(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
精製の選択性及び／または生産性を改善するために順相クロマトグラフィー系において移動相改質剤を使用することによるリポペプチドの精製方法であって、前記移動相改質剤がアミン、アミノ酸及びアミノ酸エステルからなる群から選択され、前記順相クロマトグラフィー系が移動相及び固定相を含み、前記移動相が１つ以上の溶媒を含む溶媒系であり、前記固定相がシリカゲル及びアルミナから選択され、前記アミンがメチルアミン、エチルアミン、ジイソプロピルアミン、ジエチルアミン、ジメチルアミン、エチルメチルアミン、トリエチルアミン、プロピルアミン、アニリン及びジメチルアニリンからなる群から選択される前記精製方法。
【請求項２】
移動相改質剤がアミンである請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項３】
移動相改質剤がアミノ酸またはアミノ酸エステルである請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項４】
アミノ酸またはアミノ酸エステル移動相改質剤がＬ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、Ｌ−アミノ酸エステル及びＤ−アミノ酸エステルからなる群から選択される請求の範囲第３項に記載の方法。
【請求項５】
アミノ酸またはアミノ酸エステル移動相改質剤がＬ−プロリン、Ｄ−プロリン、トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン、トランス−４−ヒドロキシ−Ｄ−プロリン、グリシン、Ｌ−スレオニン、Ｄ−スレオニン、Ｌ−リシン、Ｄ−リシン、Ｌ−メチオニン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−バリン、Ｌ−バリン、並びに前記Ｌ−及びＤ−アミノ酸のエステルからなる群から選択される請求の範囲第４項に記載の方法。
【請求項６】
アミノ酸がＬ−プロリン及びＤ−プロリンから選択される請求の範囲第５項に記載の方法。
【請求項７】
リポペプチドがカスポファンギン（ｃａｓｐｏｆｕｎｇｉｎ）、ミカファンギン（ｍｉｃａｆｕｎｇｉｎ）、シロファンギン（ｃｉｌｏｆｕｎｇｉｎ）、アニドゥラファンギン（ａｎｉｄｕｌａｆｕｎｇｉｎ）及びダプトマイシン（ｄａｐｔｏｍｙｃｉｎ）の発酵産物前駆体である請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項８】
リポペプチドがニューモカンジン（ｐｎｅｕｍｏｃａｎｄｉｎ）Ｂ０である請求の範囲第７項に記載の方法。
【請求項９】
移動相改質剤がアミンである請求の範囲第８項に記載の方法。
【請求項１０】
アミン移動相改質剤がメチルアミン、エチルアミン、ジイソプロピルアミン、ジエチルアミン、ジメチルアミン、エチルメチルアミン、トリエチルアミン、プロピルアミン、アニリン及びジメチルアニリンからなる群から選択される請求の範囲第９項に記載の方法。
【請求項１１】
移動相改質剤がアミノ酸またはアミノ酸エステルである請求の範囲第８項に記載の方法。
【請求項１２】
アミノ酸またはアミノ酸エステル移動相改質剤がＬ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、Ｌ−アミノ酸エステル及びＤ−アミノ酸エステルからなる群から選択される請求の範囲第１１項に記載の方法。
【請求項１３】
固定相がシリカゲルである請求の範囲第１２項に記載の方法。
【請求項１４】
アミノ酸またはアミノ酸エステル移動相改質剤がＬ−プロリン、Ｄ−プロリン、トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン、トランス−４−ヒドロキシ−Ｄ−プロリン、グリシン、Ｌ−スレオニン、Ｄ−スレオニン、Ｌ−リシン、Ｄ−リシン、Ｌ−メチオニン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−バリン、Ｌ−バリン、並びに前記Ｌ−及びＤ−アミノ酸のエステルからなる群から選択される請求の範囲第１３項に記載の方法。
【請求項１５】
移動相が水、メタノール及び酢酸エチルを含む溶媒系である請求の範囲第１４項に記載の方法。
【請求項１６】
アミノ酸移動相改質剤がＬ−プロリン及びＤ−プロリンから選択される請求の範囲第１５項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチド及びリポペプチド化合物の順相クロマトグラフィーにおける移動相改質剤（ｍｏｄｉｆｉｅｒ）としてのアミン、アミノ酸またはアミノ酸エステルの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
今まで、シリカゲルＨＰＬＣ精製ではニューモカンジンＢ０から主要不純物、例えばニューモカンジンＢ５及びＥ０を十分に分離できなかった。幾つかのアナログは分取条件下で主要産物ピークから部分的にしか分離されなかった。所望産物純度を達成するためには、精製ステップを少ないカラム充填量で実施する限定分離が必要であり、このため生産性が制限された。
【０００３】
ニューモカンジンＢ０のようなリポペプチドは大抵発酵プロセスの産物である。発酵プロセス中、多くの非常に密接な関係のアナログが所望産物と一緒に産生される。粗な発酵産物を精製するために順相クロマトグラフィー系がよく使用されている。順相クロマトグラフィー系は通常固定相及び移動相から構成されている。ペプチドまたはリポペプチドを精製する場合、固定相はシリカゲルまたはアルミナであり得、移動相は単一溶媒または溶媒混合物であり得、この溶媒には有機溶媒及び水が含まれる。
【０００４】
上記アナログを分離するためにはシリカゲルクロマトグラフィー及び他のタイプの順相クロマトグラフィーが有用である。しかしながら、実際に所望産物からある近似アナログを分離することは多くの場合不十分であり、不満足である。なぜならば、分離が大きくなく、重複していることがあるからである。主要産物の所望純度を適度な収率で達成するためには、１ランあたりでカラムに充填する材料の量（供給物量またはカラム充填物量ということがある）を制限する必要があり、このために操作の生産性が低下する。
【０００５】
ニューモカンジンＢ０の精製はこのカテゴリーに入る。クロマトグラフィーはシリカゲルカラムに対して溶媒混合物、具体的には酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）、メタノール（ＭｅＯＨ）及び水の混合物からなる移動相を用いている。分子量１０６５ダルトンのニューモカンジンＢ０は天然産物であり、カスポファンギンアセテート（Ｃａｎｃｉｄａｓ（登録商標））の製造における中間体として役立つ。ニューモカンジンＢ０は真菌Ｇｌａｒｅａ ｌｏｚｏｙｅｎｓｉｓの発酵により二次代謝物として産生される。米国特許第５，１９４，３７７号明細書及び同第５，２０２，３０９号明細書を参照されたい。式Ｉ及び表１に示すように、ニューモカンジンＢ０及び２つの主要アナログ不純物の構造はすべてジメチルミリステート側鎖がカップリングした環状ヘキサペプチドからなる。
【０００６】
【表１】
0004549862.tif 000002
0004549862.tif 000003
【０００７】
シリカゲルクロマトグラフィーは、所望産物及びアナログ不純物（ニューモカンジンＢ５及びＥ０を含めた）のヒドロキシリッチ環状ヘキサペプチドコアの結合アフィニティーの微妙な違いを分離するために利用している。シリカゲルＨＰＬＣ精製では、ニューモカンジンＢ０の発酵時に同時に産生される２つの主要アナログ不純物であるニューモカンジンＢ５及びＥ０はニューモカンジンＢ０の非常に近くで溶出する。従って、上記物質及び類似アナログ化合物について精製物質の目標不純物レベルを満たすためには、カラムに充填され得る粗ニューモカンジンＢ０の量は制限される。その結果、主要不純物の分離を改善するために多くの努力が払われてきた。例えば、ニューモカンジンＢ０と主要アナログ不純物間の分離を最適にするように酢酸エチル／メタノール／水の三元移動相のバランスが取られてきた。Ｄ．Ｊ．Ｒｏｕｓｈ，Ｆ．Ｄ．Ａｎｔｉａ，Ｋ．Ｅ．Ｇｏｋｌｅｎ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ，８２７：３７３−３８９（１９９８）。
【発明の開示】
【０００８】
本発明は、リポペプチドまたはペプチドのＨＰＬＣ精製中のアミノ酸、アミノ酸エステルまたはアミンを含めた移動相改質剤の使用に関する。前記移動相改質剤は固定相に結合し、固定相の結合特性を改質して、所望リポペプチドまたはペプチドのその関連不純物からの分離または精製を改善する。
【０００９】
本発明は分析クロマトグラフィーにおいて使用されるが、（大規模精製技術としてクロマトグラフィーを用いる）分取クロマトグラフィーに対してより有用である。具体的には、アミノ酸、アミノ酸エステルまたはアミンがペプチドまたはリポペプチドのクロマトグラフィー精製において、例えばカスポファンギンアセテート（Ｃａｎｃｉｄａｓ（登録商標））を製造するために出発物質として使用される天然産物（発酵産物）であるニューモカンジンＢ０の精製において移動相改質剤として使用され得る。本発明はミカファンギン、アニドゥラファンギン、シロファンギン及びダプトマイシンのような他のリポペプチドの発酵産物前駆体を精製する際にも使用される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
精製の選択性及び／または生産性を改善すべく順相クロマトグラフィー系で移動相改質剤を使用することによるペプチドまたはリポペプチドの精製方法を開示する。前記方法において、移動相改質剤はアミン、アミノ酸及びアミノ酸エステルからなる群から選択される。前記方法において、順相クロマトグラフィー系は移動相及び固定相を含む。前記方法において、固定相はシリカゲル及びアルミナから選択される。前記方法において、移動相は１つ以上の溶媒からなる溶媒系である。前記方法において、移動相改質剤はアミンである。前記方法において、アミンは第１級、第２級もしくは第３級アミンであり、この中には低級アルキル（Ｃ１−６アルキル）アミン、低級ジアルキル（Ｃ１−６アルキル）アミン及び／または芳香族（Ｃ６−１０アリール）アミンが含まれる。前記方法において使用されるアミンの例はメチルアミン、エチルアミン、ジイソプロピルアミン、ジエチルアミン、ジメチルアミン、エチルメチルアミン、トリエチルアミン、プロピルアミン、アニリン及びジメチルアニリンである。前記方法において、移動相改質剤はアミノ酸またはアミノ酸エステルである。前記方法において、アミノ酸またはアミノ酸エステル移動相改質剤はＬ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、Ｌ−アミノ酸エステル及びＤ−アミノ酸エステルからなる群から選択される。前記方法において、アミノ酸またはアミノ酸エステル移動相改質剤はＬ−プロリン、Ｄ−プロリン、トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン、トランス−４−ヒドロキシ−Ｄ−プロリン、グリシン、Ｌ−スレオニン、Ｄ−スレオニン、Ｌ−リシン、Ｄ−リシン、Ｌ−メチオニン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−バリン及びＬ−バリン、並びに上記したＬ−及びＤ−アミノ酸のエステルから選択される。前記方法において、アミノ酸はＬ−プロリン及びＤ−プロリンから選択される。
【００１１】
本発明の実施態様は、精製の分離度及び／または生産性を改善すべくアルミナまたはシリカゲルの固定相を用いる順相クロマトグラフィー系でアミンまたはアミノ酸移動相改質剤を使用することによるペプチドまたはリポペプチドの精製方法であって、精製はペプチドの精製である。ペプチドの例は１つのアミノ酸のアミノ基を別のアミノ酸のカルボキシル基とアミド結合で結合することにより形成され、微生物の二次代謝物として産生される１８００以下の分子量を有する線状及び環状アミノ酸鎖である。ペプチドの他の例はオキシトシン及びブラジキニンである。
【００１２】
本発明の更なる実施態様は、精製の分離度及び／または生産性を改善すべくアルミナまたはシリカゲルの固定相を用いる順相クロマトグラフィー系でアミンまたはアミノ酸移動相改質剤を使用することによるペプチドまたはリポペプチドの精製方法であって、精製はリポペプチドの精製である。前記方法において、リポペプチドはカスポファンギン、ミカファンギン、アニドゥラファンギン、シロファンギン及びダプトマイシンの発酵産物前駆体から選択される。前記方法において、リポペプチドはニューモカンジンＢ０である。前記方法において、移動相改質剤はアミンである。前記方法において、アミン移動相改質剤はメチルアミン、エチルアミン、ジイソプロピルアミン、ジエチルアミン、ジメチルアミン、エチルメチルアミン、トリエチルアミン、プロピルアミン、アニリン及びジメチルアニリンからなる群から選択される。前記方法において、移動相改質剤はアミノ酸またはアミノ酸エステルである。前記方法において、アミノ酸またはアミノ酸エステル移動相改質剤はＬ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、Ｌ−アミノ酸エステル及びＤ−アミノ酸エステルからなる群から選択される。前記方法において、固定相はシリカゲルである。前記方法において、アミノ酸またはアミノ酸エステル移動相改質剤はＬ−プロリン、Ｄ−プロリン、トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン、トランス−４−ヒドロキシ−Ｄ−プロリン、グリシン、Ｌ−スレオニン、Ｄ−スレオニン、Ｌ−リシン、Ｄ−リシン、Ｌ−メチオニン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−バリン及びＬ−バリン、並びに上記したＬ−及びＤ−アミノ酸のエステルから選択される。前記方法において、移動相は水、メタノール及び酢酸エチルからなる溶媒系である。前記方法において、アミノ酸移動相改質剤はＬ−プロリン及びＤ−プロリンから選択される。
【００１３】
本発明の更に別の実施態様は、精製の分離度及び／または生産性を改善すべくアルミナまたはシリカゲルの固定相を用いる順相クロマトグラフィー系でアミンまたはアミノ酸移動相改質剤を使用することによるペプチドまたはリポペプチドの精製方法であって、精製はペプチドの精製である。前記方法において、移動相改質剤はアミンである。前記方法において、移動相改質剤はアミノ酸またはアミノ酸エステルである。前記方法において、固定相はシリカゲルである。
【００１４】
本発明の精製方法に有用なリポペプチドの例は、ニューモカンジンＢ０、カスポファンギン、シロファンギン及びミカファンギンのようなエキノカンジン誘導体、アニドゥラファンギン、ダプトマイシン、特にカスポファンギン、ミカファンギン、シロファンギン、アニドゥラファンギン及びダプトマイシンの天然産物前駆体である。カスポファンギンの天然産物／発酵産物前駆体はニューモカンジンＢ０である。カスポファンギンアセテート（ＣＡＮＣＩＤＡＳ）は、現在米国において静脈内投与用抗菌剤として販売されている半合成リポペプチドエキノカンジンＢ誘導体である。アニドゥラファンギンは静脈内投与用抗菌剤としてＥｌｉ  Ｌｉｌｌｙ／Ｖｅｒｓｉｃｏｒが開発中の半合成リポペプチドエキノカンジンＢ誘導体である。アニドゥラファンギンは援用により本明細書に含まれるとする米国特許第５，９６５，５２５号明細書及び同第６，３８４，０１３号明細書に開示されている。シロファンギンは、援用により本明細書に含まれるとする米国特許第４，２９３，４８９号明細書にＥｌｉ  Ｌｉｌｌｙ／Ｖｅｒｓｉｃｏｒが抗菌剤としての使用を開示しているエキノカンジンリポペプチドである。ミカファンギン（ＦＵＮＧＡＲＤ）は、静脈内投与用抗菌剤として藤沢薬品工業が開発中のエキノカンジン様リポペプチドである。ミカファンギンは援用により本明細書に含まれるとする米国特許第６，１０７，４５８号明細書に開示されている。ダプトマイシン（ＣＩＤＥＣＩＮ）は、抗菌剤としてＣｕｂｉｓｔが開発中の半合成リポペプチド誘導体である。ダプトマイシンは援用により本明細書に含まれるとするＥｌｉ  Ｌｉｌｌｙの米国特許第４，５３７，７１７号明細書に開示されている。
【００１５】
順相クロマトグラフィー系は移動相及び固定相を使用する。移動相は１つ以上の溶媒を含む溶媒系であり、その組成は精製プロセス中一定であっても精製プロセス中経時的に溶媒組成を変化させる勾配であってもよい。移動相溶媒には、水、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ヘキサン、酢酸エチル、アセトニトリル及びジクロロメタンが含まれるが、これらに限定されない。固定相はシリカゲル及びアルミナから選択される。本発明は、移動相に移動相改質剤を添加させるペプチドまたはリポペプチドのクロマトグラフィー精製方法を提供する。カラム容量はカラムを移動させるのに必要な溶媒の容量として定義される。カラム充填量（カラム供給物量または供給物充填量とも称される）は一度に精製され得る材料（粗リポペプチドまたは粗ペプチド）の量を指す。移動相改質剤はアミノ酸、アミノ酸エステルまたはアミンとして定義される。本発明は、溶出液（移動相溶媒系）に対する移動相改質剤の添加またはカラム充填物に対する補充物としての添加を意図する。本発明で考えられるアミノ酸の例は、Ｄ−及びＬ−立体配置の両方を含む任意の天然または非天然アミノ酸である。本発明の方法で有用なアミノ酸移動相改質剤としてはＬ−及びＤ−プロリン、トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン、グリシン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−リシン、Ｌ−メチオニン及びＬ−バリンが例示される。本発明で考えられるアミン移動相改質剤の例は第１級、第２級または第３級低級アルキル（Ｃ１−６アルキル）及び／または芳香族（Ｃ６−１０アリール）アミンである。前記アミンとしてはメチルアミン、エチルアミン、ジイソプロピルアミン、ジエチルアミン、ジメチルアミン、エチルメチルアミン、トリエチルアミン、プロピルアミン、アニリン及びジメチルアニリンが例示される。
【００１６】
本発明は、低濃度の特定アミン、アミノ酸またはアミノ酸エステルを移動相に添加すると系の分離度及び選択性をシフトでき、有意な強化を与えることを示している。特に、ニューモカンジンＢ０のシリカゲルクロマトグラフィーにおいて使用されるＥｔＯＡｃ−ＭｅＯＨ−水混合物にプロリンを添加すると、前記化合物のニューモカンジンＢ５及びＥ０を含めた密接に関連する不純物からの分離度が顕著に向上する。この高い分離度により、産物リッチ留分の純度及び収率を維持しながらカラムへの産物の充填量を２〜３倍大きく増加させることができる。シリカの同一カラムを用いたとしてより少ない溶媒及びより短い時間で大量の産物が同じ純度に同じ収率で精製することができる。カラム充填物中に移動相改質剤を存在させても同様の効果が得られることも立証された。
【００１７】
米国ペンシルバニア州ピッツバーグに所在のＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した溶媒を用いた。５μｍ粒径及び１２０Å孔径を有するレギュラー裸シリカを充填した分析規模ＨＰＬＣカラム（２５０×内径４．６ｍｍ）は米国ノースカロライナ州ウィルミントンに所在のＹＭＣから入手した。半分取規模実験では米国マサチューセッツ州ビバリーに所在のＡｍｉｃｏｎから入手した公称粒径２０μｍのＧｒａｄｅ  ６３１，Ｓｉ−６０と呼称されるイレギュラーシリカを用いた。分析規模実験では、３元移動相及び供給物希釈剤中のすべての溶媒（酢酸エチル、メタノール及び水）はＨＰＬＣ用であった。半分取実験のために使用した移動相は、米国テキサス州ヒューストンに所在のＥｎｒｏｎからのメタノール（純度９９．９％（ｗ／ｗ））、米国ニュージャージー州パースアンボイに所在のＥａｓｔｍａｎからのウレタン用酢酸エチル、及び米国ミネソタ州ミネトンカに所在のＯｓｍｏｎｉｃｓからの精製ユニットを用いて実験室で作成した低イオン水から調製した。分析及び半分取規模実験では、移動相組成物は８７／９／７（ｖ／ｖ／ｖ）  酢酸エチル／メタノール／水であった。溶液の容量組成は非理想的混合効果を説明しない。便宜上、前記移動相をＷＥＡＭと呼ぶ。実験のために使用した供給物は、７９．３／１３．３／７．４（ｖ／ｖ／ｖ）  酢酸エチル／メタノール／水の溶媒混合物中に溶解したニューモカンジンＢ０を含んでした。Ｌ−プロリンは日本の協和発酵工業から入手した。グリシン、Ｌ−スレオニン、Ｄ−プロリン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−リシン、Ｌ−バリン、トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン、ジエチルアミン及びプロリンメチルエステルはドイツ国シュタインハイムに所在のＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｅ  Ｇｍｂｈから入手した。
【００１８】
分析規模実験は、カラムサーモスタット及び２７８ｎｍで検出をモニターする可変波長デテクター（ＶＷＤ）を備えたドイツ国バーデンビュルテンベルクに所在のＨｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ製ＨＰ  １１００  ＨＰＬＣ系を用いて実施した。半分取実験では、ＤｙａｘのＢｉｏｔａｇｅ部門のＤｏｒｒ  ＯｌｉｖｅｒモデルＣ（１  ＬＰＭポンピングスキッド）及びイリノイ州インディアナポリス製５０ｃｍ×内径６ｃｍの軸圧縮カラムを用いた。
【００１９】
まず、発酵プロセスを促進するために発酵混合物中に添加したＬ−プロリンを含有する粗なニューモカンジンＢ０の特定バッチの精製中に改質剤効果が観察された。
【００２０】
ニューモカンジンＢ０の粗な発酵産物をまずＨＰＬＣに充填すると、ニューモカンジンＢ０の分離が制限された。ニューモカンジンＥ０はニューモカンジンＢ０のピークの下に埋まっており、ニューモカンジンＢ０からのニューモカンジンＢ５の分離は明らかでなかった。シリカゲルＨＰＬＣの第１ランについてのＵＶ（２７８ｎｍ）トレースを示している図１Ａを参照されたい。
【００２１】
しかしながら、ニューモカンジンＢ０発酵産物のＨＰＬＣ精製ランを逐次数回実施した後、ニューモカンジンＢ０の保持時間が１０分ほど延長することが観察された。加えて、初期ランでニューモカンジンＢ０と同時に溶出されるニューモカンジンＥ０が主要ピークより先に溶出した。更に、ニューモカンジンＢ０の近くに溶出するニューモカンジンＢ５の分離が劇的に改善された。図１Ｂはこの一連のＨＰＬＣランの第１８ランを示し、保持時間の延長及び高い分離度を明らかに示している。
【００２２】
高い分離度は、カラムをメタノールで洗浄することにより逆転した。この洗浄は、強く結合した不純物を除去する目的で２０ラン毎に実施した。幾つかの追加ランの後に改善した精製結果が戻った。更なる研究で、この効果は、プロリンがカラム供給物（粗ニューモカンジンＢ０）中に存在し、それが各注入でカラムに吸着したためであったことが分かった。この現象は、効果のレベルをコントロールして実施例に記載されているように分離度及び生産性を改善させるように移動相にプロリン及び関連添加物を添加することにより一般化された。
【００２３】
本明細書中の実施例は本発明の更なる理解を助けるためのものである。特定の物質、使用した化合物及び条件は本発明の例示であって、本発明の合理的範囲を限定するものではない。
【００２４】
（実施例１）
移動相として８７／９／７（ｖ／ｖ／ｖ）  酢酸エチル／メタノール／水を用いる分析規模ＹＭＣ  ５μシリカカラムに、比較のために未改変コントロールを確立すべくＬ−プロリン非含有ニューモカンジンＢ０産物を８回注入した。この後、Ｌ−プロリン溶液を短く１０回注入し（７９．３／１３．３／７．４（ｖ／ｖ／ｖ）  酢酸エチル／メタノール／水中１．３×１０−２Ｍ  Ｌ−プロリン，６０μｌ注入，１．２ｍｌ／分で約５分間のラン時間）、更にＬ−プロリン非含有ニューモカンジンＢ０産物を９回注入した。所要により手順を繰り返した。
【００２５】
図２Ａは、プロリン注入前の保持時間と比べた、一連のプロリン注入直後になされた注入の系におけるニューモカンジンＢ０ピークの保持時間を示す。Ｌ−プロリン処理直後に保持が著しく増加することが見られたことが知見され得る。ニューモカンジンＢ０とその直ぐ前に溶出するピーク間の選択性が改善された。しかしながら、約５ラン後に保持時間は正常（ＲＲＴ〜１）に戻り、向上した選択性は失われた。これは、多分カラムからプロリン非含有移動相で連続溶出するとＬ−プロリンが脱着されるためであろう。
【００２６】
図２Ｂ及び２Ｃは、Ｌ−プロリン処理の直前または直後に得た典型的なクロマトグラムである。ニューモカンジンＢ０とニューモカンジンＢ５及びＥ０との分離が明らかに変化しているように保持時間の変化は明白である。
【００２７】
（実施例２）
Ｌ−プロリンを移動相に直接添加して５Ｔｍ  ＹＭＣシリカ充填分析カラムを用いて実験を実施した。図３Ａ、Ｂ及びＣはそれぞれ移動相中にＬ−プロリンなし、０．２６ｍＭ  Ｌ−プロリン（〜３０ｍｇ／Ｌ）添加及び０．６５ｍＭ  Ｌ−プロリン（〜７５ｍｇ／Ｌ）添加したときのクロマトグラムを示す。注入前に、カラムをプロリン含有移動相を１．２ｍｌ／分で流して２時間平衡化した。図３Ｃでは、ニューモカンジンＢ０の直ぐ前のピークは標準物質の注入によりニューモカンジンＥ０であると判明した。ニューモカンジンＥ０はクロマトグラフィーをＬ−プロリンなしで実施したときには分離不能であった。
【００２８】
（実施例３）
２０％の酢酸エチルと８０％の８７／９／７（ｖ／ｖ／ｖ）  酢酸エチル／メタノール／水からなる移動相を用いて溶出することにより、約２３分に延長することによる選択性の向上を研究した。この保持時間は、ニューモカンジンＢ０の保持時間を実施例２において０．６５ｍＭ  Ｌ−プロリンを用いたときに観察された約２２分の保持時間に匹敵する。ニューモカンジンＢ０の保持時間は延長したが、ニューモカンジンＥ０は依然としてニューモカンジンＢ０のピーク中に埋もれていた。高い分離は達成されなかった。図４参照。
【００２９】
（実施例４）
半分取規模で、内径６ｃｍ、長さ２５ｃｍのＰｒｏｃｈｒｏｍカラムに（８７／９／７（ｖ／ｖ／ｖ）  水／酢酸エチル／メタノール（ＷＥＡＭ）移動相でスラリー化した）Ａｍｉｃｏｎグレード６３１，１８〜２０μ，６０Åシリカ（３９０ｇ）を充填圧４０バールで充填して使用した。
【００３０】
ベンチマークラン：
３４．９アッセイｇ／Ｌ  ニューモカンジンＢ０供給物溶液を与えるように供給溶媒（７９．３／１３．３／７．４（ｖ／ｖ／ｖ）  酢酸エチル／メタノール／水）（１．５Ｌ）中にＬ−プロリン非含有の粗ニューモカンジンＢ０（９０ｇ）を溶解することにより供給物溶液を作成した。実験のコントロールを確立するために、供給物（８０ｍｌ，２．８ｇ  ニューモカンジンＢ０）を注入し、ＷＥＡＭ移動相を９０ｍｌ／分の流速で流して溶出させた。このランからフラクションを集め、プールした代表的なリッチ留分の分析結果は不純物プロフィールが（順相（ＮＰ）及び逆相（ＲＣ）ＨＰＬＣアッセイによる）従来バッチと一致したことを示した。
【００３１】
移動相中にＬ−プロリンを用いたラン（ベンチマークに類似の充填物）：
ＷＥＡＭ移動相を７５ｍｇ／Ｌ（０．６５０ｍＭ）の濃度のＬ−プロリンで改質した。カラムを５カラム容量（ＣＶ）の前記溶液でコンディショニングし、他の点ではベンチマークランと同じ条件下で改質移動相を用いてランを実施した。この系で見られた保持時間のシフトは分析系ほど劇的でなかった。表２に２つのランからのリッチ留分の不純物プロフィールを要約する。プロリン改質ランではニューモカンジンＢ５及びニューモカンジンＥ０の量は劇的に少なく、この系でより高い処理量が達成できることを示している。
【００３２】
【表２】
0004549862.tif 000004
Ｌ−プロリン改質移動相を用いたカラム処理量の倍化：
ベンチマーク充填量を倍にして上記したプロリン改質系を用いてランを実施した。すなわち、他の条件はすべて同じにして、供給物溶液の注入容量を２倍にすることにより５．６ｇのニューモカンジンＢ０（１４．４ｇ／ｋｇ−シリカ）を注入した。リッチ留分の不純物プロフィール、収率及び質量バランスを表３に要約する。結果は、本実施例ではベンチマーク充填量を２倍にすると収率はそのままであるが純度が向上したので、クロマトグラフィーステップの生産性を倍にするためにこの方法を使用し得ることを示している。
【００３３】
【表３】
0004549862.tif 000005
【００３４】
（実施例６）
移動相改質剤としての他のアミノ酸
現象に関する更なる見識を得るために、移動相に０．６５ｍＭの濃度でトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン、Ｌ−バリン、Ｌ−リシン、Ｌ−メチオニン、Ｄ−プロリン、Ｌ−スレオニン及びグリシンを含めた各種アミノ酸改質剤を含めて２５×０．４６ｃｍ  ＹＭＣ  ５μシリカカラムを用いて一連の分析実験を実施した。図５〜１１を参照されたい。
【００３５】
表４に保持が減少する順にアミノ酸を示す。図５〜１０は、保持時間及び選択性に対する各種影響を示す上記ランから得たクロマトグラムの例である。４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを除くすべてのアミノ酸で、保持はアミノ酸非含有の場合に比して増加し、選択性は各例で独自に変化した。例えば、トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンは、図５に示すようにニューモカンジンＢ０の保持をシフトさせなかったが、初期に溶出するピークからのニューモカンジンＢ０の分離に影響を及ぼした。
【００３６】
グリシンは側鎖を持たないが、保持時間を延長させる。このことから、保持時間のシフト及び高い分離度はアミノ酸側鎖の独自の効果ではないことが強く示唆される。
【００３７】
アミノ酸の代わりにＬ−プロリンメチルエステルを使用すると、保持時間は延長し（コントロールと比べたニューモカンジンＢ０の保持時間は１．６５であった）、選択性も変化した。
【００３８】
特定のアミノ酸を用いて３または４ランの各セットを実施した後、カラムを３６ｍｌ（〜８カラム容量、以下“ＣＶ”と呼ぶ）のメタノールで洗浄し、その後１０ＣＶのニートＷＥＡＭ移動相で平衡化した。その後、アミノ酸が除去された（すなわち、ベースライン性能が回復した）ことを確認するために３回（〜３０分）注入した。その後、カラムを７２ｍｌ（〜１７ＣＶ）の新しいアミノ酸を含有する移動相で再びコンディショニングし、新しく注入した。各アミノ酸について第３ランの保持時間を報告した。各アミノ酸に対するシリカの飽和能力が不明であるので、このプロトコルからカラムが同じモル数のアミノ酸に曝されたことを確かめた。カラムは、多分２つの第１級アミンであるので（故意に最後のアミノ酸として試験した）Ｌ−リシンに曝した後十分に再生され得なかった。
【００３９】
【表４】
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【００４０】
（実施例７）
移動相改質剤としてのジエチルアミンを用いたクロマトグラフィー
ジエチルアミンを約０．１ｇ／Ｌで移動相に添加し、実験条件は実施例６で用いた条件と同一とした。図１２に示すように、ジエチルアミンを添加すると保持時間はプロリンよりも延長した。従って、アミンまたはアミノ酸／アミノ酸エステルがこの系で移動相改質剤として使用され得るように保持時間及び選択性に対する影響はアミン官能基により媒介されると思われる。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】カラム供給物が少量のプロリンを含有している場合の粗ニューモカンジンＢ０のシリカゲルクロマトグラフィーの分取ＨＰＬＣクロマトグラム。１Ａはカラムに対する第１ラン、１Ｂはカラムに対する第１８ランである。供給物溶液からのプロリンのカラムへの吸着のために後者のランではアナログ不純物の改善された分離が見られる。
【図２】２Ａはカラムへのプロリン含有溶液を注入後のニューモカンジンＢ０の保持時間のプロットであり、プロリンがカラムからゆっくり脱着されるので元の保持時間に戻る長い保持時間が示されている。２Ｂ及び２Ｃはカラムへのプロリン注入の直前（２Ｂ）及び直後（２Ｃ）の典型的なランのクロマトグラム（８７／９／７（ｖ／ｖ／ｖ）  酢酸エチル／メタノール／水を用いる分析規模５μ  ＹＭＣシリカカラム）。
【図３】（３Ａ）Ｌ−プロリンを含まない、（３Ｂ）０．２６ｍＭ  Ｌ−プロリンを添加した、（３Ｃ）０．６５ｍＭ  Ｌ−プロリンを添加した移動相で溶出させた粗ニューモカンジンＢ０のシリカゲルＨＰＬＣクロマトグラム。プロリン添加量が多くなるとニューモカンジンＢ０の保持時間が長くなり、アナログ不純物からの分離が向上することが示されている（０．６５ｍＭ  Ｌ−プロリンを添加したときのニューモカンジンＢ０の保持時間は２２分である）。
【図４】移動相として２０％の酢酸エチルと８０％の８７／９／７（ｖ／ｖ／ｖ）  酢酸エチル／メタノール／水を用いて溶出させた粗ニューモカンジンＢ０のシリカゲルＨＰＬＣクロマトグラム。この移動相混合物によりニューモカンジンＢ０の保持時間は長くなるが、プロリンを移動相に添加したときに観察された（図３参照）そのアナログからの高い分離（図３参照）は生じなかった。
【図５】（Ａ）移動相改質剤を添加せずに（コントロール）及び（Ｂ）移動相にアミノ酸を添加して溶出させた粗ニューモカンジンＢ０のシリカゲルＨＰＬＣクロマトグラム。アミノ酸の添加がニューモカンジンＢ０の保持及び／またはそのアナログからの分離に対して影響を与えることが示されている（８７／９／７（ｖ／ｖ／ｖ）  酢酸エチル／メタノール／水を用いる分析規模５μ  ＹＭＣシリカカラム）。５Ａはカラムをトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンに曝す前のコントロールであり、５Ｂはカラムをトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンで改質した移動相に曝した後のクロマトグラムであり、ニューモカンジンＢ０の保持時間はコントロールと同様であるが、そのアナログ不純物からの分離は異なることを示している。
【図６】（Ａ）移動相改質剤を添加せずに（コントロール）及び（Ｂ）移動相にアミノ酸を添加して溶出させた粗ニューモカンジンＢ０のシリカゲルＨＰＬＣクロマトグラム。アミノ酸の添加がニューモカンジンＢ０の保持及び／またはそのアナログからの分離に対して影響を与えることが示されている（８７／９／７（ｖ／ｖ／ｖ）  酢酸エチル／メタノール／水を用いる分析規模５μ  ＹＭＣシリカカラム）。６ＡはカラムをＬ−バリンに曝す前のコントロールであり、６ＢはカラムをＬ−バリンで改質した移動相に曝した後のクロマトグラムであり、ニューモカンジンＢ０の保持時間及びそのアナログ不純物からの分離の両方でコントロールとの変化を示している。
【図７】（Ａ）移動相改質剤を添加せずに（コントロール）及び（Ｂ）移動相にアミノ酸を添加して溶出させた粗ニューモカンジンＢ０のシリカゲルＨＰＬＣクロマトグラム。アミノ酸の添加がニューモカンジンＢ０の保持及び／またはそのアナログからの分離に対して影響を与えることが示されている（８７／９／７（ｖ／ｖ／ｖ）  酢酸エチル／メタノール／水を用いる分析規模５μ  ＹＭＣシリカカラム）。７ＡはカラムをＬ−リシンに曝す前のコントロールであり、７ＢはカラムをＬ−リシンで改質した移動相に曝した後のクロマトグラムであり、ニューモカンジンＢ０の保持時間及びそのアナログ不純物からの分離の両方でコントロールとの変化を示している。
【図８】（Ａ）移動相改質剤を添加せずに（コントロール）及び（Ｂ）移動相にアミノ酸を添加して溶出させた粗ニューモカンジンＢ０のシリカゲルＨＰＬＣクロマトグラム。アミノ酸の添加がニューモカンジンＢ０の保持及び／またはそのアナログからの分離に対して影響を与えることが示されている（８７／９／７（ｖ／ｖ／ｖ）  酢酸エチル／メタノール／水を用いる分析規模５μ  ＹＭＣシリカカラム）。８ＡはカラムをＬ−メチオニンに曝す前のコントロールであり、８ＢはカラムをＬ−メチオニンで改質した移動相に曝した後のクロマトグラムであり、ニューモカンジンＢ０の保持時間及びそのアナログ不純物からの分離の両方でコントロールとの変化を示している。
【図９】（Ａ）移動相改質剤を添加せずに（コントロール）及び（Ｂ）移動相にアミノ酸を添加して溶出させた粗ニューモカンジンＢ０のシリカゲルＨＰＬＣクロマトグラム。アミノ酸の添加がニューモカンジンＢ０の保持及び／またはそのアナログからの分離に対して影響を与えることが示されている（８７／９／７（ｖ／ｖ／ｖ）  酢酸エチル／メタノール／水を用いる分析規模５μ  ＹＭＣシリカカラム）。９ＡはカラムをＤ−プロリンに曝す前のコントロールであり、９ＢはカラムをＤ−プロリンで改質した移動相に曝した後のクロマトグラムであり、ニューモカンジンＢ０の保持時間及びそのアナログ不純物からの分離の両方でコントロールとの変化を示している。
【図１０】（Ａ）移動相改質剤を添加せずに（コントロール）及び（Ｂ）移動相にアミノ酸を添加して溶出させた粗ニューモカンジンＢ０のシリカゲルＨＰＬＣクロマトグラム。アミノ酸の添加がニューモカンジンＢ０の保持及び／またはそのアナログからの分離に対して影響を与えることが示されている（８７／９／７（ｖ／ｖ／ｖ）  酢酸エチル／メタノール／水を用いる分析規模５μ  ＹＭＣシリカカラム）。１０ＡはカラムをＬ−スレオニンに曝す前のコントロールであり、１０ＢはカラムをＬ−スレオニンで改質した移動相に曝した後のクロマトグラムであり、ニューモカンジンＢ０の保持時間及びそのアナログ不純物からの分離の両方でコントロールとの変化を示している。
【図１１】（Ａ）移動相改質剤を添加せずに（コントロール）及び（Ｂ）移動相にアミノ酸を添加して溶出させた粗ニューモカンジンＢ０のシリカゲルＨＰＬＣクロマトグラム。アミノ酸の添加がニューモカンジンＢ０の保持及び／またはそのアナログからの分離に対して影響を与えることが示されている（８７／９／７（ｖ／ｖ／ｖ）  酢酸エチル／メタノール／水を用いる分析規模５μ  ＹＭＣシリカカラム）。１１Ａはカラムをグリシンに曝す前のコントロールであり、１１Ｂはカラムをグリシンで改質した移動相に曝した後のクロマトグラムであり、ニューモカンジンＢ０の保持時間及びそのアナログ不純物からの分離の両方でコントロールとの変化を示している。
【図１２】（Ａ）移動相改質剤を添加せずに（コントロール）及び（Ｂ）移動相にジエチルアミンを添加して溶出させた粗ニューモカンジンＢ０のシリカゲルＨＰＬＣクロマトグラム。ジエチルアミンの添加がニューモカンジンＢ０の保持及びそのアナログからの分離に対して非常に強い影響を与えることを示している（８７／９／７（ｖ／ｖ／ｖ）  酢酸エチル／メタノール／水を用いる分析規模５μ  ＹＭＣシリカカラム）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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