物の例は、静脈内投与のための適当な組成物と一緒にした液(溶液、懸濁液、乳濁液)を含み、それらは、純粋な化合物を含有してもよく、任意の担体または他の薬理活性化合物との組合せでもよい。可溶化したアプリジンは、熱および光ストレスの試験条件下でかなりの劣化を示すので、凍結乾燥した剤形が開発された。参照によってここに組み入れられる国際公開第99/42125号を見られたい。
【００２９】
本発明のアプリジンおよび類似体または組成物の投与は、静脈内注入によってできる。72時間までの注入時間を用いることができ、より好ましくは、1から24時間であり、約1、約3または約24時間が最も好ましい。病院に一晩滞在することなく治療を行うことを許容する短い注入時間が特に望ましい。しかし、注入は、必要ならば概ね24時間またはさらに長時間であってもよい。注入は、様々なパターンの適当な間隔をもって行ってもよく、例示的には、1週間に1回、1週間に2回、または週あたりさらに多くの回数でもよく、繰り返される各週に典型的には1週間の空白を随意に設けてもよい。
【００３０】
好ましい適用方法では、投与を複数回のサイクルで実行する。本発明の化合物の静脈内注入を、各サイクルの第一週に患者に与え、各サイクルの残り期間で患者を回復させる。各サイクルの好ましい期間は、1、3または4週のいずれかであり、必要に応じて多サイクルを与えることができる。別の投薬プロトコルでは、本発明の化合物を、例えば、3週間毎に5日連続で1時間投与する。他のプロトコルを変法として案出することができる。
【００３１】
投与遅延および/または投与低減およびスケジュール調節を、個々の患者の処置許容度に依存して必要に応じて実行する。
【００３２】
投与法の指針を上述したが、本化合物の適正な投与法は、特定の製剤、適用の様式、処置する特定の位置、宿主および腫瘍にしたがって変わってもよい。年齢、体重、性別、飲食物、投与の時間、排泄速度、宿主の状態、薬の組合せ、反応感受性、疾患の重症度のような他の因子も考慮に入れるべきである。投与は、最大許容用量内で定期的にまたは継続的に行うことができる。アプリジンの投与のさらなる指針は、参照によってここにその全体が組み入れられる国際公開第01/35974号中に与えられている。
【００３３】
アプリジンおよび類似体は、多発性骨髄腫の治療における併用療法を提供するために、他の薬とともに用いてもよい。他の薬は、同一の組成物の部分をなしていてもよいし、同時または異なる時に投与する別の組成物として提供されてもよい。
【実施例】
【００３４】
統計分析
統計的有意性を2元配置分散分析によって調べ、続いてダンカン法ポストホックテストを行った。全ての分析において、P<0.05が統計的に有意であると見なされた。
【００３５】
(実施例1)
MTT比色生存検定
細胞生存を、以前に記述されたように3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウム臭化物(MTT、Sigma Chemical、ミズーリ州セントルイス)比色検定を用いて調べた(Mitsiades C.S.ら、Blood、2001年、98、795〜804頁;  Mitsiades N.ら、Proc Natl Acad Sci USA、2002年、99、14374〜14379頁;  Mitsiades N.ら、Blood、2003年、101、2377〜2380頁)。簡単に述べると、2.5%ウシ胎児血清(FBS)の存在下およびDMSO媒体対照または最終濃度0〜100nMのアプリジン存在下で70%から80%の集密で48ウェルプレートに細胞をプレートした。各処置の終わりに、細胞を1mg/mLのMTTで4時間37℃でインキュベートした。イソプロパノールと1NのHC1の混合液(23:2(vol/vol))を激しくピペッティングしながら添加して、ホルマザン結晶を溶解した。生存可能な細胞における色素吸光度(A)を、630nmを基準波長として、570nmで測定した。細胞生存度を、無処置対照の値の百分率として推定した。全ての実験は、少なくとも3回繰り返し、各実験条件を各実験において少なくとも三つ組のウェルで繰り返した。報告したデータは、代表的な実験の平均値±SDである。
【００３６】
薬物抵抗性MM細胞系と原発性MM腫瘍細胞のパネル
我々は、薬物感受性および薬物抵抗性のヒトMM細胞系のパネルにおいてアプリジンの活性を評価した。該パネルは下記の細胞系を含んでいた。デキサメタゾン(Dex)感受性MM-1SおよびDex抵抗性MM-1R細胞系(イリノイ州シカゴ、Northwestern UniversityのSteven Rosen博士のご厚意により学術的贈呈として提供); 化学的感受性RPMI-8226/S細胞系とそれらのドキソルビシン(Dox6、Dox40)、メルファラン(LR5)およびミトキサントロン(MR20)に抵抗性の亜系(フロリダ州タンパ、Lee Moffitt Cancer CenterのWilliam Dalton博士のご厚意により学術的贈呈として提供);  H. A. Messner博士(カナダ国オンタリオ州、Ontario Cancer Institute)によるOCI-My-5細胞;  T. Kishimoto博士(日本国大阪、Osaka University)によるS6B45細胞;  ARD、ARKおよびARP-1細胞(マサチューセッツ州ボストン、Dana-Farber Cancer InstituteのNikhil Munshi博士のご厚意により提供);  OPM-1、OPM-6、K620およびLP-1細胞(ニューヨーク州ニューヨーク、Cornell UniversityのLeif Bergsagel博士のご厚意により提供); ならびにAmerican Type Culture Collection (メリーランド州ロックビル)から得たU266およびNCI-H929細胞。
【００３７】
原発性MM腫瘍細胞を、(ステロイドおよび細胞毒性の化学療法に基づく)従来のおよび比較的最近開発された抗MM剤(例えばサリドマイドまたはプロテアソーム阻害物質)に抵抗性であった10人の患者の骨髄(BM)吸引液から単離した。BM吸引液を、初めにフィコール密度遠心分離によって処理し、以前に記述されたプロトコルを使用して、CD138+選択(フローサイトメトリー活性化細胞選別(FAGS)、または免疫磁気分離を用いたCD138+ポジティブ選択のどちらかによる)によって精製した(Mitsiades C.S.ら、Blood、2001年98、795〜804頁)。全ての選別された腫瘍細胞試料は、CD38+ CD138+またはCD38+ CD45RA- 細胞において90%超の純度を持っていた。アプリジン処置の直前に、トリパンブルー排除検定によって、全ての原発腫瘍試料が95%を超える生存度を有することを確認した。全てのMM細胞系および患者MM細胞を、10%のチャコールデキストラン処理ウシ胎児血清(FBS;  Hyclone、ユタ州ローガン)ならびにL-グルタミン、ペニシリンおよびストレプトマイシン(Gibco Laboratories、ニューヨーク州グランドアイランド)を追加したRPMI 1640培地(Gibco Laboratories)で培養した。
【００３８】
結果: 薬物抵抗性MM細胞系および原発腫瘍検体に対するアプリジンの活性
我々は、従来の(例えば、デキサメタゾン、アルキル化剤、アントラサイクリン)または新規の(例えばサリドマイド、免疫調節性サリドマイド誘導体、Apo2L/TRAIL)抗MM剤に感受性または抵抗性のMM細胞を含むヒトMM細胞系の広範なパネルに対するアプリジンのインビトロ活性を試験した。MTT比色生存検定(図1)は、アプリジンが、(これらMM細胞系の圧倒的多数についての)IC50用量が(この薬剤での第一相試験の結果に基づいて臨床的に達成可能なアプリジンの濃度に対応する)10nM未満の範囲内で、我々のパネルの細胞系に対して普遍的に活性であること示した。重要なことに、このアプリジンのインビトロ活性は、最もアプリジン感受性の高い充実腫瘍モデルにおけるアプリジンのインビトロ活性に匹敵する。階層的クラスター形成分析および関連性ネットワークアルゴリズムを用いて、我々は、アプリジンと他の抗癌薬との対比でMM細胞の感受性のパターンを比較し、アプリジンに関する用量反応関係のパターンが他の薬物とは明確に異なることを見出した。
【００３９】
この知見は、APLの抗MM特性は、他の抗MM薬とは異なる分子機構によって媒介されるという見解をさらに支持するだけでなく、APLがこの疾患の異なる分子サブグループに対してさえも活性となり得ることも示唆する。
【００４０】
結果: 薬物抵抗性の原発性MM腫瘍細胞に対するアプリジンの活性
APLのインビトロ抗MM活性は細胞系モデルのみに制限されているのではないことをさらに確認するために、我々は、サリドマイドまたはその類似体および/またはプロテアソーム阻害に対して抵抗性の患者から新しく単離された原発性MM腫瘍細胞に対するAPLの効果も試験した。MM患者からの10個の原発腫瘍検体(CD138+ CD38+ MM腫瘍細胞についての純度90%超)の予備試験において、我々は、我々の細胞系パネルの試験から得られた結果に一致するアプリジンのインビトロ抗MM活性を観察した(図2)。
【００４１】
総合すると、原発性MM腫瘍検体およびMM細胞系に対するアプリジンのインビトロ研究の結果は、この薬剤が、従来の療法または強力な抗MM活性を持つ他の治験薬剤に対する新規のまたは獲得した抵抗性を持つMM細胞を含む広いスペクトルのMM細胞に対して活性でありうることを示している。
【００４２】
(実施例2)
Bcl-2および恒常的に活性なAktの安定的形質移入
MM-1S細胞を、ミリストイル化された(恒常的に活性な)AktまたはBcl-2(Upstate Biotechnologies、ニューヨーク州レークプラシッド)をコードするプラスミドベクター、または空の(新)ベクターを安定的に形質移入し、リポフェタミン2000 (Life Technologies)を用いて実行し、これに続いて、以前に記述されたように、G418含有選択培地で培養した(Mitsiades C.S.ら、Oncogene、2002年、21、5673〜5683頁;  Mitsiades N.ら、Proc Natl Acad Sci USA、2002年、99、14374〜14379頁)。
【００４３】
結果: アプリジンは、Bcl-2または恒常的に活性なAktの抗アポトーシス効果を克服する
MMおよび他の腫瘍形成物における薬物誘発性アポトーシスの制御におけるBcl-2およびPI-3K/Aktカスケードの役割が理由で、我々はまた、Bcl-2またはミリストイル化されたAkt構築物と空ベクター形質移入対照MM-1S細胞とを対比して安定的に形質移入したMM-1SヒトMM細胞におけるアプリジンの活性を特定した。我々は、Bcl-2またはmyrAkt移入細胞は、空ベクター移入細胞に比べて、アプリジンに対してより低い感受性を持ってはいなかったことを観察した(図1)。これは、Bcl-2の過剰発現またはAktおよびその下流のエフェクターの恒常的活性化が、アプリジンの抗MM効果を克服するのに十分ではないことを示唆している。
【００４４】
(実施例3)
MM細胞の骨髄間質細胞(BMSC)との共培養検定
BMSCに接着すると、MM細胞は、デキサメタゾンまたは細胞毒化学療法剤のような、従来の抗MM療法に対して低下した感受性をを有する(Chauhan D.ら、Blood、1996年、87、1104〜1112頁)。この形態の薬剤抵抗性は、MM患者が、糖質コルチコイドの投薬および/または細胞毒化学療法に基づく処置を受けても最終的に再発することの1つの鍵となる理由である。一方、最近開発されたMMのための療法のうちで、化学抵抗性またはステロイド抵抗性のMMの場合において対する抗腫瘍活性は、例えば、プロテアソーム阻害物質(Hideshima T.ら、Cancer Res.、2001年、61、3071〜3076頁)のような、BMSCのMM細胞への保護効果を克服することができるクラスの薬物によって、達成されている。したがって、我々は、アプリジンがBMSCのMM細胞との相互作用の分子的後遺症をも克服して、この意味における抗MM活性を達成することができるかどうかを調べた。我々はこのように、以前に記述されたたように、MM細胞のBMSCとのインビトロ共培養検定を実行した。BMSCは、24ウェルプレート上で集密するまで増殖させた。無血清培養液での洗浄に続いて、3人のMM患者から単離した原発腫瘍細胞(CD138+細胞おいて、95%超の純度)を、以前に記述されたようにBMSC被覆されたまたは対照のウェルに添加し(Uchiyama H.ら、Blood.、1993年、82、3712〜3720頁;  Mitsiades N.ら、Blood.、2003年、101、4055〜4062頁)、アプリジンの存在下または非存在下で48時間インキュベートした。フローサイトメトリー分析を行って、生存可能なMM細胞のCD138+集団を検出し、アプリジンのMM細胞生存度への効果を、それぞれの媒体処理培養と比較した生存可能細胞の数の%として表した。
【００４５】
結果: アプリジンは、骨髄間質性の細胞(BMSC)のMM細胞への保護作用を克服する
我々のグループおよび他の研究者の以前の研究は、サイトカインまたは細胞接着に介在される局所的骨髄(BM)微小環境(例えばBM間質細胞)の相互作用は、従来の療法(例えば、デキサメタゾンまたは細胞毒化学療法)からMM細胞を保護することができる(Chauhan D.ら、Blood.、1996年、87、1104〜1112頁)ことを示した。このように我々は、MM細胞のBMSCとの共培養の組においてアプリジンの抗MM効果を評価し、MM細胞コンパートメントにおける細胞死のフローサイトメトリー測定を用いて(図3)、MM-BMSC相互作用が、(BMSCの生存に有意の影響を及ぼさなかったアプリジン用量で)アプリジンのインビトロ抗MM活性を有意に減弱することはなかったことを観察した。
【００４６】
(実施例4)
VEGF分泌の定量
BMSCへのMM細胞接着は、BM環境内のMM細胞の部位における新しい血管の補充にとって大きな意義をもつものと見なされる事象である、血管内皮成長因子(VEGF)などの血管新生サイトカインの増大した分泌を誘発する。したがって我々は、MMおよび/またはBMSCによるVEGF分泌をアプリジンが抑制することができるかどうかを、以前に記述されたMM細胞のBMSCとのインビトロ共培養検定を用いて評価した。ここで、BMSCは、24ウェルプレートで集密するまで増殖させた。無血清培養液での洗浄に続いて、3人のMM患者から単離した原発腫瘍細胞(CD138+細胞おいて、95%超の純度)を以前に記述されたようにBMSC被覆または対照ウェルに添加し(Uchiyama H.ら、Blood.、1993年、82、3712〜3720頁;  Mitsiades N.ら、Blood.、2003年、101、4055〜4062頁)、アプリジンの存在下または非存在下で12時間インキュベートした。上澄みを収集して、市販のキット(VEGF ELISA kit、R&D Systems)を製造元の指示にしたがって用いて酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)によるVEGF濃度の検定を行った。
【００４７】
結果: アプリジンはMM/BMSCによるVEGFの分泌を低減する
VEGFは、BM微小環境でのMM細胞の増殖性反応の推定上の介在物として提案されている。VEGFはまた、腫瘍細胞の増殖区域における新しい血管の腫瘍誘発補充の鍵となる介在物でもある。急性白血病性細胞のアプリジン処置がVEGF分泌の抑制につながることを示唆する予備報告が理由で我々は、アプリジンがMM細胞によるおよび/またはBMSCによるVEGFの分泌をも抑制することができるかどうかを調べた。実際にアプリジン(20nM)での12時間の処置で、MM細胞によるVEGFの分泌を抑制することができ、加えてMM細胞をBMSCと共培養すると起こるVEGF分泌の増大を相殺することができた(図4Aと4B)。
【００４８】
(実施例5)
結果: アプリジンは、MM細胞を細胞毒化学療法剤に対して感作する
MTT比色生存検定を用いて我々は、MM細胞はドキソルビシンに対して、この処置をアプリジンと組み合わせると、その反応性を増加させることを見出した。図5は、アプリジン(2nM)での処置によってドキソルビシン(10ng/mL)に感作された原発性MM腫瘍試料の例を示す。
【００４９】
(実施例6)
アプリジンを、培養中の種々の樹立細胞に対して試験した。用いた細胞は:
・多発性骨髄腫細胞(MM1.S)
・デキサメタゾンに対して抵抗性の多発性骨髄腫系(MM1.R)
・Bcl-2を過剰発現する多発性骨髄腫
であった。
【００５０】
樹立細胞系のために細胞を96ウェルプレートにプレートし、薬物の添加前に24時間増殖させた。細胞を表示した時間、薬物とともにインキュベートし、細胞生存度を自動プレートリーダーを用いてXTTまたはMTS検定によって測定した。
【００５１】
これらの研究の結果を図6〜7に示す。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】アプリジン治療MM細胞系のパネルのMTT比色生存検定の結果を示す図である。
【図２】多剤抵抗性MM患者に由来する原発性MM腫瘍細胞試料に対するアプリジン(20nM、48時間)インビトロ活性を示す図である。
【図３】(多剤抵抗性MM患者から単離された)原発性MM腫瘍細胞の骨髄間質細胞(BMSC)との共培養が、MM細胞のアプリジンに対する反応性を有意に減弱させることはないことを示す図である。
【図４Ａ】多剤抵抗性MM患者からの原発性MM腫瘍細胞のアプリジン治療(20nM、0〜12時間)が、VEGFの分泌を抑制することを示す図である。
【図４Ｂ】アプリジン(20nM、12時間)が、原発性MM腫瘍細胞、BMSCによる、ならびに共培養されたMM細胞とBMSCによるVEGFの分泌を抑制することを示す図である。
【図５】アプリジンが原発性MM腫瘍細胞をドキソルビシンに対して感作することを示す図である。
【図６】アプリジンが、培養中のデキサメタゾン抵抗性多発性骨髄腫(MM1.R)細胞の増殖を、非経口的な系(MM1.S)と同程度に効果的に阻害することを示す図である。
【図７】アプリジンが、Bcl-2過剰発現MM細胞の増殖を阻害することを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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