(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）抗体産生細胞集団を提供すること、
ｂ）前記抗体産生細胞集団を選択した抗原及び標識抗抗体抗体と共にインキュベートすることであって、前記抗抗体抗体は前記選択した抗原に結合する抗体を産生する細胞とそうでない細胞とを区別することができること、
ｃ）前記選択した抗原に結合する抗体を産生することができる抗体産生細胞を同定すること、及び
ｄ）工程ｃ）で同定された抗体産生細胞を顕微操作技術を使用して単離すること
を含む、選択した抗原に結合する抗体を産生する抗体産生細胞を同定するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ均一系アッセイ。
【請求項２】
赤血球に前記抗原を結合させる請求項１に記載のアッセイ。
【請求項３】
ビーズに前記抗原を結合させる請求項１に記載のアッセイ。
【請求項４】
ポリクローナル抗体を介して前記抗原をビーズに結合させる請求項３に記載のアッセイ。
【請求項５】
前記ポリクローナル抗体が抗体断片である請求項４に記載のアッセイ。
【請求項６】
前記ポリクローナル抗体は、抗体Ｆａｂ、Ｆａｂ’又はＦ（ａｂ’）２断片である請求項５に記載のアッセイ。
【請求項７】
前記抗原を細胞の表面上に発現させる請求項１に記載のアッセイ。
【請求項８】
前記細胞はトランスフェクト細胞である請求項７に記載のアッセイ。
【請求項９】
前記細胞は腫瘍細胞である請求項７に記載のアッセイ。
【請求項１０】
前記抗原は感染因子である請求項１〜９のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項１１】
前記標識抗抗体抗体は抗Ｆｃ抗体である請求項１〜１０のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項１２】
前記標識抗抗体抗体は蛍光複合体で標識してある請求項１〜１１のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項１３】
前記蛍光標識抗抗体抗体はＦＩＴＣで標識してある請求項１２に記載のアッセイ。
【請求項１４】
前記ＦＩＴＣ標識抗抗体抗体は抗Ｆｃ抗体である請求項１３に記載のアッセイ。
【請求項１５】
前記抗体産生細胞は、Ｂ細胞、血漿細胞、形質芽細胞、活性化Ｂ細胞又は記憶Ｂ細胞である請求項１〜１４のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項１６】
前記抗体産生細胞は抗体を発現するように操作されたハイブリドーマ細胞又は哺乳類細胞である請求項１〜１５のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項１７】
ａ）抗体産生細胞集団を提供すること、
ｂ）前記抗体産生細胞集団を選択した抗原及び標識抗抗体抗体と共にインキュベートすることであって、前記抗抗体抗体は前記選択した抗原に結合する抗体を産生する細胞とそうでない細胞とを区別することができること、
ｃ）前記選択した抗原に結合する抗体を産生する抗体産生細胞を同定すること、
ｄ）前記同定した抗体産生細胞を顕微操作技術を使用して単離すること、及び、
ｅ）抗体又はそれらの抗体断片を合成すること
を含む、選択した抗原に結合する抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ産生方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般的に、改善された抗体産生法に関し、より具体的には抗体を得るための均一系アッセイを提供する。
【背景技術】
【０００２】
モノクローナル抗体を作製するための選択的リンパ球抗体法（ＳＬＡＭ）は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける免疫応答中に生じる高親和性抗体を任意の種から単離することを可能にすることによって、ハイブリドーマ技術及び細菌発現抗体のライブラリー両者の限界を克服する（Ｂａｂｃｏｏｋ他、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、９３、７８４３〜７８４８）。ＳＬＡＭによって、目的とする特異性又は機能を備えた１種類の抗体を産生する１個のリンパ球を大きなリンパ球集団から同定することが可能で、その抗体の特異性をコード化する遺伝情報をそのリンパ球から取り出すことも可能である。選択した抗原に結合する抗体を産生する抗体産生細胞は、適合溶血プラークアッセイを使用して検出する（Ｊｅｒｎｅ  ａｎｄ  Ｎｏｒｄｉｎ、１９６３、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１４０、４０５）。このアッセイでは、赤血球を選択抗原でコーティングし、抗体産生細胞集団及び補体源と共にインキュベートする。単一の抗体産生細胞を、溶血プラーク形成によって同定する。溶解した赤血球のプラークは、倒立顕微鏡を使用して同定し、目的の単一の抗体産生細胞は、プラークの中心で顕微操作技術を使用して取り出し、該細胞の抗体遺伝子は逆転写ＰＣＲによってクローニングする。所望する機能を備えた単一の抗体産生細胞のその他の検出方法は、国際特許明細書、ＷＯ９２／０２５５１に既に記載されている。
【０００３】
前述の溶血プラークアッセイにおいては一般的に、抗体をビオチン化する必要があるビオチン／ストレプトアビジン結合系によって赤血球を抗体でコーティングする。したがって、この方法は、純粋な形態で入手できる抗体及び抗原決定基の提示に影響を及ぼさずにビオチン化することができる抗体に限定される。この方法では、広範囲の抗体に対する抗体の単離は明らかに不可能である。たとえば、多くの蛋白質、特にＩＩＩ型蛋白質などの細胞表面発現蛋白質を精製することは困難である。多くの蛋白質は、たとえば活性部位にリジン基を含有する蛋白質は、ビオチン化によって所望する抗原決定基の立体構造及び提示が変更されてしまう。
【０００４】
未知の抗原、たとえば、腫瘍細胞などの細胞表面に発現する蛋白質に対する抗体の産生が所望されることもまたあり得る。抗体産生細胞を含有するプラークを同定するために細胞溶解を起こさせる必要があることを考慮すると、プラークアッセイにおいて抗原コーティング赤血球の代わりに腫瘍細胞を直接使用することは、実現困難である。細胞溶解は細胞の種類、抗原及び抗体濃度に左右される。所望する抗原でコーティングされた赤血球細胞は、大量の使用可能な抗体と結合し、補体が存在すれば容易に溶解する。腫瘍細胞などのその他の細胞は、表面抗原の利用性が非常に低く、したがって抗体結合が非常に少ないときは特に、容易には溶解しない。
【０００５】
本発明は、改善された抗体産生方法を提供することによって、具体的には抗体を得るための均一系アッセイを提供することによって、これらの問題に対処する。この改善されたアッセイは、前述の方法よりも多くの利点を備えており、未知の抗原、細胞表面抗原及び所望する抗原決定基の提示を変更せずにビオチン化することができない抗原を含めたいかなる抗原とも結合する抗体の同定を可能にする。結果として、従来のプラークアッセイでは今まで同定できなかった結合特異性を備えた抗体を産生することが今ではできるようになった。さらに、該アッセイは赤血球プラークアッセイよりも手軽で、抗体産生細胞をより迅速に同定することができる。
【０００６】
本発明者らは、抗体産生細胞によって産生した抗体に結合する標識抗体の存在下で、抗体産生細胞集団を抗原源と共にインキュベートすることによって、抗原に結合する抗体を産生する抗体産生細胞を得ることが可能であることを示した。驚くべきことに、未結合標識を除去する洗浄段階を必要とせずに、抗原に結合する抗体を産生する細胞をそうでない細胞と区別することが可能である。
【０００７】
したがって、本発明では、
ａ）抗体産生細胞集団を提供すること、
ｂ）前記抗体産生細胞集団を選択した抗原及び標識抗抗体抗体と共にインキュベートすることであって、前記抗抗体抗体は前記選択した抗原に結合する抗体を産生する細胞とそうでない細胞とを区別することができること、及び
ｃ）前記選択した抗原に結合する抗体を産生する抗体産生細胞を同定すること
を含む、選択した抗原に結合する抗体を産生する抗体産生細胞を同定するための均一系アッセイを提供する。
【０００８】
本明細書では、「抗体」という用語には、組換えによって、又は天然に生じたＩｇＧ型の構成要素、たとえばＩｇＧ１などの免疫グロブリン分子が含まれ、任意の抗原結合免疫グロブリン断片、たとえば、Ｆｖ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２断片、及び任意のそれらの誘導体、たとえば１本鎖Ｆｖ断片もまた含まれる。
【０００９】
本明細書では、「抗体産生細胞」という用語は、Ｂリンパ球、血漿細胞、形質芽細胞、活性化Ｂ細胞又は記憶Ｂ細胞などの抗体を分泌することができる任意の細胞を意味する。本発明で使用するための抗体産生細胞は、抗原で免疫した動物か、又は疾患の結果として抗原に対する免疫応答が生じた動物から得ることができる。本発明で使用するためのその他の抗体産生細胞には、任意の形質転換細胞、特に免疫グロブリン遺伝子又はその一部を発現する哺乳類細胞を含めることができる。一例としては、本発明で使用するための抗体産生細胞集団は、異なる結合特異性を備えた様々な抗体を産生する。
【００１０】
本発明のアッセイはまた、いずれも同じ抗体を産生する抗体産生細胞集団から高収率で抗体を産生する細胞を同定するのに使用できる。本明細書では、「高収率」という用語は、特異性が既知である抗体を産生するが、そのために最も効率的に抗体を産生する細胞を同定することが望ましい抗体産生細胞のことである。高収率細胞を同定することによって、細胞を単離して、クローニングによって再生産することが可能である。一例では、高収率抗体産生細胞はハイブリドーマ細胞である。他の例では、高収率抗体産生細胞は形質転換細胞、特に免疫グロブリン遺伝子又はその一部を発現する哺乳類細胞である。このような哺乳類細胞の例には、ＮＳ０、ＣＨＯ、ＣＯＳ及び２９３細胞が含まれるが、これだけには限定されない。
【００１１】
本明細書では、「抗原」という用語は、蛋白質、糖蛋白質及び炭水化物を含めた抗体によって認識され得る既知の、又は未知の物質を意味する。好ましくは、これらの抗原には、生物学的に活性のある蛋白質、たとえば、ホルモン、サイトカイン、それらの細胞表面受容体、細菌又は寄生虫の細胞膜又はそれらの精製成分、及びウイルス抗原が含まれる。一例では、該抗原は天然材料から直接精製することによって、又は組換え発現及び前記抗原の精製によって得られた純粋な形態で利用することができる。精製した抗原は、アッセイに組み込むために赤血球又はビーズなどのその他任意の粒子に結合させることが好ましい。他の例では、該抗原は精製が困難なものであり、このような抗原には受容体、特にＩＩＩ型蛋白質などの細胞表面発現蛋白質が含まれるがそれだけには限定されない。他の例では、抗原上への所望する抗原決定基の提示は、ビオチン化のときに変更され、これらには活性領域にリジンを含有する蛋白質が含まれるがそれだけには限定されない。他の例では、該抗原は細胞表面上に天然に、又は組換えによって発現することができる。このような細胞には、哺乳類細胞、免疫調節細胞、リンパ球、単球、多形細胞、Ｔ細胞、腫瘍細胞、酵母細胞、細菌細胞、感染因子、寄生虫、植物細胞、ＮＳ０、ＣＨＯ、ＣＯＳ、２９３細胞などのトランスフェクト細胞が含まれるがこれだけには限定されない。一例では、前記細胞の表面上で発現した抗原は、精製が困難な抗原又は前述した抗原のようにビオチン化のときに所望する抗原決定基が失われる抗原である。
【００１２】
他の例では、抗原は抗体を単離するために望ましい１個の細胞又は細胞集団であり、たとえば、哺乳類細胞、免疫調節細胞、リンパ球、単球、多形細胞、Ｔ細胞、腫瘍細胞、酵母細胞、細菌細胞、感染因子、寄生虫、植物細胞である。一実施形態では、該細胞は腫瘍細胞である。
【００１３】
本明細書では、「均一系アッセイ」という用語は、アッセイの構成成分全てを一緒にして未結合の標識抗抗体抗体を除去する必要なく抗体産生細胞を同定するアッセイのことである。「標識抗抗体抗体」という用語は、抗体の結合特異性に関係なく、抗体産生細胞によって産生された抗体の任意領域に結合する標識抗体のことである。前記抗抗体抗体はある種から得、一方該抗体産生細胞は他の種から得ることが好ましい。これらの抗体は、抗体産生細胞によって産生された抗体のＦｃ部分に結合することが好ましい。
【００１４】
該標識抗抗体抗体は、選択抗原に結合する抗体を産生する細胞をそうでない細胞と区別することができる。適切な標識は当業界では周知で、化学ルミネセンス、酵素及び蛍光標識が含まれるがこれだけには限定されない。好ましい標識は蛍光標識である。抗抗体抗体に結合させる蛍光標識は、任意の蛍光標識であることが可能で、Ａｑｕａ、テキサスレッド、ＦＩＴＣ、ローダミン、ローダミン誘導体、フルオレセイン、フルオレセイン誘導体、ｃａｓｃａｄｅ  ｂｌｕｅ、Ｃｙ５及びフィコエリトリンが含まれるがそれだけには限定されない。好ましい蛍光複合体はＦＩＴＣである。したがって、本発明によるアッセイの具体的な一例では、抗体産生細胞はウサギから得られ、標識抗抗体抗体は蛍光標識ヤギ抗ウサギ抗Ｆｃ抗体である。
【００１５】
本発明のアッセイでは、選択抗原に結合する抗体を産生する抗体産生細胞は、前記細胞を取り囲む標識抗抗体抗体の濃度の増加を検出することによって、そうでない細胞から区別される。これは、標識抗抗体抗体、したがって前記抗体によって取り囲まれた抗体産生細胞を視覚化することによって実現することが好ましい。一例では、顕微鏡を使用して実現する。該標識は、水銀蒸気紫外線ランプ及び使用した複合体に適したフィルター装置を備えた倒立顕微鏡を使用して検出することが好ましい。好ましいフィルター装置は、フルオレセインフィルター装置である。したがって、一例では、概標識が蛍光標識であれば、選択抗原に結合する抗体を産生する抗体産生細胞は、前記細胞を取り囲む蛍光の増加の位置を特定することによって同定される。
【００１６】
本発明はまた、
ａ）抗体産生細胞集団を提供すること、
ｂ）前記抗体産生細胞集団を選択した抗原及び標識抗抗体抗体と共にインキュベートすることであって、前記抗抗体抗体は選択した抗原に結合する抗体を産生する細胞とそうでない細胞とを区別することができること、
ｃ）選択した抗原に結合する抗体を産生する抗体産生細胞を同定すること、
ｄ）抗体産生細胞を単離して同定すること、及び場合によっては、
ｅ）それらから得られた抗体を合成すること
を含む選択した抗原に結合する抗体の産生方法を提供する。所望するならば、工程（ｄ）及び（ｅ）を複数回繰り返して、複数の抗体産生細胞を単離し、複数の抗体を合成することができる。したがって、本発明は、前記の方法によって同定された少なくとも一種類の抗体産生細胞及び前記細胞から合成された少なくとも一種類の抗体にも適用される。
【００１７】
本明細書で説明した均一系アッセイを使用して同定した抗体産生細胞は、当業界で周知の顕微操作技術を使用してアッセイから直接単離する。
【００１８】
抗体は、単離した抗体産生細胞から直接的に、又は間接的に合成することができる。直接的合成は、単離した抗体産生細胞を適切な培地で培養することによって実現することができる。間接的合成は、該抗体をコード化する遺伝子又はその一部を単離し、当業界で周知の方法を使用して宿主細胞で発現させることによって実現することができる。抗体遺伝子を含有するベクターを宿主細胞にトランスフェクトし、所望する特異性を備えた抗体又は抗体断片を宿主細胞で産生させるように該宿主細胞は適切な培地中で培養する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明で使用するための抗体産生細胞は、選択抗原で免疫したか、又は疾患の結果として抗原に対する免疫応答が生じた動物を含む適切な原料から得ることができる。
【００２０】
免疫応答を引き起こすために適切な当業界で周知の技術のいずれかを使用して、動物を選択した抗原で免疫することができる（「実験免疫学のハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」、Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ（著）、Ｖｏｌ  ４、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ、１９８６を参照のこと）。抗体産生細胞を得るために、ヒト、ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ウシ又はブタなどの多くの温血動物を免疫することができる。しかし、一般にはマウス、ウサギ及びラットが好ましい。
【００２１】
多数の抗体産生細胞は、免疫した動物の脾臓及びリンパ節に見いだすことができ、一旦免疫応答が生じたら、動物を犠牲にし、リンパ節を取り出す。抗体産生細胞の単一細胞懸濁液は、当業界で周知の技術を使用して調製する。抗体産生細胞はまた、疾患の最中に該細胞を産生する動物から得ることができる。たとえば、原因不明の疾患、たとえば癌に罹患したヒトから得られた抗体産生細胞を入手して、該疾患過程に影響を及ぼすか、又は該疾患の原因に関係する因子又は体成分の同定を導くことができる抗体の同定を促進するために使用することができる。同様に、抗体産生細胞は、原因不明の疾患、たとえばマラリア又はＡＩＤＳに罹患した患者から得ることができる。これらの抗体産生細胞は、血液又はリンパ節、並びに疾患組織又は正常組織から得ることができる。
【００２２】
抗体産生細胞はまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ免疫法などの培養技術によって得ることができる。このような方法の例は、Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １２１：１８〜３３においてＣ．Ｒ．Ｒｅａｄｉｎｇによって記載されている（Ｊ．Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅ、Ｈ．Ｈ．ｖａｎ  Ｖｕｎａｋｉｓ（著）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．、Ｎ．Ｙ．）。抗体産生細胞は又、従来のハイブリドーマ技術によって作製された前初期モノクローナル抗体又はオリゴクローナル抗体融合培養から得ることができる。
【００２３】
抗体産生細胞の集団は、その他の細胞に対する抗体産生細胞の大きさ又は密度に基づいた方法によって、該アッセイで使用するために濃縮することができる。密度によって細胞を分離するためにＰｅｒｃｏｌｌを使用する例は、ｖａｎ  Ｍｏｕｒｉｋ及びＷ．Ｐ．ＺｅｉｚｌｍａｋｅｒよってＭｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １２１：１７４〜１８２（Ｊ．Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅ、Ｈ．Ｈ．ｖａｎ  Ｖｕｎａｋｉｓ（著）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．、Ｎ．Ｙ．）に記載されている。牛血清アルブミン溶液の密度勾配を使用してまた、密度によって細胞を分離することができる（Ｎ．Ｍｏａｖ  ａｎｄ  Ｔ．Ｎ．Ｈａｒｒｉｓ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０５、１５１２、１９７０参照、Ｒａｉｄ、Ｄ．Ｊ．ｉｎ  Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｂ．Ｍｉｓｈｅｌｉ  ａｎｄ  Ｓ．Ｓｈｉｉｇｉ（著）、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、１９８７も参照のこと）。フィコール−ハイパーク（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓｕｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）で遠心することによって分離を実施することが好ましい。所望する抗体産生細胞が最も濃縮された画分は、所望する結合特異性を備えた抗体を含有し得る集団を選択するＥＬＩＳＡベースのアッセイを使用して、予備手段で決定することができる。代わりに、又は付け加えて、所望する抗体が最も濃縮化されている画分を機能アッセイによって決定することができる。
【００２４】
該アッセイでは、所望する結合特性を備えた抗体を産生することが推測される抗体産生細胞集団は、適切な培地に懸濁してから該アッセイで使用する。該アッセイに適した培地は、細胞強度及び細胞構造を短期間維持するために少なくとも最小限の必要条件を備えたもの、たとえば等張緩衝液である。このような培地には、Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ培地（ＲＰＭＩ）＋１０％牛胎児血清、２−β−メルカプトエタノール５０μＭ、グルタミン２ｍＭ、Ｈｅｐｅｓ２０ｍＭ、及び１×ペニシリン及びストレプトマイシンを含む免疫細胞培地が好ましい。
【００２５】
このような条件下で、抗体産生細胞は抗体を産生し分泌する。抗体産生細胞は該培地中で、単一又は少数の抗体産生細胞の選択が可能となる密度まで希釈する。どの細胞がアッセイによって示される活性に寄与するのか分からない場合、又は該活性を確認するために、選択細胞（群）が所望する結合特性を備えた抗体を産生する能力を再試験することができる。
【００２６】
該アッセイで使用する抗原は、前述のように、蛋白質、糖蛋白質、炭水化物及び細胞全体、たとえば腫瘍細胞又は表面上に抗原を発現するトランスフェクト細胞を含めた抗体を産生することができるいかなる物質であってもよい。一例では、該抗原は公知で、純粋な形態で入手することができ、測定に組み込むために赤血球又はビーズなどのその他任意の粒子の表面上にコーティングされる。粒子を抗原でいくつかのコーティングする方法は、当業者であれば知っている。これらには、塩化第２クロム法又は可溶性カルボジイミド法が含まれる。一実施形態では、ビオチン／ストレプトアビジン結合系を使用して抗原を赤血球に結合させ、その方法はＷＯ９２／０２５５１に詳述されている。
【００２７】
他の例では、該抗原を市販のビーズ（たとえば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから購入できるもの）に結合させる。抗原は、いくつかの様々な方法を使用して、好ましくは活性化ビーズへの直接結合又はビオチン対ストレプトアビジン結合ビーズを介して、ビーズに結合することができる。これらのビーズは、扱いが容易な磁石が好ましい。
【００２８】
他の例では、抗原の所望する抗原決定基がビオチン化で失われてしまうときには特に、抗原に結合するポリクローナル抗体を介して該抗原を粒子表面上に結合させる。抗原−ポリクローナル抗体−粒子複合体を調製するために、ポリクローナル抗体をまず、ビーズなどの粒子表面上に、適切な任意の方法、たとえばビオチン対ストレプトアビジン結合ビーズを介して結合させる。該ポリクローナル抗体−粒子複合体を次に、過剰な抗原とインキュベートさせて該ポリクローナル抗体を該抗原に結合させる。該抗原−ポリクローナル抗体−粒子複合体を次に未結合抗原から、たとえば遠心によって分離し、該アッセイに組み込む。該複合体に使用する該ポリクローナル抗体は、当業界で公知の任意の適切な方法を使用して、免疫原として所望する抗原を使用して、任意の適切な種で産生することができる。該ポリクローナル抗体は、完全なＩｇＧ、又はそれらの断片、たとえばＦａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２又はＦａｂ断片であってよい。断片は、当業界で公知の任意の方法、たとえばペプシン又はパパイン消化によって産生することができる。該複合体に使用したポリクローナル抗体は、抗体産生細胞によって産生された抗体を検出するためにアッセイで使用した標識抗抗体抗体によって認識されないことが重要である。たとえば、該抗体産生細胞がウサギ由来の場合、該標識抗抗体抗体は抗ウサギ抗Ｆｃ抗体であってよく、該複合で使用した該ポリクローナル抗体はウサギ以外の種、たとえば、ヤギ由来の抗体であるべきで、該抗体がウサギ由来であるならば、Ｆｃ領域を欠如した断片、たとえばＦａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２又はＦａｂ断片であるべきである。
【００２９】
他の例では、抗原の精製が困難であるか、又はビオチン化によって所望する抗原決定基が失われる場合は特に、該抗原を細胞表面上に発現させる。このような細胞は、天然に細胞表面上に抗原を発現する細胞か、又は表面上に該抗原を発現するトランスフェクト細胞であってよい。このような細胞には、哺乳類細胞、免疫調節細胞、リンパ球、単球、多形細胞、Ｔ細胞、腫瘍細胞、酵母細胞、細菌細胞、感染因子、寄生虫、植物細胞、ＮＳ０、ＣＨＯ、ＣＯＳ、２９３細胞などのトランスフェクト細胞が含まれるがこれだけには限定されない。ＮＳ０、ＣＨＯ、ＣＯＳ及び２９３細胞などの細胞のトランスフェクションは、エレクトロポレーション及びヌクレオフェクションを含めた当業界で公知の任意の方法によって実施することができる。
【００３０】
さらに他の例では、該抗原源は、それに対する抗体を単離するために望ましい任意の細胞である。このような細胞には、哺乳類細胞、免疫調節細胞、リンパ球、単球、多形細胞、Ｔ細胞、腫瘍細胞、酵母細胞、細菌細胞、感染因子、寄生虫及び植物細胞が含まれるが、これだけには限定されない。
【００３１】
該抗体産生細胞及び該抗原は、たとえば以後の実施例で説明するように実験によって測定できる適切な濃度でアッセイに組み込む。該抗体産生細胞の密度は、分離を良好になり、かつ所望する特異性を備えた抗体を産生する抗体産生細胞の同定および単離が可能になるように十分低い。該抗原は過剰に存在させて、該抗原は該抗体産生細胞よりも１０〜１０００倍過剰であることが好ましい。
【００３２】
選択した抗原に結合する抗体を同定するために、標識抗抗体抗体を該アッセイに組み込む。前記抗体は、結合特異性に関係なく、抗体産生細胞によって産生される抗体全てに結合する。このような抗体は、当業者によって容易に作製され、容易に商業的に入手できる。該抗抗体抗体は、抗Ｆｃ抗体であることが好ましい。本発明の一実施形態では、該抗体産生細胞はウサギから得られ、標識抗Ｆｃ抗体はヤギ抗ウサギ抗Ｆｃ抗体である。
【００３３】
該抗抗体抗体に結合させる標識は、当業界で公知の任意の適切な方法によって該アッセイで検出することができる任意の標識である。多くの様々な複合体、たとえば、化学ルミネセンス、酵素及び蛍光標識が抗体の標識に有用である。このような抗体は、当業者によって容易に作製され、容易に商業的に入手できる。該標識は、顕微鏡によって検出できるものであることが好ましい。一般的に、本明細書で説明した本発明の様々な態様では、使用する標識は蛍光標識が好ましい。具体的な蛍光標識は顕微鏡によって視覚化できるもので、Ａｑｕａ、テキサスレッド、ＦＩＴＣ、ローダミン、ローダミン誘導体、フルオレセイン、フルオレセイン誘導体、ｃａｓｃａｄｅ  ｂｌｕｅ、Ｃｙ５及びフィコエリトリンを含めることができるがそれだけには限定されない。前記標識は、蛍光複合体、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）が好ましい。
【００３４】
該標識抗抗体抗体は、選択抗原に結合する抗体産生細胞とそうでない細胞とを区別することができる濃度で、該アッセイで使用する。最適な濃度は、標識抗抗体抗体の濃度を変化させることによって、当業者によって実験的に決定することができる。一例では、該標識抗体は、蛍光標識抗体で、蛍光の検出が不可能な程低くはなく、蛍光のバックグラウンドが高くなるほど高くない濃度で使用する。該蛍光標識抗抗体抗体は、蛍光の過剰なバックグラウンドを生じさせずに該抗体産生細胞によって生じた抗体全てに結合するように過剰であることが好ましい。
【００３５】
選択抗原に結合する抗体を産生する抗体産生細胞を同定するために、抗体産生細胞集団、該抗原及び標識抗抗体抗体を含む測定混合物を前述の培地中でインキュベートして結合を起こさせる。最適なインキュベーション時間及び温度は当業者によって実験で決定することができる。インキュベーションは、顕微鏡スライドなどの適切な任意の容器内で、適切な任意の温度、たとえば、４℃前後と３７℃前後との間で、適切な時間、たとえば、５分前後と５時間前後との間で行う。該測定混合物のインキュベーションは、顕微鏡スライド上で３７℃で１時間まで行うことが好ましい。
【００３６】
該標識抗抗体抗体は、当業界で公知の適切な方法を使用して検出する。該標識抗抗体抗体は、顕微鏡を使用して検出することが好ましい。該抗抗体抗体は、蛍光標識に結合することがより好ましく、該蛍光は適切なフィルター装置を備えた水銀蒸気紫外線ランプを装備した倒立顕微鏡を使用して視覚化する。好ましいフィルター装置は、フルオレセインフィルター装置である。
【００３７】
選択抗原に結合する抗体を産生する抗体産生細胞は、前記細胞を取り囲む標識抗抗体抗体の濃度の増加によって同定することができる。該抗原に結合しない抗体を産生する抗体産生細胞は、標識抗抗体抗体の濃度を増大させても取り囲まれない。収率の高い抗体産生細胞は、抗抗体抗体濃度増加の局在が最も迅速に現れたものとする。
【００３８】
次に、微細ガラスピペット及び顕微操作装置などの標準的な顕微操作技術を使用して、該抗体産生細胞を直接アッセイから単離することができる。抗体は、単離した抗体産生細胞から直接的に、又は間接的に合成することができる。直接合成は、単離した抗体産生細胞を適切な培地で培養することによって実施することができる。該アッセイを使用して高収率の抗体産生細胞を同定したら、この高収率細胞をクローナルに再産生するために適切な条件下で細胞を培養する。
【００３９】
間接合成は、該抗体又はその一部をコード化する遺伝子を単離し、宿主細胞でそれらを発現することによって実現することができる。遺伝子全体をクローニングするか、又は該抗体の所望する特異性をもたらす可変領域又はそれらの一部をクローニングして、組換え抗体を作製するために使用することができる。組換え抗体は、いくつかの様々な形態をとることでき、完全な免疫グロブリン、キメラ抗体、ヒト化抗体及びＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２断片などの抗原結合断片、並びにそれらの誘導体、たとえば１本鎖Ｆｖ断片が含まれる。これらの抗体分子の作製方法は当業界で周知である（たとえば、Ｂｏｓｓ、米国特許第４８１６３９７号、Ｓｈｒａｄｅｒ、ＷＯ９２／０２５５１、Ｗａｒｄ他、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ、３４１、５４４、Ｏｒｌａｎｄｉ他、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６、３８３３、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ他、１９８４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１、６８５１、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ他、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ、３２２、３２３、Ｂｉｒｄ他、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２、４２３を参照のこと）。これらの抗体分子を産生するために使用できる発現系の種類には、細菌、酵母、昆虫及び哺乳類発現系が含まれ、その方法は当業界では周知である（Ｖｅｒｍａ他、１９９８、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２１６、１６５〜１８１）。
【００４０】
本発明によって得られた抗体は、さらに変更を加えずに使用することができるが、所望するならば、適切な診断又は治療のために、１種又は複数のリポーター分子又はエフェクター分子への結合を含めた以下の変更を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
以下の実施例は、例示のために提示されたものであり、限定するものではない。以下の略号を実施例で使用する。
ＩＣＭ−免疫細胞培地（ＲＰＭＩ＋１０％牛胎児血清、２−β−メルカプトエタノール５０μＭ、グルタミン２ｍＭ、ｈｅｐｅｓ２０ｍＭ並びに１×ペニシリン及びストレプトマイシン）
ＲＰＭＩ−Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ培地
ＰＢＳ−リン酸緩衝生理食塩水
【実施例１】
【００４２】
抗原コーティングヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）を使用した特異的抗体産生Ｂ細胞の同定
ＳＲＢＣの抗原コーティング
（ＴＣＳ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手した）ＳＲＢＣのコーティングは、ビオチン化抗原をビオチンコーティングＳＲＢＣの表面へ結合させることによって実施した。抗原コーティングＳＲＢＣは、使用日に調製し、免疫細胞培地中で５％（ｖ／ｖ）で保存した。
【００４３】
抗原特異的抗体を分泌するＢ細胞の同定
該測定混合物はＩＣＭ中で調製し、ＥＬＩＳＡ陽性集団の１０〜１０００個のＢ細胞を含有するウサギＢ細胞１０μｌ、抗原コーティングＳＲＢＣ（５％ｖ／ｖ）１０μｌ及び各実験について様々な濃度のヤギ抗ウサギＩｇＧＦｃ特異的ＦＩＴＣ複合体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）（１：１００、１：２００、１：４００及び１：８００）２０μｌを含めた。該実験は、蛍光のバックグラウンドを高くせずに抗体産生細胞を同定するために必要なヤギ抗ウサギＩｇＧＦｃ特異的ＦＩＴＣ複合体の最適濃度を決定するために設定した。
【００４４】
次に、該測定混合物をＳｉｇｍａｃｏｔｅ（登録商標）処理「チャンバー」スライド上にスポットし（１スポット当たり２〜３μｌ）、軽パラフィン油を注いだ。スライドを３７℃で２０〜３０分間インキュベートし、水銀蒸気紫外線ランプ及びフルオレセインフィルター装置を装備した倒立顕微鏡を使用して調べた。抗原特異的ＩｇＧ抗体を分泌するＢ細胞（血漿細胞）は、前記細胞を取り囲む蛍光の局在的増加によって確認した。図１を参照のこと。この方法を使用して、ヤギ抗ウサギＩｇＧＦｃ特異的ＦＩＴＣ複合体の最適濃度は１：４００であることがわかった。抗原特異的抗体を分泌しない混合物中の他のＢ細胞の周囲には蛍光は認められなかった。抗原が表面上にないＳＲＢＣ対照では、Ｂ細胞に局在する蛍光は認められなかった。
【００４５】
次に蛍光の中心に存在するＢ細胞は標準的顕微操作器具を使用してエッペンドルフ管に集め（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｔｒａｎｓｆｅｒｍａｎ  ａｎｄ  ＣｅｌｌＴｒａｍ  Ｖａｒｉｏ）、その後抗体の重鎖及び軽鎖可変領域をＰＣＲによって単離した。
【実施例２】
【００４６】
抗原コーティングビーズを使用した特異的抗体産生Ｂ細胞の同定
いずれの実験においても、ストレプトアビジンコーティング磁気ビーズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）１μＭを使用した。
【００４７】
ビーズ単層の最適密度の決定
磁石を使用してビーズ保存物一定量をＰＢＳで３回洗浄して保存剤を除去し、同量の免疫細胞培地、（ＩＣＭ）、（ＲＰＭＩ＋１０％牛胎児血清、２−β−メルカプトエタノール５０μＭ、グルタミン２ｍＭ、Ｈｅｐｅｓ  ２０ｍＭ、及び１×ペニシリン及びストレプトマイシン）に再懸濁した。
【００４８】
ビーズはＩＣＭで２倍ずつ連続希釈して、ビーズをＳｉｇｍａｃｏｔｅ処理スライドにスポット（１スポット当たり２〜３μｌ）し、軽パラフィン油で覆ったときでも単層となるビーズ密度の希釈度を決定するために使用した。洗浄ビーズの最終希釈度は１／８が最適であると決定した。
【００４９】
ビーズ上に付加する抗原及び抗原特異的Ｂ細胞の同定
ストレプトアビジンコーティングビーズを５０μｌ量ずつ洗浄して、ＰＢＳ  ５０μｌに再懸濁した。５０μｌ量それぞれを０．１μｇから２５μｇまでの範囲の異なる量のビオチン化抗原保存物（１ｍｇ／ｍｌ）と共にインキュベートした。これらを室温で時々手動で振盪しながらインキュベートした。次に磁石を使用して該ビーズをＰＢＳで洗浄し、ＩＣＭ  ５０μｌに再懸濁した。
【００５０】
次に、抗原を付加したビーズ２０μｌをＥＬＩＳＡ陽性Ｂ細胞４０μｌ、ＩＣＭ  ６０μｌ及びヤギ抗ウサギＩｇＧ  Ｆｃ特異的ＦＩＴＣ複合体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）の１／４００希釈物と混合した。
【００５１】
次に、この混合物をＳｉｇｍａｃｏｔｅ処理「チャンバー」スライド上にスポットし（１スポット当たり２〜３μｌ）、軽パラフィン油を注いだ。スライドを３７℃で２０〜３０分間インキュベートし、水銀蒸気紫外線ランプ及びフルオレセインフィルター装置を装備した倒立顕微鏡を使用して調べた。
【００５２】
抗原特異的ＩｇＧ抗体を分泌するＢ細胞（血漿細胞）は、Ｂ細胞を取り囲む蛍光の局在的増加によって確認した。図２を参照のこと。この方法を使用して、ビーズ保存物５０μｌ当たりビオチン化抗原１μｇがこの特定抗原の信号発生に最適であると決定した。抗原特異的抗体を分泌しない混合物中のその他のＢ細胞の周囲には蛍光は認められなかった。対照としては、該ビーズを他の無関連抗原でコーティングしたところ、Ｂ細胞に局在する蛍光は認められなかった。
【００５３】
次に蛍光の中心に存在するＢ細胞を標準的顕微操作器具を使用してエッペンドルフ管に集め（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｔｒａｎｓｆｅｒｍａｎ  ａｎｄ  ＣｅｌｌＴｒａｍ  Ｖａｒｉｏ）、その後細胞の１つから得られた抗体の重鎖及び軽鎖可変領域をＰＣＲによって単離した。組換えキメラＩｇＧ（ヒト定常領域）は、ＣＨＯ細胞における一過性の発現によって作製した。ＣＨＯ細胞のトランスフェクションは、製造者の指示に従ってリポフェクタミン法を使用して実施した（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１８３２４）。ＩｇＧの抗原への特異的結合はＥＬＩＳＡによって確認した（図３）。
【実施例３】
【００５４】
ＣＯＳ−１細胞上における抗原の表面発現を使用した特異的抗体産生Ｂ細胞の同定
ＣＯＳ−１細胞上における抗原の一時的発現
選択抗原を一時的に発現するＣＯＳ−１細胞を免疫細胞培地に懸濁した。細胞密度は、１ｍｌ当たり細胞２×１０７個に変更した。
【００５５】
抗原特異的抗体を分泌するＢ細胞の同定
該測定混合物はＩＣＭ中で調製し、ＥＬＩＳＡ陽性Ｂ細胞４０μｌ、１：４００に希釈したヤギ抗ウサギＩｇＧ  Ｆｃ特異的ＦＩＴＣ複合体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）４０μｌ及びＣＯＳ−１細胞懸濁液４０μｌを含めた。
【００５６】
次に、該測定混合物をＳｉｇｍａｃｏｔｅ処理「チャンバー」スライド上にスポットし（１スポット当たり２〜３μｌ）、軽パラフィン油を注いだ。スライドを３７℃で４０分間インキュベートし、水銀蒸気紫外線ランプ及びフルオレセインフィルター装置を装備した倒立顕微鏡を使用して調べた。
【００５７】
抗原特異的ＩｇＧ抗体を分泌するＢ細胞（血漿細胞）は、Ｂ細胞を取り囲む蛍光の局在的増加によって確認した。図４を参照のこと。抗原特異的抗体を分泌しない混合物中のその他のＢ細胞の周囲には蛍光は認められなかった。抗原が表面上に存在しないＣＯＳ−１細胞対照では、Ｂ細胞に局在する蛍光は認められなかった。
【００５８】
次に蛍光の中心に存在するＢ細胞は、標準的顕微操作器具を使用してエッペンドルフ管に集め（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｔｒａｎｓｆｅｒｍａｎ  ａｎｄ  ＣｅｌｌＴｒａｍ  Ｖａｒｉｏ）、その後抗体の重鎖及び軽鎖可変領域をＰＣＲによって単離した。
【実施例４】
【００５９】
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞上における抗原の表面発現を使用した特異的抗体産生Ｂ細胞の同定
ＣＨＯ細胞上における抗原の一時的発現
選択抗原を一時的に発現するＣＨＯ細胞を免疫細胞培地に懸濁した。細胞密度は、１ｍｌ当たり細胞２×１０７個に変更した。
【００６０】
抗原特異的抗体を分泌するＢ細胞の同定
該測定混合物はＩＣＭ中で調製し、ＥＬＩＳＡ陽性Ｂ細胞４０μｌ、１：４００に希釈したヤギ抗ウサギＩｇＧ  Ｆｃ特異的ＦＩＴＣ複合体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）４０μｌ及びＣＨＯ細胞懸濁液４０μｌを含めた。
【００６１】
次に、該測定混合物をＳｉｇｍａｃｏｔｅ処理「チャンバー」スライド上にスポットし（１スポット当たり２〜３μｌ）、軽パラフィン油を注いだ。スライドを３７℃で４０分間インキュベートし、水銀蒸気紫外線ランプ及びフルオレセインフィルター装置を備えた倒立顕微鏡を使用して調べた。
【００６２】
抗原特異的ＩｇＧ抗体を分泌するＢ細胞（血漿細胞）は、Ｂ細胞を取り囲む蛍光の局在的増加によって確認した。図５を参照のこと。抗原特異的抗体を分泌しない混合物中のその他のＢ細胞の周囲には蛍光は認められなかった。抗原が表面上に存在しないＣＨＯ細胞対照では、Ｂ細胞に局在する蛍光は認められなかった。
【００６３】
次に蛍光の中心に存在するＢ細胞は、標準的顕微操作器具を使用してエッペンドルフ管に集め（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｔｒａｎｓｆｅｒｍａｎ  ａｎｄ  ＣｅｌｌＴｒａｍ  Ｖａｒｉｏ）、その後抗体の重鎖及び軽鎖可変領域をＰＣＲによって単離した。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】ウサギＢ細胞、抗原をコーティングしたヒツジ赤血球及びヤギ抗ウサギＩｇＧ  Ｆｃ特異的ＦＩＴＣ複合体を含む均一系蛍光アッセイを示した図である。アッセイは、水銀蒸気紫外線ランプ及びフルオレセインフィルター装置を備えた倒立顕微鏡を使用して視覚化した。倍率は８倍である。（ａ）アッセイの位相像。（ｂ）アッセイの蛍光画像。抗原特異的抗体を分泌するＢ細胞周囲に局在する蛍光。
【図２】ウサギＢ細胞、抗原をコーティングした磁気ビーズ及びヤギ抗ウサギＩｇＧ  Ｆｃ特異的ＦＩＴＣ複合体を含む均一系蛍光アッセイを示した図である。アッセイは、水銀蒸気紫外線ランプ及びフルオレセインフィルター装置を備えた倒立顕微鏡を使用して視覚化した。倍率は２０倍である。（ａ）アッセイの位相像。（ｂ）アッセイの蛍光画像。抗原特異的抗体を分泌するＢ細胞周囲に局在する蛍光。
【図３】ＣＨＯ細胞で産生された抗体の特異的抗原結合のＥＬＩＳＡによる検出を示した図である。
【図４】ウサギＢ細胞、表面上に抗原を発現するトランスフェクトＣＯＳ−１細胞及びヤギ抗ウサギＩｇＧ  Ｆｃ特異的ＦＩＴＣ複合体を含む均一系蛍光アッセイを示した図である。アッセイは、水銀蒸気紫外線ランプ及びフルオレセインフィルター装置を備えた倒立顕微鏡を使用して視覚化した。倍率は８倍である。（ａ）アッセイの位相像。（ｂ）アッセイの蛍光画像。抗原特異的抗体を分泌するＢ細胞周囲に局在する蛍光。
【図５】ウサギＢ細胞、表面上に抗原を発現するトランスフェクトＣＨＯ細胞及びヤギ抗ウサギＩｇＧ  Ｆｃ特異的ＦＩＴＣ複合体を含む均一系蛍光アッセイを示した図である。アッセイは、水銀蒸気紫外線ランプ及びフルオレセインフィルター装置を備えた倒立顕微鏡を使用して視覚化した。倍率は８倍である。（ａ）アッセイの位相像。（ｂ）アッセイの蛍光画像。抗原特異的抗体を分泌するＢ細胞周囲に局在する蛍光。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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