(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程(A)及び(B)を少なくとも含む、デアミノノイラミニダーゼの精製方法。
(A)デアミノノイラミニダーゼを含有する溶液と、下記式で示されるデアミノノイラミン酸誘導体がそのアミノ基で結合した不溶性担体とを接触させて、該不溶性担体にデアミノノイラミニダーゼを特異的に結合させる工程。
(B)該不溶性担体に結合したデアミノノイラミニダーゼを溶離する工程。
〔化１〕
0004544663.tif 000007
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、デアミノノイラミン酸誘導体、デアミノノイラミニダーゼの精製方法及びデアミノノイラミン酸結合性物質の検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
デアミノノイラミン酸（3-deoxy-D-glycero-D-galacto-nonulosonic acid、あるいは2-keto-3-deoxy-D-glycero-D-galacto-nononic acid；以下、「ＫＤＮ」ともいう）は、シアル酸の５位の炭素に結合するＮ−アシル基が水酸基に置き換わっている以外は、シアル酸と同一の構造をしている。これまでに、ＫＤＮはシアル酸と同様、複合糖質の構成成分として生物界に広く分布し、多様な存在様式をもつことが判明している。また、ＫＤＮはシアル酸と異なるユニークな性質をもち、ＫＤＮ含有複合糖質が受精時の卵−精子相互作用において重要な役割を果たすことなどが明らかにされてきており、ＫＤＮ含有糖タンパク質や糖脂質の構造や機能の解明には大きな興味がよせられている。
【０００３】
ＫＤＮを含有する複合糖質におけるＫＤＮケトシド結合を切断する酵素（デアミノノイラミニダーゼ；以下「ＫＤＮａｓｅ」ともいう）については、いくつかの報告がある。例えば、国際公開パンフレット第ＷＯ９６／００７８１号には、Ｎ−アシルノイラミニル結合を切断しない、すなわち、ＫＤＮケトシド結合を特異的に切断する酵素と考えられるＫＤＮａｓｅが記載されている。このＫＤＮａｓｅの厳格な基質特異性はＫＤＮ含有複合糖質の構造や機能を解明するのに有用である。
【０００４】
ＫＤＮａｓｅの精製方法としては、アフィニティクロマトグラフィーを利用した方法が報告されている。例えば、ＫＤＮ含有糖タンパク質をプロナーゼで分解して得たＫＤＮ含有糖ペプチド画分を結合させた担体を用いる方法（J. Biol. Chem., 269, 21415-21419 (1994)）が知られている。またノイラミニダーゼの精製方法としては、α−チオシアロシド(2-S-(2-aminoethyl) 5-acetamido-3,5-dideoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosidonic acid)を結合させた担体を用いる方法（Glycoconjugate Journal, 15, 663-669 (1998)）等が知られている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ＫＤＮａｓｅ等のデアミノノイラミン酸結合性物質のアフィニティクロマトグラフィーに用いるのに好適なアフィニティー担体を提供することを目的とする。
【０００６】
また、本発明は、上記担体を用いるＫＤＮａｓｅ等のデアミノノイラミン酸結合性物質の精製方法および検出方法を提供すること目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、特定のＫＤＮ−チオグリコシド等のＫＤＮ誘導体を結合させた担体を用いることによって、ＫＤＮａｓｅの簡便、迅速かつ高純度な調製が可能になることを見いだし本発明を完成した。
【０００８】
本発明は、下記一般式(1)で示されるデアミノノイラミン酸誘導体（以下、本発明誘導体ともいう）を提供する。
【０００９】
【化３】
0004544663.tif 000002
（式中、Ｘは、Ｓ、ＣＨ2又はＮＨであり、Ａは、置換基を有していてもよい炭素数１〜１０の炭化水素、好ましくは飽和炭化水素または芳香族炭化水素の２価基であり、Ｄは不溶性担体との結合に使用可能な官能基を示す。）
【００１０】
本発明誘導体において、Ｄは好ましくはアミノ基である。
本発明誘導体は、好ましくは、下記式(2)で示される。
【００１１】
【化４】
0004544663.tif 000003
【００１２】
また、本発明は、本発明誘導体が結合した不溶性担体（以下、本発明不溶性担体ともいう）を提供する。
【００１３】
さらに、本発明は、本発明不溶性担体を用いる、デアミノノイラミニダーゼの精製方法（以下、本発明精製方法ともいう）、および、デアミノノイラミン酸結合性物質の検出方法（以下、本発明検出方法ともいう）を提供する。
【００１４】
本発明精製方法は、下記工程(A)及び(B)を少なくとも含む。
(A)デアミノノイラミニダーゼを含有する溶液と、本発明不溶性担体とを接触させて、該不溶性担体にデアミノノイラミニダーゼを特異的に結合させる工程。
(B)本発明不溶性担体に結合したデアミノノイラミニダーゼを溶離する工程。
【００１５】
本発明検出方法は、下記工程(A)及び(B)を少なくとも含む。
(A)デアミノノイラミン酸結合性物質を含有する溶液と、本発明不溶性担体とを接触させて、該不溶性担体にデアミノノイラミン酸結合性物質を特異的に結合させる工程。
(B)本発明不溶性担体に結合したデアミノノイラミン酸結合性物質を検出する工程。
【００１６】
本発明検出方法においては、デアミノノイラミン酸結合性物質は、好ましくは、デアミノノイラミニダーゼである。
【００１７】
【発明の実施の形態】
本発明誘導体は、上記一般式(1)で示されるデアミノノイラミン酸誘導体である。
【００１８】
一般式(1)において、Ｘは、Ｓ、ＣＨ2又はＮＨであり、好ましくはＳである。
【００１９】
Ａは、置換基を有していてもよい炭素数１〜１０の炭化水素、好ましくは飽和炭化水素（アルカン、シクロアルカン等）または芳香族炭化水素（アレーン、アルキルアレーン等）の２価基である。飽和炭化水素の２価基はアルキレン基およびシクロアルキレン基を包含する。飽和炭化水素の２価基の例としては、メチレン、エチレン、プロピレン等が挙げられる。芳香族炭化水素は、飽和炭化水素の側鎖を１以上有する芳香族炭化水素を包含し、側鎖を有する芳香族炭化水素の２価基においては、遊離原子価は、共に環と側鎖の一方にあっても、環と側鎖の両方にあってもよい。芳香族炭化水素の２価基の例としては、（ｏ−、ｍ−またはｐ−）フェニレン、メチルフェニレン、ベンジリデン、
【化５】
0004544663.tif 000004
等が挙げられる。炭素数１〜１０の炭化水素、好ましくは飽和炭化水素または芳香族炭化水素の置換基としては、アルキル基（通常には炭素数１〜５）、アシル基（通常には炭素数１〜４）、水酸基、ニトリル基、ニトロ基等が挙げられる。
置換基は複数存在してもよい。
【００２０】
Ａは、好ましくは、Ｘと結合する遊離原子価が環にあるもの例えばフェニレン基）が好ましい。
【００２１】
Ｄは不溶性担体との結合に使用可能な官能基を示す。Ｄの例としては、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、イミダゾール基が挙げられ、不溶性担体の官能基と結合させることのできるものであればよい。なお、リガンドの不溶性担体への結合方法として、隣接する水酸基をもつ担体（アガロースやセファロースなど）をＢｒＣＮで活性化させ、アミノ基と結合させる方法や、エポキシ活性化された担体のエポキシ基とアミノ基とを結合させる方法が一般的であり、アミノ基と結合させる不溶性担体の入手が容易であることから、Ｄはアミノ基であることが好ましい。
【００２２】
本発明誘導体は、好ましくは、上記式(2)で示される。
【００２３】
本発明誘導体の製造方法について以下説明する。
一般式(1)においてＸがＳであり、Ｄがアミノ基である本発明誘導体は、次のようにして製造することができる。
【００２４】
【化６】
0004544663.tif 000005
【００２５】
先ず、一般式(3)で示される化合物と一般式(4)で示される化合物を反応させて、一般式(5)で示される化合物を得る。
【００２６】
式中、Ｒ1は水酸基の保護基であり、例えば、アシル基、アラルキル基、シリル基、アルキルオキシメチル基、アセタール型またはケタール型保護基である。
【００２７】
アシル基の例としては、アセチル、クロロアセチル、ジクロロアセチル、トリフルオロアセチル、メトキシアセチル、プロピオニル、ｎ−ブチリル、（Ｅ）−２−メチルブテノイル、ペンタノイル、ベンゾイル、ｏ−（メトキシカルボニル）ベンゾイル、ｐ−フェニルベンゾイル、ｐ−トルオイル、ｐ−アニソイル、ｐ−クロロベンゾイル、ｐ−ニトロベンゾイルなどの基が挙げられる。
【００２８】
アラルキル基の例としては、ベンジル、フェネチル、３−フェニルプロピル、ｐ−メトキシベンジル、ｐ−ニトロベンジル、ｏ−ニトロベンジル、ｐ−ハロベンジル、ｐ−シアノベンジルなどの基が挙げられる。
【００２９】
シリル基の例としては、トリメチルシリル、トリエチルシリル、ジメチルイソプロピルシリル、イソプロピルジメチルシリル、メチルジ−ｔ−ブチルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリルなどの基が挙げられる。
【００３０】
アルキルオキシメチル基の例としては、メトキシメチル、エトキシメチルなどの基が挙げられる。
【００３１】
アセタール型またはケタール型保護基の例としては、イソプロピリデン、エチリデン、プロピリデン、ベンジリデン、メトキシメチリデンなどの基が挙げられる。
【００３２】
好ましいＲ1は、アセチル基、ベンゾイル基およびベンジル基であるが、アセチル基がより好ましい。
【００３３】
Ｒ1は、互いに同一でも異なっていてもよく、異なっている場合には２種以上をどのように組み合わせてもよい。なお、Ｒ1は、互いに同一であることが好ましい。最も好ましいのは、Ｒ1が互いに同一であり、かつＲ1がアセチル基であるものである。
【００３４】
Ｒ2はカルボキシル基の保護基であり、例えばアルキル基（メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基など）やベンジル基である。
【００３５】
ＬおよびＭは、反応により脱離してＬの結合している炭素原子とイオウ原子との結合を形成する基であり、例えば、Ｌとしてハロゲン原子と、Ｍとしてアルカリ金属原子または有機塩基との組合せである。ハロゲン原子の例としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子が挙げられる。アルカリ金属原子の例としては、リチウム原子、ナトリウム原子、カリウム原子が挙げられる。有機塩基の例としては、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミンが挙げられる。
【００３６】
Ａは、炭素数１〜１０の前記の炭化水素の２価基である。Ａの例は、上記一般式(1)について挙げたものが挙げられる。Ａは、好ましくは、Ｘ（ここではＳ）と結合する遊離原子価が環にあるもの（例えばフェニレン基）が好ましい。このような好ましい基を用いると、本発明誘導体の製造において、(a)反応工程の手順が少なくなる、(b)反応が容易になる、(c)安価に製造できる、(d)反応生成物の収率が高くなる、等の利点が得られる。
【００３７】
Ｒ3はアミノ基に誘導できる基であり、例えば、ニトロ基、アジド基、保護されたアミノ基（例えば、ベンジルオキシカルボニルアミノ（−ＮＨ−ＣＢｚ）、ｔ−ブトキシカルボニルアミノ（−ＮＨ−Ｂｏｃ））である。
【００３８】
一般式(3)で示される化合物と一般式(4)で示される化合物との反応は、通常には、有機溶媒（例えば、アセトニトリルなど）中、０〜４０℃で０．５〜２４時間の条件で行うことができる。一般式(5)で示される化合物の他に副産物が生じる場合もあるが、その場合には、必要により、シリカゲルクロマトグラフィーなどの常法によって一般式(5)で示される化合物を精製することができる。
【００３９】
Ｒ1、Ｒ2およびＲ3の各基は、一般式(3)で示される化合物と一般式(4)で示される化合物との反応の条件で反応しないものが選択される。
【００４０】
次に、一般式(5)で示される化合物の水酸基およびカルボキシル基の保護基を除去し、一般式(6)で示される化合物を得る。水酸基およびカルボキシル基の保護基の除去は、ナトリウムアルコキシド、アルカリ、酸等を用いる公知の方法によって行うことができる。
【００４１】
そして、一般式(6)におけるＲ3をアミノ基に誘導することにより、一般式(7)で示される化合物（一般式(1)においてＸがＳであり、Ｄがアミノ基である本発明誘導体）を得る。Ｒ3のアミノ基への誘導は、公知の方法によって行うことができる。例えば、ニトロ基である場合には、パラジウム−炭素（Ｐｄ−Ｃ）等の触媒の存在下、水素により還元することでアミノ基に誘導できる。また、保護されたアミノ基である場合には、保護基を除去することでアミノ基に誘導できる。
【００４２】
Ｒ1とＲ3の組合せによっては、アミノ基への誘導の後に水酸基の保護基の除去を行ってもよいし、また、アミノ基への誘導と水酸基の保護基の除去を同時に行ってもよい。
【００４３】
一般式(1)においてＸがＣＨ2である場合は、一般式(4)で示される化合物として、Ｒ3−Ａ−ＣＨ2−Ｓｎ−（Ｃ4Ｈ9）3（例えば、トリブチル−４−ニトロベンジルスズ）を用いて、Tetrahedron Lett., 32, 3953(1991)に記載の方法に従って一般式(3)で示される化合物と反応させることができる。あるいは、一般式(4)で示される化合物として、Ｒ3−Ａ−ＣＨ2−Ｓｉ−（ＣＨ3）3（例えば、トリメチル−４−ニトロベンジルシラン）を用いて、Chemistry Lett., 1529(1984)に記載の方法に従って一般式(3)で示される化合物と反応させることができる。
【００４４】
一般式(1)においてＸがＮＨである場合は、一般式(4)で示される化合物として、Ｒ3−Ａ−ＮＨ2（例えば、ｐ−ニトロアニリン）を用いて、上記のＸがＳである場合と同様の方法により一般式(3)で示される化合物と反応させることができる。あるいは、一般式(4)で示される化合物としてＮＨ2−Ａ−ＮＨＢｏｃを用いて、Glycoconjugate Journal, 15, 663-669(1998)に記載の方法に従って、一般式(3)で示される化合物と反応させることができる。
【００４５】
本発明誘導体は、不溶性担体に結合させることができ、これにより本発明不溶性担体を得ることができる。
【００４６】
本発明不溶性担体は、本発明誘導体が結合した不溶性担体である。本明細書において「不溶性」とは、不溶性担体が使用される条件において、不溶性担体が、それに接触する液体から、濾過等の固液分離手段により分離可能であることを意味する。
【００４７】
本発明誘導体が結合される不溶性担体は、物質の精製や分析に通常に使用される不溶性担体でよく、天然物質からなる担体及び合成物質からなる担体のいずれでもよい。具体例としては、セルロース（例えば、セルロファイン（商品名）、アガロース、架橋アガロース（例えば、セファロース（商品名））、架橋デキストラン（例えば、セファデックス（商品名））、親水性ビニルポリマー（例えば、トヨパール（商品名））などが挙げられる。
【００４８】
不溶性担体の形態は特に限定されず、繊維、微顆粒、ビーズ等のいずれでもよい。
【００４９】
本発明誘導体の不溶性担体への結合は、先ず、一般式(1)におけるＤに結合可能な官能基を有する不溶性担体を準備し、次いで本発明誘導体と官能基を有する不溶性担体を結合させることによって行うことができる。不溶性担体への官能基の導入及び本発明誘導体と官能基を有する不溶性担体との結合は、公知のアフィニティクロマトグラフィー用の担体の調製方法に準じた条件で行うことができる。
【００５０】
上記の官能基は、不溶性担体にスペーサーを介して結合したものであってもよい。
【００５１】
アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、イミダゾール基等に結合可能な官能基を導入した不溶性担体は、市販品としても得ることができる。
【００５２】
また、一般式(1)におけるＤがアミノ基の場合には、アガロースなどの隣接する水酸基を有する担体をＢｒＣＮで活性化させ、それにアミノ基を結合させることができる。
【００５３】
本発明不溶性担体は、デアミノノイラミニダーゼの精製やデアミノノイラミン酸結合物質の検出に使用することができる。また、デアミノノイラミニダーゼの拮抗阻害剤として使用することができる。
【００５４】
本発明精製方法は、下記工程(A)及び(B)を少なくとも含む。
(A)デアミノノイラミニダーゼを含有する溶液と、本発明不溶性担体とを接触させて、該不溶性担体にデアミノノイラミニダーゼを特異的に結合させる工程。
(B)本発明不溶性担体に結合したデアミノノイラミニダーゼを溶離する工程。
【００５５】
なお、工程(A)と工程(B)の間に、固液分離の工程を含むことが好ましい。
【００５６】
デアミノノイラミニダーゼは、特に限定されず、例としては、スフィンゴバクテリウム・マルチボラム由来のもの（以下、「ＫＤＮａｓｅＳｍ」ともいう）が挙げられる。
【００５７】
ＫＤＮａｓｅＳｍはスフィンゴバクテリウム・マルチボラムにおいて誘導可能な酵素であり、本発明者らは、ＫＤＮａｓｅＳｍをラージスケールで調製するため、合成ＫＤＮ−グリコシドを誘導剤として用いる酵素誘導の最適条件を確立している（Biochem. Biophys. Res. Commun. 248, 505-510(1998)）。
【００５８】
デアミノノイラミニダーゼがＫＤＮａｓｅＳｍである場合には、ＫＤＮａｓｅＳｍの精製効率が高いため、Ａは、Ｘと結合する遊離原子価が環にあるもの（例えばフェニレン基）であることが好ましい。
【００５９】
デアミノノイラミニダーゼを含有する溶液は、特に制限されず、例としては、デアミノノイラミニダーゼを産生する細菌の菌体から、超音波処理などによる破砕、もしくは浸透圧ショック等の適当な方法によって放出された酵素を含む溶液、または、この溶液から、塩析、イオン交換クロマトグラフィーなどの公知の酵素精製法により精製した酵素の溶液が挙げられる。
【００６０】
デアミノノイラミニダーゼを含有する溶液と、本発明不溶性担体とを接触させて、該不溶性担体にデアミノノイラミニダーゼを特異的に結合させる方法としては、不溶性担体としてビーズ等の形態のもの（例えば、クロマト担体）を用いた場合、デアミノノイラミニダーゼが本発明不溶性担体に結合する条件下において、本発明不溶性担体を充填したカラムにデアミノノイラミニダーゼ含有溶液を通過させ、次いで非特異的結合物質を除去するためにカラムを洗浄液で洗浄する方法（カラム法）、デアミノノイラミニダーゼ含有溶液に本発明不溶性担体を加えて攪拌した後本発明不溶性担体を溶液から分離し、次いで、非特異的結合物質を除去するために本発明不溶性担体を洗浄液で洗浄する方法（バッチ法）などが挙げられる。
【００６１】
デアミノノイラミニダーゼが本発明不溶性担体に結合する条件は、デアミノノイラミニダーゼの種類により適宜選択されるが、通常には、その酵素活性が発揮される条件である。例えばＫＤＮａｓｅＳｍの場合には、ｐＨ６〜８、塩濃度０．０５〜０．２Ｍ（ＮａＣｌの場合）という条件が挙げられる。このような条件は、例えば、本発明不溶性担体（又はそのカラム）を適切な緩衝液（例えば、０．１ＭＮａＣｌを含む０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．１））で平衡化し、また、必要により、デアミノノイラミニダーゼを含有する溶液を同緩衝液で希釈したり、同緩衝液に対して透析したりすることで得られる。
洗浄も、デアミノノイラミニダーゼが本発明不溶性担体に結合する条件下で行われる。例えばＫＤＮａｓｅＳｍの場合には、洗浄液としては、上記の緩衝液が挙げられる。
【００６２】
本発明不溶性担体に結合したデアミノノイラミニダーゼの溶離は、デアミノノイラミニダーゼの種類に依存するが、通常には、デアミノノイラミニダーゼが本発明不溶性担体に結合する条件において、塩濃度を高めることによって行うことができる。(A)の工程として上記に例示した本発明不溶性担体を充填したカラムにデアミノノイラミニダーゼ含有溶液を通過させ、次いでカラムを洗浄液で洗浄する方法を用いた場合には、塩濃度を高めた洗浄液をカラムに流すことによってデアミノノイラミニダーゼを溶離できる。例えばＫＤＮａｓｅＳｍの場合には、ｐＨ６〜８、塩濃度０．５〜１Ｍ（ＮａＣｌの場合）という条件が挙げられる。
【００６３】
本発明精製方法は、上記(A)及び(B)の工程の前後のいずれかまたは両方に、硫酸アンモニウム（硫安）、硫酸ナトリウム等による塩析、透析、限外濾過法、吸着クロマトグラフィー、陰イオン及び陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過法、電気泳動法などの公知の酵素精製工程の一つ以上の工程を含んでいてもよい。
【００６４】
本発明検出方法は、下記工程(A)及び(B)を少なくとも含む。
(A)デアミノノイラミン酸結合性物質を含有する溶液と、本発明不溶性担体とを接触させて、該不溶性担体にデアミノノイラミン酸結合性物質（以下、ＫＤＮ結合性物質ともいう）を特異的に結合させる工程。
(B)本発明不溶性担体に結合したＫＤＮ結合性物質を検出する工程。
【００６５】
なお、工程(A)と工程(B)の間に、固液分離の工程を含むことが好ましい。
【００６６】
ＫＤＮ結合性物質は、デアミノノイラミン酸に結合可能なものである限り特に制限されず、公知の物質でも未知の物質でもよい。例としては、デアミノノイラミニダーゼなどが挙げられ、好ましくは、デアミノノイラミニダーゼである。
【００６７】
ＫＤＮ結合性物質を含有する溶液は、ＫＤＮ結合性物質を含有する、または含有する可能性がある溶液である限り、特に限定されない。また、この溶液は予め精製されている必要はない。例えば、細胞、微生物、生体組織等の抽出液をそのまま用いることもできる。
【００６８】
このような溶液中に、ＫＤＮ結合性物質以外の物質が含有されていても、本発明検出方法では、検出対象であるＫＤＮ結合性物質を特異的に検出することができる。
【００６９】
本発明検出方法における(A)の工程は、本発明精製方法の(A)の工程と同様にして行うことができる。すなわち、ＫＤＮ結合性物質を含有する溶液と、本発明不溶性担体とを接触させて、該不溶性担体にＫＤＮ結合性物質を特異的に結合させる方法としては、不溶性担体としてビーズ等の形態のもの（例えば、クロマト担体）を用いた場合、ＫＤＮ結合性物質が本発明不溶性担体に結合する条件下において、本発明不溶性担体を充填したカラムにＫＤＮ結合性物質含有溶液を通過させ、次いで非特異的結合物質を除去するためにカラムを洗浄液で洗浄する方法（カラム法）、ＫＤＮ結合性物質含有溶液に本発明不溶性担体を加えて攪拌した後本発明不溶性担体を溶液から分離し、次いで、非特異的結合物質を除去するために本発明不溶性担体を洗浄液で洗浄する方法（バッチ法）などが挙げられる。
【００７０】
ＫＤＮ結合性物質が本発明不溶性担体に結合する条件は、ＫＤＮ結合性物質の種類等により適宜選択される。
【００７１】
本発明不溶性担体に結合したＫＤＮ結合性物質を検出する方法は、定性的な方法でも定量的な方法でもよい。
【００７２】
検出の方法の例としては、ＫＤＮ結合性物質を本発明不溶性担体から分離した後に、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に付し、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色や銀染色などのタンパク質染色法により染色する方法が挙げられる。また、必要に応じ、ＫＤＮ結合性物質の種類を同定するために、例えば同定の目的とするＫＤＮ結合性物質に対して特異的な抗体等を用い、例えばウェスタンブロッティング等を行ってもよい。
【００７３】
また、検出は、ＫＤＮ結合性物質を本発明不溶性担体に結合させたまま、ＫＤＮ結合性物質に対する抗体を用いる通常の免疫学的検出法により行うこともできる。
【００７４】
ＫＤＮ結合性物質に対する抗体は、ポリクローナルおよびモノクローナルのいずれでもよい。この抗体は、ＫＤＮ結合性物質もしくはその部分またはこれらと他の物質との複合体を抗原として、常法に従って例えば以下のように作成することが可能である。
【００７５】
ポリクローナル抗体は、例えばマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ等の被免疫動物を上記抗原で免疫し、これらの動物から血清を採取することによって得ることができる。被免疫動物を免疫する際に、補助剤（アジュバント）を併用することは、抗体産生細胞を賦活するので望ましい。得られた抗血清から、常法によってイムノグロブリン分画を精製してもよい。
【００７６】
モノクローナル抗体は、例えば次のようにして得られる。すなわち、上記抗原をマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ等の被免疫動物の腹腔内、皮下、足蹠(footpad)に投与した後に脾臓又は膝窩リンパ節を摘出し、これらから採取した細胞と腫瘍細胞株であるミエローマ細胞とを細胞融合させてハイブリドーマを樹立し、得られたハイブリドーマを連続増殖させ、さらに得られたハイブリドーマからＫＤＮ結合性物質に対する特異抗体を継続的に産生する細胞株を選別する。こうして選別された株を好適な培地で培養することによって、培地中にモノクローナルな抗体が得られる。あるいは、マウスの腹腔などの生体内にて前記ハイブリドーマを培養することによって、モノクローナルな抗体を大量に製造することができる。細胞融合に用いる細胞としては、脾細胞以外にリンパ節細胞および末梢血中のリンパ細胞等を用いることができる。また、ミエローマ細胞株は、異種細胞種由来のものに比べ同種細胞種由来のものが望ましく、安定な抗体産生ハイブリドーマを得ることができる。
【００７７】
得られたポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の精製法としては、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム等による塩析、低温アルコール沈殿およびポリエチレングリコールまたは等電点による選択的沈殿分別法、電気泳動法、ＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−誘導体、ＣＭ（カルボキシメチル）−誘導体等のイオン交換体を用いたイオン交換クロマトグラフィー、プロテインＡまたはプロテインＧを用いたアフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、抗原を固定化した免疫吸着クロマトグラフィー、ゲル濾過法および超遠心法等を挙げることができる。なおこの抗体を、抗原結合部位（Ｆａｂ）を分解しないプロテアーゼ（例えばプラスミン、ペプシン、パパイン等）で処理して得られるＦａｂを含むフラグメントとしても良い。
【００７８】
抗体の標識物質による標識方法および標識物質の検出方法は、通常の免疫学的方法で採用されるものでよい。
【００７９】
本発明検出方法において、ＫＤＮ結合性物質の本発明不溶性担体からの分離は必須ではない。すなわち、本発明不溶性担体に結合したままのＫＤＮ結合性物質を定性的または定量的に検出してもよい。このような検出方法としては、本発明不溶性担体に結合したＫＤＮ結合性物質を認識できる抗体を用いる免疫学的測定法が挙げられる。例えば、本発明不溶性担体に結合したままのＫＤＮ結合物質に結合できる、ＫＤＮ結合性物質に対する標識した抗体、または、本発明不溶性担体に結合したままのＫＤＮ結合性物質に結合できる、ＫＤＮ結合性物質に対する抗体およびこの抗体に対する標識した抗体を用いて、本発明不溶性担体−ＫＤＮ結合性物質−標識した抗ＫＤＮ結合性物質抗体の複合体、または、本発明不溶性担体−ＫＤＮ結合性物質−抗ＫＤＮ結合性物質抗体−標識した抗（抗ＫＤＮ結合性物質抗体）抗体の複合体を形成させ、複合体の標識を測定することにより、測定することができる。
【００８０】
ＫＤＮには未知の生理活性も期待されており、医薬品等への利用も期待される。ＫＤＮに結合する物質は、ＫＤＮの生理活性を増加、減少又は変化等させる可能性も考えられることから、医薬品等としてもの利用可能性も期待される。本発明検出方法は、このようなＫＤＮ結合性物質の探索等にも有用である。
【００８１】
【実施例】
以下に本発明を、実施例により具体的に説明する。しかしながら、これらにより本発明の技術的範囲が限定されるべきものではない。
【００８２】
【実施例１】
4-アミノフェニル 2,3-ジデオキシ-2-チオ-D-glycero-α-D-galacto-2-ノヌロピラノシドン酸（KDNα2-S-4AP）の合成
合成の各ステップにおける生成物の物性は以下の方法により測定した。
【００８３】
融点(mp)は、Yazawa By-10融点測定装置(前田理科器株式会社)を用いて測定し、補正は行わなかった。質量スペクトル(MS)は、高速原子衝撃法(FAB, マトリックスとして3-ニトロベンジルアルコール(NBA)を用いた）により、JEOL JMS-DX300及びJMS-AX505HA装置(日本電子株式会社)を用いて測定した。赤外線吸収(IR)スペクトルは、JASCO A-102装置(日本分光工業株式会社)を用いて、KBr錠剤法で測定した。比旋光度([α]D)は、JASCO DIP-370装置(日本分光工業株式会社)を用い20℃で測定した。核磁気共鳴(NMR)スペクトルは、Varian VXR-300装置(バリアンジャパンリミテッド)を用い、測定溶媒の内部標準としてテトラメチルシラン(TMS)及び3-(トリメチルシリル)-1-プロパンスルホン酸ナトリウム(DSS)を用いて測定した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーは、Silica gel 60(メルク社製、70-230 mesh)を用いた。
【００８４】
合成の概要を以下に示す。
【００８５】
【化７】
0004544663.tif 000006
【００８６】
以下、各ステップについて説明する。
（１）メチル (p-ニトロフェニル 4,5,7,8,9-ペンタ-O-アセチル-2,3-ジデオキシ-2-チオ-D-glycero-α-D-galacto-2-ノヌロピラノシド)オネート（Methyl (p-nitrophenyl 4,5,7,8,9-penta-O-acetyl-2,3-dideoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosid)onate）(化合物３)の合成
メチル 4,5,7,8,9-ペンタ-O-アセチル-2-クロロ-2,3-ジデオキシ-D-glycero-β-D-galacto-2-ノヌロピラノソネート(Chem. Pharm. Bull., 39(12), 3140-3144(1991))(化合物１, 1.02 g, 2 mmol)をアセトニトリル(30 ml)に溶解し、4-ニトロチオフェノールNa塩(化合物２, 0.71 g, 4 mmol)を加えて室温で３時間攪拌した後、反応液をろ過し、ろ液を減圧留去した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(n-ヘキサン−酢酸エチル＝１：１)で分離、精製することにより、目的化合物３(0.88 g, 70%)と、副生成物として既知化合物(Chem. Pharm. Bull., 43(19), 1654-1658(1995))であるデオキシ誘導体４(76 mg, 8%)及び５(41 mg, 5%)を得た。化合物３の粗生成物をエチルアルコールからの再結晶に付し、化合物３(0.5 g)を薄い淡黄色のプリズム晶として得た。
【００８７】
mp 113-114℃, [α]D +37.7°(c = 1.0, MeOH)
元素分析 Calcd for C26H31NO15S: C, 49.60; H, 4.96; N, 2.22.  Found: C, 49.58; H: 4.99; N, 2.25.
FAB-MS m/z: 630(M++1), 652(M++Na)
IRνmax(cm-1): 1740, 1600, 1590, 1500.
1H-NMR(CDCl3)δ: 2.06 (dd, 1H, J = 11.0, 13.0 Hz, 3-Hax), 2.93 (dd, 1H, J = 4.5, 13.0 Hz, 3-Heq), 4.04 (dd, 1H, J = 1.0, 10.0 Hz, 6-H), 4.13 (dd, 1H, J = 2.5, 12.5 Hz, 9-H), 4.29 (dd, 1H, J = 1.5, 12.5 Hz, 9-H'), 4.84 (dd, 1H, J = 9.5, 10.0 Hz, 5-H), 4.89 (ddd, 1H, J = 4.5, 9.5, 11.0 Hz, 4-H), 5.31 (br.s, 2H, 7及び8-H), 2.01 (s, 6H, OAc×2), 2.05 (s, 3H, OAc), 2.06 (s, 3H, OAc), 2.12 (s, 3H, OAc), 3.61 (s, 3H, CO2Me), 7.63 (d, 2H, J = 8.8 Hz, 4-ニトロフェニル基), 8.81 (d, 2H, J = 8.8 Hz, 4-ニトロフェニル基).
【００８８】
（２）4-ニトロフェニル 2,3-ジデオキシ-2-チオ-D-glycero-α-D-galacto-2-ノヌロピラノシドン酸（4-Nitrophenyl 2,3-dideoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosidonic acid）(化合物６)の合成
化合物３(0.94 g, 1.5 mmol)をメタノール(30 ml)に溶解し、２８％ナトリウムメトキシド−メタノール溶液(1 ml)を加えて室温で２時間撹拌した後、反応液を減圧下、２０℃で乾固し、これに水(10 ml)を加え室温で３時間放置した。反応液に水(20 ml)を加え薄めた後、Dowex-50(H+)(ダウケミカル社)を加えて弱酸性にし、樹脂をろ去し、更に水で洗った。ろ液及び洗液を合わせて凍結乾燥して、化合物６(0.60 g, 98%)を淡黄色の粉末として得た。
【００８９】
[α]D +37.6°(c = 0.5, MeOH)
元素分析  Calcd for C15H19NO10S: C, 44.44; H, 4.72; N, 3.46.  Found: C, 44.65; H, 4.84; N, 3.37.
FAB-MS m/z: 406(M++1), 428(M++Na)
IRνmax(cm-1): 3400, 1705, 1600, 1590, 1510.
1H-NMR(D2O)δ: 1.92 (dd, 1H, J = 11.0, 12.5 Hz, 3-Hax), 2.86 (dd, 1H, J = 4.5, 12.5 Hz, 3-Heq), 3.50 (dd, 1H, J = 1.5, 9.5 Hz, 6-H), 3.59 (dd, 1H, J = 8.5, 9.5 Hz, 5-H), 3.63 (dd, 1H, J = 6.0, 11.5 Hz, 9-H), 3.64 (ddd, 1H, J = 4.5, 8.5, 11.0 Hz, 4-H), 3.75 (ddd, 1H, J = 2.5, 6.0, 9.0 Hz, 8-H), 3.82 (dd, 1H, J = 1.5, 9.0 Hz, 7-H), 3.85 (dd, 1H, J = 2.5, 11.5 Hz, 9-H'), 7.79 (d, 2H, J = 9.0 Hz, 4-ニトロフェニル基), 8.22 (d, 2H, J = 9.0 Hz, 4-ニトロフェニル基).
【００９０】
（３）4-アミノフェニル 2,3-ジデオキシ-2-チオ-D-glycero-α-D-galacto-2-ノヌロピラノシドン酸（4-Aminophenyl 2,3-dideoxy-2-thio-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosidonic acid）(化合物７)の合成
化合物６(0.41 g, 1 mmol)をメタノール(50 ml)に溶解し、５％パラジウム−炭素(Pd-C)(1 g)を加えて、水素気流中で室温にて６時間攪拌した後、反応液をろ過し、残渣をメタノールで洗浄した。ろ液と洗浄液を合わせ減圧下で濃縮乾固し粉末を得た。得られた粉末をＬＨ−２０ゲル(ファルマシアバイオテク)(溶媒：MeOH)を用いて精製し、淡橙色の粉末として化合物７(0.34 g, 90%)を得た。
【００９１】
[α]D -5.8°(c = 0.5, MeOH)
元素分析  Calcd for C15H21NO8S: C, 47.99; H, 5.64; N, 3.73.  Found: C, 47.67; H, 5.84; N, 3.67.
FAB-MS m/z: 376(M++1), 398(M++Na)
IRνmax(cm-1): 3300, 1605, 1595, 1500.
1H-NMR(D2O)δ: 1.9 (dd, 1H, J = 13.0, 11.5 Hz, 3-Hax), 2.82 (dd, 1H, J = 4.5, 13.0 Hz, 3-Heq), 3.41 (dd, 1H, J = 2.0, 9.5 Hz, 6-H), 3.57 (dd, 1H, J = 9.0, 9.5 Hz, 5-H), 3.57 (dd, 1H, J = 6.5, 11.5 Hz, 9-H), 3.62 (ddd, 1H, J = 4.5, 9.0, 11.5 Hz, 4-H), 3.69 (ddd, 1H, J = 2.5, 6.5, 8.5 Hz, 8-H), 3.78 (dd, 1H, J = 2.0, 8.5 Hz, 7-H), 3.81 (dd, 1H, J = 2.5, 11.5 Hz, 9-H'), 7.42 (d, 2H, J = 8.5 Hz, 4-ニトロフェニル基), 7.69 (d, 2H, J = 8.5 Hz, 4-ニトロフェニル基).
13C-NMR(D2O)δ: 41.90 (C-3), 65.36 (C-9), 70.39 (C-7), 72.02 (C-5), 72.70 (C-4), 74.95 (C-8), 78.98 (C-6), 89.24 (C-2), 174.33 (C-1), 126.25 (C-2',6'), 140.63 (C-3',5'), 132.44 (C-1'), 134.49 (C-4').
【００９２】
【実施例２】
KDNα2-S-4APを結合させた不溶性担体の作成及びKDNα2-S-4APを結合させた不溶性担体を用いたアフィニティークロマトグラフィーによるKDNase Smの精製
(1)アフィニティーカラムの作成
エポキシ活性化セファロース6B（Pharmacia Biotech）の凍結乾燥粉末1.0 gを脱イオン水で膨潤させ、その後、ガラスフィルターを用い、脱イオン水200 ml以上で洗浄した。凍結乾燥粉末1.0 gは、膨潤するとおよそ3.5 mlのゲルになる。2.0 mlアシストチューブにリガンドとしてKDNα2-S-4AP 210 μmolを測りとり、0.6 M NaHCO3 1.2 mlに溶解した。ここに膨潤したゲル0.6 mlを添加し、25℃(20℃〜45℃)で17.5時間（一夜）よく撹拌した。撹拌後、2.5 mlシリンジ(TERUMO)に詰め、0.4 M NaHCO3で洗浄して余分なリガンドを除去した。活性基のブロッキングのため溶媒を1 Mエタノールアミン(pH 8.0)に置換し、37℃で16時間静置した。次いで、0.5 M NaCl/0.1 M酢酸緩衝液(pH 4.0)と0.5 M NaCl/0.1 M Tris-HCl緩衝液(pH 8.0)とを交互に３回繰り返して流し、洗浄した。これにより、KDNα2-S-4APを結合させた不溶性担体を充填したアフィニティーカラム(0.9×1.2 cm)が作成された。
【００９３】
(2) アフィニティーカラムに対するKDNase Smの結合と溶離
S. multivorumの菌体から浸透圧ショック法により抽出し、KDNase粗画分を得た。具体的には、S. multivorumの菌体（湿重量８ｇ）を氷冷した0.03 M NaCl/0.01 M Tris-HCl緩衝液(pH 7.1)に懸濁し、遠心（13,000×g, 20分）を行って洗浄した。この菌体の沈渣に菌体重量の10倍容（この場合、80 ml）の0.033 M Tris-HCl緩衝液(pH 7.1)を加えて懸濁させた後、よく撹拌しながら菌体重量の10倍容の40%ショ糖/0.033 M Tris-HCl緩衝液(pH 7.1)および0.0001倍容の0.1 M EDTA二ナトリウム塩を加えて、室温で10分間振盪した。遠心（13,000×g, 10分）して菌体を集め、そこに最初の菌体重量の20倍容の氷冷した1 mM酢酸マグネシウム（pH 7.1に調整）を加えて、10分間ゆっくりと攪拌した。さらに、２倍容の氷冷1 M NaCl/1 M Tris-HCl緩衝液(pH 7.1)を加え、遠心（13,000×g, 30分）して上清を得、これをKDNase粗画分とした。
【００９４】
KDNase粗画分0.5 ml(2.6 units)を実施例２（上記(1)）で作成したアフィニティーカラムにかけ、1 mM Mg(CH3COO)2/0.1 M NaCl/0.1 M Tris-HCl緩衝液(pH 7.1)で洗浄した後、1 mM Mg(CH3COO)2/0.5 M NaCl/0.1 M Tris-HCl緩衝液(pH 7.1)で溶離し、各500 μlずつ４本（各緩衝液について計2.0 ml）分取した。
分取した各フラクションの20μlを用い、国際公開パンフレット第ＷＯ９６／００７８１号に記載の４−メチルウンベリフェリルＫＤＮを用いる方法によりKDNase活性を測定した。さらに、このフラクションの400 μlをmicrocon 10（Amicon Inc.）で20μlに濃縮し、SDS-PAGEに付した。これをCBB染色することによって、タンパク質を検出した。
【００９５】
結果を図１及び２に示す。画分番号４で洗浄液から溶出液に変えた。0.5 M NaClで溶出したフラクション（画分番号５および６）に、KDNase活性が確認された。画分番号５および６には、CBB染色によって、KDNase Smの推定分子量約50KDaのバンドが見られ、またその他のタンパク質のバンドは数本しか確認されなかったことから、KDNを特異的に認識する物質を効率よく保持するカラムであると考えられる。
【００９６】
J. Biol. Chem., 269, 21415-21419, 1994には、KDN-OS（ＫＤＮオリゴ糖アルコール）を含む糖ペプチドをアフィニティーリガンドとしたアフィニティークロマトグラフィーを含む、KDNase Smの精製に関する結果が報告されている。この報告では、更に精製を進めた段階でアフィニティークロマトグラフィーを用いており、比活性の上昇は、このアフィニティークロマトグラフィーステップで60倍で、全体として173倍であった。このステップ後の比活性は127 units/mgタンパク質であった。本実施例では、より粗精製である浸透圧ショック後の画分から始めて、一度の精製で1,450 units/mgタンパク質まで比活性が上昇し、この方法の有効性は明らかである。
【００９７】
なお、このアフィニティーカラムは、繰り返し使用しても同様の結果を与え、繰り返しの使用に対して安定であった。
【００９８】
【実施例３】
KDNα2-S-4APを結合した不溶性担体を用いたアフィニティークロマトグラフィーと、他のクロマトグラフィーとの組合せによるKDNase Smの精製
(a) KDNaseの粗画分の調製
【００９９】
KDN-OSによってS. multivorumに誘導をかけて（Nishino et al., J. Biol. Chem. 271, 2909, 1996）得られた菌体を洗浄後、0.1 M NaCl/0.1 M Tris-HCl緩衝液(pH 7.1)を加えて、5 g/30 mlの懸濁液とした。次に、超音波発生装置（INSONATOR 201型、久保田商事）を用いて、氷冷下で超音波処理（100 W, 3〜5分）した。この処理液を13,000×gで60分遠心して、上清を採取した。この上清を限外濾過で濃縮して、液量を60 mlとした。
【０１００】
(b) DEAE-Toyopearl 650Mクロマトグラフィー
(a)で得られた粗画分（60 ml、4,500 units）をDEAE-Toyopearlカラム（2.4×24 cm, 109 ml,東ソー製; 0.1 M NaCl-0.25%スクロース-20 mM Tris-HCl緩衝液(pH 8.0)で平衡化）にかけて、カラムに保持されないで素通りする画分を採取して、0.1 M NaCl-0.25%スクロース-20 mM Tris-アセテート緩衝液(pH 6.0)に対して透析した。収量は、3,500 units(17 ml)であった。
【０１０１】
(c) CM-Toyopearl 650Mクロマトグラフィー
(b)で得られた画分をCM-Toyopearl 650Mカラム（2.4×23.8 cm, 108 ml,東ソー製; 0.1 M NaCl-0.25%スクロース-20 mM Tris-アセテート緩衝液(pH 6.0)で平衡化）にかけた後、0.1 M NaCl-0.25%スクロース-20 mM Tris-アセテート緩衝液(pH 6.0)中で0〜1 M NaClの塩濃度勾配によって溶出した。溶出画分の活性測定を行い、活性のある画分をプールして、限外濾過によって濃縮した。収量は、3,500 units(17 ml)であった。
【０１０２】
(d) フェニルセファロースカラムクロマトグラフィー
(c)で得られた濃縮KDNase活性画分を3 M NaCl/50 mM Tris-HCl緩衝液(pH 7.1)に対して透析したものを、フェニルセファロースカラム（1.6×20.3 cm, 41 ml,ファルマシア製）にかけて、400 mlの50 mM Tris-HCl緩衝液(pH 7.1)中で3 M〜0 M NaClの直線塩濃度勾配によって溶出した。溶出液を分画して活性測定を行い、活性をもつ画分を集めて、限外濾過で濃縮した。溶媒を限外濾過によって0.1 M NaCl/0.1 M Tris-HCl緩衝液(pH 7.1)に置換して、2 mlにした。収量は2,530 unitsであった。
【０１０３】
(e) KDNチオグリコシドをリガンドとするアフィニティーカラムの作成及びそれを用いたアフィニティークロマトグラフィー
KDNα2-S-4AP 800 μmol (4 ml)に、エポキシ活性化セファロース6Bゲル4.5 mlを加えて、室温で20時間撹拌した。その3 mlのゲルをカラムに詰めて、0.4 M NaHCO3で洗浄した後、溶媒を1 Mエタノールアミン(pH 8.0)に置換して、室温で16時間静置した。0.5 M NaCl/0.1 M酢酸ナトリウム緩衝液(pH 4.0)と0.5 M NaCl/0.1 M Tris-HCl緩衝液(pH 8.0)とを交互に３回繰り返し流すことによってカラムを洗浄した。
【０１０４】
(d)で調製したKDNase活性画分を25.8 units(60 μl)をカラムに載せて、まず、0.1 M NaCl/1 mM Mg(CH3COO)2/0.1 M Tris-HCl(pH 7.1)を21 ml流して洗浄した後、0.5 M NaCl/1 mM Mg(CH3COO)2/0.1 M Tris-HCl(pH 7.1)を12 ml流して溶離した。洗浄液および溶離液を3 mlずつ分取した。各画分について、国際公開パンフレット第ＷＯ９６／００７８１号に記載の４−メチルウンベリフェリルＫＤＮを用いる方法によりKDNase活性を測定した。結果を図３に示す。21 unitsが８〜10画分に回収され、これはカラムに載せた量の81%であった。このことから、カラムのKDNase結合の容量は、21 units/3 mlであるから、7 units/mlと計算された。また、溶出画分のSDS-PAGE/銀染色の解析から、カラムに載せる前に観察されていた約134K、約108K、約60Kおよび約42Kのバンドの中、約60Kのバンドのみが溶離された活性画分に見い出された。このバンドは、SDS-PAGE/銀染色で単一バンドとして検出され、精製KDNaseであると判断された。
【０１０５】
【発明の効果】
デアミノノイラミニダーゼなどのデアミノノイラミン酸結合性物質の精製や検出に有用な不溶性担体を製造するのに有用なデアミノノイラミン酸誘導体が提供される。また、このデアミノノイラミン酸誘導体が結合した不溶性担体、並びに、この不溶性担体を用いるデアミノノイラミン酸結合物質の精製方法および検出方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  実施例２におけるアフィニティークロマトグラフィーにより得られた溶出画分のKDNase活性を示す。Voは排除体積、Vtはベッド容量を示す。
【図２】  実施例２におけるアフィニティークロマトグラフィーにより得られた溶出画分のSDS-PAGE分析の結果を示す。
【図３】  実施例３におけるアフィニティークロマトグラフィーにより得られた溶出画分のKDNase活性を示す。
【図１】
0004544663.tif 000008
【図２】
0004544663.tif 000009
【図３】
0004544663.tif 000010