(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シクロヘキシミドを含有する培地を用いることを特徴とする、未成熟卵子の室温かつ大気中における保存及び／又は輸送方法。
【請求項２】
前記培地のシクロヘキシミド含有量が１〜１００μｇ／ｍｌである、請求項１記載の未成熟卵子の室温かつ大気中における保存及び／又は輸送方法。
【請求項３】
シクロヘキシミドを１〜１００μｇ／ｍｌ含有することを特徴とする、未成熟卵子の室温かつ大気中における保存及び／又は輸送用培地。
【請求項４】
シクロヘキシミドを１〜１００μｇ／ｍｌ含有した培地を導入した、未成熟卵子の室温かつ大気中における保存及び／又は輸送用ストロー。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、タンパク合成阻害剤、特にシクロヘキシミドを含有する培地を用いることを特徴とする、未成熟卵子の保存及び／又は輸送方法、及びそれに用いる未成熟卵子の保存及び／又は輸送用培地に関する。
【０００２】
【従来の技術】
家畜の繁殖技術において、体外受精・核移植といった繁殖効率を向上させるために用いられている技術に必須の材料である卵子は、屠体卵巣あるいはウシ生体より採取した後、直ぐに体外成熟培養を行わないとその生存性あるいは受精能力あるいは活性化能力を保持できなくなる。また、一度に採取できる卵子数も限られている。従来は、採卵した卵子がその生存性を低下させることから、採卵後直ちに適切な条件下で操作し、温度・気相調節機能の付いたインキュベ−タ−内で培養することによって、その後正常に発生する能力を維持している。特にウシ生体から卵子を採取する場合、適切な条件下で卵子を操作できる環境にウシを搬入し、そこで飼養し、採卵し、直ちに温度・気相調節機能の付いたインキュベーター内で培養することによって、初めて正常に発生する能力を有する卵子の取得が可能であった。しかし、ウシの健康上の問題で輸送できない場合や、また輸送できたとしてもそのコストあるいは労力の面から、採卵の実施は大きく制約されているのが実状である。従って、このような成熟卵子ではなく、卵胞より取り出された未成熟卵子の輸送・保存が可能になれば、体外受精・核移植技術を用いたウシ胚、産子生産がより拡大すると考えられる。このような状況下、ウシ受精卵の輸送・保存に大きな効果を発揮している超低温保存法を用いて未成熟卵を輸送・保存しようとする試みがなされているが、未成熟卵子の超低温保存後の生存性あるいは体外成熟後のその後の生存性が著しく低下することが既に報告されている（Martino et al., Mol. Reprod. Dev., 45, 503-512 (1994); Schellander et al., Theriogenology, 42, 909-915 (1994); Hochi et al., J. Mamm. Ova. Res., 14, 61-65 (1997) ）。その原因の一つとして、冷却時の未成熟卵子の細胞膜崩壊に起因していることが考えられている（Arave et al., Cryobiology, 33, 589-599 (1994); Didion et al., J. Anim. Sci., 68, 2803-2810 (1990) ）。一方、タンパク合成阻害剤であるCycloheximide あるいはserine/threonine proteine kinase阻害剤である6-dimethylaminopurine 等を用い５％CO2 in airに調整されたインキュベ−タ−内で未成熟卵子を24時間保存できることが知られている(Saeki et al., 1997)。しかしながら、未成熟卵子を輸送する際、インキュベ−タ−も同時に輸送せねばならず、商業的に利用し得る技術になっていない。このように、現在までに未成熟卵子の保存あるいは輸送の方法については、効果的な方法が知られていないというのが現状である。現在のところ、未成熟卵子の保存及び／又は輸送は、インキュベーターを用いて３９℃、飽和湿度、５％ＣＯ2 及び９５％空気の気相下で行われなければならないと考えられていた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
上述の状況に鑑み、本発明者らは鋭意研究の結果、シクロヘキシミドに代表されるタンパク合成阻害剤を含有する培地を用いることにより、採取した未成熟卵子を室温条件で、かつ大気中で長時間保存及び／又は輸送できることを見出した。従って本発明は、シクロヘキシミドに代表されるタンパク合成阻害剤を含有する培地を用いることを特徴とする、未成熟卵子の保存及び／又は輸送方法、及びそれに用いる未成熟卵子の保存及び／又は輸送用培地を提供することを課題とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、タンパク合成阻害剤、特にシクロヘキシミドを含有する培地を用いることを特徴とする、室温かつ大気中での未成熟卵子の保存及び／又は輸送方法に関する。又、未成熟卵子を保存及び／又は輸送する際に用いる、シクロヘキシミドを含有することを特徴とする未成熟卵子の保存及び／又は輸送用培地に関する。本発明により、採取した未成熟卵子を室温かつ大気中で保存及び／又は輸送する方法が提供され、体外受精あるいは核移植による産子作出のための、効率的な未成熟卵子の供給方法として有用である。尚、本発明でいう大気中とは、常圧下での空気中を意味し、通常の空気の組成を有するものであっても良い。また未成熟卵子とは正常に成育した状態に達していない卵子を全て意味し、卵子中の卵母細胞が減数分裂した細胞から排卵直前の卵細胞に至る全ての段階の細胞を意味する。
【０００５】
【発明の実施の形態】
本発明は、室温かつ大気中でタンパク合成阻害剤、特にシクロヘキシミドを含有する培地を用いることを特徴とする、未成熟卵子の保存及び／又は輸送方法に関する。また体外成熟後、体外受精あるいは核移植を行い産子を効率的に作出する際に用いる、シクロヘキシミドを含有することを特徴とする未成熟卵子の保存及び／又は輸送用培地に関する。シクロヘキシミドは、培地に対して 1〜100 μg/ml、特に好ましくは１０μg/ml含有する。また、採卵後の未成熟卵子の保存あるいは輸送時の温度は室温（０〜４０℃）でよいが、好ましくは１６〜４０℃、特に好ましくは２０℃前後がよい。培地は、通常卵子の培養に用いられるものであれば特に限定されないが、好ましくは修正合成卵管液（mSOF; Takahashi and First, Theriogenology, 37, 963-978(1992)を用いる。代表的なmSOFの組成を表１に示す。この培地に、さらに血清及び／又はホルモンなどを加える。この時、加える血清あるいはホルモンは特に限定されないが、血清としては子ウシ血清、ホルモンとしては濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）及び１７β−エストラジオールが特に好ましい。又、HEPES などの緩衝剤を用いて培地のpHを7.4 に調整するのが好ましい。尚、HEPES を緩衝剤として用いたときには、炭酸ナトリウムは除いて培地を調製するのが好ましい。本発明方法により、室温かつ大気中での未受精卵子の保存及び／又は輸送が４８時間以内、好ましくは２４時間以内で可能となる。本方法は、特に好ましくはウシの体外受精・核移植に用いるものであるが、他の哺乳動物にも応用できる。
【０００６】
【表１】
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【０００７】
さらに、より簡便に未成熟卵子を輸送するために、未成熟卵子を市販のプラスティックストロ−に封入することも可能である。この際、複数の未成熟卵子を一緒に充填してもよいが、特に好ましくは１個の未成熟卵子を１０μl の培地とともにストロ−に充填する。また、間に気相を挟むことにより、一本のストロ−に１０個程度の未成熟卵子を封入することができる（図１参照）。
【０００８】
【実施例】
以下の実施例及び試験例をもって本発明をより詳細に説明するが、これらは単に例示するのみであり、これらによって本発明は何ら限定されるものではない。
【０００９】
【実施例１】
本発明培地の製造
表１の組成に従い、ｍＳＯＦを作製した。塩化カルシウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、リン酸カルシウム、塩化ナトリウム、炭酸ナトリウムの溶液を作製し、その溶液にBME essential amino acids （B6766, Sigma社）、MEM non essential amino acids （M7145, Sigma社）、グルタミン（G1517, Sigma社）、炭酸ナトリウム、D-グルコース（関東化学社）、ピルビン酸ナトリウム（ナカライテスク社）、ポリビニルアルコール（P8136, Sigma社）、 antibiotic-mycotic solution（Gibco 社）を添加・溶解し、さらに10μg/mlシクロヘキシミド(CHX)  (Sigma 社) 、10％子ウシ血清 (Gibco 社) 、FSH （デンカ製薬社）、及び17β−エストラジオール（Sigma 社) を加え溶解し、25mM HEPES (同仁化学研究所社）で緩衝し溶液のｐＨを７．４に調整し、本発明培地とした。
【００１０】
【試験例１】
ウシ未成熟卵子の体外受精後の移植可能胚への発育能
実施例１で作製した本発明培地５０μl を入れたシャーレ中に、屠体卵巣より採取した卵丘細胞卵子複合体１０個を導入し、大気中で２０℃、２４時間保存することによって、ウシ未成熟卵子を保存（卵核胞崩壊を抑制）した。次いで通常の培地に戻して抑制状態から開放し、保存した未成熟卵子を抑制状態から開放し、常法によりそれらの未成熟卵子を体外成熟させた後体外受精を行った。体外受精した卵子を７又は８日間培養し、胚（胚盤胞）への発育能を調べた。又、屠体卵巣より採取し、すぐに体外成熟培養を開始した卵子（無処置群）、及び３９℃、飽和湿度、５％ＣＯ2 及び９５％空気の気相中で、本発明培地を用いて２４時間保存したウシ卵子を、それぞれ対照として発育能を比較した。実験は１回につき２０個の未成熟卵子を培養し、５回繰り返した。結果を表２に示す。この結果、本発明の保存方法により、それぞれの対照群と比較して高い発育能が得られた。即ち、本発明方法により従来不可能であった未成熟卵子の室温下、大気中での保存が可能となることが明らかとなった。
【００１１】
【表２】
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【００１２】
【試験例２】
ストロ−中で卵核胞崩壊を抑制した場合の移植可能胚への発育能
実施例１と同様に、本発明培地を培養液として、プラスティックストロ−内に屠体卵巣より採取した卵丘細胞卵子複合体を培養液１０μl に対し１個導入し、大気中で２０℃、２４時間未成熟卵子を保存（卵核胞崩壊を抑制）した。この際、１本のストロ−中に１０個の未成熟卵子（１卵子／１０μl ）を導入した。次いで通常の培地に戻して抑制状態から開放し、それらの未成熟卵子を体外成熟させた後体外受精を行った。体外受精した卵子を７又は８日間培養し、胚への発育能を調べた。また、本発明培地５０μl を入れたシャーレ中に、屠体卵巣より採取した卵丘細胞卵子複合体１０個を取り、大気中で２０℃、２４時間保存した未成熟卵子を対照とした。実験は１回、２０個の卵子を培養し、５回繰り返した。結果を表３に示す。この結果、ストロ−中でも、シャーレ中での保存と同等の移植可能胚への発育能が得られた。
【００１３】
【表３】
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【００１４】
【試験例３】
ウシ胎子への発育能
実施例２と同様に、本発明培地を基礎培養液として、ストロ−内の１０μl 中に屠体卵巣より採取した卵丘細胞卵子複合体１個を導入し、大気中で２０℃、２４時間保存（卵核胞崩壊を抑制）した。次いで通常の培地に戻して抑制状態から開放し、それらの未成熟卵子を体外成熟させた後体外受精を行い、培養した胚５個を５頭の受胚ウシに移植し、移植後３１日目に妊娠鑑定を行った。結果を表４に示す。この結果、３頭の受胎が確認された。この結果は従来の方法と全く変わらない結果であり、また受胎後の成育にも全く影響が無かった。
【００１５】
【表４】
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【００１６】
【発明の効果】
本発明により、採取した未成熟卵子を室温かつ大気中で保存及び／又は輸送する方法が提供される。本発明方法は、体外受精あるいは核移植による、効率的な産子作出方法として有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】  プラスティックストローを用いた未成熟卵子の保存及び／又は輸送方法を示す。
【図１】
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