(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体における心血管疾患を評価することを補助する方法であって、
ａ．個体に由来するサンプル中で、アルファ−２Ｃアドレナリン受容体におけるアミノ酸３２２〜３２５の欠失（α２ＣＤＥＬ３２２〜３２５）の有無に関する情報を得る工程；および
ｂ．前記個体に由来するサンプル中で、ベータ−１アドレナリン受容体の３８９位のアルギニン（β１Ａｒｇ３８９）の有無に関する情報を得る工程；
を含み、
α２ＣＤＥＬ３２２〜３２５とβ１Ａｒｇ３８９との両方の存在は、該個体が心血管疾患に対するリスクが増加していることを示す、方法。
【請求項２】
前記サンプルが、血液サンプル、体液、組織サンプルまたはこれらの組み合わせを含むものである請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記情報が、核酸ベースのアッセイまたはタンパク質ベースのアッセイを使用して得られる請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記心血管疾患が、卒中、血管塞栓症、血管血栓症、心不全、心臓不整脈、心筋梗塞、心筋虚血症、狭心症、高血圧、低血圧、ショック、突然心臓死またはこれらの組み合わせを含むものである請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記心血管疾患が、心不全である請求項４記載の方法。
【請求項６】
α２ＣＤＥＬ３２２〜３２５とβ１Ａｒｇ３８９との両方の存在はさらに、前記個体が、該個体における心血管疾患の発症を遅延させる治療法で処置されるのに適していることを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記治療法が、α２ＣＤＥＬ３２２〜３２５とβ１Ａｒｇ３８９のアゴニストおよび／またはアンタゴニストの投与を含むものである請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記治療法が、ライフスタイルの変化を含むものである請求項６記載の方法。
【請求項９】
心血管疾患に関する進行または早期死亡が遅延される、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
α２ＣＤＥＬ３２２〜３２５とβ１Ａｒｇ３８９との両方の存在はさらに、前記個体が、心血管疾患発症の潜在的リスクに関して、カウンセリングされるのに適していることを示す、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府の権益
本発明は、少なくとも一部は、助成番号ＮＩＨ  ＨＬ−５２３１８（SCOR in Heart Failure）、ＥＳ−０６０９６、ＨＧ−０００４０で授与された、連邦政府からの資金を用いてなされたものである。したがって米国政府は、本発明に対する一定の承認された権利を有する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、個体(individual)における心血管疾患(cardiovascular disease)を評価(assessment)する方法に関する。また、本発明は、個体における心血管疾患の発症を遅延させる方法に関する。さらに、本発明は、個体における心血管疾患に関する進行または早期死亡を遅延させる方法に関する。さらにまた、本発明は、個体における心血管疾患に関する遺伝カウンセリングの方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
心不全は、死亡および身体障害の主要な原因である。心不全のいくつかの一般的な形として、突発性拡張型心筋症（病因不明）、高血圧性心筋症（突発性拡張型心筋症と似ているが前駆的高血圧を伴う）、肥大型心筋症、および虚血性心筋症がある。最初の原因と関係なく、低い心拍出量の結果起こる高い慢性的な交感神経駆動が、最終的に、臨床的に重要な心機能障害の発症および心不全の進行にある役割を果たしていることが、諸研究から示唆されている。したがって、個体における心血管疾患を評価する方法を開発すると有利である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって、本発明の目的は、個体における心血管疾患を評価する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の一態様によれば、個体における心血管疾患を評価する方法が提供される。この方法は、個体に由来するサンプル中で多型アルファ−２Ｃ（α2CＤＥＬ３２２〜３２５）アドレナリン受容体をコードする断片の有無を検出する工程(ステップ）と、個体に由来するサンプル中で多型ベータ−１アドレナリン受容体（β1Ａｒｇ３８９）をコードする断片の有無を検出する工程とを含む。
【０００６】
本発明の他の態様によれば、個体における心血管疾患の発症(development)を遅延させる方法が提供される。この方法は、個体に由来するサンプル中で多型アルファ−２Ｃ（α2CＤＥＬ３２２〜３２５）アドレナリン受容体をコードする断片の有無を検出する工程と、個体に由来するサンプル中で多型ベータ−１アドレナリン受容体（β1Ａｒｇ３８９）をコードする断片の有無を検出する工程と、α2CＤＥＬ３２２〜３２５およびβ1Ａｒｇ３８９の有無に基づいて、個体についての治療法を選択する工程とを含む。この治療法により、その個体における心血管疾患の発症が遅延する。
【０００７】
本発明のさらなる他の態様によれば、個体における心血管疾患に関する進行(progression)または早期死亡(early death)を遅延させる方法が提供される。この方法は、個体に由来するサンプル中で多型アルファ−２Ｃ（α2CＤＥＬ３２２〜３２５）アドレナリン受容体をコードする断片の有無を検出する工程と、個体に由来するサンプル中で多型ベータ−１アドレナリン受容体（β1Ａｒｇ３８９）をコードする断片の有無を検出する工程と、α2CＤＥＬ３２２〜３２５およびβ1Ａｒｇ３８９の有無に基づいて、個体に対する治療法を選択する工程とを含む。心血管疾患に関する進行または早期死亡が遅延する。
【０００８】
本発明のさらなる他の態様によれば、個体における心血管疾患に関する遺伝カウンセリング(genetic counseling)の方法が提供される。この方法は、個体に由来するサンプル中で多型アルファ−２Ｃ（α2CＤＥＬ３２２〜３２５）アドレナリン受容体をコードする断片の有無を検出する工程と、個体に由来するサンプル中で多型ベータ−１アドレナリン受容体（β1Ａｒｇ３８９）をコードする断片の有無を検出する工程と、α2CＤＥＬ３２２〜３２５およびβ1Ａｒｇ３８９の有無に基づく心血管疾患発症の潜在的リスクに関してその個体をカウンセリングする工程とを含む。
【０００９】
本発明の追加の実施形態、目的および利点は、以下の詳細な説明を見るとより完全に明らかとなる。
【００１０】
以下の詳細な説明は、図面を参照すると、より完全に理解されよう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
交感神経駆動(sympathetic drive)を制御する主要な心臓の受容体(cardiac receptors)は、ベータ−１アドレナリン受容体（β1ＡＲ）およびアルファ−２Ｃアドレナリン受容体（α2CＡＲ）である。しかし、これらのアドレナリン受容体の発現および機能、心不全の発症および進行、β1ＡＲ（βブロッカーなど）およびα2CＡＲを標的とする薬剤を含めた治療に対する反応には、個体間でかなりのばらつきがある。
【００１２】
心臓の高く慢性的なアドレナリン刺激は、動物モデルおよびヒトにおいて、心不全の発症および／または進行に関係している。ノルエピネフリン放出は、前シナプスアルファ−２アドレナリン受容体（α2ＡＲ）のネガティブフィードバック制御下にあるが、筋細胞上での放出ノルエピネフリンの標的は、ベータ−１アドレナリン受容体（β1ＡＲ）である。本発明者らは、多型アルファ−２Ｃアドレナリン受容体（α2CＤＥＬ３２２〜３２５）が低い機能を示し、多型β1ＡＲ（β1Ａｒｇ３８９）が高い機能を示すことを発見した。さらに、本発明者らは、これらの受容体多型が組み合わされると、個体が、心血管疾患に、特定の一実施形態では心不全に、かかりやすくなることを発見した。
【００１３】
アルファ−２Ｃアドレナリン受容体およびアルファ−２Ｃアドレナリン受容体の多型形態（polymorphic form）
アルファ−２アドレナリン受容体は、細胞膜に局在し、内因性カテコールアミンアゴニスト、すなわちエピネフリンおよびノルエピネフリン、ならびに合成アゴニストおよび合成アンタゴニストの受容体として働く。アゴニストと結合した後、受容体の構造が安定化し、このことによって、特定のヘテロ三量体Ｇタンパク質のすべての活性型との接触が促進される。このＧタンパク質には、Ｇi1、Ｇi2、Ｇi3およびＧ0がある。ＧiＧタンパク質のαサブユニットは、酵素アデニリルシクラーゼの活性を低下させる働きをし、この低下によって、細胞内ｃＡＭＰ（古典的セカンドメッセンジャー）レベルが低下する。また、このＧタンパク質のαサブユニットおよび／またはβγサブユニットは、ＭＡＰキナーゼを活性化し、カリウムチャネルを開口し、電位依存性カルシウムチャネル(voltage gated calcium channnels)を抑制し、イノシトールリン酸が蓄積するように刺激する働きをする。これらの事象の開始による生理的結果として、中枢および末梢のノルアドレナリンニューロンからの神経伝達物質の放出抑制がある。
【００１４】
特に、アルファ−２Ｃアドレナリン受容体（α２Ｃ）は、脳、血管、心、肺、骨格筋、膵、腎、前立腺、回腸空腸、脾、副腎および脊髄に局在している。α２Ｃは、特定の中枢神経系の機能において、特定の役割を果たしている。その役割として、聴覚の驚愕反射の調節(modulation of the acoustic startle reflex)、前パルス抑制(prepulse inhibition)、隔離によって誘導される攻撃性(isolation induced aggression)、空間的に働く記憶(spatial working memory)、行動的絶望の発生(development of behavioral despair)、体温調節、ドーパミンおよびセロトニン代謝、心臓の交感神経および中枢ニューロンからの神経伝達物質放出の前シナプス性制御、血管緊張の接合部後制御(postjunctional regulation of vascular tone)またはその組み合わせがあるが、それらだけに限定されない。
【００１５】
本発明者らは、多型アルファ−２Ｃアドレナリン受容体（α2CＤＥＬ３２２〜３２５）を発見した。本明細書において、「多型」という用語は、ＤＮＡおよび／またはアミノ酸配列が野生型配列と比べて変異していることを指す。たいてい、最も一般的な所与の遺伝子配列が存在し、これを「野生型」と呼び、それより一般的でない異型を多型形態または多型（polymorphism）と呼ぶ。ある場合には、２つの配列で集団中の頻度が類似しており、その２つを異型(variants)と呼ぶか、あるいは特定の代用語を名称にする。多型として、一塩基多型（ＳＮＰｓ）、１つまたは複数の塩基欠失、１つまたは複数の塩基挿入があるが、これらに限定されない。多型は、同義多型であることもあり、非同義多型であることもある。同義多型では、それがコード領域中に存在するとき、アミノ酸の変化が生じない。非同義多型では、それがコード領域中に存在するとき、１つまたは複数のコドンが変化し、これによってタンパク質中のアミノ酸の置換、欠失または挿入が生じる。
【００１６】
このような変異および多型は、個体の中で、ヘテロ接合体であることもあり、ホモ接合体であることもある。ホモ接合体の個体は、相同染色体上の１つまたは複数の対応する遺伝子座に同一の対立遺伝子を有する。ヘテロ接合性の個体は、相同染色体上の１つまたは複数の対応する遺伝子座に２つの異なる対立遺伝子を有する。ある種のうち、１種類の配列の遺伝子（例えば、元のまたは野生型の「対立遺伝子」）を有するメンバーもいれば、変化した配列（例えば、異型の、変異型のまたは多型の「対立遺伝子」）を有するメンバーもいる。
【００１７】
【表１】
0004510630.tif 000002
【００１８】
表１に詳述したように、野生型アルファ−２Ｃアドレナリン受容体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１（Genbank受託番号  ＡＦ２８０３９９）として同定されている。野生型アルファ−２Ｃアドレナリン受容体は、ヌクレオチド位置９６４〜９７５にｇｇｇｇｃｇｇｇｇｃｃｇを有し、この配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２と称する。
【００１９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３（Genbank受託番号  ＡＦ２８０４００）は、核酸位置９６４〜９７５でＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２が欠失しているアルファ−２Ｃアドレナリン受容体の多型核酸配列全体である。この欠失によって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のヌクレオチド配列ｇｇｇｇｃｇｇｃｔｇａｇが核酸位置９６４〜９７５に移動する。したがって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１として同定されている野生型核酸配列と比較したとき、ヌクレオチド位置９６４〜９７５に１２個の核酸欠失を有する。
【００２０】
本発明の多型は、翻訳されたα２Ｃアドレナリン受容体にも同様に生じ得る。例えば、翻訳タンパク質産物または遺伝子産物の最初のアミノ酸（メチオニン）を、アミノ酸ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５と称する野生型α２Ｃアドレナリン受容体中のアミノ酸「１」と考える。野生型α２Ｃアドレナリン受容体は、α２Ｃアドレナリン受容体のアミノ酸３２２〜３２５にＧＡＧＰを有し、この配列をアミノ酸ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６と称する。
【００２１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７は、アミノ酸位置３２２〜３２５でＧＡＧＰが欠失しているα２Ｃアドレナリン受容体の多型アミノ酸配列全体である。多型α２Ｃアドレナリン受容体分子は、α２Ｃアドレナリン受容体のアミノ酸位置３２２〜３２５に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８であるＧＡＡＥを有する。多型α２Ｃの機能は、野生型α２Ｃアドレナリン受容体と比べて約７０％減少している。
【００２２】
本明細書において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３で同定されているα２Ｃアドレナリン受容体の多型核酸配列全体は、α2CＤＥＬ９６４〜９７５と呼ぶことができる。さらに、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７で同定されているα２Ｃアドレナリン受容体の多型アミノ酸配列全体は、α2CＤＥＬ３２２〜３２５と呼ぶことができる。
【００２３】
β１アドレナリン受容体
ベータ−１アドレナリン受容体（β1ＡＲ）は、エピネフリンおよびノルエピネフリンが内因性アゴニストであるＧタンパク質共役型アドレナリン受容体ファミリー(adrenergic family of G-protein-coupled receptors)の一員である。Ｇタンパク質共役型受容体スーパーファミリーの他の一員と同様に、そのアミノ末端は細胞外にあり、タンパク質は細胞膜を７回貫通すると予想され、カルボキシル末端は細胞内にある。アドレナリン受容体ファミリーにおいて、アゴニストは、膜貫通ドメインによって形成されたポケット中で結合し、Ｇタンパク質との結合およびその活性化は、湾曲部(loops)および尾部(tail)の、通常は膜の近くの細胞内ドメインで行われる。
【００２４】
β1ＡＲは、アデニリルシクラーゼを活性化する刺激性Ｇタンパク質(stimulatory G-protein)であるＧsとも共役し、イオンチャネルの活性化などの非ｃＡＭＰ経路とも共役する。β1ＡＲは、多数の細胞型上に発現し、これら細胞型のうち、心筋細胞では、この受容体は心臓の変力性および変時性を増大させるのに働き、脂肪細胞では、これは脂肪溶解を媒介し、腎の傍糸球体細胞では、これはレニン分泌を制御する。これらの反応についても、β2ＡＲの反応についても、ヒト集団内でいくらかのばらつきがあることが数十年の間に知られてきている。細胞内のアミノ酸位置３８９でＧｌｙがＡｒｇに転換する一般的な一塩基多型は、Ｇタンパク質との共役に重要な領域内で起こる可能性がある。Ａｒｇ３８９受容体の結果生じる表現型は、受容体とＧsの強い相互作用であり、機能的に、アデニリルシクラーゼ作用因子の高い活性化として現れる。
【００２５】
正常のヒト集団内では、機能的シグナリングにおいてかなり異なるβ1ＡＲの遺伝的異型が２つ存在する。その変異部位は、第７の膜貫通ドメインに由来する９アミノ酸以下の部位であり、パルミトイル化されていると示唆される（複数の）システインより前にある尾部の細胞内部分の中にある。この領域は時々、第４の細胞内湾曲部または細胞質尾部の近位部分と呼ばれる。β2ＡＲ、β2ＡＲ、および他のＧタンパク質共役型受容体との類似性により、この領域は、受容体がその同系のＧタンパク質Ｇsと共役するのに重要であると考えられる。
【００２６】
実際、Ａｒｇ３８９受容体とＧｌｙ３８９受容体の違いは、機能的共役(functional coupling)にある。図６に示すように、アゴニストによって開始されるＧsとの共役を示す他の指標である、受容体によって促進されるＧＴＰＳのＧsとの結合は、同様に２つの多型β1ＡＲ間で異なっている。これらの知見と一致して、グアニンヌクレオチド不在下で洗浄膜調製物中での、アゴニストによって促進される高親和状態の蓄積が、Ａｒｇ３８９受容体で検出されるが、Ｇｌｙ３８９受容体を用いた研究では、これを明らかにすることはできなかった。Ａｒｇ３８９受容体がアゴニスト存在下で活性型構造を安定化させる効率がより高いので、この受容体の場合に、アデニリルシクラーゼの基底活性が高いこと（すなわち、アゴニスト不在下で自然にＲ*に切り替わること）も予想することができる。図５に示すように、この機能的表現型は、２つの多型β1ＡＲを内因的に発現する細胞内のシグナリングを示している。
【００２７】
ヒトの３８９位に相似のアミノ酸とその周囲にある残基のどちらも、今日まで配列が決定した種内で高度に保存されており、Ｇｌｙが最初に報告された３８９位の、ヒトで見つけられた変異のみが認められている。この領域の高度な一致、Ｇタンパク質との共役におけるこの領域の重要性、ＧｌｙのＡｒｇへの置換の（大きさおよび帯電に関する）非保存的性質は、機能的結果のこのばらつきと矛盾しない。
【００２８】
先に紹介したように、β1ＡＲは、体内の多数の細胞型上に発現している。心臓において、β1ＡＲは、優勢なＡＲサブタイプを表し、心房および心室の筋細胞上に発現し、そこでこの受容体は、交感神経の刺激に反応して収縮の力および頻度が増大するように働く。左心室不全が発症するとき、β1ＡＲの発現および機能は、ヒト心不全において低下する。特定の理論に拘泥するものではないが、本発明者らは、この反応が、代謝の蓄えが限られてくるとき、持続する交感神経の刺激に心臓が対応する余地を残す保護的機構であると考える。心疾患の初期段階で、β1ＡＲの機能を維持すると、心室機能の改善に寄与することができる。上記の事情を考慮すると、２つの1ＡＲ多型間の機能における劇的な違いから、うっ血性心不全の病態生理はβ1ＡＲの遺伝子型に影響を受ける可能性があることが示唆される。
【００２９】
β1ＡＲは、心筋細胞上に発現する優勢なβＡＲであり、循環エピネフリン、および心臓の交感神経に由来する局所ノルエピネフリンに反応する。げっ歯類にβアゴニストを注射してβ1ＡＲを慢性的に活性化すると、肥大が生じ、遺伝子導入により心臓にβ1ＡＲを過剰発現させると、進行性の心筋症および不全が起こる。したがって、特定の理論に拘泥するものではないが、本発明者らは、β1Ａｒｇ３８９受容体をトランスフェクトした細胞中で、β1Ｇｌｙ３８９受容体と比べてアゴニスト刺激活性が２００％まで増加するので、β1Ａｒｇ３８９受容体がリスクファクターであると考える。
【００３０】
さらに、βＡＲアンタゴニスト（βブロッカー）は、長期の交感神経刺激の前記の結果を最小限に抑えるとの推定のもとで、心不全の長期治療に使用されている。これに加えて、βＡＲアゴニストは、生命の危険がある心不全の間、心拍出量を急激に増加させるために使用されている。しかし、心不全患者におけるβブロッカーおよびβＡＲアゴニストに対する臨床反応には、個体間でかなりのばらつきがある。特定の理論に拘泥するものではないが、本発明者らは、Ａｒｇ３８９受容体を有する個体が、高い機能を有するアデニリルシクラーゼをより強く刺激するという遺伝的に決定されたβ1ＡＲを有するはずであるので、この受容体を有する個体が、βブロッカーおよびβＡＲアゴニストによる療法に最も反応すると考える。
【００３１】
Ｇｌｙ３８９β1アドレナリン受容体の核酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９（Genbank受託番号  Ｊ０３０１９）として同定されている。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０として同定されているＧｌｙ３８９β1アドレナリン受容体のアミノ酸配列は、Ｇｌｙ３８９やβ1Ｇｌｙ３８９と呼ぶこともできる。Ａｒｇ３８９β1アドレナリン受容体の核酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１として同定されている。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２として同定されているＡｒｇ３８９β1アドレナリン受容体のアミノ酸配列は、Ａｒｇ３８９やβ1Ａｒｇ３８９と呼ぶこともできる。
【００３２】
多型アルファ−２Ｃおよびベータ−１アドレナリン受容体
本発明者らは、多型α２Ｃアドレナリン受容体が心不全のリスクファクターであることを発見した。さらに、本発明者らは、多型α２Ｃおよびβ1Ａｒｇ３８９アドレナリン受容体が個体における心血管疾患発症のリスクファクターとして相乗的に働くことを発見した。さらに、本発明者らは、この２つの座位における遺伝子型決定が、早期にまたは予防的に薬剤による介入を施すべき個体を同定する有用な手法である可能性があることを決定した。
【００３３】
図１に概要を示すように、本発明者らは、選択したアドレナリン受容体の機能的多型が、個体間のばらつきに重要なファクターであることを発見した。接合部前α2ＡＲ（α2AＡＲおよびα2CＡＲサブタイプ）は、心臓の交感神経からのノルエピネフリンの放出を制御する。多型α２Ｃアドレナリン受容体をトランスフェクトした細胞中では、アゴニストが媒介する受容体の機能がかなり欠損する。交感神経の正常な自動抑制フィードバックの欠損は、この機能障害に起因し、この障害により前シナプス性ノルエピネフリン放出の促進が生じる。この欠損に基づいて、本発明者らは、多型α２Ｃを有する個体が、心血管疾患を発症するリスクを有する可能性があることを発見した。
【００３４】
さらに、心臓の交感神経から放出されたノルエピネフリンは、筋細胞のβ1ＡＲを活性化し、この受容体は、刺激性Ｇタンパク質Ｇsと共役し、アデニリルシクラーゼを活性化し、細胞内ｃＡＭＰを増加させる。それに続くｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼＡによる複数の細胞内タンパク質のリン酸化を通じて、このようなβ1ＡＲ活性化は、心臓の変力、変弛緩および変時の増大に至る。前記で論じたように、受容体のＧs共役ドメインのアミノ酸位置３８９にＧｌｙまたはＡｒｇがコードされている多型変異に起因する、２つの一般的なβ1ＡＲがヒト集団内に存在する。組換え細胞ベースの発現システムにおいて、β1Ａｒｇ３８９は、β1Ｇｌｙ３８９と比べて、アデニリルシクラーゼとの共役の著しい促進を示す。本発明者らは、ノルエピネフリン放出およびβ1ＡＲ活性が同時に促進されるので、多型α２Ｃとβ1Ａｒｇ３８９のどちらも有する、多型α２Ｃの個体は、心不全のリスクが最も大きいことを発見した。
【００３５】
本発明者らは、β1ＡＲおよびα2CＡＲの多型が一緒になって、心血管疾患の発症の潜在的に主要なリスクファクターを表すことを発見した。特に、α2CＤｅｌ３２２〜３２５およびβ1Ａｒｇ３８９がまれではないアフリカ系アメリカ人中で、β1Ａｒｇ３８９の遺伝子型は心不全に関係しないが、α2CＤｅｌ３２２〜３２５の多型効果のみでも、ある程度のリスク（オッズ比＝５．６５）を表す。しかし、ホモ接合性の状態で一緒に生じるとき、リスクは相当であり、統計的にも高度に有意であり、オッズ比は１０．１１（９５％ＣＩ  ２．１１〜４８．５３、Ｐ＝０．００４）である。白人中でα2CＤｅｌ３２２〜３２５の多型を有する割合が低いことから、本発明者らは、β1ＡＲの遺伝子型でさらに分けた後、この人種群において有意な関係を予想しなかった。それにも関わらず、白人被験者中で、α2CＤｅｌ３２２〜３２５の対立遺伝子頻度は実際、対照群と比べて心不全患者群でより高かった。したがって、特定の理論に拘泥するものではないが、本発明者らは、この２つの多型受容体の分子の性質が、すべての個体における心血管疾患のリスクファクターであり得ると考える。
【００３６】
したがって、本発明者らは、個体における心血管疾患を評価する方法を発見した。この方法は、個体に由来するサンプル中で多型アルファ−２Ｃ（α2CＤＥＬ３２２〜３２５）アドレナリン受容体をコードする断片の有無を検出する工程と、個体に由来するサンプル中で多型ベータ−１アドレナリン受容体（β1Ａｒｇ３８９）をコードする断片の有無を検出する工程とを含む。
【００３７】
本発明者らは、個体における心血管疾患の発症を遅延させる方法をも発見した。この方法は、個体に由来するサンプル中で多型アルファ−２Ｃ（α2CＤＥＬ３２２〜３２５）アドレナリン受容体をコードする断片の有無を検出する工程と、個体に由来するサンプル中で多型ベータ−１アドレナリン受容体（β1Ａｒｇ３８９）をコードする断片の有無を検出する工程と、α2CＤＥＬ３２２〜３２５およびβ1Ａｒｇ３８９の有無に基づいて、個体についての治療法を選択する工程とを含む。この治療法により、その個体における心血管疾患の発症が遅延する。
【００３８】
本発明者らは、個体における心血管疾患における進行または早期死亡を遅延させる方法をも発見した。この方法は、個体に由来するサンプル中で多型アルファ−２Ｃ（α2CＤＥＬ３２２〜３２５）アドレナリン受容体をコードする断片の有無を検出する工程と、個体に由来するサンプル中で多型ベータ−１アドレナリン受容体（β1Ａｒｇ３８９）をコードする断片の有無を検出する工程と、α2CＤＥＬ３２２〜３２５およびβ1Ａｒｇ３８９の有無に基づいて、個体についての治療法を選択する工程とを含む。心血管疾患に関する進行または早期死亡が遅延する。
【００３９】
さらに、本発明者らは、個体における心血管疾患に関する遺伝カウンセリングの方法を発見した。この方法は、個体に由来するサンプル中で多型アルファ−２Ｃ（α2CＤＥＬ３２２〜３２５）アドレナリン受容体をコードする断片の有無を検出する工程と、個体に由来するサンプル中で多型ベータ−１アドレナリン受容体（β1Ａｒｇ３８９）をコードする断片の有無を検出する工程と、α2CＤＥＬ３２２〜３２５およびβ1Ａｒｇ３８９の有無に基づく心血管疾患発症の潜在的リスクに関してその個体をカウンセリングする工程とを含む。
【００４０】
本明細書において、「個体」は、胚、胎児、小児および成人を含めたヒトを指すものとするが、これらに限定されない。本明細書で使用することができるいずれも、様々なサンプルが個体において断片の有無を検出するために使用可能であり、そのいずれも本明細書において使用できることが、当業者には理解されよう。サンプルには、それだけに限らないが、血液サンプル、組織サンプル、体液またはこれらの組み合わせがある。
【００４１】
本明細書において、「評価」(assessment)は、個体のサンプル中のα2CＤＥＬ３２２〜３２５およびβ1Ａｒｇ３８９の有無に基づいた心血管疾患の予後、診断、モニタリング、発症遅延、進行遅延、早期死亡遅延、発症リスク、進度、進行予測、治療法に対する反応予測、治療法に対する反応適合、リスクまたは臨床的特徴を変えるライフスタイル変化の予測または指示を指すものとする。
【００４２】
本明細書において、「断片」(fragment)は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質またはこれらの組み合わせをコードする核酸および／またはアミノ酸の配列を指すものとする。一実施形態では、断片は、多型アルファ−２Ｃアドレナリン受容体（α2CＤＥＬ３２２〜３２５）またはα2CＤＥＬ３２２〜３２５部位を含む。他の実施形態では、断片は、野生型α２Ｃアドレナリン受容体またはその部位を含む。さらに他の実施形態では、断片は、多型ベータ−１アドレナリン受容体（β1Ａｒｇ３８９）またはβ1Ａｒｇ３８９部位を含む。さらに他の実施形態では、断片は、Ｇｌｙ３８９β１アドレナリン受容体またはその部位を含む。
【００４３】
心血管疾患には、それだけに限らないが、卒中、血管塞栓症、血管血栓症、心不全、心臓不整脈、心筋梗塞、心筋虚血症、狭心症、高血圧、低血圧、ショック、突然心臓死またはこれらの組み合わせがある。特定の実施形態では、心血管疾患は、心不全を含む。
【００４４】
ＤＮＡおよび／または断片の有無を検出する、種々の直接的なおよび／または間接的な既知の技術があり、そのいずれも本明細書で使用できることは、当業者には理解されよう。技術には、それだけに限らないが、蛍光法、分光法、アレイ、ダイレクトシークエンシング、制限部位分析、ハイブリダイゼーション、プライマリー（primary）が媒介するプライマリー伸長、ゲル移動法、抗体アッセイまたはこれらの組み合わせがある。アミノ酸、タンパク断片の有無を検出する、種々の直接的なおよび／または間接的な既知の技術があり、そのいずれも本明細書で使用できることは、当業者には理解されよう。この技術には、それだけに限らないが、アミノ酸シークエンシング、抗体、ウェスタンブロット、２次元ゲル電気泳動、免疫組織化学法、オートラジオグラフィーまたはこれらの組み合わせがある。
【００４５】
本明細書において、「治療法」は、心血管疾患に関して、発症を遅延させる、進行を遅延させる、または早期死亡を遅延させる手順を指すものとする。一実施形態では、治療法は、α2CＤＥＬ３２２〜３２５およびβ1Ａｒｇ３８９のアゴニストおよび／またはアンタゴニストの投与を含む。他の実施形態では、治療法は、それだけに限らないが、食事、運動などの変化を含めたライフスタイルの変化を含む。
【００４６】
先に論じたように、心不全のリスクファクターの候補としてβＡＲおよびα2CＡＲを調べることは、多数の基礎研究、動物研究、およびヒト研究の結果が土台となっている。ヒト心臓の前シナプス性交感神経上に発現するα2ＡＲは、神経伝達物質ノルエピネフリンの放出を抑制する。例えば、α2AＡＲおよびα2CＡＲの発現が欠如するように作成されたマウスにより、α2CＡＲが基底状態（刺激頻度が低い状態）下でノルエピネフリン放出を抑制することが判明している。このようなマウスは、心不全を発症する。したがって、α2CＡＲの機能を低下させ、それによってノルエピネフリン放出の慢性的促進を生じさせるこれらのファクターは、心不全を発症しやすくするファクターになっている可能性がある。さらに、β1ＡＲ機能を低下させるファクターも、個体において心不全を発症しやすくするファクターになっている可能性がある。
【００４７】
本発明者らの結果は、ホモ接合性のα2CＤｅｌ３２２〜３２５多型を有する個体で心不全の相当なリスクがあることを実証するものである。本発明者らの結果は、個体がホモ接合性のα2CＤｅｌ３２２〜３２５多型とホモ接合性のβ1Ａｒｇ３８９異型のどちらも有する（「二重ホモ接合性遺伝子型」とも称する）とき、その個体の心不全のリスクがさらに大きくなることもさらに実証する。特定の理論に拘泥するものではないが、本発明者らは、２つの多型受容体間の相互作用が、この２つの受容体が、連続型のシグナル伝達経路である局所ノルエピネフリン産生およびその標的受容体の活性化の中での２つの重要な構成要素を表すことに起因するものと考える。この相互作用の単に相加的ではなく相乗的な性質は、Ｇタンパク質共役型受容体が活性化すると、シグナルが著しく増幅されることに起因する可能性がある。これは、心不全における個々のシグナリング経路内のそのような相互作用の最初の例である。
【００４８】
二重ホモ接合性遺伝子型が存在することから、α2ＡＲアゴニストもしくはアンタゴニストおよび／またはβＡＲアゴニストもしくはアンタゴニストを用いた特異的な薬理療法が必要であることが示唆される可能性がある。ホモ接合性のα2CＤｅｌ３２２〜３２５／β1Ａｒｇ３８９遺伝子型の患者は、それに反応する集団に属する可能性もあり、反応しない集団に属する可能性もある。したがって、これらの座位の遺伝子試験を使用して、好ましい結果となる可能性が最も高くなるように、薬理療法を患者に適合させることができる。さらに、特定の理論に拘泥するものではないが、本発明者らは、このような個体は進行のリスクが最も大きいので、このような個体が、まさに心機能が比較的保存されており症状が最小限である、症候群の早期に治療を受けることから利益を得る可能性があると考える。無症候性左室肥大の個体にも、臨床的心不全への移行を停止させる目的で、同様の手法が示唆される可能性がある。最後に、心肥大または心不全でないが二重ホモ接合性遺伝子型である個体、したがって心不全を発症するリスクがある個体も、「予防療法」から利益を得ることができる。
【実施例】
【００４９】
被験者
治験実施計画書は、シンシナティ大学治験審査委員会（the University of Cincinnati Institutional Review Board）から承認を受け、被験者は、書面によるインフォームドコンセントを提出している。健常（対照）者および心不全患者は、シンシナティ地区およびその近郊の出身である。患者は、シンシナティ大学心不全プログラム（the University of Cincinnati Heart Failure Program）（１９９９年１月２日〜２００１年１月２日）で、この特定の遺伝的試験に参加することに同意し、選択基準を満たす一連の患者が集まるように依頼することによって募集する。このプログラム中の約５０％の患者は、地域の心臓専門医より紹介され、４０％以下は、この専門医療センター内の医師より紹介され、１０％以下は、自ら参加している。
【００５０】
サンプルデータを限定するため、採用基準は、２０〜７９歳であること、左室駆出分画（ＬＶＥＦ）＜３５％であること、ＮＹＨＡ  ＩＩ〜ＩＶの心不全であること、および突発性拡張型心筋症もしくは虚血性心筋症のどちらかであることとする。非虚血性拡張型心筋症であり前駆的高血圧を伴う患者は、突発性とみなす。サンプルサイズをさらに限定するため、その心不全が、原発性弁膜症、心筋炎、または閉塞性心筋症もしくは肥大型心筋症に起因する患者は、症例数を限定するため採用しない。対照群は、（調査票により評価される）これらの疾患と無関係の、明らかに健常である個体からなり、その個体は、自発的な献血者から、また新聞広告によって募集する。特に、対照群のうち、心血管疾患またはその症状の既往がある、または何らかの長期薬物療法を受けている者は全くいない。参加者の人種による分類は、自己報告によって行う。
【００５１】
遺伝子型決定
これらの座位の遺伝子型決定を、心不全患者１７１名および対照被験者１９３名に実施する。ロジスティック回帰法（logistic regression methods）を使用して、各遺伝子型およびこれらの相互作用の心不全リスクに対する潜在的効果を決定する。他の心不全患者２６１名の群に分析を実施して、遺伝子型と心不全の持続期間(duration of heart failure)の関係を評価する。他の心不全患者２６３名の群に分析を実施して、高血圧リスクを評価する。高度に多型が認められる短い縦列反復座位(short tandem repeat loci)９個の遺伝子型を用いて、人種群内における症例と対照の間の集団の層別化ができるかどうか試験する。
【００５２】
ゲノムＤＮＡを末梢血サンプルから抽出し、アドレナリン受容体多型を検出する。アドレナリン受容体の遺伝子型を、野生型α2CＡＲ（より一般的な異型を表し、これは欠失していない）、α2CＤｅｌ３２２〜３２５（４アミノ酸が欠失している異型）、β1Ａｒｇ３８９およびβ1Ｇｌｙ３８９と称する。α2CＡＲ多型（図３を参照のこと）またはβ1ＡＲ多型（図４を参照のこと）をカバーするＰＣＲ産物の配列分析と制限酵素消化の両方を用いて、ゲノムＤＮＡサンプル中の各配列異型を検出する。
【００５３】
図３に、野生型α2CＡＲおよびＤｅｌ３２２〜３２５α2CＡＲについてホモ接合性の個体を同定しているシークエンシングの電気泳動図（センス鎖）を示す。野生型配列内のヌクレオチド９６４〜９７５（ＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＣＧ）（図３Ａ）は、Ｄｅｌ３２２〜３２５配列（図３Ｂ）にはない。さらに、この１２ヌクレオチドの欠失によって、ゲノムＤＮＡサンプルから増幅した３７２ｂｐのＰＣＲ産物内にあるＮｃｉＩ制限酵素部位６個のうち１個が欠損する。したがって、ＮｃｉＩで消化したＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動から、野生型についてホモ接合性、Ｄｅｌ３２２〜３２５についてホモ接合性、およびヘテロ接合性の個体を同定する独特の断片パターンが明らかとなる（図３Ｃ）。
【００５４】
図４に、ヌクレオチド１１６５がそれぞれＧまたはＣのどちらかである、β1ＡＲ  Ｇｌｙ３８９多型またはβ1ＡＲ  Ａｒｇ３８９多型についてホモ接合性の個体を同定しているシークエンシングの電気泳動図（センス鎖）を示す。この位置にＣが存在することによって、ＢｓｍＦＩ制限酵素部位が欠損する。したがって、この多型部位を範囲とする４８８ｂｐのＰＣＲ産物のＢｓｍＦＩ消化およびアガロースゲル電気泳動によって、３つの遺伝子型（ヘテロ接合性、ホモ接合性Ｇｌｙ３８９、およびホモ接合性Ａｒｇ３８９）がすべて同定される。
【００５５】
上記の方法を組み合わせて使用して、症例および対照におけるβ1ＡＲ  Ａｒｇ３８９多型およびＤｅｌ３２２〜３２５α2CＡＲ多型の２つの座位の対立遺伝子頻度を含めて、すべてのβ1ＡＲ／α2CＡＲの遺伝子型を決定する。
【００５６】
集団の層別化の可能性を評価するため、図２に示すように、高度に多型が認められる短い縦列反復（ＳＴＲ）座位９個での対立遺伝子頻度を、ＡｍｐＦｌＳＴＲ試薬を使用し、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３７７  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Applied BioSystems）を用いて多色蛍光によって検出するマルチプレックスＰＣＲによって決定する。
【００５７】
統計分析
対立遺伝子頻度を、標準的な遺伝子カウント法を用いて計算する。遺伝子型および対立遺伝子の心不全との関係についての検定を、各人種群内で独立してカイ二乗検定を使用することによって行う。α2CＡＲ多型とβ1ＡＲ多型の相互作用について検定するため、ロジスティック回帰法を用いて、各遺伝子型およびこれらの相互作用の心不全リスクに対する効果をモデル化する。尤度比検定を用いて、年齢および性の潜在的交絡効果(potential confounding effects)について補正する前と後の両方の場合の各座位およびこれらの相互作用の有意性を評価する。
【００５８】
最後に、症例のみの分析を行って、独立カイ二乗検定を使用して単一および２つの座位の遺伝子型が高血圧の状態および診断群（突発性または虚血性）と関係するかどうか検定する。ＳＴＲ対立遺伝子の頻度を、カイ二乗検定により２つの人種群内で症例と対照の間で比較する。該当する場合、平均データを±標準偏差をつけて示す。カプランマイヤープロットおよびログランク法（log-rank tests）を用いて、生存分布が遺伝子型の種類によって有意に異なるかどうかを評価する。
【００５９】
結果
アフリカ系アメリカ人では、心不全の補正オッズは、他のα2CＡＲの遺伝子型と比べると、α2CＤｅｌ３２２〜３２５がホモ接合性である個体で５．６５倍高い（９５％信頼区間２．６７〜１１．９５、Ｐ＜０．０００１）。β1Ａｒｇ３８９のみの場合ではリスクは全く認められない。しかし、どちらの異型もホモ接合性である個体では心不全のリスクが著しく増大し、補正オッズ比＝１０．１１（９５％信頼区間２．１１〜４８．５３、Ｐ＜０．００４）である。この関係は、拡張型および虚血性心筋症の場合にも保持され、前駆的高血圧には依存しない。短い縦列反復対立遺伝子の頻度は、症例と対照の間で差がなく、これによって集団の層別化の可能性は除外される。白人でも、α2CＤｅｌ３２２〜３２５多型は心不全と関係する（対照群に対する対立遺伝子頻度０．１０５対０．０３８、ｐ＝０．０１１）。しかし、遺伝子型が両方ホモ接合性である患者が少ないので十分にリスクを評価することができない。
【００６０】
心不全症例の特徴を表２に示す。アフリカ系アメリカ人について、患者群は７８名（４９±１１歳）であり、対照群は８４名（５３±１６歳）である。白人の心不全患者群は８１名、５６±１１歳であり、対照群は１０５名、３６±１２歳である。アフリカ系アメリカ人と白人の間で両方の受容体異型の対立遺伝子頻度に有意差が認められる。この研究では、α2CＤｅｌ３２２〜３２５は、白人の対照群と比べてアフリカ系アメリカ人で１０倍多く見られる（対立遺伝子頻度０．４１１対０．０３８、Ｐ＜０．０００１）ことが明らかとなる。β1Ａｒｇ３８９は、アフリカ系アメリカ人でいくらか少ない（０．５６０対０．７６２、Ｐ＜０．０００１）。白人とアフリカ系アメリカ人の間にある２つの多型の頻度の差、特にα2CＤｅｌ３２２〜３２５座位における差があることから、２つの人種群について別個のリスク分析を実施した。
【００６１】
どちらの異型も比較的多く見られるアフリカ系アメリカ人では、表３に詳細を示すように、単一座位の分析から、α2CＤｅｌ３２２〜３２５は実際、正常な対照群（対立遺伝子頻度＝０．４１１）と比べて心不全患者群（対立遺伝子頻度＝０．６１５、Ｐ＝０．０００２）でより多く見られることが明らかとなる。可能性がある３つすべての遺伝子型を用いて分析したとき、この関係は高度に有意なままである。実際、アフリカ系アメリカ人の心不全患者群の５３％ではこの多型がホモ接合性であり、これに対して対照群では１７％にすぎない。心不全およびホモ接合性α2CＤｅｌ３２２〜３２５についての非補正オッズ比は５．５４（９５％信頼区間２．６８〜１１．４５、Ｐ＜０．０００１）である。年齢または性による有意な交絡は認められず、心不全およびホモ接合性α2CＤｅｌ３２２〜３２５についての、交絡因子で補正したオッズ比は５．６５（９５％信頼区間２．６７〜１１．９５、Ｐ＜０．０００１）である。α2CＡＲ多型と異なり、アフリカ系アメリカ人で心不全である被験者とそうでない被験者におけるβ1Ａｒｇ３８９の対立遺伝子頻度には、統計的に有意な差は認められない。
【００６２】
２つの座位の分析から、アフリカ系アメリカ人の心不全患者群におけるα2CＤｅｌ３２２〜３２５遺伝子型とβ1Ａｒｇ３８９遺伝子型の間の有意な相互作用が示唆される。この組合せから、２つの座位の心不全リスクとの倍数的（すなわち、相加的効果より大きい）関係が明らかとなる（相互作用の尤度比検定Ｐ＝０．０５）。被験者を、α2CＤｅｌ３２２〜３２５とβ1Ａｒｇ３８９のどちらもホモ接合性の群、α2CＤｅｌ３２２〜３２５のみホモ接合性の群、β1Ａｒｇ３８９のみホモ接合性の群、およびどちらもホモ接合性でない群（基準遺伝子型クラス）の４群に分ける。結果を表４に示し、この結果から、基準遺伝子型クラスと比較すると、アフリカ系アメリカ人において、α2CＤｅｌ３２２〜３２５およびβ1Ａｒｇ３８９がホモ接合性であることが、心不全リスクがかなり高くなることと関係する（非補正オッズ比＝１２．６７、９５％信頼区間２．７０〜５９．４２、Ｐ＝０．００１）ことが明らかとなる。このモデル中で年齢および性について補正したとき、オッズ比は、わずかに低下するが、高度に統計的に有意なままである（補正オッズ比＝１０．１１、９５％信頼区間２．１１〜４８．５３、Ｐ＝０．００４）。
【００６３】
これらの知見を、２つの座位の遺伝子型によって、また診断群（突発性拡張型および虚血性心筋症）または高血圧状態の症例間の分布の差によって説明することができるかどうかを評価するため、症例のみの分析を行う。アフリカ系アメリカ人の症例間で、２つの診断型間における２つの座位の遺伝子型頻度の差（カイ二乗＝１．３８、Ｐ＝０．７１）、または高血圧の患者と血圧が正常な患者の間における差（カイ二乗＝０．３３５７、Ｐ＝０．９５）は認められなかった。
【００６４】
白人において、本発明者らは、心不全患者群のα2CＤｅｌ３２２〜３２５の対立遺伝子頻度が対照群より高い（０．１０５対０．０３８、Ｐ＝０．０１１）ことを発見した（表３を参照のこと）。有意レベルの差が生じたのは、α2CＤｅｌ３２２〜３２５がホモ接合性である群の白人被験者の数が少ない（健常者群は２名、症例群は６名）ためである可能性が高い。アフリカ系アメリカ人で見られるように、白人の症例群と対照群の間でβ1Ａｒｇ３８９の頻度の差はない。白人における２つの座位のモデルと心不全リスクの有意な関係は見られない。しかし、二重ホモ接合性遺伝子型が健常者で１．９％に、心不全患者で３．７％に生じているので、これが白人において心不全のリスクファクターであることへの強い傾向が認められる。被験患者数が大きいと、この関係は統計的に有意となるはずであることが主張される。
【００６５】
アフリカ系アメリカ人では誤った関係が生じる可能性がある、対照群と心不全群の間での未確認集団の層別化の可能性を、高度に多型が認められる９個のＳＴＲ座位における遺伝子型決定によって調べ、これを表５に示す。（被験者がすべて同じ地域出身であり、人種群内での関係を調べるので、集団層別化の尤度は低くなるとみなされることに留意されたい。）アフリカ系アメリカ人内での対照被験者および心不全被験者ではこれらのマーカーの頻度に差がない（表５のＰ値を参照のこと）ことが判明し、これによって、症例群と対照群の間での集団層別化は、本発明者らの関係についての知見を説明するものではないことが示唆される。
【００６６】
最後に、十分な数の患者が存在するアフリカ系アメリカ人において偏りのある結果が生じ得るというありそうにない可能性を、分割表を用いて考える。様々なα2CＡＲ遺伝子型を有する被験者の間で、試験への登録時の年齢に差はない。しかし、４０歳より前の心不全発症のオッズは、野生型α2CＡＲがホモ接合性である者と比べてα2CＤｅｌ３２２〜３２５の保因者で４．０７倍高い（９５％信頼区間１．２５〜１３．３０、Ｐ＝０．０２３）。さらなる分析には、異なる予測罹患率を有する２群を定義するため、すべてのアフリカ系アメリカ人患者についてのＬＶＥＦの中央値（２２．０％）を使用する。ＬＶＥＦ≦２２％であるオッズは、野生型α2CＡＲがホモ接合性である者と比べてα2CＤｅｌ３２２〜３２５がホモ接合性である者で３．６３倍高い（９５％信頼区間１．１７〜１１．２２、Ｐ＝０．０３）。さらに、特定の理論に拘泥するものではないが、他の試験から、Ｄｅｌ３２２〜３２５多型の存在によって生存率を予測することができることが示唆される。この場合、試験が経過する間に死亡した、または心臓移植を受けた患者（ｎ＝１４）に対して分析を行う。この群内で、死亡時または移植を受けたときの年齢から発症時の年齢を引いたものとして定義される心不全の持続期間の中央値は、野生型α2CＡＲがホモ接合性である者（４．８年）と比べて、Ｄｅｌ３２２〜３２５がホモ接合性である患者（４．１年）でより短い。これらの結果は、「生存者効果（survivor effect）」を示すものではなく、野生型α2CＡＲと異なり、α2CＤｅｌ３２２〜３２５対立遺伝子が不全の表現型と関係するという結論を裏付けるものでもない。さらに、上記の分析は、必然的に心不全患者にしか実施されないので、これらの結果から、α2CＤｅｌ３２２〜３２５が、リスクに対する効果を有するのみならず、早期発症型の疾患の患者、およびより重症型の疾患の患者をも同定することが示唆される。４０歳より前の心不全発症のオッズは、野生型α2CＡＲがホモ接合性である者と比べてα2CＤｅｌ３２２〜３２５の保因者で４．０７倍高い（９５％信頼区間１．２５〜１３．３０、Ｐ＝０．０２３）。ＬＶＥＦ≦２２％であるオッズは、野生型α2CＡＲがホモ接合性である者と比べてα2CＤｅｌ３２２〜３２５がホモ接合性である者で３．６３倍高い（９５％信頼区間１．１７〜１１．２２、Ｐ＝０．０３）。ここに示すように、これらの関係は、どちらも統計的に有意である。β1Ａｒｇ３８９について、登録後に死亡した、または移植を受けた心不全患者（ｎ＝２１６）のより大きなコホート(cohort)を調べた。さらに、特定の理論に拘泥するものではないが、心不全の持続期間（心臓移植または死亡までの年数）は、野生型Ｇｌｙ３８９受容体がホモ接合性の個体（５．６年）と比べて多型Ａｒｇ３８９受容体がホモ接合性の個体（４．０年）でより短い。心不全患者２６３名のさらなる解析において、β1ＡＲ遺伝子型と高血圧の関係が留意される。ここで、平均＋／−標準誤差で表す収縮期血圧は、β1Ｇｌｙ３８９がホモ接合性の患者で１１０＋／−３．７ｍｍＨｇ、ヘテロ接合性の患者で１１４＋／−１．８ｍｍＨｇ、β1Ａｒｇ３８９がホモ接合性の患者で１２２＋／−１．８ｍｍＨｇである。これらのデータから、高血圧が心不全において心室機能の悪化を引き起こす可能性があるので、これらの異型を使用して、高血圧のリスクを評価することができ、これらを使用して、この効果を介して心不全を緩和することができることが明らかとなる。
【００６７】
【表２】
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【００６８】
【表３】
0004510630.tif 000004
【００６９】
*  正常群対心不全群において対立遺伝子数を比較した２×２カイ二乗検定。
†  ＷＴ、野生型α2CＡＲ（欠失を有さない）；Ｄｅｌ、α2CＤｅｌ３２２〜３２５
‡  正常群対心不全群において、可能性がある３つの遺伝子型の分布を比較した２×３カイ二乗検定。
§  性および年齢で補正した、心不全の遺伝子型（Ａｒｇ／Ａｒｇ対Ｇｌｙ／ＧｌｙおよびＧｌｙ／Ａｒｇ；あるいはＤｅｌ／Ｄｅｌ対ＷＴ／ＷＴおよびＷＴ／Ｄｅｌ）との関係に関するオッズ比。
【００７０】
【表４】
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【００７１】
*  性および年齢で補正したオッズ比
**  被験者が０のセルがあるため、これらのオッズ比は基準遺伝子型との単（２×２）比較を表す。
【００７２】
【表５】
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【００７３】
【表６】
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【００７４】
【表７】
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【００７５】
【表８】
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【００７６】
各対立遺伝子の頻度の比較により、２つの人種群内で対照群と心不全患者群の間でＰ値がすべて＞０．０５であることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】心不全のリスクファクターとしてα2CＤｅｌ３２２〜３２５およびβ1Ａｒｇ３８９アドレナリン受容体が相乗作用することを示す図である。
【図２】単一ゲルでの短い縦列反復対立遺伝子の複数のＰＣＲ検出を示す図である。中央の２レーンは、９個の短い縦列反復座位に由来する、あり得るすべての対立遺伝子を表すラダーである。各多色レーンは、コンピュータアルゴリズムによってスコア化された、１名の患者に由来する蛍光の出力を表す。赤のシグナルは、分子サイズマーカーである。
【図３】ＡおよびＢは、α２Ｃアドレナリン受容体をカバーするＰＣＲ産物の配列分析を示す図である。Ｃは、α２Ｃアドレナリン受容体をカバーするＰＣＲ産物の制限酵素消化を示す図である。
【図４】ＡおよびＢは、β１アドレナリン受容体をカバーするＰＣＲ産物の配列分析を示す図である。Ｃは、β１アドレナリン受容体をカバーするＰＣＲ産物の制限酵素消化を示す図である。
【図５】Ｇｌｙ３８９受容体およびＡｒｇ３８９受容体のアデニリルシクラーゼとの機能的共役を示す図である。同程度のレベルで各受容体を発現しているクローン細胞系を用いた研究の結果、ならびに活性の絶対値として示したデータ（Ａ）、およびフォルスコリンによる刺激に対して標準化したデータ（Ｂ）を示す。他の２つのクローン細胞系を用いた同様の研究の結果をパネルＣおよびＤに示す。Ａｒｇ３８９では、Ｇｌｙ３８９受容体と比べて、基底活性が少し増大し、アゴニスト刺激による活性が著しく増大することが実証された。各細胞系で実施した４回の独立した実験の平均の結果を示す。エラーバーがないのは、標準誤差がプロットしている印より小さいことを示す。
【図６】２つの多型β1ＡＲとの［35Ｓ］ＧＴＰγＳの結合量を示す図である。１０μＭイソプロテレノール存在下での結合量は、Ｇｌｙ３８９受容体よりＡｒｇ３８９で大きかった（ｐ＜０．０５）。データを、野生型（Ｇｌｙ３８９）受容体との結合量（平均絶対値は、Ｇｌｙ３８９で７．７±１．４×１０5ｄｐｍ／ｍｇであった）の百分率として示す。結合量の基底レベルには、２つの受容体の間で差はなかった。ｎｔとは、トランスフェクトしていない細胞である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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