(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリヌクレオチドのin vitroでの細胞内送達をするための方法であって、
（ａ）受容体に対するトランフェリン、インスリンおよびコレラ毒素よりなる群から選択される１つの受容体リガンドおよびカチオン性リピドを混合して混合物を形成させ、該リガンドと該リピドが非共有結合するようにする工程、
（ｂ）該混合物に該ポリヌクレオチドを添加し、該ポリヌクレオチドが該リピドと結合するようにする工程、そして
（ｃ）該混合物を該細胞に導入する工程、
を含んで成る方法。
【請求項２】
ポリヌクレオチドの添加の前に該混合物をインキュベートする工程をさらに含んで成る請求項１記載の方法。
【請求項３】
該混合物を該細胞に導入する前に該混合物をインキュベートする工程をさらに含んで成る請求項１記載の方法。
【請求項４】
該カチオン性リピドが中性リピドと共にリポソームフォーミュレーションの中に存在してカチオン性リポソームフォーミュレーションを形成するものである請求項１記載の方法。
【請求項５】
該中性リピドがジオレオイルホスファチジルエタノールアミンである請求項４記載の方法。
【請求項６】
該リポソームフォーミュレーションが、Ｎ−〔１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル〕−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルと、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンのフォーミュレーションである請求項４記載の方法。
【請求項７】
該リポソームフォーミュレーションが、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−〔２（スペルミンカルボキサミド）エチル〕−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミントルム（propanamintrum）トリフルオロ酢酸と、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンのフォーミュレーションである請求項４記載の方法。
【請求項８】
該フォーミュレーションが、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−〔２（スペルミンカルボキサミド）エチル〕−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミントルムトリフルオロ酢酸と、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンを有するものである請求項４記載の方法。
【請求項９】
該リポソームフォーミュレーションが、Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”’−テトラパルミチルスペルミンとジオレオイルホスファチジルエタノールアミンのフォーミュレーションである請求項４記載の方法。
【請求項１０】
該カチオン性リピドが、Ｎ−〔１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル〕−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイド、ＤＯＳＰＡ、ＤＬ−１，２−ジオレオイル−３−ジメチル−アミノプロピル−Ｂ−ヒドロキシエチルアンモニウム、ＤＬ−１，２−Ｏ−ジオレイル−３−ジメチルアミノプロピル−Ｂ−ヒドロキシエチルアンモニウム、ＤＬ−１−Ｏ−オレイル−２−オレオイル−３−ジメチルアミノプロピル−Ｂ−ヒドロキシエチルアンモニウム、ＤＭＲＩＥ、ＤＬ−１，２−ジオレオイル−３−プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム、ＴＭ−ＴＰＳより成る群から選択されるものである請求項１記載の方法。
【請求項１１】
該ポリヌクレオチドがデオキシリボ核酸である請求項１記載の方法。
【請求項１２】
該ポリヌクレオチドがリボ核酸である請求項１記載の方法。
【請求項１３】
該ポリヌクレオチドが遺伝子産物をコードするものである請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
該細胞が動物細胞である請求項１記載の方法。
【請求項１５】
下記のプロセスによって生産されるポリヌクレオチドのin vitroでの細胞内送達用生産物、
（ａ）受容体に対するトランフェリン、インスリンおよびコレラ毒素よりなる群から選択される１つの受容体リガンドとカチオン性リピドとを混合して混合物を形成させ、該リガンドと該リピドとが非共有結合するようにする工程、
（ｂ）該混合物に該ポリヌクレオチドを添加して該ポリヌクレオチドが該リピドと結合するようにする工程。
【請求項１６】
受容体に対するカチオン性リピドとトランフェリン、インスリンおよびコレラ毒素よりなる群から選択される１つの受容体リガンドを含んで成る生物活性分子のin vitroでの細胞内送達用キット。
【請求項１７】
該カチオン性リピドが中性リピドおよび該カチオン性リピドを含むリポソームフォーミュレーション中にあるものである請求項１６記載のキット。
【請求項１８】
該カチオン性リピドが、Ｎ−〔１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル〕−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイド、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−〔２（スペルミンカルボキサミド）エチル〕−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロ酢酸（ＤＯＳＰＡ）、ＤＬ−１，２−ジオレオイル−３−ジメチル−アミノプロピル−Ｂ−ヒドロキシエチルアンモニウム、ＤＬ−１，２−Ｏ−ジオレイル−３−ジメチルアミノプロピル−Ｂ−ヒドロキシエチルアンモニウム、ＤＬ−１−Ｏ−オレイル−２−オレオイル−３−ジメチルアミノプロピル−Ｂ−ヒドロキシエチルアンモニウム、ＤＭＲＩＥ、ＤＬ−１，２−ジオレオイル−３−プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム、Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”’−テトラパルミチルスペルミン（ＴＭ−ＴＰＳ）
より成る群から選択されるものである請求項１６記載のキット。
【請求項１９】
（ａ）受容体に対するトランフェリン、インスリンおよびコレラ毒素よりなる群から選択される１つの受容体リガンドおよびカチオン性リピドを混合して混合物を形成させ、該リガンドと該リピドとを非共有結合させるようにする工程、
（ｂ）該混合物にポリヌクレオチドを添加し、該ポリヌクレオチドが該リピドと結合するようにする工程、そして
ｃ）該混合物を細胞に導入する工程
を含んで成る該ポリヌクレオチド配列で該細胞をin vitroでトランスフェクトする方法。
【請求項２０】
該ポリヌクレオチドが該細胞内でその発現が望まれる遺伝子を含むものである、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
該遺伝子が嚢胞性繊維症トランスメンブラン調節タンパクをコードするものである請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
該ポリヌクレオチドの添加の前に該混合物をインキュベートする工程をさらに含んで成る請求項１９記載の方法。
【請求項２３】
該混合物を該細胞に導入する前に該混合物をインキュベートする工程をさらに含んで成る請求項１９記載の方法。
【請求項２４】
該カチオン性リピドが中性リピドと共にリポソームフォーミュレーション中に存在しカチオン性リポソームフォーミュレーションを形成するものである請求項１９記載の方法。
【請求項２５】
該中性リピドがジオレオイルホスファチジルエタノールアミンである請求項１９記載の方法。
【請求項２６】
該リポソームフォーミュレーションが、Ｎ−〔１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル〕−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルと、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンのフォーミュレーションである請求項１９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は米国ＮＩＨグラント（ＨＬ４８２８２）により一部支援された。アメリカ合衆国政府は本発明のある権利を保有する。
本発明の分野
本発明は生物活性分子の細胞内送達の分野に含まれる。
発明の背景
現時点では、体細胞遺伝子移送に関する主要な取り組み法はウイルスベクター（J.R.モルガン、R.G.トンプキンおよびM.L.ヤーマッチ（1993）、「遺伝子送達のための組換えレトロウイルスにおける進歩」Adv. Drug Del., Rev. 12, 143-158、W.H. カレッジ（1994）「嚢胞性繊維症遺伝子治療」Curr. Opin. Gene Develop. 4, 466-471、B.C. トラプネルおよびM.ゴルジグリア（1994）、「アデノウイルスベクターを使用する遺伝子治療」Curr. Opin. Biotechnol., 5, 617-625）または非ウイルスベクター（M.コッテンおよびE.ワグナー（1993）「遺伝子治療への非−ウイルスによるアプローチ」Curr. Opin. Biotech., 4, 705-710、F.D. レドリー（1994）、「非−ウイルス遺伝子治療」Curr. Opin. Biotechnol., 5, 626-636）のいずれかを使用する。
ウイルスベクターに誘導される遺伝子移送は、高い遺伝子移送効率を示すが、幾つかの面で欠陥を有している。例えば、ウイルスベクターのあるものは宿主ゲノム中に無差別にＤＮＡを組み込み（J.C. オルセン、W.フアング、L.G.ジョンソンおよびR.C.ボウチャー（1994）、「ＣＦエアウエー（airway）細胞におけるアデノウイルスベクター遺伝子発現の持続は染色体ＤＮＡ中へのベクター配列の組み込みによる」Pediatr. Pulm. S10, 230、D.W.ラッセル、A.D.ミラー、およびI.E.アレキサンダー（1994）「アデノ−関連ウイルスベクターはＳ期で優先的に細胞を形質導入する」Proc. Natl. Acad. Sci. 91, 8915-8919）、新生物形質変換（カレッジら（1994）上記、L.J. フェアベアルン、M.A.クロスおよびJ.R.アランド（1994）「パターソン・シンポジウム1993−遺伝子治療」Brit. J. Cancer, 59, 972-975）を含む潜在的危険をもたらす。さらに、アデノウイルスベクターは宿主の炎症反応や免疫反応を誘導し、これらのベクターの反復適用を不可能とする（H.S.ギンスバーグ、L.L.モルドウアー、P.B.シュガル、M.レディムトン、D.L.キリアン、R.M.チャノック、およびG.A.プリンス（1991）、「アデノウイルス肺炎の分子的病原性を研究するためのマウスモデル」Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 1651-1655、Y.P.ヤング、F.A.ヌューンズ、K.ベレンシ、E.ゴンゾル、J.F.エンゲルハルト、およびJ.M.ウイルソン（1994）、「組換えアデノウイルス内のE2aを不活性化すると嚢胞性繊維症の遺伝子治療の展望が改善される」Nature Genetics 7, 362-369、S. イエイ、N.ミッテレーダー、K.テイニー、C.オサリバン、およびB.C.トラプネル（1994）「嚢胞性繊維症のためのアデノウイルスに媒介される遺伝子移送: 肺へのベクターのイン・ビボ反復投与の定量的評価」、Gene Therapy 1, 192-200、トラプネルら（1994）、上記）。レトロウイルスベクターは安定な組み込みのためには分裂している細胞を必要とするので（D.C. ミラー、M.A.アダム、およびA.D.ミラー（1990）、「レトロウイルスベクターによる遺伝子移送は感染時に活発に複製している細胞内でのみ起こる」Mol. Cell Biol. 10, 4239-4242）、末端の分化した細胞の遺伝子治療にはこれらのベクターは不適当である。同様に、効率的な形質導入には、アデノ関連ウイルスは定常期の培養細胞よりもＳ期の細胞を好む（ラッセルら（1994）、上記）。さらに、効率的な形質導入のためにはアデノウイルスが必要でありそしてアデノ関連ウイルスの高い多重感染が必要であることは、高力価のウイルス調製物を得ることの困難性と相俟ってルーチン遺伝子治療用のベクターとしてこのウイルスを使用する場合の限界となっている。
これらのウイルスベクターを用いることと関連する問題の一部は、「分子複合体（molecular conjugate）（G.Y.ウーおよびC.H.ウー（1987）、「可溶性ＤＮＡ担体システムによる受容体により媒介されたイン・ビトロの遺伝子形質変換」J. Biol. Chem. 262, 4429-4432、E.ワグナー、M.ゼンケ、M.コッテン、H.ボイグ、およびM.L.バーンスティール（1990）「細胞内へＤＮＡを取り込むための担体としてのトランスフェリン−ポリカチオン複合体」Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414、M.A. フィンデイス、J.R.マーウイン、G.L.スピタルニ、およびH.C.チョウ（1993）、「受容体を介する遺伝子治療用のＤＮＡの標的化された送達」TIBTECH 11, 202-205、T.ファーコル、C.S.ケッツェル、およびP.B.デービス（1993）、「ポリマー性免疫グロブリン受容体を標的化することによる呼吸上皮細胞内への遺伝子移送」J. Clin. Invest. 92, 2394-2400、M.モンシグニ、A.-C. ロチェ、P.ミドウス、およびR. メイヤー（1994）「治療用の薬物および遺伝子の特異的送達のための担体としてのグリココンジュゲート」Adv. Drug Del. Rev. 4, 1-24、W.イインおよびP-W.チェング（1994）「エアウェー上皮細胞へのレクチン複合体により指令される遺伝子移送」Biochem. Biophys. Res. Commun., 205, 826-833）やカチオン性リポソーム（J.H.フェルグナー、T.R.ガデック、M.ホーム、R.ロマン、H.W.チャン、M.ウエンズ、J.P.ノースロ、G.M.リンゴールド、およびM.ダニエルセン（1987）「リポフェクチン: 高度に効率的なリピド媒介ＤＮＡトランスフェクション手順」Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7413-7417）などの遺伝子移送物質を用いて克服することができる。分子複合体は受容体リガンドをポリカチオンと化学的に連結することにより調製される（E.ワグナー、D.クリール、およびM.コッテン（1994）「受容体により媒介されるエンドサイトーシスのためのリガンドとしてトランスフェリンを用いる細胞内への薬物、タンパクおよび遺伝子の送達」Adv. Drug Del., Rev. 14, 113-135）。受容体により媒介される遺伝子送達のための分子複合体は遺伝子の抗体またはその断片をポリカチオンと化学的に連結することによっても調製することができる（M.コッテンおよびE.ワグナー（1993）上記、その中の参考文献およびT.ファーコルら（1993）上記）。ポリカチオンはＤＮＡの担体として働き、一方リガンドは細胞表層の受容体を標的化する。受容体に結合すると、この複合体はＤＮＡと共に受容体に媒介されるエンドサイトーシスにより内部に取り込まれる（フィンデイス（1993）上記、ワグナー（1994）上記、D.T.クリール（1994）「アデノウイルス−ポリリジン−ＤＮＡ複合体を用いる高効率遺伝子移送」Nat. Immun., 13, 141-164）。
カチオン性リポソームにより媒介される遺伝子移送では、リポソームがイオン相互作用によりＤＮＡに結合しそしておそらく原形質膜と融合することにより（フェルグナーら（1987）上記）および/またはエンドサイトーシスにより（X. ゾウおよびL.フアング（1994）「リポポリリジンを含むカチオン性リポソームにより媒介されるＤＮＡトランスフェクション: 特性と作用機作」Biochem. Biophys. Acta, 1189, 195-203）、ＤＮＡの送達を促進する。これらの作用剤（agent）は調製するのが容易であり、いかなるサイズのＤＮＡをも送達することができるが、一般にトランスフェクション効率が低い（カレッジ（1994）上記）。
発明の概要
本発明はその生物学的効果を及ぼすためには細胞に入らなければならない生物学的に活性な分子のための送達系に関する。このような分子にはペプチド、タンパク、またはＤＮＡまたはＲＮＡなどのポリヌクレオチドなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。好ましい態様では、かかる分子は遺伝子治療のプロトコルにおけるトランスフェクションのための遺伝子である。この送達系は好ましくはリポソームフォーミュレーション中に存在するカチオン性リピドとトランスフェリンなどの受容体リガンドから成る混合物であって、このリガンドはリポソーム成分には共有結合していない。受容体リガンドをまずカチオン性リポソームフォーミュレーションに添加してインキュベートする。ついで、細胞に送達すべき生物学的活性物質を得られたリガンド−リポソームコンビネーションに添加しそしてこの混合物を再びインキュベートする。成分を組み合わせる順序、すなわちリガンドとリポソームフォーミュレーションその後に核酸の添加は、高度に効率的なトランスフェクションを得る場合に決定的に重要である。
一般に、本発明の方法は細胞表面受容体に対し親和性を有するいかなるリガンドをも使用することができる。リガンドという用語は本明細書では広く用いられ、トランスフェリン、インスリン、コレラ毒素、アデノウイルス繊維ＫＮＯＢペプチド、並びに抗分泌成分などの受容体に対する抗体および抗体断片（例えば、Ｆａｂ断片）、および表皮成長因子やウイルスタンパク、特に受容体により媒介されるエンドサイトーシス機構を刺激するウイルスタンパクなどのペプチドおよびタンパクが含まれる。用いられるリガンドはトランスフェリンやインスリンなどの広範囲の細胞型を標的とするものまたは特異的細胞型を標的とするものであり得る。
一般に、本発明の方法はカチオン性リポソームフォーミュレーション中のいかなるモノ−またはポリカチオン性リピドおよび中性リピドをも使用することができる。カチオン性リピドはＤＯＴＭＡ、ＤＤＡＢ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＲＩ、ＤＯＲＩ−エステル、ＤＯＲＩ−エーテル、ＤＯＲＩＥ、ＤＯＴＡＰ、ＴＭ−ＴＰＳを含んでおり、それに加えて、カチオン性リピドは構造的に関連がある。〔これらの頭字語はそれぞれ本明細書で定義されるが、当分野でよく知られているものである。〕
より具体的には、本発明はリガンドがトランスフェリン、インスリン、コレラ毒素またはアデノウイルス繊維ＫＮＯＢペプチドであり、そしてカチオン性リポソームフォーミュレーションがカチオン性リピドであるＤＯＴＭＡ（Ｎ−〔１−（２，３−ジオレイロキシ）プロピル〕−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル）またはＤＤＡＢ（ジメチル  ジオクタデシルアンモニウム  ブロミド）および適当な中性リピドを含むものであるトランスフェクション作用剤（agent）を提供する。有用なカチオン性リポソームは中性リピドがＤＯＰＥ（ジオレオイル  ホスファチジルエタノールアミン）であるリポソームである。好ましいカチオン性リポソームは市販されているＤＯＴＭＡとＤＯＰＥとの１：１リポソームフォーミュレーションである「リポフェクチン」（商標）および市販されているＤＤＡＢとＤＯＰＥとの１：２．５リポソームフォーミュレーションである「リポフェクテース」（商標）である。
血清のある画分および／または成分はカチオン性リポソームのトランスフェクション効率を高めることが発見された。これらの画分または成分は、本発明のプロトコルで受容体リガンドの代わりに使用すると、リポソームトランスフェクションの効率を増加させる。
本発明の方法は調製が容易なトランスフェクション作用剤を用いる高効率遺伝子移送法である。例示した態様では、作用剤の活性成分は市場で入手可能である。さらに、一つの動物起源から調製された受容体リガンドは同一動物種の遺伝子治療に使用することができ、こうしてアデノウイルスベクターを用いるヒト遺伝子治療における主要な欠点であった宿主の炎症反応や免疫反応を軽減しまたは防止することができる。リポソームは明白な宿主の炎症反応や免疫反応をほとんどあるいは全く惹起しないようにみえる。ヒトトランスフェリンまたは他のヒトリガンドをカチオン性リポソームと組み合わせて利用すると、ヒトにおける高い遺伝子移送効率を達成しながら宿主の免疫反応を避けることができる。
本明細書で「リポフェクチン」およびトランスフェリンを用いて記述された方法はヒーラ細胞で１００％のトランスフェクション効率を達成することができる。本発明の「リポフェクチン」−トランスフェリン・トランスフェクション・プロトコルは、不死化されたＣＦエアウエー（airway）上皮細胞（ＣＦＴ１）における塩素電気伝導異常をＣＦＴＲ・ｃＤＮＡの送達により修正するために使用することもできる。トランスフェリンもヒーラ細胞の「リポフェクテース」によるトランスフェクションを有意に増強する。
本発明のトランスフェクション作用剤および方法はインビトロおよびインビボのトランスフェクション適用において有用である。これらの作用剤の調製の容易さおよび高いトランスフェクション効率はヒト遺伝子治療に対する適当なトランスフェクション作用剤の開発を促進するものである。
【図面の簡単な説明】
図１（ａ）〜（ｈ）はトランスフェリンおよびトランスフェリン１６μｇまたは０μｇのいずれかを含む「リポフェクチン」でトランスフェクトされたヒーラ細胞（Ｆ０）（１ａ）および６回逐次継代されたトランスフェクト細胞（Ｆ１〜Ｆ６）（１ｂ〜１ｇ）のＸ−Ｇａｌ染色を例示する。「リポフェクチン」−ＤＮＡ、すなわち０μｇトランスフェリンでトランスフェクトされた細胞は対照（Ｃ）（１ｈ）とした。Ｆ０の各セットに対して、９個の穴中の細胞をトランスフェクトさせた。トランスフェクション後４８時間培養した後、３個の穴（well）の細胞をＸ−ｇａｌで染色し、別の３個の穴の細胞についてはβ−ガラクトシダーゼ活性を試験し、そして残りの３個の穴の細胞は９個の穴に継代培養して次の研究に使用した。継代培養した細胞を以下に記すように処理したが、トランスフェクションはしなかった。Ｆ０（Ｃ）（１ｈ）だけを示す。その理由はＦ１（Ｃ）とＦ２（Ｃ）はＦ５（１ｆ）に類似し、そしてＦ３（Ｃ）、Ｆ４（Ｃ）、Ｆ５（Ｃ）およびＦ６（Ｃ）はＦ６（１ｇ）に類似するからである。詳細な実験プロトコルは実施例で記述する。
図２は「リポフェクチン」の存在下でのトランスフェリンによるＤＮＡ移送の増強を例示する。記号黒四角、黒丸、白四角、および白丸は、それぞれＤＮＡ、ＤＮＡ＋トランスフェリン、ＤＮＡ＋「リポフェクチン」、およびＤＮＡ＋「リポフェクチン」＋トランスフェリンを用いて細胞にトランスフェクトされた35Ｓ−ｐＣＭＶｌａｃＺを表す。各時点での値は２回の測定の平均であった。
図３は（Ａ）〔125Ｉ〕トランスフェリン、「リポフェクチン」、およびＤＮＡ、（Ｂ）「リポフェクチン」、ＤＮＡ、および〔125Ｉ〕トランスフェリン、（Ｃ）「リポフェクチン」および〔125Ｉ〕トランスフェリン、および（Ｄ）ＤＮＡおよび〔125Ｉ〕トランスフェリンの混合物のセファロース４Ｂクロマトグラフィーを例示する。混合物の各成分は１５分間のインキュベーションの期間の後に順次添加された。ボイドボリューム中に検出された放射活性の％が示してある。
図４はトランスフェリンと「リポフェクチン」より構成される遺伝子移送ベクターを用いる遺伝子移送複合体の中の効率的なものおよび非効率的なものに対して提案されたスキームを例示する。これらの複合体を（Ａ）「リポフェクチン」−トランスフェリン、（Ｂ）「リポフェクチン」−ＤＮＡ−トランスフェリン、（Ｃ）「リポフェクチン」−ＤＮＡ、（Ｄ）トランスフェリン−ＤＮＡと呼ぶ。（Ｃ）と（Ｄ）は非効率的な遺伝子移送複合体であり、一方（Ｂ）は最も効率的な遺伝子移送複合体である。対になった各成分間の相互作用の強さは、「リポフェクチン」−ＤＮＡ＞＞トランスフェリン−ＤＮＡ＞＞トランスフェリン−「リポフェクチン」である。
図５はトランスフェリンの濃度の関数としてのβ−ガラクトシダーゼ活性および青色細胞の％のグラフである。このグラフは「リポフェクチン」により媒介される遺伝子（ｐＣＭＶｌａｃＺ）移送のトランスフェクション効率がトランスフェリンにより増強されることを例示する。
図６はＣＦＴ１細胞における塩素イオン流出欠陥の修正を例示するグラフである。36Ｃｌ残存％を時間の関数としてプロットしてある。グラフでは、トランスフェリン、「リポフェクチン」およびｐＣＭＶＣＦＴＲでトランスフェクトされた細胞は白抜きダイアモンド（◇）で示され、そして「リポフェクチン」とＤＮＡでトランスフェクトされた細胞は白抜き四角（□）で示される。別の実験では、その結果は示してないが、ｐＣＭＶｌａｃＺ＋「リポフェクチン」でトランスフェクションしたときに見られたと同じ結果がトランスフェクションなしのＣＦＴ１細胞、トランスフェリン、ＤＮＡおよび「リポフェクチン」（この順序で添加された）でトランスフェクトされたＣＦＴ１細胞およびトランスフェリン＋ＤＮＡでトランスフェクトされたＣＦＴ１細胞についても得られた。
図７はトランスフェクトされた細胞中の36Ｃｌ残存％を時間の関数としてプロットした図６のグラフに類似するグラフである。白抜き丸（○）は対照（「リポフェクチン」でトランスフェクトされたＣＦＴ１細胞）を示し、黒丸（●）、白抜き四角（□）および黒ダイアモンドはそれぞれコレラ毒素、インスリンまたはトランスフェリンと「リポフェクチン」およびｐＣＭＶＣＦＴＲとの組み合わせでトランスフェクトされた細胞に対する結果を示す。細胞はＣｌ-含有培地中でＮａ36Ｃｌで予め培養した。培地を集め１分間隔で０．１ｍｍアメロライド（ameloride）を含みＣｌ-を含まない新鮮な培地を補給した。３分の終わりに、この培地に１０μμフォースコリン（forskolin）を添加した。
図８ａおよび８ｂはヒーラ細胞またはＣＦＴ１細胞それぞれへのｐＣＭＶｌａｃＺのトランスフェクション効率をインスリン量の増加の関数として示すグラフである。トランスフェクション作用剤はインスリン＋「リポフェクチン」である。
図９ａおよび９ｂはヒーラ細胞およびＣＦＴ１細胞それぞれへのｐＣＭＶｌａｃＺのトランスフェクション効率をコレラ毒素濃度の関数として示すグラフである。トランスフェクション作用剤はコレラ毒素＋「リポフェクチン」である。
図１０はヒーラ細胞へのｐＣＭＶｌａｃＺの「リポフェクチン」トランスフェクションのトランスフェクション効率を受容体リガンドの代わりに用いた血清容量の関数として示すグラフである。
図１１ａおよび１１ｂは受容体リガンドに代えてプロテインＡ画分またはコンＡ画分がそれぞれ用いられた場合のヒーラ細胞へのｐＣＭＶｌａｃＺの「リポフェクチン」トランスフェクションのトランスフェクション効率を示すグラフである。
図１２は受容体リガンドに代えてサイズで分画された血清試料を用いる「リポフェクチン」トランスフェクションのトランスフェクション効率を示すグラフである。
発明の詳細な説明
本発明は、発現可能なβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を送達するために、カチオン性リポソームフォーミュレーションである「リポフェクチン」および広範囲の細胞の受容体リガンドであるトランスフェリンを用いてヒーラ細胞に対し９８〜１００％のトランスフェクションを観察したことに一部基づいている。比較すると、「リポフェクチン」単独を使用する単純なリポフェクション（lipofection）では、ヒーラ細胞への同じＤＮＡ構築物のトランスフェクション効率は極めて低かった（３〜４％）。β−ガラクトシダーゼＤＮＡ構築物単独またはトランスフェリンとの組み合わせでは、ＤＮＡはトランスフェリンと複合体を形成することができるけれども、これらのヒーラ細胞へのトランスフェクション効率は一層低いものであった（＜０．０１％）。
トランスフェクション組成物の成分を組み合わせる順序はトランスフェクション効率にとって決定的に重要であった。カチオン性リポソームフォーミュレーションは通常の方法で調製される。このリポソームフォーミュレーションに受容体リガンドを添加し、混合物を室温でインキュベートして複合体形成の平衡にもっていく。次いで、送達すべき核酸、例えばＤＮＡ構築物を添加し、この混合物について室温で２回目のインキュベーションを行い、複合体形成の平衡にもっていく。カチオン性リポソームフォーミュレーションへの核酸の添加の後トランスフェリンを添加しても、高効率のトランスフェクション作用剤を生じることはない。同様に、核酸、リポソームフォーミュレーションおよび受容体リガンドの同時添加は高効率のトランスフェクション作用剤を生じない。
トランスフェリン受容体により媒介されるエンドサイトーシスは、それによりトランスフェリンが鉄を細胞内に送達する正常な生理的プロセスである（H.A.ヒューバーおよびC.A.フィンチ（1987）「トランスフェリンおよびトランスフェリン受容体の生理学」Physiol. Rev. 67, 520-582）。このプロセスはホロトランスフェリンがまず細胞表面にあるその受容体に中性のｐＨで結合することが必要である（P.アイセン（1994）「トランスフェリン受容体およびトランスフェリンからの鉄の放出」Adv. Exp. Med. Biol., 356, 31-40）。トランスフェリン−受容体複合体は次いで内部に入りクラスリンで覆われた小胞を形成する。エンドソーム内の酸性ｐＨで結合している鉄を放出した後、トランスフェリンはなお受容体と複合体を形成したままエンドソームから逃げ出しそして細胞表面に戻り、そこで放出されて循環に入る。この効率的な受容体リサイクルプロセスはトランスフェリン−ポリカチオン複合体を用いることにより外来ＤＮＡを細胞へ送達するために利用されてきた（ワグナーら、1987、コッテンおよびワグナー（1993）上記、ワグナーら（1994）上記、イインおよびチェング（1994）上記）。しかしながら、これらの分子複合体はトランスフェクション効率が低い（カレッジ（1994）上記、イインおよびチェング（1994）上記）。
トランスフェリンがカチオン性リポソームトランスフェクション試薬中に含められるときに観察され、リポソーム成分に共有結合した場合には観察されないトランスフェクション効率の劇的な上昇の理由は、現時点では完全には解明されていない。トランスフェクションにおけるカチオン性リポソームの役割は細胞表面上の負に荷電した基への結合と血漿膜との融合と考えられてきた。このプロセスの間に、カチオン性リポソームにより運ばれるＤＮＡ（および他の種）は細胞への入口を獲得した（フェルグナーら（1987）上記）。別の提案は、カチオン性リポソームがエンドサイトーシス経路を経てＤＮＡを細胞へ運んだというものである（ゾウおよびフアング（1994）上記）。
本発明の遺伝子移送法では、リポソームと組み合わせたトランスフェリンは、細胞内へのＤＮＡの浸入を、トランスフェリンなしのリポソームの場合の２倍のレベルで促進する。作用の理論の如何なるものにも縛られることを望まないが、高効率遺伝子移送は図４に図示したように「リポフェクチン」−ＤＮＡ−トランスフェリン複合体Ｂにより媒介されるものと信じられる。図４に例示した効率的遺伝子移送複合体および非効率的遺伝子移送複合体の形成に対して提案したスキームは以下の観察に基づいている。
１）「リポフェクチン」はＤＮＡなどのポリヌクレオチドと荷電−荷電相互作用により複合体を容易に形成し、そしてこの相互作用は電気泳動条件でも生き延びる程に十分に強力である。H.ガーション、R.ギルランド、S.B.ガットマン、およびA.ミンスキー（1993）「トランスフェクションに使用されるＤＮＡ−カチオン性リポソーム複合体の形成様式および構造的特性」Biochemistry 32, 7143-7151はＤＮＡと「リポフェクチン」との相互作用により、図4の複合体Ｃで図示したように、相関したリピド融合とＤＮＡ崩壊の結果として、凝集構造の形成をもたらすと報告している。凝集構造の露出した表面は伸展したＤＮＡ分子の構造よりもかなり小さい。
２）セファロース４Ｂクロマトグラフィーにより証明されたように、ＤＮＡはトランスフェリンと複合体を形成することができる（図３Ｄを参照）。トランスフェリンは等電点５．９を持つ両性電解質であるから、ｐＨ７．４ではトランスフェリン中に少数の陽性に荷電した基が存在しこれがこの相互作用の原因であると言えよう。アガロースゲル電気泳動中でのＤＮＡの移動度を遅らせることにトランスフェリンが失敗したことも、ＤＮＡとトランスフェリンの間の結合が非常に強いものではないという認識を支持するものである。
３）「リポフェクチン」は生理学的ｐＨでおそらくトランスフェリン中の負に荷電した基を介してトランスフェリンと弱く結合する（図３Ｃ）。この相互作用はセファロース４Ｂクロマトグラフィーで採用される条件下で「リポフェクチン」−トランスフェリン複合体を生き延びさせる程に十分に強いものではないと言えよう。しかしながら、この相互作用はトランスフェリンがＤＮＡとの結合から「リポフェクチン」の陽性に荷電した基を部分的に遮蔽し、そして同時にＤＮＡを「リポフェクチン」とトランスフェリンに結合させることができる程には十分に強いと言えよう。その結果、効率的な遺伝子移送複合体が形成される（図４、複合体Ｂ）。
４）「リポフェクチン」をＤＮＡと接触させた後、ａ）トランスフェリン、ｂ）ＤＮＡとトランスフェリンを同時に添加、またはｃ）予め形成させたＤＮＡ−トランスフェリン複合体と接触させることにより調製したトランスフェクション試薬は、すべて低いトランスフェクション効率を有する。これらの観察は図４（複合体Ｃ）に図示したような非効率的な遺伝子移送複合体の形成の結果であると言えよう。三つの成分のすべてが存在するとき、「リポフェクチン」−ＤＮＡ複合体が他の複合体の形成に先立って形成され、これが非効率的な遺伝子移送複合体の形成をもたらすのである。
細胞へのＤＮＡの浸入を促進する役割に加えて、トランスフェリンは遺伝子発現プロセスの他の段階で重要な役割を果たすことができる。例えば、「リポフェクチン」−ＤＮＡ−トランスフェリン−トランスフェリン受容体・複合体の内部浸入の後、トランスフェリンはエンドソームからＤＮＡが脱出するのを促進することができる。エンドソームからの脱出はトランスフェリンとその受容体の複合体にとって正常な生理的プロセスであるから（ヒューブナー（1987）上記、アイセン（1994）上記）、エンドソーム内に捕捉されたＤＮＡはトランスフェリンとその受容体の複合体の後についていくことにより、おそらくは傍観者効果により脱出するものであると言えよう。トランスフェリンによるトランスフェクション効率の増大がこの傍観者効果の結果であるのかあるいは他のメカニズムによる結果であるのかは解明されずに残されている。このメカニズムはインスリンなどの他の細胞受容体リガンドでも同様に機能すると言えよう。
「リポフェクチン」およびトランスフェリンについて図４に例示したスキームは一般的なものであり、インスリン、コレラ毒素およびＫＮＯＢペプチドおよびすべてのモノ−またはポリカチオン性リポソームフォーミュレーションなどを含む如何なる受容体リガンドにも適用することができる。そして特に、トランスフェリンと「リポフェクテース」フォーミュレーションおよびＤＣ−コレステロールカチオン性リポソームにも適用することができる。
本発明の高効率遺伝子移送法は、特にモノカチオン性リピドである「リポフェクチン」または「リポフェクテース」が受容体リガンドと組み合わせて使用されるとき、幾つかの利点を提供する。このトランスフェクション試薬は調製するのが容易であり、幾つかの場合には活性成分のすべてが市販されている。一つの動物起源から調製されるリガンドは同じ動物種の遺伝子治療に使用することができる。こうして、ベクターに対する宿主の免疫反応を防止することができる。宿主の炎症反応や免疫反応はアデノウイルスベクターを用いるヒト遺伝子治療の主要な欠点となってきた。（ギンスバーグら（1991）上記、トラプネルら（1994）上記、ヤングら（1994）上記、イエイら（1994）上記）。ヒトの肺における最近のリポソーム毒性研究によれば、リポソームは宿主の炎症反応や免疫反応を極く僅かしかあるいは全く惹起しないようであることが示された（D.A.トーマス、M.A.マイヤース、B.ウイチェルト、H.シュライヤー、およびR.J.ゴンザレス（1991）「健康なヒトボランティアの肺機能に対するリポソームエアロゾル吸入の急性の効果」Chest. 99, 1268-1270）そして幾つかの動物種（R. ストリブリング、E.ブルーネット、D.リギット、K.ゲンスラー、およびR.デブス（1992）「インビボにおけるエアロゾル遺伝子送達」Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 11277-11281、E.W.F.W.アルトン、O.G.ミドルトン、N.J.キャプレン、S.N.スミス、D.M.スティール、F.M.ムンコンゲ、P.K.ジェフリー、D.M.ゲッデス、S.L.ハート、R.ウイリアムソン、K.I.ファソールド、A.D,ミラー、P.ディッキンソン、B.J.スティーブンソン、G.マックラハラン、J.R.ドリン、およびD.J.ポーティアス（1993）「非侵襲的リポソーム媒介遺伝子送達は嚢胞性繊維症突然変移マウスのイオン移送欠陥を修正することができる」Nature Genetics, 5, 135-142、A,E.カノニコ、J.D.プリトマン、J.T.コナリ、B.O.メイリック、およびK.L.ブライアム（1994）「プラスミド−カチオン性リポソーム複合体のエアロゾルまたは静脈による反復送達後の肺毒性は見られない」J. Appl. Physiol., 77, 415-419、H. サン、Z.-Y. ヤング、V.J.ポムピリ、M.L.ジャッフェ、G.E.プラウツ、L.ズー、J.H.フェルグナー、C.J.ホイーラー、P.L.フェルグナー、X.ガオ、L.フアング、D.ゴードン、G.J.ナーベル、およびE.G.ナーベル（1993）「ヒト遺伝子治療用の新規なカチオン性リピドの安全性および短期毒性」Hum. Gene Ther. 4, 781-788。）
カチオン性リポソームと組み合わせてヒトトランスフェリンまたは他のヒトリガンドを利用すれば、ヒトにおける高い遺伝子移送効率を達成しながら宿主の免疫反応を避けることができる。
トランスフェリンで示されたトランスフェクション効率の増大はカチオン性リポソームが異なれば相違を生ずる。表４に示すように、トランスフェリンは「リポフェクチン」および「リポフェクテース」リポソームフォーミュレーションを用いるトランスフェクションを有意に（青色細胞の％またはβ−Ｇａｌ活性の１０倍以上）増大させる。増大はＤＣ−コレステロールリポソームでも観察されるが、ポリカチオン性リピドＤＯＳＰＡを含む「リポフェクタミン」では測定できる程の増大は観察されなかった。
１９９０年に発行された米国特許第４，８９７，３５５号（エプシュタインら）は、ＤＯＴＭＡに構造が関連しているカチオン性リピドを開示している。その中に開示されたカチオン性リピドおよび代表的な中性リピドは本発明のカチオン性リポソームフォーミュレーションに有用である。
ＤＤＡＢはモノカチオン性リピドであるジメチル  ジオクタデシルアンモニウム  ブロマイドである。米国特許第５，２７９，８３３号およびＷＯ９１／１５５０１号（ＤＤＡＢおよび関連するカチオン性リピドについては１９９１年１０月１７日に発行された）を参照のこと。関連するカチオン性リピド、例えば、オクタデシル基が他の高級なアルキル基（８以上の炭素原子を持つアルキル基）で置換されているもの、メチル基が他の低級アルキル基（１から約３個の炭素原子を持つもの）で置換されているもの、または臭素アニオンが別のアニオンで置換されているものは本発明のカチオン性リポソームフォーミュレーションに有用である。
A.シンガルおよびL.フアング（1994）「リポソームによる遺伝子の直接移送」J. Liposome Res. 4（1）: 289-299）はカチオン性リポソームの調製に有用なコレステロールのカチオン性誘導体を記述する。第三級アミノ基がアミド結合またはカルバモイル結合でリピドアンカーに結合しており、そして3〜6原子のスペーサーにより隔てられているコレステロール誘導体は、高いトランスフェクション効率、長い使用期間そして低毒性を持つリポソームを調製するのに使用することができる。X.ガオおよびL.フアング（1991）「哺乳類細胞の効率的なトランスフェクションのための新規なカチオン性リポソーム試薬」Biochem. Biophys. Res. Commun. 179: 280-285、H.ファーフード、R.ボッテガ、R.M.エパンドおよびL.フアング（1992）「遺伝子移送に対するカチオン性コレステロール誘導体の影響およびプロテインキナーゼＣ活性」Biochem. Biophys. Acta 1111: 239-246をも参照のこと。ＤＣ−コレステロールは誘導体化されたコレステロール、すなわち、３β−〔Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル〕コレステロールである。ＤＣ−コレステロールリポソームは中性リピド、例えば、ＤＯＰＥとカチオン性リピドを結合させることにより調製される。
「リポフェクタミン」はポリカチオン性リピドである２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−〔２−（スペルミンカルボキサミド）エチル〕−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロ酢酸（ＤＯＳＰＡ）とＤＯＰＥの３：１のリポソームフォーミュレーションである。米国特許第５，３３４，７６１号を参照のこと。
「セルフェクチン」（商標）は市販されているカチオン性リポソームフォーミュレーションで、ポリカチオン性リピドＮ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ’”−テトラパルミチルスペルミン（ＴＭ−ＴＰＳ）とＤＯＰＥの１：１．５（ｗ／ｗ）のフォーミュレーションのリポソームである。本発明で有用なＴＭ−ＴＰＳと関連するポリカチオン性リピドはＷＯ９５／１７３７３号（１９９５年６月２９日発行）に記述されている。
１９９４年２月１１日に出願された（ゲベイェフら）米国特許出願第０８／１９５，８６６号は本発明の方法に有用な他のカチオン性リピドを開示する。この中に開示されたウレタン誘導体が特に興味深い。
米国特許第５，２６４，６１８号はＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレオイロキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパンなどのカチオン性リピドを開示する。これらのリピドはオレオイル部分がエーテル結合ではなくエステル結合でプロピルアミンに連結している点でＤＯＴＭＡとは異なっている。ＤＯＴＭＡおよびＤＯＴＡＰに構造上関連している一群のカチオン性リピドはトリメチルアンモニウム基のメチル基の一つがヒドロキシエチル基で置換されているものである。このタイプの化合物はプロピルアミン核に連結したステアロイルエステルを有するホスホリパーゼＡのローゼンタールインヒビター（ＲＩ）（A.F.ローゼンタールおよびR.P.ゲイヤー（1960）J. Biol. Chem. 235: 2202-2206）に類似している。ＲＩのジオレオイルアナログはプロピルアミン核への脂肪酸部分の結合によりＤＯＲＩ−エーテルまはたＤＯＲＩ−エステルと普通に呼ばれている。このようなアナログのヒドロキシエチル基も例えばエステル化によりさらに官能基化することができる。ＤＯＴＭＡに構造上関連のあるこれらのカチオン性リピドはすべて本発明のカチオン性リポソームフォーミュレーションに有用である。本発明のリポソームフォーミュレーションに有用な別のカチオン性リピドは１，２−ジミリスチロキシプロパノール−３，３−ジメチルヒドロキシメチルアンモニウムブロマイドであり、これはしばしば頭字語でＤＭＲＩＥと呼ばれる。
本明細書で特記するように、この遺伝子移送法は一般に如何なる受容体リガンドにも適用することができる。コッテンとワグナー（1993）上記は、遺伝子治療への非ウイルス的アプローチに関する総説において、その表１で、受容体により媒介される遺伝子送達において複合体形成のための受容体リガンドとして有用な化合物の網羅的ではないリストを提供する。個々のリガンドの特性はそこに引用されている参考文献に記載されている。細胞を標的化するための受容体リガンドの他の実例は本明細書に引用されている他の参考文献に記載されている。本発明の増強されたトランスフェクションはトランスフェリン、インスリンおよびコレラ毒素を受容体リガンドとして用いて証明された。コッテンとワグナー（1993）の文献および本明細書で引用された他の参考文献に記述されたリガンドもすべて本発明で記述されたようにリガンドの共有結合なしにトランスフェクションの増強のために機能することができる。従って、この遺伝子移送プロトコルは細胞表面の受容体に結合して内部に取り込まれることができるリガンドに一般的に適用することができる。
本明細書で提供される具体的実施例は受容体により促進されるリポソームトランスフェクションにより細胞に送達されるＤＮＡの一過性の発現を示す。β−ガラクトシダーゼを発現したトランスフェクト細胞の集団を検出できなかったことは、このトランスフェクション作用剤を用いることにより得られる高効率遺伝子移送にもかかわらず、宿主ゲノム中へのプラスミドＤＮＡの組み込みがなお稀な現象であることを示唆する。受容体リガンドにより促進される本発明の遺伝子移送プロトコルは、宿主ゲノムＤＮＡ内への核酸、例えばＤＮＡの組み込みを達成するとして知られた如何なる技法にも使用することができる。
本発明の方法は、細胞内に導入された核酸、例えばＤＮＡの発現を増強するための既知の方法すべてにおいて使用することができる。例えば、リポソーム中の核タンパクとＤＮＡを共導入することがＤＮＡの発現の増大をもたらすことができる。Y.カネダ、K.イワイおよびT.ウチダ（1989）「成熟ラット肝における核タンパクと共導入されたＤＮＡの発現の増大」Science 243: 375-378、Y.カネダ、K.イワイおよびT.ウチダ（1989）「成熟ラット肝におけるヒトインスリン遺伝子の導入と発現」J. Biol. Chem. 264（21）: 12126-12129。非−ヒストン染色体タンパク、高移動グループ１（ＨＭＧ−１）などの核タンパクは細胞核へのＤＮＡの送達を促進しこうして発現を増強すると信じられている。本発明の方法は発現のさらなる増強を達成するためＤＮＡと核タンパクの共導入を採用することができる。
当分野で通常の技術を有する者は、本発明のトランスフェクション作用剤の調製の詳細およびトランスフェクションプロトコルの詳細は、所与の受容体リガンド、カチオン性リピド／中性リピドリポソームフォーミュレーション、核酸および標的細胞型に対して最適トランスフェクション効率および最適遺伝子発現を達成するために日常的に変更することができることを認めるはずである。このような日常的な最適化は本発明の精神および範囲の中に含まれる。
当分野で通常の技術を有する者は、本明細書で具体的に例示されたもの以外の受容体リガンド、カチオン性リピド、および中性リピドも本発明の組成物および方法において本明細書の記述に照らして使用することができることをも認めるはずである。
本発明のトランスフェリン−カチオン性リポソームプロトコルは細胞内への核酸の導入における使用について記述した。本発明のトランスフェリン−カチオン性リポソームのプロトコルは、本開示および本技法および当分野でよく知られた方法を参照することにより、遺伝子だけでなく薬物やタンパクを細胞内に導入するためも容易に適合させることができる。ワグナーら（1994）上記は受容体により媒介されるエンドサイトーシスを用いる多様な化合物の送達の総説である。
本明細書に引用された学術雑誌、特許、および特許出願はすべて、それらの全体が参照により本明細書にインコーポレートされる。引用された参考文献は、とりわけカチオン性リポソームの調製に有用な様々なカチオン性リピドおよび中性リピドの構造の詳細、リポソームおよびリポソームフォーミュレーションを調製する方法、細胞表面受容体リガンドを単離する方法またはかかるリガンドの他の調製法を含む受容体リガンドの起源、細胞生育条件の記述、標的化されたトランスフェクションのための受容体リガンドの使用の詳細およびトランスフェクション作用剤および方法のイン・ビトロおよびイン・ビボ適用の記述を提供する。
下記の実施例は本発明を例示するものであり、本発明の範囲を制限する意図を持つものでは決してない。
実施例
実施例  １：「リポフェクチン」およびトランスフェリンを用いるヒーラ細胞のトランスフェクション
方法：
「リポフェクチン」とＤＮＡの最適割合の決定
最初のアガロースゲル電気泳動は、「リポフェクチン」とＤＮＡの最適割合を決定するために、ＤＮＡ（ｐＣＭＶｌａｃＺ）（クロンテック  ラボ，インク．Palo Alto, CA）の固定量（1.5μｇ）に対して「リポフェクチン」（商標）（ギブコ／ＢＲＬ、Gaithersburg, MD）の量を変えた（０．５〜１０μｇ）混合物について実施した。アガロースゲル中のＤＮＡをエチジウムブロマイドで染色し、紫外線の下で可視化した。「リポフェクチン」と複合体を形成するとき、ＤＮＡはゲルの中に入らない。１．５μｇのＤＮＡと２〜３２μｇのトランスフェリンの混合物を分析することによりトランスフェリンがＤＮＡの移動度を遅らせ得るか否かを評価するため、同じアガロースゲル電気泳動の手順を用いた。
セファロース４Ｂクロマトグラフィー：
トランスフェリンが「リポフェクチン」−ＤＮＡ複合体とコンプレックスを作るか否かを評価するため、１００μｌのヘペス−緩衝化食塩水（ＨＢＳ）（２０ｍＭヘペス、ｐＨ７．４および１００ｍＭのＮａＣｌ）中に３２μｇの〔125Ｉ〕トランスフェリン（７×１０4ｃｐｍ）を含むトランスフェクション溶液（５００μｌ）、３μｇの「リポフェクチン」、１．５μｇのｐＣＭＶｌａｃＺ、および３００μｌのＤＭＥＭ−Ｈ（ギブコ／ＢＲＬ）をセファロース４Ｂカラム（１×１２ｃｍ）にかけた。トランスフェリン、「リポフェクチン」、およびＤＮＡの添加の順序は具体的実験プロトコルにより変動させる。この混合物を穏和に混合し、次いで各試薬の添加後１５分間インキュベートした。次に、カラムをＨＢＳで展開し、０．５ｍｌの画分を集め、ｃ−カウンターで放射活性を測定した。「リポフェクチン」はボイドボリューム（３ｍｌ）で溶出し、結合していない〔125Ｉ〕トランスフェリンは８．４〜９．０ｍｌの溶出ボリュームで溶出した。ＤＮＡ−「リポフェクチン」−トランスフェリン複合体およびＤＮＡ−トランスフェリン複合体はボイドボリュームに現れた。
遺伝子移送プロトコル：
１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭ−Ｈ培地中、４８穴培養プレート中でコンフルエンスまで生育させたヒーラ細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー、Rockville, MD）を無血清のＤＭＥＭ−Ｈで２回リンスした。次いで、これらの細胞を以下に記すように調製されたトランスフェクション溶液５００μｌに接触させた。１２×７５ｍｍのポリスチレン管（ベクトン・ディッキンソン、Lincoln Park, NJ）に下記の試薬を順次添加し、穏和に混合し、そしてそれぞれの添加後に室温で１５分間インキュベートした。すなわち、予め定められた量の新たに調製されたヒトトランスフェリン（鉄−飽和、熱不活性化されたもの）（コラボラティブ・バイオケミカル・プロダクツ、ベクトン・ディッキンソン，Bedford, MA）（通常の実験では３２μｇ）、３μｌの「リポフェクチン」（１ｍｇ／ｍｌ）、および１．５μｇのｐＣＭＶｌａｃＺを含む１００μｌのＨＢＳ。この混合物を抗生物質なし無血清のＤＭＥＭ−Ｈの３００μｌで覆われた穴それぞれに移し、次いで穏和に混合した。このプレートを水飽和環境および５％ＣＯ2の下で予め定められた時間（通常は１８〜２４時間）インキュベートした。「リポフェクチン」−ＤＮＡに接触させた対応する培養を対照として用いた。他の二つの対照はＤＮＡおよびＤＮＡ＋トランスフェリンを含んでいた。次いで、コンディション化された培地を、１０％ＦＢＳと抗生物質（５０Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン）を含むＤＭＥＭ−Ｈの１．０ｍｌで置換した。４８時間培養した後、コンディション化培地を除去後、３個の穴中の細胞を氷冷２％パラフォルムアルデヒド−０．２０％グルタルアルデヒドの３００μｌ中で１０分間固定し、ＰＢＳで２回洗浄した。次いで、固定液を除去した後、この細胞を１．０ｍｇ／ｍｌの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ）（ギブコ／ＢＲＬ）（イインおよびチェング（1994）「エアウエー上皮細胞へのレクチン複合体により指令される遺伝子移送」Biochem. Biophys. Res. Commun. 205: 826-833）の０．５ｍｌと３７℃で２日間接触させ、そしてＰＢＳで２回リンスした。位相差顕微鏡の下で無差別に選ばれた視野の２０〜３０中の細胞、総数２５００〜３０００個から青色細胞の数を数えることにより青色細胞のパーセンテージを測定した。３個の他の穴中の細胞をＰＢＳで３回リンスし、トリプシン消化によりばらばらにし、ＰＢＳで３回リンスし、次いで凍結融解のサイクルを３回行って溶解した。これらの溶解物についてβ−ガラクトシダーゼ活性をルマートＬＢ９５０１分光蛍光計（ＥＧ＆Ｇバートホールド、Nashua, NH）測定し光単位で表した（ビールら（1992）「大腸菌β−ガラクトシダーゼの迅速かつ簡易な化学発光検定法」Biotechniques 120: 320-324）、そしてタンパク（ブラドフォード試薬、バイオラド、Melville, NY）についてはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を標準として用いて測定した。データはμｇタンパク当たりの光ユニットとして表した。
ヒーラ細胞への35Ｓ−ｐＣＭＶｌａｃＺの移送：
35Ｓ−標識ｐＣＭＶｌａｃＺはＥｃｏＲＩ消化により線型化した後、無差別プライミング（ベーリンガー−マンハイム、Indianapolis,IN）により調製された。４種のトランスフェクション溶液、ＤＮＡ、ＤＮＡ＋トランスフェリン（３２μｇ）、ＤＮＡ＋「リポフェクチン」（３μｇ）、およびＤＮＡ＋「リポフェクチン」＋トランスフェリンはそれぞれ１．５μｇの35Ｓ−標識ｐＣＭＶｌａｃＺ（１．４×１０4ｃｐｍ）を含んでいた。トランスフェクション後０、０．５、１、３、６、および２４時間で、培地を除去した。次いで、細胞を１ｍｌのＨＢＳで１回洗浄し、トリプシン消化により回収し、そして１．５ｍｌのＨＢＳで２回洗浄した。ペレット状の細胞を６０μｌの蒸留水に懸濁し、凍結融解を３回行って破砕した。その一部を採り、放射活性とタンパク量を測定した。データはｃｐｍ／ｍｇタンパクとして表した。
他の方法：
ｐＣＭＶｌａｃＺは、キアゲン・プラスミド単離キット（チャツワース，CA）を用いて、このプラスミドＤＮＡを保持する大腸菌から精製した。〔125Ｉ〕トランスフェリンは以下に記述するようにクロラミン−Ｔ法により調製した。１００μｇのトランスフェリンを含む１００μｌのＨＢＳに、５μｌの１００ｍＣｉ／ｍｌＮａ 125Ｉ（アマシャム、Arlington Hts., IL）と５μｌの２ｍｇ／ｍｌクロラミンＴ（イーストマン・コダック・カンパニー、Rochester, NY）を添加した。20〜30秒インキュベートした後、5μｌのピロ亜硫酸ナトリウム（シグマ、St. Louis, MO）を添加して反応を止めた。セファデックスＧ−２５（０．５×４ｃｍ）上で〔125Ｉ〕トランスフェリンを単離した。
統計的分析：
統計的分析はトゥーテイルド、アンペアード（two-tailed, unpaired）ｔ−テスト・プログラム（GaphPAD InPlot Software、San Diego, CA）により行った。
結果：
トランスフェクション時間の関数としての遺伝子移送効率：
０．５〜２４時間の種々の時間、トランスフェリン、「リポフェクチン」、およびｐＣＭＶｌａｃＺからなるトランスフェクション溶液にヒーラ細胞を接触させると、β−ガラクトシダーゼ活性および青色細胞のパーセンテージの両方から評価されるように、β−ガラクトシダーゼの発現の増加を生じた（表１）。トランスフェリン、「リポフェクチン」、およびＤＮＡから調製される試薬でトランスフェクトされた細胞のβ−ガラクトシダーゼ活性が対照のそれの２．５倍の増加を示すことが（ｐ＝０．０００５）、０．５時間の接触の後に観察されたが、この時点での青色細胞のパーセンテージはこの両者間で異なることはなかった。１時間の接触により、β−ガラクトシダーゼ活性の１３倍の増加と３０％の青色細胞を生じた。５時間の接触の後に、本質的にすべての細胞がトランスフェクトされた。同様に、β−ガラクトシダーゼ活性は５時間までは着実に増加しそしてその後は水平になった。定形的な遺伝子移送実験には、β−ガラクトシダーゼ活性の発現を最大にするため、一晩のトランスフェクションが選ばれた。ＤＮＡまたはＤＮＡ＋トランスフェリンを用いた他の対照では、トランスフェクトされた細胞は０．０１％よりも少なかった。
トランスフェリンの量の関数としてのトランスフェクション効率:
トランスフェリン、「リポフェクチン」、およびＤＮＡの混合物で得られたトランスフェクション効率は使用したトランスフェリンの量に左右された。表２に示すように、トランスフェクトされた細胞のパーセンテージとトランスフェクトされた細胞中で発現したβ−ガラクトシダーゼ活性は３μｇ以上のトランスフェリンが用いられたときに増加した。さらに、使用したトランスフェリンの量が８μｇに達しそしてそれ以上のときは、少なくとも９７％のヒーラ細胞がトランスフェクトされた。しかしながら、β−ガラクトシダーゼ活性の最大発現は１６μｇのトランスフェリンが使用されるまでは得られなかった。
トランスフェクトされたレポーター遺伝子の継代の数の関数としての発現：
「リポフェクチン」＋トランスフェリンにより媒介されるヒーラ細胞の高トランスフェクション効率のため、送達されるレポーター遺伝子の発現が何回の継代まで維持されるかという疑問を検討するための素晴らしい機会が与えられた。図１および表３に示すように、１回の継代後の７０％から６回の継代の後の０．０１％未満まで青色に染色されたトランスフェクト細胞のパーセンテージは次第に減少した。継代数の関数としてのβ−ガラクトシダーゼ活性の漸進的減少も観察された。
トランスフェクション作用剤の特性決定：
ＤＮＡの固定量（１．５μｇ）と種々の量の「リポフェクチン」（０．５〜１０μｇ）を含む混合物のアガロースゲル電気泳動により、「リポフェクチン」が少なくともＤＮＡ量の２〜３倍（ｗ／ｗ）であったときは、全てのＤＮＡが「リポフェクチン」とコンプレックスを形成することが示された。この結果は４８穴プレートの穴それぞれに３μｇの「リポフェクチン」と１．５μｇのＤＮＡを用いるという実験プロトコルの基礎となった。
観察されたβ−ガラクトシダーゼの発現の増加がＤＮＡの移送の増加の結果か否かを評価するため、〔35Ｓ〕ＤＮＡを用いる遺伝子移送実験を行った。図２に示すように、「リポフェクチン」の非存在下では、トランスフェリンはＤＮＡ単独での移送を越えてＤＮＡ移送を増加させることはなかった。「リポフェクチン」−ＤＮＡ複合体により移送されるＤＮＡの最大量はＤＮＡ単独の移送よりも少なくとも２倍であった。ＤＮＡの添加前にトランスフェリンを「リポフェクチン」とインキュベートすると、「リポフェクチン」−ＤＮＡ複合体により送達されるＤＮＡ量の２倍となった。２４時間までに、トランスフェリン、「リポフェクチン」、およびＤＮＡの順次添加により調製された試薬を用いてトランスフェクトされた細胞内で見出されるＤＮＡの量は４０％だけ減少した。
トランスフェクション溶液内の異なる成分間の相互作用を評価するため、セファロース４Ｂカラムクロマトグラフィーを行った。３２μｇの〔125Ｉ〕トランスフェリン、３μｇの「リポフェクチン」、および１．５μｇのＤＮＡの順次添加により調製されるトランスフェクション溶液の分析から、総放射活性の６．８％がボイドボリューム中に溶出された（図３Ａ）。この溶液がＤＮＡ、「リポフェクチン」、その後に〔125Ｉ〕トランスフェリンの順序で調製されたときは、ボイドボリューム中に放射活性は検出されなかった（図３Ｂ）。同様にして調製された試薬を用いたトランスフェクション効率（３．２％）は「リポフェクチン」＋ＤＮＡでトランスフェクトすることにより得られた対照の値（３．９％）と異ならなかった。〔125Ｉ〕トランスフェリンと「リポフェクチン」の混合物を分析すると、放射活性の少量しか（０．２％）ボイドボリューム中に検出されなかった（図３Ｃ）。さらに、〔125Ｉ〕トランスフェリンをＤＮＡと混合すると、放射活性の６．８％がボイドボリューム中にも見出された（図３Ｄ）。トランスフェリン＋ＤＮＡを用いるトランスフェクション効率（２．８％）は対照と同じであった（データは示していない）。さらに、１．５μｇのＤＮＡへ２〜３２μｇのトランスフェリンを添加しても、アガロースゲル電気泳動上のＤＮＡの移動度およびバンド強度は減少しなかった。
トランスフェリンにより促進されるｐＣＭＶｌａｃＺのトランスフェクション効率のカチオン性リポソームの種類による変動：
ヒーラ細胞におけるトランスフェリンにより促進される遺伝子移送のトランスフェクション効率は用いるカチオン性リポソームが異なれば変動した。表４に示すように、「リポフェクチン」は検討した４種のカチオン性リポソームの中で最も効果的なリポソームであった。これに続いたのは「リポフェクテース」、次いでＤＣ−コレステロールであった。「リポフェクタミン」は表４にリストした結果では増強を示さなかった。しかしながら、「リポフェクタミン」を用いる実験は、その結果が表４にリストされているが、本発明の方法におけるカチオン性リポソーム成分としての「リポフェクタミン」の有用性を正確に反映しているとは言えないかも知れない。「リポフェクタミン」だけがヒーラ細胞内へのかなり効率的なトランスフェクション作用剤であると一般に知られている。ＤＮＡの４０％というトランスフェクション効率が「リポフェクタミン」単独で日常的に観察されている。P.ホーリー−ネルソンら（1993）FOCUS 15: 73を参照のこと。「リポフェクタミン」単独に対し表４の実験で観察された青色細胞のパーセンテージは、通常予想されるよりも有意に低いようにみえる。このことはトランスフェクション実験における問題が幾つかあることを示唆する。
実施例２：  ＣＦＴ１細胞の塩素移送異常のトランスフェリンにより促進されるカチオン性リポソーム媒介の遺伝子移送による修正
４８穴プレートでコンフルーエンスまで生育させたＣＴＦ１細胞を、「リポフェクチン」、ＤＮＡ、およびトランスフェリンを含むトランスフェクション溶液に２４時間接触させた。
このトランスフェクション溶液は実施例１の場合と同様に調製された。具体的には、トランスフェリンを「リポフェクチン」に添加し、この混合液を室温で約１５分間インキュベートした。その後、ＤＮＡを添加し、この混合液を室温で１５分間再度インキュベートした。
トランスフェクトされた細胞をさらに２〜３日培養し、その後グルタルアルデヒドで固定し、次いでＸ−Ｇａｌで２〜３日発色させた。トランスフェクション効率（青色細胞の％）はトランスフェリンの濃度（μｇ／トランスフェクション溶液０．５ｍｌ）に依存した、すなわち、０μｇ，０．１％、１μｇ，０．４％、２μｇ，５．５％、４μｇ，７％、８μｇ，８％、１６μｇ，１０％、および３２μｇ，１１％であった。ルミガル法（Lumigal method）で測定したβ−ガラクトシダーゼ活性も同じ傾向を示した（図５を参照）。３５ｍｍ皿中で生育したＣＦＴ１細胞にｐＣＭＶｌａｃＺを送達するのに最高のトランスフェクション効率を生じたプロトコルを用いて、３３％のトランスフェクション効率が得られた。このプロトコルを用いてｐＣＭＶＣＦＴＲでトランスフェクトされたＣＦＴ１細胞は、トランスフェリンなしの「リポフェクチン」でトランスフェクトしたＣＦＴ１細胞あるいはトランスフェクションなしのＣＦＴ１細胞よりも35Cl-流出の速度がより大きいことを示した（図６を参照）。これらの結果は、トランスフェリンにより促進されリポソームにより媒介されるＣＦＴＲ遺伝子移送がＣＦエアウエー上皮細胞の塩素移送異常を修正することができることを示すものである。塩素移送異常の有意の修正は、「リポフェクチン」と共にインスリンまたはコレラ毒素がトランスフェクションに用いられたときに観察された。（図７参照。）
方法：
トランスフェクションプロトコルおよびトランスフェクション効率の測定：
４８穴プレートにコンフルーエンスまで生育したＣＦＴ１細胞を、３μｇの「リポフェクチン」、１．５μｇのＤＮＡ、および１〜３２μｇのトランスフェリンを含むトランスフェクション溶液（０．５ｍｌ）に一晩接触させた。次いで、トランスフェクトされた細胞を７個の異なるホルモンおよび成長因子を補足したＦ−１２培地中で２〜３日間培養した。次いで、２個の穴の細胞を４％パラホルムアルデヒド中、4℃で１０分間固定し、２〜３日間Ｘ−Ｇａｌと接触させた。トランスフェクション効率は位相差顕微鏡の下でカウントされた細胞１００個当たりの青色細胞の数により決定した。３個の他の穴の細胞はトリプシン処理により回収し、そのホモジネートについてルミガル法（ビールら（1992）上記）によりβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。データはタンパクμｇ当たりの光ユニットとして表した。図５を参照。
36Ｃｌ-−流出検定：
ＣＴＦ１細胞を６穴プレート中でコンフルーエンスまで生育させた。一つの穴の細胞を「リポフェクチン」およびｐＣＭＶＣＦＴＲ＋トランスフェリンで処理し、そして２個の他の穴の細胞を上記のように「リポフェクチン」およびｐＣＭＶｌａｃＺ＋トランスフェリンで処理した。最初の２個の穴は36Cl-流出について測定し、第３の穴は固定してＸ−Ｇａｌで処理し、青色細胞の％を測定した。最初の２個の穴は５〜１０μＣｉの36Ｃｌ-で負荷をかけ、その後直ぐにＣｌ-を含まない培地でリンスした。次いで、同位元素およびＣｌ-の両方を含まない培地＋０．１ｍＭのアミロライド（amiloride）の１ｍｌを添加し、１分間隔で１０分まで採取した。３分の時点でｃＡＭＰにより媒介されるＣｌ-透過性を評価するため１０μＭのフォースコリン（forskolin）を添加した。１０分の終点で、細胞の０．１％ＳＤＳ抽出物について細胞に含まれる同位元素を測定した。データは、残存する36Ｃｌ-のパーセンテージを時間の関数としてプロットすることにより分析した。図６を参照のこと。
36Ｃｌ-−インスリンまたはコレラ毒素を用いるトランスフェクション：
６×３５ｍｍプレートの各穴のコンフルエントＣＦＴ１細胞に１８μｇのｐＣＭＶＣＦＴＲを送達するため、３６μｇの「リポフェクチン」＋３８０μｇのトランスフェリン、０．２ｍｇのインスリン、または１６０μｇのコレラ毒素を含むトランスフェクション溶液６ｍｌを用いて、塩素移送異常の有意の修正が観察された（図７）。１８μｇのｐＣＭＶｌａｃＺをＣＦＴ１細胞に送達するため同一のプロトコルを用いて同時に行われた実験では、顕著な数の細胞が青色に染まるという結果が得られた、すなわち、「リポフェクチン」，０．５％、「リポフェクチン」＋トランスフェリン，３３％、「リポフェクチン」＋インスリン，１３％、および「リポフェクチン」＋コレラ毒素，３１％である。これらの結果は野生型のＣＦＴＲのｃＤＮＡおよび受容体とカチオン性リポソームからなるトランスフェクションベクターを使用してＣＦエアウエー上皮細胞におけるｃＡＭＰ依存性の塩素コンダクタンスを回復させることが容易であることを証明する。
実施例３．インスリンおよびコレラ毒素により促進される、リポソーム媒介トランスフェクション．
トランスフェクション溶液は実施例１で記述したように調製した。ここで、受容体リガンドはインスリンまたはコレラ毒素であった。図８ａおよび８ｂは、それぞれヒーラ細胞およびＣＦＴ１細胞におけるインスリン濃度依存性のトランスフェクション効率を示す。図９ａおよび９ｂは、それぞれヒーラ細胞およびＣＣＦＴ１細胞におけるコレラ毒素濃度依存性のトランスフェクション効率を示す。トランスフェクションプロトコルはヒーラ細胞については実施例１に示すように、そしてＣＦＴ１細胞については実施例２に示すように行われた。
トランスフェクション効率は、３種の異なるリガンド（トランスフェリン、インスリンおよびコレラ毒素）の混合物を含む溶液でＣＦＴ１細胞をトランスフェクトしたときには増加しなかった。このことは一方の受容体リガンドの遺伝子トランスフェクションが他方のリガンドにより妨害されることを示唆する。
実施例４：  「リポフェクチン」により媒介される遺伝子移送を促進するヒト血清の成分
ヒト血清中のトランスフェリン濃度は約２．２〜３．７ｍｇ／ｍｌである。トランスフェリン受容体リガンドの代わりに５〜１０μｌの血清を使用することにより高いトランスフェクション効率が期待される。しかしながら、僅かなトランスフェクション効率しか観察されなかった。このことはトランスフェリンにより促進される遺伝子トランスフェクションがヒト血清の他の成分により妨害されることを示唆する。遺伝子移送の最大効率は、実施例１のプロトコルでトランスフェリンの代わりに０．０１μｌの血清が使用されるときに得られた（図１０）。
高トランスフェクション効率を生ずる別々の血清成分の特性を決定するため、ヒト血清試料をプロテインＡカラムにより分画して、ＩｇＧを枯渇させた（プロテインＡ−：通過）画分とＩｇＧを豊富化した（プロテインＡ＋：結合、そして低ｐＨで回収）画分に分けた。同じ血清試料をコンカナバリンＡカラムでも分画して、タンパクおよびマンノースフリーの糖タンパクを含む通過画分すなわちコンＡ−画分およびマンノース結合（コンＡ＋）糖タンパクを含むコンＡから回収された画分とに分けた。プロテインＡ画分のトランスフェクション効率は図１１ａに、そしてコンＡ画分のそれは図１１ｂに示してある。
０．０１μｌの血清で見出された高トランスフェクション効率の原因である成分（単数または複数）はプロテインＡ−画分およびコンＡ−画分に存在するようにみえるが、他の二つの画分には存在しないようである。これらの結果は一部のＩｇＧおよびマンノース含有糖タンパクが「リポフェクチン」により媒介される遺伝子移送を効率的に促進することができることを示している。１１〜３７μｇのトランスフェリン（このトランスフェリン濃度は８０％を越えるトランスフェクション効率を生ずるはずである）を含む量のプロテインＡ−画分を用いても低いトランスフェクション効率が観察されたのであるから、トランスフェリンにより促進される遺伝子移送を妨害する血清成分はプロテインＡ−画分に実質的に存在しておりコンＡ＋画分には存在していないと言える。
血清試料は１００および３０Ｋｄの分子量遮断を持つ遠心分離フィルターを用いてサイズによっても分画した。図１２に示すように、０．０１μｌ血清で得られた高トランスフェクション効率の原因である成分（単数または複数）は１００Ｋｄよりも大きな分子量を持つように見える。３０〜１００Ｋｄ画分および３０Ｋｄ未満の画分は両者共高トランスフェクション効率を生ずる化合物を含んでいる。８９Ｋｄの分子量を持つトランスフェリンは３０〜１００Ｋｄ画分により示される高効率遺伝子移送の少なくとも一部の原因となっている。さらに、Ｔｆにより促進される遺伝子移送を妨害する化合物は１００Ｋｄを越える画分に存在し、そして３０Ｋｄ未満の画分にも存在した。
表１．トランスフェリンおよびリポフェクチンに指令されるヒーラ細胞への遺伝子移送：トランスフェクション時間（０．５〜２４時間）の関数としての遺伝子移送効率。
詳細な実験プロトコルは実施例に記載されている。１６μｇのトランスフェリン、３μｇの「リポフェクチン」、および１．５μｇのｐＣＭＶｌａｃＺから調製された作用剤でトランスフェクションした後４８時間の培養期間の終わりに、３個の穴の細胞の溶解物について別々にルミガル法（ビールら，1992）でβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。β−ガラクトシダーゼ活性はμｇタンパク当たりの光ユニット（平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．）として表した。３個の他の穴のヒーラ細胞はＸ−Ｇａｌで染色し、青色細胞の％を測定した。
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表２．トランスフェリンおよびリポフェクチンにより指令されるヒーラ細胞への遺伝子移送：トランスフェリンの量（１〜３２μｇ）の関数としての遺伝子移送効率。
トランスフェクション溶液（５００μｌ）は３μｇの「リポフェクチン」、１．５μｇのｐＣＭＶｌａｃＺ、および示されたように変動するトランスフェリンの量を含んでいた。トランスフェクション時間は１８時間であった。実験プロトコルの詳細は実施例および表１に記載されている。
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表３．トランスフェリン、リポフェクチンおよびｐＣＭＶｌａｃＺで１００％トランスフェクトされたヒーラ細胞（Ｆ０）におけるおよび６回継代されたトランスフェクト細胞（Ｆ１からＦ６）におけるβ−ガラクトシダーゼの発現。
トランスフェクション溶液は３．０μｇのリポフェクチン、１６μｇのトランスフェリン、および１．５μｇのＤＮＡを含んでいた。トランスフェリンを含まぬ「リポフェクチン」＋ＤＮＡでトランスフェクトされた細胞を対照とした。トランスフェクション時間は１８時間であった。実験プロトコルは実施例および図１に記載してある。
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表４．異なるカチオン性リポソームを用いるヒーラ細胞でのトランスフェリンにより増強されたｐＣＭＶｌａｃＺのトランスフェクション効率。
実験プロトコルの詳細は表１および図１に記載されている。使用したトランスフェリンおよび４種の異なるカチオン性リポソームの量は、トランスフェリン，３２μｇ、「リポフェクチン」，３μｇ、「リポフェクテース」，４．２μｇ、「リポフェクタミン」，４μｇ、およびＤＣ−コレステロール，４ｎモル、であった。
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【図１Ａ】
0004512882.tif 000006
【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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