(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
病害抵抗性を誘導する農薬をスクリーニングするために使用され得る植物体であって、
ａ）植物の病害抵抗性誘導遺伝子のプロモーター；および
ｂ）該プロモーターに作動可能に連結された、蛍光タンパク質をコードする遺伝子
を含む、発現カセットを含む植物体であって、
ここで、該プロモーターが、配列番号６に記載されるＲａｃ１遺伝子プロモーター配列を有する、植物体。
【請求項２】
前記蛍光タンパク質をコードする遺伝子が、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、キンドリングレッド蛍光タンパク質、カエデタンパク質からなる群から選択される蛍光タンパク質をコードする遺伝子である、請求項１に記載の植物体。
【請求項３】
前記蛍光タンパク質をコードする遺伝子が、緑色蛍光タンパク質、をコードする遺伝子である、請求項１に記載の植物体。
【請求項４】
単子葉植物である、請求項１に記載の植物体。
【請求項５】
イネである、請求項１に記載の植物体。
【請求項６】
病害抵抗性を誘導する農薬をスクリーニングするために使用され得るシステムであって、以下：
１）請求項１に記載の植物体、ならびに、
２）以下：
ａ）植物の病害抵抗性誘導遺伝子のプロモーター；および、
ｂ）該プロモーターに作動可能に連結された、蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む、発現カセットを含む植物体であって、
ここで、該プロモーターが、配列番号１に記載されるＰＢＺ１遺伝子プロモーター配列を有する、植物体、
を含む、システム。
【請求項７】
病害抵抗性を誘導する農薬をスクリーニングするために使用され得るシステムであって、以下：
１）請求項１に記載の植物体、ならびに、
２）以下：
ａ）植物の病害抵抗性誘導遺伝子のプロモーター；および、
ｂ）該プロモーターに作動可能に連結された、蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む、発現カセットを含む植物体であって、
ここで、該プロモーターが、配列番号１に記載されるＰＢＺ１遺伝子プロモーター配列を有する、植物体、および
３）発光ダイオードを光源として使用する蛍光測定装置、
を含む、システム。
【請求項８】
病害抵抗性を誘導する農薬をスクリーニングするために使用され得るシステムであって、
１）請求項１に記載の植物体、ならびに、
２）以下：
ａ）配列番号１に記載されるＰＢＺ１遺伝子プロモーター配列を有する第１のプロモーター、
ｂ）該第１のプロモーターに作動可能に連結された、第１の蛍光タンパク質をコードする遺伝子、
ｃ）配列番号４に記載されるＤ９遺伝子プロモーター配列を有する第２のプロモーター、および、
ｄ）該第２のプロモーターに作動可能に連結された、第２の蛍光タンパク質をコードする遺伝子、
を含む、発現カセットを含む植物体、
を含む、システム。
【請求項９】
病害抵抗性を誘導する農薬をスクリーニングするために使用され得るシステムであって、
１）請求項１に記載の植物体、
２）以下：
ａ）配列番号１に記載されるＰＢＺ１遺伝子プロモーター配列を有する第１のプロモーター、
ｂ）該第１のプロモーターに作動可能に連結された、第１の蛍光タンパク質をコードする遺伝子、
ｃ）配列番号４に記載されるＤ９遺伝子プロモーター配列を有する第２のプロモーター、および、
ｄ）該第２のプロモーターに作動可能に連結された、第２の蛍光タンパク質をコードする遺伝子、
を含む、発現カセットを含む植物体、ならびに、
３）発光ダイオードを光源として使用する蛍光測定装置、
を含む、システム。
【請求項１０】
病害抵抗性を誘導する農薬を分類する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ｉ）配列番号１に記載されるＰＢＺ１遺伝子プロモーター配列を有する第１のプロモーター、および該第１のプロモーターに作動可能に連結された第１の蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む発現カセットを含む第１の植物体を提供する工程；
（ｉｉ）配列番号６に記載されるＲａｃ１遺伝子プロモーター配列を有する第２のプロモーター、および該第２のプロモーターに作動可能に連結された第２の蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む発現カセットを含む第２の植物体を提供する工程；
（ｉｉｉ）該植物体と候補薬物を接触させる工程；ならびに
（ｉｖ）該第１および第２の植物体において該第１および第２の蛍光タンパク質の発現を測定する工程；
を包含し、
ここで該第１および第２の蛍光タンパク質の発現の測定結果から、候補薬物を分類する、方法であって、
ここで、ＰＢＺ１遺伝子プロモーターからの発現を誘導し、かつＲａｃ１遺伝子プロモーターからの発現を誘導する候補薬物は、セレブロシドＢと類似する作用機構を有する薬物であると分類され、そしてここで、ＰＢＺ１遺伝子プロモーターからの発現を誘導するが、Ｒａｃ１遺伝子プロモーターからの発現を誘導しない候補薬物は、プロベナゾールと類似する作用機構を有する薬物であると分類される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、病害抵抗性を誘導する農薬のスクリーニング方法およびスクリーニングのためのシステム、ならびにその方法に使用される植物体に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物の病原菌に対する薬剤としては、代表的には、病原菌に直接の殺菌効果を有する薬剤と、病原菌に対して直接の殺菌効果を示さず、植物の病害抵抗性を誘導する薬剤とが挙げられる。植物の病害抵抗性を誘導する薬剤は、病原菌の耐性菌株の出現の頻度が少ないことから有用ではあるが、病原菌に直接の殺菌効果を有する薬剤と比較してその開発が遅れている。わずかに、イネいもち病防除剤であるオリゼメートの作用成分であるプロベナゾール、セレブロシドＢ、Ｎ−シアノメチル−２−クロロ−イソニコチン酸、２，６−ジクロロ−イソニコチン酸、ベンゾ［１，２，３］チアゾール−７−カルボチオ酸  Ｓ−メチルエステル、４−メチル−［１，２，３］チアゾール−５−カルボン酸（３−クロロ−４−メチル−フェニル）−アミド）、２，２−ジクロロ−３，３−ジメチル−シクロプロパンカルボン酸、Ｎ−（２−クロロ−ピリジン−４−カルボニル）−ベンゼンスルホンアミドなどが植物の病害抵抗性を誘導する薬剤またはその候補として開発されているのみである。
【０００３】
植物の病害抵抗性を誘導する薬剤の開発が遅れている原因の１つには、そのスクリーニング方法の開発が遅れている点にある。従って、簡便かつ迅速な植物の病害抵抗性を誘導する薬剤のスクリーニング方法の開発が求められている。
【０００４】
病害抵抗性を誘導する薬剤によって発現が誘導される遺伝子のプロモーターを用いて、候補薬剤をスクリーニングする場合には、適切なプロモーターを選択することが重要である。例えば、プロベナゾールおよびＮ−シアノメチル−２−クロロ−イソニコチン酸の両薬剤に応答性の遺伝子プロモーターとしては、ＰＢＺ１遺伝子のプロモーターが公知である（特開平９−２７０）。しかし、これら薬剤に応答性のプロモーターを病害抵抗性を誘導する薬剤のスクリーニング方法に用いた例はない。なぜなら、病害抵抗性を誘導する薬剤のスクリーニングにおいては、培養細胞レベルではなく、植物体においてそのプロモーターの応答性を検証する必要があるものの、従来は、簡便に植物体においてプロモーター活性を決定する方法が確立されていなかったからである。
【０００５】
現在まで、植物体での薬剤のスクリーニング方法は確立されておらず、従来公知のプロモーターがどの程度広範な刺激に対して応答性であるかについて、未だ検証されておらず、そのため、従来公知であるプロモーターが、簡便かつ迅速な植物の病害抵抗性を誘導する薬剤のスクリーニングに適用できるか否かは、不明である。従って、病害抵抗性を誘導する薬剤によって発現が誘導される遺伝子のプロモーターを用いて、種々の薬剤に対する応答性を検証することにより、改善された薬剤スクリーニング方法を確立することが必要である。
【０００６】
（発明の要旨）
植物において病害抵抗性を誘導する農薬をスクリーニングする方法およびシステム、ならびにその方法に使用される植物体を提供することが、本発明の課題である。
【０００７】
本発明者らは、ａ）植物の病害抵抗性誘導遺伝子の天然のプロモーター；およびｂ）該プロモーターに作動可能に連結された蛍光タンパク質をコードする遺伝子、を含む発現カセットを含むベクターによって形質転換された植物体を得て、その植物体を候補薬剤によって処理し、その蛍光タンパク質の発現量を指標にして、候補薬剤にスクリーニングを行なう方法を開発し、本発明を完成した。
【０００８】
従って、本発明は、以下を提供する。
【０００９】
１．病害抵抗性を誘導する農薬をスクリーニングするために使用され得る植物体であって、
ａ）植物の病害抵抗性誘導遺伝子のプロモーター；および
ｂ）該プロモーターに作動可能に連結された、蛍光タンパク質をコードする遺伝子
を含む、発現カセットを含む植物体。
【００１０】
２．前記プロモーターが、プロベナゾールにより発現誘導され得るプロモーターである、項目１に記載の植物体。
【００１１】
３．前記プロモーターが、配列番号１に記載されるＰＢＺ１遺伝子プロモーター配列を有する、項目２に記載の植物体。
【００１２】
４．前記プロモーターが、配列番号１に記載されるＰＢＺ１遺伝子プロモーター配列中の、プロベナゾールにより発現誘導され得る配列からなるフラグメントを有する、項目２に記載の植物体。
【００１３】
５．前記プロモーターが、配列番号４に記載されるＤ９遺伝子プロモーター配列を有する、項目２に記載の植物体。
【００１４】
６．前記プロモーターが、配列番号４に記載されるＤ９遺伝子プロモーター配列中の、プロベナゾールにより発現誘導され得る配列からなるフラグメントを有する、項目２に記載の植物体。
【００１５】
７．前記プロモーターが、配列番号６に記載されるＲａｃ１遺伝子プロモーター配列を有する、項目２に記載の植物体。
【００１６】
８．前記プロモーターが、配列番号６に記載されるＲａｃ１遺伝子プロモーター配列中の、プロベナゾールにより発現誘導され得る配列からなるフラグメントを有する、項目２に記載の植物体。
【００１７】
９．病害抵抗性を誘導する農薬をスクリーニングするために使用され得る植物体であって、
ａ）配列番号１に記載されるＰＢＺ１遺伝子プロモーター配列またはそのフラグメントを有する第１のプロモーター、
ｂ）該第１のプロモーターに作動可能に連結された、第１の蛍光タンパク質をコードする遺伝子、
ｃ）配列番号４に記載されるＤ９遺伝子プロモーター配列またはそのフラグメントを有する第１のプロモーター、ならびに
ｄ）該第２のプロモーターに作動可能に連結された、第２の蛍光タンパク質をコードする遺伝子、
を含む、発現カセットを含む植物体。
【００１８】
１０．前記蛍光タンパク質をコードする遺伝子が、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、キンドリングレッド蛍光タンパク質、カエデタンパク質からなる群から選択される蛍光タンパク質をコードする遺伝子である、項目１に記載の植物体。
【００１９】
１１．前記蛍光タンパク質をコードする遺伝子が、緑色蛍光タンパク質、をコードする遺伝子である、項目１に記載の植物体。
【００２０】
１２．単子葉植物である、項目１に記載の植物体。
【００２１】
１３．イネである、項目１に記載の植物体。
【００２２】
１４．病害抵抗性を誘導する農薬をスクリーニングするために使用され得るシステムであって、
ａ）項目３または４に記載の植物体、および
ｂ）項目５または６に記載の植物体、
を含む、システム。
【００２３】
１５．病害抵抗性を誘導する農薬をスクリーニングするために使用され得るシステムであって、
ａ）項目３または４に記載の植物体、
ｂ）項目５または６に記載の植物体、および
ｃ）発光ダイオードを光源として使用する蛍光測定法
を含む、システム。
【００２４】
１６．病害抵抗性を誘導する農薬をスクリーニングするために使用され得るシステムであって、
ａ）項目３または４に記載の植物体、
ｂ）項目５または６に記載の植物体、および
ｃ）項目７または８に記載の植物体、
を含む、システム。
【００２５】
１７．病害抵抗性を誘導する農薬をスクリーニングするために使用され得るシステムであって、
ａ）項目３または４に記載の植物体、
ｂ）項目５または６に記載の植物体、
ｃ）項目７または８に記載の植物体、および
ｄ）発光ダイオードを光源として使用する蛍光測定法
を含む、システム。
【００２６】
１８．病害抵抗性を誘導する農薬をスクリーニングするために使用され得るシステムであって、
ａ）項目９に記載の植物体、
を含む、システム。
【００２７】
１９．病害抵抗性を誘導する農薬をスクリーニングするために使用され得るシステムであって、
ａ）項目９に記載の植物体、および
ｂ）発光ダイオードを光源として使用する蛍光測定法
を含む、システム。
【００２８】
２０．病害抵抗性を誘導する農薬をスクリーニングするために使用され得るシステムであって、
ａ）項目９に記載の植物体、および
ｂ）項目７または８に記載の植物体、
を含む、システム。
【００２９】
２１．病害抵抗性を誘導する農薬をスクリーニングするために使用され得るシステムであって、
ａ）項目９に記載の植物体、
ｂ）項目７または８に記載の植物体、および
ｃ）発光ダイオードを光源として使用する蛍光測定法
を含む、システム。
【００３０】
２２．病害抵抗性を誘導する農薬をスクリーニングする方法であって、該方法は、以下の工程：
（ｉ）配列番号１に記載されるＰＢＺ１遺伝子プロモーター配列またはそのフラグメントを有する第１のプロモーター、および該第１のプロモーターに作動可能に連結された第１の蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む発現カセットを含む第１の植物体を提供する工程；
（ｉｉ）配列番号４に記載されるＤ９遺伝子プロモーター配列またはそのフラグメントを有する第２のプロモーター、および該第２のプロモーターに作動可能に連結された第２の蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む発現カセットを含む第２の植物体を提供する工程；
（ｉｉｉ）該植物体と候補薬物を接触させる工程；ならびに
（ｉｖ）該第１および第２の植物体において該第１および第２の蛍光タンパク質の発現を測定する工程；
を包含し、
ここで該第１および第２の蛍光タンパク質の発現を測定する工程において第１および第２の蛍光タンパク質の両方の発現が誘導された場合、候補薬物は植物において病害抵抗性を誘導する農薬であり得る、方法。
【００３１】
２３．前記第１および第２の蛍光タンパク質をコードする遺伝子が、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、キンドリングレッド蛍光タンパク質、カエデタンパク質からなる群から選択される蛍光タンパク質をコードする遺伝子である、項目２２に記載の方法。
【００３２】
２４．前記第１または第２の蛍光タンパク質をコードする遺伝子が、緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子である、項目２３に記載の方法。
【００３３】
２５．前記植物細胞が単子葉植物細胞である、項目２２に記載の方法。
【００３４】
２６．前記植物細胞がイネ細胞である、項目２２に記載の方法。
【００３５】
２７．前記蛍光タンパク質の発現を測定する工程が、発光ダイオードを光源として使用する蛍光測定法である、項目２２に記載の方法。
【００３６】
２８．病害抵抗性を誘導する農薬をスクリーニングする方法であって、該方法は、以下の工程：
（ｉ）第１および第２の発現カセットを含む植物体を提供する工程であって、ここで、
該第１の発現カセットは、配列番号１に記載されるＰＢＺ１遺伝子プロモーター配列またはそのフラグメントを有する第１のプロモーター、および該第１のプロモーターに作動可能に連結された第１の蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含み、そして、
該第２の発現カセットは、配列番号４に記載されるＤ９遺伝子プロモーター配列またはそのフラグメントを有する第２のプロモーター、および該第２のプロモーターに作動可能に連結された第２の蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む、工程；
（ｉｉ）該植物体と候補薬物を接触させる工程；ならびに
（ｉｉｉ）該植物体において該第１および第２の蛍光タンパク質の発現を測定する工程；
を包含し、
ここで該第１および第２の蛍光タンパク質の発現を測定する工程において第１および第２の蛍光タンパク質の両方の発現が誘導された場合、候補薬物は植物において病害抵抗性を誘導する農薬であり得る、方法。
【００３７】
２９．前記第１および第２の蛍光タンパク質をコードする遺伝子が、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、キンドリングレッド蛍光タンパク質、カエデタンパク質からなる群から選択される蛍光タンパク質をコードする遺伝子である、項目２８に記載の方法。
【００３８】
３０．前記第１または第２の蛍光タンパク質をコードする遺伝子が、緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子である、項目２９に記載の方法。
【００３９】
３１．前記植物細胞が単子葉植物細胞である、項目２８に記載の方法。
【００４０】
３２．前記植物細胞がイネ細胞である、項目２８に記載の方法。
【００４１】
３３．前記蛍光タンパク質の発現を測定する工程が、発光ダイオードを光源として使用する蛍光測定法である、項目２８に記載の方法。
【００４２】
３４．病害抵抗性を誘導する農薬をスクリーニングする方法であって、該方法は、以下の工程：
（ｉ）発現カセットを含む植物体を提供する工程であって、ここで、該発現カセットは、（ａ）配列番号１に記載されるＰＢＺ１遺伝子プロモーター配列またはそのフラグメントを有する第１のプロモーター、および該第１のプロモーターに作動可能に連結された第１の蛍光タンパク質をコードする遺伝子、および（ｂ）配列番号４に記載されるＤ９遺伝子プロモーター配列またはそのフラグメントを有する第２のプロモーター、および該第２のプロモーターに作動可能に連結された第２の蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む、工程；
（ｉｉ）該植物体と候補薬物を接触させる工程；ならびに
（ｉｉｉ）該植物体において該第１および第２の蛍光タンパク質の発現を測定する工程；
を包含し、
ここで該第１および第２の蛍光タンパク質の発現を測定する工程において第１および第２の蛍光タンパク質の両方の発現が誘導された場合、候補薬物は植物において病害抵抗性を誘導する農薬であり得る、方法。
【００４３】
３５．前記第１および第２の蛍光タンパク質をコードする遺伝子が、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、キンドリングレッド蛍光タンパク質、カエデタンパク質からなる群から選択される蛍光タンパク質をコードする遺伝子である、項目３４に記載の方法。
【００４４】
３６．前記第１または第２の蛍光タンパク質をコードする遺伝子が、緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子である、項目３５に記載の方法。
【００４５】
３７．前記植物細胞が単子葉植物細胞である、項目３４に記載の方法。
【００４６】
３８．前記植物細胞がイネ細胞である、項目３４に記載の方法。
【００４７】
３９．前記蛍光タンパク質の発現を測定する工程が、発光ダイオードを光源として使用する蛍光測定法である、項目３４に記載の方法。
【００４８】
４０．病害抵抗性を誘導する農薬を分類する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ｉ）配列番号１に記載されるＰＢＺ１遺伝子プロモーター配列またはそのフラグメントを有する第１のプロモーター、および該第１のプロモーターに作動可能に連結された第１の蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む発現カセットを含む第１の植物体を提供する工程；
（ｉｉ）配列番号６に記載されるＲａｃ１遺伝子プロモーター配列またはそのフラグメントを有する第２のプロモーター、および該第２のプロモーターに作動可能に連結された第２の蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む発現カセットを含む第２の植物体を提供する工程；
（ｉｉｉ）該植物体と候補薬物を接触させる工程；ならびに
（ｉｖ）該第１および第２の植物体において該第１および第２の蛍光タンパク質の発現を測定する工程；
を包含し、
ここで該第１および第２の蛍光タンパク質の発現の測定結果から、候補薬物を分類する、方法。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００４９】
（発明の詳細な説明）
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など、独語の場合の「ｅｉｎ」、「ｄｅｒ」、「ｄａｓ」、「ｄｉｅ」などおよびその格変化形、仏語の場合の「ｕｎ」、「ｕｎｅ」、「ｌｅ」、「ｌａ」など、スペイン語における「ｕｎ」、「ｕｎａ」、「ｅｌ」、「ｌａ」など、他の言語における対応する冠詞、形容詞など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。
【００５０】
（用語の定義）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
【００５１】
本明細書において使用される用語「タンパク質」「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとアセンブルされ得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識成分との結合体化）。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の１または２以上のアナログを含むポリペプチド（例えば、非天然のアミノ酸などを含む）、ペプチド様化合物（例えば、ペプトイド）および当該分野において公知の他の改変が包含される。
【００５２】
本明細書において使用する場合、「蛍光タンパク質」とは、蛍光を発するタンパク質をいい、例えば、オワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、配列番号３のアミノ酸配列を有する変異型ＧＦＰ、イソギンチャク近縁種Ｄｉｓｃｏｓｏｎａ  ｓｔｒｉａｔａ由来の蛍光タンパクであるＲＦＰ（Ｒｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）、Ａｅｑｕｒｅ  ｃｏｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓ由来のＧＦＰ（例えば、Ｅｖｒｏｇｅｎ社（ロシア）のＡｃｅ−Ｇｒｅｅｎ（登録商標））、甲殻生物であるＣｏｐｅｐｏｄ由来のＧＦＰ（例えば、Ｅｖｒｏｇｅｎ社（ロシア）のＣｏｐ−Ｇｒｅｅｎ（登録商標））、黄色蛍光タンパク質（例えば、Ｅｖｒｏｇｅｎ社（ロシア）のＰｈｉ−Ｙｅｌｌｏｗ（登録商標））、Ｋｉｎｄｌｉｎｇ  Ｒｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（キンドリングレッド蛍光タンパク質：ＫＦＰ−Ｒｅｄ）（例えば、Ｅｖｒｏｇｅｎ社（ロシア）のＫｉｎｄｌｉｎｇ−Ｒｅｄ（登録商標））、赤色蛍光タンパク質（例えば、Ｅｖｒｏｇｅｎ社（ロシア）のＨｕＲＥＤ−ｔａｎｄｅｍ（登録商標））、Ｋａｅｄｅ（カエデ）タンパク質（Ａｎｄｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２００２、Ｏｃｔ  １；９９（２０）：１２６５１−６）。
【００５３】
本明細書において使用する場合、「植物病原体」とは、植物に有害な影響を与える外来の因子をいい、例えば、ウイルス、真菌、細菌が挙げられるがこれらに限定されない。
【００５４】
本明細書において使用される用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。この用語はまた、「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」を含む。「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホロアミデート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換された誘導体オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドなどが例示される。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、１またはそれ以上の選択された（または、すべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８（１９９４））。用語「核酸」はまた、本明細書において、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと互換可能に使用される。特定の核酸配列はまた、「スプライス改変体」を包含する。同様に、核酸によりコードされた特定のタンパク質は、その核酸のスプライス改変体によりコードされる任意のタンパク質を暗黙に包含する。その名が示唆するように「スプライス改変体」は、遺伝子のオルタナティブスプライシングの産物である。転写後、最初の核酸転写物は、異なる（別の）核酸スプライス産物が異なるポリペプチドをコードするようにスプライスされ得る。スプライス改変体の産生機構は変化するが、エキソンのオルタ���ティブスプライシングを含む。読み過し転写により同じ核酸に由来する別のポリペプチドもまた、この定義に包含される。スプライシング反応の任意の産物（組換え形態のスプライス産物を含む）がこの定義に含まれる。
【００５５】
本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよい。「誘導体ヌクレオチド」または「ヌクレオチドアナログ」とは、天然に存在するヌクレオチドとは異なるがもとのヌクレオチドと同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログは、当該分野において周知である。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログの例としては、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００５６】
本明細書において、「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。本明細書においてプロモーターの「フラグメント」とは、好ましくは、プロモーター配列中の部分配列であって、プロモーター配列と同様の制御（例えば、薬物などの外来因子による発現誘導、組織特異的発現、時期特異的発現など）を受ける配列をいう。
【００５７】
本明細書において、「改変体」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの物質に対して、一部が変更されているものをいう。そのような改変体としては、置換改変体、付加改変体、欠失改変体、短縮（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）改変体、対立遺伝子変異体などが挙げられる。対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）とは、同一遺伝子座に属し、互いに区別される遺伝的改変体のことをいう。従って、「対立遺伝子変異体」とは、ある遺伝子に対して、対立遺伝子の関係にある改変体をいう。「種相同体またはホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇ）」とは、ある種の中で、ある遺伝子とアミノ酸レベルまたはヌクレオチドレベルで、相同性（好ましくは、６０％以上の相同性、より好ましくは、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上の相同性）を有するものをいう。そのような種相同体を取得する方法は、本明細書の記載から明らかである。「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」とは、オルソロガス遺伝子（ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ  ｇｅｎｅ）ともいい、二つの遺伝子がある共通祖先からの種分化に由来する遺伝子をいう。例えば、多重遺伝子構造をもつヘモグロビン遺伝子ファミリーを例にとると、ヒトとマウスのαヘモグロビン遺伝子はオルソログであるが，ヒトのαヘモグロビン遺伝子とβヘモグロビン遺伝子はパラログ（遺伝子重複で生じた遺伝子）である。オルソログは、分子系統樹の推定に有用であることから、オルソログもまた、本発明において有用であり得る。
【００５８】
「保存的（に改変された）改変体」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された改変体とは、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸をいい、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一な配列をいう。遺伝コードの縮重のため、多数の機能的に同一な核酸が任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンにより特定される全ての位置で、そのコドンは、コードされたポリペプチドを変更することなく、記載された対応するコドンの任意のものに変更され得る。このような核酸の変動は、保存的に改変された変異の１つの種である「サイレント改変（変異）」である。ポリペプチドをコードする本明細書中のすべての核酸配列はまた、その核酸の可能なすべてのサイレント変異を記載する。当該分野において、核酸中の各コドン（通常メチオニンのための唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンのための唯一のコドンであるＴＧＧを除く）が、機能的に同一な分子を産生するために改変され得ることが理解される。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、記載された各配列において暗黙に含まれる。好ましくは、そのような改変は、ポリペプチドの高次構造に多大な影響を与えるアミノ酸であるシステインの置換を回避するようになされ得る。
【００５９】
本明細書中において、機能的に等価なポリペプチドを作製するために、アミノ酸の置換のほかに、アミノ酸の付加、欠失、または修飾もまた行うことができる。アミノ酸の置換とは、もとのペプチドを１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸で置換することをいう。アミノ酸の付加とは、もとのペプチド鎖に１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を付加することをいう。アミノ酸の欠失とは、もとのペプチドから１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を欠失させることをいう。アミノ酸修飾は、アミド化、カルボキシル化、硫酸化、ハロゲン化、アルキル化、グリコシル化、リン酸化、水酸化、アシル化（例えば、アセチル化）などを含むが、これらに限定されない。置換、または付加されるアミノ酸は、天然のアミノ酸であってもよく、非天然のアミノ酸、またはアミノ酸アナログでもよい。天然のアミノ酸が好ましい。
【００６０】
このような核酸は、周知のＰＣＲ法により得ることができ、化学的に合成することもできる。これらの方法に、例えば、部位特異的変位誘発法、ハイブリダイゼーション法などを組み合わせてもよい。
【００６１】
本明細書において、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの「置換、付加または欠失」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、それぞれアミノ酸もしくはその代替物、またはヌクレオチドもしくはその代替物が、置き換わること、付け加わることまたは取り除かれることをいう。このような置換、付加または欠失の技術は、当該分野において周知であり、そのような技術の例としては、部位特異的変異誘発技術などが挙げられる。置換、付加または欠失は、１つ以上であれば任意の数でよく、そのような数は、その置換、付加または欠失を有する改変体において目的とする機能（例えば、癌マーカー、神経疾患マーカーなど）が保持される限り、多くすることができる。例えば、そのような数は、１または数個であり得、そして好ましくは、全体の長さの２０％以内、１０％以内、または１００個以下、５０個以下、２５個以下などであり得る。
【００６２】
本明細書において使用する場合、「作動可能に連結された（る）」とは、所望の配列の発現（作動）がある転写翻訳調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）または翻訳調節配列の制御下に配置されることをいう。プロモーターが遺伝子に作動可能に連結されるためには、通常、その遺伝子のすぐ上流にプロモーターが配置されるが、必ずしも隣接して配置される必要はない。
【００６３】
本明細書において使用する場合、植物における「病害抵抗性」とは、少なくとも２つ以上の植物疾患に対して植物の状態を改善する作用をいう。例えば、病害抵抗性を有する植物は、病害抵抗性を有さない植物と比較して、少なくとも２つ以上の植物疾患に対して、改善された耐性および／または抵抗性を有する。
【００６４】
本明細書において使用する場合、植物における「病害抵抗性を誘導する農薬」とは、少なくとも２つ以上の植物疾患に対して植物の状態を改善する農薬であり、かつ植物病原体に対して直接作用しない農薬をいう。
【００６５】
本明細書において使用する場合、植物体と、薬剤および／または農薬を「接触させる」とは、薬剤および／または農薬が植物体に対して何らかの作用をすることが可能な程度に物理的に接近することをいう。この接触は、例えば、噴霧、塗布、パンチ接種、および注入、によってなされ得る。
【００６６】
本明細書において使用する場合、「病害抵抗性誘導遺伝子」とは、病害抵抗性をもたらす何らかの刺激（例えば、プロベナゾールのような化合物との接触）によって誘導される、遺伝子をいう。この遺伝子の例としては、ＰＢＺ１遺伝子、Ｄ９遺伝子、Ｒａｃ１遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６７】
ＰＢＺ１遺伝子のプロモーターを使用する場合、代表的には、イネ由来の配列番号１に記載の配列全長、またはそのフラグメントを用いることができる。
【００６８】
Ｄ９遺伝子のプロモーターを使用する場合、代表的には、イネ由来の配列番号４に記載の配列全長、またはそのフラグメントを用いることができる。
【００６９】
Ｒａｃ１遺伝子のプロモーターを使用する場合、代表的には、イネ由来の配列番号６に記載の配列全長、またはそのフラグメントを用いることができる。
【００７０】
本発明を植物において利用する場合、植物細胞への植物発現ベクターの導入には、当業者に周知の方法、例えば、アグロバクテリウムを介する方法および直接細胞に導入する方法、が用いられ得る。アグロバクテリウムを介する方法としては、例えば、Ｎａｇｅｌらの方法（Ｎａｇｅｌ  ら（１９９０）、  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｌｅｔｔ．，６７，３２５）が用いられ得る。この方法は、まず、例えば植物発現ベクターでエレクトロポレーションによってアグロバクテリウムを形質転換し、次いで、形質転換されたアグロバクテリウムをＧｅｌｖｉｎら（Ｇｅｌｖｉｎら編（１９９４）、  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｍａｎｕａｌ  （Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ））に記載の方法で植物細胞に導入する方法である。植物発現ベクターを直接細胞に導入する方法としては、エレクトロポレーション法（Ｓｈｉｍａｍｏｔｏら（１９８９）、Ｎａｔｕｒｅ、３３８：２７４−２７６；およびＲｈｏｄｅｓら（１９８９）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４０：２０４−２０７を参照のこと）、パーティクルガン法（Ｃｈｒｉｓｔｏｕら（１９９１）、  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：９５７−９６２を参照のこと）ならびにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法（Ｄａｔｔａら（１９９０）、  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：７３６−７４０を参照のこと）が挙げられる。これらの方法は、当該分野において周知であり、形質転換する植物に適した方法が、当業者により適宜選択され得る。
【００７１】
植物発現ベクターを導入された細胞は、まずカナマイシン耐性などの薬剤耐性で選択される。次いで、当該分野で周知の方法により、植物組織、植物器官および／または植物体に再分化され得る。さらに、植物体から種子が取得され得る。導入した遺伝子の発現は、ノーザンブロット法またはＰＣＲ法により、検出し得る。必要に応じて、遺伝子産物たるタンパク質の発現を、例えば、ウェスタンブロット法により確認し得る。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】図１は、ＰＢＺ１プロモーターと連結したＧＦＰ（ＰＢＺ１：：ＧＦＰ）を用いた、ｐＢＺ１プロモーターのオリゼメート、プロベナゾール、セレブロシドＢによる発現誘導を示す。
【００７３】
未処理の葉身（Ａ）・オリゼメート処理１０日目の葉身（Ｂ）、未処理の葉身（Ｃ）、プロベナゾール処理３日目の葉身（Ｄ）、未処理の葉身（Ｅ）、セレブロシドＢ処理後６時間の葉身（Ｆ）、セレブロシドＢ処理後３日目の葉身（Ｇ）。
【図２】図２は、ＰＢＺ１：：ＧＦＰを用いた、いもち菌レース００７菌の噴霧接種の結果を示す。
【００７４】
００７菌を接種した葉身を可視光（Ａ）（Ｃ）・励起光（Ｂ）（Ｄ）で観察した。
【図３】図３は、ＰＢＺ１：：ＧＦＰを用いた、いもち菌レース０３１菌と００７菌のパンチ接種の結果を示す。
【００７５】
０３１菌を接種した葉身を可視光（Ａ）、励起光（Ｂ）で観察した。
【００７６】
００７菌を接種した葉身を可視光（Ｃ）、励起光（Ｄ）で観察した。
【図４】図４は、ＰＢＺ１プロモーターと連結したＧＦＰ（ＰＢＺ１：：ＧＦＰ）の完熟種子における発現を示す。
【００７７】
ＰＢＺ１：：ＧＦＰ導入種子を可視光（Ａ）、励起光（Ｂ）で観察した。
【図５】図５は、ＰＢＺ１：：ＧＦＰの発芽時の発現を示す。
【００７８】
ＰＢＺ１：：ＧＦＰ、導入種子をＭＳ培地に播種後２日目（Ａ，Ｂ）、３日目（Ｃ，Ｄ）、４日目（Ｅ，Ｆ）７日目（Ｇ，Ｈ）で可視光（Ａ，Ｃ，Ｅ，Ｇ）、励起光（Ｂ，Ｄ，Ｆ；Ｈ）で観察した。
【図６】図６は、ＰＢＺ１：：ＧＦＰの組織・器官特異的発現を示す。
【００７９】
励起光下で非型質転換体（Ａ）、ＰＢＺｌ：：ＧＦＰ導入イネ成熟植物体（Ｂ，Ｃ）、ＰＢＺ１：：ＧＦＰ導入イネの穎果（Ｄ）、登熟中の胚乳（Ｅ）、胚（Ｆ）、根の先端（Ｇ）を観察した。
【図７】図７は、Ｄ９プロモーターと連結したＧＦＰのプロベナゾールによる発現誘導を示す。
【００８０】
未処理の葉身（Ａ）・プロベナゾール処理７日目の葉身（Ｂ）。
【図８】図８は、Ｄ９プロモーターと連結したＧＦＰを用いた、いもち菌レース００７菌の噴霧接種の結果を示す。
【００８１】
００７菌を接種した葉身を可視光（Ａ）、および励起光（Ｂ）で観察した。
【図９】図９は、特開２００１−２６９１７１に開示される蛍光物質観察用励起光照射装置を示す。
【発明を実施するための形態】
【００８２】
（スクリーニングに用いる植物体の作製）
本発明に従って、病害抵抗性を誘導する農薬をスクリーニングするために使用され得る植物体は、（ａ）植物の病害抵抗性誘導遺伝子のプロモーター；および（ｂ）該プロモーターに作動可能に連結された、蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む、発現カセットを作製し、その発現カセットを植物に導入することによって作製される。
【００８３】
この発現カセットにおいて使用されるプロモーターとしては、種々の病害抵抗性誘導遺伝子、例えば、ＰＢＺ１遺伝子のプロモーター（配列番号１）、Ｄ９遺伝子のプロモーター（配列番号４）、およびＲａｃ１遺伝子のプロモーター（配列番号６）が挙げられる。また、本発明の発現カセットにおいて使用する場合、必ずしもこれらのプロモーターの全長を用いる必要はなく、これらプロモーターのフラグメントであって、プロベナゾールおよび／またはセレブロシドＢのような病害抵抗性を誘導する農薬に応答するフラグメントであってもよい。例えば、配列番号４に示されるＤ９遺伝子プロモーター領域１０２０ｂｐの場合、その全長のみならず、配列番号４の８１５ｂｐフラグメント（配列番号５）を用いることもできる。実際に、この配列番号４の８１５ｂｐを蛍光タンパク質をコードする遺伝子に作動可能に連結した場合、いもち病によって発現が誘導された。その８１５ｂｐフラグメントによる誘導の強度は、配列番号４の全長１０２０ｂｐを用いた場合と同様であった。
【００８４】
また、これらプロモーターを蛍光タンパク質をコードする遺伝子に連結する場合は、プロモーターが作動可能な条件であればよい。
【００８５】
この蛍光タンパク質としては、オワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、配列番号３のアミノ酸配列を有する変異型ＧＦＰ、イソギンチャク近縁種Ｄｉｓｃｏｓｏｎａ  ｓｔｒｉａｔａ由来の蛍光タンパクであるＲＦＰ（Ｒｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）、Ａｅｑｕｒｅ  ｃｏｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓ由来のＧＦＰ（例えば、Ｅｖｒｏｇｅｎ社（ロシア）のＡｃｅ−Ｇｒｅｅｎ（登録商標））、甲殻生物であるＣｏｐｅｐｏｄ由来のＧＦＰ（例えば、Ｅｖｒｏｇｅｎ社（ロシア）のＣｏｐ−Ｇｒｅｅｎ（登録商標））、黄色蛍光タンパク質（例えば、Ｅｖｒｏｇｅｎ社（ロシア）のＰｈｉ−Ｙｅｌｌｏｗ（登録商標））、Ｋｉｎｄｌｉｎｇ  Ｒｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（キンドリングレッド蛍光タンパク質：ＫＦＰ−Ｒｅｄ）（例えば、Ｅｖｒｏｇｅｎ社（ロシア）のＫｉｎｄｌｉｎｇ−Ｒｅｄ（登録商標））、赤色蛍光タンパク質（例えば、Ｅｖｒｏｇｅｎ社（ロシア）のＨｕＲＥＤ−ｔａｎｄｅｍ（登録商標））、およびＫａｅｄｅ（カエデ）タンパク質（Ａｎｄｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２００２、Ｏｃｔ  １；９９（２０）：１２６５１−６）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８６】
この発現カセットを導入した植物体の作製は、例えば、植物細胞（例えば、カルス細胞、胚細胞、種子）に発現カセットを含むベクターを導入し、その後、遺伝子導入された植物細胞を植物体に再生することによって行われ得る。植物細胞へのベクターの導入方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、トランスフェクション、形質導入、以下を用いた形質転換などが挙げられる：アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（特開昭５９−１４０８８５、特開昭６０−７００８０、ＷＯ９４／００９７７、特開２００１−２９０７５（特許３１４１０８４号）、特開２０００−２４５４８５）、エレクトロポレーション法（特開昭６０−２５１８８７）、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（特許第２６０６８５６、特許第２５１７８１３）等が例示される。本発明においては、形質転換後に再生した植物体の後代を用いることも可能である。
【００８７】
また、本発明の植物体を作製する場合は、プロモーター：蛍光タンパク質コード遺伝子の融合物を２つ以上、植物に導入する発現カセットに含ませてもよい。
【００８８】
また、本発明の植物体を作製する場合は、プロモーター：蛍光タンパク質コード遺伝子の融合物を有する発現カセットを２種類以上、植物に導入してもよい。
【００８９】
（複数のプロモーターを用いる薬剤のスクリーニング）
上記の本発明の実施例の結果、ＰＢＺ１遺伝子は、プロベナゾールおよびセレブロシドＢの両薬剤に対して応答性であり、しかも、他の２つのプロモーター、Ｄ９プロモーターおよびＲａｃ１プロモーターと比較して、蛍光タンパク質によるシグナルが強かった。従って、ＰＢＺ１プロモーターは、そのシグナルの強さから、発光ダイオードを光源として使用する蛍光測定法と組み合わせた場合、候補薬剤が病害抵抗性を誘導する農薬であるか否かを簡便に決定することができる。しかし、その一方で、ＰＢＺ１プロモーターは、他の多くのストレスに対しても応答性であるという特徴を有する。例えば、気温、水温、水分、光量等がイネの生育に不適切である場合、いわゆる生理障害が起こり、ＰＢＺ１の発現誘導が観察された。また、温室内で、葉が白く抜けるなどの生理障害が生じた場合にも、ＰＢＺ１遺伝子が誘導される。ＰＢＺ１プロモーターは、多くの無関係なストレスに対しても応答性であることから、病害抵抗性を誘導する農薬のスクリーニングにおいて擬陽性を生じやすいことも判明した。
【００９０】
その一方で、Ｄ９プロモーターは、ＰＢＺ１プロモーターと同様に、プロベナゾールに対して応答性であったが、そのシグナルは、ＰＢＺ１と比較して弱かった。従って、Ｄ９プロモーターは、そのシグナルがＰＢＺ１と比較して弱いため、ＰＢＺ１と比較して、候補薬剤が病害抵抗性を誘導する農薬であるか否かの判定を迅速に行うことはできない。その一方で、Ｄ９プロモーターは、ＰＢＺ１プロモーターと異なり多くの無関係なストレスに対して応答性ではなかった。そのため、ＰＢＺ１プロモーターによって問題となる擬陽性は、ほとんど問題とならない。
【００９１】
そこで、ＰＢＺ１プロモーターによるスクリーニングと、Ｄ９プロモーターによるスクリーニングを組み合わせることによって、迅速かつ擬陽性の少ないスクリーニングを行うことが可能である。
【００９２】
上記組み合わせスクリーニングにおいては、１つの植物体中に、（ａ）配列番号１に記載されるＰＢＺ１遺伝子プロモーター配列またはそのフラグメントを有する第１のプロモーター、およびその第１のプロモーターに作動可能に連結された第１の蛍光タンパク質をコードする遺伝子、ならびに（ｂ）配列番号４に記載されるＤ９遺伝子プロモーター配列またはそのフラグメントを有する第２のプロモーター、およびその第２のプロモーターに作動可能に連結された第２の蛍光タンパク質をコードする遺伝子、を含む１つの発現カセットを導入し、その植物体を用いることができる。あるいは、１つの植物体中に、（ａ）配列番号１に記載されるＰＢＺ１遺伝子プロモーター配列またはそのフラグメントを有する第１のプロモーター、およびその第１のプロモーターに作動可能に連結された第１の蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む第１の発現カセット、ならびに（ｂ）配列番号４に記載されるＤ９遺伝子プロモーター配列またはそのフラグメントを有する第２のプロモーター、およびその第２のプロモーターに作動可能に連結された第２の蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む第２の発現カセットを導入し、その植物体を用いることができる。あるいは、（ａ）配列番号１に記載されるＰＢＺ１遺伝子プロモーター配列またはそのフラグメントを有する第１のプロモーター、およびその第１のプロモーターに作動可能に連結された第１の蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む第１の発現カセットを導入した第１の植物体、ならびに（ｂ）配列番号４に記載されるＤ９遺伝子プロモーター配列またはそのフラグメントを有する第２のプロモーター、およびその第２のプロモーターに作動可能に連結された第２の蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む第２の発現カセットを導入した第２の植物体を用いることができる。
【００９３】
上記の植物体（単数または複数）を用いて、複数のプロモーターの応答を蛍光タンパク質の発現によって検出することによって、病害抵抗性を誘導する農薬のスクリーニングを行うことができる。
【００９４】
例えば、１次スクリーニングにおいては、ＰＢＺ１プロモーターと作動可能に連結した第１の蛍光タンパク質をコードする遺伝子の発現を測定することによって、薬剤および／または農薬の作用を評価する。ＰＢＺ１プロモーターを誘導する薬剤・農薬は、病害抵抗性を誘導する農薬の候補であり、２次スクリーニングに供される。第１の蛍光タンパク質の発現量の測定は、第１の蛍光タンパク質に適したフィルターを備えた蛍光測定装置を用いて行うことができる。
【００９５】
１次スクリーニングにおいて、陽性を示した薬剤および／または農薬について、次に、Ｄ９プロモーターと作動可能に連結した第２の蛍光タンパク質をコードする遺伝子の発現を測定することによって、薬剤および／または農薬の作用を評価する。Ｄ９プロモーターを誘導する薬剤・農薬を、病害抵抗性を誘導する農薬の候補として単離する。
【００９６】
上記複数のプロモーターの組み合わせスクリーニングによって、病害抵抗性を誘導する農薬を効率的にスクリーニングすることが可能である。
【００９７】
上記のスクリーニング法はさらに、Ｒａｃ１プロモーターを用いるスクリーニングと組み合わせられ得る。以下の実施例において示されるように、Ｒａｃ１プロモーターは、セレブロシドＢで誘導されたが、プロベナゾールでの誘導は確認されなかった。薬剤に対するプロモーターの応答性の差異は、薬剤によって異なる経路で細胞に作用することに起因すると考えられる。従って、複数種類のプロモーターの応答性を比較することによって、作用機構に基づいて候補薬剤を分類することが可能になる。
【００９８】
例えば、ＰＢＺ１プロモーターからの発現を誘導し、かつＲａｃ１プロモーターからの発現を誘導する薬剤は、セレブロシドＢと類似する作用機構を有する薬剤であると推定される。これに対して、ＰＢＺ１プロモーターからの発現を誘導するが、Ｒａｃ１プロモーターからの発現を誘導しない薬剤は、プロベナゾールと類似する作用機構を有する薬剤であると推定される。
【００９９】
この知見に基づいて、例えば、ＰＢＺ１プロモーターと作動可能に連結した第１の蛍光タンパク質をコードする遺伝子の発現を測定し、そしてＲａｃ１プロモーターと作動可能に連結した第２の蛍光タンパク質をコードする遺伝子の発現を測定することによって、薬剤をその作用機構によって分類することが可能である。
【０１００】
病害抵抗性を誘導する薬剤を分類することによって、その薬剤の施用する量、濃度、時期などの手がかりとすることができる。そのような施用の手がかりがある場合、最適な施用方法の決定に必要な試行錯誤を減らし、その結果、任意の薬剤の施用条件をより容易に決定することが可能である。
【０１０１】
（発光ダイオードによる蛍光タンパク質の検出）
本発明において、植物体において発現された蛍光タンパク質を検出するためには、例えば、特開２００１−２６９１７１に開示される蛍光物質観察用励起光照射装置を用いることができる。その蛍光物質観察用励起光照射装置は、発光ダイオードを光源とし、図９に示すように、観察に使用する蛍光物質１の励起光２の波長に近い波長を発光特性のピークとする発光ダイオード素子を光源１０として備える。例えば、（１）オワンクラゲより単離された蛍光タンパクＧＦＰに由来する改変型ＧＦＰを用いる場合、その励起波長である４８８ｎｍに近い発光特性を有する発光ダイオードを使用し、ＧＦＰを発現する形質転換植物細胞を５ｌｌｎｍの蛍光発光によって肉眼で識別できる光量１１とする；（２）イソギンチャク近縁種Discosona striataより単離された蛍光タンパク（ＲＦＰ:Red Fluorescent Protein）の改変型ＤｓＲｅｄを用いる場合は、その励起波長である５５８ｎｍに近い発光特性を有する発光ダイオードを使用し、ＲＦＰを発現する形質転換細胞をＤｓＲｅｄの５８３ｎｍの蛍光発光によって識別する。
【０１０２】
また、導入遺伝子の発現を起こさせるための装置であるプロモーターの発現特性を、適当な、再分化された個体を対象として、組織毎、あるいは生育ステージ毎に、ＧＦＰにあっては５１１ｎｍ、ＲＦＰにあっては５８３ｎｍの蛍光発光を各々検出することにより明らかにすることも可能である。あるいは、複数のプロモーターを各々異なる蛍光タンパク質をコードする遺伝子に連結し、各々のプロモーターの応答性を同時に、測定することも可能である。
【０１０３】
必要に応じて、この発光ダイオードを２個またはそれ以上束ねることにより光量を確保する。更に所要により発光帯域を狭める必要がある場合には所要の励起光２の波長のみを透過させるフィルター４を装備する。発光ダイオード素子からの放射光の帯域は狭いため、励起光２の波長のみを透過するフイルター４で波長帯域を制限した場合でも強い励起光２が得られる。
【０１０４】
発光ダイオードは電気から光への変換効率が高く、乾電池程度の電源でも十分な光量が得られ、また、発光ダイオード素子の寿命は長く、素子は熱を持ちにくいことから小型化することができる。従って、乾電池またはＡＣアダプターを電源として使用することができる。また、この装置は破損しやすい管球やフィラメント類を使っていないため、可搬性に優れ、暗室や温室、人工気象室内など場所を選ばず容易に移動して、照射、観察が可能となる。
【０１０５】
以上、好ましい実施形態を例示して本発明を説明してきた。以下に、図面を参照しながら、実施例に基づいて本発明を説明するが、以下の実施例は、例示の目的のみに提供されることに留意されるべきである。従って、本発明の範囲は、説明に用いた特定の実施形態にも下記実施例にも限定されるものではなく、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【０１０６】
以下に実施例等により本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【０１０７】
（実施例１)
ＰＣＲ法により単離したＰＢＺ１プロモーター領域を変異型ＧＦＰ（配列番号２）に融合し，バイナリベクターを用いて、特許３１４１０８４号のアグロバクテリウム法により、イネ品種「日本晴」に導入した。遺伝子導入を行ったカルスから植物体を再分化させ、再生個体を得た。この植物を温室で生育させ、後代の種子を採取した。ＰＢＺｌプロモーターを領域を変異型ＧＦＰに融合したキメラＤＮＡ導入イネ植物体を胚でのＧＦＰ発現により選抜し、キメラＤＮＡの導入が確認された植物体を得た。この植物を生育させ、既存の農薬であるオリゼメートを施用し（方法は、明治製菓研究年報ＮＯ３６、４２−５４、１９９７を参考にした）、７〜１０日目に葉身におけるＧＦＰの発現を観察した。その結果、葉身における変異型ＧＦＰ発現の誘導が確認された（図１ＡおよびＢ）。
【０１０８】
（実施例２）
実施例１と同様にキメラＤＮＡ導入形質転換イネに、既存の農薬であるオリゼメートの主成分プロベナゾールを２００ｍｇ／１の濃度で施用し、３日目に葉身における変異型ＧＦＰの発現を観察した。その結果、葉身における変異型ＧＦＰ発現の誘導が確認された（図１ＣおよびＤ）。
【０１０９】
（実施例３）
実施例１と同様にキメラＤＮＡ導入形質転換イネに、いもち菌由来のエリシタ一分子であるセレブロシドＢを２μｇ／ｍＬの濃度で施用し、６時間後に葉身におけるＧＦＰの発現を観察した。その結果、葉身における変異型ＧＦＰ発現の誘導が確認された（図１Ｅ〜Ｇ）。
【０１１０】
（実施例４）
実施例１と同様にキメラＤＮＡ導入形質転換イネに、いもち菌（００７菌）を接種し、７日目に変異型ＧＦＰの発現を観察した．その結果、葉身のいもち感染部位における変異型ＧＦＰ発現の誘導が確認された（図２および３）。
【０１１１】
（実施例５）
実施例１と同様にキメラＤＮＡ導入形質転換イネにおける非誘導性の変異型ＧＦＰの発現を観察した。その結果、茎、外頴、内頴、根、登熟中の胚、発芽中の胚乳及び、胚で変異型ＧＦＰ発現が観察されたが、完熟種子におけるＧＦＰ発現は検出されなかった（図４〜６）。
【０１１２】
（実施例６）
ＰＢＺ１以外の病害抵抗性誘導遺伝子であるＤ９遺伝子のプロモーターについて、実施例１、２および４と同様に実験を行った。
【０１１３】
実施例１と同様の方法でＤ９プロモーター（配列番号４）と連結したＧＦＰ（配列番号２）キメラＤＮＡを導入した形質転換イネに、既存の農薬であるオリゼメートの主成分プロベナゾールを２００ｍｇ／１の濃度で施用し、７日目に葉身における変異型ＧＦＰの発現を観察した。その結果、葉身における変異型ＧＦＰ発現の誘導が確認された（図７）。
【０１１４】
次に、実施例１と同様の方法でＤ９プロモーター（配列番号４）と連結したＧＦＰ（配列番号２）キメラＤＮＡを導入した形質転換イネに、いもち菌（００７菌）を接種し、７日目に変異型ＧＦＰの発現を観察した。その結果、葉身のいもち感染部位における変異型ＧＦＰ発現の誘導が確認された（図８Ｂ）。
【０１１５】
（実施例７）
ＰＢＺ１以外の病害抵抗性誘導遺伝子であるＲａｃ１遺伝子のプロモーター（配列番号６）について、実施例１〜５と同様に実験を行った。
【０１１６】
その結果、Ｒａｃ１プロモーターは、セレブロシドＢで誘導されたが、プロベナゾールでの誘導は確認できなかった（データ示さず）。また、いもち菌接種時にＲａｃ１遺伝子から転写されるＲＮＡの発現上昇は見られなかった。しかし、Ｒａｃ１ｐ：：ＧＦＰを導入したイネでは，いもち菌接種によるＧＦＰの発現誘導が確認できた。
【０１１７】
以上の結果から、病害抵抗性誘導遺伝子の中で、ＰＢＺ１遺伝子のプロモーターを用いた場合は、プロベナゾールとセレブロシドＢの双方において、蛍光タンパク質による検出が可能であったが。Ｒａｃ１プロモーターは、プロベナゾールに対する応答を確認することができず、セレブロシドＢに対して応答性であった。このことは、プロベナゾールとセレブロシドＢの作用機構が異なること、およびＰＢＺ１遺伝子とＲａｃ１遺伝子は、異なる経路で発現誘導される遺伝子であることを示す。
【０１１８】
（実施例８）
上記の本発明の実施例の結果、ＰＢＺ１遺伝子は、プロベナゾールおよびセレブロシドＢの両薬剤に対して応答性であり、しかも、他の２つのプロモーター、Ｄ９プロモーターおよびＲａｃ１プロモーターと比較して、蛍光タンパク質によるシグナルが強かった。従って、ＰＢＺ１プロモーターは、そのシグナルの強さから、発光ダイオードを光源として使用する蛍光測定法と組み合わせた場合、候補薬剤が病害抵抗性を誘導する農薬であるか否かを簡便に決定することができる。しかし、その一方で、ＰＢＺ１プロモーターは、他の多くのストレスに対しても応答性であるという特徴を有する。例えば、気温、水温、水分、光量等がイネの生育に不適切である場合、いわゆる生理障害が起こり、ＰＢＺ１の発現誘導が観察された。また、温室内で、葉が白く抜けるなどの生理障害が生じた場合にも、ＰＢＺ１遺伝子が誘導される。ＰＢＺ１プロモーターは、多くの無関係なストレスに対しても応答性であることから、病害抵抗性を誘導する農薬のスクリーニングにおいて擬陽性を生じやすいことも判明した。
【０１１９】
Ｄ９プロモーターは、ＰＢＺ１プロモーターと同様に、プロベナゾールに対して応答性であったが、そのシグナルは、ＰＢＺ１と比較して弱かった。従って、Ｄ９プロモーターは、そのシグナルがＰＢＺ１よりも弱いため、ＰＢＺ１と比較して、候補薬剤が病害抵抗性を誘導する農薬であるか否かの判定を簡便に行うことができない。その一方で、Ｄ９プロモーターは、ＰＢＺ１プロモーターと異なり多くの無関係なストレスに対して応答性ではなかった。従って、ＰＢＺ１プロモーターによって問題となる擬陽性は、Ｄ９プロモーターの場合、ほとんど問題とならない。
【０１２０】
そこで、ＰＢＺ１プロモーターによるスクリーニングと、Ｄ９プロモーターによるスクリーニングを組み合わせたスクリーニング方法を以下のように行う。
【０１２１】
組み合わせスクリーニングにおいて、（ａ）配列番号１に記載されるＰＢＺ１遺伝子プロモーター配列またはそのフラグメントを有する第１のプロモーター、およびその第１のプロモーターに作動可能に連結された第１の蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む第１の発現カセットを導入した第１の植物体、ならびに（ｂ）配列番号４に記載されるＤ９遺伝子プロモーター配列またはそのフラグメントを有する第２のプロモーター、およびその第２のプロモーターに作動可能に連結された第２の蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む第２の発現カセットを導入した第２の植物体を用いる。
【０１２２】
第１の植物体に多数の候補薬剤を接触させ、第１の蛍光タンパク質を指標として、１次スクリーニングを行う。多数の候補薬剤の中から、第１の蛍光タンパク質の発現を誘導する薬剤、すなわち、ＰＢＺ１誘導性の薬剤を選択する。次に、その選択された薬剤を、第２の植物体に接触させ、第２の蛍光タンパク質を指標として、２次スクリーニングを行う。候補薬剤の中から、第２の蛍光タンパク質の発現を誘導する薬剤、すなわち、Ｄ９誘導性の薬剤を選択する。
【０１２３】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【０１２４】
本発明によって、ａ）植物の病害抵抗性誘導遺伝子の天然のプロモーター；およびｂ）該プロモーターに作動可能に連結された蛍光タンパク質をコードする遺伝子、を含む発現カセットを含むベクターによって形質転換された植物体を得て、その植物体を候補薬剤によって処理し、その蛍光タンパク質の発現量を指標にして、候補薬剤にスクリーニングを行なう方法およびその方法のためのシステムが提供される。また、そのスクリーニング方法によって使用される植物体もまた、提供される。
【符号の説明】
【０１２５】
図面における参照番号は、以下のとおりである：
１  蛍光物質
２  励起光
４、６  フィルター
５  蛍光発光
１０  発光ダイオードからなる光源
１１  肉眼で観察できる光量
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
0004566993.tif 000009
【図９】
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【配列表】
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