(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ＮＨ2（配列番号：１）からなる化合物または配列Ａｃ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ＮＨ２（ＭＳ−３８）（配列番号：１１）からなる化合物から選択される化合物で、該アミノ酸がすべてＬ−アミノ酸である化合物。
【請求項２】
配列Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−ｄＰｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ＮＨ2（ＭＳ−０９）（配列番号：２）からなる化合物。
【請求項３】
請求項１または２記載の化合物の酸性塩。
【請求項４】
請求項１または２記載の化合物をコードするＤＮＡ分子。
【請求項５】
請求項１または２記載の化合物をコードするＤＮＡ分子を含むベクター。
【請求項６】
請求項１または２記載の化合物のアミノ酸配列の１つまたはいくつかのコピーを含有する融合タンパク質。
【請求項７】
請求項６記載の融合タンパク質をコードするＤＮＡ分子を含有するベクター。
【請求項８】
薬学的に許容可能な担体と共に請求項１、２もしくは３記載の化合物、または請求項４記載のＤＮＡ、または請求項５もしくは７記載のベクター、または請求項６記載の融合タンパク質を含む医薬組成物。
【請求項９】
請求項１、２または３記載の化合物の薬理学的に効果のある量を含む湿疹の治療剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、メラノコルチン１−受容体（ＭＣ１−受容体）についての高い親和性および選択性を有する新しい化合物に関する。新しい化合物はＭＣ１−受容体を選択的に活性化しまたは遮断し、これは、ＭＣ１−受容体とメラノコルチン受容体の他のサブタイプによって媒介される生理学的効果を区別し、動物またはヒトに対するその投与に際して選択的薬理学的作用を供するのを可能とする。また、本発明は、その製造方法およびその薬学的製剤、ならびにＭＣ１−受容体によって影響され得る医学的および獣医学的疾患の治療でのその使用に関する。
【０００２】
メラノコルチックペプチド（メラノコルチン）は動物、とくにヒトを含めた哺乳動物の天然ペプチドホルモンであり、これは、ＭＣ−受容体に結合しそれを刺激する。メラノコルチンの例はα−ＭＳＨ、β−ＭＳＨ、γ−ＭＳＨ、ＡＣＴＨおよびそれらのペプチド断片である。α−ＭＳＨは末梢色素沈着を調節するその能力で主として知られており（Eberle 1988）、他方、ＡＣＴＨはステロイドネオゲネシスを誘導することが知られている（Simpson およびWaterman 1989）。また、メラノコルチックペプチドは多数の他の生理学的状態を媒介する。かくして、それらは、免疫モジュレーターとして作用し、動機付け、学習、記憶、挙動、炎症、体温、苦痛、認識、血圧、心拍、血管の調子、脳血流、神経成長、胎盤発達、アルドステロンの合成および放出、チロキシン放出、精子形成、卵巣重量、プロラクチンおよびＦＳＨ分泌、婦人における子宮出血、皮脂およびフェロモン分泌、血中グルコースレベル、体重ホメオスタシス、子宮内胎児成長ならびに分娩の回りの他の事象に影響すると報告されている（Garrudら，1974，Wiegantら，1979，O'Donahueら，1981，O'Donahue&Dorsa1982，DeWied&Jolles 1982，Kleinら, 1985，Fengら，1987，Linら，1987，Eberle，1986，Gruber&Callahan，1989，DeWildtら，1995，Fruefman，1997）。
【０００３】
分子クローニングの使用によって、ＭＣ−受容体の５つの異なるサブタイプをコードする遺伝子は同定されている（Chhajlaniら，１９９３，ChhajlaniおよびWikberg  １９９２，Gantzら，１９９３ａ，ｂ，Mountjoyら，１９９２）。ＭＣ−受容体は、全て７つの膜貫通ドメインを形成する単一ペプチドからの形成されるＧタンパク質共役受容体のクラスに属する。５つのＭＣ−受容体はＭＣ１、ＭＣ２、ＭＣ３、ＭＣ４およびＭＣ５と呼ばれ、それらは全て刺激されてｃＡＭＰに結合する。これらのうち、ＭＣ２−受容体はＡＣＴＨ−受容体であり、他方、他のものはメラノサイト刺激ホルモン受容体（ＭＳＨ−受容体）のサブタイプを構成する。ＭＣ１−受容体はメラノサイトおよびメラノーマ細胞上に存在する（Lowら１９９４、Siegrist & Eberle  １９９５）。最近のデータは、ＭＣ１−受容体がラットおよびヒト脳の限定された領域（中脳水道周囲の灰白質）（Xiaら，１９９５）、ならびに精巣（Vanettiら，１９９４）で発現されることを示す。また、非常に重要なことには、最近、ＭＣ１−受容体はマクロファージ（Starら，１９９５）、好中球（Cataniaら，１９９６）、神経膠腫細胞および神経膠星状細胞（Wongら，１９９７）、単球および内皮細胞（Hartmeyerら，１９９７，およびそこの引用文献）上に存在することが示されている。最近、ＭＣ１−受容体ｍＲＮＡは正常マウス脳でも検出され（Rajoraら，１９９７ａ）、これは脳におけるこの受容体の特異的機能を示唆する。さらに、免疫組織化学検出技術によって得られた最近のデータは、ＭＣ１−受容体が精巣および卵巣に存在することを示す（Thoenvallら  １９９７）。これは、生殖生理学における、ならびに恐らくは生殖病理生理学におけるＭＣ１−受容体の特異的役割を示唆する。
【０００４】
ＭＣ２−受容体はＡＣＴＨ受容体である。それは副腎皮質に存在する。ＭＣ３−受容体ｍＲＮＡは脳の区別される領域に、ならびに胎盤および腸組織で見いだされる（Gantzら１９９３ａ、Desamaudら１９９４，Roselli-Rehfussら１９９３）。ＭＣ４−受容体は脳で普遍的である（Gantzら１９９３ｂ，Mountjoyら，１９９４）。ＭＣ５−受容体は脳で、ならびにいくつかの末梢組織で発現される（Chhajlaniら１９９３，Gantzら１９９４，Griffonら１９９４，Labbeら，１９９４，Barrettら１９９４，Fathiら１９９５）。より最近のデータは、全ての５つのクローン化ＭＣ−受容体がより広い組織分布を有することを示す（Chhajlani  １９９６）。
【０００５】
５つのＭＣ−受容体はメラノコルチックペプチドに対する独自の親和性を示す（Schioethら１９９５，Schioethら１９９６ａ，ｂ，ｃ）。かくして、ＭＣ１−受容体はα−ＭＳＨに対して高い親和性を示すが、β−ＭＳＨ、γ−ＭＳＨおよびＡＣＴＨに対してより低い親和性を示す。ＭＣ２−受容体は高い親和性をもってＡＣＴＨに結合するが、それはＭＳＨペプチドに結合しない。ＭＣ３−受容体はβ−およびα−ＭＳＨと比較してγ−ＭＳＨに対してわずかにより高い親和性を示す。ＭＣ４−受容体はα−ＭＳＨよりもβ−ＭＳＨに対してわずかに優越性を示し、γ−ＭＳＨに対して非常に低い親和性を示す。ＭＣ５−受容体はＭＣ１−受容体のようにＭＳＨペプチドに対する同一の能力順序を示すが、かなり低い親和性である（Schioethら１９９５，Schioethら１９９６ａ，ｂ，ｃ）。
【０００６】
多様な効果は天然メラノコルチックペプチドによって誘導されるが、種々のＭＣ−受容体サブタイプには未だ十分に関連つけられていない。これらの効果はＭＣ−受容体の異なるサブタイプによって媒介されるはずである。しかしながら、最も関連するのは、増大する証拠が、ＭＣ１−受容体が炎症の変調で重要な役割を演じることを示すことである。かくして、例えば、α−ＭＳＨは、細菌リポ多糖およびγ−インターフェロンで刺激された培養されたマウスマクロファージにおける酸化窒素（ＮＯ）の形成を阻害することが示されており、マクロファージ中でのＭＣ１−受容体の刺激によるＮＯシンターゼ（ＮＯＳ）の生産の阻害によって引き起こされると主張されている効果である（Starら１９９５）。ＮＯは炎症の全ての形態の共通のメディエーターであると信じられているので、これは、ＭＣ１−受容体の刺激が、以前にＭＳＨ−ペプチドによって誘導されることが知られていた抗炎症効果を媒介することを示す。α−ＭＳＨは単球においてインターロイキン１０（ＩＬ−１０）の形成を増加させることも知られており、これはα−ＭＳＨによって誘導された免疫抑制効果における重要な成分であると信じられている（Bhardwajら，１９９６）。
【０００７】
また、最近の研究は、α−ＭＳＨが好中球の走化性移動を強力に阻害することを示す（Cataniaら、１９９６）。さらに、好中球はＭＣ１−受容体ｍＲＮＡを含有することが知られており、これは、インターフェロンおよび細菌リポ多糖での好中球の刺激に際してアップレギュレーションされた（Cataniaら、１９９６）。かくして、好中球移動は初期炎症において重要な成分を構成するので、これらの結果は、炎症の阻害剤のメディエーターとしてのＭＣ１−受容体の重要性を示す。
【０００８】
もう１つの研究において、α−ＭＳＨ、ならびにＭＳＨ−類似体［Ｎｌｅ4，Ｄ−Ｐｈｅ7］α−ＭＳＨ（ＮＤＰ−ＭＳＨ）は、リポ多糖の腹腔内注射後にサイトカインＩＬ−１およびＴＮＦ−αの血液中への放出を阻害することが示された（Goninardら、１９９６）。これはＭＳＨ−ペプチドの抗炎症役割を支持する。
【０００９】
α−ＭＳＨは神経膠腫細胞においてイン  ビボならびにイン  ビトロで腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）の生産を阻害するので、ＭＣ−受容体の重要な抗炎症役割（ＭＣ１タイプであると推定される）は脳にも関連つけられている。後者の場合、α−ＭＳＨは細菌エンドトキシンによって誘導されたＴＮＦ−αの形成を阻害することが示されているからである（Wongら、１９９７）。もう１つの実験において、脳心室内または腹腔内に与えられたα−ＭＳＨは、局所投与された細菌リポ多糖によって誘導された中枢のＴＮＦ−αの形成を阻害した（Rajoraら、１９９７ａ）。ＴＮＦ−αは神経学的障害、感染および脳の負傷で生じ、脳における病理学的プロセスの基礎であると考えられる。これらのデータは、中枢の抗炎症作用のメディエーターとしてのＭＣ−受容体の重要な役割を示す。
【００１０】
最近、α−ＭＳＨは炎症性腸病に対するモデルにおいて炎症を減じることが示されている（Rajora  １９９７ａ）。
【００１１】
α−ＭＳＨペプチドもまた皮膚生物学において重要な役割を帰せられている。最もよく知られているのは皮膚の色素形成を刺激するその能力である。α−ＭＳＨはメラノサイトに位置するＭＣ−受容体に対してのみならず、皮膚の免疫応答性および炎症細胞、ケラチノサイト、繊維芽細胞ならびに内皮細胞に対して作用することができ、それにより、ケラチノサイトの増殖および分化を修飾し、内皮細胞および繊維芽細胞のサイトカインの生産、ならびに繊維芽細胞のコラーゲン生産を調節する。α−ＭＳＨは抗原提示細胞に対して炎症前サイトカインおよびアクセサリー分子の生産をダウンレギュレーションすることが知られている。対照的に、ＩＬ−１０のごときサプレッサー因子はα−ＭＳＨによってアップレギュレーションされる（Luger  １９９７）。イン  ビボデータは、α−ＭＳＨの全身適用が接触過敏症の誘導および惹起を阻害し、ハプテン寛容を誘導する（Luger  １９９７）。かくして、蓄積される証拠は、恐らくはＭＣ１−受容体サブタイプのＭＣ−受容体の刺激が皮膚炎症および過剰増殖皮膚病の重要な負の調節メカニズムを媒介することを示す（Luger  １９９７）。
【００１２】
これらの知見に加えて、Hartmeyerら（１９９７）は、α−ＭＳＨが皮膚微小血管内皮細胞におけるＭＣ１−受容体発現を増加させ、これらの細胞からのインターロイキン８（ＩＬ−８）の増大した放出を引き起こすことを示している。これは、炎症および免疫のモジュレーターとしての皮膚におけるＭＣ１−受容体の役割を示す（Hartmeyerら、１９９７参照）。
【００１３】
ＭＳＨペプチドの抗炎症役割についてさらに読むためには、LiptonおよびCataniaによる総説を参照されたし（１９９７）。
【００１４】
１９５７年以来、ＭＳＨ−受容体は生理学的存在として知られていた。ＭＳＨ／ＡＣＴＨペプチドに対する結合部位は、多数の脳および末梢組織で同定されている（Hnatowichら１９８９，Tatro & Reichlin  １９８７，Lichtensteigerら１９９３，Tatro & Entwistle  １９９４）。これらの受容体のペプチド構造活性研究は、ラナ  ピピエンス（Rana pipiens）（カエル）、アノリス  カロリネンシス（Anolis carolinensis）（トカゲ）およびゼノパス  ラービス（Xenopus laevis）のような下等脊椎動物からのメラニン保有細胞で行われた。受容体の研究は、後に、メラノーマ細胞系での結合によって行われた。これらのテスト系は同様の結果を与え、今や、これらの系で得られたデータはＭＣ１−受容体をいうことが知られている（Eberie  １９８６）。
【００１５】
かかるテスト系を用い、α−ＭＳＨにおけるＤ−ＰｈｅによるＬ−Ｐｈｅの置換は高い能力および延長された作用を提供することが見いだされた（Sawyerら１９８０）。また、環状［Ｃｙｓ4，Ｃｙｓ10］α−ＭＳＨ類似体が合成された；それらは、皮膚色素沈着バイオアッセイにおいてメラニン細胞刺激ホルモン産生細胞であることが見いだされた（Knitteら，１９８３、Sawyer，１９８２）。しかしながら、従前公知の天然および合成ペプチドのうちいくつか、ならびにより最近合成されたものはＭＣ１−受容体に対する高い親和性を示すが、その選択性に対してＭＣ−受容体の他のサブタイプは制限されている（例えば、とりわけHotら１９９４，Adanら１９９４参照）。しかしながら、最近、タンパク質展示ファージスクリーニングによって見いだされたペプチドは、ＭＣ−受容体に対する他のサブタイプと比較して、ＭＣ１−受容体に対するより高い親和性を示した（Szandenlingら１９９７）ことが記載された。しかしながら、臨床的および他の使用では、このペプチドは、１）ＭＣ１−受容体に対する比較的低い親和性、２）他のペプチドホルモンと比較してＭＣ１−受容体に対する低いアゴニスト効果、および３）酸化可能ＳＨ基の存在およびタンパク質分解切断に関する不安定な性質による低い安定性のために、劣った特性を示した。
【００１６】
ＭＣ１−受容体を選択的に調節する手段および方法を提供する要望が依然としてある。それにより、ＭＣ１−受容体を発現する組織および細胞に関連するプロセスおよび条件に影響する薬理学的効果は誘導できる。これらのプロセスおよび条件は免疫応答、炎症プロセス、免疫寛容、免疫モジュレーション、アレルギープロセス、生殖プロセス、メラノーマおよびＭＣ１−受容体発現細胞に関する悪性病を含むがそれに限定されない。
【００１７】
ＭＣ１−受容体を選択的かつ高い能力をもって活性化する化学化合物を提供し、ＭＣ１−受容体に対する他のホルモンおよびアゴニストの作用に選択的かつ非常に高い能力をもって拮抗する化学化合物を提供し、該化合物のヒトを含めた動物への投与方法を提供する要望がさらにある。
【００１８】
本発明により、ＭＣ１−受容体発現細胞におけるｃＡＭＰ形成の効果的な刺激と組み合わせてＭＣ１−受容体に対する高い選択性および高い親和性を示す新規化合物が開示される。他方、本発明の化合物は、ＭＣ−受容体の他のサブタイプに対する低いまたは無視できる親和性を示す。
【００１９】
また、本発明により、酸化窒素（ＮＯ）の生産を阻害する新規化合物が開示される。
【００２０】
また、本発明により、免疫変調性および抗炎症性である新規化合物が開示される。
【００２１】
本発明による化合物は、一般式（１）：
【００２２】
【化５】
0004584450.tif 000002
【００２３】
［式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１およびＲ１２はそれぞれ独立してＨおよびメチルから選択され、Ｈが好ましく、
また式中Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５およびＲ１６は、それぞれ独立してＨおよびアルキル、とりわけメチル、エチル、プロピル、イソプロピルから選択されるアルキルから選択され、式中Ｒ１３の１つの水素およびＲ１４の１つの水素は、任意にＲ１３とＲ１４間の結合に置き換えられ、式中Ｒ１５の１つの水素およびＲ１６の１つの水素が、任意にＲ１５とＲ１６間の結合に置き換えられ、式中Ｌ１とＬ２は独立して単結合、メチル、エチルからなる群より選択され、好ましくは単結合であるリンカーであり、
また式中Ｒ１９、Ｒ２０およびＲ２１はそれぞれ独立して、Ｈおよび−ＣＨ2Ｘから選択され、ここでＸはＨ、アルキル、置換アルキル、ヘテロアルキル、置換へテロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、ヘテロアルケニル、置換へテロアルケニル、アルキニル、置換アルキニル、ヘテロアルキニル、置換へテロアルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロへテロアルキル、置換シクロへテロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、シクロへテロアルケニル、置換シクロへテロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換へテロアリール官能基であり、
また式中ＮＴはＨ、ヒドロキシ、アルキル、アミノ酸、アミノ酸アナログ、ポリペプチドおよび官能基より選択され、ＣＴは水素、ヒドロキシル、アルキル、アミノ酸、アミノ酸アナログ、ポリペプチドおよび官能基から選択され、式中それぞれの不斉中心（*）はＲまたはＳ配置］
によって表される。
【００２４】
好ましくは、Ｒ２０は−ＣＨ2Ｘ、Ｘはフェニルである。
【００２５】
式（１）による化合物はペプチドを表すことが認識されるが、さらに本発明の化合物は式（１）によるペプチドに限定されず、ペプチド骨格の窒素の１つまたはいくつかが水素で置換された炭素に置き換えられた、および／またはペプチド骨格のカルボニル基の酸素の１つまたはいくつかが２つの水素に置き換えられた化合物も含むことが理解される。
【００２６】
本発明の化合物（１）の好ましい立体配置は式（２）：
【００２７】
【化６】
0004584450.tif 000003
【００２８】
［式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１およびＲ１２はそれぞれ独立してＨおよびメチルから選択され、Ｈが好ましく、
また式中Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５およびＲ１６は、それぞれ独立してＨおよびアルキル、とりわけメチル、エチル、プロピル、イソプロピルから選択されるアルキルから選択され、式中Ｒ１３の１つの水素およびＲ１４の１つの水素は、任意にＲ１３とＲ１４間の結合に置き換えられ、式中Ｒ１５の１つの水素およびＲ１６の１つの水素が、任意にＲ１５とＲ１６間の結合に置き換えられ、
また式中Ｒ１９、Ｒ２０およびＲ２１はそれぞれ独立して、Ｈおよび−ＣＨ2Ｘから選択され、ここでＸはＨ、アルキル、置換アルキル、ヘテロアルキル、置換へテロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、ヘテロアルケニル、置換へテロアルケニル、アルキニル、置換アルキニル、ヘテロアルキニル、置換へテロアルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロへテロアルキル、置換シクロへテロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、シクロへテロアルケニル、置換シクロへテロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換へテロアリール官能基であり、
また式中ＮＴはＨ、ヒドロキシ、アルキル、アミノ酸、アミノ酸アナログ、ポリペプチドおよび官能基より選択され、ＣＴは水素、ヒドロキシル、アルキル、アミノ酸、アミノ酸アナログ、ポリペプチドおよび官能基から選択される］
で開示される。
【００２９】
式（２）による化合物では、Ｒ２０の好ましい置換基はフェニルである。
【００３０】
式（２）による化合物はペプチドを表すことが認識されるが、さらに本発明の化合物は式（２）によるペプチドに限定されず、ペプチド骨格の窒素の１つまたはいくつかが水素で置換された炭素に置き換えられた、および／またはペプチド骨格のカルボニル基の酸素の１つまたはいくつかが２つの水素に置き換えられた化合物も含むことが理解される。
【００３１】
本発明によると、とくに好ましい化合物（３）が開示され、これは以下においてＭＳ０５（配列番号：１）と称される：
【００３２】
【化７】
0004584450.tif 000004
【００３３】
また、本発明は、一般式（４）で詳細に記載するごとく、式（１）、（２）および（３）による化合物の断片も含み、ここで５つの部分Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅは定義される：
【００３４】
【化８】
0004584450.tif 000005
【００３５】
［式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１およびＲ１２はそれぞれ独立してＨおよびメチルから選択され、Ｈが好ましく、
また式中Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５およびＲ１６は、それぞれ独立してＨおよびアルキル、とりわけメチル、エチル、プロピル、イソプロピルから選択されるアルキルから選択され、式中Ｒ１３の１つの水素およびＲ１４の１つの水素は、任意にＲ１３とＲ１４間の結合に置き換えられ、式中Ｒ１５の１つの水素およびＲ１６の１つの水素が、任意にＲ１５とＲ１６間の結合に置き換えられ、式中Ｌ１とＬ２は独立して単結合、メチル、エチルからなる群より選択され、好ましくは単結合であるリンカーであり、
また式中Ｒ１９、Ｒ２０およびＲ２１はそれぞれ独立して、Ｈおよび−ＣＨ2Ｘから選択され、ここでＸはＨ、アルキル、置換アルキル、ヘテロアルキル、置換へテロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、ヘテロアルケニル、置換へテロアルケニル、アルキニル、置換アルキニル、ヘテロアルキニル、置換へテロアルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロへテロアルキル、置換シクロへテロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、シクロへテロアルケニル、置換シクロへテロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換へテロアリール官能基であり、
また式中ＮＴはＨ、ヒドロキシ、アルキル、アミノ酸、アミノ酸アナログ、ポリペプチドまたは官能基より選択され、ＣＴは水素、ヒドロキシル、アルキル、アミノ酸、アミノ酸アナログ、ポリペプチド、官能基から選択され、式中それぞれの不斉中心（*）はＲまたはＳ配置であり、
ここで、部分Ａは任意に水素、ヒドロキシル、アルキル、アミノ酸、アミノ酸アナログ、ポリペプチド、または官能基に置き換えられ、
ここで、部分Ｂは任意に水素、ヒドロキシル、アルキル、アミノ酸、アミノ酸アナログ、ポリペプチド、または官能基に置き換えられ、
ここに、部分Ｄは任意に、アミノ酸またはアミノ酸アナログに置き換えられ、  および、ここで、部分Ｅは任意に、アミノ酸またはアミノ酸アナログに置き換えられる。
【００３６】
式（４）による本発明のさらに有利な実施態様において、部分Ｃはアミノ酸またはアミノ酸アナログに置き換えられ、他方、部分ＤおよびＥは保持される。
【００３７】
式（４）による本発明のさらに有利な実施態様において、部分Ｄはアミノ酸またはアミノ酸アナログに置き換えられ、他方、部分ＤおよびＥは保持される。
【００３８】
前記定義された式（４）による本発明のさらに有利な実施態様において、部分Ｅはアミノ酸またはアミノ酸アナログに置き換えられ、他方、部分ＣおよびＤは保持される。
【００３９】
本発明のある好ましい実施態様において、式（１）、（２）または（４）による化合物のＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１およびＲ１２のうちの１つまたはいくつかはメチルであるように選択され、他方、残りは水素であるように選択され、該選択はプロテアーゼおよび／またはペプチダーゼによる分解を減少または減速するようになされる。さらに、式（１）、（２）および（４）による化合物のペプチド骨格は、各々、他の原子、好ましくは酸素、炭素および水素によって炭素、窒素および酸素を置き換えることによって修飾して、プロテアーゼおよび／またはペプチダーゼによる分解を防ぎ、または減速することができる。
【００４０】
本発明のより有利な実施態様において、式（１）、（２）および（４）による化合物におけるＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１およびＲ１２の６未満、好ましくは５未満、より好ましくは４未満、好ましくは２未満がメチルであるか、最も好ましくは１つもメチルでないように選択される。
【００４１】
さらに、式（１）、（２）および（４）による化合物のペプチド骨格は、他の原子によって炭素、窒素および酸素原子を置き換えて、プロテアーゼまたはペプチダーゼによる分解を防ぎ、または減速することができ、炭素に対しては酸素であり、窒素に対しては炭素であり、酸素に対しては水素が好ましい置換基である。本発明のこの側面の好ましい実施態様において、該ペプチド骨格炭素、窒素および酸素原子の５未満、より好ましくは４未満、さらにより好ましくは３未満、最も好ましくは１未満が、酸素、炭素または水素に置き換えられる。
【００４２】
本明細書において、用語「ペプチド骨格」とは、式（１）、（２）および（４）においてその太文字によって印される原子をいう。
【００４３】
加えて、Ｒ１９、Ｒ２０およびＲ２１は、プロテアーゼまたはペプチダーゼによるその消化が遅延されまたは防止される修飾化合物を提供するように選択し得る。
【００４４】
メチルによる５以下の、好ましくは４以下、より好ましくは３以下、より好ましくは３以下、さらにより好ましくは２以下、最も好ましくは１以下の置き換えによる、より小さな構造改変に付された式（１）、（２）、（３）または（４）の化合物は本発明に含まれる。
【００４５】
本発明はトリフルオロ酢酸塩を含めた公知の酸による本発明の化合物の塩を含み、薬学的に許容し得る塩が好ましい。
【００４６】
本発明の好ましい実施態様において、内因性酵素による本発明の化合物の迅速な分解が、より短い半減期の医薬を提供するために望ましい。しかしながら、かかる化合物は「ヒット・アンド・ラン」薬物として作用し得ると認識され、その生物学的作用は、本発明の化合物が各動物において検出できる以内の時間を超えて拡大され；この効果はＭＣ１−受容体の延長された活性化による。
【００４７】
また、前記開示の本発明の化合物の構造的改変、とくに置換基Ｒ１９、Ｒ２０およびＲ２１の適当な選択は、ＭＣ１−受容体を選択的活性化または選択的遮断のいずれかの能力を有する化合物を提供するようになすことができる。本発明の化合物によるＭＣ１−受容体の典型的な活性化は、ＭＣ１−受容体に関連する生物学的応答および薬理学的効果のみならず、実施例３に示すごとき二次メッセンジャー要素ｃＡＭＰの産出の刺激を導く。また、ＭＣ１−受容体の活性化は、受容体の脱感作および／または受容体のダウンレギュレーションを導くことができ、そのいくらかは今度は生物学的応答および／またはｃＡＭＰの蓄積を生じさせるためのＭＣ１−受容体の能力の減少を導くことができる。本発明のいくつかの実施態様において、ＭＣ１−受容体脱感作および／またはＭＣ１−受容体のダウンレギュレーションを供する能力は望ましい効果である。さらに、本発明のさらなる実施態様において、ＭＣ１−受容体のアップレギュレーションおよび／または発現の増加も、本発明の化合物の投与によって供することができ、これは高度に望ましい効果であり得る。
【００４８】
他方、ＭＣ１−受容体の本発明の化合物による典型的な遮断は、内因性または外因性ＭＳＨペプチド、ペプチドアナログまたはＭＣ１−受容体の刺激性化合物による生物学的応答の誘導を妨げるであろう。
【００４９】
典型的にはＭＣ１−受容体を活性化させる能力を示す本発明による化合物は、式（１）、（２）または（４）に適合する化合物によって表され（それに限定されず）、ここで、Ｒ２０は−ＣＨ2Ｘ、Ｘはアリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、フェニルまたは置換フェニルである。典型的にはＭＣ１−受容体を遮断する能力を示す本発明の化合物は、式（１）、（２）または（４）に適合する化合物によって表され（それに限定されず）、ここで、Ｒ２０は−ＣＨ2Ｘ、Ｘはアリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ナフタレンまたは置換ナフタレンである。
【００５０】
本発明のさらなる実施態様は、インターロイキン１（ＩＬ−１）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、および腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）の形成を減少させ、酸化窒素の減少した生産を供し、および酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）の活性をダウンレギュレートする化合物に指向される。本発明の他の実施態様は、インターロイキン８（ＩＬ−８）および／またはインターロイキン１０（ＩＬ−１０）の生産を刺激する化合物に指向される。本発明のさらなる他の実施態様は、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、酸化窒素、ＮＯＳ、ＩＬ−８およびＩＬ−１０に関して記載されたものとは反対の効果を生じるものに指向される。
【００５１】
本発明の化合物は当該分野で公知の通常の化学技術によって製造することができる。それらは実施例１．１に記載されたＭＳ０５の合成が例示される。
【００５２】
また、本発明の化合物は、当該分野で公知の通常の分子生物学的技術によって製造することもできる。この場合、式（１）、（２）、（３）または（４）に適合するペプチドをコードするＤＮＡ−配列が、典型的には、まず製造される。ついで、かくして得られたＤＮＡを通常の発現系で使用される発現ベクターへ組み込む。また、適当な発現系は当該分野で公知であり、真核生物または原核生物細胞を含む。分子生物学技術を用いる本発明の化合物の製造のこの可能性のため、本発明は本発明の化合物をコードするＤＮＡも含む。本発明の化合物をコードするＤＮＡは、３’および５’末端の一方または双方において他のＤＮＡに結合することができる。したがって、本発明は、本発明の化合物をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡを含む。本発明の化合物をコードするＤＮＡはベクター中に存在することができ、そこで、それは３’および５’末端の一方または双方において他のＤＮＡに結合する。したがって、本発明は本発明の化合物をコードするＤＮＡを含むベクターを含む。
【００５３】
また、本発明は、本発明の化合物の配列の１つまたはいくつかのコピーからなる融合蛋白質を含む。かかる融合蛋白質は、典型的には、前記した原理にしたがい適当なＤＮＡを利用することによる、および当該分野でよく知られている手法の適用による発現系の使用によって製造される。
【００５４】
また、本発明は、本発明の化合物の１つまたはいくつかのコピーのアミノ酸配列をからなる融合蛋白質をコードするＤＮＡを含むベクターを含む。本発明によると、ＤＮＡは化学的に改変された非天然ＤＮＡと交換することができ、該非天然ＤＮＡはペプチドまたは蛋白質合成に関して天然ＤＮＡと同一の機能を実質的に供することができる。さらに、本発明によるＤＮＡはＲＮＡと交換することもできる。非天然ＤＮＡまたはＲＮＡを動物、とくにヒトに投与する場合、ＲＮＡまたは非天然ＲＮＡを使用するのがとくに有利である。それは、動物またはヒトの内因性ＤＮＡと組み換えられるＲＮＡまたは非天然ＤＮＡの回避のためであり、かくして、長期の副作用の危険を減少させる。
【００５５】
本明細書で、それ自体またはほかの基の一部として使用される用語「アルキル」とは、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、四級ブチル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチルまたはオクチルのごとき、炭素原子１８までの、好ましくは１から８までの直鎖または分岐鎖炭化水素鎖を含む。
【００５６】
本明細書で、それ自体またはほかの基の一部として使用される用語「ヘテロアルキル」とは、１つまたは数個の原子がヘテロ原子に置き換えられたアルキルをいう。
【００５７】
本明細書で、それ自体またはほかの基の一部として使用される用語「アルケニル」とは、プロペニル、ブテニル、ペンテニルのごとき、１つまたは数個の炭素−炭素二重結合を含む、炭素原子１８までの、好ましくは２から８までの直鎖または分岐鎖炭化水素鎖を含む。
【００５８】
本明細書で、それ自体またはほかの基の一部として使用される用語「ヘテロアルケニル」とは、１つまたは数個の炭素原子がヘテロ原子に置き換えられたアルケニルをいう。
【００５９】
本明細書で、それ自体またはほかの基の一部として使用される用語「アルキニル」とは、１つまたは数個の炭素−炭素三重結合を含有するアルキルまたはアルケニルをいう。
【００６０】
本明細書で、それ自体またはほかの基の一部として使用される用語「ヘテロアルキニル」とは、１つまたは数個の炭素−炭素三重結合を含有するヘテロアルキルまたはヘテロアルケニルをいう。
【００６１】
本明細書で、それ自体またはほかの基の一部として使用される用語「シクロアルキル」とは、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチルのごとき、炭素原子３から１２個まで、好ましくは３から８個までを含有する環状炭化水素をいい、これは、任意に１または２の環と融合していてもよく、各環は独立してシクロアルキル、シクロヘテロアルキル、シクロアルケニル、シクロヘテロアルケニル、アリールおよび／またはヘテロアリールよりなる群から選択される。
【００６２】
本明細書で、それ自体またはほかの基の一部として使用される用語「シクロヘテロアルキル」とは、１つまたは数個の炭素原子がヘテロ原子置き換えられたシクロアルキルをいう。
【００６３】
本明細書で、それ自体またはほかの基の一部として使用される用語「シクロアルケニル」とは、シクロペンテニルおよびシクロヘキセニルのごとき、１つまたは数個の炭素−炭素二重結合を含有するシクロアルキルをいう。
【００６４】
本明細書で、それ自体またはほかの基の一部として使用される用語「シクロヘテロアルケニル」とは、炭素間、炭素およびヘテロ原子間の１またはそれ以上の結合が二重結合であるシクロヘテロアルキルをいう。
【００６５】
本明細書で、それ自体またはほかの基の一部として使用される用語「アリール」とは、独立して、シクロアルキル、シクロヘテロアルキル、シクロアルケニル、シクロヘテロアルケニル、アリール、ヘテロアリールから選択される１つまたは２つの環と、任意に融合していてもよいフェニルをいう。
【００６６】
本明細書で、それ自体またはほかの基の一部として使用される用語「ヘテロアリール」とは、１またはそれ以上のヘテロ原子を含み、任意に、独立してシクロアルキル、シクロヘテロアルキル、シクロアルケニル、シクロヘテロアルケニル、アリール、ヘテロアリールから選択される１つまたは２つの環と融合していてもよい、５−から１２−員環の芳香族環、好ましくは５−から６−員環の芳香族環をいう。
【００６７】
用語「置換された」とは、それぞれ独立して、アルキル、フッ素化アルキル、アルケニル、フッ素化アルケニル、アルキニル、フッ素化アルキニル、シクロアルキル、フッ素化シクロアルキル、シクロヘテロアルキル、フッ素化シクロヘテロアルキル、シクロルケニル、フッ素化シクロルケニル、シクロヘテロアルケニル、フッ素化シクロヘテロアルケニル、アリール、フッ素化アリール、ヘテロアリール、フッ素化ヘテロアリール、官能基によって、１つまたはそれ以上の水素が置換されていることをいう。さらに、もし用語「置換された」と連結した構造が、もう１つの環状構造または他の環状構造と融合した環状構造であれば、後者の環状構造もまた置換され得る。
【００６８】
本明細書で、それ自体またはほかの基の一部として使用される用語「ハロゲン」とは、塩素、臭素、フッ素およびヨウ素をいい、塩素が好ましい。
【００６９】
本明細書で、それ自体またはほかの基の一部として使用される用語「ヘテロ原子」とは、それに対して１つまたはそれ以上の水素がその原子価にしたがって結合され得る窒素、酸素または硫黄をいい、ここで、窒素の場合、１つの酸素原子が、任意にドナーアクセプター結合によって窒素に結合し得、かくして、Ｎ−オキシドを形成する。
【００７０】
本明細書で、それ自体またはほかの基の一部として使用される用語「官能基」とは、アミノ、アシルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、アリールアジド、ヘテロアリールアミノ、ヘテロアリールアジド、ヒドロキシ、アルキルヒドロキシ、フッ素化アルキルヒドロキシ、シアノ、カルボキシ、アシルカルボキシ、アリールカルボキシ、ハロゲン、ニトロ、ヒドロキシルアミノ、アシル、フッ素化アシル、ニトロソ、スルホニル、スルフィニル、チオ、アルキルチオ、アシルチオをいう。
【００７１】
本明細書で、それ自体またはほかの基の一部として使用される用語「融合した」とは、１つまたはそれ以上の共通する原子を有する２つまたは３つの環をいい、融合した環の好ましい最大数は３である。
【００７２】
本明細書で、それ自体またはほかの基の一部として使用される用語「アミノ酸」とは、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、ｐ−ベンゾイル−フェニルアラニン、β−シクロヘキシル−アラニン、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、β−（２−ナフチル）−アラニン、ノルロイシン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、３，４−ジクロロフェニルアラニン、４−フルオロフェニルアラニン、４−ニトロフェニルアラニン、２−チエニルアラニン、３−ベンゾチエニルアラニン、４−シアノフェニルアラニン、４−ヨードフェニルアラニン、４−ブロモフェニルアラニン、４，４’−ビフェニルアラニン、ペンタフルオロフェニルアラニン、β，β−ジフェニルアラニン、Ｄ−もしくはＬ−立体配置のいずれかで、Ｄ−Ｌ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、ならびに以下の一般的構造（５）：
【００７３】
【化９】
0004584450.tif 000006
【００７４】
［式中、ＺはＨまたは−ＣＨ2Ｘ、ここで、ＸはＨ、アルキル、置換アルキル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、ヘテロアルケニル、置換ヘテロアルケニル、アルキニル、置換アルキニル、ヘテロアルキニル、置換ヘテロアルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロヘテロアルキル、置換シクロヘテロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、シクロヘテロアルケニル、置換シクロヘテロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、または官能基であり、ＮＨはＨ、官能基であるかまたはもう１つのアミノ酸に結合しており、ＣＴは官能基であるかまたはもう１つのアミノ酸に結合しており、式（５）による当該化合物はＤ−もしくはＬ−立体配置である］
を有する他の置換基をいう。
【００７５】
本明細書で、それ自体またはほかの基の一部として使用される用語「アミノ酸アナログ」とは、以下の一般的構造（６）：
【００７６】
【化１０】
0004584450.tif 000007
【００７７】
［式中、Ａは、水素および／またはメチルが原子価にしたがって結合した酸素、窒素または炭素であり、
Ｂは、水素および／または酸素が原子価にしたがって結合した酸素または炭素であり、
各不斉中心はＲもしくはＳ立体配置であり、
ＺはＨまたは−ＣＨ2Ｘであり、ここで、ＸはＨ、アルキル、置換アルキル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、ヘテロアルケニル、置換ヘテロアルケニル、アルキニル、置換アルキニル、ヘテロアルキニル、置換ヘテロアルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロヘテロアルキル、置換シクロヘテロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、シクロヘテロアルケニル、置換シクロヘテロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、または官能基であり、ＮＨはＨ、官能基であるかまたはもう１つのアミノ酸に結合しており、またはもう１つのアミノ酸アナログに結合しており、ＣＴは官能基であるかまたはもう１つのアミノ酸に結合しているか、またはもう１つのアミノ酸アナログに結合している］
を有する物質をいう。
【００７８】
本発明の化合物は、ＭＣ−受容体の５つの公知のサブタイプの中で、ＭＣ１−受容体に優先的に結合するその能力を構成するユニークで新規な特性を有する。この能力は文献に記載されている方法を用い、組換えヒトＭＣ−受容体についてのテストにおいて明らかにされる（Schioethら、Eur. J. Pharmacolo., Mol. Pharm. Sect.１９９５，２８８，３１１およびPharmacol.＆Toxicol.１９９６，７９，１６１参照）。これらのテストにおいて、実施例２に記載されたごとくに、ＣＯＳ−１細胞で発現された組換えヒトＭＣ−受容体サブタイプに対する［125Ｉ］−標識ＮＤＰ−ＭＳＨ（［Ｎｌｅ4，Ｄ−Ｐｈｅ7］α−ＭＳＨ）の結合につき競合する化合物の能力を評価した。これらのアッセイによって、以下の解離定数（Ｋiｓ）を本発明の化合物のうちのいくつかにたいして決定した。
【００７９】
【表１】
0004584450.tif 000008
【００８０】
前記表において、非標識ＮＤＰ−ＭＳＨおよび天然α−ＭＳＨ−ペプチドについてのＫi−値は比較のために載せる。表より、本発明のとくに好ましい化合物であるＭＳ０５はα−ＭＳＨと同一のＭＣ１−受容体に対する高親和性を示し、他方、それは、ＭＣ３受容体に対しては１８００倍低い親和性、ＭＣ４およびＭＣ５に対しては６５０００倍以上低い親和性をそれぞれ示す。（前記表において、＞＞５００００は「５００００よりも大きい」を意味することを意図し、これは、ＭＳ０５が５００００ｎＭまでの濃度においてＭＣ４−またはＭＣ５−受容体いずれかに結合する認識できる能力をなにも示さなかったことを意味する）。それにより、ＭＳ０５はＭＣ３、ＭＣ４およびＭＣ５受容体に対するその能力と比較した場合、ＭＣ１−受容体に対して非常に高い選択性を示す。さらに、ＭＳ０５はＭＣ１−受容体に対して非常に高い親和性を有する。表から明らかなように、ＭＳ０９はＭＣ−１受容体に対してそれが極端に高い親和性を有するように本発明のもう１つの好ましい化合物である。これらの特性は、当該分野で公知の化合物と比較して増大した安定性と関連する。その安定性は、容易に酸化可能な基（例えば、システインおよびメチオニンにおけるごとく−ＳＨ基および−ＳＨ−ＣＨ3基）の欠如によるようである。加えて、ＭＳ０５およびＭＳ０９は、従前公知の化合物と比較して二次メッセンジャーｃＡＭＰの生成を刺激するより高い能力を示す（実施例３参照）。ＭＳ０５およびＭＳ０９の非常な高い選択性とｃＡＭＰの形成を刺激する高い選択性および良好な能力との組合せはＭＳ０５およびＭＳ０９を価値あるものとする。実施例３、５および７において、ｃＡＭＰの効果的な刺激を誘導するＭＳ０５およびＭＳ０９の高い能力が示される。
【００８１】
実施例４−７は、メラノーマ細胞およびマクロファージにおける天然ＭＳＨ−受容体（すなわち、天然ＭＣ１受容体）に結合する、ならびにこれらの細胞におけるｃＡＭＰの刺激を誘導する本発明の化合物の能力を示す。実施例８は、ＮＯ生産が炎症剤（細菌リポ多糖およびインターフェロンガンマ）によって刺激された場合にマクロファージにおける酸化窒素（ＮＯ）形成を阻害する本発明の化合物の能力を示す。結果は、本発明の化合物が、本発明の化合物が効果的な抗−炎症剤であるという、さらなる意味ある証明であるＮＯの非常に効果的な阻害剤であることを示す。
【００８２】
本明細書において、用語「二次メッセンジャーｃＡＭＰを刺激する高い能力」とは、実施例３に記載された方法を用い、同一系において１０ｎＭのα−ＭＳＨによって誘導されたものと比較して、実施例３に記載されたＭＣ１−受容体発現細胞におけるｃＡＭＰ−形成の刺激を、少なくとも３５％、好ましくは少なくとも４５％、より好ましくは少なくとも５５％、最も好ましくは少なくとも６５％誘導する１０ｎＭの本発明の能力をいう。
【００８３】
しかしながら、本明細書において、化合物（「化合物」はこの意味では必要な変更を加えて「テスト化合物」ともいう）が、「二次メッセンジャーｃＡＭＰを刺激する高い能力」を示すか否かを判断する好ましい方法は、実施例５に記載された手法を本質的に用い、特異的濃度Ａのテスト化合物をＢ１６−Ｆ１マウスメラノーマ細胞（アメリカン  タイプ  カルチャー  コレクション（American Type Culture Collection））に１０から６０分の間の期間、好ましくは１０〜３０分の期間、最も好ましくは２０分の期間接触させ、ついで、細胞で形成されたｃＡＭＰの量を測定することを構成する。本手法によると、「ｃＡＭＰを刺激する高い能力」とは、テスト化合物と同一の手法を用い、特異的濃度Ａのα−ＭＳＨをＢ１６−Ｆ１マウスメラノーマ細胞に接触させることによって誘導されたものの、少なくとも３０％の量となる、より好ましくは少なくとも４０％の量となる、幾分より好ましくは少なくとも５０％の量となる、なお幾分より好ましくは少なくとも６０％の量となる、さらにより好ましくは少なくとも７０％の量となる、なおさらにより好ましくは少なくとも８０％の量となる、最も好ましくは少なくとも９０％の量となる刺激と定義される。「ｃＡＭＰの刺激」とは、この意味において、ｃＡＭＰの基礎レベルを超えて誘導されたｃＡＭＰの増大したレベルを意図し、ｃＡＭＰの基礎レベルは、接触に割り当てられた時間にテスト化合物またはα−ＭＳＨが存在しないことを除き、細胞をテスト化合物と接触させた場合におけるごとく同一の手法に付されたＢ１６−Ｆ１細胞に存在するｃＡＭＰのレベルと定義される。ｃＡＭＰを刺激するテスト化合物の能力を測定するためのこの手法に従うと、「特異的濃度Ａ」とは、範囲１〜１００ｎＭ内から選択される単一濃度を意図し、１ｎＭが好ましく、１００ｎＭがより好ましく、１０ｎＭが最も好ましい。
【００８４】
ｃＡＭＰとは、この意味で、環状アデノシン３’、５’−モノホスフェート（環状ＡＭＰ）を意図する。
【００８５】
前記で指摘したごとく、本発明の化合物は、ＮＯ生産の効果的な阻害剤である。本明細書においては、化合物（「化合物」はこの意味で必要な変更を加えて「テスト化合物」ともいう）が「ＮＯ生産の効果的な阻害剤」であるか否かを判断する好ましい方法は、実施例８に記載された手法を本質的に用い、特異的濃度Ｂのテスト化合物をマウスＲＡＷ  ２６４．７マクロファージ細胞（アメリカン  タイプ  カルチャー  コレクション）に１〜２２時間接触させ（１０〜２０時間がより好ましく、１６時間が最も好ましい）、該細胞は０〜３００ｎｇ／ｍＬの間の細菌リポ多糖の添加によりＮＯのその生産につき同時に刺激され（５０〜１５０ｎｇ／ｍＬの細菌リポ多糖がより好ましく、１００ｎｇ／ｍＬの細菌リポ多糖が最も好ましい）、また、該細胞は０〜１０ユニット／ｍＬの間のマウス組換えインターフェロンガンマの添加によっても同時に刺激され（３〜７ユニット／ｍＬのマウス組換えインターフェロンガンマがより好ましく、５ユニット／ｍＬのマウス組換えインターフェロンガンマが最も好ましい）、ついで、形成された酸化窒素（ＮＯ）の量を測定することを構成し、該ＮＯは当該分野でよく知られたいずれかの方法によって測定され、ＮＯの形成が、形成されたニトリルの量を測定することによって間接的に決定される実施例８に記載された方法が最も好ましい。本手法によると、ＮＯ生産の効果的な阻害剤とは、テスト化合物と同一の手法を用い、特異的濃度Ｂのα−ＭＳＨをマウスＲＡＷ  ２６４．７マクロファージ細胞に接触させることによって供されたＮＯ生産の阻害の、少なくとも３０％の量となる、より好ましくは少なくとも４０％の量となる、幾分より好ましくは少なくとも５０％の量となる、なお幾分より好ましくは少なくとも６０％の量となる、なおより好ましくは少なくとも７０％の量となる、なおさらにより好ましくは少なくとも８０％の量となる、最も好ましくは少なくとも９０％の量となるＮＯ生産の阻害と定義される。「ＮＯ生産の阻害」とは、この意味において、接触に割り当てられた間にテスト化合物またはα−ＭＳＨが存在しないことを除き、細胞をテスト化合物に接触させた場合のごとく同一の手法に付されたＲＡＷ  ２６４．７細胞で得られたＮＯ生産のレベルからのＮＯ生産の減少を意図する。ＮＯ生産を阻害するテスト化合物の能力を測定するこの手法によると、「特異的濃度Ｂ」とは、範囲０．１〜１００ｎＭ内から選択される単一濃度を意図し、０．１ｎＭが好ましく、１００ｎＭが幾分より好ましく、１ｎＭがより好ましく、１０ｎＭが最も好ましい。
【００８６】
加えて、本発明の化合物の多くは、とくに、式（４）による化合物を含めた式（１）および式（２）に適合するものの多くは、ＭＣ１−受容体に対するその高い選択性および結合親和性を保持しつつ、ペプチダーゼによる分解に対する増大した安定性を示す。これらの特性は、生きた動物、とくにヒトにおいて持続的薬理作用を引き起こすのに、もし全身投与後の体内での延長された半減期が望まれればとくに価値がある。
【００８７】
加えて、本発明の化合物は利点があるという重要な程度までＭＣ２−受容体に結合しない。
【００８８】
本明細書においては、「ＭＣ１／ＭＣ３−選択性」とは、ＭＣ１−受容体に対する化合物のＫi（Ｋi−ＭＣ１）に対するＭＣ３−受容体に対する同一化合物のＫi（Ｋi−ＭＣ３）の比率と定義され、Ｋi値はSchioethら１９９５および１９９６ｂによって記載された方法を用い、実施例２に記載されたごとく測定され；よって、
【００８９】
【数１】
0004584450.tif 000009
【００９０】
本明細書においては、本発明の化合物の「非常に高いＭＣ１／ＭＣ３−選択性」とは、少なくとも６０、好ましくは少なくとも１００、より好ましくは少なくとも２００、なおより好ましくは少なくとも７００、最も好ましくは少なくとも１０００、少なくとも１２００さえのＭＣ１／ＭＣ３−選択性をいう。しかしながら、本発明の現実的に全ての実施態様において、「非常に高いＭＣ１／ＭＣ３−選択性」とは、少なくとも１０、好ましくは少なくとも２０、最も好ましくは少なくとも３０のＭＣ１／ＭＣ３−選択性で充分である。
【００９１】
本明細書において、化合物の「ＭＣ１／ＭＣ４−選択性」とは、ＭＣ１−受容体に対する化合物のＫi（Ｋi−ＭＣ１）に対するＭＣ４−受容体に対する同一化合物のＫi（Ｋi−ＭＣ４）の比率と定義され、Ｋi値はSchiothら１９９５および１９９６ｂによって記載された方法を用い、実施例２に記載されたごとく測定され；よって、
【００９２】
【数２】
0004584450.tif 000010
【００９３】
本明細書においては、本発明の化合物の「非常に高いＭＣ１／ＭＣ４−選択性」とは、少なくとも３００、好ましくは少なくとも１０００、より好ましくは少なくとも３０００、なおより好ましくは少なくとも１００００、最も好ましくは少なくとも２００００、３００００を超えてさえ、５００００さえのＭＣ１／ＭＣ４−選択性をいう。しかしながら、本発明の現実的に全ての実施態様において、「非常に高いＭＣ１／ＭＣ４−選択性」とは、少なくとも３０、好ましくは少なくとも７０、最も好ましくは少なくとも１５０のＭＣ１／ＭＣ４−選択性で充分である。
【００９４】
本明細書において、化合物の「ＭＣ１／ＭＣ５−選択性」とは、ＭＣ１−受容体に対する化合物のＫi（Ｋi−ＭＣ１）に対するＭＣ５−受容体に対する同一化合物のＫi（Ｋi−ＭＣ５）の比率と定義され、Ｋi値はSchiothら１９９５および１９９６ｂによって記載された方法を用い、実施例２に記載されたごとく測定され；よって、
【００９５】
【数３】
0004584450.tif 000011
【００９６】
本明細書においては、本発明の化合物の「非常に高いＭＣ１／ＭＣ５−選択性」とは、少なくとも３００、好ましくは１０００を超えて、より好ましくは少なくとも３０００、なおより好ましくは少なくとも１００００、最も好ましくは少なくとも２００００、３００００を超えてさえ、５００００さえのＭＣ１／ＭＣ５−選択性をいう。しかしながら、本発明の現実的に全ての実施態様において、「非常に高いＭＣ１／ＭＣ５−選択性」とは、少なくとも３０、好ましくは少なくとも７０、最も好ましくは少なくとも１５０のＭＣ１／ＭＣ４−選択性で充分である。
【００９７】
この意味において、ＭＣ１−受容体に対する本発明の化合物の「非常に高い親和性」は、それが、３０ｎＭ未満、好ましくは１５ｎＭ未満、より好ましくは７ｎＭ未満、なおより好ましくは５ｎＭ未満、最も好ましくは３ｎＭ未満、２ｎＭ未満でさえ、１ｎＭ未満のＫi値を呈することを示し、ＭＣ１−受容体に対するＫi値はSchiothら１９９５および１９９６ｂによって記載された方法を用い、実施例２に記載されたごとく測定される。
【００９８】
しかしながら、この意味において、ＭＣ１−受容体に対する本発明の化合物の「非常に高い親和性」は、それが、３０ｎＭ未満、好ましくは１５ｎＭ未満、より好ましくは７ｎＭ未満、なおより好ましくは５ｎＭ未満、最も好ましくは３ｎＭ未満、２ｎＭ未満でさえ、１ｎＭ未満のＫi値を呈することを示し、ＭＣ１−受容体に対するＫi値は、マウスＢ１６−Ｆ１メラノーマ細胞を用い、実施例４に記載されたごとく測定される。
【００９９】
この意味においては、ＭＣ１受容体の使用に言及する場合は常に、またはヒトＭＣ１受容体、またはChhajlani&Wikberg（FEBS Lett,１９９２，３０９，４１７）によって記載されたＭＣ１受容体、またはSchiothらEur. J. Pharmacol. Mol. Pharm. Sect.,１９９５，２８８，３１１〜３１７またはSchiothら，Pharmacol.Toxicol.１９９６，７９，１６１〜１６５によって使用されたＭＣ１受容体に言及する場合は常に、受託番号ＤＳＭ７２１４の下でDeutche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkuluren（ＤＳＭ），Braunschweig，ドイツ国から入手可能であって、特許出願ＰＣＴ／ＤＫ９３／００２７３（ＷＯ９４／０４６７４）に記載されているＤＮＡによってコードされるＭＣ１受容体を意図する。
【０１００】
しかしながら、この意味において、ＭＣ１受容体の使用への言及をなす場合は常に、使用する受容体は本出願のいずれの事項も変更することなく、哺乳動物またはヒト起源のメラノーマ細胞に存在する天然ＭＳＨ−受容体から選択することができ；Ｂ１６−Ｆ１メラノーマ細胞における天然ＭＳＨ−受容体の選択が好ましい選択である。
【０１０１】
ＭＳＨ−受容体に言及する場合は常に、１０ｎＭ以下の解離定数でもって［125Ｉ］ＮＤＰ−ＭＳＨに結合できる結合部位をもまた意図し、解離定数は当該分野でよく知られた放射リガンド結合手法を用いて測定され、好ましいアプローチはSchiothらEur. J. Pharmacol. Mol. Pharm Sect,１９９５，２８８，３１１〜３１７またはSchiothらPharmacol. Toxicol.１９９６，７９，１６１〜１６５によって記載されており、ただし、ＭＳＨ−受容体は哺乳動物またはヒト起源のいずれの天然または非天然細胞系にも存在できるものとする。さらに、ＭＳＨ−受容体の定義によると、［125Ｉ］ＮＤＰ−ＭＳＨ結合はアッセイ手法の間に０．１μＭから１０μＭまでのあいだのα−ＭＳＨの存在によって大いに妨げることができる。
【０１０２】
この意味では、マウスＲＡＷ２６４．７マクロファージ細胞に言及する場合は常に、ＲＡＷ２６４．７マクロファージ細胞はＭＳＨ−受容体を保有する哺乳動物またはヒト起源のいずれかの他の細胞と交換でき、そのＮＯ生産はこの意味を変更することなく、α−ＭＳＨの添加によって阻害される。
【０１０３】
本発明によるとくに好ましい化合物は、構造式（１）、（２）、（３）、（４）のうちの１つまたはいくつかからなり、そのため、高ＭＣ１／ＭＣ３−選択性、高ＭＣ１／ＭＣ４−選択性、高ＭＣ１／ＭＣ５−選択性およびＭＣ１−受容体に対する高い親和性の群から選択される特性のうち１つ、好ましくは２つ、より好ましくは３つ、最も好ましくは４つが組み合わされる。さらに、本発明のさらに好ましい化合物は、該特性が二次メッセンジャーｃＡＭＰを刺激する高い能力と組み合わされるものである。
【０１０４】
用語「ＭＣ１受容体に対する高い選択性」とは、この意味で、高ＭＣ１／ＭＣ３−選択性、高ＭＣ１／ＭＣ４−選択性、高ＭＣ１／ＭＣ５−選択性の群から選択される特性の３つ、より好ましくは２つ、最も好ましくは１つを化合物が示すことを意図する。
【０１０５】
しかしながら、本発明による非常に好ましい化合物は、構造式（１）、（２）、（３）、（４）のうちの１つまたはいくつかからなり、その化合物はＮＯ生産の効果的な阻害剤でもある。
【０１０６】
顕著な陽性処理効果は、ＭＳ０５のＢＡＬＢ／Ｃマウスへの投与に際して見られた。動物を２，４−ジニトロフルオロベンゼン（ＤＮＦＢ）の注射によって感作した。まず、３０μＬの０．５％ＤＮＦＢをマウスの剃った腹部に投与し、４日後、１０μＬの０．３％ＤＮＦＢを１つの足にテストし、もう１つの足はテストせず、コントロールとして供した。０．９％生理食塩水中のＭＳ０５の溶液を用いて感作２時間前にＭＳ０５を腹腔内投与し、ついで、同一用量を４連続日腹腔内投与し、ＭＳ０５の各用量は０．０５、０．２５、０．３７、０．５および０．７５ｍｇ／ｋｇに達した。ＭＳ０５でのこれらの処理は、同一ＤＮＦＢ投与に付したが、ＭＳ０５を与えなかった動物と比較して、各々、３、５、１２、３９および１０％だけ足の浮腫を阻害することが判明した。さらに、これらのテストにおいて、ＤＮＦＢは全血液白血球数の顕著な増加ならびに血液の顆粒球数の顕著な増加を誘導し、全白血球細胞数および顆粒球数の増加はＭＳ０５処理によって本質的に正常化され、最良の効果はＭＳ０５の０．５ｍｇ／ｋｇの毎日の腹腔内投与で観察された。また、ＤＮＦＢ投与は血液中のリンパ球／単球の数を増加させ、これは、ＭＳ０５の投与に際して正常レベルまで本質的に回復した。また、血液血小板数はＤＮＦＢ処理動物で増加した；該増加はＭＳ０５の投与によって正常に向かって回復した。ＢＡＬＢ／ｃマウスの耳のＤＮＦＢ感作によって誘導された浮腫の同様の減少は、０．９％生理食塩水中のＭＳ０５およびＭＳ０９の溶液を用いる、ＭＳ０５またはＭＳ０９いずれかの動物への静脈内注射に際して観察された。かくして、これらの結果は、本発明の化合物が、ハプテンによる接触過敏症、感作を妨げ、改善しおよび／もしくは阻害し、ならびに／または浮腫に対する陽性処理効果を有することを示す。さらに、これらの結果は、本発明の化合物が血液細胞数を正常化できることを示す。従って、本発明の化合物はさらなる意味で免疫変調性である。さらに、これらの結果は、医薬の形態で投与されるべき本発明の化合物の能力を証明する。
【０１０７】
さらなるテストにおいて、ＭＳ０５またはＭＳ０９をイン  ビトロにてヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＥＣ−１細胞；Department of Health & Human Services, Centres for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA30333，USA）に投与した。ＨＭＥＣ−１細胞は、ＴＮＦα（１０ｎｇ／ｍＬ）の投与に際して、接着分子ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭおよびＥ−セレクチンについてのｍＲＮＡのアップレギュレーションされた発現で、ならびにＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭおよびＥ−セレクチンタンパク質のアップレギュレーションによって応答した。ＭＳ０５またはＭＳ０９の投与（ＭＳ０５およびＭＳ０９の好ましい濃度は０．０１ｎＭから１０μＭ内であり、ＭＳ０５またはＭＳ０９と細胞と接触させるための好ましい時間は３〜４８時間である）は、接着分子ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭおよびＥ−セレクチンについてのｍＲＮＡのアップレギュレーションされる発現の阻害、ならびにＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭおよびＥ−セレクチンタンパク質のアップレギュレーションの阻害に導いた。これらの結果は、本発明の化合物能力が免疫変調性であり、血管系に関連する炎症の治療で有用であること、例えば、脈管炎で陽性の治療効果を有することを示す。これに関連して、ＩＣＡＭ−１は細胞内接着分子タイプ１を意図し、ＶＣＡＭとは、血管接着分子を意図し、Ｅ−セレクチンとは、内皮セレクチンを意図する（Sluiterら, J. Cardiovasc. Pharmaol.1993,22 Suppl 4:S37-44;Elangbamら Wt.Pathol.1997 Jan,34(1):61-73）。
【０１０８】
本発明の化合物は、動物、とくに哺乳動物において予防的処置を含めた病気および障害および／または病理学的状態の治療および診断で使用することができるが、それらはヒトにおいてこれらの目的で最も好ましく使用される。さらに、本発明の化合物は、その生理学的状態を変化させるために健康な個体においておよび健康な動物において使用することもできる。
【０１０９】
かかる治療および診断において、本発明の化合物は、さらに、薬学的に許容される担体ならびに任意により錠剤化剤、湿潤剤、結合剤および充填剤、抗酸化剤および抗微生物剤のごとき保存剤、緩衝剤および塩を含む医薬組成物の形態で投与される。好ましい担体は注射媒体、とくに水を含む。該組成物は経口、腸、直腸および非経口経路を含めたいずれかの通常の経路によって投与される。非経口経路は静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内注射を含む。本発明の化合物は鼻孔スプレイのような吸入によって、および皮膚に局所的に投与することもできる。それらは、硬膜、鞘内および脳心室内投与することもできる。
【０１１０】
とくに、薬理学的に効果的な量の本発明の化合物を含有する医薬組成物は、とくにＭＣ１−受容体の刺激によって正に影響される、あるいはＭＣ１−受容体の遮断によって、および／またはダウンレギュレーションによって、および／または脱感作によって正に影響される状態にある生理学的状態の改変、診断、予防または治療的処置のために、動物、とくにヒトに投与される。かかる状態の例はいずれかのタイプおよびいずれかの起源の炎症を含む。とくにそれにつき炎症またはいずれかの関連状態ならびにマクロファージ、好中球、単球、ケラチノサイト、繊維芽細胞、メラノサイト、色素細胞および内皮細胞の作用を含めた状態を意図する。さらに、インターロイキン、とくにインターロイキン１（ＩＬ−１）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、および腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）のごとき炎症性サイトカインの増大した生産および／または放出によって引き起こされたまたはそれらに関連する状態が含まれる。かくして、本発明の化合物はヒト、哺乳動物および動物における免疫変調性治療で有用である。また、酸化窒素（ＮＯ）の増大した生産ならびに酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）のアップレギュレーションされた活性に関連する状態も意図する。さらに、本発明の化合物は精巣および卵巣に関連する疾患を治療するのに有用である。
【０１１１】
本明細書においては、「増大した生産」とは、健康な個体における当該内因性化合物の含有量と比較して、患者における内因性化合物の局所的、領域的または全身的に増大した形成、増大した放出、または増大した含有量をいう。本明細書では、「アップレギュレーションされた」とは、健康な個体におけるそれと比較した化合物の増大した活性または含有量をいう。
【０１１２】
本明細書では、「減少した生産」とは、健康な個体における当該内因性化合物の含有量と比較して、患者における該内因性化合物の減少した形成、減少した放出、または減少した含有量をいう。本明細書では、「ダウンレギュレーションされた」とは、健康な個体におけるそれと比較した化合物の減少した活性または含有量をいう。
【０１１３】
とくに、陽性治療効果または予防的効果は、炎症または炎症様疾患が以下の１またはそれ以上によって引き起こされたまたはそれに関連する疾患で見られる。アレルギー、過敏症、細菌感染、ウイルス感染、毒性剤によって引き起こされた炎症、発熱、自己免疫疾患、ＵＶ−放射、Ｘ−線放射、γ−放射、α−もしくはβ−粒子、日焼け、温度上昇、機械的負傷を含める原因によって引き起こされた放射損傷。さらに、任意により続いて低酸素症領域への再酸素付与（reoxygenation）による低酸素症のための炎症は、典型的には、続いてひどい炎症が起こり、この疾患は本発明の化合物での治療によって正に影響される。
【０１１４】
本発明の非常に具体的な実施態様において、本発明の化合物は、炎症成分を有する皮膚病を含めた、いずれかの器官の（真皮および表皮を含めた）皮膚の炎症病の予防または治療的処置のために投与される。本発明のこの実施態様の具体的な例は、皮膚の接触皮膚炎、皮膚の日焼け、いずれかの原因の火傷、および化学剤によって引き起こされた皮膚の炎症、乾癬、脈管炎、壊疽性膿皮症、円盤状紅斑性狼瘡、湿疹、掌蹠膿疱症、尋常性フェンフィガス（phemphigus vulgaris）の治療を含む。
【０１１５】
また、炎症成分を有する腹部病を含めた腹部における炎症病の治療のための本発明の化合物の投与は本発明に含まれる。本発明の化合物でのかかる病気の治療の具体的例は、未知の原因のものを含む胃炎、悪性胃炎（萎縮性胃炎）、潰瘍性大腸炎（大腸炎潰瘍）、クローン病、全身性硬化症、十二指腸潰瘍、小児脂肪便症、食道炎および胃潰瘍である。
【０１１６】
また、自己免疫的性質のもの、および一般的性質の他の炎症性病気を含めた、全身または全身性および／もしくは局所的免疫病の治療のための本発明の化合物の投与も本発明に含まれる。具体的例は慢性関節リウマチ、乾癬性関節炎、全身性硬化症、リウマチ性多発性筋痛、ヴェーゲナー内芽腫症、サルコイドーシス、好酸球性筋膜炎、反応性関節炎、ベクテリエフ病、全身性紅斑性狼瘡、側頭動脈炎、ベーチェット病、バーガー疾病（morbus Burger）、グッドパスチャー症候群、好酸球性肉芽腫、筋線維痛（fibromyalgia）、筋炎、および複合化結合組織病を含む。また、それには未知起源の関節炎を含めた関節炎も含まれる。
【０１１７】
さらに、炎症に関連した末梢および中枢神経系の病気の治療のための本発明の化合物の投与が本発明に含まれる。脳脈管炎、多発性硬化症、自己免疫性眼球炎、多発性神経障害の治療が本発明のこの態様に含まれる。また、アポトーシス細胞死滅を防止するための中枢神経系の炎症の治療のための本発明の化合物の投与も本発明に含まれる。さらに、本発明の化合物は神経再生を誘導する明らかな能力を示すので、この領域における細胞の損傷を含めた中枢神経系病で陽性治療効果がしばしば見られる。また、本発明のこの態様は、中枢神経系に対する外傷負傷、脳浮腫、多発性硬化症、アルツハイマー病、中枢神経系における細菌性およびウイルス性乾癬、発作、および中枢神経系における出血の治療を含む。
【０１１８】
また、炎症に関連した眼および涙腺の病気の治療のための本発明の化合物の投与も本発明に含まれる。かかる病気の具体的例は前および後ブドウ膜炎、網膜脈管炎、網膜血管炎、視神経炎、ヴェーゲナー筋芽腫症、シェーグレン症候群、上強膜炎、強膜炎、眼の疾患のサルコイドーシスおよび眼の疾患の多発性軟骨炎を含む。
【０１１９】
また、炎症に関連する耳の病気の治療のための本発明の化合物の投与も本発明に含まれ、その具体的例は耳の疾患の多発性軟骨炎および外耳炎を含む。
【０１２０】
また、炎症に関連する鼻の病気の治療のための本発明の化合物の投与も本発明に含まれ、その具体的例はサルコイドーシス、多発性軟骨炎および鼻の正中線肉芽腫である。
【０１２１】
また、口、咽頭および唾液腺の炎症に関連した病気の治療のための本発明の化合物の投与も本発明に含まれる。具体的例はこれらの領域におけるヴェーゲナー筋芽腫症、正中線肉芽腫、シェーグレン症候群および多発性軟骨炎を含む。
【０１２２】
また、肺における炎症に関連した病気の治療のための本発明の化合物の投与も本発明に含まれる。具体的例は特発性肺胞炎、原発性肺高血圧、気管支炎、慢性気管支炎、サルコイドーシス、炎症全身病における肺胞炎、炎症全身性病気における肺高血圧、ヴェーゲナー芽腫症およびグッドパスチャー症候群を含む。
【０１２３】
また、心臓の炎症の関連した病気の治療のための本発明の化合物の投与も本発明に含まれる。具体的例は心外膜炎、特発性心外膜炎、筋炎、高安動脈炎、川崎病、冠動脈脈管炎、炎症全身性病気における心膜炎、炎症全身性病気における筋炎、心内膜炎および炎症全身性病気における心内膜炎を含む。
【０１２４】
また、肝臓の炎症に関連した病気の治療のための本発明の化合物の投与も本発明に含まれる。具体的例は肝炎、慢性活動的肝炎、胆汁性肝硬変、毒性剤による肝障害、インターフェロン誘導肝炎、ウイルス感染によって誘導された肝炎、無酸素症によって誘導された肝障害、機械的外傷によって引き起こされた肝障害の治療を含む。
【０１２５】
また、膵臓の炎症に関連する病気の治療のための本発明の化合物の投与も本発明に含まれる。具体的例は糖尿病、急性膵炎、慢性膵炎の治療（および予防）を含む。
【０１２６】
また、甲状腺の炎症に関連する病気の治療のための本発明の化合物の投与も本発明に含まれる。本発明のこれらの実施態様の具体的例は甲状腺炎、自己免疫性甲状腺炎および橋本甲状腺炎を含む。
【０１２７】
また、腎臓の炎症に関連する病気の治療のための本発明の化合物の投与も本発明に含まれる。具体例は糸球体腎炎、全身性紅斑狼瘡における糸球体腎炎、結節性動脈周囲炎、ヴェーゲナー肉芽腫、グッドパスチャー症候群、ＨＬＡｂ２７関連病、ＩｇＡ腎炎（ＩｇＡ＝免疫グロブリンＡ）、腎盂腎炎、慢性腎盂腎炎および間質性腎炎を含む。
【０１２８】
また、関節の炎症に関連した病気の治療のための本発明の化合物の投与も本発明に含まれる。具体的例はベーチット病、乾癬性関節炎、慢性関節リウマチ、大腸潰瘍における関節炎、クローン病における関節炎、全身性紅斑狼瘡における関節の障害、全身性硬化症、混合結合組織病、反応性関節炎、ライター症候群を含む。さらに、いずれかの関節の関節症、とくに指関節、膝および腰の関節症の治療は本発明のこの具体例に含まれる。
【０１２９】
また、血管の炎症に関連する病気の治療のための本発明の化合物の投与も本発明に含まれる。具体的例は側頭筋動脈炎、結節性動脈周囲炎、動脈硬化症、高安動脈炎、川崎病を含む。動脈硬化症に対する保護およびその予防を供する本発明の化合物の能力はとくに有利である。これは、部分的には、内皮細胞および血管壁の酸化された低密度リポタンパク質の作用によって引き起こされた誘導性酸化窒素シンターゼ（ｉＮＯＳ）の誘導を防止する本発明の化合物の能力による。
【０１３０】
また、血液細胞および血液細胞形成器官（例えば、骨髄およびリンパ組織）の疾患である（薬物過敏症を含めた）薬物誘導過敏症の治療を含む、血液およびリンパ系の薬物誘導障害の治療のための本発明の化合物の投与も、本発明に含まれる。本発明のこの態様の具体的実施態様は貧血、顆粒球減少症、血小板減少症、白血球減少症、再生不能貧血、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少症および自己免疫性顆粒球減少症を含む。
【０１３１】
また、本発明の化合物は即時性アレルギー障害（Ｉ型アレルギー）の治療のために投与することもできる。アナフィラキシー反応、アナフィラキシー様反応、喘息、アレルギー型の喘息、未知の原因による喘息、鼻炎、枯草熱および花粉アレルギーの治療は本発明のこの具体例に含まれる。
【０１３２】
また、いずれかの起源の感染に関連する炎症の治療のための本発明の化合物の投与も本発明に含まれる。具体的例はウイルス、細菌、蠕虫および原虫によって引き起こされた感染に二次的な炎症の治療を含む。
【０１３３】
また、外傷およびいずれかの原因の組織損傷に関連する炎症の治療のための本発明の化合物の投与も本発明に含まれる。
【０１３４】
表皮細胞における色素形成を刺激する本発明の化合物の能力のため、本発明の化合物は、美容的理由のための、白斑または皮膚の色の暗色化が所望される任意の疾患の治療のための皮膚日焼け（skin tanning）の誘導に有用である。さらに、皮膚の細胞における色素形成を阻害する本発明の化合物の能力のため、それらは美容的理由でのより明るい皮膚の色を誘導するために、または皮膚のより明るい色が所望されるいずれかの疾患の間でも有用である。
【０１３５】
また、本発明の化合物は二次メッセンジャー要素ｃＡＭＰの形成を誘導するのにも有用である。とくに、環状アデノシン３’，６’−一リン酸（ｃＡＭＰ）のかかる形成は、生きた生物、とくにヒトに投与した場合、本発明の化合物の特異的薬理効果を誘導するのに所望される。しかしながら、ｃＡＭＰ形成の誘導は、例えば分析または診断目的のために、イン ビトロにて細胞または破砕細胞系において大きな価値があり得る。本発明のこの態様の具体的実施態様は、実施例３に掲げる。
【０１３６】
また、本発明の化合物は、二次メッセンジャー要素ｃＡＭＰのイン  ビボ形成を阻害するのにも有用である。かかる阻害は、例えば分析および診断目的のために、イン  ビトロにて細胞または破砕細胞系で使用することもできる。
【０１３７】
本発明の化合物は、化合物の性質、所望の治療効果および投与経路に応じて、０．００１ｍｇ／日／ｋｇ体重から１０００ｍｇ／日／ｋｇ体重まで変化し得る薬理学的に効果的な量で投与される。しかしながら、もし局所投与されれば、より少ない量で効果的であり得る。本発明の化合物は低い毒性を有し、よく寛容される。
【０１３８】
分析および診断目的のために、本発明の化合物は、放射性標識を含めた放射性形態で使用することができる。とくに、それらは放射性ヨウ素もしくはトリチウム、またはいずれかの他の適当な放射性核種を取り込むように製造することができる。かかる放射性標識化合物は、ＭＣ１−受容体の定量のために、メラノコルチン受容体の特定のサブタイプと競合する薬物の解離定数（ＫisまたはＫds）の分析のために、および、例えば受容体オートラジオグラフィー技術の使用によって、組織および組織セクションにおけるＭＣ１−受容体の位置決定のために放射性リガンド結合で使用することができる。放射性リガンド結合および受容体オートラジオグラフィーの原理は当該分野でよく知られている。あるいはまた、本発明の化合物は、各化合物、例えば蛍光標識、ビオチン、酵素、の検出を可能とする標識のいずれかの他のタイプで標識することができ、得られた化合物は対応する放射性標識化合物として同一目的で使用することができる。また、本発明の化合物はγ−線、光量子線（light photon）の放射のような二次的プロセスによって、または生化学的プロセスによって活性化される他の標識で標識することもでき、該目的は本発明の標識化合物が位置する組織の標的細胞における変化を引き起こすことである。かかる変化は生存率に影響し、化合物が投与された生物における細胞または組織を運命付けるのに有用であり得る。
【０１３９】
本発明の化合物に、光、とくにＵＶ光によって活性化することができる基を設けることもでき、該目的は光親和性標識技術の使用によってＭＣ−１受容体の共有結合標識で有用な化合物を得ることにある。光親和性標識は当該分野でよく知られた技術であり、ここに、この意味はＭＣ１−受容体の構造およびトポロジー体制を解明するのに有用である。また、本発明の化合物のかかる光活性誘導体もまた本発明の一部である。また、本発明の化合物の光活性誘導体は、例えば放射性原子、蛍光基またはビオチンのごとき基または標識を取り込み、容易に検出できる。（光親和性標識の点についてのさらなる詳細については、Leeb-Lundbergら、J. Biol. Hem.１９８４，２５９，２５７９およびScinonelli&Eberle FEBS Lett.１９７８，２２６，１３４参照）。
【０１４０】
また、本発明の化合物はガンマまたはポジトロン放射アイソトープで標識することもできる。かくして標識された化合物は、ヒトを含めた動物に全身または局所投与することができる。ＭＣ１−受容体に選択的に結合する本発明の放射性化合物の能力によって、特異的ＭＣ−受容体サブタイプのイン  ビボ結合のイメージングは、シンチグラフィー、ポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）または単一光量子放射コンピューター断層撮影法（single photon emission computed tomography）（ＳＰＥＣＴ）のごとき当該分野でよく知られた技術によって得ることができる。かかる方法をも用いることによって、動物またはヒト対象の組織におけるＭＣ１−受容体の分布および／または数についての情報を得ることができる。メラノーマ細胞はＭＣ１−受容体で豊富であることが知られているので、この情報は病気の診断、とくに悪性メラノーマの診断で価値がある。さらに、非常に同一の技術を、悪性細胞がＭＣ１−受容体を含有するいずれかの他の悪性疾患の治療で使用することができる。後者の例は卵巣または精巣に由来する癌である。本発明の化合物に直接的に適用できるこの技術の一般的例については、Baguttら  １９９４参照。
【０１４１】
さらに、本発明の化合物は毒性剤でタグを付すこともでき、悪性メラノーマ細胞またはＭＣ１−受容体を担持する他の細胞（例えば、卵巣または精巣に由来する悪性細胞）へのトキシンの標的化送達で使用できる。これに関連して、「タグを付される」とは、本発明の化合物がトキシン、例えば、リシン、ドキソルビシンおよびジフテリアトキシンに共有結合または非共有結合することを意味する。ＭＣ１−受容体に対する本発明の化合物の高い親和性および選択性によって、ＭＣ１−受容体担持細胞（例えば、メラノーマ細胞）へのトキシンの特異的送達が達成され、悪性細胞増殖が選択的に阻害され、悪性細胞の死滅さえ含まれる。このアプローチで使用される原理は当該分野でよく知られている（Murphyら、１９８６，Tatroら、１９９２，O'Hareら、１９９３）。また、本発明の化合物は内因性免疫系を活性化することができる化合物でタグを付すことができる。本発明の化合物および免疫系活性化化合物のこのように形成されたハイブリッドは、悪性メラノーマまたはＭＣ１−受容体発現病気状態の治療で使用することができる。本発明の化合物を含有するハイブリッド分子の一部は、一方では、（一次腫瘍および転移を含めた）悪性メラノーマ細胞のＭＣ１−受容体、ならびにＭＣ１−受容体担持悪性腫瘍細胞に結合し、他方、免疫系活性化成分は腫瘍細胞に向けられた免疫応答をひきおこすであろう。この変化は腫瘍細胞増殖の阻害および結果として腫瘍細胞死滅を導く。かかる「二重特異性」ハイブリッド化合物の典型的な例は本発明の化合物［すなわち、式（１）、（２）、（３）または（４）による化合物］とＴ−細胞抗原に結合できる化合物との間のハイブリッドである。典型的には、ハイブリッド化合物のＴ−細胞抗原結合化合物は、Ｔ−細胞抗原ＣＤ３に向けられた抗体である。この場合の抗体は好ましくはモノクローナル抗体である。かく形成されたハイブリッド化合物は、細胞毒性細胞を悪性メラノーマ細胞またはＭＣ１−受容体担持悪性細胞に向け、腫瘍増殖を阻害する。本発明の化合物は共有結合または非共有結合によって化学的に抗体に付着させることができる。また、ハイブリッド化合物は、本発明の化合物に対応するペプチドをコードするＤＮＡ配列と適当なタンパク質をコードする他のＤＮＡとを一体化させることによって遺伝子工学によって製造することができる。かくして、本発明の化合物のペプチド配列は、例えば抗体、ハイブリッド抗体、抗体の一部を含有するハイブリッド分子、または抗体様タンパク質を構成するより長いペプチド配列に取り込まれるようになる。さらに、ハイブリッド化合物は本発明の化合物の１つまたはいくつかのコピーを含有することができるのが認識される。ＭＣ１−受容体結合部位のいくつかのコピーが本発明のハイブリッド化合物に取り込まれる場合、かく形成されたハイブリッドはＭＣ１−受容体に対する増大した親和性を示すであろう。これはＭＣ１−受容体関連悪性病の治療で有利である。前記されたことに沿って、従って、本発明は本発明の化合物の１つまたはいくつかのコピーをもう１つの分子と一体化させたハイブリッド化合物を含む。前記アプローチを用いる免疫療法の根底の一般的原理については、Riedleら１９９８，Mukherjiら１９９５��Canevariら，１９９５およびThielemans  １９９５参照。これらのアプローチおよび方法は、前記で概説したアプローチを使用することによって、ＭＣ１−受容体発現悪性疾患を標的化するために採用することができる。
【０１４２】
本発明の化合物は、動物、とくにヒトにおいて、病気、障害および／または病理学的状態の治療および診断で使用することができる。
【０１４３】
本発明の化合物は適当な薬物送達系によって身体の好ましい部位に到達することができる。例えば、本発明の化合物は担体分子に結合させてそれを親油性とすることができる（例えば、Toth,1:Drug Targeting, 1994, 2, 217-239；Patelら，Bioconjugate Chem 1997, 8, 434-411参照）。身体中の所望の部位に対し本発明の化合物を送達するのに有用な他の技術は、ベクター媒介担体系である（例えば、Pardridge, WM:Pharmacol Toxicol 1992, 71, 3-10；Saito, Yら:Proc. Natl. Acad. Sci.USA 1995, 92, 10227-10231；Wu, DおよびPardridge, WM:J. Pharmacol. Exp. Ther.1996, 279, 77-83参照）。本発明の化合物で有用な薬物送達技術のさらに他の例は、本発明の化合物と、生物学的バリアーを介して輸送されることができる活性分子との複合を含む（例えば、Zlokovic, BV:Pharmaceutical Research 1995,12,1395-1405参照）。具体的な例は、脳血液関門を横切っての輸送を達成するためのインスリンの断片への本発明の化合物の結合を構成する（Fukuta,M.ら，Pharmaceutical Res. 1994, 11, 1681-1686）。本発明の化合物で原理的に有用な、およびそれに適用できる他の例は、Prokai-Tatrai, K.ら；J.Med.Chem. 1996, 39, 4775-4782およびMamai, Iら:J. Pharmacol.Exp.Ther. 1997,280,410-415）にみられる。本発明の化合物で適当な薬物送達のための技術の一般的総説については、Zlokovic, B.V: Pharmaceutical Res.1995, 12, 1395-1406およびPardrige, W.M:Pharmacol. Toxicol.1992, 71, 3-10参照。
【０１４４】
また、本発明は、動物またはヒトへの投与に際して、本発明の化合物に変換されるプロドラッグに関する。本発明の化合物のプロドラッグは本発明の化合物につきその特許で記載されているごとき同一目的で使用することができ、ならびに後記する実施例で開示される。
【０１４５】
本発明の化合物はペプチダーゼおよび／またはプロテアーゼ阻害剤と一緒に投与して本発明の化合物の分解を防止しまたは遅延させることができ、それにより、経口投与された場合に、身体での薬理作用のその持続ならびに胃腸管でのその安定性を延長する。本発明の化合物と一緒に投与することができるペプチダーゼ／プロテアーゼ阻害剤は、好ましくは、例えば、カプトプリル（Ｄ−３−メルカプトメチル−プロピオニル−Ｌ−プロリン）、エナプラプリル、ホスホルアミドン、アマスタチンのごときアンジオテンシン変換酵素阻害剤（ＡＣＥ−阻害剤）の群から選択される。
【０１４６】
本発明の化合物はいずれかの目的とする構造を有する他の分子の１つまたはいくつかに共有結合または非共有結合させることができ；かくして形成された修飾された化合物または複合体は本発明の化合物につきこの特許で記載されたのと同一の目的で使用することができ、ならびに以下にあげた実施例に開示されている。本発明のとくに重要な実施態様において、放射活性標識分子は本発明の化合物に共有結合されて、本発明の化合物を放射活性標識化する。
【０１４７】
以下において、多数の好ましい実施態様を参照することによって非常に詳細に本発明を記載するが、これは例示目的で掲げるものであり、断じて本発明を限定すると考えられるべきではない。
【０１４８】
略語
以下の実施例で使用される略語：
Ｆｍｏｃ＝９−フルオレニルメトキシシカルボニル
ＤＭＦ＝Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＰｆｐ＝９−フルオレニルメトキシカルボニル−Ｌ−バリンペンタフルオロフェニルエステル
ＨＯＡｔ＝１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール
Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＰｆｐ＝９−フルオレニルメトキシカルボニル−Ｌ−プロリンペンタフルオロフェニルエステル
Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＰｆｐ＝α−９−フルオレニルメトキシカルボニル−ε−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−リジンペンタフルオロフェニルエステル
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＰｆｐ＝９−フルオレニルメトキシカルボニル−グリシンペンタフルオロフェニルエステル
Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ＝９−フルオレニルメトキシカルボニル−（Ｎin−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）−Ｌ−トリプトファン
ＨＡＴＵ＝Ｏ−（７−アザべンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３，−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
ＤＩＥＡ＝Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン
Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ＝９−フルオレニルメトキシカルボニル−（Ｎg−２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル）−Ｌ−アルギニン
Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＰｆｐ＝９−フルオレニルメトキシカルボニル−Ｌ−フェニルアラニンペンタフルオロフェニルエステル
Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ＝９−フルオレニルメトキシカルボニル−Ｎim−トリチル−Ｌ−ヒスチジン
Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｕｔ）−ＯＨ＝９−フルオレニルメトキシカルボニル−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチル−Ｌ−セリン
Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＰｆｐ＝９−フルオレニルメトキシカルボニル−Ｌ−イソロイシンペンタフルオロフェニルエステル
Ａｃ＝アセチル
ｄＰｈｅ＝Ｄ−フェニルアラニン
ｄＳｅｒ＝Ｄ−セリン
ＮＭｅＳｅｒ＝Ｎ−メチル−Ｌ−セリン
ＮＭｅＶａｌ＝Ｎ−メチル−Ｌ−バリン
ＮＭｅｄＰｈｅ＝ｎ−メチル−Ｄ−フェニルアラニン
ＰｙＡＯＰ＝Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−トリス（ピロリジノ）−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
ＴＦＦＨ＝テトラメチルフルオロホルマミジニウムヘキサフルオロホスフェートＮＤＰ−ＭＳＨ＝［Ｎｌｅ4．Ｄ−Ｐｈｅ7］α−ＭＳＨ
【０１４９】
実施例１：１
Ｌ−セリル−Ｌ−セリル−Ｌ−イソロイシル−Ｌ−イソロイシル−Ｌ−セリル−Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−アルギニル−Ｌ−トリプトファニル−グリシル−Ｌ−リジル−Ｌ−プロリル−Ｌ−バリナミド（ＭＳ０５）（配列番号：１）の合成
ＭＳ０５ペプチド（Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ＮＨ２）（配列番号：１）をPerSeptive Biosystems  ＵＫ  社製  パイオニアペプチド合成システム（pioneer peptide synthesis system）を用いた固体支持体上で会合させた。
【０１５０】
開始サイクルは以下のようであった。ポリエチレン−グラフト−ポリスチレン支持体（Ｆｍｏｃ−ＰＡＬ−ＰＥＧ−ＰＳ、容量０．２ｍｍｏｌ／ｇ）に接着させた１００ｍｇ（０．０２ｍｍｏｌ）の［５−（４−Ｆｍｏｃ−アミノメチル−３，５−ジメトキシ）吉草酸をペプチド合成カラムにいれた。ついでＦｍｏｃ基をＤＭＦ中の２０％ピペリジンで５分間処理して取り除き、ついでＤＭＦにて支持体を洗浄した。
【０１５１】
開始サイクル完了ののち、樹脂を繰り返しアミノ酸結合サイクルにかけた。それぞれのサイクルは、４ｍｌ  ＤＭＦに溶解させた好ましい試薬（以下に記述のような）のカラムを通した３０−９０分間の循環、ついでＤＭＦで洗浄し、０．３ＭのＤＭＦ中の無水酢酸による５分間の処理、ＤＭＦでの洗浄、ＤＭＦ中２０％のピペリジンによる処理、ついで再度、つぎのサイクル開始前のＤＭＦによる洗浄を含む。以下のような（順番に）試薬と処理時間を使って１３サイクルを行った。１）Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＰｆｐ（４０ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）およびＨＯＡｔ（１１ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）（９０分間）、２）Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＰｆｐ（４０ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）およびＨＯＡｔ（１１ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）（６０分間）、３）Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＰｆｐ（５１ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）およびＨＯＡｔ（１１ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）（３０分間）、４）Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＰｆｐ（３７ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）およびＨＯＡｔ（１１ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）（３０分間）、５）Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（４２ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（３０ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（０．０６８ｍｌ、０．４ｍｍｏｌ）（３０分間）、６）Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ（５２ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（３０ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（０．０６８ｍｌ、０．４ｍｍｏｌ）（９０分間）、７）Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＰｆｐ（４４ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）およびＨＯＡｔ（１１ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）（６０分間）、８）Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（５０ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（３０．０ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（０．０６８ｍｌ、０．４ｍｍｏｌ）（３０分間）、９）Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ（３１ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（３０．０ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（０．０６８ｍｌ、０．４ｍｍｏｌ）（３０分間）、１０）Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＰｆｐ（４２ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）およびＨＯＡｔ（１１ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）（９０分間）、１１）Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＰｆｐ（４２ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）およびＨＯＡｔ（１１ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）（９０分間）、１２）Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ（３１ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（３０．０ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（０．０６８ｍｌ、０．４ｍｍｏｌ）（６０分間）、１３）Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ（３１ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（３０．０ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（０．０６８ｍｌ、０．４ｍｍｏｌ）（３０分間）。
【０１５２】
最後のサイクルの後、支持体をＤＭＦで洗浄し、続けてメタノールおよび塩化メチレンでの洗浄と減圧下での乾燥を行った。乾燥させた樹脂を２．５ｍｌの脱保護混合液（トリフルオロ酢酸−フェノール−アニソール−１，２−エタンジチオール−水、８２：２：２：２：２）で３時間室温にて処理した。これを濾過し、フィルター上でトリフルオロ酢酸を用いて洗浄し、濾液を集め、室温で減圧下にて濃縮した。乾燥エーテルを加え、形成した沈殿物を濾過して除き、エーテルでフィルタ上で洗浄し、ついでＫＯＨ上減圧下で乾燥させた。収量３１ｍｇ。ＨＰＬＣデータ（２×２５０ｍｍカラム、ヴィダック  アールピー（Ｖｙｄａｃ  ＲＰ）社製、Ｃ１８、９０Ａ、２０１ＨＳ１０１０）：Ｋ’（主生成物）＝３．５０（１９％アセトニトリル水溶液＋０．１％トリフルオロ酢酸、２２０ｎｍにて検出）。未処理の生成物を６０％ＭｅＣＮ水溶液１ｍｌに溶解させ、溶液を３つの部分に分け、遠心管に入れ、ついでそれらそれぞれを０．１％水性トリフルオロ酢酸で１．５ｍｌ容量まで希釈した。遠心し、透明の溶液を半予備（semipreparative）ＨＰＬＣ（１０×２５０ｍｍカラム、ヴィダック  アールピーＣ１８、９０Ａ、２０１ＨＳ１０１０、溶出−１９％アセトニトリル水溶液＋０．１％トリフルオロ酢酸、検出２２０ｎｍ）に使用した。主要ピークを含む画分をため、凍結乾燥した。白色粉末が形成された。ＭＳ−０５のトリフルオロ酢酸塩の収量は１３．２ｍｇ（３３％）であった。Ｒｆ０．２８（１−ブタノール−ピリジン−酢酸−水、４：１：１：２）。質量分析データ：ｍ／ｅ＝１５１４．３。
【０１５３】
実施例１：２
Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−ｄＰｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ＮＨ2（ＭＳ−０９）（配列番号：２）テトラトリフルオロ酢酸塩の合成を基本的に実施例１に記載のように行った。収率３６％。Ｒf０．５６。Ｋ’２．０（０．１％ＴＦＡ中２１％ＭｅＣＮ）。ｍ／ｅ  １５１２．９。
【０１５４】
実施例１：３
Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ＮＨ2（ＭＳ−３０）（配列番号：３）テトラトリフルオロ酢酸塩の合成を基本的に実施例１に記載のように行った。収率３３％。Ｒf０．７９。Ｋ’４．４（０．１％ＴＦＡ中８．４％ＭｅＣＮ）。ｍ／ｅ  １６７５．９。
【０１５５】
実施例１：４
Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ＮＨ2（ＭＳ−３１）（配列番号：４）テトラトリフルオロ酢酸塩の合成を基本的に実施例１に記載のように行った。収率３４％。Ｒf０．７５。Ｋ’２．７（０．１％ＴＦＡ中１０．８％ＭｅＣＮ）。ｍ／ｅ  １５８９．１。
【０１５６】
実施例１：５
Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ＮＨ2（ＭＳ−３２）（配列番号：５）テトラトリフルオロ酢酸塩の合成を基本的に実施例１に記載のように行った。収率２８％。Ｒｆ０．７５。Ｋ’３．３（０．１％ＴＦＡ中９．６％ＭｅＣＮ）。ｍ／ｅ  １６７５．９。
【０１５７】
実施例１：６
Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ＮＨ2（ＭＳ−３３）（配列番号：６）テトラトリフルオロ酢酸塩の合成を基本的に実施例１に記載のように行った。収率２６％。Ｒf０．７３。Ｋ’３．６（０．１％ＴＦＡ中８．４％ＭｅＣＮ）。ｍ／ｅ  １４２５．７。
【０１５８】
実施例１：７
Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ＮＨ2（ＭＳ−３４）（配列番号：７）テトラトリフルオロ酢酸塩の合成を基本的に実施例１に記載のように行った。収率５２％。Ｒf０．７２。Ｋ’２．４（０．１％ＴＦＡ中１０．８％ＭｅＣＮ）。ｍ／ｅ  １５２７．１。
【０１５９】
実施例１：８
Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ＮＨ2（ＭＳ−３５）（配列番号：８）テトラトリフルオロ酢酸塩の合成を基本的に実施例１に記載のように行った。収率４９％。Ｒf０．６８。Ｋ’２．２（０．１％ＴＦＡ中１０．８％ＭｅＣＮ）。ｍ／ｅ  １５２６．８。
【０１６０】
実施例１：９
Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ＮＨ2（ＭＳ−３６）（配列番号：９）テトラトリフルオロ酢酸塩の合成を基本的に実施例１に記載のように行った。収率４２％。Ｒf０．６８。Ｋ’２．３（０．１％ＴＦＡ中１０．８％ＭｅＣＮ）。ｍ／ｅ  １４９９．３。
【０１６１】
実施例１：１０
Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ＮＨ2（ＭＳ−３７）（配列番号：１０）テトラトリフルオロ酢酸塩の合成を基本的に実施例１に記載のように行った。収率６９％。Ｒf０．６５。Ｋ’３．３（０．１％ＴＦＡ中１２．０％ＭｅＣＮ）。ｍ／ｅ  １４９９．０。
【０１６２】
実施例１：１１
Ａｃ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ＮＨ2（ＭＳ−３８）（配列番号：１１）テトラトリフルオロ酢酸塩の合成を基本的に実施例１に記載のように行った。収率４９％。Ｒf０．７２。Ｋ’１．８（０．１％ＴＦＡ中１０．８％ＭｅＣＮ）。ｍ／ｅ  １５５４．７。
【０１６３】
実施例１：１２
ｄＳｅｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ＮＨ2（ＭＳ−３９）（配列番号：１２）テトラトリフルオロ酢酸塩の合成を基本的に実施例１に記載のように行った。収率４４％。Ｒf０．６９。Ｋ’２．２（０．１％ＴＦＡ中１２％ＭｅＣＮ）。ｍ／ｅ  １５１２．４。
【０１６４】
実施例１：１３
ＮＭｅＳｅｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ＮＨ2（ＭＳ−４０）（配列番号：１３）テトラトリフルオロ酢酸塩の合成を基本的に実施例１に記載のように行った。Ｆｍｏｃ−ＮＭｅＳｅｒ（Ｂｕt）−ＯＨを、ＰｙＡＯＰを用いて加えた。収率４７％。Ｒf０．６７。Ｋ’１．７（０．１％ＴＦＡ中１２％ＭｅＣＮ）。ｍ／ｅ  １５２６．６。
【０１６５】
実施例１：１４
Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−ＮＭｅＶａｌ−ＮＨ2（ＭＳ−４１）（配列番号：１４）テトラトリフルオロ酢酸塩の合成を基本的に実施例１に記載のように行った。Ｆｍｏｃ−ＮＭｅＶａｌ−ＯＨを、ＴＦＦＨを用いて加えた。収率２．５％。Ｒf０．６８。Ｋ’４．４（０．１％ＴＦＡ中２２．８％ＭｅＣＮ）。ｍ／ｅ  １５２７．３。
【０１６６】
実施例１：１５
Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−ＮＭｅｄＰｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ＮＨ2（ＭＳ−４２）（配列番号：１５）テトラトリフルオロ酢酸塩の合成を基本的に実施例１に記載のように行った。Ｆｍｏｃ−ＮＭｅｄＰｈｅ−ＯＨを、ＰｙＡＯＰを用いて加えた。収率４０％。Ｒf０．７０。Ｋ’２．５（０．１％ＴＦＡ中１０．８％ＭｅＣＮ）。ｍ／ｅ  １５２７．０。
【０１６７】
実施例２
本発明の化合物のヒトＭＣ−受容体への結合親和性のアッセイ
受容体クローンの発現。発現ベクターｐＲｃ／ＣＭＶ（InVitrogen Corp.,ＵＳＡ）内にクローン化したヒトＭＣ１−およびＭＣ５−受容体ＤＮＡ（Chhajlani and Wikberg１９９２；Chhajlaniら.,１９９３）、および発現ベクターｐＣＭＶ／ｎｅｏ内にクローン化したヒトＭＣ３−およびヒトＭＣ４−受容体ＤＮＡ（Gantzら.,１９９３ａ＆ｂ）を使用した。ＣＯＳ細胞を増殖させ、記載されたように（Schioetら.１９９５、１９９６ｂ）、受容体クローンでトランスフェクトした。トランスフェクト細胞を４８時間培養した後、ペトリディッシュよりはがし、記載されたように（Schioethら.１９９５、１９９６ｂ）、放射性リガンド結合に用いた。
【０１６８】
結合研究。トランスフェクトした細胞を結合緩衝液（アール（Ｅａｒｌｅ）塩、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ  ７．０、０．２％ウシ血清アルブミンを含む最小必須培地（Minimum Essential Medium））で洗浄し、９６穴プレートに分配した。ついで細胞をそれぞれの穴中で［125Ｉ］［Ｎｌｅ4，Ｄ−Ｐｈｅ7］α−ＭＳＨおよび試験すべき好ましい濃度のペプチドを含む０．１ｍｌ結合緩衝液中、３７℃にて２時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを氷上におき、細胞を０．１ｍｌの氷冷結合緩衝液にて洗浄した。ついで細胞を０．２ｍｌの０．１Ｎ  ＮａＯＨでプレートよりはがした。放射活性をWallac、Wizard自動化ガンマ計数器を用いて計数した。競合データを、非線形回帰解析を用いて計算式に入れこむことで解析した。ついでＫｉ値を、基本的にSchioethら、１９９５、１９９６ｂにて記載されているように、チェンとプラソフの方程式（Cheng and Prusoff equation）を用いることで得られたＩＣ５０値から計算した。
【０１６９】
結果
ＮＤＰ−ＭＳＨ、α−ＭＳＨ、ＭＳ０５およびＭＳ０９のＭＣ１、ＭＣ３、ＭＣ４およびＭＣ５−受容体に対するＫｉ値を以下の表に記した。
【０１７０】
【表２】
0004584450.tif 000012
【０１７１】
図１はＭＳ０５およびＭＳ０９のＭＣ１およびＭＣ３−受容体上での競合曲線を示す。
【０１７２】
実施例３
本発明の化合物の、ＭＣ１−受容体を発現している細胞内の二次メッセンジャーｃＡＭＰの生成に関する影響のアッセイ
安定細胞株の調製
ヒトＭＣ１−受容体は先にｐＺｅｏＳＶ（Invitrogen）（Szardeningsら,１９９７）内にクローン化されている。得られたベクターを、マウスＭＣ１−受容体を欠損しているメラニン欠乏マウスメラノーマ細胞株Ｂ１６Ｇ４Ｆ（Solcaら,１９９３）の、すでに記載された（Schioethら,１９９７ｂ）ようなリポソーム（Campbell,１９９５）を用いた形質転換に使用した。細胞を、１０％仔ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）で７％ＣＯ2下２４時間培養し、３００μｇ／ｍｌゼオシンを含む同じ培地内にて大きいプレートにまいた。培地を細胞巣（cell foci）が現れるまで毎４−５日間交換した。単一巣を単離し、抗生物質選別下で増殖させた。これらの受容体の発現および結合特性を測定し、先にヒトＭＣ１−受容体に対しても示されている（Chluba-de-Tapiaら、１９９６）ように、他の細胞株で発現した同じ受容体と同一であることを確認した。
【０１７３】
細胞ｃＡＭＰの刺激
ｃＡＭＰ測定のため、細胞を０．５ｍＭ  ＥＤＴＡを含むハンクス平衡塩を用いて６０〜８０％密集接着培養物よりはがし、０．５ｍＭのホスホジエステラーゼ阻害剤、３−ｉｓｏ−ブチル−１−メチル−キサンチン（ＩＢＭＸ）を含んだ通常の増殖培地中で３７℃にて３０〜６０分間インキュベートした。増殖培地内の試験化合物の適当な希釈物の２０μｌ分割量を９６穴マイクロタイタープレートに調製し、３７℃の水浴においた。刺激のために、１８０μｌの約１．５×１０5細胞を素早くそれぞれの穴に加え、すぐに混合した。２０分後、２０μｌの４．４Ｍ過塩素酸を加え、混合し、数分後２０μｌ塩基（５Ｍ  ＫＯＨ、１Ｍ  Ｔｒｉｓ）を添加して中和し、遠心した。
【０１７４】
ｃＡＭＰ濃度の決定
前記で得た２０μｌの酸処理上清を、０．０１μＣｉ［3Ｈ］ｃＡＭＰ（Amersham、１．０４  ＴＢｑ／ｍｍｏｌ、１μＣｉ／μｌ、製品番号、ＴＲＫ３０４）を含む５０μｌ緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％メルカプトエタノール、０．５ｍＭ  ＩＢＭＸ、ｐＨ＝７．４）と混合した。（Nordstedt and Fredholm，１９９０によって記載されたように調製した）１：１６希釈したブタ副腎皮抽出物を含む２００μの同様の緩衝液を加え、マイクロタイタープレートを少なくとも２時間４℃でインキュベートした。標準曲線を同様の様式で、２μＭ〜０．５ｎＭの範囲を満たすｃＡＭＰの希釈物を用いて作成した。
【０１７５】
インキュベーション完了後、溶液をＧＦ−Ｂグラスファイバーフィルタ（Whatman）上で濾過し、素早くｃａ．２ｍｌ氷冷洗浄緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ＝７．４）で洗浄した。フィルタ上の放射活性をシンチレーション液の添加後に測定した。刺激実験を４回の実験で測定し、標準曲線を２回の実験で決定した。
【０１７６】
ＭＣ１−受容体発現細胞でのｃＡＭＰ形成におけるＭＳ０５およびＭＳ０９の試験の結果
未処理コントロール細胞内でのｃＡＭＰ含量と比較した処理したＭＣ１−受容体発現細胞でのｃＡＭＰ形成の刺激の度合いを、１０ｎＭおよび１μＭのＭＳ０５およびＭＳ０９で試験し、以下の表で示した。比較のために、ＮＤＰ−ＭＳＨ、α−ＭＳＨ、フォルスコリンおよびＭＳ０４（Szardeningsら、１９９７）によって得た刺激も表した。
【０１７７】
【表３】
0004584450.tif 000013
【０１７８】
前記表中、（未処理コントロール細胞と比較した）刺激の比率は３つの独立した実験の平均±標準偏差として表した。１０ｎＭのα−ＭＳＨのｃＡＭＰの刺激を誘導する能力のパーセント（％）で計算された、１０ｎＭの化合物のｃＡＭＰを刺激する能力も示した。ＭＳ０５およびＭＳ０９両方とも、１０ｎＭおよび１μＭの両濃度で効果的なｃＡＭＰ形成の刺激剤であることが前記表から明らかである。ＭＳ０４ペプチドは１０ｎＭでｃＡＭＰへの効果が完全になく、１μＭのＭＳ０４がｃＡＭＰ形成の刺激を誘導するために要求されることに注意すべきである。ＭＳ０５およびＭＳ０９共に１０ｎＭでｃＡＭＰの高い効果的な刺激剤である。
【０１７９】
実施例４
本発明の化合物の、マウスＢ１６メラノーマ細胞におけるメラノコルチン（ＭＳＨ）受容体への結合能の立証
細胞培養
Ｂ１６マウスメラノーマ細胞（Ｂ１６−Ｆ１；ＣＲ−６３２３、アメリカンタイプカルチャーコレクション（American Type Culture Collection）、１２３０１  Parklawn Drive,Rockville，ＭＤ，２０８５２）を、１０％熱不活化ウシ胎児血清、１００ＩＵ  ペニシリン／ｍｌおよび１００マイクログラム  ストレプトマイシン／ｍｌを補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Gibco  ＢＲＬ，Gaithersburg，ＵＳＡ，カタログ番号０４１−０１９６６Ｈ）中、３７℃で９５％空気および５％ＣＯ2の加湿雰囲気下で培養した。単層で増殖した細胞を、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡを含むハンクス平衡塩を用いて培養フラスコよりはがし、低速遠心機（７００×ｇ）にて集めた。
【０１８０】
受容体結合研究
ＭＳＨ−受容体結合についてのアッセイを、先に記載された方法（Eberleら,J.Recept.Res.１９９１，１１，３１１−３２２）にしたがった原理にて、基本的に記載されている（Xiaら,Cancer Letters,１９９６，９８，１５７−１６２）ように行った。簡単に記すと、集めた細胞を９６穴プレート内に分配した結合緩衝液（結合緩衝液の組成は以下参照）で洗浄し、遠心によって穴の底上に沈降させた。ついで、細胞を、それぞれの穴中０．１ｍｌの結合緩衝液で３７℃にて２時間培養した。この緩衝液は、以下、イーグル塩、２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ  ７．４、０．２％ウシ血清アルブミン、１ｍＭ  １，１０−フェナントロリン、０．５マイクログラム  ロイペプチン／ｍｌおよび２００マイクログラム  バシトラシン／ｍｌを含むＭＥＭ（ＭＥＭ＝最小必須培地、Gibco  ＢＲＬ、Gaithersburg、ＵＳＡ、カタログ番号０４１−０１０９５Ｈ）の組成の結合緩衝液中、３７℃で［125Ｉ］［Ｎｌｅ4、Ｄ−Ｐｈｅ7］α−ＭＳＨ（０．２ｎＭ）、異なる穴内に異なる濃度の試験化合物濃度を含んだ。インキュベーションの後、プレートを氷上におき、遠心し、細胞を０．１ｍｌの氷上結合緩衝液で洗浄し、遠心し、結合緩衝液を吸い出した。ついで、最終的に沈降し、洗浄した細胞を０．２ｍｌの０．１Ｎ  ＮａＯＨにてプレートよりはがした。放射活性をワラックウィザード自動ガンマ計数器（Wallac，Wizard automatic gamma counter）を用いることで計数した。競合データを本質的に記載されたように（Bergstrom & Wikberg,Acta Pharmacol.Toxicol.１９８６，５９，２７０−２７８）質量作用コンピュータモデリング法によって解析した。
【０１８１】
結果
図２でみられるように、ＭＳ０５およびＭＳ０９ペプチドの両方が、［125Ｉ］−ＮＤＰ−ＭＳＨのＢ１６メラノーマ細胞への結合の容量依存的な阻害を起こした。質量作用コンピュータモデリング法によるデータの解析は、ＭＳ０５およびＭＳ０９ペプチドが単独のクラスの結合部位（すなわちＢ１６メラノーマ細胞ＭＳＨ−受容体、言い換えれば野生型マウスＭＣ１−受容体）で［125Ｉ］−ＮＤＰ−ＭＳＨと競合することを示した。マウスＢ１６メラノーマ細胞ＭＳＨ−受容体に対するＭＳ０５のＫｉは、１．００±０．１１ｎＭ（平均値±ＳＥＭ；ｎ＝２）であると見積もられた。マウスＢ１６メラノーマ細胞ＭＳＨ受容体に対するＭＳ０９のＫｉは、０．０６０±０．００３５ｎＭ（平均値±ＳＥＭ；ｎ＝２）であると見積もられた。
【０１８２】
実施例５
本発明の化合物の、マウスＢ１６メラノーマ細胞におけるｃＡＭＰ形成の刺激を与える能力の立証
細胞培養
Ｂ１６マウスメラノーマ細胞（Ｂ１６−Ｆ１；ＣＲＬ−６３２３、アメリカンタイプカルチャーコレクション、１２３０１  Parklawn Drive,Rockville,MD，２０８５２）を、１０％熱不活化ウシ胎児血清、１００ＩＵ  ペニシリン／ｍＬおよび１００μｇ  ストレプトマイシン／ｍＬを補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Gibco  ＢＲＬ，Gaithersburg，ＵＳＡ，カタログ番号０４１−０１９６６Ｈ）中、３７℃で９５％空気および５％ＣＯ2の加湿雰囲気下で培養した。単層で増殖した細胞を、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡを含むハンクス平衡塩を用いて６０〜８０％密集接着培養物よりはがし、低速遠心機（７００×ｇ）にて回収した。
【０１８３】
細胞ｃＡＭＰの刺激
細胞を０．５ｍＭのホスホジエステラーゼ阻害剤３−ｉｓｏ−ブチル−１−メチル−キサンチン（ＩＢＭＸ）を含んだＤＭＥＭ中で３７℃にて３０分間インキュベートした。増殖培地内の試験化合物の適当な希釈物の２０μｌ分割量を９６穴マイクロタイタープレートに調製した。ついで、このプレートを３７℃の水浴におき、１８０μＬの約１．５×１０5細胞を素早くそれぞれの穴に加え、すぐに混合した。２０分後、２０μＬの４．４Ｍ過塩素酸を各穴に混合しながら加え、数分後２０μＬの塩基（５Ｍ  ＫＯＨ、１Ｍ  Ｔｒｉｓ）を各穴に添加し、その後遠心して上清を集めた。
【０１８４】
ｃＡＭＰ濃度の決定
前記上清の２０μＬを、９６マイクロタイタープレート穴中で、０．０１μＣｉ［3Ｈ］ｃＡＭＰ（Amersham、１．０４  ＴＢｑ／ｍｍｏｌ、１μＣｉ／μＬ、製品番号、ＴＲＫ３０４）を含む５０μＬ  ｃＡＭＰアッセイ緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％メルカプトエタノール、０．５ｍＭ  ＩＢＭＸ、ｐＨ  ７．４）と混合した。ついで、（Nordstedt and Fredholm,Anal.Chem,１９９０，１８９，２３１−２３４によって記載されたように調製した）１：１６希釈したブタ副腎皮抽出物を含む２００μＬのｃＡＭＰアッセイ緩衝液を各穴に加え、マイクロタイタープレートを少なくとも２時間４℃でインキュベートした。標準曲線を、アッセイでの最終ｃＡＭＰの濃度範囲２μＭ〜０．５ｎＭを満たすｃＡＭＰ標準で上清を変換することにより作成した。
【０１８５】
インキュベーション完了後、溶液をすばやくＧＦ−Ｂグラスファイバーフィルタ（Whatman）上で濾過し、続いて２ｍｌ氷冷洗浄緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ  ７．４）でフィルタを素早く洗浄した。ついで、フィルタをシンチレーションバイアル内におき、シンチレーションカクテルを加えた。放射活性をβ−計数器を用いて計数した。細胞実験を４回の実験で測定し、標準曲線を２回の実験で決定した。
【０１８６】
結果
マウスＢ１６メラノーマ細胞でのｃＡＭＰレベルに関するα−ＭＳＨおよびＭＳ０５ペプチドの試験の結果を図３に示した。図から見ることができるように、両方のペプチドが同様の能力および効力でｃＡＭＰの顕著な増加を起こした。
【０１８７】
実施例６
本発明の化合物の、ＲＡＷ２６４．７マクロファージ細胞での、メラノコルチン（ＭＡＨ）受容体への結合の能力の立証
細胞培養
ＲＡＷ２６４．７細胞（ＴＩＢ−７１）をアメリカンタイプカルチャーコレクション、１２３０１  Parklawn Drive,Rockville，ＭＤ，２０８５２，ＵＳＡより入手し、１０％熱不活化ウシ胎児血清、１００ＩＵ  ペニシリン／ｍｌおよび１００μｇ  ストレプトマイシン／ｍｌを補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Gibco  ＢＲＬ，Gaithersburg，ＵＳＡ，カタログ番号０４１−０１９６６Ｈ）中、３７℃で９５％空気および５％ＣＯ2の加湿雰囲気下で培養した。単層で増殖した細胞を培養フラスコよりはがし、低速遠心機（７００×ｇ）にて集めた。
【０１８８】
受容体結合研究
ＭＳＨ−受容体結合を、先に記載された方法（Eberleら、J.Recept.Res.１９９１，１１，３１１−３２２）にしたがった原理にて、本質的に記載されている（Xiaら,Cancer Letters,１９９６，９８，１５７−１６２）ように行った。簡単に記すと、集めた細胞を洗浄し、９６穴プレート内に分配し、遠心によって穴の底上に沈降させた。ついで、イーグル塩、２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ  ７．４、０．２％ウシ血清アルブミン、１ｍＭ  １，１０−フェナントロリン、０．５マイクログラム  ロイペプチン／ｍｌおよび２００マイクログラム  バシトラシン／ｍｌを含むＭＥＭ（最小必須培地）にて、３７℃にて２時間、それぞれの穴に［125Ｉ］［Ｎｌｅ4，Ｄ−Ｐｈｅ7］α−ＭＳＨ（０．１ｎＭ）、３７℃で異なる穴に異なる濃度の試験化合物を含む０．１ｍｌの結合緩衝液とともに、細胞をインキュベーションした。インキュベーションの後、プレートを氷上におき、遠心し、細胞を０．１ｍｌの氷冷結合緩衝液で洗浄し、遠心し、結合緩衝液を吸い出した。最終的に沈降し、洗浄した細胞を０．２ｍｌの０．１Ｎ  ＮａＯＨにてプレートよりはがした。放射活性をワラックウィザード自動ガンマ計数器を用いることで計数した。競合データを本質的に記載されたように（Bergstrom & Wikberg,Acta Pharmacol.Toxicol.１９８６，５９，２７０−２７８）質量作用コンピュータモデリング法によって解析した。
【０１８９】
結果
図４にでみられるように、ＭＳ０５ペプチドは［125Ｉ］−ＮＤＰ−ＭＳＨのマウスＲＡＷ２６４．７細胞への結合の容量依存的な阻害を起こした。質量作用コンピュータモデリング法によるデータの解析は、ＭＳ０５が単独のタイプの結合部位（すなわちＲＡＷ２６４．７細胞ＭＳＨ−受容体、言い換えればＲＡＷ２６４．７細胞の野生型マウスＭＣ１−受容体）で［125Ｉ］−ＮＤＰ−ＭＳＨと競合することを示した。ＭＳ０５の結合部位に対する解離定数（Ｋｉ）は１．３５±０．６１ｎＭ（平均値±ＳＥＭ）であると見積もられた。
【０１９０】
実施例７
本発明の化合物の、マウスＲＡＷ２６４．７マクロファージ細胞でのｃＡＭＰ形成の刺激を与える能力の立証
ＲＡＷ２６４．７細胞を実施例６に記載のように増殖させた。ｃＡＭＰを本質的に実施例５に記載のように決定した。α−ＭＳＨおよびＭＳ０５ペプチドに対する結果を図５に示した。図より見られるように、両方のペプチドが同様の能力および効力でｃＡＭＰの顕著な増加を引き起こした。
【０１９１】
実施例８
本発明の化合物の、マウスＲＡＷ２６４．７マクロファージ細胞での酸化窒素産生を阻害する能力の立証
細胞培養
ＲＡＷ２６４．７細胞（ＴＩＢ−７１）をアメリカン  タイプ  カルチャー  コレクション、１２３０１  Parklawn Drive,Rockville,ＭＤ，２０８５２，ＵＳＡより入手し、１０％熱不活化ウシ胎児血清、１００ＩＵ  ペニシリン／ｍｌおよび１００μｇ  ストレプトマイシン／ｍｌを補充したダルベッコ改変イーグル培地（Gibco  ＢＲＬ）中、３７℃で９５％空気および５％ＣＯ2の加湿雰囲気下で培養した。単層で増殖した細胞を培養フラスコよりはがし、低速遠心機（７００×ｇ）にて集めた。
【０１９２】
ＲＡＷ２６４．７細胞との本発明の化合物のインキュベーション
前記のように得られた細胞をＦ−１２（ＨＡＭ）培地（Gibco、ＢＲＬ）中に再懸濁させ、１穴あたり２．５×１０5細胞の密度で９６穴プレート内に分配し、１００ｎｇ／ｍＬ  細菌リポ多糖（Ｌ−４３９１，Sigma Chemical Company,P.O.Box  １４５０８，St.Louis,Missouri  ６３１７８，ＵＳＡ）、５ユニット／ｍＬのマウス組換え体インターフェロンガンマ（Ｉ−５５１７，Sigma  Chemical Company、P.O.Box  １４５０８、St.Louis,Missouri  ６３１７８、ＵＳＡ）および０〜１μＭの範囲の濃度の本発明の化合物とともに１６時間インキュベートし、そののち、培地の一部分を酸化窒素（ＮＯ）の測定のため集めた。
【０１９３】
酸化窒素の測定
酸化窒素を、本質的にWishnokら（Methods in Enzymology,１９９６，２６８，１３０−１５１）の方法を用いて、亜硝酸塩産出をモニターすることで測定した。簡単に記すと、５０μＬの培養培地を５０μＬのグリース試薬（すなわち５％（容量／容量）リン酸中、０．１％Ｎ−ナフチルエチレンジアミンジヒドロクロライドおよび１％スルファニルアミドの１：１混合物）と混合し、１０分後、吸収を５４０ｎｍで測定した。亜硝酸塩の濃度を、培養液培地の代わりにアッセイに５０μＬの３から１００μＭ の間のＮａＮＯ2を添加して作成した標準曲線から計算した。
【０１９４】
結果
結果を図６に示した。この図より見ることができるように、本発明の化合物ＭＳ０５およびＭＳ０９は、α−ＭＳＨと同様にＮＯ−産出の強い容量依存的阻害を引き起こし、ＭＳ０５およびＭＳ０９の能力および抗力はα−ＭＳＨのそれと同様であった。このデータは、ＭＳ０５およびＭＳ０９が炎症を阻害するα−ＭＳＨの能力を共有することを示している。このことはＮＯが炎症の重要な構成成分であることによる。
【０１９５】
［配列リストフリーテキスト］
＜２１０＞１
＜２２３＞人工配列の記述：メラノコルチン受容体−１に対して高い親和性を有する合成ペプチド
＜２１０＞２
＜２２３＞人工配列の記述：メラノコルチン受容体−１に対して高い親和性を有する合成ペプチド
＜２２１＞ＭＯＤ＿ＲＥＳ
＜２２２＞（７）
＜２２３＞Ｄアミノ酸
＜２１０＞３
＜２２３＞人工配列の記述：メラノコルチン受容体−１に対して高い親和性を有する合成ペプチド
＜２１０＞４
＜２２３＞人工配列の記述：メラノコルチン受容体−１に対して高い親和性を有する合成ペプチド
＜２１０＞５
＜２２３＞人工配列の記述：メラノコルチン受容体−１に対して高い親和性を有する合成ペプチド
＜２１０＞６
＜２２３＞人工配列の記述：メラノコルチン受容体−１に対して高い親和性を有する合成ペプチド
＜２１０＞７
＜２２３＞人工配列の記述：メラノコルチン受容体−１に対して高い親和性を有する合成ペプチド
＜２１０＞８
＜２２３＞人工配列の記述：メラノコルチン受容体−１に対して高い親和性を有する合成ペプチド
＜２１０＞９
＜２２３＞人工配列の記述：メラノコルチン受容体−１に対して高い親和性を有する合成ペプチド
＜２１０＞１０
＜２２３＞人工配列の記述：メラノコルチン受容体−１に対して高い親和性を有する合成ペプチド
＜２１０＞１１
＜２２３＞人工配列の記述：メラノコルチン受容体−１に対して高い親和性を有する合成ペプチド
＜２１０＞１２
＜２２３＞人工配列の記述：メラノコルチン受容体−１に対して高い親和性を有する合成ペプチド
＜２２０＞
＜２２１＞ＭＯＤ＿ＲＥＳ
＜２２２＞（１）
＜２２３＞Ｄアミノ酸
＜２１０＞１３
＜２２３＞人工配列の記述：メラノコルチン受容体−１に対して高い親和性を有する合成ペプチド
＜２２０＞
＜２２１＞ＭＯＤ＿ＲＥＳ
＜２２２＞（１）
＜２２３＞Ｎ−メチル−Ｌ−セリン
＜２１０＞１４
＜２２３＞人工配列の記述：メラノコルチン受容体−１に対して高い親和性を有する合成ペプチド
＜２２０＞
＜２２１＞ＭＯＤ＿ＲＥＳ
＜２２２＞（１３）
＜２２３＞Ｎ−メチル−Ｌ−バリン
＜２１０＞１５
＜２２３＞人工配列の記述：メラノコルチン受容体−１に対して高い親和性を有する合成ペプチド
＜２２０＞
＜２２１＞ＭＯＤ＿ＲＥＳ
＜２２２＞（７）
＜２２３＞Ｎ−メチル−Ｄ−フェニルアラニン
【０１９６】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  ＭＣ１およびＭＣ３受容体に対するＭＳ０５およびＭＳ０９についての競合曲線。
【図２】  ＭＳ０５およびＭＳ０９による［125Ｉ］−ＮＤＰ−ＭＳＨのＢ１６メラノーマ細胞への結合の阻害。
【図３】  α−ＭＳＨおよびＭＳ０５によるマウスＢ１６メラノーマ細胞におけるｃＡＭＰ−形成の刺激。
【図４】  ＭＳ０５によるマウスＲＡＷ  ２６４．７細胞への［125Ｉ］−ＮＤＰ−ＭＳＨの結合の阻害。
【図５】  α−ＭＳＨおよびＭＳ０５によるマウスＲＡＷ  ２６４．７細胞におけるｃＡＭＰ−形成の刺激。
【図６】  α−ＭＳＨ、ＭＳ０５およびＭＳ０９によるマウスＲＡＷ  ２６４．７細胞における酸化窒素生産の阻害。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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