(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘッジホッグポリペプチドの単離された機能的アンタゴニストであって、該アンタゴニストはヘッジホッグレセプターに結合するが、ヘッジホッグ依存性シグナリング応答を誘導せず、該アンタゴニストはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜７及び１１のいずれかと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドであり、アンタゴニストは、：
ａ）成熟ヘッジホッグポリペプチドのＣｙｓ−１に対応するＮ末端システインを欠くヘッジホッグポリペプチドであるか、
ｂ）成熟ヘッジホッグポリペプチドのＣｙｓ−１を有するＮ末端伸長部位を含むか、
ｃ）最もＮ末端側のアミノ酸残基として成熟ヘッジホッグポリペプチドのＣｙｓ−１を有するＮ末端伸長部位を含むか、
ｄ）成熟ヘッジホッグポリペプチドのＣｙｓ−１に対応するＮ末端システインから始まるアミノ酸を最大で１２個欠いているか、又は
ｅ）Ｎ末端システインの他のアミノ酸残基への突然変異を有する、
該アンタゴニスト。
【請求項２】
Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞におけるアルカリホスフェート誘導アッセイ；Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞におけるｐｔｃ−１発現アッセイ；Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞におけるｇｌｉ−１発現アッセイ；及びＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞におけるパッチト−１タンパク質誘導アッセイよりなる群から選択するアッセイにおいて、ヘッジホッグ依存性シグナリング応答を誘導しないことを特徴とする、請求項１に記載の単離されたアンタゴニスト。
【請求項３】
アンタゴニストが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２〜７のいずれかと少なくとも９０％の同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項１に記載の単離されたアンタゴニスト。
【請求項４】
アンタゴニストが、成熟ヘッジホッグポリペプチドのＣｙｓ−１に対応するＮ末端システインを欠くヘッジホッグポリペプチドである、請求項３に記載の単離されたアンタゴニスト。
【請求項５】
成熟ヘッジホッグポリペプチドのＣｙｓ−１を有するＮ末端伸長部位を含む、請求項３に記載の単離されたアンタゴニスト。
【請求項６】
アンタゴニストが、最もＮ末端側のアミノ酸残基として成熟ヘッジホッグポリペプチドのＣｙｓ−１を有するＮ末端伸長部位を含む、請求項３に記載の単離されたアンタゴニスト。
【請求項７】
アンタゴニストが、成熟ヘッジホッグポリペプチドのＣｙｓ−１に対応するＮ末端システインから始まるアミノ酸を最大で１２個欠いている、請求項３に記載の単離されたアンタゴニスト。
【請求項８】
アンタゴニストが、Ｎ末端システインの他のアミノ酸残基への突然変異を有する、請求項３に記載の単離されたアンタゴニスト。
【請求項９】
他のアミノ酸が、極性アミノ酸又は帯電アミノ酸残基である、請求項８に記載の単離されたアンタゴニスト。
【請求項１０】
他のアミノ酸残基が、セリン残基である、請求項８又は９に記載の単離されたアンタゴニスト。
【請求項１１】
アンタゴニストが、更に、アンタゴニストのＣ末端に改変を含む、請求項３に記載の単離されたアンタゴニスト。
【請求項１２】
アンタゴニストが、Ｃ末端から最大で１１アミノ酸残基を失っている、請求項１１に記載のアンタゴニスト。
【請求項１３】
改変が、Ｃ末端に結合されたポリペプチドを含み、かつそのポリペプチドを、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ＤＮＡ結合ドメイン、ポリメラーゼ活性化ドメイン、ヒスチジンタグ及び免疫グロブリン又はこれらの部分よりなる群から選択する、請求項１１に記載のアンタゴニスト。
【請求項１４】
Ｃ末端改変が、Ｃ末端に結合された疎水性部分を含む、請求項１１に記載のアンタゴニスト。
【請求項１５】
成熟ヘッジホッグポリペプチドのＣｙｓ−１を、(ａ)ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で示される成熟ソニックヘッジホッグポリペプチドのＣｙｓ−１；(ｂ)ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示される成熟インディアンヘッジホッグポリペプチドのＣｙｓ−１；及び(ｃ)ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４で示されるの成熟デザートヘッジホッグポリペプチドのＣｙｓ−１よりなる群から選択する、請求項１に記載の単離されたアンタゴニスト。
【請求項１６】
アンタゴニストが、ソニック、デザート又はインディアンヘッジホッグ応答性レセプターに結合することができるが、ソニック、デザート又はインディアンヘッジホッグ依存性シグナリング応答を誘導できないポリペプチドを含むアンタゴニストであって、該ポリペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項１に記載の単離されたヘッジホッグアンタゴニスト。
【請求項１７】
ポリペプチドが、成熟ソニックヘッジホッグポリペプチドのＣｙｓ−１残基に対応する残基から、成熟ソニックヘッジホッグポリペプチドのＣｙｓ−１残基に対応しない残基に変化されたＮ末端残基を有する、請求項１６に記載の単離されたアンタゴニスト。
【請求項１８】
アンタゴニストが、デザート、ソニック又はインディアンヘッジホッグ応答性レセプターに結合することはできるが、ソニック、インディアン又はデザートヘッジホッグ依存性シグナリング応答を誘導できないポリペプチドを含むアンタゴニストであって、該ポリペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項１に記載の単離されたヘッジホッグアンタゴニスト。
【請求項１９】
ポリペプチドが、成熟デザートヘッジホッグポリペプチドのＣｙｓ−１残基に対応する残基から、成熟デザートヘッジホッグポリペプチドのＣｙｓ−１残基に対応しない残基に変えられたＮ末端残基を有する、請求項１８に記載の単離されたアンタゴニスト。
【請求項２０】
アンタゴニストが、インディアン、デザート又はソニックヘッジホッグ応答性レセプターに結合することはできるが、インディアン、デザート又はソニックヘッジホッグ依存性シグナリング応答を誘導できないポリペプチドを含むアンタゴニストであって、該ポリペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項１に記載の単離されたヘッジホッグアンタゴニスト。
【請求項２１】
ポリペプチドが、成熟インディアンヘッジホッグポリペプチドのＣｙｓ−１残基に対応する残基から、成熟インディアンヘッジホッグポリペプチドのＣｙｓ−１残基に対応しない残基に変化されたＮ末端残基を有する、請求項２０に記載の単離されたアンタゴニスト。
【請求項２２】
請求項１に記載の単離されたアンタゴニストであって、前記アンタゴニストがSEQ ID NO:５、６、７、９、１０及び１１から選択するアミノ酸配列を含むポリペプチドであるアンタゴニスト。
【請求項２３】
前記アンタゴニストが下記の特性を有する請求項１に記載のヘッジホッグポリペプチドの単離された機能的アンタゴニストであり：
(ｉ)単離されたアンタゴニストが、ヘッジホッグレセプターに結合し；そして
(ｉｉ)単離されたアンタゴニストが、ＡＰアッセイで試験した場合に、成熟ヘッジホッグタンパク質によるアルカリホスファターゼ(ＡＰ)誘導をブロックする、
該アンタゴニストはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜７又は１１のいずれかと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドであるアンタゴニスト。
【請求項２４】
ヘッジホッグレセプターが、パッチト−１である、請求項２３に記載の単離されたアンタゴニスト。
【請求項２５】
ｐｔｃ−１及びｇｌｉ−１発現を誘導できないという更なる特性を有する、請求項２４に記載の単離されたアンタゴニスト。
【請求項２６】
成熟ソニックヘッジホッグのＣｙｓ−１に対応するＮ末端システインを欠くヘッジホッグポリペプチドを含む、請求項２５に記載の単離されたアンタゴニスト。
【請求項２７】
発現に際して、請求項１、１６、１８又は２０の機能的アンタゴニストをコードする単離された核酸。
【請求項２８】
脊椎動物のヘッジホッグファミリーのメンバーであるヘッジホッグポリペプチドをコードする、請求項２７に記載の核酸。
【請求項２９】
ヘッジホッグポリペプチドの機能的アンタゴニストをコードする核酸であって、下記よりなる群から選択するポリヌクレオチドを含む当該核酸：
(ａ)SEQ ID NO:１６によりコードされるポリヌクレオチド；
(ｂ)発現に際して、SEQ ID NO:１６によりコードされるタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項３０】
請求項２７の核酸配列を含むベクター。
【請求項３１】
請求項３０に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３２】
請求項３０に記載のベクターに含まれる核酸配列によりコードされるヘッジホッグポリペプチドの機能的アンタゴニスト。
【請求項３３】
製薬上許容し得るキャリアー中に請求項１、１６、１８、２０又は２３に記載のポリペプチドを含む組成物。
【請求項３４】
請求項１に記載の機能的ヘッジホッグアンタゴニストを製造する方法であって、成熟ヘッジホッグポリペプチドのＮ末端システイン残基を、成熟ソニックヘッジホッグのＣｙｓ−１残基に対応する残基から、成熟ソニックヘッジホッグのＣｙｓ−１残基に対応しない残基に変化させることを含む当該方法。
【請求項３５】
変化させるステップが、ヘッジホッグポリペプチドをタンパク質分解にさらすことを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
機能的ヘッジホッグアンタゴニストタンパク質を製造する方法であって、請求項３１の宿主細胞からタンパク質を発現させてそのタンパク質を精製することを含む当該方法。
【請求項３７】
アンタゴニストの一つのアミノ酸残基に、ポリエチレングリコール及びデキストランよりなる群から選択する一つの部分を結合させた、請求項３に記載の単離されたアンタゴニスト。
【請求項３８】
ヘッジホッグ依存性シグナリング応答を、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２アルカリホスファターゼアッセイにおいて測定する、請求項１に記載のアンタゴニスト。
【請求項３９】
前記アンタゴニストがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２〜７の何れかと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項１又は２３に記載のアンタゴニスト。
【請求項４０】
前記アンタゴニストがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２〜７の何れかと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項３９に記載のアンタゴニスト。
【請求項４１】
前記ポリペプチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有する、請求項１６に記載のアンタゴニスト。
【請求項４２】
前記ポリペプチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有する、請求項１８に記載のアンタゴニスト。
【請求項４３】
前記ポリペプチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有する、請求項２０に記載のアンタゴニスト。
【請求項４４】
請求項３４又は３５に記載の方法に従って製造された機能的ヘッジホッグアンタゴニスト。
【請求項４５】
請求項３６に記載の方法に従って製造された機能的ヘッジホッグアンタゴニストタンパク質。
【請求項４６】
患者のヘッジホッグ依存性シグナリングを阻害するための医薬製剤の製造のための、請求項３３に記載の組成物の使用。
【請求項４７】
患者のヘッジホッグ依存性シグナリングを阻害するための医薬製剤の製造のための、請求項３０に記載のベクターの使用。
【請求項４８】
前記アンタゴニストがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、６及び７のいずれかから選択するアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項２２に記載の単離された機能的アンタゴニスト。
【請求項４９】
前記アンタゴニストがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項４８に記載の単離された機能的アンタゴニスト。
【請求項５０】
前記アンタゴニストがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６のアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項４８に記載の単離された機能的アンタゴニスト。
【請求項５１】
前記アンタゴニストがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７のアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項４８に記載の単離された機能的アンタゴニスト。
【請求項５２】
前記アンタゴニストがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項２２に記載の単離された機能的アンタゴニスト。
【請求項５３】
前記アンタゴニストがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６のアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項２２に記載の単離された機能的アンタゴニスト。
【請求項５４】
前記アンタゴニストがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７のアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項２２に記載の単離された機能的アンタゴニスト。
【請求項５５】
前記アンタゴニストがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９のアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項２２に記載の単離された機能的アンタゴニスト。
【請求項５６】
前記アンタゴニストがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０のアミノ酸配列を含むポリペプチドでありる、請求項２２に記載の単離された機能的アンタゴニスト。
【請求項５７】
前記アンタゴニストがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１のアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項２２に記載の単離された機能的アンタゴニスト。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
ヘッジホッグタンパク質は、脊椎動物及び無脊椎動物の両者において胚発生の様々な面を調節する細胞外シグナリングタンパク質のファミリーである(総説としては、Perrimon,N.(1995)Cell 80,517-520及び、Johnson,R.L.及びTabin,C.(1995)Cell 81,313-316を参照されたい)。このファミリーは、様々な動物から得られるメンバーを含み、ソニック、デザート及びインディアンヘッジホッグを含む。最も徹底的に特性決定された哺乳動物の同族体は、ソニックヘッジホッグ(「Ｓｈｈ」)であり、これは、中枢神経系内の底板の誘導及び腹側極性の確立並びに発生中の肢の適当な前後パターンを含む種々の胚誘導事象に関与している(Riddle,R.D.等(1993)Cell 75,1401-1416；Echelard,Y.等(1993)Cell 75,1417-1471；Roelink,H.等(1994)Cell 76,761-775；及びRoelink,H.等(1995)Cell 81,445-455)。これらの効果の媒介において、Ｓｈｈは、短距離用の接触依存性インデューサー及び長距離用の拡散性モルフォゲンとして作用すると考えられている。Ｓｈｈは、胚の脊索において発現され、神経管の腹側正中線において底板形成を接触依存様式で誘導する(Riddle等及びRoelink等、Cell,81:445前書参照)。データは、Ｓｈｈが、腹側ニューロン例えば中脳におけるドーパミン作動性ニューロン(Wang,M.Z.等(1995),Nature Med.1,1184-1188)及び脊髄における運動ニューロン(Roelink等、Cell 81:445,前書)のその後の分化を促進する長距離用の拡散性モルフォゲンとしても領域特異的様式で作用し得ることを示唆している。
【０００２】
生化学的及び遺伝学的データは、ヘッジホッグレセプターが、パッチされた腫瘍抑制遺伝子の産物であること(Marigo,V.等(1996)Nature 384,176-179；Stone,D.M.等(1996)Nature 384,129-134)及びスムースンド(Alcedo,J.(1996)Cell 86,221-232)、キュビタスインターラプタス又はその哺乳動物の対応物のｇｌｉ(Dominguez,M.等(1996)Science 272,1621-1625；Alexandre,C.等(1996)Genes&Dev.10,2003-2013)及びヒューズド(Therond,P.P.等(1996)Proc.Natl.Acad.Sci. USA 93,4224-4228)を含む他のタンパク質がヘッジホッグシグナリング経路に含まれることを示唆している。パッチト−１及びｇｌｉ−１発現の誘導は、ヘッジホッグシグナリングの下流マーカーであり、ヘッジホッグ機能に対する単純マーカーとして働く。第２のパッチト遺伝子、パッチト−２は、ヘッジホッグによっても誘導される(Takabatake,T.等(1997)FEBS Letts.410,485-489)。膜貫通タンパク質のＨｉｐも又、ヘッジホッグのレセプターとして同定されている(ＰＣＴ公開ＷＯ９８／１２３２６)。
【０００３】
Ｓｈｈは、４５ｋＤａの前駆体タンパク質として合成され、これは、自己触媒的に開裂されて、すべての公知のヘッジホッグ生物学的活性(「成熟」ソニックヘッジホッグ)の原因である２０ｋＤａのＮ末端断片と、自己プロセッシング機構を含む(Lee,J.J.等(1994)Science 266,1528-1536；Bumcrot,D.A.等(1995)Mol.Cell Biol.15,2294-2303；Porter,J.A.等(1995)Nature 374,363-366)２５ｋＤａのＣ末端断片とを生じる。このＮ末端断片は、そのＣ末端の脂質係留鎖の付加により膜結合を維持している(Porter,J.A.等(1996)Science 274,255-258；Porter,J.A.等(1995)Cell 86,21-34)。最近の生化学的データは、この脂質係留鎖をコレステロールと同定した(Porter,J.A.等(1996)Science 274、前書)が、その付加は、自己プロセッシングステップ中にＣ末端ドメインにより触媒される。Ｓｈｈは又、そのＮ末端においても、パルミンチン酸により修飾されている(ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９８／１５９２３及びPepinsky等(1998)J.Biol.Chem.,273:14037-14045に記載されている)。脂質係留鎖は、ヘッジホッグシグナルの組織局在化を制限し、おそらく、ヘッジホッグによる短距離−長距離シグナリングの調節機構の部分として進化してきたのであろう。
【０００４】
様々な神経の癌を含むある種の病理学的状態は、ヘッジホッグタンパク質の過剰発現により引き起こされる。これらの状態その他に関して、ヘッジホッグレセプタータンパク質に結合し得るがヘッジホッグによるシグナリングを誘出せず、それ故、ヘッジホッグ活性に対するアンタゴニストとして働くヘッジホッグのバージョンを開発することは有用であろう。
【０００５】
発明の要約
我々は、成熟ヘッジホッグタンパク質のＮ末端システインが生物学的活性に重要であること及びＮ末端の変化を含むあるヘッジホッグの変異体がヘッジホッグ機能をブロックし得ること；そうして、これらの変異体を機能的アンタゴニストとして役立たせることができることを発見した。これらのポリペプチドは、ヘッジホッグレセプター、パッチト−１に結合する能力を有するが、ヘッジホッグ依存性の応答を誘出する能力を有しないか又は減じた能力を有している。
【０００６】
この発明の一つの面は、ヘッジホッグポリペプチドの単離された機能的アンタゴニストである。かかるヘッジホッグポリペプチドが機能的ヘッジホッグアンタゴニストであるかどうかを決定する一次アミノ酸配列の臨界的特徴は、ヘッジホッグポリペプチドが、(ｉ)成熟ヘッジホッグのＣｙｓ−１に対応するＮ末端システインを欠いているか又は(ｉｉ)変化した形態の成熟ヘッジホッグのＣｙｓ−１に対応するＮ末端システインを含むことである。両方の場合に、このアンタゴニストの構造は、野生型ヘッジホッグの構造に十分に類似していて、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞においてこのタンパク質のヘッジホッグレセプターへの結合を可能にするが、ヘッジホッグ依存性のシグナリング応答の誘導は与えない。このヘッジホッグポリペプチドは、この臨界的一次アミノ酸配列を含む限り、ヘッジホッグファミリーの任意のメンバーの改変型であってよい。
【０００７】
それ故、一具体例において、この機能的アンタゴニストは、Ｎ末端伸長部分を含む。この部分は、成熟ヘッジホッグポリペプチドのＣｙｓ−１に対応するＮ末端システインを含むことができる。この具体例においては、Ｎ末端伸長部分は、成熟ヘッジホッグポリペプチドのＣｙｓ−１に対応するＮ末端システインが生物学的活性を示すのを効果的に阻止する。このＮ末端伸長部分は又、成熟ヘッジホッグポリペプチドのＣｙｓ−１を置き換えることができる。
【０００８】
他の具体例において、この機能的アンタゴニストは、成熟ヘッジホッグポリペプチドのＣｙｓ−１に対応するＮ末端システインから始まるアミノ酸を最大で約１２アミノ酸失っている。
【０００９】
更に別の具体例において、この機能的アンタゴニストは、成熟ヘッジホッグポリペプチドのＣｙｓ−１に対応するＮ末端システインのセリン又はアスパラギン酸等の極性アミノ酸残基又は帯電アミノ酸残基への変異を有する。
【００１０】
この発明の他の面は、Ｎ末端システインが成熟ヘッジホッグポリペプチドのＣｙｓ−１に対応するが、もはやこの成熟ペプチドのＣｙｓ−１の活性を有しない改変形態のＮ末端システインを含むヘッジホッグポリペプチドを含むヘッジホッグポリペプチドの単離された機能的アンタゴニストである。一具体例において、この機能的アンタゴニストは、Ｎ末端システインを酸化形態で有する。
【００１１】
成熟ヘッジホッグポリペプチドのＣｙｓ−１は、(ａ)成熟ソニックヘッジホッグポリペプチドのＣｙｓ−１；(ｂ)成熟インディアンヘッジホッグポリペプチドのＣｙｓ−１；及び(ｃ)成熟デザートヘッジホッグポリペプチドのＣｙｓ−１よりなる群から選択することができる。ヘッジホッグポリペプチドの好適な単離された機能的アンタゴニストは、SEQ ID NO:５、６、７、８及び９よりなるポリペプチドの群から選択する。
【００１２】
この発明の更なる面は、少なくとも次の特性を有するを有するヘッジホッグポリペプチドの単離された機能的アンタゴニストである：(ｉ)単離されたタンパク質がレセプターパッチト−１に、成熟ヘッジホッグタンパク質のパッチト−１への結合についての親和性より低い(好ましくは、同じ)親和性で結合すること；及び(ｉｉ)単離されたタンパク質が、イン・ビトロでＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞ベースのＡＰ誘導アッセイで試験した場合に、アルカリホスファターゼ(ＡＰ)の成熟ヘッジホッグタンパク質による誘導をブロックすること。これらの特性を有するアンタゴニストは、成熟ソニック、インディアン又はデザートヘッジホッグのＣｙｓ−１に対応するＮ末端システインを欠くヘッジホッグポリペプチドを含むことができる。
【００１３】
好適具体例において、このアンタゴニストポリペプチドは、SEQ ID NO:１〜８からのアミノ酸配列と少なくとも６０％相同なアミノ酸配列を含み、このアンタゴニストポリペプチドは、少なくとも１００アミノ酸長である。好ましくは、このアンタゴニストポリペプチドは、機能的アンタゴニスト生物学的活性を示す：即ち(ｉ)この単離されたタンパク質が、成熟ヘッジホッグタンパク質のパッチト−１への結合についての親和性より低い(好ましくは、同じ)親和性でレセプターパッチト−１に結合すること；及び(ｉｉ)単離されたタンパク質が、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞ベースのＡＰ誘導アッセイで試験した場合に、ＡＰの成熟タンパク質による誘導をブロックすること。
【００１４】
単離されたポリペプチド(例えば、ＲＮＡ又はＤＮＡ)も又、請求の範囲に含まれる。この発明の一具体例は、発現に際して、成熟ソニックヘッジホッグのＣｙｓ−１に対応するＮ末端システインを欠くヘッジホッグポリペプチドを含む臨界的一次アミノ酸配列を含む機能的アンタゴニストをコードする単離されたＤＮＡ配列である。
【００１５】
一具体例において、単離されたＤＮＡ配列は、成熟ソニックヘッジホッグのＣｙｓ−１を含むＮ末端伸長部分を含む機能的アンタゴニストをコードする。他の具体例において、この単離されたＤＮＡ配列は、成熟ソニックヘッジホッグのＣｙｓ−１(最もＮ末端側のアミノ酸残基)を置き換えるＮ末端伸長部分を含む機能的アンタゴニストをコードする。
【００１６】
他の具体例において、単離されたＤＮＡ配列は、成熟ソニックヘッジホッグのＣｙｓ−１に対応するＮ末端システインから始まるアミノ酸を最大で約１２アミノ酸欠いている機能的アンタゴニストをコードする。
【００１７】
更に別の具体例において、単離されたＤＮＡ配列は、Ｎ末端システインの他のアミノ酸残基への突然変異を有する機能的アンタゴニストをコードする。
【００１８】
発現に際して、成熟デザート又はインディアンヘッジホッグのＣｙｓ−１に対応するＮ末端システインを欠くヘッジホッグポリペプチドを含む臨界的一次アミノ酸配列を含む機能的アンタゴニストをコードする単離されたポリヌクレオチド(例えば、ＲＮＡ又はＤＮＡ)も又、請求の範囲に含まれる。例えば、この発明の単離されたＤＮＡ配列は、成熟デザート又はインディアンのＣｙｓ−１を含むＮ末端伸長部分を含む機能的アンタゴニストをコードすることができる。他の具体例において、単離されたＤＮＡ配列は、成熟デザート又はインディアンヘッジホッグのＣｙｓ−１(最もＮ末端側のアミノ酸残基)を置き換えるＮ末端伸長部分を含む機能的アンタゴニストをコードする。他の具体例において、単離されたＤＮＡ配列は、成熟デザート又はインディアンヘッジホッグのＣｙｓ−１に対応するＮ末端システインから始まるアミノ酸を最大で約１２個失っている機能的アンタゴニストをコードする。
【００１９】
他の具体例において、このアンタゴニストポリペプチドは、ここに記載のヘッジホッグアンタゴニスト配列並びに他のＮ末端及び／又はＣ末端アミノ酸配列を含む。このアンタゴニストポリペプチドは又、SEQ ID NO:１〜４及び５〜８からのアミノ酸配列の全部又は断片を、更なるアミノ酸残基に(好ましくは、SEQ ID NO:１〜４及び５〜８からの配列をコードするゲノムＤＮＡの５’側のゲノムＤＮＡによりコードされる残基に)読み枠を合わせて融合させて含んでもよい。更に別の好適具体例において、アンタゴニストポリペプチドは、第１のポリペプチド部分と該ポリペプチド部分(例えば、アンタゴニストポリペプチドに無関係なアミノ酸配列を有する第１の付加的ポリペプチド部分)の５’側又は３’側に融合又は結合されたヘッジホッグアンタゴニスト部分とを有するタンパク質である。即ち、この付加的ポリペプチド部分は、例えば、アンタゴニスト部分のＮ末端又はＣ末端に融合又は結合されたグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ＤＮＡ結合ドメイン又はポリメラーゼ活性化ドメイン、ヒスチジンタグ、免疫グロブリン若しくはその部分の何れかであってよい。この発明のポリペプチドは、同義遺伝子の存在、選択的転写事象、選択的ＲＮＡスプライシング事象及び選択的翻訳及び非翻訳事象の結果として生じるものを含む。このポリペプチドは、天然の細胞において発現されるヘッジホッグアンタゴニストを発現させたときに存在するのと実質的に同じ翻訳後修飾を生じる系例えば培養細胞において、又は自然の細胞で発現させたときに存在する翻訳後修飾の脱落を生じる発現させることができる。
【００２０】
この発明の他の面は、Ｎ末端システインが成熟ソニックヘッジホッグのＣｙｓ−１に対応する、修飾形態のＮ末端システインを含むヘッジホッグポリペプチドを含む機能的アンタゴニストをコードする単離されたＤＮＡ配列である。一具体例において、このＤＮＡ配列は、Ｎ末端伸長部分の一部として含まれるＮ末端システインを有する機能的アンタゴニストをコードする。
【００２１】
好適ＤＮＡ配列は、SEQ ID NO:１〜４及び５〜８よりなる群から選択するヘッジホッグポリペプチドをコードする。
【００２２】
この発明の更なる面は、少なくとも下記の特性を有するヘッジホッグポリペプチドの機能的アンタゴニストをコードする単離されたＤＮＡ配列である：(ｉ)単離されたタンパク質がレセプターパッチト−１に、成熟ヘッジホッグタンパク質のパッチト−１に対する結合親和性より低いが少なくとも類似の親和性で結合し；及び(ｉｉ)この単離されたタンパク質が、イン・ビトロでＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞ベースのＡＰ誘導アッセイで調べたときに、成熟ヘッジホッグタンパク質によるＡＰの誘導をブロックする。これらの特性を有するアンタゴニストをコードするＤＮＡ配列は、最も好ましくは、成熟ソニックヘッジホッグのＣｙｓ−１に対応するＮ末端システインを欠くヘッジホッグポリペプチドをコードする。この発明のＤＮＡ配列が、ソニックヘッジホッグ、インディアンヘッジホッグ及びデザートヘッジホッグよりなる群から選択する脊椎動物ヘッジホッグポリペプチドをコードするＤＮＡ等の脊椎動物ヘッジホッグファミリーのメンバーであるヘッジホッグポリペプチドをコードすることは好ましい。
【００２３】
ヘッジホッグポリペプチドの機能的アンタゴニストをコードする好適ＤＮＡ配列は、下記よりなる群から選択するポリヌクレオチドを含む：
(ａ)  SEQ ID NO:１６及び１７；
(ｂ)  標準的ハイブリダイゼーション条件下で前記の配列の何れかにハイブリダイズし且つヘッジホッグポリペプチドの機能的アンタゴニストの活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
(ｃ)  発現に際して、前記のポリヌクレオチド配列の何れかによりコードされるタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００２４】
尚更なる好適具体例において、この発明のアンタゴニストポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、標準的条件下で、SEQ ID NO:１６及び１７からの少なくとも１２の連続するヌクレオチドに対応するポリヌクレオチドプローブにハイブリダイズする。この発明の他の具体例は、ポリペプチドSEQ ID NO:１〜４及び５〜８より選択する群のポリペプチドと少なくとも６０％相同であるヘッジホッグポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む。
【００２５】
主題のアンタゴニストポリヌクレオチドは、例えば発現ベクターとしての利用に適したヘッジホッグアンタゴニスト遺伝子配列を与えるように、ヘッジホッグアンタゴニスト遺伝子配列に機能的に結合された転写調節配列例えば転写プロモーター又は転写エンハンサー配列の少なくとも１つを含むことができる。
【００２６】
従って、この発明の他の面は、発現に際して、成熟ヘッジホッグポリペプチドのＣｙｓ−１に対応するＮ末端システインを欠くヘッジホッグポリペプチドを含むコア物理的構造を含む機能的アンタゴニストをコードするＤＮＡ配列を含むベクター及びこのベクターを含む宿主細胞である。他の面において、この発明は、発現に際して機能的ヘッジホッグアンタゴニストをコードするポリヌクレオチドを含む細胞又は細胞の精製調製物を特徴とする。この細胞調製物は、ヒト又は非ヒト細胞例えばマウス、ハムスター若しくはラットの細胞、ウサギの細胞、サル若しくはブタの細胞よりなってよい。好適具体例において、これらの細胞は、アンタゴニストトランスジーン例えばアンタゴニスト遺伝子の異質形態を含む。治療用組成物も又、この発明に包含されることが意図される。治療用組成物は、この発明の機能的アンタゴニストポリペプチドを許容し得るキャリアーと共に含む。好ましくは、アンタゴニストポリペプチド及び少なくとも一種の付加的成分例えばキャリアー、希釈剤又は溶剤を含む組成物も又、この発明に含まれる。この付加的成分は、この組成物を、イン・ビトロ、イン・ビボの医薬的利用又は獣医学的利用に有用なものとするものであってよい。
【００２７】
機能的ヘッジホッグアンタゴニストの製造方法は、この発明の更なる面である。一つの方法は、成熟ヘッジホッグポリペプチドの残基Ｃｙｓ−１に対応する残基からのヘッジホッグポリペプチドのＮ末端システイン残基を成熟ヘッジホッグポリペプチドのＣｙｓ−１に対応しない残基に変えることを含む。この方法は、単離されたヘッジホッグポリペプチドを、生成する断片がＣｙｓ−１を含まないようにタンパク質分解にさらすステップを含むことができる。
【００２８】
機能的ヘッジホッグアンタゴニストタンパク質の他の製造方法は、機能的アンタゴニストタンパク質を宿主細胞からこの発明のＤＮＡ配列とベクターを用いて発現させ、次いで、その発現させたアンタゴニストタンパク質を精製することを含む。機能的ヘッジホッグアンタゴニストタンパク質の更なる製造方法は、ヘッジホッグタンパク質を宿主細胞からこの発明のＤＮＡ配列とベクターを用いて発現させ、次いで、その発現されたタンパク質を改変してこの発明のアンタゴニストタンパク質を形成することを含む。この改変は、少なくとも一の化学的部分のヘッジホッグタンパク質への付加(制限はしないが、例えば、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)付加及びデキストランの付加)を含むことができる。
【００２９】
患者におけるヘッジホッグ依存性シグナリングを阻害する好適な治療方法は、その患者に、この発明の治療用組成物を投与することを含む。それ故、この好適な発明は、病気(例えば、異所的又は望ましくないレベルのヘッジホッグポリペプチドを特徴とする病気)の危険にある哺乳動物例えばヒトを治療する方法を特徴とする。一つの遺伝子治療方法は、その哺乳動物に治療剤(例えば、有効量のアンタゴニストポリペプチドをコードするポリヌクレオチド)を投与することを含む。他の具体例において、この方法は、その哺乳動物に、有効量のアンタゴニストポリペプチドを投与することを含む。好適具体例において、この病気は、様々な中枢神経系の細胞の過形成及び新生物形質転換の一種である。一般に、この発明のアンタゴニストは、広範囲の細胞、組織及び臓器の機能的性能の調節に有用であり、神経防護、神経再生及び神経機能の調節の範囲の治療用途を有している。遺伝子治療における利用のための更なる治療用組成物は、機能的アンタゴニストトランスジーンを含むこの発明のベクタを含む。
【００３０】
これらのアンタゴニストポリペプチド及びポリヌクレオチドは、ヘッジホッグ活性をイン・ビボ又はイン・ビトロで調節することのできるペプチド分子の製造に；ヘッジホッグレセプターの活性化の分析に；アンタゴニストを発現する細胞の同定又はアンタゴニスト発現のレベルの評価に有用な抗アンタゴニスト抗体の生成に；ヘッジホッグ活性をイン・ビボ又はイン・ビトロで調節するのに利用できるヘッジホッグのアンタゴニスト断片の製造に有用である。
【００３１】
発明の詳細な説明
Ｉ．定義
この発明を今から下記の詳細な説明を参照しながら説明するが、それは、下記の定義を含む：
「アミノ酸」−ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質のモノマーユニット。天然のペプチド、ポリペプチド及びタンパク質中には、２０種類のアミノ酸が見出され、そのすべてはＬ−異性体である。この用語は又、アミノ酸の類似体、修飾アミノ酸残基、並びにタンパク質アミノ酸及びそれらの類似体のＤ−異性体をも包含する。
【００３２】
「タンパク質」−本質的に２０種類のアミノ酸の任意のものよりなる任意のポリマー。しばしば「ポリペプチド」を比較的大きいポリペプチドに関して用い、「ペプチド」を小さいポリペプチドに関して用いるが、これらの用語の当分野での使用は、重複しており変更される。用語「タンパク質」は、ここで用いる場合、別途記載のない限り、ペプチド、タンパク質及びポリペプチドをいう。
【００３３】
「Ｎ末端」−成熟形態のタンパク質の第一番目のアミノ酸(アミノ酸番号１)をいい、「成熟形態」のタンパク質は、任意のシグナルその他の配列の除去後の一次アミノ酸配列よりなる。
【００３４】
「Ｎ末端システイン」は、ヘッジホッグタンパク質のＮ末端を占める任意のシステインをいう。「成熟」ソニックヘッジホッグＮ末端断片のＣｙｓ−１(SEQ ID NO:３のアミノ酸残基番号１)は、シグナル領域を含む遺伝子配列によりコードされるアミノ酸残基１〜２３が除去されて「成熟」タンパク質を形成するので、ソニックヘッジホッグ遺伝子配列の残基番号２４に対応する。特に、
【００３５】
「Ｎ末端システイン」は、ヒトソニックヘッジホッグポリペプチド配列において占めるのと同じ位置を、ヘッジホッグポリペプチドにおいて占める。特に、「Ｎ末端システイン」は、SEQ ID NO:２〜４における第１のアミノ酸残基としてのアミノ酸残基番号１をいう。他のヘッジホッグタンパク質のＮ末端システインは、成熟ソニックヘッジホッグのＣｙｓ−１に正確には対応し得ないということは理解されよう。例えば、シグナル配列の異なる長さ及び配列のために、ソニックヘッジホッグ配列の残基番号２４のシステイン(シグナル配列の除去後の成熟形態の[SEQ ID NO:３]のＣｙｓ−１)は、インディアンヘッジホッグの残基番号２８のシステイン(SEQ ID NO:２の最初のアミノ酸残基)に対応し、デザートヘッジホッグの残基番号２３のシステイン(SEQ ID NO:４の最初のアミノ酸残基)に対応する。これらのタンパク質の最大の相同性は、これらのシステイン(成熟タンパク質中のＣｙｓ−１)を図１に示したように整列させることにより得られる。それにもかかわらず、当業者は、成熟タンパク質の任意所定の「Ｎ末端システイン」の正確な残基番号がヘッジホッグファミリーの異なるメンバー間で僅かに変動し得ることを認めよう。更に、当業者は、所定のヘッジホッグポリペプチドのどの残基が実際にＮ末端残基であるのかを測定することができよう。本発明は、この変化性により制限されることを意図していない。
【００３６】
「Ｎ末端伸長部分」は、Ｎ末端システインからの５’伸長をいい、少なくとも１つの個別のユニット(「エレメント」)を含む。Ｎ末端伸長部分のエレメントの１つ(例えば、アミノ酸残基)は、成熟ヘッジホッグポリペプチドのＮ末端システインを置き換えることができる。
【００３７】
「機能的アンタゴニスト」は、タンパク質の機能をイン・ビトロ又はイン・ビボで阻害することのできる因子(例えば、ヘッジホッグタンパク質)をいう。更に、この用語は、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞におけるヘッジホッグ依存性応答の誘出には不活性であるが、ヘッジホッグレセプターへの結合についてヘッジホッグと競争するヘッジホッグタンパク質を包含する。
【００３８】
「断片」は、単離されたアンタゴニストに適用する場合、アンタゴニスト活性を保持していれば、単一アミノ酸程に小さくてもよい。それは、少なくとも約１０残基、一層典型的には少なくともやく４０残基、好ましくは約１００残基長であってよい。断片は、当業者に公知の方法により生成することができる。単離されたヘッジホッグの生物学的活性を示す候補断片の能力も、ここに記載したような当業者に公知の方法によって評価することができる。
【００３９】
この発明のヘッジホッグアンタゴニストの「機能的同等物」は、ヘッジホッグアンタゴニストと異なるアミノ酸残基を有してよいが、それにもかかわらず機能的アンタゴニストとして作用する因子である。
【００４０】
「遺伝子の融合」−２つ以上のタンパク質又はその断片の、それらをコードするポリヌクレオチド分子の遺伝子発現による、個々のペプチド主鎖の共直線的な共有結合をいう。
【００４１】
「変異体」−生物の遺伝物質の任意の変化、特に野生型ポリヌクレオチド配列における任意の変化(即ち、欠失、置換、付加又は変化)又は野生型タンパク質における任意の変化。
【００４２】
「野生型」−タンパク質のエキソンの天然のポリヌクレオチド配列若しくはその部分、又はイン・ビボで正常に存在する通りのタンパク質配列若しくはその部分。
【００４３】
「成熟」ヘッジホッグタンパク質−「成熟」は、プロセッシングを受けたＮ末端ドメインを含む野生型配列をいう。例えば、ヒトソニックヘッジホッグ(Ｓｈｈ)の残基２４〜１９７、ヒトインディアンヘッジホッグ(Ｉｈｈ)の残基２３〜１９７、ヒトデザートヘッジホッグ(Ｄｈｈ)の残基２８〜２０３。成熟ヘッジホッグタンパク質の天然型は翻訳後修飾を受けるが、ここで用いる組換えバージョンの幾つかは、これらの修飾を欠くが、尚活性であり、成熟と呼ぶ。
【００４４】
用語「ポリヌクレオチド配列」と「ヌクレオチド配列」は、交換可能に用い、ここで用いる場合、断片及び同等物を含むことができる。用語「同等物」は、機能的に同等なポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をいう。「同等な」ヌクレオチド配列は、少なくとも１ヌクレオチドの置換、付加又は欠失により異なる配列例えば対立遺伝子変異体を含み、遺伝コードの縮重のためにこの発明のヘッジホッグアンタゴニストをコードするヌクレオチド配列と異なる配列を含む。
【００４５】
「標準的ハイブリダイゼーション条件」−０．５×ＳＳＣ〜約５×ＳＳＣ及び６５℃に実質的に等しいハイブリダイゼーション及び洗浄の両方のための塩及び温度条件。用語「標準的ハイブリダイゼーション条件」は、それ故、ここで用いる場合、操作的定義であり、ハイブリダイゼーション条件の範囲を包含する。一層高緊縮の条件は、例えば、プラークスクリーンバッファー(０．２％ポリビニルピロリドン、０．２％フィコール４００；０．２％ウシ血清アルブミン、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ(ｐＨ７．５)；１Ｍ  ＮａＣｌ；０．１％ピロリン酸ナトリウム；１％ＳＤＳ)；１０％デキストラン硫酸及び１００(ｇ／ｍｌ変性超音波処理済サケ精子ＤＮＡを用いて６５℃で１２〜２０時間ハイブリダイズさせ、７５ｍＭＮａＣｌ／７．５ｍＭクエン酸ナトリウム(０．５×ＳＳＣ)／１％ＳＤＳで６５℃で洗浄する。一層低緊縮の条件は、例えば、プラークスクリーンバッファー、１０％デキストラン硫酸及び１１０(ｇ／ｍｌ変性超音波処理済みサケ精子ＤＮＡを用いて５５℃で１２〜２０時間ハイブリダイズさせ、３００ｍＭＮａＣｌ／３０ｍＭクエン酸ナトリウム(２．０×ＳＳＣ)／１％ＳＤＳで、５５℃で洗浄する。Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. New York, 6.3.1-6.3.6節(1989)も参照されたい。
【００４６】
「発現制御配列」−遺伝子に機能的に結合された場合に、その遺伝子の発現を制御し、調節するポリヌクレオチド配列。
【００４７】
「機能的に結合された」−ポリヌクレオチド配列(ＤＮＡ、ＲＮＡ)は、発現制御配列がそのポリヌクレオチド配列の転写及び翻訳を制御し、調節する場合に、機能的に発現制御配列に結合される。用語「機能的に結合された」は、適当な開始シグナル(例えば、ＡＴＧ)を発現されるべきポリヌクレオチド配列の前に有すること及び、発現制御配列の制御下でのポリヌクレオチド配列の発現及びそのポリヌクレオチド配列によりコードされる所望のポリペプチドの生成を可能にする正しい読み枠を維持することを包含する。
【００４８】
「発現ベクター」−宿主細胞に導入された場合に、少なくとも一つの遺伝子の発現を可能にするポリヌクレオチド例えばＤＮＡプラスミド又はファージ(他の一般的例の内で)。このベクターは、細胞中で、複製することができてもできなくてもよい。
【００４９】
「単離された」(「実質的に純粋な」と交換可能に用いる)−ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド即ちポリヌクレオチド配列に適用する場合、その起源又は操作により、(ｉ)それが天然において結合しているすべてのポリヌクレオチドと結合してなく(例えば、宿主細胞中で発現ベクター又はその部分として存在し)；又は(ｉｉ)それが天然において結合していた部分以外のポリヌクレオチド又は他の化学的部分に結合されており；又は(ｉｉｉ)天然に存在しないＲＮＡ若しくはＤＮＡポリヌクレオチド、ゲノムポリヌクレオチドの部分、ｃＤＮＡ又は合成ポリヌクレオチドを意味する。「単離された」は、更に、(ｉ)イン・ビトロで例えばポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)により増幅され；(ｉｉ)化学合成され；(ｉｉｉ)クローニングにより組換え技術で生成され；又は(ｉｖ)開裂及びゲル分離等により精製されるポリヌクレオチド配列を意味する。従って、「実質的に純粋なポリヌクレオチド」は、それが得られた生物の天然のゲノムにおいて通常隣接しているコード配列の一方又は両方と直接隣接していないポリヌクレオチドである。実質的に純粋なＤＮＡは又、更なるヘッジホッグ配列をコードするハイブリッド遺伝子の部分である組換えＤＮＡをも包含する。
【００５０】
「単離された」(「実質的に純粋な」と交換可能に用いる)−ポリペプチドに適用する場合は、その起源又は操作によって、(ｉ)発現ベクターの一部の発現産物として宿主細胞中に存在し；又は(ｉｉ)それが天然で結合していたもの以外のタンパク質又は他の化学的部分に結合しており；又は(ｉｉｉ)天然に存在しないポリペプチド又はその部分を意味する。「単離された」は、更に、(ｉ)化学合成された；又は(ｉｉ)宿主細胞で発現されて結合タンパク質から精製されたタンパク質を意味する。この用語は、一般に、天然において共存していた他のタンパク質及びポリヌクレオチドから分離されたポリペプチドを意味する。好ましくは、このポリペプチドは、それを精製するために用いた物質例えば抗体又はゲルマトリクス(ポリアクリルアミド)からも分離されている。
【００５１】
「異質プロモーター」−ここで用いる場合、これは、自然には遺伝子又は精製ポリヌクレオチドと結合していないプロモーターである。
【００５２】
「相同な」−ここで用いる場合、これは、用語「同一」と同義語であり、２つのポリペプチド、分子間の又は２つのポリヌクレオチド間の配列類似性をいう。２つの比較する配列の両方のある位置が同じ塩基又はアミノ酸モノマーサブユニットで占められていれば(例えば、２つのＤＮＡ分子の各々のある位置がアデニンで占められており、又は２つのポリペプチドの各々のある位置がリジンで占められていれば)、それぞれの分子は、その位置で相同である。２つの配列の間の相同性パーセンテージは、それらの２つの配列により共有されるマッチング位置又は相同位置の数を比較した位置の数で除したものを１００倍したものの関数である。例えば、２つの配列中の１０の位置の内の６がマッチし又は相同であるならば、これらの２つの配列は、６０％相同である。例えば、ＤＮＡ配列CTGACTとCAGGTTは、５０％相同性を共有している(６の全位置の内の３がマッチしている)。一般に、比較は、２つの配列を最大の相同性を与えるように整列させて行う。かかるアラインメントは、例えば、Needleman等,J.Mol Biol.48:443-453(1970)の方法を用いて与えることができ、便利にコンピュータープログラム例えばＡｌｉｇｎプログラム(DNAstar, Inc.)により実行することができる。相同な配列は、同一の又は類似のアミノ酸残基を共有しており、類似の残基は、整列された参照配列中の対応するアミノ酸残基についての保存的置換体であり、又は「許された点突然変異」である。この点について、参照配列中の残基の「保存的置換」は、対応する参照残基に物理的又は機能的に類似する置換である(例えば、類似の大きさ、形状、電荷、共有結合又は水素結合を形成する能力を含む化学的特性等を有するもの)。特に好適な保存的置換は、Dayhoff等、5:Atlas of Protein Sequence and Structure, 5: 前書、3, 22章:354-352, Nat.Biomed.Res.Foundation, Washington, D.C.(1978)で「許容される点突然変異」について規定された基準を満たすものである。
【００５３】
この発明の「ヘッジホッグタンパク質」は、少なくともSEQ ID NO:２〜４よりなる一部分を有することにより定義される。この用語は又、ヘッジホッグポリペプチド又はヘッジホッグポリペプチドの機能的変異体又はヘッジホッグポリペプチド若しくは機能的変異体の生物学的活性を有する類似体をも意味する。
【００５４】
用語「ペプチド」、「タンパク質」及び「ポリペプチド」は、ここでは、交換可能に用いられる。用語「ポリヌクレオチド配列」及び「ヌクレオチド配列」も又、ここでは、交換可能に用いられる。用語「ヘッジホッグ断片」は、「ヘッジホッグ」と交換可能に用いられる。
【００５５】
ヘッジホッグ分子は、それが、次の特性の少なくとも一つを有するならば、「生物学的活性」を有する：(ｉ)その分子は、ここに規定したヘッジホッグ共通基準を満たし(SEQ ID NO:４)且つそのレセプターパッチト−１に結合する能力を有し又は、発現に際してこの特性を有するポリペプチドをコードすること；(ｉｉ)その分子は、ここに規定したヘッジホッグ共通基準を満たし又は、発現に際してこの特性を有するポリペプチドをコードすること；及び(ｉｉｉ)Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞においてアルカリホスファターゼ活性を誘導すること。
【００５６】
本発明の実施は、別途指示しない限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、タンパク質化学及び免疫学の慣用的技術を用いるが、これらは、当分野の技術範囲内である。かかる技術は、文献に記載されている。例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第二版、(Sambrook, Fritsch 及び Maniatis編), Cold Spring Harbor Laboratory Pess, 1989；DNA Cloning, 第I及びII巻(D.N.Glover編),1985；Oligonucleotide Synthesis,(M.J.Gait編)、1984；米国特許第４，６８３，１９５号(Mullis等)；Polynucleotide Hybridization (B.D.Hames及びS.J.Higgins編)、1984；Culture of Animal Cells (R.I.Freshney編).Alan R.Liss, Inc.,1987; Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press,1989; A Practical Guide to Molecular Cloning(B.Perbal),1984; Methods in Enzymology, 第154及び155巻(Wu等編)、Academic Press, New York; Gene Transfer Vector for Mammalian Cells (J.H.Miller及びM.P.Calos編),1987,Cold Spring Harbor Laboratory; Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Mayer及びWalker編), Academic Press, London, 1987; Handbook of Experiment Immunology, 第I-IV巻 (D.M.Weir及びC.C.Blackwell編),1986; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1986を参照されたい。
【００５７】
この発明の他の特徴及び利点は、下記の詳細な説明及び請求の範囲から明らかとなろう。別に指示しない限り、発明の詳細な説明中で引用したすべての参考文献を本明細書中に参考として援用する。発明の背景中の参考文献は、従来技術ではない。
【００５８】
ＩＩ．ヘッジホッグタンパク質の一般的特徴
本発明の機能的アンタゴニストは、単離されたヘッジホッグタンパク質から得ることができる。従って、ソニック、インディアン又はデザートを機能的アンタゴニストに変換することができる。
【００５９】
単離されたヘッジホッグタンパク質は、ヘッジホッグファミリーの天然の又は組換えのタンパク質であり、無脊椎動物又は脊椎動物起源から得ることができる(下記参照)。脊椎動物のヘッジホッグタンパク質のファミリーのメンバーは、キイロショウジョウバエヘッジホッグ(ｈｈ)遺伝子によりコードされるタンパク質と相同性を共有している(Mohler及びVani,(1992) Development 115,957-971)。今日まで、マウスのゲノムライブラリーとｃＤＮＡライブラリーの組み合わせたスクリーニングは、デザートヘッジホッグ(Ｄｈｈ)、ソニックヘッジホッグ(Ｓｈｈ)及びインディアンヘッジホッグ(Ｉｈｈ)と呼ばれる３つの哺乳動物ｈｈ対応物を同定しており、これらは、他の哺乳動物例えばヒト並びに魚類及び鳥類にも存在する。他のメンバーは、ムーンラットヘッジホッグ(Ｍｈｈ)並びにティギーウィンクルヘッジホッグ(ＴｗＨｈ)及びハリモグラヘッジホッグ(Ｅｈｈ)を包含する。
【００６０】
ヘッジホッグ遺伝子は、糖タンパク質をコードし、これは、開裂されて、シグナリングの原因である約２０ｋＤａのＮ末端ドメイン(SEQ ID NO:２〜４及び図１)及び約２５ｋＤａのカルボキシ末端断片を生じる。この２０ｋＤａの部分を含む様々な他の断片が、「単離されたヘッジホッグタンパク質」の定義内にあると考えられる。これらの配列並びにそれらの化学的及び物理的特性を開示している刊行物には、Hall等(1995)Nature 378,212-216；Ekker等(1995)Current Biology 5,944-955；Fan等(1995) Cell 81,457-465、Chang等(1994) Development 120, 3339-3353；Echelard等(1993)Cell 75, 1414-1430 34-38；ＰＣＴ特許出願ＷＯ９５２３２２３(及び)が含まれる。
【００６１】
ヘッジホッグ同族体には、対立形質的、系統発生的相当物などの、自然に存在するあらゆる天然ヘッジホッグ蛋白質；又はムテイン又は突然変異蛋白質などの、天然に起こる、化学的に合成した、あるいは組換えによる、他の変異体、活性を有する新規なヘッジホッグ同族体などが含まれる。アンタゴニストの作成に特に有用なヘッジホッグポリペプチドは、配列番号２〜４である。
【００６２】
ＩＩＩ．ヘッジホッグアンタゴニスト
本発明のポリペプチドで最も好ましいものは、天然又は組換えヘッジホッグ蛋白質（例えば、上記したＳｏｎｉｃ、Ｉｎｄｉａｎ又はＤｅｓｅｒｔヘッジホッグ蛋白質から得られる、脊椎動物科蛋白質などの、単離ヘッジホッグ）の生物学的活性に対するアンタゴニストである。機能的なアンタゴニストは、少なくとも以下の特性を有する。（ｉ）単離蛋白質は、成熟ヘッジホッグ蛋白質によるｐａｔｃｈｅｄ−１への結合に比べて、おそらくはより少ない親和性で、しかし好ましくは少なくとも同程度の親和性で、受容体ｐａｔｃｈｅｄ−１に結合する。（ｉｉ）ＣＲ３１０Ｔ１／２細胞を用いた生体外アルカリホスファターゼ（ＡＰ）誘導アッセイで試験した時、単離蛋白質は、成熟ヘッジホッグ蛋白質によるＡＰ誘導を阻害する。本発明のアンタゴニストは更に以下の特徴を有してもよい。（ｉｉｉ）ｐｔｃ−１及びｇｌｉ−１発現を誘発することができない。
【００６３】
当業者は、ヘッジホッグアンタゴニストと推定されるものについて、これらの特徴を容易に調べることができるであろう。より具体的に述べると、マウスの胚繊維芽細胞系Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２は、ヘッジホッグ応答性の間充織幹細胞系である。細胞をヘッジホッグで処理することによって、ｇｌｉ−１及びｐａｔｃｈｅｄ−１（公知のヘッジホッグ依存性シグナル伝達の指標）のアップレギュレーションが起こり、さらにアルカリホスファターゼ活性が誘導される。これが軟骨細胞／骨芽細胞系統に細胞が分化したことの指標となる。本発明者らは幾つかのヘッジホッグ変異体の系統パネルを作成し研究した結果、ある種の変異体は、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞におけるヘッジホッグ依存性応答の誘導について不活性であるだけでなく、その機能について成熟ヘッジホッグと競合する、すなわち機能的アンタゴニストとして作用することを発見した。
【００６４】
Ａ．アンタゴニストとしてのＮ末端改変ヘッジホッグポリペプチド
本発明者らはＮ末端を改変したある種のヘッジホッグ変異体は、ヘッジホッグ依存性応答を誘導する能力を持たないが、ヘッジホッグ受容体であるｐａｔｃｈｅｄ−１に結合する能力を保持しているため、ヘッジホッグ機能を阻害するということを発見した。
【００６５】
ヘッジホッグポリペプチド（すなわちＳｏｎｉｃ、Ｉｎｄｉａｎ又はＤｅｓｅｒｔヘッジホッグ）が、ヘッジホッグの機能的アンタゴニストであるかどうかを決定する主要な一次アミノ酸配列は、成熟ヘッジホッグのＣｙｓ−１に相当するＮ末端システイン残基である（図１参照）。ヘッジホッグポリペプチドがこのＮ末端システインを完全に欠損しているか、このＮ末端システインを改変した形状で有している（例えば化学的に改変するか、Ｎ末端の伸長基の部分として）限りは、得られるポリペプチドはヘッジホッグの機能的アンタゴニストとして作用することができる。これに関して、Ｎ末端システインが「Ｃｙｓ−１に相当する」ということは、（ａ）Ｎ末端システインが成熟Ｓｏｎｉｃ、Ｉｎｄｉａｎ又はＤｅｓｅｒｔヘッジホッグのＣｙｓ−１である、又は（ｂ）Ｎ末端システインが、成熟Ｓｏｎｉｃ、Ｉｎｄｉａｎ又はＤｅｓｅｒｔヘッジホッグのＣｙｓ−１と同じ位置を占める、ということを意味している。例えば仮にＳｏｎｉｃヘッジホッグが、本明細書に記すように変化したさもなくば改変した、Ｃｙｓ−１に相当するＮ末端システインを有するとすると、 そのヘッジホッグは、他のあらゆるヘッジホッグ同族体の活性に拮抗できることになる。本発明者らはＳｏｎｉｃ及びＩｎｄｉａｎヘッジホッグの活性に拮抗するＳｏｎｉｃヘッジホッグ蛋白質、並びにＳｏｎｉｃヘッジホッグの活性に拮抗するＤｅｓｅｒｔヘッジホッグ蛋白質を作成した。従って当業者は、本発明に詳述する方法に従って、Ｓｏｎｉｃ、Ｄｅｓｅｒｔ又はＩｎｄｉａｎヘッジホッグの活性に拮抗するＩｎｄｉａｎヘッジホッグ蛋白質を作成することが可能であることが理解されるであろう。
【００６６】
こうしたＮ末端改変の例を本明細書に記載するが、当業者は、ここに記載のアンタゴニストの構造を、例えば断片又は類似体を作成することによって改変することができるし、新たに作成した構造体について、アンタゴニスト活性を有するかどうかを試験することができるであろう。断片及び類似体の作成及び試験を可能にする従来方法の例は下記に詳述する。これらの又は類似の方法を用いて、アンタゴニストポリペプチドの断片及び類似体を作成及びスクリーニングすることができる。従って本発明に含まれる変異体は幾つも存在する。
【００６７】
１．Ｎ末端伸長
本発明のアンタゴニストポリペプチドは、Ｎ末端システインがＮ末端伸長基に結合した、ヘッジホッグポリペプチド配列を含んでいてもよい。従って例えば、単離アンタゴニストポリペプチドは、下記の特徴を有する組換え融合蛋白質であってもよい（ただしこれに限定されるものではない）。（ａ）ヘッジホッグポリペプチド本体の５’側に位置することができ、ヘッジホッグとは関係のない少なくとも１個の要素（例えばアミノ酸残基）を含む第一のＮ末端ポリペプチド部分を有する。（ｂ）本発明のヘッジホッグアンタゴニストの一部分である、ＳｏｎｉｃヘッジホッグのＣｙｓ−１に相当するＮ末端システインに、又はヘッジホッグアンタゴニストの一部分に連結する。このＮ末端伸長基（例えば第一のＮ末端ポリペプチド部分）の例としては、ヒスチジンタグ、マルトース結合蛋白質、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ＤＮＡ結合領域、又はポリメラーゼ活性化領域が挙げられる。機能的アンタゴニストは、成熟ヘッジホッグのＣｙｓ−１に置き換わる要素又は成熟ＳｏｎｉｃヘッジホッグのＣｙｓ−１に相当するＮ末端システインを含む、Ｎ末端伸長基を有していてもよい。そのようなアンタゴニストは、配列番号１で表わされる。ここではＣｙｓ−１自体は改変されていないが、Ｎ末端伸長基部分としての要素（すなわち、アミノ酸残基）に結合している。理論に拘泥されることは望まないが、この蛋白質がアンタゴニスト特性を有するのは、Ｎ末端伸長基（ヒスチジンタグ）が、伸長基が存在しない場合には機能するＮ末端システインが機能するのを阻害することが理由だと思われる。
【００６８】
２．Ｎ末端欠失
他の態様において、機能的アンタゴニストは、成熟ヘッジホッグのＣｙｓ−１に相当するＮ末端システインに始まる約１２個未満のアミノ酸を欠損する。最初の連続するアミノ酸残基が約１２個以上欠失している場合には、機能的アンタゴニストにならないことが判明した。約１０個の連続したアミノ酸を欠失したものが、好適な機能的アンタゴニストとして作用する。しかし、１０個未満の連続した残基を欠失させても、アンタゴニスト機能は保持されていた。更に、少なくとも合計約３個の残基を欠失させる場合には、不連続の残基を様々な組合わせで欠失させることもできる。
【００６９】
以下、幾つかのそのようなＳｏｎｉｃヘッジホッグアンタゴニスト：Ｓｈｈ（“Ｎ−１０”）（配列番号５：Ｎ末端領域の最初の１０個のアミノ酸を欠損する）；Ｓｈｈ（“Ｎ−９、Ｃ−３”）（配列番号６：Ｎ末端システインに始まる最初の９個のアミノ酸残基を欠損し、Ｃ末端からの最後の３個の残基を欠損する）；Ｓｈｈ（“Ｎ−５”）（配列番号７：Ｎ末端システインに始まる最初の５個のアミノ酸残基を欠損する）について述べる。
【００７０】
これらの構造を調べることによって、ヘッジホッグ蛋白質のＮ末端が有する機能の重要性が明らかになる。全ての変異体は、ｐａｔｃｈｅｄ−１への結合能については成熟Ｓｏｎｉｃヘッジホッグ（Ｓｈｈ）と区別がつかなかったが、生体外のＣ３Ｈ１０Ｔ１／２ＡＰ誘導アッセイでは不活性であった。“Ｎ−１０”（配列番号５）変異体については、ｐｔｃ−１及びｇｌｉ−１発現の誘導能についても試験したが、不活性であった。これらＮ末端変異体の全てがヘッジホッグ依存性シグナル伝達を誘導することができなかった。
【００７１】
３．Ｎ末端突然変異体
更に他の態様においては、機能的アンタゴニストは、Ｎ末端システインが突然変異で他のアミノ酸残基に置換されている。どのアミノ酸残基を用いてもよい。当業者は本明細書の開示に従うことによって、突然変異を行い、得られる突然変異体の作用を調べることができる。その一例として、Ｎ末端システインがセリン残基で置換されたＳｈｈ（“Ｃ１Ｓ”）（配列番号８）が挙げられる。この突然変異体は、ｐａｔｃｈｅｄ−１への結合能について成熟Ｓｈｈと区別がつかないが、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２ＡＰ誘導アッセイにおける機能を試験した場合、成熟ＳｈｈによるＡＰ誘導を阻害した。配列番号８のＳｈｈを、ｐｔｃ−１及びｇｌｉ−１発現の誘導能についても試験したところ、不活性であった。
【００７２】
４．Ｎ末端システイン改変
ヘッジホッグの一次アミノ酸配列は生物学的活性にとって重要なＣｙｓ−１を含んでいるので、ある種の他の改変によって、ヘッジホッグ蛋白質の不活性なアンタゴニスト変異体が得られると予想される。本発明の他の特徴は、ヘッジホッグポリペプチドの、単離された機能的アンタゴニストであり、これはシステインが改変されていることを除いては、成熟ＳｏｎｉｃヘッジホッグのＣｙｓ−１に相当するＮ末端システインを含む、ヘッジホッグポリペプチドを包含する。本発明のアンタゴニストポリペプチドは、Ｎ末端システインの生体内又は生体外での化学的変性、並びにアセチル化、メチル化、リン酸化、アミド化、カルボキシル化又は糖化といった様々な変化を含む、配列ではない改変を有してもよい。例えば機能的アンタゴニストは、酸化したＮ末端システインを有することができる。機能的アンタゴニストは、Ｎ末端伸長基の一部として包含することによって、効果的に改変できるＮ末端システインを有することができることが本発明者らによって示されている。
【００７３】
Ｂ．他の態様
本発明のアンタゴニストポリペプチドは、配列番号１〜８及び１１のアミノ酸配列と、少なくとも６０％の相同性を有するアミノ酸配列を含むことができる。アンタゴニストポリペプチドは、配列番号１〜４、５〜８及び１１の、少なくとも１００個の連続するアミノ酸を含むことができる。アンタゴニストポリペプチドは、少なくとも以下の機能的アンタゴニスト特性を有する。（ｉ）単離蛋白質は、成熟ヘッジホッグ蛋白質によるｐａｔｃｈｅｄ−１への結合に比べて、おそらくはより少ない親和性で、しか好ましくは少なくとも同程度の親和性で、受容体ｐａｔｃｈｅｄ−１に結合する。（ｉｉ）ＣＨ３１０Ｔ１／２細胞を用いた生体外アルカリホスファターゼ（ＡＰ）誘導アッセイで試験した時、単離蛋白質は、成熟ヘッジホッグ蛋白質によるＡＰ誘導を阻害する。
【００７４】
本発明のポリペプチドは、同義遺伝子の存在、代替的な転写現象、代替的なＲＮＡスプライシング現象、及び代替的な翻訳及び翻訳後現象の結果生じるものを含む。ポリペプチドは、合成によって全体を作成することができるし、あるいは蛋白質が自然に存在する細胞内で発現された時と実質的に同じ翻訳後修飾が得られる系（例えば培養細胞）内で、又は自然に存在する細胞内で発現された時に翻訳後修飾が省略される系内で発現することもできる。
【００７５】
好ましい態様においては、単離されたアンタゴニストは下記の特徴を１つ以上有するポリペプチドである。
（ｉ）配列番号２〜８のアミノ酸と、少なくとも６０、より好ましくは９０、最も好ましくは９５％の配列同一性を有する；
（ｉｉ）改変されたＮ末端システインを有するか、あるいはＮ末端システインを欠損するか、ヘッジホッグのＣｙｓ−１に相当するＮ末端システインとは異なるＮ末端システインを有する；
（ｉｉｉ）ＣＨ３１０Ｔ１／２細胞中で、成熟ヘッジホッグによるアルカリホスファターゼ誘導を阻害する；
【００７６】
（ｉｖ）成熟ヘッジホッグ蛋白質によるｐａｔｃｈｅｄ−１への結合に比べて、おそらくはより少ない親和性で、しかし好ましくは少なくとも同程度の親和性で、受容体ｐａｔｃｈｅｄ−１と結合または相互に作用する；
（ｖ）生体外のＣＨ３１０Ｔ１／２細胞中で、ｐｔｃ−１及びｇｌｉ−１の発現を誘導することができない；
（ｖｉ）ＣＨ３１０Ｔ１／２アッセイで、ＡＰを誘導することができない。
【００７７】
その上更に、本発明の単離されたヘッジホッグアンタゴニストは、ヘッジホッグとは関係のないＣ末端配列を更に含む、組換え融合蛋白質であってもよい。したがって、アンタゴニストポリペプチドは、配列番号１〜４及び５〜８のアミノ酸配列全てまたは断片が読み枠内でアミノ酸残基にさらに融合したものを含んでもよい。本発明のポリペプチドの一例としては、第一のポリペプチド部分及びヘッジホッグアンタゴニスト部分を有する蛋白質が挙げられる。このアンタゴニスト部分は、第一のポリペプチド部分と５’又は３’側で融合又は結合している。従って、まず、追加のポリペプチド部分は、アンタゴニストポリペプチドと関係のないアミノ酸配列を有する。追加のポリペプチド部分の例としては、アンタゴニスト部分のＮ又はＣ末端と融合又は結合した、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ＤＮＡ結合領域又はポリメラーゼ活性化領域、ヒスチジンタグ、免疫グロブリン又はその部分が挙げられる。さらなる改変ポリペプチドの例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及び／又はデキストランなどの化学基を有するものが挙げられる。そのような化学基の追加は、Ｎ末端システインに特異的であってもよいし、アンタゴニストポリペプチドの他のアミノ酸残基との結合を通じてもよい。ＰＥＧ又はデキストランといった基や、免疫グロブリン融合体等の構造体を用いれば、治療用に用いられるアンタゴニスト蛋白質の効能半減期を延長させることができる。
【００７８】
ＩＶ．アンタゴニストポリペプチドの発現及び作成
ここに記載した全長ヘッジホッグポリペプチド及びアンタゴニストポリペプチドは、当分野で公知の方法のうち好適なものであればどのような方法を用いても作成できるということを当業者は理解されるであろう。そのような方法としては、蛋白質を直接合成する方法から、上記したアンタゴニストポリペプチド配列を直接コードするＤＮＡ配列を作成し、これらのアンタゴニスト配列を好適な形質転換宿主内で発現させる方法まで、多岐に渡るものが挙げられる。 あるいは、本発明の機能的アンタゴニストポリペプチドは、全長ヘッジホッグ蛋白質を発現させてから、機能的アンタゴニストを形成するように適当に改変することによって得てもよい。
【００７９】
Ａ．機能的アンタゴニストの直接発現
一般に、ヘッジホッグ配列（アンタゴニストであるかどうかに関わらず）を作成するために、ヘッジホッグのアミノ酸配列全体を用いて逆に翻訳した遺伝子を作成することができる（Ｍａｎｉａｔｉｓ他、上述参照）。更に、全長ヘッジホッグをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡオリゴマーを合成してもよい。例えば、所望のヘッジホッグポリペプチド部分をコードする小さなオリゴヌクレオチドを幾つか合成して連結してもよい。個々のオリゴヌクレオチドは通常、相補的組合せのため５’又は３’に張り出し部分がある。ヘッジホッグｃＤＮＡは、配列番号１〜８及び１１のヘッジホッグポリペプチドをコードする標識付けしたＤＮＡ断片でヒトｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、オートラジオグラフィーで正のクローンを同定することによって、得ることができる。プラーク精製及びハイブリダイゼーションを更に行う場合も、従来の方法を用いて行うことができる。
【００８０】
全長ヘッジホッグポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が得られたら、ＤＮＡを改変又は突然変異誘発させて（例えばＣ及びＤ章；Ｚｏｅｌｌｅｒ他（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１、５６６２−６６、及び米国特許第４，５８８，５８５号参照）、機能的アンタゴニストポリペプチドを発現させることができる。組換え方法において、ヘッジホッグポリペプチドの内部断片又は末端断片は、単離ヘッジホッグポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の一端（末端断片用）又は両端（内部断片用）から１個以上のヌクレオチドを除去することによって、作成することができる。突然変異誘発したＤＮＡを発現することによってポリペプチド断片を得て、生物学的活性を試験する。「末端ニブリング」エンドヌクレアーゼで切断することによって、断片の配列をコードするＤＮＡを作成することもできる。蛋白質断片をコードするＤＮＡは、ランダム剪断、制限酵素切断、又はそれらの組み合わせによっても作成することができる。同様のＤＮＡ配列を作成する他の方法として、オリゴヌクレオチド合成装置を用いて化学的に合成する方法が挙げられる。そのようなオリゴヌクレオチドは、好ましくは所望のポリペプチドのアミノ酸配列に基づいた構造をもつものであり、好ましくは目的の組換えポリペプチドが内部で作成される宿主細胞に都合のよいコドンが選択される。
【００８１】
従って、単離されたポリヌクレオチド（例えばＲＮＡ又はＤＮＡ）は本発明の範囲に含まれる。これらには、配列番号１６及び１７及び配列番号１〜８及び１１をコードする配列が含まれる。本発明の単離ポリヌクレオチドは、Ｎ末端システインがＮ末端伸長基で置換されたヘッジホッグポリペプチド配列を含む、機能的ヘッジホッグアンタゴニストをコードすることができる。従って例えば、単離されたＤＮＡ配列は、下記の特徴を有する組換え融合蛋白質をコードすることができる（ただしこれに限定されるものではない）。（ａ）ヘッジホッグポリペプチド本体の５’側に位置することができ、ヘッジホッグとは関係がなくヘッジホッグのＮ末端システインを置換する、少なくとも１個の要素（例えばアミノ酸残基）を含む、第一のＮ末端ポリペプチド部分を有し、（ｂ）ヘッジホッグアンタゴニスト、又はヘッジホッグアンタゴニストの部分である第二のポリペプチドに連結する。本発明の単離ポリヌクレオチドは、成熟ヘッジホッグポリペプチド（例えばＳｏｎｉｃヘッジホッグ）のＣｙｓ−１を含みうるＮ末端伸長基を有する、機能的アンタゴニストをコードすることもできる。
【００８２】
単離ＤＮＡ配列は、発現に際して、成熟ヘッジホッグ（例えば成熟Ｓｏｎｉｃヘッジホッグ）のＣｙｓ−１に相当するＮ末端システインを欠損した、ヘッジホッグポリペプチドを包含する一次アミノ酸配列を含む、機能的アンタゴニストをコードすることができる。例えば、単離ＤＮＡ配列又はその部分（例えば配列番号１６）は、成熟ＳｏｎｉｃヘッジホッグのＣｙｓ−１に相当するＮ末端システインに始まる約１２個未満のアミノ酸を欠失した、機能的アンタゴニスト（配列番号５〜７参照）をコードすることができる。Ｎ末端システインを他のアミノ酸残基に置換した突然変異を有する機能的アンタゴニストをコードする、本発明の単離ポリヌクレオチド（例えば配列番号１７）を作成することもできる。単離ＤＮＡ配列は、Ｎ末端伸長基を含む機能的アンタゴニストをコードすることもできる（配列番号１）。
【００８３】
ヘッジホッグポリペプチドの機能的アンタゴニストをコードするＤＮＡ配列の好ましいものとしては、（ａ）配列番号１６及び１７；（ｂ）標準的ハイブリダイゼーション条件下で、上記した全ての配列にハイブリダイズし、ヘッジホッグポリペプチドの機能的アンタゴニストの活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド；及び（ｃ）上記した全てのポリヌクレオチド配列にコードされる蛋白質をコードするポリヌクレオチド、からなる群より選ばれるポリヌクレオチドが挙げられる。更に、本発明のアンタゴニストポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１６及び１７の少なくとも１２個の連続するヌクレオチド、より好ましくは配列番号１６及び１７の少なくとも２０個の連続するヌクレオチドに相当するポリヌクレオチドプローブに、標準的条件下でハイブリダイズする。
【００８４】
一度（合成、指定部位突然変異誘発、又は他の方法によって）作成したら、目的とする特定の単離ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を、発現ベクターに挿入し、所望の宿主内での蛋白質発現に適した発現制御配列に、操作可能に連結させる。正しく連結が行われたかどうかは、ヌクレオチド配列決定、制限酵素地図作成、及び好適な宿主内での生物学的活性を有するポリペプチドの発現によって、確認することができる。当分野で知られるように、トランスフェクトされた遺伝子を宿主内で高いレベルで発現させるためには、選択された発現宿主内で機能を有する転写及び翻訳発現制御配列に、その遺伝子を操作可能に連結する必要がある。
【００８５】
発現制御配列及び発現ベクターは、宿主に応じて選択される。様々な発現宿主／ベクターの組み合わせを用いることができる。真核細胞宿主に有用な発現ベクターの例としては、ＳＶ４０、ウシパピローマウィルス、アデノウィルス及びサイトメガロウィルスから得た発現制御配列を包含するベクターが挙げられる。バクテリア宿主に有用な発現ベクターの例としては、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９などの、大腸菌から得たプラスミド及びその誘導体といった、公知のバクテリアプラスミド；Ｍ１３及び繊維状一本鎖ＤＮＡファージといった、広い宿主範囲のプラスミドなどが挙げられる。好ましい大腸菌ベクターの例としては、λファージｐＬプロモーターを含むｐＬベクター（米国特許第４，８７４，７０２号）、Ｔ７ポリメラーゼプロモーターを含むｐＥＴベクター（Ｓｔｕｄｉｅｒ他、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１８５：６０−８９、１９９０ １）及びｐＳＰ７２ベクターが挙げられる。酵母菌に有用な発現ベクターの例としては、動原体プラスミドが挙げられる。
【００８６】
更に、多種多様なあらゆる発現制御配列をこれらベクター内で用いることができる。そのような有用な発現制御配列には、上記した発現ベクターの構造遺伝子に関連した発現制御配列が含まれる。有用な発現制御配列の例としては、ＳＶ４０又はアデノウィルス、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣ又はＴＲＣ系の初期及び後期プロモーター、ラムダファージ（例えばｐＬ）のメジャーオペレーター及びプロモーター領域、ｆｄ外殻蛋白質の制御領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ又は他の糖分解酵素のプロモーター、酸性ホスファターゼ（Ｐｈｏ５等）のプロモーター、酵母菌α交配系のプロモーター、原核細胞又は真核細胞遺伝子及びそれらのウィルスの発現を制御することが知られる他の配列、それらの様々な組み合わせが挙げられる。ここに記載した単離ヘッジホッグポリペプチドを大量に作成するには、好適な宿主であればどのようなものを用いることができる。宿主の例としては、バクテリア、菌類（酵母菌など）、植物、昆虫、哺乳類又は他の適当な動物の細胞又は細胞系、並びにトランスジェニック動物又は植物が挙げられる。これらの宿主のより具体的な例としては、大腸菌株（実施例１）、シュードモナス属株、バチルス属株、ストレプトミセス属株、菌類株、酵母菌株（例えばＰｉｃｈｉａ；実施例３）；ヨトウガ（ＳＦ９）及びＨｉｇｈ  ＦｉｖｅＴＭ等の昆虫細胞；チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＮＳ／Ｏ細胞等のマウス細胞、ミドリザル細胞ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０及びＢＭＴ１０、ヒト細胞等の動物細胞；及び植物細胞といった、公知の真核細胞及び原核細胞宿主が挙げられる。
【００８７】
全てのベクター及び発現制御配列は、所与の単離ポリペプチドを発現するために同等に機能する訳ではないことは理解されよう。同様に、同じ発現系で、全ての宿主が同等に機能する訳ではない。しかし、当業者はこれらのベクター、発現制御系及び宿主から適当な組み合わせを選択して実験を行うことができる。例えば、目的の単離ポリペプチドを大規模な動物培養で作成するためには、発現ベクターの数を制御する必要がある。増幅可能ベクターは、当分野において公知である（例えばＫａｕｆｍａｎ及びＳｈａｒｐ（１９８２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２、１３０４−１３１９及び米国特許第４，４７０，４６１号及び第５，１２２，４６４号参照）。ＤＮＡ配列を発現制御配列に操作可能に連結させるには、ＤＮＡ配列上流の正しい読み枠内に、翻訳開始シグナルを設ける必要がある。発現される特定のＤＮＡ配列がメチオニンで始まっていない場合、開始シグナルを置くことによって産生物のＮ末端に追加のアミノ酸（メチオニン）が置かれることになる。これによって、発現されたアンタゴニストの中心となる構造体が確実に保持される。
【００８８】
形質転換した宿主によって産生された蛋白質は、好適な方法であればどのようなものを用いても精製することができる。そのような標準的方法の例としては、クロマトグラフィー（例えばイオン交換、親和性及びサイズ排除カラムクロマトグラフィー）、遠心分離、示差溶解度（differential solubility）、又は他の標準的な蛋白質精製方法が挙げられる。免疫親和性クロマトグラフィーにおいては、Ｓｏｎｉｃヘッジホッグ等の蛋白質又は関連蛋白質に応答するように作成し、固定支持体に固着した抗体を包含する親和性カラムに、蛋白質を結合させることによって、蛋白質を単離することができる。あるいは、ヘキサヒスチジン、マルトース結合領域、インフルエンザ外殻配列及びグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ等の、親和性タグを蛋白質に付着させ、適当な親和性カラムを通過させて、容易に精製することができる。単離した蛋白質は、蛋白質分解、質量分析法、核磁気共鳴及びＸ線結晶構造解析等の方法を用いて、物理的に特徴付けることができる。
【００８９】
Ｂ．全長ポリペプチドからのアンタゴニストの作成
ヘッジホッグアンタゴニスト活性を有する単離ヘッジホッグ蛋白質断片（例えば配列番号２〜４）は、当業者に公知の方法を用いても効率的に作成できる。実施例に詳述する方法で、未反応のヘッジホッグ蛋白質から機能的ヘッジホッグアンタゴニストを作成する。
【００９０】
ペプチドは蛋白質分解酵素によって特異的に切断される。こうした酵素の例としてはプラスミン、トロンビン、トリプシン、キモトリプシン又はペプシンが挙げられる（ただしこれらに限定されるものではない）。これらの酵素はそれぞれペプチド結合の種類に応じて特異的に作用する。トリプシンは、塩基性アミノ酸、通常はアルギニン又はリジンに由来するカルボニル基を有するペプチド結合の加水分解を触媒する。ペプシン及びキモトリプシンはトリプトファン、チロシン及びフェニルアラニン等の芳香族アミノ酸由来のペプチド結合の加水分解を触媒する。蛋白質分解酵素に切断されやすい部位の切断を防ぐことによって、別の切断蛋白質断片セットを作成することができる。例えば、弱塩基溶液中でのε−アミノ酸群であるリジンとエチルトリフルオロチオアセテートとの反応によって、隣接するペプチド結合がトリプシンによる加水分解の影響をもはや受けない、ブロックアミノ酸残基を生じる。蛋白質を改変して、蛋白質分解酵素の影響を受けやすいペプチド連結が得られる。例えば、システイン残基をα−ハロエチルアミンでアルキル化することによって、トリプシンで加水分解されるペプチド連結が得られる（Ｌｉｎｄｌｅｙ（１９５６）Ｎａｔｕｒｅ１７８、６４７）。加えて、化学試薬を用いて、特異的な残基でペプチド鎖を切断することが出きる。例えば、ブロモシアンは、メチオニン残基においてペプチドを切断する（Ｇｒｏｓｓ及びＷｉｔｋｉｐ（１９６１）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８３、１５１０）。従って、改質剤、蛋白質分解酵素及び／又は化学試薬の様々な組み合わせを用いて蛋白質を処理することによって、蛋白質を、望ましい長さの重複することのない断片に分割するか、或いは望ましい長さの重複する断片に分割することができる。
【００９１】
Ｃ．科学的合成方法
ヘッジホッグアンタゴニストは、メリーフィールド固相Ｆｍｏｃ又はｔ−Ｂｏｃ化学作用等の当分野で公知の方法を用いて、化学的に合成することもできる（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｒｅｃｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ２３：４５１（１９６７）参照）。アンタゴニストを作成し試験する従来方法の例は、下記に述べる。これらの又は類似の方法を用いて、生物学的活性を有する単離ポリペプチド（例えばヘッジホッグ）の断片及び類似体を作成し、スクリーニングすることができる。 ヘッジホッグアンタゴニストは、ヘッジホッグキメラを作成する化学的方法及び組換え方法を組み合わせて用いることによって、作成することもできる。
【００９２】
Ｄ．他のアンタゴニストＤＮＡ及びペプチド配列の作成
１．ランダム突然変異誘発方法
配列番号２〜８の全体又は部分を含む、ヘッジホッグの機能的アンタゴニストのアミノ酸配列変異体は、蛋白質又はその特定の部分をコードするＤＮＡをランダム突然変異誘発させることによって調製することができる。突然変異を誘導する有用な方法として、ＰＣＲ突然変異誘発及び飽和突然変異が挙げられる。以下に挙げるそのような方法の例は、本発明の範囲を限定するものではなく、単に代表的な方法を例証するものである。この点について、当業者は、他の方法も有用であると理解できるであろう。
【００９３】
ＰＣＲ突然変異誘発：例えばＬｅｕｎｇ他（１９８９）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ１、１１−１５参照。
飽和突然変異誘発： Ｍａｙｅｒｓ他（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ２２９、２４２に記載の方法参照。
縮重オリゴヌクレオチド突然変異誘発：例えばＨａｒａｎｇ，Ｓ．Ａ．（１９８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ３９、３；Ｉｔａｋｕｒａ他（１９８４）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３、３２３及びＩｔａｋｕｒａ他、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ、Ｐｒｏｃ．３ｒｄ  Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、ｐｐ．２７３−２８９（Ａ．Ｇ．Ｗａｔｏｎ編）エルゼビア社、アムステルダム（１９８１）参照。
【００９４】
２．指定突然変異誘発法
部位を指定する方法は、Ｎ末端システイン（又は機能的同等物）を効果的に除去し、ヘッジホッグの機能的アンタゴニストの中心構造を作成する、別の方法である。非ランダムの、又は指定された突然変異誘発を行うことによって、単離ポリペプチドをコードする特異的配列又はポリヌクレオチド配列の特異的部分における突然変異を得て、単離ポリペプチドの公知のアミノ酸配列残基の欠失、挿入又は置換を含む変異体が得られる。
【００９５】
アラニンスキャニング突然変異誘発：Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ及びＷｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４４、１０８１−１０８５参照。
オリゴヌクレオチド媒介突然変異誘発：例えばＡｄｅｌｍａｎ他（１９８３）ＤＮＡ２、１８３参照。オリゴヌクレオチド指定突然変異誘発を用いて、Ｎ末端システインを他のアミノ残基、好ましくはセリン残基に突然変異させた機能的アンタゴニストをコードする単離ＤＮＡ配列を遺伝子工学処理して、機能的アンタゴニストを作成した（配列番号１７：実施例７）。
【００９６】
カセット突然変異誘発：Ｗｅｌｌｓ他（１９８５）Ｇｅｎｅ３４、３１５参照。組み合わせ突然変異誘発：例えばＬａｄｎｅｒ他、ＷＯ８８／０６６３０参照。
主題であるアンタゴニストヘッジホッグ蛋白質の突然変異体をセットで作成する方法が存在し、そのような方法は、ヘッジホッグ蛋白質の生物学的活性の潜在的な機能的アンタゴニストである変異体配列（例えば相同体）を同定するのに特に有用であることが当業者には理解されよう。そのようにして得たアンタゴニスト突然変異体セットを含んでいる組み合わせライブラリーをスクリーニングして、例えば、アンタゴニストとして作用できる新規なヘッジホッグ相同体を作成することができる。このようにして得たヘッジホッグ相同体は、例えばｐａｔｃｈｅｄ受容体に結合するが、いかなる生物学的応答も誘導しないという模倣能を有し、従って本物のヘッジホッグ又はヘッジホッグアゴニストの作用を阻害するという点で、アンタゴニストとして作用する。
【００９７】
本方法の１つの特徴においては、ヘッジホッグアンタゴニスト群のアミノ酸配列を整列させて、好ましくは可能な限り高い相同性を示す。そのような変異体群としては、例えば１以上の種から得たヘッジホッグアンタゴニストが挙げられる。整列したアンタゴニスト配列の各位置に現れるアミノ酸は、組み合わせ配列の縮重群をなすように選択される。
【００９８】
例証的な態様においては、公知である脊椎動物ヘッジホッグ蛋白質各種の成熟蛋白質の、Ｎ末端約１６８残基の整列（すなわち最初の１０個のアミノ酸残基を欠損する蛋白質）を用いて、配列番号９によって表わされる機能的アンタゴニストポリペプチドの縮重セットが得られる。ここで配列番号９における縮重位置「Ｘａａ」のそれぞれは、あるヘッジホッグ蛋白質のその位置に現れるアミノ酸であってもよいし、或いはライブラリーを拡張するためには、各Ｘａａが、それらの位置に天然で生じるアミノ酸の保守的置換であるアミノ酸残基から選択されたものであってもよい。
【００９９】
例えば、Ｘａａ（６）はＰｈｅ、Ｈｉｓ又はＴｙｒを表すが、Ｌｙｓ、Ａｒｇ又はＨｉｓであってもよい；Ｘａａ（７）はＰｒｏ又はＡｌａを表すが、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ又はＰｈｅであってもよい；Ｘａａ（９）はＬｙｓ、Ａｒｇ又はＨｉｓのいずれかのアミノ酸を表す；Ｘａａ（１０）はＶａｌ又はＴｈｒを表すが、Ｍｅｔ、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ又はＴｈｒであってもよい；そしてＸａａ（１１）はＡｌａ又はＶａｌを表すが、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ又はＴｈｒであってもよい。各Ｘａａ残基は、配列番号９に記載される残基であってもよいし、当業者に公知のように、保守的置換されたものであってもよい。より拡張したライブラリーにおいては、各Ｘａａを、あらゆるアミノ酸から選択することができる。様々な方法で、上記した潜在的なヘッジホッグアンタゴニスト相同体のライブラリーを作成することができる。作成した突然変異遺伝子産物をスクリーニングする様々な方法が当分野において知られている。
【０１００】
大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングする方法は、一般に：遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクター内にクローンし；適当な細胞を得られるベクターのライブラリーで形質転換し；所望の活性（例えばこの場合はアンタゴニスト活性、又は下流細胞内蛋白質に対する活性）の検出によって、検出した産物の遺伝子をコードするベクターが比較的容易に行える条件下で遺伝子を発現する、という工程が含まれる。そのような方法は、ヘッジホッグ受容体が「餌」蛋白質として用いられ、ヘッジホッグアンタゴニストの変異体のライブラリーが「魚」蛋白質として発現される２ハイブリッド系、並びにアンタゴニスト候補が細胞又はウィルス粒子表面上に呈示される様々な呈示ライブラリーを含む。特定の細胞又はウィルス粒子が有する、呈示された産生物を介して適当な受容体蛋白質へ結合する能力は、「パニングアッセイ」によって検出される（例えばＬａｄｎｅｒ他、ＷＯ８８／０６６３０；Ｌａｄｎｅｒ他、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９０／０２９０９；Ｇａｒｒａｒｄ他、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／０９６９０；Ｍａｒｋｓ他（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１６００７−１６０１０；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ他（１９９３）ＥＭＢＯＪ１２：７２５−７３４；Ｃｌａｃｋｓｏｎ他（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ３５２：６２４−６２８；Ｂａｒｂａｓ他（１９９２）ＰＮＡＳ８９：４４５７−４４６１）、Ｃｈａｒｂｉｔ他（１９８６）ＥＭＢＯ５、３０２９−３０３７）、Ｓｃｈｏｒｒ他（１９９１）Ｖａｃｃｉｎｅｓ９１、ｐｐ．３８７−３９２）、Ａｇｔｅｒｂｅｒｇ他（１９９０）Ｇｅｎｅ８８、３７−４５、Ｔｈｉｒｙ他（１９８９）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５５、９８４−９９３）；Ｋｕｗａｊｉｍａ他（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈ．６、１０８０−１０８３）；Ｈａｎｓｓｏｎ他（１９９２）Ｊ. Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４、４２３９−４２４５及びＫｌａｕｓｅｒ他（１９９０）ＥＭＢＯＪ．９、１９９１−１９９９）；Ｃｕｌｌ他（１９９２）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ８９：１８６５−１８６９参照）。
【０１０１】
Ｆ．単離アンタゴニストポリペプチドの他の変異体
本発明に含まれる単離分子の例としては、突然変異体、自然突然変異体、誘発突然変異体、本発明の機能的アンタゴニスト等のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに、高又は低緊縮条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされる蛋白質が挙げられる。ここに記載した全ての変異体はアンタゴニストの生物学的機能を保持することが期待される。具体的には、生物学的に活性を有する断片又は類似体は、配列番号５〜８及び１１に示すペプチド、又は配列番号２〜４のヘッジホッグペプチドの生物学的活性に拮抗するペプチドの特徴である生体内又は生体外活性を有するものである。最も好ましくは、アンタゴニストは全ての生体内又は生体外アッセイにおいて、配列番号５〜８及び１１のアンタゴニスト活性の、少なくとも１０％、好ましくは４０％以上、最も好ましくは少なくとも９０％の活性を有する。
【０１０２】
好ましい類似体の例としては、１個以上の保守的アミノ酸置換によって又は１個以上の非保守的アミノ酸置換によって、あるいは単離蛋白質の生物学的活性を損なわない欠失又は挿入によって、ここに開示した配列とは異なる配列を有する、生物学的に活性なアンタゴニスト断片が挙げられる。 保守的置換は一般に１個のアミノ酸をそれに類似した特徴を有する他のアミノ酸に置換することを含み、以下に挙げるグループ内で行われる。バリン、アラニン及びグリシン；ロイシン及びイソロイシン；アスパラギン酸及びグルタミン酸；アスパラギン及びグルタミン；セリン及びトレオニン；リジン及びアルギニン；並びにフェニルアラニン及びチロシン。非極性疎水性アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンがある。極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン及びグルタミンがある。陽電荷（塩基性）アミノ酸にはアルギニン、リジン及びヒスチジンがある。陰電荷（酸性）アミノ酸にはアスパラギン酸及びグルタミン酸がある。他の保守的置換は、当業者に公知のものである。例えば、アミノ酸アラニンについては、保守的置換をＤ−アラニン、グリシン、β−アラニン、Ｌ−システイン及びＤ−システインのいずれかから行うことができる。リジンについては、置換をＤ−リジン、アルギニン、Ｄ−アルギニン、ホモ−アルギニン、メチオニン、Ｄ−メチオニン、オルニチン又はＤ−オルニチンのいずれかで行うことができる。
【０１０３】
一般に、単離ポリペプチドの機能的特性に変化を与えると思われる置換は以下のものである：（ｉ）極性残基、例えばセリン又はトレオニンを疎水性残基、例えばロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン又はアラニンと置換した（又はその逆の）場合；（ｉｉ）システイン残基（すなわち、１個以上の他の内部システインを更に含んでもよいＮ末端システイン）を他の残基と置換した（又はその逆の）場合；（ｉｉｉ）陽性の側鎖を有する残基、例えばリジン、アルギニン又はヒスチジンを、陰性の側鎖を有する残基、例えばグルタミン酸又はアスパラギン酸と置換した（又はその逆の）場合；あるいは（ｉｖ）嵩高な側鎖を有する残基、例えばフェニルアラニンを、そのような側鎖を有さない残基、例えばグリシンと置換した（又はその逆の）場合。
【０１０４】
Ｇ．ペプチド模倣体（Mimetics）
本発明は、例えばペプチド又は非ペプチドの拮抗剤といった、模倣体の生成も提供する。ペプチド模倣体は、例えばヘッジホッグによる天然リガンド（例えば受容体）への結合を分断することによって、ヘッジホッグ蛋白質の生物学的活性に拮抗することができる。受容体ポリペプチドの分子認識に重要な役割を果たす、又はヘッジホッグ依存性シグナル伝達を促進する能力の阻害に重要な役割を果たす、目的のアンタゴニストポリペプチドの残基は、検出が可能であり、それを用いてアンタゴニスト由来ペプチド模倣体を作成することができる（例えば「網膜芽腫遺伝子蛋白質に結合するヒトパピローマウィルス蛋白質の、ペプチド阻害剤」欧州特許出願ＥＰ−４１２，７６２Ａ及びＥＰ−Ｂ３１，０８０Ａ参照）。例えば、スキャニング突然変異誘発を用いて、ヘッジホッグ依存性シグナル伝達を促進する能力の阻害に関与する特定のアンタゴニストポリペプチドのアミノ酸残基地図を作成することができる。これらの残基を模倣し、従ってヘッジホッグの機能を阻害することのできるペプチド模倣体化合物（例えばジアゼピン又はイソキノリン誘導体）を作成することができる。
【０１０５】
重要な残基の非加水分解性ペプチド類似体は、ベンゾジアゼピンを用いて作成することができる（例えばＦｒｅｉｄｉｎｇｅｒ他、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｓｈａｌｌ編、ＥＳＣＯＭ出版：オランダ国ライデン、１９８８参照）、アゼピン（例えばＨｕｆｆｍａｎ他、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｓｈａｌｌ編、ＥＳＣＯＭ出版：オランダ国ライデン、１９８８参照）、置換γラクタム環（Ｇａｒｖｅｙ他、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｓｈａｌｌ編、ＥＳＣＯＭ出版：オランダ国ライデン、１９８８）、ケトメチレン模擬ペプチド（Ｅｗｅｎｓｏｎ他（１９８６）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２９：２９５；及びＥｗｅｎｓｏｎ他、ｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ（第９回アメリカペプチドシンポジウム議事録、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、イリノイ州ロックランド、１９８５）、β−回転ジペプチドコア（Ｎａｇａｉ他（１９８５）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２６：６４７）；及びＳａｔｏ他（１９８６）Ｊ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ１：１２３１）及びβ−アミノアルコール（Ｇｏｒｄｏｎ他（１９８５）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ１２６：４１９）；及びＤａｎｎ他（１９８６）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ１３４：７１）。
【０１０６】
Ｖ．機能的拮抗作用の試験
多くの生物検定が、ヘッジホッグ活性を調べるのに用いられてきたが、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞系を用いれば、一次細胞培養又は臓器外植を扱うという煩雑な操作を必要とせずに、ヘッジホッグ機能を単純に調べることができる。マウスの胚繊維芽細胞系Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２は、ある決まった条件下で、含脂肪細胞、軟骨細胞及び骨芽細胞に分化することのできる間充織幹細胞系である（Ｔａｙｌｏｒ，Ｓ．Ｍ．及びＪｏｎｅｓ，Ｐ．Ａ．、Ｃｅｌｌ１７：７７１−７７９（１９７９）及びＷａｎｇ，Ｅ．Ａ．他、Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ９：５７−７１（１９９３））。骨形態発生蛋白質はＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞の骨細胞系統への分化を誘導し、アルカリホスファターゼ誘導がこの工程のマーカーとして用いられている（Ｗａｎｇ他、上述）。ＳｈｈはＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞に対して同様の効果を有し（Ｋｉｎｔｏ，Ｎ．他、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｓ．４０４：３１９−３２３（１９９７））、Ｓｈｈによるアルカリホスファターゼ誘導は、生体外での効力を定量的に測定するのに用いられている。Ｓｈｈ処理を行って、ｇｌｉ−１及びｐｔｃ−１発現の増加を投与量に依存させることもできる（これはＰＣＲを持ちいた分析によって容易に検出することができる）。
【０１０７】
ＩＶ．用途
Ａ．一般
一般に、ここに記載したヘッジホッグの機能的アンタゴニスト蛋白質は、治療、診断及び研究において有用である。ヘッジホッグ蛋白質の通常の生物学的活性に拮抗させることによって、本発明の化合物を生体内及び生体外の両方の組織培養における組織の操作、例えば組織分化に用いることができる。例として、精子産生の阻害が挙げられる。他の用途として、組織中の上皮細胞の成長又は分化を阻害すること、特に動物の毛の成長を阻害することが挙げられる（実施例８参照）。また、アンタゴニストを用いて、発生時の現象におけるヘッジホッグの役割、並びに成人組織におけるヘッジホッグの正常な細胞性機能を調べることができる。そのような方法は細胞培養内で用いられるだけでなく、ある種のトランスジェニック動物内でも用いることができる。
【０１０８】
治療目的で用いる場合には、アンタゴニストは一般的な用途に適した方法で用いられ、全身及び局所投与を含む様々な投与形態に調合することができる。方法及び調合についてはＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍｅａｄｅ出版社、ペンシルバニア州イーストン）に記載がある。全身投与の場合は、筋肉内、静脈内、腹腔内及び皮下などの注射が好ましい。アンタゴニストの溶液を調合することができるが、ハンクス溶液やリンガー溶液などの生理学的に適合性のある担体に調合するのが好ましい。凍結乾燥の形状も挙げられる。
【０１０９】
具体的には、治療する疾病、患者個人の状態、単離ポリペプチドの投与部位、投与方法及び医者に知られる他の要因を考慮に入れた有効な診療に沿った方法で、治療に用いられる蛋白質組成物を調合し、投与量を決定する。本発明の蛋白質の治療用投与は、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、骨液内、胸骨内、髄腔内、肝臓内、病変内及び頭蓋内の注射又は輸液法等の、非経口投与が好ましい。あるいはタブレット類、市販されている液剤用の噴霧器、乾燥粉末、凍結乾燥化又はエーロゾル化したリポソーム吸入薬などの形態をとることができる。液剤を粉末剤から再構成して用いることもできるし、局所塗布用にクリームの形状にすることもできる。
【０１１０】
ここに記載した蛋白質組成物は、薬学的に受容可能な担体を含む無菌医薬組成物として投与することができる。この担体は、数多く存在する公知の担体のどれであってもよく、例としては水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、デキストロース、グリセロル、エタノール、イオン交換剤、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミンなどの血清蛋白質、リン酸塩などの緩衝物、グリシン、ソルビン酸カリウム、硫酸プロタミンなどの飽和野菜脂肪酸・水・塩又は電解質の部分グリセリド混合物、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイドシリカ、三珪酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースに基づく物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、蝋、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロック重合体、ポリエチレングリコール及び羊毛脂などや、これらの組み合わせが挙げられる。
【０１１１】
投与量は、医者によく知られているように、用いる蛋白質の特性（例えば結合活性、生体内原形質での半減期）、調合物における蛋白質の濃度、投与経路、投与部位及び投与期間、患者の臨床上の寛容性、患者の病理学上の状態などに依存する。一般に、１人の患者につき、１投与あたり約０．５×１０-6モル未満からの蛋白質の用量が好ましいが、用量はもちろん蛋白質の性質にも依存する。一連の投与の間に投与量を変えることもできる。
【０１１２】
本発明の発明アンタゴニストポリペプチドは、ヘッジホッグ蛋白質の過度な発現により特徴付けられる疾病の治療、又はより一般的には、ヘッジホッグ蛋白質の機能に拮抗することが望まれる状態の治療に、特に有用である。ある種の基底細胞癌は、ヘッジホッグの過度な発現に関係し（Ｏｒｏ他（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ２７６：８１７−８２１）、ある種のヒト腫瘍、例えば乳癌、髄芽細胞腫がＳｈｈ遺伝子において発癌性突然変異を有することが判明しており（Ｅｐｓｔｅｉｎ他、米国特許第５，７５９，８１１号）、本発明のアンタゴニストをそのような疾病の治療に用いることができるだろう。
【０１１３】
治療目的で本発明の蛋白質を用いる例として、本発明の治療用アンタゴニストを、中枢神経系の新生細胞又は細胞の過形成形質転換といった様々な疾患を有する患者に投与することができる。ある種のヘッジホッグ蛋白質は、神経性細胞腫瘍の発生に関与していることがある。従って、本発明のヘッジホッグアンタゴニストを、例えば悪性神経膠腫、髄芽細胞腫、神経外胚葉腫瘍及び脳室上皮腫の治療に用いることができるであろう。
【０１１４】
更に、神経系が発達する間およびおそらくは成人期間においても神経分化を制御する能力をヘッジホッグ蛋白質が有すということから、ヘッジホッグアンタゴニストが、正常細胞の維持、機能動作及び成熟；損傷細胞の修復及び再生；並びに変性及び早期死について、成人のニューロン制御を促進することが予想される。
蛋白質を調合し、蛍光透視法又はラジオグラフィーにおいて不透明である物質などの検出可能なマーカーに結合させ、被験者に投与して組織を映像化することもできる。これらの複合体をセイヨウワサビペルオキシダーゼなどの物質に結合させて、免疫細胞化学的染色を行い、組織片上でヘッジホッグリガンドについて正の細胞領域を視覚化することもできる。
【０１１５】
Ｂ．遺伝子治療
本発明の単離ポリヌクレオチドを遺伝子治療プロトコルの一部として用いて、アンタゴニスト形状のヘッジホッグポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを投与することもできる。本発明は、ヘッジホッグポリペプチドの機能に拮抗させるための、特定の細胞型における生体内トランスフェクション及びアンタゴニストポリペプチド発現用の発現ベクターを特徴とする。アンタゴニストポリペプチドの発現用構造体は、生物学的に有効である担体、例えば生体内で細胞にポリヌクレオチドを効果的に投与することのできる調合又は組成物であればどのようなものを用いても投与することができる。
【０１１６】
工程には、目的の遺伝子を、ウィルスベクター（組換えレトロウィルス、アデノウィルス、アデノ関連ウィルス及び単純性疱疹ウィルス）あるいは組換えバクテリアプラスミド又は真核細胞プラスミドへ挿入することが含まれる。ウィルスベクターは細胞に直接トランスフェクトする。プラスミドＤＮＡは、陽イオン性リポソーム（リポフェクチン）又はその誘導体（例えば抗体連結体）、ポリリジン連結体、グラマシジンＳ、人工ウィルスエンベロープ、又はそのような他の細胞内担体を利用して投与することができるし、遺伝子構造体の直接注射又は生体内のＣａＰＯ4沈殿などによって投与することもできる。
【０１１７】
生体内条件で細胞内へポリヌクレオチドを導入する好ましい方法は、アンタゴニストポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えばｃＤＮＡを含むウィルスベクターを用いるものである。ウィルスベクターを用いて細胞を感染させることには、標的細胞の大部分がポリヌクレオチドを受容できるという利点がある。加えて、ウィルスベクター内にコードされる分子、例えばウィルスベクターに含まれるｃＤＮＡは、ウィルスベクターポリヌクレオチドを取り込んだ細胞内で効率的に発現される。
【０１１８】
様々なウィルスベクターを用いて、外来遺伝子の生体内投与、特にヒトへの投与を行うための組換え遺伝子投与系とすることができる。これらのベクターを用いると、遺伝子が細胞内に効率よく投与され、運搬されたポリヌクレオチドは安定的に宿主の染色体ＤＮＡ内に組み込まれる（Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．（１９９０）Ｂｌｏｏｄ７６：２７１参照）。組換えレトロウィルスの作成、及びそれらウィルスによる生体外又は生体内での細胞への感染プロトコルについては、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．他（編）Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９８９）、９章１０−１４及び他の標準的実験マニュアルを参照されたい。好適なレトロウィルスの例は、当業者に公知のものが挙げられる。環境栄養性及び両栄養性レトロウィルス系を調製するのに好適なパッケージングウィルス系の例としては、Ｃｒｉｐ、Ｃｒｅ２及びＡｍが挙げられる。レトロウィルスは、様々な遺伝子を様々な細胞型（例えば上皮細胞など）に生体外及び／又は生体内で導入するのに用いられて来た（例えばＥｇｌｉｔｉｓ他（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２３０：１３９５−１３９８；Ｄａｎｏｓ及びＭｕｌｌｉｇａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：６４６０−６４６４；Ｗｉｌｓｏｎ他（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：３０１４−３０１８；Ａｒｍｅｎｔａｎｏ他（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：６１４１−６１４５；Ｈｕｂｅｒ他（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：８０３９−８０４３；Ｆｅｒｒｙ他（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：８３７７−８３８１；Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ他（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５４：１８０２−１８０５；ｖａｎ  Ｂｅｕｓｅｃｈｅｍ他（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：７６４０−７６４４；Ｋａｙ他（１９９２）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ３：６４１−６４７；Ｄａｉ他（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０８９２−１０８９５；Ｈｗｕ他（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｎｏｌ．１５０：４１０４−４１１５；米国特許第４，８６８，１１６号；米国特許第４，９８０，２８６号；ＰＣＴ出願番号ＷＯ８９／０７１３６；ＰＣＴ出願番号ＷＯ８９／０２４６８；ＰＣＴ出願番号ＷＯ８９／０５３４５；及びＰＣＴ出願番号ＷＯ９２／０７５７３参照）。
【０１１９】
本発明で有用な他のウィルス遺伝子運搬系は、アデノウィルス由来ベクターを用いるものである（例えばＢｅｒｋｎｅｒ他（１９８８）Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ６：６１６；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ他（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５２：４３１−４３４；及びＲｏｓｅｎｆｅｌｄ他（１９９２）Ｃｅｌｌ６８：１４３−１５５参照）。アデノウィルス株Ａｄ  ５ｄｌ３２４型又は他のアデノウィルス株（例えばＡｄ２、Ａｄ３、Ａｄ７など）に由来する、好適なアデノウィルスは、当業者に公知のものである。組換えアデノウィルスは分裂していない細胞に感染することができず、上皮細胞を含む幅広い種類の細胞型を感染させることができるという点で、ある種の条件においては有利である（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ他（１９９２）、上述参照）。
【０１２０】
目的の遺伝子投与に有用な他のウィルスベクター系には、アデノ関連ウィルス（ＡＡＶ）がある。アデノ関連ウィルスは、効率的かつ生産的な生活環を達成するのにアデノウィルス又はヘルペスウィルス等の他のウィルスをヘルパーウィルスとして必要とする、自然に存在する欠損ウィルスである（Ｍｕｚｙｃｚｋａ他、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏ．ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９２）１５８：９７−１２９参照）。様々なポリヌクレオチドが、ＡＡＶベクターを用いる様々な細胞型に導入されている（例えばＨｅｒｍｏｎａｔ他（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：６４６６−６４７０；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ他（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２−２０８１；Ｗｏｎｄｉｓｆｏｒｄ他（１９８８）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２：３２−３９；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ他（１９８４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５１：６１１−６１９；及びＦｌｏｔｔｅ他（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：３７８１−３７９０参照）。
【０１２１】
上に例証したようなウィルスを用いる運搬方法に加えて、ウィルスを用いない方法を使って動物組織内でアンタゴニストポリペプチドを発現させることができる。ウィルスを用いないで遺伝子を運搬する方法の殆どが、巨大分子の吸収及び細胞内輸送を行うのに哺乳類細胞が用いている通常の機能に依存している。好ましい態様においては、本発明におけるウィルスを用いない投与系は、目的のアンタゴニスト遺伝子の吸収を標的細胞の環内経路に依存している。この種の遺伝子投与系の例としては、人工ウィルスエンベロープ、ｔａｔ蛋白質由来複合体が挙げられる（米国特許第５，７４７，６４１号参照）。代表的な態様においては、アンタゴニストポリペプチドをコードする遺伝子は、表面に陽電荷を生じる（或いは更に、標的組織の細胞表面抗原に対する抗体でタグ付けした）リポソーム（例えばリポフェクチン）に封入することができる（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／０６３０９；日本国特許出願第１０４７３８１号；及び欧州特許公開番号ＥＰ−Ａ−４３０７５参照）。
【０１２２】
臨床用途では、治療用アンタゴニスト遺伝子用の遺伝子運搬系を、当分野で公知の各方法を任意の数だけ組み合わせたものによって患者に導入することができる。例えば、遺伝子運搬系を医薬として調製したものを、静脈内注射によって全身投与すると、転写調節配列による受容体遺伝子の発現又はその組換えの制御から来る、遺伝子運搬賦形剤、細胞型又は組織型発現によって与えられるトランスフェクトの特異性から、標的細胞中で蛋白質の特異的な形質導入が支配的に起こる。他の態様にあっては、組換え遺伝子の初期投与は、非常に局所的な投与で限定されたものである。例えば遺伝子運搬賦形剤を、カテーテルによって（米国特許第５，３２８，４７０号）又は定位注射によって（Ｃｈｅｎ他（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：３０５４−３０５７）導入する。
【０１２３】
遺伝子治療用構造体の薬学的調整物は、許容可能な希釈剤中の遺伝子運搬系から実質的に構成することができるし、遺伝子運搬賦形剤を封入した、緩効性基質を包含することもできる。あるいは、組換え細胞から、レトロウィルスベクターなどの完全な遺伝子運搬系が未反応で得られる場合には、医薬調整物は、遺伝子運搬系を形成する細胞１個以上を包含することができる。
本発明を下記実施例によって例証するが、これら実施例によって限定されるものではない。
【０１２４】
実施例１：大腸菌でのＳｏｎｉｃヘッジホッグの作成
Ａ．大腸菌内での発現
成熟ＳｏｎｉｃヘッジホッグのＮ末端システインから１７４アミノ酸残基まで伸長するヒトＳｏｎｉｃヘッジホッグＮ末端領域（Ｓｈｈ）蛋白質（配列番号３）を、成熟Ｓｈｈ配列のＮ末端システインに隣接する構造体内に工学的にエンテロキナーゼ切断部位を組み込んだ６ヒスチジンタグ付き融合蛋白質（ヒスチジンタグ−Ｓｈｈ）（配列番号１参照）の形で、ｐＥＴ１１ｄ発現ベクター内にサブクローンした。（アンピシリン耐性遺伝子を有する）プラスミドを、大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙｓＳに移転した。この系においては、ＩＰＴＧはＴ７ＲＮＡポリメラーゼの発現を誘発し、ポリメラーゼが、目的の遺伝子を含む移転されたプラスミドのＴ７プロモーター領域に結合する。標的遺伝子産物が大腸菌にとって十分な毒性を有する場合には、ポリメラーゼによって得られるこの基底レベルは、プラスミドを十分に防ぐことができる。（クロラムフェニコール耐性遺伝子を含む）第二のプラスミドｐｌｙｓＳは、誘発していない条件下でポリメラーゼと結合し転写を低減させる、低レベルのＴ７リゾチームを産生する。この系を用いることによって、プラスミドを毒性の有無に関わらず確実に維持及び発現させることができる。形質転換バクテリアを、Ａ550が０．５になるまで育成し、１ｍＭ  ＩＰＴＧで誘発したのち更に２時間育成した。培養基のアリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。 ゲルをクーマシーブルーで染色し、ヘッジホッグの発現レベルをデンシトメトリーで定量した。全蛋白質の４−５％がヘッジホッグであるというのが典型的な発現レベルであった。バクテリアの残余を遠心分離で集め、−７０℃で貯蔵した。ｐｌｙｓＳプラスミドの非存在下では、ヘッジホッグの発現レベルは低かった。誘導の後ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中に溶解物をクーマシーブルーで染色したところ、ヘッジホッグを示すバンドは現われなかった。このことは、ヘッジホッグの発現が、全蛋白質の１％未満であることを意味している。
【０１２５】
精製において、特に記さない場合には、全ての工程４℃で行った。全蛋白質の４−５％でＳｈｈを発現する細胞からのバクテリア菌糸塊を解凍し、溶解緩衝液（２５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、０．５ｍＭ  ＤＴＴ）に１：４（ｗ／ｖ）の割合で再懸濁し、Ｇａｕｌｉｎプレス（ＡＰＶ  Ｒａｎｎｉｅ製、デンマーク国コペンハーゲン）に１２,０００ｐｓｉにて２回通過させて溶解した。ホモジェネートを１９，０００ｇで６０分間遠心分離し、得られた溶解物にＭＥＳ  ０．５Ｍ（ｐＨ５）を、１：１０（ｖ／ｖ）の割合で添加した。この溶解物を、２５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ５．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌで予め平衡させた、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｒ）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）カラム（４ｇ大腸菌湿潤重量／ｍｌ樹脂）に、ｐＨ５．５で充填した。カラムをカラム体積（ＣＶ）４倍分の平衡緩衝液で洗浄し、さらに３ＣＶの２５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ５．５）、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５ｍＭ  ＤＴＴで洗浄し、同じ緩衝液中に８００ｍＭ  ＮａＣｌで、ヒスチジンタグ−Ｓｈｈを溶出した。溶出分画を２８０ｎｍでの吸光度及びＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｒ）溶出からの分画を含むピークのＳｈｈプールにイミダゾール（ｐＨ７の１Ｍ原液）及びＮａＣｌ（５Ｍ原液）を添加して、それぞれ最終濃度を２０ｍＭ及び１Ｍとし、これを、２５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８）、１Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、０．５ｍＭ  ＤＴＴで予め平衡させた、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州サンタクララ）カラム（２０ｍｇ／ｍｌ樹脂）に充填した。カラムを５ＣＶの同じ緩衝液で洗浄し、３ＣＶの２５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８）、１Ｍ  ＮａＣｌ、２００ｍＭイミダゾール、０．５ｍＭ  ＤＴＴでヒスチジンタグ−Ｓｈｈを溶出した。Ｎｉカラムからの溶出プール中の蛋白質量を、２８０ｎｍにおける吸光度によって測定した。Ｎｉアガロース溶出液に等量の２．５Ｍ硫酸ナトリウムを室温で添加し、得られた物質を、２５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８）、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、１．２５Ｍ硫酸ナトリウム、０．５ｍＭ  ＤＴＴで予め平衡させた、フェニルＳｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｒ）Ｆａｓｔ  Ｒｏｗ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）カラム（２０ｍｇ／ｍｌ樹脂）に充填した。室温にて２５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８）、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５ｍＭ  ＤＴＴでヒスチジンタグ−Ｓｈｈを溶出した。ほとんどの場合、０．５ｋｇ（湿潤重量）のバクテリアペーストから、２〜３ｇのヒスチジンタグ−Ｓｈｈを回収した。産生物を０．２μｍフィルターで濾過し、アリコートを−７０℃で貯蔵した。ヒスチジンタグ−Ｓｈｈの純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定したところ約９５％であった。精製した産生物の特徴を更に調べるために、試料を電子スプレーイオン化質量分析法（ＥＳＩ−ＭＳ）で評価した。蛋白質の約５０％が、Ｎ末端メチオニンを欠いていた。
【０１２６】
ヒスチジンタグ−Ｓｈｈ及びヒスチジンタグを除去した産生物のＥＳＩ−ＭＳデータを表１に示す。ＭＳ分析として、精製した特定ヘッジホッグのアリコートを狭孔Ｃ4カラム（Ｖｙｄａｃ、カタログ番号２１４ＴＰ１０４、内径０．４６×２５ｃｍ）にて逆相ＨＰＬＣにかけた。ピークの画分を、２８０ｎｍにおける吸光度によって同定し、電子スプレーイオン源を備えたＭｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｑｕａｔｔｒｏ  ＩＩ三重四極子質量分析計に注入した。６μｌ（１ｐｍｏｌ／μｌ）のＨＰＬＣ−精製ヘッジホッグを、１０μ１／ｍｍの割合で、シリンジポンプ内の水５０％、アセトニトリル５０％、及び０．１％蟻酸を溶媒として、イオン源に直接注入した。試料注入を通じて走査を行った。Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｍａｓｓ  Ｌｙｎｘデータシステムを用いて、得られた全てのスペクトルデータをプロファイルモードにためて処理した。平均残基質量を用いて、質量値を計算した。
【０１２７】
【表１】
表１.ＥＳＩ−ＭＳによる天然及び末端切断Ｓｈｈ変異体の特徴
0004574012.tif 000002
【０１２８】
６ヒスチジンタグを切断除去するために、エンテロキナーゼ（Ｂｉｏｚｙｍｅ、カリフォルニア州サンディエゴ）を１：１０００の酵素：Ｓｈｈ比（ｗ／ｗ）でヒスチジンタグ−Ｓｈｈと共に２８℃で保温した。未切断のヒスチジンタグ−Ｓｈｈ及び結合していないヒスチジンタグを、第二のＮｉ−ＮＴＡアガロースカラム（２０ｍｇ  Ｓｈｈ／ｍｌ樹脂）に通過させて消化することによって除去した。充填に先だって、消化にイミダゾール（ｐＨ７の１Ｍ原液）及びＮａＣｌ（５Ｍ原液）を添加し、最終濃度をそれぞれ２０ｍＭ及び６００ｍＭとした。この物質を、２５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８）、６００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、０．５ｍＭ  ＤＴＴで予め平衡させたＮｉ−ＮＴＡカラムに充填し、通過させた液を集めた。カラムを１ＣＶの同じ緩衝液で洗浄し、通過流と共にプールした。ＭＥＳ（ｐＨ５の０．５Ｍ原液）をＮｉアガロース未結合画分に添加して最終濃度を５０ｍＭとし、２容量分の水を添加した。この物質を、５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ５．５）；１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５ｍＭ  ＤＴＴで予め平衡させた、第二のＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｒ）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラム（２０ｍｇ／ｍｌ樹脂）に充填した。カラムを３ＣＶの平衡緩衝液と、３００ｍＭ  ＮａＣｌを含む１ＣＶの同じ緩衝液で洗浄した。Ｓｈｈを５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ５．５）、８００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５ｍＭ  ＤＴＴで溶出した。得られた原子吸光分析データは、Ｓｈｈがこの段階で０．５モル当量のＺｎ2+を含んでいることを示した。等モル濃度のＺｎＣｌ2をＳｈｈ溶出に添加し、蛋白質を５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ５.５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０.５ｍＭ  ＤＴＴで透析した。得られたＳｈｈは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）及びＥＳＩ−ＭＳによって＞９８％の純度を持ち、原子吸光分析によって０．９〜１．１Ｚｎ2+／Ｓｈｈを含んでいることが示された。
【０１２９】
ヒスチジンタグの除去とそれに続く精製で得られる精製Ｓｈｈは、ＥＳＩ−ＭＳによって測定した予想質量と同じ質量を有することが示された（表１）。予備実験ではヒスチジンタグを有さない完全な構造体としてＳｈｈが発現された。Ｓｈｈの発現レベルは低く、得られた蛋白質は過度に酸化されていた。その結果、大腸菌中でも発現したヘッジホッグ変異体は、ヒスチジンタグ融合体として産生された。
【０１３０】
実施例２：アンタゴニストの機能についての試験
外来ヘッジホッグ蛋白質に応答する様々な細胞系が同定されている。これらの応答には、ｐｔｃ−１及びｇｌｉ−１  ｍＲＮＡの誘導（Ｔａｋａｂａｔａｋｅ他、Ｆｅｂｓ．Ｌｅｔｔ．４１０：４８５−４８９（１９９７））、ｐａｔｃｈｅｄ−１発現の誘導（Ｎａｋａｍｕｒａ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２３７：４６５−４６９（１９９７））、融合体のリン酸化（Ｔｈｒｅｏｎｄ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３：４２２４５−４２２８（１９９６））などがあり、軟骨細胞／砕骨細胞系統については、アルカリホスファターゼ活性の誘導などがある。本研究においては、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞系を、ヘッジホッグシグナル伝達のレポーターとして用いた。下記に述べるアッセイにおいて、成熟Ｓｏｎｉｃヘッジホッグがｐａｔｃｈｅｄ−１に結合し、シグナルを発生させることができるのに対し、様々なヘッジホッグ変異体は、成熟蛋白質と同等の親和性でｐａｔｃｈｅｄ−１に結合するが、特定の機能的読み出しに対しては不活性であることがわかっている。ヘッジホッグのこれらの形態は不活性であっただけでなく、野生型Ｓｏｎｉｃヘッジホッグと機能について効果的に競争しており、従ってアンタゴニストとして作用した。そのようなアンタゴニストの特異的な例は、実施例３〜７に記載する。
【０１３１】
Ａ．Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞におけるアルカリホスファターゼ活性の測定
多能性間充織細胞系Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２（Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ，Ｃ．Ａ．他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ３３、３２３１−３２３８（１９７３））を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から得て、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）にて組織培養を３７℃で維持した。ＡＰ誘導のアッセイ用に、５，０００細胞／ウェルで９６ウェルプレートに細胞を培養し、２４時間後に２倍連続希釈した精製ヘッジホッグ蛋白質を培養に添加し、更に５日間培養した。１０ｍＭジエタノールアミン（ｐＨ９．５）、０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2中で３７℃にて３０分培養して細胞を溶解し、溶解液中に色素産生基質ｐ−ニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ）を用いて、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）活性について調べた。溶解物をｐＮＰＰで３０分間培養し、９６ウェルプレートリーダー（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、マサチューセッツ州フレーミングハム）にて４０５ｎｍで数値を読んだ。ＡＰは、軟骨細胞／骨芽細胞系統への分化のマーカーである。Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２アッセイにおけるＳｈｈの用量反応は、０．１〜１０μｇ／ｍｌの範囲で観察された。
【０１３２】
大腸菌から得た、ヒスチジンタグ付き蛋白質として発現され後にタグが除去されたヒト成熟ヘッジホッグ（配列番号３）について、ＡＰ活性を読み出しとして用いるＣ３Ｈ１０Ｔ１／２アッセイによって機能を調べた。このアッセイにおいて、Ｓｈｈは、８０ｎＭのＥＣ５０、２５０ｎＭの最大シグナルでの用量依存応答を示した（図２）。この活性は、抗ヘッジホッグ中和ｍＡｂ  ５Ｅ１によって中和することができる（データ示さず）。
【０１３３】
他の形態のヘッジホッグは、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２アッセイで機能を調べた結果、不活性であるか、実質的に減少した活性を有することが示された（図２）。これらには、ヒトＳｈｈ（Ｎ−１０）（配列番号６、実施例３）、ラットＳｈｈ（Ｎ−８）（実施例４）、Ｓｈｈ（Ｎ−９／Ｃ−３）（実施例６）、Ｓｈｈ（Ｎ−５）（実施例６）、Ｓｈｈ（Ｎ−８）（実施例６）等の先端切断型；Ｃ１Ｓ  Ｓｈｈ（実施例５）等のＮ末端改変型；及びヒスチジンタグ−Ｓｈｈ（実施例７）等のＮ末端伸長型がある。
これに対して、Ｃ末端から最後の９残基だけ欠けて発現されたＳｈｈ変異体（表１における「Ｓｈｈ（Ｃ−９）」：配列番号１０）は、成熟体に比べて、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２活性の減少は見られない（図２）。
【０１３４】
Ｂ．ＲＴ−ＰＣＲによるＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞におけるｐｔｃ−１及びｇｌｉ−１誘導の測定
Ｔｒｉｚｏｌ法（Ｃｈｏｍｃｙｚｎｓｋｉ，Ｐ．及びＳａｃｃｈｉ，Ｎ．、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２：１５６（１９８７））によって、全ＲＮＡを調製した。マウス白血病ウィルス逆転写酵素を用いて３７℃、４５分間で第一のｃＤＮＡ鎖を合成した。続いて、下記条件のＰＣＲを２７サイクル（ｐｔｃ−１）又は２９サイクル（ｇｌｉ−１）行って増幅した。９５℃で３．５分、アニーリングを６２℃で１分（ｐａｔｃｈｅｄ−１）又は６４℃で２０秒（ｇｌｉ−１）、７２℃で１分（ｐｔｃ−１）又は２０秒（ｇｌｉ−１）。プライマーは下記のものを用いた。
【０１３５】
Ｐｔｃ−１  ５’−ＣＡＴＴＧＧＣＡＧＧＡＧＧＡＧＴＴＧＡＴＴＧＴＧＧ−３’（配列番号１２）
５’−ＡＧＣＡＣＣＴＴＴＴＧＡＧＴＧＧＡＧＴＴＴＧＧＧＧ−３’（配列番号１３）
Ｇｌｉ−１  ５’−ＣＧＧＧＧＴＣＴＣＡＡＡＣＴＧＣＣＣＡＧＣＴＴ−３’（配列番号１４）
５’−ＧＧＣＴＧＧＧＴＣＡＣＴＧＧＣＣＣＴＣ−３’（配列番号１５）
【０１３６】
ｐｔｃ−１及びｇｌｉ−１はそれぞれ２７０ｂｐ及び３８６ｂｐのＰＣＲ産物を検出することによって調べた。２日後にＳｈｈによるｐｔｃ−１及びｇｌｉ−１ＲＮＡの誘導は最大になった（ｐｔｃ−１ＲＮＡは２倍、ｇｌｉ−１ＲＮＡは５倍）。アッセイを５日後に終了した時、ｐｔｃ−１及びｇｌｉ−１ｍＲＮＡのレベルは両方とも、２日目のレベルより低下していた。
【０１３７】
Ｃ．Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞を持ちいたアッセイにおける、ｐａｔｃｈｅｄ−１蛋白質の誘導
Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞をＴ７５フラスコ内で増殖させ（３×１０6個）、Ｓｏｎｉｃヘッジホッグ（２μｇ／ｍｌ）又はＳｈｈ（Ｎ−１０）（配列番号６）（２μｇ／ｍｌ）と共に培養した。０、１、２、３又は４日後に、上澄液を捨て、細胞をＰＢＳで洗浄した。Ｂｒｉｊ９６（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、ミズーリ州セントルイス）、ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１０ μｇ／ｍｌアプロチニン、１０μｇ／ｍｌロイペプチン、１０μｇ／ｍｌ  Ｏ−フェナントロリン、１０ｍＭベンザミジン（benzamidine）、１０μｇ／ｍｌペプスタチンＡ、０.２ ｍｇ／ｍｌバナジン酸ナトリウム、４ｍｇ／ｍｌフッ化ナトリウムを含む、氷上の緩衝液に３０分漬けて細胞を溶解した。溶解物を１０，０００ｇで１５分間遠心分離し、上澄を親和精製したウサギ抗ｐａｔｃｈｅｄ−１抗体及び蛋白質Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｒ）と共に静置した。
【０１３８】
抗体の免疫原として、Ｍａｔｔ  Ｓｃｏｔｔ博士（スタンフォード大学から進呈）により提供された大腸菌構造体から精製した、ＧＳＴ−Ｃ末端ネズミｐａｔｃｈｅｄ断片（残基１２３７−１４１４）を用いた。抗体を、第一の非特異性ＧＳＴ樹脂と、第二のＧＳＴ−ｐａｔｃｈｅｄ  Ｃ末端樹脂の２段階精製にかけた。ペレット形成の後、ペレットを溶解緩衝液で５回洗浄したのち、ＳＤＳを含む電気泳動緩衝液中で５分間沸騰した。試料を縮小（reducing）４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動させ、ニトロセルロースに転写した（１００Ｖで２時間）。抗ｐａｔｃｈｅｄ−１  Ｃ末端抗体をプローブにしてブロッティングを行い、蛋白質Ａ−アルカリホスファターゼ及びピアスウルトラスーパーシグナル基質を用いてバンドを視覚化した。
【０１３９】
Ｍｒ＝２５０，０００のｐａｔｃｈｅｄ蛋白質は、Ｓｈｈによる処理前ではかろうじて検出できるレベルであったが、Ｓｈｈ処理の結果、用量及び時間に依存して増加することが示された。Ｓｈｈは、２日目にｐａｔｃｈｅｄ−１蛋白質応答の最大値（発現にして約５倍の増加）を誘導した。５日後にも、ｐａｔｃｈｅｄ蛋白質発現は上昇したままであり、この時点でアッセイを終了した。
【０１４０】
Ｄ．Ｉｓｌｅｔ−１誘導アッセイ
中間神経板外植片を、第１０期の鶏胚の尾側領域から切除した。運動ニューロンを誘導するために、中間神経板外植片をコラーゲンゲルに植え、ヘッジホッグ蛋白質を添加してＮ２培地で４８時間培養した。Ｉｓｌｅｔ−１＋運動ニューロンのマーカーであるＩｓｌｅｔ−１を、Ｉｓｌｅｔ−１特異モノクローナル抗体で検出した。神経板外植片を１％パラホルムアルデヒドを用いて４℃で１〜３時間固定した。外植片を一次抗体と４℃で一晩培養し、ビオチン化した抗マウスＩｇＧと共に４℃で一晩培し、最後にＣｙ３−複合ストレプトアビジンと共に４℃で一晩培養した。外植片を洗浄して顕微板に乗せた。外植片を蛍光光学部品を備えた顕微鏡で観察し、陽性反応を示した核を数えた。
【０１４１】
Ｓｈｈ及びＳｈｈの末端切断変異体は、神経管外植片におけるＩｓｌ−１発現を比較可能用量応答で誘発することができた（データは示さず）。Ｓｈｈ、並びにＳｈｈ  Ｎ−ｂ、Ｓｈｈ  Ｎ−９及びＳｈｈ  Ｎ−５の変異体のＥＣ50は、〜２ｎＭであった。ｉｓｌｅｔ−１アッセイにおけるこの活性は、ヘッジホッグアンタゴニスト属に共通の特徴を示しているようである。
【０１４２】
Ｅ．ｐａｔｃｈｅｄ−１結合アッセイ
Ｍｙｃタグ−ｐａｔｃｈｅｄ−１で一時的にトランスフェクトしたヒト腎胚芽２９３細胞を用いて、結合実験を行った。直接結合は、２９３／ｐａｔｃｈｅｄ−１細胞（１×１０6／ｍｌ）をヒトＳｈｈ−Ｉｇ融合蛋白質（５ｎＭ）（Ｓｈｈは、ヒトＩｇＧ１の、Ｆｃヒンジ部に向って残基１９７の後の、ＣH２ＣH３部分の枠内で融合する；Ｊａｋｕｂｏｗｓｋｉ他、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｍｍｕｎ．３：１３１−１４２）と培養することによって調べた。細胞を洗浄したのち、フィコエリトリン（ＰＥ）標識化ロバ抗ヒトＩｇＧと保温した。細胞を固定して、ＦＡＣＳにて読み出した。競合結合用に、１６０ｎＭのＳｈｈ又は他の蛋白質を添加し、一連の２倍希釈で力価を求めた。
【０１４３】
ＦＡＣＳを用いたアッセイを用いて、ＳｏｎｉｃヘッジホッグＮ末端領域が明らかにｐａｔｃｈｅｄ−１に結合するＩＣ50を調べたところ、〜３．５ｎＭであった。Ｓｈｈの末端を切断した変異体（表１）は、同様の親和性で結合した（図４）。Ｃ１Ｓアンタゴニスト（配列番号８）（実施例５参照）は、わずかに高い親和性（〜１ｎＭ）で結合した。
【０１４４】
Ｆ．アンタゴニストとしてのヘッジホッグ変異体の評価
Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２アッセイを用いて、野生型Ｓｈｈ機能を阻害する能力を評価することによって、試料の持つヘッジホッグ機能のアンタゴニスト性について試験した。全てのウェルに、試験試料の連続希釈に加えて２μｇ／ｍｌの成熟Ｓｈｈを入れたことを除いては、本実施例のセクションＡと実質的に同様にしてアッセイを行った。アンタゴニストの存在下で、Ｓｈｈ誘導ＡＰ活性における減少を用いることで阻害を測定することができ、読み出しに用いることによって、ＡＰの阻害を検定した。図３に示すデータは、ｐａｔｃｈｅｄ−１に結合したがＣ３Ｈ１０Ｔ１／２アッセイにおいて非活性又は低い活性しか有さなかった全てのヘッジホッグ変異体が、成熟Ｓｈｈと競合し、従って機能的アンタゴニストであることを示している。
【０１４５】
実施例３
Pichia pastoris内で生成されるＳｈｈからのアンタゴニストの検出
ヒトＳｈｈの最初の１０個のアミノ酸が欠けているＮ−１０変異体を、Pichia pastoris中で、成熟したＳｏｎｉｃヘッジホッグのＮ末端断片（配列番号３）をコードする構造体の発現により生成した。すべての方法及びPichia pastorisに対する成長培地は製造業者から提供されているＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製品マニュアルに記載されている。
【０１４６】
ｐＵＢ５５−１の作製:
ｐＵＢ５５は分泌シグナルとしてα因子ＰｒｅＰｒｏ領域を有するヒトＳｏｎｉｃヘッジホッグＮ末端領域（配列番号３）を含んでいる。ｐＵＢ５５はｐＰＩＣ９（カリフォルニア州サンジエゴのＩｎｖｉｔｏｒｏｎ社製）のＳｐＨ１部位に挿入されたｐＵＣ４−Ｋのカナマイシン遺伝子（ＨｉｎｃＩＩ−ＨｉｎｃＩＩ断片）によるｐＰＩＣ９誘導体であるｐＣＣＭ７３中で構成された。Ｅａｒ１−Ｎｏｔ１からのヒトＳｏｎｉｃヘッジホッグをコードする配列は、停止コドンとＮｏｔ１部位をコード配列中にＧｌｙ１９７に続くＮｏｔ部位とを有するｐＥＡＧ５４３から得られた。プラスミドｐＣＣＭ７３はＸｈｏＩとＮｏｔＩで切断され、ｐＥＡＧ５４３のＥａｒ１−Ｎｏｔ１とＸｈｏＩ−ＥａｒＩ断片を構成するオリゴヌクレオチド［５’ＴＣＧ ＡＧＡ ＡＡＡ ＧＡＴ ＧＣＧ ＧＡＣ ＣＧＧ ＧＣＡ ＧＧＧ ＧＧＴ ３’:配列番号１８及び５' ＣＧＡ ＡＣＣ ＣＣＣ ＴＧＣ ＣＣＧ ＧＴＣ ＣＧＣ ＡＴＣ ＴＴＴ  ＴＣ ３’:配列番号１９］で結合され、Ｓｏｎｉｃヘッジホッグをフレーム中のα因子リーダ配列に近接させて配置するための適当なコード配列を作る。
【０１４７】
ＵＢ６６−１の作製：
ｐＵＢ５５−１をＳｔｕ１で消化し、１０μｇのＤＮＡをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社の指示する方法によりPichia pastoris ＧＳ１１５細胞に形質転換した。Ｈｉｓ+形質転換体はＭＤプレート上で選択し、捕集し、それを増殖形質転換体のための選択を行うためにＹＰＤ／Ｇ４１８プレート上に広げた。株を１０ｍｌのＢＭＧＹ培地で３０℃で２日間生育し、次いで細胞を２％メタノールを含む２ｍｌのＢＭＭＹ中に再懸濁させ、３０℃でさらに２日間生育した。発現は上記のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により評価した。スケールアップ及び発酵のためにクローンＵＢ６６−１を選択した。
【０１４８】
形質転換したイーストは１０リットルの発酵器中３０℃で５日間生育した。その時点で、細胞は遠心分離により除去した。発現は２００−４００ｍｇ／ｌであったが、蛋白質の大部分（８０％以上）は蛋白質分解された。遠心分離の後、培養液の上澄みを３容積の水で希釈し、それを２５ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ５．４、１５０ｍＭのＮａＣｌで平衡させたＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦカラム（商品名）に装入した。カラムを、各々２５ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ５．４、２００ｍＭのＮａＣｌ、及び１ＣＶの２５ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ５．４、４００ｍＭのＮａＣｌでの、３×１カラム容積（ＣＶ）の順次の洗浄工程に付した。
【０１４９】
洗浄後、蛋白質分解により最初の１０アミノ酸が欠損した事後翻訳的に切り出したＳｏｎｉｃヘッジホッグ変異体Ｎ−１０（配列番号５）を、２５ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ５．５中４５０ ｍＭＮａＣｌで溶出し、６画分の０．５ＣＶを捕集した。完全なＳｏｎｉｃヘッジホッグを６５０ｍＭ及び８００ｍＭのＮａＣｌでさらに溶出した。 これらの画分のすべては還元及び非還元条件下ににＥＳＩ−ＭＳ及び ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより特徴を調べた。それぞれの画分を０．２μｍの膜を通して濾過し、等分し、−７０℃で保存した。９０％以上のＳｈｈをＮ−１０変異体として含む画分４５０−１ないし４５０−３を、後の全ての検査に使用した。表１に示した配列番号５に対する ＥＳＩ−ＭＳデータは、予想された質量を示した。４５０ｍＭ の塩に曝した後の溶出画分はＮ−１０変異体と完全なＳｏｎｉｃヘッジホッグの混合物を含んでいた。
【０１５０】
Pichiaからの成熟ＳｈｈはＣ３Ｈ１０Ｔ１／２アッセイで作用したが、Ｎ−１０形態（配列番号５，表１のＮ−１０）はＣ３Ｈ１０Ｔ１／２アッセイで不活性であった（図２）。ｐａｔｃｈｅｄ−１結合試験では、Ｎ−１０変異体は成熟Ｓｈｈに対するそれに比肩できる親和性をもってｐａｔｃｈｅｄ−１に結合する能力を保持した。Ｎ−１０変異体は成熟蛋白質の親和性をもってｐａｔｃｈｅｄ−１に結合したが、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２アッセイにおいてヘッジホッグシグナルを出すことが出来なかったので、その蛋白質は成熟生成物のアンタゴニストとして作用すると考えられた。この可能性を調べるために、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞で競合を調べた。すなわちＳｈｈを一定の２．５μｇ／ｍｌの濃度で、変異体の８個２倍系列の希釈物を全てのウエルに、完全なＳｈｈの添加に先立つ予備培養工程で、またはＳｈｈの添加と同時に細胞を収容したウエルに直接に、添加した。Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２アッセイでは、Ｎ末端から１０個のアミノ酸が欠けている、Phicia中で生成したＳｈｈ切断変異体（“Ｓｈｈ(Ｎ−１０)”：配列番号５）は、約２５０ｎＭのＩＣ50で成熟蛋白質Ｓｈｈ（図３）によるＡＰ活性の誘導を遮断することができた。
【０１５１】
実施例４：  昆虫細胞で生成したＳｈｈからのヘッジホッグアンタゴニストの検出
ラットの最初の８個のＮ末端アミノ酸が欠けているＳｈｈ−ＮのＮ−８変異体を、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ昆虫細胞（商品名）中で、ラットＳｈｈ−Ｎ（ラットの遺伝子配列中の２５−１９８残基）をコードするｃＤＮＡの発現により発生させた。Ｓｆ−９００ＩＩ培地(Life Technolory社製，Gaithersburg，ＭＤ)２．４×１０６細胞／ｍｌの密度に成長させた昆虫細胞の２０×１００ｍｌの培地に、細胞あたり４感染ウイルスの感染倍率で、ラットＳｈｈのｃＤＮＡをコードするバキュウロウイルスで感染させた。２８℃で４８時間培養後に、細胞を遠心分離により収集し、１．２リットルの１０ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4 ｐＨ６．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５ｍＭ  ＰＭＳＦに再懸濁させ、次いで遠心分離により収集した。細胞を次に１．２リットルの１０ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4 ｐＨ６．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ／０．５ｍＭ  ＰＭＳＦに再懸濁し、遠心分離により収集し、次いで−７０℃で保存した。
【０１５２】
細胞（３７．５ ｇ)を解凍して、これを３００ｍｌの１０ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4ｐＨ６.５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０.５ｍＭ  ＰＭＳＦ、５μＭのペプスタチン、１０μｇ／ｍｌのロイペプチン、２μｇ／ｍｌのＥＭに再懸濁し、次いで３０ｍｌの１０％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を添加した。この混合物を３０分間氷上で培養し、次いで粒状物を１５００Ｇで１０分間遠心分離して除去した。
その上澄み（３３０ｍｌ）に３３ｍｌの０.５Ｍ  ＭＥＳ(ｐＨ５.０)を添加し、そして全体の試料を、５ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4  ｐＨ５．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５ｍＭ  ＰＭＳＦ、０．１％ＮＰ−４０中で平衡化したＳＰ-Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ高速流樹脂（Ｐａｒｍａｓｈｉａ社，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）の３７．５ｍｌカラム（２．５ｃｍ×７．７ｃｍ）に装入した。一旦装入したら、カラムを５ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4 ｐＨ５．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０.５ｍＭ  ＰＭＳＦ、０.１％  ＮＰ−４０の２×３７．５ｍｌ等分液で洗浄し、次いで５０ｍｌの５ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4 ｐＨ５．５、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５ｍＭ  ＰＭＳＦ、０．１％ＮＰ−４０で洗浄した。
【０１５３】
結合した蛋白質を１０×１２.５ｍｌ画分の５ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4 ｐＨ５．５、８００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５ｍＭ  ＰＭＳＦ、０.１％ＮＰ−４０で溶出した。ラットＳｈｈ−Ｎ（ウエスタンブロット分析で確認）を含有する画分をプールし（体積６７．５ｍｌ）、次いで、１３５ｍｌの５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．５と混合した。試料全体を次に、アンチヘッジホッグモノクローナル抗体５Ｅ１が４．０ｍｇ抗体／ｍｌ膨潤ゲルの濃度で結合している３ｍｌのＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂと混合した。４℃で２時間培養した後、樹脂をカラムに充填し、１０×４．２ｍｌのリン酸塩緩衝塩水ｐＨ７．２、１％オクチルグリコシドで洗浄し、次いでラットＳｈｈ−Ｎを、１０×１．０ｍｌ画分の２５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４  ｐＨ３.０、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１％オクチルグリコシドで溶出して、１００μｌの１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．５を収容した試験管に入れた。
【０１５４】
この生成した蛋白質のＨＰＬＣ及びＥＳＩ−ＭＳ分析の結果、約８０％がＮ−８変異体であり、残りの２０％がＮ末端システイン残基でミリスチン酸、パルミチン酸及びアラキジン酸変性を有する全長蛋白質の混合物であった。Ｎ−８変異体をＨＰＬＣにより脂肪族アクリル化形態のものから分離した。Ｎ−８変異体はＣ３Ｈ１０Ｔ１／２アッセイにおいて不活性であり、同じアッセイにおいて成熟Ｓｈｈ活性を遮断するアンタゴニストとして作用した（図２〜３）。
【０１５５】
実施例５：直接発現によるアンタゴニストの生成
Ｎ末端システインがセリンに変異したＳｏｎｉｃヘッジホッグＮ末端領域変異体（Ｃ１Ｓ：ＤＮＡに対する配列番号１７）はＥ．Ｃｏｌｉ中でヒスタッグ（標識）した蛋白質として発現され、精製され、成熟蛋白質対して上述したようにして特性を決定された（表１参照）。Ｃ１Ｓ変異体はＣ３Ｈ１０Ｔ１／２アッセイにおいて減少した活性を有し（図２）、成熟した蛋白質に対して機能性アンタゴニストとして作用した。ヒトＳｈｈのＮ末端システインをセリンで置換したもの（Ｃ１Ｓ：配列番号８）はＣ３Ｈ１０Ｔ１／２アッセイにおいて活性を実質的に失う。このアンタゴニストの能力（ＥＣ50）は濃度が成熟蛋白質に比して３倍高くシフトし、最大ＡＰ活性（効率）は３番低い。Ｃ１Ｓ変異体はまたヒトＳｈｈによるＡＰ誘導を０．５ｍＭのＩＣ50で遮断することができる。（データは示さない）。
【０１５６】
ある場合には、本発明のアンタゴニストを生成させるのに使用される他の改変手段と関連してＣ末端から１個以上のアミノ酸を除去するのに有用であり得る。他の例では、Ｃ末端のアミノ酸延長が本発明のアンタゴニストの生成に使用できる。この目的で、最後のアミノ酸９個が欠けたＳｏｎｉｃヘッジホッグＮ末端に変異体をコードするポリヌクレオチド（Ｓｈｈ（Ｃ−９）：配列番号１０）を創出した。コードされた蛋白質はＥ．Ｃｏｌｉ中でヒスタッグ蛋白質として発現され、生成され、成熟蛋白質に対して上述したと同様にして特性が決定された（表１参照）。配列番号１０の蛋白質はＣ３Ｈ１０Ｔ１／２アッセイにおいて成熟蛋白質に比肩しうる活性を有し（図２）、ＳｈｈにおけるＣ末端配列は重要な機能を有しないことを示した。
【０１５７】
実施例６：ヘッジホッグ蛋白質アンタゴニストの蛋白質分解による生成
限定された蛋白質分解はＳｈｈアンタゴニストを成熟した蛋白質から生成するのに使用できる別の方法を提供する。多くの酵素が断片の生成に利用できるが、本発明者はプラスミン、トロンビン及びエンテロキナーゼについてこのアプローチの成功を見た。
【０１５８】
Ｎ末端からアミノ酸ＣＧＰＧＲＧＦＧＫを欠き且つＣ末端から残基ＳＧＧを欠いているＳｈｈのＮ−９／Ｃ−３変異体（配列番号６）が、ヒスタッグＳｈｈをウシプラスミン(Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ) と共に、Ｓｈｈ対酵素比１０対１（重量比）で、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４中、２０℃にて３時間培養することにより生成された。消化物を同一バッファー中でオボインヒビターカラム（Pierce, Rockford, IL) に通すことにより、プラスミンを除去した。開裂しなかったヒスタッグＳｈｈは、試料を２５ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4 ｐＨ８.０、１Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、０．５ｍＭ  ＤＴＴ中のＮｉ2+ ＮＴＡアガロースカラム(Qiagen, Santa Clarita, CA)に通すことにより除去し、残りの蛋白質はｐＨ５．５でＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（商品名）に成熟Ｓｈｈとして捕捉し溶出することにより濃縮した。等モルのＺｎＣｌ2をこのＳｈｈ変異体に添加し、これら蛋白質を５ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ５．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５ｍＭ  ＤＴＴに対して透析した。最終生成物はＥＳＩ−ＭＳ（表１）とＮ末端配列決定により特性を決定した。
【０１５９】
Ｎ末端から残基ＣＧＰＧＲを欠いているＳｈｈのＮ−５変異体（配列番号７）が、ヒスタッグＳｈｈをビオチニル化トロンビン（Novagen, Madison, WI) と共に５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ７．４中、Ｓｈｈ対酵素比１０：１（重量比）で、２０℃にて３時間培養することにより生成された。ビオチニル化トロンビンは、消化物をストレプトアバジンアガロースカラムを通すことにより除去した。このＮ−Ｓ変異体を精製し、Ｎ−９／Ｃ−３変異体に関して述べたと同様にして分析した。
【０１６０】
ＳｈｈのＮ−８変異体（配列番号１１）が、ヒスタッグＳｈｈの変異形（Ｇｌｙ−８がＡｒｇ:“Ｇ８Ｒ-Ｓｈｈ”で置換されたもの）をエンテロキナーゼ（Biozyme, San Diego,CA）と共に、２５ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4 ｐＨ８.０、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５ｍＭ  ＤＴＴ中、ヒスタッグＧ８Ｒ−Ｓｈｈ：エンテロキナーゼ比５２５：１（重量比）で、２８℃にて２時間培養することにより生成された。完全なＧ８Ｒ変異体蛋白質（変位蛋白質の開始部位直近のエンテロキナーゼ部位で開裂）及びＮ−８切断形（Ａｒｇ-８のＣ末端で開裂）を含有している流出物は、次にＢｉｏｒａｄ（商品名）(Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ)Ｂｉｏ−Ｓｃａｌｅ  Ｓ２陽イオン交換カラムで精製して、上記２つの形態に分離し、エンテロキナーゼを分離した。これら蛋白質を５ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4 ｐＨ５．５、０.５ｍＭ  ＤＴＴ中で、１５０ｍＭ〜１.０Ｍ  ＮａＣｌの直線勾配で溶出した。Ｎ−８形態の変異体は完全なＧ８R変異体蛋白質よりも充分低いＮａＣｌ濃度でカラムから溶出した。Ｎ−８形態の変異体を５ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4  ｐＨ５．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０.５ｍＭ  ＤＴＴで充分に透析した後、−８０℃で保存した。
【０１６１】
Ｎ−９／Ｃ−３（配列番号６）及び配列番号７（表１のＮ−５）はいずれもＣ３Ｈ１０Ｔ１／２アッセイで不活性である（図２）。ＳｈｈのＮ−９／Ｃ−３（配列番号６）及びＮ−Ｓ（配列番号７）切断変異体は、成熟蛋白質により誘導されるＡＰ活性を遮断し（図３）、いずれも約８０ｎＭのＩＣ50を有する。対照蛋白質ＢＳＡまたは免疫グロブリンアイソタイプ Ｇ (ＩｇＧ) の添加はＡＰ活性のＳｈｈ誘導を遮断しなかった（データは示さない）。ＳｈｈのＮ−９/Ｃ−３切断変異体（配列番号６）は実施例２に記載したアッセイで試験したときにｐｃｔ−１を誘導することが出来なかった（データは示さない）。これらの切断されたＳｈｈ変異体は、Ｓｈｈに対するものに比肩できる量的応答で中性試験管植片中でＩｓｌ-１発現を誘導することが出来た（データは示さない）。Ｓｈｈと変異体に対するＥＣ50はＩｓｌｅｔ−１伝導アッセイで約２ｎＭであった。
【０１６２】
実施例７：その他のアンタゴニスト
ヒトＳｈｈのＮ末端システインをセリン（Ｃ１Ｓ：配列番号８）で置換すると（Ｃ１Ｓ：配列番号８）、ＡＰ誘導で評価したときＣ３Ｈ１０Ｔ１／２アッセイで活性をほ実質的に失う（図２）。このＣ１Ｓ変異体の能力(ＥＣ50)は野生型に対して３倍高濃度側にシフトする。Ｃ１Ｓ変異体はまた０.５ｍＭのＩＣ50でヒトＳｈｈによるＡＰ誘導を遮断することができる。ヘッジホッグＮ末端システインのある種の化学改変（修飾）もまたアンタゴニスト変異体を精製することが期待される。
【０１６３】
ヒスタッグＳｈｈ（配列番号１）のようなＮ末端延長を有するＳｈｈ変異体はＣ３Ｈ１０Ｔ１／２アッセイにおいて不活性であり（図２）、アンタゴニストとして作用できる（図３）。Ｓｏｎｉｃヘッジホッグ蛋白質以外のヘッジホッグ蛋白質はこれらのアッセイにおいてアンタゴニストとして作用できる。ＩｎｄｉａｎヘッジホッグのＮ末端領域（その遺伝子配列によりコードされたＣｙｓ２３−１９７残基）、及びＤｅｓｅｒｔヘッジホッグのＮ末端（その遺伝子配列によりコードされるＣｙｓ ２８−２０３アミノ酸残基）は、Ｓｏｎｉｃヘッジホッグ蛋白質に関して述べた方法によりヒスタッグ蛋白質として発現され、そして精製された。得られる生成物は同様に９８％以上の純度を有し、表１にまとめたＥＳＩ−ＭＳデータはこれらの生成物に対して期待される物質を示した。
【０１６４】
Ｃ３ＨＬＯＴ１/２アッセイにおいて、Ｉｎｄｉａｎヘッジホッグ（Ｉｈｈ）はＳｏｎｉｃヘッジホッグよりも能力が劣り、ＥＣ50が約１ｍＭである（図２）。同じアッセイでＤｅｓｅｒｔヘッジホッグ(Ｄｈｈ)は不活性である。ここで精製されたＳｈｈのＮ末端切断変異体（例えばＮ−９/Ｃ−３とＮ−１０）もまたＣ３Ｈ１０Ｔ１／２アッセイにおいてＩｈｈを遮断することができる（データは示さない）。
【０１６５】
発明者はＣ３Ｈ１０Ｔ１／２アッセイでＩｎｄｉａｎヘッジホッグ及びＤｅｓｅｒｔヘッジホッグの各種変異体を試験した。本発明の開示に基づいて当業者はＩｈｈ及びＤｈｈの切断変異体（既に説明したものを含む）を生成することが出来るであろう。Ｓｈｈの切断変異体について生成した方法と同様にして生成されるこれらのＩｈｈ及びＤｈｈの切断変異体は、野生型の蛋白質Ｓｈｈ及びＩｈｈによるＡＰ活性を遮断することを期待できる。
【０１６６】
Ｄｅｓｅｒｔヘッジホッグ自体はまたアンタゴニストとして作用し、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２アッセイにおいてＳｈｈまたはＩｈｈ活性を遮断できる。Ｃ１Ｓ変異体、ヒスタッグＳｈｈ、Ｉｈｈ及びＤｈｈは全てｐａｔｃｈｅｄ−１レセプタにＳｏｎｉｃヘッジホッグに比肩し得る親和性をもって結合する（図４）。 Ｓｏｎｉｃヘッジホッグに対すると同様な方法で生成されたＩｈｈ及びＤｈｈの切断変異体はＳｈｈまたはＩｈｈ蛋白質によるＡＰ活性の誘導を遮断することができる。
【０１６７】
Ｄｈｈ自体もまたアンタゴニストとして作用して、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２アッセイにおいてＳｏｎｉｃヘッジホッグまたはＩｎｄｉａｎヘッジホッグの活性を遮断できる。
Ｃ１Ｓ変異体、ヒスタッグＳｈｈ、Ｉｈｈ、及びＤｈｈは全てｐａｔｃｈｅｄ−１レセプタにＳｏｎｉｃヘッジホッグに比肩し得る親和性をもって結合する（図４）。
【０１６８】
実施例８：Ｈｈアンタゴニストを使用する毛成長の抑制
ヘッジホッグ及びそのレセプタｐａｔｃｈｅｄ（ｐｔｃ）は皮膚（たとえば毛小泡体）(Iseki et al. (1996) Biochem.Biophys.Res.Comm.218,688-693; St-Jaques et al. (1998) Current Biology 8, 1058-1068) の上皮及び／又は間充細胞成分に発現される。上皮及び皮膚間充細胞の間の二方向相互作用は毛小泡体の発達を指令する。この相互作用を阻害すると、毛及び又は上皮組織の構造（例えばガット）を生じる増殖及び／又は分化の変動を生じることが予期される。例えばＳｈｈ（Ｎ−１０）のようなヘッジホッグアンタゴニストを毛小泡体細胞の成長及び分化の抑制に使用することができる。毛の成長とは、細胞分割により毛繊維の形成と伸長が起きることを指す。本発明のアンタゴニストを試験する技術が入手でき且つ知られている。一つの動物モデルは妊娠したマウスを本発明のアンタゴニストで処理してアンタゴニストを胎盤を通して胎児に与え、胚及び新生マウスに対して各種の試験を行うことを可能にする。
マウスはJackson Laboratory (Bar Harbor, Maine) 及び Charles River Laboratoriesから入手した。Ｂａｌｂ／ｃ及びＣ５７ｂｌ／６を使用した。
【０１６９】
Ａ．不治マウスにおける毛小泡体（Ｆｏｌｌｉｃｌｅ）の形態形成の遮断
マウスにおける体毛の発達は胚時期１３．５日で開始することが示されたので、Ｅ１２．５の妊娠マウスに本発明のアンタゴニストを注射した。ヘッジホッグ蛋白質に結合するが１０Ｔ１／２細胞の分化を遮断しない対照ヘッジホッグを使用した。処理したマウス及び処理しないマウスの子孫に対して組織学的検査を行った。Ｅ１８．５の発達段階にあるマウスの組織分析は、上皮細胞由来の基質細胞が対照マウスで内側毛根鞘の形態形成を行うことを示したが、この過程は同じ発達段階にあるアンタゴニストで処理したマウスでは存在せず最初の週を通じて遅延状態に留まることが分かった。
【０１７０】
より加齢した不治マウスの遮断
本発明のアンタゴニスト蛋白質を毛成長サイクルの第２（年齢３週）及び第４（年齢９週）成長期にあるマウスに投与した。毛成長に対する影響をはっきりさせるために、これらのマウスの背中の毛を剃った。結果は対照マウスの背中の毛は３週間で完全に修復したが、アンタゴニストで処理した毛の成長は完全に阻止された。
【０１７１】
Ｂ．誕生後の遮断
本発明者はさらに、より発達した段階でのアンタゴニストの投与により、毛形態形成を維持するのにはヘッジホッグシグナル伝達が必要であることを示す。この点を実行するために、マウスを誕生後の毛小泡体の形態形成が始まった段階でアンタゴニストの投与をおこなった。アンタゴニストで処理したマウスでは体毛が形成されたが、毛は短かく、毛成長の遅延があることが示唆された。
【０１７２】
Ｃ．遮断の逆行
無毛表現型アンタゴニストによる処理の撤回により逆行できるかどうかを調べるために、皮下注射でアンタゴニストを投与された数匹の子犬での投与を中止した。
本方法は毛成長サイクルの動的機構を変化して直接に毛小泡細胞の増殖を直接禁止し及び／又は直接幹細胞の分化を変化させるための手段を提供する。例えば、本方法は毛成長の禁止が望まれる領域の皮膚に、動物の毛小泡体寸法及び／又は毛成長速度を減少するに充分な量のヘッジホッグアンタゴニスト（例えばＳｈｈ（Ｎ１０））を投与することよりなる。このような効果は可逆的または非可逆的である。例えば、本発明の方法は毛の異常な過剰成長又は濃密成長（例えば多毛症）により特徴付けられる毛発病の治療に使用できる。ヘッジホッグアンタゴニストは、異常な多毛症である男性型多毛症の処置に使用できる。本方法はまた脱毛期間を延長する方法も提供する。
【０１７３】
本発明のアンタゴニストは上皮由来の組織の分化を抑制するために使用できる。これらの分子形は上皮組織を含む過剰形成状態及び／又は新生状態を処置するための各種治療の分化治療の基礎を提供できる。例えば、本発明の薬剤としてのアンタゴニストは、角化症のような過剰成長表皮状態の処置、或いは、基底細胞の悪性腫瘍や扁平上皮細胞の悪性腫瘍のような各種皮膚癌における高増殖率で特徴づけられる新生上皮細胞状態の処置などを意図している。ヘッジホッグアンタゴニストは、温熱又は放射線治療を受けていて通常は頭髪の喪失を生じるような患者に使用できる。ヘッジホッグアンタゴニストはしばしば上皮細胞に対して細胞増殖抑制的であり、細胞毒性が無く、このような薬剤は、放射線誘導壊死のような、効果のためには細胞サイクルのＳ期に進行することを要求する細胞毒性を有する薬剤から毛小泡体細胞を保護するのに使用できる。このように、治療中に細胞サイクルを抑制することにより、本発明の処置は、細胞死プログラムの活性化から生じるであろう壊死から、毛小泡体細胞を保護することができる。本発明の方法による処置は、毛小泡体細胞を休止状態にすることにより保護を行う。治療が終わったら、処置を中止して処方体細胞の増殖の抑制を解除する。
【０１７４】
配列の説明
SEQ ID NO:１は、ｐＥＴ１１ｂベクター中にサブクローン化されたｃＤＮＡによりコードされるｈｉｓタグ付きソニックヘッジホッグＮ末端ドメイン融合タンパク質(遺伝子工学により構築物中に成熟Ｓｈｈ配列のＣｙｓ１の直ぐ隣りにエンテロキナーゼ開裂部位を有する６ヒスチジンタグ付き融合タンパク質として)である。
0004574012.tif 000003
0004574012.tif 000004
0004574012.tif 000005
0004574012.tif 000006
【図面の簡単な説明】
【図１】  ヒトインディアン、ソニック及びデザートヘッジホッグ(それぞれ、SEQ ID NO:２、３及び４)よりなる様々なヒトヘッジホッグタンパク質のＮ末端断片のアラインメント。
【図２】  ヒトソニックヘッジホッグＮ末端ドメイン及び変異体のＣ３Ｈ１０Ｔ１／２アッセイ。ｈｕＳｈｈ及び変異体の活性を、アルカリホスファターゼ誘導を測定するＣ３Ｈ１０Ｔ１／２アッセイにおいて評価した。
0004574012.tif 000007
の一連の２倍希釈物を細胞と５日間インキュベートして、生じたアルカリホスファターゼ活性(ＡＰ)を、ＡＰ発色性基質ｐ−ニトロフェニルホスフェートを用いて４０５ｎｍで測定した。与えた数値は、二連の測定の平均を反映している。
【図３】  Ｓｈｈ−Ｎ及び切り詰めた変異体のレセプター結合アッセイにおける分析。Ｓｈｈ(■)、Ｉｈｈ(□)、Ｄｈｈ(△)、ｈｉｓタグ付きＳｈｈ(×)、Ｓｈｈ(Ｎ−５)(◆)、Ｓｈｈ(Ｎ−９／Ｃ−３)(○)、Ｓｈｈ(Ｎ−１０)(│)、Ｓｈｈ(Ｃ１Ｓ)(−)及びＳｈｈ(Ｎ−８)(▲)のパッチトに結合する相対的効力を、パッチトトランスフェクトしたＥＢＮＡ−２９３細胞につき、ＦＡＣＳ分析により評価した。試験試料の一連の希釈物をＥＢＮＡ−２９３細胞とインキュベートし、洗浄してから、結合パーセントをこれらの試料が細胞への結合をＳｈｈ−Ｉｇと競争する能力により測定した。結合したＳｈｈ−Ｉｇを平均蛍光により定量した。このデータを非線形回帰により双曲線に当てはめた。
【図４】  Ｓｈｈ変異体によるＳｈｈ活性のＣ３Ｈ１０Ｔ１／２ブロッキングアッセイ。ＡＰのＳｈｈ誘導をブロックするＳｈｈ変異体の能力を評価した。Ｄｈｈ、Ｓｈｈ(Ｎ−５)、Ｓｈｈ(Ｎ−１０)、Ｓｈｈ(Ｎ−９／Ｃ−３)、ｈｉｓタグ付きＳｈｈ−Ｎ及びＳｈｈ(Ｎ−８)の一連の２倍希釈物をＳｈｈ(２μｇ／ｍｌ)と３０分間インキュベートしてから、Ｃ３ＨＴ１０１／２アッセイにおける分析にかけた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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