(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）粘液分泌細胞による粘液の分泌を阻害すること、および／または（ｉｉ）粘液分泌を制御または指示する神経細胞からの神経伝達物質放出を阻害することによって、粘液分泌を阻害する化合物であって、該神経細胞がＣ線維の末梢終末ではなく、
該化合物が、
クロストリジウム菌神経毒素の軽鎖、またはエキソサイトーシスを阻害する、該軽鎖のフラグメントもしくは改変体からなるあるいは含む阻害ドメイン；
該細胞に該阻害ドメインをトランスロケートするトランスロケートドメイン；ならびに
（ｉ）粘液分泌細胞または（ｉｉ）粘液分泌を制御または指示する神経細胞に結合する標的ドメイン
を含み、
該化合物がクロストリジウム菌毒素ではない、化合物。
【請求項２】
前記粘液分泌細胞または神経細胞においてエキソサイトーシスを阻害し、それによって粘液または１つ以上の粘液成分のエキソサイトーシスを阻害するかまたは神経伝達物質のエキソサイトーシスを阻害する、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記標的ドメインが、サブスタンスＰ、ＶＩＰ、β２アドレナリンレセプターアゴニスト、ガストリン放出ペプチド、およびカルシトニン遺伝子関連ペプチドから選択されるドメインを含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
前記トランスロケートドメインが、ボツリヌス菌ポリペプチドのＨＮ領域、または前記細胞へ前記阻害ドメインをトランスロケートする、該領域のフラグメントもしくは改変体、を含有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかの項に記載の化合物；および
賦形剤、アジュバント、および噴射剤の少なくとも１つ
を含む組成物であって、
該組成物が、患者の気道への該化合物の経鼻または経口投与用である、組成物。
【請求項６】
エアロゾル投与用の処方である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
粘液過剰分泌の治療用医薬品の製造における、請求項１から４のいずれかの項に記載の化合物；または請求項５または６に記載の組成物の使用。
【請求項８】
喘息の治療用医薬品の製造における、請求項１から４のいずれかの項に記載の化合物；または請求項５または６に記載の組成物の使用。
【請求項９】
慢性閉塞性肺疾患の治療用医薬品の製造における、請求項１から４のいずれかの項に記載の化合物；または請求項５または６に記載の組成物の使用。
【請求項１０】
請求項１から４のいずれかの項に記載の化合物の製造方法であって、
クロストリジウム菌神経毒素を得、そして該毒素のＨＣ部分を除去または無力化するように該毒素を改変し、それによって第１の成分を提供する工程；または
ＨＣ部分が除去または無力化されているクロストリジウム菌神経毒素を得、それによって第１の成分を提供する工程；および
該第１の成分を、（ｉ）粘液分泌細胞または（ｉｉ）粘液分泌を制御もしくは指示する神経細胞に結合する第２の成分と連結する工程、
を包含する、方法。
【請求項１１】
請求項１から４のいずれかの項に記載の化合物の製造方法であって、
以下のドメイン：
粘液分泌細胞または粘液分泌を制御もしくは指示する神経細胞においてエキソサイトーシスを阻害する阻害ドメイン；および
該阻害ドメインを該細胞にトランスロケートするトランスロケートドメイン、
を有する第１の成分を得る工程；および
該第１の成分を、（ｉ）粘液分泌細胞または（ｉｉ）粘液分泌を制御もしくは指示する神経細胞に結合する第２の成分と連結する工程、
を包含する、方法。
【請求項１２】
薬学的組成物の製造方法であって、
クロストリジウム菌神経毒素を得、そして該毒素のＨＣ部分を除去または無力化するように該毒素を改変し、それによって第１の成分を提供する工程；または
ＨＣ部分が除去または無力化されているクロストリジウム菌神経毒素を得、それによって第１の成分を提供する工程；
該第１の成分を、（ｉ）粘液分泌細胞または（ｉｉ）粘液分泌を制御もしくは指示する神経細胞に結合する第２の成分と連結する工程；および
経鼻または経口投与可能な組成物中に、賦形剤、アジュバント、および噴射剤の１つ以上と組み合わせて、該第１および第２の成分を処方する工程、
を包含する、方法。
【請求項１３】
薬学的組成物の製造方法であって、
以下のドメイン：
粘液分泌細胞または粘液分泌を制御もしくは指示する神経細胞においてエキソサイトーシスを阻害する阻害ドメイン；および
該阻害ドメインを該細胞にトランスロケートするトランスロケートドメイン
を有する第１の成分を得る工程；
該第１の成分を、（ｉ）粘液分泌細胞または（ｉｉ）粘液分泌を制御もしくは指示する神経細胞に結合する第２の成分と連結する工程；および
経鼻または経口投与可能な組成物中に、賦形剤、アジュバント、および噴射剤の１つ以上と組み合わせて、該第１および第２の成分を処方する工程、
を包含する、方法。
【請求項１４】
請求項１から４のいずれかの項に記載の化合物；または請求項５または６に記載の組成物を含む、粘液過剰分泌を治療するための組成物。
【請求項１５】
請求項１から４のいずれかの項に記載の化合物；または請求項５または６に記載の組成物を含む、喘息を治療するための組成物。
【請求項１６】
請求項１から４のいずれかの項に記載の化合物；または請求項５または６に記載の組成物を含む、慢性閉塞性肺疾患を治療するための組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、粘液過剰分泌の治療、そのための組成物、およびこれらの組成物の製造に関する。本発明は、特に、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息、およびＣＯＰＤを含むその他の臨床症状における慢性気管支炎の治療に関するが、これらに限定されない。
【０００２】
粘液は、気道の内表面をおおう防御的粘弾性液体の薄いフィルムである。これは、１〜２％水溶液であり、その主な成分は、ムチンとして知られる複合糖質である。ムチンを含む粘液は、粘液分泌細胞、大気道の表面上皮杯細胞、および粘膜下腺の粘液細胞によって分泌される。ムチン放出は、構成的分泌、調節された分泌、およびプロテアーゼ細胞表面活性の３つのメカニズムによって生じる。これらのうち、外部刺激に応答し、そしてＣＯＰＤおよび喘息における治療的介入に従うのは、調節された分泌である。調節された分泌には、気道表面上にその内容物を放出するための、細胞外部と顆粒とのドッキングおよび融合による、細胞内顆粒からの放出が含まれる。顆粒の融合は、上皮細胞の形質膜と、または細胞表面で融合した多顆粒複合体による放出を導く他の顆粒の膜とのいずれかであり得る。ムチンの調節された分泌は、体液性因子によっておよび神経メカニズムによって制御される。ヒトにおける神経メカニズムには、アドレナリン性交感神経経路からの寄与は小さく、コリン性副交感神経系成分の寄与が大きい。ムチン分泌、特に病理学的症状である過剰分泌を調節する他の重要な神経経路は、非アドレナリン性非コリン性（ＮＡＮＣ）経路である。ＮＡＮＣ成分には、ニューロペプチドおよび非ペプチド伝達物質を含む順行性経路、および感覚Ｃ線維からの逆行性線維を含む局所感覚遠心経路が含まれる。
【０００３】
ＣＯＰＤは、普通の呼吸症状であり、西洋では中年における第４の最も主要な普通の死亡原因である。ＣＯＰＤは、気腫および慢性気管支炎の２つの関連する疾患を含み、これは普通同時に生じる。慢性気管支炎の病理学的根拠は、粘液の過剰分泌である。過剰な慢性気管支分泌は、喀痰を引き起こし、そして数日から多年にわたり持続し得る。ＣＯＰＤの粘液過剰分泌により、最大呼吸流が減少しそして努力肺排出が遅くなる、小気道閉塞になる。気管支拡張薬によるＣＯＰＤの損なわれた気道機能がわずかに回復することはあるが、粘液過剰分泌に対する有効な治療は現在のところない。
【０００４】
粘液過剰分泌はまた、喘息の病理生理学に著しく寄与する因子である。これは、喘息持続状態の重要な要因であり、慢性徴候および喘息の罹病率に寄与する。喘息の粘液過剰分泌は、特に、重篤なおよび慢性の症例において、現在の治療では十分に制御されない。
【０００５】
WO95/17904は、種々の病気および関連痛を治療するためのボツリヌス菌ホロ毒素の使用を記載している。特に、発汗、流涙、および粘液分泌を含む副交感神経性制御分泌のような症状を治療する方法が記載されている。
【０００６】
WO97/13410は、複合分子の生物学的活性を改良するためのアミド化結合の使用を記載している。
【０００７】
WO96/33273は、末梢感覚求心性機能を改変し得る、クロストリジウム菌神経毒素成分を含む複合体を記載している。
【０００８】
したがって、これらの病状を引き起こすまたは病状に導く粘液過剰分泌を治療、減少、または防ぐことが望まれている。
【０００９】
したがって、本発明は、粘液分泌細胞による粘液分泌を阻害する工程および／または粘液分泌を制御または指示する神経細胞からの神経伝達物質の放出を阻害する工程を含む、粘液過剰分泌を治療する方法を提供する。第２の局面では、本発明はさらに、粘液過剰分泌の治療における使用ための化合物を提供し、この化合物は、（ｉ）粘液分泌細胞による粘液分泌を阻害すること、または（ｉｉ）粘液分泌を制御または指示する神経細胞からの神経伝達物質の放出を阻害することによって、粘液分泌を阻害する。
【００１０】
本発明の利点は、粘液過剰分泌および関連疾患状態の有効な治療のための薬剤が、ここで提供されおよび使用され、いままでこのような薬剤が利用可能ではなかった罹病者に苦痛の軽減を与えることである。
【００１１】
したがって、本発明は、分泌プロセス、すなわち、粘液分泌細胞による粘液分泌および粘液分泌を調節する神経伝達物質の分泌の一方または他方または両方を阻害することによる、粘液過剰分泌の治療のための新しい異なるアプローチを示す。本発明の薬剤は、粘液過剰分泌を減少させ、および／またはＣＯＰＤおよび喘息、ならびに粘液過剰分泌が原因要素である何らかの他の疾患における過剰分泌を防ぐ。
【００１２】
本発明の化合物は、代表的には、粘液分泌細胞または粘液分泌を制御もしくは指示するニューロンにおけるエキソサイトーシスを阻害する。この化合物は、粘液過剰分泌に罹病している患者に投与され、そして特定の細胞におけるエキソサイトーシスの阻害により、粘液の分泌が減少する。粘液過剰分泌によって引き起こされるまたは悪化する特定の疾患状態は、気道に局在するので、本発明の実施態様は、気道へまたは気道の選択された領域もしくは部位への、粘液分泌細胞におけるエキソサイトーシスまたは粘液分泌を制御もしくは指示するニューロンにおけるエキソサイトーシスを阻害する化合物の局所投与を含む。
【００１３】
本発明の実施態様の化合物は、粘液分泌細胞におけるエキソサイトーシスを阻害するかまたは神経細胞におけるエキソサイトーシスを阻害するかの阻害ドメインからなるかまたは阻害ドメインを含むポリペプチドであり、それによって、粘液または１つ以上の粘液成分のエキソサイトーシスを直接的に阻害するか、あるいは、次に粘液分泌を導くあるいは刺激する神経伝達物質のエキソサイトーシスを阻害することによって粘液分泌を間接的に阻害する。阻害ドメインは、クロストリジウム菌神経毒素の軽鎖、またはエキソサイトーシスを阻害する軽鎖のフラグメントもしくは改変体を適切に含み得る。
【００１４】
化合物は、好ましくは、阻害ドメインを細胞にトランスロケートするトランスロケートドメインをさらに含む。このドメインは、ボツリヌス菌ポリペプチドのＨＮ領域、または阻害ドメインを細胞にトランスロケートするこの領域のフラグメントもしくは改変体を含み得る。
【００１５】
化合物は、好ましくは、（ｉ）粘液分泌細胞、または（ｉｉ）粘液分泌を制御もしくは指示する神経細胞に結合する標的ドメインを含む。したがって、この化合物は、これらの細胞タイプに特異的になる。また、投与経路の選択を通して化合物を標的化することによって達成される、比較的非特異的であるが粘液分泌を阻害する化合物についても適宜用いられる。このような化合物は、好ましくは、気道、特に肺において粘液分泌上皮細胞に投与される。本発明の非特異的化合物は広範なタイプの多くの細胞においてエキソサイトーシスに影響を及ぼし得ると同時に、一般的に、刺激されるこれらの細胞のみが影響を受け、そしてこれらの刺激された細胞は、代表的な病状において、粘液を分泌しそして疾患に寄与している細胞である。
【００１６】
現在のところ、適切な標的ドメインとしては、サブスタンスＰ、ＶＩＰ、β２アドレナリンレセプターアゴニスト、ガストリン放出ペプチド、およびカルシトニン遺伝子関連ペプチドから選択されるドメインが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の好ましい実施態様において標的される細胞は、（ａ）ムチンを分泌する細胞、例えば、上皮杯細胞および粘膜下顆粒粘液分泌細胞、（ｂ）粘液の水性成分を分泌する細胞、例えば、クララ細胞および漿液細胞、および（ｃ）粘液分泌を制御または指示する細胞、例えば、「感覚遠心性」Ｃ線維またはＮＡＮＣ神経系線維から選択される。化合物は、すべて同じ細胞のタイプを標的とする実質的に純粋な調製物として投与され得るか、またはそれぞれ異なる細胞を標的とする化合物の混合物であり得る。
【００１７】
本発明の特定の実施態様の化合物は、第１、第２、および第３のドメインを含む。第１のドメインは、エキソサイトーシスに必須の１つ以上の小胞または形質膜関連タンパク質を切断するように改造される。このドメインは、一旦標的された細胞に送達されると、エキソサイトーシスを防ぐ。第２のドメインは、この化合物を細胞にトランスロケートする。このドメインは、第１のドメインを細胞に送達する。第３のドメインは、標的細胞に結合する。すなわち、（ｉ）粘液分泌細胞、または（ｉｉ）粘液分泌を制御もしくは指示する神経細胞に結合する。第３のドメインは標的部分（「ＴＭ」）といい得る。化合物は、毒素に由来し得、そしてこのような化合物は、クロストリジウム菌神経毒素を含まず、そして毒素に変換され得るどのようなクロストリジウム菌神経毒素前駆体も含まないことが好ましい。ボツリヌス菌および破傷風菌毒素は、本発明の化合物のためのドメインの適切なソースである。
【００１８】
使用において、本発明の特定の実施態様の薬剤は、多くの異なる機能を有する。この薬剤は、粘液の分泌および／またはこの分泌の調節に関与する気道における関連の分泌細胞および／またはニューロンに特徴的なおよびこれらにある程度の特異性を有する表面構造（結合部位｛ＢＳ｝）に結合する。この薬剤は、細胞に侵入し、エンドサイトーシスのプロセスによってこの細胞に結合する。ある細胞表面ＢＳのみがエンドサイトーシスを受け、そして好ましくは、薬剤が結合するＢＳはこれらのうちの１つである。薬剤は、サイトゾルに侵入し、粘液の分泌および／またはこの分泌の調節に関与する気道における関連の分泌細胞および／またはニューロンに存在するエキソサイトーシス機構を改変する。
【００１９】
驚くべきことに、粘液過剰分泌の治療のための本発明の薬剤は、クロストリジウム菌神経毒素またはそのフラグメントを改変することによって作成され得る。クロストリジウム菌神経毒素類は、Ｈ鎖（ＨＣ、約100kDa）を結合およびトランスロケートするレセプターにジスルフィド結合した触媒性Ｌ鎖（ＬＣ、約50kDa）を共通構造として有している。ＨＣポリペプチドは、２つの異なる機能的ドメインのすべてまたは一部を含むと考えられている。ＨＣのカルボキシ末端側の半分（約50kDa）（ＨＣドメインと称する）は、標的ニューロン上の細胞表面レセプターへの高い親和性での神経毒素の神経特異的結合に関連するが、ＨＮドメインと称するアミノ末端側の半分（約50kDa）は、神経毒素の少なくともいくつかの部分の細胞膜を横切るトランスロケーションを媒介し、そのためＬＣの機能的活性が標的細胞内に発現されると考えられる。ＨＮドメインはまた、低ｐＨの条件下で、脂質膜にイオン透過性チャンネルを形成する特性を有し、これは、いくつかの様式で、そのトランスロケーション機能に関連し得る。
【００２０】
ボツリヌス菌神経毒素Ａ型（BoNT/A）について、これらのドメインは、ＨＣについてはアミノ酸残基872〜1296、ＨＮについてはアミノ酸残基449〜871、ＬＣについては残基１〜448にあると考えられる。トリプシンでの切断は、BoNT/AのＨＣドメインを効果的に分解して、もはやニューロンに結合および侵入し得ないＬＨＮと称する非毒性フラグメントを生成する。このように生成されたＬＨＮフラグメントもまた、親ホロ毒素および単離されたＬＣの両方と比較して増強された溶解度の特性を有する。
【００２１】
したがって、神経毒素分子内のドメインの機能的定義は、以下のように提供することができる：
【００２２】
（Ａ）クロストリジウム菌神経毒素軽鎖：
エキソサイトーシスプロセスに関連する小胞および／または形質膜関連タンパク質に高い基質特異性を示すメタロプロテアーゼ。特に、１つ以上のSNAP-25、ＶＡＭＰ（シナプトブレビン／セルブレビン）、およびシンタキシンを切断する。
【００２３】
（Ｂ）クロストリジウム神経毒素重鎖ＨＮドメイン：
軽鎖活性の機能的発現が標的細胞内で生じるように、神経毒素分子の一部のトランスロケーションを可能にする重鎖の一部。
結合ドメインを介する特異的細胞表面レセプターへの神経毒素の結合に続く、標的細胞へのエンドペプチダーゼ活性のトランスロケーションに関与するドメイン。
低ｐＨの条件下で脂質膜にイオン透過性孔の形成に関与するドメイン。
軽鎖単独の溶解度に比較して全体のポリペプチドの溶解度を上昇させることに関与するドメイン。
【００２４】
（Ｃ）クロストリジウム菌神経毒素重鎖ＨＣドメイン。
毒素の細胞へのインターナリゼーションの前に、クロストリジウム菌毒素の中毒作用に関連する細胞表面レセプターへの天然のホロ毒素の結合に関与する、重鎖の一部。
【００２５】
これらの毒素についての細胞認識マーカーの本体は、現在理解されておらず、そして特異的レセプター種は未だ同定されていないが、Kozakiらは、シナプトタグミンが、ボツリヌス菌神経毒素Ｂ型に対するレセプターであり得ることを報告している。おそらく、神経毒素のそれぞれは、異なるレセプターを有する。
【００２６】
Ｈ鎖のＨＣ領域が除去または改変されている、クロストリジウム菌神経毒素、または２つのクロストリジウム菌神経毒素のハイブリッドを、粘液の分泌および／またはこの分泌の調節に関与する気道における関連の分泌細胞および／またはニューロンの表面上のＢＳに結合する、新しい分子または部分（標的部分（ＴＭ））に共有結合することによって、粘液分泌を阻害し得る新規な薬剤が生成される。本発明のさらに驚くべき局面は、クロストリジウム菌神経毒素の軽鎖、またはエンドペプチダーゼ活性を含むＬ鎖のフラグメントが、Ｌ鎖、またはエンドペプチダーゼ活性を含むＬ鎖のフラグメントの、粘液の分泌および／またはこの分泌の調節に関与する気道における関連の分泌細胞および／またはニューロンの細胞質へのインターナリゼーションにも影響を与え得るＴＭに共有結合すれば、これもまた、粘液分泌を阻害し得る新規な薬剤を生成する。
【００２７】
したがって、本発明は、クロストリジウム軽鎖と等価の第１のドメイン、およびクロストリジウム菌毒素重鎖のＨＮの機能的局面を提供するが、クロストリジウム菌毒素のＨＣドメインの機能的局面を欠く第２のドメイン、および標的粘液分泌細胞または粘液分泌制御細胞に結合する第３のドメインを含む化合物を提供し得る。
【００２８】
本発明の目的のために、本発明のポリペプチドの第２のドメインによって示されるべきクロストリジウム菌毒素重鎖のＨＮの機能的特性は、化合物が標的細胞に近づいたとき、第１のドメインを標的細胞へトランスロケーションすることである。ＨＮドメインまたはＨＮドメインの機能に対する以下の参考文献は、この特性についての参考文献である。第２のドメインは、クロストリジウム菌毒素重鎖のＨＮドメインが他の特性を示すことを要求されない。したがって、本発明の第２のドメインは、比較的不溶性であり得るが、天然毒素のトランスロケーション機能を保持し得る−これは、溶解性がその投与に必須ではない場合、または必要な溶解性が、そのドメインおよび１つ以上の他の成分から作られた組成物に対してその１つ以上の他の成分によって与えられる場合の使用のためである。
【００２９】
本発明のポリペプチドは、組換え核酸、好ましくはＤＮＡの発現によって得られ得、そして１つのポリペプチドであり、切断された別々の軽鎖および重鎖ドメインになることをいうわけではない。したがって、ポリペプチドは、組換え技法を使用して便利におよび大量に利用可能である。
【００３０】
第１のドメインは、必要に応じて、クロストリジウム菌毒素軽鎖のフラグメントまたは改変体を含む。フラグメントは、必要に応じて、エキソサイトーシスに必須の小胞または形質膜関連タンパク質を切断する能力を実質的に保持する限り、軽鎖のＮ末端またはＣ末端フラグメントであるか、または内部フラグメントである。クロストリジウム菌毒素の軽鎖の活性に必要なドメインは、J. Biol. Chem., Vol.267, No. 21, 1992年7月、14721-14729頁に記載される。改変体は、軽鎖またはフラグメントとは異なるペプチド配列を有するが、これも小胞または形質膜関連タンパク質を切断し得る。これは、軽鎖またはそのフラグメントの挿入、欠失、および／または置換によって便利に得られる。以下に記載の本発明の実施態様では、改変体配列は、（ｉ）クロストリジウム菌毒素軽鎖またはフラグメントのＮ末端伸長、（ｉｉ）少なくとも１つのアミノ酸の変更によって改変されたクロストリジウム菌毒素軽鎖またはフラグメント、（ｉｉｉ）クロストリジウム菌毒素軽鎖またはフラグメントのＣ末端伸長、または（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）のうちの２つ以上の組み合わせを含む。
【００３１】
以下の実施例に記載の本発明の実施態様では、毒素軽鎖および毒素重鎖の一部は、ボツリヌス菌毒素Ａ型由来である。以下の実施例に記載の本発明のさらなる実施態様では、毒素軽鎖および毒素重鎖の一部は、ボツリヌス菌毒素Ｂ型由来である。ポリペプチドは、１つの毒素タイプの軽鎖またはフラグメントまたは改変体、およびもう１つの毒素タイプの重鎖またはフラグメントまたは改変体を含む。
【００３２】
本発明のポリペプチドにおいて、この第２のドメインは、好ましくは、クロストリジウム菌毒素重鎖ＨＮ部分またはクロストリジウム菌毒素重鎖ＨＮ部分のフラグメントもしくは改変体を含む。フラグメントは、ＨＮドメインの機能を保持する限り、必要に応じて、Ｎ末端またはＣ末端または内部フラグメントである。その機能に関与するＨＮ内の領域の教示は、例えば、Biochemistry 1995, 34, 15175-15181頁およびEur. J. Biochem., 1989, 185, 197-203頁に提供される。改変体は、ＨＮドメインまたはフラグメントとは異なる配列を有するが、これもＨＮドメインの機能を保持する。これはＨＮドメインまたはそのフラグメントの挿入、欠失、および／または置換によって便利に得られる。以下に記載の本発明の実施態様では、これは、（ｉ）ＨＮドメインまたはフラグメントのＮ末端伸長、（ｉｉ）ＨＮドメインまたはフラグメントのＣ末端伸長、（ｉｉｉ）少なくとも１つのアミノ酸の変更によって改変されたＨＮドメインまたはフラグメントへの改変、または（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）のうちの２つ以上の組み合わせを含む。クロストリジウム菌毒素は、好ましくは、ボツリヌス菌毒素または破傷風菌毒素である。
【００３３】
したがって、本発明のこれらのポリペプチドは、代表的には、２つ以上のポリペプチド、第１および第２のドメインを含み、ジスルフィド架橋によって結合して混成分子を形成し、そしてさらに第３のドメインに結合する。。
【００３４】
ＴＭは、気道における粘液の分泌に関与する関連の神経および／または分泌細胞上のＢＳに対する特異性を提供する。薬剤のＴＭ成分は、抗体、モノクローナル抗体、抗体フラグメント（Ｆａｂ、Ｆ(ａｂ)'２、Ｆｖ、ＳｃＦｖなど）、レクチン、ホルモン、サイトカイン、成長因子、またはペプチドを含む（しかしこれらに限定されない）、多くの細胞結合分子の１つを含み得る。
【００３５】
神経毒素分子のＨＣ部分がＨＮとして知られるＨ鎖の他の部分から除去されて、ＨＮフラグメントが神経毒素のＬ鎖にジスルフィド結合したまま残りＬＨＮとして知られるフラグメントを提供し得ることは、当業者に公知である。したがって、本発明の１つの実施態様では、クロストリジウム菌神経毒素のＬＨＮフラグメントは、１つ以上のスペーサー領域を含み得る結合を使用して、ＴＭに共有結合される。
【００３６】
クロストリジウム菌神経毒素のＨＣドメインは、例えば、化学的改変によって、変異または改変されて、神経筋接合部でのレセプターに神経毒素を結合する能力を減少または好ましくは無能化し得る。この改変されたクロストリジウム菌神経毒素は、次いで、１つ以上のスペーサー領域を含み得る結合を使用して、ＴＭに共有結合される。
【００３７】
クロストリジウム菌神経毒素の重鎖は、そのＨＣドメインが、例えば、化学的改変によって、変異または改変されて、神経筋接合部において神経毒素がレセプターに結合する能力を減少または好ましくは無能化されて、異なるクロストリジウム菌神経毒素のＬ鎖と組み合わせられ得る。このハイブリッドの、改変されたクロストリジウム神経毒素は、次いで、１つ以上のスペーサー領域を含み得る結合を使用して、ＴＭに共有結合される。
【００３８】
本発明のもう１つの実施態様では、クロストリジウム菌神経毒素のＨＮドメインは、異なるクロストリジウム菌神経毒素のＬ鎖と組み合わせられる。このハイブリッドのＬＨＮは、次いで、１つ以上のスペーサー領域を含み得る結合を使用して、ＴＭに共有結合される。本発明のさらなる実施態様では、クロストリジウム菌神経毒素の軽鎖、またはエンドペプチダーゼ活性を含む軽鎖のフラグメントは、１つ以上のスペーサー領域を含み得る結合を使用して、粘液の分泌および／またはこの分泌の調節に関与する気道における関連の分泌および／または神経細胞の細胞質へのＬ鎖またはエンドペプチダーゼ活性を含むＬ鎖のフラグメントのインターナリゼーションに影響を与え得るＴＭにも、共有結合される。
【００３９】
薬剤は、必要に応じて、何らかの所望のスペーサー領域の他に、適切なＴＭを含む融合タンパク質として、組換え発現される。組換え発現した薬剤は、神経毒素の１つの血清型をコードする遺伝子に全体的に由来し得るか、または１つ以上の血清型をコードする遺伝子に由来するキメラであり得る。本発明のもう１つの実施態様では、必要とされるＬＨＮは、種々のクロストリジウム菌タイプ由来のＬおよびＨＮのハイブリッドであり得るが、ＴＭとの融合タンパク質として組換え発現され、そして１つ以上のスペーサー領域を含み得る。
【００４０】
クロストリジウム菌神経毒素の軽鎖、またはエンドペプチダーゼ活性を含む軽鎖のフラグメントは、ＴＭとの融合タンパク質として組換え発現され得る。このＴＭは、粘液の分泌および／またはこの分泌の調節に関与する気道における関連の分泌および／または神経細胞の細胞質へのＬ鎖またはエンドペプチダーゼ活性を含むＬ鎖のフラグメントのインターナリゼーションにも影響を与え得る。発現した融合タンパク質はまた、１つ以上のスペーサー領域を含み得る。
【００４１】
本発明に記載の神経毒素フラグメントは、タンパク質の開裂を含む（しかしこれに限定されない）タンパク質技術分野で周知の方法によって、または遺伝子操作方法論によって調製され得る。このフラグメントは、好ましくは、非毒性フラグメントである。複合体は、化学的または共有リンカーを使用する、それ自体化学物質であり得る。本発明の複合体は、当業者に公知の従来の方法によって調製され得る。
【００４２】
第３の局面では、本発明は、粘液過剰分泌の治療に使用するための組成物を提供し、この組成物は、
本発明の第２の局面のいずれかに記載の化合物；および
薬学的に受容可能な賦形剤、アジュバント、および／または噴射剤の少なくとも１つ、を含み、
そして、この組成物は、患者の気道への投与用である。
【００４３】
エアロゾル投与は、好ましい投与経路であるが、本発明には、気道における上皮に化合物を送達するあらゆる投与も含まれる。経鼻投与は任意であるが、頬内は好ましい。したがって、化合物は、エアロゾルまたは噴霧器による経口投与用に、または従来の賦形剤、アジュバント、および／または噴霧剤を使用する吸入用の乾燥粉末として処方され得る。したがって、本発明はさらに、本発明の化合物および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物を提供する。
【００４４】
使用において、化合物は、ヒト用薬学的キャリア、希釈剤、および／または賦形剤とともに薬学的組成物中で用いられるが、組成物の正確な形態は、投与様式に依存する。化合物は、例えば、エアロゾルまたは噴霧可能な溶液の形態で用いられ得る。
【００４５】
以下にさらに詳細に記載される本発明の特定の実施態様では、本発明のポリペプチドは、サブスタンスＰ、およびボツリヌス菌毒素ＡのＬ鎖および重鎖ＨＮ領域を含む。使用において、これは、エアロゾルによって患者に投与され得る。ポリペプチドの溶液は、調製され、そして直径１〜５ミクロンの噴霧された粒子の肺への吸入用の噴霧器を使用して、エアロゾルに変換される。
【００４６】
本発明の化合物の投与のための用量範囲は、所望の治療効果を生じる範囲である。必要な用量範囲は、複合体の正確な性質、投与経路、処方の性質、患者の年齢、患者の症状の性質、範囲、または重篤度、禁忌、およびもしあるならば主治医の判断に依存する。しかし、必要な用量の広い変動は、複合体の正確な性質に依存して予測されるべきである。これらの用量レベルの変動は、当業者に十分に理解されるように、最適化のために標準の経験的ルーチンを使用して調節され得る。
【００４７】
液体単位投与形態は、化合物および発熱物質を含まない滅菌媒体を利用して調製される。化合物は、使用される媒体および濃度に依存して、媒体に溶解または懸濁され得る。溶液の調製において、化合物は、媒体に溶解され得、溶液は、必要ならば塩化ナトリウムの添加によって等張にし、無菌技法を用いて滅菌フィルターによる濾過によって滅菌し、そして適切な滅菌バイアルまたはアンプルに充填および密封する。あるいは、溶液安定性が適切であれば、密封した容器中の溶液は、オートクレーブによって滅菌され得る。好都合に、緩衝化剤、溶解化剤、安定化剤、保存剤もしくは抗菌剤、懸濁化もしくは乳化剤のような添加剤および／または局所麻酔剤は、媒体に溶解され得る。
【００４８】
使用前に適切な媒体に溶解または懸濁される乾燥粉末は、滅菌分野における無菌技法を使用して、滅菌前の薬物物質および他の成分を滅菌容器に充填することによって調製され得る。あるいは、薬物および他の成分は、滅菌分野の無菌技法を使用して適切な容器中に送達され得る。次いで、生成物は凍結乾燥され、そして容器は無菌的に密封される。
【００４９】
呼吸器を介する投与に適切な組成物としては、エアロゾル、噴霧可能な溶液、または吹入用の微細粉末が挙げられる。後者の場合には、５０ミクロン以下、特に１０ミクロン以下の粒子サイズが好ましい。このような組成物は、従来の方法で製造されそして従来の投与デバイスと組み合わせて用いられ得る。
【００５０】
本発明のさらなる局面では、粘液過剰分泌、喘息、またはＣＯＰＤを治療するための医薬品の製造における、粘液分泌細胞または粘液分泌を制御もしくは指示するニューロンにおけるエキソサイトーシスを阻害する化合物の使用が提供される。
【００５１】
本発明は、さらに、薬学的組成物の製造方法を提供し、
クロストリジウム菌神経毒素を得、そして上記毒素のＨＣ部分を除去または無能化するように上記毒素を改変する工程；または
ＨＣ部分が除去または無力化されているクロストリジウム菌神経毒素を得る工程；および
上記毒素を、（ｉ）粘液分泌細胞、または（ｉｉ）粘液分泌を制御もしくは指示する神経細胞に結合する標的部分と連結する工程、
を含む。
【００５２】
本発明はさらに、薬学的組成物の製造方法を提供し、
粘液分泌細胞または粘液分泌を制御もしくは阻害する神経細胞においてエキソサイトーシスを阻害する阻害ドメイン；および
上記阻害ドメインを上記細胞にトランスロケートするトランスロケートドメイン、
を有する第１の成分を得る工程；および
上記第１の成分を、（ｉ）粘液分泌細胞、または（ｉｉ）粘液分泌を制御もしくは指示する神経細胞に結合する第２の成分と連結する工程、
を含む。
【００５３】
第１および第２の成分は、好ましくは、１つ以上の賦形剤、アジュバント、および噴霧剤と組み合わせて、経口投与可能な組成物に処方される。
【００５４】
本発明の特定の実施態様は、ここで、添付の図面を参照して以下の実施例で例示される。
【００５５】
（実施例１：サブスタンスＰ−ＬＨＮ／Ａ複合体の調製方法）
凍結乾燥したペプチドを、0.1％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中で再水和し、最終濃度を１０ｍＭにした。この溶液のアリコートを、使用まで−20℃で保存した。ＬＨＮ／Ａを、ＰＢＳＥ（１mM EDTAを含むＰＢＳ）で脱塩した。得られる溶液（３〜５mg/ml）を、DMSO中10mMのＳＰＤＰのストック溶液の添加によって３または４倍モル過剰のＳＰＤＰと反応させた。室温にて３時間後、PD-10カラム上でＰＢＳＥで脱塩することによって、反応を停止した。
【００５６】
誘導体化したＬＨＮ／Ａの一部を、この溶液から取り出し、そしてＤＴＴで還元した（５mM、30分）。この試料を、280nmおよび343nmで分光学的測定によって分析して、誘導体化の程度を測定した。達成した誘導体化の程度は、代表的には２mol/molであった。
【００５７】
誘導体化したＬＨＮ／ＡのバルクとサブスタンスＰペプチドとを、ペプチドが４倍モル過剰であるような割合で混合した。複合体化反応を、４℃にて16時間以上行った。
【００５８】
生成混合物を遠心分離して、出現したあらゆる沈殿物を浄化した。上清をＰＢＳで平衡化したPD-10カラムにアプライし、そしてタンパク質画分を、ＰＢＳの添加によって溶出した。タンパク質のメインピークの後に溶出したペプチドおよび反応副生成物を捨てた。
【００５９】
複合体混合物を、濃縮器（排除限界分子量10000）による遠心分離によって、１mg/ml以上まで濃縮した。濃縮した複合体混合物を、SDS-PAGEおよびウエスタンブロッティング（抗サブスタンスＰ抗体でプローブした）によって分析して、サブスタンスＰペプチドのＬＨＮ／Ａへの結合を確認した。
【００６０】
サブスタンスＰペプチドをＳＰＤＰリンカーを介してＬＨＮ／Ａと共有結合させる方法が記載される。スルフィドリル残基を、サブスタンスＰ残基のＣ末端に組み込むが、この場合、Ｃｙｓ残基の添加による。別のリンカーが利用可能であり、類似の誘導体化化学を利用するが結合した種間の非還元性共有結合を生じるリンカーが挙げられる。
【００６１】
この特定の実施例に使用したサブスタンスＰペプチド配列は、ＲＰＫＰＱＱＦＦＧＬＭＣであるが、代わりの配列、例えば、Ｎ末端Ｃｙｓを有するサブスタンスＰであるＣＲＰＫＰＱＱＦＦＧＬＭも適切である。
【００６２】
記載した方法は、遊離のＬＨＮ／Ａから複合体を精製するためにどのようなタグ付け系（例えば、ポリＨｉｓ）の使用も行わない。これは、ペプチドのレセプター結合機能を損なわないように、オピオイドペプチドＬＨＮ／Ａの調製のための成功した方法であることを証明している。類似のアプローチは、サブスタンスＰ−ＬＨＮ／Ａの合成に適用され得る。
【００６３】
図１は、実施例１のサブスタンスＰ−ＬＨＮ／Ａ複合体の調製を例示する。図１に示す結果では、示した濃度でのＬＨＮ／ＡおよびサブスタンスＰ−ＬＨＮ／Ａ試料を、ニトロセルロースにアプライし、そしてウサギ抗サブスタンスＰ抗体（上の２列）でプローブした。ＬＨＮ／Ａ（第１列）よりもむしろ複合体（第２列）との交差反応が出現したことは、サブスタンスＰがＬＨＮ／Ａに結合したことを示す。下のコントロール列は、ＬＨＮ／Ａの存在を例示する。
【００６４】
図２は、複合体化したサブスタンスＰ−ＬＨＮ／Ａのウエスタンブロット検出を示す。サブスタンスＰ−ＬＨＮ／Ａ（レーン３）およびＬＨＮ／Ａ（レーン２）の試料を、分子量マーカー（レーン１）とともに電気泳動した。ラット抗サブスタンスＰ抗血清によるサブスタンスＰの検出は、複合体レーンにおいて約１００ｋＤａ分子量のタンパク質を示したが、ＬＨＮ／Ａのみのレーンにはこのようなバンドはなかった。したがって、複合体化したＬＨＮ／Ａは、サブスタンスＰを含む。
【００６５】
（実施例２：広い特異性薬剤の調製のための方法）
ＷＧＡ−ＬＨＮ／Ａの複合体化および精製。ＷＧＡ（リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中10mg/ml）を、周囲温度で１時間、等濃度のＳＰＤＰ（ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中10mM）と反応させた。反応副生成物をＰＢＳでの脱塩によって除去し、ジチオトレイトールを用いて架橋剤を還元した。次いで、チオピリドンおよびＤＴＴを、ＰＢＳでの脱塩によって除去して、ＷＧＡ１モルあたり１モルの−ＳＨが組み込まれた誘導体化ＷＧＡ（ｄＷＧＡ）を得た。
【００６６】
ＰＢＳＥ（１mM EDTAを含むＰＢＳ）中３〜５mg/mlの濃度のＬＨＮ／Ａを、３または４倍モル過剰のＳＰＤＰ（DMSO中10mM）と反応させた。周囲温度にて３時間後、PD-10カラム上ＰＢＳＥで脱塩することによって、反応を停止した。
【００６７】
誘導体化ＷＧＡ（ｄＷＧＡ）および誘導体化したＬＨＮ／Ａ（ｄＬＨＮ／Ａ）を、３：１のモル比で混合した。４℃にて16時間後、混合物を遠心分離して、出現したあらゆる沈殿物を浄化した。上清を限外濾過によって濃縮し、ＦＰＬＣ（登録商標）クロマトグラフィーシステム（Pharmacia）においてSuperoseＴＭ12カラムに適用した。カラムを、ＰＢＳで溶出し、そして（遊離のｄＷＧＡから分離した）高分子量複合体物質を含む画分をプールし、そしてＰＢＳ洗浄したＮ−アセチルグルコサミン−アガロース（GlcNAc-アガロース）にアプライした。ＷＧＡ−ＬＨＮ／Ａ複合体をGlcNAc-アガロースに結合し、そしてＰＢＳ中0.3Ｍ Ｎ−アセチルグルコサミンの添加によってカラムから溶出した。溶出プロファイルは、280nmでフォローし、そして複合体を含む画分をプールし、ＰＢＳに対して透析し、そして使用まで４℃にて保存した。
【００６８】
図３は、ＷＧＡ−ＬＨＮ／Ａ精製スキームのSDS-PAGE分析を示す。タンパク質画分を、４〜20％ポリアクリルアミドSDS-PAGEにかけ、クーマシーブルーで染色した。レーン６〜８を、0.1Ｍ DTTの存在下で流した。レーン１（および７）および２（および８）は、それぞれ誘導体化したＷＧＡおよび誘導体化したＬＨＮ／Ａを表す。レーン３〜５は、それぞれ複合体混合物、Superose-12クロマトグラフィー後、およびGlcNAc-アフィニティークロマトグラフィー後を表す。レーン６は、還元した最終物質を表す。概算分子量（ｋＤａ）を、図に示す。
【００６９】
（実施例３:神経培養物の調製および維持ならびに神経伝達物質放出の阻害）
ＰＣ１２細胞を、懸濁液中で増殖したストックから、２４ウェル（マトリゲルコートした）プレート（NUNCＴＭ）上に４×10５細胞／ウェルの密度で接種した。細胞を、ＲＰＭＩ、10％ウマ血清、５％ウシ胎児血清、１％ Ｌ−グルタミン中で、使用前に１週間培養した。SH-SY5Y細胞を、２４ウェルプレート（FALCONＴＭ）上に５×10５細胞／ウェルの密度で接種した。細胞を、使用前に１週間、HAM-F12:MEM（1:1 v/v）、15％ウシ胎児血清、１％ MEM非必須アミノ酸、２mM Ｌ−グルタミン中で培養した。胚脊髄（ｅＳＣ）ニューロンを、14〜15日齢胎児Sprague Dawleyラットから切除した脊髄から調製し、そして既述の方法を改変して使用して21日間培養後に使用した。
【００７０】
神経伝達物質放出の阻害。ＰＣ１２細胞またはSH-SY5Y細胞を、平衡塩類溶液（ＢＳＳ:137mM NaCl、5mM KCl、2mM CaCl２、4.2mM NaHCO３、1.2mM MgCl２、0.44mM KH２PO４、5mM グルコース、20mM HEPES、pH 7.4）で洗浄し、そして0.2mM アスコルビン酸および0.2mM パルギリンを含むＢＳＳ中[３Ｈ]-ノルアドレナリン（２μCi/ml、0.5ml/ウェル）を１時間負荷した。細胞を、４回洗浄し（15分間隔で１時間）、次いで基礎放出を、ＢＳＳ（5mM Ｋ＋）との５分インキュベーションによって測定した。次いで、細胞を、100mM Ｋ＋（適宜減少したＮａ＋を有するＢＳＳ）で５分間減極し、刺激された放出を測定した。反応液（superfusate、0.5ml）を、氷上のチューブに移し、そして簡単に遠心分離して、すべての剥離した細胞をペレットにした。付着細胞を、２Ｍ酢酸／0.1％トリフルオロ酢酸（250μl/ウェル）で可溶化した。放出および非放出放射標識の量を、それぞれ澄明にした反応液（superfusate）および細胞ライセートの液体シンチレーションカウントによって測定した。総取り込みを、放出および保持された放射活性の和で求め、そして放出割合を算出した（（放出されたカウント／総取り込みカウント）×100）。
【００７１】
ｅＳＣニューロンに、30分間、[３Ｈ]-グリシンを負荷した後、伝達物質の基礎およびカリウム刺激放出の測定を行った。0.2M NaOHで溶解した細胞の試料を使用して、総カウントを測定し、これから放出％を算出した。
【００７２】
図４〜６は、培養した神経細胞からの神経伝達物質放出の阻害を示す。ＷＧＡ−ＬＨＮ／Ａ（黒印）およびＬＨＮ／Ａ（白印）のある範囲の濃度に３日間曝露したＰＣ１２（図４）、SH-SY5Y細胞（図５）、およびｅＳＣニューロン（図６）を、刺激した[３Ｈ]-ノルアドレナリン放出（SH-SY5YおよびＰＣ１２細胞）または[３Ｈ]-グリシン放出（ｅＳＣ）能力について評価した。結果を、未処理コントロールと比較した阻害の割合で表す。各濃度を、３つ組で評価した。各細胞タイプについて、用量応答曲線は、少なくとも３つの実験を示す。示される各点は、少なくとも３つの測定値の平均±平均のＳＥである。
【００７３】
図７は、ｅＤＲＧサブスタンスＰのＷＧＡ−ＬＨＮ／Ａ阻害およびｅＳＣ[３Ｈ]-グリシン放出の用量応答曲線を示す。細胞を３日間複合体に曝露した。代表的な曲線を示す。平均ＩＣ５０ｅＤＲＧ：0.32±0.05μg/ml（ｎ＝４）、ｅＳＣ：0.06±0.01μg/ml（ｎ＝３）。
【００７４】
本発明に記載した薬剤は、ＣＯＰＤおよび喘息を含む粘液過剰分泌に関連する症状の治療のために、直接的にまたは薬学的に受容可能な塩としてのいずれかで、インビボで使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【図１】  実施例１のサブスタンスＰ−ＬＨＮ／Ａ複合体の調製を例示する図である。
【図２】  複合体化したサブスタンスＰ−ＬＨＮ／Ａのウエスタンブロット検出を示す図である。
【図３】  ＷＧＡ−ＬＨＮ／Ａ精製スキームのSDS-PAGE分析を示す図である。
【図４】  培養した神経細胞からの神経伝達物質放出の阻害を示すグラフである。
【図５】  培養した神経細胞からの神経伝達物質放出の阻害を示すグラフである。
【図６】  培養した神経細胞からの神経伝達物質放出の阻害を示すグラフである。
【図７】  ＷＧＡ−ＬＨＮ／ＡがｅＤＲＧニューロンからの放出を阻害するが、ｅＤＲＧニューロンに対する特異性を有さないことを示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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