(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）または（ｂ）に記載のポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号：１に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド。
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２】
下記（ｃ）〜（e）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（ｃ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるDNAと高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、下記ｉ）およびｉｉ）に記載の理化学的性質を有する還元酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、下記ｉ）およびｉｉ）に記載の理化学的性質を有する還元酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、または、
（e）  配列番号：２に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、下記ｉ）およびｉｉ）に記載の理化学的性質を有する還元酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
ｉ）作用：２−オキソカルボン酸に作用して、Ｒ−ヒドロキシカルボン酸を生じる。
ｉｉ）基質特異性：２−オキソ−４−フェニル酪酸に作用してＲ−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸を生じる。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載のいずれかのポリヌクレオチドによってコードされる組み換えタンパク質。
【請求項４】
請求項１または請求項２に記載のいずれかのポリヌクレオチドが挿入されたベクター。
【請求項５】
配列番号：３に記載の塩基配列からなるターミネーターを請求項１または２に記載のポリヌクレオチドに対して作動可能に連結したことを特徴とする請求項４に記載のベクター。
【請求項６】
配列番号：３に記載の塩基配列からなるターミネーター。
【請求項７】
請求項１若しくは請求項２に記載のいずれかのポリヌクレオチド、および／または請求項４若しくは請求項５に記載のベクターを発現可能に保持する形質転換体。
【請求項８】
請求項７に記載の形質転換体を培養し、発現産物を回収する工程を含む、請求項３に記載のタンパク質を製造する方法。
【請求項９】
請求項３に記載のタンパク質、および／または請求項７に記載の形質転換体を、下記式（１）
【化１】
式（１）
0004397088.tif 000014
（式中、X1、X2は、同一かまたは異なっていてもよい、H、NH4、金属原子、n=1-4）で表される2-オキソカルボン酸、またはその塩に作用させることを特徴とする、R-2-ヒドロキシカルボン酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、還元酵素をコードする遺伝子、そして形質転換体を用いたR-2-ヒドロキシカルボン酸の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
酵素は高い触媒機能をもつだけでなく、基質特異性、反応特異性とともに、立体特異性を示す。酵素の立体特異性は、いくつかの例外はあるものの、ほとんど絶対的といえる。
さて、近年における研究の精密化に伴い、医薬品、農薬、飼料、香料などの分野で光学活性体を扱うことの重要性が増している。光学異性体は生理活性をまったく異にする場合があるため、それらを特異的に得るための技術は重要である。たとえばサリドマイドは、D（R）体は催奇性を持たないが、L（S）体には強い催奇形成がある。そのラセミ体を実用に供したことが、サリドマイドによる薬害事件を引き起こす原因となった。更に対掌体の一方のみが有効な生理活性を示す場合、両者の共存によって、もう一方の異性体が単に活性を持たないという問題のみならず、有効な対掌体に対して競合阻害をもたらす。その結果、ラセミ体の生物活性が有効な対掌体に対して1／2以下に激減してしまうこともある。従って、光学的に純粋な対掌体をいかにして入手（合成または分割）するかは、産業上重要な課題となっている。
【０００３】
これまで2-オキソカルボン酸に作用して、Ｒ−ヒドロキシカルボン酸を生じる酵素としてLeuconostoc属の乳酸菌の酵素が知られている。(Biosci.Biotech.Biochem.,57(1),160-161(1993))また、 Leuconostoc属の乳酸菌を用いたＲ−ヒドロキシカルボン酸の製造方法も知られている。(Biosci.Biotech.Biochem.,56(12),2066-2067(1992)他）しかしながら、野生株による酵素の生産量は少なく、Ｒ−ヒドロキシカルボン酸を生産するには大量の菌体が必要である。したがって、この種の酵素を安価に、そして大量に生産することができる方法が望まれていた。
このような要求に対しては、必要な酵素をコードする遺伝子の単離と、得られた遺伝子による形質転換体を用いた酵素の大量生成が有効である。しかし、目的とする遺伝子の単離とクローニングは難しく、現在のところ、クローニングに成功したという報告は無い。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、2-オキソカルボン酸を基質としてＲ−ヒドロキシカルボン酸を生成することができる還元酵素をコードする遺伝子の提供を課題とする。更に本発明は、この遺伝子の発現によって得られる組み換え体、並びにその用途の提供を課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために、Leuconostoc属の乳酸菌から酵素を精製しその部分アミノ酸配列から遺伝子をクローニングして、遺伝子の塩基配列の解明を試みた。このとき、本酵素遺伝子のORFの両末端に適当な制限酵素認識部位が存在しなかったため、利用しやすい制限酵素の認識部位を導入したプライマーを作成した。更に、プライマーがアニーリングしやすいように、６塩基の認識配列以外は本酵素遺伝子配列と同じにした。本発明者らは、このようなクローニング手法によって、目的とする還元酵素の遺伝子のクローニングにはじめて成功した。
また、プラスミドの構築においては、まずpUC18のlacプロモーターとアミノ酸フレームをあわせることと、できるだけORFの上流につくペプチドを少なくするために、制限酵素としてEcoRIを使用した。更に、本発明の遺伝子の発現を効率的に行うために発現制御領域の最適化を行った。加えて、新規なターミネーターとの組み合わせによって、更に目的とする酵素の発現を増強できることを見出した。本発明のポリヌクレオチド、このポリヌクレオチドがコードするタンパク質、並びにそれらの変異体、そしてこれらタンパク質を発現する形質転換体は、これらの知見に基づいて完成されたものである。
次いで、本発明者らは、この形質転換体を用いて2-オキソカルボン酸を基質としてＲ−ヒドロキシカルボン酸を生成することに成功した。すなわち本発明は、以下のポリヌクレオチド、それによってコードされるタンパク質、並びその製造方法、及びこのタンパク質によるＲ−ヒドロキシカルボン酸の合成方法に関する。
【０００６】
〔１〕下記（ａ）または（ｂ）に記載のポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号：１に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド。
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
〔２〕下記（ｃ）または（ｄ）に記載のポリヌクレオチド。
（ｃ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、下記ｉ）およびｉｉ）に記載の作用を有する還元酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（ｄ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、下記ｉ）およびｉｉ）に記載の理化学的性質を有する還元酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
ｉ）作用：２−オキソカルボン酸に作用して、Ｒ−ヒドロキシカルボン酸を生じる。
ｉｉ）基質特異性：２−オキソ−４−フェニル酪酸に作用してＲ−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸を生じる。
〔３〕〔１〕または〔２〕に記載のいずれかのポリヌクレオチドによってコードされる組み換えタンパク質。
〔４〕〔１〕または〔２〕に記載のいずれかのポリヌクレオチドが挿入されたベクター。
〔５〕配列番号：３に記載の塩基配列からなるターミネーターを〔１〕または〔２〕に記載のポリヌクレオチドに対して作動可能に連結したことを特徴とする〔４〕に記載のベクター。
〔６〕配列番号：３に記載の塩基配列からなるターミネーター。
〔７〕〔１〕若しくは〔２〕に記載のいずれかのポリヌクレオチド、および／または〔４〕若しくは〔５〕に記載のベクターを発現可能に保持する形質転換体。
〔８〕〔７〕に記載の形質転換体を培養し、発現産物を回収する工程を含む、〔３〕に記載のタンパク質を製造する方法。
〔９〕配列番号：１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド、またはその相補鎖とハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するポリヌクレオチド。
〔１０〕〔９〕に記載のポリヌクレオチドを含む〔１〕または〔２〕に記載のポリヌクレオチド合成用プライマー。
〔１１〕〔９〕に記載のポリヌクレオチドを含む〔１〕または〔２〕に記載のポリヌクレオチド検出用プローブ。
〔１２〕〔３〕に記載のタンパク質、および／または〔７〕に記載の形質転換体を、下記式（１）で表される2-オキソカルボン酸、またはその塩に作用させることを特徴とする、R-2-ヒドロキシカルボン酸の製造方法。
【化２】
式（１）
0004397088.tif 000002
（式中、X1、X2は、同一かまたは異なっていてもよい、H、NH4、金属原子、n=1-4）
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明は、還元酵素をコードするポリヌクレオチドおよびそのホモログに関する。本発明の還元酵素をコードするポリヌクレオチドは、たとえば配列番号：１に示す塩基配列を含む。配列番号：１に示す塩基配列は、配列番号：２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質をコードしており、このアミノ酸配列を含むタンパク質は、本発明による還元酵素の好ましい態様を構成する。ところでアミノ酸をコードするコドンは単一ではなく、縮重によって複数のコドンが対応することは周知の事項である。したがって、配列番号：２に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列には、配列番号：１に示す塩基配列のみならず、異なるコドンに基づくあらゆる塩基配列が含まれる。
【０００８】
本発明の還元酵素をコードするポリヌクレオチドのホモログとは、配列番号：２に記載のアミノ酸配列、あるいは配列番号：２に記載のアミノ酸配列に１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含み、かつ次の理化学的性質ｉ）およびｉｉ）を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。
ｉ）作用：２−オキソカルボン酸に作用して、Ｒ−ヒドロキシカルボン酸を生じる。
ｉｉ）基質特異性：２−オキソ−４−フェニル酪酸に作用してＲ−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸を生じる。
当業者であれば、配列番号：１記載のＤＮＡに部位特異的変異導入法（Nucleic Acid Res. 10,pp.6487(1982) , Methods in Enzymol.100,pp.448(1983), Molecular Cloning 2ndEdt., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989) , PCR A Practical Approach IRL Press pp.200(1991)などを用いて、適宜置換、欠失、挿入、および／または付加変異を導入することによりポリヌクレオチドのホモログを得ることが可能である。あるいは、配列番号：１の塩基配列がLeuconostoc oenos ATCC 27310株に由来するものであるのに対して、この他の種から本発明の開示に基づいて得ることができる機能的に同等な酵素活性を持つタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、本発明におけるホモログを構成する。これらのホモログは、天然に存在するホモログと言うことができる。
本発明のポリヌクレオチドは、DNA、あるいはRNAであることができ、その構造は１本鎖であっても良いし相補鎖との２本鎖を構成したものであることもできる。本発明のポリヌクレオチドの長さは制限されない。更に本発明のポリヌクレオチドは、天然の、あるいは人工的なヌクレオチド誘導体で構成されたものであっても良い。また各種の標識やタグによって修飾されたものであることもできる。加えて、本発明のポリヌクレオチドには、ゲノムやcDNAに由来するもの、また人工的に合成されたポリヌクレオチド等が含まれる。
【０００９】
本発明のポリヌクレオチドのホモログは、配列番号：１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズでき、かつ、2-オキソカルボン酸に作用し、 R-2-ヒドロキシカルボン酸を生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドも含む。ストリンジェントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチドとは、配列番号：１に記載中の任意の少なくとも２０個、好ましくは少なくとも３０個、たとえば４０、６０または１００個の連続した配列を一つ、または複数選択したＤＮＡをプローブＤＮＡとし、たとえば ECL direct nucleic acid labeling and detection system (Amersham Pharmaica Biotech社製)を用いて、マニュアルに記載の条件（wash：42℃、0.5x SSCを含むprimary wash buffer)において、ハイブリダイズするＤＮＡを指す。
【００１０】
さらに、本発明のポリヌクレオチドのホモログは、配列番号：２に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０%、好ましくは少なくとも８０%または９０%、より好ましくは９５%以上のホモロジーを有するタンパク質をコードするＤＮＡを含む。タンパク質のホモロジー検索は、たとえば DNA Databank of JAPAN(DDBJ)を対象に、FASTA programや BLAST programなどを用いて行うことができる。
【００１１】
本発明は、配列番号：２に記載のアミノ酸配列を含み、かつ、2-オキソカルボン酸に作用し、 R-2-ヒドロキシカルボン酸を生成する活性を有する還元酵素、及びそのホモログを含む。配列番号：２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質は、本発明による還元酵素の好ましい態様を構成する。
【００１２】
本発明の還元酵素のホモログとは、配列番号：２に記載のアミノ酸配列に１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含む。当業者であれば、配列番号：１記載のＤＮＡに部位特異的変異導入法（Nucleic Acid Res. 10,pp.6487(1982) , Methods in Enzymol.100,pp.448(1983), Molecular Cloning 2ndEdt., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989) , PCR A Practical Approach IRL Press pp.200(1991) ）などを用いて、適宜置換、欠失、挿入、および／または付加変異を導入することにより本発明による還元酵素のホモログをコードするポリヌクレオチドを得ることができる。得られたポリヌクレオチドを宿主に導入して発現させることにより、配列番号：２に記載の還元酵素のホモログを得ることが可能である。
【００１３】
本発明の還元酵素をコードするポリヌクレオチドは、たとえば、以下のような方法によって単離することができる。すなわち、還元酵素産生能を有する乳酸菌のゲノムライブラリーを、配列番号：１に示す塩基配列から選択された塩基配列を含むＤＮＡをプローブとしてスクリーニングすることにより、本発明のポリヌクレオチドを単離することができる。配列番号：１に示す塩基配列がLeuconostoc oenos ATCC 27310株に由来するものなので、この菌株から調製したライブラリーを用いて本発明のポリヌクレオチドを単離することができる。また近縁の乳酸菌や、あるいは他種の乳酸菌に由来するライブラリーを利用することによって、本発明におけるホモログを単離することもできる。
【００１４】
乳酸菌のゲノムライブラリーは、公知の方法によって得ることができる。すなわち、まず乳酸菌の培養物を集めて、これを物理的に、あるいは酵素的に破壊する。具体的には、たとえば菌体の凍結等により細胞壁を破壊することができる。更に核分画を集めて、フェノール／クロロホルム等で核酸を抽出し、制限酵素等でランダムに切断する。ランダムに切断されたゲノムの断片を、適当なクローニングベクターに挿入すればゲノムライブラリーを得ることができる。
【００１５】
これらのライブラリーに対して、好ましくは先に述べたようなストリンジェントな条件下でプローブをハイブリダイズさせる。ポジティブクローンを集めてその塩基配列を決定し、本発明によるポリヌクレオチドであることが確認される。単離されたポリヌクレオチドがタンパク質翻訳領域の全長を含まない場合には、得られた塩基配列情報に基づいて全長塩基配列を得ることができる。未知の領域をPCRによって増幅する方法として、染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で消化後、自己環化させたＤＮＡを鋳型として逆ＰＣＲを行う方法（Genetics 120, 621-623(1988)）が公知である。あるいは、DNA断片の末端にリンカーをライゲーションしてPCRを行うＲＡＣＥ法（Rapid Amplification of cDNA End、「ＰＣＲ実験マニュアル」p25-33,ＨＢＪ出版局）も公知である。
【００１６】
更に、配列番号：１または配列番号：２５に示す塩基配列に基づいて設定されたプライマーを用い、ＰＣＲ法を利用して本発明のポリヌクレオチドを得ることもできる。すなわち、先に述べたゲノムライブラリーを鋳型として、ＰＣＲ法を行い、目的とする長さの断片を回収する。これを適当なクローニングベクターに挿入してクローニングすることにより、本発明のポリヌクレオチドを単離することができる。プライマーとしてディジェネレーティブ・プライマーを用いることによって、配列番号：１のみならず、この塩基配列と相同性の高いホモログを合成することもできる。与えられた塩基配列に基づいて、その配列を増幅することができるプライマーやホモログを増幅しうるディジェネレーティブ・プライマーを設計することは、当業者が日常的に行っていることである。なお本発明のポリヌクレオチドは、以上のような方法によってクローニングされたゲノムＤＮＡ、あるいはｃＤＮＡの他、合成によって得ることもできる。
【００１７】
このようにして単離された、本発明による還元酵素をコードするポリヌクレオチドを公知の発現ベクターに挿入することにより、還元酵素発現ベクターが提供される。また、この発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養することにより、本発明の還元酵素を組み換え体から得ることができる。
本発明において還元酵素を発現させるために、形質転換の対象となる微生物は、還元酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組み換えベクターにより形質転換され、還元酵素活性を発現することができる生物であれば特に制限はない。利用可能な微生物としては、たとえば以下のような微生物を示すことができる。
【００１８】
エシェリヒア(Escherichia)属
バチルス(Bacillus)属
シュードモナス(Pseudomonas)属
セラチア(Serratia)属
ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属
コリネバクテリイウム(Corynebacterium)属
ストレプトコッカス(Streptococcus)属
ラクトバチルス(Lactobacillus)属など宿主ベクター系の開発されている細菌
ロドコッカス(Rhodococcus)属
ストレプトマイセス(Streptomyces)属など宿主ベクター系の開発されている放線菌
サッカロマイセス(Saccharomyces)属
クライベロマイセス(Kluyveromyces)属
シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属
チゴサッカロマイセス(Zygosaccharomyces)属
ヤロウイア(Yarrowia)属
トリコスポロン(Trichosporon)属
ロドスポリジウム(Rhodosporidium)属
ハンゼヌラ(Hansenula)属
ピキア(Pichia)属
キャンディダ(Candida)属などの宿主ベクター系の開発されている酵母
ノイロスポラ(Neurospora)属
アスペルギルス(Aspergillus)属
セファロスポリウム(Cephalosporium)属
トリコデルマ(Trichoderma)属などの宿主ベクター系の開発されているカビ
【００１９】
形質転換体の作製のための手順および宿主に適合した組み換えベクターの構築は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うことができる（例えば、Sambrookら、モレキュラー・クローニング、Cold Spring Harbor Laboratories)。微生物中などにおいて、本発明のD-アミノアシラーゼ遺伝子を発現させるためには、まず微生物中において安定に存在するプラスミドベクターやファージベクター中にこのＤＮＡを導入し、その遺伝情報を転写・翻訳させる必要がある。そのためには、転写・翻訳を制御するユニットにあたるプロモーターを本発明のＤＮＡ鎖の5'-側上流に、より好ましくはターミネーターを3'-側下流に、それぞれ組み込めばよい。このプロモーター、ターミネーターとしては、宿主として利用する微生物中において機能することが知られているプロモーター、ターミネーターを用いる必要がある。これら各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター、ターミネータ−などに関して「微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版」、特に酵母に関しては、Adv. Biochem. Eng. 43, 75-102(1990)、Yeast 8, 423-488(1992)、などに詳細に記述されている。
【００２０】
例えばエシェリヒア属、特に大腸菌エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)においては、プラスミドベクターとして、pBR、pUC系プラスミドを利用でき、lac(β−ガラクトシダーゼ)、trp(トリプトファンオペロン)、tac、trc(lac、trpの融合)、λファージPＬ、PＲなどに由来するプロモーターなどが利用できる。また、ターミネーターとしては、trpA由来、ファージ由来、rrnBリボソーマルＲＮＡ由来のターミネーターなどを用いることができる。
【００２１】
バチルス属においては、ベクターとしてpUB110系プラスミド、pC194系プラスミドなどが利用可能であり、染色体にインテグレートすることもできる。また、プロモーター、ターミネーターとしてapr(アルカリプロテアーゼ)、npr(中性プロテアーゼ)、amy(α−アミラーゼ)などが利用できる。
シュードモナス属においては、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)、シュードモナス・セパシア(Pseudomonas cepacia)などで宿主ベクター系が開発されている。トルエン化合物の分解に関与するプラスミドTOLプラスミドを基本にした広宿主域ベクター(RSF1010などに由来する自律的複製に必要な遺伝子を含む）pKT240などが利用可能であり、プロモーター、ターミネーターとして、リパーゼ（特開平5-284973）遺伝子などが利用できる。
【００２２】
ブレビバクテリウム属特に、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム(Brevibacterium lactofermentum)においては、pAJ43(Gene 39, 281(1985))などのプラスミドベクターが利用可能である。プロモーター、ターミネーターとしては、大腸菌で使用されているプロモーター、ターミネーターがそのまま利用可能である。
コリネバクテリウム属、特にコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)においては、pCS11(特開昭57-183799)、pCB101(Mol. Gen. Genet. 196, 175(1984)などのプラスミドベクターが利用可能である。
ストレプトコッカス(Streptococcus)属においては、pHV1301(FEMS Microbiol. Lett. 26, 239(1985)、pGK1（Appl. Environ. Microbiol. 50, 94(1985)）などがプラスミドベクターとして利用可能である。
【００２３】
ラクトバチルス(Lactobacillus)属においては、ストレプトコッカス属用に開発されたpAMβ1（J. Bacteriol. 137, 614(1979)）などが利用可能であり、プロモーターとして大腸菌で利用されているものが利用可能である。
ロドコッカス(Rhodococcus)属においては、ロドコッカス・ロドクロウス(Rhodococcus rhodochrous)から単離されたプラスミドベクターが使用可能である(J. Gen. Microbiol. 138,1003(1992))。
【００２４】
ストレプトマイセス(Streptomyces)属においては、HopwoodらのGenetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratories(1985)に記載の方法に従って、プラスミドを構築することができる。特に、ストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans)においては、pIJ486 (Mol. Gen. Genet. 203, 468-478, 1986)、pKC1064(Gene 103,97-99(1991) )、pUWL-KS (Gene 165,149-150(1995) )が使用できる。また、ストレプトマイセス・バージニア(Streptomyces virginiae)においても、同様のプラスミドを使用することができる（Actinomycetol. 11, 46-53(1997))
サッカロマイセス(Saccharomyces)属、特にサッカロマイセス・セレビジアエ(Saccharomyces cerevisiae) においては、YRp系、YEp系、YCp系、YIp系プラスミドが利用可能であり、染色体内に多コピー存在するリボソームＤＮＡとの相同組み換えを利用したインテグレーションベクター（EP 537456など）は、多コピーで遺伝子を導入でき、かつ安定に遺伝子を保持できるため極めて有用である。また、ADH(アルコール脱水素酵素)、GAPDH(グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素)、PHO(酸性フォスファターゼ)、GAL(β−ガラクトシダーゼ)、PGK(ホスホグリセレートキナーゼ)、ENO(エノラーゼ)などのプロモーター、ターミネーターが利用可能である。
【００２５】
クライベロマイセス属、特にクライベロマイセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)においては、サッカロマイセス・セレビジアエ由来2μm系プラスミド、pKD1系プラスミド（J. Bacteriol. 145, 382-390(1981)）、キラー活性に関与するpGKl1由来プラスミド、クライベロマイセス属における自律増殖遺伝子KARS系プラスミド、リボソームＤＮＡなどとの相同組み換えにより染色体中にインテグレート可能なベクタープラスミド（EP 537456など）などが利用可能である。また、ADH、PGKなどに由来するプロモーター、ターミネーターが利用可能である。
シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属においては、シゾサッカロマイセス・ポンベ由来のARS (自律複製に関与する遺伝子)及びサッカロマイセス・セレビジアエ由来の栄養要求性を相補する選択マーカーを含むプラスミドベクターが利用可能である（Mol. Cell. Biol. 6, 80(1986)）。また、シゾサッカロマイセス・ポンベ由来のADHプロモーターなどが利用できる（EMBO J. 6, 729(1987)）。特に、pAUR224は、宝酒造から市販されており容易に利用できる。
【００２６】
チゴサッカロマイセス属(Zygosaccharomyces)においては、チゴサッカロマイセス・ロウキシ (Zygosaccharomyces rouxii)由来のpSB3（Nucleic Acids Res. 13, 4267(1985)）などに由来するプラスミドベクターが利用可能であり、サッカロマイセス・セレビジアエ由来PHO5プロモーターや、チゴサッカロマイセス・ロウキシ由来GAP-Zr(グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素)のプロモーター（Agri.Biol. Chem. 54, 2521(1990)）などが利用可能である。
ハンゼヌラ(Hansenula)属においては、ハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)において宿主ベクター系が開発されている。ベクターとしては、ハンゼヌラ・ポリモルファ由来自律複製に関与する遺伝子（HARS1、HARS2）も利用可能であるが、比較的不安定であるため、染色体への多コピーインテグレーションが有効である（Yeast 7, 431-443(1991)）。また、メタノールなどで誘導されるAOX（アルコールオキシダーゼ)、FDH(ギ酸脱水素酵素)のプロモーターなどが利用可能である。
【００２７】
ピキア(Pichia)属においては、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)などにピキア由来自律複製に関与する遺伝子(PARS1、PARS2)などを利用した宿主ベクター系が開発されており（Mol. Cell. Biol. 5, 3376(1985)）、高濃度培養とメタノールで誘導可能な AOXなど強いプロモーターが利用できる（Nucleic Acids Res. 15, 3859(1987)）。
キャンディダ(Candida)属においては、キャンディダ・マルトーサ(Candida maltosa)、キャンディダ・アルビカンス(Candida albicans)、キャンディダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、キャンディダ・ウチルス(Candida utilis)などにおいて宿主ベクター系が開発されている。キャンディダ・マルトーサにおいてはキャンディダ・マルトーサ由来ＡＲＳがクローニングされ（Agri. Biol. Chem. 51, 51, 1587(1987)）、これを利用したベクターが開発されている。また、キャンディダ・ウチルスにおいては、染色体インテグレートタイプのベクターは強力なプロモーターが開発されている（特開平08-173170）。
【００２８】
アスペルギルス(Aspergillus)属においては、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、アスペルギルス・オリジー(Aspergillus oryzae)などがカビの中で最もよく研究されており、プラスミドや染色体へのインテグレーションが利用可能であり、菌体外プロテアーゼやアミラーゼ由来のプロモーターが利用可能である（Trends in Biotechnology 7, 283-287(1989)）。
トリコデルマ(Trichoderma)属においては、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)を利用したホストベクター系が開発され、菌体外セルラーゼ遺伝子由来プロモーターなどが利用できる（Biotechnology 7, 596-603(1989)）。
【００２９】
本発明はまた、配列番号：３に記載の塩基配列からなるターミネーターと、これを用いた本発明による前記還元酵素の組み換え体の製造方法に関する。本発明のポリヌクレオチドとして配列番号：１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドを用い、大腸菌を宿主として発現させるとき、配列番号：３に示すターミネーターを組み合わせることによって、より高度な発現が期待できる。配列番号：３の塩基配列からなるターミネーターは、もともと本発明の還元酵素が単離されたLeuconostoc oenosのゲノムに由来する新規な遺伝子である。この新規なターミネーターを本発明のポリヌクレオチドの下流に配置するとき、公知のエンハンサーやターミネーターでは期待できないほどの高度な発現が見られる。したがって、本発明のポリヌクレオチドの発現に当たり、配列番号：３に記載のターミネーターを用いるのは、望ましい態様である。
【００３０】
また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が開発されており、特に蚕を用いた昆虫（Nature 315, 592-594(1985)）や菜種、トウモロコシ、ジャガイモなどの植物中に大量に異種タンパク質を発現させる系が開発されており、好適に利用できる。
【００３１】
本発明の還元酵素をコードするポリヌクレオチドで形質転換された宿主微生物は、公知の情報に従って培養され、その培養物から本発明による還元酵素を回収することができる。培地としては炭素源、窒素源、無機物およびその他の栄養素を適量含有する培地ならば、合成培地または天然培地のいずれでも使用可能であり、液体培地または固体培地を使用することができる。
具体的には、炭素源として、グルコース、フルクトース、マルトース、ガラクトース、澱粉、澱粉加水分解物、糖蜜、廃糖蜜などの糖類、麦、とうもろこしなどの天然炭水化物、グリセロール、メタノール、エタノールなどのアルコール類、酢酸、グルコン酸、ピルビン酸、クエン酸などの脂肪酸類、ノルマルパラフィンなどの炭化水素類、グリシン、グルタミン、アスパラギンなどのアミノ酸類等の一般的な炭素源より使用するかびの資化性を考慮して、適宜一種または二種以上選択して使用する。窒素源としては、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、大豆加水分解物、ミルクカゼイン、カザミノ酸、各種アミノ酸、コーンスティープリカー、その他の動物、植物、微生物の加水分解物などの有機窒素化合物、アンモニア、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化ナトリウムなどのアンモニウム塩、硝酸ナトリウムなどの硝酸塩、尿素などの無機窒素化合物より使用かびの資化性を考慮して、適宜一種または二種以上選択して使用する。
さらに、無機塩として微量のマグネシウム、マンガン、カリウム、カルシウム、ナトリウム、銅、亜鉛などのリン酸塩、塩酸塩、硝酸塩、酢酸塩等より適宜一種または二種以上を選択して使用することができる。また、必要に応じて植物油、界面活性剤、シリコンなどの消泡剤を添加してもよい。
培養は前記培地成分を含有する液体培地中で振とう培養、通気攪拌培養、連続培養、流加培養などの通常の培養方法を用いて行うことができる。
培養条件は、培養の種類、培養方法により適宜選択すればよく、該菌株が増殖し、還元酵素を産生できる条件であれば特に制限はない。通常は、培養開始時のpHを4から10、好ましくは6から8に調節し、15から50℃、好ましくは25から35℃の温度条件下で培養することが望ましい。
【００３２】
十分に菌体が増殖した後に、あるいは増殖過程において、形質転換体の外来遺伝子の発現を誘導する条件を与える。たとえばlacプロモーターに対しては、IPTGを与えることにより、その下流に連結されている外来遺伝子の発現が誘導される。あるいは温度感受性プロモーターであれば、発現に必要な温度条件で培養を行う。
【００３３】
培養時間は、十分量の還元酵素活性を有する菌体が得られれば特に制限はなく、通常は1日から14日、このましくは1日から3日培養する。遺伝子発現に伴ってに生産蓄積された本発明の還元酵素は、次のような方法で採取、分取することができる。
【００３４】
還元酵素が菌体内に蓄積される場合には、培養終了後、菌体をろ過、遠心分離等の方法で集め、緩衝液、生理食塩水等で菌体を洗浄後、例えば、凍結融解処理、超音波処理、加圧処理、浸透圧差処理、磨砕処理などの物理手段、もしくはリゾチームなどの細胞壁溶解酵素処理のような生化学的処理もしくは界面活性剤との接触処理などの化学的処理を単独または組み合わせて行うことにより菌体を破砕し、還元酵素を抽出することができる。こうして得られた粗還元酵素は、塩析、有機溶媒などによる分別沈殿、塩析クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、色素クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィーをオープンカラム、中圧クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）によって行う分離および等電点電気泳動、native-電気泳動などの電気泳動法による分離等の手段を単独もしくは組み合わせて用いることにより精製することができる。
【００３５】
具体的には、例えば、ろ過や遠心分離で集めた菌体を凍結、粉砕処理後緩衝液に懸濁し、Dyno Millを用いて磨砕処理し、還元酵素抽出液を得て、その後、硫安を用いた塩析処理、DEAE-Sepharose FF イオン交換クロマトグラフィー、Phenyl-Sepharose FF 疎水クロマトグラフィー、Superdex200 ゲルろ過クロマトグラフィー、Mono Q イオン交換クロマトグラフィーを行い、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動的に単一のバンドに精製することができる。
【００３６】
このようにして精製された配列番号：２に示すアミノ酸配列からなる本発明による還元酵素は、下記の(a)から(f)の理化学的性質を有する。
(a)作用： ２−オキソカルボン酸を還元してR-2-ヒドロキシカルボン酸を生成する。
(b)分子量：SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動における分子量が約33000Daである。
(c)基質特異性：
(d)温度安定性：pH9.5で30分間熱処理した場合、45℃では安定であり、60℃以上では失活する。
(e)至適温度：pH7.5で反応させる場合、温度約45℃において作用が至適である。
(f)安定化剤：還元剤によって、その活性が安定に保持され、さらにICH3CONH2で活性化される。
【００３７】
本発明による還元酵素の基質特異性は、次のようにして確認することができる。例えば、酵素活性測定法として、10 mMの基質(2-オキソ-4-フェニル酪酸)、0.1 mMのNADPH、100 μMのリン酸緩衝液(pH 6.0)及び酵素液を含む全容2 mlの反応液を調製した。この反応液の37℃,340 nmにおけるNADPHの吸光度の減少を分光光度計(MILTON ROY SPECTRONIC 3000 ARRAY)で測定した。以上の反応系で基質を含まないものをブランクとして使用した。この条件において１分間に1 μMのNADPHが酸化される酵素量を１単位(U)とし、比活性はタンパク質1 mgあたりの単位数として算出した。タンパク質の測定は牛血清アルブミン(BSA)を標準物質としてLowry法により測定した。
このような解析結果によれば、配列番号：２に示すアミノ酸配列からなる本発明の還元酵素は、2-オキソ-4-フェニル酪酸の他に特に次の基質に対して特に良く作用することが確認された。各基質に対する2-オキソ-4-フェニル酪酸との反応性を１００としたときの相対活性を以下に示す。
2-オキソヘプタン酸（１３２）
2-オキソオクタン酸（１１２）
2-オキソヘキサン酸（１００）
本発明の還元酵素は、種々の2-オキソカルボン酸に作用して、Ｒ−ヒドロキシカルボン酸を生じる性質を有するため、本発明の還元酵素を用いてＲ−ヒドロキシカルボン酸を工業的に有利に製造することが可能である。
【００３８】
適用可能な2-オキソカルボン酸酸としては特に制限されず、広い範囲の化合物から選択できる。代表的な2-オキソカルボン酸は、式（１）で表される2-オキソカルボン酸である。中でも2-オキソ-4-フェニル酪酸は、医薬品などの中間体として用いられるR-2-ヒドロキシ-4-フェニル酪酸を生じる有用な基質である。
【化３】
式（１）
0004397088.tif 000003
（式中、X1、X2は、同一かまたは異なっていてもよい、H、NH4、金属原子、n=1-4）
【００３９】
本発明においてＲ−ヒドロキシカルボン酸の製造に用いられる還元酵素としては、精製酵素の他、部分精製酵素も含まれる。また、本発明においては、これら酵素タンパク質を用いるだけでなく、還元酵素産生能を有する形質転換体自体を用いることも可能である。すなわち、還元酵素産生能を有する形質転換体を直接2-オキソカルボン酸に作用させて、Ｒ−２−ヒドロキシカルボン酸を製造することも可能である。
【００４０】
還元酵素、または還元酵素産生能を有する形質転換体を2-オキソカルボン酸に作用させる際には、還元酵素の活性や安定性、還元酵素産生能を有する乳酸菌の反応性にとって好ましい条件を選択する。本発明による還元酵素が金属イオンによる活性阻害を防ぐために、反応液にEDTAなどのキレート剤を添加することができる。
反応の基質である2-オキソカルボン酸の濃度に特に制限はないが、通常0.1〜30%程度の濃度が用いられる。反応収率は５０−１００％である場合が多い。使用する還元酵素の量は大量に使用すれば反応が速く進む場合が多いが、通常は1U〜1000U/ml程度用いられる。反応温度は還元酵素がその活性を発現できる温度に維持することが好ましく、特に30から50℃に維持することが好ましい。また反応pHも、還元酵素がその活性を発現できるpHに維持することが好ましくpH4〜10で行われる。また、攪拌下、あるいは静置下で行うことができる。
【００４１】
一般に酵素や微生物は、固定化することによって安定化される。固定化する方法としては、ポリアクリルアミドゲル法、含硫多糖ゲル法（カラギーナンゲル法）、アルギン酸ゲル法、寒天ゲル法などの公知の方法を用いることができる。固定化した酵素や微生物による反応時間は、D-アミノアシラーゼの量と基質量に左右される。当業者は、経験的にこれらの条件を最も理想的な条件に最適化することができる。通常は10〜100時間の反応により、目的とする反応生成物を効率良く得ることができる。
【００４２】
反応液から反応により生じたＲ−２−ヒドロキシカルボン酸は、例えば、濃縮、等電点沈殿などによる直接結晶法やイオン交換樹脂処理、膜分離などの公知の方法により回収することができる。例えば２−オキソ−４−フェニル酪酸としてＲ−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸を生成した場合、酸性下で酢酸エチル等の有機溶媒で抽出することによって、反応液からＲ−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸を採取する。
【００４３】
【実施例】
以下に、本発明を実施例をあげて説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
［実施例１］還元酵素の精製
Leuconostoc oenos ATCC 27310株の培養方法
保存stab培地で、30℃、18時間培養を行い、500 mlの前培養培地［Glucose 8 %(w/v), Yeast extract 2 %(w/v), MnSO4・6H2O, CaCO3 2 %(w/v); pH 7.0］に二白金線分接種し、30℃で30時間、静置培養した。この後、本培養として培地7 lの10 l容ジャーファーメンター(丸菱、MDL 1000)に前培養培地500 mlを接種し、37℃で200 rpm、通気量1 vvmで18時間培養を行った。この培養液から6000 rpm、10分間の遠心分離により菌体の回収を行い、生理食塩水に懸濁し、洗浄を行った。この懸濁液を再度、遠心分離して菌体回収を行い、湿菌体を得た。
保存stab培地：
Glucose 20 g/l
Yeast extract 10 g/l
Polypepton 10 g/l
CH3COONa・3H2O 10 g/l
MgSO4・5H2O 0.01 g/l
FeSO4・7H2O 0.01 g/l
NaCl 0.01 g/l
Agar 15 g/l
CaCO3  10 g/l; pH 6.8
【００４４】
粗酵素液の調製
得られた湿菌体に0.02 %(w/v) の2-メルカプトエタノールを含む10 mMリン酸緩衝液(pH 7.2)を50 %(w/v)となるように加え懸濁した。この菌体を氷冷下で、超音波破砕機(BRANSON SONIFIER)を用いて破砕した。これを、15,000 rpm, 10分間遠心分離機により上清を回収し、粗酵素液とした。
【００４５】
酵素活性測定法
酵素活性測定法として、10 mMの基質(2-オキソ-4-フェニル酪酸)、0.1 mMのNADPH、100 μMのリン酸緩衝液(pH 6.0)及び酵素液を含む全容2 mlの反応液を調製した。この反応液の37℃,340 nmにおけるNADPHの吸光度の減少を分光光度計(MILTON ROY SPECTRONIC 3000 ARRAY)で測定した。以上の反応系で基質を含まないものをブランクとして使用した。この条件において１分間に1 μMのNADPHが酸化される酵素量を１単位(U)とし、比活性はタンパク質1 mgあたりの単位数として算出した。タンパク質の測定は牛血清アルブミン(BSA)を標準物質としてLowry法により測定した。
【００４６】
結果と考察
１回のジャー培養7 lの培地あたり、約40 gの湿菌体を得ることができた。この菌体を破砕して得られた粗酵素液中のタンパク質量は、本酵素精製のために十分量であると考えられたため、これを用いて2-オキソ-4-フェニル酪酸還元酵素の精製を行っていくことにした。
【００４７】
2-オキソ-4-フェニル酪酸還元酵素の精製
精製方法の検討の結果、以下に示したような方法により0〜4℃のもとでOPBRaseの精製を行った。なお、以下で述べるリン酸緩衝液はすべて0.02 %(w/v)の2-メルカプトエタノールを含む10 mMリン酸カリウム緩衝液(pH 7.2)を用いた。
【００４８】
硫酸アンモニウムによる塩析
L. oenos ATCC 27310株の菌体を破砕して得られた粗酵素液に60 %飽和となるように氷冷下、撹拌しながらゆっくりと硫酸アンモニウムを加えて、4℃で一晩放置し、15,000 rpm、4℃、15分間遠心分離し上清を回収した。これをリン酸緩衝液に対して透析膜(三光純薬)を用いて透析を行い、酵素液を限外濾過膜(Amicon, centriplus)により濃縮した。
【００４９】
疎水クロマトグラフィー
硫安分画後の濃縮液の硫酸アンモニウム濃度を疎水クロマトグラフィーにおける初濃度2 Mの(NH4)2SO4に合わせた。Butyl-Toyopearl 650M(Tosoh Co., Ltd., Tokyo)を充填したガラスカラム(1.1 cm×25 cm)を2 M(NH4)2SO4のリン酸緩衝液300 mlを用いて平衡化した後、酵素液をアプライし、同じ緩衝液200 mlで洗浄した。これをそれぞれ150 mlの2.0 M, 1.5 M, 1.25 M, 1.0 M, 0.75 M, 0.5 M, 0 Mの(NH4)2SO4を用いて硫安濃度を段階的に順次下げていくステップワイズ法により40 ml/hrの流速で溶出を行った。6 mlずつをフラクションとして分画した。この活性画分を集めて限外濾過膜(Amicon, centriplus)により濃縮した。
【００５０】
陰イオン交換クロマトグラフィー
Butyl-Toyopearl 650Mで分画し、集めた活性画分を濃縮した酵素液の硫安を除去した後、リン酸緩衝液200 mlで平衡化したDEAE-Toyopearl 650M(Tosoh Co., Ltd., Tokyo)を充填したガラスカラム(1.1 cm×26.5 cm)にアプライした。同じ緩衝液200 mlで洗浄した後、それぞれ800 mlを用いて0〜0.3 MのKCl濃度を順次上げるグラジエント法によりKClの濃度勾配を直線的に形成させ、60 ml/hrの流速で溶出を行った。16 mlずつをフラクションとして分画した。この活性画分を集めて同様に限外濾過膜(Amicon, centriplus)により濃縮した。
【００５１】
タンパク質の純度検定
Laemmliの緩衝系を用い、ゲル濃度10 %のドデシル硫酸ナトリウムーポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)により検定した。また、染色は銀染色(シルベストステイン、ナカライ)により、分子量マーカーとしてCombitheck, Calibration protein(Boehringer Mannheim)を用い、fructose-6-phosphate kinase(MW 85,200), glutamate dehydrogenase(MW 55,600), aldolase(MW 39,200), triosephosphateisomerase(MW 26,600)を使用した。
【００５２】
結果と考察
菌体から抽出した粗酵素液を用い、硫安塩析、透析を行った後、Butyl-Toyopearl650Mによる疎水クロマトグラフィーに供した。ステップワイッズ法により溶出を行ったところ硫安濃度1.25 Mで目的の酵素を溶出した。溶出した活性画分を集め濃縮した後、DEAE-Toyopearl 650Mによる陰イオン交換クロマトグラフィーに供した。本酵素は塩化カリウム濃度約1.5 Mで溶出され、SDS-PAGEにおいて単一なバンドとして確認されたため、これらを回収し、精製酵素標品とした。精製過程と各精製過程における回収率を表１に示す。
【００５３】
【表１】
0004397088.tif 000004
得られた精製酵素標品は13 %の収率で31.0 U/mgの比活性で得ることができ、粗酵素に比較して約155倍となった。精製酵素標品は電気泳動的に単一なバンドとして検出され、その結果から本酵素の分子量は約33,000であると推定された。
【００５４】
［実施例２］還元酵素をコードする遺伝子のクローニング
・OPBRaseの部分アミノ酸配列の決定
N末端アミノ酸配列の決定
精製酵素標品1 nmol相当分をSpin blot法によりPVDF膜に吸着させ、膜を洗浄後、プロテインシークエンサー(Model 477A-120A, Perkin-Elmer Applied BiosystemsDivision, Foster City, calif., U.S.A.)に供し、解析した。
【００５５】
リジルエンドペプチダーゼ処理による精製酵素の切断、ペプチド断片の調製
精製酵素標品10nmolを乾固し、8 Mとなるように尿素を加えた200 mM Tris-HCl緩衝液(pH 8.0)で溶解した。これに2 μlの2-メルカプトエタノール(Nacalai Tesque,Inc., Kyoto)を加え、窒素置換を行った後、室温で16時間放置した。3 μlの4-ビニルピリジン(Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka)を加え、室温で6時間暗所で振とうし、ピリジルエチル化を行った。反応は、2 μlのギ酸を加えることにより停止させた。
ピリジルエチル化の後、100 mM Tris-HCl緩衝液(pH 8.0)で2日間透析を行い、再び乾固した。これに8 Mの尿素を含む300 μlの100 mM Tris-HCl緩衝液(pH 8.0)で溶解し、100 pmolのリジルエンドペプチダーゼ(Wako Pure Chemical Industries)を加え、30℃で24、48、72時間反応させた。
この断片を0.1 ％のトリフルオロ酢酸を溶媒とした逆相C8カラム(Shodex C8P-50 4D, 4.6 mm×150 mm)で流速0.8 ml/min、アセトニトリルの濃度勾配をアプライ5分後から1 ％/minの条件でHPLC展開し、溶出したペプチドをUVモニターの吸光度216 nmと280 nmで検出し、分離回収した。
【００５６】
内部アミノ酸配列の決定
得られたペプチド断片を乾固し、あらかじめポリブレン処理をしたメンブレンにアプライした。同じプロテインシークエンサーを用いた。
結果と考察
これらのアミノ酸配列のホモロジー検索の結果、N末端アミノ酸配列及びOPBR-1とOPBR-4がdehydrogenaseと相同性が見られた。これは酸化還元酵素に属する酵素であり、他のものよりOPBRaseの一部である可能性が高いと思われた。これらの結果からも本酵素は酸化還元酵素であると考えられた。（OPBR-1とOPBR-4は精製酵素より決定した内部部分アミノ酸配列）
【００５７】
・OPBRaseの部分アミノ酸配列からのPCRプライマーの作成、及びプローブの作製PCRプライマーの作製
本酵素のアミノ酸配列より推定される塩基配列をもつオリゴヌクレオチドを用いた、短いプローブでの目的遺伝子のスクリーニングを行うよりも、L.oenos ATCC 27310株のゲノムDNAへの特異性を高めるため、長いプローブを用いる方がよいと思われた。そのため、プローブのゲノムDNAへの特異性をより高いものへとするために、Polymerase chain reaction法(PCR)による長いプローブの作製を試みた。精製酵素より決定した本酵素のN末端アミノ酸配列、及び内部部分アミノ酸配列をもとに、それぞれ順方向、逆方向のオリゴヌクレオチドプライマーを設計し、ダテコンセプト(Co., Ltd., Sapporo)にて依頼合成した。
【００５８】
PCR反応によるプローブの作製
L. oenos ATCC 27310株のゲノムDNAの抽出
菌体培養法
L. oenos ATCC 27310株をstab保存培地に接種し、30℃で一晩培養した後、液体培地［Glucose 8 %(w/v),Yeast extract 2 %(w/v), MnSO4・6H2O 10 ppm, CaCO3  2 %(w/v) ; pH 7.0］に接種し、30℃、30時間静置培養して得られた菌体を使用した。
【００５９】
ゲノムDNAの抽出
培養後、培地を遠心分離(6,000 rpm, 4℃, 10min)によって菌体を回収し、TEN緩衝液［10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 0.1 M NaCl, pH 8.0］で２回洗浄した。これに、終濃度10 mg/mlとなるようにTEN緩衝液で溶解したリゾチーム(卵白由来、Wako PureChemical Industries)溶液を10 ml加えて懸濁し、37℃で一晩、インキュベートした。反応後、終濃度3.3 ％(w/v)となるように10 ％SDSを6 ml加えて37℃で3時間インキュベートし、細胞を破砕した。次に、フェノール処理、エタノール沈澱を行った後、TE緩衝液［10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0］に再溶解し、終濃度100 μg/mlとなるようにRNaseを加えて37℃,1時間消化した。この後、フェノール処理、フェノール‐クロロホルム処理、エタノール沈澱を行い、ゲノムDNAとした。
【００６０】
ゲノムPCR
DNAサーマルサイクラー(Perkin Elmer Cetus Co., Ltd.)を用いてPCRを行った。プライマーsOPBRn+aOPBR1, sOPBRn+aOPBR2, sOPBR1+aOPBR2, sOPBR2+aOPBR1の組み合わせで、４組の反応系を行った。
【００６１】
PCR産物の確認
ライゲーション
ゲノムPCRのそれぞれのプライマーの組み合わせによりPCR産物が１種類と認められたものについて、増幅されたDNA断片の解析を行った。前述の反応系を５チューブずつ作成し、それらを合わせて2％アガロースゲル電気泳動で分離し、Sephaglas BandPrep Kit(Pharmacia Biotech)を用いてゲルから回収した。このDNA断片をTAクロ−ニング法によりT4 DNA ligase(Nippon gene Co., Ltd., Tokyo)を用いてTベクター(pUC19をSma Iで処理し、Taq Polymeraseで3'末端にT塩基を付加したもの)に16℃、4時間インキュベートしてライゲーションを行った。PCR産物は一般にTaq Polymeraseの作用で3'末端にA塩基が１塩基突出した構造を取っており、3'末端にT塩基が１塩基突出したベクターを故意に用いれば、容易にベクターにライゲーションできるというのが、TAクローニング法の原理である。
ライゲ−ション後、ヒ−トショック法でE. coli JM109株を形質転換させ、SOC培地［Trypton(Difco) 20 g/l, Yeast extract(Difco) 5 g/l, NaCl 0.585 g/l, KCl 0.186 g/l, MgCl2 1.9 g/l, Glucose 3.6 g/l］で37℃、1時間振とう培養した後、100μg/mlのアンピシリンを含むLBプレート［Polypepton 10 g/l, Yeast extract 5 g/l, NaCl 10 g/l, Agar 20 g/l; pH 7.0］に塗沫し、37℃で培養した。
【００６２】
PCR産物のDNAシークエンシング、解析
プラスミドの調製
終濃度100 μl/mlのアンピシリンを含むLB培地［Polypepton 10 g/l, Yeast extract 5g/l, NaCl 10 g/l; pH 7.0］に、滅菌した楊枝の先でプレートからコロニーを接種し、37℃、一晩振とう培養した。この培養液からFlexiPrep Kit(Pharmacia Biotech)を用いてプラスミドを抽出した。
【００６３】
シークエンシング、解析
ALFexpress DNA Sequencer(Pharmacia Biotech)を用いて、泳動条件Voltage:1,500V, Current: 55 mA, Power: 25-30 W, Water Preheat: 55℃, Sampling Interval: 2sec, Running Time: 700 minで行った。伸長反応はvistra systems ThermoSequenasecore sequencing kit with 7-deaza-dGTP(Amersham International plc, UK)で行った。アミノ酸配列のホモロジー検索などの情報は、The National Center for Biotechnology Information(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)のインターネットサービスを利用した。
【００６４】
結果と考察
精製されたOPBRaseより決定された部分アミノ酸配列をもとに推定される塩基配列をもつPCRプライマーを作製し、それを用いてL. oenos ATCC 27310株のゲノムDNAについてゲノムPCRを行い、後のハイブリダイゼーションに用いるプローブの作製を試みた。
精製OPBRaseから決定された部分アミノ酸配列のホモロジ−解析の結果、OPBR-1とOPBR-4が酸化還元酵素であるデヒドロゲナーゼと相同性を有していたことから、N末端アミノ酸配列から順方向に１つと、OPBR-1とOPBR-4から順方向と逆方向に２つずつオリゴヌクレオチドプライマーを設計し、合成した。  このように合成したオリゴヌクレオチドプライマーを用いてゲノムPCRを行った。電気泳動において単一のバンドとしてPCR産物の増幅が確認されたのは、反応系４組の内、sOPBRn+aOPBR1(680 bp), sOPBRn+aOPBR2(700 bp)の２組だった。このうち680bpのPCR産物の方が上手くライゲーションできた。
よって、このPCR産物のシークエンシングを行い、それより推定されるアミノ酸配列のホモロジーを調べたところ、主に種々の菌株由来のglycerate dehydrogenase、D-3-phosphoglycerate dehydrogenase、2-hydroxyacid dehydrogenaseなどと、プローブのアミノ酸配列中30 %前後の相同性が見られた。これらの酵素も本酵素も酸化還元酵素に分類される酵素群の一部である。PCR増幅断片のアミノ酸配列のホモロジ−解析の結果、このPCR産物はOPBRase遺伝子の一部である可能性があると思われるため、今後のハイブリダイゼーションのためのプローブとして用いることにした。
【００６５】
2-オキソ-4-フェニル酪酸還元酵素遺伝子をもつDNA断片が、L. oenos ATCC 27310株のゲノムライブラリーよりスクリーニングされ、クローニングされた。その結果、得られたプラスミドpOPBRはそのインサ−トDNA中にOPBRase遺伝子と思われるORFを所有していた。OPBRase遺伝子の転写方向はlacプロモーターの遺伝子誘導方向と同じ配置に位置していたが、形質転換体の無細胞抽出液におけるOPBRase活性測定を行ったところ、コントロール(E. coli JM109/pBluescript KS+)と差はなく、SDS-PAGEにおける生成タンパク質の確認においても違いは見られなかった。これは、lacプロモーターと本酵素遺伝子の開始コドンの間の距離に関係するものと思われ、OPBRase遺伝子の活性増大、大量発現を目的とした発現プラスミドの構築を試みることにした。
ベクターpUC18のlacプロモーターと、インサートのOPBRase遺伝子の開始コドンとの距離を短くすることとアミノ酸フレームを合わせることにより、OPBRase遺伝子の活性の増大を試みた。プラスミドpOPBRをもとに、OPBRaseのORFの両端にEcoR I、SalIそれぞれの制限酵素認識部位を導入したDNA断片の作成を行った。OPBRaseのORFの開始コドンの上流にEcoR I認識サイトを導入したプライマーを作製し、終止コドンの下流域のOPBRase遺伝子自身のターミネーターの上流部位と下流部位それぞれにSal I認識サイトを導入したプライマーを作製した。これらのプライマーを用いてプラスミドpOPBRを鋳型としてPCRによりprimer A+B, A+Cの組み合わせでOPBRase遺伝子を含む断片を増幅した。
【００６６】
・合成したプライマー
primer A（配列番号：４）
5'- ACGAA GAATTC(EcoRI site) AACA ATG(開始コドン)AAAAAAGTT -3'
primer B（配列番号：５）
5'- ACCA GTCGAC(Sal I site) GTATGTGGTTTT -3'
primer C（配列番号：６）
5'- TTGGT GTCGAC(Sal I site) CTTGTCTCACA -3'
【００６７】
・結果
プライマーA+B、A+Cの組み合わせで生じた断片をEcoRI、SalIで処理し、同様に処理したpUC18に連結し、OPBRase遺伝子のターミネーターを保持するもの、及び保持しないプラスミドを構築した。それぞれpOPBR-LS、pOPBR-LLと名付けた。pOPBR-LS、pOPBR-LLのベクターDNAとインサートDNAとの繋ぎ目の塩基配列、及びアミノ酸フレームが期待された通りになっていることをシークエンシングにより確認した。SDS-PAGEによる生成タンパク質の確認ではOPBRaseと特定できるバンドは検出できなかった。SDS-PAGEでは菌体の無細胞抽出液を供したため、他のタンパク質と重なっているか、バンドとして確認できる量のタンパク質が生成されなかったためであると思われる。
プラスミドを有するE. coliの酵素活性測定のコントロールとして、ベクターpUC18のみをもつE. coli JM109を使用した。活性測定の結果、pOPBR-LLにおいてpOPBRと比べて活性の上昇が確認された。このことから、lacプロモーターとOPBRase遺伝子のアミノ酸フレームを合わせて新規作製したプラスミドは目的遺伝子の発現が行われたと思われる。以上の結果から、本酵素遺伝子の下流域（ターミネーター）の重要性が示唆された。しかし、IPTGによる酵素遺伝子の発現誘導調節ができていなかった。E. coli JM109/pUC18ではlacプロモーターの発現調節をホスト大腸菌のF'因子上のlac Iqのみに依存しているために、pUC18のコピー数に追いつかずに転写が起こり、IPTGによる誘導調節の効果がなかったと考えられる。IPTGによる発現誘導を可能にするため、あるいは更にOPBRase活性を高めるためにベクター、プロモーターの交換を行い、発現試験を行うことにした。
【００６８】
・プロモーターの交換によるOPBRase遺伝子発現への効果
・lacプロモーターからtrcプロモーターへの交換
pUC18のlacプロモーターとOPBRase遺伝子の開始コドンとのフレームを合わせることにより、活性の増大を試みたが、その活性をさらに増大することと、OPBRase遺伝子の上流に存在するアミノ酸をできるだけ少なくすること、また、誘導物質IPTGによる発現誘導を可能にするためにベクターとしてpTrc99Aを使用し、そのベクターの有するtrcプロモーターを利用してOPBRase遺伝子を発現させることを試みた。ベクターpTrc99Aは、それ自身lacIq遺伝子ももち、ベクターのコピー数に見合うlacIqの発現も行われ、それによりIPTGによる発現誘導が厳密に行えると思われる。また、pTrc99Aはマルチクローニングサイトの上流に強力なプロモーターtrc、下流に強力な転写終了シグナルrrnBをもっている。これらのことから、pTrc99Aを使用した。
【００６９】
方法
pOPBR-LS、pOPBR-LLをそれぞれEcoR I+Sal Iで処理し、電気泳動によりインサートを分離し、その部分をゲルよりDNA CELLを用いて回収した。OPBRase遺伝子のアミノ酸フレームとベクターpTrc99A上の開始コドンのフレームを合わせるために、Klenow Fragmentで断片の平滑末端化を行い、Nco Iで処理したpTrc99Aを同様の方法により平滑末端化を行った。これらを連結し、trcプロモーター制御下の新しい発現プラスミドの構築を行った。
この手法で、pTrc99Aのtrcプロモーターと本酵素遺伝子のアミノ酸フレームが一致させることができた。
【００７０】
・lacプロモーターからT7プロモーターへの交換
trcプロモーターを用いる手法とは別に、OPBRase遺伝子の発現をさらに増大させるために強力なプロモーターであるT7プロモーターをもつベクターpET21b(+)を利用してOPBRase遺伝子の発現を行った。pET21b(+)は強力なプロモーターT7をもっているベクターで、この下流にアミノ酸フレームが合うように目的遺伝子を挿入することにより遺伝子の発現を試みた。このベクターの宿主として用いるE. coli BL21(DE3)は、ゲノム上にT7 RNAポリメラーゼ発現系をもつ。このBL21(DE3)に構築した発現プラスミドを導入すると、IPTGの誘導により、まずBL21(DE3)のゲノム上のT7RNAポリメラーゼが発現し、それにより続いて目的遺伝子の強力な転写が始まる。
【００７１】
方法
pUC18を用いて発現プラスミドを構築したときと同様の方法で新しい発現プラスミドの構築を行った。前に作成したOPBRase遺伝子のORFのN末端側、C末端側にそれぞれEcoR I, Sal Iの制限酵素認識部位を導入したプライマー（先にお送りしましたプライマーです）を使用し、PCRによりOPBRase遺伝子のターミネーターを保持するものと欠けているもの２種類の断片を作成した。これらの断片をEcoR I+Sal Iで処理し、同様に処理したpET21b(+)とライゲーションを行った。ヒートショック法によりE. coliJM109に形質転換した。それぞれの形質転換体からプラスミドを抽出し、適当な制限酵素で処理した後、アガロ−スゲル電気泳動によりインサートの有無を確認した。期待されたインサートDNAをもつプラスミドで再度、E. coli BL21(DE3)を形質転換し、OPBRase遺伝子の発現系を構築した。
【００７２】
・結果
OPBRase遺伝子の発現をさらに増大させるためにベクターpTrc99Aのtrcプロモーター、pET21b(+)のT7プロモーターを利用することとし、pTrc99Aで構築したものをpOPBR-TS, pOPBR-TL, pET21b(+)で構築したものをpOPBR-7S,pOPBR-7Lと名付けた。pOPBRの末尾に-T(7)Sが付いているものはOPBRase遺伝子自身のターミネーターを保持しないもので、-T(7)Lが付いているものはターミネーターを保持するものである。また、-TS(L)が付いているものはpTrc99Aで構築したもので-7S(L)が付いているものはpET21b(+)で構築したものである。
【００７３】
pTrc99Aを用いて構築したプラスミドにおいては、pOPBR-TS, pOPBR-TLの両方において誘導物質IPTGを加えた方がU/mg protein, U/ml brothの値が高く、IPTGにより酵素遺伝子の発現誘導が行われていると思われた。また、自身のターミネーターを保持するpOPBR-TLの方が高い活性が得られた。これは自身のターミネーターの方がOPBRase構造遺伝子と良い位置関係にあり、より厳密に転写が行われ、そのためmRNAが安定になっているためであると思われる。一方、pET21b(+)を用いて構築したプラスミドにおいては、これもpTrc99Aのときと同様に自身のターミネーターを保持するpOPBR-7Lの方が高い活性を示した。
しかし、誘導物質IPTGと活性との関係においては、pTrc99Aのときとは逆にIPTGを加えない方が高い活性を示した。pETシステムにおいて、IPTGを加えることによって目的遺伝子の強制的な生産が行われ、そのため生成タンパク質のインクルージョンボディーが形成される可能性を含んでいる。よって、IPTGを培地中に加えないものよりも酵素活性が低かったと思われる。SDS-PAGEによる生成タンパク質の確認では、いずれの場合もOPBRaseと特定できるバンドは検出できなかった。全形質転換体E.coliで比較した結果、菌体内タンパク質1 mgあたりの活性が最も高いE. coli JM109/pOPBR-TLが目的酵素生産菌として適していると考えられる。
【００７４】
結果として、いずれのベクターを使用した場合においても、本酵素遺伝子自身のターミネーターをもつプラスミドにおいて高い活性が確認された。本発明による酵素の発現における、この遺伝子の下流域（ターミネーター）の重要性が示唆された。また、pTrc99Aを使用した場合は、IPTGによる発現誘導が確認された。
【００７５】
・それぞれの形質転換体の無細胞抽出液の調製と活性測定
それぞれ形質転換体E. coli JM109株のコロニーを100 μl/mlのアンピシリンを含むLB培地5 mlに楊枝で接種し、37 ℃で15時間振とう培養した。誘導物質IPTGは培養直後に終濃度1 mMとなるように培養液に加えた。培養液を3,000 rpm、10 min、4 ℃で遠心して菌体を回収し、少量の10 mMリン酸カリウム緩衝液(pH 7.2)で菌体を洗浄し、同様に遠心を行った。菌体回収時の生育は、分光光度計(HITACHI U-1000)でOD660を測定した。1 mlの10 mMリン酸カリウム緩衝液(pH 7.2)に懸濁し、超音波破砕機(Sonifier Model 250; Branson)を用いて、氷冷下、１分間×２回行い、細胞を破砕した。これを15,000 rpm、15 min、4 ℃で遠心してその上清を回収し、無細胞抽出液を得た。アッセイ法は公知の方法(Biosci.Biotech.Biochem.,57(1),160-161, 1993)を参考にして行った。終濃度10 mMの2-オキソ-4-フェニル酪酸、0.1 mMのNADPH、100 μMのリン酸カリウム緩衝液(pH 6.0)、及び酵素液を含む全量2 mlの反応液を調製し、37 ℃、340 nmにおけるNADPHの吸光度の減少を分光光度計(MILTON ROY SPECTRONIC 3000ARRAY)で測定した。１分間に1 μMのNADPHが酸化される酵素量を1 Uとした。酵素反応測定のブランクとして、基質を含まない反応系を用意した。粗酵素液としては、約2 mg/mlのタンパク濃度のものが得られ、酵素反応において、これを100 μMのリン酸カリウム緩衝液(pH 6.0)で５倍希釈したものをアッセイ系に200 μl加えた場合、NADPHの良好な減少直線が得られた。形質転換体における細胞内タンパク質量は、Lowry法により測定した。結果を表２にまとめた。
【００７６】
・活性測定結果
【表２】
0004397088.tif 000005
【００７７】
［実施例８］（形質転換株での遺伝子発現）
実施例７で得られた形質転換株をアンピシリン（50μg/mL）を含む液体 LB培地上で終夜 26℃で振盪培養し、0.1mM IPTGを加えた後、さらに 4時間、30℃で振盪培養を行なった。培養後に菌体を遠心分離により集菌し、生理食塩水で培地成分を洗浄し、1% 2-オキソ-4-フェニル酪酸、0.01% 2-メルカプトエタノールを含む、50mMトリス 塩酸緩衝液（pH 7.0）に懸濁し、全量 1mLの反応液として 30℃、6hr振盪反応を行なった。なお、コントロールとしては大腸菌 JM109株を使用した。
反応終了後、遠心分離により除菌を行ない、反応上清に対し、生成したＲ−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸の量を、キラルカラムを用いた高速液体クロマトグラフィー（カラム：CHIRALPAK WH （4.6x250mm）（ダイセル化学工業株式会社製）、溶離液： CH3CN / 0.5mM CuSO4=8:2、検出 A220nm、流速 1.5mL/min、カラム温度 50℃）によって、定量し、光学純度も測定した。
形質転換株では反応液上清中に 0.99g/L(>99%ee)のＲ−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸が認められたが、コントロールではＲ−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸の蓄積は認められなかった。
【００７８】
【発明の効果】
本発明により、Leuconostoc oenosに由来する還元酵素と、それをコードする遺伝子の構造が明らかにされた。決定された遺伝子の塩基配列を用いて、本発明による還元酵素を遺伝子組み換え体として大量に、そして安価に製造することができる。
本発明の還元酵素は、２−オキソ−４−フェニル酪酸に対する活性が高く、 Ｒ−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸を効率良く生成することができる。 本発明の還元酵素によって合成することができるＲ−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸は、医薬品原料などとして有用な化合物である。
【００７９】
【配列表】
0004397088.tif 000006
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