(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の一般式（１）または（２）：
【化１】
0004510440.tif 000018
（式中、Ｂは次の構造：
【化２】
0004510440.tif 000019
を有する環であり、ここで：
Ｒ１＝−ＣＨ＝ＣＨ２、−ＣＨ（ＯＡｌｋ）ＣＨ３、−ＣＨＯ、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ（Ａｌｋ）ＣＨ（ＣＯＡｌｋ）２、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＯＡｌｋ）２、−ＣＨ（Ａｌｋ）ＣＨ２ＣＯＡｌｋ、−ＣＨ（Ａｌｋ）ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、及び−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３；
Ｒ２＝−ＣＨ３、−ＣＨＯ、−ＣＨ（ＯＨ）Ａｌｋ、−ＣＨ＝ＣＨＡｌｋ、ＣＨ２ＯＨ、及びＣＨ２ＯＡｌｋ；
Ｒ３＝−ＯＨ、−ＯＡｌｋ、−ＮＨ−Ａｌｋ、ＮＨ−Ｘ−ＣＯＯ−（ＨＧ）＋、−ＮＨ−Ｙ−ＮＲ８Ｒ９、及びＮＨ−Ｙ−ＯＨ；
Ｒ４＝−Ｏ−（ＨＧ）＋、−ＯＡｌｋ、−ＮＨ−Ａｌｋ、及びＮＨ−Ｘ−ＣＯＯ−（ＨＧ）＋；
Ｒ５＝−Ｏ−（ＨＧ）＋、−ＯＡｌｋ、−ＮＨ−Ａｌｋ、及びＮＨ−Ｘ−ＣＯＯ−（ＨＧ）＋；
Ｒ６＝Ｈ及び−ＣＯＯＡｌｋ；
Ｒ７＝−Ｏ−（ＨＧ）＋、−ＯＡｌｋ、−ＮＨ−Ａｌｋ、及び−ＮＨ−Ｘ−ＣＯＯ−（ＨＧ）＋；
Ｒ８＝Ｈ及びＡｌｋ
Ｒ９＝Ｈ及びＡｌｋであり、
ここで：
−ＮＨ−Ｘ−ＣＯＯ−＝有機アミノ酸の残基；
Ｘ＝アルキリデン、ペプチド、オリゴペプチド、及び−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２−、式中、ｎ＝１−３０；
Ｙ＝アルキリデン及び−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２−、式中、ｎ＝１−３０；
Ｇ＝Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、アミノアルキルグリコシド、ＴＲＩＳ、アミノ酸、及びオリゴペプチド；及び
Ａｌｋ＝アルキル置換基）
を有する医薬品グレードの水溶性ポルフィリン誘導体を製造する方法であって：
ａ）自然に生育する植物、藻類、血液成分、昆虫の分泌物、微生物からなる群から選択される、結晶性アルキルフェオフォルビドを含有する生物学的原料を１工程または２工程で直接酸性アルコーリシスする工程；
ｂ）得られた該アルキルフェオフォルビドの酸性ポルフィリンへの変換工程；及び
ｃ）水及び水性有機溶液からなる群から選択される媒質中で、該酸性ポルフィリンとＮ−メチル−Ｄ−グルカミン、アミノアルキルグリコシド、ＴＲＩＳ、アミノ酸、及びオリゴペプチドからなる群から選択される親水性有機アミンとを反応させる工程：
からなることを特徴とする方法。
【請求項２】
さらに下記の工程（ｄ）含む請求項１記載の方法。
（ｄ）揮発性溶媒を用いる逆相クロマトグラフィーにより水溶性ポルフィリン誘導体を精製する工程。
【請求項３】
親水性有機アミンがＮ−メチル−Ｄ−グルカミンである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
自然に生育する植物及び藻類がＳｐｉｒｕｌｉｎａ
Ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｍａｘｉｍａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ、イラクサ、及びホウレンソウを含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
直接的な１工程または２工程の酸性アルコーリシスが、メタノリシス及びエタノリシスからなる群から選択される、請求項１〜４に記載のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生物学的に活性な化合物の化学に関するものであり、即ち、水溶性ポルフィリン誘導体、特には、タイプ１及び２のクロリン、バクテリオクロリン、フェオフォルビド、及びバクテリオフェオフォルビド誘導体を製造する新規な方法に関するものである。本発明の化合物は、癌、感染性疾患、及び他の疾患の光力学的療法のための光増感剤として、並びに、他のケースにおける光照射療法のための光増感剤として使用することができる。
【０００２】
【化３】
0004510440.tif 000002
式中のＢは、次の化学構造式を有する環である：
【０００３】
【化４】
0004510440.tif 000003
ここで：
Ｒ１＝−ＣＨ＝ＣＨ２、−ＣＨ（ＯＡｌｋ）ＣＨ３、−ＣＨＯ、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ（Ａｌｋ）ＣＨ（ＣＯＡｌｋ）２、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＯＡｌｋ）２、−ＣＨ（Ａｌｋ）ＣＨ２ＣＯＡｌｋ、−ＣＨ（Ａｌｋ）ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、及び−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３
Ｒ２＝−ＣＨ３、−ＣＨＯ、−ＣＨ（ＯＨ）Ａｌｋ、−ＣＨ＝ＣＨＡｌｋ、ＣＨ２ＯＨ、及びＣＨ２ＯＡｌｋ；
Ｒ３＝−ＯＨ、−ＯＡｌｋ、−ＮＨ−Ａｌｋ、ＮＨ−Ｘ−ＣＯＯ−（ＨＧ）＋、−ＮＨ−Ｙ−ＮＲ８Ｒ９、−及びＮＨ−Ｙ−ＯＨ；
Ｒ４＝−Ｏ−（ＨＧ）＋、−ＯＡｌｋ、−ＮＨ−Ａｌｋ、及びＮＨ−Ｘ−ＣＯＯ−（ＨＧ）＋；
Ｒ５＝−Ｏ−（ＨＧ）＋、−ＯＡｌｋ、−ＮＨ−Ａｌｋ、及びＮＨ−Ｘ−ＣＯＯ−（ＨＧ）＋；
Ｒ６＝Ｈ及び−ＣＯＯＡｌｋ；
Ｒ７＝−Ｏ−（ＨＧ）＋、−ＯＡｌｋ、−ＮＨ−Ａｌｋ、及び−ＮＨ−Ｘ−ＣＯＯ−（ＨＧ）＋；
Ｒ８＝Ｈ及びＡｌｋ
Ｒ９＝Ｈ及びＡｌｋ。
ここで：
−ＮＨ−Ｘ−ＣＯＯ−＝有機アミノ酸の残基；
Ｘ＝アルキリデン、ペプチド、オリゴペプチド、及び−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２−、式中、ｎ＝１−３０；
Ｙ＝アルキリデン及び−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２−、式中、ｎ＝１−３０；
Ｇ＝親水性有機アミン（ｆ．ｅｘ．Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン及び他のアミノ基含有炭水化物誘導体、ＴＲＩＳ、アミノ酸、オリゴペプチド）；及び
Ａｌｋ＝アルキル置換基。
【背景技術】
【０００４】
光力学的療法（ＰＤＴ）は、様々な医学的用途で使用すべく現在探求されている最も前途有望な技術のうちの一つであり（光力学的療法、その基本原理と臨床的適用（Ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ  ｔｈｅｒａｐｙ，ｂａｓｉｃ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）。Ｅｄｓ．Ｂ．Ｗ．Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ、Ｔｈ．Ｊ．Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、１９９２年、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、特には、腫瘍を破壊するための広く認識された治療法である（光力学的腫瘍療法、第二世代及び第三世代の光増感剤（Ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ  ｔｕｍｏｒ  ｔｈｅｒａｐｙ，２ｎｄ  ａｎｄ  ３ｒｄ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒｓ）。Ｅｄ．Ｊ．Ｇ．Ｍｏｓｅｒ、Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９９８年、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）。ポルフィリンは、ＰＤＴにおいて広く使用されている化合物である。ポルフィリンの薬剤学的適用における重大な問題は、生理的溶液中における溶解度が低いことである。これは、ＰＤＴ及び他の用途のための効果的な医薬品グレードの注射可能な溶液の調製を殆ど不可能に為す。
【０００５】
ＰＤＴ用の水溶性ポルフィリン誘導体を製造する幾つかの方法が当技術分野において知られている。Ｓｍｉｔｈらによる米国特許第５，３３０，７４１号は、リシル−クロリンｐ６三ナトリウムを製造する方法を開示しており、その方法は、ピリジンの存在下における、メチルフェオフォルビドａ変換に由来するプルプリン１８メチルエステルと塩化メチレン中の水性リジンとの反応を含む。その混合物は、室温で１２時間攪拌され、続いて、それらの溶媒が高度の真空下において除去される。そのようにして調製された粗生成物は、逆相ＨＰＬＣにより精製され、その後、凍結乾燥される。癌のＰＤＴのための注射可能な溶液を調製するため、その調製物は、先ず、リン酸緩衝液中に溶解され、その後、０．１Ｎの水酸化ナトリウムが加えられる。この溶液のｐＨ値が０．１ＮのＨＣｌを用いてｐＨ７．３５に調節され、続いて、ミクロ細孔フィルターを通じて無菌濾過される。
【０００６】
上述の方法の欠点は、実行する際の再現性の不足と困難性、及び有毒試薬を使用することを含み、これらの欠点が、その方法での薬剤製造を殆ど不適切に為している。更に、そのようにして調製された興味対象の水溶性生成物は、水溶液の形態では、暗所において４℃で２４時間しか安定でなく、そして、固形の場合には、暗所において４℃で４ヶ月まで安定である［Ｍ．Ｗ．Ｌｅａｃｈ、Ｒ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ、Ｊ．Ｅ．Ｂｏｇｇａｎ、Ｓ．−Ｊ．Ｌｅｅ、Ｓ．Ａｕｔｒｙ、Ｋ．Ｍ．Ｓｍｉｔｈ、ラットにおける皮下９Ｌ神経膠腫の光力学的療法でのリシルクロリンｐ６／クロリンｐ６混合物の有効性（Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ  ｏｆ  ａ  Ｌｙｓｙｌｃｈｌｏｒｉｎ  ｐ６／Ｃｈｌｏｒｉｎ  ｐ６  ｍｉｘｔｕｒｅ  ｉｎ  Ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ９Ｌ  Ｇｌｉｏｍａ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｒａｔ）。Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１９９２年、５２、１２３５−１２３９；米国特許第５，３３０，７４１号］。
【０００７】
フェオフォルビドａ（３）の水溶性ナトリウム塩を製造する方法が存在し、Ｎａｋａｚａｔｏによる米国特許第５，３７８，８３５号に記載されている。この発明によれば、フェオフォルビドａ（４）がジエチルエーテル中に溶解され、そして、その溶液に、ｎ−プロパノール、イソ−プロパノール、またはそれらの混合液中におけるアルカリの高度希釈溶液が一滴ずつ非常にゆっくりと加えられる。フェオフォルビドａの塩が完全に沈殿するまでその反応を維持し、そして、その沈殿物が遠心分離され、真空下で乾燥される。次いで、その生成物を水に溶解して、濃度が０．５％でｐＨが９．２−９．５の溶液に為し、その後、この溶液がｐＨ７．４−７．８のリン酸緩衝液で希釈される。
【０００８】
Ｎａｋａｚａｔｏが開示している方法の欠点は、この技術では、注射可能な濃縮（＞１％）フェオフォルビドａ水溶液を生成できないことである。更に、本発明の著者らは、乾燥状態で保存したときにそのような塩が化学的に不安定であることと、乾燥状態で保存した後の水中におけるそれらの溶解能力が不完全であることを実証した。
【０００９】
【化５】
0004510440.tif 000004
本発明に最も近い類似の方法は、Ｇ．Ｖ．Ｐｏｎｏｍａｒｅｖらによるロシア特許ＲＵ第２１４４５３８号に開示されている方法であり、その方法は、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ  Ｐｌａｔｅｎｓｉｓシアノバクテリアバイオマスからのクロロフィルａの調製、更には、標準的な手順によるクロリンｅ６への変換［Ｓ．Ｌｏｔｊｏｎｅｎ、Ｐ．Ｈ．Ｈｙｎｎｉｎｅｎ、（１０Ｒ）−及び（１０Ｓ）−フェオフィチンａ及びｂを製造する改善された方法（Ａｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  （１０Ｒ）−  ａｎｄ  （１０Ｓ）−ｐｈｅｏｐｈｙｔｉｎｓ  ａ  ａｎｄ  ｂ）。Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、１９８３年、７０５−７０８；Ｐ．Ｈ．Ｈｙｎｎｉｎｅｎ、Ｓ．Ｌｏｔｊｏｎｅｎ、選択的加水分解の原理を利用する、クロロフィル混合物からのホルビン誘導体の調製（Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｈｏｒｂｉｎ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｆｒｏｍ  ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ  ｍｉｘｔｕｒｅ  ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ  ｏｆ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ）。Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、１９８０年、５３９−５４１；Ｓ．Ｌｏｔｊｏｎｅｎ、Ｐ．Ｈ．Ｈｙｎｎｉｎｅｎ、湿性クロリンｅ６及びロジンｇ７トリメチルエステルを製造する便利な方法（Ａ  ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｗｅｔ  ｃｈｌｏｒｉｎ  ｅ６  ａｎｄ  ｒｈｏｄｉｎ  ｇ７  ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒｓ）。Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、１９８０年、５４１−５４３］を包含する多段ステップの直進的な化学反応シーケンスにより、クロリンｅ６（７）とＮ−メチル−Ｄ−グルコサミンを含む広空間占有（spacious）有機アミンとの水溶性錯体を調製するものであり、それのアセトン溶液への漸次的な水の付加によるクロリンｅ６の沈殿と、それに続く遠心分離、水を用いる３重の洗浄、及び、その後の２ｇ−ｅｑ．の広空間占有有機アミンの水溶液を用いる湿性クロリンｅ６の処理後における全体的な収率は５０％を超える。
【００１０】
水溶性クロリンの調製的合成にとって、特には工業的合成及び薬剤製造にとって決定的な困難性の原因となるこの方法の重大な不都合な点は以下の事項である：
１．中間生成物としてのクロリンｅ６は、未知の限定的なクロリンｅ６含量を伴う湿性の塊として得られる。得られるクロリンｅ６の量に関するこの不安定性は、更なる結果的溶液を標準化する能力を損なう不確定性を創出する。
【００１１】
２．この合成シーケンスにおける重要な中間体は、性状が酸性であるために精製及び標準化すべく取り扱うのが困難なフェオフォルビドａ（４）である。（Ｐｏｎｏｍａｒｅｖが利用したような）繰り返し行われる沈殿によるフェオフォルビドａ（４）の分離は定量的でなく、従って、大規模な調製には都合が悪い。
【００１２】
３．この指示されている方法により得られるフェオフォルビドａ（４）は、分離するのが難しい不純物を含んでいる。この不都合な状態は、フェオフォルビドａ（４）の定量に不確定性をもたらし、フェオフォルビドａ（４）をクロリンへ変換する過程におけるシクロペンタノン環の化学的な開放を妨害する。
【００１３】
４．Ｐｏｎｏｍａｒｅｖにより調製されたクロリンｅ６の水溶性塩のサンプルは、そこに記載されている手順を使用しても、標的とするクロリンｅ６生成物から分離することができないような非ポルフィリンタイプ及びポルフィリンタイプの様々な不純物を含んでいることに留意すべきである。詳細には、ＴＬＣ法及びＨＰＬＣ法を用いることによって認められ得るポルフィリン不純物の中には、フェオフォルビドａ（４）、プルプリン１８（８）、クロリンｐ６（９）、及び幾種類かの他の共存物がある。
【００１４】
【化６】
0004510440.tif 000005
上述の発明の親水性アミンとの塩としてのタイプ（４）、（８）、及び（９）の化合物は、それらの個々のクロリンｅ６塩と比較して、水に対する溶解度が著しく低いことにより特徴付けられることが認識されよう。それにもかかわらず、クロリンｅ６塩の存在下において、上述の発明の親水性アミンとの塩としてのタイプ（４）、（８）、及び（９）の化合物は、クロリンｅ６塩を伴う錯体の形成が起こり得ることによって説明され得る状態よりもはるかに高い水溶性を有している。この現象は、それらの水に対する溶解度が異なることを利用して、タイプ（４）、（８）、及び（９）の化合物の如き不純物からクロリンｅ６生成物を分離することを不可能に為す。
【００１５】
５．水溶性クロリンを調製するためにＰｏｎｏｍａｒｅｖが使用している有機アミンは、実際に適用するのに最適なものではない。特に、比較的高い溶解度を有するクロリンとの錯体を形成するＤ−グルコサミンは、アルデヒド基で酸化が起こり得るため、充分に安定ではない。それと同時に、Ｄ−グルコサミンは、その溶液中において、構造的不確定性をもたらし、それ故、個々の詳細な構造的特徴付けが難しく、従って、薬剤調製のための品質管理の要件を満たさない幾種類かの異性体の形態で存在している可能性がある。Ｐｏｎｏｍａｒｅｖはもう一つの広空間占有アミン、即ち、Ｎ−メチル−Ｄ−グルコサミンを使用しているが、このアミンも、上述のＤ−グルコサミンと同じ欠点を有しており、その上、このアミンは、調製するのが難しいため、利用しにくい。
【００１６】
６．Ｐｏｎｏｍａｒｅｖは、広空間占有有機アミンを用いるクロリンｅ６誘導体の水溶性塩の形成を特許請求しているが、例えばｔｅｒｔ−ブチル基、ネオペンチル基、アダマンチル基、シクロヘキシル基を含有するもの等の通常の広空間占有有機アミンは、広空間占有有機部分が高度の疎水性を有しているため、水溶性クロリンｅ６塩の調製に使用できなかったという理由から、これは非常に疑念を抱かせる。
【００１７】
この態様は、上述の他の態様と相俟って、Ｐｏｎｏｍａｒｅｖにより特許請求されている方法を用いてＧＭＰ規準に準拠した効果的な医薬品グレードの組成物を製造することを不可能に為す。
【００１８】
本発明における興味対象を合成するための開始（starting）ポルフィリン誘導体は、伝統的には、純粋且つ標準的な生のポルフィリン材料であるメチル（５）またはエチル（６）フェオフォルビドａから得られる。生物学的な原料からポルフィリンを分離するための今日までに知られている一般的な方法は、先ずクロロフィルを得るために有機溶媒を用いて行われる面倒な一連の長い洗浄ステップ、及び／又は、その生物材料の細胞壁を破壊するための凍結ステップ、及び、そのバイオマスの化学的な処理と共に繰り返し行われる抽出ステップを含み、次いで、そのクロロフィルは、フェオフィチンに変換され、続いて、フェオフォルビドを生成すべく加水分解される（Ｋ．Ｍ．Ｓｍｉｔｈ、Ｄ．Ａ．Ｇｏｆｆ、及びＤ．Ｊ．Ｓｉｍｐｓｏｎ、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９８５年、１０７、４９４６−４９５４；Ｒ．Ｋ．Ｐａｎｄｅｙ、Ｄ．Ａ．Ｂｅｌｌｎｉｅｒ、Ｋ．Ｍ．Ｓｍｉｔｈ、及びＴ．Ｊ．Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．、１９９１年、５３、６５−７２）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
従って、医学的な適用、特には光力学的療法に適した、標準的な含量の望ましい物質を伴う、純粋で化学的に安定した医薬品グレードの水溶性ポルフィリン誘導体を製造する簡単且つ効率的な方法を提供することに対するニーズがある。本発明は、このニーズを満たし、更に、関連する他の利点提供する。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の一つの目的は、標準的な含量の望ましい物質を伴い、且つ、種々の医学的適用、特にはＰＤＴに適した、化学的に安定な水溶性ポルフィリン誘導体を提供することである。
【００２１】
本発明の別の目的は、薬剤組成物において有効な、医薬品グレードで高純度の水溶性ポルフィリン誘導体を提供することである。
【００２２】
本発明の別の目的は、化学的に安定した水溶性ポルフィリン誘導体を製造する方法を提供することである。
【００２３】
本発明の尚も別の目的は、先行技術の欠点を回避しながら、生物学的原料から化学的に安定した水溶性ポルフィリン誘導体を製造する簡単で時間的に効率のよい方法を提供することである。
【００２４】
本発明の更に別の目的は、癌及び他の過増殖性疾患、感染症、及び他の病気などの治療等、医学的な用途において使用するための薬剤学的に許容可能な調製物における、化学的に安定した水溶性ポルフィリン誘導体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
本発明の一つの実施形態は水溶性ポルフィリン誘導体を製造する方法からなり、その方法は、生物学的な原料をワン−ステップまたは２工程で直接的に酸性アルコーリシスして結晶性アルキルフェオフォルビドを生成するステップ、得られたアルキルフェオフォルビドを酸性ポルフィリンに変換するステップ、及び、水中または水性有機溶液中においてその酸性ポルフィリンを親水性有機アミンと反応させるステップを含む。
【００２６】
本発明の別の実施形態は水溶性ポルフィリン誘導体を製造する方法からなり、その方法は、水中または水性有機溶液中において酸性ポルフィリンを親水性有機アミンと反応させるステップを含む。
【００２７】
本発明の尚も別の実施形態は水溶性ポルフィリン誘導体を製造する方法からなり、その方法は、生物学的な原料をワン−ステップまたは２工程で直接的に酸性アルコーリシスして結晶性アルキルフェオフォルビドを生成するステップ、得られたアルキルフェオフォルビドを酸性ポルフィリンに変換するステップ、水中または水性有機溶液中においてその酸性ポルフィリンを親水性有機アミンと反応させるステップ、及び、結果として生じた水溶性ポルフィリン誘導体を、揮発性溶媒を用いる逆相クロマトグラフィーにより精製するステップを含む。
【００２８】
更に別の実施形態では、本発明は水溶性ポルフィリン誘導体を製造する方法を提供し、その方法は、水中または水性有機溶液中において酸性ポルフィリンを親水性有機アミンと反応させるステップ、及び、揮発性溶媒を用いる逆相クロマトグラフィーにより水溶性ポルフィリン誘導体を精製するステップを含む。更に、本発明は、光力学的療法及び他の医学的用途において使用するための薬剤組成物に有用な、この発明により提供される方法によって得られる、化学式（１）及び（２）の水溶性ポルフィリン誘導体を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
本発明を説明する前に、この開示で使用される特定の用語の定義について説明することが有用であろう。
【００３０】
ポルフィリンは、それぞれ、ピロールに結合して特徴的なテトラピロール環構造を形成する１個の炭素原子または１個の窒素原子のブリッジを有する大環状化合物である。ポルフィリン誘導体には、ジヒドロピロール単位を含有するものを含め、多くの異なるクラスがある。本明細書では、ポルフィリンという用語は、ポルフィリン、フタロシアニン、クロリン、フェオフォルビド、それらのメタロ誘導体、及び、ＰＤＴ及び薬剤調製に適した他のポルフィリン様化合物を指し示すべく使用される。
【００３１】
本明細書で使用する場合、生物学的な原料は、例えば植物、藻類、血液成分、及び昆虫の分泌物等を含む、本発明の化合物を製造する材料である。
【００３２】
本発明の目的は、水中または水性有機溶液中における酸性ポルフィリンを、親水性有機アミンと、好適には、薬剤調製に有用なポリヒドロキシル化された安定で無毒な化合物であるＮ−メチル−Ｄ−グルカミン（１０）と、または、マルトース誘導体（１１）及び（１２）等のアミノアルキル及びアミノアリールグリコシド、あるいは、炭水化物誘導体に結合された他のアミノ基と反応させるステップを含む、ここで説明されている方法により達成される。他の意図される試薬は、これらに限定するものではないが、これも安定且つ無毒で薬剤調製に有用な化合物であるトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳとしても知られている）（１３）、または化合物（１４）及び（１５）等のＴＲＩＳ誘導体を伴うもの、並びに、ビス（２−ヒドロキシエチル）アミン（１６）の如き他のタイプの親水性アミンを含む。また、オリゴリジン、好ましくはペンタリジン及びヘキサリジン等のアミノ酸またはオリゴペプチドも、本発明による水溶性ポルフィリン誘導体を調製するのに適した親水性有機アミンとして使用することができる。
【００３３】
【化７】
0004510440.tif 000006
実施例９で説明されているような本発明の一つの好適な実施形態によれば、（遊離酸としての）化学的に純粋なポルフィリンと適切な親水性有機アミンとの定量的な化学量論的反応が、不活性ガス下における暗所において室温で実行される。使用される溶媒は、不活性ガス（例えば、アルゴン、ヘリウム、または他のもの）で脱気された化学的に純粋な水か、あるいは、必要な場合には、化学的に純粋で脱気された適当な有機溶媒と水との混合物かのいずれかである。この有機溶媒は、その後、（開始ポルフィリンの起こり得る破壊を回避するため）加熱することなく、真空下で蒸発させられ、そして、その生成物が凍結乾燥される。場合によっては、（遊離酸としての）ポルフィリンと適切な親水性有機アミンとの反応が起こるように、開始ポルフィリンを溶解することによってその反応を補助すべく、有機溶媒を加えることが必要になる。可能な有機溶媒の例は、アセトン、または、塩化メチレンとメタノールの混合物である。結果として生じる水溶性の凍結乾燥ポルフィリンは、化学的に純粋で、医学的または生物学的に適用するための滅菌を除き、それ以上の精製を何ら必要としない。
【００３４】
本発明の別の好適な実施形態によれば、開始ポルフィリンの湿性ペーストを含む、純粋でない成分を使用することができる。その反応は、すべてのポルフィリンコンポーネントと反応させるために過剰量の親水性有機アミンが使用される点を除き、上述の場合と同様に実施される。真空下における反応混合物の濃縮後、結果として生じた水溶性ポルフィリンは、好ましくはＲＰ  Ｃ−８またはＣ−１８タイプの適切な逆相吸着剤を伴うカラムでのクロマトグラフィーにより精製される。標的生成物を伴うフラクションを収集し、有機溶媒を除去するため、加熱することなく、真空下において蒸発させ、次いで、凍結乾燥することにより、所望の水溶性ポルフィリン誘導体を得ることができる。揮発性溶媒を用いる逆相クロマトグラフィーによって水溶性ポルフィリン誘導体を精製するために開発されたプロトコルは、医療用調製物を製造する上で非常に重要な、標準的且つ高品質の生成物をもたらす。
【００３５】
本発明の尚も別な実施形態は、生物学的な原料からポルフィリン化合物を得る簡単且つ効率的な方法である。その方法は、生物学的原料のワン−ステップまたはツー−ステップからなる直接的な酸性アルコーリシス、好適にはメタノーリシスまたはエタノーリシスを実施し、標的ポルフィリン誘導体を得るための更なる種々の化学的変換に適した重要な中間生成物として、結晶性アルキルフェオフォルビド（好適にはメチル及びエチル）を得るステップを含む。このシンプルで、且つ、比較的素早い手順は、これまでに知られている手順で必要とされた、有機溶媒を用いる面倒な洗浄ステップ、または、開始生物材料の（細胞壁を破壊するために行われる）凍結ステップ、及び、繰り返し行われる抽出ステップ等を伴うことなく、生物学的原料からポルフィリン誘導体を調製することができる。
【００３６】
合成過程における中間生成物として結晶性のアルキルフェオフォルビド（好適にはメチル及びエチル）を使用することは、シンプルな精製と標準化の可能性を提供し、これは、ＰＤＴ等の医学的手順において使用するための薬剤調製物を製造する上で非常に重要である。
【００３７】
アルコーリシスの成果は、開始する生物学的原料の質、特にはそれの乾燥度に依存し、この乾燥度は、アルコーリシス中における必要な酸の濃度を維持する上で重要である。従って、例えば乾燥されたＳｐｉｒｕｌｉｎａまたはＣｈｌｏｒｅｌｌａ（クロレラ）のバイオマス、または、粉末状の乾燥したイラクサの葉等の充分に乾燥した材料のケース（実施例１−５参照）では、アルキルフェオフォルビドの直接的なワン−ステップ調製を実施することが可能である。
【００３８】
充分に乾燥していない原料のケースでは、アルキルフェオフォルビドの調製は、ホウレンソウからのメチルフェオフォルビドａ（５）及びｂ（１７）の調製（実施例６参照）により例証されているような、ツー−ステップのアルコーリシスにより実施される。そのようなケースでは、開始原料中における大量すぎる量の水の存在は、フィトールエステルを開裂するのに適した酸の適切な濃度の発生を妨げる。それにもかかわらず、最初のアルコーリシスステップ後に得られるフェオフィチンは、第二のアルコーリシスステップにおける結晶性アルキルフェオフォルビドの調製で充分に使用できる程度に乾燥している。
【００３９】
水溶性の形態への更なる変換に適した酸性ポルフィリンの調製は、ポルフィリン原料、例えば、本発明で説明されている手順に従って生物学的な原料から得られる結晶性アルキルフェオフォルビドの化学的な変換により果たされる。
【００４０】
【化８】
0004510440.tif 000007
詳細には、エトキシ−誘導体（１９）等の２−デビニル−２−（１−アルコキシエチル）−クロリンｅ６は、酢酸中におけるＨＢｒの飽和溶液を用いるメチルまたはエチルフェオフォルビドａのヒドロ臭素化により、それぞれの２−デビニル−２−（１−ブロモエチル）−フェオフォルビドａを生成し、更に、アルコーリシスにより、２−デビニル−２−（１−アルコキシエチル）フェオフォルビドａ（例えば化合物１８）をもたらし（Ｃ．Ｒｉｍｉｎｇｔｏｎ、Ａ．Ｒｏｅｎｎｅｓｔａｄ、Ａ．Ｗｅｓｔｅｒｎ、及びＪ．Ｍｏａｎ、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９８８年、２０、１１３９−１１４９；Ｋ．Ｒ．Ａｄａｍｓ、Ｃ．Ｒ．Ｂｅｒｅｍｂａｕｍ、Ｒ．Ｂｏｎｎｅｔｔ、Ａ．Ｎ．Ｎｉｚｈｎｉｋ、Ａ．Ｓａｌｇａｄｏ、及びＭ．Ａ．Ｖａｌｌｅｓ、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．１、１９９２年、１４６５−１４７０）、その後、鹸化によって、三酸（１９）、または、例えばＮ−メチル−Ｄ−グルカミン（１０）との水溶性塩（実施例１０）としてのそれぞれの２−デビニル−２−（１−アルコキシエチル）−クロリンｅ６を形成することにより得ることができる。
【００４１】
２−デビニル−２−（１−ブロモエチル）−フェオフォルビドのアルコーリシスの代わりに行われる、同様な仕方の別のタイプの求核試薬と２−デビニル−２−（１−ブロモエチル）−フェオフォルビドとの反応は、本発明によるそれらの水溶性の形態の調製において使用され得る種々の可能なポルフィリン誘導体の形成をもたらす。
【００４２】
また、水溶性の形態における種々の異なるクロリン及びフェオフォルビド誘導体を製造する本発明の方法は、アミン（１０）と酸（４）及び（２０）−（３３）との水溶性の塩を製造する実施例１５−３０（以下で開示される）により例証することもできる。
【００４３】
【化９】
0004510440.tif 000008
【００４４】
【化１０】
0004510440.tif 000009
本発明による酸性ポルフィリン誘導体と親水性アミンとの反応は、それぞれの水溶性塩の形成をもたらす。詳細には、フェオフォルビド誘導体の場合、これらは単塩であり、一方、三酸クロリン（３４）からは、位置６（原子のナンバリングは化合物４−６で示されている）のカルボキシル基が塩を形成するのに充分な酸性を呈示しないため、［以下の反応図式１で示されているように、中間体（３５）等の生じ得る単塩のうちの一つの中間体形成を介して］二塩が形成される。
反応図式１．
【００４５】
【化１１】
0004510440.tif 000010
Ｇ−親水性アミン。
本発明の水溶性ポルフィリン塩は（反応図式２のクロリンで例証されているように）水中に溶解されている間に加水分解を受け得るため、本発明の水溶性塩を調製し、それらを、過剰な親水性アミンの存在下において溶解された状態で保存するのが望ましい。
【００４６】
本発明の水溶性クロリン二塩は、実施例９Ｂで例証されているように、カラムクロマトグラフィーでの精製により個々の状態で得ることができる。精製された二塩の水中における溶解は、二塩と比べて低く、更に恐らくは、水に溶けにくい親クロリン（１）と比べてさえ低い水溶解度を有し得る単塩（例えばタイプ３５の単塩、反応図式２参照）を与える可逆的加水分解を伴う。そのようなプロセスは、溶液の保存中に少量の沈殿物の形成をもたらし得る。
反応図式２．
【００４７】
【化１２】
0004510440.tif 000011
Ｇ−親水性アミン。
【００４８】
ＰＤＴの如き医学的な用途でこれらの溶液を使用するためには、そのような望ましくないプロセスを防ぎ、透明で均質な溶液を維持することが必ず必要になるが、それらを果たすためには、望ましいポルフィリン誘導体が二塩の形態に保たれ、従って、二塩の加水分解による単塩及び親クロリンの形成が防止されるように、少量且つ既知量のそれぞれの親水性アミン（例えば、２モル当量未満、より好適には、０．０５当量から０．５当量までの間）の存在下において、二塩を水に溶解することが好ましい。
【００４９】
本明細書で開示されている親水性アミンとクロリン及びフェオフォルビド誘導体との塩は、水に対して１ｍｇ／Ｌの１０分数（tenths）のオーダーの溶解度を有しており、これは、様々な用途においてそれらを有用に為す。本発明の一つの付加的な目的は、アミノ酸フラグメントを伴わない親フェオフォルビド化合物よりも水に対する溶解度が１００倍以上高いことを特徴とする親水性アミンとの塩を形成すべく、ペプチド結合を介して取り付けられたアミノ酸単位を担持するフェオフォルビド誘導体を調製することである。特に、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン（１０）とフェオフォルビド誘導体（３６）との塩は４０ｍｇ／Ｌの溶解度を有しており、一方、ペプチド結合で接続されたアミノ酸残基を担持する誘導体（７、２０−３３）は５ｇ／Ｌより大きな溶解度を有している。
【００５０】
【化１３】
0004510440.tif 000012
本発明の別の目的は、化学式（１）及び（２）による化学的に安定で水溶性のポルフィリン誘導体を様々な医学的用途で使用することである。上述の化合物は、癌及び他の過増殖性疾患、感染症、乾癬、アテローム性動脈硬化症、ＡＭＤ、及び、光力学的療法で治療するのに適した他の疾患及び感染症を治療するためのＰＤＴにおいて使用するのに特に好適である。上述の化合物は、水に対するそれらの溶解度のため、例えば注射等の種々の異なる投与法のための薬剤学的に許容可能で活性な様々の調製物の形態で調合することができる。
【００５１】
また、本発明は、癌及び他の過増殖性疾患、並びに感染症の光力学的療法での、本発明により製造される高純度で水溶性のポルフィリン誘導体の使用も考慮に入れている。ＰＤＴは、先ず、それらの誘導体を特定の治療部位へ送給するための薬剤学的に許容可能な適用賦形剤（application  vehicle）にそれらの誘導体を組み入れることにより遂行される。皮膚癌及び他の皮膚疾患等の病気を対象とした一つの実施形態では、上述の適用賦形剤は、一般的に、皮膚科用クリーム剤、ゲル剤、または、時として、エアロゾル液体分散剤である。賦形剤中におけるそれらの誘導体を治療領域へ投与した後、罹患組織にそれらのポルフィリン誘導体が優先的に蓄積するように充分な時間が掛けられる。最後に、上述の罹患組織の細胞を壊死させるため、その治療領域が、適切な波長とそれらのポルフィリン誘導体を活性化するのに充分なパワーとを有する光で照射される。
【００５２】
細胞培養実験における、本発明の一つのポルフィリン誘導体、即ち、実施例９Ｂにより調製されたＮ−メチル−Ｄ−グルカミン（１０）とクロリンｅ６（７）との水溶性塩の暗毒性（実施例３１、図１）及び光毒性（実施例３２、図２）の決定は、ＰＤＴにおいて使用するためのそれらの化合物が優れた特性を有していることを示した。また、それらの実験は、同じ化合物であるが、Ｐｏｎｏｍａｒｅｖのテクノロジー（ＲＵ第２１４４５３８号）により調製された化合物の特性が劣っている（暗毒性が高く、光毒性が低い）ことを実証するためにも実施された。
【００５３】
しかし、特殊なケースでは、種々の異なるポルフィリン誘導体の親水性アミン塩からなる定められた混合物が罹患組織に対して更に高い光毒性を発揮するのであれば、それらの混合物を投与することが有利であろう。この増強された光毒性は、クロリンｅ６の親水性アミン塩の存在下における同じ親水性アミンとの塩としての化合物（４）、（７）、及び（８）からなる混合物の水に対する溶解度が増強したという観測現象によってもたらされたものと考えることができよう。
【００５４】
本発明の水溶性の形態の良好な光毒性に関する他の例が表１及び２に与えられており、それらの表は、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン（１０）と酸（４）、（７）、（２２）及び（２５）との水溶性塩を用いたＨｅＬａ細胞における暗毒性及び光毒性実験の結果をまとめたものである。
【００５５】
本発明の別の目的は、ここに開示されている水溶性の形態のクロリン及びフェオフォルビド誘導体を抗菌的な光力学的療法において使用することである。これは、表３に提示されているデータによって例証されており、表３は、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン（１０）と酸（４）、（７）、（２２）及び（２５）との水溶性塩を用いた数多くの微生物の光力学的治療の結果をまとめたものである。
【００５６】
実施例
以下の実施例は、薬剤組成物の調製において使用されるべき本発明の水溶性ポルフィリン誘導体を如何にして製造するかについての充分且つ例証的な開示及び説明を当業者に与えるために提示されたものであり、本発明者が発明と考えている内容の範囲を制限すべく意図されたものではない。使用されている数字（例えば、量、温度等）に関する正確さを保証すべく努力が為されているが、幾分かの実験誤差及び偏差を考慮に入れるべきである。
【実施例１】
【００５７】
Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓからのメチルフェオフォルビド（５）の取得
（Ａ）２０ｇのＳｐｉｒｕｌｉｎａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、６０ｍＬのメタノール、及び１０ｍＬの濃硫酸からなる混合物を室温で３時間攪拌し、３０ｍＬのメタノールで希釈した後、Ｃｅｌｉｔｅのパッドを通じて濾過した。漏斗の内容物をメタノール（７０ｍＬ）で洗った。上述の溶液をヘキサン（２×３０ｍＬ）で抽出し、クロロホルム（１００ｍＬ）で希釈した後、塩化カリウムの飽和水溶液（３００ｍＬ）中に注いだ。結果として生じた混合物をＣｅｌｉｔｅのパッドを通じて濾過し、水性相をクロロホルム（２×５０ｍＬ）で抽出した。それらを合わせた抽出液を水で洗浄した後、綿を通じて濾過し、濃縮した。その残分をクロロホルム−ヘキサン（１：１、３０ｍＬ）の混合物中に溶解し、酸化アルミニウムのパッドを通じて濾過した後、最初にヘキサン（非極性の非クロリンコンポーネントを取り除くため）で洗い、次に塩化メチレン（メチルフェオフォルビドを得るため）で洗浄した。塩化メチレン溶液を濃縮し、その残分を、最初に塩化メチレン−メタノール（３ｍＬ＋７ｍＬ）から再結晶化させ、二回目に塩化メチレン−メタノール（１ｍＬ＋１０ｍＬ）から再結晶化させ、最後にメタノール（１０ｍＬ）で洗浄することにより、１１３ｍｇの純粋なメチルフェオフォルビドａ（５）を得た。１Ｈ−ＮＭＲスペクトル：９．４１、９．２３、８．５６（３Ｈ、すべてｓ、メソ−Ｈ）；７．８８（１Ｈ、ｑ、−ＣＨ＝ＣＨ２）、６．２５−６．１０（２Ｈ、−ＣＨ＝ＣＨ２）、６．２８（１Ｈ、ｓ、シクロペンタノン−Ｈ）、４．５０、４．２５（２Ｈ、ｍ、７−Ｈ、８−Ｈ）；３．５５（２Ｈ、ｑ、４−ＣＨ２ＣＨ３）；３．９３、３．７０、３．６３、３．３９、３．１５（１５Ｈ、すべてｓ、５×−ＣＨ３）；２．７５−２．２０（４Ｈ、ｍ、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＣＨ３）；１．８５（３Ｈ、ｄ、８−ＣＨ３）；１．７１（３Ｈ、ｍ、４−ＣＨ２ＣＨ３）；０．５５及び−１．６８ｐｐｍ（２Ｈ、２つのブロードｓ、２×−ＮＨ−）。その生成物は、Ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｃ．（ＵＳＡ）から得られた同じ化合物とあらゆる点で一致した。
【００５８】
（Ｂ）１０ｇのＳｐｉｒｕｌｉｎａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、３０ｍＬのメタノール、及び５ｍＬのｃｏｎｃ．硫酸からなる混合物を室温（ｒ．ｔ．）で３時間攪拌し、冷水（７０ｍＬ）で希釈した後、Ｃｅｌｉｔｅのパッドを通じて濾過した。漏斗の内容物をｐＨ７までの水、エタノール（５０ｍＬ）、ヘキサン（４×３０ｍＬ）で洗い、アセトン（１２０ｍＬ）を用いて、必要なメチルフェオフォルビドを漏斗の内容物から取り出した。上述の溶液を濃縮し、クロロホルム中に溶解した後、硫酸ナトリウム（無水）のパッドを通じて濾過し、濃縮した。その残分を、最初に塩化メチレン−メタノール（１．５ｍＬ＋５ｍＬ）から再結晶化させ、二回目に塩化メチレン−メタノール（１．５ｍＬ＋１０ｍＬ）から再結晶化させ、最後にメタノール（１５ｍＬ）で洗浄することにより、６０ｍｇの純粋なメチルフェオフォルビドａ（５）を得た。
【００５９】
（Ｃ）ＭｅＯＨ（１５００ｍＬ）中における５００ｇのＳｐｉｒｕｌｉｎａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓの懸濁液にＨ２ＳＯ４（ｃｏｎｃ．、２５０ｍＬ）を室温で攪拌しながら加えた。形成されたその混合物を３時間ｒ．ｔ．に保持した後、水（６Ｌ）中に注ぎ、Ｃｅｌｉｔｅのパッド（直径１２ｃｍ、高さ２ｃｍ；フィルターＳｃｈｏｔｔ  Ｎ３上）を通じて濾過した。そのフィルター上のペーストを水（３×８００ｍＬ、ｐＨ６まで）で洗い、次いで、エタノール（３×３００ｍＬ）及び石油エーテル（４０−６０℃、３×２５０ｍＬ）で洗浄した。次に、アセトン（合計で１．２Ｌ）を用いて、そのパッドから標的生成物を取り出し、濃縮し、ＣＨＣｌ３（２００ｍＬ）中に溶解し、脱脂綿を通じて濾過した後、真空下において濃縮し、その残分をＣＨ２Ｃｌ２（４０ｍＬ）とＭｅＯＨ（２００ｍＬ）の混合物から結晶化させることにより、〜９０％の純度（ＣＨＣｌ３／アセトン（９５：５）におけるＴＬＣ）からなる２．４５ｇのメチルフェオフォルビドａを得た。そのメチルフェオフォルビドａをＣＨＣｌ３（２０ｍＬ）中に溶解した後、ＣＨＣｌ３で溶出することにより、Ａｌ２Ｏ３（中性、Ｇｒａｄｅ  ＩＩ；ｄ  ８ｃｍ、ｈ  ５ｃｍ）のパッドを通過させた；濃縮、及び、ＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）とＭｅＯＨ（２５０ｍＬ）の混合物からの再結晶化は、２．３８ｇの純粋（ＴＬＣ対照）なメチルフェオフォルビドａ（５）を与えた。両結晶化ステップの母液の通常の後処理（クロマトグラフィー及び再結晶化）により、付加的な量のメチルフェオフォルビドａ（〜１０−１５％）を得ることができる。
【実施例２】
【００６０】
Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓからのエチルフェオフォルビド（６）の取得
６０ｍＬの９６％水性エタノールと１０ｍＬの濃硫酸中において２０ｇのＳｐｉｒｕｌｉｎａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓをエタノーリシスし、その後、すべてのステップにおいてメタノールの代わりにエタノールを使用する点を除き、メチルフェオフォルビドａ（５）を製造する実施例１Ａで説明されているようにして後処理することにより、１１０ｍｇの結晶性エチルフェオフォルビドａ（６）を得た。１Ｈ−ＮＭＲスペクトル：９．５７、９．４２、８．６１（３Ｈ、すべてｓ、メソ−Ｈ）；７．９９（１Ｈ、ｑ、−ＣＨ＝ＣＨ２）、６．３２、６．２６（２Ｈ、ｄｄ、−ＣＨ＝ＣＨ２）、６．２７（１Ｈ、ｓ、シクロペンタノン−Ｈ）、４．５１、４．２８（２Ｈ、ｍ、７−Ｈ、８−Ｈ）；４．０７（２Ｈ、ｑ、−ＣＯＯＣＨ２ＣＨ３）；３．７１（２Ｈ、ｑ、４−ＣＨ２ＣＨ３）；３．８９、３．７２、３．４１、３．２７（１２Ｈ、すべてｓ、４×−ＣＨ３）；２．６９、２．４７、２．３７、２．２２（４Ｈ、ｍ、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＣＨ２ＣＨ３）；１．８３（３Ｈ、ｄ、８−ＣＨ３）；１．７３（３Ｈ、ｔ、４−ＣＨ２ＣＨ３）；１．１２（３Ｈ、ｔ、−ＣＯＯＣＨ２ＣＨ３）；０．５７、−１．４６ｐｐｍ（２Ｈ、２つのブロードｓ、２×−ＮＨ−）。
【実施例３】
【００６１】
Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ  ｍａｘｉｍａからのメチルフェオフォルビドａ（５）の取得
１０ｇのＳｐｉｒｕｌｉｎａ  ｍａｘｉｍａを３０ｍＬのメタノールと５ｍＬの濃硫酸で処理し、その後、実施例１Ｂにおけるメチルフェオフォルビドａ（５）の調製で説明されているようにして後処理することにより、６４ｍｇの純粋なメチルフェオフォルビドａ（５）を得ることができた。
【実施例４】
【００６２】
Ｃｈｌｏｒｅｌｌａからのメチルフェオフォルビドａ（５）及びｂ（１７）の取得
１０ｇのＣｈｌｏｒｅｌｌａの乾燥バイオマスをメタノーリシスに掛け、その後、実施例３で説明されているようにして後処理することにより、１Ｈ  ＮＭＲ分光法で決定したときの比が２０：７のメチルフェオフォルビドａとｂの混合物（１４０ｍｇ）が生成された。得られたその混合物を、クロロホルム−トルエン−アセトン（１５：３０：１．５）で溶出する、Ｓｉｌｉｃａ（シリカ）ゲル６０（Ｆｌｕｋａ、７０−２３０メッシュ）を伴うカラムでのクロマトグラフィーに掛けることにより、個々のメチルフェオフォルビドａ（５）及びｂ（１７）が生成された。このメチルフェオフォルビドａ（５）は、上で説明されている生成物とあらゆる点で一致した。メチルフェオフォルビドｂ（１７）に対する１Ｈ−ＮＭＲスペクトルデータ：１１．０（１Ｈ、ｓ、ＣＨＯ）、１０．２２、９．５０、８．５５（３Ｈ、すべてｓ、メソ−Ｈ）；７．９８（１Ｈ、ｑ、−ＣＨ＝ＣＨ２）、６．４０−６．１５（２Ｈ、−ＣＨ＝ＣＨ２）、６．２５（１Ｈ、ｓ、シクロペンタノン−Ｈ）、４．４８、４．２０（２Ｈ、ｍ、７−Ｈ、８−Ｈ）；３．６０（２Ｈ、ｑ、４−ＣＨ２ＣＨ３）；３．９３、３．７８、３．７５、３．４０（１２Ｈ、すべてｓ、４×−ＣＨ３）；２．７５−２．２０（４Ｈ、ｍ、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＣＨ３）；１．８５（３Ｈ、ｄ、８−ＣＨ３）；１．７１（３Ｈ、ｍ、４−ＣＨ２ＣＨ３）；０．４８及び−１．６０ｐｐｍ（２Ｈ、２つのブロードｓ、２×−ＮＨ−）。
【実施例５】
【００６３】
粉末状の乾燥したイラクサの葉からのメチルフェオフォルビドａ（５）及びｂ（１７）の取得
５００ｇの乾燥した粉末状のイラクサの葉をメタノーリシスし、その後、実施例１Ｃで説明されているようにして後処理することにより、１Ｈ  ＮＭＲ分光法で決定したときの比が６．５：１のメチルフェオフォルビドａ（５）とｂ（１７）の混合物（１．７４ｇ）が生成された。
【実施例６】
【００６４】
凍結されたホウレンソウの葉からのメチルフェオフォルビドａ（５）及びｂ（１７）の取得
１００ｇの凍結させたホウレンソウの葉とＭｅＯＨ（１００ｍＬ）の混合物に、Ｈ２ＳＯ４（ｃｏｎｃ．、５ｍＬ）をｒ．ｔ．で攪拌しながら加えた。形成されたその混合物を１６時間ｒ．ｔ．に保持し、水（１００ｍＬ）で希釈した後、Ｃｅｌｉｔｅを通じて濾過した。その残分をアセトン（３×５０ｍＬ）で洗浄し、それらのアセトン抽出液をＣＨ２Ｃｌ２−水（１：１、１００ｍＬ）で希釈した後、その有機相を分離し、濃縮した。その残分を、ＭｅＯＨ中における１００ｍＬの５％ｃｏｎｃ．Ｈ２ＳＯ４中においてメタノーリシスに掛け、その後、実施例１Ｃで説明されているようにして後処理することにより、１Ｈ  ＮＭＲ分光法で決定したときの比が２：１のメチルフェオフォルビドａ（５）とｂ（１７）の４０ｍｇの混合物を得た。
【実施例７】
【００６５】
メチル２−デビニル−２−（１−エトキシエチル）−フェオフォルビドａ（１８）の調製
３．５ｇ（５．８ｍｍｏｌ）のメチルフェオフォルビドａ（５）を臭化水素と酢酸（ｄ  １．４４、５０ｍＬ）の混合物に溶解し、１８時間放置した。その後、その混合物を真空下において５０℃で蒸発乾固させ、無水エタノール（１００ｍＬ）を攪拌しながら加えた。１８時間後、その反応混合物を砕いた氷に攪拌しながら注ぎ、ＣＨ２Ｃｌ２（３×４０ｍＬ）で抽出した。それらを合わせた抽出液を水（４×７０ｍＬ）で洗い、真空下で蒸発乾固させた。その残分をＣＨ２Ｃｌ２で溶出するシリカゲル（４０−６３μｍ、Ｍｅｒｃｋ）でのカラムクロマトグラフィーに掛けることにより、２．９５ｇの生成物（１８）（収率７７％）を得た。１Ｈ−ＮＭＲスペクトル：９．８２、９．５８、８．５５（３Ｈ、すべてｓ、メソ−Ｈ）；６．３１（１Ｈ、ｓ、１０−Ｈ）、５．９６（１Ｈ、ｑ、２−ＣＨＣＨ３）；４．５３、４．２５（２Ｈ、ｍ、７−Ｈ、８−Ｈ）；３．７１（４Ｈ、ｄｑ、４−ＣＨ２ＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ３）；３．９３、３．８７、３．６３、３．４１、３．２８（１５Ｈ、すべてｓ、５×−ＣＨ３）；２．６７、２．５１、２．３７、２．２３（４Ｈ、ｍ、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＣＨ３）；２．１１（３Ｈ、ｄ、２−ＣＨＣＨ３）；１．８０（３Ｈ、ｄ、８−ＣＨ３）；１．７５（３Ｈ、ｔ、４−ＣＨ２ＣＨ３）；１．３６（３Ｈ、ｔ、−ＯＣＨ２ＣＨ３）；０．５５、−１．４１（２Ｈ、２つのブロードｓ、２×−ＮＨ）。
【実施例８】
【００６６】
クロリンｅ６（７）の調製
アルゴン下における（ヘリウムで）脱気されたアセトン（１２ｍＬ）中の１４０ｍｇ（２３１μｍｏｌ）のメチルフェオフォルビドａ（３５）の攪拌溶液にＫＯＨの水溶液（脱気、１０％−ｓｏｌｎ、１０ｍＬ）を加えた。その混合物を４０℃で４０分間攪拌し、６５℃まで加熱した後、ＫＯＨの３％水溶液（５ｍＬの脱気された１０％ａｑ．ＫＯＨと１１ｍＬの脱気水から調製）を加えた。結果として得られたその混合物をアルゴン下において２．５時間攪拌し、６５℃で加熱した後、ｒ．ｔ．まで冷却し、１００ｍＬの水で希釈した後、２ＮのＨＣｌ（１２ｍＬ）で酸性化した。その後、その沈殿物を遠心分離（５０００ｒｐｍで３分間）し、水（３×３０ｍＬ）で洗い、再度遠心分離し、１０ｍＬの水に再懸濁させ、凍結乾燥させることにより、遊離酸として粗クロリンｅ６（１２０ｍｇ、ＴＬＣを対照として８７％、〜９０％の純度）を得た。ＴＬＣ：ＲＰ−１８  ＴＬＣプレート（Ｍｅｒｃｋ）、ＭｅＯＨ−ＣＨ２Ｃｌ２（３：１）、Ｒｆ０．６；汚染物質：もっと極性の高いＲｆ＜０．３の不純物。最終精製：２０ｍｇの粗クロリンｅ６をＭｅＯＨ−ＣＨ２Ｃｌ２−水（３：１：１、４ｍＬ）中に溶解し、ＭｅＯＨ−ＣＨ２Ｃｌ２−水（４：３：１、２ｍＬ／分）で溶出するＲＰ−８カラム（Ｍｅｒｃｋ、＃１１４４７、２４０×１０、４０−６３μｍ）でのＭＰＬＣに掛けることにより、純粋なクロリンｅ６（７）（１５ｍｇ、７５％）を得た。汚染性不純物はＭｅＯＨ−ＣＨ２Ｃｌ２（３：１）で溶出された。１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＤＭＳＯ−ｄ６）：９．８８、９．７８、９．１８（３Ｈ、すべてｓ、メソ−Ｈ）；８．３３（１Ｈ、ｄｄ、−ＣＨ＝ＣＨ２）；６．４７（１Ｈ、ｄ、シス−ＣＨ＝ＣＨ２）；６．２２（１Ｈ、ｄ、トランス−ＣＨ＝ＣＨ２）；５．３８（２Ｈ、ｍ、−ＣＨ２ＣＯＯＨ）；４．６２（１Ｈ、ｍ、−ＣＨＣＨ３）；４．４８（１Ｈ、ｍ、−ＣＨＣＨ２）；３．８３（２Ｈ、ｍ、−ＣＨ２ＣＨ３）；３．５９、３．５３、３．３３（９Ｈ、すべてｓ、−ＣＨ３）；２．６２、２．２７、２．１４（４Ｈ、ｍ、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ）；１．７０、１．６６（６Ｈ、ｍ、−ＣＨＣＨ３＋−ＣＨ２ＣＨ３）；１．６４、−１．９０（２Ｈ、強度の異なる２つのブロードｓ、２×−ＮＨ−）。１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル（ＤＭＳＯ−ｄ６）特徴的な信号のみ：１７４．１５、１７３．４６、１７２．３４（ＣＯＯＨ）；１２９．２１（−ＣＨ＝ＣＨ２）；１２２．２５（−ＣＨ＝ＣＨ２）；１０３．７４（γ）；１０１．１２（β）；９８．０９（α）；９４．６７（δ）；５２．６６（ＣＨＣＨ２）；４８．１９（ＣＨＣＨ３）；３７．８０（−ＣＨ２ＣＯＯＨ）；３０．８２、２９．５０（−ＣＨＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ）；２２．９２（ＣＨＣＨ３）；１８．９１（ＣＨ２ＣＨ３）；１７．５８（ＣＨ２ＣＨ３）；１１．００、１０．９８（ＡｒＭｅ）。
【実施例９】
【００６７】
Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン（１０）とクロリンｅ６（７）との水溶性塩の調製
（Ａ）水（４ｍＬ）中におけるＮ−メチル−Ｄ−グルカミン（１０）（４ｍｇ、２１μｍｏｌ）の溶液を、ＭｅＯＨ−ＣＨ２Ｃｌ２（３：１、２０ｍＬ）（または、アセトン）中における５ｍｇ（８．４μｍｏｌ）のクロリンｅ６（７）の溶液に加え、それらの有機溶媒を真空下で蒸発させて除去した。結果として得られたその水性溶液を膜（２０μｍ）を通じて濾過し、凍結乾燥させることにより、この水溶性塩（９ｍｇ、過剰のＮ−メチル−Ｄ−グルカミンを含む）を定量的に得た。
【００６８】
（Ｂ）水酸化カリウム（１０ｍＬ）の脱気された１０％水溶液を、脱気されたアセトン（１２ｍＬ）中における５０ｍｇのメチルフェオフォルビドａ（５）の溶液に加えた。その混合物を不活性な雰囲気（アルゴン）下において４０℃で３０分間攪拌し、その後、１５ｍＬの水酸化カリウムの脱気された３％水溶液を加えた。結果として得られたその混合物を不活性な雰囲気（アルゴン）下において６５℃で２時間攪拌した後、水（１００ｍＬ）で希釈し、ＨＣｌ（ｐＨ６まで）の２Ｎ水溶液を加えることによりクロリンｅ６（７）を沈殿させた。その沈殿物を遠心分離（３０００ｒｐｍで５分間）し、水（３×１０ｍＬ）で洗うことによりクロリンｅ６の湿性ペーストがもたらされ、その湿性ペーストを、それ以上精製することなく、次のステップで直接的に使用した。得られたクロリンｅ６（７）の全サンプルをＮ−メチル−Ｄ−グルカミン（１０）（３０ｍｇ、２ｅｑ．）及び水（１０ｍＬ）とアルゴン下において混合することにより、その水溶性塩の約５％溶液を得た。結果として得られた混合物を完全に溶解するまで攪拌し、蒸発乾固させ、水−メタノール勾配（４０％から８０％まで）におけるＲＰ  Ｃ−８を用いるカラムでの更なるＨＰＬＣに掛けた。標的生成物を含有するその混合物のサンプルを収集し、凍結乾燥することにより、約７５−８０％の収率で水溶性の二塩を得た。それの化学構造を１Ｈ  ＮＭＲ分光法で確認した。詳細には、（２．７０ｐｐｍにおける）グルカミンコンポーネントのＮ−Ｍｅ群と（１．７５ｐｐｍにおける）クロリン単位の８−Ｍｅ群の信号を積分することにより、クロリンｅ６（７）とＮ−メチル−Ｄ−グルカミン（１０）部分の比が１：２であることが確認された。
【００６９】
（Ｃ）５０ｍｇ（８４μｍｏｌ）の粉末状クロリンｅ６（７）、４０ｍｇ（０．２１ｍｍｏｌ）のＮ−メチル−Ｄ−グルカミン（１０）、及び水（５０ｍＬ、不活性ガスで予備的に脱気）の混合物を、完全に溶解するまで、アルゴン下において暗所で攪拌した。結果として生じたその溶液を膜（２０μｍ）を通じて濾過し、凍結乾燥することにより、この水溶性塩（９０ｍｇ、過剰のＮ−メチル−Ｄ−グルカミンを含む）を定量的に得た。
【実施例１０】
【００７０】
２−デビニル−２−（１−エトキシエチル）−クロリンｅ６（１９）の調製
メチル２−デビニル−２−（１−エトキシエチル）−フェオフォルビドａ（１８）（２．８ｇ、４．１ｍｍｏｌ）を、クロリンｅ６の調製（実施例８）で説明されているようにして鹸化に掛けることにより、カラムクロマトグラフィー後、２．１ｇの生成物（１９）（収率７９％）を得た。１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＤＭＳＯ−ｄ６）：９．８８、９．７８、９．１８（３Ｈ、すべてｓ、メソ−Ｈ）；６．４７（１Ｈ、ｄ、シス−ＣＨ＝ＣＨ２）；６．２２（１Ｈ、ｄ、トランス−ＣＨ＝ＣＨ２）；５．５．１（２Ｈ、ｍ、−ＯＣＨ２ＣＨ３）；５．３８（２Ｈ、ｍ、−ＣＨ２ＣＯＯＨ）；４．６２（１Ｈ、ｍ、−ＣＨＣＨ３）；４．４８（１Ｈ、ｍ、−ＣＨＣＨ２）；４．２９（１Ｈ、ｑ、−ＣＨＣＨ３）；３．８３（２Ｈ、ｍ、−ＣＨ２ＣＨ３）；３．５９、３．５３、３．３３（９Ｈ、すべてｓ、−ＣＨ３）；２．６２、２．２７、２．１４（４Ｈ、ｍ、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ）；１．８３（１Ｈ、ｄ、−ＣＨ（Ｏ−）ＣＨ３）；１．７０、１．６６（６Ｈ、ｍ、−ＣＨＣＨ３＋−ＣＨ２ＣＨ３）；１．５４（３Ｈ、ｔ、−ＯＣＨ２ＣＨ３）；−１．９０（２Ｈ、強度の異なる２つのブロードｓ、２×−ＮＨ−）。１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル（ＤＭＳＯ−ｄ６）特徴的な信号のみ：１７４．１５、１７３．４６、１７２．３４（ＣＯＯＨ）；１２９．２１（−ＣＨ＝ＣＨ２）；１０３．７４（γ）；１０１．１２（β）；９８．０９（α）；９４．６７（δ）；６７．９７（−ＣＨ（Ｏ−）ＣＨ３）；６３．４９（−ＯＣＨ２ＣＨ３）；５２．６６（ＣＨＣＨ２）；４８．１９（ＣＨＣＨ３）；３７．８０（−ＣＨ２ＣＯＯＨ）；３０．８２、２９．５０（−ＣＨＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ）；２２．９２（ＣＨＣＨ３）；２０．２０（−ＣＨ（Ｏ−）ＣＨ３）；１８．９１（ＣＨ２ＣＨ３）；１７．５８、１５．２３（ＣＨ２ＣＨ３＋−ＯＣＨ２ＣＨ３）；１１．００、１０．９８（ＡｒＭｅ）。
【実施例１１】
【００７１】
Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン（１０）とクロリンｅ６誘導体（１９）との水溶性塩の調製
実施例９Ｃで説明されているようにして３０ｍｇの２−デビニル−２−（１−エトキシエチル）−クロリンｅ６（１９）を２０ｍｇのＮ−メチル−Ｄ−グルカミン（１０）と反応させることにより、５０ｍｇの凍結乾燥された水溶性塩を定量的に得た。
【実施例１２】
【００７２】
ビス［２−（β−マルトシルオキシ）エチル］アミン（１１）の調製
ペル−Ｏ−アセチル−マルトシルブロミド（５００ｍｇ、０．７ｍｍｏｌ）、Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミン（５６ｍｇ、０．２３３ｍｍｏｌ）、及び２，４，６−トリメチルピリジン（８０μｌ、０．６０５ｍｍｏｌ）の溶液を、−２０℃において、トリフルオロメタンスルホン酸銀（２０８ｍｇ、０．８０５ｍｍｏｌ）と１．５ｍＬの無水ＣＨ２Ｃｌ２の攪拌混合物に滴下させながら加えた。その混合物を放置してｒ．ｔ．にまで温めた後、０．５ｍＬのトリエチルアミンで処理し、２００ｍＬのジクロロメタンで希釈し、Ｎａ２Ｓ２Ｏ３（５０ｍＬ）の飽和水溶液と水（５０ｍＬ）で洗い、濃縮し、酢酸エチル−石油エーテル（１：１）におけるフラッシュクロマトグラフィーに掛けることにより、粗Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｎ，Ｎ−ビス［２−（ヘプタ−Ｏ−アセチル−β−マルトシルオキシ）エチル］アミン（５７ｍｇ）を得た。選定された構造の特異的１３Ｃ  ＮＭＲデータ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：２０．４１（ＣＨ３ＣＯ）；４６．９２、４７．２４、４８．００、及び４８．０２（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ及びＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ）；６１．３０、６１．５０、６１．９８、及び６２．５２（グルコース部分のＣ−６）；６７．１８（ＮＣＯＯＣＨ２Ｃ６Ｈ５）；６７．８１、６８．３３、６９．１４、６９．８４、７２．０２、７２．５５、７５．１０（グルコース部分のＣ−２−Ｃ−５）；９５．３８（α−グルコース部分のＣ−１）；１００．１８および１０１．１０（β−グルコース部分のＣ−１）；１２７．７３、１２８．０１、及び１２８．４０（ＯＣＨ２Ｃ６Ｈ５）；１６４．００（ＮＣＯＯ）；１６９．２４、１６９．４２、１６９．７６、１６９．９８、１７０．３５（ＣＨ３ＣＯ）。［α］Ｄ  ３８．９°（ｃ１、酢酸エチル）。得られたその生成物を無水メタノール中における０．１Ｍのナトリウムメチラートに溶解して２時間保持した後、イオン交換樹脂ＫＵ−２（Ｈ＋）で中和し、濾過した。その濾液をＰｄ／Ｃ下において夜通し水素化分解に掛け、濾過し、凍結乾燥させることにより、２３ｍｇの化合物（１１）、［α］Ｄ  ７１°（ｃ１、水）を得た。選定された構造の特異的１３Ｃ  ＮＭＲデータ（５００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）：４８．７４（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ）、５０．８５（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ）；６１．７２（α−グルコース部分のＣ−６）、６１．９２（β−グルコース部分のＣ−６）、７７．２８（β−グルコース部分のＣ−４）；１００．８３（α−グルコース部分のＣ−１）；１０３．４０（β−グルコース部分のＣ−１）。
【実施例１３】
【００７３】
ビス［２−（β−マルトシルオキシ）エチル］アミン（１１）とクロリンｅ６（７）との水溶性塩の調製
実施例９Ｃで説明されているようにして５ｍｇのクロリンｅ６（７）を１８．６ｍｇのアミン（１１）と反応させることにより、２３ｍｇの凍結乾燥された水溶性塩を略定量的に得た。
【実施例１４】
【００７４】
メチルメソフェオフォルビド−ａ（３７）の取得
メチルフェオフォルビド−ａ（５）（１３０ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）を５ｍＬのテトラヒドロフランに溶解し、カーボン上の３０ｍｇの１０％Ｐｄ（ＯＨ）２上で、〜１気圧のＨ２において、室温で１時間、水素化した。溶媒を濾過して取り除き、その溶液を濃縮することにより、純粋なメチルメソピロフェオフォルビド−ａ（３７）（１２５ｍｇ、定量的）を得た。
【実施例１５】
【００７５】
メソクロリン−ｅ６（２０）の取得
実施例９Ｂで説明されているようにしてメチルメソフェオフォルビド−ａ（３７）（２０ｍｇ、０．０３３ｍｍｏｌ）をアルカリ性加水分解することにより、メソクロリン−ｅ６（１７ｍｇ、８６％）を生成した。ＭＳ（−）（エレクトロスプレー）：５９７．３（Ｍ−Ｈ）。
【実施例１６】
【００７６】
Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン（１０）とメソクロリンｅ６（２０）との水溶性塩の調製
実施例９Ｃで説明されているようにして１５ｍｇのメソクロリンｅ６（２０）を１２ｍｇのＮ−メチル−Ｄ−グルカミン（１０）と反応させることにより、２７ｍｇの凍結乾燥された水溶性塩を定量的に生成した。
【００７７】
【化１４】
0004510440.tif 000013
【実施例１７】
【００７８】
Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン（１０）とフェオフォルビドａ（４）との水溶性塩の調製
メチルフェオフォルビドａ（５）（３０ｍｇ、０．０４９ｍｍｏｌ）を２ｍＬの５０％硫酸に溶解し、その混合物を室温で２時間攪拌した後、氷冷水で希釈し、クロロホルムで抽出した。その抽出液を水で洗い、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濃縮することにより、粗フェオフォルビド−ａ（４）を得た。その後、その粗フェオフォルビド−ａ（４）を３ｍＬのＮ−メチル−Ｄ−グルカミン（１０）（１１．６ｍｇ、１．２ｅｑ．）水溶液に溶解した。結果として得られた溶液を４５μｍのフィルターを通じて濾過し、凍結乾燥させることにより、２９ｍｇの凍結乾燥された水溶性塩を得た。ＭＳ（−）（エレクトロスプレー）（酸４コンポーネント）：５９１．２（Ｍ−Ｈ）。
【実施例１８】
【００７９】
Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン（１０）とジメチルクロリンｅ６ジメチルエステル（２１）との水溶性塩の調製
［Ｌｏｔｊｏｎｅｎ  Ｓ．、Ｈｙｎｎｉｎｅｎ  Ｐ．Ｈ．、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、１９８０年、５４１−５４３に従って調製された］クロリン−ｅ６トリメチルエステル（３８）を５０％硫酸で酸性加水分解し、実施例１７で説明されているようにして９ｍｇのＮ−メチル−Ｄ−グルカミン（１０）と反応させることにより、３２ｍｇの凍結乾燥された水溶性塩がもたらされた。ＭＳ（−）（エレクトロスプレー）（酸２１コンポーネント）：６２３．５（Ｍ−Ｈ）。
【実施例１９】
【００８０】
Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン（１０）とメソピロフェオフォルビドａ誘導体（２５）との水溶性塩の調製
メチルフェオフォルビド−ａ（５）（１．３ｇ、２．０９ｍｍｏｌ）を１００ｍＬのピリジン中に溶解し、窒素下において暗所で８時間還流させながら攪拌した。ピリジンを蒸発により除去し、その残分をジクロロメタン／メタノールから再結晶化させることにより、１．０８ｇ（９２％）のメチルピロフェオフォルビド−ａ（３９）を得た。ＵＶ／ｖｉｓλｍａｘ（ε）（ＣＨ２Ｃｌ２）：４１０（１１２５００）、５０９（１１４００）、５３７（９８００）、６１１（８５００）、６６９（４７０００）ｎｍ。
【００８１】
メチルピロフェオフォルビドａ（３９）（１．０ｇ、１．７８ｍｍｏｌ）を１００ｍＬのアセトン中に溶解し、カーボン上の３００ｍｇの１０％Ｐｄ上で、〜８−１０気圧のＨ２において、室温で２時間、水素化した。溶媒を濾過して取り除き、その溶液を濃縮することにより、純粋なメチルメソピロフェオフォルビドａ（４０）（１．０ｇ、ｑｕａｎｔ．）を得た。ＵＶ／ｖｉｓλｍａｘ（ε）（ＣＨ２Ｃｌ２）：４０８（１３６０００）、５０１（１２４００）、５３４（１１８００）、６０３（１０５００）、６５６（５４６００）ｎｍ；１Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：９．４０（ｓ、１Ｈ、β−メソＨ）、９．１６（ｓ、１Ｈ、α−メソＨ）、８．４６（ｓ、１Ｈ、δ−メソＨ）、５．２６及び５．０８（ＡＢ、Ｊ＝１９．７Ｈｚ、１０−ＣＨ２）、４．４６（ｄｑ、１Ｈ、Ｊ７、８＝２．０Ｈｚ、８−Ｈ）、４．２７（ｄｔ、１Ｈ、７−Ｈ）、３．８０及び３．６４（それぞれｑ、４Ｈ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、２ａ−及び４ａ−ＣＨ２）、３．６３、３．５２、３．２８、及び３．２１（それぞれｓ、１２Ｈ、１−、３−、５−Ｍｅ及びＣＯＯＭｅ）、２．８０−２．２０（ｍ、４Ｈ、７ａ、ｂ−ＣＨ２ＣＨ２）、１．８０（ｄ、３Ｈ、Ｊ＝７．３Ｈｚ、８−Ｍｅ）、１．７１及び１．６３（それぞれｔ、６Ｈ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、２ｂ−及び４ｂ−Ｍｅ）、０．６０及び−１．６０（それぞれｂｒ  ｓ、２Ｈ、ＮＨ）。
【００８２】
メチルメソピロフェオフォルビドａ（４０）（２５０ｍｇ、０．４４３ｍｍｏｌ）を５ｍＬの５０％硫酸中に溶解し、その混合物を室温で２時間攪拌した後、氷冷水で希釈し、クロロホルムで抽出した。これらの抽出液を水で洗い、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濃縮することにより、粗メソピロフェオフォルビドａ（３６）を得た。この粗メソピロフェオフォルビドａ（３６）を２０ｍＬのジクロロメタン中に溶解した後、０．３ｍＬ（２．２２ｍｍｏｌ、〜５ｅｑ．）のトリエチルアミンを加え、続いて、０．１ｍＬ（０．５７６ｍｍｏｌ、１．３ｅｑ．）のペンタフルオロフェニルトリフルオロアセテートを加えた。（化合物４１を生成すべく）その混合物を室温で２０分間攪拌し、０．５ｍＬの水を加え、続いて、５ｍＬのジクロロメタン中における化合物４２（２００ｍｇ、ＧｌｙｃｏＳｅｎｓｅ  ＡＧ、Ｊｅｎａ、Ｇｅｒｍａｎｙの製品）の溶液を加えた。その混合物を室温で３０分間攪拌し、ジクロロメタンで希釈した後、水と５％硫酸で洗い、乾燥させ、濃縮した。その残分をＳｉｌｉｃａゲルでのフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。アセトン−ジクロロメタン（２０：８０）での溶出は、２９０ｍｇ（８８％）のアミド４３を与えた。ＵＶ／ｖｉｓλｍａｘ（ε）（ＣＨ２Ｃｌ２）：４０８（１３６５００）、５０１（１２３００）、５３４（１１８００）、６０３（１００００）、６５６（５４５００）ｎｍ；１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：９．４１（ｓ、１Ｈ、β−メソＨ）、９．２０（ｓ、１Ｈ、α−メソＨ）、８．４７（ｓ、１Ｈ、δ−メソＨ）、６．０８（ｂｒ  ｓ、１Ｈ、ＣＯＮＨ）、５．２６及び５．０８（ＡＢ、Ｊ＝１９．７Ｈｚ、１０−ＣＨ２）、４．５１（ｂｒ  ｑ、１Ｈ、８−Ｈ）、４．３２（ｂｒ  ｄ、１Ｈ、７−Ｈ）、３．８２及び３．６６（それぞれｑ、４Ｈ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、２ａ−及び４ａ−ＣＨ２）、３．７８（ｓ、２Ｈ、ＯＣＨ２ＣＯＯＭｅ）、３．６３、３．３２、及び３．２１（それぞれｓ、９Ｈ、１−、３−、及び５−Ｍｅ）、３．５２（ｓ、３Ｈ、ＣＯＯＭｅ）、３．２８（ｂｒ  ｓ、１２Ｈ、ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）、２．８０−１．９０（ｍ、４Ｈ、７ａ、ｂ−ＣＨ２ＣＨ２）、１．８０（ｄ、３Ｈ、Ｊ＝７．３Ｈｚ、８−Ｍｅ）、１．７２及び１．６８（それぞれｔ、６Ｈ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、２ｂ−及び４ｂ−Ｍｅ）、０．７０及び−１．６０（それぞれｂｒ  ｓ、２Ｈ、ＮＨ）。１３Ｃ−ＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：１９６．３、１７２．４、１７２．３、１６０．２、１５５．２、１５０．３、１４９．０、１４５．０、１４２．３、１４１．６、１３７．３、１３６．９、１３５．６、１３１．３、１３０．１、１２７．８、１０５．９、１０４．１、９５．８、９２．５、７０．５、７０．２、６９．９、６９．６、６８．２、５１．６、５０．１、４８．０、３９．１、３９．０、３２．６、３０．２、２３．１、１９．５、１９．４、１７．５、１７．０、１２．０、１１．３、１１．０。
【００８３】
アミド４３（１９５ｍｇ、０．２６３ｍｍｏｌ）を４ｍＬの５０％硫酸に溶解し、その混合物を室温で２時間攪拌した後、氷冷水で希釈した。結果として生じた沈殿物を遠心分離（５０００ｒｐｍで３分間）し、ｐＨ７まで水（２×５０ｍＬ）で洗い（２５形成）、アセトン（５０ｍＬ）、メタノール（１５ｍＬ）、及び水（６ｍＬ）の混合液中に溶解した。その後、上述の溶液にＮ−メチル−Ｄ−グルカミン（１０）（５６ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ、１．１ｅｑ．）を加えた。結果として得られた溶液を真空（〜２０ｍｍＨｇ）下において４０℃で濃縮し、有機溶媒を除去した。その濃縮プロセスの残分を４０ｍＬの水に溶解した後、４５μｍのフィルターを通じて濾過し、凍結乾燥させることにより、２３９ｍｇの水溶性塩を得た。ＵＶ／ｖｉｓλｍａｘ（ε）（Ｈ２Ｏ）：３７５（４６５５０）、５１４（５７５０）、５４８（５７５０）、６０８（６３２０）、６６０（２１２６０）。ＭＳ（−）（エレクトロスプレー）（酸２５コンポーネント）：７２４．７（Ｍ−Ｈ）。
【００８４】
【化１５】
0004510440.tif 000014
【実施例２０】
【００８５】
Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン（１０）とバクテリオフェオフォルビド誘導体（２９）との水溶性塩の調製
１３０ｍＬのジクロロメタン中におけるメチルメソピロフェオフォルビド−ａ（４０）（６５０ｍｇ、１．１５２ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に０．５ｍＬのピリジンを加え、続いて、６００ｍｇ（２．３６１ｍｍｏｌ、２．０５ｅｑ．）のオスミウムテトロキシドを加えた。その反応混合物を室温で４８時間攪拌した後、オスミウム酸塩を遊離ジオール（４４）に変換すべく、その溶液にＨ２Ｓを５分間通気し、その混合物をＳｉｌｉｃａゲルで分離した。アセトン−クロロホルム（５：９５）での溶出は開始化合物（４０）（１９０ｍｇ、２９％）を与えた。アセトン−クロロホルム（１５：８５）での溶出はジオール（４４）（３５０ｍｇ、５１％）を与えた。そのジオール（４４）を、室温において３０分間、２０ｍＬのｃｏｎｃ．Ｈ２ＳＯ４で処理した。その反応混合物を氷冷水で希釈した後、クロロホルムで抽出した。それらの抽出液を重炭酸ナトリウム水溶液と水で洗い、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濃縮した。その残分をＳｉｌｉｃａゲルでのカラムクロマトグラフィーにより精製した。アセトン−クロロホルム（１：９９）での溶出はケトン（４５）（１８０ｍｇ、（４０）から始めて２７％）をもたらした［ｃｆ．Ｒ．Ｋ．Ｐａｎｄｅｙら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、１９９７年、６２、１４６３−１４７２］。得られたケトン（４５）を５ｍＬの５０％硫酸に溶解し、その混合物を室温で２時間攪拌した後、氷冷水で希釈し、クロロホルムで抽出した。それらの抽出液を水で洗い、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濃縮することにより、粗化合物４６を得た。その粗化合物４６を２０ｍＬのジクロロメタン中に溶解し、０．２ｍＬ（１．５８ｍｍｏｌ、〜５ｅｑ．）のトリエチルアミンを加え、続いて、７０μｌ（０．４１１ｍｍｏｌ、１．３ｅｑ．）のペンタフルオロフェニルトリフルオロアセテートを加えた。（４７を与えるべく）その混合物を室温で２０分間攪拌した後、０．５ｍＬの水を加え、続いて、５ｍＬのジクロロメタン中における化合物４２（１５０ｍｇ、ＧｌｙｃｏＳｅｎｓｅ  ＡＧ、Ｊｅｎａ、Ｇｅｒｍａｎｙの製品）の溶液を加えた。その混合物を室温で３０分間攪拌した後、ジクロロメタンで希釈し、水と５％硫酸で洗い、乾燥させ、濃縮した。その残分をＳｉｌｉｃａゲルでのフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。アセトン−ジクロロメタン（２０：８０）での溶出は、２０５ｍｇ（８５％）のアミド（４８）を与えた。ＵＶ／ｖｉｓλｍａｘ（ε）（ＣＨ２Ｃｌ２）：３９４（４２３００）、４１２（４４１００）、５０６（７６５０）、５３９（９１００）、５９７（４５００）、６５２（１５７５０）、７１２（３０６００）ｎｍ；１Ｈ−ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：９．１８、８．７２、８．５０（それぞれｓ、３Ｈ、メソＨ）、６．１０（ｂｒ  ｓ、１Ｈ、ＣＯＮＨ）、５．２０（ｍ、２Ｈ、１０−ＣＨ２）、４．５０及び４．３０（共にｍ、２Ｈ、８−Ｈ及び７−Ｈ）、３．８８（ｓ、２Ｈ、ＯＣＨ２ＣＯＯＭｅ）、３．５８、３．４１、及び３．２１（それぞれｓ、９Ｈ、１−、３−、及び５−Ｍｅ）、３．５１（ｓ、３Ｈ、ＣＯＯＭｅ）、３．３０（ｂｒ  ｓ、１２Ｈ、ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）、２．８０−１．９０（ｍ、４Ｈ、７ａ、ｂ−ＣＨ２ＣＨ２）、１．９０−１．６５（ｍ、６Ｈ、２×ＣＨ２ＣＨ３）、０．５（ｍ、３Ｈ、ＣＨ２ＣＨ３）、−０．１０及び−１．７０（それぞれｂｒ  ｓ、２Ｈ、ＮＨ）。１３Ｃ−ＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：２０１．４、１９９．２、１７２．３、１７１．７、１５３．３、１４１．０、１３７／２、９８．２、９５．０、９１．３、８９．７、８７．１、７９．４、７０．７、７０．４、７０．１、６９．８、６８．４、５３．４、５１．８、４９．９、４８．０、３９．３、３６．２、３２．９、３２．１、３０．５、２８．５、２５．９、２３．２、１９．３、１６．９、１１．９、１１．０、９．０、８．１。
【００８６】
アミド誘導体（４８）（２０５ｍｇ、０．２７０ｍｍｏｌ）を４ｍＬの５０％硫酸に溶解し、その混合物を室温で２時間攪拌した後、氷冷水で希釈した。結果として生じた沈殿物を遠心分離（５０００ｒｐｍで３分間）し、（２９を与えるべく）ｐＨ７まで水（２×５０ｍＬ）で洗い、アセトン（５０ｍＬ）、メタノール（１５ｍＬ）、及び水（６ｍＬ）の混合液中に溶解した。この溶液にＮ−メチル−Ｄ−グルカミン（１０）（５６ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ、１．１ｅｑ．）を加えた。結果として得られた溶液を真空（〜２０ｍｍＨｇ）下において４０℃で濃縮して有機溶媒を取り除いた。その残分を４０ｍＬの水に溶解し、４５μｍのフィルターを通じて濾過し、その溶液を真空（〜２０ｍｍＨｇ）下において４０℃で濃縮した後、真空（〜１ｍｍＨｇ）下において４０℃で乾燥させることにより、２４０ｍｇの水溶性塩を得た。ＵＶ／ｖｉｓλｍａｘ（ε）（Ｈ２Ｏ）：４２０（４０４００）、５１５（５３８０）、５６１（６１５０）、６６８（９６１０）、７７６（５１２００）。ＭＳ（−）（エレクトロスプレー）（酸２９コンポーネント）：７４０．７（Ｍ−Ｈ）。
【実施例２１】
【００８７】
Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン（１０）とフェオフォルビドａ誘導体（２２）との水溶性塩の調製
ペンタフルオロフェニルトリフルオロアセテート（１５μＬ）でフェオフォルビドａ（４）（１７ｍｇ、０．０２８ｍｍｏｌ）を活性化し、続いて、過剰なトリエチルアミンの存在下において化合物４２（２５ｍｇ、ＧｌｙｃｏＳｅｎｓｅ  ＡＧ、Ｊｅｎａ、Ｇｅｒｍａｎｙの製品）と反応させ、その後、５０％硫酸で酸性加水分解し、実施例１９で説明されているようにして６．５ｍｇのＮ−メチル−Ｄ−グルカミン（１０）と反応させることにより、２３ｍｇの凍結乾燥された水溶性塩を得た。ＭＳ（−）（エレクトロスプレー）（酸２２コンポーネント）：７８０．１（Ｍ−Ｈ）。
【実施例２２】
【００８８】
Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン（１０）とフェオフォルビドａ誘導体（２３）との水溶性塩の調製
５０％硫酸でメチルピロフェオフォルビドａ（３９）（１５ｍｇ）を酸性加水分解し、続いて、ペンタフルオロフェニルトリフルオロアセテート（１５μＬ）で活性化し、過剰なトリエチルアミンの存在下において化合物４２（２５ｍｇ、ＧｌｙｃｏＳｅｎｓｅ  ＡＧ、Ｊｅｎａ、Ｇｅｒｍａｎｙの製品）と反応させ、その後、５０％硫酸で酸性加水分解し、実施例１９で説明されているようにして６ｍｇのＮ−メチル−Ｄ−グルカミン（１０）と反応させることにより、１９ｍｇの凍結乾燥された水溶性塩を得た。ＭＳ（−）（エレクトロスプレー）（酸２３コンポーネント）：７２２．１（Ｍ−Ｈ）。
【実施例２３】
【００８９】
Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン（１０）とメソフェオフォルビドａ誘導体（２４）との水溶性塩の調製
５０％硫酸でメチルメソフェオフォルビド−ａ（３７）（１６ｍｇ）を酸性加水分解し、続いて、ペンタフルオロフェニルトリフルオロアセテート（１５μＬ）で活性化し、過剰なトリエチルアミンの存在下において化合物４２（２５ｍｇ、ＧｌｙｃｏＳｅｎｓｅ  ＡＧ、Ｊｅｎａ、Ｇｅｒｍａｎｙの製品）と反応させ、その後、５０％硫酸で酸性加水分解し、実施例１９で説明されているようにして６ｍｇのＮ−メチル−Ｄ−グルカミン（１０）と反応させることにより、１８ｍｇの凍結乾燥された水溶性塩を得た。ＭＳ（−）（エレクトロスプレー）（酸２４コンポーネント）：７８２．２（Ｍ−Ｈ）。
【実施例２４】
【００９０】
Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン（１０）とメソピロフェオフォルビドａ誘導体（２６）との水溶性塩の調製
ペンタフルオロフェニルトリフルオロアセテート（２０μｌ）でメソピロフェオフォルビドａ（３６）（２０ｍｇ、０．０３４ｍｍｏｌ）を活性化し、続いて、過剰なトリエチルアミンの存在下において化合物４９（４０ｍｇ、ＧｌｙｃｏＳｅｎｓｅ  ＡＧ、Ｊｅｎａ、Ｇｅｒｍａｎｙの製品）と反応させ、そして、実施例１９で説明されているようにして７ｍｇのＮ−メチル−Ｄ−グルカミン（１０）と反応させることにより、３２ｍｇの凍結乾燥された水溶性塩を得た。ＭＳ（−）（エレクトロスプレー）（酸２６コンポーネント）：８５６．７（Ｍ−Ｈ）。
【実施例２５】
【００９１】
Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン（１０）とメソピロフェオフォルビドａ誘導体（２７）との水溶性塩の調製
ペンタフルオロフェニルトリフルオロアセテート（１５μｌ）でメソピロフェオフォルビドａ（３６）（１５ｍｇ、０．０２６ｍｍｏｌ）を活性化し、続いて、過剰なトリエチルアミンの存在下において２０ｍｇのグリシンメチルエステルと反応させ、その後、５０％硫酸で酸性加水分解し、実施例１９で説明されているようにして５ｍｇのＮ−メチル−Ｄ−グルカミン（１０）と反応させることにより、１９ｍｇの凍結乾燥された水溶性塩を得た。ＭＳ（−）（エレクトロスプレー）（酸２７コンポーネント）：５９２．６（Ｍ−Ｈ）。
【実施例２６】
【００９２】
Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン（１０）とメソピロフェオフォルビドａ誘導体（２８）との水溶性塩の調製
ペンタフルオロフェニルトリフルオロアセテート（１５μｌ）でメソピロフェオフォルビド−ａ（３６）（１４ｍｇ、０．０２４ｍｍｏｌ）を活性化し、続いて、過剰なトリエチルアミンの存在下において２５ｍｇのε−アミノカプロン酸メチルエステルと反応させ、その後、５０％硫酸で酸性加水分解し、実施例１９で説明されているようにして５ｍｇのＮ−メチル−Ｄ−グルカミン（１０）と反応させることにより、２０ｍｇの凍結乾燥された水溶性塩を得た。ＭＳ（−）（エレクトロスプレー）（酸２８コンポーネント）：６４８．５（Ｍ−Ｈ）。
【実施例２７】
【００９３】
Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン（１０）とクロリン−ｅ６誘導体（３０）との水溶性塩の調製
（化合物５０を生成すべく）１，４−ジオキサン（３ｍＬ）中におけるメチルフェオフォルビドａ（５）（３８ｍｇ、０．０６３ｍｍｏｌ）とＮ，Ｎ−ジメチル−１，３−ジアミノプロパン（１００μＬ）の混合物を室温に１０時間保持した。この溶液に６ＭのＮａＯＨ水溶液（０．１ｍＬ）を加え、結果として得られたその混合物を１０分間還流させた。その後、５ｍＬの水を加え、還流を更に１０分間続けた。その混合物を冷却し、３０ｍＬの水で希釈した後、ｐＨ４．５まで酢酸で酸性化した。形成された沈殿物を遠心分離（５０００ｒｐｍで３分間）した後、水で洗うことにより、二酸誘導体（３０）を得た。その二酸誘導体（３０）を７ｍＬのＮ−メチル−Ｄ−グルカミン（１０）（３０ｍｇ、１．２ｅｑ．）水溶液に溶解した。結果として得られた溶液を４５μｍのフィルターを通じて濾過し、凍結乾燥させることにより、６２ｍｇの水溶性塩を得た。ＭＳ（＋）（エレクトロスプレー）（酸３０コンポーネント）：６８１．３（Ｍ＋Ｈ）。
【実施例２８】
【００９４】
Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン（１０）とクロリンｅ６誘導体（３１）との水溶性塩の調製
メチルフェオフォルビドａ（５）（２２ｍｇ、０．０３６ｍｍｏｌ）を１，７−ジアミノヘプタン（１００μＬ）と反応させ、続いて、ＮａＯＨ水溶液でアルカリ性加水分解した後、実施例２７で説明されているようにして１８ｍｇのＮ−メチル−Ｄ−グルカミン（１０）と反応させることにより、４１ｍｇの凍結乾燥された水溶性塩を得た。ＭＳ（−）（エレクトロスプレー）（酸３１コンポーネント）：７０９．４（Ｍ＋Ｈ）。
【実施例２９】
【００９５】
Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン（１０）とクロリンｅ６誘導体（３２）との水溶性塩の調製
１，４−ジオキサン（３ｍＬ）中におけるフェオフォルビドａ（４）（２０ｍｇ、０．０３３ｍｍｏｌ）とε−アミノカプロン酸メチルエステル（５０ｍｇ、〜１０ｅｑ．）の溶液を室温に１２０時間保持した。その混合物をジクロロメタンで希釈し、０．５ＮのＨＣｌ水溶液と水で洗い、乾燥させ、濃縮し、Ｓｉｌｉｃａゲルでのフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。３％ＭｅＯＨ−ジクロロメタンでの溶出は、２２ｍｇ（８８％）のアミド誘導体（５１）をもたらした。そのアミド誘導体（５１）を５０％硫酸で酸性加水分解した後、実施例１７で説明されているようにして１３．５ｍｇのＮ−メチル−Ｄ−グルカミン（１０）と反応させることにより、３３ｍｇの凍結乾燥された水溶性塩を得た。ＭＳ（−）（エレクトロスプレー）（酸３２コンポーネント）：７２２．３（Ｍ−Ｈ）。
【実施例３０】
【００９６】
Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン（１０）とクロリンｅ６誘導体（３３）との水溶性塩の調製
１，４−ジオキサン（３ｍＬ）中におけるフェオフォルビドａ（４）（２０ｍｇ、０．０３４ｍｍｏｌ）と２−アミノエタノール（５０μＬ）の溶液を室温に１時間保持した。その混合物をジクロロメタンで希釈し、０．５ＮのＨＣｌ水溶液と水で洗い、乾燥させ、濃縮し、Ｓｉｌｉｃａゲルでのフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。３％ＭｅＯＨ−ジクロロメタンでの溶出は、２０ｍｇ（９１％）のアミド誘導体３３をもたらした。実施例１７で説明されているようにして８ｍｇのＮ−メチル−Ｄ−グルカミン（１０）と反応させることにより、２８ｍｇの凍結乾燥された水溶性塩を得た。ＭＳ（−）（エレクトロスプレー）（酸３３コンポーネント）：６５２．２（Ｍ−Ｈ）。
【実施例３１】
【００９７】
本発明により調製されたＮ−メチル−Ｄ−グルカミン（１０）とクロリンｅ６（７）との水溶性塩とＰｏｎｏｍａｒｅｖら（ＲＵ第２１４４５３８号）により調製されたものとの、ＯＶ２７７４細胞における暗毒性（細胞毒性）の対比的な決定
本発明の実施例９Ｂにより調製されたＮ−メチル−Ｄ−グルカミン（１０）とクロリンｅ６（７）との水溶性塩（化合物Ａ）とＰｏｎｏｍａｒｅｖによるロシア特許第２１４４５３８号により調製されたもの（化合物Ｂ）との細胞毒性（暗毒性）を決定するため、ＯＶ２７７４細胞（播種濃度：ＲＰＭＩ−１６４０ｗ．Ｐ．（フェノールレッドを伴う）、５％のウシ胎児血清、２ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘ  Ｉ、１００μｇ／ｍＬのＰｅｎｉｃｉｌｌｉｎ（ペニシリン）／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ストレプトマイシン）中において５０−７５個の細胞／ｍｍ２）を５０μＭまでの漸増する種々の濃度で２４時間インキュベーションした。細胞の生存は、ニュートラルレッドアッセイを用いて、更に２４時間後に、増感剤を含まない培地において測定した。数値は、インキュベーションされていない対照サンプルに対する百分率で表されている。各インキュベーション濃度に対して、３回の独立的な実験を四重に実施した。それらの実験から得られたデータが図１に記載されている。化合物Ａは、化合物Ｂに比べ、ＯＶ２７７４細胞に対して低い細胞毒性を示した。細胞の生存は、２５μＭまでのインキュベーション濃度で有意に減少しなかった（化合物Ｂ：１０μＭ）。これまでのところ、ＩＣ５０値（対照と比較して、細胞増殖を５０％に低減するインキュベーション濃度）は決定することができなかった。試験したうちで最高のインキュベーション濃度は、８０％以上の細胞の生存をもたらした。
【実施例３２】
【００９８】
本発明により調製されたＮ−メチル−Ｄ−グルカミン（１０）とクロリンｅ６（７）との水溶性塩とＰｏｎｏｍａｒｅｖら（ＲＵ第２１４４５３８号）により調製されたものとの、６７０ｎｍでの照射下におけるＯＶ２７７４細胞での暗毒性（細胞毒性）の対比的な決定
本発明の実施例９により調製されたＮ−メチル−Ｄ−グルカミン（１０）とクロリンｅ６（７）との水溶性塩（化合物Ａ）とＰｏｎｏｍａｒｅｖによるロシア特許第２１４４５３８号により調製されたもの（化合物Ｂ）との光毒性を決定するため、ＯＶ２７７４細胞（播種濃度：ＲＰＭＩ−１６４０ｗ／ｏＰ．（フェノールレッドを伴う）、５％のウシ胎児血清、２ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘ  Ｉ、１００μｇ／ｍＬのＰｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ中において５０−７５個の細胞／ｍｍ２）を、化合物Ｂでの先の実験において使用したのと同じ濃度でインキュベーションした（１０μＭ、２４時間）。光増感剤を伴わず、また、フェノールレッドも伴わない培地における第二のインキュベーション期間後、６７０ｎｍでの照射（１０−２５ｍＷ／ｃｍ２、０．１−２．５Ｊ／ｃｍ２）を実施した。細胞の生存はニュートラルレッドアッセイを用いて測定した。数値は、インキュベーションは為されたが、照射は為されていない対照に対する百分率で表されている。５回の独立的な実験を四重に実施した。それらのサンプルのＩＤ５０値（対照と比較して、細胞増殖を５０％に低減する流束量（エネルギー密度））が、光毒性の定量的な測度として機能した。それらの実験から得られたデータが図２に与えられている。結果は、化合物Ｂと比べ、化合物Ａの光毒性が幾分高いことを示した。そのＩＤ５０値は化合物Ｂの場合の約半分であった（０．１Ｊ／ｃｍ２対０．２Ｊ／ｃｍ２）。
【実施例３３】
【００９９】
Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン（１０）とクロリン（７）及びフェオフォルビド［（４）、（２２）、及び（２５）］誘導体との水溶性塩のＨｅＬａ細胞における暗毒性（細胞毒性）の決定
実施例９、１７、１９、及び２１により調製されたＮ−メチル−Ｄ−グルカミン（１０）とクロリンｅ６（７）及びフェオフォルビド−ａ誘導体（４、２２、２５）との水溶性塩の暗毒性を決定するため、ＨｅＬａ（ヒト頸部癌細胞）細胞の単層培養を、２μｇ／ｍＬから５００μｇ／ｍＬまでの量で漸増する種々の濃度の光増感剤を伴う９６−ウェルプレート（播種濃度：１０％のウシ胎児血清を伴うＤｕｌｂｅｃｏ変法必須培地（ＤＭＥＭ）において、１個のウェル当たり７０００個の細胞）内でインキュベーションし、４８時間インキュベーションした。
【０１００】
それらの細胞を純粋なＤＭＥＭで洗い、室温で１５分間、１０％ホルマリンで処理した。また、それらの細胞を水で２回洗い、クリスタルバイオレットの０．１％溶液（５０μｌ／ウェル）と共に１５分間インキュベーションした後、水で洗い、エタノール（１００μｌ／ウェル）で処理した。細胞の生存をモニタリングするため、形成されたエタノール溶液の光学密度を、Ｓｐｅｃｏｒｄ  １００（Ａｎａｌｙｔｉｋ  Ｊｅｎａ  ＡＧ、Ｇｅｒｍａｎｙ）分光光度計を用いて、５９４ｎｍで測定した。
【０１０１】
数値は、インキュベーションされていない対照に対する百分率で表されている。各インキュベーション濃度に対して８回の実験を実施した。それらの実験から得られたデータが表１に与えられており、その表は、ＩＣ５０値及びＩＣ８０値（対照と比較して、細胞増殖を５０％及び２０％にまで低減するインキュベーション濃度）を示している。
【０１０２】
表１．Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン（１０）とクロリン（７）及びフェオフォルビド［（４）、（２２）、及び（２５）］誘導体との水溶性塩のＨｅＬａ細胞における暗毒性（細胞毒性）データ（実施例３３）
【０１０３】
【表１】
0004510440.tif 000015
【実施例３４】
【０１０４】
Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン（１０）とクロリン（７）及びフェオフォルビド［（４）、（２２）、及び（２５）］誘導体との水溶性塩の６６２ｎｍでの照射下におけるＨｅＬａ細胞での光毒性の決定
実施例９、１７、１９、及び２１により調製されたＮ−メチル−Ｄ−グルカミン（１０）とクロリンｅ６（７）及びフェオフォルビド−ａ（４、２２、２５）誘導体との水溶性塩の光毒性を決定するため、ＨｅＬａ（ヒト頸部癌細胞）細胞の単層培養を、０．０１μｇ／ｍＬから４０μｇ／ｍＬまでの量で漸増する種々の濃度の光増感剤を伴う９６−ウェルプレート（播種濃度：１０％のウシ胎児血清を伴うＤＭＥＭにおいて、１個のウェル当たり３０，０００個の細胞）内でインキュベーションした。３０分のインキュベーション時間後、６６２ｎｍでの照射［Ｃｅｒａｌａｓ  ＰＤＴレーザー、ＢｉｏＬｉｔｅｃ  ＡＧ、Ｇｅｒｍａｎｙ；１５０ｍＷ／ｃｍ２、５−２０Ｊ／ｃｍ２）を実施した。細胞の生存はＭＴＴアッセイを用いて測定した。数値は、照射は為されたが、インキュベーションは為されていない対照に対する百分率で表されている。実験は八重に実施された。それらの実験から得られたデータが表２に与えられており、その表は、１０Ｊ／ｃｍ２の照射後に観測されたＩＣ５０値及びＩＣ９０値を示している。
【０１０５】
表２．Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン（１０）とクロリン（７）及びフェオフォルビド［（４）、（２２）、及び（２５）］誘導体との水溶性塩のＨｅＬａ細胞における光毒性データ（実施例３４）
【０１０６】
【表２】
0004510440.tif 000016
【実施例３５】
【０１０７】
Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン（１０）とクロリン（７）及びフェオフォルビド［（４）、（２２）、及び（２５）］誘導体との水溶性塩の抗菌的光力学的療法実験における光毒性の決定
使用した微生物は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＡＴＣＣ２５９２３）、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ（ＡＴＣＣ２９２１２）、及びＣａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ（臨床的）の博物館及び臨床的な菌株であった。
【０１０８】
細菌のコロニーは、以下のタイプの固形培地で培養された：ブドウ球菌寒天１１０でのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、５％のウマ血液を伴うＣｏｌｕｍｂｉａ寒天からなる基剤でのＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｓａｂｕｒｏデキストロース寒天でのＣａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ。
【０１０９】
ＭｃＦａｒｌａｎｄ規準に従って０．５−１．０（１ｍＬ中に、１．５−５×１０８個の細菌数）の値を有する等張ＮａＣｌ溶液中における初期細菌懸濁液（ＩＢＳ）を調製し、その後、１：１００に希釈した。
【０１１０】
細菌細胞数計測の適当な対照用に、ＩＢＳの一部を等張ＮａＣｌ溶液で（初期濃度の１０−３まで）１：１０００に希釈して、０．１ｍＬからなる３つのアリコートを取り、それぞれを、それらの微生物に適した培地を伴う別々のペトリ皿に植えた。細菌のコロニーを３７℃で２４時間（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの場合は４８時間）インキュベーションした後、コロニーを計数し、それぞれ３個のペトリ皿の平均値を対照値として使用した。
【０１１１】
Ａ）．温度及びレーザー照射操作の管理
２．０ｍＬの初期細菌懸濁液（ＩＢＳ）を３７℃で３０分間保存した後、等張ＮａＣｌ溶液で（初期濃度の１０−３まで）１：１０００に希釈して、０．１ｍＬからなる３つのアリコートを取り、それぞれを、それらの微生物に適した培地を伴う別々のペトリ皿に植えた。細菌のコロニーを３７℃に２４時間保持した後、計数し、それぞれ３個のペトリ皿の平均値を決定して対照値として使用した。
【０１１２】
別のＩＢＳのサンプル（２．０ｍＬ）を３７℃で３０分間保存した後、送給される光エネルギーの線量が５０Ｊ／ｃｍ２になるように、３Ｗの出力パワーを有する「Ｃｅｒａｌａｓ  ＰＤＴ」レーザーで、４０ｍｍのペトリ皿（懸濁液層の厚み−２ｍｍ）にレーザー光を２１０秒間照射した。その混合物を等張ＮａＣｌ溶液で（初期濃度の１０−３まで）１：１０００に希釈して、０．１ｍＬからなる３つのアリコートを取り、それぞれを、別々のペトリ皿に植え、培養した後、上で説明されているようにして計数した。
【０１１３】
表３のデータ［治療方式Ｂ及びＣは（７）に対して提示］は、光増感剤を伴うことなく、５０Ｊ／ｃｍ２の線量でのレーザー照射下における、３７℃での３０分間のＩＢＳの保管が、実際的に、細菌の生存度に影響を及ぼさないことを示している。
【０１１４】
Ｂ）．暗毒性の決定
５００μｇ／ｍＬの濃度を有する光増感剤の０．５ｍＬの保存溶液を２．０ｍＬのＩＢＳに加え、結果的な光増感剤の濃度を１００μｇ／ｍＬにした。形成されたその懸濁液を３７℃で３０分間保存した後、等張ＮａＣｌ溶液で（初期濃度の１０−３まで）１：１０００に希釈した。３部の０．１ｍＬを取り、３個のペトリ皿に植えた後、上で説明されているようにして計数した。
【０１１５】
表３のデータは、本発明の光増感剤が、３０分のインキュベーション時間内において、１００μｇ／ｍＬの濃度下で、実際的な暗毒性効果を有していないことを示している。
【０１１６】
Ｃ）．光毒性の決定
５００μｇ／ｍＬの濃度を有する光増感剤の０．１２５ｍＬまたは０．５ｍＬの保存溶液をＩＢＳの２．０ｍＬ部分に加え、結果的な光増感剤の濃度をそれぞれ２５μｇ／ｍＬ及び１００μｇ／ｍＬにした。形成されたその懸濁液を３７℃で３０分間保存した後、５０Ｊ／ｃｍ２の密度で照射した。０．１ｍＬからなる３つのアリコートを取り、３個のペトリ皿に植えた。残りの懸濁液部分を等張ＮａＣｌ溶液で（初期濃度の１０−２または１０−３まで）１：１００または１：１０００に希釈し、各希釈液から取った０．１ｍＬの３つのアリコートを３個のペトリ皿に植えた後、上で説明されているようにして計数した。
【０１１７】
表３のデータは、本発明の水溶性塩が、抗菌的な光力学的療法用の光増感剤として潜在的に適用可能であることを示している。
【０１１８】
表３．抗菌的な光力学的療法の実験における、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン（１０）とクロリン（７）及びフェオフォルビド［（４）、（２２）、及び（２５）］誘導体との水溶性塩の適用（実施例３５）
【０１１９】
【表３】
0004510440.tif 000017
＊治療方式：
Ａ、使用した初期細菌懸濁液（ＩＢＳ）中の対照細菌数；
Ｂ、ＩＢＳを３７℃に３０分間恒温保持した後の細菌数；
Ｃ、５０Ｊ／ｃｍ２（Ｃｅｒａｌａｓ  ＰＤＴ、３Ｗ、２１０秒）の線量でレーザー照射した後の細菌数；
Ｄ、光増感剤（１００μｇ／ｍＬの濃度）と共に３０分間インキュベーションした後の細菌数；
Ｅ、２５μｇ／ｍＬの濃度の光増感剤を用いて光力学的治療を行った後の細菌数；
Ｆ、１００μｇ／ｍＬの濃度の光増感剤を用いて光力学的治療を行った後の細菌数；
実施例を参照しながら本発明の好適な実施形態を説明してきたが、本発明は、まさにそれらの実施形態に限定されるものではなく、当業者により、添付の特許請求項で定義されている通りの本発明の範囲または精神から逸脱することなく、そこに様々な変更及び変形を為し得ることを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１２０】
【図１】図１：本発明（実施例９）により調製した場合（Ａ）とＰｏｎｏｍａｒｅｖ（ＲＵ第２１４４５３８号）により調製した場合（Ｂ）の、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン（１０）とクロリンｅ６（７）との水溶性塩の暗毒性（細胞毒性、実施例１４）の決定；この試験は、指示されている通りの種々の異なる濃度で光増感剤を付加した条件下におけるＯＶ２７７４細胞で実施された。
【図２】図２：本発明（実施例９）により調製した場合（Ａ）とＰｏｎｏｍａｒｅｖ（ＲＵ第２１４４５３８号）により調製した場合（Ｂ）の、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン（１０）とクロリンｅ６（７）との水溶性塩の光毒性（実施例１５）の決定；この試験は、指示されている通りの種々の異なる濃度で光増感剤を付加し、６７０ｎｍで照射した条件下におけるＯＶ２７７４細胞で実施された。
【図１】
0004510440.tif 000020
【図２】
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