(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ATCC No. 55962のＥ．コリ株。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は一般的に、組換えDNA技法の分野に関する。より詳しくは、本発明は高い効率で形質転換表現型を付与する能力により特徴づけられる新規細菌突然変異、及び前記新規突然変異を含んで成る細菌を用いての高コンピテント細胞の製造方法を記載する。
背景技術
宿主細胞中へのDNA（及び他の類似するポリヌクレオチド）の導入工程は、組換えDNA技法の鍵となる観点である。ポリヌクレオチドが宿主細胞中に導入される工程は、形質転換と呼ばれる。細菌細胞は一般的に、大部分の組換えDNA実験及び遺伝子構築操作のための好ましい宿主である。遺伝子構築実験のための特に興味ある細菌は、Ｅ．コリ（E.coli）である。“受容能力”（competence）（外因性DNAを効率よく取り込む能力）がＥ．コリ増殖サイクルの天然の特徴でない場合、Ｅ．コリ中に外因性ポリヌクレオチドを導入するために人工的方法が使用されるべきである。細菌、たとえばＥ．コリを外因性核酸に対してより透過性にする種々の受容能力誘発方法が特に興味あるものである。ポリヌクレオチドに対するそれらの透過性を増強するために処理された細菌細胞は一般的に、コンピテント細胞として言及される。
コンピテント細胞を製造するための多くの確立された方法が存在する。それらの方法は、Mandel and Higs, J. of Mol. Biol. 53 : 159（1970）のCaCl2インキュベーション法、及び多くのよく知られたその変法を包含する。Hanahanは、Ｅ．コリの形質転換の効率を効果的にする因子の詳細な研究を行なって来た（J. Mol. Biol. 166 : 557-580（1983））。ここで彼は、酢酸カリウム、KCl、MnCl2、CaCl2及びヘキサミン塩化コバルトを含んで成る緩衝液によりＥ．コリ細胞を洗浄する段階を含んで成る、高いコンピテントＥ．コリ細胞の生成方法を記載しており、この方法は一般的に、高いコンピテントＥ．コリを生成する最良の利用できる方法と見なされている。コンピテントＥ．コリ細胞を生成するもう１つの方法は、アメリカ特許第4,981,797号（Jesseeなど.）に記載されている。Jesseeなど．は、受容能力誘発方法の一部として、１８℃〜３２℃の温度範囲においてＥ．コリ細胞を増殖せしめることによって高レベルの受容能力が誘発され得ることを示している。
Ｅ．コリ細胞をコンピテントにするための種々の技法は、種々の形質転換効率を有するコンピテントＥ．コリ細胞を生成する。DNAがコンピテントＥ．コリ中に侵入する正確な機構は、完全には理解されていない。コンピテントＥ．コリ細胞の１つの組成物がコンピテントＥ．コリ細胞のもう１つの組成物の形質転換効率となぜ異なるかは、完全には理解されていない。Hanahan, in Escherichia Coli and Salmonella Typhimurium : Cellular and Molecular Biology, Editor F.C. Neidhardt, American Society for Microbiology, Washington, D.C.（1987）。
上記方法はさらに、約１×１０9cfu／μｇ超らせんプラスミドDNAの効率を達成するために最適化されて来た。この数は高く思えるが、このプラスミド（pUC）についての理論的な効率は、３×１０11cfu／μｇである。さらに、実質的な実験条件、たとえば超らせん化されるよりもむしろ連結されるDNA基質の形質転換に適用される場合、観察されるコロニー形成単位の実際の数は、超らせんpUCが試験基質として使用される場合に達成される程度よりも低い程度であった。
過去の開発によってさえ、“コンピテント”Ｅ．コリ細胞の調製におけるわずかな割合の細胞のみがDNA取り込みのために実際的に有能である。従って、コンピテントＥ．コリ細胞の組成物を生成するために現在使用される方法及び細胞はまだ、有意に改良され得る。
あるいは、コンピテント細胞を生成するための他の方法は、それぞれが外因的に付加されたDNAを複製し、そして発現する増強された能力を有するコンピテントＥ．コリ細胞の形成をもたらすことができる。Hanahanは、J. Mol. Bio. 166 : 557-580（1983）において、コンピテントＥ．コリ細胞が細胞エンベロープを通してのDNAの輸送のためのチャネルを含み、そしてＥ．コリ細胞の形質転換のための受容能力の決定における制限段階が、細胞が注目のDNAを取り込んだ後、細胞において生じる現象、すなわち確立段階（establishment step）であることを推定している。コンピテントＥ．コリ細胞の組成物の形質転換効率に影響を及ぼすもう１つの因子は、細胞の遺伝子型である。いくつかのＥ．コリ株は、同じ受容能力誘発方法にゆだねられた他のＥ．コリ株よりも、より高い形質転換性コンピテント細胞組成物を生成することが知られている。
Ｅ．コリがDNA取り込みのためにコンピテントにされ得るという初期の発見に続いて、研究は、形質転換効率を高めるために行われて来た。酢酸カリウム、KCl、MnCl2、CaCl2、グリセロール、及びヘキサミン塩化コバルトを含んで成る緩衝液における細胞の洗浄段階を用いる、J. Mol. Bio. 166 : 557-580（1987）に記載されるHanahanの方法を用いて、得られる形質転換効率の最大レベルは、超らせんpUC18プラスミドDNA １μｇ当たり約１×１０9個の形質転換体である。細胞当たりに基づけば、これは、実際的に形質転換される集団において、300個の細胞当たり約１個の細胞として解釈される。しかしながら、上記数は一般的に、小さな超らせんプラスミドに対して単に適用される。多くの組換えDNA実験によくあることが、大きなプラスミド、又は連結された分子が関与する場合、実際的に形質転換される“コンピテント”細胞の数は、劇的に減少する。それ自体、卓越した形質転換能力のコンピテントＥ．コリを生成するための新規且つ改良された方法、及び卓越した形質転換能力を示すＥ．コリの新規株のための連続した必要性が存在する。所望の結果を得るために必要とされる形質転換の数が最少化されるそのような方法及び株は、遺伝子工学の分野におけるほとんどの研究者にとって広く興味あるものであろう。従って、たとえば、大きな遺伝子ライブラリーがより容易に構築され得、そして複雑な組換え分子の構成がより容易に達成され得る。
発明の開示
本明細書に記載される発明は、広範囲の種類の受容能力誘発方法に使用され得る、高い形質転換性のグラム陰性細菌細胞、たとえばＥ．コリの新規株を生成するための方法を提供する。本発明の方法は、細菌細胞を突然変異誘発し、高い効率の形質転換表現型について前記突然変異誘発された細胞を選択し、そして高いコンピテント細菌の新規組成物を構成するために、高い効率の形質転換を担当する（又はそれに関連する）突然変異誘発された遺伝子材料を用いる方法を包含する。
本発明の１つの態様は、Hte突然変異を欠いているＥ．コリに比べて、（外来性プラスミドの）形質転換表現型の高い効率を付与するHte突然変異を含んで成るものとして特徴づけられる生物学的に純粋なＥ．コリ株である。
本発明のもう１つの態様は、遺伝子型Δ（mcrA）183Δ :（mcrCB-hsdSMR-mrr）173 endA1 supE44 thi-1 recA1 gyrA96 relA1 lac tetR Hte［Ｆ’proAB lacIq ＺΔM15 Tn10（TetR）Amy CamR］を有するＥ．コリXL10−GOLDの新規株である。本発明はさらに、そのような細胞の凍結組成物、及び前記細胞をコンピテントにするための方法に関する。
本発明のさらなる態様は、興味ある異種遺伝子材料をクローン化し又はサブクローン化するためへのHte突然変異を有する細胞の使用である。
本発明を実施するためへの最良の態様
ここに記載される発明は、遺伝子修飾を欠いているＥ．コリ細胞と比較した場合、適切な受容能力誘発方法によりプロセッシングされた後、増強された形質転換効率を有するよう遺伝子的に修飾されたグラム陰性細菌細胞、たとえばＥ．コリを包含する。正しい遺伝子型を担持する微生物が非常に増強された形質転換効率を示すことができることは、これまで示されている。特に、アメリカ特許第5,512,468号（引用により本明細書に組込まれる）は、Ｅ．コリにおけるα−アミラーゼ遺伝子の存在が形質転換効率をいかに高めるかを記載する。
本発明の細菌細胞は、突然変異誘発されたHte領域の組込みにより修飾されている。本発明のためには、前記Hte領域は、Hte領域の突然変異誘発された形を有する細胞に、形質転換表現型の高い効率を付与する領域として特徴づけられる。本発明の開示のためには、用語“組込み”とは、本明細書において使用される場合、相同又は非相同組換えによる細菌ゲノム中へのHte領域の突然変異誘発された変異体の挿入、又はHte領域の変異体のエピゾーム存在を意味する。同様に、Hte変異体は、Hte突然変異を有する細菌宿主に対して、高い効率の形質転換表現型を付与するHte遺伝子座の突然変異誘発された形として定義される。
好ましくは、Hte領域の突然変異誘発された変異体を有する細菌宿主は、生物学的に純粋であろう。本発明のためには、“生物学的に純粋な”細菌株は、単一細胞に由来し、又は直接的に共通する先祖の細胞から少なくとも99.9％構成されているであろう。
Hte領域は、増強された形質転換効率表現型について、突然変異誘発されたＥ．コリをスクリーニングし／選択することによって同定された。特に、一連の形質転換段階が、“コンピテント”細胞の集団を選択的に富化するために、細菌変異体の混合された集団をスクリーニングするために使用された。形質転換スクリーニング方法の選択的特徴は、限定された量のDNAの使用に由来した。形質転換の間に使用されるDNAの量の制限は、抗生物質選択が適用された後、高められた形質転換効率を有する細胞の富化及び同定を思いがけなく可能にした。これまでの研究は、所定の培養物における実質的にすべての細胞が外因的に添加されたDNAを結合するが、しかしDNA取り込みのために実際的に“コンピテント”である低割合の細胞のみが形質転換されることを示している。それらの反応動態を仮定すれば、添加されるDNAの量の制限は、増強された形質転換効率を担持する細胞についての効果的な選択を可能にすることが予測されないであろう。一般的に、DNAの量の“制限”は、DNA／細胞のモル比が、１以下、典型的には、約0.5以下、より典型的には、約0.1以下、及び特に約0.05以下、及び好ましくは約0.001である状況を記載する。
複数回（少なくとも２回〜いづれかの実際的な数まで）の形質転換による選択が、高い効率の形質転換を実施できる性質を有する細胞についてより厳重に選択するために使用され得る。好ましくは、形質転換による連続した回数の選択が、一連の異なるベクター及び選択マーカーを用いて進行するであろう。適用できる場合、形質転換による複数回の選択の間に使用される種々のベクターは、好ましくはそしてそれぞれ、異なるプラスミド不適合性グループから得られた複製の起点を含んで成る。さらに、必ずしも必要ではないが、所定の回数の選択の後に得られる種々の形質転換体は、形質転換による次の回の選択の前、個々に又は集合的に回収され得る。
所望する高い効率の形質転換表現型を示す細菌が同定された後、トランスポゾンライブラリーが生成され、そして一般化されたＰ１トランスダクションが、適切な受容体株中へのその突然変異誘発されたHte領域を移動せしめるために使用された。その得られる“Hte−”細菌は、Hte領域を組込んでいない細胞に比べて増強された形質転換効率、そして特に、ゆるんだ（relaxed）プラスミド及び大きなプラスミドのための増強された形質転換効率を示した。本発明のためには、用語“形質転換効率”とは、コンピテント細胞の所定の組成物のコンピテントレベルの測定値を意味する。形質転換効率は、コンピテント細胞組成物に添加される外因性DNAの個々のμｇ（又は他の量）当たりに得られる形質転換体の数により表わされる。
典型的には、Hte領域の存在は、少なくとも約２倍、より典型的には少なくとも約４倍、及び好ましくは少なくとも約１オーダー程度、所定の細菌の形質転換効率を機能的に高めるであろう。Hte領域の存在が大きなプラスミド及び位相的にゆるんだプラスミド（実質的に超らせんでも又はゆるみ過ぎてもいないプラスミド）の形質転換効率を高めることが、特に興味の対象である。本発明のためには、用語“大きなプラスミド”とは、典型的には、少なくとも約15kbのサイズ、好ましくは少なくとも約２５kb〜約100kbのサイズのプラスミドを意味するであろう。本発明のためには、所定の細菌におけるHte領域の変異体の存在は、典型的には、大きな及び／又はゆるんだプラスミドのための形質転換効率を、少なくとも約２倍、より典型的には、少なくとも約４倍、好ましくは少なくとも約６〜８倍、そしてより好ましくは、少なくとも約１〜２オーダー程度、高めるであろう。
本発明の特定の態様は、Ｅ．コリXL10−GOLDの新規株である。1997年４月２８日、株XL10−GOLDは、特許手続のための微生物の寄託の国際承認に基づくブダペスト条約及び規則（ブダペスト条約）下で、American Type Cultune Collection（ATCC）, Rockville, MD, USAに寄託され、そして従って、ブダペスト条約に従って維持され、そして入手可能にされ得る。そのような株の入手可能性は、いづれかの政府の権威の下でその特許法に従って許可された権利に違反して本発明を実施する承諾と解されるものではない。
寄託された培養物は、下記に示されるATCC寄託番号を割り当てられた：
0004512207.tif 000002
本発明の他の観点は、グラム陰性細菌、たとえばＥ．コリ細胞を、形質転換のためにコンピテントにするための方法を包含する。それらの方法は最少限、Hte領域の適切に突然変異誘発された変異体をコードするポリヌクレオチドをＥ．コリ中に移行させる段階を包含する。そのような修飾された細胞は続いて、広範囲の種類の受容能力誘発方法のいづれかを用いてコンピテントにされ得る。本発明のためには、用語“受容能力誘発方法”とは、外因性DNAによる形質転換に対してＥ．コリ細胞をコンピテントにするために使用されるいづれかの方法を意味する。Ｅ．コリ（及び他のグラム陰性細菌）のための受容能力誘発方法は、当業者によく知られている。受容能力誘発技法は相互にかなり異なるが、ほとんどすべての受容能力誘発技法は、細胞の多価カチオン及び０℃近くの温度への暴露を包含する。本発明に使用するための受容能力誘発技法は、Mandel and Higa（J. Mol. Bio., 53 : 159（1970））のCaCl2インキュベーション方法、及び酢酸カリウム、KCl、MnCl2、CaCl2、グリセロール及びヘキサミン塩化コバルトを含んで成る一連の緩衝液における細胞の処理を用いる、Hanahan, J. Mol. Bio., 166 : 557-580（1983）の方法を包含するが、但しそれらだけには限定されない。Hanahanの方法は、本発明への使用のためには特に好ましい。Hanahanにより教示される緩衝液に加えて又はそれの代わりに、塩化ルビジウムを含んで成る緩衝液も使用され得る。追加の教示は、中でも、次のものに見出され得る：アメリカ特許第4,981,797号（Jessee）、及びSambrookなど., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Press（1989）、及びその定期的改訂版、及びHanahan and Bloom, Escherichia Coli and Salmonella Typhimurium : Cellular and Molecular Biology,“Mechanism of DNA Transformation”, eclitor F.C. Neidhardt, American Society for Microbiology, Washington, D.C.（1996）（それらは引用により本明細書に組込まれる）。
本発明のコンピテント細胞は、最ともよく知られている形質転換方法を用いて形質転換され得る。それらの方法は典型的には、外因性DNAの存在下で、コンピテント細胞を熱パルスに暴露する段階を包含する。そのような形質転換方法の例は、Mandel and Higa, J. of Mol. Biol., 53 : 159（1970）、及びHanahan（1983）J. Mol. Bio., 166 : 557-580（1983）により記載される標準的な高受容能力誘発方法に見出され得る。
細菌宿主中にHte領域を導入するために使用される遺伝子構造体は、細菌細胞において自律的に複製するか、又は細菌細胞のゲノム中に組込まれるよう企画され得る。好ましくは、Hte領域をコードする遺伝子構造体は、宿主細胞内でのHte領域の安定した維持を提供するよう企画される。さらに、遺伝子構造体が自律的に複製する場合、その構造体は、広く使用される細菌ベクターとのプラスミド不適合性をもたらす複製起点、たとえばcolE１レプリコンを含むべきではない。
Hte領域をコードするポリヌクレオチド配列の他に、遺伝子構造体はまた、多くの従来の遺伝子ベクター、たとえばプラスミド、ファージ、ファージミド、及び同様のもののいづれか１つを含むことができる。
好ましくは、遺伝子構造体は、Hte領域内にコードされる必須遺伝子を発現するであろう。Ｅ．コリ及び他のグラム陰性細菌において注目の遺伝子を発現するための方法はよく知られている。そのような方法の例に関しては、Gene Expression Technology : Methods and Enzymology, Vol. 185, Goeddel, Editor, A cademic Press, Incorporated, San Diego, California（1991）を参照のこと。
Hte領域をコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子構造体は、広範囲の種類の形質転換技法のいづれか、たとえば形質転換（transformation）、接合（conjugation）、三親接合（triparental mating）、特殊化された又は一般化されたファージトランスダクション、エレクトロポレーション及び同様の技法を用いて、Ｅ．コリ細胞中に導入され得る。本発明のコンピテントＥ．コリ細胞は、その記載されるHte細胞が受容能力誘発工程にかけられた場合に、生成される。Ｅ．コリ細胞が受容能力誘発方法によりコンピテントにされた後、その細胞は、融解後にそれらの受容能力を保持するよう凍結され得る。凍結されたコンピテント細胞は本発明の特に有用な態様である。なぜならば、それらは長期間、貯蔵され得るからであり、従って、コンピテント細胞の新鮮な調製物を一定して生成する必要性を回避できるからである。凍結されたコンピテント細胞を調製するためのプロトコールは、当業者に知られている。そのようなプロトコールの例は、Hanahan, J. Mol. Bio., 166 : 557-580（1983）に見出され得る。
所定の形質転換プロトコールを用いてのコンピテント細胞の所定の組成物の測定された形質転換効率は一般的に、細菌を形質転換するために使用される特定の外因性DNAに依存して変化するであろうことはまた、認識されるべきである。特に、因子、たとえば外因性DNAのサイズ及びトポロジーは、形質転換効率に有意に影響を及ぼすことができる。
Hte領域をコードする遺伝子構造体の導入は、広範囲の種類のＥ．コリ株の組成物の形質転換効率を高める。典型的には、所定の遺伝子工学実験のために特に有用である、Hte領域を含むＥ．コリの所定の株の遺伝子型が選択され得る。
ここに記載される選択方法、表現型スクリーニング方法、及び寄託されたＥ．コリ株が存在するなら、種々の遺伝子及び分子生物学的方法が、Hte領域の構造、及び高い効率の形質転換表現型を担当する特定の突然変異をさらに定義するために使用され得る。そのような方法の例は、次の文献に記載されている：Maniatis, T.など., Molecular Cloning,（1st Ed.）及びSambrook, J.など.,（2nd Ed.）, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor（1982, 1989）; Methods in Enzymol., Vols. 68, 100, 101, 118 and 152-155（1979, 1983, 1986 and 1987）; 及びMolecular Cloning, D.M. Clover, Ed., IRL Press, Oxford（1985）。培地組成物及び一般的な微生物遺伝子技法は、次の文献に記載される：Miller, J.H., Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, New York（1972）、及びMiller, J.H., A Short Course in Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Press, New York（1995）（それらは引用により本明細書中に組込まれる）、並びに前述の文献。DNA操作及び酵素処理は、製造業者により推薦される方法に従って実施される。
高い効率の形質転換表現型を担当する、Hte領域における特定の単一の遺伝子又は複数の遺伝子（オペロンの場合）が特徴づけられると、高い効率の形質転換表現型に関連するコードされた生成物がまた特徴づけられ得る。従って、本発明の追加の態様は、現在記載される選択方法及びスクリーニング方法により同定されるような高い効率の形質転換表現型と関連するHteタンパク質又はその機能的誘導体である。
用語“Hteタンパク質”とは、本明細書において使用される場合、所望の表現型を提供するHteタンパク質の突然変異誘発された形のアミノ酸残基配列を有するタンパク質を意味するのみならず、また、天然に存在するHteタンパク質の機能的誘導体及び変異体も意味する。
Hteタンパク質の“機能的誘導体”は、Hteタンパク質と同じような質的な生物学的活性を有する化合物である。好ましくは、“機能的誘導体”は、変異体又は生来のHteタンパク質のフラグメント、及びHteタンパク質の誘導体及びそれらのフラグメント（但し、それらは所望の表現型を付与することに関係している）を包含するが、但しそれらだけには限定されない。“フラグメント”は、成熟ポリペプチドの配列内の領域を含んで成る。用語“誘導体”は、Hteタンパク質のアミノ酸配列変異体を定義するために使用され、そして用語“変異体”はまた、この定義内のアミノ酸配列及び変異体を言及する。
好ましくは、機能的誘導体は、対応するHteタンパク質又はポリペプチドのその対応する領域と、少なくとも約６５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは約７５％のアミノ酸配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性、最とも好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドである。最とも好ましくは、Hteタンパク質の機能的誘導体は、高い形質転換効率の表現型の付与を直接的に担当する、Hteタンパク質内の領域を保持するか、又はその領域を模倣する。
Hteタンパク質の機能的誘導体はまた、Hteタンパク質に由来する、化学的に修飾された又は誘導体化された分子を包含する。
用語“機能的誘導体”は、さらに及び特に、Hteタンパク質と同じような質的生物学的活性を有するペプチド及び小さな有機分子を包含する。
Hteタンパク質に関しての“同一性”又は“相同性”とは、配列を一列配列し、そして必要なら、最大の％相同性を達成するためにギャップを導入した後、そして配列同一性の一部としていづれかの保存性置換も考慮しないで、生来のHteポリペプチドのその対応する残基に対して同一である、候補体配列におけるアミノ酸残基の％として、本明細書においては定義される。Ｎ−又はＣ−末端延長又は挿入のいづれも、同一性又は相同性を低めるものとして解されないであろう。一列配列についてのコンピュータープログラミング方法は、当業界においてよく知られている。
Hteタンパク質、又はその機能的誘導体をコードする遺伝子が同定され、そしてクローン化されると、Hteタンパク質のアミノ酸配列変異体、又はその機能的フラグメントは、生来のHte DNA配列中に適切なヌクレオチド変化を導入することにより、又は所望のポリペプチドのインビトロ合成により、当業界において知られている方法により調製される。アミノ酸配列変異体の構成に２種の次の主要変数が存在する：突然変異部位の位置、及び突然変異の性質。Hteタンパク質のアミノ酸配列変異体は好ましくは、天然において存在しない対応するHteアミノ酸配列変異体を生成するためにHte遺伝子を突然変異誘発することによって構成される。
そのような変異体は、たとえば、切断されたHte分子を生成するために、変更されたリーディングフレーム及び翻訳の早期終結をもたらすフレーム−シフト突然変異として構築され得る。同様に、Hteタンパク質の別個の部分の除去を効果的にもたらすイン−フレーム欠失が、Hte遺伝子において行なわれ得る。そのようなアミノ酸配列の欠失は一般的に、約１〜３０個の残基、より好ましくは約１〜１０個の残基の範囲であり、そして典型的には、必ずしも必要ではないが、連続的である。欠失は一般的に、リガンド結合に直接的に、関与しない領域において導入される。
これに代えて、又これに加えて、アミノ酸の変更は、達成されるべき目的に依存して、他の細菌種から得られたHteタンパク質の異なる部位において、又は高度に保存された領域において行なわれ得る。
そのような位置での部位は典型的には、たとえば、（１）達成される結果に依存して、まず、保存性選択により、そして次に、より基本的な選択により置換し、（２）標的残基を欠失し、又は（３）位置決定された部位に隣接して同じか又は異なった種類の残基を挿入することによって、あるいは選択１〜３の組合せにより、連続的に修飾されるであろう。
１つの有用な技法は、“アラニンスキャンニング”（Cunningham and Wells, Science 244, 1081-1085（1989））と呼ばれる。ここで、残基又は標的残基の群が同定され、そしてアラニン又はポリアラニンにより置換される。次に、アラニン置換に対して機能的な感度を示すドメインが、アラニン置換の部位で又は該部位のために、さらなる又は他の置換基を導入することによって精製される。
所望の突然変異を同定した後、Hteタンパク質変異体をコードする遺伝子が化学的合成により得られる。
より好ましくは、Hteタンパク質アミノ酸配列変異体をコードするDNAが、Hteタンパク質の先に調製された変異体又は非変異体バージョンをコードするDNAの部位特定突然変異誘発により調製される。部位特定（部位特異的）突然変異誘発は、横断される欠失連結部の両端上に安定した複合体を形成するための十分なサイズ及び配列複雑性のプライマー配列を供給するために、所望の突然変異のDNA配列をコードする特異的オリゴヌクレオチド配列、及び十分な数の隣接するヌクレオチドの使用を通してのHteタンパク質変異体の生成を可能にする。典型的には、約２０〜５０個の長さのオリゴヌクレオチドのプライマーが好ましく、そして配列の連結部の両側上の少なくとも約５〜１０個の残基が変更される。一般的に、部位特異的突然変異誘発の技法が、出版物、たとえばEdelmanなど., DNA 2 : 183（1983）により例示されるように、当業界において十分に知られている。認識されるであろうように、その部位特異的突然変異誘発技法は、典型的には、一本鎖及び二本鎖形の両者として存在するファージベクターを使用する。部位特異的突然変異誘発において有用な典型的なベクターは、Ｍ13ファージのようなベクターを包含する。この及び他のファージベクターは市販されており、そしてそれらの使用は当業者に良く知られている。Ｍ13由来のベクターを用いての、DNAフラグメントにおけるオリゴデオキシリボヌクレオチド指図された部位特異的突然変異の構成のための種々の及び効果的な方法は、Zoller, M. J. and Smith, M., Nucleic Acids Res. 10, 6487-6500, 1982により公開されている。また、複製の一本鎖ファージ起点を含むプラスミドベクター（Veiraなど., Meth. Enzymol. 153 : 3（1987））が、一本鎖DNAを得るために使用され得る。あるいは、ヌクレオチド置換は、インビトロで適切なDNAフラグメントを合成し、そしてそれを、当業界において知られているPCR法により増幅することによって導入される。
一般的に、部位特異的突然変異誘発は、まず、適切なタンパク質をコードするDNA配列をその配列内に含む一本鎖ベクターを得ることによって実施され得る。所望の突然変異誘発された配列を担持するオリゴヌクレオチドプライマーは一般的に、合成的に、たとえばCreaなど., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 5765（1978）の方法により調製される。次に、このプライマーが、一本鎖タンパク質配列含有ベクターとアニーリングされ、そしてDNA−重合酵素、たとえばＥ．コリポリメラーゼＩクレノウフラグメントにゆだねられ、突然変異を担持する鎖の合成が完結される。従って、一本の鎖がオリジナルの突然変異誘発されていない配列をコードし、そして二本目の鎖が所望する突然変異を担持するヘテロ二重鎖が形成される。次に、このヘテロ二本鎖ベクターが、適切な宿主細胞、たとえばHB101細胞を形質転換するために使用され、そして突然変異誘発された配列配置を担持する組換えベクターを含むクローンが選択される。その後、突然変異誘発された領域が切り出され、そしてタンパク質生成のための適切な発現ベクターに配置される。
PCR技法はまた、Hteタンパク質のアミノ酸配列変異体の創造にも使用され得る。少量の鋳型DNAがPCRにおける出発材料として使用される場合、鋳型DNA中の対応する領域とは配列においてわずかに異なるプライマーが、そのプライマーが鋳型と異なっている位置でのみ鋳型配列と異なる比較的多量の特異的DNAフラグメントを生成するために使用され得る。プラスミドDNAへの突然変異の導入のためには、プライマーの１つが、突然変異の位置とオーバーラップし、そして突然変異を含むよう企画され；他方のプライマーの配列は、プラスミドの反対側の鎖の配列のストレッチと同一であるべきであるが、しかしこの配列はプラスミドDNAにそっていづれの位置にでも位置され得る。しかしながら、第２プライマーの配列は、そのプライマーにより結合されるDNAの全増幅領域が最後に容易に配列決定され得るように、第１プライマーの配列から200ヌクレオチド以内に位置することが好ましい。上記のようなプライマー対を用いてのこのPCR増幅は、プライマーにより特定される突然変異位置で、及びたぶん、鋳型コピーが少々、誤差−傾向にある場合、他の位置で異なるDNAフラグメント集団をもたらす。
前述の及び類似する突然変異誘発技法のさらなる詳細は、一般的なテキストブック、たとえばSambrookなど., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor（1989）、及びCurrent Protocols in Molecular Biology, Ausubelなど. eds., John Wiley and Sons（1995）に見出される。
天然に存在するアミノ酸は、共通する側鎖の性質に基づいて次のグループに分けられ得る：
（１）疎水性：ノルロイシン、met，ala，val，leu，ile ;
（２）中性疎水性：cys，ser，thr ;
（３）酸性：asp，gln ;
（４）塩基性：asn，gln，his，lys，arg ;
（５）鎖の配向に影響を及ぼす残基：gly，pro；及び
（６）芳香族：trp，tyr，phe。
保存性置換は、１つのグループ内のメンバーと同じグループ内の他のメンバーとの交換を包含し、ところが非保存性置換はそれらのクラスの内の１つのクラスのメンバーと他のクラスのメンバーとの交換を必要とする（一般的には、Orcutt, B.C. and Dayhoff, M.O., Scoring Matrices, PIN Report MAT-0285, February 1985を参照のこと）。非保存性置換により得られる変異体は、得られる変異体の生物学的性質／機能における有意な変化をもたらすことが予測され、そして正常なHte機能を阻止するHteタンパク質変異体をもたらすことができる。種々の種間で保存されるアミノ酸位置は一般的に、その目的が生物学的機能を保持することである場合、比較的保存性態様で置換されている。
アミノ酸挿入は、１つの残基〜100又はそれ以上の残基を含むポリペプチドの範囲のアミノ−及び／又はカルボキシル−末端融合、並びに単一の又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入を包含する。配列内挿入（すなわち、Hteコード領域内への挿入）は、一般的に、約１〜１０個の残基、より好ましくは１〜５個の残基、より好ましくは１〜３個の残基の範囲であり得る。末端挿入の例は、組換え宿主細胞からのHteタンパク質の指図された細胞局在化又は分泌を提供するために、Hteタンパク質のＮ−末端に異種Ｎ−末端シグナル配列を融合した変異体Hteタンパク質を包含する。そのようなシグナル配列は一般的に、意図された宿主細胞種から得られ、そして従って、その意図された宿主細胞種に対して相同である。適切な配列は、Ｅ．コリのためのSTII又はＩｐｐを包含する。Hteタンパク質の他の挿入変異体は、Ｃ−末端融合を包含する。さらに、Hteタンパク質のさらなる変異体は、構成成分のアミノ酸の化学的修飾、又は非天然のアミノ酸、又は非生物学的起源のアミノ酸の組込みを通して得られる。
特定の変異体Hteタンパク質の特徴を、あらかじめ予測することはしばしば困難であるので、スクリーニングが最適な変異体を選択するために必要とされることが認識されるであろう。このためには、遺伝子スクリーニングアッセイ、たとえば下記アッセイは、非常に重要であることがわかるであろう。
変更された形質転換効率が変更された細胞エンベロープ（たとえば外層膜における変更されたLPS、及び変更された膜流動性）と関係している場合、Hte領域により提供される所望の表現型は、無能力にされた又は機能的に不活性な細胞タンパク質により引き起こされた構造的異形に関係している可能性もある。たとえば、Hte遺伝子の突然変異誘発は、１又は複数のトランジション又はトランスバージョン突然変異によるキーコード領域における停止コドンの生成をもたらす可能性がある。さらに、フレーム−シフト突然変異は、所望の高い効率の形質転換表現型を生成するために生来のリーディングフレームを破壊するであろう。そのような突然変異が関与する場合、所望の表現型を生成する特に好ましい方法は、突然変異誘発された遺伝子のすべて又は実質的な部分を欠失することである。最適には、Hte遺伝子の少なくとも必須部分が欠失され、又は適切なフレーム−シフト突然変異が、３により割りきれる数の塩基を欠失することによって生成され得る。突然変異誘発された遺伝子を欠失することによって、復帰の機会が劇的に減じられる。
任意には、Hte遺伝子は、選択マーカーを、Hteコード領域中に又はその近くに挿入することによる挿入突然変異誘発により不活性化され得る。従って、Hte突然変異の安定した維持は、正しい抗生物質選択技法を提供することによって確保され得る。欠失又は挿入失活によるHte遺伝子座の不活性化はまた、Hte遺伝子が遺伝子又はオペロンのためのリプレッサー又は活性化因子分子をコードする場合にも好ましく、ここで前記遺伝子又はオペロンのその得られる構成的発現（又は不活性化）はHte表現型に寄与する。
ここに記載されているHte突然変異は、増強された発現、又は遺伝子生成物又はオペロンの過剰発現をもたらすこともまた可能である。逆に言えば、Hte領域の突然変異誘発は、特定遺伝子生成物又はオペロンの過少発現をもたらすこともまた可能である。
本発明のさらなる態様は、Hteタンパク質の正常な機能を阻害しもしくは増強する化合物を発現するか、又はそれに暴露されるかもしくはそれにより処理される微生物が、増強された形質転換効率、又はHte表現型を示すような化合物である。
ここに記載されるHte-コンピテント細胞はまた、他の所望の遺伝子マーカーと組合され得る。たとえば、適切なHte-領域が、炭水化物分解酵素をコードする遺伝子又はその機能的誘導体を含み、そして発現するよう構築された細菌中に移動され得る。好ましくは、炭水化物分解酵素は、澱粉を分解することができる。発現された酵素は好ましくは、細胞のペリプラズム空間に位置するが、しかしながら、本発明の実施は、発現される炭水化物分解酵素の細胞位置に関して、いづれの特定の理論にも依存しない。
さらに、Hte領域は、LacZ遺伝子内の特定の突然変異と共にLacZαフラグメント補完を用いてスクリーンされ得るクローニングベクターと共に使用され得る。同様に、細胞は、形質転換DNAによる補完を提供するために、種々の他の欠失又は突然変異を含むことができる。宿主細胞は、クローニングを促進するために制限−修飾系を有しても又は欠いてもよい。宿主細胞はまた、１又は複数の組換え系、たとえばRecA，RecBCを欠くこともできる。本発明に使用するための特に好ましいＥ．コリ株は、好熱性細菌から単離されたα−アミラーゼの発現のために遺伝子構体の付加により修飾されており、そしてそれぞれ、ATCC受託番号第69480号、第69481号及び第69482号を有する、XL１−BlueTM株（Stratagene, La Jolla, California），XL１−Blue MR株及びSURETM株（Stratagene, La Jolla, California）である。ATCC受託番号第69480号、第69481号及び第69482号を有するＥ．コリ株中のαアミラーゼ遺伝子を含むプラスミドは、当業者によく知られている技法を用いて、他の細菌株に容易に移送され得る。同様に、当業者は、受託番号第69480号、第69481号及び第69482号を有するＥ．コリ株中のプラスミドからαアミラーゼ遺伝子を切出し、そして新規細菌株への遺伝子の移送の前に、新規遺伝子構造体に前記αアミラーゼ遺伝子を移送することができる。
Ｅ．コリが言及されているが、他のグラム陰性細菌細胞もまた、Hte領域の導入によりよりコンピテントにされ得る。たとえば、その細菌の例として、属シュードモナス（Pseudomonas）、リゾビウム（Rhizobium）、アグロバクテリウム（Agrobacterium）、サルモネラ（Salmonella）、プロテウス（Proteus）、シゲラ（Shigella）、クレブシーラ（Klebsiella）及び同様のものを挙げることができる。
突然変異誘発物質技法の特定の例が本明細書に記載されるが、当業者は、本明細書の開示に記載される発明を実施するために広範囲の種類の突然変異誘発物質技法のいづれかを実施できると思われる。
Hte変異体の増強された形質転換効率が与えられる場合、ここに記載される細胞は、注目の異種遺伝子材料のクローニング及びサブクローニングのために特に有用である。典型的には、そのような遺伝子材料は、注目の原核生物遺伝子、又は動物、特に哺乳類遺伝子又はcDNAを包含する。任意には、注目の遺伝子材料は、ゲノム又はcDNAライブラリーに存在するであろう。さらに、大きなプラスミドの増強された形質転換効率が与えられる場合、Hte変異体はまた、注目の遺伝子材料、たとえば大きなプラスミド、たとえば酵母シャトルベクター、哺乳類ウィルスベクター（レトロウィルス、アデノウィルス、乳頭腫ウィルス、ヘルペスウィルス、アデノ随伴ウィルス、狂犬病ウィルス、及び同様のもの；一般的には、Sambrookなど., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, Vol. 3 : 16.1-16.89（1989）を参照のこと）、植物ウィルスベクター、又は昆虫ベクター（たとえば、バキュロウィルス）のクローニング、サブクローニング、及び構築において特に有用である。
上記の発明は、次の例により良好に理解され得る。それらの例は、本発明を単に例示するためであって、本発明を制限するものではない。
例
Ｅ．コリ染色体の突然変異誘発
Ｅ．コリ染色体の突然変異誘発を、Miller, J.,（1995）, A Short Course in Bacterial Genetics. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NYから適合された標準的方法により実施した。Ｅ．コリ株CAG1001（C. Gross, U. Wisconsinからの）の対数的に増殖する培養物50mlを、Sorrall遠心分離機において4000rpmでペレット化し、ＭＣ緩衝液（100mMのMgSO4，５mMのCaCl2）により１度洗浄し、そしてＭＣ  ４０mlに懸濁した。得られる懸濁液５mlを、６枚の殺菌されたペトリ皿の各々に小分けした。５つのそれらのサンプルを、次のようにして、Stratagene Stratalinker 2400（カタログ＃400075）中で種々の強さの紫外線により処理した。皿のフタを除去し、そして細胞のそばに置き、そして100uJ，200uJ，300uJ，400uJ、又は600uJに暴露し；６番目のサンプルは処理されなかった。暴露の前、個々のアリコート５μｌを取り出し、１０-4に希釈し、そしてその100μｌをＬＢプレート上にプレートし、細胞生存率を測定した。暴露の後、細胞を５０mlの円錐形試験管中にピペットで取り、そして1.2mlの５×ＬＢを添加した。突然変異誘発された（及び対照の）サンプルを１時間インキュベートし、そしてその５μｌを生存率プレートのために取り出した。１０-2，１０-3、及び１０-4希釈溶液100μｌをＬＢプレート上にプレートし、ここで培養物を一晩、増殖せしめた。次の朝、個々のプレート上のコロニーの数を測定し、そしてそれらの突然変異誘発されていない対照に比較した。９５〜９９％の細胞の死をもたらすＵＶの強さを、適切なものとして選択し；それらのサンプルに対応する一晩の培養物をプールし、DMSOを添加し、８％の最終濃度にし、そして細胞を−８０℃で貯蔵した。
大きな及び小さな両プラスミドに対して高められた形質転換効率を示すＥ．コリ変異体を再生するために、上記のＵ．Ｖ．生存体をプールし、中間−対数期に増殖せしめ、そしてコンピテント細胞を標準的方法により調製した。次に、それらの細胞を、制限された量のpUC DNA（１pg）により形質転換し、そしてアンピシリン耐性形質転換体を選択した。このスクリーニングの基本原理は、細胞よりも少ないDNA分子が形質転換に添加される場合、より“形質転換性”であるいづれかの特定の細胞がpUC DNA分子を組込む高い傾向を有するためであった。Ｅ．コリCAG1001を出発株として使用した。なぜならば、それは既知の突然変異を担持せず、そしてsnpO（既知のサプレッサーtRNA活性を有さない）であるからであった。さらに、それは、XL１−Blue／DH５α（未公開の観察）のような株と比較する場合、良好には形質転換されないからであった。従って、バックグラウンド形質転換効率が低いので、所望の特徴を有するいづれかの変異体は、より明白である。この実験において、1,500個の形質転換体を個々のプールから得た。それらの細胞の中に、より高い形質転換効率を有する変異体（及び、その大部分は未変化であるが、しかし統計学的確率で形質転換されている）が存在することが推定された。次に、それらの形質転換体をプールし、中間−対数期まで増殖せしめ、そしてコンピテント細胞を再び調製した。次に、それらのプールを、１ngのpQL１、すなわちpUCと共に安定して維持され得、そして異なった抗生物質選択マーカー（クロラムフェニコール）を担持するpACYC184の誘導体（Quinn Lu、未公開）により形質転換した。約200の形質転換体を有するプレートを選択し、そして保存した。注目の変異体の数を増すための方法として、形質転換体／プールの数を減じた。この数を用いることによって、個々のプールが、実際的に、富化された形質転換表現型を有する単一変異体を含むことができることが認識された。次に、それらの200のコロニーの分析のため、９０のコロニーをランダムに選択し、そしてコンピテント細胞の小規模調製物を調製した。前記９０のコロニーを、pAL205、すなわち比較的大きく（１５kb）、テトラサイクリン耐性であり、そしてその複製起点がpUC及びpACYC184の起点と適合できるRSF1010の誘導体により形質転換した。それらの９０のコロニーのうち、最高数の形質転換体を提供する１５のコロニー（実際の効率は、細胞密度及び通常制御される他の因子が多過ぎるために、同時に分析されなかったので、測定されなかった）を、追加の分析のために選択した。
次に、それらの１５の株からのコンピテント細胞を、光学密度及び種々の他のパラメーターをモニターしながら、標準的方法により調製した。それらの株のうち４つの株が、形質転換効率の有意な上昇性を示し、そしてそれらの４つの株は変異体再生のために次のプールに提供された（番号７，１２，３３及び５９）。
富化及び評価のためのコンピテント細胞の調製
可能性ある変異体又は単離された変異体（下記参照のこと）のいづれかのプールのコンピテント細胞を、同様にして調製した。適切な量の細胞（実験に依存して、１０ml〜250ml）を、約0.35の光学密度（Ｏ．Ｄ．600）まで、ＬＢ培地において増殖せしめた。細胞を、適切な遠心分離機の管に移送し（５０mlの円錐試験管中で増殖した１０mlの培養物については、この移送は必要でなかった）、そして1,400rpmで４℃でペレット化した。そのペレットを、FSB（10mMの酢酸カリウム、pH7.6，４５mMの塩化マンガン、１０mMの塩化カルシウム、３mMのヘキサミン塩化コバルト、及び８％のグリセロール）中で、その最初の体積の半分に懸濁し、そして前記のようにして、遠心分離した。次に、ペレットをFSBの元の体積の１／２０に懸濁し、DMSOを添加して８％の最終濃度にし、そしてコンピテント細胞調製物を−８０℃で凍結した。少量のコンピテント細胞調製物が即時評価のために製造される場合、DMSO添加及び凍結段階が回避され、そして100μｌの細胞懸濁液が即時に試験された。
コンピテント細胞の形質転換を、標準的条件（詳細については、Stratagene Conpent Cell Manualを参照のこと）を用いて行なった。それらのマニュアルに記載されるように、β−メルカプトエタノール又はUltraBetaが、その適用に依存して、添加されるか、又は保留された（詳細については、テキストを参照のこと）。
λ：：Tn10突然変異誘発
トランスポゾンTn10（テトラサイクリン耐性）のランダム挿入を、Klecknerなど., 1991, Methods in Enzymology 204 : 139により記載されるようにして実施した。λ：1098（Tn10）は、λＯ遺伝子（DNA複製）及びint遺伝子（溶原化）に存在するアンバー変異のために、supO Ｅ．コリ宿主において複製も又は溶原化もできない欠陥λウィルスである。従って、supO Ｅ．コリ中への侵入に基づいて、それらのファージはさらに増殖することができないが、しかしコードされた遺伝子を発現できるまま存続する。このファージはTn10テトラサイクリン耐性遺伝子をコードするDNAのセグメントを担持する（トランスポジションのために必要とされるIS10要素により取り囲まれる）。ファージはまた、ランダムトランスポジションを触媒するために必要とされるTn10トランスポザーゼ（transposase）タンパク質を担持する。supO Ｅ．コリがλ：1098により感染される場合、その染色体上のある場所に位置するtet耐性遺伝子のコピーを含むテトラサイクリン耐性細菌が選択され得る。（注：λ：λ遺伝子中のアンバー変異の抑制がこの宿主の複製及び続く細胞溶解を可能にするので、1098のストックはsupO Ｅ．コリに基づいて調製され得る）。
λ：対数的に増殖するＥ．コリ100μｌの１０10ファージ粒子による感染により1098挿入を生じさせ；トランスポジション頻度は１０-4〜１０-5であるので、約１０3〜１０4のテトラサイクリン耐性コロニーを、このシステムを用いて得ることができた。より多くのランダムTn10挿入が所望される場合、複数回の感染が実施された。
上記セクション５．１．に記載される４種の可能性ある変異体は、CAG KanR原栄養性バックグラウンドにおいて存在した。従って、スクリーニングが反復される場合、それらの４種の変異体から、XL２−Blue（XL１−MRA）の適切な誘導体へのすべての染色体セグメントを“移送する”ことが必要であった。ランダムトランスポジションマッピングスキームが、Ｅ．コリ染色体中にtet耐性遺伝子をランダムに導入するために使用された。このランダムトランスポジション法は、細胞が非抑制（supO）的であり、そしてテトラサイクリン感受性であることを必要とした。
前記４種の可能性ある変異体の個々を、テトラサイクリン耐性遺伝子のランダムトランスポジションにゆだね、そして約5,000のコロニーを集めた。トランスポジションがランダムである場合、５０の挿入は、Ｅ．コリゲノム上の100ｋ塩基対当たり１つの挿入を統計学的に表わすであろう（１挿入／100kbを用いるための理由は、下記に説明されるであろう）。しかしながら、一般化されたトランスダクションの間、プールのすべての領域が代表され、そして再生されることを確実にするために、本発明者は約5,000のTetR誘導体を選択した。
Ｐ１溶解物の調製
Ｐ１ファージ溶解物を、Miller（1995）に記載のようにして、調製した。注目の株の培養物５mlを、５mMのCaCl2により補充されたＬＢ中で３７℃で、中間−対数期まで増殖せしめた。細胞１mlを、１２mlのFalcon2059管中にピペットで入れ、そして１μｌの高力価Ｐ１ストック（１０8〜１０9pfu／ml；JM101に基づいて調製された）を添加した。ほとんどのストックのために、感染は、四重反復して行なわれ、そして組合された。ファージ及び細胞を３７℃で、１５〜２０分間、振盪しないでインキュベートした。次に、ＮＹプレート上に注がれたサンプルに、2.5mlの上部寒天（５mMまでのCaCl2により補充されている）を添加することによって細胞溶解物をプレートし、そして３７℃で一晩インキュベートした。次の朝、上部寒天を、１２mlの遠心分離管中に削り入れた。プレートを１mlのＬＢにより洗浄し、そして残る寒天／スラリーを管に添加した。次に、５滴（パスツールピペットにより分散された）のクロロホルムを管に添加し、そして懸濁液を回転せしめた（最高の設定で、１０〜２０秒）。サンプルを室温で１５分間インキュベートし、次に5,000rpmでSorrall遠心分離機（４℃）により１５分間、遠心分離した。ファージ含有上清液を回収し、そして新しい１２mlの遠心分離管に移し、強くキャップし、そして４℃で貯蔵した。
Ｐ１トランスダクション
Ｐ１トランスダクションを、Miller（1995）により記載のようにして実施した。受容体株５mlを、５mMのCaCl2により補充されたＬＢ培地において一晩増殖せしめた。静置培養物を、5,000rpmで５分間のSorrall遠心分離機による遠心分離により収穫し、そして等体積のＭＣ緩衝液（100mMのMgSO4，５mMのCaCl2）に懸濁した。細胞を３７℃の空気振盪機中に入れ、そして２０分間インキュベートし、次に前記のようにして遠心分離した。ペレットを500μｌのＭＣ緩衝液に懸濁し；その細胞懸濁液100μｌを、１２mlのFalcon遠心分離管に移した。１〜100μｌのＰ１溶解物（その量は、個々の力価に依存して異なり；従って、個々のトランスダクションのためには、１，５，２５、及び100mlが試験された）を、個々の管に添加した。１つのサンプルは、対照として、常に処理されないまま放置された。Ｐ１感染された細胞を３７℃で約１５〜２０分間インキュベートした。１Ｍのクエン酸ナトリウム200μｌの添加により反応を停止した。ＬＢ 0.5mlを個々のサンプルに添加し、そして細胞を３７℃で１時間増殖せしめ、薬物耐性遺伝子の発現を可能にした（本明細書に記載される実験においては、テトラサイクリン耐性）。発現の後、管のすべての内容物を、適切な抗生物質を含むＬＢプレート又はNZYプレート上にプレートした。
テトラサイクリン耐性遺伝子（及び、従って、セクション５．３．に論じられる４種のＥ．コリゲノムのランダム領域）の再生を、Ｐ１トランスダクションにより達成した。Ｐ１は、敏感なＥ．コリ株の感染の後に、そのDNAを複製し、それをパッケージし、最終的に、宿主細胞の溶解及び死を引き起こすバクテリオファージである。すべてのパッケージされた粒子の９９％は感染性Ｐ１粒子であり、そして１％は、誤ってパッケージされた、宿主細胞DNA（すなわち、Ｅ．コリ染色体DNA）のランダム100kb断片である。それらの溶解物が新規の宿主を感染するために使用される場合、それらの新規細胞の９９％が感染され、そして殺され、そして１％は前の株からのＥ．コリゲノムDNAの100kbセグメントのための受容体になる。組込まれた選択マーカー（Tn10 tet耐性遺伝子のような）を有するＥ．コリ株に基づいて溶解物が調製され、そして受容体が相同組換えできる場合、それ自体の代わりにＰ１−増殖した宿主からのこの100kb領域を含むキメラＥ．コリ株が生成され得る。この態様においては、変異体プールからの5,000のtet耐性コロニーをプールし、そしてそれらを、新たな株（XL１−MRA，recA+，XL２−BlueのＦ-バージョン）に移送することによって、最高の形質転換プールからのランダム染色体領域を選択した。約5,000のtetR形質導入体を４種の変異体の個々のために選択し、プールし、そして上記のような形質転換富化実験にかけた。１ngのpACYC177（KanR）を用いて、個々のプールを形質転換し、そして300〜500の形質転換体を続いてプールし、そして１ngのpAL205（クロラムフェニコール耐性）により形質転換し、そして５０〜150のコロニーを選択した。次に、それらの５０〜150のコロニーをプールし、そしてpUCにより形質転換し、そして２０〜４０の得られるコロニーを再びプールした。それらの３回の追加の富化段階を、他の位置で組込まれるTetRトランスポゾンについてスクリーンするために実施した。次に、２０〜４０の形質転換体をＰ１により感染せしめ、そして改良された形質転換効率を提供するセグメントに隣接するTetR遺伝子を含むはずである新規溶解物を調製した。
次に、それらの４種のＰ１溶解物を、XL１−Blue MR担持のpJC859によりトランスダクションした。このプラスミドは、Ｅ．コリrecA+遺伝子（Ｐ１トランスダクションのプロセッシングのために必要である）を有するpBR322誘導体であり、そして個々の形質導入体を画線培養し、そして親XL１−Blue含有pJC8S7と比較して、形質転換効率について分析した。
同定された４種のＰ１プールの各々から、形質転換効率の上昇を示す単一のコロニーを選択した。それらの変異体を、単離されたオリジナル変異体に対応して、７，１２，３３及び５９と命名した。
0004512207.tif 000003
XL１−BLUEバックグラウンド中への可能性ある突然変異の移送
XL１−MR／pJC859は、Ｅ．コリRecA+遺伝子生成物を発現するプラスミドを含むXL１／XL２blueのＦ-誘導体である。この株をXL２−Blueの同系バージョンに転換するためには、細胞からRecAプラスミドを除去することが必要であった。これは、５０〜100世代にわたる、LB Tet（アンピシリン選択ではない）中での延長された増殖及びアンピシリン感受性についての単一コロニーのスクリーニングにより達成された。４種の変異体の各々の少なくとも１つを同定し；約100〜500の個々のコロニーを、注目のアンピシリン感受性細胞を単離するためにスクリーンした。
次に、４種のＥ．コリ変異体の各々を、XL２−BlueのＦ’アミラーゼエピソームと接合するＦ1接合のための受容体として使用した。次に、小規模コンピテント細胞調製物を、それらの外接合体（exconjugant）に基づいて製造し、そしてpUC及びpRK2013（25kbのプラスミド）を用いての形質転換効率を測定した（表２を参照のこと）。次に、pUC及びpRK2013の両者を用いて最高の相対的効率を示す株（変異体＃１２）を、大規模調製のために使用した。
0004512207.tif 000004
表２に示される形質転換効率を次のようにして測定した。100pgのpUC又は500ngのpRK2013を、100μｌのコンピテント細胞に添加し、そして標準のプロトコールに従って形質転換せしめた。個々の形質転換混合物のアリコート（0.1％，１％，１０％、等）を、形質転換効率を評価するために、適切な選択プレート上にプレートした。それらのデータが示すところによれば、小さなプラスミド（pUC）に関しての相対的形質転換効率は、XL２−Blueに比較して、未変化のままであったが、２５kbのpRK2013プラスミドによる形質転換の効率は、XL10−GOLDにおいて劇的に高められた。大きなプラスミドの形質転換効率の観察される上昇は、Hte-突然変異を有する細胞の特に有用な特徴である。
続くトランスダクション研究が示すところによれば、XL10−GOLDからのHte領域がＥ．コリの異種株中に移送される場合、形質転換効率の約６倍の増強が観察された。種々の宿主間でHte領域を移送するためにＰ１トランスダクションが使用され得るなら、そのHte領域はさらに、XL10−GOLD中に組込まれた、tet遺伝子をコードしたトランスポゾンから100kb以内に存在するDNAのその領域内に位置するものとして特徴づけられ得る。
形質転換の最適化
DNAの添加の１０分前、成分細胞への一定の化合物の添加は、形質転換を劇的に改良することができる。前記のことを最良に実施する細胞系のために、形質転換効率を、現在のUltraBetaに存在する２種の化合物のマトリックスを製造することによって最適化した。pUC及びpRK2013の両者を基質として使用し、そして個々の成分の最適濃度を測定した。そのような最適化パラメーターのさらなる例は、なかでも、110mMのNaCl溶液、及び５０mMの２−メルカプトエタノールの使用を包含する。
コンピテント細胞の他の特徴の分析
いづれかの改良されたバージョンに存在する必要があるコンピテント細胞の他の特徴は、青−白色スクリーニングを実施する可能性（Ｆ lac IqZΔＭ15の存在）、既知の制限系の欠失（Hsd-，McrBCF-，McrA-）、及びminiprep DNA単離の妨害を担当するEndA１ヌクレアーゼの欠失である。これらの特徴を、＃１２変異体について試験した。細胞はそれらの特徴のすべてを維持した。従って、PCRクローニング及びライブラリー構成のためのその利用性を評価するさらなる実験を行なうために変異体１２を使用した。
連結されたDNAによる効率
一般的に、連結されたDNAは、超らせんDNAの効率よりも有意に低い効率で形質転換する。この差異を評価するために、及び変異体１２が、既存のＥ．コリ株に比較して、連結された分子を良好に形質転換することができるかどうかを決定するために、次の実験を実施した。１０ngのpCAL  ｎ−EKプラスミド−DNAを、提供される説明書に従って、連結非依存性クローニング（ligation independent cloning）（LIC，Stratageneカタログ＃214310）のために調製した。カナマイシン耐性遺伝子を、適合性LIC末端を含むプライマーを用いてPCR増幅し、そしてその増幅された生成物を、適切な適合性末端を生成するために、指図されたようにして処理した。それらのDNAを、LICについての提案された条件に従ってアニーリングした。次に、アニーリングされたDNA混合物のアリコートを用いて、変異体１２（この後、XL10−GOLDとして言及する）、及びLife TechnologiesからのDH５を形質転換した。コロニー形成単位（cfu）の数を、超らせんpUC DNAが基質である場合に観察される数と比較した。このデータは、アニーリングされた（すなわち、連結された）DNAについてのcfuの数が、DH５に比較して、XL10−GOLDに関して２０倍高く、そしてpUC効率は５倍高かったことを示した。連結されたDNA分子のための形質転換のこの増強は、それらの株間で有意な差異である。
次に、第２シリーズの連結を、ベクターとして、プラスミドpADGa14（7.6kb）及びpCMV-Script（4.3kb）を用いて調製した。それらのプラスミドをEcoRＩ及びXhoＩにより消化した。約１０ngのマウス脳cDNAライブラリー（StratageneのcDNA合成キットを用いて調製された）を、３０ngのpCMV-Script（又は６０ngのpADGa14）に連結した。この連結反応を４℃で一晩、進行せしめ、そして従って、XL10−GOLD，DH10B及びXL２−Blue中に形質転換した。両実験についてのデータは、表３に示される。この結果によれば、DHB10に比べて、pUC DNAの形質転換で約５倍良好であり、そして連結された（すなわち、大きな）DNA分子の形質転換で約２０〜４０倍良好であった。観察された差異は、クローニングへの適用、たとえばcDNAライブラリーの構成又はPCRクローニングにおいて非常に有意であり、そしてHte突然変異を有する細胞のもう１つの特に有用な特徴を表わす。
0004512207.tif 000005
ライブラリー１：pADGa14，pBluescript由来のプラスミド（7.6kb）を、EcoRＩ及びXhoＩにより消化した。その消化されたベクター６０ngを、上記のようにして、cDNA １０ngに連結した。形質転換を同じ態様で実施し、そしてアンピシリン耐性形質転換体の数を数えた。
ライブラリー２：pCMV-Script，pBluescript由来のプラスミド（4.3kb）を、EcoRＩ及びXhoＩにより消化した。その消化されたベクター３０ngを、標準的プロトコールにより調製されたcDNA １０ngに連結した。前記DNAを、１０μの体積において４℃で一晩、連結し、そしてその１μの体積を、示される株のコンピテント細胞に添加した。
XL10−GOLDを形質転換する好ましい方法の特徴は次の通りである：
１．Falcon 2059管への細胞100μｌの小分け。
２．５０μＭの最終濃度までの３−メルカプトエタノールの添加（２μｌ）。
３．110mMの最終濃度までのNaClの添加（２μｌ）。
４．氷上で１０分間の管のインキュベーション。
５．DNAの添加。
６．氷上で３０分間のインキュベーション。
７．４２℃で３０秒間の熱パルス。
８．氷上で２分間の管のインキュベーション。
９．前もって暖められたNZY培地0.9mlの添加、及び３７℃で６０分間、225〜250rpmで振盪しながらのインキュベーション。
１０．所望によりアリコートのプレート及び３７℃で一晩のインキュベーション。
上記明細書に言及されるすべての出版物及び特許は、引用により本明細書中に組込まれる。前述の明細書は、当業者による本発明の実施を十分に可能にすると思われる。実際、本発明を実施するための上記態様の種々の修飾は、当業者に明らかであり、そして本発明の範囲内である。