(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
αｖβ５含有組織において血管形成を阻止するための医薬組成物であって、該医薬組成物はαｖβ５拮抗体の血管形成阻止量を含み、該αｖβ５拮抗体がαｖβ５に免疫特異的であるがαｖβ１、αｖβ３又はαＩＩｂβ３に免疫特異的でないモノクローナル抗体である、前記医薬組成物。
【請求項２】
前記モノクローナル抗体が、Ｐ１Ｆ６と称するモノクローナル抗体である請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記組織が炎症組織であり、前記血管形成が炎症組織血管形成である請求項１記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記組織が関節炎組織である請求項３記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記関節炎組織が、リウマチ様関節炎に罹った哺乳動物に存在する請求項４記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記血管形成が、糖尿病性網膜症、老人性黄斑変性症、推定眼ヒストプラズマ症、未熟児網膜症及び血管新生緑内障からなる眼疾患群より選ばれた眼疾患における血管形成である、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記組織が血管腫である請求項１記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記組織が充実性腫瘍又は充実性腫瘍転移であり、前記血管形成が腫瘍血管形成である請求項１記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記血管形成がサイトカインによって誘導される請求項１記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記サイトカインが、血管内皮細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子−α及び表皮増殖因子からなる群より選ばれる請求項９記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記サイトカインが血管内皮細胞増殖因子であり、前記血管形成が網膜血管形成、腫瘍血管形成及び炎症組織血管形成からなる群より選ばれる請求項１０記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記血管形成阻止量が２μＭ〜５ｍＭである請求項１記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的には、医薬品の分野に関し、詳細には、ビトロネクチンレセプターαｖβ５の拮抗体を用いて組織のαｖβ５仲介血管形成を阻止する方法及び組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
インテグリンは、細胞外マトリックスタンパク質を結合し、通常は細胞接着現象と言われる細胞−細胞及び細胞−細胞外マトリックス相互作用を仲介することが既知の細胞レセプターの一種である。しかしながら、多くのインテグリンとその各リガンドが文献に記載されているが、インテグリンの多くの生物学的機能は依然としてわかりにくいままである。インテグリンレセプターは、α及びβサブユニットからなるヘテロ二量体非共有結合糖タンパク質の構造上の特徴を共有したタンパク質ファミリーを構成している。
【０００３】
ビトロネクチンに優先的に結合することの最初の特性に対して名付けられたビトロネクチンレセプターは、現在、αｖβ１、αｖβ３及びαｖβ５と称される３種類の異なるインテグリンを示すことが既知である。Ｈｏｒｔｏｎ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈｏｌ．，７１：７４１−７５９（１９９０）。αｖβ１は、フィブロネクチン及びビトロネクチンと結合する。αｖβ３は、フィブリン、フィブリノーゲン、ラミニン、トロンボスポンジン、ビトロネクチン、フォンビルブラント因子、オステオスポンチン及び骨シアロプロテインＩを含む種々のリガンドと結合する。αｖβ５は、ビトロネクチンと結合する。組織内の多くの細胞相互作用においてそれらの３種類のインテグリンが果たす特定の細胞接着の役割はなお研究中である。しかしながら、生物学的機能が異なる種々のインテグリン及び生物学的特異性を共有する種々のインテグリンとサブユニットがあることは明らかである。
【０００４】
多くのインテグリンに対するリガンドの重要な認識部位は、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）トリペプチド配列である。ＲＧＤは、ビトロネクチンレセプターインテグリンに対して上記で同定したリガンドの全てに見られる。そのＲＧＤ認識部位は、ＲＧＤ配列を含むポリペプチド（“ペプチド”）によってよく似ており、そのようなＲＧＤペプチドはインテグリン機能の既知のインヒビターである。しかしながら、ＲＧＤペプチドの配列及び構造によって阻害の特異性が変えられ特定のインテグリンを標的にすることがわかることは重要である。
【０００５】
ＲＧＤ認識部位の論理についてはＰｉｅｒｓｃｈｂａｃｈｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，３０９：３０−３３（１９８４）及びＰｉｅｒｓｃｈｂａｃｈｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：５９８５−５９８８（１９８４）を参照されたい。種々のインテグリン特異性を有するＲＧＤポリペプチドは、Ｇｒａｎｔら，Ｃｅｌｌ，５８：９３３−９４３（１９８９），Ｃｈｅｒｅｓｈら，Ｃｅｌｌ，５８：９４５−９５３（１９８９），Ａｕｍａｉｌｌｅｙら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｓ．，２９１：５０−５４（１９９１）及びＰｆａｆｆら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：２０２３３−２０２３８（１９９４）並びに米国特許第４，５１７，６８６号、同第４，５７８，０７９号、同第４，５８９，８８１号、同第４，６１４，５１７号、同第４，６６１，１１１号、同第４，７９２，５２５号、同第４，６８３，２９１号、同第４，８７９，２３７号、同第４，９８８，６２１号、同第５，０４１，３８０号及び同第５，０６１，６９３号に記載されている。
【０００６】
血管新生とも言われる血管形成は、新たに発生する血管の組織への増殖を含む組織血管新生の過程である。その過程は、内皮細胞及び平滑筋細胞の浸潤によって仲介される。その過程は、次の３方法のいずれかで進行すると思われる。１）
血管が以前から存在する血管から発芽する；２）血管の新規発生が前駆細胞から生じる（血管形成）；又は３）存在する小血管の直径が増大する。Ｂｌｏｏｄら，Ｂｉｏｃｈ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１０３２：８９−１１８（１９９０）。血管内皮細胞は、ビトロネクチンレセプター（αｖβ３又はαｖβ５）、コラーゲンＩ及びＩＶ型レセプター（αｖβ１）、ラミニンレセプター（α２β１）、フィブロネクチン／ラミニン／コラーゲンレセプター（α３β１）及びフィブロネクチンレセプター（α５β１）を含む少なくとも５種類のＲＧＤ依存性インテグリンを含むことが既知である。Ｄａｖｉｓら，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５１：２０６−２１８（１９９３）。平滑筋は、α５β１、αｖβ３及びαｖβ５を含む少なくとも６種類のＲＧＤ依存性インテグリンを含むことが既知である。
【０００７】
血管形成は、新生児期の発生では重要な過程であるが、創傷治癒並びに組織炎症、関節炎、乾癬、がん、糖尿病性網膜症、黄斑変性症及び他の血管新生眼疾患を含む種々の臨床上重要な疾患の発病でも重要である。血管形成と関連があるこれらの臨床上の疾病は、血管形成疾患と言われる。Ｆｏｌｋｍａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３５：４４２−４４７（１９８７）。血管形成は、通常は成人又は成熟組織に存在しないが、創傷治癒及び黄体成長周期には存在する。例えば、Ｍｏｓｅｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４８：１４０８−１４１０（１９９０）を参照されたい。
【０００８】
種々のインテグリンα又はβサブユニットに免疫特異的なモノクローナル抗体を用いる試験管内細胞接着の阻止は、ビトロネクチンレセプターαｖβ３が微小血管内皮細胞を含む様々な種類の細胞の細胞接着に関係があることを示している。
【０００９】
Ｄａｖｉｓら，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５１：２０６−２１８（１９９３）。更に、Ｎｉｃｏｓｉａら，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１３８：８２９−８３３（１９９１）には、コラーゲンゲルで培養したラット大動脈から“微小血管”の試験管内形成を阻止するためにＲＧＤペプチド、ＧＲＧＤＳの使用が記載された。
【００１０】
しかしながら、コラーゲンゲル培養内の試験管内“微小血管”形成の阻止は、微小血管構造が毛細血管の発芽と同じであること或いはコラーゲンゲル培養内の微小血管の形成が関節炎組織、腫瘍組織又は血管形成阻止が望ましい疾患組織のような無傷組織への新生血管の発生と同じものであることが証明されないので組織における血管形成阻止のモデルではない。
【００１１】
最近、血管形成におけるαｖβ３の役割が確認された。Ｂｒｏｏｋｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６４：５６９−５７１（１９９４）を参照されたい。インテグリンは、ヒト創傷肉芽組織の血管に発現されるが正常な皮膚には発現されないことがわかった。αｖβ３レセプターに対するモノクローナル抗体は、増殖因子（サイトカイン）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）及び腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）並びにメラノーマフラグメントによって誘導される血管形成を阻止した。しかしながら、拮抗体は新しい血管のみ阻止し、以前から存在している血管を阻止しなかった。更に、特定の線状及び環状ＲＧＤ含有ペプチドが血管新生を阻止することもわかった。
【００１２】
血管形成の阻止が腫瘍の発生を制限するのに有効な治療法であることが提案された。血管形成の阻止は、（１）ｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）のような“血管形成分子”の放出阻害、（２）抗ｂＦＧＦ抗体の使用等による血管形成分子の中和、及び（３）血管形成刺激に対する内皮細胞応答の阻害によって提案された。後者の戦略が注目され、Ｆｏｌｋｍａｎら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３：８９−９６（１９９２）には血管形成を阻止するために用いられるコラゲナーゼインヒビター、基底膜代謝回転インヒビター、止血ステロイド、真菌由来血管形成インヒビター、血小板因子４、トロンボスポンジン、Ｄ−ペニシラミン及びチオマリン酸金のような関節炎薬剤、ビタミンＤ３類縁体、α−インターフェロン等を含む数種の内皮細胞応答インヒビターが記載された。更に提案された血管形成インヒビターについてはＢｌｏｏｄら，Ｂｉｏｃｈ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１０３２：８９−１１８（１９９０），Ｍｏｓｅｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４８：１４０８−１４１０（１９９０），Ｉｎｇｂｅｒら，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，５９：４４−５１（１９８８）並びに米国特許第５，０９２，８８５号、同第５，１１２，９４６号、同第５，１９２，７４４号及び同第５，２０２，３５２号を参照されたい。
【００１３】
しかしながら、血管形成におけるインテグリンαｖβ５の役割は、本発明まで示唆も同定もされてなく、αｖβ５阻害を標的にした前述の参考文献に血管形成インヒビターが記載されたものもない。更に、本発明以外の文献は、血管新生、特に、増殖因子、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子−α（ＴＧＦ−α）及び表皮増殖因子（ＥＧＦ）によって誘導した血管新生におけるαｖβ５インテグリンに関係していない。
【００１４】
血管形成の調節に関与する増殖因子の数は限定されるが、異なるレベルの調節の過程が静止状態から血管新生状態への転換に存在する。Ｄ’Ａｍｏｒｅ，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｏｐｈｔｈａｌ．Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉ．，３５：３９７４−３９７９（１９９４）を参照されたい。血管形成に関与する増殖因子は合成レベルで調節されるものもあれば、活性化状態によって調節されるものもある。静止血管は損傷又は虚血後に血管新生を受けるのでそれらの細胞現象が起こる。
【００１５】
ＶＥＧＦは、特に、原発性腫瘍及び虚血性眼疾患において主要な血管形成伝達物質であると考えられる。概説についてはＦｏｌｋｍａｎ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１：２７−３１（１９９５）を参照されたい。ＶＥＧＦは、チロシンキナーゼ活性を有する高親和性膜結合レセプターに結合する内皮細胞特異的血管形成因子（Ｆｅｒｒａｒａら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．Ｒｅｖ．，１３：１８−３２（１９９２））及び血管透過性因子（Ｓｅｎｇｅｒら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，４６：５６２９−５６３２（１９８６））である４６キロダルトン（ｋＤａ）のホモ二量体である（Ｊａｋｅｍａｎら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８９：２４４−２５３（１９９２））。
【００１６】
最近、レセプターチロシンキナーゼの活性化により細胞外マトリックスタンパク質のインテグリン依存性細胞遊走が促進されることがわかった。特に、Ｋｌｅｍｋｅら，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１２７：８５９−８６６（１９９４）には、細胞運動を促進するのにＥＧＦレセプター（ＥＧＦＲ）チロシンキナーゼに関係があるとされたが、αｖβ５インテグリンを用いるビトロネクチンのＦＧヒト膵臓がん腫細胞の接着には関係がないとされた。著者らは、ＥＧＦリガンドによるＥＧＦＲの占有によりＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性化が活性化され、最後にはタンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）依存性経路を刺激し、細胞が本来遊走することが不可能なビトロネクチン基質のαｖβ５依存性細胞遊走の誘導をもたらすことを直接証明している。従って、Ｋｌｅｍｋｅらの知見は、細胞遊走においてインテグリン活性を有するサイトカイン、特にＥＧＦの存在が関係することを証明している。ＰＫＣの活性化により、ニワトリ絨毛尿膜モデル系において血管形成調節に関与することがわかった。Ｔｓｏｐａｎｏｇｌｏｕら，Ｊ．Ｖａｓｃ．Ｒｅｓ．，３０：２０２−２０８（１９９３）を参照されたい。著者らは、ＰＫＣの特定の活性化因子及びインヒビターを同定し、そのモデル系において血管形成を各々刺激及び阻止した。
【００１７】
しかしながら、上述されたＫｌｅｍｋｅらにもＴｓｏｐａｎｏｇｌｏｕらにも種々の症状及び病態において血管形成を促進するにあたってのサイトカインの役割及びαｖβ５インテグリンの発現及び／又は活性化及びαｖβ５特異的拮抗体によるその阻止が記載されていない。
【００１８】
最近の実験的証明から、眼疾患のサルモデル系においてレチナール静脈閉塞によって誘導されたレチナール虚血により眼房のＶＥＧＦが急速に上昇したことがわかった。その上昇は、Ｍｉｌｌｅｒら，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．，１４５：５７４−５８４（１９９４）に記載されるように虹彩の血管新生と同時に起こった。更に、酸素圧低下を生じる増殖性網膜症のマウスモデル系におけるデータのＶＥＧＦメッセンジャーＲＮＡは、相対的酸素圧低下の６〜１２時間以内に増え、血管新生が生じるまで上昇したままであることがわかった。新しい血管が減少するにつれて、Ｐｉｅｒｃｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９２：９０５−９０９（１９９５）に記載されるようにＶＥＧＦ発現も減少した。
【００１９】
従って、虚血の動物モデルで証明された最近のデータから、ＶＥＧＦの誘導と虚血の誘導後の血管新生との相関が示された。ＶＥＧＦ及び他の増殖因子は、また、Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１：２７−３１（１９９５）に概説されるように血管新生を含む他の症状及び病態に関係している。
【００２０】
Ｆｏｌｋｍａｎらの文献には、望ましくない血管形成を制御するために用いられる現在の臨床方法が総括されている。臨床試験の患者に血小板因子４、フマギリン誘導体、カルボキシアミノトリアゾール等を含む血管形成インヒビターによる治療法を行っている。しかしながら、文献又は現在の治療上の文献には、αｖβ５の発現が血管形成、特にＶＥＧＦによって誘導した血管形成と相関するものはない。
【００２１】
従って、本発明の以前にはαｖβ５の存在と活性化と相関した血管形成を受ける組織において血管形成を制御するためにαｖβ５拮抗体による治療法を記載又は使用したものはない。
【００２２】
従って、出願人は、αｖβ３及び血管形成に対する増殖因子との関係についてここに報告した研究以外に組織においてαｖβ５仲介細胞接着のインヒビターを用いて血管形成が阻止された証明を知らない。特に、αｖβ５機能が組織において血管形成に必要であること又はαｖβ５拮抗体が組織、特に眼血管新生疾患において血管形成を阻止することができることを以前に証明したものはない。
【発明の開示】
【００２３】
本発明は、組織においてαｖβ３要求性血管形成経路のほかに新規なαｖβ５依存性経路が別個に存在することを証明するものである。従って、本発明は、血管形成を阻止することができるαｖβ５インヒビターを述べるものである。本発明は、更に、血管形成を促進するのにαｖβ５仲介活性が増殖因子レセプターチロシンキナーゼ及びタンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）の増殖因子（サイトカイン）活性化と相関することを述べるものである。この方法で機能する増殖因子（サイトカイン）としては、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子−α（ＴＧＦ−α）、表皮増殖因子（ＥＧＦ）等が挙げられる。
【００２４】
従って、本発明は、組織において血管形成を阻止する方法であって、αｖβ５拮抗体の血管形成阻止量を含む組成物を該組織に投与することを特徴とする方法を述べるものである。治療されるべき組織は、血管新生が起こっている疾患組織のような血管形成の阻止が望ましい組織とすることができる。具体的な組織としては、血管新生を受ける眼組織、炎症組織、充実性腫瘍、転移腫瘍、再狭窄を受ける組織及び類似組織が挙げられる。好適実施態様においては、αｖβ５の発現と関連した血管新生は、増殖因子、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ−α及びＥＧＦに曝露した結果である。
【００２５】
糖尿病性網膜症（糖尿病性増殖性網膜症とも言われる）、老人性黄斑変性症、推定眼ヒストプラズマ症、早産網膜症、鎌状赤血球網膜症及び血管新生緑内障を含む疾患において血管形成が顕著な眼のような組織においてＶＥＧＦ誘導血管新生を阻止する方法に関する治療法が特に好ましい。好適実施態様においては、更に、治療法は角膜移植、ヘルペス性角膜炎、梅毒性角膜炎、翼状片、コンタクトレンズ装用に伴う血管新生パンヌス等を含む角膜血管新生障害に起こる血管形成を阻止する方法に関する。
【００２６】
本方法に使用するためのαｖβ５拮抗体は、αｖβ５に結合しかつビトロネクチン天然リガンドに結合するαｖβ５の能力を競合的に阻害することができる。好ましくは、拮抗体は他のインテグリンよりαｖβ５に特異性を示す。特に好適実施態様においては、αｖβ５拮抗体はビトロネクチン又は他のＲＧＤ含有リガンドのαｖβ５への結合を阻害するが、ビトロネクチンのαｖβ３又はαＩＩｂβ３への結合を実質的に阻害しない。好ましいαｖβ５拮抗体は、線状又は環化ポリペプチド、モノクローナル抗体又はその機能性断片、又は全てαｖβ５と特異的に相互作用する有機擬似体とも呼ばれるαｖβ５リガンドの擬似体である有機分子とすることができる。
【００２７】
本発明のαｖβ５拮抗体の投与としては、眼内、静脈内、経皮、滑液嚢内、筋肉内及び経口投与が挙げられる。他の好適実施態様においては、投与と腫瘍発生及びがん転移を制御する化学療法とが併用される。
【００２８】
図面の簡単な説明
図面は、本開示の一部をなすものである。
【００２９】
図１Ａ〜図１Ｄは、αｖインテグリン抗体拮抗体によるサイトカイン誘導ウサギ角膜血管形成の阻止を示す写真である。ｂＦＧＦ或いはＶＥＧＦで処理することによる血管形成の誘導及びαｖインテグリン抗体拮抗体、Ｐ１Ｆ６（αｖβ５）及びＬＭ６０９（αｖβ３）による治療効果は実施例４に記載されている。ＯＤ及びＯＳは、実験用ウサギの各々右目及び左目である。大きな矢印は浮腫を伴う角膜血管形成を示し、小さな矢印は正常な結膜の縁血管を示す。図１Ａ及び図１はｂＦＧＦによる血管形成の誘導を示す写真であり、図１Ｃ及び図１ＤはＶＥＧＦによる血管形成の誘導を示す写真である。図１Ａ及び図１Ｃのウサギ角膜はＰ１Ｆ６による治療を示す写真であり、図１Ｂ及び図１ＤはＬＭ６０９による治療を示す写真である。
【００３０】
図２Ａ及び図２Ｂは、各々ｂＦＧＦ或いはＶＥＧＦによる誘導に続いてＰ１Ｆ６或いはＬＭ６０９によるｍＡｂ処理した後の平均新生血管面積ｍｍ２＋／−標準誤差（２組の各々についてｎ＝８）を示すヒストグラムである。結果は実施例４に記載されている。
【００３１】
図３Ａ〜図３Ｆは、ニワトリＣＡＭ標品に対する抗インテグリン抗体処理の作用を示す写真である。結果は実施例６Ａに記載されている。血管形成をｂＦＧＦ或いはＶＥＧＦで誘導し、続いて対照として又は図１の説明に記載されたＰ１Ｆ６又はＬＭ６０９モノクローナル抗体と共にリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）を静脈内投与する。ｂＦＧＦで処理したＣＡＭを図３Ａ、図３Ｃ及び図３Ｅに示し、ＶＥＧＦで処理したＣＡＭを図３Ｂ、図３Ｄ及び図３Ｆを示す。ＰＢＳを静脈内に注射する対照ＣＡＭを図３Ａ及び図３Ｂに示す。図３Ｃ及び図３Ｄに示されるＣＡＭを治療するためにＰ１Ｆ６抗体を用い、図３Ｅ及び図３Ｆに示されるＣＡＭを治療するためにＬＭ６０９抗体を用いた。
【００３２】
図４Ａ及び図４Ｂは、図３Ａ〜図３Ｆに示された結果の定量を示すヒストグラムである。血管形成指数をＹ軸上に対照又は抗体処理に対してプロットする。図４及び図４Ｂは、各々ｂＦＧＦ誘導及びＶＥＧＦ誘導血管形成を示す図である。
【００３３】
結果は実施例４に示されている。
【００３４】
図５Ａ〜図５Ｆは、実施例６に記載されたニワトリＣＡＭ標品に対する合成ペプチド処理の効果を示す写真である。血管形成をｂＦＧＦ或いはＶＥＧＦにより誘導し、続いて対照として又は合成環状ペプチドＲＧＤｆＶ（配列番号４）又はＲＡＤｆＶ（配列番号５）と共にリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）を静脈内投与する。ｂＦＧＦで処理したＣＡＭを図５Ａ、図５Ｃ及び図５Ｅに示し、ＶＥＧＦで処理したＣＡＭを図５Ｂ、図５Ｄ及び図５Ｆに示す。ＰＢＳを静脈内に注射する対照ＣＡＭを図５Ａ及び図５Ｂに示す。図５Ｃ及び図５Ｄに示されるＣＡＭを治療するためにＲＤＧｆＶペプチドを用い、図５Ｅ及び図５Ｆに示されるＣＡＭを治療するためにＲＡＤｆＶペプチドを用いた。
【００３５】
図６Ａ及び図６Ｂは、図５Ａ〜図５Ｆに示された結果の定量を示すヒストグラムである。血管形成指数をＹ軸上に対照又は抗体処理に対してプロットする。図６及び図６Ｂは、各々ｂＦＧＦ誘導及びＶＥＧＦ誘導血管形成を示す図である。
【００３６】
結果は実施例６に示されている。
【００３７】
図７Ａ〜図７Ｅは、別個のサイトカイン、ｂＦＧＦ、ＴＮＦ−α、ＶＥＧＦ及びＴＧＦ−αで誘導したＣＡＭ血管形成に対する抗インテグリンモノクローナル抗体及びカルホスチンＣの作用を示すヒストグラムである。ＰＭＡも評価した。
【００３８】
分析及び結果は実施例６に記載されている。結果をヒストグラムでプロットし、血管形成指数をＹ軸上に示し、種々の対照又はインヒビターをＸ軸上に示す。図７Ａ〜図７Ｅは、各々ｂＦＧＦ、ＴＮＦ−α、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ−α及びＰＭＡで誘導した血管形成を示すヒストグラムである。
【００３９】
図８は、実施例５Ｃ及び図６Ｄに記載されるように分析を行ったニワトリ胚ＣＡＭにおけるＣＳ１メラノーマ腫瘍発生に対する抗体処理の作用を示すヒストグラムである。Ｘ軸上に示された種々の処理に対して腫瘍重量ミリグラム（ｍｇ）をＹ軸上にプロットする。ＣＳＡＴは、インテグリンβ１サブユニットに特異的な対照抗体である。ＬＭ６０９及びＰ１Ｆ６は以前に記載されている。
【００４０】
図９は、Ｙ軸上にプロットした腫瘍容積ｍｍ３で測定されるメラノーマ腫瘍発生に対してαｖβ５ペプチド拮抗体、標識ペプチド１８９（配列番号９）の効果を対照と対比して示すヒストグラムである。分析及び結果は実施例８に記載されている。
【００４１】
図１０は、実施例１０Ａ〜Ｇに記載される化合物７の合成を示すスキームである。
【００４２】
図１１は、実施例１０Ａ〜Ｃ；Ｈ〜Ｉに記載される化合物９の合成を示すスキームである。
【００４３】
図１２は、実施例１０Ｊに記載される化合物１０の合成を示すスキームである。
【００４４】
図１３は、実施例１０Ｋ〜Ｌ及び１０Ｍ〜Ｎに各々記載される化合物１２及び化合物１４の合成を示すスキームである。
【００４５】
図１４は、化合物１５、化合物１６、化合物１７及び化合物１８を示す化学構造である。前記化合物の詳細な合成は、実施例１０Ｏ〜Ｒに記載されている。
【００４６】
発明の詳細な説明
Ａ．定義
アミノ酸残基：ポリペプチドのペプチド結合における化学消化（加水分解）によって生成されたアミノ酸。本明細書に記載されるアミノ酸残基は、“Ｌ”異性体であることが好ましい。しかしながら、所望の機能性がポリペプチドによって保持される限りＬ−アミノ酸残基を“Ｄ”異性体の残基に置き換えることができる。ＮＨ２は、ポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離アミノ基を意味する。ＣＯＯＨは、ポリペプチドのカルボキシ末端に存在する遊離カルボキシ基を意味する。標準ポリペプチド命名法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４３：３５５２−５９（１９６９）に記載され、３７  ＣＦＲ§１．８２２（ｂ）（２））で採用された）に従うに当たり、アミノ酸残基の略号を下記の対応表に示す。
【００４７】
【表１】
0004544639.tif 000002
更に、次の略号は下記の意味をする。
【００４８】
【表２】
0004544639.tif 000003
全てのアミノ酸残基配列は、本明細書において左右の向きがアミノ末端からカルボキシ末端への慣用的方向にある式で表されことは留意されるべきである。更に、アミノ酸残基配列の始め又は終わりのダッシュは、１個以上のアミノ酸残基の配列へのペプチド結合を意味することは留意されるべきである。
【００４９】
ポリペプチド：  隣接アミノ酸残基のα−アミノ基とカルボキシ基間のペプチド結合によって相互に結合した線状のアミノ酸残基。
【００５０】
ペプチド：  ポリペプチドのように一方をもう一方に結合した約５０個を超えない線状のアミノ酸残基。
【００５１】
環状ペプチド：  対応する線状ペプチドに由来しかつ遊離Ｎ末端又はＣ末端が存在せず該対応する線状ペプチドのＮ末端が前記対応する線状ペプチドのＣ末端カルボン酸へのアミド結合をなす環状ペプチド。
【００５２】
タンパク質：  ポリペプチドのように一方をもう一方に結合した５０個より多い線状のアミノ酸残基。
【００５３】
合成ペプチド：  天然に存在するタンパク質及びその断片を含まないペプチド結合で共に結合した化学的に生成したアミノ酸残基鎖。
【００５４】
Ｂ．概要
本発明は、一般的には、血管形成が特定のビトロネクチンレセプターαｖβ５によって仲介されかつαｖβ５機能阻害が血管形成を阻止するという発見に関する。
【００５５】
本発見は、血管形成が種々の疾患過程に役割を果たしていることから重要である。血管形成を阻止することにより、疾患に介在し、症状を改善し、ある場合には疾患を治癒することができる。
【００５６】
新しい血管の発生が疾患と関係がある病状の原因であるか又はその原因となる場合、血管形成の阻止はその疾患の有害な作用を減少させる。例としては、リウマチ様関節炎、糖尿病性網膜症、炎症疾患、再狭窄症等が挙げられる。新しい血管の発生が有害組織の成長を支持するために必要である場合、血管形成の阻止は組織への血液供給を減少させ、血液供給の要求に基づいて組織量の減少に寄与する。例としては、増殖因子誘導血管形成をきたす虚血に応答した新しい血管の発生、腫瘍の厚さが数ｍｍを超えて発生するために血管新生が継続的に要求される場合の腫瘍の発生及び充実性腫瘍転移を確立する場合の腫瘍の発生が挙げられる。
【００５７】
本発明の方法は、治療法が血管形成に非常に選択的であり他の生物学的過程には選択的でないことから部分的に効果的である。実施例に示されるように、新しい血管の発生は実質的にαｖβ５のみ含有し、治療法は成熟血管に悪影響を及ぼさない。
【００５８】
αｖβ５のみの阻害が血管形成を効果的に阻止する発見は、潜在的特異性が高く相対的に毒性の低い治療組成物の開発を可能にする。本発明は１種以上のインテグリンを阻害する能力を有するペプチド系試薬の使用を開示するが、αｖβ５をより選択的に阻害する他の試薬を設計することができる。従って、ある種のペプチド系試薬はαｖβ５によって仲介されるもの以外の他の生物学的過程を阻害するという副作用がない。
【００５９】
例えば、本発明の教示によって示されるように、αｖβ５機能阻害に同様に選択的であるαｖβ５との免疫反応に非常に選択的でありかつαｖβ１、αｖβ３又はαＩＩｂβ３に選択的でないモノクローナル抗体を調製することが可能である。更に、ＲＧＤ含有ペプチドも本明細書に記載されるようにαｖβ５の阻害に選択的であるように設計される。
【００６０】
本発明の発見以前には血管形成及び血管形成に依存する過程がαｖβ５の生物学的機能を拮抗する試薬の使用により生体内で阻害されることは知られていなかった。
【００６１】
Ｃ．血管形成の阻止方法
本発明は、組織において血管形成を阻止し、血管形成に関係する組織における現象を阻止する方法を提供する。一般的には、本方法は、αｖβ５拮抗体の血管形成阻止量を含む組成物を該組織に投与することを特徴とする。
【００６２】
本発明の方法を実施するのに用いられる標的組織は、αｖβ５インテグリンレセプターの検出可能な存在を特徴とするαｖβ５含有組織として定義される。言い換えると、αｖβ５含有組織は細胞膜内のαｖβ５レセプター複合体の存在によって定義される。かかる組織としては、上皮及び間葉由来細胞が含まれる。レセプターの存在は、免疫反応が顕微鏡、免疫沈降、リガンド結合分析での競合及び類似手法によって組織に検出されるレセプターと抗αｖβ５インテグリンレセプター抗体との免疫反応性を含む多数の手段によって求められる。組織においてαｖβ５の存在を検出するのに使用するために好ましい抗体は、下記及び実施例１に記載される。例えば、免疫蛍光顕微鏡による腎、皮膚及び眼組織におけるαｖβ５の分布は実施例２に記載される。
【００６３】
本発明の方法の関係においては、αｖβ５含有組織は血管形成の徴候をもつものとしても特徴づけられる。上記の血管形成としては、全ての血管形成過程がαｖβ５によって仲介されかつαｖβ５の発現に依存する“発芽”、脈管形成又は血管腫脹を含む組織の血管新生に関係する種々の過程が含まれる。外傷治癒、黄体形成及び胚形成を除いて血管形成過程の大部分は疾患過程と関連があり、本治療法の使用はその疾患に選択的でありかつ有害な副作用がないと考えられる。
【００６４】
血管形成疾患と呼ばれる血管形成が重要であると考えられる種々の疾患としては、免疫及び非免疫炎症、慢性関節リウマチ及び乾癬のような炎症疾患、再狭窄症、アテローム性動脈硬化巣の毛細血管増殖及び骨粗鬆症のような血管の不適切な又は時機を失った侵入と関連がある疾患、及び充実性腫瘍、充実性腫瘍転移、線維性血管腫、水晶体後線維増殖、血管腫、カポジ肉腫及び腫瘍成長を支持する血管新生を必要とする類似のがんのようながん関連疾患が挙げられる。
【００６５】
血管新生を特徴とする眼疾患は、特に好ましい治療標的である。眼の血管新生は、視覚の破滅的喪失をきたす莫大な数の眼疾患に見られる最も共通の病変である。以前から存在する絨毛、網膜又は傍縁血管からの新しい血管の発生は、浮腫、出血又は線維脈管膜形成を招き眼の正常な解剖学上の関係の破壊及び付随する正常な視覚機能喪失をきたす。
【００６６】
血管形成を特徴とする眼疾患としては、角膜移植、ヘルペス性角膜炎、梅毒性角膜炎、翼状片、コンタクトレンズ装用に伴う血管新生パンヌス等が挙げられる。
【００６７】
更に、眼疾患としては、糖尿病性網膜炎（ＤＲ）、老人性黄斑変性症（ＡＲＭＤ）、推定眼ヒストプラズマ症（ＰＯＨＳ）、早産網膜症（ＲＯＰ）及び血管新生緑内障等が挙げられる。これらの疾患における血管形成の阻止は必ずしも基礎にある疾患を治癒しないが、それらに伴う視力罹病率を著しく減少させる。
【００６８】
例えば、２５年を超える間糖尿病に罹っている３００，０００人の９０％が逸脱血管及び／又は増殖血管を特徴とする網膜疾患であるＤＲに罹っている。これらの患者の３０％は、実際に、本発明の治療法で改善される後者の症状に罹っている。ＡＲＤＭについては、６５歳を超える人口の２５％、約６３０，０００人がその疾患に罹っており、２０３０年までに６３００，０００人を超える人がＡＲＤＭに罹るであろう。結果として、本発明の治療組成物及び方法によりαｖβ５関連血管形成を阻止する能力をもつことは治療的価値が大きい。
【００６９】
従って、疾患組織において血管形成を阻止する方法は、疾患の症状を改善すると共に疾患によっては疾患の治癒に寄与する。実施態様においては、本発明は組織における血管形成阻止それ自体を企図する。組織における血管形成の程度及び本方法によって達成される阻止の程度は、免疫組織化学によりαｖβ５が正の新生及び未熟血管構造を検出する実施例に記載されるような種々の方法で評価される。
【００７０】
本明細書に記載される種々の組織又は有機組織から構成された器官は、血管が血管形成刺激時に侵入することができる皮膚、筋肉、臓器、結合組織、関節、骨及び類似の組織を含む病態の血管形成を支持することができる。
【００７１】
特に、本発明の方法及びαｖβ５拮抗体組成物は、サイトカインとも呼ばれる増殖因子によって誘導された血管形成を阻止するのに治療的に有効である。生理的条件下で血管形成は高度に調節され、Ｂｒｏｏｋｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６４：５６９−５７６１（１９９４）に以前に発表されたように塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）のような特定の血管形成分子によって活性化されることがわかった。負の血管形成調節剤も記載されている。従って、血管形成は、局所刺激物質とインヒビター間の複雑なバランスによって調節される。Ｄ’Ａｍｏｒｅ，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｏｐｈｔｈａｌ．Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉ．，３５：３９７４−３９７９（１９９４）参照。
【００７２】
正常な静止毛細血管をしっかりと調節する血管形成刺激物質とインヒビター間の生理的バランスが妨げられる場合、ある種の病態が生じるにつれて毛細血管の内皮細胞が増殖、遊走及び最後には分化するように誘導されて新しい血管を形成する。
【００７３】
血管形成は、Ｌｅｉｂｏｖｉｃｈ，“Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  ｏｆ  Ｔｕｍｏｒ  Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ”，“Ｈｕｍａｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ：  Ｔｈｅｉｒ  Ｒｏｌｅ  ｉｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ”，ｅｄｓ．Ａｇｇａｒｗａｌ  ＆  Ｐｕｒｉ，Ｃｈａｐ．３５，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．（１９９５）に概説されるように初発現象に続いて後発現象を有する現象カスケードとして確認される。初発現象の前に、血管外供給源から供給された血管形成増殖因子及びサイトカインが供給される。次に、初発現象が標的微小血管系において細胞間結合の破壊、内皮細胞活性化抗原及びタンパク質分解表現型の発現の誘導、及び方向性での内皮細胞遊走の開始により進行する。後発現象は、発生する毛細血管蕾の細胞、内皮細胞、周囲細胞及び平滑筋細胞内の増殖因子及びサイトカイン遺伝子の自己分泌及びパラ分泌発現で確認される。それらの細胞は、細胞と細胞外マトリックスとの相互作用をモジュレートし、存在する成熟血管から新しい機能性毛細血管ループが形成される。
【００７４】
本明細書及び背景で述べた文献には、ヒト及び実験動物の双方においてαｖβ５発現亢進と関連があるもの、即ち、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ−α及びＥＧＦ、腫瘍量の増大と関連があるもの及び増殖性血管新生眼疾患の血管形成開始におけるものを含む増殖因子の出現の間での関連が記載されている。
【００７５】
従って、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦ−αが、特に、細胞増殖を促進するという特性を特徴とする増殖因子と考えられる。増殖因子は、ある細胞によって分泌され、その分泌細胞又は別の細胞に作用するタンパク質である。作用能は、通常は貫膜タンパク質である増殖因子レセプターの存在に依存する。ＶＥＧＦのような増殖因子は、一般的にはサイトカインと言われ、同じ細胞（自己分泌）或いは別の細胞（パラ分泌）の成長及び代謝に影響を及ぼす、細胞によって分泌されるポリペプチドホルモンとして定義される。サイトカインという用語は、免疫系の細胞によって生じる分子及び同じ系の生体応答調節剤に限定されない。従って、サイトカインは広い範疇の用語であり、生体応答の種類に基づく下位範疇がＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α等の刺激増殖因子又はエンハンサーである。
【００７６】
概説としては、Ａｇｇａｒｗａｌら，“Ｃｏｍｍｏｎ  ａｎｄ  Ｕｎｃｏｍｍｏｎ  Ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｏｆ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：  Ａｎ  Ｏｖｅｒｖｉｅｗ”，“Ｈｕｍａｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ：  Ｔｈｅｉｒ  Ｒｏｌｅ  ｉｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ”，ｅｄｓ．Ａｇｇａｒｗａｌ  ＆  Ｐｕｒｉ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．（１９９５）を参照されたい。
【００７７】
本発明においては、組織において血管形成を阻止するのに使用するためにαｖβ５に特異的な拮抗体、及びＶＥＧＦに対する抗体のようなαｖβ５に特異的でない増殖因子拮抗体が企図される。好適実施態様においては、本明細書に記載されるαｖβ５拮抗体は、αｖβ５インテグリンレセプターの発現が誘導される増殖因子誘導血管形成を阻止するのに有効である。この関係において好ましい増殖因子としては、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α等が挙げられる。
【００７８】
背景で述べた増殖因子ＥＧＦ及びＶＥＧＦは、共にチロシンキナーゼとして作用する細胞レセプターに結合することが既知である。ＥＧＦレセプターの活性化は、αｖβ５の活性化をもたらしてビトロネクチン基質上の特定な細胞の遊走を可能にするプロテインキナーゼＣの活性化と相関することがわかった。従って、サイトカイン又は増殖因子に対する曝露とインテグリン発現又は活性化における協調応答間の作用機構は、複雑な生物学的過程である。本発明に示されるように（実施例６Ａ参照）、ウサギ眼モデル或いはニワトリ絨毛尿膜モデルにおける組織をサイトカインＶＥＧＦで処理するとプロテインキナーゼＣの活性化に依存するαｖβ５増強血管形成が得られる。
【００７９】
特に好適な実施態様においては、本発明は、血管形成がＶＥＧＦによって誘導された組織において血管形成を阻止するためのαｖβ５拮抗体の使用を企図する。
【００８０】
例えば、種々の動物モデル系における網膜の虚血により、ミュラー細胞から分泌されるＶＥＧＦのアップレギュレーションを生じ、結果としてその生産が眼内の組織の血管新生を誘導することがわかった。Ｍｉｌｌｅｒら，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．，１４５：５７４−５８４（１９９４）及びＰｉｅｒｃｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９２：９０５−９０９（１９９５）を参照されたい。
【００８１】
従って、本発明においては、治療されるべき組織は糖尿病性網膜炎、黄斑変性症、血管新生緑内障又は上述の類似疾患に罹った患者の網膜組織であり、阻止されるべき血管形成は網膜組織の血管新生がある網膜組織血管形成である。眼血管新生症状又は疾患をもつ患者からの角膜を含む具体的な組織は、上記及び実施例に記載される。網膜血管形成を治療する本発明のαｖβ５拮抗体の効果を評価する具体的なモデル系は、実施例９に記載される網膜血管新生のマウスモデルである。
【００８２】
他の関連実施態様においては、治療されるべき組織は炎症を起こした組織であり、阻止されるべき血管形成は炎症を起こした組織の血管新生がある炎症を起こした組織の血管形成である。その種類においては、本方法は慢性関節リウマチに罹った患者、免疫又は非免疫炎症組織、乾癬組織等のような関節炎組織における血管形成阻止を企図する。
【００８３】
サイトカインのインターロイキン１及び腫瘍壊死因子−αは、内皮細胞上での接着分子発現の誘導及び酵素放出に基づく関節破壊に直接役割があるリウマチ様関節炎と関連があると考えられる。Ａｒｅｎｄら，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ＆  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ，３８：１５１−１６０（１９９５）を参照されたい。双方のサイトカインをサイトカイン特異的インヒビターで阻害しかつ症状において発現する細胞接着分子を標的にする治療法が提案された。Ｈａｓｋａｒｄら，Ｃｅｌｌ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｃｏｍｍ．，２：２３５−２３８（１９９４）を参照されたい。
【００８４】
従って、本発明以前のようにαｖβ５接着分子の関係の治療に取組みかつ指示することによる関節炎症状における血管形成の阻止は、本発明の他の好適実施例である。
【００８５】
他の関連実施態様においては、治療されるべき組織は充実性腫瘍、転移、皮膚がん、乳がん、血管腫又は線維性血管腫及び類似のがんに罹った患者の腫瘍組織であり、阻止されるべき血管形成は腫瘍組織の血管新生がある腫瘍組織血管形成である。本方法により治療可能な典型的な充実性腫瘍組織としては、肺、膵臓、乳房、結腸、喉頭、卵巣及び類似組織が挙げられる。
【００８６】
ヒト充実性腫瘍に存在する複雑なサイトカイン網目の役割は、Ｌｅｅｋら，Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌ．，５６：４２３−４３５（１９９４）の概説の主題であり、この文献の開示は本願明細書に含まれるものとする。ＶＥＧＦ、酸性及び塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）、ＴＧＦ−α及び−β、ＥＧＦ、ＴＮＦ−α、血小板由来内皮細胞増殖因子、アンギオゲニン、インターフェロンα及びγ、インターロイキン１、６及び８等を含む多数のサイトカインは、悪性腫瘍組織及び細胞系における血管形成の種々の細胞機構に影響すると考えられる。例えば、ＶＥＧＦは、様々な種類の腫瘍の局在性のほかにＢｒｏｗｎら，Ｈｕｍａｎ  Ｐａｔｈ．，２６：８６−９１（１９９５）に記載されるように乳がんにおける血管形成に関連しでいることが最近わかった。
【００８７】
種々のサイトカインを分泌しかつサイトカインＶＥＧＦ、ＴＧＦ−α及びＥＧＦとの応答における、詳しくは本発明における局在化血管形成及び得られたαｖβ５介在血管形成を誘導する腫瘍は、腫瘍組織試料を抗サイトカイン抗体で選別することにより同定可能である。かかる方法は、培養した或いは生検した腫瘍組織試料について当業者に良く知られている。上記サイトカインに対する抗体は、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ニューヨーク州ユニオンデイル）又はＵｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（ニューヨーク州レークプラシッド）から市販されている。選定腫瘍組織のこれらの手段による選別は、本発明のαｖβ５拮抗体による血管形成阻害活性の可能性を評価することを可能にする。
【００８８】
具体的な腫瘍組織の血管形成、及びその阻止は実施例に記載されている。
【００８９】
腫瘍組織血管形成の阻止は、血管新生が腫瘍発生に重要な役割を果たすことから本発明の他の好適実施例である。腫瘍組織の血管新生が存在しないときの腫瘍組織は、必要とする栄養が得られず、増殖が遅く、追加の増殖が止まり、退行し、最後には壊死になって腫瘍の消滅がもたらされる。
【００９０】
言い換えると、本発明は、本方法に従って腫瘍の血管形成を阻止することにより腫瘍の血管新生を阻止する方法を提供する。同様に、本発明は、血管形成阻止方法を行うことにより腫瘍発生を阻止する方法を提供する。
【００９１】
本方法は、また、（１）転移形成には原発性腫瘍の血管新生が必要であるので転移性がん細胞は該原発性腫瘍を出ることができること及び（２）続発性部位の確立には転移の増殖を支持する血管新生がひつようであることから転移の形成に対しても特に効果的である。関連実施態様においては、本発明は、充実性腫瘍及び転移の確立の調節に対する慣用の化学療法のような他の治療法と併用した方法を企図する。血管形成インヒビターの投与は、典型的には化学療法中又は化学療法後に行われるが、血液補給及び栄養素を腫瘍組織に供給することにより回復するように血管形成を誘導することにより腫瘍組織が毒性に対して応答する度の化学療法後に血管形成を阻止することが好ましい。更に、充実性腫瘍が転移に対する予防として切除された手術後に血管形成阻止方法を施すことが好ましい。
【００９２】
本発明が腫瘍血管新生の阻止に用いられる限り、本方法は腫瘍組織発生の阻止、腫瘍転移形成の阻止、及び確立した腫瘍の退行に適用することができる。後者については、腫瘍量の減少は本発明に使用するために記載されたウサギ眼分析モデルにおいて又はＹａｎら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９１：９８６−９９６（１９９３）に記載されるように重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）をもつマウスの皮膚がヒト新生児包皮と置き換えられるキメラマウス：ヒトモデルのモデル系を用いて評価され、その文献の記載は本願明細書に含まれるものとする。後者のモデルは、本発明の方法による血管形成及びその阻止を調べる生体内モデルである。本発明のウサギ腫瘍モデルとαｖβ５拮抗体による具体的な結果は実施例５Ｃと６Ｄに示され、ＳＣＩＤマウスモデルにおける血管形成の阻止の結果は実施例８に記載される。
【００９３】
再狭窄症は、血管形成術の成功を妨害する経皮貫径冠状血管形成術の部位における平滑筋細胞（ＳＭＣ）遊走及び増殖の過程である。再狭窄中ＳＭＣの遊走及び増殖は、本方法によって阻止される血管形成過程とみなされる。従って、本発明は、血管形成術後の患者において本発明の方法に従って血管形成を阻止することにより再狭窄症の阻止を企図する。再狭窄症の阻止については、αｖβ５拮抗体が典型的には血管形成術後の約２〜約２８日間、更に典型的には手術後の最初の約１４日間投与される。
【００９４】
多くの実施態様において本発明で治療される患者はヒト患者が望ましいが、本発明の原理は本発明が“患者”という語に含まれるものである全ての哺乳動物について有効であることを意味することは理解されるべきである。この関係において、哺乳動物は、疾患、特に畜産又は家畜哺乳動物種の治療が本発明の方法について探究される哺乳動物種を含むことが理解される。
【００９５】
組織において血管形成を阻止し、血管形成関連疾患の治療方法を行う本方法は、血管形成が起こっている組織又は血管形成が起こる危険がある組織を、天然リガンドに結合するαｖβ５を阻害することができるαｖβ５拮抗体の治療的に有効な量を含む組成物と接触させることを特徴とする。従って、本方法は、本発明のαｖβ５拮抗体を含む生理的に許容しうる組成物の治療的に有効な量を患者に投与することを特徴とする。
【００９６】
αｖβ５拮抗体投与の用量範囲は拮抗体の形態及びその効力に左右され、血管形成及び血管形成によって仲介される疾患症状が改善される所望効果を生じるのに十分な量である。用量は、過粘稠度症候群、肺水腫、鬱血性心不全等の副作用を生じるほどの量であってはならない。用量は、一般的には、年齢、症状、性別及び患者の疾患の程度で変動し、当業者によって決定される。用量は、また、合併症の現象においては個々の医師によって調整される。
【００９７】
αＶβ５拮抗体は、リガンド、即ち、ビトロネクチンに対するレセプターの結合活性を阻害することにより生理的又は薬理的活性を遮断又は阻止する分子である。好ましいαｖβ５拮抗体は、モノクローナル抗体、ペプチド或いはαｖβ５リガンドの擬似体である有機分子とすることができる。
【００９８】
治療的に有効な量は、治療される組織において測定可能な血管形成阻止を生じるのに十分なαｖβ５拮抗体の量、即ち、血管形成阻止量である。血管形成の阻止は、本明細書に記載される免疫組織化学又は当業者に既知の他の方法によってその場で測定される。
【００９９】
αＶβ５拮抗体がαｖβ５リガンド有機擬似体、ＲＧＤ含有ペプチド、抗αｖβ５モノクローナル抗体、もしくはその断片、又はαｖβ５レセプター擬似体の形態をとることができる限り、効力、及び“治療的に有効な”量の発現が変動し得ることは理解されるべきである。しかしながら、本分析法に示されるように、当業者は本発明の候補αｖβ５拮抗体の効力を容易に評価することができる。
【０１００】
αＶβ５拮抗体の効力は、ＣＡＭ分析、生体内ウサギ眼分析、及び本明細書に全て記載されるαｖβ５に対する天然リガンドの結合阻害を測定することによる血管形成の阻止を含む種々の手段、及び類似の分析によって測定される。
【０１０１】
好ましいαｖβ５拮抗体は、０．５マイクロモル（μＭ）未満、好ましくは０．１μＭ未満、更に好ましくは０．０５μＭ未満の拮抗体濃度の溶液中でビトロネクチンのような天然リガンドのαｖβ５への結合を実質的に阻害する能力を有する。“実質的に”は、ビトロネクチン結合の少なくとも５０％の減少がαｖβ５拮抗体の存在下の阻害によって認められることを意味し、本明細書においては５０％阻害はＩＣ５０値と言われる。
【０１０２】
更に好ましいαｖβ５拮抗体は他のインテグリンよりαｖβ５に選択性を示す。従って、好ましいαｖβ５拮抗体は、αｖβ５に対するビトロネクチン結合を実質的に阻害するが、αｖβ１、αｖβ３及びαＩＩｂβ５のような他のインテグリンに対するビトロネクチン結合を実質的に阻害しない。αｖβ５に対するビトロネクチン結合を阻害するときのＩＣ５０活性が他のインテグリンに対するビトロネクチン結合を阻害するときのＩＣ５０活性に比べて１０倍〜１００倍低いαｖβ５拮抗体が特に好ましい。インテグリンに対するビトロネクチン結合を阻害するときのＩＣ５０活性を測定する具体的な分析は実施例に記載される。
【０１０３】
本発明のαｖβ５拮抗体のモノクローナル抗体としての治療的に有効な量は、典型的には、生理的に許容しうる組成物で投与した場合に約０．０１〜約１００マイクログラム（μｇ）／ミリリットル（ｍｌ）、好ましくは約１〜約５μｇ／ｍｌ、通常は約５μｇ／ｍｌの血漿濃度を得るのに十分であるような量である。言い換えると、用量は、約０．１〜約３００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．２〜約２００ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは約０．５〜約２０ｍｇ／ｋｇに１日１回以上の投与で１〜７日間に変動させることができる。
【０１０４】
拮抗体がモノクローナル抗体の断片の形である場合の量は、全抗体の質量に相対する断片の質量に基づいて容易に調整される。好ましい血漿モル濃度は、約２マイクロモル（μＭ）〜約５ミリモル（ｍＭ）、好ましくは約１００μＭ〜１ｍＭの抗体拮抗体である。
【０１０５】
本発明のαｖβ５拮抗体のポリペプチド又は他の類似の大きさの小分子αｖβ５リガンド擬似体としての治療的に有効な量は、典型的には、生理的に許容しうる組成物で投与した場合に約０．１〜約２００マイクログラム（μｇ）／ミリリットル（ｍｌ）、好ましくは約１〜約１５０μｇ／ｍｌの血漿濃度を得るのに十分であるようなポリペプチドの量である。約５００ｇ／モルの量を有するポリペプチドに対して、好ましい血漿モル濃度は、約２マイクロモル（μＭ）〜約５ミリモル（ｍＭ）、好ましくは約１００μＭ〜１ｍＭのポリペプチド拮抗体である。言い換えると、用量／体重は、約０．１〜約３００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．２〜約２００ｍｇ／ｋｇに１日１回以上の投与で１〜７日間に変動させることができる。
【０１０６】
本発明のモノクローナル抗体、ポリペプチド又は有機擬似体は、注射又は時間をかけて徐々に注入することにより非経口的に投与される。治療されるべき組織は、典型的には全身系投与によって体内で接触し、たいていは治療組成物の静脈内投与によって治療されるが、標的にした組織が標的分子を含む可能性がある他の組織及び送達手段も企図される。従って、本発明のモノクローナル抗体、ポリペプチド又は有機擬似体は眼内、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、洞内、経皮投与され、蠕動手段によっても送達される。
【０１０７】
本発明のαｖβ５拮抗体を含む治療組成物は、静脈内に、例えば、単位用量を注射することにより慣用的に投与される。本発明の治療組成物に対して用いられる場合の“単位用量”という用語は、患者に対する単位用量として適切な物理的に分離している単位を意味し、各単位は必要とされる希釈剤、即ち、担体又は伝達体と会合して所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性物質を含有する。
【０１０８】
実施例に示された好適実施態様においては、αｖβ５拮抗体は１回の用量で静脈内投与される。
【０１０９】
組成物は、投薬処方と適合する方法及び治療的に有効な量で投与される。投与されるべき量及び投与のタイミングは、治療されるべき患者、有効成分を用いる患者の全身の能力及び所望される治療効果の程度に左右される。投与に必要とされる有効成分の正確な量は、開業医の判断に左右され、各個体に特有である。しかしながら、全身系適用に適した用量範囲は、本明細書に開示され、投与経路に左右される。投与に適した用法は可変であるが、典型的には、最初の投与に続いて１時間以上の間隔で注射又は他の投与によって繰り返される。また、生体内治療法に指定される範囲で血中濃度を維持するのに十分な連続静脈内注入が企図される。
【０１１０】
Ｄ．治療組成物
本発明は、本明細書に記載される治療法を実施するのに有効な治療組成物を企図する。本発明の治療組成物は、有効成分としてその中に溶解又は分散されたαｖβ５拮抗体と共に生理的に許容しうる担体を含有する。好適実施態様においては、αｖβ５拮抗体治療組成物は治療のために哺乳動物又はヒト患者に投与される場合に免疫原性ではない。
【０１１１】
本明細書に用いられる組成物、担体、希釈剤及び試薬を意味する“薬学的に許容しうる”、“生理的に許容しうる”及びその文法上変化した用語は、同じ意味に用いられ、はきけ、めまい、胃の不調等の望ましくない生理作用を生じることなく哺乳動物に投与することができることを示す。
【０１１２】
有効成分が溶解又は分散されたものを含む薬理的組成物の調製は、当該技術において十分に理解されており処方に対して制限されることを必要としない。典型的には、かかる組成物は溶液或いは懸濁液のような注射用剤として調製されるが、使用前に液体としての溶液又は懸濁に適した固体剤形も調製される。調製を乳化することもできる。
【０１１３】
有効成分を、薬学的に許容しうる及び有効成分と適合する賦形剤と本明細書に記載される治療法に使用するのに適した量で混合することができる。適切な賦形剤は、例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等及びその組合わせである。更に所望により、本組成物は有効成分の有効性を高める湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝剤等の少量の補助物質を含有することができる。
【０１１４】
本発明の治療組成物は、その中の成分の薬学的に許容しうる塩を包含することができる。薬学的に許容しうる塩としては、塩酸又はリン酸のような無機酸、又は酢酸、酒石酸、マンデル酸等の有機酸と形成される酸付加塩（ポリペプチドの遊離アミノ基と形成される）が含まれる。遊離カルボキシル基と形成される塩は水酸化ナトリウム、アンモニウム、カルシウム又は鉄のような無機塩基、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等の有機塩基から誘導される。
【０１１５】
環状ポリペプチドαｖβ５拮抗体の調製に用いられる場合、ＨＣｌ塩が特に好ましい。
【０１１６】
生理的に許容しうる担体は当該技術において周知である。液体担体の具体例は有効成分と水のほかに物質を含まないか又は生理的ｐＨ値のリン酸ナトリウム、生理的食塩水又はその双方、例えば、リン酸塩緩衝食塩水を含む滅菌水溶液である。更に、水性担体は１種以上の緩衝塩、及び塩化ナトリウム及びカリウム、デキストロース、ポリエチレングリコール及び他の溶質のような塩を含有することができる。
【０１１７】
液体組成物は、また、水に加えて及び水を加えずに液相を含有することもできる。かかる液相の具体例は、グリセリン、綿実油のような植物油、及び水／油型エマルジョンである。
【０１１８】
治療組成物は、典型的には全治療組成物の重量に対して少なくとも０．１重量％の量の拮抗体を含有するように処方された本発明のαｖβ５拮抗体の血管形成阻止量を含有する。重量％は、全組成物に対するインヒビターの重量比である。従って、０．１重量％は、全組成物１００ｇに対して０．１ｇのインヒビターである。
【０１１９】
Ｅ．インテグリンαｖβ５の拮抗体
αｖβ５拮抗体は、組織において血管形成を阻止する本方法に用いられ、天然αｖβ５リガンドとの機能上の相互作用が妨害されるような方法でαｖβ５と相互作用する化合物を含むさまざまな形態をとることができる。具体的な拮抗体としては、αｖβ５上のリガンド結合部位に由来するαｖβ５の類縁体又は擬似体、αｖβ５リガンド結合相互作用に関係する構造領域に似ている天然αｖβ５リガンドの擬似体、特にαｖβ５の天然リガンドのＲＧＤ含有ドメインに対応するαｖβ５に特異的な天然リガンドの機能上の結合ドメインに対応する配列をもつポリペプチド、及び全てが本明細書に定義される拮抗体活性を示すαｖβ５或いは天然リガンドと免疫反応する抗体が含まれる。
【０１２０】
１．ポリペプチド
実施態様においては、本発明は、ポリペプチドとしてのαｖβ５拮抗体を企図する。ポリペプチド（ペプチド）αｖβ５拮抗体は、αｖβ５リガンド相互作用に関係する領域において天然αｖβ５リガンド或いはαｖβ５自体の配列特徴をもちかつ本明細書に記載されるαｖβ５拮抗体活性を示すものである。好ましいαｖβ５拮抗体ペプチドは、ＲＧＤトリペプチドを含み、配列がＲＧＤ含有領域において天然リガンドに対応する。
【０１２１】
好ましいＲＧＤ含有ポリペプチドは、配列が周知であるビトロネクチンのような天然αｖβ５リガンドのＲＧＤ含有領域のアミノ酸残基配列に対応する配列をもっている。
【０１２２】
特に好ましいαｖβ５拮抗体ペプチドは、上述のように他のインテグリンに比べた場合に天然リガンドに対するαｖβ５結合を優先的に阻止する。これらのαｖβ５特異的ペプチドは、少なくともαｖβ５に対する特異性が他のインテグリンの阻害のような望ましくない副作用の頻度を減少させることから特に好ましい。
【０１２３】
αＶβ５に対する選択性をもつ好ましいαｖβ５拮抗体ペプチドの同定は、実施例に記載されるＥＬＩＳＡ分析のような典型的な結合分析阻害で容易に確認される。
【０１２４】
実施態様においては、本発明のポリペプチドは、約１００個を超えないアミノ酸残基、好ましくは約６０個を超えない残基、更に好ましくは約３０個を超えない残基を含む。ペプチドは線状又は環状とすることができるが、特に好ましいペプチドは環状である。実施例に好ましいペプチドが記載される。
【０１２５】
αＶβ５リガンドのαｖβ５への結合を拮抗するのに必要な配列を含みかつ本明細書に記載されるような分析でαｖβ５拮抗体として機能することができる限り、本ポリペプチドは天然αｖβ５リガンドのアミノ酸残基配列と同一であることを必要としないことは理解されるべきである。
【０１２６】
本ポリペプチドとしては、ポリペプチドがαｖβ５拮抗体である限りアミノ酸残基配列が本明細書に示されるポリペプチドの類縁体、断片又は化学誘導体が含まれる。従って、本ペプチドは、さまざまな変化、置換、挿入及び欠失を受けることができ、かかる変化は使用においてある種の利点を与える。この点で、本発明のαｖβ５拮抗体ポリペプチドは、１以上の変化が行われる場合に示されるペプチドの配列と同一であるよりもそれに対応し、本明細書に定義される分析の１以上においてαｖβ５拮抗体として機能する能力を保持している。
【０１２７】
従って、ポリペプチドは、アミド、タンパク質との複合体、環化ペプチド、重合ペプチド、類縁体、断片、化学修飾ペプチド及び類似の誘導体が含まれる種々の形態のペプチド誘導体のいずれであってもよい。
【０１２８】
“類縁体”という用語は、１種以上の残基が機能的に類似の残基で同類置換されかつ本明細書に記載されるαｖβ５拮抗体活性を示す本明細書に詳細に示される配列と実質的に同一のアミノ酸残基配列をもつポリペプチドが含まれる。同類置換の例としては、イソロイシン、バリン、ロイシン又はメチオニンのような非極性（疎水性）残基の他の基に対する置換、アルギニンとリシン、グルタミンとアスパラギン、グリシンとセリン間のような極性（親水性）残基の他の基に対する置換、又はアスパラギン酸又はグルタミン酸のような酸性残基の他の基に対する置換が含まれる。
【０１２９】
“同類置換”という用語は、ポリペプチドが必要な阻害活性を示すならば非誘導化残基の代わりに化学誘導化残基の使用が含まれる。
【０１３０】
“化学誘導体”は、側鎖官能基の反応によって化学的に誘導された１個以上の残基をもつ本ポリペプチドを意味する。かかる誘導化分子としては、例えば、遊離アミノ基が誘導化されてアミン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基又はホルミル基を形成する分子が含まれる。遊離カルボキシル基は誘導化されて塩、メチル及びエチルエステル又は他の種類のエステル又はヒドラジンを形成することができる。遊離ヒドロキシ基は、誘導化されてＯ−アシル又はＯ−アルキル誘導体を形成することができる。ヒスチジンのイミダゾール窒素は、誘導化されてＮ−インベンジルヒスチジンを形成することができる。化学誘導体としては、２０個の標準アミノ酸の天然に存在するアミノ酸誘導体を１個以上含むペプチドが含まれる。例えば、プロリンが４−ヒドロキシプロリンに置換され、リシンが５−ヒドロキシリシンに置換され、ヒスチジンが３−メチルヒスチジンに置換され、セリンがホモセリンに置換され、リシンがオルニチンに置換される。本発明のポリペプチドは、また、必要な活性が維持される限り、１個以上の付加及び／又は欠失又は配列が本明細書に示されるポリペプチドの配列に相対する残基をもつポリペプチドが含まれる。
【０１３１】
“断片”という用語は、アミノ酸残基配列が本明細書に示されるポリペプチドより短いアミノ酸残基配列をもつ本ポリペプチドを意味する。
【０１３２】
本発明のポリペプチドが天然αｖβ５リガンドの配列と同一でない配列をもつ場合には、典型的には１個以上の同類又は非同類置換が行われたことから１００個中通常は約３０個を超えない数、好ましくは１０個を超えない数が置換される。
【０１３３】
追加の残基は、本発明のポリペプチドを標識又は固体マトリックスに便利にくっつける“リンカー”を与えるためにポリペプチドの末端或いは担体に付加される。
【０１３４】
本発明のポリペプチドと用いられる標識、固体マトリックス及び担体は、下記に記載される。
【０１３５】
アミノ酸残基リンカーは、通常は少なくとも１個の残基であり、４０個以上の残基、たいていは１〜１０個の残基であってもよいが、αｖβ５リガンドエピトープを形成しない。連鎖に用いられる典型的なアミノ酸残基は、チロシン、システイン、リシン、グルタミン酸及びアスパラギン酸等である。更に、本ポリペプチドは、特にことわらない限り、末端ＮＨ２アシル化、例えば、アセチル化、又はチオグリコール酸アミド化、例えば、アンモニア、メチルアミンによる末端カルボキシアミド化、及び類似の末端修飾によって修飾される配列によりαｖβ５リガンドの天然配列と異なる。周知のように末端修飾は、プロテイナーゼ消化による感受性を減少させかつ溶液、特にプロテアーゼが存在する生物学的液体中のポリペプチドの半減期を長くするように働くのに有効である。この点で、ポリペプチドの環化は、有効な末端修飾であり、環化によって形成された安定な構造であることから及び本明細書に記載される環状ペプチドに認められる生物活性の観点から特に好ましい。
【０１３６】
本発明のペプチドは、薬学的に許容しうる塩の形で用いられる。本発明のペプチドと塩を形成することができる適切な酸としては、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、塩酸（ＨＣｌ）、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、リン酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、アントラニル酸、ケイ皮酸、ナフタレンスルホン酸、スルファニル酸等のような無機酸が挙げられる。ＨＣｌ塩が特に好ましい。
【０１３７】
本発明のペプチドと塩を形成することができる適切な塩基としては、水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム等の無機塩基、及びモノ、ジ及びトリアルキル及びアリールアミン（トリエチルアミン、ジイソプロピルアミン、メチルアミン、ジメチルアミン等）及び置換されていてもよいエタノールアミン（エタノールアミン、ジエタノールアミン等）のような有機塩基が挙げられる。
【０１３８】
本明細書において本ポリペプチドと呼ばれる本発明のペプチドは、組換えＤＮＡ技術を含むポリペプチド技術における当業者に既知の手法によって合成される。固相メリフィールド合成法のような合成化学法は、純度、抗原特異性、望ましくない副産物がない、製造が容易等の理由のために好ましい。用いうる多くの手法のきわめて良好な概要は、固相ペプチド合成についてはＳｔｅｗａｒｄら，“Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｃｏ．，サンフランシスコ，１９６９；  Ｂｏｄａｎｓｚｋｙら，“Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｓｅｃ．Ｅｄｉｔ．，１９７６；  Ｊ．Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，“Ｈｏｒｍｏｎａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ”，Ｖｏｌ．２，ｐ．４６，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（ニューヨーク），１９８３；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，３２：２２１−９６，１９６９；  Ｆｉｅｌｄｓら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．，３５：１６１−２１４，１９９０；  米国特許第４，２４４，９４６号、古典的溶液合成についてはＳｃｈｒｏｄｅｒら，“Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ”，Ｖｏｌ．１，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（ニューヨーク），１９６５に見出され、その各々の記載は本願明細書に含まれるものとする。かかる合成に使用できる適切な保護基は、上記の本文及びＪ．Ｆ．Ｗ．ＭｃＯｍｉｅ，“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク，１９７３に記載されており、それらの記載は本願明細書に含まれるものとする。
【０１３９】
一般的には、企図された固相合成法は、１個以上のアミノ酸残基又は適当に保護されたアミノ酸残基を成長するペプチド鎖に連続付加することを含む。通常は、最初のアミノ酸残基のアミノ基或いはカルボキシル基が選択的に除去可能な適切な保護基によって保護される。リシンのような反応性側鎖基を含むアミノ酸に選択的に除去可能な種々の保護基が用いられる。
【０１４０】
具体例として固相合成を用いると、保護又は誘導化アミノ酸を非保護カルボキシル基又はアミノ基を介して不活性固体支持体に結合する。次に、アミノ基又はカルボキシル基の保護基を選択的に除去し、固体支持体に既に結合した残基とアミド結合を形成するのに適した条件下で適当に保護された相補（アミノ又はカルボキシル）基をもつ配列の次のアミノ酸を混合及び反応させる。次に、アミノ基又はカルボキシル基の保護基を新たに付加したアミノ酸残基から除去し、次のアミノ酸（適当に保護された）を付加する等々。所望のアミノ酸が全て適切な配列に結合した後、残っている末端基及び側鎖基の保護基（及び固体支持体）は連続して又は同時に除去して最終の線状ポリペプチドを生成する。
【０１４１】
上記のように調製された線状ポリペプチドを反応させて対応する環状ペプチドを形成することができる。ペプチドを環化する具体的な方法は、Ｚｉｍｍｅｒら，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  １９９２，ｐｐ．３９３−３９４，ＥＳＣＯＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｂ．Ｖ．，１９９３に記載されている。典型的には、ｔ−ブトキシカルボニル保護ペプチドメチルエステルをメタノールに溶解し、水酸化ナトリウム溶液を加え、混合液を２０℃（２０Ｃ）に反応させてメチルエステル保護基を加水分解的に除去する。溶媒を蒸発させた後、ｔ−ブトキシカルボニル保護ペプチドを酢酸エチルで酸性にした水性溶媒から抽出する。次に、ジオキサン共溶媒中緩和な酸性条件下でｔ−ブトキシカルボニル保護基を除去する。そのようにして得られた遊離アミノ末端及びカルボキシ末端を有する非保護線状ペプチドを、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール及びＮ−メチルモルホリンの存在下にジクロロメタン及びジメチルホルムアミドの混合液中線状ペプチドの希釈溶液とジシクロヘキシルカルボジイミドとを反応させることにより対応する環状ペプチドに変換する。得られた環状ペプチドをクロマトグラフィーで精製する。
【０１４２】
特に好ましい環状ペプチド合成法は、Ｇｕｒｒａｔｈら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２１０：９１１−９２１（１９９２）及び実施例に記載されている。αｖβ５結合血管形成を主に示す組織において本方法で使用するのに特に好ましいペプチドは、実施例に記載されており、配列番号４、６、７、８及び９に示されるポリペプチドが含まれる。
【０１４３】
２．モノクローナル抗体
実施態様においては、本発明は、αｖβ５と免疫反応しかつ本明細書に記載される天然リガンドへのαｖβ５結合を阻害するモノクローナル抗体としてのαｖβ５拮抗体を述べるものである。本発明は、また、抗体を産生する細胞系、該細胞系の生産方法及び該モノクローナル抗体の生産方法を述べるものである。
【０１４４】
本発明のモノクローナル抗体は、１）単離したαｖβ５と免疫反応する及び２）αｖβ５へのビトロネクチン結合を阻害する抗体分子を含んでいる。αｖβ５へ優先的に結合する好ましいモノクローナル抗体としては、実施例に記載されるｍＡｂ  Ｐ１Ｆ６及びｍＡｂ  Ｐ５Ｈ９の免疫反応特性を有するモノクローナル抗体が含まれる。
【０１４５】
文法上さまざまに変形した“抗体又は抗体分子”という用語は、免疫グロブリン分子及び／又は免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、即ち、抗体結合部位又はパラトープを含む分子の集団を意味する集合名詞として本明細書に用いられる。
【０１４６】
“抗体結合部位”は、抗原を特異的に結合する重鎖及び軽鎖可変及び超可変領域から構成される抗体分子の構造部分である。
【０１４７】
本発明に使用する具体的な抗体は、無傷免疫グロブリン分子、実質的に無傷の免疫グロブリン分子及びＦａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）２及びＦ（ｖ）として当該技術において既知の部分を含み抗体断片とも言われる、パラトープを含む免疫グロブリン分子の一部である。
【０１４８】
他の好適実施態様においては、本発明は、本発明のモノクローナル抗体に由来するＦａｂフラグメントを含む切断型免疫グロブリン分子を企図する。ＦｃレセプターのないＦａｂフラグメントは可溶性であり、血清半減期において治療上有利であり、可溶性Ｆａｂフラグメントを使用する方法において診断上有利である。可溶性Ｆａｂフラグメントの調製は、一般的には免疫学的技術において既知であり、さまざまな方法によって達成される。
【０１４９】
例えば、実質的に無傷の抗体に対してパパイン及びペプシンを周知の方法で各々タンパク質分解反応させることによりＦａｂ及びＦ（ａｂ′）２部分（フラグメント）が調製される。例えば、Ｔｈｅｏｆｉｌｏｐｏｌｏｕｓ  ＆  Ｄｉｘｏｎの米国特許第４，３４２，５６６号を参照されたい。Ｆａｂ′抗体部分も周知であり、Ｆ（ａｂ′）２部分から生産され、次に、メルカプトエタノールとのような２つの重鎖部分を結合するジスルフィド結合の還元に続いて得られたタンパク質メルカプタンをヨードアセトアミドのような試薬でアルキル化する。無傷免疫グロブリン分子を含む抗体が好ましく、本明細書に示されるように用いられる。
【０１５０】
文法上さまざまに変形した“モノクローナル抗体”という用語は、具体的なエピトープと免疫反応することができる唯一の種類の抗体結合部位を含む抗体分子の集団を意味する。即ち、モノクローナル抗体は、典型的には、免疫反応するエピトープに単結合親和性を示す。従って、モノクローナル抗体は、各々が異なるエピトープに免疫特異的な複数の抗体結合部位をもつ抗体分子を含むことができる、例えば、二重特異性モノクローナル抗体。モノクローナル抗体は、典型的には、唯一の種類の抗体分子を分泌する（産生する）ハイブリドーマと呼ばれる単細胞のクローンによって産生された抗体から構成される。抗体産生細胞とミエローマ又は他の自己永続細胞系を融合することによりハイブリドーマ細胞が形成される。かかる抗体の調製は、Ｋｏｈｌｅｒ  ＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７（１９７５）に最初に記載され、その論文の記載は本願明細書に含まれるものとする。更に、Ｚｏｌａ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  ＡＭａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８７）に方法が記載されている。そのように調製されたハイブリドーマ上清についてαｖβ５と免疫反応する抗体分子の存在及び天然リガンドへのαｖβ５結合の阻害を選別する。
【０１５１】
概要としては、モノクローナル抗体組成物を生産するハイブリドーマを形成するために、ミエローマ又は他の自己永続細胞系をαｖβ５源で超免疫した哺乳動物の脾臓から得られたリンパ球と融合する。
【０１５２】
ハイブリドーマを調製するために用いられるミエローマ細胞系はリンパ球と同じ種由来であることが好ましい。典型的には、１２９  ＧｌＸ＋株のマウスが好ましい哺乳動物である。本発明に使用するのに適切なマウスミエローマとしては、アメリカン・タイプ・カルチュア・コレクション、メリーランド州ロックビルからＣＲＬ  １５８０及びＣＲＬ  １５８１の呼称で各々入手できるヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン感受性（ＨＡＴ）細胞系Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３及びＳｐ２／Ｏ−Ａｇ１４ｇａが含まれる。
【０１５３】
脾細胞は、典型的には、ミエローマ細胞とポリエチレングリコール（ＰＥＧ）１５００を用いて融合させる。融合ハイブリッドは、ＨＡＴに対する感受性によって選択される。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、その変法が実施例に記載される酵素結合免疫吸着剤検定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて同定される。
【０１５４】
本発明のモノクローナル抗体は、また、適切な特異性を有する抗体分子を分泌するハイブリドーマを含有する栄養培養液を含むモノクローナルハイブリドーマ培養を開始することにより生産される。培養は、ハイブリドーマが抗体分子を培養液に分泌するのに十分な条件及び時間で維持される。次に、抗体含有培養液が集められる。次に、抗体分子が周知の手法で単離される。
【０１５５】
これらの組成物の調製に有用な培養液は、当該技術及び市販双方において周知であり、合成培養液、近交系マウス等が挙げられる。具体的な合成培養液は、４．５ｇ／ｌグルコース、２０ｍＭグルタミン及び２０％ウシ胎児血清で補足したダルベッコの最少必須培地（ＤＭＥＭ；  Ｄｕｌｂｅｃｃｏら，Ｖｉｒｏｌ．，８：３９６，１９５９）である。具体的な近交系マウス株はＢａｌｂ／ｃである。
【０１５６】
モノクローナル抗体、ハイブリドーマ細胞又はハイブリドーマ細胞培養物の他の生産方法も周知である。例えば、Ｓａｓｔｒｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６：５７２８−５７３２（１９８９）及びＨｕｓｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１２７５−１２８１（１９８９）に記載された免疫学的レパートリーからモノクローナル抗体を単離する方法を参照されたい。
【０１５７】
ハイブリドーマ細胞及び本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を含む培養物も企図される。モノクローナル抗体ｍＡｂ  Ｐ１Ｆ６及びｍＡｂ  Ｐ５Ｈ９を分泌するハイブリドーマ細胞系が特に好ましく、その調製は実施例に記載されている。
【０１５８】
実施態様においては、本発明は、ｍＡｂ  Ｐ１Ｆ６及びｍＡｂ  Ｐ５Ｈ９の免疫反応特性を有するモノクローナル抗体を企図する。
【０１５９】
モノクローナル抗体が本発明のモノクローナル抗体と同じ（即ち、等価な）特異性（免疫反応特性）をもつ場合には前者が予め選ばれた標的分子に結合しないように後者を妨げるかを確認することにより過度に実験せずに求めることが可能である。固相に存在する場合に標的分子に結合する標準競合分析において本発明のモノクローナル抗体による結合の減少によって示されるように、試験されるモノクローナル抗体が本発明のモノクローナル抗体と競合する場合にはその２つのモノクローナル抗体は同じか又は密接に関連したエピトープに結合すると思われる。
【０１６０】
モノクローナル抗体が本発明のモノクローナル抗体の特異性を有するかを求める他の方法は、本発明のモノクローナル抗体と通常は反応性の標的分子とプレインキュベートし、次に、試験されるモノクローナル抗体を加えて試験されるモノクローナル抗体の標的分子を結合する能力が阻止されるかを求めるものである。
【０１６１】
試験されるモノクローナル抗体が多分阻害される場合には、本発明のモノクローナル抗体と同じか又は機能的に等価なエピトープ特異性を有する。
【０１６２】
モノクローナル抗体が本発明のモノクローナル抗体の特異性を有するかを求める他の方法は、問題の抗体のＣＤＲ領域のアミノ酸残基配列を求めるものである。ＣＤＲ領域において同一の又は機能的に等価なアミノ酸残基配列をもつ抗体分子は、同じ結合特異性を有する。ポリペプチドの配列方法は当該技術において周知である。
【０１６３】
抗体の免疫特異性、その標的分子結合能及び抗体がエピトープに対して示す付随する親和性は、抗体が免疫反応するエピトープによって定義される。エピトープ特異性は、抗体の免疫グロブリンの重鎖可変領域アミノ酸残基配列によって少なくとも部分的に及び軽鎖可変領域アミノ酸残基配列によって部分的に定義される。
【０１６４】
“結合特異性を有する”という用語の使用は、等価なモノクローナル抗体が同じか又は類似の免疫反応（結合）特性を示しかつ予め選ばれた標的分子への結合に競合することを意味する。
【０１６５】
人間化モノクローナル抗体は、特にヒトにおいて治療的に用いられる限りマウスモノクローナル抗体より特に有利である。詳細には、ヒト抗体は“異種”抗原ほど速やかに循環から清浄化されない。更に、ヒト抗体は異種抗原及び異種抗体と同じ方法で免疫系を活性化しない。“人間化”抗体の調製方法は、一般的には、当該技術において周知であり、本発明の抗体に容易に適用される。
【０１６６】
従って、実施態様においては、本発明は、抗原を結合する抗体能力を実質的に妨害せずに移植してヒト免疫系の成分を導入することにより人間化される本発明のモノクローナル抗体を企図する。
【０１６７】
３．αｖβ５特異的擬似体
本発明は、αｖβ５機能を妨害する能力をもつポリペプチド、抗体及び“擬似体”と称する他の分子が含まれるたいていのαｖβ５拮抗体が本発明に用いられることを証明する。αｖβ５機能を特に妨害しかつ他のインテグリン機能を妨害しない拮抗体が特に好ましい。
【０１６８】
この関係においては、さまざまな試薬が必要な生物活性を有する限り本方法で使用するのに適切であることが理解される。これらの試薬は、レセプター内のリガンド結合ドメインを遮断して正常な機能を妨害（即ち、阻止）することによりレセプターとリガンドの機能上の相互作用に関係するαｖβ５リガンドに“似せる”能力を有するので擬似体と包括的に言われる。代替的実施態様においては、αｖβ５拮抗体がリガンドではなくむしろレセプターの擬似体である。
【０１６９】
擬似体は、抗体又はリガンド由来ペプチド以外の上記の性質を示す分子である。ペプチドの合成類縁体、上記の結合ドメインの結合ポケットのように形成される化合物、又は他の分子とすることができる。本発明の好ましい擬似体は、有機系分子であり、有機擬似体と呼ばれる。αｖβ５リガンドに対する擬似体であることによりαｖβ５拮抗体として機能する特に好ましい有機擬似体分子は、実施例１０に記載される化合物７、９、１０、１２、１４、１５、１６、１７及び１８である。
【０１７０】
αＶβ５擬似体の設計は、分子モデリング、二次元核磁気共鳴（２−Ｄ  ＮＭＲ）分析、ｘ線結晶学、ペプチドのランダムスクリーニング、ペプチド類縁体又は他の化学ポリマーライブラリー、及び類似の薬剤設計方法を含む当該技術において既知の薬剤設計についての種々の構造分析解析法で行われる。
【０１７１】
αＶβ５拮抗体がαｖβ５の選択阻害の機能特性を共有する種々の異なる化学構造である小ポリペプチド、モノクローナル抗体又は有機分子であることを示す本発明の明細書に示された広範囲の構造上の証明の観点から、本方法に有効な本αｖβ５拮抗体の構造は限定されることを必要としないが本明細書に定義されるαｖβ５擬似体が含まれる。
【０１７２】
Ｆ．αｖβ５拮抗体の同定方法
本発明は、また、本方法に従って使用するための候補αｖβ５拮抗体を同定する分析法を述べるものである。これらの分析法においては、候補分子について天然リガンドへのαｖβ５結合を阻害する点での効力を評価し、組織において血管形成を阻止する点での効力を評価する。
【０１７３】
第１の分析は、ニワトリ絨毛尿膜（ＣＡＭ）における血管形成を測定し、ＣＡＭ分析と呼ばれる。ＣＡＭ分析は、他のものに詳述されており、血管形成及び腫瘍組織の血管新生の双方を測定するために用いられてきた。Ａｕｓｐｒｕｎｋら，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，７９：５９７−６１８（１９７５）及びＯｓｓｏｎｓｋｉら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，４０：２３００−２３０９（１９８０）を参照されたい。
【０１７４】
ＣＡＭ分析は、全組織の血管新生が起こっていることから生体内血管形成の十分に認められた分析モデルである。実際のニワトリ胚血管は、ＣＡＭ内又はＣＡＭ上で発育した組織内へ増殖している。
【０１７５】
本明細書に示されるＣＡＭ分析は、新しい血管増殖の量及び程度の双方に対して血管新生の阻害を示す。更に、腫瘍組織のようなＣＡＭに移植した組織の発育をモニターすることが容易である。更に、該分析は、分析系において毒性の内部制御があることから特に有用である。ニワトリ胚を試験試薬に曝露する。それだけで、胚の健康状態が毒性を示す。
【０１７６】
血管形成を測定する第２の分析は、生体内ウサギ眼モデルであり、ウサギ眼分析と呼ばれる。ウサギ眼分析は、他のものに詳述されており、タリドマイドのような血管形成インヒビターの存在下に血管形成及び血管新生の双方を測定するために用いられてきた。Ｄ’Ａｍａｔｏら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９１：４０８２−４０８５（１９９４）を参照されたい。
【０１７７】
ウサギ眼分析は、角膜縁から角膜内へ発生するウサギ血管によって例示される血管新生過程が眼の通常は透明な角膜を介して簡単に可視化されるので生体内血管形成の十分に認められた分析モデルである。更に、血管新生の促進もしくは阻止又は血管新生の退行の経時の程度及び量の双方が簡単にモニターされる。
【０１７８】
更に、ウサギを試験試薬に曝露し、それだけでウサギの健康状態が試験試薬の毒性を示す。
【０１７９】
第３の分析は、天然リガンド、ビトロネクチンのαｖβ５への直接結合の阻害を測定し、好適実施態様が実施例に詳述される。該分析は、典型的には、阻止がαｖβ５特異的阻害によって仲介される固相におけるビトロネクチンのような天然リガンドの単離αｖβ５への結合阻害の程度をＥＬＩＳＡで測定するものである。
【０１８０】
従って、該分析は、αｖβ５に対する特異的を示しかつ天然リガンドが他のインテグリンを結合することから阻害しない化合物を同定するために用いられる。特異性分析は、αｖβ５及び他のインテグリンの双方について天然リガンドを結合する各々の能力及び予め選ばれたリガンドを結合するインテグリンの各々の能力を阻害する候補化合物を別個の分析室内で同時に選別するＥＬＩＳＡ分析を平行して実験することにより行われる。
【実施例】
【０１８１】
下記の実施例は、本発明を具体的に説明するものであり、本発明を個々に限定するものとして解釈されるものでないことは当然のことである。更に、当業者の範囲内である現在既知の又は後に開発される本発明の変更は、後に請求の範囲に記載される本発明の範囲内に包含されるものである。
【０１８２】
１．αｖβ５特異的モノクローナル抗体の調製
Ｗａｙｎｅｒら，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１１３：９１９−９２９（１９９１）に記載されるようにＡ５４９肺がん腫細胞をＲＢＦ／ＤｎＪマウスに免疫することにより標準ハイブリドーマ法を用いてモノクローナル抗体、Ｐ１Ｆ６及びＰ５Ｈ９を生産した。この文献の記載は本願明細書に含まれるものとする。脾臓を免疫マウスから切除し、Ｎｓ−１／ＦＯＸ−ＮＹミエローマ細胞と融合する。がん腫細胞ビトロネクチンレセプターに対するハイブリドーマ産生抗体を、Ｗａｙｎｅｒらに記載されるビトロネクチン被覆表面へのＵＣＬＡ−Ｐ３接着の特異的阻害により選別し、胸腺細胞支持細胞上で限界希釈することによりクローン化した。
【０１８３】
Ｐ１Ｆ６及びＰ５Ｈ９の両モノクローナル抗体は、αｖβ５複合体と特異的に免疫反応し、αｖサブユニット、β５サブユニット又は他のインテグリンと免疫反応しないことがわかった。Ｐ１Ｆ６モノクローナル抗体は、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，メリーランド州ゲイザースバーグ）から市販されており、Ｐ５Ｈ９モノクローナル抗体はＦｒｅｄ  Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，ワシントン州シアトルのＤｒ．Ｅ．Ｗａｙｎｅｒから入手したものである。
【０１８４】
本発明に使用するための他のαｖβ５モノクローナル抗体を、ここに記載されるように同様に誘導及び確認する。更に、αｖβ５モノクローナル抗体を、不純な或いは精製した形態のαｖβ５で免疫するマウスから単離した脾臓を融合することにより生産する。αｖβ５の精製は、インテグリンバイオロジーの当業者に周知の手順であり、Ｓｍｉｔｈら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５：１１００８−１１０１３（１９９０）に記載されており、この文献の記載は本願明細書に含まれるものとする。精製されると、単離したレセプターを、Ｅ２項及び実質的にＫｏｈｌｅｒ  ＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７（１９７５）に記載されるように調製されるマウスを免疫する免疫原として調製する。得られたハイブリドーマクローンについて免疫原との反応性を選別し、次に、下記の実施例に記載されるように確認する。
【０１８５】
２．抗αｖβ５モノクローナル抗体の特異性の確認及びαｖβ５発現の組織分布のマッピングでの使用
Ａ．ビトロネクチンに対する特異性  実施例１で調製されたＰ５Ｈ９モノクローナル抗体は、ＵＣＬＡ−Ｐ３がん腫細胞のビトロネクチンへの結合を阻止しコラーゲン又はフィブロネクチンへの細胞結合に影響しないことがＷａｙｎｅｒら，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１１３：９１９−９２９（１９９１）によってわかった。その細胞は、αｖβ５ビトロネクチンレセプターのみ含み、αｖβ３特異性を有するものを含まず、非還元条件でα鎖（１６０ｋＤ）及びβ鎖（９５ｋＤ）からなるヘテロ二量体を免疫沈降することもわかった。Ｐ５Ｈ９で検出されたαｖβ５レセプターは、Ｍ２１メラノーマ細胞及びＨ２９８１がん腫細胞のビトロネクチンへの接着を仲介することもわかった。Ｐ１Ｆ６モノクローナル抗体は、同じ免疫反応性プロファイルを有する。
【０１８６】
Ｂ．抗インテグリンレセプター抗体による免疫蛍光
創傷治癒中、血管の基底膜はフォンビルブラント因子、フィブロネクチン及びフィブリンを含む数種の接着性タンパク質を発現する。更に、接着性レセプターのインテグリンファミリーの一部は培養した平滑筋及び内皮細胞の表面上で発現する。Ｃｈｅｒｅｓｈ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８４：６４７１（１９８７）；  Ｊａｎａｔら，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１５１：５８８（１９９２）；  Ｃｈｅｎｇら，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１３９：２７５（１９８９）を参照されたい。
【０１８７】
インテグリンβ５サブユニットの構造及び機能のほかに、他の抗β５モノクローナル抗体でマッピングすることによるサブユニットの組織分布は、Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉら，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．，１０５：１０１−１１１（１９９３）に記載されており、この明細書の記載は本願明細書に含まれるものとする。
【０１８８】
実施例１に記載されたものと同様の上記のβ５サブユニット特異的モノクローナル抗体を、Ａ５４９ヒト肺がん腫細胞系で免疫したマウスからの脾細胞を用いて調製されるハイブリドーマから分泌した。ハイブリドーマの培養上清によるＡ５４９細胞のポジティブ表面染色及び表面標識Ａ５４９抽出液からのαｖβ５複合体の免疫沈降によってハイブリドーマを選択した。次に、モノクローナル抗体を用いて正常ヒト胸腺、皮膚及び腎におけるβ５サブユニットの組織分布をマッピングした。Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉらの文献に記載されるように行われるβ５インテグリンに特異的な抗体による後続のストレプトアビジン−ビオチンイムノペルオキシダーゼ染色のためにクリオスタットミクロトームで凍結組織ブロックから４μ厚切片を切り取った。
【０１８９】
胸腺切片の染色から、血管、ハッサル小体、皮質及び髄質の間質細胞、及び基底膜にβ５の分布が示された。皮膚切片から、表皮の基底層及び血管皮膚壁にβ５が示され、腎切片から、糸球体部、旁糸球体装置、近位曲尿細管及び集合管の染色が示された。従って、β５の分布は、毛細内皮細胞を含む異なる種類の細胞、更に重要なことにはその細胞上の異なる種類の細胞に対して不均一であり、その染色は培養した臍帯静脈内皮細胞の染色と一致した。
【０１９０】
Ｃ．抗インテグリンレセプター抗体による眼疾患に罹った患者からのヒト網膜組織の免疫蛍光
眼の血管新生は、視力の破滅的消失を生じる多数の眼疾患に認められる最も共通の病変である。以前から存在する脈絡膜、網膜又は縁周囲血管から新しい血管の発生は、浮腫、出血又は線維血管膜形成を招き、眼の正常な解剖学的関係の破壊を生じ、付随して正常な視覚機能の消失を生じる。
【０１９１】
生理的条件下、血管形成は高度に調節され、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）及び腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）のような特定の血管形成サイトカインによって活性化されることがわかった。Ｂｒｏｏｋｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６４：５６９−５７１（１９９４）に記載されるように、αｖβ３に対するモノクローナル抗体は下記のＣＡＭモデルを含むモデル系においてｂＦＧＦ及びＴＮＦ−α誘導血管形成の双方を阻止することがわかった。実施例４〜６に記載されるように、αｖβ５に対するモノクローナル抗体は、特に血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子−α（ＴＧＦ−α）及び表皮増殖因子（ＥＧＦ）によって誘導した別個の血管形成経路を阻止する。
【０１９２】
従って、本発明の関係において本明細書に記載される２経路の血管形成は異なるインテグリン、αｖβ３及びαｖβ５によって定義される。ヒト眼疾患におけるこれらのインテグリンの発現及び役割を調べるために、糖尿病性増殖性網膜症（ＰＤＲ）をもつ患者から硝子体切除術で新生血管網膜上膜及び新生血管網膜下膜の一塊を得た。これらの患者について臨床的に追跡し、臨床試験及び蛍光眼底血管造影法によって証明される活性な増殖性血管新生疾患をもつことに基づく組織学的評価を選択した。得られた組織をティッシュテック凍結保存剤中で直接凍結し、切片にした。
【０１９３】
これらの患者からの組織を免疫蛍光で試験した場合、血管はマウスモノクローナル抗体ＬＭ６０９との免疫反応性によって示されるようにインテグリンαｖβ３に陽性であった。インテグリンの分布は、血管に制限されるように見られ、因子に対するウサギ抗体でマッピングした血管のマーカー、フォンビルブラント因子の染色と一致した。免疫反応性の部位をローダミン結合抗マウス免疫グロブリン或いはフルオレセイン結合抗ウサギ免疫グロブリンで可視化し、その双方の使用はインテグリンの場所と血管特異抗体の同時局在を可能にした。
【０１９４】
正常な眼又は血管を活発に増殖しない萎縮性膜をもつ患者から得られた試料は、免疫蛍光でインテグリンαｖβ３に陰性であった。
【０１９５】
同時に、同じ組織について実施例１で調製された抗αｖβ５モノクローナル抗体、Ｐ１Ｆ６によるαｖβ５の存在と分布を免疫組織化学的に分析した。αｖβ５がフォンビルブラント因子の分布で同時局在した血管に存在することが染色からわかった。しかしながら、非血管組織はＰ１Ｆ６による蛍光が制限され、αｖβ５の広い分布を示した。これは、血管に制限されるαｖβ３の存在と対照的であった。
【０１９６】
αｖβ３とαｖβ５間で各々の抗体ＬＭ６０９とＰ１Ｆ６による膜の免疫蛍光染色を比較した場合、血管壁に対する染色パターンはほとんど同じであり、αｖβ３とαｖβ５は共に糖尿病性網膜症のような血管新生眼疾患に存在する新たに増殖するヒト血管の表面上に表されることが示された。
【０１９７】
ここに記載された結果から、活発な増殖性血管新生疾患をもつ患者からの新生血管膜に見られるようにαｖβ５インテグリンレセプターは血管形成が起こっている特定の種類の組織で選択的に発現することがわかる。従って、実施例４〜６に記載される具体的な増殖因子に曝露された組織と共にこれらの組織は、本発明の治療態様の理想的な標的である。
【０１９８】
３．合成ペプチドの調製
本発明の方法を実施するのに用いられる環状ポリペプチドを、例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，３２：２２１−２９６（１９６９）及びＦｉｅｌｄｓ，Ｇ．Ｂ．  ＆  Ｎｏｂｌｅ，Ｒ．Ｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．，３５：１６１−２１４（１９９０）に記載される標準固相合成法を用いて合成した。
【０１９９】
２グラム（ｇ）のＢＯＣ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−ＯＭｅ（配列番号１）をまず６０ミリリットル（ｍｌ）のメタノールに溶解し、これに１．５ｍｌの２Ｎ水酸化ナトリウム溶液を加えて混合液を生成した。次に、その混合液を２０℃（２０Ｃ）で３時間攪拌した。蒸発後、残留物を水に溶解し、ｐＨ３に希ＨＣｌで酸性にし、酢酸エチルで抽出した。抽出液をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、蒸発し、得られたＢＯＣ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−ＯＨ（配列番号２）をジオキサン中２０ｍｌの２Ｎ  ＨＣｌと２０Ｃで２時間攪拌した。得られた混合液を蒸発してＨ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−ＯＨ（配列番号３）を得、引き続き１８００ｍｌのジクロロメタンと２００ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）の混合液に溶解し、続いて０Ｃに冷却した。その後、０．５ｇのジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣＩ）、０．３ｇの１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）及び０．２３ｍｌのＮ−メチルモルホリンを連続して攪拌しながら加えた。
【０２００】
得られた混合液を０Ｃで更に２４時間、次に２０Ｃで更に４８時間攪拌した。その溶液を濃縮し、混合床イオン交換体で処理して塩を除去した。得られた樹脂をろ過で除去した後、清澄化溶液を蒸発し、残留物をクロマトグラフィーで精製してシクロ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ）（一文字略号でｃ−ＲＧＤｆＶとも示される）（配列番号４）を回収した。ペプチド中の小さい枠の文字は、大文字で示されるアミノ酸のＤ体を示し、Ｌ体を示さない。
【０２０１】
環状制御ペプチド、シクロ（Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ）（ＲＡＤｆＶとして一文字略号でも示される）（配列番号５）を上記のように調製した。環状ペプチドｃ−ＲＡＤｆＶ（配列番号５）はフィブリノーゲンのインテグリンαｖβ３への結合を阻害しフィブリノーゲンのインテグリンαＩＩｂβ３又はα５β１への結合を阻害しないことが以前に示されている（Ｐｆａｆｆら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：２０２３３−２０２３８，１９９４）。
【０２０２】
天然リガンドのαｖβ５への結合に特異的に阻害する他のペプチドは、下記の実施例に記載されるように特異性及び活性範囲を試験するように同様に調製される。これらは、同じように得られた次のペプチドが含まれる：シクロ（Ｇｌｙ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ）（配列番号６）及びシクロ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｖａｌ）（配列番号７）。アミノ酸残基配列Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ（配列番号８）及びシクロ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−−Ｄ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−ＭｅＶａｌ）（配列番号９）を有するペプチドも合成される。配列番号９においては、ＭｅＶａｌの先頭部分“Ｍｅ”は、６位のバリンがメチル化バリンであることを意味する。
【０２０３】
４．生体内ウサギ眼モデル分析によって測定されるαｖβ５拮抗体による増殖因子誘導血管形成の阻止
増殖因子誘導血管形成に対する抗αｖβ５拮抗体の作用は、眼の角膜によって例示される天然の透明構造で観察される。新しい血管は角膜縁から増殖し、本来は血管がない角膜の中心に血液が豊富に供給される。角膜に適用されるＶＥＧＦ及びＴＧＦ−αのような血管形成刺激物質は、角膜縁から新しい血管の増殖を誘導する。角膜に適用される血管形成拮抗体は、角膜縁からの新しい血管の増殖を阻止する。従って、角膜は、角膜縁から見えやすい堅いコラーゲン充填角膜組織へ内皮細胞の侵入によって血管形成を受ける。従って、ウサギ眼モデル分析は、化合物を眼の角膜へ直接接種した後の血管形成の促進及び阻止を直接観察するための生体内モデルとなる。
【０２０４】
Ａ．生体内ウサギ眼モデル分析１）増殖因子によって誘導した血管形成
下記のように生体内ウサギ眼モデル分析において増殖因子による血管形成を誘導した。
【０２０５】
ａ．増殖因子及びモノクローナル抗体を含むハイドロンペレットの調製
増殖因子及びモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を含むハイドロンポリマーペレットをＤ’Ａｍａｔｏら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９１：４０８２−４０８５（１９９４）に記載されるように調製した。個々のペレットは、スクラルフェート（カラフェート）（Ｃａｒａｆｅｔ，Ｍａｒｉｏｎ  Ｍｅｒｒｅｌｌ  Ｄｏｗ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，オハイオ州シンシナテイ）に結合した７５０ｎｇの増殖因子（サイトカインとも言われる）、特にｂＦＧＦ或いはＶＥＧＦを含有しサイトカンを安定化すると共に周囲組織への緩慢な放出を行わせた。更に、ＰＢＳ中４０μｇのｍＡｂ  Ｐ１Ｆ６（抗αｖβ５）又は制御抗体、ＬＭ６０９（抗αｖβ３）を含有するハイドロンペレットを調製した。
【０２０６】
試験ｍＡｂは全て周知の方法に従いプロテインＡセファロースＣＬ−４Ｂアフィニティーカラムクロマトグラフィーを用いて腹水から精製した。次に、溶離した免疫グロブリンをＰＢＳに対して透析し、デトキシゲル（Ｄｅｔｏｘｉ−ｇｅｌ）（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，イリノイ州ロックフォード）で処理して内毒素を除去した。内毒素は、有効な血管形成性及び炎症性刺激物質であることがわかっている。従って、モノクローナル抗体について色素原カブトガニアメーバ様細胞溶解物分析（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，メリーランド州ウォーカースビル）で内毒素の存在を試験し、検出可能な内毒素のないｍＡｂのみをウサギ眼モデル分析に用いた。
【０２０７】
ペレットを、表面に２．５ｍｍコアがあいた特別に調製したテフロンペグに注入した。約１２μｌの注型材料を各ペグに入れ、滅菌フードで一晩重合した。次に、ペレットを紫外線照射により滅菌した。
【０２０８】
８匹の一連の動物を両眼実験に用い、各動物に予め選ばれた抗体と共に予め選ばれたサイトカイン又は対照免疫グロブリンを含むハイドロンを移植した。詳しくは、各ウサギについては一方の角膜をｍＡｂ  Ｐ１Ｆ６と共にｂＦＧＦ或いはＶＥＧＦを含むハイドロンペレットを外科的に移植し、もう一方の角膜をＭＡｂ  ＬＭ６０９と共にｂＦＧＦ或いはＶＥＧＦで処理した。個々のペレットを、ウサギの角膜支質中央に形成された外科的につくった“ポケット”に移植した。外科操作は、個々の角膜を写真で記録するカメラを取り付けたビームスプリッタを備えたワイルドモデルＭ６９１手術顕微鏡を用いて滅菌法のもとで行った。３×５ｍｍの“ポケット”を、６９ビーバーブレードで角膜の厚さの１／２の３ｍｍまで切開することにより角膜支質につくった。基質を虹彩用へらを用いて末梢的に解剖し、ペレットを辺縁から２ｍｍの末梢縁に移植した。
【０２０９】
次の１２日間にサイトカインとｍＡｂは、移植したペレットから周囲の組織へ拡散して角膜縁から血管形成を引き起こした。
【０２１０】
左右角膜は、各々ＯＳとＯＤと呼ばれる。次に、角膜を１２日間観察した。手術の１０日後に写真を取りそのときの血管新生が最大である。
【０２１１】
上記のサイトカイン／ｍＡｂ混合物による処理の代表的な写真結果を図１Ａ〜図１Ｄに示す。サイトカイン誘導血管形成の対応する量のｍＡｂ阻止を図２Ａ及び図２Ｂに示す。角膜をｂＦＧＦ／Ｐ１Ｆ６及びＶＥＧＦ／ＬＭ６０９の組合わせに各々曝露した図１Ａ及び図１Ｄにおいては、大きな矢印で示されるように浮腫によるサイトカイン誘導血管形成が著しい。従って、αｖβ５抗体、Ｐ１Ｆ６はｂＦＧＦ誘導血管形成を阻止するのに有効でなかった。同様に、αｖβ３抗体、ＬＭ６０９はＶＥＧＦ誘導血管形成を阻止するのに有効でなかった。
【０２１２】
対照的に、ｂＦＧＦ／ＬＭ６０９及びＶＥＧＦ／Ｐ１Ｆ６のサイトカイン／ｍＡｂ組合わせをウサギモデルに用いた場合、図１Ｂ及び図１Ｃに各々示されるように抗体でサイトカイン誘導血管形成が阻止された。これらの図においては、小さな矢印で示された正常な結膜辺縁血管が示され、ある種のサイトカイン誘導血管形成を阻止するのにインテグリン抗体の有効性を意味する。
【０２１３】
上記のサイトカイン誘導血管形成に対する特定のｍＡｂインテグリン免疫反応性の作用は、図２Ａ及び図２Ｂに示されるように定量される。血管形成は、図２Ａ及び図２Ｂに示されるように各々ｂＦＧＦ或いはＶＥＧＦで促進された。処理した眼の写真をニコンカメラを外に備えたワイルド手術用顕微鏡で毎日取った。
【０２１４】
写真をコダックエクタクロム６４Ｔスライドフィルムに記録し、モデルＧＳ６７０画像デンシトメータで得られた後のバイオラドモレキュラーアナリスト１．１ソフトウェアを用いるコンピュータ定量化のために画像を変換した。ヒストグラムは、ｍＡｂ  Ｐ１Ｆ６又はＬＭ６０９曝露後の平均新生血管面積＋／−標準誤差（２系の各々についてｎ＝８）を示す。
【０２１５】
図２Ａに示されるように、ＬＭ６０９は、同じ動物の両眼をＰ１Ｆ６で処理したものと比べた場合に８６％（ｐ＜０．００５、両眼のｔ検定）だけｂＦＧＦ誘導血管形成を減少させた。図２Ｂに示されるようにＶＥＧＦを用いて血管形成を促進した場合、反対の作用が見られ、Ｐ１Ｆ６はＶＥＧＦ誘導血管形成に対する作用が最小のＬＭ６０９処理眼に比べて６０％（ｐ＜０．０３、両眼のｔ検定）だけ血管新生の平均面積を減少させた。
【０２１６】
新しいサイトカイン誘導血管のみ個々のｍＡｂへの曝露で作用し以前から存在する縁周囲血管は両ｍＡｂに影響されず、実験効果は角膜の新たに形成する血管に限定されることは意味のあることである。
【０２１７】
αＶβ５発現と特に相関するサイトカイン誘導血管形成を阻害するのに使用するための実施例３で調製された及び下記のように調製される合成ペプチドを用いて同様の分析を行う。
【０２１８】
個々のサイトカインによって誘導された血管形成がある種の抗インテグリン抗体によってのみ影響されることを示す結果、特にαｖβ５インテグリンレセプターがＶＥＧＦ誘導血管形成に役割を果たすことを示す結果を確認するために、ニワトリ絨毛尿膜（ＣＡＭ）の他の血管新生モデルを次の実施例に示されるサイトカインとインテグリン抗体の組合わせを用いて評価した。
【０２１９】
５．ニワトリ絨毛尿膜（ＣＡＭ）標品での血管形成
Ａ．未処理ＣＡＭの確認
１）ＣＡＭの調製
血管形成は、正常胚血管形成が成熟血管の形成をもたらした後にニワトリ絨毛尿膜（ＣＡＭ）に誘導される。血管形成は、Ｌｅｉｂｏｖｉｃｈら，Ｎａｔｕｒｅ，３２９：６３０（１９８７）及びＡｕｓｐｒｕｎｋら，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，７９：５９７（１９７５）に記載されるように特定のサイトカイン又は腫瘍断片に応答して誘導されることがわかった。ニワトリ胚から後続の血管形成誘導及び本発明のαｖβ５拮抗体による下記の実施例６に記載されるその阻止のためのＣＡＭを調製した。
【０２２０】
マッキンタイア家禽（カリフォルニア州レイクサイド）から卵生１０日のニワトリ胚を入手し、３７Ｃ、湿度６０％でインキュベートした。小さなクラフトドリル（Ｄｒｅｍｅｌ，Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｍｅｒｓｏｎ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｃｏ．，ウイスコンシン州ラシーヌ）を用いて肺胞のすぐ上の卵の端に殻から小さな穴をあけた。二番目の穴は、卵を光に透かして見ることにより前に求めた胚血管のない領域の卵の幅広い方にドリルであけた。最初の穴に負圧をかけることによりＣＡＭ（絨毛尿膜）が得られ、殻膜から離れＣＡＭ上に偽肺胞を生じるた。小型のといし（Ｄｒｅｍｅｌ）を使用して下がったＣＡＭの上に殻から１．０センチメートル（ｃｍ）×１．０ｃｍ平方の窓を開けた。小窓から、下にあるＣＡＭに直接近づくことができる。
【０２２１】
次に、血管形成が止まった胚形成の１０日目に得られたＣＡＭ標品を用いた。
【０２２２】
従って、サイトカイン処理に応答して新しい血管形成を誘導する本発明に標品を用いた。
【０２２３】
２）ＣＡＭの組織学
ニワトリ胚ＣＡＭの顕微鏡的構造を分析するために、凍結塊から免疫蛍光分析用クリオスタットミクロトームで６ミクロン（μｍ）厚切片を切り取った。
【０２２４】
典型的な卵生１０日の未処理ＣＡＭは血管がない領域である。ＣＡＭ系の血管形成がこの段階の胚形成によって止まっているので、該系は本発明において隣接領域からの既存の血管から現在血管のないＣＡＭの領域への新しい血管系の生産を種々のサイトカインで促進するのに有用である。
【０２２５】
下記の実施例においてＣＡＭモデルに示されるように、血管が正常な胚形成において新たに増殖している間又はサイトカンによって誘導されている間、血管はαｖβ３及びαｖβ５を発現している。
【０２２６】
Ｂ．増殖因子により誘導された血管形成
血管形成は、ウサギ眼モデルにおいてサイトカン又は実施例４Ａに記載される増殖因子によって誘導されることがわかった。ここに記載される実験においては、実施例４に記載されるウサギ角膜標品での血管形成をここに記載されるＣＡＭ血管に局所適用される増殖因子によって同様に誘導した。
【０２２７】
血管形成は、ハンクス液（ＨＢＳＳ，ＧＩＢＣＯ，ニューヨーク州グランドアイランド）又は予め選ばれたサイトカインを予め選ばれた濃度で含有するＨＢＳＳで飽和した５×５ミリメートル（ｍｍ）ワットマンフィルターディスク（ワットマンろ紙Ｎｏ．１）、即ち、血管形成に対する作用を試験するためのものを血管のない領域の卵生１０日のニワトリ胚のＣＡＭに入れることにより誘導し、後に、窓をテープで閉じた。７２時間後に光学顕微鏡で血管形成をモニターした。ＣＡＭを急速冷凍し、次に、６μｍのクリオスタット切片をアセトンで固定し、実施例１に記載されるαｖβ５に対するものを含む１０μｇ／ｍｌの選定抗インテグリン抗体で実施例２Ｂ及び２Ｃに記載されたように免疫蛍光法で染色した。
【０２２８】
Ｂｒｏｏｋｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６４：５６９−５７１（１９９４）による以前の研究には、血管がｂＦＧＦ及びＴＮＦ−αの両処理標品には容易に明らかであるが未処理ＣＡＭには存在しないことが示されている。著者らは、αｖβ３発現がｂＦＧＦ誘導血管形成後に増強されることも示している。インテグリンβ１の発現は未処理ＣＡＭに見られるものから変化しなかったが、β１は刺激した血管では容易に検出可能であった。
【０２２９】
これらの発表された知見から、ヒト及びニワトリ双方において血管形成に関係する血管はαｖβ３の発現を増強することが示された。これと一致してＪａｎａｔら，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１５１：５８８（１９９２）；  Ｅｎｅｎｓｔｅｉｎら，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．，２０３：４９９（１９９２）及びＳｗｅｒｌｉｃｋら，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍ．，９９：７１５（１９９３）に記載されるように、培養内皮細胞の発現は試験管内で種々のサイトカインによって誘導された。
【０２３０】
本発明においては、種々の接着性インテグリンレセプターαｖβ５の発現及び活性化に依存する血管形成を促進する別個のサイトカイン仲介経路が求められた。
【０２３１】
αＶβ５の発現、αｖβ５拮抗体による血管形成及びその阻止に関してここに記載されるＣＡＭをサイトカインＶＥＧＦ、ＴＧＦ−α及びＥＧＦに曝露することの影響を実施例６に記載する。
【０２３２】
Ｃ．腫瘍によって誘導された血管形成
腫瘍誘導血管形成におけるαｖβ５の役割を調べるために、Ｂｒｏｏｋｓら，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１２２：１３５１（１９９３）及びここに記載される卵生１７日のニワトリ胚のＣＡＭから以前に増殖及び単離した種々のαｖβ５陰性ヒトミエローマ及びがん腫断片をＣＡＭ分析に用いる。
【０２３３】
ＣＡＭ上の腫瘍断片を直接並置することによりＣＡＭ分析系において血管形成を誘導する。ニワトリ胚ＣＡＭの調製は、上記の手順と同じである。ろ紙ディスクの代わりに下記の細胞系浮遊液の増殖から得られるαｖβ５陰性腫瘍の５０〜５５ミリグラム（ｍｇ）重量断片を最初は血管のない領域のＣＡＭに置く。
【０２３４】
Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉら，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．，１０５：１０１−１１１（１９９３）に記載される細胞系、ラブドミオサルコーマ、ミエロイド（ＨＬ−６０又はＫＧ−１）及びリンホイド（Ｔ細胞−Ｊｕｒｋａｔ，ＨＰＢ／ＡＬＬ，ＰＥＥＲ；及び種々のＢ細胞系）を用いてニワトリ胚のＣＡＭ上でヒト充実性腫瘍を増殖する。種々の細胞系の単細胞浮遊液をまず全量３０μｌの滅菌ＨＢＳＳ中のＣＡＭに加える。窓をテープで閉じ、ヒト腫瘍病変を増殖させるために胚を７日間インキュベートする。７日間の終わりの卵生１７日の胚にＣＡＭから腫瘍を切除し、ＣＡＭの周囲組織を切り取る。腫瘍を血管形成に使用するために５０〜５５ｍｇの腫瘍断片に薄く切る。血管のない領域の実施例５Ａに記載される新しい卵生１０日のニワトリ胚ＣＡＭセット上に腫瘍断片を置く。
【０２３５】
次に、αｖβ５誘導サイトカイン（ＶＥＧＦ、ＴＧＦ−α又はＥＧＦ）の局所適用又は静脈内適用した及びしないニワトリ胚ＣＡＭ上で生体内増殖した腫瘍を上記のようにｍＡｂ、Ｐ１Ｆ６又はＰ５Ｈ９によるαｖβ５発現に対して染色する。
【０２３６】
引き続いて、腫瘍誘導血管形成に対する抗体及びペプチドの作用を測定する実施例６Ｃ及び６Ｄに記載されるようにこれらのＣＡＭ腫瘍標品を処理する。
【０２３７】
１実施態様においては、サンフランシスコのカリフォルニア大学のＤｒ．Ｃａｒｏｌｉｎｅ  Ｄａｍｓｋｙから入手したハムスターメラノーマ細胞、ＣＳ−１をメラノーマ腫瘍の形成のために上記ＣＡＭ分析で使用した。ほぼ５０ｍｇのＣＳ−１腫瘍断片を新しい卵生１０日のニワトリ胚ＣＡＭ上に移した後、標品に１００μｇ又は３００μｇのＰ１Ｆ６抗体、ＬＭ６０９抗体或いは対照ＣＳＡＴ（抗β１）抗体を別個に静脈内注入した。対照は、更に、処理していない標品も含まれた。結果を下記の実施例６Ｄに示す。
【０２３８】
６．ＣＡＭ分析において測定される血管形成の阻止
Ａ．インヒビターの静脈内適用による増殖因子誘導血管形成の阻止
ＣＡＭ標品に静脈内注入したモノクローナル抗体による増殖因子誘導血管形成に対する作用を、本発明の生体内モデル系として使用するために評価した。
【０２３９】
活発な血管新生後に血管の発生が停止すると、αＶβ５発現が免疫蛍光分析による検出可能なレベルまで減少する。成熟血管において発現がないことと対照的に血管形成を受ける血管におけるαｖβ５発現のこの制御は、ＣＡＭ血管形成分析系のモデルである下記に示される血管形成を制御及び阻止する本発明のユニークな能力を与える。
【０２４０】
静脈内注入用ニワトリ胚ＣＡＭの調製は実質的に上記の通りとした。
【０２４１】
卵生１０日のニワトリ胚について増殖因子飽和フィルターディスクを適用することにより血管形成を誘導した。詳しくは、最初の分析においてｂＦＧＦ或いはＶＥＧＦに各々１５０ｎｇ／ｍｌの濃度で曝露することにより血管形成を誘導した。
【０２４２】
光に透かして見る方法で増殖因子を適用する場合、目立つ血管を選び卵殼に印を付けて位置を示した。殻にドリルで穴を開け、ＣＡＭを下げ、次に、増殖因子飽和ろ紙を上記のＣＡＭ上に別個に置いた。窓を滅菌テープで閉じ、インキュベーター内で胚を置き換えた。
【０２４３】
２４時間後に、前に選んだ目立つ血管のすぐ上の卵殻の側面に第２の小窓を注意深く切断した。外側の卵殻を無傷の胚膜を残して注意深く除去した。小滴の鉱油（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｏｒｐ，コネチカット州ノルウォーク）で殻膜を透明にし、血管が容易に可視化されるようにした。次に、ＰＢＳ中リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）、７５μｇの精製滅菌抗インテグリン抗体又は７５μｇの合成ペプチド（環状ペプチドＲＧＤｆＶ、配列番号４及び対照環状ペプチドＲＡＤｆＶ、配列番号５）を増殖因子誘導ＣＡＭ上の明らかな血管に注入した。窓をテープで閉じ、胚を７２時間までインキュベートした。
【０２４４】
フィルターディスク及び代表的なＣＡＭ周囲組織を立体顕微鏡（図３Ａ〜図３Ｆ及び図５Ａ〜図５Ｆ）で写真をとり、１条件に対して１２個のＣＡＭについて平均血管形成指数＋／−標準誤差を求めた（図４Ａ〜図４Ｂ及び図６Ａ〜図６Ｂ）。血管形成について各ディスクの領域内の血管の分枝の数及び程度を分析することにより二重盲検法で各胚を評点した。評点は１（低）〜４（高）の範囲であり、血管形成指数は全てのデータからバックグラウンドの１を引くことにより求めた。
【０２４５】
ＣＡＭモデルにおける増殖因子誘導血管形成のインテグリン抗体仲介阻止の特異性は、上記のウサギ角膜モデルに見られたものを反映した。図３Ａ及び図３Ｂに各々示されるように、ｂＦＧＦ及びＶＥＧＦは共に対照ＰＢＳ処理ＣＡＭにおいて血管形成を引き起こした。しかしながら、αｖβ５特異抗体で処理すると図３Ｄに示されるようにＶＥＧＦ誘導血管形成の阻止がもたらされ、図３Ｃに見られるようにｂＦＧＦ誘導血管形成に対しては阻止が検出されなかった。対照的に、ＬＭ６０９αｖβ３特異抗体はｂＦＧＦ誘導血管形成を阻止した（図３Ｅ）が、ＶＥＧＦ誘導ＣＡＭにおいては血管形成に対してほとんど効果がなかった（図３Ｆ）。
【０２４６】
これらの結果は、対照として抗体なし曝露と共にＬＭ６０９或いはＰ１Ｆ６への曝露に対して血管形成指数がプロットされるｂＦＧＦ及びＶＥＧＦ処理ＣＡＭ双方について各々の図４Ａ及び図４Ｂの棒グラフにも示されている。従って、インテグリン特異抗体による増殖因子誘導血管形成の阻止は、増殖因子の種類に左右される。
【０２４７】
ＲＧＤ含有ペプチドに対する曝露は上記の結果を支持する。図５Ａ及び図５Ｂに示されるようにＰＢＳの存在下のｂＦＧＦ及びＶＥＧＦ双方に対する曝露により対照ＣＡＭにおいて血管形成がもたらされた。対照的に、αｖβ３及びαｖβ５双方に対する環状ペプチド拮抗体ＲＧＤｆＶ（配列番号４）はｂＦＧＦ或いはＶＥＧＦによって誘導された血管形成を消滅させた。環状ペプチドＲＡＤｆＶ（配列番号５）はｂＦＧＦ或いはＶＥＧＦ処理ＣＡＭ標品において血管形成に影響しなかった。結果は、試験と対照のペプチドへの曝露を示すｂＦＧＦ及びＶＥＧＦ促進ＣＡＭの血管形成指数のグラフである図６Ａ及び図６Ｂに示されている。従って、ウサギ角膜でのものと共にこれらの知見は、ｂＦＧＦ及びＶＥＧＦ誘導血管形成は異なるが類似のαｖ特異インテグリンに依存し環状ペプチドＲＧＤｆＶにより阻止可能であることを意味する。
【０２４８】
同様の分析は、更に、αｖβ５関連血管形成に対する特異性を示しαｖβ３関連血管形成に特異性を示さないペプチドを定義するために実施例３に記載されたように合成ペプチドを用いて行われる。分析は実施例１０に記載されるように調製された有機分子を用いても行われる。
【０２４９】
増殖因子誘導血管形成のインテグリン抗体阻止の特異性を、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、トランスフォーミング増殖因子−α（ＴＧＦ−α）又はホルボールエステル、４−β−ホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート（ＰＭＡ）を含む増殖因子血管形成誘導分析を拡大することにより確認及び強化した。
【０２５０】
ｂＦＧＦ及びＶＥＧＦを含む上記の増殖因子（サイトカイン）を上記の卵生１０ＢＣＡＭモデルに１．０μｇ／ｍｌの濃度で別個に加えた。ＰＭＡは２０ｎｇ／ｍｌの濃度で用いた。
【０２５１】
増殖因子処理後の２４時間後に、抗体、ＬＭ６０９及びＰ１Ｆ６又はプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）インヒビター、カルホスチンＣを上記のように１回の脈管内投与で或いは下記の実施例に記載される局所投与でＣＡＭモデルに別個に与えた。引き続き３日間にわたる脈管内注射については、抗体を１胚あたり７５μｇの濃度で用い、カルホスチンＣを１００ｎＭの用量で用いた。
【０２５２】
１３日目に、フィルターディスクとＣＡＭ結合組織を分け、立体顕微鏡で血管形成を分析した。ディスクの領域内の血管の分枝の数及び程度を分析することにより血管形成を二重盲検法で評点した。評点は低（１）〜高（４）の範囲とした。血管形成指数は、全てのデータからバックグラウンド評点の１を引くことにより求めた。１条件に対して５〜６個の胚を用いて実験を２〜４回繰り返した。
【０２５３】
図７Ａ及び図７Ｂに各々示されるように、抗αｖβ３抗体ＬＭ６０９はｂＦＧＦ及びＴＮＦ−αに応答した血管形成を阻止するが抗αｖβ５抗体Ｐ１Ｆ６はほとんど阻止作用がなかった。対照的に、図７Ｃ〜図７Ｅに各々示されるように、Ｐ１Ｆ６はＶＥＧＦ、ＴＧＦ−α又はＰＭＡによって誘導された血管形成を阻止するのに有効であるがＬＭ６０９は阻止しなかった。
【０２５４】
ＰＭＡ、血管形成の強力な誘導物質はプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）、セリントレオニンキナーゼの細胞内ファミリーを活性化することができる。従って、ニワトリＣＡＭ上の血管形成に対するカルホスチンＣ、ＰＫＣインヒビターの作用を試験した。カルホスチンＣは、ＰＭＡ（図７Ｅ）並びにＶＥＧＦ及びＴＧＦ−α（各々図７Ｃ及び図７Ｄに示される）によって誘導された血管形成を阻止しｂＦＧＦ又はＴＮＦ−α仲介血管形成に対する効果は最小であった（各々図７Ａ及び図７Ｂに示される）。
【０２５５】
更に、これらの結果は２つの異なる別個の血管形成経路の存在を示し、第１の経路はＢｒｏｏｋｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６４：５６９−５７１（１９９４）に記載されたようにＰＫＣと主として依存しないαｖβ３仲介シグナルに依存し、第２経路はＰＫＣ活性化に決定的に依存するαｖβ５仲介導入シグナルによって増強される。
【０２５６】
上記の実験のほかに、ＬＭ６０９を静脈内接種したＣＡＭ組織においてＰ１Ｆ６及びＬＭ６０９ｍＡｂの局在を求めるために、固定切片をＨＢＳＳ中２．５％ＢＳＡで室温において１時間阻止し、続いてヤギ抗マウスローダミン標識二次抗体（Ｔａｇｏ）の１：２５０希釈液で染色した。次に、切片をツェイス免疫蛍光複式顕微鏡で分析する。
【０２５７】
Ｂ．インヒビターの局所適用による増殖因子誘導血管形成の阻止
αｖβ５が血管形成において活発な役割を果たすかを求めるために、上記の増殖因子で飽和したフィルターディスクをＣＡＭ上に置き、血管形成を誘導した後にＰ１Ｆ６或いはＬＭ６０９を適用する。
【０２５８】
次に、ディスクを全量２５μｌの滅菌ＨＢＳＳ中２５ｍｇのｍＡｂを含有する５０ｍｌのＨＢＳＳで０、２４及び４８時間において処理する。７２時間にＣＡＭを取り出し、３５ｍｍのペトリ皿に入れ、１ｍｌのＰＢＳで１回洗浄する。ろ紙の底面及びＣＡＭ組織を二重盲検法で２人の観察者によりオリンパス立体顕微鏡下で分析する。血管形成阻止は、ＣＡＭがディスクのすぐ下のＣＡＭの血管浸潤が＞５０％減少を示す場合に顕著であるとみなされる。実験は、１条件に対して６〜７個の胚を用いて１抗体あたり４回繰り返す。
【０２５９】
血管のない領域に隣接した正常な血管発生からの以前から存在する成熟血管に対するインテグリン抗体の作用を調べるために、ｍＡｂで飽和したフィルターディスクはサイトカインを局所適用していない卵生１０日の胚からのＣＡＭの血管新生領域に置かれる。
【０２６０】
ＣＡＭ分析は、また、増殖因子誘導血管形成に対する環状及び線状ペプチドの作用を求めるために本発明の合成ペプチドを用いて行われる。上記のように調製した８μｇのペプチドを全量２５μｌの滅菌ＨＢＳＳ中に別個に存在させる。ペプチド溶液を直ちに及び２４時間及び４８時間においてＣＡＭ標品に適用する。７２時間においてろ紙とＣＡＭ周囲組織を分け、上記のように調べた。
【０２６１】
同様の分析は、実施例１０に記載されるように調製した有機分子を用いて行われる。
【０２６２】
Ｃ．腫瘍誘導血管形成の局所適用による阻止
１）モノクローナル抗体による処理
抗αｖβ５抗体及びペプチド拮抗体の作用を評価した上記の血管形成分析のほかに、腫瘍誘導血管形成におけるαｖβ５の役割を調べる。誘導物質として、卵生１７日のニワトリ胚のＣＡＭから以前に増殖及び単離したαｖβ５陰性ヒト組織を用いる。断片を実施例５Ｃに記載されたように調製する。
【０２６３】
上記のように、ｍＡｂを２５μｌのＨＢＳＳ中２５μｇの濃度で腫瘍断片に別個に局所適用し、窓をテープで閉じる。２４時間及び４８時間に同じ方法でｍＡｂを加える。７２時間に腫瘍及びＣＡＭ周囲組織を上記のように分析する。
【０２６４】
実施例５Ｃに記載されたように、インテグリンαｖβ５を発現しないヒト細胞系を卵生１０日のニワトリ胚のＣＡＭに移植することにより最初に腫瘍を誘導する。
【０２６５】
腫瘍誘導血管形成に対するｍＡｂの作用を定量するために、ＣＡＭの病巣面内の腫瘍に入る血管を二重盲検方法で２人の観察者により立体顕微鏡下で計数する。
【０２６６】
実施例３で調製した合成ペプチド及び実施例１０で調製した有機分子を、上記と同様に腫瘍誘導血管形成ＣＡＭ分析系に局所適用する。血管の生育性に対するペプチド及び有機分子の作用を同様に評価する。
【０２６７】
Ｄ．腫瘍誘導血管形成の静脈内適用による阻止
１）モノクローナル抗体による処理
上で調製した腫瘍誘導血管を、静注で投与したｍＡｂで処理した。ＣＳ−１メラノーマ腫瘍を実施例５Ｃに記載されたようにＣＡＭ上に置き、窓をテープで閉じ、２４時間後に１００〜３００μｇの精製ｍＡｂを上記のニワトリ胚血管の静脈内に１回接種した。次に、ニワトリ胚を７日間インキュベートした。次に、血管形成の程度を上記のように観察した。この後、腫瘍を切除し、その重量で分析して腫瘍増殖又は抑制に対する抗体曝露の影響を求めた。
【０２６８】
ＣＳ−１腫瘍の３００μｇのαｖβ５特異抗体Ｐ１Ｆ６による処理結果を図８に示す。腫瘍重量は、ＣＳＡＴ処理腫瘍に対する未処理に比べて５０ｍｇ未満まで劇的に減少した。しかしながら、αｖβ３特異抗体ＬＭ６０９もＰ１Ｆ６より効果が小さいが腫瘍増殖を阻止した。１００μｇのＰ１Ｆ６で処理された腫瘍で匹敵する結果が得られた。従って、Ｐ１Ｆ６はＣＡＭ標品による腫瘍モデルにおいてαｖβ５仲介血管形成を阻止するのに効果的であり、腫瘍細胞量の減少をもたらした。
【０２６９】
２）合成ペプチド又は有機分子による処理
ＣＡＭ分析系において腫瘍誘導血管系に対するペプチド又は有機分子の影響を評価する。ｍＡｂの静注の代わりに実施例３及び１０に各々記載されるように調製した合成ペプチド及び有機分子鎖を可視血管に別個に静注する。
【０２７０】
７．リガンド−レセプター結合分析によって検出されるαｖβ５特異拮抗体の同定
実施例１及び３で各々調製したαｖβ５免疫反応性抗体及び合成ペプチドを、精製リガンド−レセプター結合分析においてαｖβ５、αｖβ３及びαＩＩｂβ３レセプター結合活性を拮抗する能力を測定することにより選別する。これらの結合実験の方法は、Ｂａｒｂａｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９０：１０００３−１０００７（１９９３），Ｓｍｉｔｈら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５：１１００８−１１０１３（１９９０）及びＰｆａｆｆら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：２０２３３−２０２３８（１９９４）に記載されており、これらの文献の記載は本願明細書に含まれるものとする。
【０２７１】
レセプターを固体支持体に固定化しかつリガンド及び拮抗体が可溶性であるリガンド−レセプター結合分析において拮抗体を同定する方法を記載する。リガンドを固体支持体に固定化しかつレセプター及び拮抗体が可溶性であるリガンド−レセプター結合分析を記載する。
【０２７２】
概要としては、選定した精製インテグリンをタイターテックマイクロタイターウェルに１ウェルあたり５０ナノグラム（ｎｇ）の被覆濃度で別個に固定化する。リガンド−レセプター結合分析に用いられるレセプターの精製は、当該技術に周知であり、当業者に良く知られた方法で容易に入手しうる。４Ｃで１８時間インキュベートした後、プレート上の非特異的結合部位をトリス緩衝食塩水中１０ミリグラム／ミリリットル（ｍｇ／ｍｌ）のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で阻止する。阻止実験については、種々の濃度の選定抗体又はペプチドについて１２５Ｉ−ビトロネクチン又は他の標識リガンドのインテグリンレセプター、αｖβ５、αｖβ３、αｖβ１及びαＩＩｂβ３への結合を阻止する能力を試験する。
【０２７３】
これらのリガンドは具体的なインテグリンに最適な結合、αｖβ５及びαｖβ３にビトロネクチン及びαＩＩｂβ３にフィブリノーゲンを示すがビトロネクチンの両レセプターへの結合を阻止する抗体或いはペプチドを用いる結合実験の阻害は、レセプターのリガンドへの結合を最大の１／２阻害するのに必要なペプチドのマイクロモル（μＭ）の量の正確な定量を可能にする。放射能標識リガンドを１ｎＭの濃度で用い、結合は非標識合成ペプチドを別個に投与する。３時間インキュベートした後、洗浄で遊離リガンドを除去し、結合リガンドをγ計数で検出する。
【０２７４】
従って、ここに記載されるリガンド−レセプター分析を用いて本発明を実施するのにビトロネクチンレセプター（αｖβ５）拮抗体として用いられる、具体的なインテグリンレセプター、詳しくはαｖβ５に選択特異性を示すモノクローナル抗体及び有機分子と共に環状又は線状合成ペプチドの双方を選別する。
【０２７５】
８．キメラマウス：ヒト分析で測定されるαｖβ５拮抗体による腫瘍組織増殖の生体内退縮
ＳＣＩＤマウスからの皮膚の一部をヒト新生児包皮に置き換えることにより生体内キメラマウス：ヒトモデルをつくった。生体内キメラマウス：ヒトモデルを実質的にＹａｎら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９１：９８６−９９６（１９９３）に記載されるように調製した。概要としては、２ｃｍ２の正方形の皮膚面をＳＣＩＤマウス（６〜８週齢）から外科的に切除し、ヒト包皮に置き換えた。マウスに麻酔をかけ、腹部側方部の各側の５ｃｍ２領域を剃髪した。皮膚の下の筋膜まで十分な厚さを除去することにより２ｃｍ２の２枚の円形移植片床を調製した。ヒト新生児包皮に由来する同じサイズの十分な厚さのヒト皮膚移植片を創傷床に入れ、適所を縫合した。移植片にバンドエイドを被覆し、皮膚を縫合した。創傷を被覆するためにミクロポア布テープも用いた。
【０２７６】
皮膚移植片を確立した後、ヒト包皮にメラノーマ細胞を接種した。Ｍ２１Ｌヒトメラノーマ細胞系を用いてＳＣＩＤマウスのヒト皮膚移植片にヒト充実性腫瘍を形成した。２×１０６Ｍ２１Ｌの単細胞浮遊液をヒト皮膚移植片へ皮内注射した。次に、測定可能なヒト腫瘍が増殖する２〜４週間マウスを観察した。
【０２７７】
測定可能な腫瘍を確立した後、配列番号９（環状ＲＧＤ含有ペプチドＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−メチル化Ｖａｌ）を有する２５０μｇのペプチド（１００μｌ容量）或いは対照ペプチド、シクロＡｒｇ−βＡｌａ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｖａｌを１週間に３回３週間かけてマウスに腹腔内注射した。この期間の終わりに、腫瘍を切除し重量及び組織学で分析した。
【０２７８】
Ｘ軸のペプチド処理に対してＹ軸に腫瘍容積ｍｍ３がプロットされる図９に結果を示す。ペプチド１８９として図面に表示した配列番号９を有する試験ペプチドは、腫瘍容積が３００ｍｍ３より大きい対照ペプチド（ペプチド６０１として表示した）に比べて約２５ｍｍ３まで腫瘍容積を顕著に減少させた。
【０２７９】
従って、αｖβ５拮抗体ペプチド１８９の静脈内適用によりαｖβ５レセプターを阻止すると上記のＣＡＭ及びウサギ眼モデル系と同じ方法で本モデル系においてもメラノーマ腫瘍の退縮がもたらされた。
【０２８０】
本発明の他のαｖβ５拮抗体、即ち、抗体及び実施例１０に記載されるように調製される有機分子の有効性を評価するために、上記のＳＣＩＤ／ヒトキメラモデルを用いる。
【０２８１】
９．αｖβ５仲介網膜血管形成及びαｖβ５拮抗体によるその阻止のマウスモデルの調製
網膜血管新生組織でのαｖβ３及びαｖβ５発現の実施例２Ｃの観察に基づき、新規なマウスモデルを用いて網膜血管形成に対する両インテグリンの全身系に投与し環状ペプチド拮抗体の作用を実験した。新生仔マウスは、生後最初の２週間で網膜血管を発生し、表在性網膜血管系が視神経頭から始まり末梢に放射状に伸びる血管の多くの高度に分枝した網目を形成して他の哺乳動物及びヒトに観察されるのと同じ方法で網膜表面を被覆する（Ｊｉａｎｇら，Ｇｌｉａ，１５：１−１０（１９９５）。
【０２８２】
モデルについては、新生仔マウスに環状ペプチドＲＧＤｆＶ（配列番号４）（ペプチド２０３とも呼ばれる）又は対照ペプチドＲＡＤｆＶ（配列番号５）を０日から開始して４日間毎日２回皮下注射した。生後５日に眼球を取り出し、室温で４．０％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）に固定した。
【０２８３】
マウス網膜血管形成を定量するために、視神経頭から時計の１２時間を６等分した扇形の各々に選ばれた１本の血管の最も末梢にある点までの距離を測定した。平均距離を計算し、全同腹仔から得られた同様のデータと平均した。網膜血管の全量を測定するために、全試料を２．０μｍの光学的切片で走査しデジタル方式で記憶させた。次に、バイオラドレーザシャープソフトウェアの“シード”機能を用いて各切片の容積画素の閾値及び計数を出した。マクロを書き込み全切片の容量を合計し全血管構造の値を求めた。
【０２８４】
写真から２次元で血管増殖を直接測定することによって、全身系に投与したペプチド拮抗体２０３は対照ペプチドに相対する網膜の血管形成を４４％だけ阻止した（Ｎ＝９、ｐ＜０．００００００１、両眼のｔ検定）。未処理の新生仔マウスとペプチド２０３を投与している生後５日のマウス間に統計的差異は見られず、該ペプチドは血管形成を効果的に阻止した。更に、未処理の生後５日のマウスと対照ペプチドを投与している同齢のマウス期に統計的差異は見られなかった。
【０２８５】
従って、未処理の対照マウスと比較した場合にＲＧＤｆＶ処理新生仔マウスの網膜血管形成の阻止は、実際上１００％である。
【０２８６】
３次元の血管増殖を用いる更に定量的な分析を用いると、対照と比べてペプチド２０３処理マウスにおいて網膜血管容積の７８％減少が見られた。２０３処理マウスにおいて生後５日の血管の平均容積は３．６×１０６μｍ３であり、対照処理マウスにおいては１５．７×１０６μｍ３であった。未処理新生児マウスにおいて網膜血管が占める容積は生後５日の２０３処理マウスと区別できない。
【０２８７】
上で得られた結果から拮抗体が確立した血管に作用せずに新しい血管形成を特異的に阻止することがわかった。結果は、網膜血管新生疾患の病変が網膜下血管新生疾患に見られるものと異なりかつαｖβ５拮抗体が血管形成と関連がある失明する眼疾患をもつ患者を治療するのに効果的であることを示している。
【０２８８】
同様の分析は、実施例１０に記載されるように調製した有機擬似体のαｖβ５拮抗体を用いて行われる。
【０２８９】
１０．有機分子αｖβ５拮抗体の調製
αｖβ５拮抗体有機化合物７、９、１０、１２、１４、１５、１６、１７及び１８の合成を、下記及び簡単な説明の付いた図面に示す。次に、本発明の有機模擬体と呼ばれる得られた有機分子をαｖβ５仲介血管形成を阻止する方法に用いる。
【０２９０】
下記の合成の各々について、パーキン・エルマー２４１分光光度計ＵＶで旋光を測定し、ベックマンＤＵ−７０分光計で可視スペクトルを記録した。ブルッカーＡＭＸ−４００及びＡＭＸ−５００光度計で４００ＭＨｚ及び５００ＭＨｚの１Ｈ及び１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルを記録した。高速原子衝撃（ＦＡＢ）条件下、ＶＧ  ＺＡＢ−ＺＳＥ質量光度計で高分解能質量スペクトル（ＨＲＭＳ）を記録した。カラムクロマトグラフィーを７０〜２３０メッシュのシリカゲルを用いて行った。メルクＡｒｔ．５７４４（０．５ｍｍ）で分取ＴＬＣを行った。融点をトーマスフーバー装置で測定した。
【０２９１】
Ａ．化合物１：図１０に示されるｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−チロシンベンジルエステル
【０２９２】
【化１】
0004544639.tif 000004
０．１Ｍ（Ｍ）塩化メチレン中Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトシキカルボニル）−Ｌ−チロシン（ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−チロシン）（１．０当量；Ａｌｄｒｉｃｈ）の溶液にジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（１．５当量）を２５℃で加え、１時間攪拌した。次に、１．５当量のベンジルアルコールを加え、混合液を２５℃で更に１２時間攪拌した。
【０２９３】
次に、反応混合液を酢酸エチル（０．１０Ｍ）で希釈し、水で２回（２×）、食塩水で１回（１×）洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。次に、溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。化合物１、ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−チロシンベンジルエステルはシグマ社から購入することもできる。
【０２９４】
Ｂ．化合物２：図１０工程ｉに示される（Ｓ）−３−（４−（４−ブロモブチルオキシ）フェニル−２−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルプロピオン酸ベンジルエステル
【０２９５】
【化２】
0004544639.tif 000005
ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−チロシンベンジルエステル（２ｇ、５．３８ミリモル；上記のように合成した）、１，４−ジブロモブタン（１．９ｍｌ、１６．２ミリモル；Ａｌｄｒｉｃｈ）、炭酸カリウム（５ｇ）及び１８−クラウン−６（０．１ｇ；Ａｌｄｒｉｃｈ）の混合液を８０℃で１２時間加熱した。冷却後、沈殿をろ別し、反応混合液を減圧下で蒸発乾固した。次に、粗生成物を１００％ヘキサンを用いて結晶化することにより精製して２．５ｇ（９２％）の化合物２を得た。
【０２９６】
Ｃ．化合物３：図１０工程ｉｉに示される（Ｓ）−３−（４−（４−アジドブチルオキシ）フェニル−２−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルプロピオン酸ベンジルエステル
【０２９７】
【化３】
0004544639.tif 000006
化合物２（２．５ｇ、４．９ミリモル）をアジ化ナトリウム（１．６ｇ、２５ミリモル）とジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（２０ｍｌ）中２５℃で１２時間攪拌した。次に、溶媒を蒸発し、残留物を水（約１０ｍｌ）で処理し、酢酸エチルで２回抽出した。有機層を合わせ、硫酸マグネシウムで乾燥し、蒸発して２．０ｇ（９０％）の化合物３を無色のシロップとして得た（ＦＡＢ−ＭＳ：  ４６９（Ｍ＋Ｈ＋）。
【０２９８】
Ｄ．化合物４：図１０工程ｉｉｉに示される（Ｓ）−３−（４−（４−アジドブチルオキシ）フェニル−２−アミノプロピオン酸ベンジルエステル
【０２９９】
【化４】
0004544639.tif 000007
化合物３（２．０ｇ（４．４ミリモル））をトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ；２ｍｌ）に溶解し、室温で３時間攪拌した。減圧下で蒸発して１．６ｇ（定量的）の化合物４を無色のシロップとして得、精製せずに次の工程に用いた。ＦＡＢ−ＭＳ：  ３６９（Ｍ＋Ｈ＋）。
【０３００】
Ｅ．化合物５：図１０工程ｉｖに示される（Ｓ）−３−（４−（４−アジドブチルオキシ）フェニル−２−ブチルスルホンアミドプロピオン酸ベンジルエステル
【０３０１】
【化５】
0004544639.tif 000008
化合物４（１．６ｇ；４．３ミリモル）、ブタンスルホン酸塩化物（０．８４ｍｌ；６．６ミリモル）及びトリエチルアミン（１．５当量）の混合液を塩化メチレン（２０ｍｌ）中室温で１２時間攪拌した。次に、反応混合液を蒸発し、残留物を酢酸エチルに溶解し、希ＨＣｌ、水性重炭酸ナトリウム及び水で洗浄した。蒸発乾固した後、粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、トルエン／酢酸エチル１５：１）で精製して１．４ｇ（６７％）の化合物５を無定形固形物として得た。
【０３０２】
Ｆ．化合物６：図１０工程ｖに示される（Ｓ）−３−（４−（４−アミノブチルオキシ）フェニル−２−ブチルスルホンアミドプロピオン酸
【０３０３】
【化６】
0004544639.tif 000009
化合物５（１．３ｇ（２．６ミリモル）を、２０ｍｌの酢酸エチル／メタノール／水５／３／１及び０．２ｍｌのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）に溶解し、１００ｍｇのパラジウム（１０％／木炭）の存在下に２５℃で水素（１気圧；パーシェーカー装置）によって水素添加した。３時間後、触媒をろ別し、溶媒を蒸発して化合物６を油状残留物として得た。水から凍結乾燥した後、１．０ｇ（定量的）の化合物６を白色粉末として得た。ＦＡＢ−ＭＳ：  ３７３（Ｍ＋Ｈ＋）。
【０３０４】
Ｇ．化合物７：図１０工程ｖｉに示される（Ｓ）−３−（４−（４−グアニジノブチルオキシ）フェニル−２−ブチルスルホンアミドプロピオン酸
【０３０５】
【化７】
0004544639.tif 000010
ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ；５ｍｌ）中化合物６（２００ｍｇ；０．５ミリモル）、３．５−ジメチルピラゾル−１−カルボキサミジン硝酸塩（ＤＰＦＮ）（１７０ｍｇ；０．８ミリモル；Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）及びトリエチルアミン（０．１５ｍｌ、１．０ミリモル）を６０℃で１２時間加熱した。冷却後、溶媒を減圧下で蒸発し、残留物をＨＰＬＣ（Ｌｉｃｈｒｏｃａｒｔ  ＲＰ−１８、勾配アセトニトリル／水＋０．３％ＴＦＡ９９：１〜１：９９）で精製して凍結乾燥後に５０ｍｇ（２５％）の化合物７を白色無定形粉末として得た。ＦＡＢ−ＭＳ：  ４１５（Ｍ＋Ｈ＋）、ｍ．ｐ．：７０℃。
【０３０６】
Ｈ．化合物８：図１１工程ｉｉｉに示される（Ｓ）−３−（４−（４−アミノブチルオキシ）フェニル−２−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルプロピオン酸
【０３０７】
【化８】
0004544639.tif 000011
化合物３（０．５ｇ（１．０７ミリモル）を、１０ｍｌの酢酸エチル／メタノール／水５／３／１及び０．１ｍｌのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）に溶解し、３０ｍｇのパラジウム（１０％／木炭）の存在下に２５℃で水素（１気圧；パーシェーカー装置）によって水素添加した。３時間後、触媒をろ別し、溶媒を蒸発して化合物８を油状残留物として得た。水から凍結乾燥した後、３７０ｍｇ（定量的）の化合物８を白色粉末として得た。ＦＡＢ−ＭＳ：  ３５３（Ｍ＋Ｈ＋）。
【０３０８】
Ｉ．化合物９：図１１工程ｉｖに示される（Ｓ）−３−（４−（４−グアニジノブチルオキシ）フェニル−２−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルプロピオン酸
【０３０９】
【化９】
0004544639.tif 000012
ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ；５ｍｌ）中化合物８（２００ｍｇ；０．５ミリモル）、３．５−ジメチルピラゾル−１−カルボキサミジン硝酸塩（ＤＰＦＮ）（１７０ｍｇ；０．８ミリモル；Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）及びトリエチルアミン（０．１５ｍｌ、１．０ミリモル）を６０℃で１２時間加熱した。冷却後、溶媒を減圧下で蒸発し、残留物をＨＰＬＣ（Ｌｉｃｈｒｏｃａｒｔ  ＲＰ−１８、勾配アセトニトリル／水＋０．３％ＴＦＡ９９：１〜１：９９）で精製して凍結乾燥後に１６０ｍｇ（９０％）の化合物９を白色無定形粉末として得た。ＦＡＢ−ＭＳ：  ３９５（Ｍ＋Ｈ＋）。
【０３１０】
Ｊ．化合物１０：図１２工程ｉ〜ｖｉに示される（Ｒ）−３−（４−（４−グアニジノブチルオキシ）フェニル−２−ブチルスルホンアミドプロピオン酸
【０３１１】
【化１０】
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化合物７を合成する反応順序を用いてＤ−チロシン類縁体１０を同様に調製し、化合物１０を生成する中間化合物１００〜６００を用いて次の通り２０５ｍｇを白色無定形物質ＦＡＢ−ＭＳ：  ４１５（Ｍ＋Ｈ＋）として得た。
【０３１２】
１）化合物１００：図１２に示されるｔ−Ｂｏｃ−Ｄ−チロシンベンジルエステル
【０３１３】
【化１１】
0004544639.tif 000014
０．１Ｍ塩化メチレン中Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトシキカルボニル）−Ｄ−チロシン（ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−チロシン）（１．０当量；Ａｌｄｒｉｃｈ）の溶液にジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（１．５当量）を２５℃で加え、１時間攪拌した。次に、１．５当量のベンジルアルコールを加え、混合液を２５℃で更に１２時間攪拌した。次に、反応混合液を酢酸エチル（０．１０Ｍ）で希釈し、水で２回、食塩水で１回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。次に、溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。
【０３１４】
２）化合物２００：図１２工程ｉに示される（Ｒ）−３−（４−（４−ブロモブチルオキシ）フェニル−２−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルプロピオン酸ベンジルエステル
【０３１５】
【化１２】
0004544639.tif 000015
ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−チロシンベンジルエステル（２ｇ、５．３８ミリモル；上記のように合成した）、１，４−ジブロモブタン（１．９ｍｌ、１６．２ミリモル；Ａｌｄｒｉｃｈ）、炭酸カリウム（５ｇ）及び１８−クラウン−６（０．１ｇ；Ａｌｄｒｉｃｈ）の混合液を８０℃で１２時間加熱した。冷却後、沈殿をろ別し、反応混合液を減圧下で蒸発乾固した。次に、粗生成物を１００％ヘキサンを用いて結晶化することにより精製して２．５ｇ（９２％）の化合物２００を得た。
【０３１６】
３）化合物３００：図１２工程ｉｉに示される（Ｒ）−３−（４−（４−アジドブチルオキシ）フェニル−２−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルプロピオン酸ベンジルエステル
【０３１７】
【化１３】
0004544639.tif 000016
化合物２００（２．５ｇ、４．９ミリモル）をアジ化ナトリウム（１．６ｇ、２５ミリモル）とジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（２０ｍｌ）中２５℃で１２時間攪拌した。次に、溶媒を蒸発し、残留物を水（約１０ｍｌ）で処理し、酢酸エチルで２回抽出した。有機層を合わせ、硫酸マグネシウムで乾燥し、蒸発して２．０ｇ（９０％）の化合物３００を無色のシロップとして得た（ＦＡＢ−ＭＳ：  ４６９（Ｍ＋Ｈ＋）。
【０３１８】
４）化合物４００：図１２工程ｉｉｉに示される（Ｒ）−３−（４−（４−アジドブチルオキシ）フェニル−２−アミノプロピオン酸ベンジルエステル
【０３１９】
【化１４】
0004544639.tif 000017
化合物３００（２．０ｇ（４．４ミリモル））をトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ；２ｍｌ）に溶解し、室温で３時間攪拌した。減圧下で蒸発して１．６ｇ（定量的）の化合物４００を無色のシロップとして得、精製せずに次の工程に用いた。ＦＡＢ−ＭＳ：  ３６９（Ｍ＋Ｈ＋）。
【０３２０】
５）化合物５００：図１２工程ｉｖに示される（Ｒ）−３−（４−（４−アジドブチルオキシ）フェニル−２−ブチルスルホンアミドプロピオン酸ベンジルエステル
【０３２１】
【化１５】
0004544639.tif 000018
化合物４００（１．６ｇ；４．３ミリモル）、ブタンスルホン酸塩化物（０．８４ｍｌ；６．６ミリモル）及びトリエチルアミン（１．５当量）の混合液を塩化メチレン（２０ｍｌ）中室温で１２時間攪拌した。次に、反応混合液を蒸発し、残留物を酢酸エチルに溶解し、希ＨＣｌ、水性重炭酸ナトリウム及び水で洗浄した。蒸発乾固した後、粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、トルエン／酢酸エチル１５：１）で精製して１．４ｇ（６７％）の化合物５００を無定形固形物として得た。
【０３２２】
６）化合物６００：図１２工程ｖに示される（Ｒ）−３−（４−（４−アミノブチルオキシ）フェニル−２−ブチルスルホンアミドプロピオン酸
【０３２３】
【化１６】
0004544639.tif 000019
化合物５００（１．３ｇ（２．６ミリモル）を、２０ｍｌの酢酸エチル／メタノール／水５／３／１及び０．２ｍｌのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）に溶解し、１００ｍｇのパラジウム（１０％／木炭）の存在下に２５℃で水素（１気圧；パーシェーカー装置）によって水素添加した。３時間後、触媒をろ別し、溶媒を蒸発して化合物６００を油状残留物として得た。水から凍結乾燥した後、１．０ｇ（定量的）の化合物６を白色粉末として得た。ＦＡＢ−ＭＳ：  ３７３（Ｍ＋Ｈ＋）。
【０３２４】
７）化合物１０：図１２工程ｖｉに示される（Ｒ）−３−（４−（４−グアニジノブチルオキシ）フェニル−２−ブチルスルホンアミドプロピオン酸
ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ；５ｍｌ）中化合物６００（２００ｍｇ；０．５ミリモル）、３．５−ジメチルピラゾル−１−カルボキサミジン硝酸塩（ＤＰＦＮ）（１７０ｍｇ；０．８ミリモル；Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）及びトリエチルアミン（０．１５ｍｌ、１．０ミリモル）を６０℃で１２時間加熱した。冷却後、溶媒を減圧下で蒸発し、残留物をＨＰＬＣ（Ｌｉｃｈｒｏｃａｒｔ  ＲＰ−１８、勾配アセトニトリル／水＋０．３％ＴＦＡ９９：１〜１：９９）で精製して凍結乾燥後に５０ｍｇ（２５％）の化合物１０を白色無定形粉末として得た。ＦＡＢ−ＭＳ：  ４１５（Ｍ＋Ｈ＋）、ｍ．ｐ．：７０℃。
【０３２５】
Ｋ．化合物１１：図１３に示される（Ｓ）−３−（４−（４−アジドブチルオキシ）フェニル−２−（１０−カンファスルホンアミド）プロピオン酸ベンジルエステル
【０３２６】
【化１７】
0004544639.tif 000020
化合物４（１．０ｇ；２．７ミリモル）、１０−カンファスルホン酸塩化物（６．６ミリモル；Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）及びトリエチルアミン（１．５当量）の混合液を塩化メチレン（２０ｍｌ）中室温で１２時間攪拌した。次に、反応混合液を蒸発し、残留物を酢酸エチルに溶解し、希ＨＣｌ、水性重炭酸ナトリウム及び水で洗浄した。蒸発乾固した後、粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、トルエン／酢酸エチル１５：１）で精製して１．４ｇ（６７％）の化合物１１を無定形固形物として得た。
【０３２７】
Ｌ．化合物１２：図１３ｉ〜ｉｉに示される（Ｓ）−３−（４−（４−グアニジノブチルオキシ）フェニル−２−（１０−カンファスルホンアミド）プロピオン酸
【０３２８】
【化１８】
0004544639.tif 000021
下記の条件に従い化合物１１を水素添加及びグアニル化した後に化合物１２を得た。
【０３２９】
工程ｉ：化合物１１（１．３ｇ（２．６ミリモル）を、２０ｍｌの酢酸エチル／メタノール／水５／３／１及び０．２ｍｌのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）に溶解し、１００ｍｇのパラジウム（１０％／木炭）の存在下に２５℃で水素（１気圧；パーシェーカー装置）によって水素添加した。３時間後、触媒をろ別し、溶媒を蒸発して中間体アミンを油状残留物として得た。水から凍結乾燥した後、１．０ｇ（定量的）の中間体アミンを白色粉末として得、次のように続けた。
【０３３０】
工程ｉｉ：ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ；５ｍｌ）中上で生成した中間体アミン化合物（２００ｍｇ；０．５ミリモル）、３．５−ジメチルピラゾル−１−カルボキサミジン硝酸塩（ＤＰＦＮ）（１７０ｍｇ；０．８ミリモル；Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）及びトリエチルアミン（０．１５ｍｌ、１．０ミリモル）を６０℃で１２時間加熱した。冷却後、溶媒を減圧下で蒸発し、残留物をＨＰＬＣ（Ｌｉｃｈｒｏｃａｒｔ  ＲＰ−１８、勾配アセトニトリル／水＋０．３％ＴＦＡ９９：１〜１：９９）で精製して凍結乾燥後に５０ｍｇ（２５％）の化合物１２を白色無定形粉末として得た。ＦＡＢ−ＭＳ：  ５０９．６（Ｍ＋Ｈ＋）。
【０３３１】
Ｍ．化合物１３：図１３に示される（Ｓ）−３−（４−（５−ブロモペンチルオキシ）フェニル−２−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルプロピオン酸ベンジルエステル
【０３３２】
【化１９】
0004544639.tif 000022
ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−チロシンベンジルエステル（４．５ｇ、１２．１ミリモル；上記のように合成した化合物１）、１，５−ジブロモペンタン（５ｍｌ、３６．７ミリモル；Ａｌｄｒｉｃｈ）、炭酸カリウム（１０ｇ）及び１８−クラウン−６（０．２５ｇ；Ａｌｄｒｉｃｈ）の混合液を８０℃で１２時間加熱した。冷却後、沈殿をろ別し、反応混合液を減圧下で蒸発乾固した。次に、粗生成物を１００％ヘキサンを用いて結晶化することにより精製して５．３５ｇ（８５％）の化合物１３を得た。
【０３３３】
Ｎ．化合物１４：図１３工程ｉ〜ｖに示される（Ｓ）−３−（４−（５−グアニジノペンチルオキシ）フェニル−２−ブチルスルホンアミドプロピオン酸
【０３３４】
【化２０】
0004544639.tif 000023
臭素−アジ化合物交換、Ｂｏｃ開裂、ブタンスルホン酸塩化物によるスルホン化、水素添加及びＤＰＦＮによるグアニル化の５工程反応順序を中間化合物１〜６を用いて上記の操作と同様に行って化合物７を生成するか又は化合物１００〜６００を用いて上記のように化合物１０を生成した。化合物１４を白色粉末として得た。ＦＡＢ−ＭＳ：  ４２９（Ｍ＋Ｈ＋）。
【０３３５】
Ｏ．化合物１５：図１４に示される３−（４−アミジノフェニル）−（５−（４−（２−カルボキシ−２−アミノエチル）フェノキシ）メチル−２−オキサゾリジノン、二塩酸塩１）化合物１５の出発物質２−Ｎ−ＢＯＣ−アミノ−３−（４−ヒドロキシフェニル（プロピオネート）の合成
【０３３６】
【化２１】
0004544639.tif 000024
０．１０Ｍメタノール及び１％希ＨＣｌ中で（Ｄ又はＬ）、Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ（Ｄ）−チロシン（ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ（Ｄ）−チロシン）（１．０当量；Ｓｉｇｍａ）のエステル化により出発物質２−Ｎ−Ｂｏｃ−アミノ−３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオネートを得た。反応混合液を２５℃で１２時間攪拌し、炭酸カリウムで中和し、酢酸エチル（０．１０Ｍ）で希釈し、水で２×、食塩水で１×洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。次に、溶媒を減圧下で除去し、次に、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して２−Ｎ−ＢＯＣ−３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオネートを得た。
【０３３７】
２）化合物１５の出発物質３−ｐ−Ｎ−ＢＯＣ−アミジノフェニル−５−メタンスルホニルオキシメチル−２−オキサゾリジノンの合成：３工程の手順は次の通りである
塩化メチレン（０．１０Ｍ）中ｐ−アミノベンゾニトリル（１．０当量；Ａｌｄｒｉｃｈ）を２，３−エポキシプロパノール（１．０当量；Ａｌｄｒｉｃｈ）と２５℃で１２時間攪拌した。次に、溶媒を減圧下で除去し、粗４−（２，３−ジヒドロキシプロピルアミノ）ベンゾニトリルを下記の通り次の工程へ続けた。
【０３３８】
２５℃においてジメチルホルムアミド（０．１０Ｍ）中４−（２，３−ジヒドロキシプロピルアミノ）ベンゾニトリルを、炭酸ジエチル（１．１当量；Ａｌｄｒｉｃｈ）及びｔｅｒｔ−ブチル酸カリウム（１．１当量；Ａｌｄｒｉｃｈ）と１１０℃で６時間攪拌した。次に、反応混合液を酢酸エチル（０．１０Ｍ）で希釈し、水で２×、食塩水で１×洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。次に、溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して３−（４−シアノフェニル）−５−ヒドロキシメチル−２−オキサゾリジンを得、下記の通り次の工程へ続けた。
【０３３９】
２５℃において塩化メチレン（０．１０Ｍ）中３−（４−シアノフェニル）−５−ヒドロキシメチル−２−オキサゾリジン（１．０当量；上記）を１．１当量の硫化水素、１．１当量のヨウ化メチル及び１．１当量の酢酸アンモニウムと攪拌した。
【０３４０】
反応混合液を６時間攪拌し、次に、酢酸エチル（０．１０Ｍ）で希釈し、水で２×、食塩水で１×洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。次に、溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィーで精製してアミジンを得、下記の通り次の工程へ続けた。
【０３４１】
上記のように合成した１．０当量のアミジンを、２５℃において塩化メチレン（０．１０Ｍ）中１．１当量のＢＯＣ−ＯＮ（２−ＢＯＣ−オキシイミノ）−２−フェニルアセトニトリル；Ａｌｄｒｉｃｈ）で保護し、６時間攪拌した。次に、反応混合液を酢酸エチル（０．１０Ｍ）で希釈し、水で２×、食塩水で１×洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。次に、溶媒を減圧下で除去し、粗生成物を０．１０Ｍ塩化メチレン及び１．１当量の塩化メタンスルホニル中でエステル化した。反応混合液を０℃で６時間攪拌し、水（５当量）で急冷し、酢酸エチル（０．１０Ｍ）で希釈し、水で２×、食塩水で１×洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。次に、溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して３−ｐ−Ｎ−ＢＯＣ−アミジノフェニル−５−メタンスルホニルオキシメチル−２−オキサゾリジノンを得た。
【０３４２】
３）中間体２−Ｎ−ＢＯＣ−アミノ−３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオネートを３−ｐ−Ｎ−ＢＯＣ−アミジノフェニル−５−メタンスルホニルオキシメチル−２−オキサゾリジノンでカップリングして保護形態の化合物１５、３−（４−ＢＯＣ−アミジノフェニル）−５−（４−（２−メトキシカルボニル−２Ｎ−ＢＯＣ−アミノエチル）フェニオキシルメチル−２−オキサゾリジノンを生成する
１．９ｇの２−Ｎ−ＢＯＣ−アミノ−３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオネート（上記）、２０ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）及びＮａＨ（１．０当量）の混合液を室温で３０分間攪拌した。攪拌後、１０ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中１．８ｇの３−ｐ−Ｎ−ＢＯＣ−アミジノフェニル−５−メタンスルホニルオキシメチル−２−オキサゾリジノン（上記）を加え、室温で１５分間攪拌した。次に、反応混合液を酢酸エチル（０．１０Ｍ）で希釈し、水で２×、食塩水で１×洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。次に、溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して保護形態の化合物１５、３−（４−ＢＯＣ−アミジノフェニル）−５−（４−（２−メトキシカルボニル−２Ｎ−ＢＯＣ−アミノエチル）フェニルオキシメチル−２−オキサゾリジノンを得、次の工程へ続けた。
【０３４３】
４）保護形態の化合物１５を脱保護して化合物１５：３−（４−アミジノフェニル）−５−（４−（２−カルボキシ−２−アミノエチル）フェノキシ）メチル−２−オキサゾリジノン、二塩酸塩、図１４を生成する
保護形態の化合物１５、３−（４−ＢＯＣ−アミジノフェニル）−５−（４−（２−メトキシカルボニル−２Ｎ−ＢＯＣ−アミノエチル）フェニオキシルメチル−２−オキサゾリジノン（１．０当量；上記のように合成）を４ｍｌの２ＮＮａＯＨで室温において４時間処理した。次に、ジオキサン中４０ｍｌの２ＮＨＣｌ溶液を滴下して０〜２５℃で３時間混合した。次に、反応混合液を重炭酸ナトリウム（５当量）で急冷し、酢酸エチル（０．１０Ｍ）で希釈し、水で２×、食塩水で１×洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。次に、溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して化合物１５：３−（４−アミジノフェニル）−５−（４−（２−カルボキシ−２−アミノエチル）フェノキシ）メチル−２−オキサゾリジノン、二塩酸塩；ｍ．ｐ．１６５℃（ｄ）を得た。
【０３４４】
Ｐ．化合物１６：図１４に示される３−（４−アミジノフェニル）−（５−（４−（２−カルボキシ−２−Ｎ−ブチルスルホニルアミノエチル）フェノキシ）メチル−２−オキサゾリジノン
１）化合物１６の出発物質２−Ｎ−ブチルスルホニルアミノ−３−（４−ヒドロキシフェニル（プロピオネート）の合成
【０３４５】
【化２２】
0004544639.tif 000025
０．１０Ｍメタノール及び１％希ＨＣｌ中で（（Ｄ又はＬ）チロシン）（１．０当量；Ｓｉｇｍａ）をエステル化することにより出発物質２−Ｎ−ブチルスルホニルアミノ−３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオネートを得た。反応混合液を２５℃で１２時間攪拌し、炭酸カリウムで中和し、酢酸エチル（０．１０Ｍ）で希釈し、水で２×、食塩水で１×洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。次に、溶媒を減圧下で除去し、粗生成物を次のように続けた。
【０３４６】
上記化合物（４．３ミリモル）、ブタンスルホン酸塩化物（６．６ミリモル）及びトリエチルアミン（１．５当量）の混合液を塩化メチレン（２０ｍｌ）中室温で１２時間攪拌した。次に、反応混合液を蒸発し、残留物を酢酸エチルに溶解し、希ＨＣｌ、水性重炭酸ナトリウム及び水で洗浄した。蒸発乾固した後、粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、トルエン／酢酸エチル１５：１）で精製して標記化合物を得た。
【０３４７】
２）化合物１６の出発物質３−ｐ−Ｎ−ＢＯＣ−アミジノフェニル−５−メタンスルホニルオキシメチル−２−オキサゾリジノンの合成：３工程の手順は次の通りである
塩化メチレン（０．１０Ｍ）中ｐ−アミノベンゾニトリル（１．０当量；Ａｌｄｒｉｃｈ）を２，３−エポキシプロパノール（１．０当量；Ａｌｄｒｉｃｈ）と２５℃で１２時間攪拌した。次に、溶媒を減圧下で除去し、粗４−（２，３−ジヒドロキシプロピルアミノ）ベンゾニトリルを下記のように次の工程へ続けた。
【０３４８】
２５℃においてジメチルホルムアミド（０．１０Ｍ）中４−（２，３−ジヒドロキシプロピルアミノ）ベンゾニトリルを、炭酸ジエチル（１．１当量；Ａｌｄｒｉｃｈ）及びｔｅｒｔ−ブチル酸カリウム（１．１当量；Ａｌｄｒｉｃｈ）と１１０℃で６時間攪拌した。次に、反応混合液を酢酸エチル（０．１０Ｍ）で希釈し、水で２×、食塩水で１×洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。次に、溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して３−（４−シアノフェニル）−５−ヒドロキシメチル−２−オキサゾリジンを得、下記の通り次の工程へ続けた。
【０３４９】
２５℃において塩化メチレン（０．１０Ｍ）中３−（４−シアノフェニル）−５−ヒドロキシメチル−２−オキサゾリジン（１．０当量；上記）を１．１当量の硫化水素、１．１当量のヨウ化メチル及び１．１当量の酢酸アンモニウムと攪拌した。反応混合液を６時間攪拌し、次に、酢酸エチル（０．１０Ｍ）で希釈し、水で２×、食塩水で１×洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。次に、溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィーで精製してアミジンを得、下記の通り次の工程へ続けた。
【０３５０】
上記のように合成した１．０当量のアミジンを、２５℃において塩化メチレン（０．１０Ｍ）中１．１当量のＢＯＣ−ＯＮ（２−ＢＯＣ−オキシイミノ）−２−フェニルアセトニトリル；Ａｌｄｒｉｃｈ）で保護し、６時間攪拌した。次に、反応混合液を酢酸エチル（０．１０Ｍ）で希釈し、水で２×、食塩水で１×洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。次に、溶媒を減圧下で除去し、粗生成物を０．１０Ｍ塩化メチレン及び１．１当量の塩化メタンスルホニル中でエステル化した。反応混合液を０℃で６時間攪拌し、水（５当量）で急冷し、酢酸エチル（０．１０Ｍ）で希釈し、水で２×、食塩水で１×洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。次に、溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して３−ｐ−Ｎ−ＢＯＣ−アミジノフェニル−５−メタンスルホニルオキシメチル−２−オキサゾリジノンを得た。
【０３５１】
３）中間体２−Ｎ−ブチルスルホニルアミノ−３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオネートを３−ｐ−Ｎ−ＢＯＣ−アミジノフェニル−５−メタンスルホニルオキシメチル−２−オキサゾリジノンでカップリングして保護形態の化合物１６、３−（４−ＢＯＣ−アミジノフェニル）−５−（４−（２−メトキシカルボニル−２−Ｎ−ブチルスルホニルアミノエチル）フェニオキシルメチル−２−オキサゾリジノンを生成する
１．９ｇの２−Ｎ−ブチルスルホニルアミノ−３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオネート（上記）、２０ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）及びＮａＨ（１．０当量）の混合液を室温で３０分間攪拌した。攪拌後、１０ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中１．８ｇの３−ｐ−Ｎ−ＢＯＣ−アミジノフェニル−５−メタンスルホニルオキシメチル−２−オキサゾリジノン（上記）を加え、室温で１５分間攪拌した。次に、反応混合液を酢酸エチル（０．１０Ｍ）で希釈し、水で２×、食塩水で１×洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。次に、溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して保護形態の化合物１６、３−（４−ＢＯＣ−アミジノフェニル）−５−（４−（２−メトキシカルボニル−２−Ｎ−ブチルスルホニルアミノエチル）フェニオキシルメチル−２−オキサゾリジノンを得、次の工程へ続けた。
【０３５２】
４）保護形態の化合物１６を脱保護して化合物１６：３−（４−アミジノフェニル）−５−（４−（２−カルボキシ−２−Ｎ−ブチルスルホニルアミノエチル）フェノキシ）メチル−２−オキサゾリジノン、図１４を生成する
保護形態の化合物１６、３−（４−ＢＯＣ−アミジノフェニル）−５−（４−（２−メトキシカルボニル−２−Ｎ−ブチルスルホニルアミノエチル）フェニオキシルメチル−２−オキサゾリジノン（１．０当量；上記のように合成）を４ｍｌの２Ｎ  ＮａＯＨで室温において４時間処理した。次に、ジオキサン中４０ｍｌの２Ｎ  ＨＣｌ溶液を滴下して０〜２５℃で３時間混合した。次に、反応混合液を重炭酸ナトリウム（５当量）で急冷し、酢酸エチル（０．１０Ｍ）で急冷し、水で２×、食塩水で１×洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。次に、溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して化合物１６：３−（４−アミジノフェニル）−５−（４−（２−カルボキシ−２−Ｎ−ブチルスルホニルアミノエチル）フェノキシ）メチル−２−オキサゾリジノン；ｍ．ｐ．２３６−２３７℃を得た。
【０３５３】
Ｑ．化合物１７：図１４に示される３−（４−アミジノフェニル）−（５−（４−（２−カルボキシ−２−Ｎ−プロピルスルホニルアミノエチル）フェノキシ）メチル−２−オキサゾリジノン
１）化合物１７の出発物質２−Ｎ−プロピルスルホニルアミノ−３−（４−ヒドロキシフェニル（プロピオネート）の合成
【０３５４】
【化２３】
0004544639.tif 000026
０．１０Ｍメタノール及び１％希ＨＣｌ中で（（Ｄ又はＬ）チロシン）（１．０当量；Ｓｉｇｍａ）をエステル化することにより出発物質２−Ｎ−プロピルスルホニルアミノ−３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオネートを得た。反応混合液を２５℃で１２時間攪拌し、炭酸カリウムで中和し、酢酸エチル（０．１０Ｍ）で希釈し、水で２×、食塩水で１×洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。次に、溶媒を減圧下で除去し、粗生成物を次のように続けた。
【０３５５】
上記化合物（４．３ミリモル）、プロピルスルホン酸塩化物（６．６ミリモル；Ａｌｄｒｉｃｈ）及びトリエチルアミン（１．５当量）の混合液を塩化メチレン（２０ｍｌ）中室温で１２時間攪拌した。次に、反応混合液を蒸発し、残留物を酢酸エチルに溶解し、希ＨＣｌ、水性重炭酸ナトリウム及び水で洗浄した。蒸発乾固した後、粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、トルエン／酢酸エチル１５：１）で精製して標記化合物を得た。
【０３５６】
２）化合物１７の出発物質３−ｐ−Ｎ−ＢＯＣ−アミジノフェニル−５−メタンスルホニルオキシメチル−２−オキサゾリジノンの合成：３工程の手順は次の通りである
塩化メチレン（０．１０Ｍ）中ｐ−アミノベンゾニトリル（１．０当量；Ａｌｄｒｉｃｈ）を２，３−エポキシプロパノール（１．０当量；Ａｌｄｒｉｃｈ）と２５℃で１２時間攪拌した。次に、溶媒を減圧下で除去し、粗４−（２，３−ジヒドロキシプロピルアミノ）ベンゾニトリルを下記のように次の工程へ続けた。
【０３５７】
２５℃においてジメチルホルムアミド（０．１０Ｍ）中４−（２，３−ジヒドロキシプロピルアミノ）ベンゾニトリル（１．０当量；上記）を、炭酸ジエチル（１．１当量；Ａｌｄｒｉｃｈ）及びｔｅｒｔ−ブチル酸カリウム（１．１当量；Ａｌｄｒｉｃｈ）と１１０℃で６時間攪拌した。次に、反応混合液を酢酸エチル（０．１０Ｍ）で希釈し、水で２×、食塩水で１×洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。次に、溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して３−（４−シアノフェニル）−５−ヒドロキシメチル−２−オキサゾリジンを得、下記の通り次の工程へ続けた。
【０３５８】
２５℃において塩化メチレン（０．１０Ｍ）中３−（４−シアノフェニル）−５−ヒドロキシメチル−２−オキサゾリジン（１．０当量；上記）を１．１当量の硫化水素、１．１当量のヨウ化メチル及び１．１当量の酢酸アンモニウムと攪拌した。
【０３５９】
反応混合液を６時間攪拌し、次に、酢酸エチル（０．１０Ｍ）で希釈し、水で２×、食塩水で１×洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。次に、溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィーで精製してアミジンを得、下記の通り次の工程へ続けた。
【０３６０】
上記のように合成した１．０当量のアミジンを、塩化メチレン（０．１０Ｍ）中１．１当量のＢＯＣ−ＯＮ（２−ＢＯＣ−オキシイミノ）−２−フェニルアセトニトリル；Ａｌｄｒｉｃｈ）で保護し、６時間攪拌した。次に、反応混合液を酢酸エチル（０．１０Ｍ）で希釈し、水で２×、食塩水で１洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。
【０３６１】
次に、溶媒を減圧下で除去し、粗生成物を０．１０Ｍ塩化メチレン及び１．１当量の塩化メタンスルホニル中でエステル化した。反応混合液を０℃で６時間攪拌し、水（５当量）で急冷し、酢酸エチル（０．１０Ｍ）で希釈し、水で２×、食塩水で１×洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。次に、溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して３−ｐ−Ｎ−ＢＯＣ−アミジノフェニル−５−メタンスルホニルオキシメチル−２−オキサゾリジノンを得た。
【０３６２】
３）中間体２−Ｎ−プロピルスルホニルアミノ−３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオネートを３−ｐ−Ｎ−ＢＯＣ−アミジノフェニル−５−メタンスルホニルオキシメチル−２−オキサゾリジノンでカップリングして保護形態の化合物１７、３−（４−ＢＯＣ−アミジノフェニル）−５−（４−（２−メトキシカルボニル−２−Ｎ−プロピルスルホニルアミノエチル）フェニオキシルメチル−２−オキサゾリジノンを生成する
１．９ｇの２−Ｎ−プロピルスルホニルアミノ−３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオネート（上記）、２０ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）及びＮａＨ（１．０当量）の混合液を室温で３０分間攪拌した。攪拌後、１０ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中１．８ｇの３−ｐ−Ｎ−ＢＯＣ−アミジノフェニル−５−メタンスルホニルオキシメチル−２−オキサゾリジノン（上記）を加え、室温で１５分間攪拌した。次に、反応混合液を酢酸エチル（０．１０Ｍ）で希釈し、水で２×、食塩水で１×洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。次に、溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して保護形態の化合物１７、３−（４−ＢＯＣ−アミジノフェニル）−５−（４−（２−メトキシカルボニル−２−Ｎ−プロピルスルホニルアミノエチル）フェニルオキシメチル−２−オキサゾリジノンを得、次の工程へ続けた。
【０３６３】
４）保護形態の化合物１７を脱保護して化合物１７：３−（４−アミジノフェニル）−５−（４−（２−カルボキシ−２−Ｎ−プロピルスルホニルアミノエチル）フェノキシ）メチル−２−オキサゾリジノン、図１４を生成する
保護形態の化合物１７、３−（４−ＢＯＣ−アミジノフェニル）−５−（４−（２−メトキシカルボニル−２−Ｎ−プロピルスルホニルアミノエチル）フェニオキシルメチル−２−オキサゾリジノン（１．０当量；上記のように合成）を４ｍｌの２Ｎ  ＮａＯＨで室温において４時間処理した。次に、ジオキサン中４０ｍｌの２Ｎ  ＨＣｌ溶液を滴下して０〜２５℃で３時間混合した。次に、反応混合液を重炭酸ナトリウム（５当量）で急冷し、酢酸エチル（０．１０Ｍ）で急冷し、水で２×、食塩水で１×洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。次に、減圧下で溶媒を除去し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して化合物１７：３−（４−アミジノフェニル）−５−（４−（２−カルボキシ−２−Ｎ−プロピルスルホニルアミノエチル）フェノキシ）メチル−２−オキサゾリジノン；ｍ．ｐ．２００℃（ｄ）を得た。
【０３６４】
Ｒ．化合物１８：図１４に示される３−（４−アミジノフェニル）−（５−（４−（２−カルボキシ−２−Ｎ−エチルスルホニルアミノエチル）フェノキシ）メチル−２−オキサゾリジノン
１）化合物１８の出発物質２−Ｎ−エチルスルホニルアミノ−３−（４−ヒドロキシフェニル（プロピオネート）の合成
【０３６５】
【化２４】
0004544639.tif 000027
０．１０Ｍメタノール及び１％希ＨＣｌ中で（（Ｄ又はＬ）チロシン）（１．０当量；Ｓｉｇｍａ）をエステル化することにより出発物質２−Ｎ−エチルスルホニルアミノ−３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオネートを得た。反応混合液を２５℃で１２時間攪拌し、炭酸カリウムで中和し、酢酸エチル（０．１０Ｍ）で希釈し、水で２×、食塩水で１×洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。次に、溶媒を減圧下で除去し、粗生成物を次のように続けた。
【０３６６】
上記化合物（４．３ミリモル）、エチルスルホン酸塩化物（６．６ミリモル；Ａｌｄｒｉｃｈ）及びトリエチルアミン（１．５当量）の混合液を塩化メチレン中室温で１２時間攪拌した。次に、反応混合液を蒸発し、残留物を酢酸エチルに溶解し、希ＨＣｌ、水性重炭酸ナトリウム及び水で洗浄した。蒸発乾固した後、粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、トルエン／酢酸エチル１５：１）で精製して標記化合物を得た。
【０３６７】
２）化合物１８の出発物質３−ｐ−Ｎ−ＢＯＣ−アミジノフェニル−５−メタンスルホニルオキシメチル−２−オキサゾリジノンの合成：３工程の手順は次の通りである
塩化メチレン（０．１０Ｍ）中ｐ−アミノベンゾニトリル（１．０当量；Ａｌｄｒｉｃｈ）を２，３−エポキシプロパノール（１．０当量；Ａｌｄｒｉｃｈ）と２５℃で１２時間攪拌した。次に、溶媒を減圧下で除去し、粗４−（２，３−ジヒドロキシプロピルアミノ）ベンゾニトリルを下記のように次の工程へ続けた。
【０３６８】
２５℃においてジメチルホルムアミド（０．１０Ｍ）中４−（２，３−ジヒドロキシプロピルアミノ）ベンゾニトリル（１．０当量；上記）を、炭酸ジエチル（１．１当量；Ａｌｄｒｉｃｈ）及びｔｅｒｔ−ブチル酸カリウム（１．１当量；Ａｌｄｒｉｃｈ）と１１０℃で６時間攪拌した。次に、反応混合液を酢酸エチル（０．１０Ｍ）で希釈し、水で２×、食塩水で１×洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。次に、溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して３−（４−シアノフェニル）−５−ヒドロキシメチル−２−オキサゾリジンを得、下記の通り次の工程へ続けた。
【０３６９】
２５℃において塩化メチレン（０．１０Ｍ）中３−（４−シアノフェニル）−５−ヒドロキシメチル−２−オキサゾリジン（１．０当量；上記）を１．１当量の硫化水素、１．１当量のヨウ化メチル及び１．１当量の酢酸アンモニウムと攪拌した。
【０３７０】
反応混合液を６時間攪拌し、次に、酢酸エチル（０．１０Ｍ）で希釈し、水で２×、食塩水で１×洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。次に、溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィーで精製してアミジンを得、下記の通り次の工程へ続けた。
【０３７１】
上記のように合成した１．０当量のアミジンを、塩化メチレン（０．１０Ｍ）中１．１当量のＢＯＣ−ＯＮ（２−ＢＯＣ−オキシイミノ）−２−フェニルアセトニトリル；Ａｌｄｒｉｃｈ）で保護し、６時間攪拌した。次に、反応混合液を酢酸エチル（０．１０Ｍ）で希釈し、水で２×、食塩水で１×洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。次に、減圧下で溶媒を除去し、粗生成物を０．１０Ｍ塩化メチレン及び１．１当量の塩化メタンスルホニル中でエステル化した。反応混合液を０℃で６時間攪拌し、水（５当量）で急冷し、酢酸エチル（０．１０Ｍ）で希釈し、水で２×、食塩水で１×洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。次に、溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して３−ｐ−Ｎ−ＢＯＣ−アミジノフェニル−５−メタンスルホニルオキシメチル−２−オキサゾリジノンを得た。
【０３７２】
３）中間体２−Ｎ−エチルスルホニルアミノ−３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオネートを３−ｐ−Ｎ−ＢＯＣ−アミジノフェニル−５−メタンスルホニルオキシメチル−２−オキサゾリジノンでカップリングして保護形態の化合物１８、３−（４−ＢＯＣ−アミジノフェニル）−５−（４−（２−メキシカルボニル−２−Ｎ−エチルスルホニルアミノエチル）フェニオキシルメチル−２−オキサゾリジノンを生成する
１．９ｇの２−Ｎ−ブチルスルホニルアミノ−３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオネート（上記）、２０ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）及びＮａＨ（１．０当量）の混合液を室温で３０分間攪拌した。攪拌後、１０ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中１．８ｇの３−ｐ−Ｎ−ＢＯＣ−アミジノフェニル−５−メタンスルホニルオキシメチル−２−オキサゾリジノン（上記）を加え、室温で１５分間攪拌した。次に、反応混合液を酢酸エチル（０．１０Ｍ）で希釈し、水で２×、食塩水で１×洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。次に、溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して保護形態の化合物１８、３−（４−ＢＯＣ−アミジノフェニル）−５−（４−（２−メトキシカルボニル−２−Ｎ−ブチルスルホニルアミノエチル）フェニオキシルメチル−２−オキサゾリジノンを得、次の工程へ続けた。
【０３７３】
４）保護形態の化合物１８を脱保護して化合物１８：３−（４−アミジノフェニル）−５−（４−（２−カルボキシ−２−Ｎ−エチルスルホニルアミノエチル）フェノキシ）メチル−２−オキサゾリジノン、図１４を生成する
保護形態の化合物１８、３−（４−ＢＯＣ−アミジノフェニル）−５−（４−（２−メトキシカルボニル−２−Ｎ−エチルスルホニルアミノエチル）フェニオキシルメチル−２−オキサゾリジノン（１．０当量；上記のように合成）を４ｍｌの２Ｎ  ＮａＯＨで室温において４時間処理した。次に、ジオキサン中４０ｍｌの２Ｎ  ＨＣｌ溶液を滴下して０〜２５℃で３時間混合した。次に、反応混合液を重炭酸ナトリウム（５当量）で急冷し、酢酸エチル（０．１０Ｍ）で急冷し、水で２×、食塩水で１×洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。次に、溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して化合物１８：３−（４−アミジノフェニル）−５−（４−（２−カルボキシ−２−Ｎ−エチルスルホニルアミノエチル）フェノキシ）メチル−２−オキサゾリジノン；ｍ．ｐ．２１２℃（ｄ）を得た。
【０３７４】
上記明細書は、当業者が本発明を実施するのに十分であると考えられる。実際に、本明細書に図示及び記述されたものの他に本発明の様々な変更が上記説明から当業者に明らかであり、下記の請求の範囲に包含される。
【０３７５】
【表３】
0004544639.tif 000028
0004544639.tif 000029
0004544639.tif 000030
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【図面の簡単な説明】
【０３７６】
【図１】αｖインテグリン抗体拮抗体によるサイトカイン誘導ウサギ角膜血管形成の阻止を示す写真である。ｂＦＧＦ或いはＶＥＧＦで処理することによる血管形成の誘導及びαｖインテグリン抗体拮抗体、Ｐ１Ｆ６（αｖβ５）及びＬＭ６０９（αｖβ３）による治療効果は実施例４に記載されている。ＯＤ及びＯＳは、実験用ウサギの各々右目及び左目である。大きな矢印は浮腫を伴う角膜血管形成を示し、小さな矢印は正常な結膜の縁血管を示す。図１Ａ及び図１はｂＦＧＦによる血管形成の誘導を示す写真であり、図１Ｃ及び図１ＤはＶＥＧＦによる血管形成の誘導を示す写真である。図１Ａ及び図１Ｃのウサギ角膜はＰ１Ｆ６による治療を示す写真であり、図１Ｂ及び図１ＤはＬＭ６０９による治療を示す写真である。
【図２Ａ】各々ｂＦＧＦ或いはＶＥＧＦによる誘導に続いてＰ１Ｆ６或いはＬＭ６０９によるｍＡｂ処理した後の平均新生血管面積ｍｍ２＋／−標準誤差（２組の各々についてｎ＝８）を示すヒストグラムである。結果は実施例４に記載されている。
【図２Ｂ】各々ｂＦＧＦ或いはＶＥＧＦによる誘導に続いてＰ１Ｆ６或いはＬＭ６０９によるｍＡｂ処理した後の平均新生血管面積ｍｍ２＋／−標準誤差（２組の各々についてｎ＝８）を示すヒストグラムである。結果は実施例４に記載されている。
【図３】ニワトリＣＡＭ標品に対する抗インテグリン抗体処理の作用を示す写真である。結果は実施例６Ａに記載されている。血管形成をｂＦＧＦ或いはＶＥＧＦで誘導し、続いて対照として又は図１の説明に記載されたＰ１Ｆ６又はＬＭ６０９モノクローナル抗体と共にリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）を静脈内投与する。ｂＦＧＦで処理したＣＡＭを図３Ａ、図３Ｃ及び図３Ｅに示し、ＶＥＧＦで処理したＣＡＭを図３Ｂ、図３Ｄ及び図３Ｆを示す。ＰＢＳを静脈内に注射する対照ＣＡＭを図３Ａ及び図３Ｂに示す。図３Ｃ及び図３Ｄに示されるＣＡＭを治療するためにＰ１Ｆ６抗体を用い、図３Ｅ及び図３Ｆに示されるＣＡＭを治療するためにＬＭ６０９抗体を用いた。
【図４Ａ】図３Ａ〜図３Ｆに示された結果の定量を示すヒストグラムである。血管形成指数をＹ軸上に対照又は抗体処理に対してプロットする。図４及び図４Ｂは、各々ｂＦＧＦ誘導及びＶＥＧＦ誘導血管形成を示す図である。
【図４Ｂ】図３Ａ〜図３Ｆに示された結果の定量を示すヒストグラムである。血管形成指数をＹ軸上に対照又は抗体処理に対してプロットする。図４及び図４Ｂは、各々ｂＦＧＦ誘導及びＶＥＧＦ誘導血管形成を示す図である。
【図５】実施例６に記載されたニワトリＣＡＭ標品に対する合成ペプチド処理の効果を示す写真である。血管形成をｂＦＧＦ或いはＶＥＧＦにより誘導し、続いて対照として又は合成環状ペプチドＲＧＤｆＶ（配列番号４）又はＲＡＤｆＶ（配列番号５）と共にリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）を静脈内投与する。ｂＦＧＦで処理したＣＡＭを図５Ａ、図５Ｃ及び図５Ｅに示し、ＶＥＧＦで処理したＣＡＭを図５Ｂ、図５Ｄ及び図５Ｆに示す。ＰＢＳを静脈内に注射する対照ＣＡＭを図５Ａ及び図５Ｂに示す。図５Ｃ及び図５Ｄに示されるＣＡＭを治療するためにＲＤＧｆＶペプチドを用い、図５Ｅ及び図５Ｆに示されるＣＡＭを治療するためにＲＡＤｆＶペプチドを用いた。
【図６Ａ】図５Ａ〜図５Ｆに示された結果の定量を示すヒストグラムである。血管形成指数をＹ軸上に対照又は抗体処理に対してプロットする。図６及び図６Ｂは、各々ｂＦＧＦ誘導及びＶＥＧＦ誘導血管形成を示す図である。
【図６Ｂ】図５Ａ〜図５Ｆに示された結果の定量を示すヒストグラムである。血管形成指数をＹ軸上に対照又は抗体処理に対してプロットする。図６及び図６Ｂは、各々ｂＦＧＦ誘導及びＶＥＧＦ誘導血管形成を示す図である。
【図７Ａ】別個のサイトカイン、ｂＦＧＦ、ＴＮＦ−α、ＶＥＧＦ及びＴＧＦ−αで誘導したＣＡＭ血管形成に対する抗インテグリンモノクローナル抗体及びカルホスチンＣの作用を示すヒストグラムである。
【図７Ｂ】別個のサイトカイン、ｂＦＧＦ、ＴＮＦ−α、ＶＥＧＦ及びＴＧＦ−αで誘導したＣＡＭ血管形成に対する抗インテグリンモノクローナル抗体及びカルホスチンＣの作用を示すヒストグラムである。
【図７Ｃ】別個のサイトカイン、ｂＦＧＦ、ＴＮＦ−α、ＶＥＧＦ及びＴＧＦ−αで誘導したＣＡＭ血管形成に対する抗インテグリンモノクローナル抗体及びカルホスチンＣの作用を示すヒストグラムである。
【図７Ｄ】別個のサイトカイン、ｂＦＧＦ、ＴＮＦ−α、ＶＥＧＦ及びＴＧＦ−αで誘導したＣＡＭ血管形成に対する抗インテグリンモノクローナル抗体及びカルホスチンＣの作用を示すヒストグラムである。
【図７Ｅ】別個のサイトカイン、ｂＦＧＦ、ＴＮＦ−α、ＶＥＧＦ及びＴＧＦ−αで誘導したＣＡＭ血管形成に対する抗インテグリンモノクローナル抗体及びカルホスチンＣの作用を示すヒストグラムである。
【図８】実施例５Ｃ及び図６Ｄに記載されるように分析を行ったニワトリ胚ＣＡＭにおけるＣＳ１メラノーマ腫瘍発生に対する抗体処理の作用を示すヒストグラムである。
【図９】Ｙ軸上にプロットした腫瘍容積ｍｍ３で測定されるメラノーマ腫瘍発生に対してαｖβ５ペプチド拮抗体、標識ペプチド１８９（配列番号９）の効果を対照と対比して示すヒストグラムである。
【図１０】化合物７の合成を示すスキームである。
【図１１】化合物９の合成を示すスキームである。
【図１２】化合物１０の合成を示すスキームである。
【図１３】化合物１２及び化合物１４の合成を示すスキームである。
【図１４】化合物１５、化合物１６、化合物１７及び化合物１８を示す化学構造である。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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