(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
メラノサイトを、線維芽細胞増殖因子Ｉ又はＵＶ照射マクロファージ培養上清と被検物質との存在下で培養し、該被検物質のメラノサイトのデンドライトの伸長抑制作用を測定することを特徴とする、メラノサイトのデンドライトの伸長抑制作用を有する物質のスクリーニング法。
【請求項２】
メラノサイトを、線維芽細胞増殖因子Ｉ又はＵＶ照射マクロファージ培養上清と被検物質との存在下で培養し、該被検物質のメラノサイトのデンドライトの伸長抑制作用を測定することを特徴とする、色素異常症の処置に有効な物質のスクリーニング法。
【請求項３】
色素異常症がそばかすである、請求項２に記載のスクリーニング法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、メラノサイトのデンドライトの伸長抑制作用を有する物質のスクリーニング法に関する。
【０００２】
また、本発明は、色素異常症の処置に有効な物質のスクリーニング法に関する。
【０００３】
【従来の技術】
そばかす等の皮膚の色素異常の要因として、メラニンが関連していることは周知である。
【０００４】
色素異常を改善する化合物として、古くは亜ヒ酸等の砒素化合物、過酸化水素水等の物質に始まって、グルタチオン誘導体、アスコルビン酸とその誘導体、フェルラ酸類、コウジ酸類、トラネキサム酸類、レゾルシノール及びその誘導体類等が開発されている。
【０００５】
これらの化合物による色素異常の改善作用メカニズムは、チロシナーゼを阻害しメラニンの生成を抑制するものや、メラノサイトの働きそのものを阻害するもの等、それぞれの化合物によりそのメカニズムは大きく異なることが解明されている。また、これら以外の色素異常改善作用のメカニズムが存在するであろうことは、種々の色素異常症の現象学的な観察結果より、推測されている。なお、色素異常症の現象としては、メラニン顆粒数そのものが増える色素異常症や、メラニン顆粒数そのものは増えないがメラニン顆粒がより深部にまでディストリビュートするような色素異常症の現象が知られている。
【０００６】
しかし、メラニン顆粒数そのものが増えない色素異常において、そのメカニズムは知られていない。
【０００７】
また、上記色素異常に対して適切な処置剤となる物質を選択するための有用なスクリーニング法は知られていない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、この様な状況下為されたものであり、上記色素異常の処置剤となる物質のスクリーニング法を提供することを課題とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
発明者らは、上記課題を解決するために、種々の色素異常のメカニズムを追い求めて、鋭意研究努力を重ねた結果、そばかす等の色素異常症は、メラニン顆粒数そのものは、皮膚全体に於いては変わらないものの、メラノサイトから表皮細胞へのメラニン顆粒の移行が促進され、ここに於いてメラニン顆粒の局在化が起こり、以て、黒く見えることを見いだした。この際に重要な要素となっていることが、メラノサイトからのメラニン顆粒の受け渡しであり、これにメラノサイトのデンドライトの伸長が大きく関わっていることを見いだし、発明を完成させるに至った。
【００１０】
即ち、本発明は、以下の通りである。
【００１１】
（１）メラノサイトを、線維芽細胞増殖因子Ｉ又はＵＶ照射マクロファージ培養上清と被検物質との存在下で培養し、該被検物質のメラノサイトのデンドライトの伸長抑制作用を測定することを特徴とする、メラノサイトのデンドライトの伸長抑制作用を有する物質のスクリーニング法。
【００１２】
（２）メラノサイトを、線維芽細胞増殖因子Ｉ又はＵＶ照射マクロファージ培養上清と被検物質との存在下で培養し、該被検物質のメラノサイトのデンドライトの伸長抑制作用を測定することを特徴とする、色素異常症の処置に有効な物質のスクリーニング法。
【００１３】
（３）色素異常症がそばかすである、（２）に記載のスクリーニング法。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明についてその実施の形態を中心に詳細に説明する。
【００１５】
＜１＞色素異常の起因物質のスクリーニング法
以下に説明するのは、皮膚全体のメラニン顆粒数がほぼ一定でメラニン顆粒のメラノサイトから表皮細胞への移行によって起こる色素異常の起因物質のスクリーニング法であり、色素異常の起因被疑物質の存在下でメラノサイトを培養し、メラノサイトのデンドライトの伸長促進作用を測定するスクリーニング法である。
【００１６】
メラノサイトとは、メラニンを産生する色素細胞であり、哺乳動物では表皮基底層及び毛根に多数存在する。また、ヒト表皮のメラノサイトは人種によらずほぼ一定の密度（約１５００／ｍｍ2）で分布していることが知られている。本発明で用いることができるメラノサイトは、ヒト、マウス等に由来するものが挙げられる。
【００１７】
デンドライトとは、色素細胞や神経細胞がもつ樹枝状の突起である。前記色素異常としては、そばかす、シミ（老人性色素斑）、肝斑、日光性花弁状色素斑等が挙げられる。
【００１８】
メラノサイトを取得、培養する方法としては、特に制限はないが、鈴木等の方法（In Vitro Cell. Dev, Bio. 29A: 419-426; 1993）が挙げられる。具体的には、生体の特定の部位（例えば、マウスの尻尾等）の皮膚切片をトリプシン処理等し、メラノサイトを含む表皮細胞を真皮層より分離し、牛胎仔血清（ＦＢＳ）、酢酸テトラデカノイルフォルボール（ＴＰＡ）、イソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ）等を加えた、イーグルの最小培地等の培地で培養する方法で実施できる。
【００１９】
メラノサイトのデンドライトの伸長促進作用の測定方法としては、メラノサイトのデンドライトの伸長が確認できれば、特に制限はないが、光学顕微鏡及び電子顕微鏡等により観察するか、あるいはビデオスコープを用いてモニターに映し出す事によって観察することにより実施できる。この時、対照として起因被疑物質を加えないものに対しても観察すると、起因被疑物質の存在下で培養したメラノサイトのデンドライトの伸長の程度が判定しやすい。
【００２０】
以下にデンドライトの伸長促進作用の測定の好適な例を記載するが、本発明はこれに限定されない。まず、鈴木等の方法（In Vitro Cell. Dev, Bio. 29A: 419-426; 1993）に従って、マウスの皮膚よりメラノサイトを取り出し、培養する。即ち、マウスの尻尾等の部位の皮膚切片をトリプシン処理等し、メラノサイトを含む表皮細胞を真皮層より分離し、牛胎仔血清（ＦＢＳ）、酢酸テトラデカノイルフォルボール（ＴＰＡ）、イソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ）等を加えた、イーグルの最小培地等の培地で培養する。培養後、トリプシン処理したメラノサイトの細胞を、再度種々の色素異常の起因被疑物質の存在下で培養し、デンドライトの伸長の程度を観察すればよい。
【００２１】
この時の条件としては、メラノサイトの色素数が10〜50/mm2程度になるようにディッシュ上にキャスティングすることが、デンドライトの伸長の程度を観察する上で好ましい。これより多すぎると、デンドライトの伸長が重なりなどによって観察しにくくなり、少なすぎると、例数が少なすぎて色素異常の起因被疑物質の影響の全体の印象が把握しにくいからである。
【００２２】
色素異常の起因被疑物質の添加量は、従来の薬効成分の検定に準じて行えば良く、細胞毒性など毒性発現の閾値の１／２〜１／１０量を上限として、ドーズを振ればよい。
【００２３】
＜２＞本発明のデンドライトの伸長抑制作用を有する物質のスクリーニング法
本発明は、メラノサイトを、皮膚全体のメラニン顆粒数がほぼ一定でメラニン顆粒のメラノサイトから表皮細胞への移行によって起こる色素異常の後記起因物質と被検物質との存在下で培養し、被検物質のメラノサイトのデンドライトの伸長抑制作用を測定することによってメラノサイトのデンドライトの伸長抑制作用を有する物質をスクリーニングする方法である。
【００２４】
以下に、本発明のデンドライトの伸長抑制作用を有する物質のスクリーニング法に関する好適な例を挙げるが、これに限定されない。まず、鈴木等の方法（InVitro Cell. Dev, Bio. 29A: 419-426; 1993）に従って、マウスの皮膚よりメラノサイトを取り出し、培養する。即ち、マウスの尻尾等の部位の皮膚切片をトリプシン処理等し、メラノサイトを含む表皮細胞を真皮層より分離し、牛胎仔血清（ＦＢＳ）、酢酸テトラデカノイルフォルボール（ＴＰＡ）、イソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ）等を加えた、イーグルの最小培地等の培地で培養する。そして、トリプシン処理したメラノサイトの細胞を再度、色素異常の起因物質の存在下で培養した後、被検物質を添加してさらに培養する。このとき、デンドライトの伸長が促進されるか、又は抑制されるかを観察する。
【００２５】
デンドライトの伸長が抑制されれば、被検物質は、デンドライトの伸長抑制作用を有する物質であり、そばかす、シミ（老人性色素斑）、肝斑、日光性花弁状色素斑等の色素異常症の処置剤として有用である。
【００２６】
被検物質の添加のタイミングは、上記のように色素異常の起因物質を作用させた後にメラノサイトに添加してもよいし、色素異常の起因物質と被検物質を同時にメラノサイトに添加したり等、測定系によって適宜検討して決定できる。また、被検物質の添加方法は、被検物質の性質が変化しない限り特に限定されない。
【００２７】
スクリーニング法の別の態様として、被検物質が起因物質の抗体であるとわかっている場合には、起因物質と、抗体である被検物質を免疫沈降したものをメラノサイトの培養系に添加して、デンドライトの伸長抑制作用を測定する方法が挙げられる。この場合、対照として通常培地でメラノサイトを培養することにより、デンドライトの伸長の程度を比較しやすくなる。
【００２８】
本発明のデンドライトの伸長抑制作用を有する物質のスクリーニング法によって、そばかす等の色素異常症に対して有効な処置剤となりうる物質をスクリーニングできる。
【００２９】
＜３＞メラノサイトのデンドライトの伸長促進作用を有する物質（色素異常の起因物質）
メラノサイトのデンドライトの伸長促促進作用を有する物質（皮膚全体のメラニン顆粒数がほぼ一定でメラニン顆粒のメラノサイトから表皮細胞への移行によって起こる色素異常の起因物質）としては、線維芽細胞増殖因子Ｉ（ＦＧＦ−１）又はＵＶ照射マクロファージ培養上清が挙げられる。これらのものをメラノサイトの培養時に共存させることにより、メラノサイトのデンドライトの伸長を促進する作用を発揮する。これらはメラノサイト培養に於いてデンドライトの伸長促進手段として使用される。
【００３０】
【実施例】
以下に、実施例を挙げて本発明について具体的に説明するが、本発明がこれら実施例にのみ限定を受けないことは言うまでもない。
【００３１】
【実施例１】
１２９／ＳｖＣＰマウスを用いて、その皮膚よりメラノサイトを取り出し、ディッシュ上に集め、そのデンドライトの伸長を観測した。このメラノサイトの培養法は、鈴木らの方法に従って行った（インビトロ・セルラー・アンド・デベロップメンタル・バイオロジー In Vitro Cell. Dev. Biol. 29A: 419-426; 1993）。即ち、マウス尾部の皮膚を切りだし、この皮膚片を０．５％トリプシン培地溶液で処理し表皮シートを分離させた。この表皮シートは分離できなかった単球と線維芽細胞とともにフェノールレッドを含まない１０％ＦＢＳ（牛胎仔血清）、１０ｎｇのＴＰＡ（酢酸テトラデカノイルフォルボール）、１００μＭのＩＢＭＸ（イソブチルメチルキサンチン）を加えたＭＥＭ（イーグルの最小）培地中で３日間培養した。表皮細胞は０．０２５％トリプシンを含むＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で処理した後、１２ｍｍの培養ウエル中に色素顆粒を有するメラノサイトの細胞数が１５００個程度になるように調整し、フェノールレッドを含まない１０％ＦＢＳ、１０ｎｇのＴＰＡ、１００μＭのＩＢＭＸを加えたＭＥＭ培地５００μｌ中で、対照群はそのまま、検査群は線維芽細胞増殖因子Ｉ（５０ｎｇ）を加えて２日間培養した。
【００３２】
これらの細胞の培養経過は光学顕微鏡及び電子顕微鏡で観察し、デンドライトの平均的な伸長を観察し、対照群と検査群で比較したところ、明らかに検査群の方が著しく伸びていることがわかった。しかしながら、平均のメラニン顆粒数は差がなかった。これにより、線維芽細胞増殖因子Ｉは、メラノサイトのデンドライトの伸長を促進し、この伸長により、メラニン顆粒の基底細胞への移行を促進し、色素の異常を引き起こしていることがわかった。検査群と対照群のデンドライトの伸長を示す写真を図１に示す。
【００３３】
【実施例２】
（１）実施例１において、ＦＧＦ−１がメラノサイトのデンドライトの伸長を促進していたことが判明したが、このＦＧＦ−１の由来を考えると、生体内においてはマクロファージに由来すると考えることが自然であると考え、マクロファージのメラノサイトのデンドライト伸長に対する影響を検討した。
【００３４】
即ち、マクロファージは、同系のマウスの腹腔細胞を採取し、１０％ＦＢＳ加ＭＥＭ培地に２×１０6個／ｍｌで懸濁させ、紫外線Ｂを６０ｍＪ／ｃｍ2のエネルギー量で照射し、これを１日培養し得た培地をUV照射マクロファージ培養上清とした。
【００３５】
実施例１と同様にディッシュ上に集めたメラノサイトを上記ＵＶ照射マクロファージの培養上清を含む培養液で２日間培養し、デンドライトの伸長を確かめたところ、伸長を促進していることが確認された。
【００３６】
（２）更に、これがＦＧＦ−１による作用であることを確かめるために、シアンブロミド懸濁液１０μｌに、被検物質としての抗ＦＧＦ−１抗体、及びウサギＩｇＧをそれぞれ２０μｇ結合させ、上記培養上清を免疫沈降し、これらをメラノサイトに加えて培養した。対照として、通常培地でメラノサイトを培養したもののデンドライトを観察した。
【００３７】
その結果、抗ＦＧＦ−１抗体で免疫沈降した場合には、ウサギＩｇＧを用いた場合に比べデンドライトの伸長が明らかに抑制された。これらの写真を図２に示す。
【００３８】
【発明の効果】
本発明によれば、これまで知られていなかったメカニズムの色素異常に対する処置剤となりうる物質のスクリーニング法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  実施例１における検査群（ａ）と対照群（ｂ）のメラノサイトを示す。（ａ）は、ＦＧＦ−１（１００ｎｇ／ｍｌ）を添加後、４８時間培養したマウスメラノサイトの形態を示す。（ｂ）は、通常培地で培養したメラノサイトを示す。
ｂａｒ＝５０μｍ
【図２】  実施例２で培養したメラノサイト（ｃ：rabbit IgG、ｄ：抗ＦＧＦ−１抗体，ｅ：対照群）を示す。マウスマクロファージ培養上清をrabbit IgG(positive control)、抗ＦＧＦ−１抗体で免疫沈降し、培養マウスメラノサイトに添加。（ｃ）と（ｄ）の写真は添加後４８時間の代表的なメラノサイトの形態を示す。（ｅ）は、通常培地で培養したメラノサイトを示す。
ｂａｒ＝５０μｍ
【図１】
0004395221.tif 000002
【図２】
0004395221.tif 000003