(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
放線菌（Actinomycetales）目に属し、受託番号FERM P-20563で寄託された放線菌ST13株である、六価クロムを還元する能力を有する微生物。
【請求項２】
請求項１記載の微生物と六価クロムとを接触させる、六価クロム還元方法。
【請求項３】
上記六価クロムは培地に含有され、当該培地で上記微生物を培養することを特徴とする請求項２記載の六価クロム還元方法。
【請求項４】
六価クロムを含有する環境に対して、請求項１記載の微生物を接触させる環境浄化方法。
【請求項５】
上記環境は汚染土壌及び/又は水環境であることを特徴とする請求項４記載の環境浄化方法。
【請求項６】
上記環境から水酸化クロムを回収する工程を更に含む請求項４記載の環境浄化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、環境汚染物質として知られる六価クロムを還元できる新規微生物に関し、また、この新規微生物を用いた六価クロム還元方法及び環境浄化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ステンレスなどの各種合金の成分として重要な金属であるクロムには、金属クロム、三価クロム、六価クロムという３種類の形がある。このうち、六価クロムは、生体毒性と発がん性を示すことが知られており、工場廃水や土壌といった各種環境に含まれることで深刻な環境問題を惹起している。例えば、クロムメッキ工場などの跡地においては、土壌中に六価クロムを含有している可能性があり、その土地の再利用には浄化の必要性がある。
【０００３】
一般に、汚染環境の修復としては、環境中に含まれる環境汚染物質を化学的或いは生物学的に処理して無毒化している。六価クロムについては、一般的に、化学的処理により三価クロムに無毒化される。六価クロムを除去する化学処理方法としては、酸性溶液中で亜硫酸水素ナトリウムなどの還元剤を添加して、六価クロムから三価クロムに還元している。しかし、この化学処理法には、六価クロムの濃度が低いと処理効率が悪くなるといった問題がある。さらに、六価クロムの還元に使用する還元剤そのものが有害物質であるといった問題もある。
【０００４】
このような問題に対する有効な手段として、生物学的に六価クロムを還元する手法が検討されている。すなわち、バイオレメディエーション（Bioremediation）の技術を適用し、環境中に含まれる六価クロムを三価クロムに還元することで、効率的に低コストで環境浄化できることが期待されている。
【０００５】
しかしながら、従来、六価クロム還元能を有する微生物としては、例えば特許文献１に開示された微生物が知られているが、その還元能力の低さから実用化にいたっていない。
【０００６】
【特許文献１】特開2002-281960号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、本発明は、上述したような実状に鑑み、六価クロムの還元能力に優れ、六価クロムを含有する環境のバイオレメディエーションに好適な新規な微生物、及びこれを用いた六価クロム還元方法並びに環境浄化方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上述した目的を達成するため、本発明者らが鋭意検討した結果、優れた六価クロム還元能を有する新規微生物を特定の土壌から単離することに成功し、本発明を完成するに至った。なお、本発明者らが単離した新規微生物は、平成17年6月14日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東1-1-1 中央第6）にFERM P-20563として寄託されている。
【０００９】
すなわち、本発明は以下を包含する。
【００１０】
(1)  放線菌（Actinomycetales）目に属し、配列番号１に記載の塩基配列と９６％以上相同な塩基配列を含む16S rDNAを有し、六価クロムを還元する能力を有する微生物。
【００１１】
(2)  寄託番号FERM P-20563で寄託された放線菌ST13株であることを特徴とする(1)記載の微生物。
【００１２】
(3)  上記(1)又は(2)記載の微生物と六価クロムとを接触させる、六価クロム還元方法。
【００１３】
(4)  上記六価クロムは培地に含有され、当該培地で上記微生物を培養することを特徴とする(3)記載の六価クロム還元方法。
【００１４】
(5)  六価クロムを含有する環境に対して、上記(1)又は(2)記載の微生物を接触させる環境浄化方法。
【００１５】
(6)  上記環境は汚染土壌及び/又は水環境であることを特徴とする(5)記載の環境浄化方法。
(7)  上記環境から水酸化クロムを回収する工程を更に含む(5)記載の環境浄化方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、六価クロム還元能を有する従来の微生物と比較して、優れた六価クロム還元能を有する、放線菌目に属する新規微生物を提供することができる。本発明に係る新規微生物を使用することによって、環境中に含まれる六価クロムを効率的に還元し、当該環境の無害化を低コストで実現することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係る新規微生物は、放線菌（Actinomycetales）目に属する微生物であって、配列番号１に記載の塩基配列と９６％以上相同な塩基配列を含む16S rDNAを有する微生物である。本発明に係る新規微生物は、従来公知の六価クロム還元能を有する微生物と比較して、優れた六価クロム還元能を有するといった有利な特徴を備えている。
【００１８】
ここで、配列番号１に記載の塩基配列は、本発明に係る新規微生物のリボソームを構成するrRNA群のうち16S rRNAをコードするDNA（すなわち、16S rDNA）の部分塩基配列である。後述の実施例において詳細に説明するが、ある菌株における16S rDNAの塩基配列が基準株の16S rDNAの塩基配列と97％以上の相同性を有する場合に、当該基準株と同種であると判別されるところ、配列番号１に記載の塩基配列と97％以上の相同性を示す公知の16S rDNA塩基配列は現在知られていない。また、後述の実施例において詳細に説明するが、配列番号１に記載の塩基配列と最も高い相同性（95.0%）を示す種における16S rDNA塩基配列を用いて、配列番号１に記載の塩基配列に基づく分子系統樹を作成したところ、本発明に係る新規微生物は、既知の帰属分類群には帰属せず新属を形成する蓋然性が高い。
【００１９】
したがって、配列番号１に記載の塩基配列と96％以上相同な塩基配列を含む16S rDNAを有する微生物は、全て新規微生物であり、六価クロム還元能を有する限り本発明に含まれることとなる。配列番号１に記載の塩基配列と96％以上相同な塩基配列を含む16S rDNAを有する微生物としては、例えば、放線菌ST13株に対して突然変異を導入した放線菌ST13株の変異株を挙げることができる。なお、放線菌ST13株は、本発明者によって単離同定され、平成17年6月14日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東1-1-1 中央第6）にFERM P-20563として寄託されている。
【００２０】
突然変異を導入する手法としては、特に限定されず、紫外線照射、Ｘ線等の放射線照射、亜硝酸等の化学的変異原処理等のランダムに突然変異を誘発する手法を挙げることができる。また、突然変異を導入する手法としては、市販のキット等を使用した、部位特異的突然変異導入法を適用しても良い。如何なる方法であれ、配列番号１に記載の塩基配列と９６％以上相同な塩基配列を含む16S rDNAを有し、六価クロム還元能を備える微生物であれば、本発明に係る新規微生物に含まれる。なお、これらの手法を適用して、寄託番号FERM P-20563で寄託された放線菌ST13株の変異株を取得することは当業者にとって容易である。
【００２１】
一方、本発明において、六価クロム還元能を測定する手法としては、特に限定されないが、例えば、六価クロムを含有する培地で供試菌株を培養し、培地中の六価クロムの減少量を測定するか三価クロムの増加量を測定する方法を挙げることができる。より具体的には、ジフェニルカルバジド比色法による六価クロムの定量分析により、液体培地中の六価クロムの減少量を測定しても良い。例えば、0.6mMの濃度で六価クロムを含有する液体培地で供試菌株を３日間程度培養し、液体培地に含まれる六価クロム量を経時的に測定する。六価クロム量は、例えば1,5-ジフェニルカルボノヒドラジド水溶液とサンプリングした液体培地とを混合し、波長540nmの吸光度を測定することで算出することができる。
【００２２】
したがって、このような手法を適用することで、配列番号１に記載の塩基配列と９６％以上相同な塩基配列を含む16S rDNAを有する菌株が六価クロム還元能を有するか否か判別することができる。言い換えると、このような手法を適用することによって、配列番号１に記載の塩基配列と９６％以上相同な塩基配列を含む16S rDNAを有する菌株が本発明に含まれるか否か判別することができる。
【００２３】
本発明に係る新規微生物は、六価クロムを環境汚染物質として含有する環境の浄化に利用することができる。浄化対象の環境としては、液体廃棄物、工場排水等の水環境、スラッジ、表層土壌、地下の堆積物等の汚染土壌を含む、各種環境を挙げることができる。本発明に係る新規微生物を用いた環境浄化方法は、具体的には、従来公知のいわゆるバイオレメディエーション技術を適用して実現することができる。バイオレメディエーション技術としては、原位置処理プロセス及び移動処理プロセスのいずれを適用しても良いが、両者を組み合わせて適用しても良い。原位置処理プロセスとは、汚染環境の存在している場所で処理することを意味する。移動処理プロセスとは、地上にあるリアクター或いは専用の場所で汚染物質を処理すべく、汚染土壌や液体廃棄物を汚染環境の存在している場所以外に移動させて処理することを意味する。
【００２４】
いずれのプロセスを適用する場合であっても、本発明に係る新規微生物を浄化対象の環境に接触させることによって、当該環境に含まれる六価クロム量を減少させることができ、当該環境を無害化することができる。なお、環境に含まれる六価クロムが還元されて生成した三価クロムは従来公知の手法により、当該環境から水酸化クロムとして回収することも可能である。
【００２５】
本発明に係る新規微生物をクロムメッキ工程の廃水処理に適用する場合には、以下のように実施することができる。先ず、クロムメッキ工程の廃水、すなわち、クロムメッキした試料に対する水による洗浄工程で排出される酸性の六価クロム含有水を、水酸化ナトリウムなどで適度に中和する。その後、処理すべき六価クロム含有水中の六価クロム濃度を水や培養液で適度に薄めて（例えば10分の1程度の濃度）ST13株を接触させる。一定時間、適度な温度で接触させることによって六価クロムを三価クロム含有水に変換する。このような処理プロセスによって安全かつ効率的に六価クロムを処理できる。接触の方法は、ST13株を培養している培養液と六価クロム含有水を混合して撹拌する方法や、フィルターなどでST13株が漏れ出ないように詰め込まれているカラム状の容器に適当な流速で六価クロム含有水を1回または複数回通過させることなどを挙げることができるが、これらの方法に限定されない。生成される三価クロム含有水の処理は、水酸化ナトリウムや水酸化カルシウムなどを添加する工程を次に行うことによって、水酸化クロムのスラッジ固形物として回収することが挙げられるが、これらの方法に限定されない。
【実施例】
【００２６】
以下、本発明に係る新規微生物及びこれを用いた六価クロム還元方法を、実施例を用いてより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
【００２７】
［実施例１］  六価クロムを還元する菌の単離
菌株の分離用培地として次の〔表１〕に示す培地を調製した。
【００２８】
【表１】
0004395870.tif 000002
【００２９】
本例では、クロムメッキ工場の土壌の一部を適当量の水で洗浄して得た水溶液を、表１の六価クロム含有LB寒天培地に直接添加し、室温にてインキュベートした。8日後に六価クロム含有培地上で生育できる菌のコロニーが形成されていた。その中から六価クロムを還元する能力を有する菌を単離して、その一つをST13株と命名し、これを得た。
【００３０】
［実施例２］  菌による六価クロムの還元
ST13株を〔表２〕に示す液体培地6mlで、室温48時間の前培養を行った。0.5mlの培養液を6000×gで5分間の遠心分離を行い、上清を除いた。残った菌体に六価クロム含有ISP液体培地0.5mlを添加して、室温で培養した。六価クロム含有ISP液体培地は、ISP液体培地に種々高濃度のCrO3水溶液を添加して、適当な六価クロムの終濃度を持つ培地にした。
【００３１】
【表２】
0004395870.tif 000003
【００３２】
六価クロム含有ISP液体培地に懸濁したST13株は、室温、1000rpmで振盪培養した。その1日後に培養液を6000×gで5分間の遠心分離を行い、上清から0.06mlをサンプリングした。サンプリング後の残りのST13株とその培養液は再度懸濁して培養を続けた。培養開始から2日後も同様にしてサンプリングした。培養開始から3日後も同様にしてサンプリングした。そのサンプリングした培養遠心上清液に含まれる六価クロム濃度は、以下の方法で定量化した。
【００３３】
4.85mgの1,5ジフェニルカルボノヒドラジドを2mlのアセトンに溶解し、10mM濃度のジフェニルカルボノヒドラジド水溶液を調製した。10mMジフェニルカルボノヒドラジド1容量とH2SO49容量を混合して、1mMジフェニルカルボノヒドラジド水溶液を調製した。ST13の培養遠心上清液と1mMジフェニルカルボノヒドラジド水溶液を１対１で混合して、室温で10分間静置した。また、ST13の培養遠心上清液のかわりに種々濃度の六価クロムを含有するISP液体培地と1mMジフェニルカルボノヒドラジド水溶液を１対１で混合して、室温で10分間静置した。六価クロムが存在すると色を呈するので、この呈色を分光光度計を用いて540nmの吸光度として測定した。種々濃度の六価クロムを含有するISP液体培地からの測定結果を基準にして、ST13株の培養遠心上清液の六価クロム濃度を算出した。図１にST13株による六価クロムの還元を示す。
【００３４】
六価クロム濃度が0.5mMまでの培養液は、ST13株によって1日間で測定限界に近い0.0013mMまで低下した。六価クロム濃度が0.9mMまでの培養液は、ST13株によって2日間で測定限界に近い0.0021mMまで低下した。六価クロム濃度が1.0mMの培養液は、ST13株によって3日間で測定限界に近い0.0059mMまで低下した。
【００３５】
基本培地として〔表３〕に示すLB液体培地を使用して、ST13株による六価クロムの還元を行った。
【００３６】
【表３】
0004395870.tif 000004
【００３７】
すなわち、種々高濃度のCrO3水溶液を添加して適当な六価クロムの終濃度を持つ六価クロム含有LB液体培養液を調整した。六価クロム含有ISP液体培地の場合と同様にしてST13株によって培養液中の六価クロムを還元した。図２にST13株による六価クロムの還元を示す。
【００３８】
六価クロム濃度が1.2mMまでの培養液は、ST13株によって5日目に測定限界に近い0.0006mMまで低下した。六価クロム濃度が1.4mMから2.0mMまでの培養液も、ST13株によって六価クロム濃度の低下傾向を示した。
【００３９】
［実施例３］  ST13株の同定
ST13株の培養性状および生理生化学性状をCowan and Steel’s Manual for the Identification of Medical Bacteria. 3rd edition. 1993, Cambridge University Pressにしたがって観察・測定した。〔表４〕にその結果を示す。
【００４０】
【表４】
0004395870.tif 000005
【００４１】
この結果から、ST13株は運動性を持たないグラム陽性を示す球菌で、グルコースを酸化せず、カタラーゼ反応陽性、オキシダーゼ反応陰性などの性状を示している。これらの結果はST13株がActinomycetales目であることを示している。
【００４２】
ST13株の16S rDNAを篠田吉史ら（2000）島津評論57巻121-132項に記載の方法にしたがって決定した。その塩基配列を配列番号１に示す。
この配列番号１をキーとしてGenBank/DDBJ/EMBLデータベースに対して相同性検索した。その結果、ST13株の16S rDNAはDermacoccus nishinomiyaensisの基準株であるDSM20448株とJanibacter limosusの基準株であるDSM111140株のそれに対して、最も高い相同性率95.0％の相同性をそれぞれ示した。一般に16S rDNAの塩基配列による解析では、基準株に対して相同性率97％以上を示す場合において、その検体が基準株と同種である可能性が大きいといえる。したがってST13株の種レベルでの帰属は困難と考えられる。一方、検索された属はDermacoccus、Janibacter、Terrabacter、Rarocbacter等のMicrococcineae亜目に分類される属が占めた。したがってST13株の目レベルの帰属では、Micrococcineae亜目の可能性が高いと考えられる。
【００４３】
次に、Micrococcineae亜目に属する14科から、その科の基準となる属を含む25属を選択して、合計40種類の基準株由来の16S rDNAを取得してST13株を含めた分子系統樹を作成した。分子系統樹の推定には近接結合法を用い、樹型の妥当性を示すブーツストラップは1000回発生させた。その結果を図３に示す。ST13株を含有するDermacoccas nishinomiyaensisとKyotocossus schroeteriを含めたクラスターは、Dermacoccaceae科の形成するクラスターである。したがってST13株はDermacoccaceae科への帰属が考えられるが、Demetria terragenaと形成した系統枝のブーツストラップ値は66％とやや低い値を示した。さらに周囲を取り巻く系統枝のブーツストラップ値も低めであった。ブーツストラップ値は系統枝の信頼性を示す値であり、大きいほど信頼性が高い。このことから、ST13株がDermacoccaceae科へ帰属することも十分に検証できているとは言えない。
【００４４】
したがって現時点で得られるGenbank/DDBJ/EMBLデータベースを使って得られる分子系統解析からは、ST13株は既知の帰属分類群には帰属せずに、新属、新種を形成している蓋然性が高いと結論付けられる。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】六価クロム含有ISP液体培地におけるST13株による六価クロムの還元能を示す特性図である。
【図２】六価クロム含有LB液体培地におけるST13株による六価クロムの還元能を示す特性図である。
【図３】Micrococcineae亜目に属する40種類の基準株及びST13株を含めた分子系統樹である。
【図１】
0004395870.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【配列表】
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