(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
膜により分離された少なくとも二つのチャンバーを有しており、細胞活性を測定するために電磁放射検出ビームを用いる細胞活性アッセイ装置において、
前記膜は、第一表面、第二表面、厚みmt、および、直径pdの複数のオフアクシス孔を有し、前記オフアクシス孔は、前記膜の前記第一表面に垂直な線に対して角度αで前記第一表面から前記第二表面へと前記膜を貫通していること、
前記角度αは、電磁放射の検出ビームが前記第一表面に対し正確に垂直となり、前記第一表面と前記第二表面間を通過しないようにするものであること、
を特徴とする装置。
【請求項２】
膜により分離された少なくとも二つのチャンバーを有しており、細胞活性を測定するために電磁放射検出ビームを用いる細胞活性アッセイ装置において、
前記膜は、第一表面、第二表面、厚みmt、および、直径pdの複数のオフアクシス孔を有し、前記オフアクシス孔は、前記膜の前記第一表面に垂直な線に対して角度αで前記第一表面から前記第二表面へと前記膜を貫通していること、
前記角度αは、ある入射角範囲を有する電磁放射の検出ビームが前記膜の前記第一表面とほぼ垂直に入射しても、前記第一表面と前記第二表面間を通過しないようにするものであること、
を特徴とする装置。
【請求項３】
請求項１または２の細胞活性アッセイ装置において、前記角度αは、１５度から７０度であること、
を特徴とする装置。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかの細胞活性アッセイ装置において、前記角度αは、角度φより大きく、 その角度φは、式φ＝sin−１(pd/mt)で定義されるものであること、
を特徴とする装置。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかの細胞活性アッセイ装置において、前記角度αは、角度βと角度θとの和よりも大きく、角度βは、前記第一表面に垂直な線に対する前記検出ビームの最大入射角度であり、角度θは、式θ＝sin−１    ([pd x cosβ]/mt)で定義されるものであること、
を特徴とする装置。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかの細胞活性アッセイ装置において、さらに、前記膜に取り付けられた剛性フレームであって、前記膜が剛性フレームにより平らに保持されるようなものを備えたこと、
を特徴とする装置。
【請求項７】
細胞活性を測定するために電磁放射検出ビームを用いる細胞活性アッセイ装置に用いられる膜であって、
第一および第二表面、厚みmt、および、直径pdの複数のオフアクシス孔を有するフィルムを備え、前記オフアクシス孔は、前記フィルムの前記第一表面に垂直な線に対して角度αで前記第一表面から前記第二表面へと前記膜を貫通していること、
前記角度αは、電磁放射の検出ビームが前記第一表面に対し正確に垂直となり、前記第一表面と前記第二表面間を通過しないようにするものであること、
を特徴とする膜。
【請求項８】
細胞活性を測定するために電磁放射検出ビームを用いる細胞活性アッセイ装置に用いられる膜であって、
第一および第二表面、厚みmt、および、直径pdの複数のオフアクシス孔を有するフィルムを備え、前記オフアクシス孔は、前記フィルムの前記第一表面に垂直な線に対して角度αで前記第一表面から前記第二表面へと前記膜を貫通していること、
前記角度αは、ある入射角範囲を有する電磁放射の検出ビームが前記膜の前記第一表面とほぼ垂直に入射しても、前記第一表面と前記第二表面間を通過しないようにするものであること、
を特徴とする膜。
【請求項９】
請求項７または８にかかる膜において、前記角度αは、３度から７０度の間であること、
を特徴とする膜。
【請求項１０】
請求項７〜９のいずれかにかかる膜において、前記角度αは、角度φより大きく、 その角度φは、式φ＝sin−１(pd/mt)で定義されるものであること、
を特徴とする膜。
【請求項１１】
請求項７〜１０のいずれかにかかる膜において、前記角度αは、角度βと角度θとの和よりも大きく、角度βは、前記第一表面に垂直な線に対する前記検出ビームの最大入射角度であり、角度θは、式θ＝sin−１    ([pd x cosβ]/mt)で定義されるものであること、
を特徴とする膜。
【請求項１２】
細胞活性を測定する方法であって、
(a)  第一表面および第二表面を有し、前記第一表面と接触する複数の細胞を含む第一液体試料と、前記第二表面と接触する第二液体試料を分離する多孔性の不透明膜を有する細胞活性アッセイ装置を設けるステップと；
(b)  細胞活性アッセイ装置をインキュベートするステップと；
(c)  第一の波長を有する電磁放射の第一ビームを、前記第一液体試料を介し前記膜の前記第一表面方向に向けるステップと；
(d)  第二の波長を有する放射された電磁放射の第一の量を測定するステップと；
(e)  第一の波長を有する電磁放射の第二ビームを、前記第二液体試料を介し前記膜の前記第二表面方向に向けるステップと；および
(f)  第二の波長を有する放射された電磁放射の第二の量を測定するステップ；を備え、
前記膜は、厚みmtを有し、前記複数のオフアクシス孔は直径pdを有しており、前記メッセージを前記送信機に送信すること、前記複数のオフアクシス孔は、前記膜の前記第一表面に垂直な線に対して角度αで前記第一表面から前記第二表面へと前記膜を貫通しており、前記角度αは、角度βと角度θとの和よりも大きく、角度βは、前記第一表面に垂直な線に対する前記検出ビームの最大入射角度であり、角度θは、式θ＝sin−１    ([pd x cosβ]/mt)で定義されるものであること、
前記角度αは、ある入射角範囲を有する電磁放射の検出ビームが前記膜の前記第一表面とほぼ垂直に入射しても、前記第一表面と前記第二表面間を通過しないようにするものであること、
を特徴とする方法。
【請求項１３】
細胞活性を測定する方法であって、
(a)  第一液を収納するための、上方リムを有する第一チャンバーを設けるステップと；
(b)  前記第一液体試料を前記第一チャンバーに注入するステップと；
(c)  前記上方リムを第一の疎水性化合物で覆うステップと；
(d)  下表面、上表面、および前記上表面から前記下表面に前記膜を貫通する複数のオフアクシス孔を有する膜を設けるステップと；
(e)  第一領域が前記第一チャンバーの前記上方リムと同じサイズかつ同じ形を有するように前記膜の前記下表面の第一領域を第二の疎水性化合物で覆うステップと；
(f)  前記第一の疎水性化合物と前記第二の疎水性化合物が近接するよう前記膜で前記第一チャンバーに蓋をするステップと；
(g)  前記膜の上表面を、前記膜の第二領域を取り囲む第三の疎水性化合物で覆い、これにより、複数の細胞を有する第二液体試料を収納するための第二チャンバーステップが前記第一チャンバーとは正反対に形成されるステップと；
(h)  前記第二液体試料を前記第二チャンバーに注入するステップと；
(i)  前記第一液体試料および前記第二液体試料を収納する前記第一チャンバーおよび第二チャンバーをインキュベートするステップと；
(j)  前記膜の前記第一表面に対し第一ビームがほぼ垂直になるような入射角範囲を有する第一波長の電磁放射の前記第一ビームを前記第一チャンバー方向に向けるステップと；および
(k)  第二の波長を有する放射された電磁放射の第一量を測定するステップ；を備え、
前記複数のオフアクシス孔は、前記膜の前記第一表面に垂直な線に対して角度αで前記第一表面から前記第二表面へと前記膜を貫通しており、
前記角度αは、ある入射角範囲を有する電磁放射の検出ビームが前記膜の前記第一表面とほぼ垂直に入射しても、前記第一表面と前記第二表面間を通過しないようにするものであること、
を特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１３の方法において、前記第二チャンバーを覆う前記透明膜は、前記第二液体試料と接触する下表面を有すること、
を特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１４の方法において、前記第一の波長を有する前記電磁放射が当たると、前記第二の波長を有する前記電磁放射を発するように前記染料を選択すること、
を特徴とする方法。
【請求項１６】
細胞活性を測定する方法であって、
(a)  第一表面および第二表面を有し、前記第一表面と接触する複数の細胞を含む第一液体試料と、前記第二表面と接触する第二液体試料を分離する多孔性の不透明膜を有する細胞活性アッセイ装置を設けるステップと；
(b)  細胞活性アッセイ装置をインキュベートするステップと；
(c)  第一の波長を有する電磁放射の第一ビームを、前記第一液体試料を介し前記膜の前記第一表面方向に向けるステップと；
(d)  第二の波長を有する放射された電磁放射の第一の量を測定するステップと；
(e)  第一の波長を有する電磁放射の第二ビームを、前記第二液体試料を介し前記膜の前記第二表面方向に向けるステップと；および
(f)  第二の波長を有する放射された電磁放射の第二の量を測定するステップ；を備え、
前記第一の波長は、第一の波長範囲を備えており；前記第二の波長は、第二の波長範囲を備えており、
前記膜は、厚みmtを有し、前記複数のオフアクシス孔は直径pdを有しており、前記メッセージを前記送信機に送信すること、前記複数のオフアクシス孔は、前記膜の前記第一表面に垂直な線に対して角度αで前記第一表面から前記第二表面へと前記膜を貫通しており、前記角度αは、角度βと角度θとの和よりも大きく、角度βは、前記第一表面に垂直な線に対する前記検出ビームの最大入射角度であり、角度θは、式θ＝sin−１    ([pd x cosβ]/mt)で定義されるものであり、
前記角度αは、ある入射角範囲を有する電磁放射の検出ビームが前記膜の前記第一表面とほぼ垂直に入射しても、前記第一表面と前記第二表面間を通過しないようにするものであること、
を特徴とする方法。
【請求項１７】
細胞活性アッセイ装置に用いられる膜を構成する方法であって、
(a)  エキシマレーザー装置により放射された２００ナノメーターから４００ナノメーターの波長を有するレーザービームであって、マスクに当たると複数の分散したビームになるレーザービームをフィルム方向に向けるステップと；
(b)  フイルムに垂直な線に対して、１５度から７０度の間の角度αで前記フィルム材上に前記複数の分散ビームの焦点を合わせるステップと；および
(c)  除去法によって前記フイルムを貫通する孔を形成するステップ；を備え、
前記角度αは、ある入射角範囲を有する電磁放射の検出ビームが前記膜の前記第一表面とほぼ垂直に入射しても、前記第一表面と前記第二表面間を通過しないようにするものであること、
を特徴とする方法。
【請求項１８】
細胞活性アッセイ装置に用いられるまっすぐなオフアクシス孔を有する膜を構成する方法であって、
高いエネルギーが蓄積された粒子の流れをフィルムに照射するステップと；
前記高エネルギー蓄積粒子の流れを、前記フィルムに垂直な線に対して角度αで前記フィルムに衝突させ、これにより、破壊されたポリマーの軌跡を作るステップと；および
前記破壊されたポリマーの軌跡をエッチングし、これにより、膜内にまっすぐなオフアクシス孔を形成するステップ；を備えており、
前記角度αは、１５度から７０度であり、
前記角度αは、ある入射角範囲を有する電磁放射の検出ビームが前記膜の前記第一表面とほぼ垂直に入射しても、前記第一表面と前記第二表面間を通過しないようにするものであること、
を特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【背景】
【０００２】
【発明の分野】
この発明は、様々な化学的環境に応じた走化性、移動、浸潤、血管形成、成長、増殖、分化または細胞の相互作用などの細胞活性のアッセイ（CAA）調査のための方法および装置に関するものである。
【０００３】
【発明の背景】
走化性は、化学物質の濃度匂配に応じた生物細胞または組織の直接的な運動（移動）である。浸潤は、バリアの中へまたはそれを通じて細胞が運動（移動）することである。癌浸潤は、インビボにて、生物学的組織等の中へまたはそれを通じて、癌細胞によって引き起こされた運動のことである。例えば、コラーゲンやマトリゲルのような特別な細胞を基質とするプロテインや、その他の物質によって形成されたバリアの中へまたはそれを通じて、癌細胞によって引き起こされた運動も該当する。血管形成は、内皮細胞による移動および毛細血管の形成である。成長は、細胞のサイズ、形状、複雑性が増大することである。増殖は、細胞分解による細胞の成長である。分化は、多様な機能的役割および新規かつ多様な形質の発現と通常関連して、細胞が未分化な状態 からより分化した状態に変化するプロセスである。細胞の相互作用は、付近の同種または異種細胞間による存在および運動に応じた移動、浸潤、血管形成、成長、増殖または分化のような細胞行動の交互変化である。ここでは、このような活性およびこれと同じような活性をまとめて「細胞活性」と記し、アッセイを行うための装置は、「細胞活性アッセイ装置」と記す。
【０００４】
「走化性チャンバー」、「Boydenチャンバー」、「Boyden走化性チャンバー」、「ブラインドウェル(blind well)チャンバー」、「マイクロ走化性チャンバー」のような様々な記述で言及される一種の一般的なシングルサイト（site）細胞活性アッセイ装置は、膜で隔離された２つの仕切部屋（コンパートメント）を備え、その一方または両方が大気に通じている。マルチサイト装置は、よく「マルチウェル走化性チャンバー」または「マルチウェル Boydenチャンバー」のように言及され、多数のサイトの外に、同種の基盤サイト構造を備えている（米国特許NO.5,210,021、5,302,515参照）。この種のアッセイ用装置は、培養液にて懸濁されている細胞を上部仕切部屋にピペットで移し、走化性因子およびコントロールを底部仕切部屋にピペットで移す。走化性因子は、用量作用曲線を得るために様々な希釈溶液において使用され得る。このコントロールは、一般的に、(a)ネガティブ：細胞の懸濁に用いた培養液を膜の下でも用いる場合、(b)化学運動性(chemokinetic)：走化性因子を、同一の濃度で、細胞を含む培養液および膜の反対側のウェルに入れる場合、および(c)ポジティブ：既知の化学誘引物質を底部ウェルに入れる場合の３種類に分けられる。化学運動性コントロールによって、走化性因子と接触することが要因で高められた細胞のランダム運動と、その走化性因子の濃度匂配における直接的な反応とを区別することができる。
【０００５】
細胞活性アッセイ装置は、いわゆる走化性活性の走化性因子に対する種々の由来の細胞の反応を測定するために使用することもできる。種々の由来の細胞とは、例えば、病気で苦しんでいる患者から取得した免疫性細胞である。この場合において、この種々の反応(differential response)が、抑制されているのか若しくは通常なのかを観察して、問題となっている細胞の反応を、ネガティブコントロールといわゆる走化性因子により特定することができる。
【０００６】
走化性活性は、細胞活性アッセイ装置にて、安定した濃度勾配を設定することによって測定される。すなわち、あらかじめ定めた時間それを培養し、それから膜を通じて移動した細胞（または膜の中へ移動した細胞）をカウントする。そして、テストした走化性因子の濃度勾配があるところにおける細胞活性と、濃度勾配がないところにおける細胞活性間において比較が行われる。
【０００７】
ある一種の細胞活性アッセイ装置および方法では、走化性反応は、化学薬品を含有するチャンバーに最も接近している膜の表面の細胞の数を、物理的にカウントすることによって測定される。この種の細胞活性アッセイ装置の一例は、参考までにここに記載しておくが、米国特許NO.5,210,021（Goodwin,Jr.)に記載されている。定量データを取得するある従来の方法は、細胞活性アッセイ装置から膜を取り除き、もとの細胞の懸濁液を含有するチャンバーに最も接近している膜の表面から細胞を取り除く。そして、細胞を固定して染色し、それから顕微鏡によって染色された細胞を観察およびカウントする。膜をすべてを調べるための時間と費用から、膜をすべて調べ、カウントした場合よりも結果は正確ではないが、代表的な膜の領域だけをカウントする。
【０００８】
ディスポーサブル96ウェルマイクロプレート形式を使用する細胞活性アッセイは、結果物を定量化する特別な方法に従う。細胞活性アッセイとして、例えば、ChemoTxTM（Neuro Probe, Inc.,Gaitherburg,MDから入手可能）がある。手作業で染色およびカウントする上記の方法は、利用され得るが、時間がかかるため薦められない。好ましい方法は、フィルタを備えたマイクロプレートに遠心力を作用させて、フィルタを通じて移動した細胞を下部ウェルの底部に入れる。それから、MTT、MTS（Promega,Madison,Wisから入手可能）などの染料で、細胞を染色して、標準自動式実験用濃度リーダ（たまに、エリザプレートリーダと呼ばれる）において読み取る。
【０００９】
この装置を用いて定量データを取得する別の方法として、蛍光性の原料を用いて細胞を染色する方法がある。例えば、Calcein AM（Molecular Probes, Eugene, Oreから入手可能）である。マイクロプレートに移動させた細胞に遠心力を作用させ、自動式蛍光プレートリーダ（例えば、Cytofluor はPE Biosystems, Foster City, Ca.、Victor2はEG & G Wallac, Gaithersburg, Md.から入手可能、fmax Molecular Devices, Sunnyvale, Ca.から入手可能)を用いて細胞をカウントする。この自動式プレートリーダは、１番目の光の波長で、移動させた細胞の蛍光性の染料を励起し、２番目の波長で、放射された光を読み取る。代わりに、移動しなかった細胞は各サイトの上面から取り除かれ、フレームされた膜が取り付けられたプレートは、自動式蛍光プレートリーダにおいて、プレート上で細胞をスピンさせないで、膜の底部上や膜の孔のような下部ウェルに、フィルタから落ちた細胞をカウントすることによって、読み取られる。
【００１０】
米国特許NO.5,601,997（Tchao）に記載されている別の型の走化性装置では、走化性反応は、上述のように蛍光性の染料を細胞にラベルすることによっても測定される。しかしながら、Tchaoの装置では、膜の一方にある細胞が、反対側から細胞を取り除かなくてもカウントされるように、蛍光性染料の励起および放射波長に対して不透明なフィルムで、膜が生成される。Tchaoの方法は、カイネティックアッセイの一例である。このようなアッセイにおいて、膜の細胞が移動する方向の面は、励起波長の染料によって照射される。その面の細胞は、放射波長にて放射された光強度を測定することによって、周期的にカウントされる。これにより、研究員は、膜を通じて移動する細胞の割合をデータとして取得することができる。研究員は、アッセイを終了しなければ、細胞がもともとあった膜の面からそれらの細胞を除去することができず、それによってカイネティックスタディを行うことが不可能になってしまうから、膜は不透明でなければならない。
【００１１】
【定義および略語】
【００１２】
【略語】
1.  「電磁放射」は、ここでは「ER.」と略書する。
【００１３】
2.  「孔の直径」は、ここでは「pd.」と略書する。
【００１４】
3.  「膜の厚さ」は、ここでは「mt.」と略書する。
【００１５】
4.  「曲率半径」は、ここでは「rc.」と略書する。
【００１６】
5.  「ハイ・スループット・スクリーニング」は、ここでは「HTS.」と略書する。
【００１７】
6.  「細胞を用いたハイ・スループット・スクリーニング」は、ここでは「CBHTS.」と略書する。
【００１８】
7.  「ナノメーター」は、ここでは「nm.」と略書する。
【００１９】
8.  「マイクロリットル」は、ここでは「ul.」と略書する。
【００２０】
9.  「マイクログラム」は、ここでは「ug.」と略書する。
【００２１】
10.  「変動係数」は、ここでは「CV.」と略書する。
【００２２】
11.  「細胞活性アッセイ装置」は、ここでは「CAAA」と略書する。
【００２３】
12.  「tcc」は、ここではサイトに導入された細胞の総数を略書したものである。13.  「U1」は、ここでは、アッセイ開始時におけるCAAAのサイトの上部ボリュームから放射された光量を略書したものである。これは、tcc.に比例している。
【００２４】
14.  「L1」は、ここでは、従来の技術(background)で知られているように、アッセイ開始時におけるCAAAのサイトの下部ボリュームから放射された光量を略書したものである。
【００２５】
15.  「U2」は、ここでは、アッセイ終了時におけるCAAAのサイトの上部ボリュームから放射された光量を略書したものである。
【００２６】
16.  「L2」は、ここでは、アッセイ終了時におけるCAAAのサイトの下部ボリュームから放射された光量を略書したものである。
【００２７】
17.  「CL2」は、ここでは、CAAAのサイトの下部ボリュームから放射された光量L2から、もとのL1(background L1)を控除したものを略書したものである。
【００２８】
18.  「cmc」は、ここでは、CL2に比例する「完全に移動した細胞数」を略書したものである。
【００２９】
19.  「cmc％」は、ここでは、そのサイトに導入した総細胞数におけるcmcのパーセント、すなわちcmc／tccを略書したものである。
【００３０】
20.  「pmc」は、ここでは、U1−(CL2＋U2)に比例する「部分的に移動した細胞数」を略書したものである。
【００３１】
21.  「pmc％」は、そのサイトに導入した総細胞数における部分的に移動した細胞のパーセント、すなわちpmc／tccを略書したものである。
【００３２】
22.  「mc」は、ここでは、cmc＋pmcに等しい「移動した細胞」を略書したものである。
【００３３】
1.  「mc％」は、ここでは、mc／tccであるmcのパーセントを略書したものである。
【００３４】
【定義】
1.  「チャンバー」、「ウェル」または「ボリューム」は、ここでCAAAにおいて使用されるとき、液体サンプルを含有するCAAAの３次元のエリアを意味する。
【００３５】
2.  「オフアクシス」は、ここで膜の孔について使用されるとき、平らにした場合に、0°を越え90°未満の傾斜角度を有して、膜に対して傾いている孔を意味する。
【００３６】
3.  「正確に垂直」は、ここでERビームおよび平らな表面において使用されるとき、すべてのERビームが、その表面に垂直であることを意味している。
【００３７】
4.  「β-ノーマル」は、ここでERビームおよび平らな表面において使用されるとき、その表面に対していくつかは(some of)正確に垂直であるERビームを意味し、βが最大角度であり、90°程度未満の角度範囲内の入射角の差である。言い換えれば、表面におけるβ-ノーマル ERビームは、図２に示すように、最大入射角度としてβをもつ光のコーンである。
5.  「ほぼ垂直」は、ここでERおよび平らな表面において使用されるとき、そのERが前記表面に対してβ-ノーマルであり、かつβが15°未満であることを意味している。（一般的な細胞活性アッセイ用検出・定量化システムは、βが15°未満である検出ビームを備えていることを認識(recognition)している。）
6.  「検出ビーム」は、ここでERにおいて使用されるとき、特定の距離および特定の穴から特定のコーン(cone)内の装置のサイトに導かれた自動式リーダーまたは検出・定量化システムのERを意味している。
【００３８】
7.  「β-ノーマル検出ビーム」は、ここで使用されるとき、β-ノーマル ERを使用する検出ビームを意味している。
【００３９】
8.  「理想的な不透明」は、ここでフィルムについて使用されるとき、すべてのERをストップまたはブロックするフィルムを意味している。
【００４０】
9.  「R-不透明」は、ここでフィルムまたは膜について使用されるとき、R波長範囲内において、ERをストップするフィルムまたは膜を意味している。このRは、nm.表示のER波長の範囲を定めるブラケットの数値(a pair of numbers in brackets)によって、条件として指定されたものである(is specified)。
【００４１】
10.  「R-不透明＠P％」は、ここでフィルムまたは膜について使用されるとき、R範囲内において、P％を越えるERをストップするフィルムまたは膜を意味している。このPは、0〜100の十進法の数値であり、ブロックされるERのパーセントを表している。例えば、この発明の実施形態で使用される１のフィルムは、480〜580nm.の波長範囲内において、99.0％以上のERをブロックする。これと同じフィルムは、480〜490および510〜540nm.のER範囲内において、99.9％をブロックする。ここでは、このフィルムは、「480-580-不透明＠99.0％」、「480-490-不透明＠99.9％」および「510-540-不透明＠99.9％」と表す。
【００４２】
11.  「理想的な不透明」は、ここで膜について使用されるとき、(a)膜を形成するフィルムが理想的に不透明であり、(b)膜の複数の孔が、垂直かつ平行にならんでおり、さらに(c)その複数の孔が、膜が平らである場合に、正確に垂直なERが、孔をまっすぐ通過できないように配置され、角度をなしている膜を意味している。
【００４３】
12.  「β-ノーマル不透明」は、ここで膜について使用されるとき、β-ノーマル ERは、どの孔もまっすぐ通過することができないような膜を意味している。
【００４４】
13.  「実質的に不透明」は、ここで膜について使用されるとき、ほぼ垂直なERが、孔をまっすく通過することができないような膜を意味している。
【００４５】
14.  「幾何学的にR-不透明＠P％）」は、ここで膜について使用されるとき、(a)原料のフィルムがR-不透明＠P％であり、さらに(b)正確に垂直なERが、膜のどの孔もまっすぐ通過しない膜を意味している。図１に示すように、膜のオフアクシス孔の最小入射角度αは、次式を満たさなければならない。
【００４６】
α＞φ where φ＝sin-1(pd/mt).    (1)
15.  「β-ノーマル R-不透明＠P％」は、ここで膜について使用されるとき、(a)膜のフィルムがR-不透明＠P％であり、さらに(b)β-ノーマル ERが、どの孔もまっすぐ通過しないことを意味している。図2に示すように、膜のオフアクシス孔の最小入射角度αは、次式を満たさなければならない。
【００４７】
α＞(β＋θ), where θ＝sin-1(［pd×cosβ］/mt).    (2)
16. 「実質的にR-不透明＠P％」は、ここで膜について使用されるとき、(a)R-不透明＠P％で形成されており、(b)ほぼ垂直な ERが、どの孔もまっすぐ通過させない膜を意味している。このような膜のオフアクシス孔の最小入射角度αは、βが15°未満において、上記(2)式を満たさなければならない。
【００４８】
17.  「ほぼ垂直」は、ここで膜の孔について使用されるとき、膜を平らにした場合に、15°以下の入射角度をもつ膜に対して傾いている孔を意味している。
【００４９】
R-不透明＠P％膜は、必ずしも、実質的に R-不透明＠P％、β-ノーマル R-不透明＠P％、幾何学的に R-不透明＠P％ではないことを書き留めておく。なぜなら、ほぼ垂直な光をまっすぐ通過させる垂直な孔を有している場合があるからである。
【００５０】
細胞活性のアッセイに適する膜として、99.0％以上のPを有しており、孔によって形成された膜の開口領域が、膜の2％以上の大きさになるように、孔の直径が3ミクロンを越えることが好ましいことを書き留めておく。特に、仮に、孔がほぼ垂直ならば、表面に対してほぼ垂直なERが、膜をまっすぐ通過するから、これらの用途の膜はR-不透明＠P％になり得ない。一方、仮に、孔が実質的にオフアクシスであり、その他の特徴が同じであるならば、膜は、実質的に R-不透明＠P％、β-ノーマル R-不透明＠P％、幾何学的に R-不透明＠P％になり得る。
【００５１】
【発明の概要】
本発明は、膜を採用したＣＡＡ装置ならびに、ＨＴＳ、ＣＢＨＴＳおよび細胞ベースのスクリーニング用であるとともに、細胞活性の基礎研究用のＣＡＡ装置を用いた方法を提供する。特に、本発明は、ほぼＲ−不透明＠Ｐ％の膜の集合を用いたＣＡＡ装置に関する。また、本発明は、前記ＣＡＡ装置に用いられる膜、およびその製造方法を含んでいる。
【００５２】
本発明の膜は、ＣＡＡ装置を用いる検出および数値化に用いられる機器のＥＲの波長に対してほぼＲ−不透明＠Ｐ％であるので、膜の片側から細胞を検出し、その数を数える作業は、当該膜の反対側の細胞、または、それと同時又はその次に行われる当該膜の他方側の細胞の検出および集計による影響を受けない。これにより、従来の方法よりも正確な結果が得られる。特に、このことは、ピペット量のばらつき、および、その中に細胞が保持(suspended)されたメデイア内への細胞の不均等な分配によるエラーの両方を除去する検出および数値化法を用いることで可能となる。これにより、薬物の発見および開発においてＨＴＳ用およびＣＢＨＴＳ用に適切となるようアッセイのＣＶを低下させることができる。
【００５３】
Ｔｃｈａｏの膜は、いくつかの蛍光染料の励起および放出波長に対して不透明なフィルムにより構成されている。すなわち、Ｔｃｈａｏ膜は、Ｒ−不透明＠Ｐ％膜である、ここで、Ｒは、前記検出および数量化システムにより用いられる波長範囲であり、Ｐは、ブロックされる割合である。しかし、Ｔｃｈａｏ膜は、特に、ほぼ垂直に貫通する孔が求められている。したがって、”形状的に(geometrically)Ｒ−不透明＠Ｐ％”な膜、”および”βーノーマルＲ−透明＠Ｐ％”な膜のいずれでもない、ここで、”β”は、検出ビームにおける光の最大入射角度であり、”Ｒ”は、光の波長範囲である。したがって、”ほぼＲ−不透明＠Ｐ％”な膜ではない。孔は、ほぼ垂直に形成されているので、標準的な検出器からの検出ビームは、孔をそのまま通過する。したがって、細胞活性アッセイ用に通常用いられている、５％から１５％のオープン領域（孔の総面積）を有する膜を用いると、膜の孔を通過する光は、かなりの量となる。励起ビームにより膜の表面に対して垂直に伝送された波長は、ほぼ垂直な孔を通過し、当該膜の反対側にある細胞は、検出ビームによりカウントされる。すなわち、光、つまり、βーノーマル、ここでβは、１５度未満であり、は膜を貫通し、活性細胞(excite cell)は、孔を越え、光を発し、（この光は、ほぼ垂直な孔をサイド通過するので）カウントされる(over pores which will emit light and be counted)。これにより、膜を通じて移動しなかった細胞は、ＥＲを発するためにシミュレートされ、カウントされ、結果の精度を低下させる。このことは、以下の二つから力学アッセイ用には、問題とならない。まず第一に、膜のオープン領域は、５％から１５％の間にすぎず、アッセイに用いられる細胞の数を、それが膜の１０％だけを覆うように設定することができる。これにより、孔を越える細胞の数が減少する。二番目に、力学的な研究(kinetic study)において、重要なパラメーターは、変化レートであり、細胞が孔を越えて移動した場合に、膜の開始側(origination side)にある細胞がカウントされるという事は、検出器は、励起ビ−ムがそのまま通過しないように形成したオフアクシスの孔を有する同じフィルムで作った不透明膜を用いた場合よりも早く細胞をカウントするということだけを意味する。他方、力学だけでなく他の、または、力学的な数値を測定しないアッセイに関し、この方法は、かかるアッセイにおいて膜の両側の異なる点において全ての細胞をカウントし、上述の方法のように、ほぼ垂直な孔を形成してアッセイの精度を低下させ、ＣＶを著しく上昇させる。
【００５４】
【詳細な説明】
膜のジオメトリー
図１は、正確に垂直なＥＲ１５０で作製した、本発明の膜の理想的な実施形態の一部分の拡大切断面を示す。図１の膜１００は、第１表面１１０、第２表面１２０、複数の孔１３０を備えている。膜１００の孔は、あらゆる孔の最小入射角がαであるようなオフアクシス（ｏｆｆ−ａｘｉｓ）となっている。孔１３０は、検出ビームが孔を通って膜の第２表面から第１表面（または逆）へ直接進行することができないような入射角を有している。図１に示すように、最小入射角αはφよりも大きくなければならない。ここで、φは次式で定義される。
【００５５】
φ  ＝  ｓｉｎ−１（ｐｄ／ｍｔ）  （１）
ここで、ｐｄは孔直径であり、ｍｔは膜厚さである。この場合、正確に垂直な検出ビームから放射されるＥＲは、膜の孔を通って直線的に進行することができない。
【００５６】
図２は、本発明の膜の一部分の、拡大した切断面の略図である。β−ノーマル不透明膜２００は、上面２１０、底面２２０及び複数の孔２３０を有している。検出ビームの最大入射角を持つ、β‐ノーマル検出ビームから放射される光線２６０は、図２に示している。孔直径ｐｄ及び膜厚さｍｔは図示したとおりである。最小入射角での膜の孔の角度はαである。膜２００は、以下の場合に限りβ−ノーマル不透明である。
【００５７】
α＞（β＋q）  ここで、q＝ｓｉｎ−１（［ｐｄ×ｃｏｓβ］／ｍｔ）  （２）である。
【００５８】
図３は、曲線状の孔３００を有する本発明の膜の実施態様の一部分の拡大した切断面の略図である。図には、上面３１０、底面３２０、及び孔３３０が示されている。β−ノーマル検出ビームから放射される光線３６０は、検出ビームの最大入射角βを有しており、これは図３に示されている。孔直径ｐｄ及び膜厚さｍｔは示したとおりである。膜の孔の最小入射角αは、図３に示されているように決定される。膜３００は、式（２）を満たす場合に限り、β−ノーマル不透明である。
【００５９】
α＞（β＋q）  ここで、q＝ｓｉｎ−１（［ｐｄ×ｃｏｓβ］／ｍｔ）  （２）である。
【００６０】
膜作製
図４ａは、本発明の膜の実施態様の作製に用いる装置の、縮小した切断面の略図である。膜を作製するもととなるフィルムは、巻き出しロール（ｕｎｗｉｎｄ  ｒｏｌｌ）４１０と呼ばれるロールの上でウェブを形成しており、フィルムは、巻き出され、巻き出しロール４１０と、第２ロールである、作製された膜を有する巻き取りロール（ｒｅｗｉｎｄ  ｒｏｌｌ）４３０との間の平面部分４２０で保持される。巻き出しロール４１０と巻き取りロール４３０との間のフィルムの平面部分４２０は、エキシマレーザーライト４４０の複数のビームの下を通過し、それぞれのビームは、作製される孔よりもわずかに小さい直径を有している。どれくらい小さいかについては、フィルムの厚さ、フィルムの材料、レーザーからのＥＲの波長によって決定される。ＥＲの波長が、一般的には２００ｎｍから４００ｎｍの間と非常に短いことを理由として、エキシマレーザーを利用することとしている。これにより、孔をミクロン以下にすることができる。しかしながら、本発明の好ましい実施態様での孔のサイズは、１．０、２．０、５．０、８．０、１０．０、１２．０、１４．０ミクロンであり、これらは、サブミクロンの孔と比べると比較的作成が容易である。レーザーライト４４０のビームは、図４ａに示すように角度αにてフィルムにあたる。好ましい実施態様においては、αは、特定のβ−ノーマル不透明膜が要求する膜厚さ、孔直径、実行する細胞活性アッセイの性質に依存して、１５°から７０°の間である。いくつかのアッセイでは、最短の孔が最適であり、他のアッセイでは、より長い孔が最適である。例えば、最小の培養期間のためにデザインしたアッセイでは、短い孔が好ましい。一方、最大の感度が優先されるならば、より少ない数のネガティブコントロール細胞が膜を通過するであろうから、より長い孔が好適であると考えられる。
【００６１】
エキシマレーザーＥＲの複数のビームは、レーザー出力を多数の分散ビーム、例えば幾千ものビームを形成するマスクに衝突させることによって得られるものであり、それらは、その後フィルムに集中する。レーザーＥＲは、フィルムをアブレーション（ａｂｌａｔｅ）し、材料を通過する直線状の孔を生成する。アブレーションの時間は、レーザーのパワー、フィルム材料の組成、厚さによって決定される。詳細については、当該分野の当業者にとって周知である。レーザーによる膜作製の一つの利点は、正確な位置と孔の数をコントロールすることができることにある。異なる数及び位置の孔を有する細胞活性アッセイ装置の、異なるサイトに関連するばらつきを除くことで、アッセイのＣＶ（変動係数）を低くすることができるのであるから、レーザーによる膜作製は有効である。また、各サイトのための小さい体積と面積が要求される細胞ベースのアッセイには、レーザーによる膜作製が必須である。本発明の一つの好ましい実施態様は、１ｍｍ直径に１５３６サイトを有するマイクロプレートサイズの装置（５．０３０”×３．３６５”フットプリント）を用いて行った。この装置によって行われたβ−ノーマル不透明膜の好ましい実施態様は、１、２、３、５、８、１０、１２、１４ミクロンの孔直径を有しており、厚さは、５から５０ミクロンの間である。孔密度は、１×１０３から２×１０７孔／ｃｍ２の範囲である。アッセイサイトに対する膜の面積が小さくなればなるほど、孔の不規則分布に関連する誤差が大きくなる。このことは、アッセイ全体のＣＶに消極的に影響する。したがって、孔のサイズ、数、角度、位置において実質的に変動のないエキシマレーザーによる膜作製には、重要な利点がある。
【００６２】
図４ｂは、本発明の膜の好適な作製方法の平面斜視略図であり、図４ｃは、その側面図である。この方法では、膜は、図４ａに示すレーザー装置による孔のアブレーションによって得られるフィルムから構成される。この方法において、一面に結合するフィルム４６１を備えるＣＡＡＡ４６０のフレームは、図４ｃに示すように、スライド部材４７１を持つ角度をもったジグ４７０に正確に位置する。作製される孔の直径に比例した直径を有する多数のレーザービーム４４０は、図示するように入射角αでフィルムにあたる。上述したように、β−ノーマル不透明膜を構成するためには、式（２）が満たされていなければならない。その式は、
α＞（β＋q）  ここで、q＝ｓｉｎ−１（［ｐｄ×ｃｏｓβ］／ｍｔ）  （２）であり、図２に示すように、ｍｔは膜厚さであり、ｐｄは孔直径である。もし、β＜１５度であれば、作製される膜は実質的に不透明であろう。フレームされたフィルム４６１は、レーザービーム４４０の下で、矢印４７５で示される方向に増分ステップ（ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ  ｓｔｅｐ）で移動し、レーザービームがフィルムにあたる位置において角度αを保っている。レーザーライト源（図示せず）と、フィルム上のレーザービームのクラスターを集中させるフォーカスレンズシステム４５０との間の光学距離において分散するビームのクラスターを形成するマスク（図示せず）によって定められるパターンで、ビーム４４０は、孔の配列を連続的にアブレーションする。レーザーによる膜作製装置の本実施態様において、レーザービーム４４０は、図４ｂに示す１５３６サイトからなる３２×４８配列を有するＣＡＡＡのサイトに一致する、パターン４８０に集中される。この作製技術は、（ａ）各サイトの孔の数が固定され、（ｂ）前記孔は、フレームされたフィルム４６１全体にまたがった、様々な固定された均一パターンで位置されうる、という利点がある。このことは、フレームされた膜を用いたＣＡＡＡにおけるサイト毎の変動は、膜について実質的にゼロであるということを意味する。このことは、さらに、いくつかの実施態様（以下に詳述する）における疎水性のマスクの適用は、位置的にも、寸法的にも、サイトの均一性に起因するアッセイのＣＶに関して、もはや不可欠ではないということを意味している。
【００６３】
図４ｄは、図４ａに示すように、孔が加工され、焼かれ、レーザーによってアブレーションされているフィルムから、本発明の膜を作製する方法を示している。膜を作製するもととなるフィルムは、巻き出しロール４１０の上でウェブを形成しており、フィルムは、巻き出され、第２ローラー４９０の付近を通り、そこで９０度方向を変えて、非常に小さい直径の作製ロール４９５の付近を通っている。作製ロール４９５の直径は、この方法で作製される孔の曲率半径（ｒｃ）に比例しており：作製ロール４９５の直径が小さくなればなるほど、孔のｒｃも小さくなっている。レーザーＥＲは、作製ローラー４９５の付近で曲がっているフィルム領域の非常に狭い部分での角度範囲で、フィルムにあたる。レーザーＥＲは、曲がったフィルム中で直線状の孔をアブレーションし、そのため、膜が平面状になったときに孔が曲がる（図３参照）。膜のウェブは、それから、ロール４９１に付近で直角になり、作製された膜として巻き出され、巻き取りロール４３０に向かう。フィルムは、矢印４７５で示される方向に、非常に小さい増分ステップで移動し、ステップの増分は、レーザーがフィルムの孔をアブレーションする面積の幅によって決定される。レーザービーム４４０は、連続して孔の配列をアブレーションし、直径とパターンはマスクによって決定される（図示せず）。孔の角度範囲は、作製ロール４９５の直径、及び、レーザービーム４４０がフィルムにあたる領域の面積に比例する。
【００６４】
図５ａは、本発明の膜の実施態様の作製に使用する第２種目の装置の、縮小した切断面の略図を示す。膜を作製するもととなるフィルムは、巻き出しロール５１０上でウェブ形状をしており、フィルムは、巻き出され、中間ロール５３０と５４０との間の平面５２０に保持され、それから、照射を受けた膜を巻き取る巻き取りロール５５０に向かって移動する。フィルムの部分は、平面及び中間ロール（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｒｏｌｌ）５３０と５４０との間のトート（ｔａｕｇｈｔ）５２０に保持され、サイクロトロン（図示せず）によって放射された高エネルギー荷電粒子のビーム５６０の下を通過する。一つの好ましい実施態様における高エネルギー粒子ビームの直径は約６ｃｍであり、その高エネルギー粒子ビームは、図５ｂに示すスィーピングマグネット５７０からの電磁場によって偏向されたウェブに沿って、前後に偏向される。ビームは、ウェブの動作のラインに垂直な軌道で、フィルムの幅にそって前後に偏向する。ビーム（またはイオンの霧）は、フィルムを通過するときには、スィーピングマグネット５７０から約５ｍの距離にある。フィルム５２０の幅を超えてビームが前後に偏向するのに従って、フィルムは、膜に要求される孔の密度によって決定される一定の割合（ｓｔｅａｄｙ  ｒａｔｅ）でビームの下を移動する。フィルムがビームの下を通過するのに従い、荷電粒子が通過し、フィルムを構成するポリマー鎖の分子結合を切る。ビーム中の粒子のエネルギーは、１から２百万エレクトロンボルトの範囲にあり、ビームの入射角αでフィルムを完全に通過するのに十分であるに違いない。この角度αは、１５°から７０°に設定されている。特定のβ−ノーマル不透明膜のための最適な角度は、膜厚さ、孔直径、実行する細胞活性アッセイの性質によって決定される。
【００６５】
この作製技術において、プロセスの第２工程は、示してはいないが、エッチングバス中で水浸する照射されたフィルムによって構成されている。この工程では、サイクロトロンからの高エネルギー粒子によって生成されたフィルムを介して、孔を、切断されたポリマーの直線軌道に沿ってエッチングする。孔の直径は、エッチングプロセスの時間、エッチングバスの温度及び濃度によって決定される。このプロセスの詳細については、照射−エッチング（ｔｒａｃｋ−ｅｔｃｈ）膜作製分野の当業者にとって周知である。
【００６６】
細胞活性アッセイ装置
図6aから6cは、本発明のある実施形態の略図である。複数サイトＣＡＡ装置６００は、βーノーマルＲ−透明＠Ｐ％膜を有し、これは、特に、上述のＲ−不透明＠Ｐ％膜と同等なものである。図6aは、装置全体の平面および断面図であり、図6bおよび図6cは、当該装置の部分拡大図である。
【００６７】
アッセイ装置６００は、三つの剛性部品：剛性フレーム６２０に接着された透明フィルム６２１からなる上部、第二剛性部６５０に接着された膜６５１からなる中間部、および、透明な射出成形マイクロプレート６８０からなる底部、から構成されている。
【００６８】
膜６５１は、プラスチック、ガラス、セラミック、有機物質、またはこれらの組み合わせを含む様々な素材から製造可能なフィルムから構成することができる。膜孔６９５（図6cのみに表されている）は、いろいろな方法で形成することができ、そのうち二つは、上で説明した。フレーム６５０は、プラスチック、鋼、ステンレス鋼、アルミニウム、又は他の適切な材料でもよい。かかるフレームは、それ自身に取り付けられている、膜、および格子(grids)、被覆物(coatings)又はサイトデリミネーテイング装置(site-deliminating devices) のいずれをもほぼ平らに保持するのに十分な剛性を有していなければならない。前記の膜は、適切な方法であれば、接着剤、ヒートシール超音波シールまたは機械的方法を含むどのような固定方法によってフレームに接着してもよい。
【００６９】
図6aは、８個ｘ１２個で配列されたＣＡＡ装置６００の９６個のアッセイサイト６３０を示している。各アッセイサイト６３０は、膜６５１の上に位置する上方ボリューム６９３および膜６５の下に位置するマイクロプレート６８０内の下方ボリューム又はウエル６９２である二次元コンパートメント（ウェル）とともに膜６５１の分離・分割領域６５６を備えている。
【００７０】
フィルム６２１は、各上方ボリューム６９３の頂面を区切り、検出ビームによるＥＲおよびテストサイト６３０の上方ウエルから放射されたＥＲの反射および屈折を最小化し、光学的に都合がよい平面を形成する。フィルム６２１の底面に固定された不透明マスク６２５が、アッセイサイト６３０の頂面において透明のスポット６２７を取り囲み、分離する。かかるマスクも、疎水性であり、上方ボリューム６９３の頂面を取り囲む(circumscribes)。
【００７１】
図6cは、ＣＡＡ装置６００の中間部を構成するフレーム６５０を有する膜６５１の側面を非常に大きく拡大した図である。図6cは、ほぼＲ−不透明＠Ｐ％膜６５１である膜のオフアクシル孔６９５を示している。また、この図は、アッセイサイト６３０の端部における膜部(membrane section)を示し、膜６５１に固定されている、頂面６５３上の一つ（６５５）および底面６５２上の一つ（６５４）の二つの疎水性マスクを図示している。疎水性マスク６５５は、サイト６３０の上方ボリュームの底面周辺(bottm perimeter)を区切るとともに、膜を越えてて細胞が活性可能な膜エリアを囲む。疎水性マスク６５４は、以下で述べるように、下方ボリュームの頂面を取り囲み易くする。
【００７２】
アッセイ中、各サイト６３０の上方ボリューム（上のウエル）６９３および下方ボリューム（下のウエル）６９２は、化学物質および／又は、図6bおよび図6aの断面図の斜線により示された懸濁状態の生物学的細胞を含んだ溶液で満たされる。各上方ボリューム６９３内の溶液の表面張力は、疎水性マスクのペア６２５および６５５と一緒になって、上方ボリュームに溶液を閉じこめるとともに、上方ボリュームを取り囲み分離する空間６９７を創り出す。下方ボリューム６９２のリム６８５に固定されている疎水性コーテイング６８６は、膜６５１の下側６５２上の疎水性マスク６５４で封をするようなシールドを形成する。膜６５１は、下方ボリューム溶液を閉じこめる下方ウエル６９２のリム６８５上、又は、それと対向するよう位置し、保持される。マイクロプレート６９０のウエルの平らな透明底面６８２は、光がそこを通じて６９２に出入りすることができる光学的に優れた平面である。
【００７３】
図7a1および図7b1は、１、５３６個のアッセイサイトを有するＣＡＡ装置７００の平面図および側面図をそれぞれ示す。本実施形態において、アッセイサイト７３０は、標準のマイクロプレート（５．０３０インチｘ３．３６５インチ）の使用面積(footprnt)内に３２ｘ４８のアレイが配列されている。この装置７００は、上方剛性フレーム７２０、中間剛性フレーム７５０および下方剛性フレーム７８０の三つの剛性部品から構成されている。上方剛性フレーム７２０は、透明フィルム７２１に接着されている。また、中間剛性フレーム７５０は、実質的にＲ−不透明＠Ｐ％膜７５１に接着されている。さらに、下方剛性フレーム７８０は、透明フィルム７８１に接着されている。アッセイサイト７３０のそれぞれは、図7bに示すように、上方ボリューム７９３および下方ボリューム７９２を有している。
【００７４】
図7bは、ＣＡＡ装置７００の一部を示す拡大断面図である。上方フイルム７２１は、その底面７２３に接着された疎水性マスク７２５を有している。膜７５１は、その頂面７５３に接着された頂面疎水性マスク７５５、および、その底面７５２に接着された疎水性マスク７５４を有している。下方フィルム７８１は、それに疎水性マスク７８４が接着された頂面７８２を有している。
【００７５】
各アッセイサイト７３０は、上方フイルム７２１の透明領域７２７および前記透明領域７２７を取り囲む底面７２３上の疎水性マスク７２５、膜７５１のオープン領域７５６および７５６を取り囲む膜７５１の頂面７５３上の疎水性マスク７５５、膜７５１の底面７５２上の疎水性マスク７５４、下方フィルム７８１の透明領域７８６、下方フィルム７８１の頂面７８２上の疎水性マスク７８４、上方ボリューム７９３ならびに下方ボリューム７９２から構成されている。上方の気室(air space)７９７および下方の気室７９８が各サイトを取り囲むとともに分離する。この実施形態においては、ボリィーム７９３および７９２は、０．５マイクロリットルから２．５マイクロリットルであり、サイト７３０の中央までの距離は２．２５ミリメートルである。
【００７６】
疎水性マスク７２５および７８４は、半透明であり、上方フイルム７２７および下方フイルム７８６のそれぞれの透明領域を取り囲み、以下の各アッセイサイトの真上に位置する。検出ビーム７６０および７６１からのＥＲおよび上方および下方ボリュームにおける蛍光性染料によって発せられたＥＲ７６２および７６３は、下方透明領域７２７および上方透明領域７８６を通じてそれぞれ出入りする。上方フイルム７２１上の検出／定量化装置は、ハウジング７４０、サイト７３０の頂面７５３および上方ボリューム７９３から発せられたＥＲ７６２を集光するための光ファイバー束７４２、ならびにサイト７３０の膜の上方ボリューム７９３および頂面７５３に対して励起ＥＲ７６０を伝送するための他の光学経路(conduit)７４４から構成されている。下方フイルム７８１下の検出／定量化装置は、カウジング７４１、サイト７３０の下方ボリューム７９２から発せられたＥＲ７６３を集光するための光ファイバー束７４３、ならびにサイト７３０の膜の下方ボリューム７９２および底面７５２に対して励起ＥＲ７６１を伝送するための他の光学経路７４５から構成されている。
【００７７】
三つの剛性フレーム７８０、７５０および７２０間のインターフェースは、気体交換(gas exchange)のために密閉してもよいし、アッセイが必要としない場合は密閉しなくてもよい。ほとんどの細胞ベースアッセイにおいては、酸素および二酸化炭素の拡散を抑制しすぎることなく過度の蒸発を防ぐため、空気流を最小にする必要がある。これを達成するには、オープンセル形式(open cell form)の薄い膜をフレーム間に位置させること、フレーム間に複数の小さなチャネルを設けること、膜７２１および／または７８１用に適切なガス交換率を有するフィルム素材を用いること、テストサイト間の膜７２１および／または７８１に顕微鏡でしか見えない程度の穴(microscopic holes)を設けること、または適切なガス交換率を得るため、テストサイトの７２１および／または７８１に顕微鏡でしか見えない程度の孔を十分に設けること、を含めて多くの方法がある。
【００７８】
半透明膜の製造のために用いられる適切なフィルムが得られる素材には、プラスチック、有機物質、金属、ガラスセラミックおよびこれらの組み合わせを含んでいる。本発明の半透明膜の好ましい実施形態においては、様々な波長範囲で当該膜を半透明にし、セル活性アッセイに用いられるセル識別用の染料の蛍光励起と放出帯域とを一致させる様々な染料を含むポリエステルフィルムが用いられる。上述の実施形態のサイクロトロン照射(cyclotron bomberdment)およびエッチング技術で製造されるものには、エッチング可能な素材を用いることが必要である。ポリエステルおよびポリカーボネートは、非常に優れたエッチング特性を有しており、広く用いられている。ポリエステルは、一旦製造した後、染料をフィルム内に混入させるのが容易なのでポリカーボネートよりも好ましい。こうして、ベースフィルムに染料を混入させてポリカーボネートフィルムが構成されるが、このフィルムの他の特性、特に厚みが均一でないので、フィルム材料としては余り好ましくない。
【００７９】
膜を半透明にする他の方法には、金属膜をプラスチックフィルムおよび／または膜上にコーテイングまたは堆積させることがある。かかる製造方法には、利益と不利益がある。例えば、染色済みのほぼ不透明な膜を用いると、孔内の反射をによっていくらかの光が孔を通過する。しかし、細胞活性アッセイに用いられる標準的な検出／数値化システムは、それを測定できるほど感度がよくないので、通過する光の量は、非常に小さいく実用上問題とはならない。しかし、膜が金属原子でコートされている場合、孔の内表面は、非常に反射しやすくなっている。このことは、Ｐが９９．９％の実質的にＲ−不透明＠Ｐ％膜を製造しようとする目的とは反するものである。さらに、堆積されたコーテイングは、アッセイにおいて用いられる細胞の活性を阻害又はそれに影響を与えてはならない。
【００８０】
細胞アッセイ装置を用いた方法
上記図6aから図6cに図示された本発明の実施形態を用いた方法において、測定対象の細胞は、膜の一方側に配置され、細胞活性におよぼす溶液の影響アッセイしようとするその溶液は、前記膜の正反対の側に配置される。本実施形態の好ましい膜は、ほぼＲ−不透明＠Ｐ％膜である、ここで、Ｒは４００ナノメーターから５８０ナノメーターで、Ｐ％は、９９．９％で、膜厚は、３１ミクロンであり、孔の直径が８ミクロンであり、オフアクシス孔の入り口(incodent)の角度範囲は、４４度から４６度の間である。励起に４８５ナノメーターのＥＲを有するＣＡＡ装置およびサイト内細胞によって発せられたＥＲ用の５３０ナノメーター検出／数値化システムを用いると、膜の反対側の細胞の励起／検出／数値化システムからの貢献度は、任意のサイトのカウント数の０．０００５％未満である。かかる膜は、平方センチ当たり１ｘ１０３から２ｘ１０９の範囲の孔密度、１から１０００ミクロンの膜厚、約１５度から７０度の入口角度を持った孔を有するものであってもよい。
【００８１】
以下に、ＣＡＡ装置６００を用いた他の方法又はそれと同様の方法を説明する。
【００８２】
方法Ｉ
方法Ｉは、以下のステップを備えている：
１．  約８４個の下方ボリューム（ウエル）６９２を、３０マイクロリットルの試験溶液で満たす、すなわち、ポジテイブコントロール、ネガテイブコントロール又は、未知コントロールである。
【００８３】
２．残りの、下方プレート６８０の約一列を、前記検出／数値化システムの最低感度又はその少し下まで低下させる段階的希釈(serial dilusion)を行うよう２５マイクロリットルの細胞懸濁液(cell suspension)で満たす。これにより、テストサイトの下方ボリュームの読み取りが読み取り行われた場合のエラーの補償基準が設定される。
【００８４】
３．フレームにしっかり取り付けられた膜６５０／６５１は、マイクロプレートに位置し、そこに取り付けられる。
【００８５】
４．テストサイトのうち約８４個の上方ボリューム６９３において膜６５１の頂面に約２５マイクロリットルの細胞懸濁液が、滴下される。ステップ２のように、段階的希釈が行われている約２５マイクロリットルの同じ細胞懸濁液が、残りの上方サイトに滴下される。
【００８６】
５．蓋６２０／６２１がＣＡＡ装置に置し、そこに取り付けられる。
【００８７】
６．自動蛍光読み取り機(automatic fluorescence rreader)が、組み立てられたＣＡＡ装置６００ならびに各サイトにおけるＵ１およびＬ１の読み取りのために用いられる。かかるデータは、後に行われる比較、補償、および演算のため、メモリに記憶される。
【００８８】
７．ＣＡＡ装置６００は、適切な温度および湿度で（例えば、人間用ＣＡＡの場合、３７℃で９８％の相対湿度が、通常適切である）ならびに、特定細胞活性のアッセイのため適切な時間間隔で、インキュベートされる。この間隔は、通常、１５分から４８時間の間である。光学的インキュベーションの長さは、力学計算を行うこと(doing kinetics)または異なるインキュベーション時間による連続的実験を行い、次に、最善の実験結果を得られるインキュベーション時間を選択することにより決定される。細胞活性アッセイにおいて、このことは、通常、ネガテイブコントロールサイトにおける計測値間の差とポジテイブコントロールサイトにおける計測値間の差が最大化されることを意味する。しかし、ＨＴＳにおいては、インキュベーション時間が長ければ長いほど、アッセイが高価になるので、最良のインキュベーションを短くせざる得ない。これは、ネガテイブコントロールサイト、ポジテイブコントロールサイト、および検査される化学物質を有するサイト間に著しい差が存在するかどうかを決定するための最短時間である。
【００８９】
８．ＣＡＡ装置６００が、インキューベーターから取り除かれ、ステップ（６）で説明したように、第二の時間ならびに各サイトにおけるＵ２およびＬ２を読み出し、係るデータをコンピュータのメモリに記憶する。
【００９０】
９．コンピュータは、ステップ６およびステップ８において集めたデータからｃｍｃ、ｃｍｃのパーセント、ｐｍｃ、ＰＭＣのパーセント、ｍｃ、およびｍｃのパーセントを算出する。コンピュータは、細胞懸濁液を段階的に希釈させた列サイトから集めたデータを用いて検出／数値化システムのエラーを補償することもできる。次に、コンピュータは、両端サイト(replicatesite)の各セット用に上述の数値の平均値を算出し、ポジテイブサイトのセット、ネガテイブサイトのセットおよび未知サイトのセットを比較した全アッセイの結果を集計する。また、コンピュータは、アッセイ用にＣＶを算出する。こうして算出された結果は、後の分析に利用可能である。
【００９１】
方法ＩＩ
方法ＩＩは、方法Ｉと同じステップを備えており、さらにステップ７の後に行われるステップ7aをさらに備えている；
7a.  例えば、２５４ナノメーターの短波長のＥＲを照射することにより上方ウエル内の細胞を全て死滅させるか、装置内の全ての細胞を死滅させ、（２）蓋６２０／６２１を取り除き、フィルム６２１の底表面６２３上の各サイトに約１０マイクロリットルの溶液を有し、細胞を素早く死滅させる他の蓋に置き換え、又は（３）これと等価の方法を行うことによりこれを達成する。
【００９２】
方法ＩＩＩ
方法ＩＩＩは、方法Ｉと同じステップを備えており、さらにステップ７の後に行われるステップ７ｂをさらに備えている；
7b.  以下の事を行うことにより、上方ウエル内又は装置内の全ての細胞を不活性化させる(immobilize)：（１）細胞を凍結させる（通常、装置全体を凍結させる事により達成される）、（２）細胞（又は装置）の温度を０℃から４℃の間に急激に低下させ、（３）蓋６２０／６２１を、例えば、４ミリモル(millimolar)のＥＤＴＡ等の細胞を不活性にするフィルム６２１の下方表面上の全てのサイトに固定されている液を有する他の蓋と置き換え、又は（４）これと等価の方法を行うことによりこれを達成する。
【００９３】
細胞活性が急激すぎ、異なるテストサイトで細胞が活性化する時間の差により結果の精度が低下する(compromised)ような場合、方法ＩＩおよび方法ＩＩＩは、方法Ｉよりも好ましい。このことは、インキュベーション時間が短い、例えば、３０分未満であり、検出／数値化時間が長い、例えば、１０分である場合に特に顕著である。ＨＴＳ用および超ＨＴＳ用に沢山のサイト（例えば、１５３６サイトおよび３４５６サイトと）を有する場合、正確な結果を得るため、細胞を死滅あるいは不活性化させなければならない。
【００９４】
方法ＩＶから方法ＶＩ
方法ＩＶは、方法Ｉを簡略化したものである。この方法において、ステップ（６）を除き、方法Ｉの全てのステップが実行される。これにより、かかる方法において、上方および下方ウエルからの放射読み取り値(readings of the emissions)は、一度だけしか得られない。
【００９５】
方法Ｖは、方法Ｉを簡略化したものであり、方法ＶＩは、方法ＩＩＩを簡略化したものである。すなわち、上述したように、ステップ（６）の読み取りは行われない。
【００９６】
簡略化されていない方法と比べ、これらの簡略化法ＩＶからＶＩは十分なデータを出力せず、かかるデータから抽出された情報は十分でもないし、重要性も低いが、いくつかのスクリーニング状況では十分である。かかる簡略化法は、方法Ｉから方法ＩＩＩに比べ、高速で、しかも安価であるという利点がある。
【００９７】
方法ＶＩＩ
方法ＶＩＩは、本質的な方法の集合である。方法ＶＩＩは、方法Ｉから方法ＶＩのすべてを備えており、Ｒ−不透明＠Ｐ％膜を有する装置を用いているが、実質的にはＲ−不透明＠Ｐ％ではない。すなわち、この方法の集合に用いられている膜は、最新鋭の検出／数値化システムにより用いられるような、ほぼ垂直のＥＲを許容する孔を有し、膜をそのまま貫通させるものである。これにより、感度は低下するが、いくつかのＣＢＨＴＳ状況下においては、方法Ｉから方法ＩＩＩと比較すると適切な結果が得られる。
【００９８】
方法ＶＩＩＩ
方法ＶＩＩＩは、他の方法の集合である。かかる方法は、上記で開示し、図7a1,
7a2、7bおよび7cに示されているようなＣＡＡ装置を用いている。これらの方法において、方法Ｉから方法ＶＩＩまでの最初の五つのステップは、以下のように変更される：
1a. 様々な制御溶液(control solutions)、ポジテイブおよびネガテイブ、ならびにテスト溶液、例えば、走化性要因(chemotatic factors)、が冷たい状態で準備される。これらの溶液は、約２０℃から４０℃の間の温度でゲル化させるため、アッセイの細胞と互換性のある、十分な割合のコラーゲン(collagen)、ゼラチン(gelatin)、ファイバーネクチン(fibernectin)、ラマニン(lamanin)または他の適切なゲル形成材料を含んでいる。これらの溶液は、約４℃から１０℃に置かれている場合にはゲル化しないので、予め４℃で貯蔵することで準備することができる。２０℃から３７℃に達すると、これらの液はゲル化してしまう。ゲル化剤の温度、ペーハー値、および濃度は、ゲル化するのに要する時間量によって決定される。これらのパラメーターは、一定の制限内で、都合にあわせて操作することができる。例えば、１ミリリットルのＤＭＥＭバッファ中の、約１００μグラムタイプＩのコラーゲンであってペーハー値が７．２のものは、多くの細胞活性アッセイ用に適切な溶剤である（臨床癌研究、Vol. 5, 1999年３月、M.E.スターンス等を参照のこと）。
【００９９】
テストされる化合物と混合したゲル形成化合物を含む０．５μリットルから２．５μリットル間の低温溶液と同量（例えば、ポジテイブコントロール（既知の走化性要因）、追加化合物の無いネガテイブコントロール、および未知のもの）は、テストサイト７３０の下のボリュームの底面を定める疎水性マスク７８４によって取り囲まれる下方フィルム７８１の頂面７８２上にピペッテイングロボット（例えば、コネチカット州、ブルックフィールドのサイバーラボ社のモデルＣ−３００またはモデルＣ−４００）を用いてピボットされる。使用可能な１５３６個のうち約１５００個のサイトにピボットがなされる。液の水滴が、フィルム７８１に付着し、頂面７８２から１．０ｍｍから１．７ｍｍ上昇する。疎水性マスクは、細胞活性テストサイトを視覚的に定め、テスト溶液の横方向への移動を阻止する。
【０１００】
2a. 残りのテストサイトは、段階的希釈が行われている細胞懸濁液で満たされるが、この場合、ステップ（1a）と同量が用いられる。システムの様々な部品のエラーの検出を促進するとともに、かかるエラーを補償するため、他の種類のコントロールおよび調整溶液、例えば、蛍光性染料、を装置の様々な場所に置くこともできる。
【０１０１】
3a. フレームにしっかり取り付けられた膜７５０／７５１は、下のフレームに取り付けられた膜７８０／７８１上に位置するとともに、それに取り付けられる。位置決めまたは取り付け金具または接着剤は、装置の下方と中間部品とを一緒にし、固定する。膜と底のフィルム間の最終的な距離は、下方フィルム上の溶液が膜７５１の下表面７５２に接し、それを濡らすように、フレームの一部である、下方フィルム７８２の頂面と膜７５２の底面間の厚みによって決定される。その範囲内で低い方のボリュームを所望する場合、かかる距離は短くなるが、反対の場合もありうる。
【０１０２】
3b. 一つになったこれら二つの部品７８０および７５０は、溶液をゲル化させるために、取っておかれ、または、１０分から９０分の間インキュベーター内に置いておかれる。
【０１０３】
4a.  次に、０．５マイクロリットルと２．５μリットルの間の細胞懸濁液が、の膜７５１の頂面７５３上の約１５００個のサイト上に滴下される。しかし、この場合、段階的希釈が行われているサイトおよびコントロールおよび調整溶液を有する他のサイトに、細胞懸濁液が滴下されることはない。これは、ＣＡＡ装置６００と異なり、ＣＡＡ装置７００においては下方ウエルにおけるこれらのサイトの溶液が、膜の底面側７５４と接触するからである。
【０１０４】
5a. 次に、蓋７２１／７２０は、フレームに取り付けられた膜７５０／７５１上に位置するとともに、取り付け金具または接着剤によって固定された前記二つの下方部品上に置かれる。上法フィルム７２１の下面７２３は、約１５００個のボリューム内の細胞懸濁液と接触し、装置の三つの剛性部品７２０、７５０および７８０がユニット７００を構成する。
【０１０５】
本手順のこの時点で、方法Ｉから方法ＶＩＩＩのいずれかにおいても、（上述の）ステップ（６）から始まる工程についてハードウエアの必要に応じて変更を加えるようにしてもよい。例えば、動蛍光読み取り機の検出ビーム発生器(detector beams)は、サイトの上方および下方ボリュームから発せられた光を集め、その量を測定する集光システム(optical collection system)よりも小型でなければならない。
【０１０６】
上述の方法においては、各サイドにおいて、(a)ピペットされた細胞の数、(b)膜を通じて移動した細胞の数、(c)移動していない数、(d)膜内に移動しているが、それを通過していない数、および(e)移動総数、の検出および数値化を可能にするため装置６００、７００、又はそれに近似した装置を用いている。このデータから、いずれのサイトから移動した細胞の割合とともに、そのサイトの膜を通過した細胞の割合をも算出することができる。この結果は各サイトごとに算出することが可能なので、ピペットにより生じるエラー（量のばらつき）および各ボリューム内への細胞の不均等な分配によるエラーの両方を除去することができる。
【０１０７】
装置６００または装置７００において用いられるほぼＲ−不透明＠Ｐ％膜が、図４ｂおよび図４ｃで開示された方法により製造されている場合、サイトからサイト間の孔の数を完全に均一にすることができるので、ＣＶを更に減少させることが可能となる。
【０１０８】
方法ＶＩＩＩが、Ｒ−不透明＠Ｐ％膜といっているが、実質的にＲ−不透明＠Ｐ％ではない膜を採用したＣＡＡ装置を用いた場合でも、いくつかのＣＢＨＴＳ状況下で、適切な結果が得られる。これらの結果は、(a)孔密度が非常に低く、(b)孔の直径の大きい、(c)膜厚が薄い、および(d)細胞密度の低い、ものを用いることが好ましいアッセイを含んでいる。また、このシステムは、非常に低いバックグランド蛍光性(background fluorescence)を有していなければならならず、検出／数値化システムは、非常に高い感度を有しなければならない。かかる状況において、検出システムは、細胞が孔を通って移動する場合に、かかる細胞を検出する。例えば、セロミックス社（ペンシルバニア州、ピッツバーグ）により、このことを達成するような新たな検出機器であって、解像度の高い光学システムが開発されている。この状況において、いくつの細胞が膜を通過して移動したかを測定することはできないが、孔を介していくつ移動したかは測定することが出来る。かかるアッセイは、珍しく、高価である。このようなＣＢＨＴＳ状況が、存在する場合、これに用いられる方法は、多分、細胞活性の運動(kinetics)に関するデータを取得し、かかる方法は、上述したものとは異なる。
【０１０９】
上述の全ての方法は、ＣＡＡ装置の下方ウエル内に細胞が挿入されるよう変更することができる。例えば、方法ＶＩＩＩにおいて、上述のように、細胞を、ゲル化していないゲル溶液(ungelled gel solution)として保留(suspended)しておき、膜の底面が反転した場合、膜の底面上のサイトに滴下することができる。反転したフレーム取り付け下方フィルム(inverted lower framed film)は、次に、反転したフレーム取り付け膜(inverted framed membrane)上に位置すると共にそれに取り付けられる。溶液がゲル化すると、装置は、反転し、テスト溶液およびコントロールが膜の上方サイトに滴下され、次に、フレーム取り付け上方フィルムが位置し、取り付けられる。こうして、細胞は、フィルターを通じて上に移動する。装置の相違に適合する変更を行うことにより、６００に近似するＣＡＡ装置を用いて同様の結果を得ることができる。
【０１１０】
本明細書中で説明した実施形態に関し、上記の開示を考慮に入れて様々な変更を加え、改良を行うことは、当業者にとって自明のことである。例えば、既存のものに代わる新しいＣＡＡ装置において、各サイトが、ウエルを上方チャンバーおよび下方チャンバーに分割する挿入物(an insert)を有するウエルである。このようなＣＡＡ装置において、挿入物は、プレートの形になるよう一緒に接着される。かかる挿入物は、本発明の膜を組み込む。
【０１１１】
他の例としては、特定の場合、細胞サンプルおよび当該サンプル液内の化学物質間、または膜を介しての細胞の移動後に溶液内に混合された化学物質の化学的な相互作用が、ＥＲビームを導入すること無く検出可能な光を生成する。かかる場合に、化学物質が膜の反対側のチャンバー内に拡散していると、移動しない細胞により発せられるＥＲの通過を阻止するため、角度を付けて孔を設けなければならなくなる。さらに、本発明は、サンプルが液体培地(liquid medium)でなくてもよいアッセイをも含み、導入され検出されたＥＲの波長に対し、膜がほぼ不透明である限り、例えば、気体培地(gas medium)によって運ぶようにしてもよい。
【０１１２】
前記の実施形態の開示および本発明の方法は、図示および説明の目的でなされたものであり、本発明を、開示されたものと同じ形式のものに完全に限定することを意図するものではない。本発明の範囲は、添付した特許請求の範囲およびその均等物のみによって決められる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、正確に垂直なＥＲによる本発明の一つの膜の一部分の切断面の略図である。
【図２】  図２は、β−ノーマルＥＲによる本発明の膜の一部分の切断面の略図である。
【図３】  図３は、曲線状の（ｃｕｒｖｅｄ）孔（ｐｏｒｅｓ）及びノーマルなＥＲによる本発明の膜の一部分の切断面の略図である。
【図４ａ】  図４ａは、フィルムのウェブ（ｗｅｂ）及びエキシマレーザーによる本発明の膜の作製プロセスの略図である。
【図４ｂ】  図４ｂは、フレームされたフィルム及びエキシマレーザーによる本発明の膜の作製プロセスの平面図の略図である。
【図４ｃ】  図４ｃは、フレームされたフィルム及びエキシマレーザーによる本発明の膜の作製プロセスを示す図４ｂの側面図である。
【図４ｄ】  図４ｄは、エキシマレーザーによる本発明の曲線状の孔を有する膜の作製プロセスの略図である。
【図５ａ】  図５ａは、サイクロトロン照射（及びそれに続くエッチング）を用いた、本発明の膜の第２作製プロセスの側面図の略図である。
【図５ｂ】  図５ｂは、サイクロトロン照射を用いた、本発明の膜の第２作製プロセスの平面図の略図である。
【図６ａ】  図６ａは、上述の図で見た本発明の好ましい実施態様で構成されるＣＡＡＡの略図である。
【図６ｂ】  図６ｂは、図６ａの好ましい実施態様の、拡大した切断面の略図の一部分を示す。
【図６ｃ】  図６ｃは、膜の孔を示す図６ａの好ましい実施態様の、さらに拡大した切断面の一部分の略図である。
【図７ａ】  図７ａ１及び図７ａ２は、それぞれ、本発明のその他の好ましい実施態様の平面図及び側面図である。
【図７ｂ】  図７ｂは、図７ａ１及び図７ａ２で示す本発明の好ましい実施態様の一部分の、拡大した切断面の略図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図４ｄ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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