(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
イソフラボンアグリコン濃度を高めたイソフラボン化合物濃縮物の製造法であって、
（１）微生物を用いた発酵により加水分解された大豆を非極性溶媒により脱脂し、得られた脱脂生成物を乾燥させる工程と、
（２）工程（１）で得られた乾燥脱脂生成物を極性溶媒で抽出し、得られたイソフラボン化合物を含有する抽出物を濃縮乾固する工程と、
（３）工程（２）で得られた濃縮乾固抽出物を極性溶媒で溶解し、さらに加水希釈した後に、分離して不溶性物質を得る工程と、
前記極性溶媒が、メタノール、エタノール、プロパノール、アセトン、又はこれらと水との混合物であり、
（４）工程（３）で得られた不溶性物質を、必要に応じて洗浄し、乾燥させて溶媒を除去する工程を含んでなる、製造法。
【請求項２】
工程（１）の非極性溶媒が低級炭化水素であり、工程（２）の極性溶媒が低級エステルである、請求項１に記載の製造法。
【請求項３】
工程（１）の非極性溶媒がｎ−ヘキサンであり、工程（２）の極性溶媒が酢酸エチルであり、工程（３）の極性溶媒がエタノールである、請求項１に記載の製造法。
【請求項４】
前記微生物を用いた発酵により加水分解された大豆が、醤油油、醤油粕、たまり粕、味噌、豆味噌、納豆、又は発酵大豆である、請求項１〜３の何れか一項に記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
［発明の背景］
発明の分野
本発明は、イソフラボン化合物を含有する物質、特に豆科、バラ科、アヤメ科、桑科、ヒユ科等の植物から、イソフラボン化合物を製造する方法に関するものである。特に、豆科植物からイソフラボン化合物を、とりわけイソフラボングリコシドが加水分解してできたイソフラボンアグリコンを、製造する方法に関するものである。
背景技術
イソフラボンは、下記式（Ｉ）で示されるものであり、現在のところ天然由来のものとしては、豆科、バラ科、あやめ科、くわ科、およびヒユ科、特に豆科植物に存在する。
0004397525.tif 000002
イソフラボン化合物またはイソフラボン化合物の前駆体は、上記式（Ｉ）で示されるイソフラボンを基本骨格として、アルキル基、ヒドロキシル基、アルキルオキシル基などの各種置換基を有するものである。
イソフラボン化合物は下記式（ＩＩ）で示されるものであり、その代表的なものを下記表Ａに示す。
0004397525.tif 000003
上記式（ＩＩ）中、Ｒ１がグルコースのものはイソフラボングリコシドと、イソフラボングリコシドが加水分解されたものはイソフラボンアグリコンと呼ばれている。
イソフラボン化合物は、近年、エストロゲン作用、抗エストロゲン作用、酸化防止作用、抗溶血作用、抗菌作用、抗脂血、抗コレステロール作用、鎮痙作用、ガン細胞の分化誘導作用、ガン遺伝子阻害作用、制ガン効果、およびその他の生理活性を持っていることが知られており、その有用性が注目されている。
特に、これらイソフラボン化合物の中でも、イソフラボングリコシドが加水分解されてできたイソフラボンアグリコンに関する薬理作用について多くの報告がなされている。
例えば、ゲニスチンから配糖体であるグルコースが加水分解されてできたアグリコンであるゲニステインは、癌遺伝子による癌化の誘導に必須であるチロシンキナーゼを阻害する物質（ＴＫ阻害剤）であることが明らかにされ、その制癌効果が確認されている（秋山ら、生化学、５９巻９号、１０１６頁（１９８７））。
また、ゲニステインは、イソフラボン化合物のなかでも特にエストロゲン作用を有しており、骨粗鬆症治療効果や免疫抑制効果があることが確認されている。
特に、女性の場合には、閉経後の骨粗鬆症が問題となっており、その原因としてエストロゲンの不足によって引き起こされる骨代謝回転亢進に伴う骨量の減少を挙げることができる。
しかし、骨粗鬆症の治療として行われるエストロゲンの直接投与は、子宮ガン、乳ガン、などの生殖器に対する副作用を引き起こす問題があるため、食品である豆科植物、とりわけ大豆など、から有効成分であるイソフラボン化合物を効率良く抽出し、健康食品、あるいは末病対応食品として利用することができれば安全性の面から見ても有効である。
イソフラボン化合物はその薬理作用を有することから、近年、医療、食品業界等においてその需要が要求されている。しかし、イソフラボン化合物自体、天然物質に存在する量が少なく、とりわけイソフラボンアグリコンの量は極めて少ないものである。
例えば、豆科に属する大豆中には、イソフラボン化合物の９５％以上がイソフラボングリコシドとして存在し、イソフラボンアグリコンは５％以下しか存在していない。この為、イソフラボン化合物を有用量含有する物質から、イソフラボン化合物、特にイソフラボンアグリコンを簡便かつ効果的に回収する方法が今日、要求されている。
この要求に対して従来、例えば、種々の合成吸着樹脂を用いて大豆蒸煮液からイソフラボン化合物を回収する方法を示した報告「味噌製造における大豆蒸煮液からのイソフラボン誘導体の回収」（北田  善三ら、日本食品工業学会誌、第３３巻、第１２号、頁８２１〜８２５、１９８６年１２月）がある。
しかし、この報告では、大豆蒸煮液等を原料としたものを樹脂充填カラムに流入した後、含水アルコールによりイソフラボン化合物を溶出、回収する方法が教示されているものの、得られるイソフラボン化合物の収量は極めて少ないものである。
特開昭６２−１２６１８６号明細書記載の方法によれば、イソフラボン化合物を得るという目的は達成されるものの、そのほとんどがイソフラボングリコシドである、ダイジン、ゲニスチンであり、所望されるイソフラボンアグリコンの収量は少ないものであった。
また、醤油、味噌の発酵中において、イソフラボングリコシドが十分に加水分解されてイソフラボンアグリコンが生成していることを明らかにした、「醤油・味噌の製造工程におけるＩｓｏｆｌａｖｏｎｅおよびその配糖体の分布状態研究法（第１報）」（木原  清、醤研、Ｖｏｌ．１６、Ｎｏ．５、頁１９０〜１９４、１９９０年）の報告がある。
しかし、この報告では、醤油等の製造各工程におけるイソフラボングリコシドが加水分解されイソフラボンアグリコンとなる状況を示すために、イソフラボン化合物を定性、定量するための方法を教示したものであって、イソフラボンアグリコンを工業的に製造する方法としては困難なものである。
特開平５−１７０７５６号明細書記載の方法は、醤油粕または醤油油に生成したイソフラボン化合物からイソフラボンアグリコンを抽出するものである。この方法は前記文献の記載通り、醤油の製造工程中にイソフラボングリコシドが加水分解されてイソフラボンアグリコンとなることを利用してイソフラボンアグリコンの生成比率を高めるものであるが、所望の収量を上げるには至っていない。
更に、特開平１−２５８６６９号明細書記載の方法は、大豆自体の持つ酵素の１種であるβ−グルコシダーゼを用いることにより、イソフラボングリコシドを加水分解することによってイソフラボンアグリコンを生成し回収する方法であるが、実際にはイソフラボンアグリコンの生成比率は低いものであった。
本出願人が先に特許出願した、特願平６−３２３８５号、特願平７−１７９１１１号、特願平７−２６８８８号、特願平８−８８５５２号、特願平９−８３０３６号、等の明細書に記載された方法には、穀類（大豆等）に麹菌などの微生物を接種して豆類中に大量に存在しているインフラボングリコシドを加水分解することにより、イソフラボンアグリコンを大量に含んでなるイソフラボン化合物を製造する方法が開示されている。これらの方法は、イソフラボングリコシドからイソフラボンアグリコンを効率良く生成する点に注目して改良、改質をおこなったものである。
以上の従来技術は、確かにイソフラボン化合物、およびイソフラボンアグリコンを原料から分離回収する方法（イソフラボングリコシドを種々の手段により加水分解してイソフラボンアグリコンの含有量を高める方法なども含まれる）として、改善、改良がなされた有用なものであるが、本発明者が知る限りでは、分離生成されたイソフラボンアグリコンの収率は十分ではないものと考えられる。
特に、上記従来技術、特に特開平５−１７０７５６号明細書記載の方法に代表される技術においては、一般的に、最初にアルコールでイソフラボン化合物を抽出して洗浄した後に、炭化水素等により脱脂する方法のものがほとんとであり、原料を最初に十分脱脂する工程に着目したものは存在していない。
そのため、イソフラボングリコシド、とりわけその加水分解されたイソフラボンアグリコンの収率が上がらなかったものと考えられる。
［発明の概要］
本発明者らは、今般、最初に原料を十分に脱脂する工程を有することにより、次工程の溶媒抽出においてイソフラボン化合物を収率高く製造する方法に着目したのである。そして、本発明は、イソフラボンアグリコンを収率高く製造する方法を提供するものである。更に、本発明は、食品、医薬等の利用にも考慮して、安全な溶媒を使用して製造することに着眼したものである。
＜要旨＞
即ち、本発明は、イソフラボン化合物および／またはその前駆体を含有する原料からイソフラボン化合物を抽出し分離することを含んでなるイソフラボン化合物の製造法であって、イソフラボン化合物を抽出し分離するのに先立って前記原料に対し脱脂を施すことを特徴とする、イソフラボン化合物の製造法である。
典型的には、本発明は、下記、（１）、（２）、（３）、および（４）の各工程を含んでなることを特徴とする、イソフラボン化合物の製造法である。
（１）イソフラボン化合物および／またはその前駆体を含有する原料を脱脂し、得られた脱脂生成物を乾燥させる工程、
（２）工程（１）で得られた乾燥脱脂生成物を溶媒で抽出し、得られたイソフラボン化合物を含有する抽出物を濃縮乾固する工程、
（３）工程（２）で得られた濃縮乾固抽出物を溶媒で溶解し、さらに加水希釈した後に、分離して不溶性物質を得る工程、
（４）工程（３）で得られた不溶性物質を、必要に応じて洗浄し、乾燥させて溶媒を除去して、イソフラボン化合物を得る工程。
＜効果＞
本発明によるイソフラボン化合物の製造法、特にイソフラボングリコシドを加水分解して得られるイソフラボンアグリコンの製造法は、イソフラボン化合物を抽出し分離するのに先立って前記原料に対し脱脂を施すことにより、前記従来技術に内包されている種々の問題点を解決することができるものである。
即ち、例えば、最初にイソフラボン化合物を含有する原料をアルコールで抽出する方法（特開平５−１７０７５６号明細書等参照のこと）の場合のように、イソフラボン化合物を含有する原料（醤油粕等）を直接極性溶媒で抽出を行うと原料に存在する脂質も同時に抽出されるので、その後に非極性溶媒（例えば、ｎ−ヘキサン）で脱脂したとしても、イソフラボン化合物から脂質を分離することが困難であり、その結果イソフラボン化合物、特にイソフラボンアグリコンの収率があまり良くないことが、今回分かった。
これは、イソフラボンアグリコンがイソフラボングリコシドに比べて極性が低いため（例えば、イソフラボングリコシドとイソフラボンアグリコンとを含むイソフラボン化合物の試料を薄層クロマトグラフィーで測定すると、両者のスポットの間に複数の脂溶性成分が混在する程、極性の変化が確認できる）、イソフラボンアグリコンは脂溶性成分と混在しやすく、脂質と併存する場合には分離することが困難であるという理由によるものである。
しかしながら、本発明によるイソフラボン化合物の製造法では、上述のように原料を最初に十分脱脂することを特徴とするものであるから、かかる問題点が少なく最終目的物質であるイソフラボンアグリコンを収率高く得ることができるものである。
［発明の具体的な説明］
本発明は、イソフラボン化合物および／またはその前駆体を含有する原料からイソフラボン化合物を抽出し分離することを含んでなるイソフラボン化合物の製造法であって、イソフラボン化合物を抽出し分離するのに先立って前記原料に対し脱脂を施すことを特徴とするイソフラボン化合物の製造法を提供するものである。
典型的には、本発明は、下記、（１）、（２）、（３）、および（４）の各工程を含んでなることを特徴とする、イソフラボン化合物の製造法である。
（１）イソフラボン化合物および／またはその前駆体を含有する原料を脱脂し、得られた脱脂生成物を乾燥させる工程、
（２）工程（１）で得られた乾燥脱脂生成物を溶媒で抽出し、得られたイソフラボン化合物を含有する抽出物を濃縮乾固する工程、
（３）工程（２）で得られた濃縮乾固抽出物を溶媒で溶解し、さらに加水希釈した後に、分離して不溶性物質を得る工程、
（４）工程（３）で得られた不溶性物質を、必要に応じて洗浄し、乾燥させて溶媒を除去して、イソフラボン化合物を得る工程。
＜イソフラボン化合物の製造法−原料＞
本発明のイソフラボン化合物の製造法に使用される、イソフラボン化合物および／またはその前駆体を含有する原料は、イソフラボン化合物を有意量含量する物質であればいずれのものであってもよいが、製造されるイソフラボン化合物の用途が食品、医薬品等のものであるとの限定条件が課せられるならば天然由来のものがよい。
天然由来のものとしては、イソフラボン化合物を有用量含有する豆科、バラ科、アヤメ科、桑科、ヒユ科、及びその他の植物が存在するが、大豆・小豆・及びその他の穀類などの豆科植物が好ましい。
原料としては、豆科植物自体のみならず、加工された豆科植物（例えば、豆科植物を加水分解したものも含まれる）、豆科植物を原料とした物品製造過程において生じた主産物、副産物であってもよく、また、これらの一種または二種以上の混合物であってもよい。
豆科植物のなかでも好ましいのは大豆である。大豆は、その種類を問わず、また加工された大豆、大豆を原料とした食品、およびその他の物品製造過程で生じた主産物、副産物のいずれのものであってもよい。
典型的には、大豆（種類、粒色を問わない）、脱皮大豆、抽出大豆、分離大豆、脱脂大豆、大豆タンパク質、醤油油、醤油粕、たまり粕、味噌、豆味噌、納豆、発酵大豆、大豆絞り粕、大豆蒸煮液、およびその他のものを用いることができる。
特に、イソフラボンアグリコンを有意量含有するように加水分解された大豆が好ましく、典型的には、醤油油、醤油粕、たまり粕、味噌、豆味噌、納豆、発酵大豆（本発明において、醗酵大豆とは、麹菌を用いて発酵した大豆をいう）、およびその他のものなどが、好ましい。
麹菌は、例えば、本出願人によって先に出願した明細書に記載されているものを好ましくは用いることができる（例えば特願平６−３２３８５号）。具体的には、古くからの日本独特の発酵食品やテンペに用いられている麹菌であり、食品として安全なアスペルギルス・ウサミ、アスペルギルス・カワチ、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・サイトイ、アスペルギルス・オリゼー、アスペルギルス・ニガー等アスペルギルス属およびリゾープス属のフィターゼ力価およびフォスファターゼ力価の高い麹菌等を例示することができる。
また、これらの原料は、溶媒の極性に影響を受けないように十分に乾燥し、水分を除去したものを使用することが好ましい。
なお、本発明ではこれらの原料の一種または二種以上のものを混合して使用してもよい。さらに原料の形態は、固体物、粉状物、ミンチ物、およびその他の形状、またはこれらの混合形態のいずれのものであってもよい。
＜イソフラボン化合物の製造法−脱脂＞
インフラボン化合物および／またはその前駆体を含有する原料を脱脂する方法は、慣用方法が用いられる。
典型的には、原料として、大豆（種類、粒色を問わない）、また加工された大豆、大豆を原料とした食品、およびその他の物品製造過程で生じた主産物、副産物を使用する場合には、人力、畜力、水力などによる圧搾法、エキスペラー、およびその他の連続圧搾法、水酸化ナトリウム等を用いてケン化を行う方法、およびその他の方法またはこれらの二以上の組み合わせがあるが、本発明においては現在主流となっている溶媒抽出法を用いるのが好ましい。
溶媒抽出法は、製造工程において不要な大豆油、及びその他の脂質を十分に抽出して、除去することができる。
溶媒抽出法に用いられる溶媒は、典型的には、非極性溶媒であり、とりわけ原料中の不要な大豆油、及びその他の脂質を十分に抽出することができる非極性溶媒であって、イソフラボンアグリコンが可溶しないような極性の低い溶媒であればいずれのものも使用することができる。
溶媒抽出法に用いられる非極性溶媒は、典型的には、低級炭化水素、石油系エーテル類、およびその他の有機溶媒が好ましく、一般的には、ｎ−ヘキサン、ベンゼン、四塩化炭素、およびその他のもの、またはこれらの二種以上の組み合わせが考えられるが、本発明において特に好ましいのは、ｎ−ヘキサンである。
ｎ−ヘキサンは、イソフラボンアグリコンを可溶しない溶媒であるとともに、食品の抽出溶媒として使用されており安全面において優れているものである。
上記脱脂方法は、一般的には、脱脂温度は、ｎ−ヘキサンの沸点付近（約６９℃）であり、脱脂効率を高めるために還流抽出を行い、脱脂時間は原料の量にもよるが典型的には約２〜５時間で、行う。
＜イソフラボン化合物の製造法−脱脂生産物の乾燥＞
原料を脱脂して、得られた脱脂生成物を乾燥する方法は、慣用方法が用いられる。
典型的には、天日乾燥、（熱）風乾燥、真空乾燥、通気乾燥、流動乾燥、噴霧乾燥、凍結乾燥、減圧乾燥、赤外線乾燥、高周波乾燥、およびその他の乾燥法、またはこれらの混合方法が用いられるが、本発明においては、次工程において使用される溶媒の極性に影響しない程度に溶媒を除去する乾燥方法であればいずれの方法を用いることができる。
本発明において好ましい乾燥方法は、風乾である。風乾は、脱脂するのに用いられた溶媒を除去する方法として簡易で低コストなものである。
＜イソフラボン化合物の製造法−乾燥脱脂生成物の抽出＞
乾燥させて得られた脱脂生成物からイソフラボン化合物を抽出する方法は、慣用方法が用いられるが、本発明においては、典型的には、溶媒抽出が好ましい。
溶媒抽出は、タンパク質、糖質、繊維、等の不要な成分を除去するのに好ましい。
溶媒抽出に用いられる溶媒は、典型的には、極性溶媒であり、とりわけ乾燥脱脂生成物中に存在するイソフラボン化合物、特にイソフラボンアグリコンを抽出することができる極性溶媒であればいずれのものも使用することができる。
溶媒抽出に用いられる極性溶媒は、典型的には、低級エステル、水、低級アルコール、低級アセトン、低級脂肪酸、およびその他の溶媒が好ましく、例えば、酢酸エチル、酢酸メチル、水、メタノール、エタノール、アセトン、酢酸、およびその他の溶媒、またはこれらの混合溶媒を用いることができる。本発明において特に好ましいのは、酢酸エチルである。
酢酸エチルは、特にイソフラボンアグリコンを抽出できる極性溶媒として好ましく、また沸点が低く、しかも食品の抽出溶媒として使用されており安全面において優れているものである。
上記抽出方法は、一般的には、抽出温度は、酢酸エチルの沸点付近（約７７．１℃）であり、抽出時間は原料の量にもよるが典型的には約２〜５時間で、行う。
抽出後、必要に応じて、さらに脱脂を行うべく上記＜イソフラボン化合物の製造法−脱脂＞工程を行ってもよい。
＜イソフラボン化合物の製造法−抽出物の濃縮乾固＞
イソフラボン化合物を含有する抽出物を濃縮乾固する方法は、慣用される方法が用いられる。
典型的には、減圧濃縮、加熱濃縮、通風濃縮、冷凍濃縮、噴霧濃縮、およびその他の濃縮方法等、またはこれらの混合方法がある。本発明においては減圧濃縮が好ましい。
減圧濃縮は、一般的には、減圧下で行うことにより加熱温度を低くすることができ濃縮速度を上げることができるという利点を有する。
上記減圧濃縮方法は、一般的には、先の抽出工程の抽出溶媒である、酢酸エチルの物性（沸点約７７．１℃）を考慮しつつ、濃縮効率を高めるためにロータリーエバポレターなどで行うことが好ましい。
＜イソフラボン化合物の製造法−濃縮乾固抽出物の溶解、加水希釈＞
（１）濃縮乾固抽出物の溶解
濃縮乾固された抽出物を溶解するのに使用される溶媒は、典型的には、極性溶媒であり、とりわけ濃縮乾固された抽出物から極性物質であるイソフラボン化合物を十分溶解することができる極性溶媒であればいずれのものであっても使用することができる。
濃縮乾固された抽出物を溶解するのに使用される極性溶媒は、典型的には、低級アルコール、水、低級アセトン、低級脂肪酸、低級エステル、およびその他の溶媒、またはこれらの混合物が挙げられる。具体的には、メタノール、エタノール、水、アセトン、酢酸、およびその他の溶媒が挙げられる。
本発明において使用される好ましい極性溶媒は、低級アルコール、一般的には、メタノール、エタノール、プロパノール、およびその他の低級アルコールであり、その中でも特に好ましいのは、エタノールである。
エタノールは、イソフラボン化合物を溶解する極性溶媒として好ましく、また沸点が低く、しかも食品に使用するのに安全性を有しているものである。
なお、溶媒の濃度は、濃縮乾固された抽出物を十分に溶解することができるように高濃度のものがよく、溶媒の濃度が９５％以上、好ましくは９９％以上のものがよい。極めて高濃度の極性溶媒を使用するのは極性物質であるイソフラボン化合物を十分に溶解させるためである。
（２）加水希釈
濃縮乾固抽出物を極性溶媒で溶解した後、加水希釈するのは、イソフラボン化合物のうち、イソフラボングリコシドよりもわずかに極性が低いイソフラボンアグリコンを不溶性物質として溶液中に沈殿させるためである。
加水量は、極性の高い不純物質を除去させ、かつ、イソフラボンアグリコンを不溶化して、分離するという目的を達成する程度の量が好ましい。
典型的には、上記（１）の濃縮乾固抽出物を溶解するのに用いた極性溶媒が、メタノール、エタノールなどの低級アルコールである場合には、その濃度が、約２０％になる程度までに加水することで上記目的を達し得る。
加水希釈した後、イソフラボンアグリコン濃度の高いイソフラボン化合物を相当量含有した不溶性物質を分離するには、慣用方法が用いられる。
典型的には、固液分離、例えば、濾過、遠心が挙げられ、好ましくは濾過である。
固液分離することにより、比較的に極性の高い脂質、およびその他のものを可溶物として除去することができる。
この可溶物は、主としてイソフラボングリコシドからなるイソフラボン化合物をも含んでいるため、イソフラボングリコシドの抽出原料とすることができる。
＜イソフラボン化合物の製造法−任意の洗浄、乾燥＞
必要に応じて洗浄することにより、不要物を除去する。
また、乾燥は、＜イソフラボン化合物の製造法−脱脂生産物の乾燥＞で記述した方法を用いる。
乾燥により、所望のイソフラボン化合物濃縮物を得ることができる。
［実施例］
下記の実施例は、本発明を更に詳細に説明するものである。従って、下記の実施例は、本発明の内容を容易に理解するために単に例示列挙したものであって、何ら本発明の範囲を限定するものではない。
＜実施例１＞
原料として、我々の前記特許出願の明細書に記載した製造法（特願平６−３２３８５号）により、大豆胚軸に麹菌を接種することで製造した発酵大豆胚軸を用いて、イソフラボン化合物を分離し抽出した。具体的には、以下に示す通りである。
原料である発酵大豆胚軸を粉砕すきで約１００メッシュ程度に粉砕して、粉砕発酵大豆胚軸を調製した。
粉砕発酵大豆胚軸に３倍量のｎ−ヘキサンを加え、還流抽出を３時間行った。抽出後、固液分離し、脱脂生成物を乾燥した後の重量は脱脂前の約８９％であった。抽出後のｎ−ヘキサンにはイソフラボン化合物が抽出されていないことは薄層クロマトグラフィーによって、確認できた。
なお、十分な脱脂を行うためには同様の抽出をさらに２〜３回行うことが有効であると、この時点で確認した。
次いで、得られた乾燥脱脂発酵大豆胚軸に３倍量の酢酸エチルを加え、還流抽出を約３時間を行った後に、固液分離し、酢酸エチル分画をロータリーエバポレーターで減圧濃縮を行った。得られた濃縮乾固抽出物は原料重量に対して２〜５％であった。
なお、回収率を上げるには、酢酸エチルでの抽出を数回繰り返して行うことが好ましく、また、脱脂が不充分な場合には、濃縮乾固抽出物に対してｎ−ヘキサンを用いてさらに脱脂を行うことが好ましいことを、この時点において確認した。
次いで、濃縮乾固抽出物を少量の９９％エチルアルコールで溶解した後、エチルアルコールの濃度が約２０％なるまで加水希釈すると、不溶性物質が沈澱するので、しばらく静置した後、固液分離（濾紙を用いた濾過）を行い不溶物を分離し、減圧乾燥することによりイソフラボン化合物濃縮物を得ることができた。
イソフラボン化合物の回収率は４０〜７０％であった。
評価
得られたイソフラボン化合物濃縮物を合成吸着樹脂（例えば、ダイヤイオンＨＰ−２０、日本練水株式会社製）を充填した大型のカラムに供給し分離した。
この分離により、更にイソフラボン化合物を分取することができ、純度の高いダイジン、ゲニスチン、ダイゼイン、ゲニステインを高収率で得ることができた。
しかしながら、従来技術のように予め確実に原料を脱脂していない場合には、合成吸着樹脂を使用しても分取の効率が悪く、その結果、各イソフラボン化合物を得ることは困難であることが考えられる。
原料である発酵大豆胚軸と、本発明により製造したイソフラボン化合物濃縮物とについて、イソフラボン化合物の含有量を液体クロマトグラフィー法（Ｊ．Ａｇｉｃ，Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ３０，Ｐ３５３〜３５５記載の方法）を用いて測定した。
その測定結果は、以下の表Ｂに記載する通りである。
0004397525.tif 000004
表Ｂから、原料である発酵大豆胚軸に比べて、本発明により製造されたイソフラボン化合物の濃縮物は、含有されるイソフラボン化合物の量が、イソフラボングリコシドの場合は約１０〜１３倍、イソフラボンアグリコンの場合には約５７〜６４倍、と圧倒的に高いことが分かる。この結果から本発明がイソフラボン化合物を簡便で、効率よく、しかも高収率で製造することができることを証明している。
＜比較例１＞
脱脂大豆を原料とする通常の醤油製造方法で得られた醤油粕３００ｇを原料とし、特開平５−１７０７５６号明細書に記載された方法に準拠してイソフラボン化合物の製造を数回行った。
イソフラボン化合物の回収率は、約１０％を越えることはなかった。
原料である醤油粕と、製造したイソフラボン化合物の濃縮物とについて、イソフラボン化合物の含有量を＜実施例１＞と同一方法で数回測定したが、イソフラボン化合物の回収率が低く、また各イソフラボン化合物の純度が向上しなかった。
とくにダイジン、ゲニスチンにあっては、検出されなかった。
特開平５−１７０７５６号明細書に記載された方法に準拠してイソフラボン化合物の製造を行った場合、イソフラボン化合物の回収率は、本発明のイソフラボン化合物の製造法に比べて低いものであり、また、イソフラボン化合物濃縮物中の各イソフラボン化合物の純度を上げることは非常に困難であった。
この原因としては、本実施例において、ｎ−ヘキサンで脱脂した後の生成物は２９０ｇであり、ｎ−ヘキサンに溶解している脂質が３％以上であることが分かった。さらに、この脂質の特性を調べてみるとタールのように粘性が俳常に高いことが分かった。
このことから、特開平５−１７０７５６のように醤油粕から直接極性溶媒（８０％エタノール）で抽出を行うと、この粘性の高い脂質も同時に抽出され、極性の高い脂質と低い脂質が強く混合した状態となり、各々の成分の溶媒による分離が困難になったものと思われる。
このことは、元来、大豆に存在する脂質の種類が豊富であり、またそれぞれの極性が異なっているうえに、更に醤油製造中にこれらの脂質等が加水分解されて、非常に多くの成分が構成されるに至ったことに起因するものと考えられる。
従って、その後に、ｎ−ヘキサンで脱脂したとしても、イソフラボン化合物か脂質を分離することが困難になるとが、今回の実施例により理解できる。
しかしながら、＜実施例１＞に示すように、本発明のイソフラボン化合物の製造法によれば、イソフラボン化合物と脂質の分離はスムーズに行われた。
上記、実施例から理解できるように、本発明によるイソフラボン化合物の製造法は、従来技術に比べて、イソフラボン化合物および／またはその前駆体を有意量含有する原料を、先ず十分に脱脂した後、抽出分離を行うためイソフラボン化合物を、とりわけイソフラボンアグリコンを高収率により得ることができるものである。この点、前記［発明の概要］、実施例等において述べた通りである。
以上から、本発明による製造法は、イソフラボン化合物および／またはその前駆体を有意量含有する原料から、制癌効果、骨粗鬆症治療効果、免疫抑制効果、およびその他の医学的効果等に優れているイソフラボン化合物、とりわけイソフラボンアグリコンを高い濃度で、極めて容易な方法で、かつ低コストに製造することができる。本発明の製造法で生産されたイソフラボン化合物は、近年、その需要が極めて要求されている医薬、食品業界に原料として大量に供給することができる。また本発明の製造法で生産されたイソフラボン化合物は、個々のイソフラボンアグリコンの出発原料として用いることができる。